BRPI0614523A2 - método para identificação de peptìdeos, polinucleotìdeo, vetor recombinante, célula, planta e métodos para seleção de peptìdeos e para conferir em uma planta a capacidade de resistir à infecção causada por fungos - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA IDENTIFICAçãO DE PEPTIDEOS, POLINUCLEOTìDEO, VETOR RECOMBINANTE, CéLULA, PLANTA E MéTODOS PARA SELEçãO DE PEPTìDEOS E PARA CONFERIR EM UMA PLANTA A CAPACIDADE DE RESISTIR à INFECçãO CAUSADA POR FUNGOS. A presente invenção refere-se a um método para a identificação de peptídeos tendo uma afinidade para a superfície de fungos é provido, sendo este um método para identificação de peptídeos capazes de afetar o desenvolvimento de um fungo. Também são providas composições compreendendo peptídeos identificados usando-se o método da presente invenção. Em adição, polinucleotídeos isolados, vetores, cassetes de expressão e células transformadas, capazes de expressar peptídeos identificados pelo método da presente invenção, são providos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOPARA IDENTIFICAÇÃO DE PEPTÍDEOS, POLINUCLEOTÍDEO, VETORRECOMBINANTE, CÉLULA, PLANTA E MÉTODOS PARA SELEÇÃO DEPEPTÍDEOS E PARA CONFERIR EM UMA PLANTA A CAPACIDADE DERESISTIR À INFECÇÃO CAUSADA POR FUNGOS".

Pedidos de Patente Relacionados

Este pedido de patente é uma continuação em parte do Pedidode Patente dos Estados Unidos Número de Série 09/829.549, depositado em10 de abril de 2001, que reivindica o benefício de prioridade do Pedido dePatente Provisório dos Estados Unidos Número de Série 60/195.785, depo-sitado em 10 de abril de 2000. Este pedido também reivindica benefício doPedido de Patente Provisório dos Estados Unidos 60/704.933, depositadoem 2 de agosto de 2005. Todos os pedidos antes mencionados são aquiincorporados por referência.

Listagem de Seqüência

Este pedido de patente é acompanhado por uma listagem deseqüência em uma forma legível de computador que reproduz precisamenteas seqüências aqui descritas.

Antecedentes

A presente invenção refere-se ao uso de tecnologia de apresen-tação de fago para identificar peptídeos que se ligam a fungos patogênicose, mais particularmente, a fungos patogênicos do gênero Phytophthora,Phakopsora e Uromyces. Bibliotecas de apresentação de fagos de peptídeosaleatórios são construídas usando-se oligonucleotídeos degenerados. O fa-go que expressa os peptídeos em sua superfície são contactados com fun-gos em diferentes estágios de vida, e aqueles fagos que se ligam são isola-dos, amplificados, e os peptídeos identificados. Uma vez identificados, ospeptídeos podem ser selecionados para atividade antifungal e usados paraidentificar e caracterizar locais de ligação nos fungos.

Phytophthora é um organismo que causa doença economica-mente importante nos Estados Unidos que causa grandes perdas em muitasespécies de colheita agronomicamente importantes. Phytophthora sojae é asegunda patogenia mais importante de sojas nos Estados Unidos. (Doupnik,Plant Dis. 77:1170-1171). Phytophthora capsici tem uma ampla faixa dehospedeiro, e limitam mais notavelmente a produção de alto valor, colheitasde verdura solanácea. O controle destas patogenias é particularmente difícil,freqüentemente requerendo tratamento de campos totais com compostosbiocidas. Embora eficaz, o interesse aumentado sobre o ambiente e custoseconômicos de tais tratamentos requerem a necessidade de métodos decontrole alternativos.

As espécies Phytophthora são parasitas forçados adaptados àsobrevivência de longo tempo na ausência de plantas hospedeiras. Oóspo-ros ou quelamidoesporos existem em baixas densidades no solo, e capaci-tam à sobrevivência da patogenia. Na presença de uma planta susceptível, apatogenia progride rapidamente através de uma série de etapas de desen-volvimento finamente ajustadas que produzem ciclos de infecção e doença.O desenvolvimento de patogenia de oósporos ou quelamidoesporos atravésde liberação de zoósporo, enquistamento, germinação e infecção, pareceseguir corretamente à primeira vista. Ainda, a progressão de estágios devida é finamente ajustada a sinais ambientais, particularmente aqueles sinaisprovenientes de uma planta hospedeira.

Zoósporos é o estágio de vida de maior importância para disper-são a locais de infecção de raiz. Um local mais susceptível está localizadoimediatamente atrás do meristema apical da raiz onde as células estão sealongando. Os exsudatos liberados de células de alongamento servem comosinais que dirigem movimento quimiotático de zoósporos em direção ao local(Carlile, em Phytophthora: Its Biology, Taxonomy, Ecology and Pathology,Erwin et al., eds., APS Press, 1983; Deacon and Donaldson, Mycoi Res.97:1153-1171, 1993). A resposta quimiotática do zoósporo varia com a com-posição de exsudatos de raiz, e é específica de espécie. Por exemplo, zoós-poros de P. capsici, P. cactorum, e outras espécies são atraídas a um arran-jo de açúcares e aminoácidos (Hickman, Phytopathology, 60:1128-1135,1970; Khew and Zentmyer, Phytopathology, 63:1511-1517, 1973), mas zo-ósporos de P. sojae são atraídos a compostos isoflanóides específicos (Nor-ris et al., Plant Physiol., 117:1171-1178, 1998). Embora o mecanismo preci-so de quimioatraição não seja conhecido, Deacon and Donaldson (Mycol.Res., 97:1153-1171, 1993) e Carlile (em Phytophthora: Its Biology, Taxo-nomy, Ecology and Pathology, Erwin et al., eds., APS Press, 1983) resumiuexperimentos que sugerem o envolvimento de quimiorreceptores na superfí-cie do zoósporo.

Os zoósporos encistam-se à medida que eles se aproximam dasuperfície da raiz em resposta aos sinais ambientais. O encistamento de zo-ósporos de P. palmivora e outra espécie Phytophthora, por exemplo, podeser influenciado pelas concentrações de íon de cálcio local (Griffith et al.,Arch. Microbiol., 149:565-571, 1988; Warburton and Deacon, Fungai Gene-tics Biol., 25:54-62, 1998). O encistamento pode também ser induzido pelaalta concentração de quimio-atraidores ou por componentes de parede decélula de raiz. Por exemplo, os zoósporos de P. sojae encistam-se na pre-sença de altas concentrações de compostos isoflavonóides de soja (Morrisand Ward, Physiol. MoL Plant Pathol., 40:17-22, 1992). Em contraste, zoós-poros de Pythium aphanidermatum encistados quando em contato com resí-duos de fucosil e galactosil de superfícies de célula de raízes de agrião(Longman and Callow, Physiol. Moi Plant Pathol., 30:139-150, 1987; Estra-da-Garcia et al., J. Exp. Bot. 41:693-699, 1990). Deacon and Donaldson(Myeol. Res., 97:1153-1171, 1993) notaram que o encistamento na presençade altas concentrações de atraidores seria pernicioso à infecção potencial, e,desse modo, selecionado contra o tempo. Eles sugerem, contudo, que atrai-dores na superfície da raiz podem ser suficientemente concentrados parapredisporem zoósporos para encistar após contato com resíduos de superfí-cie de raiz.

Quando em contato com uma raiz, os zoósporos encistam-secom uma orientação específica de modo que um tubo de germe emerge emdireção a raiz. Se os zoósporos encistam-se antes do contato com a raiz, ostubos de germe emergirão em qualquer orientação, e devem reorientar demodo a localizar a raiz, e infectar a planta. Os receptores de superfície decélula no tubo de germe são pensados serem envolvidos neste processo deorientação de raiz. Morri et al., (Plant Physiol., 117:1171-1178, 1998), porexemplo, demonstraram uma resposta orientada de crescimento de cistorecentemente germinado de P sojae para concentrações não-tóxicas baixasde compostos isoflavonóides derivados de soja. Zentmyer (Science,133:1595-1596, 1091) reportou orientação hifal de P. cinnamomi em direçãoàs raízes de hospedeiro, mas a natureza do(s) composto(s) atraidor(es) nãofoi definida.

Após infecção, o hifal cresce através de tecido de planta interce-Iularmente e/ou intracelularmente, dependendo da espécie de patogenia(Stossel et al., Can, J. Bot., 58:2594-2601, 1980; Coffey and Wilson, emPhytophthora: Its Biologyl Taxonomy, Ecology and Pathology, Erwin et al.,APS Press, 1983; Enkerli et al., Can, J. Bot., 75:1493-1508, 1997; Hardhanand Mitchell, Fungai Gen. Biol., 24:252-284, 1998; Murdoch and Hardham,Protoplasma, 201:180-193, 1998). Haustoria são formadas por algumas es-pécies Phytophthora, incluindo P. infestans (Coffey and Wilson, em Phytoph-thora: Its Biology, Taxonomy, Ecology and Pathology, Erwin et al., eds., APSPress, 1983), P. capsici (Jones et al., Phytopathology, 64:1084-1090, 1974),e P sojae (Stossel et al., Can. J. Bot., 58:2594-2601, 1980). Ambos hifals ehaustoria estabelecem contato estreito com as paredes e membranas decélula de hospedeiro. Presumivelmente, os receptores de superfície de célu-Ia na detecção de sinais de planta, embora evidência direta esteja carecen-do. A evidência indireta de receptores de superfície de célula vem de obser-vações tais como a ocorrência de vesículas na porção distai de haustoria(Coffey and Wilson, em Phytophthora: Its Biology, Taxonomy, Ecology andPathology, Erwin et al., eds., APS Press, 1983). Heath (Can. J. Bot., 73(Suppl.):S131-S139, 1995) discutiu os eventos possíveis de crescimento deponta de hifals fungais envolvendo comunicação com o ambiente circundan-te, via canal de íon e funções de vesícula.

Conforme discutido acima, a evidência aponta para a proemi-nência de receptores de superfície celular em disparo comportamental e e-tapas de desenvolvimento de Phytophthora. Os receptores de superfície decélulas, portanto, podem proporcionar um meio para romper desenvolvimen-to de patogenia e, desse modo, infectividade. Retardo ou rompimento dedesenvolvimento pode ter um impacto substancial, visto que os zoósporostêm somente um tempo limitado para localizar, contactar, e penetrar um localde infecção que está efetivamente se movendo com o crescimento da pontada raiz. Esta limitação de tempo resulta a partir da susceptibilidade de mu-dança dos tecidos de raiz, visto que conforme os tecidos na região de alon-gamento maturam, eles se tornam significantemente susceptíveis a infecção(English and Mitchel, Phytopathology, 78:1478-1483, 1988).

"Fago de fusão" são vetores bacteriófagos filamentosos nosquais peptídeos estranhos e proteínas são clonados em um gene de reves-timento de fago e revelados como parte de uma proteína de revestimento defago. Os genes de revestimento comumente usados para a produção de fa-go de fusão são os gene pVIII e gene plll. Cerca de 3900 cópias de pVIIIcompõem a porção maior do revestimento de proteína de virion tubular. Ca-da proteína de revestimento pVIII ocorre em um ângulo raso ao eixo Iongitu-dinal do virion, com seu terminal-C enterrado no interior perto do DNA, e seuterminal-N exposto ao ambiente externo. Cinco cópias da proteína de reves-timento plll estão localizadas na extremidade terminal de cada virion, e estãoenvolvidas na fixação do fago para plll de E. coli, e para reagrupamento dovírus após infecção e replicação. Os peptídeos revelados como parte de pVI-II estão restritos na matriz de sua reprodução no revestimento de virion. Emcontraste, os peptídeos revelados como parte de plll são mais flexíveis devi-do à posição terminal das proteínas plll. Fago específico pode ser construídopara revelar peptídeos de seis a 15 aminos ácidos em comprimento. A inser-ção de oligonucleotídeos aleatórios ou degenerados nos genes de proteínade revestimento permite a produção de bibliotecas de peptídeo aleatóriasreveladas por fago. Uma biblioteca de revelação típica contém 10 a 100 có-pias a mais de 108 peptídeos de seqüência aleatória. Desse modo, a revela-ção do fago é útil para seleção de peptídeos raros com características deligação desejadas.

As bibliotecas de peptídeo aleatórias preparadas por fago têmsido usadas para isolamento de Iigantes para receptores de superfície decélula em células de mamíferos. Por exemplo, os peptídeos têm sido isola-dos de bibliotecas preparadas por fago que ligam as glicoproteínas integrinde transmembrana envolvidas na matriz extracelular de célula e interaçõescélula-célula (0'Neil et al., Proteins, 14:509-515, 1992; Smith et al., J. BiolChem., 269-32788-32795, 1994; Healy et al., Biochemistry, 34:3948-3955,1995). O fago preparou peptídeos de adesão de célula especificamente blo-queados para moléculas extracelulares definidas, e outras células (Koivunenet al., J. Bioi Chem., 268:20205-20210, 1993; Koivunen et al., J. Cell Biol.,124:373-380, 1994; Healy et al., Biochemistry, 34:3948-3955, 1995; Pasqua-Iini et al., Nature Biotech, 15: 542-547, 1997). Bibliotecas de peptídeo porpreparação aleatória de fago têm também sido usadas para selecionar pep-tídeos que se distinguem entre tecidos de cérebro e de rim (Pasqualini e Ru-oslahti, Nature, 380: 364-366, 1996). Seleção de afinidade in vivo de peptí-deos aleatórios preparados por fago tem também sido usada para selecionarpeptídeos que ligam seletividade a células endoteliais de vasos sangüíneosde tecidos de tumor específicos (Pasqualini et al., Nature Biotech, 15: 542-547, 1997). Quando estes peptídeos foram fundidos em um fármaco anti-câncer e injetados em camundongos que suportam tumor, os peptídeos a-tingem com sucesso o fármaco para vasos sangüíneos de tumor, e impedemo desenvolvimento progressivo do tumor (Arap et al., Science, 279: 377-380,1998).

Os métodos de preparação de fago têm sido aplicados em pato-genia de planta em somente circunstâncias muito limitadas. Os métodos depreparação de fago têm sido usados quase exclusivamente para identificaranticorpos para diagnose de vírus de planta (Susi et al., Phytopathology,88:230-233; 1998; Ziegler et al., Phytopathology, 88:1302-1305, 1998; Griepet al., J. Plant Pathol., 105:147-156 1999; Toth et al., Phytopathology,89:1015-1021, 1999). A preparação de fago foi usada em um exemplo sim-ples para selecionar anticorpos com afinidade a epitopos de superfície ex-posta em cisto recentemente germinado e esporos de Phytophthora infes-tans (Gough et al., J. Immunol. Methods, 228:97-108, 1999). Fragmentos deanticorpo de fragmento variável (Fv) de cadeia simples de fago isolado pre-parado não foram acessados para sua potência para influenciar o compor-tamento de esporos ou cistos recentemente germinados. Os anticorpos fo-ram testados para sua atividade antifungal com esporângio, mas foram veri-ficados terem atividade antifungal não-detectável.

Phakopsora pachyrhizi é um fungo que causa uma doença deferrugem de soja (Glycines Max). A patogenia se difundiu da Ásia para todasas outras regiões de produção de soja no mundo. P. pachyrhizi chegou aosEstados Unidos durante o final de 2004. No presente, não é conhecida resis-tência durável disponível em quaisquer variedades de soja. Uromyces ap-pendiculatus é um fungo que causa ferrugem no feijão (Phaseolus vulgaris).

Os produtores estão trabalhando para identificar genes no feijão que podemser manipulados para resistência à ferrugem. Os produtores de soja dos Es-tados Unidos têm antecipado a chegada de Phakopsora pachyrhizi, o fungoque causa ferrugem à soja, visto sua ocorrência reportada no Brasil. A che-gada de P. pachyrhizi nos Estados Unidos foi antecipada, e os fazendeirosdevem agora responder a ocorrência anual potencial desta nova doença. Osfazendeiros interessados têm se baseado nos relatórios de perdas que vari-am de 10 a 80% em outras regiões do mundo quando medições de controlenão foram implementadas com sucesso.

Os produtores de soja foram concernidos porque resistência na-tural não-durável a ferrugem foi descoberta após testar mais do que 18.000variedades de soja dos Estados Unidos, e a patogenia, P. pachyrhizi podeinfectar potencialmente qualquer cultivar produzido. Na antecipação da che-gada da patogenia de ferrugem, uma grande quantidade de pesquisa foiconduzida para identificar fungicidas eficazes, e liberação governamental deemergência para aplicação a soja foi obtida. Seleção tradicional e métodosde produção têm identificado genes de resistência não maior às patogeniasantes mencionadas, e, particularmente, no caso de U. appendiculatus e P.pachyrhizi.

Os fungicidas, do mesmo modo, serão a linha de frente de defe-sa por muitos anos até que novos genes de resistência ou outras formas deresistência sejam identificados.

