BR132012033307E2 - Composições farmacêuticas contendo extrato e/ou frações de cascas de aspidosperma subincanum e uso - Google Patents

Abstract

Composições farmacêuticas contendo extrato e/ou frações de cascas de aspidosperma subincanum e uso. Certificado de adição de invenção referente ao pedido de patente pi0905584-3, depositado em 23 de dezembro de 2009. Esse certificado de adição descreve os processos para obtenção de extrato etanílico e frações alacaloídicas a partir de cascas de aspidosperma subincanum, popularmente denominada "pau-pereira-falso", contendo uleína. O certificado de adição compreende, ainda, a obtenção de composições farmacêuticas que contêm o extrato, frações e/ou uleína, bem como sua utilização para o tratamento de malária humana. O extrato, as frações e a uleína apresentados foram ensaiados e mostraram atividade antiplasmódica, particularmente contra plasmodium falciparum.

Description

“COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO EXTRATO E/OU FRAÇÕES DE CASCAS DE ASPIDOSPERMA SUBINCANUM E USO” Certificado de Adição de Invenção referente ao pedido de patente PIQ905584-3, depositado em 23 de dezembro de 2009. Esse Certificado de Adição descreve os processos para obtenção de extrato etanólico e frações alacaloídicas a partir de cascas de Aspidosperma subincanum, popularmente denominada “pau-pereira-falso”, contendo uleína. O Certificado de Adição compreende, ainda, a obtenção de composições farmacêuticas que contêm o extrato, frações e/ou uleína, bem como sua utilização para o tratamento de malária humana. O extrato, as frações e a uleína apresentados foram ensaiados e mostraram atividade antiplasmódica, particularmente contra Plasmodium falciparum.

Atualmente, a malária ocorre em mais de 109 países e territórios. A estimativa é de 1 milhão de mortes por ano. No Brasil, a região amazônica é considerada a área endêmica. O grande problema é que o Plasmodium falciparum é resistente à maioria dos antimaláricos convencionais, como a cloroquina (http://www.who.int/malaria/ world_malaria_report_2010 /en/index. html>. Acessado em 20 de agosto 2011). Dessa forma, a pesquisa de quimioterápicos antimaláricos a partir de plantas constitui uma estratégia válida e promissora. A espécie Aspidosperma subincanum (família Apocynaceae), uma árvore nativa do Brasil, tem uma história de uso para tratamento de malária humana, o que motivou seu estudo. A Aspidosperma subincanum é popularmente conhecida, na região de Paracatu, no noroeste de Minas Gerais, como “pau-pereira-falso” (PPF); porém, em diferentes regiões do Brasil, é também conhecida como guatambú, guatambú-vermelho, carrasco ou pereira- do-campo.

BREVE DECRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras 1A, 1B e 1C apresentam os fluxogramas das extrações ácido-base pelos métodos A, B e C, respectivamente, a partir de pó de cascas de A. subincanum. A Figura 2 apresenta os perfis cromatográficos por CLAE-DAD para os extratos e frações obtidos a partir de cascas de Aspidosperma subincanum (PPF): A) EEAS(A) (extrato etanólico bruto); B) ASN(A) (fração não alcaloídica obtida pelo método A); C) ASAL(A) (fração alacaloídica obtida pelo método A); D) ASD(B) (extrato alcaloídico bruto obtido pelo método B); E) ASN(B) (fração não alcaloídica obtida pelo método B); F) ASAL(B) (fração alcaloídica obtida pelo método B); G) ASAL(C) (fração alcaloídica obtida pelo método C); H) Uleína. Setas indicam picos da uleina. A Figura 3 mostra as curvas dose-resposta das amostras frente ao P. falciparum: A) EEAS(A) (extrato etanólico bruto); B) ASN(A) (fração não alcaloídica obtida pelo método A); C) ASAL(A) (fração alacaloídica obtida pelo método A); D) ASD(B) (extrato alcaloídico bruto obtido pelo método B); E) ASN(B) (fração não alcaloídica obtida pelo método B); F) ASAL(B) (fração alcaloídica obtida pelo método B); G) ASAL(C) (fração alcaloídica obtida pelo método C).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA O presente Certificado de Adição descreve o processo para obtenção de extrato e fração padronizados de Aspidosperma subincanum, popularmente denominada "pau-pereira-falso", e demonstra que a uleína é o alcalóide majoritário nas cascas dessa espécie. O Certificado de Adição compreende, ainda, a obtenção de composições farmacêuticas que contêm o extrato, fração derivada deste e/ou uleína, bem como sua utilização para o tratamento da malária.

