BRPI0608511A2 - composto modulador da expressão de transportadores de vitamina c, composição nutricional ou farmacêutica, uso da mesma e método para identificação do referido composto - Google Patents

Abstract

COMPOSTO MOI)ULADOR DA EXPRESSãO DE TRANSPORTADORES DE VITAMINA C, COMPOSIçãO NUTRICIONAL OU FARMACêUTICA, USO DA MESMA E MéTODO PARA IDENTIFICAçãO DO REFERIDO COMPOSTO. A presente invenção refere-se a composições capazes de modular biodisponibilidade de vitamina C em indivíduos. Em particular, a presente invenção refere-se a métodos de identificação de compostos, capazes de modular expressão de transportadores de Vitamina C, ao uso desses compostos em alimentos ou gêneros alimentícios e ao uso dos mesmos compostos para o tratamento ou prevenção de tecido doente ou estressado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES NUTRICIONAIS PARA MODULAR BIODISPONIBILIDADE DE VITAMINA C".

A presente invenção refere-se a composições nutricionais e farmacêuticas que modulam biodisponibilidade de vitamina C em indivíduos. Em particular, a presente invenção refere-se a métodos para identificar compostos, capazes de modular expressão de transportadores de vitamina C, ao uso desses compostos em composições nutricionais e farmacêuticas e ao uso desses compostos para o tratamento ou prevenção de tecido doente ou estressado.

Reconhece-se que vitaminas desempenham papéis diversos na função metabólica do corpo.

Por exemplo, sabe-se que Vitamina A solúvel em gordura (retini-ana) é metabolizada para produzir vários derivados chamados retinóides que são úteis no tratamento ou prevenção de cegueira noturna. Também, retinóides ou Vitamina A, respectivamente, são usadas como terapia para aperfeiçoar a aparência de pele danificada pelo sol.

Uma outra Vitamina de grande interesse é Vitamina C (ácido ascorbico, 2,3-dideidro-L-treoexano-1,4-lactona), que parece ser um componente multifatorial nos processos biológicos que ocorrem no corpo.

Vitamina C é exigida para muitas reações enzimáticas envolvendo a biossíntese de componentes de tecido conectivo, incluindo elastina, fibronectina, proteoglicanos, matriz óssea e fibrilina associada a elastina. Além disso, parece desempenhar um papel na expressão gênica de colágeno e secreção celular pró-colágeno. Ácido ascorbico é também um co-fator no caminho biossintético de carnitina e está envolvido na modulação de absorção de ferro, transporte e armazenagem. Ele auxilia na absorção intestinal de ferro reduzindo ferro férrico para ferro ferroso e poderá estimular síntese de ferritina para promover armazenagem de ferro nas células. Também, está envolvido na biossíntese de corticosteróides, aldosterona, a conversão de colesterol em ácidos biliares.

Acima de tudo, a Vitamina C é conhecida por suas propriedadesantioxidantes. Estudos indicam que um status antioxidante sérico defectivo contribui para o desenvolvimento de várias doenças, tais como doenças cardíacas coronarianas, câncer e doenças neurodegenerativas, freqüentemente causadas por um estresse oxidante no sistema nervoso central.

Obviamente, a Vitamina C parece ser eficaz na prevenção do início de vários tipos de câncer, incluindo bexiga, mama, cervical, colorretal, esôfago, pulmão, pancreático, próstata, glândula salivar, estômago, leucemia e linfoma não-Hodgkin. Sabe-se também que a Vitamina C desempenha um papel importante no tratamento ou prevenção de efeitos ocasionados porefeitos nocivos exercidos sobre a pele.

As vitaminas não são sintetizadas no corpo, mas têm de ser supridas de fontes exógenas, geralmente com a dieta. Entretanto, alimento tipo ocidental caracteriza-se normalmente por conter uma quantidade de gordura muito alta, embora sendo deficiente de vitaminas, de modo que na maioria dos casos o suprimento de várias vitaminas é subótimo. Sob essas circunstâncias, é prática comum suprir vitaminas em forma de um suplemento.

Esses suplementos poderão compreender uma vitamina apenas ou um número das mesmas, em cujo caso os produtos são referidos como formulações chamadas multivitaminas . Também, as vitaminas poderão ser supridas a áreas particulares do corpo para o tratamento ou prevenção de uma doença, tais como, por exemplo, via produtos para cuidados da pele.

Um problema de todas as formas de administração de vitaminas presentes reside em proporcionar a vitamina em uma forma biodisponível, isto é, em uma forma que o corpo/células poderão facilmente absorver. Como um exemplo, um indivíduo poderá ser suprido com uma dada quantidade de ácido ascórbico, produzida mediante, por exemplo, meios químicos, todavia absorverá uma quantidade limitada deste apenas, uma vez que obviamente componentes adjuvantes parecem ser necessários para maximizar esse propósito. Especificamente, isso é de interesse, em caso de grandes doses, isto é, uma superdose, de vitaminas que são empregadas para o tratamento de um distúrbio, de modo que essas grandes doses poderão exercer ações farmacodinâmicas úteis na terapia.Desse modo, um problema da presente invenção reside em proporcionar novos meios de transferir vitaminas para um indivíduo em uma forma biodisponível.

