BR9508666B1 - mÉtodos para detectar distérbio proliferativo celular e cÂncer de um àrgço, bem como kit. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para"MÉTODOS PARA DETECTAR DISTÚRBIO PROLIFERATIVO CELULAR ECÂNCER DE UM ÓRGÃO, BEM COMO KIT".

1. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se geralmente a de-tecção de uma seqüência de ácido nucléico de marcação eespecificamente a detecção de um distúrbio proliferativocelular com uma seqüência de ácido nucléico hipermutávelem uma amostra.

2. Descrição da Arte Anterior

Os genomas de mamíferos consistem de seqüênciasde DNA únicas interdispersas com seqüências de DNA mode-radamente e altamente repetitivas. O mapeamento genéticopor análise de ligação meiótica foi realizado tradicio-nalmente usando variações em DNA de seqüência única, comopolimorfismos de comprimento de fragmento de restrição(Botstein, et al., Am. J. Hum. Genet., 32:314-331, 1980),como marcadores genéticos. Recentemente, variações noselementos de seqüência repetitiva como mini-satélite ouseqüências de repetição em tandem de número variável(VNTR) (Jeffreys, et al., Nature, 314: 67-73, 1985; Naka-mura, et al. , Science, 235: 1616-1622, 1987), e motivosde seqüência simples variável ou microsatélite (VSSM)(Litt e Luty, Am. J. Hum. Genet., 44: 397-401, 1989; We-ber e May, Am. J. Hum. Genet., 44: 388-396, 1989) foramverificadas como utilizáveis para estudos de ligação. Umavantagem do uso de variações de seqüência repetitivas emvez de variações de seqüências únicas é o número aparen-temente maior de alelos presentes em populações normaisquando comparado com os polimorfismos de comprimento defragmento de restrição (RFLPs). Uma segunda vantagem é acapacidade de prontamente detectar variações de compri-mento de seqüência usando a reação de cadeia polimerasepara facilitar a análise rápida e barata de grandes núme-ros de amostras de DNA.

Os elementos de microsatélite consistem de se-qüências de mono-, di-, ou tri-nucleotideos simples, ondeos alelos diferem por um ou mais unidades de repeti-ção(Luty, et al. , Am. J. Hum. Genet., 46: 776-783, 1990;Tautz, et al., Nature, 322: 652-656, 1986; Weber e May,Am. J. Hum. Genet., 44: 388-396, 1989). Mini-satélites,ou seqüências VNTR, tipicamente tem uma unidade de repe-tição de 20 a várias centenas de nucleotídeos e alelosdiferem em pouco como uma unidade de repetição. Dentre asseqüências simples, os elementos de repetição (TG)n ou(CAn) foram recentemente provados como extremamente uti-lizáveis paa mapeamento meiótico porque (1) eles sãoabundantes no genoma, (2) desempenham um grande número dediferentes alelos e (3) podem ser rapidamente testadosusando a reação de cadeia polimerase (Litt e Luty, Am. J.Hum. Genet., 44: 397-401, 1989; Weber e May, Am. J. Hum.Genet., 44: 388-396, 1989).

Várias outros motivos de seqüências curtas foramencontrados em genomas de mamíferos (Hellman, et al., Ge-ne, 68: 93-100, 1988; Knott, et al., Nuc. Acids Res., 14:9215-9216, 1986; Litt e Luty, Am. J. Hum. Genet., 44:397-401, 1989; Milstein, et al., Nuc. Acids Res., 12:6523-6535, 1984; Stoker, et al. , Nuc. Acids Res., 13:4613-4621, 1985; Vassart, et al. , Science, 233: 683-684,1987; e Vergnaud, Nuc. Acids Res., 17: 7623-7630, 1989);e genomas de aves (Gyllensten, et al., Nuc. Acids Res.,17: 2203-2214, 1989; Longmire, et al. , Genomics, 2: 14-24, 1988) e pensa-se que acumulam por deslizamento de DNAdurante a replicação (Tautz, et al., Nature, 322: 652-656, 1986) ou eventos de recombinação desiguais (Wolff,et al., Genomics, 5: 382-384, 1989). Muitos destes ele-mentos de repetição demonstram um alto grau de variaçãogenética e, assim, são também utilizáveis para mapeamentomeiótico e mitótico.

A seqüência VNTR isolada por Jeffreys, (acima)contém uma seqüência de núcleo invariante GGGCAGGAXG quecontém algumas similaridades para a seqüência chi de fagolambda (Wolff, et al., Genomics, 5: 382-384, 1989) e édetectada por um fragmento de restrição de bacteriófagoM13 (Vassart, et al., Science, 233: 683-684, 1987). Oselementos de repetição similares foram detectados porNakamura, et al. (Science, 235: 1616-1622, 1987) e contémuma unidade de núcleo comum, similar, mas distintaGGGGTGGGG. Elementos deste tipo ocorrem em várias seqüên-cias de genes conhecidas incluindo o local de (globina.

Os elementos VNTR similares foram descritos com a apoli-poproteína B (Boerwinkle, et al. , Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 86: 212-216, 1989; Knott, et al. , Nuc. Acids Res.,14: 9215-9216, 1986) e genes de tipo II de colágeno(Stoker, et al., Nuc. Acids Res., 13.: 4613-4621, 1985) econtém um motivo rico em AT distinto. Apesar de uma fun-ção fisiológica para elementos repetitivos deste tipo nãoter sido definida, eles tem sido sugeridos como pontos empotencial para a recombinação de cromossomos (DeBustros,et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85: 5693-5697, 1988)ou elementos importantes para o controle de expressão ge-nética (Hellman, et al., Gene, 68:93-100, 1988; Milstein,et al., Nuc. Acids Res., 12: 6523-6535, 1984).

Os microsatélites representam uma classe muitocomum e altamente polimórfica de elementos genéticos nogenoma humano. Os marcadores de microsatélites contendoseqüências de repetição foram usados para mapeamento ge-nético primário e análise de ligação como descrito(Weber, et al., Am. J. Human Genet., 4A: 388, 1989). Aampliação PCR destas repetições permite a rápida avalia-ção para perda de heterozigozidade (LOH) e pode simplifi-car muito os procedimentos para mapear genes supressoresde tumor (Ruppert, et al. , Câncer Res. .53: 5093, 1993;van der Riet, et al., Câncer Res., 54: 1156, 1994). Maisrecentemente, microsatélites foram usados para identifi-car mutações especificas em alguns distúrbios herdadosincluindo doença de Huntington, (HD), cromossomo X frágil(FX) , distrofia miotônica (MD) , ataxia espinocerebelartipo I (SCA 1), distrofia muscular espinobulbar (SBMA), eatrofia dentatorubral palidolusiana hereditária (DRPLA),(The Huntington's Disease Collaborative Research Group.,Cell, 72: 971, 1993; E. J. Kremer, et al., Science, 252:1711, 1991; G. Imbert, et al. , Nature Genet., 4: 72,1993); Η. T. Orr, et al. , Nature Genet., 4: 221, 1993);V. Biancalana, et al., Hum. Mol. Genet., I: 255, 1992, M-Y., Chung, et al. , Nature Genet., 5.: 254, 1993, R. Koide,et al., Nature Genet., 6: 9, 1994).

A instabilidade de microsatélite foi recentemen-te descrita em cânceres humanos. Por exemplo, a instabi-lidade de microsatélite foi registrada como sendo um as-pecto importante de tumores de pacientes com carcinonacoloretal não polipose hereditário (HNPCC) (Peltomàki, etal., Science, 260: 810, 1993; Aaltonen, et al. , Science,260: 812, 1993; Thibodeau, et al. , Science, 260: 816,1993). Além disso, a instabilidade de microsatélite, de-monstrada por expansão ou deleção de elementos de repeti-ção foi registrada em tecidos neoplásticos coloretais,endométricos, mama, gástrico, pancreático, bexiga (J. I.Risinger, et al., Câncer Res., .53.: 5100, 1993; H-J. Han,et al., Câncer Res., .53: 5087, 1993; P. Peltomàki, etal., Câncer Res., .53: 5853, 1993; M. Gonzalez-Zulueta, etal., Câncer Res., 53.: 5620, 1993), e recentemente emSCLC. Em pacientes HNPCC, esta instabilidade genética édevido a mutações somáticas e herdadas deum gene de repa-ro de combinação errada critico (hMSH-2). As mutações dehMLH-1 e outros genes de reparo de combinação errada crí-ticos também podem ser responsáveis pela instabilidadedetectada em pacientes com HNPCC.

O câncer permanece uma causa principal da morta-lidade no mundo todo, e apesar de avanços em diagnósticoe tratamento, a taxa de sobrevivência global não melhoroude modo significante nos últimos vinte anos. Permaneceuma necessidade não atendida de um meio mais sensívelpara um diagnóstico prematuro. Os testes típicos para de-tectar infiltração rara de células de tumor em amostrasclínicas utilizando processos de ampliação que requeremetapas de clonagem adicionais e síntese de um grande nú-mero de sondas específicas para oligômeros para detectaruma ampla variedade de mutações oncogênicas para cadatipo de tumor (Sidransky, et al., Science, 252: 706,1991; Sidransky, et al., Science, 256: 102, 1992). A pre-sente invenção provê um teste sensível para detectar vá-rios cânceres usando marcadores de microsatélite hipermu-táveis e uma estratégia de ampliação que elimina a neces-sidade de etapas de clonagem adicionais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção provê um processo de triagemsensível, confiável, rápido, para a detecção de um dis-túrbio proliferativo celular em várias amostras clínicas.A invenção utiliza a ampliação e detecção de ácido nu-cléico em microsatélite (seqüências de repetição peque-nas) para detectar uma população clonam de células em umaamostra clínica.A invenção é baseada na descoberta inesperada deque as alterações de microsatélite são detectáveis comouma população clonal de células no DNA de amostras clíni-cas citológicas. Estas amostras incluem urina, catarro, emargens histopatológicas obtidas de pacientes com câncer.

A invenção provê um processo para detectar umadistúrbio proliferativo celular de mamíferos (isto é, ne-oplasia) associado com um ácido nucléico alvo ("target")de mamíferos hipermutável em um espécime, compreendendoisolar o ácido nucléico presente no espécime e detectar apresença ou ausência (isto é perda de heterozigozidade,LOH) do ácido nucléico alvo hipermutável, tipicamenteapós ampliação do ácido nucléico.

Em uma forma de realização, a etapa de ampliaçãono processo da invenção é realizada com uma reação multi-plex. Assim, em vez de realizar as reações de ampliaçãomúltiplas para identificar cada alteração clonal, inicia-dores para diferentes marcadores são combinados em umaúnica reação de ampliação simples, melhorando a identifi-cação de uma grande proporção de distúrbios proliferati-vos celulares.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

FIGURA 1 mostra um gel acrilamida desnaturantede DNA normal (N) e com tumor (T) da trilha 1, B17 (TCC)(marcador FGA) ; trilha 2, L21 (SCLS) (marcador AR); tri-lha 3, B30 (TCC) (marcador UT762) ; e trilha 4, L5 (SCLG)(marcador D14S50).

FIGURA 2 mostra um gel acrilamida desnaturantede Painel A), uma amostra de urina (U) de B27 (TCC) ana-lisado com marcador FGA e comparado com DNA de tecidonormal (N) e tumor (T); painel B) margem histológica (M)de L31 (NSCLC) triada comAR e comparada com tecido de tu-mor; e painel C) amostra de escarro (S) de L25 (SCLC)analisada com CHRNB e comparada com DNA de tecido normale tumor.

FIGURA 3 mostra DNA de linfócitos de pacientes(N) ampliados com EGA marcador em variadas diluições comDNA de tumor de 1 em 5 (20%) a 1 em 1000 (0,1%). Novasbandas são indicadas por uma seta. Painel A, DNA de tumorde B17 (TCC); painel B, DNA de tumor de B27 (TCC).

FIGURA 4 mostra um teste PCR multiplex utilizan-do DNA de B27 (TCC) e uma amostra de urina correspondenteampliada com três diferentes conjuntos de iniciadores(FGA, ACTBP2, AR) na mesma reação PCR (N: DNA normal, T:DNA de tumor; U: DNA de urina).

FIGURA 5 mostra os resultados dos estudos em 2 5pacientes tendo diagnóstico confirmado de câncer por pa-tologia. Amostras de Sangue (B), Tumor (T) e urina (U)foram comparadas para detecção de alterações de microsa-télites.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um processo paradetectar um distúrbio proliferativo celular associado comum ácido nucléico alvo tendo uma seqüência de nucleotí-deos hipermutável. Preferivelmente, a seqüência de nucle-otídeos hipermutável é uma seqüência de DNA de mi-crosatélite. As alterações de microsatélites em váriaslesões de câncer, por exemplo, podem ser detectadas poruso de marcadores de repetição de microsatélites. Umacombinação de marcadores de repetição pode ser utilizadano processo da invenção para identificar uma grande por-centagem de distúrbios proliferativos celulares ou neo-plasias mesmo se as células neoplásticas compreenderemsomente uma fração pequena da amostra clinica.

