BRPI0616091B1 - Processed product by the heat and their production methods of edible plant and transgenic plant, reduction of acrylamide content in plant product and gene overexpression in potato tuberculu, isolated polynucleotyd sequence and plant - Google Patents

Description

“Produto Processado pelo Calor e Respectivos Métodos de Produção de Produto de Planta Comestível e de Planta Transgênica, de Redução do Conteúdo de Acrilamida em Produto de Planta e de Sobreexpressão de Gene em Tubérculo de Batata, Seqüência de Polinucleotideo Isolado e Planta” Relatório Descritivo Referência Remissiva a Pedidos de Prioridade Este Pedido de Patente norte-americano não provisório reivindica prioridade sobre os pedidos norte-americanos provisórios números 60/718.335, depositado em 20 de setembro de 2005, e 60/833.788, depositado em 28 de julho de 2006, ambos os quais são aqui incorporados por referência.

Campo da Invenção A presente invenção está relacionada a métodos genéticos para regular negativa e positivamente os genes em uma planta, por exemplo, nos órgãos de armazenamento dessa planta ricos em amido, para diminuir o nível de acrilamida que se acumula com o aquecimento oriundo do processamento desses órgãos.

Histórico O aquecimento de alimentos que contêm tanto asparagina livre quando açúcares redutores resulta na produção de acrilamida. A acrilamida é um produto químico industrial usado no mundo inteiro para sintetizar poliacrilamida. A exposição a esse composto reativo resulta numa rápida absorção e mesmo distribuição entre os tecidos (Barber e colaboradores, Neurotoxicology 2001, 22, 341-353). Em roedores, os efeitos toxicológicos da alta concentração de acrilamida (>2 mg/kg de peso corporal) incluem sintomas neurológicos, fertilidade diminuída e câncer (Friedman, J. Agric. Food Chem, 2003, 51, 4504-4526).

Também se sabe que a exposição ocupacional a altos níveis de acrilamida eleva a incidência de neurotoxicidade em humanos (LoPa-chin, Neurotoxicology, 2004, 25, 617-630), mas não há efeitos documentados da acrilamida na reprodução humana ou na carcinogênese. Tanto a acrilamida quanto o seu metabólito oxidizado glicidamida reagem com a valina amino-terminal da hemoglobina para formar adutos. A extensão da formação de adutos é uma boa marcadora dos níveis de exposição e implica em uma dose diária de formação de adutos de aproximadamente 100 pg (Tareke e colaboradores, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 4998-5006). Embora se acreditasse inicialmente que água potável, cosméticos e o fumo fossem as únicas principais fontes de exposição ambiental à acrilamida (Bergmark, Chem. Res. Toxicol, 1997, 10, 78-84), análises recentes indicaram que o consumo de alimentos fritos ou assados ricos em amido contribuem com 36% da ingestão de acrilamida (Becker e Pearson, Dietary habits and nutrient intake in Sweden 1997-98. Riksmaten 1997-98, 1999). A acrilamida na dieta é derivada em grande parte das reações induzidas pelo calor entre o grupo amina do aminoácido livre asparagi-na e o grupo carbonila dos açúcares redutores (Mottram e colaboradores, Nature, 2002,419, 448-449; Stadler e colaboradores, Nature, 2002, 419, 449-450). Os tubérculos frescos de batata contêm altos níveis de asparagina, mas concentrações relativamente baixas de açúcares redutores, como glicose e frutose. Entretanto, os açúcares redutores acumulam durante o armazenamento a frio através da expressão de invertases induzidas pelo frio, as quais catalisam a conversão de sacarose em glicose e frutose.

Tentativas anteriores de se limitar o acúmulo de acrilamida em alimentos ricos em amido não resultaram em aplicações práticas e custo-efetivas. Um primeiro método de arte prévia é baseado na modificação de parâmetros de processamento, como a razão entre superfície e volume, temperatura e tempo de fritura. Embora aplicações desse método sejam parcialmente eficazes em diminuir o acúmulo de acrila-mida, elas alteram as características sensoriais do produto alimentício final ao reduzir a cor, modificar o formato e alterar o gosto e a textura. Essas alterações não são desejáveis.

Um segundo método é baseado na incubação de produtos alimentícios parcialmente processados com asparaginase (EC 3.5.1.1) ou gluminase (EC 3.4.1.2) antes do aquecimento (ver Pedidos de Patente Mundial 2004/030468 A3 e 2004/026042 Al). Esse método é caro e só pode ser aplicado prontamente a materiais como farinha de trigo, que podem ser facilmente misturados com a enzima.

Um terceiro método adiciona um competidor da asparagina, como a glicina, ao alimento parcialmente processado (Pedido de Patente Mundial 2005/025330 Al para tubérculos de batata, Pedido de Patente US 2004/0081724 Al para grãos de café torrados, pedido de patente mundial 2005/004620 Al para grãos de cacau, pedido de patente mundial 2005/004628 Al para alimentos baseados em milho). Esse método é apenas parcialmente efetivo, requer altas concentrações do aditivo e é caro demais para ser amplamente aplicado.

Um quarto método adiciona uma enzima alteradora de açúcar redutor, que consiste da aldose redutase, ao material alimentício antes do aquecimento (ver Patente US 6989167). Esse método não é muito eficaz e é muito caro para ser amplamente aplicado.

Um quinto método reveste o alimento com um reagente selecionado, de um grupo que consiste de um composto contendo aminoácido, um sal de aminoácido, uma amida de aminoácido, um éster de aminoá- cido e misturas destes, antes do aquecimento (ver pedido de patente mundial 2005/077203A3). Esse método é apenas parcialmente eficaz e é muito caro para ser aplicado amplamente.

Um sexto método é baseado na seleção de germoplasma que contém níveis muito baixos tanto de açúcares redutores quanto de asparagina. A disponibilidade desse germoplasma tornaria possível introgredir as características ‘baixo açúcar’ e “baixa asparagina’ em variedades que são aceitáveis para amplo uso na indústria alimentícia. Entretanto, nenhuma planta de cultivo com baixo nível de asparagina foi identificada até agora. Mesmo se esse germoplasma for descoberto no futuro, levaria pelo menos de 15 a 20 anos para introduzir as características desejadas nas variedades comerciais.

Um sétimo método modifica geneticamente o cultivo para reduzir os níveis de açúcares redutores. Esse método é baseado na regulação negativa da expressão dos genes envolvidos na degradação do amido, como os genes RI associados a amido e fosforilase-L (ver, por exemplo, o Pedido de Patente US 2003/0221213 Al). Embora parcialmente eficaz, alimentos processados derivados desses cultivos modificados ainda contêm cerca de um terço dos níveis de acrilamida encontrados em produtos controle.

Assim, há uma necessidade importante de métodos para reduzir os níveis de acrilamida em alimentos processados que são obtidos de cultivos ricos em amido. Esses métodos devem ser efetivos do ponto de vista do custo e não devem reduzir as características sensoriais do alimento. A presente invenção proporciona esses métodos.

Sumário da Invenção Numa modalidade, a invenção proporciona uma nova estratégia para reduzir os níveis de acrilamida em um alimento processado que foi obtido aquecendo os tecidos ricos em amido do cultivo. De maneira inédita, essa estratégia emprega métodos de engenharia genética para reduzir os níveis de asparagina nos tecidos ricos em amido de uma planta do cultivo em pelo menos 50%, Numa modalidade, os níveis de asparagina nos tecidos ricos em amido de uma planta do cultivo são reduzidos diminuindo-se o nível de biossíntese da asparagina e/ou aumentando o nível do metabolismo de asparagina. Qualquer um dos mecanismos pode empregar a regulação negativa ou positiva dos genes que estão direta ou indiretamente envolvidos em cada uma das vias de asparagina. Num aspecto, o gene envolvido no metabolismo da asparagina codifica uma asparaginase. Num aspecto, o gene envolvido na biossíntese da asparagina codifica uma asparagina sintetase.

Noutro aspecto, os genes que estão indiretamente envolvidos em uma via da asparagina são selecionados de um grupo contendo um gene de glutamina sintetase (GS), um gene de nitrato redutase (NR), um gene 14-3-3 e um gene de hexoquinase (HXK).

Num aspecto, o nível de biossíntese da asparagina é reduzido pela diminuição da expressão de pelo menos um gene envolvido na biossíntese de asparagina.

Num aspecto, a expressão reduzida de um gene envolvido na bi-ossíntese de asparagina é obtida pela introdução na planta de um cassete de expressão contendo, de 5' para 3', (i) ura promotor, (ii) pelo menos uma cópia da sequência que contém pelo menos um fragmento de pelo menos um gene envolvido no metabolismo da asparagina e, opcionalmente, (iii) um segundo promotor ou um terminador, sendo que o primeiro e o opcional segundo promotores estão posicionados na orientação convergente.

Num aspecto, o cassete de expressão que é usado para reduzir a expressão de um gene envolvido na biossíntese de asparagina contém duas cópias de uma seqüência contendo pelo menos um fragmento de um gene envolvido no metabolismo de asparagina.

Num aspecto, as duas cópias estão posicionadas como (i) repetições invertidas ou (ii) repetições diretas.

Num aspecto, o gene envolvido na biossíntese de asparagina é isolado da batata, de uma batata selvagem, como a Solarium phurej, da batata doce, do ínhame, de um cafeeiro, de um cacauzeiro, do trigo, do milho, da aveia, do sorgo ou da cevada, e codifica uma asparagina sintetase.

Num aspecto, o gene da asparagina sintetase contém uma seqüência que compartilha pelo menos 70% de identidade com pelo menos um fragmento da seqüência mostrada na SEQ ID.: L

Em outro aspecto, o gene da asparagina sintetase contém uma seqüência que compartilha pelo menos 70% de identidade com pelo menos um fragmento da seqüência mostrada na SEQ ID.: 2.

Num aspecto, a sobreexpressão de um gene envolvido no metabolismo da asparagina é obtida pela introdução na planta de um cassete de expressão contendo, de 5' para 3', um primeiro promotor, um gene envolvido na biossíntese de asparagina e um terminador.

Num aspecto, o gene envolvido no metabolismo de asparagina é isolado da batata, de uma batata selvagem, como a Solarium phurej, da batata doce, do inhame, de um cafeeiro, de um cacauzeiro, do trigo, do milho, da aveia, do sorgo ou da cevada, e codifica uma asparaginase. Num aspecto, o gene da asparaginase contém uma seqüência que compartilha pelo menos 70% de identidade com a seqüência mostrada em SEQ ID.: 9, 10, 14, 15, 31, 32 ou 33.

Em outro aspecto, o gene da asparaginase contém uma seqüência que compartilha pelo menos 70% de identidade com a seqüência mostrada em SEQ ID.: 14.

Em outro aspecto, o gene envolvido na biossíntese de asparagina é um gene de glutamina sintetase ou hexoquinase.

Num aspecto, o promotor é um promotor de (i) um gene de amido sintetase ligada ao um grânulo de batata, (ii) um gene de ADP glicose pirofosforilase de batata, (iii) um gene de ubiquitina-7 de batata, (iv) um gene de patatina de batata, (v) um gene de ílavonóide mono-oxigenase de batata.

Num aspecto, o promotor de um gene de amido sintetase ligada ao um grânulo de batata compartilha pelo menos 70% de identidade com pelo menos parte da SEQ ID NO.: 8, o promotor do gene de ADP glicose pirofosforilase de batata compartilha pelo menos 70% de identidade com pelo menos parte da SEQ ID NO.: 7, o promotor do gene de ubiquitina-7 de batata compartilha pelo menos 70% de identidade com pelo menos parte da SEQ ID NO.: 21, o promotor do gene de patatina de batata compartilha pelo menos 70% de identidade com pelo menos parte da SEQ ID NO.: 22 e um promotor do gene de ílavonóide mono-oxigenase de batata compartilha pelo menos 70% de identidade com pelo menos parte da SEQ ID NO.: 13.

Em outro aspecto, o promotor é o promotor de um gene que é expresso em um tubérculo, raiz ou semente de um cultivo rico em amido destinado ao processamento alimentício.

Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para reduzir os níveis de acrilamida em um alimento que foi obtido pelo aquecimento dos tecidos de um cultivo por meio da redução simultânea da asparagina e dos açúcares redutores nos tecidos. Numa modalidade, o tecido é um tecido rico em amido do cultivo ou da planta. Num aspecto, a redução simultânea dos níveis de asparagina e açúcares redutores é obtida por meio (i) da regulação negativa da expressão de um gene envolvido na biossíntese da asparagina ou na sobreexpressão de um gene envolvido no metabolismo da asparagina, e (ii) da regulação negativa de pelo menos um gene envolvido na degradação do amido.

Num aspecto, a expressão de um gene na degradação do amido é regulada negativamente pela introdução na planta de um cassete de expressão contendo, de 5’ para 3', (i) um promotor, (ii) pelo menos uma cópia de uma seqüência contendo pelo menos um fragmento de um gene envolvido na degradação do amido e, opcionalmente, (iii) ou um segundo promotor ou um terminador, sendo que o primeiro promotor e o opcional segundo promotor estão posicionados na orientação convergente.

Num aspecto, um gene envolvido na degradação do amido é selecionado de um grupo que consiste de (i) um gene RI associado ao amido e (ii) um gene de fosforilase-L associada ao amido.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método para simultaneamente reduzir os níveis de acrilamida em um alimento que foi obtido pelo aquecimento de tecidos de um cultivo e aumentar as características sensoriaís desse alimento através da redução simultânea dos níveis de asparagina e de açúcares redutores nos tecidos. Numa modalidade, o tecido é um tecido rico em amido do cultivo ou da planta.

Num aspecto, a redução simultânea é obtida por meio do emprego de uma construção de 'ataque multigénico' (multigene-targeting) que contém um primeiro cassete de expressão contendo ou (i) um gene de asparaginase operacionalmente ligado a um promotor ou (ii) pelo menos uma cópia de um fragmento de um gene de asparagina sintetase operacionalmente ligado a um promotor e um segundo cassete de expressão contendo pelo menos uma cópia de um segmento de DNA que contenha tanto um fragmento do gene RI quanto um fragmento do gene da fosforilase operacionalmente ligados a um promotor, sendo que o primeiro e segundo cassetes de expressão podem ser o mesmo cassete de expressão, Numa modalidade, uma planta contém pelo menos uma célula transformada de maneira estável com a construção de ataque multigê-nico. Numa modalidade seguinte, a planta produz tubérculos. Em outra modalidade, a planta produtora de tubérculos é uma batata. Em outra modalidade, a planta produtora de tubérculos contém o cassete integrado de maneira estável em seu genoma.

Em outro aspecto, a invenção fornece um produto processado a partir de um tubérculo transgênico, sendo que (a) pelo menos uma célula do tubérculo transgênico contém a construção de ataque multi-gênico, e (b) o produto tem uma concentração mais baixa de acrilamida que um produto equivalente de um tubérculo não transgênico da mesma variedade vegetal.

Em outro aspecto, a invenção fornece um produto de um tubérculo transgênico, sendo que (a) pelo menos uma célula do tubérculo transgênico contém a construção de ataque multigênico, (b) o produto tem uma concentração mais baixa de acrilamida que um produto equivalente de um tubérculo não transgênico da mesma espécie, e (c) o produto exibe ainda uma taxa mais baixa de escurecimento (browning) não enzimático, quando comparado com o produto equivalente de um tubérculo não transgênico da mesma espécie.

Em outro aspecto, a invenção fornece um produto de um tubérculo transgênico, sendo que (a) pelo menos uma célula do tubérculo transgênico contém a construção de ataque multigênico, (b) o produto tem uma concentração mais baixa de acrilamida que um produto equivalente de um tubérculo não transgênico da mesma espécie e (c) o produto exibe ainda uma taxa mais baixa de escurecimento não enzimático quando comparado com o produto equivalente de um tubérculo não transgênico da mesma espécie, e (d) o produto exibe ainda um perfil sensorial melhorado quando comparado com o produto equivalente de um tubérculo não transgênico da mesma espécie. Numa modalidade, o produto vegetal comestível tem características sensoriais melhoradas quando comparado com um produto equivalente de uma planta que não foi modificada de acordo com os presentes métodos inventivos, Numa modalidade, o produto vegetal comestível tem pelo menos uma característica sensorial melhorada selecionada do grupo que consiste de aparência, sabor, aroma e textura.

Numa modalidade, o tubérculo transgênico é uma batata. Numa modalidade adicional, o produto é batata frita. Em outra modalidade adicional, o produto é batata chip.

