BRPI0505957B1

BRPI0505957B1 - Método e equipamento para detecção de morte súbita dos citros

Info

Publication number: BRPI0505957B1
Application number: BRPI0505957-7A
Authority: BR
Inventors: Marcondes Bastos Pereira Milori Débora; André de Castro Jorge Lúcio; Torre Neto André; Carlos Corte Terencio Jean; Martin Neto Ladislau
Original assignee: Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária - Embrapa
Priority date: 2005-12-22
Filing date: 2005-12-22
Publication date: 2018-03-06
Also published as: BRPI0505957A

Abstract

método e equipamento para detecção de morte súbita dos citros a presente invenção refere-se a um equipamento e método para detecção precoce da morte súbita dos citros através da diferença de fluorescência observada em caules e folhas. para isto, a planta é submetida a uma luz de médio comprimento de onda onde é detectada a doença. a técnica possibilita a detecção da doença de forma mais rápida e precisa do que a metodologia atual, que se baseia em inspeção visual. através dela toma-se possível a seleção de mudas e o mapeamento de zonas de produção para controle da disseminação da doença.

Description

(54) Título: MÉTODO E EQUIPAMENTO PARA DETECÇÃO DE MORTE SÚBITA DOS CITROS (51) Int.CI.: C12Q 1/68 (73) Titular(es): EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA - EMBRAPA (72) Inventor(es): DÉBORA MARCONDES BASTOS PEREIRA MILORI; LÚCIO ANDRÉ DE CASTRO JORGE; ANDRÉ TORRE NETO; JEAN CARLOS CORTE TERENCIO; LADISLAU MARTIN NETO

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MÉTODO E EQUIPAMENTO PARA DETECÇÃO DE MORTE SÚBITA DOS CITROS

CAMPO PA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um equipamento e método para detecção da Morte 5 Súbita dos Citros no talhão utilizando como mecanismo de observação de imagens de fluorescência das árvores e espectroscopia de fluorescência do caule e das folhas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O Brasil é o maior exportador mundial de suco de laranja concentrado congelado, com 74,6% das vendas no comércio internacional, dos quais 95% são produzidos pelo

Estado de São Paulo. Além disso, ocupa o 1° lugar em produção mundial de suco de laranja, com 49,3% do total, seguido dos Estados Unidos da América com 37,6%. Entretanto, os EUA consomem praticamente toda a sua produção, pois tem uma participação de apenas 3,1% nas transações internacionais.

O Estado de São Paulo tem cerca de 34,2 milhões de plantas em formação e 163,5 milhões de plantas cítricas em produção, respondendo por mais de 80% da produção nacional de frutos cítricos. Atualmente é responsável por 97% das exportações brasileiras, sendo o grande núcleo dinâmico do complexo citrícula brasileiro. Este mercado destina cerca de US$ 1,5 bilhão de divisas para o país, Estado e municípios e emprega 400 mil pessoas.

Além da sua eficiência e capacidade de produção, a citricultura paulista apresenta algumas características peculiares:

1) Os pomares de Citrus de São Paulo ocupam uma área quase contínua de aproximadamente 615.300 há (FNP. Citrus. AGR1ANUAL 2003: anuário da agricultura brasileira. FNP consultoria & agroínformativos, São Paulo, p.295-314,

2003.), sem grandes variações de relevo ou barreiras físicas e com grande tráfego de pessoas entre eles,

2) As plantas cítricas são perenes e, portanto, estão expostas durante todo o ano e por vários anos ao ataque de pragas e doenças. Além disso, a emissão de brotações novas pode ser observada durante grande parte do ano, o que confere uma continuidade de tecidos suscetíveis e de inoculo entre as estações de cultivo, /

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3) Os pomares paulistas apresentam uma variabilidade genética muito baixa. Apenas quatro variedades de laranjeiras doces (Citrus sinensis Osbeck): ‘Pêra-Rio’, ‘Natal’, Valência’ e ‘Hamlin’, propagadas vegetativamente por enxertia, representam 92% da citricultura. O porta-enxerto utilizado em aproximadamente

85% das árvores é o limoeiro ‘Cravo’ (C. limonia Osbeck) devido a sua rusticidade, vigor conferido à copa e resistência às condições de deficiência hídrica do norte e noroeste do Estado.

Estas características conduzem a uma alta vulnerabilidade da cultura à ocorrência de epidemias de doenças conhecidas e de novas doenças, como é o caso da Morte Súbita dos

Citrus (MSC), com importantes conseqüências para a sustentabilidade do agronegócio.

Relatos datados de 1997 indicam a ocorrência da morte de muitas laranjeiras doces enxertadas sobre limoeiro ‘Cravo’, por motivos desconhecidos, no município do Prata, Minas Gerais. Na época, todas as plantas foram erradicadas e a propriedade foi totalmente replantada com mudas e outros porta-enxertos. Os sintomas apresentados por essas plantas contaminadas lembram muito os sintomas observados atualmente para a morte súbita dos citrus (MSC). Entretanto, o primeiro relato oficial da doença foi feito em fevereiro de 2001, quando os sintomas característicos da doença foram descritos por GimenesFernandes & Bassanezi (GIMENES-FERNANDES, N. & BASSANEZI, R.B. Doença de causa desconhecida afeta pomares cítricos no norte de São Paulo e sul do Triângulo

Mineiro. Summa Phytopathologica, v.27, n.l, p.93, 2001).

