BR122020012304B1 - BINDING COMPOUND FOR ANTIBODY-DRUG CONJUGATES, PRODUCTION METHOD AND INTERMEDIATES - Google Patents
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Abstract
é fornecido um conjugado anticorpo-fármaco que pode ser usado como um agente antitumor que tem um excelente efeito antitumor e é altamente seguro, o referido conjugado sendo caracterizado por ser produzido por ligação de um composto antitumor representado pela fórmula (1) a um anticorpo por meio de um ligante tendo uma estrutura representada pela fórmula: -l1-l2-lp-nh-(ch2)n1-la-lb-lc- (em que o anticorpo é ligado ao terminal de l1, e o composto antitumor é ligado ao terminal de lc na qual o sítio de ligação do composto antitumor é um átomo de nitrogênio em um grupo amino localizado na posição-1).an antibody-drug conjugate is provided which can be used as an antitumor agent which has an excellent antitumor effect and is highly safe, said conjugate being characterized by being produced by linking an antitumor compound represented by formula (1) to an antibody by means of a linker having a structure represented by the formula: -11--12-lp-nh-(ch2)n1-la-lb-lc- (wherein the antibody is attached to the terminus of 11, and the antitumor compound is attached to the terminal of lc in which the binding site of the antitumor compound is a nitrogen atom in an amino group located at the 1-position.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um conjugado de anticor- po-fármaco tendo um fármaco antitumor conjugado a um anticorpo capaz de atingir células de tumor por meio de uma porção de estrutura do ligante, o conjugado sendo útil como um fármaco antitumor.[001] The present invention relates to an antibody-drug conjugate having an antitumor drug conjugated to an antibody capable of targeting tumor cells by means of a linker framework portion, the conjugate being useful as an antitumor drug .
[002] Um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) tendo um fár- maco com citotoxicidade conjugado a um anticorpo, cujo antígeno é expresso sobre a superfície de células de câncer e que também se liga a um antígeno capaz de internalização celular, e, portanto, pode liberar o fármaco seletivamente para células de câncer e é, desse modo, esperado causar o acúmulo do fármaco dentro de células de câncer e matar as células de câncer (ver, Literaturas de Não Patente 1 a 3). Como um ADC, Mylotarg (Gemtuzumabe ozogamicina) em que cali- queamicina é conjugado a um anticorpo anti-CD33 é aprovado como um agente terapêutico para leucemia mieloide aguda. Além disso, Adcetris (Brentuximabe vedotin), em que auristatina E é conjugada a um anticorpo anti-CD30, foi recentemente aprovado como um agente terapêutico para linfoma de Hodgkin e linfoma de célula grande ana- plásica (ver, Literatura de Não Patente 4). Os fármacos contidos em ADCs que foram aprovados até agora alvejam DNA ou tubulina.[002] An antibody-drug conjugate (ADC) having a drug with cytotoxicity conjugated to an antibody, whose antigen is expressed on the surface of cancer cells and which also binds to an antigen capable of cell internalization, and, therefore, it can selectively deliver the drug to cancer cells and is thus expected to cause the drug to accumulate within cancer cells and kill the cancer cells (see, Non-Patent Literatures 1 to 3). As an ADC, Mylotarg (Gemtuzumab ozogamycin) in which calicheamicin is conjugated to an anti-CD33 antibody is approved as a therapeutic agent for acute myeloid leukemia. In addition, Adcetris (Brentuximab vedotin), in which auristatin E is conjugated to an anti-CD30 antibody, has recently been approved as a therapeutic agent for Hodgkin's lymphoma and anaplastic large cell lymphoma (see, Non-Patent Literature 4) . The drugs contained in ADCs that have been approved so far target DNA or tubulin.
[003] Com respeito a um antitumor, compostos de baixo peso molecular, derivados de camptothecina, compostos que inibem a to-poisomerase I de exibir um efeito antitumor, são conhecidos. Entre eles, um composto antitumor representado pela fórmula abaixo Fórmula 1
[004] DE-310 é um complexo em que exatecano é conjugado a um polímero de poliálcool de carboximetildextrana biodegradável por meio de um espaçador de peptídeo de GGFG (Literatura de Patente 3). Convertendo exatecano em uma forma de um profármaco de polímero, de modo que uma propriedade de retenção de sangue elevada possa ser mantida e também uma elevada propriedade alvejável para uma área de tumor é passivamente aumentada utilizando a permeabilidade aumentada de vasos sanguíneos recentemente formados den- tro de tumor e propriedade de retenção em tecidos de tumor. Com DE- 310, por meio de uma clivagem do espaçador de peptídeo por enzima, exatecano e exatecano com glicina conectada a um grupo amino são continuamente liberados como uma principal substância ativa. Como um resultado, os farmacocinéticos são melhorados e DE-310 foi descoberto ter maior eficácia do que o exatecano administrado sozinho, embora a dosagem de exatecano é menor do que no caso da administração de exatecano sozinho de acordo com vários modelos de avaliação de tumor em estudos não clínicos. Um estudo clínico foi conduzido para DE-310, e casos efetivos foram confirmados em humanos, em que um relato sugerindo que a principal substância ativa acumula-se em um tumor senão em tecidos normais estava presente, entretanto, existe também um relato indicando que o acúmulo de DE-310 e a principal substância ativa em um tumor não é muito diferente do acúmulo em tecidos normais em humanos, e, desse modo, nenhum alvejamen- to passivo é observado em humanos (ver, Literaturas de Não Patente 11 a 14). Como um resultado, DE-310 não foi também comercializado, e ainda não está claro se ou não exatecano funciona efetivamente como um fármaco orientado para tal alvejamento.[004] DE-310 is a complex in which exatecan is conjugated to a biodegradable carboxymethyldextran polyalcohol polymer by means of a GGFG peptide spacer (Patent Literature 3). By converting exatecan into a form of a polymer prodrug, so that a high blood retention property can be maintained and also a high targetable property for a tumor area is passively increased using the increased permeability of newly formed blood vessels within of tumor and retention property in tumor tissues. With DE-310, via an enzyme-linked peptide spacer cleavage, exatecan and exatecan with glycine connected to an amino group are continuously released as a major active substance. As a result, pharmacokinetics are improved and DE-310 was found to have greater efficacy than exatecan given alone, although the dosage of exatecan is lower than in the case of administering exatecan alone according to various tumor assessment models in non-clinical studies. A clinical study was conducted for DE-310, and effective cases were confirmed in humans, in which a report suggesting that the main active substance accumulates in a tumor if not in normal tissues was present, however, there is also a report indicating that the accumulation of DE-310 and the main active substance in a tumor is not very different from accumulation in normal tissues in humans, and thus no passive targeting is observed in humans (see, Non-Patent Literatures 11 to 14) . As a result, DE-310 has also not been commercialized, and it is still unclear whether or not exatecan works effectively as a targeted drug for such a targeting.
[005] Como um composto relativo a DE-310, um complexo em que uma porção de estrutura representado por -NH(CH2)4C(=O)- é inserida entre espaçador de -GGFG- e exatecano para formar -GGFG- NH(CH2)4C(=O)- usado como uma estrutura espaçadora é também conhecido (Literatura de Patente 4). Entretanto, o efeito antitumor do complexo não é conhecido absolutamente. Lista de Citação Literatura de Patente Literatura de Patente 1: Patente Japonesa Aberta à Inspeção Pública No. 5-59061 Literatura de Patente 2: Patente Japonesa Aberta à Inspeção Pública No. 8-337584 Literatura de Patente 3: Publicação Internacional No. WO 1997/46260 Literatura de Patente 4: Publicação Internacional No. WO 2000/25825 Literatura de Não Patente[005] As a compound related to DE-310, a complex in which a structure portion represented by -NH(CH2)4C(=O)- is inserted between -GGFG- spacer and exatecan to form -GGFG-NH( CH2)4C(=O)- used as a spacer structure is also known (Patent Literature 4). However, the antitumor effect of the complex is not known at all. Citation List Patent Literature Patent Literature 1: Japanese Patent Open to Public Inspection No. 5-59061 Patent Literature 2: Japanese Patent Open to Public Inspection No. 8-337584 Patent Literature 3: International Publication No. WO 1997/ 46260 Patent Literature 4: International Publication No. WO 2000/25825 Non-Patent Literature
[006] Literatura de Não Patente 1: Ducry, L., et al. Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13; conjugados de anticorpo-fármaco: Linking cytotoxic payloads to monoclonal antibodies.[006] Non-Patent Literature 1: Ducry, L., et al. Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13; antibody-drug conjugates: Linking cytotoxic payloads to monoclonal antibodies.
[007] Literatura de Não Patente 2: Alley, S. C., et al. Current Opi nion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537; conjugados de anticor- po-fármaco: liberação de fármaco alvejado para câncer.[007] Non-Patent Literature 2: Alley, S.C., et al. Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537; antibody-drug conjugates: targeted cancer drug release.
[008] Literatura de Não Patente 3: Damle N.K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452; Quimioterapia dirigida ao tumor com imu- noconjugados de caliqueamicina.[008] Non-Patent Literature 3: Damle N.K. Expert Opinion. Biol. The R. (2004) 4, 1445-1452; Tumor-targeted chemotherapy with calicheamicin immunoconjugates.
[009] Literatura de Não Patente 4: Senter P. D., et al. Nature Bio technology (2012) 30, 631-637; A descoberta e desenvolvimento de brentuximabe vedotina para uso em linfoma de Hodgkin recaído e lin- foma sistêmico de célula grande anaplásica.[009] Non-Patent Literature 4: Senter P.D., et al. Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637; Discovery and development of brentuximab vedotin for use in relapsed Hodgkin's lymphoma and anaplastic large cell systemic lymphoma.
[0010] Literatura de Não Patente 5: Kumazawa, E., Tohgo, A., Exp. Opin. Invest. Drugs (1998) 7, 625-632.; Atividade antitumor de DX-8951f: um novo derivado de camptotecina.[0010] Non-Patent Literature 5: Kumazawa, E., Tohgo, A., Exp. Opin. Invest. Drugs (1998) 7, 625-632.; Antitumor activity of DX-8951f: a new camptothecin derivative.
[0011] Literatura de Não Patente 6: Mitsui, I., Kumazawa, E., Hiro- ta, Y., et al. Jpn J. Cancer Res. (1995) 86, 776-782; Um novo derivado de camptotecina solúvel em água, DX-8951f, exibe potente atividade antitumor contra tumores humanos in vitro e in vivo.Non-Patent Literature 6: Mitsui, I., Kumazawa, E., Hirota, Y., et al. Jpn J. Cancer Res. (1995) 86, 776-782; A new water-soluble camptothecin derivative, DX-8951f, exhibits potent antitumor activity against human tumors in vitro and in vivo.
[0012] Literatura de Não Patente 7: Takiguchi, S., Tohgo, A., et al. Jpn J. Cancer Res. (1997) 88, 760-769.; Efeito antitumor de DX-8951, um novo análogo de camptotecina, em células de tumor pancreático humanas e suas variantes resistentes a CPT-11 cultivadas in vitro e xenoenxertadas em camundongos nus.[0012] Non-Patent Literature 7: Takiguchi, S., Tohgo, A., et al. Jpn J. Cancer Res. (1997) 88, 760-769.; Antitumor effect of DX-8951, a new camptothecin analogue, on human pancreatic tumor cells and their CPT-11 resistant variants cultured in vitro and xenografted in nude mice.
[0013] Literatura de Não Patente 8: Joto, N. et al. Int J Cancer (1997) 72, 680-686.; DX-8951f, um análogo de camptotecina solúvel em água, exibe potente atividade antitumor contra uma linhagem de célula de câncer de pulmão humana e sua variante resistente a SN-38.[0013] Non-Patent Literature 8: Joto, N. et al. Int J Cancer (1997) 72, 680-686.; DX-8951f, a water-soluble camptothecin analogue, exhibits potent antitumor activity against a human lung cancer cell line and its SN-38 resistant variant.
[0014] Literatura de Não Patente 9: Kumazawa, E. et al. Cancer Chemother. Pharmacol. (1998) 42, 210-220.; Potentes e amplos efeitos antitumor de DX-8951f, um derivado de camptotecina solúvel em água, contra vários tumores humanos xenoenxertados em camundongos nus.[0014] Non-Patent Literature 9: Kumazawa, E. et al. Cancer Chemother. Pharmacol. (1998) 42, 210-220.; Potent and broad antitumor effects of DX-8951f, a water-soluble camptothecin derivative, against several human tumors xenografted in nude mice.
[0015] Literatura de Não Patente 10: De Jager, R., et al. Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273.; DX-8951f: sumário de experiências clínicas de fase I.[0015] Non-Patent Literature 10: De Jager, R., et al. Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273.; DX-8951f: summary of phase I clinical trials.
[0016] Literatura de Não Patente 11: Inoue, K. et al. Polymer Drugs in the Clinical Stage, Editado por Maeda et al. (2003), 145-153.; Conjugado de CM-dextrana-poliálcool-camptotecina, DE-310 com um novo sistema veículo e seus dados preclínicos.Non-Patent Literature 11: Inoue, K. et al. Polymer Drugs in the Clinical Stage, Edited by Maeda et al. (2003), 145-153.; CM-dextran-polyalcohol-camptothecin conjugate, DE-310 with a new vehicle system and its preclinical data.
[0017] Literatura de Não Patente 12: Kumazawa, E. et al. Cancer Sci (2004) 95, 168-175.; DE-310, um novo sistema veículo macro molecular para o análogo de camptotecina DX-8951f: Potentes atividades antitumor em vários modelos de tumor murino.[0017] Non-Patent Literature 12: Kumazawa, E. et al. Cancer Sci (2004) 95, 168-175.; DE-310, a novel macromolecular carrier system for the camptothecin analogue DX-8951f: Potent antitumor activities in various murine tumor models.
[0018] Literatura de Não Patente 13: Soepenberg, O. et al. Clinical Cancer Research, (2005) 11, 703-711.; Estudo de fase I e farmacoci- nético de DE-310 em pacientes com tumores sólidos avançados.[0018] Non-Patent Literature 13: Soepenberg, O. et al. Clinical Cancer Research, (2005) 11, 703-711.; Phase I and pharmacokinetic study of DE-310 in patients with advanced solid tumors.
[0019] Literatura de Não Patente 14: Wente M. N. et al. Investiga tional New Drugs (2005) 23, 339-347.; DE-310, um profármaco ma-cromolecular do inibidor de topoisomerase I exatecano (DX-8951), em pacientes com tumores sólidos operáveis. Sumário da Invenção Problema Técnico[0019] Non-Patent Literature 14: Wente M.N. et al. Investigational New Drugs (2005) 23, 339-347.; DE-310, a macromolecular prodrug of topoisomerase I inhibitor exatecan (DX-8951), in patients with operable solid tumors. Invention Summary Technical Problem
[0020] Com respeito ao tratamento de tumor por um anticorpo, um efeito antitumor insuficiente pode ser observado mesmo quando o an- ticorpo reconhece um antígeno e liga-se a células de tumor, e existe um caso em que um anticorpo antitumor mais efetivo é necessário. Além disso, muitos compostos antitumor de baixo peso molecular têm um problema em segurança como efeito colateral e toxicidade mesmo que os compostos tenham um excelente efeito antitumor, permanece como um objetivo obter um efeito terapêutico superior ainda realçando a segurança. Desse modo, um objetivo da presente invenção é conseguir fornecer um fármaco antitumor tendo um excelente efeito terapêutico, que é excelente em termos de efeito antitumor e segurança. Métodos para Solucionar o Problema[0020] With respect to the treatment of tumor by an antibody, an insufficient antitumor effect can be observed even when the antibody recognizes an antigen and binds to tumor cells, and there is a case where a more effective antitumor antibody is required. Furthermore, many low molecular weight antitumor compounds have a problem in safety as a side effect and toxicity even though the compounds have an excellent antitumor effect, it remains an objective to obtain a superior therapeutic effect while enhancing safety. Thus, an object of the present invention is to achieve an antitumor drug having an excellent therapeutic effect, which is excellent in terms of antitumor effect and safety. Methods to Solve the Problem
[0021] Os inventores pensam que, quando um composto antitumor exatecano é convertido em um conjugado de anticorpo-fármaco, por meio de uma porção de estrutura do ligante, por conjugação ao anticorpo, que é capaz de atingir células de tumor, que é tendo uma propriedade de reconhecimento de células de tumor, uma propriedade de ligação a células de tumor, uma propriedade de internalização dentro de células de tumor, uma atividade citocida contra células de tumor, ou similares, o composto antitumor pode ser mais seguramente liberado para células de tumor para especificamente exibir o efeito antitumor do composto em células de tumor, e, desse modo, o efeito antitumor pode ser seguramente exibido e também um efeito citocida realçado do anticorpo é esperado, e a dose do composto antitumor pode ser reduzida em comparação a um caso de administração do composto sozinho, e, desse modo, uma influência do composto antitumor sobre células normais pode ser aliviada de modo que maior segurança possa ser alcançada.[0021] The inventors think that when an exatecan antitumor compound is converted into an antibody-drug conjugate, by means of a linker structure portion, by antibody conjugation, it is capable of targeting tumor cells, which is having a tumor cell recognition property, a tumor cell binding property, an internalization property within tumor cells, a cytocidal activity against tumor cells, or the like, the antitumor compound can be more safely delivered to tumor cells. tumor to specifically exhibit the antitumor effect of the compound on tumor cells, and thereby the antitumor effect can be safely displayed and also an enhanced cytocidal effect of the antibody is expected, and the dose of the antitumor compound can be reduced compared to a case of administration of the compound alone, and thus an influence of the antitumor compound on normal cells can be alleviated so that greater safety can be be achieved.
[0022] Neste contexto, os inventores criaram um ligante com uma estrutura específica e sucedida na obtenção de um conjugado de anti- corpo-fármaco em que o anticorpo e exatecano são conjugados um ao outro por meio do ligante, e confirmaram um excelente efeito antitumor exibido pelo conjugado para desse modo completar a presente invenção.[0022] In this context, the inventors created a linker with a specific structure and succeeded in obtaining an antibody-drug conjugate in which the antibody and exatecan are conjugated to each other through the linker, and confirmed an excellent antitumor effect exhibited by the conjugate to thereby complete the present invention.
[0023] Especificamente, a presente invenção refere-se aos seguin tes. [1] Um conjugado de anticorpo-fármaco em que um composto antitumor representado pela fórmula a seguir: Fórmula 2
[0024] Aqui, o anticorpo é conectado ao terminal de L1, o compos to antitumor é conectado ao terminal de Lc com o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 como posição de conexão, em que n1 representa um número inteiro de 0 a 6, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, -CH2-C(=O)-NH- (CH2)n3-C(=O)-, -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-, ou - C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-, em que n2 representa um número inteiro de 2 a 8, n3 representa um número inteiro de 1 a 8, n4 representa um número inteiro de 1 a 8, L2 representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, -S-(CH2)n6-C(=O)- , ou uma ligação simples, em que n5 representa um número inteiro de 1 a 6, n6 representa um número inteiro de 1 a 6, LP representa um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoáci- dos, La representa -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O-, ou uma ligação simples, em que n7 representa um número inteiro de 1 a 6, R1 representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-COOH, ou -(CH2)n9-OH, n8 representa um número inteiro de 1 a 4, n9 representa um número inteiro de 1 a 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, ou uma ligação simples, em que R2 e R3 cada um independentemente representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-COOH, ou -(CH2)nc-OH, R4 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, na representa um número inteiro de 0 a 6, nb representa um número inteiro de 1 a 4, nc representa um número inteiro de 1 a 4, contanto que quando na for 0, R2 e R3 não sejam iguais um ao outro, Lc representa -CH2- ou -C(=O)-, - (Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 3
[0025] A presente invenção também se refere a cada um dos se guintes. [2] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [1], em que Lc é -C(=O)-. [3] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com [1] ou [2], em que a ligação entre o anticorpo e L1 é uma ligação de tioéter que é formada em um sítio de ligação de dissul- feto presente em uma parte de articulação do anticorpo, uma ligação de dissulfeto que é formada em um sítio de ligação de dissulfeto presente em uma parte de articulação do anticorpo, ou uma ligação de amida que é formada em um grupo amino presente em uma cadeia lateral de um aminoácido constituindo o anticorpo ou no grupo amino terminal. [4] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que o resíduo de peptídeo de LP é um resíduo de aminoácido compreendendo um aminoácido selecionado de fenilalani- na, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido as- pártico. [5] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que LP é um resíduo de peptídeo consistindo em 4 aminoácidos. [6] O conjugado de anticorpo-fármaco de acordo com qualquer um de [1] a [3], em que LP é -GGFG-. [7] Um conjugado de anticorpo-fármaco em que um composto antitumor representado pela fórmula a seguir: Fórmula 5
[0026] Aqui, o anticorpo é conectado ao terminal de L1, o compos to antitumor é conectado ao terminal de Lc com o átomo de nitrogênio do grupo amino na posição 1 como uma posição de conexão, em que n1 representa um número inteiro de 0 a 6, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, -CH2-C(=O)-NH- (CH2)n3-C(=O)-, -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-, ou - C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-, em que n2 representa um número inteiro de 2 a 8, n3 representa um número inteiro de 1 a 8, n4 representa um número inteiro de 1 a 8, L2 representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, -S-(CH2)n6-C(=O)- , ou uma ligação simples, em que n5 representa um número inteiro de 1 a 6, n6 representa um número inteiro de 1 a 6, LP representa um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG, La representa -O- ou uma ligação simples, Lb representa -CR2(-R3)- ou uma ligação simples, em que R2 e R3 cada um representa um átomo de hidrogênio, Lc representa -C(=O)-, - (Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 6
[0027] No acima, -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura represen tada pela fórmula a seguir: Fórmula 11
[0028] Aqui, o anticorpo é conectado ao terminal de L1, o compos to antitumor é conectado ao terminal de Lc, em que n1 representa um número inteiro de 0 a 6, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- e é conectado a o anticorpo por meio de uma ligação de tioéter que é formada em um sítio de ligação de dissulfeto presente em uma parte de articulação do anticorpo, em que n2 representa um número inteiro de 2 a 8, L2 representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- ou uma ligação simples, em que n5 representa um número inteiro de 1 a 6, LP representa um resíduo de tetrapeptídeo de GGFG, La representa -O- ou uma ligação simples, Lb representa -CR2(-R3)- ou uma ligação simples, em que R2 e R3 cada um representa um átomo de hidrogênio, Lc representa -C(=O)-, e -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 14
[0029] No acima, -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura represen tada pela fórmula a seguir: Fórmula 15
[0030] No acima, -(Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura represen tada pela fórmula a seguir: Fórmula 17
[0031] Na fórmula, Q representa (maleimid-N-il)-, HS-, X-CH2- C(=O)-NH-, ou (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, X representa um átomo de bromo ou um átomo de iodo, nQ representa um número inteiro de 2 a 8, L2a representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- ou uma ligação simples, em que n5 representa um número inteiro de 1 a 6, LP representa um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoáci- dos selecionados de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico, n1 representa um número inteiro de 0 a 6, La representa -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O-, ou uma ligação simples, em que n7 representa um número inteiro de 1 a 6, R1 representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-COOH, ou -(CH2)n9-OH, n8 representa um número inteiro de 1 a 4, n9 representa um número inteiro de 1 a 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, ou uma ligação simples, em que R2 e R3 cada um independentemente representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-COOH, ou -(CH2)nc-OH, R4 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, na representa um número inteiro de 0 a 6, nb representa um número inteiro de 1 a 4, nc representa um número inteiro de 1 a 4, contanto que quando na for 0, R2 e R3 não sejam iguais um ao outro, Lc representa -CH2- ou -C(=O)-, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 19
[0032] No acima, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 22
[0033] No acima, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 25
[0034] No acima, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 27
[0035] Na fórmula, Q representa (maleimid-N-il)-, HS-, X-CH2- C(=O)-NH-, ou (Pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, X representa um átomo de bromo ou um átomo de iodo, nQ representa um número inteiro de 2 a 8, L2a representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- ou uma ligação simples, em que n5 representa um número inteiro de 1 a 6, LP representa um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoáci- dos selecionados de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico, n1 representa um número inteiro de 0 a 6, La representa -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O-, ou uma ligação simples, em que n7 representa um número inteiro de 1 a 6, R1 representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-COOH, ou -(CH2)n9-OH, n8 representa um número inteiro de 1 a 4, n9 representa um número inteiro de 1 a 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, ou uma ligação simples, em que R2 e R3 cada um independentemente representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-COOH, ou -(CH2)nc-OH, R4 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, na representa um número inteiro de 0 a 6, nb representa um número inteiro de 1 a 4, nc representa um número inteiro de 1 a 4, con-tanto que quando na for 0, R2 e R3 não sejam iguais um ao outro, Lc representa -CH2- ou -C(=O)-, (maleimid-N-il)- é um grupo represen-tado pela fórmula a seguir: Fórmula 33
[0036] No acima, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 37
[0037] No acima, (maleimid-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 39
[0038] No acima, L1 é a posição de conexão para o anticorpo, Lc é uma posição de conexão para um composto antitumor, em que n1 representa um número inteiro de 0 a 6, L1 representa -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, -CH2-C(=O)-NH- (CH2)n3-C(=O)-, -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-, ou - C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-, em que n2 representa um número inteiro de 2 a 8, n3 repre-senta um número inteiro de 1 a 8, n4 representa um número inteiro de 1 a 8, L2 representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, -S-(CH2)n6- C(=O)-, ou uma ligação simples, em que n5 representa um número inteiro de 1 a 6, n6 repre-senta um número inteiro de 1 a 6, LP representa um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoáci- dos, La representa -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O-, ou uma ligação simples, em que n7 representa um número inteiro de 1 a 6, R1 representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-COOH, ou -(CH2)n9-OH, n8 representa um número inteiro de 1 a 4, n9 representa um número inteiro de 1 a 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, ou uma ligação simples, em que R2 e R3 cada um independentemente representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-COOH, ou -(CH2)nc-OH, R4 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, na representa um número inteiro de 0 a 6, nb representa um número inteiro de 1 a 4, nc representa um número inteiro de 1 a 4, con-tanto que quando na for 0, R2 e R3 não sejam iguais um ao outro, Lc representa -CH2- ou -C(=O)-, - (Succinimid-3-il-N)- tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 41
[0039] Com um conjugado de anticorpo-fármaco tendo um com posto antitumor exatecano conjugado por meio de um ligante com uma estrutura específica, um excelente efeito antitumor e segurança podem ser alcançados.[0039] With an antibody-drug conjugate having an exatecan antitumor compound conjugated through a linker with a specific structure, an excellent antitumor effect and safety can be achieved.
[0040] Figura 1: Figura 1 mostra uma sequência de aminoácido de B7-H3 variante 1 (SEQ ID NO: 1).[0040] Figure 1: Figure 1 shows an amino acid sequence of B7-H3 variant 1 (SEQ ID NO: 1).
[0041] Figura 2: Figura 2 mostra uma sequência de aminoácido de B7-H3 variante 2 (SEQ ID NO: 2).[0041] Figure 2: Figure 2 shows an amino acid sequence of B7-H3 variant 2 (SEQ ID NO: 2).
[0042] Figura 3: Figura 3 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia pesada tipo M30-H1 (SEQ ID NO: 9).[0042] Figure 3: Figure 3 shows an amino acid sequence of an M30-H1 type heavy chain (SEQ ID NO: 9).
[0043] Figura 4: Figura 4 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia pesada tipo M30-H2 (SEQ ID NO: 10).[0043] Figure 4: Figure 4 shows an amino acid sequence of an M30-H2 type heavy chain (SEQ ID NO: 10).
[0044] Figura 5: Figura 5 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia pesada tipo M30-H3 (SEQ ID NO: 11).[0044] Figure 5: Figure 5 shows an amino acid sequence of an M30-H3 type heavy chain (SEQ ID NO: 11).
[0045] Figura 6: Figura 6 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia pesada tipo M30-H4 (SEQ ID NO: 12).[0045] Figure 6: Figure 6 shows an amino acid sequence of an M30-H4 type heavy chain (SEQ ID NO: 12).
[0046] Figura 7: Figura 7 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve tipo M30-L1 (SEQ ID NO: 13).[0046] Figure 7: Figure 7 shows an amino acid sequence of an M30-L1 type light chain (SEQ ID NO: 13).
[0047] Figura 8: Figura 8 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve tipo M30-L2 (SEQ ID NO: 14).[0047] Figure 8: Figure 8 shows an amino acid sequence of an M30-L2 type light chain (SEQ ID NO: 14).
[0048] Figura 9: Figura 9 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve tipo M30-L3 (SEQ ID NO: 15).Figure 9: Figure 9 shows an amino acid sequence of an M30-L3 type light chain (SEQ ID NO: 15).
[0049] Figura 10: Figura 10 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve tipo M30-L4 (SEQ ID NO: 16).[0049] Figure 10: Figure 10 shows an amino acid sequence of an M30-L4 type light chain (SEQ ID NO: 16).
[0050] Figura 11: Figura 11 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve tipo M30-L5 (SEQ ID NO: 17).Figure 11: Figure 11 shows an amino acid sequence of an M30-L5 type light chain (SEQ ID NO: 17).
[0051] Figura 12: Figura 12 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve tipo M30-L6 (SEQ ID NO: 18).[0051] Figure 12: Figure 12 shows an amino acid sequence of an M30-L6 type light chain (SEQ ID NO: 18).
[0052] Figura 13: Figura 13 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve tipo M30-L7 (SEQ ID NO: 19).Figure 13: Figure 13 shows an amino acid sequence of an M30-L7 type light chain (SEQ ID NO: 19).
[0053] Figura 14: Figura 14 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia pesada de anticorpo M30 (SEQ ID NO: 20).Figure 14: Figure 14 shows an amino acid sequence of an M30 antibody heavy chain (SEQ ID NO: 20).
[0054] Figura 15: Figura 15 mostra uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve de anticorpo M30 (SEQ ID NO: 21).Figure 15: Figure 15 shows an amino acid sequence of an M30 antibody light chain (SEQ ID NO: 21).
[0055] Figura 16: Figura 16 mostra uma sequência de nucleotídeo de B7-H3 variante 1 (SEQ ID NO: 26).[0055] Figure 16: Figure 16 shows a nucleotide sequence of B7-H3 variant 1 (SEQ ID NO: 26).
[0056] Figura 17: Figura 17 mostra o efeito de um conjugado de anticorpo-fármaco (2) em células A375 de linhagem de melanoma hu-mano subcutaneamente transplantadas. Na figura, a linhagem com losangos abertos retrata resultados sobre tumor não tratado, a linha-gem com triângulos abertos retrata o efeito de um anticorpo M30-H1- L4P, e a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2).Figure 17: Figure 17 shows the effect of an antibody-drug conjugate (2) on subcutaneously transplanted human melanoma lineage A375 cells. In the figure, the open-diamond lineage depicts results on untreated tumor, the open-triangle lineage depicts the effect of an M30-H1-L4P antibody, and the open circle lineage depicts the effect of the antibody-drug conjugate ( two).
[0057] Figura 18: Figura 18 mostra o efeito do conjugado de anti- corpo-fármaco (2) em células A375 de linhagem de melanoma humano subcutaneamente transplantadas. A linhagem com losangos abertos retrata resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com quadrados cheios retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2) adminis-trado em 0,1 mg/kg, a linhagem com marcas X retrata o efeito do con-jugado de anticorpo-fármaco (2) administrado em 0,3 mg/kg, a linha-gem com triângulos cheios retrata o efeito do conjugado de anticorpo- fármaco (2) administrado em 1 mg/kg, e a linhagem com círculos aber-tos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2) administrado em 3 mg/kg.Figure 18: Figure 18 shows the effect of antibody-drug conjugate (2) on subcutaneously transplanted human melanoma lineage A375 cells. The open-diamond strain depicts untreated tumor, the filled square strain depicts the effect of antibody-drug conjugate (2) given at 0.1 mg/kg, the X-marked strain depicts the effect of the colon. -antibody-drug conjugate (2) given at 0.3 mg/kg, the lineage with filled triangles depicts the effect of antibody-drug conjugate (2) given at 1 mg/kg, and the lineage with open circles -tos depicts the effect of antibody-drug conjugate (2) administered at 3 mg/kg.
[0058] Figura 19: Figura 19 mostra o efeito do conjugado de anti- corpo-fármaco (2) sobre células Calu-6 de linhagem de câncer de pul-mão de célula não pequena humana subcutaneamente transplantada. A linhagem com losangos abertos retrata resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito de um anti- corpo M30-H1-L4P, e a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2).[0058] Figure 19: Figure 19 shows the effect of antibody-drug conjugate (2) on Calu-6 cells of subcutaneously transplanted human non-small cell lung cancer lineage. The open-diamond lineage depicts results on untreated tumor, the open-triangle lineage depicts the effect of an M30-H1-L4P antibody, and the open circle lineage depicts the effect of antibody-drug conjugate (2).
[0059] Figura 20: Figura 20 mostra os efeitos de conjugados de anticorpo-fármaco (1), (13), (41), e (55) sobre células A375 de linhagem de melanoma humano subcutaneamente transplantadas. Na figura, a linhagem com losangos abertos retrata resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (1), a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (13), a linhagem com marcas X retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (41), e a linhagem com quadrados abertos retrata o efeito do conjugado de an- ticorpo-fármaco (55).Figure 20: Figure 20 shows the effects of antibody-drug conjugates (1), (13), (41), and (55) on subcutaneously transplanted human melanoma lineage A375 cells. In the figure, the lineage with open diamonds depicts results on untreated tumor, the lineage with open circles depicts the effect of antibody-drug conjugate (1), the lineage with open triangles depicts the effect of antibody-drug conjugate (13) , the X-marked strain depicts the effect of the antibody-drug conjugate (41) and the open square strain depicts the effect of the antibody-drug conjugate (55).
[0060] Figura 21: Figura 21 mostra os efeitos de conjugados de anticorpo-fármaco (13), (41), e (55) sobre células Calu-6 de linhagem de câncer de pulmão de célula não pequena humana subcutaneamen- te transplantada. A linhagem com losangos abertos retrata resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com círculos abertos retrata o efeito de DE-310, a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (13), a linhagem com marcas X retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (41), e a linhagem com quadrados abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (55).[0060] Figure 21: Figure 21 shows the effects of antibody-drug conjugates (13), (41), and (55) on subcutaneously transplanted human non-small cell lung cancer line Calu-6 cells. The open-diamond strain depicts results on untreated tumor, the open circle strain depicts the effect of DE-310, the open-triangle strain depicts the effect of antibody-drug conjugate (13), the X-marked strain depicts the effect of antibody-drug conjugate (41) and the lineage with open squares depicts the effect of antibody-drug conjugate (55).
[0061] Figura 22: Figura 22 mostra os efeitos de conjugados de anticorpo-fármaco (17), (18), (19), (59), (60), e (61) sobre células A375 de linhagem de melanoma humano subcutaneamente transplantadas. Na figura, a linhagem com losangos cheios retrata resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com quadrados cheios retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (17), a linhagem com quadrados abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (18), a li-nhagem com círculos abertos retrata o efeito do conjugado de anticor- po-fármaco (19), a linhagem com triângulos cheios retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (59), a linhagem com triângulos aber-tos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (60), e a linha-gem com marcas X retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (61).Figure 22: Figure 22 shows the effects of antibody-drug conjugates (17), (18), (19), (59), (60), and (61) on human melanoma lineage A375 cells subcutaneously transplanted. In the figure, the line with filled diamonds depicts results on untreated tumor, the line with filled squares depicts the effect of the antibody-drug conjugate (17), the line with open squares depicts the effect of the antibody-drug conjugate (18) , the lineage with open circles depicts the effect of the antibody-drug conjugate (19), the lineage with filled triangles depicts the effect of the antibody-drug conjugate (59), the lineage with open triangles depicts the effect of antibody-drug conjugate (60), and the X-marked lineage depicts the effect of antibody-drug conjugate (61).
[0062] O conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção é um fármaco antitumor em que um anticorpo de antitumor é conjugado a um composto de antitumor por meio de uma porção de estrutura do ligante e explicado em detalhes abaixo. Anticorpo[0062] The antibody-drug conjugate of the present invention is an antitumor drug wherein an antitumor antibody is conjugated to an antitumor compound by means of a linker framework portion and explained in detail below. Antibody
[0063] O anticorpo usado no conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção significa uma imunoglobulina e é uma molécula contendo um sítio de ligação a antígeno imunoespecificamente ligando a um antígeno. A classe do anticorpo da presente invenção pode ser qualquer de IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, e IgY e é preferivelmente IgG. A subclasse do anticorpo da presente invenção pode ser qualquer de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2 e é preferivelmente IgG1 ou IgG2. O anticorpo pode ser derivado de quaisquer espécies, e exemplos preferidos das espécies podem incluir humanos, ratos, camundongos, e coelhos. No caso de quando derivado de outro do que espécies humanas, ele é preferivelmente quimerizado ou humanizado usando uma técnica bem conhecida. O anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal e é pre-ferivelmente um anticorpo monoclonal.The antibody used in the antibody-drug conjugate of the present invention means an immunoglobulin and is a molecule containing an antigen-binding site immunospecifically binding to an antigen. The antibody class of the present invention can be any of IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY and is preferably IgG. The antibody subclass of the present invention can be any of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2 and is preferably IgG1 or IgG2. The antibody can be derived from any species, and preferred examples of the species can include humans, rats, mice, and rabbits. In the case when derived from other than human species, it is preferably chimerized or humanized using a well known technique. The antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody and is preferably a monoclonal antibody.
[0064] O anticorpo da presente invenção pode ser aquele que é capaz de atingir células de tumor. Visto que o anticorpo da presente invenção é conjugado com um fármaco tendo atividade antitumor por meio de um ligante, o anticorpo preferivelmente possui uma ou mais de uma propriedade de reconhecer uma célula de tumor, uma proprie- dade de ligação a uma célula de tumor, uma propriedade de internali- zação em um célula de tumor, e uma propriedade de danificar uma célula de tumor.[0064] The antibody of the present invention may be one that is capable of targeting tumor cells. Since the antibody of the present invention is conjugated to a drug having antitumor activity through a linker, the antibody preferably has one or more of a property of recognizing a tumor cell, a property of binding to a tumor cell, an internalizing property in a tumor cell, and a property of damaging a tumor cell.
[0065] A atividade de ligação do anticorpo contra células de tumor pode ser confirmada usando citometria de fluxo. A internalização do anticorpo em células de tumor pode ser confirmada usando (1) um en-saio de visualizar um anticorpo incorporado em células sob um mi-croscópio de fluorescência usando um anticorpo secundário (fluores-centemente rotulado) ligando-se ao anticorpo terapêutico (Cell Death e Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) um ensaio de medir a quanti-dade de fluorescência incorporada em células usando um anticorpo secundário (fluorescentemente rotulado) ligando-se ao anticorpo tera-pêutico (Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 5268-5282, Dezembro de 2004), ou (3) um ensaio Mab-ZAP usando uma imunotoxina ligando-se ao anticorpo terapêutico em que a toxina é liberada mediante incorporação em células para inibir desenvolvimento celular (Bio Techniques 28: 162-165, Janeiro de 2000).[0065] Antibody binding activity against tumor cells can be confirmed using flow cytometry. Antibody internalization in tumor cells can be confirmed using (1) an assay of visualizing an antibody incorporated into cells under a fluorescence microscope using a secondary antibody (fluorescent-labeled) binding to the therapeutic antibody ( Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) an assay measuring the amount of fluorescence incorporated into cells using a secondary (fluorescently labeled) antibody binding to the therapeutic antibody (Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 5268-5282, December 2004), or (3) a Mab-ZAP assay using an immunotoxin binding therapeutic antibody in which the toxin is released upon incorporation into cells to inhibit cell development (Bio Techniques 28:162-165, January 2000).
[0066] A atividade antitumor do anticorpo refere-se a uma ativida de citotóxica ou efeito citocida contra células de tumor e pode ser con-firmada in vitro determinando atividade inibitória contra desenvolvimen-to celular. Por exemplo, uma linhagem de célula de câncer superex- pressando uma proteína alvo para o anticorpo é cultivada, e o anticorpo é adicionado em concentrações de variação no sistema de cultura para determinar uma atividade inibitória contra formação de focos, formação de colônia, e desenvolvimento esferóide. A atividade antitumor pode ser confirmada in vivo, por exemplo, administrando o anticorpo a um camundongo nu com uma linhagem de célula de tumor transplantada altamente expressando a proteína alvo, e determinando mudança na célula de câncer. Visto que o fármaco conjugado no conjugado de anticorpo-fármaco exerce um efeito antitumor, é mais prefe- rido, porém não essencial que o anticorpo em si deva ter um efeito an-titumor. Para exercer o efeito antitumor e também para especificamente e seletivamente danificar células de tumor pelo fármaco, é importante e também preferido que o anticorpo deva ter a propriedade de internalizar para migrar em células de tumor.[0066] The antitumor activity of the antibody refers to a cytotoxic activity or cytocidal effect against tumor cells and can be confirmed in vitro by determining inhibitory activity against cell development. For example, a cancer cell line overexpressing a target protein for the antibody is cultured, and the antibody is added at varying concentrations in the culture system to determine an inhibitory activity against foci formation, colony formation, and development. spheroid. Antitumor activity can be confirmed in vivo, for example, by administering the antibody to a nude mouse with a transplanted tumor cell line highly expressing the target protein, and determining change in the cancer cell. Since the drug conjugated to the antibody-drug conjugate exerts an antitumor effect, it is more preferred, but not essential that the antibody itself should have an antitumor effect. To exert the antitumor effect and also to specifically and selectively damage tumor cells by the drug, it is important and also preferred that the antibody should have the property to internalize to migrate into tumor cells.
[0067] Exemplos de um tal anticorpo podem incluir, porém não li mitados a, um anticorpo anti-A33, um anticorpo anti-B7-H3, um anti-corpo anti-CanAg, um anticorpo anti-CD20, um anticorpo anti-CD22, um anticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-CD33, um anticorpo anti- CD56, um anticorpo anti-CD70, um anticorpo anti-CEA, um anticorpo anti-Cripto, um anticorpo anti-EphA2, um anticorpo anti-G250, um anti-corpo anti-MUC1, um anticorpo anti-GPNMB, um anticorpo anti- integrina, um anticorpo anti-PSMA, um anticorpo anti-tenascina, um anticorpo anti-SLC44A4, e um anticorpo anti-mesotelina.[0067] Examples of such an antibody may include, but are not limited to, an anti-A33 antibody, an anti-B7-H3 antibody, an anti-CanAg antibody, an anti-CD20 antibody, an anti-CD22 antibody , an anti-CD30 antibody, an anti-CD33 antibody, an anti-CD56 antibody, an anti-CD70 antibody, an anti-CEA antibody, an anti-Cripto antibody, an anti-EphA2 antibody, an anti-G250 antibody, a anti-MUC1 antibody, an anti-GPNMB antibody, an anti-integrin antibody, an anti-PSMA antibody, an anti-tenascin antibody, an anti-SLC44A4 antibody, and an anti-mesothelin antibody.
[0068] O anticorpo da presente invenção é preferivelmente um an ticorpo anti-CD30, um anticorpo anti-CD33, um anticorpo anti-CD70, ou um anticorpo anti-B7-H3, e mais preferivelmente um anticorpo anti- B7-H3.The antibody of the present invention is preferably an anti-CD30 antibody, an anti-CD33 antibody, an anti-CD70 antibody, or an anti-B7-H3 antibody, and more preferably an anti-B7-H3 antibody.
[0069] O anticorpo da presente invenção pode ser obtido usando um método usualmente realizado na técnica, que envolve imunizar animais com um polipeptídeo antigênico e coletar e purificar anticorpos produzidos in vivo. A origem do antígeno não é limitada a humanos, e os animais podem ser imunizados com um antígeno derivado de um animal não humano tais como um camundongo, um rato e similares. Neste caso, a reatividade cruzada de anticorpos ligando-se ao antíge- no heterólogo obtido com antígenos humanos pode ser testada para avaliar quanto a um anticorpo aplicável a uma doença humana.[0069] The antibody of the present invention can be obtained using a method commonly performed in the art, which involves immunizing animals with an antigenic polypeptide and collecting and purifying antibodies produced in vivo. The origin of the antigen is not limited to humans, and animals can be immunized with an antigen derived from a non-human animal such as a mouse, rat and the like. In this case, the cross-reactivity of antibodies binding to the heterologous antigen obtained with human antigens can be tested to assess for an antibody applicable to a human disease.
[0070] Alternativamente, células produtoras de anticorpo que pro duzem anticorpos contra o antígeno são fundidas com células de mi- eloma de acordo com um método conhecido na técnica (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; e Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) para estabilizar hibridomas, das quais anticorpos monoclonais podem ser, por sua vez obtidos.[0070] Alternatively, antibody-producing cells that produce antibodies to the antigen are fused with myeloma cells according to a method known in the art (eg, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495- 497 ; and Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, NY (1980)) to stabilize hybridomas, from which monoclonal antibodies can in turn be obtained.
[0071] O antígeno pode ser obtido geneticamente construindo cé lulas hospedeiras para produzir um gene codificando a proteína anti- gênica. Especificamente, os vetores que permitem expressão do gene antígeno são preparados e transferidos para células hospedeiras de modo que o gene seja expresso. O antígeno desse modo expresso pode ser purificado.[0071] The antigen can be obtained genetically by building host cells to produce a gene encoding the antigenic protein. Specifically, vectors that allow expression of the antigen gene are prepared and transferred to host cells so that the gene is expressed. The antigen thus expressed can be purified.
[0072] O anticorpo anti-CD30, o anticorpo anti-CD33, e o anticorpo anti-CD70 podem ser obtidos por um método conhecido na técnica com referência a WO2002/043661, Patente dos Estados Unidos No. 5,773,001, e WO2006/113909, respectivamente.Anti-CD30 antibody, anti-CD33 antibody, and anti-CD70 antibody can be obtained by a method known in the art with reference to WO2002/043661, United States Patent No. 5,773,001, and WO2006/113909, respectively.
[0073] O anticorpo B7-H3 usado na presente invenção é preferi velmente aquele tendo propriedades como descrito abaixo. (1) um anticorpo tendo as seguintes propriedades: (a) especificamente ligando-se a B7-H3, (b) tendo atividade de fagocitose mediada por célula de-pendente de anticorpo (ADCP), e (c) tendo atividade antitumor in vivo. (2) O anticorpo de acordo com (1), em que B7-H3 é uma molécula compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 1 ou 2. (3) O anticorpo de acordo com (1) ou (2), em que o anticorpo tem CDRH1 compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 3, CDRH2 compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 4, e CDRH3 compreendendo a sequên-cia de aminoácido representada por SEQ ID NO: 5 como complemen-taridade de cadeia pesada determinando regiões, e CDRL1 compre- endendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 6, CDRL2 compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 7, e CDRL3 compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 8 como complementaridade de cadeia leve determinando regiões. (4) O anticorpo de acordo com qualquer de (1) a (3), em que a região constante do mesmo é uma região constante derivada de humano. (5) O anticorpo de acordo com qualquer de (1) a (4), em que o anticor-po é um anticorpo humanizado. (6) O anticorpo de acordo com (5), em que o anticorpo tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de amino- ácido selecionada do grupo consistindo em (a) uma sequência de ami- noácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 9, (b) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 10, (c) uma sequência de ami- noácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 11, (d) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 12, (e) uma sequência de ami- noácido tendo pelo menos 95% ou homologia maior em quaisquer das sequências (a) a (d), e (f), uma sequência de aminoácido derivada de quaisquer das sequências (a) a (d) pelas deleções, substituições, ou adições de pelo menos um aminoácido, e uma região variável de ca-deia leve compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em (g), uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 13, (h) uma se-quência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 14, (i) uma sequência de aminoácido descrita nas po-sições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 15, (j) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 16, (k) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 17, (l) uma sequência de amino- ácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 18, (m) uma sequência de aminoácido descrita nas posições de ami- noácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 19, (n) uma sequência de aminoáci- do tendo pelo menos 95% ou homologia maior em quaisquer das se-quências (g) a (m), e (o), uma sequência de aminoácido derivada de quaisquer das sequências (g) a (m) pelas deleções, substituições, ou adições de pelo menos um aminoácido. (7) O anticorpo de acordo com (6), em que o anticorpo tem uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve seleci-onadas do grupo consistindo em uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 13, uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de amino- ácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 14, a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve compre-endendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de ami- noácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 15, a região variável de cadeia pe-sada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas po-sições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 9 e uma região variá-vel de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 16, a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma se-quência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 17, a região variável de cadeia pesada compreenden-do uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoáci- do 20 a 141 em SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 18, a região variável de ca-deia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 19, a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma se-quência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 13, a região variável de cadeia pesada compreenden-do uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoáci- do 20 a 141 em SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 14, a região variável de ca-deia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoá- cido descrita nas posições de aminoácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 15, e a região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 141 em SEQ ID NO: 12 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de amino- ácido 21 a 128 em SEQ ID NO: 16. (8) O anticorpo de acordo com (6) ou (7), em que o anticorpo compre- ende uma cadeia pesada e uma cadeia leve selecionadas do grupo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de ami- noácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 13, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoá- cido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 14, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 15, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compre-endendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de ami- noácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 16, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoáci- do 20 a 471 em SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 17, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma se-quência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 18, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de ami- noácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 19, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoá- cido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 13, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 14, a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posi-ções de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 15, e a cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve com-preendendo uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 16. (9) O anticorpo de acordo com qualquer de (6) a (8), em que o anticor-po compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve selecionadas do grupo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 13, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 14, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 15, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 16, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido re- presentada por SEQ ID NO: 17, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 9 e uma ca-deia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 18, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve com-preendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 19, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido re-presentada por SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 13, a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 14, a cadeia pesada com-preendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido re-presentada por SEQ ID NO: 15, e a cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 12 e uma ca-deia leve compreendendo a sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 16. (10) O anticorpo de acordo com (8) ou (9), em que o anticorpo carece de um aminoácido no terminal carbóxi da sequência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 9 ou 12 na cadeia pesada. (11) um anticorpo obtido por um método para produzir o anticorpo de acordo com qualquer de (1) a (10), o método compreendendo as etapas de: cultivar uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo codificando o anticorpo; e co-letar o anticorpo de interesse das culturas obtido na etapa anterior. (12) O anticorpo de acordo com qualquer de (1) a (11), em que a modi-ficação de um glicano é regulada a fim de realçar atividade citotóxica dependente de anticorpo.The B7-H3 antibody used in the present invention is preferably the one having properties as described below. (1) an antibody having the following properties: (a) specifically binding to B7-H3, (b) having antibody-dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP) activity, and (c) having antitumor activity in vivo . (2) The antibody according to (1), wherein B7-H3 is a molecule comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2. (3) The antibody according to (1) or (2) , wherein the antibody has CDRH1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:3, CDRH2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:4, and CDRH3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:5 as heavy chain complementarity determining regions, and CDRL1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, CDRL2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and CDRL3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 as light chain complementarity determining regions. (4) The antibody according to any of (1) to (3), wherein the constant region thereof is a human-derived constant region. (5) The antibody according to any of (1) to (4), wherein the antibody is a humanized antibody. (6) The antibody according to (5), wherein the antibody has a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of (a) an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO:9, (b) an amino acid sequence depicted at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO:10, (c) an amino acid sequence depicted at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 11, (d) an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 12, (e) an amino acid sequence having at least 95% or greater homology in any of the sequences (a ) to (d), and (f), an amino acid sequence derived from any of sequences (a) to (d) by deletions, substitutions, or additions of at least one amino acid, and a light chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of (g), an amino acid sequence described at positions from m inoacid 21 to 128 in SEQ ID NO:13, (h) an amino acid sequence depicted at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO:14, (i) an amino acid sequence depicted at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 15, (j) an amino acid sequence depicted at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 16, (k) an amino acid sequence depicted at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO : 17, (1) an amino acid sequence depicted at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 18, (m) an amino acid sequence depicted at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 19 , (n) an amino acid sequence having at least 95% or greater homology in any of the sequences (g) to (m), and (o), an amino acid sequence derived from any of the sequences (g) to (m) by deletions, substitutions, or additions of at least one amino acid. (7) The antibody according to (6), wherein the antibody has a heavy chain variable region and a light chain variable region selected from the group consisting of a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described in amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 13, a heavy chain variable region comprising an amino sequence - acid described at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 14, the heavy chain variable region comprising an amino acid sequence depicted at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence depicted at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 15, the heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence depicted at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 16, the heavy chain variable region comprising an amino acid sequence depicted at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region comprising a sequence amino acid sequence depicted at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 17, the heavy chain variable region comprising an amino acid sequence depicted at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 18, the heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: O: 9 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 19, the heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 13, the heavy chain variable region comprising an amino acid sequence described at positions from amino acid 20 to 141 in SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO: 14, the heavy chain variable region comprising a amino acid sequence depicted at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO:12 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence depicted at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO:15, and a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence depicted at amino acid positions 20 to 141 in SEQ ID NO: 12 and a light chain variable region comprising an amino acid sequence depicted at amino acid positions 21 to 128 in SEQ ID NO:12 : 16. (8) The antibody according to (6) or (7), wherein the antibody comprises a heavy chain and a light chain selected from the group consisting of a heavy chain comprising an amino acid sequence described at the positions of amino acid 20 to 471 in SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 13, the heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions. amino acid 20 to 471 in SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 14, the heavy chain comprising an amino acid sequence described at positions d and amino acid 20 to 471 in SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 15, the heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 16, the heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 17, the heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 18, the heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in S EQ ID NO: 9 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 19, the heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 13, the heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 14, the heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 12 and a chain light comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 15, and heavy chain comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 12 and a cad a light weight comprising an amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 16. (9) The antibody according to any one of (6) to (8), wherein the antibody comprises a heavy chain and a light chain selected from the group consisting of a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, the heavy chain comprising the sequence of amino acid represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, the heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising the represented amino acid sequence by SEQ ID NO: 15, the heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, the heavy chain comprises comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, the heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a ca- a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18, the heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, the heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, the heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising the sequence of amino acid represented by SEQ ID NO: 15, and a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16. (10) antibody according to (8) or (9), wherein the antibody lacks an amino acid at the carboxy terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 12 in the heavy chain. (11) an antibody obtained by a method for producing the antibody according to any one of (1) to (10), the method comprising the steps of: culturing a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide encoding the antibody; and collecting the antibody of interest from the cultures obtained in the previous step. (12) The antibody according to any one of (1) to (11), wherein the modification of a glycan is regulated in order to enhance antibody-dependent cytotoxic activity.
[0074] A seguir, o anticorpo B7-H3 usado na invenção é descrito.Next, the B7-H3 antibody used in the invention is described.
[0075] Os termos "câncer" e "tumor" quando usados aqui são usa dos com o mesmo significado.[0075] The terms "cancer" and "tumor" when used herein are used with the same meaning.
[0076] O termo "gene" quando usado aqui inclui não somente DNA, mas também mRNA do mesmo, cDNA do mesmo e cRNA do mesmo.[0076] The term "gene" when used herein includes not only DNA but also mRNA from it, cDNA from it, and cRNA from it.
[0077] O termo "polinucleotídeo" como usado aqui é usado com o mesmo significado como um ácido nucleico e também inclui DNA, RNA, sondas, oligonucleotídeos, e iniciadores.[0077] The term "polynucleotide" as used herein is used with the same meaning as a nucleic acid and also includes DNA, RNA, probes, oligonucleotides, and primers.
[0078] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" como usados aqui são usados sem distinção.[0078] The terms "polypeptide" and "protein" as used herein are used without distinction.
[0079] O termo "célula" como usado aqui também inclui células em um indivíduo animal e células cultivadas.[0079] The term "cell" as used herein also includes cells in an animal individual and cultured cells.
[0080] O termo "B7-H3" como usado aqui é usado no mesmo sig nificado como proteína B7-H3, e também refere-se a B7-H3 variante 1 e/ou B7-H3 variante 2.The term "B7-H3" as used herein is used in the same meaning as B7-H3 protein, and also refers to B7-H3 variant 1 and/or B7-H3 variant 2.
[0081] O termo "CDR" como usado aqui refere-se a uma região determinando complementaridade (CDR), e é conhecido que cada ca-deia leve e pesada de uma molécula de anticorpo tem três regiões de-terminando complementaridade (CDRs). O CDR é também chamado a região hipervariável, e está presente em uma região variável de cada cadeia leve e pesada de um anticorpo. Ele é um sítio que tem variabi-lidade não usualmente elevada em sua estrutura primária, e existem três CDRs separados na estrutura primária de cada cadeia de polipep- tídeo leve e pesada. Nesta especificação, quando para os CDRs de um anticorpo, os CDRs da cadeia pesada são representados por CDRH1, CDRH2, e CDRH3 do lado do terminal amino da sequência de aminoácido da cadeia pesada, e os CDRs da cadeia leve são re-presentados por CDRL1, CDRL2, e CDRL3 do lado do terminal amino da sequência de aminoácido da cadeia leve. Estes sítios estão próxi-mos uns aos outros na estrutura terciária e determinam a especificida- de para um antígeno ao qual o anticorpo liga-se.[0081] The term "CDR" as used herein refers to a complementarity-determining region (CDR), and it is known that each light and heavy chain of an antibody molecule has three complementarity-determining regions (CDRs). The CDR is also called the hypervariable region, and is present in a variable region of each light and heavy chain of an antibody. It is a site that has unusually high variability in its primary structure, and there are three separate CDRs in the primary structure of each heavy and light polypeptide chain. In this specification, when for the CDRs of an antibody, the heavy chain CDRs are represented by CDRH1, CDRH2, and CDRH3 on the amino-terminal side of the heavy chain amino acid sequence, and the light chain CDRs are represented by CDRL1 , CDRL2, and CDRL3 on the amino-terminal side of the light chain amino acid sequence. These sites are close to each other in the tertiary structure and determine the specificity for an antigen to which the antibody binds.
[0082] A frase "hibridização é realizada sob condições rigorosas" como usada aqui refere-se a um processo em que hibridização é reali-zada sob condições sob as quais a identificação possa ser alcançada realizando hibridização a 68 °C em uma solução de hibridização co-mercialmente disponível ExpressHyb Hibridization Solution (fabricada por Clontech, Inc.) ou realizando hibridização a 68 °C na presença de NaCl a 0,7 a 1,0 M usando um filtro tendo DNA imobilizado nele, se-guido por realização de lavagem a 68 °C usando 0,1 a 2 x solução de SSC (1 x solução de SSC é composta de NaCl a 150 mM e citrato de sódio a 15 mM) ou sob condições equivalentes a isso. 1. B7-H3The phrase "hybridization is carried out under stringent conditions" as used herein refers to a process in which hybridization is carried out under conditions under which identification can be achieved by performing hybridization at 68°C in a hybridization solution commercially available ExpressHyb Hybridization Solution (manufactured by Clontech, Inc.) or performing hybridization at 68°C in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter having DNA immobilized thereon, followed by performing washing at 68°C using 0.1 to 2 x SSC solution (1 x SSC solution is made up of 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate) or under equivalent conditions. 1. B7-H3
[0083] B7-H3 é um membro da família B7 expresso sobre células apresentadoras de antígeno como uma molécula coestimulatória, e é considerado agir sobre um receptor sobre T células para realçar ou suprimir atividade imune.[0083] B7-H3 is a member of the B7 family expressed on antigen presenting cells as a costimulatory molecule, and is considered to act on a receptor on T cells to enhance or suppress immune activity.
[0084] B7-H3 é uma proteína tendo uma estrutura de transmem- brana de única passagem, e o domínio extracelular de terminal N de B7-H3 contém duas variantes. A variante 1 de B7-H3 (4Ig-B7-H3) con-tém um domínio Ig semelhante a V ou semelhante a C em dois sítios, respectivamente, e a variante 2 de B7-H3 (2Ig-B7-H3) contém um do-mínio Ig semelhante a V ou semelhante a C em um sítio, respectiva-mente.[0084] B7-H3 is a protein having a single-pass transmembrane structure, and the N-terminal extracellular domain of B7-H3 contains two variants. B7-H3 variant 1 (4Ig-B7-H3) contains a V-like or C-like Ig domain at two sites, respectively, and B7-H3 variant 2 (2Ig-B7-H3) contains a V-like or C-like Ig domain at one site, respectively.
[0085] Como para B7-H3 a ser usado na invenção, B7-H3 pode ser diretamente purificado de células expressando B7-H3 de um ma-mífero humano ou um não humano (tal como um rato ou um camun-dongo) e usado, ou uma fração de membrana celular das células acima descritas pode ser preparada e usada. Além disso, B7-H3 pode ser obtida por síntese in vitro da mesma ou produção da mesma em uma célula hospedeira por meio de engenharia genética. Na engenharia genética, especificamente, após cDNA de B7-H3 ser integrado em um vetor capaz de expressar cDNA de B7-H3, B7-H3 pode ser obtido sin-tetizando-a em uma solução contendo uma enzima, um substrato e uma substância de energia requerida para a transcrição e translação, ou expressando B7-H3 em outra célula hospedeira transformada pro- cariótica ou eucariótica.[0085] As for B7-H3 to be used in the invention, B7-H3 can be directly purified from cells expressing B7-H3 of a human or non-human mammal (such as a rat or a mouse) and used , or a cell membrane fraction of the cells described above can be prepared and used. Furthermore, B7-H3 can be obtained by in vitro synthesis of the same or production of the same in a host cell by means of genetic engineering. In genetic engineering, specifically, after B7-H3 cDNA is integrated into a vector capable of expressing B7-H3 cDNA, B7-H3 can be obtained by synthesizing it in a solution containing an enzyme, a substrate and a substance. energy required for transcription and translation, or expressing B7-H3 in another transformed prokaryotic or eukaryotic host cell.
[0086] A sequência de aminoácido de uma estrutura de leitura aberta (ORF) de um gene de variante 1 de B7-H3 humano é represen-tada por SEQ ID NO: 1 na Listagem de Sequência. Além disso, a se-quência de SEQ ID NO: 1 é mostrada na figura 1.The amino acid sequence of an open reading frame (ORF) of a human B7-H3 variant 1 gene is represented by SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. Furthermore, the sequence of SEQ ID NO: 1 is shown in figure 1.
[0087] A sequência de aminoácido de uma ORF de um gene de variante 2 de B7-H3 humano é representado por SEQ ID NO: 2 na Lis-tagem de Sequência. Além disso, a sequência de SEQ ID NO: 2 é mostrada na figura 2.The amino acid sequence of an ORF of a human B7-H3 variant 2 gene is represented by SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. Furthermore, the sequence of SEQ ID NO: 2 is shown in figure 2.
[0088] Além disso, uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácido em que um ou diversos aminoácidos são substituídos, deletados e/ou adicionados em qualquer das sequências de aminoáci- dos de B7-H3 acima descritas e também tem uma atividade biológica equivalente àquela da proteína é também incluída em B7-H3.[0088] Furthermore, a protein that consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted and/or added to any of the above-described B7-H3 amino acid sequences and also has an equivalent biological activity that of the protein is also included in B7-H3.
[0089] A variante 1 de B7-H3 humana madura da qual a sequência sinal foi removida corresponde a uma sequência de aminoácido con-sistindo em resíduos de aminoácido 27 a 534 da sequência de amino- ácido representada por SEQ ID NO: 1. Além disso, a variante 2 de B7- H3 humana madura da qual a sequência sinal foi removida correspon-de a uma sequência de aminoácido consistindo em 27 a 316 do se-quência de aminoácido representada por SEQ ID NO: 2.The mature human B7-H3 variant 1 from which the signal sequence has been removed corresponds to an amino acid sequence consisting of amino acid residues 27 to 534 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1. Furthermore, the mature human B7-H3 variant 2 from which the signal sequence was removed corresponds to an amino acid sequence consisting of 27 to 316 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:2.
[0090] 2. Produção de anticorpo anti-B7-H3[0090] 2. Production of anti-B7-H3 antibody
[0091] O anticorpo contra B7-H3 da invenção pode ser obtido por imunização de um animal com B7-H3 ou um polipeptídeo arbitrário se-lecionado da sequência de aminoácido de B7-H3, e coletando e purifi- cando o anticorpo produzido in vivo de acordo com um procedimento comum. As espécies biológicas de B7-H3 a serem usadas como um antígeno não estão limitadas a ser humano, e um animal pode ser imunizado com B7-H3 derivado de um animal que não humano, tal como um camundongo ou um rato. Neste caso, examinando a reativi- dade cruzada entre um anticorpo ligando-se à B7-H3 heteróloga obtida e B7-H3 humana, um anticorpo aplicável a uma doença humana pode ser selecionado.The B7-H3 antibody of the invention can be obtained by immunizing an animal with B7-H3 or an arbitrary polypeptide selected from the amino acid sequence of B7-H3, and collecting and purifying the antibody produced in vivo according to a common procedure. The biological species of B7-H3 to be used as an antigen are not limited to human, and an animal can be immunized with B7-H3 derived from an animal other than human, such as a mouse or rat. In this case, by examining the cross-reactivity between an antibody binding to the obtained heterologous B7-H3 and human B7-H3, an antibody applicable to a human disease can be selected.
[0092] Além disso, um anticorpo monoclonal pode ser obtido de um hibridoma estabelecido fundindo-se células produtoras de anticorpo que produzem um anticorpo contra B7-H3 com células de mieloma de acordo com um método conhecido (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature, (1975) 256, pp. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodi-es, pp. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)).[0092] Furthermore, a monoclonal antibody can be obtained from an established hybridoma by fusing antibody-producing cells that produce an antibody against B7-H3 with myeloma cells according to a known method (eg, Kohler and Milstein, Nature , (1975) 256, pp. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodi-es, pp. 365-367, Plenum Press, NY (1980)).
[0093] B7-H3 a ser usada como um antígeno pode ser obtida ex pressando o gene B7-H3 em uma célula hospedeira usando engenha-ria genética.[0093] B7-H3 to be used as an antigen can be obtained by expressing the B7-H3 gene in a host cell using genetic engineering.
[0094] Especificamente, um vetor capaz de expressar o gene B7- H3 é produzido, e o vetor resultante é transfectado em uma célula hospedeira para expressar o gene, e em seguida, o B7-H3 expresso é purificado. A seguir, um método de obtenção de um anticorpo contra B7-H3 é especificamente descrito.[0094] Specifically, a vector capable of expressing the B7-H3 gene is produced, and the resulting vector is transfected into a host cell to express the gene, and then the expressed B7-H3 is purified. In the following, a method of obtaining an antibody against B7-H3 is specifically described.
[0095] Preparação de antígeno[0095] Antigen Preparation
[0096] Exemplos do antígeno a ser usado para produzir o anticor po anti-B7-H3 incluem B7-H3, um polipeptídeo consistindo em uma sequência de aminoácido parcial compreendendo pelo menos 6 ami- noácidos consecutivos de B7-H3, e um derivado obtido adicionando-se uma determinada sequência de aminoácido ou veículo a ele.[0096] Examples of the antigen to be used to produce the anti-B7-H3 antibody include B7-H3, a polypeptide consisting of a partial amino acid sequence comprising at least 6 consecutive amino acids of B7-H3, and a derivative obtained adding a certain amino acid sequence or vehicle to it.
[0097] B7-H3 pode ser purificado diretamente de tecidos de tumor humano ou células de tumor e usado. Além disso, B7-H3 pode ser ob- tido sintetizando-o in vitro ou produzindo-o em uma célula hospedeira por engenharia genética.[0097] B7-H3 can be purified directly from human tumor tissues or tumor cells and used. Furthermore, B7-H3 can be obtained by synthesizing it in vitro or producing it in a host cell by genetic engineering.
[0098] Com respeito à engenharia genética, especificamente, após o cDNA de B7-H3 ser integrado em um vetor capaz de expressar o cDNA de B7-H3, B7-H3 pode ser obtido sintetizando-o em uma solução contendo uma enzima, um substrato e uma substância de energia requerida para a transcrição e translação, ou expressando B7-H3 em outra célula hospedeira transformada procariótica ou eucariótica.[0098] With respect to genetic engineering, specifically, after the B7-H3 cDNA is integrated into a vector capable of expressing the B7-H3 cDNA, B7-H3 can be obtained by synthesizing it in a solution containing an enzyme, a substrate and an energy substance required for transcription and translation, or expressing B7-H3 in another transformed prokaryotic or eukaryotic host cell.
[0099] Além disso, o antígeno pode também ser obtido como uma proteína secretória expressando uma proteína de fusão obtida ligando o domínio extracelular de B7-H3, que é uma proteína de membrana, a uma região contante de um anticorpo em um sistema vetor-hospedeiro apropriado.[0099] Furthermore, the antigen can also be obtained as a secretory protein expressing a fusion protein obtained by linking the extracellular domain of B7-H3, which is a membrane protein, to a constant region of an antibody in a vector-system appropriate host.
[00100] O cDNA de B7-H3 pode ser obtido, por exemplo, por um método assim chamado método de PCR, em que uma reação de ca-deia de polimerase (doravante citada como "PCR") é realizada usando uma biblioteca de cDNA expressando cDNA de B7-H3 como um pa-drão e iniciadores que especificamente aplificam o cDNA de B7-H3 (ver Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, pp. 487-489).[00100] The B7-H3 cDNA can be obtained, for example, by a method so-called PCR method, in which a polymerase chain reaction (hereinafter referred to as "PCR") is performed using a cDNA library expressing B7-H3 cDNA as a template and primers that specifically amplify the B7-H3 cDNA (see Saiki, RK, et al., Science, (1988) 239, pp. 487-489).
