BRPI0617267A2 - composições e formulações farmacêuticas e seus usos no tratamento de pacientes com doenças de auto-anticorpos positivos, bem como processo para avaliar a resposta ao tratamento - Google Patents

Abstract

COMPOSIçõES E FORMULAçõES FARMACêUTICAS E SEUS USOS NO TRATAMENTO DE PACIENTES COM DOENçAS DE AUTO- ANTICORPOS POSITIVOS, BEM COMO PROCESSO PARA AVALIAR A RESPOSTA AO TRATAMENTO. A presente invenção se relaciona a métodos e composições para uso no tratamento de pacientes com doença de auto-anticorpo positivo. Em uma modalidade específica, a presente invenção se relaciona a um método para tratar um(a) paciente que tem um título de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma sanguíneo ou soro compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente imunomodulatário, tal como um antagonista de Neutrocina-alfa. Adicionalmente, é provido um método para reduzir a frequência e/ou quantidade da administração de corticosteróide a pacientes. Em modalidades preferidas, o paciente tem lupus eritematoso sistêmico. Métodos para determinar se um paciente com lupus está respondendo ao tratamento médico também são providos.

Description

"COMPOSIÇÕES E FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E SEUSUSOS NO TRATAMENTO DE PACIENTES COM DOENÇAS DE AUTO-ANTICORPOS POSITIVOS, BEM COMO PROCESSO PARA AVALIAR ARESPOSTA AO TRATAMENTO"

Antecedentes da Invenção

A proteína neutrocina-alf a (SEQ ID NO: 2) é ummembro da família TNF de ligantes que compartilham identida-de de seqüência de aminoácidos com APRIL (28,'7%, SEQ ID NO:4), TNFa (16,2%), e Iinf otoxina-a (Lta) (14,1%) (Moore, etal., (1999) Science 285: 260-263). Neutrocina-alfa é conheci-da na literatura científica e de patentes sob muitos nomes,incluindo estimulante de linfócito B (BlyS), fator de ativa-ção de célula B (BAFF), ligante expressado por leucócito re-lacionado a TNF e ApoL - 1 (TALL-I) (Moore, et al., (1999)Science 285: 260-263; Schneider et al., (1999) J. Exp. Med.189: 1747-1756 e Khare et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sei.97: 3370-3375). A nomenclatura oficial para neutrocina-alfaé membro 13B da superfamília de fator de necrose tumoral(ligante) (TNFSF13b). O gene de neutrocina-alfa completo co-difica um polipeptídeo de 285 aminoácidos que tem um domíniotransmembrana entre os aminoácidos 47 e 73 precedido por umaseqüência não hidrofóbica característica de proteínas liga-das a membrana do tipo II. Como outros membros da famíliaTNF, neutrocina-alfa funciona como uma proteína trimérica.Na expressão de neutrocina-alfa na superfície da célula, odomínio extracelular é clivado no aminoácido 134 para libe-rar um trímero biologicamente ativo.

A neutrocina-alfa é conhecida por se ligar a trêsreceptores diferentes da superfamília do receptor de fator de necrose tumoral. Esses são ativadores transmembranares eque interagem com CAML (TACI, número de acesso do GenBankAAC517 90, SEQ ID NO: 6), receptor de fator ativador de célu-la B, antígeno de maturação de célula B (BCMA, número de a-cesso do GenBank NP_001183 SEQ ID NO: 8) e (BAFF-R, númerode acesso do GenBank NP_443177 SEQ ID NO: 10) (Gross, etal., (2000) Nature 404: 995-999; Thompson et al. , (2001)Science 293: 2108-2111 e Yan et al., (2000) Nature Immunol.1: 252-256). A expressão dos receptores á amplamente restri-ta a Iinfócitos B (Moore, et al.f (1999) Science 285: 260-263) . Acredita-se que a maioria dos efeitos de neutrocina-alfa sejam mediados por BAFF-R devido aos efeitos acentuadosnos compartimentos de célula B de camundongos deficientes naexpressão de neutrocina-alfa ou expressão de BAFF-R que nãosão evidentes em camundongos deficientes em TACI ou BCMA (S- chieman et al., (2001) Science 292: 2111-2114; Gross et al.,(2001) Immunity 15: 289-302 e Yan et al., (2000) Nature Im-munol. 1: 252-256).

Quando a proteína neutrocina-alfa foi avaliada invitro e in vivo, foi demonstrado que a neutrocina-alf a pro-move a proliferação, diferenciação e sobrevivência de célulaB. Adicionalmente, foi demonstrado também que a neutrocina-alfa tem algum efeito em células T (MacKay et al., (1999) J.Exp. Med. 190: 1697-1710; Huard et al., (2001) J. Immunol.167: 6225-6231; Huard et al., (2004) Int. Immunol. 16: 467-475; Ng et al., (2004) J. Immunol. 173: 807-817). Camundon-gos que foram engenheirados para superexpressar transgenica-mente neutrocina-alfa tivera números aumentados de célula Bperiféricas e concentração de imunoglobulina sérica aumenta-da. Adicionalmente, camundongos transgênicos para neutroci-na-alfa apresentaram um fenótipo auto-imune parecido com a-quele visto em lúpus eritematoso sistêmico humano incluindoo desenvolvimento de auto-anticorpos e sintomas associadoscom glomerulonefrite (Moore et al., (1999) Science 285: 260-263; MacKay et al., (1999) J. Exp. Med. 192: 129-135). Estu-dos posteriores mostraram que níveis de neutrocina-alfa nosoro e/ou líquido sinovial também estavam super-regulados empacientes com doenças auto-imunes tal como lúpus eritematososistêmico, artrite reumatóide e síndrome de Sjõgren (Cheemaet al., (2001) Arthritis Rheum. 44: 1313-1319; Groom et al.,(2002) J. Clin. Invest. 109-59-68; Mariette et al., (2003)Ann. Rheum. Dis. 62: 168-171). Conseqüentemente, há umacrença generalizada na comunidade científica que antagonis- tas de neutrocina-alfa têm potenciais terapêuticos no trata-mento de doenças auto-imunes.

Lúpus eritematoso sistêmico (SLE ou "lúpus") é umadoença auto-imune cujos sintomas são extremamente heterogê-neos. O padrão atual para diagnosticar um paciente com SLEcontém 11 critérios: (1) erupção "em asa de borboleta" ma-lar, (2) erupção discóide, (3) fotossensibilidade, (4) úlce-ras orais, (5) artrite, (6) serosite, (7) distúrbio renal,(8) distúrbio neurológico, (9) distúrbio hematológico, (10)distúrbio imunológico e (11) presença de anticorpo anti-nuclear. Esses critérios são explicados em maiores detalhesem Tan et al., (1982) Arthritis Rheum. 25: 1271-1277; e Ho-chberg et al., Arthritis Rheum. (1997) 40: 1725, que sãodesse modo incorporadas como referências em suas totalida-des. Uma pessoa que tem quaisquer 4 desses onze critériospode ser diagnosticada com SLE. Conseqüentemente, indivíduosque têm um diagnóstico clínico de SLE podem ter sintomas quenão se sobrepõem. Além disso, muitos dos sintomas de lúpusse sobrepõem com sintomas de outras doenças. Por exemplo,artrite reumatóide, polimiosite-dermatomiosite, esclerosesistêmica (ou escleroderma), síndrome de Sjõgren e váriasformas de vasculite compartilham sintomas com lúpus, inclu-indo uma ou mais das seguintes características, a presençade auto-anticorpos, incluindo anticorpos anti-nucleares eanticorpos anti-dsDNA, dor nas articulações e erupções intu-mescidas e cutâneas e envolvimento de órgão. Assim, na prá-tica, é freqüentemente difícil diagnosticar corretamente pa-cientes com lúpus e pacientes com outras doenças similares.Fatores adicionais que levam à dificuldade em diagnosticar adoença lúpus incluem o fato de que a doença não se desenvol-ve rapidamente, mais exatamente, pacientes acumulam gradual-mente sintomas com o tempo. Adicionalmente, SLE é uma doençacom atividade variável em um paciente. Algumas vezes, a do-ença está quiescente, enquanto em outras vezes pacientes ex-perimentam um aumento no número e/ou gravidade de seus sin-tomas, em um episódio "explosivo". Finalmente, não há nenhumteste de laboratório que irá diagnosticar lúpus definitiva-mente. Conseqüentemente, há a necessidade na técnica paraser capaz de definir subgrupos de pacientes com lúpus comsintomas particulares e fazer correlações entre aqueles sub-grupos de pacientes e tratamentos que são mais capazes debeneficiar pacientes naqueles subgrupos.O presente pedido identifica subgrupos particula-res de pacientes com doenças auto-imunes que são mais capa-zes de se beneficiarem do tratamento com agentes imunomodu-latórios.

Sumário da Invenção

Em um ensaio clinico de fase 2, foi descoberto quetratamento de pacientes com lúpus com um anticorpo que neu-traliza a proteína neutrocina-alfa, dada como uma infusão IVnos dias 0, 14, 28 e então a cada quatro semanas até a sema- na 52, melhoraram significativamente sintomas associados comlúpus no subgrupo dos(as) pacientes que têm um título de ANAde 1:80 ou maior e/ou maior que ou igual a 30 UI/mL de anti-corpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo (veja e-xemplo 1). Surpreendentemente, melhoras significativas esta- tisticamente em ponto final clínico que medem a atividade dadoença (tal como redução na pontuação SELENA SLEDAI, expli-cada em maiores detalhes abaixo) apenas foram obtidas em umsubgrupo dos pacientes, como em oposição à população de pa-cientes inteira inscrita no ensaio clínico. Assim, a presen- te invenção se relaciona à identificação de subgrupos de pa-cientes que são mais capazes de responder ao tratamento comum agente imunomodulatório tal como um antagonista de neu-trocina-alfa.

Conseqüentemente, em uma modalidade, a presente invenção provê um método para tratar um(a) paciente que temum título de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ou igual a30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro san-güíneo compreendendo administrar uma quantidade terapeutica-mente eficaz de um agente imunomodulatório. Agentes imunomo-dulatórios são descritos em maiores detalhes abaixo. Em umamodalidade específica, o agente imunomodulatório é um anta-gonista de neutrocina-alfa, incluindo mas não limitando aanticorpo anti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a an-tigeno deste, uma proteína receptora de neutrocina-alfa oufragmento ou variante desta, um anticorpo que se liga a umreceptor de neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antí-geno deste, um peptídeo ou polipeptídeo de ligação a neutro-cina-alfa, uma variante polipeptídica de neutrocina-alfae/ou APRIL (p. ex., uma forma dominante negativa de neutro-cina-alfa e/ou APRIL). Antagonistas adicionais de neutroci-na-alfa incluem antagonistas de molécula pequena de neutro-cina-alfa, miméticos peptídicos de neutrocina-alfa, RNAs an-ti-sentido e pequenos RNAs de interferência (siRNAs) que di-recionam-se a neutrocina-alfa, RNAs anti-sentido e pequenosRNAs de interferência (siRNAs) que direcionam-se a APRIL,RNAs anti-sentido e pequenos RNAs de interferência (siRNAs)que direcionam-se a receptores de neutrocina-alfa e/ou re-ceptores de APRIL. Receptores de neutrocina-alfa incluem, p.ex., ativadores transmembranares e que interagem com CAML(TACI, número de acesso do GenBank AAC51790, SEQ ID NO: 6),receptor de fator ativador de célula B, antígeno de matura-ção de célula B (BCMA, número de acesso do GenBank NP_001183SEQ ID NO: 8) e (BAFF-R, número de acesso do GenBankNP_443177 SEQ ID NO: 10).

Em outra modalidade, a presente invenção provê ummétodo para tratar um(a) paciente com uma doença auto-imuneque tem um título de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ouigual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ousoro sangüíneo compreendendo administrar uma quantidade te-rapeuticamente eficaz de um agente imunomodulatório. Exem-pios de doença auto-imune em que alguém pode identificar pa-cientes com um título de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior queou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasmaou soro sangüíneo incluem, mas não estão limitadas a, lúpuseritematoso sistêmico (SLE), artrite reumatóide, síndrome deSjõgren, escleroderma, polimiosite-dermatomiosite, síndromede Felty, doença mista do tecido conjuntivo, síndrome deRaynaud, artrite juvenil crônica, glomerulonefrite, púrpuratrombocitopênica idiopática e nefropatia de IgA.

Em uma modalidade específica, a invenção provê ummétodo para tratar um(a) paciente com síndrome de Sjogrenque tem um título de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ouigual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ousoro sangüíneo compreendendo administrar uma quantidade te-rapeuticamente eficaz de um agente imunomodulatório. Em ou- tra modalidade específica, a invenção provê um método paratratar um(a) paciente com síndrome de Sjõgren que tem um tí-tulo de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ou igual a 30UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüí-neo compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamen-te eficaz de um antagonista de neutrocina-alfa.

Em uma modalidade específica, a invenção provê ummétodo para tratar um(a) paciente com artrite reumatóide quetem um título de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ou i-gual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ousoro sangüíneo compreendendo administrar uma quantidade te-rapeuticamente eficaz de um agente imunomodulatório. Em ou-tra modalidade específica, a invenção provê um método paratratar um(a) paciente com artrite reumatóide que tem um tí-tulo de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ou igual a 30UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüí-neo compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamen-te eficaz de um antagonista de neutrocina-alfa.

Em uma modalidade específica, a invenção provê ummétodo para tratar um(a) paciente com lúpus eritematoso sis-têmico (SLE) que tem um título de ANA de 1:80 ou maior e/oumaior que ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA emseu plasma ou soro sangüíneo compreendendo administrar umaquantidade terapeuticamente eficaz de um agente imunomodula-tório. Em outra modalidade específica, a invenção provê ummétodo para tratar um(a) paciente com lúpus eritematoso sis-têmico (SLE) que tem um título de ANA de 1:80 ou maior, e/oumaior que ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA emseu plasma ou soro sangüíneo compreendendo administrar umaquantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de neu-trocina-alfa. Em uma modalidade específica, o paciente comlúpus terá um diagnóstico clínico de SLE de acordo com oscritérios do American College of Rheumatology (ACR) (veja, por exemplo, Tan et al., Arthritis Rheum. 25: 1271-7, (1982)e Hochberg et al. , Arthritis Rheum. 40: 1725 (1997), que sãodesse modo incorporadas como referência em suas totalida-des) .A presente invenção também provê um método paratratar um paciente compreendendo fazer uma determinação, an-tes de administrar um agente imunomodulatório, de que o(a)paciente tem um titulo de ANA de 1:80 ou maior e/ou maiorque ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seuplasma ou soro sangüíneo. A presente invenção também provêum método para tratar um paciente compreendendo fazer umadeterminação, antes de administrar um antagonista de neutro-cina-alfa, de que o(a) paciente tem um titulo de ANA de 1:80ou maior e/ou maior que ou igual a 30 UI/mL de anticorposanti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo.

Em outras modalidades, a invenção provê provê ummétodo para tratar um paciente com lúpus compreendendo fazeruma determinação, antes de administrar um agente imunomodu- latório, de que o (a) paciente com lúpus tem um ou mais dasseguintes características: um diagnóstico clínico de SLE deacordo com os critérios do American College of Rheumatology(ACR) (veja, por exemplo, Tan et al., Arthritis Rheum. 25:1271-7, (1982) e Hochberg et al., Arthritis Rheum. 40: 1725(1997)); uma pontuação SELENA SLEDAI >6; níveis diminuídosdo complemento C4 em seu plasma sangüíneo ou soro; níveisdiminuídos do complemento C3 em seu plasma sangüíneo ou so-ro; um título de ANA de 1:80 ou maior, maior que ou igual a30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro san-güíneo; está recebendo ^7,5 miligramas/dia de prednisona ououtro corticosteróide para tratamento de sintomas relaciona-dos a lúpus e/ou está recebendo ou recebeu previamente tera-pia imunossupressora para o tratamento de sintomas relacio-nados a lúpus. Em uma modalidade especifica, a determinaçãoé feita por um médico com base em uma avaliação do registromédico do paciente. Em outra modalidade especifica, a deter-minação é feita por um médico com base em resultados de tes-tes de laboratório obtidos desde o último tratamento médicodo paciente (incluindo tratamentos médicos com agentes imu-nomodulatórios) para lúpus, se houverem, e antes de começaro tratamento médico compreendendo administrar uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um agente imunomodulatório (in-cluindo um antagonista de neutrocina-alfa) conforme descritoaqui.

Em outra modalidade, a presente invenção provê umamétodo para reduzir a freqüência e/ou quantidade de corti-costeróide administrado a um(a) paciente que tem um titulode ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ou igual a 30 UI/mLde anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneocompreendendo administrar uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um agente imunomodulatório.

Em uma modalidade específica, a invenção provê umamétodo para reduzir a freqüência e/ou quantidade de corti-costeróide administrado a um(a) paciente com síndrome deSjõgren que tem um título de ANA de 1:80 ou maior e/ou maiorque ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seuplasma ou soro sangüíneo compreendendo administrar uma quan-tidade terapeuticamente eficaz de um agente imunomodulató-rio. Em outra modalidade específica, a invenção provê umamétodo para reduzir a freqüência e/ou quantidade de corti-costeróide administrado a um(a) paciente com síndrome deSjõgren que tem um titulo de ANA de 1:80 ou maior e/ou maiorque ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seuplasma ou soro sangüíneo compreendendo administrar, uma quan-tidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de neutrocina-alfa.

Em uma modalidade específica, a invenção prove umamétodo para reduzir a freqüência e/ou quantidade de corti-costeróide administrado a um(a) paciente com artrite reuma-tóide que tem um título de ANA de 1:80 ou maior e/ou maiorque ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seuplasma ou soro sangüíneo compreendendo administrar uma quan-tidade terapeuticamente eficaz de um agente imunomodulató-rio. Em outra modalidade específica, a invenção provê umamétodo para reduzir a freqüência e/ou quantidade de corti-costeróide administrado a um(a) paciente com artrite reuma-tóide que tem um título de ANA de 1:80 ou maior e/ou maiorque ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seuplasma ou soro sangüíneo compreendendo administrar uma quan-tidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de neutro-cina-alfa.

Em uma modalidade específica, a invenção provê umamétodo para reduzir a freqüência e/ou quantidade de corti-costeróide administrado a um(a) paciente com lúpus eritema-toso sistêmico (SLE) que tem um título de ANA de 1:80 oumaior e/ou maior que ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo compreendendo adminis-trar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente i-munomodulatório. Em outra modalidade específica, a invençãoprovê uma método para reduzir a freqüência e/ou quantidadede corticosteróide administrado a um(a) paciente com lúpuseritematoso sistêmico (SLE) que tem um titulo de ANA de 1:80ou maior e/ou maior que ou igual a 30 UI/mL de anticorposanti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo compreendendo ad-ministrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anta-gonista de neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, opaciente com lúpus terá um diagnóstico clínico de SLE de a-cordo com os critérios do American College of Rheumatology(ACR) (veja, por exemplo, Tan et ai., Arthritis Rheum. 25:1271-7, (1982) e Hochberg et al. , Arthritis Rheum. 40: 1725(1997), que são por meio deste incorporadas como referênciaem suas totalidades).

Em uma modalidade adicional, a invenção provê ummétodo para reduzir a quantidade de corticosteróide adminis-trada a um (a) paciente que tem um título de ANA de 1:80 oumaior e/ou maior que ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo é reduzida em pelo me-nos 25% até ^ 7,5 miligramas/dia. Em uma modalidade especí-fica, o corticosteróide é selecionado do grupo que consisteem prednisona, prednisolona, hidrocortisona, metilpredniso-Iona e dexametasona. Em uma modalidade específica adicional,o corticosteróide é prednisona. Em outra modalidade, é pro-vido um método para reduzir a freqüência e/ou quantidade decorticosteróide administrado a um paciente com uma doençaauto-imune compreendendo administrar uma quantidade terapeu-ticamente eficaz de um anticorpo anti-neutrocina-alfa.

Em outro ensaio clínico de fase 2 (Exemplo 3), emque pacientes com artrite reumatóide receberam tratamentocom um anticorpo que neutraliza a proteína neutrocina-alfa,dado como uma infusão IV nos dias 0, 14, 28 e então a cadaquatro semanas até a semana 24, o tratamento foi mais capazde melhorar sintomas associados com artrite reumatóide empacientes que tinham uma pontuação DAS28 maior que 5.1, pa-cientes que não tinham recebido previamente terapia anti-TNFe/ou pacientes que tinham fator reumatóide em seu plasmae/ou soro sangüíneo antes de começar o tratamento com o an- ticorpo que neutraliza a proteína neutrocina-alfa. Subgruposadicionais de pacientes com artrite reumatóide que pareceramser mais capazes de responder ao tratamento com o anticorpoque neutraliza a proteína neutrocina-alfa incluíram pacien-tes do sexo masculino, pacientes que tinham anticorpos anti-CCP (£eptídeo citrulinado cíclico) em seu plasma e/ou sorosangüíneo, pacientes que receberam metotrexato concomitante-mente com o anticorpo que neutraliza a proteína neutrocina-alfa, pacientes que não tiveram êxito previamente no trata-mento com metotrexato e/ou pacientes que não tiveram êxitopreviamente na terapia com metotrexato e pelo menos uma ou-tra terapia DMARD.

Em outra modalidade, a invenção provê um métodopara determinar se um paciente com lúpus está respondendo atratamento médico compreendendo determinar a pontuaçãoSELENA SLEDAI, BILAG e PGA antes da administração de um tra-tamento médico; administrar o tratamento médico e determinara pontuação SELENA SLEDAI, BILAG e PGA após a administraçãodo tratamento médico. Neste método, o paciente será conside-rado como tendo respondido ao tratamento médico se: a pontu-ação SELENA SLEDAI do paciente determinada após a adminis-tração do tratamento médico for 4 ou mais pontos menos que apontuação SELENA SLEDAI antes da administração do tratamentomédico; a pontuação de índice BILAG do paciente determinadaapós a administração do tratamento médico não incluir umanova pontuação de domínio de órgão BILAG A ou 2 novas pontu-ações de domínio de órgão BILAG B comparada à pontuaçãoBILAG determinada antes da administração do tratamento médi-co e a pontuação PGA determinada após a administração dotratamento médico for <0,3 pontos maior que a pontuação dePGA determinada antes da administração do tratamento médico.

Conseqüentemente, em uma modalidade, a invençãoprovê um método para tratar um paciente com artrite reuma- tóide compreendendo fazer uma determinação, antes da admi-nistração de um agente imunomodulatório, em que o pacientecom artrite reumatóide tem uma ou mais das seguintes carac-terísticas: o paciente não recebeu previamente terapia anti-TNF, p. ex., Infliximab (também conhecido como Remicade™ Centocor, Inc.), adalimumab (Humira® de Abbott Laboratories)ou etanercept (Enbrel®); o (a) paciente tem fator reumatóideem seu plasma e/ou soro sangüíneo; o (a) paciente tem anti-corpos anti-CCP (peptídeo citrulinado cíclico) mensuráveisem seu plasma e/ou soro sangüíneo; o (a) paciente tem nível de CRP (proteína reativa C) elevado em seu plasma e/ou sorosangüíneo; o paciente não teve êxito previamente com uma oumais drogas anti-reumáticas modificadoras de doença; essepaciente tem uma pontuação de atividade de doença modificadaalta (DAS28); o paciente tem articulações intumescidas e hi-persensível; o paciente sofre de inflexibilidade matinal; opaciente tem uma taxa de sedimentação eritrocitica (ESR) au-mentada e/ou o paciente é do sexo masculino.

Em outra modalidade, a invenção provê uma formula-ção farmacêutica aquosa compreendendo uma quantidade tera-peuticamente eficaz de um anticorpo, um tampão em uma quan-tidade de cerca de 5 mM até cerca de 50 mM, NaCl em umaquantidade de cerca de 150 mM até cerca de 500 mM, um tenso-ativo em uma quantidade de cerca de 0, 003% até cerca de0,05% com um pH de cerca de 5,5 até cerca de 6,5. Em uma mo-dalidade especifica, o anticorpo na formulação descrita aci-ma é um anticorpo que tem um isotipo de IgGl/lambda. Em umamodalidade adicional, o anticorpo na formulação acima des-crita é um anticorpo humano que tem um isotipo deIgGl/lambda, o tampão na formulação acima descrita é 10 mMde histidina ou citrato de sódio, o tensoativo na formulaçãoacima descrita é polissorbato 80 em uma quantidade de 0,01%p/v, o NaCl na formulação acima descrita está presente emuma concentração de cerca de 150 mM e a formulação tem um pHde 6,0. Em outras modalidades especificas, as formulaçõesacima descritas são estáveis em uma temperatura de cerca de2-8°C por pelo menos um ano. Em outra modalidade, o anticor-po na formulação acima descrita está presente em uma quanti-dade de 100 mg/mL.

Em uma modalidade especifica, a invenção provê umaformulação farmacêutica aquosa compreendendo 100 mg/mL deanticorpo IgGl/λ, 0,74 mg/mL de L-histidina, 1,1 mg/mL decloreto de L-histidina. , 8,8 mg/mL de NaCl e 0,1 mg/mL depolissorbato 80 e em que a formulação tem um pH 6,0.

Breve Descrição das Figuras

Os seguintes desenhos são ilustrativos de modali-dades da invenção e não se destinam a limitar o âmbito dainvenção conforme abrangido pelas reivindicações.

A figura 1 mostra o decréscimo porcentual médio naSELENA SLEDAI na semana 52 em paciente que tinham um titulode ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA na linha basal. Os valores de P fo-ram determinados usando um teste t.

Definições

Em um aspecto, a presente invenção está direciona-da amplamente a métodos para tratar um paciente com doençade auto-anticorpos positivos pela administração de uma quan-tidade terapeuticamente eficaz de um agente imunomodulató-rio. Um paciente com doença de auto-anticorpos positivos éum paciente que tem títulos de auto-anticorpos detectáveisem uma ou mais amostras de fluidos biológicos tal como soroou plasma sangüíneo ou líquido sinovial.

Aqui contida, referência a um "agente imunomodula-tório" é uma referência à classe geral de compostos farma-cêuticos que podem estimular ou inibir o sistema imune. Osexemplos úteis aqui descrevem o uso bem-sucedido de um anti-corpo anti-neutrocina-alfa antagonista no tratamento de umsubgrupo de pacientes com lúpus. Assim, o termo "agente imu-nomodulatório" é destinado especificamente a abranger molé-culas ou compostos farmacêuticos que possam agir como um an-tagonista de neutrocina-alfa. Antagonistas de neutrocina-alfa incluem, mas não estão limitados a, composições compre-endendo um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou fragmentos deligação a antigeno deste, proteínas receptoras de neutroci-na-alfa ou fragmentos ou variantes desta, um anticorpo quese liga a um receptor de neutrocina-alfa ou fragmento de li-gação a antigeno deste e peptideo ou polipeptídeos de liga-ção a neutrocina-alfa. Receptores de neutrocina-alfa inclu-em, p. ex. , ativador transmembrana e que interage com CAML (TACI, número de acesso do GenBank AAC51790), BAFF-R (númerode acesso do GenBank NP_443177) e antigeno de maturação decélula B (BCMA, número de acesso do GenBank NP_001183) . For-mas particularmente úteis dos receptores de neutrocina-alfaincluem formas solúveis dos domínios extracelulares. Recep- tores de neutrocina-alfa ou fragmentos ou variantes destes epolipeptídeos de ligação a neutrocina-alfa podem ser usadoscomo proteínas de fusão, p. ex., proteínas de fusão com Fcou albumina sérica humana (HSA). Antagonistas adicionais deneutrocina-alfa incluem antagonistas de molécula pequena deneutrocina-alfa, miméticos peptídicos de neutrocina-alfa,variantes polipeptídicas de neutrocina-alfa e/ou APRIL (p.ex., formas dominantes negativas de neutrocina-alfa ouAPRIL). Tais variantes polipeptídicas de neutrocina-alfae/ou APRIL podem antagonizar a função de neutrocina-alfa, por exemplo, pela interferência com a homo- ou heteromulti-merização de neutrocina-alfa ou APRIL. Senão, variantes po-lipeptídicas de neutrocina-alfa e/ou APRIL prevenirão quepolipeptídeos que as contenham se liguem a e/ou sinalizematravés de receptores de neutrocina-alfa tal como TACI, BCMAe BAFF-R. Antagonistas adicionais de neutrocina-alfa incluemantagonistas de molécula pequena de neutrocina-alfa, miméti-cos peptidicos de neutrocina-alfa, RNAs anti-sentido e pe-quenos RNAs de interferência (siRNAs) que se direcionam aneutrocina-alfa, pequenos RNAs de interferência (siRNAs) quese direcionam a APRIL, pequenos RNAs de interferência (siR-NAs) que se direcionam a receptores de neutrocina-alfa e/oureceptores de APRIL. Antagonistas de neutrocina-alfa sãodescritos em maiores detalhes abaixo.

Acredita-se que o anticorpo anti-neutrocina-alfafuncione reduzindo números de célula B e/ou atividade de cé-lula B, tal como secreção de imunoglobulina. Assim, o termo"agente imunomodulatório" também destina-se especificamentea abranger agentes imunomodulatórios de célula B e em parti-cular compostos e moléculas farmacêuticas que inibem ou re-duzem diretamente ou indiretamente a atividade de célula B(p. ex., proliferação, diferenciação, sobrevivência ou se-creção de imunoglobulina de célula B) e/ou número de célulasB. Em uma modalidade especifica, um agente imunomodulatórioque pode ser usado em conjunto com os métodos da presenteinvenção é um agente que reduz a atividade ou número totalde células B, células B ativadas, células B nalve, células Bde memória, células B plasmáticas e células B plasmocitói-des, células B CD19+ e células B CD20+.

O sisteme imune é uma rede complexa de citocinas ecélulas que interagem. Por exemplo, células apresentadorasde antigeno (APCs, tal como macrófagos e células dendriti-cas) e células Τ, especificamente células T auxiliares (Th)CD4+, têm um papel na ativação de células B para prolifera-ção e secreção de anticorpos (incluindo auto-anticorpos emcertos ajustes patológicos). Assim, é possível inibir a ati-vidade de célula B reduzindo ou inibindo números ou ativida-de de APC ou célula Th. Da mesma maneira, sabe-se que há di-ferentes tipos de resposta imune tal como respostas Thl eTh2. Agentes imunomodulatórios que podem ser usados nos mé-todos da invenção podem promover um tipo de resposta imunesobre outro e desse modo ter efeitos vantajosos no tratamen-to de pacientes com doença de auto-anticorpo positivos. Con-seqüentemente, neste sentido mais amplo, o termo "agente i-munomodulatório" destina-se especificamente a abranger com-postos ou moléculas farmacêuticas que estimulam ou inibem a atividade ou quantidade de uma ou mais células, moléculas desuperfície celular (p. ex., moléculas de sinalização de su-perfície celular) e/ou citocinas do sistema imune, incluindocélulas, moléculas de superfície celular (p. ex., moléculasde sinalização de superfície celular) e citocinas que são parte do sistema imune inato e/ou adaptativo. Células dosistema imune incluem, mas não estão limitadas a células B,células T, células dendríticas, monócitos, macrófagos, neu-trófilos, eosinófilos, basófilos, mastócitos e células as-sassinas naturais (natural killer, NK). Moléculas de super-fície celular na superfície de células do sistema imune quepodem ser estimuladas ou inibidas por um agente imunomodula-tório incluem, mas não estão limitadas aos antígenos CD talcomo CD20. Citocinas importantes no sistema imune incluem,mas não estão limitadas a, membros da superfamilia de ligan-tes de TNF, incluindo, mas não limitando a neutrocina-alfa,APRIL ou CD40L.

Descrição Detalhada

Em um ensaio clinico de fase II em pacientes comlúpus eritematoso sistêmico, utilizadores descobriram quetratamento de pacientes com lúpus com um anticorpo que neu-traliza a proteína neutrocina-alfa, dada como um infusão IVnos dias 0, 14, 28 e então a cada quatro semanas até a sema-na 52, melhorou significativamente sintomas associados comlúpus em pacientes que têm um título de ANA de 1:80 ou maiore/ou maior que ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNAem seu plasma ou soro sangüíneo (veja exemplo 1).

Conseqüentemente, uma modalidade específica da presente invenção provê um método para tratar um(a) pacientecom lúpus eritematoso sistêmico que têm um título de ANA ^1:80 e/ou maior que ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo com um anticorpo anta-gonista de neutrocina-alfa. Alguém versado na técnica pron-tamente entenderia entretanto, que moléculas de anticorposão de uma variedade de moléculas que podem agir como anta-gonistas de neutrocina-alfa. Assim, outra modalidade especí-fica da presente invenção provê um método para tratar um pa-ciente com lúpus eritematoso sistêmico que tem um título deANA ^ 1:80 e/ou maior que ou igual a 30 UI/mL de anticorposanti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo com um anticorpoantagonista de neutrocina-alfa.

Antagonistas de neutrocina-alfa incluem, mas nãoestão limitados a, composições compreendendo um anticorpoanti-neutrocina-alfa ou fragmentos de ligação a antigenodeste, proteínas receptoras de neutrocina-alfa ou fragmentosou variantes destas, um anticorpo que se liga a um receptorde neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antigeno deste,ou peptídeos ou polipeptídeos de ligação a neutrocina-alfa.Receptores de neutrocina-alfa incluem, p. ex., ativadortransmembranar e que interage com CAML (TACI, número de a-cesso do GenBank AAC51790), BAFF-R (número de acesso do Gen-Bank NP_443177) e antigeno de maturação de célula B (BCMA,número de acesso do GenBank NP_001183). Formas particular-mente úteis dos receptores de neutrocina-alfa incluem formassolúveis dos domínios extracelulares capazes de se ligarem aneutrocina-alfa. Receptores de neutrocina-alfa ou fragmentosou variantes destes e polipeptídeos de ligação a neutrocina-alfa podem ser usados como proteínas de fusão, p. ex., pro-teínas de fusão com Fc ou albumina sérica humana (HSA) . Emuma modalidade específica, um antagonista de neutrocina-alfaé uma proteína TACI-Fc. Um exemplo de uma proteína TACI-Fcsão os aminoácidos 1-154 da SEQ ID NO: 6 fusíonados à regiãoFc de uma molécula de imunoglobulina IgGl. Em uma modalidadeespecífica, um antagonista de neutrocina-alfa é uma proteínaBAFF-R-Fc. Um exemplo de uma proteína BAFF-R-Fc são os ami-noácidos 1-70 da SEQ ID NO: 10 fusionados à região Fc de umamolécula de imunoglobulina IgGl. Opcionalmente, o aminoácido20 (valina) no BAFF-R é substituído por asparagina e o ami-noácido 27 (Ieucina) no BAFF-R é substituído por prolina.SEQ ID NO: 26 mostra os aminoácidos 1-70 de BAFF-R com essasduas alterações de aminoácidos.

Antagonistas adicionais de neutrocina-alfa incluemde neutrocina-alfa incluem antagonistas de molécula peguenade neutrocina-alfa, miméticos peptidicos de neutrocina-alfa,variantes polipeptidicas de neutrocina-alfa e/ou APRIL (p.ex., formas dominantes negativas de neutrocina-alfa ouAPRIL). Tais variantes polipeptidicas de neutrocina-alfae/ou APRIL podem antagonizar a função de neutrocina-alfa,por exemplo, pela interferência com a homo- ou heteromulti-merização de neutrocina-alfa ou APRIL. Em uma modalidade es-pecifica, um antagonista de neutrocina-alfa é fragmento pro-téico de neutrocina-alfa ou variante deste que funciona comoum dominante negativo. Senão, variantes polipeptidicas deneutrocina-alfa e/ou APRIL prevenirão que polipeptideos queas contenham se liguem a e/ou sinalizem através de recepto-res de neutrocina-alfa tal como TACI, BCMA e BAFF-R. Antago-nistas adicionais de neutrocina-alfa incluem antagonistas demolécula pequena de neutrocina-alfa, miméticos peptidicos deneutrocina-alfa, RNAs anti-sentido e pequenos RNAs de inter-ferência (siRNAs) que se direcionam a neutrocina-alfa, pe-quenos RNAs de interferência (siRNAs) que se direcionam aAPRIL, pequenos RNAs de interferência (siRNAs) que se dire-cionam a receptores de neutrocina-alfa e/ou receptores deAPRIL. Antagonistas de neutrocina-alfa são descritos em mai-ores detalhes abaixo.

De maneira similar, alguém versado na técnica a-preciará que agentes imunomodulatórios, incluindo em parti-cular, moléculas que podem modular atividades ou números decélula Β, podem ser úteis na presente invenção. Em modalida-des especificas, um agente modulatório de célula B que podeser usado em conjunto com os métodos da presente invenção éum agente que inibe ou reduz diretamente ou indiretamente aatividade de célula B (p. ex., proliferação, diferenciação,sobrevivência ou secreção de imunoglobulina de célula B)e/ou número de células B. Em outra modalidade, agentes modu-latórios de célula B que podem ser usados em conjunto com osmétodos da presente invenção são agentes que reduzem a ati- vidade ou número total de células B, células B ativadas, cé-lulas B nalve, células B de memória, células B plasmáticas ecélulas B plasmocitóides, células B CD19+ e/ou células BCD20+. Moléculas imunomodulatórias e modulatórias de célulaB que podem ser usadas na presente invenção são conhecidas por aqueles versados na técnica e são descritas em maioresdetalhes abaixo.

Em outra modalidade, a invenção provê um métodopara tratar um paciente que cai no subgrupo de pacientes comlúpus eritematoso sistêmico que têm a doença de lúpus erite- matoso sistêmico (SLE ou "lúpus") "ativo" compreendendo ad-ministrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anta-gonista de anticorpo de neutrocina-alfa. Em modalidades es-pecificas, a invenção provê um método para tratar um pacien-te que foi previamente diagnosticado com lúpus e tem lúpus ativo, compreendendo administrar uma quantidade terapeutica-mente eficaz de um antagonista de anticorpo de neutrocina-alfa. A invenção provê um método para tratar um paciente quecai no subgrupo de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico-

que têm a doença de lúpus eritematoso sistêmico (SLE ou "lú-pus") ativo compreendendo fazer uma determinação de que opaciente tem "lúpus ativo" antes de administrar uma quanti-dade terapeuticamente eficaz de um antagonista de anticorpode neutrocina-alfa. Em modalidades especificas, a invençãoprovê um método para tratar um paciente que foi previamentediagnosticado com lúpus e tem lúpus ativo, compreendendo fa-zer uma determinação de que o paciente foi previamente diag-nosticado com lúpus e tem lúpus ativo antes de administraruma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista deanticorpo de neutrocina-alfa.

Em outra modalidade, a invenção provê um métodopara tratar um paciente que cai no subgrupo de pacientes comlúpus eritematoso sistêmico que têm a doença de lúpus erite-matoso sistêmico (SLE ou "lúpus") "ativo" compreendendo ad-ministrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anta-gonista de neutrocina-alfa ou outro agente imunomodulatórioconhecido na técnica e/ou aqui descrito. Em modalidades es-pecificas, a invenção provê um método para tratar um pacien-te que foi previamente diagnosticado com lúpus e tem lúpusativo, compreendendo administrar uma quantidade terapeutica-mente eficaz de um antagonista de neutrocina-alfa ou outroagente imunomodulatório conhecido na técnica e/ou aqui des-crito. A invenção provê um método para tratar um pacienteque cai no subgrupo de pacientes com lúpus eritematoso sis-têmico que têm a doença de lúpus eritematoso sistêmico ativocompreendendo fazer uma determinação de que o paciente tem"lúpus ativo" antes de administrar uma quantidade terapeuti-camente eficaz de um antagonista de neutrocina-alfa ou outroagente imunomodulatório conhecido na técnica e/ou aqui des-crito. Em modalidades específicas, a invenção provê um méto-do para tratar um paciente que foi previamente diagnosticadocom lúpus e tem lúpus ativo, compreendendo fazer uma deter-minação de que o paciente foi previamente diagnosticado comlúpus e tem lúpus ativo antes de administrar uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um antagonista de neutrocina-alfaou outro agente imunomodulatório conhecido na técnica e/ouaqui descrito.

Em modalidades específicas, um paciente com lúpusativo é definido como um paciente que tem um diagnósticoclínico de SLE de acordo com os critérios do American Colle-ge of Rheumatology (ACR) (veja, por exemplo, Tan et al., Ar-thritis Rheum. 25: 1271-7, (1982) e Hochberg et al., Arthri-tis Rheum. 40: 1725 (1997), que são desse modo incorporadascomo referência em suas totalidades).

Em modalidades específicas, um paciente com lúpusativo é definido como um paciente que tem uma pontuaçãoSELENA SLEDAI >4. SELENA SLEDAI quer dizer índice de Ativi-dade de Doença de Lúpus Eritematoso Sistêmico, conforme mo-dificado pelo ensaio do Safety of Estrogen in Lupus Erythe-matosus National Assessment. Pontuações SELENA SLEDAI sãodeterminadas rotineiramente por clínicos/médicos usando téc-nicas e metodologias conhecidas na técnica, veja, por exem-plo, Bombardier, et al., Arthritis Rheum. 35(6): 630-40,1992 e Strand, et al., J Rheumatol. 26(2): 490-7, 1999, quesão por meio deste incorporados como referência em suas to-talidades. Em resumo, uma pontuação SELENA SLEDAI é determi-nada considerando a atividade de doença de DLE em 24 catego-rias espalhadas por 9 sistemas de órgãos. Doenças e algunssistemas de órgãos é ponderada mais pesadamente que doença em outros sistemas de órgãos. Em particular, medidas de ati-vidade de doença de SLE em sistema nervoso central e vascu-lar, se presentes, são aquinhoadas com 8 pontos, medidas deatividade de doença de SLE renais e músculo-esqueléticas, sepresentes, são aquinhoadas com 4 pontos, medidas de ativida- de de doença de SLE serosas, dérmicas e imunológicas, sepresentes, são aquinhoadas com 2 pontos e medidas de ativi-dade de doença de SLE constitucionais e hematológicas, sepresentes, são aquinhoadas com 1 ponto. A pontuação SELENASLEDAI teórica máxima é 105, mas na prática, poucos pacien- tes têm pontuações maiores que 45.

No sistema de pontuação SELENA SLEDAI padrão, 4pontos são aquinhoados se o indivíduo tem um novo surgimentoou aumento recente de proteinúria maior que 0,5 gramas/24horas. Em outras palavras, se o valor da proteinúria obtidoem uma amostra de urina de 24 horas é mais de 0,5g maior queo valor determinado para a amostra de urina de 24 horas ime-diatamente anterior do paciente, 4 pontos serão aquinhoadospara proteinúria na escala SELENA SLEDAI. Isto é comumentedescrito como um aumento ou novo surgimento de proteinúriade "> 0,5g/24 horas". Assim, sob o sistema de pontuaçãoSELENA SLEDAI padrão, um indivíduo que é aquinhoado com 4pontos na linha de base para proteinúria terá uma SELENASLEDAI que melhora em uma visita subseqüente contanto que ovalor de proteinúria na amostra de urina de 24 horas corren-te não seja mais de 0,5g maior que o valor de proteinúriadeterminado para a amostra de urina de 24 horas imediatamen-te anterior do paciente. Em outras palavras, o paciente terá4 pontos deduzidos da sua pontuação total mesmo diante deproteinúria estável ou aumentos de proteinúria ^ 0,5g/24 ho-ras. Uma modificação das regras de pontuação de proteinúriaem SELENA SLEDAI é descrita no Exemplo 2. No Exemplo 2, apontuação de proteinúria é modificada para que 4 pontos con-tinuem a ser aquinhoados a menos que a proteinúria determi-nada para a amostra de urina de 24 horas presente seja maisde 0,5 gramas menor que o valor de proteinúria determinadopara a amostra de urina de 24 horas imediatamente anteriordo paciente. Adicionalmente, se houver um novo surgimento deproteinúria ou um aumento de proteinúria que é > 0,5g/24 ho-ras, 4 pontos são aquinhoados. Aqui, quando a escala SELENASLEDAI refere-se a, pontuação para proteinúria pode ser fei-ta de acordo com a escala SELENA SLEDAI padrão. De preferên-cia, a pontuação para proteinúria na determinação de umapontuação ELENA SLEDAI do paciente é realizada de acordo como sistema de pontuação de proteinúria descrito no Exemplo 2.

Em outras modalidades especificas, um paciente comlúpus ativo é definido como um paciente que tem uma pontuação SELENA SLEDAI^ 5. Em modalidades especificas adicionais,um paciente com lúpus ativo é definido como um paciente quetem uma pontuação SELENA SLEDAI^ 6. Em modalidades especifi-cas adicionais, um paciente com lúpus ativo é definido comoum paciente que tem uma pontuação SELENA SLEDAI^ 7. Em moda-lidades específicas adicionais, um paciente com lúpus ativoé definido como um paciente que tem uma pontuação SELENASLEDAI^ 8. Em outras modalidades específicas, um pacientecom lúpus ativo é definido como um paciente que tem uma pon-tuação SELENA SLEDAI^ 9. Em outras modalidades específicas,um paciente com lúpus ativo é definido como um paciente quetem uma pontuação SELENA SLEDAI^ 10. Em modalidades especí-ficas adicionais, um paciente com lúpus ativo é definido co-mo um paciente que tem uma pontuação SELENA SLEDAI^ 11. Emmodalidades específicas adicionais, um paciente com lúpusativo é definido como um paciente que tem uma pontuação

SELENA SLEDAI> 12.

Em outras modalidades, um paciente com lúpus ativoé definido como um(a) paciente que tem anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo. Títulos, concentrações ouníveis de anticorpo anti-dsDNA podem ser determinados roti-neiramente por clínicos/médicos usando técnicas e metodolo-gias conhecidas na técnica. Um exemplo para determinar títu-los, concentrações ou níveis de anticorpo anti-dsDNA é umensaio imunoadsorvente ligado a enzima (ELISA) baseado naligação específica de anticorpos anti-dsDNA a dsDNA imobili-zado, veja, por exemplo, Halbert et al. , J Lab Clin Med 97:97-111 (1981). Outro ensaio exemplar para determinar títu-los, concentrações ou níveis de anticorpo anti-dsDNA é umensaio de imunofluorescência indireta baseado na ligação es-pecífica de anticorpos anti-dsDNA ao dsDNA de uma célula deCrithidia Iuciliaer veja, por exemplo, Whiteside et al., AmJ Clin Pathol 72: 829-35 (1979). Ainda outro ensaio exemplarpara determinar títulos, concentrações ou níveis de anticor-po anti-dsDNA é o ensaio de Farr baseado na ligação especí-fica de anticorpos anti-dsDNA a dsDNA radiomarcado, seguidopor precipitação de complexos de dsDNA radiomarcado-anticorpo anti-dsDNA, veja, por exemplo, Davis et alAm JClin Pathol 67: 374-8 (1977). Em modalidades específicas,um(a) paciente com lúpus ativo é definido como um pacienteque tem Unidades Internacionais/mL de anticorpos anti-dsDNAmaiores que ou iguais a 30 em seu plasma ou soro sangüíneo,onde uma Unidade Internacional (UI) é baseada na preparaçãode referência de anticorpo anti-dsDNA na Organização Mundialde Saúde, veja, por exemplo, Feltkamp et al., Ann Rheum Dis47: 740-746 (1988). Cada referência referida neste parágrafoé incorporada aqui como referência em sua totalidade.

Em uma modalidade específica adicional, um(a) pa-ciente com lúpus ativo é definido como um paciente que temmais de ou igual a 40 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seuplasma ou soro sangüíneo. Em uma modalidade específica adi-cional, um (a) paciente com lúpus ativo é definido como um paciente que tem mais de ou igual a 50 UI/mL de anticorposanti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo. Em uma modalida-de específica adicional, um(a) paciente com lúpus ativo édefinido como um paciente que tem mais de ou igual a 60UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüí- neo. Em uma modalidade específica adicional, um(a) pacientecom lúpus ativo é definido como um paciente que tem mais deou igual a 75 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasmaou soro sangüíneo. Em uma modalidade específica adicional,um (a) paciente com lúpus ativo é definido como um pacienteque tem mais de ou igual a 100 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo. Em uma modalidade es-pecífica adicional, um(a) paciente com lúpus ativo é defini-do como um paciente que tem mais de ou igual a 125 UI/mL deanticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo. Emuma modalidade específica adicional, um(a) paciente com lú-pus ativo é definido como um paciente que tem mais de ou i-gual a 150 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo. Em uma modalidade específica adicional,um (a) paciente com lúpus ativo é definido como um pacienteque tem mais de ou igual a 200 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo. Em uma modalidade es-pecífica adicional, um(a) paciente com lúpus ativo é defini- do como um paciente que tem mais de ou igual a 300 UI/mL deanticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo.

Em outras modalidades, um(a) paciente com lúpusativo é definido como um paciente que tem anticorpos anti-nucleares (ANA+) em seu plasma ou soro sangüíneo. Título de anticorpo anti-nuclear pode ser determinado rotineiramentepor clínicos/médicos usando técnicas e metodologias conheci-das na técnica. Um ensaio exemplar para determinar título deanticorpo anti-nuclear é um ensaio de imunofluorescência in-direta baseado na ligação específica de .anticorpos anti- nucleares a células epiteliais humanas Hep-2, veja, por e-xemplo, Osborn et al., Arthritis Rheum 27: 1286-9 (1984). Emoutro ensaio exemplar, concentrações ou níveis de anticorposanti-nucleares podem ser determinados usando uma ELISA base-ado na ligação específica de ANA a antígenos de ANA imobili-zados, por exemplo, dsDNA, Ro/SS-A, La/SS-B, Sm, RNP, veja,por exemplo, Fenger et al., Clin Chem 50: 2147-7 (2004).Testes de ANA são descritos adicionalmente em Kavanaugh etal., Archives of Pathology & Laboratory Medicine (2000) 124:71-81 e Greidinger, EL e Hoffman, RW, Laboratory Medicine(2003) 34: 113-117. Cada referência referida neste parágrafoé incorporada aqui como referência em sua totalidade.

Em modalidades específicas preferidas, um paciente com lúpus ativo é definido como um paciente que tem um títu-lo de ANA de 1:80 ou maior (isto é, um teste de ANA positivoé obtido quando o fator de diluição do plasma ou soro san-güíneo do paciente é 80 ou maior). Títulos de 1:160, 1:320 e1:640, por exemplo, são maiores que um título de 1:80). Emoutras modalidades preferidas, um paciente com lúpus ativo édefinido como um paciente que tem um título de ANA de 1:60ou maior. Em uma modalidade preferida adicional, um pacientecom lúpus ativo é definido como um paciente que tem um títu-lo de ANA de 1:320 ou maior. Em uma modalidade preferida a-dicional, um paciente com lúpus ativo é definido como um pa-ciente que tem um título de ANA de 1:640 ou maior. Em umamodalidade específica, o título de ANA é medido usando imu-nofluorescência indireta em células Hep-2. Em outra modali-dade específica, o título de ANA é medido usando um ensaiode ELISA anti-dsDNA.

Em outras modalidades, um paciente com lúpus ativoé definido como um paciente que tem auto-anticorpos detectá-veis, incluindo, mas não limitando a anticorpos anti-Ro/SS-A, anticorpos anti-La/SS-B, anticorpos anti-RNP, anti-cardiolipina (anti-fosfolipideo), anticorpos anti-dsDNA, an-ticorpos anti-Sm. Títulos, concentrações ou níveis de auto-anticorpo podem ser determinados rotineiramente por clíni-cos/médicos usando técnicas e metodologias conhecidas na técnica.

Em outras modalidades, um(a) paciente com lúpusativo é definido como um paciente que tem níveis de comple-mento C3 e/ou C 4 diminuídos em seu plasma ou soro sangüíneo.Alguém versado na técnica entende que o nível normal de C3e/ou C 4 pode variar dependendo do ensaio usado para medir C3e/ou C4. Conseqüentemente, um nível normal de complemento C3de plasma ou soro pode ser cerca de 90 miligramas/decilitroaté cerca de 180 miligramas/decilitro. Em outras modalidadesespecíficas, um nível normal de complemento C3 de plasma ousoro também podem variar de cerca de 88 miligramas/decilitroaté cerca de 206 miligramas/decilitro ou de cerca de 88 mi-ligramas/decilitro até cerca de 252 miligramas/decilitro. Umnível normal de complemento C4 de plasma ou soro pode sercerca de 16 miligramas/decilitro até cerca de 47 miligra-mas/decilitro. Em outras modalidades específicas, um nívelnormal de complemento C4 de plasma ou soro também podem va-riar de cerca de 12 miligramas/decilitro até cerca de 72 mi-ligramas/decilitro ou de cerca de 13 miligramas/decilitroaté cerca de 75 miligramas/decilitro. Em modalidades especí-ficas, um nível diminuído de complemento C3 de plasma ou so-ro é definido como menos de 90 miligramas/decilitro. Em mo-dalidades específicas, um nível diminuído de complemento C3de plasma ou soro é definido como menos de 88 miligra-mas/decilitro. Em modalidades especificas, um nivel diminuí-do de complemento C3 de plasma ou soro é definido como menosde 85 miligramas/decilitro. Em modalidades específicas, umnível diminuído de complemento C3 de plasma ou soro é defi-nido como menos de 80 miligramas/decilitro. Em modalidadesespecíficas, um nível diminuído de complemento C3 de plasmaou soro é definido como menos de 75 miligramas/decilitro. Emmodalidades específicas, um nível diminuído de complementoC4 de plasma ou soro é definido como menos de 16 miligra-mas/decilitro. Em modalidades específicas, um nível diminuí-do de complemento C4 de plasma ou soro é definido como menosde 15 miligramas/decilitro. Em modalidades específicas, umnível diminuído de complemento C4 de plasma ou soro é defi-nido como menos de 14 miligramas/decilitro. Em modalidadesespecíficas, um nível diminuído de complemento C4 de plasmaou soro é definido como menos de 13 miligramas/decilitro. Emmodalidades específicas, um nível diminuído de complementoC4 de plasma ou soro é definido como menos de 12 miligra-mas/decilitro. Em modalidades específicas, um nível diminuí-do de complemento C4 de plasma ou soro é definido como menosde 11 miligramas/decilitro. Em modalidades específicas, umnível diminuído de complemento C4 de plasma ou soro é defi-nido como menos de 10 miligramas/decilitro. Em modalidadesespecíficas, um nível diminuído de complemento C4 de plasmaou soro é definido como menos de 9 miligramas/decilitro. Ní-veis de complemento podem ser determinados rotineiramentepor clínicos/médicos usando técnicas e metodologias conheci-das na técnica, p. ex., usando um ensaio de imunodifusão ra-dial.

Em outras modalidades, um paciente com lúpus ativoé definido como um (a) paciente que tem qualquer uma ou maisdas seguintes características: um diagnóstico clínico de SLEde acordo com os critérios do American College of Rheumato-Iogy (ACR) (veja, por exemplo, Tan et al., Arthritis Rheum.25: 1271-7, (1982) e Hochberg et al., Arthritis Rheum. 40:1725 (1997)); uma pontuação SELENA SLEDAI >6; níveis diminu-ídos do complemento C4 em seu plasma sangüíneo ou soro; ní-veis diminuídos do complemento C3 em seu plasma sangüíneo ousoro; um título de ANA de 1:80 ou maior, maior que ou iguala 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou sorosangüíneo; está recebendo ^7,5 miligramas/dia de prednisonaou outro corticosteróide para tratamento de sintomas rela-cionados a lúpus e/ou está recebendo ou recebeu previamenteterapia imunossupressora para o tratamento de sintomas rela-cionados a lúpus .

Em outras modalidades, um paciente com lúpus ativoé definido como um(a) paciente que tem qualquer uma ou maisdas seguintes características: um diagnóstico clínico de SLEde acordo com os critérios do American College of Rheumato-Iogy (ACR); uma pontuação SELENA SLEDAI ^8; níveis diminuí-dos do complemento C4 em seu plasma sangüíneo ou soro; ní-veis diminuídos do complemento C3 em seu plasma sangüíneo ousoro; um título de ANA de 1:80 ou maior, maior que ou iguala 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou sorosangüíneo; está recebendo até 40 miligramas/dia de predniso-na ou outro corticosteróide para tratamento de sintomas re-lacionados a lúpus e/ou está recebendo ou recebeu previamen-te terapia imunossupressora para o tratamento de sintomasrelacionados a lúpus.

Múltiplos índices de atividade de doença são bemconhecidos por clínicos/médicos na técnica e podem ser usa-dos para medir a extensão da atividade de doença reumática,tal como atividade de doença de SLE (veja, por exemplo, S-trand et al., J Rheumatol 26: 490-7, (1999)). Em uma modali-dade, a SELENA SLEDAI é usada como um índice de atividade dedoença (daí) (veja, por exemplo, Bombardier et al., Arthri-tis Rheum 35: 630-40 (1992)). Em outra modalidade, o índicede rubor de SLE é usado como um daí (veja, por exemplo, Pe-tri et al., Lupus 8: 685-91, (1999)). Em uma modalidade adi-cional, o índice de Lesão das Clínicas Colaboradoras Inter-nacionais de Lúpus Sistêmico/Congregação Americana de Reuma-tologia (SLICC/ACR) é usado como um daí (veja, por exemplo,Galdman et al., Arthritis Rheum 39: 363-9 (1996)). Em outramodalidade, a avaliação Global do clínico (PGA) é usada comoum daí. O PGA é uma escala visual análoga com uma faixa de Oaté 3 em que O é atividade de doença nula, 1 é atividade dedoença leve, 2 é atividade de doença moderada e 3 é ativida-de de doença grave, é usada como um daí. Ainda em outra mo-dalidade, The Medicai Outcomes Survey Short Form (SF-36) éusado como um daí.O SF-36 é um instrumento de qualidade devida relacionado a saúde (HRQOL) genérico que demonstrou-serefletir o impacto de SLE em todos os domínios de HRQOL emestudos de coorte observacionais, assim como ensaios aleató-rios (Cook et al., J Rheumatol 27: 1892-1895 (2000); Thumbooet al., J Rheumatol 26: 97-102 (1999); Thumboo et al., JRheumatol 27: 1414-1420 (2000); Ware JE et al., Med Care 30:473-483 (1992); Smolen JS et al., J Rheumatol 26: 504-507(1999); Gladman et ai., Lupus 5: 190-195 (1996); Alonso J etal., Qual Life Res 13: 283-298 (2004) e Gladman et al., JRheumatol 27: 377-9 (1995), cada uma das quais é incorporadacomo referência aqui em sua totalidade).

Em uma modalidade adicional, o EQ-5D (também co-nhecido como o instrumento EuroQol) é usado como um dai. 0EQ-5D é uma medida de qualidade de vida relacionada à saúdegenérica. Ele destina-se a ser simples, questionário auto-administrado que contém não apenas um sistema de classifica-ção de estado de saúde descritivo, mas também é capaz de ge-rar um índice ou pontuação composta refletindo o valor depreferência associado a um dado estado de saúde. 0 sistemadescritivo EQ-5D consiste em cinco dimensões: mobilidade,auto-cuidado, atividades usuais, dor/desconforto e ansieda-de/depressão. Cada dimensão tem três níveis refletindo "ne-nhum problema de saúde", "problemas de saúde moderados" e"problemas de saúde extremos" (veja, por exemplo, Health Po-Iicy (1990) Dez. 16(3): 199-208, que é incorporado aqui comoreferência).

Em uma modalidade adicional, a subescala de Avali-ação Funcional para Terapia de Doença Crônica-Fadiga (FACIT-F) do Sistema de Medição de Avaliação Funcional para Terapiade Doença Crônica (FACIT) é usado como um daí. A subescalaFACIT-F é uma compilação de 27 itens de questões gerais di-vididas em quatro domínios de QOL primários: bem-estar físi-co, bem-estar social/familiar, bem-estar emocional e bem-estar funcional. Esta ferramenta de medição colige retroali-mentação do paciente sobre nível de energia, apatia e a ha- bilidade para iniciar ou finalizar atividades (veja, por e-xemplo, Yellen, SB et al., Journal of Pain and Symptom Mana-gement, 24(6): 547-561 (2002), cada uma das quais é incorpo-rada como referência aqui em sua totalidade).

Em uma modalidade adicional, a Pontuação de Ativi-dade de Doença (DAS28) é usada como um daí. DAS28 é uma fer-ramenta padrão usada por reumatologistas para avaliar a ati-vidade de doença reumática. Esta ferramenta de medição cal-cula uma pontuação de índice na avaliação de: número de ar-ticulações suscetíveis a dor ao toque (TEN), o número de ar- ticulações inchadas (SW), a taxa de sedimentação eritrocíti-ca (ESR) e a avaliação do paciente de atividade de doença(VAS; mm) (veja, por exemplo, Van der Heijde D. M. F. M. etal., J Rheumatol 20: 579-8 (1993); Prevoo M. L. L. et al.,Arthritis Rheum 38: 44-8 (1995), cada uma das quais é incor-porada como referência aqui em sua totalidade).

Em uma modalidade adicional, o Grupo de Avaliaçãode Lúpus das I_lhas Britânicas (BILAG) é usado como um daí(veja, por exemplo, Isenberg et al., Rheumatolgy 44: 902-6(2005); Gordon et al., Rheumatology 42(11): 1372-9 (2003);Isenberg et al., Lupus 9(9): 651-4, (2000); Hay et al., Q JMed 86: 447-58 (1993); e o guia para usuários do programaBLI PS™ Versão 3.0, liberado em 4 de abril de 2004, ADS-Limathon Ltda, cada uma das quais é incorporada como refe-rência aqui em sua totalidade). 0 índice BILAG compreende 8órgãos/sistemas corpóreos conhecidos como sendo afetados nolúpus e pontua cada um dependendo se as características clí-nicas são/estão novas, piores, as mesmas ou melhoradas com-paradas com a medição prévia. Para cada um dos 8 ór-gãos/sistemas corpóreos, a gravidade da manifestação da do-ença de SLE é uma pontuação A, B, C, D ou E com A sendo amais grave (veja, por exemplo, Hay, ibid) . 0 índice BILAGprovê uma pontuação composta para avaliar a gravidade da do- ença e eficácia do tratamento. Esta pontuação composta adi-ciona contribuições sobre cada um dos 8 órgãos/sistemas cor-póreos afetados no lúpus. Usando BILAG ou outras medidas co-nhecidas na técnica, o tratamento pode ser direcionado a pa-ciente com lúpus com manifestação da doença em subgrupos es-pecíficos de órgãos/sistemas.

Conseqüentemente, em uma modalidade específica, umpaciente com lúpus que está sendo ou foi tratado com um a-gente imunomodulatório conhecido na técnica e/ou descritoaqui é considerado como estando respondendo/tendo respondido ao tratamento se o paciente atingiu uma redução em sua pon-tuação SELENA SLEDAI. Em uma modalidade específica, um paci-ente com lúpus que está sendo ou foi tratado com um agenteimunomodulatório conhecido na técnica e/ou descrito aqui éconsiderado como estando respondendo/tendo respondido ao tratamento se o paciente atingiu uma redução em sua pontua-ção SELENA SLEDAI comparada à mesma pontuação SELENA SLEDAIde linha basal do paciente, a pontuação SELENA SLEDAI deter-minada antes daquele início de tratamento pelo paciente como agente imunomodulatório. Em uma modalidade específica, umpaciente com lúpus que está sendo ou foi tratado com um a-gente imunomodulatório conhecido na técnica e/ou descritoaqui é considerado como estando respondendo/tendo respondidoao tratamento se o paciente atingiu pelo menos uma reduçãode quatro pontos em sua pontuação SELENA SLEDAI. Em uma mo-dalidade específica, um paciente com lúpus que está sendo oufoi tratado com um agente imunomodulatório conhecido na téc-nica e/ou descrito aqui é considerado como estando respon- dendo/tendo respondido ao tratamento se o paciente atingiupelo menos uma redução de quatro pontos em sua pontuaçãoSELENA SLEDAI comparada à mesma pontuação SELENA SLEDAI delinha basal do paciente, a pontuação SELENA SLEDAI determi-nada logo antes daquele início de tratamento pelo pacientecom o agente imunomodulatório.

Em outra modalidade específica, um paciente comlúpus que está sendo ou foi tratado com um agente imunomodu-latório conhecido na técnica e/ou descrito aqui é considera-do como estando respondendo/tendo respondido ao tratamentose o paciente não experimentou uma piora da atividade da do-ença como determinado pela Avaliação Global do Médico (PGA).Em uma modalidade específica, o paciente não experimentouuma piora da atividade da doença se a pontuação PGA diminu-iu, permaneceu estável ou aumentou em menos de 0,3 pontos. Em uma modalidade específica, o paciente não experimentouuma piora da atividade da doença se a pontuação PGA diminu-iu, permaneceu estável ou aumentou em menos de 0,3 pontos apartir da mesma pontuação PGA de linha basal do paciente, apontuação PGA determinada logo antes daquele início de tra-tamento pelo paciente com o agente imunomodulatório.

Em outra modalidade especifica, um paciente comlúpus que está sendo ou foi tratado com um agente imunomodu-latório conhecido na técnica e/ou descrito aqui é considera-do como estando respondendo/tendo respondido ao tratamentose o paciente não experimentou uma piora da atividade da do-ença como determinado pelo índice de atividade de doença doGrupo de Avaliação de Lúpus das Ilhas Britânicas (BILAG). Emuma modalidade específica, o paciente não experimentou umapiora da atividade da doença se o paciente não ganhou umanova pontuação de domínio de órgão de BILAG A ou não ganhou2 novas pontuações de domínio de órgão de BILAG B. Em umamodalidade específica, o paciente não experimentou uma piorada atividade da doença se o paciente não ganhou uma novapontuação de domínio de órgão de BILAG A ou não ganhou 2 no-vas pontuações de domínio de órgão de BILAG B desde a avali-ação de BILAG de linha basal do paciente, a avaliação deBILAG determinada logo antes daquele início de tratamentopelo paciente com o agente imunomodulatório.

Em outra modalidade específica, um paciente comlúpus que está sendo ou foi tratado com um agente imunomodu-latório conhecido na técnica e/ou descrito aqui é considera-do como estando respondendo/tendo respondido ao tratamentose o paciente atingiu uma redução em sua pontuação SELENASLEDAI, não teve uma piora considerável de sua pontuação PGAe não experimentou uma piora da atividade da doença como de-terminado pelo índice de atividade de doença do Grupo de A-valiação de Lúpus das Ilhas Britânicas (BILAG) comparados àssuas pontuação de SELENA SLEDAI, pontuação PGA e avaliaçãoBILAG de linhas basais, respectivamente. Em uma modalidadeespecifica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tra-tado com um agente imunomodulatório é considerado como es-tando respondendo/tendo respondido ao tratamento se o paci-ente atingiu pelo menos uma redução de quatro pontos em suapontuação SELENA SLEDAI, não teve um aumento de mais de 0,30pontos em sua pontuação PGA e não ganhou uma nova pontuaçãode domínio de órgão de BILAG A ou não ganhou 2 novas pontua-ções de domínio de órgão de BILAG B, comparados às suas pon-tuação de SELENA SLEDAI, pontuação PGA e avaliação BILAG delinhas basais, respectivamente.

Em outra modalidade específica, um paciente comlúpus que está sendo ou foi tratado com um agente imunomodu-latório conhecido na técnica e/ou descrito aqui é considera-do como estando respondendo/tendo respondido ao tratamentose a dose de prednisona do paciente foi reduzida. Em outramodalidade específica, um paciente com lúpus que está sendoou foi tratado com um agente imunomodulatório conhecido natécnica e/ou descrito aqui é considerado como estando res-pondendo/tendo respondido ao tratamento se a dose de predni-sona do paciente foi reduzida comparada à dose de prednisonade linha basal do paciente, o paciente estava tomando a dosede prednisona logo antes daqueles início de tratamento pelopaciente com o agente imunomodulatorio. Em outra modalidadeespecífica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tra-tado com um agente imunomodulatório conhecido na técnicae/ou descrito aqui é considerado como estando responden-do/tendo respondido ao tratamento se a dose de prednisona dopaciente foi reduzida em pelo menos 25%. Em outra modalidadeespecifica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tra- tado com um agente imunomodulatório conhecido na técnicae/ou descrito aqui é considerado como estando responden-do/tendo respondido ao tratamento se a dose de prednisona dopaciente foi reduzida em pelo menos 25% até menos de ou i-gual a 7,5 mg/dia. Em outra modalidade especifica, um paci- ente com lúpus que está sendo ou foi tratado com um agenteimunomodulatório conhecido na técnica e/ou descrito aqui éconsiderado como estando respondendo/tendo respondido aotratamento se a dose de prednisona do paciente foi reduzidaem pelo menos 25% a partir da dose de prednisona de linha basal do paciente até menos de ou igual a 7,5 mg/dia. Em ou-tra modalidade especifica, um paciente com lúpus que estásendo ou foi tratado com um agente imunomodulatório conheci-do na técnica e/ou descrito aqui é considerado como estandorespondendo/tendo respondido ao tratamento se a dose de prednisona do paciente foi reduzida em pelo menos 50%. Emoutra modalidade especifica, um paciente com lúpus que estásendo ou foi tratado com um agente imunomodulatório conheci-do na técnica e/ou descrito aqui é considerado como estandorespondendo/tendo respondido ao tratamento se a dose deprednisona do paciente foi reduzida em pelo menos 50% atémenos de ou igual a 7,5 mg/dia. Em outra modalidade especi-fica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tratadocom um agente imunomodulatório conhecido na técnica e/oudescrito aqui é considerado como estando respondendo/tendorespondido ao tratamento se a dose de prednisona do pacientefoi reduzida em pelo menos 50% a partir da dose de predniso-na de linha basal do paciente até menos de ou igual a 7,5mg/dia.

Outras medidas podem ser usada para medir a quali-dade de uma resposta de um paciente com lúpus ao tratamento.Em uma modalidade especifica, um paciente com lúpus que estásendo ou foi tratado com um agente imunomodulatório conheci- do na técnica e/ou descrito aqui é considerado como estandorespondendo/tendo respondido ao tratamento se o paciente temuma Pontuação de Vistoria de Saúde SF-36 melhorada. Em outramodalidade especifica, um paciente com lúpus que está sendoou foi tratado com um agente imunomodulatório conhecido natécnica e/ou descrito aqui é considerado como estando res-pondendo/tendo respondido ao tratamento se o paciente temuma Pontuação de Vistoria de Saúde SF-36 melhorada comparadaà Pontuação de Vistoria de Saúde SF-36 de linha basal do pa-ciente.

Em uma modalidade especifica, um paciente com lú-pus que está sendo ou foi tratado com um agente imunomodula-tório conhecido na técnica e/ou descrito aqui é consideradocomo estando respondendo/tendo respondido ao tratamento se opaciente tem uma pontuação EQ-5D melhorada. Em outra modali-dade especifica, um paciente com lúpus que está sendo ou foitratado com um agente imunomodulatório conhecido na técnicae/ou descrito aqui é considerado como estando responden-do/tendo respondido ao tratamento se o paciente tem uma pon-tuação EQ-5D melhorada comparada à pontuação EQ-5D de linhabasal do paciente.

Em uma modalidade especifica, um paciente com lú-pus que está sendo ou foi tratado com um agente imunomodula-tório conhecido na técnica e/ou descrito aqui é consideradocomo estando respondendo/tendo respondido ao tratamento se opaciente demonstra fadiga reduzida como mostrado pela pontu-ação FACIT-F do paciente. Em outra modalidade especifica, umpaciente com lúpus que está sendo ou foi tratado com um a-gente imunomodulatório conhecido na técnica e/ou descritoaqui é considerado como estando respondendo/tendo respondidoao tratamento se o paciente demonstra fadiga reduzida comomostrado pela pontuação FACIT-F do paciente comparada à pon-tuação FACIT-F de linha basal do paciente.

Em uma modalidade específica, um paciente com lú-pus que está sendo ou foi tratado com um agente imunomodula-tório conhecido na técnica e/ou descrito aqui é consideradocomo estando respondendo/tendo respondido ao tratamento se opaciente tem uma pontuação DAS28 melhorada. Em outra modali- dade específica, um paciente com lúpus que está sendo ou foitratado com um agente imunomodulatório conhecido na técnicae/ou descrito aqui é considerado como estando responden-do/tendo respondido ao tratamento se o paciente tem uma pon-tuação DAS28 melhorada comparada à pontuação DAS28 de linha basal do paciente.

Em outra modalidade específica, um paciente comlúpus que está sendo ou foi tratado com um agente imunomodu-latório conhecido na técnica e/ou descrito aqui é considera-do como estando respondendo/tendo respondido ao tratamentose o paciente tem uma freqüência e/ou duração reduzida derubores. Em outra modalidade especifica, um paciente com lú-pus que está sendo ou foi tratado com um agente imunomodula-tório conhecido na técnica e/ou descrito aqui é consideradocomo estando respondendo/tendo respondido ao tratamento se opaciente tem uma freqüência e/ou duração reduzida de ruborescomparadas às freqüência e/ou duração reduzida de ruboresantes do tratamento com o agente imunomodulatório. Em outra modalidade especifica, um paciente com lúpus que está sendoou foi tratado com um agente imunomodulatório conhecido natécnica e/ou descrito aqui é considerado como estando res-pondendo/tendo respondido ao tratamento se o paciente temuma gravidade reduzida de rubores. Em outra modalidade espe- cifica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tratadocom um agente imunomodulatório conhecido na técnica e/oudescrito aqui é considerado como estando respondendo/tendorespondido ao tratamento se o paciente tem uma gravidade re-duzida de rubores comparada à gravidade de rubores antes do tratamento com o agente imunomodulatório. O indice de ruborde SLE avalia a freqüência e gravidade de exacerbações nossintomas de lúpus (rubores). rubores são categorizados como"leves ou moderados" ou "graves", rubores leves ou moderadosenvolvem um ou mais dos seguintes: alteração na pontuaçãoSELENA SLEDAI de 3 pontos ou mais; novos/piores lúpus dis-cóides, fotossensiveis, profundos, de vasculite cutânea oubolhoso; úlceras nasofaringeanas, pleurite; pericardite, ar-trite, febre (SLE); aumento em prednisona, mas não mais que0,5 mg/kg/dia; NSAID ou Plaquenil adicionados para atividadede doença e aumento maior que 1,0 na pontuação PGA, mas nãomais que 2,5. rubores graves envolvem um ou mais dos seguin-tes: alteração na pontuação SELENA SLEDAI maior que 12; no-vo/pior CNS-SLE; vasculite, nefrite, miosite, Pit<60.000;anemia do heme (<7% ou diminuição em HB >3%) ; duplicação dadosagem de prednisona; aumento em prednisona até mais de 0,5mg/kg/dia; prescrição de Cytoxan; prescrição de Azatioprina,prescrição de metotrexato; hospitalização (SLE) e aumento napontuação PGA até mais de 2,5. Em outra modalidade especifi-ca, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tratado comum agente imunomodulatório conhecido na técnica e/ou descri-to aqui é considerado como estando respondendo/tendo respon-dido ao tratamento se o paciente tem uma freqüência e/ougravidade reduzida de rubores como medido pelo índice de ru-bor de SLE. Em outra modalidade específica, um paciente comlúpus que está sendo ou foi tratado com um agente imunomodu-latório conhecido na técnica e/ou descrito aqui é considera-do como estando respondendo/tendo respondido ao tratamentose o paciente tem uma freqüência e/ou gravidade reduzida derubores como medido pelo índice de rubor de SLE comparadasàs freqüência e/ou gravidade de rubores prévias. Em outramodalidade específica, um paciente com lúpus que está sendoou foi tratado com um agente imunomodulatório conhecido natécnica e/ou descrito aqui é considerado como estando res-pondendo/tendo respondido ao tratamento se o paciente temuma freqüência e/ou gravidade reduzida de rubores como medi-do por uma versão modificada do índice de rubor de SLE. Emoutra modalidade especifica, um paciente com lúpus que estásendo ou foi tratado com um agente imunomodulatório conheci-do na técnica e/ou descrito aqui é considerado como estandorespondendo/tendo respondido ao tratamento se o paciente temuma freqüência e/ou gravidade reduzida de rubores como medi-do por uma versão modificada do índice de rubor de SLE com-paradas às freqüência e/ou gravidade de rubores prévias dopaciente. A versão modificada do índice de rubor de SLE ex-clui rubores graves desencadeados pela pontuação SELENASLEDAI sozinha.

Conseqüentemente, em uma modalidade específica, umpaciente com lúpus que está sendo ou foi tratado com um an-tagonista de neutrocina-alfa incluindo, mas não limitando a,um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação aantígeno deste, uma proteína receptora de neutrocina-alfa(p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante des-ta, um anticorpo anti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex.,TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento de ligação a antígenodeste, polipeptídeos de ligação a neutrocina-alfa, variantespolipeptídicas de neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou an-ti-sentidos que se direcionam a neutrocina-alfa, APRIL,TACI, BCMA, BAFF-R ou outro receptor para neutrocina-alfae/ou APRIL, é considerado como estando respondendo/tendorespondido ao tratamento se o paciente atingiu uma reduçãoem sua pontuação SELENA SLEDAI. Em uma modalidade específi-ca, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tratado comum antagonista de neutrocina-alfa é considerado como estandorespondendo/tendo respondido ao tratamento se o(a) pacienteatingiu uma redução em sua pontuação SELENA SLEDAI comparadaà mesma pontuação SELENA SLEDAI de linha basal do paciente,a pontuação SELENA SLEDAI determinada logo antes daquele i-nicio de tratamento pelo paciente com o antagonista de neu-trocina-alfa. Em uma modalidade especifica, um paciente comlúpus que está sendo ou foi tratado com um antagonista deneutrocina-alfa é considerado como estando respondendo/tendorespondido ao tratamento se o(a) paciente atingiu pelo menosuma redução de quatro pontos em sua pontuação SELENA SLEDAI.Em uma modalidade especifica, um paciente com lúpus que estásendo ou foi tratado com um antagonista de neutrocina-alfa éconsiderado como estando respondendo/tendo respondido aotratamento se o(a) paciente atingiu pelo menos uma reduçãode quatro pontos em sua pontuação SELENA SLEDAI comparada àmesma pontuação SELENA SLEDAI de linha basal do paciente, apontuação SELENA SLEDAI determinada logo antes daquele ini-cio de tratamento pelo paciente com o antagonista de neutro-cina-alfa. Em uma modalidade especifica, um antagonista deneutrocina-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Em umamodalidade especifica, um antagonista de neutrocina-alfa éuma proteína TACI-Fc. Em uma modalidade específica, um anta-gonista de neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Em umamodalidade específica, um antagonista de neutrocina-alfa éum pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade espe- cífica, um antagonista de neutrocina-alfa é fragmento deproteína neutrocina-alfa ou variante que funciona como umdominante negativo.

Em outra modalidade específica, um paciente comlúpus que está sendo ou foi tratado com um antagonista deneutrocina-alfa incluindo, mas não limitando a, um anticorpoanti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antigeno des-te, uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p. ex. , TACI,BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta, um anticorpoanti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ouBAFF-R) ou fragmento de ligação a antigeno deste, polipeptí-deos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptídicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos quese direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-Rou outro receptor para neutrocina-alfa e/ou APRIL, é consi-derado como estando respondendo/tendo respondido ao trata-mento se o paciente não experimentou uma piora da atividadeda doença se a pontuação PGA diminuiu, permaneceu estável ouaumentou em menos de 0,3 pontos. Em uma modalidade específi-ca, o paciente não experimentou uma piora da atividade dadoença se a pontuação PGA diminuiu, permaneceu estável ouaumentou em menos de 0,3 pontos a partir da mesma pontuaçãoPGA de linha basal do paciente, a pontuação PGA determinadalogo antes daquele início de tratamento pelo paciente com oantagonista de neutrocina-alfa. Em uma modalidade específi-ca, o antagonista de neutrocina-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, o antagonistade neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc. Em uma modalidadeespecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteínaBAFF-R-Fc. Em uma modalidade específica, o antagonista deneutrocina-alfa é um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em umamodalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa éfragmento de proteína neutrocina-alfa ou variante que fun-ciona como um dominante negativo.

Em outra modalidade específica, um paciente comlúpus que está sendo ou foi tratado com um antagonista deneutrocina-alfa incluindo, mas não limitando a, um anticorpoanti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antígeno des-te, uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p. ex., TACI,BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta, um anticorpoanti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ouBAFF-R) ou fragmento de ligação a antígeno deste, polipeptí-deos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptídicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos quese direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-Rou outro receptor para neutrocina-alfa e/ou APRIL, é consi-derado como estando respondendo/tendo respondido ao trata-mento se o paciente não experimentou uma piora da atividadeda doença como determinado pelo índice de atividade de doen-ça do Grupo de Avaliação de Lúpus das Ilhas Britânicas(BILAG). Em uma modalidade específica, o paciente não expe- rimentou uma piora da atividade da doença se o paciente nãoganhou uma nova pontuação de domínio de órgão de BILAG A ounão ganhou 2 novas pontuações de domínio de órgão de BILAGB. Em uma modalidade específica, o paciente não experimentouuma piora da atividade da doença se o paciente não ganhouuma nova pontuação de domínio de órgão de BILAG A ou não ga-nhou 2 novas pontuações de domínio de órgão de BILAG B desdea avaliação de BILAG de linha basal do paciente, a avaliaçãode BILAG determinada logo antes daquele início de tratamentopelo paciente com o antagonista de neutrocina-alfa. Em umamodalidade especifica, o antagonista de neutrocina-alfa é umanticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade especifi-ca, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc.

