BRPI0605952B1 - Composições cicatrizantes - Google Patents

Abstract

CICATRIZANTE BIOFÁRMACO. O cicatrizante biofármaco se aplica a área da indústria farmacêutica de fitoterápicos para ser utilizado como "medicamento fitoterápico" com ação cicatrizante e antibacteriano em feridas de pacientes diabéticos ou não, em micoses, unheiros, assaduras, queimaduras, etc. É um produto a base de plantas brasileiras contendo extrato de quatro plantas (Schinus terebinthifolius raddi, Physalis angulata linné, Cereus hildemanianus shucus, e Anadenanthera colubrina benth).

Description

1. As composições cicatrizantes se aplicam a área da indústria farmacêutica de fitoterápicos para serem utilizadas como “medicamento fitoterápico” com ação cicatrizante e antibacteriano em feridas de pacientes diabéticos ou não, em micoses, unheiros, assaduras, queimaduras, etc. É um produto a base de plantas brasileiras contendo extrato de quatro plantas (Schinus terebinthifolius raddi, Physalis angulata linné, Cereus hildemanianus shucus, e Anadenanthera colubrina benth), nas quais foram realizadas as pesquisas comprobatórias do efeito cicatrizante das formulações em gel e pomada em coelhos diabéticos e com feridas, ou não. Foram também realizadas as pesquisas fitoquímica qualitativa e controle de qualidade do produto.

2. No mercado existem produtos sintéticos como, por exemplo, a pomada Kolagenase bem como um fitoterápico (Cataflan), que foram testados em comparação com o cicatrizante biofármaco e o tempo de cicatrização e a eficácia terapêutica cicatrizante biofármaco foi comprovadamente mais eficaz quando testado em animais e comparado com medicamentos da área. Os demais cicatrizantes disponíveis no mercado para os portadores de diabetes não são tão eficazes uma vez que causam nos usuários efeitos colaterais diversos como alergias, tempo lento de cicatrização, vermelhidão e às vezes até queimaduras em peles. Muitos produtos existem no mercado e nem sempre atuam de forma satisfatória na cicatrização de lesões em pacientes diabéticos com complicações na microcirculação periférica. Pacientes utilizando cicatrizantes normais do mercado têm tido dificuldades na cicatrização de suas feridas. Vários pacientes passam anos com feridas sem que ocorra a cicatrização. Quando os problemas se agravam esses pacientes têm dificuldades quanto à oxigenação de tecidos e isso pode levar a gangrenas e amputações de parte do corpo principalmente dedos dos pés e mãos. A oxigenação dos tecidos ocorre com mais dificuldade, pois a hemoglobina, uma das proteínas do sangue que leva o oxigênio a todos os tecidos tem dificuldade de circulação. O desenvolvimento do cicatrizante biofármaco promoveu os efeitos desejados como cicatrizante em ferida de diabéticos ou não, sem causar efeitos colaterais como os fármacos tradicionais, e é, por isso, uma alternativa para o combate às feridas de diabéticos, já que também é um produto com menos custos, bons efeitos terapêuticos e menos efeitos colaterais.

3. Alguns parâmetros foram pesquisados como a amostragem (retirada de material representativo do lote do princípio ativo), características do produto, descrição botânica, identificação química, quantificação das substâncias presentes, pesquisa de metais pesados e pesquisa de contaminantes microbiológicos nos produtos formulados atendendo as exigências da ANVISA.

4. O desenvolvimento do cicatrizante biofármaco envolveu conhecimentos da fitomedicina abordando a pesquisa do fitoterápico, objeto desse pedido de patente, para promover a cicatrização em pacientes diabéticos ou não (foram feitos testes, primeiro em animais experimentais). No desenvolvimento do cicatrizante biofármaco foram realizados todos os testes necessários com animais experimentais diabéticos para comprovar seus efeitos sobre a ferida, verificando-se também os efeitos não tóxicos em doses maiores. Foram essas as pesquisas que permitiram através da exploração científica multidisciplinar determinar os agentes biologicamente ativos do cicatrizante biofármaco e sua formulação para que possa ser utilizado como medicamento.

5. Dentro deste desenvolvimento do cicatrizante biofármaco, é importante destacar que, no extrato dessas quatro plantas, existe a sinergia, ou seja, um efeito potencializador entre as várias substâncias presentes no extrato. Essas substâncias foram identificadas na parte do controle de qualidade e identificadas dentro das classes dos flavonóides, taninos, saponinas, esteróides, triterpenóides, alcalóides. Sendo os flavonóides em maior quantidade, atribui-se a eles e ao sinergismo entre essas outras substâncias, o potencial efeito cicatrizante. Os flavonoides das quatro plantas atuam impedindo a síntese aumentada de colágeno polimérico e glicoproteínas acídicas, substâncias estas que aumentam em pacientes diabéticos e dificultam a cicatrização por afetarem a microcirculação periférica. No cicatrizante biofármaco foi utilizado um Gel de Carbômero Carbopol 940, viscosidade em 0,5% de água a pH 7,5 entre 40 a 60 pascais-segundo (Pa S) - Carbopol - ou pomada de cera de polietileno 400g/mol com densidade entre 1,124 e 1,126 e ponto de fusão entre 65 e 108 °C - Creme Polawax - concentrado que favorecia a penetração dos princípios ativos permitindo que os flavonóides e os demais componentes dos diferentes extratos pudessem ter essa ação cicatrizante.

6. De acordo com os resultados obtidos no desenvolvimento do produto, objeto desse pedido de patente, ao ser testado as feridas que persistiam em média um mês para cicatrizar nos animais feridos, cicatrizavam completamente em torno de 15 dias com o uso do cicatrizante biofármaco.

7. O processo de reparação e cicatrização não é um simples processo linear no qual fatores de crescimento disparam a proliferação celular, e sim uma integração de processos interativos dinâmicos, que envolvem mediadores solúveis, elementos figurados do sangue, produção de matriz extracelular e células parenquimatosas.