[00101] Como a síntese in vitro do polipeptídeo, por exemplo, Rapid Translation System (RTS) fabricado por Roche Diagnostics, Inc. pode ser exemplificado, porém não está limitado a ele.As the in vitro synthesis of the polypeptide, for example, Rapid Translation System (RTS) manufactured by Roche Diagnostics, Inc. can be exemplified but is not limited to it.
[00102] Exemplos das células hospedeiras procarióticas incluem Escherichia coli e Bacillus subtilis. A fim de transformar as células hospedeiras com um gene alvo, as células hospedeiras são transfor-madas por um vetor plasmídeo compreendendo um réplicon, isto é, um derivado de origem de replicação de uma espécie compatível com o hospedeiro, e uma sequência regulatória. Além disso, o vetor prefe-rivelmente tem uma sequência capaz de impor seletividade fenotípica sobre a célula transformada.[00102] Examples of prokaryotic host cells include Escherichia coli and Bacillus subtilis. In order to transform host cells with a target gene, the host cells are transformed by a plasmid vector comprising a replicon, i.e., an origin of replication derivative of a species compatible with the host, and a regulatory sequence. Furthermore, the vector preferably has a sequence capable of imposing phenotypic selectivity on the transformed cell.
[00103] Exemplos de células hospedeiras eucarióticas incluem células de vertebrado, células de inseto, e células de levedura. Como as células de vertebrado, por exemplo, células COS de símios (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos muri- nos NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), e linhagens deficientes de di- hidrofolato redutase (Urlaub, G. e Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) de células de ovário de hamster chinês (Células CHO; ATCC: CCL-61); e similares são frequentemente usa-dos, entretanto, as células não estão limitadas a elas.[00103] Examples of eukaryotic host cells include vertebrate cells, insect cells, and yeast cells. Like vertebrate cells, for example, simian COS cells (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), murine fibroblasts NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658 ), and dihydrofolate reductase deficient lines (Urlaub, G. and Chasin, LA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) from Chinese hamster ovary cells (CHO Cells ; ATCC: CCL-61); and the like are often used, however, cells are not limited to them.
[00104] O transformante desse modo obtido pode ser cultivado de acordo com um procedimento comum, e pelo cultivo do transformante, um polipeptídeo alvo é produzido intracelularmente ou extracelular- mente.The transformant thus obtained can be cultured according to a common procedure, and by culturing the transformant, a target polypeptide is produced intracellularly or extracellularly.
[00105] Um meio adequado a ser usado para a cultura pode ser se-lecionado de vários meios de cultura comumente usados, dependendo das células hospedeiras empregadas. Se a Escherichia coli for empre-gada, por exemplo, um meio LB suplementado com um antibiótico, tal como ampicilina ou IPMG, quando necessário, pode ser usado.[00105] A suitable medium to be used for the culture can be selected from several commonly used culture media, depending on the host cells employed. If Escherichia coli is used, for example, an LB medium supplemented with an antibiotic, such as ampicillin or IPMG, when necessary, can be used.
[00106] Uma proteína recombinante produzida intracelularmente ou extracelularmente pelo transformante através de tal cultura pode ser separada e purificada por qualquer de vários métodos de separação conhecidos utilizando a propriedade física ou química da proteína. Exemplos específicos dos métodos incluem o tratamento com um precipitante de proteína comum, ultrafiltração, vários tipos de cromatografia líquida, tais como cromatografia de peneira molecular (filtração de gel), cromatografia por adsorção, cromatografia por per-muta de íon, e cromatografia por afinidade, diálise, e uma combinação dos mesmos.[00106] A recombinant protein produced intracellularly or extracellularly by the transformant through such a culture can be separated and purified by any of several known separation methods utilizing the physical or chemical property of the protein. Specific examples of the methods include treatment with a common protein precipitant, ultrafiltration, various types of liquid chromatography such as molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography , dialysis, and a combination thereof.
[00107] Além disso, por ligação de uma etiqueta de seis resíduosde histidina a uma proteína recombinante a ser expressa, a proteína pode ser eficientemente purificada com uma coluna de afinidade de níquel. Alternativamente, ligando a região Fc de IgG a uma proteína recombi- nante a ser expressa, a proteína pode ser eficientemente purificada com uma coluna de proteína A.[00107] Furthermore, by binding a six-residue histidine tag to a recombinant protein to be expressed, the protein can be efficiently purified with a nickel affinity column. Alternatively, by linking the Fc region of IgG to a recombinant protein to be expressed, the protein can be efficiently purified with a protein A column.
[00108] Combinando-se os métodos acima descritos, uma grande quantidade de um polipeptídeo alvo pode ser facilmente produzida em produção elevada e pureza elevada.[00108] By combining the methods described above, a large amount of a target polypeptide can be easily produced in high production and high purity.
[00109] (2) Produção de anticorpoo monoclonal anti-B7-H3[00109] (2) Production of anti-B7-H3 monoclonal antibody
[00110] Exemplos do anticorpo específico que se liga a B7-H3 in cluem um anticorpo específico monoclonal que se liga a B7-H3, e um método de obtenção do anticorpo é como descrito abaixo.[00110] Examples of the specific antibody which binds to B7-H3 include a specific monoclonal antibody which binds to B7-H3, and a method of obtaining the antibody is as described below.
[00111] A produção de um anticorpo monoclonal geralmente requer as seguintes etapas operacionais de: (a) purificação de um biopolímero a ser usado como um an- tígeno; (b) preparação de células produtoras de anticorpo por imu-nização de um animal por injeção do antígeno, coleção do sangue, en-saio de seu título de anticorpo para determinar quando quando o baço é excisado; (c) preparação de células de mieloma (doravante citada como "mieloma"); (d) fusão das células produtoras de anticorpo com o mielo- ma; (e) avaliação de um grupo de hibridomas produzindo um anticorpo desejado; (f) divisão dos hibridomas em clones celulares individuais (clonagem); (g) opcionalmente, cultivar o hibridoma ou criação de um animal implantado com o hibridoma para produzir uma grande quanti-dade de um anticorpo monoclonal; (h) exame do anticorpo monoclonal desse modo produzido quanto à atividade biológica e especificidade de ligação, ou ensaio do mesmo quanto às propriedades como um reagente rotulado; e simila-res.[00111] The production of a monoclonal antibody generally requires the following operational steps of: (a) purification of a biopolymer to be used as an antigen; (b) preparing antibody-producing cells by immunizing an animal by injecting the antigen, collecting the blood, testing its antibody titer to determine when the spleen is excised; (c) preparing myeloma cells (hereinafter referred to as "myeloma"); (d) fusion of antibody-producing cells with myeloma; (e) evaluating a group of hybridomas producing a desired antibody; (f) dividing the hybridomas into individual cell clones (cloning); (g) optionally, culturing the hybridoma or raising an animal implanted with the hybridoma to produce a large amount of a monoclonal antibody; (h) examining the monoclonal antibody so produced for biological activity and binding specificity, or testing it for properties as a labeled reagent; and the like.
[00112] Doravante, o método de produção de um anticorpo monoclonal será descrito em detalhes seguindo as etapas acima, entretanto, o método não está limitado a elas, e, por exemplo, células produtoras de anticorpo exceto células de baço e mieloma podem ser usadas. (a) Purificação de antígeno[00112] Hereinafter, the method of producing a monoclonal antibody will be described in detail following the steps above, however, the method is not limited to them, and for example antibody-producing cells except spleen and myeloma cells can be used . (a) Antigen purification
[00113] Como o antígeno, B7-H3 preparado pelo método como acima descrito ou um peptídeo parcial do mesmo pode ser usado.[00113] Like the antigen, B7-H3 prepared by the method as described above or a peptide partial thereof can be used.
[00114] Além disso, uma fração de membrana preparada de células recombinantes expressando B7-H3 ou as células recombinantes ex-pressando as próprias B7-H3, e também um peptídeo parcial da prote-ína da invenção quimicamente sintetizado por um método conhecido por aqueles versados na técnica pode também ser usado como o antí- geno. (b) Preparação de células produtoras de anticorpo[00114] In addition, a membrane fraction prepared from recombinant cells expressing B7-H3 or the recombinant cells expressing B7-H3 themselves, and also a partial peptide of the protein of the invention chemically synthesized by a method known to those skilled in the art can also be used as the antigen. (b) Preparation of antibody producing cells
[00115] O antígeno obtido na etapa (a) é misturado com um adjuvante, tal como adjuvante completo ou incompleto de Freund ou sulfato de potássio de alumínio e a mistura resultante é usada como um imunógeno para imunizar um animal experimental. Como o animal ex-perimental, qualquer animal usado em um método de produção de hi- bridoma conhecido pode ser usado sem qualquer problema. Especifi-camente, por exemplo, um camundongo, um rato, uma cabra, uma ovelha, um gado vacum, um cavalo, ou similares, podem ser usados. Entretanto, do ponto de vista de facilidade de disponibilidade de células de mieloma a serem fundidas acom as células produtoras de anticorpo extraídas, um camundongo ou um rato é preferivelmente usado como o animal a ser imunizado.[00115] The antigen obtained in step (a) is mixed with an adjuvant such as Freund's complete or incomplete adjuvant or aluminum potassium sulfate and the resulting mixture is used as an immunogen to immunize an experimental animal. Like the experimental animal, any animal used in a known hybridoma production method can be used without any problem. Specifically, for example, a mouse, rat, goat, sheep, cattle, horse, or the like can be used. However, from the standpoint of the ease of availability of myeloma cells to be fused with the extracted antibody-producing cells, a mouse or rat is preferably used as the animal to be immunized.
[00116] Além disso, a linhagem de um camundongo ou um rato a ser usado não é particularmente limitada, e no caso de um camundongo, por exemplo, várias linhagens, tais como A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, e 129 e similares podem ser usadas, e no caso de um rato, por exemplo, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer e similares podem ser usados.[00116] Furthermore, the strain of a mouse or a rat to be used is not particularly limited, and in the case of a mouse, for example, various strains such as A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE , C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, RIII, SJL, SWR, WB, and 129 and the like can be used, and in the case of a mouse, by example, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer and the like can be used.
[00117] Estes camundongos e ratos são comercialmente disponíveis de criadores / distribuidores de animais experimentais, por exemplo, CLEA Japan, Inc. e Charles River Laboratories Japan, Inc.[00117] These mice and rats are commercially available from experimental animal breeders/distributors, eg CLEA Japan, Inc. and Charles River Laboratories Japan, Inc.
[00118] Entre estes, em consideração de compatibilidade de fusão com células de mieloma descritas abaixo, no caso de um camundongo, a linhagem BALB/c, e no caso de um rato, as linhagens Wistar e Low são particularmente preferidas como o animal a ser imunizado.[00118] Among these, in consideration of fusion compatibility with myeloma cells described below, in the case of a mouse, the BALB/c lineage, and in the case of a rat, the Wistar and Low lineages are particularly preferred as the animal a be immunized.
[00119] Além disso, em consideração de homologia antigênica entre humanos e camundongos, é também preferido usar um camundongo tendo função biológica diminuída para remover auto-anticorpos, isto é, um camundongo com uma doença autoimune.[00119] Furthermore, in consideration of antigenic homology between humans and mice, it is also preferred to use a mouse having diminished biological function to remove autoantibodies, ie, a mouse with an autoimmune disease.
[00120] A idade de tal camundongo ou rato no momento de imunização é preferivelmente de 5 a 12 semanas de idade, mais preferivelmente 6 a 8 semanas de idade.The age of such a mouse or rat at the time of immunization is preferably 5 to 12 weeks old, more preferably 6 to 8 weeks old.
[00121] A fim de imunizar um animal com B7-H3 ou um recombi- nante do mesmo, por exemplo, um método conhecido descrito em detalhes, por exemplo, em Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. e Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) ou similares, pode ser usado.[00121] In order to immunize an animal with B7-H3 or a recombinant thereof, for example, a known method is described in detail, for example, in Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E.A. and Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) or the like, can be used.
[00122] Entre estes métodos de imunização, um método específico preferido é, por exemplo, como segue.[00122] Among these immunization methods, a specific preferred method is, for example, as follows.
[00123] Isto é, primeiro, uma fração de proteína de membrana servindo como o antígeno ou células usadas para expressar o antígeno é/são intradermicamente ou intraperitonealmente administradas a um animal.[00123] That is, first, a membrane protein fraction serving as the antigen or cells used to express the antigen is/are intradermally or intraperitoneally administered to an animal.
[00124] Entretanto, a combinação de ambas as rotinas de adminis-tração é preferida para aumentar a eficiência de imunização, e quando a administração intradérmica é realizada na primeira metade e a admi-nistração intraperitoneal é realizada na última metade ou apenas na última dosagem, a eficiência de imunização pode ser particularmente aumentada.[00124] However, the combination of both administration routines is preferred to increase immunization efficiency, and when intradermal administration is performed in the first half and intraperitoneal administration is performed in the latter half or only in the last dosage , the immunization efficiency can be particularly increased.
[00125] A escala de administração do antígeno varia, dependendo do tipo de animal a ser imunizado, diferença individual ou similares. Entretanto, em general, uma escala de administração em que a fre-quência de administração do antígeno é de 3 a 6 vezes e o intervalo de dosagem é de 2 a 6 semanas é preferida, e uma escala de adminis-tração em que a frequência de administração do antígeno é de 3 a 4 vezes e o intervalo de dosagem é de 2 a 4 semanas é mais preferida.[00125] The scale of administration of the antigen varies depending on the type of animal to be immunized, individual difference or similar. However, in general, an administration scale where the frequency of antigen administration is 3 to 6 times and the dosage interval is 2 to 6 weeks is preferred, and an administration scale where the frequency of antigen administration is 3 to 4 times and the dosing interval is 2 to 4 weeks is most preferred.
[00126] Além disso, a dose do antígeno varia dependendo do tipo de animal, diferenças individuais ou similares, entretanto, a dose é ge-ralmente estabelecida em 0,05 a 5 mg, preferivelmente cerca de 0,1 a 0,5 mg.[00126] In addition, the antigen dose varies depending on the type of animal, individual differences or the like, however, the dose is usually set at 0.05 to 5 mg, preferably around 0.1 to 0.5 mg .
[00127] Uma imunização de reforço é realizada 1 a 6 semanas, pre-ferivelmente 2 a 4 semanas, mais preferivelmente 2 a 3 semanas após a administração do antígeno como descrito acima.A booster immunization is carried out 1 to 6 weeks, preferably 2 to 4 weeks, more preferably 2 to 3 weeks after administration of the antigen as described above.
[00128] A dose do antígeno no momento da realização da imunização de reforço varia dependendo do tipo ou tamanho do animal ou si-milares, entretanto, no caso de, por exemplo, um camundongo, a dose é geralmente estabelecida em 0,05 a 5 mg, preferivelmente 0,1 a 0,5 mg, mais preferivelmente cerca de 0,1 a 0,2 mg.[00128] The antigen dose at the time of booster immunization varies depending on the type or size of the animal or similar, however, in the case of, for example, a mouse, the dose is generally set at 0.05 to 5mg, preferably 0.1 to 0.5mg, more preferably about 0.1 to 0.2mg.
[00129] Células de baço ou linfócitos incluindo células produtoras de anticorpo são assepticamente removidas do animal imunizado 1 a 10 dias, preferivelmente 2 a 5 dias, mais preferivelmente 2 a 3 dias após a imunização de reforço. Neste momento, o título de anticorpo é medido, e se um animal tendo um título de anticorpo suficientemente aumentado é usado como uma fonte de suprimento das células produ-toras de anticorpo, o procedimento subsequente pode ser realizado mais eficientemente.Spleen cells or lymphocytes including antibody producing cells are aseptically removed from the immunized animal 1 to 10 days, preferably 2 to 5 days, more preferably 2 to 3 days after the booster immunization. At this point, the antibody titer is measured, and if an animal having a sufficiently increased antibody titer is used as a source of supply of the antibody-producing cells, the subsequent procedure can be performed more efficiently.
[00130] Exemplos do método de medição do título de anticorpo a ser usado aqui incluem um método RIA e um método ELISA, porém o método não está limitado a eles.[00130] Examples of antibody titer measurement method to be used here include an RIA method and an ELISA method, but the method is not limited to them.
[00131] Por exemplo, se um método ELISA é empregado, a medição do título de anticorpo na invenção pode ser realizada de acordo com os procedimentos como descrito abaixo.[00131] For example, if an ELISA method is employed, the measurement of antibody titer in the invention can be performed according to the procedures as described below.
[00132] Primeiramente, um antígeno purificado ou parcialmente pu-rificado é adsorvido à superfície de uma fase sólida tal como uma placa de 96 cavidades para ELISA, e a superfície da fase sólida não tendo nenhum antígeno adsorvido a ela é coberta com uma proteína não relacionada ao antígeno, tal como albumina de soro bovino (doravante citada como "BSA"). Após lavar a superfície, a superfície é trazida em contato com uma amostra serialmente diluída (por exemplo, soro de camundongo) como um anticorpo primário para permitir o anticorpo na amostra ligar-se ao antígeno.[00132] First, a purified or partially purified antigen is adsorbed to the surface of a solid phase such as a 96-well ELISA plate, and the surface of the solid phase having no antigen adsorbed to it is covered with a non-protein. related to the antigen, such as bovine serum albumin (hereinafter referred to as "BSA"). After washing the surface, the surface is brought into contact with a serially diluted sample (eg, mouse serum) as a primary antibody to allow the antibody in the sample to bind to the antigen.
[00133] Além disso, como um anticorpo secundário, um anticorpo rotulado com uma enzima contra um anticorpo de camundongo é adi-cionado e é permitido ligar-se ao anticorpo de camundongo. Após la-vagem, um substrato para a enzima é adicionado e uma mudança em absorvência que ocorre devido ao desenvolvimento da cor induzido por degradação do substrate ou similares, é medida e o título de anticorpo é calculado com base na medição.[00133] Furthermore, as a secondary antibody, an antibody labeled with an enzyme against a mouse antibody is added and is allowed to bind to the mouse antibody. After washing, a substrate for the enzyme is added and a change in absorbance that occurs due to color development induced by substrate degradation or the like is measured and the antibody titer is calculated based on the measurement.
[00134] A separação das células produtoras de anticorpo das célu- las de baço ou linfócitos do animal imunizado pode ser realizada de acordo com um método conhecido (por exemplo, Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977), 6, p. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495). Por exemplo, no caso de células de baço, um método geral em que as células produtoras de anticorpo são separadas por homo-geneização do baço para obter as células por meio de filtração com uma malha de aço inoxidável e suspendendo as células em Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) pode ser empregado. (c) Preparação de células de mieloma (doravante citada como "mi- eloma")The separation of the antibody-producing cells from the spleen or lymphocyte cells of the immunized animal can be carried out according to a known method (for example, Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977), 6, p. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495) . For example, in the case of spleen cells, a general method in which antibody-producing cells are separated by homogenizing the spleen to obtain the cells by filtering through a stainless steel mesh and suspending the cells in Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) can be used. (c) Preparation of myeloma cells (hereinafter referred to as "myeloma")
[00135] As células de mieloma a serem usadas para fusão celular não estão particularmente limitadas e células adequadas podem ser selecionadas de linhagens celulares conhecidas. Entretanto, em con-sideração de conveniência quando um hibridoma é selecionado de cé-lulas fundidas, é preferido usar uma linhagem deficiente de HGPRT (hipoxantina-guanina fosforibosil transferase) cujo procedimento de seleção foi estabelecido.The myeloma cells to be used for cell fusion are not particularly limited and suitable cells can be selected from known cell lines. However, for the sake of convenience when a hybridoma is selected from fused cells, it is preferred to use an HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) deficient strain whose selection procedure has been established.
[00136] Mais especificamente, exemplos da linhagem deficiente de HGPRT incluem X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63- Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8,653(X63,653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11- 45,6TG1,7(45,6TG), FO, S149/5XXO, e BU,1 derivados de camun-dongos; 210.RSY3.Ag,1,2,3(Y3) derivados de ratos; e U266AR(SKO- 007), GM1500-GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW- HMy2(HMy2) e 8226AR/NIP4-1(NP41) derivados de humanos. Estas linhagens deficientes de HGPRT estão disponíveis de, por exemplo, a American Type Culture Collection (ATCC) ou similares.More specifically, examples of the HGPRT deficient lineage include X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8,653(X63,653), SP2 /0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1,7(45.6TG), FO, S149/5XXO, and BU,1 derived from mice; 210.RSY3.Ag,1,2,3(Y3) derived from rats; and U266AR(SKO-007), GM1500-GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) and 8226AR/NIP4-1(NP41) derived from humans. These HGPRT deficient strains are available from, for example, the American Type Culture Collection (ATCC) or the like.
[00137] Estas linhagens celulares são subcultivadas em um meio apropriado, tal como um meio de 8-azaguanina [um meio obtido adici-onando-se 8-azaguanina a um meio de RPMI 1640 suplementado com glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina, e soro de bezerro fetal (do-ravante citado como "FCS")], Iscove's Modified Dulbecco's Medium (doravante citado como "IMDM"), ou Dulbecco's Modified Eagle Me-dium (doravante citado como "DMEM"). Neste caso, 3 a 4 dias antes da realização da fusão celular, as células são subcultivadas em um meio normal [por exemplo, um meio de ASF104 (fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.) contendo FCS a 10%] para garantir não menos do que 2 x 107 células no dia de fusão celular. (d) Fusão celular[00137] These cell lines are subcultured in an appropriate medium, such as an 8-azaguanine medium [a medium obtained by adding 8-azaguanine to an RPMI 1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, and fetal calf serum (hereinafter referred to as "FCS")], Iscove's Modified Dulbecco's Medium (hereinafter referred to as "IMDM"), or Dulbecco's Modified Eagle Me-dium (hereinafter referred to as "DMEM"). In this case, 3 to 4 days before performing cell fusion, cells are subcultured in a normal medium [eg, an ASF104 medium (manufactured by Ajinomoto Co., Ltd.) containing 10% FCS] to ensure no less than 2 x 107 cells on the day of cell fusion. (d) Cell fusion
[00138] Fusão entre as células produtoras de anticorpo e as células de mieloma pode ser apropriadamente realizada de acordo com um método conhecido (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. e Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.), sob condições tais que a taxa de sobrevivência de células não é excessivamente reduzida.[00138] Fusion between antibody-producing cells and myeloma cells can be appropriately performed according to a known method (Weir, DM Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987) , Kabat, EA and Mayer, MM, Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.), under conditions such that the cell survival rate is not excessively reduced.
[00139] Como tal método, por exemplo, um método químico em que as células produtoras de anticorpo e as células de mieloma são mistu-radas em uma solução contendo um polímero, tal como polietileno gli- col em uma alta concentração, um método físico usando estimulação elétrica, ou similares, pode ser usado. Entre estes métodos, um exem-plo específico do método químico é como descrito abaixo.[00139] As such a method, for example, a chemical method in which antibody-producing cells and myeloma cells are mixed in a solution containing a polymer such as polyethylene glycol in a high concentration, a physical method using electrical stimulation, or the like, can be used. Among these methods, a specific example of the chemical method is as described below.
[00140] Isto é, no caso onde o polietileno glicol é usado na solução contendo um polímero em uma alta concentração, as células produto-ras de anticorpo e as células de mieloma são misturadas em uma so-lução de polietileno glicol tendo um peso molecular de 1500 a 6000, mais preferivelmente 2000 a 4000 em uma temperatura de 30 a 40°C, preferivelmente de 35 a 38°C durante 1 a 10 minutos, preferivelmente 5 a 8 minutos. (e) Seleção de um grupo de hibridomas[00140] That is, in the case where polyethylene glycol is used in the solution containing a polymer in a high concentration, the antibody-producing cells and the myeloma cells are mixed in a solution of polyethylene glycol having a molecular weight 1500 to 6000, more preferably 2000 to 4000 at a temperature of 30 to 40°C, preferably 35 to 38°C for 1 to 10 minutes, preferably 5 to 8 minutes. (e) Selection of a group of hybridomas
[00141] O método de seleção de hibridomas obtido pela fusão celular acima descrita não é particularmente limitado. Geralmente, um método de seleção de HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) (Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550) é usado.The hybridoma selection method obtained by cell fusion described above is not particularly limited. Generally, a HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) selection method (Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550) is used .
[00142] Este método é efetivo quando hibridomas são obtidos usando as células de mieloma de uma linhagem deficiente de HGPRT que não pode sobreviver na presença de aminopterina.[00142] This method is effective when hybridomas are obtained using myeloma cells of an HGPRT deficient lineage that cannot survive in the presence of aminopterin.
[00143] Isto é, por cultura de células não fundidas e hibridomas em um meio de HAT, apenas hibridomas resistentes à aminopterina são seletivamente deixados sobreviver e proliferar. (f) Divisão em clone cellular individual (clonagem)[00143] That is, by culturing unfused cells and hybridomas in a HAT medium, only aminopterin resistant hybridomas are selectively allowed to survive and proliferate. (f) Division into individual cell clone (cloning)
[00144] Como um método de clonagem para hibridomas, um método conhecido, tal como um método de metilcelulose, um método de agarose suave, ou um método de diluição limitante pode ser usado (ver, por exemplo, Barbara, B. M. e Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman e Company, San Francisco (1980)). Entre estes métodos, particularmente, um método de cultura tridimensional tal como um método de metilcelulose é preferido. Por exemplo, o grupo de hibridomas produzidos por fusão celular é sus-penso em um meio de metilcelulose tal como ClonaCell-HY Selection Medium D (fabricado por StemCell Technologies, inc., #03804) e culti-vado. Em seguida, as colônias de hibridoma formadas são colhidas, por meio das quais os hibridomas monoclonais podem ser obtidos. As colônias de hibridoma respectivas colhidas são cultivadas, e um hibri- doma que foi confirmado ter um título de anticorpo estável em um so- brenadante de cultura de hibridoma obtido é selecionado como uma linhagem de hibridoma de produção de anticorpo monoclonal de B7- H3.[00144] As a cloning method for hybridomas, a known method such as a methylcellulose method, a mild agarose method, or a limiting dilution method can be used (see, for example, Barbara, BM and Stanley, MS : Selected Methods in Cellular Immunology, WH Freeman and Company, San Francisco (1980)). Among these methods, particularly, a three-dimensional culture method such as a methylcellulose method is preferred. For example, the group of hybridomas produced by cell fusion is suspended in a methylcellulose medium such as ClonaCell-HY Selection Medium D (manufactured by StemCell Technologies, inc., #03804) and cultured. Then, the formed hybridoma colonies are harvested, whereby monoclonal hybridomas can be obtained. The respective harvested hybridoma colonies are cultured, and a hybridoma that has been confirmed to have a stable antibody titer in a obtained hybridoma culture supernatant is selected as a B7-H3 monoclonal antibody producing hybridoma line.
[00145] Exemplos da linhagem de hibridoma desse modo estabele- cida incluem o hibridoma M30 de B7-H3. Nesta especificação, um an-ticorpo produzido pelo hibridoma M30 de B7-H3 é citado como "anti-corpo M30 " ou simplesmente "M30".Examples of the hybridoma lineage thus established include the hybridoma M30 of B7-H3. In this specification, an antibody produced by the hybridoma M30 of B7-H3 is referred to as "antibody M30" or simply "M30".
[00146] A cadeia pesada do anticorpo M30 tem uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 20 na Listagem de Se-quência. Além disso, a cadeia leve do anticorpo M30 tem uma se-quência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 21 na Listagem de Sequência. Na cadeia pesada a sequência de aminoácido repre-sentada pela SEQ ID NO: 20 na Listagem de Sequência, uma sequên-cia de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 1 a 19 é uma sequência sinal, uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 é uma região variável, e uma se-quência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 142 a 471 é uma região constante. Além disso, na sequência de aminoácido de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 21 na Listagem de Se-quência, uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 1 a 22 é uma sequência sinal, uma sequência de aminoá- cido consistindo em resíduos de aminoácido 23 a 130 é uma região variável, e uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 131 a 235 é uma região constante. (g) Preparação de anticorpo monoclonal por cultura de hibridomaThe heavy chain of the M30 antibody has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 in the Sequence Listing. In addition, the M30 antibody light chain has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 in the Sequence Listing. In the heavy chain the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 in the Sequence Listing, an amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 19 is a signal sequence, an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 141 is a variable region, and an amino acid sequence consisting of amino acid residues 142 to 471 is a constant region. Furthermore, in the light chain amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 in the Sequence Listing, an amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 22 is a signal sequence, an amino acid sequence consisting of residues from amino acid 23 to 130 is a variable region, and an amino acid sequence consisting of amino acid residues 131 to 235 is a constant region. (g) Preparation of monoclonal antibody by hybridoma culture
[00147] Por cultura do hibridoma desse modo selecionado, um anti-corpo monoclonal pode ser eficientemente obtido. Entretanto, antes da cultura, é preferido realizar a avaliação de um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal alvo.By culturing the hybridoma thus selected, a monoclonal antibody can be efficiently obtained. However, prior to culturing, it is preferred to carry out the evaluation of a hybridoma that produces a target monoclonal antibody.
[00148] Em tal avaliação, um método conhecido pode ser empregado.[00148] In such an assessment, a known method may be employed.
[00149] A medição do título de anticorpo na invenção pode ser rea-lizada, por exemplo, por um método ELISA explicado no item (b) des-crito acima.[00149] The measurement of antibody titer in the invention can be carried out, for example, by an ELISA method explained in item (b) described above.
[00150] O hibridoma obtido pelo método descrito acima pode ser armazenado em um estado congelado em nitrogênio líquido ou em um congelador a -80°C ou abaixo.[00150] The hybridoma obtained by the method described above can be stored in a frozen state in liquid nitrogen or in a freezer at -80°C or below.
[00151] Após conclusão de clonagem, o meio é mudado de um meio de HT para um meio normal, e o hibridoma é cultivado.[00151] Upon completion of cloning, the medium is changed from an HT medium to a normal medium, and the hybridoma is cultured.
[00152] Cultura em larga escala é realizada por rotação da cultura usando um grande frasco de cultura ou por cultura rotatória. A partir do sobrenadante obtido pela cultura em larga escala, um anticorpo mono-clonal que especificamente liga-se à proteína da invenção pode ser obtido por purificação usando um método conhecido por aqueles ver-sados na técnica tal como filtração de gel.[00152] Large-scale culture is performed by rotation of the culture using a large culture flask or by rotational culture. From the supernatant obtained by the large scale culture, a monoclonal antibody that specifically binds to the protein of the invention can be obtained by purification using a method known to those skilled in the art such as gel filtration.
[00153] Além disso, o hibridoma é injetado na cavidade abdominal de um camundongo da mesma linhagem como o hibridoma (por exemplo, o acima descrito BALB/c) ou um camundongo Nu/Nu para proliferar o hibridoma, por meio do qual os ascites contendo uma grande quantidade do anticorpo monoclonal da invenção pode ser obtida.[00153] Furthermore, the hybridoma is injected into the abdominal cavity of a mouse of the same lineage as the hybridoma (eg the above described BALB/c) or a Nu/Nu mouse to proliferate the hybridoma, whereby the ascites containing a large amount of the monoclonal antibody of the invention can be obtained.
[00154] No caso onde o hibridoma é administrado na cavidade ab-dominal, se um óleo mineral, tal como 2,6,10,14-tetrametil pentadecano (pristano) for administrado 3 a 7 dias antes a ele, uma maior quantidade dos ascites pode ser obtida.[00154] In the case where the hybridoma is administered into the ab-dominal cavity, if a mineral oil such as 2,6,10,14-tetramethyl pentadecane (pristane) is administered 3 to 7 days before it, a larger amount of ascites can be obtained.
[00155] Por exemplo, um imunossupressor é previamente injetado na cavidade abdominal de um camundongo da mesma linhagem do hibridoma para inativar células T. 20 dias depois disso, 106 a 107 célu-las de clone de hibridoma são suspensas em um meio livre de soro (0,5 ml), e a suspensão é administrada na cavidade abdominal do ca-mundongo. Em geral, quando o abdômen é expandido e enchido com o ascite, o ascite é coletado do camundongo. Por este método, o anti-corpo monoclonal pode ser obtido em uma concentração que é cerca de 100 vezes ou muito maior do que aquela na solução de cultura.[00155] For example, an immunosuppressant is previously injected into the abdominal cavity of a mouse of the same strain as the hybridoma to inactivate T cells. 20 days thereafter, 106 to 107 hybridoma clone cells are suspended in a serum-free medium (0.5 ml), and the suspension is administered into the mouse's abdominal cavity. In general, when the abdomen is expanded and filled with ascites, the ascites is collected from the mouse. By this method, the monoclonal antibody can be obtained at a concentration that is about 100 times or much higher than that in the culture solution.
[00156] O anticorpo monoclonal obtido pelo método acima descrito pode ser purificado por um método descrito, por exemplo, em Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Sci-entific Publications, Oxford (1978).The monoclonal antibody obtained by the method described above can be purified by a method described, for example, in Weir, D.M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).
[00157] O anticorpo monoclonal desse modo obtido tem alta especi-ficidade de antígeno para B7-H3. (h) Ensaio de anticorpo monoclonal[00157] The monoclonal antibody thus obtained has high antigen specificity for B7-H3. (h) Monoclonal antibody assay
[00158] O isótipo e subclasse do anticorpo monoclonal desse modo obtido podem ser determinados como segue.The isotype and subclass of the monoclonal antibody thus obtained can be determined as follows.
[00159] Primeiramente, exemplos do Método de identificação incluem um método Ouchterlony, um método ELISA, e um método RIA.[00159] Firstly, examples of the Identification Method include an Ouchterlony method, an ELISA method, and an RIA method.
[00160] Um Método Ouchterlony é simples, porém quando a con-centração do anticorpo monoclonal é baixa, uma operação de conden-sação é requerida.[00160] An Ouchterlony Method is simple, however when the concentration of the monoclonal antibody is low, a condensing operation is required.
[00161] Por outro lado, quando um método ELISA ou um método RIA é usado, diretamente reagindo o sobrenadante de cultura com uma fase sólida adsorvida pelo antígeno e usando anticorpos correspondentes a vários tipos de isótipos de imunoglobulina e subclasses como anticorpos secundários, o isótipo e subclasse do anticorpo monoclonal podem ser identificados.[00161] On the other hand, when an ELISA method or an RIA method is used, directly reacting the culture supernatant with a solid phase adsorbed by the antigen and using antibodies corresponding to various types of immunoglobulin isotypes and subclasses as secondary antibodies, the isotype and subclass of the monoclonal antibody can be identified.
[00162] Além disso, como um método mais simples, um kit de iden-tificação comercialmente disponível (por exemplo, Mouse Typer Kit fabricada por Bio-Rad Laboratories, Inc.) ou similares, pode também ser usado.[00162] In addition, as a simpler method, a commercially available identification kit (eg, Mouse Typer Kit manufactured by Bio-Rad Laboratories, Inc.) or the like can also be used.
[00163] Além disso, a determinação quantitativa da proteína pode ser realizada pelo método Folin Lowry e um método de cálculo com base na absorvência a 280 nm [1,4 (OD 280) = Imunoglobulina 1 mg/ml].[00163] In addition, the quantitative determination of the protein can be performed by the Folin Lowry method and a calculation method based on the absorbance at 280 nm [1.4 (OD 280) = Immunoglobulin 1 mg/ml].
[00164] Além disso, mesmo quando o anticorpo monoclonal é sepa-radamente e independentemente obtido realizando novamente as eta pas de (a) a (h) em (2), é possível obter um anticorpo tendo a atividade citotóxica equivalente àquela do anticorpo M30. Como um exemplo de tal anticorpo, um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo do anticproo M30 pode ser exemplificado. O M30 reconhece um epítopo no domínio IgC1 ou IgC2, que é um domínio no domínio extracelular B7-H3, e liga-se ao domínio IgC1 ou o domínio IgC2 ou ambos. Portanto, como o epítopo para o anticorpo da invenção, particularmente, um epítopo presente no domínio IgC1 ou IgC2 de B7-H3 pode ser exemplificado. Se um anticorpo monoclonal recentemente produzido liga um peptídeo parcial ou uma estrutura terciária parcial àquela a qual o anticorpo M30 liga-se, pode ser determinado que o anticorpo monoclonal liga-se ao mesmo epítopo do anticorpo M30. Além disso, confirmando que o anti-corpo monoclonal compete com o anticorpo M30 ao qual se liga a B7- H3 (isto é, o anticorpo monoclonal inibé a ligação entre o anticorpo M30 e B7-H3), pode ser determinado que o anticorpo monoclonal ligase ao mesmo epítopo do anticorpo M30 mesmo se a estrutura ou sequência de epítopo específica não foi determinada. Quando é confirmado que o anticorpo monoclonal liga-se ao mesmo epítopo do anticorpo M30, o anticorpo monoclonal é fortemente esperado que tenha uma atividade citotóxica equivalente àquela do anticorpo M30. (3) Outros anticorpos[00164] Furthermore, even when the monoclonal antibody is separately and independently obtained by performing steps (a) to (h) in (2) again, it is possible to obtain an antibody having the cytotoxic activity equivalent to that of the M30 antibody . As an example of such an antibody, an antibody which binds to the same epitope as the M30 antiprone can be exemplified. M30 recognizes an epitope in the IgC1 or IgC2 domain, which is a domain in the B7-H3 extracellular domain, and binds to the IgC1 domain or the IgC2 domain or both. Therefore, as the epitope for the antibody of the invention, particularly, an epitope present in the IgC1 or IgC2 domain of B7-H3 can be exemplified. If a newly produced monoclonal antibody binds a partial peptide or a partial tertiary structure to which the M30 antibody binds, it can be determined that the monoclonal antibody binds to the same epitope as the M30 antibody. Furthermore, by confirming that the monoclonal antibody competes with the M30 antibody to which B7-H3 binds (i.e., the monoclonal antibody inhibits the binding between the M30 antibody and B7-H3), it can be determined that the monoclonal antibody binds to the same epitope as the M30 antibody even if the structure or specific epitope sequence has not been determined. When it is confirmed that the monoclonal antibody binds to the same epitope as the M30 antibody, the monoclonal antibody is strongly expected to have a cytotoxic activity equivalent to that of the M30 antibody. (3) Other antibodies
[00165] O anticorpo da invenção inclui não somente o anticorpo monoclonal acima descrito contra B7-H3, porém também um anticorpo recombinante obtido por modificação artificial para o propósito de di-minuir a antigenicidade heteróloga para humanos, tais como um anti-corpo quimérico, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano. Estes anticorpos podem ser produzidos usando um método conhecido.[00165] The antibody of the invention includes not only the above-described monoclonal antibody against B7-H3, but also a recombinant antibody obtained by artificial modification for the purpose of decreasing heterologous antigenicity for humans, such as a chimeric antibody, a humanized antibody and a human antibody. These antibodies can be produced using a known method.
[00166] Como o anticorpo quimérico, um anticorpo no qual regiões variáveis e constantes do anticorpo são derivadas de diferentes espé-cies, por exemplo, um anticorpo quimérico, no qual uma região variá- vel de anticorpo derivado de camundongo ou de rato é conectada a uma região constante de anticorpo derivado de humano, pode ser exemplificado (ver Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, (1984)).[00166] Like chimeric antibody, an antibody in which antibody variable and constant regions are derived from different species, for example, a chimeric antibody, in which a mouse or rat-derived antibody variable region is connected to a human-derived antibody constant region, can be exemplified (see Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, (1984)).
[00167] Como o anticorpo humanizado, um anticorpo obtido integrando apenas uma região de determinação de complementariedade (CDR) em um anticorpo derivado de humano (ver Nature (1986) 321, pp. 522-525), e um anticorpo obtido enxertando uma parte dos resíduos de aminoácido da estrutura, bem como a sequência de CDR a um anticorpo humano por um método de enxerto de CDR (WO 90/07861) pode ser exemplificado.As the humanized antibody, an antibody obtained by integrating only a complementarity determining region (CDR) into a human-derived antibody (see Nature (1986) 321, pp. 522-525), and an antibody obtained by grafting a part of the framework amino acid residues as well as the CDR sequence to a human antibody by a CDR grafting method (WO 90/07861) can be exemplified.
[00168] Entretanto, o anticorpo humanizado derivado do anticorpo M30 não está limitada a um anticorpo humanizado específico contanto que o anticorpo humanizado tenha todos os 6 tipos de sequências de CDR do anticorpo M30 e tenha uma atividade antitumor. A região variável de cadeia pesada do anticorpo M30 tem CDRH1 (NYVMH) consistindo em uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 3 na Listagem de Sequência, CDRH2 (YINPYNDDVKYNEKFKG) consistindo em uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 4 na Listagem de Sequência, e CDRH3 (WGYYGSPLYYFDY) consistindo em uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 5 na Listagem de Sequência. Além disso, a região variável de cadeia leve do anticorpo M30 tem CDRL1 (RASSRLIYMH) consistindo em uma sequência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 6 na Listagem de Sequência, CDRL2 (ATSNLAS) consistindo em uma se-quência de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 7 na Listagem de Sequência, e CDRL3 (QQWNSNPPT) consistindo em uma sequên-cia de aminoácido representada pela SEQ ID NO: 8 na Listagem de Sequência.[00168] However, the humanized antibody derived from the M30 antibody is not limited to a specific humanized antibody as long as the humanized antibody has all 6 types of CDR sequences of the M30 antibody and has an antitumor activity. The heavy chain variable region of antibody M30 has CDRH1 (NYVMH) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing, CDRH2 (YINPYNDDVKYNEKFKG) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in Sequence Listing, and CDRH3 (WGYYGSPLYYFDY) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the Sequence Listing. In addition, the M30 antibody light chain variable region has CDRL1 (RASSRLIYMH) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing, CDRL2 (ATSNLAS) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 in the Sequence Listing, and CDRL3 (QQWNSNPPT) consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 in the Sequence Listing.
[00169] Como um exemplo do humanizado anticorpo de um anticorpo de camundongo M30, uma combinação arbitrária de uma cadeia pesada compreendendo a região variável de cadeia pesada consistindo em qualquer um de (1) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 9, 10, 11, ou 12 na Listagem de Sequência, (2) uma sequência de aminoácido tendo uma homologia de pelo menos 95% ou mais com a sequência de ami- noácido (1) descrita above, e (3) uma sequência de aminoácido em que um ou diversos aminoácidos na sequência de aminoácido (1) descrita acima são deletados, substituídos ou adicionados e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em qualquer um de (4) uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou 19 na Listagem de Sequência, (5) uma sequência de aminoáci- do tendo uma homologia de pelo menos 95% ou mais com a sequência de aminoácido (4) descrita acima, e (6) uma sequência de aminoá- cido em que um ou diversos aminoácidos na sequência de aminoácido (4) descrita acima são deletados, substituídos ou adicionados pode ser exemplificada.[00169] As an example of the humanized antibody of an M30 mouse antibody, an arbitrary combination of a heavy chain comprising the heavy chain variable region consisting of any one of (1) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9, 10, 11, or 12 in the Sequence Listing, (2) an amino acid sequence having a homology of at least 95% or more to the amino acid sequence (1) described above, and ( 3) an amino acid sequence in which one or several amino acids in the amino acid sequence (1) described above are deleted, substituted or added and a light chain comprising a light chain variable region consisting of any one of (4) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, or 19 in the Sequence Listing, (5) an amino acid sequence having a homology of at least 95% or more with the amino acid sequence (4) described above, and (6) an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence (4) described above are deleted, substituted or added can be exemplified.
[00170] O termo "diversos" como usado aqui se refere a 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, ou 1 ou 2.[00170] The term "miscellaneous" as used herein refers to 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or 1 or 2 .
[00171] Como a substituição de aminoácido nesta especificação, uma substituição de aminoácido conservativa é preferida. A substituição de aminoácido conservativa refere-se a uma substituição que ocorre dentro de um grupo de aminoácidos relacionados às cadeias laterais de aminoácido. Grupos de aminoácido preferidos são como segue: um grupo acídico (ácido aspártico e ácido glutâmico); um grupo básico (lisina, arginina, e histidina); um grupo não polar (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, e triptofano); e uma família polar não carregada (glicina, asparagina, glutamina, ciste- ína, serina, treonina, e tirosina). Grupos de aminoácido mais preferidos são como segue: um grupo hidróxi alifático (serina e treonina); um grupo contendo amida (asparagina e glutamina); um grupo alifático (alanina, valina, leucina, e isoleucina); e um grupo aromático (fenilala- nina, triptofano, e tirosina). Tal substituição de aminoácido é preferi-velmente realizada dentro de uma faixa que não prejudica as proprie-dades de uma substance tendo a sequência de aminoácido original.As the amino acid substitution in this specification, a conservative amino acid substitution is preferred. Conservative amino acid substitution refers to a substitution that occurs within a group of amino acids related to amino acid side chains. Preferred amino acid groups are as follows: an acidic group (aspartic acid and glutamic acid); a basic group (lysine, arginine, and histidine); a non-polar group (alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, and tryptophan); and an uncharged polar family (glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine, and tyrosine). More preferred amino acid groups are as follows: an aliphatic hydroxy group (serine and threonine); an amide containing group (asparagine and glutamine); an aliphatic group (alanine, valine, leucine, and isoleucine); and an aromatic group (phenylalanine, tryptophan, and tyrosine). Such amino acid substitution is preferably performed within a range that does not impair the properties of a substance having the original amino acid sequence.
[00172] Como um anticorpo que tem uma combinação preferida de uma combinação preferida de uma cadeia pesada e uma cadeia leve descrita acima, um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada com-preendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de ami- noácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 13; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 14; um anticorpo consistindo em a cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 15; um anticorpo consistindo em a cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 16; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo a região variável de cadeia pesa-da consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resí-duos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 17; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo a região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de ami- noácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compre-endendo a região variável de cadeia pesada consistindo em uma se-quência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 19; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 13; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variá-vel de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 14; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 15; e um anticorpo consistindo em uma ca-deia pesada compreendendo uma região variável de cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve com-preendendo uma região variável de cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 de SEQ ID NO: 16 pode ser exemplificado.As an antibody having a preferred combination of a preferred combination of a heavy chain and a light chain described above, an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of a sequence of amino acid consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 14; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of a sequence of amino acid consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 15; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of a sequence of amino acid consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 16; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO:9 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of at an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 17; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO:9 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of a amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO:9 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of at an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 19; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of a sequence of amino acid consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of a amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 14; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of a sequence of amino acid consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 15; and an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 16 can be exemplified.
[00173] Além disso, como um anticorpo que tem uma combinação mais preferida de uma cadeia pesada e uma cadeia leve descrita acima, um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma se-quência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 13; um anticorpo consistindo em uma cadeia pe-sada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 14; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consis-tindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 15; um an-ticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma se-quência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequên- cia de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 16; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada con-sistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de amino- ácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 17; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consis-tindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de amino- ácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 19; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 13; um anticorpo consistindo em uma cadeia pe-sada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 14; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de ami- noácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoá- cido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 15; e um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 471 de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 233 de SEQ ID NO: 16 pode ser exemplificado.[00173] Furthermore, as an antibody having a more preferred combination of a heavy chain and a light chain described above, an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 14; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 15; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 16; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 17; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 19; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 14; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 15; and an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: : 16 can be exemplified.
[00174] Além disso, como um anticorpo que tem outra combinação mais preferida de uma cadeia pesada e uma cadeia leve descrita aci-ma, um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma se-quência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistin-do em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16; um anticorpo consistindo em uma ca-deia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoáci- do de SEQ ID NO: 17; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesa-da consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada con-sistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13; um anticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve con-sistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14; um an- ticorpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma se-quência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consis-tindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15; e um anti-corpo consistindo em uma cadeia pesada consistindo em uma se-quência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 e uma cadeia leve consis-tindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 pode ser exemplificado.[00174] Furthermore, as an antibody having another more preferred combination of a heavy chain and a light chain described above, an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a chain light consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; and an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 can be exemplified.
[00175] Combinando-se uma sequência tendo uma alta homologia com a sequência de aminoácido de cadeia pesada acima descrita com uma sequência tendo uma alta homologia com a sequência de amino- ácido de cadeia leve acima descrita, é possível selecionar um anticorpo tendo a atividade citotóxica equivalente àquela de cada dos anticorpos acima descritos. Tal homologia é geralmente uma homologia de 80% ou mais, preferivelmente uma homologia de 90% ou mais, mais preferivelmente uma homologia de 95% ou mais, mais preferivelmente uma homologia de 99% ou mais. Além disso, combinando-se uma sequência de aminoácido em que um a diversos resíduos de aminoácido são substituídos, deletados ou adicionados na sequência de aminoácido de cadeia pesada ou cadeia leve, é também possível selecionar um anticorpo tendo uma atividade citotóxica equivalente àquela de cada um dos anticorpos acima descritos.By combining a sequence having a high homology to the above-described heavy chain amino acid sequence with a sequence having a high homology to the above-described light chain amino acid sequence, it is possible to select an antibody having the activity cytotoxic equivalent to that of each of the above-described antibodies. Such homology is generally 80% or greater homology, preferably 90% or greater homology, more preferably 95% or greater homology, most preferably 99% or greater homology. Furthermore, by combining an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are substituted, deleted or added to the heavy chain or light chain amino acid sequence, it is also possible to select an antibody having a cytotoxic activity equivalent to that of each. of the antibodies described above.
[00176] A homologia entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando parâmetros padrões de algorítmo Blast versão 2,2,2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, e David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). O al- gorítmo Blast pode ser usado também através da Internet acessando o site www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.The homology between two amino acid sequences can be determined using standard parameters of the Blast version 2.2.2 algorithm (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller , and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). The Blast algorithm can also be used over the Internet by accessing www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.
[00177] Na sequência de aminoácido de cadeia pesada representa- da pela SEQ ID NO: 9, 10, 11 ou 12 na Listagem de Sequência, uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 1 a 19 é uma sequência sinal, uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 20 a 141 é uma região variável, e uma se-quência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 142 a 471 é uma região constante. As sequências de SEQ ID NO: 9, 10, 11 e 12 são mostradas nas Figs. 3, 4, 5 e 6 respectivamente.[00177] In the heavy chain amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, 10, 11 or 12 in the Sequence Listing, an amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 19 is a signal sequence, a sequence of amino acid consisting of amino acid residues 20 to 141 is a variable region, and an amino acid sequence consisting of amino acid residues 142 to 471 is a constant region. The sequences of SEQ ID NO: 9, 10, 11 and 12 are shown in Figs. 3, 4, 5 and 6 respectively.
[00178] Além disso, na sequência de aminoácido de cadeia leve representada pela SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 na Lista-gem de Sequência, uma sequência de aminoácido consistindo em re-síduos de aminoácido 1 a 20 é uma sequência sinal, uma sequência de aminoácido consistindo em resíduos de aminoácido 21 a 128 é uma região variável, e uma sequência de aminoácido consistindo em resí-duos de aminoácido 129 a 233 é uma região constante. As sequências de SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19 são mostradas na figura 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13 respectivamente.Furthermore, in the light chain amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 or 19 in the Sequence Listing, an amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 20 is a signal sequence, an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 is a variable region, and an amino acid sequence consisting of amino acid residues 129 to 233 is a constant region. The sequences of SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 and 19 are shown in Figure 7, 8, 9, 10, 11, 12 and 13 respectively.
[00179] Além disso, o anticorpo da invenção inclui um anticorpo humano que se liga ao mesmo epítopo como o anticorpo M30. Um an-ticorpo humano anti-B7-H3 refere-se a um anticorpo humano tendo apenas uma sequência de um anticorpo derivado de um cromossoma humano. O anticorpo humano anti-B7-H3 pode ser obtido por um mé-todo usando um camundongo produtor de anticorpo humano, tendo um fragmento de cromossoma humano compreendendo genes de cadeia leve e pesada de um anticorpo humano (ver Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic e Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. e Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, pp. 722-727, etc.).[00179] Furthermore, the antibody of the invention includes a human antibody that binds to the same epitope as the M30 antibody. An anti-B7-H3 human antibody refers to a human antibody having only one sequence of an antibody derived from a human chromosome. The anti-B7-H3 human antibody can be obtained by a method using a human antibody-producing mouse having a human chromosome fragment comprising light and heavy chain genes from a human antibody (see Tomizuka, K. et al. , Nature Genetics (1997) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol 10, pp 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, pp. 722-727, etc.).
[00180] Tal camundongo produtor de anticorpo humano pode ser criado especificamente como segue. Um animal geneticamente modifi-cado em que locos de gene de cadeia leve e pesada de imunoglobuli- na endógena foram rompidos, e em vez disso, locos de gene de cadeia leve e pesada de imunoglobulina humana foram introduzidos por meio de um vetor de cromossoma artificial de levedura (YAC) ou similares, é criado produzindo um animal nocaute e um animal transgênico e acasalando estes animais.[00180] Such a human antibody-producing mouse can be specifically bred as follows. A genetically modified animal in which endogenous immunoglobulin light and heavy chain gene loci have been disrupted, and instead, human immunoglobulin light and heavy chain gene loci have been introduced via an artificial chromosome vector yeast (YAC) or similar, is bred by producing a knockout animal and a transgenic animal and mating these animals.
[00181] Além disso, de acordo com uma técnica de DNA recombi- nante, usando cDNAs codificando cada de tal cadeia pesada e cadeia leve de um anticorpo humano, e preferivelmente um vetor compreen-dendo tais cDNAs, células eucarióticas são transformadas, e uma cé-lula transformante que produz um anticorpo humano monoclonal re- combinante é cultivada, por meio da qual o anticorpo pode também ser obtido a partir do sobrenandante de cultura.[00181] Furthermore, according to a recombinant DNA technique, using cDNAs encoding each of such a human antibody heavy chain and light chain, and preferably a vector comprising such cDNAs, eukaryotic cells are transformed, and a The transforming cell producing a recombinant monoclonal human antibody is cultured, whereby the antibody can also be obtained from the culture supernatant.
[00182] Aqui, como o hospedeiro, por exemplo, células eucarióticas, preferivelmente células mamíferas tais como células CHO, linfócitos, ou células de mieloma podem ser usadas.Here, as the host, for example, eukaryotic cells, preferably mammalian cells such as CHO cells, lymphocytes, or myeloma cells can be used.
[00183] Além disso, um método de obtenção de um anticorpo humano derivado de exibição de fago selecionado de uma biblioteca de anticorpo humano (ver Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthal-mology & Visual Science. (2002) 43 (7), pp. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), pp. 189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), pp. 427-431, etc.) é também conhecido.[00183] Furthermore, a method of obtaining a human antibody derived from phage display selected from a human antibody library (see Wormstone, IM et al., Investigative Ophthal-mology & Visual Science. (2002) 43 (7) , pp. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), pp. 189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 ( 3), pp. 427-431, etc.) is also known.
[00184] Por exemplo, um método de exibição de fago em que uma região variável de um anticorpo humano é expressa sobre a superfície de um fago como um anticorpo de cadeia simples (scFv), e um fago que se liga a um antígeno é selecionado (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1105-1116) pode ser usado.[00184] For example, a phage display method in which a variable region of a human antibody is expressed on the surface of a phage as a single chain antibody (scFv), and a phage that binds to an antigen is selected (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1105-1116) can be used.
[00185] Analisando o gene do fago selecionado com base na liga- ção a um antígeno, uma sequência de DNA codificando a região variá-vel de um anticorpo humano que se liga a um antígeno pode ser de-terminada.[00185] By analyzing the selected phage gene based on binding to an antigen, a DNA sequence encoding the variable region of a human antibody that binds to an antigen can be determined.
[00186] Se a sequência de DNA de scFv que se liga a um antígeno é determinada, um anticorpo humano pode ser obtido preparando-se um vetor de expressão compreendendo a sequência e introduzindo o vetor em um hospedeiro apropriado para expressá-lo (WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, pp. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), pp. 1105-1116).[00186] If the scFv DNA sequence that binds to an antigen is determined, a human antibody can be obtained by preparing an expression vector comprising the sequence and introducing the vector into an appropriate host to express it (WO 92 /01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, pp. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23(9), pp. 1105-1116).
[00187] Se um anticorpo humano recentemente produzido liga-se a um peptídeo parcial ou uma estrutura terciária parcial à qual o anticorpo M30 liga-se, pode ser determinado que o anticorpo humano liga-se ao mesmo epítopo como o anticorpo M30. Além disso, confirmando que o anticorpo humano competes com o anticorpo M30 para o que se liga a B7-H3 (isto é, o anticorpo humano inibe a ligação entre o anticorpo M30 e B7-H3), pode ser determinado que o anticorpo humano liga-se ao mesmo epítopo como o anticorpo M30 mesmo se a estrutura ou sequência de epítopo específica não foi determinada. Quando é confirmado que o anticorpo humano liga-se ao mesmo epítopo que o anticorpo M30, o anticorpo humano é fortemente acreditado ter uma atividade citotóxica equivalente àquela do anticorpo M30.[00187] If a newly produced human antibody binds to a partial peptide or a partial tertiary structure to which the M30 antibody binds, it can be determined that the human antibody binds to the same epitope as the M30 antibody. Furthermore, by confirming that the human antibody competes with the M30 antibody for what binds to B7-H3 (i.e., the human antibody inhibits the binding between the M30 antibody and B7-H3), it can be determined that the human antibody binds to the same epitope as the M30 antibody even if the structure or specific epitope sequence has not been determined. When it is confirmed that the human antibody binds to the same epitope as the M30 antibody, the human antibody is strongly believed to have a cytotoxic activity equivalent to that of the M30 antibody.
[00188] Os anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, ou an-ticorpos humanos obtidos pelo método acima descrito são avaliados quanto a propriedade de ligação a um antígeno por um método conhe-cido ou similar, e um anticorpo pode ser selecionado.[00188] Chimeric antibodies, humanized antibodies, or human antibodies obtained by the above-described method are evaluated for the binding property to an antigen by a known or similar method, and an antibody can be selected.
[00189] Como um exemplo de outro índice para uso na comparação das propriedades de anticorpos, a estabilidade de anticorpos pode ser exemplificada. A calorimetria de varredura diferencial (DSC) é um dis-positivo capaz de rapidamente e precisamente medir uma temperatura de ponto médio de desnaturação térmica (Tm) a ser usada como um índice favorável da estabilidade conformacional relativa de proteínas. Medindo-se os valores Tm usando DSC e comparando-se os valores, uma diferença em estabilidade térmica pode ser comparada. É conhe-cido que a estabilidade de armazenagem de anticorpos mostra alguma correlação com a estabilidade térmica de anticorpos (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, pp. 265273), e um anticorpo preferido pode ser selecionado usando a estabilidade térmica como um índice. Exemplos de outros índices para seleção de anticorpos incluem os seguintes aspectos: a produção em uma célula hospedeira apropriada é elevada; e a agregabilidade em uma solução aquosa é baixa. Por exemplo, um anticorpo que mostra a maior produção nem sempre mostra a maior estabilidade térmica, e, portanto, é necessário selecionar um anticorpo mais adequado para a administração a humanos fazendo avaliação abrangente com base nos índices acima descritos.[00189] As an example of another index for use in comparing the properties of antibodies, the stability of antibodies can be exemplified. Differential Scanning Calorimetry (DSC) is a device capable of quickly and accurately measuring a midpoint temperature of thermal denaturation (Tm) to be used as a favorable index of the relative conformational stability of proteins. By measuring the Tm values using DSC and comparing the values, a difference in thermal stability can be compared. It is known that the storage stability of antibodies shows some correlation with the thermal stability of antibodies (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, pp. 265273), and a preferred antibody can be selected using thermal stability as an index. Examples of other indices for selecting antibodies include the following aspects: production in an appropriate host cell is high; and the aggregability in an aqueous solution is low. For example, an antibody that shows the highest production does not always show the greatest thermal stability, and therefore it is necessary to select an antibody most suitable for administration to humans by making a comprehensive evaluation based on the indices described above.
[00190] Na invenção, uma variante modificada do anticorpo é também incluída. A variante modificada refere-se a uma variante obtida submetendo-se o anticorpo da invenção à modificação química ou bio-lógica. Exemplos da variante quimicamente modificada incluem varian-tes quimicamente modificadas ligando-se a uma porção química a um esqueleto de aminoácido, variantes quimicamente modificadas com uma cadeia de carboidrato ligada a N ou ligada a O, etc. Exemplos da variante biologicamente modificada incluem variantes obtidas por mo-dificação pós-translacional (tais como glicosilação ligada a N ou ligada a O, processamento de terminal N ou C, desamidação, isomerização de ácido aspártico, ou oxidação de metionina), e variantes em que um resíduo de metionina foi adicionado à terminação N que é expressa em uma célula hospedeira procariótica.[00190] In the invention, a modified variant of the antibody is also included. Modified variant refers to a variant obtained by subjecting the antibody of the invention to chemical or biological modification. Examples of the chemically modified variant include chemically modified variants linking a chemical moiety to an amino acid backbone, chemically modified variants having an N-linked or O-linked carbohydrate chain, etc. Examples of the biologically modified variant include variants obtained by post-translational modification (such as N-linked or O-linked glycosylation, N- or C-terminal processing, deamidation, aspartic acid isomerization, or methionine oxidation), and variants in that a methionine residue has been added to the N-terminus that is expressed in a prokaryotic host cell.
[00191] Além disso, um anticorpo rotulado a fim de possibilitar a de- tecção ou isolação do anticorpo ou um antígeno da invenção, por exemplo, um anticorpo rotulado por enzima, um anticorpo rotulado por fluorescência, e um anticorpo rotulado por afinidade são também incluídos no significado de variante modificada. Tal variante modificada do anticorpo da invenção é útil para melhorar a estabilidade e retenção sanguínea do anticorpo original da invenção, reduzindo a antigenicidade do mesmo, detectando ou isolando tal anticorpo ou antígeno, e assim por diante.[00191] Furthermore, an antibody labeled in order to enable detection or isolation of the antibody or an antigen of the invention, for example, an enzyme-labeled antibody, a fluorescent-labeled antibody, and an affinity-labeled antibody are also included in the meaning of modified variant. Such a modified variant of the antibody of the invention is useful for improving the stability and blood retention of the original antibody of the invention, reducing the antigenicity thereof, detecting or isolating such antibody or antigen, and so on.
[00192] Além disso, regulando a modificação de um glicano que é ligado ao anticorpo da invenção (glicosilação, desfucosilação, etc.), é possível realçar uma atividade citotóxica celular dependente do anti-corpo. Como a técnica para a regulação da modificação de um glicano de anticorpos, WO 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31140, etc. são conhecidos. Entretanto, a técnica não está limitada a eles. No anticorpo da invenção, um anticorpo, em que a modificação de um glicano é regulada, é também incluído.[00192] Furthermore, by regulating the modification of a glycan that is bound to the antibody of the invention (glycosylation, defucosylation, etc.), it is possible to enhance an antibody-dependent cellular cytotoxic activity. As the technique for regulating the modification of an antibody glycan, WO 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31140, etc. They are known. However, the technique is not limited to them. In the antibody of the invention, an antibody, in which modification of a glycan is regulated, is also included.
[00193] No caso onde um anticorpo é produzido primeiro isolando um gene de anticorpo e em seguida introduzindo o gene em um hospedeiro apropriado, uma combinação de um hospedeiro apropriado e um vetor de expressão apropriado pode ser usada. Exemplos específicos do gene de anticorpo incluem uma combinação de um gene codificando uma sequência de cadeia pesada de um anticorpo descrita nesta especificação e um gene codificando uma sequência de cadeia leve da mesma. Quando uma célula hospedeira é transformada, é possível inserir o gene de sequência de cadeia pesada e o gene de sequência de cadeia leve no mesmo vetor de expressãor, e também em diferentes vetores de expressão separadamente.[00193] In the case where an antibody is produced by first isolating an antibody gene and then introducing the gene into an appropriate host, a combination of an appropriate host and an appropriate expression vector can be used. Specific examples of the antibody gene include a combination of a gene encoding a heavy chain sequence of an antibody described in this specification and a gene encoding a light chain sequence thereof. When a host cell is transformed, it is possible to insert the heavy chain sequence gene and the light chain sequence gene into the same expression vector, and also into different expression vectors separately.
[00194] No caso onde células eucarióticas são usadas como o hos-pedeiro, células animais, células de planta, e microorganismos euca- rióticos podem ser usados. Como as células animais, células mamífe-ras, por exemplo, células COS de símios (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos murinos NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), e linhagens deficientes de di-hidrofolato redu- tase (Urlaub, G. e Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) de células de ovário de hamster chinês (Células CHO; ATCC: CCL-61) pode ser exemplificadas.[00194] In the case where eukaryotic cells are used as the host, animal cells, plant cells, and eukaryotic microorganisms can be used. Like animal cells, mammalian cells, e.g., simian COS cells (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), murine fibroblasts NIH3T3 (ATCC No. CRL -1658), and dihydrofolate reductase deficient lines (Urlaub, G. and Chasin, LA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) from hamster ovary cells Chinese (CHO cells; ATCC: CCL-61) can be exemplified.
[00195] No caso onde células procarióticas são usadas, por exemplo, Escherichia coli e Bacillus subtilis podem ser exemplificados.[00195] In the case where prokaryotic cells are used, for example, Escherichia coli and Bacillus subtilis can be exemplified.
[00196] Introduzindo-se um gene de anticorpo desejado nestas células por meio de transformação, e cultivando as células desse modo transformadas in vitro, o anticorpo pode ser obtido. No Método de cul-tura acima descrito, a produção pode algumas vezes variar, depen-dendo da sequência do anticorpo e, portanto, é possível selecionar um anticorpo que é facilmente produzido como um produto farmacêutico usando a produção como um índice entre os anticorpos tendo uma ati-vidade de ligação equivalente. Portanto, no anticorpo da invenção, um anticorpo obtido por um método de produção de um anticorpo, charac- terizado por incluir uma etapa de cultura da célula hospedeira trans-formada e uma etapa de coleção de um anticorpo desejado de um produto cultivado obtido na etapa de cultura é também incluída.By introducing a desired antibody gene into these cells by means of transformation, and culturing the thereby transformed cells in vitro, the antibody can be obtained. In the above-described Culture Method, production may sometimes vary depending on the antibody sequence and therefore it is possible to select an antibody that is easily produced as a pharmaceutical product using production as an index between antibodies having an equivalent binding activity. Therefore, in the antibody of the invention, an antibody obtained by a method of producing an antibody, characterized by including a step of culturing the trans-formed host cell and a step of collecting a desired antibody from a cultivated product obtained in the step of culture is also included.
[00197] Sabe-se que um resíduo de lisina na terminação carboxila da cadeia pesada de um anticorpo produzido em uma célula mamífera cultivada é deletado (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), e sabe-se também que dois resíduos de aminoácido (glicina e lisina) na terminação carboxila da cadeia pesada de um anticorpo pro-duzido em uma célula mamífera cultivada são deletados e um resíduo de prolina recentemente localizado na terminação carboxila é amidado (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Entretanto, tal deleção e modificação da sequência de cadeia pesada sequence não afeta a afi-nidade de ligação a antígeno e a função efetora (a ativação de um complemento, a citotoxicidade celular dependente do anticorpo, etc.) do anticorpo. Portanto, na invenção, um anticorpo submetido a tal mo-dificação é também incluído, e uma variante de deleção em que um ou dois aminoácidos foram deletados na terminação carboxila da cadeia pesada, a variante obtida por amidação da variante de deleção (por exemplo, a cadeia pesada em que o resíduo de prolina de terminal carboxila foi amidado), e similares podem ser exemplificadas. O tipo de variante de deleção tendo uma deleção na terminação carboxila da cadeia pesada do anticorpo de acordo com a invenção não é limitado às variantes acima, contanto que a afinidade de ligação a antígeno e a função efetora sejam conservadas. As duas cadeias pesadas de cons-tituição do anticorpo de acordo com a invenção podem ser de um tipo selecionado do grupo que consiste em uma cadeia pesada de tamanho natural e a variante de deleção acima descrita, ou podem ser de dois tipos em combinação selecionados delas. A relação da quantidade de cada variante de deleção pode ser afetada pelo tipo de células mamíferas cultivadas que produzem o anticorpo de acordo com a in-venção e as condições de cultura, entretanto, um caso onde um resí-duo de aminoácido na terminação carboxila foi deletado em ambas as cadeias pesadas contidas como componentes principais no anticorpo de acordo com a invenção pode ser exemplificado.[00197] A lysine residue at the carboxy terminus of the heavy chain of an antibody produced in a cultured mammalian cell is known to be deleted (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), and it is also known to two amino acid residues (glycine and lysine) at the carboxy terminus of the heavy chain of an antibody produced in a cultured mammalian cell are deleted and a proline residue newly located at the carboxy terminus is amidated (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 ( 2007)). However, such deletion and modification of the heavy chain sequence does not affect the antigen-binding affinity and effector function (activation of a complement, antibody-dependent cellular cytotoxicity, etc.) of the antibody. Therefore, in the invention, an antibody undergoing such modification is also included, and a deletion variant in which one or two amino acids have been deleted at the carboxy terminus of the heavy chain, the variant obtained by amidation of the deletion variant (e.g. the heavy chain in which the carboxyl-terminal proline residue has been amidated), and the like can be exemplified. The type of deletion variant having a deletion at the carboxy terminus of the antibody heavy chain according to the invention is not limited to the above variants, as long as the antigen-binding affinity and the effector function are conserved. The two constituent heavy chains of the antibody according to the invention may be of one type selected from the group consisting of a full-length heavy chain and the above-described deletion variant, or may be of two types in combination selected from them . The ratio of the amount of each deletion variant can be affected by the type of cultured mammalian cells that produce the antibody according to the invention and the culture conditions, however, a case where an amino acid residue at the carboxy terminus was deleted in both heavy chains contained as major components in the antibody according to the invention can be exemplified.
