BR132012021144E2

BR132012021144E2 - process for producing hesperitin, obtained hesperitin and their uses

Info

Publication number: BR132012021144E2
Application number: BR132012021144A
Authority: BR
Inventors: Gabriela Alves Macedo; José Valdo Madeira Júnior
Original assignee: Unicamp
Priority date: 2012-08-23
Filing date: 2012-08-23
Publication date: 2015-09-22

Abstract

processo para produção de hesperetina, hesperetina obtida e seus usos. a presente invenção compreende um processo para produção de hesperetina, um flavonólde encontrado em frutas citricas, conhecido por seu poder antioxidante, anticarcinogênico, vasoprotetor e apresentar outras importantes propriedades terapêuticas e que, frequentemente é encontrada em plantas em sua forma glicosilada, pouco biodisponivel e com poder antioxidativo. a produção é feita através da fermentação sólida em bagaço de laranja empregando o fungo paediomyces variotll, o que permite que o bagaço de laranja apresente maior capacidade antioxidante em relação ao meio não fermentado. através do presente invento ainda é possível a extração de um ingrediente interessante para indústria alimentícia, por atuar como conservante impedindo a oxidação dos produtos, e ao mesmo tempo apresentando propriedades funcionais e farmacêuticas, como atividade antiviral, anti-carcinogenico, anti-inflamatório, antimicrobiano.process for producing hesperetin, obtained hesperetin and its uses. The present invention comprises a process for the production of hesperetin, a flavonide found in citrus fruits, known for its antioxidant, anticarcinogenic, vasoprotective power and other important therapeutic properties and which is often found in plants in their glycosylated, poorly bioavailable form. antioxidant power. The production is made by solid fermentation in orange bagasse using the fungus paediomyces variotll, which allows the orange bagasse to have greater antioxidant capacity than the unfermented medium. It is still possible through the present invention to extract an interesting ingredient for the food industry by acting as a preservative preventing the oxidation of the products, while having functional and pharmaceutical properties such as antiviral, anti-carcinogenic, anti-inflammatory, antimicrobial activity. .

Description

PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE HESPERETINA, HESPERETINA OBTIDA E SEUS USOS CERTIFICADO DE ADIÇÃO DE INVENÇÃO DO PI1103791-1, DEPOSITADO EM 05.08.2011 CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção compreende um processo de produção de hesperetina através da fermentação sólida em bagaço de laranja empregando o fungo Paecilomyces variotii. A hesperetina é um flavonóide encontrado em frutas cítricas, conhecido por seu poder antioxidante, anticarcinogênico, vasoprotetor e apresentar outras importantes propriedades terapêuticas. Em plantas, a hesperetina encontra-se frequentemente na forma glicosilada (hesperidina) e, portanto, pouco biodisponível e menor poder antioxidante. Dessa forma, o processo descrito na presente invenção colabora para o aumento da biodisponibilidade desse composto e atividade nutracêutica de vários alimentos, utilizando para isso resíduos da indústria de laranja como substrato da fermentação.PROCESS FOR PRODUCTION OF HESPERETIN, OBTAINED HESPERETIN AND ITS USES OF ADDITION CERTIFICATE OF INVENTION OF PI1103791-1, DEPOSITED ON 08.08.2011 FIELD OF THE INVENTION The present invention comprises a process of producing hesperetin by solid fermentation in orange pomace employing the fungus. Paecilomyces variotii. Hesperetin is a flavonoid found in citrus fruits, known for its antioxidant, anticarcinogenic, vasoprotective power and other important therapeutic properties. In plants, hesperetin is often found in glycosylated form (hesperidine) and therefore poorly bioavailable and less antioxidant. Thus, the process described in the present invention contributes to increase the bioavailability of this compound and the nutraceutical activity of various foods by using residues from the orange industry as fermentation substrate.

Dessa forma, o presente invento permite que o bagaço de laranja apresente maior capacidade antioxidante em relação ao meio não fermentado, possibilitando ainda a extração de um ingrediente interessante para indústria alimentícia, podendo atuar como conservante para impedir a oxidação dos produtos e assim aumentar a vida de prateleira desses, e, ao mesmo tempo, apresentam propriedades funcionais e de interesse para a indústria farmacêutica, pois tem atividade antiviral, anti-carcinogenica, anti-inflamatória e antimicrobiana.Thus, the present invention allows the orange pomace to have greater antioxidant capacity compared to the unfermented medium, while also allowing the extraction of an interesting ingredient for the food industry, and can act as a preservative to prevent the oxidation of products and thus increase the shelf life. and at the same time have functional properties of interest to the pharmaceutical industry, as it has antiviral, anti-carcinogenic, anti-inflammatory and antimicrobial activity.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A FERMENTAÇÃO SÓLIDA A economia brasileira é baseada na produção agrícola, em que se pode destacar a laranja. Além da comercialização deste produto in natura, o setor agroindustrial também está envolvido com o processamento e com a produção de suco de laranja. Assim, este produto gera resíduos de interesse para nutrição animal, como o bagaço da laranja na forma peletizada, muito utilizado para nutrição de ruminantes.BACKGROUND OF THE INVENTION SOLID FERMENTATION The Brazilian economy is based on agricultural production, in which orange can be highlighted. In addition to marketing this product in natura, the agroindustrial sector is also involved in the processing and production of orange juice. Thus, this product generates residues of interest for animal nutrition, such as orange pomace in pellet form, widely used for ruminant nutrition.