Como usado aqui, o termo "hipermutável" refere-se a uma seqüência de ácido nucléico que é suscetível ainstabilidade, assim resultando em alterações de ácidonucléico. Estas alterações incluem a deleção e adição denucleotideos. As seqüências hipermutáveis da invenção sãopreferivelmente seqüências de DNA em microsatélites que,por definição, são seqüências de DNA de repetição em tan-dem pequenas. Os marcadores de DNA de microsatélites sãousados para detectar seqüências hipermutáveis assim comoperda de heterozigozidade (LOH) e instabilidade genômica.

O ácido nucléico hipermutável pode ser uma se-qüência de ácido nucléico neoplástica. 0 termo ácido nu-cléico "neoplástico" refere-se a uma seqüência de ácidonucléico que diretamente ou indiretamente é associada comou provoca um neoplasma. 0 processo da invenção é aplicá-vel a detecção de seqüências de nucleotideos hipermutávi-es associadas com tumores benignos assim como malignos. 0processo pode ser usado para detectar qualquer seqüênciade nucleotideos hipermutável, sem levar em conta a ori-gem, desde que a seqüência esteja presente de modo detec-tável em um espécime. O espécime pode ser sangue, urina,catarro, bile, fezes, esfregaços cervicais, saliva, lá-grimas, fluido espinal cerebral, gânglios linfáticos re-gionais e margens histopatológicas, e qualquer fluido docorpo que drena uma cavidade ou orgão do corpo. Por exem-plo, a neoplasia de gânglios linfáticos regionais, asso-ciada com um tumor mamário primário pode ser detectadautilizando o processo da invenção. O termo "gânglios lin-fáticos regionais" refere-se a tecido linfóide formandoorgãos linfóides ou nódulos que estão em proximidade in-tima com o tumor primário. Por exemplo, os gânglios lin-fáticos regionais no caso de carcinomas na cabeça e pes-coço incluem gânglios linfáticos cervicais, gânglios lin-fáticos prelaringeais, gânglios linfáticos justa-esofa-geais pulmonares, e gânglios linfáticos submandibulares.Os gânglios linfáticos regionais para carcinomas de teci-do mamário incluem os gânglios axilares e intercostais. 0termo "externo a neoplasma primário" significa que o es-pécime é tomado de um sítio diferente de outro diretamen-te do próprio neoplasma. Este espécime pode ser utilizá-vel na avaliação de se ocorreu ou não a metástase de neo-plasma primário.

O processo também pode ser usado para detectaruma seqüência de nucleotídeos hipermutável com um tumorprimário por teste da margem de tumor circundante. Comousado aqui, o termo "margem de tumor" refere-se ao tecidocircundando um tumor discernível. No caso de remoção ci-rúrgica de um tumor sólido, a margem de tumor é o tecidocortado fora com o tumor discernível que geralmente pare-ce ser normal a olho nu. Mais particularmente, como usadoaqui, "margem" refere-se a a borda, ou limites de um tu-mor. A margem geralmente se estende de cerca de 0,2 cm acerca de 3 cm do tumor primário mas pode ser maior depen-dendo do tamnho do tumor sólido primário.

Em seu sentido mais amplo, a presente invençãopermite a detecção de qualquer seqüência de ácido nucléi-co alvo hipermutável de relevância diagnostica ou tera-pêutica, onde a seqüência de ácido nucléico alvo estápresente em uma amostra de tecido. A seqüência de nucleo-tídeos alvo pode ser, por exemplo, um polimorfismo decomprimento de fragmento de restrição (RFLP), deleção denucleotideo, adição de nucleotídeo, ou qualquer outra se-qüência de ácido nucléico de mamíferos de interesse emtais espécimes de tecido. Preferivelmente, o ácido nu-cléico hipermutável de microsatélite da invenção contémdeleções ou adições de ácido nucléico.

Os microsatélites hipermutáveis mais preferidosno processo da invenção compreendem a seqüência (X)n, emque X é o número de nucleotídeos na seqüência de repeti-ção e é maior do que ou igual a 1, preferivelmente maiorque ou igual a 2, e mais pref erivelmente maior que ouigual a 3 e em que η é o número de repetições e é maiordo que ou igual a 2, e pref erivelmente de 4 a 6. Preferi-velmente, quando X é 2, a seqüência de nucleotídeos é TC.Preferivelmente, quando X é 3, a seqüência de nucleotí-deos é selecionada dentre AGC, TCC, CAG, CAA e CTG. Pre-ferivelmente, quando X é 4, a seqüência de nucleotídeos éselecionada dentre AAAG, AGAT e TCTT.

A seqüência de ácido nucléico hipermutável épreferivelmente associada com um local conhecido. Porexemplo, as alterações de microsatélite hipermutáveis po-dem ser detectadas usando um marcador selecionado dentreARA (cromossomo X), D14S50 (cromossomo 14), AR (cromosso-mo X), MD (cromossomo 19), SAT (cromossomo 6),DRPLA (cro-mossomo 12) , ACTBP2 (cromossomo 6) , FGA (cromossomo 4) ,D4S243 (cromossomo 4) e UT762 (cromossomo 21) . As se-qüências de repetição em tandem foram identificadas comoassociadas com doença de Huntington, (HD), síndrome doX frágil (FX), distrofia miotônica (MD), ataxia espinocerebelar I (SCAl), distrofia muscular espino-bulbar,e atrofia de dentatorubralpalidoluisiano hereditário(DRPLA). Quando a seqüência de nucleotídeos de X é maior,é mais provável que o local de microsatélite terá altera-ções, por exemplo uma repetição de tri-nucleotídeos émais provável para ter deleções ou adições do que a repe-tição de di-nucleotídeo. Assim, na presente invenção, ve-rificou-se que 8% de 25 marcadores de tri-nucleotídeos outetra-nucleotídeos demonstraram alterações de microsaté-lites por 100 espécimes de tumor examinados, enquanto so-mente 0,7% de 83 marcadores de microsatélite de di-nucleotídeos foram encontrados como contendo alterações.Além disso, verificou-se que uma repetição regular, comoAAT AAT AAT é mais provável de ser hipermutável do queuma seqüência que contém interrupções na seqüência de re-petição, por exemplo AAT GAC AAT AAT. Conseqüentemente,os versados na arte podem prontamente identificar as se-qüências de ácido nucléico alvo hipermutável por conside-ração do tamanho da seqüência de candidato e se a seqüên-cia é interrompida sem recorrer a experimentação indevi-da. Outros marcadores de microsatélites serão conhecidospelos critérios aqui descritos e são acessíveis aos ver-sados na arte. Os marcadores de microsatélites menoresincluindo repetições de di-nucleotídeos e mono-nucleotídeos podem ser hipermutáveis e utilizáveiks paraesta análise.

A presente invenção identifica seqüências alvohipermutáveis, preferivelmente locais de microsatélites,que são singulares a um distúrbio proliferativo celular,tumor primário, ou sítios metastáticos derivados de tumorprimário. Na célula de tumor, a seqüência de nucleotídeoshipermutável é evidenciada por deleções de ácido nucléicoou expansão de seqüência de repetição como comparado comuma célula normal; assim, é possível projetar técnicasdiagnosticas apropriadas dirigidas à seqüência específicae a projetar estratégias terapêuticas uma vez a seqüênciaé identificada.

O termo "distúrbio proliferativo celular" denotapopulações de células malignas que morfologicamente comfreqüência parecem diferir de tecido circundante. Porexemplo, o processo da invenção é utilizável na detecçãode malignidades de vários sistemas de orgãos, como, porexemplo, pulmão, mama, linfóide, gastrointestinal, e tra-to genito-urinário, assim como carcinomas epiteliais, queincluem malignidades como cânceres de cólon, carcinoma decélula renal, câncer de próstata, carcinoma de célula nãopequena do pulmão, câncer de intestino delgado, câncer dacabeça e pescoço, câncer de estômago, câncer de bexiga,câncer de rim, câncer cervical, câncer do esofago, equalquer outro tipo de orgão que tem um fluido de drena-gem ou tecido acessível a análise. O processo da invençãoé também utilizável para detectar doenças proliferativasde células não malignas como adenomas de cólon, hiperpla-sia, displasia, e outras lesões "pré-malignas". Essenci-almente, qualquer distúrbio que é etiologicamente ligadoa um local de microsatélite hipermutável seria considera-do suscetível a detecção.

Quando se deseja ampliar a seqüência de nucleo-tídeo alvo antes da detecção, como uma seqüência de nu-cleotídeos hipermutável, isto pode ser obtido usando oli-gonucleotídeos que são iniciadores para ampliação. Osiniciadores de oligonucleotídeos são projetados com basena identificação de seqüência de ácido nucléico das regi-ões de flanco contígua com a seqüência de nucleotídeoshipermutável. Por exemplo, no caso de seqüência de ácidonucléico alvo hipermutável, os iniciadores de oligonucle-otídeos compreendem seqüências que são capazes de hibri-dizar com seqüências de nucleotídeos flanqueando os lo-cais de mutações, como as seguintes seqüências de nucleo-tídeos :a. 5'-CTT GTG TCC CGG CGT CTG-3'(SEQ ID NO: 1);

b. 5'-C AGC CCA GCA GGA CCA GTA-3'(SEQ ID NO: 2);

C. 5'-TGG TAA CAG TGG AAT ACT GAC-3'(SEQ ID NO: 3);

d. 5'-ACT GAT GCA AAA ATC CTC AAC-3'(SEQ ID NO: 4);

e. 5*-GA TGG GCA AAC TGC AGG CCT GGG AAG-3'(SEQ ID NO: 5);

f. 5'-GCT ACA AGG ACC CTT CGA GCC CCG TTC-3'(SEQ ID NO: 6);

g. 5'-GAT GGT GAT GTC TTG AGA CTG CTG-3'(SEQ ID NO: 7);

h. 5'-GAG CAT TTC CCC ACC CAC TGG AGG-3'(SEQ ID NO: 8);

i. 5'-GTT CTG GAT CAC TTC GCG GA-3'(SEQ ID NO: 9);

j. 5'-TGA GGA TGG TTC TCC CCA AG-3'(SEQ ID NO: 10);

k. 5*-AGT GGT GAA TTA GGG GTG TT-3'(SEQ ID NO: 11) ;

l. 5'-CTG CCA TCT TGT GGA ATC AT-3'(SEQ ID NO: 12);

m. 5'-CTG TGA GTT CAA AAC CTA TGG-31(SEQ ID NO: 13);

n. 5'-GTG TCA GAG GAT CTG AGA AG-3'(SEQ ID NO: 14);ο. 5'-GCA CGC TCT GGA ACA GAT TCT GGA-3'(SEQ ID NO: 15);

ρ. 5'-ATG AGG AAC AGC AAC CTT CAC AGC-3'(SEQ ID NO: 16);

q. 5'-TCA CTC TTG TCG CCC AGA TT-3'(SEQ ID NO: 17) ;

r. 5'-TAT AGC GGT AGG GGA GAT GT-3'(SEQ ID NO: 18);

s. 5'-TGC AAG GAG AAA GAG AGA CTG A-3'(SEQ ID NO: 19) ;

t. 5'-AAC AGG ACC ACA GGC TCC TA-3'(SEQ ID NO: 20) ; e

u. seqüências complementares a seqüências a.a t.

Os iniciadores que hibridizam estas seqüênciasflanço são, por exemplo, os seguintes:

a. 5'-CAG ACG CCG GGA CAC AAG-3'(SEQ ID NO: 21) ;

b. 5'-TAC TGG TCC TGC TGG GCT G-3'(SEQ ID NO: 22);

c. 5'-GTC AGT ATT ACC CTG TTA CCA-3'(SEQ ID NO: 23);

d. 5'-GTT GAG GAT TTT TGC ATC AGT-3'(SEQ ID NO: 24) ;

e. 5'-CTT CCC AGG CCT GCA GTT TGC CCA TC-3'(SEQ ID NO: 25) ;

f. 5'-GAA CGG GGC TCG AAG GGT CCT TGT AGC-3'(SEQ ID NO: 26) ;g. 5'-CAC CAG TCT CAA CAC ATC ACC ATC-3'(SEQ ID NO: 27);

h. 5'-CCT CCA GTG GGT GGG GAA ATG CTC-3'(SEQ ID NO: 28);

i. 5'TCC GCG AAG TGA TCC AGA AC-3'

(SEQ ID NO: 29) ;j. 5*-CTT GGG GAG AAC CAT CCT CA-3'

(SEQ ID NO: 30) ;k. 5'-AAC ACC CCT AAT TCA CCA CT-3'(SEQ ID NO: 31) ;

l. 5'-CCA TAG GTT TTG AAC TCA CAG-3'(SEQ ID NO: 32);

m. 5'-CCA TAG GTT TTG AAC TCA CAG-3"(SEQ ID NO: 33) ;

n. 5'-CTT CTC AGA TCC TCT GAC AC-3'(SEQ ID NO: 34);

o. 5'-TCC AGA ATC TGT TCC AGA GCG TGC-3'(SEQ ID NO: 35) ;

p. 5'-GCT GTG AAG GTT GCT GTT CCT CAT-3'(SEQ ID NO: 36);

q. 5'-AAT CTG GGC GAC AAG AGT GA-3'(SEQ ID NO: 37);

r. 5'-ACA TCT CCC CTA CCG CTA TA-3'(SEQ ID NO: 38);

S. 5'-TCA GTC TCT CTT TCT CCT TGC A-3'(SEQ ID NO: 39);

t. 5'-TAG GAG CCT GTC GTC CTG TT-3"(SEQ ID NO: 40); eu. seqüências complementares a seqüências a.a t.