Os fungicidas não têm sido tradicionalmente usados em muitaprodução de soja. Conseqüentemente, existe informação limitada concer-nente aos custos desta prática de controle de doença e sua viabilidade i-gualmente econômica. Estes interesses têm conduzido a estimativas variá-veis da área medida em acres no Missouri e outros estados que podem seralterados de soja para colheitas alternativas.

Para proteger os fazendeiros de soja e assegurar que encontremas necessidades nacionais, alternativas a fungicidas devem ser desenvolvi-das o mais rapidamente possível. Esta descrição proporciona um novo tipode resistência à ferrugem baseada em biotecnologia. A tecnologia envolve odesenvolvimento e desdobramento de peptídeos de defesa em plantastransgênicas, tais como sojas. A tecnologia similarmente impacta patogeniade ferrugem de soja de campo importante (Phaseolus vulgaris), Uromycesappendiculatus.

Como fungos de indução de ferrugem, U. appendiculatus e P.pachyrhizi pertencem à ordem Uredinales, dentro da classe Basidiomycetes.U. appendiculatus produz cinco estágios de esporos em uma planta de hos-pedeiro simples. P. pachyrhizi reproduz predominantemente por uredoespo-ros em uma planta de hospedeiro simples. Uredoesporos são responsáveispela difusão rápida do fungo. P. pachyrhizi pode infectar número indetermi-nado de espécies de legumes, em adição à soja.

Uredoesporos de U. appendiculatus penetram através das aber-turas estomatais foliares. P. pachyrhizi difere em que uredoesporos germi-nados penetram diretamente através da camada de célula epidermal da fo-lha. Tipicamente, um uredoesporo que se aterra em uma superfície de folhagermina para produzir uma almofada de infecção (appressorium) que adereà superfície. Em ambas as espécies, o appressorium produz uma hifa componta hifal que penetra a planta. Após penetração, cada fungo desenvolveestrutura similar à rosca (hifa) que cresce intercelularmente através dos teci-dos de folha. Os hifals entram nas células de hospedeiro sem matá-las. Ali,elas produzem estruturas esféricas (haustoria) que extraem nutrientes a par-tir das células de folha vivas. Logo após, a infecção de cada fungo formauredia que produz esporos adicionais.As bibliotecas de preparação de fago combinatoriais proporcio-nam uma vasta ordem de peptídeos aleatórios dos quais selecionam Iigantesdirigidos a proteínas de interesse (0'Neil et al., 1992). As bibliotecas de pep-tídeo de preparação de fago são misturas de clones de fago filamentosos,cada um dos quais revelando uma seqüência de peptídeo estranha simplesna superfície do virion (Cwerla, 1990; Scott e Smith, 1990). O peptídeo reve-lado é fisicamente ligado com seu DNA de codificação no genoma de fago.Desse modo, o peptídeo pode ser facilmente e rapidamente identificado, etransferido para outros vetores ou sistemas de preparação. Bibliotecas típi-cas contêm 109 variantes aleatórias de peptídeo.

As bibliotecas aleatórias de peptídeo são úteis para isolamentode Iigantes de importância para moléculas de superfície de célula de célulasde mamífero. Por exemplo, peptídeos com afinidade para glicoproteínas detransmembrana, integris, foram isolados de bibliotecas de bioclassificaçãocontra moléculas purificadas (0'Neil et al., 1992; Smith et al., 1994; Healy etal., 1995). Alguns peptídeos foram encontrados para bloquear a adesão decélula para moléculas extracelulares definidas, e para outras células. A efici-ência de ligação de peptídeo e inibição foi específica para motivo de se-qüência de peptídeo (Koivunen et al., 1993; Koivunen et al., 1994; Healy etal., 1995; Pasqualini et al., 1995), e a eficiência de seleção foi específica pa-ra tecidos de órgão particulares (Pasqualini e Ruoslahti, 1996).

O que é necessário, portanto, é um método rápido e eficientepara seleção de peptídeos para ligação específica a patogenias de planta.Uma vez identificados, os peptídeos podem ser adicionalmente avaliadospor sua capacidade de impedir infecção de plantas pela patogenia, e peptí-deos adequados podem ser aplicados diretamente à planta, usados paratratar o solo, ou, alternativamente, seqüências que codificam os peptídeospodem ser introduzidas nas plantas para conferir imunidade ou resistênciacontra a patogenia. Dessa maneira, métodos econômicos e ambientalmenteseguros e eficazes de controlar patogenias de planta podem ser desenvolvi-dos.

SumárioA presente invenção supera os problemas esboçados acima, e éum avanço na técnica pela provisão de resistência às patogenias em plan-tas. Em um aspecto, as sojas são tornadas resistentes à ferrugem de sojaonde resistência não-durável é atualmente disponível. Em outro exemplo, asmesmas técnicas gerais podem proporcionar Phaseolus vulgaris que é resis-tente à ferrugem comum.

Em um exemplo, um método para identificação de peptídeostendo uma afinidade para a superfície de uma patogenia de planta. Nestemétodo, uma biblioteca é construída para incluir peptídeos aleatórios pelaprovisão de peptídeos que codificam oligonucleotídeos degenerados. Osoligonucleotídeos são inseridos em um vetor apropriado que expressa ospeptídeos codificados em sua superfície, e é capaz de transfectar uma célulahospedeira. Uma célula hospedeira é transfectada com o vetor em uma for-ma infecciosa para criar uma biblioteca de peptídeos no vetor. O vetor queexpressa a biblioteca de peptídeo é, em seguida, contactada com uma pato-genia-alvo, e permitida se ligar à patogenia. O vetor não-ligado é removido, eo vetor que se ligou à patogenia eluiu. O vetor eluído é, em seguida, amplifi-cado em uma célula hospedeira adequada, e os oligonucleotídeos inseridosisolados. Os oligonucleotídeos são, em seguida, seqüenciados por qualquermétodo adequado, e a seqüência de aminoácido deduzida a partir da se-qüência dos oligonucleotídeos.

Um aspecto das instrumentalidades descritas se refere a peptí-deos, e aos meios para sua seleção, como nova soja e fatores de resistênciade feijão. Os peptídeos são vantajosamente identificados e selecionadossem qualquer conhecimento de alvos de patogenicidade específicos na pa-togenia. Desde que estes peptídeos não ocorrem necessariamente em sojaou feijão na natureza, a patogenia não foi exposta a eles antes. Conseqüen-temente, a eficiência de peptídeos desenvolvidos em soja e feijão pode serampla através de populações de patogenia diversas, e a eficiência, do mes-mo modo, será durável.

Métodos tradicionais de seleção de peptídeo por preparação defago são baseados na classificação de bibliotecas contra moléculas purifica-das de interesse específico, por exemplo, conforme mostrado em Barbas etal., 2001. A presente metodologia difere das técnicas anteriores, em que aseleção da biblioteca contra células totais não requer conhecimento anteriorde um alvo específico, ou altas concentrações da molécula-alvo purificada.

Em um aspecto de o que é mostrado, moléculas pequenas co-nhecidas como peptídeos podem proporcionar resistência à ferrugem emplantas transformadas quando reveladas como parte de esqueleto das prote-ínas. Em um exemplo, estes peptídeos podem ser selecionados de acordocom as instrumentalidades descritas aqui pela afinidade de ligação para es-truturas infectivas de cistos recentemente germinados, isto é, esporos ger-minados, de U. appenciculatus e P. pachyrhizi. Esta afinidade de ligaçãopode inibir desenvolvimento adicional e patogênese dos esporos. Os peptí-deos são, conseqüentemente, mostrados para inibir patogênese destes fun-gos. Em um exemplo particular, citokinin oxidase pode ser modificada paraservir como um esqueleto da proteína para preparação de peptídeos sele-cionados em plantas.

Com o tempo, as populações de patogenia podem ser capazesde se adaptar à presença de um peptídeo de conferência de resistência se-lecionada. Contudo, dada a facilidade de seleção e classificação de peptí-deo, um novo peptídeo de defesa pode ser selecionado rapidamente paraencontrar o desafio de mudança das populações de patogenia. Vantagensparticulares das instrumentalidades descritas incluem velocidade e simplici-dade de processo de seleção de peptídeo e avaliação de fenótipo, a seleçãode peptídeo não requer conhecimento de alvos de patogenicidade em umapatogenia, uma alta percentagem de recuperação de peptídeos eficazes,uma capacidade de identificar rapidamente novos peptídeos de defesa emdemanda, uma capacidade de desdobrar esqueletos de peptídeos em teci-dos de planta susceptíveis, e uma capacidade de modificar construtos deesqueleto de peptídeo rapidamente em demanda.

Outro aspecto proporciona uma composição antifungal compre-endendo pelo menos um peptídeo selecionado a partir do grupo consistindoem ADPPRTVST (SEQ ID NO:7), ADRPSMSPT (SEQ IDO NO:8), A-DITDPMGA (SEQ ID N0:20), AVGTHTPDS (SEQ ID N0:21), AVSPNVHDG(SEQ ID NO:22), LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO:24), EFRKNYPSAA-PLIPR (SEQ ID N0:31), LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ ID NO:33), e AAP-DLQDMA (SEQ ID N0:4).

Ainda outro aspecto é um nucleotídeo recombinante compreen-dendo uma seqüência de codifica um peptídeo selecionado a partir do grupoconsistindo em ADPPRTVST (SEQ ID NO:7), ADRPSMSPT (SEQ ID NO:8),ADITDPMGA (SEQ ID N0:20), AVGTHTPDS (SEQ ID NO:21), AVSPN-VHDG (SEQ ID NO:22), LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO:24), E-FRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO:31), LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ IDNQ:33), e AAPDLQDAM (SEQ ID NO:4).

Ainda outro aspecto é um vetor recombinante compreendendouma seqüência de nucleotídeo que codifica um peptídeo selecionado a partirdo grupo consistindo em ADPPRTVST (SEQ ID NO:7), ADRPSMSPT (SEQID NO:8), ADITDPMGA (SEQ ID N0:20), AVGTHTPDS (SEQ ID NO:21),AVSPNVHDG (SEQ ID NO:22), LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO:24),EFRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO:31), LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ IDNO:33), e AAPDLQDAM (SEQ ID NO:4).

Um outro aspecto é uma célula transformada com um vetorcompreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica um peptídeoselecionado a partir do grupo consistindo em ADPPRTVST (SEQ ID NO:7),ADRPSMSPT (SEQ ID NO:8), ADITDPMGA (SEQ ID N0:20), AVGTHTPDS(SEQ ID NO:21), AVSPNVHDG (SEQ ID NO:22), LTRCLVSTEMAARRP(SEQ ID NO:24), EFRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO:31), LFXCYPPCTYSY-CLS (SEQ ID NO:33), e AAPDLQDAM (SEQ ID NO:4).

Em ainda outro aspecto é provido um cassete de expressãocompreendendo como componentes operativamente ligados, um promotor;uma seqüência de nucleotídeo que codifica um peptídeo selecionado a partirdo grupo consistindo em ADPPRTVST (SEQ ID NO:7), ADRPSMSPT (SEQID NO:8), ADITDPMGA (SEQ ID N0:20), AVGTHTPDS (SEQ ID NO:21),AVSPNVHDG (SEQ ID NO:22), LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO:24),EFRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO:31), LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ IDNO:33), e AAPDLQDAM (SEQ ID N0:4); e uma seqüência de sinal de termi-nação de transcrição.

Um aspecto adicional proporciona uma planta recombinantecompreendendo um cassete de expressão compreendendo um promotor;uma seqüência de nucleotídeo que codifica um peptídeo selecionado a partirdo grupo consistindo em ADPPRTVST (SEQ ID NO:7), ADRPSMSPT (SEQID NO:8), ADITDPMGA (SEQ ID N0:20), AVGTHTPDS (SEQ ID NO:21),AVSPNVHDG (SEQ ID NO:22), LTRCLVSTEMAARRP (SEQ ID NO:24),EFRKNYPSAAPLIPR (SEQ ID NO:31), LFXCYPPCTYSYCLS (SEQ IDNO:33), e AAPDLQDAM (SEQ ID NO:4); e uma seqüência de sinal de termi-nação de transcrição.

Outro aspecto proporciona um método para caracterização depeptídeos tendo uma afinidade para a superfície de patogenias de plantacompreendendo provisão de uma biblioteca de peptídeos aleatórios produzi-dos pela provisão de peptídeos que codificam oligonucleotídeos degenera-dos; inserção dos oligonucleotídeos em um vetor apropriado que expressaos peptídeos em sua superfície e é capaz de transfectar uma célula hospe-deira; e transfecção de uma célula hospedeira apropriada com o vetor paraamplificar o vetor em uma forma infecciosa para criar uma biblioteca de pep-tídeos no vetor. O vetor que expressa a biblioteca de peptídeo é, em segui-da, contactado com uma patogenia de planta de interesse, e o vetor permiti-do se ligar à patogenia. Após ligação, o vetor não-ligado é removido e o ve-tor ligado eluído a partir da patogenia. O vetor eluído é amplificado em umacélula hospedeira adequada, e os oligonucleotídeos inseridos nos vetoreseluídos isolados. Os peptídeos codificados pelos oligonucleotídeos são, emseguida, produzidos, contactados com as patogenias de planta de interesse,e o efeito de infectividade observado. Em uma concretização, os oligonu-cleotídeos isolados são seqüenciados, as seqüências de aminoácido dospeptídeos deduzidas da seqüência de nucleotídeo, e os peptídeos produzi-dos pela síntese química. Em outra concretização, os peptídeos são produ-zidos pela inserção dos oligonucleotídeos isolados em um vetor de expres-são que é usado para transformar uma célula hospedeira adequada. As cé-lulas hospedeiras transformadas são então mantidas sob condições ade-quadas para expressão dos peptídeos.

Bibliotecas combinatoriais têm também sido selecionadas contraintacto de células para recuperação de peptídeos que se ligam a populaçõesde proteínas de superfície não-definidas. Os peptídeos recuperados por estetipo de seleção podem ser avaliados para um fenótipo de interesse. Por e-xemplo, selecionou-se peptídeos com afinidade para zoósporos móveis dapatogenia de planta oomicete, Phytophthora. As seleções de fenótipo produ-zem uma subcoleção de peptídeos que rompe o desenvolvimento normal porindução de encistamento prematuro dos esporos (Bishop-Hurley et al.,2002). Também mostrou-se que peptídeos selecionados para afinidade rom-pem o desenvolvimento de zoósporo quando preparados, ou em formato depreparação de fago, ou quando sintetizados como moléculas livres (Laskeyet al., 2001; Bishop-Hurley et al., 2002).

Breve Descrição dos Desenhos

Estas e outras características, aspectos, e vantagens, tornar-se-ão melhores compreendidas com relação à seguinte descrição, reivindica-ções em anexo, e figuras acompanhantes, onde:

A figura 1 mostra a organização de seqüências de peptídeo f8em seis famílias. À esquerda estão os dendogramas e à direita estão os no-mes e seqüências dos peptídeos.

A figura 2 mostra encistamento de zoósporos de P. capsici emresposta ao contato com os peptídeos preparados por fago f8 indicados nasvárias concentrações dadas. Os valores de percentagem representam a mé-dia de dois experimentos. A percentagem de encistamento para controle dapopulação de zoósporo que não contém fago varia entre 0 e 10%.

A figura 3 mostra encistamento de zoósporos de P. capsici emresposta ao contato com os peptídeos preparados por fago f8 e f88 indica-dos nas várias concentrações dadas.

A figura 4 mostra ligação dos peptídeos preparados por fago in-dicados para zoósporos de P. capsici. Os valores representam a média detrês experimentos.A figura 5 mostra a especificidade de ligação dos peptídeos pre-parados por fago indicados para P. capsici. Os valores representam a médiade três experimentos.

A figura 6 é um mapa de plasmídeo pJE-7. AOX-P é o promotorde álcool oxidase, Mat-α é a seqüência secretória mat-α, CKX1 é a citoquinaoxidase de seqüência 1, Pc87 é um peptídeo exemplar, e AOX-TT é a se-qüência de terminação de álcool oxidase. Abaixo do mapa está a seqüênciade filamento duplo que codifica Pc87 mostrando o filamento (+) (5' AG CTAGCA GAT AGA CCA TCA ATG TCA CCA ACA TAG T 3', SEQ ID NO:46), eo filamento (-) (5' CT AGA CTA TGT TGG TGA CAT TGA TGG TCT ATCTGT T 3', SEQ ID NO:47).

A figura 7 mostra a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO:48)do inserto exemplar contido em pJE-7, onde os nucleotídeos sublinhadossão a seqüência secretória mat-α (clivagem pela enzima Kex2 ocorre após aúltima arginina sublinhada), seguido pela citoquina oxidase de seqüência 1.Os dois aminoácidos sublinhados duplos (KL) foram adicionados para auxili-ar na construção da proteína de fusão. A seqüência de aminoácido do peptí-deo exemplar Pc87 é mostrada em tipo negrito.

A figura 8 é um diagrama esquemático de processo mostrandoum método para identificação de peptídeos de defesa de planta que podemser usados para transformar planta, e conceder resistência à patogenias deferrugem.