Em outra modalidade, o tubérculo transgênico é uma batata e o produto do tubérculo transgênico é armazenado entre 4°C e 12°C por cerca de uma a trinta semanas e contém um nível de glicose de menos de 50% do nível de glicose de um tubérculo não transgênico da mesma espécie armazenado sob as mesmas condições que o tubérculo transgênico.

Numa modalidade, a planta é selecionada de um grupo que consiste de batata, milho, café, cacau e trigo.

Em outra modalidade, a planta é transformada com uma cepa de bactéria selecionada do grupo que consiste de Agrobacteúum tumefa-ciens, Rhizobium trifolii, Rhizobium leguminosarum, Phyüobacterium myrsinacearum, SinoRhizobium meliloti e MesoRhjzobium loti.

Num aspecto, a invenção fornece uma seqüência polinucleotídica isolada contendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que é capaz de reduzir os níveis de asparagina em uma planta e, consequentemente, reduzir os níveis de acrilamida no produto processado dessa planta.

Numa modalidade, a seqüência de ácido nucléico compartilha pelo menos 70% de identidade com a seqüência que é selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 9, 10, 14, 15, 31, 32 e 33, ou uma variante ou fragmento destas e esse ácido nucléico codifica um polipep-tídeo com atividade de asparaginase.

Numa modalidade adicional, a variante tem uma identidade de seqüência que é maior ou igual a 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, ou 60% em seqüência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 9, 10, 14, 15, 31, 32 e 33, Em outro aspecto, é fornecida uma seqüência polinucleotídica isolada contendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma asparaginase capaz de reduzir os níveis de asparagina em uma planta e, conseqüentemente, reduzir os níveis de acrilamida no produto processado dessa planta.

Em outro aspecto, a invenção propicia uma planta transgênica com níveis reduzidos de expressão de asparaginase, a qual pode ser usada para produzir um alimento processado com um conteúdo menor de acrilamida.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um alimento com menor conteúdo de acrilamida, o qual foi obtido através do processamento de um tubérculo transgêníco com um conteúdo menor de asparagina.

Com base nos dados da U.S. Food an Drug Administration (www.cfsan.fda.gov/~dms/acrydata.html), uma batata frita típica produzida em um restaurante de uma grande cadeia de fast food contém mais de 100-partes por bilhão (ppb) de acrilamida. A quantidade média de acrilamida nessa batata frita típica é de 404 ppb e a ingestão diária média de acrilamida pelo consumo de batata frita é de 0,07 microgramas/quilograma de peso corporal/dia. Conseqüentemen-te, a batata frita representa 16% do total de ingestão alimentar de acrilamida. As quantidades médias de acrilamida numa batata frita assada em forno (oven-bakeã) e batata chips produzida por um processo comercial são de 698 ppb e 597 ppb, respectivamente. Assim, alimentos processados derivados de batata, incluindo batata frita, fritas assadas em forno e batata chips, representam 38% do total de ingestão alimentar de acrilamida.

De acordo com a presente invenção, o nível de acrilamida que está presente em uma batata frita, frita assada ou chip que é obtida de um tubérculo produzido por uma planta transgênica de uma variedade específica da presente invenção é menor que o nível de acrilamida em uma batata frita, frita assada ou chip obtida de uma planta não transgênica da mesma variedade por um fator maior do que 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes, 20 vezes ou mais do que 20 vezes.

Em termos de partes por bilhão, uma batata frita produzida de um tubérculo da presente invenção pode ter entre 1-20 ppb, 20-40 ppb, 40-60 ppb, 60-80 ppb ou 80-100 ppb de acrilamida.

Em termos de partes por bilhão, uma frita assada em forno, uma batata chip ou batata dourada (hash brown) produzida de um tubérculo da presente invenção pode ter entre 1-20 ppb, 20-40 ppb, 40-60 ppb, 60-80 ppb, 80-100 ppb, 100-120 ppb, 120-140 ppb, 140-160 ppb, 160-180 ppb ou 180-200 ppb de acrilamida. A presente invenção não está limitada a reduzir o nível de acrilamida em fritas e chips produzidas de tubérculos. Outros alimentos podem ser manipulados de acordo com a presente invenção para reduzir os níveis de acrilamida.

Os níveis de acrilamida em cereais matutinos podem ser reduzidos de cerca de 50-250 ppb para níveis abaixo de 40 ppb, e preferencialmente para níveis abaixo de 20 ppb.

Os níveis de acrilamida em bolachas, como Dare Breton Thin Wheat Crackers e Wasa Original Crispbread Fiber Rye, podem ser reduzidos de cerca de 300-500 ppb para níveis abaixo 100 ppb, e preferencialmente para níveis abaixo de 50 ppb.

Os níveis de acrilamida em chocolate, como Ghirardelli Unswee-tened Cocoa ou Hershey's Cocoa, podem ser reduzidos de cerca de 300-900 ppb para níveis abaixo de 200 ppb e preferencialmente para níveis abaixo de 50 ppb.

Os níveis de acrilamida em biscoitos podem ser reduzidos de cerca de 50-200 ppb para níveis abaixo de 40 ppb e preferentemente para níveis abaixo de 20 ppb.

Os níveis de acrilamida em café moído podem ser reduzidos de cerca de 175-350 ppb para níveis abaixo de 60 ppb, e preferencialmente para níveis abaixo de 30 ppb.

Os níveis de acrilamida no pão integral podem ser reduzidos de cerca de 50-150 ppb para níveis abaixo de 30 ppb e, de preferência, para níveis abaixo de 15 ppb.

Deve-se entender que muitos fatores influenciam os níveis de a-crilamida no produto alimentício final. Esses fatores incluem o cultivo, a variedade, as condições de crescimento, as condições de armazenamento da semente ou do tubérculo colhido e as variáveis de processamento, tais como a temperatura de aquecimento, o período de aquecimento, o tipo de óleo usado na fritura e a superfície exposta. A aplicação dos métodos descritos na presente invenção reduzirão os níveis de acrilamida por pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 90%.

Breve Descrição dos Desenhos Figura 1: Diagrama de (A) pSIM1148, (B) pSIM1151 e (C) pSIM658. LB = terminação esquerda do T-DNA, P:Agp = promotor Agp da batata, 2a = cópia anti-senso de um fragmento do gene ast2, Ia= cópia anti-senso de um fragmento do gene astl, Ib= cópia senso de um fragmento do gene astl, 2b= cópia senso de um fragmento do gene ast2, P:Gbss = promotor Gbss da batata, T:nos = terminador do gene nopali-na sintetase da Agrobacterium, P:nos = promotor do gene nopalina sintetase da Agrobacterium, RB = terminação direita do T-DNA, P:Ubi7 = promotor do gene de Ubiquitina-7 da batata.

Figure 2: Construção Russet Boise. PF= fragmento do promotor, GF = fragmento do gene.

Descrição Detalhada das Implementações Desejáveis A presente invenção proporciona seqüências polinucleotídicas e métodos para reduzir os níveis de acrilamida. A presente invenção usa termos e frases que são bem conhecidos daqueles que praticam a técnica. A menos que sejam definidos de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que normalmente entendido por um indivíduo com habilidade média na arte a qual esta invenção pertence. Em geral, a nomenclatura usada aqui e os procedimentos laboratoriais em cultivo de células, genética molecular e química e hibridização de ácidos nucléicos são aqueles bem conhecidos e comumente empregados na arte. As técnicas padrões são usadas para métodos de ácido nucléico recombinante, síntese de polinucleotídeo, cultivo microbiano, cultivo celular, cultivo de tecidos, transformação, transfecção, transdução, química analítica, química orgânica sintética, síntese química, análise química e formulação e distribuição farmacêutica. Em geral, as etapas de reações enzimáticas, purificação e/ou isolamento foram realizadas de acordo com as especificações do fabricante. As técnicas e procedimentos são geralmente realizados de acordo com a metodologia convencional (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd. edition, editado por Sambrook & Russel Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001).

Acrilamida: A acrilamida como monômero é considerada tóxica, afetando diretamente o sistema nervoso. Pode ser considerada um carcinógeno. A acrilamida é prontamente absorvida de soluções aquo-sas pela pele sem proteção. A fórmula molecular é C3H5NO; estrutural: CH2=CH-CO-NH2.

Agrobacterium ou transformação bacteriana: como é bem conhecido na área, as Agrobacteria que são usadas para transformar células vegetais são derivados desarmados e virulentos de, normalmente, Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. Ao infectarem plantas, explantes, células ou protoplastos, a Agrobacterium transfere um segmeno de DNA de um vetor plasmidial para o núcleo da célula vegetal. O vetor tipicamente contém o polinucleotídeo desejado, que está localizado entre as terminações de um T-DNA ou P-DNA. Entretanto, qualquer bactéria capaz de transformar uma célula vegetal pode ser usada, como Rhizobium trifolii, Rhizobium leguminosarum, PhyUobacterium myrsinaceamm, SinoRhizobium meliloti e MesoRhizobi-um loti.

Angiosperma: plantas vasculares que possuem sementes acon-dicionadas em um ovário. As angiospermas são plantas com sementes que produzem flores, as quais produzem frutos. As angiospermas são divididas em plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas.

Biossíntese de asparagina: reações enzimaticamente catalisadas que ocorrem em uma planta para produzir asparagina.

Metabolismo de asparagina: reações enzimaticamente catalisadas que ocorrem em uma planta para converter asparagina em outros compostos.

Asparaginase: Asparaginase, a qual é encontrada em várias plantas, animais e células bacterianas, é uma enzima envolvida no metabolismo de asparagina. Ela catalisa a desaminação da asparagina para produzir ácido aspártico e um íon de amônio, resultando numa diminuição de asparagina em circulação livre.

Asparagina sintetase: Essa enzima está envolvida na biossíntese da asparagina e catalisa a síntese de asparagina a partir do asparta-to.

Resistência a antibióticos: a habilidade de uma célula de sobreviver na presença de um antibiótico. A resistência a antibióticos, como empregada aqui, resulta da expressão de gene de resistência a antibióticos na célula hospedeira. Uma célula pode ter resistência a qualquer antibiótico. Exemplos de antibióticos comumente usados incluem a canamicina e a hidromicina.

Planta dicotiledônea (dicot): uma planta que floresce cujos embriões têm duas metades de uma semente ou cotilédones, vasos foliares que se ramificam e partes florais em múltiplos de quatro ou cinco. Exemplos de dicots incluem, mas sem limitação, batata, beterraba, brócolis, mandioca, batata doce, pimenta, poinsétia, feijão, soja e abacate.

Endógeno: ácido nucléico, gene, polinucleotídeo, molécula de DNA, RNA, mRNA ou cDNA que é isolado do genoma de uma planta ou espécie de planta que será transformada ou que é isolado de uma planta ou espécie que é compatível sexualmente ou interfértil com a espécie vegetal a ser transformada, é “nativa” da, i.e., indígena a, da espécie vegetal.

Cassete de expressão: um polinucleotídeo consistindo em 5' para 3', (a) um primeiro promotor, (b) uma seqüência contendo (i) pelo menos uma cópia de um gene ou fragmento de gene, ou (ii) pelo menos uma cópia de um promotor de um gene, e (c) um terminador ou um segundo promotor que está posicionado na orientação oposta do primeiro promotor.

Exógeno: “exógeno,” quando se está referindo a um ácido nu-cléíco, significa que aquele ácido nucléico é derivado de organismos não vegetais ou derivado de uma planta que não é da mesma espécie da planta a ser transformada ou não é derivado de uma planta que não é interfértil com a planta a ser transformada, não pertence a espécie da planta alvo. De acordo com a presente invenção, DNA ou RNA exógeno representa ácidos nucléicos que ocorrem naturalmente na constituição genética de fungos, bactérias, vírus, mamíferos, peixes ou aves, mas não ocorrem naturalmente na planta a ser transformada. Assim, um ácido nucléico exógeno é um que codifica, por exemplo, um polipeptídeo que não é naturalmente produzido pela planta transformada. Um ácido nucléico exógeno não tem que codificar um produto protéico.

Gene: Um gene é um segmento de uma molécula de DNA que contém toda a informação necessária para a síntese de um produto, cadeia polipeptídica ou molécula de RNA que inclui tanto seqüências codificantes quanto não codificantes. Um gene pode representar também múltiplas seqüências, sendo que cada uma pode ser expressa independentemente, e pode codificar proteínas levemente diferentes que apresentam a mesma atividade funcional. Por exemplo, os genes da asparagína sintetase 1 e 2 podem, em conjunto ser referidos como um gene.

Elemento genético: um “elemento genético” é qualquer sequência nucleotídica discreta, como, mas não limitada a, um promotor, gene, terminador, intron, acentuador, região não traduzida 5', região não traduzida 3' ou sítio de reconhecimento de recombinase.

Modificação genética: introdução estável de DNA no genoma de certos organismos pela aplicação de métodos de biologia molecular e celular.

Gimnosperma: como empregado aqui, esse termo se refere a plantas com sementes que produzem sementes sem ovários. Exemplos de gimnospermas incluem coníferas, cicas, nogueiras do Japão e Ephedras.

Introdução: como empregado aqui, esse termo se refere à inserção de uma seqüência de ácido nucléico em uma célula por métodos que incluem infecção, transfecção, transformação e transdução.

Plantas monocotiledôneas (monocotj: uma planta que floresce e que tem embriões com um cotilédone ou folha na semente, vasos foliares paralelos e partes florais em múltiplos de três. Exemplos de monocots incluem milho, arroz, aveia, trigo, cevada e sorgo.

Nativo: ácido nucléico, gene, polinucleotídeo, molécula de DNA, RNA, mRNA ou cDNA que é isolado do genoma de uma planta ou espécie de planta que será transformada ou que é isolado de uma planta ou espécie que é compatível sexualmente ou interfértil com a espécie vegetal a ser transformada, é “nativa” da, i.e., indígena a, da espécie vegetal. DNA nativo: ácido nucléico, gene, polinucleotídeo, molécula de DNA, RNA, mRNA ou cDNA que é isolado do genoma de uma planta ou espécie de planta que será transformada ou que é isolado de uma planta ou espécie que é compatível sexualmente ou interfértil com a espécie vegetal a ser transformada, é “nativa” da, i.e., indígena a, da espécie vegetal. Em outras palavras, um elemento genético nativo representa todo material genético que está acessível àqueles que cultivam as plantas para a melhoria destas por meio de cruzamento vegetal clássico. Qualquer variante de ácido nucléico nativo também é considerada “nativa” de acordo com a presente invenção. Por exemplo, um DNA nativo pode conter uma mutação pontual, já que mutações pontuais ocorrem naturalmente. É também possível ligar dois DNAs nativos diferentes por meio de sítios de restrição, porque esses sítios existem por quase todo os genomas vegetais.

Construção de ácido nucléico nativo: um polinucleotídeo contendo pelo menos um DNA nativo.

Ligado operacionalmente: combinar duas ou mais moléculas de maneira que, em conjunto, elas funcionem de maneira apropriada em uma célula vegetal. Por exemplo, um promotor é ligado operacionalmente a um gene estrutural quando o promotor controla a transcrição do gene estrutural.

Sobreexpressão: expressão de um gene a níveis que são maiores do que aqueles que existem em plantas não transgênicas.

P-DNA: a seqüência de terminação do DNA de transferência de origem vegetal (“P-DNA”) da presente invenção não é idêntica em seqüência de nucleotídeo à seqüência de terminação de DNA de transferência de origem bacteriana, mas ela funciona para essencialmente a mesma função. Ou seja, o P-DNA pode ser usado para transferir e integrar um polinucleotídeo no outro. UM P-DNA pode ser inserido em um plasmídeo indutor de tumores, como o plasmídeo Ti de Agrobacteri-um, no lugar de um T-DNA convencional, e mantido em uma cepa bacteriana, assim como plasmídeos convencionais de transformação. O P-DNA pode ser manipulado de maneira a conter o polinucleotídeo desejado, o qual destina-se à integração no genoma vegetal via transformação vegetal mediada por bactéria. Ver Rommens e colaboradores em WO20Q3/069980, US-2003-0221213, US-2004-0107455 e W02005/004585, as quais estão aqui incorporadas por referência.