[00198] Como isótipo do anticorpo da invenção, por exemplo, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) pode ser exemplificado, e IgG1 ou IgG2 pode ser exemplificado preferivelmente.As the isotype of the antibody of the invention, for example, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) can be exemplified, and IgG1 or IgG2 can be exemplified preferably.
[00199] Como a função do anticorpo, geralmente uma atividade de ligação a antígeno, uma atividade de neutralização da atividade de um antígeno, uma atividade de realce da atividade de um antígeno, uma atividade de citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) e uma atividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) podem ser exemplificadas. A função do anticorpo da invenção é uma atividade de ligação a B7-H3, preferivelmente uma atividade de fagoci- tose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP), mais prefe-rivelmente uma atividade de citotoxicidade (atividade antitumor) para célula de tumor mediada por uma atividade de ADCP. Além disso, o anticorpo da invenção pode ter uma atividade ADCC e/ou uma ativida-de CDC em adição a uma atividade de ADCP.[00199] As the antibody function, generally an antigen-binding activity, an antigen-neutralizing activity, an antigen-enhancing activity, an antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity, and a complement dependent cytotoxicity (CDC) activity can be exemplified. The function of the antibody of the invention is a B7-H3 binding activity, preferably an antibody-dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP) activity, more preferably a tumor cell-mediated cytotoxicity activity (antitumor activity) by an ADCP activity. Furthermore, the antibody of the invention may have an ADCC activity and/or a CDC activity in addition to an ADCP activity.
[00200] O anticorpo obtido pode ser purificado para homogeneidade. A separação e purificação do anticorpo pode ser realizada empregando-se um método de separação e purificação de proteína convencional. Por exemplo, o anticorpo pode ser separado e purificado apro-priadamente selecionando e combinando cromatografia de coluna, fil-tração por filtro, ultrafiltração, precipitação de sal, diálise, eletroforese de gel de poliacrilamida preparativa, eletroforese por focagem isoelé- trica, e similares (Strategies for Proteína Purification and Characteriza-tion: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Ma-nual. Ed Harlow e David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), porém o método não está limitado a eles.The obtained antibody can be purified to homogeneity. Antibody separation and purification can be accomplished using a conventional protein separation and purification method. For example, the antibody can be separated and purified appropriately by selecting and combining column chromatography, filter filtration, ultrafiltration, salt precipitation, dialysis, preparative polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing electrophoresis, and the like (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), but the method is not limited to them.
[00201] Exemplos de tal cromatografia incluem cromatografia por afinidade, cromatografia por permuta de íon, cromatografia hidrofóbica, cromatografia por filtração de gel, cromatografia de fase reversa, e cromatografia por adsorção.Examples of such chromatography include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography.
[00202] Tal cromatografia pode ser realizada empregando-se cro- matografia líquida, tal como HPLC ou FPLC.Such chromatography can be performed employing liquid chromatography, such as HPLC or FPLC.
[00203] Como uma coluna a ser usada em cromatografia por afinidade, uma coluna de proteína A e uma coluna de proteína G podem ser exemplificadas. Por exemplo, como uma coluna usando uma coluna de proteína A, Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) e similares pode ser exemplificadas.As a column to be used in affinity chromatography, a protein A column and a protein G column can be exemplified. For example, as a column using a protein A column, Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) and the like can be exemplified.
[00204] Além disso, usando um veículo tendo um antígeno imobilizado nele, o anticorpo pode também ser purificado utilizando a propri- edade de ligação do anticorpo ao antígeno. Composto de antitumor[00204] Furthermore, using a vehicle having an antigen immobilized thereon, the antibody can also be purified using the binding property of the antibody to the antigen. Antitumor compound
[00205] O composto antitumor a ser conjugado ao conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção é explicado. O composto anti-tumor não é particularmente limitado se ele for um composto tendo um efeito antitumor e um grupo substituinte ou uma estrutura parcial per-mitindo a conecção a uma estrutura do ligante. Quando uma parte ou o ligante inteiro é clivado em células de tumor, a porção de composto antitumor é liberada para mostrar o efeito antitumor do composto anti-tumor. Quando o ligante é clivado em uma posição de conexão ao fármaco, o composto antitumor é liberado em sua estrutura intrínseca para exibir seu efeito antitumor intrínsico.The antitumor compound to be conjugated to the antibody-drug conjugate of the present invention is explained. The antitumor compound is not particularly limited if it is a compound having an antitumor effect and a substituent group or a partial structure allowing connection to a linker structure. When a part or the entire ligand is cleaved in tumor cells, the antitumor compound portion is released to show the antitumor effect of the antitumor compound. When the ligand is cleaved at a drug-binding position, the antitumor compound is released into its intrinsic structure to exhibit its intrinsic antitumor effect.
[00206] Exemplos do composto antitumor podem incluir doxorubici- na, daunorubicina, mitomicina C, bleomicina, ciclocitidina, vincristina, vinblastina, metotrexato, agente antitumor com base em platina (cis-platina ou derivados da mesmo), taxol ou derivatives do mesmo, e camptotecina ou derivatives da mesma (agente antitumor descrito na Patente Japonesa Depositada Aberta ao Público No. 6-87746). No conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção, exatecano co-mo um derivado de camptotecina (((1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3- di-hidro-9-hidróxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino [1,2-b]quinolina-10,13(9H,15H)-diona; mostrado na seguinte fórmula) pode ser preferivelmente usado. Fórmula 43
[00207] Embora tendo um excelente efeito antitumor, exatecano não foi comercializado como um fármaco antitumor. O composto pode ser facilmente obtido por um método conhecido e o grupo amino na posição 1 pode ser preferivelmente usado como a posição de conexão à estrutura do ligante. Além disso, embora o exatecano possa ser também liberado em células de tumor, enquanto parte do ligante está ainda ligado a ela, ele é um excelente composto que exibe um exce-lente efeito antitumor mesmo em tal caso.[00207] Although having an excellent antitumor effect, exatecan has not been marketed as an antitumor drug. The compound can be easily obtained by a known method and the amino group at position 1 can preferably be used as the position of attachment to the linker structure. Furthermore, although exatecan can also be released into tumor cells while part of the ligand is still bound to it, it is an excellent compound that exhibits an excellent antitumor effect even in such a case.
[00208] Com respeito ao conjugado de anticorpo-fármaco, o número de moléculas de fármaco conjugado por molécula de anticorpo é um fator essencial que tem uma influência sobre a eficácia e segurança. A produção do conjugado de anticorpo-fármaco é realizada definindo-se a condição de reação incluindo as quantidades de uso de materiais brutos e reagentes para a reação, a fim de ter um número constante de moléculas de fármaco conjugado, uma mistura contendo diferentes números de moléculas de fármaco conjugado é geralmente obtido ao contrário da reação química de um composto de baixo peso molecular. O número de fármacos conjugados em uma molécula de anticorpo é expresso ou especificado pelo valor médio, isto é, o número médio de moléculas de fármaco conjugado. A menos que especificamente des-crito de outro modo como um princípio, o número de moléculas de fármaco conjugado significa um valor médio, exceto em um caso em que ele representa um conjugado de anticorpo-fármaco tendo um nú-mero específico de moléculas de fármaco conjugado que é incluído em uma mistura de conjugado de anticorpo-fármaco tendo diferente núme-ro de moléculas de fármaco conjugado. O número de moléculas de exatecano conjugadas a uma molécula de anticorpo é controlável, e como um número médio de moléculas de fármaco conjugado por anti-corpo, cerca de 1 a 10 exatecanos podem estar ligados. Preferivel-mente, é 2 a 8, e mais preferivelmente 3 a 8. Entretanto, uma pessoa versada na técnica pode planejar uma reação para conjugar um núme-ro requerido de moléculas de fármaco a uma molécula de anticorpo com base na descrição dos exemplos do presente pedido e pode obter um anticorpo conjugado com um número controlado de moléculas de exatecano.[00208] With respect to the antibody-drug conjugate, the number of conjugated drug molecules per antibody molecule is an essential factor that has an influence on the efficacy and safety. The production of the antibody-drug conjugate is carried out by defining the reaction condition including the amounts of use of raw materials and reagents for the reaction, in order to have a constant number of conjugated drug molecules, a mixture containing different numbers of Conjugated drug molecules is usually obtained unlike the chemical reaction of a low molecular weight compound. The number of drugs conjugated to an antibody molecule is expressed or specified by the mean value, that is, the average number of drug molecules conjugated. Unless specifically described otherwise as a principle, the number of conjugated drug molecules means an average value, except in a case where it represents an antibody-drug conjugate having a specific number of drug molecules conjugate that is included in an antibody-drug conjugate mixture having different number of conjugate drug molecules. The number of exatecan molecules conjugated to an antibody molecule is controllable, and as an average number of conjugated drug molecules per antibody, about 1 to 10 exatecans can be bound. Preferably, it is 2 to 8, and more preferably 3 to 8. However, a person skilled in the art can design a reaction to conjugate a required number of drug molecules to an antibody molecule based on the description of the examples in present application and can obtain an antibody conjugated to a controlled number of exatecan molecules.
[00209] Por que o exatecano tem uma estrutura de camptotecina, sabe-se que o equilíbrio muda para uma estrutura com um anel de lactona fechado (anel fechado) em um meio acídico aquoso (por exemplo, pH 3 aproximadamente) porém ele muda para uma estrutura com um anel de lactona aberto (anel aberto) em um meio básico aquoso (por exemplo, pH 10 ou aproximadamente). Um conjugado de fármaco sendo introduzido com um resíduo de exatecano corresponde à estrutura de anel fechado e a estrutura de anel aberto é também acreditada ter o mesmo efeito antitumor e é desnecessário dizer que qualquer uma delas inclui-se no escopo da presente invenção.[00209] Because exatecan has a camptothecin structure, it is known that the equilibrium changes to a structure with a closed lactone ring (closed ring) in an aqueous acidic medium (eg pH 3 approximately) but it changes to a structure with an open lactone ring (open ring) in a basic aqueous medium (eg pH 10 or so). A drug conjugate being introduced with an exatecan residue corresponds to the closed ring structure and the open ring structure is also believed to have the same antitumor effect and it goes without saying that either of them falls within the scope of the present invention.
[00210] Estrutura de ligante[00210] Binder Structure
[00211] No que diz respeito ao conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção, a estrutura de ligante para conjugar um fármaco antitumor ao anticorpo é explicada. O ligante tem uma estrutura da se-guinte estrutura: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-.With respect to the antibody-drug conjugate of the present invention, the linker structure for conjugating an antitumor drug to the antibody is explained. The linker has a structure of the following structure: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-.
[00212] O anticorpo é conectado ao terminal de L1 (terminal oposto à conexão a L2), e o fármaco antitumor é conectado ao terminal de Lc (terminal oposto à conexão a Lb).[00212] The antibody is connected to the terminal of L1 (terminal opposite the connection to L2), and the antitumor drug is connected to the terminal of Lc (terminal opposite the connection to Lb).
[00213] n1 representa um número inteiro de 0 a 6 e é preferivelmente um número inteiro de 1 a 5, e mais preferivelmente 1 a 3. 1. L1[00213] n1 represents an integer from 0 to 6 and is preferably an integer from 1 to 5, and more preferably 1 to 3. 1. L1
[00214] L1 é uma porção no ligante representado pela seguinte es-trutura: - (Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-, - CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-, - C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-, ou - C(=O)-(CH2)n4-C(=O)- No acima, n2 é um número inteiro de 2 a 8, n3 é um número inteiro de 1 a 8, e n4 é um número inteiro de 1 a 8.[00214] L1 is a moiety in the linker represented by the following structure: - (Succinimid-3-yl-N)-(CH2)n2-C(=O)-, - CH2-C(=O)-NH- (CH2)n3-C(=O)-, - C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-, or - C(=O)-( CH2)n4-C(=O)- In the above, n2 is an integer from 2 to 8, n3 is an integer from 1 to 8, and n4 is an integer from 1 to 8.
[00215] No ligante tendo uma estrutura representada por - (Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)- de L1, "-(Succinimid-3-il-N)-" tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 44
[00216] Posição 3 da estrutura parcial acima é a posição de conexão ao anticorpo. A ligação ao anticorpo na posição 3 é caracterizada ligando-o com formação de tioéter. Por outro lado, o átomo de nitrogê-nio na posição 1 da porção de estrutura é conectado ao átomo de car-bono de metileno que está presente dentro do ligante incluindo a estru-tura. Especificamente, -(Succinimid-3-il-N)-(CH2)n2-C(=O)-L2- é uma estrutura representada pela fórmula a seguir (aqui, "anticorpo-S-" ori-gina-se de um anticorpo). Fórmula 45
[00217] Na fórmula, n2 é um número inteiro de 2 a 8, e preferivelmente 2 a 5.[00217] In the formula, n2 is an integer from 2 to 8, and preferably 2 to 5.
[00218] No ligante tendo uma estrutura representada por -CH2- C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)- de L1, n3 é um número inteiro de 1 a 8, pre-ferivelmente 2 a 6. Este ligante é conectado ao anticorpo no seu átomo de carbono de terminal metileno e tem a seguinte estrutura para cone-xão por formação de tioéter, como com o ligante anterior (aqui, "anti- corpo-S-" origina-se de um anticorpo). Anticorpo-S-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-L2-.[00218] In the linker having a structure represented by -CH2- C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)- of L1, n3 is an integer from 1 to 8, preferably 2 to 6. This ligand is connected to the antibody at its methylene terminal carbon atom and has the following structure for connection by thioether formation, as with the previous ligand (here, "antibody-S-" originates from an antibody). Antibody-S-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-L2-.
[00219] No ligante tendo uma estrutura representada por -C(=O)- cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- de L1, "-(N-li-3-diminiccuS)-" tem uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 46
[00220] Nesta porção de estrutura, o átomo de nitrogênio na posição 1 é conectado ao átomo de carbono de metileno presente na estrutura do ligante contendo esta estrutura. O átomo de carbono na posição 3 é conectado ao átomo de enxofre terminal de -S-(CH2)n6- C(=O)- de L2 no ligante. Esta porção -S-(CH2)n6-C(=O)- de L2 no ligan- te forma uma estrutura de ligante combinada somente com -C(=O)- cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- de L1 no ligante. No acima, "- cic.Hex(1,4)-" contido no ligante representa um grupo 1,4-ciclo- hexileno. No ligante, -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- é conectado ao anticorpo com ligação de formação de amida em seu carbono de carbonila terminal (aqui, "anticorpo-NH-" origina-se de um anticorpo). Fórmula 47
[00221] O grupo amino do anticorpo para esta ligação de formação de amida é o grupo amino terminal de uma cadeia lateral de um resíduo de lisina no anticorpo ou um grupo amino no terminal N do anticorpo. Referido ligante de uma estrutura pode conectar-se formando ligação de éster com o grupo hidróxi de um aminoácido no anticorpo exceto tal ligação de amida.[00221] The antibody amino group for this amide-forming bond is the terminal amino group of a side chain of a lysine residue in the antibody or an amino group at the N-terminus of the antibody. Such a linker of a structure may connect by forming an ester bond with the hydroxy group of an amino acid on the antibody other than such an amide bond.
[00222] A porção de estrutura "-cic.Hex(1,4)-" contida em referido ligante pode ser um grupo alquileno cíclico saturado divalente exceto o grupo 1,4-ciclo-hexileno, isto é, um grupo hidrocarboneto saturado cí-clico divalente tais como um grupo ciclobutileno, um grupo ciclopenti- leno, um grupo cicloeptaleno, ou um grupo ciclooctaleno, um grupo hidrocarboneto aromático divalente tais como um grupo fenileno ou um grupo naftileno, ou um grupo heterocíclico divalente saturado de 5 ou 6 membros, parcialmente saturado, aromático contendo 1 ou 2 heteroá- tomos. Alternativamente, esta porção pode ser um grupo alquileno di-valente tendo 1 a 4 átomos de carbono. A conexão ao grupo divalente pode ocorrer em posições adjacentes ou em posições distantes.[00222] The structure portion "-cic.Hex(1,4)-" contained in said linker may be a divalent saturated cyclic alkylene group except for the 1,4-cyclohexylene group, i.e., a cyclic saturated hydrocarbon group. -divalent cyclic such as a cyclobutylene group, a cyclopentylene group, a cycloeptalene group, or a cyclooctalene group, a divalent aromatic hydrocarbon group such as a phenylene group or a naphthylene group, or a 5- or 6-membered saturated divalent heterocyclic group , partially saturated, aromatic containing 1 or 2 heteroatoms. Alternatively, this moiety can be a divalent alkylene group having 1 to 4 carbon atoms. Connection to the divalent group can take place at adjacent positions or at distant positions.
[00223] No ligante tendo uma estrutura representada por -C(=O)- (CH2)n4-C(=O)- como L1, n4 é um número inteiro de 1 a 8, e preferivel-mente 2 a 6. Este ligante é também conectado por ligação de formação de amida em seu grupo carbonila terminal com um grupo amino do anticorpo, como com os ligantees mencionados acima (ver a seguinte fórmula; na estrutura do mesmo, "anticorpo-NH-" origina-se de um anticorpo). Anticorpo-NH-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-L2-.[00223] In the ligand having a structure represented by -C(=O)- (CH2)n4-C(=O)- as L1, n4 is an integer from 1 to 8, and preferably 2 to 6. This linker is also connected by amide forming bond at its terminal carbonyl group with an amino group of the antibody, as with the linkers mentioned above (see the following formula; in the structure thereof, "antibody-NH-" originates from an antibody). Antibody-NH-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-L2-.
[00224] Exemplos específicos de L1 no ligante podem incluir -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- - CH2C(=O)NH-CH2-C(=O)-, - CH2C(=O)NH-CH2CH2-C(=O)- - CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2-C(=O)- - CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- - CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- -C(=O)-Aril-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- - C(=O)-cic.Het-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- - C(=O)-CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-. (Arila representa um grupo hidrocarboneto aromático divalente, e cic.Het representa um grupo heterocíclcio cíclico divalente). 2. L2[00224] Specific examples of L1 in the linker may include -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2-C(=O)- - (Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- - CH2C(=O)NH-CH2-C(= O)-, - CH2C(=O)NH-CH2CH2-C(=O)- - CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2-C(=O)- - CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O) )- - CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- -C(= O)-Aryl-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- - C(=O)-cic.Het-CH2-(N-li-3-diminiccuS)- - C(=O)-CH2CH2-C (=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- - C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-. (Aryl represents a divalent aromatic hydrocarbon group, and cic.Het represents a divalent cyclic heterocyclic group). 2. L2
[00225] L2 é um ligante representado pela seguinte estrutura: -NH-(CH2CH2O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, ou -S-(CH2)n6-C(=O)-, L2 pode não estar presente, e em um tal caso, L2 é uma ligação sim-ples. No acima, n5 é um número inteiro de 1 a 6, e n6 é um número in-teiro de 1 a 6.[00225] L2 is a ligand represented by the following structure: -NH-(CH2CH2O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, or -S-(CH2)n6-C(=O)-, L2 may not be present, and in such a case, L2 is a simple binding. In the above, n5 is an integer from 1 to 6, and n6 is an integer from 1 to 6.
[00226] No ligante tendo uma estrutura de -NH-(CH2CH2O)n5-CH2- CH2-C(=O)- como L2, n5 é um número inteiro de 1 a 6, e preferivelmen-te 2 a 4. Esta porção no ligante é conectada a L1 em seu grupo amino terminal e é conectada a LP em seu grupo carbonila no outro terminal.In the linker having a structure of -NH-(CH2CH2O)n5-CH2-CH2-C(=O)- as L2, n5 is an integer from 1 to 6, and preferably 2 to 4. This portion in the linker it is connected to L1 at its terminal amino group and it is connected to LP at its carbonyl group at the other terminus.
[00227] No ligante tendo uma estrutura de -S-(CH2)n6-C(=O)- como L2, n6 é um número inteiro de 1 a 6, e preferivelmente 2 a 4.[00227] In the linker having a structure of -S-(CH2)n6-C(=O)- as L2, n6 is an integer from 1 to 6, and preferably 2 to 4.
[00228] Exemplos específicos de L2 podem incluir -NH-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-, -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-.[00228] Specific examples of L2 may include -NH-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-, -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-.
[00229] Quando L2 for -S-(CH2)n6-C(=O)-, L1 para ser combinado com isso é -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-. Exemplos específicos de -L1-L2- podem incluir -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S- CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-. 3. LP[00229] When L2 is -S-(CH2)n6-C(=O)-, L1 to be combined with that is -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li -3-diminiccuS)-. Specific examples of -L1-L2- may include -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2-C(=O)- -C (=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4) )-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS) )-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-Hi-3-diminiccuS)-S-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-. 3. LP
[00230] O ligante LP é um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoácidos. Especificamente, ele consiste em um resíduo de oli- gopeptídeo em que 2 a 6 aminoácidos são ligados por uma ligação de peptídeo. O ligante LP é conectado a L2 em seu terminal N e é conec-tado ao grupo amino de porção de -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- do ligante em seu terminal C. O aminoácido constituindo LP no ligante não é particu-larmente limitado, entretanto, exemplos do mesmo incluem um amino- ácido L ou D, preferivelmente um aminoácido L. E, ele pode ser um aminoácido tendo uma estrutura tais como β-alanina, ácido ε- aminocaproico, ou ácido y-aminobutírico além de um a-aminoácido, além disso, ele pode ser um aminoácido de tipo não natural tal como aminoácido N-metilado.[00230] The LP linker is a peptide residue consisting of 2 to 7 amino acids. Specifically, it consists of an oligopeptide residue in which 2 to 6 amino acids are linked by a peptide bond. The LP linker is connected to L2 at its N terminus and is connected to the amino group of the -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- portion of the linker at its C terminus. is particularly limited, however, examples thereof include an L or D amino acid, preferably an L amino acid. And, it may be an amino acid having a structure such as β-alanine, ε-aminocaproic acid, or y- acid. aminobutyric in addition to an α-amino acid, moreover, it may be an unnatural type amino acid such as N-methylated amino acid.
[00231] A sequência de aminoácido de LP não é particularmente limitada, porém exemplos do aminoácido constituinte incluem fenilala- nina (Phe; F), tirosina (Tyr; Y), leucina (Leu; L), glicina (Gly; G), alanina (Ala; A), valina (Val; V), lisina (Lys; K), citrulina (Cit), serina (Ser; S), ácido glutâmico (Glu; E), e ácido aspártico (Asp; D). Entre eles, exem-plos preferidos incluem fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, se- rina, ácido glutâmico, e ácido aspártico. Dependendo do tipo do ami- noácido, o padrão de liberação de fármaco pode ser controlado. O número do aminoácido pode ser entre 2 a 7.[00231] The amino acid sequence of LP is not particularly limited, but examples of the constituent amino acid include phenylalanine (Phe; F), tyrosine (Tyr; Y), leucine (Leu; L), glycine (Gly; G), alanine (Ala; A), valine (Val; V), lysine (Lys; K), citrulline (Cit), serine (Ser; S), glutamic acid (Glu; E), and aspartic acid (Asp; D). Among them, preferred examples include phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid, and aspartic acid. Depending on the type of amino acid, the drug release pattern can be controlled. The amino acid number can be between 2 to 7.
[00232] Exemplos específicos de LP podem incluir -GGF- -DGGF- -(D-)D-GGF- -EGGF- -GGFG- -SGGF- -KGGF- -DGGFG- -GGFGG- -DDGGFG- -KDGGFG- -GGFGGGF- [no acima, "(D-)D" representa um ácido D-aspártico].[00232] Specific examples of LP may include -GGF- -DGGF- -(D-)D-GGF- -EGGF- -GGFG- -SGGF- -KGGF- -DGGFG- -GGFGG- -DDGGFG- -KDGGFG- -GGFGGGF - [in the above, "(D-)D" represents a D-aspartic acid].
[00233] Particularmente exemplos preferidos de LP para o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção podem incluir -GGFG-.Particularly preferred examples of LP for the antibody-drug conjugate of the present invention may include -GGFG-.
[00234] Na estrutura representada por -NH-(CH2)n1- dentro do li- gante, n1 é um número inteiro de 0 a 6 e é preferivelmente um número inteiro de 1 a 5, e mais preferivelmente 1 a 3. O grupo amino desta porção é conectado ao terminal C de LP no ligante. 4. La[00234] In the structure represented by -NH-(CH2)n1- within the ligand, n1 is an integer from 0 to 6 and is preferably an integer from 1 to 5, and more preferably 1 to 3. The group amino of this portion is connected to the C-terminus of LP on the linker. 4. There
[00235] O ligante La é representado por qualquer de estruturas - C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, e -O- ou é uma ligação simples. No acima, n7 é um número inteiro de 1 a 6, R1 é um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-COOH, ou - (CH2)n9-OH, n8 é um número inteiro de 1 a 4, e n9 é um número inteiro de 1 a 6.[00235] The linker La is represented by any of the structures -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, and -O- or is a single bond. In the above, n7 is an integer from 1 to 6, R1 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, -(CH2)n8-COOH, or -(CH2)n9-OH, n8 is an integer from 1 to 4, and n9 is an integer from 1 to 6.
[00236] A estrutura amida -C(=O)-NH- dentro do ligante La é conectada a Lb em seu lado de átomo de nitrogênio. Na porção de estrutura de -NR1-(CH2)n7- dentro de La, n7 é um número inteiro de 1 a 6, e pre-ferivelmente 1 a 3. Esta porção é conectada a Lb em seu lado de meti- leno. R1 é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono. O grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono pode ser linear ou ramificado. Exemplos do mesmo podem incluir um grupo metila, um grupo etila, um grupo propila, um grupo isopropila, um grupo butila, um grupo isobutila, um grupo sec-butila, um grupo terc-butila, um grupo pentila, um grupo isopentila, um grupo 2- metilbutila, um grupo neopentila, um grupo 1-etilpropila, um grupo hexila, um grupo isoexila, um grupo 4-metilpentila, um grupo 3- metilpentila, um grupo 2-metilpentila, um grupo 1-metilpentila, um grupo 3,3-dimetilbutila, um grupo 2,2-dimetilbutila, um grupo 1,1- dimetilbutila, um grupo 1,2-dimetilbutila, um grupo 1,3-dimetilbutila, um grupo 2,3-dimetilbutila, e um grupo 2-etilbutila. Deles, um grupo metila ou um grupo etila é preferido. Quando R1 tem uma estrutura representada por -(CH2)n8-COOH, n8 é um número inteiro de 1 a 4, e preferivelmente 1 ou 2. Quando R1 tem uma estrutura representada por - (CH2)n9-OH, n9 é um número inteiro de 1 a 6, e preferivelmente 1 ou 2. R1 é preferivelmente um átomo de hidrogênio, um grupo metila, um grupo etila, -CH2COOH, -CH2CH2-COOH, ou -CH2CH2-OH, e mais preferivelmente um átomo de hidrogênio, um grupo metila, ou -CH2COOH. É também preferivelmente um átomo de hidrogênio. A porção La do ligante pode ser -O- ou uma ligação simples. 5. Lb[00236] The amide structure -C(=O)-NH- within the ligand La is connected to Lb on its nitrogen atom side. In the structure portion of -NR1-(CH2)n7- within La, n7 is an integer from 1 to 6, and preferably 1 to 3. This portion is connected to Lb on its methylene side. R1 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. The alkyl group having 1 to 6 carbon atoms can be straight or branched. Examples thereof may include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, a pentyl group, an isopentyl group, a 2-methylbutyl group, a neopentyl group, a 1-ethylpropyl group, a hexyl group, an isohexyl group, a 4-methylpentyl group, a 3-methylpentyl group, a 2-methylpentyl group, a 1-methylpentyl group, a 3-group ,3-dimethylbutyl group, a 2,2-dimethylbutyl group, a 1,1-dimethylbutyl group, a 1,2-dimethylbutyl group, a 1,3-dimethylbutyl group, a 2,3-dimethylbutyl group, and a 2- ethylbutyl. Of them, a methyl group or an ethyl group is preferred. When R1 has a structure represented by -(CH2)n8-COOH, n8 is an integer from 1 to 4, and preferably 1 or 2. When R1 has a structure represented by -(CH2)n9-OH, n9 is a number integer from 1 to 6, and preferably 1 or 2. R1 is preferably a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, -CH2COOH, -CH2CH2-COOH, or -CH2CH2-OH, and more preferably a hydrogen atom, a methyl group, or -CH2COOH. It is also preferably a hydrogen atom. The La portion of the linker can be -O- or a single bond. 5. Lb
[00237] O ligante Lb é qualquer de estruturas -CR2(-R3)-, -O-, e - NR4- ou é uma ligação simples. No acima, R2 e R3 cada um indepen-dentemente representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila ten-do 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-COOH, ou - (CH2)nc-OH, R4 é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, na é um número inteiro de 0 a 6, nb é um nú-mero inteiro de 1 a 4, e nc é um número inteiro de 0 a 4. Quando na ou nc for 0, R2 e R3 não sejam iguais um ao outro.[00237] The linker Lb is any of the structures -CR2(-R3)-, -O-, and -NR4- or is a single bond. In the above, R2 and R3 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-COOH, or -(CH2) )nc-OH, R4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, na is an integer from 0 to 6, nb is an integer from 1 to 4, and nc is a number integer from 0 to 4. When na or nc is 0, R2 and R3 are not equal to each other.
[00238] Quando cada de R2 e R3 é um grupo alquila, este grupo alquila é interpretado como definido no grupo alquila de R1. Quando R2 e R3 têm uma estrutura de -(CH2)na-NH2, na é um número inteiro de 0 a 6, e preferivelmente 0, ou é 3 a 5. Quando na for 0, R2 e R3 não sejam iguais um ao outro. Quando R2 e R3 têm uma estrutura de -(CH2)nb- COOH, nb é um número inteiro de 1 a 4, e preferivelmente 1 ou 2. Quando R2 e R3 têm uma estrutura de -(CH2)nc-OH, nc é um número inteiro de 0 a 4, e preferivelmente 1 ou 2.[00238] When each of R2 and R3 is an alkyl group, this alkyl group is interpreted as defined in the alkyl group of R1. When R2 and R3 have a structure of -(CH2)na-NH2, na is an integer from 0 to 6, and preferably 0, or is 3 to 5. When na is 0, R2 and R3 are not equal to each other . When R2 and R3 have a -(CH2)nb-COOH structure, nb is an integer from 1 to 4, and preferably 1 or 2. When R2 and R3 have a -(CH2)nc-OH structure, nc is an integer from 0 to 4, and preferably 1 or 2.
[00239] Cada de R2 e R3 é preferivelmente um átomo de hidrogênio, um grupo metila, um grupo etila, -NH2, -CH2CH2CH2NH2, - CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2COOH, - CH2CH2-COOH, -CH2OH, ou -CH2CH2-OH, e mais preferivelmente um átomo de hidrogênio, um grupo metila, -NH2, -CH2CH2CH2CH2NH2, - CH2COOH, -CH2CH2-COOH, -CH2OH, ou -CH2CH2-OH. Eles são também preferivelmente átomos de hidrogênio.[00239] Each of R2 and R3 is preferably a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, -NH2, -CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2COOH, -CH2CH2-COOH, -CH2OH, or -CH2CH2- OH, and more preferably a hydrogen atom, a methyl group, -NH2, -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2COOH, -CH2CH2-COOH, -CH2OH, or -CH2CH2-OH. They are also preferably hydrogen atoms.
[00240] Quando R4 é um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, este grupo alquila é interpretado como definido no grupo alquila de R1. R4 é preferivelmente um átomo de hidrogênio ou um grupo meti- la, e mais preferivelmente um átomo de hidrogênio.[00240] When R4 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, this alkyl group is interpreted as defined in the alkyl group of R1. R4 is preferably a hydrogen atom or a methyl group, and more preferably a hydrogen atom.
[00241] Exemplos específicos da estrutura representada por -NH- (CH2)n1-La-Lb- como o ligante podem incluir - NH-CH2- -NH-CH(-Me)- - NH-C(-Me)2- -NH-CH2-CHMe- - NH-CH(-CH2OH)- - NH-CH(-CH2COOH)- - NH-CH(-CH2CH2COOH)- - NH-CH(-CH2CH2CH2CH2NH2)- - NH-CH2CH2- - NH-CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2-O- - NH-CH2CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2C(-Me)2- - NH-CH2CH2NH- - NH-CH2CH2NH-CH2- - NH-CH2CH2NMe-CH2- - NH-CH2CH2NH-CH2CH2- - NH-CH2CH2NMe-CH2CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2COOH)-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2OH)- - NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2COOH)- - NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2CH2CH2CH2NH2)- - NH-CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2CH(NH2)-.[00241] Specific examples of the structure represented by -NH-(CH2)n1-La-Lb- as the linker may include -NH-CH2- -NH-CH(-Me)- - NH-C(-Me)2- -NH-CH2-CHMe- - NH-CH(-CH2OH)- - NH-CH(-CH2COOH)- - NH-CH(-CH2CH2COOH)- - NH-CH(-CH2CH2CH2CH2NH2)- - NH-CH2CH2- - NH -CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2-O- - NH-CH2CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2C(-Me)2- - NH-CH2CH2NH- - NH-CH2CH2NH-CH2- - NH-CH2CH2NMe- CH2- - NH-CH2CH2NH-CH2CH2- - NH-CH2CH2NMe-CH2CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2COOH)-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2OH)- - NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2COOH)- - NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2CH2CH2CH2NH2)- - NH-CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2CH(NH2)-.
[00242] Deles, exemplos preferidos do mesmo podem incluir - NH-CH2- - NH-CH2-CH(Me)- - NH-CH(-CH2OH)- - NH-CH(-CH2CH2COOH)- - NH-CH2CH2- - NH-CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2-O- - NH-CH2CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2C(-Me)2- - NH-CH2CH2NH- - NH-CH2CH2NH-CH2- - NH-CH2CH2NMe-CH2- - NH-CH2CH2NMe-CH2CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2COOH)-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2OH)- - NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2COOH)- - NH-CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2CH2-.[00242] Of them, preferred examples thereof may include - NH-CH2- - NH-CH2-CH(Me)- - NH-CH(-CH2OH)- - NH-CH(-CH2CH2COOH)- - NH-CH2CH2- - NH-CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2-O- - NH-CH2CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2C(-Me)2- - NH-CH2CH2NH- - NH-CH2CH2NH-CH2- - NH-CH2CH2NMe -CH2- - NH-CH2CH2NMe-CH2CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2COOH)-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2C(=O )-NHCH(-CH2OH)- - NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2COOH)- - NH-CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2CH2-.
[00243] Mais exemplos preferidos do mesmo podem incluir - NH-CH2- - NH-CH2CH2- - NH-CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2-O- - NH-CH2CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2NH- - NH-CH2CH2NH-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2COOH)-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2COOH)- - NH-CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2CH2-.[00243] More preferred examples thereof may include - NH-CH2- - NH-CH2CH2- - NH-CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2-O- - NH-CH2CH2-O-CH2- - NH-CH2CH2NH- - NH-CH2CH2NH-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2COOH)-CH2- - NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2COOH)- - NH-CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2- - NH-CH2CH2CH2CH2CH2-.
[00244] Outros exemplos preferidos do mesmo podem incluir - NH-(CH2)3-, - NH-CH2-O-CH2-, e - NH-(CH2)2-O-CH2-. - . Lc[00244] Other preferred examples thereof may include - NH-(CH2)3-, -NH-CH2-O-CH2-, and -NH-(CH2)2-O-CH2-. - . lc
[00245] O ligante Lc é -CH2- ou -C(=O)-. Referido ligante é conectado ao composto antitumor. Lc do ligante é mais preferivelmente - C(=O)-.The linker Lc is -CH2- or -C(=O)-. Said ligand is connected to the antitumor compound. Lc of the linker is most preferably -C(=O)-.
[00246] No ligante, o comprimento de cadeia de -NH-(CH2)n1-La-Lb- Lc é preferivelmente um comprimento de cadeia de 4 a 7 átomos, e mais preferivelmente um comprimento de cadeia de 5 ou 6 átomos.In the linker, the chain length of -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc is preferably a chain length of 4 to 7 atoms, and more preferably a chain length of 5 or 6 atoms.
[00247] No que diz respeito ao conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção, quando ele for transferido para o interior de células de tumor, a porção de ligante é clivada e o derivado de fármaco tendo uma estrutura representada por NH2-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) é libe-rado para expressar uma ação antitumor. Exemplos do derivado de antitumor exibindo um efeito antitumor por liberação do conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção incluem um derivado de anti-tumor tendo uma porção de estrutura em que a estrutura representada por -NH-(CH2)n1-La-Lb- do ligante é ligada com Lc e tem um grupo ami-no terminal, e os particularmente preferidos incluem os seguintes. NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) NH2-CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)[00247] With respect to the antibody-drug conjugate of the present invention, when it is transferred into tumor cells, the linker portion is cleaved and the drug derivative having a structure represented by NH2-(CH2) n1-La-Lb-Lc-(NH-DX) is released to express an antitumor action. Examples of the antitumor derivative exhibiting an antitumor effect upon release of the antibody-drug conjugate of the present invention include an antitumor derivative having a structure portion wherein the structure is represented by -NH-(CH2)n1-La-Lb- of the linker is linked with Lc and has a terminal amino group, and particularly preferred ones include the following. NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) NH2 -CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
[00248] Entretanto, em caso de NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), foi confirmado que, quando a estrutura aminal na molécula for instável, ela novamente sofre uma auto-degradação para liberar o seguinte HO- CH2-C(=O)-(NH-DX). Aqueles compostos podem ser também preferi-velmente usados como um intermediário de produção do conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção.[00248] However, in case of NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), it has been confirmed that when the aminal structure in the molecule is unstable, it again undergoes a self-degradation to release the following HO-CH2-C(=O)-(NH-DX). Those compounds can also be preferably used as an intermediate for producing the antibody-drug conjugate of the present invention.
[00249] Para o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção em que exatecano é usado como um fármaco, é preferível que a porção de estrutura fármaco-ligante tendo a seguinte estrutura [-L1-L2- LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)] seja conectada a um anticorpo. O número de conjugado médio da porção de fármaco-ligante de estrutura por anticorpo pode ser 1 a 10. Preferivelmente, é 2 a 8, e mais preferi-velmente 3 a 8. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)[00249] For the antibody-drug conjugate of the present invention in which exatecan is used as a drug, it is preferable that the drug-linker structure portion having the following structure [-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1 -La-Lb-Lc-(NH-DX)] is connected to an antibody. The average drug-structure linker portion conjugate number per antibody may be 1 to 10. Preferably, it is 2 to 8, and more preferably 3 to 8. -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C( =O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3 -yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O) )-(NH-DX) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid -3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid -3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid -3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX ) -(Succinimid-3 -yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) - CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C (=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
[00250] Entre eles, os mais preferidos são os seguintes. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).[00250] Among them, the most preferred are the following. -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C (=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)-(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2 -C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O) - (NH-DX) -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS )-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[00251] Os particularmente preferidos são os seguintes. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).[00251] Particularly preferred are as follows. -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH -CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
[00252] No que diz respeito à estrutura de ligante para conjugar o anticorpo e um fármaco no conjugado de anticorpo-fármaco do presen-te pedido, o preferido ligante pode ser construído conectando preferidas estruturas mostradas para cada parte do ligante explicado acima. Quando para a estrutura de ligante, aqueles com a seguinte estrutura pode ser preferivelmente usado. Entretanto, o terminal esquerdo da estrutura é uma posição de conexão com o anticorpo e o terminal direi-to é uma posição de conexão com o fármaco. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-With respect to the linker structure for conjugating the antibody and a drug in the antibody-drug conjugate of the present application, the preferred linker can be constructed by connecting preferred structures shown for each part of the linker explained above. When for the linker structure, those with the following structure can preferably be used. However, the left end of the framework is an antibody-connecting position and the right-hand end is a drug-connecting position. -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl -N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C (=O)- -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl-N) -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(= O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O) )-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O) -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3 -diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-
[00253] Entre eles, os mais preferidos são os seguintes. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.[00253] Among them, the most preferred are the following. -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid -3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O) -NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2 -C(=O)- -C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- -C(=O)-cic.Hex(1,4)- CH2-(N-Hi-3-diminicuS)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
[00254] Os particularmente preferidos incluem os seguintes. -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-il-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-. Método de produçãoParticularly preferred ones include the following. -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C( =O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- -(Succinimid-3-yl-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(= O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-. production method
[00255] Em seguida, explicações são dadas para o método repre-sentativo para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção ou um intermediário de produção do mesmo. Entretanto, os compostos são a seguir descritos com o número de composto mostra-do em cada fórmula de reação. Especificamente, eles são referidos como um "composto da fórmula (1)", um "composto (1)", ou similares. Os compostos com números exceto aqueles são também descritos similarmente. 1. Método de produção 1Next, explanations are given for the representative method for producing the antibody-drug conjugate of the present invention or an intermediate for producing the same. However, the compounds are described below with the compound number shown in each reaction formula. Specifically, they are referred to as a "compound of formula (1)", a "compound (1)", or the like. Compounds with numbers other than those are also described similarly. 1. Production method 1
[00256] O conjugado de anticorpo-fármaco representado pela fórmula (1) em que o anticorpo é ligado à estrutura de ligante por meio de tioéter pode ser produzido pelo seguinte método, por exemplo. Fórmula 48
[00257] Especificamente, o conjugado de anticorpo-fármaco (1) pode ser produzido reagindo o composto (2), que é obtido pelo método descrito abaixo, com o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila.[00257] Specifically, the antibody-drug conjugate (1) can be produced by reacting the compound (2), which is obtained by the method described below, with the antibody (3a) having a sulfhydryl group.
[00258] O anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila pode ser obtido por um método bem conhecido na técnica (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Exemplos includem: reagente de Traut é reagido com o grupo amino do anticorpo; S-acetiltioalcanoatos de N-succinimidila são reagidos com o grupo amino do anticorpo seguidos por reação com hidroxilami- na; após reagir com 3-(piridilditio)propionato de N-succinimidila, o anticorpo é reagido com um agente de redução; o anticorpo é reagido com um agente de redução tais como ditiotreitol, 2-mercaptoetanol, e clori- drato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) para reduzir a ligação de dis- sulfeto em uma parte de articulação no anticorpo para formar um grupo sulfidrila, porém não é limitado a isso.The antibody (3a) having a sulfhydryl group can be obtained by a method well known in the art (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Examples include: Traut's reagent is reacted with the amino group of the antibody; N-succinimidyl S-acetylthioalkanoates are reacted with the amino group of the antibody followed by reaction with hydroxylamine; after reacting with N-succinimidyl 3-(pyridyldithio)propionate, the antibody is reacted with a reducing agent; the antibody is reacted with a reducing agent such as dithiothreitol, 2-mercaptoethanol, and tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) to reduce the disulfide bond at a hinge moiety on the antibody to form a sulfhydryl group, but is not limited to that.
[00259] Especificamente, usando 0,3 a 3 molares equivalentes de TCEP como um agente de redução por dissulfeto em parte de articula-ção no anticorpo e reagindo com o anticorpo em uma solução de tam- pão contendo um agente de quelação, o anticorpo com dissulfeto par-cialmente ou completamente reduzido em parte de articulação no anti-corpo pode ser obtido. Exemplos do agente de quelação incluem ácido tetraacético de etilenodiamina (EDTA) e ácido pentaacético de dietile- notriamina (DTPA). Isto pode ser usado em concentração de 1 mM a 20 mM. Exemplos do solução de tampão que podem ser usados inclu-em uma solução de fosfato de sódio, borato de sódio, ou acetato de sódio. Como um exemplo específico, reagindo o anticorpo com TCEP a 4 °C a 37 °C durante 1 a 4 horas, o anticorpo (3a) tendo grupo sulfi- drila parcialmente ou completamente reduzido pode ser obtido.[00259] Specifically, using 0.3 to 3 molar equivalents of TCEP as a reducing agent by disulfide in part hinge in the antibody and reacting with the antibody in a buffer solution containing a chelating agent, the antibody with disulfide partially or completely reduced in part articulation in the antibody can be obtained. Examples of the chelating agent include ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) and diethylenetriamine pentaacetic acid (DTPA). This can be used in concentrations from 1 mM to 20 mM. Examples of the buffer solution that can be used include a solution of sodium phosphate, sodium borate, or sodium acetate. As a specific example, by reacting the antibody with TCEP at 4°C to 37°C for 1 to 4 hours, the antibody (3a) having partially or completely reduced sulfhydryl group can be obtained.
[00260] Entretanto, realizando a reação para adicionar um grupo sulfidrila a uma porção ligantea de fármaco, a porção ligantea de fár- maco pode ser conjugada por uma ligação de tioéter.[00260] However, by carrying out the reaction to add a sulfhydryl group to a drug binding moiety, the drug binding moiety can be conjugated by a thioether bond.
[00261] Em seguida, usando 2 a 20 molares equivalentes do composto (2) pelo anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila, o conjugado de anticorpo-fármaco (1) em que 2 a 8 moléculas de fármaco são conju-gadas por anticorpo pode ser produzido. Especificamente, é suficiente que a solução contendo o composto (2) dissolvido nela seja adicionada a uma solução de tampão contendo o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila para a reação. Aqui, exemplos da solução de tampão que podem ser usado incluem solução de acetato de sódio, fosfato de só-dio, e borato de sódio. pH para a reação é 5 a 9, e mais preferivelmente a reação é realizada perto de pH 7. Exemplos do solvente para dis-solver o composto (2) incluem um solvente orgânico tais como sulfóxi- do de dimetila (DMSO), formamida de dimetila (DMF), acetamida de dimetila (DMA), e N-metil-2-piridona (NMP). É suficiente que a solução de solvente orgânico contendo o composto (2) dissolvido seja adicio-nada em 1 a 20% v/v a uma solução de tampão contendo o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila para a reação. A temperatura de reação é 0 a 37 °C, mais preferivelmente 10 a 25 °C, e o tempo de reação é 0,5 a 2 horas. A reação pode ser terminada desativando a reatividade de composto não reagido (2) com um reagente contendo tiol. Exemplos do reagente contendo tiol incluem cisteína e N-acetil-L-cisteína (NAC). Mais especificamente, 1 a 2 equivalentes molares de NAC são adicionados ao composto (2) usado e, incubando em temperatura am-biente durante 10 a 30 minutos, a reação pode ser terminada.[00261] Then, using 2 to 20 molar equivalents of compound (2) per antibody (3a) having a sulfhydryl group, the antibody-drug conjugate (1) wherein 2 to 8 drug molecules are conjugated per antibody can be produced. Specifically, it is sufficient that the solution containing the compound (2) dissolved therein is added to a buffer solution containing the antibody (3a) having a sulfhydryl group for the reaction. Here, examples of the buffer solution that can be used include sodium acetate solution, sodium phosphate, and sodium borate. pH for the reaction is 5 to 9, and most preferably the reaction is carried out around pH 7. Examples of the solvent to dissolve compound (2) include an organic solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO), formamide of dimethyl (DMF), dimethyl acetamide (DMA), and N-methyl-2-pyridone (NMP). It is sufficient that the organic solvent solution containing the dissolved compound (2) is added by 1 to 20% v/v to a buffer solution containing the antibody (3a) having a sulfhydryl group for the reaction. The reaction temperature is 0 to 37 °C, more preferably 10 to 25 °C, and the reaction time is 0.5 to 2 hours. The reaction can be terminated by deactivating the reactivity of unreacted compound (2) with a thiol-containing reagent. Examples of the thiol-containing reagent include cysteine and N-acetyl-L-cysteine (NAC). More specifically, 1 to 2 molar equivalents of NAC are added to the compound (2) used and, by incubating at room temperature for 10 to 30 minutes, the reaction can be terminated.
[00262] O conjugado de anticorpo-fármaco produzido (1) pode ser submetido a, após concentração, permuta de tampão, purificação, e medição de concentração de anticorpo e número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo de acordo com pro-cedimentos comuns descritos abaixo, identificação do conjugado de anticorpo-fármaco (1). Procedimento comum A: Concentração de solução aquosa de anticor-po ou conjugado de anticorpo-fármaco[00262] The antibody-drug conjugate produced (1) can be subjected to, after concentration, buffer exchange, purification, and measurement of antibody concentration and average number of drug molecules conjugated per antibody molecule according to pro- common procedures described below, identification of the antibody-drug conjugate (1). Common Procedure A: Concentration of Aqueous Antibody Solution or Antibody-Drug Conjugate
[00263] A um recipiente Amicon Ultra (50,000 MWCO, Millipore Corporation), uma solução de anticorpo ou conjugado de anticorpo- fármaco foi adicionada e a solução do anticorpo ou conjugado de anti- corpo-fármaco foi concentrada por centrifugação (centrífuga durante 5 a 20 minutos a 2000 G a 3800 G) usando uma centrífuga (Allegra X- 15R, Beckman Coulter, Inc.). Procedimento comum B: Medição de concentração de anticorpoTo an Amicon Ultra container (50,000 MWCO, Millipore Corporation), a solution of antibody or antibody-drug conjugate was added and the solution of antibody or antibody-drug conjugate was concentrated by centrifugation (centrifuge for 5 to 20 minutes at 2000G to 3800G) using a centrifuge (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.). Common Procedure B: Antibody Concentration Measurement
[00264] Usando um detector de UV (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), medição da concentração de anticorpo foi realizada de acordo com o método definido pelo fabricante. Naquele momento, coe-ficiente de absorção a 280 nm diferente para cada anticorpo foi usado (1,3 mLmg-1cm-1 a 1,8 mLmg-1cm-1). Procedimento comum C-1: Permuta de tampão para anticorpo[00264] Using a UV detector (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.), antibody concentration measurement was performed according to the method defined by the manufacturer. At that time, a different absorption coefficient at 280 nm for each antibody was used (1.3 mLmg-1cm-1 to 1.8 mLmg-1cm-1). Common Procedure C-1: Exchange from Buffer to Antibody
[00265] Coluna NAP-25 (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) usando veículo Sephadex G-25 foi equilibrada com tampão de fosfato (10 mM, pH 6,0) (é referido como PBS6,0/EDTA na especificação) contendo cloreto de sódio (137 mM) e ácido tetraacéti- co de diamina de etileno (EDTA, 5 mM) de acordo com o método defi-nido pelo manual de instrução do fabricante. Solução aquosa do anti-corpo foi aplicada em uma quantidade de 2,5 mL em coluna NAP-25 simples, e em seguida a fração (3,5 mL) eluída com 3,5 mL de PBS6,0/EDTA foi coletada. A fração resultante foi concentrada pelo Procedimento comum A. Após medir a concentração do anticorpo usando o Procedimento comum B, a concentração de anticorpo foi ajustada para 10 mg/mL usando PBS6,0/EDTA. Procedimento comum C-2: Permuta de tampão para anticorpoNAP-25 column (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) using Sephadex G-25 vehicle was equilibrated with phosphate buffer (10 mM, pH 6.0) (is referred to as PBS6, 0/EDTA in specification) containing sodium chloride (137 mM) and ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA, 5 mM) according to the method defined by the manufacturer's instruction manual. Aqueous solution of the antibody was applied in an amount of 2.5 mL in a simple NAP-25 column, and then the fraction (3.5 mL) eluted with 3.5 mL of PBS6.0/EDTA was collected. The resulting fraction was concentrated by Common Procedure A. After measuring the antibody concentration using Common Procedure B, the antibody concentration was adjusted to 10 mg/ml using PBS6.0/EDTA. Common Procedure C-2: Buffer to Antibody Exchange
[00266] Coluna NAP-25 (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) usando veículo Sephadex G-25 foi equilibrada com tampão de fosfato (50 mM, pH 6,5) (é referido como PBS6,5/EDTA na especificação) contendo cloreto de sódio (50 mM) e EDTA (2 mM) de acordo com o método definido pelo fabricante. Solução aquosa do an-ticorpo foi aplicada em uma quantidade de 2,5 mL a coluna NAP-25 simples, e em seguida a fração (3,5 mL) eluída com 3,5 mL de PBS6,5/EDTA foi coletada. A fração resultante foi concentrada pelo Procedimento comum A. Após medir a concentração do anticorpo usando o Procedimento comum B, a concentração de anticorpo foi ajustada para 20 mg/mL usando PBS6,5/EDTA. Procedimento comum D-1: Purificação de conjugado de anticorpo- fármaco[00266] NAP-25 column (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) using Sephadex G-25 vehicle was equilibrated with phosphate buffer (50 mM, pH 6.5) (is referred to as PBS6, 5/EDTA in specification) containing sodium chloride (50 mM) and EDTA (2 mM) according to the method defined by the manufacturer. Aqueous solution of the antibody was applied in an amount of 2.5 ml to the simple NAP-25 column, and then the fraction (3.5 ml) eluted with 3.5 ml of PBS6.5/EDTA was collected. The resulting fraction was concentrated by Common Procedure A. After measuring the antibody concentration using Common Procedure B, the antibody concentration was adjusted to 20 mg/ml using PBS6.5/EDTA. Common Procedure D-1: Purification of Antibody-Drug Conjugate
[00267] Coluna NAP-25 foi equilibrada com qualquer tampão sele-cionado de tampão de fosfato comercialmente disponível (PBS7,4, Cat. No. 10010-023, Invitrogen), tampão de fosfato de sódio (10 mM, pH 6,0; é referido como PBS6,0) contendo cloreto de sódio (137 mM), e tampão de acetato contendo sorbitol (5 %) (10 mM, pH 5,5; é referido como ABS na especificação). Solução aquosa da reação de conjugado de anticorpo-fármaco foi aplicada em uma quantidade de cerca de 1,5 mL à coluna NAP-25, e em seguida eluída com o tampão em uma quantidade definida pelo fabricante para coletar a fração de anti-corpo. A fração coletada foi novamente aplicada à coluna NAP-25 e, repetindo 2 a 3 vezes no total o processo de purificação de filtração de gel para eluição com tampão, o conjugado de anticorpo-fármaco exclu-indo ligante de fármaco não conjugado e um composto de baixo peso molecular (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), N-acetil-L- cisteína (NAC), e sulfóxido de dimetila) foi obtido. Procedimento comum E: Medição de concentração de anticorpo em conjugado de anticorpo-fármaco e número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo.[00267] NAP-25 column was equilibrated with any selected commercially available phosphate buffer buffer (PBS7.4, Cat. No. 10010-023, Invitrogen), sodium phosphate buffer (10 mM, pH 6.0 is referred to as PBS6.0) containing sodium chloride (137 mM), and acetate buffer containing sorbitol (5%) (10 mM, pH 5.5; is referred to as ABS in the specification). Aqueous solution of the antibody-drug conjugate reaction was applied in an amount of about 1.5 mL to the NAP-25 column, and then eluted with the buffer in an amount defined by the manufacturer to collect the antibody fraction. The collected fraction was again applied to the NAP-25 column and, repeating 2 to 3 times in total, the gel filtration purification process for elution with buffer, antibody-drug conjugate excluding unconjugated drug ligand and a compound Low molecular weight (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP), N-acetyl-L-cysteine (NAC), and dimethyl sulfoxide) was obtained. Common Procedure E: Measurement of antibody concentration in antibody-drug conjugate and average number of drug molecules conjugated per antibody molecule.
[00268] A concentração de fármaco conjugada no conjugado de an- ticorpo-fármaco pode ser calculada medindo absorvância de UV de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo-fármaco em dois comprimentos de onda de 280 nm e 370 nm, seguidos por realização do cálculo mostrado abaixo.[00268] The concentration of drug conjugated in the antibody-drug conjugate can be calculated by measuring the UV absorbance of an aqueous solution of the antibody-drug conjugate at two wavelengths of 280 nm and 370 nm, followed by performing the calculation shown below.
[00269] Uma vez que a absorvância total em qualquer comprimento de onda for igual à soma da absorvância de todas as espécies químicas que absorvem luz que estão presentes em um sistema [aditividade de absorvância], quando o coeficiente molar de absorções do anticorpo e o fármaco permanecerem os mesmos antes e após conjugação entre o anticorpo e o fármaco, a concentração de anticorpo e a concentração de fármaco no conjugado de anticorpo-fármaco são expressas com as seguintes equações. A280 = AD,280 + AA,280 = SD,28OCD + SA,28OCA Equação (1) A370 = AD,37O+ AA,370 = SD,37OCD + SA,37OCA Equação (2)[00269] Since the total absorbance at any wavelength is equal to the sum of the absorbance of all light-absorbing chemical species that are present in a system [absorbance additivity], when the molar coefficient of antibody absorptions and the drug remains the same before and after conjugation between the antibody and the drug, the antibody concentration and the drug concentration in the antibody-drug conjugate are expressed with the following equations. A280 = AD,280 + AA,280 = SD,28OCD + SA,28OCA Equation (1) A370 = AD,37O+ AA,370 = SD,37OCD + SA,37OCA Equation (2)
[00270] No acima, A280 representa a absorvância de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo-fármaco a 280 nm, A370 representa a absorvância de uma solução aquosa do conjugado de anticorpo- fármaco a 370 nm, AA,280 representa a absorvância de um anticorpo a 280 nm, AA,370 representa a absorvância de um anticorpo a 370 nm, AD,280 representa a absorvância de um precursor conjugado a 280 nm, AD,370 representa a absorvância de um precursor conjugado a 370 nm, εA,280 representa o coeficiente molar de absorção de um anticorpo a 280 nm, SA,370 representa o coeficiente molar de absorção de um anticorpo a 370 nm, SD,280 representa o coeficiente molar de absorção de um precursor conjugado a 280 nm, SD,370 representa o coeficiente molar de absorção de um precursor conjugado a 370 nm, CA representa a concentração de anticorpo em um conjugado de anticorpo-fármaco, e CD representa a concentração de fármaco em um conjugado de anti- corpo-fármaco.[00270] In the above, A280 represents the absorbance of an aqueous solution of the antibody-drug conjugate at 280 nm, A370 represents the absorbance of an aqueous solution of the antibody-drug conjugate at 370 nm, AA.280 represents the absorbance of a antibody at 280 nm, AA.370 represents the absorbance of an antibody at 370 nm, AD.280 represents the absorbance of a conjugated precursor at 280 nm, AD.370 represents the absorbance of a conjugated precursor at 370 nm, εA,280 represents the molar coefficient of absorption of an antibody at 280 nm, SA.370 represents the molar coefficient of absorption of an antibody at 370 nm, SD.280 represents the molar coefficient of absorption of a conjugated precursor at 280 nm, SD.370 represents the molar coefficient of absorption of a conjugated precursor at 370 nm, CA represents the concentration of antibody in an antibody-drug conjugate, and CD represents the concentration of drug in an antibody-drug conjugate.
[00271] Como para SA,280, SA,370, SD,280, e SD,370 no acima, valores an-teriormente preparados (valor estimado com base no cálculo ou valor de medição obtido por medição de UV do composto) são usados. Por exemplo, SA,280 pode ser estimado de uma sequência de aminoácido de um anticorpo usando um método de cálculo conhecido (Proteína Sci-ence, 1995, vol. 4, 2411-2423). SA,370 é geralmente zero. SD,280 e SD,370 podem ser obtidos com base em lei de Lambert-Beer (Absorvância = concentração molar x coeficiente molar de absorção x comprimento de trilha celular) medindo a absorvância da solução em que o conjugado precursor a ser usado é dissolvido em uma certa concentração molar. Medindo A280 e A370 de uma solução aquosa do conjugado de anticor- po-fármaco e resolvendo as equações simultâneas (1) e (2) usando os valores, CA e CD podem ser obtidos. Além disso, dividindo CD por CA, o número médio de fármaco conjugado por anticorpo pode ser obtido.[00271] As for SA,280, SA,370, SD,280, and SD,370 in the above, previously prepared values (estimated value based on calculation or measurement value obtained by UV measurement of the compound) are used . For example, SA,280 can be estimated from the amino acid sequence of an antibody using a known calculation method (Protein Sci-ence, 1995, vol. 4, 2411-2423). SA,370 is generally zero. SD,280 and SD,370 can be obtained based on Lambert-Beer law (Absorbance = molar concentration x molar coefficient of absorption x cell path length) by measuring the absorbance of the solution in which the precursor conjugate to be used is dissolved in a certain molar concentration. By measuring A280 and A370 of an aqueous solution of the antibody-drug conjugate and solving simultaneous equations (1) and (2) using the CA and CD values can be obtained. Furthermore, by dividing CD by CA, the average number of drug conjugated per antibody can be obtained.
[00272] O composto representado pela fórmula (2) no método de produção 1 é qualquer composto representado pela fórmula a seguir: Fórmula 51
[00273] Na fórmula, n1, n2, n3, L2, LP, La, Lb, e Lc são como já definido, e Lc é uma posição de conexão para o fármaco.[00273] In the formula, n1, n2, n3, L2, LP, La, Lb, and Lc are as already defined, and Lc is a connection position for the drug.
[00274] Em um intermediário útil em produzir um tal composto da presente invenção, preferivelmente, n2 é um número inteiro de 2 a 5, L2 é -NH-(CH2CH2O)n5-CH2CH2-C(=O)- ou uma ligação simples, n5 é um número inteiro de 2 a 4, LP é GGFG, e -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- é uma estrutura parcial de -NH-CH2CH2-C(=O)-, NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, - NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-. Halogênio é preferivelmente bromo ou iodo. Exemplos específicos destes compostos podem incluir os seguintes [aqui, (maleimid-N-il) representa um grupo maleimidila (grupo 2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-ila)]. (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX)[00274] In an intermediate useful in producing such a compound of the present invention, preferably, n2 is an integer from 2 to 5, L2 is -NH-(CH2CH2O)n5-CH2CH2-C(=O)- or a single bond , n5 is an integer from 2 to 4, LP is GGFG, and -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- is a partial structure of -NH-CH2CH2-C(=O)-, NH-CH2CH2CH2 -C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, or -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-. Halogen is preferably bromine or iodine. Specific examples of these compounds may include the following [here, (maleimid-N-yl) represents a maleimidyl group (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl group)]. (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG -NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) ( maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid -N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH -CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid- N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N -yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2 - C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C( =O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2 -C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) ( maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O )-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C (=O)- (NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid- N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)- NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O -CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O) -GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(= O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2 -C(=O)- (NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) X -CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH -CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O) )-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(= O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) X- CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) X-CH2-C(=O)-NH -CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX)
[00275] Na fórmula, X representa um átomo de bromo ou um átomo de iodo. Todos estes compostos de bromo e iodo podem ser preferi-velmente usados como intermediários de produção.[00275] In the formula, X represents a bromine atom or an iodine atom. All these bromine and iodine compounds can preferably be used as production intermediates.
[00276] A fim de garantir uma quantidade do conjugado, uma plura-lidade de conjugados obtidos sob condições de produção similares pa-ra terem um número equivalente de fármacos (por exemplo, cerca de ± 1) pode ser misturada para preparar novos lotes. Neste caso, o número médio de fármacos cai entre os números médios de fármacos nos conjugados antes da mistura. 2. Método de produção 2[00276] In order to guarantee a quantity of the conjugate, a plurality of conjugates obtained under similar production conditions to have an equivalent number of drugs (eg, about ± 1) can be mixed to prepare new batches. In this case, the average number of drugs falls between the average numbers of drugs in the conjugates before mixing. 2. Production method 2
[00277] O conjugado de anticorpo-fármaco representado pela fórmula (1) em que o anticorpo é conectado por meio de um grupo amida a um ligante e tendo uma ligação de tioéter dentro do ligante, especifi-camente, uma estrutura em que -L1-L2- é -C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N- li-3-diminiccuS)-S-(CH2)n6-C(=O)-, pode ser também produzida pelo seguinte método. Fórmula 52
[00278] Na fórmula, AB-L1' representa um grupo que o anticorpo e ligante L1 são conectados e, além disso, o terminal de L1 é convertido em um grupo N-maleimidila. Este grupo especificamente tem uma es-trutura em que -(N-li-3-diminiccuS)- em AB-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N- li-3-diminiccuS)- é convertido em um grupo maleimidila. L2' representa um grupo HS-(CH2)n6-C(=O)- em que o terminal é um grupo mercapto, e AB representa o anticorpo.[00278] In the formula, AB-L1' represents a group that the antibody and L1 ligand are connected and, in addition, the L1 terminus is converted into an N-maleimidyl group. This group specifically has a structure where -(N-li-3-diminiccuS)- in AB-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-(N-li-3-diminiccuS) - is converted into a maleimidyl group. L2' represents an HS-(CH2)n6-C(=O)- group where the terminus is a mercapto group, and AB represents the antibody.
[00279] Especificamente, o conjugado de anticorpo-fármaco (1) pode ser produzido reagindo o composto (2a), que é obtido pelo método descrito abaixo, com o anticorpo (3b) que é conectado ao ligante tendo um grupo maleimidila.[00279] Specifically, the antibody-drug conjugate (1) can be produced by reacting the compound (2a), which is obtained by the method described below, with the antibody (3b) which is connected to the linker having a maleimidyl group.
[00280] O anticorpo (3b) tendo um grupo maleimidila pode ser também obtido por um método bem conhecido na técnica (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Exemplos incluem: um ligante bifuncional, tal como succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC), que é capaz de ligar-se a um grupo amino ou um grupo hidroxila e tem um grupo maleimidila que é deixado reagir sobre o grupo amino do ligante para introduzir um grupo maleimidila, porém não é limitado a isso.Antibody (3b) having a maleimidyl group can also be obtained by a method well known in the art (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Examples include: a bifunctional linker, such as succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), which is capable of binding an amino group or a hydroxyl group and has a maleimidyl group which is allowed to react on the amino group of the linker to introduce a maleimidyl group, but is not limited thereto.
[00281] Por exemplo, um composto tendo uma porção reativa por grupo amino e uma porção reativa por grupo tiol ligadas por meio de um ligante pode ser preferivelmente usado. Aqui, a porção reativa por grupo amino pode ser éster ativo, éster de imida, ou similares, e a por-ção reativa por tiol pode ser maleimidila, haleto de acetila, haleto de alquila, ditiopiridila, ou similares.[00281] For example, a compound having an amino group-reactive moiety and a thiol group-reactive moiety linked via a linker can preferably be used. Here, the amino group-reactive moiety can be active ester, imide ester, or the like, and the thiol-reactive moiety can be maleimidyl, acetyl halide, alkyl halide, dithiopyridyl, or the like.
[00282] Como um método para construir o ligante com grupo amino ou grupo hidróxi de um aminoácido constituindo o anticorpo, particu-larmente por meio de uma ligação de amido com o grupo amino, o composto a ser primeiro reagido com o anticorpo pode ser um com-posto representado pela fórmula a seguir: Q1-L1a-Q2.[00282] As a method for constructing the linker with amino group or hydroxy group of an amino acid constituting the antibody, particularly by means of a starch bond with the amino group, the compound to be first reacted with the antibody may be a compound represented by the following formula: Q1-L1a-Q2.
[00283] [Na fórmula, Q1 representa (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O- C(=O)-, (3-Sulfo-pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, RQ-O-C(=N)-, ou O=C=N-, L1a- representa -cic.Hex(1,4)-CH2-, um grupo alquileno tendo 1 a 10 átomos de carbono, um grupo fenileno, -(CH2)n4-C(=O)-, -(CH2)n4a-NH- C(=O)-(CH2)n4b-, ou -(CH2)n4a-NH-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-, Q2 representa (maleimid-N-ila), um átomo de halogênio, ou -S-S-(2- piridila), RQ representa um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, n4 re-presenta um número inteiro de 1 a 8, n4a representa um número inteiro de 0 a 6, e n4b representa um número inteiro de 1 a 6.][00283] [In the formula, Q1 represents (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-, (3-Sulfo-pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)- OC(=O)-, RQ-OC(=N)-, or O=C=N-, L1a- represents -cic.Hex(1,4)-CH2-, an alkylene group having 1 to 10 carbon atoms , a phenylene group, -(CH2)n4-C(=O)-, -(CH2)n4a-NH-C(=O)-(CH2)n4b-, or -(CH2)n4a-NH-C(= O)-cic.Hex(1,4)-CH2-, Q2 represents (maleimid-N-yl), a halogen atom, or -SS-(2-pyridyl), RQ represents an alkyl group having 1 to 6 atoms of carbon, n4 represents an integer from 1 to 8, n4a represents an integer from 0 to 6, and n4b represents an integer from 1 to 6.]
[00284] No acima, RQ é um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, e mais preferivelmente um grupo metila ou um grupo etila.[00284] In the above, RQ is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and more preferably a methyl group or an ethyl group.
[00285] O grupo alquileno de L1a pode ser aqueles tendo 1 a 10 átomos de carbono. O grupo fenileno pode ser qualquer de configurações orto, meta, e para e é mais preferivelmente um grupo para- ou meta-fenileno.[00285] The alkylene group of L1a can be those having 1 to 10 carbon atoms. The phenylene group can be any of the ortho, meta, and para configurations and is more preferably a para- or meta-phenylene group.
[00286] Exemplos preferidos de L1a podem incluir -cic.Hex(1,4)-CH2- , -(CH2)5-NH-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-, -(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-, - (CH2)5-NH-C(=O)-(CH2)2-, -CH2-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)5-, -(CH2)10-, -(para-Ph)-, -(meta-Ph)-, -(para-Ph)-CH(-CH3)-, -(CH2)3-(meta-Ph)-, e - (meta-Ph)-NH-C(=O)-CH2-.[00286] Preferred examples of L1a may include -cic.Hex(1,4)-CH2-, -(CH2)5-NH-C(=O)-cic.Hex(1,4)-CH2-, -( CH2)2-NH-C(=O)-CH2-, -(CH2)5-NH-C(=O)-(CH2)2-, -CH2-, -(CH2)2-, -(CH2) 3-, -(CH2)5-, -(CH2)10-, -(para-Ph)-, -(meta-Ph)-, -(para-Ph)-CH(-CH3)-, -(CH2 )3-(meta-Ph)-, and -(meta-Ph)-NH-C(=O)-CH2-.