As composições do presente Certificado de Adição caracterizam-se pelo uso das frações alcaloídicas obtidas a partir de cascas de Aspidosperma subincanum por diferentes metodologias ou uleína, combinados com excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de excipientes incluem água, solução salina, soluções tamponadas com fosfato, solução de Ringer, solução de dextrose, solução de Hank, soluções salinas biocompatíveis contendo ou não polietilenoglicol. Veículos não aquosos, como óleos fixos, óleo de sésamo, oleato de etila, ou triglicerídeo também podem ser utilizados.

Podem ser preparadas composições com um excipiente ou mistura desses.

Os excipientes também podem conter quantidades menores de aditivos, como substâncias que aumentam a isotonicidade e estabilidade química de substâncias ou tampões. Exemplos de tampões incluem tampão fosfato, tampão bicarbonato e tampão Tris, enquanto exemplos de conservantes incluem timerosal, m- ou o-cresol, formalina e álcool benzílico. As composições podem ser líquidas ou sólidas. Desta forma, numa formulação sólida, o excipiente pode incluir dextrose, conservantes, para qual água ou solução salina estéril podem ser acrescentadas antes da administração e, aglutinantes, desintegrantes, diluentes, lubrificantes e tensoativos. Além disso, podem ser preparadas nanoformulações.

Essas composições podem ser administradas via intramuscular, intravenosa, subcutânea, oral, inalatória ou como dispositivos que possam ser implantados ou injetados, sendo preferencialmente administrados por via oral.

Foram empregados três métodos distintos de extração ácido-base.

Todos os métodos foram executados para se obter alcalóides, uma classe de metabólito secundário frequentemente encontrada nesse gênero de plantas.

Para confirmação dos resultados, os extratos obtidos foram analisados por Cromatografia em Camada Delgada (CCD), Cromatografia em Coluna de Sílica gel e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Detector de Diodo(CLAE-DAD). Ademais, foi testada a atividade antiplasmódica in vitro dos extratos e das frações obtidas em culturas do P. falciparum (clone W2). O presente Certificado de Adição pode ser mais bem entendido através dos seguintes exemplos, não limitantes da tecnologia.

Exemplo 1: Obtenção do extrato, frações deste e substância isolada de cascas de Aspidosperma subincanum As cascas do caule de PPF foram submetidas à secagem em estufa com circulação de ar, à temperatura de 40°C, e submetidas a moagem em moinho de facas. A partir do pó da casca, foram realizadas extrações ácido-base para separação de alcalóides, empregando-se três metodologias diferentes: métodosA.BeC (Figuras 1A, 1Be 1C). Método A: Para a obtenção do extrato etanólico bruto, foram pesados, separadamente, 300g do pó da casca de PPF aos quais foi adicionado cerca de 1L de etanol 96°GL. A mistura foi transferida para um percolador, adicionou- se quantidade adicional de etanol, até cobrir o material que permaneceu em maceração por cerca de 24h. Decorrido esse tempo, o líquido obtido foi recolhido, e o solvente foi removido em evaporador rotatório. A extração com etanol foi repetida por quatro vezes. O extrato bruto (20,Og, 6,70%g) foi obtido após remoção do solvente. O processo foi repetido por 4 vezes, com um total de 1050 g do pó das cascas obtendo-se, ao final, 90g do extrato etanólico bruto, EEAS(A). A uma alíquota do EEAS(A) (30g) foram adicionados 10 mL de etanol, 300 mL de HCI 1N e 250 mL de diclorometano. Houve separação de fases, uma aquosa, menos densa, e outra orgânica, mais densa, que foram separadas em um funil de decantação. A extração com diclorometano foi repetida por mais três vezes (3 x 250 mL de diclorometano). A fase orgânica foi secada com Na2S04 anidro, filtrada e removido o solvente, obtendo-se, assim, a fração não alcaloídica, ASN(A), (28 g; 20,94%). Já a fase aquosa ácida foi alcalinizada com NH4OH até o pH 9-10. Em um funil de separação foi feita a partição com 40mL de diclorometano que foi repetida por 3 vezes (3x 40 mL de diclorometano). A fase orgânica foi secada com Na2S04 anidro. Após filtração e evaporação do solvente em evaporador rotatório, foi obtida a fração alcaloídica, ASAL(A) (3,04g; 10,13%). O mesmo processo foi repetido por duas vezes obtendo-se um total de 9,12 g de ASAL(A) e 18,85 g de ASN(A). A porcentagem de 10,13% refere-se ao teor de alcalóides no extrato etanólico e permite deduzir que a porcentagem de alcalóides obtida pelo método A, nas cascas de A. subincanum é, portanto, de 0,67%. Método B: A 200g do pó da casca de Aspisdosperma subincanum foram adicionados 10 mL de NH4OH concentrado e 250 mL de diclorometano. A mistura foi transferida para um percolador e, após cerca de 8h, o solvente foi recolhido. A extração com diclorometano foi repetida por 3 vezes (3X250 mL).