Através da fermentação em estado sólido pode-se melhorar a qualidade nutricional deste resíduo com a quebra de compostos antinutricionais como o fitato e tanino; Além disso, a fermentação em estado sólido pode ser utilizada para produção de flavonóides, como hesperidina e hesperetina, a partir de resíduos agroindustriais. Compostos fenólicos têm sido uma das principais questões do consumo de frutas e vegetais em benefício à saúde, principalmente relacionado à atividade antioxidante. A produção de hesperetina por processo biológico é um passo importante na obtenção de compostos bioativos de alto valor agregado que podem ser empregados na industria de alimentos e farmacêuticas, como antioxidantes naturais com efeitos benéficos a saúde. A fermentação em estado sólido (FES) proporciona o cultivo de microorganismos em substratos sólidos na ausência de uma fase aquosa livre (Pandey, A. Solid-state fermentation. Biochemistry Engeenering Journal 13, p. 81- 84, 2003). No entanto, o substrato deve apresentar umidade adequada para manter o crescimento e o metabolismo do micro-organismo, sem exceder a capacidade de retenção máxima de água pela matriz (Foong, C. W.; Janaun, J.; Krishnaiah, K.; Prabhakar, A. Effect of superficial air velocity on solid State fermentation of palm kernel cake in a lab scale fermenter using locally isolated strain. Industrial Crops and Products 30, p. 114-118, 2009). A matriz sólida utilizada no processo pode ser tanto a fonte de nutriente quanto simplesmente um suporte impregnado com nutrientes adequados ao desenvolvimento do micro-organismo (Pandey, 2003), (Nagao, N.; Matsuyama.T.; Yamamoto, H.; Toda, T. A novel hybrid system of solid State and submerged fermentation with recycle for organic solid waste treatment. ProcessBiochemistry 39, p. 37-43, 2003). Existem diferenças significativas entre os processos de fermentação em estado sólido e fermentação submersa (FS). A principal diferença entre FES e FS é a quantidade de água livre no meio de cultivo. Na FS, a quantidade de sólidos não ultrapassam 50 g/L, enquanto na FES o conteúdo de sólidos varia de 20 a 70% do peso total do meio (Mitchell, D. A.; Losane, B. K. Definition, characteristic and potentiai. In: Doelle, H.; Mitchell, D. A., Rols, C. E. Solid substrate cultivation. Elsevier Applied Science, p. 1- 16,1992). A FES confere vantagens sobre a FS como a utilização de meios de cultura simples e não hidrossolúveis, compostos de materiais de origem vegetal, como farelos e cascas de arroz, trigo, milho e outros cereais, necessitando de poucos nutrientes adicionais ao meio. Adicionalmente, o custo do meio de fermentação pode representar até 30% do total de uma produção enzimática. Assim, há interesse na utilização de resíduos agroindustriais como substrato, representando, em países como o Brasil, matéria prima abundante e de baixo custo (Graminha, E. B. N.; Gonçalves, A. Z. L.; Pirota, R. D. P. B.; Balsalobre, Μ. A A.; Da Silva, R. E. Enzyme production by solid-state fermentation: application to animal nutrition. Animal Feed Science and Technology 144, p. 1-22, 2008), (Pandey, 2003). Devido ao baixo teor de umidade e a ausência de água livre no meio, a probabilidade de contaminação por bactérias é reduzida. A pequena quantidade de água empregada na FES também implica em vantagens, tais como menor volume reacional e maior concentração do produto (Nagao, 2003), (Mitchell, 1992) (Mohapatra, P. K.; Maity, C.; Rao, R. S.; Pati, B. R.; Mondai, K. C. Tannase production by Bacillus licheniformis KBR6: Optimization of submerged culture conditions by Taguchi DOE methodology. Food Research International 42, p. 430-435, 2009.; Singhania, R. R.; Patel, A. K.; Soccol, C. R.; Pandey, A. Recent advances in solidstate fermentation. Biochemica! Engineering Journal 44, p. 13-18, 2009).Through solid state fermentation, the nutritional quality of this residue can be improved by breaking down antinutritional compounds such as phytate and tannin; In addition, solid state fermentation can be used to produce flavonoids such as hesperidin and hesperetin from agroindustrial residues. Phenolic compounds have been one of the main issues of fruit and vegetable consumption for health benefit, mainly related to antioxidant activity. Biological production of hesperetin is an important step in obtaining high value-added bioactive compounds that can be employed in the food and pharmaceutical industry as natural antioxidants with beneficial health effects. Solid state fermentation (FES) provides for the cultivation of microorganisms on solid substrates in the absence of a free aqueous phase (Pandey, A. Solid-state fermentation. Biochemistry Engeenering Journal 13, p. 81-84, 2003). However, the substrate must have adequate moisture to maintain growth and metabolism of the microorganism, without exceeding the maximum water retention capacity of the matrix (Foong, CW; Janaun, J .; Krishnaiah, K .; Prabhakar, A Effect of shallow air velocity on solid State fermentation of palm kernel cake in a lab scale fermenter using locally isolated strain Industrial Crops and Products 30, pp 114-118, 2009). The solid matrix used in the process can be both the nutrient source and simply a support impregnated with nutrients suitable for microorganism development (Pandey, 2003), (Nagao, N.; Matsuyama.T .; Yamamoto, H .; Toda , T. The novel hybrid system of solid state and submerged fermentation with recycle for organic solid waste treatment (Process Biochemistry 39, pp. 37-43, 2003). There are significant differences between solid state fermentation and submerged fermentation (FS) processes. The main difference between FES and FS is the amount of free water in the culture medium. In FS, the amount of solids does not exceed 50 g / l, while in FES the solids content varies from 20 to 70% of the total weight of the medium (Mitchell, DA; Losane, BK Definition, characteristic and potentiai. In: Doelle, Mitchell, DA, Rols, CE Solid substrate cultivation (Elsevier Applied Science, pp. 1-16,1992). FES confers advantages over FS such as the use of simple, non-water soluble culture media composed of plant-based materials such as rice bran, wheat, maize and other cereals, requiring few additional nutrients in the medium. Additionally, the cost of the fermentation medium may represent up to 30% of the total enzyme production. Thus, there is interest in the use of agroindustrial residues as substrate, representing, in countries such as Brazil, abundant and low cost raw material (Graminha, EBN; Gonçalves, AZL; Pirota, RDPB; Balsalobre, Μ. A A .; Da Silva , RE Enzyme production by solid-state fermentation: application to animal nutrition Animal Feed Science and Technology 144, pp. 1-22, 2008), (Pandey, 2003). Due to the low moisture content and the absence of free water in the medium, the likelihood of bacterial contamination is reduced. The small amount of water employed in FES also implies advantages such as lower reaction volume and higher product concentration (Nagao, 2003), (Mitchell, 1992) (Mohapatra, PK; Maity, C.; Rao, RS; Pati, BR; Mondai, KC Tannase production by Bacillus licheniformis KBR6: Optimization of submerged culture conditions by Taguchi DOE methodology.Food Research International 42, pp. 430-435, 2009; Singhania, RR; Patel, AK; Soccol, CR; Pandey, A. Recent advances in solidstate fermentation Biochemistry (Engineering Journal 44, pp. 13-18, 2009).