Esse problema foi resolvido proporcionando compostos e/ou composições nutricionais e farmacêuticas capazes de modular a transcrição de transportadores de vitamina C em células de tal modo que a absorção de vitamina C nas células-alvo seja aumentada e a absorção de vitamina C poderá ser ativamente promovida e controlada, ou a absorção de vitamina C nas células-alvo seja diminuída.

Nos estudos experimentais extensivos resultando na presente invenção, os inventores mencionados observaram que em um experimento de cultura celular, certos compostos modularam o nível intracelular de vitamina C. Seguindo essa primeira descoberta, as células foram adicionalmente investigadas enquanto podia ser estabelecido que, por exemplo, a redução de vitamina C intracelular foi acompanhada por uma redução no nível de mRNA transportador de vitamina C. Sem desejar estar ligado por qualquer teoria, acredita-se presentemente que esses compostos capazes de modular a transcrição de transportadores de vitamina C em células agem na transcrição gênica de genes transportadores de vitamina C resultando em um nível elevado ou reduzido dessa proteína com o efeito que a absorção de vitamina C pelas células-alvo é aumentada ou a absorção de vitamina C pelas células é reduzida ou mesmo incapacitada, respectivamente.

Estudos recentes revelaram a existência de dois transportadores de vitamina C dependentes de sódio (SVCT1 e SVCT2, símbolo genético: SLC23A1 e SLC23A2) em mamíferos, incluindo o homem. Hibridizações in situ em tecidos de ratos confinaram expressão de SVCT1 a superfícies epi-teliais tais como intestino, rim e fígado, considerando que SVCT2 é amplamente expresso, incluindo cérebro, olho, glândulas adrenais e pituitárias, pulmão, estômago e testículos. Têm-se demonstrado que SVCT1 é amplamente confinado a epitélios transportando massa, onde funciona homeosta-se total do corpo. Até agora, não foi relatada a expressão de SVCTs na pele.

A figura 1 mostra um gráfico que representa o conjunto experi-mental para teste in vitro de expressão gênica de SVCT. Queratinócitos primários confluentes (NHEK) foram tratados com um composto de teste ou subseqüentemente usados para transcrição inversa e análise de PCR em tempo real de SVCT1 e SVCT2. Análise de mRNA de 18S-rRNA e GAPDH funcionou como controle endógeno de (genes responsáveis pela manutenção do metabolismo celular).

A figura 2 mostra uma análise de PCR em tempo real de queratinócitos primários tratados com extrato de alecrim a 2,5%. Alterações dobradas na expressão relativa de queratinócitos primários (NHEK) tratados com extrato de alecrim comparadas com células de controle e relativas a GAPDH são mostradas. Pontos representam médias de 4 amostras biológicas com cada técnica triplicada. As células de controle em 4 h foram iniciadas 1 vez e é representada pela linha de referência. Intervalos confidentes foram calculados usando ANOVA. Dados são estatisticamente significativos se barras em setas não tocarem a linha cruzada 1.

A figura 3 mostra um gráfico que representa o conjunto experimental para teste in vitro de absorção de ácido ascórbico. Células HaCaT confluentes foram tratadas por 18-24 h com um composto de teste ou controle, incubadas com ácido ascórbico marcado 14C em duas diferentes concentrações (5 u.M e 250 uM) por 5 minutos, 10 min., 30 min., 60 min., 90 min. e 120 min. As células foram lisadas e a radiomarcaçao no sobrenadante e no lisato celular foi quantificada por meio de contagem de cintilações (cintiló-grafo).

A figura 4 mostra a absorção de ácido ascórbico em queratinócitos primários tratados com e sem extrato de alecrim a 2,5%. NHEK foram tratados por 24 h com extrato de alecrim a 2,5% (círculos cheios) ou com controle (círculos abertos) e absorção de ácido ascórbico 14C-marcado foi medida após diferentes pontos de tempo e expressa como nmol por cavidade (A: 5 fiM de ácido ascórbico, B: 250 ^iM de ácido ascórbico). Dados representam médias de duas réplicas e foram reproduzidos em um conjunto de experimentos independente (dados não mostrados).

A figura 5 mostra um teste in vitro de absorção de ácido ascórbi-co em um modelo de estresse oxidativo. Células HaCaT confluentes foram tratadas por 2 h com 50 |iM de menadiona (losangos pretos), 500 jliM de H2O2 (triângulos), meio condicionado obtido de células HaCaT irradiadas por UV (quadrados) ou controle (losangos cinzas) e subseqüentemente incubadas com 50 |j,M de ácido ascórbico 14C-marcado por 5 minutos, 10 min., 30 min., 60 min., 90 min. e 120 min. As células foram lisadas e a radiomarcação no sobrenadante e no lisato celular quantificada por meio de contagem de cintilações. Um gráfico representando os desvios padrões correspondentes de 3 experimentos independentes com 2 réplicas de técnica cada uma.