Em uma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Em uma modalidade específica,o antagonista de neutrocina-alfa é um pepticorpo anti-neutrocina-alf a . Em uma modalidade específica, o antagonistade neutrocina-alfa é fragmento de proteína neutrocina-alfaou variante que funciona como um dominante negativo.

Em outra modalidade específica, um paciente comlúpus que está sendo ou foi tratado com um antagonista deneutrocina-alfa incluindo, mas não limitando a, um anticorpoanti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antígeno des-te, uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p. ex., TACI,BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta, um anticorpoanti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ouBAFF-R) ou fragmento de ligação a antígeno deste, polipeptí-deos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptídicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos quese direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-Rou outro receptor para neutrocina-alfa e/ou APRIL, é consi-derado como estando respondendo/tendo respondido ao trata-mento se o(a) paciente atingiu uma redução em sua pontuaçãoSELENA SLEDAI, não teve uma piora considerável de sua pontu-ação PGA e não experimentou uma piora da atividade da doençacomo determinado pelo índice de atividade de doença do Grupode Avaliação de Lúpus das Ilhas Britânicas (BILAG) compara-dos às suas pontuação de SELENA SLEDAI, pontuação PGA e ava-liação BILAG de linhas basais, respectivamente. Em uma moda-lidade especifica, um paciente com lúpus que está sendo oufoi tratado com um antagonista de neutrocina-alfa é conside-rado como estando respondendo/tendo respondido ao tratamentose o(a) paciente atingiu pelo menos uma redução de 4 pontosem sua pontuação SELENA SLEDAI, não teve um aumento de maisde 0,30 pontos em sua pontuação PGA e não ganhou uma novapontuação de domínio de órgão de BILAG A ou não ganhou 2 no-vas pontuações de domínio de órgão de BILAG B, comparados àssuas pontuação de SELENA SLEDAI, pontuação PGA e avaliaçãoBILAG de linhas basais, respectivamente. Em uma modalidadeespecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é um anticorpoanti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, o anta- gonista de neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc. Em umamodalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa éuma proteína BAFF-R-Fc. Em uma modalidade específica, o an-tagonista de neutrocina-alfa é um pepticorpo anti-neutrocina-alf a . Em uma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é fragmento de proteína neutrocina-alfaou variante que funciona como um dominante negativo.

Em outra modalidade específica, um paciente comlúpus que está sendo ou foi tratado com um antagonista deneutrocina-alfa incluindo, mas não limitando a, um anticorpoanti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antígeno des-te, uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p. ex. , TACI,BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta, um anticorpoanti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ouBAFF-R) ou fragmento de ligação a antígeno deste, polipepti-deos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptidicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos quese direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-Rou outro receptor para neutrocina-alfa e/ou APRIL, é consi-derado como estando respondendo/tendo respondido ao trata-mento se a dose de prednisona do paciente foi reduzida. Emoutra modalidade especifica, um paciente com lúpus que estásendo ou foi tratado com um antagonista de neutrocina-alfa éconsiderado como estando respondendo/tendo respondido aotratamento se a dose de prednisona do paciente foi reduzidacomparada à dose de prednisona de linha basal do paciente, opaciente estava tomando a dose de prednisona logo antes da-quele inicio de tratamento pelo paciente com o antagonistade neutrocina-alfa. Em outra modalidade especifica, um paci-ente com lúpus que está sendo ou foi tratado com um antago-nista de neutrocina-alfa é considerado como estando respon-dendo/tendo respondido ao tratamento se a dose de prednisonado paciente foi reduzida em pelo menos 25%. Em outra modali-dade especifica, um paciente com lúpus que está sendo ou foitratado com um antagonista de neutrocina-alfa é consideradocomo estando respondendo/tendo respondido ao tratamento se adose de prednisona do paciente foi reduzida em pelo menos25% até menos de ou igual a 7,5 mg/dia. Em outra modalidadeespecifica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tra-tado com um antagonista de neutrocina-alfa é considerado co-mo estando respondendo/tendo respondido ao tratamento se adose de prednisona do paciente foi reduzida em pelo menos25% a partir da dose de prednisona de linha basal do pacien-te até menos de ou igual a 7,5 mg/dia. Em outra modalidadeespecifica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tra-tado com um antagonista de neutrocina-alfa é considerado co-mo estando respondendo/tendo respondido ao tratamento se adose de prednisona do paciente foi reduzida em pelo menos50%. Em outra modalidade especifica, um paciente com lúpusque está sendo ou foi tratado com um antagonista de neutro-cina-alfa é considerado como estando respondendo/tendo res-pondido ao tratamento se a dose de prednisona do pacientefoi reduzida em pelo menos 50% até menos de ou igual a 7,5mg/dia. Em outra modalidade especifica, um paciente com lú-pus que está sendo ou foi tratado com um antagonista de neu-trocina-alfa é considerado como estando respondendo/tendo respondido ao tratamento se a dose de prednisona do pacientefoi reduzida em pelo menos 50% a partir da dose de predniso-na de linha basal do paciente até menos de ou igual a 7,5mg/dia. Em uma modalidade especifica, o antagonista de neu-trocina-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma mo-dalidade especifica, o antagonista de neutrocina-alfa é umaproteina TACI-Fc. Em uma modalidade especifica, o antagonis-ta de neutrocina-alfa é uma proteina BAFF-R-Fc. Em uma moda-lidade especifica, o antagonista de neutrocina-alfa é umpepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específi-ca, o antagonista de neutrocina-alfa é fragmento de proteinaneutrocina-alfa ou variante que funciona como um dominantenegativo.

Outras medidas podem ser usada para medir a quali-dade de uma resposta de um paciente com lúpus ao tratamento.Em uma modalidade especifica, um paciente com lúpus que estásendo ou foi tratado com um antagonista de neutrocina-alfaincluindo, mas não limitando a, um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antigeno deste,uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p. ex., TACI,BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta, um anticorpoanti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCiVLA ouBAFF-R) ou fragmento de ligação a antigeno deste, polipeptí-deos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptídicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos quese direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-Rou outro receptor para neutrocina-alfa e/ou APRIL, é consi-derado como estando respondendo/tendo respondido ao trata-mento se o paciente tem uma Pontuação de Vistoria de SaúdeSF-36 melhorada. Em outra modalidade específica, um pacientecom lúpus que está sendo ou foi tratado com um antagonistade neutrocina-alfa incluindo, mas não limitando a, um anti-corpo anti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antíge-no deste, uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p. ex.,TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta, um an-ticorpo anti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMAou BAFF-R) ou fragmento de ligação a antigeno deste, poli-peptídeos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptí-dicas de neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos que se direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI,BCMA, BAFF-R ou outro receptor para neutrocina-alfa e/ouAPRIL, é considerado como estando respondendo/tendo respon-dido ao tratamento se o paciente tem uma Pontuação de Visto-ria de Saúde SF-36 melhorada comparada à Pontuação de Visto-ria de Saúde SF-36 de linha basal do paciente. Em uma moda-lidade especifica, o antagonista de neutrocina-alfa é um an-ticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade especifica,o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc. Emuma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfaé uma proteína BAFF-R-Fc. Em uma modalidade específica, oantagonista de neutrocina-alfa é um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, o antagonistade neutrocina-alfa é fragmento de proteína neutrocina-alfaou variante que funciona como um dominante negativo.

Em uma modalidade específica, um paciente com lú-pus que está sendo ou foi tratado com um antagonista de neu-trocina-alfa incluindo, mas não limitando a, um anticorpoanti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antígeno des-te, uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p. ex. , TACI,BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta, um anticorpoanti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ouBAFF-R) ou fragmento de ligação a antígeno deste, polipeptí-deos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptídicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos quese direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-Rou outro receptor para neutrocina-alfa e/ou APRIL, é consi-derado como estando respondendo/tendo respondido ao trata-mento se o paciente tem uma pontuação EQ-5D melhorada. Emoutra modalidade específica, um paciente com lúpus que estásendo ou foi tratado com um antagonista de neutrocina-alfaincluindo, mas não limitando a, um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antigeno deste,uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p. ex., TACI,BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta, um anticorpo anti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ouBAFF-R) ou fragmento de ligação a antigeno deste, polipeptí-deos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptídicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos quese direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-R ou outro receptor para neutrocina-alfa e/ou APRIL, é consi-derado como estando respondendo/tendo respondido ao trata-mento se o paciente tem uma pontuação EQ-5D melhorada compa-rada à pontuação EQ-5D de linha basal do paciente. Em umamodalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específi-ca, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc.Em uma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Em uma modalidade específica,o antagonista de neutrocina-alfa é um pepticorpo anti- neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, o antagonistade neutrocina-alfa é fragmento de proteína neutrocina-alfaou variante que funciona como um dominante negativo.

Em uma modalidade específica, um paciente com lú-pus que está sendo ou foi tratado com um antagonista de neu-trocina-alfa incluindo, mas não limitando a, um anticorpoanti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antigeno des-te, uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p. ex., TACI,BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta, um anticorpoanti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ouBAFF-R) ou fragmento de ligação a antigeno deste, polipeptí-deos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptidicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos quese direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-Rou outro receptor para neutrocina-alfa e/ou APRIL, é consi-derado como estando respondendo/tendo respondido ao trata-mento se o paciente demonstra fadiga reduzida como mostradopela pontuação FACIT-F do paciente. Em outra modalidade es-pecifica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi trata-do com um antagonista de neutrocina-alfa incluindo, mas nãolimitando a, um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou fragmentode ligação a antigeno deste, uma proteína receptora de neu-trocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ouvariante desta, um anticorpo anti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento de ligaçãoa antigeno deste, polipeptídeos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptidicas de neutrocina-alfa e/ou APRILe siRNAs ou anti-sentidos que se direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-R ou outro receptor para neu-trocina-alfa e/ou APRIL, é considerado como estando respon-dendo/tendo respondido ao tratamento se o paciente demonstrafadiga reduzida como mostrado pela pontuação FACIT-F do pa-ciente comparada à pontuação FACIT-F de linha basal do paci-ente. Em uma modalidade específica, o antagonista de neutro-cina-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma moda-lidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é umaproteína TACI-Fc. Em uma modalidade específica, o antagonis-ta de neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Em uma moda-lidade especifica, o antagonista de neutrocina-alfa é umpepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específi-ca, o antagonista de neutrocina-alfa é fragmento de proteínaneutrocina-alfa ou variante que funciona como um dominantenegativo.

Em uma modalidade específica, um paciente com lú-pus que está sendo ou foi tratado com um antagonista de neu-trocina-alfa incluindo, mas não limitando a, um anticorpoanti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antígeno des-te, uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p. ex. , TACI,BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta, um anticorpoanti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ouBAFF-R) ou fragmento de ligação a antígeno deste, polipeptí-deos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptídicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos quese direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-Rou outro receptor para neutrocina-alfa e/ou APRIL, é consi-derado como estando respondendo/tendo respondido ao trata-mento se o paciente tem uma pontuação DAS28 melhorada. Emoutra modalidade específica, um paciente com lúpus que estásendo ou foi tratado com um antagonista de neutrocina-alfaincluindo, mas não limitando a, um anticorpo anti-neutrocina-alf a ou fragmento de ligação a antígeno deste,uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p. ex., TACI,BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta, um anticorpoanti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ouBAFF-R) ou fragmento de ligação a antígeno deste, polipeptí-deos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptidicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos quese direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-Rou outro receptor para neutrocina-alfa e/ou APRIL, é consi-derado como estando respondendo/tendo respondido ao trata-mento se o paciente tem uma pontuação DAS28 melhorada compa-rada à pontuação DAS28 de linha basal do paciente. Em umamodalidade especifica, o antagonista de neutrocina-alfa é umanticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específi- ca, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc.Em uma modalidade específi ca, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Em uma modalidade específica,o antagonista de neutrocina-alfa é um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, o antagonistade neutrocina-alfa é fragmento de proteína neutrocina-alfaou variante que funciona como um dominante negativo.

Em outra modalidade específica, um paciente comlúpus que está sendo ou foi tratado com um antagonista deneutrocina-alfa incluindo, mas não limitando a, um anticorpoanti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antígeno des-te, uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p. ex., TACI,BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta, um anticorpoanti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ouBAFF-R) ou fragmento de ligação a antígeno deste, polipeptí-deos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptidicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos quese direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-Rou outro receptor para neutrocina-alfa e/ou APRIL, é consi-derado como estando respondendo/tendo respondido ao trata-mento se o paciente tem uma freqüência e/ou duração reduzidade rubores. Em outra modalidade especifica, um paciente comlúpus que está sendo ou foi tratado com um antagonista deneutrocina-alfa é considerado como estando respondendo/tendorespondido ao tratamento se o paciente tem uma freqüênciae/ou duração reduzida de rubores comparadas às freqüênciae/ou duração reduzida de rubores antes do tratamento com oantagonista de neutrocina-alfa. Em outra modalidade especi-fica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tratadocom um antagonista de neutrocina-alfa é considerado como es-tando respondendo/tendo respondido ao tratamento se o paci-ente tem uma gravidade reduzida de rubores. Em outra modali-dade especifica, um paciente com lúpus que está sendo ou foitratado com um antagonista de neutrocina-alfa é consideradocomo estando respondendo/tendo respondido ao tratamento se opaciente tem uma gravidade reduzida de rubores comparada àgravidade de rubores antes do tratamento com o antagonistade neutrocina-alf a. 0 índice de rubor de SLE avalia a fre-qüência e gravidade de exacerbações nos sintomas de lúpus(rubores). rubores são categorizados como "leves ou modera-dos" ou "graves", rubores leves ou moderados envolvem um oumais dos seguintes: alteração na pontuação SELENA SLEDAI de3 pontos ou mais; novos/piores lúpus discóides, fotossensí-veis, profundos, de vasculite cutânea ou bolhosos; úlcerasnasofaríngeanas, pleurite; pericardite, artrite, febre(SLE) ; aumento em prednisona, mas não mais que 0,5mg/kg/dia; NSAID ou Plaquenil adicionados para atividade dedoença e aumento maior que 1,0 na pontuação PGA, mas nãomais que 2,5. rubores graves envolvem um ou mais dos seguin-tes: alteração na pontuação SELENA SLEDAI maior que 12; no-vo/pior CNS-SLE; vasculite, nefrite, miosite, Pit<60.000;anemia do heme (<7% ou diminuição em Hb >3%) ; duplicação dadosagem de prednisona; aumento em prednisona até mais de 0,5mg/kg/dia; prescrição de Cytoxan; prescrição de Azatioprina;prescrição de metotrexato; hospitalização (SLE) e aumento napontuação PGA até mais de 2,5. Em outra modalidade especifi-ca, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tratado comum antagonista de neutrocina-alfa é considerado como estandorespondendo/tendo respondido ao tratamento se o paciente temuma freqüência e/ou gravidade reduzida de rubores como medi-do pelo índice de rubor de SLE. Em outra modalidade especí-fica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tratadocom um antagonista de neutrocina-alfa é considerado como es-tando respondendo/tendo respondido ao tratamento se o paci-ente tem uma freqüência e/ou gravidade reduzida de ruborescomo medido pelo índice de rubor de SLE comparadas às fre-qüência e/ou gravidade de rubores antes do tratamento com oantagonista de neutrocina-alfa. Em outra modalidade especí-fica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tratadocom um antagonista de neutrocina-alfa é considerado como es-tando respondendo/tendo respondido ao tratamento se o paci-ente tem uma freqüência e/ou gravidade reduzida de ruborescomo medido por uma versão modificada do índice de rubor deSLE. Em outra modalidade específica, um paciente com lúpusque está sendo ou foi tratado com um antagonista de neutro-cina-alfa é considerado como estando respondendo/tendo res-pondido ao tratamento se o paciente tem uma freqüência e/ougravidade reduzida de rubores como medido por uma versão mo-dificada do índice de rubor de SLE comparadas às freqüênciae/ou gravidade de rubores antes do tratamento com o antago-nista de neutrocina-alfa. A versão modificada do índice derubor de SLE exclui rubores graves desencadeados pela pontu-ação SELENASLEDAI sozinha. Em uma modalidade específica, oantagonista de neutrocina-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, o antagonistade neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc. Em uma modalidadeespecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteínaBAFF-R-Fc. Em uma modalidade específica, o antagonista deneutrocina-alfa é um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa éfragmento de proteína neutrocina-alfa ou variante que fun-ciona como um dominante negativo.

Os índices de atividade de doença acima descritos(p. ex., SELENA SLEDAI, PGA, BILAG, índice de rubor de SLE,Pontuação SF-36 Vistoria de Saúde, EQ-5D, FACIT-F, DAS28)podem ser usados para avaliar a condição de um paciente comlúpus individualmente ou em combinação. Melhorias na saúdedo paciente como medido por esses índices de atividade dedoença também podem ser avaliadas algum tempo após início dotratamento com um antagonista de neutrocina-alfa ou outroagente imunomodulatório conhecido na técnica e/ou descritoaqui incluindo, mas não limitando a, um anticorpo anti-neutrocina-alf a ou fragmento de ligação a antígeno deste,uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p. ex., TACI,BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta, iam anticorpoanti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ouBAFF-R) ou fragmento de ligação a antígeno deste, polipeptí-deos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptídicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos quese direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-Rou outro receptor para neutrocina-alfa e/ou APRIL, em rela-ção a uma ou mais das prévias medições de pontuação de índi-ce de atividade de doença do paciente. Adicionalmente, emuma modalidade específica, um paciente com lúpus que estásendo ou foi tratado com um antagonista de neutrocina-alfa éconsiderado como estando respondendo/tendo respondido aotratamento se o paciente mantém uma pontuação de atividadede doença melhorada em relação a uma medição prévia. Em umamodalidade específica, uma ou mais pontuações de índice deatividade de doença são avaliados antes de iniciar o trata-mento com um antagonista de neutrocina-alfa ou outro agenteimunomodulatório em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12semanas, meses e/ou anos após o começo do tratamento com oantagonista de neutrocina-alfa ou outro agente imunomodula-tório. Em uma modalidade específica, o antagonista de neu-trocina-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma mo-dalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é umaproteína TACI-Fc. Em uma modalidade específica, o antagonis-ta de neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Em uma moda-lidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é umpepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específi-ca, o antagonista de neutrocina-alfa é fragmento de proteínaneutrocina-alfa ou variante que funciona como um dominantenegativo.

Em uma modalidade específica, um paciente com lú-pus com manifestação da doença em um ou mais órgãos/sistemasé tratado com um antagonista de neutrocina-alfa e/ou outroagente imunomodulatório conhecido na técnica e/ou descritoaqui incluindo, mas não limitando a, um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antígeno deste, uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p. ex., TACI,BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta, um anticorpoanti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ouBAFF-R) ou fragmento de ligação a antígeno deste, polipeptí-deos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptídicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos quese direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-Rou outro receptor para neutrocina-alfa e/ou APRIL. Em umamodalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é umanticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específi-ca, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc.Em uma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Em uma modalidade específica,o antagonista de neutrocina-alfa é um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, o antagonistade neutrocina-alfa é fragmento de proteína neutrocina-alfaou variante que funciona como um dominante negativo. Em mo-dalidades específicas, um paciente com lúpus com manifesta-ção da doença em um ou mais sistemas de órgãos internos, comou sem envolvimento de sistemas mucocutâneos e/ou músculo-esqueléticos, é tratado com um antagonista de neutrocina-alfa e/ou outro agente imunomodulatório conhecido na técnicae/ou descrito aqui. Em modalidades especificas, um pacientecom lúpus com manifestação da doença em um ou mais sistemasde órgãos internos, sem envolvimento de sistemas mucocutâ-neos e/ou músculo-esqueléticos, é tratado com um antagonistade neutrocina-alfa e/ou outro agente imunomodulatório conhe-cido na técnica e/ou descrito aqui. No lúpus, manifestaçõesde doença envolvendo os sistemas mucocutâneos e/ou músculo-esqueléticos incluem, mas não estão limitados a: erupçãodiscóide, erupção malar, ou outra erupção cutânea, ulceraçãode mucosa, paniculite, vasculite cutânea, trombose cutânea,infarto digital, trombose digital, alopecia, eritema peri- ungual, pérnio, hemorragias subungueal, miosite, poliartri-te, artrite, tendinite, artralgia e mialgia. No lúpus, sis-temas de órgãos internos que podem ser afetados por lúpus,incluem, mas não estão limitados a, o sistema nervoso, osistema circulatório, o sistema respiratório, o sistema ex-cretor/urinário, o sistema digestivo e os olhos. Manifesta-ção da doença lúpus no sistema nervoso inclui, mas não estálimitada a meningite asséptica, vasculite cerebral, sindromedesmielinizante, mielopatia, estudo confusional agudo, psi-cose, polirradiduloneuropatia desmielinizante inflamatóriaaguda, mononeuropatia, neuropatia craniana, plexipatia, po-lineuropatia, distúrbio de ataque, estado de mal epilético,doença cerebrovascular não devida a vasculite, disfunçãocognitiva, distúrbio do movimento, distúrbio autonômico, a-taxia cerebelar, dor de cabeça, enxaqueca, transtornos dohumor e distúrbio de ansiedade. Manifestações da doença lú-pus no sistema circulatório incluem, mas não estão limitadasa miocardite, insuficiência cardíaca, arritmia, disfunçãovalvular nova, serosite, tamponamento cardíaco, efusão pleu-ral com dispnéia, hemorragia pulmonar, vasculite pulmonar,alveolite intersticial, pneumonite intersticial, síndrome decontração pulmonar, aortite e vasculite coronária. Manifes-tações da doença lúpus no sistema digestivo incluem, mas nãoestão limitadas a peritonite, serosite abdominal, ascite,enterite de lúpus, colite de lúpus, má absorção, enteropatiade perda protéica, hepatite, pseudo-obstrução intestinal,colecisite aguda e pancreatite aguda. Manifestações da doen-ça lúpus associadas com o olho incluem, mas não estão Iimi-tadas a inflamação orbital, queratite, uveíte anterior, uve-íte posterior, vasculite de retina, episclerite, esclerite,doença vaso-oclusiva da coróide, corpos cutóides, neuriteótica e neuropatia ótica isquêmica anterior.

Uma resposta de paciente a tratamento com um anta-gonista de neutrocina-alfa ou outro agente imunomodulatórioconhecido na técnica e/ou descrito aqui, incluindo, mas nãolimitando a, um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou fragmentode ligação a antígeno deste, uma proteína receptora de neu-trocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ouvariante desta, um anticorpo anti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento de ligaçãoa antígeno deste, polipeptídeos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptídicas de neutrocina-alfa e/ou APRIL-

e siRNAs ou anti-sentidos que se direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-R ou outro receptor para neu-trocina-alfa e/ou APRIL, também pode ser monitorada pela a-valiação de biomarcadores em um ou mais intervalos após ocomeço do tratamento e comparação da avaliação de biomarca-dor do paciente com a linha basal do paciente e/ou uma medi-ção prévia para o(s) mesmo(s) biomarcador(es). Biomarcadoresque podem ser avaliados incluem, mas não estão limitados a,níveis de imunoglobulina (p. ex., níveis de imunoglobulinasérica total, assim como IgM, IgG, IgA e/ou IgE séricos),níveis de auto-anticorpo (p. ex., níveis de anticorpo anti-dsDNA, anticorpo anti-CCP, anticorpo anti-Ro/SS-A, anticorpoanti-La/SS-B, anticorpo anti-RNP, anticorpo anti-cardiolipina (anti-fosfolipídeo) e anticorpo anti-Sm assimcomo título de ANA), números de célula B (p. ex., números decélula B total, números de célula B ativada, números de cé-lula B nalve, números de célula B de memória, números de cé-lula B plasmática e números de célula B plasmacitóide, célu-las B CD20+ e células B CD19+ totais), nível de complementoC4, nível de complemento C3. Em uma modalidade específica,medições de biomarcadores são avaliadas antes do início dotratamento com um antagonista de neutrocina-alfa ou outroagente imunomodulatório e/ou em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11 ou 12 semanas, meses e/ou. anos após o começo do tra-tamento com o antagonista de neutrocina-alfa ou outro agenteimunomodulatório. Em uma modalidade específica, o antagonis-ta de neutrocina-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa.Em uma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc. Em uma modalidade especifica, oantagonista de neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Emuma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfaé um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade es-pecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é fragmento deproteína neutrocina-alfa ou variante que funciona como umdominante negativo.

Em uma modalidade específica, um paciente com lú-pus que está sendo ou foi tratado com um antagonista de neu-trocina-alfa ou outro agente imunomodulatório conhecido natécnica e/ou descrito aqui, incluindo, mas não limitando a,um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação aantígeno deste, uma proteína receptora de neutrocina-alfa(p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante des-ta, um anticorpo anti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex.,TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento de ligação a antígenodeste, polipeptídeos de ligação a neutrocina-alfa, variantespolipeptídicas de neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou an-ti-sentidos que se direcionam a neutrocina-alfa, APRIL,TACI, BCMA, BAFF-R ou outro receptor para neutrocina-alfae/ou APRIL, é considerado como estando respondendo/tendorespondido ao tratamento se o paciente tem um nível diminuí-do de imunoglobulina (p. ex., níveis de imunoglobulina séri-ca total, assim como IgM, IgG, IgA e/ou IgE séricos) compa-rado à medição de linha basal do paciente para imunoglobuli-na. Em uma modalidade específica, o antagonista de neutroci-na-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modali-dade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma pro-teina TACI-Fc. Em uma modalidade específica, o antagonistade neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Em uma modali-dade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é um pep-ticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica,o antagonista de neutrocina-alfa é fragmento de proteínaneutrocina-alfa ou variante que funciona como um dominantenegativo. Em uma modalidade específica, um paciente com lú-pus que está sendo ou foi tratado com um antagonista de neu-trocina-alfa ou outro agente imunomodulatório é consideradocomo estando respondendo/tendo respondido ao tratamento se opaciente tem um nível diminuído de imunoglobulina (p. ex.,níveis de imunoglobulina sérica total, assim como IgM, IgG,IgA e/ou IgE séricos) comparado a uma ou mais das mediçõesprévias do paciente para imunoglobulina. Em uma modalidadeespecífica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tra-tado com um antagonista de neutrocina-alfa ou outro agenteimunomodulatório é considerado como estando responden-do/tendo respondido ao tratamento se o paciente mantém umnível diminuído de imunoglobulina (p. ex., níveis de imuno-globulina sérica total, assim como IgM, IgG, IgA e/ou IgEséricos) comparado a uma ou mais das medições prévias do pa-ciente para imunoglobulina. Em uma modalidade específica, umpaciente com lúpus que está sendo ou foi tratado com um an-tagonista de neutrocina-alfa ou outro agente imunomodulató-rio é considerado como estando respondendo/tendo respondidoao tratamento se o paciente atinge um nível normal de imuno-globulina (p. ex., níveis de imunoglobulina sérica total,assim como IgM, IgG, IgA e/ou IgE séricos).Em uma modalidade específica, um paciente com lú-pus que está sendo ou foi tratado com um antagonista de neu-trocina-alfa incluindo, mas não limitando a, um anticorpoanti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antígeno des-te, uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p. ex., TACI,BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta, um anticorpoanti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ouBAFF-R) ou fragmento de ligação a antígeno deste, polipeptí-deos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptídicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos quese direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-Rou outro receptor para neutrocina-alfa e/ou APRIL, é consi-derado como estando respondendo/tendo respondido ao trata-mento se o paciente tem um nível diminuído de auto-anticorpo(p. ex., níveis de anticorpo anti-dsDNA, anticorpo anti-CCP,anticorpo anti-Ro/SS-A, anticorpo anti-La/SS-B, anticorpoanti-RNP, anticorpo anti-cardiolipina (anti-fosfolipídeo) eanticorpo anti-Sm assim como título de ANA) comparado à me-dição de linha basal do paciente para auto-anticorpo. Em uma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é umanticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específi-ca, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc.Em uma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Em uma modalidade específica,o antagonista de neutrocina-alfa é um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, o antagonistade neutrocina-alfa é fragmento de proteína neutrocina-alfaou variante que funciona como um dominante negativo. Em umamodalidade especifica, um paciente com lúpus que está sendoou foi tratado com um antagonista de neutrocina-alfa ou ou-tro agente imunomodulatório é considerado como estando res-pondendo/tendo respondido ao tratamento se o paciente tem umnivel diminuído de auto-anticorpo (p. ex., níveis de anti-corpo anti-dsDNA, anticorpo anti-CCP, anticorpo anti-Ro/SS-A, anticorpo anti-La/SS-B, anticorpo anti-RNP, anticorpo an-ti-cardiolipina (anti-fosfolipídeo) e anticorpo anti-Sm as-sim como título de ANA) comparado a uma ou mais das mediçõesprévias do paciente para auto-anticorpo. Em uma modalidadeespecífica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tra-tado com um antagonista de neutrocina-alfa ou outro agenteimunomodulatório é considerado como estando responden-do/tendo respondido ao tratamento se o paciente mantém umnível diminuído de auto-anticorpo (p. ex., níveis de anti-corpo anti-dsDNA, anticorpo anti-CCP, anticorpo anti-Ro/SS-A, anticorpo anti-La/SS-B, anticorpo anti-RNP, anticorpo an-ti-cardiolipina (anti-fosfolipídeo) e anticorpo anti-Sm as-sim como título de ANA) comparado a uma ou mais das mediçõesprévias do paciente para auto-anticorpo. Em uma modalidadeespecífica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tra-tado com um antagonista de neutrocina-alfa ou outro agenteimunomodulatório é considerado como estando responden-do/tendo respondido ao tratamento se o paciente atinge umnível normal de auto-anticorpo (p. ex., níveis de anticorpoanti-dsDNA, anticorpo anti-CCP, anticorpo anti-Ro/SS-A, an-ticorpo anti-La/SS-B, anticorpo anti-RNP, anticorpo anti-cardiolipina (anti-fosfolipídeo) e anticorpo anti-Sm assimcomo titulo de ANA) . Em uma modalidade especifica, auto-anticorpos do isotipo IgG são medidos.

Em uma modalidade especifica, um paciente com lú-pus que está sendo ou foi tratado com um antagonista de neu-trocina-alfa ou outro agente imunomodulatório incluindo, masnão limitando a, um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou frag-mento de ligação a antigeno deste, uma proteína receptora deneutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmentoou variante desta, um anticorpo anti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex. , TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento de ligaçãoa antigeno deste, polipeptídeos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptídicas de neutrocina-alfa e/ou APRILe siRNAs ou anti-sentidos que se direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-R ou outro receptor para neu-trocina-alfa e/ou APRIL, é considerado como estando respon-dendo/tendo respondido ao tratamento se o paciente tem umnúmero diminuído de células B (p. ex., números de célula Btotal, números de célula B ativada, números de célula Bnalve, números de célula B plasmática e números de célula Bplasmacitóide, números de células B CD20+ e números de célu-las B CD19+ totais) comparado à medição de linha basal dopaciente para número de célula B. Em uma modalidade especí-fica, o antagonista de neutrocina-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, o antagonistade neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc. Em uma modalidadeespecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteínaBAFF-R-Fc. Em uma modalidade específica, o antagonista deneutrocina-alfa é um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em umamodalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa éfragmento de proteína neutrocina-alfa ou variante que fun-ciona como um dominante negativo. Em uma modalidade especí-fica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tratadocom um antagonista de neutrocina-alfa ou outro agente imuno-modulatório é considerado como estando respondendo/tendorespondido ao tratamento se o paciente tem um número diminu-ído de células B (p. ex., números de célula B total, númerosde célula B ativada, números de célula B nalve, números decélula B plasmática e números de célula B plasmacitóide, nú-meros de células B CD20+ e números de células B CD19+ to-tais) comparado a uma ou mais das medições prévias do paci-ente para número de célula B. Em uma modalidade específica,um paciente com lúpus que está sendo ou foi tratado com umantagonista de neutrocina-alfa ou outro agente imunomodula-tório é considerado como estando respondendo/tendo respondi-do ao tratamento se o paciente mantém um número diminuído decélulas B (p. ex., números de célula B total, números de cé-lula B ativada, números de célula B nalve, números de célulaB plasmática e números de célula B plasmacitóide, números decélulas B CD20+ e números de células B CD19+ totais) compa-rado a uma ou mais das medições prévias do paciente para nú-mero de célula B. Em uma modalidade específica, um pacientecom lúpus que está sendo ou foi tratado com um antagonistade neutrocina-alfa ou outro agente imunomodulatório é consi-derado como estando respondendo/tendo respondido ao trata-mento se o paciente atinge um número normal de células B (p.ex., números de célula B total, números de célula B ativada,números de célula B nalve, números de célula B plasmática enúmeros de célula B plasmacitóide, números de células BCD20+ e números de células B CD19+ totais).

Em uma modalidade especifica, um paciente com lú-pus que está sendo ou foi tratado com um antagonista de neu-trocina-alfa ou outro agente imunomodulatório conhecido natécnica e/ou descrito aqui incluindo, mas não limitando a,um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação aantigeno deste, uma proteína receptora de neutrocina-alfa(p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante des-ta, um anticorpo anti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex.,TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento de ligação a antigenodeste, polipeptídeos de ligação a neutrocina-alfa, variantespolipeptídicas de neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou an-ti-sentidos que se direcionam a neutrocina-alfa, APRIL,TACI, BCMA, BAFF-R ou outro receptor para neutrocina-alfae/ou APRIL, é considerado como estando respondendo/tendorespondido ao tratamento se o paciente tem um nível de fatordo complemento C4 sérico aumentado comparado à medição delinha basal do paciente para C4. Em uma modalidade específi-ca, o antagonista de neutrocina-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alf a . Em uma modalidade específica, o antagonistade neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc. Em uma modalidadeespecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteínaBAFF-R-Fc. Em uma modalidade específica, o antagonista deneutrocina-alfa é um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em umamodalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa éfragmento de proteína neutrocina-alfa ou variante que fun-ciona como um dominante negativo. Em uma modalidade especi-fica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tratadocom um antagonista de neutrocina-alfa ou outro agente imuno-modulatório é considerado como estando respondendo/tendorespondido ao tratamento se o paciente tem um nivel aumenta-do de C4 comparado a uma ou mais das medições prévias do pa-ciente para C4. Em uma modalidade especifica, um pacientecom lúpus que está sendo ou foi tratado com um antagonistade neutrocina-alfa ou outro agente imunomodulatório é consi-derado como estando respondendo/tendo respondido ao trata-mento se o paciente mantém um nivel aumentado de C4 compara-do a uma ou mais das medições prévias do paciente para C4.Em uma modalidade especifica, um paciente com lúpus que estásendo ou foi tratado com um antagonista de neutrocina-alfaou outro agente imunomodulatório é considerado como estandorespondendo/tendo respondido ao tratamento se o paciente a-tinge um nivel normal de C4.

Em uma modalidade especifica, um paciente com lú-pus que está sendo ou foi tratado com um antagonista de neu-trocina-alfa ou outro agente imunomodulatório conhecido natécnica e/ou descrito aqui incluindo, mas não limitando a,um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação aantigeno deste, uma proteína receptora de neutrocina-alfa(p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante des-ta, um anticorpo anti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex.,TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento de ligação a antigenodeste, polipeptídeos de ligação a neutrocina-alfa, variantespolipeptídicas de neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou an-ti-sentidos que se direcionam a neutrocina-alfa, APRIL,TACI, BCMA, BAFF-R ou outro receptor para neutrocina-alfae/ou APRIL, é considerado como estando respondendo/tendorespondido ao tratamento se o paciente tem um nivel de fatordo complemento C3 sérico aumentado comparado à medição delinha basal do paciente para C3. Em uma modalidade especifi-ca, o antagonista de neutrocina-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade especifica, o antagonistade neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc. Em uma modalidadeespecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteínaBAFF-R-Fc. Em uma modalidade específica, o antagonista deneutrocina-alfa é um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em umamodalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa éfragmento de proteína neutrocina-alfa ou variante que fun-ciona como um dominante negativo. Em uma modalidade especí-fica, um paciente com lúpus que está sendo ou foi tratadocom um antagonista de neutrocina-alfa ou outro agente imuno-modulatório é considerado como estando respondendo/tendorespondido ao tratamento se o paciente tem um nível aumenta-do de C3 comparado a uma ou mais das medições prévias do pa-ciente para C3. Em uma modalidade específica, um pacientecom lúpus que está sendo óu foi tratado com um antagonistade neutrocina-alfa ou outro agente imunomodulatório é consi-derado como estando respondendo/tendo respondido ao trata-mento se o paciente mantém um nível aumentado de C3 compara-do a uma ou mais das medições prévias do paciente para C3.Em uma modalidade específica, um paciente com lúpus que estásendo ou foi tratado com um antagonista de neutrocina-alfaou outro agente imunomodulatório é considerado como estandorespondendo/tendo respondido ao tratamento se o paciente a-tinge um nível normal de C3.

Em modalidades específicas, a invenção provê um método para tratar um paciente que foi previamente tratadocom um ou mais imunossupressores compreendendo administraruma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista deneutrocina-alfa ou outro agente imunomodulatório conhecidona técnica e/ou descrito aqui incluindo, mas não limitando a, um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligaçãoa antígeno deste, uma proteína receptora de neutrocina-alfa(p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante des-ta, um anticorpo anti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex.,TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento de ligação a antígenodeste, polipeptídeos de ligação a neutrocina-alfa, variantespolipeptídicas de neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou an-ti-sentidos que se direcionam a neutrocina-alfa, APRIL,TACI, BCMA, BAFF-R ou outro receptor para neutrocina-alfae/ou APRIL. Em modalidades específicas, a invenção -provê um método para tratar um paciente que foi previamente diagnos-ticado com lúpus eritematoso sistêmico (lúpus) e foi previa-mente tratado com um ou mais imunossupressores compreendendoadministrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um an-tagonista de neutrocina-alfa ou outro agente imunomodulató- rio. Em uma modalidade específica, o antagonista de neutro-cina-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma moda-lidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é umaproteína TACI-Fc. Em uma modalidade específica, o antagonis-ta de neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Em uma moda-lidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é umpepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específi-ca, o antagonista de neutrocina-alfa é fragmento de proteínaneutrocina-alfa ou variante que funciona como um dominantenegativo. Em modalidades específicas, o imunossupressor como qual o paciente foi previamente tratado é azatioprina (p.ex., IMURAN™), ciclofosfamida (p. ex., Cytoxan®, Neosar,CTX) , um inibidor calcineurina, por exemplo, FK506, tacroli-mus ou cilosporina (p. ex., PROGRAF®) e/ou CELLCEPT® (mico-fenolato mofetil, o metabólito ativo do qual é o ácido micofenólico).

Terapias mais correntes para lúpus e doenças auto-imunes utilizam medicações que bloqueiam não especificamentevárias vias inflamatórias. Talvez as medicações mais perigo-sas usadas nesta terapia sejam corticosteróides. Ao mesmotempo que corticosteróides tal como prednisona são essenci-ais para controlar manifestações de doença, elas também têmnumerosos efeitos adversos na saúde do paciente tal como,imunossupressão global levando a infecção, osteoporose le-vando a fraturas e aterosclerose levando a acidentes vascu-lares cerebrais e ataques cardíacos de início precoce. Em umestudo clínico, utilizadores descobriram que o tratamentocom um anticorpo que neutraliza a proteína neutrocina-alfa,dada como uma infusão IV nos dias O, 14, 28 e então a cadaquatro semanas até a semana 52, foi eficaz em reduzira do-sagem do corticosteróide prednisona que foi necessário paramelhorar manifestações de doença em paciente com lúpus. Es-pecificamente, tratamento com o anticorpo anti-neutrocina-alfa pareceu estar associado com uso de prednisona reduzidodurante os últimos três meses do período de tratamento. Empacientes que tinham um título de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ou igual a 30 UI/mL de anti-dsDNA na linha basal,uma porcentagem maior de indivíduos recebendo o anticorpoanti-neutrodinização tiveram suas doses de prednisona redu-zidas, enquanto ao contrário um número maior de indivíduosrecebendo tratamento placebo tiveram aumentos para uma dosede prednisona maior que 7,5 mg/dia.

Conseqüentemente, em uma modalidade, a invençãoprovê um método para reduzir a freqüência de tratamentos decorticosteróides e/ou a quantidade de corticosteróide admi-nistrado a um paciente compreendendo administrar uma quanti-dade terapeuticamente eficaz de um antagonista de neutroci-na-alfa ou outro agente imunomodulatório conhecido na técni-ca e/ou descrito aqui incluindo, mas não limitando a, um an-ticorpo anti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antí-geno deste, uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p.ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta,um anticorpo anti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI,BCMA ou BAFF-R) ou fragmento de ligação a antígeno deste,polipeptídeos de ligação a neutrocina-alfa, variantes poli-peptídicas de neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos que se direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI,BCMA, BAFF-R ou outro receptor para neutrocina-alfa e/ouAPRIL. Em modalidades específicas, o corticosteróide é pred-nisona, prednisolona, hidrocortisona, metilprednisolona oudexametasona. Em uma modalidade especifica, o antagonista deneutrocina-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Em umamodalidade especifica, o antagonista de neutrocina-alfa éuma proteína TACI-Fc. Em uma modalidade específica, o anta-gonista de neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Em umamodalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é umpepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específi-ca, o antagonista de neutrocina-alfa é fragmento de proteínaneutrocina-alfa ou variante que funciona como um dominantenegativo. Em uma modalidade específica, o paciente no qual aterapia de corticosteróide é reduzida é um paciente que so-fre de inflamação. Em outra modalidade específica, o pacien-te no qual a terapia de corticosteróide é reduzida é um pa-ciente que sofre de doença auto-imune, incluindo, mas nãolimitando a, artrite reumatóide, lúpus, síndrome de Sjõgrenou outra doença auto-imune, tal como alguma listada aqui.

Conseqüentemente, em uma modalidade específica, ainvenção provê um método para reduzir a freqüência de trata-mentos de corticosteróides e/ou a quantidade de corticoste-róide administrado a um paciente com lúpus eritematoso sis-têmico (lúpus) compreendendo administrar uma quantidade te-rapeuticamente eficaz de um antagonista de neutrocina-alfaou outro agente imunomodulatório conhecido, na técnica e/oudescrito aqui incluindo, mas não limitando a, um anticorpoanti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antígeno des-te, uma proteína receptora de neutrocina-alfa (p. ex. , TACI,BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante desta, um anticorpoanti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ouBAFF-R) ou fragmento de ligação a antigeno deste, polipeptí-deos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptidicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos quese direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-Rou outro receptor para neutrocina-alfa e/ou APRIL. Em outramodalidade especifica, a invenção provê um método para redu-zir a freqüência de tratamentos de prednisona e/ou a quanti-dade de prednisona administrada a um paciente com lúpus eri-tematoso sistêmico (lúpus) compreendendo administrar umaquantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de neu-trocina-alfa ou outro agente imunomodulatório conhecido natécnica e/ou descrito aqui incluindo, mas não limitando a,um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação aantigeno deste, uma proteína receptora de neutrocina-alfa(p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante des-ta, um anticorpo anti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex.,TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento de ligação a antigenodeste, polipeptídeos de ligação a neutrocina-alfa, variantespolipeptidicas de neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou an-ti-sentidos que se direcionam a neutrocina-alfa, APRIL,TACI, BCMA, BAFF-R ou outro receptor para neutrocina-alfae/ou APRIL. Neste contexto, "quantidade terapeuticamente e-ficaz" se refere a uma quantidade que reduz o corticosterói-de necessário para aliviar manifestações de doença para asquais corticosteróides são tipicamente prescritos. Essas ma-nifestações são bem conhecidas por clínicos/médicos, como osão as metodologias para determinar a quantidade de anticor-po/composição eficaz para reduzir a gravidade dessas mani-festações. Em modalidades preferidas, a dosagem do anticorpoda invenção administrada a um paciente é 0,1 mg/kg até 100mg/kg do peso corporal do paciente. De maior preferência, adosagem administrada a um paciente está entre 0,1 mg/kg até20 mg/kg do peso corporal do paciente. Nas modalidades maispreferidas, a dose administrada a um paciente é 1, 4, 10 ou20 mg/kg.

Em uma modalidade especifica, a quantidade de cor-ticosteróide (p. ex., prednisona) administrada a um pacienteé diminuída a partir de uma dose previamente maior para ^80miligramas/dia enquanto o mesmo paciente está concomitante-mente em um regime de tratamento que compreende a adminis-tração de um antagonista de neutrocina-alfa ou outro agenteimunomodulatório conhecido na técnica ou descrito aqui in-cluindo, mas não limitando a, um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antígeno deste, uma proteínareceptora de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R)ou fragmento ou variante desta, um anticorpo anti-receptorde neutrocina-alf a (p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou frag-mento de ligação a antígeno deste, polipeptídeos de ligaçãoa neutrocina-alfa, variantes polipeptídicas de neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos que se direcionama neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-R ou outro recep-tor para neutrocina-alfa e/ou APRIL. Em uma modalidade espe-cífica, a quantidade de corticosteróide (p. ex., prednisona)administrada a um paciente é diminuída a partir de uma dosepreviamente maior para ^40 miligramas/dia enquanto o mesmopaciente está concomitantemente em um regime de tratamentoque compreende a administração de um antagonista de neutro-cina-alfa ou outro agente imunomodulatório. Em uma modalida-de especifica, a quantidade de corticosteróide (p. ex.,prednisona) administrada a um paciente é diminuída a partirde uma dose previamente maior para menos de 20 miligra-mas/dia enquanto o mesmo paciente está concomitantemente emum regime de tratamento que compreende a administração de umantagonista de neutrocina-alfa ou outro agente imunomodula-tório. Em uma modalidade específica, a quantidade de corti-costeróide (p. ex., prednisona) administrada a um paciente édiminuída a partir de uma dose previamente maior para ^ 10miligramas/dia enquanto o mesmo paciente está concomitante-mente em um regime de tratamento que compreende a adminis-tração de um antagonista de neutrocina-alfa ou outro agenteimunomodulatório. Em uma modalidade específica, a quantidadede corticosteróide (p. ex., prednisona) administrada a umpaciente é diminuída a partir de uma dose previamente maiorpara ^ 8 miligramas/dia enquanto o mesmo paciente está con-comitantemente em um regime de tratamento que compreende aadministração de um antagonista de neutrocina-alfa ou outroagente imunomodulatório. Em uma modalidade específica, aquantidade de corticosteróide (p. ex., prednisona) adminis-trada a um paciente é diminuída a partir de uma dose previa-mente maior para ^ 6 miligramas/dia enquanto o mesmo pacien-te está concomitantemente em um regime de tratamento quecompreende a administração de um antagonista de neutrocina-alfa ou outro agente imunomodulatório. Em uma modalidade es-pecífica, a quantidade de corticosteróide (p. ex., predniso-na) administrada a um paciente é diminuída a partir de umadose previamente maior para ^ 4 miligramas/dia enquanto omesmo paciente está concomitantemente em um regime de trata-mento que compreende a administração de um antagonista deneutrocina-alfa ou outro agente imunomodulatório. Em uma mo-dalidade específica, a quantidade de corticosteróide (p.ex., prednisona) administrada a um paciente é diminuída apartir de uma dose previamente maior para ^ 2 miligramas/diaenquanto o mesmo paciente está concomitantemente em um regi-me de tratamento que compreende a administração de um anta-gonista de neutrocina-alfa ou outro agente imunomodulatório.

Em uma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alf a é um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidadeespecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteínaTACI-Fc. Em uma modalidade específica, o antagonista de neu-trocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Em uma modalidade es-pecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é um pepticorpoanti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, o anta-gonista de neutrocina-alfa é fragmento de proteína neutroci-na-alfa ou variante que funciona como um dominante negativo.

Em uma modalidade específica, a quantidade decorticosteróide (p. ex., prednisona) administrada a um paci-ente é diminuída a partir de uma dose previamente maior para7,5 miligramas/dia enquanto o mesmo paciente está concomi-tantemente em um regime de tratamento que compreende a admi-nistração de um antagonista de neutrocina-alfa ou outro a-gente imunomodulatório conhecido na técnica e/ou descritoaqui. Em uma modalidade específica, a quantidade de corti-costeróide (ρ, ex., prednisona) administrada a um paciente épor fim diminuída em pelo menos 25% enquanto o paciente estáconcomitantemente em um regime de tratamento que compreendea administração de um antagonista de neutrocina-alfa ou ou-tro agente imunomodulatório comparada à dose de prednisonaque o paciente estava tomando antes de iniciar o regime detratamento que compreende a administração de um antagonistade neutrocina-alfa ou outro agente imunomodulatório. Em umamodalidade específica, a quantidade de corticosteróide (p.ex., prednisona) administrada a um paciente é por fim dimi-nuída em pelo menos 50% enquanto o paciente está concomitan-temente em um regime de tratamento que compreende a adminis-tração de um antagonista de neutrocina-alfa ou outro agenteimunomodulatório comparada à dose de prednisona que o paci-ente estava tomando antes de iniciar o regime de tratamentoque compreende a administração de um antagonista de neutro-cina-alfa ou outro agente imunomodulatório. Em uma modalida-de específica, a quantidade de corticosteróide (p. ex.,prednisona) administrada a um paciente é por fim diminuídaem pelo menos 25% até <7,5 miligramas/dia enquanto o paci-ente está concomitantemente em um regime de tratamento quecompreende a administração de um antagonista.de neutrocina-alfa ou outro agente imunomodulatório comparada à dose deprednisona que o paciente estava tomando antes de iniciar oregime de tratamento que compreende a administração de umantagonista de neutrocina-alfa ou outro agente imunomodula-tório. Em uma modalidade específica, a quantidade de corti-costeróide (p. ex., prednisona) administrada a um paciente épor fim diminuída em pelo menos 50% até <7,5 miligramas/diaenquanto o paciente está concomitantemente em um regime detratamento que compreende a administração de um antagonistade neutrocina-alfa ou outro agente imunomodulatório compara-da à dose de prednisona que o paciente estava tomando antesde iniciar o regime de tratamento que compreende a adminis-tração de um antagonista de neutrocina-alfa ou outro agenteimunomodulatório. Em uma modalidade específica, o antagonis-ta de neutrocína-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa.Em uma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc. Em uma modalidade específica, oantagonista de neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Emuma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfaé um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade es-pecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é fragmento deproteína neutrocina-alfa ou variante que funciona como umdominante negativo.

Em uma modalidade específica, um paciente é tira-do, temporariamente ou permanentemente, ^da terapia de corti-costeróide (p. ex., prednisona) enquanto o paciente estáconcomitantemente em um regime de tratamento que compreendea administração de um antagonista de neutrocina-alfa ou ou-tro agente imunomodulatório. Em uma modalidade específica, oantagonista de neutrocina-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, o antagonistade neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc. Em uma modalidadeespecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteínaBAFF-R-Fc. Em uma modalidade específica, o antagonista deneutrocina-alfa é um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em umamodalidade específica, o antagonista" de neutrocina-alfa éfragmento de proteína neutrocina-alfa ou variante que fun-ciona como um dominante negativo.

Em modalidades específicas, antagonistas de neu-trocina-alfa ou outros agentes imunomodulatórios conhecidosna técnica e/ou descritos aqui são usados para tratar paci-ente com diagnose clínica de artrite reumatóide (AR). Em mo-dalidades específicas, o paciente com artrite reumatóidetratado não terá uma malignidade de célula B. Além disso, opaciente com artrite reumatóide é opcionalmente tratado adi-cionalmente com qualquer um ou mais agentes empregados paratratar AR tal como salicilato; drogas anti-inflamatórias nãoesteroidais tal como indometacina, fenilbutazona, derivadosde ácido fenilacético (p. ex., ibuprofeno e fenoprofeno),ácidos acéticos de naftaleno (naproxeno), ácido pirrolealca-nóico (tometino), ácidos indolacéticos (sulindac), ácido an-tranílico halogenado (meclofenamato de sódio), piroxican,zomepirac e diflunisal; anti-maláricos tal como cloroquina;sais de ouro; penicilamina; ou agentes imunossupressores talcomo metotrexato ou corticosteróides em dosagens conhecidaspara tais drogas ou dosagens reduzidas. De preferência, en-tretanto, o paciente com artrite reumatóide é tratado apenascom o antagonista de neutrocina-alfa ou outro agente imuno-modulatório conhecido na técnica e/ou descrito aqui. Em umamodalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é umanticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específi-ca, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc.Em uma modalidade especifica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Em uma modalidade específica,o antagonista de neutrocina-alfa é um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, o antagonistade neutrocina-alfa é fragmento de proteína neutrocina-alfaou variante que funciona como um dominante negativo. Taisagentes imunomodulatórios são administrados ao paciente comAR de acordo com um plano de dosagem conforme descrito in-fra, que pode ser prontamente determinado por alguém de co-nhecimento ordinário da técnica. A resposta primária é de-terminada pelo índice de Paulus (Paulus et alArthritisRheum. 33: 477-484 (1990)), isto é, melhora do inflexibili-dade matinal, número de articulações doloridas e inflamadas,sedimentação eritrocítica (ESR) e pelo menos uma melhora de2 pontos em uma escala de 5 pontos de gravidade de doençaavaliada pelo paciente e pelo médico. A administração de an-tagonista de neutrocina-alfa'ou outro agente imunomodulató-rio conhecido na técnica e/ou descrito aqui aliviará um oumais dos sintomas de AR no paciente tratado como descritoacima.·

Em um ensaio clínico de fase 2 (Exemplo 3) , em quepacientes com artrite reumatóide receberam tratamento com umanticorpo que neutraliza a proteína neutrocina-alfa, dadocomo uma infusão IV nos dias 0, 14,· 28 e.então a cada quatrosemanas até a semana 24, o tratamento foi mais capaz de me-lhorar sintomas associados com artrite reumatóide em pacien-tes que tinham uma pontuação DAS28 maior que 5.1, pacientesque não tinham recebido previamente terapia anti-TNF e/oupacientes que tinham fator reumatóide em seu plasma e/ou so-ro sangüíneo antes de começar o tratamento com o anticorpoque neutraliza a proteína neutrocina-alfa. Subgrupos adicio-nais que pareceram ser mais capazes de responder ao trata- mento com o anticorpo que neutraliza a proteína neutrocina-alfa incluíram pacientes do sexo masculino, pacientes quetinham anticorpos anti-CCP (peptídeo citrulinado cíclico) emseu plasma e/ou soro sangüíneo, pacientes que receberam me-totrexato concomitantementé com o anticorpo que neutraliza a proteína neutrocina-alfa, pacientes que não tiveram êxitopreviamente no tratamento com metotrexato e/ou pacientes quenão tiveram êxito previamente na terapia com metotrexato epelo menos uma outra terapia DMARD.

Conseqüentemente, a invenção provê um método paratratar um paciente com artrite reumatóide com antagonista deneutrocina-alfa ou outro .agente imunomodulatório conhecidona técnica e/ou descrito aqui, em que o citado paciente comartrite reumatóide tem qualquer um ou mais das seguintes ca-racterísticas: o paciente não recebeu previamente terapiaanti-TNF, p. ex., Infliximab (também conhecido como Remica-de™ Centocor, Inc.), adalimumab (Humira® de Abbott Laborato-ries) ou etanercept (Enbrel®); o(a) paciente tem fator reu-matóide em seu plasma e/ou soro sangüíneo; o(a) paciente temanticorpos anti-CCP (peptídeo citrulinado cíclico) mensurá- veis em seu plasma e/ou soro sangüíneo; o (a) paciente temnível de CRP (proteína reativa C) elevado em seu plasma e/ousoro sangüíneo; o paciente não teve êxito previamente comuma ou mais drogas anti-reumáticas modificadoras de doença;esse paciente tem uma pontuação de atividade de doença modi-ficada alta (DAS28); o paciente tem articulações intumesci-das e hipersensiveis; o paciente sofre de inflexibilidadematinal; o paciente tem uma taxa de sedimentação eritrocíti-ca (ESR) aumentada e/ou o paciente é do sexo masculino. Emuma modalidade especifica, o antagonista de neutrocina-alfaé um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade espe-cifica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteínaTACI-Fc. Em uma modalidade específica, o antagonista de neu-trocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Em uma modalidade es-pecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é um pepticorpoanti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, o anta-gonista de neutrocina-alfa é fragmento de proteína neutroci-na-alfa ou variante que funciona como um dominante negativo.Em modalidades específicas, o (a) paciente com artrite reuma-tóide tem fator reumatóide igual a ou maior que 12 UI/mL emseu plasma e/ou soro sangüíneo. Em modalidades específicas,nível CRP elevado é definido como pelo menos 1,5 miligramaspor litro. Em modalidades específicas, um nível CRP elevadoé definido como pelo menos 5 miligramas por litro. Em moda-lidades específicas, um nível CRP elevado é definido comopelo menos 6 miligramas por litro. Em modalidades específi-cas, um nível CRP elevado é definido como pelo menos 9 mili-gramas por litro. Em modalidades específicas, um nível CRPelevado é definido como pelo menos 10 miligramas por litro.Em modalidades específicas, um nível CRP elevado é definidocomo pelo menos 20 miligramas por litro. Em modalidades es-pecíficas, o(a) paciente com artrite reumatóide tem anticor-po anti-CCP igual a ou maior que 10 unidades em seu plasmae/ou soro sangüíneo. Em modalidades específicas, o(a) paci-ente com artrite reumatóide tem anticorpo anti-CCP igual aou maior que 20 unidades em seu plasma e/ou soro sangüíneo.

Em modalidades específicas, o paciente com não teve êxitopreviamente com um ou mais DMARDs, incluindo, mas não limi-tando a, metotrexato, aminoquinolona, sulfassalazina e Ie-fulnomida. Em modalidades específicas, o paciente com nãoteve êxito previamente em tratamento com metotrexato. Em mo-dalidades específicas, o paciente tem uma pontuação DAS28maior que 5.1. Em modalidades específicas, o paciente tempelo menos 6 articulações intumescidas e pelo menos 8 arti-culações hipersensíveis. Em modalidades específicas, o paci-ente tem um ESR maior que 28 mm/horas. Em modalidades espe-cíficas, o paciente sofre de inflexibilidade matinal por pe-lo menos 45 minutos. Em modalidades específicas, o pacientesofre de inflexibilidade matinal por pelo menos uma hora. Emmodalidades específicas, o paciente sofre de inflexibilidadematinal por pelo menos uma hora e meia. Em modalidades espe-cíficas, o paciente sofre de inflexibilidade matinal por pe-lo menos 2 horas. Em uma modalidade específica, o antagonis-ta de neutrocina-alfa é um anticorpo ánti-neutrocina-alfa.Em uma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc. Em uma modalidade específica, oantagonista de neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Emuma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfaé um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade es-pecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é fragmento deproteína neutrocina-alfa ou variante que funciona como umdominante negativo.

Conseqüentemente, a invenção provê um método paratratar um paciente com artrite reumatóide com antagonista deneutrocina-alfa ou outro agente imunomodulatório conhecidona técnica e/ou descrito aqui incluindo, mas não limitandoa, um· anticorpo anti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligaçãoa antígeno deste, uma proteína receptora de neutrocina-alfa(p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento ou variante des-ta, um anticorpo anti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex.,TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento de ligação a antígenodeste, polipeptídeos de ligação a neutrocina-alfa, variantespolipeptídicas de neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou an-ti-sentidos que se direcionam a neutrocina-alfa, APRIL,TACI, BCMA, BAFF-R ou outro receptor para neutrocina-alfae/ou APRIL, em que o citado paciente com artrite reumatóidetem qualquer um ou mais das seguintes características: o pa-ciente não recebeu previamente terapia anti-TNF, p. ex., In-fliximab (também conhecido como Remicade™ Centocor, Inc.),adalimumab (Humira® de Abbott Laboratories) ou etanercept(Enbrel®); o (a) paciente tem fator reumatóide em seu plasmae/ou soro sangüíneo; o (a) paciente tem anticorpos anti-CCP(joeptídeo citrulinado cíclico) mensuráveis em seu plasmae/ou soro sangüíneo; o (a) paciente tem nível de CRP (proteí-na reativa C) elevado em seu plasma e/ou soro sangüíneo; opaciente não teve êxito previamente com uma ou mais drogasanti-reumáticas modificadoras de doença; esse paciente temuma pontuação de atividade de doença (DAS28) modificada al-ta; o paciente tem articulações intumescidas e hipersensi-veis; o paciente sofre de inflexibilidade matinal; o pacien-te tem uma taxa de sedimentação eritrocitica (ESR) aumentadae/ou o paciente é do sexo masculino. Em modalidades especí-ficas, o (a) paciente com artrite reumatóide tem fator reuma-tóide igual a ou maior que 12 UI/mL em seu plasma e/ou sorosangüíneo. Em modalidades específicas, nível CRP elevado édefinido como pelo menos 1,5 miligramas por litro. Em moda-lidades específicas, .um nível CRP elevado é definido comopelo menos 5 miligramas por litro. Em modalidades específi-cas, um nível CRP elevado é definido como pelo menos 6 mili-gramas por litro. Em modalidades específicas, um nível CRPelevado é definido como pelo menos 9 miligramas por litro.Em modalidades específicas, um nível CRP elevado é definidocomo pelo menos 10 miligramas por litro. Em modalidades es-pecíficas, um nível CRP elevado é definido como pelo menos20 miligramas por litro. Em modalidades específicas, o (a)paciente com artrite reumatóide tem anticorpo anti-CCP iguala ou maior que 10 unidades em seu plasma e/ou soro sangüí-neo. Em modalidades específicas, o (a) paciente com artritereumatóide tem anticorpo anti-CCP igual a ou maior que 20unidades em seu plasma e/ou soro sangüíneo. Em modalidadesespecíficas, o paciente com não teve êxito previamente comum ou mais DMARDs, incluindo, mas não limitando a, metotre-xato, aminoquinolona, sulfassalazina e lefulnomida. Em moda-lidades específicas, o paciente com não teve êxito previa-mente em tratamento com metotrexato. Em modalidades especí-ficas, o paciente tem uma pontuação DAS28 maior que 5.1. Emmodalidades específicas, o paciente tem pelo menos 6 articu-lações intumescidas e pelo menos 8 articulações hipersensí-veis. Em modalidades específicas, o paciente tem um ESR mai-or que 28 mm/horas. Em modalidades específicas, o pacientesofre de inflexibilidade matinal por pelo menos 45 minutos.Em modalidades específicas, o paciente sofre de inflexibili-dade matinal por pelo menos uma hora. Em modalidades especí-ficas, o paciente sofre de inflexibilidade matinal por pelomenos uma hora e meia. Em modalidades específicas, o pacien-te sofre de inflexibilidade matinal por pelo menos 2 horas.

Em outra modalidade específica, um paciente comartrite reumatóide que está sendo ou foi tratado com um an-tagonista de neutrocina-alfa ou outro agente imunomodulató-rio conhecido na técnica e/ou descrito aqui, incluindo, masnão limitando a, um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou frag-mento de ligação a antígeno deste,· uma proteína receptora deneutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmentoou variante desta, um anticorpo anti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento de ligaçãoa antígeno deste, polipeptídeos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptídicas de neutrocinaTalfa e/ou APRILe siRNAs ou anti-sentidos que se direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-R ou outro receptor para neu-trocina-alfa e/ou APRIL, é considerado como estando respon-dendo/tendo respondido ao tratamento se o paciente atingiuuma resposta ACR20. O ACR20 é um índice desenvolvido peloAmerican College of Rheumatology (ACR) para avaliar a res-posta do paciente ao tratamento para artrite reumatóide.Umaresposta ACR20 é definida como pelo menos uma redução de 20%na contagem de articulação hipersensivel e contagem de arti-culação intumescida, além de uma melhora de pelo menos 20%em três de cinco outras avaliações de sintomas ou manifesta-ções de doença (isto é, avaliação de dor do paciente, avali-ação global do paciente, avaliação global do médico, defici-ência auto-avaliada pelo paciente, reagente de fase aguda[ESR ou CRP] ) . Em uma modalidade especifica, o antagonistade neutrocina-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Emuma modalidade especifica, o antagonista de neutrocina-alfaé uma proteína TACI-Fc. Em uma modalidade específica, o an-tagonista de neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Emuma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfaé um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade es-pecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é fragmento deproteína neutrocina-alfa ou variante que funciona como umdominante negativo.

Em outra modalidade específica, um paciente comartrite reumatóide que está sendo ou foi tratado com um an-tagonista de neutrocina-alfa ou outro agente imunomodulató-rio conhecido na técnica e/ou descrito aqui, incluindo, masnão limitando a, um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou frag-mento de ligação a antígeno deste, uma proteína receptora deneutrocina-alfa ou fragmento ou variante desta, polipeptí-deos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptídicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL e siRNAs ou anti-sentidos quese direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-Rou outro receptor para neutrocina-alfa e/ou APRIL, é consi-derado como estando respondendo/tendo respondido ao trata-mento se o paciente atingiu uma resposta ACR50. 0 ACR50 é umÍndice desenvolvido pelo American College of Rheumatology(ACR) para avaliar a resposta do paciente ao tratamento paraartrite reumatóide. Uma resposta ACR50 é definida como pelomenos uma redução de 50% na contagem de articulação hiper-sensível e contagem de articulação intumescida, além de umamelhora de pelo menos 50% em três de cinco outras avaliaçõesde sintomas ou manifestações de doença (isto é, avaliação dedor do paciente, avaliação global do paciente, avaliaçãoglobal do médico, deficiência auto-avaliada pelo paciente,reagente de fase aguda [ESR ou CRP] ) . Em uma modalidade es-pecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é um anticorpoanti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, o anta-gonista de neutrocina-alfa é uma proteína TACI-Fc. Em umamodalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa éuma proteína BAFF-R-Fc. Em uma modalidade específica, o an-tagonista de neutrocina-alfa é um pepticorpo anti-neutrocina-alf a. Em uma modalidade específica, o antagonistade neutrocina-alfa é fragmento de proteína neutrocina-alfaou variante que funciona como um dominante negativo.

Em outra modalidade específica, um paciente comartrite reumatóide que está sendo ou foi tratado com um an-tagonista de neutrocina-alfa ou óutro agente imunomodulató-rio conhecido na técnica e/ou descrito aqui, incluindo, masnão limitando a, um anticorpo anti-neutrocina-alfa ou frag-mento de ligação a antígeno deste, uma proteína receptora deneutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmentoou variante desta, um anticorpo anti-receptor de neutrocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA ou BAFF-R) ou fragmento de ligaçãoa antigeno deste, polipeptideos de ligação a neutrocina-alfa, variantes polipeptidicas de neutrocina-alfa e/ou APRILe siRNAs ou anti-sentidos que se direcionam a neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA, BAFF-R ou outro receptor para neu-trocina-alfa e/ou APRIL, é considerado como estando respon-dendo/tendo respondido ao tratamento se o paciente atingiuuma resposta ACR70. O ACR70 é um índice desenvolvido peloAmerican College of Rheumatology (ACR) para avaliar a res-posta do paciente ao tratamento para artrite reumatóide. Umaresposta ACR70 é definida como pelo menos uma redução de 70%na contagem de articulação hipersensível e contagem de arti-culação intumescida, além de uma" melhora de pelo menos 70%em três de cinco outras avaliações de sintomas ou manifesta-ções de doença (isto é, avaliação de dor do paciente, avali-ação global do paciente, avaliação global do médico, defici-ência auto-avaliada pelo paciente, reagente de fase aguda[ESR ou CRP]).

Em uma modalidade específica, o antagonistade neutrocina-alfa é um anticorpo anti-neutrocina-alfa. Emuma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfaé uma proteína TACI-Fc. Em uma modalidade específica, o an-tagonista de neutrocina-alfa é uma proteína BAFF-R-Fc. Emuma modalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfaé um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em uma modalidade es-pecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é fragmento deproteína neutrocina-alfa ou variante que funciona como umdominante negativo.Agentes imunomodulatórios

A presente invenção provê um método para tratarum (a) paciente que tem um titulo de ANA de 1:80 ou maiore/ou maior que ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo com um agente imunomodulató-rio. O significado de "agente imunomodulatório" quando usadoaqui é discutido supra. Em uma modalidade especifica, o a-gente imunomodulatório é um antagonista de neutrocina-alfa.Por "antagonista", entende-se agentes capazes de inibir ou neutralizar as ações funcionais e/ou biológicas in vitroe/ou in vivo de neutrocina-alf a (p. ex., estímulo de dife-renciação, proliferação e/ou sobrevivência de células B; es-tímulo de produção de Ig por células B e ligação a um recep-tor de neutrocina-alfa). Esta inibição pode ocorrer com ousem contato físico direto entre o antagonista e o polipeptí-deo de neutrocina-alfa (p. ex., o antagonista pode modularum efetor a montante da atividade de neutrocina-alfa a fimde reduzir a citada·atividade). Ensaios para testar a habi-lidade de antagonistas de neutrocina-alfa para inibir a ati- vidade de célula B são descritos aqui. Antagonistas de neu-trocina-afa incluem, mas não estão limitados a, um anticorpoanti-neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antígeno des-te, uma proteína receptora de neutrocina-alfa ou fragmentoou variante desta, um anticorpo que se liga a um receptor de neutrocina-alfa ou fragmento de ligação a antígeno deste,peptídeo ou polipeptídeo de ligação a neutrocina-alfa, vari-antes polipeptídicas de neutrocina-alfa e/ou APRIL (p. ex.,uma forma dominante negativa de neutrocina-alfa e/ou APRIL).Antagonistas adicionais de neutrocina-alfa incluem antago-nistas de pequenas moléculas de neutrocina-alfa, miméticospeptidicos de neutrocina-alfa, RNAs anti-sentido e pequenosRNAs de interferência (siRNAs) que direcionam-se a neutroci-na-alfa, RNAs anti-sentido e pequenos RNAs de interferência(siRNAs) que direcionam-se a APRIL, RNAs anti-sentido e pe-quenos RNAs de interferência (siRNAs) que direcionam-se areceptores de neutrocina-alfa e/ou receptores de APRIL. Cadaum desses é descrito em maiores detalhes abaixo.

Antagonistas de neutrocina-alfa

A. Polipeptideos de neutrocina-alfa e APRILEm uma modalidade especifica, o antagonista deneutrocinã-alfa para uso nos métodos da presente invenção éum polipeptideo, fragmento ou variante de neutrocina-alfa ouAPRIL . Polipeptideos de neutrocina-alfa, polipeptideos deAPRIL e fragmento e variantes destes são descritos em maio-res detalhes abaixo. A proteína de neutrocina-alfa (SEQ IDNO: 2) é um membro da família TNF de ligantes que comparti-lham identidade de seqüência de aminoácidos com APRIL (SEQID NO: 4, No. de acesso do GenBank AF046888; Número de Pu-blicação Internacional PCT W097/33902; Hahne M. et al., JExp Med. (1998) 188(6): 1185-90), TNFa e Iinfotoxina-a (Lta)(Moore, et al., (1999). 0 gene de neutrocina-alfa completocodifica um polipeptideo de 285 aminoácidos que tem um domí-nio intracelular entre os resíduos 1 e 46, um domínio trans-membranar entre os resíduos 47 e 73 precedido por uma se-qüência não hidrofóbica característica de proteínas ligadasa membrana do tipo II e um domínio extracelular entre os re-síduos 7 4 e 285. Como outros membros da família TNF, neutro-cina-alfa funciona como uma proteína trimérica. Na expressãode neutrocina-alfa na superfície da célula, o domínio extra-celular é clivado no aminoácido 134 para liberar um trímerobiologicamente ativo. Caracterização estrutural revela queembora ligantes da família TNF demonstram diversidade de se-qüência, elas mostram alta homologia estrutural. A proteínaneutrocina-alfa, como outros membros da família TNF de li-gantes, é um sanduíche β de duas camadas que forma uma formade rocambole semelhante a TNF. A proteína neutrocina-alfa ésimilar aos outros ligantes da família TNF na estrutura ge-ral e dimensões. Entretanto, a região de ligação ao receptorde neutrocina-alfa é uma fenda mais acentuada que aquelasobservadas para outras citocinas (Oren, et al., (2002) Natu-re Structural Biology 9: 288-292). Polipeptídeos de neutro-cina-alfa são descritos em maiores detalhes em, por exemplo,Números de Publicação Internacional W098/18921, W000/50597,W002/1820 e WO03/033658 cada um dos quais é incorporado aquicomo referência em sua totalidade.

Como descrito acima, polipeptídeos de neutrocina-alfa funcionam para estimular a proliferação de célula B,diferenciação, sobrevivência e secreção de Ig. Assim, alguémnão esperaria usar a forma nativa de neutrocina-alfa nos mé-todos da presente invenção. Entretanto, a forma nativa deneutrocina-alfa pode ser usada como um agente de direciona-mento para levar outros agentes que podem inibir atividadede célula B (p. ex., unidades ou proteínas citotóxicas) emproximidade com uma célula B (veja, por exemplo, Exemplo 12-

e 13 de W000/033658, em que neutrocina-alfa radiomarcada éusada para direcionamento até e matar células que expressamreceptores de neutrocina-alfa que são predominantemente cé-lulas B em origem). Senão, fragmentos ou variantes de neu-trocina-alfa que se ligam a um ou mais receptores de neutro-cina-alfa, mas não induzem sinalização podem ser usados comoum antagonista de neutrocina-alfa. Fragmentos ou variantesde neutrocina-alfa que afetam a habilidade de neutrocina-alfa para formar ou manter homotrimeros ou heterotrimerosestáveis também podem ser usados como um antagonista de neu-trocina-alfa nos métodos da invenção. Assim, polipeptideosde neutrocina-alfa que podem ser usados nos métodos da pre-sente invenção incluem fragmentos ou variantes polipeptídi-cas da proteina neutrocina-alfa de SEQ ID NO: 2. Os fragmen-tos ou variantes polipeptidicas podem ser "independentes" oucompreendidos em um polipeptideo maior do qual o fragmentoforma uma parte ou região, de maior preferência como uma re-gião continua única. Em modalidades especificas, polipepti-deos de neutrocina-alfa que podem ser usados nos métodos dainvenção abrangem fragmentos polipeptidicos compreendendo,ou senão, consistindo no domínio extracelular previsto deneutrocina-alfa (resíduos de aminoácidos 73-285 de SEQ IDNO: 2) e o fragmento solúvel de neutrocina-alfa (resíduos deaminoácidos 134-285 de SEQ ID NO: 2) . Em outra modalidade,os fragmentos ou variantes polipeptidicas que podem ser usa-dos nos métodos da invenção compreendem, ou senão, consistemno fragmento ou variante polipeptídica com pelo menos 80%,.85%, 90%. 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade comos fragmentos polipeptídicos de neutrocina-alfa nativa des-crita acima.

Em outra modalidade, variantes polipeptidicas deneutrocina-alfa que podem ser usadas nos métodos da presenteinvenção incluem miméticos de peptideo. Miméticos são molé-culas contendo peptideo que imitam elementos de estruturasecundária de proteína. Veja, por exemplo, Johnson et al.,"Peptide Turn Mimetics" em BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY,Pezzuto et al., eds. Chapman and Hall, Nova Iorque (1993),incorporado aqui como referência. A lógica oculta por trásdo uso de imitadores peptídicos é que o cerne peptídico deproteínas existe principalmente para orientar cadeias late-rais de aminoácidos de tal maneira a facilitar interaçõesmoleculares, tal como aquelas de anticorpo e antígeno. Espe-ra-se que um imitador peptídico permita interações molecula-res similares à molécula natural. Esses princípios podem serusados para engenheirar moléculas de segunda geração que têmmuitas das propriedades naturais dos peptídeos de direciona-mento divulgados aqui, mas com características alteradas emesmo melhoradas.

APRIL (SEQ ID NO: 4) é um membro da família TNF deligantes que compartilham identidade de seqüência com neu-trocina-alfa (SEQ ID NO: 2; No. de Acesso no GenBankNM_006573; Moore, et al., (1999) Science 285: 260-263; Sch-neider et al., (1999) J. Exp. Med. 189: 1747-1756 e Khare etal., (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. 97: 3370-3375), TNFa elinfotoxina-a (Lta) (Moore, et al., (1999)). O gene completode APRIL codifica um polipeptídeo de 250 aminoácidos que temum domínio intracelular entre os resíduos 1 e 28, um domíniotransmembrana entre os resíduos 29 e 49 e um domínio extra-celular entre os resíduos 50 e 250. Como outros membros dafamília TNF, APRIL funciona como uma proteína trimérica. Naexpressão de APRIL na superfície da célula, o domínio extra-celular é clivado no aminoácido 105 para liberar um trímerobiologicamente ativo.

Em uma modalidade específica, um polipeptídeo deAPRIL que pode ser usado nos métodos da presente invençãoinclui fragmentos ou variantes polipeptídicas da proteínaAPRIL de SEQ ID NO: 4. Os fragmentos polipeptídicos podemser "independentes" ou compreendidos em um polipeptídeo mai-or do qual o fragmento forma uma parte ou região, de maiorpreferência como uma região contínua única. Em modalidadesespecíficas, polipeptídeos de APRIL que podem ser usados nosmétodos da invenção abrangem fragmentos polipeptídicos com-preendendo, ou senão, consistindo no domínio extracelularprevisto de APRIL (resíduos de aminoácidos 50-250 de SEQ IDNO: 4) e o fragmento solúvel de APRIL (resíduos de aminoáci-dos 105-250 de SEQ ID NO: 4) . Em outra modalidade, os frag-mentos ou variantes polipeptídicas que podem ser usados nosmétodos da invenção compreendem, ou senão, consistem nofragmento ou variante polipeptídica com pelo menos 80%, 85%,90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com osfragmentos polipeptídicos de APRIL nativa descrita acima.

Em outra modalidade, variantes polipeptídicas deAPRIL que podem ser usadas nos métodos da presente invençãoincluem miméticos de peptídeo. miméticos são moléculas con-tendo peptídeo que imitam elementos de estrutura secundáriade proteína. Veja, por exemplo, Johnson et al., "PeptideTurn Mimetics" em BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto etal., eds. Chapman and Hall, Nova Iorque (1993), incorporadoaqui como referência. A lógica oculta por trás do uso de i-mitadores peptídicos é que o cerne peptídico de proteínasexiste principalmente para orientar cadeias laterais de ami-noácidos de tal maneira a facilitar interações moleculares,tal como aquelas de anticorpo e antígeno. Espera-se que um imitador peptídico permita interações moleculares similaresà molécula natural. Esses princípios podem ser usados paraengenheirar moléculas de segunda geração que têm muitas daspropriedades naturais dos peptídeos de direcionamento divul-gados aqui, mas com características alteradas e mesmo melho- radas.

Os polipeptídeos de neutrocina-alfa e APRIL quepodem ser usados nos métodos da invenção podem ser expressa-dos ou sintetizados em uma forma modificada, tal como umaproteína de fusão (compreendendo o polipeptídeo unido atra- vés de uma ligação peptídica a uma seqüência de proteína he-teróloga (de um proteína diferente)) e pode incluir não ape-nas sinais de secreção, mas também regiões funcionais hete-rólogas adicionais. Tal proteína de fusão pode ser feita pe-la ligação de polinucleotídeos de neutrocina-alfa ou APRIL com a seqüência de ácido nucléico desejada codificando a se-qüência de aminoácidos desejada, por métodos conhecidos natécnica, na fase de leitura apropriada e expressando o pro-duto de proteína de fusão por métodos conhecidos na técnica.Senão, tal proteína de fusão pode ser feita por técnicas desíntese de proteínas, p. ex., por uso de um sintetizador depeptídeo. Assim, por exemplo, uma região de aminoácidos adi-cionais, particularmente aminoácidos carregados, pode seradicionada à extremidade N-terminal do polipeptídeo para me-lhorar a estabilidade e persistência na célula hospedeira,durante a purificação, ou durante manuseio e estocagem sub-seqüentes. Além disso, unidades peptídicas podem ser adicio-nadas ao polipeptídeo para facilitar a purificação. Tais re-giões podem ser removidas antes da preparação final do poli-peptídeo. A adição de unidades peptídicas a polipeptídeospara engendrar secreção ou excreção, para melhorar a estabi-lidade e para facilitar a purificação, entre outros, é téc-nica familiar e rotineira na arte.

Uma proteína de fusão de neutrocina-alfa ou APRILpreferida que pode ser usada nos métodos da invenção compre-ende uma região heteróloga de imunoglobulina que é útil paraestabilizar e purificar proteínas. Por exemplo, EP-A-O 464533 (equivalente canadense 2045869) e W000/024782 divulgamproteínas de fusão compreendendo várias porções de regiãoconstante de moléculas de imunoglobulina junto com outraproteína humana ou parte desta. Proteínas de fusão de imuno-globulina e neutrocina-alfa foram descritas em, por exemplo,Yu et al., (2000) Nat Immunol 1: 252-256, aqui incorporadacomo referência em sua totalidade. Proteínas de fusão de i-munoglobulina e APRIL foram descritas em, por exemplo, Pu-blicação PCT WO00/087977, aqui incorporada como referênciaem sua totalidade. Em muitos casos, a parte Fc em uma prote-ina de fusão é completamente vantajosa para uso na terapia ediagnóstico e assim resulta, por exemplo, em propriedadesfarmacocinéticas melhoradas (EP-A 0232 262). Por outro lado,para alguns usos seria desejável ser capaz de excluir a par-te Fc após a proteína de fusão ter sido expressa, detectadae purificada da maneira vantajosa descrita. Este é o casoquando a porção Fc prova ser um obstáculo para uso na tera-pia e diagnóstico, por exemplo, quando a proteína de fusão épara ser usada como antígeno para imunizações. Na descobertade fármacos, por exemplo, proteínas humanas, tal como hIL-5foram fusionadas a porções Fc para a finalidade de ensaiosde triagem/varredura de alta carga de entrada para identifi-car antagonistas de hIL-5. Veja, D. Bennett et al., J Mo-lecular Recognition 8: 52-58 (1995) e K. Johanson et al., JBiol Chem 270: 9459-9471 (1995).