A figura 9 mostra encistamento de zoósporos ao redor da regiãoapical de uma citoquina oxidase de secreção de raiz transformada (CKX)que revela um peptídeo selecionado por afinidade (esquerda), e modelo deencistamento de zoósporo normal ao redor de uma ponta de raiz tipo selva-gem (direita).

A figura 10 mostra inibição de crescimento de cisto recentemen-te germinado de U. appendiculatus por clone 19 de peptídeo de fago sele-cionado por afinidade (SEQ ID 50, tabela 3) (esquerda), e germinação ecrescimento de uredoesporo normal na presença de biblioteca de fago não-selecionada (direita).Definições

"Seqüência de secreção" significa uma seqüência que direcionasecretórios recentemente sintetizados ou proteínas de membrana para eatravés das membranas do retículo endoplasmático, ou a partir do citoplas-ma para o periplasma através da membrana interna de bactéria, ou a partirda matriz de mitocôndria no espaço interno, ou a partir do estroma de cloro-plastos no tilacóide. A füsão de tal seqüência a um gene que é para ser ex-presso em um hospedeiro heterólogo assegura secreção da proteína recom-binante a partir da célula hospedeira.

"Germiling" significa um cisto recentemente germinado (5-8 ho-ras pós-germinação) que suporta um tubo de germe emergente.

"TBS" significa solução salina Tris-tamponada (50 mM de Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM de NaCI).

Um "polinucleotídeo recombinante" significa um polinucleotídeoque está livre de uma ou ambas das seqüências de nucleotídeo que flan-queia o polinucleotídeo no genoma que ocorre naturalmente do organismodo qual o polinucleotídeo é derivado. O termo inclui, por exemplo, um polinu-cleotídeo ou fragmento deste, que é incorporado em um vetor ou cassete deexpressão; em um plasmídeo ou vírus que se replica autonomamente; noDNA genômico de um procariota ou eucariota; ou que existe como uma mo-lécula separada independente de outros polinucleotídeos. Ele também incluium polinucleotídeo recombinante que é parte de um polinucleotídeo híbrido,por exemplo, uma codificação de uma seqüência de polipeptídeo.

"IPTG" é isopropiltiogalactoside.

"TU" significa unidade de transdução.

"Tampão de NAP" é 80 mM de NaCI, 50 mM de NH4H2PO4, pHajustado para 7,0 com NH4OH.

"NZY-1c" é um meio de crescimento bacterial contendo 1% deNZ amina A (um meio tipo typtone; Humko-Sheffield Chemical, Norwich,N.Y), 0,5% de extrato de levedura, 0,5% de NaCI, pH 7,0 ajustado com Na-OH.

"PCR" significa reação em cadeia de polimerase.Conforme aqui usado, "polinucleotídeo" e "oligonucleotídeo" sãousados intercambeavelmente, e se referem a uma forma polimérica (2 oumais monômeros) de nucleotídeos de qualquer comprimento, ou ribonucleo-tídeos ou deoxirribonucleotídeos. Embora os nucleotídeos sejam usualmenteunidos por ligações de fosfodiéster, o termo também inclui nucleotídeos po-liméricos contendo ligações de suporte de amida neural compostas de uni-dades de aminoetil glicina. Este termo se refere somente à estrutura primáriada molécula. Desse modo, este termo inclui DNA ou RNA de filamento duploe simples. Ele também inclui tipos conhecidos de modificações, por exemplo,etiquetas, metilação, "capas", substituição de um ou mais dos nucleotídeosque ocorrem naturalmente com um análogo, modificações de internucleotí-deo, tais como, por exemplo, aqueles com ligações não-carregadas (por e-xemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos,etc), aqueles contendo porções pendentes, tais como, por exemplo, proteí-nas (incluindo, por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos desinal, poli-L-lisina, etc), aqueles com intercalantes (por exemplo, acridina,psoralen, etc), aqueles contendo quelantes (por exemplo, metais, metaisradioativos, boro, metais oxidativos, etc), aqueles contendo alquilantes, a-queles com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucléicos alfa anomé-ricos, etc), bem como formas não-modificadas do polinucleotídeo. Os polinu-cleotídeos incluem ambas as cepas de sentido e anti-sentido.

"Seqüência" significa a ordem linear na qual monômeros ocor-rem em um polímero, por exemplo, a ordem de aminoácidos em um polipep-tídeo, ou a ordem de nucleotídeos em um polinucleotídeo.

"Peptídeo", "Proteína" e "Polipeptídeo" são usados intercambea-velmente, e significam um composto que consiste em dois ou mais aminoá-cidos que são ligados por meio de ligações de peptídeo.

"Proteína recombinante" significa que a proteína, se compreen-dendo uma seqüência de aminoácido primária nativa ou mutante, é obtidapor expressão de um gene transportado por uma molécula de DNA recombi-nante em uma célula outra que a célula na qual este gene e/ou proteína énaturalmente encontrado. Em outras palavras, o gene é heterólogo ao hos-pedeiro no qual ele é expresso. Deve ser notado que qualquer alteração deum gene, incluindo a adição de um polinucleotídeo que codifica uma porçãode purificação de afinidade, produz este gene não-natural para a propostadesta definição, e, desse modo, este gene não pode ser "naturalmente" en-contrado em qualquer célula.

Um "peptídeo não-imunoglobulínico" significa um peptídeo quenão é uma imunoglobulina, uma região reconhecida de uma imunoglobulina,ou contém uma região de uma imunoglobulina. Por exemplo, uma regiãovariável de cadeia simples de uma imunoglobulina seria excluída desta defi-nição.

"Substancialmente puro" ou "substancialmente purificado" signi-fica que a substância está livre de outras proteínas contaminantes, ácidosnucléicos, e outros biológicos derivados a partir do organismo fonte original.A pureza pode ser ensaiada por métodos padrão, e ordinariamente serãopelo menos cerca de 40% puro, mais ordinariamente pelo menos cerca de50% puro, geralmente pelo menos cerca de 60% puro, mais geralmente or-dinariamente pelo menos cerca de 70% puro, freqüentemente pelo menoscerca de 75% puro, mais freqüentemente pelo menos cerca de 80% puro,tipicamente pelo menos cerca de 85% puro, mais tipicamente pelo menoscerca de 90% puro, preferivelmente pelo menos cerca de 95% puro, maispreferivelmente pelo menos cerca de 98% puro, e em concretizações aindamais preferidas, pelo menos cerca de 99% puro. A análise pode ser em per-centagem em peso e molar, avaliada, por exemplo, por espectrofotometriade manchamento de gel, ou etiquetação terminal, etc.

Descrição Detalhada

A seguinte descrição detalhada é provida para auxiliar aquelesversados na técnica na prática das presentes instrumentalidades. Ainda as-sim, esta descrição detalhada não deve ser construída para limitar indevi-damente a presente invenção, visto que modificações e variações nas con-cretizações aqui discutidas podem ser feitas por aqueles versados na técni-ca sem fugir do espírito ou escopo da presente invenção.

Todas as publicações, patentes, pedidos de patente, base dedados e outras referências citadas neste pedido de patente, são aqui incor-porados por referência em sua totalidade, como se cada publicação indivi-dual, patente, pedido de patente, base de dados, ou outra referência fossemespecífica e individualmente indicados para serem incorporados por referên-cia.

Existe um interesse crescente entre os produtores de soja queP. pachyrhizi, a causa de ferrugem de soja, entre e se difunda através dasáreas de produção norte americanas no futuro próximo. O interesse ocorrede estimativas de perda de colheita de mais do que 50% em algumas regi-ões do mundo. Interesses a cerca desta doença têm aumentado com a re-cente descoberta do fungo de ferrugem no Brasil acima de 5 graus de latitu-de norte. É, do mesmo modo, que no futuro próximo, os esporos de P. pach-yrhizi serão conduzidos pelos ventos que prevalecem em direção ao nortenos Estados Unidos (Rizvi, 2004). Devido a existirem genes de resistência àdoença conhecidos eficazes contra ferrugem, os planos de controle de do-ença atuais estão nas aplicações repetidas de fungicida protetor, a revelaçãoabaixo proporcionando uma opção adicional, que é usar novas tecnologiasde peptídeo para identificar e distribuir peptídeos de defesa que se ligam àsestruturas infectivas de P. pachurhizi e patogenias de ferrugem relacionadaspara parar o desenvolvimento da ferrugem. Os peptídeos de defesa podemser designados para expressão em plantas e distribuídos em locais de infec-ção e colonização de patogenia. Planta, tal como soja e feijão de campo,pode ser projetada para expressar estes peptídeos para produzir linhas deplantas que são unicamente resistentes à ferrugem.

Um programa de desenvolvimento, conseqüentemente, identificapeptídeos que se ligam à esporos de P pachurhizi infectivos e cistos recen-temente germinados, avalia a eficiência de peptídeos de ligação para inibi-ção de germinação de esporo e crescimento fungai, incorpora e testa peptí-deos de defesa candidatos em plantas para potencial de resistência.

A patogenia de ferrugem produz esporos (uredinioesporos) queinfectam folhas de soja, hastes e conjuntos de semente. Os esporos são so-prados pelo vento e caem na planta onde eles germinam para produzir umtubo de germe (definido como a fase de cisto recentemente germinado) quepenetra os tecidos da planta. Após penetração, o fungo se desenvolve adi-cionalmente pela produção de um crescimento filamentoso que se espalhainter e intracelularmente através dos tecidos (Bonde et al., 1976; Koch eHoppe, 1988). Com o tempo, a colonização do tecido conduz a produção deesporos infectivos adicionais que são liberados no vento, e movidos paraoutras plantas.

Embora alguns genes de resistência para ferrugem de soja se-jam hipotetizados, muitos têm falhado sob as condições de campo, ou nostestes de inoculação em estufa. Uma vez que a patogenia chega em umanova área geográfica, os cultivadores se vêem de frente com uma situaçãoem que não existe virtualmente nenhuma resistência à ferrugem disponívelem cultivares de soja comerciais, ou linhas de produção. Para o futuro previ-sível, os cultivadores necessitarão aplicar fungicidas periodicamente atravésde cada estação de crescimento.

A descoberta de novos genes de resistência em soja ou relativospróximos usando tecnologias convencionais, e a incorporação de tais genesem linhas de soja comerciais, é esperada requerer alguns anos. A descriçãoseguinte vantajosamente acelera este processo. Estas possibilidades se-guem de avanços recentes na tecnologia de peptídeo, tecnologia de trans-formação de planta, e biologia molecular, que foram combinadas para o a-vanço aqui descrito. A tecnologia de peptídeo combinatorial capacita a sele-ção de coleções diversas massivas para aquelas que se ligam às estruturasinfectivas de patogenias de planta, e rompem seu desenvolvimento antes edurante infecção da planta. Ferramentas de biologia molecular e transforma-ção de planta capacitam a construção de sistemas de distribuição para ex-pressar estes peptídeos de defesa em locais de infecção em plantas.

Os polipeptídeos de defesa podem ser definidos como aquelesque se ligam à estruturas infectivas, por exemplo., esporos de patogenias deplanta e de animal para interromper o desenvolvimento da patogenia. Ospeptídeos que se ligam e interrompem ou param a função de patogenia al-cançam este efeito pela ligação às proteínas de superfície de patogenia quesão importantes na regulação do desenvolvimento. Uma proteína de superfí-cie selecionada para este uso pode, por exemplo, ser uma enzima que énecessária para formação de parede de célula e crescimento vegetativo outalvez, uma proteína que controla o impedimento de minerais que são críti-cos para crescimento. Os métodos aqui descritos, por meio de ilustração,podem selecionar eficazmente patogenias contra coleções diversas de pep-tídeo que contêm um bilhão ou mais de combinações aleatórias de peptídeo.A técnica é especificamente aplicada para destroçar P. pachyrhizi e patoge-nias relacionadas.

Será mostrado por meio dos exemplos que se seguem comoidentificar peptídeos que se ligam a esporos infectivos de P. pachyrhizi ecistos recentemente germinados, bem como os esporos de patogenias aná-logas ou relacionadas. Uma coleção de peptídeos é gerada e confirmadapara se ligar a esporos infectivos, ou tubos de germe (cistos recentementegerminados) da patogenia. Para identificar os peptídeos de ligação, esporosou cistos recentemente germinados são misturados com coleções, conveni-entemente conhecidas como bibliotecas, ou peptídeos aleatórios que sãorevelados nas partículas de bacteriófagos (vírus), por exemplo, conformemostrado por Wilson et al., 1998. Por esta aproximação, os esporos e cistosrecentemente germinados podem, por meio de ilustração, serem expostos aum bilhão de peptídeos aleatórios. Uma ampla variedade de muitas bibliote-cas de peptídeo adequadas é conhecida na técnica. Em algumas bibliotecas,os peptídeos contêm somente oito aminoácidos, enquanto que, em outrasbibliotecas, cada peptídeo contém 15 aminoácidos.

Após mistura e exposição para incubação correta, lavagem poderemover todos os peptídeos que não grudam fortemente aos esporos e cis-tos recentemente germinados. Os esporos e cistos recentemente germina-dos podem ser tratados para liberar os peptídeos aderentes, aumentar seusnúmeros, e repetir o processo de seleção. Após uma pluralidade de etapasde seleção repetitivas onde cada etapa confirma a ligação de afinidade deligação de peptídeo da etapa anterior, recuperação é certa de numerosospeptídeos que grudam muito fortemente às proteínas e outros componentesde esporos e superfícies de tubo de germe. Em um exemplo, 3 ou 4 etapasde seleção seqüencial são suficientes para proporcionar este resultado.

Uma vez que a afinidade de ligação de peptídeo é confirmadaconforme descrito acima, é possível avaliar a eficiência de peptídeos de liga-ção para inibir germinação de esporos e crescimento fungai. Uma vez que onúmero de peptídeos de ligação tenha sido identificado, é possível selecio-nar aqueles que impactam a função de patogenia. Os peptídeos que parama germinação de esporos e crescimento de cisto recentemente germinadosão de interesse particular. Qualquer destes comportamentos disruptivosconduzirão a infecção de patogenia cessada ou reduzida, e doença. Ensaiosde alto rendimento podem ser usados para testar numerosos peptídeos paracapacidade de parar ou tornar lento a germinação de esporos ou crescimen-to vegetativo em Phytophthora, P. pachyrhizi, ou patogenias análogas. Expe-riência tem mostrado que uma grande percentagem de peptídeos testes po-de ter um impacto no desenvolvimento de patogenia.

Uma vez que um peptídeo de defesa tenha sido identificado, eleé distribuído para pontos de infecção dentro de uma planta, sem degradaçãopor enzimas de planta. Um método para alcançar esta distribuição é fixar opeptídeo a uma proteína que é naturalmente produzida por uma planta, eque é produzida em tecidos colonizados pela patogenia. Em um exemplo,citoquina oxidase tem sido usada com sucesso para esta proposta. Esta pro-teína é produzida naturalmente pelas plantas, e é envolvida na regulação dohormônio de crescimento de planta, citokinin. Os peptídeos de defesa po-dem ser fixados a esta proteína, e usados para modificar função de patoge-nia. Em um exemplo, isto tem sido feito em Phytophthora.

Os peptídeos de defesa podem ser fundidos para citoquina oxi-dase e outras proteínas que são naturalmente secretadas pelas células noespaço intercelular onde elas podem entrar em contato com a patogenia deferrugem de colonização. Alternativamente, as fusões podem incluir proteí-nas que são componentes de paredes de célula de planta. Estas proteínassão também posicionadas para interagirem com a patogenia ambos inter- eintracelularmente. As bases de dados proteômicas comercialmente disponí-veis proporcionam uma ampla variedade de seqüências de gene para prote-ínas veículo de peptídeo candidatas que podem ser usadas como uma alter-nativa para CKX. Estas estruturas de proteína veículo podem ser analisadasusando-se algoritmos proteômicos estruturais convencionais para apresen-tação ou revelação ótimas do peptídeo de defesa.

Constructos de proteína-peptídeo candidatos podem ser expres-sos e secretados inicialmente na levedura, Pichia. Este hospedeiro facilita aconcentração e purificação de uma proteína ou polipeptídeo, e testa osmesmos para inibição de germinação de esporo de patogenia e crescimentode cisto recentemente germinado.

Uma vez que os melhores peptídeos de defesa e os melhoresmodos de revelação na proteína veículo são confirmados, constructos gené-ticos podem ser formados para confirmação na planta, tal como soja ou fei-jão de campo. Métodos de transformação e expressão de planta de genesestranhos são bem-conhecidos na técnica.

Patogenias particularmente virulentas e perigosas, similares a Ppachyrhizi, são contidas por regulação governamental. Este perigo e a com-plexidade regulatória são evitados pelo uso de protocolos de seleção depeptídeo inicial usando uma patogenia de ferrugem alternativa ou análoga.Puccinia polysora, a patogenia fungai que causa ferrugem do sul de milho foireportada por Hollier e King, 1985. Esta patogenia é prontamente disponívelsem restrições, e pode ser manipulada sob condições laboratoriais padrão.