8. Para a indução do Diabetes mellitus, têm-se empregado usualmente o aloxano (5,6 dioxiuracil monohidrato). Sua ação diabetogênica caracteriza-se pela produção de radicais livres que são tóxicos, especificamente nas células β do pâncreas, levando à degeneração e morte definitiva das mesmas que param de produzir insulina e o animal fica, então, diabético. Nos animais com diabetes foram induzidas feridas para se permitir avaliar o efeito cicatrizante do fitoterápico biofármaco em diabéticos.

9. Na avaliação da ação cicatrizante do biofármaco, em gel, foram utilizados 35 coelhos da raça Nova Zelândia, brancos, com 90 ± dias, separados em sete grupos de cinco, sendo dois grupos-controle, divididos em um grupo não lesionado (gnl) e outro grupo lesionado sem tratamento (glst), e cinco grupos de tratamentos. Induziu-se diabetes pela administração intraperitoneal de aloxano e, posteriormente, foram provocadas feridas no tecido cutâneo com substâncias irritantes. As áreas lesionadas dos coelhos diabéticos, induzidos por aloxano, foram submetidos ao tratamento com o cicatrizante biofármaco em gel nas concentrações de 1, 3, 5, 10 e 15%. Os resultados foram interpretados através de análises macro e microscópicas. Para as análises microscópicas os coelhos foram eutanasiados, após serem anestesiados, sendo retiradas as amostras de pele das áreas lesionadas, preparadas lâminas de cortes histológicos e feitas medições de espessura de epiderme e derme. Os resultados foram interpretados com o auxílio de análise univariada, teste de média - teste de Duncan (p<0,05). Os resultados analisados nas microfotografias e nas medições foram significativos de recuperação tanto da epiderme quanto da derme, num período de 14 dias de tratamento. Verificou-se que o tratamento com o cicatrizante biofármaco em gel, obtido de extratos das plantas acima relacionadas na concentração de 5% foi suficiente, eficaz e seguro na cicatrização e na prevenção de contaminação microbiana exógena, mostrando regenerações dos tecidos lesionados com espessuras de epiderme e derme semelhantes às do grupo controle, ao final de 15 dias de tratamento.

Descrição das Figuras:

10. A figura descrita abaixo exemplifica a invenção, objeto do atual pedido de patente: Gráfico 1: trata da evolução do processo de cicatrização de lesões cutâneas em tratados com cicatrizante biofármaco em gel a 5 e 10% comparados com a pomada kollagenase®. De acordo com os resultados obtidos observou-se que o cicatrizante biofármaco em gel nas concentrações de 5 e 10% tiveram as maiores taxas de cicatrização que a pomada kollagenase®.

Objetivos do cicatrizante biofármaco

11. O objetivo foi formular em gel e pomada o cicatrizante biofármaco para agir como antiinflamatório e cicatrizante em pacientes diabéticos ou não. O cicatrizante biofármaco foi formulado com mais poder de penetração e ação rápida e com menos efeitos colaterais, sendo assim mais eficientes que os disponíveis no mercado, solucionando o problema da cicatrização em diabéticos. Foi também objetivo desenvolver um produto para pessoas com má circulação e que teriam um tempo lento de cicatrização que é o que ocorre com os diabéticos.

12. Para atingir esses objetivos foi desenvolvido o cicatrizante biofármaco, em gel e pomada, em diferentes concentrações e realizados os testes in vivo, utilizando coelhos normais e diabéticos induzidos por aloxano e que foram induzidas feridas de pele. Foi também testada a formulação do cicatrizante biofármaco para fazer uma avaliação histopatológica dos tecidos cicatrizados em comparação com controle positivo (pomada kollagenase com cloranfenicol®) e com controle (solução fisiológica 0,9%), em diferentes concentrações do cicatrizante biofármaco em gel e pomada.

13. O cicatrizante biofármaco, objeto desse pedido de patente, foi obtido dos extratos de Schinus terenbithifolius radd (cascas do caule), Physalis angulata linné (partes aéreas) Cereus hildemanius shucus (partes aéreas), Anadenanthera colubrina benth (cascas de caule) 5 a 70 g de cada um por 100mL de extrato. Os extratos hidroalcoólicos (etanol: água 6,5 : 3,5) das Schinus terenbithifolius radd (cascas do caule), Physalis angulata linné (partes aéreas) Cereus hildemanius shucus (partes aéreas), Anadenanthera colubrina benth (cascas de caule) foram preparados trabalhando-se com as concentrações de 5 a 70% dos formulados em gel e pomada. Foram realizados testes fitoquímicos e foram detectados a presença de saponinas, esteróides, alcalóides, flavonóides, taninos sendo atribuídas as atividades cicatrizantes, antiinflamatórias e antibacterianas a alguns desses compostos, principalmente os flavonóides.

14. No controle de qualidade da matéria-prima bruta (extratos das plantas citadas acima) e do cicatrizante biofármaco foram determinados testes de pureza e integridade, análise qualitativa e quantitativa dos princípios ativos, screening fitoquímico (para saponinas, esteróides e triterpenóides, alcalóides, flavonóides, taninos) de acordo com as exigências da ANVISA.

Descrição da metodologia do ensaio biológico e do controle de qualidade Metodologias aplicadas aos testes de Screening fitoquímico: 1 - SAPONINA

15. Teste de formação de espuma - Foram re-dissolvidos aproximadamente 20mg do material em 5mL de água destilada em um tubo de ensaio, agitando-se vigorosamente durante 5 minutos. A formação de espuma intensa e persistente, pelo menos durante 30 minutos, indica um teste positivo para a presença de SAPONINAS.