A figura 6 mostra um teste in vitro de absorção de ácido ascórbico em um modelo de estresse oxidativo. Células HaCaT confluentes foram tratadas com 50 ^iM de FeCI3 (triângulos) ou controles (losangos cinzas) por 24 h e por 2 h adicionais com 50 yM de menadiona (símbolos cheios) ou controles (símbolos abertos). Subseqüentemente, as células foram incubadas com 50 |^M de ácido ascórbico 14C- marcado por 5 minutos, 10 min., 30 min., 60 min., 90 min. e 120 min., as células foram lisadas e a radiomarcação no sobrenadante e no lisato celular quantificada por meio de contagem de cintilações. Um gráfico representando as linhas de tempo experimentais é mostrado em A. Dados mostrados em B representam médias com desvios padrões correspondentes de 2 experimentos independentes com 2 réplicas de técnica cada uma.

De acordo com uma modalidade, a presente invenção proporciona compostos capazes de modular o nível intracelular de Vitamina C. Os compostos poderão ser obtidos por um método que compreende as etapas de (a) preparar uma cultura celular; (b) expor essa cultura celular a uma quantidade apropriada do composto a ser identificado e uma quantidade a-propriada de Vitamina C; (c) determinar o nível de Vitamina C ou da taxa de expressão de transportadores de Vitamina C na célula de tecido; e (d) comparar a taxa de expressão dos transportadores de Vitamina C com um controle.

Em geral, para realizar o método descrito em linhas gerais acima, a cultura celular poderá ser efetuada com células derivadas de qualquerespécie de ser vivo, por exemplo, animais, incluindo seres humanos, de uma linhagem celular ou de um tecido para fornecer uma cultura primária de células. As células são preferencialmente de origem mamífera, mais preferencialmente de ser humano ou origem animal de estimação. De acordo com uma modalidade, as células são células epiteliais, que são, de acordo com uma modalidade preferida, melanócitos e/ou queratinócitos, que para a facilidade da cultura celular poderão ser imortalizadas.

As células são crescidas sob condições convencionais, por exemplo, em meio RPMI, meio KGM ou meio Eagle modificado por Dulbecco até um certo número, que poderá ser determinado por um método de Câmara Thoma ou qualquer outro método apropriado conhecido daquele versado no estado da técnica.

Subseqüentemente, um composto de teste é adicionado ao meio e ao mesmo tempo, ou após um dado período de tempo uma quantidade predeterminada de Vitamina C. A quantidade de Vitamina C a ser adicionada à Cultura celular é preferencialmente em uma faixa de 0,1 fiM a 10 mM, mais preferencialmente, em uma faixa de 0,1 jliM a 0,5 mM, enquanto a quantidade do composto de teste situa-se em uma faixa de 0,1 ^iM a 100 |iM para compostos puros e 0,001% (p/v) a 0,5% (p/v) para extratos de produto natural, mais preferencialmente em uma faixa de 1 |iM a 100 iiM para compostos puros e 0,01% (p/v) a 0,5% (p/v) para extratos de produto natural. A preparação de extratos é conhecida daquele versado no estado da técnica. Os extratos poderão ser, por exemplo, qualquer espécie de extratos aquosos ou extratos com acetato de etila hidrolisados ou não-hidrolisados. O composto de teste e a Vitamina C poderão ser adicionados como pó ou em uma forma dissolvida.

Em uma etapa seguinte, determina-se o efeito da substância de teste na expressão de transportadores de Vitamina C. Esse poderá ser obtido determinando o nível de mRNA transportador de Vitamina C ou proteína, ou a quantidade de Vitamina C absorvida ou restante no sobrenadante de cultura.

De acordo com uma modalidade preferida o efeito da substânciade teste é determinado assegurando a transcrição de transportadores de Vitamina C, preferencialmente, os transportadores de Vitamina C SVCT1 e SVCT2 (símbolo genético: SLC23A1 e SLC23A2).

Após um curto período de incubação, as células são separadas do meio através de centrifugação. A expressão do mRNA transportador de Vitamina C é visualizada por meio de PCR em tempo real e/ou northern blots e poderá ser também quantificada.

Na PCR em tempo real, a quantidade inicial do modelo é quantificada especificamente, sensível e reprodutivelmente, onde a quantidade do produto final amplificado no ponto final é detectada. PCR em tempo real monitora a fluorescência emitida durante a reação como um indicador de produção de amplicon durante cada ciclo de PCR conforme oposto à detecção do ponto final. O progresso da reação em tempo real poderá ser observado em alguns sistemas. PCR em tempo real não detecta o tamanho do amplicon, contudo, não é influenciada por quantificação não-específica elimina processamento pós-PCR de produtos de PCR (que é necessário em TA-PCR competitiva). Isso aumenta produtividade total e reduz as possibilidades de contaminação de transporte. Em comparação a PCR convencional, PCR em tempo real também oferece uma faixa dinâmica muito mais ampla.

Faixa dinâmica de qualquer ensaio determina como concentração-alvo pode variar e ainda ser quantificada. Uma PCR em tempo real poderá ser realizada preferencialmente em formato de 96 cavidades para obter uma alta produtividade total das amostras.