[00287] Q1 é preferivelmente (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, Q2 é preferivelmente (maleimid-N-ila), ou -S-S-(2-piridila) pode ser usado quando uma ligação de dissulfeto deve ser formada.[00287] Q1 is preferably (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-, Q2 is preferably (maleimid-N-yl), or -SS-(2-pyridyl) can be used when a disulfide bond must be formed.
[00288] No acima, (pirrolidina-2,5-diona-N-il)- é um grupo representado pela fórmula a seguir: Fórmula 53
[00289] Exemplos de um tal composto incluem sulfosuccinimidil-4- (N-maleimidilmetil)ciclo-hexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), N- succinimidil-4-(N-maleimidilmetil)-ciclo-hexano-1-carbóxi-(6- amidocaproato) (LC-SMCC), N-succinimidil éster de ácido undecanoi- co de K-maleimidila (KMUA), N-succinimidil éster de ácido butírico de y-maleimidila (GMBS), N-hidroxisuccinéster de imida de ácido caproico de ε-maleimidila (EMCS), m-maleimidilbenzoil-N-hidroxisuccinéster de imida (MBS), N-(a-maleimidilacetóxi)-succinéster de imida (AMAS), succinimidil-6-(β-maleimidilpropionamida)hexanoato (SMPH), 4-(p- maleimidilfenil)-butirato de N-succinimidila (SMPB), N-(p- maleimidilfenil)isocianato (PMPI), N-succinimidil-4-(iodoacetil)- aminobenzoato (SIAB), iodoacetato de N-succinimidila (SIA), bromoa- cetato de N-succinimidila (SBA), 3-(bromoacetamida)propionato de N- succinimidila (SBAP), N-succinimidil-3-(2-piridoditio)propionato (SPDP), e succinimidiloxicarbonil-α-metil-α-(2-piridilditio)tolueno (SMPT).[00289] Examples of such a compound include sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidylmethyl)cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), N-succinimidyl-4-(N-maleimidylmethyl)-cyclohexane-1-carboxylate -(6-amidocaproate) (LC-SMCC), K-maleimidyl undecanoic acid N-succinimidyl ester (KMUA), y-maleimidyl butyric acid N-succinimidyl ester (GMBS), -maleimidyl imide N-hydroxysuccinester ε-maleimidyl caproic acid (EMCS), m-maleimidylbenzoyl-N-hydroxysuccinester imide (MBS), N-(a-maleimidylacetoxy)-succinester imide (AMAS), succinimidyl-6-(β-maleimidylpropionamide)hexanoate (SMPH ), N-succinimidyl 4-(p-maleimidylphenyl)-butyrate (SMPB), N-(p-maleimidylphenyl)isocyanate (PMPI), N-succinimidyl-4-(iodoacetyl)-aminobenzoate (SIAB), N-iodoacetate succinimidyl (SIA), N-succinimidyl bromoacetate (SBA), N-succinimidyl 3-(bromoacetamide)propionate (SBAP), N-succinimidyl-3-(2-pyridodithio)propionate (SPDP), and succinimidyloxycarbonyl-α -methyl-α-(2-pyridyldithio)toluene (SMPT).
[00290] Especificamente, por exemplo, reagindo 2 a 6 equivalentes de SMCC com o anticorpo (3) em um tampão de fosfato de pH 6 a 7 em temperatura ambiente durante 1 a 6 horas, o éster ativo de SMCC pode reagir com o anticorpo para produzir o anticorpo (3b) tendo um grupo maleimidila. O anticorpo obtido (3b) pode ser purificado por pro-cedimento comum D-2 descrito abaixo, e usado para a reação seguinte com o composto (2a). Procedimento comum D-2: Purificação de anticorpo derivado de 4-(N- maleimidilmetil)-ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidila (SMCC).[00290] Specifically, for example, by reacting 2 to 6 equivalents of SMCC with the antibody (3) in a phosphate buffer of pH 6 to 7 at room temperature for 1 to 6 hours, the active ester of SMCC can react with the antibody to produce the antibody (3b) having a maleimidyl group. The obtained antibody (3b) can be purified by standard procedure D-2 described below, and used for the next reaction with compound (2a). Common Procedure D-2: Purification of antibody derived from succinimidyl 4-(N-maleimidylmethyl)-cyclohexane-1-carboxylate (SMCC).
[00291] Coluna NAP-25 foi equilibrada com PBS6,5/EDTA. A solução de reação contendo o anticorpo derivado de 4-(N-maleimidilmetil)- ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidila (aqui, referido como SMCC) foi aplicada em uma quantidade de cerca de 0,5 mL à coluna NAP-25, e em seguida eluída com o tampão em uma quantidade definida pelo fabricante para coletar o fração de anticorpo para purificação.[00291] NAP-25 column was equilibrated with PBS6.5/EDTA. The reaction solution containing the antibody derived from succinimidyl 4-(N-maleimidylmethyl)-cyclohexane-1-carboxylate (herein, referred to as SMCC) was applied in an amount of about 0.5 mL to the NAP-25 column , and then eluted with the buffer in an amount defined by the manufacturer to collect the antibody fraction for purification.
[00292] O grupo amino do anticorpo para conectar-se ao ligante pode ser um grupo amino de terminal N e/ou um grupo amino realizado por um resíduo de lisina, porém não é limitado a isso. Alternativamente, o anticorpo pode ser conectado ao ligante com formação de ligação de éster por uso de um grupo hidróxi realizado por um resíduo de serina.[00292] The amino group of the antibody to connect to the linker may be an N-terminal amino group and/or an amino group carried by a lysine residue, but it is not limited thereto. Alternatively, the antibody can be attached to the linker with ester bond formation by use of a hydroxy group carried by a serine residue.
[00293] A reação do composto (2a) com o anticorpo (3b) conectado ao ligante tendo um grupo maleimidila pode ser realizada da mesma ma-neira como o método para reagir o composto (2) com o anticorpo (3a) tendo um grupo sulfidrila como mencionado no Método de produção 1.[00293] The reaction of the compound (2a) with the antibody (3b) connected to the linker having a maleimidyl group can be carried out in the same manner as the method for reacting the compound (2) with the antibody (3a) having a group sulfhydryl as mentioned in Production Method 1.
[00294] Para o conjugado de anticorpo-fármaco (1) preparado, con-centração, permuta de tampão, purificação, e identificação do conju-gado de anticorpo-fármaco (1) pela medição de concentração de anti- corpo e um número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo podem ser realizados da mesma maneira como Método de produção 1.[00294] For the prepared antibody-drug conjugate (1), concentration, buffer exchange, purification, and identification of the antibody-drug conjugate (1) by measuring antibody concentration and an average number of drug molecules conjugated per antibody molecule can be carried out in the same manner as Production method 1.
[00295] O composto representado pela fórmula (3b) no Método de produção 2 tem a seguinte estrutura (ver a seguinte fórmula; na estru-tura do mesmo, "anticorpo -NH-" origina-se de um anticorpo). Fórmula 56
[00296] Um composto que é um intermediário para produzir o con-jugado de anticorpo-fármaco da presente invenção e tem a estrutura acima é como descrito abaixo (na fórmula, n é um número inteiro de 1 a 10, preferivelmente 2 a 8, e mais preferivelmente 3 a 8). Fórmula 57
[00297] Além disso, exemplos do composto da presente in- venção em que o terminal é um grupo mercapto podem incluir os se- guintes. HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)- (NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) 3. Método de produção 3[00297] Furthermore, examples of the compound of the present invention where the terminal is a mercapto group may include the following. HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-( NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(= O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2 -C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C( =O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O -CH2-C(=O)- (NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C( =O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-( NH-DX) 3. Production method 3
[00298] O conjugado de anticorpo-fármaco representado pela fórmula (1) em que o anticorpo é conjugado à porção ligantea de fármaco por meio de uma ligação de amido pode ser produzido por um método descrito abaixo. Por exemplo, como para -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)- de L1, seu éster ativo L1', por exemplo, (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)- (CH2)n4-C(=O)-, pode ser preferivelmente usado. Quando L2 for uma ligação simples, o conjugado de anticorpo-fármaco (1) pode ser produ- zido pelo seguinte método, por exemplo. Fórmula 58
[00299] Especificamente, o conjugado de anticorpo-fármaco (1) pode ser produzido reagindo o composto (2b), que é obtido pelo método descrito abaixo, com o anticorpo (3).[00299] Specifically, the antibody-drug conjugate (1) can be produced by reacting the compound (2b), which is obtained by the method described below, with the antibody (3).
[00300] O composto (2b) é capaz de conectar ao grupo amino ou grupo hidroxila do anticorpo. O grupo amino e grupo hidroxila do anticorpo refere-se a, como descrito no Método de produção 2, por exemplo, um grupo amino de terminal N realizado pelo anticorpo e/ou um grupo amino realizado por um resíduo de lisina e um grupo hidróxi realizado por um resíduo de serina, respectivamente, porém eles não são limitados a isso.[00300] The compound (2b) is capable of connecting to the amino group or hydroxyl group of the antibody. The amino group and hydroxyl group of the antibody refers to, as described in Production Method 2, for example, an N-terminal amino group carried by the antibody and/or an amino group carried by a lysine residue and a hydroxy group carried out by a serine residue, respectively, but they are not limited to that.
[00301] O composto (2b) é éster ativo composto de um grupo N- hidroxisuccinimidil éster. Alternativamente, outros éster ativos, por exemplo, um grupo sulfosuccinimidil éster, N-hidroxiftalimidil éster, N- hidroxisulfoftalimidil éster, orto-nitrofenil éster, para-nitrofenil éster, 2,4- dinitrofenil éster, 3-sulfonil-4-nitrofenil éster, 3-carbóxi-4-nitrofenil éster, e pentafluorofenil éster, podem ser usados.[00301] Compound (2b) is active ester composed of an N-hydroxysuccinimidyl ester group. Alternatively, other active esters, for example a sulfosuccinimidyl ester, N-hydroxyphthalimidyl ester, N-hydroxysulfophthalimidyl ester, ortho-nitrophenyl ester, para-nitrophenyl ester, 2,4-dinitrophenyl ester, 3-sulfonyl-4-nitrophenyl ester, group, 3-carboxy-4-nitrophenyl ester, and pentafluorophenyl ester, can be used.
[00302] Usando 2 a 20 equivalentes molares do composto (2b) por anticorpo (3) na reação do composto (2b) com o anticorpo (3), o con-jugado de anticorpo-fármaco (1) em que 1 a 10 moléculas de fármaco são conjugadas por anticorpo pode ser produzido. Especificamente, a solução contendo o composto (2b) dissolvido nela pode ser adicionada a uma solução de tampão contendo o anticorpo (3) para a reação para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco (1). Aqui, exemplos da so-lução de tampão que podem ser usados incluem solução de acetato de sódio, fosfato de sódio, e borato de sódio. pH para a reação pode ser 5 a 9, e mais preferivelmente a reação é realizada perto de pH 7. Exemplos do solvente para dissolver o composto (2b) incluem um sol-vente orgânico tais como sulfóxido de dimetila (DMSO), formamida de dimetila (DMF), acetamida de dimetila (DMA), e N-metil-2-piridona (NMP). É suficiente que a solução de solvente orgânico contendo o composto (2b) dissolvido aí seja adicionada a 1 a 20 % v/v a uma so-lução de tampão contendo o anticorpo (3) para a reação. A temperatura de reação é 0 a 37°C, mais preferivelmente 10 a 25°C, e o tempo de reação é 0,5 a 20 horas.[00302] Using 2 to 20 molar equivalents of the compound (2b) per antibody (3) in the reaction of the compound (2b) with the antibody (3), the antibody-drug conjugate (1) in which 1 to 10 molecules of drug are conjugated by antibody can be produced. Specifically, the solution containing the compound (2b) dissolved therein can be added to a buffer solution containing the antibody (3) for the reaction to produce the antibody-drug conjugate (1). Here, examples of the buffer solution that can be used include sodium acetate solution, sodium phosphate, and sodium borate. pH for the reaction can be 5 to 9, and most preferably the reaction is carried out around pH 7. Examples of the solvent to dissolve compound (2b) include an organic solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethyl formamide (DMF), dimethyl acetamide (DMA), and N-methyl-2-pyridone (NMP). It is sufficient that the organic solvent solution containing the compound (2b) dissolved therein is added at 1 to 20% v/v to a buffer solution containing the antibody (3) for the reaction. The reaction temperature is 0 to 37°C, more preferably 10 to 25°C, and the reaction time is 0.5 to 20 hours.
[00303] Para o conjugado de anticorpo-fármaco produzido (1), con-centração, permuta de tampão, purificação, e identificação do conju-gado de anticorpo-fármaco (1) pela medição de concentração de anti-corpo e um número médio de moléculas de fármaco conjugadas por molécula de anticorpo podem ser realizados da mesma maneira como Método de produção 1.[00303] For the antibody-drug conjugate produced (1), concentration, buffer exchange, purification, and identification of the antibody-drug conjugate (1) by measuring antibody concentration and an average number of drug molecules conjugated per antibody molecule can be carried out in the same manner as Production method 1.
[00304] A porção (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-(CH2)n4- C(=O)- no Método de produção 3 tem a seguinte estrutura. Fórmula 59
[00305] Exemplos do composto da presente invenção tendo a estrutura parcial acima podem incluir os seguintes. (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O- CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) 4. Método de produção 4[00305] Examples of the compound of the present invention having the above partial structure may include the following. (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2, 5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N -yl)-OC(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC (=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)- CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2-C(= O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C (=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) ( pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH 2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2CH2CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C (=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2-C( =O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2CH2-C(= O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O) )-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O) -GGFG- NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH -CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)- CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2 CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O -CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) 4. Production method 4
[00306] O composto representado pela fórmula (2) ou (2b) como um intermediário usado no método de produção anterior e um sal farmaco- logicamente aceitável do mesmo podem ser produzidos pelo seguinte método, por exemplo. Fórmula 60
[00307] Na fórmula, Lc é -C(=O)- e é conectado a -(NH-DX) com formação de ligação de amida, L1' representa estrutura de L1 em que o terminal é convertido em um grupo maleimidila ou um grupo haloaceti- la, ou em (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-, e P1, P2, e P3 cada um representa um grupo de proteção.[00307] In the formula, Lc is -C(=O)- and is connected to -(NH-DX) with amide bond formation, L1' represents L1 structure in which the terminal is converted into a maleimidyl group or a haloacetyl group, or in (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-(CH2)n4-C(=O)-, and P1, P2, and P3 each represent a protection group.
[00308] O composto (6) pode ser produzido derivatizando o ácido carboxílico (5) em um éster ativo, anidrido de ácido misturado, haleto de ácido, ou similares, e reagindo-o com NH2-DX [indicando exateca- no; nome químico: (1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-di-hidro-9- hidróxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2- b]quinolin-10,13(9H,15H)-diona] (4) ou um sal farmacologicamente aceitável do mesmo.[00308] The compound (6) can be produced by derivatizing the carboxylic acid (5) into an active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like, and reacting it with NH2-DX [indicating exatecane; chemical name: (1S,9S)-1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo[de]pyrano[3', 4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-10,13(9H,15H)-dione] (4) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
[00309] Reagentes de reação e condições que são comumente usados para síntese de peptídeo podem ser empregados para a reação. Existem vários tipos de éster ativo. Por exemplo, ele pode ser produzido reagindo fenois tais como p-nitrofenol, N-hidróxi benzotriazol, N-hidróxi succinimida, ou similares, com o ácido carboxílico (5) usando um agente de condensação tal como N,N'-diciclo- hexilcarbodiimida ou cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbo- diimida. Além disso, o éster ativo pode ser também produzido pela reação do ácido carboxílico (5) com trifluoroacetato de pentafluorofenila ou similares; a reação do ácido carboxílico (5) com hexafluorofosfito de oxitripirrolidinofosfônio de 1-benzotriazolila; a reação do ácido carboxí- lico (5) com cianofosfonato de dietila (método de dispersão); a reação do ácido carboxílico (5) com trifenilfosfina e dissulfeto de 2,2'-dipiridila (método de Mukaiyama); a reação do ácido carboxílico (5) com um de-rivado de triazina tais como cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2- il)-4-metilmorfolínio (DMTMM); ou similares. Além disso, a reação pode ser também realizada por, por exemplo, um método de haleto de ácido pelo qual o ácido carboxílico (5) é tratado com haleto de ácido tais co-mo cloreto de tionila e cloreto de oxalila na presença de uma base. Reagindo o éster ativo, anidrido de ácido misturado, ou haleto de ácido do ácido carboxílico (5) obtidos conformemente com o composto (4) na presença de uma base adequada em um solvente inerte a -78°C a 150°C, o composto (6) pode ser produzido. (Entretanto, " solvente iner-te " indica um solvente que não inibe a reação para a qual o solvente é usado.)[00309] Reaction reagents and conditions that are commonly used for peptide synthesis can be employed for the reaction. There are several types of active ester. For example, it can be produced by reacting phenols such as p-nitrophenol, N-hydroxy benzotriazole, N-hydroxy succinimide, or the like, with the carboxylic acid (5) using a condensing agent such as N,N'-dicyclohexylcarbodiimide or 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride. Furthermore, the active ester can also be produced by reacting the carboxylic acid (5) with pentafluorophenyl trifluoroacetate or the like; the reaction of carboxylic acid (5) with 1-benzotriazolyl oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphite; the reaction of the carboxylic acid (5) with diethyl cyanophosphonate (dispersion method); the reaction of carboxylic acid (5) with triphenylphosphine and 2,2'-dipyridyl disulfide (Mukaiyama method); the reaction of the carboxylic acid (5) with a triazine derivative such as 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM); or similar. Furthermore, the reaction can also be carried out by, for example, an acid halide method whereby the carboxylic acid (5) is treated with acid halide such as thionyl chloride and oxalyl chloride in the presence of a base . By reacting the active ester, mixed acid anhydride, or carboxylic acid acid halide (5) obtained accordingly with compound (4) in the presence of a suitable base in an inert solvent at -78°C to 150°C, the compound (6) can be produced. (However, "inert solvent" indicates a solvent that does not inhibit the reaction for which the solvent is used.)
[00310] Exemplos específicos da base usada para cada etapa descrita acima incluem carbonato de um metal de álcali ou um metal terroso de álcali, um alcóxido de metal de álcali, hidróxido ou hidreto de um metal de álcali incluindo carbonato de sódio, carbonato de potássio, etóxido de sódio, butóxido de potássio, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidreto de sódio, e hidreto de potássio, base organo- metálica representada por um alquil lítio incluindo n-butil lítio, dialqui- lamino lítio incluindo di-isopropilamida de lítio; base organometálica de bissililamina incluindo bis(trimetilsilil)amida de lítio; e base orgânica incluindo piridina, 2,6-lutidina, colidina, 4-dimetilaminopiridina, trietila- mina, N-metil morfolina, di-isopropiletilamina, e diazabici- clo[5,4,0]undec-7-eno (DBU).[00310] Specific examples of the base used for each step described above include alkali metal carbonate or alkali earth metal, alkali metal alkoxide, alkali metal hydroxide or hydride including sodium carbonate, potassium carbonate , sodium ethoxide, potassium butoxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium hydride, and potassium hydride, organometallic base represented by an alkyl lithium including n-butyl lithium, dialkylamino lithium including diisopropylamide of lithium; organometallic bissilylamine base including lithium bis(trimethylsilyl)amide; and organic base including pyridine, 2,6-lutidine, collidine, 4-dimethylaminopyridine, triethylamine, N-methyl morpholine, diisopropylethylamine, and diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene (DBU) .
[00311] Exemplos do solvente inerte que é usado para a reação da presente invenção incluem um solvente de hidrocarboneto halogenado tais como diclorometano, clorofórmio, e tetracloreto de carbono; um solvente de éter tais como tetraidrofurano, 1,2-dimetoxietano, e dioxa-no; um solvente de hidrocarboneto aromático tais como benzeno e to- lueno; e um solvente de amida tais como N,N-dimetil formamida, N,N- dimetil acetamida, e N-metilpirrolidin-2-ona. Além deles, um solvente de sulfóxido tais como sulfóxido de dimetila e sulfolano; e um solvente de cetona tais como acetona e metil etil cetona pode ser usado de-pendendo do caso.[00311] Examples of the inert solvent that is used for the reaction of the present invention include a halogenated hydrocarbon solvent such as dichloromethane, chloroform, and carbon tetrachloride; an ether solvent such as tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane, and dioxane; an aromatic hydrocarbon solvent such as benzene and toluene; and an amide solvent such as N,N-dimethyl formamide, N,N-dimethyl acetamide, and N-methylpyrrolidin-2-one. In addition to them, a sulfoxide solvent such as dimethyl sulfoxide and sulfolane; and a ketone solvent such as acetone and methyl ethyl ketone may be used depending on the case.
[00312] O grupo hidróxi, grupo carbóxi, grupo amino, ou similares, de La e Lb no composto (6) pode ser protegido com um grupo de proteção que é comumente usado em síntese de composto orgânico, como mencionado mais tarde. Especificamente, exemplos do grupo de pro-teção para um grupo hidroxila incluem um grupo alcoximetila tal como grupo metoximetila; um grupo arilmetila tais como grupo benzila, grupo 4-metoxibenzila, e grupo trifenilmetila; um grupo alcanoíla tal como grupo acetila; um grupo aroíla tal como grupo benzoíla; e um grupo silila tal como grupo terc-butil difenilsilila. O grupo carbóxi pode ser protegido, por exemplo, como um éster com um grupo alquila tais como grupo metila, grupo etila, e grupo terc-butila, um grupo alila, ou um grupo arilmetila tal como grupo benzila. O grupo amino pode ser pro-tegido com um grupo de proteção para um grupo amino que é geral-mente usado para síntese de peptídeo, por exemplo, um grupo alqui- lóxi carbonila tais como grupo terc-butilóxi carbonila, grupo metoxicar- bonila, e grupo etoxicarbonila; um grupo arilmetila tais como aliloxicar- bonila, grupo 9-fluorenilmetilóxi carbonila, grupo benzilóxi carbonila, grupo parametoxibenzilóxi carbonila, e grupo para (ou or- to)nitroibenzilóxi carbonila; um grupo alcanoíla tal como grupo acetila; um grupo arilmetila tais como grupo benzila e grupo trifenil metila; um grupo aroíla tal como grupo benzoíla; e um grupo aril sulfonila tais co-mo grupo 2,4-dinitrobenzeno sulfonila ou grupo ortonitrobenzeno sul-fonila. Proteção com e desproteção do grupo de proteção podem ser realizadas de acordo com um método comumente realizado.[00312] The hydroxy group, carboxy group, amino group, or the like, of La and Lb in compound (6) can be protected with a protecting group that is commonly used in organic compound synthesis, as mentioned later. Specifically, examples of the protecting group for a hydroxyl group include an alkoxymethyl group such as methoxymethyl group; an arylmethyl group such as benzyl group, 4-methoxybenzyl group, and triphenylmethyl group; an alkanoyl group such as an acetyl group; an aroyl group such as a benzoyl group; and a silyl group such as tert-butyl diphenylsilyl group. The carboxy group can be protected, for example, as an ester with an alkyl group such as a methyl group, an ethyl group, and a tert-butyl group, an allyl group, or an arylmethyl group such as a benzyl group. The amino group can be protected with a protecting group for an amino group that is generally used for peptide synthesis, for example, an alkyloxycarbonyl group such as tert-butyloxycarbonyl group, methoxycarbonyl group, and ethoxycarbonyl group; an arylmethyl group such as allyloxycarbonyl, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, paramethoxybenzyloxycarbonyl group, and para(or ortho)nitroibenzyloxycarbonyl group; an alkanoyl group such as an acetyl group; an arylmethyl group such as benzyl group and triphenyl methyl group; an aroyl group such as a benzoyl group; and an aryl sulfonyl group such as a 2,4-dinitrobenzene sulfonyl group or orthonitrobenzene sulfonyl group. Protection with and deprotection of the protection group can be carried out according to a commonly performed method.
[00313] Em relação ao grupo de proteção P1 para o grupo amino terminal do composto (6), um grupo de proteção para um grupo amino que é geralmente usado para síntese de peptídeo, por exemplo, grupo terc-butilóxi carbonila, grupo 9-fluorenilmetilóxi carbonila, e grupo ben- zilóxi carbonila, pode ser usado. Exemplos do outro grupo de proteção para um grupo amino incluem um grupo alcanoíla, tal como, grupo acetila; um grupo alcoxicarbonila tais como grupo metoxicarbonila e grupo etoxicarbonila; um grupo arilmetóxi carbonila tais como grupo parametoxibenzilóxi carbonila, e grupo para (ou orto)nitroibenzilóxi carbonila; um grupo arilmetila tais como grupo benzila e grupo trifenil metila; um grupo aroíla tal como grupo benzoíla; e um grupo aril sulfo-nila tais como grupo 2,4-dinitrobenzeno sulfonila e grupo ortonitroben- zeno sulfonila. O grupo de proteção P1 pode ser selecionado depen-dendo de, por exemplo, propriedades de um composto tendo um grupo amino a ser protegido.[00313] With respect to the P1 protecting group for the terminal amino group of compound (6), a protecting group for an amino group that is generally used for peptide synthesis, for example, tert-butyloxy carbonyl group, 9-group fluorenylmethyloxy carbonyl, and benzyloxy carbonyl group, can be used. Examples of the other protecting group for an amino group include an alkanoyl group such as acetyl group; an alkoxycarbonyl group such as methoxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group; an arylmethoxy carbonyl group such as a paramethoxybenzyloxy carbonyl group, and a para (or ortho)nitrobenzyloxy carbonyl group; an arylmethyl group such as benzyl group and triphenyl methyl group; an aroyl group such as a benzoyl group; and an aryl sulfonyl group such as 2,4-dinitrobenzene sulfonyl group and orthonitrobenzene sulfonyl group. The protecting group P1 can be selected depending on, for example, properties of a compound having an amino group to be protected.
[00314] Por desproteção do grupo de proteção P1 para o grupo amino terminal do composto (6) obtido, o composto (7) pode ser produzido. Reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.[00314] By deprotection of the P1 protecting group for the terminal amino group of the obtained compound (6), the compound (7) can be produced. Reagents and conditions can be selected depending on the protection group.
[00315] O composto (9) pode ser produzido derivatizando o ácido carboxílico de peptídeo (8) tendo o terminal N protegido com P2 em um éster ativo, anidrido de ácido misturado, ou similares, e reagindo-o com o composto (7) obtido. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar um ligação de peptídeo entre o ácido carboxílico de peptídeo (8) e o composto (7) podem ser adequa-damente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo de proteção P2 pode ser adequadamente selecionado da-queles descritos para o grupo de proteção do composto (6), e a seleção pode ser feita com base em, por exemplo, as propriedades do composto tendo um grupo amino a ser protegido. Como é geralmente usado para síntese de peptídeo, repetindo sequencialmente a reação e desproteção do aminoácido ou peptídeo constituindo o ácido carbo- xílico de peptídeo (8) para o alongamento, o composto (9) pode ser também produzido.[00315] The compound (9) can be produced by derivatizing the carboxylic acid peptide (8) having the N-terminus protected with P2 in an active ester, mixed acid anhydride, or the like, and reacting it with the compound (7) obtained. The reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used to form a peptide bond between the carboxylic acid of peptide (8) and compound (7) may be suitably selected from those described for the synthesis of compound (6) . The protecting group P2 can be suitably selected from those described for the protecting group of the compound (6), and the selection can be made based on, for example, the properties of the compound having an amino group to be protected. As it is generally used for peptide synthesis, sequentially repeating the reaction and deprotection of the amino acid or peptide constituting the peptide (8) carboxylic acid for elongation, compound (9) can also be produced.
[00316] Desprotegendo P2 como o grupo de proteção para o grupo amino do composto (9) obtido, o composto (10) pode ser produzido. Reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.[00316] By deprotecting P2 as the protecting group for the amino group of the obtained compound (9), the compound (10) can be produced. Reagents and conditions can be selected depending on the protection group.
[00317] É possível produzir o composto (2) ou (2b) derivatizando o ácido carboxílico (11) ou (11b) em um éster ativo, anidrido de ácido misturado, haleto de ácido, ou similares, e reagindo-o com o composto (10) obtido. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de peptídeo entre o ácido carboxí- lico (11) ou (11b) e o composto (10) podem ser adequadamente sele-cionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).[00317] It is possible to produce the compound (2) or (2b) by derivatizing the carboxylic acid (11) or (11b) into an active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like, and reacting it with the compound (10) obtained. The reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used to form a peptide bond between the carboxylic acid (11) or (11b) and the compound (10) may be suitably selected from those described for the synthesis of the compound (6).
[00318] O composto (9) pode ser também produzido pelo seguinte método, por exemplo.[00318] The compound (9) can also be produced by the following method, for example.
[00319] O composto (13) pode ser produzido derivatizando o ácido carboxílico de peptídeo (8) tendo o terminal N protegido com P2 em éster ativo, anidrido de ácido misturado, ou similares, e reagindo-o com o composto de amina (12) tendo o grupo carbóxi protegido com P3 na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de peptídeo entre o ácido carboxílico de peptídeo (8) e o composto (12) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo de proteção P2 para o grupo amino do composto (13) pode ser adequadamente selecionado daqueles descritos para o grupo de proteção do composto (6). Em relação ao grupo de proteção P3 para um grupo carbóxi, um grupo de proteção comumente usado como um grupo de proteção para um grupo carbóxi em química sin-tética orgânica, em particular, síntese de peptídeo pode ser usado. Especificamente, ele pode ser adequadamente selecionado daqueles descritos para o grupo de proteção do composto (6), por exemplo, és-teres com um grupo alquila, tais como, um grupo metila, um grupo eti- la, ou um terc-butila, alil ésteres, e benzil ésteres. Em tal caso, é ne-cessário que o grupo de proteção para um grupo amino e o grupo de proteção para um grupo carbóxi possam ser removidos por um diferen-te método ou diferentes condições. Por exemplo, um exemplo repre-sentativo inclui uma combinação em que P2 é um grupo terc-butilóxi carbonila e P3 é um grupo benzila. Os grupos de proteção podem ser selecionados daqueles supracitados dependendo de, por exemplo, as propriedades de um composto tendo um grupo amino e um grupo car- bóxi a ser protegido. Para remoção dos grupos de proteção, reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de prote-ção.[00319] The compound (13) can be produced by derivatizing the peptide (8) carboxylic acid having the N-terminus protected with P2 in active ester, mixed acid anhydride, or the like, and reacting it with the amine compound (12 ) having the carboxy group protected with P3 in the presence of a base. The reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used to form a peptide bond between the carboxylic acid of peptide (8) and compound (12) may be suitably selected from those described for the synthesis of compound (6). The protecting group P2 for the amino group of the compound (13) can be suitably selected from those described for the protecting group of the compound (6). Regarding the P3 protecting group for a carboxy group, a protecting group commonly used as a protecting group for a carboxy group in organic synthetic chemistry, in particular, peptide synthesis can be used. Specifically, it can be suitably selected from those described for the protecting group of compound (6), for example, esters with an alkyl group such as a methyl group, an ethyl group, or a tert-butyl group, allyl esters, and benzyl esters. In such a case, it is necessary that the protecting group for an amino group and the protecting group for a carboxy group can be removed by a different method or different conditions. For example, a representative example includes a combination where P2 is a tert-butyloxy carbonyl group and P3 is a benzyl group. Protecting groups can be selected from those mentioned above depending on, for example, the properties of a compound having an amino group and a carboxy group to be protected. For removal of protecting groups, reagents and conditions can be selected depending on the protecting group.
[00320] Por desproteção do grupo de proteção P3 para o grupo car- bóxi do composto (13) obtido, o composto (14) pode ser produzido. Reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo de proteção.[00320] By deprotection of the protecting group P3 to the carboxy group of the compound (13) obtained, the compound (14) can be produced. Reagents and conditions are selected depending on the protection group.
[00321] O composto (9) pode ser produzido derivatizando o composto (14) obtido em éster ativo, anidrido de ácido misturado, haleto de ácido, ou similares, e reagindo com o composto (4) na presença de uma base. Para a reação, condições e reagentes de reação que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem ser também usados, e as condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).Compound (9) can be produced by derivatizing compound (14) obtained into active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like, and reacting with compound (4) in the presence of a base. For the reaction, reaction conditions and reagents that are generally used for peptide synthesis may also be used, and the reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used for the reaction may be suitably selected from those described for the synthesis of the compound. (6).
[00322] O composto (2) ou (2b) pode ser também produzido pelo seguinte método, por exemplo.The compound (2) or (2b) can also be produced by the following method, for example.
[00323] Por desproteção do grupo de proteção P2 para o grupo amino do composto (13), o composto (15) pode ser produzido. Reagentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção.[00323] By deprotection of the P2 protecting group to the amino group of the compound (13), the compound (15) can be produced. Reagents and conditions can be selected depending on the protection group.
[00324] O composto (16) ou (16b) pode ser produzido derivatizando o derivado de ácido carboxílico (11) ou (11b) em éster ativo, anidrido de ácido misturado, haleto de ácido, ou similares, e reagindo-o com o composto (15) obtido na presença de uma base. As condições de rea-ção, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de amido entre o ácido carboxílico de peptídeo (11) ou (11b) e o composto (15) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6).[00324] The compound (16) or (16b) can be produced by derivatizing the carboxylic acid derivative (11) or (11b) into active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like, and reacting it with the compound (15) obtained in the presence of a base. The reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used to form a starch bond between the carboxylic acid of peptide (11) or (11b) and compound (15) may be suitably selected from those described for the synthesis of compound (6).
[00325] Por desproteção do grupo de proteção para o grupo carbóxi do composto (16) ou (16b) obtido, o composto (17) ou (17b) pode ser produzido. Isto pode ser realizado similar à desproteção do grupo car- bóxi para produzir o composto (14).[00325] By deprotection of the protecting group for the carboxy group of the compound (16) or (16b) obtained, the compound (17) or (17b) can be produced. This can be done similar to the deprotection of the carboxy group to produce compound (14).
[00326] O composto (2) ou (2b) pode ser produzido derivatizando o composto (17) ou (17b) em éster ativo, anidrido de ácido misturado, haleto de ácido, ou similares, e reagindo-o com o composto (4) na pre-sença de uma base. Para a reação, condições e reagentes de reação que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem ser tam-bém usados, e as condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). 5. Método de produção 5[00326] The compound (2) or (2b) can be produced by derivatizing the compound (17) or (17b) in active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like, and reacting it with the compound (4 ) in the presence of a base. For the reaction, reaction conditions and reagents that are generally used for peptide synthesis can also be used, and the reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used for the reaction can be suitably selected from those described for the synthesis. of the compound (6). 5. Production method 5
[00327] O composto representado pela fórmula (2) de um intermediário pode ser também produzido pelo seguinte método. Fórmula 61
[00328] Na fórmula, L1' corresponde a L1 tendo uma estrutura em que o terminal é convertido em um grupo maleimidila ou um grupo ha- loacetila, e P4 representa um grupo de proteção.[00328] In the formula, L1' corresponds to L1 having a structure in which the terminal is converted into a maleimidyl group or a haloacetyl group, and P4 represents a protecting group.
[00329] O composto (19) pode ser produzido derivatizando o composto (11) em éster ativo, anidrido de ácido misturado, ou similares, e reagindo-o com o ácido carboxílico de peptídeo (18) tendo o terminal C protegido com P4 na presença de uma base. As condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para formar uma ligação de peptídeo entre o ácido carboxílico de peptídeo (18) e o composto (11) podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). O grupo de proteção P4 para o grupo carbóxi do composto (18) pode ser adequadamente selecionado daqueles descritos para o grupo de proteção do composto (6).[00329] Compound (19) can be produced by derivatizing compound (11) into active ester, mixed acid anhydride, or the like, and reacting it with the carboxylic acid of peptide (18) having the C-terminus protected with P4 in the presence of a base. The reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used to form a peptide bond between the carboxylic acid of peptide (18) and compound (11) may be suitably selected from those described for the synthesis of compound (6). The protecting group P4 for the carboxy group of the compound (18) can be suitably selected from those described for the protecting group of the compound (6).
[00330] Por desproteção do grupo de proteção para o grupo carbóxi do composto (19) obtido, o composto (20) pode ser produzido. Isto pode ser realizado similar à desproteção do grupo carbóxi para produzir o composto (14).[00330] By deprotection of the protecting group for the carboxy group of the compound (19) obtained, the compound (20) can be produced. This can be done similar to the deprotection of the carboxy group to produce compound (14).
[00331] O composto (2) pode ser produzido derivatizando o composto (20) obtido em éster ativo, anidrido de ácido misturado, ou similares, e reagindo-o com o composto (7). Para a reação, condições e reagentes de reação que são geralmente usados para síntese de pep- tídeo podem ser também usados, e as condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para a reação podem ser adequa-damente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). 6. Método de produção 6The compound (2) can be produced by derivatizing the obtained compound (20) into active ester, mixed acid anhydride, or the like, and reacting it with the compound (7). For the reaction, reaction conditions and reagents that are generally used for peptide synthesis can also be used, and the reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used for the reaction can be suitably selected from those described for the synthesis of the compound (6). 6. Production method 6
[00332] O intermediário de produção (2a) descrito no Método de produção 2 em que L2' corresponde a L2 tendo uma estrutura em que o terminal é convertido em um grupo mercaptoalcanoíla pode ser produ-zido pelo seguinte método. Fórmula 62
[00333] O composto (2a) pode ser produzido derivatizando o ácido carboxílico (21) tendo um grupo mercapto terminal em éster ativo, ani- drido de ácido misturado, ou similares, e reagindo-o com o composto (10). Para a reação, condições e reagentes de reação que são geral-mente usados para síntese de peptídeo podem ser também usados, e as condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados pa-ra a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles descri-tos para a síntese do composto (4).The compound (2a) can be produced by derivatizing the carboxylic acid (21) having a terminal mercapto group into active ester, mixed acid anhydride, or the like, and reacting it with the compound (10). For the reaction, reaction conditions and reagents which are generally used for peptide synthesis may also be used, and the reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used for the reaction may be suitably selected from those described. for the synthesis of the compound (4).
[00334] Além disso, o composto (23) pode ser produzido derivati- zando o composto (21) em éster ativo, anidrido de ácido misturado, haleto de ácido, ou similares, reagindo-o com o composto (15), e des-protegendo o grupo de proteção para o grupo carbóxi do composto (22) obtido.[00334] Furthermore, the compound (23) can be produced by derivatizing the compound (21) in active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like, reacting it with the compound (15), and des -protecting the protecting group for the carboxy group of the compound (22) obtained.
[00335] O composto (2a) pode ser produzido derivatizando o composto (23) em éster ativo, anidrido de ácido misturado, haleto de ácido, ou similares, e reagindo-o com o composto (4) na presença de uma base. Para a reação, condições e reagentes de reação que são geralmente usados para síntese de peptídeo podem ser também usados, e as condições de reação, reagentes, base, e solvente inerte usados para a reação podem ser adequadamente selecionados daqueles descritos para a síntese do composto (6). 7. Método de produção 7The compound (2a) can be produced by derivatizing the compound (23) in active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like, and reacting it with the compound (4) in the presence of a base. For the reaction, reaction conditions and reagents that are generally used for peptide synthesis may also be used, and the reaction conditions, reagents, base, and inert solvent used for the reaction may be suitably selected from those described for the synthesis of the compound. (6). 7. Production method 7
[00336] A seguir, o método para produzir o composto (10c) tendo n1 = 1, La = O, e Lb = CR2(-R3) no intermediário de produção (10) descrito no Método de produção 4 é descrito em detalhes. O composto repre-sentado pela fórmula (10c), um sal ou um solvato do mesmo pode ser produzido de acordo com o seguinte método, por exemplo. Fórmula 63
[00337] Na fórmula, LP, R2, e R3 são como definidos acima, L repre-senta um grupo acetila, um átomo de hidrogênio, ou similares, X e Y cada representa um oligopeptídeo consistindo em 1 a 3 aminoácidos, P5 e P7 cada representa um grupo de proteção para um grupo amino, e P6 representa um grupo de proteção para um grupo carbóxi.[00337] In the formula, LP, R2, and R3 are as defined above, L represents an acetyl group, a hydrogen atom, or the like, X and Y each represent an oligopeptide consisting of 1 to 3 amino acids, P5 and P7 each represents a protecting group for an amino group, and P6 represents a protecting group for a carboxy group.
[00338] Um composto representado pela fórmula (24) pode ser pro-duzido usando ou aplicando o método descrito em Patente Japonesa Aberta à Inspeção Pública No. 2002-60351 ou a literatura (J. Org. Chem., Vol. 51, página 3196, 1986), e se necessário, removendo os grupos de proteção ou modificando os grupos funcionais. Alternativa-mente, pode ser também obtido tratando um aminoácido com um grupo amino terminal protegido ou amida de ácido de oligopeptídeo com grupo amino protegido com aldeído ou cetona.[00338] A compound represented by formula (24) can be produced using or applying the method described in Japanese Patent Laid-open to Public Inspectorate No. 2002-60351 or the literature (J. Org. Chem., Vol. 51, page 3196, 1986), and if necessary, removing the protecting groups or modifying the functional groups. Alternatively, it can also be obtained by treating an amino acid with a terminal amino group protected or oligopeptide acid amide with amino group protected with aldehyde or ketone.
[00339] Reagindo o composto (24) com o composto (25) tendo um grupo hidroxila em uma temperatura variando de sob resfriamento para temperatura ambiente em um solvente inerte na presença de um ácido ou uma base, o composto (26) pode ser produzido. Exemplos do ácido que podem ser usados incluem ácido inorgânico, tais como, áci-do hidrofluórico, ácido hidroclórico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, e ácido bórico; um ácido orgânico, tais como, ácido acético, ácido cítrico, ácido paratoluenossulfônico, e ácido metanossulfônico; e um ácido de Lewis, tais como, tetrafluoroborato, cloreto de zinco, clo-reto de estanho, cloreto de alumínio, e cloreto de feroo. Ácido parato- luenossulfônico é particularmente preferido. Em relação à base a ser usada, qualquer uma das bases supracitadas pode ser adequadamente selecionada e usada. Exemplos preferidos das mesmas incluem um alcóxido de metal de álcali tal como terc-butóxido de potássio, um hi-dróxido de metal de álcali tais como hidróxido de sódio e hidróxido de potássio; hidreto de metal de álcali tais como hidreto de sódio e hidreto de potássio; base organometálica representada por dialquilamino lítio tal como di-isopropilamida de lítio; e base organometálica de bissilila- mina tal como bis(trimetilsilil)amida de lítio. Exemplos do solvente a ser usado para a reação incluem um solvente de éter tais como tetraidro- furano e 1,4-dioxano; e um solvente de hidrocarboneto aromático tais como benzeno e tolueno. Aqueles solventes podem ser preparados como uma mistura com água. Além disso, o grupo de proteção para um grupo amino como exemplificado por P5 não é particularmente limitado se ele for um grupo comumente usado para a proteção de um grupo amino. Exemplos representativos incluem os grupos de proteção para um grupo amino que são descritos no Método de produção 4. En-tretanto, na presente reação, o grupo de proteção para um grupo amino como exemplificado por P5 pode ser clivado. Em tal caso, é necessário realizar a reação com um reagente adequado para proteger um grupo amino como pode ser requerido.[00339] By reacting the compound (24) with the compound (25) having a hydroxyl group at a temperature ranging from under cooling to room temperature in an inert solvent in the presence of an acid or a base, the compound (26) can be produced . Examples of the acid that can be used include inorganic acid such as hydrofluoric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, and boric acid; an organic acid such as acetic acid, citric acid, paratoluenesulfonic acid, and methanesulfonic acid; and a Lewis acid such as tetrafluoroborate, zinc chloride, tin chloride, aluminum chloride, and ferrous chloride. Parato-Luenesulfonic acid is particularly preferred. With regard to the base to be used, any of the aforementioned bases can be properly selected and used. Preferred examples thereof include an alkali metal alkoxide such as potassium tert-butoxide, an alkali metal hydroxide such as sodium hydroxide and potassium hydroxide; alkali metal hydride such as sodium hydride and potassium hydride; organometallic base represented by dialkylamino lithium such as lithium diisopropylamide; and bissilylamine organometallic base such as lithium bis(trimethylsilyl)amide. Examples of the solvent to be used for the reaction include an ether solvent such as tetrahydrofuran and 1,4-dioxane; and an aromatic hydrocarbon solvent such as benzene and toluene. Those solvents can be prepared as a mixture with water. Furthermore, the protecting group for an amino group as exemplified by P5 is not particularly limited if it is a group commonly used for protecting an amino group. Representative examples include the protecting groups for an amino group which are described in Production Method 4. However, in the present reaction, the protecting group for an amino group as exemplified by P5 can be cleaved. In such a case, it is necessary to carry out the reaction with a suitable reagent to protect an amino group as may be required.
[00340] O composto (27) pode ser produzido removendo o grupo de proteção P6 do composto (26). Aqui, apesar dos exemplos representa-tivos do grupo de proteção para um grupo carbóxi como exemplificado por P6 serem descritos no Método de produção 4, é desejável neste caso que o grupo de proteção P5 para um grupo amino e o grupo de proteção P6 para um grupo carbóxi sejam os grupos de proteção que podem ser removidos por um diferente método ou diferentes condições. Por exemplo, um exemplo representativo inclui uma combinação em que P5 é um grupo 9-fluorenilmetilóxi carbonila e P6 é um grupo benzila. Os grupos de proteção podem ser selecionados dependendo de, por exemplo, as propriedades de um composto tendo um grupo amino e um grupo carbóxi a serem protegidos. Para remoção dos gru-pos de proteção, reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo de proteção.[00340] The compound (27) can be produced by removing the P6 protecting group from the compound (26). Here, although representative examples of the protecting group for a carboxy group as exemplified by P6 are described in Production Method 4, it is desirable in this case that the protecting group P5 for an amino group and the protecting group P6 for an carboxy group are protecting groups that can be removed by a different method or different conditions. For example, a representative example includes a combination where P5 is a 9-fluorenylmethyloxy carbonyl group and P6 is a benzyl group. Protecting groups can be selected depending on, for example, the properties of a compound having an amino group and a carboxy group to be protected. For removal of protective groups, reagents and conditions are selected depending on the protective group.
[00341] O composto (29) pode ser produzido derivatizando o ácido carboxílico (27) em éster ativo, anidrido de ácido misturado, haleto de ácido, ou similares, e reagindo-o com o composto (4) e um sal farma- cologicamente aceitável do mesmo para produzir o composto (28) se-guido por remoção do grupo de proteção P5 do composto (28) obtido. Para a reação entre o composto (4) e o ácido carboxílico (27) e a rea-ção para remover o grupo de proteção P6, os mesmos reagentes e condições de reação como aqueles descritos para Método de produção 4 podem ser usados.[00341] The compound (29) can be produced by derivatizing the carboxylic acid (27) into active ester, mixed acid anhydride, acid halide, or the like, and reacting it with the compound (4) and a salt pharmacologically acceptable thereof to produce the compound (28) followed by removing the P5 protecting group from the compound (28) obtained. For the reaction between the compound (4) and the carboxylic acid (27) and the reaction to remove the P6 protecting group, the same reagents and reaction conditions as those described for Production method 4 can be used.
[00342] O composto (10c) pode ser produzido reagindo o composto (29) com um aminoácido com grupo amino terminal protegido ou o oli- gopeptídeo (30) com grupo amino protegido para produzir o composto (9c) e removendo o grupo de proteção P7 do composto (9c) obtido. O grupo de proteção para um grupo amino como exemplificado por P7 não é particularmente limitado se ele for geralmente usado para a proteção de um grupo amino. Exemplos representativos do mesmo incluem os grupos de proteção para um grupo amino que são descritos no Método de produção 4. Para remover o grupo de proteção, reagentes e condições são selecionados dependendo do grupo de proteção. Pa ra a reação entre o composto (29) e o composto (30), condições e re-agentes de reação que são comumente usados para síntese de peptí- deo podem ser empregados. O composto (10c) produzido pelo método supracitado pode ser derivatizado no composto (1) da presente inven-ção de acordo com o método descrito acima. 8. Método de produção 8The compound (10c) can be produced by reacting the compound (29) with an amino acid with terminal amino group protected or the oligopeptide (30) with amino group protected to produce the compound (9c) and removing the protecting group P7 of compound (9c) obtained. The protecting group for an amino group as exemplified by P7 is not particularly limited if it is generally used for protecting an amino group. Representative examples thereof include the protecting groups for an amino group which are described in Production Method 4. To remove the protecting group, reagents and conditions are selected depending on the protecting group. For the reaction between compound (29) and compound (30), reaction conditions and reagents that are commonly used for peptide synthesis can be employed. The compound (10c) produced by the above method can be derivatized to the compound (1) of the present invention according to the method described above. 8. Production method 8
[00343] A seguir, o método para produzir o composto (2c) tendo n1 = 1, La = O, e Lb = CR2(-R3) no intermediário de produção (2) descrito no Método de produção 4 é descrito em detalhes. O composto repre-sentado pela fórmula (2c), um sal ou um solvato do mesmo pode ser produzido de acordo com o seguinte método, por exemplo. Fórmula 64
[00344] Na fórmula, L1', L2, LP, R2, e R3 são como definidos acima, Z representa um oligopeptídeo consistindo em 1 a 3 aminoácidos, P8 re-presenta um grupo de proteção para um grupo amino, e P9 representa um grupo de proteção para um grupo carbóxi.[00344] In the formula, L1', L2, LP, R2, and R3 are as defined above, Z represents an oligopeptide consisting of 1 to 3 amino acids, P8 represents a protecting group for an amino group, and P9 represents a protecting group for a carboxy group.
[00345] O composto (33) pode ser produzido removendo o grupo de proteção P8 do aminoácido ou oligopeptídeo (31) com grupo amino terminal protegido e grupo carbóxi para produzir o composto (32) e re-agindo a forma amina obtida (32) com o composto (11). O grupo de proteção para um grupo amino como exemplificado por P8 não é parti-cularmente limitado se ele for um grupo comumente usado para a pro-teção de um grupo amino. Exemplos representativos incluem os grupos de proteção para um grupo amino que são descritos no Método de produção 4. Além disso, para remover o grupo de proteção P8, reagen-tes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de pro-teção. Para a reação entre o composto (32) e o ácido carboxílico (11), os mesmos reagentes e condições de reação como aqueles descritos para Método de produção 4 podem ser usados.[00345] The compound (33) can be produced by removing the P8 protecting group of the amino acid or oligopeptide (31) with terminal protected amino group and carboxy group to produce the compound (32) and re-acting the obtained amine form (32) with the compound (11). The protecting group for an amino group as exemplified by P8 is not particularly limited if it is a group commonly used for protecting an amino group. Representative examples include the protecting groups for an amino group which are described in Production Method 4. Furthermore, to remove the P8 protecting group, reagents and conditions can be selected depending on the protecting group. For the reaction between compound (32) and carboxylic acid (11), the same reagents and reaction conditions as those described for Production method 4 can be used.
[00346] O intermediário de produção (2c) pode ser produzido remo-vendo o grupo de proteção P9 do composto (33) para produzir o com-posto (34) e reagindo o ácido carboxílico obtido (34) com o composto (29). Os exemplos representativos do grupo de proteção para um grupo carbóxi como exemplificado por P9 são descritos no Método de pro-dução 4. Para a reação de desproteção dos mesmos, os mesmos rea-gentes e condições de reação como aqueles descritos para Método de produção 4 podem ser usados. Para a reação entre o composto (29) e o ácido carboxílico (34), condições e reagentes de reação que são ge-ralmente usados para síntese de peptídeo podem ser também usados. O composto (2c) produzido pelo método supracitado pode ser derivati- zado no composto (1) da presente invenção de acordo com o método descrito acima. 9. Método de produção 9[00346] The production intermediate (2c) can be produced by removing the P9 protecting group from the compound (33) to produce the compound (34) and reacting the obtained carboxylic acid (34) with the compound (29) . Representative examples of the protecting group for a carboxy group as exemplified by P9 are described in Production Method 4. For the deprotection reaction thereof, the same reagents and reaction conditions as those described for Production Method 4 can be used. For the reaction between compound (29) and carboxylic acid (34), reaction conditions and reagents that are generally used for peptide synthesis can also be used. The compound (2c) produced by the above method can be derivatized to the compound (1) of the present invention according to the method described above. 9. Production method 9
[00347] A seguir, o método para produzir o composto (17c) tendo n1 = 1, La = O, e Lb = CR2(-R3) no intermediário de produção (17) descrito no Método de produção 4 é descrito em detalhes. O composto repre-sentado pela fórmula (17c), um sal ou um solvato do mesmo pode ser também produzido de acordo com o seguinte método, por exemplo. Fórmula 65
[00348] O composto (36) pode ser produzido por desproteção do grupo de proteção P5 para o grupo amino do composto (26) com grupo amino terminal protegido e grupo carbóxi para produzir o composto (35) e reagindo a forma de amina obtida (35) com o oligopeptídeo (30) com grupo amino terminal protegido ou grupo amino protegido. O grupo de proteção para um grupo amino como exemplificado por P5 não é particularmente limitado se ele for um grupo comumente usado para a proteção de um grupo amino. Exemplos representativos incluem os grupos de proteção para um grupo amino que são descritos no Método de produção 4. Além disso, para remover o grupo de proteção P5, rea-gentes e condições podem ser selecionados dependendo do grupo de proteção. Aqui, apesar dos exemplos representativos do grupo de pro-teção para um grupo carbóxi como exemplificado por P6 e o grupo de proteção para um grupo amino como exemplificado por P7 incluirem os grupos de proteção para um grupo carbóxi e um grupo amino que são descritos no Método de produção 4, é desejável que o grupo de prote-ção P6 para um grupo carbóxi e o grupo de proteção P7 para um grupo amino sejam os grupos de proteção que podem ser removidos pelo mesmo método ou mesmas condições. Por exemplo, um exemplo re-presentativo inclui uma combinação em que P6 é um grupo benzil éster e P7 é um grupo benzilóxi carbonila.[00348] The compound (36) can be produced by deprotecting the P5 protecting group to the amino group of the compound (26) with terminal protected amino group and carboxy group to produce the compound (35) and reacting the obtained amine form ( 35) with the oligopeptide (30) with terminal amino group protected or amino group protected. The protecting group for an amino group as exemplified by P5 is not particularly limited if it is a group commonly used for protecting an amino group. Representative examples include the protecting groups for an amino group which are described in Production method 4. Furthermore, to remove the P5 protecting group, reagents and conditions can be selected depending on the protecting group. Here, although representative examples of the protecting group for a carboxy group as exemplified by P6 and the protecting group for an amino group as exemplified by P7 include the protecting groups for a carboxy group and an amino group that are described in Production method 4, it is desirable that the P6 protecting group for a carboxy group and the P7 protecting group for an amino group are the protecting groups that can be removed by the same method or same conditions. For example, a representative example includes a combination where P6 is a benzyl ester group and P7 is a benzyloxy carbonyl group.
[00349] O composto (37) pode ser produzido removendo o grupo de proteção P6 para o grupo carbóxi do composto (36) e o grupo de pro-teção P7 para o grupo amino do composto (36). O composto (37) pode ser também produzido sequencialmente removendo o grupo de prote-ção P6 para o grupo carbóxi e o grupo de proteção P7 para o grupo amino, ou o composto (37) pode ser produzido removendo de uma vêz ambos os grupos de proteção P6 e P7 que podem ser removidos pelo mesmo método ou mesmas condições.The compound (37) can be produced by removing the protecting group P6 for the carboxy group of the compound (36) and the protecting group P7 for the amino group of the compound (36). The compound (37) can also be produced sequentially by removing the P6 protecting group for the carboxy group and the P7 protecting group for the amino group, or the compound (37) can be produced by removing both of both groups at once. P6 and P7 protection that can be removed by the same method or same conditions.
[00350] O composto (17c) pode ser produzido reagindo o composto obtido (37) com o composto (11). Para a reação entre o composto (37) e o composto (11), os mesmos reagentes e condições de reação como aqueles descritos para Método de produção 4 podem ser usados. No precedente, o composto representado pela fórmula a seguir: Fórmula 66
[00351] Especificamente, na fórmula acima, Q é (maleimid-N-il)-, HS-, X-CH2-C(=O)-NH-, ou (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, X é um átomo de bromo ou um átomo de iodo, nQ é um número inteiro de 2 a 8, L2a representa -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- ou uma ligação simples, em que n5 representa um número inteiro de 1 a 6, LP representa um resíduo de peptídeo consistindo em 2 a 7 aminoáci- dos, n1 representa um número inteiro de 0 a 6, La representa -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O-, ou uma ligação simples, em que n7 representa um número inteiro de 1 a 6, R1 representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)n8-COOH, ou -(CH2)n9-OH, n8 representa um número inteiro de 1 a 4, n9 representa um número inteiro de 1 a 6, Lb representa -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, ou uma ligação simples, em que R2 e R3 cada um independentemente representa um átomo de hidrogênio, um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-COOH, ou -(CH2)nc-OH, R4 representa um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo 1 a 6 átomos de carbono, na representa um número inteiro de 0 a 6, nb representa um número inteiro de 1 a 4, nc representa um número inteiro de 1 a 4, con-tanto que quando na for 0, R2 e R3 não sejam iguais um ao outro, Lc representa -CH2- ou -C(=O)-, (maleimid-N-il)- é um grupo tendo uma estrutura representada pela fórmula a seguir: Fórmula 67
[00352] Um composto em que Lc é -C(=O)- é preferido como um intermediário de produção.[00352] A compound where Lc is -C(=O)- is preferred as a production intermediate.
[00353] Em relação ao resíduo de peptídeo de LP, um composto de um resíduo de aminoácido consistindo em um aminoácido selecionado de fenilalanina, glicina, valina, lisina, citrulina, serina, ácido glutâmico, e ácido aspártico é preferido como um intermediário de produção. Entre aqueles resíduos de peptídeo, um composto em que LP é um resíduo de peptídeo consistindo em 4 aminoácidos é preferido como um intermediário de produção. Mais especificamente, um composto em que LP é -GGFG- é preferido como um intermediário de produção.[00353] With respect to the LP peptide residue, a compound of an amino acid residue consisting of an amino acid selected from phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid, and aspartic acid is preferred as a production intermediate . Among those peptide residues, a compound where LP is a peptide residue consisting of 4 amino acids is preferred as a production intermediate. More specifically, a compound where LP is -GGFG- is preferred as a production intermediate.
[00354] Além disso, em relação ao -NH-(CH2)n1-La-Lb-, um composto de -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é preferido como um intermediário de produção. Um composto de NH- CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-(CH2)2-O-CH2-C(=O)- é mais preferido.[00354] Furthermore, in relation to -NH-(CH2)n1-La-Lb-, a compound of -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, - NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2-O-CH2- is preferred as a production intermediate. A compound of NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, or -NH-(CH2)2-O-CH2-C(=O)- is more preferred.
[00355] Em relação ao nQ, um composto em que ele é um número inteiro de 2 a 6 é preferido como um intermediário de produção.[00355] Regarding nQ, a compound where it is an integer from 2 to 6 is preferred as a production intermediate.
[00356] Um composto em que L2a é uma ligação simples ou n5 é um número inteiro de 2 a 4 é preferido como um intermediário de produção.[00356] A compound where L2a is a single bond or n5 is an integer from 2 to 4 is preferred as a production intermediate.
[00357] Quando Q for (maleimid-N-il)-, um composto em que nQ é um número inteiro de 2 a 5, L2a é uma ligação simples, e -NH-(CH2)n1- La-Lb- é -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é preferido como um intermediário de produção. Um composto em que -NH- (CH2)n1-La-Lb- é -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é mais preferido. Um composto em que nQ é um número inteiro de 2 ou 5 é também preferido.[00357] When Q is (maleimid-N-yl)-, a compound where nQ is an integer from 2 to 5, L2a is a single bond, and -NH-(CH2)n1-La-Lb- is - NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2-O-CH2- is preferred as a production intermediate . A compound where -NH-(CH2)n1-La-Lb- is -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2-O-CH2- is most preferred. A compound where nQ is an integer of 2 or 5 is also preferred.
[00358] Além disso, quando Q for (maleimid-N-il)-, um composto em que nQ é um número inteiro de 2 a 5, L2a é -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2- CH2-C(=O)-, n5 é um número inteiro de 2 a 4, e -NH-(CH2)n1-La-Lb- é - NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é preferido como um intermediário de produção. Um composto em que n5 é um número inteiro de 2 ou 4 é mais preferido. Um composto em que - NH-(CH2)n1-La-Lb- é -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH- CH2CH2-O-CH2- é também preferido.[00358] Furthermore, when Q is (maleimid-N-yl)-, a compound where nQ is an integer from 2 to 5, L2a is -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2- C(=O)-, n5 is an integer from 2 to 4, and -NH-(CH2)n1-La-Lb- is -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, - NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2-O-CH2- is preferred as a production intermediate. A compound where n5 is an integer of 2 or 4 is more preferred. A compound in which -NH-(CH2)n1-La-Lb- is -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2-O-CH2- is also preferred.
[00359] Quando Q for HS-, um composto em que nQ é um número inteiro de 2 a 5, L2a é uma ligação simples, e -NH-(CH2)n1-La-Lb- é -NH- CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é preferido como um intermediário de produção. Um composto em que -NH- (CH2)n1-La-Lb- é -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2- O-CH2- é mais preferido.[00359] When Q is HS-, a compound where nQ is an integer from 2 to 5, L2a is a single bond, and -NH-(CH2)n1-La-Lb- is -NH-CH2CH2-, - NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2-O-CH2- is preferred as a production intermediate. A compound in which -NH-(CH2)n1-La-Lb- is -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2-O-CH2- is more preferred.
[00360] Quando Q for X-CH2-C(=O)-NH-, um composto em que X é um átomo de bromo é preferido como um intermediário de produção. Um composto em que nQ é um número inteiro de 2 a 8 é preferido, também um composto em que L2a é uma ligação simples é preferido, e um composto em que -NH-(CH2)n1-La-Lb- é -NH-CH2CH2CH2-, -NH- CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é preferido como um intermediário de produção.[00360] When Q is X-CH2-C(=O)-NH-, a compound in which X is a bromine atom is preferred as a production intermediate. A compound where nQ is an integer from 2 to 8 is preferred, also a compound where L2a is a single bond is preferred, and a compound where -NH-(CH2)n1-La-Lb- is -NH- CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2-O-CH2- is preferred as a production intermediate.
[00361] Quando Q for (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-, um composto em que nQ é um número inteiro de 2 a 5, L2a é uma ligação simples, e -NH-(CH2)n1-La-Lb- é -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH- CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, ou - NH-CH2CH2-O-CH2- é preferido como um intermediário de produção. Um composto em que -NH-(CH2)n1-La-Lb- é -NH-CH2CH2CH2-, -NH- CH2-O-CH2-, ou -NH-CH2CH2-O-CH2- é mais preferido.[00361] When Q is (pyrrolidine-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-, a compound where nQ is an integer from 2 to 5, L2a is a single bond, and -NH -(CH2)n1-La-Lb- is -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2 -O-CH2- is preferred as a production intermediate. A compound in which -NH-(CH2)n1-La-Lb- is -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, or -NH-CH2CH2-O-CH2- is more preferred.
[00362] Mais especificamente, os seguintes são compostos preferido como intermediários de produção. (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)- (NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH- CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2- C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2- C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-il)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) Br-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH- DX) (pirrolidina-2,5-diona-N-il)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)- GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)[00362] More specifically, the following compounds are preferred as production intermediates. (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-GGFG -NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) ( maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG- NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH- DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C (=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O )-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (maleimid-N-yl)-CH2CH2-C(=O)-NH -CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O- CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2- C(=O)-(NH-DX) Br-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX) (pyrrolidine -2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)
[00363] Entretanto, o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção, quando é deixado no ar ou recristalizado, pode absorver umidade para ter água de adsorção ou transformar um hidrato, e um tal composto e um sal contendo água são também incluídos na presente invenção.[00363] However, the antibody-drug conjugate of the present invention, when it is left in the air or recrystallized, can absorb moisture to have adsorption water or transform a hydrate, and such a compound and a salt containing water are also included in the present invention.
[00364] Um composto rotulado com vários isótopos radioativos ou não radioativos é também incluído na presente invenção. Um ou mais átomos constituindo o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção podem conter um isótopo atômico em relação não natural. Exemplos do isótopo atômico incluem deutério (2H), trítio (3H), iodo- 125 (125I), e carbono-14 (14C). Além disso, o composto da presente in-venção pode ser radioativo rotulado com um isótopo radioativo tais como trítio (3H), iodo-125 (125I), carbono-14 (14C), cobre-64 (64Cu), zir- cônio-89 (89Zr), iodo-124 (124I), flúor-18 (18F), índio-111 (111I), carbono- 11 (11C) e iodo-131 (131I). O composto rotulado com um isótopo radioa-tivo é útil como um agente terapêutico ou profilático, um reagente para pesquisa tal como um reagente de ensaio e um agente para diagnósti-co tal como um agente de imagem de diagnóstico in vivo. Sem ser re-lacionado à radioatividade, qualquer tipo de variante de isótopo do conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção está dentro do escopo da presente invenção. Fármacos[00364] A compound labeled with various radioactive or non-radioactive isotopes is also included in the present invention. One or more atoms constituting the antibody-drug conjugate of the present invention may contain an atomic isotope in unnatural relationship. Examples of the atomic isotope include deuterium (2H), tritium (3H), iodine-125 (125I), and carbon-14 (14C). Furthermore, the compound of the present invention may be radioactively labeled with a radioactive isotope such as tritium (3H), iodine-125 (125I), carbon-14 (14C), copper-64 (64Cu), zirconium- 89 (89Zr), iodine-124 (124I), fluorine-18 (18F), indium-111 (111I), carbon-11 (11C) and iodine-131 (131I). The compound labeled with a radioactive isotope is useful as a therapeutic or prophylactic agent, a screening reagent such as an assay reagent, and a diagnostic agent such as an in vivo diagnostic imaging agent. Without being related to radioactivity, any type of isotope variant of the antibody-drug conjugate of the present invention is within the scope of the present invention. Drugs
[00365] O conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção exibe a atividade citotóxica contra células de câncer, e desse modo, pode ser usado como um fármaco, particularmente como um agente terapêutico e/ou agente profilático para câncer.[00365] The antibody-drug conjugate of the present invention exhibits cytotoxic activity against cancer cells, and thus, can be used as a drug, particularly as a therapeutic and/or prophylactic agent for cancer.
[00366] Exemplos do tipo de câncer ao qual o conjugado de anti- corpo-fármaco da presente invenção é aplicado incluem câncer de pulmão, câncer renal, câncer urotelial, câncer colorretal, câncer de próstata, glioblastoma multiforme, câncer de ovário, câncer pancreáti- co, câncer de mama, melanoma, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de estômago, ou câncer de esôfago, entretanto, não está limi-tado a eles, contanto que seja uma célula câncer expressando, em uma célula de câncer como um objeto de tratamento, uma proteína que o anticorpo dentro do conjugado de anticorpo-fármaco possa reconhecer.[00366] Examples of the type of cancer to which the antibody-drug conjugate of the present invention is applied include lung cancer, kidney cancer, urothelial cancer, colorectal cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer, pancreatic cancer - co, breast cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer, stomach cancer, or esophageal cancer, however, is not limited to them, as long as it is a cancer cell expressing, in a cancer cell like an object of treatment, a protein that the antibody within the antibody-drug conjugate can recognize.
[00367] O conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção pode ser preferivelmente administrado a um mamífero, porém é mais preferivelmente administrado a um humano.The antibody-drug conjugate of the present invention can preferably be administered to a mammal, but is more preferably administered to a human.
[00368] Substâncias usadas em uma composição farmacêutica con-tendo conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção podem ser adequadamente selecionadas e aplicadas de aditivos de formulação ou similares, que são geralmente usados na técnica, tendo em vista a concentração de dosagem ou administração.[00368] Substances used in a pharmaceutical composition containing antibody-drug conjugate of the present invention may be suitably selected and applied from formulation additives or the like, which are generally used in the art, in view of the dosage or administration concentration.
[00369] O conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção pode ser administrado como uma composição farmacêutica contendo pelo menos um ingrediente farmaceuticamente adequado.[00369] The antibody-drug conjugate of the present invention can be administered as a pharmaceutical composition containing at least one pharmaceutically suitable ingredient.
[00370] Por exemplo, a composição farmacêutica acima tipicamente contém pelo menos um veículo farmacêutico (por exemplo, líquido es-terilizado). Por exemplo, água e óleo (óleo de petróleo e óleo de origem animal, origem de planta, ou origem sintética (o óleo pode ser, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo ou similares)). Água é um veículo mais típico quando a com-posição farmacêutica acima for administrada intravenosamente. Solu-ção salina, uma solução de dextrose aquosa, e uma solução de glice- rol aquosa podem ser também usadas como um veículo líquido, em particular, para uma solução de injeção. Um veículo farmacêutico ade-quado é conhecido na técnica. Se desejado, a composição acima pode também conter uma quantidade de traço de um agente umectante, um agente emulsificante, ou um agente de tamponamento de pH. Exem-plos de veículo farmacêutico adequado são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. As formulações corres-pondem a um modo de administração.[00370] For example, the above pharmaceutical composition typically contains at least one pharmaceutical carrier (eg, sterile liquid). For example, water and oil (petroleum oil and oil of animal origin, plant origin, or synthetic origin (the oil can be, for example, peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil or the like)) . Water is a more typical vehicle when the above pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solution, an aqueous dextrose solution, and an aqueous glycerol solution can also be used as a liquid vehicle, in particular, for an injection solution. A suitable pharmaceutical carrier is known in the art. If desired, the above composition may also contain a trace amount of a wetting agent, an emulsifying agent, or a pH buffering agent. Examples of suitable pharmaceutical carriers are described in "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin. The formulations correspond to a mode of administration.