Fenótipo: fenótipo é um traço ou característica distintiva de uma planta, a qual pode ser alterada de acordo com a presente invenção pela integração de um ou mais “polinucleotídeos desejados’ e/ou marcadores selecionáveis/triáveis no genoma de pelo menos uma célula vegetal de uma planta transformada. O(s) “polinucleotídeo(s) desejado^)” e/ou marcadores podem efetuar uma mudança no fenótipo de uma planta transformada ao modificar qualquer uma de uma série de características ou propriedades genéticas, moleculares, bioquímicas, fisiológicas, morfológicas e agronômicas da célula vegetal ou planta transformada. Assim, a expressão de um ou mais polinucleotídeos desejados integrados de maneira estável em um genoma vegetal que produz o fenótipo de concentrações reduzidas de acrilamida nos tecidos vegetais.

Tecido vegetal: uma “planta” é qualquer uma de uma série de organismos multicelulares, eucarióticos, fotossintéticos do reino Plantae que produzem embriões, contêm cloroplastos e possuem paredes celulares de celulose. Um aparte da planta, isto é, um “tecido vegetal” pode ser tratado de acordo com os métodos da presente invenção para produzir uma planta transgênica. Vários tecidos vegetais apropriados podem ser transformados de acordo com a presente invenção e incluem, mas sem limitação, embriões somáticos, pólen, folhas, caules, calo, estolões, microtubérculos e brotos. Assim, a presente invenção abrange a transformação de plantas angiospermas e gimnospermas como trigo, milho, arroz, cevada, aveia, beterraba, batata, tomate, alfafa, mandioca, batata doce e soja. De acordo com a presente invenção, “tecido vegetal* também abrange células vegetais. Células vegetais incluem culturas de suspensão, calo, embriões, regiões meristemáticas, tecido do calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen, sementes e microsporos. Os tecidos vegetais podem estar em vários estágios de maturação e podem ser cultivados em cultura líquida ou sólida, ou em solo ou meios apropriados em vasos, estufas ou no campo. Tecido vegetal também se refere a qualquer clone dessa planta, semente, prole, propágulo, quer seja gerado sexuadamente ou assexuadamente, e descendentes destes, como enxertos ou sementes. De particular interesse são a batata, o milho e o trigo.

Transformação vegetal e cultura de células: refere-se amplamente ao processo pelo qual células vegetais são modificadas geneticamente e transferidas para um meio de cultura vegetal apropriado para manutenção, crescimento adicional e/ou desenvolvimento adicional. Esses métodos são bem conhecidos para aqueles com habilidade na arte.

Processamento: o processo de produzir um alimento a partir de (1) uma semente de, por exemplo, trigo, milho, café ou cacau, (2) um tubérculo de, por exemplo, batata, ou (3) da raiz de, por exemplo, batata doce e inhame, que consiste de aquecimento a pelo menos 120°C. Exemplos de alimentos processados incluem pão, cereal matutino, tortas, bolos, torrada, biscoitos, cookies, pizza, pretzels, tortilha, batata frita, fritas assadas, batata chips, batata dourada e café e cacau torrados.

Prole: uma “prole” da presente invenção, como a prole de uma planta transgênica, é uma que nasceu, ou foi gerada, ou derivada de uma planta ou planta transgênica. Assim, uma planta da “prole”, isto é, uma planta da geração “Fl” é um filho ou descendente da planta transgênica produzida pelos métodos inventivos. Uma prole de uma planta transgênica pode conter em pelo menos um, alguns ou todos os genomas de suas células, o polinucleotídeo desejado que foi integrado na célula da planta transgênica mãe pelos métodos descritos aqui. Assim, o polinucleotídeo desejado é “transmitido” ou “herdado” pela planta da prole. O polinucleotídeo desejado que é herdado pela planta da prole pode estar localizado dentro de uma construção de T-DNA ou P-DNA, a qual também é herdada pela planta da prole da sua mãe. O termo “prole”, como usado aqui, também pode se referir aos filhos ou descendentes de um grupo de plantas.

Promotor: por promotor pretende-se designar um ácido nucléi-co, de preferência DNA que se liga à RNA polimerase e/ou a outros elementos reguladores de transcrição. Como com qualquer promotor, os promotores da invenção atual facilitarão ou controlarão a transcrição de DNA ou RNA para gerar uma molécula de mRNA a partir de uma molécula de ácido nucléico que está ligada operacionalmente ao promotor. Como explicado anteriormente, o RNA gerado pode codificar uma proteína ou polipeptídeo ou pode codificar uma molécula de RNA de interferência ou anti-senso.

Um promotor é uma seqüência de ácido nucléico que permite que um gene com o qual esteja associado seja transcrito. Em procario-tos, um promotor consiste normalmente de duas pequenas seqüências nas posições -10 e -35 acima do gene, ou seja, antes do gene na direção da transcrição. A seqüência em -10 é chamada de Pribnow box e geralmente consiste de seis nucleotídeos TATAAT. O Pribnow box é essencial para começar a transcrição em procariotos, A outra seqüência em -35 consiste em seis nucleotídeos TTGACA, cuja presença facilita a taxa de transcrição.

Os promotores eucarióticos são mais diversos e, por isso, mais difíceis de caracterizar, mesmo assim há certas características fundamentais. Por exemplo, os promotores eucarióticos normalmente se encontram acima do gene ao qual estão mais imediatamente associados. Os promotores podem ter elementos reguladores localizados a várias quilobases de distância do sítio de início da transcrição, embora certas conformações estruturais terciárias do complexo transcricional possam fazer com que o DNA dobre, o que faz com que os elementos reguladores se aproximem do sítio real de transcrição. Muitos promotores eucarióticos contêm uma seqüência “TATA box”, que normalmente é identificada pela seqüência nucleotídica TATAAA. Esse elemento se liga à proteína de ligação TATA, a qual auxilia na formação do complexo transcricional da RNA polimerase. A TATA box normalmente reside nem um raio de 50 bases do sítio de início da transcrição.

Os promotores eucarióticos também são caracterizados pela presença de certas seqüências reguladoras que se ligam a fatores de transcrição envolvidos na formação do complexo transcricional. Um exemplo é a E-box identificada pela seqüência CACGTG, a qual se liga a fatores de transcrição na família hélice-básica-hélice-laço. Também há regiões nas quais o conteúdo de nucleotídeo GC é alto.

Logo, de acordo com a presente invenção, uma seqüência parcial, ou um “fragmento” específico de promotor de um promotor, por exemplo, do gene da asparagina sintetase, que pode ser usado na produção de um polinucleotídeo pretendido da presente invenção, pode ou não conter um ou mais desses elementos ou nenhum desses elementos. Numa modalidade, um fragmento de seqüência de um promotor da presente invenção não é funcional e não contém uma TATA box.

Outra característica da construção da presente invenção é que ela promove a transcrição convergente de uma ou mais cópias do polinucleotídeo que não está, ou não estão, ligada operacionalmente a um terminador, por meio de dois promotores opostos. Devido à ausência de um sinal de terminação, o comprimento do pool de moléculas de RNA que é transcrito do primeiro e segundo promotores pode ser de vários tamanhos. Às vezes, por exemplo, a maquinaria transcricional pode continuar a transcrever além do último nucleotideo que significa o “fim” da seqüência do polinucleotídeo desejado. Por isso, neste arranjo em particular, a terminação da transcrição pode ocorrer pela ação fraca e não intencional de seqüências mais baixas que, por exemplo, promovem a formação de hairpin, ou pela ação de terminadores transcricionais não intencionais localizados no DNA vegetal que flanqueia o sítio de integração do DNA de transferência. O polinucleotídeo desejado pode estar ligado ao promotor em duas diferentes orientações. Numa orientação, por exemplo, “senso”, pelo menos a parte 5' do transcrito de RNA resultante compartilhará identidade de seqüência com pelo menos uma parte de pelo menos um transcrito-alvo. Na outra orientação, designada “anti-senso”, pelo menos a parte 5' do transcrito esperado será idêntica ou homóloga a pelo menos parte do complemento inverso de pelo menos um transcrito-alvo.

Um promotor vegetal é um promotor capaz de iniciar a transcrição em células vegetais, mesmo que a sua origem não seja em células vegetais. Exemplos de promotores vegetais incluem, mas não estão limitados àqueles obtidos de plantas, vírus de plantas e bactérias, como Agrobacterium ou Rhizobium, as quais contêm genes expressos em células vegetais. Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em certos tecidos, como no xilema, nas folhas, nas raízes e nas sementes. Esses promotores são chamados de promotores preferenciais de tecido. Os promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos são chamados de promotores tecído-específicos. Um promotor específico de um tipo de células direciona primariamente a expressão em certos tipos de células em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes e folhas. Um promotor induzível ou reprimível é um promotor que está sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas ou a presença de luz. Os promotores tecido-específicos, preferenciais de tecido, específicos de tipo celular e induzíveis constituem a classe dos promotores não-constitutivos, Um promotor constitutivo é um promotor que está ativo sob a maioria das condições ambientais e na maioria das plantas.

Polinucleotídeo é uma sequência nucleotídica que consiste de uma seqüência codificante de um gene ou um fragmento desta {contendo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos, sendo desejável pelo menos 30 nucleotídeos consecutivos, e sendo mais desejável ainda pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos), um promotor, um intron, uma região acentuadora, um sítio de poliadenilação, um sítio de iniciação de transcrição, regiões 5' ou 3' não traduzíveis, um gene repórter, um marcador selecionâvel ou similar. O polinucleotídeo pode conter DNA ou RNA de fita simples ou fita dupla. O polinucleotídeo pode conter bases modificadas ou um arcabouço modificado. O polinucleotídeo pode ser genômico, um transcrito de RNA (como mRNA) ou uma seqüência nucleotídica processada (como um cDNA). O polinucleotídeo pode conter uma seqüência nas orientações senso ou anti-senso.

Um polinucleotídeo isolado é uma seqüência polinucleotídica que não está no seu estado nativo, por exemplo, o polinucleotídeo é composto de uma seqüência nucleotídica não encontrada na natureza, ou o polinucleotídeo está separada de seqüências nucleotídicas com as quais está normalmente próximo, ou está próximo a seqüências nucleo-tídicas com as quais normalmente não está perto, Semente: uma “semente” pode ser considerada um óvulo vegetal maduro que contém um embrião e uma parte propagativa de uma planta, como um tubérculo ou um esporo. Uma semente pode ser incubada antes da transformação mediada por Agrobacterium, no escuro, por exemplo, para facilitar a germinação. Uma semente pode também ser esterilizada antes da incubação, como com um rápido tratamento com água sanitária. A plântula resultante pode então ser exposta à cepa desejada de Agrobacterium.

Marcador selecionável/triável: um gene que, se expresso em plantas ou tecidos vegetais, toma possível distingui-los de outras plantas ou tecidos vegetais que não expressam esse gene. Os procedimentos de triagem podem requerer ensaios para a expressão das proteínas codificadas pelo gene marcador triável. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem o gene da neomicina fosfotransferase (NptII) codificando resistência para a canamicina e a geneticina, o gene da higromicina fosfotransferase (Hptll) codificando resistência para a higromicina e outros genes similares conhecidos na técnica.

Características sensoriais: painéis de indivíduos treinados profissionalmente podem avaliar produtos alimentícios em relação a suas características sensoriais, como aparência, sabor, aroma e textura. Uma avaliação de batatas fritas que foram obtidas de tubérculos cujos níveis de expressão gênica de RI e fosforilase-L foram regulados negativamente é descrita no Exemplo 4. Batatas fritas de tubérculos descritos no Exemplo 5 também apresentarão características sensoriais melhoradas. Assim, a presente invenção contempla o melhoramento das características sensoriais de um produto vegetal obtida de uma planta que foi modificada de acordo com a presente invenção para a manipular as suas vias de biossíntese e metabolismo de asparagina.

Identidade de seqüência: como usada aqui, “identidade de seqüência” ou “identidade” no contexto de duas sequências de ácido nucléico ou polipeptídeos se refere aos resíduos nas suas seqüências que são os mesmos quando alinhados para correspondência máxima em uma região específica. Quando a percentagem de identidade de seqüência é usada em referência a proteínas, se reconhece que a posição dos resíduos que não são idênticas costumam diferir devido a substituições conservadas de aminoácido, nas quais os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicida-de) e, por isso, não alteram as propriedades funcionais da molécula, Nos locais onde as seqüências diferem em substituições conservadas, a percentagem da identidade de seqüência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservada da substituição. Diz-se que as seqüências que divergem devido a essas substituições conservadas tem “similaridade de seqüência” ou “similaridade”. Os meios para fazer esse ajuste são bem conhecidos daqueles com habilidade na arte. Normalmente, isso envolve contar uma substituição conservada com um erro parcial em vez de total, aumentando assim a percentagem de identidade de seqüência. Assim, por exemplo, se ura aminoácido idêntico receber um valor e uma substituição não conservada receber um valor zero, uma substituição conservada recebería um valor entre zero e 1. A contagem de substituições conservadas é calculada, por exemplo, de acordo com o algoritmo de Meyers e Miller, Computer Applic. Biol. ScL, 4: 11 17 (1988), por exemplo, como implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, EUA).

Como empregada aqui, percentagem da identidade de seqüência significa o valor determinado pela comparação de duas seqüências alinhadas de maneira ótima sobre uma janela de comparação, sendo que a porção da sequência polinucleotídica na janela de comparação pode conter adições ou deleções (isto é, falhas) quando comparada com a sequência referência (a qual não contém adições ou deleções), para o alinhamento ótimo das duas sequências. A percentagem é calculada determinando-se o número de posições nas quais a base de ácido nucléico ou. resíduo de aminoãcido idênticos ocorre em ambas as sequências para produzir um número de posições corretas, dividindo-se o número de posições corretas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para chegar-se à percentagem de identidade de sequência. A “identidade de sequência" possui um significado reconhecido na arte e pode ser calculada usando técnicas publicadas. Ver Computa-tional Molecular Biology, Lesk, ed. (Oxford University Press, 1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, ed. (Academic Press, 1993), Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin & Griffin, eds., (Humana Press, 1994), Sequence Analysis in Molecular Biology, Von Heinje ed., Academic Press (1987), Sequence Analysis Primer, Gribskov & Devereux, eds. (Macmillan Stockton Press, 1991) e Carillo & Lipton, SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988). Os métodos comumente empregados para determinar identidade ou similaridade entre duas sequências incluem, mas não estão limitados àquelas mostradas em Guide To Huge Computers, Bishop, ed., (Academic Press, 1994) e Carillo & Lipton, supra. Os métodos para determinar identidade de similaridade estão codificados em programas de computador. Os métodos computacionais preferidos para determinar identidade e similaridade entre duas seqüências incluem, mas sem limitação, o pacote de programas GCG (Devereux e colaboradores, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul e colabo- radores, J, Mol Biol 215: 403 (1990)), e FASTDB (Brutlag e colaboradores, Comp. App. Biosci. 6: 237 (1990)).

Silenciamento: a transcrição unidirecional e não interrompida de genes ou fragmentos de genes do promotor ao terminador pode ativar o silenciamento pós-transcricional dos genes alvo. Os cassetes de expressão iniciais para o silenciamento pós-transcricional de genes em plantas consistiam de um único fragmento de gene posicionado em uma orientação anti-senso (McCormick e colaboradores, patente norte-americana 6617496; Shewmaker e colaboradores, Patente US 5.107.065) ou senso (van der Krol e colaboradores, Plant Cell 2:291-299, 1990) entre sequências reguladoras de iniciação e terminação de transcrito. Em Arabidopsis, o reconhecimento dos transcritos resultantes por polimerase de RNA dependente de RNA leva a produção de RNA de fita dupla (ds). A divagem desse dsRNA por proteínas tipo Dicer (Del), como Dcl4, gera pequenos RNAs de interferência (siRNAs) de 21 nucleotídeos (nt), Esses siRNAs complexam com proteínas, incluindo membros da família Argonaute (Ago) para produzir complexos silenciadores induzidos por RNA (RISCs). Os RISCs atacam então RNAs homólogos para divagem endonucleolítica.

Construções mais eficazes de silenciamento contêm tanto o componente senso quanto o anti-senso, produzindo moléculas de RNA que se dobram em estruturas de hairpvn (Waterhouse e colaboradores, Proc NatlAcad. Sei USA 95: 13959-13964, 1998). Supôs-se que os altos níveis de dsRNA produzidos pela expressão de repetições invertidas de genes trans promovessem a atividade de múltiplos Deis. A análise de knockouts combinatórios de Del em Arabidopsis deram suporte a essa idéia e também identificaram Dcl4 como sendo uma das proteínas envolvidas na divagem do RNA.