2 - Esteróides e triterterpenóides

16. Teste de Lebermann-Buchard - Foram re-dissolvidos alguns miligramas do material em 3mL de clorofórmio, filtrando-se, quando necessário. Juntou-se à solução clorofórmica, 2mL de anidrido acético, agitou-se suavemente e adicionaram-se cinco gotas de ácido sulfúrico pelas paredes do tubo. O desenvolvimento de uma sucessão de cores, do róseo ao azul e verde, indicou teste positivo para ESTERÓIDES e TRITERPENÓIDES.

3 - Alcalóides

17. Foram re-dissolvidos alguns miligramas do material em 8mL de HCl (1%), filtrando-se, quando necessário. Dividiu-se a solução ácida em quatro frações de 2mL distribuídas em quatro tubos de ensaio, devidamente identificados e adicionaram-se gotas dos reagentes usuais de precipitação de alcalóides, citados a seguir. A formação de precipitado abundante indicou teste positivo para ALCALÓIDES.

4 - Flavonóides

18. Teste I - Foram re-dissolvidos alguns miligramas do material em 5mL de metanol filtrando-se, quando necessário.

19. Adicionou-se 1mL de HCl (conc) e deixou-se reagir com 1cm de fita de magnésio. O desenvolvimento de uma coloração rósea indicou o teste positivo para FLAVONÓIDES.

20. Teste II - Foram re-dissolvidos alguns miligramas do material em 3mL de acetona filtrando-se, quando necessário. Concentrou-se a solução em banho-maria até 0,5mL. Em seguida, adicionou-se 0,05mg do ácido oxálico e igual quantidade de ácido bórico. Aqueceu-se em banho-maria por 5 minutos. Teve-se o cuidado para não deixar secar totalmente o conteúdo do frasco, juntando-se em seguida 10mL de éter etílico observando-se à luz UV. O desenvolvimento de florescência indica um teste positivo para FLAVONÓIDES.

5 - Taninos

21. Foram re-dissolvidos alguns miligramas do extrato em 10mL de água destilada. Filtrou, quando necessário e dividiu-se o volume total da solução em duas porções iguais. Tratando-se cada uma delas com gotas de um dos seguintes reagentes:

22. Teste I - Solução de cloreto férrico 1% - O aparecimento de precipitado ou coloração verde ou azul indica teste positivo para TANINOS.

23. Teste II - Solução de gelatina 0,5% - O aparecimento de precipitado também indica teste positivo para TANINOS.

Aplicação cromatográfica

24. O controle de qualidade dos extratos foi realizado através de processo cromatográfico, obedecendo ao seguinte protocolo:

25. Dissolveram-se alguns miligramas do material a ser testado em 2mL de solvente e manteve-se a solução em recipiente coberto para evitar evaporação.

26. Separaram-se quatro cromatoplacas e colocou-se em cada uma delas “spots” do material (gotas) à distância de 1,5cm do bordo inferior e 0,7 dos bordos laterais. Usou-se um conjunto de cromatoplacas para cada um dos extratos obtidos na filtração em sílica.

27. Prepararam-se as câmaras de cromatografia em frascos de Borel ou outro recipiente adequado, colocando cada mistura eluente de modo a deixar 0,5cm de profundidade (4-5mL em frascos de Borel). Foram utilizados tantos recipientes quantos necessários.

28. Colou-se uma tira de papel-filtro aderida com o eluente à parede do recipiente, de modo a cobrir a metade de sua área, para provocar a saturação da câmara com os vapores do eluente.

29. Deixou-se o eluente correr até que a frente atingisse o bordo superior. Retirou-se a placa, observou-se sob a luz ultravioleta em câmara escura e anotaram-se graficamente os resultados. A placa foi seca e colocada para revelar em câmara com vapores de iodo.

Eluentes básicos usados no processo seriado:

30. Eluente I: Hexano

31. Eluente II: Clorofórmio

32. Eluente III: Clorofórmio + metanol (95:5)

33. Eluente IV: Clorofórmio + metanol (90:10)

34. Caso nenhum dos eluentes I, II, III e IV apresentasse boa resolução, seria necessário repetir o processo com eluentes de polaridade intermediária escolhidos na série eluotrópica entre os dois que provocaram, respectivamente, pequena e grande migração. No entanto, esse procedimento não foi necessário.

Controle de qualidade do produto:

35. O controle de qualidade do cicatrizante biofármaco foi realizado a partir da coleta do material através de observações macroscópicas (flores e frutos) e de testes organolépticos das partes aéreas da planta e de cascas dos vegetais, seguida da análise qualitativa e quantitativa realizada diretamente sobre o cicatrizante biofármaco, antes e depois do envase, bem como durante todo o tempo de validade de cada lote.

36. O controle do tempo do produto em prateleira foi realizado através da amostragem significativa e periódica dos materiais coletados em toda a linha de produção para avaliação cromatográfica e antimicrobiana.

37. Todos esses dados foram colocados juntos para formar a ficha técnica que compõe o dossiê de cada lote do produto.

Matéria-prima vegetal

38. O controle desses materiais foi realizado periodicamente através de inspeções no campo onde se produz a matéria-prima sem a presença de defensivos agrícolas ou agrotóxicos. As coletas foram realizadas através de podas manuais durante os meses de outubro a janeiro. Os trabalhos de coleta foram desenvolvidos no período da manhã, no horário de 5 às 10 horas, após minuciosa inspeção e seleção dos espécimes e das partes aéreas. Os espécimes que apresentam problemas morfológicos ou parasitários são imediatamente descartados.

39. Durante as coletas uma amostragem de plantas inteiras e/ou, floridas foi coletada aleatoriamente para obtenção de exsicatas necessárias à identificação e posterior herborização.

Secagem

40. Após a coleta, os dados dos materiais botânicos foram fichados e em seguida foram distribuídos nas telas do sistema de secagem, utilizando sistemas de secadores suspensos protegidos com telas, processando nas condições ambientais de temperatura e de aeração até o material vegetal atingir os 12% de umidade. Os secadores foram protegidos da incidência direta do sol e de temperaturas elevadas, além da proteção contra os insetos e os roedores. Durante e após a secagem os materiais foram submetidos a inspeções visuais.