[00371] Vários sistemas de liberação são conhecidos e eles podem ser usados para administrar o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção. Exemplos da rotina de administração incluem rotinas intradérmicas, intramusculares, intraperitoneais, intravenosas, e sub-cutâneas, porém não limitados a isso. A administração pode ser feita por injeção ou injeção de bolus, por exemplo. De acordo com uma modalidade preferida específica, a administração do conjugado de an- ticorpo-fármaco é realizada por injeção. Administração parenteral é uma rotina de administração preferida.[00371] Several delivery systems are known and they can be used to administer the antibody-drug conjugate of the present invention. Examples of routine administration include intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, and subcutaneous, but not limited to, routines. Administration can be done by injection or bolus injection, for example. According to a specific preferred embodiment, administration of the antibody-drug conjugate is carried out by injection. Parenteral administration is a preferred administration routine.
[00372] De acordo com uma modalidade representativa, a composição farmacêutica é prescrita, como uma composição farmacêutica adequada para administração intravenosa a humanos, de acordo com os procedimentos convencionais. A composição para administração intravenosa é tipicamente uma solução em uma solução aquosa de tampão estéril e isotônica. Se necessário, o fármaco pode conter um agente solubilizante e anestésicos locais para aliviar a dor em sítio de injeção (por exemplo, lignocaína). Geralmente, o ingrediente acima é fornecido individualmente como qualquer um de pó liofilizado ou um concentrado anidroso contido em um recipiente que é obtido por meio de selagem de uma ampôla ou um sachê tendo uma quantidade do agente ativo ou como uma mistura em uma forma de dosagem unitária. Quando o fármaco deve ser administrado por injeção, ele pode ser administrado de um frasco de injeção contendo água ou salina de grau farmacêutico estéril. Quando o fármaco for administrado por injeção, uma ampôla de água estéril ou salina para injeção pode ser fornecida de tal modo que os ingredientes supracitados sejam misturados entre si antes da administração.[00372] According to a representative embodiment, the pharmaceutical composition is prescribed, as a pharmaceutical composition suitable for intravenous administration to humans, according to conventional procedures. The composition for intravenous administration is typically a solution in a sterile, isotonic aqueous buffer solution. If necessary, the drug may contain a solubilizing agent and local anesthetics to alleviate pain at the injection site (eg, lignocaine). Generally, the above ingredient is supplied individually as either a freeze-dried powder or anhydrous concentrate contained in a container which is obtained by sealing an ampoule or sachet having an amount of the active agent or as a mixture in a dosage form. unitary. When the drug is to be administered by injection, it may be administered from an injection vial containing sterile pharmaceutical grade water or saline. When the drug is to be administered by injection, an ampoule of sterile water or saline for injection may be provided in such a way that the above ingredients are mixed together prior to administration.
[00373] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser uma composição farmacêutica contendo somente o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção ou uma composição farma-cêutica contendo o conjugado de anticorpo-fármaco e pelo menos um agente de tratamento de câncer exceto o conjugado. O conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção pode ser administrado com outro agente de tratamento de câncer. O efeito anti-câncer pode ser realçado conformemente. Outro agente anti-câncer usado para tal propósito pode ser administrado a um indivíduo simultaneamente com, separadamente de, ou subsequentemente ao conjugado de an- ticorpo-fármaco, e pode ser administrado ao mesmo tempo que variando o intervalo de administração para cada. Exemplos do agente de tratamento de câncer incluem abraxano, carboplatina, cisplatina, gen- citabina, irinotecano (CPT-11), paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vi- norelbina, fármacos descritos em Publicação Internacional No. WO 2003/038043, análogos de LH-RH (leuprorelina, goserelina, ou simila-res), fosfato de estramustina, antagonista de estrogênio (tamoxifeno, raloxifeno, ou similares), e um inibidor de aromatase (anastrozol, le- trozol, exemestano, ou similares), porém não é limitado contanto que ele seja um fármaco tendo uma atividade antitumor.[00373] The pharmaceutical composition of the present invention can be a pharmaceutical composition containing only the antibody-drug conjugate of the present invention or a pharmaceutical composition containing the antibody-drug conjugate and at least one cancer treatment agent except the conjugate . The antibody-drug conjugate of the present invention can be administered with another cancer treatment agent. The anti-cancer effect can be enhanced accordingly. Another anti-cancer agent used for such purpose may be administered to a subject simultaneously with, separately from, or subsequent to the antibody-drug conjugate, and may be administered while varying the administration interval for each. Examples of the cancer treating agent include abraxane, carboplatin, cisplatin, gemcitabine, irinotecan (CPT-11), paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vinorelbine, drugs described in International Publication No. WO 2003/038043, LH analogues -RH (leuprorelin, goserelin, or the like), estramustine phosphate, estrogen antagonist (tamoxifen, raloxifene, or similar), and an aromatase inhibitor (anastrozole, letrozole, exemestane, or similar), but it is not limited as long as it is a drug having an antitumor activity.
[00374] A composição farmacêutica pode ser formulada em uma formulação de liofilização ou uma formulação líquida como uma formu-lação tendo composição desejada e pureza requerida. Quando formu-lada como uma formulação de liofilização, ela pode ser uma formulação contendo aditivos de formulação adequados que são usados na técnica. Também para uma formulação líquida, ela pode ser formulada como uma formulação líquida contendo vários aditivos de formulação que são usados na técnica.[00374] The pharmaceutical composition can be formulated in a lyophilization formulation or a liquid formulation as a formulation having desired composition and required purity. When formulated as a lyophilization formulation, it can be a formulation containing suitable formulation additives that are used in the art. Also for a liquid formulation, it can be formulated as a liquid formulation containing various formulation additives that are used in the art.
[00375] Composição e concentração da composição farmacêutica podem variar dependendo do método de administração. Entretanto, o conjugado de anticorpo-fármaco contido na composição farmacêutica da presente invenção pode exibir o efeito farmacêutico mesmo em uma pequena dosagem quando o conjugado de anticorpo-fármaco tiver maior afinidade para um antígeno, que é, afinidade maior (= valor de Kd menor) em termos da constante dissociação (que é, valor de Kd) para o antígeno. Desse modo, para determinar a dosagem do conjugado de anticorpo-fármaco, a dosagem pode ser determinada tendo em vista uma situação relativa à afinidade entre o conjugado de anti- corpo-fármaco e antígeno. Quando o conjugado de anticorpo-fármaco da presente invenção for administrado a um humano, por exemplo, cerca de 0,001 a 100 mg/kg pode ser administrado uma vez ou administrado diversas vezes com um intervalo de um tempo durante 1 a 180 dias. Exemplos[00375] Composition and concentration of the pharmaceutical composition may vary depending on the method of administration. However, the antibody-drug conjugate contained in the pharmaceutical composition of the present invention can exhibit the pharmaceutical effect even at a small dosage when the antibody-drug conjugate has higher affinity for an antigen, that is, higher affinity (= lower Kd value ) in terms of the dissociation constant (that is, Kd value) for the antigen. Thus, to determine the dosage of the antibody-drug conjugate, the dosage can be determined in view of a situation regarding the affinity between the antibody-drug conjugate and antigen. When the antibody-drug conjugate of the present invention is administered to a human, for example, about 0.001 to 100 mg/kg may be administered once or administered several times with an interval of time for 1 to 180 days. Examples
[00376] A presente invenção é especificamente descrita tendo em vista os exemplos mostrados abaixo. Entretanto, a presente invenção não é limitada a eles. Além disso, não é por nenhum meio interpretada em um sentido limitado. Além disso, a menos que especificamente descrito de outro modo, o reagente, solvente, e material de partida descritos na especificação podem ser facilmente obtidos de um fornecedor comercial. Exemplo de Referência 1 anticorpo M30-H1-L4[00376] The present invention is specifically described in view of the examples shown below. However, the present invention is not limited to them. Furthermore, it is by no means interpreted in a limited sense. Furthermore, unless specifically described otherwise, the reagent, solvent, and starting material described in the specification are readily available from a commercial supplier. Reference Example 1 M30-H1-L4 antibody
[00377] De anticorpos humanizados de um anticorpo anti-B7-H3, um anticorpo composto de uma cadeia pesada consistindo em uma sequência de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 20 a 471 em SEQ ID NO: 9 e uma cadeia leve consistindo em uma sequên-cia de aminoácido descrita nas posições de aminoácido 21 a 233 em SEQ ID NO: 16 foi produzido de acordo com um método conhecido na técnica para produzir anticorpo anti-B7-H3 humanizado designado co-mo um anticorpo M30-H1-L4 (ou simplesmente referidos como "M30- H1-L4"). Exemplo de Referência 2 anticorpo M30-H1-L4P[00377] From humanized antibodies to an anti-B7-H3 antibody, an antibody composed of a heavy chain consisting of an amino acid sequence described at amino acid positions 20 to 471 in SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of a sequence The amino acid sequence described at amino acid positions 21 to 233 in SEQ ID NO: 16 was produced according to a method known in the art to produce humanized anti-B7-H3 antibody designated as an M30-H1-L4 antibody (or simply referred to as "M30-H1-L4"). Reference Example 2 M30-H1-L4P antibody
[00378] A modificação de um glicano ligado ao anticorpo M30-H1- L4 obtido acima foi regulada por desfucosilação de acordo com um método conhecido na técnica para produzir anticorpo com a modifica-ção regulada de um glicano designado como um anticorpo M30-H1- L4P (ou simplesmentereferidos como "M30-H1-L4P"). Exemplo de Referência 3 anticorpo anti-CD30The modification of a glycan linked to the antibody M30-H1-L4 obtained above was regulated by defucosylation according to a method known in the art to produce antibody with the regulated modification of a glycan designated as an antibody M30-H1- L4P (or simply referred to as "M30-H1-L4P"). Reference Example 3 anti-CD30 antibody
[00379] Um anticorpo anti-CD30 foi produzido com referência à Pu-blicação Nacional de Pedido de Patente Internacional No. 2005506035. Sua sequência é mostrada em SEQ ID NOs: 27 e 28. Exemplo de Referência 4 anticorpo anti-CD33[00379] An anti-CD30 antibody was produced with reference to National Publication of International Patent Application No. 2005506035. Its sequence is shown in SEQ ID NOs: 27 and 28. Reference Example 4 anti-CD33 antibody
[00380] Um anticorpo anti-CD33 foi produzido com referência à Patente Japonesa Depositada Aberta ao Público No. 8-48637. Sua sequência é mostrada em SEQ ID NOs: 29 e 30. Exemplo de Referência 5 anticorpo anti-CD70[00380] An anti-CD33 antibody was produced with reference to Japanese Patent Laid-Open Patent No. 8-48637. Its sequence is shown in SEQ ID NOs: 29 and 30. Reference Example 5 anti-CD70 antibody
[00381] Um anticorpo anti-CD70 foi produzido com referência à Pu-blicação Nacional de Pedido de Patente Internacional No. 2008538292. Sua sequência é mostrada em SEQ ID NOs: 31 e 32. Exemplo 1 4-Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]butanamida Fórmula 70
[00382] Ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico (0,237 g, 1,13 mmol) foi dissolvido em diclorometano (10 mL), N-hidroxisuccinimida (0,130 g, 1,13 mmol) e cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (0,216 g, 1,13 mmol) foram adiciona-dos, e agitados durante 1 hora. A solução de reação foi adicionada gota a gota a uma solução de N,N-dimetil formamida (10 mL) carregada com mesilato do composto (4) (0,500 g, 0,94 mmol) e trietilamina (0,157 mL, 1,13 mmol), e agitada em temperatura ambiente durante 1 dia. O solvente foi removido sob pressão reduzida e o resíduo obtido foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto título (0,595 g, quantitativo). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,31 (9H, s), 1,58 (1H, t, J=7,2 Hz), 1,66 (2H, t, J=7,2 Hz), 1,82-1,89 (2H, m), 2,12-2,21 (3H, m), 2,39 (3H, s), 2,92 (2H, t, J=6,5 Hz), 3,17 (2H, s), 5,16 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,59-5,55 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,78 (1H, t, J=6,3 Hz), 7,30 (1H, s), 7,79 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,40 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (APCI) m/z: 621 (M+H)+ Processo 2: 4-Amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]butanamida4-(tert-Butoxycarbonylamino)butanoic acid (0.237 g, 1.13 mmol) was dissolved in dichloromethane (10 mL), N-hydroxysuccinimide (0.130 g, 1.13 mmol) and 1-ethyl-3 hydrochloride -(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (0.216 g, 1.13 mmol) was added, and stirred for 1 hour. The reaction solution was added dropwise to a solution of N,N-dimethyl formamide (10 mL) loaded with compound (4) mesylate (0.500 g, 0.94 mmol) and triethylamine (0.157 mL, 1.13 mmol) ), and stirred at room temperature for 1 day. The solvent was removed under reduced pressure and the residue obtained was purified by silica gel column chromatography [chloroform - chloroform : methanol = 8 : 2 (v/v)] to yield the title compound (0.595 g, quantitative). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.31 (9H, s), 1.58 (1H, t, J=7, 2 Hz), 1.66 (2H, t, J=7.2 Hz), 1.82-1.89 (2H, m), 2.12-2.21 (3H, m), 2.39 ( 3H, s), 2.92 (2H, t, J=6.5 Hz), 3.17 (2H, s), 5.16 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.24 ( 1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.59-5.55 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.78 (1H, t , J=6.3 Hz), 7.30 (1H, s), 7.79 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.40 (1H, d, J=8.6 Hz). MS (APCI) m/z: 621 (M+H)+ Process 2: 4-Amino-N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10.13 - dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1 -yl]butanamide
[00383] O composto (0,388 g, 0,61 mmol) obtido no Processo 1 acima foi dissolvido em diclorometano (9 mL). Ácido trifluoroacético (9 mL) foi adicionado e ele foi agitado durante 4 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir trifluoroacetato do composto título (0,343 g, quantitativo). Este composto foi confirmado no tumor de um camundongo transportando câncer que recebeu o conjugado de anticorpo-fármaco (13) ou (14). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,79-1,92 (4H, m), 2,10-2,17 (2H, m), 2,27 (2H, t, J=7,0 Hz), 2,40 (3H, s), 2,80-2,86 (2H, m), 3,15-3,20 (2H, m), 5,15 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,61 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,72 (3H, brs), 7,82 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,54 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (APCI) m/z: 521 (M+H)+ Exemplo 2 conjugado de anticorpo-fármaco (1) Fórmula 71
[00384] N-(Terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanilglicina (0,081 g, 0,19 mmol) foi dissolvido em diclorometano (3 mL), N- hidroxisuccinimida (0,021 g, 0,19 mmol) e cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (0,036 g, 0,19 mmol) foram adiciona-dos e em seguida agitados durante 3,5 horas. A solução de reação foi adicionada gota a gota a uma solução de N,N-dimetil formamida (1,5 mL) carregada com o composto (0,080 g, 0,15 mmol) de Exemplo 1, e agitada em temperatura ambiente durante 4 horas. O solvente foi re-movido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto título (0,106 g, 73 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,36 (9H, s), 1,71 (2H, m), 1,86 (2H, t, J=7,8 Hz), 2,15-2,19 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,77 (1H, dd, J=12,7, 8,8 Hz), 3,02 (1H, dd, J=14,1, 4,7 Hz), 3,08-3,11 (2H, m), 3,16-3,19 (2H, m), 3,54 (2H, d, J=5,9 Hz), 3,57-3,77 (4H, m), 4,46-4,48 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,00 (1H, t, J=6,3 Hz), 7,17-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, t, J=5,7 Hz), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,92 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,15 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,27 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,46 (1H, d, J=8,2 Hz). MS (APCI) m/z: 939 (M+H)+ Processo 2: trifluoroacetato de glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9- etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro- 1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)glicinamidaN-(Tert-butoxycarbonyl)glycylglycyl-L-phenylalanylglycine (0.081 g, 0.19 mmol) was dissolved in dichloromethane (3 mL), N-hydroxysuccinimide (0.021 g, 0.19 mmol) and 1-hydrochloride ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (0.036 g, 0.19 mmol) was added and then stirred for 3.5 hours. The reaction solution was added dropwise to a solution of N,N-dimethyl formamide (1.5 mL) loaded with the compound (0.080 g, 0.15 mmol) from Example 1, and stirred at room temperature for 4 hours. . The solvent was removed under reduced pressure and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform - chloroform : methanol = 8 : 2 (v/v)] to yield the title compound (0.106 g, 73% ). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.36 (9H, s), 1.71 (2H, m), 1.86 (2H, t, J=7.8 Hz), 2.15-2.19 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.77 (1H, dd, J=12.7.8 0.8 Hz), 3.02 (1H, dd, J=14.1, 4.7 Hz), 3.08-3.11 (2H, m), 3.16-3.19 (2H, m) , 3.54 (2H, d, J=5.9 Hz), 3.57-3.77 (4H, m), 4.46-4.48 (1H, m), 5.16 (1H, d , J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.55-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 7.00 (1H, t, J=6.3 Hz), 7.17-7.26 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.71 (1H, t, J=5.7 Hz), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.92 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.15 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.27 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.46 (1H, d, J=8.2 Hz). MS (APCI) m/z: 939 (M+H)+ Process 2: glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy trifluoroacetate -4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1 ,2-b]quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl)glycinamide
[00385] O composto (1,97 g, 2,10 mmol) obtido no Processo 1 aci- ma foi dissolvido em diclorometano (7 mL). Após adicionar ácido triflu- oroacético (7 mL), ele foi agitado durante 1 hora. O solvente foi remo-vido sob pressão reduzida, e foi carregado com tolueno para destilação azeotrópica. Os resíduos obtidos foram purificados por cromato- grafia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir o composto título (1,97 g, 99%). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,71-1,73 (2H, m), 1,82-1,90 (2H, m), 2,12-2,20 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,75 (1H, dd, J=13,7, 9,4 Hz), 3,03-3,09 (3H, m), 3,18-3,19 (2H, m), 3,58-3,60 (2H, m), 3,64 (1H, d, J=5,9 Hz), 3,69 (1H, d, J=5,9 Hz), 3,72 (1H, d, J=5,5 Hz), 3,87 (1H, dd, J=16,8, 5,9 Hz), 4,50-4,56 (1H, m), 5,16 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, s), 5,55-5,60 (1H, m), 7,17-7,27 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,78-7,81 (2H, m), 7,95-7,97 (3H, m), 8,33-8,35 (2H, m), 8,48-8,51 (2H, m). MS (APCI) m/z: 839 (M+H)+ Processo 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi- 4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)glicinamidaThe compound (1.97 g, 2.10 mmol) obtained in Process 1 above was dissolved in dichloromethane (7 mL). After adding trifluoroacetic acid (7 ml), it was stirred for 1 hour. The solvent was removed under reduced pressure, and charged with toluene for azeotropic distillation. The residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform - split organic layer chloroform : methanol : water = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] to yield the title compound (1.97 g, 99%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.71-1.73 (2H, m), 1.82-1.90 ( 2H, m), 2.12-2.20 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.75 (1H, dd, J=13.7, 9.4 Hz), 3.03 -3.09 (3H, m), 3.18-3.19 (2H, m), 3.58-3.60 (2H, m), 3.64 (1H, d, J=5.9 Hz ), 3.69 (1H, d, J=5.9 Hz), 3.72 (1H, d, J=5.5 Hz), 3.87 (1H, dd, J=16.8, 5, 9 Hz), 4.50-4.56 (1H, m), 5.16 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.8 Hz), 5 .42 (2H, s), 5.55-5.60 (1H, m), 7.17-7.27 (5H, m), 7.32 (1H, s), 7.78-7.81 (2H, m), 7.95-7.97 (3H, m), 8.33-8.35 (2H, m), 8.48-8.51 (2H, m). MS (APCI) m/z: 839 (M+H)+ Process 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]glycylglycyl- L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15 -hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl)glycinamide
[00386] A uma solução de N,N-dimetilformamida (1,2 mL) do composto (337 mg, 0,353 mmol) obtido no Processo 2 acima, trietilamina (44,3 mL, 0,318 mmol) e hexanoato de 6-maleimida de N-succinimidila (119,7 mg, 0,388 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 5 : 1 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (278,0 mg, 76 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,12-1,22 (2H, m), 1,40-1,51 (4H, m), 1,66-1,76 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,05-2,21 (6H, m), 2,39 (3H, s), 2,79 (1H, dd, J=14,0, 9,8 Hz), 2,98-3,21 (5H, m), 3,55-3,77 (8H, m), 4,41-4,48 (1H, m), 5,15 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,40 (1H, d, J=17,1 Hz), 5,44 (1H, d, J=17,1 Hz), 5,54-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,20-7,27 (5H, m), 7,30 (1H, s), 7,70 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,03 (1H, t, J=5,8 Hz), 8,08 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,14 (1H, d, J=7,9 Hz), 8,25 (1H, t, J=6,1 Hz), 8,46 (1H, d, J=8,5 Hz). MS (APCI) m/z: 1032 (M+H)+ Processo 4: conjugado de anticorpo-fármaco (1)To a N,N-dimethylformamide (1.2 mL) solution of the compound (337 mg, 0.353 mmol) obtained in Process 2 above, triethylamine (44.3 mL, 0.318 mmol) and 6-maleimide hexanoate N-succinimidyl (119.7 mg, 0.388 mmol) was added and stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was removed under reduced pressure and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform - chloroform : methanol = 5 : 1 (v/v)] to yield the title compound as a pale yellow solid (278, 0mg, 76%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.12-1.22 (2H, m), 1.40-1.51 ( 4H, m), 1.66-1.76 (2H, m), 1.80-1.91 (2H, m), 2.05-2.21 (6H, m), 2.39 (3H, s), 2.79 (1H, dd, J=14.0, 9.8 Hz), 2.98-3.21 (5H, m), 3.55-3.77 (8H, m), 4 .41-4.48 (1H, m), 5.15 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.24 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.40 (1H, d, J=17.1 Hz), 5.44 (1H, d, J=17.1 Hz), 5.54-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6. 99 (2H, s), 7.20-7.27 (5H, m), 7.30 (1H, s), 7.70 (1H, t, J=5.5Hz), 7.80 (1H, , d, J=11.0 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.8 Hz), 8.08 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.14 (1H, d , J=7.9 Hz), 8.25 (1H, t, J=6.1 Hz), 8.46 (1H, d, J=8.5 Hz). MS (APCI) m/z: 1032 (M+H)+ Process 4: antibody-drug conjugate (1)
[00387] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum C-1 e Procedimento comum B (como coefici-ente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,025 mL; 3,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fos-fato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00387] Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml by replacing the medium with PBS6.0/EDTA using the common Procedure C-1 and Procedure common B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) described in Production Method 1. The solution (1.25 mL) was placed in a 1.5 mL polypropylene tube. mL and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.025 mL; 3.0 equivalents per antibody molecule) and an aqueous solution of 1 M dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00388] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,109 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 acima (0,039 mL; 4,6 equivalentes por molécula de an-ticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corpora tion) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,008 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e agitada em temperatura ambiente para terminar a reação de ligante de fármaco durante mais 20 minutos.[00388] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.109 ml) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 3 above (0.039 ml; 4.6 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature during 40 minutes. Then, an aqueous solution (0.008 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and stirred at room temperature to terminate the drug binding reaction for a further 20 minutes.
[00389] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois dis-so, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.[00389] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated by Common Procedure A.
[00390] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.[00390] Physicochemical characterization: Using the common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5000 (mean measured value), and SD,370 = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00391] Concentração de anticorpo: 13,02 mg/mL, produção de an-ticorpo: 9,1 mg (73%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,4. Exemplo 3 conjugado de anticorpo-fármaco (2) Fórmula 72
[00392] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (4,0 mL) foi coletada em um tubo de 15 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,118 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,200 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora .[00392] Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (4.0 mL) was collected in a 15 mL tube and charged with an aqueous solution of TCEP to 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.118 mL; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.200 mL). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00393] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima durante 10 minutos a 22°C, uma solução de sulfóxido de dimetila (0,236 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fár- maco ao anticorpo a 22 °C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,00471 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligan- te de fármaco a 22 °C durante mais 20 minutos.[00393] Conjugation between drug and antibody ligand: After incubating the above solution for 10 minutes at 22°C, a dimethyl sulfoxide solution (0.236 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Procedure 3 of Example 2 was added thereto and incubated to conjugate the drug linker to the antibody at 22°C for 40 minutes. Then, an aqueous solution (0.00471 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at 22°C for a further 20 minutes.
[00394] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 17,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00394] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 17.5 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00395] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,28Ü = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,37Ü = 0 (valor de cálculo estimado), SD,28Ü = 5000 (valor médio medido), e SD,37Ü = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca- racterísticos foram obtidos.[00395] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,28Ü = 235300 (estimated design value), SA,37Ü = 0 (estimated design value), SD, 28Ü = 5000 (mean mean value), and SD,37Ü = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00396] Concentração de anticorpo: 1,80 mg/mL, produção de anti-corpo: 26,1 mg (65%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 5,9. Exemplo 4 conjugado de anticorpo-fármaco (3) Fórmula 73
[00397] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum C-1 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropile- no de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,051 mL; 6,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.[00397] Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml by replacing the medium with PBS6.0/EDTA using the common Procedure C-1 and Procedure common B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) described in Production Method 1. The solution (1.25 mL) was placed in a 1.5 mL polypropylene tube. mL and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.051 mL; 6.0 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous solution of dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Teste, Inc.; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00398] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,067 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 (0,085 mL; 10,0 equivalentes por molécu-la de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agi-tado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em tem-peratura ambiente durante 60 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,013 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adi-cionada a isso e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.[00398] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.067 ml) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 3 of Example 2 (0.085 mL; 10.0 equivalents per molecule of antibody) to the above solution at room temperature, this was shaken using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody in room temperature for 60 minutes. Then, an aqueous solution (0.013 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and stirred to terminate the drug-binding reaction at room temperature for a further 20 minutes.
[00399] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00399] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
[00400] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.[00400] Physicochemical characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5000 (mean measured value), and SD,370 = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00401] Concentração de anticorpo: 1,67 mg/mL, produção de anti-corpo: 10,02 mg (80%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,3. Exemplo 5 conjugado de anticorpo-fármaco (4) Fórmula 74
[00402] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum C-1 e Procedimento comum B (como coefici-ente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,051 mL; 6,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fos-fato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.[00402] Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml by replacing the medium with PBS6.0/EDTA using the common Procedure C-1 and Procedure common B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) described in Production Method 1. The solution (1.25 mL) was placed in a 1.5 mL polypropylene tube. mL and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.051 mL; 6.0 equivalents per antibody molecule) and an aqueous solution of 1 M dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00403] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,025 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 (0,127 mL; 15,0 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 60 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,019 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.[00403] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.025 ml) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 3 of Example 2 (0.127 ml; 15.0 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 60 minutes. Then, an aqueous solution (0.019 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and stirred to terminate the drug-binding reaction at room temperature for a further 20 minutes.
[00404] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois dis- so, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.[00404] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. After that, the solution was concentrated by Common Procedure A.
[00405] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.[00405] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5000 (mean measured value), and SD,370 = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00406] Concentração de anticorpo: 1,19 mg/mL, produção de anti-corpo: 7,14 mg (57%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 7,5. Exemplo 6 conjugado de anticorpo-fármaco (5) Fórmula 75
[00407] Quase as quantidades inteiras dos conjugados de anticor- po-fármaco de Exemplos 4 e 5 foram misturadas e a solução foi con-centrada pelo Procedimento comum A para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco título.Almost entire amounts of the antibody-drug conjugates of Examples 4 and 5 were mixed and the solution was concentrated by Common Procedure A to produce the title antibody-drug conjugate.
[00408] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anti-corpo: 15,37 mg, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,7. Exemplo 7 conjugado de anticorpo-fármaco (6) Fórmula 76
[00409] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD30 produzido no Exemplo de Referência 3 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,75 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solu-ção (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 2 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0297 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0,050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubandoa 37 °C durante 1 hora .[00409] Antibody reduction: The anti-CD30 antibody produced in Reference Example 3 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.75 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (1.0 mL) was collected in a 2 mL tube and loaded with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0297 mL; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.050 mL) . After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00410] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima a 22 °C durante 10 minutos, uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0593 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fár- maco ao anticorpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0119 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e in- cubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22°C durante mais 20 minutos.[00410] Conjugation between drug ligand and antibody: After incubating the above solution at 22 °C for 10 minutes, a solution of dimethyl sulfoxide (0.0593 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Process 3 of Example 2 was added thereto and incubated to conjugate the drug ligand to the antibody at 22°C for 40 minutes. Then, an aqueous solution (0.0119 mL; 18.4 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at 22°C for another 20 minutes.
[00411] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00411] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
[00412] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,28Ü = 270400 (valor de cálculo estimado), SA,37Ü = 0 (valor de cálculo estimado), SD,28Ü = 5000 (valor médio medido), e SD,37Ü = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.[00412] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,28Ü = 270400 (estimated design value), SA,37Ü = 0 (estimated design value), SD, 28Ü = 5000 (mean measured value), and SD,37Ü = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00413] Concentração de anticorpo: 0,99 mg/mL, produção de anti-corpo: 5,94 mg (59%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,3. Exemplo 8 - conjugado de anticorpo-fármaco (7)Fórmula 77
[00414] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD30 produzido no Exemplo de Referência 3 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento co- mum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,75 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solu-ção (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 2 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 30 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0148 mL; 6,9 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0,050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.[00414] Antibody reduction: The anti-CD30 antibody produced in Reference Example 3 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.75 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (1.0 mL) was collected in a 2 mL tube and charged with an aqueous solution of TCEP a 30 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0148 mL; 6.9 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.050 mL). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00415] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima durante 10 minutos a 22 °C, uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0297 mL; 13,8 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 30 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 foi adicionada a isso e incubada durante 40 minutos a 22 °C para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo. Em seguida, uma solução aquosa (0,0178 mL; 27,6 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22 °C durante mais 20 minutos.[00415] Conjugation between drug ligand and antibody: After incubating the above solution for 10 minutes at 22 °C, a dimethyl sulfoxide solution (0.0297 ml; 13.8 equivalents per antibody molecule) containing 30 mM of the compound obtained in Process 3 of Example 2 was added thereto and incubated for 40 minutes at 22°C to conjugate the drug binder to the antibody. Then, an aqueous solution (0.0178 mL; 27.6 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at 22°C °C for another 20 minutes.
[00416] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00416] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
[00417] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 270400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.[00417] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 270400 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5000 (mean measured value), and SD,370 = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00418] Concentração de anticorpo: 0,99 mg/mL, produção de anti- corpo: 5,94 mg (59%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,8. Exemplo 9 conjugado de anticorpo-fármaco (8) Fórmula 78
[00419] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD33 produzido no Exemplo de Referência 4 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,66 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solu-ção (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 2 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0297 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0,050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.[00419] Antibody reduction: The anti-CD33 antibody produced in Reference Example 4 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.66 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (1.0 mL) was collected in a 2 mL tube and loaded with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0297 mL; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.050 mL) . After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00420] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima durante 10 minutos a 22 °C, uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0593 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 de Exem- plo 2 foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fár- maco ao anticorpo a 22 °C durante 40 minutos. Em seguida, uma so-lução aquosa (0,0119 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22 °C durante mais 20 minutos.[00420] Conjugation between drug ligand and antibody: After incubating the above solution for 10 minutes at 22 °C, a dimethyl sulfoxide solution (0.0593 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Process 3 of Example 2 was added thereto and incubated to conjugate the drug ligand to the antibody at 22°C for 40 minutes. Then, an aqueous solution (0.0119 mL; 18.4 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at 22°C for another 20 minutes.
[00421] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00421] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
[00422] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,28Ü = 256400 (valor de cálculo estimado), SA,37Ü = 0 (valor de cálculo estimado), SD,28Ü = 5000 (valor médio medido), e SD,37Ü = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.[00422] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,28Ü = 256400 (estimated design value), SA,37Ü = 0 (estimated design value), SD, 28Ü = 5000 (mean measured value), and SD,37Ü = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00423] Concentração de anticorpo: 1,06 mg/mL, produção de anti-corpo: 6,36 mg (64%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,4. Exemplo 10 conjugado de anticorpo-fármaco (9) Fórmula 79
[00424] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD33 produzido no Exemplo de Referência 4 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,66 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solu-ção (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 2 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 30 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0148 mL; 6,9 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0,050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.[00424] Antibody reduction: The anti-CD33 antibody produced in Reference Example 4 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.66 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (1.0 mL) was collected in a 2 mL tube and loaded with an aqueous solution of 30 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0148 mL; 6.9 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.050 mL) . After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00425] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima durante 10 minutos a 22 °C, uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0297 mL; 13,8 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 30 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22 °C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0178 mL; 27,6 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22 °C durante mais 20 minutos.[00425] Conjugation between drug ligand and antibody: After incubating the above solution for 10 minutes at 22 °C, a dimethyl sulfoxide solution (0.0297 ml; 13.8 equivalents per antibody molecule) containing 30 mM of the compound obtained in Process 3 of Example 2 was added thereto and incubated to conjugate the drug ligand to the antibody at 22°C for 40 minutes. Then, an aqueous solution (0.0178 mL; 27.6 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at 22°C °C for another 20 minutes.
[00426] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00426] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
[00427] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.[00427] Physicochemical characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 256400 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5000 (mean measured value), and SD,370 = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00428] Concentração de anticorpo: 0,95 mg/mL, produção de anti-corpo: 5,70 mg (57%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,7. Exemplo 11 conjugado de anticorpo-fármaco (10) Fórmula 80
[00429] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD70 produzido no Exemplo de Referência 5 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,69 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solu-ção (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 2 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0297 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0,050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.[00429] Antibody reduction: The anti-CD70 antibody produced in Reference Example 5 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.69 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (1.0 mL) was collected in a 2 mL tube and loaded with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0297 mL; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.050 mL) . After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00430] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima a 22 °C durante 10 minutos, uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0593 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fár- maco ao anticorpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0119 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22°C durante mais 20 minutos.[00430] Conjugation between drug and antibody ligand: After incubating the above solution at 22 °C for 10 minutes, a solution of dimethyl sulfoxide (0.0593 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Process 3 of Example 2 was added thereto and incubated to conjugate the drug ligand to the antibody at 22°C for 40 minutes. Then, an aqueous solution (0.0119 mL; 18.4 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at 22°C °C for another 20 minutes.
[00431] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00431] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
[00432] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,28Ü = 262400 (valor de cálculo estimado), SA,37Ü = 0 (valor de cálculo estimado), SD,28Ü = 5000 (valor médio medido), e SD,37Ü = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.[00432] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,28Ü = 262400 (estimated design value), SA,37Ü = 0 (estimated design value), SD, 28Ü = 5000 (mean measured value), and SD,37Ü = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00433] Concentração de anticorpo: 1,00 mg/mL, produção de anti-corpo: 6,00 mg (60%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,2. Exemplo 12 conjugado de anticorpo-fármaco (11) Fórmula 81
[00434] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD70 produzido no Exemplo de Referência 5 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,69 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solu- ção (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 2 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 30 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0148 mL; 6,9 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solu- ção aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37C durante 1 hora.[00434] Antibody reduction: The anti-CD70 antibody produced in Reference Example 5 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.69 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (1.0 mL) was collected in a 2 mL tube and loaded with a 30 mM aqueous TCEP solution (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0148 mL; 6.9 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.050 mL). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00435] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima a 22C durante 10 minutos, uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0297 mL; 13,8 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 30 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 2 foi adicionada a isso e incubada durante 40 minutos a 22C para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo. Em seguida, uma solução aquosa (0,0178 mL; 27,6 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso encubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22C durante mais 20 minutos.[00435] Conjugation between drug ligand and antibody: After incubating the above solution at 22C for 10 minutes, a dimethyl sulfoxide solution (0.0297 ml; 13.8 equivalents per antibody molecule) containing 30 mM of the compound obtained in Process 3 of Example 2 was added thereto and incubated for 40 minutes at 22°C to conjugate the drug binder to the antibody. Then, an aqueous solution (0.0178 mL; 27.6 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug binding reaction at 22 C for another 20 minutes.
[00436] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00436] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
[00437] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 262400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.[00437] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 262400 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5000 (mean measured value), and SD,370 = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00438] Concentração de anticorpo: 0,96 mg/mL, produção de anti-corpo: 5,76 mg (58%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,6. Exemplo 13 conjugado de anticorpo-fármaco (12) Fórmula 82
[00439] O composto (80 mg, 0,084 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 2 foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exem-plo 2 usando propioato de 3-maleimida de N-succinimidila (24,6 mg, 0,0924 mmol) em vez de hexanoato de 6-maleimida de N-succinimidila para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (60,0 mg, 73 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,89 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,70-1,78 (2H, m), 1,81-1,94 (2H, m), 2,12-2,23 (4H, m), 2,42 (3H, s), 2,81 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,01-3,15 (3H, m), 3,16-3,23 (2H, m), 3,30-3,35 (1H, m), 3,58-3,71 (6H, m), 3,71-3,79 (1H, m), 4,44-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=19,0 Hz), 5,27 (1H, d, J=19,0 Hz), 5,43 (1H, d, J=17,6 Hz), 5,47 (1H, d, J=17,6 Hz), 5,57-5,63 (1H, m), 6,56 (1H, s), 7,02 (2H, s), 7,177,22 (1H, m), 7,22-7,30 (5H, m), 7,34 (1H, s), 7,73 (1H, t, J=5,6 Hz), 7,83 (1H, d, J=10,7 Hz), 8,08 (1H, t, J=5,6 Hz), 8,15 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,30 (2H, dt, J=18,7, 5,7 Hz), 8,49 (1H, d, J=8,8 Hz). MS (APCI) m/z: 990 (M+H)+ Processo 2: conjugado de anticorpo-fármaco (12)The compound (80 mg, 0.084 mmol) obtained in Process 2 of Example 2 was reacted in the same manner as Process 3 of Example 2 using N-succinimidyl 3-maleimide propioate (24.6 mg, 0, 0924 mmol) instead of N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate to yield the title compound as a pale yellow solid (60.0 mg, 73%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.89 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.70-1.78 (2H, m), 1.81-1.94 ( 2H, m), 2.12-2.23 (4H, m), 2.42 (3H, s), 2.81 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 3.01 -3.15 (3H, m), 3.16-3.23 (2H, m), 3.30-3.35 (1H, m), 3.58-3.71 (6H, m), 3 .71-3.79 (1H, m), 4.44-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.0 Hz), 5.27 (1H, d, J =19.0 Hz), 5.43 (1H, d, J=17.6 Hz), 5.47 (1H, d, J=17.6 Hz), 5.57-5.63 (1H, m ), 6.56 (1H, s), 7.02 (2H, s), 7.177.22 (1H, m), 7.22-7.30 (5H, m), 7.34 (1H, s) , 7.73 (1H, t, J=5.6 Hz), 7.83 (1H, d, J=10.7 Hz), 8.08 (1H, t, J=5.6 Hz), 8 .15 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.30 (2H, dt, J=18.7, 5.7 Hz), 8.49 (1H, d, J=8.8 Hz) . MS (APCI) m/z: 990 (M+H)+ Process 2: antibody-drug conjugate (12)
[00440] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 1 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Pro-cesso 4 de Exemplo 2.[00440] Using the antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 2 and the compound obtained in Process 1 above, the antibody-title drug conjugate was obtained in the same manner as Process 4 of Example 2.
[00441] Concentração de anticorpo: 12,16 mg/mL, produção de an-ticorpo: 8,5 mg (68%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,4. Exemplo 14 conjugado de anticorpo-fármaco (13) Fórmula 83
[00442] O composto (100 mg, 0,119 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 2 foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exem-plo 2 usando di-isopropiletilamina (20,8 μL, 0,119 mmol) em vez de trietilamina e 3-(2-(2-(3- maleinimidapropanamida)etóxi)etóxi)propanoato de N-succinimidila (50,7 mg, 0,119 mmol) em vez de hexanoato de 6-maleimida de N- succinimidila para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (66,5 mg, 48 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,85 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,65-1,74 (2H, m), 1,77-1,90 (2H, m), 2,07-2,19 (4H, m), 2,30 (2H, t, J=7,2 Hz), 2,332,36 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,76 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 2,96-3,18 (9H, m), 3,42-3,44 (4H, m), 3,53-3,76 (10H, m), 4,43 (1H, td, J=8,6, 4,7 Hz), 5,14 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,38 (1H, d, J=17,2 Hz), 5,42 (1H, d, J=17,2 Hz), 5,52-5,58 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,98 (2H, s), 7,12-7,17 (1H, m), 7,18-7,25 (4H, m), 7,29 (1H, s), 7,69 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,78 (1H, d, J=11,3 Hz), 7,98-8,03 (2H, m), 8,11 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,16 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,23 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,44 (1H, d, J=9,0 Hz). MS (APCI) m/z: 1149 (M+H)+ Processo 2: conjugado de anticorpo-fármaco (13)[00442] The compound (100 mg, 0.119 mmol) obtained in Process 2 of Example 2 was reacted in the same manner as Process 3 of Example 2 using diisopropylethylamine (20.8 µL, 0.119 mmol) instead of triethylamine and N-succinimidyl 3-(2-(2-(3-maleimidepropanamide)ethoxy)ethoxy)propanoate (50.7 mg, 0.119 mmol) instead of N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate to yield the title compound as a pale yellow solid (66.5 mg, 48%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.85 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.65-1.74 (2H, m), 1.77-1.90 ( 2H, m), 2.07-2.19 (4H, m), 2.30 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.332.36 (2H, m), 2.38 (3H, s ), 2.76 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 2.96-3.18 (9H, m), 3.42-3.44 (4H, m), 3. 53-3.76 (10H, m), 4.43 (1H, td, J=8.6, 4.7 Hz), 5.14 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.23 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.38 (1H, d, J=17.2 Hz), 5.42 (1H, d, J=17.2 Hz), 5.52-5 .58 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.98 (2H, s), 7.12-7.17 (1H, m), 7.18-7.25 (4H, m ), 7.29 (1H, s), 7.69 (1H, t, J=5.5 Hz), 7.78 (1H, d, J=11.3 Hz), 7.98-8.03 (2H, m), 8.11 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.16 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.23 (1H, t, J=5, 9 Hz), 8.44 (1H, d, J=9.0 Hz). MS (APCI) m/z: 1149 (M+H)+ Process 2: antibody-drug conjugate (13)
[00443] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 1 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Pro-cesso 4 de Exemplo 2.[00443] Using the antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 2 and the compound obtained in Process 1 above, the antibody-title drug conjugate was obtained in the same manner as Process 4 of Example 2.
[00444] Concentração de anticorpo: 12,76 mg/mL, produção de an-ticorpo: 8,9 mg (71%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,4. Exemplo 15 conjugado de anticorpo-fármaco (14) Fórmula 84
[00445] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 4.[00445] Using the antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 2 and the compound obtained in Process 1 of Example 14, the antibody-title drug conjugate was obtained in the same manner as Process 1 of Example 4.
[00446] Concentração de anticorpo: 1,60 mg/mL, produção de anti-corpo: 9,60 mg (77%), e número médio de moléculas de fármaco con- jugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,1. Exemplo 16 conjugado de anticorpo-fármaco (15) Fórmula 85
[00447] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 5.[00447] Using the antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 2 and the compound obtained in Process 1 of Example 14, the antibody-title drug conjugate was obtained in the same manner as Process 1 of Example 5.
[00448] Concentração de anticorpo: 1,64 mg/mL, produção de anti-corpo: 9,84 mg (79%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 7,1. Exemplo 17 conjugado de anticorpo-fármaco (16) Fórmula 86
[00449] Quase as quantidades inteiras dos conjugados de anticor- po-fármaco de Exemplos 15 e 16 foram misturadas e a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco título.Nearly entire amounts of the antibody-drug conjugates of Examples 15 and 16 were mixed and the solution was concentrated by Common Procedure A to produce the title antibody-drug conjugate.
[00450] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anti-corpo: 17,30 mg, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,5. Exemplo 18 conjugado de anticorpo-fármaco (17) Fórmula 87
[00451] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (100 mL, 1 g do anticorpo) foi colocada em um frasco de 250 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (2,43 mL; 3,6 equivalentes por mo-lécula de anticorpo) e também com uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (5 mL). Após confirmar que a solução teve pH perto de 7,4 usando um medidor de pH, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00451] Antibody reduction: The antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (100 mL, 1 g antibody) was placed in a 250 mL vial and charged with a solution 10 mM aqueous TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (2.43 mL; 3.6 equivalents per molecule of antibody) as well as a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (5 mL). After confirming that the solution had a pH close to 7.4 using a pH meter, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00452] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi- cionar sulfóxido de dimetila (2,14 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (3,51 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado com um agi-tador para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 130 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,547 mL) de NAC a 100 mM foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00452] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding dimethyl sulfoxide (2.14 ml) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 of Example 14 (3.51 ml; 5 .2 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, this was shaken with a shaker to conjugate the drug binder to the antibody in a water bath at 15°C for 130 minutes. Then, an aqueous solution (0.547 ml) of 100 mM NAC was added thereto and also incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for 20 minutes.
[00453] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação por ultrafiltração usando um aparato de ultrafiltração composto de uma membrana de ultrafiltração (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Bio-max 50 KDa), uma bomba de tubo (Cole-Parmer International, Master-Flex Pump modelo 77521-40, Pump Head modelo 7518-00), e um tubo (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Especificamente, ao mesmo tempo que ABS foi adicionado gota a gota (um total de 800 mL) como uma solução de tampão para purificação à solução de rea-ção, purificação de ultrafiltração foi realizada para remover ligantees de fármaco não conugados e outros reagentes baixo peso molecular, também substituindo a solução de tampão com ABS, e também con-centrando a solução, para produzir cerca de 70 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00453] Purification: The above solution was subjected to purification by ultrafiltration using an ultrafiltration apparatus composed of an ultrafiltration membrane (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Bio-max 50 KDa), a tube pump (Cole-Parmer International, Master-Flex Pump Model 77521-40, Pump Head Model 7518-00), and a tube (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Specifically, while ABS was added dropwise (a total of 800 mL) as a buffer solution for purification to the reaction solution, ultrafiltration purification was carried out to remove unconjugated drug binders and other low weight reagents. molecular, also replacing the buffer solution with ABS, and also concentrating the solution, to produce about 70 mL of a solution containing the antibody-titer drug conjugate.
[00454] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,28Ü = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,37Ü = 0 (valor de cálculo estimado), SD,28Ü = 4964 (valor medido), e SD,37Ü = 18982 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00454] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,28Ü = 235300 (estimated design value), SA,37Ü = 0 (estimated design value), SD, 28Ü = 4964 (measured value), and SD,37Ü = 18982 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00455] Concentração de anticorpo: 14,5 mg/mL, produção de anti-corpo: 1,0 g (cerca de 100 %), e número médio de moléculas de fár- maco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,5. Exemplo 19 - conjugado de anticorpo-fármaco (18) Fórmula 88
[00456] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (5 mL, 50 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 15 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,135 mL; 4 equivalentes por molécula de anticorpo). Após confirmar que a solução teve pH perto de 7,4 usando um medidor de pH, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.[00456] Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (5 mL, 50 mg antibody) was placed in a 15 mL tube and charged with a solution 10 mM aqueous TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.135 ml; 4 equivalents per antibody molecule). After confirming that the solution had a pH close to 7.4 using a pH meter, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00457] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar sulfóxido de dimetila (0,064 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,219 mL; 6,5 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 90 minutos. Em se- guida, uma solução aquosa (0,033 mL; 9,8 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente du-rante mais 20 minutos.[00457] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding dimethyl sulfoxide (0.064 mL) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 of Example 14 (0.219 mL; 6.5 equivalents per antibody molecule) to the above solution, this was incubated to conjugate the drug ligand to the antibody in a water bath at 15°C for 90 minutes. Next, an aqueous solution (0.033 mL; 9.8 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for another 20 minutes.
[00458] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 19 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00458] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 19 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
[00459] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 4964 (valor medido), e SD,370 = 18982 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00459] Physicochemical characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 4964 (measured value), and SD,370 = 18982 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00460] Concentração de anticorpo: 2,17 mg/mL, produção de anti-corpo: 41 mg (82%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 5,0. Exemplo 20 conjugado de anticorpo-fármaco (19) Fórmula 89
[00461] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (4 mL, 40 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 15 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,140 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo). Após confirmar que a solução teve pH perto de 7,4 usando um medidor de pH, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.[00461] Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (4 mL, 40 mg antibody) was placed in a 15 mL tube and charged with a solution 10 mM aqueous TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.140 ml; 5.2 equivalents per antibody molecule). After confirming that the solution had a pH close to 7.4 using a pH meter, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00462] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,232 mL; 8,6 equi-valentes por molécula de anticorpo) à solução acima, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 90 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,035 mL; 12,9 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.[00462] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 of Example 14 (0.232 ml; 8.6 equivalents per antibody molecule) to the above solution, this was incubated to conjugate the drug ligand to the antibody in a water bath at 15°C for 90 minutes. Then, an aqueous solution (0.035 mL; 12.9 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for a further 20 minutes.
[00463] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 13 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00463] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 13 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
[00464] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 4964 (valor medido), e SD,370 = 18982 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00464] Physicochemical characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 4964 (measured value), and SD,370 = 18982 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00465] Concentração de anticorpo: 2,36 mg/mL, produção de anti-corpo: 31 mg (77%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 5,9. Exemplo 21 conjugado de anticorpo-fármaco (20) Fórmula 90
[00466] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL, 12,5 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0287 mL; 3,4 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00466] Antibody reduction: The M30-H1-L4 antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (1.25 mL, 12.5 mg of antibody) was placed in a 1.5 tube. mL and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0287 mL; 3.4 equivalents per antibody molecule) and an aqueous solution of 1 M dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00467] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi- cionar sulfóxido de dimetila (0,0267 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,0439 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi incubado para conju-gar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0066 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.[00467] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding dimethyl sulfoxide (0.0267 ml) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 of Example 14 (0.0439 ml; 5 .2 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, this was incubated to conjugate the drug ligand to the antibody in a water bath at 15°C for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.0066 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for a further 20 minutes.
[00468] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.[00468] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated by Common Procedure A.
[00469] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 4964 (valor medido), e SD,370 = 18982 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00469] Physicochemical characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 4964 (measured value), and SD,370 = 18982 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00470] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anti-corpo: 8,7 mg (70%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 3,5. Exemplo 22 conjugado de anticorpo-fármaco (21) Fórmula 91
[00471] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL, 12,5 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0439 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo) (0,0287 mL; 3,4 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipo- tássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de arti-culação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00471] Antibody reduction: The M30-H1-L4 antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (1.25 mL, 12.5 mg of antibody) was placed in a 1.5 tube. ml and loaded with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0439 ml; 5.2 equivalents per antibody molecule) (0.0287 ml; 3.4 equivalents per molecule of antibody antibody) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 mL). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding in the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00472] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do com-posto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,0726 mL; 8,6 equivalen-tes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambi-ente, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solu-ção aquosa (0,011 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fár- maco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.[00472] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 of Example 14 (0.0726 ml; 8.6 equivalents per molecule of antibody) to the above solution at room temperature, this was incubated to conjugate the drug ligand to the antibody in a water bath at 15°C for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.011 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for an additional 20 minutes.
[00473] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois dis-so, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.[00473] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated by Common Procedure A.
[00474] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 4964 (valor medido), e SD,370 = 18982 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00474] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 4964 (measured value), and SD,370 = 18982 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00475] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anti-corpo: 8,3 mg (66%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 5,5. Exemplo 23 conjugado de anticorpo-fármaco (22) Fórmula 92
[00476] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD30 produzido no Exemplo de Referência 3 foi preparado para ter concentração de anti- corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,75 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 mL; 2,5 equivalentes por molécula de anticorpo). A ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00476] Antibody reduction: The anti-CD30 antibody produced in Reference Example 3 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.75 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (0.4 mL, 4 mg antibody) was placed in a 1.5 mL tube and loaded with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 ml; 2.5 equivalents per antibody molecule). The disulfide binding in the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00477] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar sulfóxido de dimetila (0,0098 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,0116 mL; 4,5 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0017 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também in-cubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00477] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding dimethyl sulfoxide (0.0098 mL) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 of Example 14 (0.0116 mL; 4 0.5 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, this was shaken using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.0017 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and also incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for 20 minutes.
[00478] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00478] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00479] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 270400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 4964 (valor medido), e SD,370 = 18982 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00479] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 270400 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 4964 (measured value), and SD,370 = 18982 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00480] Concentração de anticorpo: 0,86 mg/mL, produção de anti- corpo: 2,2 mg (54%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 2,5. Exemplo 24 - conjugado de anticorpo-fármaco (23) Fórmula 93
[00481] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD30 produzido no Exemplo de Referência 3 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,75 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,35 mL, 3,5 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0113 mL; 5 equivalentes por molécula de anticorpo). A ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00481] Antibody reduction: The anti-CD30 antibody produced in Reference Example 3 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.75 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (0.35 mL, 3.5 mg antibody) was placed in a 1.5 tube. ml and loaded with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0113 ml; 5 equivalents per antibody molecule). The disulfide binding in the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00482] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do com-posto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,0204 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) e propileno glicol (Kanto Chemical Co., Inc., 0,18 mL) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corpora- tion) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0031 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00482] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 of Example 14 (0.0204 ml; 9 equivalents per antibody molecule) and propylene glycol (Kanto Chemical Co., Inc., 0.18 mL) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug binder to the antibody at room temperature for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.0031 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and also incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for 20 minutes.
[00483] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00483] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00484] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 270400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 4964 (valor medido), e SD,370 = 18982 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00484] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 270400 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 4964 (measured value), and SD,370 = 18982 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00485] Concentração de anticorpo: 0,41 mg/mL, produção de anti-corpo: 1,0 mg (29%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 7,1. Exemplo 25 conjugado de anticorpo-fármaco (24) Fórmula 94
[00486] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD33 produzido no Exemplo de Referência 4 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,66 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 mL; 2,5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0058 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00486] Antibody reduction: The anti-CD33 antibody produced in Reference Example 4 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.66 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (0.4 mL, 4 mg antibody) was placed in a 1.5 mL tube and loaded with a 10 mM aqueous TCEP solution (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 mL; 2.5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Teste, Inc.; 0.0058 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00487] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar sulfóxido de dimetila (0,0101 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,0116 mL; 4,5 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0017 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também in-cubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00487] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding dimethyl sulfoxide (0.0101 mL) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 of Example 14 (0.0116 mL; 4 0.5 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, this was shaken using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.0017 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and also incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for 20 minutes.
[00488] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00488] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00489] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,28Ü = 256400 (valor de cálculo estimado), SA,37Ü = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 4964 (valor medido), e SD,370 = 18982 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00489] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,28Ü = 256400 (estimated design value), SA,37Ü = 0 (estimated design value), SD, 280 = 4964 (measured value), and SD,370 = 18982 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00490] Concentração de anticorpo: 1,25 mg/mL, produção de anti-corpo: 3,1 mg (78%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 3,7. Exemplo 26 conjugado de anticorpo-fármaco (25) Fórmula 95
[00491] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD33 produzido no Exemplo de Referência 4 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,66 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 mL; 5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,006 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de ar-ticulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00491] Antibody reduction: The anti-CD33 antibody produced in Reference Example 4 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.66 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (0.4 mL, 4 mg antibody) was placed in a 1.5 mL tube and loaded with a 10 mM aqueous TCEP solution (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 mL; 5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.006 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide binding in part-linkage in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00492] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do com-posto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,0233 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0035 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligan- te de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00492] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 of Example 14 (0.0233 ml; 9 equivalents per antibody molecule) to the solution above at room temperature, this was agitated using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.0035 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and also incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for 20 minutes.
[00493] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00493] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00494] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 4964 (valor medido), e SD,370 = 18982 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00494] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 256400 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 4964 (measured value), and SD,370 = 18982 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00495] Concentração de anticorpo: 1,17 mg/mL, produção de anti-corpo: 2,9 mg (73%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 7,3. Exemplo 27 conjugado de anticorpo-fármaco (26) Fórmula 96
[00496] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD70 produzido no Exemplo de Referência 5 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,69 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 mL; 2,5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0058 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00496] Antibody reduction: The anti-CD70 antibody produced in Reference Example 5 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.69 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (0.4 mL, 4 mg antibody) was placed in a 1.5 mL tube and loaded with a 10 mM aqueous TCEP solution (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 mL; 2.5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Teste, Inc.; 0.0058 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00497] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar sulfóxido de dimetila (0,0101 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 (0,0116 mL; 4,5 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0017 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também in-cubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00497] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding dimethyl sulfoxide (0.0101 mL) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 of Example 14 (0.0116 mL; 4 0.5 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, this was shaken using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.0017 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and also incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for 20 minutes.
[00498] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00498] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00499] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 262400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 4964 (valor medido), e SD,370 = 18982 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00499] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 262400 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 4964 (measured value), and SD,370 = 18982 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00500] Concentração de anticorpo: 1,14 mg/mL, produção de anti-corpo: 2,9 mg (71%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 3,8. Exemplo 28 conjugado de anticorpo-fármaco (27) Fórmula 97
[00501] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD70 produzido no Exemplo de Referência 5 foi preparado para ter concentração de anti- corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,69 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 mL; 5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,006 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de ar-ticulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00501] Antibody reduction: The anti-CD70 antibody produced in Reference Example 5 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.69 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (0.4 mL, 4 mg antibody) was placed in a 1.5 mL tube and loaded with a 10 mM aqueous TCEP solution (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 mL; 5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.006 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide binding in part-linkage in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00502] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0233 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 14 à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0035 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligan- te de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00502] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a solution of dimethyl sulfoxide (0.0233 ml; 9 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 of Example 14 to the above solution in At room temperature, this was agitated using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.0035 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and also incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for 20 minutes.
[00503] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00503] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00504] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,28Ü = 262400 (valor de cálculo estimado), SA,37Ü = 0 (valor de cálculo estimado), SD,28Ü = 4964 (valor medido), e SD,37Ü = 18982 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00504] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,28Ü = 262400 (estimated design value), SA,37Ü = 0 (estimated design value), SD, 28Ü = 4964 (measured value), and SD,37Ü = 18982 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00505] Concentração de anticorpo: 1,13 mg/mL, produção de anti-corpo: 2,8 mg (71%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 7,4. Exemplo 29 conjugado de anticorpo-fármaco (28) Fórmula 98
[00506] O composto (90 mg, 0,107 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 2 foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exem-plo 2 usando di-isopropiletilamina (18,7 μL, 0,107 mmol) em vez de trietilamina e 1-maleinimida-3-oxo-7,10,13,16-tetraoxa-4- azanonadecan-19-oato de N-succinimidila (55,1 mg, 0,107 mmol) em vez de hexanoato de 6-maleimida de N-succinimidila para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (50 mg, 37 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,85 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,64-1,74 (2H, m), 1,77-1,90 (2H, m), 2,06-2,19 (4H, m), 2,27-2,32 (2H, m), 2,33-2,37 (2H, m), 2,38 (3H, s), 2,72-2,80 (3H, m), 2,96-3,19 (6H, m), 3,39-3,48 (10H, m), 3,52-3,75 (10H, m), 4,39-4,48 (1H, m), 5,14 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,23 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,38 (1H, d, J=17,0 Hz), 5,42 (1H, d, J=17,0 Hz), 5,52-5,58 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,98 (1H, s), 7,13-7,24 (5H, m), 7,29 (1H, s), 7,69 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,78 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,98-8,03 (2H, m), 8,10 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,16 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,23 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,44 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (APCI) m/z: 1237 (M+H)+ Processo 2: conjugado de anticorpo-fármaco (28)[00506] The compound (90 mg, 0.107 mmol) obtained in Process 2 of Example 2 was reacted in the same manner as Process 3 of Example 2 using diisopropylethylamine (18.7 µL, 0.107 mmol) instead of triethylamine and N-succinimidyl 1-maleinimide-3-oxo-7,10,13,16-tetraoxa-4-azanonedecan-19-oate (55.1 mg, 0.107 mmol) instead of N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate to yield the title compound as a pale yellow solid (50 mg, 37%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.85 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.64-1.74 (2H, m), 1.77-1.90 ( 2H, m), 2.06-2.19 (4H, m), 2.27-2.32 (2H, m), 2.33-2.37 (2H, m), 2.38 (3H, s), 2.72-2.80 (3H, m), 2.96-3.19 (6H, m), 3.39-3.48 (10H, m), 3.52-3.75 ( 10H, m), 4.39-4.48 (1H, m), 5.14 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.23 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.38 (1H, d, J=17.0 Hz), 5.42 (1H, d, J=17.0 Hz), 5.52-5.58 (1H, m), 6.52 (1H , s), 6.98 (1H, s), 7.13-7.24 (5H, m), 7.29 (1H, s), 7.69 (1H, t, J=5.5 Hz) , 7.78 (1H, d, J=10.9 Hz), 7.98-8.03 (2H, m), 8.10 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.16 ( 1H, t, J=5.7 Hz), 8.23 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.44 (1H, d, J=8.6 Hz). MS (APCI) m/z: 1237 (M+H)+ Process 2: antibody-drug conjugate (28)
[00507] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum C-1 e Procedimento comum B (como coefici-ente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,025 mL; 3,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fos-fato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00507] Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml by replacing the medium with PBS6.0/EDTA using the common Procedure C-1 and Procedure common B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) described in Production Method 1. The solution (1.25 mL) was placed in a 1.5 mL polypropylene tube. mL and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.025 mL; 3.0 equivalents per antibody molecule) and an aqueous solution of 1 M dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00508] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,102 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 acima (0,047 mL; 5,5 equivalentes por molécula de an-ticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corpora-tion) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,009 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em tem-peratura ambiente durante mais 20 minutos.[00508] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.102 ml) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 above (0.047 ml; 5.5 equivalents per molecule of antibody) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 40 minutes. Then, an aqueous solution (0.009 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and stirred to terminate the drug-binding reaction at room temperature for a further 20 minutes.
[00509] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois dis-so, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.[00509] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated by Common Procedure A.
[00510] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.[00510] Physicochemical characterization: Using the common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5000 (mean measured value), and SD,370 = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00511] Concentração de anticorpo: 13,60 mg/mL, produção de an-ticorpo: 9,5 mg (76 %), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,3. Exemplo 30 conjugado de anticorpo-fármaco (29) Fórmula 99
[00512] O composto (0,839 g, 1,00 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 2 foi reagido da mesma maneira como Processo 1 de Exem-plo 1 usando N-(terc-butoxicarbonil)-β-alanina em vez de ácido 4-(terc- butoxicarbonilamino)butanoico. O produto cru obtido foi usado no pro-cesso seguinte sem purificação. Processo 2: β-Alanilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro- 9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)glicinamida[00512] The compound (0.839 g, 1.00 mmol) obtained in Process 2 of Example 2 was reacted in the same manner as Process 1 of Example 1 using N-(tert-butoxycarbonyl)-β-alanine instead of acid 4-(tert-butoxycarbonylamino)butanoic. The crude product obtained was used in the next process without purification. Process 2: β-Alanylglycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3, 9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-4 - oxobutyl)glycinamide
[00513] O produto cru obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 2 para produzir o com-posto título como um sólido amarelo pálido (0,610 g, 67 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,67-1,77 (2H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,09-2,22 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,46-2,55 (2H, m), 2,82-2,73 (1H, m), 2,95-3,13 (5H, m), 3,14-3,21 (2H, m), 3,55-3,80 (6H, m), 4,44-4,52 (1H, m), 5,20 (2H, dd, J=35,0, 19,0 Hz), 5,42 (2H, s), 5,53-5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,14-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,67 (2H, brs), 7,72-7,78 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,10-8,17 (2H, m), 8,29 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,42 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,47 (1H, d, J=8,6 Hz). Processo 3: N-(bromoacetil)-β-alanilglicilglicil-L-fenilalanil-N-(4- {[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-il]amino}-4-oxobutil)glicinamida[00513] The crude product obtained in Process 1 above was reacted in the same manner as Process 2 of Example 2 to yield the title compound as a pale yellow solid (0.610 g, 67%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.67-1.77 (2H, m), 1.79-1.92 ( 2H, m), 2.09-2.22 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.46-2.55 (2H, m), 2.82-2.73 (1H, m), 2.95-3.13 (5H, m), 3.14-3.21 (2H, m), 3.55-3.80 (6H, m), 4.44-4.52 ( 1H, m), 5.20 (2H, dd, J=35.0, 19.0 Hz), 5.42 (2H, s), 5.53-5.60 (1H, m), 6.54 (1H, s), 7.14-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.67 (2H, brs), 7.72-7.78 (1H, m), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.10-8.17 (2H, m), 8.29 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.42 (1H, , t, J=5.7 Hz), 8.47 (1H, d, J=8.6 Hz). Process 3: N-(bromoacetyl)-β-alanylglycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1- yl]amino}-4-oxobutyl)glycinamide
[00514] A uma solução de diclorometano (4,5 mL) de ácido 2- bromoacético (96,3 mg, 0,693 mmol), N-hidroxisuccinimida (79,7 mg, 0,693 mmol) e 1,3-di-isopropilcarbodiimida (0,107 mL, 0,693 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente. A solução de reação foi adicionada a uma solução de N,N-dimetil formamida (4,5 mL) do composto (473 mg, 0,462 mmol) obtido no Processo 2 acima e trietilamina (0,154 mL, 1,11 mmol) a 0 °C e agitada em temperatura ambiente durante 1 hora. A solução de reação foi purificada por cro- matografia de coluna de sílica-gel [solvente de eluição: clorofórmio - clorofórmio : metanol = 85 : 15 (v/v)]. O sólido obtido foi lavado com solvente misto de clorofórmio : metanol : dietil éter para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (191 mg, 40 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,67-1,77 (2H, m), 1,79-1,92 (2H, m), 2,08-2,22 (4H, m), 2,33 (2H, t, J=7,0 Hz), 2,40 (3H, s), 2,74-2,83 (1H, m), 2,99-3,12 (3H, m), 3,14-3,21 (2H, m), 3,243,30 (2H, m), 3,56-3,77 (6H, m), 3,82 (2H, s), 4,41-4,51 (1H, m), 5,20 (2H, q, J=18,9 Hz), 5,42 (2H, s), 5,54-5,60 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,157,27 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,69-7,74 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,06 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,13 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,21-8,34 (3H, m), 8,46 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 1030, 1032 (M+H)+ Processo 4: conjugado de anticorpo-fármaco (29)To a dichloromethane (4.5 mL) solution of 2-bromoacetic acid (96.3 mg, 0.693 mmol), N-hydroxysuccinimide (79.7 mg, 0.693 mmol) and 1,3-diisopropylcarbodiimide ( 0.107 ml, 0.693 mmol) were added and stirred at room temperature. The reaction solution was added to an N,N-dimethyl formamide (4.5 mL) solution of the compound (473 mg, 0.462 mmol) obtained in Process 2 above and triethylamine (0.154 mL, 1.11 mmol) at 0° C and stirred at room temperature for 1 hour. The reaction solution was purified by silica gel column chromatography [elution solvent: chloroform - chloroform : methanol = 85 : 15 (v/v)]. The solid obtained was washed with mixed solvent of chloroform : methanol : diethyl ether to yield the title compound as a pale yellow solid (191 mg, 40%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.67-1.77 (2H, m), 1.79-1.92 ( 2H, m), 2.08-2.22 (4H, m), 2.33 (2H, t, J=7.0Hz), 2.40 (3H, s), 2.74-2.83 (1H, m), 2.99-3.12 (3H, m), 3.14-3.21 (2H, m), 3.243.30 (2H, m), 3.56-3.77 (6H , m), 3.82 (2H, s), 4.41-4.51 (1H, m), 5.20 (2H, q, J=18.9 Hz), 5.42 (2H, s) , 5.54-5.60 (1H, m), 6.54 (1H, s), 7.157.27 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.69-7.74 (1H, , m), 7.80 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.06 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.13 (1H, d, J=7.8 Hz ), 8.21-8.34 (3H, m), 8.46 (1H, d, J=8.6 Hz). MS (ESI) m/z: 1030, 1032 (M+H)+ Process 4: antibody-drug conjugate (29)
[00515] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum C-1 e Procedimento comum B (como coefici-ente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,025 mL; 3,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fos-fato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00515] Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml by replacing the medium with PBS6.0/EDTA using the common Procedure C-1 and Procedure common B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) described in Production Method 1. The solution (1.25 mL) was placed in a 1.5 mL polypropylene tube. mL and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.025 mL; 3.0 equivalents per antibody molecule) and an aqueous solution of 1 M dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00516] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,09 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 (0,059 mL; 7,0 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,009 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.[00516] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.09 mL) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 3 (0.059 mL) ; 7.0 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 40 minutes . Then, an aqueous solution (0.009 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and stirred to terminate the drug-binding reaction at room temperature for a further 20 minutes.
[00517] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois dis-so, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.[00517] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated by Common Procedure A.
[00518] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,28Ü = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,37Ü = 0 (valor de cálculo estimado), SD,28Ü = 5000 (valor médio medido), e SD,37Ü = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.[00518] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,28Ü = 235300 (estimated design value), SA,37Ü = 0 (estimated design value), SD, 28Ü = 5000 (mean measured value), and SD,37Ü = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00519] Concentração de anticorpo: 13,9 mg/mL, produção de anti-corpo: 9,7 mg (78%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 3,2. Exemplo 31 conjugado de anticorpo-fármaco (30) Fórmula 100
[00520] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 3 de Exemplo 30, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 4.[00520] Using the antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 2 and the compound obtained in Process 3 of Example 30, the antibody-title drug conjugate was obtained in the same manner as Process 1 of Example 4.
