BRPI0402615B1 - Method for insulation of langerhans ilhotes from pancreatic tissue, and use of a purified neutral protease (np) - Google Patents

Abstract

"protease neutra (np) e produto empregando protease neutra para dissociação de tecido bem como método para sua produção". a presente invenção refere-se ao uso de uma protease neutra (np) juntamente com uma colagenase que consiste em que uma protease neutra que não está contida em uma preparação de enzima colagenase, e que não é produzida por uma produção recombinante, seja misturada antes do início de uma dissociação de tecido com uma colagenase ou uma preparação de enzima colagenase, com uma dosagem individual das proporções quantitativas de protease neutra e colagenase para aperfeiçoamento dos resultados de isolamento no que diz respeito a rendimento, viabilidade e integridade das células.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA ISOLAMENTO DE ILHOTAS DE LANGERHANS A PARTIR DE TECIDO PANCREÁTICO, E USO DE UMA PROTEASE NEUTRA PURIFICADA (NP)".

Campo de Aplicacão [001] Esta invenção se refere ao uso de uma protease neutra (NP) para uma dissociação de tecido. Técnica Anterior [002] A DE 4445891 A1 descreve uma protease recombinante (protease neutra, NP) de Clostridium histolyticum e seu uso para o isolamento de células e agregados celulares. Sendo assim, parte-se do fato de que, para se usar protease natural para o isolamento de células e agregados celulares em uma grande extensão, é necessário tornar disponível a protease neutra em qualidade reprodutível e em grandes quantidades, o que é possível devido a um método de produção recombinante. Entretanto, a clonagem da protease neutra não é imediata mente possível já que dificilmente são conhecidas sequências de Clostridium histolyticum. Portanto, não são possíveis conclusões quanto ao uso do códon e, portanto, quanto a restrição da degeneração dos oligonucleotídeos utilizáveis.

[003] Um produto pronto para uso, produzido pelo fabricante a partir de uma mistura de certas proporções de colagenase I e II e protease neutra, pode ser visto na US 5,989,888.

[004] De acordo com este método, uma protease neutra que está contida na preparação de colagenase é empregada de modo que não é obtida uma elevada estabilidade das enzimas. Adicione-se a isto que, quanto a protease neutra está contida por um maior tempo na colagenase, aparece uma redução da atividade enzimática com umidade.

Sumário da Invenção [005] O alvo desta invenção é o de tornar disponível um produto, um método para sua produção, bem como o seu uso para uma dissociação de tecido, com o qual são obtidos resultados de isolamento aperfeiçoado no que diz respeito ao rendimento, viabilidade, e integridade das células.

[006] Este alvo é obtido por um produto com as características da reivindicação 1, com um método de acordo com a reivindicação 3, e com o uso de acordo com a reivindicação 9.

[007] O produto de acordo com a invenção consiste em um componente A separado de uma protease (NP) de Clostridium histolyticum que não está contido em uma preparação de enzima colagenase, e de um componente B separado da colagenase ou de uma preparação de enzima colagenase, sendo que para uma dissociação de tecido o componente A é adicionado ao componente B em quantidades respectivamente necessárias antes do início da dissociação.

[008] A protease neutra empregada não é disponível por uma produção recombinante.

[009] O método de acordo com a invenção consiste em que um componente separado A de uma protease neutra (NP) de Clostridium histolyticum com um teor definido, que não está contido em uma preparação de enzima colagenase e que não é produzido por uma produção recombinante, é misturado a um componente B separado de uma colagenase purificada ou parcialmente purificada ou de uma preparação de enzima colagenase com uma dosagem individual das proporções quantitativas de ambos os componentes antes do início da dissociação de tecido.

[0010] O uso de acordo com a invenção consiste em uma protease neutra (NP), completamente purificada, não contida em uma preparação de enzima colagenase em uma quantidade respectivamente selecionada como uma mistura individual a uma colagenase, ou a uma preparação de enzima colagenase para a dissociação de tecido ou para o isolamento de células ou agregados multicelulares, por exemplo, feitos de tecidos para aperfeiçoamento dos resultados do isolamento no que diz respeito a rendimento, viabilidade e integridade das células.

[0011] O uso de uma protease neutra juntamente com colagenase purificada ou parcialmente purificada com um teor definido de protease neutra com uma dosagem individual das proporções quantitativas de ambos os componentes é particularmente vantajosa, sendo que é empregada uma protease neutra que não é produzida por uma produção recombinante.