Northern blots permitem a determinação do peso molecular de um mRNA, sua discriminação e adicionalmente a proporção de quantidades relativas do mRNA presente. RNA mensageiro (mRNA) é primeiro separado por eletroforese em gel, usualmente um gel de agarose. Posteriormente, o RNA é transferido para uma folha de papel mata-borrão, preferencialmente nitrocelulose, embora outros tipos de papéis, ou membranas, possam ser usados. As moléculas de RNA retêm o mesmo padrão de separação que as mesmas tinham no gel. A mancha é incubada com uma sonda, que é DNA de filamento único. Essa sonda formará pares de base com sua seqüênciacomplementar de RNA e ligar-se-á para formar um híbrido de RNÀ-DNA de filamento duplo. A sonda não pode ser vista, mas ela é radioativamente marcada ou apresenta uma enzima ligada a ela (por exemplo, fosfatase alcalina, peroxidase de raiz forte ou uma enzima fluorescente tal como a proteína verde fluorescente). Em seguida a localização da sonda é revelada incuban-do-a com um substrato correspondente que a enzima ligada converte em um produto colorido visível ou emite luz que revelará filme de raios X. Se a sonda foi marcada com radioatividade, ela pode ser exposta ao filme de raios X diretamente. Posteriormente, as bandas obtidas são comparadas com amostras de controle de células sadias e de tecido doente, ou estressado. Em particular, o tamanho e intensidade das bandas são de interesse, os quais poderão ser comparados visualmente ou quantificados por meio de um dispositivo de fotoimagem.

De acordo com uma modalidade preferida essas proteínas transportadoras de Vitamina C são os transportadores de Vitamina C dependentes de sódio humanos SVCT 1 e/ou SVCT 2.

O aumento de transcrição de um transportador de Vitamina C é indicativo da capacidade da substância de teste aumentar absorção de Vitamina C através da célula, considerando que a diminuição de transcrição de um transportador de Vitamina C indica a capacidade da substância de teste diminuir Vitamina C.

Alternativamente, a quantidade de Vitamina C absorvida pelas células poderá ser determinada diretamente, por exemplo, usando vitamina C marcada 14C ou por meio das propriedades redutivas de Vitamina C, uma vez que as células são capazes de armazenar um excesso dessa Vitamina por um certo período de tempo. As células são analisadas por procedimentos adequados, incluindo métodos mecânicos e químicos. Subseqüentemente, a detecção poderá ser realizada por meio de contagem de cintilaçoes em caso de vitamina C marcada 14C ou a redução de 2,6-diclorfenolindopenol de sódio (DCPIP, Reagente de Tillmans), Solução de Fehling, Solução de Be-nedict, Solução de Lugol ou a titulação com iodato de potássio. A determinação por meio da cromatografia líquida de alto desempenho/alta pressão (H-PLC) poderá compreender detecção de UV-VIS sob um comprimento de onda de 265 nm, detecção de fluorescência após derivatização de deidro-ácido ascórbico com o-fenildiamina para um produto fluorescente e detecção ele-troquímica usando, por exemplo, eletrodos de grafite. Radicais livres pode-rão ser também detectados diretamente por ressonância paramagnética eletrônica (RME). Outros métodos compreendem também, mas não são limitados a esse fim, espectrometria de massa (EM) ou cromatografia gasosa (CG). Entender-se-á que os respectivos resultados são comparados com um controle negativo.

Os compostos que devem ser investigados compreendem qual-quer substância química, capaz de influenciar/modular a expressão de uma proteína transportadora. Esses compostos poderão ser preferencialmente extratos de produtos naturais derivados, fitoquímicos, aminoácidos, ácidos graxos colesterol, minerais e açúcares.

De acordo com uma modalidade, extrato de alecrim de diferentes origens (extratos de origem aquosa e acetato de etila) (hidrolisados e não-hidrolisados) modifica a transcrição de um transportador de Vitamina C pelo fato de que a transcrição de mRNA de SVCT1 é diminuída e absorção de Vitamina C através da célula é reduzida. Outros compostos capazes de reprimir regulação da transcrição de mRNA de SVCT1 são alguns fitoquímicos tais como sulforafano, ácido retinóico todo trans e zinco ou um sal dos mesmos, dependendo da respectiva aplicação de um sal nutricional, farmacêutico ou dermatológico aceitável tal como ZnCI2, significativamente reprimiram expressão de mRNA de SVCT1. Esses compostos exercem seus e-feitos de uma maneira dependente de tempo. Verificou-se que essas descobertas não são devido a efeitos citotóxicos dos compostos de teste, mas indicam potencial real na redução de níveis de mRNA SVCT1.

De acordo com uma outra modalidade ferro ou sais dos mesmos, dependendo da respectiva aplicação de um sal nutricional farmacêutico ou dermatológico aceitável tal como FeCl3, modifica a transcrição de um transportador de Vitamina C pelo fato de que sua transcrição é aumentada e absorção de Vitamina C através da célula é expandida. Outros compostosque mostram essa característica são glutationa, N-acetil-cisteína e lisina. Isso indica que origens diferentes de compostos alimentícios são também capazes de aumentar biodisponibilidade de ácido ascórbico para tecidos. Verificou-se surpreendentemente, que o efeito dos compostos acima mencionados capazes de aumentar transcrição de transportador de Vitamina C poderá ser ainda intensificado/fortificado através de combinação de dois ou mais desses compostos, tais como FeCI3 e glutationa.