Como alguém versado na técnica apreciará e comodiscutido acima, os polipeptídeos de neutrocina-alfa e APRILpodem ser fusionados a outras seqüências polipeptídicas. Porexemplo, os polipeptídeos de neutrocina-alfa que podem serusados nos métodos da corrente invenção podem ser fusionadoscom o domínio constante de imunoglobulinas (IgA, IgE, IgG,IgM)., ou porções destes (CHI, CH2, CH3, ou qualquer combina-ção destes e porções destes), ou albumina (incluindo, masnão limitando a albumina humana recombinante ou fragmentosou variantes desta (veja, p. ex., Patente US No. 5.876.969,divulgada em 2 de março de 1999, Patente EP 0 413 622 e Pa-tente US No. 5.766.883, divulgada em 16 de junho de 1998,incorporadas aqui como referência em suas totalidades), re-sultando em polipeptídeos quiméricos.

Tais proteínas de fusão podem facilitar a purifi-cação, podem estender a vida de prateleira e podem aumentara meia-vida in vivo. Isto foi demonstrado para proteínas quiméricas consistindo nos primeiros dois domínios do poli-peptídeo-CD4 humano e vários domínios das regiões constantesdas cadeias pesada ou leve de imunoglobulinas de mamíferos.Veja, p. ex., EP 394.827; Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (1988). Distribuição melhorada de um antígeno atravésda barreira epitelial do sistema imune foi demonstrada paraantígenos (p. ex. , insulina) conjugados a um par de ligaçãode FcRn tal como fragmentos Fc ou IgG (veja, p. ex., Publi-cações PCT WO 96/22024 e WO 99/04813). Proteínas de fusão deIgG que têm uma estrutura dimérica ligada por dissulfeto de-vido às ligações dissulfeto de porção de IgG também foramdemonstradas como sendo mais eficientes na ligação a e neu-tralização de outras moléculas que polipeptídeos monoméricosou fragmentos destes sozinhos. Veja, p. ex., Fountoulakis etal., J Biochem 270: 3958-3964 (1995).

Albumina sérica humana (HSA ou HA), uma proteínasde 585 aminoácidos na sua forma madura (SEQ ID NO: 11), éresponsável por uma proporção significativa da pressão osmó-tica do soro e também funciona como um carreador de ligantesendógenos e exógenos. No momento, HA para uso clínico é pro-duzida por extração a partir de sangue humano. A produção deHA recombinante (rHA) em microorganismos foi divulgada em EP330 451 e EP 361 991.

A função de albumina como uma molécula carreadorae sua natureza inerte são propriedades desejáveis para usocomo um carreador e transportador de polipeptideos in vivo.O uso de albumina como um componente de uma proteína de fu-são com albumina como um carreador para várias proteínas foisugerido em WO 93/15199, WO 93/15200 e EP 413 622. 0 uso defragmentos N-terminais de HA para fusão a polipeptideos tam-bém foi proposta (EP 399 666) . A fusão de albumina a umaproteína terapêutica pode ser obtida por manipulação genéti-ca, tal que o DNA que codifica HA, ou um fragmento deste, é unido ao DNA que codifica a proteína terapêutica. Um hospe-deiro adequado é então transformado ou transfectado com asseqüências nucleotídicas fusionadas, assim organizadas em umplasmídeo adequado como para expressar um polipeptídeo defusão. A expressão pode ser executada in vitro a partir de, por exemplo, células procarióticas ou eucarióticas, ou invivo, a partir de um organismo transgênico.

Uma proteína de fusão com albumina que pode serusada nos métodos da presente invenção compreende pelo menosum fragmento ou variante de um polipeptídeo de neutrocina-alfa e pelo menos um fragmento ou variante de albumina séri-ca humana, que estão associados um com o outro, de preferên-cia por fusão genética (isto é, a proteína de fusão com al-bumina é gerada por tradução de um ácido nuclêico em que umpolinucleotídeo que codifica toda a neutrocina-alfa ou uma porção é unido na mesma fase de leitura com um polinucleotí-deo que codifica toda a albumina ou uma porção) ou conjuga-ção química um ao outro. 0 polipeptídeo de neutrocina-alfa ea proteína albumina, uma vez parte da proteína de fusão comalbumina, podem ser referidos como uma "porção" ou "unidade"da proteína de fusão com albumina (p. ex., uma "porção neu-trocina-alfa" ou uma "porção de proteína albumina").

Em uma modalidade, uma proteína de fusão com albu-mina que pode ser usada nos métodos-da invenção compreende,ou senão consiste em, um polipeptídeo de neutrocina-alfa euma proteína albumina sérica. Em outras modalidades, umaproteína de fusão com albumina que pode ser usada nos méto-dos da invenção compreende, ou senão consiste em, um frag-mento de neutrocina-alfa e uma proteína albumina sérica. Emoutras modalidades, uma proteína de fusão com albumina quepode ser usada nos métodos da invenção compreende, ou senãoconsiste em, uma variante de neutrocina-alfa e uma proteínaalbumina sérica. Em modalidades preferidas, o componente deproteína albumina sérica da proteína de fusão com albumina éa porção madura da albumina sérica.

Em modalidades adicionais, uma proteína de fusãocom albumina que pode ser usada nos métodos da invenção com-preende, ou senão consiste em, um polipeptídeo de neutroci-na-alfa e um fragmento de albumina sérica biologicamente a-tivo e/ou terapeuticamente ativo. Em modalidades adicionais,uma proteína de fusão com albumina que pode ser usada nosmétodos da invenção compreende, ou senão consiste em, um po-lipeptídeo de neutrocina-alfa e uma variante de albumina sé-rica biologicamente ativa e/ou terapeuticamente ativa. Emmodalidades preferidas, a porção de neutrocina-alfa da pro-teína de fusão com albumina é o polipeptídeo de neutrocina-alfa completo. Em uma modalidade preferida adicional, a por-ção de proteína neutrocina-alfa da proteína de fusão com al-bumina é o domínio maduro, solúvel do polipeptídeo de neu-trocina-alfa.

Em modalidades adicionais, uma proteína de fusãocom albumina que pode ser usada nos métodos da invenção com-preende, ou senão consiste em, um fragmento ou variante deneutrocina-alfa e um fragmento ou variante biologicamenteativo e/ou terapeuticamente ativo de albumina sérica. Em mo-dalidades preferidas, a invenção provê uma proteína de fusãocom albumina que compreende, ou senão consiste na porção ma-dura do polipeptídeo de neutrocina-alfa e na porção madurada albumina sérica (incluindo, mas não limitando à albuminasérica humana recombinante ou fragmentos ou variantes desta(veja, p. ex., Patente US No. 5.876.969, divulgada em 2 demarço de 1999, Patente EP 0 413 622 e Patente US No.5.766.883, divulgada em 16 de junho de 1998, incorporadasaqui como referência em suas totalidades) ) . Em uma modalida-de preferida, polipeptídeos de neutrocina-alfa (incluindofragmentos ou variantes destes) são fusionados à forma madu-ra de albumina sérica humana (isto é, aminoácidos 1-585 dealbumina sérica humana como mostrado nas Figuras 1 e 2 dePatente EP 0 322 094) que são incorporados aqui como refe-rência em sua totalidade. Em outra modalidade preferida, an-ticorpos da presente invenção (incluindo fragmentos ou vari-antes destes) são fusionados a fragmentos polipeptídicos quecompreendem, ou senão consiste em, resíduos de aminoácidos1-x de albumina sérica humana, onde χ é um número inteiro de1 até 585 e o fragmento de albumina tem atividade de albumi-na sérica humana. Em outra modalidade preferida, polipeptí-deos de neutrocina-alfa (incluindo fragmentos ou variantesdestes) são fusionados a fragmentos polipeptidicos que com-preendem, ou senão consiste em, resíduos de aminoácidos 1-zde albumina sérica humana, onde ζ é um número inteiro de 369até 419, como descrito na Patente US 5.766.883 incorporadaaqui como referência em sua totalidade. Polipeptídeos deneutrocina-alfa (incluindo fragmentos ou variantes destes)podem ser fusionados ou à extremidade N- ou à C-terminal daproteína heteróloga (p. ex., polipeptídeo de Fc de imunoglo-bulina ou polipeptídeo de albumina sérica humana).

Em modalidades preferidas, a proteína de albuminasérica humana usada nas proteínas de fusão com albumina quepode ser usada nos métodos da invenção contém um ou ambosdos seguintes grupos de mutações pontuais com referência àSEQ ID NO: 11: Leu407 para Ala, Leu408 para Vai, Val409 paraAla e Arg410 para Ala; ou Arg410 para A, Lys413 para Gln eLys414 para Gln (veja, p. ex., Publicação Internacional No.W095/23857, incorporada por meio deste em sua totalidade co-mo referência aqui). Em modalidades ainda mais preferidas,proteínas de fusão com albumina que podem ser usadas nos mé-todos da invenção que contêm um ou ambos dos grupos acimadescritos de mutações pontuais têm estabilidade/resistênciamelhorada à clivagem proteolítica pela Yap3p de levedura,permitindo produção aumentada de proteínas de fusão com al-bumina recombinantes expressadas em células hospedeiras delevedura.

De preferência, a proteína de fusão com albuminaque pode ser usada nos métodos da invenção compreende HA co-mo a porção N-terminal e polipeptídeo de neutrocina-alfa co-mo a porção C-terminal. Senão, uma proteína de fusão com al-bumina compreendendo HA como a porção C-terminal e polipep-tideo de neutrocina-alfa como a porção N-terminal também po-de ser usada.

Em outras modalidades, a proteína de fusão com al-bumina que pode ser usada nos métodos da invenção tem um po-lipeptídeo de neutrocina-alfa fusionado fusionado tanto naextremidade N-terminal como na C-terminal de albumina. Emuma modalidade específica, os polipeptídeos de neutrocina-alfa fusionados nas extremidades N- e C-terminais são osmesmos. Em outra modalidade, os polipeptídeos de neutrocina-alfa fusionados nas extremidades N- e C-terminais são poli-peptídeos de neutrocina-alfa diferentes. Em outra modalida-de, um polipeptídeo de neutrocina-alfa é fusionado fusionadotanto na extremidade N-terminal como na C-terminal de albu-mina e um polipeptídeo heterólogo é fusionado na extremidaderemanescente.

Adicionalmente, as proteínas de fusão com albuminaque podem ser usadas nos métodos da invenção podem incluirum peptídeo de ligação entre as porções fusionadas para pro-ver maior separação física entre as unidades. O peptídeo deligação pode consistir em aminoácidos tal que ele seja fle-xível ou mais rígido.

Geralmente, as proteínas de fusão com albumina quepodem ser usadas nos métodos da invenção podem ter uma regi-ão derivada de HA e uma região de neutrocina-alfa. Múltiplasregiões de cada proteína, entretanto, podem ser usadas parafazer uma proteína de fusão com albumina que pode ser usadanos métodos da invenção. De modo similar, mais de uma prote-ína podem ser usadas para fazer uma proteína de fusão comalbumina que pode ser usada nos métodos da invenção. Por e-xemplo, uma proteína pode ser fusionada tanto à extremidadeN- como a C-terminal da HA. Em tal configuração, as porçõesprotêicas podem ser as mesmas ou diferentes moléculas deproteína. A estrutura de proteínas de fusão com albumina bi-funcionais pode ser representada como: X-HA-Y ou Y-HA-X.

Em uma modalidade específica, a proteína neutroci-na-alfa ou fragmento ou variante desta que pode ser usadanos métodos da invenção pode ser conjugada a uma citotoxina(p. ex., um agente citostático ou citocida) . Uma citotoxinaou- agente citotóxico inclui qualquer agente que seja preju-dicial às células. Exemplos incluem paclitaxol, citocalasinaB, gramicidina D, brometo de etídeo, emetina, mitomicina,etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchici-na, doxorrubicina, daunorrubicina, diidróxi antracino diona,mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína,lidocaína, propranolol e puromicina e seus análogos ou homó-logos.

Em outra modalidade, uma proteína ou fragmento ouvariante de neutrocina-alfa que pode ser usada nos métodosda invenção pode ser conjugada a uma toxina.

Por "toxina" entende-se um ou mais compostos quese ligam e ativam sistemas efetores citotóxicos endógenos,radioisótopos, holotoxinas, toxinas modificadas, subunidadescataliticas de toxinas, ou quaisquer moléculas ou enzimasnão presentes normalmente na superfície de uma célula quesob condições definidas causam a morte da célula. Toxinasque podem ser usadas incluem, mas não estão limitadas a, ra-dioisótopos conhecidos na técnica, compostos tal como, porexemplo, anticorpos (ou fixação de complemento contendo por-ções destes) que se ligam a um sistema efetor citotóxico en-dógeno induzido ou inerente, timidina quinase, endonuclease, RNAse, alfa toxina, ricina, abrina, exotoxina A de Pseudomo-nas, toxina diftérica, saporina, momordina, gelonina, prote-ína anti-viral de caruru-de-cacho, alfa-sarcina e toxina docólera. "Toxina" também inclui um agente citostático ou ci-tocida, um agente terapêutico ou um íon metálico radioativo,p. ex., alfa-emitidores tal como, por exemplo, 213Bi, ou ou-tros radioisótopos tal como, por exemplo, 103Pd, 133Xe, 131If68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 35S, 90Y, 153Sm, 153Gd, 169Yb, 51Cr,54Mn, 75Se, 113Sn, 90Itrio, 117Estanho, 186Rênio, 166Holmio e188Renio.

Em um exemplo adicional, polipeptídeos de APRILque podem ser usados nos métodos da corrente invenção podemser fusionados com o domínio constante de imunoglobulinas(IgA, IgE, IgG, IgM), ou porções destes (CHI, CH2, CH3, ouqualquer combinação destes e porções destes), ou albumina(incluindo, mas não limitando a albumina humana recombinanteou fragmentos ou variantes desta (veja, p. ex., Patente USNo. 5.876.969, divulgada em 2 de março de 1999, Patente EP O413 622 e Patente US No. 5.766.883, divulgada em 16 de junhode 1998, incorporadas aqui como referência em suas totalida-des), resultando em polipeptideos quiméricos.

Tais proteínas de fusão podem facilitar a purifi-cação, podem estender a vida de prateleira e podem -aumentara meia-vida in vivo. Isto foi demonstrado para proteínasquiméricas consistindo nos primeiros dois domínios do poli-peptídeo-CD4 humano e vários domínios das regiões constantesdas cadeias pesada ou leve de imunoglobulinas de mamíferos.Veja, p. ex., EP 394.827; Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (1988). Distribuição melhorada de um antígeno atravésda barreira epitelial do sistema imune foi demonstrada paraantígenos (p. ex. , insulina) conjugados a um par de ligaçãode FcRn tal como fragmentos Fc ou IgG (veja, p. ex., Publi-cações PCT WO 96/22024 e WO 99/04813). Proteínas de fusão deIgG que têm uma estrutura dimérica ligada por dissulfeto de-vido às ligações dissulfeto de porção de IgG também foramdemonstradas como sendo mais eficientes na ligação a e neu-tralização de outras moléculas que polipeptideos monoméricosou fragmentos destes sozinhos. Veja, p. ex., Fountoulakis etal., J Biochem 270: 3958-3964 (1995).

Uma proteína de fusão com albumína que pode serusada nos métodos da presente invenção compreende pelo menosum fragmento ou variante de um polipeptídeo de APRIL e pelomenos um fragmento ou variante de albumina sérica humana,que estão associados um com o outro, de preferência por fu-são genética (isto é, a proteína de fusão com albumina é ge-rada por tradução de um ácido nuclêico em que um polinucleo-tídeo que codifica toda a APRIL ou uma porção é unido namesma fase de leitura com um polinucleotideo que codificatoda a albumina ou uma porção) ou conjugação química um aooutro. 0 polipeptídeo de APRIL e a proteína albumina, umavez parte da proteína de fusão com albumina, podem ser refe-ridos como uma "porção" ou "unidade" da proteína de fusãocom albumina (p. ex., uma "porção APRIL" ou uma "porção deproteína albumina").

Em uma modalidade, uma proteína de fusão com albu-mina que pode ser usada nos métodos da invenção compreende,ou senão consiste em, um polipeptídeo de APRIL e uma proteí-na albumina sérica. Em outras modalidades, uma proteína defusão com albumina que pode ser usada nos métodos da inven-ção compreende, ou senão consiste em, um fragmento de APRILe uma proteína albumina sérica. Em outras modalidades, uma proteína de fusão com albumina que pode ser usada nos méto-dos da invenção compreende, ou senão consiste em, uma vari-ante de APRIL e uma proteína albumina sérica. Em modalidadespreferidas, o componente de proteína albumina sérica da pro-teína de fusão com albumina é a porção madura da albuminasérica.

Em modalidades adicionais, uma proteína de fusãocom albumina que pode ser usada nos métodos da invenção com-preende, ou senão consiste em, um polipeptídeo de APRIL e umfragmento de albumina sérica biologicamente ativo e/ou tera-peuticamente ativo. Em modalidades adicionais, uma proteínade fusão com albumina que pode ser usada nos métodos da in-venção compreende, ou senão consiste em, um polipeptídeo deAPRIL e uma variante de albumina sérica biologicamente ativoe/ou terapeuticamente ativa. Em modalidades preferidas, aporção de APRIL da proteína de fusão com albumina é o poli-peptideo de APRIL completo. Em uma modalidade preferida adi-cional, a porção de APRIL da proteína de fusão com albuminaé o domínio maduro, solúvel do polipeptídeo de APRIL.

Em modalidades adicionais, uma proteína de fusãocom albumina que pode ser usada nos métodos da invenção com-preende, ou senão consiste em, um fragmento ou variante deAPRIL e um fragmento ou variante biologicamente ativo e/outerapeuticamente ativo de albumina sérica. Em modalidadespreferidas, a invenção provê uma proteína de fusão com albu-mina que compreende, ou senão consiste na porção madura dopolipeptídeo de APRIL e na porção madura da albumina sérica.

Em modalidades adicionais, uma proteína de fusãocom albumina que pode ser usada nos métodos da invenção com-preende, ou senão consiste em, um fragmento ou variante deAPRIL e um fragmento ou variante biologicamente ativo e/outerapeuticamente ativo de albumina sérica. Em modalidadespreferidas, a invenção provê uma proteína de fusão com albu-mina que compreende, ou senão consiste na porção madura dopolipeptídeo de APRIL e na porção madura da albumina sérica(incluindo, mas não limitando à albumina sérica humana re-combinante ou fragmentos ou variantes desta (veja, p. ex.,Patente US No. 5.876.969, divulgada em 2 de março de 1999,Patente EP O 413 622 e Patente US No. 5.766.883, divulgadaem 16 de junho de 1998, incorporadas aqui como referência emsuas totalidades)). Em uma modalidade preferida, polipeptí-deos de APRIL (incluindo fragmentos ou variantes destes) sãofusionados à forma madura de albumina sérica humana (isto é,aminoácidos 1-585 de albumina sérica humana como mostradonas Figuras 1 e 2 de Patente EP 0 322 094) que são incorpo-rados aqui como referência em sua totalidade. Em outra moda- lidade preferida, anticorpos da presente invenção (incluindofragmentos ou variantes destes) são fusionados a fragmentospolipeptidicos que compreendem, ou senão consiste em, resí-duos de aminoácidos 1-x de albumina sérica humana, onde χ éum número inteiro de 1 até 585 e o fragmento de albumina tem atividade de albumina sérica humana. Em outra modalidadepreferida, polipeptídeos de APRIL (incluindo fragmentos ouvariantes destes) são fusionados a fragmentos polipeptidicosque compreendem, ou senão consiste em, resíduos de aminoáci-dos 1-z de albumina sérica humana, onde ζ é um número intei- ro de 369 até 419, como descrito na Patente US 5.766.883 in-corporada aqui como referência em sua totalidade. Polipeptí-deos de APRIL (incluindo fragmentos ou variantes destes) po-dem ser fusionados ou à extremidade N- ou à C-terminal daproteína heteróloga (p. ex., polipeptídeo de Fc de imunoglo- bulina ou polipeptídeo de albumina sérica humana).

Em modalidades preferidas, a proteína de albuminasérica humana usada nas proteínas de fusão com albumina quepode ser usada nos métodos da invenção contém um ou ambosdos seguintes grupos de mutações pontuais com referência à SEQ ID NO: 11: Leu407 para Ala, Leu408 para Vai, Val409 paraAla e Arg410 para Ala; ou Arg410 para A, Lys413 para Gln eLys414 para Gln (veja, p. ex., Publicação Internacional No.W095/23857, incorporada por meio deste em sua totalidade co-mo referência aqui). Em modalidades ainda mais preferidas,proteínas de fusão com albumina que podem ser usadas nos mé-todos da invenção que contêm um ou ambos dos grupos acimadescritos de mutações pontuais têm estabilidade/resistênciamelhorada à clivagem proteolitica pela Yap3p de levedura,permitindo produção aumentada de proteínas de fusão com al-bumina recombinantes expressadas em células hospedeiras delevedura.

De preferência, a proteína de fusão com albumina que pode ser usada nos métodos da invenção compreende HA co-mo a porção N-terminal e polipeptídeo de APRIL como a porçãoC-terminal. Senão, uma proteína de fusão com albumina com-preendendo HA como a porção C-terminal e polipeptídeo deAPRIL como a porção N-terminal também pode ser usada.

Em outras modalidades, a proteína de fusão com al-bumina que pode ser usada nos métodos da invenção tem um po-lipeptídeo de APRIL fusionado tanto na extremidade N-terminal como na C-terminal de albumina. Em uma modalidadeespecífica, os polipeptídeos de APRIL fusionados nas extre-midades N- e C-terminais são os mesmos. Em outra modalidade,os polipeptídeos de APRIL fusionados nas extremidades N- eC-terminais são polipeptídeos de APRIL diferentes. Em outramodalidade, um polipeptídeo de APRIL é fusionado fusionadotanto na extremidade N-terminal como na C-terminal de albu- mina e um polipeptídeo heterólogo é fusionado na extremidaderemanescente.

Adicionalmente, as proteínas de fusão com albuminaque podem ser usadas nos métodos da invenção podem incluirum peptídeo de ligação entre as porções fusionadas para pro-ver maior separação física entre as unidades. 0 peptídeo deligação pode consistir em aminoácidos tal que ele seja fle-xível ou mais rígido.

Geralmente, as proteínas de fusão com albumina quepodem ser usadas nos métodos da invenção podem ter uma regi-ão derivada de HA e uma região de APRIL. Múltiplas regiõesde cada proteína, entretanto, podem ser usadas para fazeruma proteína de fusão com albumina que pode ser usada nosmétodos da invenção. De modo similar, mais de uma proteínapodem ser usadas para fazer uma proteína de fusão com albu-mina que pode ser usada nos métodos da invenção. Por exem-plo, uma proteína pode ser fusionada tanto à extremidade N-como a C-terminal da HA. Em tal configuração, as porçõesprotêicas podem ser as mesmas ou diferentes moléculas deproteína. A estrutura de proteínas de fusão com albumina bi-funcionais pode ser representada como: X-HA-Y ou Y-HA-X.

Em uma modalidade específica, uma proteína APRILou fragmento ou variante desta que pode ser usada nos méto-dos da invenção pode ser conjugada a uma citotoxina (p. ex.,um agente citostático ou citocida). Uma citotoxina ou agentecitotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial àscélulas. Exemplos incluem paclitaxol, citocalasina B, grami-cidina D, brometo de etídeo, emetina, mitomicina, etoposí-deo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, do-xorrubicina, daunorrubicina, diidróxi antracino diona, mito-xantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína,lidocaina, propranolol e puromicina e seus análogos ou homó-logos.

Em outra modalidade, uma proteína ou fragmento ouvariante de APRIL que pode ser usada nos métodos da invençãopode ser conjugada a uma toxina.

Por "toxina" entende-se um ou mais compostos quese ligam e ativam sistemas efetores citotóxicos endógenos,radioisótopos, holotoxinas, toxinas modificadas, subunidadescatalíticas de toxinas, ou quaisquer moléculas ou enzimasnão presentes normalmente na superfície de uma célula quesob condições definidas causam a morte da célula. Toxinasque podem ser usadas incluem, mas não estão limitadas a, ra-dioisótopos conhecidos na técnica, compostos tal como, porexemplo, anticorpos (ou fixação de complemento contendo por-ções destes) que se ligam a um sistema efetor citotóxico en-dógeno induzido ou inerente, timidina quinase, endonuclease,RNAse, alfa toxina, ricina, abrina, exotoxina A de Pseudomo-nas, toxina diftérica, saporina, momordina, gelonina, prote-ína anti-viral de caruru-de-cacho, alfa-sarcina e toxina docólera. "Toxina" também inclui um agente citostático ou ci-tocida, um agente terapêutico ou um íon metálico radioativo,p. ex., alfa-emitidores tal como, por exemplo, Bi, ou ou-tros radioisótopos tal como, por exemplo, 103Pd, 133Xe, 131I,68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 35S, 90Y, 153Sm, 153Gd, 169Yb, 51Cr,54Mn, 75Se, 113Sn, 90Itrio, 117Estanho, 186Rênio, 166Holmio e188Rênio.

Engenharia de proteínas pode ser empregada paraalterar as características de polipeptídeos de neutrocina-alfa e APRIL para gerar polipeptídeos que podem ser usadosnos métodos da invenção. Tecnologia de DNA recombinante co-nhecida por aqueles versados na técnica pode ser usada paracriar novas proteínas mutantes ou "muteínas" incluindo subs-tituições, deleções, adições de aminoácidos único ou múlti-plos ou proteínas de fusão. Tais polipeptídeos modificadospodem mostrar, p. ex., atividade melhorada, atividade dimi-nuída ou estabilidade aumentada. Além disso, eles podem serpurificados em maiores rendimentos e mostrar melhor solubi-lidade que o polipeptídeo natural correspondente, pelo menossob condições de purificação e estocagem. Por exemplo, paramuitas proteínas, incluindo o domínio extracelular ou a(s)forma(s) madura(s) de uma proteína secretada, é conhecido natécnica que um ou mais aminoácidos podem ser deletados daextremidade N-terminal ou C-terminal sem perda considerávelde função biológica. Por exemplo, Ron, et al.r J Biol Chem268: 2984-2988 (1993) relatou proteínas KGF modificadas quetêm atividade de ligação a heparina mesmo se os resíduos deaminoácidos amino-terminais 3, 8, ou 27 fossem perdidos.

Os polipeptídeos de neutrocina-alfa e APRIL quepodem ser usados nos métodos da presente invenção podem sermonômeros ou multímeros (isto é, dímeros, trímeros, tetrâme-ros e multímeros maiores). Em modalidades específicas, ospolipeptídeos de neutrocina-alfa e APRIL que podem ser usa-dos nos métodos da invenção podem ser homômeros ou heterôme-ros. Um homômero de neutrocina-alfa, refere-se a um multíme-ro contendo apenas polipeptídeos de neutrocina-alfa (inclu-indo fragmentos, variantes e proteínas de fusão de neutroci-na-alfa, como descrito aqui). Esses homômeros podem conterpolipeptídeos de neutrocina-alfa que têm seqüências de ami-noácidos idênticas ou diferentes. Em modalidades especifi-cas, os polipeptídeos de neutrocina-alfa que podem ser usa-dos nos métodos da presente invenção são homodímeros de neu-trocina-alfa (p. ex., contendo dois polipeptídeos de neutro-cina-alfa que têm seqüências de aminoácidos idênticas ou di-ferentes) ou são homotrímeros de neutrocina-alfa (p. ex.,contendo três polipeptídeos de neutrocina-alfa que têm se-qüências de aminoácidos idênticas ou diferentes). Em uma mo-dalidade preferida, os polipeptídeos de neutrocina-alfa quepodem ser usados nos métodos da presente invenção são homo-trímeros de neutrocina-alfa. Em modalidades adicionais, opolipeptídeo de neutrocina-alfa que pode ser usado nos méto-dos da invenção é pelo menos um homodímero, pelo menos umhomotrímero, ou pelo menos um homotetrâmero. Um homômero deAPRIL, refere-se a um multímero contendo apenas polipeptí-deos de APRIL (incluindo fragmentos, variantes e proteínasde fusão de APRIL, como descrito aqui). Esses homômeros po-dem conter polipeptídeos de APRIL que têm seqüências de ami-noácidos idênticas ou diferentes. Em modalidades específi-cas, os polipeptídeos de APRIL que podem ser usados nos mé-todos da presente invenção são homodímeros de APRIL (p. ex.,contendo dois polipeptídeos de APRIL que têm seqüências deaminoácidos idênticas ou diferentes) ou são homotrímeros deAPRIL (p. ex., contendo três polipeptídeos de APRIL que têmseqüências de aminoácidos idênticas ou diferentes).Em umamodalidade preferida, os polipeptídeos de APRIL que podemser usados nos métodos da invenção são homotrimeros deAPRIL. Em modalidades adicionais, o polipeptideo de APRILque pode ser usado nos métodos da invenção é pelo menos umhomodímero, pelo menos um homotrímero, ou pelo menos um ho-motetrâmero.

Neutrocina-alfa heteromérica se refere a um multí-mero contendo polipeptideos heterólogos (isto é, polipeptí-deos de uma proteína diferente) além de polipeptideos deneutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, o polipeptí-deo de neutrocina-alfa que pode ser usado nos métodos da in-venção é um heterodímero, um heterotrímero, ou um heterote-trâmero. Em modalidades adicionais, o polipeptideo de neu-trocina-alfa que pode ser usado nos métodos da invenção é ummultímero que é pelo menos um heterodímero, pelo menos umheterotrímero, ou pelo menos um heterotetrâmero. APRIL hete-romérica refere-se a um multímero contendo polipeptideos he-terólogos (isto é, polipeptideos de uma proteína diferente)além de polipeptideos de APRIL. Em uma modalidade específi-ca, o polipeptideo de APRIL que pode ser usado nos métodosda invenção é um heterodímero, um heterotrímero, ou um hete-rotetrâmero. Em modalidades adicionais, o polipeptideo deAPRIL que pode ser usado nos métodos da invenção é um multí-mero que é pelo menos um heterodímero, pelo menos um hetero-trímero, ou pelo menos um heterotetrâmero. Em modalidadesadicionais, o polipeptideo de neutrocina-alfa que pode serusado nos métodos da invenção é um heterotrímero compreen-dendo tanto polipeptideos de neutrocina-alfa como polipepti-deos de APRIL ou seus fragmentos ou variantes. Em modalida-des adicionais, o polipeptideo de neutrocina-alfa que podeser usado nos métodos da invenção é um heterotrimero compre-endendo um polipeptideo de neutrocina-alfa (incluindo frag-mentos ou variantes) e dois polipeptideos de APRIL (incluin-do fragmentos ou variantes). Em modalidades adicionais, opolipeptideo de neutrocina-alfa que pode ser usado nos méto-dos da invenção é um heterotrimero compreendendo dois poli-peptideos de neutrocina-alfa (incluindo fragmentos ou vari-antes) e um polipeptideo' de APRIL (incluindo fragmentos ou variantes).

Em modalidades adicionais, os polipeptideos deneutrocina-alfa que podem ser usados nos métodos da invençãosão homoméricos, especialmente homotriméricos, polipeptideosde neutrocina-alfa, em que os componentes de proteína indi- vidual dos multímeros compreendem, ou senão, consistem naforma madura de neutrocina-alfa (p. ex., resíduos de aminoá-cidos 134-285 de SEQ ID NO: 2) ou seus fragmentos ou varian-tes. Em outras modalidades específicas, os polipeptideos deneutrocina-alfa que podem ser usados nos métodos da invençãosão heteroméricos, especialmente heterotriméricos, polipep-tideos de neutrocina-alfa tal como um heterotrimero contendodois polipeptideos de neutrocina-alfa e um polipeptideo deAPRIL ou um heterotrimero contendo um polipeptideo de neu-trocina-alfa e dois polipeptideos de APRIL e em que os com-ponentes de proteína individual do heterômero de neutrocina-alfa compreendem, ou senão, consistem na porção solúvel ex-tracelular madura de neutrocina-alfa (p. ex., resíduos deaminoácidos 134-285 de SEQ ID NO: 2) ou seus fragmentos ouvariantes, ou na porção solúvel extracelular madura de APRIL(p. ex., resíduos de aminoácidos 105-250 de SEQ ID NO: 4) ouseus fragmentos ou variantes.

Em modalidades adicionais, os polipeptídeos deAPRIL que podem ser usados nos métodos da invenção são homo-méricos, especialmente homotriméricos, polipeptídeos deAPRIL, em que os componentes de proteína individual dos mul-tímeros compreendem, ou senão, consistem na forma madura deAPRIL (p. ex., resíduos de aminoácidos 105-250 de SEQ ID NO:4) ou seus fragmentos ou variantes. Em outras modalidadesespecíficas, os polipeptídeos de APRIL que podem ser usadosnos métodos da invenção são heteroméricos, especialmente he-terotriméricos, polipeptídeos de APRIL tal como üm hetero-trímero contendo dois polipeptídeos de APRIL e um polipeptí-deo de neutrocina-alfa ou um heterotrímero contendo um poli-peptídeo de APRIL e dois polipeptídeos de neutrocina-alfa eem que os componentes de proteína individual do heterômerode APRIL compreendem, ou senão, consistem na porção solúvelextracelular madura de APRIL (p. ex., resíduos de aminoáci-dos 105-250 de SEQ ID NO: 4) ou seus fragmentos ou varian-tes, ou na porção solúvel extracelular madura de neutrocina-alfa (p. ex., resíduos de aminoácidos 134-285 de SEQ ID NO:2) ou seus fragmentos ou variantes.

Multímeros que podem ser usados nos métodos da in-venção podem ser o resultado de associações hidrofóbicas,hidrofílicas, iônicas e/ou covalentes e/ou podem ser ligadasindiretamente por por exemplo, formação de lipossomo. Assim,em uma modalidade, multímeros, tal como, por exemplo, homo-dímeros ou homotrimeros são formados quando os polipeptideosentram em contato uns com os outros em solução. Em outra mo-dalidade, heteromultímeros, tal como, por exemplo, hetero-trímeros ou heterotetrâmeros, são formados quando os poli-peptídeos entram em contato uns com os outros em solução. Emoutras modalidades, multimeros são formados por associaçõescovalentes com e/ou entre os polipeptideos de neutrocina-alfa. Em outras modalidades, multimeros são formados por as-sociações covalentes com e/ou entre os polipeptideos deAPRIL. Tais associações covalentes podem envolver um ou maisresíduos de aminoácidos contidos na seqüência polipeptídica(p. ex., aquela relacionada na SEQ ID NO: 2 para neutrocina-alfa ou aquela relacionada na SEQ ID NO: 4 para APRIL) . Emum exemplo, as associações covalentes são reticulações entreresíduos de cisteína localizados nas seqüências polipeptídi-cas que interagem no polipeptídeo nativo (isto é, que ocor-rem naturalmente). Em outro exemplo, as associações covalen-tes podem envolver um ou mais resíduos de aminoácidos conti-dos na seqüência polipeptídica heteróloga em uma proteína defusão com neutrocina-alfa ou APRIL (veja, p. ex., Patente USNúmero 5.478.925). Em um exemplo específico, as associaçõescovalentes são entre a seqüência heteróloga contida em umaproteína de fusão neutrocina-alfa-Fc (como descrito aqui).Em um exemplo específico, as associações covalentes são en-tre a seqüência heteróloga contida em uma proteína de fusãoAPRIL-Fc (como descrito aqui). Em outro exemplo específico,associações covalentes nas proteínas de fusão que podem serusadas nos métodos da invenção são entre seqüência polipep-tidica heteróloga de outro membro receptor/ligante de famí-lia TNF que é capaz de formar multímeros covalentemente as-sociados, tal como, por exemplo, osteoprotegerina (veja, p.ex., Publicação Internacional No. WO 98/49305, os conteúdosda qual são incorporados aqui como referência em sua totali-dade). Em outra modalidade, dois ou mais polipeptídeos deneutrocina-alfa e/ou polipeptídeos de APRIL são unidos atra-vés de ligantes sintéticos (p. ex., Iigantes peptídicos, decarboidrato ou de polímero solúvel). Exemplos incluem aque-Ies ligantes peptídicos descritos em Pat. US No. 5.073.627(incorporada por meio deste como referência). Proteínas com-preendendo múltiplos polipeptídeos de neutrocina-alfa e/oupolipeptídeos de APRIL separados por ligantes peptídicos po-dem ser produzidas usando tecnologia do DNA recombinanteconvencional.

Em uma modalidade específica, um antagonista deneutrocina-alfa que pode ser usado nos métodos da invenção éuma forma dominante negativa de neutrocina-alfa e/ou APRIL.Em particular, variantes de neutrocina-alfa e/ou APRIL, in-cluindo formas dominantes negativas, foram descritas em, porexemplo, Publicações de Patentes Internacionais números WO06/034106, WO 05/113598, WO 04/089982, WO 04/081043 e WO03/057856 e Publicações de Patentes US números US20060014248, US 20050221443, US 20050130892, US 20050048626,US 2005003480 e US 20030166559. Cada uma das referências a-cima mencionadas é incorporada aqui como referência em suastotalidades. Tais variantes de neutrocina-alfa e/ou APRILpodem antagonizar a função de neutrocina-alfa, por exemplo,pela interferência com a homo- ou heteromultimerização deneutrocina-alfa e/ou APRIL. Senão, variantes polipeptidicasde neutrocina-alfa e/ou APRIL podem prevenir polipeptideosos compreendendo de se ligarem a e/ou sinalizar através dereceptores de neutrocina-alfa tal como TACI, BCMA e BAFF-R.

Em outra modalidade, o antagonista de neutrocina-alfa é o mutante de proteína de neutrocina-alfa descrito emGao et al., (2006) Biotechnol Lett 28: 1649-54, que é incor-porado aqui como referência em sua totalidade.

Em outra modalidade, o antagonista de neutrocina-alfa que pode ser usado nos métodos da invenção é Δ BAFF(SEQ ID NO: 12).

B. Anticorpos Anti-neutrocina-alfa

Em uma modalidade específica, o antagonista deneutrocina-alfa é um anticorpos anti-neutrocina-alfa oufragmento de ligação a antígeno deste. Anticorpos anti-neutrocina-alf a e fragmentos destes foram descritos em, porexemplo, Publicações PCT WO 01/087977, WO 03/016468, WO01/60397, WO 02/02641 e WO 03/55979; Publicação US Nos.2005/0070694 e 2005/0255532; e Cao et al., (2005) ImmunolLett 101: 87-94; Ch' en et al., (2005) Cell Immunol 236: 78-85; Liu et al., (2005) Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai)37: 415-420; Schneider et al., (1999) J Exp Med 189: 1747-1756; Sun et al., (2006) Hybridoma 25: 80-85; Sun et al.,(2006) Hybridoma 25: 238-242; e são descritos em maiores de-talhes abaixo. Cada uma das referências acima mencionadas éincorporada aqui como referência em suas totalidades.

0 termo "anticorpo", como aqui utilizado, se refe-re a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamenteativas de moléculas de imunoglobulinas, isto é, moléculasque contêm um sitio de ligação a antigeno que se liga imuno-especificamente a um antigeno. Como tal, o termo anticorpoabrange não apenas moléculas de anticorpos inteiros, mastambém fragmentos de anticorpo, assim como variantes (inclu-indo derivados) de anticorpos e fragmentos de anticorpos.Exemplos de moléculas que são descritas pelo termo "anticor-po" neste pedido incluem, mas não estão limitados a: Fvs decadeia única (scFvs), fragmentos Fab, fragmentos Fab',F(ab')2, Fvs ligadas por dissulfeto (sdFvs), Fvs e fragmen-tos compreendendo ou senão consistindo em, um domínio VL oum VH. O termo "Fv de cadeia única" ou "scFv" como aqui uti-lizado se refere a um polipeptídeo compreendendo um domínioVL de anticorpo ligado a um domínio VH de um anticorpo. An-ticorpos que se ligam imunoespecificamente a um antigenoparticular (p. ex., neutrocina-alfa) podem ter reatividadecruzada com outros antígenos. De preferência, anticorpos quese ligam imunoespecificamente a um antigeno particular nãoreagem.cruzadamente com outros antígenos. Anticorpos que seligam imunoespecificamente a um antigeno particular podemser identificados, por exemplo, por imunoensaios ou outrastécnicas conhecidas por aqueles versados na técnica, p. ex.,os imunoensaios descritos no Pedido de Patente US No.60/834.152, depositado em 31 de julho de 2006, que é pormeio deste incorporada como referência em sua totalidade.

Anticorpos que podem ser usados nos métodos dapresente invenção incluem, mas não estão limitados a, anti-corpos monoclonais, multiespecíficos, humanos ou quiméricos,anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentosF(ab'), anticorpos anti-idiotipicos (anti-Id) e fragmentosde ligação a epitopo de quaisquer dos acima. As moléculas deimunoglobulina da invenção podem ser de qualquer tipo (p.ex., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (p. ex., IgGi,IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2) ou subclasse de molécula deimunoglobulina.

Anticorpos que podem ser usados nos métodos dapresente invenção também podem incluir formas multiméricas.de anticorpos. Por exemplo, anticorpos que podem ser usadosnos métodos da presente invenção podem tomar a forma de dí-meros, trimeros ou multimeros de ordens maiores de anticorpode moléculas imunoglobulina monoméricas. Dimeros de molécu-las de imunoglobulinas completas ou fragmentos F(ab'>2 sãotetravalentes, enquanto dimeros de fragmentos Fab ou molécu-las scFv são bivalentes. Monômeros individuais dentro de ummultimero de anticorpo podem ser idênticos ou diferentes,isto é, eles podem ser multimeros de anticorpo heteroméricoou homomérico. Por exemplo, anticorpos individuais dentro deum multimero podem ter as mesmas ou diferentes especificida-des. A multimerização de anticorpos pode ser realizada atra-vés de agregação natural de anticorpos ou através de técni-cas de ligação química ou recombinante conhecidas na técni-ca. Por exemplo, alguma porcentagem de preparações de anti-corpo purificado (p. ex., moléculas de IgGl purificadas)formam espontaneamente agregados de proteína contendo homo-dímeros de anticorpo e outros multimeros de anticorpo demaiores ordens. Senão, homodimeros de anticorpo podem serformados através de técnicas de ligação química conhecidasna técnica. Por exemplo, agentes de reticulação heterobifun-cionais incluindo, mas não limitando a, SMCC [succinimidil4-(maleimidometil)cicloexano-l-carboxilato] e SATA [(N-succinimidil)S-acetiltio-acetato] (disponível, por exemplo,em Pierce Biotechnolog, Inc. (Rockford, IL)) podem ser usa-dos para formar multímeros de anticorpo. Um protocolo exem-plar para a formação de homodimeros de anticorpo é dado emGhetie et al., Proceedings of the National Academy of Scien-ces USA (1997) 94: 7509-7514, que é por meio deste incorpo-rada como referência em sua totalidade. Homodimeros de anti-corpo podem ser convertidos em homodimeros Fab12 através dedigestão com pepsina. Outro meio para formar homodimeros deanticorpo é através do uso do peptídeo T15 autofílico des-crito em Zhao e Kohler, The Journal of Immunology (2002) 25:396-404, que é por meio deste incorporada como referência emsua totalidade.

Senão, anticorpos podem ser feitos para multimeri-zar através de técnicas de DNA recombinante. IgM e IgA for-mam naturalmente multímeros de anticorpo através da intera-ção com o polipeptídeo de cadeia J. Moléculas não IgA ou nãoIgM, tal como moléculas de IgG, podem ser engenheiradas paraconter o domínio de interação de cadeia J de IgA ou IgM,conferindo desse modo a habilidade para formar multímeros demaiores ordens nas moléculas não IgA ou não IgM (veja, porexemplo, Chintalacharuvu et al., (2001) Clinicai Immunology101: 21-31 e Frigerio et al., (2000) Plant Physiology 123:1483-94, ambas as quais são incorporadas por meio deste comoreferência em suas totalidades). Dimeros ScFv também podemser formados através de técnicas recombinantes conhecidas natécnica; um exemplo da construção de dimeros scFv é dado emGoel et al., (2000) Câncer Research 60: 6964-6971 que é pormeio deste incorporada como referência em sua totalidade.Multimeros de anticorpo podem ser purificados usando qual-quer método adequado conhecido na técnica, incluindo, masnão limitando a, cromatografia de peneira molecular.

A menos que definido de outro modo na especifica-ção, ligação especifica ou ligação imunoespecifica por umanticorpo significa que o anticorpo se liga ao antigeno al-vo, mas não se liga significativamente a (isto é, reage cru-zadamente com) proteínas fora o antigeno alvo, tal como ou-tras proteínas da mesma família de proteínas (p. ex., outrosligantes da família TNF) . Um anticorpo que se liga a um an-tigeno alvo e não reage cruzadamente com outras proteínasnão é necessariamente um anticorpo que não se liga as cita-das outras proteínas em todas as condições; de preferência,o anticorpo específico ao antigeno alvo se liga preferenci-almente ao antigeno alvo comparado com sua habilidade parase ligar às citadas outras proteínas tal que ele seja ade-quado para uso em pelo menos um tipo de ensaio ou tratamen-to, isto é, dê baixos níveis de ruído ou não resulte em ne-nhum efeito adverso absurdo no tratamento. É bem conhecidoque a porção de uma proteína ligada por um anticorpo é co-nhecida como o epítopo. Um epítopo pode ou ser linear (istoé, compreendido de resíduos de aminoácidos seqüenciais emuma seqüência de proteína) ou conformacional (isto é, com-preendido por um ou mais resíduos de aminoácidos que não sãocontíguos na estrutura primária da proteína, mas que são u-nidas pela estrutura secundária, terciária ou quaternária deuma proteína). Dado que anticorpos específicos a antígenoalvo se ligam a epítopos do antígeno alvo, um anticorpo quese liga especificamente ao antígeno alvo pode ou não se li-gar a fragmentos do antígeno alvo e/ou variantes do antígenoalvo (p. ex., proteínas que possuem pelo menos 90% de iden-tidade com o antígeno alvo) dependendo da presença ou ausên-cia do epítopo ligado por um dado anticorpo específico a an-tígeno alvo no fragmento de antígeno alvo ou variante. I-gualmente, anticorpos específicos a antígeno alvo podem seligar a espécies ortólogas do antígeno alvo (incluindo frag-mentos deste) dependendo da presença ou ausência do epítoporeconhecido pelo anticorpo no ortólogo. Adicionalmente, an-ticorpos específicos a antígeno alvo podem se ligar a formasmodificadas do antígeno alvo, por exemplo, proteínas de fu-são com antígeno alvo. Em tal caso, quando anticorpos se Ii-gam a proteínas de fusão com antígeno alvo, o anticorpo devefazer contato de ligação com a unidade de antígeno alvo daproteína de fusão afim que a ligação seja específica.

Anticorpos que se ligam especificamente a qualquerantígeno alvo particular podem ser identificados/ por exem-plo, por imunoensaios ou outras técnicas conhecidas por a-queles versados na técnica, p. ex., os imunoensaios descri-tos no Pedido de Patente US No. 60/834.152, depositado em 31de julho de 2006, que é por meio deste incorporada como re-ferência em sua totalidade. Anticorpos que podem ser usadosnos métodos da presente invenção podem ser "específicos" pa-ra neutrocina-alfa, mas isto não é uma necessidade. Anticor-pos anti-neutrocina-alfa que podem ser usados nos métodos dainvenção podem ser descritos ou especificados em termos desua reatividade cruzada. Anticorpos que não se ligam a qual-quer outro análogo, ortólogo ou homólogo de um polipeptídeode neutrocina-alfa podem ser usados nos métodos da invenção.Em modalidades específicas, anticorpos que podem ser usadosnos métodos da invenção reagem cruzadamente com homólogosmurinos, de rato e/ou de coelho de proteínas humanas e seusepítopos correspondentes.

Em uma modalidade específica, anticorpos que seligam a um polipeptídeo de neutrocina-alfa, fragmento poli-peptídico, ou variante de SEQ ID NO: 2 e/ou um epítopo deneutrocina-alfa (como determinado por imunoensaios bem co-nhecidos na técnica para avaliar ligação antígeno-anticorpoespecífica) podem ser usados nos métodos da invenção. Em umamodalidade específica, anticorpos que podem ser usados nosmétodos da invenção podem se ligar a polipeptídeos de neu-trocina-alfa fusionados a outras seqüências . polipeptídicas.Por exemplo, polipeptídeos de neutrocina-alfa podem ser fu-sionados ao domínio constante de imunoglobulinas (IgA, IgE,IgG, IgM), ou porções deste (CHI, CH2, CH3, ou qualquer com-binação destes e porções destes), ou albumina (incluindo,mas não limitando a albumina humana recombinante ou fragmen-tos ou variantes desta (veja, p. ex., Patente US No.5.876.969, divulgada em 2 de março de 1999, Patente EP 0 413622 e Patente US No. 5.766.883, divulgada em 16 de junho de1998, incorporadas aqui como referência em suas totalida-des), resultando em polipeptídeos quiméricos. Tais proteínasde fusão podem facilitar a purificação, podem estender a vi-da de prateleira e podem aumentar a meia-vida in vivo. Istofoi demonstrado para proteínas quiméricas consistindo nosprimeiros dois domínios do polipeptídeo-CD4 humano e váriosdomínios das regiões constantes das cadeias pesada ou levede imunoglobulinas de mamíferos. Veja, p. ex., EP 394.827;Traunecker et al., Nature, 331: 84-86 (1988). Distribuiçãomelhorada de um antígeno através da barreira epitelial dosistema imune foi demonstrada para antígenos (p. ex., insu-lina) conjugados a um par de ligação de FcRn tal como frag-mentos Fc ou IgG (veja, p. ex., Publicações PCT WO 96/22024e WO 99/04813). Proteínas de fusão de IgG que têm uma estru-tura dimérica ligada por dissulfeto devido às ligações dis-sulfeto de porção de IgG também foram demonstradas como sen-do mais eficientes na ligação a e neutralização de outrasmoléculas que polipeptídeos monoméricos ou fragmentos destessozinhos. Veja, p. ex., Fountoulakis et al., J Biochem 270:3958-3964 (1995).

Em outra modalidade, anticorpos podem ser usadosnos métodos da invenção se ligam a polipeptídeos de neutro-cina-alfa mutante que foram gerados por mutagênese aleatóriade um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de neutro-cina-alfa, por PCR propenso a erro, inserção nucleotídicaaleatória ou outros métodos antes da recombinação. Em outramodalidade, anticorpos que podem ser usados nos métodos dainvenção se ligam a um ou mais componentes, motivos, seções,partes, domínios, fragmentos, etc., de neutrocina-alfa re-combinados com um ou mais componentes, motivos, seções, par-tes, domínios, fragmentos, etc. De uma ou mais moléculas he-terólogas. Em modalidades preferidas, as moléculas heterólo-gas são, por exemplo, TNF-alfa, Iinfotoxina-alfa (LT-alfa,também conhecida como TNF-beta), LT-beta (encontrada no he-terotrímero complexo LT-alfa2-beta), OPLG, FasL, CD27L,CD30L, CD40L, 4-1BBL, FcR3, OX40L, TNF-gama (Publicação In-ternacional No. WO 96/14328), ΔΙΜ-Ι (Publicação Internacio-nal No. WO 97/33899), AIM-II (Publicação Internacional No.WO 97/34911), APRIL (J Exp Med 188(6): 1185-1190), endocina-alfa (Publicação Internacional No. WO 98/07880), OPG, 0X40 efator de crescimento de nervo (NGF) e formas solúveis defaz, CD30, CD27, CD40 e 4 IBB, TR2 (Publicação InternacionalNo. WO 96/34095), DR3 (Publicação Internacional No. WO97/33904), DR4 (Publicação Internacional No. WO 98/32856),TR5 (Publicação Internacional No. WO 98/30693), TR6 (Publi-cação Internacional No. WO 98/30694), TR7 (Publicação Inter-nacional No. WO 98/41629), TRANK, TR9 (Publicação Interna-cional No. WO 98/56892), TRIO (Publicação Internacional No.WO 98/54202), 312C2 (Publicação Internacional No. WO98/06842), TR12, CAD e v-FLIP. Em modalidades adicionais, asmoléculas heterólogas são qualquer membro da família TNF.

Em modalidades específicas, anticorpos que podemser usados nos métodos da invenção se ligam a polipeptídeosde neutrocina-alfa homoméricos, especialmente homotriméri-cos. Em outras modalidades específicas, anticorpos que podem-

ser usados nos métodos da invenção se ligam a polipeptideosde neutrocina-alfa heteroméricos, especialmente heterotrimé-ricos tal como um heterotrimero contendo dois polipeptideosde neutrocina-alfa e um polipeptideo de APRIL ou um hetero-trimero contendo um polipeptideo de neutrocina-alfa e doispolipeptideos de APRIL. Em uma modalidade especifica, os an-ticorpos que podem ser usados nos métodos da invenção se li-gam a polipeptideos de neutrocina-alfa homoméricos, especi-almente homotriméricos, em que os componentes de proteínaindividual dos multímeros consistem na forma madura de neu-trocina-alfa (p. ex., resíduos de aminoácidos 134-285 de SEQID NO: 2). Em outras modalidades específicas, os anticorposque podem ser usados nos métodos da invenção se ligam a po-lipeptideos de neutrocina-alfa heteroméricos, especialmenteheterotriméricos, tal como um heterotrimero contendo doispolipeptideos de neutrocina-alfa e um polipeptideo de APRILou um heterotrimero contendo um polipeptideo de neutrocina-alfa e dois polipeptideos de APRIL e em que os componentesde proteína individual do heterômero de neutrocina-alfa con-sistem na porção solúvel extracelular madura de neutrocina-alfa (p. ex., resíduos de aminoácidos 134-285 de SEQ ID NO:2) ou na porção solúvel extracelular madura de APRIL (p.ex., resíduos de aminoácidos 105-250 de SEQ ID NO: 4).

Em modalidades específicas, os anticorpos que po-dem ser usados nos métodos da invenção se ligam a epítoposconformacionais de uma proteína monomérica de neutrocina-alfa. Em modalidades específicas, os anticorpos que podemser usados nos métodos da invenção se ligam a epítopos con-formacionais de uma proteína multimérica, especialmente tri-mérica de neutrocina-alfa. Em outras modalidades, anticorposque podem ser usados nos métodos da invenção se ligam a epí-topos conformacionais que surgem da justaposição de neutro-cina-alfa com um polipeptideo heterólogo, tal como pode es-tar presente quando a neutrocina-alfa forma heterotrimeros(p. ex. , com polipeptideos de APRIL), ou em proteínas de fu-são entre neutrocina-alfa e um polipeptideo heterólogo.

Anticorpos que podem ser usados nos métodos da in-venção incluem, mas não estão limitados a, anticorpos poli-clonais, monoclonais, multiespecificos, humanos, humanizadosou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab,fragmentos F(ab'), fragmentos produzidos por uma bibliotecade expressão de Fab, anticorpos antiidiotípicos (anti-Id)(incluindo, p. ex., anticorpos anti-id contra anticorpos an-ti-neutrocina-alfa) e fragmentos de ligação a epítopo dequaisquer dos acima. Em modalidades preferidas, a imunoglo-bulina é de um isotipo IgGl ou IgG4. Imunoglobulinas podemter tanto uma cadeia pesada como uma leve. Um arranjo de ca-deias pesadas de IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY pode ser pa-reado com uma cadeia leve das formas capa ou lambda.

Em uma modalidade específica, os anticorpos quepodem ser usados nos métodos da invenção são fragmentos deanticorpo de ligação a neutrocina-alfa e incluem, mas nãoestão limitados a, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs de cadeiaúnica (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados pordissulfeto (sdFV) e fragmentos compreendendo ou um domínioVL ou VH. Fragmentos de anticorpo de ligação a neutrocina-alfa, incluindo anticorpos de cadeia única, podem compreen-der a(s) região(ões) variável(is) sozinha(s) ou em combina-ção com a totalidade ou uma porção dos seguintes: região dedobra, domínios CHI, CH2 e CH3. Em uma modalidade específi-ca, fragmentos de ligação a neutrocina-alfa que podem serusados nos métodos da invenção compreendem qualquer combina-ção de região(ões) variável(is) com uma região de dobra, do-mínios CHI, CH2 e CH3. Os anticorpos que podem ser usadosnos métodos da invenção podem ser de qualquer origem animalincluindo pássaros e mamíferos. De preferência, os anticor-pos são humanos, murinos (p. ex., camundongo e rato), deburro, coelho ship, bode, porquinho-da-índia, camelo, cavaloou galinha. Conforme aqui utilizado, anticorpos "humano" in-cluem anticorpos que têm a seqüência de aminoácidos de umaimunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bi-bliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgêni-cos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não ex-pressam imunoglobulinas endógenas, como descrito, por exem-plo, na Patente US No. 5.939.598 por Kucherlapati et al. , osconteúdos da qual são incorporados aqui como referência emsuas totalidades.

Os anticorpos que podem ser usados nos métodos dainvenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos, triespe-cíficos ou de maior multiespecificidade. Anticorpos multies-pecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos deum polipeptídeo de neutrocina-alfa ou podem ser específicosigualmente para um polipeptídeo de neutrocina-alfa assim co-mo para um epítopo heterólogo, tal como um polipeptídeo he-terólogo ou material de suporte sólido. Veja, p. ex., Publi-cações PCT WO 93/17715 WO 92/08802; WO 91/00360; WO92/05793; Tutt et al.r J Immunol 147: 60-69 (1991); PatentesUS Nos. 4.474.893, 4.714.681, 4.925.648, 5.573.920,5.601.819; Kostelny et al., J Immunol 148: 1547-1553 (1992).

Anticorpos que podem ser usados nos métodos da in-venção podem ser descritos ou especificados em termos de su-as afinidades de ligação a um polipeptideo de neutrocina-alfa. Em modalidades especificas, anticorpos que podem serusados nos métodos da invenção se ligam a polipeptideos deneutrocina-alfa, ou fragmentos ou variantes destes, com umaconstante de dissociação ou K0 de menos de ou igual a 5 X 10"9 Μ, IO"9 M, 5 X IO"10 Μ, IO"10 M, 5 X IO"11 Μ, IO"11 M, 5 X IO"12M, ou IO"12 M. Em uma modalidade especifica, anticorpos quepodem ser usados nos métodos da invenção se ligam a polipep-tideos de neutrocina-alfa com uma constante de dissociaçãoou Kd que está em qualquer uma das faixas que estão entrecada um dos valores individuais relacionados.

Anticorpos de neutrocina-alfa que perturbam as in-terações receptor/ligante com polipeptideos de neutrocina-alfa parcialmente ou completamente podem ser usados nos mé-todos da invenção. Também são incluídos anticorpos específi-cos a neutrocina-alfa que não previnem ligação de ligante,mas previnem ativação de receptor. Ativação de receptor (is-to é, sinalização) pode ser determinada por técnicas descri-tas aqui ou de outro modo conhecidas na técnica. Por exem-plo, ativação de receptor pode ser determinada pela detecçãode ativação dos fatores de transcrição NF-AT, AP-1,ΜΑΡΚ8/JNK e/ou NF-capaB (incluindo a via de sinalização deNF-capaB não canônica) usando técnicas conhecidas na técni-ca, e/ou a fosforilação (p. ex., tirosina ou seri-na/treonina) do receptor ou seu substrato por i-munoprecipi-tação seguida de análise por western blot.

Os anticorpos de neutrocina-alfa acima podem serfeitos usando métodos conhecidos na técnica. Veja, p. ex.,Publicação PCT WO 96/40281; Patente US No. 5.811.097; Denget al., Blood 92(6): 1981-1988 (1998); Chen et al., CâncerRes 58(16): 3668-3678 (1998); Harrop et al., J Immunol161(4): 1786-1794 (1998); Zhu et al., Câncer Res 58(15):3209-3214 (1998); Yoon et al., J Immunol 160(7): 3170-3179(1998); Prat et al., J Cell Sci 111 (Pt2): 237-247 (1998);Pitard et al., J Immunol Methods 205(2): 177-190 (1997); Li-autard et al., Cytokine 9(4): 233-241 (1997); Carlson etal., J Biol Chem 272(17):11295-11301 (1997); Taryman et al.,Neuron 14(4): 755-762 (1995); Muller et al., Structure 6(9):1153-1167 (1998); Bartunek et al., Cytokine 8(1): 14-20(1996) (que são todas incorporadas como referência aqui emsuas totalidades).

Em uma modalidade especifica, anticorpos de neu-trocina-alf a (incluindo moléculas compreendendo, ou senãoconsistindo em, fragmentos de anticorpo ou variantes destes)que podem ser usados nos métodos da invenção se ligam espe-cificamente a neutrocina-alfa ou um fragmento ou variante deneutrocina-alfa. Em particular, anticorpos tal como, por e-xemplo, Fvs de cadeia única (scFvs) que têm uma seqüência deaminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS: 13-18, como re-ferido na Tabela 1 podem ser usados nos métodos da invenção.

Tabela:1 scFvs que se ligam imunoespecificamente aneutrocina-alfa

ID de clone SEQ ID NO AAs de VL AAs de AAs de AAs de AAs de AAs de AAs de AAs dede scFv CDRl De CDR2 De CDR3 De VH CDRl CDR2 CDR3 de

VL VL VL de VH de VH VH

13 141-249 163-173 189-195 228-238 1-123 26-35 50-66 99-112

14 143-251 166-177 193-199 232-240 1-125 26-35 50-66 99-114

15 142-250 164-174 190-196 229-239 1-124 26-35 50-66 99-113

16 143-251 166-177 193-199 232-240 1-125 26-35 50-66 99-114

17 141-149 163-173 189-195 228-238 1-123 26-35 50-66 99-112

18 142-250 164-176 192-198 231-239 1-125 26-35 50-66 99-114

Em uma modalidade da presente invenção, anticorposque podem ser usados nos métodos da invenção se ligam a neu-trocina-alfa e compreendem um polipeptideo que tem a seqüên-cia de aminoácidos de qualquer um dos domínios VH referidosna Tabela 1 e/ou qualquer um dos domínios VL referidos naTabela 1. Em modalidades preferidas, anticorpos que podemser usados nos métodos da invenção compreendem a seqüênciade aminoácidos de um domínio VH e domínio VL do mesmo scFvreferido na Tabela 1. Em modalidades alternativas, anticor-pos que podem ser usados nos métodos da -invenção compreendema seqüência de aminoácidos de um domínio VH e domínio VL descFvs diferentes do referido na Tabela 1. Em outra modalida-de, anticorpos que podem ser usados nos métodos da invençãose ligam especificamente a neutrocina-alfa e compreendem umpolipeptídeo que tem a seqüência de aminoácidos de qualquerum, quaisquer dois, três o mais dos CDRs de VH referidos naTabela 1 e/ou qualquer um, quaisquer dois, três o mais dosCDRs de VL referidos na Tabela 1. Em modalidades preferidas,anticorpos que podem ser usados nos métodos da invenção com-preendem a seqüência de aminoácidos de uma CDR de VH e CDRde VL do mesmo scFv referido na Tabela 1. Em modalidades al-ternativas, anticorpos que podem ser usados nos métodos dainvenção compreendem a seqüência de aminoácidos de um CDR deVH e CDR de VL de diferentes scFvs dos referidos na Tabela1. Moléculas compreendendo, ou senão consistindo em, frag-mentos de anticorpo ou variantes dos scFvs referidos na Ta-bela 1 que se ligam imunoespecificamente a neutrocina-alfatambém podem ser usadas nos métodos da invenção.

Em uma modalidade especifica, um anticorpo anti-neutrocina-alfa que pode ser usado nos métodos da invençãocompreende os domínios VH e VL de SEQ ID NO: 13, como des-crito na Tabela 1. Em outra modalidade específica, um anti-corpo que pode ser usado nos métodos da presente invençãocompreende as regiões VHCDRl, VHCDR2, VHCDR3 e CDRl de VL,VLCDR2 e VLCDR3 de SEQ ID NO: 13, como descrito na Tabela 1.

Em uma modalidade específica, um anticorpo anti-neutrocina-alfa que pode ser usado nos métodos da invençãocompreende os domínios VH e VL de SEQ ID NO: 14, como des-crito na Tabela 1. Em outra modalidade específica, um anti-corpo que pode ser usado nos métodos da presente invençãocompreende as regiões VHCDRl, VHCDR2, VHCDR3 e CDRl de VL,VLCDR2 e VLCDR3 de SEQ ID NO: 13, como descrito na Tabela 1.Em uma modalidade específica, um anticorpo anti-neutrocina-alfa que pode ser usado nos métodos da invençãocompreende os domínios VH e VL de SEQ ID NO: 13, como des-crito na Tabela 1. Em outra modalidade específica, um anti-corpo que pode ser usado nos métodos da presente invençãocompreende as regiões VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 e CDRl de VL,VLCDR2 e VLCDR3 de SEQ ID NO: 14, como descrito na Tabela 1.

Em uma modalidade específica, um anticorpo anti-neutrocina-alfa que pode ser usado nos métodos da invençãocompreende os domínios VH e VL de SEQ ID NO: 15, como des-crito na Tabela 1. Em outra modalidade específica, um anti-corpo que pode ser usado nos métodos da presente invençãocompreende as regiões VHCDRl, VHCDR2, VHCDR3 e CDRl de VL,VLCDR2 e VLCDR3 de SEQ ID NO: 15, como descrito na Tabela 1.

Em uma modalidade específica, um anticorpo anti-neutrocina-alfa que pode ser usado nos métodos da invençãocompreende os domínios VH e VL de SEQ ID NO: 16, como des-crito na Tabela 1. Em outra modalidade específica, um anti-corpo que pode ser usado nos métodos da presente invençãocompreende as regiões VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 e CDRl de VL,VLCDR2 e VLCDR3 de SEQ ID NO: 16, como descrito na Tabela 1.

Em uma modalidade específica, um anticorpo anti-neutrocina-alfa que pode ser usado nos métodos da invençãocompreende os domínios VH e VL de SEQ ID NO: 17, como des-crito na Tabela 1. Em outra modalidade específica, um anti-corpo que pode ser usado nos métodos da presente invençãocompreende as regiões VHCDRl, VHCDR2, VHCDR3 e CDRl de VL,VLCDR2 e VLCDR3 de SEQ ID NO: 17, como descrito na Tabela 1.Em uma modalidade especifica, um anticorpo anti-neutrocina-alfa que pode ser usado nos métodos da invençãocompreende os domínios VH e VL de SEQ ID NO: 18, como des-crito na Tabela 1. Em outra modalidade específica, um anti-corpo que pode ser usado nos métodos da presente invençãocompreende as regiões VHCDRl, VHCDR2, VHCDR3 e CDRl de VL,VLCDR2 e VLCDR3 de SEQ ID NO: 18, como descrito na Tabela 1.

Em uma modalidade específica, um anticorpo anti-neutrocina-alfa que pode ser usado nos métodos da invençãocompreende os domínios VH e VL de 15C10, um anticorpo anti-neutrocina-alfa neutralizante que é descrito em, por exem-plo, Publicação de Patente US No. 20050186637. A seqüênciade aminoácidos do domínio VH de 15C10 é dado na SEQ ID NO:19. A seqüência de aminoácidos do domínio VL de 15C10 é dadona SEQ ID NO: 20. Em uma modalidade específica, um anticorpoanti-neutrocina-alfa que pode ser usado nos métodos da in-venção é um fragmento de ligação a antígeno ou variante de15C10. Em uma modalidade específica, um anticorpo anti-neutrocina-alf a que pode ser usado nos métodos da presenteinvenção é uma versão humanizada de 15C10. Em outra modali-dade específica, um anticorpo anti-neutrocina-alfa que podeser usado nos métodos da presente invenção compreende as re-giões VHCDRl, VHCDR2, VHCDR3 e CDRl de VL, VLCDR2 e VLCDR3de 15C10.

Em outra modalidade específica, um anticorpo anti-neutrocina-alfa que pode ser·usado nos métodos da invençãocompreende os domínios VH e VL do anticorpo anti-neutrocina-alfa 4A5-3.1.1-B4 descrito na Publicação de Patente Interna-cional WO 03/0164468, que é incorporada aqui como referênciaem sua totalidade. Neutrocina-alfa é referida como hTNFSF13bem WO 03/0164468. A seqüência de aminoácidos do domínio VHde 4A5-3.1.1-B4 é dado na SEQ ID NO: 21. A seqüência de ami-noácidos do domínio VL de 4A5-3.1.1-B4 é dado na SEQ ID NO:22. Em uma modalidade específica, um anticorpo anti-neutrocina-alfa que pode ser usado nos métodos da invenção éum fragmento de ligação a antígeno ou variante de 4A5-3.1.1-B4. Em outra modalidade específica, um anticorpo que podeser usado nos métodos da presente invenção compreende as re-giões VHCDRl, VHCDR2, VHCDR3 e CDRl de VL, VLCDR2 e VLCDR3de 4A5-3.1.1-B4.

Em uma modalidade específica, anticorpos anti-neutrocina-alfa que podem ser usados nos métodos da invençãose ligam especificamente a polipeptídeo de neutrocina-alfaexpressado a partir de uma célula.

C.Polipeptídeos de ligação a neutrocina-alfaEm uma modalidade específica, o antagonista deneutrocina-alfa é um peptídeo ou polipeptídeo de ligação aneutrocina-alfa. Peptídeos ou polipeptídeos de ligação aneutrocina-alfa foram descritos em, por exemplo, Publicaçõesde Patente Internacional números WO 05/005462, WO 05/000351,WO 02/092620, WO 02/16412, WO 02/02641 e WO 02/16411 e Pu-blicações de Patente US números US 2006135430, US2006084608, US 2003194743, US 2003019156 e US 2003091565,cada uma das quais é incorporada aqui como referência em suatotalidade. Peptídeos ou polipeptídeos de ligação a neutro-cina-alfa foram descritos em, por exemplo, Sun et al. ,(2006) Biochem Biophys Res Commun 346: 1158-1162 que é in-corporada aqui como referência em sua totalidade. Peptideosde ligação a neutrocina-alfa que podem se usados nos métodosda presente invenção incluem polipeptideos curtos identifi-cados de seqüências peptidicas aleatórias visualizadas pelafusão com proteínas de revestimento de fago filamentoso. Pa-ra discussão de tecnologia de biblioteca peptídica de visua-lização de fago (phage dísplay) veja, por exemplo, Scott etal., (1990), Science 249: 386; Devlin et al., (1990) Science249: 404; Pat. US No. 5.223.409, publicada em 29 de junho de1993; Pat. US No. 5.733.731, publicada em 31 de março de1998; Pat. US No. 5.4 98.530, publicada em 12 de março de1996; Pat. US No. 5.432.018, publicada em 11 de julho de1995; Pat. US No. 5.338.665, publicada em 16 de agosto de1994; Pat. US No. 5.922.545, publicada em 13 de julho de1999; WO 96/40987, publicada em 19 de dezembro de 1996 e WO98/15833, publicada em 16 de abril de 1998 (cada uma dasquais é incorporada como referência em sua totalidade). Fa-gos que expressa os peptídeos são isolados por rodadas su-cessivas de purificação por afinidade contra um peptídeo al-vo de neutrocina-alfa imobilizado seguida por repropagação.

Os candidatos com a ligação mais alta a neutrocina-alfa po-dem ser seqüenciados para determinar a identidade de cadapeptídeo de ligação. Cada peptídeo de ligação identificadopode estão ser aderido a um "veículo" para gerar um peptídeode ligação a neutrocina-alfa adicional para uso nos métodosdo presente experimento. 0 termo "veículo" se refere a umamolécula que previne a degradação e/ou aumenta a meia-vida,reduz toxicidade, reduz imunogenicidade, ou aumenta a ativi-dade biológica de um peptideo de ligação a neutrocina-alfa.Veículos exemplares incluem um domínio Fc e variantes deste(um "Pepticorpo", que é preferido); um polímero linear (p. ex., polietileno glicol (PEG), incluindo PEG de 5kD, 20 kD e30 kD, polisisina, dextran, etc.); um polímero de cadeia ra-mificada (veja, por exemplo, Pat. US No. 4.289.872 para Den-kenwalter et al., publicada em 15 de setembro de 1981;5.229.490 para Tam, publicada em 20 de julho de 1993; WO 93/21259 por Frechet et al., publicada em 28 de outubro de1993); um lipídeo; um grupo colesterol (tal como um esterói-de); um carboidrato ou oligossacarídeo (p. ex., dextran);qualquer proteína, polipeptídeo ou peptideo natural ou sin-tético que se ligue a um receptor de resgate; albumina, in- cluindo, mas não limitando a albumina humana recombinante oufragmentos ou variantes desta (veja, p. ex., Patente US No.5.876.969, publicada em 2 de março de 1999, Patente EP 0 413622 e atente US No. 5.766.883, publicada em 16 de junho de1998, incorporadas aqui como referência em suas totalida-des); e um domínio de zíper de leucina e outras de tais pro-teínas e fragmentos de proteína. Polipeptídeos de ligação aneutrocina-alfa que podem ser usados nos métodos da invençãorequerem a presença de pelo menos um veículo aderido ao pep-tideo através da extremidade N-terminal, C-terminal ou de uma cadeia lateral de um dos resíduos de aminoácidos. Múlti-plos veículos também podem ser usados; p. ex., Fcs em cadaextremidade ou um Fc em uma extremidade e um grupo PEG naoutra extremidade ou uma cadeia lateral. Para peptídeos deligação a neutrocina-alfa um domínio Fc é o veículo preferi-do. 0 domínio Fc pode ser fusionado à extremidade N ou C-terminal dos peptídeos ou tanto à extremidade N como à C-terminal. Fusão na extremidade N-terminal é preferida.

Como mencionado acima, variantes de Fc são veícu-los adequados para peptídeos de ligação a neutrocina-alfaque podem ser usados nos métodos da invenção. Um Fc nativopode ser modificado extensivamente para formar uma variantede Fc, contanto que a ligação ao receptor de resgate sejamantida; veja, por exemplo, WO 97/34631 e WO 96/32478. Emtais variantes de Fc, alguém pode remover um ou mais sítiosde um Fc nativo que provê características estruturais de a-tividade funcional não requerida pelos peptídeos de ligaçãoa neutrocina-alfa que podem ser usados nos métodos da inven-ção. Alguém pode remover esses sítios por, por exemplo,substituição ou deleção de resíduos, inserção de resíduos nosítio, oú porções truncadas contendo o sítio. Os resíduosinseridos ou substituídos também podem ser aminoácidos alte-rados, tal como peptiddoimitadores ou D-aminoácidos. Varian-tes de Fc podem ser desejáveis por várias razões, muitas dasquais são descritas abaixo. Variantes Fc exemplares incluemmoléculas e seqüências em que:

1. Sítios envolvidos na formação de ligação dissul-feto são removidos. Tal remoção pode·evitar reação com ou-tras proteínas contendo cisteína presentes na célula hospe-deira usada para produzir as moléculas da invenção. Para es-ta finalidade, o segmento contendo cisteína da extremidadeN-terminal pode ser truncado ou resíduos de cisteína podemser deletados ou substituídos por outros aminoácidos (p.ex., alanil, seril) . Mesmo quando resíduos de cisteína sãoremovidos, os domínios de Fc de cadeia única ainda podemformar um domínio de Fc dimérico que é mantido junto não co-valentemente.

2. Um Fc nativo é modificado para torná-lo maiscompatível com uma célula hospedeira selecionada. Por exem-plo, alguém pode remover a seqüência PA próxima à extremida-de N-terminal de um Fc nativo típico, que pode ser reconhe-cido por uma enzima digestiva em E. Coli tal como prolinaiminopeptidase. Alguém também pode adicionar um resíduo demetionina N-terminal, especialmente quando a molécula é ex-pressada recombinantemente em uma célula bacteriana tal comoE. Coli.

3. Uma porção da extremidade N-terminal de um Fcnativo é removida para prevenir heterogeneidade N-terminalquando expressada em uma célula hospedeira selecionada. Paraesta finalidade, alguém pode deletar qualquer um dos primei-ros 20 resíduos de aminoácidos da extremidade N-terminal.

4. Um ou mais sítios de glicosilação são removidos.Resíduos que são tipicamente glicosilados (p. ex., asparagi-na) podem conferir resposta citolítica. Tais resíduos podemser deletados ou substituídos por resíduos não glicosilados(p. ex., alanina).

5.Sítios envolvidos na interação com complemento,tal como o sítio de ligação a Clq, são removidos. Por exem-plo, alguém pode deletar ou substituir a seqüência EKK deIgGl humana. Recrutamento do complemento pode não ser vanta-joso para as moléculas que podem ser usadas nos métodos dainvenção e, portanto, podem ser evitadas com tal variante deFc.

6. São removidos sítios que afetam a ligação a re-ceptores de Fc fora um receptor de resgate. Um Fc nativo po-de ter sítios para interação com certas células brancas dosangue que não são requeridas para as moléculas de fusão depeptídeo de ligação a neutrocina-alfa que podem ser usadasnos métodos da invenção e, portanto, podem ser removidas.7.0 sítio ADCC é removido. Sítios ADCC são conhe-cidos na técnica; veja, por exemplo, Molec Immunol 29(5):633-9 (1992) com relação aos sítios ADCC em IgGl. Esses sí-tios, também, não são requeridos para as moléculas de fusãoque podem ser usadas nos métodos da invenção e, portanto,podem ser removidas.

8.Quando o Fc nativo é derivado de um anticorponão humano, o Fc nativo pode ser humanizado. Tipicamente,para humanizar um Fc nativo, alguém substituirá resíduos se-lecionados no Fc nativo não humano por resíduos que são nor-malmente encontrados em Fc nativo humano. Técnicas para hu-manização de anticorpo são bem conhecidas na técnica.

Um veículo alternativo para peptídeos de ligação aneutrocina-alfa que pode ser usado nos métodos da invençãoseria uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, anticorpo, frag-mento de anticorpo, ou molécula pequena (p. ex., um compostopeptidomimético) capaz de se ligar a um receptor de resgate.Por exemplo, alguém poderia usar como um veículo um polipep-tídeo descrito em Pat US No. 5.739.277. Peptídeos também po-deriam ser selecionados por visualização por fago ou triagemRNA-peptideo para ligação a receptor de resgate. Tais com-postos de ligação a receptor de resgate também são incluídosno significado de "veículo" e podem ser usados para peptí-deos de ligação a neutrocina-alfa que podem ser usados nosmétodos da invenção. Tas veículos deveriam ser selecionadospor meia-vida aumentada (p. ex. , evitando seqüências reco-nhecidas por proteases) e imunogenicidade diminuída (p. ex.,favorecendo seqüências não imunogênicas, como descoberto emhumanização de anticorpo).

Como mencionado acima, veículos de polímero tambémpodem ser usados em peptídeos de ligação a neutrocina-alfaque podem ser usados nos métodos da invenção. Vários meiospara aderir unidades químicas úteis como veículos estão atu-almente disponíveis, veja, p. ex., Publicação Internacionaldo Tratado de Cooperação de Patentes ("PCT") No. WO96/11953, incorporada aqui como referência em sua totalida-de. Esta publicação PCT divulga, entre outras coisas, a ade-são seletiva de polímeros solúveis em água à extremidade N-terminal de proteínas.

Em uma modalidade específica, um veículo de polí-mero preferido é polietileno glicol (PEG). 0 grupo PEG podeser de qualquer peso molecular conveniente e pode ser linearou ramificado. 0 peso molecular médio do PEG de preferênciavariará de cerca de 2 quilodáltons ("kD") até cerca de 100kD, de maior preferência de cerca de 5 kD até cerca de 50kD, da maior preferência de cerca de 5 kD até cerca de 10kD. Os grupos PEG geralmente estarão aderidos aos peptídeosde ligação a neutrocina-alfa que podem ser usados nos méto-dos da invenção através de acilação ou alquilação redutoraatravés de um grupo reativo na unidade de PEG (p. ex., umgrupo aldeido, amino, tiol ou éster) para um grupo reativono composto da invenção (p. ex., um grupo aldeido, amino, ouéster).

Uma estratégia útil para a PEGuilação de peptideossintéticos consiste em combinar, através da formação de umaligação de conjugado em solução, um peptideo e uma unidadede PEG, cada um portando uma funcionalidade especial que émutuamente reativa com a outra. Os peptideos podem ser fa-cilmente preparados com sintese em fase sólida convencional.Os peptideos são "pré-ativados" com um grupo funcional apro-priado em um sitio especifico. Os precursores são purifica-dos e completamente caracterizados antes de reagir com a u-nidade de PEG. A ligação do peptideo com PEG geralmente o-corre em fase aquosa e pode ser facilmente monitorada porHPLC analítico de fase reversa. Os peptideos PEGuilados po-dem ser facilmente purificados por HPLC preparativa e carac-terizados por HPLC analítica, análise de aminoácidos e es-pectrometria de massas por dessorção a laser.