[0012] Devido ao produto de acordo com a invenção e ao uso de acordo com a invenção de protease neutra para uma dissociação de tecido, um aperfeiçoamento dos resultados do isolamento, no que diz respeito a rendimento, viabilidade, e integridade das células, é obtido pelo fato de que protease neutra (NP) de Clostridium histolyticum é empregada separadamente, não contida em uma preparação de enzima colagenase, por uma adição individual da protease neutra a uma preparação de enzima colagenase ou de colagenase ou de colagenase I e II para o isolamento de células ou agregados celulares de tecidos. Protease neutra de Clostridium histolyticum é empregada. Sendo assim, prevalece a individualidade dependente do tipo e/ou da condição do tecido. O procedimento é tal que a adição de colagenase e da protease neutra ocorre respectivamente dependendo da quantidade de tecido. A protease neutra não está contida em uma preparação de colagenase de modo que uma estabilidade maior das enzimas é obtida. Adicione-se a isto que não é empregada nenhuma mistura de protease neutra e colagenase produzida por um fabricante e mantida armazenada ou em estoque. Protease neutra e colagenase são combinadas brevemente antes do início de uma dissociação de tecido.

[0013] A demonstração da função por digestão, dependendo das espécies, condição do órgão e posição do órgão, é particularmente vantajosa. Surpreendentemente, mostrou-se que somente devido à variação da adição de protease neutra, os resultados do isolamento poderíam ser significantemente aperfeiçoados no que diz respeito ao rendimento das ilhotas (islet) dos equivalentes celulares, viabilidade, integridade da ilhotas celulares ou agregados das ilhotas celulares. Sendo assim, a adição da colagenase desempenha uma parte menos crítica, já que ela é uma enzima que é rei ativa mente pouco tóxica para as células. A quantidade de protease neutra é mais crítica, já que a enzima tem uma ação de deterioração celular em quantidades muito grandes, e em quantidades muito baixas a dissociação de tecido permanece incompleta, portanto o rendimento das ilhotas celulares isoladas e dos agregados das ilhotas celulares é mais baixo. Para poder dosar individualmente a protease neutra, também é importante que seja empregada uma colagenase purificada ou parcialmente purificada que contenha baixas quantidades de outras atividades proteolíticas, tais como aquelas da protease neutra.

[0014] Configurações vantajosas da invenção são o objeto das sub-reivi ndicações.

Descrição das Modalidades Preferidas [0015] Otimização do isolamento das ilhotas a partir de pâncreas de porcinos e de seres humanos por adaptação enzimática relativa ao doador, [0016] O isolamento das ilhotas de Langerhans do tecido pancreático toma uma posição especial no campo da separação celular enzimática. Contra ri a mente ao isolamento dos outros tipos de células de diferentes tecidos, o isolamento das ilhotas é caracterizado pela tentativa de separar um agregado celular multicelular, as ilhotas, de outro órgão, o pâncreas, preservando a integridade morfológica. Este objetivo faz exigências especiais quanto à metodologia aplicada.

[0017] O método de filtração por digestão semi-automática tornou-se estabelecido como um procedimento padrão para o isolamento das ilhotas do pâncreas de animais maiores, este método combinando uma digestão enzimática com uma dissociação mecânica do pâncreas. A seleção das enzimas colagenolíticas ou misturas de protease apropriadas constitui um desafio especial. Essas misturas deveríam, no caso ideal, garantir uma dissociação máxima do tecido exócrino para uma dissociação mínima do tecido das ilhotas. Entre as diversas enzimas existentes nas misturas impuras de protease colagenolítica, colagenases da classe I e II foram identificadas como sendo essenciais para o desprendimento das ilhotas do pâncreas de ratos e porcos. Já que colagenases puras somente levam a uma digestão insuficiente do tecido pancreático de cães e ratos, outras proteases na forma de dispase, protease neutra ou tripsina parecem ser necessárias para um desprendimento eficiente de ilhotas. Uma descoberta preliminar no pâncreas de porcinos também fala de um efeito sinergístico positivo da "protease neutra" não especificado no desprendimento das ilhotas. O mecanismo de ação de proteases não específicas é possivelmente o desprendimento de fibras de colágeno devido à degradação proteolítica de proteoglicanos, de modo que as atividades colagenolíticas obtêm um acesso mais fácil a seus substratos. Além disso, uma hidrólise mais forte de fragmentos de colágeno através de protease não-específica é discutida. Um excesso de protease neutra pode acelerar a degradação proteolítica da própria colagenase e contribuir para a desintegração das ilhotas, devido à lisis das moléculas de adesão sensitivas a protease (moléculas de adesão celular CAM). Por outro lado, podería ser mostrado em ratos que ilhotas parecem ser relativamente resistentes à ação proteolítica de colagenase pura.