Um versado na arte será capaz de gerar iniciado-res apropriados para ampliar as seqüências alvo de ácidosnucléicos adicionais, como os locais de flanço de seqüên-cias de microsatélites conhecidas, usando rotinas conhe-cidas na arte e os ensinamentos desta invenção.

Em geral, os iniciadores usados de acordo com oprocesso da invenção englobam oligonucleotídeos de com-primento suficiente e seqüência apropriada que proveeminiciação específica de polimerização de um número signi-ficante de moléculas de ácido nucléico contendo o ácidonucléico alvo sob as condições de severidade para a rea-ção usando os iniciadores. Deste modo, é possível ampliarseletivamente a seqüência de ácido nucléico alvo espe-cífico contendo o ácido nucléico de interesse. Especi-ficamente, o termo " iniciador" como usado refere-se auma seqüência compreendendo dois ou mais deoxinucleotí-deos ou ribonucleotídeos, preferivelmente pelo menosoito, cuja seqüência é capaz de iniciar a síntese de umproduto de extensão de iniciador que é substancialmentecomplementar a um filamento de ácido nucléico alvo. 0iniciador de oligonucleotídeo tipicamente contém 15-22ou mais nucleotídeos, apesar de poder conter menos nu-cleotídeos desde que o íons magnésio seja de especifi-cidade suficiente para permitir essencialmente somentea ampliação de seqüência de nucleotídeo alvo especifi-camente desejada (isto é, o iniciador é substan-cialmente complementar.

As condições experimentais que conduzem a sínte-se incluem a presença de trifosfatos de nucleosídeos e umagente para polimerização, como polimerase de DNA, e umpH e temperatura apropriados. 0 iniciador é preferivel-mente de filamento único para eficácia máxima em amplia-ção, mas pode ser de filamento duplo. Se de filamento du-plo, o iniciador é primeiro tratado para separar seus fi-lamentos antes de ser usado para preparar os produtos deextensão. Preferivelmente, o iniciador é um oligo-deoxiribonucleotideo. 0 iniciador deve ser suficientemen-te longo para iniciar a síntese de produtos de extensãona presença de agente indutor para polimerização. O com-primento exato do iniciador irá depender de muitos fato-res, incluindo temperatura, tampão, e composição de nu-cleotídeo.

Os iniciadores usados de acordo com a o processoda invenção são projetados para serem "substancialmente"complementares a cada filamento de seqüência de nucleotí-deo mutante a ser ampliado. Substancialmente complementarsignifica que os iniciadores devem ser suficientementecomplementares para hibridizar com seus filamentos res-pectivos sob condições que permitem ao agente a polimeri-zação funcionar. Em outras palavras, os iniciadores devemter suficiente complementariedade com as seqüências deflanco para hibridizar com e permitir ampliação da se-qüência de nucleotídeos. Preferivelmente, o término 3' doiniciador que é estendida tem uma perfeita complementar!-edade de pares de bases com o filamento de flanco comple-mentar.

Os iniciadores de oligonucleotídeos usados deacordo com a invenção são empregados em qualquer processode ampliação que produz aumentadas quantidades de ácidonucléico alvo. Tipicamente, um iniciador é complementar afilamento negativo (-) da seqüência de nucleotídeo mutan-te e o outro é complementar ao filamento (+) positivo. Arecombinação de iniciadores para ácido nucléico desnatu-rado seguido por extensão com uma enzima, como o fragmen-to grande de polimerase I (Klenow) ou polimerase de DNATAQ e nucleotídeos ou ligases, resulta em filamentos (+)e (-) recentemente sintetizados contendo o ácido nucléicoalvo. Porque estes ácidos nucléicos recentemente sinteti-zados são também gabaritos, ciclos repetidos de desnatu-ração, recombinação de iniciador, e extensão resulta emprodução exponencial da região (isto é, a seqüência denucleotídeos hipermutável alvo) definida pelo iniciador.O produto da reação de ampliação é um duplex de ácido nu-cléico discreto com términos correspondendo às termina-ções dos iniciadores específicos empregados. Os versadosna arte sabem que outras metodologias de ampliação quetambém podem ser utilizadas para aumentar o número de có-pias de ácido nucléico alvo.

Os iniciadores de oligonucleotídeos para uso nainvenção podem ser preparados usando qualquer processoapropriado, como processos fosfotriéster convencional efosfodiéster convencional ou formas de realização automa-tizadas dos mesmos. Em tal forma de realização automati-zada, fosforamiditos de dietila são usados como materiaisde partida e podem ser sintetizados como descrito por Be-aucage et al (Tetrahedron Letters, 22: 1859-1862, 1981) .

Um processo para sintetizar oligonucleotídeos em um su-porte sólido modificado é descrito na patente US4.458.066. Um processo de ampliação que pode ser usado deacordo com a invenção é a reação de cadeia polimerase(PCR) descrita nas patentes US n°s 4.683.202 e 4.683.195.

O ácido nucléico de qualquer espécime, em formapurificada ou não purificada, pode ser utilizado como umácido nucléico de partida, ou ácidos, desde que contenhaou se suspeita contenha, a seqüência de ácido nucléicoespecífica, contendo o ácido nucléico alvo. Assim, o pro-cesso pode empregar, por exemplo DNA ou RNA, incluindoRNA mensageiro (mRNA) , em que DNA ou RNA pode ser de fi-lamento simples ou filamento duplo. No caso que o RNAdeve ser usado como um gabarito, e/ou condições 'toimaspara transcrição reversa, o gabarito para DNA deve serusado. Além disso, um híbrido DNA-RNA que contém um fila-mento de cada pode ser usado. Uma mistura de ácido nu-cléico também pode ser usada, ou os ácidos nucléicos pro-duzidos em uma reação de ampliação anterior, usando omesmo ou diferentes iniciadores também podem ser usados.A seqüência de nucleotídeos mutantes a ser ampliada podeser uma fração de uma molécula maior ou pode estar pre-sente inicialmente como uma molécula discreta, de modoque a seqüência específica constitui todo o ácido nucléi-co. Não é necessário que a seqüência seja ampliada paraestar presente inicialmente em forma pura; ela pode seruma fração menor de uma mistura complexa, como contido emDNA humano completo.

Onde a seqüência de nucleotídeo neoplástica alvoda amostra contém dois filamentos, é necessário separaros filamentos do ácido nucléico antes de poder ser usadocomo o gabarito. A separação de filamentos pode ser efe-tuada seja como uma etapa separada ou simultaneamente coma síntese dos produtos de extensão do iniciador. Esta se-paração de filamentos pode ser obtida usando várias con-dições de desnaturação apropriadas, incluindo meios físi-cos, químicos ou enzimáticos; a palavra "desnaturante"inclui todos estes significados. Um processo físico deseparar filamentos de ácido nucléico envolve aquecer oácido nucléico até ele desnaturar. A desnaturação térmicatípica pode envolver temperaturas na faixa de cerca de80°C a 105°C por tempos na faixa de cerca de 1 a 10 minu-tos. A separação de filamentos também pode ser induzidapor uma enzima da classe de enzimas conhecida como heli-cases ou pela enzima RecA, que tem atividade helicase, ena presença de riboATP que é conhecido como desnaturandoDNA. As condições de reação apropriadas para separação defilamentos de ácidos nucléicos com helicases são descri-tas por Kuhn Hoffmann-Berling (CSH-Quantitative Biology,43: 63, 1978) e técnicas para uso de RecA são estudadasem C. Radding (Ann. Rev. Genetics, 16: 405-437, 1982).

Se o ácido nucléico contendo o ácido nucléicoalvo a ser ampliado for de filamento único, seu comple-mento é sintetizado por adição de um ou dois iniciadoresde oligonucleotídeos. Se se usar um único iniciador, umproduto de extensão de iniciador é sintetizado na presen-ça de um iniciador, um agente para polimerização, e osquatro trifosfatos de nucleosídeo descritos abaixo. 0produto será complementar ao ácido nucléico de filamentoúnico e irá hibridizar com um ácido nucléico de filamentoúnico para formar um duplex de filamentos de comprimentodesigual que pode ser então separado em filamentos únicospara produzir os dois filamentos complementares separadosúnicos. Alternativamente, dois iniciadores podem ser adi-cionados ao ácido nucléico de filamento único e a reaçãorealizada como descrito.

Quando filamentos complementares de ácido nu-cléico ou ácidos são separados, sem levar em conta se oácido nucléico foi originalmente de filamentos duplo ouúnico, os filamentos separados estão prontos para seremusados como um gabarito para a síntese de filamentos deácido nucléico adicionais. Esta síntese é realizada sobcondições permitindo a hibridização de iniciadores paragabaritos. Em geral, a síntese ocorre em uma soluçãoaquosa tamponada, preferivelmente a um pH de 7-9, maispreferivelmente de cerca de 8. Preferivelmente, um exces-so molar (de ácido nucléico genômico, usualmente a cercade 10^8: 1 iniciador/gabarito) de dois iniciadores de oli-gonucleotídeos é adicionado para o tampão contendo os fi-lamentos de gabarito separados. Entende-se no entanto quea quantidade de filamento complementar pode não ser co-nhecida se o processo da invenção for usado para aplica-ções diagnosticas, de modo que a quantidade de iniciadorcom relação à quantidade de filamento complementar nãopode ser determinada com certeza. Como uma matéria práti-ca, no entanto, a quantidade de iniciador adicionada irágeralmente estar em excesso molar sobre a quantidade defilamento complementar (gabarito) quando a seqüência aser ampliada está contida em uma mistura de filamentos deácido nucléico de cadeia Ioga complicada. Um grande ex-cesso molar é preferido para melhorar a eficácia do pro-cesso.

Em algumas formas de realização de ampliação, ossubstratos, por exemplo os trifosfatos de deoxiribonucle-otideo dATP, dCTP, dGTP e dTTP, são adicionados à misturade síntese, seja separadamente, seja junto com os inicia-dores, em quantidades apropriadas e a solução resultanteé aquecida a cerca de 90°C -IOO0C de cerca de 1 a 10 mi-nutos, preferivelmente de 1 a 4 minutos. Após este perío-do de aquecimento, a solução é deixada resfriar em tempe-ratura ambiente, que é preferível para a hibridização doiniciador. À mistura resfriada, adiciona-se um agenteapropriado para efetuar a reação de extensão de iniciador(chamado agente "agente para polimerização"), e a reaçãoé deixada ocorrer sob condições conhecidas na arte. 0agente para polimerização também pode ser adicionado jun-to com os outros reagentes se for estável em calor. Estareação de síntese (ou ampliação) pode ocorrer em tempera-tura ambiente até uma temperatura acima da qual o agentepara polimerização não funciona mais. Assim, por exemplo,se a polimerase de DNA fora usada com o agente, a tempe-ratura é geralmente não maior que cerca de 40°C.

O agente para polimerização pode ser qualquercomposto ou sistema que irá funcionar para obter a sínte-se de produtos de extensão de iniciador, incluindo enzi-mas. As enzimas apropriadas para este fim incluem, porexemplo, polimerase de DNA de E. coli I, polimerase Taq,fragmento Klenow de polimerase de DNA de E. coli I, poli-merase de DNA T4, outras polimerases de DNA disponíveis,muteínas de polimerase, transcriptase reversa, ligase, eoutras enzimas, incluindo enzimas estáveis a calor (istoé, as enzimas que desempenham extensão de iniciador apósserem submetidas a temperaturas suficientemente elevadaspara provocar desnaturação) . As enzimas apropriadas irãofacilitar a combinação dos nucleotídeos de modo apropria-do para formar os produtos de extensão de iniciador quesão complementares a cada filamento de nucleotídeo mutan-te. Em geral, a síntese será iniciada a terminação 3' decada iniciador e prosseguir na direção 5' ao longo do fi-lamento de gabarito, até a síntese terminar, produzindomoléculas de diferentes comprimentos. Pode-se ter agentespara polimerização, no entanto, que iniciam a síntese naterminação 5' e prosseguem na outra direção, usando omesmo processo que descrito acima. Em qualquer evento, oprocesso da invenção não é limitado às formas de realiza-ção de ampliação que são aqui descritas.

O filamento de nucleotideo mutante recentementesintetizado e seu filamento de ácido nucléico complemen-tar irão formar uma molécula de filamento duplo sob con-dições de hibridização como descrito acima e este híbridoé usado em etapas subseqüentes do processo. Na próximaetapa, a molécula de filamento duplo recentemente sinte-tizada é submetida a condições de desnaturação usandoqualquer um dos procedimentos descritos acima para provermoléculas de filamento único.

O processo acima é repetido nas moléculas de fi-lamento único. Agente adicional para polimerização, nu-cleotídeos, e iniciadores pode ser adicionado, se neces-sário, para a reação prosseguir sob as condições descri-tas acima. Novamente, a síntese será iniciada em uma ter-minação de cada um dos iniciadores de oligonucleotídeos eirá prosseguir junto com os filamentos simples do gabari-to para produzir ácido nucléico adicional. Após esta eta-pa, metade do produto de extensão irá consistir da se-qüência de ácido nucléico específica ligada pelos doisiniciadores.