Até o momento, não é possível prever se a doença irá disseminar-se por todo o parque citrícula e em qual velocidade, e nenhuma evidência indica que se manterá restrita aos locais onde se encontra. Entretanto, por sua capacidade de provocar definhamento e morte de plantas sobre o limoeiro ‘Cravo’, que representa aproximadamente 85% das 200 milhões de árvores do Estado de São Paulo, e da sua velocidade de progresso e disseminação, a MSC representa um grande risco e, portanto, tem causado grande preocupação ao setor citrícula.

Como os sintomas são observados em plantas com pelo menos 22 meses de idade, acredita-se que o período de incubação da MSC seja, no mínimo em tomo de dois anos em plantas jovens, e talvez maior em plantas mais velhas. Inicialmente, toda a copa da planta apresenta uma perda de brilho generalizada e a coloração das folhas passa de verde-escura, característica de uma folha bem nutrida e sadia, para o amarelo-esverdeado. À medida que a doença avança, pode ocorrer a desfolha parcial da planta, que apresenta poucas brotaçoes

3/14 * · «·· * · · novas e ausências de brotações internas e em um estágio avançado da doença, ocorre a desfolha total e a morte da planta com retenção dos frutos.

Os sintomas observados nas copas poderiam ser confundidos com sintomas de doenças como a ‘gomose’ e o 'declínio’ e por isso não permitem o diagnóstico preciso da doença.

Como esses sintomas são, na verdade, resultantes de uma provável ausência de um sistema radicular abundante e funcional, o que irá identificar a doença é a presença de coloração amarelo-alaranjada nos tecidos internos da casca do porta-enxerto, logo abaixo da zona da enxertia, que difere da ‘gomose’ por ser ao redor de todo o tronco do porta-enxerto e não setorizado. Essa coloração é conseqüência da degeneração e obstrução do fio em a, que levará à morte das raízes da planta por falta de nutrientes vindos da copa. Por isso, plantas com MSC que apresentam copas assintomáticas já podem ter uma obstrução do floema.

O tempo entre o aparecimento dos sintomas e a morte da planta é variável, pois plantas que não sofrem pressão abiótica, como estresse hídrico e alta produção de frutos (BASSANEZI, R.B.; YAMAMOTO, P.T. & GIMEN ES-FERNANDES, N. Progresso dos sintomas de “morte súbita” em pomares de laranjeiras ‘Valência’ e 'Pêra-Rio' (Resumo). Summa Phytopathologica, v.28, n.l, p.73, 2002c), podem conseguir se manter por mais tempo e algumas vezes o floema chega a se regenerar, mas as plantas são pouco produtivas.

Plantas com idades avançadas são afetadas mais facilmente pela doença que sugere20 se que deva ser provocada por uma associação de um Tymovirus com Citrus Sudden Death (CSD), como relata Maccheroni et nl., 2005. Com a intenção de diminuir as perdas provocadas pela doença, a medida profilática mais utilizada está sendo a substituição do porta-enxerto original da planta por porta-enxertos tolerantes à Morte Súbita dos Citros.

Atualmente, segundo a Defesa Sanitária Vegetal, a MSC já atingiu 30 municípios dos Estados de Minas Gerais e São Paulo, perfazendo as cidades de Monte Alegre de Minas, Prata, Campo Florido, Planura, Uberlândia, Comendador Gomes , Frutal, São Francisco de Sales, Uberaba, Conceição das Alagoas, Ituiutaba e Fronteira no Estado de Minas Gerais; já no Estado de São Paulo temos relatos da doença nos municípios de Colômbia, Barretos, Olímpia, Guaraci, Altair, Nova Granada, Cajobi, Bálsamo, Onda

Verde, Paulo de Faria, Riolândia, Ibirá, Cosmorama, Ipiguá, Monte Azul Paulista , Tanabi, Embaúba e Bebedouro.

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A detecção precoce da Morte Súbita dos Citros é de extrema importância para o monitoramento desta doença, provocando um aumento no rendimento da lavoura de laranjas, limão, tangerina e etc. --------O sistema proposto na presente invenção para aprimorar a detecção da Morte Súbita 5 dos Citros é um sistema básico de fluorescência, que é utilizado usualmente na análise de materiais fluorescentes, como por exemplo em medicina, para análise de tecidos orgânicos, inclusive como técnica de detecção de câncer, a biópsia óptica (R. A Zângaro, L. Silveira Jr., R. Manoharan, G. Zonios, I. Itzkan, R. Dasari, J. Van Dam, M; Feld, Rapid multiexcitation fluorescence spectroscopy system for in vivo tissue diagnosis, Applied Optics,

Vol. 35 (25), 1996). A inovação da proposta está na determinação de um índice extraído da espectroscopia de fluorescência e das imagens de fluorescência que seja capaz de fazer a detecção da Morte Súbita dos Citros. Sistema similar já foi utilizado também no pedido de patente PI0201249-9, porém neste documento o método não alia a imagem de fluorescência e a espectroscopia de fluorescência com excitação específica para detecção da Morte Súbita dos Citros.