Polímeros polissacarídicos são outro tipo de polí-mero hidrossolúvel que pode ser usado para peptideos de li-gação a neutrocina-alfa que podem ser usados nos métodos dainvenção. Dextrans são polímeros polissacarídicos compreen-didos por subunidades individuais de glicose predominante-mente ligadas por ligações al-6. 0 dextran por si só estádisponível em muitas faixas de peso molecular e está pronta-mente disponível em pesos moleculares de cerca de 1 kD atécerca de 70 kD. Dextran é um polímero hidrossolúvel adequadopara uso em peptídeos de ligação a neutrocina-alfa que podemser usados nos métodos da invenção como um veículo por si só ou em combinação com outro veículo (p. ex., Fc). Veja, porexemplo, WO 96/11953 e WO 96/05309. 0 uso de dextran conju-gado a imunoglobulinas de diagnóstico ou terapêuticas foirelatado; veja, por exemplo, Publicação de Patente EuropéiaNo. 0 315 456, que é incorporada por meio deste como refe- réncia em sua totalidade. Dextran de cerca de 1 kD até cercade 20 kD é preferido quando o dextran é usado como um veícu-lo de acordo com a presente invenção.

Em uma modalidade específica, peptídeos de ligaçãoa neutrocina-alfa que podem ser usados nos métodos da inven- ção opcionalmente incluem um "ligante". Quando presente, suaestrutura química não é crítica desde que sirva primariamen-te como um espaçador. 0 ligante é de preferência feito deaminoácidos unidos por ligações peptídicas. Assim, em moda-lidades preferidas, o ligante é feito de 1 até 30 aminoáci-dos ligados por ligações peptídicas, em que os aminoácidossão selecionados dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmen-te. Alguns desses aminoácidos podem ser glicosilados, como ébem entendido por aqueles na técnica. Em uma modalidade maispreferida, os 1 até 20 aminoácidos são selecionados de gli-cina, alanina, prolina, asparagina, glutamina e lisina. Ain-da de maior preferência, um ligante é feito de uma maioriade aminoácidos que estão estericamente desimpedidos, tal co-mo glicina e alanina. Assim, ligantes preferidos são poli-glicinas (particularmente (Gly)4 (Gly)5, poli (Gly-Ala)5 e po-lialaninas. Ligantes preferidos são ligantes de aminoácidoscompreendendo mais de 5 aminoácidos, com ligantes adequadostendo até cerca de 500 aminoácidos selecionados de glicina,alanina, prolina, asparagina, glutamina, lisina, treonina,serina ou aspartato. Ligantes de cerca de 20 ate 50 aminoá-cidos são os mais preferidos.

Ligantes não peptidicos também são úteis para pep-tideos de ligação a neutrocina-alfa que podem ser usados nosmétodos da invenção. Por exemplo, ligantes de alquila talcomo -NH—(CH2)n—C(O)—, em que n=2-20 poderiam ser usados.Esses ligantes de alquila podem ser adicionalmente substitu-ídos por qualquer grupo não impedido estericamente tal comoalquila inferior (p. ex., Ci-Ce) acila inferior, halogênio(p. ex., CL, Br), CN, NH2, fenila, etc.

Em modalidades preferidas, os peptídeos de ligaçãoa neutrocina-alfa que podem ser usados nos métodos da inven-ção incluem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ou a seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO: 25. Em uma modalidade preferidaparticular, o peptídeo de ligação a neutrocina-alfa que podeser usado nos métodos da invenção é a seqüência de aminoáci-dos de SEQ ID NO: 23 (AMG 623; pepticorpo AGP3).

Receptores de neutrocina-alfa

Em uma modalidade específica, o antagonista deneutrocina-alfa é uma proteína receptora de neutrocina-alfaou fragmento ou variante desta. Receptores de neutrocina-alfa incluem, p. ex., ativador transmembranar e que interagecom CAML (TACI, número de acesso do GenBank AAC51790, SEQ IDNO: 6) , receptor de fator ativador de célula B (BAFF-R, nú-mero de acesso do GenBank NP_443177 SEQ ID NO: 10) e antíge-no de maturação de célula B (BCMA, número de acesso do Gen-Bank NP_001183 SEQ ID NO: 8) . Proteínas receptoras de neu-trocina-alfa, fragmentos e variantes destas, assim como an-ticorpos foram descritos em, por exemplo, Publicações PCT WO03/014294, WO 02/066516, WO 02/024909, WO 03/014294, WO03/024991, WO 02/094852 e WO 04/011611 e Publicação de Pa-tente US Nos. US 20030148445, US 20030099990, US 2005070689,US 2005043516 e US 2003012783 e são descritos em maiores de-talhes abaixo. Cada uma das referências acima mencionadas éincorporada aqui como referência em suas totalidades..

D.Receptores de neutrocina-alfa, TACI

Polipeptideo de TACI, tal como aqueles descritosabaixo, agem como antagonistas de neutrocina-alfa e/ou APRILe também podem ser usado nos métodos da presente invenção.TACI, também conhecido como TR17, é· uma proteína de 2 93 re-síduos de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) , com um peso moleculardeduzido de cerca de 31,8 kDa. Uma seqüência nucleotídica deum cDNA que codifica TACI é dada em SEQ ID NO: 5. Aminoáci-dos preditos de cerca de 1 até cerca de 165 constituem o do-mínio extracelular (SEQ ID NO: 6) ; aminoácidos de cerca de166 até cerca de 186 constituem o domínio transmembrana (SEQID NO: 6) ; e aminoácidos de cerca de 187 até cerca de 293constituem o domínio intracelular (SEQ ID NO: 6) .

Conseqüentemente, em uma modalidade, uma proteínaTACI que pode ser usado nos métodos da presente invenção éum polipeptídeo isolado compreendendo, ou senão consistindoem uma porção de SEQ ID NO: 6, tal como, por exemplo, o do-mínio extracelular de TACI (compreendendo aminoácidos 1 até165 de SEQ ID NO: 6) e/ou o domínio rico em cisteína de TACI(compreendendo aminoácidos 33 até 104 de SEQ ID NO: 6); as-sim como polipeptídeos que possuem pelo menos 80% de identi-dade, de maior preferência pelo menos 90% ou 95% de identi-dade, ainda de maior preferência pelo menos 96%, 97%, 98%,99% ou 100% de identidade com os polipeptídeos descritos acima.

Em outra modalidade, uma proteína TACI que podeser usada nos métodos da presente invenção é um polipeptídeoisolado compreendendo aminoácidos 1 até 154 de SEQ ID NO: 6assim como polipeptídeos que possuem pelo menos 80% de iden-tidade, de maior preferência pelo menos 90% ou 95% de iden-tidade, ainda de maior preferência pelo menos 96%, 97%, 98%,99% ou 100% de identidade com os polipeptídeos descritos a-cima.

Por um polipeptídeo que tem uma seqüência de ami-noácidos com pelo menos, por exemplo, 95% de "identidade" auma seqüência de aminoácidos de referência de um polipeptí-deo TACI entende-se que a seqüência de aminoácidos do poli-peptídeo possui identidade com a seqüência de referência ex-ceto que a seqüência polipeptídica pode incluir até cincoalterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos do amino-ácido de referência do receptor TACI. Em outras palavras,para obter um polipeptídeo que tem uma seqüência de aminoá-cidos com pelo menos 95% de identidade com a seqüência deaminoácidos de referência, até 5% dos resíduos de aminoáci-dos na seqüência de referência podem ser deletados ou subs-tituídos por outro aminoácido, ou vários aminoácidos até 5%do total de resíduos de aminoácidos na seqüência de referên-cia podem ser inseridos na seqüência de referência. Essasalterações da seqüência de referência podem ocorrer nas po-sições amino ou carbóxi-terminais da seqüência de aminoáci-dos de referência ou em qualquer lugar entre aquelas posi-ções terminais, entremeadas individualmente entre resíduosna seqüência de referência ou em um ou mais grupos contíguosna seqüência de referência.

Fragmentos polipeptídicos de TACI incluem polipep-tídeos compreendendo ou senão, consistindo em: uma seqüênciade aminoácido em um polipeptídeo maior do qual o fragmentoforma uma parte ou região, da maior preferência como uma re-gião contígua única. Em modalidades adicionais, os fragmen-tos de polipeptídeo compreendem, ou senão consistem em, umou mais domínios TACI. Fragmentos polipeptídicos preferidosincluem um membro selecionado do grupo: (a) um polipeptídeocompreendendo ou senão, consistindo no domínio extracelularde TACI (predito como constituindo os resíduos de aminoáci-dos de cerca de 1 até cerca de 165 de SEQ ID NO: 6) ; (b) umpolipeptídeo compreendendo ou senão, consistindo em, um do-mínio rico em cisteína de TACI (predito como constituindo osresíduos de aminoácidos de cerca de 33 até cerca de 104 deSEQ ID NO: 6) ; (c) um polipeptídeo compreendendo ou senão,consistindo no domínio transmembrana de TACI (predito comoconstituindo os resíduos de aminoácidos de cerca de 166 atécerca de 18 6 de SEQ ID NO: 6) ; (d) um polipeptideo compreen-dendo ou senão, consistindo no domínio intracelular de TACI(predito como constituindo os resíduos de aminoácidos decerca de 187 até cerca de 293 de SEQ ID NO: 6); ou (e) qual-quer combinação de polipeptídeos (a)-(d).

Acredita-se que os motivos ricos em cisteína deTACI sejam importantes para interações entre TACI e seus Ii-gantes, neutrocina-alfa e APRIL. Conseqüentemente, em moda-lidades preferidas, fragmentos polipeptídicos de TACI quepodem ser usados nos métodos da presente invenção compreen-dem, ou senão consistem nos resíduos de aminoácidos 33 até66 e/ou 70 até 104 de SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade espe-cífica, os polipeptideo de TACI que podem ser usados nos mé-todos da presente invenção compreendem, ou senão consistemem um ou ambos os motivos ricos em cisteína extracelulares(resíduos 33 até 66 e resíduos 70 até 104 de SEQ ID NO: 6) .Proteínas compreendendo ou senão consistindo em uma seqüên-cia polipeptídica que possui pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%,97%, 98% ou 99% de identidade com as seqüências polipeptídi-cas de um ou ambos os motivos ricos em cisteína também sãopreferidos.

Outros fragmentos da proteína de TACI que podemser usados nos métodos da invenção são fragmentos caracteri-zados por atributos funcionais ou estruturais de TACI. Taisfragmentos incluem resíduos de aminoácidos que compreendemregiões de alfa-hélice e formadoras de alfa-hélice ("regiõesalfa"), regiões de folha beta e formadoras de folha beta("regiões beta"), regiões de volta e formadoras de coita("regiões de volta"), regiões espirais e formadoras de espi-ral ("regiões espirais"), regiões hidrofilicas, regiões hi-drofóbicas, regiões anfipáticas alfa, regiões anfipáticasbeta, regiões formadoras de superfície e regiões de alto ín-dice antigênico (isto é, contendo quatro ou mais aminoácidoscontíguos que têm um índice antigênico maior que ou igual a1,5, como identificado usando os parâmetros padrões do pro-grama de Jameson-WOlf) de TACI (SEQ ID NO: 6) completa (istoé, inteira) como é discutido na Patente US No. 6.969.519.Certas regiões preferidas incluem, mas não estão limitadasa, regiões alfa, regiões beta, regiões de volta e regiõesespirais preditas por Garnier-Robson; regiões alfa, regiõesbeta e regiões de volta preditas por Chou-Fasman; hidrofíli-cas preditas por Kyte-Doolittle; regiões hidrofóbicas predi-tas por Hopp-Woods; regiões anfipáticas alfa e beta preditaspor Eisenberg; regiões formadoras de superfície de Emini; eregiões de alto índice antigênico de Jameson-Wolf, como pre-dito usando os parâmetros padrões desses programas de compu-tador..

O polipeptídeo TACI para uso nos métodos da inven-ção podem ser expressados em uma forma modificada, tal comouma proteína de fusão (compreendendo o polipeptídeo unidoatravés de uma ligação peptídica a uma seqüência de proteínaheteróloga (de uma proteína diferente)) e pode incluir nãoapenas sinais de secreção, mas também regiões funcionais he-terólogas adicionais. Senão, tal proteína de fusão pode serfeita por técnicas de síntese de proteína, p. ex., por usode um sintetizador peptídico. Assim, uma região de aminoáci-dos adicionais, particularmente aminoácidos carregados, po-dem ser adicionados à extremidade N-terminal do polipeptideopara melhorar a estabilidade e persistência na célula hospe-deira, durante a purificação ou durante manuseio e estocagemsubseqüentes. Além disso, unidades peptidicas podem ser adi-cionadas ao polipeptideo para facilitar a purificação. Taisregiões podem ser removidas antes da preparação final do po-lipeptideo. A adição de unidades peptidicas a polipeptideospara engendrar secreção ou excreção, para melhorar a estabi-lidade e para facilitar a purificação, entre outros, é téc-nica familiar e rotineira na técnica.

Uma proteína de fusão de TACI preferida que podeser usada nos métodos da invenção compreende uma região he-teróloga de imunoglobulina que é útil para solubilizar pro-teínas. Por exemplo, EP-A-O 464 533 (equivalente canadense2045869) e W000/024782 divulgam proteínas de fusão compreen-dendo várias porções de região constante de moléculas de i-munoglobulina junto com outra proteína humana ou parte des-ta. Proteínas de fusão de imunoglobulina e TACI foram des-critas em, por exemplo, Publicações PCT WO 01/60397, WO01/81417, WO 01/087977 e WO 02/94852; Publicações US Nos. US2003103986 e US 2006034852 e Gross et al., (2000) Nature404: 995-999 e Yu et al.f (2000) Nat Immunol 1: 252-256, a-qui incorporadas como referências em suas totalidades. Emmuitos casos, a parte Fc em uma proteína de fusão é comple-tamente vantajosa para uso na terapia e diagnóstico e assimresulta, por exemplo, em propriedades farmacocinéticas me-lhoradas (EP-A 0232 262). Por outro lado, para alguns usosseria desejável ser capaz de excluir a parte Fc após a pro-teína de fusão ter sido expressa, detectada e purificada damaneira vantajosa descrita. Este é o caso quando a porção Fcprova ser um obstáculo para uso na terapia e diagnóstico,por exemplo, quando a proteína· de fusão é para ser usada co-mo antígeno para imunizações. Na descoberta de fármacos, porexemplo, proteínas humanas, tal como receptor de hIL-5 foramfusionadas a porções Fc com a finalidade de ensaios de tria-gem/varredura de alta carga de entrada para identificar an-tagonistas de hIL-5. Veja, D. Bennett et al., Journal of Mo-lecular Recognition 8: 52-58 (1995) e K. Johanson et al.,The Journal of Biological Chemistry 270: 9459-9471 (1995).Em uma modalidade específica, a proteína de fusão TACI-Fcque pode ser usada nos métodos da invenção é Atacicept(TACI-Ig) .

Alguém versado na técnica apreciará e como discu-tido acima, os polipeptídeos de TACI podem ser fusionados aoutras seqüências polipeptídicas. Por exemplo, os polipeptí-deos de TACI podem ser fusionados com o domínio constante deimunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM), ou porções destes(CHI, CH2, CH3, ou qualquer combinação destes e porções des-tes) , ou albumina (incluindo, mas não limitando a albuminahumana recombinante ou fragmentos ou variantes desta (veja,p. ex., Patente US No. 5.876.969, divulgada em 2 de março de1999, Patente EP 0 413 622 e Patente US No. 5.766.883, di-vulgada em 16 de junho de 1998, incorporadas aqui como refe-rência em suas totalidades)), resultando em polipeptídeosquiméricos.Tais proteínas de fusão podem facilitar a purifi-cação, podem estender a vida de prateleira e podem aumentara meia-vida in vivo. Isto foi demonstrado para proteínasquiméricas consistindo nos primeiros dois domínios do poli-peptídeo-CD4 humano e vários domínios das regiões constantesdas cadeias pesada ou leve de imunoglobulinas de mamíferos.Veja, p. ex., EP 394.827; Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (1988). Distribuição melhorada de um antígeno atravésda barreira epitelial do sistema imune foi demonstrada paraantígenos (p. ex., insulina) conjugados a um par de ligaçãode FcRn tal como fragmentos Fc ou IgG (veja, p. ex., Publi-cações PCT WO 96/22024 e WO 99/04813). Proteínas de fusão deIgG que têm uma estrutura dimérica ligada por dissulfeto de-vido às ligações dissulfeto de porção de IgG também foramdemonstradas como sendo mais eficientes na ligação a e neu-tralização de outras moléculas que polipeptídeos monoméricosou fragmentos destes sozinhos. Veja, p. èx., Fountoulakis etalJ Biochem 270: 3958-3964 (1995).

Uma proteína de fusão com albumina que pode serusada nos métodos da presente invenção compreende pelo menosum fragmento ou variante de um polipeptídeo de TACI e pelomenos um fragmento ou variante de albumina sérica humana,que estão associados um com o outro, de preferência por fu-são genética (isto é, a proteína de fusão com albumina é ge-rada por tradução de um ácido nuclêico em que um polinucleo-tídeo que codifica toda a TACI ou uma porção é unido na mes-ma fase de leitura com um polinucleotídeo que codifica todaa albumina ou uma porção) ou conjugação química um ao outro.O polipeptideo de TACI e a proteína albumina, uma vez parteda proteína de fusão com albumina, podem ser referidos comouma "porção" ou "unidade" da proteína de fusão com albumina(p. ex., uma "porção TACI" ou uma "porção de proteína albumina").

Em uma modalidade, uma proteína de fusão com albu-mina que pode ser usada nos métodos da invenção compreende,ou senão consiste em, um polipeptideo de TACI e uma proteínaalbumina sérica. Em outras modalidades, uma proteína de fu-são com albumina que pode ser usada nos métodos da invençãocompreende, ou senão consiste em, um fragmento de TACI e umàproteína albumina sérica. Em outras modalidades, uma proteí-na de fusão com albumina que pode ser usada nos métodos dainvenção compreende, ou senão consiste em, uma variante deTACI e uma proteína albumina sérica. Em modalidades preferi-das, o componente de proteína albumina sérica da proteína defusão com albumina é a porção madura da albumina sérica.

Em modalidades adicionais, uma proteína de fusãocom albumina que pode ser usada nos métodos da invenção com-preende, ou senão consiste em, um polipeptideo de TACI e umfragmento de albumina sérica biologicamente ativo e/ou tera-peuticamente ativo. Em modalidades adicionais, uma proteínade fusão com albumina que pode ser usada nos métodos da in-venção compreende, ou senão consiste em, um polipeptideo deTACI e uma variante de albumina sérica biologicamente ativae/ou terapeuticamente ativa. Em modalidades preferidas, aporção de TACI da proteína de fusão com albumina é o poli-peptideo de TACI completo. Em uma modalidade preferida adi-cional, a porção TACI da proteína de fusão com albumina é odomínio maduro, solúvel do polipeptídeo de TACI.

Em modalidades adicionais, uma proteína de fusãocom albumina que pode ser usada nos métodos da invenção com-preende, ou senão consiste em, um fragmento ou variante deTACI e um fragmento ou variante biologicamente ativo e/outerapeuticamente ativo de albumina sérica. Em modalidadespreferidas, a invenção provê uma proteína de fusão com albu-mina que compreende, ou senão consiste na porção madura dopolipeptídeo de TACI e na porção madura da albumina sérica.

Em modalidades adicionais, uma proteína de fusãocom albumina que pode ser usada nos métodos da invenção com-preende, ou senão consiste em, um fragmento ou variante deTACI e um fragmento ou variante biologicamente ativo e/outerapeuticamente ativo de albumina sérica. Em modalidadespreferidas, a invenção provê uma proteína de fusão com albu-mina que compreende, ou senão consiste na porção madura dopolipeptídeo de TACI e na porção madura da albumina sérica(incluindo, mas não limitando à albumina sérica humana re-combinante ou fragmentos ou variantes desta (veja, p. ex.,Patente US No. 5.876.969, divulgada em 2 de março de 1999,Patente EP O 413 622 e Patente US No. 5.766.883, divulgadaem 16 de junho de 1998, incorporadas aqui como referência emsuas totalidades)). Em uma modalidade preferida, polipeptí-deos de TACI (incluindo fragmentos ou variantes destes) sãofusionados à forma madura de albumina sérica humana (isto é,aminoácidos 1-585 de albumina sérica humana como mostradonas Figuras 1 e 2 de Patente EP O 322 094) que são incorpo-rados aqui como referência em sua totalidade. Em outra moda-lidade preferida, anticorpos da presente invenção (incluindofragmentos ou variantes destes) são fusionados a fragmentospolipeptidicos que compreendem, ou senão consistem em, resí-duos de aminoácidos 1-x de albumina sérica humana, onde χ éum número inteiro de 1 até 585 e o fragmento de albumina tematividade de albumina séricã humana. Em outra modalidadepreferida, polipeptideos de TACI (incluindo fragmentos ouvariantes destes) são fusionados a fragmentos polipeptidicosque compreendem, ou senão consiste em, resíduos de aminoáci-dos 1-z de albumina sérica humana, onde ζ é um número intei-ro de 369 até 419, como descrito na Patente US 5.766.883 in-corporada aqui como referência em sua totalidade. Polipepti-deos de TACI (incluindo fragmentos ou variantes destes) po-dem ser fusionados ou à extremidade N- ou à C-terminal daproteína heteróloga (p. ex., polipeptídeo de Fc de imunoglo-bulina ou polipeptídeo de albumina sérica humana).

Em modalidades preferidas, a proteína de albuminasérica humana usada nas proteínas de fusão com albumina quepode ser usada nos métodos da invenção contém um ou ambosdos seguintes grupos de mutações pontuais com referência àSEQ ID NO: 11: Leu407 para Ala, Leu408 para Vai, Val409 paraAla e Arg410 para Ala; ou Arg410 para A, Lys413 para Gln eLys414 para Gln (veja, p. ex., Publicação Internacional No.W095/23857, incorporada por meio deste em sua totalidade co-mo referência aqui). Em modalidades ainda mais preferidas,proteínas de fusão com albumina que podem ser usadas nos mé-todos da invenção que contêm um ou ambos dos grupos acimadescritos de mutações pontuais têm estabilidade/resistênciamelhorada à clivagem proteolitica pela Yap3p de levedura,permitindo produção aumentada de proteínas de fusão com al-bumina recombinantes expressadas em células hospedeiras delevedura.

De preferência, a proteína de fusão com albuminaque pode ser usada nos métodos da invenção compreende HA co-mo a porção N-terminal e polipeptídeo de TACI como a porçãoC-terminal. Senão, uma proteína de fusão com albumina com-preendendo HA como a porção C-terminal e polipeptídeo deTACI como a porção N-terminal também pode ser usada.

Em outras modalidades, a proteína de fusão com al-bumina que pode ser usada nos métodos da invenção tem um po-lipeptídeo de TACI fusionado fusionado tanto na extremidadeN-terminal como na C-terminal de albumina. Em uma modalidadeespecífica, os polipeptídeos de TACI fusionados nas extremi-dades N- e C-terminais são os mesmos. Em outra modalidade,os polipeptídeos de TACI fusionados nas extremidades N- e C-terminais são polipeptídeos de TACI diferentes. Em outra mo-dalidade, um polipeptídeo de TACI é fusionado fusionado tan-to na extremidade N-terminal como na C-terminal de albuminae um polipeptídeo heterólogo é fusionado na extremidade re-manescente .

Adicionalmente, as proteínas de fusão com albuminaque podem ser usadas nos métodos da invenção podem incluirum peptídeo de ligação entre as porções fusionadas para pro-ver maior separação física entre as unidades. O peptídeo deligação pode consistir em aminoácidos tal que ele seja fie-xível ou mais rígido.

Geralmente, as proteínas de fusão com albumina quepodem ser usadas nos métodos da invenção podem ter uma regi-ão derivada de HA e uma região de TACI. Múltiplas regiões decada proteína, entretanto, podem ser usadas para fazer umaproteína de fusão com albumina que pode ser usada nos méto-dos da invenção. De modo similar, mais de uma proteína podemser usadas para fazer uma proteína de fusão com albumina quepode ser usada nos métodos da invenção. Por exemplo, umaproteína pode ser fusionada tanto à extremidade N- como a C-terminal da HA. Em tal configuração, as porções protêicaspodem ser as mesmas ou diferentes moléculas de proteína. Aestrutura de proteínas de fusão com albumina bifuncionaispode ser representada como: X-HA-Y ou Y-HA-X.

Em uma modalidade específica, a proteína TACI oufragmento ou variante desta que pode ser usada nos métodosda invenção pode ser conjugada a uma citotoxina (p. ex., umagente citostático ou citocida). Uma citotoxina ou agentecitotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial àscélulas. Exemplos incluem paclitaxol, citocalasina B, grami-cidina D, brometo de etídeo, emetina, mitomicina, etoposí-deo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, do-xorrubicina, daunorrubicina, diidróxi antracino diona, mito-xantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína,lidocaína, propranolol e puromicina e seus análogos ou homó-logos.

Em outra modalidade, uma proteína ou fragmento ouvariante de TACI que pode ser usada nos métodos da invençãopode ser conjugada a uma toxina.

Por "toxina" entende-se um ou mais compostos quese ligam e ativam sistemas efetores citotóxicos endógenos,radioisótopos, holotoxinas, toxinas modificadas, subunidadescataliticas de toxinas, ou quaisquer moléculas ou enzimasnão presentes normalmente na superfície de uma célula quesob condições definidas causam a morte da célula. Toxinasque podem ser usadas incluem, mas não estão limitadas a, ra-dioisótopos conhecidos na técnica, compostos tal como, porexemplo, anticorpos (ou fixação de complemento contendo por-ções destes) que se ligam a um sistema efetor citotóxico en-dógeno induzido ou inerente, timidina quinase, endonuclease,RNAse, alfa toxina, ricina, abrina, exotoxina A de Pseudomo-nas, toxina diftérica, saporina, momordina, gelonina, prote-ína anti-viral de caruru-de-cacho, alfa-sarcina e toxina docólera. "Toxina" também inclui um agente citostático ou ci-tocida, um agente terapêutico ou um íon metálico radioativo,p. ex., alfa-emitidores tal como, por exemplo, 213Bi, ou ou-tros radioisótopos tal como, por exemplo, 103Pd, 133Xe, 131I,68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 35S, 90Y, 153Sm, 153Gd, 169Yb, 51Cr,54Mn, 75Se, 113Sn, 90Itrio, 117Estanho, 186Rênio, 166Holmio e188Rênio.

Engenharia de proteínas pode ser empregada paramelhorar ou alterar as caracter!sticas de polipeptídeos deTACI que podem ser usados nos métodos da invenção. Tecnolo-gia de DNA recombinante conhecida por aqueles versados natécnica pode ser usada para criar novas proteínas mutantesou "muteínas incluindo substituições, deleções, adições deaminoácidos único ou múltiplos ou proteínas de fusão". Taispolipeptídeos modificados podem mostrar, p. ex., atividademelhorada ou estabilidade aumentada. Além disso, eles podemser purificados em maiores rendimentos e mostrar melhor so-lubilidade que o polipeptídeo natural correspondente, pelomenos sob certas condições de purificação e estocagem.

As proteínas TACI que podem ser usadas nos métodosda invenção podem ser monômeros ou multímeros (isto é, díme-ros, trímeros, tetrâmeros e multímeros maiores). Em modali-dades específicas, os polipeptídeos da invenção são monôme-ros, dímeros, trímeros ou tetrâmeros. Em modalidades adicio-nais, os multímeros da invenção são pelo menos dímeros, pelomenos trímeros, ou pelo menos tetrâmeros. Acredita-se quecertos membros da família TNF existam na forma trimérica(Beutler e Huffel, Science 264: 667, 1994; Banner et al.,Cell 73: 431, 1993). Assim, TCAI trimérica pode oferecer avantagem de atividade biológica acentuada.

Em modalidades específicas, os multímeros podemser homômeros ou heterômeros. Como usado aqui, o termo homô-mero, se refere a um multímero contendo apenas proteínasTACI (incluindo fragmentos, variantes e proteínas de fusão,como descrito aqui). Esses homômeros podem conter proteínasTACI que têm seqüências polipeptídicas idênticas ou diferen-tes. Em uma modalidade específica, um homômero é um multíme-ro contendo apenas proteínas TACI que têm uma seqüência po-lipeptídica idêntica. Em outra modalidade específica, um ho-mômero é um multímero contendo proteínas TACI que têm se-qüências polipeptidicas diferentes.

Conforme aqui utilizado, o termo heterômero se re-fere a um multimero contendo proteínas heterólogas (isto é,proteínas contendo apenas seqüências polipeptidicas que nãocorrespondem à seqüências polipeptidicas codificadas pelogene de TACI) além das proteínas TACI. Multímeros podem sero resultado de associações hidrofóbicas, iônicas e/ou cova-lentes e/ou podem ser ligadas indiretamente, por exemplo,por formação de lipossomo. Assim, em uma modalidade, multí-meros, tal como, por exemplo, homodímeros ou homotrímeros,heterotrímeros ou heterotetrâmeros são formados quando asproteínas entram em contato umas com as outras em solução.Em outras modalidades, multímeros são formados por associa-ções covalentes com e/ou entre as proteínas TACI. Tais asso-ciações covalentes podem envolver um ou mais resíduos de a-minoácidos contidos na seqüência polipeptídica da proteínas.Em um exemplo, as associações covalentes são reticulaçõesentre resíduos de cisteína localizados nas seqüências poli-peptidicas das proteínas que interagem no polipeptídeo nati-vo (isto é, que ocorre naturalmente). Em outro exemplo, asassociações covalentes são a conseqüência de manipulaçãoquímica ou recombinante.

Senão, tais associações covalentes podem envolverum ou mais resíduos de aminoácidos contidos na seqüência po-lipeptídica heteróloga em uma proteína de fusão com TACI. Emum exemplo, as associações covalentes são entre a seqüênciaheteróloga contida em uma proteína de fusão (veja, p. ex.,Patente US Número 5.478.925, os conteúdos da qual são incor-porados como referência aqui em sua totalidade). Em um exem-plo especifico, as associações covalentes são entre a se-qüência heteróloga contida em uma proteína de fusão TACI-Fc(como descrito aqui). Em outro exemplo específico, associa-ções covalentes de proteínas de fusão são entre seqüênciaspolipeptídicas heterólogas de outro membro receptor/ligantede família TNF que é capaz de formar multímeros covalente-mente associados, tal como, por exemplo, osteoprotegerina(veja, p. ex. , Publicação Internacional No. WO 98/49305, osconteúdos da qual são incorporados aqui como referência emsua totalidade) . Em outra modalidade, dois ou mais polipep-tídeos de TACI são unidos através de ligantes sintéticos (p.ex., ligantes peptídicos, de carboidrato ou de polímero so-lúvel) . Exemplos incluem aqueles ligantes peptídicos descri-tos em Pat. US No. 5.073.627 (incorporada por meio deste co-mo referência). Proteínas compreendendo múltiplos polipeptí-deos de TACI separados por ligantes peptídicos podem serproduzidas usando tecnologia do DNA recombinante convencio-nal .

Em uma modalidade específica, anticorpos que seligam a um polipeptídeo de TACI, um fragmento polipeptídico,uma variante de SEQ ID NO: 6 e/ou um epítopo de TACI (comodeterminado por imunoensaios bem conhecidos na técnica paraavaliar ligação antígeno-anticorpo específica) podem ser u-sados nos métodos da invenção. Anticorpos anti-TACI e frag-mentos destes foram descritos em, por exemplo, PublicaçõesPCT WO 04/011611, WO 01/087977, WO 01/60397 e WO 02/66516;Publicação de Patente US US 2005043516 e US 2003012783; eCh' em et al., (2005) Cell Immunol 236: 78-85; e Liu et al.,(2005) Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi 19: 168-169. Cadauma das referências acima mencionadas é incorporada aqui co-mo referência em suas totalidades. Anticorpos incluem, masnão estão limitados a, anticorpos policlonais, monoclonais,multiespecificos, humanos, humanizados ou quiméricos, anti-corpos de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'),fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão deFab, anticorpos antiidiotipicos (anti-Id) (incluindo, p.ex., anticorpos anti-id contra anticorpos anti-TACI) e frag-mentos de ligação a epitopo de quaisquer dos acima. 0 termo"anticorpo", como aqui utilizado, se refere as moléculas deimunoglobulina e porções imunologicamente ativas de molécu-las de imunoglobulinas, isto é, moléculas que contêm um sí-tio de ligação a antigeno que se liga imunoespecificamente aum antigeno. As moléculas de imunoglobulina podem ser dequalquer tipo (p. ex., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clas-se (p. ex., IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2) ou subclassede molécula de imunoglobulina. Em modalidades especificas,as moléculas de imunoglobulina são IgGl. Em outras modalida-des especificas, as moléculas de imunoglobulina são IgG4.

Fragmentos de anticorpo de ligação a TACI que po-dem ser usados nos métodos da invenção incluem, mas não es-tão limitados a, Fab, Fab1 e FCab1)2, Fd, Fvs de cadeia úni-ca (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados por dis-sulfeto (sdFV) e fragmentos compreendendo ou um domínio VLou VH. Fragmentos de anticorpo de ligação a antigeno, inclu-indo anticorpos de cadeia única, podem compreender a(s) re-gião(ões) variável(is) sozinhas ou em combinação com a tota-lidade ou uma porção do seguinte: região de dobra, domíniosCHI, CH2 e CH3. Também incluídos são os fragmentos de liga-ção a antígeno também compreendendo qualquer combinação deregião (ões) variável(is) com uma região de dobra, domíniosCHI, CH2 e CH3. Os anticorpos podem ser de qualquer origemanimal incluindo pássaros e mamíferos. De preferência, osanticorpos são humanos, murinos (p. ex., camundongo e rato),de burro, coelho ship, bode, porquinho-da-índia, camelo, ca-valo ou galinha. Conforme aqui utilizado, anticorpos "huma-nos" incluem anticorpos que têm a seqüência de aminoácidosde uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isoladosde bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais trans-gênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que nãoexpressam imunoglobulinas endógenas, como descrito, por e-xemplo, na Patente US No. 5.939.598 por Kucherlapati et al.,os conteúdos da qual são incorporados aqui como referênciaem suas totalidades.

Anticorpos anti-TACI que podem ser usados nos mé-todos da invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos,triespecíficos ou de maior multiespecificidade. Anticorposmultiespecíficos podem ser específicos para diferentes epí-topos de um polipeptídeo de TACI ou podem ser específicosigualmente para um polipeptídeo de TACI assim como para umepítopo heterólogo, tal como um polipeptídeo heterólogo oumaterial de suporte sólido. Veja, p. ex., Publicações PCT WO93/17715 WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al.,J Immunol 147: 60-69 (1991); Patentes US Nos. 4.474.893,4.714.681, 4.925.648, 5.573.920, 5.601.819; Kostelny et al.,J Immunol 148: 1547-1553 (1992), os conteúdos das quais sãoincorporados aqui como referência em sua totalidade.

Anticorpos de TACI podem ser descritos ou especi-ficados em termos de sua reatividade cruzada. Anticorpos quenão se ligam a qualquer outro análogo, ortólogo ou homólogode um polipeptideo de TACI podem ser usados nos métodos dainvenção. Em modalidades especificas, anticorpos TACI reagemcruzadamente com homólogos murinos, de rato e/ou de coelhode proteínas TACI humanas e seus epítopos correspondentes.Em uma modalidade específica, um anticorpo anti-TACI que po-de ser usado nos métodos da invenção se liga não apenas aTACI, mas também se liga a BCMA e BAFF-R.

Anticorpos de TACI que podem ser usados nos méto-dos da invenção podem ser descritos ou especificados em ter-mos de suas afinidades de ligação a um polipeptideo de TACI.Afinidades de ligação preferidas incluem aquelas com umaconstante de dissociação ou Kd de menor que de ou igual a 5 X10"9 Μ, 10"9 M, 5 X 10"10 Μ, 10"10 M, 5 X 10"11 Μ, 10"11 M, 5 X10"12 M, ou 10"12 M.

Anticorpos de TACI que podem ser usados nos méto-dos da invenção podem agir como agonistas ou antagonistasdos polipeptídeos de TACI. Por exemplo, anticorpos de TACIque perturbam as interações receptor/ligante com os polipep-tídeos de TACI parcialmente ou completamente são incluídos.Também são incluídos anticorpos específicos a receptor quenão previnem ligação de ligante, mas previnem ativação dereceptor. Ativação de receptor (isto é, sinalização) podeser determinada por técnicas descritas aqui ou de outro modoconhecidas na técnica. Por exemplo, ativação de receptor po-de ser determinada pela detecção de ativação dos fatores detranscrição NF-AT, AP-1, e/ou NF-capaB usando técnicas co-nhecidas na técnica, e/ou a fosforilação (p. ex., tirosinaou serina/treonina) do receptor ou seu substrato por imuno-precipitação seguida de análise por western blot.

Em uma modalidade especifica, anticorpos de TACIespecíficos a receptor que tanto previnem a ligação de Ii-gante como a ativação de receptor, assim como anticorpos deTACI que reconhecem o complexo ligante receptor e, de prefe-rência, não reconhecem especificamente o receptor não ligadoou o ligante não ligado podem ser usados nos métodos da in-venção. Os anticorpos de TACI acima podem ser feitos usandométodos conhecidos conhecidos na técnica. Veja, p. ex. , Pu-blicação PCT WO 96/40281; Patente US No. 5.811.097; Deng etal., Blood 92(6): 1981-1988 (1998); Chen et al., Câncer Res58(16): 3668-3678 (1998); Harrop et al., J Immunol 161(4):1786-1794 (1998); Zhu et al., Câncer Res 58(15): 3209-3214(1998) ; Yoon et al., J Immunol 160(7): 3170-3179 (1998);Prat et al., J Cell Sci 111(Pt2): 237-247 (1998); Pitard etal., J Immunol Methods 205(2): 177-190 (1997); Liautard etal., Cytokine 9(4): 233-241 (1997); Carlson et al., J BiolChem 272(17) : 11295-11301 (1997); Taryman et al., Neuron14(4): 755-762 (1995); Muller et al., Structure 6(9): 1153-1167 (1998); Bartunek et al., Cytokine 8(1): 14-20 (1996)(que são todas incorporadas como referência aqui em suas to-talidades).Ε. Receptor de neutrocina-alfa, BCMA

Polipeptideos de BCMA, tal como aqueles descritosabaixo, agem como antagonistas de neutrocina-alfa e/ou APRILe também podem ser usados nos métodos da presente invenção.BCMA, também conhecido como TR18, é uma proteína de 184 re-síduos de aminoácidos (SEQ ID NO: 8), com um peso moleculardeduzido de cerca de 20,1 kDa. Uma seqüência nucleotídica deum cDNA que codifica BCMA é dada em SEQ ID NO: 7. Aminoáci-dos preditos de cerca de 1 até cerca de 54 constituem o do-mínio extracelular (SEQ ID NO: 8); aminoácidos de cerca de55 até cerca de 80 constituem o domínio transmembrana (SEQID NO: 8); e aminoácidos de cerca de 81 até cerca de 184constituem o domínio intracelular (SEQ ID NO: 8).

Conseqüentemente, em uma modalidade, uma proteínaBCMA que pode ser usada nos métodos da presente invenção éum polipeptídeo isolado compreendendo, ou senão consistindona seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, ou um polipep-tídeo compreendendo, ou senão, consistindo na porção de SEQID NO: 8, tal como, por exemplo, o domínio extracelular deBCMA (compreendendo aminoácidos 1 até 54 de SEQ ID NO: 8)e/ou o domínio rico em cisteína de BCMA (compreendendo ami-noácidos 8 até 41 de SEQ ID NO: 8); assim como polipeptídeosque possuem pelo menos 80% de identidade, de maior preferên-cia pelo menos 90% ou 95% de identidade, ainda de maior pre-ferência pelo menos 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidadecom os polipeptídeos descritos acima.

Por um polipeptídeo que tem uma seqüência de ami-noácidos com pelo menos, por exemplo, 95% de "identidade" auma seqüência de aminoácidos de referência de um polipeptí-deo BCMA entende-se que a seqüência de aminoácidos do poli-peptideo possui identidade com a seqüência de referência ex-ceto que a seqüência polipeptidica pode incluir até cincoalterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos do amino-ácido de referência do receptor BCMA. Em outras palavras,para obter um polipeptideo que tem uma seqüência de aminoá-cidos com pelo menos 95% de identidade com a seqüência deaminoácidos de referência, até 5% dos resíduos de aminoáci-dos na seqüência de referência podem ser deletados ou subs-tituídos por outro aminoácido, ou vários aminoácidos até 5%do total de resíduos de aminoácidos na seqüência de referên-cia podem ser inseridos na seqüência de referência. Essasalterações da seqüência de referência podem ocorrer nas po-sições amino ou carbóxi-terminais da seqüência de aminoáci-dos de referência ou em qualquer lugar entre aquelas posi-ções terminais, entremeadas individualmente entre resíduosna seqüência de referência ou em um ou mais grupos contíguosna seqüência de referência.

Fragmentos polipeptídicos de BCMA incluem polipep-tídeos compreendendo ou senão, consistindo em: uma seqüênciade aminoácidos contida em SEQ ID NO: 8. Fragmentos polipep-tídicos podem ser "independentes" ou compreendidos por umpolipeptideo maior do qual o fragmento forma uma parte ouregião, da maior preferência como uma região contígua única.Em modalidades adicionais, os fragmentos de polipeptideocompreendem, ou senão consistem em, um ou mais domíniosBCMA. Fragmentos polipeptídicos preferidos incluem um membroselecionado do grupo: (a) um polipeptideo compreendendo ousenão, consistindo no domínio extracelular de BCHA (preditocomo constituindo os resíduos de aminoácidos de cerca de 1até cerca de 54 de SEQ ID NO: 8) ; (b) um polipeptideo com-preendendo ou senão, consistindo em, um domínio rico em cis-terna de BCMA (predito como constituindo os resíduos de ami-noácidos de cerca de 8 até cerca de 41 de SEQ ID NO: 8); (c)um polipeptideo compreendendo ou senão, consistindo no domí-nio transmembrana de BCMA (predito como constituindo os re-síduos de aminoácidos de cerca de 55 até cerca de 80 de SEQID NO: 8); (d) um polipeptideo compreendendo ou senão, con-sistindo no domínio intracelular de BCMA (predito como cons-tituindo os resíduos de aminoácidos de cerca de 81 até cercade 184 de SEQ ID NO: 8); ou (e) qualquer combinação de poli-peptídeos (a)-(d).

Acredita-se que os motivos ricos em cisteína deBCMA sejam importantes para interações entre BCMA e seus Ii-gantes, neutrocina-alfa e APRIL. Conseqüentemente, em moda-lidades preferidas, fragmentos polipeptídicos de BCMA quepodem ser usados nos métodos da presente invenção compreen-dem, ou senão consistem na seqüência de aminoácidos de resí-duos de aminoácidos 8 até 41 de SEQ ID NO: 8. Proteínas com-preendendo ou senão consistindo em uma seqüência polipeptí-dica que possui pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou99% de identidade com as seqüências polipeptídicas do moti-vos rico em cisteína também são preferidas.

Outros fragmentos da proteína de BCMA que podemser usados nos métodos da invenção são fragmentos caracteri-zados por atributos funcionais ou estruturais de BCMA. Taisfragmentos incluem resíduos de aminoácidos que compreendemregiões de alfa-hélice e formadoras de alfa-hélice ("regiõesalfa"), regiões de folha beta e formadoras de folha beta("regiões beta"), regiões de volta e formadoras de coita("regiões de volta"), regiões espirais e formadoras de espi-ral ("regiões espirais"), regiões hidrofilicas, regiões hi-drofóbicas, regiões antipáticas alfa, regiões antipáticasbeta, regiões formadoras de superfície e regiões de alto ín-dice antigênico (isto é, contendo quatro ou mais aminoácidoscontíguos que têm um índice antigênico maior que ou igual a1,5, como identificado usando os parâmetros padrões do pro-grama de Jameson-Wolf) de BCMA (SEQ ID NO: 8) completa (istoé, inteira) como é discutido no Pedido de Patente US No.10/786.176. Certas regiões preferidas incluem, mas não estãolimitadas a, regiões alfa, regiões beta, regiões de volta eregiões espirais preditas por Garnier-Robson; regiões alfa,regiões beta e regiões de volta preditas por Chou-Fasman;hidrofílicas preditas por Kyte-Doolittle; regiões hidrofóbi-cas preditas por Hopp-Woods; regiões antipáticas alfa e betapreditas por Eisenberg; regiões formadoras de superfície deEmini; e regiões de alto índice antigênico de Jameson-Wolf,como predito usando os parâmetros padrões desses programasde computador.

O polipeptídeo BCMA para uso nos métodos da inven-ção pode ser expressado em uma forma modificada, tal comouma proteína de fusão (compreendendo o polipeptídeo unidoatravés de uma ligação peptídica a uma seqüência de proteínaheteróloga (de uma proteína diferente)) e pode incluir nãoapenas sinais de secreção, mas também regiões funcionais he-terólogas adicionais. Senão, tal proteína de fusão pode serfeita por técnicas de síntese de proteína, p. ex., por usode um sintetizador peptídico. Assim, uma região de aminoáci-dos adicionais, particularmente aminoácidos carregados, podeser adicionada à extremidade N-terminal do polipeptídeo paramelhorar a estabilidade e persistência na célula hospedeira,durante a purificação ou durante manuseio e estocagem subse-qüentes. Além disso, unidades peptídicas podem ser adiciona-das ao polipeptídeo para facilitar a purificação. Tais regi-ões podem ser removidas antes da preparação final do poli-peptídeo. A adição de unidades peptídicas a polipeptídeospara engendrar secreção ou excreção, para melhorar a estabi-lidade e para facilitar a purificação, entre outros, é téc-nica familiar e rotineira na técnica.

Uma proteína de fusão de BCMA preferida que podeser usada nos métodos da invenção compreende uma região he-teróloga de imunoglobulina que é útil para solubilizar pro-teínas. Por exemplo, EP-A-O 464 533 (equivalente canadense2045869) e W000/024782 divulgam proteínas de fusão compreen-dendo várias porções de região constante de moléculas de i-munoglobulina junto com outra proteína humana ou parte des-ta. Proteínas de fusão de imunoglobulina e BCMA foram des-critas em, por exemplo, Publicações PCT WO 01/087977, WO01/60397 e WO 01/24811 e Gross et al., (2000) Nature 404:995-999, Thompson, et al., (2000) J Exp Med 192: 129-135 eYu et al(2000) Nat Immunol 1: 252-256, aqui incorporadascomo referências em suas totalidades. Em muitos casos, aparte Fc em uma proteína de fusão é completamente vantajosapara uso na terapia e diagnóstico e assim resulta, por exem-plo, em propriedades farmacocinéticas melhoradas (EP-A 0232262) . Por outro lado, para alguns usos, seria desejável sercapaz de excluir a parte Fc após a proteína de fusão ter si-do expressa, detectada e purificada da maneira vantajosadescrita. Este é o caso quando a porção Fc prova ser um obs-táculo para uso na terapia e diagnóstico, por exemplo, quan-do a proteína de fusão é para ser usada como antígeno paraimunizações. Na descoberta de fármacos, por exemplo, proteí-nas humanas, tal como receptor de hIL-5 foram fusionadas aporções Fc com a finalidade de ensaios de triagem/varredurade alta carga de entrada para identificar antagonistas dehIL-5. Veja, D. Bennett et al., Journal of Molecular Recog-nition 8: 52-58 (1995) e K. Johanson et al., The Journal ofBiological Chemistry 270: 9459-9471 (1995).

Como alguém versado na técnica apreciará e comodiscutido acima, os polipeptídeos de BCMA podem ser fusiona-dos a outras seqüências polipeptídicas. Por exemplo, os po-lipeptídeos de BCMA podem ser fusionados com o domínio cons-tante de imunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM), ou porçõesdestes (CHI, CH2, CH3, ou qualquer combinação destes e por-ções destes), ou albumina (incluindo, mas não limitando aalbumina humana recombinante ou fragmentos ou variantes des-ta (veja, p. ex. , Patente US No. 5.876.969, divulgada em 2de março de 1999, Patente EP O 413 622 e Patente US No.5.766.883, divulgada em 16 de junho de 1998, incorporadasaqui como referência em suas totalidades)), resultando empolipeptideos quiméricos.

Tais proteínas de fusão podem facilitar a purifi-cação, podem estender a vida de prateleira e podem aumentara meia-vida in vivo. Isto foi demonstrado para proteínasquiméricas consistindo nos primeiros dois domínios do poli-peptídeo-CD4 humano e vários domínios das regiões constantesdas cadeias pesada ou leve de imunoglobulinas de mamíferos.Veja, p. ex., EP 394.827; Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (1988). Distribuição melhorada de um antígeno atravésda barreira epitelial do sistema imune foi demonstrada paraantígenos (p. ex., insulina) conjugados a um par de ligaçãode FcRn tal como fragmentos Fc ou IgG (veja, p. ex., Publi-cações PCT WO 96/22024 e WO 99/04813). Proteínas de fusão deIgG que têm uma estrutura dimérica ligada por dissulfeto de-vido às ligações dissulfeto de porção de IgG também foramdemonstradas como sendo mais eficientes na ligação a e neu-tralização de outras moléculas que polipeptideos monoméricosou fragmentos destes sozinhos. Veja, p. ex., Fountoulakis etal., J Biochem 270: 3958-3964 (1995).

Uma proteína de fusão com albumina que pode serusada nos métodos da presente invenção compreende pelo menosum fragmento ou variante de um polipeptídeo de BCMA e pelomenos um fragmento ou variante de albumina sérica humana,que estão associados um com o outro, de preferência por fu-são genética (isto é, a proteína de fusão com albumina é ge-rada por tradução de um ácido nuclêico em que um polinucleo-tídeo que codifica toda a BCMA ou uma porção é unido na mes-ma fase de leitura com um polinucleotideo que codifica todaa albumina ou uma porção) ou conjugação quimica um ao outro.0 polipeptideo de BCMA e a proteína albumina, uma vez parteda proteína de fusão com albumina, podem ser referidos comouma "porção", "região" ou "unidade" da proteína de fusão comalbumina (p. ex., uma "porção TACI" ou uma "porção de prote-ína albumina").

Em uma modalidade, uma proteína de fusão com albu-mina que pode ser usada nos métodos da invenção compreende,ou senão consiste em, um polipeptideo de BCMA e uma proteínaalbumina sérica. Em outras modalidades, uma proteína de fu-são com albumina que pode ser usada nos métodos da invençãocompreende, ou senão consiste em, um fragmento de BCMA e umaproteína albumina sérica. Em outras modalidades, uma proteí- na de fusão com albumina que pode ser usada nos métodos dainvenção compreende, ou senão consiste em, uma variante deBCMA e uma proteína albumina sérica. Em modalidades preferi-das, o componente de proteína albumina sérica da proteína defusão com albumina é a porção madura da albumina sérica.

Em modalidades adicionais, uma proteína de fusãocom albumina que pode ser usada nos métodos da invenção com-preende, ou senão consiste em, um polipeptideo de BCMA e umfragmento de albumina sérica biologicamente ativo e/ou tera-peuticamente ativo. Em modalidades adicionais, uma proteína de fusão com albumina que pode ser usada nos métodos da in-venção compreende, ou senão consiste em, um polipeptideo deBCMA e uma variante de albumina sérica biologicamente ativae/ou terapeuticamente ativa. Em modalidades preferidas, aporção de BCMA da proteína de fusão com albumina é o poli-peptídeo de BCMA completo. Em uma modalidade preferida adi-cional, a porção BCMA da proteína de fusão com albumina é odomínio maduro, solúvel do polipeptídeo de BCMA.

Em modalidades adicionais, uma proteína de fusãocom albumina que pode ser usada nos métodos da invenção com-preende, ou senão consiste em, um fragmento ou variante deBCMA e um fragmento ou variante biologicamente ativo e/outerapeuticamente ativo de albumina sérica. Em modalidadespreferidas, a invenção provê uma proteína de fusão com albu-mina que compreende, ou senão consiste na porção madura dopolipeptídeo de BCMA e na porção madura da albumina sérica.

Em modalidades adicionais, uma proteína de fusãocom albumina que pode ser usada nos métodos da invenção com-preende, ou senão consiste em, um fragmento ou variante deBCMA e um fragmento ou variante biologicamente ativo e/outerapeuticamente ativo de albumina sérica. Em modalidadespreferidas, a invenção provê uma proteína de fusão com albu-mina que compreende, ou senão consiste na porção madura dopolipeptídeo de BCMA e na porção madura da albumina sérica(incluindo, mas não limitando à albumina sérica humana re-combinante ou fragmentos ou variantes desta (veja, p. ex.,Patente US No. 5.876.969, divulgada em 2 de março de 1999,Patente EP 0 413 622 e Patente US No. 5.766.883, divulgadaem 16 de junho de 1998, incorporadas aqui como referência emsuas totalidades)). Em uma modalidade preferida, polipeptí-deos de BCMA (incluindo fragmentos ou variantes destes) sãofusionados à forma madura de albumina sérica humana (isto é,aminoácidos 1-585 de albumina sérica humana como mostradonas Figuras 1 e 2 de Patente EP 0 322 094) que são incorpo-rados aqui como referência em sua totalidade. Em outra moda-lidade preferida, anticorpos da presente invenção (incluindofragmentos ou variantes destes) são fusionados a fragmentospolipeptidicos que compreendem, ou senão consistem em, resí-duos de aminoácidos 1-x de albumina sérica humana, onde χ éum número inteiro de 1 até 585 e o fragmento de albumina tematividade de albumina sérica humana. Em outra modalidadepreferida, polipeptídeos de BCMA (incluindo fragmentos ouvariantes destes) são fusionados a fragmentos polipeptidicosque compreendem, ou senão consiste em, resíduos de aminoáci-dos 1-z de albumina sérica humana, onde ζ é um número intei-ro de 369 até 419, como descrito na Patente US 5.766.883 in- corporada aqui como referência em sua totalidade. Polipeptí-deos de BCMA (incluindo fragmentos. ou variantes destes) po-dem ser fusionados ou à extremidade N- ou à C-terminal daproteína heteróloga (p. ex., polipeptídeo de Fc de imunoglo-bulina ou polipeptídeo de albumina sérica humana).

Em modalidades preferidas, a proteína de albuminasérica humana usada nas proteínas de fusão com albumina quepode ser usada nos métodos da invenção contém um ou ambosdos seguintes grupos de mutações pontuais com referência àSEQ ID NO: 11: Leu407 para Ala, Leu408 para Vai, Val409 paraAla e Arg410 para Ala; ou Arg410 para A, Lys413 para Gln eLys414 para Gln (veja, p. ex., Publicação Internacional No.W095/23857, incorporada por meio deste em sua totalidade co-mo referência aqui). Em modalidades ainda mais preferidas,proteínas de fusão com albumina que podem ser usadas nos mé-todos da invenção que contêm um ou ambos dos grupos acimadescritos de mutações pontuais têm estabilidade/resistênciamelhorada à clivagem proteolítica pela Yap3p de levedura,permitindo produção aumentada de proteínas de fusão com al-bumina recombinantes expressadas em células hospedeiras delevedura.

De preferência, a proteína de fusão com albuminaque pode ser usada nos métodos da invenção compreende HA co-mo a porção N-terminal e polipeptídeo de BCMA como a porçãoC-terminal. Senão, uma proteína de fusão com albumina com-preendendo HA como a porção C-terminal e polipeptídeo deBCMA como a porção N-terminal também pode ser usada.

Em outras modalidades, a proteína de fusão com al-bumina que pode ser usada nos métodos da invenção tem um po-lipeptídeo de BCMA fusionado tanto na extremidade N-terminalcomo na C-terminal de albumina. Em uma modalidade específi-ca, os polipeptídeos de BCMA fusionados nas extremidades N-e C-terminais são os mesmos. Em outra modalidade, os poli-peptídeos de BCMA fusionados nas extremidades N- e C-terminais são polipeptídeos de BCMA diferentes. Em outra mo-dalidade, um polipeptídeo de BCMA é fusionado fusionado ouna extremidade N-terminal ou na C-terminal de albumina e umpolipeptídeo heterólogo é fusionado na extremidade remanes-cente .

Adicionalmente, as proteínas de fusão com albuminaque podem ser usadas nos métodos da invenção podem incluirum peptídeo de ligação entre as porções fusionadas para pro-ver maior separação física entre as unidades. O peptideo deligação pode consistir em aminoácidos tal que ele seja fle-xível ou mais rígido.

Geralmente, as proteínas de fusão com albumina quepodem ser usadas nos métodos da invenção podem ter uma regi-ão derivada de HA e uma região de BCMA. Múltiplas regiões decada proteína, entretanto, podem ser usadas para fazer umaproteína de fusão com albumina que pode ser usada nos méto-dos da invenção. De modo similar, mais de uma proteína podemser usadas para fazer uma proteína de fusão com albumina quepode ser usada nos métodos da invenção. Por exemplo, umaproteína pode ser fusionada tanto à extremidade N- como a C-terminal da HA. Em tal configuração, as porções protêicaspodem ser as mesmas ou diferentes moléculas de proteína. Aestrutura de proteínas de fusão com albumina bifuncionaispode ser representada como: X-HA-Y ou Y-HA-X.

Em uma modalidade específica, a proteína BCMA oufragmento ou variante desta que pode ser usada nos métodosda invenção pode ser conjugada a uma citotoxina (p. ex., umagente citostático ou citocida). Uma citotoxina ou agentecitotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial àscélulas. Exemplos incluem paclitaxol, citocalasina B, grami-cidina D, brometo de etídeo, emetina, mitomicina, etoposí-deo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, do-xorrubicina, daunorrubicina, diidróxi antracino diona, mito-xantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína,lidocaína, propranolol e puromicina e seus análogos ou homó-logos.

Em outra modalidade, uma proteína ou fragmento ouvariante de BCMA que pode ser usada nos métodos da invençãopode ser conjugada a uma toxina.

Por "toxina" entende-se um ou mais compostos quese ligam e ativam sistemas efetores citotóxicos endógenos,radioisótopos, holotoxinas, toxinas modificadas, subunidadescatalíticas de toxinas, ou quaisquer moléculas ou enzimasnão presentes normalmente na superfície de uma célula que1Ú sob condições definidas causam a morte da célula. Toxinasque podem ser usadas incluem, mas não estão limitadas a, ra-dioisótopos conhecidos na técnica, compostos tal como, porexemplo, anticorpos (ou fixação de complemento contendo por-ções destes) que se ligam a um sistema efetor citotóxico en-dógeno induzido ou inerente, timidina quinase, endonuclease,RNAse, alfa toxina, ricina, abrina, exotoxina A de Pseudomo-nas, toxina diftérica, saporina, momordina, gelonina, prote-ína anti-viral de caruru-de-cacho, alfa-sarcina e toxina docólera. "Toxina" também inclui um agente citostático ou ci-tocida, um agente terapêutico ou um íon metálico radioativo,p. ex. , alfa-emitidores tal como, por exemplo, 213Bi, ou ou-tros radioisótopos tal como, por exemplo, 103Pd, 133Xe, 131I,68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 35S, 90Y, 153Sm, 153Gd, 169Yb, 51Cr,54Mn, 75Se, 113Sn, 90Itrio, 117Estanho, 186Rênio, 166Holmio e188Renio.

Engenharia de proteínas pode ser empregada paramelhorar ou alterar as características de polipeptídeos deBCMA que podem ser usados nos métodos da invenção. Tecnolo-gia de DNA recombinante conhecida por aqueles versados natécnica pode ser usada para criar novas proteínas mutantesou "muteinas incluindo substituições, deleções, adições deaminoácidos único ou múltiplos ou proteínas de fusão". Taispolipeptídeos modificados podem mostrar, p. ex., atividademelhorada ou estabilidade aumentada. Além disso, eles podemser purificados em maiores rendimentos e mostrar melhor so-lubilidade que o polipeptídeo natural correspondente, pelomenos sob certas condições de purificação e estocagem. Em ainda outra modalidade da invenção, o mutante de polipeptí-deo BCMA pode ser um "dominante negativo". Para este fim,polipeptídeos de BCMA defectivos, tal como, por exemplo, mu-tantes que carecem de todo ou de uma porção do domínio con-servado de TNF, podem ser usados para diminuir a atividadede BCMA. Os polipeptídeos de BCMA não funcionais serão mon-tados para formar um receptor (p. ex., multímero) que podeser capaz de se ligar, mas que é incapaz de induzir transdu-ção de sinal.

As proteínas de BCMA que podem ser usadas nos mé-todos da invenção podem estar em monômeros ou multímeros(isto é, dímeros, trímeros, tetrâmeros e multímeros maio-res) . Em modalidades específicas, os polipeptídeos da inven-ção são monômeros, dímeros, trímeros ou tetrâmeros. Em moda-lidades adicionais, os multímeros da invenção são pelo menos dímeros, pelo menos trímeros, ou pelo menos tetrâmeros. A-credita-se que certos membros da família TNF existam na for-ma trimérica' (Beutler e Huffel, Science 264: 667, 1994; Ban-ner et al., Cell 73: 431, 1993). Assim, BCMA trimérica podeoferecer a vantagem de atividade biológica acentuada.

Em modalidades especificas, os multímeros podemser homômeros ou heterômeros. Como usado aqui, o termo homô-mero, se refere a um multimero contendo apenas proteínasBCMA (incluindo fragmentos, variantes e proteínas de fusão,como descrito aqui). Esses homômeros podem conter proteínasBCMA que têm seqüências polipeptídicas idênticas ou diferen-tes. Em uma modalidade específica, um homômero é um multime-ro contendo apenas proteínas BCMA que têm uma seqüência po- lipeptídica idêntica. Em outra modalidade específica, um ho-mômero é um multimero contendo proteínas BCMA que têm se-qüências polipeptídicas diferentes.

Conforme aqui utilizado, o termo heterômero se re-fere a um multimero contendo proteínas heterólogas (isto é,proteínas contendo apenas seqüências polipeptídicas que nãocorrespondem à seqüências polipeptídicas codificadas pelogene de BCMA) além das proteínas BCMA. Multímeros podem sero resultado de associações hidrofóbicas, iônicas e/ou cova-lentes e/ou podem ser ligadas indiretamente, por exemplo,por formação de lipossomo. Assim, em uma modalidade, multí-meros, tal como, por exemplo, homodímeros ou homotrímeros,heterotrímeros ou heterotetrâmeros são formados quando asproteínas entram em contato umas com as outras em solução.Em outras modalidades, multímeros são formados por associa-ções covalentes com e/ou entre as proteínas BCMA. Tais asso-ciações covalentes podem envolver um ou mais resíduos de a-minoácidos contidos na seqüência polipeptídica da proteínas.Em um exemplo, as associações covalentes são reticulaçõesentre resíduos de cisteina localizados nas seqüências poli-peptidicas das proteínas que interagem no polipeptideo nati-vo (isto é, que ocorre naturalmente). Em outro exemplo, asassociações covalentes são a conseqüência de manipulaçãoquímica ou recombinante.

Senão, tais associações covalentes podem envolverum ou mais resíduos de aminoácidos contidos na seqüência po-lipeptídica heteróloga em uma proteína de fusão com BCMA. Emum exemplo, as associações covalentes são entre a seqüênciaheteróloga contida em uma proteína de fusão (veja, p. ex. ,Patente US Número 5.478.925, os conteúdos da qual são incor-porados como referência aqui em sua totalidade). Em um exem-plo específico, as associações covalentes são entre a se-qüência heteróloga contida em uma proteína de fusão BCMA-Fc(como descrito aqui) . Em outro exemplo específico, associa-ções covalentes de proteínas de fusão são entre seqüênciaspolipeptídicas heterólogas de outro membro receptor/ligantede família TNF que é capaz de formar multímeros covalente-mente associados, tal como, por exemplo, osteoprotegerina(veja, p. ex., Publicação Internacional No. WO 98/49305, osconteúdos da qual são incorporados aqui como referência emsua totalidade). Em outra modalidade, dois ou mais polipep-tídeos de BCMA são unidos através de ligantes sintéticos (p.ex., ligantes peptídicos, de carboidrato ou de polímero so-lúvel). Exemplos incluem aqueles ligantes peptídicos descri-tos em Pat. US No. 5.073.627 (incorporada por meio deste co-mo referência). Proteínas compreendendo múltiplos polipeptí-deos de BCMA separados por ligantes peptídicos podem serproduzidas usando tecnologia do DNA recombinante convencio-nal .

Em uma modalidade especifica, anticorpos que seligam a um polipeptideo de BCMA, um fragmento polipeptidico,uma variante de SEQ ID NO: 8 e/ou um epitopo polipeptidicode BCMA (como determinado por imunoensaios bem conhecidos natécnica para avaliar ligação antigeno-anticorpo especifica)podem ser usados nos métodos da invenção. Anticorpos anti-BCMA e fragmentos destes foram descritos em, por exemplo,Publicações PCT WO 01/087977, WO 01/60397 e WO 02/66516; eCh' em et al., (2005) Cell Immunol 236: 78-85. Cada uma dasreferências acima mencionadas é incorporada aqui como refe-rência em suas totalidades. Anticorpos incluem, mas não es-tão limitados a, anticorpos policlonais, monoclonais, multi- específicos, humanos, humanizados ou quiméricos, anticorposde cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmen-tos piroduzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anti-corpos antiidiotípicos (anti-Id) (incluindo, p. ex., anti-corpos anti-id contra anticorpos anti-BCMA) e fragmentos de ligação a epitopo de quaisquer dos acima. 0 termo "anticor-po", como aqui utilizado, se refere a moléculas de imunoglo-bulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de i-munoglobulinas, isto é, moléculas que contêm um sítio de li-gação a antígeno que se liga imunoespecificamente a um antí- geno. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquertipo (p. ex., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (p.ex., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2) ou subclasse de mo-lécula de imunoglobulina. Em modalidades específicas, as mo-léculas de imunoglobulina são IgGl. Em outras modalidadesespecificas, as moléculas de imunoglobulina são IgG4.

Fragmentos de anticorpo de ligação a BCMA que po-dem ser usados nos métodos da invenção incluem, mas não es-tão limitados a, Fab, Fab1 e F(ab')2, Fd, Fvs de cadeia úni-ca (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados por dis-sulfeto (sdFV) e fragmentos compreendendo ou um domínio VLou VH. Fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno, inclu-indo anticorpos de cadeia única, podem compreender a(s) re-gião(Ões) variável(is) sozinhas ou em combinação com a tota-lidade ou uma porção do seguinte: região de dobra, domíniosCHI, CH2 e CH3. Também incluídos são os fragmentos de liga-ção a antígeno também compreendendo qualquer combinação deregião(ões) variável (is) com uma região de dobra, domíniosCHI, CH2 e CH3. Os anticorpos podem ser de qualquer origemanimal incluindo pássaros e mamíferos. De preferência, osanticorpos são humanos, murinos (p. ex., camundongo e rato),de burro, coelho ship, bode, porquinho-da-índia, camelo, ca-valo ou galinha. Conforme aqui utilizado, anticorpos "huma-nos" incluem anticorpos que têm a seqüência de aminoácidosde uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isoladosde bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais trans-gênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que nãoexpressam imunoglobulinas endógenas, como descrito, por e-xemplo, na Patente US No. 5.939.598 por Kucherlapati et al.,os conteúdos da qual são incorporados aqui como referênciaem suas totalidades.

Anticorpos anti-BCMA que podem ser usados nos mé-todos da invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos,triespecíficos ou de maior multiespecificidade. Anticorposmultiespecificos podem ser específicos para diferentes epí-topos de um polipeptídeo de BCMA ou podem ser específicosigualmente para um polipeptídeo de BCMA assim como para umepítopo heterólogo, tal como um polipeptídeo heterólogo oumaterial de suporte sólido. Veja, p. ex., Publicações PCT WO93/17715 WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al.,J Immunol 147: 60-69 (1991); Patentes US Nos. 4.474.893,4.714.681, 4.925.648, 5.573.920, 5.601.819; Kostelny et al.,J Immunol 148: 1547-1553 (1992), os conteúdos das quais sãoincorporados aqui como referência em sua totalidade.

Anticorpos de BCMA podem ser descritos ou especi-ficados em termos de sua reatividade cruzada. Anticorpos quenão se ligam a qualquer outro análogo, ortólogo ou homólogode um polipeptídeo de BCMA podem ser usados nos métodos dainvenção. Em modalidades específicas, anticorpos BCMA reagemcruzadamente com homólogos murinos, de rato e/ou de coelhode proteínas BCMA humanas e seus epítopos correspondentes.Em uma modalidade específica, um anticorpo anti-BCMA que po-de ser usado nos métodos da invenção se liga não apenas aBCMA, mas também se liga a TACI e BAFF-R.

Anticorpos de BCMA que podem ser usados nos méto-dos da invenção também podem ser descritos ou especificadosem termos de suas afinidades de ligação a um polipeptídeo deBCMA. Afinidades de ligação preferidas incluem aquelas comuma constante de dissociação ou K0 de menor que de ou igual a5 X IO"9 Μ. IO"9 M. 5 X IO"10 Μ. IO"10 M, 5 X IO"11 Μ. IO"11 M. 5X 10 12 Μ, ou 10 12 Μ.

Anticorpos de BCMA que podem ser usados nos méto-dos da invenção podem agir como agonistas ou antagonistasdos polipeptideos de BCMA. Por exemplo, anticorpos de BCMAque perturbam as interações receptor/ligante com os polipep-tideos de BCMA parcialmente ou completamente são incluídos.Também são incluídos anticorpos específicos a receptor quenão previnem ligação de ligante, mas previnem ativação dereceptor. Ativação de receptor (isto é, sinalização) podeser determinada por técnicas descritas aqui ou de outro modoconhecidas na técnica. Por exemplo, ativação de receptor po-de ser determinada pela detecção de ativação dos fatores detranscrição NF-AT, AP-1, e/ou NF-capaB usando técnicas co-nhecidas na técnica, e/ou a fosforilação (p. ex., tirosinaou serina/treonina) do receptor ou seu substrato por imuno-precipitação seguida de análise por western blot.

Em uma modalidade específica, anticorpos de BCMAespecíficos a receptor que tanto previnem a ligação de li-gante como a ativação de receptor, assim como anticorpos deBCMA que reconhecem o complexo ligante receptor e, de prefe-rência, não reconhecem especificamente o receptor não ligadoou o ligante não ligado podem ser usados nos métodos da in-venção. Os anticorpos de BCMA acima podem ser feitos usandométodos conhecidos conhecidos na técnica. Veja, p. ex., Pu-blicação PCT WO 96/40281; Patente US No. 5.811.097; Deng etal., Blood 92(6) : 1981-1988 (1998); Chen et al., Câncer Res58(16): 3668-3678 (1998); Harrop et al., J Immunol 161(4):1786-1794 (1998); Zhu et al., Câncer Res 58(15): 3209-3214(1998); Yoon et al., J Immunol 160(7): 3170-3179 (1998);Prat et al., J Cell Sci 111(Pt2): 237-247 (1998); Pitard etal., J Immunol Methods 205(2): 177-190 (1997); Liautard etal., Cytokine 9(4): 233-241 (1997); Carlson et al., J BiolChem 272(17):11295-11301 (1997); Taryman et al., Neuron14(4): 755-762 (1995); Muller et al., Structure 6(9): 1153-1167 (1998); Bartunek et al., Cytokine 8(1): 14-20 (1996)(que são todas incorporadas como referência aqui em suas to-talidades).

F. Receptor de neutrocina-alfa, BAFF-RPolipeptideos de BAFF-R, tal como aqueles descri-tos abaixo, agem como antagonistas de neutrocina-alfa e/ouAPRIL e também podem ser usados nos métodos da presente in-venção. BAFF-R, também conhecido como TR21, é uma proteínade 184 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO: 10), com um pesomolecular deduzido de cerca de 18,9 kDa. Uma seqüência, nu-cleotídica de um cDNA que codifica BAFF-R é dada em SEQ IDNO: 9. Aminoácidos preditos de cerca de 1 até cerca de 81constituem o domínio extracelular (SEQ ID NO: 10); aminoáci-dos de cerca de 82 até cerca de 101 constituem o domíniotransmembrana (SEQ ID NO: 10); e aminoácidos de cerca de 102até cerca de 184 constituem o domínio intracelular (SEQ IDNO: 10).

Conseqüentemente, em uma modalidade, uma proteínaBAFF-R que pode ser usada nos métodos da presente invenção éum polipeptídeo isolado compreendendo, ou senão consistindona seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, ou um polipep-tídeo compreendendo, ou senão, consistindo em uma porção deSEQ ID NO: 10, tal como, por exemplo, o domínio extracelularde BAFF-R (compreendendo aminoácidos 1 até 81 de SEQ ID NO:10) e/ou o domínio rico em cisteína de BAFF-R (compreendendoaminoácidos 19 até 35 de SEQ ID NO: 10); assim como polipep-tídeos que possuem pelo menos 80% de identidade, de maiorpreferência pelo menos 90% ou 95% de identidade, ainda demaior preferência pelo menos 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% deidentidade com os polipeptídeos descritos acima.

Em outra modalidade, uma proteína BAFF-R que podeser usada nos métodos da presente invenção é um polipeptídeoisolado compreendendo aminoácidos de 1 até 70 de SEQ ID NO:10 e/ou a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. SEQ IDNO: 26 mostra aminoácidos 1-70 de BAFF-R em que o aminoácido20 (valina) em BAFF-R é substituído por uma asparagina e oaminoácido 27 (Ieucina) em BAFF-R é substituído por prolina.Em outra modalidade, uma proteína BAFF-R que pode ser usadanos métodos da presente invenção é um polipeptídeo isoladocompreendendo aminoácidos 2 até 70 de SEQ ID NO: 26. Poli-peptídeos. que possuem pelo menos 80% de identidade, de maiorpreferência pelo menos 90% ou 95% de identidade, ainda demaior preferência pelo menos 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% deidentidade com os polipeptídeos descritos acima também podemser usados nos métodos da presente invenção.

Por um polipeptídeo que tem uma seqüência de ami-noácidos com pelo menos, por exemplo, 95% de "identidade" auma seqüência de aminoácidos de referência de um polipeptí-deo BAFF-R entende-se que a seqüência de aminoácidos do po-lipeptídeo possui identidade com a seqüência de referênciaexceto que a seqüência polipeptídica pode incluir até cincoalterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos do amino-ácido de referência do receptor BAFF-R. Em outras palavras,para obter um polipeptideo que tem uma seqüência de aminoá-cidos com pelo menos 95% de identidade com a seqüência deaminoácidos de referência, até 5% dos resíduos de aminoáci-dos na seqüência de referência podem ser deletados ou subs-tituídos por outro aminoácido, ou vários aminoácidos até 5%do total de resíduos de aminoácidos na seqüência de referên-cia podem ser inseridos na seqüência de referência. Essasalterações da seqüência de referência podem ocorrer nas po-sições amino ou carbóxi-terminais da seqüência de aminoáci-dos de referência ou em qualquer lugar entre aquelas posi-ções terminais, entremeadas individualmente entre resíduosna seqüência de referência ou em um ou mais grupos contíguosna seqüência de referência.

Fragmentos polipeptídicos de BAFF-R incluem poli-peptídeos compreendendo ou senão, consistindo em: uma se-qüência de aminoácidos contida em SEQ ID NO: 10. Fragmentospolipeptídicos podem ser "independentes" ou compreendidospor um polipeptideo maior do qual o fragmento forma uma par-te ou região, da maior preferência como uma região contíguaúnica. Em modalidades adicionais, os fragmentos de polipep-tideo compreendem, ou senão consistem em, um ou mais domí-nios BAFF-R. Fragmentos polipeptídicos preferidos incluem ummembro selecionado do grupo: (a) um polipeptideo compreen-dendo ou senão, consistindo no domínio extracelular de BAFF-R (predito como constituindo os resíduos de aminoácidos decerca de 1 até cerca de 81 de SEQ ID NO: 10) ; (b) um poli-peptideo compreendendo ou senão, consistindo em, um domíniorico em cisteína de BAFF-R (predito como constituindo os re-síduos de aminoácidos de cerca de 19 até cerca de 35 de SEQID NO: 10); (c) um polipeptídeo compreendendo ou senão, con-sistindo no domínio transmembrana de BAFF-R (predito comoconstituindo os resíduos de aminoácidos de cerca de 82 atécerca de 101 de SEQ ID NO: 10); (d) um polipeptídeo compre-endendo ou senão, consistindo no domínio intracelular deBAFF-R (predito como constituindo os resíduos de aminoácidosde cerca de 102 até cerca de 184 de SEQ ID NO: 10); ou (e)qualquer combinação de polipeptídeos (a)-(d).

Acredita-se que os motivos ricos em cisteína deBAFF-R sejam importantes para interações entre BAFF-R e seusligantes, neutrocina-alfa e APRIL. Conseqüentemente, em mo-dalidades preferidas, fragmentos polipeptídicos de BAFF-Rque podem ser usados nos métodos da presente invenção com-preendem, ou senão consistem na seqüência de aminoácidos deresíduos de aminoácidos 19 até 35 de SEQ ID NO: 10. Proteí-nas compreendendo ou senão consistindo em uma seqüência po-lipeptídica que possui pelo menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%,98% ou 99% de identidade com as seqüências polipeptídicas domotivos rico em cisteína também são preferidas.

Outros fragmentos da proteína de BAFF-R que podemser usados nos métodos da invenção são fragmentos caracteri-zados por atributos funcionais ou estruturais de BAFF-R.Tais fragmentos incluem resíduos de aminoácidos que compre-endem regiões de alfa-hélice e formadoras de alfa-hélice("regiões alfa"), regiões de folha beta e formadoras de fo-lha beta ("regiões beta"), regiões de volta e formadoras decoita ("regiões de volta"), regiões espirais e formadoras deespiral ("regiões espirais"), regiões hidrofílicas, regiões hidrofóbicas, regiões anfipáticas alfa, regiões anfipáticasbeta, regiões formadoras de superfície e regiões de alto ín-dice antigênico (isto é, contendo quatro ou mais aminoácidoscontíguos que têm um índice antigênico maior que ou igual a1,5, como identificado usando os parâmetros padrões do pro- grama de Jameson-Wolf) de BAFF-R (SEQ ID NO: 10) completa(isto é, inteira) como é discutido na Patente US No.7.112.410. Certas regiões preferidas incluem, mas não estãolimitadas a, regiões alfa, regiões beta, regiões de volta eregiões espirais preditas por Garnier-Robson; regiões alfa, regiões beta e regiões de volta preditas por Chou-Fasman ;hidrofílicas preditas por Kyte-Doolittle; regiões hidrofóbi-cas preditas por Hopp-Woods; regiões anfipáticas alfa e betapreditas por Eisenberg; regiões formadoras de superfície deEmini; e regiões de alto índice antigênico de Jameson-Wolf,como predito usando os parâmetros padrões desses programasde computador.

0 polipeptídeo BAFF-R para uso nos métodos da in-venção pode ser expressado em uma forma modificada, tal comouma proteína de fusão (compreendendo o polipeptídeo unido através de uma ligação peptídica a uma seqüência de proteínaheteróloga (de uma proteína diferente)) e pode incluir nãoapenas sinais de secreção, mas também regiões funcionais he-terólogas adicionais. Senão, tal proteína de fusão pode serfeita por técnicas de síntese de proteína, p. ex. , por usode um sintetizador peptídico. Assim, uma região de aminoáci-dos adicionais, particularmente aminoácidos carregados, podeser adicionada à extremidade N-terminal do polipeptídeo paramelhorar a estabilidade e persistência na célula hospedeira,durante a purificação ou durante manuseio e estocagem subse-qüentes. Além disso, unidades peptídicas podem ser adiciona-das ao polipeptídeo para facilitar a purificação. Tais regi-ões podem ser removidas antes da preparação final do poli-peptídeo. A adição de unidades peptídicas a polipeptídeospara engendrar secreção ou excreção, para melhorar a estabi-lidade e para facilitar a purificação, entre outros, é téc-nica familiar e rotineira na técnica.

Uma proteína de fusão de BAFF-R preferida que podeser usada nos métodos da invenção compreende uma região he-teróloga de imunoglobulina que é útil para solubilizar pro-teínas. Por exemplo, EP-A-O 4 64 533 (equivalente canadense2045869) e W000/024782 divulgam proteínas de fusão compreen-dendo várias porções de região constante de moléculas de i-munoglobulina junto com outra proteína humana ou parte des-ta. Proteínas de fusão de imunoglobulina e BAFF-R foram des-critas em, por exemplo, Pelletier et al.r (2003) J Biol Chem278: 33127-33133 e Carter et al. , (2005) Arthritis Rheum 52:3943-3954, aqui incorporadas como referências em suas tota-lidades. Em muitos casos, a parte Fc em uma proteína de fu-são é completamente vantajosa para uso na terapia e diagnós-tico e assim resulta, por exemplo, em propriedades farmaco-cinéticas melhoradas (EP-A 0232 262). Por outro lado, paraalguns usos, seria desejável ser capaz de excluir a parte Fcapós a proteína de fusão ter sido expressa, detectada e pu-rificada da maneira vantajosa descrita. Este é o caso quandoa porção Fc prova ser um obstáculo para uso na terapia e di-agnóstico, por exemplo, quando a proteína de fusão é paraser usada como antígeno para imunizações. Na descoberta defármacos, por exemplo, proteínas humanas, tal como receptorde hIL-5 foram fusionadas a porções Fc com a finalidade deensaios de triagem/varredura de alta carga de entrada paraidentificar antagonistas de hIL-5. Veja, D. Bennett et al.,Journal of Molecular Recognition 8: 52-58 (1995) e K. Johan-son et al.f The Journal of Biological Chemistry 270: 9459-9471 (1995). Em uma modalidade específica, a proteína de fu-são BAFF-R-Fc que pode ser usada nos métodos da invenção éBR3-Fc.

