BRPI0614056A2 - prevenção de rejeição crÈnica em transplante de órgão sólido - Google Patents

Abstract

PREVENçãO DE REJEIçãO CRÈNICA ETRANSPLANTE DE ORGãO SóLIDO. A presente invenção refere-se ao uso de vetores de vírus adeno-associados recombinantes (rAAV) para transduzir células de um órgáo sólido a ser transplantado com uma seqúência de ácido nucléico codificando um polipeptideo imunomodulador, por exemplo, IL-lO, a expressão do qual reduz a probabilidade de rejeição do órgão transplantado pelo sistema imune hospedeiro. Processos de aperfeiçoamento de eficiência de transplante de órgáo sólido através de administração de vetores rAAV codificando IL-lO para um órgáo sólido isolado antes de transplante daquele órgáo em um sujeito também são descritos. O órgáo sólido a ser transduzido pode ser o coração, rim, fígado, ilhotas pancreáticas, pulmão ou intestino.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PREVENÇÃODE REJEIÇÃO CRÔNICA EM TRANSPLANTE DE ÓRGÃO SÓLIDO".

REFERÊNCIA-CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

Este pedido reivindica prioridade sob 35.U.S.C. 119(e) para pe-dido de patente provisório US 60/697 459, depositado em 7 de julho de2005, os conteúdos do qual são aqui incorporados por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção está no campo de transplante de órgão só-lido, e especificamente processos mais eficientes de prevenção de rejeiçãomediada - imune de ditos órgãos transplantados.

ANTECEDENTES

O sucesso de transplante de órgão sólido é limitado pela rejei-ção do órgão transplantado pelo sistema imune hospedeiro. Rejeição agudade enxerto refere-se à resposta imune imediatamente seguindo transplante,e rejeição crônica refere-se a rejeição de termo mais longo que é marcadapor formação de anticorpo alo-reativo, infiltração de leucócitos e aceleradaateriopatia de enxerto como visto em transplante de coração. Embora su-pressão imune genérica sistêmica possa ser usada para prevenir rejeição deórgão, tal supressão imune generalizada expõe o sujeito a infecções oportu-nísticas, cânceres (por exemplo, cânceres de sangue) e outras complicaçõesindesejáveis incluindo osteoporose, hipertensão, obesidade, diabetes, pobrecura de ferimento,cushingóide, oscilações de humor, supressão de medulaóssea, disfunção hepática, perda de cabelo, nefrotoxidez, cardiomiopatia,problemas gastrointestinais, particularmente quando usada por um longotempo para combater rejeição crônica. Existe uma necessidade de aperfei-çoados processos de transplante de órgão sólido que evitem rejeição crônica.

IL-10 é um modulador imunossupressivo que desempenha pa-péis importantes em tolerância de célula-T periférica. IL-10 foi mostrado des-viar a produção de citocina de Th 1 para Th2 que está associado com enxer-tos de longa sobrevivência. Através de inibição de síntese de citocina IL-12diferenciando Th1, IL-10 bloqueia desenvolvimento de T1, produção de cito-cinas IFN-γ e IL-2, e por isso evita potencial destruição de enxerto por res-postas CTL. IL-10 também foi mostrado promover apoptose de células T alo-reativas via o caminho Faz/FasL, que é um dos mecanismos para sobrevi-vência de enxerto. Em adição, IL-10 regula descendentemente expressão deMHC Classe Il e moléculas co-estimuladoras CD40, CD80 e CD86 sobreAPC. Conseqüentemente, repetitiva estimulação de células T com alo-antígenos na presença de IL-10 induz células T reguladoras produzindo IL-e TGF-β com atividades supressivas e resulta em prevenção de rejeiçãode enxerto.

Terapia de gene IL-10 foi testada em vários modelos de trans-plante (Tabela 1). Números na Tabela 1 referem-se às referências de litera-tura descrevendo os estudos relevantes.