Dentre as características da FES, a baixa atividade de água do meio de cultivo sólido influencia nos aspectos fisiológicos dos micro-organismos, tais como no seu crescimento vegetativo, esporulação, germinação de esporos, produção de enzimas e atividade enzimática (Grammha, 2008). A FES pode, em alguns casos, ser economicamente mais interessante na produção de enzimas. George e colaboradores (George, S.; Raju, V.; Subramanian, T. V.; Jayaraman, K. Comparative study of protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation. Bioprocess Engineering 16, p. 381-382, 1997) compararam a produção de protease entre a fermentação em estado sólido e submersa. Os autores relataram que para um mesmo rendimento do produto, foram utilizados 100 ml_ de nutrientes em FS e 1 g para FES.Among the characteristics of FES, the low water activity of the solid culture medium influences the physiological aspects of microorganisms, such as its vegetative growth, sporulation, spore germination, enzyme production and enzymatic activity (Grammha, 2008). FES may, in some cases, be economically more interesting in enzyme production. George et al. (George, S.; Raju, V .; Subramanian, TV; Jayaraman, K. Comparative study of protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation. Bioprocess Engineering 16, p. 381-382, 1997) compared production of protease between solid and submerged fermentation. The authors reported that for the same product yield, 100 ml_ of nutrients in FS and 1 g in FES were used.

PRODUÇÃO DE LARANJA A laranja pertence ao grupo dos cítricos, que são classificadas nas espécies Citrus sinensis (laranja-doce) e Citrus aurantium (laranja-azeda), elas são consumidas por humanos, principal mente nas formas fresca ou como sucos processados ou ainda concentrados. Após a extração do suco da laranja, restam resíduos dos quais se destacam os óleos essenciais, d-limoneno e a casca, a qual apresenta o albedo e o flavedo (Santana, M. F. S. Caracterização físico-química de fibra alimentar de laranja e maracujá. Tese de Doutorado - UNICAMP-FEA, 2005).ORANGE PRODUCTION Orange belongs to the group of citrus, which are classified in the species Citrus sinensis (sweet orange) and Citrus aurantium (sour orange), they are consumed by humans, mainly in fresh forms or as processed or concentrated juices. . After the extraction of orange juice, residues remain, including the essential oils, d-limonene and the peel, which presents albedo and flavedo (Santana, MFS Physicochemical characterization of orange and passion fruit dietary fiber. Doctoral Degree - UNICAMP-FEA, 2005).

Hoje, no Brasil, a citricultura está voltada para a exportação, representando cerca de 53% do cenário mundial de suco de laranja, responsável por 80% do comércio internacional e 49% da produção brasileira neste setor (Pereira, C. L. F. Avaliação da sustentabilidade ampliada de produtos agroindustriais. Tese de Doutorado - UNICAMP-FEA, 2008).Today, in Brazil, the citrus industry is export oriented, representing about 53% of the world scenario of orange juice, responsible for 80% of international trade and 49% of Brazilian production in this sector (Pereira, CLF. agroindustrial products PhD Thesis - UNICAMP-FEA, 2008).

Indústrias de processamento alimentício, especialmente as de frutas, geram importantes quantidades de resíduos, ao qual devem ser propriamente gerenciados, por reciclagem, incineração ou aterramento (Pereira, 2008). Em 2010, estima-se produzir 66,4 milhões de toneladas de laranjas pelo mundo, um aumento de 14% em relação ao período de 1997 a 1999. Desta produção 30,1 milhões de toneladas serão processadas para o setor de sucos, óleos essenciais e casca (Food And Agriculture Organization Of The United Nations. Medium-term prospects for agricultura! commodities - Projections to the year 2010, Róme, Italy, 2003. Available from: <http://www.fao.org/docrep/006/y5143e/y5143e12.htm>). Estes resíduos são usados para formulação de rações ou podem ser administrados diretamente ao animal (Bampidis, V. A.; Robinson, P. H. Citrus by-products as ruminant feeds: a review. Animal Feed Science and Technology 128, p. 175-217, 2006).Food processing industries, especially fruit industries, generate significant amounts of waste, which must be properly managed by recycling, incineration or landfill (Pereira, 2008). In 2010, it is estimated to produce 66.4 million tons of oranges worldwide, an increase of 14% over the period 1997 to 1999. From this production 30.1 million tons will be processed for the juice, essential oils sector. and bark (Food And Agriculture Organization Of The United Nations. Medium-term Prospects For Agriculture! commodities - Projections to the year 2010, Rome, Italy, 2003. Available from: <http://www.fao.org/docrep/006 /y5143e/y5143e12.htm>). These residues are used for feed formulation or can be administered directly to the animal (Bampidis, V.A.; Robinson, P.H. Citrus by-products as ruminant feeds: a review. Animal Feed Science and Technology 128, p. 175-217, 2006).