[0018] Quando se avalia as provas referenciadas, deveria ser levado em consideração que a sensibilidade das ilhotas ao efeito destrutivo das proteases neutras depende da espécie e é determinada pelo padrão de partição morfológica dos contatos celulares e do caráter específico da matriz de colágeno. Assim, para o porco, o teor de colágeno periinsular está o mais baixo dentre todas as espécies examinadas até agora (cães, humanos, ratos, vacas), e do caráter específico da cápsula de tecido conectivo protetor existente apenas rudimentarmente. Por outro lado, nestas espécies, o maior número de contatos celulares entre células endócrinas e células pancreáticas exócrinas deve ser descoberto. Portanto, as exigências que são feitas a uma mistura de protease colagenolítica, no que se refere ao perfil de atividade, depende da espécie doadora que é empregada. Essas descobertas importantes levam ao desenvolvimento e utilização comercial das misturas de enzima para o isolamento das ilhotas do pâncreas do rato (Liberase RI®), do cão (Liberase C®), do porco (Liberase PI®) e do ser humano (Liberase Hl®) pela companhia Roche. Esses produtos diferem essencialmente no teor de protease neutra.

[0019] Além das diferenças dependendo das espécies, também existem naturalmente variações intra-específicas e individuais de doadores. Para o doador de pâncreas humano, acima de tudo uma característica dependente da idade de fatores tais como condução nutricional, hábitos de consumo e tendências anteriores, induzem a uma enorme variação do rendimento após o isolamento das ilhotas. Para o porco, acima de tudo a idade do doador deve ser indicada como uma variável altamente significante para uma massa de ilhotas isolável, o que faz parecer que doadores jovens < 25 anos são, em muitos casos, não apropriados para um isolamento de sucesso das ilhotas. Mudanças relativas à idade, tais como índice de massa corporal aumentada que comumente está associada a uma fibrilização pancreática ou uma degeneração graxa do pâncreas, aumentam a capacidade de isolamento das ilhotas do pâncreas humano. Apesar dessas mudanças morfológicas deixarem parecer com que mesmo o pâncreas de doadores geriátricos apropriados para o isolamento de ilhotas, uma redução da funcionalidade das ilhotas relativa à idade também tem que ser levada em consideração. Portanto, apenas uma extensão do grupo de doadores com doadores juvenis ou moços aumentaria extremamente o potencial de transplante clínico das ilhotas.

[0020] Para o pâncreas de porcinos, as diferenças histológicas entre animais adultos e jovens, que substancialmente dificultam um isolamento com êxito das ilhotas do pâncreas juvenil, também foram apontadas. Além disso, investigações recentes mostram que mesmo em linhas definidas de reprodução, diferenças significantes podem ser mostradas entre indivíduos da mesma idade no que diz respeito à massa isolável das ilhotas.

[0021] As declarações precedentes levam à conclusão de que o caráter específico dos fatores de doadores diferentes requer ser tomado individualmente em consideração quando se trata de um pâncreas de doador. Um procedimento de isolamento específico contém em particular uma modificação das misturas de proteases colagenolíticas que são usadas levando em consideração os resultados histológicos acima discutidos. Enzimas disponíveis ou misturas de enzimas devem permitir ao usuário a maior flexibilidade possível sem pressioná-lo para a complexidade de uma mistura individual. A disponibilidade de uma mistura de colagenase classe l/classe II pura,como pode ser obtida na forma de colagenase NB-1 da Nordmark/Serva, concorda com esta exigência em uma grande extensão. Dependendo do status do respectivo doador, deveria ser ajustada uma concentração de colagenase que deveria ser individualmente completada respectivamente por protease neutra.

[0022] A invenção será explicada pelas seguintes modalidades e exemplos.

Exemplo 1 [0023] A adaptação da atividade de protease neutra sucessivamente suporta o isolamento das células de ilhotas de porcos após um armazenamento frio de longo prazo.