Um componente das construções convencionais de silenciamen- to gênico baseadas em RNA senso, anti-senso e fita dupla (ds) é o terminador transcricional. WO 2006/036739 mostra que esse elemento regulador se toma obsoleto quando fragmentos de gene são dispostos entre dois promotores funcionalmente ativos e orientados em direções opostas. A transcrição convergente resultante ativa um silenciamento gênico que é pelo menos tão eficaz quanto a transcrição unidirecional “promotor ao terminador'’. Além de RNAs curtos de vários tamanhos e não poliadenilados, o cassete sem terminador produziu transcritos mais longos e raros que alcançam o promotor no flanco. A substituição de fragmentos gênicos por seqüências derivadas de promotores aumentou ainda amais a extensão do silenciamento gênico.

Numa modalidade desejável da presente invenção, o polinucleo-tídeo desejado contém uma seqüência parcial de um promotor do gene alvo ou uma seqüência parcial que compartilhe identidade com uma porção do promotor do gene alvo. Logo, o polinucleotídeo pretendido da presente invenção contém um fragmento específico de um promotor de interesse do gene alvo. O polinucleotídeo desejado pode estar ligado operacionalmente a um ou mais promotores funcionais. Várias construções contempladas pela presente invenção incluem, mas não estão limitadas à (1) uma construção na qual o polinucleotídeo desejado contém um ou mais fragmentos de seqüência do promotor que está ligado operacionalmente nas duas bordas a promotores 'drivers' funcionais. Esses dois promotores funcionais estão dispostos em uma orientação convergente, de maneira que cada fita do polinucleotídeo desejado seja transcrita; (2) uma construção na qual o polinucleotídeo desejado está ligado operacionalmente a um promotor funcional na sua terminação 5' ou 3', e o polinucleotídeo desejado também está ligado operacionalmente, na sua terminação que não está ligada ao promotor, a uma seqüência termina- dora funcional; (3) uma construção na qual o polinucleotídeo desejado está ligado operacionalmente a um promotor funcional na sua terminação 5' ou 3', mas na qual o polinucleotídeo desejado não está ligado operacionalmente a um terminador; ou (4) um cassete no qual o polinucleotídeo desejado contém um ou mais fragmentos de sequência do promotor, mas não está ligado operacionalmente a qualquer promotor ou terminador, Logo, uma construção da presente invenção pode conter dois ou mais promotores 'driver1 que flanqueiam um ou mais polinucleotídeos desejados ou que flanqueiam cópias do polinucleotídeo desejado, de maneira que ambas as fitas do polinucleotídeo desejado sejam transcritas. Ou seja, um promotor pode estar orientado para iniciar a transcrição a partir da terminação 5' de um polinucleotídeo desejado, enquanto um segundo promotor pode estar orientado operacionalmente para iniciar a transcrição a partir da terminação 3' do mesmo polinucleotídeo desejado. Os promotores orientados em direções opostas podem flanquear múltiplas cópias do polinucleotídeo desejado. Logo, o número de cópias pode variar de modo que uma construção contenha 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 ou mais de 100 cópias, ou qualquer número inteiro entre estes, do polinucleotídeo desejado, o qual pode ser flanqueado pelos promotores 'driver1 que estão orientados para induzir transcrição convergente, Se nenhum dos cassetes contiver uma sequência terminadora, então essa construção, por virtude do arranjo de transcrição convergente, pode produzir transcritos de RNA que têm comprimentos diferentes, Nesse caso, portanto, podem existir subpopulações de transcritos de RNA parcialmente ou totalmente transcritos que contêm seqüên-cias parciais ou completas do polinucleotídeo desejado transcrito do cassete respectivo. Alternativamente, na ausência de um terminador funcional, a maquinaria de transcrição pode ultrapassar o fim do polinucleotídeo desejado para produzir um transcrito que é mais longo que o polinucleotídeo desejado.

Numa construção que contém duas cópias do polinucleotídeo desejado, portanto, em que um dos polinucleotídeos pode ou não estar orientado na direção complementar inversa ao outro, e onde os polinucleotídeos estão ligados operacionalmente a promotores para induzir uma transcrição convergente, e não há um terminador funcional na construção, a maquinaria de transcrição que inicia a partir de um polinucleotídeo desejado pode seguir transcrevendo a outra cópia do polinucleotídeo desejado e vice-versa. As múltiplas cópias do polinucleotídeo desejado podem estar orientadas em várias permutações: no caso em que as duas cópias do polinucleotídeo desejado estão presentes na construção, as cópias podem, por exemplo, estar orientadas na mesma direção, em uma orientação reversa em relação a outra, ou na orientação complementar inversa a outra, por exemplo.

No arranjo em que um dos polinucleotídeos desejados está orientado na orientação complementar inversa ao outro polinucleotídeo, um transcrito de RNA pode ser produzido que contenha não apenas a sequência “senso” do primeiro polinucleotídeo, mas também a sequência “anti-senso” do segundo polinucleotídeo. Se o primeiro e segundo polinucleotídeos contêm a mesma ou a substancialmente mesmo seqüência de DNA, então, um único transcrito de RNA pode conter duas regiões que são complementares entre si e que podem, portanto, se ligar. Logo, esse único transcrito de RNA que é assim transcrito pode formar uma estrutura dupla hairpin parcial ou completa.

Por outro lado, se duas cópias desse transcrito longo forem produzidas, uma de cada promotor, então existirão duas moléculas de RNA, cada uma das quais compartilharia regiões de complementaridade de seqüência com a outra. Logo, a região “senso” do primeiro transcrito de RNA pode se ligar com a região “anti-senso” do segundo transcrito de RNA e vice versa. Nesse arranjo, portanto, outra dupla de RNA pode ser formada, a qual consistirá de dois transcritos de RNA separados, ao contrário da dupla hairpin que forma de um único transcrito de RNA autocomplementar.

Altemativamente, duas cópias do polinucleotídeo desejado podem estar orientadas na mesma direção, de maneira que, no caso de transcrição read-fkrough, o transcrito de RNA longo que é produzido a partir de um promotor possa conter, por exemplo, a seqüência senso da primeira cópia do polinucleotídeo desejado e também a seqüência senso da segundo cópia do polinucleotídeo desejado. O transcrito de RNA que é produzido a partir do outro promotor orientado convergentemente, portanto, pode conter a seqüência anti-senso da segunda cópia do polinucleotídeo desejado e também a seqüência anti-senso da primeira cópia do polinucleotídeo desejado. Dessa maneira, é provável que nenhum dos transcritos de RNA contivesse regiões de complementaridade exata e, portanto, nenhuma dos transcritos de RNA se dobraria sobre si mesmo para produzir uma estrutura hairpin. Por outro lado, os dois transcritos individuais de RNA poderíam hibridizar e se ligar um ao outro para formar uma dupla de RNA.

Logo, Num aspecto, a presente invenção fornece uma construção que não tem um terminador ou que não tem um terminador que é precedido por uma região de DNA codificando uma ribozima autospli-cing, mas que contém um primeiro promotor que está ligado operacionalmente ao polinucleotídeo desejado, Tecido: qualquer parte de uma planta que é usada para produzir um alimento. Um tecido pode ser um tubérculo de batata, uma raiz de batata doce ou uma semente de um milho.

Terminadores transcricionais: As construções de expressão de DNA da presente invenção normalmente têm uma região de terminação transcricional na borda oposta à região reguladora de iniciação de transcrição. A região de terminação transcricional pode ser selecionada para a estabilidade do mRNA de maneira a melhorar a expressão e/ou para a adição de caudas de poliadenilação ao produto da transcrição do gene. A tradução de um polipeptídeo nascente sofre terminação quando um dos três códons de terminação de cadeia entra no sítio A do ribossomo. Os códons de terminação de tradução são UAA, UAG, and UGA.

Na presente invenção, os terminadores de transcrição são derivados a partir de um gene ou, preferivelmente, de uma seqüência que não represente um gene, mas sim DNA intergênico. Por exemplo, a seqüência terminadora do gene da ubiquitina de batata pode ser usada e é mostrada na SEQ ID NO: 5.

DNA de transferência (T-DNA): um DNA de transferência é um segmento de DNA demarcado por terminações de T-DNA ou de P-DNA para criar um T-DNA ou P-DNA, respectivamente. UM T-DNA é um elemento genético que é bem conhecido como um elemento capaz de integrar uma seqüência nucleotídica contida entre as suas terminações em outro genoma. Nesse caso, um T-DNA é flanqueado, tipicamente, por duas seqüências “terminais”. Um polinucleotídeo desejado da presente invenção e uma marcador selecionável podem ser dispostos entre a seqüência terminal esquerda e a seqüência terminal direita do T-DNA. O polinucleotídeo desejado e o marcador selecionável contidos no T-DNA podem estar ligados operacionalmente a uma variedade de ácidos nucléicos específicos de plantas (isto é, nativos) ou exógenos), como elementos reguladores promotores ou terminadores que facilitam sua expressão, isto é, a transcrição e/ou tradução da seqüência de DNA codificada pelo polinucleotídeo desejado ou marcador selecionável.

Transformação de células vegetais: um processo pelo qual um ácido nucléico é inserido de maneira estável no genoma de uma célula vegetal. A transformação pode ocorrer sob condições naturais ou artificiais usando vários métodos bem conhecidos na arte. A transformação pode se valer de qualquer método conhecido para a inserção de seqüências de ácido nucléicos em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, incluindo protocolos de transformação mediados por Agrobacterium, como 'transformação refinada1 ou 'procriação precisa', infecção viral, sondas (whiskers), eletroporação. microinjeção, tratamento com polietileno glicol, choque térmico, lipofecção e bombardeamento de partículas.

Planta transgênica: uma planta transgênica da presente invenção ê uma que contém pelo menos um genoma celular em que um ácido nucléico exógeno foi integrado de maneira estável. De acordo com a presente invenção, uma planta transgênica é uma planta que contém apenas uma célula ou genoma celular modificados geneticamente, ou é uma planta que contém algumas células modificadas geneticamente, ou é uma planta na qual todas as células são geneticamente modificadas. Uma planta transgênica da presente invenção pode ser uma que contém a expressão do polinucleotídeo desejado, isto é, o ácido nucléico exógeno, em certas partes da planta. Assim, uma planta transgênica pode conter apenas células modificadas geneticamente em certas partes de sua estrutura.

Variante: uma “variante”, como usada aqui, significa uma se-qüência de nucleotídeos ou aminoácidos que diverge da seqüência de nucleotídeos ou aminoácidos padrão ou dada de um gene ou proteína. Os termos “isoforma”, “isotipo” e “análogo” também se referem a formas “variantes” de uma seqüência de nucleotídeos ou de aminoácidos. Uma sequência de aminoácido que é alterada pela adição, remoção ou substituição de um ou mais aminoácidos, ou pela mudança da seqüên-cia de nucleotídeos, pode ser considerada uma seqüência “variante”. A variante pode ter mudanças “conservadas”, nas quais o aminoácido substituinte tem propriedades estruturais e químicas similares, for exemplo, substituição de leucina por isoleucina. Uma variante pode ter mudanças “não conservadas”, por exemplo, substituição de glicina por triptofano. Pequenas variações análogas também podem incluir dele-ções, inserções, ou ambas, de aminoácidos. Diretrizes a respeito de quais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou deletados podem ser obtidas usando programas de computador bem conhecidos na arte, como o software Vector NTI Suite (InforMax, MD). “Variante” também pode se referir a um gene “shuffled”, como aqueles descritos em pacientes alocados a Maxygen.

Deve ficar entendido que a presente invenção não está limitada à metodologia, protocolos, vetores e reagentes etc. descritos aqui, já que esses podem variar. Deve ser entendido também que a terminologia usada aqui é usada com o propósito apenas de descrever implementações específicas e não deve ser entendido como uma limitação à abrangência da presente invenção. Deve-se perceber que, como empregado aqui e nas reivindicações, as formas singulares de “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referências plurais, a menos que o contexto afirme claramente outro sentido. Assim, por exemplo, a referência a “um gene” é uma referência a um ou mais genes e inclui equivalentes destes conhecidos daqueles com habilidade na arte e assim por diante. De fato, alguém com conhecimento na técnica pode usar os métodos descritos aqui para expressar qualquer gene nativo (conhecido atualmente ou posteriormente) em sistemas da planta hospedeira.

Seqüências de Polinucleotídeos A presente invenção está relacionada a uma molécula nucléica isolada que consiste de um polinucleotídeo contendo uma sequência selecionada de um grupo consistindo de qualquer uma das seqüências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24, ou 25. A invenção também fornece fragmentos funcionais de seqüências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24, ou 25. A invenção fornece ainda ácidos nucléicos complementares, ou fragmentos destes, a qualquer uma das seqüências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24, ou 25, bem como um ácido nucléico contendo pelo menos 15 bases contíguas, o qual hibridi-za com qualquer uma das seqüências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 1,2, 3,4,9, 10, 14, 15, 23, 24, ou 25.

Por molécula(s) de ácido nucléico “isolada(s)”, nos referimos a uma molécula de ácido nucléico, DNA ou RNA, que foi removida do seu ambiente natural. Por exemplo, moléculas de DNA recombinante contidas em uma construção de DNA são consideradas isoladas para os propósitos da presente invenção. Exemplos adicionais de moléculas de DNA isoladas incluem moléculas de DNA recombinante mantidas em células hospedeiras heterólogas ou moléculas de DNA purificadas (parcialmente ou substancialmente) em solução. Moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vitro das moléculas de DNA da presente invenção. Moléculas de ácido nucléico isoladas, de acordo com a presente invenção, incluem ainda essas moléculas produzidas sinteti-camente.

As moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem estar na forma de RNA, como mRNA, ou na forma de DNA, incluindo, por exemplo, cDNA e DNA genômico obtido por clonagem ou produzido sinteticamente. O DNA ou RNA pode ser fita dupla ou fita simples. 0 DNA de fita simples pode ser a fita codificante, também chamada de fita senso, ou pode ser a fita não codificante, também conhecida como fita anti-senso. A menos que seja indicado diferentemente, todas as seqüências nucleotídícas determinadas aqui através do seqüenciamento de uma molécula de DNA, foram determinadas usando um seqüenciador automático de DNA (como o Modelo 373 da Applied Biosystems, Inc.). Portanto, como é sabido na técnica para qualquer seqüência de DNA determinada por essa abordagem automática, qualquer seqüência nucleotídica determinada assim pode conter alguns erros. As seqüências nucleotídicas determinadas por automação são normalmente pelo menos cerca de 95% idênticas, sendo mais comum que sejam pelo menos cerca de 96% idênticas até pelo menos cerca de 99,9% idênticas à seqüência nucleotídica real da molécula de DNA seqüenciada. A seqüência real pode ser determinada com mais precisão por outras abordagens, incluindo métodos manuais de seqüenciamento de DNA bem conhecidos na arte. Como também é sabido na técnica, uma única inserção ou deleção em uma seqüência nucleotídica determinada comparada à seqüência real causará uma mudança do referencial de leitura na tradução da seqüência nucleotídica, de maneira que a seqüência de aminoácidos esperada codificada por uma seqüência nucleo-tidica determinada pode ser completamente diferente da seqüência de aminoácidos verdadeiramente codificada pela molécula de DNA seqüenciada, começando a partir do ponto dessa inserção ou deleção.