Controle da moagem

41. Após o procedimento de secagem os materiais, antes de serem moídos, foram vistoriados com o acompanhamento da ficha técnica de produção e em seguida foram moídos e peneirados concomitantemente em moinho desintegrador elétrico do tipo Haley. A coleta do vegetal moído é feita diretamente no flange do recipiente coletor (ciclone) de aço inoxidável. Ao final dessa etapa, o operador, de posse de ficha técnica de produção, anotou todos os dados e as observações pertinentes e pesou a matéria prima. Após a limpeza do equipamento, o material vegetal seco e moído seguiu a seqüência de produção descrita, sob a supervisão de um conferente.

Controle do processo de extração

42. Em recipientes rigorosamente limpos, procedeu-se à pesagem de cada matéria prima vegetal que fez parte da formulação do fitoterápico, anexando aos extratores a respectiva ficha técnica de produção com todos os dados. Essa etapa também foi avaliada por um conferente. Após o término da operação o extrato foi passado em filtros de 5 micrômetros para um recipiente limpo. Uma amostra representativa do produto de extração foi separada e reservada para análises de controle de qualidade.

Análise para controle de qualidade do cicatrizante biofármaco

43. Uma alíquota de 100mL do extrato filtrado, obtida como uma amostra representativa da operação de extração foi concentrada em banho-maria e seca em dessecador com sílica. O produto final foi pesado para determinação da concentração de sólidos totais e o padrão aceito corresponde a uma faixa de 4,0-4,2%. Nesta etapa, procedeu-se ao cálculo para o ajuste da correção da concentração do extrato utilizado na formulação do produto final, com o solvente etanol: água na mesma proporção usada na extração. Em seguida, o produto seco foi triturado em um gral, homogeneizado, e após esse procedimento aproximadamente 1g foi separado para análises químicas por cromatografia de camada delgada. As análises foram realizadas da seguinte forma: uma amostra representativa do produto concentrado e seco, pesando 1g, foi dissolvido em 10mL de etanol:água com agitação e um pouco de aquecimento (aproximadamente 60°C), e logo após foi passado em papel de filtro. Uma fração desse filtrado foi aplicada com um capilar de vidro, como um ponto próximo ao da amostra padrão do produto, sobre uma placa de CCD (sílica gel PF254-Merck), tamanho 3,5 x 10 cm, eluída com clorofórmio:metanol (1;1) + AcOH (0,1%). O produto da extração estará aprovado se a amostra sob análise apresentar como resultado cromatográfico, após a placa ser eluída dentro de cuba contendo o solvente descrito anteriormente, os mesmos Rf (p1,p2,p3) da amostra padrão.

Formulação e controle do cicatrizante biofármaco

44. Em laboratório, iniciou-se a formulação do cicatrizante biofármaco, procedendo-se da seguinte maneira: adicionou-se ao recipiente o produto vegetal moído e pesado, etanol:água (6,5:3,5), deixando-se em maceração por oito dias. Todos esses dados e as observações pertinentes foram incorporados à ficha técnica de produção, avaliada por um supervisor.

45. Recolheu-se uma amostra do fitoterápico preparado, para enviar ao Laboratório de Controle de Qualidade, onde foram procedidas as análises organolépticas, macroscópicas, cromatográficas e físico-químicas, utilizando os dados e as substâncias-padrão de referências.

46. Em seguida, foram realizados o envasamento em frascos de vidro com capacidade para 120 mL e a rotulagem em equipamento totalmente automatizado, seguido de seu fechamento com tampas plásticas. Logo após, cada produto foi acondicionado em cartuchos de cartolina, devidamente identificado e providos de bula. Separou-se uma nova amostragem obtida aleatoriamente para o controle de qualidade, destinado ao teste de estabilidade descrito a seguir (ensaio clássico), à avaliação antimicrobiana periódica e à amostra para a contra-prova.

47. Finalizando, procedeu-se à embalagem dos frascos nos respectivos cartuchos em caixas de papelão de 24 unidades, todas devidamente identificadas, para depósito no almoxarifado e posterior expedição.

Teste de estabilidade do cicatrizante biofármaco

48. Os testes de estabilidade do cicatrizante biofármaco foram realizados de acordo com a seguinte metodologia: dez frascos de cada lote do produto foram coletados através da escolha aleatória e após notificação detalhada do lote, do número de cartuchos e do prazo de validade, e foram submetidos a uma avaliação, a fim de realizar a projeção da estabilidade do produto em relação ao tempo de exposição (prateleira) que ele irá sofrer durante a comercialização do medicamento (36 meses). Para tanto, duas amostras foram abertas de cada vez, após o período de produção de 6,12,18, 24, 30 e 36 meses.

49. As avaliações foram realizadas quanto às suas propriedades físicas, químicas e antibióticas, da seguinte forma:

50. a) aspectos gerais (tampas, rótulos, e frascos)

51. b) conteúdo: cor, odor, pH, atividade antimicrobiana

52. c) resultados cromatográficos (CCD), em relação aos apresentados após a formulação do produto, antes do envase.

Estabilidade térmica do cicatrizante biofármaco

53. Os testes de estabilidade do cicatrizante biofármaco foram realizados do seguinte modo: dois frascos (entre os dez coletados de cada lote) do produto por sua vez são eleitos para análises, em suas embalagens comerciais. Nas análises eles foram colocados em estufas, nas temperaturas de 30°C por 12 horas, seguido de 12 horas na temperatura de 12°C.

54. Essas operações foram repetidas por mais três vezes e, então, abriu-se a tampa, para as análises quanto às propriedades mencionadas anteriormente. Os testes de avaliações foram realizados a cada seis meses após o envase, durante 36 meses:

55. a) aspectos gerais (tampas, rótulos, e frasco);

56. b) conteúdo: cor, odor, pH; atividade antimicrobiana; e

57. c) resultados cromatográficos (CCD), em relação aos apresentados após a formulação do produto, antes do envase.