Recentemente, também foram publicadas três métodos utilizando imagens de fluorescência para se detectar, diagnosticar e quantificar o stress das plantas indicando deficiência de nutrientes ou presença de doença:

O documento US 2005/0072935 relata um método não-destrutivo para testar as 20 qualidades (firmeza, textura, aroma e cor) das frutas e vegetais usando a fluorescência como técnica de suporte. No caso deste documento eles utilizam uma excitação em banda larga de 400 a 650 nm (lâmpada de mercúrio com filtro) e medem a fluorescência da clorofila na região do vermelho (690 nm) e infravermelho próximo (740 nm) espacialmente e temporalmente. As imagens são tratadas por meios computacionais. A curva característica da intensidade de fluorescência no tempo que mede a transferência da energia da fluorescência e a diminuição da fluorescência são utilizadas no diagnóstico precoce do stress da planta. Na presente invenção, intitulada “Método e Equipamento para detecção da Morte Súbita dos Citros”, a excitação é feita com led ou laser no azul (-460 nm), sendo portanto uma banda de excitação bem mais estreita que permite visualizar a fluorescência de outros componentes fotossintéticos que emitem no amarelo ( -590 nm) cuja concentração aumenta em situações de stress. No caso da presente invenção, intitulada “Método e Equipamento para detecção da Morte Súbita dos Citros”, além de se trabalhar com as imagens de fluorescência tratadas através métodos de inteligência artificial para * ·

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• · ··· • » · • « * ·· · • ··· ·· ··· ··· * · ·· · • · • · · • · identificação de stress, que já é um diferencial em relação ao pedido de patente US 2005/0072935, o diagnóstico final baseia-se num método espectroscópico específico para a detecção da morte súbita dos citros.

A patente US 5,981,958 objetiva detectar a eficiência da taxa fotossintética nas folhas quando as mesmas estão submetidas a agentes bióticos e abióticos que possam interferir neste rendimento. O método consiste em coletar imagens de fluorescência da folha excitando-a com uma lâmpada dotada de filtro em tempos de 7 s (F_?w) , 150 s (F_t) e no escuro (F<fo,*). Destas imagens eles subtraem pixel a pixel e obtém a eficiência fotossintética (F) dos componentes da folha:

Esta eficiência fotossintética foi correlacionada com alguns tipos de danos em plantas. A presente invenção propõe a obtenção de uma única imagem de fluorescência tratada com métodos computacionais que será um indicativo de stress na planta. E posteriormente, os grupos em situação de stress serão analisados por técnicas espectroscópicas, tratamento que não é . feito na patente 5,981, 958. Através da espectroscopia de fluorescência conseguimos diferenciação entre doenças por traços específicos do espetro de emissão.

O trabalho de Bravo et al. (C. Bravo, D. Moshou, R. Oberti, J. West, A. McCartney, L. Bodria, and H. Ramon. “Foliar Disease Detection in the Field Using Optícal Sensor Eusion”. Agricultural Engíneering International: the CIGR Journal of Scientífic Research and Development. Manuscript FP 04 008. Vol. VI. December, 2004) objetivou detectar o stress na variedade de trigo causado por condições de campo. Através de imagens de fluorescência entre 450 e 900 nm desenvolveu-se um dispositivo óptico para identificar uma doença denominada de ferrugem amarela causada por Puccima striiformis. Em seu dispositivo os autores capturam as imagens de fluorescência de plantas de trigo com a lâmpada de xenônio desligada e depois fazem a mesma imagem com a lâmpada ligada e subtraem as imagens pixel a pixel. O trabalho difere da presente invenção no método que consiste em tomar somente a imagem de fluorescência da folha de citros e tratá-la com ferramentas computacionais. O trabalho define um índice baseado nas imagens para avaliar a saúde das plantas, mas não diferencia doenças.

^550

550nm 690nm • · · · · * · · · · · » · · · ··· ··· · • ···· ···· · · ·· · · ·· · · · · · · « · < ··*····· ···· • ·· · · · ··· · ·

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No trabalho de BRAVO et al (C. Bravo, D. Moshou, R. Oberti, J. West, A.

McCartney, L. Bodria, and H. Ramon. “Foliar Disease Detection in the Field Using Optical Sensor Fusion”. Agricultural Engineering. International; the CIGR Journal of Scientific Research and Development. Manuscript FP 04 008. Vol. VI. December, 2004) não há p \ aplicação de técnicas espectroscópicas para a detecção de doenças.

A presente invenção pretende propor um sistema e um método para detecção da Morte Súbita dos Citros que é fruto de um estudo criterioso a respeito das propriedades espectroscópicas de materiais originados de árvores de citros saudáveis e doentes com a morte súbita. O método de análise das imagens de fluorescência é totalmente diferente, sendo que nenhum outro documento relata a utilização de um sistema baseado em inteligência artificial como o aqui proposto. Quanto a espectroscopia de fluorescência, a excitação específica em 576 nm permite o diagnóstico nas folhas e porta-enxertos, tendo a vantagem de conseguir a diferenciação entre MSC e Declínio. Desta forma, a presente invenção objetiva a identificação rápida, econômica e muito menos invasiva do que o método atual de identificação, diminuindo as perdas dos atuais dois milhões de plantas (Gimenes-Fernades & Bassanezi, 2001) nos Estados de São Paulo e Minas Gerais. Vale ressaltar que árvores com porta-enxerto Limão Cravo representam 85% do parque citrícula nacional (Gimenes-Fernades & Bassanezi, 2001).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 - Substâncias químicas presentes em árvores que são passíveis de fluorescência. 1 - clorofila A; 2 - clorofila B; 3 - β-caroteno; 4 - β-criptoxantina.