De acordo com uma modalidade alternativa, a presente invenção também proporciona uma composição, contendo um composto que apresenta a característica acima descrita em linhas gerais pelo fato de que a transcrição de um transportador de Vitamina C é aumentada ou diminuída, e opcionalmente Vitamina C.

Em princípio, o composto poderá ser incluído em qualquer composição nutricional, tais como bebidas, por exemplo, bebidas frias ou quentes, tais como refrigerantes ou chá, ou para gêneros alimentícios, por exemplo, molhos, incluídos em temperos, etc. Por exemplo, em algumas modalidades, o composto poderá ser proporcionado em, ou misturado com uma bebida, ou agitado em um alimento semi-sólido tais como pudim, coberturas para bolo, "topping", molho, purê, cereal cozido, ou molho de salada, por exemplo, ou de outra maneira adicionado a um alimento. O composto poderá compreender um ou mais ingredientes inertes, especialmente, se é desejável limitar a quantidade de calorias adicionadas à dieta. Por exemplo, os compostos identificados pela presente invenção poderão também conter ingredientes opcionais incluindo, por exemplo, ervas, outras vitaminas senão ascorbato, minerais, intensificadores, colorantes, edulcorantes, aromatizan-tes, ingredientes inertes e similares. Esses ingredientes opcionais poderão ser formas que ocorrem naturalmente ou concentradas.

De acordo com uma modalidade preferida, a composição considerada pela presente invenção é uma composição nutricional tais como leite, iogurte, coalhada, queijo, leites fermentados, produtos fermentados à base de leite, sorvetes, produtos à base de cereal fermentado, pós à base de leite, fórmulas infantis ou alimentos para animais de estimação.Da mesma maneira, o composto poderá ser formulado em uma composição farmacêutica e/ou cosmética, por exemplo, em comprimidos, tais como comprimidos multivitamínicos, sachês, suspensões líquidas, suplemento oral seco, suplemento oral úmido, alimentação seca em tubo, alimentação úmida em tubo, cremes, loções, pomadas, etc. Entender-se-á que a respectiva forma da composição farmacêutica e/ou cosmética exige exci-pientes e/ou veículos adequados, os quais incluem, por exemplo, maltodex-trina, carbonato de cálcio, fosfato dicálcio, fosfato tricálcio, celulose micro-cristalina, dextrose, farinha de arroz, estearato de magnésio, ácido esteárico, croscarmelose sódica, amido glicolato de sódio, crospovidona, sacarose, gomas vegetais, lactose, metilcelulose, povidona, carboximetilcelulose, amido de milho, e similares (incluindo misturas dos mesmos). Veículos preferidos incluem carbonato de cálcio, estearato de magnésio, maltodextrina, e misturas dos mesmos.

Os vários ingredientes e o excipiente e/ou veículo são misturados e formados na forma desejada usando técnicas convencionais. O comprimido ou cápsula da presente invenção poderá ser revestida com um revestimento entérico que se dissolve em um pH de cerca de 6,0 a 7,0. Um revestimento entérico adequado que se dissolve no intestino delgado mas não no estômago é acetato ftalato de celulose. Em outras modalidades, o suplemento é proporcionado como um pó ou líquido adequado para adicionar a um alimento ou bebida pelo consumidor.

Todas as composições nutricionais e farmacêuticas/cosméticas poderão conter, exceto o composto capaz de aumentar a expressão de transportadores de Vitamina C, também a própria Vitamina C.

De acordo com uma outra modalidade preferida, o composto incluído na presente composição é selecionado de extratos de produto natural, fitoquímicos, aminoácidos, ácidos graxos, colesterol, minerais, açúcares ou uma mistura dos mesmos.

Em geral, uma quantidade de 0,001-100, cuja última poderá ser representada por uma modalidade de suplemento oral, preferencialmente de, 0,05 a 50% em peso, do composto de teste no peso da composição.De acordo com uma modalidade alternativa, os presentes compostos e/ou composições poderão ser utilizadas para aperfeiçoamento da biodisponibilidade de Vitamina C em tecidos, tais como, por exemplo, intestino, olho, fígado, ósseo, articulações, pele e cérebro. Uma vez que a Vitamina C é altamente solúvel em água, quantidades eficazes que são absorvidas por células, são baixas em comparação às quantidades ingeridas. Em comum, o termo biodisponibilidade descreve (= descrição de FDA) a taxa e grau aos quais o ingrediente ativo ou porção ativa é absorvido de um produto de composição e torna-se disponível no sítio de ação. A biodisponibilidade de fármacos oralmente ingeridos é determinada por fatores que incluem a natureza da molécula, sua estabilidade, e a formulação administrada - e no paciente - tal como uma área superficial intestinal reduzida como resultado de doença eólica ou ressecção intestinal e sé ou não o fármaco é tomado com uma refeição. Fatores que influenciam a biodisponibilidade poderão incluir, mas sem se limitar aos mesmos, uma pobre absorção do trato gastrointestinal, efeito hepático de primeiro passo e, metabolização e degradação do fármaco antes de atingir circulação sistêmica. A permissão dietética usual recomendada (RDA) de Vitamina C envolve também sua biodisponibilidade e quantidades a 60 mg/dia para adultos.