[0024] Para salvar os escassos recursos dos órgãos humanos em uma ampla extensão, testes preliminares são realizados com porcos. Entre eles, encontramos em particular a titração de concentrações limitadas de colagenase e protease neutra que é primeiro avaliado em pancreata de porcinos adultos (> 24 meses). Já que a colagenase NB-1 é primeiramente disponível somente em quantidades limitadas, isolamentos de ilhotas de porcinos são realizados com colagenases NB-8. Sendo assim, são usadas somente cargas que são caracterizadas por um teor mínimo de protease neutra e tripsina, bem como, pelo teor mais baixo possível de clostripain. Testes preliminares mostram aqui que o tempo de digestão e a quantidade do tecido digestível são claramente correlacionados com a concentração da protease neutra.

[0025] Para garantir uma concentração de enzima constante para cada série de teste, a quantidade de colagenase distendida será adaptada à quantidade do tecido empregado. Este é contrário ao propagado protocolo de Liberase da companhia Roche para o qual uma quantidade constante de enzima de 500 mg deveria ser empregada independentemente da massa de tecido. Para três concentrações de colagenase que têm que ser determinadas preliminarmente empiricamente (por exemplo 4 mg/g de órgão, 6 mg/g e 8 mg/g), a quantidade ótima de protease neutra é interativamente titrada na faixa de aproximadamente 0,2 - 0,6 DMC-U/g de órgão.

[0026] A duração da digestão, a proporção do tecido insertado em relação ao tecido da digestão, o rendimento das ilhotas, a pureza e o tamanho médio das ilhotas, são considerados parâmetros de isolamento relevantes. A mistura mais eficaz é testada em 6 órgãos. As ilhotas que são então isoladas são submetidas a um controle de quantidade, que considera a funcionalidade e a viabilidade das ilhotas, bem como in vitro com estimulação estática de glicose, e integridade das colorações das membranas, bem como in vivo por meio de bioensaios de camundongos nús diabéticos. A melhor combinação presumível de colagenase NB-I e protease neutra também deveria ser confirmada por testes com NB-1 colagenase em 8 órgãos.

[0027] Devido à experiência empírica coletada, é possível adaptar esses testes de otimização interativos em porcos jovens (aproximadamente com 6 meses) doadores e repeti-los, em uma reduzida extensão, para combinações de enzima promissoras.

[0028] O mesmo também é válido para os testes de otimização com NB-1 colagenase para o procedimento de isolamento humano. Pela consideração prática orientada de fatores doadores relativos à idade, duas classes de idade são formadas para doadores de pâncreas que refletem a experiência obtida até agora: < 25 anos, > 25 anos. O esquema de titração acima mencionado para protease neutra deveria ser adaptado para pancreata humana e executado preliminarmente empi ricamente para determinar concentrações de colagenase (por exemplo, 4 mg/g e 5 mg/órgão).

[0029] A combinação a mais presumivelmente eficaz de NB-1 colagenase e protease neutra é testada para cada classe de idade em 6 órgãos e as células isoladas são submetidas a um controle de qualidade in vitro e ín vivo (ver abaixo).

[0030] Uma dose individual é possível devido ao uso de protease neutra com colagenase purificada ou pardalmente purificada com um baixo teor definido de protease neutra. Uma preparação da mistura de enzima tem lugar no que se refere a unidades ao invés de massa, já que a atividade específica é muito desigual.

[0031] A adaptação da atividade da protease neutra suporta com sucesso o isolamento das células das ilhotas de porcos após um longo tempo de armazenamento a frio.

Antecedentes: [0032] A dissociação enzimática de tecido pancreático através da colagenase constitui uma etapa decisiva no processo de isolamento das células das ilhotas. A variabilidade do colágeno pancreático para diferentes tipos levou à produção de misturas de enzimas específicas. Entretanto, as misturas de enzima disponíveis no momento não oferecem a possibilidade de dosar componentes individuais por meio de variáveis doadoras individuais, por exemplo o tempo de isquemia fria. Supomos que a adaptação individual da atividade de protease neutra poderia ser usada como um fator crítico da digestão enzimática do pâncreas para facilitar o desprendimento com sucesso das células das ilhotas. Para provar esta hipótese, pancreata de porcos foram submetidas a um armazenamento de longo prazo (6,5 horas) antes que ocorresse a dissociação por meio de colagenase NB-8 de Serva, que é caracterizado por uma quantidade mínima de protease neutra. Métodos: [0033] Após amostragem, pancreata de animais não mais criados foram distendidas intradutalmente com colagenase NB-8, dissolvidos em uma solução UW fria. A atividade colagenolítica definitiva foi 4 FZ-U/g de um tecido pancreático. Após experiências preliminares, protease neutra (Serva) foi adaptada a 0,6 ou 0,9 DMC-U/g ou 0,14 DMC-U/g para pancreata recentemente preparada (n = 5) ou armazenada (n = 5). Células de ilhotas foram isoladas por digestão-filtração modificada e purificadas em um Cobe 2991 empregando Ficoll ditrizoato de sódio. O controle de qualidade compreendeu a amostra de exclusão de azul tripano e a incubação estática de glicose (2,8 até 20 mM de glicose).