Figura 2 - Montagem experimental para obtenção das imagens de fluorescência. 1 laser de argônio; 2- prisma; 3,4 e 5 - espelhos planos; 6 - câmera; 7 - aquisição de dados.

Figura 3 - Imagens de duas folhas de citros; (l) imagem real da folha saudável, (2) imagem da fluorescência da folha saudável, (3) imagem real da folha com morte súbita, (4) imagem da fluorescência da folha com morte súbita.

Figura 4 -- Topologia da rede MLP utilizada, com 3 classes de saída; classe 1; Morte Súbita, classe 2; Declíneo e classe 3: nenhuma delas,

Figura 5 - Montagem experimental para obtenção de imagens em campo. 1 - laser ou led; 2- cabo óptico; 3 - árvores; 4 - filtro óptico; 5 - câmera; 6 - computador portátil para aquisição de dados.

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Figura 6 - Esquema do equipamento embarcado que será levado ao campo para obtenção de imagens de fluorescência com o intuito de fazer a verificação rápida da saúde dos pomares. 1 - pomar; 2 - sistema de detecção embarcado; 3 - mapa de infestação.

Figura 7 - Esquema do equipamento que será levado ao campo para realização de medidas espectroscópicas. 1 - laser ou led; 2- cabo óptico de excitação; 3 - filtro óptico ajustável; 4 - acoplador de fibra óptica; 5 - cabo óptico misto; 6 - sonda; 7 - folha a ser analisada; 8 - cabo óptico de emissão; 9 - miniespectrômetro; 10 - computador portátil para aquisição de dados; 11 - corte transversal do cabo óptico misto; 12 - fibras óptica de excitação; 13 - fibra óptica para coletar emissão.

Figura 8 - Diferença típica entre o espectro de excitação de caule com declínio (1), saudável (2) e um doente com Morte Súbita (3) com emissão em 629 nm.

Figura 9 - Diferença típica entre o espectro de emissão de caule saudável (2) e um doente com Morte Súbita (1) quando excitados em 576 nm.

Figura 10 - Avaliação de árvores saudáveis e doentes utilizando o índice espectroscópico definido através das diferenças espectrais mostradas na Figura 6. 1 plantas doentes, 2- plantas saudáveis.

Figura 11 - Diferença típica entre o espectro de emissão de uma folha saudável, uma doente com morte súbita e uma com declínio quando excitadas em 576 nm. 1 - Planta com morte súbita; 2 - plantas saudável; 3 - planta com declínio.

Figura 12 - Avaliação de árvores saudáveis e doentes utilizando o índice espectroscópico definido através das diferenças espectrais mostradas na Figura 8. 1 Planta com morte súbita; 2 - planta saudável; 3 - planta com declínio.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção vem mostrar que a doença que atinge grande parte do Parque Citrícola Brasileiro - Morte Súbita dos Citros - pode ter sua detecção de forma rápida e precoce através da tecnologia de imagem de fluorescência aliada à técnica de espectroscopia, evitando que grande parte da nossa agricultura citrícola e economia seja rigorosamente abalada.

Uma primeira concretização da presente invenção é um Método para detecção da Morte Súbita dos Citros caracterizado por compreender os seguintes estágios:

a) Fazer uma varredura georeferenciada das plantas do pomar utilizando-se um equipamento para coletar imagens de fluorescência dos órgãos vegetais;

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b) Tratar as imagens de fluorescência coletadas em um software de análise de imagens;

c) Analisar as imagens geradas pelo software;

d) Diferenciar as plantas sadias das plantas doentes;

e) Analisar as plantas doentes através da técnica de espectroscopía de fluorescência; e

f) Detectar plantas com Morte Súbita dos Citros através de índices específicos para os órgãos vegetais.

Uma segunda concretização da presente invenção é um método para detecção da Morte Súbita dos Citros caracterizado por compreender os seguintes estágios:

c) Analisar as imagens geradas pelo software;

d) Diferenciar as plantas sadias das plantas doentes;

e) Analisar as plantas doentes através da técnica de espectroscopia de fluorescência;

f) Aplicar índices específicos para os órgãos vegetais, sendo o índice para portaenxertos definido pela fórmula (I) e o índice para folhas definido pela fórmula.(II):

_τ Intensidade do pico em 629 nm ¹ Intensidade do pico em 823 nm Intensidade do pico em 735 nm

Intensidade do pico em 688 nm ' ⁽ⁿ⁾

g) Detectar a Morte Súbita dos Citros através de um índice II acima de 6.4 e 12 abaixo de 1.3.

Uma terceira concretização da presente invenção é um método de acordo com a Reivindicação 1 ou 9 caracterizado pelo fato da varredura das plantas do pomar ser realizada através de um sistema móvel.