Cada “seqüência nucleotídica” apresentada aqui é apresentada como uma seqüência de desoxiribonucleotídeos (abreviados A, G, C e T). Entretanto, “seqüência nucleotídica” de uma molécula de ácido nucléico ou polinucleotídeo significa, para uma molécula ou polinucleotídeo de DNA, uma seqüência de desoxiribonucleotídeos, e para uma molécula de ou polinucleotídeo de RNA, a seqüência correspondentes de ribonu- cleotídeos (A, G, C e U), na qual cada desoxinucleotideo de timidina (T) na seqüência especificada de desoxinucleotídeos é substituído pelo ribonucleotídeo uridina (U). A presente invenção também está direcionada a fragmentos das moléculas de ácido nucléico isoladas descritas aqui. Preferencialmente, os fragmentos de DNA consistem de pelo menos 15 nucleotídeos, sendo mais desejável pelo menos 20 nucleotídeos, e mais desejáveis ainda pelo menos 30 nucleotídeos, os quais são úteis como sondas de diagnóstico e iniciadores. É claro que fragmentos maiores com até o comprimento total das moléculas de ácido nucléico da presente invenção também são úteis como sondas de diagnóstico, de acordo com técnicas convencionais de hibridização, ou como iniciadores para amplificação da seqüência alvo pela reação em cadeia da polimerase (PCR), como descrita, por exemplo, em Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd. edition, editado por Sambrook & Russel, (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, cujo conteúdo na íntegra está aqui incorporado por referência. Fragmentos de pelo menos 20 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, significa fragmentos que incluem 20 ou mais bases contíguas da seqüência nucleotídica de SEQ ID NOs: 1, 2, 17, 20, 21. Os ácidos nucléicos contendo as seqüências nucleotídicas em SEQ ID NOs: 1, 2, 17, 20, 21 podem ser gerados usando métodos convencionais de síntese de DNA, os quais serão rotineiros para aqueles com habilidade na arte. Por exemplo, divagem com endonucleases de restrição ou quebra por sonicação podem ser facilmente usados para gerar fragmentos de vários tamanhos. Alternativamente, os fragmentos de DNA da presente invenção podem ser gerados sinteticamente de acordo com técnicas conhecidas.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ácido nucléico isolada que consiste de um polinucleotídeo que hibridiza sob condições severas de hibridização a uma porção do polinucleotídeo em uma molécula de ácido nucléico da invenção descrita acima. Polinucleotídeo que hibridiza com uma “porção” de um polinucleotídeo significa um polinucleotídeo (tanto DNA quanto RNA) hibridizando com pelo menos cerca de 15 nucleotídeos, sendo desejável pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, sendo mais desejável pelo menos cerca de 30 nucleotídeos, e sendo mais desejável ainda mais de 30 nucleotídeos. Esses fragmentos que hibrídizam com os fragmentos de referência são úteis como sonda de diagnóstico e iniciadores. Uma sonda, como usada aqui, é definida como sendo pelo menos cerca de 100 bases contíguas de uma das sequências de ácido nucléico apresentadas em SEQ ID NOs: 1-230. Para o propósito desta invenção, duas seqüências hibridizam quando elas formam um complexo de fita dupla em uma solução de hibridização de SSC 6X, SDS 0,5%, solução de Denhardt 5X e 100pg de DNA carrea-dor não específico. Ver Ausubel e colaboradores, seção 2.9, suplemento 27 (1994). As seqüências podem hibridizar em “severidade moderada”, a qual é definida como uma temperatura de 60°C em uma solução de hibridização de SSC 6X, SDS 0,5%, solução de Denhardt 5X e 100gg de DNA carreador não específico. Para hibridização de “alta severidade”, a temperatura é aumentada para 68°C. Após a reação de hibridização de severidade moderada, os nucleotídeos são lavados cinco vezes em uma solução de SSC 2X mais SDS 0,05% em temperatura ambiente, com lavagens subseqüentes com de SSC 0,1X mais SDS 0,1%, a 60°C por 1 h. Para alta severidade, a temperatura do banho é aumentada para 68°C. Para os propósito desta invenção, nucleotídeos hibridizados são aqueles que são detectados usando 1 ng de uma sonda radioativa com uma radioatividade específica de 10.000 cpm/ng, sendo que os nucleotídeos hibridizados são claramente visualizados após exposição a um filme de raios-X a 70°C por não mais que 72 horas. A presente aplicação é dirigida a moléculas de ácido nucléico que são pelo menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à seqüência de ácido nucléico descrita em SEQ ID NOs: 1, 2, 17, 20, 21. São preferidos, no entanto, moléculas de ácido nucléico que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à seqüência de ácido nucléico mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 17, 20, 21. Diferenças entre duas seqüências de ácido nucléico pode ocorrer nas posições terminais 5' e 3’ da seqüência de nucleotídeos referência ou em qualquer lugar entre essas posições terminais, espalhados tanto individualmente entre os nucleotídeos na seqüência de referência quanto em um ou mais grupos contíguos dentro da seqüência de referência.

Como uma questão prática, uma molécula de ácido nucléico em particular ser pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência nucleotídica de referência se refere a uma comparação feita entre duas moléculas usando algoritmos padrões bem conhecidos na arte e pode ser determinada convencionalmente usando programas de computador disponíveis publicamente, como o algoritmo BLASTN, Ver Altschul e colaboradores, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997).

Análise de Seqüências Os métodos de alinhamento de seqüência para comparação são bem conhecidos na arte. O alinhamento ótimo das seqüências para comparação pode ser realizado pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl Math. 2: 482 (1981); pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. MoI. BioL 48: 443 (1970); pelo método de busca por similaridade de Pearson e Lesam, Proc. Natl. Acad. Sei 85: 2444 (1988); por implementações computadorizadas desses algoritmos, incluindo, mas sem limitação: CLUSTAL no programa PC/Gene da Intelligenetics, Mountain View, Califórnia; GAP, BESTFIT5 BLAST, FASTA, e TFASTA no pacote Wisconsin Genetics Software, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, EUA; o programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins e Sharp, Gene 73: 237 244 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151 153 (1989); Corpet e colaboradores, Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1988); Huang e colaboradores, Computer Applications in the Biosci-ences 8; 155-65 (1992), e Pearson e colaboradores, Methods in Molecular Biology 24: 307-331 (1994). A família BLAST de programas que pode ser usada para buscas de similaridade em bancos de dados inclui: BLASTN para consultas de seqüências de nucleotídeos em bancos de dados de seqüências nucleo-tídicas; BLASTX para consultas de seqüências de nucleotídeos em bancos de dados de proteínas; BLASTP para consultas de seqüências de proteínas em bancos de dados de proteína; TBLASTN para consultas de seqüências de proteínas em bancos de dados de seqüências de nucleotídeos; e TBLASTX para consultas de seqüências de nucleotídeos em bancos de dados de nucleotídeos. Ver, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, e colaboradores, Eds., Greene Publishing and Wiley- Interscience, New York (1995); Altschul e colaboradores, J. Mol Biol, 215:403-410 (1990); e Altschul e colaboradores, Nucleic Acids Res, 25:3389-3402 (1997). O software para realizar análises BLAST está disponível publicamente, por exemplo, através do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Esse algoritmo envolve primeiro a identificação de pares de seqüência com valores altos (HSPs) pela identificação de palavras curtas com comprimento W na seqüência de consulta, que combinam ou satisfazem algum valor limite positivo T quando alinhadas com uma palavra de mesmo comprimento na seqüência do banco de dados. T é chamado de valor limite de palavra vizinha (neighborhood worá score threskolá1), Essa identificação inicial de palavra vizinha age como uma semente para iniciar buscas que encontrem HSPs mais longas que as contenham. As identificações de palavras são então estendidas em ambas as direções ao longo de cada seqüência até que o valor acumulado de alinhamento possa ser aumentado. Os valores cumulativos são calculados usando, para seqüências núcleotídicas, os parâmetros M (valor de recompensa para um par de resíduos que combinam; sempre > 0) e N (valor de penalidade para resíduos que não combinam; sempre < 0). Para seqüências de aminoá-cidos, uma matriz de valoração é usada para calcular o valor cumulativo. As extensões da identificação de palavras em cada direção são paradas quando; o valor cumulativo de alinhamento diminui pela quantidade X do valor máximo atingido; o valor cumulativo vai a zero ou menos devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos com valores negativos; ou fim das seqüências é alcançado. Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüências nucleotídicas) usa como base os valores de tamanho de palavra (W) de 11, um esperado (E) de 10, um corte de 100, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as fitas. Para seqüências de aminoácidos, o programa BLASTP as bases de tamanho de palavra (W) de 3, um esperado (E) de 10, e a matriz de valoração BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915).

Além de calcular a percentagem de identidade de seqüência, o algoritmo BLAST também realiza análises estatísticas da similaridade entre duas seqüências (ver, e.g., Karlin & Altschul, Proc. Natl Acad. Sei. USA 90:5873-5877 (1993)). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é menor probabilidade de soma (P(N)), a qual fornece uma indicação da probabilidade de uma combinação entre duas se qüências de nucleotídeos ou aminoácidos ocorrer aleatoriamente. O alinhamento múltiplo das seqüências pode ser realizado u-sando o método de alinhamento CLUSTAL (Higgins e Sharp (1989) CABIOS. 5:151 153) com os parâmetros base (GAP PENALTY=I05 GAP LENGTH PENALTY=IO). Os parâmetros base para alinhamento de pares usando o método CLUSTAL são KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WIN-DOW=5 e DIAGONALS SAVED=5.

Os seguintes parâmetros de operação são preferíveis para a determinação de alinhamentos e similaridades usando BLASTN que contribuem para os valores de E e para as percentagens de identidade para seqüências de polinucleotídeos: comando de operação Unix: blastall -p blastn -d embldb -e 10 -GO -EO -r 1 -v 30 -b 30 -i queryseq -o results; os parâmetros são: -p Nome do programa [String]; -d Banco de dados [String]; -e Valor de expectativa (E) [Real]; -G Custo para abrir a falha (zero ativa o comportamento base) [Integer]; -E Custo para estender a falha (zero ativa o comportamento base) [Integer]; -r Recompensa para uma combinação de nucleotídeo (apenas para blastn) [Integer]; -v Número de descrições de uma linha (V) [Integer]; -b Número de alinhamentos a mostrar (B) [Integer]; -i Consultar arquivo [File In]; e -o BLAST reportar arquivo de resultado [File Out] Optíonal.

As identificações ou “acertos” em uma ou mais seqüências do banco de dados por uma seqüência de consulta produzidas por BLASTN, FASTA, BLASTP ou um algoritmo similar alinham e identificam porções similares das seqüências. Os acertos são arrumados na ordem do grau de similaridade e do comprimento da sobreposição de seqüências. Os acertos em uma seqüência do banco de dados geralmente representam uma sobreposição com apenas uma fração do comprimento da seqüência consultada.

Os algoritmos BLASTN, FASTA e BLASTP também produzem va- lores “esperados" para alinhamentos, O valor Esperado (E) indica o números de acertos aleatórios que podem “esperados” em um certo número de seqüências contíguas, quando se está buscando em um banco de dados de um determinado tamanho. O valor Esperado é usado como um limite de significância para determinar se um acerto em um banco de dados, como o banco de dados EMBL, indicam uma similaridade verdadeira. Por exemplo, um valor E de 0,1 alocado a um acerto de polinucleotídeo é interpretado como significando que em um banco de dados do tamanho do banco de dados EMBL, pode-se esperar 0,1 acerto na porção alinhada da seqüência com um valor similar devido ao acaso. Por esse critério, as porções alinhadas e combinadas das seqüências de nucleotídeos têm então uma probabilidade de 90% de serem a mesma. Para seqüências com um valor E de 0,01 ou menos para porções alinhadas e combinadas, a probabilidade de se encontrar uma combinação ao acaso no banco de dados EMBL é 1% ou menos usando o algoritmo BLAST ou FASTA.

De acordo com uma modalidade, os polinucleotídeos “variantes”, referindo-se a cada um dos polinucleotídeos da presente invenção, contêm preferencialmente seqüências o mesmo número ou menos de ácidos nucléicos do que cada um dos polinucleotídeos da presente invenção e que produzem um valor E de 0,01 ou menos, quando comparados com o polinucleotídeo da presente invenção. Ou seja, um polinucleotídeo variante é qualquer seqüência que tem pelo menos 99% de probabilidade de ser a mesma que a do polinucleotídeo da presente invenção, medido como tendo um valor E de 0,01 ou menos usando os algoritmos BLASTN, FASTA, ou BLASTP ajustados nos parâmetros descritos acima.

Alternativamente, os polinucleotídeos variantes da presente invenção hibridizam com as seqüências polinucleotídicas descritas nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24, ou 25 ou complementos, seqüências reversas, ou complementos reversos dessas sequências, sob condições severas. A presente invenção abrange polinucleotídeos que diferem das seqüências apresentadas, mas que, como conseqüência da degeneração do código genético, codificam um polipeptídeo que é o mesmo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Assim, os polinucleotídeos que contêm seqüências que diferem das seqüências polinucleotídi-cas apresentadas em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24 ou 25; ou complementos, seqüências reversas ou complementos reversos destas, como resultado de substituições conservadas são contemplados e abrangidos pela presente invenção. Além disso, os polinucleotídeos que contêm seqüências que diferem das seqüências polinucleotídicas apresentadas em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4,9, 10, 14, 15, 23, 24, ou 25 ou complementos, seqüências reversas ou complementos reversos destas, como resultado de deleções e/ou inserções que totalizem menos de 10% do comprimento total da seqüência são também contemplados e abrangidos pela presente invenção.

Além de ter uma identidade de seqüência especificada com uma seqüência de polinucleotídeo inventiva, polinucleotídeos variantes preferivelmente têm uma estrutura e/ou características funcionais adicionais em comum com o polinucleotídeo inventivo. Além de compartilharem um alto grau de similaridade em sua estrutura primária com os polinucleotídeos da presente invenção, os polinucleotídeos com um grau de identidade especificado com, ou capazes de hibridizar com um polinucleotídeo inventivo preferivelmente têm pelo menos uma das seguintes características: (i) eles contêm uma região de leitura aberta ou uma região de leitura aberta parcial que codifica um polipeptídeo com substancialmente as mesmas propriedades funcionais do polipep- tídeo codificado pelo polinucleotídeo inventivo; ou(ii) eles possuem domínios em comum.

Fontes de Elementos e Sequências de DNA

Todos e quaisquer elementos e sequências de DNA descritos aqui podem ser endógenos a um ou mais genomas vegetais. Por isso, em uma modalidade em particular da presente invenção, todos os elementos e seqüências de DNA, os quais são selecionados para o cassete final de transferência são endógenos, ou nativos do genoma da planta que será transformada. Por exemplo, todas as seqüências podem vir do genoma da batata. Alternativamente, um ou mais dos elementos ou seqüências de DNA podem ser endógenos de um genoma vegetal que não é o mesmo da espécie da planta a ser transformada, mas que funciona de qualquer maneira na célula vegetal hospedeira. Essas plantas incluem batata, tomate e alfafa. A presente invenção também abrange o uso de um ou mais elementos genéticos de uma planta que seja interfértil com a planta que será transformada.

Nesse caso, a “planta” da presente invenção inclui, mas não está limitada à batata, tomate, abacate, alfafa, beterraba, mandioca, batata doce, soja, ervilha, feijão, milho, trigo, arroz, cevada e sorgo. Assim, a planta pode ser uma monocot ou uma dicot. “Planta” e “material vegetal” também abrangem células vegetais, sementes, prole das plantas, propágulos gerados sexuadamente ou assexuadamente, e descendentes de qualquer um destes, como enxertos e sementes. “Material vegetal” pode se referir a células vegetais, culturas de células em suspensão, calo, embriões, regiões meristemáticas, tecido do calo, folhas raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen, sementes, plântulas em germinação e microsporos. As plantas podem estar em vários estágios de maturação e podem ser cultivadas em cultura líquida ou sólida ou em solo ou era meio apropriado em vasos, estufas e no campo. A expressão de uma seqüência líder, traüer ou gênica pode ser transiente ou permanente.

Nesse caso, uma seqüência terminal de DNA de transferência derivado de planta (“P-DNA”) da presente invenção não é idêntica em seqüência de nucleotídeo a qualquer seqüência terminal conhecida de T-DNA de origem bacteriana, mas ela funciona para essencialmente a mesma função. Ou seja, o P-DNA pode ser usado para transferir e integrar um polinucleotídeo no outro. UM P-DNA pode ser inserido em um plasmídeo indutor de tumores, como o plasmídeo Ti de Agrobacteri-um, no lugar de um T-DNA convencional, e mantido em uma cepa bacteriana, assim como plasmídeos convencionais de transformação. O P-DNA pode ser manipulado de maneira a conter o polinucleotídeo desejado, o qual destina-se à integração no genoma vegetal via transformação vegetal mediada por bactéria. Ver Rommens e colaboradores em W02003/069980, US-2003-0221213, US-2004-0107455 e W02005/004585, que são aqui incorporadas por referência.

Assim, a seqüência terminal de difere por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais nucleotideos de uma seqüência terminal conhecida de T-DNA de uma espécie de Agrobacte-rium, como Agrobacterium tumefatíens ou Agrobacterium rhizogenes.

Uma seqüência terminal de P-DNA não é mais similar do que 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51% ou 50% em seqüência de nucleotideos a uma seqüência terminal de T-DNA de Agrobacterium.

Foram desenvolvidos métodos para identificar e isolar DNAs de transferência de plantas, particularmente de batata e trigo, e fizeram uso do consenso do motivo terminal descrito em US-2004-0107455, o qual é aqui incorporado por referência.