As etapas de desnaturação e síntese de produtode extensão pode ser repetida na freqüência necessáriapara ampliar a seqüência de nucleotídeos hipermutável demarcação na extensão necessária para detecção. A quanti-dade de seqüência de ácido nucléico hipermutável produzi-da irá se acumular em um modo exponencial.Em uma forma de realização da invenção, uma com-binação de marcadores de microsatélite hipermutável é am-pliada em uma única reação de ampliação. Os marcadoressão "multiplexados"em uma única reação de ampliação, porexemplo por combinação de iniciadores em mais de um lo-cal. Por exemplo, DNA de uma amostra de urina é ampliadocom três diferentes conjuntos de iniciador rotulados ale-atoriamente como FGA, ACTBP2 e AR, na mesma reação de am-pliação. Os produtos são por fim separados em um gelacrilamida desnaturante e então expostos a filme para vi-sualização e análise.

O produto ampliado pode ser detectado por análi-se de southern blot, sem usar sondas radioativas. Em talprocesso, por exemplo, uma amostra pequena de DNA conten-do um nível muito baixo de seqüência de nucleotídeo hi-permutável em microsatélite é ampliada e analisada viavima técnica de southern blot. 0 uso de sondas não radioa-tivas ou rótulos é facilitado pelo alto nível de sinalampliado. Em uma forma de realização preferida da inven-ção, um trifosfato de nucleosideo é rotulado de modo ra-dioativo, assim permitindo visualização direta do produtode ampliação por auto-radiografia. Em outra forma de rea-lização, os iniciadores de ampliação são rotulados fluo-rescentes e ciclados através de um sistema de eletrofore-se. A visualização de produtos ampliados é por detecção alaser seguido por exibição gráfica auxiliada por computador.

Os ácidos nucléicos tendo uma seqüência de mi-crosatélite hipermutável detectada no processo da inven-ção podem ser ainda avaliados, detectados, clonados, se-quenciados e outros, ou em solução, ou após ligação a umsuporte sólido, por qualquer processo geralmente aplicadoà detecção de uma seqüência de DNA específica como PCR,restrição de oligômero (Saiki, et al., Bio/Technology, 3:1008-1012, 1985), análise de sonda (ASO) de oligonucleo-tídeo específica para alelo (Conner, et al. , Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 80.: 278, 1983), testes de ligação de oli-gonucleotídeo (OLAs) (Landegren, et al. , Science, 241:1077, 1988), e outros. As técnicas moleculares para aná-lise de DNA foram estudadas (Landegren, et al. , Science,242 : 229-237, 1988).

Em outra forma de realização da invenção, osfragmentos de ácido nucléico purificados que contém se-qüências de oligonucleotídeos de 10-50 bases de locais demicrosatélite, são rotulados de modo radioativo. As pre-parações rotuladas são usadas para sondar ácido nucléicopela técnica de hibridização Southern. Os fragmentos denucleotídeos de um espécime, antes ou após ampliação, sãoseparados em fragmentos de diferentes massas moleculares,por eletroforese de gel e transferidos para filtros queligam ácido nucléico. Após exposição à sonda rotulada,que irão hibridizar em fragmentos de nucleotídeos, con-tendo seqüências de ácido nucléico alvo, a ligação dasonda radioativa para marcar fragmentos de ácido nucléicoé identificada por auto-radiografia (ver Genetic Enginee-ring, 1, ed. Robert Williamson, Academic Press,(1981), 72-81).

As sondas para locais de microsatélite da pre-sente invenção podem ser usadas para examinar a distribu-ição dos fragmentos específicos detectados, assim como ograu quantitativo (relativo) de ligação da sonda para de-terminar a ocorrência de seqüências de ligação fortementeespecífica (hibridização), assim indicando a presença dealterações extensivas em um local particular.

Na maior parte, a sonda (ou iniciador de amplia-ção) será rotulada com um átomo ou radical inorgânico,mais comumente usando radionuclídeos, mas também talvezmetais pesados. Convenientemente, um rótulo radioativopode ser empregado. Os rótulos radioativos incluem P,I, H, C, S, ou outro. Qualquer rótulo radioativopode ser empregado que provê um sinal adequado e tem su-ficiente meia-vida. Outros rótulos incluem ligandos, quepodem servir como um elemento de par de ligação específi-co para um ligando rotulado, e outros. Uma ampla varieadede rótulos foi empregada em imuno-testes que podem serprontamente empregados no presente teste. A escolha dorótulo será governada pelo efeito do rótulo na taxa dehibridização e a ligação da sonda a seqüência de nucleo-tídeo mutante. Será necessário que o rótulo forneça sen-sibilidde suficiente para detectar a quantidade de se-qüência de nucleotídeo mutante disponível para hibridiza-ção. Outras considerações serão a facilidade de sínteseda sonda, instrumentação prontamente disponível, capaci-dade para automatizar, conveniência e outros.O modo em que o rótulo é ligado à sonda irá va-riar dependendo da natureza do rótulo. Para um rótulo ra-dioativo, podem-se empregar várias técnica. Comumente em-

pregada é a tradução "nick" com ^32 um a- P-dNTP ou hidróli-se de fosfato terminal com fosfatase alcalina seguido porrotulação com^32 P empregando γ- ^32 P-ATP e quinase de po-linucleotideo T4. Alternativamente, os nucleotideos podemser sintetizados onde um ou mais dos elementos presentessão substituídos com um isótopo radioativo, por exemplohidrogênio com trítio. Se desejado, filamentos rotuladoscomplementares podem ser usados como sondas para melhorara concentração de rótulo hibridizado.

Quando estão envolvidos outros rótulos radionu-clideos, vários grupos de ligação podem ser empregados.

Uma hidroxila terminal pode ser esterifiçada, com ácidosinorgânicos, por exemplo ^32P fosfato, ou ácidos orgânicos14C, ou onde esterifiçados para prover grupos de ligaçãopara o rótulo. Alternativamente, bases intermediárias po-dem ser substituídas com grupos de ligação ativáveis, quepodem então ser ligados a um rótulo.

Enzimas de interesse como grupos repórter serãoprimariamente fosfatase alcalina, hidrolases, particular-mente esterases e glicosidases, ou oxidoreductases, par-ticularmente peroxidases. Os compostos fluorescentes in-cluem fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus de-rivados, dansila, umbeliferona e assim em diante. Os qui-mico-luminescentes incluem, por exemplo, luciferina, e2,3-di-hidroftalazinodionas (por exemplo luminol).

Uma sonda de oligômero pode ser empregada parahibridização a uma seqüência de nucleotideo fixada em umsuporte poroso insolúvel em água. Dependendo da fonte doácido nucléico, o modo em que o ácido nucléico é fixadono suporte pode variar. Os versados na arte sabem, ou po-dem verificar com facilidade, diferentes suportes que po-dem ser usados no processo da invenção.

0 ácido nucléico de um espécime é colocado empontos ou espalhado sobre um filtro para prover uma plu-ralidade de porções individuais. 0 filtro é um suportesólido poroso inerte, por exemplo membranas de náilon ounitro celulose. Qualquer uma das células de mamíferospresentes no espécie é tratada para liberar seu ácido nu-cléico. A Iise e desnaturação de ácido nucléico, assimcomo as lavagens subseqüentes, podem ser obtidas com umasolução apropriada durante um tempo suficiente para lisaras células e desnaturar o ácido nucléico. Outros agentesde desnaturação incluem temperaturas elevadas, reagentesorgânicos, (por exemplo álcoois, amidas, aminas, uréias,fenóis e sulfóxidos), ou alguns íons inorgânicos (porexemplo tiocianato e perclorato). Alternativamente, ácidonucléico pode ser isolado de sangue usando procedimentospadrões com o DNA subseqüentemente aplicado à membrana.

Após desnaturação, o filtro é lavado em uma so-lução tamponada aquosa, como Tris, geralmente a um pH decerca de 6 a 8, geralmente 7. Uma ou mais das lavagenspode estar envolvida, convenientemente usando o mesmoprocedimento que empregado para a Iise e desnaturação.Após a Iise, desnaturação e lavagens foramobtidos, o fil-tro manchado com ácido nucléico é secado em temperaturaelevada, geralmente de cerca de 5O0C a 70°C ou reticuladopor UV (para membranas de náilon). Sob este procedimento,o ácido nucléico é fixado em posição e pode ser testadocom a sonda quando conveniente.

A pré-hibridização pode ser obtida por incubaçãodo filtro em uma temperatura suavemente elevada duranteum tempo suficiente com a solução de hibridização sem asonda para umedecer completamente o filtro. Várias solu-ções de hibridização podem ser empregadas, compreendendode cerca de 20 a 60% do volume, preferivelmente 30%, deum solvente orgânico polar, inerte, ou soluções de hibri-dização aquosas.

A técnica de hibridização particular não é es-sencial à invenção. Outras técnicas de hibridização sãobem conhecidas ou facilmente verificadas pelo versado naarte. À medida que melhoras são feitas nas técnicas dehibridização, elas podem ser prontamente aplicadas noprocesso da invenção.

A quantidade de sonda rotulada que está presentena solução de hibridização irá variar amplamente, depen-dendo da natureza do rótulo, a quantidade de sonda rotu-lada, que pode razoavelmente se ligar ao filtro, e a se-veridade da hibridização. Em geral, excesso substancialsobre as concentrações estequiométricas da sonda será em-pregado para melhorar a taxa de ligação ea sonda ao ácidonucléico alvo fixo.

Vários graus de estringência de hibridização po-dem ser empregados. Quanto mais severas as condições,maior a complementaridade que é requerida para hibridiza-ção entre a sonda e a seqüência de ácido nucléico alvo defilamento único para formação duplex. A severidade podeser controlada por temperatura, concentração de sonda,comprimento da sonda, resistência iônica, tempo e outros.De modo conveniente, a severidade da hibridização é vari-ada por mudança da polaridade da solução de reagente pormanipulação da concentração de formamida na faixa de 2 0%a 50%. As temperaturas empregadas estarão normalmente nafaixa de cerca de 20°C a 80°C, geralmente 30°C a 75°C(ver, geralmente, Current Protocole iniciador MolecularBiology, Ausubel ed. Wiley & sons, 1989) . Alternativamen-te, a severidade pode ser controlada quando a sonda nãorecombinada é lavada.

Após o filtro ter sido contatado com um soluçãode hibridização em uma temperatura moderada durante umperíodo de tempo suficiente para permitir a ocorrência dahibridização, o filtro é então introduzido em uma segundasolução tendo cloreto de sódio, citrato de sódio, e dode-cilsulfato de sódio. 0 tempo pelo que o filtro é mantidona segunda solução pode variar de 5 minutos a 3 horas oumais. A segunda solução e a temperatura (geralmente 5°Cabaixo da temperatura de fusão) determina a estringência,dissolução de duplexes, e seqüências complementares cur-tas. Para sondas de oligonucleotídeos curtas, a tempera-tura de fusão pode ser padronizada de acordo com o com-primento da sonda, em vez da seqüência, por inclusão decloreto de amônio tetrametila na solução de lavagem (Di-Lella e Woo, Meth. Enzymol. 152: 447, 1987). 0 filtropode agora ser testado pela presença de duplexes de acor-do com a natureza do rótulo. Quando o rótulo é radioati-vo, o filtro é secado e exposto a filme de raios-X.

Os materiais para uso no teste da invenção sãoapropriados de modo ideal para a preparação de um estojo.Este estojo pode compreende um dispositivo de veículosendo compartimentalizado para receber em confinamentoíntimo um ou mais dispositivos de recipiente como frascospequenos, tubos e outros, cada um dentre os dispositivosde recipiente compreendendo um dos elementos separados aserem usados no processo.

Por exemplo, um dos dispositivos de recipientepode compreender iniciadores de ampliação para um local demicrosatélite ou uma sonda de hibridização, todos sendorotulados de modo detectável. Se presente, um segundo reci-piente pode compreende um tampão de Iise. 0 estojo tambémpode ter recipientes contendo nucleotídeo(s) para ampliaçãoda seqüência de ácido nucléico alvo que pode ou não serrotulada e/ou um recipiente compreendendo um dispositivode repórter, como proteína ligando a biotina, como avidinaou estreptavidina, ligado a uma molécula repórter, como umrótulo enzimático, fluorescente ou radionuclídeo.

A descrição acima geralmente descreve a presenteinvenção. Uma compreensão mais completa pode ser obtida porreferência aos seguintes exemplos específicos que são pro-vidos aqui para fins de ilustração somente e não se desti-nam a limitar o escopo da invenção.