58. d) os resultados das análises devem situar-se dentro dos limites de aceitação, considerando que todos os resultados comparativos com o padrão se encontram dentro dos níveis de aceitação plena. Estes dados analíticos servem para monitorar e para convalidar a validade de 36 meses do produto posto para comercialização. Com a finalidade de ratificar esse prazo, periodicamente foram feitos ensaios termogravimétricos, realizados com o objetivo de ratificar os resultados dos dados da estabilidade do produto, realizados por amostragem seletiva.

Avaliação da estabilidade térmica e química do cicatrizante biofármaco

59. O cicatrizante biofármaco foi avaliado quanto à estabilidade térmica e química dos seus constituintes, pelo período de 36 meses consecutivos, através de avaliações cromatográficas realizadas em 80 frascos de 120mL do produto com tampa plástica, produzidos em diferentes lotes de produção.

60. Nas análises físico-químicas os sólidos totais foram de 4-4,2%, pH em torno de 5,7, cor marrom-escuro, e apresentaram viscosidade - 200 a 400cp.

Manipulação do cicatrizante biofármacos

61. Antes de iniciar as tarefas na área de manipulação lavou-se as mãos com solução de limpeza e secou-se com papel toalha. Monitorou-se o prazo de validade da água destilada armazenada, das soluções de limpeza e sanitizante, ligou-se os equipamentos e, depois de um tempo previamente determinado, verificou-se as leituras de aferições, efetuando os registros de temperaturas, pressão, umidade e outros.

62. Redução do grau alcoólico

63. X = graduação desejada x volume desejado/graduação disponível;

64. x= quantidade de álcool de graduação disponível a ser completada com água destilada até o volume desejado para obtenção da graduação solicitada.

65. A lavagem das embalagens, bem como dos materiais do laboratório, foi realizada com solução detergente, com o auxílio de uma esponja limpa. O enxágüe, inicialmente com água potável, foi completado com água destilada e solução sanitizante.

66. A secagem dos materiais foi realizada por intermédio da estufa com circulação de ar, sob temperatura de 50 a 60°C, por tempo adequado para cada material.

67. Os processos de limpeza e sanitização da área, como um todo, devem ter seu cronograma definido de modo a não interferirem na manipulação.

68. O armazenamento das matérias primas e dos produtos finais passou pelos controles de qualidades físico-químicas e microbiológicos.

69. Para preparar os géis à base de extratos vegetais, procedeu-se da seguinte forma: dispersou-se o carbopol em parte de água destilada, deixando em repouso para ocorrer hidratação. Adicionou-se o agente de neutralização (trietanolamina) sob agitação com hélices, segundo proporções preestabelecidas de extratos vegetais e foram incorporados ao gel de carbopol, sob continua homogeneização. Controle da estabilidade dos géis.

Controle da viscosidade e do pH

70. A determinação da viscosidade e do pH foi realizada após a preparação dos géis e 30 dias de acondicionamento na temperatura ambiente de 30 mais ou menos 5°C.

71. O controle do aspecto macroscópico foi feito pela observação das possíveis alterações de coloração brilho ou turbidez dos géis, no mesmo período determinado para o controle de pH e de viscosidade.

72. O controle da influência da temperatura sobre os géis foi observado após submeter amostras de géis a 45°C, posteriormente a 0°C e depois à temperatura ambiente observando-se a variação de volume, perda de viscosidade e modificação de pH.

73. O controle microbiológico foi realizado com a finalidade de observar possível continuação com fungos ou outros agentes contaminantes de géis, não sendo necessária a inclusão de nipagin para esta segurança na formulação.

74. No preparo do gel foi realizada uma formulação contendo os extratos das quatro plantas dos extratos de Schinus terebinthifolius raddi, Physalis angulata linné, Cereus hildemanianus shucus e Anadenanthera colubrina benth. Em seguida dispersou-se o carbopol em água destilada, adicionando-se trietanolamina como agente de neutralização.

Teste microbiológico

75. Estes testes foram realizados utilizando cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 25285) e Echerichia coli. (ATCC 25922). O extrato das quatro plantas apresentou atividade inibitória considerável, mesmo quando testado em várias diluições.

76. Foram realizados testes de inibição microbiana para as bactérias gram positiva Staphylococcus aureus (ATCC 25985) e gram negativa Escherichia coli (ATCC 25922). Para o crescimento e manutenção das linhagens foram utilizados caldo simples, ágar simples (com 0,5 % de NaCl) e ágar Mueller Hinton (Acumedia Manufacturers, Inc. Baltimore, Maryland 212200), preparados conforme o fabricante. A partir das culturas estoque, as bactérias foram repicadas, sendo então incubadas a 37 °C por 12 horas. Para o método de difusão em meio sólido, a cultura de bactéria foi ajustada para aproximadamente 1,5 x 108 bactérias/mL, Escala McFarland n° 0,5. Para determinação da concentração inibitória mínima (CIM), a cultura de concentração conhecida foi diluída em série, utilizando solução salina estéril até obtenção da suspensão contendo 103 UFC/mL. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.

77. Concentração inibitória mínima (CIM) - O extrato etanólico bruto foi dissolvido em solução aquosa de DMSO a 10%, para uma concentração final de 200,0 mg/mL (solução estoque). Várias diluições contendo 2000,0, 1000,0, 500,0 e 200,0 μL/mL foram preparadas em tubos contendo caldo simples, para obter, respectivamente, 40,0, 20,0, 10,0 e 4,0 mg/mL. Tubos contendo solução estoque sem o inoculo e o meio inoculado sem extrato, foram incluídos no teste como controles. Todos os tubos foram inoculados com 25,0 μL da cultura de microrganismo e incubados a 37 °C por 14 horas, após as quais os valores de CIM foram determinados utilizando a escala de McFarland.