Nesse caso, um DNA derivado de planta da presente invenção, como qualquer uma das sequências, sítios de divagem, regiões ou elementos apresentados aqui, é funcional se promove a transferência e integração de um polinucleotídeo ao qual está ligado em outra molécula de ácido nucléico, como em um cromossomo vegetal, com uma freqüên-cia de transformação de cerca de 99%, cerca de 98%, cerca de 97%, cerca de 96%, cerca de 95%, cerca de 94%, cerca de 93%, cerca de 92%, cerca de 91%, cerca de 90%, cerca de 89%, cerca de 88%, cerca de 87%, cerca de 86%, cerca de 85%, cerca de 84%, cerca de 83%, cerca de 82%, cerca de 81%, cerca de 80%, cerca de 79%, cerca de 78%, cerca de 77%, cerca de 76%, cerca de 75%, cerca de 74%, cerca de 73%, cerca de 72%, cerca de 71%, cerca de 70%, cerca de 69%, cerca de 68%, cerca de 67%, cerca de 66%, cerca de 65%, cerca de 64%, cerca de 63%, cerca de 62%, cerca de 61%, cerca de 60%, cerca de 59%, cerca de 58%, cerca de 57%, cerca de 56%, cerca de 55%, cerca de 54%, cerca de 53%, cerca de 52%, cerca de 51%, cerca de 50%, cerca de 49%, cerca de 48%, cerca de 47%, cerca de 46%, cerca de 45%, cerca de 44%, cerca de 43%, cerca de 42%, cerca de 41%, cerca de 40%, cerca de 39%, cerca de 38%, cerca de 37%, cerca de 36%, cerca de 35%, cerca de 34%, cerca de 33%, cerca de 32%, cerca de 31%, cerca de 30%, cerca de 29%, cerca de 28%, cerca de 27%, cerca de 26%, cerca de 25%, cerca de 24%, cerca de 23%, cerca de 22%, cerca de 21%, cerca de 20%, cerca de 15%, ou cerca de 5% ou pelo menos cerca de 1%.

Qualquer uma dessas seqüências e elementos relacionados à transformação pode ser modificado e mutacionado para alterar a eficiência de transformação. Outras seqüências de polinucleotídeos podem ser adicionadas à sequência de transformação da presente invenção. Por exemplo, ela pode ser modificada para possuir múltiplos sítios de clonagem 5' e 3' ou sítios adicionais de restrição. A seqüência de um sítio de divagem apresentada aqui, por exemplo, pode ser modificada para aumentar a chance que o arcabouço de DNA do vetor que a acompanha não seja integrado no genoma vegetal.

Qualquer polinucleotídeo desejado pode ser inserido entre as se-qüências de divagem ou terminais descritas aqui. Por exemplo, um polinucleotídeo desejado pode ser um gene selvagem ou modificado que é nativo de uma espécie vegetal, ou pode ser um gene de um genoma não vegetal. Por exemplo, quando se transforma uma batata, pode-se fazer um cassete de expressão que contenha um promotor específico de batata ligado operacionalmente a um gene desejado de batata ou fragmento deste e a um terminador específico de batata. O cassete de expressão pode conter elementos genéticos adicionais de batata, como uma seqüência peptídeo-sinal fundida em referencial no terminal 5' do gene, e um acentuador pós-transcricional de batata. A presente invenção não está limitada a esse arranjo e um cassete de expressão pode ser construído de maneira que o polinucleotídeo desejado, embora ligado operacionalmente a um promotor, não está ligado operacionalmente a uma seqüência terminadora.

Quando uma seqüência ou elemento relacionado à transformação, como aqueles descritos aqui, são identificados e isolados de uma planta, e se essa seqüência ou elemento são subseqüentemente usados para transformar uma planta da mesma espécie, essa seqüência ou elemento pode ser descrito como “nativo” daquele genoma vegetal.

Assim, um elemento genético “nativo” se refere a um ácido nu-cléico que existe naturalmente em, se origina de, ou pertence ao genoma de uma planta que será transformada. Na mesma linha, o termo “endógeno” também pode ser usado para identificar um ácido nucléico específico, por exemplo, um DNA ou RNA, ou uma proteína "nativa” da planta. Endógeno significa um elemento que se origina de dentro do organismo. Assim, qualquer molécula de ácido nucléico, gene, polinu-cleotídeo, DNA, RNA, mRNA, ou cDNA que é isolado do genoma de uma planta ou espécie vegetal que será transformada, ou é isolado de uma planta ou espécie que é sexualmente compatível ou interfértil com a espécie de planta a ser transformada, é “nativa”, isto é, indígena, à espécie vegetal. Em outras palavras, um elemento genético nativo representa todo material genético que está acessível aos criadores de planta para a melhoria de plantas pelo cruzamento vegetal clássico. Qualquer variante de um ácido nucléico nativo também é considerada “nativa” de acordo com a presente invenção. Nesse caso, um ácido nucléico “nativo” também pode ser isolado de uma planta ou espécie sexualmente compatível com esta e modificada ou mutacionada de maneira que a variante resultante tenha uma similaridade maior ou igual a 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, ou 60% em sequência de nucleotídeos em relação ao ácido nucléico nativo não modificado isolado da planta. Uma variante de ácido nucléico nativo também pode ter uma similaridade menor do que cerca de 60%, menor do que cerca de 55%, ou menor do que cerca de 50% em seqüência nucleotídica.

Um ácido nucléico “nativo" isolado de uma planta também pode codificar uma variante do produto protéico natural transcrito e traduzido daquele ácido nucléico. Assim, uma ácido nucléico nativo pode codificar uma proteína que tem uma similaridade maior ou igual a 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, ou 60% em seqüência de aminoácidos em relação à proteína nativa e não modificada expressa na planta da qual o ácido nucléico foi isolado.

Promotores Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser usados para direcionar de maneira específica a expressão de polipeptídeos e proteínas nos tecidos das plantas. Os ácidos nucléicos da presente invenção também podem ser usados para direcionar de maneira específica a expressão de RNA anti-senso ou RNA envolvido em RNA de interferência (RNAi), como RNA de interferência pequeno (siRNA), nos tecidos das plantas, o que pode ser útil para inibir ou bloquear completamente a expressão dos genes alvos. Como usado aqui, “produto codificado” significa o produto final do ácido nucléico que está ligado operacionalmente aos promotores. Por exemplo, uma proteína ou polipeptídeo é um produto codificado, bem como RNA anti-senso ou siRNA, que são os produtos finais do ácido nucléico que codifica o RNA anti-senso. O produto codificado pode ser também um mRNA não traduzido. Os termos polipeptídeo e proteína são usados como sinônimos aqui. Como usado aqui, promotor significa um ácido nucléico, de preferência um DNA, que se liga à RNA polimerase e/ou a outros elementos reguladores de transcrição. Como com qualquer promotor, os promotores da presente invenção facilitarão ou controlarão a transcrição de DNA ou RNA para gerar uma molécula de mRNA a partir de uma molécula de ácido nucléico que está ligada operacionalmente ao promotor. O RNA pode codificar uma proteína ou polipeptídeo, ou pode codificar um RNA de interferência ou uma molécula anti-senso. Como usado aqui, “ligado operacionalmente” significa a fusão, ligação ou síntese química de DNA, de maneira que seja formada uma seqüência de combinação promotor-ácido nucléico em uma orientação específica para que a sequência de ácido nucléico seja transcrita em um segmento de RNA. Os promotores da presente invenção também podem conter parte ou toda a região não traduzível 5' (5' UTR) do transcrito de mRNA resultante. Por outro lado, os promotores da presente invenção não necessariamente precisam conter qualquer 5' UTR.

Um promotor, como empregado aqui, também pode incluir elementos reguladores. Por outro lado, um elemento regulador pode também estar separado do promotor. Os elementos reguladores conferem uma série de características importantes à região do promotor. Alguns elementos se ligam a fatores de transcrição para aumentar a taxa de transcrição do ácido nucléico ligado operacionalmente. Outros elementos se ligam a repressores que inibem a atividade de transcrição. O efeito de fatores de transcrição na atividade do promotor pode determinar se a atividade do promotor é alta ou baixa, isto é, se o promotor é “forte" ou “fraco".

Em outra modalidade, um promotor constitutivo pode ser usado para expressar sequências polinucleotidicas inventivas.

Em outra modalidade, vários promotores induzíveis de genes vegetais podem ser usados para expressar as seqüências polinucleotidicas inventivas. Os promotores induzíveis regulam a expressão gênica em resposta a sinais ambientais, hormonais ou químicos. Exemplos de promotores induzíveis por hormônio incluem os promotores induzíveis por auxina (Baumann e colaboradores Plant Cell 11:323-334(1999)), o promotor induzivel por citocinina (Guevara-Garcia Plant Mol. Biol. 38:743-753(1998)) e os promotores que respondem à giberelina (Shi e colaboradores Plant Mol. Biol 38:1053-1060(1998)). Além disso, promotores que respondem a calor, luz, ferimento, resistência a patógeno e produtos químicos, como jasmonato de metila ou ácido salicílico, podem ser usados para expressar as seqüências polinucleotídicas inventivas.

Numa modalidade, o promotor é um promotor de amido sintase ligada ao grânulo, um promotor do gene de ADP-glicose pirofosforilase de batata ou um promotor de flavonóide 3-monooxigenase. Em outra modalidade,o promotor é um promotor especifico de semente. A presente invenção também abrange polinucleotídeos que diferem das seqüências apresentadas, mas que como conseqüência da degeneração do código genético, codificam um polipeptídeo que é o mesmo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Assim, os polinucleotídeos que contêm seqüências que diferem das seqüências polinucleotídicas apresentadas em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24, ou 25; ou complementos, seqüências reversas, ou complementos reversos destas, como resultado de substituições conservadas são contemplados e abrangidos pela presente invenção. Além disso, os polinucleotídeos que contêm seqüências que diferem das seqüências polinucleotídicas apresentadas em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24, ou 25 ou complementos, seqüências reversas, ou complementos reversos destas, como resultado de deleções e/ou inserções que totalizem menos de 10% do comprimento total da seqüência são também contemplados e abrangidos pela presente invenção.

Além de terem uma identidade de seqüência específica em relação a uma seqüência polinucleotídica inventiva, polinucleotídeos variantes têm preferivelmente características estruturais e/ou funcionais adicionais em comum com o polinucleotídeo inventivo. Além de compartilharem um alto grau de similaridade na sua estrutura primária com os polinucleotídeos da presente invenção, os polinucleotídeos com um grau de identidade especificado com, ou capazes de hibridizar com um polinucleotídeo inventivo preferivelmente têm pelo menos uma das seguintes características: (i) eles contêm uma região de leitura aberta ou uma região de leitura aberta parcial que codifica um polipeptídeo com substancialmente as mesmas propriedades funcionais do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo inventivo; ou (ii) eles possuem domínios em comum.

Fontes de Elementos e Seqüências de DNA

Todos e quaisquer elementos e seqüências de DNA descritos aqui podem ser endógenos a um ou mais genomas vegetais. Por isso, era uma modalidade em particular da presente invenção, todos os elementos e seqüências de DNA, os quais são selecionados para o cassete final de transferência são endógenos, ou nativos do genoma da planta que será transformada. Por exemplo, todas as seqüências podem vir do genoma da batata. Alternativamente, um ou mais dos elementos ou seqüências de DNA podem ser endógenos de um genoma vegetal que não é o mesmo da espécie da planta a ser transformada, mas que funciona de qualquer maneira na célula vegetal hospedeira. Essas plantas incluem batata, tomate e alfafa. A presente invenção também abrange o uso de um ou mais elementos genéticos de uma planta que seja interfértil com a planta que será transformada.

Nesse caso, a “planta” da presente invenção inclui, mas não está limitada à batata, tomate, alfafa, beterraba, mandioca, batata doce, soja, ervilha, feijão, milho, trigo, arroz, cevada e sorgo. “Planta” e “material vegetal” também abrangem células vegetais, sementes, prole das plantas, propágulos gerados sexuadamente ou assexuadamente, e descendentes de qualquer um destes, como enxertos e sementes. “Material vegetal” pode se referir a células vegetais, culturas de células em suspensão, calo, embriões, regiões meristemáticas, tecido do calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen, sementes, plântu- Ias em germinação e microsporos. As plantas podem estar em vários estágios de maturação e podem ser cultivadas em cultura líquida ou sólida, ou em solo ou em meio apropriado em vasos, estufas e no campo. A expressão de uma seqüência líder, traüer ou gênica pode ser transiente ou permanente.

Construções de Ácido Nucléico A presente invenção fornece construções de moléculas de ácido nucléico e seqüências polipeptídicas isoladas da presente invenção. Numa modalidade, as construções de DNA da presente invenção são plasmídeos Ti derivados de A. tumefodens.

Durante o desenvolvimento das construções de ácido nucléico desta invenção, os vários componentes da construção, ou fragmentos destes, serão inseridos normalmente em um vetor de clonagem conveniente, por exemplo, um plasmídeo que seja capaz de se replicar em uma hospedeiro bacteriano, por exemplo, E, coli. Existem vários vetores que foram descritos na literatura, muitos dos quais estão disponíveis comercialmente. Após cada clonagem, o vetor de clonagem com a inserção desejada pode ser isolado e submetido à manipulação adicional, como digestão de restrição, inserção de novos fragmentos ou nucleotídeos, ligação, deleção, mutação, resecção etc., para ajustar os componentes da seqüência desejada. Uma vez que a construção tenha sido completada, pode então ser transferida para o vetor apropriado para manipulações adicionais, de acordo com o modo de transformação da célula hospedeira.

Uma molécula de DNA recombinante da invenção pode incluir normalmente um marcador selecíonãvel, de maneira que as células transformadas possam ser facilmente identificadas e selecionadas entre as células não transformadas. Exemplos desses marcadores incluem, mas sem límitaçãoo gene da neomicina fosfotransferase (nptll) (Potiykus e colaboradores, Mol. Gen. Genet. 199:183-188 (1985)), o qual confere resistência à canamicina. As células que expressam o gene nptll podem ser selecionadas um antibiótico apropriado, como a canamicina ou o G418. Outros marcadores selecionáveis comumente usados incluem o gene bar, que confere resistência a bialaphos; um gene mutante de EPSP sintase (Hinchee e colaboradores, Bio/Technology 6:915-922 (1988)), o qual confere resistência ao glifosato; e um gene mutante de acetolactato sintase (ALS), o qual confere resistência à imidazolinona ou à sulfoniluréia (Pedido de Patente Europeu 154.204, 1985).

Além disso, os vetores podem incluir uma origem de replicação (replicons) para uma célula hospedeira específica. Vários replicons procarióticos são conhecidos daqueles com habilidade na arte e tem a função de dirigir a replicação e manutenção autônoma de uma molécula recombinante em uma célula hospedeira procariótica. A invenção também fornece células hospedeiras que contêm as construções de DNA da presente invenção. Como usada aqui, células hospedeiras se referem à célula na qual o produto codificado é fmal-mente expresso. Dessa maneira, uma célula hospedeira pode ser uma célula individual, uma cultura de células ou células que são parte de um organismo. A célula hospedeira também pode ser parte de um embrião, endosperma, espermatozóide ou óvulo, ou zigoto.

Conseqüentemente, a presente invenção também fornece plantas ou células vegetais que contêm as construções de DNA da presente invenção. De preferência, as plantas são angiospermas ou gimnosper-mas. A construção de expressão da presente invenção também pode ser usada para transformar várias plantas, tanto mococotiledôneas (por exemplo, trigo, grama, milho, cevada, sorgo, orquídea, iris, lírio, cebola, banana, cana de açúcar e palmeira), quanto dicotiledôneas (por exemplo, Arabidopsis, batata, tabaco, tomate, abacate, pimenta, beterraba, brócolis, mandioca, batata doce, algodão, poinsétia, legumes, alfafa, soja, ervilha, feijão, pepino, uva, brassica, cenoura, morango, alface, carvalho, bôrdo, nogueira, rosa, hortelã, abóbora, margarida, cacto, eucalipto), e gimnospermas (por exemplo, pinheiro-comum; ver Aronen, Finnish Forest Res, Papers, Vol. 595, 1996), whitespruce (Ellis e colaboradores, Biotechnology 11:84-89, 1993), e lariço (Huang e colaboradores, In Vitro Cell 27:201-207, 1991).