[0034] Além disso, a atividade mitocondrial foi avaliada por meio da produção de formazana e a 490 nm empregando compostos de tetrazolio (MTS) e expressa como unidades arbitrárias (AU) por mg de proteína.

Resultados: [0035] O tempo total de digestão de pancreata armazenada por um longo prazo foi consideravelmente encurtado se comparado a uma pancreata recentemente preparada (48 ± 3 comparado a 63 + 3, P < 0,05). Nenhuma diferença foi mencionada no que diz respeito ao peso do pâncreas e à qualidade do tecido digerido. Após a purificação das células das ilhotas que foram isoladas com 0,14 ou 0,9 DMC-U/g, nenhuma diferença foi mencionada no que diz respeito à pureza definitiva (> 95%), para a partição das ilhotas (> 95%) e a recuperação do tecido da célula das ilhotas (73 + 9 comparado a 72 +16). Após armazenamento de longo prazo, o rendimento da célula das ilhotas foi levemente menor se comparado a preparações recentemente isoladas (146 000 + 43000 se comparado a 212 000 + 52000 IEQ, NS), mas não significantemente menor. O controle de qualidade resultou em uma viabilidade celular das ilhotas excepcional (99,9 + 1 comparado a 99,4 ± 0,3 % NS), um teor de insulina intracelular preservado (1720 + 96 comparado a 1760 ± 280 pU/IEQ, NS), bem como um índice de estimulação de glicose comparável (1,7 ± 0,2 comparado a 1,5 ± 0,1, NS) após a digestão com 0,14 ou 0,6 ou 0,9 DMC-U/g. A atividade mitocondrial não era diferente entre as células das ilhotas isoladas após um armazenamento de longo prazo (0,85 ± 0,06 AU/mg) e células recentemente preparadas (0,90 ± AU/mg).

Conclusões: [0036] Este estudo demonstra com um modelo de pancreata de porcinos armazenada a longo -prazo que a dosagem individual de componentes únicos de uma mistura de enzima é útil de acordo com as variáveis do doador individual para facilitar o desprendimento das células das ilhotas. A adaptação individual da atividade de protease neutra também poderia ser útil para a consideração da isquemia quente, da idade do doador e da degeneração graxa ou fibrosa do tecido pancreático.

Exemplo II

[0037] A determinação da relação ótima de protease neutra para colagenase para o isolamento de ilhotas de Langerhans alvo: [0038] Determinação da relação ótima de protease neutra/colagenase (NPCR) na mistura de enzimas que é empregada para o isolamento das ilhotas de Langerhans. Misturas de colagenase Serva com diferentes NPCR são comparadas umas com as outras e com Liberase e colagenase do tipo V, como controles de um modelo de rato.

Antecedentes: [0039] Liberase é no presente a mistura de enzima usada universalmente para o isolamento de ilhotas humanas. Seu desenvolvimento foi um aperfeiçoamento definitivo se comparado com colagenases crúas desde que purificadas, livres de endotoxinas, e mostrou pouco sua variabilidade de carga para carga para a atividade enzimática.