Removeu-se o solvente em evaporador rotatório e, obteve-se o extrato bruto de aloaloides, ASD(B) (3,36g; 1,68%) ao qual foram adicionados etanol (5 m!_), diclorometano (40ml_) e ácido clorídrico 1N (50mL). Houve separação de fases que foram separadas em funil de decantação. A fase orgânica foi secada com Na2S04 anidro, filtrada e, após remoção do solvente, obteve-se, a fração não alcaloídica, ASN(B) (1,79 g; 0,90 %). Já a fase aquosa ácida foi alcalinizada com NH4OH até o pH 9-10. Em um funil de separação foi feita a partição (repetida cerca de 3 vezes) com 40mL de diclorometano. À fase orgânica adicionou-se Na2S04 anidro e após filtração e evaporação do solvente, obteve- se a fração alcaloídica, ASAL(B) (0,590g; 0,29%).

Método C A 300g do pó da casca de Aspisdosperma subincanum foram adicionados cerca de 1000 mL de HCI 1N e transferiu-se a mistura para um percolador. Após cerca de 2h, o filtrado foi recolhido e a extração com HCI 1N foi repetida por 3 vezes. A solução ácida resultante de cada extração foi filtrada em funil de placa porosa (n° 3) e, em seguida, alcalinizada com NH4OH até 0 pH 9-10 e extraída com diclorometano (3 x 250 mL). A solução orgânica obtida após partição foi retornada ao funil de separação e lavada com água destilada. A fase orgânica foi secada com Na2S04 anidro, filtrada e, após remoção do solvente obteve-se a fração alcaloídica, ASAL(C) (1,89 g; 0,90%).

Exemplo 2: Análise dos extratos e frações por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) Os extratos e frações foram caracterizados por CCD, utilizando-se, como eluente, CHCI3:MeOH:NH4OH (85:15:0,2), e, como revelador, o anisaldeído sulfúrico. Os perfis destes em CCD mostraram a presença de substâncias alcaloídicas no extrato etanólico bruto e nas frações obtidas por todos os métodos utilizados, inclusive nas frações denominadas como não-alcaloídicas. A presença da uleína nas cascas de Aspidosperma subincanum foi detectada por comparação com amostra autêntica deste alcalóide que isolamos anteriormente a partir das cascas de Aspidosperma parvifolium.