Transformação e Regeneração Vegetal Os presentes polinucleotídeos podem ser introduzidos em uma célula vegetal hospedeira pelos procedimentos padrões conhecidos na arte para introduzir seqüências recombinantes em uma célula hospedeira alvo. Esses procedimentos incluem mas não estão limitados à transfecção, infecção, transformação, captação natural, eletroporação, biolística e Agrobacterium. Os métodos para introduzir genes exógenos em plantas são conhecidos na arte e podem ser usados para inserir uma construção da invenção na planta hospedeira, incluindo protocolos de transformação vegetais biológicos e físicos. Ver, por exemplo, Miki e colaboradores, 1993, “Procedure for Introducing Foreign DNA into Planta, In: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick e Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, páginas 67-88. Os métodos escolhidos variam com a planta hospedeira e incluem métodos de transfecção química, como fosfato de cálcio, transferência gênica mediada por microrganismo, como Agrobacterium (Horsch e colaboradores, Science 227:1229-31, 1985), eletroporação, microinjeção e bombardeamento biolístico. Os métodos preferíveis de transformação incluem cruzamento preciso (ver: Pedidos de Patente US 2003/0221213 Al, 2004/0107455 Al e 2005/0229267 Al) e transformação refinada (ver Pedido de Patente US 2005/0034188 Al).

Consequentemente, a presente invenção também fornece plantas ou células vegetais que contém os polinucleotídeos ou polipeptídeos da presente invenção. Numa modalidade, as plantas são angiospermas ou gimnospermas. Além do significado comum de planta, o termo “plantas” também significa aqui fruto, sementes, estróbilo etc. da planta. A planta da presente invenção pode ser um transfectante direto, o que quer dizer que o vetor foi introduzido diretamente na planta, como por meio de Agrobacterium, ou a planta pode ser da prole de uma planta transfecta-da. A prole também pode ser obtida por reprodução assexuada de uma planta transfectada. A planta de segunda ou subsequente geração pode ou não ser produzida por reprodução sexuada, isto é, fertilização. Além disso, a planta pode ser um gametófito (estágio haplóide) ou um esporó-fíto (estágio diplóide).

Nesse caso, a presente invenção contempla a transformação de uma planta com um ou mais elementos de transformação que são geneticamente originários da planta. A presente invenção abrange uma abordagem “toda nativa” da transformação, na qual apenas elementos de transformação nativos da planta são finalmente integrados na planta desejada por meio de transformação. Nesse sentido, a presente invenção abrange a transformação de uma espécie vegetal específica apenas com elementos genéticos de transformação que são nativos daquela espécie vegetal. A abordagem nativa também pode significar que um elemento de transformação especifico é isolado da mesma planta que será transformada, da mesma espécie vegetal ou de uma planta que é sexualmente interfértil com a planta a ser transformada.

Por outro lado, a planta a ser transformada pode ser transformada com um cassete de transformação que contém um ou mais elementos e seqüências genéticos oriundos de uma planta de espécie diferente. Pode ser desejável usar, por exemplo, um sítio de divagem que é nativo do genoma da batata em um cassete ou plasmídeo de transformação para transformar tomate ou pimenta. A presente invenção não está limitada, no entanto, às abordagens nativa e toda nativa. Um cassete ou plasmídeo de transformação da presente invenção também pode abranger seqüências e elementos de outros organismos, como de espécies bacterianas.

Os exemplos a seguir são apresentados como representação de implementações especificas da presente invenção. Esses exemplos não devem ser entendidos de maneira alguma como uma limitação da abrangência da invenção. Deve ser entendido que podem ser implementadas muitas variações e modificações mantendo-se dentro do espírito e abrangência da invenção.

Exemplos Exemplo 1 Expressão de Genes de Asparagina Sintetase Regulada Negativamente Este Exemplo demonstra que a expressão regulada negativamente de um gene envolvido na biossíntese de asparagina nos tecidos ricos em amido do cultivo diminui a asparagina nesses tecidos e, conseqüen-temente, reduz a quantidade de acrilamida no alimento obtido pelo aquecimento desses tecidos ricos em amido. A sequência do gene de asparagina sintetase (Asfl) da batata é mostrada em SEQ ID NO.: l.A seqüência parcial do gene de asparagina sintetase-2 (A$t2) da batata é mostrada em SEQ ID NO.: 2.

Fragmentos desses genes, mostrados em SEQ ID NO.: 3 e 4, foram ligados para criar SEQ ID NO.: 5, Duas cópias do segmento de DNA -resultante foram inseridas, como repetições invertidas e separadas pelo espaçador mostrado em SEQ ID NO.: 6, entre os promotores com orientação convergente dos genes da ADP-glicose pirofosforilase (Agp) e da amido sintase ligada ao grânulo (Gbss) (SEQ ID NO.: 7 e 8, respecti- vamente). A construção silenciadora resultante foi inserida entre as regiões terminais de T-DNA que já continha um cassete de expressão para o gene marcador selecionável da neomicina fosfotransferase (nptlüj.

Um vetor binário contendo esse T-DNA, designado pSIM1148 (Figura IA), foi introduzido na Agrobacterium LBA4404 como descrito a seguir. Células competentes de LB4404 (50 pL) foram incubadas por 5 min em gelo na presença de 1 pg de vetor de DNA, congeladas por cerca de 15 s em nitrogênio líquido e incubadas a 37°C por 5 min. Após a adição de lmL de meio líquido, as células tratadas foram cultivadas por 3 h a 28°C e plaqueadas em meio líquido/agar contendo estreptomicina (100 mg/L) e canamicina (100 mg/L). Os DNAs do vetor são então isolados em culturas de pernoite das colônias individuais de LBA4404 e examinados por análise de restrição para confirmar a presença do DNA plasmidial intacto.

Diluições de dez vezes das culturas de pernoite de Agrobacterium foram cultivadas por 5-6 horas, precipitadas a 2.800 RPM, lavadas com meio MS líquido (Phytotechnology) suplementado com sacarose (3%, pH 5,7) e ressuspendidas no mesmo meio até 0,2 OD/600nm. As células ressuspensas foram misturadas e usadas para infectar segmentos internos de 0,4-0,6 mm da variedade “Ranger Russet” de batata.

Os caules infectados foram incubados por dois dias em meio de co-cultivo (sais MS 1/10, sacarose 3%, pH 5,7) contendo 6 g/L agar a 22°C em uma câmara de cultivo Percival (16 h de luz) e subseqüente-mente transferidos para meio de indução de calo (CIM, meio MS suplementado com sacarose 3%, 2,5 mg/L de zeatina ribosídeo, 0,1 mg/L de ácido acético naftaleno e 6g/L de agar) contendo timentina (150 mg/L) e canamicina (100 mg/L). Após um mês de cultivo em CIM, os explantes foram transferidos para meio de indução de broto (SIM, meio MS suplementado com sacarose 3%, 2,5 mg/L de zeatina ribosídeo, 0,3 mg/L de ácido giberélico GA3 e 6g/L de agar) contendo timentina e canamicina (150 e 100 mg/L respectivamente) até que os brotos aparecessem. Os brotos que nasceram no fim do período de regeneração foram transferidos para o meio MS com 3% de sacarose, 6 g/L de agar e timentina (150mg/L). As plantas transgênicas foram transferidas para solo e colocadas em uma estufa.

Após três meses, os tubérculos foram colhidos e analisados quanto aos seus níveis de asparagina de acordo com o Offidal Methods of Amlysis of AOAC INTERNATIONAL (2002), 17th Edition, AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, EUA Método Oficial 982.30. Essa análise demonstrou que 17 das 26 plantas pSIM1148 continham apenas cerca de 25% a 50% da asparagina presente nas plantas controle (Tabela 1).

Os tubérculos de algumas das plantas com níveis baixos de asparagina foram cortados, cozidos, pré-fritos e completamente fritos para produzir batatas fritas. Essas batatas fritas foram moídas até um pó bem fino em nitrogênio líquido e enviadas em gelo seco até os laboratórios Covance laboratories. Em Covance, os níveis de acrilamida foram determinados realizando-se cromatografia líquida/espectrometria de massa/espectrometria de massa (LC/MS/MS) (United States Food and Drng Administration, Centerfor Food Safety and Apptied Nutútion Office of Plant ã Dairy Foods and Beverages, “Detection and Quantitation of Acrylamide in Foodd’, 2002). A Tabela 2 mostra que as fritas das plantas pSIM48 com baixa asparagina acumularam menos que um terço da acrilamida que é produzida em fritas controle.

Como alternativa ao uso dos promotores de Agp e Gbss como e-lementos reguladores, também é possível empregar dois promotores Gbss. Uma construção contendo a repetição invertida que consiste nos fragmentos dos genes Astl e Ast2 entre dois promotores Gbss foi introduzidas entre as regiões terminais de um T-DNA para produzir um vetor binário pSIMllSl (Figura 1B). Esse vetor foi usado para produzir linhagens de batata transgênica de uma maneira similar à descrita para pSIM1148. Além disso, seqüências derivadas do gene Ast podem ser inseridas entre um promotor e um terminador.

Para qualquer gene Ast, pode haver outras seqüências com um alto grau de similaridade de seqüência. É possível usar essas seqüências homólogas para produzir construções silenciadoras. Por exemplo, fragmentos de um gene Ast de tomate podem ser usados para silenciar o gene Ast homólogo em batata.

Após a identificação de um gene Ast vegetal, iniciadores específicos do gene são produzidos para a amplificação por PCR do gene. A amplificação por PCR é realizada de acordo com os métodos conhecidos na arte e então o gene amplificado por PCR é clonado em um vetor de clonagem.

Os genes Ast podem ser identificados por buscas em banco de dados ou podem ser isolados de DNA vegetal. Um exemplo de genes Ast de um cultivo que não a batata são os genes Ast de trigo mostrados em SEQ ID NO.: 34 e 35. O silenciamento simultâneo desses genes no grão de trigo tomará possível reduzir os níveis de asparagina na farinha e, conseqüentemente, os níveis de acrilamida em, por exemplo, pães, biscoitos, cookks ou bolachas.

Em vez de usar fragmentos dos genes Ast para a produção de uma construção silenciadora, é possível empregar os fragmentos obtidos dos promotores dos genes Ast. Esses promotores podem ser isolados por meio da aplicação de métodos como PCR inverso, e duas cópias de fragmentos específicos do promotor de 150-600 pares de base podem então ser inseridos como repetições invertidas entre um promotor e um terminador ou entre dois promotores com orientação convergente (ver: Rommens e colaboradores, pedido de patente mundial 2006/036739 A2, o qual está aqui incorporado por referência).

Exemplo 2 Sobreexpressão dos Genes de Asparaginase Este Exemplo demonstra que a sobreexpressão de um gene envolvido no metabolismo de asparagina nos tecidos ricos em amido do cultivo diminui a quantidade de asparagina nesses tecidos e, consequentemente, reduz a quantidade de acrilamida no alimento obtido pelo aquecimento desses tecidos ricos em amido. A sequência do gene de asparaginase (Asgl) da variedade Ranger Russet de batata é mostrada em SEQ 1D NO.: 9. O referencial aberto de leitura correspondente e a seqüência de aminoácidos esperada são mostrados em SEQ ID NO.: 10 e 11, respectivamente. Um vetor binário contendo o gene Asgl inserido entre o promotor Agp e o terminador Ubi3 (SEQ ID NO.: 12) é designado pSIM658 (Figura 1C).

Os níveis de expressão do gene Asgl em tubérculos foram determinados por meio da aplicação de PCR de transcriptase reversa em tempo real quantitativo. A Tabela 3 mostra que 18 dos 25 tubérculos de plantas pSIM658 superexprimiram o gene Asgl cerca de 2 a 20 vezes. Esses tubérculos foram usados para produzir batatas fritas. As análises químicas demonstraram que as fritas de duas das linhagens transgêni-cas continham níveis reduzidos de acrilamida (Tabela 4). Ê possível empregar também outros promotores específicos de tubérculo para controlar a expressão do gene Asgl. O plasmídeo pSIM757 contém o promotor Gbss ligado operacionalmente ao gene Asgl. A transformação da batata com o DNA de transferência desse plasmídeo produz plantas resistentes à canamicina que superexpres-sam o gene Asgl. Outros promotores que podem ser usados para controlar a expressão de asparaginase em tubérculos de batata podem ser selecionados do grupo que consiste dos promotores de patatina, promotores induzidos pelo frio e promotores flavonóide-3'-monooxigenase (Fmo). Um promotor Fmo é mostrado em SEQ ID NO.: 13. Esse promotor está ativo em tubérculos semimaduros e maduros, mas não em minitubérculos.

Em vez de usar Asgl, é também possível explorar outros genes de asparaginase. A SEQ ID NO.: 14 mostra a sequência de cDNA do gene Asgl alternativo de batata. Outros exemplos de genes de asparaginase incluem o gene de asparaginase de E. coli (número de acesso ZlOSIm; SEQ ID NO.: 31), Agrobacterium (número de acesso Atu3044; SEQ ID NO.: 32), cevada (número de acesso AF308474; SEQ ID NO.: 33), e qualquer gene que codifique uma proteína com o motivo pfamOll 12.12 (Marchler-Bauer e colaboradores, Nucleic Acids Res 33, D 192-6, 2005). A sequência do gene de asparaginase do trigo é mostrada em SEQ ID NO: 15. A seqüência de aminoácidos esperada é apresentada em SEQ ID NO: 16.

Para qualquer gene de asparaginase, pode haver outras seqüên-cias de asparaginase com um alto grau de similaridade de seqüência. Por exemplo, um gene de asparaginase de origem vegetal pode ser identificado por uma busca em um banco de dados como o mantido pelo NCBI.

Após a identificação de um gene de asparaginase vegetal, inicia-dores específicos do gene são produzidos para a amplificação por PCR do gene de asparaginase. A amplificação por PCR é realizada de acordo com os métodos conhecidos na arte e então o gene da asparaginase amplificado por PCR é clonado em um vetor de clonagem. A asparaginase está ligada operacionalmente a um promotor es pecífico de semente, como o promotor do gene de puroindolina de trigo mostrado em SEQ ID NO: 17. Um DNA de transferência contendo o cassete de expressão resultante é introduzido usando métodos convencionais de transformação para a produção de trigo com baixa asparagi-na. A farinha originária da semente desse trigo acumulará menos acrilamida durante o aquecimento.

Exemplo 3 Sobreexpressão de Glutamina Sintetase A sobreexpressão do gene de glutamina sintetase resultará em níveis reduzidos de asparagina. Qualquer seqüência que codifique uma proteína com atividade de glutamina sintetase pode ser ligada operacionalmente a um promotor que é expresso no órgão desejado da planta, como um tubérculo de batata. A batata contém três genes de glutamina sintetase relacionados, mostrados em SEQ ID NOs.: 28-30. Um segmento de DNA contendo um fragmento de cada um desses genes pode ser usado regular negativamente de maneira eficaz a atividade a atividade da glutamina sintetase. Com esse propósito, pelo menos uma cópia do segmento pode ser inserido entre dois promotores convergentes ou entre um promotor e um terminador. O cassete de expressão resultante pode ser introduzido na planta de interesse por meio de qualquer método de transformação. Pode-se então selecionar as plantas transgênicas que produzem órgãos com baixa asparagina. O processamento por calor desses órgãos fornecerá produtos que contêm menos acrilamida do que produtos obtidos do correspondente. Por exemplo, um tubérculo trans-gênico processado produzirá batatas fritas que contêm níveis mais baixos de acrilamida do que as batatas fritas obtidas de tubérculos não transformados. O resultado da sobreexpressão de glutamina sintetase nos níveis de asparagina foram descritos por Harrison e colaboradores (Plant Physiology 133: 252-262, 20.03). Entretanto, esses autores não poderíam ter antecipado as conseqüências inesperadas de níveis reduzidos de asparagina em um acúmulo fortemente reduzido de acrilamida por indução de calor.

De maneira similar, é possível regular negativamente a expressão de um gene endógeno que apresenta atividade de nitrato redutase. Com esse propósito, pelo menos uma cópia de uma parte do gene ou promotor de um gene de nitrato redutase pode ser expressa. As plantas transgênicas podem ser tríadas pelo nível de expressão do gene de nitrato redutase e as linhagens que apresentam níveis reduzidos podem subsequentemente serem tríadas para níveis reduzidos de asparagina. Também é possível silenciar um gene de hexose quinase e aumentar os níveis de ácido aspártico ao mesmo tempo em que se reduz os níveis de asparagina. A correlação entre sobreexpressão dos genes de nitrato redutase e de hexoquinase com os níveis aumentados de asparagina foram descritos previamente (Roland e colaboradores, Armu Rev Plant Biol 57: 675-709, 2006; Szopa, Biochem Soc Trans 30: 405-410, 2002). Entretanto, os autores não anteciparam a abordagem oposta para reduzir os níveis de acrilamida em alimentos.