Estes resíduos apresentam crescente interesse, isso porque há uma importância econômica e ecológica na sua remoção (Pereira, 2008). A casca de laranja apresenta componentes interessantes para a nutrição de animais, tais como: fibras alimentares, vitaminas, minerais e substâncias fenólicas (Aguilar, C. IM.; Aguilera-Carbo, A.; Robledo, A; Ventura, J.; Belmares, R.; Martinez, D.; Rodríguez-Herrera, R. Contreras, J. Production of antioxidant nutraceuticals by solid-state cultures of pomegranate (Punica granatum) peel and creosote bush (Larrea Trídentata) leaves. Food Technology and Biotechnology 46, p. 218-222, 2008). As fibras alimentares são consideradas a parte comestível de plantas ou carboidratos análogos que são resistentes à digestão e absorção no intestino. Elas podem ser divididas em duas frações: solúvel e não-solúvel em água. Apresentam efeitos fisiológicos benéficos ao sistema gastrintestinal, alterações do metabolismo de nutrientes e outros derivados da fermentação realizada no intestino (Chau, C. F.; Huang, Y. L. Comparison of the Chemical composition and physicochemical properties of different fibers prepared from the peel of Citrus sinensis L. Cv. Liucheng. Journal of Agricultural and Food Chemistry 51, p. 2615-2618, 2003). Em frutas, incluindo citrus, o total de fibras totais presentes são da ordem de 35 a 59 gramas a cada 100 gramas de matéria seca, sendo 21 a 44 gramas por 100 gramas para fibras insolúveis e 10 a 14 grama por 100 gramas de matéria seca para fibras solúveis (Grigelmo-Miguel, N.; Martin-Belloso, O. Comparison of dietary fibre from byproducts of Processing fruits and greens and from cereais. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie 32, p. 503-508, 1999).These wastes are of growing interest, because there is an economic and ecological importance in their removal (Pereira, 2008). Orange peel has interesting components for animal nutrition, such as: dietary fiber, vitamins, minerals and phenolic substances (Aguilar, C. IM .; Aguilera-Carbo, A.; Robledo, A; Ventura, J .; Belmares , R. Martinez, D. Rodríguez-Herrera, R. Contreras, J. Production of antioxidant nutraceuticals by solid-state cultures of pomegranate (Punica granatum) peel and creosote bush (Larrea Trídentata) leaves Food Technology and Biotechnology 46, pp 218-222, 2008). Dietary fiber is considered the edible part of plants or analogous carbohydrates that are resistant to digestion and absorption in the intestine. They can be divided into two fractions: soluble and non-soluble in water. They have beneficial physiological effects on the gastrointestinal system, changes in nutrient metabolism and other derivatives of fermentation performed in the intestine (Chau, CF; Huang, YL. Comparison of the chemical composition and physicochemical properties of different fibers prepared from the peel of Citrus sinensis L. Cv Liucheng, Journal of Agricultural and Food Chemistry 51, pp. 2615-2618, 2003). In fruits, including citrus, the total total fiber content is 35 to 59 grams per 100 grams of dry matter, with 21 to 44 grams per 100 grams for insoluble fibers and 10 to 14 grams per 100 grams of dry matter. for soluble fibers (Grigelmo-Miguel, N.; Martin-Belloso, O. Comparison of dietary fiber from by-products of Processing fruits and greens and from cereals. Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie 32, p. 503-508, 1999).

Os minerais também estão presentes em citrus, principalmente o cálcio que representa cerca de 21,7 gramas a cada quilograma de matéria seca; o fósforo com 1,2 gramas; potássio com 6,8 gramas; ferro com 180 gramas e zinco com 16 gramas a cada quilograma de matéria seca (Bampidis, V. A.; Robinson, P. H. Citrus by-products as ruminant feeds: a review. Animal Feed Science and Technology 128, p. 175-217, 2006). O cálcio em conjunto com o fósforo está diretamente envolvido com o desenvolvimento e manutenção do sistema esquelético e participa em muitos processos fisiológicos (NRC (National Research Council), Nutrient Requirements of Fish. National Academic Press, Washington, DC, 1993). Em vertebrados, o cálcio se liga ao fósforo no composto hidroxiapatita para formar o principal componente dos ossos. Para os peixes este mineral é afetado pela constituição química da água. A absorção deve ser pela água em que o peixe se ambienta e também pela alimentação (Lall, S. P. The minerais. In: Halver, J.E., Hardy, R.W. (Eds), Fish Nutrition, 3rd ed. Academic Press, San Diego, CA, p. 259-308, 2002). Estudos mostraram que a inclusão de cálcio na ração para peixes da espécie Litopenaeus vannamei aumentaram seu peso corpôreo (Cheng, K. M.; Hu, C. Q.; Liu, Y. N.; Zheng, S. X.; Qi, X. J. Effects of dietary calcium, phosphorus and calcium/phosphorus ratio on the growth and tissue mineralization of Litopenaeus vannamei reared in low-salinity water. Aquacuiture 251, p. 472-483, 2006). Também que a suplementação de cálcio com 0,75% na ração apresentou efeito positivo na mineralização dos ossos na espécie Salmo salar (Vielma, J.; Lall, S. P. Phosphorus utilization by Atlantic salmon (Salmo salai) reared in freshwater is not influenced by higher dietary calcium intake. Aquacuture 160, p. 117-128, 1998).Minerals are also present in citrus, especially calcium which represents about 21.7 grams per kilogram of dry matter; phosphorus with 1.2 grams; 6.8 gram potassium; 180 gram iron and 16 gram zinc for each kilogram of dry matter (Bampidis, V.A.; Robinson, P.H. Citrus by-products as ruminant feeds: a review. Animal Feed Science and Technology 128, p. 175-217, 2006). Calcium in conjunction with phosphorus is directly involved in the development and maintenance of the skeletal system and participates in many physiological processes (National Research Council), National Academic Press, Washington, DC, 1993). In vertebrates, calcium binds to phosphorus in the hydroxyapatite compound to form the major component of bones. For fish this mineral is affected by the chemical constitution of water. Absorption should be by the water in which the fish is acclimated and also by food (Lall, SP The Minerals. In: Halver, JE, Hardy, RW (Eds), Fish Nutrition, 3rd Ed. Academic Press, San Diego, CA, pp. 259-308, 2002). Studies have shown that the inclusion of calcium in the Litopenaeus vannamei fish diet increased its body weight (Cheng, KM; Hu, CQ; Liu, YN; Zheng, SX; Qi, XJ Effects of dietary calcium, phosphorus and calcium / phosphorus ratio). on the growth and tissue mineralization of Litopenaeus vannamei reared in low-salinity water (Aquacuiture 251, pp. 472-483, 2006). Calcium supplementation with 0.75% in the diet also had a positive effect on bone mineralization in Salmo salar (Vielma, J .; Lall, SP.) Phosphorus utilization by Atlantic salmon (Salmo salai) reared in freshwater. dietary calcium intake (Aquacuture 160, pp. 117-128, 1998).