[0040] Entretanto, já que os resultados do transplante das ilhotas estão se desenvolvendo rapidamente e, é necessário para aperfeiçoar ainda mais a configuração e padronização das misturas de enzimas que estejam disponíveis no mercado. Não há por exemplo nenhum padrão das cargas de Liberase desprendidas no que diz respeito às atividades por grama do produto dos diferentes componentes enzimáticos. Portanto, há uma variabilidade considerável de carga para carga para a atividade de colagenase, a atividade da protease neutra e do NPCR, como isto é mostrado no certificado de análise do produtor. Por esta razão, o NPCR ótimo para o isolamento das ilhotas não é conhecido. Também é concebível que um NPCR adaptado pudesse ser necessário para cada pâncreas, de acordo com sua estrutura, a idade do doador, o tempo de isquemia. Uma nova enzima que está disponível no mercado é Serva colagenase, embalada em frascos separados com a protease neutra. Isto permite uma mistura específica dos dois componentes para obter-se uma proporção predeterminada, ao invés de executar o isolamento com uma proporção que foi preliminarmente fixada pelo produtor e que varia de carga para carga. Com o modelo do rato, deve-se determinar qual o NPCR ótimo para o isolamento das ilhotas. Métodos: [0041] Sete grupos de ratos Lewis serão usados como doadores de ilhotas. 18 ratos estarão em cada grupo. Os grupos serão determinados como se segue: Grupo 1: [0042] Isolamento das ilhotas com colagenase Serva pura, sem protease neutra (NPCR = 0% p/p) Grupo 2: [0043] Isolamento das ilhotas com colagenase Serva, com um NPCR de 3% p/p Grupo 3: [0044] Isolamento das ilhotas com colagenase Serva, com um NPCR de 6% p/p Grupo 4: [0045] Isolamento das ilhotas com colagenase Serva, com um NPCR de 12% p/p Grupo 5: [0046] Isolamento das ilhotas com colagenase Serva, com um NPCR de 24% p/p Grupo 6: [0047] Isolamento das ilhotas ocorre com liberase RI.

Grupo 7: [0048] Isolamento das ilhotas ocorre com colagenase do tipo V (Sigma).

Exemplo IIA

[0049] O papel da protease neutra durante o isolamento das ilhotas, avaliado com a preparação de uma nova enzima Alvo: [0050] Diversas preparações de enzima estão disponíveis para o isolamento das ilhotas. Uma delas é um produto altamente purificado com componentes separados (colagenase e protease neutra) que permite a adaptação da concentração de protease neutra para o isolamento das ilhotas. Para este estudo, avaliamos o papel da protease neutra durante o isolamento das ilhotas. Método: [0051] Sete grupos de ratos Sprague-Daley (18 ratos por grupo) foram formados para o isolamento das ilhotas padronizado de acordo com o tipo de enzima. Carregamos 2 mg/mL (Sigma Chemical, para grupo II Liberase por 0,6 mg/mL (Roche) de colagenase do tipo XI para o grupo I e para o grupo II até VII 0,6 mg/mL (Serva Electrophorese) de NB1 colagenase. Colagenase pura NB1 foi carregada para o grupo III. Para os grupos IV, V, VI e VII, uma concentração de 7,5, 15, 22 e/ou 30 g/mL de protease neutra (NP) foi adicionada. Os resultados foram avaliados no que se refere aos rendimentos das ilhotas, apoptose (detecção de morte celular ELISA, Roche e coloração Tunel), de secreções (quantikinas M, Sistema R&D) de citoquinas (IL-Ιβ, IL-6, TNFa, IFNy, secreção de insulina (incubação estática) e morfologia das ilhotas (histologia e imuno-histologia).

Resultados: [0052] O teor de endotoxinas da solução de enzima foi para os grupos I e II 173 + 22 e 120 + 11 EU/mL. Para os grupos III até VII, ele aumentou gradualmente de acordo com a concentração de NP, de 0,4 até 58 EU/mL (p< 0,05). Os rendimentos dos equivalentes (IE) das ilhotas por rato foi de 1367 + 522 e 1755 + 110 para o grupo I e/ou II. Para os grupos III até VII, os rendimentos IE por rato seguiu uma distribuição de Gaussian de acordo com a concentração de NP com um rendimento maior para o grupo V, 1712 + 245 e um menor para o grupo III (597 + 277) e o grupo VII (905 + 297) (p = 0,05). Para os grupos III até VII, a morfologia das ilhotas foi influenciada pela concentração de NP com um número decrescente de ilhotas capturadas e um número ascendente de ilhotas fragmentadas à medida em que o teor de NP aumentou. O aumento da concentração de NP foi relativa a uma deterioração progressiva do anel celular das ilhotas que foi comparável para o grupo VII com a deterioração que foi observada para os grupos I e II. O desprendimento das citoquinas (IL-1β, IL-6, TNFa, IFNy) foi menor nos grupos III até VII se comparado aos grupos I e II, entretanto ele não foi influenciado pela concentração de NP, a necrose e apoptose das células das ilhotas foram estatisticamente significantemente menores nos grupos III até VII se comparado aos grupos I e II, entretanto eles não foram influenciados pela concentração de NP. O índice de estímulo médio da secreção de insulina foi de 2,96 para o grupo I, 5,17, para o grupo II e eles estiveram entre 5,25 e 5,43 para os grupos III até VII.