Uma quarta concretização da presente invenção é um equipamento para detectar a Morte Súbita dos Citrus caracterizado por possuir um um aparelho coletor de imagens de fluorescência , um cabo óptico de excitação, um filtro óptico ajustável, um acoplador de fibra óptica, um cabo óptico misto, uma sonda, um cabo óptico de emissão, um miniespectômetro e um processador de dados.

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Uma quinta concretização da presente invenção é um equipamento de acordo com qualquer uma das Reivindicações 36 a 48 caracterizado pelo fato do equipamento ser responsável pela realização de medidas espectroscópicas e de obtenção de imagens, de fluorescência em campo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Atualmente, o método de detecção da Morte Súbita dos Citros (MSC) é realizado através de inspeção visual, observando como primeiros sintomas a perda de brilho das folhas, e no estádio avançado ocorre o amarelecimento da parte interna do porta enxerto e morte da planta. Este método de analisar doenças em citros, além de impreciso, é extremamente invasivo, pois pode expor as árvores saudáveis a ação de agentes patogênicos como a Xylella fastidiosa e Phythophtora ciitrophtora. Desta maneira, esta invenção propõe um método que visa substituir a inspeção realizada pelos técnicos, diminuindo o tempo e custo para detecção da doença no pomar anteriormente a sintomatologia visual descrita.

Com o objetivo de solucionar os problemas relacionados a esta doença e na prerrogativa de superá-los, é que o presente sistema de detecção precoce da Morte Súbita dos Citros foi desenvolvido por meio da fluorescência, objeto da presente invenção, que consiste em detectar a doença o mais rápido possível para diminuir as perdas, tanto para o citricultor quanto para a cadeia que o circunda. Além da utilização de métodos fitossanitários recomendados e controlados, como o uso de mudas sadias, torna-se impreterível a detecção do problema precocemente.

É neste momento que a fluorescência se toma um dispositivo simples e eficiente que pode fazer a diferença. A fluorescência é uma técnica que permite detectar alterações químicas que ocorrem tanto no caule quanto nas folhas de plantas afetadas pela Morte Súbita dos Citros antes de suas manifestações visuais perceptíveis.

Mesmo quando ainda não ocorreram alterações visuais, a técnica de análise por fluorescência permite a confirmação da doença no campo, usando um mecanismo simples e rápido de detecção. Quando detectado precocemente, torna-se necessário o uso da subenxertia para evitar maiores perdas.

As imagens de fluorescência permitem uma varredura rápida pelo pomar detectando plantas sob stress hídrico e nutricional, ou que estejam afetadas por agentes patogênicos, que possivelmente possam estar doentes. Em áreas afetadas por falta de homeostase seria •·· ··* • · · · ··· · ·· · · ·· · · ·· · • · · · ·· · · ······ · · · · • * · * · « ·

10/14 utilizado a espectroscopia de fluorescência para verificação do stress provocado, possivelmente, pelo agente causador da MSC. Os parâmetros aplicados na espectroscopia de fluorescência foram originados através de um minucioso estudo dos materiais que λ

compõem a folha e o caule de citros. Neste estudo observou-se que a excitação no amarelo, mais especificamente em 576 nm, é capaz de diferenciar porta-enxerto doente e saudável, devido a existência de variações espectrais significativas, como será explicado no decorrer deste texto. Experimento realizado com 100 amostras de porta-enxertos de citros obteve-se um índice de precisão de 86% e 69 amostras de folhas cítricas com índice de precisão de 83%.

Esta técnica mostra que é possível a detecção precoce da Morte Súbita dos Citros em diferentes situações tais como no próprio local onde se encontra o pomar através da amostragem de plantas doentes, tanto nas folhas quanto nos porta-enxertos de mudas intolerantes a doença em estudo.

Quando ocorre a infestação de um pomar por um “antígeno”, a composição química ou a quantidade de muitos de seus constituintes é alterada em função da doença. Alguns destes compostos orgânicos que podem ser alterados são fluorescentes, como por exemplo a clorofila, o β-caroteno e a β-criptoxantina (Figura 1). Existem outros constituintes fluorescentes que podem ser alterados como alguns pigmentos acessórios, tais como carotenos e xantofilas.

A presente invenção baseia-se em um equipamento e método capazes de avaliar as alterações químicas sofridas em uma árvore de citros, quando infectada pelo agente patogênico que causa a Morte Súbita, utilizando técnica de imagens de fluorescência e espectroscopia de fluorescência. Com este método, pretende-se realizar a detecção precoce da MSC que seja mais preciso e menos invasivo do que o atual.

A princípio, para se desenvolver o método proposto nesta invenção, realizou-se uma caracterização espectroscópica das folhas e caules para que fossem observadas as diferenças espectrais entre um material saudável e doente utilizando-se um espectrômetro de fluorescência convencional. Entretanto, as análises podem ser feitas em todos os órgãos vegetais: folhas, caules, raízes e flores.