HESPERETINA A hesperetina é um flavonóide encontrado em quantidades traço em frutas cítricas, conhecido por seu poder antioxidante, anticarcinogênico, vasoprotetor e apresentar outras importantes propriedades terapêuticas. A hesperetina encontrada em plantas está frequentemente conjugada com açúcares (principalmente glicose) na forma de glicosídos, chamado de hesperidina (hesperetina-7-O-ramnosídeo). Essa forma gliosilada reduz a biodisponibilidade e capacidade antioxidante deste composto, devido a importância da presença de grupos hidroxilas não ligados na estabilidade de radicais livres. Sendo assim, a hidrólise desses conjugados fenólicos pode ser uma alternativa para aumentar a concentração de polifenóis livres bem como bidisponibilidade e a atividade nutracêutica de vários alimentos.HESPERETIN Hesperetin is a flavonoid found in trace amounts in citrus fruits, known for its antioxidant, anticarcinogenic, vasoprotective power and other important therapeutic properties. Hesperetin found in plants is often conjugated with sugars (mainly glucose) in the form of glycosides, called hesperidin (hesperetin 7-O-ramnoside). This glycosylated form reduces the bioavailability and antioxidant capacity of this compound due to the importance of the presence of unbound hydroxyl groups on free radical stability. Thus, hydrolysis of these phenolic conjugates may be an alternative to increase the concentration of free polyphenols as well as the bioavailability and nutraceutical activity of various foods.

Compostos fenólicos têm sido uma das principais questões do consumo de frutas e vegetais em benefício à saúde, principalmente relacionado à atividade antioxidante. A maioria dos alimentos usa antioxidantes sintéticos, como BHA (butylated hydroxyanisole), BHT (butylated hydroxytoluene) e TBHQ (tertiary butylhydroquinone). Entretanto, o emprego de aditivos os sintéticos ainda apresenta dúvidas sobre a segurança, o que acabou aumentando o interesse aos antioxidantes naturais. Estes compostos são determinantes para o potencial antioxidativo de alimentos e assim adquiri-los a partir de uma fonte natural. Alguns compostos fenólicos podem exercer importante papel tecnológico como na prevenção da oxidação lipídica e outras substâncias, para assim aumentar sua vida de prateleira (shelf-life).Phenolic compounds have been one of the main issues of fruit and vegetable consumption for health benefit, mainly related to antioxidant activity. Most foods use synthetic antioxidants such as BHA (butylated hydroxyanisole), BHT (butylated hydroxytoluene) and TBHQ (tertiary butylhydroquinone). However, the use of synthetic additives still poses safety concerns, which has increased interest in natural antioxidants. These compounds are crucial for the antioxidant potential of foods and thus acquire them from a natural source. Some phenolic compounds can play an important technological role, such as preventing lipid oxidation and other substances, thus increasing their shelf life.

Outros compostos, no entanto, como no caso da hesperetina, além do aspecto tecnológico citado acima, o valor agregado a ele seria muito maior se fosse empregado como composto bioativo, que protege o consumidor do desenvolvimento de doenças crônico-degenerativas, pois este composto possui atividades biológicas anticancerígenas e antiproliferativas comprovadas na literatura.Other compounds, however, as in the case of hesperetin, besides the technological aspect mentioned above, the value added to it would be much higher if it were used as bioactive compound, which protects the consumer from the development of chronic degenerative diseases, since this compound has anticancer and antiproliferative biological activities proven in the literature.

Um processo alternativo para produção de hesperetina ou alimentos ricos em compostos bioativos derivados de compostos fenólicos, seria a utilização de resíduos da indústria de laranja como substrato da fermentação para produção desses compostos.An alternative process for producing hesperetin or foods rich in bioactive compounds derived from phenolic compounds would be to use orange industry residues as a fermentation substrate for the production of these compounds.

Dessa forma, o presente invento descreve um processo que permite com que o bagaço de laranja apresente maior capacidade antioxidante em relação ao meio não fermentado, possibilitando ainda a extração de um ingrediente interessante para indústria alimentícia, podendo atuar como conservante para impedir a oxidação dos produtos e assim aumentar sua vida de prateleira, ao mesmo tempo apresentam propriedades funcionais e farmacêuticas, pois possuem atividade antiviral, anti-carcinogenica, anti-inflamatória e antimicrobiana.Thus, the present invention describes a process that allows orange pomace to have greater antioxidant capacity than the unfermented medium, while also allowing the extraction of an interesting ingredient for the food industry, and can act as a preservative to prevent the oxidation of products. and thus increase their shelf life, at the same time have functional and pharmaceutical properties, as they have antiviral, anti-carcinogenic, anti-inflammatory and antimicrobial activity.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A produção mundial de laranja tem aumentado significativamente desde a década de oitenta, especialmente no setor de processamento de suco, sendo que cerca de 40% desta produção é convertida em subproduto, principalmente a casca.BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION Worldwide orange production has increased significantly since the 1980s, especially in the juice processing sector, with around 40% of this production being converted into byproduct, mainly peel.