[00521] Concentração de anticorpo: 1,94 mg/mL, produção de anti-corpo: 11,64 mg (93 %), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 5,6. Exemplo 32 conjugado de anticorpo-fármaco (31) Fórmula 101
[00522] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 3 de Exemplo 30, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 5.[00522] Using the antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 2 and the compound obtained in Process 3 of Example 30, the antibody-title drug conjugate was obtained in the same manner as Process 1 of Example 5.
[00523] Concentração de anticorpo: 1,90 mg/mL, produção de anti-corpo: 11,40 mg (91%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,7. Exemplo 33 conjugado de anticorpo-fármaco (32) Fórmula 102
[00524] Quase as quantidades inteiras dos conjugados de anticor- po-fármaco de Exemplos 31 e 32 foram misturadas e a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco título.Nearly entire amounts of the antibody-drug conjugates of Examples 31 and 32 were mixed and the solution was concentrated by Common Procedure A to produce the title antibody-drug conjugate.
[00525] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anti-corpo: 21,06 mg, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,0. Exemplo 34 conjugado de anticorpo-fármaco (33) Fórmula 103
[00526] A uma solução de N,N-dimetil formamida (10,0 mL) de Nε- (terc-butoxicarbonil)-Na-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil-L-lisina (1,00 g, 2,14 mmol), N-hidroxisuccinimida (0,370 g, 3,20 mmol), e cloridrato de éster de ácido 4-aminobutanoico de terc-butila (0,830 g, 4,27 mmol), cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,610 g, 3,20 mmol) e N,N-di-isopropiletilamina (0,410 ml, 2,35 mmol) foram adicio-nados e agitados em temperatura ambiente durante 3 dias. A solução de reação foi diluída com acetato de etila e lavada com uma solução aquosa de ácido cítrico a 10 % e uma solução aquosa saturada de carbonato de hidrogênio de sódio, e salmoura saturada, e em seguida a camada orgânica foi secada sobre sulfato de magnésio anidroso. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir o composto título como um sólido incolor (1,35 g, quantitativo). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 1,14-1,42 (4H, m), 1,36 (9H, s), 1,37 (9H, s), 1,48-1,67 (4H, m), 2,18 (2H, t, J=7,6 Hz), 2,84-2,93 (2H, m), 2,99-3,11 (2H, m), 3,84-3,94 (1H, m), 4,18-4,30 (3H, m), 6,76 (1H, t, J=5,4 Hz), 7,33 (2H, t, J=7,3 Hz), 7,39-7,45 (3H, m), 7,73 (2H, dd, J=7,3, 2,7 Hz), 7,85-7,92 (3H, m). Processo 2: 4-{[N6-(terc-butoxicarbonil)-L-lisil]amino}butanoato de terc- butila[00526] To a solution of N,N-dimethyl formamide (10.0 mL) of Nε-(tert-butoxycarbonyl)-Na-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl-L-lysine (1.00 g , 2.14 mmol), N-hydroxysuccinimide (0.370 g, 3.20 mmol), and tert-butyl 4-aminobutanoic acid ester hydrochloride (0.830 g, 4.27 mmol), 1-ethyl-3 hydrochloride -(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (0.610 g, 3.20 mmol) and N,N-diisopropylethylamine (0.410 ml, 2.35 mmol) were added and stirred at room temperature for 3 days. The reaction solution was diluted with ethyl acetate and washed with an aqueous 10% citric acid solution and a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, and saturated brine, and then the organic layer was dried over magnesium sulfate. anhydrous. The solvent was removed under reduced pressure to yield the title compound as a colorless solid (1.35 g, quantitative). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 1.14-1.42 (4H, m), 1.36 (9H, s), 1.37 (9H, s), 1.48-1, 67 (4H, m), 2.18 (2H, t, J=7.6Hz), 2.84-2.93 (2H, m), 2.99-3.11 (2H, m), 3 .84-3.94 (1H, m), 4.18-4.30 (3H, m), 6.76 (1H, t, J=5.4 Hz), 7.33 (2H, t, J =7.3 Hz), 7.39-7.45 (3H, m), 7.73 (2H, dd, J=7.3, 2.7 Hz), 7.85-7.92 (3H, m). Process 2: tert-butyl 4-{[N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysyl]amino}butanoate
[00527] A uma solução de N,N-dimetil formamida (8,00 mL) do composto (1,35 g, 2,22 mmol) obtido no Processo 1 acima, piperidina (2,00 mL) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 1,5 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir uma mistura contendo o composto título. A mistura foi usada para a reação seguinte sem outra purificação. Processo 3: N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-valil-N6-(terc- butoxicarbonil)-N-(4-terc-butóxi-4-oxobutil)-L-lisinamidaTo a N,N-dimethyl formamide (8.00 mL) solution of the compound (1.35 g, 2.22 mmol) obtained in Process 1 above, piperidine (2.00 mL) was added and stirred in at room temperature for 1.5 hours. The solvent was removed under reduced pressure to produce a mixture containing the title compound. The mixture was used for the next reaction without further purification. Process 3: N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-N-(4-tert-butoxy-4-oxobutyl)-L-lysinamide
[00528] A uma solução de N,N-dimetil formamida (30,0 mL) da mistura (2,22 mmol) obtida no Processo 2 acima, N-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]-L-valina (1,13 g, 3,32 mmol), N-hidroxisuccinimida (0,310 g, 2,66 mmol), e cloridrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (0,550 g, 2,88 mmol) foram adiciona-dos e agitados em temperatura ambiente durante 18 horas. A solução de reação foi diluída com acetato de etila e lavada com uma solução aquosa saturada de carbonato de hidrogênio de sódio e salmoura sa-turada, e em seguida a camada orgânica foi secada sobre sulfato de magnésio anidroso. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de síli-ca-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido incolor (0,363 g, 23 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,84 (6H, t, J=6,0 Hz), 1,12-1,64 (8H, m), 1,34 (9H, s), 1,38 (9H, s), 1,90-2,04 (1H, m), 2,17 (2H, t, J=7,3 Hz), 2,79-2,90 (2H, m), 2,99-3,09 (2H, m), 3,83-3,91 (1H, m), 4,08-4,44 (4H, m), 6,71 (1H, t, J=5,4 Hz), 7,32 (2H, t, J=7,3 Hz), 7,42 (3H, t, J=7,3 Hz), 7,74 (2H, t, J=7,0 Hz), 7,85-7,91 (4H, m). MS (ESI) m/z: 709 (M+H)+ Processo 4: formiato de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-valil-N-(3- carboxipropil)-L-lisinamida[00528] To a N,N-dimethyl formamide solution (30.0 mL) of the mixture (2.22 mmol) obtained in Process 2 above, N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L- valine (1.13 g, 3.32 mmol), N-hydroxysuccinimide (0.310 g, 2.66 mmol), and 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (0.550 g, 2.88 mmol) were added and stirred at room temperature for 18 hours. The reaction solution was diluted with ethyl acetate and washed with a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate and saturated brine, and then the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. The solvent was removed under reduced pressure and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform - chloroform : methanol = 9 : 1 (v/v)] to yield the title compound as a colorless solid (0.363 g, 23 %). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.84 (6H, t, J=6.0 Hz), 1.12-1.64 (8H, m), 1.34 (9H, s) , 1.38 (9H, s), 1.90-2.04 (1H, m), 2.17 (2H, t, J=7.3 Hz), 2.79-2.90 (2H, m ), 2.99-3.09 (2H, m), 3.83-3.91 (1H, m), 4.08-4.44 (4H, m), 6.71 (1H, t, J =5.4 Hz), 7.32 (2H, t, J=7.3 Hz), 7.42 (3H, t, J=7.3 Hz), 7.74 (2H, t, J=7 0.0Hz), 7.85-7.91 (4H, m). MS (ESI) m/z: 709 (M+H)+ Process 4: N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-valyl-N-(3-carboxypropyl)-L-lysinamide formate
[00529] Ao composto (0,363 mg, 0,512 mmol) obtido no Processo 3 acima, ácido fórmico (10,0 ml) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 4 horas. O solvente foi removido sob pressão redu-zida para produzir o composto título. O composto foi usado para a rea-ção seguinte sem outra purificação. Processo 5: N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-valil-N6-(terc- butoxicarbonil)-N-(3-carboxipropil)-L-lisinamidaTo the compound (0.363 mg, 0.512 mmol) obtained in Process 3 above, formic acid (10.0 ml) was added and stirred at room temperature for 4 hours. The solvent was removed under reduced pressure to yield the title compound. The compound was used for the next reaction without further purification. Process 5: N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-N-(3-carboxypropyl)-L-lysinamide
[00530] À suspensão de 1,4-dioxano (5,00 mL) do composto (0,512 mmol) obtido no Processo 4 acima, uma solução aquosa saturada de carbonato de hidrogênio de sódio (20,0 ml) e dicarbonato de di-terc- butila (0,178 ml, 0,769 mmol) foram adicionados e agitados em tempe-ratura ambiente durante 3 horas. A solução de reação foi diluída com acetato de etila e lavada com uma solução aquosa de ácido cítrico a 10 % e salmoura saturada, e em seguida a camada orgânica foi secada sobre sulfato de magnésio anidroso. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir o composto título como um sólido inco-lor (0,295 g, 88 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,84 (6H, t, J=6,7 Hz), 1,13-1,39 (4H, m), 1,35 (9H, s), 1,48-1,62 (4H, m), 1,91-2,04 (1H, m), 2,20 (2H, t, J=7,3 Hz), 2,80-2,89 (2H, m), 2,99-3,11 (2H, m), 3,87 (1H, dd, J=8,5, 6,7 Hz), 4,06-4,35 (4H, m), 6,71 (1H, t, J=6,0 Hz), 7,32 (2H, t, J=7,6 Hz), 7,39-7,46 (3H, m), 7,74 (2H, t, J=7,6 Hz), 7,83-7,94 (4H, m). MS (ESI) m/z: 653 (M+H)+ Processo 6: N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]-L-valil-N6-(terc- butoxicarbonil)-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)-L-lisinamida.[00530] To 1,4-dioxane suspension (5.00 ml) of the compound (0.512 mmol) obtained in Process 4 above, a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate (20.0 ml) and dicarbonate of di- tert-butyl (0.178 ml, 0.769 mmol) was added and stirred at room temperature for 3 hours. The reaction solution was diluted with ethyl acetate and washed with an aqueous 10% citric acid solution and saturated brine, and then the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. The solvent was removed under reduced pressure to yield the title compound as a colorless solid (0.295 g, 88%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.84 (6H, t, J=6.7 Hz), 1.13-1.39 (4H, m), 1.35 (9H, s) , 1.48-1.62 (4H, m), 1.91-2.04 (1H, m), 2.20 (2H, t, J=7.3 Hz), 2.80-2.89 (2H, m), 2.99-3.11 (2H, m), 3.87 (1H, dd, J=8.5, 6.7 Hz), 4.06-4.35 (4H, m ), 6.71 (1H, t, J=6.0 Hz), 7.32 (2H, t, J=7.6 Hz), 7.39-7.46 (3H, m), 7.74 (2H, t, J=7.6Hz), 7.83-7.94 (4H, m). MS (ESI) m/z: 653 (M+H)+ Process 6: N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-N-(4- {[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H- benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl)-L-lysinamide.
[00531] Mesilato do composto (4) (0,240 g, 0,452 mmol) foi reagido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 1 usando o composto (0,295 g, 0,452 mmol) obtido no Processo 5 acima em vez de ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)butanoico para produzir o composto título como um sólido laranja pálido (0,208 g, 43 %). MS (ESI) m/z: 1071 (M+H)+ Processo 7: L-Valil-N6-(terc-butoxicarbonil)-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5- fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)-L-lisinamida[00531] Compound (4) mesylate (0.240 g, 0.452 mmol) was reacted in the same manner as Process 1 of Example 1 using the compound (0.295 g, 0.452 mmol) obtained in Process 5 above instead of 4-(tert) acid -butoxycarbonylamino)butanoic acid to yield the title compound as a pale orange solid (0.208 g, 43%). MS (ESI) m/z: 1071 (M+H)+ Process 7: L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro -9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7 ]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl)-L-lysinamide
[00532] O composto (0,208 g, 0,194 mmol) obtido no Processo 6 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 2 para produzir uma mistura contendo o composto título. A mistura foi usada para a reação seguinte sem outra purificação. Processo 8: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il)hexanoil]-L-valil- N6-(terc-butoxicarbonil)-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil- 10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)-L-lisinamida[00532] The compound (0.208 g, 0.194 mmol) obtained in Process 6 above was reacted in the same manner as Process 2 to produce a mixture containing the title compound. The mixture was used for the next reaction without further purification. Process 8: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-N-(4 -{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H - benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl)-L-lysinamide
[00533] A mistura (0,194 mmol) obtida no Processo 7 acima foi reagida da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (0,133 g, 56 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,77 (6H, t, J=5,7 Hz), 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,14-1,71 (10H, m), 1,35 (9H, s), 1,77-1,95 (3H, m), 2,022,23 (7H, m), 2,40 (3H, s), 2,84 (3H, q, J=6,4 Hz), 3,05 (2H, d, J=6,7 Hz), 3,17 (2H, s), 3,26-3,39 (3H, m), 4,01-4,16 (2H, m), 5,15 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,36-5,48 (2H, m), 5,51-5,60 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,72 (1H, t, J=6,0 Hz), 6,99 (2H, s), 7,31 (1H, s), 7,717,85 (5H, m), 8,41 (1H, d, J=9,1 Hz). MS (ESI) m/z: 1041 (M+H)+ Processo 9: trifluoroacetato de N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]-L-valil-N-(4-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-4- oxobutil)-L-lisinamidaThe mixture (0.194 mmol) obtained in Process 7 above was reacted in the same manner as Process 3 of Example 2 to yield the title compound as a pale yellow solid (0.133 g, 56%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.77 (6H, t, J=5.7 Hz), 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.14-1 .71 (10H, m), 1.35 (9H, s), 1.77-1.95 (3H, m), 2.022.23 (7H, m), 2.40 (3H, s), 2. 84 (3H, q, J=6.4 Hz), 3.05 (2H, d, J=6.7 Hz), 3.17 (2H, s), 3.26-3.39 (3H, m ), 4.01-4.16 (2H, m), 5.15 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.24 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.36 -5.48 (2H, m), 5.51-5.60 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.72 (1H, t, J=6.0 Hz), 6. 99 (2H, s), 7.31 (1H, s), 7.717.85 (5H, m), 8.41 (1H, d, J=9.1 Hz). MS (ESI) m/z: 1041 (M+H)+ Process 9: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl] trifluoroacetate -L-valyl-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13, 15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl)-L- lysinamide
[00534] À solução de diclorometano (10,0 ml) do composto (0,110 mg, 0,106 mmol) obtido no Processo 8 acima, ácido trifluoroacético (4,00 ml) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 5 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (70,0 mg, 64 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,76-0,81 (6H, m), 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,12-1,31 (4H, m), 1,39-1,56 (8H, m), 1,57-1,74 (3H, m), 1,79-1,96 (3H, m), 2,06-2,18 (7H, m), 2,40 (3H, s), 2,70-2,80 (2H, m), 3,01-3,10 (2H, m), 3,13-3,22 (2H, m), 4,04 (1H, t, J=7,6 Hz), 4,10-4,20 (1H, m), 5,15 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,36-5,47 (2H, m), 5,52-5,60 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,32 (1H, s), 7,61 (3H, brs), 7,75-7,88 (4H, m), 8,43 (1H, d, J=8,5 Hz). MS (ESI) m/z: 941 (M+H)+ Processo 10: conjugado de anticorpo-fármaco (33)To the dichloromethane (10.0 ml) solution of the compound (0.110 mg, 0.106 mmol) obtained in Process 8 above, trifluoroacetic acid (4.00 ml) was added and stirred at room temperature for 5 hours. The solvent was removed under reduced pressure to yield the title compound as a pale yellow solid (70.0 mg, 64%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.76-0.81 (6H, m), 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.12-1.31 ( 4H, m), 1.39-1.56 (8H, m), 1.57-1.74 (3H, m), 1.79-1.96 (3H, m), 2.06-2, 18 (7H, m), 2.40 (3H, s), 2.70-2.80 (2H, m), 3.01-3.10 (2H, m), 3.13-3.22 ( 2H, m), 4.04 (1H, t, J=7.6 Hz), 4.10-4.20 (1H, m), 5.15 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.24 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.36-5.47 (2H, m), 5.52-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s) 7.00 (2H, s), 7.32 (1H, s), 7.61 (3H, brs), 7.75-7.88 (4H, m), 8.43 (1H, d, J =8.5 Hz). MS (ESI) m/z: 941 (M+H)+ Process 10: antibody-drug conjugate (33)
[00535] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 9 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Pro-cesso 2 de Exemplo 29.[00535] Using the antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 2 and the compound obtained in Process 9 above, the antibody-title drug conjugate was obtained in the same manner as Process 2 of Example 29.
[00536] Concentração de anticorpo: 12,0 mg/mL, produção de anti-corpo: 8,4 mg (67 %), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,2. Exemplo 35 conjugado de anticorpo-fármaco (34) Fórmula 104
[00537] O composto (84,0 mg, 0,100 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 2 foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 usando 3-mercaptopropionato de N-succinimidila em vez de hexanoato de 6-maleimida de N-succinimidila para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (61,2 mg, 66 %). 1H-RMN (DMSO-D6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,77-1,66 (2H, m), 1,791,92 (2H, m), 2,07-2,24 (4H, m), 2,31-2,47 (3H, m), 2,40 (3H, s), 2,592,69 (2H, m), 2,78 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 2,98-3,13 (3H, m), 3,143,23 (2H, m), 3,54-3,79 (6H, m), 4,40-4,50 (1H, m), 5,20 (2H, dd, J=36,8, 19,2 Hz), 5,36-5,47 (2H, m), 5,52-5,63 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,14-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,68-7,74 (1H, m), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,03-8,09 (1H, m), 8,13 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,19-8,29 (2H, m), 8,46 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 927 (M+H)+ Processo 2: conjugado de anticorpo-fármaco (34)[00537] The compound (84.0 mg, 0.100 mmol) obtained in Process 2 of Example 2 was reacted in the same manner as Process 3 of Example 2 using N-succinimidyl 3-mercaptopropionate instead of N-6-maleimide hexanoate -succinimidyl to yield the title compound as a pale yellow solid (61.2 mg, 66%). 1H-NMR (DMSO-D6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.77-1.66 (2H, m), 1.791.92 (2H, m), 2, 07-2.24 (4H, m), 2.31-2.47 (3H, m), 2.40 (3H, s), 2.592.69 (2H, m), 2.78 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 2.98-3.13 (3H, m), 3.143.23 (2H, m), 3.54-3.79 (6H, m), 4.40 -4.50 (1H, m), 5.20 (2H, dd, J=36.8, 19.2 Hz), 5.36-5.47 (2H, m), 5.52-5.63 (1H, m), 6.54 (1H, s), 7.14-7.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.68-7.74 (1H, m), 7.80 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.03-8.09 (1H, m), 8.13 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.19-8 .29 (2H, m), 8.46 (1H, d, J=8.6 Hz). MS (ESI) m/z: 927 (M+H)+ Process 2: antibody-drug conjugate (34)
[00538] Derivatização de SMCC de anticorpo: O anticorpo M30-H1- L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 20 mg/mL substituindo o meio com PBS6,5/EDTA usando o Procedimento comum C-2 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (0,25 mL) foi colocada em um tubo de 1,5 mL, carregada com solução de DMSO (0,0063 mL; que corresponde a cer-ca de 2,55 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo succini- midil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato a 27,6 mM (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.) em temperatura ambiente, e re-agida em temperatura ambiente durante 2 horas. Esta solução de rea-ção foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-2 para produzir 0,7 mL de uma solução contendo cerca de 5 mg do anti-corpo derivado de SMCC.[00538] Derivatization of antibody SMCC: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 20 mg/ml by replacing the medium with PBS6.5/EDTA using standard Procedure C-2 and Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used). The solution (0.25 mL) was placed in a 1.5 mL tube, loaded with DMSO solution (0.0063 mL; corresponding to about 2.55 equivalents per antibody molecule) containing succinimidyl 27.6 mM -4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.) at room temperature, and re-acted at room temperature for 2 hours. This reaction solution was subjected to purification using Common Procedure D-2 to produce 0.7 ml of a solution containing about 5 mg of the SMCC-derived antibody.
[00539] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar DMSO (0,045 mL) e uma solução de DMSO contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 (0,015 mL; que corresponde a cerca de 2,4 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 16 horas.[00539] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding DMSO (0.045 mL) and a DMSO solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 (0.015 mL; corresponding to about 2.4 equivalents per molecule of antibody) to the above solution at room temperature, this was shaken using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 16 hours.
[00540] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) para produzir 3,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.[00540] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) to produce 3.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated by Common Procedure A.
[00541] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00541] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E (as molar absorption coefficient, SA.280 = 235300 (estimated design value), SA.370 = 0 (estimated design value), SD.280 = 5000 (average design value) measured), and SD,370 = 19000 (mean measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00542] Concentração de anticorpo: 3,85 mg/mL, produção de anti-corpo: 0,8 mg (16%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 2,9. Exemplo 36 conjugado de anticorpo-fármaco (35) Fórmula 105
[00543] Derivatização de SMCC de anticorpo: O anticorpo M30-H1- L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 20 mg/mL substituindo o meio com PBS6,5/EDTA usando o Procedimento comum C-2 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (0,25 mL) foi colocada em um tubo de 1,5 mL, carregada com solução de DMSO (0,0125 mL; que corresponde a cer-ca de 5,1 equivalentes por molécula de anticorpo) contendo succinimi- dil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-1-carboxilato a 27,6 mM (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.) em temperatura ambiente, e reagida em temperatura ambiente durante 2 horas. Esta solução de reação foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-2 para pro-duzir 0,7 mL de uma solução contendo cerca de 5 mg do anticorpo de-rivado de SMCC.Derivatization of antibody SMCC: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 20 mg/ml by replacing the medium with PBS6.5/EDTA using standard Procedure C-2 and Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used). The solution (0.25 mL) was placed in a 1.5 mL tube, loaded with DMSO solution (0.0125 mL; corresponding to about 5.1 equivalents per antibody molecule) containing succinimidyl -4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate to 27.6 mM (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.) at room temperature, and reacted at room temperature for 2 hours. This reaction solution was subjected to purification using Common Procedure D-2 to produce 0.7 ml of a solution containing about 5 mg of the SMCC-derived antibody.
[00544] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar DMSO (0,03 mL) e uma solução de DMSO contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 35 (0,03 mL; que corres-ponde a cerca de 4,8 equivalentes por molécula de anticorpo) à solu-ção acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 16 horas.[00544] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding DMSO (0.03 ml) and a DMSO solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 of Example 35 (0.03 ml; which corresponds to about 4.8 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 16 hours.
[00545] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) para produzir 3,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.[00545] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) to produce 3.5 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated by Common Procedure A.
[00546] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00546] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD.280 = 5000 (average value measured), and SD,370 = 19000 (mean measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00547] Concentração de anticorpo: 2,43 mg/mL, produção de anti-corpo: 0,5 mg (10%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 4,2. Exemplo 37 conjugado de anticorpo-fármaco (36) Fórmula 106
[00548] O composto (84,0 mg, 0,100 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 2 foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 usando suberato de di(N-succinimidila) em vez de hexa- noato de 6-maleimida de N-succinimidila para produzir o composto tí-tulo como um sólido amarelo pálido (77,1 mg, 71 %). 1H-RMN (DMSO-D6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,21-1,38 (4H, m), 1,431,50 (2H, m), 1,55-1,63 (2H, m), 1,68-1,76 (2H, m), 1,80-1,91 (2H, m), 2,07-2,22 (6H, m), 2,40 (3H, s), 2,60-2,67 (2H, m), 2,76-2,84 (5H, m), 2,97-3,22 (5H, m), 3,56-3,76 (6H, m), 4,40-4,50 (1H, m), 5,20 (2H, q, J=18,8 Hz), 5,37-5,48 (2H, m), 5,53-5,62 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,157,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,71 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,04 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,09 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,14 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,26 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,47 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 1092 (M+H)+ Processo 2: conjugado de anticorpo-fármaco (36)[00548] The compound (84.0 mg, 0.100 mmol) obtained in Process 2 of Example 2 was reacted in the same manner as Process 3 of Example 2 using di(N-succinimidyl) suberate instead of 6-hexanoate. N-succinimidyl maleimide to yield the title compound as a pale yellow solid (77.1 mg, 71 %). 1H-NMR (DMSO-D6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.21-1.38 (4H, m), 1.431.50 (2H, m), 1, 55-1.63 (2H, m), 1.68-1.76 (2H, m), 1.80-1.91 (2H, m), 2.07-2.22 (6H, m), 2.40 (3H, s), 2.60-2.67 (2H, m), 2.76-2.84 (5H, m), 2.97-3.22 (5H, m), 3. 56-3.76 (6H, m), 4.40-4.50 (1H, m), 5.20 (2H, q, J=18.8 Hz), 5.37-5.48 (2H, m), 5.53-5.62 (1H, m), 6.54 (1H, s), 7.157.28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.71 (1H, t , J=5.5 Hz), 7.80 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.04 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.09 (1H, t, J =5.9 Hz), 8.14 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.26 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.47 (1H, d, J=8 .6 Hz). MS (ESI) m/z: 1092 (M+H)+ Process 2: antibody-drug conjugate (36)
[00549] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 20 mg/mL substituindo o meio com PBS6,5/EDTA usando o Procedimento comum C-2 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (0,25 mL) foi colocada em um tubo de 1,5 mL, carregada com uma solução de DMSO contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 acima (0,025 mL; que corresponde a cerca de 3,7 equivalentes por molécula de anticorpo) em temperatura ambiente, e agitada usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 16 horas.[00549] Conjugation between drug binder and antibody: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 20 mg/ml by replacing the medium with PBS6.5/EDTA using common Procedure C -2 and Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used). The solution (0.25 ml) was placed in a 1.5 ml tube, loaded with a DMSO solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 above (0.025 ml; corresponding to about 3.7 equivalents per molecule of antibody) at room temperature, and shaken using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 16 hours.
[00550] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) para produzir 3,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.[00550] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) to produce 3.5 ml of a solution containing the antibody-title drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated by Common Procedure A.
[00551] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00551] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E (as molar absorption coefficient, SA.280 = 235300 (estimated design value), SA.370 = 0 (estimated design value), SD.280 = 5000 (average design value) measured), and SD,370 = 19000 (mean measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00552] Concentração de anticorpo: 6,25 mg/mL, produção de anti- corpo: 1,3 mg (26%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 3,2. Exemplo 38 conjugado de anticorpo-fármaco (37) Fórmula 107
[00553] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 20 mg/mL substituindo o meio com PBS6,5/EDTA usando o Procedimento comum C-2 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado). A solução (0,5 mL) foi colocada em um tubo de 1,5 mL, depois disso carregada com uma solução de DMSO contendo DMSO (0,025 mL) e 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 37 (0,025 mL; que corresponde a cerca de 7,4 equivalentes por molécula de anticorpo) em temperatura ambiente, e agitada usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 16 horas.[00553] Conjugation between drug binder and antibody: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 20 mg/ml by replacing the medium with PBS6.5/EDTA using common Procedure C -2 and Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used). The solution (0.5 ml) was placed in a 1.5 ml tube, thereafter loaded with a DMSO solution containing DMSO (0.025 ml) and 10 mM of the compound obtained in Process 1 of Example 37 (0.025 ml; corresponds to about 7.4 equivalents per antibody molecule) at room temperature, and shaken using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 16 hours.
[00554] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) para produzir 3,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois disso, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.[00554] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) to produce 3.5 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated by Common Procedure A.
[00555] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00555] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD.280 = 5000 (average value measured), and SD,370 = 19000 (mean measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00556] Concentração de anticorpo: 4,36 mg/mL, produção de anti-corpo: 0,9 mg (18%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 4,1. Exemplo 39 conjugado de anticorpo-fármaco (38) Fórmula 108
[00557] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: O anticorpo anti-CD30 produzido no Exemplo de Referência 3 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,5/EDTA usando o Procedimento comum C-2 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,75 mLmg-1cm- 1 foi usado). A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL, depois disso carregada com DMSO (0,017 mL) e uma solução de DMSO contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 37 (0,023 mL; que corresponde a 9 equivalentes por mo-lécula de anticorpo) em temperatura ambiente, e agitada usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 4 horas.[00557] Conjugation between drug binder and antibody: The anti-CD30 antibody produced in Reference Example 3 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml by replacing the medium with PBS6.5/EDTA using standard Procedure C-2 and Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.75 mLmg-1cm-1 was used). The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was placed in a 1.5 ml tube, thereafter loaded with DMSO (0.017 ml) and a DMSO solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 of Example 37 (0.023 mL; which corresponds to 9 equivalents per molecule of antibody) at room temperature, and shaken using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature during 4 hours.
[00558] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00558] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D-1 (ABS was used as buffer solution) to produce 2.5 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
[00559] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 270400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 2670 (valor medido), e SD,3?O = 15820 (valor medido) foram usados), os se-guintes valores característicos foram obtidos.[00559] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E (as molar absorption coefficient, SA,280 = 270400 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD.280 = 2670 (measured value ), and SD,3?O = 15820 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00560] Concentração de anticorpo: 0,55 mg/mL, produção de anti-corpo: 1,4 mg (34%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 2,7. Exemplo 40 conjugado de anticorpo-fármaco (39) Fórmula 109
[00561] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: O anticorpo anti-CD33 produzido no Exemplo de Referência 4 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,5/EDTA usando o Procedimento comum C-2 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,66 mLmg-1cm- 1 foi usado). A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL, depois disso carregada com DMSO (0,017 mL) e uma solução de DMSO contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 de Exemplo 37 (0,023 mL; que corresponde a 9 equivalentes por mo-lécula de anticorpo) em temperatura ambiente, e agitada usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 4 horas.[00561] Conjugation between drug binder and antibody: The anti-CD33 antibody produced in Reference Example 4 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml by replacing the medium with PBS6.5/EDTA using standard Procedure C-2 and Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.66 mLmg-1cm-1 was used). The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was placed in a 1.5 ml tube, thereafter loaded with DMSO (0.017 ml) and a DMSO solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 of Example 37 (0.023 mL; which corresponds to 9 equivalents per molecule of antibody) at room temperature, and shaken using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature during 4 hours.
[00562] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00562] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) to produce 2.5 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
[00563] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento co mum E (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 2670 (valor medido), e SD,370 = 15820 (valor medido) foram usados), os se-guintes valores característicos foram obtidos.[00563] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E (as molar absorption coefficient, SA,280 = 256400 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD.280 = 2670 (value measured), and SD,370 = 15820 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00564] Concentração de anticorpo: 0,93 mg/mL, produção de anti-corpo: 2,3 mg (58%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 4,0. Exemplo 41 conjugado de anticorpo-fármaco (40) Fórmula 110
[00565] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: O anticorpo anti-CD70 produzido no Exemplo de Referência 5 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,5/EDTA usando o Procedimento comum C-2 e Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,69 mLmg-1cm- 1 foi usado). A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL, depois disso carregada com DMSO (0,017 mL) e uma solução de DMSO contendo 10 mM do composto obtido no Processo 1 (0,023 mL; que corresponde a 9 equivalentes por molécula de anticor- po) de Exemplo 37 em temperatura ambiente, e agitada usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 4 horas.[00565] Conjugation between drug binder and antibody: The anti-CD70 antibody produced in Reference Example 5 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml by replacing the medium with PBS6.5/EDTA using standard Procedure C-2 and Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.69 mLmg-1cm-1 was used). The solution (0.4 ml, 4 mg of the antibody) was placed in a 1.5 ml tube, thereafter loaded with DMSO (0.017 ml) and a DMSO solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 1 (0.023 ml ; which corresponds to 9 equivalents per antibody molecule) of Example 37 at room temperature, and shaken using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature during 4 hours.
[00566] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00566] Purification: The above solution was subjected to purification using Common Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) to produce 2.5 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
[00567] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 262400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 2670 (valor medido), e SD,370 = 15820 (valor medido) foram usados), os se-guintes valores característicos foram obtidos.[00567] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E (as molar absorption coefficient, SA,280 = 262400 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD.280 = 2670 (measured value ), and SD,370 = 15820 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00568] Concentração de anticorpo: 1,04 mg/mL, produção de anti-corpo: 2,6 mg (65 %), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 4,1. Exemplo 42 2-(2-Aminoetóxi)-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4- metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]acetamida Fórmula 111
[00569] Mesilato do composto (4) (3,10 g, 5,47 mol) foi reagido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 1 usando ácido {2- [(terc-butoxicarbonil)amino]etoxi}acético (J. Med. Chem., 1992, vol. 35, pp. 2928) (1,55 g, 6,01 mmol) em vez de ácido 4-(terc- butoxicarbonilamino)butanoico para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (2,56 g, 73 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,26 (9H, s), 1,81-1,91 (2H, m), 2,13-2,22 (2H, m), 2,40 (3H, s), 3,08-3,26 (4H, m), 3,43-3,53 (2H, m), 4,00 (1H, d, J=15,1 Hz), 4,05 (1H, d, J=15,1 Hz), 5,14 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,22 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,40 (1H, d, J=16,6 Hz), 5,44 (1H, d, J=16,6 Hz), 5,59-5,66 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,86 (1H, t, J=5,4 Hz), 7,31 (1H, s), 7,79 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,49 (1H, d, J=9,1 Hz). MS (APCI) m/z: 637 (M+H)+ Processo 2: 2-(2-Aminoetóxi)-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4- metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]acetamida[00569] Compound (4) mesylate (3.10 g, 5.47 mol) was reacted in the same manner as Process 1 of Example 1 using {2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]ethoxy}acetic acid (J. Med. Chem., 1992, vol. 35, pp. 2928) (1.55 g, 6.01 mmol) in place of 4-(tert-butoxycarbonylamino)butanoic acid to yield the title compound as a pale yellow solid (2 56 g, 73 %). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.26 (9H, s), 1.81-1.91 (2H, m) , 2.13-2.22 (2H, m), 2.40 (3H, s), 3.08-3.26 (4H, m), 3.43-3.53 (2H, m), 4 .00 (1H, d, J=15.1 Hz), 4.05 (1H, d, J=15.1 Hz), 5.14 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.22 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.40 (1H, d, J=16.6 Hz), 5.44 (1H, d, J=16.6 Hz), 5.59-5 .66 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.86 (1H, t, J=5.4 Hz), 7.31 (1H, s), 7.79 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.49 (1H, d, J=9.1 Hz). MS (APCI) m/z: 637 (M+H)+ Process 2: 2-(2-Aminoethoxy)-N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl -10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b ]quinolin-1-yl]acetamide
[00570] O composto (1,50 g, 2,36 mol) obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 1 para produzir trifluorocloridrato do composto título como um sólido amarelo pálido (1,50 g, quantitativo). Este composto foi confirmado no tumor de um camundongo transportando câncer que recebeu o conjugado de anticorpo-fármaco (41). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,5 Hz), 1,81-1,92 (2H, m), 2,15-2,23 (2H, m), 2,41 (3H, s), 3,05 (2H, t, J=5,1 Hz), 3,15-3,23 (2H, m), 3,71 (2H, t, J=5,1 Hz), 4,10 (2H, s), 5,19 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,24 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,43 (2H, s), 5,58-5,66 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,33 (1H, s), 7,73-7,84 (4H, m), 8,55 (1H, d, J=9,1 Hz). MS (APCI) m/z: 537 (M+H)+ Exemplo 43 conjugado de anticorpo-fármaco (41) Fórmula 112
[00571] O composto (554 mg, 0,85 mmol) de Exemplo 42 foi reagido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 2 para produzir o composto título (775 mg, 95 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,85 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,36 (9H, s), 1,78-1,89 (2H, m), 2,13-2,22 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,71 (1H, dd, J=13,4, 9,8 Hz), 2,95 (1H, dd, J=13,4, 4,3 Hz), 3,09-3,23 (1H, m), 3,233,32 (2H, m), 3,40-3,62 (8H, m), 3,73 (1H, dd, J=16,5, 5,5 Hz), 4,03 (2H, s), 4,39-4,47 (1H, m), 5,17 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,41 (1H, d, J=16,8 Hz), 5,45 (1H, d, J=16,8 Hz), 5,57-5,64 (1H, m), 6,54 (1H, s), 6,99 (1H, t, J=5,8 Hz), 7,13-7,26 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,76-7,82 (2H, m), 7,90 (1H, t, J=5,2 Hz), 8,13 (1H, d, J=7,9 Hz), 8,27 (1H, t, J=5,8 Hz), 8,49 (1H, d, J=8,5 Hz). MS (APCI) m/z: 955 (M+H)+ Processo 2: trifluoroacetato de glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S,9S)- 9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro- 1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)etil]glicinamidaThe compound (554mg, 0.85mmol) of Example 42 was reacted in the same manner as Process 1 of Example 2 to yield the title compound (775mg, 95%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.85 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.36 (9H, s), 1.78-1.89 (2H, m) , 2.13-2.22 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.71 (1H, dd, J=13.4, 9.8 Hz), 2.95 (1H, dd , J=13.4, 4.3 Hz), 3.09-3.23 (1H, m), 3.233.32 (2H, m), 3.40-3.62 (8H, m), 3. 73 (1H, dd, J=16.5, 5.5 Hz), 4.03 (2H, s), 4.39-4.47 (1H, m), 5.17 (1H, d, J= 18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.41 (1H, d, J=16.8 Hz), 5.45 (1H, d, J=16, 8 Hz), 5.57-5.64 (1H, m), 6.54 (1H, s), 6.99 (1H, t, J=5.8 Hz), 7.13-7.26 ( 5H, m), 7.31 (1H, s), 7.76-7.82 (2H, m), 7.90 (1H, t, J=5.2 Hz), 8.13 (1H, d , J=7.9 Hz), 8.27 (1H, t, J=5.8 Hz), 8.49 (1H, d, J=8.5 Hz). MS (APCI) m/z: 955 (M+H)+ Process 2: glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-trifluoroacetate- 9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7] indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)ethyl]glycinamide
[00572] O composto (630 mg, 0,659 mmol) obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 2 para produzir o composto título (588 mg, 92 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,79-1,90 (2H, m), 2,13-2,22 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,71 (1H, dd, J=13,4, 10,1 Hz), 2,99 (1H, dd, J=13,4, 4,3 Hz), 3,09-3,23 (1H, m), 3,24-3,32 (3H, m), 3,41-3,71 (7H, m), 3,86 (1H, dd, J=16,8, 5,8 Hz), 4,04 (2H, s), 4,52 (1H, td, J=9,0, 4,1 Hz), 5,17 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,41 (1H, d, J=16,5 Hz), 5,45 (1H, d, J=16,5 Hz), 5,56-5,65 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,13-7,26 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,87-8,01 (4H, m), 8,29-8,36 (2H, m), 8,46-8,55 (2H, m). MS (APCI) m/z: 855 (M+H)+ Processo 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)etil]glicinamida[00572] The compound (630 mg, 0.659 mmol) obtained in Process 1 above was reacted in the same manner as Process 2 of Example 2 to yield the title compound (588 mg, 92%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.79-1.90 (2H, m), 2.13-2.22 ( 2H, m), 2.39 (3H, s), 2.71 (1H, dd, J=13.4, 10.1 Hz), 2.99 (1H, dd, J=13.4, 4, 3Hz), 3.09-3.23 (1H, m), 3.24-3.32 (3H, m), 3.41-3.71 (7H, m), 3.86 (1H, dd , J=16.8, 5.8 Hz), 4.04 (2H, s), 4.52 (1H, td, J=9.0, 4.1 Hz), 5.17 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.41 (1H, d, J=16.5 Hz), 5.45 (1H, d, J= 16.5 Hz), 5.56-5.65 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.13-7.26 (5H, m), 7.32 (1H, s), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.87-8.01 (4H, m), 8.29-8.36 (2H, m), 8.46-8.55 ( 2H, m). MS (APCI) m/z: 855 (M+H)+ Process 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]glycylglycyl- L-phenylalanyl-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10, 13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)ethyl ]glycinamide
[00573] O composto (240 mg, 0,247 mmol) obtido no Processo 2 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 para produzir o composto título (162 mg, 62 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, t, J=7,6 Hz), 1,13-1,22 (2H, m), 1,40-1,51 (4H, m), 1,78-1,90 (2H, m), 2,09 (2H, t, J=7,6 Hz), 2,14-2,21 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,74 (1H, dd, J=13,6, 9,7 Hz), 2,96 (1H, dd, J=13,6, 4,5 Hz), 3,08-3,24 (1H, m), 3,24-3,30 (1H, m), 3,33-3,40 (4H, m), 3,47-3,68 (7H, m), 3,72 (1H, dd, J=16,6, 5,7 Hz), 4,03 (2H, s), 4,42 (1H, td, J=8,6, 4,2 Hz), 5,17 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,7 Hz), 5,40 (1H, d, J=17,2 Hz), 5,44 (1H, d, J=17,2 Hz), 5,57-5,64 (1H, m), 6,52 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,25 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,747,81 (2H, m), 7,99 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,03-8,11 (2H, m), 8,22 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,47 (1H, d, J=9,1 Hz). MS (APCI) m/z: 1048 (M+H)+ Processo 4: conjugado de anticorpo-fármaco (41)[00573] The compound (240 mg, 0.247 mmol) obtained in Process 2 above was reacted in the same manner as Process 3 of Example 2 to yield the title compound (162 mg, 62%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J=7.6Hz), 1.13-1.22 (2H, m), 1.40-1.51 ( 4H, m), 1.78-1.90 (2H, m), 2.09 (2H, t, J=7.6Hz), 2.14-2.21 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.74 (1H, dd, J=13.6, 9.7 Hz), 2.96 (1H, dd, J=13.6, 4.5 Hz), 3.08- 3.24 (1H, m), 3.24-3.30 (1H, m), 3.33-3.40 (4H, m), 3.47-3.68 (7H, m), 3. 72 (1H, dd, J=16.6, 5.7 Hz), 4.03 (2H, s), 4.42 (1H, td, J=8.6, 4.2 Hz), 5.17 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.40 (1H, d, J=17.2 Hz), 5.44 (1H , d, J=17.2 Hz), 5.57-5.64 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.13-7.25 ( 5H, m), 7.31 (1H, s), 7.747.81 (2H, m), 7.99 (1H, t, J=5.7Hz), 8.03-8.11 (2H, m ), 8.22 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.47 (1H, d, J=9.1 Hz). MS (APCI) m/z: 1048 (M+H)+ Process 4: antibody-drug conjugate (41)
[00574] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 3 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Pro-cesso 2 de Exemplo 29.[00574] Using the antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 2 and the compound obtained in Process 3 above, the antibody-title drug conjugate was obtained in the same manner as Process 2 of Example 29.
[00575] Concentração de anticorpo: 12,0 mg/mL, produção de anti-corpo: 8,4 mg (67 %), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,5. Exemplo 44 conjugado de anticorpo-fármaco (42) Fórmula 113
[00576] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 3 de Exemplo 43, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 5.[00576] Using the antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 2 and the compound obtained in Process 3 of Example 43, the antibody-title drug conjugate was obtained in the same manner as Process 1 of Example 5.
[00577] Concentração de anticorpo: 0,83 mg/mL, produção de anti- corpo: 4,98 mg (40%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 7,2. Exemplo 45 conjugado de anticorpo-fármaco (43) Fórmula 114
[00578] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 3 de Exemplo 43, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 4.[00578] Using the antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 2 and the compound obtained in Process 3 of Example 43, the antibody-title drug conjugate was obtained in the same manner as Process 1 of Example 4.
[00579] Concentração de anticorpo: 1,06 mg/mL, produção de anti-corpo: 6,36 mg (51%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,3. Exemplo 46 conjugado de anticorpo-fármaco (44) Fórmula 115
[00580] Quase as quantidades inteiras dos conjugados de anticor- po-fármaco de Exemplos 44 e 45 foram misturadas a a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco título.Almost entire amounts of the antibody-drug conjugates of Examples 44 and 45 were mixed and the solution was concentrated by Common Procedure A to produce the title antibody-drug conjugate.
[00581] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anti-corpo: 10,21 mg, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,6. Exemplo 47 conjugado de anticorpo-fármaco (45)
[00582] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL, 12,5 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0287 mL; 3,4 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00582] Antibody reduction: The M30-H1-L4 antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (1.25 mL, 12.5 mg of antibody) was placed in a 1.5 tube. mL and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0287 mL; 3.4 equivalents per antibody molecule) and an aqueous solution of 1 M dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00583] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi- cionar sulfóxido de dimetila (0,0267 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 43 (0,0439 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi incubado para conju-gar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0066 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.[00583] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding dimethyl sulfoxide (0.0267 ml) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 3 of Example 43 (0.0439 ml; 5 .2 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, this was incubated to conjugate the drug ligand to the antibody in a water bath at 15°C for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.0066 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for a further 20 minutes.
[00584] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois dis-so, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.[00584] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated by Common Procedure A.
[00585] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5193 (valor medido), e SD,370 = 20347 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00585] Physicochemical characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5193 (measured value), and SD,370 = 20347 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00586] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anti-corpo: 9,3 mg (74%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 3,7. Exemplo 48 conjugado de anticorpo-fármaco (46) Fórmula 117
[00587] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL, 12,5 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0439 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo) (0,0287 mL; 3,4 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipo- tássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de arti-culação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00587] Antibody reduction: The M30-H1-L4 antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (1.25 mL, 12.5 mg of antibody) was placed in a 1.5 tube. ml and loaded with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0439 ml; 5.2 equivalents per antibody molecule) (0.0287 ml; 3.4 equivalents per molecule of antibody antibody) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 mL). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding in the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00588] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar uma solução de sulfóxido de dimetila (0,0726 mL; 8,6 equivalen-tes por molécula de anticorpo) contendo 10 mM do composto obtido no Processo 3 de Exemplo 43 à solução acima em temperatura ambiente, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,011 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adi-cionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fárma- co em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.[00588] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a solution of dimethyl sulfoxide (0.0726 ml; 8.6 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Process 3 of Example 43 to the above solution at room temperature, this was incubated to conjugate the drug ligand to the antibody in a water bath at 15°C for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.011 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for an additional 20 minutes.
[00589] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois dis-so, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.[00589] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated by Common Procedure A.
[00590] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5193 (valor medido), e SD,370 = 20347 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00590] Physicochemical characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5193 (measured value), and SD,370 = 20347 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00591] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anti-corpo: 7,8 mg (62%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 5,2. Exemplo 49 N-[(1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-β-alaninamida Fórmula 118
[00592] Mesilato do composto (4) (500 mg, 0,941 mmol) foi reagido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 1 usando N-(terc- butoxicarbonil)-β-alanina em vez de ácido 4-(terc- butoxicarbonilamino)butanoico para produzir o composto título como um sólido amarelo-marrom (616 mg, quantitativo). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,29 (9H, s), 1,86 (2H, dt, J=15,1, 7,3 Hz), 2,04-2,22 (2H, m), 2,31 (2H, t, J=6,8 Hz), 2,40 (3H, s), 3,10-3,26 (4H, m), 5,15 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,26 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, dd, J=18,8, 16,4 Hz), 5,57 (1H, dt, J=8,5, 4,2 Hz), 6,53 (1H, s), 6,78 (1H, t, J=5,5 Hz), 7,30 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,46 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 607 (M+H)+ Processo 2: N-[(1S,9S)-9-Etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-β-alaninamida[00592] Compound (4) mesylate (500 mg, 0.941 mmol) was reacted in the same manner as Process 1 of Example 1 using N-(tert-butoxycarbonyl)-β-alanine instead of 4-(tert-butoxycarbonylamino) acid butanoic acid to yield the title compound as a yellow-brown solid (616 mg, quantitative). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.29 (9H, s), 1.86 (2H, dt, J=15, 1, 7.3 Hz), 2.04-2.22 (2H, m), 2.31 (2H, t, J=6.8 Hz), 2.40 (3H, s), 3.10- 3.26 (4H, m), 5.15 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.26 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.42 (2H, dd, J =18.8, 16.4 Hz), 5.57 (1H, dt, J=8.5, 4.2 Hz), 6.53 (1H, s), 6.78 (1H, t, J= 5.5 Hz), 7.30 (1H, s), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.46 (1H, d, J=8.6 Hz). MS (ESI) m/z: 607 (M+H)+ Process 2: N-[(1S,9S)-9-Ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2 ,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]- β-alaninamide
[00593] O composto obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 1 para produzir trifluo- roacetato do composto título como um sólido amarelo (499 mg, 86 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,86 (2H, dquin, J=14,6, 7,2, 7,2, 7,2, 7,2 Hz), 2,06-2,27 (1H, m), 2,41 (3H, s), 2,46-2,57 (2H, m), 3,08 (2H, t, J=6,8 Hz), 3,14-3,24 (2H, m), 5,22 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,29 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,43 (2H, s), 5,58 (1H, dt, J=8,5, 4,5 Hz), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,74 (3H, brs), 7,82 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,67 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 507 (M+H)+ Exemplo 50 conjugado de anticorpo-fármaco (47) Fórmula 119
[00594] O composto (484 mg, 0,780 mmol) de Exemplo 49 foi reagido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 2 para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (626 mg, 87 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,27-1,42 (9H, m), 1,77-1,93 (2H, m), 2,06-2,22 (2H, m), 2,36 (2H, t, J=7,2 Hz), 2,40 (3H, d, J=1,6 Hz), 2,44-2,54 (2H, m), 2,76 (1H, dd, J=14,5, 10,2 Hz), 3,02 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,12-3,22 (2H, m), 3,52 (6H, d, J=6,3 Hz), 4,42-4,54 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,42 (1H, dd, J=18,4, 16,4 Hz), 5,57 (1H, dt, J=8,7, 4,4 Hz), 6,53 (1H, s), 6,98 (1H, t, J=5,9 Hz), 7,14-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,777,84 (1H, m), 7,91 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,16 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,27 (1H, t, J=5,1 Hz), 8,52 (1H, d, J=9,0 Hz). Processo 2: trifluoroacetato de glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9- etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro- 1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-β- alaninamida[00594] The compound (484 mg, 0.780 mmol) of Example 49 was reacted in the same manner as Process 1 of Example 2 to yield the title compound as a pale yellow solid (626 mg, 87%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.27-1.42 (9H, m), 1.77-1.93 ( 2H, m), 2.06-2.22 (2H, m), 2.36 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.40 (3H, d, J=1.6 Hz), 2.44-2.54 (2H, m), 2.76 (1H, dd, J=14.5, 10.2 Hz), 3.02 (1H, dd, J=13.9, 4.5 Hz), 3.12-3.22 (2H, m), 3.52 (6H, d, J=6.3 Hz), 4.42-4.54 (1H, m), 5.19 (1H , d, J=19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.4 Hz), 5.42 (1H, dd, J=18.4, 16.4 Hz), 5.57 (1H, dt, J=8.7, 4.4 Hz), 6.53 (1H, s), 6.98 (1H, t, J=5.9 Hz), 7.14-7.28 ( 5H, m), 7.31 (1H, s), 7.777.84 (1H, m), 7.91 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.16 (1H, d, J=7 .8 Hz), 8.27 (1H, t, J=5.1 Hz), 8.52 (1H, d, J=9.0 Hz). Process 2: glycylglycyl-L-phenylalanylglycyl-N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10, trifluoroacetate 13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]-β-alaninamide
[00595] O composto (624 mg, 0,675 mmol) obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 2 para produzir o composto título como um sólido amarelo (626 mg, 92 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,86 (2H, tt, J=14,5, 7,2 Hz), 2,07-2,22 (2H, m), 2,36 (2H, t, J=7,2 Hz), 2,40 (3H, s), 2,44-2,54 (2H, m), 2,75 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,04 (1H, dd, J=13,7, 4,3 Hz), 3,12-3,22 (2H, m), 3,58 (2H, d, J=4,7 Hz), 3,69 (3H, td, J=11,2, 5,7 Hz), 3,87 (1H, dd, J=17,0, 5,7 Hz), 4,54 (1H, m, J=17,8, 4,5 Hz), 5,19 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,43 (2H, s), 5,51-5,60 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,14-7,29 (5H, m), 7,32 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,88 (1H, t, J=5,7 Hz), 7,97 (3H, brs), 8,29-8,38 (2H, m), 8,50 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,55 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 825 (M+H)+ Processo 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanilglicil-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-β-alaninamida[00595] The compound (624 mg, 0.675 mmol) obtained in Process 1 above was reacted in the same manner as Process 2 of Example 2 to yield the title compound as a yellow solid (626 mg, 92%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.86 (2H, tt, J=14.5, 7.2 Hz), 2 .07-2.22 (2H, m), 2.36 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.40 (3H, s), 2.44-2.54 (2H, m), 2.75 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 3.04 (1H, dd, J=13.7, 4.3 Hz), 3.12-3.22 (2H, m), 3.58 (2H, d, J=4.7 Hz), 3.69 (3H, td, J=11.2, 5.7 Hz), 3.87 (1H, dd, J=17 0.0, 5.7 Hz), 4.54 (1H, m, J=17.8, 4.5 Hz), 5.19 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.26 (1H , d, J=18.8 Hz), 5.43 (2H, s), 5.51-5.60 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.14-7.29 ( 5H, m), 7.32 (1H, s), 7.81 (1H, d, J=10.9 Hz), 7.88 (1H, t, J=5.7 Hz), 7.97 ( 3H, brs), 8.29-8.38 (2H, m), 8.50 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.55 (1H, d, J=8.6 Hz). MS (ESI) m/z: 825 (M+H)+ Process 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]glycylglycyl- L-phenylalanylglycyl-N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro -1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]-β-alaninamide
[00596] O composto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtido no Processo 2 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 para produzir o composto título como um sólido (14,0 mg, 21 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,12-1,22 (2H, m), 1,39-1,51 (4H, m), 1,79-1,91 (2H, m), 2,02-2,20 (2H, m), 2,07 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,30-2,42 (4H, m), 2,40 (3H, s), 2,78 (1H, dd, J=14,1, 9,4 Hz), 3,02 (1H, dd, J=14,7, 4,9 Hz), 3,12-3,21 (2H, m), 3,26-3,42 (2H, m), 3,50-3,80 (6H, m), 4,40-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=19,6 Hz), 5,26 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,42 (2H, brs), 5,51-5,62 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,84 (2H, m), 8,01 (1H, t, J=5,3 Hz), 8,06 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,14 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,25 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,53 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 1018 (M+H)+ Processo 4: conjugado de anticorpo-fármaco (47)[00596] The compound (60.0 mg, 0.0646 mmol) obtained in Process 2 above was reacted in the same manner as Process 3 of Example 2 to yield the title compound as a solid (14.0 mg, 21%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.12-1.22 (2H, m), 1.39-1.51 ( 4H, m), 1.79-1.91 (2H, m), 2.02-2.20 (2H, m), 2.07 (2H, t, J=7.4 Hz), 2.30 -2.42 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.78 (1H, dd, J=14.1, 9.4 Hz), 3.02 (1H, dd, J=14 .7, 4.9 Hz), 3.12-3.21 (2H, m), 3.26-3.42 (2H, m), 3.50-3.80 (6H, m), 4. 40-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.6 Hz), 5.26 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.42 (2H, brs ), 5.51-5.62 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.13-7.28 (5H, m), 7.31 ( 1H, s), 7.74-7.84 (2H, m), 8.01 (1H, t, J=5.3 Hz), 8.06 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.14 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.25 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.53 (1H, d, J=8.6 Hz). MS (ESI) m/z: 1018 (M+H)+ Process 4: antibody-drug conjugate (47)
[00597] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 3 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Pro- cesso 4 de Exemplo 2.[00597] Using the antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 2 and the compound obtained in Process 3 above, the antibody-title drug conjugate was obtained in the same manner as Process 4 of Example 2.
[00598] Concentração de anticorpo: 12,27 mg/mL, produção de an-ticorpo: 8,6 mg (69 %), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,4. Exemplo 51 conjugado de anticorpo-fármaco (48) Fórmula 120
[00599] O composto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 50 foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 usando propionato de 3-maleimida de N-succinimidila em vez de hexanoato de 6-maleimida de N-succinimidila para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (36,0 mg, 57 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,85 (2H, dt, J=14,4, 7,5 Hz), 2,05-2,22 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,30-2,44 (5H, m), 2,73-2,84 (1H, m), 3,02 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,17 (3H, d, J=5,1 Hz), 3,26-3,40 (2H, m), 3,41-3,81 (6H, m), 4,40-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, brs), 5,52-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 6,99 (2H, s), 7,13-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,80 (2H, d, J=10,2 Hz), 8,03 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,12 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,20-8,31 (2H, m), 8,52 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 976 (M+H)+ Processo 2: conjugado de anticorpo-fármaco (48)[00599] The compound (60.0 mg, 0.0646 mmol) obtained in Process 2 of Example 50 was reacted in the same manner as Process 3 of Example 2 using N-succinimidyl 3-maleimide propionate instead of 6 hexanoate. -N-succinimidyl maleimide to yield the title compound as a pale yellow solid (36.0 mg, 57%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.85 (2H, dt, J=14.4, 7.5 Hz), 2 .05-2.22 (2H, m), 2.40 (3H, s), 2.30-2.44 (5H, m), 2.73-2.84 (1H, m), 3.02 (1H, dd, J=13.9, 4.5 Hz), 3.17 (3H, d, J=5.1 Hz), 3.26-3.40 (2H, m), 3.41- 3.81 (6H, m), 4.40-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J=18, 8 Hz), 5.42 (2H, brs), 5.52-5.61 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.13-7, 28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.80 (2H, d, J=10.2 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.5 Hz), 8. 12 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.20-8.31 (2H, m), 8.52 (1H, d, J=8.6 Hz). MS (ESI) m/z: 976 (M+H)+ Process 2: antibody-drug conjugate (48)
[00600] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 1 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Pro-cesso 4 de Exemplo 2.[00600] Using the antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 2 and the compound obtained in Process 1 above, the antibody-title drug conjugate was obtained in the same manner as Process 4 of Example 2.
[00601] Concentração de anticorpo: 11,59 mg/mL, produção de an-ticorpo: 8,1 mg (65%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,7. Exemplo 52 conjugado de anticorpo-fármaco (49) Fórmula 121
[00602] O composto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 50 foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 usando 3-(2-(2-(3- maleinimidapropanamida)etóxi)etóxi)propanoato de N-succinimidila em vez de hexanoato de 6-maleimida de N-succinimidila para produzir o composto título como um sólido (23,0 mg, 31 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,77-1,92 (2H, m), 2,07-2,21 (2H, m), 2,27-2,42 (6H, m), 2,40 (3H, s), 2,74-2,84 (1H, m), 2,97-3,06 (1H, m), 3,09-3,21 (4H, m), 3,25-3,39 (6H, m), 3,45 (4H, s), 3,50-3,80 (8H, m), 4,41-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=18,4 Hz), 5,26 (1H, m, J=18,4 Hz), 5,42 (2H, brs), 5,51-5,61 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,13-7,28 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,87 (2H, m), 7,93-8,07 (2H, m), 8,09-8,21 (2H, m), 8,26 (1H, brs), 8,54 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 1135 (M+H)+ Processo 2: conjugado de anticorpo-fármaco (49)[00602] The compound (60.0 mg, 0.0646 mmol) obtained in Process 2 of Example 50 was reacted in the same manner as Process 3 of Example 2 using 3-(2-(2-(3-maleinimidepropanamide)ethoxy) N-succinimidyl ethoxy)propanoate in place of N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate to yield the title compound as a solid (23.0 mg, 31%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.77-1.92 (2H, m), 2.07-2.21 ( 2H, m), 2.27-2.42 (6H, m), 2.40 (3H, s), 2.74-2.84 (1H, m), 2.97-3.06 (1H, m), 3.09-3.21 (4H, m), 3.25-3.39 (6H, m), 3.45 (4H, s), 3.50-3.80 (8H, m) , 4.41-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=18.4 Hz), 5.26 (1H, m, J=18.4 Hz), 5.42 ( 2H, brs), 5.51-5.61 (1H, m), 6.54 (1H, s), 7.00 (2H, s), 7.13-7.28 (5H, m), 7 .31 (1H, s), 7.74-7.87 (2H, m), 7.93-8.07 (2H, m), 8.09-8.21 (2H, m), 8.26 (1H, brs), 8.54 (1H, d, J=8.6 Hz). MS (ESI) m/z: 1135 (M+H)+ Process 2: antibody-drug conjugate (49)
[00603] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 1 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Pro-cesso 2 de Exemplo 29.[00603] Using the antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 2 and the compound obtained in Process 1 above, the antibody-title drug conjugate was obtained in the same manner as Process 2 of Example 29.
[00604] Concentração de anticorpo: 14,50 mg/mL, produção de an-ticorpo: 10,2 mg (82 %), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,8. Exemplo 53 conjugado de anticorpo-fármaco (50) Fórmula 122
[00605] O composto (60,0 mg, 0,0646 mmol) obtido no Processo 2 de Exemplo 50 foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 usando 1-maleinimida-3-oxo-7,10,13,16-tetraoxa-4- azanonadecanoato de N-succinimidila em vez de hexanoato de 6- maleimida de N-succinimidila para produzir o composto título como um sólido (23,0 mg, 29 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, t, J=7,0 Hz), 1,85 (2H, tt, J=14,6, 7,1 Hz), 2,06-2,22 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,28-2,43 (6H, m), 2,78 (1H, dd, J=13,7, 9,4 Hz), 3,02 (1H, dd, J=14,1, 3,9 Hz), 3,09-3,22 (4H, m), 3,27-3,41 (4H, m), 3,47 (12H, d, J=8,6 Hz), 3,53-3,81 (10H, m), 4,41-4,51 (1H, m), 5,19 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,26 (1H, d, J=18,8 Hz), 5,42 (2H, brs), 5,53-5,61 (1H, m), 6,54 (1H, s), 7,00 (2H, s), 7,127,29 (5H, m), 7,31 (1H, s), 7,74-7,85 (2H, m), 8,03 (2H, d, J=6,6 Hz), 8,11-8,21 (2H, m), 8,27 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,54 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 1224 (M+H)+ Processo 2: conjugado de anticorpo-fármaco (50)[00605] The compound (60.0 mg, 0.0646 mmol) obtained in Process 2 of Example 50 was reacted in the same manner as Process 3 of Example 2 using 1-maleinimide-3-oxo-7,10,13,16 N-succinimidyl-tetraoxa-4-azanonedecanoate in place of N-succinimidyl-6-maleimide hexanoate to yield the title compound as a solid (23.0 mg, 29%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.86 (3H, t, J=7.0 Hz), 1.85 (2H, tt, J=14.6, 7.1 Hz), 2 .06-2.22 (2H, m), 2.40 (3H, s), 2.28-2.43 (6H, m), 2.78 (1H, dd, J=13.7, 9, 4 Hz), 3.02 (1H, dd, J=14.1, 3.9 Hz), 3.09-3.22 (4H, m), 3.27-3.41 (4H, m), 3.47 (12H, d, J=8.6 Hz), 3.53-3.81 (10H, m), 4.41-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, brs), 5.53-5.61 (1H, m), 6.54 ( 1H, s), 7.00 (2H, s), 7.127.29 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.74-7.85 (2H, m), 8.03 (2H, , d, J=6.6 Hz), 8.11-8.21 (2H, m), 8.27 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.54 (1H, d, J= 8.6 Hz). MS (ESI) m/z: 1224 (M+H)+ Process 2: antibody-drug conjugate (50)
[00606] Usando o anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 e o composto obtido no Processo 1 acima, o conjugado de anticorpo-fármaco título foi obtido da mesma maneira como Pro-cesso 4 de Exemplo 2. Concentração de anticorpo: 13,47 mg/mL, produção de anticorpo: 9,4 mg (75%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,1. Exemplo 54 conjugado de anticorpo-fármaco (51) Fórmula 123
[00607] Mesilato do composto (4) (0,500 g, 0,882 mmol) foi reagido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 1 usando ácido 6- (terc-butoxicarbonilamino)hexanoico em vez de ácido 4-(terc- butoxicarbonilamino)butanoico para produzir o composto título (0,620 g, quantitativo). 1H-RMN (DMSO-d6) δ: 0,83 (3H, t, J=7,8 Hz), 1,14-1,28 (2H, m), 1,31 (9H, s), 1,47-1,61 (2H, m), 1,75-1,89 (2H, m), 2,04-2,17 (4H, m), 2,35 (3H, s), 2,81-2,88 (2H, m), 3,09-3,16 (2H, m), 5,10 (1H, d, J=19,4 Hz), 5,16 (1H, d, J=19,4 Hz), 5,39 (2H, s), 5,48-5,55 (1H, m), 6,50 (1H, s), 6,73-6,78 (1H, m), 7,26 (1H, s), 7,74 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,39 (1H, d, J=9,0 Hz). Processo 2: trifluoroacetato de 6-amino-N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]hexanamida[00607] Compound (4) mesylate (0.500 g, 0.882 mmol) was reacted in the same manner as Process 1 of Example 1 using 6-(tert-butoxycarbonylamino)hexanoic acid instead of 4-(tert-butoxycarbonylamino)butanoic acid for yield the title compound (0.620 g, quantitative). 1H-NMR (DMSO-d6) δ: 0.83 (3H, t, J=7.8 Hz), 1.14-1.28 (2H, m), 1.31 (9H, s), 1, 47-1.61 (2H, m), 1.75-1.89 (2H, m), 2.04-2.17 (4H, m), 2.35 (3H, s), 2.81- 2.88 (2H, m), 3.09-3.16 (2H, m), 5.10 (1H, d, J=19.4 Hz), 5.16 (1H, d, J=19, 4Hz), 5.39 (2H, s), 5.48-5.55 (1H, m), 6.50 (1H, s), 6.73-6.78 (1H, m), 7. 26 (1H, s), 7.74 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.39 (1H, d, J=9.0 Hz). Process 2: 6-amino-N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13, trifluoroacetate 15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]hexanamide
[00608] O composto (0,397 g, 0,611 mmol) obtido no Processo 1 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 1 para produzir o composto título (0,342 g, 84 %). 1H-RMN (DMSO-d6) δ: 0,88 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,31-1,41 (2H, m), 1,52-1,70 (4H, m), 1,80-1,94 (2H, m), 2,05-2,18 (2H, m), 2,21 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,40 (3H, s), 2,81 (2H, t, J=7,4 Hz), 3,10-3,25 (2H, m), 3,33 (2H, brs), 5,18 (1H, d, J=19,8 Hz), 5,22 (1H, d, J=19,8 Hz), 5,41 (2H, d, J=16,6 Hz), 5,45 (2H, d, J=16,6 Hz), 5,53-5,60 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,32 (1H, s), 7,80 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,49 (1H, d, J=9,2 Hz). Processo 3: N-(terc-butoxicarbonil)glicilglicil-L-fenilalanil-N-(6- {[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexa-hidro-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-il]amino}-6-oxoexil)glicinamida[00608] The compound (0.397 g, 0.611 mmol) obtained in Process 1 above was reacted in the same manner as Process 2 of Example 1 to yield the title compound (0.342 g, 84%). 1H-NMR (DMSO-d6) δ: 0.88 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.31-1.41 (2H, m), 1.52-1.70 (4H, m ), 1.80-1.94 (2H, m), 2.05-2.18 (2H, m), 2.21 (2H, t, J=7.4 Hz), 2.40 (3H, s), 2.81 (2H, t, J=7.4 Hz), 3.10-3.25 (2H, m), 3.33 (2H, brs), 5.18 (1H, d, J =19.8 Hz), 5.22 (1H, d, J=19.8 Hz), 5.41 (2H, d, J=16.6 Hz), 5.45 (2H, d, J=16 0.6 Hz), 5.53-5.60 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.32 (1H, s), 7.80 (1H, d, J=10.9 Hz ), 8.49 (1H, d, J=9.2 Hz). Process 3: N-(tert-butoxycarbonyl)glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(6-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo -2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl ]amino}-6-oxohexyl)glycinamide
[00609] O composto (0,170 g, 0,516 mmol) obtido no Processo 2 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 1 de Exemplo 2 para produzir o composto título (0,225 g, 91 %). 1H-RMN (DMSO-d6) δ: 0,88 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,43-1,70 (6H, m), 1,87 (2H, td, J=15,0, 7,4 Hz), 2,10-2,22 (3H, m), 2,28-2,37 (1H, m), 2,42 (3H, s), 2,78-2,85 (1H, m), 3,01-3,10 (3H, m), 3,15-3,22 (2H, m), 3,543,61 (5H, m), 3,62-3,69 (1H, m), 4,44-4,53 (1H, m), 5,17 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,25 (1H, d, J=19,2 Hz), 5,45 (2H, s), 5,54-5,61 (1H, m), 6,55 (1H, s), 7,02 (1H, t, J=6,1 Hz), 7,11-7,28 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,63-7,69 (1H, m), 7,82 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,90-7,96 (1H, m), 8,17 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,28 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,46 (1H, d, J=9,0 Hz). Processo 4: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-(6-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-6- oxoexil)glicinamida[00609] The compound (0.170 g, 0.516 mmol) obtained in Process 2 above was reacted in the same manner as Process 1 of Example 2 to yield the title compound (0.225 g, 91%). 1H-NMR (DMSO-d6) δ: 0.88 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.43-1.70 (6H, m), 1.87 (2H, td, J=15 0.0, 7.4 Hz), 2.10-2.22 (3H, m), 2.28-2.37 (1H, m), 2.42 (3H, s), 2.78-2, 85 (1H, m), 3.01-3.10 (3H, m), 3.15-3.22 (2H, m), 3.543.61 (5H, m), 3.62-3.69 ( 1H, m), 4.44-4.53 (1H, m), 5.17 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.45 (2H, s), 5.54-5.61 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.02 (1H, t, J=6.1 Hz), 7.11 -7.28 (5H, m), 7.33 (1H, s), 7.63-7.69 (1H, m), 7.82 (1H, d, J=11.0 Hz), 7. 90-7.96 (1H, m), 8.17 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.28 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.46 (1H, d , J=9.0 Hz). Process 4: Glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(6-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-10,13-dioxo-2,3,9,10,13, 15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-6-oxohexyl)glycinamide
[00610] O composto (0,105 g, 0,108 mmol) obtido no Processo 3 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 2 de Exemplo 2 para produzir o composto título (0,068 mg, 65 %). 1H-RMN (DMSO-d6) δ: 0,89 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,15-1,67 (6H, m), 1,79-1,97 (2H, m), 2,08-2,24 (4H, m), 2,42 (3H, s), 2,76-2,82 (1H, m), 3,003,10 (5H, m), 3,19 (1H, s), 3,50-3,63 (2H, m), 3,64-3,76 (3H, m), 3,843,92 (1H, m), 4,51-4,59 (1H, m), 5,17 (1H, d, J=19,4 Hz), 5,24 (1H, d, J=19,4 Hz), 5,44 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,55 (1H, brs), 7,15-7,29 (5H, m), 7,33 (1H, s), 7,72-7,78 (1H, m), 7,82 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,96-8,08 (2H, m), 8,30-8,38 (2H, m), 8,46-8,56 (2H, m). Processo 5: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-(6-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi- 10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-6- oxoexil)glicinamidaThe compound (0.105 g, 0.108 mmol) obtained in Process 3 above was reacted in the same manner as Process 2 of Example 2 to yield the title compound (0.068 mg, 65%). 1H-NMR (DMSO-d6) δ: 0.89 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.15-1.67 (6H, m), 1.79-1.97 (2H, m ), 2.08-2.24 (4H, m), 2.42 (3H, s), 2.76-2.82 (1H, m), 3.003.10 (5H, m), 3.19 ( 1H, s), 3.50-3.63 (2H, m), 3.64-3.76 (3H, m), 3.843.92 (1H, m), 4.51-4.59 (1H, m), 5.17 (1H, d, J=19.4 Hz), 5.24 (1H, d, J=19.4 Hz), 5.44 (2H, s), 5.53-5, 61 (1H, m), 6.55 (1H, brs), 7.15-7.29 (5H, m), 7.33 (1H, s), 7.72-7.78 (1H, m) , 7.82 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.96-8.08 (2H, m), 8.30-8.38 (2H, m), 8.46-8.56 (2H,m). Process 5: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(6-{[(1S,9S )-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4 ':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-6-oxohexyl)glycinamide
[00611] O composto (58 mg, 0,060 mmol) obtido no Processo 4 acima foi reagido da mesma maneira como Processo 3 de Exemplo 2 para produzir o composto título (39 mg, 62 %). 1H-RMN (CD3OD) δ: 0,99 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,27 (2H, td, J=11,6, 6,1 Hz), 1,38-1,44 (2H, m), 1,50-1,63 (6H, m), 1,65-1,80 (2H, m), 1,89-1,98 (2H, m), 2,17-2,25 (3H, m), 2,26-2,36 (3H, m), 2,40 (3H, s), 2,95 (1H, dd, J=14,3, 9,2 Hz), 3,12 (1H, dd, J=13,7, 5,7 Hz), 3,15-3,25 (4H, m), 3,44 (2H, t, J=7,2 Hz), 3,65 (1H, d, J=17,2 Hz), 3,76 (1H, d, J=17,2 Hz), 3,79-3,86 (4H, m), 4,43 (1H, dd, J=8,9, 6,0 Hz), 5,10 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,25 (1H, d, J=18,9 Hz), 5,35 (1H, d, J=16,6 Hz), 5,56 (1H, d, J=16,0 Hz), 5,60-5,64 (1H, m), 6,76 (2H, s), 7,12-7,24 (6H, m), 7,58 (1H, s), 7,60 (1H, d, J=10,9 Hz), 7,68 (1H, t, J=5,7 Hz). MS (ESI) m/z: 1060 (M+H)+ Processo 6: conjugado de anticorpo-fármaco (51)[00611] The compound (58 mg, 0.060 mmol) obtained in Process 4 above was reacted in the same manner as Process 3 of Example 2 to yield the title compound (39 mg, 62%). 1H-NMR (CD3OD) δ: 0.99 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.27 (2H, td, J=11.6, 6.1 Hz), 1.38-1, 44 (2H, m), 1.50-1.63 (6H, m), 1.65-1.80 (2H, m), 1.89-1.98 (2H, m), 2.17- 2.25 (3H, m), 2.26-2.36 (3H, m), 2.40 (3H, s), 2.95 (1H, dd, J=14.3, 9.2 Hz) , 3.12 (1H, dd, J=13.7, 5.7 Hz), 3.15-3.25 (4H, m), 3.44 (2H, t, J=7.2 Hz), 3.65 (1H, d, J=17.2 Hz), 3.76 (1H, d, J=17.2 Hz), 3.79-3.86 (4H, m), 4.43 (1H , dd, J=8.9, 6.0 Hz), 5.10 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.35 (1H, d, J=16.6 Hz), 5.56 (1H, d, J=16.0 Hz), 5.60-5.64 (1H, m), 6.76 (2H, s) , 7.12-7.24 (6H, m), 7.58 (1H, s), 7.60 (1H, d, J=10.9 Hz), 7.68 (1H, t, J=5 .7 Hz). MS (ESI) m/z: 1060 (M+H)+ Process 6: antibody-drug conjugate (51)
[00612] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solu-ção (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0147 mL; 2,3 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0. 050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.[00612] Antibody reduction: The antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (1.0 mL) was collected in a 1.5 mL tube and charged with an aqueous solution of TCEP at 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0147 mL; 2.3 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0 050 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00613] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução a 22 °C durante 10 minutos, uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 5 acima (0,0295 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22 °C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,00590 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22 °C durante mais 20 minutos.[00613] Conjugation between drug ligand and antibody: After incubating the solution at 22 °C for 10 minutes, a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 5 above (0.0295 ml; 4.6 equivalents per antibody molecule) was added thereto and incubated to conjugate the drug ligand to the antibody at 22°C for 40 minutes. Then, an aqueous solution (0.00590 mL; 9.2 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at 22°C °C for another 20 minutes.