Paralelamente, foi montado um sistema para se obter imagens de fluorescência conforme ilustra a Figura 2. Um laser, led ou uma fonte de luz no azul (420-480 nm) excita a amostra (6), no caso a folha da laranjeira, que vai emitir fluorescência devido aos seus pigmentos. No caso dos experimentos em laboratório a excitação foi feita com um laser de

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As imagens coletadas através deste sistema são tratadas no software de análise de imagens, PROCITROS, desenvolvido pela Embrapa Instrumentação Agropecuária. As etapas deste processamento sao:

1. Realce das imagens com uma transformada espacial para encontrar o melhor contraste e correção gama. Como resultado observa-se que uma folha saudável fluoresce no vermelho em comprimentos de onda típicos da emissão da clorofila, 660 e 800nm. Entretanto, a folha doente, com Morte Súbita ou Declínio, fluoresce no amarelo, 550 a

590 nm, conforme é mostrado na Figura 3 (verificar Figuras em anexo).

2. Extração dos histogramas RGB (R=red, vermelho; G=green, verde; B=blue, azul), que são as distribuições em freqüência de cada componente RGB de cada pixel da imagem.

3. Treinamento de uma rede neural do tipo Multi Layer Perceptron (MLP) com o algoritmo backpropctgation, com topologia apresentada na Figura 4. Redes neurais artificiais são técnicas de inteligência artificial muito úteis para a geração de protótipos em campo devido sua rapidez de processamento e análise. Na Figura 4 tem-se a topologia da rede utilizada, em três camadas. A primeira camada é a camada de entrada onde se apresenta as distribuições RGB para treinamento da rede e processamento. A Segunda camada, ou intermediária, possui 31og3 neurônios e é responsável pela memória da rede. A terceira camada, ou camada de saída, apresenta 3 classes de saída: a classe 1 Morte Súbita, classe 2 Declínio e classe três nenhuma delas ou outras.

4. O processamento automático de classificação a partir da rede neural de folhas doentes com Morte súbita e Declínio, e Sadias.

Através da técnica de imagens de fluorescência conseguimos diferenciar uma folha saudável de uma folha doente. Portanto, a técnica de imagens de fluorescência pode ser utilizada como uma análise preliminar do problema numa varredura rápida que poderá ser feita num carrinho pelo pomar para identificar árvores com problemas. Detectado o talhão sintomático, a constatação da doença deverá ser feita com outro método baseado em

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técnicas espectroscópicas. Serão consideradas plantas doentes aquelas que mostrarem uma emissão significativa no amarelo e nestas serão realizadas medidas utilizando espectroscopia de fluorescência.

A presente invenção também tem como uma de suas concretizações um equipamento para realização das medidas em campo, tanto para a obtenção de imagens quanto para realização de medidas espectroscópicas. O sistema para obtenção das imagens está esquematizado na Figura 5. Este sistema pode ser embarcado em um carrinho com sistema de localização Global (GPS), conforme mostrado na Figura 6, que fornece as coordenadas geográficas via satélite para obtenção de medidas georeferenciadas, o qual permite levantamento de mapas de infestação. Uma vez detectadas as regiões com sinais de problemas, as mesmas podem ser avaliadas através de um sistema portátil para realização da espectroscopia de fluorescência montado segundo o esquema da Figura 7.

Esse equipamento (Figuras 5, 6 e 7) é caracterizado por apresentar um aparelho coletor de imagens de fluorescência , um cabo óptico de excitação, um filtro óptico ajustável, um acoplador de fibra óptica, um cabo óptico misto, uma sonda, um cabo óptico de emissão, um miniespectômetro e um processador de dados.

EXEMPLO

Foi realizado um minucioso estudo utilizando espectroscopia de fluorescência em caules e folhas saudáveis e doentes. Para este estudo forma utilizadas folhas e porta20 enxertos saudáveis e doentes extraídos de árvores de mesma idade, sendo analisadas aleatoriamente, Foram utilizados pedaços de porta-enxerto de árvores de laranjeira PêraRio e Valencia e folhas de laranjeira Pêra-Rio enxertadas sobre limão ‘cravo’ [ Citrus timonia (L.) Osbeckj plantadas há 14 e 19 anos. No caso dos porta-enxertos, as plantas de laranjeiras doces apresentavam medidas semelhantes quanto a variedade da copa/cavalo, tamanho da copa, diâmetro do caule e idade. Foram analisadas 100 amostras de portaenxertos entre saudáveis, doentes com Morte Súbita dos Citros e com Declínio dos Citros certificadas pelos técnicos da Fundecitrus. Foram retiradas lâminas do material interno dos porta-enxertos para as análises de espectroscopia de fluorescência convencional em um equipamento Shimadzu, modelo RF-5301PC. Inicialmente o material foi caracterizado através de seus espectros de emissão e excitação de fluorescência. Todas as medidas foram realizadas com fendas de excitação e emissão de 5 nm, velocidade de varredura média e sem a utilização de filtros.

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Através deste estudo observou-se que para a excitação em 572-578 nm ocorriam as maiores diferenças espectrais, como mostra Figura 8. Utilizando esta excitação o espectro de emissão do caule de uma planta saudável e uma planta doente apresentam, diferenças significativas de intensidade, como mostra a Figura 9.

Para o porta-enxerto, a razão entre a intensidade dos picos em 629 e 823 nm no espectro de emissão com excitação em 576 nm foi definida como um índice para detecção da doença fi. Nos porta-enxertos com Morte Súbita dos Citros foram encontrados valores de Ii acima de 6.4; já para os porta-enxertos saudáveis e com Declínio dos Citros valores inferiores a 6.4. Desta forma, através deste método é possível se detectar a Morte Súbita dos Citros.