Dessa forma, o processo descrito no presente invento permite que o bagaço de laranja apresente maior capacidade antioxidante em relação ao meio não fermentado, representando um ingrediente interessante para produção de hesperetina, um flavonóide de grande interesse comercial por ser um composto que previne a oxidação dos alimentos, podendo assim atuar como conservante para o aumento da vida de prateleira desses, além de apresentar outras características funcionais, de suplementação e farmacológicas, atuando como elemento anti-tumoral, anti-viral e anti-inflamatório. A presente invenção compreende, portanto, o processo de produção de hesperetina, através da fermentação em estado sólido, em bagaço de laranja empregando o fungo Paecilomyces varíotii, a hesperetina obtida pelo processo descrito e seus usos.Thus, the process described in the present invention allows the orange pomace to have greater antioxidant capacity than the unfermented medium, representing an interesting ingredient for the production of hesperetin, a flavonoid of great commercial interest because it is a compound that prevents the oxidation of thus acting as a preservative to increase shelf life of these foods, in addition to presenting other functional, supplementation and pharmacological characteristics, acting as an anti-tumor, anti-viral and anti-inflammatory element. The present invention therefore comprises the process of producing hesperetin by solid state fermentation in orange pomace employing the fungus Paecilomyces variotii, the hesperetin obtained by the process described and its uses.

Atualmente, a obtenção de compostos fenólicos para serem incorporados aos alimentos é feita por extração ou síntese química. Os compostos fenólicos são recuperados a partir de fontes naturais através da extração sólido-líquido ou líquido-líquido, empregando solventes orgânicos em sistemas de fluxo de calor. Entretanto, outras técnicas têm sido usadas para obter estes compostos, incluindo o uso de fluidos supercrítico, processos de alta pressão, extração por micro-ondas ou por ultra-som. O processo descrito na presente invenção para produção de hesperetina por fermentação a partir de bagaço de laranja é uma alternativa que não utiliza compostos tóxicos, como os solventes orgânicos. A hesperetina é obtida de fonte natural, sendo produzida por Paecilomyces variotii através de seu metabolismo secundário ou ação enzimática.Currently, the phenolic compounds to be incorporated into foods are obtained by extraction or chemical synthesis. Phenolic compounds are recovered from natural sources by solid-liquid or liquid-liquid extraction employing organic solvents in heat flow systems. However, other techniques have been used to obtain these compounds, including the use of supercritical fluids, high pressure processes, microwave or ultrasound extraction. The process described in the present invention for producing hesperetin by fermentation from orange pomace is an alternative that does not use toxic compounds such as organic solvents. Hesperetin is obtained from a natural source, being produced by Paecilomyces variotii through its secondary metabolism or enzymatic action.

Foram obtidos valores de 4 mg de hesperetina a cada 100 gramas de bagaço de laranja. Essa produção foi conduzida utilizando 10 gramas de bagaço de laranja, 10 mL de água destilada com tempo de fermentação de 48 horas.Values of 4 mg of hesperetin were obtained per 100 grams of orange pomace. This production was conducted using 10 grams of orange pomace, 10 mL of distilled water with fermentation time of 48 hours.

BREVE DESCRIÇÃO DOS ANEXOSBRIEF DESCRIPTION OF ANNEXES

No Anexo 1 é possível visualizar-se a produção de Hesperetina durante a fermentação do bagaço de laranja pelo Paecilomyces variotii e é possível identificar-se que o período ótimo de incubação do micro-organismo Paecilomyces variotii para produção da Hesperetina é de 48 horas, sofrendo uma pequena queda até 96 horas, e tornando-se constante até 120 horas. DESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO CARACTERIZAÇÃO DO RESÍDUO DE LARANJA: O resíduo do bagaço de laranja na forma seca da casca (albedo e flavedo) deve ser triturado e submetido a um processo de separação granulométrica em tamis de 10 mesh, com 1,68 mm para avaliação de se pH, quantidade de água e teor de umidade.Annex 1 shows the production of Hesperetin during orange bagasse fermentation by Paecilomyces variotii and it is possible to identify that the optimal incubation period of the microorganism Paecilomyces variotii for production of Hesperetin is 48 hours. a small drop up to 96 hours, and becoming steady up to 120 hours. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION ORANGE RESIDUE CHARACTERIZATION: The residue from the orange peel in the dry form of the peel (albedo and flavedo) must be ground and subjected to a 1.68 mm 10 mesh sieve size separation process for evaluation. pH, water content and moisture content.