78. Após os testes microbiológicos e o preparo do gel em maior quantidade para os testes biológicos, foram induzidas feridas de pele em animais (Coelhos Nova Zelândia) experimentais com diabetes e testados durante um mês a cicatrização em pele de coelhos diabéticos. Foram testados nas concentrações de 1, 3, 5, 10, 15% das concentrações do fitoterápico biofármacos.

Modelo experimental para indução da diabetes e tratamento com gel cicatrizante biofármaco

79. Os coelhos selecionados após análises laboratoriais receberam a droga aloxano marca Sigma, por administração via intraperitoneal, para indução da diabetes, e após sete dias foram realizados exames laboratoriais para verificação da diabetes (dosagem de glicose e hemoglobina glicosilada). Constatado que os animais estavam diabéticos, fez-se o preparo dos animais selecionados para indução das lesões.

80. Para indução das lesões foram realizadas tricotomia nas coxas esquerda e direita em uma área medindo acima de 1 (centímetro quadrado). Com o auxílio de um cotonete foi feita administração tópica sobre a área preparada, de substância irritante (ácido clorídrico 10%), com aplicação diária por um período de sete dias, quando se constatou que as áreas tratadas apresentavam-se com lesões.

81. Os animais foram separados em sete grupos de cinco, obedecendo à disposição apresentada no Quadro 1:

82. Para avaliar se os animais estavam diabéticos foram avaliados glicose utilizando-se kits da marca Biomérieux e foi utilizado o analisador automático de Bioquímica Alizé. Os animais diabéticos apresentaram glicemia entre 290 a 400mg/dL.

83. A maioria dos sintomas da diabetes são relacionados à hiperglicemia ou acúmulo de glicose em vários tecidos comprovando este estado patológico dos coelhos tratados através da diferença estatisticamente significativa entre os animais diabéticos aloxano induzidos e os animais normais. Tabela 1: Valores médios dos parâmetros sanguíneos dos grupos de coelhos e porcentagem de variação dos animais diabéticos aloxano induzidos, diabéticos tratados e normais.

84. A Tabela 1 expressa que não houve diferença estatística significativa para as taxas de colesterol entre os diferentes tratamentos. O nível de hiperlipidemiaé observado a longo prazo no diabetes (acúmulo de 25% a mais de lipídios do que o normal). No estado diabético, o fígado oxida esses ácidos graxos e produz acetona, acetoacetato e β- hidroxibutirato.

85. As células musculares e o tecido adiposo também mostram importantes alterações metabólicas no diabetes. O glicogênio muscular quase desaparece e a proteína muscular é degradada para suportar a gliconeogênese. Os músculos cardíacos e esqueléticos satisfazem suas necessidades energéticas a partir de cetonas e ácidos graxos.

86. As células adiposas liberam ativamente ácidos graxos sob os estímulos lipolíticos do glucagon, catecolaminas e a deficiência de insulina.

87. Os tecidos não insulino dependentes respondem a diabetes de modo totalmente diferente. As hexoquinases, estímulo - chave do uso de glicose, estão aumentadas na mucosa jejunal, no córtex renal e nos nervos periféricos de animais diabéticos. Na hiperglicemia, o uso de glicose aumenta, e os açucares acumulam-se.

88. Em excesso, este acúmulo leva a lesão tecidual. A entrada desimpedida de glicose para dentro de muitos tecidos aumenta a glicose celular, produzindo sua ligação às proteínas dos tecidos (glicosilação). O estado diabético danifica os tecidos não insulino-dependentes, incluindo glomérulos, vasos retinianos, nervos e células circulantes do sangue.

89. Níveis baixos de insulina diminuem as atividades das enzimas glicolíticas e o uso de glicose é muito inferior aos níveis vistos durante o jejum. Concomitantemente, as atividades enzimáticas gliconeogênicas hepáticas aumentam as taxas gliconeogênicas. Com esse excesso de ácidos graxos livres, o fígado aumenta a gliconeogênese secretando grandes quantidades de VLDL’s e acumula ácidos graxos em forma de gotículas.

Preparo das amostras de pele Avaliação histopatológico da pele:

90. Os animais foram sacrificados e foram retiradas as amostras de pele para os estudos histopatológicos. Eles foram colocados em solução formalina na concentração de 10%, e devidamente preparados para os cortes e as confecções das lâminas histopatológicas.

Preparo das lâminas:

91. Os fragmentos de pele foram coletados e fixados em líquido de Bouin, em solução aquosa de formol a 10%, em fixador de Zencker por um período de 24 horas, sendo recortados após 12 horas de fixação. Procedeu-se então à desidratação em série crescente de álcool etílico a 70, 80, 95% e absoluto I e II, diafanização em xilol I e II e inclusão em parafina.

Fixadores e técnicas de coloração:

92. Utilizou-se Glutaraldeído e Formol tamponado em quantidade suficiente para cobrir o tecido de pele.

93. Formaldeído 40%.......................................100mL

94. Água destilada............................................900mL

95. NaH2PO4.H2O...........................................4,0g

96. Na2HPO4(anidro)......................................6,5g

97. Líquido de Bouin

98. Ácido pícrico......................................750mL

99. Ácido acético..........................................5mL

100. Formaldeído........................................250mL

101. Adicionou-se o ácido acético e formaldeído antes do uso.

102. Fixador de Zencker

103. Cloreto de mercúrio(II)...................................60mL

104. Bicromato de potássio....................................25mL

105. Água destilada.............................................1000mL

106. Cortes seriados de 5 micrômetros de espessura foram obtidos em micrótomo rotativo OLYMPUS CUT 4055, distendidos em banho-maria histológico OMA MJ72 e fixados em lâminas histológicas previamente tratadas com albumina. Tais cortes foram corados pela técnica de Hematoxilina-Eosina objetivando a caracterização histológica do órgão.