Intensidade do pico em 629 nm ¹ Intensidade do pico em 823 nm

Para um conjunto de 100 amostras de porta-enxerto a percentagem de acerto do índice definido foi em torno de 86%, como mostra a Figura 10.

No caso das folhas, elas foram retiradas das árvores de forma a tangenciar os quatro lados de uma planta. Em cada lado foram retiradas amostras aleatoriamente, e desta forma, extraímos a última folha da laranjeira de cada lado, com alturas similares, e de plantas com porte semelhantes. As folhas retiradas das laranjeiras doentes e sadias foram analisadas em um espectro fluorímetro da marca Shimadzu (RF-5301PC) in natura no modo de emissão de fluorescência com excitação em 576 nm, utilizando a informação já obtida para os caules. Os espectros de emissão foram obtidos com os seguintes parâmetros: fenda de excitação - 5 nm, fenda de emissão = 5 nm, velocidade de varredura - média, intervalo de aquisição = 590 a 900 nm. Estas medidas foram feitas retirando a parte central e superior do limbo e colocada sobre um suporte para análise neste experimento.

Um conjunto de 69 amostras com as folhas saudáveis e doentes com Morte Súbita e

Declínio foi utilizado para este estudo. A razão da utilização das folhas com Declínio para o estudo é ver se a técnica consegue diferenciar as duas doenças, já que no campo, na fase inicial, ambas são muito parecidas. Na Figura 11 temos um exemplo típico de espectro de emissão observado para excitação em 576 nm para folhas saudáveis e doentes.

As diferenças espectrais também possibilitaram a definição de um índice I₂ para diferenciação entre o estado saudável e caracterização das duas doenças.

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Intensidade do pico em 735 nm Intensidade do pico em 688 nm

Nas folhas com Morte Súbita dos Citros, o índice I₂ apresenta valores abaixo de 1.3; já nas folhas sadias temos valores entre 1.3 e 1.8 e nas folhas com Declínio dos Citros temos valores superiores a 1,8. Isto indica que podemos diferenciar, com precisão, folhas sadias de folhas com Morte Súbita dos Citros e Declínio. A percentagem de acerto para este novo índice foi de 83%, como mostra a Figura 12.

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Claims

REIVIDICAÇÕES

1) Método para detecção precoce da Morte Súbita dos Citros caracterizado por compreender os seguintes estágios:

a) Fazer uma varredura georreferenciada das plantas do pomar utilizando-se um equipamento para coletar imagens de fluorescência dos órgãos vegetais;

b) Tratar as imagens de fluorescência coletadas em um software de análise de imagens;

c) Analisar as imagens geradas pelo software;

d) Diferenciar as plantas sadias das plantas doentes;

e) Analisar as plantas doentes através da técnica de espectroscopia de fluorescência;

f) Detectar plantas com Morte Súbita dos Citros através de índices específicos para os órgãos vegetais;

g) Aplicar índices específicos para os órgãos vegetais, sendo o índice para porta-enxertos definido pela fórmula (I) e o índice para folhas definidos pala fórmula (II):

Intensidade do pico em 629 nm Intensidade do pico em 823 nm ^(I)

Intensidade do pico em 735 nm Intensidade do pico em 688 nm (II)
2) Método para detecção precoce da Morte Súbita dos Citros de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato da Morte Súbita dos Citros ser detectada através de um I1, maior que 6.4.
3) Método para detecção precoce da Morte Súbita dos Citros de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato das plantas saudáveis e com Declínio serem detectadas através de um I1 menor do que 6.4.
4) Método para detecção precoce da Morte Súbita dos Citros de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato da Morte Súbita dos Citros ser detectada através de um I2, abaixo de 1.3.
5) Método para detecção precoce da Morte Súbita dos Citros de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato do Declínio ser detectado através de um I2, acima de 1.8.

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6) Método para detecção precoce da Morte Súbita dos Citros de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato das plantas sadias serem detectadas através de um I2 entre 1.3 e 1.8.
7) Método de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato das imagens de

5 fluorescências serem alterações na composição química dos constituintes das plantas.
8) Método de acordo com a Reivindicação 7 caracterizado pelo fato dos constituintes serem fluorescentes.
9) Método de acordo com a Reivindicação 7 caracterizado pelo fato dos constituintes fluorescentes serem pigmentos fotossintéticos da planta.

10
10) Método de acordo com a Reivindicação 7 caracterizado pelo fato dos constituintes fluorescentes serem, principalmente, as clorofilas a e b, alguns pigmentos acessórios tais como carotenos e xantofilas.
11) Método de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato das imagens de fluorescências serem obtidas através de excitação com fonte de luz.

15
12) Método de acordo com a Reivindicação 11 caracterizado pelo fato da fonte de luz ser laser, led ou lâmpada.
13) Método de acordo com a Reivindicação 11 caracterizado pela da fonte de luz estar na faixa de comprimento de onda entre 420 e 480 nm.
14) Método de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato da coleta das imagens

20 terem sido realizadas através de um Charged Coupled Device - CCD com resposta espectral do visível.
15) Método de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato do software de análise de imagens utilizar redes neurais na classificação automática da Morte Súbita dos Citros e Declínio com histogramas RGB - inteligência artificial.