A) Determinação do pHA) pH determination

Para determinação do pH, adicionam-se 5 mL de água deionizada a 0,5 g de amostra e agita-se a mistura vigorosamente. Após 10 minutos, o pH do sobrenadante é medido em potenciômetro e, o resultado obtido deve ser 4,1, com variação de 0,01 para mais ou para menos. B) Porcentagem de Água Para determinar-se a quantidade de água presente no resíduo de laranja, sugere-se utilizar metodologia para amostras com baixa quantidade de água livre, como cereais, casca de frutas, resíduos vegetais e grãos, como a desenvolvida por Laitinen (Laitnen, Η. A. Boyer, K. W. Automobile exhaust particulates properties of environmental significance. Environmental Science and Technology 279, p. 457-1086, 1975). Esta metodologia baseia-se na oxidação de SO2 pelo l2, que constituem o reagente de Karl Fischer, na presença de água, conforme ilustrado na equação química a seguir: l2+ so2 + h2o — 2HI + h2so4 Esta metodologia deve ser realizada por titulação volumétrica, pois fornece diretamente a porcentagem de água da amostra, sendo necessário fornecer a massa de amostra adicionada no frasco de titulação. A quantidade de água na amostra deve ser de aproximadamente 8,01%, com variação de 0,19% para mais ou para menos. C) Umidade Para determinação da umidade da amostra, deve-se incubar 0,5 g da amostra por 24 horas em estufa a 105°C e, deve-se fazer a pesagem em períodos regulares até que essas amostras atinjam peso constante. PROCESSO FERMENTATIVO: A) Microroanismo e preparo do pré-inóculo O microrganismo Paecilomyces varíotii deve ser mantido em meio Potato Dextrose Agar (PDA - OXOlD - CM0139) com suplemento de 0,2% de ácido tânico (Tanal B - Prozyn - BioSolutions) e, antes de ser utilizado no meio de cultura, deve permanecer incubado em estufa a 30 °C durante 72 horas.For pH determination, 5 ml of deionized water is added to 0.5 g of sample and the mixture is shaken vigorously. After 10 minutes, the pH of the supernatant is measured in a potentiometer and the result obtained should be 4.1, ranging from 0.01 to plus or minus. B) Water Percentage To determine the amount of water present in the orange residue, it is suggested to use methodology for samples with low amount of free water, such as cereals, fruit peel, vegetable residues and grains, as developed by Laitinen. (Laitnen, A. Boyer, KW Automotive exhaust particulate properties of environmental significance. Environmental Science and Technology 279, p. 457-1086, 1975). This methodology is based on the oxidation of SO2 by l2, which is Karl Fischer's reagent, in the presence of water, as illustrated in the following chemical equation: l2 + so2 + h2o - 2HI + h2so4 This methodology should be performed by volumetric titration, as it directly provides the sample water percentage and the sample mass added to the titration vial must be supplied. The amount of water in the sample should be approximately 8.01%, with a plus or minus 0.19% change. C) Moisture To determine the moisture content of the sample, 0.5 g of the sample should be incubated for 24 hours in an oven at 105 ° C and weighed at regular intervals until these samples reach constant weight. FERMENTATIVE PROCESS: A) Microanism and pre-inoculum preparation The Paecilomyces varíotii microorganism should be maintained in Potato Dextrose Agar (PDA - OXOlD - CM0139) medium with a 0.2% tannic acid supplement (Tanal B - Prozyn - BioSolutions) and , before use in the culture medium, should be incubated in an oven at 30 ° C for 72 hours.

Após a incubação, deve ser realizada uma suspensão celular com um homogeneizador, obtendo-se no final uma concentração de 9 x 106 células/mL. B) Meio de Fermentação Devem ser misturados, na proporção de g/mL, 1 parte do resíduo (bagaço de laranja) para 1 parte de água destilada e 10% de ácido tânico. Em seguida, o recipiente no qual foi feita a mistura deve ser esterilizado em autoclave a temperatura de 121 °C durante 15 minutos.After incubation, a cell suspension with a homogenizer should be carried out, resulting in a concentration of 9 x 10 6 cells / mL. B) Fermentation Medium 1 part of the residue (orange pomace) to 1 part distilled water and 10% tannic acid should be mixed in g / mL ratio. Then the mixing vessel should be autoclaved at 121 ° C for 15 minutes.

Após ser resfriado à temperatura ambiente, adiciona-se a suspensão de esporos do Paecilomyces variotii, ao meio de fermentação do bagaço de laranja, citado no parágrafo anterior. Após a inoculação, os recipientes devem ser incubados em estufa a 30°C durante 120 horas. C) Otimização de Produção de Hesperetina Para produção de hesperetina foi determinado que o período ótimo de incubação do microorganismo Paecilomyces variotii é de 48 horas, sofrendo uma pequena queda até as 96 horas, quando o valor de produção torna-se constante e apresenta queda após 120 horas, como podemos verificar no anexo 1.After being cooled to room temperature, the spore suspension of Paecilomyces variotii is added to the orange pomace fermentation medium referred to in the previous paragraph. After inoculation, the containers should be incubated in an oven at 30 ° C for 120 hours. C) Optimization of Hesperetin Production For hesperetin production, it was determined that the optimal incubation period of the Paecilomyces variotii microorganism is 48 hours, with a slight decrease until 96 hours, when the production value becomes constant and decreases after 120 hours, as we can see in annex 1.

Como rendimento, foram obtidos valores de 4 mg de hesperetina a cada 100 gramas de bagaço de laranja. Essa produção foi conduzida utilizando 10 gramas de bagaço de laranja, 10 mL de água destilada com tempo de fermentação de 48 horas.As a yield, 4 mg of hesperetin was obtained per 100 grams of orange pomace. This production was conducted using 10 grams of orange pomace, 10 mL of distilled water with fermentation time of 48 hours.