Em uma concretização, bibliotecas de peptídeo são construídaspela inserção de seqüências de ácido nucléico que codificam peptídeos deseis a 15 aminoácidos de comprimento em vetores adequados, embora se-qüências que codificam peptídeos mais longos possam ser usadas. Os pep-tídeos codificados pelos nucleotídeos podem ser completamente aleatóriosem natureza, ou podem ser restringidos em sua composição para encontraros requerimentos estruturais e funcionais. Por exemplo, e sem limitação,uma ponte de cisteína pode ser inserida no peptídeo. Em uma concretiza-ção, a seqüência de ácido nucléico não codifica uma imunoglobulina (anti-corpo), ou uma região de imunoglobulina reconhecida, tal como uma regiãovariável. Qualquer vetor que expressará os oligonucleotídeos pode ser usa-do. Preferivelmente um vetor é usado, que resultará em expressão da biblio-teca de peptídeo na superfície de uma célula ou vírus, ou na superfície deum compartimento intracelular ou organela de uma célula ou vírus. Dessamaneira, os peptídeos expressos estarão disponíveis para interagirem commoléculas-alvo potenciais, ou células que entram em contato com a superfí-cie contendo os peptídeos. Conforme será aparente a um versado na técni-ca, se os peptídeos são expressos na superfície de compartimentos intrace-lulares ou organelas, o alvo potencial deve também residir intracelularmente,ou a organela ou compartimento intracelular devem ser expostos ao ambien-te externo por, por exemplo, Iisis da célula.

Métodos de produção de oligonucleotídeos e inserção dos mes-mos em vetores são bem-conhecidos àqueles versados na técnica, e so-mente serão brevemente revistos aqui. Mais comumente, os oligonucleotí-deos são sintetizados em um suporte sólido usando método de fosfito triés-ter de Beaucage e Caruthers (Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981; vertambém, Patentes dos Estados Unidos Números 4.973.679 e 4.458.066).Numerosos suportes sólidos são disponíveis, incluindo gotas de vidro deporo controlado, copolímeros de poliestireno, sílica-gel e papel celulose. Apreparação de um oligonucleotídeo começa com a ligação do grupo 3'-hidroxila do primeiro nucleosídeo ao suporte sólido. Suportes sólidos con-tendo nucleotídeos são disponíveis de fontes comerciais. O oligonucleotídeoé sintetizado a partir da direção 3' a 5', e a cadeia é alongada por ataquenucleofílico do 5'-hidroxila do oligonucleotídeo imobilizado no 3'-fosfato ati-vado ou fosorframidita de um bloco de construção 5'-protegido solúvel. Odinuclosídeo fosfito intermediário formado deve, em seguida, ser oxidado aofosfato mais estável antes da extensão de cadeia. O processo é repetido atéque o número desejado de nucleotídeos tenha sido adicionado. Dispositivosautomáticos são comercialmente disponíveis para a síntese de oligonucleo-tídeos. Em adição, numerosos fornecedores proporcionam serviços de sín-tese de oligonucleotídeos customizados.

Qualquer sistema de vetor capaz de expressar os peptídeos dabiblioteca de peptídeo pode ser usado na prática, e numerosos sistemas devetor são conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, Wilson e Findlay, Can. J.Microbiol., 44:313-329, 1998). Quando o peptídeo é preparado como partede pVIII, sistemas de fago adequados incluem tipo 8, tipo 88, e tipo 8+8.

Quando plll é utilizado, sistemas de fago adequados incluem tipo 3, tipo 33 etipo 3+3. Quando o peptídeo é inserido em pVI, sistemas de fago adequadosincluem tipo 6, tipo 66, e tipo 6+6. Em adição, sistema de vetor de fago T7 efago 8 podem ser usados. Em uma concretização preferida, os peptídeos dabiblioteca são expressos fundidos para uma proteína de revestimento de umbacteriófago filamentoso, de modo que os peptídeos são expressos na su-perfície do virion e, desse modo, são disponíveis para interagirem com mo-léculas-alvo, ou receptores de superfície de célula. Em uma concretizaçãopreferida, a biblioteca f8-1 é usada em que peptídeos 8-mer aleatórios sãofundidos para a proteína de revestimento pVIII. Em outra concretização pre-ferida, a biblioteca f88-4 é usada em que peptídeos 15-mer aleatórios sãofundidos para a proteína de revestimento pVIII. O fago na biblioteca f88-4prepara peptídeos sem tendência de ocorrência de aminoácido. O fago nabiblioteca f8-1 são não-inclinados, com a exceção de alanina na primeiraposição, e um de quatro resíduos na segunda posição. Todas as outras po-sições são aleatoriamente ocupadas por qualquer aminoácido.

Métodos para produção da biblioteca de peptídeo de produçãode fago f8-1 foram descritos anteriormente (Ver, Petrenko et al., Prot. Engi-neering, 9:797-801, 1996, e referências aqui citadas). A biblioteca revelapeptídeos estranhos em toda cópia das 3900 cópias de proteína de revesti-mento maior pVIII. A expressão de peptídeo necessita não ser induzida porIPGT. O oligonucleotídeo degenerado usado para o inserto de 8-aminoácidoé: GCA GNN (NNN)7, onde N é qualquer nucleotídeo. Portanto, o primeiroaminoácido é uma alanina (A), e o segundo aminoácido é uma valina (V),alanina (A), aspartato (D), glutamato (E), ou glicina (G). O restante dos ami-noácidos no peptídeo é completamente aleatório.

Do mesmo modo, métodos para a produção de biblioteca depeptídeo de produção de fago f88-4 foram também anteriormente descritos(Zhong et al., J. Bioi Chem. 269:24183-24188, 1994; Smith e Scott, Methodsin Enzymology, 217:228-257, 1993; Smith, Gene, 128:1-2, 1993, e referên-cias aqui citadas). Esta biblioteca revela peptídeos estranhos de 15 aminoá-cidos em 150 a 300 cópias de proteína de revestimento maior pVIII. O res-tante das 3900 cópias das subunidades pVIII são derivadas da pVIII tipo sel-vagem. O genoma de fago desse modo suporta dois genes pVIII que codifi-cam dois tipos diferentes de moléculas pVIII. Uma pVIII é o recombinanteque revela o peptídeo 15-mer estranho, enquanto a outra é a pVIII tipo sel-vagem normalmente presente no fago. A expressão do gene pVIII recombi-nante é acionada pelo promotor/operador de tac que se pode induzir porIPTG. Devido a presença de dois genes pVIII, o virion f88 consiste em ummodelo de mosaico de subunidades pVIII tipo selvagem e recombinante.

A seqüência de oligonucleotídeo usada para insertos de 15-meraminoácido é (NNK)i5, onde N é A, T, C ou G, e K designa G ou T. Dessemodo, a região que circunda o inserto 15-mer é: LVPMLS-FA(X)15PAEGDDPAKA (SEQ ID NO:1), onde X é aminoácido codificado pelocódon NNK.

As partículas de fago podem ser usadas para selecionar os pep-tídeos aleatórios expressos no virion por sua capacidade de se ligar a com-postos e células de interesse. Em uma concretização preferida, a bibliotecade peptídeo de produção de fago é usada para selecionar peptídeos que seligam a patogenias de planta. Em outra concretização preferida, os peptí-deos são selecionados por sua capacidade de se ligar a fungos patogênicos.Em ainda outra concretização preferida, peptídeos de produção de fago sãoselecionados por sua capacidade de se ligar a membros do gênero Phytoph-thora. Quando se examinam patogenias com mais do que um estágio devida simples, é preferível que cada estágio de vida seja examinado, vistoque diferenças significantes no número, tipos e afinidade de locais de liga-ção podem ocorrer com mudanças nos estágios de desenvolvimento.

Por exemplo, quando se examinam membros do gênero Phyto-phthora, aproximadamente 105 a 106 organismos são misturados com apro-ximadamente 108 a 109 peptídeos de produção de fago, e incubados por umtempo suficiente para permitir ligação. Será aparente àqueles versados natécnica que, dependendo de fatores tais como a espécie de patogenia, ofago e o peptídeo, que outras concentrações de organismos e peptídeosproduzidos podem ser usadas de acordo com a presente descrição. Em al-guns casos, pode ser desejável pré-incubar os peptídeos preparados comoutros estágios de vida do mesmo organismo de modo a identificar aquelespeptídeos que se ligam somente a um estágio de vida específico. Após incu-bação, o organismo é submetido a lavagens múltiplas, de modo a removerpeptídeos não-ligados e fracamente ligados. No caso de zoósporos de Phy-tophthora, a lavagem é feita usando-se uma solução de aproximadamente50 mM de LiCI. Após lavagem, peptídeos preparados por fago ligado sãoeluídos, preferivelmente em pH baixo, e o fago eluído amplificado em umhospedeiro adequado. Em uma concretização, o hospedeiro é K91 E. coli.Métodos para amplificação de bacteriófago em E. coli são bem-conhecidosna técnica, e podem ser encontrados, por exemplo, em Smith e Scott, Me-thods in Enzymology, 217:228-257, 1993; Ausubel et al. eds., Short Proto-cols in Molecular Biology, 2nd ed., Wiley & Sons, 1995; e Sambrook et al.,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Em umaconcretização, o procedimento de seleção é repetido pelo menos uma vezde modo a enriquecer peptídeos preparados por fago de alta afinidade. Emoutra concretização, o processo de seleção é repetido três vezes.

Uma vez que os peptídeos de alta afinidade preparados por fagosão identificados, os fagos são amplificados, preferivelmente em E. coli, e oDNA isolado de fago usando métodos padrão, tais como aqueles encontra-dos em, por exemplo, Smith e Scott, Methods in Enzymology, 217:228-257,1993; Ausubel et al. eds., Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., Wi-ley $ Sons, 1995; e Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1989. Uma vez que o DNA de fago tenha sido iso-lado, os oligonucleotídeos inseridos podem ser clivados a partir do DNA u-sando-se as mesmas enzimas de restrição usadas para inserir os oligonu-cleotídeos, e os fragmentos de enzima de restrição separados a partir dorestante do DNA. Os oligonucleotídeos podem, em seguida, serem seqüen-ciados usando-se qualquer método padrão. O seqüenciamento pode ser efe-tuado por qualquer método adequado, por exemplo, dideoxi seqüenciamento(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74:5463-5467), seqüenciamentoquímico (Maxam and Gilbert, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 74:560-564, 1977),ou qualquer variação desta, incluindo o uso de seqüenciadores automáticos.

Em uma concretização, o seqüenciamento é acompanhado usando-se umseqüenciador ABI Prism 377 automático (Applied Biosystems, Foster City,Calif). Uma vez que o seqüenciamento do oligonucleotídeo é conhecido, asseqüências de aminoácido dos peptídeos codificados podem ser prontamen-te deduzidas usando-se o código genético.

Os peptídeos preparados por fago de ligação de alta afinidadepodem ser adicionalmente selecionados por sua capacidade de alterar o de-senvolvimento, crescimento e/ou infectividade da patogenia. Nesta concreti-zação, os peptídeos preparados por fago são incubados com uma patoge-nia-alvo por um tempo suficiente para permitir ligação. Em seguida à ligação,a patogenia é observada para alterações em seu desenvolvimento ou capa-cidade de infectar um hospedeiro. Em uma concretização, aproximadamente200 zoósporos de um membro do gênero Phytophthora são combinadoscom um peptídeo preparado por fago em água destilada em diluições emsérie duas vezes em volume constante em pratos petri. A faixa de concen-trações de fago pode variar, mas geralmente varia entre 1 a 10 χ 109 viri-οη/μl. Um controle negativo não contendo fago é incluído em cada seleção.Após um período de incubação de usualmente cerca de 20 minutos à tempe-ratura ambiente, o número de zoósporos encistados em cada concentraçãode fago é determinado. Usando-se este método, é possível selecionar racio-nalmente peptídeos de caráter definido e avaliá-los para indução de espéciee específica de estágio de vida de respostas funcionais mediadas por recep-tor, tal como encistamento de zoósporo. Os peptídeos encontrados para in-terferirem com o desenvolvimento de uma patogenia podem ser usados paraimpedir ou limitar infecção de um hospedeiro com a patogenia.

O presente método pode também ser usado para caracterizarreceptores de ligação de peptídeo na superfície de patogenias de planta.Nesta concretização, o peptídeo de preparação de fago que foi etiquetado(fago teste) é incubado com células de organismos diferentes, e em estágiosdiferentes de desenvolvimento. A afinidade de ligação relativa do fago eti-quetado pode, em seguida, ser determinada pela ligação competitiva e aná-lise de Scatchard. Em uma análise de ligação competitiva, uma concentra-ção constante de fagos testes é permitida se ligar a uma patogenia-alvo e,em seguida, fago de competição não-etiquetado é adicionado sobre umafaixa de concentrações. O fago de competição pode ser o mesmo como ofago teste, ou pode ser diferente. A patogenia-alvo é, em seguida, lavadapara remover fago especificamente ou fracamente ligado, e a quantidade defago teste ligado é determinada pela medição da quantidade de etiquetapresente nas células-alvo. O grau de competição pode ser medido conformea concentração de fago de competição requerido para inibir ligação do fagoteste por 50% (IC5o). Os resultados dos ensaios de competição podem serusados para determinar mudanças no número, tipo e afinidade de receptoresde superfície de célula sobre o tempo.

Dentro do escopo das instrumentalidades descritas, estão oligo-nucleotídeos recombinantes, descobertos pelo método aqui ensinado, quecodificam peptídeos tendo atividade antifungal. Estes oligonucleotídeos re-combinantes podem ser usados para produzir polinucleotídeos recombinan-tes que são comumente usados como vetores de clonagem e de expressão,embora outros usos sejam possíveis. Um vetor de clonagem é uma moléculade DNA auto-replicante que serve para transferir um segmento de DNA emuma célula hospedeira. Os três tipos mais comuns de vetores de clonagemsão plasmídeos bacteriais, fagos, e outras viroses. Um vetor de expressão éum vetor de clonagem designado de modo que uma seqüência de codifica-ção inserida em um local particular será transcrita e transladada em umaproteína.

Ambos os vetores de clonagem e de expressão contêm seqüên-cias de nucleotídeo que permitem que os vetores repliquem uma ou maiscélulas hospedeiras adequadas. Nos vetores de clonagem, esta seqüência égeralmente uma que capacita o vetor a replicar independentemente doscromossomos da célula hospedeira, e também inclui quaisquer origens dereplicação ou seqüências de replicação autônomas. Várias origens bacteriaise virais de replicação são bem-conhecidas àqueles versados na técnica, eincluem, mas não estão limitadas a, origem de plasmídio pBR322, origem deplasmídio de 2 με, e origens de SV40, de polioma, de adenovírus, de VSV eorigens virais BPV.

As seqüências de oligonucleotídeos da presente descrição po-dem ser usadas para produzir peptídeos antifungais pelo uso de vetores deexpressão recombinantes contendo a seqüência de oligonucleotídeo. Osvetores de expressão adequados incluem seqüências de DNA cromossomal,não-cromossomal e sintético, por exemplo, derivados de SV 40; plasmídeosbacteriais; DNA de fago; baculovírus; plasmídeo de levedura; vetores deri-vados de combinações de plasmídeos e DNA de fago; e DNA viral, tal comovacina, adenovírus, vírus fowl pox, e pseudorabies. Em adição, qualquer ou-tro vetor que é replicável e viável no hospedeiro pode ser usado.

A seqüência de nucleotídeo de interesse pode ser inserida novetor por uma variedade de métodos. Nos métodos mais comum, a seqüên-cia é inserida em local(is) de endonuclease de restrição apropriado(s) usan-do-se procedimentos comumente conhecidos àqueles versados na técnica, edetalhados, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning, A Labora-tory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, (1981) e Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., John Wiley & Sons (1992).

Em um vetor de expressão, a seqüência de interesse é opera-velmente ligada a uma seqüência de controle de expressão adequada, oupromotor reconhecido pela célula hospedeira para direcionar síntese demRNA. Os promotores são seqüências não-transladadas localizadas geral-mente 100 a 1000 pares bases (bp) a montante a partir do códon de partidade um gene estrutural que regula a transcrição e translação de seqüênciasde ácido nucléico sob seu controle. Os promotores são geralmente classifi-cados como, ou induzíveis, ou constitutivos. Promotores induzíveis são pro-motores que iniciam níveis aumentados de transcrição de DNA sob seu con-trole na resposta de alguma mudança no ambiente, por exemplo, a presençaou ausência de um nutriente, ou uma mudança na temperatura. Promotoresconstitutivos, em contraste, mantêm um nível relativamente constante detranscrição.