EXEMPLOS

Durante estudos de mapeamento primário usando 43marcadores de di-nucleotídeos em mais de 300 tumores, in-cluindo SCC, carcinoma de pulmão de célula não pequena(NSCLC), carcinoma de célula transcional da bexiga (TCC),e carcinoma da pele de célula escamosa e basal, altera-10 ções somáticas únicas foram observadas em aproximadamente0,7% do DNA do tumor. Esta baixa taxa de alterações de"fundo" em marcadores de di-nucleotídeos é consistentecom outros estudos demonstrando algumas mudanças em tumo-res não associados com HNPCC (S. N. Thibodeau, et al. ,Science, 260: 816, 1993; J. I. Risinger, et al. , CâncerRes., 53.: 5100, 1993; H-J. Han, et al. , Câncer Res., 53:5087, 1993); P. Peltomaki, et al. , Câncer Res., .53.: 5853,1993); M. Gonzalez-Zulueta, et al., Câncer Res., 53:5620, 1993; R. Wooster, et al. , Nature Gent., 6: 152,1994) e DNA embrionário (J. L. Weber et al., Am. J. HumanGenet., 44: 388, 1989), J. Weissenback, et al. , Nature,359: 794, 1992; (A. J. Jeffreys, et al. , Nature Genet.,6: 136, 1994). 35 SCC, 20 NSCLC, 10 SCLC, e 32 TCC paresde DNA com câncer e normal foram testados usando marcado-res tri- e tetra-nucleotídeos (TABELA 1). Dentre estes,aproximadamente 8% e 20% de DNA de tumor tinha alteraçõessomáticas usando marcadores de tri- e tetra-nucleotídeos,respectivamente. Dentre os nove marcadores, quatro (MD,DRPLA, AR (SBMA) , e SAT (SCAl)) foram associados com do-ença neurológica e tem expansão embrionária revelada desuas seqüências de repetição em pacientes afetados. Devi-do a estas alterações embrionárias, pensa-se que estesmarcadores podem ser mais suscetíveis a expansão ou dele-ção em DNA de tumor como comparado com seqüências de re-petição de di-nucleotideos. Os outros marcadores foramescolhidos dentre marcadores de repetição de tri- ou te-tra-nucleotídeos comercialmente disponíveis exceto paraUT762 (em cromossomo humano 21) que foi previamente des-crito como tendo um excesso de alterações embrionárias emcromossomo humano 21 (C. C. Talbot, Jr., et al. , 43rdAmerican Society of Human Genetics Meeting, Abstract,1993).

EXEMPLO 1

INICIADORES USADOS PARA AMPLIAÇÃO DE DNA DE ESPÉCIME

Todos os tumores foram congelados exceto SCLCque foi incrustado em parafina. 0 tecido não neoplásticofoi micro-dissecado para ser usado como DNA normal. Al-ternativamente, sangue novo foi obtido e linfócitos sepa-rados. 0 tecido normal de de tumor foi digerido com 1%SDS-proteinase K seguido por precipitação com etanol paraextrair DNA. 50 ngde DNA foram submetidos a ampliaçãoPCR, os produtos foram ciclados em géis acrilamida desna-turantes como previamente descrito (P. van der Riet, etal., Câncer Res., 54: 1156, 1994), H. Nawroz, P., CâncerRes., 54: 1152, 1994; P. Cairns, et al., Câncer Res., 54:1422, 1994).Os iniciadores usados para ampliar cada localforam obtidos de Research Genetics, Inc., exceto dos se-guintes locais:

a. 5'-CAG ACG CCG GGA CAC AAG-3'(SEQ ID NO: 21);

b. 5'-TAC TGG TCC TGC TGG GCT G-3'(SEQ ID NO: 22);

c. 5'-GTC AGT ATT ACC CTG TTA CCA-3'(SEQ ID NO: 23);

d. 5'-GTT GAG GAT TTT TGC ATC AGT- 3'(SEQ ID NO: 24);

e. 5'-CTT CCC AGG CCT GCA GTT TGC CCA TC-3'(SEQ ID NO: 25);

f. 5'-GAA CGG GGC TCG AAG GGT CCT TGT AGC-3'(SEQ ID NO: 26);

g. 5'-CAC CAG TCT CAA CAC ATC ACC ATC-3'(SEQ ID NO: 27);

h. 5'-CCT CCA GTG GGT GGG GAA ATG CTC-3'(SEQ ID NO: 28);

i. 5'TCC GCG AAG TGA TCC AGA AC-3'(SEQ ID NO: 29) ;

j. 5*-CTT GGG GAG AAC CAT CCT CA-3'(SEQ ID NO: 30) ;

k. 5'-AAC ACC CCT AAT TCA CCA CT-3'(SEQ ID NO: 31) ;

1. 5'-CCA TAG GTT TTG AAC TCA CAG-3'(SEQ ID NO: 32);

m. 5'-CCA TAG GTT TTG AAC TCA CAG-3'(SEQ ID NO: 33);

η. 5'-CTT CTC AGA TCC TCT GAC AC-3'(SEQ ID NO: 34);

o. 5'-TCC AGA ATC TGT TCC AGA GCG TGC-3'(SEQ ID NO: 35);

p. 5'-GCT GTG AAG GTT GCT GTT CCT CAT-3'(SEQ ID NO: 36) ;

q. 5'-AAT CTG GGC GAC AAG AGT GA-3'(SEQ ID NO: 37);

r. 5'-ACA TCT CCC CTA CCG CTA TA-3'(SEQ ID NO: 38);

s. 5'-TCA GTC TCT CTT TCT CCT TGC A-3'(SEQ ID NO: 39);

t. 5*-TAG GAG CCT GTC GTC CTG TT-3"(SEQ ID NO: 40); e

u. seqüências complementares a seqüências a. a t.

P. Modrich, Annu. Rev. Genet., 25: 229, (1991).

As amostras citológicas foram fiadas a 3000 χ g durante5', e lavadas duas vezes com PBS. As pelotas de célulasforam digeridas com 1% SDS-proteinase K, e DNA extraídocom previamente descrito (D. Sidransky, et al. , Science,252: 706, 1991), Science, 256: 102, 1992; DNA de margemcirúrgica foi obtido de lâminas que foram histopatologi-camente negativas. 0 tecido foi raspado e colocado em xi-Ieno para remover parafina em excesso. Após centrifugaçãocom um quarto de volume 70% de etanol, as pelotas foramdigeridas e DNA extraído como previamente descrito (D.Sidransky, supra, R. Η. Hruban, supra, L. Mao, supra).

EXEMPLO 2

DETECÇÃO DE ALTERAÇÕES EM LOCAIS DE MICROSATÉLITE

Cada local de microsatélite foi ampliado em DNAnormal/tumor em pares por PCR e produtos rotulados foramentão ciclados em géis acrilamida desnaturantes e expos-tos a filme. 29%de câncer da cabeça e do pescoço, 5% deNSCLC, 50% de SCLC, e 28% de tumores da bexiga demonstra-ram alterações de microsatélites em pelo menos um marca-dor suscetível (TABELA 1). Estas alterações genéticas fo-ram identificadas como uma nova banda (ou bandas) na tri-lha de DNA de tumor e não estavam presentes na trilha deDNA normal em pares (FIGURA 1) . FIGURA 1 mostra altera-ções em microsatélite em DNA de tumor. DNA de tumor enormal foi ampliado por PCR e ciclado em géis acrilamidadesnaturantes como descrito (P. van der Riet, supra). No-vas bandas representando deleção ou expansão de seqüên-cias de repetição em tandem foram vistas em todas as qua-tro trilhas de tumor como indicado pelas setas. Trilha 1)B17 (TCC) com marcador FGA em cromossomo 4; trilha 2) L21(SCLC) com marcador AR em cromossomo X; trilha 3) B30(TCC) com marcador UT762 em cromossomo 21, e trilha 4) L5(SCLC) com marcador D14S50 no cromossomo 14. (N: DNA nor-mal. T: DNA tumor).

Para cada caso, a ampliação foi repetida e asalterações reproduzidas. A freqüência de alterações foisignificativamente maior nestes marcadores de repetiçãode tri- ou tetra-nucleotídeos e também pareceu ser espe-cifico para tipo tumor (TABELA 1). Em TCC, por exemplo, arepetição AR é alterada em 3% dos tumores, enquanto 18%de SCCs demonstraram alterações neste local. Uma dife-rença significante na freqüência de alterações entre se-qüências de repetição de tri- e tetra-nucleotideos rela-cionadas com doença e não doença não foi observada suge-rindo que pode existir um mecanismo celular mais genera-lizado para estas mudanças, em vez de diferenças de se-qüência inerentes nas regiões de repetição.

SCLC demonstrou instabilidade de microsatélitegeneralizada similar à vista em tumores associados comHNPCC e alterou uma elevada porcentagem de todos os mar-cadores incluindo di-nucleotídeos (A. Merlo, et al. , supra).

Apesar da instabilidade de microsatélite difun-dida ter sido encontrada com maior freqüência em HNPCC,outros tumores não HNPCC contém alterações ocasionais.

Estas mudanças geralmente envolvem somente um local, emvez de locais múltiplos tipicamente vistos em pacientescom HNPCC (A. Merlo, et al. , supra; R. Wooster, et al.,supra). A instabilidade difundida encontrada em SCLC éuma exceção, e a base genética para isto é ainda desco-nhecida. Neste estudo, nenhum dos tumores que foram tes-tados foi associado a HNPCC. A comparação de repetição dedi-nucleotídeo (29 de 4171 testados) versus alterações derepetição de tri- ou tetra-nucleotideos (44 de 874 testa-dos) nestes 97 tumores revela uma suscetibilidade signi-ficante para instabilidade genética nos alelos maiores(ρ=0,08 χ 10 por X análises). A elevada freqüência dealterações de microsatélites encontrada sugere aqui quealguns locais podem ser inerentemente mais instáveis doque outros. 0 mecanismo produzindo os alelos alteradosnestes tumores pode diferir do descrito em HNPCC (F. Le-ach, et al., Cell, 75: 1215, 1993; R. Fishel, et al. ,Cell, 25: 1027, 1993) ou pode refletir defeitos mais su-tis em vias de reparo similares ou relacionadas (P. Mo-drich, Annu. Rev. Genet., 25: 229, 1991). A partir destesdados, parece que alterações de microsatélites ocasionaispodem ser um fenômeno relativamente geral em muitos cân-ceres humanos com alguns locais alterados em modo especi-fico para o tipo de tumor.<table>table see original document page 43</column></row><table>As alterações de microsatélites para cada marca-dor testado deu um número de alterações detectadas emcada tipo de tumor.

SCC: carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço,NSCLC: carcinoma de pulmão de célula não pequena,SCLC: carcinoma de pulmão de célula pequenaTCC: carcinoma de célula transcional da bexiga26 dentre 100 (26%) dos tumores no total demons-trou alterações em pelo menos um local

* Relacionado com a doença.

EXEMPLO 3

DETECÇÃO DE POPULAÇÕES CLONAIS DE CÉLULAS DERIVADASDE TUMOR

Estas alterações de microsatélite clonais foramestudadas para verificar se elas poderiam ser detectadasem amostras citológicas como marcadores específicos paratumores. Para demonstrar sua aplicação clínica em poten-cial, várias amostras citológicas correspondentes que fo-ram consideradas negativas para a presença de células decâncer por microscopia luminosa foram analisadas. QuandoDNA de B27 de tumor da bexiga foi triado com o marcadorde tetra-nucleotídeo FGA, uma nova banda foi identificadana trilha do tumor como comparado com o normal (FIGURA2A). FIGURA 2 mostra a detecção de alterações microsaté-lites clonais em amostras clínicas. As condições de PCR eanálise de gel foram descritas (P. van der Riet, et al. ,supra). Novas bandas são indicadas por setas, Painel A).

A amostra de urina citológica correspondente de B27 (TCC)foi analisada usando marcador FGA e comparada com DNA detumor e normal. Uma nova banda ou "trocada" é vista natrilha de tumor versus trilha normal e em uma intensidademenor, porém significante na trilha de urina. Painel (B),DNA linfocitico não foi disponível deste paciente, masuma banda clara é logo identificada na margem histológica"negativa"de L31 (NSCLC) que corresponde à banda novamais intensa na trilha de tumor quando triada com marca-dor AR. Painel (C), ampliação de marcador CHRNB; a amos-tra de catarro correspondente de L25 (SCLC) revelou duasbandas claras consistentes com as novas bandas na trilhade tumor.Estas bandas não estão presentes no DNA normal(N: DNA normal, U: urina DNA, T: tumor DNA, M: margemDNA, S: catarro (DNA).

O DNA obtido da amostra de urina dos pacientesantes da cirurgia foi triado com o mesmo marcador, reve-lando a mesma banda nova em uma menor intensidade no DNAda urina (D. Sidransky, et al., supra). A intensidade dabanda trocada foi de aproximadamente 5% da intensidade dabanda correspondente em DNA de tumor, indicando que so-mente uma pequena população de células na amostra de uri-na foi derivada de tumor. Um paciente com SCLC foi veri-ficado como tendo um novo alelo de CHRNB no DNA de tumorquando comparado com DNA normal. Quando DNA de uma amos-tra de escarro correspondente, coletada de modo prospec-tivo, foi triado com o marcador CHRNB, a mudança genéticaidêntica no DNA do escarro inicialmente encontrada noSCLC do paciente (FIGURA 2c). Novamente, a menor intensi-dade das novas bandas no catarro sugeriu que somente umafração pequena de células de can estava presente na amos-tra. Várias margens cirúrgicas histopatologicamente nega-tivas foram examinadas (D. Sidransky, et al., supra). 0DNA de tumor de L29 demonstra uma nova banda menor nomarcador de microtitulação IFN, quando DNA em pares deuma margem cirúrgica histologicamente negativa apresentoua mesma banda trocada em menor intensidade (FIGURA 2B) .