[00614] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (PBS7,4 foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00614] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (PBS7.4 was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00615] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.[00615] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5000 (mean measured value), and SD,370 = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00616] Concentração de anticorpo: 0,97 mg/mL, produção de anti-corpo: 5,82 mg (58%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 1,7. Exemplo 55 conjugado de anticorpo-fármaco (52) Fórmula 124
[00617] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solu-ção (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0295 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0. 050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37 °C durante 1 hora.[00617] Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (1.0 mL) was collected in a 1.5 mL tube and charged with an aqueous solution of TCEP at 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0295 mL; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0 050 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00618] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima a 22 °C durante 10 minutos, uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 5 de Exemplo 54 (0,0590 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0118 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22°C durante mais 20 minutos.[00618] Conjugation between drug ligand and antibody: After incubating the above solution at 22 °C for 10 minutes, a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 5 of Example 54 (0.0590 ml; 9, 2 equivalents per antibody molecule) was added thereto and incubated to conjugate the drug ligand to the antibody at 22°C for 40 minutes. Then, an aqueous solution (0.0118 mL; 18.4 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at 22°C °C for another 20 minutes.
[00619] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (PBS7,4 foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00619] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (PBS7.4 was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00620] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca racterísticos foram obtidos.[00620] Physicochemical characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5000 (mean measured value), and SD,370 = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00621] Concentração de anticorpo: 0,94 mg/mL, produção de anti-corpo: 5,64 mg (56%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,1. Exemplo 56 conjugado de anticorpo-fármaco (53) Fórmula 125
[00622] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solu-ção (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0147 mL; 2,3 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0. 050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00622] Antibody reduction: The M30-H1-L4 antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (1.0 mL) was collected in a 1.5 mL tube and charged with an aqueous solution of TCEP at 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0147 mL; 2.3 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0 050 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00623] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima a 22°C durante 10 minutos, uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 5 de Exemplo 54 (0,0295 mL; 4,6 equivalentes por molécula de an-ticorpo) foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,00590 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anti-corpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22°C durante mais 20 minutos.[00623] Conjugation between drug ligand and antibody: After incubating the above solution at 22°C for 10 minutes, a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 5 of Example 54 (0.0295 ml; 4, 6 equivalents per antibody molecule) was added thereto and incubated to conjugate the drug ligand to the antibody at 22°C for 40 minutes. Then, an aqueous solution (0.00590 mL; 9.2 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at 22°C for another 20 minutes.
[00624] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (PBS7,4 foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00624] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (PBS7.4 was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00625] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,28Ü = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,37Ü = 0 (valor de cálculo estimado), SD,28Ü = 5000 (valor médio medido), e SD,37Ü = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.[00625] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,28Ü = 235300 (estimated design value), SA,37Ü = 0 (estimated design value), SD, 28Ü = 5000 (mean measured value), and SD,37Ü = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00626] Concentração de anticorpo: 1,22 mg/mL, produção de anti-corpo: 7,32 mg (73%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 1,5. Exemplo 57 conjugado de anticorpo-fármaco (54) Fórmula 126
[00627] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solu-ção (1,0 mL) foi coletada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0295 mL; 4,6 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tes- que, Inc.; 0. 050 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00627] Antibody reduction: The antibody M30-H1-L4 produced in Reference Example 1 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (1.0 mL) was collected in a 1.5 mL tube and charged with an aqueous solution of TCEP at 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0295 mL; 4.6 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0 050 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00628] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após incubar a solução acima a 22°C durante 10 minutos, uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 5 de Exemplo 54 (0,0590 mL; 9,2 equivalentes por molécula de anticorpo) foi adicionada a isso e incubada para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo a 22°C durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,0118 mL; 18,4 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco a 22°C durante mais 20 minutos.[00628] Conjugation between drug binder and antibody: After incubating the above solution at 22°C for 10 minutes, a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 5 of Example 54 (0.0590 ml; 9, 2 equivalents per antibody molecule) was added thereto and incubated to conjugate the drug ligand to the antibody at 22°C for 40 minutes. Then, an aqueous solution (0.0118 mL; 18.4 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at 22°C °C for another 20 minutes.
[00629] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (PBS7,4 foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00629] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (PBS7.4 was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00630] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.[00630] Physicochemical characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5000 (mean measured value), and SD,370 = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00631] Concentração de anticorpo: 1,06 mg/mL, produção de anti-corpo: 6,36 mg (64%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,0. Exemplo 58 conjugado de anticorpo-fármaco (55) Fórmula 127
[00632] A uma mistura contendo N-9- fluorenilmetoxicarbonilglicilglicina (4,33 g, 12,2 mmol), tetraidrofurano (120 ml), e tolueno (40,0 ml), piridina (1,16 ml, 14,7 mmol) e tetraace- tato de chumbo (6,84 g, 14,7 mmol) foram adicionados e refluxados sob aquecimento durante 5 horas. Após a solução de reação ser resfriada para temperatura ambiente, os insolúveis foram removidos por filtração através de celita, e concentrados sob pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram dissolvidos em acetato de etila e lavado com água e salmoura saturada, e em seguida a camada orgânica foi secada sobre sulfato de magnésio anidroso. Após o solvente ser removido sob pressão reduzida, os resíduos obtidos foram purificados por cro- matografia de coluna de sílica-gel hexano : acetato de etila = 9 : 1 (v/v) - acetato de etila para produzir o composto título como um sólido inco-lor (3,00 g, 67 %). 1H-RMN (400 MHz, CDCI3) δ: 2,07 (3H, s), 3,90 (2H, d, J=5,1 Hz), 4,23 (1H, t, J=7,0 Hz), 4,46 (2H, d, J=6,6 Hz), 5,26 (2H, d, J=7,0 Hz), 5,32 (1H, brs), 6,96 (1H, brs), 7,32 (2H, t, J=7,3 Hz), 7,41 (2H, t, J=7,3 Hz), 7,59 (2H, d, J=7,3 Hz), 7,77 (2H, d, J=7,3 Hz). Processo 2: [({N-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]glicil}amino)metóxi]acetato de benzilaTo a mixture containing N-9-fluorenylmethoxycarbonylglycylglycine (4.33 g, 12.2 mmol), tetrahydrofuran (120 ml), and toluene (40.0 ml), pyridine (1.16 ml, 14.7 mmol) ) and lead tetraacetate (6.84 g, 14.7 mmol) were added and refluxed under heating for 5 hours. After the reaction solution was cooled to room temperature, insolubles were removed by filtration through celite, and concentrated under reduced pressure. The residues obtained were dissolved in ethyl acetate and washed with water and saturated brine, and then the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. After the solvent was removed under reduced pressure, the residues obtained were purified by silica gel column chromatography hexane : ethyl acetate = 9 : 1 (v/v) - ethyl acetate to yield the title compound as a solid colorless (3.00 g, 67%). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 2.07 (3H, s), 3.90 (2H, d, J=5.1 Hz), 4.23 (1H, t, J=7.0 Hz ), 4.46 (2H, d, J=6.6 Hz), 5.26 (2H, d, J=7.0 Hz), 5.32 (1H, brs), 6.96 (1H, brs ), 7.32 (2H, t, J=7.3 Hz), 7.41 (2H, t, J=7.3 Hz), 7.59 (2H, d, J=7.3 Hz), 7.77 (2H, d, J=7.3 Hz). Process 2: [({N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycyl}amino)methoxy]benzyl acetate
[00633] À solução de tetraidrofurano (40,0 mL) do composto (3,68 g, 10,0 mmol) obtido no Processo 1 acima e glicolato de benzila (4,99 g, 30,0 mmol), terc-butóxido de potássio (2,24 g, 20,0 mmol) foi adicio-nado a 0°C e agitado em temperatura ambiente durante 15 minutos. A solução de reação foi carregada com acetato de etila e água a 0°C e extraída com acetato de etila e clorofórmio. A camada orgânica obtida foi secada sobre sódio sulfato e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram dissolvidos em dioxano (40,0 mL) e água (10,0 mL), carregado com carbonato de hidrogênio de sódio (1,01 g, 12,0 mmol) e cloroformiato de 9-fluorenilmetila (2,59 g, 10,0 mmol), e agitado em temperatura ambiente durante 2 horas. A solução de reação foi carregada com água e extraída com acetato de etila. A camada orgânica obtida foi secada sobre sódio sulfato e filtra- da. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [hexano : acetato de etila = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] para produzir o composto título em substância oleosa incolor (1,88 g, 40 %). 1H-RMN (400 MHz, CDCI3) δ: 3,84 (2H, d, J=5,5 Hz), 4,24 (3H, t, J=6,5 Hz), 4,49 (2H, d, J=6,7 Hz), 4,88 (2H, d, J=6,7 Hz), 5,15-5,27 (1H, m), 5,19 (2H, s), 6,74 (1H, brs), 7,31-7,39 (7H, m), 7,43 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,61 (2H, d, J=7,4 Hz), 7,79 (2H, d, J=7,4 Hz). Processo 3: ácido [({N-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]glicil}amino)metóxi]acético[00633] To tetrahydrofuran (40.0 mL) solution of the compound (3.68 g, 10.0 mmol) obtained in Process 1 above and benzyl glycolate (4.99 g, 30.0 mmol), tert-butoxide of potassium (2.24 g, 20.0 mmol) was added at 0°C and stirred at room temperature for 15 minutes. The reaction solution was charged with ethyl acetate and water at 0°C and extracted with ethyl acetate and chloroform. The obtained organic layer was dried over sodium sulfate and filtered. The solvent was removed under reduced pressure. The residues obtained were dissolved in dioxane (40.0 mL) and water (10.0 mL), charged with sodium hydrogen carbonate (1.01 g, 12.0 mmol) and 9-fluorenylmethyl chloroformate (2.59 g, 10.0 mmol), and stirred at room temperature for 2 hours. The reaction solution was charged with water and extracted with ethyl acetate. The obtained organic layer was dried over sodium sulfate and filtered. The solvent was removed under reduced pressure and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [hexane : ethyl acetate = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] to yield the title compound as colorless oily substance (1.88 g, 40%). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 3.84 (2H, d, J=5.5 Hz), 4.24 (3H, t, J=6.5 Hz), 4.49 (2H, d , J=6.7 Hz), 4.88 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.15-5.27 (1H, m), 5.19 (2H, s), 6.74 (1H, brs), 7.31-7.39 (7H, m), 7.43 (2H, t, J=7.4 Hz), 7.61 (2H, d, J=7.4 Hz) , 7.79 (2H, d, J=7.4 Hz). Process 3: [({N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycyl}amino)methoxy]acetic acid
[00634] O composto (1,88 g, 3,96 mmol) obtido no Processo 2 acima foi dissolvido em etanol (40,0 mL) e acetato de etila (20,0 ml). Após adicionar catalisador de paládio sobre carbono (376 mg), isto foi agita-do sob atmosfera de hidrogênio em temperatura ambiente durante 2 horas. Os insolúveis foram removidos por filtração através de celita, e o solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir o composto título como um sólido incolor (1,52 g, quantitativo). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 3,62 (2H, d, J=6,3 Hz), 3,97 (2H, s), 4,18-4,32 (3H, m), 4,60 (2H, d, J=6,7 Hz), 7,29-7,46 (4H, m), 7,58 (1H, t, J=5,9 Hz), 7,72 (2H, d, J=7,4 Hz), 7,90 (2H, d, J=7,4 Hz), 8,71 (1H, t, J=6,5 Hz). Processo 4: 9H-Fluoren-9-ilmetil(2-{[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]amino}-2-oxoetil)carbamatoThe compound (1.88 g, 3.96 mmol) obtained in Process 2 above was dissolved in ethanol (40.0 ml) and ethyl acetate (20.0 ml). After adding palladium on carbon catalyst (376 mg), this was stirred under hydrogen atmosphere at room temperature for 2 hours. Insolubles were removed by filtration through celite, and the solvent was removed under reduced pressure to yield the title compound as a colorless solid (1.52 g, quantitative). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 3.62 (2H, d, J=6.3 Hz), 3.97 (2H, s), 4.18-4.32 (3H, m) , 4.60 (2H, d, J=6.7 Hz), 7.29-7.46 (4H, m), 7.58 (1H, t, J=5.9 Hz), 7.72 ( 2H, d, J=7.4 Hz), 7.90 (2H, d, J=7.4 Hz), 8.71 (1H, t, J=6.5 Hz). Process 4: 9H-Fluoren-9-ylmethyl(2-{[(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2, 3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino} -2-oxoethoxy)methyl]amino}-2-oxoethyl)carbamate
[00635] Sob resfriamento por gelo, a uma solução de N,N-dimetil formamida (10,0 mL) de mesilato do composto (4) (0,283 g, 0,533 mmol), N-hidroxisuccinimida (61,4 mg, 0,533 mmol), e o composto (0,205 g, 0,533 mmol) obtido no Processo 3 acima, N,N-di- isopropiletilamina (92,9 μL, 0,533 mmol) e N,N'-diciclo- hexilcarbodiimida (0,143 g, 0,693 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 3 dias. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromato- grafia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] para produzir o composto título como um sólido marrom pálido (0,352 g, 82 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,81 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,73-1,87 (2H, m), 2,06-2,20 (2H, m), 2,34 (3H, s), 3,01-3,23 (2H, m), 3,58 (2H, d, J=6,7 Hz), 3,98 (2H, s), 4,13-4,25 (3H, m), 4,60 (2H, d, J=6,7 Hz), 5,09-5,22 (2H, m), 5,32-5,42 (2H, m), 5,50-5,59 (1H, m), 6,49 (1H, s), 7,24-7,30 (3H, m), 7,36 (2H, t, J=7,4 Hz), 7,53 (1H, t, J=6,3 Hz), 7,66 (2H, d, J=7,4 Hz), 7,75 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,84 (2H, d, J=7,4 Hz), 8,47 (1H, d, J=8,6 Hz), 8,77 (1H, t, J=6,7 Hz). MS (ESI) m/z: 802 (M+H)+ Processo 5: N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamida[00635] Under ice-cooling, to a solution of N,N-dimethyl formamide (10.0 mL) of compound (4) mesylate (0.283 g, 0.533 mmol), N-hydroxysuccinimide (61.4 mg, 0.533 mmol) ), and the compound (0.205 g, 0.533 mmol) obtained in Process 3 above, N,N-diisopropylethylamine (92.9 µL, 0.533 mmol) and N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (0.143 g, 0.693 mmol) were added and stirred at room temperature for 3 days. The solvent was removed under reduced pressure and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform - split organic layer chloroform : methanol : water = 7 : 3 : 1 (v/v/v)] to yield the title compound as a pale brown solid (0.352 g, 82%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.81 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.73-1.87 (2H, m), 2.06-2.20 ( 2H, m), 2.34 (3H, s), 3.01-3.23 (2H, m), 3.58 (2H, d, J=6.7Hz), 3.98 (2H, s ), 4.13-4.25 (3H, m), 4.60 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.09-5.22 (2H, m), 5.32-5, 42 (2H, m), 5.50-5.59 (1H, m), 6.49 (1H, s), 7.24-7.30 (3H, m), 7.36 (2H, t, J=7.4 Hz), 7.53 (1H, t, J=6.3 Hz), 7.66 (2H, d, J=7.4 Hz), 7.75 (1H, d, J= 11.0 Hz), 7.84 (2H, d, J=7.4 Hz), 8.47 (1H, d, J=8.6 Hz), 8.77 (1H, t, J=6, 7 Hz). MS (ESI) m/z: 802 (M+H)+ Process 5: N-[(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin- 1-yl]amino}-2-oxoethoxy)methyl]glycinamide
[00636] A uma solução de N,N-dimetil formamida (11,0 mL) do composto (0,881 g, 1,10 mmol) obtido no Processo 4 acima, piperidina (1,1 mL) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 2 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir uma mistura contendo o composto título. A mistura foi usada para a reação seguinte sem outra purificação. Processo 6: N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanil-N- [(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamidaTo a N,N-dimethyl formamide (11.0 mL) solution of the compound (0.881 g, 1.10 mmol) obtained in Process 4 above, piperidine (1.1 mL) was added and stirred at room temperature for 2 hours. The solvent was removed under reduced pressure to produce a mixture containing the title compound. The mixture was used for the next reaction without further purification. Process 6: N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4 -methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2 -b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)methyl]glycinamide
[00637] Sob resfriamento por gelo, a uma solução de N,N-dimetil formamida (50,0 mL) da mistura (0,439 mmol) obtida no Processo 5 acima, N-hidroxisuccinimida (0,101 g, 0,878 mmol), e N-[(9H-fluoren-9- ilmetóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina (o composto descrito na Pa-tente Japonesa Depositada Aberta ao Público No. 2002-60351) (0,440 g, 0,878 mmol), N,N'-diciclo-hexilcarbodiimida (0,181 g, 0,878 mmol) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 4 dias. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 9 : 1 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido laranja pálido (0,269 g, 58 %). MS (ESI) m/z: 1063 (M+H)+ Processo 7: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamida[00637] Under ice-cooling, to a N,N-dimethyl formamide solution (50.0 mL) of the mixture (0.439 mmol) obtained in Process 5 above, N-hydroxysuccinimide (0.101 g, 0.878 mmol), and N- [(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycylglycyl-L-phenylalanine (the compound described in Japanese Patent Laid-open Patent No. 2002-60351) (0.440 g, 0.878 mmol), N,N'-dicyclo -hexylcarbodiimide (0.181 g, 0.878 mmol) was added and stirred at room temperature for 4 days. The solvent was removed under reduced pressure and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform - chloroform : methanol = 9 : 1 (v/v)] to yield the title compound as a pale orange solid (0.269 g , 58%). MS (ESI) m/z: 1063 (M+H)+ Process 7: Glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy- 4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)methyl]glycinamide
[00638] A uma solução de N,N-dimetil formamida (4,00 mL) do composto (0,269 g, 0,253 mmol) obtido no Processo 6 acima, piperidi- na (0,251 mL, 2,53 mmol) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 2 horas. O solvente foi removido sob pressão redu-zida para produzir uma mistura contendo o composto título. A mistura foi usada para a reação seguinte sem outra purificação. Processo 8: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamidaTo a N,N-dimethyl formamide (4.00 mL) solution of the compound (0.269 g, 0.253 mmol) obtained in Process 6 above, piperidine (0.251 mL, 2.53 mmol) was added and stirred at room temperature for 2 hours. The solvent was removed under reduced pressure to produce a mixture containing the title compound. The mixture was used for the next reaction without further purification. Process 8: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(2-{[(1S, 9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyran [3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)methyl]glycinamide
[00639] A uma solução de N,N-dimetil formamida (10,0 mL) do composto (0,253 mmol) obtido no Processo 7 acima, hexanoato de 6- maleimida de N-succinimidila (0,156 g, 0,506 mmol) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 3 dias. O solvente foi remo- vido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : meta-nol = 9 : 1 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido ama-relo pálido (0,100 g, 38 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,83 (3H, t, J=7,2 Hz), 1,09-1,21 (2H, m), 1,33-1,47 (4H, m), 1,75-1,90 (2H, m), 2,00-2,23 (4H, m), 2,36 (3H, s), 2,69-2,81 (1H, m), 2,94-3,03 (1H, m), 3,06-3,22 (2H, m), 3,23-3,74 (8H, m), 3,98 (2H, s), 4,39-4,50 (1H, m), 4,60 (2H, d, J=6,7 Hz), 5,17 (2H, s), 5,39 (2H, s), 5,53-5,61 (1H, m), 6,50 (1H, s), 6,96 (2H, s), 7,11-7,24 (5H, m), 7,28 (1H, s), 7,75 (1H, d, J=11,0 Hz), 7,97 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,03 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,09 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,27 (1H, t, J=6,5 Hz), 8,48 (1H, d, J=9,0 Hz), 8,60 (1H, t, J=6,5 Hz). MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)+ Processo 9: conjugado de anticorpo-fármaco (55)To a N,N-dimethyl formamide (10.0 mL) solution of the compound (0.253 mmol) obtained in Process 7 above, N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate (0.156 g, 0.506 mmol) was added and stirred at room temperature for 3 days. The solvent was removed under reduced pressure and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform - chloroform : methanol = 9 : 1 (v/v)] to yield the title compound as a yellow solid. -pale (0.100 g, 38%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.83 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.09-1.21 (2H, m), 1.33-1.47 ( 4H, m), 1.75-1.90 (2H, m), 2.00-2.23 (4H, m), 2.36 (3H, s), 2.69-2.81 (1H, m), 2.94-3.03 (1H, m), 3.06-3.22 (2H, m), 3.23-3.74 (8H, m), 3.98 (2H, s) , 4.39-4.50 (1H, m), 4.60 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.17 (2H, s), 5.39 (2H, s), 5. 53-5.61 (1H, m), 6.50 (1H, s), 6.96 (2H, s), 7.11-7.24 (5H, m), 7.28 (1H, s) , 7.75 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.97 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.9 Hz), 8 .09 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.27 (1H, t, J=6.5 Hz), 8.48 (1H, d, J=9.0 Hz), 8.60 (1H, t, J=6.5 Hz). MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)+ Process 9: antibody-drug conjugate (55)
[00640] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum C-1 e Procedimento comum B (como coefici-ente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,025 mL; 3,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fos-fato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00640] Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml by replacing the medium with PBS6.0/EDTA using the common Procedure C-1 and Procedure common B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) described in Production Method 1. The solution (1.25 mL) was placed in a 1.5 mL polypropylene tube. mL and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.025 mL; 3.0 equivalents per antibody molecule) and an aqueous solution of 1 M dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00641] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,109 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 acima (0,039 mL; 4,6 equivalentes por molécula de an-ticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corpora-tion) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 40 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,008 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.[00641] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.109 ml) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 above (0.039 ml; 4.6 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 40 minutes. Then, an aqueous solution (0.008 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and stirred to terminate the drug-binding reaction at room temperature for a further 20 minutes.
[00642] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois dis-so, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A descrito no Método de produção 1.[00642] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated by common Procedure A described in Production Method 1.
[00643] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.[00643] Physicochemical characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5000 (mean measured value), and SD,370 = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00644] Concentração de anticorpo: 12,57 mg/mL, produção de an-ticorpo: 8,8 mg (70%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,2. Exemplo 59 conjugado de anticorpo-fármaco (56) Fórmula 128
[00645] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum C-1 e Procedimento comum B (como coefici-ente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,051 mL; 6,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fos-fato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00645] Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml by replacing the medium with PBS6.0/EDTA using the common Procedure C-1 and Procedure common B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) described in Production Method 1. The solution (1.25 mL) was placed in a 1.5 mL polypropylene tube. mL and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.051 mL; 6.0 equivalents per antibody molecule) and an aqueous solution of 1 M dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00646] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,067 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,085 mL; 10,0 equivalentes por molé-cula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em tem-peratura ambiente durante 60 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,013 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adi- cionada a isso e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.[00646] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.067 mL) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 58 (0.085) mL; 10.0 equivalents per molecule of antibody) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody in time. room temperature for 60 minutes. Then, an aqueous solution (0.013 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and stirred to terminate the drug-binding reaction at room temperature for a further 20 minutes.
[00647] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00647] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
[00648] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5000 (valor médio medido), e SD,370 = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca-racterísticos foram obtidos.[00648] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5000 (mean measured value), and SD,370 = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00649] Concentração de anticorpo: 1,33 mg/mL, produção de anti-corpo: 7,98 mg (64%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 4,9. Exemplo 60 conjugado de anticorpo-fármaco (57) Fórmula 129
[00650] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 2 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL substituindo o meio com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum C-1 e Procedimento comum B (como coefici-ente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL) foi colocada em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,051 mL; 6,0 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fos-fato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00650] Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 2 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml by replacing the medium with PBS6.0/EDTA using the common Procedure C-1 and Procedure common B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) described in Production Method 1. The solution (1.25 mL) was placed in a 1.5 mL polypropylene tube. mL and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.051 mL; 6.0 equivalents per antibody molecule) and an aqueous solution of 1 M dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00651] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,025 mL) e uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,127 mL; 15,0 equivalentes por molé-cula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em tem-peratura ambiente durante 60 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,019 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adi-cionada a isso e agitada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.[00651] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.025 ml) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 58 (0.127 mL; 15.0 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody in time. room temperature for 60 minutes. Then, an aqueous solution (0.019 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and stirred to terminate the drug-binding reaction at room temperature for a further 20 minutes.
[00652] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois dis-so, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A descrito no Método de produção 1.[00652] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated by common Procedure A described in Production Method 1.
[00653] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,28Ü = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,37Ü = 0 (valor de cálculo estimado), SD,28Ü = 5000 (valor médio medido), e SD,37Ü = 19000 (valor médio medido) foram usados), os seguintes valores ca- racterísticos foram obtidos.[00653] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,28Ü = 235300 (estimated design value), SA,37Ü = 0 (estimated design value), SD, 28Ü = 5000 (mean mean value), and SD,37Ü = 19000 (mean mean value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00654] Concentração de anticorpo: 0,91 mg/mL, produção de anti-corpo: 5,46 mg (44%), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 6,3. Exemplo 61 conjugado de anticorpo-fármaco (58) Fórmula 130
[00655] Quase as quantidades inteiras dos conjugados de anticor- po-fármaco de Exemplos 59 e 60 foram misturadas e a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A descrito no Método de pro-dução 1 para produzir o conjugado de anticorpo-fármaco título.Nearly entire amounts of the antibody-drug conjugates of Examples 59 and 60 were mixed and the solution was concentrated by common Procedure A described in Production Method 1 to produce the title antibody-drug conjugate.
[00656] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anti-corpo: 12,30 mg, e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 5,4. Exemplo 62 conjugado de anticorpo-fármaco (59) Fórmula 131
[00657] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (100 mL, 1 g do anticorpo) foi colocada em um frasco de 250 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (2,43 mL; 3,6 equivalentes por mo-lécula de anticorpo) e também com uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (5 mL). Após confirmar que a solução teve pH perto de 7,4 usando um medidor de pH, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00657] Antibody reduction: The antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 1 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (100 mL, 1 g antibody) was placed in a 250 mL vial and charged with a solution 10 mM aqueous TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (2.43 mL; 3.6 equivalents per molecule of antibody) as well as a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (5 mL). After confirming that the solution had a pH close to 7.4 using a pH meter, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00658] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do com-posto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (3,51 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo) e sulfóxido de dimetila (2,14 mL) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado com um agitador para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 130 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,547 mL) de NAC a 100 mM foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente du-rante 20 minutos.[00658] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 58 (3.51 ml; 5.2 equivalents per antibody molecule) and dimethyl sulfoxide (2.14 ml) to the above solution at room temperature, this was stirred with a stirrer to conjugate the drug linker to the antibody in a 15°C water bath for 130 minutes. Then, an aqueous solution (0.547 mL) of 100 mM NAC was added thereto and also incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for 20 minutes.
[00659] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação por ultrafiltração usando um aparato de ultrafiltração composta de uma membrana de ultrafiltração (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Bio-max 50 KDa), uma bomba de tubo (Cole-Parmer International, Master-Flex Pump modelo 77521-40, Pump Head modelo 7518-00), e um tubo (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Especificamente, ao mesmo tempo que ABS foi adicionado gota a gota (um total de 800 mL) como uma solução de tampão para purificação à solução de rea-ção, purificação de ultrafiltração foi realizada para remover ligantees de fármaco não conugados e outros reagentes de baixo peso molecu-lar, também substituindo a solução de tampão com ABS, e também concentrando a solução, para produzir cerca de 70 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00659] Purification: The above solution was subjected to purification by ultrafiltration using an ultrafiltration apparatus composed of an ultrafiltration membrane (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Bio-max 50 KDa), a tube pump (Cole-Parmer International, Master-Flex Pump Model 77521-40, Pump Head Model 7518-00), and a tube (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Specifically, while ABS was added dropwise (a total of 800 mL) as a buffer solution for purification to the reaction solution, ultrafiltration purification was carried out to remove unconjugated drug binders and other low-grade reagents. molecular weight, also replacing the buffer solution with ABS, and also concentrating the solution, to produce approximately 70 mL of a solution containing the antibody-titer drug conjugate.
[00660] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00660] Physicochemical characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5178 (measured value), and SD,370 = 20217 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00661] Concentração de anticorpo: 14,2 mg/mL, produção de anti-corpo: 1,0 g (about 100%), e número médio de moléculas de fármaco conjugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,2. Exemplo 63 conjugado de anticorpo-fármaco (60) Fórmula 132
[00662] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (5 mL, 50 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 15 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,075 mL; 4 equivalentes por mo-lécula de anticorpo). Após confirmar que a solução teve pH perto de 7,0 usando um medidor de pH, a ligação de dissulfeto em parte de ar-ticulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00662] Antibody reduction: The antibody M30-H1-L4P produced in Reference Example 1 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (5 mL, 50 mg antibody) was placed in a 15 mL tube and charged with a solution 10 mM aqueous TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.075 mL; 4 equivalents per molecule of antibody). After confirming that the solution had a pH close to 7.0 using a pH meter, the disulfide binding in part-linkage in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00663] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do com-posto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,219 mL; 6,5 equivalentes por molécula de anticorpo) e sulfóxido de dimetila (0,064 mL) à solução acima, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 90 minutos. Em se-guida, uma solução aquosa (0,033 mL; 9,8 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente du-rante mais 20 minutos.[00663] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 58 (0.219 ml; 6.5 equivalents per antibody molecule) and sulfoxide of dimethyl (0.064 ml) to the above solution, this was incubated to conjugate the drug ligand to the antibody in a water bath at 15°C for 90 minutes. Then, an aqueous solution (0.033 mL; 9.8 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for a further 20 minutes.
[00664] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 19 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00664] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 19 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
[00665] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00665] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5178 (measured value), and SD,370 = 20217 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00666] Concentração de anticorpo: 2,19 mg/mL, produção de anti-corpo: 42 mg (83 %), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 4,7. Exemplo 64 conjugado de anticorpo-fármaco (61) Fórmula 133
[00667] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4P produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (4 mL, 40 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 15 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,14 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo). Após confirmar que a solução teve pH perto de 7,0 usando um medidor de pH, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00667] Antibody reduction: The M30-H1-L4P antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (4 mL, 40 mg antibody) was placed in a 15 mL tube and charged with a solution 10 mM aqueous TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.14 ml; 5.2 equivalents per antibody molecule). After confirming that the solution had a pH close to 7.0 using a pH meter, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00668] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do com-posto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,232 mL; 8,6 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 60 minutos. Em seguida, uma solução aquosa (0,035 mL; 12,9 equivalentes por molécula de anticorpo) de NAC a 100 mM foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.[00668] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 58 (0.232 ml; 8.6 equivalents per antibody molecule) to the solution above, this was incubated to conjugate the drug ligand to the antibody in a water bath at 15°C for 60 minutes. Then, an aqueous solution (0.035 mL; 12.9 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for a further 20 minutes.
[00669] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 13 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00669] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 13 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
[00670] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00670] Physicochemical characterization: Using the common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5178 (measured value), and SD,370 = 20217 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00671] Concentração de anticorpo: 2,03 mg/mL, produção de anti-corpo: 26 mg (66%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 5,7. Exemplo 65 conjugado de anticorpo-fármaco (62) Fórmula 134
[00672] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL, 12,5 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0287 mL; 3,4 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidro-gênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00672] Antibody reduction: The M30-H1-L4 antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (1.25 mL, 12.5 mg of antibody) was placed in a 1.5 tube. mL and charged with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0287 mL; 3.4 equivalents per antibody molecule) and an aqueous solution of a dipotassium hydrogen phosphate 1M (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00673] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do com-posto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,0439 mL; 5,2 equivalen-tes por molécula de anticorpo) e sulfóxido de dimetila (0,0267 mL) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi incubado para conju-gar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0066 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.[00673] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 58 (0.0439 ml; 5.2 equivalents per molecule of antibody) and dimethyl sulfoxide (0.0267 ml) to the above solution at room temperature, this was incubated to conjugate the drug ligand to the antibody in a water bath at 15°C for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.0066 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for a further 20 minutes.
[00674] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois dis-so, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.[00674] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated by Common Procedure A.
[00675] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,28Ü = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,37Ü = 0 (valor de cálculo estimado), SD,28Ü = 5178 (valor medido), e SD,37Ü = 20217 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00675] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,28Ü = 235300 (estimated design value), SA,37Ü = 0 (estimated design value), SD, 28Ü = 5178 (measured value), and SD,37Ü = 20217 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00676] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anti-corpo: 7,8 mg (62%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 3,4. Exemplo 66 conjugado de anticorpo-fármaco (63) Fórmula 135
[00677] Redução do anticorpo: O anticorpo M30-H1-L4 produzido no Exemplo de Referência 1 foi preparado para ter concentração de anticorpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,61 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (1,25 mL, 12,5 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0439 mL; 5,2 equivalentes por molécula de anticorpo) (0,0287 mL; 3,4 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipo- tássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0625 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,4 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de arti-culação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00677] Antibody reduction: The M30-H1-L4 antibody produced in Reference Example 1 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.61 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (1.25 mL, 12.5 mg of antibody) was placed in a 1.5 tube. ml and loaded with an aqueous solution of 10 mM TCEP (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0439 ml; 5.2 equivalents per antibody molecule) (0.0287 ml; 3.4 equivalents per molecule of antibody antibody) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.0625 mL). After confirming that the solution had a pH of 7.4 ± 0.1, the disulfide binding in the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00678] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do com-posto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,0726 mL; 8,6 equivalen-tes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambi-ente, isto foi incubado para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em um banho de água a 15°C durante 1 hora. Em seguida, uma solu- ção aquosa (0,011 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e incubada para terminar a reação de ligante de fár- maco em temperatura ambiente durante mais 20 minutos.[00678] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 58 (0.0726 ml; 8.6 equivalents per molecule of antibody) to the above solution at room temperature, this was incubated to conjugate the drug ligand to the antibody in a water bath at 15°C for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.011 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for an additional 20 minutes.
[00679] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 6 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título. Depois dis-so, a solução foi concentrada pelo Procedimento comum A.[00679] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as buffer solution) described in Production Method 1 to produce 6 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated by Common Procedure A.
[00680] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 235300 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00680] Physicochemical characterization: Using the Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 235300 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5178 (measured value), and SD,370 = 20217 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00681] Concentração de anticorpo: 10,0 mg/mL, produção de anti-corpo: 7,3 mg (58%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 5,4. Exemplo 67 conjugado de anticorpo-fármaco (64) Fórmula 136
[00682] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD30 produzido no Exemplo de Referência 3 foi preparado para ter concentração de anti- corpo de 10 mg/mL com PBS6,5/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,75 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 mL; 2,5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0058 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00682] Antibody reduction: The anti-CD30 antibody produced in Reference Example 3 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.5/EDTA using Common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.75 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (0.4 mL, 4 mg antibody) was placed in a 1.5 mL tube and loaded with a 10 mM aqueous TCEP solution (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 mL; 2.5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Teste, Inc.; 0.0058 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00683] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do com-posto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,0116 mL; 4,5 equivalen-tes por molécula de anticorpo) e sulfóxido de dimetila (0,0101 mL) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0017 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também in-cubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00683] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 58 (0.0116 ml; 4.5 equivalents per molecule of antibody) and dimethyl sulfoxide (0.0101 mL) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature during 1 hour. Then, an aqueous solution (0.0017 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and also incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for 20 minutes.
[00684] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00684] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00685] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,28Ü = 270400 (valor de cálculo estimado), SA,37Ü = 0 (valor de cálculo estimado), SD,28Ü = 5178 (valor medido), e SD,37Ü = 20217 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00685] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,28Ü = 270400 (estimated design value), SA,37Ü = 0 (estimated design value), SD, 28Ü = 5178 (measured value), and SD,37Ü = 20217 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00686] Concentração de anticorpo: 0,96 mg/mL, produção de anti-corpo: 2,4 mg (60 %), e número médio de moléculas de fármaco con-jugadas (n) por molécula de anticorpo: 3,7. Exemplo 68 conjugado de anticorpo-fármaco (65) Fórmula 137
[00687] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD30 produzido no Exemplo de Referência 3 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,75 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 mL; 5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,006 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de ar-ticulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00687] Antibody reduction: The anti-CD30 antibody produced in Reference Example 3 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.75 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (0.4 mL, 4 mg antibody) was placed in a 1.5 mL tube and loaded with a 10 mM aqueous TCEP solution (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 mL; 5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.006 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide binding in part-linkage in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00688] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do com-posto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,0233 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0035 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligan- te de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00688] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 58 (0.0233 ml; 9 equivalents per antibody molecule) to the solution above at room temperature, this was agitated using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.0035 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and also incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for 20 minutes.
[00689] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00689] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00690] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 270400 (valor de cálculo estimado), SA,3?O = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00690] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 270400 (estimated design value), SA,3?O = 0 (estimated design value), SD,280 = 5178 (measured value), and SD,370 = 20217 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00691] Concentração de anticorpo: 0,39 mg/mL, produção de anti-corpo: 1,0 mg (24%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 6,8. Exemplo 69 conjugado de anticorpo-fármaco (66) Fórmula 138
[00692] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD33 produzido no Exemplo de Referência 4 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,66 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 mL; 2,5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0058 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00692] Antibody reduction: The anti-CD33 antibody produced in Reference Example 4 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.66 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (0.4 mL, 4 mg antibody) was placed in a 1.5 mL tube and loaded with a 10 mM aqueous TCEP solution (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 mL; 2.5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Teste, Inc.; 0.0058 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00693] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do com-posto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,0116 mL; 4,5 equivalen-tes por molécula de anticorpo) e sulfóxido de dimetila (0,0101 mL) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0017 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também in-cubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00693] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 58 (0.0116 ml; 4.5 equivalents per molecule of antibody) and dimethyl sulfoxide (0.0101 mL) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature during 1 hour. Then, an aqueous solution (0.0017 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and also incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for 20 minutes.
[00694] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00694] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00695] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00695] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 256400 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5178 (measured value), and SD,370 = 20217 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00696] Concentração de anticorpo: 1,19 mg/mL, produção de anti-corpo: 3,0 mg (74%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 3,8. Exemplo 70 conjugado de anticorpo-fármaco (67) Fórmula 139
[00697] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD33 produzido no Exemplo de Referência 4 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,66 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 mL; 5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,006 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de ar-ticulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00697] Antibody reduction: The anti-CD33 antibody produced in Reference Example 4 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.66 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (0.4 mL, 4 mg antibody) was placed in a 1.5 mL tube and loaded with a 10 mM aqueous TCEP solution (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 mL; 5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Tesque, Inc.; 0.006 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide binding in part-linkage in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00698] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adicionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do composto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,0233 mL; 9 equi-valentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fár- maco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0035 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00698] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 58 (0.0233 ml; 9 equivalents per antibody molecule) to the above solution in At room temperature, this was agitated using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.0035 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and also incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for 20 minutes.
[00699] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo- fármaco título.[00699] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00700] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 256400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00700] Physicochemical characterization: Using the common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 256400 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5178 (measured value), and SD,370 = 20217 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00701] Concentração de anticorpo: 1,24 mg/mL, produção de anti-corpo: 3,1 mg (78%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 7,0. Exemplo 71 conjugado de anticorpo-fármaco (68) Fórmula 140
[00702] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD70 produzido no Exemplo de Referência 5 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,69 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 mL; 2,5 equivalentes por molécula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,0058 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de articulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00702] Antibody reduction: The anti-CD70 antibody produced in Reference Example 5 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.69 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (0.4 mL, 4 mg antibody) was placed in a 1.5 mL tube and loaded with a 10 mM aqueous TCEP solution (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0065 mL; 2.5 equivalents per antibody molecule) and a 1 M aqueous dipotassium hydrogen phosphate solution (Nacalai Teste, Inc.; 0.0058 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide binding on the hinge part in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00703] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do com-posto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,0116 mL; 4,5 equivalen-tes por molécula de anticorpo) e sulfóxido de dimetila (0,0101 mL) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0017 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também in- cubada para terminar a reação de ligante de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00703] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 58 (0.0116 ml; 4.5 equivalents per molecule of antibody) and dimethyl sulfoxide (0.0101 mL) to the above solution at room temperature, this was stirred using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature during 1 hour. Then, an aqueous solution (0.0017 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and also incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for 20 minutes.
[00704] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00704] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00705] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,280 = 262400 (valor de cálculo estimado), SA,370 = 0 (valor de cálculo estimado), SD,280 = 5178 (valor medido), e SD,370 = 20217 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00705] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,280 = 262400 (estimated design value), SA,370 = 0 (estimated design value), SD, 280 = 5178 (measured value), and SD,370 = 20217 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00706] Concentração de anticorpo: 1,10 mg/mL, produção de anti-corpo: 2,8 mg (69%), e número médio de moléculas de fármaco conju-gadas (n) por molécula de anticorpo: 3,8. Exemplo 72 conjugado de anticorpo-fármaco (69) Fórmula 141
[00707] Redução do anticorpo: O anticorpo anti-CD70 produzido no Exemplo de Referência 5 foi preparado para ter concentração de anti-corpo de 10 mg/mL com PBS6,0/EDTA usando o Procedimento comum B (como coeficiente de absorção a 280 nm, 1,69 mLmg-1cm-1 foi usado) e Procedimento comum C-1 descritos no Método de produção 1. A solução (0,4 mL, 4 mg do anticorpo) foi colocada em um tubo de 1,5 mL e carregada com uma solução aquosa de TCEP a 10 mM (To-kyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 mL; 5 equivalentes por molé-cula de anticorpo) e uma solução aquosa de fosfato de hidrogênio de dipotássio a 1 M (Nacalai Tesque, Inc.; 0,006 mL). Após confirmar que a solução teve pH de 7,0 ± 0,1, a ligação de dissulfeto em parte de ar-ticulação no anticorpo foi reduzida incubando a 37°C durante 1 hora.[00707] Antibody reduction: The anti-CD70 antibody produced in Reference Example 5 was prepared to have antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using common Procedure B (as absorption coefficient at 280 nm, 1.69 mLmg-1cm-1 was used) and Common Procedure C-1 described in Production Method 1. The solution (0.4 mL, 4 mg antibody) was placed in a 1.5 mL tube and loaded with an aqueous solution of 10 mM TCEP (To-kyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0.0129 mL; 5 equivalents per molecule of antibody) and an aqueous solution of 1 M dipotassium hydrogen phosphate (Nacalai Tesque, Inc.; 0.006 ml). After confirming that the solution had a pH of 7.0 ± 0.1, the disulfide binding in part-linkage in the antibody was reduced by incubating at 37°C for 1 hour.
[00708] Conjugação entre ligante de fármaco e anticorpo: Após adi-cionar uma solução de sulfóxido de dimetila contendo 10 mM do com-posto obtido no Processo 8 de Exemplo 58 (0,0233 mL; 9 equivalentes por molécula de anticorpo) à solução acima em temperatura ambiente, isto foi agitado usando um rotator de tubo (MTR-103, fabricado por AS ONE Corporation) para conjugar o ligante de fármaco ao anticorpo em temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, uma solução aquosa (0,0035 mL) de NAC a 100 mM (Sigma-Aldrich Co. LLC) foi adicionada a isso e também incubada para terminar a reação de ligan- te de fármaco em temperatura ambiente durante 20 minutos.[00708] Conjugation between drug and antibody ligand: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Process 8 of Example 58 (0.0233 ml; 9 equivalents per antibody molecule) to the solution above at room temperature, this was agitated using a tube rotator (MTR-103, manufactured by AS ONE Corporation) to conjugate the drug ligand to the antibody at room temperature for 1 hour. Then, an aqueous solution (0.0035 mL) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added thereto and also incubated to terminate the drug-binding reaction at room temperature for 20 minutes.
[00709] Purificação: A solução acima foi submetida à purificação usando o Procedimento comum D-1 (ABS foi usado como solução de tampão) descrito no Método de produção 1 para produzir 2,5 mL de uma solução contendo o conjugado de anticorpo-fármaco título.[00709] Purification: The above solution was subjected to purification using standard Procedure D-1 (ABS was used as the buffer solution) described in Production Method 1 to produce 2.5 ml of a solution containing the antibody-drug conjugate title.
[00710] Caracterização fisicoquímica: Usando o Procedimento comum E descrito no Método de produção 1 (como coeficiente molar de absorção, SA,28Ü = 262400 (valor de cálculo estimado), SA,37Ü = 0 (valor de cálculo estimado), SD,28Ü = 5178 (valor medido), e SD,37Ü = 20217 (va-lor medido) foram usados), os seguintes valores característicos foram obtidos.[00710] Physicochemical Characterization: Using Common Procedure E described in Production Method 1 (as molar absorption coefficient, SA,28Ü = 262400 (estimated design value), SA,37Ü = 0 (estimated design value), SD, 28Ü = 5178 (measured value), and SD,37Ü = 20217 (measured value) were used), the following characteristic values were obtained.
[00711] Concentração de anticorpo: 1,16 mg/mL, produção de anti-corpo: 2,9 mg (73%), e número médio de moléculas de fármaco conju- gadas (n) por molécula de anticorpo: 7,0. Exemplo 73 (Outro método para sintetizar o composto de Processo 8 de Exemplo 58) Fórmula 142
[00712] Sob resfriamento por gelo, à solução de THF (12,0 ml) de alaninato de N-[(9H-fluoren-9-ilmetóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenila de terc-butila (J. Pept. Res., 1999, vol. 53, pp. 393) (0,400 g, 0,717 mmol), 1,8-diazabiciclo[5,4,0]-7-undeceno (0,400 ml) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 4 dias, e em seguida hexanoato de 6-maleimida de N-succinimidila (0,221 g, 0,717 mmol) foi também adi-cionado e agitado durante 3 horas. A solução de reação foi diluída com acetato de etila e lavada com uma solução aquosa de ácido cítrico a 10 %, uma solução aquosa saturada de carbonato de hidrogênio de sódio, e salmoura saturada, e em seguida a camada orgânica foi secada sobre sulfato de magnésio anidroso. Após o solvente ser removido sob pressão reduzida, os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : meta-nol = 9 : 1 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido ama-relo pálido (0,295 g, 78 %). 1H-RMN (400 MHz, CDCI3) δ: 1,28-1,36 (2H, m), 1,41 (9H, s), 1,57- 1,71 (4H, m), 2,23 (2H, t, J=7,6 Hz), 3,09 (2H, d, J=6,0 Hz), 3,51 (2H, t, J=7,6 Hz), 3,85-4,02 (4H, m), 4,69-4,78 (1H, m), 6,15 (1H, t, J=4,6 Hz), 6,33 (1H, d, J=7,3 Hz), 6,60 (1H, t, J=5,0 Hz), 6,68 (2H, s), 7,10-7,16 (2H, m), 7,22-7,31 (3H, m). MS (ESI) m/z: 529 (M+H)+ Processo 2: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanina[00712] Under ice-cooling, to the THF solution (12.0 ml) of N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycylglycyl-L-phenyl tert-butyl alaninate (J. Pept. Res ., 1999, vol. 53, pp. 393) (0.400 g, 0.717 mmol), 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (0.400 ml) was added and stirred at room temperature for 4 days , and then N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate (0.221 g, 0.717 mmol) was also added and stirred for 3 hours. The reaction solution was diluted with ethyl acetate and washed with an aqueous 10% citric acid solution, a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, and saturated brine, and then the organic layer was dried over magnesium sulfate. anhydrous. After the solvent was removed under reduced pressure, the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform - chloroform : methanol = 9 : 1 (v/v)] to yield the title compound as a yellow solid. pale gray (0.295 g, 78%). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 1.28-1.36 (2H, m), 1.41 (9H, s), 1.57-1.71 (4H, m), 2.23 ( 2H, t, J=7.6 Hz), 3.09 (2H, d, J=6.0 Hz), 3.51 (2H, t, J=7.6 Hz), 3.85-4, 02 (4H, m), 4.69-4.78 (1H, m), 6.15 (1H, t, J=4.6 Hz), 6.33 (1H, d, J=7.3 Hz ), 6.60 (1H, t, J=5.0 Hz), 6.68 (2H, s), 7.10-7.16 (2H, m), 7.22-7.31 (3H, m). MS (ESI) m/z: 529 (M+H)+ Process 2: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]glycylglycyl- L-phenylalanine
[00713] A uma solução de diclorometano (8,00 ml) do composto (0,295 g, 0,558 mmol) obtido no Processo 1 acima, ácido trifluoroacéti- co (4,00 mL) foi adicionado e agitado em temperatura ambiente durante 18 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (0,240 g, 91 %). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 1,15-1,23 (2H, m), 1,40-1,53 (4H, m), 2,10 (2H, t, J=7,6 Hz), 2,88 (1H, dd, J=13,7, 8,9 Hz), 3,04 (1H, dd, J=13,7, 5,0 Hz), 3,35-3,43 (2H, m), 3,58-3,77 (4H, m), 4,41 (1H, td, J=7,8, 5,0 Hz), 7,00 (2H, s), 7,16-7,31 (5H, m), 8,00 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,06 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,13 (1H, d, J=7,8 Hz). Processo 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamidaTo a dichloromethane solution (8.00 ml) of the compound (0.295 g, 0.558 mmol) obtained in Process 1 above, trifluoroacetic acid (4.00 ml) was added and stirred at room temperature for 18 hours. The solvent was removed under reduced pressure to yield the title compound as a pale yellow solid (0.240 g, 91%). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 1.15-1.23 (2H, m), 1.40-1.53 (4H, m), 2.10 (2H, t, J=7 0.6 Hz), 2.88 (1H, dd, J=13.7, 8.9 Hz), 3.04 (1H, dd, J=13.7, 5.0 Hz), 3.35-3 .43 (2H, m), 3.58-3.77 (4H, m), 4.41 (1H, td, J=7.8, 5.0 Hz), 7.00 (2H, s), 7.16-7.31 (5H, m), 8.00 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.06 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.13 (1H , d, J=7.8 Hz). Process 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(2-{[(1S, 9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyran [3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)methyl]glycinamide
[00714] O composto (0,572 g, 1,21 mmol) obtido no Processo 2 acima foi dissolvido em diclorometano (12,0 mL), carregado com N- hidroxisuccinimida (0,152 g, 1,32 mmol) e cloridrato de 1-(3- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (0,253 g, 1,32 mmol), e agitado durante 1 hora. A solução de reação foi adicionada a uma solução de N,N-dimetil formamida (22,0 mL) da mistura (1,10 mmol) obtida no Processo 5 de Exemplo 58, e agitada em temperatura ambiente duran-te 3 horas. A solução de reação foi carregada com uma solução aquo- sa de ácido cítrico a 10 % e extraída com clorofórmio. A camada orgâ-nica obtida foi secada sobre sulfato de sódio e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (0,351 g, 31 %). Os dados instrumentais do composto foram os mesmos como aquele do composto de Processo 8 de Exem-plo 58. Exemplo 74 (Outro método para sintetizar composto de Processo 8 de Exemplo 58) Fórmula 143
[00715] A uma solução de tetraidrofurano (200 ml) do composto (7,37 g, 20,0 mmol) obtida no Processo 1 de Exemplo 58, glicolato de benzila (6,65 g, 40,0 mmol) e monoidrato de ácido p-toluenossulfônico (0,381 g, 2,00 mmol) foram adicionados a 0°C e agitados em temperatura ambiente durante 2 horas e 30 minutos. A solução de reação foi carregada com uma solução aquosa saturada de carbonato de hidro-gênio de sódio e extraída com acetato de etila. A camada orgânica ob-tida foi secada sobre sódio sulfato e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cro- matografia de coluna de sílica-gel [hexano : acetato de etila = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] para produzir o composto título como um sólido incolor (6,75 g, 71 %). Os dados instrumentais do composto foram o mesmo como aquele do composto de Processo 2 de Exemplo 58. Processo 2: N-[(Benzilóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina-N-{[(2- (benzilóxi)-2-oxoetóxi]metil}glicinamidaTo a tetrahydrofuran (200 ml) solution of the compound (7.37 g, 20.0 mmol) obtained in Process 1 of Example 58, benzyl glycolate (6.65 g, 40.0 mmol) and monohydrate p-toluenesulfonic acid (0.381 g, 2.00 mmol) was added at 0°C and stirred at room temperature for 2 hours and 30 minutes. The reaction solution was charged with a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate and extracted with ethyl acetate. The obtained organic layer was dried over sodium sulfate and filtered. The solvent was removed under reduced pressure and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [hexane : ethyl acetate = 100 : 0 (v/v) - 0 : 100] to yield the title compound as a colorless solid (6.75 g, 71 %). The instrumental data of the compound was the same as that of the compound from Process 2 of Example 58. Process 2: N-[(Benzyloxy)carbonyl]glycylglycyl-L-phenylalanine-N-{[(2-(benzyloxy)-2-oxoethoxy ]methyl}glycinamide
[00716] A uma solução de N,N-dimetil formamida (140 mL) do com-posto (6,60 g, 13,9 mmol) obtido no Processo 1 acima, 1,8- diazabiciclo[5,4,0]undec-7-eno (2,22 g, 14,6 mmol) foi adicionado a 0 °C e agitado em temperatura ambiente durante 15 minutos. A solução de reação foi carregada com uma solução de N,N-dimetil formamida (140 mL) de N-[(benzilóxi)carbonil]glicilglicil-L-fenilalanina (6,33 g, 15,3 mmol), N-hidroxisuccinimida (1,92 g, 16,7 mmol), e cloridrato de 1-(3- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (3,20 g, 16,7 mmol) agitados an-tecipadamente em temperatura ambiente durante 1 hora, e agitados em temperatura ambiente durante 4 horas. A solução de reação foi carregada com ácido hidroclórico a 0,1 N e extraída com clorofórmio. A camada orgânica obtida foi secada sobre sódio sulfato e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido incolor (7,10 g, 79 %). 1H-RMN (DMSO-D6) δ: 2,78 (1H, dd, J=13,9, 9,6 Hz), 3,05 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,56-3,80 (6H, m), 4,15 (2H, s), 4,47-4,55 (1H, m), 4,63 (2H, d, J=6,6 Hz), 5,03 (2H, s), 5,15 (2H, s), 7,16-7,38 (15H, m), 7,52 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,03 (1H, t, J=5,5 Hz), 8,17 (1H, d, J=8,2 Hz), 8,36 (1H, t, J=5,7 Hz), 8,61 (1H, t, J=6,6 Hz). Processo 3: Glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(carboximetóxi)metil]glicinamidaTo a N,N-dimethyl formamide (140 mL) solution of the compound (6.60 g, 13.9 mmol) obtained in Process 1 above, 1,8-diazabicyclo[5.4.0] undec-7-ene (2.22 g, 14.6 mmol) was added at 0 °C and stirred at room temperature for 15 minutes. The reaction solution was charged with an N,N-dimethyl formamide (140 mL) solution of N-[(benzyloxy)carbonyl]glycylglycyl-L-phenylalanine (6.33 g, 15.3 mmol), N-hydroxysuccinimide ( 1.92 g, 16.7 mmol), and 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (3.20 g, 16.7 mmol) were stirred in advance at room temperature for 1 hour, and stirred in at room temperature for 4 hours. The reaction solution was charged with 0.1 N hydrochloric acid and extracted with chloroform. The obtained organic layer was dried over sodium sulfate and filtered. The solvent was removed under reduced pressure and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform - chloroform : methanol = 8 : 2 (v/v)] to yield the title compound as a colorless solid (7.10 g, 79%)). 1H-NMR (DMSO-D6) δ: 2.78 (1H, dd, J=13.9, 9.6 Hz), 3.05 (1H, dd, J=13.9, 4.5 Hz), 3.56-3.80 (6H, m), 4.15 (2H, s), 4.47-4.55 (1H, m), 4.63 (2H, d, J=6.6 Hz) , 5.03 (2H, s), 5.15 (2H, s), 7.16-7.38 (15H, m), 7.52 (1H, t, J=5.9 Hz), 8. 03 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.17 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.36 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.61 ( 1H, t, J=6.6 Hz). Process 3: Glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(carboxymethoxy)methyl]glycinamide
[00717] A uma solução de N,N-dimetil formamida (216 mL) do com-posto (7,00 g, 10,8 mmol) obtido no Processo 2 acima, catalisador de paládio sobre carbono (7,00 g) foi adicionado e agitado sob atmosfera de hidrogênio em temperatura ambiente durante 24 horas. Os insolú-veis foram removidos por filtração através de celita, e o solvente foi removido sob pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram dissolvidos em água, o material insolúvel foi removido por filtração através de celi- ta, e o solvente foi removido sob pressão reduzida. Este procedimento foi repetido duas vezes para produzir o composto título como um sólido incolor (3,77 g, 82 %). 1H-RMN (DMSO-D6) δ: 2,84 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,08 (1H, dd, J=13,7, 4,7 Hz), 3,50-3,72 (4H, m), 3,77-3,86 (2H, m), 3,87 (2H, s), 4,52-4,43 (1H, m), 4,61 (2H, d, J=6,6 Hz), 7,12-7,30 (5H, m), 8,43 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,54 (1H, d, J=7,8 Hz), 8,70 (1H, t, J=6,3 Hz), 8,79 (1H, t, J=5,5 Hz). Processo 4: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(carboximetóxi)metil]glicinamida[00717] To a N,N-dimethyl formamide (216 mL) solution of the compound (7.00 g, 10.8 mmol) obtained in Process 2 above, palladium on carbon catalyst (7.00 g) was added and stirred under hydrogen atmosphere at room temperature for 24 hours. Insolubles were removed by filtration through celite, and the solvent was removed under reduced pressure. The residues obtained were dissolved in water, insoluble material was removed by filtration through celite, and the solvent was removed under reduced pressure. This procedure was repeated twice to yield the title compound as a colorless solid (3.77 g, 82%). 1H-NMR (DMSO-D6) δ: 2.84 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 3.08 (1H, dd, J=13.7, 4.7 Hz), 3.50-3.72 (4H, m), 3.77-3.86 (2H, m), 3.87 (2H, s), 4.52-4.43 (1H, m), 4. 61 (2H, d, J=6.6 Hz), 7.12-7.30 (5H, m), 8.43 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.54 (1H, d , J=7.8 Hz), 8.70 (1H, t, J=6.3 Hz), 8.79 (1H, t, J=5.5 Hz). Process 4: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(carboxymethoxy)methyl]glycinamide
[00718] A uma solução de N,N-dimetil formamida (85,0 mL) do composto (3,59 g, 8,48 mmol) obtido no Processo 3 acima, hexanoato de 6-maleimida de N-succinimidila (2,88 g, 9,33 mmol) e trietilamina (0,858 g, 8,48 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. A solução de reação foi carregada com ácido hidroclórico a 0,1 N e extraída com clorofórmio e um solvente misto de clorofórmio e metanol [clorofórmio : metanol = 4 : 1 (v/v)]. A camada orgânica obtida foi secada sobre sulfato de sódio e filtrada. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purifi-cados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3: 1 (v/v/v)] para produzir o composto título como um sólido incolor (3,70 g, 71 %). 1H-RMN (DMSO-D6) δ: 1,13-1,24 (2H, m), 1,42-1,53 (4H, m), 2,11 (2H, t, J=7,4 Hz), 2,80 (1H, dd, J=13,7, 9,8 Hz), 3,06 (1H, dd, J=13,9, 4,5 Hz), 3,37 (2H, t, J=7,2 Hz), 3,56-3,78 (6H, m), 3,97 (2H, s), 4,46-4,53 (1H, m), 4,61 (2H, d, J=6,3 Hz), 7,00 (2H, s), 7,15-7,29 (5H, m), 8,038,20 (3H, m), 8,32 (1H, t, J=5,9 Hz), 8,60 (1H, t, J=6,7 Hz). Processo 5: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1- il)hexanoil]glicilglicil-L-fenilalanil-N-[(2-{[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9- hidróxi-4-metil-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]amino}-2- oxoetóxi)metil]glicinamidaTo a N,N-dimethyl formamide (85.0 mL) solution of the compound (3.59 g, 8.48 mmol) obtained in Process 3 above, N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate (2, 88 g, 9.33 mmol) and triethylamine (0.858 g, 8.48 mmol) were added and stirred at room temperature for 1 hour. The reaction solution was charged with 0.1 N hydrochloric acid and extracted with chloroform and a mixed solvent of chloroform and methanol [chloroform : methanol = 4 : 1 (v/v)]. The obtained organic layer was dried over sodium sulfate and filtered. The solvent was removed under reduced pressure and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform - split organic layer chloroform : methanol : water = 7 : 3: 1 (v/v/v)] to yield the title compound as a colorless solid (3.70 g, 71 %). 1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.13-1.24 (2H, m), 1.42-1.53 (4H, m), 2.11 (2H, t, J=7.4 Hz ), 2.80 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 3.06 (1H, dd, J=13.9, 4.5 Hz), 3.37 (2H, t, J=7.2 Hz), 3.56-3.78 (6H, m), 3.97 (2H, s), 4.46-4.53 (1H, m), 4.61 (2H, d , J=6.3 Hz), 7.00 (2H, s), 7.15-7.29 (5H, m), 8.038.20 (3H, m), 8.32 (1H, t, J= 5.9 Hz), 8.60 (1H, t, J=6.7 Hz). Process 5: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(2-{[(1S, 9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyran [3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)methyl]glycinamide
[00719] A uma solução de N,N-dimetil formamida (40,0 mL) de me- silato do composto (4) (1,14 g, 2,00 mmol), trietilamina (0,202 g, 2,00 mmol), o composto (1,48 g, 2,40 mmol) obtido no Processo 4 acima, e cloreto de 4-(4,6-dimetóxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolíneo (0,993 g, 3,00 mmol) contendo 16,4 % de água foram adicionados a 0 °C e agi-tados em temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente foi removi-do sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : meta-nol = 8 : 2 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido ama-relo pálido (1,69 g, 82 %). Os dados instrumentais do composto foram o mesmo como aquele do composto de Processo 8 de Exemplo 58. Exemplo 75 N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-2- hidroxiacetamida Fórmula 144
[00720] Sob resfriamento por gelo, a uma suspensão de N,N-dimetil formamida (20,0 mL) de mesilato do composto (4) (0,500 g, 0,941 mmol), N,N-di-isopropiletilamina (0,492 mL, 2,82 mmol) e cloreto de acetoxiacetila (0,121 ml, 1,13 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromato- grafia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de clorofórmio : metanol : água = 7 : 3: 1 (v/v/v)] para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (0,505 g, quantitativo). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,4 Hz), 1,81-1,92 (2H, m), 2,08 (3H, s), 2,08-2,22 (2H, m), 2,41 (3H, s), 3,14-3,21 (2H, m), 4,51 (2H, dd, J=19,4, 14,7 Hz), 5,22 (2H, dd, J=40,1, 19,0 Hz), 5,43 (2H, s), 5,56-5,61 (1H, m), 6,53 (1H, s), 7,31 (1H, s), 7,81 (1H, d, J=11,0 Hz), 8,67 (1H, d, J=8,6 Hz). MS (ESI) m/z: 536 (M+H)+ Processo 2: N-[(1S,9S)-9-etil-5-fluoro-9-hidróxi-4-metil-10,13-dioxo- 2,3,9,10,13,15-hexa-hidro-1H,12H- benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-il]-2- hidroxiacetamida[00720] Under ice-cooling, to a suspension of N,N-dimethyl formamide (20.0 mL) of compound (4) mesylate (0.500 g, 0.941 mmol), N,N-diisopropylethylamine (0.492 mL, 2.82 mmol) and acetoxyacetyl chloride (0.121 ml, 1.13 mmol) were added and stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was removed under reduced pressure and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform - split organic layer chloroform : methanol : water = 7 : 3: 1 (v/v/v)] to yield the title compound as a pale yellow solid (0.505 g, quantitative). 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.81-1.92 (2H, m), 2.08 (3H, s) , 2.08-2.22 (2H, m), 2.41 (3H, s), 3.14-3.21 (2H, m), 4.51 (2H, dd, J=19.4, 14.7 Hz), 5.22 (2H, dd, J=40.1, 19.0 Hz), 5.43 (2H, s), 5.56-5.61 (1H, m), 6, 53 (1H, s), 7.31 (1H, s), 7.81 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.67 (1H, d, J=8.6 Hz). MS (ESI) m/z: 536 (M+H)+ Process 2: N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2 ,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]- 2- hydroxyacetamide
[00721] A uma suspensão de metanol (50,0 mL) do composto (0,504 g, 0,941 mmol) obtido no Processo 1 acima, tetraidrofurano (20,0 ml) e uma solução aquosa de hidróxido de sódio a 1 N (4,00 ml, 4,00 mmol) foram adicionados e agitados em temperatura ambiente durante 1 hora. A reação foi terminada pela adição de ácido hidroclóri- co a 1 N (5,00 ml, 5,00 mmol), e o solvente foi removido sob pressão reduzida. Os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - camada orgânica dividida de cloro-fórmio : metanol : água = 7 : 3: 1 (v/v/v)] para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (0,412 g, 89 %). Este composto foi confirmado no tumor de um camundongo transportando câncer que recebeu o conjugado de anticorpo-fármaco (55) ou (56). 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, t, J=7,3 Hz), 1,78-1,95 (2H, m), 2,09-2,28 (2H, m), 2,39 (3H, s), 3,07-3,27 (2H, m), 3,96 (2H, d, J=6,0 Hz), 5,11-5,26 (2H, m), 5,42 (2H, s), 5,46-5,54 (1H, m), 5,555,63 (1H, m), 6,52 (1H, s), 7,30 (1H, s), 7,78 (1H, d, J=10,9 Hz), 8,41 (1H, d, J=9,1 Hz). MS (ESI) m/z: 494 (M+H)+ Exemplo 76 (Outro método para sintetizar composto de Exemplo 75) Fórmula 145
[00722] Ácido glicólico (0,0201 g, 0,27 mmol) foi dissolvido em N,N- dimetil formamida (1,0 mL), carregado com N-hidroxisuccinimida (0,0302 g, 0,27 mmol) e cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3- etilcarbodiimida (0,0508 g, 0,27 mmol), e agitado durante 1 hora. A so-lução de reação foi adicionada a uma suspensão de N,N-dimetil for- mamida (1,0 mL) carregada com mesilato do composto (4) (0,1 g, 0,176 mmol) e trietilamina (0,025 mL, 0,18 mmol) e agitada em temperatura ambiente durante 24 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida e os resíduos obtidos foram purificados por cromatografia de coluna de sílica-gel [clorofórmio - clorofórmio : metanol = 10 : 1 (v/v)] para produzir o composto título como um sólido amarelo pálido (0,080 g, 92 %). Os dados instrumentais do composto foram o mesmo como aquele do composto obtido no Processo 2 de Exemplo 75. (Exemplo teste 1) Produção de vetor de expressão de variante 1 B7- H3 humano de comprimento natural[00722] Glycolic acid (0.0201 g, 0.27 mmol) was dissolved in N,N-dimethyl formamide (1.0 mL), charged with N-hydroxysuccinimide (0.0302 g, 0.27 mmol) and hydrochloride of 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide (0.0508 g, 0.27 mmol), and stirred for 1 hour. The reaction solution was added to a suspension of N,N-dimethyl formamide (1.0 mL) loaded with compound (4) mesylate (0.1 g, 0.176 mmol) and triethylamine (0.025 mL, 0 .18 mmol) and stirred at room temperature for 24 hours. The solvent was removed under reduced pressure and the residues obtained were purified by silica gel column chromatography [chloroform - chloroform : methanol = 10 : 1 (v/v)] to yield the title compound as a pale yellow solid (0.080 g , 92%). The instrumental data of the compound was the same as that of the compound obtained in Process 2 of Example 75. (Test Example 1) Production of full-length human B7-H3 variant 1 expression vector
[00723] cDNA codificando a variante 1 B7-H3 humano foi amplificado por reação de PCR usando cDNA sintetizado de célula LNCaP (Co-leção de Cultura tipo Americana: ATCC) RNA total como um modelo e seguinte grupo iniciador: iniciador 1: 5'-ctatagggagacccaagctggctagcatgctgcgtcggcggggcag-3' (SEQ ID NO: 22) e Iniciador 2: 5'- aacgggccctctagactcgagcggccgctcaggctatttcttgtccatcatcttctttgctgtcag-3' (SEQ ID NO: 23).cDNA encoding human B7-H3 variant 1 was amplified by PCR reaction using cDNA synthesized from LNCaP cell (American Type Culture Collection: ATCC) Total RNA as a template and following primer group: primer 1: 5' -ctatagggagacccaagctggctagcatgctgcgtcggcggggcag-3' (SEQ ID NO:22) and Primer 2: 5'- aacgggccctctagactcgagcggccgctcaggctatttcttcttgtccatcatcttctttgctgtcag-3' (SEQ ID NO:23).