Como alguém versado na técnica apreciará e comodiscutido acima, os polipeptídeos de BAFF-R podem ser fusio-nados a outras seqüências polipeptídicas. Por exemplo, ospolipeptídeos de BAFF-R podem ser fusionados com o domínioconstante de imunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM), ou por-ções destes (CHI, CH2, CH3, ou qualquer combinação destes eporções destes), ou albumina (incluindo, mas não limitando aalbumina humana recombinante ou fragmentos ou variantes des-ta (veja, p. ex., Patente US No. 5.876.969, divulgada em 2de março de 1999, Patente EP 0 413 622 e Patente US No.5.766.883, divulgada em 16 de junho de 1998, incorporadasaqui como referência em suas totalidades)), resultando empolipeptídeos quiméricos.Tais proteínas de fusão podem facilitar a purifi-cação, podem estender a vida de prateleira e podem aumentara meia-vida in vivo. Isto foi demonstrado para proteínasquiméricas consistindo nos primeiros dois domínios do poli-peptídeo-CD4 humano e vários domínios das regiões constantesdas cadeias pesada ou leve de imunoglobulinas de mamíferos.Veja, p. ex., EP 394.827; Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (1988). Distribuição melhorada de um antígeno atravésda barreira epitelial do sistema imune foi demonstrada paraantígenos (p. ex., insulina) conjugados a um par de ligaçãode FcRn tal como fragmentos Fc ou IgG (veja, p. ex., Publi-cações PCT WO 96/22024 e WO 99/04813). Proteínas de fusão deIgG que têm uma estrutura dimérica ligada por dissulfeto de-vido às ligações dissulfeto de porção de IgG também foramdemonstradas como sendo mais eficientes na ligação a e neu-tralização de outras moléculas que polipeptídeos monoméricosou fragmentos destes sozinhos. Veja, p. ex., Fountoulakis etalJ Biochem 270: 3958-3964 (1995).

Um exemplo de uma proteína BAFF-R-Fc são aminoáci-dos 1-70 de SEQ ID NO: 10 fusionados à região Fc de uma mo-lécula de imunoglobulina de IgGl. Opcionalmente, o aminoáci-do 20 (valina) em BAFF-R é substituído por asparagina e oaminoácido 27 (Ieucina) em BAFF-R é substituído por prolina.SEQ ID NO: 26 mostra os aminoácidos 1-70 de BAFF-R com essasduas alterações de aminoácidos.

Uma proteína de fusão com albumina que pode serusada nos métodos da presente invenção compreende pelo menosum fragmento ou variante de um polipeptídeo de BAFF-R e pelomenos um fragmento ou variante de albumina sérica humana,que estão associados um com o outro, de preferência por fu-são genética (isto é, a proteína de fusão com albumina é ge-rada por tradução de um ácido nuclêico em que um polinucleo-tídeo que codifica toda a BAFF-R ou uma porção é unido namesma fase de leitura com um polinucleotídeo que codificatoda a albumina ou uma porção) ou conjugação química um aooutro. O polipeptídeo de BAFF-R e a proteína albumina, umavez parte da proteína de fusão com albumina, podem ser refe- ridos como uma "porção", "região" ou "unidade" da proteínade fusão com albumina (p. ex., uma "porção BAFF-R" ou uma"porção de proteína albumina").

Em uma modalidade, uma proteína de fusão com albu-mina que pode ser usada nos métodos da invenção compreende,ou senão consiste em, um polipeptídeo de BAFF-R e uma prote-ína albumina sérica. Em outras modalidades, uma proteína defusão com albumina que pode ser usada nos métodos da inven-ção compreende, ou senão consiste em, um fragmento de BAFF-Re uma proteína albumina sérica. Em outras modalidades, uma proteína de fusão com albumina que pode ser usada nos méto-dos da invenção compreende, ou senão consiste em, uma vari-ante de BAFF-R e uma proteína albumina sérica. Em modalida-des preferidas, o componente de proteína albumina sérica daproteína de fusão com albumina é a porção madura da albumina sérica.

Em modalidades adicionais, uma proteína de fusãocom albumina que pode ser usada nos métodos da invenção com-preende, ou senão consiste em, um polipeptídeo de BAFF-R eum fragmento de albumina sérica biologicamente ativo e/outerapeuticamente ativo. Em modalidades adicionais, uma pro-teína de fusão com albumina que pode ser usada nos métodosda invenção compreende, ou senão consiste em, um polipeptí-deo de BAFF-R e uma variante de albumina sérica biologica-mente ativa e/ou terapeuticamente ativa. Em modalidades pre-feridas, a porção de BAFF-R da proteína de fusão com albumi-na é o polipeptídeo de BAFF-R completo. Em uma modalidadepreferida adicional, a porção BAFF-R da proteína de fusãocom albumina é o domínio maduro, solúvel do polipeptídeo deBAFF-R.

Em modalidades adicionais, uma proteína de fusãocom albumina que pode ser usada nos métodos da invenção com-preende, ou senão consiste em, um fragmento ou variante deBAFF-R e um fragmento ou variante biologicamente ativo e/outerapeuticamente ativo de albumina sérica. Em modalidadespreferidas, a invenção provê uma proteína de fusão com albu-mina que compreende, ou senão consiste na porção madura dopolipeptídeo de BAFF-R e na porção madura da albumina sérica.

Em modalidades adicionais, uma proteína de fusãocom albumina que pode ser usada nos métodos da invenção com-preende, ou senão consiste em, um fragmento ou variante deBAFF-R e um fragmento ou variante biologicamente ativo e/outerapeuticamente ativo de albumina sérica. Em modalidadespreferidas, a invenção provê uma proteína de fusão com albu-mina que compreende, ou senão consiste na porção madura dopolipeptídeo de BAFF-R e na porção madura da albumina sérica(incluindo, mas não limitando à albumina sérica humana re-combinante ou fragmentos ou variantes desta (veja, p. ex.,Patente US No. 5.876.969, divulgada em 2 de março de 1999,Patente EP 0 413 622 e Patente US No. 5.766.883, divulgadaem 16 de junho de 1998, incorporadas aqui como referência emsuas totalidades)). Em uma modalidade preferida, polipeptí-deos de BAFF-R (incluindo fragmentos ou variantes destes)são fusionados à forma madura de albumina sérica humana (is-to é, aminoácidos 1-585 de albumina sérica humana como mos-trado nas Figuras 1 e 2 de Patente EP 0 322 094) que são in-corporados aqui como referência em sua totalidade. Em outramodalidade preferida, anticorpos da presente invenção (in-cluindo fragmentos ou variantes destes) são fusionados afragmentos polipeptidicos que compreendem, ou senão consis-tem em, resíduos de aminoácidos 1-x de albumina sérica huma-na, onde χ é um número inteiro de 1 até 585 e o fragmento dealbumina tem atividade de albumina sérica humana. Em outramodalidade preferida, polipeptídeos de BAFF-R (incluindofragmentos ou variantes destes) são fusionados a fragmentospolipeptidicos que compreendem, ou senão consiste em, resí-duos de aminoácidos 1-z de albumina sérica humana, onde ζ éum número inteiro de 369 até 419, como descrito na PatenteUS 5.766.883 incorporada aqui como referência em sua totali-dade. Polipeptídeos de BAFF-R (incluindo fragmentos ou vari-antes destes) podem ser fusionados ou à extremidade N- ou àC-terminal da proteína heteróloga (p. ex., polipeptídeo deFc de imunoglobulina ou polipeptídeo de albumina sérica humana).Em modalidades preferidas, a proteína de albuminasérica humana usada nas proteínas de fusão com albumina quepodem ser usadas nos métodos da invenção contém um ou ambosdos seguintes grupos de mutações pontuais com referência àSEQ ID NO: 11: Leu407 para Ala, Leu408 para Vai, Val409 paraAla e Arg410 para Ala; ou Arg410 para A, Lys413 para Gln eLys414 para Gln (veja, p. ex., Publicação Internacional No.W095/23857, incorporada por meio deste em sua totalidade co-mo referência aqui). Em modalidades ainda mais preferidas, proteínas de fusão com albumina que podem ser usadas nos mé-todos da invenção que contêm um ou ambos dos grupos acimadescritos de mutações pontuais têm estabilidade/resistênciamelhorada à clivagem proteolítica pela Yap3p de levedura,permitindo produção aumentada de proteínas de fusão com al-bumina recombinantes expressadas em células hospedeiras delevedura.

De preferência, a proteína de fusão com albuminaque pode ser usada nos métodos da invenção compreende HA co-mo a porção N-terminal e polipeptídeo de BAFF-R como a por-ção C-terminal. Senão, uma proteína de fusão com albuminacompreendendo HA como a porção C-terminal e polipeptídeo deBAFF-R como a porção N-terminal também pode ser usada.

Em outras modalidades, a proteína de fusão com al-bumina que pode ser usada nos métodos da invenção tem um po-lipeptídeo de BAFF-R fusionado tanto na extremidade N-terminal como na C-terminal de albumina. Em uma modalidadeespecífica, os polipeptídeos de BAFF-R fusionados nas extre-midades N- e C-terminais são os mesmos. Em outra modalidade,os polipeptídeos de BAFF-R fusionados nas extremidades N- eC-terminais são polipeptídeos de BAFF-R diferentes. Em outramodalidade, um polipeptídeo de BAFF-R é fusionado fusionadoou na extremidade N-terminal ou na C-terminal de albumina eum polipeptídeo heterólogo é fusionado na extremidade rema-nescente .

Adicionalmente, as proteínas de fusão com albuminaque podem ser usadas nos métodos da invenção podem incluirum peptídeo de ligação entre as porções fusionadas para pro-ver maior separação física entre as unidades. 0 peptídeo deligação pode consistir em aminoácidos tal que ele seja fle-xível ou mais rígido.

Geralmente, as proteínas de fusão com albumina quepodem ser usadas nos métodos da invenção podem ter uma regi-ão derivada de HA e uma região de BAFF-R. Múltiplas regiõesde cada proteína, entretanto, podem ser usadas para fazeruma proteína de fusão com albumina que pode ser usada nosmétodos da invenção. De modo similar, mais de uma proteínapodem ser usadas para fazer uma proteína de fusão com albu- mina que pode ser usada nos métodos da invenção. Por exem-plo, uma proteína pode ser fusionada tanto à extremidade N-como a C-terminal da HA. Em tal configuração, as porçõesprotêicas podem ser as mesmas ou diferentes moléculas deproteína. A estrutura de proteínas de fusão com albumina bi-funcionais pode ser representada como: X-HA-Y ou Y-HA-X.

Em uma modalidade específica, a proteína BAFF-R oufragmento ou variante desta que pode ser usada nos métodosda invenção pode ser conjugada a uma citotoxina (p. ex., umagente citostático ou citocida). Uma citotoxina ou agentecitotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial àscélulas. Exemplos incluem paclitaxol, citocalasina B, grami-cidina D, brometo de etideo, emetina, mitomicina, etoposí-deo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, do-xorrubicina, daunorrubicina, diidróxi antracino diona, mito-xantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaina,lidocaina, propranolol e puromicina e seus análogos ou homó- logos.

Em outra modalidade, uma proteína ou fragmento ouvariante de BAFF-R que pode ser usada nos métodos da inven-ção pode ser conjugada a uma toxina.

Por "toxina" entende-se um ou mais compostos quese ligam e ativam sistemas efetores citotóxicos endógenos,radioisótopos, holotoxinas, toxinas modificadas, subunidadescatalíticas de toxinas, ou quaisquer moléculas ou enzimasnão presentes normalmente na superfície de uma célula quesob condições definidas causam a morte da célula. Toxinasque podem ser usadas incluem, mas não estão limitadas a, ra-dioisótopos conhecidos na técnica, compostos tal como, porexemplo, anticorpos (ou fixação de complemento contendo por-ções destes) que se ligam a um sistema efetor citotóxico en-dógeno induzido ou inerente, timidina quinase, endonuclease, RNAse, alfa toxina, ricina, abrina, exotoxina A de Pseudomo-nas, toxina diftérica, saporina, momordina, gelonina, prote-ína anti-viral de caruru-de-cacho, alfa-sarcina e toxina docólera. "Toxina" também inclui um agente citostático ou ci-tocida, um agente terapêutico ou um íon metálico radioativo,p. ex., alfa-emitidores tal como, por exemplo, Bi, ou ou-tros radioisótopos tal como, por exemplo, 103Pd, 133Xe, 131If68Gef 57Cof 65Zn, 85Sr, 32P, 35S, 90Y, 153Sm, 153Gd, 169Yb, 51Cr,54Mn, 75Se, 113Sn, 90Itrio, 117Estanho, 186Rênio, 166Holmio e188Rênio.

Engenharia de proteínas pode ser empregada paramelhorar ou alterar as características de polipeptídeos deBAFF-R que podem ser usados nos métodos da invenção. Tecno-logia de DNA recombinante conhecida por aqueles versados natécnica pode ser usada para criar novas proteínas mutantesou "muteínas incluindo substituições, deleções, adições deaminoácidos único ou múltiplos ou proteínas de fusão". Taispolipeptídeos modificados podem mostrar, p. ex., atividademelhorada ou estabilidade aumentada. Além disso, eles podemser purificados em maiores rendimentos e mostrar melhor so-lubilidade que o polipeptídeo natural correspondente, pelomenos sob certas condições de purificação e estocagem. Emainda outra modalidade da invenção, o mutante de polipeptí-deo BAFF-R pode ser um "dominante negativo". Para este fim,polipeptídeos de BAFF-R defectivos, tal como, por exemplo,mutantes que carecem de todo ou de uma porção do domínioconservado de TNF, podem ser usados para diminuir a ativida-de de BAFF-R. Os polipeptídeos de BAFF-R não funcionais se-rão montados para formar um receptor (p. ex., multímero) quepode ser capaz de se ligar, mas que é incapaz de induzirtransdução de sinal.

As proteínas de BAFF-R que podem ser usadas nosmétodos da invenção podem estar em monômeros ou multimeros(isto é, dimeros, trimeros, tetrâmeros e multimeros maio-res). Em modalidades especificas, os polipeptideos da inven-ção são monômeros, dimeros, trimeros ou tetrâmeros. Em moda-lidades adicionais, os multimeros da invenção são pelo menosdimeros, pelo menos trimeros, ou pelo menos tetrâmeros. A-credita-se que certos membros da família TNF existam na for-ma trimérica (Beutler e Huffel, Science 264: 667, 1994; Ban-ner et al., Cell 73: 431, 1993). Assim, BAFF-R trimérica po-de oferecer a vantagem de atividade biológica acentuada.

Em modalidades específicas, os multimeros podemser homômeros ou heterômeros. Como usado aqui, o termo homô-mero, se refere a um multímero contendo apenas proteínasBAFF-R (incluindo fragmentos, variantes e proteínas de fu-são, como descrito aqui). Esses homômeros podem conter pro-teínas BAFF-R que têm seqüências polipeptídicas idênticas oudiferentes. Em uma modalidade específica, um homômero é ummultímero contendo apenas proteínas BAFF-R que têm uma se-qüência polipeptídica idêntica. Em outra modalidade especí-fica, um homômero é um multímero contendo proteínas BAFF-Rque têm seqüências polipeptídicas diferentes.

Conforme aqui utilizado, o termo heterômero se re-fere a um multímero contendo proteínas heterólogas (isto é,proteínas contendo apenas seqüências polipeptídicas que nãocorrespondem à seqüências polipeptídicas codificadas pelogene de BAFF-R) além das proteínas BAFF-R. Multimeros podemser o resultado de associações hidrofóbicas, iônicas e/oucovalentes e/ou podem ser ligadas indiretamente, por exem-pio, por formação de lipossomo. Assim, em uma modalidade,multímeros, tal como, por exemplo, homodimeros ou homotríme-ros, heterotrimeros ou heterotetrâmeros são formados quandoas proteínas entram em contato umas com as outras em solu-ção. Em outras modalidades, multímeros são formados por as-sociações covalentes com e/ou entre as proteínas BAFF-R.Tais associações covalentes podem envolver um ou mais resí-duos de aminoácidos contidos na seqüência polipeptídica daproteína. Em um exemplo, as associações covalentes são reti-culações entre resíduos de cisteína localizados nas seqüên-cias polipeptídicas das proteínas que interagem no polipep-tídeo nativo (isto é, que ocorre naturalmente) . Em outro e-xemplo, as associações covalentes são a conseqüência de ma-nipulação química ou recombinante.

Senão, tais associações covalentes podem envolverum ou mais resíduos de aminoácidos contidos na seqüência po-lipeptídica heteróloga em uma proteína de fusão com BAFF-R.Em um exemplo, as associações covalentes são entre a seqüên-cia heteróloga contida em uma proteína de fusão (veja, p.ex. , Patente US Número 5.478.925, os conteúdos da qual sãoincorporados como referência aqui em sua totalidade) . Em umexemplo específico, as associações covalentes são entre aseqüência heteróloga contida em uma proteína de fusão BAFF-R-Fc (como descrito aqui). Em outro exemplo específico, as-sociações covalentes de proteínas de fusão são entre seqüên-cias polipeptídicas heterólogas de outro membro recep-tor/ligante de família TNF que é capaz de formar multímeroscovalentemente associados, tal como, por exemplo., osteopro-tegerina (veja, ρ. ex., Publicação Internacional No. WO98/49305, os conteúdos da qual são incorporados aqui comoreferência em sua totalidade). Em outra modalidade, dois oumais polipeptideos de BAFF-R são unidos através de ligantessintéticos (p. ex., ligantes peptidicos, de carboidrato oude polímero solúvel). Exemplos incluem aqueles ligantes pep-tidicos descritos em Pat. US No. 5.073.627 (incorporada pormeio deste como referência). Proteínas compreendendo múlti-plos polipeptideos de BAFF-R separados por ligantes peptídi-cos podem ser produzidas usando tecnologia do DNA recombi-nante convencional.

Em uma modalidade específica, anticorpos que seligam a um polipeptídeo de BAFF-R, um fragmento polipeptídi-co, uma variante de SEQ ID NO: 10 e/ou um epítopo polipeptí-dico de BAFF-R (como determinado por imunoensaios bem conhe-cidos na técnica para avaliar ligação antígeno-anticorpo es-pecífica) podem ser usados nos métodos da invenção. Anticor-pos anti-BAFF-R e fragmentos destes foram descritos em, porexemplo, Lee et al., (2006) Synthetic anti-BR3 antibodiesthat mimic BAFF binding and target both human and murine Bcells Blood (artigo de primeira edição de Blood, pré-publicado online em 13 de julho de 2006) Vol. 0 No. 2006,pp. 200603011, Ch' em et al., (2005) Cell Immunol 236: 78-85, Nakamura et al., (2005) Virchows Arch 447: 53-60 e Car-ter et al., (2005) Arthritis Rheum 52: 3943-3954. Cada umadas referências acima mencionadas é incorporada aqui comoreferência em suas totalidades. Anticorpos incluem, mas nãoestão limitados a, anticorpos policlonais, monoclonais, mui-tiespecíficos, humanos, humanizados ou quiméricos, anticor-pos de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'),fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão deFab, anticorpos antiidiotipicos (anti-Id) (incluindo, p.ex., anticorpos anti-id contra anticorpos anti-BAFF-R) efragmentos de ligação a epitopo de quaisquer dos acima. 0termo "anticorpo", como aqui utilizado, se refere a molécu-las de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas demoléculas de imunoglobulinas, isto é, moléculas que contêm um sitio de ligação a antigeno que se liga imunoespecifica-mente a um antigeno. As moléculas de imunoglobulina podemser de qualquer tipo (p. ex., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA eIgY), classe (p. ex., IgG3., IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2) ousubclasse de molécula de imunoglobulina. Em modalidades es- pecificas, as moléculas de imunoglobulina são IgGl. Em ou-tras modalidades especificas, as moléculas de imunoglobulinasão IgG4.

Fragmentos de anticorpo de ligação a BAFF-R quepodem ser usados nos métodos da invenção incluem, mas nãoestão limitados a, Fab, Fab1 e F(ab')2, Fd, Fvs de cadeiaúnica (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados pordissulfeto (sdFV) e fragmentos compreendendo ou um domínioVL ou VH. Fragmentos de anticorpo de ligação a antigeno, in-cluindo anticorpos de cadeia única, podem compreender a(s) região(ões) variável(is) sozinhas ou em combinação com a to-talidade ou uma porção do seguinte: região de dobra, domí-nios CHI, CH2 e CH3. Também incluídos são os fragmentos deligação a antigeno também compreendendo qualquer combinaçãode região(ões) variável(is) com uma região de dobra, domí-nios CHI, CH2 e CH3. Os anticorpos podem ser de qualquer o-rigem animal incluindo pássaros e mamíferos. De preferência,os anticorpos são humanos, murinos (p. ex., camundongo e ra-to) , de burro, coelho ship, bode, porquinho-da-índia, came-lo, cavalo ou galinha. Conforme aqui utilizado, anticorpos"humanos" incluem anticorpos que têm a seqüência de aminoá-cidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos iso-lados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animaistransgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e quenão expressam imunoglobulinas endógenas, como descrito, porexemplo, na Patente US No. 5.939.598 por Kucherlapati etal., os conteúdos da qual são incorporados aqui como refe-rência em suas totalidades.

Anticorpos anti-BAFF-R que podem ser usados nosmétodos da invenção podem ser monoespecíficos, biespecífi-cos, triespecíficos ou de maior multiespecificidade. Anti-corpos multiespecíficos podem ser específicos para diferen-tes epítopos de um polipeptídeo de BAFF-R ou podem ser espe-cíficos igualmente para um polipeptídeo de BAFF-R assim comopara um epítopo heterólogo, tal como um polipeptídeo heteró-Iogo ou material de suporte sólido. Veja, p.ex., PublicaçõesPCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tuttet al., J Immunol 147: 60-69 (1991); Patentes US. Nos.4.474.893, 4.714.681, 4.925.648, 5.573.920, 5.601.819; Kos-telny et al., J Immunol 148: 1547-1553 (1992), os conteúdosdas quais são incorporados aqui como referência em sua totalidade.Anticorpos de BAFF-R podem ser descritos ou espe-cificados em termos de sua reatividade cruzada. Anticorposque não se ligam a qualquer outro análogo, ortólogo ou homó-logo de um polipeptideo de BAFF-R podem ser usados nos méto-dos da invenção. Em modalidades especificas, anticorposBAFF-R reagem cruzadamente com homólogos murinos, de ratoe/ou de coelho de proteínas BAFF-R humanas e seus epítoposcorrespondentes. Em uma modalidade específica, um anticorpoanti-BAFF-R que pode ser usado nos métodos da invenção seliga não apenas a BAFF-R, mas também se liga a TACI e BCMA.

Anticorpos de BAFF-R que podem ser usados nos mé-todos da invenção também podem ser descritos ou especifica-dos em termos de suas afinidades de ligação a um polipepti-deo de BAFF-R. Afinidades de ligação preferidas incluem a-quelas com uma constante de dissociação ou Kd de menor que deou igual a 5 X IO"9 Μ, IO"9 M, 5 X IO"10 Μ, IO"10 M, 5 X IO"11Μ, IO"11 M, 5 X IO"12 M, ou 10~12 M.

Anticorpos de BAFF-R que podem ser usados nos mé-todos da invenção podem agir como agonistas ou antagonistasdos polipeptídeos de BAFF-R. Por exemplo, anticorpos deBAFF-R que perturbam as interações receptor/ligante com ospolipeptídeos de BAFF-R parcialmente ou completamente sãoincluídos. Também são incluídos anticorpos específicos a re-ceptor que não previnem ligação de ligante, mas previnem a-tivação de receptor. Ativação de receptor (isto é, sinaliza-ção) pode ser determinada por técnicas descritas aqui ou deoutro modo conhecidas na técnica. Por exemplo, ativação dereceptor pode ser determinada pela detecção de ativação dosfatores de transcrição NF-AT, ΆΡ-1, e/ou NF-capaB usandotécnicas conhecidas na técnica, e/ou a fosforilação (p. ex.,tirosina ou serina/treonina) do receptor ou seu substratopor imunoprecipitação seguida de análise por western blot.

Em uma modalidade especifica, anticorpos de BAFF-Respecíficos a receptor que tanto previnem a ligação de li-gante como a ativação de receptor, assim como anticorpos deBAFF-R que reconhecem o complexo ligante receptor e, de pre-ferência, não reconhecem especificamente o receptor não Ii-gado ou o ligante não ligado podem ser usados nos métodos dainvenção. Os anticorpos de BAFF-R acima podem ser feitos u-sando métodos conhecidos conhecidos na técnica. Veja, p.ex., Publicação PCT WO 96/40281; Patente US No. 5.811.097;Deng et al., Blood 92(6): 1981-1988 (1998); Chen et al.,Câncer Res 58(16): 3668-3678 (1998); Harrop et al., J Immu-nol 161(4): 1786-1794 (1998); Zhu et al., Câncer Res 58(15):3209-3214 (1998); Yoon et al., J Immunol 160(7): 3170-3179(1998); Prat et al., J Cell Sci 111 (Pt2): 237-247 (1998);Pitard et al., J Immunol Methods 205(2): 177-190 (1997); Li-autard et al., Cytokine 9(4): 233-241 (1997); Carlson etal., J Biol Chem 272 (17):11295-11301 (1997); Taryman et al.,Neuron 14(4): 755-762 (1995); Muller et al., Structure 6(9):1153-1167 (1998); Bartunek et al., Cytokine 8(1): 14-20(1996) (que são todas incorporadas como referência aqui emsuas totalidades).

G. Anticorpos anti-APRIL

Em uma modalidade específica, o antagonista deneutrocina-alfa é um anticorpo anti-APRIL ou fragmento deligação a antlgeno deste. Anticorpos anti-APRIL e fragmentosdestes foram descritos em, por exemplo, Publicações PCT WO01/087977, WO 99/12965, WO 01/60397 e WO 02/094192; PatenteUS No. 6.506.882; Patente US No. 2003/01668 64, depositado em11 de outubro de 2002 e Ch' en et al., (2005) Cell Immunol236: 78-85 e são descritos em maiores detalhes abaixo. Cadauma das referências mencionadas acima é incorporada aqui co-mo referência em sua totalidade.

Em uma modalidade especifica, anticorpos que seligam a um polipeptideo de APRIL, fragmento polipeptidico ouvariante de SEQ ID NO: 4 e/ou um epitopo de APRIL (como de-terminado por imunoensaios bem conhecidos na técnica paraavaliar ligação antigeno-anticorpo especifica) podem ser u-sados nos métodos da invenção. Em uma modalidade especifica,anticorpos que podem ser usados nos métodos da invenção po-dem se ligar a polipeptideos de APRIL fusionados a outrasseqüências polipeptidicas. Por exemplo, polipeptideos deAPRIL podem ser fusionados ao domínio constante de imunoglo-bulinas (IgA, IgE, IgG, IgM), ou porções deste (CHI, CH2,CH3, ou qualquer combinação destes e porções destes), ou al-bumina (incluindo, mas não limitando a albumina humana re-combinante ou fragmentos ou variantes desta (veja, p. ex.,Patente US No. 5.876.969, divulgada em 2 de março de 1999,Patente EP 0 413 622 e Patente US No. 5.766.883, divulgadaem 16 de junho de 1998, incorporadas aqui como referência emsuas totalidades)), resultando em polipeptideos quiméricos.Tais proteínas de fusão podem facilitar a purificação, podemestender a vida de prateleira e podem aumentar a meia-vidain vivo. Isto foi demonstrado para proteínas quiméricas con-sistindo nos primeiros dois domínios do polipeptídeo-CD4 hu-mano e vários domínios das regiões constantes das cadeiaspesada ou leve de imunoglobulinas de mamíferos. Veja, p.

ex., EP 394.827; Traunecker et al. , Nature, 331: 84-86(1988). Distribuição melhorada de um antígeno através dabarreira epitelial do sistema imune foi demonstrada para an-tígenos (p. ex., insulina) conjugados a um par de ligação deFcRn tal como fragmentos Fc ou IgG (veja, p. ex., Publica-ções PCT WO 96/22024 e WO 99/04813) . Proteínas de fusão deIgG que têm uma estrutura dimérica ligada por dissulfeto de-vido às ligações dissulfeto de porção de IgG também foramdemonstradas como sendo mais eficientes na ligação a e neu-tralização de outras moléculas que polipeptídeos monoméricosou fragmentos destes sozinhos. Veja, p. ex., Fountoulakis etal., J Biochem 270: 3958-3964 (1995).

Em modalidades específicas, anticorpos que podemser usados nos métodos da invenção se ligam a polipeptídeosde APRIL homoméricos, especialmente homotriméricos. Em ou-tras modalidades específicas, anticorpos que podem ser usa-dos nos métodos da invenção se ligam a polipeptídeos deAPRIL heteroméricos, especialmente heterotriméricos tal comoum heterotrímero contendo dois polipeptídeos de APRIL e umpolipeptídeo de neutrocina-alfa ou um heterotrímero contendoum polipeptídeo de APRIL e dois polipeptídeos de neutrocina-alfa. Em uma modalidade específica, os anticorpos que podemser usados nos métodos da invenção se ligam a polipeptídeosde APRIL homoméricos, especialmente homotriméricos, em queos componentes de proteína individuais dos multímeros con-sistem na forma madura de APRIL (p. ex., resíduos de aminoá-cidos 105-250 de SEQ ID NO: 4). Em outras modalidades espe-cíficas, anticorpos que podem ser usados nos métodos da in-venção se ligam a polipeptídeos de APRIL heteroméricos, es-pecialmente heterotriméricos tal como um heterotrímero con-tendo dois polipeptídeos de APRIL e um polipeptídeo de neu-trocina-alfa ou um heterotrímero contendo um polipeptídeo deAPRIL e dois polipeptídeos de neutrocina-alfa e em que oscomponentes de proteína individuais do heterômero de APRILconsistem na porção solúvel extracelular madura de APRIL (p.ex., resíduos de aminoácidos 105-250 de SEQ ID NO: 4) ou naporção solúvel extracelular madura de neutrocina-alfa (p.ex., resíduos de aminoácidos 134-285 de SEQ ID NO: 2).

Em modalidades específicas, os anticorpos que po-dem ser usados nos métodos da invenção se ligam a epítoposconformacionais de uma proteína de APRIL monomérica. Em mo-dalidades específicas, os anticorpos que podem ser usadosnos métodos da invenção se ligam a epítopos conformacionaisde uma proteína de APRIL multimérica, especialmente triméri-ca. Em outras modalidades, anticorpos que podem ser usadosnos métodos da invenção se ligam a epítopos conformacionaisque surgem da justaposição de APRIL com um polipeptídeo he-terólogo, tal como pode estar presente quando APRIL formaheterotrímeros (p. ex., com polipeptídeos de neutrocina-alfa), ou em proteínas de fusão entre APRIL e um polipeptí-deo heterólogo.

Anticorpos que podem ser usados nos métodos da in-venção incluem, mas não estão limitados a, anticorpos poli-clonais, monoclonais, multiespecificos, humanos, humanizadosou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab,fragmentos F(ab'), fragmentos produzidos por uma bibliotecade expressão de Fab, anticorpos antiidiotipicos (anti-Id)(incluindo, p. ex., anticorpos anti-id contra anticorpos an-ti-APRIL) e fragmentos de ligação a epitopo de quaisquer dosacima. O termo "anticorpo", como aqui utilizado, se refere amoléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ati- vas de moléculas de imunoglobulinas, isto é, moléculas quecontêm um sitio de ligação a antigeno que se liga imunoespe-cificamente a um antigeno. As moléculas de imunoglobulina dainvenção podem ser de qualquer tipo (p. ex., IgG, IgE, IgM,IgD, IgA e IgY), classe (p. ex., IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. Em moda-lidades preferidas, a imunoglobulina é de um isotipo IgGl ouIgG4. Imunoglobulinas podem ter tanto uma cadeia pesada comouma leve. Um arranjo de cadeias pesadas de IgG, IgE, IgM,IgD, IgA e IgY pode ser pareado com uma cadeia leve das for-mas capa ou lambda.

Em uma modalidade especifica, os anticorpos quepodem ser usados nos métodos da invenção são fragmentos deanticorpo de ligação a APRIL e incluem, mas não estão limi-tados a, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs de cadeia única(scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados por dissul-feto (sdFV) e fragmentos compreendendo ou um domínio VL ouVH. Fragmentos de anticorpo de ligação a APRIL, incluindoanticorpos de cadeia única, podem compreender a(s) regi-ão(ões) variável(is) sozinha(s) ou em combinação com a tota-lidade ou uma porção dos seguintes: região de dobra, domí-nios CHI, CH2 e CH3. Em uma modalidade especifica, fragmen-tos de ligação a APRIL que podem ser usados nos métodos dainvenção compreendem qualquer combinação de região(ões) va-riável (is) com uma região de dobra, domínios CHI, CH2 e CH3.Os anticorpos que podem ser usados nos métodos da invençãopodem ser de qualquer origem animal incluindo pássaros e ma-míferos. De preferência, os anticorpos são humanos, murinos (p. ex., camundongo e rato), de burro, coelho ship, bode,porquinho-da-índia, camelo, cavalo ou galinha. Conforme aquiutilizado, anticorpos "humanos" incluem anticorpos que têm aseqüência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e in-cluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglo-bulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endóge-nas, como descrito, por exemplo, na Patente US No. 5.939.598por Kucherlapati et al., os conteúdos da qual são incorpora-dos aqui como referência em suas totalidades.

Os anticorpos que podem ser usados nos métodos dainvenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos, triespe-cíficos ou de maior multiespecificidade. Anticorpos multies-pecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos deum polipeptídeo de APRIL ou podem ser específicos igualmente para um polipeptídeo de APRIL assim como para um epítopo he-terólogo, tal como um polipeptídeo heterólogo ou material desuporte sólido. Veja, p.ex., Publicações PCT WO 93/17715 WO92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al., J Immunol147: 60-69 (1991); Patentes US Nos. 4.474.893, 4.714.681,4.925.648, 5.573.920, 5.601.819; Kostelny et al.r J Immunol148: 1547-1553 (1992).

Anticorpos anti-APRIL que podem ser usados nos mé-todos da invenção podem ser descritos ou especificados emtermos de suas reatividades cruzadas. Anticorpos que não seligam a qualquer outro análogo, ortólogo ou homólogo de umpolipeptideo de APRIL podem ser usados nos métodos da inven-ção. Em uma modalidade especifica, anticorpos que podem serusados nos métodos da invenção reagem cruzadamente com neu-trocina-alfa. Em modalidades especificas, anticorpos que po-dem ser usados nos métodos da invenção reagem cruzadamentecom homólogos murinos, de rato e/ou de coelho de proteínashumanas e seus epítopos correspondentes.

Anticorpos que podem ser usados nos métodos da in-venção podem ser descritos ou especificados em termos de su-as afinidades de ligação a um polipeptideo de APRIL. Em mo-dalidades específicas, anticorpos que podem ser usados nosmétodos da invenção se ligam a polipeptídeos de APRIL, oufragmentos ou variantes destes, com uma constante de disso-ciação ou Kd de menos de ou igual a 5 X 10"9 M, 10"9 M, 5 X10"10 Μ, 10"10 M, 5 X 10"11 Μ, 10"11 M, 5 X 10"12 M, ou 10"12 M.

Em uma modalidade específica, anticorpos que podem ser usa-dos nos métodos da invenção se ligam a polipeptídeos deAPRIL com uma constante de dissociação ou K0 que está emqualquer uma das faixas que estão entre cada um dos valoresindividuais relacionados.

Por exemplo, anticorpos de APRIL que perturbam asinterações receptor/ligante com polipeptídeos de APRIL par-cialmente ou completamente podem estão incluídos. Também sãoincluídos anticorpos específicos a APRIL que não previnemligação de ligante, mas previnem ativação de receptor. Ati-vação de receptor (isto é, sinalização) pode ser determinadapor técnicas descritas aqui ou de outro modo conhecidas natécnica. Por exemplo, ativação de receptor pode ser determi-nada pela detecção de ativação dos fatores de transcriçãoNF-AT, AP-I e/ou NF-capaB usando técnicas conhecidas na téc- nica, e/ou a fosforilação (p. ex., tirosina ou seri-na/treonina) do receptor ou seu substrato por imunoprecipi-tação seguida de análise por western blot.

Em uma modalidade específica, anticorpos específi-cos a APRIL que tanco previnem ligação de ligante como a a- tivação de receptor, assim como anticorpos que reconhecem ocomplexo ligante receptor e, de preferência, não reconhecemespecificamente o receptor não ligado ou o ligante não liga-do podem ser usados nos métodos da invenção. Em uma modali-dade específica, anticorpos de neutralização que se ligam aoligante e previnem a ligação do ligante ao receptor, assimcomo anticorpos que se ligam ao ligante, prevenindo dessemodo a ativação de receptor, mas não previnem o ligante dese ligar ao receptor podem ser usados nos métodos da inven-ção. Os anticorpos de APRIL acima podem ser feitos usandométodos conhecidos conhecidos na técnica. Veja, p. ex., Pu-blicação PCT WO 96/40281; Patente US No. 5.811.097; Deng etal., Blood 92(6): 1981-1988 (1998); Chen et al. , Câncer Res58(16): 3668-3678 (1998); Harrop et al., J Immunol 161(4):1786-1794 (1998); Zhu et al., Câncer Res 58(15): 3209-3214(1998); Yoon et ai., J Immunol 160(7): 3170-3179 (1998);Prat et al., J Cell Sci 111(Pt2): 237-247 (1998); Pitard etal., J Immunol Methods 205(2): 177-190 (1997); Liautard etal., Cytokine 9(4): 233-241 (1997); Carlson et al., J BiolChem 272 (17) :11295-11301 (1997); Taryman et al., Neuron14(4): 755-762 (1995); Muller et al., Structure 6(9): 1153-1167 (1998); Bartunek et al., Cytokine 8(1): 14-20 (1996)(que são todas incorporadas como referência aqui em suas to-talidades).

H. Polipeptideos de ligação a APRIL

Em uma modalidade especifica, o antagonista deneutrocina-alfa é um peptideo ou polipeptideo de ligação aAPRIL. Peptideos ou polipeptideos de ligação a APRIL foramdescritos em, por exemplo, Publicações de Patente Interna-cional números WO 01/87977, WO 01/87979 e Publicações de Pa-tente US números US 2002081296 e US 2002086018, cada uma dasquais é incorporada aqui como referência em sua totalidade.Peptideos de ligação a APRIL que podem se usados nos métodosda presente invenção incluem polipeptideos curtos identifi-cados de seqüências peptidicas aleatórias visualizadas pelafusão com proteínas de revestimento de fago filamentoso. Pa-ra discussão de tecnologia de biblioteca peptidica de visua-lização de fago (phage display) veja, por exemplo, Scott etal., (1990), Science 249: 386; Devlin et al., (1990) Science249: 404; Pat. US No. 5.223.409, publicada em 29 de junho de1993; Pat. US No. 5.733.731, publicada em 31 de março de1998; Pat. US No. 5.498.530, publicada em 12 de março de1996; Pat. US No. 5.432.018, publicada em 11 de julho de1995; Pat. US No. 5.338.665, publicada em 16 de agosto de1994; Pat. US No. 5.922.545, publicada em 13 de julho de1999; WO 96/40987, publicada em 19 de dezembro de 1996 e WO98/15833, publicada em 16 de abril de 1998 (cada uma dasquais é incorporada como referência em sua totalidade) . Fa-gos que expressam os peptideos são isolados por rodadas su-cessivas de purificação por afinidade contra um peptideo al-vo de APRIL imobilizado seguida por repropagação. Os candi-datos com a ligação mais alta a APRIL podem ser seqüenciadospara determinar a identidade de cada peptideo de ligação.Cada peptideo de ligação a APRIL identificado pode estão seraderido a um "veiculo" para gerar um peptideo de ligação aAPRIL adicional para uso nos métodos do presente experimen-to. O termo "veiculo" se refere a uma molécula que previne adegradação e/ou aumenta a meia-vida, reduz toxicidade, reduzimunogenicidade, ou aumenta a atividade biológica de um pep-tideo de ligação a APRIL. Veículos exemplares incluem um do-mínio Fc e variantes deste (um "Pepticorpo", que é preferi-do); um polímero linear (p. ex., polietileno glicol (PEG),incluindo PEG de 5kD, 20 kD e 30 kD, polisisina, dextran,etc.); um polímero de cadeia ramificada (veja, por exemplo,Pat. US No. 4.289.872 para Denkenwalter et al., publicada em15 de setembro de 1981; 5.229.490 para Tam, publicada em 20de julho de 1993; WO 93/21259 por Frechet et alpublicadaem 28 de outubro de 1993); um lipídeo; um grupo colesterol(tal como um esteróide); um carboidrato ou oligossacarídeo(p. ex., dextran); qualquer proteína, polípeptídeo ou peptí-deo natural ou sintético que se ligue a um receptor de res-gate; albumina, incluindo, mas não limitando a albumina hu-mana recombinante ou fragmentos ou variantes desta (veja, p.ex. , Patente US No. 5.87 6.969, publicada em 2 de março de1999, Patente EP 0 413 622 e atente US No. 5.766.883, publi-cada em 16 de junho de 1998, incorporadas aqui como referên-cia em suas totalidades); e um domínio de zíper de leucina eoutras de tais proteínas e fragmentos de proteína. Polipep-tídeos de ligação a APRIL que podem ser usados nos métodos da invenção requerem a presença de pelo menos um veículo a-derido ao peptídeo através da extremidade N-terminal, C-terminal ou de uma cadeia lateral de um dos resíduos de ami-noácidos. Múltiplos veículos também podem ser usados; p.ex., Fcs em cada extremidade ou um Fc em uma extremidade e um grupo PEG na outra extremidade ou uma cadeia lateral. Pa-ra peptídeos de ligação a APRIL um domínio Fc é o veículopreferido. 0 domínio Fc pode ser fusionado à extremidade Nou C-terminal dos peptídeos ou tanto à extremidade N como àC-terminal. Fusão na extremidade N-termínal é preferida.

Como mencionado acima, variantes de Fc são veícu-los adequados para peptídeos de ligação a APRIL que podemser usados nos métodos da invenção. Um Fc nativo pode sermodificado extensivamente para formar uma variante de Fc,contanto que a ligação ao receptor de resgate seja mantida; veja, por exemplo, WO 97/34631 e WO 96/32478. Em tais vari-antes de Fc, alguém pode remover um ou mais sítios de um Fcnativo que provê características estruturais de atividadefuncional não requerida pelos peptídeos de ligação a APRILque podem ser usados nos métodos da invenção. Alguém poderemover esses sítios por, por exemplo, substituição ou dele-ção de resíduos, inserção de resíduos no sítio, ou porçõestruncadas contendo o sítio. Os resíduos inseridos ou substi-tuídos também podem ser aminoácidos alterados, tal como pep-tiddoimitadores ou D-aminoácidos. Variantes de Fc podem serdesejáveis por várias razões, muitas das quais são descritasabaixo. Variantes Fc exemplares incluem moléculas e seqüên-cias em que:

1.Sítios envolvidos na formação de ligação dissul-feto são removidos. Tal remoção pode evitar reação com ou-tras proteínas contendo cisteína presentes na célula hospe-deira usada para produzir as moléculas da invenção. Para es-ta finalidade, o segmento contendo cisteína da extremidadeN-terminal pode ser truncado ou resíduos de cisteína podemser deletados ou substituídos por outros aminoácidos (p.ex., alanil, seril). Mesmo quando resíduos de cisteína sãoremovidos, os domínios de Fc de cadeia única ainda podemformar um domínio de Fc dimérico que é mantido junto não co-valentemente.

2. Um Fc nativo é modificado para torná-lo maiscompatível com uma célula hospedeira selecionada. Por exem-plo, alguém pode remover a seqüência PA próxima à extremida-de N-terminal de um Fc nativo típico, que pode ser reconhe-cido por uma enzima digestiva em E. Coli tal como prolinaiminopeptidase. Alguém também pode adicionar um resíduo demetionina N-terminal, especialmente quando a molécula é ex-pressada recombinantemente em uma célula bacteriana tal comoΕ. Coli.

3. Uma porção da extremidade N-terminal de um Fcnativo é removida para prevenir heterogeneidade N-terminalquando expressada em uma célula hospedeira selecionada. Paraesta finalidade, alguém pode deletar qualquer um dos primei-ros 20 resíduos de aminoácidos da extremidade N-terminal.

4. Um ou mais sítios de glicosilação são removidos.Resíduos que são tipicamente glicosilados (p. ex., asparagi-na) podem conferir resposta citolítica. Tais resíduos podemser deletados ou substituídos por resíduos não glicosilados(p. ex., alanina).

5.Sítios envolvidos na interação com complemento,tal como o sítio de ligação a Clq, são removidos. Por exem-plo, alguém pode deletar ou substituir a seqüência EKK deIgGl humana. Recrutamento do complemento pode não ser vanta-joso para as moléculas que podem ser usadas nos métodos dainvenção e, portanto, podem ser evitadas com tal variante deFc.

6.São removidos sítios que afetam a ligação a re-ceptores de Fc fora um receptor de resgate. Um Fc nativo po-de ter sítios para interação com certas células brancas dosangue que não são requeridas para as moléculas de fusão depeptídeo de ligação a neutrocina-alfa que podem ser usadasnos métodos da invenção e, portanto, podem ser removidas.

7.O sítio ADCC é removido. Sítios ADCC são conhe-cidos na técnica; veja, por exemplo, Molec Immunol 29(5):633-9 (1992) com relação aos sítios ADCC em IgGl. Esses sí-tios, também, não são requeridos para as moléculas de fusãoque podem ser usadas nos métodos da invenção e, portanto,podem ser removidas.

8. Quando o Fc nativo é derivado de um anticorponão humano, o Fc nativo pode ser humanizado. Tipicamente,para humanizar um Fc nativo, alguém substituirá resíduos se-lecionados no Fc nativo não humano por resíduos que são nor-malmente encontrados em Fc nativo humano. Técnicas para hu-manização de anticorpo são bem conhecidas na técnica.

Um veículo alternativo para peptídeos de ligação aAPRIL que pode ser usado nos métodos da invenção seria umaproteína, polipeptídeo, peptídeo, anticorpo, fragmento deanticorpo, ou molécula pequena (p. ex., um composto peptido-mimético) capaz de se ligar a um receptor de resgate. Porexemplo, alguém poderia usar como um veículo um polipeptídeoconforme descrito em Pat US No. 5.739.277. Peptídeos tambémpoderiam ser selecionados por visualização por fago ou tria-gem RNA-peptídeo para ligação a receptor de resgate. Taiscompostos de ligação a receptor de resgate também são inclu-ídos no significado de "veículo" e podem ser usados parapeptídeos de ligação a APRIL que podem ser usados nos méto-dos da invenção. Tas veículos deveriam ser selecionados pormeia-vida aumentada (p. ex., evitando seqüências reconheci-das por proteases) e imunogenicidade diminuída (p. ex., fa-vorecendo seqüências não imunogênicas, como descoberto emhumanização de anticorpo).

Como mencionado acima, veículos de polímero tambémpodem ser usados em peptídeos de ligação a APRIL que podemser usados nos métodos da invenção. Vários meios para aderirunidades químicas úteis como veículos estão atualmente dis-poníveis, veja, p. ex. , Publicação Internacional do Tratadode Cooperação de Patentes ("PCT") No. WO 96/11953, incorpo-rada aqui como referência em sua totalidade. Esta publicaçãoPCT divulga, entre outras coisas, a adesão seletiva de polí-meros solúveis em água à extremidade N-terminal de proteí-nas .

Em uma modalidade específica, um veículo de polí-mero preferido é polietileno glicol (PEG). 0 grupo PEG pode ser de qualquer peso molecular conveniente e pode ser linearou ramificado. 0 peso molecular médio do PEG de preferênciavariará de cerca de 2 quilodáltons ("kD") até cerca de 100kD, de maior preferência de cerca de 5 kD até cerca de 50kD, da maior preferência de cerca de 5 kD até cerca de 10kD. Os grupos PEG geralmente estarão aderidos aos peptídeosde ligação"a APRIL que podem ser usados nos métodos da in-venção através de acilação ou alquilação redutora através deum grupo reativo na unidade de PEG (p. ex., um grupo aldeí-do, amino, tiol ou éster) para um grupo reativo no compostoda invenção (p. ex., um grupo aldeído, amino, ou éster).

Uma estratégia útil para a PEGuilação de peptídeossintéticos consiste em combinar, através da formação de umaligação de conjugado em solução, um peptídeo e uma unidadede PEG, cada um portando uma funcionalidade especial que é mutuamente reativa com a outra. Os peptídeos podem ser fa-cilmente preparados com síntese em fase sólida convencional.Os peptídeos são "pré-ativados" com um grupo funcional apro-priado em um sítio específico. Os precursores são purifica-dos e completamente caracterizados antes de reagir com a u-nidade de PEG. A ligação do peptideo com PEG geralmente o-corre em fase aquosa e pode ser facilmente monitorada porHPLC analítico de fase reversa. Os peptídeos PEGuilados po-dem ser facilmente purificados por HPLC preparativa e carac-terizados por HPLC analítica, análise de aminoácidos e es-pectrometria de massas pôr dessorção a laser.

Polímeros polissacarídicos são outro tipo de polí-mero hidrossolúvel que pode ser usado para peptídeos de Ii-gação a APRIL que podem ser usados nos métodos da invenção.Dextrans são polímeros polissacarídicos compreendidos porsubunidades individuais de glicose predominantemente ligadaspor ligações al-6. O dextran por si só está disponível emmuitas faixas de peso molecular e está prontamente disponí-vel em pesos moleculares de cerca de 1 kD até cerca de 70kD. Dextran é um polímero hidrossolúvel adequado para uso empeptídeos de ligação a APRIL que podem ser usados nos méto-dos da invenção como um veículo por si só ou em combinaçãocom outro veículo (p. ex., Fc). Veja, por exemplo, WO96/11953 e WO 96/05309. O uso de dextran conjugado a imuno-globulinas de diagnóstico ou terapêuticas foi relatado; ve-ja, por exemplo, Publicação de Patente Européia No. O 315456, que é incorporada por meio deste como referência em suatotalidade. Dextran de cerca de 1 kD até cerca de 20 kD épreferido quando o dextran é usado como um veículo de acordocom a presente invenção.

Em uma modalidade específica, peptídeos de ligaçãoa APRIL que podem ser usados nos métodos da invenção opcio-nalmente incluem um "ligante". Quando presente, sua estrutu-ra química não é crítica desde que sirva primariamente comoum espaçador. 0 ligante é de preferência feito de aminoáci-dos unidos por ligações peptídicas. Assim, em modalidadespreferidas, o ligante é feito de 1 até 30 aminoácidos liga-dos por ligações peptídicas, em que os aminoácidos são sele-cionados dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente. Algunsdesses aminoácidos podem ser glicosilados, como é bem enten-dido por aqueles na técnica. Em uma modalidade mais preferi-da, os 1 até 20 aminoácidos são selecionados de glicina, a-lanina, prolina, asparagina, glutamina e lisina. Ainda demaior preferência, um ligante é feito de uma maioria de ami-noácidos que estão estericamente desimpedidos, tal como gli-cina e alanina. Assim, ligantes preferidos são poliglicinas(particularmente (Gly)4 (Gly)5, poli (Gly-Ala)5 e polialani-nas. Ligantes preferidos são ligantes de aminoácidos compre-endendo mais de 5 aminoácidos, com ligantes adequados tendoaté cerca de 500 aminoácidos selecionados de glicina, alani-na, prolina, asparagina, glutamina, lisina, treonina, serinaou aspartato. Ligantes de cerca de 20 ate 50 aminoácidos sãoos mais preferidos.

Ligantes não peptídicos também são úteis para pep-tídeos de ligação a APRIL que podem ser usados nos métodosda invenção. Por exemplo, ligantes de alquila tal como -NH—(CH2)n—C(O)--, em que n=2-20 poderiam ser usados. Esses li-gantes de alquila podem ser adicionalmente substituídos porqualquer grupo não impedido estericamente tal como alquilainferior (p. ex., Ci-Ce) acila inferior, halogênio (p. ex. ,CL, Br), CN, NH2, fenila, etc.

I.siRNAs e anti-sentido

Em uma modalidade especifica, o antagonista deneutrocina-alfa é um RNA anti-sentido, RNA catalitico (ribo-zima) ou RNA curto de interferência (siRNA) que se direcionaa neutrocina-alfa, APRIL ou receptores para neutrocina-alfa(p. ex., TACI, BCMA e BAFF-R) . Em uma modalidade especifica,moléculas anti-sentido direcionadas contra neutrocina-alfa,APRIL, TACI, BCMA ou BAFF-R podem ser usadas nos métodos dainvenção. Tecnologia anti-sentido pode ser usada para con-trolar expressão gênica através de DNA ou RNA anti-sentidoou através de formação de hélice tripla. Técnicas anti-sentido são discutidas, por exemplo, em Okano, J Neurochem56: 560 (1991): "Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibi-tors of Gene Expression", CRC Press, Boca Raton, FL (1988) .Formação de hélice tripla é discutida em, por exemplo, Leeet al., Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Cooney etal., Science 241: 456 (1988) e Dervan et al., Science 251:1360 (1991). Os métodos são baseados na ligação de um poli-nucleotideo a um DNA ou RNA complementar. Por exemplo, aporção codificante 5' de um polinucleotideo que codifica odomínio extracelular do polipeptídeo da presente invençãopode ser usada para desenhar um oligonucleotídeo de RNA an-ti-sentido de cerca de 10 até 40 pares de bases de compri-mento. Um oligonucleotídeo de DNA é desenhado para ser com-plementar a uma região do gene envolvido em transcrição pre-venindo desse modo a transcrição e a produção de neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA ou BAFF-R. Os oligonucleotídeos deRNA anti-sentido se hibridizam com o mRNA in vivo e bloquei-am a tradução da molécula de mRNA em polipeptídeo de neutro-cina-alfa, APRIL, TACI, BCMA ou BAFF-R. Os oligonucleotideosdescritos acima também podem ser distribuídos para célulastal que o RNA ou DNA anti-sentido possa ser expresso in vivopara inibir a produção de neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMAou BAFF-R.

Em uma modalidade, o ácido nuclêico anti-sentidode neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA ou BAFF-R que pode serusado nos métodos da invenção é produzido intracelularmentepor transcrição de uma seqüência exógena. Por exemplo, umvetor ou uma porção deste, é transcrito, produzindo um ácidonuclêico (RNA) anti-sentido que pode ser usado nos métodosda invenção. Tal vetor conteria uma seqüência codificando o ácido nuclêico anti-sentido de neutrocina-alfa, APRIL, TACI,BCMA ou BAFF-R. Tal vetor poderia permanecer epissomal outornar-se integrado cromossomicamente, contanto que ele pos-sa ser transcrito para produzir o RNA anti-sentido desejado.Tais vetores podem ser construídos por métodos de tecnologiade DNA recombinante padrões na técnica. Vetores podem serplasmidiais, virais ou outros conhecidos na técnica, usadospara replicação e expressão em células vertebradas. Expres-são da seqüência codificando neutrocina-alfa, APRIL, TACI,BCMA ou BAFF-R, ou fragmentos destes, pode ser por qualquerpromotor conhecido na técnica por agir em células de verte-brado, de preferência humanas. Tais promotores podem ser in-duzíveis ou constitutivos. Tais promotores incluem, mas nãoestão limitados a, a região promotora precoce de SV40 (Ber-noist e Chambon, Nature 29: 304-310 (1981)), o promotor con-tido na repetição terminal longa 3' de vírus do sarcoma deRous (Yamamoto et al., Cell 22: 787-797 (1980)), o promotorde timidina de herpes (Wagner et al., Proc Natl Acad Sci USA78: 1441-1445 (1981)), as seqüências regulatórias do gene dametalotioneina (Brinster et al., Nature 296: 39-42 (1982)),etc.

Os ácidos nuclêicos anti-sentido que podem ser u-sados nos métodos da invenção compreendem uma seqüência com-plementar a pelo menos uma porção de um transcrito de RNA deum gene de neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA ou BAFF-R. En-tretanto, complementaridade absoluta, embora preferida, nãoé requerida. Uma seqüência "complementar a pelo menos umaporção de um RNA", referida a aqui, significa uma seqüênciaque tem complementaridade suficiente para ser capaz de hi-bridizar-se com o RNA, formando um dúplex estável; no casode ácidos nuclêicos de neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA ouBAFF-R de fita dupla, uma única fita do DNA dúplex pode as-sim ser testada, ou formação tríplex pode ser avaliada. Ahabilidade para hibridizar dependerá tanto do grau de com-plementaridade como do comprimento do ácido nuclêico anti-sentido. Geralmente, quanto maior for o ácido nuclêico quese hibridiza, mais mal pareamentos de base com neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA ou BAFF-R ele pode conter e aindaformar um dúplex estável (ou tríplex como o caso puder ser).Alguém versado na técnica pode verificar um grau tolerávelde mal pareamento por uso de procedimentos padrões para de-terminar o ponto de desnaturação do complexo hibridizado.Oligonucleotideos que são complementares à extre-midade 5' da mensagem, p. ex., a seqüência 5' não traduzidaaté e incluindo o códon de iniciação AUG, devem funcionarmais eficientemente na inibição de tradução. Entretanto, de-monstrou-se que seqüências complementares às seqüências 3'não traduzidas de mRNAs são mais eficazes na inibição detradução de mRNAs também. Veja geralmente, Wagner R. 1994,Nature 372: 333-335. Assim, oligonucleotideos complementaresàs regiões 5' e 3' não traduzidas, não codificantes de neu-trocina-alfa (SEQ ID NO: 1), APRIL (SEQ ID NO: 3), TACI (SEQID NO: 5), BCMA (SEQ ID NO: 7) ou BAFF-R (SEQ ID NO: 9), po-deriam ser usados em uma abordagem anti-sentido para inibira tradução de mRNA de neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA ouBAFF-R endógeno. Oligonucleotideos complementares à região5' não traduzida do mRNA devem incluir o complemento do có-don de iniciação AUG. Oligonucleotideos anti-sentido comple-mentares a regiões codificantes de mRNA são inibidores menoseficientes de tradução, mas poderiam ser usados de acordocom métodos da invenção. Se desenhados para hibridizarem-secom a região 5', 3' ou codificante de mRNA de neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA ou BAFF-R, ácidos nuclêicos anti-sentido deveriam ter pelo menos seis nucleotideos de compri-mento e são de preferência oligonucleotideos que variam de 6até cerca de 50 nucleotideos de comprimento. Em aspectos es-pecíficos, o oligonucleotídeo tem pelo menos 10 nucleoti-deos, pelo menos 17 nucleotideos, pelo menos 25 nucleotideosou pelo menos 50 nucleotideos.

Os polinucleotídeos que podem ser usados nos méto-dos da invenção podem ser DNA ou RNA ou misturas quiméricasou derivados ou versões modificadas destes, de fita simplesou fita dupla. O oligonucleotideo pode ser modificado na u-nidade de base, unidade de açúcar ou cerne de fosfato, porexemplo, para melhorar a estabilidade da molécula, hibridi-zação, etc. O oligonucleotideo pode incluir outros gruposanexados tal como peptideos (p. ex., para direcionar recep-tores de célula hospedeira in vivo) , ou agentes facilitado-res de transporte através da membrana celular (veja, p. ex.,Letsinger et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86: 6553-6556; Lemaitre et al., Proc Natl Acad Sci USA 84: 648-652

(1987); Publicação PCT No. WO 88/09810, publicada em 15 dedezembro de 1988) ou da barreira hemato-encefálica (veja, p.ex., Publicação PCT No. WO 89/10134, publicada em 25 de a-bril 1988), agentes de clivagem desencadeador por hibridiza-ção. (Veja, p. ex., Krol et al., BioTechniques 6: 958-976

(1988)) ou agentes intercalantes. (Veja, p. ex., Zon, Pharm.Res 5: 539-549 (1988)). Para esta finalidade, o oligonucleo-tideo pode ser conjugado a uma outra molécula, p. ex., umagente reticulador desencadeado por hibridização, agentetransportador, agente de clivagem desencadeado por hibridi-zação, etc.

O oligonucleotideo anti-sentido que pode ser usadonos métodos da invenção pode compreender pelo menos uma uni-dade de base modificada que é selecionada do grupo incluin-do, mas não limitando a, 5-fluoruracila, 5-bromouracila, 5-clorouracil, 5-iodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxiidroximetil) uracila, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboxinetilaminometiluracila, diidrouracila, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracila, 5-metoxiaminometil-2-tiouracila, be-ta-D-manosilqueosina, 5-metoxicarboximetiluracila, 5-metoxiuracila, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido ura-cil-5-oxiacético (ν), vibutoxosina, pseudouracila, queosina,2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, metiléster do ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (ν) , 5-metil-2-tiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracila, (acp3)w,e 2,6-diaminopurina.

0 oligonucleotideo anti-sentido que pode ser usadonos métodos da invenção também pode compreender pelo menosuma unidade de açúcar modificado selecionado do grupo inclu-indo, mas não limitando a, arabinose, 2-fluorarabinose, xi-lulose e hexose.

Em ainda outra modalidade, o oligonucleotideo an-ti-sentido que pode ser usado nos métodos da invenção com-preende pelo menos um cerne de fosfato modificado seleciona-do do grupo incluindo, mas não limitando a, um fosforotioa-to, um fosforoditioato, um fosforamidotioato, um fosforami-dato, um fosfordiamidato, um metilfosfonato, um alquil fos-fotriéster e um formacetal ou seu análogo.

Em ainda outra modalidade, o oligonucleotideo an-ti-sentido que pode ser usado nos métodos da invenção é umoligonucleotideo alfa-anomérico. Um oligonucleotídeo alfa-anomérico forma híbridos de fita dupla específicos com RNAcomplementar em que, ao contrário das beta-unidades usuais,as fitas correm paralelas uma a outra (Gautier et al., NuclAcids Res 15: 6625-6641 (1987)). 0 oligonucleotídeo é um 2-0- metilribonucleotídeo (Inoue et al., Nucl Acids Res 15:6131-6148 (1987)), ou um análogo de RNA-DNA quimérico (Inoueet al., FEBS Lett 215: 327-330 (1997)).

Polinucleotídeos que podem ser usados nos métodosda invenção podem ser sintetizados por métodos padrões co-nhecidos na técnica, p. ex., por uso de um sintetizador deDNA automatizado (tal como estão disponíveis comercialmenteem Bioresearch, Applied Biosystems, etc.). Como exemplos,oligonucleotídeos de fosforotioato podem ser sintetizadospelo método de Stein et al., (Nucl Acids Res 16: 3209(1988)), oligonucleotídeos de metilfosfonato podem ser pre-parados por uso de suporte de polímero de vidro poroso con-trolado (Sarin et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 7448-7451)), etc.

Embora nucleotídeos anti-sentido complementares àseqüência de região codificante de neutrocina-alfa, APRIL,TACI, BCMA ou BAFF-R possa ser usada, aquelas complementaresà região não traduzida transcrita são as mais preferidas pa-ra uso nos métodos da invenção.

Em uma modalidade específica, antagonistas de neu-trocina-alfa que podem ser usados nos métodos da invençãotambém incluem um RNA catalítico, ou uma riboziam (veja, p.ex., Publicação Internacional PCT WO 90/11364, publicada em4 de outubro de 1990; Sarver et al., Science 247: 1222-1225(1990)) direcionadas contra neutrocina-alfa, APRIL, TACI,BCMA ou BAFF-R. Embora ribozimas que clivam mRNA em seqüên-cias de reconhecimento sitio-especifico possam ser usadaspara destruir mRNAs de neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA ouBAFF-R, o uso de ribozimas de cabeça de martelo é preferidopara uso nos métodos da invenção. Ribozimas de cabeça demartelo clivam mRNAs em locais ditados por regiões flanquea- doras que formam pares de bases complementares com o mRNAalvo. 0 único requerimento é que o mRNA alvo tenha a seguin-te seqüência de duas bases: 5'-UG-3'. A construção e produ-ção de ribozimas de cabeça de martelo são bem conhecidas natécnica e são descritas mais completamente em Haseloff e Gerlach, Nature 334: 585-591 (1988). Há numerosos sítios declivagem de ribozima de cabeça de martelo potenciais nas se-qüências nucleotídicas de neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMAou BAFF-R. De preferência, a ribozima é engenheirada paraque o sítio de reconhecimento de clivagem esteja localizado próximo à extremidade 5' "do mRNA de neutrocina-alfa, APRIL,TACI, BCMA ou BAFF-R; isto é, para aumentar a eficiência eminimizar o acúmulo intracelular de transcritos de mRNA nãofuncionais.

Como na abordagem anti-sentido, as ribozimas que podem ser usadas nos métodos da invenção podem ser compostasde oligonucleotídeos modificados (p. ex., para estabilidade,direcionamento melhorados, etc.) e devem ser distribuídospara células que expressam neutrocina-alfa, APRIL, TACI,BCMA ou BAFF-R in vivo. Construções de DNA codificando a ri-bozima que podem ser introduzidas na célula da mesma maneiraconforme descrito acima para a introdução de DNA codificantede anti-sentido. Um método preferido de distribuição envolveo uso de uma construção de DNA "codificante" da ribozima sobo controle de um promotor constitutivo forte, tal como, porexemplo, promotor de pol III ou pol II, de modo que célulastransfectadas produzam quantidades suficientes da ribozimapara destruir mensagens de neutrocina-alfa, APRIL, TACI,BCMA ou BAFF-R endógenas e inibam a tradução. Já que ribozi-mas diferentes de moléculas anti-sentido, são cataliticas,uma concentração intracelular menor é requerida para efici-ência .

Em uma modalidade especifica, RNA curto de inter-ferência direcionado contra neutrocina-alfa, APRIL, TACI,BCMA ou BAFF-R pode ser usado nos métodos da invenção. Atecnologia de siRNA pode ser usada para controlar expressãogênica através da indução do complexo de silenciamento indu-zido por RNA de células (RISC). Técnicas de siRNA são discu-tidas, por exemplo, em Hamilton AJ e Baulcombe DC Science1999 286(5441): 950-2; Elbashir SM et al., Nature 2001411(6836): 494-8 e Hanon, Gregory J e Rossi, John J Nature431: 371-8 (2004). Os métodos são baseados na introdução deRNA curto de fita dupla (geralmente 20-25 nucleotideos) emuma célula. 0 RNA de fita dupla é desenrolado e cada fitaseparada. Uma fita simples do RNA é então incorporada noRISC. o RISC então direciona clivagem de mRNA especifica aseqüência resultando em repressão traducional. Por exemplo,a porção codificante de um polinucleotideo que codifica umpolipeptideo de neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA ou BAFF-Rpode ser usada para desenhar um oligonucleotideo de siRNA decerca de 20 até 25 nucleotideos de comprimento. Um oligonu- cleotideo de DNA é desenhado com o fragmento de 20-25 nucle-otideos apropriado, um espaçador de aproximadamente 9 nucle-otideos e o complemento reverso do fragmento nucleotidicoescolhido. Espera-se que o transcrito de RNA produzido apartir desta construção se enovelado por si só para formar uma alça em grampo. Distribuição do RNA de alça em grampopara a célula resulta em processamento pela Rnase, Dicer pa-ra dar o siRNA curto de fita dupla. A incorporação de um fi-ta deste siRNA no complexo efetor de RISC resulta na cliva-gem do mRNA direcionado pelo siRNA a fim de inibir a produ-ção de neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA ou BAFF-R.

Em uma modalidade, o ácido nuclêico de neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA ou BAFF-R que pode ser usado nos mé-todos da invenção é produzido intracelularmente por trans-crição de uma seqüência exógena. Por exemplo, um vetor ou uma porção deste, é transcrito, produzindo um siRNa que podeser usado nos métodos da invenção. Tal vetor conteria umaseqüência codificando o ácido nuclêico de neutrocina-alfa,APRIL, TACI, BCMA ou BAFF-R. Tais vetores podem ser constru-ídos por métodos de tecnologia de DNA recombinante padrõesna técnica. Vetores podem ser plasmidiais, virais ou outrosconhecidos na técnica, usados para replicação e expressão emcélulas vertebradas. A transcrição da seqüência codificandoo siRNA de neutrocina-alfa, APRIL, TACI, BCMA ou BAFF-R étipicamente efetuada usando um promotor de RNA polimeraseIII (p. ex. , U6 ou Hl), que geralmente direciona a transcri-ção de RNAs nucleares pequenos (snRNAs).

Moduladores de Célula B

Além de receptores para neutrocina-alfa e APRIL,linfócitos B expressam uma variedade de moléculas de super-fície celular que funcionam para informar células B sobre omicroambiente extracelular e agem como sinais transmembranapara regular positivamente e negativamente a função e sobre- vivência de célula B. Entre esses receptores, CD19, CD20 eCD22 foram identificados como alvos promissores para inter-venção terapêutica.

CD20 é uma proteína integral de membrana que ageem um complexo como um canal de cálcio. Inibidores do canalde cálcio de CD20 perturbam a homeostase de Ca2+ e a pro-gressão do ciclo celular. Em uma modalidade específica, umanticorpo anti-CD20 pode ser usado nos métodos da presenteinvenção. Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-CD20que pode ser usado nos métodos da invenção é Rituxan® (ritu- ximab). Em outra modalidade preferida, o anticorpo anti-CD20que pode ser usado nos métodos da invenção é TRU-015. Em ou-tra modalidade preferida, o anticorpo anti-CD20 que pode serusado nos métodos da invenção é ocrelizumab (PR070769). Emoutra modalidade preferida, o anticorpo anti-CD20 que pode ser usado nos métodos da invenção é IMMU-106. Em outra moda-lidade preferida, o anticorpo anti-CD20 que pode ser usadonos métodos da invenção é HuMax-CD20.

CD22 é um membro da família siglec de proteínas deligação a ácido siálico encontrado em uma variedade de célu-las, incluindo linfócitos Β. A interação de CD22 com uma va-riedade de ligantes de carboidrato em eis e trans resulta naregulação de vários aspectos do desenvolvimento, prolifera-ção e ativação de célula B. Em uma modalidade especifica, umanticorpo anti-CD22 pode ser usado nos métodos da presenteinvenção. Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-CD22que pode ser usado nos métodos da invenção é epratuzumab.Outros Agentes Imunomodulatórios

Em uma modalidade especifica, os métodos da pre-sente invenção podem ser praticados com um ou mais dos se-guintes fármacos: CellCept (micofenolato de mofetila; MMF),Orencia® (abatacept; CTLA4-Ig), Riquent™ (abetimus sodium;LJP 394), Prestara™ (praserona), Edratide (TV-4710), Acte-mra® (tocilizumab; atlizumab), VX-702, TRX 1, IPP-201101,ABR-215757, agonista de esfingosina-l-fosfato-1 (SlPl), Hu-Max-InfIam™ (MDX 018), MEDI-545 (MDX-1103/1333) , Rhudex®,Desoxiespergualina, ENBREL™ (Etanercept), anticorpo anti-TNF, anticorpo anti-interferon-alfa.

Populações de pacientesComo descrito aqui, dados de um ensaio clinico emque paciente com lúpus foram tratados com um anticorpo queneutraliza a proteína neutrocina-alfa, melhoram significati-vãmente os sintomas associados com lúpus em pacientes quetêm um título de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ou i-gual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA (Exemplo 1) . Sur-preendentemente, melhorias significativas estatisticamenteem pontos finais clínicos medindo a atividade de doença (talcomo uma redução na pontuação SELENA SLEDAI, explicada emmaiores detalhes abaixo) foram obtidas apenas em um subgrupode pacientes, como oposto à população de pacientes inteiraalistada no ensaio clinico. Assim, a presente invenção serelaciona à identificação de subgrupos de pacientes que sãomais capazes de responder ao tratamento com um agente imuno-modulatório tal como um antagonista de neutrocina-alfa.

Adicionalmente, como descrito aqui, lúpus sistêmi-co eritematoso (SLE) é uma doença extremamente heterogêneaque é dificil de diagnosticar corretamente devido à naturezaampla de sintomas que um paciente pode ter e ao fato de quemuitos dos sintomas associados com lúpus também são vistosem várias outras doenças auto-imunes. Assim, uma modalidadeda presente invenção provê um método para tratar um pacienteque tem um titulo de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ouigual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ousoro sangüíneo compreendendo administrar uma quantidade te-rapeuticamente eficaz de um antagonista de neutrocina-alfaou outro agente imunomodulatório conhecido na técnica e/oudescrito aqui independente do diagnóstico da doença. Outramodalidade da presente invenção provê um método para tratarum paciente que tem um título de ANA de 1:80 ou maior e/oumaior que ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA emseu plasma ou soro sangüíneo compreendendo administrar umaquantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de neu-trocina-alfa ou outro agente imunomodulatório conhecido natécnica e/ou descrito aqui independente do diagnóstico dadoença e compreendendo adicionalmente fazer uma determinaçãode que o paciente tem um título de ANA de 1:80 ou maior e/oumaior que ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA emseu plasma ou soro sangüíneo, antes de administrar o agenteimunomodulatório.

Em modalidades adicionais, o paciente que tem umtítulo de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ou igual a 30UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüí-neo tem uma doença auto-imune que não é SLE. Em modalidadesadicionais, o paciente que tem um título de ANA de 1:80 oumaior e/ou maior que ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo tem artrite reumatói-de. Em modalidades adicionais, o paciente que tem um títulode ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ou igual a 30 UI/mLde anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüíneo temsíndrome de Sjõgren. Em modalidades adicionais, o pacienteque tem um título de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ouigual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ousoro sangüíneo tem escleroderma. Em modalidades adicionais,o paciente que tem um título de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA emseu plasma ou soro sangüíneo tem poliomiosite-dermatomiosite. Em modalidades adicionais, o paciente quetem um título de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ou i-gual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ousoro sangüíneo tem síndrome de Felty. Em modalidades adicio-nais, o paciente que tem um título de ANA de 1:80 ou maiore/ou maior que ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNAem seu plasma ou soro sangüíneo tem doença de tecido conjun-tivo mista. Em modalidades adicionais, o paciente que tem umtitulo de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ou igual a 30UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou soro sangüí-neo tem síndrome de Raynaud. Em modalidades adicionais, opaciente que tem um título de ANA de 1:80 ou maior e/ou mai-or que ou igual a 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seuplasma ou soro sangüíneo tem artrite juvenil crônica.

Além disso, nota-se que em ambos os ensaio clíni-cos de fase 2 usando um anticorpo que neutraliza a proteínaneutrocina-alfa para tratar paciente com lúpus eritematososistêmico e artrite reumatóide (veja, Exemplos 1 e 3) foiobservado que era mais provável que pacientes com doença deauto-anticorpos positivos na linha basal respondesse ao tra-tamento. Como descrito aqui, paciente com SLE que tinham umtítulo de ANA de 1:80 ou maior e/ou maior que ou igual a 30UI/mL de anticorpos anti-dsDNA na linha basal mostraram umaresposta mais forte como um grupo que pacientes cujos títu-los de ANA eram menores que 1:80 e cujo nível de anticorpoanti-dsDNA era menor que 30 UI/mL. De maneira similar, emartrite reumatóide, foi observado que pacientes que forampositivos para fator reumatóide [RF] ou anticorpos anti-peptídeo citrunilado cíclico [CCP] na linha basal mostraramuma resposta mais forte como um grupo que pacientes com ar-trite reumatóide que não foram positivos para fator reuma-tóide [RF] ou anticorpos anti-peptídeo citrunilado cíclico[CCP] na linha basal.

Assim, em outro aspecto da presente invenção, éprovido um método para tratar um paciente que é positivo pa-ra fator reumatóide [RF] ou anticorpos anti-peptideo citru-nilado cíclico [CCP] na linha basal, compreendendo adminis-trar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonis-ta de neutrocina-alfa ou outro agente imunomodulatório co- nhecido na técnica e/ou descrito aqui independente do diag-nóstico da doença. Outra modalidade da presente invençãoprovê um método para tratar um paciente que é positivo parafator reumatóide [RF] ou anticorpos anti-peptideo citrunila-do cíclico [CCP] na linha basal, compreendendo administraruma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista deneutrocina-alfa ou outro agente imunomodulatório conhecidona técnica e/ou descrito aqui independente do diagnóstico dadoença e compreendendo adicionalmente fazer a determinaçãode que o paciente é positivo para fator reumatóide [RF] ouanticorpos anti-peptideo citrunilado cíclico [CCP] na linhabasal, antes de administrar o agente imunomodulatório. Emmodalidades específicas, um(a) paciente é considerado comopositivo para fator reumatóide se ele tem > 12 UI/mL de fa-tor reumatóide em seu plasma ou soro sangüíneo. Em modalida- des específicas, um paciente é considerado como positivo pa-ra anticorpo anti-CCP se o (a) paciente tem > 10 unidades deanticorpo anti-CCP em seu plasma ou soro sangüíneo.

Em um aspecto adicional da presente invenção, éprovido um método para tratar um paciente que é positivo pa- ra auto-anticorpo na linha basal, compreendendo administraruma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista deneutrocina-alfa ou outro agente imunomodulatório conhecidona técnica e/ou descrito aqui independente do diagnóstico dadoença. Outra modalidade da presente invenção provê um méto-do para tratar um paciente que é positivo para auto-anticorpo na linha basal, compreendendo administrar umaquantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de neu-trocina-alfa ou outro agente imunomodulatório conhecido natécnica e/ou descrito aqui independente do diagnóstico dadoença e compreendendo adicionalmente fazer uma determinaçãode que o paciente é positivo para auto-anticorpo na linhabasal, antes de administrar o agente imunomodulatório.

Fazendo Agentes imunomodulatórios

Métodos para fazer e/ou isolar agentes imunomodu-latórios que podem ser usados na presente invenção são co-nhecidos por aqueles versados nas técnicas relevantes. Abai-xo, métodos disponíveis para fazer agentes imunomodulatóriosque são proteináceos na natureza (p. ex., anticorpos anti-neutrocina-alfa, peptídeos e polipeptídeos de ligação a neu-trocina-alfa, proteínas receptoras de neutrocina-alfa assimcomo fragmentos e variantes dos polipeptídeos acima mencio-nados) são revistos brevemente.

Em uma modalidade, um polinucleotídeo codificandouma proteína imunomodulatória é inserido em um vetor (p.ex., um vetor de expressão ou clonagem). O vetor pode ser,por exemplo, um vetor de fago, um plasmídeo, viral ou retro-viral. Vetores retrovirais podem ser competentes para repli-cação ou defectivos para replicação. No último caso, a pro-pagação viral geralmente ocorrerá apenas em células hospe-deiras complementares. Os polinucleotídeos codificando umaproteína imunomodulatória podem ser unidos a um vetor con-tendo um marcador selecionável para propagação em um hospe-deiro. A introdução da construção do vetor na célula hospe-deira pode ser efetuada por técnicas conhecidas na técnicaque incluem, mas não estão limitadas a, transfecção por fos-fato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextran, trans-fecção, mediada por lipideo catiônico, eletroporação, trans-dução, infecção ou outros métodos. Tais métodos são descri-tos em muitos manuais de laboratório padrões, tal como Daviset al., Basic Methods In Molecular Biology (1986).

Geralmente, vetores de expressão recombinante in-cluirão origens de replicação e marcadores selecionáveispermitindo transformação da célula hospedeira, p. ex., o ge-ne de resistência a ampicilina de E. Coli e o gene TRPl deS. Cerevisiae e um promotor derivado de um gene altamenteexpresso para direcionar transcrição de uma seqüência estru-tural a jusante. Tais promotores podem ser derivados de en-zimas glicoliticas codificando operons tal como 3-fosfoglicerato quinase (PGK), fator-a, fosfatase ácida, ouproteínas de choque térmico, entre outras. A seqüência es-trutural heteróloga é montada na fase apropriada com a ini-ciação de tradução e seqüências de terminação e de preferên-cia, uma seqüência líder capaz de direcionar a secreção deproteína traduzida no espeço periplásmico ou meio extracelu-lar. Opcionalmente, a seqüência heteróloga pode codificar umproteína de fusão incluindo um peptídeo de identificação N-terminal conferindo características desejadas, por exemplo,estabilização ou purificação simplificada de produto recom-binante expresso.Em uma modalidade, o polinucleotídeo codificandouma proteína imunomodulatória é associado operacionalmentecom um elemento regulatório heterólogo apropriado (p. ex.,promotor ou acentuador), tal como, o promotor PL de fago lambda, os promotores lac, trp, phoA e tac de E. Colir ospromotores precoce e tardio de SV40 e promotores de LTRs re-trovirais, para designar alguns. Outros promotores adequadosserão conhecidos pelo técnico versado.

Como indicado, os vetores de expressão incluirão de preferência pelo menos um marcador selecionável. Taismarcadores incluem genes de resistência a neomicina, G418,ou diidrofolato redutase para cultura de células eucarióti-cas e de resistência a tetraciclina, canamicina ou ampicili-na para cultivar E. Coli e outras bactérias. Exemplos repre-sentativos de hospedeiros apropriados incluem, mas não estãolimitados a, células bacterianas, tal como células de E. Co-Iir Streptomyces e Salmonella typhimurium; células fúngicas,tal como células de levedura (p. ex., Saccharomyces cerevi-siae ou Piehia pastoris (No. de acesso do ATCC 201178)); cé- lulas de inseto tal como S2 de Drosophila e Sf9 de Spodopte-ra; células animais tal como células CH0, COS, 293 e de me-lanoma de Bowes; e células vegetais. Meios de cultura e con-dições apropriadas para as células hospedeiras acima descri-tas são conhecidos na técnica.