EXEMPLO DETERMINAÇÃO DO PERÍODO ÓTIMO DE INCUBAÇÃO: A fim de se definir o melhor tempo de fermentação para produção dos fenólicos foram realizados testes nos tempos 0, 24, 48, 72, 96 e 120 h de fermentação. A extração destes compostos, foi realizada de acordo com a metodologia modificada de Hayat et ai. (Hayat, K.; Zhang, X.; Farooq, U.; Abbar, S.; Xia, S.; Jia, C.; Zhong, F.; Zhang, J. Effect of microwave treatment on phenolic content and antioxidant activity of citrus mandarin pomace. Food Chemistry 123, 423-429, 2010), em que 1 g do resíduo cítrico foi extraído em 25 mL de solução metanólica à 80% em agitação de 200 rpm durante 30 min e em seguida tratado no aparelho ultra-som durante 30 min. A mistura é filtrada em papel de filtro Whatman n°4, e em seguida em filtros de 0,45 pm. Por fim, analisou-se o extrato em HPLC para identificação e quantificação dos compostos fenólicos. O sistema cromatográfico foi realizado no UHPLC Dionex com detector DAD, coluna C18 (5 pm, 4,6 mm x 150 mm, Waters, USA) para separação à temperatura de 30 °C. A fase móvel A consistia de água e ácido fórmico 0,1%; a fase móvel B de solução de ácido fórmico 0,1% em metanol. A injeção da amostra foi de 20 pL em um fluxo de 0,6 mL/min, enquanto o gradiente do solvente em porcentagem de volume foi de: 0-5 min, 10% B; 5-40 min, 10-80% B; 40-45 min, 80-10% B; 45-50 min, 10% B e operou-se o detector DAD na faixa de 190 a 480 nm.EXAMPLE DETERMINATION OF THE BEST INCUBATION PERIOD: In order to define the best fermentation time for phenolic production, tests were performed at fermentation times 0, 24, 48, 72, 96 and 120 h. Extraction of these compounds was performed according to the modified methodology of Hayat et al. (Hayat, K .; Zhang, X .; Farooq, U .; Abbar, S.; Xia, S .; Jia, C.; Zhong, F .; Zhang, J. Effect of microwave treatment on phenolic content and antioxidant activity. of citrus mandarin pomace, Food Chemistry 123, 423-429, 2010), wherein 1 g of the citrus residue was extracted into 25 mL of 80% methanolic solution while stirring at 200 rpm for 30 min and then treated in the ultrasonic apparatus. sound for 30 min. The mixture is filtered on Whatman # 4 filter paper, and then on 0.45 pm filters. Finally, the HPLC extract was analyzed for identification and quantification of phenolic compounds. The chromatographic system was performed on the Dionex UHPLC with DAD detector, column C18 (5 pm, 4.6 mm x 150 mm, Waters, USA) for separation at 30 ° C. Mobile phase A consisted of water and 0.1% formic acid; mobile phase B of 0.1% formic acid solution in methanol. Sample injection was 20 pL in a flow rate of 0.6 mL / min, while solvent gradient in volume percentage was: 0-5 min, 10% B; 5-40 min, 10-80% B; 40-45 min, 80-10% B; 45-50 min, 10% B and the DAD detector was operated in the range 190 to 480 nm.

Os ácidos fenólicos foram identificados pelo tempo de retenção e os espectros do UV-Vis dos padrões e os ácidos fenólicos quantificados a partir das áreas dos picos a 270 nm.Phenolic acids were identified by retention time and UV-Vis spectra of standards and phenolic acids quantified from peak areas at 270 nm.

Todos os compostos fenólicos foram quantificados por curva de calibração, sendo que as concentrações foram expressas em microgramas por grama de amostra em peso seco (pg/g PS). A partir do método acima descrito, verificou-se a quantidade de hesperidina obtida em cada um dos períodos observados e, dessa forma, determinou-se que o período ótimo de incubação do micro-organismo Paecilomyces variotii para produção da Hesperetina foi de 48 horas, sofrendo uma pequena queda até 96 horas, e tornando-se constante até 120 horas.All phenolic compounds were quantified by calibration curve, and concentrations were expressed in micrograms per gram of dry weight sample (pg / g PS). From the method described above, the amount of hesperidin obtained in each of the observed periods was verified and, thus, it was determined that the optimal incubation period of Paecilomyces variotii microorganism for production of Hesperetin was 48 hours, suffering a slight drop up to 96 hours, and becoming steady up to 120 hours.

Ao mesmo tempo a presença da Hesperidina, que é a forma gliconada (apresenta rutinose) da Hesperetina, sofreu redução durante a fermentação. Este resultado mostrou que provavelmente o micro-organismo hidrolizou a rutinose, tornando o composto na forma agliconada (Tabela 1 e Anexo 1).At the same time, the presence of Hesperidine, which is the glycated form (shows rutinosis) of Hesperetin, was reduced during fermentation. This result showed that the microorganism probably hydrolyzed rutinosis, rendering the compound in the agglonated form (Table 1 and Annex 1).

Tabela 1. Produção de Hesperetina durante a Fermentação do Bagaço de Laranja pelo Paecilomyces varíotii.Table 1. Production of Hesperetin during Orange Bagasse Fermentation by Paecilomyces varíotii.

Claims

Process for production of hesperetin by the microorganism Paecilomyces variotii characterized by solid fermentation in orange pomace.

Process for the production of hesperetin by the microorganism Paecilomyces variotii according to Claim 1, characterized in that the culture medium consists of orange pomace and distilled water.

Process for the production of hesperetin by the microorganism Paecilomyces variotii according to Claim 2, characterized in that the culture medium is preferably composed of 1 part in grams of orange pomace to 1 part in milliliters of distilled water.

Process for the production of hesperetin by the microorganism Paecilomyces variotii according to claims 1 to 3, characterized in that the fermentation of the microorganism in the culture medium preferably takes place for 48 hours.

Hesperetin characterized in that it is produced according to the process described in claims 1 to 4.

6. Hesperetin characterized by being produced by the microorganism Paecilomyces variotii by solid fermentation.

7. Hesperetin characterized by being produced by the microorganism Paecilomyces variotii by solid fermentation in orange pomace.

Hesperetin according to any one of claims 5 to 7, characterized in that it is preferably obtained after 48 hours of incubation.

9. Hesperetin produced by the microorganism Paecilomyces variotii characterized by solid fermentation in orange pomace.

Hesperetin produced by the microorganism Paecilomyces variotii according to claim 9, which is preferably obtained after 48 hours of incubation.

11. Hesperetin produced by the microorganism Paecilomyces varioiii by solid fermentation in orange pomace, which is preferably obtained after 48 hours of incubation.

Use of the process described in claims 1 to 4 for producing hesperetin.

Use of hesperetin obtained according to claims 1 to 11, characterized in that it is for additive in functional foods.

Use of hesperetin obtained according to claims 1 to 11, characterized in that it is a food preservative.

Use of hesperetin obtained according to Claims 1 to 11, characterized in that it is for nutritional supplementation.

Use of hesperetin obtained using the culture medium described in claims 1 to 11 characterized in that it is for the production of drugs.