Isto é consistente com a observação anterior que célulasde tumor infiltrantes não detectadas podem ser identifi-cadas em margens cirúrgicas após "completa" ressecção ci-rúrgica com técnicas moleculares sensíveis.

Estes exemplos demonstram a capacidade de detec-tar populações clonais de células derivadas de tumor emamostras citológicas e tecido histopatológico. Este testefoi prontamente reprodutível usando outros marcadores al-terados para testar amostras correspondentes nestes casose amostras em pares de outros pacientes. As amostrasclínicas de pacientes sem uma alteração de microsatélitedetectada no tumor primário foram consistentemente negativas.

EXEMPLO 4

DETERMINAÇÃO DA SENSIBILIDADE POR DILUIÇÃO

Um problema óbvio na triagem de amostras clíni-cas é a necessidade de detectar um número extremamentepequeno de células de câncer dentre um grande fundo decélulas normais, especificamente em fluidos do corpo comourina e catarro. Para demonstrar a sensibilide do pro-cesso da invenção, o DNA de tumores da bexiga B17, quetem um maior novo alelo e B27, que tem um menor alelonovo foram utilizados. Estas duas amostras foram esco-lhidas devido à observação de que alelos menores tendema ampliar menor do que alelos maiores por PCR. DNA de tu-mor foi diluído com DNA linfocitico, normal, do mesmo pa-ciente e 50 ng de DNA de cada diluição foi ampliadopor PCR.

FIGURA 3 mostra a determinação da sensibilidadepor simples diluição. DNA de tumores (T) contendo altera-ções foram diluídos com o DNA de linfócito de pacientescorrespondente (N) de 1 em 5 (20%) a 1 em 1000 (0,1%).

Amostras foram então ampliadas por PCr com FGA marcadore,separado por eletroforese de gel desnaturante e visuali-zados por auto-radiografia como descrito (P. van der Ri-et, et al., supra). Novas bandas são indicadas por umaseta. 0 painel (A) mostra a nova banda vista na trilha dotumor de B17 (TCC) é ainda visível quando diluído com seuDNA correspondente normal a 0,1%. Similarmente, no Painel(B), a nova banda de DNA de tumor de B27 (TCC) é clara-mente vista quando diluída a 0,5%.

A banda "trocada" foi vista na mistura de di-luição contendo somente 0,1% de tumor DNA em B17 e 0,5%de tumor DNA em B27. Estes resultados sugerem que esteprocesso pode potencialmente detectar uma célula de cân-cer dentre 200 a 1000 células normais, assim provendosua utilidade em potencial como um teste de triagem clinico.EXEMPLO 5

TESTE PCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICOHIPERMUTÁVEL

As alterações de microsatélite em HNPCC e SCLCpodem ser detectadas por uso apenas de alguns marcadoresde repetição de microsatélites porque estes tumores alte-ram uma alta porcentagem de todos os alelos testados.

Para tumores não HNPCC, um único marcador de repetição detri- ou tetra-nucleotídeo bem selecionado pode potencial-mente identificar acima de 15% de tumores para um tipo decâncer em particular. Em Em SCC e TCC, sete marcadoresselecionados detectaram acima de 28% de tumores (TABELA1). Devido ao mecanismo genético subjacente a estas alte-rações ocasionais ainda não ser conhecido, é possível quealguns cânceres não demonstram quaisquer alterações semlevar em conta quantos marcadores são testados. Mesmo as-sim, o genoma humano contém acima de 100.000 regiões derepetição e é muito provável que outros marcadores candi-datos possam ser identificados para esta análise. Umacombinação de marcadores de repetição pode ser utilizadapara identificar uma elevada porcentagem de pacientes comcâncer, a capacidade de testar potencialmente vários mar-cadores em uma única reação PCR pode simplificar a abor-dagem de triagem final.

DNA de B27 (TCC) e uma amostra de urina corres-pondente foi ampliado com três diferentes conjuntos deiniciadores (FGA em cromossomo 4, ACTBP2 em cromossomo 6,e AR no cromossomo X) , na mesma reação PCR, separado emgéis acrilamida desnaturantes e expostos a filme. A con-centração de cada iniciador foi diluída a 100 ng/μg nareação PCR final. Uma nova banda na trilha do tumor éidêntica à banda menos intensa, correspondente na trilhade DNA da urina. (N: DNA normal, T: tumor DNA, U: urina DNA).

A possibilidade desta abordagem é mostrada naFIGURA 4, onde os três marcadores são multiplexados emuma única reação PCR. Os resultados demonstram claramenteuma nova banda em DNA da urina idêntica ao alelo alteradono tumor TCC primário correspondente.

Esta abordagem é bem mais simples de realizar doque os testes a base em PCR anteriores seguido por clona-gem e hibridização específica para oligômero para detec-tar mutações de oncogenes (D. Sidransky, et al. , supra).

Apesar da sensibilidade deste teste ser levemente diminu-ída, com detecção de célula de câncer limitado a um fundode aproximadamente 5 00 células normais como comparado com10.000 células normais usando a abordagem anterior, evi-dência de estudos anteriores sugere que é suficiente de-tectar células de câncer na maior parte dos espécimesclínicos incluindo catarro (FIGURA 3). Além disso, even-tos oligoclonais raros às vezes secundários a inflamaçãoou hiperplasia não puderam ser detectados devido à suadiluição dentre um fundo em excesso de células normaissem estas alterações. Apesar de mutações de oncogenes queproveem células neoplásticas com uma vantagem de cresci-mento distinta não serem especificamente detectadas, amonoclonalidade é uma característica fundamental de todosos neoplasmas e detecção de populações de células clonaisem amostras citológicas permanece um sinal omíno (P. J.Fialkow, Biochem. Biophys. Acta., 458: 283, 1976; P. C.Nowell, Science, 94: 23, 1976). O acúmulo de eventos ge-néticos em subseqüentes células-filha é bem reconhecido eum clone detectável pode ser esperado como persistindo eprovavelmente continue junto com a via de progressão neo-plástica (E. R. Fearon, et al. , Cell, 61: 709, 1990; D.Sidransky, et al. , Nature, 355: 846, 1992; D. Sidransky,et al., N. Engl. J. Med., 326: 737, 1992).

Apesar de muitos dos eventos genéticos em pro-gressão de câncer coloretal serem conhecidos (E. R. Fea-ron, et al., supra), alguns eventos foram bem caracteri-zados na maior parte de outros tipos de tumor e nem todosocorreram em um dado tumor. A capacidade de detectar po-pulações de células clonais prematuras em pacientes semconhecimento preciso de mutações de genes específicas notumor primário é uma maior preocupação neste teste. Defato, estes são precisamente os pacientes que podem sercandidatos ideais para as estratégias quimio-preventivase/ou que conduzem a resseção cirúrgica com acompanhamentocuidadoso. Além disso, a detecção de células de câncerinfiltrantes raras em margens histopatológicas pode terum grande impacto em prática cirúrgica corrente. Porque otumor primário já é resseccionado nestes casos, a rápidatriagem de DNA tumor pode prover um único marcador paradetecção destas células de tumor infiltrantes.A presente invenção indica que as alterações demicrosatélites parecem ser um aspecto comum em câncereshumanos e que maiores repetições são provavelmente maisprováveis a este tipo de instabilidade genética. A eleva-da freqüência de alterações observada em vários marcado-res parece ser específica para o tipo de tumor; a seleçãode marcadores apropriados com uma taxa relativamente ele-vada de instabilidade para um dado tipo de tumor podepermitir o uso de teste PCR multiplex para identificaruma alta porcentagem de neoplasmas em pacientes. A iden-tificação destas alterações em fluidos do corpo e margenscirúrgicas atesta a seu uso em potencial como marcadoresclonais na detecção de células neoplásticas. Um teste detriagem simples e poderoso aplicável a vários cânceres eamostras patológicas é demonstrado pela presente inven-ção. Poque o câncer é tão predominante na população, estaabordagem molecular tem implicações importantes na detec-ção do câncer.

EXEMPLO 6

ALTERAÇÕES DE MICROSATÉLITE E OH EM CÂNCER DE BEXIGAPRIMÁRIO

Para testar a abordagem usada nos exemplos ante-riores para detecção de câncer na bexiga, 60 marcadores60 tri- e tetra-nucleotídeos foram triados em 50 pessoascom câncer de bexiga primário, anônimas, de um banco detumores no Johns Hopkins University School of Medicine.Apesar de muitos marcadores não mostrarem alterações, 80%(40/50) dos neoplasmas continham pelo menos uma nova al-teração no tumor quando comparados com o DNA normal com-binado. Além disso, um painel selecionado dos 10 marcado-res mais suscetíveis poderia teoricamente detectar 52% detodos os cânceres primários da bexiga (tabela 2).

Este painel de 10 marcadores selecionados foitestado usando o sedimento de urina de um grupo de 25 pa-cientes com uma lesão suspeitos de câncer de bexiga nacistoscopia e cinco controles sem anterior conhecimentode seu diagnótico patológico. As amostras de urina foramcoletadas antes da cistoscopia e análise de microsatélitefoi feita em modo cego. 0 DNA normal e urina em pares fo-ram ampliados de cada paciente e os alelos polimórficosnestes 10 locais de microsatélite foram comparados. 0 se-dimento de urina em sete de 20 (45%) pacientes com câncerde bexiga continha uma nova alteração do microsatélite(expansão ou deleção de unidades de repetição) em acordoíntimo com a freqüência esperada com base na análise detumores primários (tabela 1) figura 5). Inesperadamente,no entanto, amostras adicionais demonstraram perda clarade heterozigozidade (LOH) no sedimento de urina consis-tente com perda alélica. Devido à perda de cromossomo 9ser um evento genético freqüente em câncer de bexiga,três marcadores de di-nucleotídeo foram examinados paraexpandir a análise na região crítica de perda no cromos-somo 9p21. Estes marcadores confirmaram a presença de de-leções em tumores que demonstraram perda de cromossomo 9com marcador D9S747. No todo, a análise do microsatélitecom todos os 13 marcadores demonstrou a presença de célu-Ias neoplásticas em 19 dentre 20 pacientes com câncer pa-tologicamente confirmado por detecção de ,ou uma alteraçãode repetição ou LOH. No caso único onde um clone neoplás-tico não foi identificado na urina, o paciente abrigou umtumor pequeno e que não continha alterações em qualquerum dos locais testado. Como importante, nenhum dos cincopacientes de controle demonstrou que quaisquer alteraçõesde microsatélite ou deleções de cromossomo.

A figura 5 mostra os resultados de estudos de 25pacientes tendo diagnóstico confirmado de câncer por pa-tologia. Dezenove dentre 20(95%) tinha alterações clonaisidênticas na amostra de urina e pelo menos nove (45%) fo-ram citologicamente negativos de câncer ou atipia.

Para ainda confirmar que estas deleções não fo-ram espúrias mas intimamente associaas com progressão ne-oplástica, o tumor primário foi obtido de biópsias inici-ais em 18 dentre 20 pacientes com câncer que foram anali-sados no estudo (em 2 casos material de biópsia não foisuficiente para outra análise). Em cada caso (Tabela 2),as mesmas alterações de microsatélite foram identificadasno tumor primário que estavam presentes no sedimento deurina. Além disso, virtualmente o mesmo padrão LOH foiconfirmado em cada um dos tumores primários que foi ini-cialmente identificado no sedimento de urina. No entanto,em dois pacientes,deleções adicionais foram identificadasem urina que não foram identificadas nas biópsias primá-rias. Em ambos os casos, LOH é pelo menos um local (eperda do alelo idêntico) foi compartilhada entre o sedi-mento de urina e tumor primário indicando que a detecçãode um clone genético mais avançado na urina provavelmentederivado da mesma célula progenitora. Em cinco casos, umdiagnóstico patológico de inflamação foi estabelecido porbiópsia mas em dois destes casos, células atípicas (quese suspeita mas não diagnosticas para neoplasma) foramidentificados. Em ambos os casos, as mudanças genéticasforam detectadas no sedimento de urina (em um caso, célu-las atípicas abundantes foram também identificadas em se-dimento de urina por análise citológica (ver abaixo).

As células de sedimento de urina foram entãoexaminadas por análise morfológica independente (micros-copia de luz) . A análise citológica foi realizada em 18dentre 20 pacientes com câncer na bexiga e em 3 dos 5 pa-cientes com inflamação aparente. As células neoplásticasforam identificadas em nove pacientes em que a análisemolecular foi positiva e em m onde a análise moleculardeixou de identificar neoplasia. Em quatro casos adicio-nais, células atípicas foram novamente vistas que nãoeram diagnosticas para câncer mas claramente clonais poranálise molecular. Como importante, muitas das célulasque foram consideradas atípicas ou neoplásticas foram defato prevalescentes em toda a amostra e compostas da mai-or parte de células epiteliais consistentes com LOH clarodemonstrado por análise molecular. Consistente com estaobservação, em alguns pacientes, as biópsias pequenascontinham apenas uma pequena porcentagem de células neo-plásticas ainda o sedimento de urina demonstrou LOH claroe pareceu ser composto quase completamente de células ne-oplásticas que compartilharam a mesma alteração genética.Isto também é consistente com deleções recentes na maiorparte das células com o sedimento de urina em alguns pa-cientes com câncer na bexiga.