Uma seqüência de ácido nucléico é operavelmente ligada quan-do é colocada em um relacionamento funcional com outra seqüência de áci-do nucléico. Por exemplo, DNA para uma pré- seqüência ou condutor secre-tário é operativamente ligado a DNA para um polipeptídeo se ele é expressocomo uma proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotoré operavelmente ligado a uma seqüência de codificação se ele afeta a trans-crição da seqüência ; ou um local de ligação de ribossoma é operavelmenteligado a uma seqüência de codificação se ele está posicionado de modo afacilitar translação. Geralmente, seqüências operavelmente ligadas são con-tíguas e, no caso de um condutor secretório, contíguas e em fase de leitura.A ligação é alcançada pela ligação em locais de enzima de restrição. Se Ιο-cais de restrição adequados não são disponíveis, então adaptadores de oli-gonucleotídeo sintéticos ou Iigantes podem ser usados, conforme é conheci-do àquele versado na técnica, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Labora-tory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, (1989) e Aussbel et al.,Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., John Wiley & Sons (1992).

Promotores comuns usados em vetores de expressão incluem,mas não estão limitados a, promotor LTR ou SV40, os promotores de E. coliIac ou tpr, e o promotor de fago lâmbida PL. Promotores de planta induzíveisúteis incluem promotores de choque térmico (Ou-Lee et al. (1986) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 83:6815; Ainley et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14: 949), umpromotor induzível de nitrato derivado de gene espinafre nitrito reduetase(Back et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17:9), promotores induzíveis de hormônio(Yamaguchi-Shinozaki et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:905; Kares et al.,(1990) Plant Mol. Biol. 15:905), e promotores induzíveis leves associadoscom a subunidade pequena de RuBP carboxilase e famílias de gene LHCPKuhlemeier et al. (1989) Plant Cell 1:471; Feinbaum et al. (1991) Mol Gen.Genet. 226:449; Weisshaar et al. (1991) EMBO J. 10: 1777; Lam and Chua(1990) Science 248:471; Castresana et al. (1988) EMBO J. 7:1929; Schulze-Lefert et al. (1989) EMBO J. 8: 651). Outros promotores conhecidos paracontrolar a expressão de genes em células procariótica ou eucariótica po-dem ser usados, e são conhecidos àquele versado na técnica. Vetores deexpressão podem conter um local de ligação de ribossomo para iniciação detranslação, e um terminador de transcrição. O vetor pode também conterseqüências úteis para amplificação de expressão de gene.

Vetores de expressão e clonagem podem, e usualmente contêm,um gene de seleção, ou marcador de seleção. Tipicamente, este gene codi-fica uma proteína necessária para a sobrevivência ou crescimento da célulahospedeira transformada com o vetor. Exemplos de marcadores adequadosincluem dihidrofolato reductase (DHFR), ou resistência à neomycin para cé-lulas eucarióticas, e resistência à tetraciclina ou ampicilina para E. coli. Mar-cadores de seleção em plantas incluem resistência à blenomycin, glifosato,higromycin, kanamycin, metotrexato, fleomycin, fosfinotricin, spectinomycin,streptomycin, sulfonamida e sulfoniluréias. Maliga et al., Methods in PlantMolecular Biology, Cold Spring Harbor Press, 1995, p. 39.

Em adição, vetores de expressão podem também conter se-qüências marcadoras ligadas a uma seqüência de nucleotídeo para umaproteína que codifica uma proteína adicional usada como um marcador. Oresultado é um híbrido ou proteína de fusão compreendendo duas proteínasligadas e diferentes. A proteína marcadora pode proporcionar, por exemplo,um marcador imunológico ou enzimático para a proteína recombinante pro-duzida pelo vetor de expressão. Marcadores adequados incluem, mas nãoestão limitados a, fosfatase alcalina (AP), myc, hemagglutinin (HA), β-glucuronidase (GUS), luciferase, e proteína fluorescente verde (GFP).

As seqüências de polinucleotídeo da presente descrição podemtambém ser parte de um cassete de expressão que em um mínimo compre-ende, operavelmente ligada na direção 5' a 3', uma seqüência regulatória, talcomo um promotor, um polinucleotídeo que codifica um peptídeo da presen-te descrição, e uma seqüência de sinal de terminação transcricional funcio-nal em uma célula hospedeira. O promotor pode ser de qualquer dos tiposaqui discutidos, por exemplo, um promotor específico de tecido, um promotordesenvolvimentalmente regulado, um promotor específico de organela, umpromotor específico de semente, um promotor específico de plastídeo, etc. Ocassete de expressão pode adicionalmente compreender uma região de co-dificação de peptídeo operavelmente ligada de alvejamento, de trânsito oude secreção, capaz de direcionar transporte da proteína produzida. O casse-te de expressão pode adicionalmente compreender uma seqüência de nu-cleotídeo que codifica um marcador selecionável, e/ou uma porção de purifi-cação.

Mais particularmente, a presente descrição inclui construtos re-combinantes compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo isolado quecodifica os peptídeos antifungais da presente descrição. Os construtos po-dem incluir um vetor, tal como um plasmídeo, ou vetor viral, em que a se-qüência foi inserida, ou na orientação de avanço, ou reversa. O construtorecombinante pode adicionalmente compreender seqüências reguíatórias,incluindo, por exemplo, um promotor operativamente ligado à seqüência.Grandes números de vetores adequados e promotores são conhecidos à-quele versado na técnica, e são comercialmente disponíveis.

Uma concretização adicional da presente descrição se refere acélulas hospedeiras transformadas contendo construtos compreendendo asseqüências de oligonucleotídeo da presente descrição. A célula hospedeirapode ser uma célula eucariótica mais alta, tal como uma célula de mamíferoou de planta, ou uma célula eucariótica inferior, tal como uma célula de leve-dura, ou o hospedeiro pode ser uma célula procariótica, tal como uma célulabacterial. A introdução do construto na célula hospedeira pode ser acompa-nhada por uma variedade de métodos, incluindo transfecção de fosfato decálcio, transfecção mediada por DEAE-dextran, Polibreno, fusão de proto-plasto, lipossomas, microinjeção direta no núcleo, carregamento de raspa-gem, e eletroporação. Em plantas, uma variedade de métodos diferentespode ser empregada para introduzir vetores de transformação/expressão emprotoplastos de planta, células, tecidos de calo, discos de folha, meristemas,etc., para gerar plantas transgênicas. Estes métodos incluem, por exemplo,transformação mediada por Agrobacterium, distribuição de canhão de parti-cuia, microinjeção, eletroporação, transformação de protoplasto mediada porpolietileno glicol, transformação mediada por lipossoma, etc (revisado emPotrykus (1991) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. BioL 42:205).

Os peptídeos produzidos por expressão dos polinucleotídeos dapresente descrição podem ser obtidos pela transformação de uma célulahospedeira por qualquer dos métodos anteriormente descritos, desenvol-vendo a célula hospedeira sob condições apropriadas, induzindo expressãodo polinucleotídeo, e isolamento da(s) proteína(s) de interesse. Se a proteí-na é retida no interior da célula hospedeira, a proteína pode ser obtida porIisis das células hospedeiras, enquanto se a proteína é uma proteína secre-tada, ela pode ser isolada a partir do meio de cultura. Vários métodos sãodisponíveis para purificação de proteínas, e são conhecidos àquele versadona técnica. Estes incluem precipitação por, por exemplo, sulfato de amôniaou precipitação de etanol, extração de ácido, cromatografia de troca de â-nion ou cátion, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interaçãohidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita,cromatografia de lectin, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC),eletroforese sob condições nativa ou de desnaturação, focalização isoelétri-ca, e imunoprecipitação.

Alternativamente, peptídeos codificados pelos polinucleotídeosda presente descrição podem ser produzidos por síntese química usando-se,ou síntese de peptídeo de fase sólida, ou por síntese de peptídeo de soluçãoclássica também conhecida como síntese de peptídeo de fase líquida. Nasíntese de fase líquida suportada por oligômero, o desenvolvimento do pro-duto é fixado a um grupo polimérico solúvel grande. O produto de cada eta-pa da síntese pode, em seguida, ser separado de reagentes não-reagidosbaseados na grande diferença de tamanho entre o produto fixado de políme-ro relativamente grande e os reagentes não-reagidos. Isto permite que rea-ções ocorram em soluções homogêneas, e eliminem etapas de purificaçãotediosas associadas com síntese de fase líquida tradicional. A síntese defase líquida suportada por oligômero também foi adaptada a síntese de faselíquida automática de peptídeos.Para síntese de peptídeo de fase sólida, o procedimento requero conjunto seqüencial dos aminoácidos apropriados em um peptídeo de umaseqüência desejada, enquanto o final do desenvolvimento de peptídeo estáligado a um suporte insolúvel. Usualmente, o terminal carboxila do peptídeoé ligado a um polímero do qual pode ser liberado sob tratamento com umreagente de clivagem. Em um método comum, um aminoácido é ligado auma partícula de resina, e o peptídeo gerado em uma maneira gradual poradições sucessivas de aminoácidos protegidos para produzir uma cadeia deaminoácidos. As modificações da técnica descrita por Merrifield são comu-mente usadas (ver, por exemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soe. 96:2989-93,1964). Em um método de fase sólida automático, peptídeos são sintetizadospelo carregamento de aminoácido de terminal carbóxi em um Iigante orgâni-co (por exemplo, PAM, 4-oximetilfenilacetamidometil), que é covalentementefixado a uma resina de poliestireno insolúvel reticulada com divinil benzeno.A âmina terminal pode ser protegida pelo bloqueio com t-butiloxicarbonila.Grupos hidroxila e carboxila são comumente protegidos pelo bloqueio comgrupos O-benzila. A síntese é acompanhada em um sintetizador de peptídeoautomático, um número do qual são comercialmente disponíveis. Em segui-da à síntese, o produto pode ser removido da resina. Os grupos de bloqueiosão removidos tipicamente pelo uso de ácido hidroflúorico ou ácido trifluor-metil sulfônico, de acordo com os métodos estabelecidos (por exemplo, Ber-got e McCurdy, Applied Biosystems Bulletin, 1987). Em seguida à clivagem epurificação, um rendimento de aproximadamente 60 a 70% é tipicamenteproduzido. A purificação do peptídeo produto é acompanhada por, por e-xemplo, cristalização do peptídeo de um solvente orgânico, tal como metil-butil éter, em seguida dissolução em água destilada, e usando-se diálise (seo peso molecular do peptídeo objeto é maior do que cerca de 500 dáltons),ou cromatografia líquida de alta pressão reversa (por exemplo, usando-seuma coluna C18 com 0,1% de ácido trifluoracético e acetonitrila como sol-ventes) se o peso molecular do peptídeo é menor do que 500 dáltons. Opeptídeo purificado pode ser Iiofilizado e armazenado em um estado secoaté uso. A análise dos peptídeos resultantes pode ser acompanhada usan-do-se os métodos comuns de cromatografia líquida de alta pressão analítica(HPLC), e espectrometria de massa de eletropulverização (ES-MS).

Em geral, plantas transgênicas compreendendo células conten-do polinucloetídeos da presente descrição podem ser produzidas por qual-quer dos métodos precedentes; seleção de células de planta que foramtransformadas em um meio seletivo; regeneração de células de planta queforam transformadas para produzir plantas diferenciais; e seleção de umaplanta transformada que expressa a(s) proteína(s) codificada(s) pelos poli-nucleotídeos da presente descrição em um nível desejado. Métodos especí-ficos para transformação de uma ampla variedade de dicots e obtenção deplantas transgênicas são bem-documentados na literatura (Gasser e Fraley,Science 244:1293, 1989; Fisk e Dandekar, Scienthia Horticulturae 55:5,1993; e as referências citadas neste).

Transformação bem-sucedida e regeneração de planta têm sidoalcançadas em uma variedade de monocots. Exemplos específicos são co-mo segue: aspargus (asparagus afficinalis; Bytebier et al. (1987) Proc. NatLAcad. Sei. USA 84:5345); cevada (Hordeum vulgarae; Wan e Lemaux (1994)Plant PhysioL 104:37); milho (Zea mays\ Rhodes et al. (1985) Science240:204; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2: 603; Fromm et al. (1990)Bio/Technology 8: 833; Koziel et al. (1993) Bio/Technology 11: 194); aveiasCAvena sativa; Somers et al. (1992) Bio/Technology 10:1589); grama de po-mar (Dactylis glomerata; Horn et al. (1988) Plant Cell Rep. 7: 469); arroz(Oryza sativa, incluindo variedades indica e japonica; Toriyama et al. (1988)Bio/Technology 6: 10; Zhang et al. (1988) Plant Cell Rep. 7: 379; Luo e Wu(1988) Plant MoL Biol. Rep. 6: 165; Zhang e Wu (1988) Thgeor. Appll. Genet.76: 835; Christou et al. (1991) Bio/Technology 9: 957); centeio (Secale ce-reale\ De Ia Pena et al. (1987) Nature 325: 274); sorgo (Sorghum bicolor,Cassas et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 11212); cana de açúcar(Saccharum spp\ Bower e Birch (1992) Plant J. 2: 409); vivazes altas (Festu-ca arundinacea; Wang et al. (1992) Bio/Technology 10: 691); gramado {A-grostis palustris; Zhong et al (1993) Plant Cell Rep. 13; 1); e trigo (Triticumaestivum-, Vasil et al., (1992) Bio/Technology 10: 667; Weeks et al. (1993)Plant PhysioL 102: 1077; Becker et al. (1994) Plant J. 5: 299).

Em uma concretização preferida, as plantas são transformadascom polinucleotídeos recombinantes que codificam os peptídeos antifungaisda presente descrição, que resultam nos peptídeos sendo secretados pelaplanta. Em outra concretização preferida, os peptídeos antifungais são se-cretados pelas raízes da planta transformada. As plantas que secretam pep-tídeos antifungais podem ser construídas pelos métodos acima descritosusando-se cassetes de expressão que incorporam uma seqüência de secre-ção que direcionam secreção dos peptídeos. Alternativamente, as plantaspodem ser transformadas com uma seqüência de nucleotídeo que codificauma proteína de fusão construída a partir dos peptídeos antifungais da pre-sente descrição, e uma proteína que é normalmente secretada pela planta.Por exemplo, uma proteína de fusão pode ser produzida entre um peptídeoantifiungal e a enzima citocininas oxidase. A citokinin oxidase é uma enzimaprotetora que age para degradar citokinins exógenas que podem interferircom o controle de crescimento de planta. Pela fusão dos peptídeos antifun-gais para a região do gene citokinin oxidase que controla a secreção, o pep-tídeo antifungal seria secretado pela planta transformada, proporcionando,desse modo, proteção de fungos patogênicos.

Antes de serem usadas para transformar plantas, as proteínasde fusão contendo peptídeos antifungais podem ser selecionadas por ativi-dade usando-se o método de preparação de fago da presente descrição. Emgeral, uma proteína de fusão pode ser construída contendo um peptídeo an-tifungal; a porção de controle secretório de uma proteína, tal como citokininoxidase; e a proteína de revestimento de fago pVIII ou plll. As proteínas defusão preparadas por fago assim construídas podem, em seguida, seremselecionadas usando-se o método da presente descrição para selecionaraquelas proteínas de fusão que se ligam a um fungo patogênico-alvo, e re-sultam em alternações que limitam a patogenicidade.

Exemplos

Os seguintes exemplos são pretendidos para proporcionar ilus-trações da aplicação da presente descrição. Os exemplos seguintes não sãopretendidos para definir completamente, ou, de outro modo, limitar o escopoda invenção.

Exemplo 1

Espécie Fungai e Produção de Zoósporo

As cepas fungais usadas foram P. capsici (ATCCC 15399); P.sojae (cepa 7-6-1, curso 25) (A. F. Schmitthenner, Ohio State University); ePhytophthora parasítica. Todas as culturas foram mantidas como micélia emplacas de ágar de feijão-de-lima (P. sojae), ou placas de àgar de farinha demilho (Difco, USA) (P. capsici e P. parasítica) a 15 graus C. Cópias de micé-lio foram produzidas por transferência de porções de micélio (5 mm χ 5 mm)para placas de ágar contendo 10% de suco de verdura V8® (Campbell SoupCo., USA). Três porções por placa foram desenvolvidas por três a seis dias a25 graus C. Produção de esporângio foi induzida em P. capsici por limpezadas placas e incubação a 25 graus C com luz. Após um a dois dias, a libera-ção de zoósporo foi induzida por inundação das placas com água estéril por20 a 30 minutos. A produção de zoósporo de P. parastica foi idêntica àquelade P capsici, exceto que as placas foram lavadas com água estéril por doisminutos antes da incubação a 25 graus C com luz. A liberação de zoósporofoi induzida de esporângio de P. sojae por inundamento das placas por qua-tro vezes em água estéril em intervalos de 30 minutos. Os zoósporos foramliberados dentro de duas a quatro horas. Após sua liberação, os zoósporosforam filtrados através de quatro camadas de tecido grosseiro de algodãopara remover casos esporangiais e fragmentos de micélia. Uma amostra dasuspensão foi girada por 30 segundos para induzir encistamento, e o cistocontado sob um microscópio em um hemacitômetro.