A célula hospedeira pode ser uma célula eucarióti-ca superior, tal como uma célula mamífera (p. ex., uma célu-la derivada de humano), ou uma célula eucariótica inferior,tal como uma célula de levedura, ou a célula hospedeira podeser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana.Pode ser escolhida a cepa hospedeira que modula a expressãodas seqüências gênicas inseridas, ou modifica e processa oproduto gênico da foram especifica desejada. A expressão decertos promotores pode ser elevada na presença de certos in-dutores; assim a expressão do polipeptideo engenheirado ge-neticamente pode ser controlada. Além disso, células hospe-deiras diferentes têm características e mecanismos específi-cos para o processamento e modificação traducional e pós- traducional (p. ex. , fosforilação, clivagem) de proteínas.Linhagens celulares apropriadas podem ser escolhidas paragarantir as modificações e processamento desejados da prote-ína estrangeira expressada. A seleção de vetores e promoto-res apropriados para expressão em uma célula hospedeira é umprocedimento bem conhecido e as técnicas de requisito paraconstrução de vetor expressão, introdução do vetor no hospe-deiro e expressão no hospedeiro são habilidades de rotina natécnica.

Vetores de expressão úteis para uso bacteriano são construídos pela inserção de uma seqüência de DNA estruturalcodificando uma proteína desejada junto com sinais de inici-ação e terminação de tradução adequados em fase de leituraoperacional com um promotor funcional. O vetor compreenderáum ou mais marcadores selecionáveis fenotípicos e uma origem de replicação para garantir a manutenção do vetor e, se de-sejável, prover amplificação dentro do hospedeiro. Hospedei-ros procarióticos adequados para transformação incluem E.coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e várias es-pécies do gênero Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcusrembora outros também possam ser empregados em uma questão deescolha. Como um exemplo representativo, mas não limitante,vetores de expressão úteis para uso bacteriano podem compre-ender um marcador selecionável e origem bacteriana de repli-cação derivada de plasmideos disponíveis comercialmente com-preendendo elementos genéticos do bem conhecido vetor declonagem pBR322 (ATCC 37017) . Tais vetores comerciais inclu-em, por exemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsa-la, Suécia) e GEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA) . Essasseções "de cerne" de pBR322 são combinadas com um promotorapropriado e a seqüência estrutural a ser expressa. Entrevetores preferidos para uso em bactérias estão incluídospHE4-5 (Acesso do ATCC No. 209311; e variações deste), pQE70, pQE60 e pQE-9, disponíveis em QIAGEN, Inc., supra;vetores pBS; vetores Phagescript, vetores Bluescript, pNH8A,pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponíveis em Stratagene; e p-trc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponíveis emPharmacia. Vetores de expressão preferidos para uso em sis-temas de levedura incluem, mas não estão limitados a, pYES2,pYDl, pTEFl/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalpha, pPIC9,pPIC3.5, pHIL-D2, pHIL-Sl, pPIC3.5K, pPIC9K e PA0815 (todosdisponíveis em Invitrogen, Carlsbad, CA) . Entre vetores eu-carióticos preferidos estão pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl e pSG disponíveis em Stratagene; e pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL(disponíveis em ·Pharmacia). Outros vetores adequados serãoprontamente evidentes para o técnico versado.

Após transformação de uma cepa hospedeira adequadae crescimento da cepa hospedeira até uma densidade celularapropriada, o promotor selecionado é induzido por meios a-propriados (p. ex., mudança de temperatura ou indução quími-ca) e células são cultivadas por um período adicional. Célu-Ias são tipicamente recuperadas por centrifugação, rompidaspor meios físicos ou químicos e o extrato bruto resultanteretido para purificação adicional.

Células microbianas empregadas na expressão deproteínas podem ser rompidas por qualquer método convenien-te, incluindo ciclos de congelamento-descongelamento, soni-cação, rompimento mecânico, ou uso de agentes que lisam cé-lula, tais métodos são bem conhecidos por aqueles versadosna técnica.

Em uma modalidade, a levedura Pichia pastoris éusada para expressar a proteína neutrocina-alfa em um siste-ma eucariótico. Pichia pastoris é uma levedura metilotróficaque pode metabolizar metanol como sua única fonte de carbo-no. Uma etapa principal na via metabolização de metanol é aoxidação de metanol a formaldeído usando 02. Esta reação écatalisada pela enzima álcool oxidase. A fim de metabolizarmetanol como sua única fonte de carbono, Pichia pastoris de-ve gerar altos níveis de álcool oxidase devido, em parte, àrelativamente baixa afinidade da álcool oxidase por 02. Con-seqüentemente, em um meio de crescimento que depende de me-tanol como uma fonte de carbono principal, a região promoto-ra de um dos dois genes de álcool oxidase (AOXl) é altamenteativa. Na presença de metanol, a álcool oxidase produzida apartir do gene AOXl compreende até aproximadamente 30% daproteína solúvel total em Pichia pastoris. Veja, Ellis, S.B., et ai., Mol Cell Biol 5: 1111-21 (1985); Koultz, P. J.Et al., Yeast 5: 167-77 (1989); Tschopp, J. F., et al., NuclAcids Res 15: 3859-76 (1987). Assim, uma seqüência codifi-cante heteróloga sob a regulação transcricional de toda ouparte da seqüência regulatória de AOXl é expressa em níveisexcepcionalmente altos na levedura Pichia crescida na pre-sença de metanol.

Em um exemplo, o vetor plasmidial pPIC9K é usadopara expressar DNA codificando uma proteína imunomodulatóriaou porção desta como exposto aqui, em um sistema de levedurade Pichea essencialmente como descrito em "Pichia Protocols:Methods in Molecular Biology", D. R. Higgins e J. Cregg,eds. The Humana Press, Totowa, NJ, 1998. Este vetor de ex-pressão permite a expressão e secreção de uma proteína imu-nomodulatória devido ao promotor forte de AOXl ligado aopeptídeo sinal secretório (isto é, líder) da fosfatase (PHO)alcalina de Piehia pastoris localizado a montante de um múl-tiplo sítio de clonagem.

Muitos outros vetores de levedura poderiam ser u-sados no lugar de pPIC9K, tal como pYES2, pYDl, pTEFl/Zeo,pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalpha, pPIC9, pPIC3.5, pHIL-D2,pHIL-Sl, pPIC3.5K e PA0815, como alguém versado na técnicaprontamente apreciaria, contanto que a construção de expres-são proposta proveja sinais para transcrição, tradução, se-creção (se desejado) e semelhantes, localizados apropriada-mente, incluindo um AUG Na fase de leitura como requerido.

Em uma modalidade, expressão em alto nível de umaseqüência codificante heteróloga pode ser obtida pela clona-gem do polinucleotideo heterólogo da invenção em um vetor deexpressão tal como, por exemplo, pGAPZ ou pGAPZalpha, ecrescimento da cultura de levedura na ausência de metanol.

A transcrição do DNA codificando proteínas imuno-modulatórias por eucariotos superiores é aumentada pela in-serção de uma seqüência acentuadora no vetor. Acentuadoressão elementos do DNA que agem em eis, geralmente cerca de 10até 300 pb que age em um promotor para aumentar sua trans-crição. Exemplos incluindo o acentuador de SV40 no lado tar-dio da origem de replicação pb 100 até 270, um acentuador depromotor precoce de citomegalovirus, o acentuador de poliomano lado tardio da origem de replicação e acentuadores de a-denovirus.

Vários sistemas de cultura de células mamíferostambém podem ser empregados para expressar proteína recombi-nante. Exemplos de sistemas de expressão mamíferos incluemlinhagens COS-7 de fibroblastos de rim de macaco, descritaspor Gluzman (Cell 23: 175 (1981)) e outras linhagens celula- res capazes de expressar um vetor compatível, por exemplo,as linhagens celulares C127, 3T3, CHO, HeLa e BHK. Vetoresde expressão em mamíferos compreenderão uma origem de repli-cação, um promotor e acentuador adequados e também quaisquersítios de ligação a ribossomo necessários, sítio de poliade-nilação, sítios doadores e aceptores de splice, seqüênciasde terminação transcricional e seqüências flanqueadoras 5'não transcritas. Seqüências de DNA derivadas dos sítios desplice e poliadenilação de SV40 podem ser usados para proveros elementos genéticos não transcritos requeridos.

Em uma modalidade especifica, construções designa-das para expressar uma porção de uma proteína imunomodulató-ria, tal como os domínios extracelulares dos receptores deneutrocina-alfa (p. ex. TACI, BCMA e BAFF-R) são usadas. Al-guém versado na técnica seria capaz de usada as seqüênciaspolinucleotídicas e polipeptídicas providas como SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO:8, respectivamente, ou SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respec-tivamente, para desenhar iniciadores polinucleotídicos paragerar tal construção de expressão.

Células hospedeiras são usadas para expressar ospolinucleotídeos codificando uma proteína imunomodulatória.Tais células hospedeiras incluem células hospedeiras primá-rias, secundárias e imortalizadas de origem vertebrada, par-ticularmente de origem mamífera. Em alguns casos, as célulashospedeiras terão sido engenheiradas para deletar ou substi-tuir material genético endógeno (p. ex., seqüência codifi-cante de neutrocina-alfa) e/ou para incluir material genéti- co (p. ex., seqüências polinucleotídicas heterólogas) . Emalguns casos, a célula hospedeira é modificada a fim de pro-mover e/ou alterar a expressão do polinucleotídeo endógenocodificando a proteína imunomodulatória. Por exemplo, técni-cas conhecidas na técnica podem ser usadas para associar o- peracionalmente regiões controle heterólogas (p. ex., promo-tor e/ou acentuador) e seqüências polinucleotídicas endóge-nas através de recombinação homóloga (veja, p. ex., PatenteUS No. 5.641.670, publicada em 24 de junho de 1997; Publica-ção Internacional No. WO 96/29411, publicada em 26 de setem-bro de 1996; Publicação Internacional No. WO 94/12650, pu-blicada em 4 de agosto de 1994; Koller et ai., Proc Natl A-cad Sci USA 86: 8932-35 (1989); e Zijlstra et al., Nature342:435-438 (1989), as divulgações de cada uma das quais sãoincorporadas como referência em suas totalidades).

As células hospedeiras aqui descritas podem serusadas de uma maneira convencional para produzir a proteínaimunomodulatória. Senão, sistemas de tradução livres de cé-lula também podem ser empregados para produzir um polipeptí-deo imunomodulatório usando RNAs derivados das construçõesde DNA da presente invenção.

A fase AUG como requerido pode ser expressa ousintetizada de uma forma modificada, tal como uma proteínade fusão (compreendendo o polipeptídeo unido através de umaligação peptídica a uma seqüência heteróloga (de uma proteí-na diferente)), e pode incluir não apenas sinais de secre-ção, mas também regiões funcionais heterólogas. Tal proteínade fusão pode ser feita pela ligação de polinucleotídeos co-dificando a proteína imunomodulatória à seqüência de ácidonuclêico desejada codificando a seqüência de aminoácidos de-sejada um ao outro, por métodos conhecidos na técnica, nafase de leitura apropriada, e expressão do produto de prote-ína de fusão por métodos conhecidos na técnica. Senão, talproteína de fusão pode ser feita por técnicas de síntese deproteínas, p. ex., por uso de um sintetizador peptídico. As-sim, por exemplo, uma região de aminoácidos adicionais, par-ticularmente aminoácidos carregados pode ser adicionada àextremidade N-terminal do polipeptideo para melhorar a esta-bilidade e persistência na célula hospedeira, durante a pu-rificação, ou durante manuseio e estocagem subseqüentes. A-lém disso, unidades peptidicas podem ser adicionadas ao po-lipeptideo para facilitar a purificação. Tais regiões podemser removidas antes da preparação final do polipeptideo. Aadição de unidades peptidicas a polipeptideos para engendrarsecreção ou excreção, para melhorar a estabilidade e parafacilitar a purificação, entre outros, é técnica familiar e rotineira na arte.

Em uma modalidade, um polinucleotideo codificandouma proteína imunomodulatória pode ser fusionada a seqüên-cias sinais que direcionarão a localização de uma proteínaimunomodulatória a compartimentos particulares de uma célulaprocariótica ou eucariótica e/ou direcionará a secreção daproteína imunomodulatória a partir de uma célula procarióti-ca ou eucariótica. Por exemplo, em E. coli, alguém desejarádirecionar a expressão da proteína para o espaço periplásmi-co. Exemplos de seqüências sinais ou proteínas (ou fragmen- tos desta) aos quais os polipeptideos da invenção podem serfusionados a fim de direcionar a expressão do polipeptideopara o espaço periplásmico de bactérias incluem, mas não es-tão limitadas à seqüência sinal de pelB, à seqüência sinal. de de proteína de ligação à maltose (MBP), MBP, à seqüência sinal de ompA, à seqüência sinal da subunidade de enteroto-xina B termolábil de E. coli periplásmica e à seqüência si-nal de de fosfatase alcalina. Muitos vetores estão comerci-almente disponíveis para a construção de proteínas de fusãoque direcionarão a localização de uma proteína, tal como asérie de pMAL de vetores (particularmente a série pMAL-p)disponível em New England Biolabs. Em uma modalidade especí-fica, polinucleotídeos codificaindo uma proteína imunomodula-tória podem ser fusionados à seqüência sinal de pectato lia-se de pelB para aumentar a eficiência de expressão e purifi-cação de tais polipeptídeos em bactérias Gram-negativas. Ve-ja, Patente US Nos. 5.576.195 e 5.846.818, os conteúdos dasquais são aqui incorporados como referência em suas totali-dades.

Exemplos de peptídeos sinais que podem ser fusio-nados a uma proteína imunomodulatória a fim de direcionarsua secreção em célula de mamífero incluem, mas não estãolimitados à seqüência sinal de estaniocalcina(MLQNSAVLLLLVISASA, SEQ ID NO: 27) e uma seqüência sinalconsenso (M PTWAWWL FLVLLLALWAPARG, SEQ ID NO: 28). Uma se-qüência sinal adequada que pode ser usada em conjunção comsistemas de expressão baculovirais é a seqüência sinal gp67(aminoácidos 1-19 de Acesso no GanBank Número AAA72759) .

Uma proteína de fusão preferida compreende uma re-gião heteróloga de imunoglobulina que é útil para estabili-zar e purificar proteínas. Por exemplo, EP-A-O 464 533 (e-quivalente canadense 2045869) divulga proteínas de fusãocompreendendo várias porções de região constante de molécu-las de imunoglobulina junto com outra proteína humana ouparte desta. Em muitos casos, a parte Fc em uma proteína defusão é completamente vantajosa para uso na terapia e diag-nóstico e assim resulta, por exemplo, em propriedades farma-cocinéticas melhoradas (EP-A 0232 262). Por outro lado, paraalguns usos seria desejável ser capaz de excluir a parte Fcapós a proteína de fusão ter sido expressa, detectada e pu-rificada da maneira vantajosa descrita. Este é o caso quandoa porção Fc prova ser um obstáculo para uso na terapia e di-agnóstico, por exemplo, quando a proteína de fusão é paraser usada como antígeno para imunizações. Na descoberta defármacos, por exemplo, proteínas humanas, tal como hIL-5 fo-ram fusionadas a porções Fc para a finalidade de ensaios detriagem/varredura de alta carga de entrada para identificarantagonistas de hIL-5. Veja, D. Bennett et al., J MolecularRecognition 8: 52-58 (1995) e K. Johanson et al., J BiolChem 270: 9459-9471 (1995).

Proteínas imunomodulatórias que podem ser usadas nos métodos da presente invenção incluem produtos natural-mente purificados, produtos de procedimentos de síntese quí-mica e produtos produzidos por técnicas recombinantes a par-tir de um hospedeiro procariótico ou eucariótico, incluindo,por exemplo, células bacterianas, de levedura, de vegetaissuperiores, de inseto e de mamífero. Dependendo do hospedei-ro empregado em um procedimento de produção recombinante, asproteínas imunomodulatórias podem ser glicosiladas ou podemser não glicosiladas. Além disso, proteínas imunomodulató-rias também podem incluir um resíduo de metionina modificadainicial, em alguns casos como resultado de processos media-dos por hospedeiro.

Proteínas imunomodulatórias que podem ser usadasnos métodos da presente invenção podem ser sintetizadas qui-micamente usando técnicas conhecidas na técnica (p. ex., ve-ja Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Prin-cipies, W. H. Freeman & Co., NY e Hunkapiller, M. et al.,1984, Nature 310: 105-111). Por exemplo, um peptideo corres-pondendo a um fragmento de uma proteína imunomodulatória po-de ser sintetizado por uso de um sintetizador peptídico. A-lém do mais, se desejado, aminoácidos não clássicos ou aná-logos de aminoácidos químicos podem ser introduzidos comouma substituição ou adição na seqüência polinucleotídica co-dificando a proteína imunomodulatória. Aminoácidos não clás-sicos incluem, mas são estão limitados aos D-isômeros dosaminoácidos comuns, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-aminoisobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-amino butí-rico, g-Abu, e-Ahx, ácido 6-amino hexanóico, Aib, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, ornitina, nor-leucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina,homocitrulina, ácido cistéico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, cicloexilalanina, b-alanina, á-cidos flúor-amino, aminoácidos designadores tal como aminoá-cidos b-metil, aminoácidos Ca-metil, aminoácidos Na-metil, eanálogos de aminoácidos em geral. Além do mais, o aminoácidopode ser D (destrógero) ou L (levógero).

Proteínas imunomodulatórias que podem ser usadasnos métodos da presente invenção podem ser modificadas dife-rencialmente durante ou após a tradução, p. ex., por glico-silação, acetilação, fosforilação, amidação, derivação porgrupos protetores/de bloqueio conhecidos, clivagem proteolí-tica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligantecelular, etc. Qualquer dentre numerosas modificações quími-cas podem ser efetuadas por técnicas conhecidas, incluindo,mas não limitando, a clivagem química específica por brometocianogênico, tripsina, quimiotripsina, papaína, protease V8,NaBH4, acetilação, formilação, oxidação, redução, síntesemetabólica na presença de tunicamicina, etc.

Modificações pós-traducionais adicionais incluem,por exemplo, p. ex., cadeias de carboidrato ligadas a N ouligadas a 0, processamento de extremidades N-terminais ou Ο-terminais, adesão de unidades químicas ao cerne de aminoáci-dos, modificações químicas de cadeias de carboidrato ligadasa N ou ligadas a 0 e adição ou deleção de resíduos de metio-nina N-terminais como resultado de expressão em célula hos-pedeira procariótica. Os polipeptídeos também podem ser mo-difiçados com um marcador detectável, tal como um marcadorenzimático, fluorescente, radioisotópico ou de afinidade pa-ra permitir a detecção e isolamento da proteína.

Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidasede rabanete, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, glicoseoxidase ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos degrupo prostético adequado incluem estreptavidina/biotina eavidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequa-dos incluem biotina, umbeliferona, fluoresceína, isotiocia-nato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluo-resceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo deum material luminescente inclui luminol; exemplos de materi-ais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina e aquo-rina; e exemplo de materiais radioativos adequados incluemum ion metálico radioativo, p. ex., alfa-emitidores tal co-mo, por exemplo, 213Bi, ou outros radioisótopos tal como, porexemplo, iodo (131I, 125I, 123I, 121I), carbono (14C), enxofre(35S), tritio (3H), indio (115mIn, 113mIn, 112In, 111In) e tecné-cio ("Tc, 99mTc), tálio (201Ti), gálio (68Ga, 67Ga), paládio(103Pd), molibdênio (99Mo), xenônio (133Xe), flúor (18F), 153Sm,177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re,142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr,54Mn, 75Se, 113Sn, 117Estanho.

Em modalidades específicas, proteínas imunomodula-tórias que podem ser usadas nos métodos da presente invençãopodem ser marcadas com Európio. Por exemplo, proteínas imu-nomodulatórias (p. ex., antagonistas de neutrocina-alfa) po-dem ser marcadas com Európio usando o kit de marcação de EuDELFIA (catálogo# 1244-302, Perkin Elmer Life Sciences, Bos-ton, MA) seguindo instruções do fabricante.

Em modalidades específicas, proteínas imunomodula-tórias (p. ex., são aderidas a quelantes macrocíclicos úteispara conjugar íons radiometálicos, incluindo, mas não Iimi-tando a, 111In, 177Lu, 90Y, 166Ho e 153Sm, a polipeptídeos. Emuma modalidade preferida, o íon radiometálico associado aosquelantes macrocíclicos aderidos a uma proteína imunomodula-tória é 111In. Em outra modalidade preferida, o íon radiome-tálico associado ao quelante macrocíclico aderido a uma pro-teína imunomodulatória é 90Y. Em modalidades específicas, oquelante macrocíclico é ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N' , N' ' , N ' 1 '-tetracético (DOTA). Emoutras modalidades específicas, o DOTA é aderido a uma pro-teína imunomodulatória através de uma molécula ligante. E-xemplos de moléculas ligantes úteis para. conjugar DOTA a umpolipeptídeo são comumente conhecidos na técnica - veja, porexemplo, DeNardo et al., Clin Câncer Res 4(10): 2483-90,1998; Peterson et al., Bioconjug Chem 10(4): 553-7, 1999; eZimmerman et al., Nucl Med Biol 26(8): 943-50, 1999 que sãodesse modo incorporadas como referência em suas totalidades.Além disso, Patentes US 5.652.361 e 5.756.065, que divulgamagentes quelantes que podem ser conjugados a anticorpos emétodos para fazê-los e usá-los, são desse modo incorporadascomo referência em suas totalidades. Embora as Patentes US5.652.361 e 5.756.065 ponham em evidência agentes quelantede conjugação a anticorpos, alguém versado na técnica pode-ria prontamente adaptar o método divulgado ai a fim de con-jugar agentes quelantes a outros polipeptideos.

Em uma modalidade, uma proteína imunomodulatóriaque pode ser usada nos métodos da presente invenção pode sermarcada com biotina.

Derivados modificados quimicamente de proteínasimunomodulatórias que podem prover vantagens adicionais talcomo solubilidade, estabilidade e tempo de circulação in vi-vo e in vitro do polipeptídeo aumentados ou imunogenicidadediminuída (veja Patente US No. 4.179.337) também podem serusados nos métodos da presente invenção. As unidades quími-cas para derivação podem ser selecionadas a partir de polí-meros solúveis em água tal como polietileno glicol, copolí-meros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelu-lose, dextran, álcool polivinílico e semelhantes. Os poli-peptideos podem ser modificados em posições aleatórios namolécula ou em posições pré-determinadas na molécula e podemincluir uma, duas, três ou mais unidades químicas aderidas.

0 polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. Para polietileno gli-col, o peso molecular preferido está entre 1 kDa e cerca de100 kDa (o termo "cerca de" indica que em preparações de po-lietileno glicol, algumas moléculas pesarão mais, algumasmenos, que o peso molecular declarado) para facilidade no manuseio e fabricação. Outros tamanhos podem ser usados, de-pendendo do perfil terapêutico desejado (p. ex., da duraçãode liberação retardada desejado, dos efeitos, se houver al-gum na atividade biológica, da facilidade no manuseio, dograu ou ausência de antigenicidade e de outros efeitos co-nhecidos do polietileno glicol em uma proteína terapêuticaou análogo) . Por exemplo, o polietileno glicol pode ter umpeso molecular médio de cerca de 200, 500, 1000, 1500, 2000,2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000,

7500, í 3000, 8 500, 9000, 9500, 10, . 000, 10. 500, 11. 000,11.500, 12. 000 , 12. 500, 13.000, 13 . 500, 14. 000, 14. 500,15.000, 15. 500 , 16. 000, 16.500, 17 .000, 17 . 500, 18. 000,18.500, 19. 000 , 19. 500, 20.000, 25 .000, 30. 000, 35. 000,40.000, 50. 000 , 55. 000, 60.000, 65 .000, 70. 000, 75. 000,80.000, 85.000, 90.000, 95.000 ou 100.000 kDa.

Como mencionado acima, o polietileno glicol podeter uma estrutura ramificada. Polietileno glicóis ramifica-dos são descritos, por exemplo, em Patente US No. 5.643.575;Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 59-72(1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18: 2745-2750 (1999); e Caliceti et alBioconjug. Chem. 10: 638-646(1999), as divulgações de cada uma das quais são incorpora-das aqui como referência.

As moléculas de polietileno glicol (ou outras uni-dades químicas) devem ser aderidas à proteína considerando-se os efeitos em domínios funcionais ou antigènicos da pro-teína. Há vários métodos de adesão disponíveis para aquelesversados na técnica, p. ex., EP O 401 384, aqui incorporadacomo referência (acoplamento a PEG para G-CSF), veja tambémMalik et al., Exp Hematol 20: 1028-1035 (1992) (relatandopeguilação de GM-CSF usando cloreto de tresila). Por exem-plo, polietileno glicol pode ser ligado covalentemente atra-vés de resíduos de aminoácidos através de um grupo reativo,tal como, um grupo amino ou carboxílico livre. Grupos reati-vos são aqueles aos quais uma molécula de polietileno glicolativada pode ser ligada. Os resíduos de aminoácidos que têmum grupo amino livre podem incluir, por exemplo, resíduos delisina e resíduos do aminoácido N-terminal; aqueles que têmum grupo carboxílico livre podem incluir resíduos de ácidoaspártico, resíduos de ácido glutâmico e do resíduo de ami-noácido C-terminal. Grupos sulfidrila também podem ser usa-dos como um grupo reativo para adesão de moléculas de polie-tileno glicol. Preferido para finalidades terapêuticas é aadesão em um grupo amino, tal como adesão na extremidade N-terminal ou grupo de lisina.

Como sugerido acima, polietileno glicol pode seraderido a proteínas através da ligação de quaisquer dentrevários resíduos de aminoácidos. Por exemplo, polietilenoglicol pode ser ligado a proteínas através de ligações cova-lentes a resíduos de lisina, histidina, ácido aspártico, á-cido glutâmico, ou cisteína. Uma ou mais químicas de reaçãopodem ser empregadas para aderir polietileno glicol a resí-duos de aminoácidos específicos (p. ex., lisina, histidina,ácido aspártico, ácido glutâmico, ou cisteína) da proteínaou a mais de um tipo de resíduo de aminoácido (p. ex., lisi-na, histidina, ácido aspártico, ácido glutâmico, cisteína ecombinações destes) da proteína.

Alguém pode desejar especificamente proteínas qui-micamente modificadas na extremidade N-terminal. Usando po-lietileno glicol como uma ilustração, alguém pode selecionardentre uma variedade de moléculas de polietileno glicol (por peso molecular, ramificação, etc.), a proporção de moléculasde polietileno glicol para moléculas de proteína (ou peptí-deo) na mistura de reação, o tipo de reação de peguilação aser realizada e o método de obtenção da proteína peguiladaN-terminalmente selecionado. O método para obter a prepara-ção peguilada N-terminalmente (isto é, separar esta unidadede outras unidades monopeguiladas se necessário) pode serpor purificação do material peguilado N-terminalmente de umapopulação de moléculas de proteína peguilada. Proteínas se-letivas quimicamente modificadas na modificação N-terminalpodem ser obtidas por alquilação redutora que explora a rea-tividade diferencial de tipos diferentes de grupos aminoprimários (lisina contra o N-terminal) disponíveis para de-rivação em uma proteína particular. Sob as condições de rea-ção apropriadas, derivação consideravelmente seletiva daproteína na extremidade N-terminal com um grupo carbonilacontendo polímero á obtida.

Como indicado acima, a peguilação das proteína da invenção pode ser realizada por vários meios. Por exemplo,polietileno glicol pode ser aderido à proteína diretamenteou por um ligante intermediário. Sistemas sem ligantes paraadesão de polietileno glicol a proteínas são descritos emDelgado et al., Crit Rev Thera Drug Carrier Sys 9: 249-304(1992); Francis et al., Intern J of Hematol 68: 1-18 (1998);Patente US No. 4.002.531; Patente US No. 5.349.052; WO95/06058 e WO 98/32466, as divulgações de cada uma das quaissão incorporadas aqui como referência.

Um sistema para aderir polietileno glicol direta- mente a resíduos de aminoácidos de proteínas sem um liganteintermediário emprega MPEG tresilado, que é produzido pelamodificação de polietileno glicol mometóxi (MPEG) usandocloreto de tresila (ClSO2CH2CF3) . Na reação de proteína comMPEG tresilado, polietileno glicol é aderido diretamente aos grupo amino da proteína. Assim, a invenção inclui conjugadosde proteína-polietileno glicol produzidos pela reação deproteína da invenção com uma molécula de polietileno glicolque tem um grupo 2,2,2-trifluoretano sulfonila.

Polietileno glicol também pode ser aderido a pro- teína usando vários ligantes intermediários diferentes. Porexemplo, Patente US No. 5.612.460, a divulgação inteira daqual é incorporada aqui como referência, divulga ligantes deuretano para conectar polietileno glicol a proteínas. Conju-gados de proteína-polietileno glicol em que o polietilenoglicol é aderido à proteína por um ligante também podem serproduzidos pela reação de proteínas com compostos tal comosuccinato de MPEG-succinimidila, MPEG ativado com 1,1'-carbonildiimidazol, carbonato de MPEG-2,4,5-tricloropenila,succinato de MPEG-p-succinimidila, e vários derivados desuccinato de MPEG. Vários derivados de polietileno glicol equímicas de reação adicionais para aderir polietileno glicola proteína são descritos em WO 98/32466, a divulgação intei- ra dos quais é incorporada aqui como referência. Produtos deproteína peguilada produzidos usando as químicas de reaçãodispostas aqui são incluídas dentro do âmbito da invenção.

o número de unidades de polietileno glicol aderi-das a cada proteína da invenção (isto é, o grau de substitu-ição) também pode variar. Por exemplo, as proteínas pequila-das da invenção podem estar ligada, em média a 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20 ou mais moléculas de poli-etileno glicol". De maneira similar, o grau médio de substi-tuição varia tal como 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18,17-19, 18-20 unidades de polietileno glicol por molécula deproteína. Métodos para determinar o grau de substituição sãodiscutidos, por exemplo, em Delgado et al., Crit Rev TheraDrug Carrier Sys 9: 249-304 (1992).

Proteínas imunomodulatórias que podem ser usadasnos métodos da presente invenção podem ser recuperadas e pu-rificadas por métodos conhecidos que incluem, mas não estãolimitados a, sulfato de amônio ou precipitação por etanol,extração ácida, cromatografia de troca aniônica ou catiôni-ca, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia por inte-ração hidrofóbica, cromatografia por afinidade, cromatogra-fia de hidroxiapatita, e cromatografia de lectina. Da maiorpreferência, cromatografia liquida de alta resolução("HPLC") é empregada para purificação.

Formulações e Administração

A invenção provê métodos para tratamento, inibiçãoe profilaxia por administração a um indivíduo de uma quanti-dade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo umagente imunomodulatório, tal como um antagonista de neutro-cina-alfa. Em uma modalidade específica, o antagonista deneutrocina-àlfa é uma proteína TACI-Fc. Em uma modalidadeespecífica, o antagonista de neutrocina-alfa é uma proteínaBAFF-R-Fc. Em uma modalidade específica, o antagonista deneutrocina-alfa é um pepticorpo anti-neutrocina-alfa. Em umamodalidade específica, o antagonista de neutrocina-alfa éfragmento de proteína neutrocina-alfa ou variante que fun-ciona como um dominante negativo. Em uma modalidade preferi-da, o agente imunomodulatório é consideravelmente purificado(p. ex., consideravelmente livre de substâncias que limitamseu efeito ou produzem efeitos colaterais indesejados) . Oindivíduo é de preferência um animal, incluindo, mas não li-mitando a animais tal como vacas, porcos, cavalos, galinhas,gatos, cachorros, etc., e é de preferência um mamífero e damaior preferência humano.

Um agente imunomodulatório será formulado e dosadode uma maneiro consistente com boa prática médica, levandoem conta a condição clinica do paciente individual (especi-almente os efeitos colaterais do tratamento com o agente i-munomodulatório sozinho), o sitio de distribuição da compo-sição contendo o agente imunomodulatório, o método de admi-nistração, o planejamento de administração e outros fatoresconhecidos por médicos. A "quantidade terapeuticamente efi-caz" de um agente imunomodulatório para fins daqui é assimdeterminada por tais considerações.

Vários sistemas de distribuição são conhecidos epodem ser usados para administrar uma composição farmacêuti-ca compreendendo um agente imunomodulatório, p. ex., encap-sulamento em lipossomos, microparticulas, microcápsulas, cé-lulas recombinantes capazes de expressar o composto, endoci-tose mediada por receptor (veja, p. ex., Wu e Wu, J BiolChem 262: 4429-4432 (1987)), construção de um ácido nuclêicocomo parte de um vetor retrociral ou outro, etc. Métodos pa-ra introdução incluem, mas não estão limitados a vias intra-dérmicas, intramusculares, intraperitoniais, intravenosas,subcutâneas, intranasais, epidurais e orais. Uma composiçãofarmacêutica compreendendo um agente imunomodulatório podeser administrada pode qualquer via conveniente, por exemplo,por infusão ou injeção bolus, por absorção através de reves-timentos epiteliais ou mucocutâneos (p. ex., mucosa oral,retal e intestinal, etc.) e pode ser administrada junto comoutros agentes ativos biologicamente. A administração podeser sistêmica ou local. Além disso, pode ser desejável in-troduzir a composição farmacêutica compreendendo um agenteimunomodulatório no sistema nervoso central por qualquer viaadequada, incluindo injeção intraventricular e intratecal; ainjeção intraventricular pode ser facilitada por um catéterintraventricular, por exemplo, aderido a um reservatório,tal como um reservatório de Ommaya. A administração pulmonartambém pode ser empregada, p. ex., por uso de uma inaladorou nebulizador, e formulação com um agente aerossolizante.

Em uma modalidade especifica, a presente invençãoé direcionada a formulações farmacêuticas de agentes tera-pêuticos (p. ex. , agentes imunomodulatórios conhecidos natécnica e/ou descritos aqui). Em particular, a presente in-venção é direcionada a formulações farmacêuticas de agentesterapêuticos que são proteináceos na natureza (p. ex., pro-teínas e anticorpos). Uma formulação farmacêutica da inven-ção contém excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em ge-ral, uma formulação farmacêutica da invenção é formulada talque um agente terapêutico retenha sua atividade física, quí-mica e biológica. Uma formulação farmacêutica da invençãopode ser estocada a 2-8°C, a -40°C ou a -80°C. Em uma modali-dade específica, uma formulação estável é uma em que menosde cerca de 1% de oxidação do agente terapêutico é observadaem 2 anos e/ou menos de 4% de desaminação do agente terapêu-tico é observada em 2 anos. A quantidade de agente terapêu-tico presente em uma formulação farmacêutica da invenção édeterminada, por exemplo, levando em conta os volumes de do-se e modo(s) de administração desejados. Em uma modalidadeda invenção, a concentração de um agente terapêutico em umaformulação farmacêutica da invenção é de cerca de 1-160mg/mL, cerca de 10-155 mg/mL, cerca de 20-150 mg/mL, cercade 30-145 mg/mL, cerca de 40-140 mg/mL, cerca de 50-135mg/mL, cerca de 60-130 mg/mL, cerca de 70-125 mg/mL, cercade 80-120 mg/mL, cerca de 90-115 mg/mL, cerca de 95-110mg/mL, cerca de 100-105 mg/mL, ou cerca de 100 mg/mL. Faixasintermediárias da concentrações citadas acima, p. ex., cercade 11-154 mg/mL, também são destinadas a serem parte da in-venção. Por exemplo, faixas de valores usando uma combinaçãode quaisquer dos valores citados acima como limites superiore inferior são destinados a serem incluídos. Neste contexto"cerca de" inclui as faixas particularmente citadas e faixasque são maiores ou menores em muitos (5, 4, 3, 2, ou 1)mg/mL, nos limites superior e inferior da faixa.

Formulações farmacêuticas aquosas da invenção com-preendem uma solução de pH tamponado. Em uma modalidade dainvenção, o tampão usado em formulações farmacêuticas da in-venção tem um pH que varia de cerca de 5 até cerca de 7. Emuma modalidade preferida, o tampão usado em formulações far-macêuticas da invenção tem um pH que varia de cerca de 5,8até cerca de 6,2. Em outra modalidade preferida, o tampãousado em formulações farmacêuticas da invenção tem um pH decerca de 6,0. Faixas intermediárias dos pHs citados acimatambém são destinadas a serem parte da invenção. Por exem-plo, faixas de valores usando uma combinação de quaisquerdos valores citados acima como limites superior e inferiorsão destinados a serem incluídos. Neste contexto "cerca de"inclui as faixas particularmente citadas e faixas que sãomaiores ou menores em 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, ou 0,1 unidades depH, nos limites superior e inferior da faixa. Exemplos detampões que controlarão o pH dentro de faixas preferidas in-cluem acetato (p. ex., acetato de sódio), succinato (tal co-mo succinato de sódio), gluconato, histidina, citrato, Tris,fosfato, glicilglicina e outros tampões de ácido orgânico.

Tampões exemplares adicionais são aqueles que são farmaceu-ticamente aceitáveis e podem ser criados a partir de seusácidos, bases e sais adequados, tal como. aqueles que são de-finidos abaixo.

Ácidos farmaceuticaraente aceitáveis incluem ácidosinorgânicos e orgânicos que não são tóxicos na concentraçãoe modo em que eles são formulados. Por exemplo, ácidos inor-gânicos adequados incluem clorídrico, perclorídrico, bromí-drico, iodrídico, nítrico, sulfúrico, sulfônico, sulfínico,sulfanílico, fosfórico, carbônico, etc. Ácidos orgânicos a-dequados incluem os de alquila de cadeia linear ou ramifica-da, aromáticos, cíclicos, cicloalifáticos, arilalifáicos,heterocíclicos, saturados, insaturados, mono-, di- e tri-carboxílico, incluindo por exemplo, fórmico, acético, 2-hidroxiacético, trifluoracético, fenilacético, trimetilacé-tico, t-butil acético, antranílico, propanóico, 2-hidroxipropanóicohidroxipropanóico, 2-oxopropanóico, propan-dióico, ciclopentanopropiônico, 3-fenilpropiônico, butanói-co, butandióico, benzóico, 3-(4-hidroxibenzoil)benzóico, 2-acetoxi-benzóico, ascórbico, cinâmico, lauril sulfúrico, es-teárico, mucônico, mandélico, succínico, embônico, fumárico,málico, malêico, hidroximalêico, malônico, lático, cítrico,tartárico, glicólico, glicônico, glucônico, pirúvico, glio-xálico, oxálico, mesílico, succínico, salicílico, ftálico,palmóico, palmêico, tiociânico, metanossulfônico, etanossul-fônico, 1,2-etanodissulfônico, 2-hidroxietanossulfônico,benzenossulfônico, 4-clorobenzenossulfônico, naftaleno-2-sulfônico, p-toluenossulfônico, canforsulfônico, A-metilbiciclo[2,2,2]oct-2-eno-l-carboxilico, glucoeptônico,4,4'-metilenobis-3 - (hidróxi-2-eno-l-carboxilico) , hidroxi-naptóico, etc.

Bases farmaceuticamente aceitáveis incluem basesinorgânicas e orgânicas que não são tóxicas na concentração e modo em que elas são formulados. Por exemplo, bases ade-quadas incluem aquelas formadas de metais formadores de baseinorgânica tal como litio, sódio, potássio, magnésio, cál-cio, amônio, ferro, zinco, cobre, manganês, alumínio, N-metilglucamina, morfolina, piperidina e bases não tóxicasorgânicas incluindo amina primária, secundária e terciária,amirías substituídas, aminas cíclicas e resinas de troca iô-nica básica, [p. ex., N(R')4+ (em que R' é independentementeH ou alquila C1-4, p. ex., amônio, Tris)], por exemplo, iso-propilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tri-propilamina, etanolamina, 2-dietilaminoetanol, trimetamina,dicicloexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, pro-caína, hidrabamina, colina, betaína, etilenodiamina, gluco-samina, metilglucosamina, teobromina, purinas, piperazina,piperidina, N-etilpiperidina, resinas de poliamina e seme-lhantes. Bases não tóxicas orgânicas particularmente prefe-ridas são isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimeta-mina, diciclohexilamina, colina e cafeína.

Ácidos e bases farmaceuticamente aceitáveis adi-cionais usáveis com a presente invenção incluem aqueles quesão derivados de aminoácidos, por exemplo, histidina, glici-na, fenilalanina, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina easparagina.

Tampões farmaceuticamente aceitáveis incluem aque-les derivados tanto de sais de adição de ácido como de basedos ácidos e bases indicados acima. Em uma modalidade da in-venção, o tampão de uma formulação farmacêutica da invençãoé succinato, histidina, citrato e/ou fosfato. Em uma modali-dade preferida, o tampão de uma formulação farmacêutica dainvenção é histidina. Em outra modalidade preferida, o tam-pão de uma formulação farmacêutica da invenção é citrato.

Em outra modalidade da invenção, a concentração dotampão em uma formulação farmacêutica da invenção é de cercade 5-50 mM, cerca de 5-20 mM, cerca de 5-15 mM, ou cerca de10 mM. Faixas intermediárias das concentrações acima cita-das, p. ex., cerca de 6-48 mM, também são destinadas a seremparte da invenção. Por exemplo, faixas de valores usando umacombinação de quaisquer dos valores citados acima como Iimi-tes superior e inferior são destinados a serem incluídos.Neste contexto "cerca de" inclui as faixas particularmentecitadas e faixas que são maiores ou menores em muitos (5, 4,3, 2, 1) mM, nos limites superior e/ou inferior da faixa.

Um tensoativo também pode ser adicionado a umaformulação farmacêutica da invenção. Tensoativos exemplaresincluem tensoativos não iônicos tal como polissorbatos (p.ex., polissorbatos 20 ou 80) ou poloxâmeros (p. ex., poloxâ-mero 188). Outros tensoativos farmaceuticamente aceitáveissão bem conhecidos na técnica e também são contemplados. Emuma modalidade especifica, uma quantidade de tensoativo éadicionada em uma quantidade suficiente para reduzir a agre-gação de um agente terapêutico (tal como aquele que ocorrepor agitação ou shipping) para minimizar a formação de par-ticulados em uma formulação farmacêutica da invenção e/oupara reduzir adsorção não especifica de um agente terapêuti-co. Em uma modalidade preferida, uma formulação farmacêuticada invenção inclui um tensoativo que é polissorbato.

Em uma modalidade, uma formulação farmacêutica dainvenção contém o tensoativo polissorbato 20. Em uma modali-dade preferida, uma formulação farmacêutica da invenção con-tém entre pelo menos 0,007% e cerca de 0,07% de polissorbato20. Em outra modalidade preferida, uma formulação farmacêu-tica da invenção contém entre 0,01% e cerca de 0,05% de po-lissorbato 20. Em outra modalidade preferida, uma formulaçãofarmacêutica da invenção contém entre cerca de 0,01% e cercade 0,03% de polissorbato 20. Em outra modalidade preferida,cerca de 0,01% de polissorbato 20 é encontrado em uma formu-lação farmacêutica da invenção. Neste contexto "cerca de"inclui as faixas particularmente citadas e faixas que sãomaiores ou menores em 0,01%, 0,009%, 0,008%, 0,007%, 0,006%ou 0,005% nos limites superior e/ou inferior da faixa, com acondição da porcentagem de polissorbato 20 não ser menor que0,007%.

Em outra modalidade preferida, uma formulação far-macêutica da invenção contém o tensoativo polissorbato 80.Em uma modalidade preferida, uma formulação farmacêutica dainvenção contém entre cerca de 0,0015% e cerca de 0,07% depolissorbato 80. Em outra modalidade preferida, uma formula-ção farmacêutica da invenção contém entre cerca de 0,003% ecerca de 0,05% de polissorbato 80. Em outra modalidade pre-ferida, uma formulação farmacêutica da invenção contém entrecerca de 0, 005% e cerca de 0,03% de polissorbato 80. Em ou-tra modalidade preferida, uma formulação farmacêutica da in-venção contém entre cerca de 0,01% e cerca de 0,03% de po-lissorbato 80. Em outra modalidade preferida, cerca de 0,01%de polissorbato 80 é encontrado em uma formulação farmacêu-tica da invenção. Neste contexto "cerca de" inclui as faixasparticularmente citadas e faixas que são maiores ou menoresem 0,01%, 0,009%, 0,008%, 0,007%, 0,006% ou 0,005% nos limi-tes superior e/ou inferior da faixa, com a condição da por-centagem de polissorbato 80 não ser menor que 0,0015%.

Um modificador de tonicidade também pode ser adi-cionado a uma formulação farmacêutica da invenção. Modifica-dores de tonicidade úteis incluem sais e aminoácidos. Saisque são farmaceuticamente aceitáveis e adequados para formu-lações farmacêuticas da invenção incluem cloreto de sódio,succinato de sódio, sulfato de sódio, cloreto de potássio,cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, e cloreto de cál-cio. Sais preferidos para uso em formulações farmacêuticasda invenção são NaCl e MgCl2. NaCl pode melhorar a estabili-dade de um agente terapêutico pela proteção do agente da de-saminação e agregação. Em uma modalidade preferida, uma for-mulação farmacêutica da invenção contém NaCl. Em outra moda-lidade preferida, uma formulação farmacêutica da invençãocontém entre cerca de 150 e cerca de 500 mM de NaCl. Em ou-tra modalidade preferida, uma formulação farmacêutica da in-venção contém cerca de 150 mM de NaCl. Neste contexto "cercade" inclui as faixas particularmente citadas e faixas quesão maiores ou menores em 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25 ou 50 mM,nos limites superior e/ou inferior da faixa. Em uma modali-dade preferida, formulações farmacêuticas da invenção sãoisotônicas. Por isotônica, entende-se que uma formulaçãofarmacêutica da invenção tem essencialmente a mesma pressãoosmótica que o sangue humano. Formulações isotônicas geral-mente terão uma pressão osmótica de cerca de 250 até 350mOsm, de preferência de cerca de 290 até cerca de 310 Osm.Neste contexto "cerca de" inclui as faixas particularmentecitadas e faixas que são maiores ou menores em muitos (5, 4,3, 2, ou 1) mOsm, nos limites superior e/ou inferior da fai-xa. Isotonicidade pode ser medida usando um osmômetro depressão de vapor ou tipo congelamento por gelo, por exemplo.

Em uma modalidade, uma formulação farmacêutica dainvenção contém os agentes acima identificados (isto é, a-gente terapêutico, tampão, tensoativo e modificador de toni-cidade) e é essencialmente livre de um ou mais conservantes,tal como álcool benzilico, fenol, m-cresol, clorobutanol ebenzetônio Cl. Em outra modalidade, um conservante pode serincluído em uma formulação farmacêutica da invenção, parti-cularmente quando a formulação é uma formulação de multido-se. Um ou mais outros veículos, excipientes ou estabilizado-res farmaceuticamente aceitáveis tal como aqueles descritosem Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol,A. Ed. (1980) podem ser incluídos em uma formulação farma-cêutica da invenção desde que eles não afetem adversamentesignificativamente as características desejadas da formula-ção. Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis nãosão tóxicos para destinatários das dosagens e concentraçõesempregadas e incluem; agentes tamponantes adicionais; co-solventes; anti-oxidantes incluindo ácido ascórbico e metio-nina; agentes quelantes tal como EDTA; complexos metálicos(p. ex., complexos Zn-proteína); polímeros biodegradáveistal como poliésteres; conservantes; crioprotetores; Iipopro-tetores; agentes de volume e semelhantes. Exemplos de crio-protetores adequados incluem polióis, polietileno glicol(PEG), albumina sérica bovina (BSA), ácido glutâmico, outrosaminoácidos e semelhantes. Crioprotetores adequados adicio-nais incluem açúcares e alcoóis de açúcar tal como sacarose,manose, trealose, glicose, sorbitol, e manitol e semelhan-tes. Lioprotetores adequados podem abranger açúcares inclu-indo sacarose, trealose, lactose, e maltose e semelhantes.Agentes de volume adequados incluem manitol, glicina, e sor-bital e semelhantes.

Em uma modalidade específica, uma formulação far-macêutica da invenção não compreende um crioprotetor. Em umamodalidade adicional, uma formulação farmacêutica da inven-ção não compreende sacarose.

EDTA, que é comumente usado para estabilizar umaformulação de proteína, também pode ser incluído em uma for-mulação farmacêutica da invenção. EDTA, como um agente que-lante, pode inibir a oxidação catalisada por metal dos gru-pos sulfidrila, reduzindo assim a formação de agregados li-gados por dissulfeto. Uma concentração preferida de EDTA éde cerca de 0,01% até cerca de 0,2%.

Uma formulação farmacêutica da invenção também po-de ser combinada com um ou mais outros agentes terapêuticosconforme necessário, para a indicação particular a ser tra-tada, de preferência aqueles com atividades complementaresque não afetem adversamente um agente terapêutico em umaformulação farmacêutica da invenção. Combinações são contem-pladas quando os agentes terapêuticos adicionais são formu-lados como um mistura com os agentes imunomodulatórios. Alémdisso, combinações são contempladas quando os agentes tera-pêuticos adicionais são formulados independentemente, massão destinados para administração simultânea ou sobrepostacom um agente imunomodulatório. Tais agentes terapêuticosadicionais estão adequadamente presentes em combinação emquantidades que são eficazes para a finalidade destinada.Agentes terapêuticos adicionais que podem ser combinados coma formulação da invenção são descritos adicionalmente aqui.

A presente invenção provê, em uma modalidade pre-ferida, uma formulação farmacêutica compreendendo, ou senãoconsistindo em, 10 mM de tampão de histidina, NaCl 150 mM, e0,01% de polissorbato 80, pH 6,0 (± 0,5). Em uma modalidadepreferida, uma formulação farmacêutica da invenção compreen-de, ou senão consiste em, um anticorpo em uma quantidade decerca de 1 mg/mL até cerca de 160 mg/mL, de preferência decerca de 8 0 mg/mL até cerca de 120 mg/mL, 10 mM de tampão dehistidina, NaCl 150 mM, e 0,01% de polissorbato 80, pH 6,0(± 0,5). Em outra modalidade preferida, uma formulação far-macêutica da invenção compreende, ou senão consiste em, umanticorpo em uma quantidade de cerca de 1 mg/mL até cerca de160 mg/mL, de preferência de cerca de 80 mg/mL até cerca de120 mg/mL, 10 mM de tampão de histidina, NaCl 150 mM, e0,01% de polissorbato 80, pH 6,0 (± 0,5) para administraçãointravenosa. Em outra modalidade preferida, uma formulaçãofarmacêutica da invenção compreende, ou senão consiste em,um anticorpo em uma quantidade de cerca de 1 mg/mL até cercade 160 mg/mL, de preferência de cerca de 80 mg/mL até cercade 120 mg/mL, 10 mM de tampão de histidina, NaCl 150 mM, e0,01% de polissorbato 80, pH 6,0 (± 0,5) para administraçãosubcutânea. Neste contexto "cerca de" inclui as faixas par-ticularmente citadas e faixas que são maiores ou menores em muitos (5, 4, 3, 2, ou 1) mg/mL, nos limites superior e/ouinferior da faixa.

Em uma modalidade preferida, uma formulação farma-cêutica da invenção compreende, ou senão consiste em, 100mg/mL de um anticorpo, 10 mM de tampão de histidina, NaCl 150 mM, e 0,01% de polissorbato 80, pH 6,0 (± 0,5). Em outramodalidade preferida, uma formulação farmacêutica da inven-ção compreende, ou senão consiste em, 100 mg/mL de um anti-corpo, 10 mM de tampão de histidina, NaCl 150 mM, e 0,01% depolissorbato 80, pH 6,0 (± 0,5) para administração intrave-nosa. Em outra modalidade preferida, uma formulação farma-cêutica da invenção compreende, ou senão consiste em, 100mg/mL de um anticorpo, 10 mM de tampão de histidina, NaCl150 mM, e 0,01% de polissorbato 80, pH 6,0 (± 0,5) para ad-ministração subcutânea.

A presente invenção provê, em uma modalidade pre-ferida, uma formulação farmacêutica compreendendo, ou senãoconsistindo em, 0,74 mg/mL de L-histidina, 1,1 mg/mL de mo-nocloreto de L-histidina, 8,8 mg/mL de NaCl e 0,1 mg/mL depolissorbato 80, pH 6,0 (± 0,5). Em outra modalidade prefe-rida, uma formulação farmacêutica compreende, ou senão con-siste em, um anticorpo em uma quantidade de cerca de 1 mg/mLaté cerca de 160 mg/mL, de preferência de cerca de 80.mg/mLaté cerca de 120 mg/mL, 0,74 mg/mL de L-histidina, 1,1 mg/mLde monocloreto de L-histidina, 8,8 mg/mL de NaCl e 0,1 mg/mLde polissorbato 80, pH 6,0 (± 0,5). Em outra modalidade pre-ferida, uma formulação farmacêutica da invenção compreende,ou senão consiste em, um anticorpo em uma quantidade de cer-ca de 1 mg/mL até cerca de 160 mg/mL, de preferência de cer-ca de 80 mg/mL até cerca de 120 mg/mL, 0,74 mg/mL de L-histidina, 1,1 mg/mL de monocloreto de L-histidina, 8,8mg/mL de NaCl e 0,1 mg/mL de polissorbato 80, pH 6,0 (± 0,5)para administração intravenosa. Em outra modalidade preferi-da, uma formulação farmacêutica da invenção compreende, ousenão consiste em, um anticorpo em uma quantidade de cercade 1 mg/mL até cerca de 160 mg/mL, de preferência de cercade 80 mg/mL até cerca de 120 mg/mL, 0,74 mg/mL de L-histidina, 1,1 mg/mL de monocloreto de L-histidina, 8,8mg/mL de NaCl e 0,1 mg/mL de polissorbato 80, pH 6,0 (± 0,5)para administração subcutânea. Neste contexto "cerca de" in-clui as faixas particularmente citadas e faixas que são mai-ores ou menores em muitos (5, 4, 3, 2, ou 1) mg/mL, nos li-mites superior e/ou inferior da faixa.

Em uma modalidade preferida, uma formulação farma-cêutica da invenção compreende, ou senão consiste em, 100mg/mL de um anticorpo, 0,74 mg/mL de L-histidina, 1,1 mg/mLde monocloreto de L-histidina, 8,8 mg/mL de NaCl e 0,1 mg/mLde polissorbato 80, pH 6,0 (± 0,5). Em outra modalidade pre-ferida, uma formulação farmacêutica da invenção compreende,ou senão consiste em, 100 mg/mL de um anticorpo, 0,74 mg/mLde L-histidina, 1,1 mg/mL de monocloreto de L-histidina, 8,8mg/mL de NaCl e 0,1 mg/mL de polissorbato 80, pH 6,0 (± 0,5)para administração intravenosa. Em outra modalidade preferi-da, uma formulação farmacêutica da invenção compreende, ousenão consiste em, 100 mg/mL de um anticorpo, 0,74 mg/mL deL-histidina, 1,1 mg/mL de monocloreto de L-histidina, 8,8mg/mL de NaCl e 0,1 mg/mL de polissorbato 80, pH 6,0 (± 0,5)para administração subcutânea.

Em uma modalidade preferida, o anticorpo em umaformulação farmacêutica da invenção é um anticorpo monoclo-nal. Em outra modalidade preferida, o anticorpo em uma for-mulação farmacêutica da invenção é um anticorpo de IgG. Emoutra modalidade preferida, o anticorpo em uma formulaçãofarmacêutica da invenção é um anticorpo de IgGl. Em outramodalidade preferida, o anticorpo em uma formulação farma-cêutica da invenção é um anticorpo de IgGl/λ. Em outra moda-lidade preferida, o anticorpo em uma formulação farmacêuticada invenção é um anticorpo humano ou humanizado.

Em uma modalidade preferida, uma formulação farma-cêutica da invenção é estável por pelo menos 6 meses a 2-8°C. Em outra modalidade preferida, uma formulação farmacêu-tica da invenção é estável por pelo menos 9 meses a 2-8°C.Em outra modalidade preferida, uma formulação farmacêuticada invenção é estável por pelo menos 1 ano a 2-8°C. Em outramodalidade preferida, uma formulação farmacêutica da inven-ção é estável por pelo menos 1,5 anos a 2-8°C. Em outra mo-dalidade preferida, uma formulação farmacêutica da invençãoé estável por pelo menos 2 anos a 2-8°C. Em outra modalidadepreferida, uma formulação farmacêutica da invenção é estávelpor pelo menos 3 anos a 2-8°C. Em outra modalidade preferi-da, uma formulação farmacêutica da invenção é estável porpelo menos 4 anos a 2-8°C. Em outra modalidade preferida,uma formulação farmacêutica da invenção é estável por pelomenos 5 anos a 2-8°C.

Em uma modalidade preferida, um anticorpo em umaformulação farmacêutica da invenção pode mostrar estabilida-de significativa por repetidos ciclos de congelamento-descongelamento e seguindo tal tratamento pode permanecerestável após ser descongelado. Em geral, uma formulação aser congelada é rapidamente congelada, por exemplo, em ni-trogênio liquido. Descongelamento pode ser em uma faixa detemperatura, p. ex., de cerca de 0°C até cerca de 25°C, queé descongelamento lento; ou de cerca de 26°C até 40°C, que édescongelamento rápido. Neste contexto "cerca de" inclui asfaixas particularmente citadas e faixas que são maiores oumenores em muitos (5, 4, 3, 2, ou 1) graus Celsius, nos li-mites superior e/ou inferior da faixa. Um exemplo de descon-gelamento rápido é descongelamento de uma formulação farma-cêutica da invenção em um banho-maria a 37°C. Em uma modali-dade preferida, um anticorpo em uma formulação farmacêuticada invenção é estável por pelo menos um ciclo de congelamen-to-descongelamento. Em outra modalidade preferida, um anti-corpo em uma formulação farmacêutica da invenção é estávelpor pelo menos dois ciclos de congelamento-descongelamento.

Em outra modalidade preferida, um anticorpo em uma formula-ção farmacêutica da invenção é estável por pelo menos trêsciclos de congelamento-descongelamento. Em outra modalidadepreferida, um anticorpo em uma formulação farmacêutica dainvenção é estável por pelo menos quatro ciclos de congela-mento-descongelamento. Em outra modalidade preferida, um an-ticorpo em uma formulação farmacêutica da invenção é estávelpor pelo menos cinco ciclos de congelamento-descongelamento.

Em outra modalidade preferida, um anticorpo em uma formula-ção farmacêutica da invenção é estável por pelo menos dezciclos de congelamento-descongelamento.

Pode ser desejável determinar um regime ótimo paracongelamento-descongelamento de uma formulação farmacêuticada invenção para preservar a estabilidade, ou pode ser dese-jável identificar uma formulação farmacêutica da invençãoque provê a maior estabilidade para um anticorpo que serásubmetido a um ciclo particular de congelamento-descongelamento. Conseqüentemente, em uma modalidade da in-venção, este parâmetro é avaliado. Por exemplo, uma formula-ção farmacêutica da invenção pode ser avaliada por estabili-dade sob uma variedade de condições de congelamento-descongelamento tal como congelamento rápido, congelamentolento, descongelamento rápido, descongelamento lento em vá-rias combinações para determinar o procedimento que produzos produtos de degradação mais raros (p. ex., que têm a mai-or estabilidade).

Um estudo de concentração mostrou que um anticorpode IgGl/λ pode ser concentrado até pelo menos 160 mg/mL emuma formulação farmacêutica da invenção compreendendo 10 mMde tampão de histidina, NaCl 150 mM, e 0,01% de polissorbato80, pH 6,0 sem efeitos prejudiciais na pureza (como determi-nado por SEC-HPLC) e agregação (nenhum particulado foi ob-servado) (dados não mostrados) . Além disso, um aumento naviscosidade foi observado com concentração. Conforme a vis-cosidade aumenta, a possibilidade de dificuldades na admi-nistração aumenta. Estudos mostraram que amostras com visco-sidades menores que 7,75 cP podem ser facilmente injetadasatravés de uma agulha de 30G polegadas em menos de 10 se-gundos. Como mostrado na Tabela X, mesmo em uma concentraçãode anticorpo de IgGl/λ de 160 mg/mL, a viscosidade da formu-lação farmacêutica está abaixo de 7,75 cP e assim ainda éfacilmente injetada através de uma seringa.

Tabela X. Viscosidade como uma Função de Concen-tração de Anticorpo de IgGl/λ

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As formulações a serem usadas para administraçãoin vivo são da maior preferência estéreis. Isto é prontamen-te realizado por filtração através de membranas de filtraçãoestéreis, antes de, ou após a preparação da formulação.

Em uma modalidade preferida, o anticorpo da inven-ção é formulado e, 10 mM de citrato de sódio, 1,9% de glici-na, 0,5% de sacarose, 0,01% de polissorbato 80, pH 6,5 (±0,3). Em outra modalidade preferida, o anticorpo da invençãoé formulado em 10 mM de citrato de sódio, 1,9% de glicina,0,5% de sacarose, 0,01% de polissorbato 80, pH 6,5 (± 0,3)para administração intravenosa.

Em uma modalidade preferida, o anticorpo da inven-ção é formulado e, 10 mM de citrato de sódio, 8% de sacaro-se, 0,04% (p/v) de polissorbato 80, pH 6,5 (± 0,3). Em outramodalidade preferida, o anticorpo da invenção é formulado e,10 mM de citrato de sódio, 8% de sacarose, 0,04% (p/v) depolissorbato 80, pH 6,5 (± 0,3) para administração intrave-nosa. Em outra modalidade preferida, o anticorpo da invençãoé formulado e, 10 mM de citrato de sódio, 8% de sacarose,0,04% (p/v) de polissorbato 80, pH 6,5 (± 0,3) para adminis-tração subcutânea.

Geralmente, as formulações são preparadas por con-tato entre o antagonista de neutrocina-alfa ou outro agenteimunomodulatório conhecido na técnica e/ou descrito aqui u-niformemente e intimamente com veículos líquidos ou veículossólidos finamente divididos ou ambos. Então, se necessário,o produto é modelado na formulação desejada. De preferência,o veículo é um veículo parenteral, de maior preferência umasolução que é isotônica com o sangue do destinatário. Exem-plos de tais veículos carreadores incluem água, salina, so-lução de Ringer e solução de dextrose. Veículos não aquosostal como óleos fixos e oleato de etila também são úteis a-qui, assim como lipossomos.

0 veículo contém adequadamente quantidades menoresde aditivos tal como substâncias que acentuam a isotonicida-de e estabilidade química. Tais materiais não são tóxicosnas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampõestal como fosfato, citrato, succinato, ácido acético e outrosácido orgânicos e seus sais; antioxidantes tal como ácidoascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular (menos quecerca de dez resíduos), p. ex., poliarginina ou tripeptí-deos; proteínas, tal como albumina sérica, gelatina, ou imu-noglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpir-rolidona; aminoácidos, tal como glicina, ácido glutâmíco,ácido aspártico ou arginina; monossacarídeos, dissacarídeose outros carboidratos incluindo celulose e seus derivados,glicose, manose, sacarose ou dextrinas; agente quelantes talcomo EDTA; alcoóis de açúcar tal como manitol ou sorbitol;counterions tal como sódio; conservantes, tal como cresol,fenol, clorobutanol, álcool de benzila e parabenos e/ou ten-soativos não iônicos tal como polissorbatos, poloxâmeros ou PEG.

Composições compreendendo polipeptideos imunomodu-latórios são tipicamente formulados em tais veículos em umaconcentração de cerca de 0,001 mg/mL até 100 mg/mL, ou 0,1mg/mL até 100 mg/mL, de preferência 1-10 mg/mL ou 1-10mg/mL, em um pH de cerca de 3 até 10, ou 3 até 8, de maiorpreferência 5-8, da maior preferência 6-7. Será entendidoque o uso de certos dos excipientes, veículos ou estabiliza-dores precedentes resultará na formação de sais polipeptídicos.

Composições a serem usadas para administração te-rapêutica são da maior preferência estéreis. Esterilidade éprontamente realizada por filtração através de membranas defiltração estéreis (p. ex., membranas de 0,2 mícrons) . Com-posições terapêuticas geralmente são colocadas em um recipi-ente que tem uma porta de acesso estéril, por exemplo, umabolsa para solução intravenosa ou frasco que tem um tampãopenetrável por uma agulha de injeção hipodérmica.

Composições farmacêuticas compreendendo agentesimunomodulatórios que podem ser usados nos métodos da pre-sente invenção ordinariamente serão estocados em recipientesde unidade ou de multidose, por exemplo, ampolas ou frascosselados, como uma solução aquosa ou como uma formulação Iio-filizada para reconstituição. Como um exemplo de uma formu-lação liofilizada, frascos de 10 mL são preenchidos com 5 mL de solução polipeptidica de neutrocina-alfa aquosa 1% (p/v)filtrada estéril e a mistura resultante é liofilizada. A so-lução de infusão é preparada por reconstituição do polipep-tideo neutrocina-alfa liofilizado usando água para injeçãobacteriostática.

Senão, composições farmacêuticas compreendendo a-gentes imunomodulatórios que podem ser usados nos métodos dapresente invenção são estocados em recipientes de dose únicana forma liofilizada. A seleção de infusão é reconstituídausando um veículo estéril para injeção.

Em modalidades específicas, agentes imunomodulató-rios que podem ser usados na presente invenção são polipep-tídeos radiomarcados tal como uma forma radiomarcada de neu-trocina-alfa ou anticorpo anti-CD20. Tais composições farma-cêuticas compreendendo moléculas radiomarcadas também podem compreender radioprotetores e expansores plásmicos tal comoascorbato de sódio, gentran-40 e glicerol. Em modalidadesespecíficas, composições que podem ser usada nos métodos dapresente invenção compreendem formas iodadas de polipeptí-deos de neutrocina-alfa ou fragmentos ou variantes destes que são formulados em 10,0 mM de citrato de sódio, 140,0 mMde cloreto de sódio, 8,7 mM de HEPES, 4% (p/v) de ascorbatode sódio, 3,3% (p/v) de Genetran-40.

Em modalidades específicas, uma composição que po-de ser usada nos métodos da presente invenção compreende pe-lo menos 1 mg/mL de uma forma iodada de resíduos de aminoá-cidos 134-285 de SEQ ID NO: 2, 10,0 mM de citrato de sódio,140,0 mM de cloreto de sódio, 8,7 mM de HEPES, 4% (p/v) deascorbato de sódio, 3,3% (p/v) de Genetran-40. Em modalida-des específicas, uma composição que pode ser usada nos méto-dos da presente invenção compreende pelo menos 2 mg/mL deuma forma iodada de resíduos de aminoácidos 134-285 de SEQID NO: 2, 10,0 mM de citrato de sódio, 140,0 mM de cloreto de sódio, 8,7 mM de HEPES, 4% (p/v) de ascorbato de sódio,3,3% (p/v) de Genetran-40. Em modalidades específicas, umacomposição que pode ser usada nos métodos da presente inven-ção compreende pelo menos 3 mg/mL de uma forma iodada de re-síduos de aminoácidos 134-285 de SEQ ID NO: 2, 10,0 mM de citrato de sódio, 140,0 mM de cloreto de sódio, 8,7 mM deHEPES, 4% (p/v) de ascorbato de sódio, 3,3% (p/v) de Gene-tran-40. Em modalidades específicas, uma composição que podeser usada nos métodos da presente invenção compreende pelomenos 4 mg/mL de uma forma iodada de resíduos de aminoácidos 134-285 de SEQ ID NO: 2, 10,0 mM de citrato de sódio, 140,0mM de cloreto de sódio, 8,7 mM de HEPES, 4% (p/v) de ascor-bato de sódio, 3,3% (p/v) de Genetran-40. Em modalidades es-pecíficas, uma composição que pode ser usada nos métodos dapresente invenção compreende pelo menos 4,6 mg/mL de uma forma iodada de resíduos de aminoácidos 134-285 de SEQ IDNO: 2, 10,0 mM de citrato de sódio, 140,0 mM de cloreto desódio, 8,7 mM de HEPES, 4% (p/v) de ascorbato de sódio, 3,3%(p/v) de Genetran-40.Em modalidades específicas, uma composição que po-de ser usada nos métodos da presente invenção compreende en-tre cerca de 0,1 mg/mL até 20 mg/mL de uma forma iodada deresíduos de aminoácidos 134-285 de SEQ ID NO: 2, 10,0 mM decitrato de sódio, 140,0 mM de cloreto de sódio, 8,7 mM deHEPES, 4% (p/v) de ascorbato de sódio, 3,3% (p/v) de Gene-tran-4 0. Em modalidades específicas, uma composição que podeser usada nos métodos da presente invenção compreende entre1 mg/mL e 10 mg/mL de uma forma iodada de resíduos de amino-ácidos 134-285 de SEQ ID NO: 2, 10,0 mM de citrato de sódio,140,0 mM de cloreto de sódio, 8,7 mM de HEPES, 4% (p/v) deascorbato de sódio, 3,3% (p/v) de Genetran-40. Em modalida-des específicas, uma composição que pode ser usada nos méto-dos da presente invenção compreende entre 2 mg/mL e 8 mg/mLde uma forma iodada de resíduos de aminoácidos 134-285 deSEQ ID NO: 2, 10,0 mM de citrato de sódio, 140,0 mM de clo-reto de sódio, 8,7 mM de HEPES, 4% (p/v) de ascorbato de só-dio, 3,3% (p/v) de Genetran-40. Em modalidades específicas,uma composição que pode ser usada nos métodos da presenteinvenção compreende entre 3 mg/mL e 6 mg/mL de uma forma io-dada de resíduos de aminoácidos 134-285 de SEQ ID NO: 2,10,0 mM de citrato de sódio, 140,0 mM de cloreto de sódio,8,7 mM de HEPES, 4% (p/v) de ascorbato de sódio, 3,3% (p/v)de Genetran-40.

Em modalidades preferidas, uma composição que podeser usada nos métodos da presente invenção compreende um an-ticorpo anti-neutrocina-alfa. Em outras modalidades, umacomposição que pode ser usada nos métodos da presente inven-ção compreende um anticorpo que se liga especificamente aneutrocina-alfa. Em outras modalidades, uma composição quepode ser usada nos métodos da presente invenção compreendeum anticorpo anti-neutrocina-alfa antagonistico. Em outrasmodalidades, uma composição que pode ser usada nos métodosda presente invenção compreende um anticorpo que se liga es-pecificamente a neutrocina-alfa e neutraliza a atividade bi-ológica de neutrocina-alfa. Em outras modalidades, uma com-posição que pode ser usada nos métodos da presente invençãocompreende um anticorpo anti-neutrocina-alfa que se liga auma proteína neutrocina-alfa recombinante purificada de umacultura de células em que a citada proteína neutrocina-alfarecombinante é codificada por um polinucleotídeo codificandopelo menos aminoácidos 134 até 185 de SEQ ID NO: 2. Em ou-tras modalidades, uma composição que pode ser usada nos mé-todos da presente invenção compreende um anticorpo que seliga especificamente a neutrocina-alfa em que o citado anti-corpo se liga a uma proteína neutrocina-alfa recombinantepurificada de uma cultura de células em que a citada proteí-na neutrocina-alfa recombinante é codificada por um polinu-cleotídeo codificando pelo menos aminoácidos 134 até 185 deSEQ ID NO: 2.

Composições farmacêuticas contendo agentes imuno-modulatórios podem ser administradas oralmente, retalmente,parenteralmente, subcutaneamente, intracisternamente, intra-vaginalmente, intraperitonealmente, topicamente (como porpós, pomadas, gotas ou emplastros transdérmicos) , bucalmen-te, ou como um borrifado oral ou nasal (p. ex., através deinalação de um vapor ou pó).

0 termo "parenteral" como aqui utilizado se referea modos de administração que incluem injeção e infusão in-travenosa, intramuscular, intraperitonial, intra-esternal,subcutânea e intra-articular.

Em uma modalidade preferida, composições contendoagentes imunomodulatórios são administradas subcutaneamente.

Em outra modalidade preferida, composições conten-do agentes imunomodulatórios são administradas intravenosa- mente.

Composições contendo agentes imunomodulatóriostambém podem ser administradas por sistemas de liberação re-tardada. Exemplos adequados de composições de liberação re-tardada incluem materiais poliméricos adequados (tal como, por exemplo, matrizes de polímero semi-permeável na forma deartigos modelados, p. ex., filmes ou microcápsulas) , materi-ais hidrofóbicos adequados (por exemplo como uma emulsão emum óleo aceitável) ou resinas de troca iônica e derivadosmoderadamente solúveis (tal como, por exemplo, um sal mode-radamente solúvel).

Matrizes de liberação retardada incluem polilacti-deos (Pat US No. 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácidoL-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopoly-mers 22: 547-556 (1983)), metracilato de poli(2- hidroxietila) (R. Langer et al., J Biomed Mater Res 15: 167-277 (1981) e R. Langer, Chem Tech 12: 98-105 (1982)), aceta-to de etileno vinila (R. Langer et al., Id.) ou ácido poli-D- (-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988).Em uma modalidade especifica, composições contendoagentes imunomodulatórios são formuladas em um sistema dedistribuição de fármaco polimérico, biodegradável, por exem-plo, como descrito em Patente US Nos 4.938.763; 5.278.201;5.278.519; 5.340.849 e 5.487.897 e nas Publicações Interna-cionais Números WO 01/35929, WO 00/24374 e WO 00/06117 quesão incorporados desse modo como referência em suas totali-dades. Em modalidades especificas, composições contendo a-gentes imunomodulatórios são formuladas usando o sistema bi-odegradável ATRIGEL® dos Laboratórios Atrix, Inc. (Fort Col-lins, Colorado). Em outras modalidades especificas, composi-ções contendo agentes imunomodulatórios são formuladas usan-do o sistema de liberação retardada ProLease® disponível emAlkernes, Inc. (Cambridge, MA).

Exemplos de polímeros biodegradáveis que podem serusados nas formulações farmacêuticas, incluem, mas não estãolimitados a, polilactideos, poliglicolideos, policaprolacto-nas, polianidridos, poliamidas, poliuretanos, poliesterami-das, poliortoésteres, polidioxanonas, poliacetais, polique-tais, policarbonatos, poliortocarbonatos, polifosfazenos,poliidroxibutiratos, poliidroxivaleratos, oxalatos de poli-alquileno, succinatos de polialquileno, ácido poli(málico) ,poli(aminoácidos), éter de poli(metil vinila) , anidrido po-li (malêico), polivinilpirrolidona, polietileno glicol, poli-idroxicelulose, quitina, quitosana e copolímeros, terpolíme-ros, ou combinações ou misturas dos materiais acima. Os po-límeros preferidos são aqueles que têm um menor grau decristalização e são mais hidrofóbicos. Esses polímeros e co-polímeros são mais solúveis nos solventes biocompatíveis queos polímeros altamente cristalinos tal como poliglicolídeo equitina que também têm um alto grau de ligação de hidrogê-nio. Materiais preferidos com os parâmetros de solubilidadedesejados são os polilactídeos, policaprolactonas e copolí-meros desses com glicolídeo em que há mais regiões amorfaspara aumentar a solubilidade. Em modalidades preferidas es-pecíficas, os polímeros biodegradáveis que podem ser usadosna formulação de composições contendo agentes imunomodulató-rios são poli(lactídeo-co-glicolídeos). Propriedades polimé-ricas tal como peso molecular, hidrofobicidade e proporçãolactídeo/glicolídeo podem ser modificadas para obter o per-fil de liberação de fármaco desejado (veja, p. ex., Raviva-rapau et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 89: 732-741(2000), que é por meio deste incorporada como referência emsua totalidade).

Também é preferido que o solvente para o polímerobiodegradável seja não tóxico, miscível em água e de outromodo biocompatível. Exemplos de tais solventes incluem, masnão estão limitados a, N-metil-2-pirrolidona, 2-pirrolidona,alcanóis C2 até C6, alcoóis Cl até C15, dils, trióis e te-traóis tal como etanol, glicerina propileno glicol, butanol;alquil cetonas C3 até C15 tal como acetona, dietil cetona emetil etil cetona; ésteres C3 até C15 tal como acetato demetila, acetato de etila, lactato de etila, alquil cetonastal como metil etil cetona, amidas Cl até C15 tal como dime-tilformamida, dimetilacetamida e caprolactamo; éteres C3 atéC20 tal como tetraidrofurano, ou solquetal; tweens, triace-tina, carbonato de propileno, decilmetilsulfóxido, dimetilsulfóxido, ácido olêico, l-dodecilazacicloeptan-2-ona. Ou-tros solventes preferidos são álcool benzilico, benzoato debenzila, dipropileno glicol, tributirina, oleato de etila,glicerina, glicofural, miristato de isopropila, palmitato deisopropila, ácido olêico, polietileno glicol, carbonato depropileno e citrato de trietila. Os solventes mais preferi-dos são N-metil-2-pirrolidona, 2-pirrolidona, dimetil sulfó-xido, triacetina e carbonato de propileno devido à habilida-de de solvatação e suas compatibilidades .

Adicionalmente, composições de formulações conten-do agentes imunomodulatórios e um polímero biodegradáveltambém podem incluir agentes de modificação de taxa de libe-ração e/ou agentes formadores de poro. Exemplos de agentesde modificação de taxa de liberação incluem, mas não estãolimitados a, ácidos graxos, triglicerideos, outros compostoshidrofóbicos semelhantes, solventes orgânicos, compostosplastificantes e compostos hidrofilicos. Agentes de modifi-cação de taxa de liberação adequados incluem, por exemplo,ésteres de ácidos mono-, di- e tricarboxílicos, tal como a-cetato de 2-etoxietila, acetato de metila, acetato de etila,ftalato de dietila, ftalato de dimetila, ftalato de dibuti-la, adipato de dimetila, succinato de dimetila, oxalato dedimetila, citrato de dimetila, citrato de trietila, citratode acetil tributila, citrato acetil trietila, triacetato deglicerol, sebecato de di(n-butil) e semelhantes; poliidróxialcoóis, tal como propileno glicol, polietileno glicol, gli-cerina, sorbitol e semelhantes; ácidos graxos, triésteres deglicerol, tal como triglicerideos, óleo de soja epoxidizadoe outros óleos vegetais epoxidizados; esteróis, tal como co-lesterol; alcoóis, tal como alcanóis C.sub.6-C.sub.12, 2-etoxietanol e semelhantes. O agente de modificação de taxade liberação pode ser usado isoladamente ou em combinaçãocom outros de tais agentes. Combinações adequadas de agentesde modificação de taxa de liberação incluem, mas não estãolimitadas a, glicerina/propileno glicol, sorbitol/glicerina,óxido de etileno/óxido de propileno, butileno glicol/ácidoadipico e semelhantes. Agentes de modificação de taxa de li-beração preferidos incluem, mas não estão limitados a, ex-trato de dimetila, citrato de trietila, heptanoato de etila,glicerina e hexanediol. Agentes formadores de poro adequadosque podem ser usados na composição de polímero incluem, masnão estão limitados a, açúcares tal como sacarose e dextro-se, sais tal como cloreto de sódio e carbonato de sódio, po-límeros tal como hidroxilpropilcelulose, carboximetilcelulo-se, polietileno glicol e polivinilpirrolidona. Cristais só-lidos que proverão um tamanho de poro definido, tal como salou açúcar, são preferidos.

Em modalidades específicas, composições contendoagentes imunomodulatórios são formuladas usando o sistemamucoadesivo bioerodível BEMA™, sistema de absorção mucocutâ-neo MCA™, sistema de micropartículas solvente SMP™ ou siste-ma de polímero biocompatível BCP™ dos laboratórios Atrix,Inc. (Fort Collins, Colorado).

Composições de liberação retardada também incluemcomposições incluídas dentro de lipossomos (veja geralmente,Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al., em Li-posomes in the Therapy of Infectious Disease and Câncer, Lo-pez-Berestein e Fidler (eds.), Liss, Nova Iorque, pp. 317-327 e 353-365 (1989)). Lipossomos podem ser preparados pormétodos conhecidos por si: DE 3.218.121; Epstein et al.,Proc Natl Acad Sci USA 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al.,Proc Natl Acad Sci USA 77: 4030-4034 (1980); EP 52.322; EP36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; Pedido de Pat.Japonês 83-118008; Pat US Nos. 4.485.045 e 4.544.545 e EP102.324. Ordinariamente, os lipossomos são do tipo unilame-lar pequeno (cerca de 200-800 Angstrons) em que o conteúdolipidico é maior que cerca de 30 mol. porcentual de coleste-rol, a proporção selecionada sendo ajustada para a terapiaimunomodulatória ótima.

Em outra modalidade composições de liberação re-tardada incluem formulações conhecidas na técnica.

Ainda em uma modalidade adicional, as composiçõescompreendendo um agente imunomodulatório são distribuídospor meio de uma bomba (veja, Langer, supra; Sefton, CRCCrit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al.,Surgery 88: 507 (1980); Saudek et al., N Engl J Med 321: 574(1989)).

Outros sistemas de liberação retardada são discu-tidos na revisão por Langer (Science 249: 1527-1533 (1990)).