107. As lâminas foram analisadas com o auxílio de microscópio de luz binocular CARL-ZEISS AXIOLAB, em aumentos de 4 vezes para epiderme e de 40 vezes para a derme e foram realizadas três leituras para lâminas.

108. Para a avaliação da ação cicatrizante do biofármaco em gel e pomada, foram feitas avaliações macroscópicas das áreas lesionadas e análises microscópicas da espessura da epiderme e derme, que foram interpretadas com o auxílio de análise univariada e teste de média-teste de Duncan (p<0,05).

109. O Gráfico 1 mostra o controle visual da cicatrização. Tabela 2 - A: Evolução cicatricial de feridas epiteliais em coelhos diabéticos induzidos por aloxano tratados com gel fitoterápico a 5%, kollagenase ou veículo. Os resultados são apresentados como média (cm) por grupo.

Tabela 2 - B: Evolução cicatricial de feridas epiteliais em coelhos diabéticos induzidos por aloxano tratados com gel fitoterápico a 10%, kollagenase ou veículo. Os resultados são apresentados como média (cm) por grupo.

Tabela 3: Valores médios da área de redução das feridas em coelhos diabéticos para seus respectivos tratamentos.

As médias seguidas de pelo menos uma mesma letra na coluna não diferem entre si ao nível de 1% de probabilidade para o teste de Tuckey; DT: Dia de tratamento.

110. De acordo com os resultados obtidos na Tabela 3, a partir do sexto dia de tratamento, comparando as áreas lesionadas com os grupos controle, foram notadas uma redução das áreas lesionadas e diminuição das secreções, em todos os grupos, nas diversas concentrações do cicatrizante biofármaco em gel. Houve progressão da cicatrização, com evidências macroscópicas da regeneração parcial da área lesionada. Foram constatadas cicatrizações completas com regeneração dos tecidos e recuperação dos pêlos nas áreas lesionadas em um período de 14 dias após o início do tratamento. O tratamento na concentração de 5% foi o que apresentou o melhor resultado.

111. Os coelhos do grupo não lesionado apresentaram uma espessura média de epiderme de 0,2883μ x 1000 e o grupo lesionado sem tratamento uma espessura de 0,0714μ x 1000. Observou-se que houve uma recuperação da epiderme em todos os grupos de tratamento com o gel Cicatrizante Biofármaco nas diferentes concentrações e que houve diferenças significativas entre eles. Verificou-se que os tratamentos com gel Cicatrizante Biofármaco na concentração de 10% tieveram menor recuperação da área lesionada. As maiores recuperações da área lesionada foram observadas nos tratamentos com o cicatrizante biofármaco em gel nas concentrações de 5% apresentando uma espessura média de epiderme de 0,4449 μ x 1000, respectivamente. Avaliação da cicatrização em animais diabéticos aloxano - induzidos Tabela 4: Equações de regressão ajustadas da variável área da lesão em centímetros em função do tempo para os respectivos tratamentos e os coeficientes de determinação em coelhos diabéticos.

** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste de “t”

112. De acordo com a Tabela 4 onde foram determinadas as áreas da lesão do tratamento com o gel 5% e na base do gel observou-se que esses foram mais homogêneos (r 2 > 0, 92). Apesar do gel a 5% ter iniciado com uma ÂL menor em relação aos outros tratamentos, a regressão dia a dia foi maior que o controle e proporcionalmente maior que a base da pomada.

113. Através dos resultados da tabela 4 notou-se que a área de lesão dos animais tratados com o gel a 5% foi bem menores do que os tratados com a kolagenase mostrando ter o gel maior eficácia terapêutica em menos tempo.

Análise histopatológica do tecido cicatrizado de coelhos diabéticos aloxano- induzidos

114. A epiderme submetida ao tratamento com pomada e gel do cicatrizante biofármaco apresentou melhor organização das células da camada basal e a camada córnea, de células queratinizadas, apresentou maior homogeneidade ao longo da epiderme, quando comparada com a epiderme submetida ao tratamento com solução fisiológica 0,9%.

115. Quando comparado ao tratamento com pomada Kollagenase® , a camada córnea apresentou maior desenvolvimento e a epiderme, neste tratamento, apresentou células mais justapostas, semelhantemente ao observado com o tratamento do gel a 5%.

116. As fibras colágenas do tratamento com o gel a 5%, se comparadas com as do tratamento que utilizou a base do gel e principalmente, em relação ao tratamento controle, apresentou fibras mais espaçadas e menos espessas). O gel fitoterápico a 5% desencadeou um processo de neovascularização que propiciou cicatrização mais rápida, favorecida por melhor organização das fibras conjuntivas. Tabela 5 - Valores médios da derme e epiderme dos respectivos tratamentos em milímetros.

As médias seguidas de pelo menos uma mesma letra na coluna não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade para o teste de Tukey.

117. A Tabela 6 apresenta análise de variância das variáveis epiderme e derme. Porém, quanto à derme reticular, pode-se dizer que o processo cicatricial ocorreu das camadas mais profundas para as mais superficiais, observando-se maior organização e coesão dos elementos conjuntivos nessa camada, ficando o gel fitoterápico a 5% e a pomada Kollagenase® com organização parecida. A vascularização pôde ser observada nos tratamentos com base do gel e com o gel 5%. Tabela 6: Resumo da Análise de variância da epiderme e derme dos tratamentos com pomada fitoterápica a 20%, base da pomada, solução fisiológica a 0,9%, e pomada Kollagenase®.

* F significativo ao nível de 5% de probabilidade, FV: Fontes de variação; GL: Graus de liberdade; CV (%): Coeficiente de variação em porcentagem.

Análise estatística

118. Todos os delineamentos foram inteiramente casualizados, e para comparar o efeito de aloxano sobre os níveis sanguíneos de albumina, glicose, colesterol e triacilgliceróis nos coelhos, após o final do experimento cicatrização realizou-se a análise de regressão, onde a é o valor inicial estimado no tempo de O (zero) e b é a taxa de variação (inclinação da reta).