Exemplo 2

Preparação de Células de K19kan E. coli Não-Alimentadas eFago Titerinz como Unidades de Transdução

Antes da seleção da biblioteca, os fagos foram titulados comounidades de transdução de tetraciclina (TU) em células não-alimentadas deK91 BIuKan (resistente à kanomycin) Escherichia coli, de acordo com méto-dos publicados (Smith & Scott, Methods in Enzymology, 217:228-257, 1993;Yu and Smith, Methods em Enzymology, 267:3-27, 1996). As unidades detrandução são um modo eficaz de medir a infectividade do fago, e são usu-almente expressas como TU/ml de fago. Brevemente, células K91 BIuKanforam desenvolvidas a 37 graus C com agitação vigorosa (~ 170 rpm) em 20ml de supercaldo (Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217:228-257,1993) para fase de Iog média (OD6oo~0,45). As células foram, em seguida,incubadas com agitação branda por um adicional de 5 minutos para permitirqualquer fplll cortado regenerar. As células foram centrifugadas em um tubode 50 ml estéril de Oak Ridge a 2200 rpm por 10 minutos em um rotor Sor-vali SS34 a 4 graus C. O sobrenadante foi derramado, e as células foramressuspensas em 20 ml de 80 mM de NaCI, colocadas em um frasco de 125ml de cultura, e sacudidas brandamente por 45 minutos a 37 graus C e 70rpm. As células foram, em seguida, centrifugadas conforme acima, e ressus-pensas em 1 ml de tampão NAP frio. As células não-alimentadas foram ar-mazenadas a 4 graus C, e permaneceram infectivas por 3 a 5 dias.

Os fagos foram titulados como unidades de transdução (TU) emcélulas de E. co//'K91BluKan não alimentadas (preparadas conforme acima).Os fagos foram analiticamente titulados usando-se TBS/gelatina como o di-luente. Dez microlitros de cada diluição de fago foram depositados comouma gotícula na parede interna de um tubo disponível de 15 ml estéril manti-do em um ângulo de 10 graus a partir da horizontal. Dez microlitros de célu-las de E. co//K91 BIuKan não alimentadas foram adicionadas a cada gotículade fago, e esta foi incubada por 10 minutos à temperatura ambiente parapermitir tempo para o fago infectar as células concentradas. Após 10 minu-tos, 1 ml de supercaldo contendo 0,2 mg/ml de tetraciclina foi adicionado àscélulas, e incubadas por 20 a 40 minutos a 37 graus C com agitação. Paraamplificação do fago Í88-4/15 mer, o supercaldo também contém 1 mM deIPTG para induzir expressão de pVIII recombinante. As células infectadasforam, em seguida, difundidas (200 ml por placa) em placas Luria-Bertani(LB) contendo 40 mg/ml de tetraciclina. As placas foram, em seguida, incu-badas por -24 horas a 37 graus C.

Exemplo 3Seleção de Faqo de Ligação de Zoósporo

Uma alíquota de 1011 unidades de transdução (TU) a partir dabiblioteca f8-1 (Petriko et al., 9:797-801, 1996) foi adicionada a 106 de zoós-poros de P. capsici recentemente liberados à temperatura ambiente em 4 mlde 50 mM de LiC, e incubados por 30 minutos à temperatura ambiente comagitação branda. O mesmo procedimento foi usado para biblioteca f88-4,exceto em alguns casos zoósporos de P. sojae foram usados (clones Soj).Os zoósporos contendo o fago ligado foram lavados 10 vezes em 150 μΙ de50 mM de LiC, e centrifugados a 1000 χ g por 45 segundos para removerfago não-ligado. Após a décima lavagem, os fagos ligados foram eluídoscom 200 μΙ de tampão de eluição (HCI 0,1 N), glicina suficiente para trazerpH para 2,2, 1 mg/ml de albumina de soro bovino). Os fagos eluídos foramamplificados por infecção de células de E. coli K91 BIuKan não alimentadas,conforme descrito acima. Os fagos amplificados foram, em seguida, purifica-dos por precipitação com polietileno glicol, conforme descrito abaixo, e res-suspensos em tampão de TBS, conforme descrito por Smith and Scott (Me-thods in Enzymology, 217:228-257, 1993). Uma alíquota de fago purificadofoi subseqüentemente reaplicada em zoósporos recentemente liberados,conforme descrito acima, para um total de três purificações de afinidade eduas etapas de amplificação. Enriquecimento seletivo do fago de ligação dezoósporo foi monitorado pelo cálculo de percentagem de rendimento apóscada etapa de seleção, conforme descrito em Smith e Scott (Methods inEnzymology, 217:228-257, 1993). Isto foi feito pelo cálculo do fago total (ex-presso como unidades de transdução) que foi aplicado ao zoósporos, e me-dindo-se a produção total de fago (como unidades de transdução) que foirecuperado a partir dos zoósporos, e expressando o resultado como umapercentagem. O rendimento de fago eluído a partir dos zoósporos após cadaetapa de seleção, foi entre 10"4 a 10"5% indicando que este procedimento foibem-sucedido na seleção para ligação de fago para os zoósporos. Os zoós-poros estavam intactos e esféricos após as etapas de lavagem, mostrandoque pouco ou nenhum encistamento tinha ocorrido durante o processo deseleção.Exemplo 4

Purificação de Faqo

Células de E. coli K91 BIuKan infectadas com fago foram desen-volvidas durante a noite em 20 ml de supercaldo (contendo 40 mg/ml de te-traciclina) a 37 graus C, e 170 rpm. A cultura foi centrifugada para peletizaras células de £ coli (contendo fago) em um rotor SS34 por 10 minutos a5.000 x g. O sobrenadãnte foi removido e colocado em um tubo novo OakRidge, e PEG/NaCI (16,7% de polietileno glicol/3,3 M de NaCl) foi adicionadoa uma taxa de 150 I por ml de sobrenadãnte para precipitar o fago. Os fagosforam precipitados durante a noite a 4 graus C e, em seguida, peletizadospor centrifugação em um tubo de 50 ml Oak Ridge a 10.000 rpm por 20 mi-nutos em um rotor SS34. Os fagos peletizados foram ressuspensos em 1 mlde solução salina Tris-tamponada (TBS). Estes foram novamente reprecipi-tados pela adição de 150 ml de PEG/NaCl, e deixados durante a noite a 4graus C. Os fagos foram peletizados por centrifugação em uma centrífugasuperior de bancada, e o pélete foi ressuspenso em TBS.

Exemplo 5

Isolamento. Seqüenciamento e Análise de DNA

O DNA usado para seqüenciamento foi isolado de clones de fa-go individuais de acordo com o método de Smith e Scott (Methods in Enzy-mology, 217:228-257, 1993). DNA de filamento simples foi seqüenciado apartir de terminal 3' usando-se um seqüenciador ABI Prism 377 automático(Applied Biosystems, Foster City, Calif.), seguindo o protocolo do fabricante.O iniciador usado para clones f8 foi 5'-GGAGCCCTTTAATTGTATCGG-3'(SEQ ID NO:2). O iniciador usado para clones f88 foi 5'-AGT AGC AGA AGCCTG AAG A-3'(SEQ ID NO:3).

Seqüências de DNA foram traduzidas usando-se o programa de"tradução" do ExPASy Molecular Biology Server (websitehttp://www.expasv.ch/). As seqüências foram comparadas com ácido nucléi-co e seqüências de proteína armazenadas em bases de dados de seqüência(GenBank, EMBL, dbEST, SwissProt, PlR) usando-se algoritmos padrão (is-to é) FASTA (Limpman e Person, Science, 227:1435-1441, 1985), e coman-dos BLAST (Altschul et. al., J. Molecular Biol., 215:403-410, 1990). As se-qüências de peptídeo foram alinhadas usando-se CIustaIW (Thompson et al.,Nuc. Acid. Res., 22:4673-4680, 1994) com uma tabela de peso PAM250 e odendograma visto usando-se Tree View (Page, Computer Applic. Biosci.,12:357-358, 1996). As seqüências de f8-mer DNA obtidas codificadas para19 seqüências de peptídeo prognosticadas (Tabela 1). A maioria dos peptí-deos contém resíduos de aminoácido que foram prognosticados para seremformadores α-helicoidais fortes (isto é, Glu, Ala e Leu) e quebradores a-helicoidal (isto é, Gly e Pro). Apesar da falta de um motivo comum, o pro-grama de alinhamento de seqüência múltipla CIustaW foi usado para agru-par peptídeos similares na forma de um dendograma. O dendograma, cons-truído a partir dos peptídeos alinhados, indicou que as seqüências de peptí-deo 18-mer podem ser agrupadas em seis grupos de família amplos confor-me representado na figura 1 e Tabela 1. As seqüências selecionadas a partirda biblioteca f88-4/15 mer são mostradas na Tabela 2.

Exemplo 6

Ensaio de Encistamento

Clones de fago selecionados foram isolados de acordo com Smi-th e Scott (Methods in Enzymology, 217:228-257, 1993), e duas vezes purifi-cados usando-se polietileno glicol, conforme descrito acima, com a exceçãoque os fagos foram ressuspensos em água destilada ao invés de TBS. Aconcentração de virion foi calculada pela medição da absorvância a A269(Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217:228-257, 1993). Gotículas deágua de aproximadamente 20 μΙ contendo cerca de 400 zoósporos recente-mente liberados foram incubadas com fago em diluições em série duas ve-zes, de modo que elas continham peptídeos de suporte de fago em concen-trações de ou 1 χ 1010, 5 χ 109, 2,5 χ 109 ou 1,25 χ 109 virion/μΙ de gotícula.Um controle negativo não recebeu fago, e foi usado para monitorar a quanti-dade de encistamento espontâneo na população de zoósporo. Após umaincubação de 20 minutos à temperatura ambiente, o número de zoósporosencistados foi contado, usando-se um microscópio em ampliação de 100x. Aconcentração de virion de fago foi calculada de acordo com Smith e Scott(Methods in Enzymology1 217:228-257, 1993).

A eficiência dos peptídeos f8 na indução de encistamento pre-maturo variou com a família de seqüência, e com a concentração de fago(figura 2). Em uma concentração de 1 χ 1010 virion/μΙ (64 μΜ), muitas famí-lias de peptídeo foram eficazes na indução de encistamento. Em uma con-centração de 2,5 χ 109 virion, contudo, existe uma diferença de 3 a 5 vezesnos peptídeos que causou altos níveis de encistamento (Pc42, Pc78, Pc87 ePc64) e peptídeos causando níveis baixos de encistamento (Pc15B, Pc56 ePc45). Em uma concentração de 1,25 χ 109 (8 μΜ), todas as famílias de pep-tídeo eram minimamente eficazes na indução de encistamento. O fago tiposelvagem também causou encistamento dos zoósporos de P. capsici; contu-do, a fração de zoósporos encistados pelo fago selecionado era duas a setevezes maior do que a fração encistada pelo fago tipo selvagem em todos osexperimentos. A capacidade de peptídeos que suportam fago de P. capsiciselecionado de encistar prematuramente zoósporos foi específica para P.capsici. Pouco ou nenhum encistamento foi observado quando zoósporos P.sojae e P. parastica foram incubados com peptídeos de suporte de fago a 1χ 1010 virion/μΙ, uma concentração que resultou em quase 100% de encista-mento para zoósporos de P. capsici. Resultados similares foram obtidos compeptídeos f88-4 15 mer. A capacidade de peptídeos 15 mer representativosem causar encistamento prematuro em comparação ao clone f-8 Pc87 émostrada na figura 3.

Exemplo 7

Especificidade de Ligação

Peptídeos preparados por fago com altas e baixas capacidadesde indução de encistamento para sua capacidade de se ligar aos zoóporosde P. capsici. Os clones de fago Pc87 e Pc45 foram aleatoriamente selecio-nados conforme os clones representativos que induzem níveis altos e baixosde encistamento, respectivamente (cf. figura 2). O vetor de fago foi incluídocomo um tratamento de controle. Os clones de fago foram amplificados porinfecções de E. colie purificados conforme descrito acima. Para cada reaçãode ligação, 5 χ 1010 TU de fago foram incubados com 200.000 zoósporos deΡ. capisici. As reações de ligação e lavagens foram realizadas conformedescrito no Exemplo 3 para seleção de fago. Os fagos eluídos a partir dapopulação de zoósporo foram titulados em células de E. coli K91BluKan, eexpressos como unidades de transdução totais. Um procedimento similar foiusado para determinar se o fago selecionado se ligou aos cistos de P capsici.

O vetor de fago e clones Pc45 e Pc87 se ligam diferencialmenteaos zoósporos de P. capsici. Mais do que 107 TU de fago Pc87 foram eluí-dos de zoósporos após 30 minutos de incubação, enquanto somente 50.000TU de fago Pc45 ou vetor de fago foram eluídos sob as mesmas condições(figura 4). Além disso, a ligação foi específica para o estágio de zoósporo:menos do que 104 Pc87 foram eluídos de cistos a cerca da mesma ligaçãoobservada com fago de vetor de controle (figura 5).

Exemplo 8

Construção de Proteína de Fusão Secretada

Fusões de DNA carboxi terminal foram construídos para codifi-car para os peptídeos de interesse pela ligação de oligonucleotídeos sintéti-cos nos locais de enzimas de restrição, Hindlll e Xbal, do vetor transportadorpJE-6. O vetor de plasmídeo pJE-6 foi construído a partir da construto deexpressão de Pichia pastoris pROM-46 derivada a partir do plasmídeopPICZ-alfa (Invitrogen, Carlsbad1 Calif.), previamente descrito (Cregg et al.,Bio/Technology, 11:905-910, 1993; Rosenfeld, Methods in Enzymoiogy,306:154-169, 1999). Plasmídeo pROM-46 foi digerido com endonuclease derestrição, Hindlll, preenchido com enzima Klenow e dNTP's, e religado comT4 DNA ligase. Estas etapas eliminam um local de restrição de Hindlll pre-sente dentro da seqüência de alfa plasmídeo pPICZ, e o plasmídeo foi de-signado pJE-4. A seqüência na extremidade 3' da seqüência de codificação foimutagenizada por PCR para substituir o códon de parada com o local de restri-ção Hindlll. Este plasmídeo foi designado pJE-6. Os oligonucleotídeos sintéti-cos que codificam para um peptídeo exemplar (Pc87, ADRPSMSPT, SEQ IDNO:8) foram ligados no plasmídeo pJE-6, digeridos com Hindlll e Xbal. Esteplasmídeo foi designado pJE-7 (figura 6). O plasmídeo pJE-7 foi seqüenciadopara confirmar o inserto, e os resultados são mostrados na figura 7.Tabela 1

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Conforme mostrado acima, esqueletos de proteína podem serdesignados para revelação de peptídeos quando os peptídeos são transfor-mados em plantas. Por meio de ilustração, citokinin oxidase (CKX) pode serusada como um esqueleto de distribuição de peptídeo. Um membro da famí-lia de CKX derivada de milho (Morris, 1997) pode, por exemplo, ser usadocomo uma molécula de distribuição. CKX é endogenamente produzida, pos-sui uma seqüência de sinal de peptídeo para secreção de células, e é sufici-entemente glicosilatada para proporcionar estabilidade na presença de en-zimas proteolíticas na região intracelular (Morri et al., 1999).

Baseado na estrutura tridimensional conhecida de CKX1 confor-me reportado por Malito et al., 2004, CKX pode ser projetada para revelarpeptídeos em um terminal C exposto. Os construtos de esqueleto podem,por exemplo, ser expressos e secretados de levedura. Nos experimentosiniciais, a capacidade inibitória de peptídeos selecionados foi dramática, e80-90% de encistamento de zoósporo foi obtido. Em controles de água, en-cistamento de zoósporos de Phytophthora foi 25% ou menos (Fang et al.,2004). Raízes de tomate peludo podem, por exemplo, serem produzidas u-sando-se estes construtos, e, em se fazendo isto, foi encontrado que os es-queletos de peptídeos são secretados na rizosfera, onde eles induzem en-cistamento de zoósporo antes deles se acumularem na superfície da raiz,bloqueando, desse modo, infecção. Isto é mostrado na figura 9.

Em adição à operação acima, mas pela expansão das mesmastécnicas, peptídeos 15-mer foram selecionados de bibliotecas combinatóriasque se ligam fortemente a uredoesporos de U. apperidiculatus. Este fungofoi usado como um substituto ou análogo selecionado para P. pachyrhizi,onde acesso a P. pachyrhizi é proximamente controlado para contaminantedesta patogenia. Estas classificações identificaram um número de peptídeosque inibem crescimento após germinação de esporo inicial, por exemplo,conforme mostrado na Figura 10. Os peptídeos são eficazes em concentra-ções micromolares. O desenvolvimento de peptídeos de defesa em CKXpode capacitar distribuição para a superfície de hifals fungais que penetramo espaço intercelular de folhas.

Exemplo 9

Metodologia de Seleção de PeptídeoA figura 8 é um diagrama esquemático de processo mostrandoum protocolo 800 para seleção de peptídeo. Para começar, uma bibliotecade peptídeo preparada por fago de partida pode ser misturada na etapa 802com extratos de planta para remover peptídeos que interagem com proteí-nas de planta e outros fatores. A produção com tais peptídeos removidos édesignada Sub-biblioteca 1.