Para administração parenteral, em uma modalidade,o agente imunomodulatório é formulado geralmente pela mistu-ra dele em um grau desejado de pureza, em uma forma injetá-vel de dosagem unitária (solução, suspensão ou emulsão) , comum veiculo farmaceuticamente aceitável, isto é, um que sejanão tóxico a destinatários nas dosagens e concentrações em-pregadas e seja compatível com outros ingredientes da formu-lação. Por exemplo, quando o ingrediente ativo é uma proteí-na imunomodulatória, a formulação de preferência não incluiagentes de oxidação e outros compostos que são conhecidospor serem deletérios a polipeptideos.

Em uma modalidade específica, pode ser desejáveladministrar os compostos ou composições farmacêuticas local-mente na área em necessidade de tratamento; isto pode serobtido, por exemplo, e não por questão de limitação, por in-fusão local durante cirurgia, aplicação tópica, p. ex., emconjunto com um curativo de ferimento após cirurgia, por in-jeção, por meio de um catéter, por meio de um supositório,ou por meio de um implante, o citado implante sendo um mate-rial poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas,tal como membranas sialásticas ou fibras. De preferência,quando for administrada um proteína, incluindo um anticorpo,da invenção, deve-se tomar cuidado para usar materiais que aproteína não absorva.

Em outra modalidade, o agente imunomodulatório po-de ser distribuído em uma vesícula, em particular um lipos-somo (veja, Langer Science 249: 1527-153.3 (1990); Treat etal., em Liposomes in the Therapy of Infectious Disease andCâncer, Lopez-Berestein e Fidler (eds.), Liss, Nova Iorque,pp. 317-327 e 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid, pp.317-327; veja geralmente ibid).

Ainda em outra modalidade, o agente imunomodulató-rio pode ser distribuído em sistema de liberação controlada.Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (veja Langer,supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987);Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980); Saudek et al., N Engl J Med 321: 574 (1989)). Em outra modalidade, materiaispoliméricos podem ser usados (veja Medicai Applications ofControlled Release, Langer e Wise (eds.), CRC Press, BocaRaton, Flórida (1974); Controlled Drug Bioavailability, DrugProduct Design and Performance, Smolen e Ball (eds.); Wiley, Nova Iorque (1984); Rabger e Peppas, J., Macromol Sci RevMacromol Chem 23: 61 (1983); veja também Levy et al., Sci-ence 228: 190 (1985); During et al., Ann Neurol 25: 351(1989); Howard et al., J Neurosurg. 71: 105 (1989)). Aindaem outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado em proximidade do alvo terapêutico, isto é, océrebro, assim requerendo apenas uma fração da dosagem sis-têmica (veja, p. ex., Goodson, em Medicai Applications ofControlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).

Outros sistemas de liberação controlada são discu- tidos na revisão por Langer (Science 249: 1527-1533 (1990)).

Em uma modalidade específica, onde o composto dainvenção é um ácido nuclêico codificando uma proteína, o á-cido nuclêico pode ser administrado in vivo para promover aexpressão de sua proteína codificada, pela construção destecomo parte de um vetor de expressão de ácido nuclêico apro-priado e administração deste para que ele torne-se intrace-lular, p. ex., por uso de um vetor retroviral (veja PatenteUS No. 4.980.286), ou por injeção direta ou por uso de bom--

bardeamento de micropartículas (ρ. ex., uma arma gênica; Bi-olistic, Dupont), ou por revestimento com lipideos ou recep-tores de superfície celular ou agentes de transfecção, oupor administração desse em ligação com um peptídeo semelhan-te a homeobox que é conhecido por entrar no núcleo (veja, p.ex., Joliot et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 1864-1868(1991)), etc. Senão, um ácido nuclêico pode ser introduzidointracelularmente e incorporado no DNA de célula hospedeirapara expressão por recombinação homóloga.

A presente invenção também provê composições far-macêuticas. Tais composições compreendem uma quantidade te-rapeuticamente eficaz de um composto e um veículo farmaceu-ticamente aceitável. Em uma modalidade específica, o termo"farmaceuticamente. aceitável" significa aprovado por uma a-gência regulatória federal ou de um governo de estado oulistado na Farmacopéia de USA ou outra farmacopéia geralmen-te reconhecida para uso em animais e mais particularmente emhumanos. O termo "veículo" se refere a um diluente, adjuvan-te, excipiente ou carreador com o qual o terapêutico é admi-nistrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos es-téreis, tal como água e óleos, incluindo aqueles de origempetrolífera, animal, vegetal ou sintética, tal como óleo deamendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e se-melhantes. Água é um veículo preferido quando a composiçãofarmacêutica é administrada intravenosamente. Soluções sali-nas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podemser empregadas como veículos líquidos, particularmente parasoluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados in-cluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte,arroz, farinha de trigo, calcário, gel de silica, estearatode sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de só-dio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno, glicol, á-gua etanol e semelhantes. A composição, se desejado, tambémpode conter quantidades menores de agentes umidificantes ouemulsificantes, ou agentes tamponadores de pH. Essas compo-sições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emul-sões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações deliberação retardada e semelhantes. A composição pode serformulada como um supositório, com ligantes e veículos tra-dicionais al como triglicerídeos. Formulação oral pode in-cluir veículos tal como graus farmacêuticos de manitol, lac-tose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulo-se, carbonato de magnésio, etc. Exemplos de veículos farma-cêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceu-tical Sciences " por, E. W. Martin. Tais composições conte-rão uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto depreferência na forma purificada, junto com uma quantidadeadequada de veículo para prover a forma para administraçãoapropriada ao paciente. A formulação deve ajustar-se ao modode administração.

Em uma modalidade preferida, a composição é formu-lada de acordo com procedimentos de rotina como uma composi-ção farmacêutica adaptada para administração intravenosa aseres humanos.

Tipicamente, composições para administração intra-venosa são soluções em tampão aquoso isotônico. Quando ne-cessário, a composição também pode incluir um agente de so-lubilização e um anestésico local tal como lignocaina paraaliviar a dor no sitio da injeção. Geralmente, os ingredien-tes são supridos separadamente ou misturados junto em formade dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado se-co ou concentrado sem água em um recipiente selado hermeti-camente tal como uma ampola ou sachê indicando a quantidadedo agente ativo. Quando a composição é para ser administradapor infusão, ela pode ser dispensada com uma garrafa de in-fusão contendo água ou salina de grau farmacêutico estéril.Quando a composição é administrada por injeção, uma ampolade água estéril para injeção pode ser provida para que osingredientes possam ser misturados antes da administração.

Agentes imunomodulatórios podem ser formulados co-mo formas neutras ou de sais. Sais farmaceuticamente aceitá-veis incluem aqueles formados com ânions tal como aquelesderivados de ácidos clorídricos, fosfóricos, acéticos, oxá-licos, tartáricos, etc., e aqueles formados com cátions talcomo aqueles derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio,hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaina, etc.

A quantidade do agente imunomodulatório que seráeficaz nos métodos da invenção como descrito aqui pode serdeterminada por técnicas clinicas padrões. Além disso, en-saio in vitro podem opcionalmente ser empregados para ajudara' identificar faixas de dosagem ótimas. A dose precisa a serempregada na formulação também dependerá da via de adminis-tração e da gravidade da doença ou distúrbio e deve ser de-cidida de acordo com o julgamento do médico e de cada cir-cunstância do paciente. Doses eficazes podem ser extrapola-das a partir de curvas de resposta de dose a partir de sis-temas de teste modelo animal in vitro.

Para anticorpos, a dosagem administrada a um paci-ente é tipicamente 0,1 mg/kg até 100 mg/kg do peso corporaldo paciente. De preferência, a dosagem administrada a um pa-ciente está entre 0,1 mg/kg e 20 mg/kg do peso corporal dopaciente, de maior preferência 1 mg/kg até 10 mg/kg do peso corporal do paciente. Em modalidades preferidas, uma dose de1, 4, 10 ou 20 mg/kg é administrada intravenosamente a umpaciente. Geralmente, anticorpos humanos têm uma maior meia-vida no corpo humano que anticorpos de outras espécies devi-do à resposta imune à polipeptideos exógenos. Assim, dosa- gens menores de anticorpos humanos e administração menosfreqüente é freqüentemente possível. Adicionalmente, a dosa-gem e freqüência de administração de anticorpos da invençãopode ser reduzida pelo aumento da captação e penetração te-cidual (p. ex. , no cérebro) dos anticorpos por modificaçõestal como, por exemplo, lipidação.

Como uma proposição geral, a quantidade farmaceu-ticamente eficaz total de um polipeptídeo administrado pa-renteralmente por dose estará na faixa de cerca de 1 micro-grama/kg/dia até 10 mg/kg/dia de peso corporal do paciente,embora, como mencionado acima, isto será submetido à discer-nimento terapêutico. De maios preferência, esta dose é depelo menos 0,01 mg/kg/dia e da maior preferência para huma-nos entre cerca de 0,01 e 1 mg/kg/dia.Em outra modalidade, um polipeptideo é administra-do a um humano em um dose entre 0,0001 e 0,045 mg/kg/dia, depreferência, em uma dose entre 0,0045 e 0,045 mg/kg/dia e demaior preferência, em uma dose de cerca de 45 microgra-ma/kg/dia em humanos; e em uma dose de cerca de 3 mg/kg/diaem camundongos.

Se dado continuamente, o polipeptideo tipicamenteé administrado em uma taxa de dosagem de cerca de 1 micro-grama/kg/hora até cerca de 50 microgramas/kg/hora, por 1-4injeções por dia ou por infusões subcutâneas continuas, porexemplo, usando uma mini-bomba. Uma solução em bolsa intra-venosa também pode ser empregada.

O comprimento de tratamento necessário para obser-var alterações e o intervalo após o tratamento para que res-postas ocorram parece variar dependendo do efeito desejado.

Composições compreendendo agentes imunomodulató-rios podem ser administrados como uma infusão continua, in-jeções discretas múltiplas por dia (p. ex., três ou mais ve-zes por dia, ou duas vezes por dia), injeção única por dia,ou como injeções discretas dadas intermitentemente (p. ex.,duas vezes por dia, uma vez por dia, dia sim, dia não, duasvezes por semana, semanalmente, bissemanalmente, mensalmen-te, bimestralmente e trimestralmente). Se dado continuamen-te, um polipeptideo tipicamente é administrado em uma taxade dosagem de cerca de 0,001 até 10 micrograma/kg/hora atécerca de 50 microgramas/kg/hora, por 1-4 injeções por dia oupor infusões subcutâneas continuas, por exemplo, usando umamini-bomba.Dosagens eficazes das composições compreendendoagentes imunomodulatórios a serem administrados podem serdeterminados através de procedimentos bem conhecidos por a-queles na técnica que dirigi-se a tais parâmetros como meia-vida biológica, biodisponibilidade e toxicidade. Tal deter-minação está bem dentro na capacidade daqueles versados natécnica, especialmente à luz da divulgação detalhada providaaqui.

Bioexposição de um organismo a um agente imu-nomodulatório também pode ter uma função importante na de-terminação de um regime de dosagem terapeuticamente e/oufarmacologicamente eficaz. Variações de dosagem tal como ad-ministrações repetidas de uma dose relativamente baixa de umagente imunomodulatório por um periodo de tempo relativamen-te longo podem ter um efeito que é terapeuticamente e/oufarmacologicamente distinguivel daquele obtido com adminis-trações repetidas de uma dose relativamente alta de um agen-te imunomodulatório por um periodo de tempo relativamentecurto.

Usando fatores de conversão de dosagem em área desuperfície equivalente fornecidos por Freireich, E. J., etal., (Câncer Chemotherapy Reports 50(4): 219-44 (1966)) al-guém de conhecimento ordinário na técnica é capaz de conver-ter dados convenientemente obtidos do uso de agente imunomo-dulatório em um dado sistema experimental em uma estimativaacurada de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de agenteimunomodulatório a ser administrado por dose em outro siste-ma experimental. Dados experimentais obtidos através da ad-ministração do agente imunomodulatório em camundongos, porexemplo, podem ser convertidos através dos fatores de con-versão fornecidos por Freireich, et al., para corretas esti-mativas de doses farmaceuticamente eficazes de neutrocina-alfa em rato, macaco, cachorro e humano. A tabela de conver-são a seguir (Tabela III) é um resumo dos dados providos porFreireich, et al. A Tabela III dá fatores aproximados paradoses de conversão expressadas em termos de MG/kg de uma es-pécie para uma dose por área de superfície equivalente ex-pressada como MG/kg em outra espécie tabulada.

Tabela III. Fatores de Conversão de Dosagem porÁrea de Superfície Equivalente

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Assim,, por exemplo, usando os fatores de conversãoprovidos na Tabela III, uma dose de 50 mg/kg no camundongo éconvertida para uma dose apropriada de 12,5- mg/kg na macacoporque (50 mg/kg) χ (1/4) = 12,5 mg/kg. Como um exemplo adi-cional, doses de 0, 02, 0, 08, 0, 8, 2 e 8mg/kg em equiparaçãode efeito de doses de camundongo de 1,667 microgramas/kg,6,67 microgramas/kg,, 66,7 microgramas/kg, 166,7 microgra-mas/kg, e 0,667 mg/kg, respectivamente, no humano.Em certas modalidades, a administração de formasradiomarcadas de neutrocina-alfa ou anticorpo anti-neutrocina-alfa é contemplada. A dosagem radiométrica a seraplicada pode variar consideravelmente. A composição de neu-trocina-alfa ou anticorpo anti-neutrocina-alfa radiomarcadopode ser administrada em uma dose de cerca de 0,1 até cercade 100 mCi por 70kg de peso corporal. Em outra modalidade, acomposição de neutrocina-alfa ou anticorpo anti-neutrocina-alfa radiomarcado pode ser administrada em uma dose de cercade 0,1 até cerca de 50 mCi por 70kg de peso corporal. Em ou-tra modalidade, a composição de neutrocina-alfa ou anticorpoanti-neutrocina-alfa radiomarcado pode ser administrada emuma dose de cerca de 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35,40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mCi por 70kg de peso corporal.

A composição de neutrocina-alfa ou anticorpo anti-neutrocina-alfa radiomarcado pode ser administrada em umadose de cerca de 0,1 até cerca de 10 mCi/kg de peso corpo-ral. Em outra modalidade, a composição de neutrocina-alfa ouanticorpo anti-neutrocina-alfa radiomarcado pode ser admi- nistrada em uma dose de cerca de 0,25 até cerca de 5 mCi/kgde peso corporal. Em modalidades especificas, a composiçãode neutrocina-alfa ou anticorpo anti-neutrocina-alfa radio-marcado pode ser administrada em uma dose de cerca de 0,35,0,70, 1,35, 1,70, 2,0, 2,5 ou 3,0 mCI/kg.

A composição de neutrocina-alfa ou anticorpo anti-neutrocina-alfa radiomarcado pode ser administrada em umadose de cerca de 1 até cerca de 50 mCi/m2. Em outra modali-dade, a composição de neutrocina-alfa ou anticorpo anti-neutrocina-alfa radiomarcado pode ser administrada em umadose de cerca de 10 até cerca de 30 mCi/m2. Em modalidadesespecificas, a composição de neutrocina-alfa ou anticorpoanti-neutrocina-alfa radiomarcado pode ser administrada emuma dose de cerca de 10, 15, 20, 25 ou 30 mCi/m2.

A concentração de anticorpo anti-neutrocina-alfaSV, anticorpo anti-neutrocina-alfa, proteína neutrocina-alfaSV e/ou neutrocina-alfa total em uma composição de neu-trocina-alfa ou anticorpo anti-neutrocina-alfa radiomarcadotambém pode variar, por exemplo de cerca de 1 micrograma/kgaté cerca de Img/kg. Em modalidades específicas, a concen-tração anticorpo anti-neutrocina-alfaSV, anticorpo anti-neutrocina-alfa, proteína neutrocina-alfaSV e/ou neutrocina-alfa total em uma composição de neutrocina-alfa ou anticorpoanti-neutrocina-alfa radiomarcado pode ser cerca de 5, 10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90,95 ou 100 microgramas/kg.

Por exemplo, linfomas são conhecidos por serem tu-mores radiossensíveis. Para produção de imagem imunodiagnós-tica, marcação traço pelo complexo pode ser usada, tipica-mente 1-20 mg de proteína neutrocina-alfa são marcados comcerca de 1 até 60 mCi de radioisótopo. A dose pode ser dealgum modo dependente do isótopo usada para produção de ima-gem; quantidades na maior extremidade da faixa, de preferên-cia 40 até 60 mCi, podem ser usadas com 99mTc; quantidadesna menor extremidade da faixa, de preferência 1-20 mCi, po-dem ser usadas com IllIn. Para fins de produção de imagem,cerca de 1 até cerca de 30 mg de complexo de neutrocina-alfapodem ser dados a um indivíduo. Para fins de radioimunotera-pia, o complexo de neutrocina-alfa é administrado a um indi-víduo em quantidade suficiente para que a dose corporal in-teira recebida seja até cerca de 1100 cGy, mas de preferên-cia menor que ou igual a 500 cGy. A quantidade total de pro-teína neutrocina-alfa administrada a um indivíduo, incluindoproteína neutrocina-alfa, conjugado de neutrocina-alfa ecomplexo de neutrocina-alfa, pode variar de 1,0 pg/kg até1,0 mg/kg de peso corporal do paciente. Em outra modalidade,a quantidade total de proteína neutrocina-alfa administradaa um indivíduo, incluindo proteína neutrocina-alfa, conjuga-do de neutrocina-alfa e complexo de neutrocina-alfa, podevariar de 20 μς/kg até 100 mg/kg de peso corporal do paciente .

Uma quantidade de radioatividade que proveria a-proximadamente 500cGy para o corpo inteiro de um humano éestimada como sendo cerca de 825 mCi de 131I. As quantidadesde radioatividade a serem administradas dependem, em parte,do isotopo escolhido. Para terapia com 90Y, de cerca de 1até cerca de 200 mCi quantidades de radioatividade são con-sideradas apropriadas, com quantidades preferíveis sendo 1até 150 mCi e 1 até 100 mCi (p. ex., 60 mCi) sendo mais pre-ferido. Os meios preferidos para estimar doses teciduais apartir da quantidade de radioatividade administrada é reali-zar uma imagem ou outro regime farmacocinético com uma dosetraço, para obter estimativas da dosimetria predita. Na de-terminação da dosagem apropriada de radiofarmacêutico paraadministrar a um indivíduo, é necessário considerar a quan-tidade de radiação que órgãos individuais receberão compara-da à tolerância máxima para tais órgãos. Tal informação éconhecida por aqueles versados na técnica, por exemplo, vejaEmami et al., International Journal of Radiation Oncology,Biology, Physics 21: 109-22 (1991); e Meredith, Câncer Bio-therapy & Radiopharmaceuticals 17: 83-99 (2002), ambas asquais são por meio deste incorporadas como referência em su-as totalidades.

Um protocolo de "alta-dose", por exemplo na faixade 200 até 600 cGy (ou maior) para o corpo inteiro, pode re-querer o suporte de um protocolo de substituição de medulaóssea, como a medula óssea é o tecido que limita a dosagemde radiação devido à toxicidade.

Em modalidades especificas, um paciente recebemúltiplas administrações de uma composição (p. ex., anticor-po que se liga especificamente a neutrocina-alf a ou outroagente imunomodulatório conhecido na técnica e/ou descritoaqui) . Um grupo de administrações múltiplas é referido comoum ciclo. Um ciclo único pode compreender, por exemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais administrações.Para qualquer uma das administrações, a dose pode ser fixadaou ser variável para permitir carregamento de fármaco inici-al e/ou serem responsáveis pelas diferenças especificas aopaciente em massa, área de superfície corporal, atividade dedoença, resposta de doença, tolerabilidade a fármaco, temposde recuperação, parâmetros de PK e/ou resposta(s) farmacoló-gica(s).

0 tempo entre quaisquer duas administrações em umdado ciclo pode ser fixado ou ser variável para acomodar di-ferenças paciente-especificas na atividade de doença, res-posta de doença, tolerabilidade a fármaco, tempos de recupe-ração, parâmetros de PK e/ou resposta(s) farmacológica(s) .Em modalidades especificas, a pacientes é dada um dose decarregamento inicial que é duas vezes a quantidade dada emadministrações subseqüentes. Em outras modalidades, o tempoentre qualquer duas administrações pode ser 1, 2, 3, 4, 5,6, ou 7 dias (1 semana) ou mais. Em modalidades especificas,o tempo entre quaisquer duas administrações pode ser 1, 2,3, 4, 5, 6, 7 ou 8 semanas ou mais. Pacientes também podemreceber múltiplos ciclos de tratamento. Se mais de um ciclofor necessário, o tempo entre quaisquer dois ciclos de tra-tamento pode ser fixado ou variável para acomodar diferençaspaciente-especificas na atividade de doença, resposta de do-ença, tolerabilidade a fármaco, tempos de recuperação, parâ-metros de PK e/ou resposta(s) farmacológica(s) . Em modalida-des especificas, o tempo entre quaisquer dois ciclos podeser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 meses ou mais. Emmodalidades especificas, o tempo entre quaisquer dois ciclospode ser 1, 2, 3, 4, 5 anos ou mais. Em modalidades especi-ficas, o paciente recebe uma administração bolus inicial se-guida por um ou múltiplos tratamentos em ciclo.

Em uma modalidade, a administração bolus inicialcompreende uma dose de mais que ou igual a 2 mg/kg de um an-ticorpo antagonista de neutrocina-alfa administrado intrave-nosamente a um paciente. Em uma modalidade, a administraçãobolus inicial compreende uma dose de mais que ou igual a 5mg/kg de um anticorpo antagonista de neutrocina-alfa admi-nistrado intravenosamente a um paciente. Em modalidades pre-feridas, a administração bolus inicial é uma dose de maisque ou igual a 10 mg/kg de um anticorpo antagonista de neu-trocina-alfa administrado intravenosamente a um paciente. Emoutras modalidades, a administração bolus inicial é uma dosede mais que ou igual a 15 mg/kg de um anticorpo antagonistade neutrocina-alfa administrado intravenosamente a um paci-ente. Em uma modalidade, a administração bolus inicial com-preende uma dose de mais que ou igual a 20 mg/kg de um anti-corpo antagonista de neutrocina-alfa administrado intraveno-samente a um paciente.

Em outras modalidades especificas, o bolus inicialcompreende um anticorpo anti-CD20.

Em outras modalidades especificas, o bolus inicialcompreende um agente que esgota célula B.

A invenção, também prove um pacote ou kit farmacêu-tico compreendendo um ou mais recipientes preenchidos com umou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas. Op-cionalmente associado com tal(is) recipiente(s) pode estarum aviso na forma prescrita por uma agência governamentalque regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêu-ticos ou biológicos, tal aviso reflete aprovação pela agên-cia de fabricação, uso ou venda para administração humana.

Um agente imunomodulatório pode ser administradosozinha ou em combinação com outros agentes terapêuticos,incluindo, mas não limitando a, um ou mais agentes imunomo-dulatórios, agentes quimioterapêuticos, antibióticos, anti-virais, anti-inflamatórios esteroidais e não esteroidais,agentes imunoterapêuticos convencionais e citocinas. Combi-nações podem ser administradas concomitantemente, p. ex.,como um mistura, separadamente, mas simultaneamente; ou se-qüencialmente. Isto inclui apresentações em que agentes com-binados são administrados juntos como uma mistura terapêuti-ca e também procedimentos em que os agentes combinados sãoadministrados separadamente, mas simultaneamente, p. ex.,como através de linhas intravenosas separadas no mesmo indi-viduo. Administração "em combinação" inclui adicionalmente aadministração separada de um dos compostos ou agentes dadosprimeiro, seguido pela segundo.

Nos parágrafos sucessores, é descrito que um agen-te imunomodulatório pode ser administrado em combinação comoutro composto. Em certas circunstâncias, o composto adicio-nal também é por si só um agente imunomodulatório. A divul-gação naqueles parágrafos destina-se a comunicar que é espe-cificamente contemplado que dois ou mais agentes imunomodu-latórios distintos podem ser administrados em combinação um com o outro em conjunto com os métodos da presente invenção.Por exemplo, é especificamente contemplado que um anticorpoanti-neutrocina-alfa pode ser usado em conjunto com um anti-corpo anti-CD20 em conjunto com os métodos da presente in-venção .

Agentes imunossupressores não específicos conven-cionais, que podem ser administrados em combinação com umagente imunomodulatório incluem, mas não estão limitados a,esteróides, ciclosporina, análogos de ciclosporina, ciclo-fosfamida, ciclofosfamida IV, metilprednisolona, prednisolo-na, azatioprina, FK-506, 15-desoxiespergualina e outros a-gentes imunossupressores que agem por supressão da função decélulas T de resposta. Outros agentes imunossupressores, que podem ser administrados em combinação com um agente imunomo-dulatório incluem, mas não estão limitados a, prednisolona,metotrexato, talidomida, metoxissalen, rapamicina, leflumi-da, mizoribina (BREDININ™), brequinar, desoxiespergualina eazaspirano (SKF 105685).

Em modalidades especificas, um agente imunomodula-tório é administrado em combinação com um imunossupressor.Preparações imunossupressoras que podem ser administradas emcombinação com um agente imunomodulatório incluem, mas nãoestão limitados a, ORTHOCLONE OKT®3 (muromonab-CD3) ,SANDIMMUNE™, NEORAL™, SANGDYA™ (ciclosporina) , PROGRAF®(FK506, tacrolimus), CELLCEPT® (micofenolato de mofetila, doqual o metabólito ativo é ácido micofenólico) , IMURAN™ (aza-tioprina) , glicorticosteróides, esteróides adrenocorticaistal como DELTASONE™ (prednisona) e HYDELTRASOL™ (prednisolo-na), FOLEX™ e MEXATE™ (metotrexato)', OXSORALEN-ULTRA™ (meto-xissalen) e RAPAMUNE™ (sirolimus). Em uma modalidade especi-fica, imunossupressores podem ser usados para prevenir a re-jeição de transplante de órgão medula óssea.

Em outra modalidade, um agente imunomodulatório éadministrado em combinação com terapia de esteróides. Este-róides que podem ser administrados em combinação com um a-gente imunomodulatório incluem, mas não estão limitados a,corticosteróides orais, prednisona e metilprednisolona (p.ex., metilprednisolona IV). Em uma modalidade especifica, umagente imunomodulatório é administrado em combinação comprednisona. Em uma modalidade especifica adicional, um agen-te imunomodulatório é administrado em combinação com predni- sona e um agente imunossupressor. Agentes imunossupressoresque podem ser administrados com um agente imunomodulatório eprednisona são aqueles descritos aqui e incluem, mas não es-tão limitados a, azatioprina, ciclofosfamida e ciclofosfami-da IV. Em outra modalidade especifica, um agente imunomodu- latório é administrado em combinação com metilprednisolona.Em uma modalidade especifica adicional, um agente imunomodu-latório é administrado em combinação com metilprednisolona eum agente imunossupressor. Agentes imunossupressores que po-dem ser administrados com um agente imunomodulatório e me- tilprednisolona são aqueles descritos aqui e incluem, masnão estão limitados a, azatioprina, ciclofosfamida e ciclo-fosfamida IV.

Em uma modalidade preferida, um agente imunomodu-latório é administrado em combinação com um antimalárico. Antimaláricos que podem ser administrados com um agente imu-nomodulatório incluem, mas não estão limitados a, hidroxi-cloroquina (p. ex., PLAQUENIL™), cloroquina e/ou quinacrina.

Em uma modalidade preferida, um agente imunomodu-latório é administrado em combinação com uma NSAID.

Em uma modalidade não exclusiva, um agente imuno-modulatório é administrado em combinação com um, dois, três,quatro, cinco, dez, ou mais das seguintes drogas: NRD-101(Hoescht Marion Roussel), diclofenac (Dimethaid), oxaprozinapotássica (Monsanto), mecasermina (Chiron), T-614 (Toyama),pemetrexado dissódico (Eli Lilly) , atreleuton (Abbott), val-decoxib (Monsanto), eltenac (Byk Gulden), campath, AGM-1470(Takeda), CDP-571 (Celltech Chiroscience) , CM-IOl (Carbo-Med), ML-3000 (Merckle), CB-2431 (KS Biomedix) , CBF-BS2 (KSBiomedix), terapia gênica por IL-IRa (Valentis), JTE-522(Japan Tobacco), paclitaxel (Angiotech) , DW-166HC (DongWha) , mesilato de darbufelona (Warner-Lambert) , receptor 1de TNF solúvel (synergen; Amgen), IPR-6001 (Institute forPharmaceutical Research), trocade (Hoffman-La Roche), EF-5(Scotia Pharmaceuticals), BIIL-284 (Boeringer Ingelheim),BIIF-1149 (Boeringer Ingelheim), Leuko Vax (Inflammatics),MK-663 (Merck), ST-1482 (Sigma-Tau) e propionato de butixo-cort (WarnerLambert).

Em uma modalidade, um agente imunomodulatório éadministrado em combinação com um ou mais dos seguintes fár-macos: Infliximab (também conhecido como Remicade™ Centro-cor, Inc.), Trocade (Roche, RO-32-3555) , Leflumide (tambémconhecido como Arava™ de Hoescht Marion Roussel), Kineret™(um antagonista de receptor de IL-I também conhecido comoAnakinra de Amgen, Inc.), SCIO-469 (inibidor de quinase p38de Seios, Inc) , Humira® (adalimumab de Abbott Laboratories)e/ou ASLERA™ (prasterona, desidroepiandrosterona, GL701) deGenelabs Technologies Inc.

Em outra modalidade, um agente imunomodulatório éadministrado em combinação com um, dois, três, quatro, cincoou mais das seguintes drogas: metotrexato, sulfassalazina,aurotiomalato de sódio, auranofina, ciclosporina, penicila-mina, azatioprina, um fármaco antimalárico (p. ex., comodescrito aqui), ciclofosfamida, clorambucil, ouro, ENBREL™(Etanercept), anticorpo anti-TNF, LJP 394 (La Jolla Pharma-ceutical Company, San Diego, Califórnia) e prednisolona.

Em outra modalidade, um agente imunomodulatório éadministrado em combinação com um antimalárico, metotrexato,anticorpo anti-TNF, ENBREL™ e/ou sulfassalazina. Em uma mo-dalidade, um agente imunomodulatório é administrado em com-binação com metotrexato. Em outra modalidade, um agente imu-nomodulatório é administrado em combinação com um anticorpoanti-TNF. Em outra modalidade, um agente imunomodulatório éadministrado em combinação com metotrexato e anticorpo anti-TNF. Em outra modalidade, um agente imunomodulatório é admi-nistrado em combinação com sulfassalazina. Em outra modali-dade especifica, um agente imunomodulatório é administradoem combinação com metotrexato, anticorpo anti-TNF e sulfas-salazina. Em outra modalidade, um agente imunomodulatório éadministrado em combinação com ENBREL™. Em outra modalidade,um agente imunomodulatório é administrado em combinação comENBREL™ e metotrexato. Em outra modalidade, um agente imuno-modulatório é administrado em combinação com ENBREL™, meto-trexato e sulfassalazina. Em outra modalidade, um agente i-munomodulatório é administrado em combinação com ENBREL™ esulfassalazina. Em outras modalidades, um ou mais antimalá-ricos é combinado com uma das combinações acima relaciona-das. Em uma modalidade especifica, um agente imunomodulató-rio é administrado em combinação com um antimalárico (p.ex., hidroxicloroquina), ENBREL™, metotrexato e sulfassala-zina. Em outra modalidade especifica, um agente imunomodula-tório é administrado em combinação com um antimalárico (p.ex., hidroxicloroquina) , sulfassalazina, anticorpo anti-TNFe metotrexato.

Em uma modalidade adicional, um agente imunomodu-latório é administrado sozinho ou em combinação com um oumais preparações de globulina imune intravenosa. Preparaçõesde globulina imune intravenosa que podem ser administradascom um agente imunomodulatório incluem, mas não estão Iimi-tadas a, GAMMAR™, EVEEGAM™, SANDOGLOBULIN™, GAMMAGARD S/D™ eGAMIMUNE™. Em uma modalidade especifica, um agente imunomo-dulatório é administrado em combinação com preparações deglobulina imune intravenosa em terapia de transplante (p.ex., transplante de medula óssea).

Em uma modalidade adicional, um agente imunomodu-latório é administrado sozinho ou em combinação com um agen-te anti-inflamatório. Agentes anti-inflamatórios que podemser administrados com um agente imunomodulatório incluem,mas não estão limitados a, glicocorticóides e aos anti- inflamatórios não esteroidais, derivados de ácido aminoaril-carboxilico, derivados de ácido arilacético, derivados deácido arilbutirico, ácidos arilcarboxilicos, derivados deácidoarilpropiônico, pirazóis, pirazolonas, derivados de á-cido salicilico, tiazinocarboxamidas, ácido e- acetamidocapróico, S-adenosilmetionina, ácido 3-amino-4-hidroxibutirico, amixetrina, bendazac, benzidamina, bucofo-na, difempiramida, ditazol, emnorfazona, guaiazuleno, nabu-metona, nimesuleto, orgoteina, oxaceprol, paranilina, peri-soxal, pifoxime, proquazona, proxazol e tenidap.

Em modalidades específicas, um agente imunomodula-tório é administrado sozinho ou em combinação com anticorpoanti-CD4. Em uma modalidade, co-administração de um agenteimunomodulatório com anticorpo anti-CD4 é prevista para tra-tamento de artrite reumatóide. Em uma modalidade, co-administração de um agente imunomodulatório com anticorpoanti-CD4 é prevista para tratamento de lúpus eritematososistêmico.

Em modalidades específicas, um agente imunomodula-tório é administrado sozinho ou em combinação com anticorpoanti-IL-15. Em uma modalidade, co-administração de um agenteimunomodulatório com anticorpo anti-IL-15 é prevista paratratamento de artrite reumatóide. Em uma modalidade, co-administração de um agente imunomodulatório com anticorpoanti-IL-15 é prevista para tratamento de lúpus eritematososistêmico.

Em modalidades específicas, um agente imunomodula-tório é administrado sozinho ou em combinação com CTLA4-Ig eLEA29Y. Em uma modalidade, co-administração de um agente i-munomodulatório com CTLA4-Ig e LEA29Y é prevista para trata-mento de artrite reumatóide. Em uma modalidade, co-administração de um agente imunomodulatório com CTLA4-Ig eLEA29Y é prevista para tratamento de lúpus eritematoso sistêmico .

Em modalidades específicas, um agente imunomodula-tório é administrado sozinho ou em combinação com anticorpoanti-receptor de IL-6. Em uma modalidade, co-administraçãode um agente imunomodulatório com anticorpo anti-receptor deIL-6 é prevista para tratamento de artrite reumatóide. Emuma modalidade, co-administração de um agente imunomodulató-rio com anticorpo anti-receptor de IL-6 é prevista para tra-tamento de lúpus eritematoso sistêmico.

Em modalidades especificas, um agente imunomodula-tório é administrado sozinho ou em combinação com anticorpoanti-C5 (componente do complemento). Em uma modalidade, co-administração de um agente imunomodulatório com anticorpoanti-C5 é prevista para tratamento de artrite reumatóide. Emuma modalidade, co-administração de um agente imunomodulató-rio com anticorpo anti-C5 é prevista para tratamento de lú-pus eritematoso sistêmico.

Em modalidades especificas, um agente imunomodula- tório é administrado sozinho ou em combinação com inibidoresda cascata do complemento. Inibidores da cascata do comple-mento incluem, mas não estão limitados a, anticorpos anti-properdina (Gliatech); TP-IO, um receptor do complemento so-lúvel recombinante tipo I (AVANT Immunotheragenetics Inc.);Pexelizmab, um inibidor do C5 do complemento (Alexion Phar-maceuticals Inc.); e 5G1.1, um anticorpo monoclonal que pre-vine a clivagem do componente do complemento C5 em seus com-ponentes pró-inflamatórios. Em uma modalidade, co-administração de um agente imunomodulatório com inibidores da cascata do complemento é prevista para tratamento de in-flamação, artrite reumatóide e/ou lúpus eritematoso sistêmi-co .

Em outra modalidade, um agente imunomodulatório éadministrado em combinação com um agente quimioterapêutico.Agente quimioterapêuticos que podem ser administrado em com-binação com um agente imunomodulatório incluem, mas não es-tão limitados a, derivados de antibióticos (p. ex., doxorru-bicina, bleomicina, daunorrubicina e dactinomicina) ; anties-trógenos (p. ex., tamoxifeno); anti-metabólitos (p. ex.,fluoracil, 5-FU, metotrexato, floxuridina, interferon alfa-2b, ácido glutâmico, plicamicina, mercaptopurina e 6-tioguanina); agentes citotóxicos (p. ex., carmustina, BCNU,lomustina, CCNU, arabinosideo de citosina, ciclofosfamida,estramustina, hidroxiuréia, procarbazina, mitomicina, bus-sulfano, cis-platina e sulfato de vincristina); hormônios(p. ex., medroxiprogesterona, fosfato sódico de estramusti-na, etinil estradiol, estradiol, acetato de megestrol, me-tiltestosterona, difosfato de dietilestilbestrol, clorotria-niseno e testolactona); derivados de mostarda de nitrogênio(p. ex., mefalen, corambucil, mecloretamina (mostarda de ni-trogênio) e tiotepa); esteróides e combinações (p. ex., fos-fato de betametasona sódica); e outros (p. ex., dicarbazina,asparaginase, mitotano, sulfato de vincristina, sulfato devinblastina e etoposideo).

Em uma modalidade especifica, um agente imunomodu-latório é administrado em combinação com CHOP (ciclofosfami-da, doxorrubicina, vincristina e prednisona) ou combinaçãode um ou mais dos componentes de CHOP. Em uma modalidade, umagente imunomodulatório é administrado em combinação com an-ticorpos anti-CD20, tal como anticorpos anti-CD20 monoclo-nais humanos. Em outra modalidade, um agente imunomodulató-rio é administrado em combinação com anticorpos anti-CD20 eCHOP, ou anticorpos anti-CD20 e qualquer combinação de um oumais dos componentes de CHOP, particularmente ciclofosfamidae/ou prednisona. Em uma modalidade especifica, um agente i- munomodulatório é administrado em combinação com Rituximab.Em uma modalidade adicional, um agente imunomodulatório éadministrado em combinação com Rituximab e CHOP, ou Rituxi-mab e qualquer combinação de um ou mais dos componentes deCHOP, particularmente ciclofosfamida e/ou prednisona. Em uma modalidade especifica, um agente imunomodulatório é adminis-trado em combinação com tositumomab (anticorpo anti-CD20 daCoulter Pharmaceuticals, San Francisco, CA). Em uma modali-dade adicional, um agente imunomodulatório é administradocom tositumomab e CHOP, ou tositumomab e qualquer combinaçãode um ou mais dos componentes de CHOP, particularmente ci-clofosf amida e/ou prednisona. Tositumomab pode opcionalmenteestar associado com 1311. Os anticorpos anti-CD20 podem op-cionalmente estarem associados com pró-fármacos citotóxicos,toxinas ou radioisótopos.

Em outra modalidade especifica, um agente imunomo-dulatório é administrado em combinação com Zevalin™. Em umamodalidade adicional, um agente imunomodulatório é adminis-trado com Zevalin™ e CHOP, ou Zevalin™ e qualquer combinaçãode um ou mais dos componentes de CHOP, particularmente ci- clofosfamida e/ou prednisona. Zevalin™ pode estar associadocom um ou mais radioisótopos. Isótopos particularmente pre-feridos são 90Y e 111In.

Em modalidades adicionais, um agente imunomodula-tório é administrado em combinação com Rituximab (Rituxanlm)e/ou Ibritumomab Tiuxetan (Zevalin™, p. ex., (In-Ill) Ibritu-momab Tiuxetan ou (Y-90) Ibritumomab Tiuxetan) . Em uma moda-lidade especifica, um agente imunomodulatório é administradoem combinação com Rituximab e/ou Ibritumomab Tiuxetan para otratamento de Iinfoma não Hodgkin.

Em modalidades especificas, um agente imunomodula-tório é administrado como um tratamento crônico que é suple-mentado com administração de anti-CD20 após rubor de doença, p. ex., após um rubor de lúpus.

Em modalidades adicionais, um agente imunomodula-tório é administrado em combinação com medilato de imatinib(Gleevec®: metanossulfonato de 4-[(4-metil-l-piperazinil)metil]-N-[4-metil-3- [ [4-(3-piridinil)-2-pirimidinil]amino]-fenil]benzamida).

Em modalidades adicionais, um agente imunomodula-tório é administrado em combinação com bortezomib (Velcade™ácido [(IR)-3-metil-l-[[(2S)-l-oxo-3-fenil-2-[(pirazinilcarbonil)amino]propil]amino]butil]borônico.

Em modalidades adicionais, um agente imunomodula-tório é administrado em combinação com alemtuzumab (Campa-th®) .

Em modalidades adicionais, um agente imunomodula-tório é administrado em combinação com fosfato de fludarabi-na (Fludara®: 9H-purin-6-amino,2-flúor-9-(5-0-fosfono-p-D-arabinofuranosil)(2-flúor-ara-AMP)).

Um agente imunomodulatório pode ser administradoem combinação com um ou mais agentes terapêuticos úteis notratamento de mieloma múltiplo incluindo, mas não limitandoa, agentes alquilantes, antraciclinas, carmustina (DTI-015,BCNU, BiCNU, Gliadel Wafer(D) , ciclofosfamida (Cytoxan®, Neo-sar®, CTX), dexametasona (Decadron®), doxorrubicina (Adri-amycin®, Doxil®, Rubex®), melfalan (L-PAM, Alkeran®, mostar-da de fenilalanina), prednisona, talidomida e vincristina(Oncovorin®, Onco TCS®, VCR, leurocristine®).

Combinações preferidas de agentes terapêuticos ú-teis no tratamento de mieloma múltiplo que podem ser admi-nistradas em combinação com um agente imunomodulatório in-cluem, mas não estão limitadas a, ciclofosfamida + predniso-na, melfalan + prednisona (MP), vincristina + Adriamycin® +dexametasona (VAD), vincristina + carmustina + melfalan +ciclofosfamida + prednisona (VBMCP; o protocolo M2) e vin-cristina + melfalan + ciclofosfamida + prednisona alternandocom vincristina + carmustina + doxorrubicina + prednisona(VMCP/VBAP).

Um agente imunomodulatório pode ser administradoem combinação com um ou mais agentes terapêuticos úteis notratamento de linfoma não Hodgkin incluindo, mas não limi-tando a, 2-clorodesoxiadenosina, amifostina (Ethyol®, Ethio-fost®, WR-272), bexaroteno (Targretin®, Targretin gel®, Tar-gretin oral®, LGD1069) bleomicina (Blenoxano®) , bussulfano(Busulfex®, Myleran®), carboplatina (Paraplatin®, CBDCA),carmustina (DTI-015, BCNU, BiCNU, Gliadel Wafer®), clorambu-cil (Leukeran®), cisplatina (Platinol®, CDDP), cladribina(2-CdA, Leustatin®), ciclofosfamida (Cytoxan®, Neosar®,CTX), citarabina (Cytosar-U®, ara-C, arabinosideo de citosi-na, DepoCyt®) , dacarbazina (DTC), daunorrubicina (daunomici-na, DaunoXome®, Daunorubicin®, Cerubidine®), Denileukin dif-titox (Ontak®), dexametasona (Decadron®), mesilato de dolae-tron (Anzemet®), doxorrubicina (Adriamycin®, Doxil®, Ru- bex®), Eritropoetina (EPO®, Epogen®, Procrit®) , fosfato deetoposideo (EtopophosEtopophos®), etoposideo (VP-16), Vepe-sid®), fludarabina (Fludara®, FAMP), Granisetron (Kytril®) ,hidrocortisona, idarrubicina (Idamycin®, DMDR, IDA), ifosfa-mida (IFEX®), interferon alfa (Alfaferone®, Alpha-IF®) , in-terferon alfa 2a (Intron A®), mecloretamina (mustarda de ni-tro, HN2, Mustargen®) , melfalan (L-PAM, Alkeran®, mustardade fenilalanina), Methotrexate® (MTX, Mexate®, Folex®), me-tilprednisolona (Solumedrol®), mitoxantrona (Novantrone®,DHAD), ondansetron (Zofran®) , pentostatina (Nipent®, 2- desoxicoformicina), perfosfamida (4-hidroperoxiciclofosfamida, 4HC), prednisona, procarbazina(Matulane®), Rituximab® (Rituxan®, Mab anti-CD20), tiotepa(trietilenotiofosforamida, Thioplex®), topotecano (Hycam-tin®, SK&F-1048 64, NSC-609699, Evotopin®), vinblastina (Vel-ban, VLB), vincristina (Oncovin®, Onco TCS®, VCR, Leurocris-tine®) e vindesina (Eldisine®, Fildesin®).

Combinações preferidas de agentes terapêuticos ú-teis no tratamento de linfoma não Hodgkin que podem ser ad-ministradas em combinação com um agente imunomodulatório in- cluem, mas não estão limitadas a, Adriamycin® + blenoxano +vinblastina + dacarbazina (ABVD), terapia anti-idiotipo(BsAb) + interferon alfa, terapia anti-idiotipo (BsAb) +clorambucil, terapia anti-idiotipo (BsAb) + interleucina-2,BCNU (carmustina) + etoposideo + Ara-C (citarabina) + melfa-Ieno (BEAM), bleomicina + etoposideo + adriamicina + ciclo-fosfamida + vincristina + procarbazina + prednisona(BEACOPP), briostatina + vincristina, ciclofosfamida + BCNU(carmustina) + VP-16 (etoposideo) (CBV), ciclofosfamida +vincristina + prednisona (CVP), ciclofosfamida + Adriamycin®(hidroxildaunomicina) + vincristina (Oncovorin) + prednisona(CHOP), ciclofosfamida + Novantrone® (mitoxantrona) + vin-cristina (Oncovorin) + prednisona (CNOP), ciclofosfamida + doxorrubicina + teniposideo + prednisona, ciclofosfamida +Adriamycin® (hidroxildaunomicina) + vincristina (Oncovorin)+ prednisona + Rituximab (CHOP + Rituximab) , ciclofosfamida+ doxorrubicina + teniposideo + prednisona + interferon al-fa, citarabina + bleomicina + vincristina + metotrexato (Cy-taBOM), dexametasona + citarabina + cisplatina (DHAP), dexa-metasona + ifosfamida + cisplatina + etoposideo (DICE), do-xorrubicina + vinblastina + mecloretamina + vincristina +bleomicina + etoposideo + prednisona (Stanford V), etoposi-deo + vinblastina + adriamicina (EVA), etoposideo + metil-prednisona + citarabina + cisplatina (ESHAP), etoposideo +prednisona + ifosfamida + cisplatina (EPIC), fludarabina,mitoxantrona + dexametasona (FMD), fludarabina, dexametaso-na, citarabina (ara-C), + cisplatina (Platinol®) (FluDAP),ifosfamida + cisplatina + etoposideo (ICE), mecloretamina +Oncovin® (vincristina) + procarbazina + prednisona (MOPP),mesna + ifosfamida + idarrubicina + etoposideo (MIZE), meto-trexato com recuperação de leucovirina + bleomicina + adria-micina + ciclofosfamida + oncovorin + dexametasona (m-BACOD), prednisona + metotrexato + adriamicina + ciclofosfa-mida + etoposideo (ProMACE), tiotepa + bussulfano + ciclo-fosfamida, tiotepa + bussulfano + melfalan, topotecano + pa-clitaxel e vincristina (Oncovin® + Adriamycin® + dexametaso-na (VAD).

Exemplos adicionais de agentes terapêuticos úteisno tratamento de linfoma não Hodgkin que podem ser adminis-trados em combinação com um agente imunomodulatório incluem,mas não estão limitados a, A007 (4-4'-diidroxibenzofenono- 2,4-dinitrofenilidrazona), AG-2034 (AG-2024, AG-2032, inibi-dor de GARFT [transformilase de glicinamida ribonucleosí-deo]), aldesleucina (IL-2, Proleukin®), Alemtuzumab (Campa-th®) , alitretinoina (Panretin®, LGN-1057), altretamina (He-xalen®, hexametilmelamina, Hexastat®), aminocamptotecina (9- AC, 9-aminocamptotecina, NSC 603071), Mab antiCD19/CD3 (scFvanti-CDl9/CD3, Mab anti-NHL), terapia anti-idiotipo (BsAb),arabinosilguanina (ara-G, GW506U78), trióxido arsênico (Tri-senox®, ATO), B43-genisteina (conjugado Ac anti-CD19/genisteina), conjugados de anticorpo B7, betatina (Be- ta-LT), antagonistas de BlyS, briostatina-1 (Bryostatin®,BMY-45618, NSC-339555), CHML (lipideos moleculares heterogê-neos citotrópicos), clofarabina (cloro-flúor-araA) , daclizu-mab (Zenapax®), depsipeptideo (FR901228, FK228), dolastati-na-10 (DOLA-IO, NSC-376128), Epirrubicina (Ellence®, EPI, 4' epi-doxorrubicina), Epratuzumab (Lymphocide®, anti-CD22 hu-manizado, HAT), ligante Fly3/flk2 (Mobista®) , G3139 (Gena-sense®, GentaAnticode®, anti-sentido de Bcl-2), HulDlO (Mabanti-HLA-DR, SMART 1D10), HumaLYM (Mab anti-CD20), Ibritumo-mab tiutexan (Zevalin®), interferon gama (Gama-interferon,Gamma 100®, Gama-IF), irinotecano (Camptosar®, CPT-Il, Topo-tecin®, CaptoCPT-I), ISIS-2053, ISIS-3521 (anti-sentido dePKC-alfa), imunotoxina Lmb-2 (toxina imune recombinante an- ti-CD25, anti-Tac(Fv)-PE38), Leuvectin® (citofectina + gengede IL-2, terapia gênica de IL-2), Lym-I (131-LLYM-l) , vacinapara linfoma (Genitope), nelarabina (composto 506, U78),compostos de neugeno (Oncomyc-NG®, Resten-NG®, anti-sentidode myc), scFv NovoMAb-G2 (IgM de NovoMAb-G2), 06- benzilguanina (BG, Procept®), Oxaliplatina (Eloxatine®, Elo-xatin®) , paclitaxel (Paxene®, Taxol®), paclitaxel-DHA (Taxo-prexin®), peldesina (BCX-34, inibidor de PNP), rebecamicinae análogos de rebecamicina, SCH-66336, sobuzoxano (MST-16,Perazolin®) , SU5416 (Semaxanib®, inibidor de VEGF), TER-286, talidomida, TNP-470 (AGM-1470), tositumomab (Bexxar®), vals-podar (PSC 833), vaxid (vacina de DNA para linfoma de célulaΒ) , vinorelbina (Navelbine®), WFlO (regulador de macrófago)e XR-9576 (XR-9351, P-inibidor de MDR/glicoproteína) .

Um agente imunomodulatório pode ser administrado em combinação com um ou. mais agentes terapêuticos úteis notratamento de leucemia linfocitica aguda incluindo, mas nãolimitando a, ansacrina, carboplatina (Paraplatin®, CBDCA),carmustina (DTI-015, BCNU, BiCNU, Gliadel Wafer®), colecali-ferol, ciclofosfamida (Cytoxan®, Neosar®, CTX), citarabina (Cytosar-U®, ara-C, arabinosideo de citosina, DepoCyt®),daunorrubicina (daunomicina, DamoXome®, Daunorubicin®, Ceru-bidine®), dexametasona (Decadron®), doxorrubicina (Adriamy-cin®, Doxil®, Rubex®), etoposideo (VP-16, Vepesid®), Fil-grastam® (Neupogen®, G-CSF, Leukine®), fludarabina (Fluda-ra®, FAMP), idarrubicina (Idamycin®, DMDR, IDA), ifosfamida(IFEX®), mesilato de imatinib (STI-571, Imatinib®, Glivec®,Gleevec®, inibidor de tirosina quinase Abi), interferon gama(Gama-interferon, Gamma 100®, Gama-IF), L-asparaginase (Els-par®, Crastinin®, Asparaginase medac®, Kidrolase®), mercap-topurina (6-mercaptopurina, 6-MP), Methotrexate® (MTX, Mexa-tec®, Folex®), mitoxantrona (Novantrone®, DHAD), Pegasparga-se® (Oncospar®), prednisona, ácido retinóico, teniposideo(VM-26, Vumon®), tioguanina (6-tioguanina, 6-TG), topotecano(Hycamtin®, SK&F-104864, NSC-609699, Evotopin®), tretinoina(Retin-A®, Atragen®, ATRA, Vesanoid®) e vincristina (Oncovorin®, Onco TCS®, VCR, Leurocristine®).

Exemplos adicionais de agentes terapêuticos úteisno tratamento de leucemia linfocitica aguda que podem seradministrados em combinação com um agente imunomodulatórioincluem, mas não estão limitados a, Aminocamptotecina (9-AC,9-aminocamptotecina, NSC 603071), aminopterina, anamicina(AR-522, anamicina LF, Aronex®), arabinosilguanina (Ara-G,GW506U78, Nelzarabine®), trióxido arsênico (Trisenox®, ATO,Atrivex®), B43-genisteína (conjugado de Ac anti-CD19/genisteína), B4 3-PAP (conjugado de Ac anti-CD19/proteína antiviral de caruru-de-cacho), cordicepina,CS-682, decitabina (5-aza-2'-desoxiitidina), dolastin-10(DOLA-IO, NSC-37 6128), G3139 (Genasense®, GentaAnticode®,anti-sentido de Bcl-2), irofulveno (MGI-114, ivofulvano, a-nálogo de acilfulveno), MS-209, fenilbutirato, quinina, TNP-470 (AGM-1470, fumagilina), trimetrexato (Neutrexin®), tro-xacitabina (BCH-204, BCH-4556, Troxatyl(D) , UCN-Ol (7-hidroxiestaurosporina), WHI-P131 e vacina WTl.

Combinações preferidas de agentes terapêuticos ú-teis no tratamento de leucemia linfocítica aguda que podemser administradas em combinação com um agente imunomodulató-rio incluem, mas não estão limitadas a, carboplatina + mito-xantrona, carmustina) + ciclofosfamida + etoposideo, citara-bina + daunorrubicina, citarabina + doxorrubicina, citarabi-na + idarrubicina, citarabina + interferon gama, citarabina + L-asparaginase, citarabina + mitoxantrona, citarabina +fludarabina e mitoxantrona, etoposideo + citarabina, etopo-sideo + ifosfamida, etoposideo + mitoxantrona, ifosfamida +etoposideo + mitoxantrona, ifosfamida + teniposideo, meto-trexato + mercaptopurina, metotrexato + mercaptopurina + vincristina + prednisona, fenilbutirato + citarabina, fenil-butirato + etoposideo, fenilbutirato + topotecano, fenilbu-tirato + tretinoína, quinino + doxorrubicina, quinino + mi-toxantrona + citarabina, tioguanina + citarabina + ansacri-na, tioguanina + etoposideo + idarrubicina, tioguanina + á- cido retinóico + colecalerol, vincristina + prednisona, vin-cristina + prednisona e L-asparaginase, vincristina + dexa-metasona/prednisona + asparaginase + daunorrubicina/ doxor-rubicina, vincristina + dexametasona/prednisona + asparagi-nase + daunorrubicina/doxorrubicina + ciclofosfamida + meto-trexato e vincristina + dexametasona/prednisona + asparagi-nase + daunorrubicina/doxorrubicina + ciclofosfamida + meto-trexato + filgrastina.

Um agente imunomodulatório pode ser administradoem combinação com um ou mais agentes terapêuticos úteis notratamento de leucemia linfocitica crônica incluindo, masnão limitando a, clorambucil (Leukeran®), cladribina (2-CdA,Leustatin®), ciclofosfamida (Cytoxan®, Neosar®, CTX), cita-rabina (Cytosar-U®, ara-C, arabinosideo de citosina, De-poCyt®, octofosfato de citarabina, ara-CMP), doxorrubicina(Adriamycin®, Doxil®, Rubex®), fludarabina (Fludara®, FAMP) ,pentostatina (Nipent®, 2-desoxicoformicina), prednisona evincristina (Oncovorin®, Onco TCS®, VCR, Leurocristine®).

Exemplos adicionais de agentes terapêuticos úteisno tratamento de leucemia linfocitica crônica que podem seradministrados em combinação com um agente imunomodulatórioincluem, mas não estão limitados a, alemuzumab (Campath®),Aminocamptotecina (9-AC, 9-aminocamptotecina, NSC 603071),aminopterina, anamicina (AR-522, anamicina LF, Aronex®), a-rabinosilguanina (Ara-G, GW506U78, Nelzarabine®), trióxidoarsênico (Trisenox®, ATO, Atrivex®), briostatina-1 (Bryosta-tin®, BMY-45618, NSC-339555), CS-682, dolastin-10 (DOLA-IO,NSC-376128), filgrastina (Neupogen®, G-CSF, leucina), flavo-piridol (NSC-649890, HMR-1275), G3139 (Genasense®, GentaAn-ticode®, anti-sentido de Bcl-2), irofulveno (MGI-114, ivo-fulvano, análogo de acilfulveno), MS-209, fenilbutirato, Ri-tuximab® (Rituxan®, MAb anti-CD20), talidomida, teofilina,TNP-470 (AGM-1470, fumagilina) , UCN-Ol (7-hidroxiestaurosporina) e WHI-P131.

Combinações preferidas de agentes terapêuticos ú-teis no tratamento de leucemia linfocitica crônica que podemser administradas em combinação com um agente imunomodulató-rio incluem, mas não estão limitadas a, fludarabina + pred-nisona e ciclofosfamida + doxorrubicina + vincristina +prednisona (CHOP).

Em uma modalidade adicional, um agente imunomodu-latório é administrado em combinação com citocinas. Citoci-nas que podem ser administradas com um agente imunomodulató-rio incluem, mas não estão limitadas a, GM-CSF, G-CSF, IL2,IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL10, IL12, IL13, IL15, anti-CD40,CD40L, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, TNF-alfa e TNF-beta. Emoutra modalidade, um agente imunomodulatório pode ser admi-nistrado com qualquer interleucina, incluindo, mas não limi-tando a, IL-Ialfa, IL-lbeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6,IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL12, IL13, IL-14, IL15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21 e IL-22. Em modalida-des preferidas, um agente imunomodulatório é administrado emcombinação com IL-4 e IL-10. Foi observado pelos inventoresque tanto IL4 como ILlO acentuam a proliferação de célula Bmediada por neutrocina-alfa.

In vitro, foi observado pelos inventores que IFNgama e IL-10, cada uma, acentuam expressão de superfície ce-lular de neutrocina-alfa em monócitos e macrófagos (macrófa-gos foram obtidos cultivando monócitos primários com 20ng/mLde M-CSF por 12-15 dias), enquanto tratamento com IL-4.dimi-nuiu a expressão de superfície celular de neutrocina-alfa emmonócitos e macrófagos. IL-4 administrada com IL-10 resultouem uma inibição completa da expressão de superfície celularde neutrocina-alfa induzida por IL-10. IL-4 administrada comIFN-gama resultou em expressão de superfície celular de neu-trocina-alfa aumentada. Tratamento de macrófagos com IFN-gama e IL-IO resultou em um aumento de 3 vezes de neutroci-na-alfa solúvel (ativa) liberada no meio de cultura compara-dos com macrófagos não tratados.

Em uma modalidade adicional, um agente imunomodu-latório é administrado com uma quimiocina. Em outra modali-dade, um agente imunomodulatório é administrado com quimio-cina beta-8, quimiocina beta-1 e/ou proteína inflamatória demacrófago 4. Em uma modalidade preferida, uma agente imuno-modulatório é administrado com quimiocina beta-8.

Em uma modalidade adicional, um agente imunomodu-latório é administrado em combinação com um antagonista deIL-4. Antagonistas de IL-4 que podem ser administrados comum um agente imunomodulatório incluem, mas não estão limita-dos a, : polipeptideos receptores de IL-4 solúvel, formasmultiméricas de polipeptídeos receptores de IL-4 solúvel;anticorpos anti-receptor de IL-4 que se ligam ao receptor deIL-4 sem transduzir o sinal biológico elicitado por IL-4,anticorpos anti-IL-4 que bloqueiam a ligação de IL-4 a um oumais receptores de IL-4 e muteínas de IL-4 que se ligam areceptores de IL-4, mas não transduzem o sinal biológico e-licitado por IL-4. De preferência, os anticorpos empregadosde acordo com este método são anticorpos monoclonais (inclu-indo fragmentos de anticorpo, tal como, por exemplo, aquelesdescritos aqui).

Em uma modalidade adicional, um agente imunomodu-latório é administrado em combinação com fatores de cresci-mento hematopoéticos. Fatores de crescimento hematopoéticosque podem ser administrados com um agente imunomodulatórioincluem, mas não estão limitados a, LEUKINE™ (SARGRAMOSTIM™)E NEUPOGEN™ (FILGRASTIM™).

Em uma modalidade adicional, um agente imunomodu-latório é administrado em combinação com fatores de cresci-mento de fibroblastos. Fatores de crescimento de fibroblas-tos que podem ser administrados com um agente imunomodulató-rio incluem, mas não estão limitados a, FGF-If FGF-2, FGF-3,FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-IO, FGF-11,FGF-12, FGF-13, FGF-14 e FGF-15.

Em uma modalidade adicional, um agente imunomodu-latório é . administrado em combinação com um anti-hipertensivo. Anti-hipertensivos que podem ser administradoscom um agente imunomodulatório incluem, mas não estão Iimi-tados a, agentes bloqueadores de canal de cálcio, tal comonifedipina (ADALAT™, PROCARDIA™); vasodilatadores periféri-cos, tal como hidralazina (APRESOLINA™); agentes bloqueado-res beta-adrenérgicos, tal como propanolol (INDERAL™); blo-queadores alfa/beta adrenérgicos, tal como lebetolol(NORMODYNE™, TRANSDATE™); agentes que inibem a produção deangiotensina II, tal como captopril (CAPOTEN™); agentes queinibem diretamente a atividade de angiotensina IIf tal comolosartan (COZAAR™); e diuréticos de tiazida, tal como hidro-clorotiazida (HYDRODIURIL™, ESIDREX™).

Agentes imunomodulatórios podem ser administradossozinhos ou em combinação com adjuvantes. Adjuvantes que po-dem ser administrados com um agente imunomodulatório inclu-em, mas não estão limitados a, alum, alum mais desoxicolato(ImmunoAg), MTP-PE (Biocine Corp.), QS21 (Genentech, Inc.),BCG e MPL. Em uma modalidade especifica, um agente imunomo-dulatório é administrado em combinação com alum. Em outramodalidade especifica, um agente imunomodulatório é adminis-trado em combinação com QS-21. Adjuvantes adicionais que po-dem ser administrados com um agente imunomodulatório inclu-em, mas não estão limitados a, imunomodulador de lipideo mo-nofosforil, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, sais de a-luminio, MF-59 e tecnologia de adjuvante virossomal. Vacinasque podem ser administradas com um agente imunomodulatórioincluem, mas não estão limitados a, vacinas direcionadas aproteção contra MMR (sarampo, caxumba, rubéola), pólio, va-ricela, tétano/difteria, hepatite A, hepatite B, haemophilusinfluenzae B, coqueluche, pneumonia, gripe, doença de Lyme, rotavirus, cólera, febre amarela, encefalite japonesa, poli-omielite, raiva, febre tifóide e coqueluche e/ou PNEUM0VAX-23™. Em outra modalidade especifica, uma gente imunomodula-tório é usado em combinação com PNEUMOVAX-23™.

Em uma modalidade, um agente imunomodulatório é administrado em combinação com outro membro da família TNF.Moléculas de TNF, relacionadas a TNF ou semelhantes a TNFque podem ser administradas com um agente imunomodulatórioincluem, mas não estão limitadas a, formas solúveis de TNF-alfa, Iinfotoxina-alfa (LT-alfa, também conhecida como TNF- beta), LT-beta (encontrada em LT-alfa2-beta heterotrímerocomplexo), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-IBBL, DcR3,OX40L, TNF-gama (Publicação Internacional No. WO 96/14328),TRAIL/AIM-I (Publicação Internacional No. WO 97/33899),LIGHT/AIM-II (Publicação Internacional No. WO 97/34911),APRIL (J Exp Med 188(6): 1185-1190), endocina-alfa (Publica-ção Internacional No. WO 98/07880), FASTR/TR6 (PublicaçãoInternacional No. WO 98/30694), Osteoprotegrina (OPG) e neu-trocina-alfa (Publicação Internacional No. WO 98/18921, 0X40e fator de crescimento de nervo (NGF) e formas solúveis deFas, CD30, CD27, CD40 e 4-IBB, TR2 (Publicação InternacionalNo. WO 96/34095), DR3 (Publicação Internacional No. WO97/33904), TRAIL-Rl/DR4 (Publicação Internacional No. WO98/32856), TRAIL-R3, TR5 (Publicação Internacional No. WO98/30693), TR6 (Publicação Internacional No. WO 98/30694),TRAIL-R2/TR7 (Publicação Internacional No. WO 98/41629),TRANK, TR9 (Publicação Internacional No. WO 98/56892),TRAIL-R4/TRIO (Publicação Internacional No. WO 98/54202),312C2 (Publicação Internacional No. WO 98/06842), e TR12.

Em outra modalidade, um agente imunomodulatório éadministrado em combinação com um ou mais receptores de neu-trocina-alfa (p. ex., TACI, BCMA e BAFF-R) . Em modalidadespreferidas, o receptor de neutrocina-alfa é solúvel. Em ou-tras modalidades preferidas, o receptor de neutrocina-alfa éfusionado à região Fc de uma molécula de imunoglobulina talcomo a região Fc de uma molécula de IgG. Por exemplo, resí-duos de aminoácidos 1-154 de TACI (Acesso do GenBank númeroAAC51790), aminoácidos 1-48 de BCMA (Acesso do GenBank núme-ro NP_00118 3) ou aminoácidos 1 até 81 de BAFF-R (Acesso doGenBank número NP_443177) podem ser fusionados à região Fcde uma molécula de IgG e usados em combinação com outro a-gente imunomodulatório conhecido na técnica e/ou descritoaqui. Em outra modalidade, uma proteína BAFF-R-Fc que podeser administrada em combinação com um agente imunomodulató-rio são aminoácidos 1-70 de SEQ ID NO: 10 fusionados à regi-ão Fc de uma molécula de imunoglobulina de IgGl. Opcional-mente, o aminoácido 20 (valina) em BAFF-R é substituído porasparagina e o aminoácido 27 (Ieucina) em BAFF-R é substitu-ído por prolina.

Em uma modalidade preferida, um agente imunomodu-latório é administrado em combinação com anticorpos anti-CD40L e/ou anticorpos anti-CD40.

Em uma modalidade adicional, um agente imunomodu-latório é administrado sozinho ou em combinação com agen-te (s) anti-angiogênico(s). Agentes anti-angiogênicos que po-dem ser administrados com um agente imunomodulatório inclu-em, mas não estão limitados a, Angiostatina (Entremed, Rock-ville, MD) , troponina-1 (Boston Life Sciences, Boston, MA) ,fator anti-invasivo, ácido retinóico e derivados deste, pa-clitaxel (Taxol), suramina, inibidor tecidual de metalopro-teinase-1, inibidor tecidual de metaloproteinase-2, VEGI,inibidor-1 de ativador de plasminogênio, inibidor-2 de ati-vador de plasminogênio, e várias formas dos metais de tran-sição do "grupo d" lighter.

Metais de transição do "grupo d" lighter incluem,por exemplo, espécies de vanádio, molibdênio, tungstênio,titânio, nióbio e tântalo. Tais espécies de metais de tran-sição podem formar complexos de metal de transição. Comple-xos adequados das espécies de metal de transição acima men-cionadas incluem complexos de metais de transição oxo.Exemplos representativos de complexos de vanádioincluem complexos de oxo vanádio tal como complexos de vana-dato e vanadil. Complexos de vanadato adequados incluem com-plexos de metavanadato e ortovanadato tal como, por exemplo,metavanadato de amônio, metavanadato de sódio e ortovanadatode sódio. Complexos de vanadil adequados incluem, por exem-plo, acetilaceonato de vanadil e sulfato de vanadil incluin-do hidratos de sulfato de vanadil tal como sulfato de vana-dil mono- e triidratados.

Exemplos representativos de complexos de tungstê-nio e molibdênio também incluem complexos oxo. Complexos deoxo tungstênio adequados incluem complexos de óxido detungstênio e tungstato. Complexos de tungstato adequados in-cluem tungstato de amônio, tungstato de cálcio, tungstato desódio diidratado e ácido túngstico. Óxidos de tungstênio a-dequados incluem óxido tungstênio (IV) e óxido de tungstênio(VI). Complexos de molibdênio oxo adequados incluem comple-xos de molibdato, óxido de molibdênio e molibdenil. Comple-xos de molibdato adequados incluem molibdato de amônio eseus hidratos, molibdato de sódio e seus hidratos e molibda-to de potássio e seus hidratos. Óxidos de molibdênio adequa-dos incluem óxido de molibdênio (VI), óxido de molibdênio(VI) e ácido molibdico. Complexos de molibdenil adequadosincluem, por exemplo, acetilacetonato de molibdenil. Outroscomplexos de tungstênio e molibdênio adequados incluem hi-droxo derivados de, por exemplo, glicerol, ácido tartárico e açúcares.

Uma ampla variedade de outros fatores anti-angiogênicos também pode ser utilizada dentro do contexto dapresente invenção. Exemplos representativos incluem, mas nãoestão limitados a, fator de plaquetas 4; sulfato de protami-na; derivados de quitina sulfatada (preparados a partir deconchas de caranguejo rainha/queen crab), (Murata et al.,Câncer Res. 51: 22-26, 1991); complexo de peptidoglicano depolissacarideo sulfatado (SP-PG) (a função deste compostopode ser acentuada pela presença de esteróides tal como ci-trato de tamoxifeno e estrogênio); estaurosporina; modulado-res de metabolismo de matriz, incluindo, por exemplo, análo-gos de prolina, cisidroxiprolina, d,L-3,4-desidroprolina,tiaprolina, alfa,alfa-dipiridil, fumarato de aminopropioni-trila; 4-propil-5-(4-piridinil)-2(3H)-oxazolona; metotrexa-to; mitoxantrona; heparina; interferons; soro de macroglobu-Iina 2; ChIMP-3 (Pavloff et al., J Bio Chem 267: 17321-17326, 1992); quimiostatina (Tomkinson et al., Biochem J286: 475-480, 1992); tetradecassulfato de ciclodextrina; e-ponemicina; camptotecina; fumagilina (Ingber et al. , Nature348: 555-557, 1990); tiomalato de sódio e ouro ("GST"; Mat-subara e Ziff, J Clin Invest 79: 1440-1446, 1987); soro deanticolagenase; alfa2-antiplasmina (Holmes et al., J BiolChem 262(4): 1659-1664, 1987); bisantreno (National CâncerInstitute); ácido lobenzarit dissódico (N-(2)-carboxifenil-4-cloroantroníIico ou "CCA"; (Takeuchi et al., Agents Acti-ons 36: 312-316, 1992); e inibidores de metaloproteinase talcomo BB94.

Fatores anti-angiogênicos adicionais que tambémpodem ser utilizados no contexto da presente invenção inclu-em talidomida (Celgene, Warren, NJ); esteróide angiostático;AGM-1470 (H. Brem e J. Folkman J Pediatr Surg 28: 445-51(1993)); um antagonista de integrina alfa ν beta 3 (C. Stor-gard et al., J Clin Invest 103: 47-54 (1999)); carboxinami-nolmidazol; carboxiamidotriazol (CAI) (Instituto Nacional deCâncer, Bethesda, MD) ; conbretastina A-4 (CA4P) (OXIGENE,Boston, MA) ; esqualamina (Magainin Pharmaceuticals, PlymouthMeeting, PA); TNP-470, (Tap Pharmaceuticals, Deerfield, IL);ZD-OlOl AstraZeneea (London, UK); para (CT2584); benefina,briostatina-1 (SC339555); CGP-41251 (PKC 412); CM101; dexra-zoxano (ICRF187); DMXAA; endostatina; flavopridiol; geneste-ina; GTE; inter; iressa (ZD1839); oetreotideo (somatostai-na) ; panretina; penaeilamina; fotoponto; PI-88; prinomastat(AG-3340) purlitin; suradista (FCE26644); tamoxifeno (Nolva-dex); tazaroteno; tetratiomolibdato; xeloda (eapeeitabina) e5-fluoruracil.

Agentes anti-angiogênicos que podem ser adminis-trados em combinação com um agente imunomodulatório podemtrabalhar através de uma variedade de mecanismos incluindo, mas não limitando a, inibindo proteólise da matriz extrace-lular, bloqueando a função de moléculas de adesão de matrizextracelular endotelial, antagonizando a função de indutoresde angiogênese tal como fatores de crescimento e inibindoreceptores de integrina expressos em células endoteliaisproliferantes. Exemplos de inibidores anti-angiogênicos queinterferem com proteólise de matriz extracelular e que podemser administrados em combinação com um agente imunomodulató-rio incluem, mas não estão limitados a, AG-3340 (Agouron, LaJolla, CA), BAY-12-9566 (Bayer, West Haven, CT), BMS-275291(Bristol Myers Squibb, Princeton, NJ), CGS-27032A (Novartis,Bast Hanover, NJ) , marinastat (British Biotech, Oxford, UK)e metastat (Aeterna, St-Foy, Quebec). Exemplos de inibidoresanti-angiogênicos que agem bloqueando a função de moléculasde adesão de matriz extracelular endotelial e que podem seradministradas em combinação com um agente imunomodulatórioincluem, mas não estão limitados a, EMD-121974 (Merck KcgaADarmstadt, Germany) e vitaxina (Ixsys, La Jolla,CA/Medimmune, Gaithersburg, MD) . Exemplos de inibidores an-ti-angiogênicos que agem antagonizando diretamente ou ini-bindo indutores de angiogênese e que podem ser administradasem combinação com um agente imunomodulatório incluem, masnão estão limitados a, angiozima (Ribozyme, Boulder, CO) ,anticorpo anti-VEGF (Genentech, S. San Francisco, CA), PTK-7 87/ZK-22584 6 (Novartis, Basel, Switzerlan) , SU-IOl (Sugen,S. San Francisco, CA), SU-5416 (Sugen/ Pharmacia Upjohn,Bridgewater, NJ) e SU-6668 (Sugen). Outros agentes anti-angiogênicos agem para inibir indiretamente a angiogênese.Exemplos de inibidores indiretos de angiogênese que podemser administrados em combinação com um agente imunomodulató-rio incluem, mas não estão limitados a, IM-862 (Cytran, Kir-kland, WA), interferon-alfa, IL-12 (Roche, Nutley, NJ) e po-lissulfato de pentosano (Georgetown University, Washington,DC).

Em modalidades particulares, o uso de um agenteimunomodulatório em combinação com agentes anti-angiogênicosé contemplado para o tratamento, prevenção e/ou melhora deuma doença auto-imune, tal como, por exemplo, uma doença au-to-imune aqui descrita.

Em uma modalidade particular, o uso de um agenteimunomodulatório em combinação com um agente anti- angiogênico é contemplado para o tratamento, prevenção e/oumelhora de artrite. Em uma modalidade particular, o uso deum agente imunomodulatório em combinação com um agente anti-angiogênico é contemplado para o tratamento, prevenção e/oumelhora de artrite reumatóide.

Em outra modalidade, um agente imunomodulatório éadministrado em combinação com um anti-coagulante. Anti-coagulantes que podem ser administrados com um agente imuno-modulatório incluem, mas não estão limitados a, heparina,varfarina e aspirina. Em uma modalidade especifica, um agen- te imunomodulatório é administrado em combinação com hepari-na e/ou varfarina. Em outra modalidade especifica, um agenteimunomodulatório é administrado em combinação com varfarina.Em outra modalidade especifica, um agente imunomodulatório éadministrado em combinação com varfarina e aspirina. Em umamodalidade especifica, um agente imunomodulatório é adminis-trado em combinação com heparina. Em uma modalidade especi-fica, um agente imunomodulatório é administrado em combina-ção com heparina e aspirina.

Em outra modalidade, um agente imunomodulatório éadministrado em combinação com um agente que suprime a pro-dução de anticorpos anticardiolipina. Em uma modalidade es-pecifica, um agente imunomodulatório é administrado em com-binação com heparina. Em modalidades especificas, um agenteimunomodulatório é administrado em combinação com um agenteque bloqueia e/ou reduz a habilidade de anticorpos anticar-diolipina a se ligarem a proteína beta-2-glicoproteína I(b2GPI) de plasma que liga fosfolipideo.

Em certas modalidades, um agente imunomodulatórioé administrado em combinação com agentes anti-retrovirais,inibidores de transcriptase reversa nucleosídicos, inibido-res de transcriptase reversa não nucleosídicos e/ou inibido-res de protease. Inibidores de transcriptase reversa nucleo-sídicos que podem ser administrados em combinação com um a-gente imunomodulatório, incluem, mas não estão limitados a,RETROVIR™ (zidovudina/AZT), VIDEX™ (didanosina/ddl) , HIVIDm(zalcitabina/ddC), ZERIT™ (estavudina/d4T) , EPIVIR™ (lamivu-dina/3TC) e COMBIVIR™ (zidovudina/lamivudina). Inibidores de transcriptase reversa não nucleosídicos que podem ser admi-nistrados em combinação com um agente imunomodulatório, in-cluem, mas não estão limitados a, VIRAMUNE™ (nevirapina),RESCRIPTOR™ (delavirdina) e SUSTIVA™ (efavirenz). Inibidoresde protease que podem ser administrados em combinação com umagente imunomodulatório, incluem, mas não estão limitados a,CRIXIVAN™ (indinavir), NORVIR™ (ritonavir), INVIRASE™ (sa-quinavir) e VIRACEPT™ (nelfinavir).

Em certas modalidades, um agente imunomodulatórioé administrado em combinação com agentes anti-retrovirais,inibidores de transcriptase reversa nucleosídi-cos/nucleotídicos (NRTIs), inibidores de transcriptase re-versa não nucleosídicos (NNRTIs) e/ou inibidores de protease(Pis) . NRTIs que podem ser administrados em combinação comum agente imunomodulatório, incluem, mas não estão limitadosa, RETROVIR™ (zidovudina/AZT), VIDEX™ (didanosina/ddl) ,HIVID™ (zalcitabina/ddC), ZERIT™ (estavudina/d4T), EPIVIR™(lamivudina/3TC) e COMBIVIR™ (zidovudina/lamivudina) . NNRTIsque podem ser administrados em combinação com um agente imu-nomodulatório, incluem, mas não estão limitados a, VIRAMUNE™(nevirapina), RESCRIPTOR™ (delavirdina) e SUSTIVA™ (efavi-renz). Inibidores de protease que podem ser administrados emcombinação com um agente imunomodulatório, incluem, mas nãoestão limitados a, CRIXIVAN™ (indinavir), NORVIR™ (ritona-vir) , INVIRASE1" (saquinavir) e VIRACEPT™ (nelfinavir) .

NRTIs adicionais incluem LODENOSINE™ (F-ddA; umNRTI de adenosina estável a ácido; Triangle/Abbott);COVIRACIL™ (entricitabina/FTC; estruturalmente relacionado alamivudina (3TC), mas com atividade in vitro 3 até 10 vezesmaior; Triangle/Abbott); dOTC (BCH-10652, também estrutural-mente relacionado a lamivudina, mas retém atividade contrauma proporção considerável de isolados resistentes a lamivu-dina; Biochem Pharma); Adefovir (aprovação negada para tera-pia anti-HIV pelo FDA; Gilead Sciences); PREVE0N® (AdefovirDipivoxil, o pró-fármaco ativo de adefovir; sua forma ativaé PMEA-pp); TEN0F0VIR™ (bis-POC PMPA, um pró-fármaco dePMPA; Gilead); DAPD/DXG (metabólito ativo de DAPD; Trian-gle/Abbott) ; D-D4FC (relacionado a 3TC, com atividade contra virus resistente a AZT/3TC); GW420867X (Glaxo Wellcome);ZIAGEN™ (abacavir/159U8 9; Glaxo Wellcome Inc.); CS-87(3'azido-2',3'-didesoxiuridina; WO 99/66936); e formas depró-fármaco que portam S-acil-2-tioetil (SATE) de β-Ι,-Γ040 eβ-L-FddC (WO 98/17281).

NNRTIs adicionais incluem COACTINON™ (emiviridi-na/MKC-442, NNRTI potente da classe HEPT; Triangle/Abbott);

CAPRAVIRINE™ (AG-1549/S-l153, um NNRTI de próxima geraçãocom atividade contra virus contendo a mutação K103N; Agou-ron) ; PNU-142721 (tem atividade 20 até 50 vezes maior queseu predecessor delavirdina e é ativo contra mutantes K103N;Pharmacia & Upjohn); DPC-961 e DPC-963 (derivados de segundageração de efavirenz, desenhado para ser ativo contra viruscom a mutação K103N; DuPOnt); GW-420867X (tem atividade 25vezes maior que HBY097 e é ativo contra mutantes K103N; Gla-xo Wellcome); CALANOLÍDEO A (agente que ocorre naturalmentena árvores de látex; ativo contra virus contendo uma ou ou-tra ou ambas as mutações Y181C e K103N); e própolis (W099/49830).