Dentre os casos detectados por análise molecu-lar, se tem as assim chamadas lesões CIS "planas" e cincotinham cânceres TI prematuros. Estas lesões são as com omaior potencial para progressão clínica e as que devemser esperadas como se beneficiando da detecção prematura.

Se tem somente um caso (uma lesão TI pequena) que nãocontinha uma alteração genética clonal em tanto tumorprimário como urina correspondente. Como interessante, acitologia foi positiva neste paciente, apesar de não serclaro se a análise molecular adicional poderia identifi-car uma alteração ou marcador deletado se mais locaisfossem testados.

Os exemplos anteriores demonstraram que a análi-se de microsatélite pode ser uma ferramenta importantepara a detecção de câncer na bexiga primário. Um painelde marcadores foi escolhido que eram particularmente sus-cetíveis a alterações e o número de alterações observadoem sedimento de urina é consistente com a análise no pre-sente pedido de patente demonstrando pelo menos uma alte-ração em muitos tumores primários (ver figura 5).

A observação inesperada de que se poderia pron-tamente determinar LOH melhorou de modo significante aestratégia de detecção da presente invenção. Além disso,a identificação de tanto alteração como LOH parece com-plementar, como três pacientes foram detectados por iden-tificação de alterações sem LOH em qualquer dos locaistestados. Inicialmente, foi registrado que a perda decromossomo 9 é um evento prematuro e freqüente na pro-gressão de câncer na bexiga. Além disso, a análise mole-cular de pacientes com tumores múltiplos demonstrou queestes tumores múltiplos pareceram surgir de uma única cé-lula progenitora que semeou e formou uma população na mu-cosa da bexiga, potencialmente contando pelo risco eleva-do de recorrência nestes pacientes. As presentes verifi-cações são compatíveis com a hipótese de que grandes áre-as de mucosa da bexiga transformada existem em pacientescom neoplasmas mesmo pequenos. Além disso, vários fatorespodem contribuir para o enriquecimento de população decélulas de tumor na urina 1) epitélio normal é abrigadode modo mais lento do que o epitélio do tumor que podeaumentar a proporção de células de tumor no sedimento deurina, 2) células normais podem sofrer apoptose enquantoas células de tumor podem sobreviver durante armazenagemnormal que pode também aumentar a proporção de células detumor; e 3) porções externas de tumores geralmente repre-sentam populações de crescimento ativo que podem expandirde subclones de um tumor e se abrigar pesadamente na uri-na e aumentar a população de células de tumor.

Dois casos interessantes continham alteração demicrosatélite ou LOH em locais múltiplos sem evidênciadefinitiva de um tumor primário por patologia. No entan-to, a impressão clínica foi de suspeita de câncer e célu-las atípicas foram identificadas apesar de severa infla-mação em ambos os casos. Estes dois casos são provavel-mente em alto risco de ocorrência de câncer e provavel-mente abrigam lesões de tumor que faltavam na biópsia oulesões pré-malignas que faltam de alterações morfológicassignificantes. Outro fenômeno interessante é a presençade alterações clonais adicionais na urina correspondenteem alguns casos de câncer. Esta observação sugere que ascélulas de um clone potencialmente mais agressivo, gene-ticamente modificado, são desprendidas do tecido para aurina. As células mutantes p5 3 podem compreender somenteuma fração pequena das células na urina apesar de suapredominância surpreendente no tumor primário. Juntas,estas observações sugerem que a lesão primária clinica-mente óbvia pode não contribuir para a maior parte de cé-lulas neoplásticas em sedimento de urina.

Apesar de 9 5% de tumores primários neste estudocego serem detectados, os resultados são provavelmenteuma sub-estimativa da utilidade desta abordagem. Primei-ro, um maior número de marcadores suscetíveis pode serutilizado para detectar alterações de microsatélite pri-márias. Somente 60 marcadores de microsatélites foramexaminadas aqui e muitas outras podem potencialmente seridentificadas que são mais suscetíveis a alteração em ne-oplasmas, incluindo maiores repetições. Segundo, a faci-lidade de detecção de LOH agora coloca em perspectiva autilidade de modelos de progressão molecular. Existe bemmais de doze cromossomos com deleções comuns em câncer nabexiga primário. Os marcadores adicionais que formam aregião 9p21 freqüentemente deletada foram testados e mar-cadores adicionais de outras áreas comuns de deleção emcâncer na bexiga primário podem ser testados. Por exem-plo, perda da porção distai de 14q é raro em tumores pa-pilares da bexiga mas ubíquos em lesões CIS clinicamenteagressivos. De fato, um paciente com CIS abrigou LOH emcromossomo 14q como a única anormalidade no sedimento deurina. Um "alelotipo" completo de células neoplásticas emsedimento de urina pode um dia ser integrado com informa-ção prognostica obtida de correlações clínicas de mudan-ças genéticas em tumores primários.

Detectado por comparação de DNA normal para DNAde tumor primário demonstrando deleção ou recombinante deum cromossomo. Em estudos de alelotipos anteriores, maisde 95% de carcinomas de células transicionais de bexigademonstraram LOH em pelo menos um local por uso de umpainel de marcadores de microsatélites através do genoma.

A presente invenção agora traz à luz a utilidade imediatade acumular estudos demonstrando LOH em muitos locais e odesenvolvimento de modelos de progressão moleculares paradetecção clínica. Na maior parte dos casos neste estudo,as análises morfológicas e citológicas não foram diagnós-ticas. A análise de microsatélite é um teste simples esensível para a detecção de populações de tumor clonal emsedimento de urina e parece que conduz a abordagens auto-matizadas de baixo custo.<table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table>A invenção agora descrita completamente, é evi-dente para o versado na arte que muitas mudanças e modi-ficações podem ser feitas sem sair do espirito ou escopoda invenção.LISTAGEM DA SEOUENCIA(1) INFORMAÇÃO GERAL

(i) REQUERENTE: THE JOHNS HOPKINS UNIVERSITYSCHOOL OF MEDICINE

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: DETECÇÃO DE SEQÜÊNCIADE ÁCIDO NUCLÉICO HIPERMUTÁVEL EM TECIDO

(iii) NÚMERO DE SEQÜÊNCIAS: 40

(iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:(A) NOME: Fish & Richardson P.C.

(B) RUA: 4225 Executive Square, Apto. 1400

(C) CIDADE: La Jolla

(D) ESTADO: CA

(E) PAÍS: USA

(F) CÓDIGO POSTAL: 92037

(v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR

(A) TIPO DE SUPORTE: disco floppy

(B) COMPUTADOR: compatível IBM

(C) SISTEMA DE OPERAÇÃO: DOS

(D) SOFTWARE: FastSEQ, versão #1.1

(vi) DADOS PEDIDO ATUAL:

(A) NÚMERO PEDIDO: PCT/US95/

(B) DATA DE DEPÓSITO: 31 agosto 1995

(C) CLASSIFICAÇÃO:(vi) DADOS PEDIDO ANTERIOR:

(A) NÚMERO PEDIDO:

(B) DATA DE DEPÓSITO:(viii) INFORMAÇÃO ADVOGADO/AGENTE:

(A) NOME: Haile, Ph.D. Lisa A.(B) NÚMERO REGISTRO: 38.347

(C) NÚMERO REFERÊNCIA/ADVOGADO:07265/03 5W01

(ix) INFORMAÇÃO TELECOMUNICAÇÃO:

(A) TELEFONE: 619-678-5070

(B) TELEFAX: 619-678-5099

(C) TELEX:INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: CDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:CTTGTGTCCC GGCGTCTGINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: CDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO(ν) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(Xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:CAGCCCAGCA GGACCAGTAINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:TGGTAACAGT GGAATACTGA CINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: CDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:(vi) FONTE ORIGINAL:

(Xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:ACTGATGCAA AAATCCTCAA CINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO(V) TIPO FRAGMENTO:(vi) FONTE ORIGINAL:

(Xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:GATGGGCAAA CTGCAGGCCT GGGAAGINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO(V) TIPO FRAGMENTO:(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:GCTACAAGGA CCCTTCGAGC CCCGTTCINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:GATGGTGATG TGTTGAGACT GGTGINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: CDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:GAGCATTTCC CCACCCACTG GAGGINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear(li) TIPO MOLÉCULA: CDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:GTTCTGGATC ACTTCGCGGAINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:TGAGGATGGT TCTCCCCAAGINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: CDNA (iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (V) TIPO FRAGMENTO: (Vi) FONTE ORIGINAL: (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 11AGTGGTGAAT TAGGGGTGTT INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) FILAMENTOS: único (D) TOPOLOGIA: linear (Ü) TIPO MOLÉCULA: cDNA (Üi) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (V) TIPO FRAGMENTO: (vi) FONTE ORIGINAL: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 12CTGCCATCTT GTGGAATCAT INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucléico (C) FILAMENTOS: único(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: CDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:13CTGTGAGTTC AAAACCTATG GINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:14GTGTCAGAGG ATCTGAGAAGINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:GCACGCTCTG GAACAGATTC TGGAINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO(V) TIPO FRAGMENTO:(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:ATGAGGAACA GCAACCTTCA CAGCINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO(ν) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(Xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:TCACTCTTGT CGCCCAGATTINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 18:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO(V) TIPO FRAGMENTO:(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:TATAGCGGTA GGGGAGATGTINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 19:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO(V) TIPO FRAGMENTO:(vi) FONTE ORIGINAL:(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 19:T GCAAGGAGA AAGAGAGAC T GA 22

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 20:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: CDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 20:AACAGGACCA CAGGCTCCTA 20

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 21:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: Único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(V) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 21:CAGACGCCGG GACACAAG 18INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 22

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear(li) TIPO MOLÉCULA: CDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO(V) TIPO FRAGMENTO:(vi) FONTE ORIGINAL:

(Xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:TACTGGTCCT GCTGGGCTGINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 23:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO(V) TIPO FRAGMENTO:(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:GTCAGTATTA CCCTGTTACC AINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 24:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:(A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO(V) TIPO FRAGMENTO:(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 24:

GTTGAGGATT TTTGCATCAG T 21

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 25:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 25:CTTCCCAGGC CTGCAGTTTG CCCATC 26

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 26:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(Xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:GAACGGGGCT CGAAGGGTCC TTGTAGCINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 27:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:CACCAGTCTC AACACATCAC CATCINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 28:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear(ii) TIPO MOLÉCULA: CDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(Xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 28:CCTCCAGTGG GTGGGGAAAT GCTC 24

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 29

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:29:TCCGCGAAGT GATCCAGAAC 20

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 30:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO

(ν) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(Xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:CTTGGGGAGA ACCATCCTCAINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 31:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:AACACCCCTA ATTCACCACTINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 32:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 32:ATGATTCCAC AAGATGGCAG 20

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3 3

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: CDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 33:CCATAGGTTT TGAACTCACA G 21

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 34:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(Xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 34:CTTCTCAGAT CCTCTGACACINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 35:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO(V) TIPO FRAGMENTO:(vi) FONTE ORIGINAL:

(Xl) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:TCCAGAATCT GTTCCAGAGC GTGCINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 36:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: CDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(Xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:GCTGTGAAGG TTGCTGTTCC TCATINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 37:(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(Xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:37:AATCTGGGCG ACAAGAGTGA 20

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 38:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(Xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO: 38:ACATCTCCCC TACCGCTATA 20

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 39:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(V) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:TCAGTCTCTC TTTCTCCTTG CAINFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 40:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases

(B) TIPO: ácido nucléico

(C) FILAMENTOS: Único

(D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO MOLÉCULA: cDNA

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO

(v) TIPO FRAGMENTO:

(vi) FONTE ORIGINAL:

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA: SEQ ID NO:TAGGAGCCTG TGGTCCTGTT

Claims (32)

1. Método para detectar um distúrbio prolifera-tivo celular de mamíferos associado com uma alteração noácido nucléico alvo hipermutável, caracterizado pelo fatode que compreende isolar ácidos nucléicos presentes em umespécime de um mamífero, em que o espécime é obtido apartir de um sítio que é externo ao sítio do distúrbioproliferativo celular, e detectar a presença ou ausênciada alteração no ácido nucléico alvo hipermutável no espé-cime, em que o ácido nucléico alvo hipermutável é um mar-cador de microsatélite, em um local selecionado dentre ogrupo consistindo em ARA, D14S50, AR, MD, SAT, DRPLA,ACTBP2, FGA, D4S243 e UT762.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o ácido nucléico alvo hiper-mutável é ampliado antes da detecção.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, ca-racterizado pelo fato de que a ampliação é por meio deoligonucleotídeos que hibridizam em regiões flanqueadorasdo ácido nucléico alvo hipermutável.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o ácido nucléico alvo é se-lecionado dentre o grupo consistindo em uma deleção deácido nucléico e uma adição de ácido nucléico.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o distúrbio prolif erativocelular não é devido a um reparo de defeito genético.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o distúrbio prolif erativocelular é um neoplasma.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, ca-racterizado pelo fato de que o neoplasma é selecionadodentre o grupo consistindo em cabeça, pescoço, pulmão,esofaringe, estômago, intestino delgado, cólon, bexiga,rim e cérvix.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, ca-racterizado pelo fato de que o neoplasma é benigno.