A sub-biblioteca 1 é misturada 804 com uredoesporos germina-dos ou cistos recentemente germinados pelo qual é comumente conhecidocomo unia técnica de bioclassificação. Os peptídeos preparados por fagoligado são recuperados 806 dos cistos recentemente germinados. A concen-tração de cada peptídeo preparado por fago recuperado é aumentada poramplificação 808 em E. coli. Os peptídeos preparados por fago são recupe-rados 810 após amplificação, e misturados 812 com extratos de planta paranovamente assegurar remoção de peptídeos que interagem com proteínasde planta e outros fatores. A produção com tais peptídeos removidos é de-signado Sub-biblioteca 2.

A etapa 814 determina se as etapas acima foram realizadas umnúmero suficiente de vezes para assegurar estringência de seleção de pep-tídeos de defesa de planta candidatos. Começando com a Sub-biblioteca 2,Sub-bibliotecas 3, 4 e 5 são geradas por interações sucessivas η em que asetapas 806 a 812 são repetidas. Cada interação requer mistura da Sub-biblioteca mais recentemente gerada, por exemplo, Sub-biblioteca 2, comuredoesporos germinados ou cistos recentemente germinados com uso datécnica de bioclassificação. Os peptídeos preparados por fago ligado sãorecuperados a partir dos cistos recentemente germinados. A concentraçãode cada peptídeo preparado por fago recuperado é aumentada por amplifi-cação em E. coli.

Uma vez que o processo tenha interado η vezes, de acordo como desenho do processo, clones de fago aleatoriamente selecionados de Sub-biblioteca η (ou de qualquer outra de η Sub-bibliotecas) podem ser testados816 para sua capacidade de inibir crescimento de cistos recentemente ger-minados, isto é, uredoesporos germinados. Os peptídeos candidatos quemostram inibição bem-sucedida podem ser providos 818 como construtos degene fundido que combinam os peptídeos de defesa de planta com um genede proteína de superfície de planta, tal como CKX, amplificados 820 em umhospedeiro ínterim, tal como Pichia, e, eventualmente, usados para trans-formar 822 soja ou feijão de campo para conceder resistência à ferrugem.

Uma concretização específica do método precedente pode serdescrita no contexto de cinco partes, AaE.

A parte A requer a preparação de Sub-biblioteca 1 pela remoçãode peptídeos que interagem com componentes de planta. Uma quantidadede 3,0 g de folha Pinto é misturada com 7 ml de tampão (20 mM de Tris-HCI,5 ηM de EDTA1 pH 7,0), e a mistura é moída para proporcionar um homoge-nato. Em um micro tubo de 2 ml, 0,9 do homogenato é combinado com 0,1ml de 1014 fagos (f88-4/15-mer), para proporcionar um total de 1013 virions. Amistura resultante é incubada à temperatura ambiente de cerca de 23 grausC por 30 minutos em um oscilador orbital (-500 rpm). A mistura incubada écentrifugada usando-se centrífuga convencional a velocidade superior por 5minutos. O sobrenadante é recuperado, salvo, e centrifugado novamente. Osobrenadante é usado para amplificação de fago.

A parte B envolve uma primeira etapa de bioclassificação. Apro-ximadamente 1,5 milhão de esporos a partir de uma patogenia selecionadasão incubados em 0,01 % de Tween 20 e 25 ppm de B-ionona por 5 horas a20 graus C. Adiciona-se 1012 TU fagos. A mistura é dividida em dois micro-tubos, totalizando 3 ml em volume. Os microtubos, incluindo a mistura espo-ro/fago, são incubados à temperatura ambiente de cerca de 23 graus C) emum oscilador orbital (-500 rpm) por 30 minutos. A mistura incubada é centri-fugada, o sobrenadante é removido, 0,5 ml de água é adicionado, e os teo-res remanescentes são combinados em um microtubo. Os materiais combi-nados são centrifugados, o sobrenadante é removido, e o pélete é lavadocom 1 ml de água. Esta etapa de centrifugação com remoção de sobrena-dante e lavagem é repetida dez vezes. Uma quantidade de 150 ul de tampãode eluição é adicionada ao pélete, que contém fago e esporo. O tampão deeluição é bem misturado, e a mistura repousa por 5 minutos à temperaturaambiente. A mistura é, em seguida, centrifugada, e o sobrenadante é salvo.75 ul de tampão de eluição é adicionado e misturado por centrifugação adi-cional como antes. Todo o sobrenadante é combinado. Isto é repetido usan-do-se 210 ul de tampão de eluição. Uma quantidade de 44 ul de Tris-HCI 1M(pH 9,0) é adicionada para neutralizar o sobrenadante eluído. O sobrenadan-te neutralizado é amplificado para produzir Sub-biblioteca 1.

A parte C requer a preparação de Sub-biblioteca 2. A sub-biblioteca 2 é produzida usando-se a Sub-biblioteca 1 amplificada a partir daprimeira etapa de bioclassificação na Parte B. Isto é feito pelo uso da Sub-biblioteca 1 ao invés da biblioteca original f88-5/15-mer da Parte A, mas, deoutro modo, seguindo a Parte A do protocolo.

A parte D requer a geração de Sub-bibliotecas adicionais pelouso de etapas adicionais de bioclassificação incluindo as etapas 2, 3 e 4. Aparte B é repetida três vezes:

1. Para a etapa 2 de bioclassificação, 4,2 χ 1011 TU fagos a partirda segunda Sub-biblioteca são usados para produzir Sub-biblioteca 3;

2. Para a etapa 3 de bioclassificação, 5,6 χ 1011 TU fagos ampli-ficados a partir do segundo bioclassificação são usados para produzir Sub-biblioteca 4; e

3. Para a etapa 4 de bioclassificação, 5,1 χ 1011 TU fagos ampli-ficados a partir do terceiro bioclassificação são usados para produzir Sub-biblioteca 5.

As colônias da etapa 4 de bioclassificação são captadas, se-qüenciadas e testadas para inibição de crescimento de cisto recentementegerminado.

A parte E requer teste para inibição de crescimento de uredoes-poro. Incuba-se 30 ul de esporos germinados (-250) com 3 χ 1012 a 20 grausC durante a noite. Acessa-se o crescimento de tubo de germe fungai (isto é,crescimento de cisto recentemente germinado), e compara-se com água ef88, isto é, fago somente sem qualquer peptídeo preparado, como controles.

Exemplo 10

Peptídeos que inibem crescimento de Uromyces appendiculatus,e pelo bloqueio de desenvolvimento de germling (esporo germinado)

A metodologia do Exemplo 9 pode ser repetida para patogeniasde U. appendiculatus. As Tabelas 3 e 4 mostram peptídeos que podem serusados para inibir crescimento de uredoesporos germinados (cistos recen-temente germinados) a partir destas patogenias.

Tabela 3

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Tabela 4

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Exemplo 11

Uso de citokinin oxidase como um esqueleto de proteína paradistribuição de peptídeos selecionados em pontos de infecção de U. appen-diculatus de tecidos de feijão (Phaseolus vulgaris).

CKX é modificado conforme descrito acima para fundir os peptí-deos de defesa das Tabelas 3 e 4. Uma transformação mediada por agro-bacterium de Phaseolus vulgaris é realizada para proporcionar uma plantaque expressa cada peptídeo. As plantas transformadas são expostas a U.appendiculatus. A taxa e severidade de infecção são comparadas a umaplanta de controle para confirmar eficácia dos peptídeos de defesa contra apatogenia.

Exemplo 12Uso de citokinin oxidase como um esqueleto de proteína paradistribuição de peptídeos selecionados em pontos de infecção de P. pachy-rhizióe tecidos de soja (Glycine Max).

CKX é modificado conforme descrito acima para fundir os peptí-deos de defesa das Tabelas 3 e 4. Uma transformação mediada por agro-bacterium de soja é realizada para proporcionar uma planta que expressacada peptídeo. As plantas transformadas são expostas a P. pachyrhizi. Ataxa e severidade de infecção são comparadas a uma planta de controlepara confirmar eficácia dos peptídeos de defesa contra a patogenia.

Conclusão

À luz da descrição detalhada da invenção e dos exemplos apre-sentados acima, pode ser apropriado que os vários aspectos da invençãosão alcançados.

É para ser compreendido que a presente invenção foi descritaem detalhes por meio de ilustração e exemplo, de modo a informar outrosversados na técnica com a invenção, seus princípios, e sua aplicação práti-ca. Formulações particulares e processos da presente invenção não são li-mitados às descrições das concretizações específicas apresentadas, maspreferivelmente as descrições e exemplos devem ser vistas em termos dasreivindicações que se segue, e suas equivalentes. Enquanto alguns dos e-xemplos e descrições acima incluem algumas conclusões sobre o modo quea invenção pode funcionar, os inventores não pretendem estarem ligadospor estas conclusões e funções, mas apenas colocar as explanações o má-ximo possível.

É para ser adicionalmente compreendido que as concretizaçõesespecíficas da presente invenção, conforme colocada, não são pretendidascomo sendo exaustiva e Iimitante da invenção, e que muitas alternativas,modificações e variações serão aparentes àqueles versados na técnica à luzdos exemplos precedentes e descrição detalhada. Conseqüentemente, estainvenção é pretendida para envolver todas tais alternativas, modificações evariações que caem dentro do espírito e escopo das reivindicações que seseguem.Listagem de Referências

Os seguintes documentos são por isso incorporados como refe-rência na mesma extensão como inteiramente descrito neste:Barbas, C.F., III Burton, D.R., Scott, J.K., Sliverman, G.J. (2001). Phage Display. ALaboratory ManuaL Cold Spring harbor Laboratory Press,

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<1I0> University of Missouri

ENGLISHr JAMSS T

SCKMIDTi FRANCIS J

STACSY, GARY

ZHiWEI, FANG

<120> "MÉTODO PARA IDENTIFICAÇÃO DE PEPTÍDEOS, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR RE-COMBINANTE, CÉLULA, PLANTA E MÉTODOS PARA SELEÇÃO DE PEPTÍDEOS EPARA CONFERIR EM UMA PLANTA A CAPACIDADE DE RESISTIR À INFECÇÃO CAU-SADA POR FUNGOS"

<130> Jfettet 438962

<250> 10/829,549

<151> 2001-04-10

<150> 60/155,785

<151> 200Ó-04-10

<160> 63

<Í70> PatentIn version 3.3

<21Ó> 1

<2ll> 33

<2.12> PRT

<2l3> Bacteriófago filamentoso tipo 88

<220>

<22l> VARIANTE

<222> (9)..(23)

<223> χ é algum aminoácido codificado pelo códon NNK onde N é Á, T1 C ou G e Kdesigna G ou T

<400> 1

<table>table see original document page 55</column></row><table> <210> 2

<21i> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<22Ô>

<223> Iniciador<220><221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> Iniciador

<400> 2caacrccttta attgtatcgg

<210> 3<211> 19<212> DNA<213> Artifieial

<220> <223> Iniciador

<400> 3êgtagcagaa gcctgaaga19

<210> 4<211> 9<212> PRT<213> Artificial

<220> <223>· Inserção de peptídeo aleatória

<400> 4

Aia Ala Pro Asp Leu Gln Asp Ala Met1 5

<210> 5<211> 9<212> PRT<213> Artificial

<220><223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 5

Ala Asp Arg Leu Asn Ser Asp Ala Gly1 5

<210> 6<211> 9<212> PRT<213> Artificial

<220><223> Inserção de peptídeo aleatória<400> 6Ala Asp Arg Pro Ser 1Phr Thr Ser Leu1 5

<210> 7<211> 9<212> PRT<213> Artificial

<220> <223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 7

Ala Aãp Fro Pro· Arg Thr Val Ser Thr1 5

<210> 8<211> 9<212> PRT<213> Artificial .

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 8Ala hsp Arg Pro Ser Met Ser Pro Thr1 5

<210> 9<211> 9<212> PRT<213> Artificial .

<220><223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 9

Ala Asp Arg Thr Ser Asn Ala Ser Thr1 5

<210> 10<211> 9<212> FRT<213> Artificial

<220><223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 9

<210> 10<211> 9<212> PRT<213> Artificial

<400> 10

<220><223>Ala Asp Lys Ser Tyr Ile Pro Ser Ser1 5<2l0> 11

<212> 9

<212> JPRT

<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 11

ftla Val Arg Asa Pro SeE His His Ser1 5

<220> 12

<2I1> 9 <212> PRT

<213> IUrtlficial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<4O0> 12

Ala Asp Fro Thr Pro Arg Sly Uis Ser1 5

<210><211><212><213>

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória<400> 13

Alá: Âsp Ero -ThX Airg Gll> Prb^ Hxs Ser'

:.i3 9

FRT

Artificial

<210> 14 <211> 9<212> PRT<213>..Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

- <400> . 14 . .

Ala Glu His Gln Asn Ser Ws Gly Pro1 5

<210> 15<211> 10<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 15

Ala ftsp AIs Artf Ser Ala Giy Aia IJLe S-er

1 5 10

<210> 16 -

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 16

Ala Asp Ser Lys Asn Ala iGly Ρϊ-0 Met

1 5

<2l0> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 11

Ala GlU: ThE Lys Phe Ser Gly Ser Ala

1 5

<210>- 9<211> 18

<212> PRT<213> Artifieisl

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória<400> 16

Ala Asp Pro Lys Glf Ser Gly Vai Thr

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> mi

<213> Artificial

<220><2 2 3> I nserção de peptídeo aleatória<400> 19

Alô Gly Iieu.Thr Ser Pro Asn Aôp Met1 5

<21Ü> 20

<222> 9

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<213> Artificial

<220>

<223> lnserÇão de peptídeo aleatória

<400> 20

Ala Asp Ue Thr Asp Pro Met Gly Ma

<210> 21

<211> $

<2.12> PRT

<213> Artificial

<22D>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<40Ô> 21

Ala :Gly rte HiS Thr Btó Asp" Ser

<21Ô> 22<211> 9<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> InserÇão de peptídeo aleatória

<40 Q> 22

Aia Vai Ser Pro Asn Val His Aso Gly

<21Q> 23<211> 15<212> PRT<213> Artificial

<220>

< 223 > lnserÇão de peptídeo aleatória

<4Õ0> 23Val Ala Ala Phe Ser Leu Val Trp Ala Thr His Leu Met Leu Ser1 5 10 15

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 24

Leu Thr Mg Cys Leu Val Ser Tte Glu Met Ala Aiâ Axg Arg Pro

1 5 10 15

<210> 25

<2Í1> 15

<212>

<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 25

Ser Ala Pno Tys Leu.Pro fyr Fhe Asp leu Leu.His. :Phe Fro Ile1 5 10 15

<210> 26<211> 15

<212> FET;

<213> Artificial

<220> :

<223> Inserção de peptídeo aleatória

VARIANTE

(14)., (14) .

X= amnoácido desconhecido

Pro Ser Ser Tyx Giu Ala Sêsr Arg tog. Pro Glu His-frp Xaa Phe

1 5 10 15

<210> 27<211> 15<212> PRf<213> Artificiai

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<220><221><222><223><400> 27

Ser ais Thr Asp Thr Th,r Leu Pro Ket Ket Thr Ala. Ile Arg Sar1 5 10 15

<210> 2Q

<Z11> 15

<212> SRT

<213> Artificial

<220>

<223> lnserÇão de peptídeo aleatória

<220>

<221> VAEIANTE

<222> {9)..{9}

<223> χ= aminoácido desconhecido

<100> '28

Thr Arg Leu Ser Pro Met Glu Ser Xaa Al*: Met Leu teu Ala Pro1 5 10 15

<210> 29

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificiais.

<220> ■·..■■..