De acordo com uma modalidade da presente invenção usa-se a composição para o tratamento ou prevenção de uma doença acompanhada por um baixo potencial redutivo em um indivíduo, tais como doenças cardíacas, câncer, doenças neurodegenerativas e envelhecimento. Uma vez que a pele, como o maior órgão de um ser vivo é exposta a influências ambientais prejudiciais, a presente invenção particularmente considera o uso dos presentes compostos para o tratamento e/ou prevenção de condições causadas por estresse exercido na pele. Um estresse deve ser interpretado compreender estresse físico, por exemplo, irradiação por ultravioleta da pele, estresse químico, tais como exposição a agentes químicos, materiais poluentes ou alergênicos, ou estresse biológico, tais como reações alérgicas ou ser exposta a, ou infectada por microorganismos, tais como bactérias patogênicas, vírus, fungos, etc.Em princípio, tais condições compreendem qualquer espécie de processos patológicos, tais como doenças dermatológicas ou geralmente que envolvem radicais livres.

De acordo com uma modalidade preferida, usa-se a presente composição para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou estresse de um tecido particular, incluindo lesões primárias que é uma alteração física do tecido considerado ser causada diretamente pelo processo de doença e lesões secundárias da pele resultando de fatores externos tais como coceira, trauma ou alterações causadas por cicatrização. Em relação, por exemplo, a pele, lesões primárias na pele poderão compreender dermatite atópica, pso-ríase, dermatite bacteriana e lesões da pele causadas por infecções virais.

De acordo com ainda uma outra modalidade, a presente invenção também proporciona um método de identificar compostos que apresentam a capacidade de modular a expressão de transportadores de Vitamina C de tal modo que a expressão de transportadores de Vitamina C seja aumentada ou diminuída. O termo "aumento" geralmente designa um aumento de expressão e o termo "diminuição" refere-se a uma expressão reduzida, em que a adição do composto a ser testado leva a uma alteração detectável na taxa de expressão dos transportadores de Vitamina C e/ou no teor de Vitamina C das células do tecido.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção sem limitá-la.

Exemplos

Teste in-vitro à base de PCR em tempo real para monitoração da expressão gênica de modulação

Usou-se queratinócitos epidérmicos primários adultos (NHEK) de Cambrex Company (USA, número de ordem: CC-2501) nesse estudo. Eles foram crescidos em meio KGM {Cambrex Company, USA, número de ordem: CC-3101 e CC-4131) em pratos plásticos revestidos com fibronectina e colágeno tipo I (placas de 6 ou 12 cavidades) a 37°C e CO2 a 5% e expandidos até passo 4 onde eles foram usados para experimentos adicionais.

Células NHEK em passo 4 foram assentadas em placas de 6 cavidades em uma densidade de 5.000 células/cm2, determinadas por meiode uma câmara Thoma sob um microscópio óptico. As células foram crescidas para confluência de 100% em 5-6 dias com meio alterado a cada segundo dia e foram adicionalmente usadas para teste in vitro para expressão gênica conforme representada esquematicamente na figura 1.

Após a densidade considerada ter sido alcançada, os compostos de teste foram aplicados (extrato de alecrim (0,1 % (p/v) e 0,25% (p/v) como extrato aquoso de diferentes origens ou extratos de acetato de etila hidroli-sados e não-hidrolisados, 10 yM de extrato de gingko biloba, 10 nM de gaiato de epigalocatequina (EGCg), 10 (iM de (R,S)-equol, 10 de quercetina, 10 H.M de hesperetina, 10 de curcumina ou 10 \M de genisteína) ou a mesma quantidade de solvente usado para dissolver os compostos de teste que funcionaram como controles negativos. As células com composto de teste aplicado ou controle negativo foram incubadas a 37°C e C02 a 5% por 4 h, 8 h, 16 h ou 24 h. Após remoção do sobrenadante, as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada fosfato de meio Dubellco (PBS, Sigma, Alemanha), as células foram lisadas com 350 jil de um tampão lise (Tampão RL, Qiagen AG, Basel, Suíça) contendo 1% de p-mercaptoetanol {Sigma, USA) e RNAs totais de lisatos celulares foram extraídos usando a coluna de QIAshredder e o Mini-/c/'f de RNeasy® {Qiagen AG, Basel, Suíça). Quantificação de RNA foi realizada usando o Kit de quantificação RNA de Ribogreen® (Sondas Moleculares, USA) em placas de 96 cavidades e uma leitora de microplaca de fluorescência (Spectros de flúor mais F 129005, Te-carí). As medições foram feitas em duplicata. As amostras foram diluídas 1:680 ou 1:3.400 em um volume final de 100 \x\ de tampão 1 x TE. Diluições do RNA ribossômico em uma concentração de 1; 0,5; 0,1; 0,02; 0 ng/ml foram usadas como padrões e a medição foi realizada através de fluorimetria em 485 nm e 538 nm. Quantificação de RNA foi em seguida calculada comparada com a curva padrão. Integridade de RNA foi controlada usando ele-troforese em gel de agarose (1% de agarose em TBE: 90 mM de Tris/HCI pH 8,0, 80 mM de ácido bórico, 3 mM de EDTA em ddH20).