Exemplo 3: Isolamento da uleína Parte da fração alcaloídica obtida pela extração ácido-base pelo método C, ASAL(C), a partir das cascas de PPF foi separada por cromatografia em camada delgada em escala preparativa, em uma placa de vidro de 20 cm X 20 cm, com uma camada de sílica gel com 2 mm de espessura, foi aplicada uma solução de 100 mg da amostra em 1mL de diclorometano e, para a eluição, utilizou-se CHCI3: MeOH: NH4OH (85:15:0,4). Após observação sob luz ultra- violeta, removeu-se a sílica gel da placa de vidro, de acordo com as diferentes faixas visualizadas, correspondentes às substâncias fluorescentes (alcalóides). A sílica de cada faixa foi removida da placa de vidro e lavada com uma mistura CH2CI2:MeOH 30%v/v. As soluções obtidas foram filtradas e, posteriormente, concentradas em evaporador rotatório. Foram realizadas quatro separações por CCDP, o que gerou 9 frações após remoção da sílica. As frações foram submetidas a CQD usando o eluente CHCl3:MeOH:NH4OH (85:15:0,2) e anisaldeído sulfOrico como revelador, usando-se uleína como referência.

Exemplo 4: Análise dos extratos, frações e uleína por CLAE-DAD

Para obtenção dos perfis cromatográficos, utilizou-se uma coluna UChrospher 100 RP-18 (partículas de 5 pm, 250 x 4 mm d.i.), com detecção por UV 220-400 nm, fluxo de 1 mL/min e temperatura de 40eC.

Foram pesados cerca de 5mg de cada um dos extratos/frações e 2mg de uleína que foram solubilizados em 1 mL de metanol grau CLAE, por sonicação, em ultrassom, por 15 min; seguindo-se centrifugação a 10.000 rpm, por 10 min. Q sobrenadante foi empregado nas análises por CLAE-FR. O método empregado nestas análises consiste em um tipo de eluição mista entre gradiente e isocrático, empregando-se uma solução tampão pH 5 (A) composta por ácido acético (0,2%), trietilamina (0,33 a 0,34%) em água, acertado para pH5, e acetonitrila (B), no seguinte programa de eluição: T= 0 min, A= 90%, B=10%; T= 10 min, A= 80%, B=20%; T= 32 min, A= 50%, B=50%; T= 35 min, A= 90%, B=10%. Nas análises foi empregado detector de arranjo de diiodos (CLAE-DAD), com varredura e obtenção dos cromatogramas com detecção no comprimento de onda (λ) de 304nm.

Nos cromatogramas do extrato etanólico bruto, EEAS(A) (Figura 2A) e da fração não alcaloídica ASN(A) obtida pelo método A, (Figura 2B) praticamente não se observam picos correspondentes a alcalóides, os quais, nas condições empregadas, ocorrem na faixa de 10 a 20 min., o que se explica pelo baixo teor de alcalóides nestas amostras. Já nos cromatogramas das frações alcaloídicas obtidas pelos métodos A, ASAL(A) (Figura 2C), B, ASAL(B) (Figura 2F) e C, ASAL(C) (Figura 2G) observam-se picos correspondentes a alcalóides, sendo que aqueles com TR em torno de 18 min correspondem à uleína, isolada anteriormente de A. parvifolium (DOLABELA, 2007; JÁCOME et al., 2004) e cujo cromatograma e espectro no UV registrado online são mostrados na Figura 2H.

Estas análises confirmam, portanto, a presença de uleína nas cascas de Aspidosperma subincanum, como exemplificado pela Figura 2. Além disso, estes cromatogramas mostram perfis cromatográficos diferentes para amostras obtidas pelos diferentes métodos de extração de alcalóides. Assim, constata-se que o método C foi mais efetivo para extração da uleína (TR=18,04 min), como mostra a Figura 2G, na qual a porcentagem da área para o pico deste alcalóide é de 56,21% enquanto que pelos métodos A (Figura 2C) e B (Figura 2F) suas áreas correspondem a 20,65% e 29,87%, respectivamente. O pico com TR~12min é mais intenso (% de área 47,84) na fração de alcalóides obtida pelo método A, ASAL(A) (Figura 2C). Estas variações na composição das frações alcaloídicas certamente terão efeito na atividade antiplasmódica das mesmas e é de grande importância ter conhecimento destas na preparação de extratos padronizados quando o objetivo é o desenvolvimento de fitoterápicos.

Exemplo 5: Avaliação da atividade antiplasmódica A atividade antiplasmódica in vitro do extrato bruto e de frações alcaloídicas obtidos a partir de cascas de PPF foi avaliada em cultura de P. falciparum, clone W2 (resistente a cloroquina). A atividade antiplasmódica foi testada de acordo com Rieckman e colaboradores (RIECKMAN, K.H. et al.