TABELA 1

EXPERIMENTOS DE TERAPIA DE GENE IL-10 EM TRANSPLANTE DEORGAO (LITERATURA CITADA)

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Estudos usando DNA plasmídeo e vetores adenovirais codifi-cando IL-10 demonstraram a eficácia de IL-10 em rejeição aguda de enxerto.Entretanto, expressão de IL-10 de plásmideos ou vetores virais como ade-novírus, vírus de herpes e retrovírus obteve sucesso limitado em prolonga-mento de sobrevivência de aloenxerto devido a limitada eficiência de transfe-rência de gene e expressão transiente de transgene em enxertos (3-9, 15).

Existe uma necessidade de processos aperfeiçoados de terapiade gene IL-10 para transplantes de órgão sólido que resulte em sustentadaexpressão local de IL-10 suficiente para reduzir a probabilidade de rejeiçãocrônica de enxerto.

SUMÁRIO

Em um aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de veto-res vírus adeno-associados recombinantes (rAAV) para transdução de célu-las de um órgão sólido a ser transplantado com uma seqüência de ácido nu-cléico codificando um polipeptídeo imunomodulador, por exemplo, IL-10, aexpressão do qual reduz a probabilidade de rejeição do órgão transplantadopelo sistema imune hospedeiro.

Em uma outra modalidade, em adição a transdução de rAAV deum órgão sólido a ser transplantado, a invenção ainda compreende o uso deagentes imunomoduladores para supressão de rejeição aguda. Em uma rea-lização um agente imunossupressivo é administrado aproximadamente nomomento do transplante. Em uma outra modalidade um agente imuno-supressivo é administrado antes do transplante. Ainda em uma outra mopda-lidade, agente(s) imunossupressivo são um ou mais agentes selecionadosdo grupo incluindo, mas não limitado a, IL-10 e FK506. Em outras modalida-des, tratamento com agente(s) imunomodulador é abreviado ou interrompidouma vez expressão direcionada por rAAV do polipeptídeo imunomodulador,por exemplo, IL-10, tenha começado.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a proces-sos de aperfeiçoamento de eficiência de transplante de órgão sólido atravésde administração de vetores rAAV codificando IL-10 para um órgão sólidoisolado antes de transplante daquele órgão em um sujeito. Em uma realiza-ção, IL-10 é expresso em pelo menos algumas das células do órgão isoladoapós administração dos vetores rAAV. Em uma outra realização a expressãode IL-10 causa um desvio de uma resposta imune semelhante a Th1 parauma semelhante a Th2. Em várias realizações, o órgão sólido a ser transdu-zido é o coração, rim, fígado, ilhota pancreática, pulmão e intestino.DESCRIÇÃO DETALHADA

Em uma realização, a presente invenção é relacionada ao trata-mento de um órgão sólido isolado com um vetor rAAV codificando um poli-peptídeo imunomodulador, por exemplo, IL-10, antes de transplante daqueleórgão em um sujeito. A seqüência de ácido nucléico codificando o polipeptí-deo imunomodulador é aqui referida como um transgene. Expressão dotransgene dentro de células e tecidos daquele órgão transplantado pode re-tardar e/ou prevenir rejeição de enxerto.

Polipeptídeos imunomoduladores apropriados que podem serusados nos processos da presente invenção incluem, mas não são limitadosa inibidores IL-10, IL-I, inibidores de Iigante CD-40, TGF-β, GITR e FOXP3.

Embora vetores AAV ofereçam persistente expressão de trans-gene com desprezível inflamação de tecido, o início de expressão de trans-gene de vetores AAV é normalmente retardada por 1 -2 semanas em compa-ração a umas poucas horas com vetores adenovirais. Por isso o uso de vetorAAV pode ser combinado com agente(s) imunomodulador administrado a-proximadamente ao mesmo tempo do transplante, e em outras realizaçõeso(s) agente(s) imunomodulador é abreviado ou interrompido uma vez ex-pressão de transgene tenha começado. Ainda em outras modalidades admi-nistração do(s) agente(s) imunomodulador é interrompida uma vez aqueletransgene seja expresso em níveis suficientes para prevenir rejeição de enxerto.

Como aqui usado, agente imunomodulador refere-se a qualquersubstância imunomoduladora que não é liberada como um transgene atra-vés de terapia de gene, por exemplo, uma molécula pequena, peptídeo ouproteína. Agentes imunomoduladores incluem, mas não são limitados a, pro-teína IL-10, FK506, ciclosporina, rapamicina, azatioprina, micofenolato mofe-til, ciclofosfamida, Ieflunomida e corticosteróides. Em várias modalidades dapresente invenção, um único agente imunomodulador pode ser usado, oudois ou mais agentes imunomoduladores podem ser usados em combina-ção, tanto seqüencialmente como simultaneamente.