Para transcrição reversa 2 ui de hexâmeros aleatórios pd(N)6 {Amersham Biosciences, Art. N- 272080, Inglaterra) e 1 (il de dNTP (10 mM,Amersham Biosciences, Art. N-. 272050, -60, -70, -80, Inglaterra) foram adicionados a 2 u.g de RNA em água sem nuclease (Ambion, USA) em um volume total de 12 Após 5 minutos de incubação a 65°C, as amostras foram imediatamente colocadas em gelo e rapidamente centrifugadas. Em seguida, 4 nl de 5 X tampão de primeiro filamento (250 mM de NaCI, 0,1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 0,1% (V/v) NP-40, 50% (v/v) de glicerol), 2 (xl de ditiotreitol, 1 uJ de inibidor RNase e 1 \i\ de transcriptase reversa SuperScript II RNase H" (SUPERase-ln, 20 U/pi, Ambion, Art. N°. 2694, USA) foram adicionados (volume final de 20 ui). A transcrição reversa Research Inc. USA) usando o seguinte programa de temperatura: ativação da enzima: 10 minutos a 25°C; reação de transcrição reversa: 60 minutos a 42°C; inibição da enzima: 20 minutos a 70°C. A amostra foi em seguida mantida no freezer a -20°C até uso adicional.

A PCR em tempo real foi realizada de acordo com o método TaqMan® em placas de 96 cavidades (96 WP) usando iniciadores e sondas de ensaios sobre demanda (SVCT1: Hs00195277_m1, SVCT2:, Hs00192765_m1, 18S-rRNA: 4310893E, GAPDH: 4310884E, Applied Biosystems, USA). Análise foi feita em triplicata usando uma mistura padrão (3,5 x) que continha 43,7 ii\ de TaqMan® 2 x mistura padrão de PCR Universal {Applied Biosystems, USA), 4,4 jil de primers e sondas de ensaios-sobre-demanda, 21,9 jliI de água sem nuclease e 17,5 |il de cDNA (87,5 ng = 25 ng por réplica). Tri-plicatas de 25 uJ de mistura padrão foram carregadas em uma placa de reação ABI PRISM de 96 cavidades {Applied Biosystems, USA), cobertas com uma cobertura adesiva óptica transparente e centrifugadas três vezes em 2.000 rpm por 1 minuto ou até que todas as bolhas de ar fossem removidas. A reação de PCR foi em seguida efetuada no Sistema de Detecção Seqüencial ABI PRISM® 7000 {Applied Biosystems, USA) usando o seguinte programa de temperatura: ativação da enzima: 2 minutos a 50°C; desnaturação: 10 minutos a 95°C e 40 ciclos de amplificação alvo: 15 segundos de recozi-mento a 95°C e 1 min. de extensão a 60°C. A análise dos esquemas de amplificação foi feita usando o software ABI PRISM®. Ajustagens de linha de base foram feitas individualmente (SVCT1: 17-27, SVCT2: 6-15, 18S-rRNA:2-12; GAPDH: 8-18), considerando que limiares foram ajustados manualmente em 0,2 para todos os iniciadores. Expressão gênica foi normalizada para cada GAPDH ou 18S-rRNA e análise estatística foi feita por ANOVA.

O tratamento com extrato de alecrim resultou em uma diminuição significativa da expressão de SVCT1 na PCR em tempo real em comparação ao controle negativo, considerando que expressão de SVCT2 não foi alterada (cf. Fig. 2). Interessantemente, a adição do composto em diferentes quantidades (0,1% (p/v) e 0,25% (p/v) por cavidade, em condições constantes de ensaio) levou a uma diminuição da expressão dependente de dose. A adição de extrato de ginkgo biloba, (-) gaiato de epigalocatequina (EGCg), equol, quercitina, hesperetina/hesperidina, curcumina e genisteína nas concentrações de 10 nM, contudo, não mostrou qualquer influência no sentido de expressão de SVCT1 e SVCT2.

Teste in vitro à base de vitamina C marcada 14C para monitorar a absorção de vitamina C

Queratinócitos imortalizados humanos (HaCaT) foram semeados em pratos plásticos de 6 cavidades ou 12 cavidades em uma densidade de 20.000 células/cm2 e crescidos em Meio Eagle Modificado por Dulbecco contendo 4.500 mg/l de glicose, suplementado com penicilina e estreptomicina (cada 100 U/ml), soro fetal bovino a 10% e 0,584 g/L de glutamina até confluência a 37°C, umidade relativa a 95% e C02 a 5%. O meio foi alterado a cada segundo dia.

Preparou-se uma solução de estoque 50 mM de ácido ascórbico marcado UC dissolvendo 1,85 MBq (Amersham Biosciences, RU) em 77 fil de tampão de transferência (140 mM de NaCI, 4,2 mM de KHC03, 5,8 mM de KCI, 1,3 mM de CaCI2, 0,5 mM de MgCI2, 10 mM de Hepes, 1% de Penicilina Estreptomicina, 0,1 mM de DTT (recentemente adicionado)) sob condições semi-estéreis. Essa solução de estoque foi usada imediatamente e a solução restante foi armazenada a -20°C por um período de tempo máximo de 2 semanas.