119. A análise estatística de regressão também permitiu comparar a variação entre os tratamentos sobre todas as características avaliadas. Assim como para a regressão das feridas dia a dia em função do tempo, tanto em animais normais como diabéticos.

120. Baseado nas formas das curvas das médias das variáveis determinadas ao longo do tempo, estimou-se o modelo linear simples (Y= a + b x tempo) de regressão para cada tratamento em função do tempo de 17 dias de experimento. A análise de regressão foi feita com os dados do delineamento experimental (regressão considerando as repetições).

121. A análise da regressão histológica foi realizada através de 10 medições da espessura da epiderme e 10 medições da espessura da derme de cada animal submetido a cada tratamento. As análises de correlação objetivaram constatar se algum dos tratamentos era altamente correlacionado com a regressão das feridas através de análise estatística das medias dos grupos por área da lesão.

122. Na Tabela 7 apresentou-se o resumo da análise de variância da regressão das áreas das feridas em coelhos diabéticos induzidos por Aloxano, estabelecendo o nível de significância para o teste de Tuckey (p> 0,01) em função do tratamento dia a dia, assim como os coeficientes de variação em porcentagem das médias dos grupos. Tabela 7: Resumo da análise de variância da área de feridas em coelhos diabéticos aloxano - induzidos por em função do tratamento em dias.

NS F não significativo, * F significativo ao nível de 5% de probabilidade; ** F significativo ao nível de 1% de probabilidade; CV(%): Coeficiente de variação em porcentagem.

123. A tabela 8 mostrou as áreas de regressão da ferida dia após dia. Tabela 8: Valores médios da área de regressão da ferida em coelhos diabéticos para seus respectivos tratamentos

As médias seguidas de pelo menos uma mesma letra na coluna não diferem entre si ao nível de 1% de probabilidade para o teste de Tuckey; DT: Dia de tratamento.

Análise histopatológica do tecido cicatrizado de coelhos diabéticos aloxano - induzidos

124. A epiderme submetida ao tratamento com gel a 5% apresentou melhor organização das células da camada basal e a camada córnea, de células queratinizadas, apresentou maior homogeneidade ao longo da epiderme quando comparada com a epiderme submetida ao tratamento com solução fisiológica 0,9%.

125. Quando comparado ao tratamento com pomada Kollagenase® a camada córnea apresentou maior desenvolvimento e a epiderme neste tratamento apresentou células mais justapostas, semelhantemente ao observado com o tratamento do gel a 5%

126. Este maior desenvolvimento foi significativo para o tratamento com o gel a 5% quando em comparação com a espessura da epiderme da Kollagenase® e do controle Tabela 4. Não houve diferença significativa na espessura da derme entre os tratamentos ficando a diferenciação apenas quanto ao nível organizacional. As fibras colágenas do tratamento com o gel a 5% se comparadas com as do tratamento que utilizou a base da pomada e principalmente, em relação ao tratamento controle, apresentou fibras mais espaçadas e menos espessas. O gel fitoerápico a 5% desencadeou um processo de neovascularização que propiciou cicatrização mais rápida, favorecida por melhor organização das fibras conjuntivas.

127. Na Tabela 9 encontram-se registrados os valores médios de derme e epiderme. Nesses resultados pode-se observar que o gel a 5% apresentou nível de derme que não foi estatisticamente significativo quando comparado aos outros grupos. Também observou-se que a epiderme foi maior no gel a 5% e esse valor foi estatisticamente significativo quando comparado aos outros grupos. Tabela 9: Valores médios da derme e epiderme dos respectivos tratamentos em milímetros.

As médias seguidas de pelo menos uma mesma letra na coluna não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade para o teste de Tukey.

128. A Tabela 9 apresenta análise de variância das variáveis epiderme e derme. Porém, quanto à derme reticular, pode-se dizer que o processo cicatricial ocorreu das camadas mais profundas, para as mais superficiais, observando-se maior organização e coesão dos elementos conjuntivos nessa camada, ficando o gel a 5% e a pomada Kollagenase® com níveis parecidos de organização. A vascularização pôde ser observada nos tratamentos com base do gel e com o gel a 5%. Tabela 10: Resumo da Análise de variância da epiderme e derme dos tratamentos com pomada fitoterápica a 20%, base da pomada, solução fisiológica a 0,9%, e pomada Kollagenase®.

* F significativo ao nível de 5% de probabilidade, FV: Fontes de variação; GL: Graus de liberdade; CV(%): Coeficiente de variação em porcentagem.

129. De acordo com os resultados obtidos observou-se que os tratamentos foram estatisticamente significativos tanto na derme quanto na epiderme dos coelhos Tabela 10.

130. Pode-se concluir que o fitoterápico em gel e pomada possui ação cicatrizante em feridas em diabéticos ou não conforme comprovado na pesquisa.

Claims (3)

1. Composição cicatrizante caracterizada por compreender o extrato hidroalcoólico das plantas Schinus terebinthifolius raddi, Physalis angulata linné, Cereus hildemanianus shucus, e Anadenanthera colubrina benth.

2. Composição cicatrizante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender o extrato hidroalcoólico das plantas Schinus terebinthifolius raddi, Physalis angulata linné, Cereus hildemanianus shucus, e Anadenanthera colubrina benth em gel a 5% e 10% em carbômero carbopol 940, viscosidade em 0,5% de água a pH 7,5 entre 40 a 60 pascais-segundo (Pa S).

3. Composição cicatrizante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender o extrato hidroalcoólico das plantas Schinus terebinthifolius raddi, Physalis angulata linné, Cereus hildemanianus shucus, e Anadenanthera colubrina benth em pomada a 5 e 10% em cera de polietileno 400g/mol com densidade entre 1,124 e 1,126 e ponto de fusão entre 65 e 108 °C.

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