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 29

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<210> 30 ·

<211> IS

<212> PRf

<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<4G0> 30

Mét SerV Asn prò Tiir Ser ;:His Ala''Fro Cys -Pro 'Vâl Glu IIe1 5 10 15

<210> 31

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220><223> Inserção de peptídeo aleatória<Í0Ò> 31

Glu Phe Arg Lys Asn Tyif Pro Ser Ala Ala Pro Leu Ile Pro Arg1 5 10 15

<21ü> 32<211> 15<212> PRT

<213> Artificial ..<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<22o>

<221> VARIANTE

<222> (2)..(2)<223 > χ= aminoácido desconhecido

<400> 32

Pro' Jfaa Vai His -Gly' Ser Jle Ero Leu Thr.Pro Fro teu Gly Ehe

<210> -3.3 '

<211 > 15<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<22Q>

<221> VARIANTE

<222> (3)..(3)

<223> χ= aminoácido desconhecido

<4Q0> 33

Leu Phe Xaa Cys Tyr Peto Psro Cya' fJvr' Tyr Sei Tyr Cys Lau S«x1 5 10 . 15

<210> 34

<211 > 15<212> PRT

<213> Artificial

<22Q>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<22Ü>

<221> VARIANTE<222> (14)..{14)<223> X= amirioácido desconhecido<400> 34

Net Ser Asn Phe Pro Tbr Ser His Ala Pro Cys Fro Val Xaa Ile1 5 10 15

<210> 35

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 35

Fro Glu Txp Lys Ser iSer frp Sei Pro Cys fhr Pro Arg Cyg Pro1 5 10 15

<210> 36

<211> 15

<212> KRT

<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<220>

<221> VARIANTE

<222> (11).,{11)

<223> χ é M ou I

<400> 36

Ala Met Sex Arg Trp Leu 'Jlrg -feto Arg Glu Xaa Asn Ala Pro Pro1 5 10 15

<210> 37<211> : ·. IS :<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<220>

<221> VARIANTE

<222> {65..(6>

<223> χ= peptídeo desconhecido

<220>

<221> VARIANTE

<222> (10),.£10)

<223> χ= peptídeo desconhecido<400> 37

Thr His Thr Ttit Phe Xaa Val Thr Vai Xaa Leu His Gio Ρεσ Pro1 5 10 15

<210> 38

<211> 15

<212> rat

<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<220>

<221> VARIANTE

<222> (6) (6)

<223> χ= peptídeo desconhecido

<220>

<221> VARIANTE

<222> (10).,(10)

<223> :x= peptídeo desconhecido

<400> 38

Thr His' Tlir-/Thrx PheXaa Va 1-:Tht Val XaaZfeu-BislGlu Pro/Pro;1 5 10 15

<210> 39

<211> 15

<212> PRT

<213> -Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 39

Pro fhr. tói Ãrg lbitón' Αϊ® Pro Ser Gys Sex lie Ile Val1 5 10 15

<210> 40

<211> 15

<212> PET

<213> Artificial· V

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<100> 40

Aia Pro Oln Cys His Els Leu Pro Phe Asp Met Ile eis Val1 5 10 15<210> 41

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<220>

<221> VARIANTE

<222> {12} .. (12)

<223> X= peptídeo desconhecido

<400> 41

Asn iis Asn Ser Leu Pró Ala Gln Tyr I>eu Vai Xâa Ile Leu ftrg1 5 10 15

<210> 42 <211> 15<212> PRt<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória<400> 42

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<210> 13<211> 15 <212> PR1F<213> artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 43

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<210> 44

<211> 15

<212> PRf

<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 44

h&n &XO l&VfTyx Lys Asn Pro Pro Peo Arg Vsl -Ala Met Cys Lêu1 5 10 15<210> 45

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<40Ú> 45

<table>table see original document page 67</column></row><table>

<210> 46

<211> 36

;<212> DNA

<213> Artificial '

<220>

<i223> + filamentos de DNA codificando peptídeo Pc 87

<400> 46

agctsgcâgs fcsfaecatea afcgteaccaa cataqt36

<210> 47

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> + filamentos de DNA codificando peptídeo Pc 87

<40O> 47

ctagactatg ttggtgacat tgatfgtcts. tctgct36

<210> 48

<211> 611

<212> FRT

<2135> Artificial

<220>

<223> Peptídeo aleatório Pc 87

<220>

<221> SINAL

<222> (1}..(1}

<223> Seqüência secretória Mat-alfa

<220>

<221> DOMÍNIO

<222> {1)..{1)

<223> Citocina oxidase 1<220>

<221> D0MINI°

<222> (l)..(1)<223> Ligante<220>

<221> DOMÍNIO

<222> (1)..1)<223> Peptídeo aleatório Pc 87

<400> 48

M@t Arg Phe Pro Ser Iie Phe Thr Alafal Phe Ala: Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala leu Ms Ala Pro Val Asíj Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ma Gln20 25 .30

lie. Pro Ma AsgfMa VaI Ile GIy Tyr Ser .Asp Μά GIu Gly Asp Fhe35 40 45-'.

Asp-VaA' 11» Vai Leu Pro Ph® Ser Asn Sei Ihs Asn Asn Gly Leis Lew50. 55 60

SiIie : Jle 'Aan--Thr- Thr'Ile &la: Ser Ilé Ála· AAa Lys Gla:-Glu Gly

65 'Ser Aisu Glu Lys Arg LeU Ala Ala Sly Thr Pro Ala Leu Gly Asp Asp

Arg eiy Arg Pro Tiep Pro Ala Ser Leu Ala Ala Leu Ala Leu . Asp 'Gly100 MOS :. " 110 ;■■·'

Eys Leu--Arg ftar'-Asp Ser: Asn Ala Thr Ala Ala Ala Ser Thr.;Aisp Phe■ -IiS "120 125

Gly Asn He Thr Ser Ala Leu te© AIs Ala Val Leu Tyr Pro Ser Thr

' 130 ' ' 135 : : ..-"■' .140 - ■

iOly Asp Leu Vai. Ms- Leu Leu Ser 'Ála Ala Asn Ser Thr Pro1- Qly Trρ145 . .. ■ ' 150 ISS . 160

Rro Tyx fhr Ile'"Ala Phe Arg Gly Arg Sly Hís Ser Leu Met Gly Gln. M65 ν 170 :175 '

Ala Phe Ala Pro Sly Gly Val Vai Val Asn180 185

Met Ala Ser Les Giy Asp190Ala Ala Ala Pro Pro Arg Xle Asn Val Ser Ala Asp Gly Arg Tyr VaX195 200 205

Asp Ala Gly Gly Glu Gln VaI Trp lie Asp Val l*eu Arg Ala 5er Lêu210 215 220

Ala Arg Gly VaI Kla Pro Arg Ser Trp Asn Asp Tyr fceu Tyr ILeu Thr225 230 235 240

Val Gly Gly Thr Leii Ser Asn Ala Siy Ue Ser Giy Glh Ala Ehe Axg245 250 2S5

His Gly Sxo Gln Iie Ser Ass Val Leu Glu Met Aip Vai: Ile Thr Gly260 265 270

His Gly Glu Met Val Thr Cya Ser Lys Gln Leu Asn Ala Asp Leu Phe

275 280 285

Asp Ala Val Leu Cly Gly Leu Gly Glti Phe Gly Val Ile Thar Arg Ala290 295 300

Arg IIe Ala Val Glu- Pro Ala Pro Ala Arg Ala Arg Trp Val- Arg 1Phev305 310 315 320

Vel Tyr Thr Asp Phe Ala Ala Phe Ser Alô Asp Gln Glu-Arg Leu- Ttir325 230 335

Ala Pro Arg Pro Gly Gly Gly Gly Ala Ser Ffae Gly- Pro. Met Ser Tyr340 345 350

Vai GIu Gly Ssr Val Phe Val Asn Gln Ser fceu Ala Thr Asp Levi Ala355 360 365

Asn Thr GIy Phe Pbe Thr Asp Aia Asp Val Ala Axg Ile Val Ala Leu370 375 380

Ala Gly Glu Arg Asn Ala Thr fhr Val Tyr Ser Ile Glu Ala Thr Leu3B5 390 395 400

Aen Tyr Asp Asn Aia Tbx Ala Ala Ala Ala Ala' Val Asp-Gln Glu -Leu405 410

Ala Sêr vai Leu Gly Thx Leu Ser Tyr Val Glu Gly Phe Ala Phe Gln420 425 430Arg Asp Val Ala Tyr Ma Alã Phe Leu Asp Arg Vai His Gly Slu Glu435 440 445

-Val Ala Leu Asn Lys Leu Gly teu Trp Arg Val Pro Hia Peo Trp Lew450 455 460

Asn Mst Phe Val- Pr© Irg Ser Arg lie Ala Asp Phe ASp Arg Gly Val465 470 475 480

Phe Lys Gly Ile Leu- Gln Gly Ίhr Aôp Iie Val Gly Pro Lsu Hs Val485 490 4SS

Tye Pro Leu Asn Iiys Ser Met. Trp ftsp-.Aep Sly Met Sex Ala Aia- Thr500 505 520

Pro Ser GIu Aép Val ffina. Tyr Ala Val Ser: tóu l»eu Pha Ser Ser Val315 520 525

Ald-Pro-Asn Asp Leu Ala Arg teu GinGlu Gln Asn " A.rg. Arg Ile Leu530 535 540

Arg iPtte Cys Asp leu Ms Sly lie Gln Tyr Lys Thx...¥yr. Leu. Ala ftrg545 550 555 560

Bis thr Asp Arg Ser Asp TiTp Val Arc His Phe Gly Ma Alia Lys Trp565 570 575

Asn. Axg Phe Vãl.Sla Met Lys Asn Lys Tyr Rsp Pro Lys Asr§. Leu 'teu580 585 590

Sar Pro- Gly Gln Asp Xle Fhe Asn Lys Leu Als; Asp Arg Pro Ser Hfefr595 600 605

Ser Pro Thr

610

<21G> 49 <2ll> 15 <212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória<400> 49

Ala Asp Sto Cys His Met Pro Pro Arg Met Pro Bto Leu Pro Ile<table>table see original document page 71</column></row><table>

<210> 50

<211> 15

<212 > PRT

<2ί3> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeó aleatória

<400> 50

<table>table see original document page 71</column></row><table>

<210> 51

<2ll> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 51

<table>table see original document page 71</column></row><table>

<210> 52

<2H> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 52

<table>table see original document page 71</column></row><table>

<210> 53

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<22 3> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 53

<table>table see original document page 71</column></row><table>

<210> 54<211>. 15

<212> PRT

<2Í3> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptideo aleatória

<400> 54

Val Phe Thr Pro Met Asrv Leu Ser Pro Fro Fhe Met Gln Pro Fro1 5 10 15

<210> 55<2il> 15<212> PRT<213> Artificial

<220><223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 55

Ala Aia Gly Fm Mn Ile Fro Prç. Pro : ffi§ Arg Ala Ssr Thr Trjs

<210> 56<211> 15<2X2> FRT<213> artificial

<220><223> Inserção de peptídeo aleatória

<40O> 56

Ala. Bis : teu-'Tyr Ser Gly Alá Se:r. Leu-Tyr Aeg Vãl fyr Arg Ser

<210> 57

<211> 15

<212> PRT

<213> Artifioial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<4ϋϋ> 57

Gly Pro Pro Smr Ile Leu Leu Ala IJLe. <51 y .Thr Ser Leu Thir

<2I0> 58

<21X> IS

<212> PKT

<213> Artificial<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória<400> 58

Leu Ser Ser Pro Tyr Als Cys M« teu Phe Val Val Lys Gly Ma1 5 10 15

<210> 59<2il> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> lnserÇão de peptídeo aleatória<400> 59

ftrg Gly Trp Ser Val Ser His Mis Ser teu Leu Met Wzo Val fto1 5 10 15

<210> 60

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Insercão de peptídeo aleatória

<400> 60 ·

Aig SêS Thr Ala Ser Fxq Gln Ãlã teu Asa Pro- Leu VWr! Ala Ser1 5 10 15

<210> 61

<211> 15

<232> PRT

<213> Artificial<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 61

Ser Leu Phe Ehe GLu Val Ser ftrg Met Leu Val Arg Leu Leu Ser1 5 10 15

<210> 62 <211> 15<212> FRT<213> Artificial

<220>

<223> Inserção de peptídeo aleatória

<400> 62Ser Arg Trp Trρ Arg Cys Vai Thr Het Thr Glfi l>ro Cys Thr Thr1 5 10 15

<210> 63

<211> 15

<212> PRf

<213> Artificial

<220>

<223> lnserÇã° de peptídeo aleatória<400> 63

Val Vai Ala Leu Arg Trp Gly Jxp Ser Pro Irfm Arg Pro Pro Sly1 5 10 15

Claims (25)

1. Método para identificação de peptídeos não-imunoglobulínicostendo uma afinidade para a superfície de fungos, caracterizado pelo fato deque compreende:(a) construção de uma biblioteca de peptídeos por,(i) preparação de oligonucleotídeos aleatórios;(ii) inserção dos referidos oligonucleotídeos aleatórios em umvetor que expressa peptídeos codificados pelos referidos oligonucleotídeosaleatórios em sua superfície, e é capaz de transfectar uma célula hospedeira;(iii) transfectar uma célula hospedeira apropriada com o referidovetor para amplificar o referido vetor em uma forma infecciosa para criar umabiblioteca de peptídeos na superfície do referido vetor;(b) colocar em contato o referido vetor que expressa a referidabiblioteca de peptídeo com um fungo-alvo pertencendo a um gênero selecio-nado de um grupo consistindo em Phakapsona e Uronyces, e remover dovetor não-ligado;(c) eluição do vetor ligado dos referidos fungos;(d) amplificação de referido vetor ligado;(e) seqüenciamento dos oligonucleotídeos candidatos contidosno referido vetor eluído;(f) determinação da seqüência de aminoácido de peptídeos codi-ficados pelos referidos oligonucleotídeos candidatos contidos no referidovetor eluído; e(g) seleção dos peptídeos não-imunoglobulínicos para os quais aseqüência de aminoácido foi determinada.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que compreende adicionalmente repetição das etapas (b) a (d) pelomenos uma vez.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o fungo-alvo compreende Phakopsora pachyrhizi.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o fungo-alvo compreende Uromyces appendiculatus.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o referido vetor é posto em contato com o referido fungo-alvo emestágios de vida diferentes do referido fungo.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, o referido estágio devida é o estágio de vida de zoosporo ou o estágio de vida de germinação.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o referido vetor é um vetor de fusão de fago.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o referido peptídeo é expresso como parte de uma proteína derevestimento do referido vetor.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que os referidos oligonucleotídeos aleatórios codificam peptídeoscontendo de 6 a 15 aminoácidos.

10. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreendeuma primeira seqüência codificante, um peptídeo de defesa de planta sele-cionado a partir do grupo consistindo na SEQ ID NO:49, SEQ ID N0:50,SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:- 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 e combinaçõesdestas.

11. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 10, caracteri-zado pelo fato de que compreende adicionalmente uma segunda seqüênciacodificante, codificando um segundo polipeptídeo, em que o referido segun-do poliptídeo quando expresso é fixado ao referido peptídeo de defesa daplanta.

12. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 11, caracteri-zado pelo fato de que o segundo polipeptídeo compreende um membro dasproteínas ou seus fragamentos da família CKX.

13. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 11, caracteri-zado pelo fato de que a primeira seqüência codificante, codifica o peptídeoda SEQ ID NO: 50.

14. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compre-ende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 10.

15. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende o polinu-cleotídeo como definido na reivindicação 10, o referido polinucleotídeo tendosido introduzido na referida célula por transformação.

16. Planta, caracterizada pelo fato de que compreende polinu-cleotídeo como definido na reivindicação 10, o referido polinucleotídeo tendosido introduzido na referida planta por transformação.

17. Método para seleção de peptídeos para a capacidade deafetar o desenvolvimento de um fundo caracterizado pelo fato de que com-preende:(a) construção de uma biblioteca de peptídeos por,(i) preparação de oligonucleotídeos aleatórios;(ii) inserção dos referidos oligonucleotídeos aleatórios em umvetor apropriado que expressa peptídeos codificados por referidos oligonu-cleotídeos aleatórios em sua superfície, e é capaz de transfectar uma célulahospedeira;(iii) transfectar uma célula hospedeira apropriada com o referidovetor para amplificar referido vetor em uma forma infecciosa para criar umabiblioteca de peptídeos na superfície de referido vetor;(b) colocar em contato o referido vetor que expressa a referidabiblioteca de peptídeo com um fungo-alvo, e remover o vetor não-ligado;(c) eluição dos vetores ligados dos referidos fungos;(d) amplificação dos referidos vetores ligados;(e) isolamento dos oligonucleotídeos candidatos contidos nosreferidos vetores eluídos;(f) produção dos peptídeos codificados pelos referidos oligonu-cleotídeos candidatos;(g) colocar em contato os referidos peptídeos com um fungo-alvo; e(h) determinação do efeito dos referidos peptídeos no cresci-mento do referido fungo.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe-lo fato de que compreende adicionalmente repetição de (b) a (d) pelo menosuma vez.

19. Método para conferir em uma planta a capacidade de resistirà infecção causada por fungos, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) introduzir em uma planta um polinucleotídeo compreendendo uma primei-ra seqüência codificante codificando um peptídeo de defesa da planta; (b)permitir que o referido peptídeo de defesa da planta seja expresso na referi-da planta para executar a função antifúngica ao referido peptídeo de defesa.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizafo pelofato de que a planta é soja.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pe-lo fato de que o polinucleotídeo é introduzido na planta por transformação.

22. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pe-lo fato de que o polinucleotídeo compreende adicionalmente uma segunaseqüência codificante codificando um esqueleto de distribuição de peptídeofacilitando a distribuição e/ou apresentação do peptídeo de defesa da planta.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe-lo fato de que o esqueleto de distribuição de peptídeo é um membro das pro-teínas ou seus fragmentos da família CKY.

24. Método de acordo coma reivindicação 19, caracterizado pe-lo fato de que a primeira seqüência codificante codifica pelo menos um pep-tídeo de defesa da planta selecionado do grupo que consistindo na SEQ IDNO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53,SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ IDNO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62,SEQ ID NO: 63, e combinações destes.

25. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pe-lo fato de que a primeira seqüência codificante codifica o peptídeo da SEQID NO: 50.