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16) Método de acordo com a Reivindicação 15 caracterizado pelo fato do software utilizar préprocessamento e tratamento matemático baseado em redes neurais.
17) Método de acordo com a Reivindicação 16 caracterizado pelo fato da rede neural ser do tipo Multi Layer Perceptron (MPL).
18) Método de acordo com a Reivindicação 17 caracterizado pelo fato da rede neural Multi

30 Layer Perceptron (MPL) utilizar o algoritmo backpropagation.
19) Método de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato dos órgãos das plantas serem folhas, caules, flores e raízes.

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20) Método de acordo com a Reivindicação 19 caracterizado pelo fato das folhas das plantas sadias fluorescerem no vermelho.
21) Método de acordo com a Reivindicação 20 caracterizado pelo fato das folhas fluorescerem em comprimentos de ondas típicos da emissão da clorofila.

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22) Método de acordo com a Reivindicação 21 caracterizado pelo fato das folhas fluorescerem em comprimentos de ondas entre 660 e 800nm.
23) Método de acordo com a Reivindicação 19 caracterizado pelo fato das folhas das plantas doentes fluorescerem no amarelo.
24) Método de acordo com a Reivindicação 23 caracterizado pelo fato das folhas das plantas

10 doentes fluorescerem em comprimentos de ondas entre 550 e 590nm.
25) Método de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato da varredura das plantas do pomar ser realizada através de um sistema móvel.
26) Método de acordo com a Reivindicação 25 caracterizado pelo fato do sistema móvel conter um Sistema de Localização Global - GPS.

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27) Método de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato da técnica de espectroscopia fazer análises em órgãos vegetais.
28) Método de acordo com a Reivindicação 27 caracterizado pelo fato dos órgãos vegetais serem flores, folhas, caules e raízes.
29) Método de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado pelo fato da técnica de

20 espectroscopia utilizar excitação em comprimento de onda nas faixas 572-578 nm.
30) Método de acordo com a Reivindicação 29 caracterizado pelo fato do comprimento de onda utilizado para diferenciar plantas com Morte súbita dos Citrus ser preferencialmente 576 nm.
31) Método de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado por diferenciar plantas com Morte

25 Súbita dos Citrus, com Declínio e Saudáveis.
32) Método de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado por tornar possível a detecção da doença em estágio inicial de comprometimento das plantas.
33) Equipamento de acordo com a Reivindicação 1 caracterizado por compreender um aparelho coletor de imagens de fluorescência, um cabo óptico de excitação, um filtro óptico ajustável,

30 um acoplador de fibra óptica, misto, um cabo óptico misto, uma sonda, um cabo óptico de emissão, um miniespectômetro e um processador de dados.

Petição 870180001859, de 09/01/2018, pág. 9/11

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34) Equipamento de acordo com a Reivindicação 33 caracterizado por detectar a Morte Súbita dos Citrus.
35) Equipamento de acordo com as Reivindicações 33 ou 34 caracterizado pelo fato do equipamento possuir as funções de coleta de imagens de fluorescência e espectroscopia de

5 emissão de fluorescência.
36) Equipamento de acordo com as Reivindicações 34 ou 35 caracterizado pelo fato do equipamento ser responsável pela obtenção de imagens do campo.
37) Equipamento de acordo com as Reivindicações 34 ou 35 caracterizado pelo fato do aparelho coletor de imagens compreender um cabo óptico de excitação, um filtro óptico, uma câmara

10 digital e um processador de dados.
38) Equipamento de acordo com qualquer uma das Reivindicações 33 a 37 caracterizado pelo fato do processador de dados conter um software para identificação de plantas sob stress.
39) Equipamento de acordo com a Reivindicação 38 caracterizado pelo fato do software utilizar

15 inteligência artificial.
40) Equipamento de acordo com a Reivindicação 39 caracterizado pelo fato do equipamento ser responsável pela realização de medidas espectroscópicas de emissão fluorescência.
41) Equipamento de acordo com qualquer uma das Reivindicações 33 a 37 caracterizado

20 pelo fato do cabo óptico misto compreender fibras ópticas de excitação e fibras ópticas para coletar emissão.
42) Equipamento de acordo com a Reivindicação 33 caracterizado pelo fato do cabo óptico misto compreender 6 fibras ópticas de excitação e 1 fibra óptica para coletar emissão.
43) Equipamento de acordo com qualquer uma das Reivindicações 33 a 37 caracterizado

25 pelo fato da luz de excitação ser filtrada através de um filtro óptico ajustável.
44) Equipamento de acordo com qualquer uma das Reivindicações 33 a 37 caracterizado pelo fato do miniespectômetro realizar difração de luz e detecção através de arranjo de diodos calibrados.
45) Equipamento de acordo com qualquer uma das Reivindicações 33 a 37 caracterizado

30 pelo fato do processador de dados ser um computador.

Petição 870180001859, de 09/01/2018, pág. 10/11

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46) Equipamento de acordo com qualquer uma das Reivindicações 33 a 37 caracterizado pelo fato do equipamento ser responsável pela realização de medidas espectroscópicas e de obtenção de imagens de fluorescência em campo.

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FIGURAS

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