Drug sensitivity of Plasmodium falciparum. An in vitro microtechnique. Lancet, v.i, p.22-23, 1978; CARVALHO, L.H. Quimioterapia experimental com extratos brutos de plantas e compostos quimicamente definidos, UFMG, 1990).

As amostras foram distribuídas em placas de 96 poços em triplicata e em diferentes concentrações. Em seguida, os parasitos (parasitemia 1%; hematócrito 1%) foram adicionados aos mesmos poços e mantidos em contato com as amostras teste por um período de 24h, em estufa de CO2, a 37°C. Após 24h, foi acrescentada hipoxantina tritiada em todos os poços e, passado mais 18h, as placas foram congeladas por um período de 24h. O conteúdo dos poços foi aspirado e a leitura realizada em contador de radioatividade (1450 Microbeta TRILUX, PerkinElmer ). Foram determinadas curvas dose-resposta para cada amostra a fim de determinar a concentração da amostra que inibe em 50% o crescimento dos parasitos (CI50)· Os resultados obtidos pelos bioensaios in vitro (Tabela 1) foram expressos em Cl50, que corresponde à concentração mínina da amostra teste capaz de inibir o parasito; e IS, que corresponde ao índice de seletividade, ou seja, quanto maior o valor, maior será a seletivade da substância testada contra o P. falciparum e menor contra as demais células.

Todos os extratos alcaloídicos mostraram-se ativos, sendo os mais ativos aqueles dos extratos bruto, ASD(B) e alcaloídico, ASAL(B) obtidos pelo método B, os quais apresentaram valores de CI50 de 550 e 990 ng/mL, respectivamente. É interessante notar que essas frações foram cerca de 4 - 7 vezes mais ativas do que a fração alcaloídica obtida pelo método A, ASAL(A) que apresentou Cl50 = 4,270 ± 980 ng/mL. Essa diferença pode estar relacionada com a composição dessas frações. Assim, ASAL(A) contem, predominantemente, o alcalóide com TR~12 min.(% área 47,84) (Figura 2C) enquanto que em ASD(B) (Figura 2D) e ASAL(B) (Figura 2F) tem-se áreas de picos semelhantes para uleína (TR=18,04 min; % área 20,65) e o alcalóide com TR~12 min. No entanto, este último tem uma concentração maior de uleína do que ASAL(A). O índice de Seletividade (IS) (Tabela 1) é calculado a partir da razão entre a dose citotóxica para 50% das células (HepG2) e sua atividade antiplasmódica (Cl50) (IS = CC50 / CI50)· Todas as amostras apresentaram IS > 10 e, portanto, têm ação seletiva frente ao P. falciparum (clone W2). As frações mais ativas, ASD(B) (Cl50 = 0,55 pg/mL) e ASAL(B) (Cl50 = 0,99 pg/mL) aprentaram maiores valores de IS, respectivamente, 389,31 e 209,44 (Figura 3).

Tabela 1 - Valores da atividade antiplasmódica (Cl50), da citotoxicidade (CCso) e do Índice de seletividade para o extrato etanólico bruto e frações obtidos a partir de cascas de Aspidçsperma subincanum (PPF) Todos os métodos utilizados foram eficientes para a obtenção de extratos e frações ricas em alcalóides. Ademais, os extratos e as frações se mostraram ativas ao P. falciparum.

Claims (4)

1. Composições farmacêuticas, caracterizadas por compreenderem extrato e/ou frações obtidas a partir de cascas de Aspidosperma subinçanum contendo de 20% a 60% de alcalóides e, pelo menos um excipiente farmacêutica e farmacologicamente aceitável.

2. Composições farmacêuticas, de acordo com as reivindicação 1, caracterizadas por apresentarem atividade antiplasmódica.

3. Composições farmacêuticas, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizadas por serem administradas pelas vias oral, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, transdérmica ou como dispositivos que possam ser implantados ou injetados; sendo preferencialmente administradas por via oral.

4. Composições farmacêuticas, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizadas por serem na preparação de medicamentos para tratar malária humana.