9. Método de acordo com a reivindicação 6, ca-racterizado pelo fato de que o neoplasma é maligno.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o espécime é selecionadodentre o grupo consistindo em escarro, urina, bile, fe-zes, esfregaços cervicais, saliva, lágrimas, fluido espi-nhal cerebral, gânglios linfáticos regionais e margenshistopatológicas.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o ácido nucléico alvo com-preende a seqüência (X)n, em que X > 1 nucleotídeo e emque η > 2.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que o ácido nucléico alvo com-preende a seqüência (X)n, em que X > 2 nucleotídeos e emque η > 2.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, ca-racterizado pelo fato de que a seqüência X é selecionadadentre o grupo consistindo em TC, AGC, TCC, CAG, CAA,CTG, AAAG, AGAT e TCTT.

14. Método de acordo com a reivindicação 3, ca-racterizado pelo fato de que a seqüência de nucleotídeosda região flanqueadora à qual o oligonucleotídeo se hi-bridiza é selecionada dentre o grupo de seqüências con-sistindo em:a. 5'-CTT GTG TCCCGG CGT CTG-3 *(SEQ ID NO: 1);b. 5'-C AGC CCA GCA GGA CCA GTA-3'(SEQ ID NO: 2);c. 5'-TGG TAA CAG TGG AAT ACT GAC-3'(SEQ ID NO: 3);d. 5'-ACT GAT GCA AAA ATC CTC AAC-3*(SEQ ID NO: 4);e. 5'-GA TGG GCA AAC TGC AGG CCT GGG AAG-31(SEQ ID NO: 5);f. 5'-GCT ACA AGG ACC CTT CGA GCC CCG TTC-3'(SEQ ID NO: 6);g. 5'-GAT GGT GAT GTG TTG AGA CTG GTG-31(SEQ ID NO: 7);h. 5'-GAG CAT TTC CCC ACC CAC TGG AGG-3'(SEQ ID NO: 8);i. 5'-GTT CTG GAT CAC TTC GCG GA-3'(SEQ ID NO: 9);j. 5'-TGA GGA TGG TTC TCC CCA AG-3'(SEQ ID NO: 10);k. 5'-AGT GGT GAATTA GGG GTG TT-3'(SEQ ID NO: 11);l. 5-CTG CCA TCT TGT GGA ATC AT-3'(SEQ ID NO: 12);m. 5'-CTG TGA GTT CAA AAC CTA TGG-3'(SEQ ID NO: 13);n. 5'-GTG TCA GAG GAT CTG AGA AG-3'(SEQ ID NO: 14);O. 5'-GCA CGC TCT GGA ACA GAT TCT GGA-3'(SEQ ID NO: 15);p. 5'-ATG AGGAAC AGC AAC CTT CAC AGC-3'(SEQ ID NO: 16);q. 5-TCA CTC TTG TCG CCC AGA TT-3'(SEQ ID NO: 17);r. 5'-TAT AGC GGT AGG GGA GATGT-3'(SEQ ID NO: 18);s. 5'-TGC AAG GAG AAA GAG AGA CTG A-3 1(SEQ ID NO: 19); et. 5'-AAC AGG ACC ACA GGC TCC TA-3'(SEQ ID NO: 20).

15. Método de acordo com a reivindicação 14, ca-racterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo é sele-cionado dentre o grupo consistindo em:a. 5'-CAG ACG CCG GGA CAC AAG-3'(SEQ ID NO: 21);b. 5'-TAC TGG TCC TGC TGGGCT G-31(SEQ ID NO: 22);c. 5'-GTC AGT ATT ACC CTG TTA CCA-3'(SEQ ID NO: 23);d. 5'-GTT GAG GAT TTT TGC ATC AGT-3'(SEQ ID NO: 24);e. 5'-CTT CCC AGG CCT GCA GTT TGC CCA TC-3'(SEQ ID NO: 25);f. 5'-GAA CGG GGC TCG AAG GGT CCT TGT AGC-3(SEQ ID NO: 26) ;g. 5'-CAC CAG TCT CAA CAC ATC ACC ATC-3'(SEQ ID NO: 27);h. 5'-CCT CCA GTG GGT GGG GAA ATG CTC-3'(SEQ ID NO: 28);i. 51TCC GCG AAG TGA TCC AGA AC-3'(SEQ ID NO: 29);j. 5'-CTT GGG GAG AAC CAT CCT CA-31(SEQ ID NO: 30);k. 5·-AAC ACC CCT AAT TCA CCA CT-3'(SEQ ID NO: 31);-1. 5'-ATG ATT CCA CAA GAT GGC AG-3'(SEQ ID NO: 32);m. 5'-CCA TAG GTT TTG AAC TCA CAG-3'(SEQ ID NO: 33);n. 5'-CTT CTC AGA TCC TCT GAC AC-31(SEQ ID NO: 34);o. 5'-TCC AGA ATC TGT TCC AGA GCG TGC-3'(SEQ ID NO: 35);ρ. 5'-GCT GTG AAG GTTGCT GTT CCT CAT-31(SEQ ID NO: 36);q. 5'-AAT CTG GGC GAC AAG AGT GA-3'(SEQ ID NO: 37) ;r. 5'-ACA TCT CCC CTA CCG CTA TA-3'(SEQ ID NO: 38);s. 5'-TCA GTC TCT CTT TCT CCT TGC A-3'(SEQ ID NO: 39); et. 5'-TAG GAG CCT GTG GTC CTG TT-3 1(SEQ ID NO: 40).

16. Kit utilizável para a detecção de um distúr-bio proliferativo celular de mamíferos associado com umácido nucléico alvo hipermutável de um espécime de teci-do, o kit sendo caracterizado pelo fato de que compreendeum dispositivo de veículo sendo compartimentalizado parareceber, em confinamento próximo do mesmo, um ou mais re-cipientes contendo iniciadores de oligonucleotídeos, emque pelo menos um dos referidos iniciadores compreendeuma seqüência selecionada dentre o grupo consistindo em:SEQ ID Nos: 21-40.

17. Kit de acordo com a reivindicação 16, carac-terizado pelo fato de que o espécime é selecionado dentreo grupo consistindo em escarro, urina, bile, fezes, es-fregaços cervicais, saliva, lágrimas, fluido espinhal ce-rebral, gânglios linfáticos regionais e margens histopa-tológicas.

18. Kit de acordo com a reivindicação 16, carac-terizado pelo fato de que ainda compreende um deoxinucle-otídeo rotulado de modo detectável.

19. Kit de acordo com a reivindicação 16, carac-terizado pelo fato de que os locais são multiplexados.

20. Método para detectar câncer de um órgão emum espécime de um fluido do corpo que drena o órgão, emque o espécime é selecionado dentre o grupo consistindoem urina, saliva, bile, fezes, esfregaços cervicais, lá-grimas, fluido espinhal cerebral e gânglios linfáticos,caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:detectar a presença ou ausência de uma alteraçãode um marcador de microssatélite em relação a uma amostrade controle, em que a alteração do marcador de microssaté-lite no espécime em relação à amostra de controle indica apresença de câncer no órgão que drena o fluido do corpo,em um local selecionado dentre o grupo consistindo em ARA,D14550, AR, MD, SAT, DRPLA, ACTBP2, FGA, D45243 e UT762.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, ca-racterizado pelo fato de que o espécime é urina e o órgãoé bexiga.

22. Método de acordo com a reivindicação 20, ca-racterizado pelo fato de que o espécime é saliva e o ór-gão é língua.

23. Método de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 20-22, caracterizado pelo fato de que o mar-cador de microssatélite é ampliado antes de detectar.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, ca-racterizado pelo fato de que o marcador de microssatéliteé ampliado por meio de oligonucleotídeos que hibridizamem regiões flanqueadoras do marcador de microssatélite.

25. Método de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 20-22, caracterizado pelo fato de que a alte-ração é selecionada dentre o grupo consistindo em uma de-leção de ácido nucléico e uma adição de ácido nucléico.

26. Método de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 20-22, caracterizado pelo fato de que o cân-cer não é devido a um reparo de defeito genético.

27. Método de acordo com qualquer uma das rei-cador de microssatélite compreende a seqüência (X)n, emque X > 1 nucleotídeo e em que η > 2.

28. Método de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 20-22, caracterizado pelo fato de que o mar-cador de microssatélite compreende a seqüência (X)n, emque X > 2 nucleotídeo e em que η > 2.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, ca-racterizado pelo fato de que a seqüência X é selecionadadentre o grupo consistindo em TC, AGC, TCC, CAG, CAA,CTG, AAAG, AGAT e TCTT.

30. Método de acordo com a reivindicação 24, ca-racterizado pelo fato de que as regiões flanqueadoras domarcador de microssatélite são selecionadas dentre o gru-po consistindo em:a. 51-CTT GTG TCCCGG CGT CTG-3' (SEQ ID N0:1);b. 5'-C AGC CCA GCA GGA CCA GTA-3'(SEQ ID NO:2);c. 5'-TGG TAA CAG TGG AAT ACT GAC-3'(SEQ ID NO:3);d. 5'-ACT GAT GCA AAA ATC CTC AAC-3'(SEQ ID NO:4);e. 5'-GA TGG GCA AAC TGC AGG CCT GGG AAG-3'(SEQ ID NO:5);f. 5'-GCT ACA AGG ACC CTT CGA GCC CCG TTC-3'(SEQ ID NO:6);g. 5'-GAT GGT GAT GTG TTG AGA CTG GTG-3'(SEQ ID NO:7);h. 5'-GAG CAT ITC CCC ACC CAC TGG AGG-3(SEQ ID NO:8);i. 51-GTT CTG GAT CAC TTC GCG GA-3'(SEQ ID NO:9);j. 5'-TGA GGA TGG TTC TCC CCA AG-3'(SEQ ID NO:19);k. 5·-AGT GGT GAATTA GGG GTG TT-3'(SEQ ID NO:11);-1. 5-CTG CCA TCT TGT GGA ATC AT-31(SEQ ID NO:12);m. 5'-CTG TGA GTT CAA AAC CTA TGG-31(SEQ ID NO:13);n. 5'-GTG TCA GAG GAT CTG AGA AG-3'(SEQ IDNO:14);o. 5'-GCA CGC TCT GGA ACA GAT TCT GGA-3 '(SEQ ID NO:15);p. 5'-ATG AGGAAC AGC AAC CTT CAC AGC-3'SEQ ID NO:16);q. 5-TCA CTC TTG TCG CCC AGA TT-31(SEQ ID NO: 17);r. 5'-TAT AGC GGT AGG GGA GATGT-3'(SEQ ID NO:18);s. 5'-TGC AAG GAG AAA GAG AGA CTG A-3'(SEQ ID NO:19); et. 5'-AAC AGG ACC ACA GGC TCC TA-3'(SEQ ID NO:2O).

31. Método de acordo com a reivindicação 30, ca-racterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo é sele-cionado dentre o grupo consistindo ema. 5'-CAG ACG CCG GGA CAC AAG-3'(SEQ ID NO:21);b. 5'-TAC TGG TCC TGC TGGGCT G-3'(SEQ ID NO:22);c. 5'-GTC AGT ATT ACC CTG TTA CCA-3'(SEQ ID NO:23);d. 5'-GTT GAG GAT TTT TGC ATC AGT-3'(SEQ ID NO:24);e. 5' -CTT CCC AGG CCT GCA GTT TGC CCA TC-3 '(SEQ ID NO:25) ;f. 5'-GAA CGG GGC TCG AAG GGT CCT TGT AGC-3 '(SEQ ID NO:26) ;g. 5'-CAC CAG TCT CAA CAC ATC ACC ATC-3'(SEQ ID NO:27);h. 5'-CCT CCA GTG GGT GGG GAA ATG CTC-3'(SEQ ID NO:28) ;i. 5'-TCC GCG AAG TGA TCC AGA AC-3'(SEQ ID NO:29);j. 5'-CTT GGG GAG AAC CAT CCT CA-3'(SEQ ID NO:30) ;k. 5'-AAC ACC CCT AAT TCA CCA CT-3'(SEQ ID NO:31);-1. 5'-ATG ATT CCA CAA GAT GGC AG-31(SEQ ID NO:32);m. 5'-CCA TAG GTT TTG AAC TCA CAG-3'(SEQ ID NO:33);n. 5'-CTT CTC AGA TCC TCT GAC AC-3'(SEQ ID NO:34);o. 5'-TCC AGA ATC TGT TCC AGA GCG TGC-3'(SEQ ID NO:35);p. 5'-GCT GTG AAG GTTGCT GTT CCT CAT-3'(SEQ ID NO:36);q. 5'-AAT CTG GGC GAC AAG AGT GA-3'(SEQ ID NO:37);r. 5'-ACA TCT CCC CTA CCG CTA TA-3'(SEQ ID NO:38);s. 5'-TCA GTC TCT CTT TCT CCT TGC A-3'(SEQ ID NO:39) ; et. 5·-TAG GAG CCT GTG GTC CTG TT-3'(SEQ ID NO:4O).

32. Método de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 20-22, caracterizado pelo fato de que o mar-cador de microssatélite é selecionado dentre o grupo con-sistindo em ARA, D14S50, AR, MD, SAT, DRPLA, ACTBP2, FGA,D4S243 e UT762.