Inibidores de protease adicionais incluemLOPINAVIR™ (ABT378/r; Abbott Laboratories); BMS-232632 (umazapeptídeo; Bristol-Myres Squibb); TIPRANAVIR™ (PNU-140690,uma diidropirona não peptídica; Pharmacia & Upjohn); PD- 178390 (uma diidropirona não peptídica; Parke-Davis); L-756.423 (um análogo de indinavir; Merck); DMP-450 (um com-posto de uréia cíclico; Avid & DuPont); AG-1776 (um peptido-mimético com atividade in vítro contra vírus resistentes ainibidor de protease; Agouron); VX-175/GW-433908 (pró-fármaco de fosfato de amprenavir; Vertex & Glaxo Wellcome);CGP61755 (Ciba) e AGENERASE (amprenavir; Glaxo WellcomeInc.).

Agentes anti-retrovirais incluem inibidores de fu-são/ligantes de gp41. Inibidores de fusão/ligante de gp41incluem T-20 (um peptideo dos resíduos 643-678 do ectodomí-nio da proteína transmembrana gp41 de HIV que se liga a gp41no seu estado relaxado e previne a transformação para o es- tado fusiogênico; Trimeris) e T-1249 (um inibidor de fusãode segunda geração; Trimeris).

Agentes anti-retrovirais adicionais incluem anta-gonistas de receptor de quimiocina/inibidores de fusão. An-tagonistas de receptor de quimiocina/inibidores de fusão in- cluem antagonistas de CXCR4 tal como AMD 3100 (um bicicla-mo), SDF-I e seus análogos e ALX40-4C (um peptideo catiôni-co) , T22 (um peptideo de 18 aminoácidos; Trimeris) e os aná-logos de T22 T134 e T140; antagonistas de CCR5 tal comoRANTES (9-68), AOP-RANTES, NNY-RANTES e TAK-779; e antago-nistas de CCR5/CXCR4 tal como NSC 651016 (uma análogo dedistamicina). Também são incluídos antagonistas de CCR2B,CCR3 e CCR6. Agonistas de receptor de quimiocina tais comoRANTES, SDF-I, MIP-Ιβ, etc., também'm podem inibir fusão.

Agentes anti-retrovirais adicionais incluem inibi-dores de integrase. Inibidores de integrase incluem ácidodicafeoilquínicos (DFQA), ácido L-quicórico (um ácido dica-feoiltartárico (DCTA)); quinalizarina e antraquinonas rela-cionadas; ZINTEVIR™ (AR 177, um oligonucleotídeo que prova-velmente age na superfície celular em vez de ser um inibidorde integrase verdadeiro; arondex); e naftóis tais como aque-les divulgados em WO 98/50347.

Agentes anti-retrovirais adicionais incluem com-postos semelhantes a hidroxiuréia tal como BCX-34 (um inibi-dor de purina nucleosídeo fosforilase; Biocryst); inibidoresde ribonucleotideo redutase tal como DIDOX™ (Molecules forHealth); inibidores de inosina monofosfato desidrogenase(IMPDH) tal como VX-497 (Vertex) e ácidos micofólicos talcomo CellCept (micofenolato mofetil; Roche).

Agentes anti-retrovirais adicionais incluem inibi-dores de integrase viral, inibidores de translocação nuclearde genoma viral tal como compostos de arilenobis(metilcetona); inibidores de entrada de HIV tal como AOP-RANTES, NNY-RANTES, proteína de fusão RANTES-IgG, complexossolúveis de RANTES e glicosaminoglicanas (GAG) e AMD-3100;inibidores de dedo de zinco de nucleocapsideo tal como com-postos de ditiano; alvos de Tat e Rev de HIV e fármaco-acentuadores tal como ABT-378.

Outras terapias anti-retrovirais e terapias adju-vantes incluem citocinas e linfocinas tais como MIP-Ioí, MIP-1β, SDF-la, IL-2, PROLEUKIN™ (aldesleucina/L2-7001; Chiron),IL-4, IL-8, IL-10, IL-12 e IL-13; interferons tal como IFN-a2a; antagonistas de TNFs, NfKB, GM-CSF, M-CSF e IL-10; a- gentes que modulam a ativação imune tal como ciclosporina eprednisona; vacinas tal como Remune™ (imunógeno de HIV), APL400-003 (Apollon), gpl20 recombinante e fragmentos, glico-proteína de envelope recombinante bivalente (B/E),rgpl20CM235, MN rgpl20, SF-2 rgpl20, complexo de CD4 solú-vel/gpl20, proteína delta JR-FL, peptídeo sintético ramifi-cado derivado de domínio de C3/C4 de gpl20 descontínuo, imu-nógenos competentes para fusão e vacinas para Gag, Pol, Nefe Tat; terapias baseadas em gene tal como elementos supres-sores genéticos (GSEs; WO 98/54366) , e intracinas (quimioci-nas CC geneticamente modificadas direcionadas ao RE parabloquear a expressão de superfície de CCR5 recém-sintetizado(Yang et al. , PNAS 94: 11567-72 (1997); Chen et al., Nat Med3: 1110-16 (1997)); anticorpos tais como o anticorpo anti-CXCR4 12G5, os anticorpos anti-CCR5 2D7, 5C7, PA8, PA9,PAIO, PAl1, PAl2 e PA14, os anticorpos anti-CD4 Q4120 e RPA-T4, o anticorpo anti-CCR3 7B11, os anticorpos anti-gpl2017b, 48d, 447-52D, 257-D, 268-D e 50.1, anticorpos anti-Tat,anticorpos anti-TNF-oí e anticorpo monoclonal 33A; agonistase antagonistas de receptor de hidrocarbonetos de arila (AH)tal como TCDD, 3,31,4,4',5-pentaclorobifenil, 3,3',4,4'-tetraclorobifenil e α-naftoflavona (WO 98/30213) e antioxi-dantes tal como éster etílico de γ-L-glutamil-L-cisteína (γ-GCE; WO 99/56764).

Em outras modalidades, um agente imunomodulatóriopode ser administrado em combinação com um agente anti-infecção oportunista. Agentes anti-oportunistas que podemser administrados em combinação com um agente imunomodulató-rio, incluem, mas não estão limitados a, TRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE™, DAPSONE™, PENTAMIDINE™, ATOVAQUONE™,ISONIAZID™, RIFAMPIN™, PYRAZINAMIDE™, ETHAMBUTOL™,RIFABUTIN™, CLARITHROMYCIN™, AZITHROMYCIN™, GANCICLOVIR™,FOSCARNET™, CIDOFOVIR™, FLÜCONAZOLE™, ITRACONAZOLE™,KETOCONAZOLE™, ACYCLOVIR™, FAMCICOLVIR™, PYRIMETHAMINE™,LEUCOVORIN™, NEUPOGEN™ (filgrastim/G-CSF) e LEUKINE™ (sar-gramostim/GM-CSF). Em uma modalidade específica, um agenteimunomodulatório é usado em qualquer combinação comTRIMETHOPRIM-SULFAMETHOXAZOLE™, DAPSONE™, PENTAMIDINE™ e/ouATOVAQUONE™ para diagnosticar, prevenir e/ou tratar profila-ticamente uma infecção oportunista de pneumonia por Pneu-mocystis carinii. Em outra modalidade especifica, um agenteimunomodulatório é usado em qualquer combinação comISONIAZID™, RIFAMPIN™, PYRAZINAMIDE™ e/ou ETHAMBUTOL™ paradiagnosticar, prevenir e/ou tratar profilaticamente uma in-fecção oportunista complexa por Mycobacterium avium. Em ou-tra modalidade especifica, um agente imunomodulatório é usa- do em qualquer combinação com RIFABUTIN™, CLARITHROMYCIN™e/ou AZITHROMYCIN™ para diagnosticar, prevenir e/ou tratarprofilaticamente uma infecção oportunista por Mycobacteriumtuberculosis. Em outra modalidade especifica, um agente imu-nomodulatório é usado em qualquer combinação com GANCICLOVIR™, FOSCARNET™ e/ou CID0F0VIR™ para diagnosticar,prevenir e/ou tratar profilaticamente uma infecção oportu-nista por citomegalovirus. Em outra modalidade especifica,um agente imunomodulatório é usado em qualquer combinaçãocom FLUC0NAZ0LE™, ITRAC0NAZ0LE™ e/ou KET0C0NAZ0LE™ para di-agnosticar, prevenir e/ou tratar profilaticamente uma infec-ção oportunista fúngica. Em outra modalidade especifica, umagente imunomodulatório é usado em qualquer combinação comACYCLOVIR™ e/ou FAMCIC0LVIR™ para diagnosticar, prevenire/ou tratar profilaticamente uma infecção oportunista porvirus herpes simplex tipo I- e/ou tipo II. Em outra modalida-de especifica, um agente imunomodulatório é usado em qual-quer combinação com PYRIMETHAMINE™ e/ou LEUC0V0RIN™ para di-agnosticar, prevenir e/ou tratar profilaticamente uma infec-ção oportunista por Toxoplasma gondii. Em outra modalidadeespecifica, um agente imunomodulatório é usado em qualquercombinação com LEUCOVORIN™ e/ou NEUPOGEN™ para diagnosticar,prevenir e/ou tratar profilaticamente uma infecção oportu-nista bacteriana.

Em uma modalidade adicional, um agente imunomodu-latório é administrado em combinação com um agente antivi-ral. Agentes antivirais que podem ser administrados com umagente imunomodulatório incluem, mas não estão limitados a,aciclovir, ribavirina, amantadina e remantidina.

Em uma modalidade adicional, um agente imunomodu-latório é administrado em combinação com um agente antibió-tico. Agente antibióticos que podem ser administrados com umagente imunomodulatório incluem, mas não estão limitados a, amoxicilina, aminoglicosideos, beta-lactamo (glicopeptideo) ,beta-lactamases, clindamicina, cloranfenicol, cefalospori-nas, ciprofloxacina, eritromicina, fluorquinolonas, macrolí-deos, metronidazol, penicilinas, quinolonas, rifampicina,estreptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, trimetoprim- sulfantoxazol e vancomicina.

Adicionalmente, um agente imunomodulatório podeser administrado sozinho ou em combinação com outros regimesterapêuticos, incluindo, mas não limitando a, terapia porradiação. Tal terapia combinatorial pode ser administrada seqüencialmente e/ou concomitantemente.

Kits

A invenção também provê um pacote ou kit farmacêu-tico compreendendo um ou mais recipientes preenchidos com umou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas. Op-cionalmente, um aviso está associado a tal(is) recipiente(s)na forma prescrita por uma agência governamental que regulaa fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou bio-lógicos, tal aviso reflete a aprovação pela agência de fa-bricação, uso ou venda para administração humana. Além dis-so, os polipeptideos da presente invenção podem ser emprega-dos em conjunto com outros compostos terapêuticos. Em umamodalidade especifica, o kit contém um aviso na forma pres- crita por uma agência governamental que regula a fabricação,uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, talaviso reflete a aprovação pela agência de fabricação, uso ouvenda para administração humana em pacientes que têm um ti-tulo de ANA maior que ou igual a 1:80 e/ou maior que ou i- gual a 30 UI de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma ou sorosangüíneo.

Exemplos

A invenção tendo sido geralmente descrita, a mesmaserá mais prontamente entendida com referência aos seguintesexemplos, que são providos para fins de ilustração e não sãodestinados a limitar.

Exemplo 1: Resumo de resultados de um ensaio clí-nico testando o uso de um anticorpo (belimumab) que neutra-liza a proteína neutrocina-alfa para tratar lúpus eritemato-so sistêmico (SLE).

Um ensaio prospectivo, aleatório, duplo-cego, con-trolado por placebo testou belimumab, um anticorpo que neu-traliza a proteína neutrocina-alfa, adicionado ao padrão deterapia de cuidado para SLE. Quatrocentos e quarenta e noveindivíduos com SLE por critérios ACR (Tan et al., ArthritisRheum. 25: 1271-7, (1982); e Hochberg et alArthritisRheum. 40: 1725 (1997)), com uma história de auto-anticorpos mensuráveis e pontuação SELENA SLEDAI ^4 na triagem foramavaliados.

0 agente em estudo (1, 4, 10 mg/kg de belimumab)ou placebo foi administrado intravenosamente nos dias 0, 14,28 então a cada 28 dias até 52 semanas. Indivíduos que com-pletaram o período de tratamento de 52 semanas tiveram a op-ção de continuar o estudo por um período de extensão de 24semanas. 0 belimumab foi formulado em 10 mM de citrato desódio, 1,9% de glicina, 0,5% de sacarose, 0,01% (p/v) de po-lissorbato 80, pH 6,5 (±0,3). Indivíduos recebendo dose pla- cebo receberam a formulação 10 mM de citrato de sódio, 1,9%de glicina, 0,5% de sacarose, 0,01% (p/v) de polissorbato80, pH 6,5 (±0,3) sem belimumab. A eficácia foi avaliada acada 1-2 meses por SELENA SLEDAI (SS) , índice de rubor deSLE, Avaliação Global do Médico (PGA) . As pontuações de ati- vidade de doença BILAG e SF-36 também foram avaliadas regu-larmente. pontos finaiss de eficácia primária pré-definidaforam redução porcentual na pontuação SS na semana 24 e tem-po até rubor por 52 semanas como definido pelo índice de ru-bor de SLE. Marcadores biológicos incluíram ANA, anticorpo (Ac) anti-dsDNA, C3/C4, isotitpos de IgG e FACS de célula Bperiférica. Células B foram analisadas a cada 1-2 meses porFACS 4-cores (CD19, CD20, CD27, CD69, CD38 e CD45) . auto-anticorpo sérico, incluindo anticorpo anti-dsDNA, isotiposde IgG, protéina total e níveis de albumina foram obtidosnas mesmas visitas. A proporção de probabilidade de qui-quadrado, teste de Wilcoson ou teste-t foi usada para anali-sar as alterações nos marcadores biológicos.

A idade média dos indivíduos neste estudo foi de42; a duração média de SLE nesses indivíduos era de 8,8 a-nos. O nível de linha basal de atividade de doença nessesindivíduos era relativamente alto, com aproximadamente 67%dos indivíduos tendo uma pontuação SS de 8 pontos ou maior(pontuação SS média: 9,6). Noventa e três porcento dos indi-víduos alistados neste estudo eram do sexo feminino. Setentaporcento dos indivíduos eram caucasianos; 24% dos indivíduosafro-americanos; 3% dos indivíduos asiáticos; e 18% dos in-divíduos hispânicos (sobreposição de categorias). Noventa e oito porcento dos indivíduos tinham historicamente pontuadopara ANA e 71,5% dos indivíduos eram ANA+ na inscrição (tí-tulo de ANA > 1:80 e/ou Ac anti-dsDNA > 30 Ui/mL na tria-gem/dia 0). Cinqüenta porcento dos indivíduos tinham um tí-tulo de anti-dsDNA ^ 30 Ui/mL na inscrição. As medicaçõesconcomitantes mais comuns para SLE usadas na linha basal in-cluíam as seguintes: esteróides (aproximadamente 70% dos in-divíduos), aminoquinolinas (p. ex., anti-maláricos) (70%),inibidores de COX-2 (28%), inibidores de COX-I (26%), azati-oprina (20%), metotrexato (16%) e micofenolato de mofetila(16%) . Trinta e quatro porcento e 42% de indivíduos ativos eplacebo, respectivamente, estavam recebendo doses clinica-mente significativas de corticosteróides sistêmicos (defini-dos como uma dose de prednisona ou equivalente a prednisona> 7,5 mg/dia) na linha basal. Não houve diferenças signifi-cativas em características na linha basal ou taxas de com-pletude pelos ramos de tratamento (81% completaram).

pontos finaiss de eficácia primária não atingiramsignificância estatística, mas a pontuação SS foi reduzidasignificativamente em 2 9% na semana 52 em indivíduos ANA+(p= 0, 0435, veja a Figura 1). rubores de SLE diminuíram emindivíduos belimumab durante as semanas 24-52 usando uma li-nha basal de semana 24 (log rank p= 0, 036). Embora nenhumadiferença significativa em pontuações BILAG numéricas com-postas (BILAG composto calculado pela conversão de graus desistema de órgãos a pontuações numéricas como se segue: A=9,B=3, C=I, D=0, E=0) tenha sido observada, em indivíduosANA+, a análise de pontuações para os 8 domínios de órgãosindividuais revelou menores aumentos na pontuação em doisdomínios de órgãos (muco-esquelético, p< 0,008; neurológico,ρ < 0,038) e uma tendência para menores aumentos na pontua-ção em três domínios de órgãos (cardiovascular & respirató-rio, ρ = 0,060; geral, p< 0,15; renal, p< 0,15) em indiví-duos tratados por belimumab na semana 52. A pontuação PGAmelhorou da semana 16 (p=0,016) até a semana 52 (p< 0,002,todos os ativos X placebo). Melhoras ocorreram apesar de au-mentos de prednisona em tratados com placabo X belimumab(aumento até >7,5 mg/dia, -15% X -7%). EM indivíduos ANA+,uma redução significativa na freqüência de aumento em pred-nisona, a partir de baixa dose de ^7,5 mg/dia até alta dosede >7,5 mg/dia, doi observada tão cedo quanto na semana 8(p<0,05 pelas semanas 8-12 e pelas semanas 32-40). Não houveresposta por dose em eficácia, sugerindo que todas as dosassão igualmente ativas. Nenhuma diferença clinicamente signi-ficativa foi notada em segurança, incluindo efeitos adversos(EA) , gravidade de EA, infecções ou toxicidade de lab. emtodos os ramos de belimumab X placebo. Menos indivíduos embelimumab tiveram pleurisia (3,3% X 8%, p< 0,05), enquantomais tiveram urticária (4% X 0%, p<0,05). Reações a infusãoforam raras, apenas com 1 evento grave relatado. Imunogeni-cidade a belimumab foi observada em 1 indivíduo (1 mg/dia).

Conforme mostrado na Tabela IX, análise de indiví-duos ANA+ na semana 52, revelou que tratamento com belimumabresultou em estabilização significativa da doença em relaçãoao placebo conforme mediado pelo índice BILAG (row 3) e porpGA (row 4). Adicionalmente, taxas de resposta entre os gru-pos de tratamentos no ensaio também foram analisadas usandoum ponto final de resposta combinada (row 1) , que combinouuma medição de atividade de doença global conforme medidopela pontuação SS, com uma medição de uma condição global dopaciente conforme avaliado pelo índice de atividade de doen-ça PGA e uma medição da doença em sistemas de órgãos especí-ficos conforme medido pela escala BILAG. Um paciente foipontuado como respondendo ao tratamento no ponto final com-binado se ele tivesse uma redução na pontuação SELENA SLEDAI>4 pontos, nenhuma piora em sua pontuação PGA definida comoaumento de <0,3 pontos na pontuação PGA e nenhuma piora emqualquer sistema de órgão específico definida como nenhumanova pontuação de domínio de órgão A de BILAG nem 2 novaspontuações de domínio de órgão B de BILAG. Análise de indi-víduos ANA+ usando o ponto final composto descrito acima re-velou uma resposta significativa a belimumab (p= 0,0058).

Adicionalmente, em indivíduos ANA+, melhoras sig-nificativas de PGA e Pontuações de Componente Físico SF-36(SF-36 PCS) foram observadas cedo no tratamento. A alteraçãoporcentual média a partir da linha basal de PGA mostrou me-lhora significativa (p< 0,05) tão cedo quanto na semana 4 emindivíduos ANA+ tratados com belimumab quando comparados aindivíduos ANA+ tratados com placebo. Os valores para alte-ração porcentual média na pontuação PGA em 8 semanas, 16 se-manas, 4 8 semanas e 52 semanas também mostraram melhora sig-nificativa em indivíduos ANA+ tratados com belimumab compa-rados a indivíduos ANA+ tratados com placebo (p< 0,05 em 8,16 e 48 semanas; p< 0,01 na semana 52) . A SF-36 PCS médiatambém mostrou melhoras significativas em qualidade de vidaem indivíduos ANA+ tratados com belimumab comparados com in-divíduos ANA+ tratados com placebo nas semanas 12, 24, 48 e52 (p<0,05 em cada ponto de tempo).

Reduções significativas em contagens de célula B(expressas como alterações porcentuais medianas a partir dalinha basal) foram observadas para indivíduos tratados combelimumab durante o curso do estudo, incluindo células BCD19+ (p<0,01 para cada medição tomada durante as semanas 8-52), células B ativadas (CD20+/CD69+; p<0,01 para cada medi-ção tomada durante as semanas 8-52), células B naive(CD20+/CD27-; p<0,01 para cada medição tomada durante as se-manas 8-52) e células B plasmacitóides (CD20+/CD138+; p<0,01para cada medição tomada durante as semanas 16-52). Mediçõesde contagens de célula B na semana 24 demonstraram que beli-mumab (todos os tratados combinados) reduziu significativa-mente célula B na semana 24 comparados a indivíduos tratadoscom placebo. Na semana 24, uma redução significativa nascontagens de célula B (expressas como alteração porcentualmediana a partir da linha basal; p<0,0001) foi observada pa-ra células B CD19+, células B naive (CD20 + /CD27-) , células Bativadas (CD20+/CD69+) e células B plasmacitóides(CD20+/CD138+). Belimumab (todos os tratados combinados) re-duziu significativamente contagens de célula B na semana 52(medianas). Na semana 52, a alteração porcentual mediana emcélulas B CD20+ foi de 54%* para todos os grupos em trata-mento combinados com redução significativa observada tão ce-do quanto na semana 8 (p<0,0001). Na semana 52, a alteraçãoporcentual mediana em células B plasmacitóides(CD20+/CD138+) foi de 62%* para todos os grupos em tratamen-to combinados. E a alteração porcentual mediana em células Bativadas (células B CD20+/CD69+) foi de 70%* na semana 52 (*todos p<0, 002) . Na semana 52, células B CD19+ e células Bnaive (CD20+/CD27-) foram reduzidas significativamente, em-bora populações de célula de memória tenham sido preserva-das. Em contraste, células de plasma (CD20-/CD138+) aumenta-ram 72,5% sobre a linha basal (2,7%) em indivíduos tratadoscom belimumab X 30,6% em placebo/padrão de cuidado (p=0,02)na semana 52. Além disso, a redução induzida por belimumabem contagens de célula B continuou até a semana 76. Na sema-nas 76, a alteração porcentual mediana em células B CD20+foi de 61% para todos os grupos em tratamento combinados. Nasemanas 76, a alteração porcentual mediana em células Bplasmacitóides (CD20+/CD138+) foi de 60% para todos os gru-pos em tratamento combinados. E a alteração porcentual medi-ana em células B ativadas (células B CD20+/CD69+) na semana76 foi de 84% para todos os grupos em tratamento combinados.Entre indivíduos que tinham título de anti-dsDNA ^ 30 Ui/mLna inscrição, uma redução significativa no título de anti-dsDNA (expressa como como alteração porcentual mediana apartir da linha basal) foi observada tão cedo quanto na se- mana 4 em indivíduos tratados com belimumab contra indiví-duos tratados com placebo (p<0,01 para cada medição tomadadurante as semanas 4-12; p<0,03 para cada medição tomada du-rante as semanas 16-24 e p<0,01 para cada medição tomada du-rante as semanas 32-52) . Belimumab reduziu Ac anti-dsDNA na semana 52 em 30% (p<0, 002, positivo na linha basal) X 9% doplacebo. Este efeito foi amparado pela medição da semana 76que mostrou uma redução de 28% em Ac anti-dsDNA. Reduçõessignificativas induzidas por belimumab nos níveis de IgG,IgA, IgE e IgM (expressas como alterações porcentuais media- nas a partir da linha basal) foram evidentes tão cedo comona semana 8 (p<0,0001) em indivíduos tratados com belimumabcomparados a controles tratados com placebo. Na semana 52,IgG, IgA, IgE e IgM séricas foram reduzidas (10%, 14%, 34% e29%, respectivamente). As reduções continuara, até a semana76 (12%, 15%, 35% e 34%, respectivamente). Além disso, paraaqueles indivíduos com níveis de. isotipo de Ig elevado nalinha basal, 41% (52/128, p=0,0014) dos indivíduos que rece-beram belimumab voltaram a níveis de isotipo de Ig normaisenquanto apenas 16% (7/45) dos indivíduos controle tenhamnormalizado. Um aumento significativo foi observado em ní-veis de complemento C4 (expressos como alterações porcentu-ais medianas a partir da linha basal) para cada medição to-mada durante as semanas 4-52 entre pacientes com complementoC4 baixo na linha basal em ramos tratados com belimumab(p<0,01). Na semana 52, C4 aumentou em 33% (p=0,0126m C4 delinha basal baixo) em ramos tratados com belimumab. Novamen-te, o efeito de belimumab foi amparado, com C4 melhorandoaté 46% na semana 76, em ramos tratados com belimumab. Nasemana 52, 14,5% (24/165) de indivíduos anti-dsDNA+ receben-do belimumab converteram para negativo comparados com 3,5%(2/58) do placabo (p=0,012). Na semana 76, 3 indivíduos an-ti-dsDNA+ adicionais recebendo belimumab converteram a nega-tivo .

Belimumab foi bem tolerado e demonstrou bioativi-dade significativa. Belimumab melhorou pontuações PGA, redu-ziu contagens de célula B, aumentou C4, reduziu anti-dsDNA ereduziu/normalizou níveis de isotipo de Ig. Belimumab retar-dou o início de rubor até 6 meses. Em indivíduos com positi-vidade a ANA na inscrição, a pontuação SS melhorou signifi-cativamente na semana 52. Finalmente, um ponto final de res-posta combinada revelou uma resposta significativa a trata-mento por belimumab por indivíduos ANA+ (veja a Tabela IX).

Tabela IX. Taxa de resposta em indivíduos ANA+ nasemana 52<table>table see original document page 369</column></row><table>

Exemplo 2: Pontuando proteinúria para SELENA

SLEDAI

Mau funcionamento renal é freqüentemente associado

com lúpus eritematoso sistêmico. Alguém versado na técnicaestaria ciente de uma variedade de medições padrões que po-dem ser usadas para avaliar a função renal, por exemplo, aprogressão para doença renal de estágio terminal, duplicaçãocontrolada de creatinina sérica, depuração de creatinina,depuração de iotomalato, concentração de proteína e uma úni-ca amostra de urina e concentração de proteína em uma amos-tra de urina de 24h.

Alterações em proteinúria calculadas a partir de"amostras de urina de 24 horas" é uma das categorias pontua-das na SELENA SLEDAI. Medições de proteinúria podem ser rea-lizadas por qualquer método conhecido na técnica. Em uma mo-dalidade especifica, uma única amostra de urina é coletada ea quantidade de proteína e/ou depuração de creatinina é me-dida, veja, por exemplo, Lemann et al., Clin Chem 33: 297-9,1987 e Schwab et al., Arch Intern Med 147(5): 943-4, 1987.Em uma modalidade específica, a urina é coletada por 24h e aquantidade de proteína e/ou depuração de creatinina é deter-minada. Em uma modalidade específica, uma única amostra deurina é coletada, a proporção da quantidade de proteína emrelação à quantidade de depuração de creatinina é determina-da, e esta proporção é usada para estimar a quantidade deproteína em uma amostra de urina de 24 horas, veja, por e-xemplo, Ruggenenti, et al., BMJ 316(7130): 504-9, 1998. Por-tanto, neste exemplo, uma "amostra de urina de 24 horas" po-de se referir aos gramas de proteína na urina com base emuma amostra de urina de 24 horas, ou a uma estimativa dosgramas de proteína em uma amostra de urina de 24 horas. Uma estimativa dos gramas de proteína em uma amostra de urina de24 horas pode ser baseada em, por exemplo, a proporção daquantidade de proteína em uma única amostra de urina em re-lação à quantidade de depuração de creatinina em uma únicaamostra de urina.

Nos sistema de pontuação SELENA SLEDAI padrão, umpaciente que exibe um novo início de proteinúria ou um au-mento recente em proteinúria que resulta em um valor de pro-teinúria na amostra de urina de 24 horas corrente que é pelomenos 0,5 gramas maior que o valor de proteinúria determina-do na amostra de urina de 24 horas imediatamente anterior,será designada uma pontuação de 4 para proteinúria na escalaSELENA SLEDAI publicada, veja, por exemplo, Bombardier etal., Arthritis Rheum 35(6): 630-40, 1992. Consequentemente,sob o sistema de pontuação SELENA SLEDAI padrão, um indiví-duo que é designado com 4 pontos na linha basal para protei-núria terá uma SELENA SLEDAI melhorada em uma visita subse-qüente contanto que a proteinúria não continue a subir em >0,5g em uma amostra de urina de 24 horas (isto é, o pacien-te terá 4 pontos deduzidos da sua pontuação total mesmo di-ante de proteinúria estável ou aumentos ^ 0,5g/24).

Uma modificação das regras de pontuação de protei-núria em SELENA SLEDAI é descrita abaixo. Como no sistema de pontuação de SELENA SLEDAI padrão, um paciente que exibe umnovo início de proteinúria ou um aumento recente em protei-núria que resulta em um valor de proteinúria na amostra deurina de 24 horas que é pelo menos 0,5 gramas maior que ovalor de proteinúria determinado na amostra de urina de 24 horas imediatamente anterior, será designado com uma pontua-ção de 4 para proteinúria. Adicionalmente, se um valor deproteinúria do paciente não melhorou (isto é, não houve umadiminuição na proteinúria na amostra de urina de 24 horascorrente de pelo menos 0,5 gramas comparado ao valor de pro- teinúria determinado para a amostra de urina de 24 horas i-mediatamente anterior) um paciente continuará a ser designa-do com uma pontuação de 4 para proteinúria. Se, entretanto,um valor de proteinúria de pacientes melhorou (isto é, houveuma diminuição na proteinúria na amostra de urina de 24 ho-ras corrente de pelo menos 0,5 gramas comparado ao valor deproteinúria determinado para a amostra de urina de 24 horasimediatamente anterior) um paciente será designado com umapontuação de 0 para proteinúria.

Em uma modalidade especifica, a medição de protei-núria prévia foi feita em uma amostra de urina de 24 horasque foi obtida ^26 semanas antes da medição corrente.

Exemplo 3: Resumo de resultados de um ensaio clí-nico testando o uso de um anticorpo (belimumab) que neutra-liza a proteína neutrocina-alfa para tratar artrite reuma-tóide (AR).

Um estudo multicêntrico, aleatório, duplo-cego,controlado por placebo foi realizado em indivíduos com AR.Indivíduos foram postos aleatoriamente em 4 grupos de trata-mento (placebo, 1 mg/kg, 4 mg/kg e 10 mg/kg). Belimumab ouplacebo foi administrado em doses de 1, 4 e 10 mg/kg nos di-as 0, 14 e 28 e a cada 28 dias depois disso for 24 semanas,seguido por um período de extensão de 24 semanas opcional.Belimumab foi formulado em 10 mM de citrato de sódio, 1,9%de glicina, 0,5% de sacarose, 0,01% de polissorbato 80, pH6,5 (± 0,3). Indivíduos recebendo dose placebo receberam aformulação (10 mM de citrato de sódio, 1,9% de glicina, 0,5%de sacarose, 0,01% de polissorbato 80, pH 6,5 (± 0,3)) sembelimumab. Um total de 283 indivíduos participaram do estu-do. Belimumab foi administrado a 214 indivíduos em doses de1, 4 ou 10 mg/kg durante a fase de tratamento de 24 semanasdo estudo. Sessenta e nove indivíduos receberam placebo.Uma resposta ACR20 estatisticamente superior foiobtida no grupo de tratamento de 1 mg/kg (p=0,0097), assimcomo em todos os grupos de tratamento ativos combinados(p=0,0213). 0 ACR20 é um índice desenvolvido pelo AmericanCollege of Rheumatology (ACR) para avaliar a resposta do pa-ciente a tratamento para artrite reumatóide. Uma respostaACR20 é definida como pelo menos uma redução de 20% na con-tagem de articulação hipersensível e contagem de articulaçãointumescida, além de uma melhora de pelo menos 20% em três de cinco outras avaliações de sintomas ou manifestações dedoença (isto é, avaliação de dor do paciente, avaliação glo-bal do paciente, avaliação global do médico, deficiência au-to-avaliada pelo paciente, reagente de fase aguda [ESR ouCRP] ) . Além disso, o resultado para o grupo de tratamento de 1 mg/kg permaneceu estatisticamente significativo sob ajustepara comparações múltiplas usando o procedimento Bonferroni-closed (p<0,0166). Como em indivíduos com SLE, belimumab foiassociado com respostas ACR20 melhoradas em indivíduos comdoença de auto-anticorpos positivos (fator reumatóide [FR]ou peptídeo citrulinado cíclico [CCP]), assim como em indi-víduos positivos para proteína C-reativa (CRP) na linha ba-sal. Atividade biológica foi observada incluindo reduçõesestatisticamente significativas em células B CD20+, célulasB naive, células B ativadas e RF; células de memória aumen- taram no primeiro mês de tratamento e declinaram vagarosa-mente com o tratamento continuado. Belimumab foi bem tolera-do em todas as doses. Uma relação de dose-resposta não foievidente neste estudo para eficácia, segurança nem efeitosde biomarcadores. Tratamento continuado no período de exten-são do estudo foi bem tolerado. A resposta ACR20 aumentouaté aproximadamente 40% na semana 48. Efeitos em biomarcado-res aumentaram ou foram mantidos com tratamento continuado,enquanto células de memória continuaram a declinar para ní-veis basais. Concentrações de soro neste estudo estavam nafaixa esperada com base nos dados de Fase 1 e medicaçõesconcomitantes (isto é, metotrexato, leflunomida ou hidroxi-cloroquina) não tiveram um efeito significativo nas exposi-ções a belimumab.

Exemplo 4: Neutrocina-alfa estende tempo de vidade célula B através de duas vias de sinalização independen-tes

Neutrocina-alfa, também chamada BLyS (estimuladorde Iinfócito B) , BAFF, TALL-I, THANK, TNFSF13B e zTNF4, éessencial para a sobrevivência de linfócitos B periféricos(Rolinkf A. G. e Melchersf F. (2002) Curr Opin Immunol 14,266-275). A importância de neutrocina-alfa na homeostase decélula B nalve é melhor demonstrada pela descoberta de quecamundongos deficientes em neutrocina-alfa por deleção ouintrodução gênica direcionada de receptores isca solúveistêm déficits surpreendentes em célula B de zona marginal efoliculares, as principais populações de célula B periféricamadura (Grossf J. A.f et al., (2001) Immunity 15, 289-302;Schiemann, B., et al(2001) Science 293, 2111-2114). Aocontrário, expressão ectópica de neutrocina-alfa a partir deum transgene espande notoriamente células B de zona perifé-rica marginal e foliculares sem afetar células T, célulasBI, células B perféricas transicionais (Tl) precoces ou cé-lulas B em desenvolvimento na medula (Mackay, F. et al.,(2003) Annu Rev Immunol 21: 231-264). Neutrocina-alfa tambémé requerida para a manutenção de numerosos tumores de célulaB e estimulo por neutrocina-alfa desregulados recupera célu-la B auto-reativas da exclusão, promovendo desse modo a pro-dução de auto-anticorpo (Kalled, S. L. (2005) Immunol Rev204: 43-54). Assim, neutrocina-alfa tem um papel critico nahomeostase tanto de células B normais como patogênicas. Esteexemplo detalha os resultados de experimentos realizados pa-ra entender o mecanismo pelo qual neutrocina-alfa promove a sobrevivência de célula B.

Procedimentos Experimentais

Camundongos: camundongos Pim-l+/+2+/+, Pim-l~/~2+/'+,Pim-l+/+2_/" e Pim-l-/~2~/_ foram gerados a partir de estoquePim-l+/~2+/~ de Paul Rothman Columbia University, New York,NY. Camundongos C57BL/6 (B6) eram do The Jackson Laboratory,Bar harbor ME ou do programa de produção do National CâncerInstitute, NCI-Fredrick, Fredrick MD. Animais foram criadose mantidos na Univ. of Pennsylvania, Harvard Medicai School,ou na Univ. of Massachusetts Medicai School de acordo comdiretrizes de Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional.

Purificação de célula B: células B esplênicas fo-ram obtidas por tratamento por anti-thyll.2 e complemento deesplenócitos seguido por purificação de células B em repousousando um gradiente de percoll passo a passo e recuperandocélulas na interface de 60-70%. Em alguns experimentos célu-las B CD23+ foram obtidas por seleção positiva e separaçãomagnética de esplenócitos usando anticorpo anti-CD23 bioti-nilado (BD Biosciences-Pharmigen, San Diego CA) e microesfe-ras revestidas com estreptavidina (Miltenyi Biotec, AuburnCA) . Células B CD23+ não foram selecionadas por tamanho emPercoll já que a ativação ambiental in vivo leva à perda deCD23. Células B preparadas por anticorpo e Percoll eram >90%B220+, enquanto células B CD23+ estavam >95% puras.

Culturas de células: células B purificadas ou cé-lulas B CD23+ foram cultivadas em RPMI-1640 suplementado com2-mercaptoetanol, aminoácidos MEM não essenciais, glutamina,penicilina e estreptomicina (meios completos, CM). Para en-saios de sobrevivência de célula B e outros foi usada neu-trocina-alfa humana recombinante feita em Human Genome Sci-ences, Rockville MD a 50-100 ng/mL. Neutrocina-alfa humana marcada com FLAG foi de Dr. Randolph Noelle, Dartmouth Medi-cai School. Neutrocina-alfa murina foi adquirida de AlexisBiochemicals, San Diego CA e interferon alfa humano (IFNa)de PBL Biomedical, Piscataway, NJ. Rapamicina foi usada emuma concentração final de 50 nM, adicionada a culturas de um estoque dissolvido em metanol. Células B controle em experi-mentos usando rapamicina foram tratadas com metanol como umcontrole de veiculo. Para ensaios cinéticos, células B forampreparadas e refrigeradas durante a noite a 4°C. Cinco aseis χ 106 células B purificadas por amostra foram cenrifu- gadas em placas de 24 poços que foram revestidas com 5 pg/mLde anticorpo M2 anti-FLAG monoclonal (Sigma), lavadas, blo-queadas com BSA 1% em PBS, seguida pela adição de 2 pg/poçode neutrocina-alfa humna marcada com FLAG uma hora antes dalavagem e adição de célula. Células B controle não estimula-das foram aquelas centrifugadas em poços tratados com anti-corpo anti-FLAG sozinho. Células B também foram ativadas porincubação com anti-IgM murino (5 yg/mL), anti-CD40 (0,5pg/mL) ou 100 ng/mL de neutrocina-alfa humana recombinanteadicionada a tampão de ensaio cinético (solução salina ba-lanceada de Hank mais 2% de BSA).

Anticorpos e transferência de Western: anti-Pim 2(1D12) de camundongo, Pim 1 (19F7), anti-actina de cabra (1-19) , anti-Ig de camundongo, anti-Ig de coelho e anti Ig degoat acoplado a HRP foram obtidos de Santa Cruz Biotechno-logy, Santa Cruz CA. Anti-f osf oserina 473 Akt de coelho,fosfoserina 389 p70 S6 quinase, fosfotreonina 24/32FKHR/FKRHLl, f osf oGSK3a/p, GSK, p70S6K, FKHR e Akt foram ob- tidos de Cell Signaling, Beverly MA. Anti-Mcl-I de camundon-go de coelho foi obtido de Rockland, Wilmington, MA. Lisadoscelulares totais foram preparados pela lavagem de células Bem PBS gelado e Iise em RIPA (150 mM de NaCl, 1% de NP-40,0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, 50 mM de Tris pH8,0) suplementado com inibidores de protease (minitab, Ro-che, Indianapolis IN) e coquetéis de inibidor de fosfatase Ie II (Sigma). Dez até cinqüenta microgramas de proteína fo-ram resolvidos em géis de bis-tris poliacrilamida NuPage 4-12% (Invitrogen, Carlsbad CA) e transferidos para nitrocelu- lose. Transferências foram bloqueadas com 3% de BSA (Sigma,livre de IgG), 0,2% de Tween-20 em PBS e incubados com anti-corpo primário no mesmo tampão durante a noite a 4°C. Trans-ferências foram lavadas com PBS-0,2% Tween-20, incubados comanticorpo secundário conjugado a HRP e revelados usando ECL-plus (Amersham Bioscience, Piscataway NJ) . Transferênciasforam despojadas para remarcação pela incubação por 20 minu-tos a 650C em PBS suplementado com 1% de SDS e 100 μΜ de β-mercaptoetanol. Transferências foram então lavadas e bloque-adas como acima.

Ensaios de sobrevivência: células B a 5 χ 106/mLforam cultivadas em placas de cultura de tecido de 24 poçosem CM a 37°C. Células B foram suplementadas com 50-100 ng/mLde rhuneutrocina-alfa, 50 nM de rapamicina, 200 U de IFNoíhumano, ou uma combinação desses reagentes. Células B forampré-tratadas com 50 nM de rapamicina ou veiculo 1 hora antesdo cultivo com os suplementos em teste, rapamicina frescafoi adicionada após 48 horas de cultura. Sobrevivência foimonitorada diariamente pela contagem de células viáveis u-sando exclusão por trypan blue com cada determinação feitaem triplicata.

Resultados

Investigação no mecanismo pelo qual neutrocina-alfa promove sobrevivência de célula B revelou que neutroci-na-alfa ativa a via de Akt/mTOR em células B. Células B pu-rificadas foram estimuladas por 0, 5, 20, 60 ou 120 minutoscom 100 ng/mL de neutrocina-alfa murina ou humana recombi-nante ou anti-Ig (controle positivo) a 37°C em meio pré-gaseifiçado. Lisados foram preparados a partir de amostrasgeladas e analisados por transferência de Western. Tal esti-mulação de células B primárias com neutrocina-alfa recombi-nante resultou em ativação da via Akt como determinado pelafosforilação aumentada nos resíduos de serina 473 e treonina308 de Akt. Experimentos adicionais em que células B purifi-cadas foram estimuladas com neutrocina-alfa marcada com FLAGligada a placa, neutrocina-alfa solúvel (100 ng/mL) ou 0,5μg/mL de anti-CD40 (controle positivo) mostraram que Akt porsi só foi ativado como visto pela fosforilação dos substra-tos de Akt, GSK£ e os fatores de transcrição de forquilha(forkhead) FOXOl e F0X03a. mTOR é o principal efetor a ju-sante de Akt. Subseqüentemente ao estímulo por neutrocina-alfa, a ativação de mTOR em células B primárias também foimostrada pela fosforilação dos substratos de mTOR, p70 S6quinase e o inibidor de tradução 4E-BP1. Padrões de fosfori-lação foram estudados por transferência de Western.

Rapamicina é um inibidor potente de mTOR e um su-pressor potente de proliferação e diferenciação de célula B.Células B em repouso pequenas de doadores normais foram cul-tivadas por 4 dias com e sem 100 ng/mL de rhuneutrocina-alfa, veículo ou 50 nM de rapamicina que foi usado para pré-tratar células B antes do cultivo, adicionado diretamente aculturas após iniciação e readicionadas a cada 2 dias. Célu-las viáveis foram determinadas no dia 4. Co-cultura de célu-las B CD23+ ou B totais com neutrocina-alfa e rapamicina nãopreveniu acentuamento de sobrevivência mediado por neutroci-na-alfa como medido pelo número de células viáveis presentesapós 4 dias de cultura. Este resultado sugeriu que outra viade sobrevivência pode estar ativa em células B tratadas comneutrocina-alfa.

Pims são uma família de três serina/treonina qui-nases que podem prover proteção contra apoptose resistente arapamicina, induzida em células hematopoéticas por uma vari-edade de ativadores (Fox, C. J. et.et., (2003). Genes Dev17: 1841-1854 e Fox, C. J. et. et. , (2005) J Exp Med 201:259-266). Foi mostrado por transferência de Western que sub-seqüentemente a 2 dias de tratamento com 100 ng/mL de rhu-neutrocina-alfa, células B primárias supra regularam a ex-pressão de Piml e Pim2.

Para testar o envolvimento de Piml e Pim2 na so-brevivência de célula B mediada por neutrocina-alfa, célulasB CD23+ de doadores heterozigotos Pim l"/+2"/+ selvagens, du-plo-deficientes Pim ou deficientes em Pim 2 (Pim 1+/"

2~'~) foram cultivadas em CM por 4 dias com veiculo, 100ng/mL de rhuneutrocina-alfa e com ou sem 50 nM de rapamici-na. A viabilidade foi determinada diariamente por exclusãode trypan blue. De maneira interessante, células B de camun-dongos duplamente deficientes em Pim 1 e Pim 2 (células Pim1-/-2-/-) exibiram sobrevivência acentuada quando expostas aneutrocina-alfa. Este resultado poderia ser explicado semTOR e Pims 1 e 2 operassem em vias de sinalização distintasonde cada uma mediasse a promoção por neutrocina-alfa de so-brevivência celular. Para testar a teoria de que duas viasseparadas estavam envolvidas, o feito de rapamicina na so-brevivência mediada por neutrocina-alfa em células B Pim2~'~ foi testado. A adição de rapamicina anula a habilidadede neutrocina-alfa em acentuar a sobrevivência de célula Bem células Pim 1-/-2-/-. Investigação adicional mostrou quecélulas B Pim l+/"2_/", deficientes apenas na função de Pim 2,foram tão sensíveis à rapamicina quanto células B Pim \~,~2~l~indicando que Pim 1 não é necessário para efeitos de neu-trocina-alfa na sobrevivência de célula B. Juntos, esses da-dos mostram que há duas vias independentes que trabalham pa-ra mediar a sobrevivência mediada por neutrocina-alfa e quecada via sozinha é suficiente para essa atividade de neutro-cina-alfa.

Experimentos adicionais indicaram que a expressãode Mcl-I, um membro da família de Bcl-2 que tem uma funçãona promoção de homeostase de células TeB periférica, é re-querida para acentuação eficaz da sobrevivência de célula B(proteção contra indução de apoptose) (dados não mostrados) .

Conseqüentemente, uma composição compreendendo uminibidor da via Akt/mTOR (p. ex. , rapamicina) e um inibidorda via de Pim 2 pode ser usada para imitar os feitos induzi-dos por um antagonista de neutrocina-alfa. Assim, uma compo-sição compreendendo um inibidor da via de Akt/mTOR (p. ex.,rapamicina) e um inibidor da via de Pim 2 pode ser usada co-mo uma antagonista de neutrocina-alfa para inibir sobrevi-vência de célula B ou para tratar uma ou mais doenças oudistúrbios divulgados aqui. Por exemplo, uma composição com-preendendo um inibidor da via de Akt/mTOR (p. ex., rapamici-na) e um inibidor da via de Pim 2 pode ser usada para dimi-nuir tempo de vida de célula B. Adicionalmente, uma composi-ção compreendendo um inibidor da via de Akt/mTOR (p. ex.,rapamicina) e um inibidor da via de Pim 2 pode ser usada pa-ra tratar uma doença auto-imune. Em modalidades específicas,uma composição compreendendo um inibidor da via de Akt/mTOR(ρ. ex., rapamicina) e um inibidor da via de Pim 2 pode serusada para tratar doenças auto-imunes mediadas por célula B.Em outras modalidades especificas, uma composição compreen-dendo um inibidor da via de Akt/mTOR (p. ex., rapamicina) eum inibidor da via de Pim 2 pode ser usada para tratar doen-ças auto-imunes em que auto-anticorpos sejam prevalentes. Emmodalidades especificas, uma composição compreendendo um i-nibidor da via de Akt/mTOR (p. ex., rapamicina) e um inibi-dor da via de Pim 2 pode ser usada para tratar artrite reu- matóide, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla,miastenia grave, sindrome de Sjõgren, diabete tipo 1, púrpu-ra trombocitopênica idiopática, sindrome de Guillian-Barré,tireoidite de Hashimoto ou doença de Grave.

Adicionalmente, uma composição compreendendo um inibidor de Mcl-I pode ser usada para imitar os efeitos in-duzidos por um antagonista de neutrocina-alfa. Assim, umacomposição compreendendo um inibidor de Mcl-I pode ser usadacomo um antagonista de neutrocina-alfa para inibir a sobre-vivência de célula B ou para tratar uma ou mais doenças oudistúrbios divulgados aqui. Por exemplo, uma composição com-preendendo um inibidor de Mcl-I pode ser usada para diminuirtempo de vida de célula B. Adicionalmente, uma composiçãocompreendendo um inibidor de Mcl-I pode ser usada para tra-tar uma doença auto-imune. Em modalidades especificas, uma composição compreendendo um inibidor de Mcl-I pode ser usadapara tratar doenças auto-imunes mediadas por célula B. Emoutras modalidades especificas, uma composição compreendendoum inibidor de Mcl-I pode ser usada para tratar doenças au-to-imunes em que auto-anticorpos sejam prevalentes. Em moda-lidades específicas, uma composição compreendendo um inibi-dor de Mcl-I pode ser usada para tratar artrite reumatóide,lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, miasteniagrave, síndrome de Sjõgren, diabete tipo 1, púrpura trombo-citopênica idiopática, síndrome de Guillian-Barré, tireoidi-te de Hashimoto ou doença de Grave.

Exemplo 5: Caracterização de formulações de anti-corpo

A análise de 1 mg/mL de anticorpo de IgGl/λ formu-lado em tampões de 10 mM de histidina e 10 mM de citrato porcalorimetria de varredura diferencial foi usada para avaliara estabilidade térmica do anticorpo em cada formulação. 0anticorpo particular usado neste estudo foi um anticorpo deIgGl/λ que é específico para neutrocina-alfa e é capaz deneutralizar a atividade de neutrocina-alfa. A análise reve-lou que a temperatura de desnaturação foi a mais alta paraambos os tampões na faixa de pH de 6,0-7,5 e temperatura dedesnaturação mais alta geralmente indica estabilidade térmi-ca mais alta. A temperatura de desnaturação do tampão de ci-trato foi de ~2°C mais alta que o tampão de histidina nestafaixa de pH, sugerindo que o tampão de citrato pode dar umaformulação de anticorpo mais estável. Entretanto, a reversi-bilidade térmica do anticorpo foi mais alta no tampão dehistidina que no tampão de citrato. Isto sugere que o anti-corpo tem maior estabilidade biofísica em histidina que emcitrato apesar de sua temperatura de desnaturação mais bai-xa. Isto foi confirmado por estudos de estabilidade de for-mulações de anticorpo que descobriram que 10 mM de histidinaresultou em menos agregação que 10 mM de citrato quando es-tocados a 2-8°C por 18 meses. Durante o estudo de estabili-dade, a capacidade tamponante dos dois tampões foi avaliadapor medições de pH repetidas. Além de prover maios estabili-dade biofísica para o anticorpo, a histidina parece provermaior capacidade tamponante em pH 6,0-6,5 que o citrato emuma faixa de pH de 6,5-7,0. No estudo de estabilidade de 18meses, as formulações de histidina permaneceram em um pH es-tável durante o tempo em todas as temperaturas testadas (2-S0Cr 25°C e 40°C) . Em contraste, as formulações de citratotiveram variações mais amplas nas temperaturas mais altas(dados não mostrados).

Exemplo 6: Estudo de estabilidade de longo prazo de uma formulação de anticorpo

Para determinar a vida de prateleira de uma formu-lação de anticorpo, um estudo de estabilidade de longo prazode 100 mg/mL de anticorpo em 10 mM de histidina, 150 mM deNaCl, 0,01% (p/v) de polissorbato 80, pH 6,0 foi realizado. O anticorpo particular usado neste estudo foi um anticorpode IgGl/λ que é específico para neutrocina-alfa e é capaz deneutralizar a atividade de neutrocina-alfa. Alíquotas de 2mL em frascos de vidro de 5 mL foram estocadas verticalmentepor 24 meses a -80°C, 2-8°C, 25°C e 40°C. Amostras foram es- tocadas a -80°C como um controle, a 2-8°C para determinar avida de prateleira e em condições aceleradas (25°C e 40°C)para monitorar quaisquer possíveis vias degradação que pode-riam ocorrer. Periodicamente por 24 meses, amostras foramanalisadas por múltiplos ensaios, incluindo: inspeção visu-al, pH, concentração, SDS-PAGE, SEC-HPLC, HPLC de troca iô-nica (IE-HPLC), bioensaio, isoeletrofocalizaçâo capilar (cl-EF) , mapeamento peptidico, RP-HPLC e ISOQUANT®.

Análises de amostras estocadas por 24 meses a 2-8°C e -80°C por SEC-HPLC, IE-HPLC e RP-HPLC foram compará-veis visualmente por todos os três métodos, apenas com pe-quenas diferenças observadas. A amostra de 2-80C diminuiu empureza de SEC-HPLC em uma taxa aproximada de 0,03% por mês eaumentou em picos de IE-HPLC eluidos precocemente (princi-palmente devido a desamidação) em uma taxa aproximada de0,14% por mês (dados não mostrados). A amostra de 2-8°C mos-trou apenas pequenas alterações em agregação (<1%(, desami-dação (~4%) e oxidação (1%) do anticorpo após 24 meses deestocagem. Entretanto, degradação significativa foi observa-da em todos os ensaios para amostras estocadas sob condiçõesaceleradas. A degradação observada por SEC-HPLC sob condi-ções aceleradas incluíram anto agregação como fragmentação.Ensaios de IE-HPLC mostraram que estocagem em condições ace-leradas resulta em um aumento em picos que eluem precocemen-te. Desamidação e fragmentação foram observadas por mapea-mento peptidico a 25°C; desamidação, oxidação, fragmentação erearranjo de aspartato para isoaspartato foram observados a40°C. Assim, 100 mg/mL de um anticorpo de IgGl/λ em uma for-mulação farmacêutica da invenção são estáveis a 2-8°C porpelo menos 24 meses de estocagem.

Exemplo 7: Ensaio in vitro para testar a inibiçãode interação neutrocina-alfa-receptor de neutrocina-alfaO seguinte descreve um ensaio que pode ser usadopara testar se um composto trabalha como um antagonista deneutrocina-alfa. Especificamente, este ensaio mede a habili-dade do composto em inibir a ligação de neutrocina-alfa so- lúvel a seu receptor cognato em células IM9.

Preparação de neutrocina-alfa biotiniladaCem pg de neutrocina-alfa humana ou de camundongoé dialisada durante a noite a 4°C contra 50 mM de bicarbona-to de sódio (carbonato de sódio e hidrogênio) pH 8,5 usandoum cassete slide-a-lyzer (Pierce) . No próximo dia, NHS-biotina (Pierce) é dissolvida em DMSO para 13,3 mg/mL. Estaé então adicionada à neutrocina-alfa em uma proporção molarde 20:1 de biotina:neutrocina-alfa, misturada e incubada emgelo por 2 horas. A neutrocina-alfa biotinilada é então dia- lisada de volta em PBS estéril (Sigma) usando um cassete s-lide-a-lyzer durante a noite a 4°C. A atividade biológica daneutrocina-alfa biotinilada é confirmada usando o ensaio deinibição de ligação a receptor (veja abaixo).

Manutenção de células IM9

Células IM9 são uma linhagem celular de linfócitoB humano que expressa receptores de neutrocina-alfa. CélulaIM9 podem ser mantidas em RPMI-1640 suplementado com 4 mM deglutamina, 10% de FCS, 10 U de penicilina, 100 mg/mL de es-treptomicina (todos os reagentes da Sigma). As células são descongeladas de estoque congelado e podem ser usadas em en-saios após 5 dias em cultura quando elas atingem uma densi-dade de 4-8 χ 105/mL.

Ensaio de inibição de ligação a receptorPlacas de 96 poços de fundo chato (Costar) são re-vestidas com IOOpL por poço de uma diluição 1:10 de poli-L-lisina (Sigma) em PBS por 1 hora a temperatura ambiente. Asplacas são então lavadas duas vezes com água, deixadas eva- porar e colocadas a 4°C durante a noite. Cem pL de célulasIM9 (a 106/mL em meio de cultura RPMI-1640) são então adi-cionados a cada poço. Placas são então centrifugadas a 3200rpm por 5 min para sedimentar as células. Os meios são cui-dadosamente aspirados e 200pL de MPBS (PBS contendo 3% de solução de bloqueio de Marvel) adicionados a cada poço. Asplacas são então deixadas bloquear por 1 hora em temperaturaambiente.

Em uma placa de 96 poços separada, 10 pL de neu-trocina-alfa biotinilada (a 162,5 ng/mL) em MPBS são adicio- nados a cada poço para dar uma concentração final de 25ng/mL. Cinqüenta e cinco pL de cada composto teste são adi-cionados a cada poço. 0 volume final em cada poço é de 65pL.De preferência, o composto em teste também é diluído emMPBS. Placas são então incubadas em temperatura ambiente por 30 minutos.

As placas revestidas com IM9 são lavadas duas ve-zes em PBS, secas por drenagem e imediatamente 50 pL da mis-tura fago/neutrocina-alfa-biotinilada são adicionados e in-cubados em temperatura ambiente por 1 hora. Placas são Iava- das três vezes em PBST e três vezes em PBS secas por drena-gem e 50 pL de estreptavidina-Delfia (Wallac) são adiciona-dos a cada poço em diluição de 1:1000 no tampão de ensaio dofabricante. As placas são então incubadas a temperatura am-biente por 1 hora e lavadas seis vezes em solução de lavagemde Delfia (Wallac). Após deixar as placas secas, 100 yL porpoço de solução de acentuamento de Delfia (Wallac) são adi-cionados. As placas são gentilmente drenadas para estimulara formação de micelas, incubadas a temperatura ambiente por10 minutos e lidas por fluorescência em uma estação de tra-balho Wallac 1420 a 6520 nm.

Controles apropriados para incluir neste ensaioincluem uma única amostra de bio-néutrocina-alfa para de-monstrar que a ligação máxima de neutrocina-alfa biotiniladaao seu receptor ocorre neste ensaio e amostra que não conte-nha bio-neutrocina-alfa para demonstrar o sinal de fundoneste ensaio. Um controle adicional útil é um composto nãoespecifico a neutrocina-alfa ou "irrelevante" - um compostoque é estruturalmente similar ao composto teste, mas que nãose acredita que interaja com neutrocina-alfa ou um dos re-ceptores de neutrocina-alfa. Se o composto teste fosse umanticorpo anti-neutrocina-alfa do isotipo IgGl, um controle"irrelevante" adequado seria outro anticorpo de IgGl que não é especifico para neutrocina-alfa ou um de seus receptores.

Exemplo 8: Ensaio de proliferação de célula B hu-mana para triagem in vitro de moléculas antagonistas de neu-trocina-alfa

Um bioensaio para avaliar os efeitos de um antago-nista putativo de neutrocina-alfa é realizado em triplicataem formato de 96 poços pela mistura de volumes iguais deneutrocina-alfa, células que respondem e antagonista putati-vo cada um dos quais é preparado como um reagente estoque3Χ.

Linfócitos B são purificados de amigdala humanapor MACS (depleção anti-CD3), lavados e ressuspendidos emmeio completo (CM) (RPMI 1640 com 10% de SFB contendo 100 U/mL de penicilina, 100pg/mL de estreptomicina, 4 mM de glu-tamina, 5xl0~5 M de beta-mercaptoetanol) em uma concentraçãode 3 χ IO6 células/mL. Staphylococcus aureus, Cowan I (SAC,CalBiochem) é adicionado a células em concentração de 3X (3X= diluição 1:33.333 do estoque).

Enquanto isso, oito diluições seriadas (3 vezes)de antagonista potencial são preparadas em CM tal que os an-tagonistas diluídos estejam em 3X a concentração final a sertestada no ensaio. Por exemplo, anticorpos são rotineiramen-te testados começando em uma concentração final de 10μg/mL e baixando até cerca de 1,5 ng/mL.

Neutrocina-alfa humana é preparada em CM em con-centração de 3X (3X = 300 ng/mL, 30 ng/mL e 3 ng/mL) em CM.Antagonistas potenciais são rotineiramente testados em mui-tas concentrações de neutrocina-alfa para evitar falsos ne-gativos devido à afinidade inesperadamente baixa ou à con-centração do antagonista.

Cinqüenta microlitros de antagonista diluído e50pL de neutrocina-alfa diluída são então adicionados a po-ços contendo 50pL da mistura de células.

Células são então incubadas por 72 horas (37°C, 5%de CO2) em uma câmara completamente umidifiçada. Após 72 ho-ras, as células são suplementadas com 0,5μCi/poço de 3H-timidina (6,7Ci/mmol) e incubadas por 24 horas adicionais.Placas são recuperadas usando um recuperador de célula Tom-tec e filtros contados em um contador de cintilação TopCount(Packard).

Controles apropriados para incluir neste ensaioincluem uma amostra em que nenhum antagonista seja incluídopara demonstrar que a incorporação de 3H-timidina máxima o-corre neste ensaio e uma amostra que não contenha neutroci-na-alfa para demonstrar o sinal de fundo neste ensaio. Umcontrole adicional útil é um composto teste não específico aneutrocina-alfa ou "irrelevante" - um composto que é estru-turalmente similar ao composto teste, mas que não se acredi-ta que interaja com neutrocina-alfa ou um dos receptores deneutrocina-alfa. Por exemplo, se o composto teste fosse umanticorpo anti-neutrocina-alfa do isotipo IgGl, um controle"irrelevante" adequado seria outro anticorpo de IgGl que nãoé específico para neutrocina-alfa ou um de seus receptores.

Alguém versado na técnica estará ciente de modifi-cações que podem ser feitas a este ensaio, por exemplo, naordem de etapas ou dos reagentes usados. Como um exemplo es-pecífico, as células B podem ser preparadas com anti-IgM emvez de SAC. Alguém versado na técnica também está ciente deoutros ensaios que podem ser usados para testar a habilidadede um composto para agir como um antagonista de neutrocina-alf a .

Exemplo 9: Ensaio de proliferação de célula B mu-rína para triagem in vitro de moléculas antagonistas de neu-trocina-alfa

Para determinar se um potencial antagonista deneutrocina-alfa inibe proliferação de célula B mediada porneutrocina-alfa, um ensaio de proliferação de esplenócitomurino pode ser realizado. Em resumo, esplenócitos murinossão isolados por jato em um baço usando uma agulha 25g e 10mL de meio completo (RPMI 1640 com 10% de SFB contendo 100U/mL de penicilina, 100ug/mL de estreptomicina, 4 mM de glu-tamina, 5xl0~5 M de beta-mercaptoetanol). As células sãopassadas por um filtro de náilon de 100 microns para removeragregados celulares. A suspensão celular é então ficollada a 400 χ g por 25 minutos a temperatura ambiente (um tubo côni-co de 15mL/baço; 3mL de Ficoll, 10 mL de suspensão celu-lar/baço; Ficol 1083 da Sigma). As células recuperadas sãolavadas 3 vezes em meio completo e contadas. Células recupe-radas são então diluídas a uma concentração de 3 χ 106mL em meio completo contendo uma concentração de 3X de SAC (3X =diluição de 1: 33.333 do estoque; estoque é uma suspensão a10% de S. Aureus (cepa Cowan I) disponível de Calbiochem).

Para cada anticorpo, 50 microlitros de diluiçõesde anticorpo em concentrações de 30yg/mL, 3,0μg/mL, e 0,3yg/mL são aliquotados em poços individuais de uma placade 96 poços em triplicata. Meio não contendo nenhum anticor-po (e controles de isotipo humano (adquiridos comercialmen-te) quando necessário) são usados como controles negativos.

A proteína neutrocina-alfa é diluída em meio com- pleto a concentrações de 300ng/mL, 90ng/mL e 30ng/mL. Cin-qüenta microlitros de cada diluição de neutrocina-alfa é en-tão adicionada às séries de diluição de anticorpo nas pla-cas. A placa contendo as diluições de neutrocina-alfa e an-ticorpo são então incubadas por 30 minutos a 37°C, 5% deCO2, após o que 50 microlitros da suspensão de esplenócitoscontendo SAC é adicionada a todos os poços. As placas sãoentão incubadas por 72 horas (37°C, 5% de CO2) .

Após 72 horas, cada poço é suplementado com 50pLde meio completo contendo 0,5pCi de 3H-timidina (6,7Ci/mM;Amersham) e células são incubadas por 20-24 horas adicionais(37°C, 5% de CO2) . Após a incubação células são recuperadasusando um recuperador de células Tomtec e filtros contado emum contador de cintilação TopCount (Packard).

Alguém versado na técnica estará ciente de modifi-cações que podem ser feitas a este ensaio, por exemplo, naordem de etapas ou dos reagentes usados. Como um exemplo es-pecifico, as células B podem ser preparadas com anti-IgM emvez de SAC. Alguém versado na técnica também está ciente deoutros ensaios que podem ser usados para testar a habilidadede um composto para agir como um antagonista de neutrocina-alfa.

Será evidente que a invenção pode ser praticada deoutro modo que como particularmente descrito nas descriçõese exemplos anteriores. Numerosas modificações e variações dapresente invenção são possíveis a luz dos ensinamentos acimae, portanto, estão dentro do âmbito das reivindicações ane-xadas.

A divulgação completa de todas as publicações (in-cluindo patentes, publicações de patente, artigos de jornal,manuais de laboratório, livros ou outros documento) citadosaqui são por meio deste incorporados como referência.Adicionalmente, a Listagem de Seqüências submetidaem anexo tanto na forma de computador como em papel é pormeio deste incorporada como referência em sua totalidade.Adicionalmente, a divulgação inteira (incluindo a especifi- cação, listagem de seqüências e ilustrações) de cada um dosseguintes Pedidos de Patente Provisórios e Não ProvisóriosUS e Pedidos de Patente Internacional é aqui incorporada co-mo referência em sua totalidade: Pedido Provisório US Nos.60/725.625, depositado em 13 de outubro de 2005; 60/735.967,depositado em 14 de novembro de 2005; 60/776.664 depositadoem 27 de fevereiro de 2006; 60/781.387, depositado em 13 demarço de 2006; 60/787.557, depositado em 31 de março de2006; 60/797.360, depositado em 4 de maio de 2006;60/814.870, depositado em 20 de junho de 2006; 60/815.558,depositado em 22 de junho de 2006; 60/815.827, depositado em23 de junho de 2006; 60/834.150, depositado em 31 de julhode 2006; 60/725.626, depositado em 13 de outubro de 2005;60/735.988, depositado em 14 de novembro de 2005;60/776.665, depositado em 27 de fevereiro de 2006; 60/797.351, depositado em 4 de maio de 2006; 60/814.869, de-positado em 20 de junho de 2006; 60/815.559, depositado em22 de junho de 2006; 60/834.152, depositado em 31 de julhode 2006; 60/725.627, depositado em 13 de outubro de 2005;60/735.964, depositado em 14 de novembro de 2005; 60/776.658, depositado em 27 de fevereiro de 2006;60/725.629, depositado em 13 de outubro de 2005; 60/735.963,depositado em 14 de novembro de 2005; 60/776.660, depositadoem 27 de fevereiro de 2006; 60/725.628, depositado em 13 deoutubro de 2005; 60/735.987, depositado em 14 de novembro de2005; 60/776.659, depositado em 27 de fevereiro de 2006;60/543.261, depositado em 11 de fevereiro de 2004;60/580.387, depositado em 18 de junho de 2004; 60/617.191,depositado em 12 de outubro de 2004; 60/368.548, depositadoem 1 de abril de 2002; 60/336.726, depositado em 7 de dezem-bro de 2001; 60/331.478, depositado em 16 de novembro de2001; 60/330.835, depositado em 31 de outubro de 2001;60/329.747, depositado em 18 de outubro de 2001 e60/329.508, depositado em 17 de outubro de 2001; 60/225.628,depositado em 15 de agosto de 2000; 60/227.008, depositadoem 23 de agosto de 2000; 60/234.338, depositado em 22 de se-tembro de 2000; 60/240.806, depositado em 17 de outubro de2000; 60/250.020, depositado em 30 de novembro de 2000;60/276.248, depositado em 6 de março de 2001; 60/293.499,depositado em 25 de maio de 2001; 60/296.122, depositado em7 de junho de 200; 60/304.809, depositado em 13 de julho de2001; 60/122.388, depositado em 2 de março de 1999;60/124.097, depositado em 12 de março de 1999; 60/126.599,depositado em 26 de março de 2000; 60/127.598, depositado em2 de abril de 1999; 60/130.412, depositado em 16 de abril de1999; 60/130.696, depositado em 23 de abril de 1999;60/131.278, depositado em 27 de abril de 1999; 60/131.673,depositado em 29 de abril de 1999; 60/136.784, depositado em28 de maio de 1999; 60/142.659, depositado em 6 de julho de1999; 60/145.824, depositado em 27 de julho, de 1999;60/167.239, depositado em 24 de novembro de 1999;60/168.624, depositado em 3 de dezembro de 1999; 60/171.108,depositado em 16 de dezembro de 1999; 60/171.626, depositadoem 23 de dezembro de 1999; 60/176.015, depositado em 14 dejaneiro de 2000 e 60/036.100, depositado em 14 de janeiro de1997; Pedidos Não Provisórios US de Nos. Seriais: 11/054.539depositado em 10 de fevereiro de 2005; 10/739.042 depositadoem 19 de dezembro de 2003; 10/735.965 depositado em 16 dedezembro de 2003; 10/270.487 depositado em 16 de outubro de2002; 09/929.493 depositado em 14 de agosto de 2001;09/588.947 depositado em 8 de junho de 2000; 09/589.285 de-positado em 8 de junho de 2000; 09/589.286 depositado em 8de junho de 2000; 09/589.287 depositado em 8 de junho de2000; 09/589.288 depositado em 8 de junho de 2000;09/507.968 depositado em 22 de fevereiro de 2000; 09/255.794depositado em 23 de fevereiro de 1999 e 09/005.874 deposita-do em 12 de janeiro de 1998; e Pedido de Patente Internacio-nal de Nos. Seriais PCT/US01/25549 depositado em 15 de agos-to de 2001; PCT/US00/04336 depositado em 22 de fevereiro de2000 e PCT/US96/17 957 depositado em 25 de outubro de 1996.

Claims (32)

1. Composição farmacêutica compreendendo um anta-gonista de Neutrocina-alfa, CARACTERIZADA pelo fato de serpara o uso no tratamento de um paciente que tem um titulo deANA >1:80 ou > 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seuplasma sangüíneo ou soro, onde o dito antagonista é para seradministrado em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

2. Uso de um antagonista de Neutrocina-alfa,CARACTERIZADO pelo fato de ser para a preparação de uma com- posição farmacêutica para tratar um paciente que tem um tí-tulo de ANA > 1:80 ou ^ 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA emseu plasma sangüíneo ou soro, onde o dito antagonista é paraser administrado em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

3. Composição farmacêutica ou uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO (A) pelo fato do pacienteter uma doença autoimune.

4. Composição farmacêutica ou uso, de acordo com areivindicação 3, CARACTERIZADO(A) pelo fato da dita doençaautoimune ser lupus eritematoso sistêmico (LES).

5. Composição farmacêutica ou uso, de acordo com areivindicação 3, CARACTERIZADO (A) pelo fato da doença autoi-mune ser artrite reumatóide, síndrome de Sjõgren, esclero-dermia, polimiosite, dermatomiosite, síndrome de Felty, do-ença mista do tecido conjuntivo, síndrome de Raynaud, ou ar- trite crônica juvenil.

6. Composição farmacêutica ou uso, de acordo comquaisquer das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO (A) pelofato do antagonista de Neutrocina-alfa ser um anticorpo an-ti-Neutrocina-aIfa.

7. Composição farmacêutica ou uso, de acordo com areivindicação 6, CARACTERIZADO (A) pelo fato do anticorpocompreender a seqüência de amino ácido de um conjunto de do-mínios VH e VL selecionados do grupo consistindo de:(a) o domínio VH e o domínio VL da SEQ ID NO : 13;(b) o domínio VH e o domínio VL da SEQ ID NO : 14;(C) o domínio VH e o domínio VL da SEQ ID NO : 15;(d) O domínio VH e O domínio VL da SEQ ID NO : 16;(e) O domínio VH e O domínio VL da SEQ ID NO : 17;(f) O domínio VH e O domínio VL da SEQ ID NO : 18;(g) O domínio VH da SEQ ID NO:19 e o domino VL da SEQ IDNO:20; e(h) o domínio VH da SEQ ID NO: 21 e o domínio VL da SEQID NO:22.

8. Composição farmacêutica compreendendo um anta-gonista de Neutrocina-alfa para o uso no tratamento de umpaciente com lupus eritematoso sistêmico, CARACTERIZADA pelofato do dito antagonista ser para ser administrado em umaquantidade terapeuticamente eficaz a um paciente após a de-terminação de que o dito paciente tem um título de ANA ^-1:80 ou ^ 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasmasangüíneo ou soro.

9. Uso de um antagonista de Neutrocina-alfa para apreparação de uma composição farmacêutica para o tratamentode um paciente com lupus eritematoso sistêmico,CARACTERIZADO pelo fato do dito antagonista ser para ser ad-ministrado em uma quantidade terapeuticamente eficaz a umpaciente após a determinação de que o dito paciente tem umtitulo de ANA > 1:80 ou > 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNAem seu plasma sangüíneo ou soro.

10. Composição farcamêutica ou uso, de acordo comquaisquer das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO (A) pelofato do antagonista de Neutrocina-alfa ser administrado emcombinação com um anticorpo anti-CD20.

11. Composição farmacêutica ou uso, de acordo comquaisquer das reivindicações 1 a 7 e 10, CARACTERIZADO (A)pelo fato do dito antagonista de Neutrocina-alfa ser paraser administrado após a determinação de que o paciente temum título de ANA ^ 1:80 ou ^ 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma sangüíneo ou soro.

12. Composição farmacêutica ou uso, de acordo coma reivindicação 8 ou 9, CARACTERIZADO (A) pelo fato do ditoantagonista de Neutrocina-alfa ser para ser administrado a-pós a determinação de que o paciente tem pelo menos uma ca-racterística do grupo consistindo em:(a) uma pontuação SELENA SLEDAI > 6;(b) um nível diminuído do fator do complemento C3 em seuplasma sangüíneo ou soro;(c) um nível diminuído do fator do complemento C4 em seuplasma sangüíneo ou soro;(d) o paciente estar recebendo ^ 7,5 miligramas/dia deprednisona; e(e) o paciente estar recebendo ou ter previamente rece-bido terapia imunossupressora para o tratamento desintomas relacionados a lupus.

13. Composição farmacêutica compreendendo um anta-gonista de Neutrocina-alfa, CARACTERIZADA pelo fato de serpara o uso na redução de freqüência ou quantidade de admi-nistração de corticosteróide a um paciente com lupus erite-matoso sistêmico, onde o dito antagonista é para ser admi-nistrado em uma quantidade terapeuticamente eficaz ao ditopaciente.

14. Uso de um antagonista de Neutrocina-alfa,CARACTERIZADO pelo fato de ser para a preparação de uma com- posição farmacêutica para a redução de freqüência ou quanti-dade de administração de corticosteróide a um paciente comlupus eritematoso sistêmico, onde o dito antagonista é paraser administrado em uma quantidade terapeuticamente eficazao dito paciente.

15. Composição farmacêutica ou uso, de acordo coma reivinidicação 13 ou 14, CARACTERIZADO(A) pelo fato do di-to antagonista de Neutrocina-alfa ser para ser administradoapós a determinação de que paciente tem pelo menos uma ca-racterística selecionada do grupo consistindo em: (a) um título de ANA > 1:80;(b) ^ 30 UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma san-güíneo ou soro;(c) uma pontuação SELENA SLEDAI ^ 6;(d) um nível diminuído do fator do complemento C3 em seuplasma sangüíneo ou soro;(e) um nível diminuído do fator do complemento C4 em seuplasma sangüíneo ou soro;(f) o paciente estar recebendo ^ 7,5 miligramas/dia de pred-nisona; e(g) o paciente estar recebendo ou ter previamente recebidoterapia imunossupressora para o tratamento de sintomas rela-cionados a lupus.

16. Processo in vitro para determinar se um paci-ente com lupus está respondendo a tratamento médico,CARACTERIZADO pelo fato de compreender:(a) determinar a pontuação SELENA SLEDAIr BILAG e PGA do pa-ciente antes da administração de tratamento médico;(b) administrar o tratamento médico; e(c) determinar a pontuação SELENA SLEDAI, BILAG e PGA do pa-ciente em seguida à administração de tratamento médico;onde o paciente é considerado como tendo respondido ao tra-tamento médico se a pontuação SELENA SLEDAI determinada naetapa (c) for 4 ou mais pontos menos que a pontuação SELENASLEDAI determinada na etapa (a), a pontuação de índice BILAGdeterminada na etapa (c) não incluir uma nova pontuação dedomínio de órgão BILAG A ou 2 novas pontuações de domínio deórgão BILAG B comparada à pontuação BILAG determinada na e-tapa (a), e a pontuação PGA determinada na etapa (c) ser <-0,3 pontos maior que a pontuação de PGA determinada na etapa(a).

17. Processo, de acordo com a reivindicação 16,CARACTERIZADO pelo fato do tratamento médico ser uma compo-sição farmacêutica compreendendo um antagonista de Neutroci-na-alfa.

18. Composição farmacêutica ou uso, de acordo comquaisquer das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO (A) pelofato do dito paciente ter um titulo de ANA ^ 1:80 e ^ 30UI/mL de anticorpos anti-dsDNA em seu plasma sangüíneo ousoro.

19. Composição farmacêutica ou uso, de acordo comquaisquer das reivindicações 8, 9, 13, 14 e 15,CARACTERIZADO (A) pelo fato do dito antagonista de Neutroci-na-alfa ser para ser administrado após a determinação de quepaciente tem menos do que 90 miligramas/decilitro do fatordo complemento C3 em seu plasma sangüíneo ou soro.

20. Composição farmacêutica ou uso, de acordo comquaisquer das reivindicações 8, 9, 13, 14 e 15,CARACTERIZADO(A) pelo fato do dito antagonista de Neutroci-na-alfa ser para ser administrado após a determinação de queo paciente tem menos do que 16 miligramas/decilitro do fatordo complemento C4 em seu plasma sangüíneo ou soro.

21. Composição farmacêutica ou uso, de acordo comquaisquer das reivindicações 8, 9, 11 e 15, CARACTERIZADO(A)pelo fato da determinação ser para ser feita com base no re-gistro médico do paciente ou com base nos testes de labora-tório.

22. Composição farmacêutica ou uso, de acordo comquaisquer das reivindicações 1, 2, 8, 9, 13, 14 e 17,CARACTERIZADO(A) pelo fato do dito antagonista ser uma pro-teína compreendendo o domínio de ligação de Neutrocina-alfade TACI (SEQ ID NO: 6), o domínio de ligação de Neutrocina-alfa de BCMA (SEQ ID NO: 8), o domínio de ligação de Neutro-cina alfa de BAFF-R (SEQ ID NO: 10) ou uma variante do domí-nio de ligação de Neutrocina-alfa de BAFF-R tendo a sequên-cia de aminoácido de resíduos de aminoácidos 2-70 da SEQ IDNO:26.

23. Composição farmacêutica ou uso, de acordo comquaisquer das reivindicações 1, 2, 8, 9, 13, 14 e 17,CARACTERIZADO(A) pelo fato do dito antagonista ser um peptí-deo de ligação de Neutrocina-alfa, um pepticorpo, uma vari-ante protéica de Neutrocina-alfa ou um anticorpo receptor deanti-Neutrocina-alfa.

24. Composição farmacêutica ou uso, de acordo comquaisquer das reivindicações 8, 9, 13, 14 e 17,CARACTERIZADO (A) pelo fato do dito antagonista ser um anti-corpo anti-Neutrocina-alfa.

25. Composição farmacêutica ou uso, de acordo coma reivinidicação 23, CARACTERIZADO (A) pelo fato da varianteprotéica de Neutrocina-alfa agir como um dominante negativo.

26. Composição farmacêutica ou uso, de acordo coma reivindicação 13 ou 14, CARACTERIZADO (A) pelo fato do ditocorticosteróide ser selecionado a partir do grupo consistin-do de prednisona, prednisolona, hidrocortisona, metilpredni-solona e dexametasona.

27. Composição farmacêutica ou uso, de acordo coma reivindicação 26, CARACTERIZADO(A) pelo fato da quantidadede prednisona administrada ao paciente ser reduzida de pelomenos 25% a < 7,5 miligramas/dia.

28. Formulação farmacêutica aquosa, CARACTERIZADApelo fato de compreender uma quantidade terapeuticamente e-ficaz de um anticorpo, um tampão em uma quantidade de cercade 5mM a cerca de 50mM, NaCl em uma quantidade de cerca de-150mM a cerca de 500mM, um surfactante em uma quantidade decerca de 0,003% a cerca de 0,05%, com um pH de cerca de 5,5a cerca de 6,5.

29. Formulação, de acordo com a reivinidicação 28,CARACTERIZADA pelo fato do anticorpo ser um anticorpo deIgGl/λ humano, do tampão ser IOmM de histidina, do surfac-tante ser polissorbato 80 em uma quantidade de 0,01% p/v, doNaCl ser 150mM e onde a formulação tem um pH de 6,0.

30. Formulação, de acordo com a reivindicação 29,CARACTERIZADA pelo fato de ser estável em um temperatura decerca de 2-80C por pelo menos um ano ou por pelo menos 2 anos.

31. Formulação, de acordo com a reivindicação 29,CARACETRIZADA pelo fato do anticorpo estar presente em umaquantidade de 100 mg/mL.

32. Formulação farmacêutica aquosa, de acordo coma reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de compreender-100 mg/mL de anticorpo IgCl/À,0,74 mg/mL de L-histidina, 1,1mg/mL de monohidrocloreto de L-histidina, 8,8 mg/mL de NaCle 0,1 mg/mL de polissorbato 80 e onde a formulação tem um pHde 6,0.