Obviamente, há outras estratégias para modificar os níveis de asparagina em plantas por meio da expressão de genes que estão direta ou indiretamente envolvidos na síntese ou no metabolismo de asparagina, Nossos resultados sugerem que qualquer um desses métodos pode ser usado para produzir alimentos com baixa acrilamida.

Exemplo 4 Expressão Simultânea Regulada Negativamente de Genes de Degradação de Amido e Biossíntese de Asparagina Este Exemplo demonstra que a expressão simultânea regulada negativamente de genes envolvidos na degradação do amido e na biossíntese de asparagina, respectivamente, em tecidos ricos em amido de um cultivo pode diminuir o acúmulo de acrilamida em um alimento obtido a partir do aquecimento desses tecidos ricos em amido.

As plantas transgênicas que produzem tubérculos com níveis baixos de açúcares redutores e asparagina foram geradas em duas etapas. Primeiro, as plantas foram transformadas com o P-DNA do vetor binário pSIM371. Esse P-DNA contém duas cópias de um polinucleotí-deo contendo fragmentos dos genes PPO (SEQ ID NO.: 18), RI (SEQ 1D NO.: 19), e phL (SEQ ID NO.: 20), inseridas como repetições invertidas entre o promotor Gbss e o terminador Ubi3, Uma cepa de Agrobacterium contendo tanto pSIM371 quando o vetor LifeSupport pSIM368, que contém cassetes de expressão para ambos os genes nptll e codA inseridos entre as regiões terminais de um T-DNA, foi usada para infectar 21.900 explantes de caule de batata. Após um período de co-cultivo de dois dias, os explantes infectados foram submetidos a um tratamento com canamicina por cinco dias para selecionar a expressão transiente do gene nptll Para impedir a proliferação de células contendo T-DNAs integrados de maneira estável, os explantes foram subsequentemente transferidos para um meio contendo 5-fluorocitosina (5FC). Esse produto químico é convertido em 5-fluorouracil (5FU) tóxico pelo produto do gene codA (Perera e colaboradores, 1993). Um total de 3.822 brotos que sobreviveram a dupla seleção foram genotipados para a presença do P-DNA e ausência de qualquer DNA exógeno tanto do T-DNA quanto do arcabouço do plasmí-deo. Essa análise identificou 256 brotos de DNA todo nativo (intragêni-co), as quais permitiu-se desenvolverem raízes, para então serem plantadas em solo e cultivadas por seis semanas em câmaras de crescimento. Para triar atividade PPO, uma solução de catecol foi pipetada nas superfícies cortadas dos minitubérculos de aproximadamente 2 cm.

Quarenta e oito linhagens que tiveram o escurecimento induzido por catecol do tubérculo inibido foram cultivados na estufa por três meses até produzirem tubérculos semimaduros que foram testados bioquimi-camente para níveis residuais de atividade PPO. Essa análise demonstrou que o emprego da construção de silenciamento do gene PPO diminui a atividade PPO em cerca de 90%. Tanto as 48 linhagens intragênicas quanto as plantas controle não transformadas Ranger Russet e Russet Burbank foram subseqüentemente propagadas e cultivadas no campo em Idaho, Aberdeen.

Os tubérculos maduros de todas as linhagens intragênicas e controle foram analisadas quanto aos níveis de glicose após três e seis meses de armazenamento a frio, A maioria das linhagens (43) apresentou uma maior redução de adoçamento induzido por frio (~60%) do que a obtida com as linhagens controle que tiveram apenas um dos genes associados ao amido silenciados. As batatas fritas derivadas dos tubérculos silenciados das plantas 371-28 e 371-38 continham menos de um terço da neurotoxina acrilamida acumulada nas fritas controle (Tabela 4). Essa redução foi antecipada porque a acrilamida é em grande parte oriunda das reações induzidas por calor entre o grupo carbonila dos açúcares redutores e a asparagina (Mottram e colaboradores, 2002; Stadler e colaboradores, 2002).

As características sensoriais das batatas fritas modificadas foram avaliadas por um painel de oito indivíduos treinados profissional-mente. As batatas fritas oriundas dos tubérculos da Ranger Russet modificada apresentaram uma melhor aparência visual do que as fritas da Ranger Russet ou Ranger Burbank. Além disso, as fritas intragênicas apresentaram um aroma significativamente melhor quando sentido pelo epitélio olfativo, que é localizado no teto da cavidade nasal. Uma tendência similar foi observada para os tubérculos que haviam sido armazenados por 10 semanas a 4°C. De fato, as linhagens intragênicas 371-28, 30, 38 e 68 armazenadas no frio atingiram ou ultrapassaram os atributos sensoriais das variedades não transformadas frescas.

Uma linhagem de batata com baixo açúcar foi retransformada com pSIM1148. Comparadas com as batatas fritas das plantas pSIM1148 originais, as fritas dos duplo transformantes resistentes à canamicina apresentarão geralmente níveis mais reduzidos de acrilami-da. Assim, os duplo transformantes produzem tubérculos que podem ser usados para obter fritas que (i) contêm níveis reduzidos de acrilami-da e (ii) apresentam características sensoriais melhoradas.

Exemplo 5 Métodos de Transformação de DNA Todo Nativos para Reduzir Tanto os Níveis de Asparagina Quanto de Adoçamento Induzido Pelo Frio em Tubérculos de Batata Este Exemplo descreve o emprego de métodos de transformação de DNA todo nativos para reduzir tanto os níveis de asparagina quanto de adoçamento induzida por frio em tubérculos de batata. Os alimentos processados obtidos desses tubérculos conterão níveis reduzidos de acrilamida, O DNA de transferência usado para transformação contém dois cassetes de expressão inseridos entre as regiões terminais oriundas de batata é mostrado em SEQ ID NO.: 23 (Figura 2). O primeiro cassete consiste de duas cópias de um segmento de DNA contendo fragmentos de promotores dos genes Ppo (SEQ ID NO,: 24), PhL (SEQ ID NO.: 25) e Rl (SEQ ID NO.: 26), inseridos como repetições invertidas entre um promotor do gene Agp funcionalmente ativo e o terminador do gene de ubiquitina-3. O segundo cassete consiste de duas cópias de um segmento de DNA contendo fragmentos dos genes Astl, Ast2 e Ppo (SEQ ID NO.: 27) inseridos como repetições invertidas entre dois promotores do gene Gbss funcionalmente ativos e orientações convergentes Um plasmídeo contendo tanto o DNA de transferência quanto o cassete de expressão para o gene de isopentenila transferase (ipt) é introduzido na Agrobacterium LBA4404, e a cepa resultante é usada para transformar variedades de batatas, como Ranger Russet e Atlantic, por meio de métodos de transformação sem marcadores (ver: Craig Richael, “Generation of marker-free and backbone-free transgenic plants using a single binary approadt’, Pedido de Patente Provisório 60/765,177, que é aqui incorporado por referência). Permite-se que as plantas transformadas que não apresentam um fenótipo de citocina, descrito como tendo o crescimento interrompido e sendo incapaz de desenvolver raiz, produzam tubérculos. Os tubérculos de algumas das linhagens apresentarão níveis baixos de atividade da enzima Ppo, como pode ser testado pela pipetagem de 0,5 mL de catecol 50 mM nas superfícies recém-cortadas de tubérculos. Os níveis de atividade da enzima Ppo podem ser determinados de maneira mais precisa misturando-se tubérculos pulverizados (1 grama) por 1 hora em tampão de ácido propano-sulfônico 3-(N-morfolino) 50 em pH 6,5 (5 mL). Após a precipitação da fração sólida, a mudança de OD410 pode ser determinada com o tempo. As linhagens de tubérculo que contêm menos do que 25% de atividade da enzima Ppo serão testados ainda mais por meio da incubação dos tubérculos a cerca de 4°C. Após pelo menos um mês, os níveis de glicose podem ser determinados, por exemplo, usando o reagente glicose oxidase/peroxidase (Megazyme, Irlanda). As linhagens de tubérculos que apresentam níveis de atividade de Ppo reduzidos em mais de 75% e uma adoçamento induzida por frio reduzida em mais de 50% podem ser analisados quanto aos níveis de asparagina livre. Se os níveis de asparagina livre foram reduzidos por cerca de mais de 50%, os tubérculos podem ser processados e analisados quanto aos níveis de acrilamida. As linhagens transformadas que não contêm níveis baixos de asparagina, além de baixa Ppo e baixo adoçamento induzido pelo frio, podem ser usados o aumento de volume [bulk up) e produção comercial. As batatas fritas oriundas de tubérculos das linhagens desejáveis contêm menos açúcares redutores, tornando possível reduzir o período de cozimento e preservar o sabor original da batata. Além disso, sua aparência visual é melhorada pela ausência de depósito de açúcar (sugar ends) e manchas negras (black spot bruise). As batatas fritas também têm um aroma melhor e acumulam menos níveis de acrilamida, como pode ser determinado por painéis sensoriais treinados para avaliar fritas por características sensoriais.

Examplo 6 Tilling Os genes envolvidos na biossíntese de asparagina, como a aspa-ragina sintetase, também podem ser regulados negativamente por meio de mutação. Um método para obter esse objetivo é chamado de ‘mirar lesões locais induzidas em genoma’ (Tilling). Esse método combina a eficiência da mutagênese induzida por etil metanosulfonato (EMS) com a habilidade da cromatografia líquida denaturante de alta desempenho (DHPLC) de detectar mudanças de pares de base para análise de heteroduplex. O método gera uma vasta gama de alelos mutantes, é rápido e automático e é aplicável a qualquer organismo que pode ser mutagenizado quimicamente. No método básico de TILLING, as sementes são mutagenizadas por tratamento com EMS. As plantas Ml resultantes são autofertilizadas e a geração M2 de indivíduos é usada para preparar amostras de DNA para triagem mutacional, enquanto suas sementes são inventoriadas. As amostras de DNA são agrupadas, dispostas em microplacas e submetidas a PCR gene-específico (McCal lum e colaboradores, Nat Biotechnol 18: 455-457). Há várias alternativas ao tilling. Por exemplo, é possível empregar diferentes tipos de mutágeno, como nêutrons rápidos ou diepoxibu-tano (DEB). Todos esses métodos podem ser associados a plataformas de genética reversa que permitem a triagem e o isolamento de mutantes para genes pré-selecionados. Os métodos foram descritos em detalhe em, por exemplo, Wang e colaboradores, Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology, Volume I, 2006, Global Science Books.

Além disso, é possível simplesmente triar o germoplasma disponível para um fenótipo de baixa asparagina. Assim, cruzamento vegetal molecular, cruzamento mutacional e seleção de linhagem proporcionam métodos que tornam possível obter variedades de ‘baixa asparagina’.

Exemplo 7 Reduzindo os Níveis de Asparagina Os níveis de asparagina podem também ser reduzidos modificando-se as práticas de cultivo. Por exemplo, o gene da asparagina sintetase é suprimido por carbono (Koch KE. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47:509-540, 1996). Também é possível reduzir o acúmulo de asparagina reduzindo-se a razão de nitrogênio/enxofre no solo. Os níveis relativamente baixos de nitrogênio resultarão em concentrações reduzidas de compostos ricos em N e em um aumento dos metabólitos contendo S, como cisteína, glutatíona e S-adenosilmetionina, Dessa maneira, os solos que contêm C relativamente alto, S relativamente alto e N relativamente baixo podem ser usados para produzir alimentos com asparagina relativamente baixa.

Tabelas Tabela 1 Níveis de Asparagina em Tubérculos de Linhagens de Batata Crescidas em Estufa com Três Meses de Idade Tabela 2 Níveis de Acrilamida em Batatas Fritas Obtida a Partir de Tubérculos de Linhagens de Batata Crescidas em Estufa com Três Meses de Idade.

Os níveis foram determinados de acordo com United States Food and Drug administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition Office ofthe Plant & Dairy Foods and Beverages, “Detection and Quantitation of Acrylamide in Foods” (2002).

Tabela 3 Níveis de Expressão do Gene de Asparaginase-1 em Tubérculos de Batata de Linhagens de Batata Crescidas em Câmara com Seis Semanas de Idade Determinados por RT-PCR Quantitativo em Tempo Real Tabela 4 Níveis de Acrilamida em Batatas Fritas Obtidas a Partir de Tubérculos de Linhagens de Batata Crescidas em Estufa com Três Meses de Idade REIVINDICAÇÕES

Claims (8)

1. Processo Para Reduzir o Teor de Acrilamida em Produto de Tubérculo, transformado termicamente a partir de uma planta de batata, caracterizado por que o referido método compreende expressar na referida planta um polinucleotídeo compreendendo a sequência completa ou parcial do gene que codifica a asparagi-na sintetase 1 definida pela SEQ ID NO: 1; em que as referidas plantas de batata produzem tubérculos que contêm pelo menos uma concentração 40% mais baixa de acrilamida, quando submetidos a tratamento térmico, em comparação com a concentração de acrilamida de um produto de controle de tubérculo tratado termicamente que é obtido a partir de uma planta de batata de controle que não expressa o polinucleotídeo.

2. Processo Para Reduzir o Teor de Acrilamida em Produto de Tubérculo, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que o polinucleotídeo está operacionalmente ligado a pelo menos um promotor com expressão tecidual específica.

3. Processo Para Reduzir o Teor de Acrilamida em Produto de Tubérculo, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por que o promotor tem expressão de tecido específica de tubérculo.

4. Processo Para Reduzir o Teor de Acrilamida em Produto de Tubérculo, processado termicamente a partir de uma planta de batata, caracterizado por que o referido método compreende expressar na referida planta um polinucleotídeo compreendendo a sequência completa ou parcial do gene que codifica a asparagi-na sintetase 1 definida pela SEQ ID NO: 1; em que as referidas plantas de batata produzem tubérculos que contêm pelo menos uma concentração de acrilamida 40% inferior, quando submetidos a tratamento térmico, em comparação com a concentração de acrilamida de um produto de controle de tubérculo tratado termicamente que é obtido a partir de uma planta de batata de controle que não expressa o polinucleotídeo, em que o polinucleotídeo está operativamente ligado a um promotor com expressão de tecido específico de tubérculo.

5. Processo Para Reduzir o Teor de Acrilamida em Produto de Tubérculo, transformado termicamente a partir de uma planta de batata, caracterizado por que o referido método compreende expressar na referida planta um polinucleotídeo compreendendo a sequência completa ou parcial do gene que codifica a asparagi-na sintetase 1 definida pela SEQ ID NO: 1; em que as referidas plantas de batata produzem tubérculos que contêm pelo menos uma concentração de acrilamida 40% inferior, quando submetidos a tratamento térmico, em comparação com a concentração de acrilamida de um produto de controle de tubérculo tratado termicamente que é obtido a partir de uma planta de batata de controle que não expressa o polinucleotídeo em que o polinucleotídeo está operativamente ligado ao promotor de amido-sintase ligado a grânulos de batata compreendendo a sequência definida por SEQ ID NO: 8.

6. Processo Para Reduzir o Teor de Acrilamida em Produto de Tubérculo, processado termicamente a partir de uma planta de batata, caracterizado por que o referido método compreende expressar na citada planta um polinucleotídeo compreendendo a sequência completa ou parcial do gene que codifica a asparagi-na sintetase 1 definida pela SEQ ID NO: 1; em que as referidas plantas de batata produzem tubérculos que contêm pelo menos uma concentração de acrilamida 40% inferior, quando submetidos a tratamento térmico, em comparação com a concentração de acrilamida de um produto de controle de tubérculo tratado termicamente que é obtido a partir de uma planta de batata de controle que não expressa o polinucleotídeo em que o polinucleotídeo está operacionalmente ligado ao promotor do gene da pirofosforilase de ADP-glucose da batata compreendendo a sequência definida pela SEQ ID NO: 7.

7. Processo Para Reduzir o Teor de Acrilamida em Produto de Tubérculo, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, caracterizado por que o produto de tubérculo transformado termicamente é um produto selecionado do grupo que consiste em batata frita, batata em pedaços, batata, batata cozida e batata desidratada.

8. Processo Para Reduzir o Teor de Acrilamida em Produto de Tubérculo, de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, caracterizado por que o produto processado termicamente tem pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de uma concentração de 80% mais baixa de acrilamida, quando submetido a tratamento térmico, em comparação com a concentração de acrilamida de um produto de controle de tubérculo tratado termicamente que é obtido a partir de uma planta de batata de controle que não expressa o polinucleotídeo.