Conclusão: [0053] Protease neutra é um aditivo decisivo a colagenase para o isolamento das ilhotas no que diz respeito aos rendimentos das ilhotas. A colagenase Serva com uma concentração apropriada de protease neutra pode ser comparada com a Liberase no que se refere aos rendimentos das ilhotas e função. Entretanto, ela é relacionada a baixo desprendimento das citoquinas das células das ilhotas e da apoptose, o que resulta em uma morfologia celular aperfeiçoada. Exemplo III

[0054] Preservação de longo prazo com êxito do pâncreas por meio do processo de duas camadas para o subsequente isolamento das células das ilhotas de porcinos.

Antecedente: [0055] A sensibilidade especial das células das ilhotas de porcinos evitou o isolamento com êxito da pancreata após um armazenamento de longo-prazo. Para o isolamento com êxito de células de ilhotas humanas, a acumulação de oxigênio no tecido pancreático foi recentemente desenvolvido por meio de método de duas camadas (TLM) durante o armazenamento a frio. Até agora, nenhum dado está disponível acerca da preservação de longo prazo da pancreata de porcinos por meio de TLM. Portanto, o objetivo deste estudo foi o de examinar a eficiência do TLM para o isolamento com êxito das células das ilhotas de pancreata de porcinos que foram submetidos à preservação TLM por 6,5 horas (n = 5) comparado à pancreata recentemente preparada (n = 5). Método: [0056] Imediatamente após a amostragem, pancreata não mais usada de animais de criação foram distendidas intradutalmente com colagenase (Serva), diluídas em uma solução UW fria com uma concentraçãode 4 mg por g de tecido pancreático. Células de ilhotas foram isoladas por digestão-filtração modificada e purificadas em um Cobe 2991 empregando um diatrizoato de sódio Ficoll. O controle de qualidade compreendeu a amostra de exclusão de tripano azul e a incubação de glicose estática (2,8 até 20 mM de glicose). Além disso, a atividade mitocondrial foi avaliada por meio da produção de formazana e determinada a 490 nm por uso de um composto de tetrazólio (MTS) e expressa como unidades arbitrárias (AU) por mg de proteína.

Resultados: [0057] Após a purificação nenhuma diferença significativa pode ser constatada entre pancreata recentemente preparada e pancreata preservada em TLM no que diz respeito à pureza definitiva (> 95%), o rendimento (2440 ± 580 comparado a 1800 ± 250 lEQ/g), a viabilidade (99,4 ± 0,3 comparada a 100,0 ± 0,0 lEQ/g) e o índice de estimulação de glicose (1,73 ± 0,19 comparado com 1,48 ± 0,14 NS) das células das ilhotas. O teor intracelular de insulina foi aumentado após a preservação de TLM comparado com a preparação recente (2250 ± 110 se comparado a 1760 ± 280 pU/IEQ, NS). Comparado às células das ilhotas recentemente isoladas, a atividade mitocondrial foi mantida pela TLM durante o armazenamento de longo prazo (0,96 ± 0,15 comparado com 1,01 ±0,17 AU/mg, NS).

Conclusões: [0058] Este estudo demonstra a eficiência da TLM para a preservação de longo prazo de pancreata de porcinos antes do isolamento com êxito das células das ilhotas.

Exemplo IV

[0059] Compreende o armazenamento do tecido (pâncreas de porcinos) com o método de duas camadas em hidrocarboneto perfluorado, dissociação de tecido através de adição individual de protease neutra.

[0060] Hidrocarboneto perfluorado tem uma capacidade de combinação de oxigênio elevada. Portanto, o tecido armazenado é melhor suprido com oxigênio, de modo que o metabolismo pode ser melhor mantido e o tecido resiste melhor ao armazenamento de algumas horas. Para o isolamento de células, a solução de enzima digestora foi adicionada tanto antes do armazenamento (TLM pré-carregado) ou após o armazenamento (TLM pós-carregado). Novamente a possibilidade de variação da protease neutra adicionada é importante (para uma concentração constante de colagenase de 4 PZ-U/g do órgão): pré-carga de menor quantidade (0,1 DMC-U/g do órgão) já que um tempo de digestão maior seja dado pelo armazenamento) e pós -carga de maior quantidade (0,9 DMC-U/g do órgão).

[0061] Assim sendo, a otimização do isolamento celular resulta por variação da protease neutra e do método de armazenamento.