Células HaCaT confluentes foram incubadas com ou sem composto de teste (solução aquosa de FeCb em diferentes concentrações) por18-24 horas e eventualmente estressadas por 2 h adicionais com 50 nM de menadiona, 500 fiM de H202 ou meio condicionado obtido de HaCaTs irradiadas por UV. Em seguida as células foram lavadas duas vezes com PBS e incubadas com 300 uJ ou 400 jxl de ácido ascórbico marcado 14C sob diferentes concentrações de (5 uM, 50 [iM ou 250 |iM) diluindo a solução de estoque preparada na quantidade apropriada de tampão de transferência. Após incubação a 37°C por diferentes períodos de tempo (5, 10, 30, 60, 90 e 120 min.) as células foram imediatamente colocadas em gelo, o sobrenadante removido e congelado, as células lavadas duas vezes com PBS gelado e finalmente colhidas com um raspador de células e 300 |J ou 400 ul de tampão uréia (9,5 M de uréia, 10 mM de Tris/HCI pH 8,0, 2 mM de EDTA pH 8,0). Quantidade de radiomarcação no sobrenadante e lisato celular foi em seguida medida através de contagem de cintilações de uma diluição de 50 \xl de sobrenadante ou 200 |jJ de lisato celular em 9 ml de coquetel de cintila-ção. Dados obtidos foram analisados por meio de tempo de incubação de borradura versus absorção de ácido ascórbico (cada um como porcentagem ou nmolar).

Verificou-se também que outros compostos aumentam absorção de ácido ascórbico no modelo de estresse oxidativo usando condições experimentais similares conforme descritas acima. Esses compostos exibindo essa característica eram glutationa, N-acetil-cisteína e lisina (dados não mostrados).

Claims (14)

1. Composto capaz de modular expressão de transportadores de Vitamina C em células obteníveis por um método que compreende as etapas de:(a) preparar uma cultura celular;(b) expor essa cultura celular a uma quantidade do composto a ser identificado e uma quantidade de Vitamina C;(c) determinar o nível de transportadores de Vitamina C na célula de tecido; e(d) comparar a taxa de expressão dos transportadores de Vitamina C com um controle, com um aumento de nível indicando a capacidade do composto de teste aumentar absorção de Vitamina C nas células.

2. Composição nutricional ou farmacêutica contendo um composto, de acordo com a reivindicação 1, e opcionalmente Vitamina C.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, em que o composto capaz de modular expressão de transportadores de Vitamina C é selecionado de extratos de produto natural, fitoquímicos, aminoácidos, ácidos graxos, colesterol, minerais, açúcares ou uma mistura dos mesmos.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 4, em que o composto capaz de modular expressão através de diminuição de expressão de transportadores de Vitamina C é extrato de alecrim, sulforafano, ácido retinóico totalmente trans e zinco, ou um sal do mesmo.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, em que o composto capaz de modular expressão através de aumento de expressão de transportadores de Vitamina C é ferro ou um sal do mesmo, glutationa, N-acetil-cisteína e lisina.

6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 5, em que o composto capaz de modular transportadores de Vitamina C, é contido em uma quantidade na faixa de 0,0001 a 100% em peso, baseado no peso total da composição.

7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, em que é selecionada de iogurte, leite, coalhada, queijo, leites fermenta-dos, produtos fermentados à base de leite, sorvetes, produtos à base de cereal fermentado, pós à base de leite, fórmulas infantis, comprimidos, suspensões líquidas, suplemento oral seco, suplemento oral úmido, alimentação seca em tubo ou alimentação úmida em tubo.

8. Uso de um composto ou uma composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, para modular a biodisponibilidade de Vitamina C em um tecido de interesse, preferencialmente no intestino, olho, fígado, osso, articulações, pele e o cérebro.

9. Uso de um composto ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, para o tratamento ou prevenção de uma doença ou estresse em um tecido de interesse, preferencialmente no intestino, olho, fígado, osso, articulações, pele e o cérebro.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, em que a doença ou estresse da pele é dermatite, psoríase, dermatite bacteriana e lesões da pele causadas por infecções virais ou arranhões, trauma ou alterações causadas por cicatrização.

11. Método para a identificação de compostos que modulam a expressão de transportadores de Vitamina C em células eucarióticas, método este que compreende as etapas de:(a) preparar uma cultura celular;(b) expor essa cultura celular a uma quantidade do composto a ser identificado e uma quantidade de Vitamina C;(c) determinar a taxa de expressão dos transportadores de Vitamina C nas células; e(d) comparar o nível da taxa de expressão dos transportadores de Vitamina C nas células com um controle, com um nível elevado indicando a capacidade do composto de teste aumentar absorção de Vitamina C nas células.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que as células da cultura celular são derivadas do intestino, olho, fígado, osso, articulações e/ou a pele.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que asproteínas transportadoras de Vitamina C são os transportadores de Vitamina C dependente de sódio humano SVCT 1 (símbolo genético SLC23A1) e/ou SVCT 2 (símbolo genético SLC23A2).

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, em que os compostos que têm de ser identificados são derivados de extratos de produto natural, fitoquímicos, aminoácidos, ácidos graxos, coles-terol, minerais e açúcares.