Aqueles versados na técnica podem determinar facilmente atra-vés de experimentos animais ou experimentos clínicos a ótima cronometra-gem para liberação de agente(s) imunomodulador para um sujeito receben-do um transplante de órgão sólido de acordo com os processos da presenteinvenção. Similarmente, aquele versado na técnica pode realizar experimen-tos para determinar qual agente imunomodulador conhecido é melhor naprevenção de rejeição aguda até início de expressão de IL-10 mediada porrAAV.

Se expressão de longo termo de IL-10 em um órgão transplan-tado previne rejeição crônica será medida em parte por deteção de formaçãode anticorpo alo-reativo, infiltração de leucócito, e acelerada arteriopatia deenxerto como visto em transplante de coração.

EXEMPLO 1

Uso de RAAV-IL-10 em Enxertos de Coração e Rim Singenéicos

O seguinte experimento é realizado para determinar a eficiênciade transdução de AAV2-rato IL-10 (rlL-10) em enxertos de coração e rimsingenéicos, usando ratos tratados com vetor AAV-null como controles. Esteexperimento é usado para estabelecer o tempo de início, o nível, e a dura-ção de expressão de rlL-10 de transgene em transplante após transdução ex vivo.

* coração ou rim anterógrado / isolado sofre perfusão com 1x1012vg de vetor por 20 minutos no frio.

* o órgão é transplantado de volta para hospedeiro autólogo.

* eficiência de transdução é determinada em dias 7, 14, 28, 56 e 180.

1. DNA FISH é realizado para DNA rlL-10 de transgene eIF é realizada para expressão de proteína rlL-10 em enxertos.

2. Biodistribuição é determinada por PCR e RT-PCR de rlL-em vários tecidos incluindo coração, pulmão, fígado, rim, baço e PBMC.

3. Produção de rlL-10 sistêmica é medida por um ensaioELISA de níveis de rlL-10 em soro.TABELA 2

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EXEMPLO 2

Uso de RAAV-IL-10 em Aloenxertos de coração e rim

O seguinte experimento é realizado para determinar a eficáciade transdução de AAV2-rlL-10 no prolongamento de sobrevivência de aloen-xerto. Grupos de ratos recebem órgãos transplantados transduzidos comvetores AAV, como mostrado na Tabela 3. Proteína rlL-10 é administradacomo um agente imunomodulador em alguns experimentos para ligar o re-tardo de tempo entre transdução e o início de expressão de transgene. De-vido administração sistêmica de IL-10 ter sido mostrada exacerbar rejeiçãode aloenxerto cardíaco em camundongos, o imunomodulador convencionalFK506 é administrado ao invés de IL-10 em outros experimentos até o mo-mento em que expressão de IL-10 mediada por AAV é estabelecida. Expe-rimentos controles incluem: nenhum tratamento, tratamento com vetoresAAV2-null; e tratamento com agente imunomodulador convencional sozinhosem vetores AAV.

TABELA 3

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As seguintes análises são realizadas. A duração de sobrevivên-cia de enxerto é determinada. A expressão de citocina Th 1 são monocinas émedida para determinar se elas são reguladas descendentemente em enxer-tos transduzidos com AAV2-rlL10. O chip de proteína citocina pode ser usa-do se necessário para selecionar para um espectro mais amplo de citocinasreguladas por IL-10. Finalmente, os níveis de anticorpos alo-reativos e infil-tração de leucócitos são determinados, como é a capacidade de resposta decélulas T alo-específicas.REFERÊNCIAS

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Claims (3)

1. Processo de realização de um transplante de órgão sólido emum sujeito compreendendo:administração a um órgão sólido a ser transplantado de umvírus associado - adeno recombinante (rAAV) codificando um transgene i-munomodulador; etransplantando o dito órgão sólido no dito sujeito.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, onde o transgeneimunomodulador é IL-10.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, ainda compreendendo:administração de um agente imunomodulador ao dito sujeito.