Dados na tabela I: [0062] Esses são os dados detalhados concernentes ao rendimento dos equivalentes das células das ilhotas, viabilidade, integridade das células das ilhotas.

[0063] Os dados mostram que os resultados que podem ser atingidos com respeito a rendimento de equivalentes de células de ilhotas, viabilidade, integridade das células das ilhotas ou agregados de células das ilhotas são comparativamente bons independentemente do armazenamento (2 = TLM-pré-carregado (4 PZ-U; 0,1 DMC-U); 4=UW-pré-carregado (4 PZ-U; 0,1 DMC-U); 3 =TLM-pós-carregado (4 PZ-U; 0,9 DMC-U) ou não-armazenado (6 - não-armazenado (4-PZ-U; 0,9 DMC-U) quando a quantidade de protease neutra é correspondentemente adaptada.

Tabela I

Resultado do isolamento antes da purificação Após purificação Exp.Grup. lEQPre SEM n IEQ/IN Pre SEM n IEQ Post SEM n IEQ/IN Post SEM n 6 382467 69415 6 0,81 0,08 6 388877 100179 6 0,90 0,09 6 3 245500 51272 6 0,73 0,15 6 238550 37398 6 0,69 0,10 6 2 309357 32394 7 0,84 0,08 7 210429 22852 7 0,68 0,06 7 4 192229 22697 7 0,72 0,07 7 109957 34669 7 0,60 0,06 7 Significados: ns ns ns ns 3:2 Tabela I -continuação- Exp.Grup. IEQ Rec (%) SEM n OD/103IE SEM n SI SEM n mU/103IE SEM 6 97,5 15,6 6 0,701 0,048 6 2,76 0,42 6 678 13 3 104,6 16,7 6 0,760 0,043 6 1,86 0,29 6 648 8 2 69,1 4,6 7 0,792 0,030 7 1,47 0,15 7 682 3 4 83,6 9,2 7 0,803 0,034 7 1,56 0,15 7 1060 13 Significados: ns 6:2 ns 6 = sem armazenamento (4 PZ-U, 0,9 DWC-U) 3 = armazenamento de TLM, adição de enzima após o armazenamento (4 PZ-U, 0,1 DMC-U) 2 = armazenamento de TLM, adição de enzima antes do armazenamento (4 PZ-U, 0,1 DMC-U) 4 = armazenamento em UW tampão, adição de enzima antes do armazenamento (4 PZ-U, 0,1 DMC-U) IEQ/IN = índice de fragmentação OD = atividade mitocondrial MU = Teor de insulina REIVINDICAÇÕES

Claims (13)

1. Método para isolamento de ilhotas de Langerhans a partir de tecido pancreático, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) misturar um componente A preparado separadamente com um componente B preparado separadamente, em uma taxa de misturação pré-determinada de componente A para componente B de 3% (p/p), 6% (p/p), 12% (p/p) ou 24% (p/p), para prover uma mistura reativa, sendo que o componente A é uma protease neutra (NP) completamente purificada de Clostridium histoliticum, a qual não está contida em uma preparação de enzima colagenase e a qual não é produzida por uma produção recombinante, e o componente B é uma colagenase purificada ou parcialmente purificada; (b) combinar a mistura reativa diretamente depois disso com o tecido pancreático; e (c) isolar as ilhotas de Langerhans.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a taxa de misturação de componente A para componente B é 3% (p/p).

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a taxa de misturação de componente A para componente B é 6% (p/p).

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a taxa de misturação de componente A para componente B é 12% (p/p).

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a taxa de misturação de componente A para componente B é 24% (p/p).

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de que o tecido pancreático é pâncreas de porcino.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de que o tecido pancreático é pâncreas humano.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado pelo fato de que o tecido pancreático foi previamente armazenado utilizando um método em duas camadas com hi-drocarbonetos perfluorados.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tecido pancreático é pâncreas de porcino ou pâncreas humano.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o tecido pancreático é pâncreas de porcino.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o tecido pancreático é pâncreas humano.

12. Uso de uma protease neutra purificada (NP) de Clostri-dium histolyticum, que não está contida em uma preparação de enzima de colagenase em uma quantidade como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é como aditivo único a uma colagenase ou preparaçãode enzima colagenase, para dissociação de tecido ou isolamento das células ou agregados celulares.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o armazenamento ocorre de acordo com o método de duas camadas com hidrocarboneto perfluorado.