[00724] Em seguida, o produto de PCR obtido foi purificado usando MagExtractor PCR & Gel de limpeza (Toyobo Co., Ltd.). O produto pu-rificado foi também digerido com enzimas de restrição (NheI/NotI) e depois disso purificado usando MagExtractor PCR & Gel de limpeza (Toyobo Co., Ltd.). pcDNA3,1 (+) DNA de plasmídeo (Life Technologi-es) foi digerido com as mesmas enzimas de restrição como acima (NheI/NotI) e depois disso purificado usando MagExtractor PCR & Gel de limpeza (Toyobo Co., Ltd.).[00724] Then, the obtained PCR product was purified using MagExtractor PCR & Cleaning Gel (Toyobo Co., Ltd.). The purified product was also digested with restriction enzymes (NheI/NotI) and thereafter purified using MagExtractor PCR & Cleansing Gel (Toyobo Co., Ltd.). pcDNA3.1(+) Plasmid DNA (Life Technologi-es) was digested with the same restriction enzymes as above (NheI/NotI) and thereafter purified using MagExtractor PCR & Cleansing Gel (Toyobo Co., Ltd.).
[00725] Estas soluções de DNA purificado foram misturadas, também carregadas com alta ligação (Toyobo Co., Ltd.), e incubada para ligação a 16°C durante 8 horas.These purified DNA solutions were mixed, also loaded with high binding (Toyobo Co., Ltd.), and incubated for binding at 16°C for 8 hours.
[00726] Células competentes de Escherichia coli DH5α (Life Technologies) foram transformadas pela adição do produto de reação obtido.[00726] Competent cells of Escherichia coli DH5α (Life Technologies) were transformed by adding the reaction product obtained.
[00727] As colônias desse modo obtidas foram submetidas a PCR direto de colônia usando iniciadores de PCR e iniciador reverso de BGH para selecionar os clones candidatos.The colonies thus obtained were subjected to colony direct PCR using PCR primers and BGH reverse primer to select candidate clones.
[00728] Os clones candidatos obtidos foram cultivados em um meio líquido (LB/Amp), e o DNA de plasmídeo foi extraído com MagExtrac-tor-Plasmid- (Toyobo Co., Ltd.).The candidate clones obtained were cultured in a liquid medium (LB/Amp), and plasmid DNA was extracted with MagExtrac-tor-Plasmid- (Toyobo Co., Ltd.).
[00729] Cada clone obtido foi comparado com a sequência de CDS fornecida pela análise de sequenciamento entre[00729] Each clone obtained was compared with the CDS sequence provided by the sequencing analysis between
[00730] Iniciador 3 (iniciador de promotor de CMV): 5'-cgcaaatgggcggtaggcgtg-3' (SEQ ID NO: 24) e Iniciador 4 (iniciador reverse de BGH): 5'-tagaaggcacagtcgagg-3' (SEQ ID NO: 25) Com o DNA de plasmídeo obtido como um modelo.Primer 3 (CMV promoter primer): 5'-cgcaaatgggcggtaggcgtg-3' (SEQ ID NO: 24) and Primer 4 (BGH reverse primer): 5'-tagaaggcacagtcgagg-3' (SEQ ID NO: 25 ) With the plasmid DNA obtained as a template.
[00731] Após confirmar a sequência, o clone obtido foi cultivado em 200 mL de meio LB/Amp, e o DNA de plasmídeo foi extraído usando o kit VioGene Plasmid Midi V-100.[00731] After confirming the sequence, the clone obtained was cultured in 200 ml of LB/Amp medium, and plasmid DNA was extracted using the VioGene Plasmid Midi V-100 kit.
[00732] O vetor foi designado como pcDNA3,1-B7-H3. A sequência de um sítio de ORF do gene de variante 1 B7-H3 clonado no vetor é mostrada nas posições de nucleotídeo 1 a 1602 de SEQ ID NO: 26 (Figura 16) na Listagem de Sequência. Também, a sequência de ami- noácido do B7-H3 variante 1 é mostrada em SEQ ID NO: 1 na Lista-gem de Sequência. (Exemplo teste 2) Preparação de célula de CCRF-CEM estavelmente expressando o gene de variante 1 B7-H3.The vector was designated as pcDNA3,1-B7-H3. The sequence of an ORF site of the B7-H3 variant 1 gene cloned into the vector is shown at nucleotide positions 1 to 1602 of SEQ ID NO: 26 (Figure 16) in the Sequence Listing. Also, the amino acid sequence of B7-H3 variant 1 is shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. (Test example 2) Preparation of CCRF-CEM cell stably expressing B7-H3 variant 1 gene.
[00733] pcDNA3,1-B7-H3 produzidos no Exemplo teste 1 foi trans- fectado nas células CCRF-CEM (ATCC) por eletroporação usando Nu- cleofector II (fabricado por Lonza Grupo Ltd.). Em seguida, as células foram também cultivadas durante duas noites em meio RPMI1640 (Life Technologies) contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) (posterior- mente, referidos como 10% de FBS-RPMI1640) sob condições de 37°C e 5% de CO2.[00733] pcDNA3,1-B7-H3 produced in Test Example 1 was transfected into CCRF-CEM (ATCC) cells by electroporation using Nucleofector II (manufactured by Lonza Group Ltd.). Thereafter, cells were also cultured for two nights in RPMI1640 medium (Life Technologies) containing 10% fetal bovine serum (FBS) (hereinafter referred to as 10% FBS-RPMI1640) under conditions of 37°C and 5°C. % CO2.
[00734] Após o dia 2 de cultura, a cultura foi iniciada em 10% de FBS-RPMI1640 contendo 750 μg/mL G418 (Life Technologies) a fim de selecionar as células de CCRF-CEM em que o pcDNA3,1-B7-H3 estava estavelmente integrado.[00734] After day 2 of culture, the culture was started in 10% FBS-RPMI1640 containing 750 μg/mL G418 (Life Technologies) in order to select the CCRF-CEM cells in which pcDNA3,1-B7- H3 was stably integrated.
[00735] Após 1 mês de cultura, a clonagem foi realizada pelo método de diluição limitante a fim de produzir um clone de célula única. Es-pecificamente, as células tendo resistência a G418 foram diluídas em 10 células/mL, inoculadas a uma placa de 96 cavidades em uma con-centração de 100 μL/cavidade, e cultivadas, e as células deixadas pro-liferar foram recuperadas das cavidades individuais.[00735] After 1 month of culture, cloning was performed by the limiting dilution method in order to produce a single cell clone. Specifically, cells having resistance to G418 were diluted to 10 cells/ml, inoculated to a 96-well plate at a concentration of 100 μL/well, and cultured, and cells allowed to proliferate were recovered from the wells individual.
[00736] Citometria de fluxo foi usado para confirmer a expressão de B7-H3 em cada clone recuperado. Especificamente, cada clone recu-perado foi lavado duas vezes com PBS contendo 5% de FBS, depois disso suspenso pela adição de PBS contendo 5% de FBS e 10 μg/mL de M30, e deixado descansar a 4°C durante 30 minutos. O clone foi lavado duas vezes com PBS contendo 5% de FBS, depois disso sus-penso pela adição de fração de lgG de cabra conjugada com Fluores- ceína para IgG de camundongo (Molécula inteira) (#55493, fabricado por ICN Pharmaceuticals, Inc.) diluído 1000 vezes com PBS contendo 5% de FBS, e deixado descansar a 4°C durante 30 minutos. O clone foi lavado duas vezes com PBS contendo 5% de FBS, depois disso ressuspenso em PBS contendo 5% de FBS, e detectado usando um citômetro de fluxo (FC500: Beckman Coulter, Inc.).[00736] Flow cytometry was used to confirm the expression of B7-H3 in each recovered clone. Specifically, each recovered clone was washed twice with PBS containing 5% FBS, thereafter suspended by the addition of PBS containing 5% FBS and 10 µg/ml M30, and allowed to rest at 4°C for 30 minutes. The clone was washed twice with PBS containing 5% FBS, thereafter suspended by the addition of Fluorescein-conjugated goat IgG fraction to mouse IgG (Whole Molecule) (#55493, manufactured by ICN Pharmaceuticals, Inc .) diluted 1000 times with PBS containing 5% FBS, and allowed to rest at 4°C for 30 minutes. The clone was washed twice with PBS containing 5% FBS, thereafter resuspended in PBS containing 5% FBS, and detected using a flow cytometer (FC500: Beckman Coulter, Inc.).
[00737] As células de CCRF-CEM estavelmente expressando um gene de B7-H3 de variante 1 desse modo obtido por estes procedimentos foram designadas como as células CEM_V1_3.1_2. As células CCRF-CEM de linhagem origem foram usadas como uma linhagem celular sem expressão de B7-H3. (Exemplo teste 3) Teste de Citotoxicidade (1) de conjugado de anticor- po-fármacoCCRF-CEM cells stably expressing a variant 1 B7-H3 gene thereby obtained by these procedures were designated as CEM_V1_3.1_2 cells. CCRF-CEM cells of parent lineage were used as a cell line without B7-H3 expression. (Example test 3) Antibody-drug conjugate Cytotoxicity Test (1)
[00738] As células CEM_V1_3.1_2 produzidas no Exemplo teste 2 ou as células CCRF-CEM (ATCC) foram cultivadas em RPMI1640 (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (MOREGATE) (posterior-mente, referidas como um meio). As células CEM_V1_3.1_2 ou as cé-lulas CCRF-CEM foram preparadas para ter a concentração de 8 x 104 células/mL usando um meio, adicionado em uma concentração de 25 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular carregada com 65 μL/cavidade de um meio, e cultivadas durante a noi-te. No dia seguinte, o anticorpo M30-H1-L4, anticorpo M30-H1-L4P, e o conjugado de anticorpo-fármaco cada qual diluído em 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM, e 0,064 nM usando um meio foram adicionados em uma concentração de 10 μL/cavidade à microplaca. Um meio foi adicionado em uma concentração de 10 μL/cavidade às cavidades não suplementadas de substância teste. As células foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37°C durante 3 dias. Após a cultura, a mi- croplaca foi tirada do incubador e deixada descansar em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi carregada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescen- te CellTiter-Glo (Promega) e agitada. Após a microplaca ser deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos, a quantidade de emissão de luz foi medida usando uma leitora de placa (PerkinEl- mer). O valor de IC50 foi calculado de acordo com a seguinte Equação: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOG10b - LOG10a) / (d - c) + LOG10b) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Relação de células vivas suplementadas com a substância teste tendo a concentração a d: Relação de células vivas suplementadas com substância teste tendo a concentração bThe CEM_V1_3.1_2 cells produced in Test Example 2 or the CCRF-CEM cells (ATCC) were cultured in RPMI1640 (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (hereinafter referred to as a medium). CEM_V1_3.1_2 cells or CCRF-CEM cells were prepared to have a concentration of 8 x 104 cells/mL using a medium, added at a concentration of 25 μL/well to a 96-well cell culture microplate loaded with 65 μL/well of a medium, and grown overnight. The next day, the M30-H1-L4 antibody, M30-H1-L4P antibody, and the antibody-drug conjugate each diluted to 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, and 0.064 nM using a medium were added at a concentration of 10 µL/well to the microplate. A medium was added at a concentration of 10 µL/well to the unsupplemented wells of test substance. Cells were grown under 5% CO2 at 37°C for 3 days. After culture, the microplate was removed from the incubator and allowed to rest at room temperature for 30 minutes. The culture solution was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) and shaken. After the microplate was left to rest at room temperature for 10 minutes, the amount of light emission was measured using a plate reader (PerkinElmer). The IC50 value was calculated according to the following Equation: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOG10b - LOG10a) / (d - c) + LOG10b) a: Concentration a of the test substance b: Concentration b of the test substance c: Ratio of live cells supplemented with the test substance having the concentration ad: Ratio of living cells supplemented with the test substance having the concentration b
[00739] As concentraçãos a e b estabelecem a relação a > b cruzando 50% de relação de células vivas.[00739] The a and b concentrations establish the a > b ratio crossing 50% of the living cell ratio.
[00740] A taxa de sobrevivência de células em cada concentração foi calculada de acordo com a seguinte Equação: Taxa de sobrevivência de células (%) = a / b x 100 a: Quantidade média de emissão de luz das cavidades su-plementadas por substância teste (n = 2) b: Quantidade média de emissão de luz das cavidades não suplementadas de substância teste (n = 10).[00740] The cell survival rate at each concentration was calculated according to the following Equation: Cell survival rate (%) = a / bx 100 a: Average amount of light emission from the wells supplemented by test substance (n = 2) b: Average amount of light emission from unsupplemented test substance wells (n = 10).
[00741] Os conjugados de anticorpo-fármaco (5), (16), (21), (32), (44), (45), (46), (52), e (54) exibiram uma atividade citotóxica de IC50 < 0,1 (nM) contra as células CEM_V1_3.1_2. Os conjugados de anticor- po-fármaco (1), (12), (13), (20), (28), (29), (35), (36), (37), (41), (49), e (53) exibiram uma atividade citotóxica de 0,1 < IC50 < 1 (nM) contra as células. Os conjugados de anticorpo-fármaco (33), (34), (47), (48), (50), e (51) exibiram uma atividade citotóxica de 1 < IC50 < 100 (nM) contra as células. Por outro lado, nenhum destes conjugados de anti- corpo-fármaco exibiram uma atividade citotóxica contra as células CCRF-CEM (> 100 (nM)). Nem o anticorpo M30-H1-L4 nem o anticorpo M30-H1-L4P exibiram uma atividade citotóxica contra ambas as células (> 100 (nM)). (Exemplo teste 4) Teste de Citotoxicidade (2) de conjugado de anticor- po-fármaco[00741] Antibody-drug conjugates (5), (16), (21), (32), (44), (45), (46), (52), and (54) exhibited a cytotoxic activity of IC50 < 0.1 (nM) against CEM_V1_3.1_2 cells. Antibody-drug conjugates (1), (12), (13), (20), (28), (29), (35), (36), (37), (41), (49 ), and (53) exhibited a cytotoxic activity of 0.1 < IC50 < 1 (nM) against the cells. Antibody-drug conjugates (33), (34), (47), (48), (50), and (51) exhibited a cytotoxic activity of 1 < IC50 < 100 (nM) against the cells. On the other hand, none of these antibody-drug conjugates exhibited cytotoxic activity against CCRF-CEM cells (>100 (nM)). Neither the M30-H1-L4 antibody nor the M30-H1-L4P antibody exhibited cytotoxic activity against both cells (>100 (nM)). (Example test 4) Antibody-drug conjugate Cytotoxicity Test (2)
[00742] Células SR de células positivas de antígeno (ATCC) ou células Daudi de células negativas de antígeno (ATCC) foram cultivadas em RPMI1640 (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (MORE- GATE) (posteriormente, referidos como um meio). As células SR ou as células Daudi foram preparadas para ter a concentração de 2,8 x 104 células/mL usando um meio e adicionadas em uma concentração de 90 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular. Duas horas mais tarde, o anticorpo anti-CD30 e conjugados de anti- corpo-fármaco (6) e (7) cada qual diluído em 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 320 pM, 64 pM, 12,8 pM, e 2,6 pM usando um meio foram adicionados em uma concentração de 10 μL/cavidade à microplaca. Um meio foi adici-onado em uma concentração de 10 μL/cavidade às cavidades não su-plementadas de substância teste. As células foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37°C durante 3 dias. Após a cultura, a microplaca foi tirada do incubador e deixada descansar em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi carregada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo (Promega) e agitada. Após a microplaca ser deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos, a quantidade de emissão de luz foi medida usando uma leitora de placa (PerkinElmer). O valor de IC50 foi calculado de acordo com a seguinte Equação: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGwb - LOGwa) / (d - c) + LOGwb) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Relação de células vivas suplementadas com a substân-cia teste tendo a concentração a d: Relação de células vivas suplementadas com a substân-cia teste tendo a concentração bAntigen positive cell SR cells (ATCC) or antigen negative cell Daudi cells (ATCC) were cultured in RPMI1640 (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MORE-GATE) (hereinafter referred to as a medium ). SR cells or Daudi cells were prepared to have a concentration of 2.8 x 104 cells/ml using a medium and added at a concentration of 90 µl/well to a 96-well cell culture microplate. Two hours later, anti-CD30 antibody and antibody-drug conjugates (6) and (7) each diluted to 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 320 pM, 64 pM, 12.8 pM , and 2.6 pM using a medium were added at a concentration of 10 µL/well to the microplate. A medium was added at a concentration of 10 μL/well to the unsupplemented wells of test substance. Cells were grown under 5% CO2 at 37°C for 3 days. After culturing, the microplate was removed from the incubator and allowed to rest at room temperature for 30 minutes. The culture solution was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) and shaken. After the microplate was left to rest at room temperature for 10 minutes, the amount of light emission was measured using a plate reader (PerkinElmer). The IC50 value was calculated according to the following Equation: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGwb - LOGwa) / (d - c) + LOGwb) a: Concentration a of the test substance b: Concentration b of the test substance c: Ratio of live cells supplemented with the test substance having the concentration ad: Ratio of living cells supplemented with the test substance having the concentration b
[00743] As concentraçãos a e b estabelecem a relação a > b cruzando 50% de relação de células vivas.[00743] The a and b concentrations establish the a > b ratio crossing 50% of the living cell ratio.
[00744] A taxa de sobrevivência das células em cada concentração foi calculada de acordo com a seguinte Equação: Taxa de sobrevivência das células (%) = a / b x 100 a: Quantidade média de emissão de luz das cavidades su-plementadas pela substância teste (n = 2) b: Quantidade média de emissão de luz das cavidades não suplementadas de substância teste (n = 12)[00744] The cell survival rate at each concentration was calculated according to the following Equation: Cell survival rate (%) = a / bx 100 a: Average amount of light emission from the wells supplemented by the test substance (n = 2) b: Average amount of light emission from unsupplemented test substance wells (n = 12)
[00745] Os conjugados de anticorpo-fármaco (6) e (7) exibiram uma atividade citotóxica de IC50 < 0,01 (nM) contra as células SR. Por outro lado, os conjugados de anticorpo-fármaco (6) e (7) não exibiram nenhuma atividade citotóxica contra as células Daudi (> 4,0 (nM)). O anticorpo anti-CD30 não exibiu nenhuma atividade citotóxica contra ambas as células (> 4,0 (nM)). (Exemplo teste 5) Teste de Citotoxicidade (3) do conjugado de anticor- po-fármaco[00745] Antibody-drug conjugates (6) and (7) exhibited a cytotoxic activity of IC50 < 0.01 (nM) against SR cells. On the other hand, antibody-drug conjugates (6) and (7) did not exhibit any cytotoxic activity against Daudi cells (> 4.0 (nM)). Anti-CD30 antibody exhibited no cytotoxic activity against both cells (> 4.0 (nM)). (Example test 5) Antibody-drug conjugate Cytotoxicity Test (3)
[00746] As células SR de células positivas de antígeno (ATCC) foram cultivadas em RPMI1640 (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referido como um meio). As células SR foram preparadas para ter a concentração de 2,8 x 104 célu- las/mL usando um meio e adicionadas em uma concentração de 90 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular. Duas horas mais tarde, o anticorpo anti-CD30 e os conjugados de an- ticorpo-fármaco (22), (23), (38), (64), e (65) cada qual diluído em 1000 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, e 1 pM usando um meio foram adicionados em uma concentração de 10 μL/cavidade à micro- placa. Um meio foi adicionado em uma concentração de 10 μL/cavidade às cavidades não suplementadas de substância teste. As células foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37°C durante 6 dias. Após a cultura, a microplaca foi tirada do incubador e deixada descansar em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi car-regada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo (Promega) e agitada. Após a microplaca ser deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos, a quantidade de emissão de luz foi medida usando uma leitora de placa (PerkinElmer). O valor de IC50 foi calculada de acordo com a seguinte Equação: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Relação de células vivas suplementadas com a substân-cia teste tendo a concentração a d: Relação de células vivas suplementadas com a substân-cia teste tendo a concentração bSR cells from antigen positive cells (ATCC) were cultured in RPMI1640 (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (hereinafter referred to as a medium). SR cells were prepared to have a concentration of 2.8 x 104 cells/mL using a medium and added at a concentration of 90 μL/well to a 96-well microplate for cell culture. Two hours later, the anti-CD30 antibody and antibody-drug conjugates (22), (23), (38), (64), and (65) each diluted to 1000 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, and 1 pM using a medium were added at a concentration of 10 µL/well to the microplate. A medium was added at a concentration of 10 µL/well to the unsupplemented wells of test substance. Cells were grown under 5% CO2 at 37°C for 6 days. After culturing, the microplate was removed from the incubator and allowed to rest at room temperature for 30 minutes. The culture solution was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) and shaken. After the microplate was allowed to rest at room temperature for 10 minutes, the amount of light emission was measured using a plate reader (PerkinElmer). The IC50 value was calculated according to the following Equation: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob) a: Concentration a of the test substance b: Concentration b of the test substance c: Ratio of live cells supplemented with the test substance having the concentration ad: Ratio of living cells supplemented with the test substance having the concentration b
[00747] As concentraçãos a e b estabelecem a relação a > b cruzando 50% de Relação de células vivas.[00747] Concentrations a and b establish the ratio a > b crossing 50% of the ratio of living cells.
[00748] A taxa de sobrevivência de células em cada concentração foi calculada de acordo com a seguinte Equação: Taxa de sobrevivência de células (%) = a / b x 100 a: Quantidade média de emissão de luz das cavidades su-plementadas de substância teste (n = 2) b: Quantidade média de emissão de luz das cavidades não suplementadas de substância teste (n = 12)[00748] The cell survival rate at each concentration was calculated according to the following Equation: Cell survival rate (%) = a / bx 100 a: Average amount of light emission from the test substance supplemented wells (n = 2) b: Average amount of light emission from unsupplemented test substance wells (n = 12)
[00749] Os conjugados de anticorpo-fármaco (23), (38), (64), e (65) exibiram uma atividade citotóxica de IC50 < 0,01 (nM) contra as células SR. O conjugado de anticorpo-fármaco (22) exibiram uma atividade citotóxica de IC50 < 0,1 (nM) contra as células SR. O anticorpo anti- CD30 não exibiram nenhuma atividade citotóxica contra as células SR (> 4,0 (nM)). (Exemplo teste 6) Teste de citotoxicidade (4) de conjugado de anticor- po-fármaco[00749] Antibody-drug conjugates (23), (38), (64), and (65) exhibited a cytotoxic activity of IC50 < 0.01 (nM) against SR cells. The antibody-drug conjugate (22) exhibited a cytotoxic activity of IC50 < 0.1 (nM) against SR cells. Anti-CD30 antibody exhibited no cytotoxic activity against SR cells (> 4.0 (nM)). (Example test 6) Antibody-drug conjugate cytotoxicity test (4)
[00750] As células HL-60 de células positivas de antígeno (ATCC) ou as células Raji de células negativas de antígeno (ATCC) foram cul-tivadas em RPMI1640 (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referido como um meio). As células HL-60 ou as células Raji foram preparadas para ter a concentração de 8 x 104 células/mL usando um meio e adicionadas em uma concentra- ção de 25 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular carregada com 65 μL/cavidade de um meio. O anticorpo anti- CD33 e conjugados de anticorpo-fármaco (8) e (9) cada qual diluído em 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM, e 0,064 nM usando um meio foram adicionados em uma concentração de 10 μL/cavidade à microplaca. Um meio foi adicionado em uma concentração de 10 μL/cavidade às cavidades não suplementadas de substância teste. As células foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37°C durante 3 dias. Após a cultura, a microplaca foi tirada do incubador e deixada descansar em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi carregada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo (Promega) e agitada. Após a microplaca ser deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos, a quantidade de emissão de luz foi medida usando uma leitora de placa (PerkinElmer). O valor de IC50 foi calculado de acordo com a seguinte Equação: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGwb - LOGwa) / (d - c) + LOGwb) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Relação de células vivas suplementadas com a substân-cia teste tendo a concentração a d: Relação de células vivas suplementadas com a substân-cia teste tendo a concentração bHL-60 cells from antigen positive cells (ATCC) or Raji cells from antigen negative cells (ATCC) were cultured in RPMI1640 (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (later, referred to as a means). HL-60 cells or Raji cells were prepared to have a concentration of 8 x 104 cells/mL using a medium and added at a concentration of 25 μL/well to a 96-well cell culture microplate loaded with 65 μL /cavity of a medium. Anti-CD33 antibody and antibody-drug conjugates (8) and (9) each diluted to 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, and 0.064 nM using medium were added at a concentration of 10 μL/well to the microplate. A medium was added at a concentration of 10 µL/well to the unsupplemented wells of test substance. Cells were grown under 5% CO2 at 37°C for 3 days. After culturing, the microplate was removed from the incubator and allowed to rest at room temperature for 30 minutes. The culture solution was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) and shaken. After the microplate was left to rest at room temperature for 10 minutes, the amount of light emission was measured using a plate reader (PerkinElmer). The IC50 value was calculated according to the following Equation: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGwb - LOGwa) / (d - c) + LOGwb) a: Concentration a of the test substance b: Concentration b of the test substance c: Ratio of live cells supplemented with the test substance having the concentration ad: Ratio of living cells supplemented with the test substance having the concentration b
[00751] As concentraçãos a e b estabelecem a relação a > b cruzando 50% de Relação de células vivas.[00751] Concentrations a and b establish the ratio a > b crossing 50% of the ratio of living cells.
[00752] A taxa de sobrevivência de células em cada concentração foi calculada de acordo com a seguinte Equação: Taxa de sobrevivência de células (%) = a / b x 100 a: Quantidade média de emissão de luz das cavidades su-plementadas de substância teste (n = 2) b: Quantidade média de emissão de luz das cavidades não suplementadas de substância teste (n = 5)[00752] The cell survival rate at each concentration was calculated according to the following Equation: Cell survival rate (%) = a / bx 100 a: Average amount of light emission from the test substance supplemented wells (n = 2) b: Average amount of light emission from unsupplemented test substance wells (n = 5)
[00753] Os conjugados de anticorpo-fármaco (8) e (9) exibiram uma atividade citotóxica de IC50 < 0,1 (nM) contra as células HL-60. Por outro lado, os conjugados de anticorpo-fármaco (8) e (9) não exibiram nenhuma atividade citotóxica contra as células Raji (> 100 (nM)). O anticorpo anti-CD33 não exibiram nenhuma atividade citotóxica contra ambas as células (> 100 (nM)). (Exemplo teste 7) Teste de citotoxicidade (5) de conjugado de anticor- po-fármacoAntibody-drug conjugates (8) and (9) exhibited a cytotoxic activity of IC50 < 0.1 (nM) against HL-60 cells. On the other hand, antibody-drug conjugates (8) and (9) did not exhibit any cytotoxic activity against Raji cells (>100 (nM)). The anti-CD33 antibody exhibited no cytotoxic activity against both cells (>100 (nM)). (Example test 7) Antibody-drug conjugate cytotoxicity test (5)
[00754] As células NOMO-1 de células positivas de antígeno (HSRRB) foram cultivadas em RPMI1640 (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referido como um meio). As células NOMO-1 foram preparadas para ter a concentração de 2,8 x 104 células/mL usando um meio e adicionado em uma concentração de 90 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular. Duas horas mais tarde, o anticorpo anti-CD33 e conjugados de anticorpo-fármaco (24), (25), e (67) cada qual diluído em 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM, e 0,064 nM usando um meio foram adicionados em uma concentração de 10 μL/cavidade à microplaca. Um meio foi adicionado em uma concentração de 10 μL/cavidade às cavidades não suplementadas de substância teste. As células foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37°C durante 6 dias. Após a cultura, a microplaca foi retirada do incubador e deixada descansar durante 30 minutos em temperatura ambiente. A solução de cultura foi carregada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo (Promega) e agitados. Após a micro- placa ser deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos, a quantidade de emissão de luz foi medida usando uma leitora de placa (PerkinElmer). O valor de IC50 foi calculado de acordo com a seguinte Equação: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Relação de células vivas suplementadas com a substân-cia teste tendo a concentração a d: Relação de células vivas suplementadas com a substân-cia teste tendo a concentração bAntigen positive cells NOMO-1 cells (HSRRB) were cultured in RPMI1640 (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (hereinafter referred to as a medium). NOMO-1 cells were prepared to have a concentration of 2.8 x 104 cells/mL using a medium and added at a concentration of 90 µL/well to a 96-well microplate for cell culture. Two hours later, anti-CD33 antibody and antibody-drug conjugates (24), (25), and (67) each diluted to 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0 .32 nM, and 0.064 nM using a medium were added at a concentration of 10 µL/well to the microplate. A medium was added at a concentration of 10 µL/well to the unsupplemented wells of test substance. Cells were grown under 5% CO2 at 37°C for 6 days. After culture, the microplate was removed from the incubator and allowed to rest for 30 minutes at room temperature. The culture solution was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) and shaken. After the microplate was left to rest at room temperature for 10 minutes, the amount of light emission was measured using a plate reader (PerkinElmer). The IC50 value was calculated according to the following Equation: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob) a: Concentration a of the test substance b: Concentration b of the test substance c: Ratio of live cells supplemented with the test substance having the concentration ad: Ratio of living cells supplemented with the test substance having the concentration b
[00755] As concentraçãos a e b estabelecem a relação a > b cruzando 50% de Relação de células vivas.[00755] Concentrations a and b establish the ratio a > b crossing 50% of the ratio of living cells.
[00756] A taxa de sobrevivência de células em cada concentração foi calculada de acordo com a seguinte Equação: Taxa de sobrevivência de células (%) = a / b x i00 a: Quantidade média de emissão de luz das cavidades su-plementadas de substância teste (n = 2) b: Quantidade média de emissão de luz das cavidades não suplementadas de substância teste (n = 5)[00756] The cell survival rate at each concentration was calculated according to the following Equation: Cell survival rate (%) = a / bx i00 a: Average amount of light emission from the test substance supplemented wells (n = 2) b: Average amount of light emission from unsupplemented test substance wells (n = 5)
[00757] O conjugado de anticorpo-fármaco (25) exibiram uma atividade citotóxica de IC50 < 0,i (nM) contra as células NOMO-i. Os con-jugados de anticorpo-fármaco (24) e (67) exibiram uma atividade cito- tóxica de i < IC50 < i00 (nM) contra as células. O anticorpo anti-CD33 não exibiu nenhuma atividade citotóxica contra as células NOMO-i (> i00 (nM)). (Exemplo teste 8) Teste de citotoxicidade (6) do conjugado de anticor- po-fármacoThe antibody-drug conjugate (25) exhibited a cytotoxic activity of IC50 < 0.1 (nM) against NOMO-i cells. Antibody-drug conjugates (24) and (67) exhibited a cytotoxic activity of i < IC50 < i00 (nM) against the cells. Anti-CD33 antibody exhibited no cytotoxic activity against NOMO-i cells (> 100 (nM)). (Example test 8) Antibody-drug conjugate cytotoxicity test (6)
[00758] As células U25i de células positivas de antígeno (ATCC) ou as células MCF-7 de células negativas de antígeno (ATCC) foram cultivadas em RPMIi640 (GIBCO) contendo i0% de soro bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referidos como um meio). As células U25i ou as células MCF-7 foram preparadas para ter a concentração de 2,8 x 104 células/mL usando um meio, adicionado em uma concen-tração de 90 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cul-tura celular, e cultivada durante a noite. No dia seguinte, o anticorpo anti-CD70 e os conjugados de anticorpo-fármaco (10) e (11) cada qual diluído em 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM, e 0,064 nM usando um meio foram adicionados em uma concentração de 10 μL/cavidade à microplaca. Um meio foi adicionado em uma concentra-ção de 10 μL/cavidade às cavidades não suplementadas de substância teste. As células foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37°C durante 6 dias. Após a cultura, a microplaca foi retirada do incubador e deixada descansar em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi carregada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabili-dade de Célula Luminescente CellTiter-Glo (Promega) e agitados. Após a microplaca ser deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos, a quantidade de emissão de luz foi medida usando uma leitora de placa (PerkinElmer). O valor de IC50 foi calculado de acordo com a seguinte Equação: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOG10b - LOG10a) / (d - c) + LOG10b) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Relação de células vivas suplementadas com a substân-cia teste tendo a concentração a d: Relação de células vivas suplementadas com a substân-cia teste tendo a concentração bAntigen positive cells U25i cells (ATCC) or antigen negative cells MCF-7 cells (ATCC) were cultured in RPMIi640 (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (hereinafter referred to as a way). U25i cells or MCF-7 cells were prepared to have a concentration of 2.8 x 104 cells/mL using a medium, added at a concentration of 90 μL/well to a 96-well microplate for cell culture , and grown overnight. The next day, the anti-CD70 antibody and antibody-drug conjugates (10) and (11) each diluted to 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, and 0.064 nM using a medium was added at a concentration of 10 µL/well to the microplate. A medium was added at a concentration of 10 μL/well to the test substance not supplemented wells. Cells were grown under 5% CO2 at 37°C for 6 days. After culture, the microplate was removed from the incubator and allowed to rest at room temperature for 30 minutes. The culture solution was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) and shaken. After the microplate was left to rest at room temperature for 10 minutes, the amount of light emission was measured using a plate reader (PerkinElmer). The IC50 value was calculated according to the following Equation: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOG10b - LOG10a) / (d - c) + LOG10b) a: Concentration a of the test substance b: Concentration b of the test substance c: Ratio of live cells supplemented with the test substance having the concentration ad: Ratio of living cells supplemented with the test substance having the concentration b
[00759] As concentraçãos a e b estabelecem a relação a > b cruzando 50% de Relação de células vivas.[00759] Concentrations a and b establish the ratio a > b crossing 50% of the ratio of living cells.
[00760] A taxa de sobrevivência de células em cada concentração foi calculada de acordo com a seguinte Equação: Taxa de sobrevivência de células (%) = a / b x 100 a: Quantidade média de emissão de luz das cavidades su- plementadas de substância teste (n = 2) b: Quantidade média de emissão de luz das cavidades não suplementadas de substância teste (n = 12)[00760] The cell survival rate at each concentration was calculated according to the following Equation: Cell survival rate (%) = a / bx 100 a: Average amount of light emission from the test substance supplemented wells (n = 2) b: Average amount of light emission from unsupplemented test substance wells (n = 12)
[00761] Os conjugados de anticorpo-fármaco (10) e (11) exibiram uma atividade citotóxica de IC50 < 1 (nM) contra as células U251. Por outro lado, os conjugados de anticorpo-fármaco (10) e (11) não exibiram nenhuma atividade citotóxica contra as células MCF-7 (> 90 (nM)). O anticorpo anti-CD70 não exibiram nenhuma atividade citotóxica contra ambas as células (> 100 (nM)). (Exemplo teste 9) Teste de citotoxicidade (7) do conjugado de anticor- po-fármacoThe antibody-drug conjugates (10) and (11) exhibited a cytotoxic activity of IC50 < 1 (nM) against U251 cells. On the other hand, antibody-drug conjugates (10) and (11) did not exhibit any cytotoxic activity against MCF-7 cells (> 90 (nM)). The anti-CD70 antibody exhibited no cytotoxic activity against both cells (>100 (nM)). (Example test 9) Antibody-drug conjugate cytotoxicity test (7)
[00762] As células U251 de células positivas de antígeno (ATCC) foram cultivadas em RPMI1640 (GIBCO) contendo 10% de soro bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referidos como um meio). As células U251 foram preparadas para ter a concentração de 2,8 x 104 células/mL usando um meio e adicionado em uma concentração de 90 μL/cavidade a uma microplaca de 96 cavidades para cultura celular. Duas horas mais tarde, o anticorpo anti-CD70 e conjugados de anti- corpo-fármaco (26), (27), (40), (68), e (69) cada qual diluído em 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM, e 0,064 nM usando um meio foram adicionados em uma concentração de 10 μL/cavidade à microplaca. Um meio foi adicionado em uma concentração de 10 μL/cavidade às cavidades não suplementadas de substância teste. As células foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37°C durante 6 dias. Após a cultura, a microplaca foi retirada do incubador e deixada descansar em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi carregada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo (Promega) e agitada. Após a microplaca ser deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos, a quantidade de emissão de luz foi medida usando uma leitora de pla- ca (PerkinElmer). O valor de IC50 foi calculado de acordo com a se-guinte Equação: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Relação de células vivas suplementadas com a substân-cia teste tendo a concentração a d: Relação de células vivas suplementadas com a substân-cia teste tendo a concentração bAntigen positive cells (ATCC) U251 cells were cultured in RPMI1640 (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (hereinafter referred to as a medium). U251 cells were prepared to have a concentration of 2.8 x 104 cells/mL using a medium and added at a concentration of 90 µL/well to a 96-well microplate for cell culture. Two hours later, the anti-CD70 antibody and antibody-drug conjugates (26), (27), (40), (68), and (69) each diluted to 1000 nM, 200 nM, 40 nM , 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, and 0.064 nM using a medium were added at a concentration of 10 µL/well to the microplate. A medium was added at a concentration of 10 µL/well to the unsupplemented wells of test substance. Cells were grown under 5% CO2 at 37°C for 6 days. After culture, the microplate was removed from the incubator and allowed to rest at room temperature for 30 minutes. The culture solution was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) and shaken. After the microplate was left to rest at room temperature for 10 minutes, the amount of light emission was measured using a plate reader (PerkinElmer). The IC50 value was calculated according to the following Equation: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGiob - LOGioa) / (d - c) + LOGiob) a: Concentration a of test substance b : Concentration b of the test substance c: Ratio of live cells supplemented with the test substance having the concentration ad: Ratio of living cells supplemented with the test substance having the concentration b
[00763] As concentraçãos a e b estabelecem a relação a > b cruzando 50% de Relação de células vivas.[00763] Concentrations a and b establish the ratio a > b crossing 50% of the ratio of living cells.
[00764] A taxa de sobrevivência de células em cada concentração foi calculada de acordo com a seguinte Equação: Taxa de sobrevivência de células (%) = a / b x i00 a: Quantidade média de emissão de luz das cavidades su-plementadas de substância teste (n = 2) b: Quantidade média de emissão de luz das cavidades não suplementadas de substância teste (n = i2)[00764] The cell survival rate at each concentration was calculated according to the following Equation: Cell survival rate (%) = a / bx i00 a: Average amount of light emission from the test substance supplemented wells (n = 2) b: Average amount of light emission from unsupplemented test substance cavities (n = i2)
[00765] Os conjugados de anticorpo-fármaco (26), (27), (40), e (69) exibiram uma atividade citotóxica de i < IC50 < i0 (nM) contra as célu-las U25i. O conjugado de anticorpo-fármaco (68) exibiu uma atividade citotóxica de i0 < IC50 < i00 (nM) contra as células. O anticorpo anti- CD70 não exibiu nenhuma atividade citotóxica contra as células U25i (> i00 (nM)). (Exemplo teste i0) Teste de citotoxicidade (8) de fármaco liberadoAntibody-drug conjugates (26), (27), (40), and (69) exhibited a cytotoxic activity of i < IC50 < i0 (nM) against U25i cells. The antibody-drug conjugate (68) exhibited a cytotoxic activity of 10 < IC50 < 100 (nM) against the cells. Anti-CD70 antibody did not exhibit any cytotoxic activity against U25i cells (> 100 (nM)). (Example test i0) Cytotoxicity test (8) of released drug
[00766] As células A375 (ATCC) foram cultivadas em DMEM (GIB- CO) contendo i0% de soro bovino fetal (MOREGATE) (posteriormente, referido como um meio). As células A375 foram preparadas para ter a concentração de 4 x i04 células/mL usando um meio, adicionadas em uma concentração de 25 μL/cavidade a uma microplaca de 96 ca- vidades para cultura celular (CORNING) carregadas com 65 μL/cavidade de um meio, e cultivadas durante a noite. No dia seguinte, cada substância teste diluída em 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1,6 nM, 0,32 nM, e 0,064 nM usando DMSO foi adicionada em uma con-centração de 0,5 μL/cavidade à microplaca. DMSO foi adicionado em uma concentração de 0,5 μL/cavidade às cavidades não suplementa-das de substância teste. O volume do meio em cada cavidade foi ajus-tado para 100 μL pela adição de 10 μL/cavidade de um meio, e as cé-lulas foram cultivadas sob 5% de CO2 a 37°C durante 6 dias. Após a cultura, a microplaca foi retirada do incubador e deixada descansar em temperatura ambiente durante 30 minutos. A solução de cultura foi car-regada com uma quantidade igual de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo (Promega) e agitada. Após a microplaca ser deixada descansar em temperatura ambiente durante 10 minutos, a quantidade de emissão de luz foi medida usando uma leitora de placa. O valor de IC50 foi calculado de acordo com a seguinte Equação: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGwb - LOGwa) / (d - c) + LOGwb) a: Concentração a da substância teste b: Concentração b da substância teste c: Relação de células vivas suplementadas com a substân-cia teste tendo a concentração a d: Relação de células vivas suplementadas com a substân-cia teste tendo a concentração bA375 cells (ATCC) were cultured in DMEM (GIB-CO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (hereinafter referred to as a medium). A375 cells were prepared to have a concentration of 4 x 104 cells/mL using a medium, added at a concentration of 25 μL/well to a 96-well cell culture microplate (CORNING) loaded with 65 μL/well of a medium, and grown overnight. The next day, each test substance diluted to 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, and 0.064 nM using DMSO was added at a concentration of 0.5 µL/well to the microplate. DMSO was added at a concentration of 0.5 µL/well to unsupplemented test substance wells. The volume of medium in each well was adjusted to 100 µL by adding 10 µL/well of a medium, and the cells were cultured under 5% CO2 at 37°C for 6 days. After culture, the microplate was removed from the incubator and allowed to rest at room temperature for 30 minutes. The culture solution was loaded with an equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) and shaken. After the microplate was left to rest at room temperature for 10 minutes, the amount of light emission was measured using a plate reader. The IC50 value was calculated according to the following Equation: IC50 (nM) = antilog((50 - d) x (LOGwb - LOGwa) / (d - c) + LOGwb) a: Concentration a of the test substance b: Concentration b of the test substance c: Ratio of live cells supplemented with the test substance having the concentration ad: Ratio of living cells supplemented with the test substance having the concentration b
[00767] As concentraçãos a e b estabelecem a relação a > b cruzando 50% de Relação de células vivas.[00767] Concentrations a and b establish the ratio a > b crossing 50% of the ratio of living cells.
[00768] A taxa de sobrevivência de células foi calculada de acordo com a seguinte Equação: Taxa de sobrevivência de células (%) = a / b x 100 a: Quantidade média de emissão de luz das cavidades su-plementadas de substância teste (n = 2) b: Quantidade média de emissão de luz das cavidades não suplementadas de substância teste (n = 10)[00768] The cell survival rate was calculated according to the following Equation: Cell survival rate (%) = a / bx 100 a: Average amount of light emission from the test substance supplemented wells (n = 2) b: Average amount of light emission from unsupplemented test substance wells (n = 10)
[00769] O composto de Exemplo (75) e exatecano exibiram uma atividade citotóxica de 0,1 < IC50 < 1 (nM) contra as células A375. O composto de Exemplo (42) exibiu uma atividade citotóxica contra 1 < IC50 < 10 (nM) contra as células. O composto de Exemplo (1) exibiu uma atividade citotóxica contra 10 < IC50 < 100 (nM) contra as células. (Exemplo teste 11) Teste Antitumor (1)The compound of Example (75) and exatecan exhibited a cytotoxic activity of 0.1 < IC50 < 1 (nM) against A375 cells. The compound of Example (42) exhibited cytotoxic activity against 1 < IC50 < 10 (nM) against cells. The compound of Example (1) exhibited cytotoxic activity against 10 < IC50 < 100 (nM) against cells. (Example test 11) Antitumor Test (1)
[00770] Camundongo: camundonogos nus BALB/c fêmeas de 5 a 6 semanas de idade (Charles River Laboratories Japan, Inc.) foram aclimatizados durante 4 a 7 dias sob condições de SPF antes do uso no experimento. Os camundongos foram alimentados com alimentação sólida esterilizada (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) e fornecido água de torneira esterilizada (preparada pela adição de solução de hi- poclorito de sódio de 5 a 15 ppm).[00770] Mouse: 5 to 6 week old female BALB/c nude mice (Charles River Laboratories Japan, Inc.) were acclimatized for 4 to 7 days under SPF conditions prior to use in the experiment. The mice were fed sterile solid feed (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) and provided with sterile tap water (prepared by adding 5 to 15 ppm sodium hypochlorite solution).
[00771] Ensaio e expressão de cálculo: Em todos os estudos, o eixo maior e o eixo menor de tumor foram medidos duas vezes em uma semana usando um calibrador eletrônico digital (CD-15C, Mitutoyo Corp.), e o volume do tumor (mm3) foi calculado. A expressão de cál-culo é como mostrado abaixo. Volume do tumor (mm3) = 1/2 x eixo maior (mm) x [eixo menor (mm)]2[00771] Assay and calculation expression: In all studies, major axis and minor axis of tumor were measured twice in one week using a digital electronic calibrator (CD-15C, Mitutoyo Corp.), and tumor volume (mm3) was calculated. The calculation expression is as shown below. Tumor volume (mm3) = 1/2 x major axis (mm) x [minor axis (mm)]2
[00772] Todos os conjugados de anticorpo-fármaco foram diluídos com salina fisiológica (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) e usados em um volume de 10 mL/kg para administração intravenosa à cauda de cada camundongo. As células A375 de linhagem de melanoma humano foram adquiridas de ATCC (Coleção de Cultura tipo America-na). 8 x 106 células suspensas em salina fisiológica foram subcutane- amente transplantadas ao abdômen direito de cada camundongo fêmea nu (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 11. O anticorpo M30-H1-L4P e o conjugado de anticorpo- fármaco (2) foram cada qual intravenosamente administrados em uma dose de 10 mg/kg à cauda de cada camundongo nos Dias 11, 18, e 25.[00772] All antibody-drug conjugates were diluted with physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) and used in a volume of 10 mL/kg for intravenous administration to the tail of each mouse. A375 human melanoma lineage cells were purchased from ATCC (America-type Culture Collection). 8 x 106 cells suspended in physiological saline were subcutaneously transplanted to the right abdomen of each nude female mouse (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 11. The M30-H1-L4P antibody and the antibody-drug conjugate (2) were each administered intravenously at a dose of 10 mg/kg to the tail of each mouse on Days 11, 18, and 25.
[00773] Os resultados são mostrados na Figura 17. Na figura, a li-nhagem com losangos abertos retrata os resultados sobre o tumor não tratado, a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito do anticorpo M30-H1-L4P, e a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2).[00773] The results are shown in Figure 17. In the figure, the lineage with open diamonds depicts the results on the untreated tumor, the lineage with open triangles depicts the effect of antibody M30-H1-L4P, and the lineage with open circles depict the effect of the antibody-drug conjugate (2).
[00774] Como observado a partir destes resultados, a administração do conjugado de anticorpo-fármaco (2) notavelmente diminuiu o volume do tumor, e nenhum outro desenvolvimento de tumor foi observado após a administração final. Pelo contrário, a administração do anticorpo M30-H1-L4P resultou na progressão do desenvolvimento do tumor.[00774] As seen from these results, administration of the antibody-drug conjugate (2) remarkably decreased tumor volume, and no further tumor development was observed after the final administration. In contrast, administration of the M30-H1-L4P antibody resulted in progression of tumor development.
[00775] Além disso, os camundongos que receberam o conjugado de anticorpo-fármaco (2) estavam livres de sinais notáveis, tais como perda de peso, sugerindo que o conjugado de anticorpo-fármaco (2) seja pouco tóxico e altamente seguro. (Exemplo teste 12) Teste Antitumor (2)[00775] Furthermore, the mice that received the antibody-drug conjugate (2) were free of notable signs such as weight loss, suggesting that the antibody-drug conjugate (2) is low-toxic and highly safe. (Example test 12) Antitumor Test (2)
[00776] As células A375 de linhagem de melanoma humano foram adquiridas de ATCC (Coleção de Cultura tipo Americana). 6 x 106 células suspensas em salina fisiológica foram subcutaneamente transplantadas ao abdômen direito de cada camundongo fêmea nu (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 18. O conjugado de anticorpo-fármaco (2) foi intravenosamente administrado em cada dose (0,1, 0,3, e 1,3 mg/kg) à cauda de cada camundongo nos Dias 18, 25, e 32 em uma relação de qw x 3.Human melanoma lineage A375 cells were purchased from ATCC (American Type Culture Collection). 6 x 106 cells suspended in physiological saline were transplanted subcutaneously into the right abdomen of each nude female mouse (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 18. The antibody-drug conjugate (2) was administered intravenously at each dose ( 0.1, 0.3, and 1.3 mg/kg) to the tail of each mouse on Days 18, 25, and 32 in a qw x 3 ratio.
[00777] Os resultados são mostrados na Figura 18. Na figura, a li-nhagem com losangos abertos retrata os resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com quadrados cheios retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2) administrado a 0,1 mg/kg, a linhagem com marcas X retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2) admi-nistrado a 0,3 mg/kg, a linhagem com triângulos cheios retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2) administrado a 1 mg/kg, e a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do conjugado de anti- corpo-fármaco (2) administrado a 3 mg/kg. O conjugado de anticorpo- fármaco (2) foi efetivo para a diminuição do tumor de uma maneira de-pendente de dose. (Exemplo teste 13) Teste Antitumor (3)The results are shown in Figure 18. In the figure, the lineage with open diamonds depicts the results on untreated tumor, the lineage with filled squares depicts the effect of antibody-drug conjugate (2) administered at 0, 1 mg/kg, X-marked strain depicts effect of antibody-drug conjugate (2) given at 0.3 mg/kg, strain with filled triangles depicts effect of antibody-drug conjugate (2) given at 1 mg/kg, and the lineage with open circles depicts the effect of antibody-drug conjugate (2) given at 3 mg/kg. The antibody-drug conjugate (2) was effective for tumor shrinkage in a dose-dependent manner. (Example test 13) Antitumor Test (3)
[00778] As células Calu-6 de linhagem de câncer de pulmão de célula não pequena humana foram adquiridas de ATCC (Coleção de Cultura tipo Americana). 5 x 106 células suspensas em salina fisiológica foram subcutaneamente transplantadas ao abdômen direito de cada camundongo fêmea nu (Dia 0), e os camundongos foram aleatoria-mente agrupados no Dia 11. O anticorpo M30-H1-L4P e conjugado de anticorpo-fármaco (2) foram cada qual intravenosamente administrados em uma dose de 10 mg/kg à cauda de cada camundongo nos Dias 11, 18, e 25 em uma relação de qw x 3.Human non-small cell lung cancer lineage Calu-6 cells were purchased from ATCC (American Type Culture Collection). 5 x 106 cells suspended in physiological saline were transplanted subcutaneously into the right abdomen of each nude female mouse (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 11. The M30-H1-L4P antibody and antibody-drug conjugate ( 2) were each administered intravenously at a dose of 10 mg/kg to the tail of each mouse on Days 11, 18, and 25 in a qw x 3 ratio.
[00779] Os resultados são mostrados na Figura 19. Na figura, a li-nhagem com losangos abertos retrata os resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito do anticorpo M30-H1-L4P, e a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (2). A administração do conjugado de anticorpo-fármaco (2) notavelmente diminuiu o volume de tumor, e ne-nhum outro desenvolvimento de tumor foi observado após a adminis-tração final. Pelo contrário, a administração do anticorpo M30-H1-L4P resultou na progressão do desenvolvimento do tumor.[00779] The results are shown in Figure 19. In the figure, the lineage with open diamonds depicts the results on untreated tumor, the lineage with open triangles depicts the effect of antibody M30-H1-L4P, and the lineage with circles open plates depict the effect of the antibody-drug conjugate (2). Administration of the antibody-drug conjugate (2) remarkably decreased tumor volume, and no further tumor development was observed after the final administration. In contrast, administration of the M30-H1-L4P antibody resulted in progression of tumor development.
[00780] Além disso, os camundongos que receberam o conjugado de anticorpo-fármaco (2) estavam livres de sinais notáveis tais como perda de peso, sugerindo que o conjugado de anticorpo-fármaco (2) seja pouco tóxico e altamente seguro. (Exemplo teste 14) Teste antitumor (4)[00780] Furthermore, the mice that received the antibody-drug conjugate (2) were free of notable signs such as weight loss, suggesting that the antibody-drug conjugate (2) is low-toxic and highly safe. (Example test 14) Antitumor test (4)
[00781] As células A375 de linhagem de melanoma humano foram adquiridas de ATCC (Coleção de Cultura tipo Americana). 8 x 106 células suspensas em salina fisiológica foram subcutaneamente transplantadas ao abdômen direito de cada camundongo fêmea nu (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 21. Os conjugados de anticorpo-fármaco (1), (13), (41), e (55) foram cada qual intravenosamente administrado em uma dose de 10 mg/kg à cauda de cada camundongo no Dia 21.Human melanoma lineage A375 cells were purchased from ATCC (American Type Culture Collection). 8 x 106 cells suspended in physiological saline were transplanted subcutaneously into the right abdomen of each female nude mouse (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 21. Antibody-drug conjugates (1), (13), (41 ), and (55) were each administered intravenously at a dose of 10 mg/kg to the tail of each mouse on Day 21.
[00782] Os resultados são mostrados na Figura 20. Na figura, a li-nhagem com losangos abertos retrata os resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do adminis-trado conjugado de anticorpo-fármaco (1), a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito do administrado conjugado de anticorpo- fármaco (13), a linhagem com marcas X retrata o efeito do administra do conjugado de anticorpo-fármaco (41), e a linhagem com quadrados abertos retrata o efeito do administrado conjugado de anticorpo- fármaco (55). A administração do conjugado de anticorpo-fármaco (1), (13), (41), ou (55) notavelmente diminuiu o volume do tumor, e todos estes conjugados de anticorpo-fármaco exerceram um efeito inibitório de desenvolvimento de tumor.[00782] The results are shown in Figure 20. In the figure, the lineage with open diamonds depicts the results on untreated tumor, the lineage with open circles depicts the effect of administered antibody-drug conjugate (1), the strain with open triangles depicts the effect of administered antibody-drug conjugate (13), the strain with X-marks depicts the effect of administering the antibody-drug conjugate (41) and the strain with open squares depicts the effect of administered antibody-drug conjugate (55). Administration of antibody-drug conjugate (1), (13), (41), or (55) remarkably decreased tumor volume, and all of these antibody-drug conjugates exerted an inhibitory effect on tumor development.
[00783] Além disso, os camundongos que receberam o conjugado de anticorpo-fármaco (1), (13), (41), ou (55) estavam livres de sinais notáveis tais como perda de peso, sugerindo que os conjugados de anticorpo-fármaco (1), (13), (41), e (55) são pouco tóxico e altamente seguro. (Exemplo teste 15) Teste antitumor (5)[00783] Furthermore, mice that received the antibody-drug conjugate (1), (13), (41), or (55) were free of notable signs such as weight loss, suggesting that the antibody-drug conjugates drug (1), (13), (41), and (55) are low toxic and highly safe. (Example test 15) Antitumor test (5)
[00784] As células Calu-6 de linhagem de câncer de pulmão de cé- lula não pequena humana foram adquiridas de ATCC (Coleção de Cul-tura tipo Americana). 5 x 106 células suspensas em salina fisiológica foram subcutaneamente transplantadas ao abdômen direito de cada camundongo fêmea nu (Dia 0), e os camundongos foram aleatoria-mente agrupados no Dia 12. Os conjugados de anticorpo-fármaco (13), (41), e (55) foram cada qual intravenosamente administrado em uma dose de 10 mg/kg à cauda de cada camundongo no Dia 12. Como um controle comparativo, DE-310 foi intravenosamente administrado em uma dose de 0,1 mg/kg à cauda de cada camundongo no Dia 12. Aqui, a acima mencionada dose do conjugado de anticorpo- fármaco foi com base na quantidade do anticorpo no conjugado e a acima mencionada dose de DE-310 foi com base na quantidade do fármaco contido nela. Neste aspecto, as quantidades dos fármacos respectivamente contidos no conjugado de anticorpo-fármaco e DE- 310 foram cerca de 1 : 100. Isto significa que as doses do conjugado de anticorpo-fármaco e DE-310 foram iguais em termos das quantidades dos fármacos contidos nelas.The human non-small cell lung cancer lineage Calu-6 cells were purchased from the ATCC (American Type Culture Collection). 5 x 106 cells suspended in physiological saline were subcutaneously transplanted to the right abdomen of each female nude mouse (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 12. Antibody-drug conjugates (13), (41) and (55) were each intravenously administered at a dose of 10 mg/kg to the tail of each mouse on Day 12. As a comparative control, DE-310 was intravenously administered at a dose of 0.1 mg/kg to the tail of each mouse. each mouse on Day 12. Here, the above-mentioned dose of antibody-drug conjugate was based on the amount of antibody in the conjugate and the above-mentioned dose of DE-310 was based on the amount of drug contained therein. In this regard, the amounts of the drugs respectively contained in the antibody-drug conjugate and DE-310 were about 1:100. This means that the doses of the antibody-drug conjugate and DE-310 were equal in terms of the amounts of the drugs contained. in them.
[00785] Os resultados são mostrados na Figura 21. Na figura, a li-nhagem com losangos abertos retrata os resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com círculos abertos retrata o efeito de DE-310, a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito do conjugado de anti- corpo-fármaco (13), a linhagem com marcas X retrata o efeito do con-jugado de anticorpo-fármaco (41), e a linhagem com quadrados abertos retrata o efeito do conjugado de anticorpo-fármaco (55). A adminis-tração do conjugado de anticorpo-fármaco (13), (41), ou (55) notavel-mente diminuiu o tumor volume, visto que a administração de DE-310 não exibiu nenhuma redução no volume do tumor.[00785] The results are shown in Figure 21. In the figure, the lineage with open diamonds depicts the results on untreated tumor, the lineage with open circles depicts the effect of DE-310, the lineage with open triangles depicts the effect of the antibody-drug conjugate (13), the X-marked lineage depicts the effect of the antibody-drug conjugate (41) and the open square lineage depicts the effect of the antibody-drug conjugate (55) . Administration of antibody-drug conjugate (13), (41), or (55) remarkably decreased tumor volume, whereas administration of DE-310 exhibited no reduction in tumor volume.
[00786] Além disso, os camundongos que receberam o conjugado de anticorpo-fármaco (13), (41), ou (55) estavam livres de sinais notáveis tais como perda de peso, sugerindo que estes conjugados de an ticorpo-fármaco são pouco tóxicos e altamente seguros. (Exemplo teste 16) Teste antitumor (6)[00786] Furthermore, mice that received the antibody-drug conjugate (13), (41), or (55) were free of notable signs such as weight loss, suggesting that these antibody-drug conjugates are poor. toxic and highly safe. (Example test 16) Antitumor test (6)
[00787] As células A375 de linhagem de melanoma humano foram adquiridas de ATCC (Coleção de Cultura tipo Americana). 1 x 107 células suspensas em salina fisiológica foram subcutaneamente transplantadas ao abdômen direito de cada camundongo fêmea nu (Dia 0), e os camundongos foram aleatoriamente agrupados no Dia 11. Os conjugados de anticorpo-fármaco (17), (18), (19), (59), (60), e (61) foram cada qual intravenosamente administrado em uma dose de 3 mg/kg à cauda de cada camundongo nos Dias 11 e 18 em uma relação de qw x 2.Human melanoma lineage A375 cells were purchased from ATCC (American Type Culture Collection). 1 x 107 cells suspended in physiological saline were subcutaneously transplanted to the right abdomen of each female nude mouse (Day 0), and the mice were randomly grouped on Day 11. Antibody-drug conjugates (17), (18), (19 ), (59), (60), and (61) were each administered intravenously at a dose of 3 mg/kg to the tail of each mouse on Days 11 and 18 in a qw x 2 ratio.
[00788] Os resultados são mostrados na Figura 22. Na figura, a li-nhagem com losangos cheios retrata os resultados sobre tumor não tratado, a linhagem com quadrados cheios retrata o efeito do adminis-trado conjugado de anticorpo-fármaco (17), a linhagem com triângulos abertos retrata o efeito do administrado conjugado de anticorpo- fármaco (18), a linhagem com círculos abertos retrata o efeito do ad-ministrado conjugado de anticorpo-fármaco (19), a linhagem com tri-ângulos cheios retrata o efeito do administrado conjugado de anticor- po-fármaco (59), a linhagem com quadrados abertos retrata o efeito do administrado conjugado de anticorpo-fármaco (60), e a linhagem com marcas X retrata o efeito do administrado conjugado de anticorpo- fármaco (61).[00788] The results are shown in Figure 22. In the figure, the lineage with filled diamonds depicts the results on untreated tumor, the lineage with filled squares depicts the effect of administered antibody-drug conjugate (17), the strain with open triangles depicts the effect of the administered antibody-drug conjugate (18), the strain with open circles depicts the effect of the administered antibody-drug conjugate (19), the strain with filled triangles depicts the effect of the administered antibody-drug conjugate (59), the open square line depicts the effect of the administered antibody-drug conjugate (60), and the X-marked line depicts the effect of the administered antibody-drug conjugate (61 ).
[00789] A administração do conjugado de anticorpo-fármaco (17), (18), (19), (59), (60), ou (61) notavelmente diminuiu o volume do tumor, e todos estes conjugados de anticorpo-fármaco exerceram um efeito inibitório de desenvolvimento de tumor.[00789] Administration of antibody-drug conjugate (17), (18), (19), (59), (60), or (61) remarkably decreased tumor volume, and all of these antibody-drug conjugates exerted an inhibitory effect on tumor development.
[00790] Além disso, os camundongos que receberam o conjugado de anticorpo-fármaco (17), (18), (19), (59), (60), ou (61) estavam livres de sinais notáveis tais como perda de peso, sugerindo que estes con- jugados de anticorpo-fármaco são pouco tóxicos e altamente seguros. Texto Livre de Listagem de Sequência SEQ ID NO: 1 - Sequência de aminoácido do B7-H3 variante 1 SEQ ID NO: 2 - Sequência de aminoácido do B7-H3 variante 2 SEQ ID NO: 3 - Sequência de aminoácido de CDRH1 do anticorpo M30 SEQ ID NO: 4 - Sequência de aminoácido de CDRH2 do anticorpo M30 SEQ ID NO: 5 - Sequência de aminoácido de CDRH3 do anticorpo M30 SEQ ID NO: 6 - Sequência de aminoácido de CDRL1 do anticorpo M30 SEQ ID NO: 7 - Sequência de aminoácido de CDRL2 do anticorpo M30 SEQ ID NO: 8 - Sequência de aminoácido de CDRL3 do anticorpo M30 SEQ ID NO: 9 - Sequência de aminoácido do M30-H1-cadeia pesada tipo SEQ ID NO: 10 - Sequência de aminoácido da cadeia pesada tipo M30-H2 SEQ ID NO: 11 - Sequência de aminoácido da cadeia pesada tipo M30-H3 SEQ ID NO: 12 - Sequência de aminoácido da cadeia pesada tipo M30-H4 SEQ ID NO: 13 - Sequência de aminoácido da cadeia leve tipo M30-L1 SEQ ID NO: 14 - Sequência de aminoácido da cadeia leve tipo M30-L2 SEQ ID NO: 15 - Sequência de aminoácido da cadeia leve tipo M30-L3 SEQ ID NO: 16 - Sequência de aminoácido da cadeia leve tipo M30-L4 SEQ ID NO: 17 - Sequência de aminoácido da cadeia leve tipo M30-L5 SEQ ID NO: 18 - Sequência de aminoácido da cadeia leve tipo M30-L6 SEQ ID NO: 19 - Sequência de aminoácido da cadeia leve tipo M30-L7 SEQ ID NO: 20 - Sequência de aminoácido da cadeia pesada do anti-corpo M30 SEQ ID NO: 21 - Sequência de aminoácido de uma cadeia leve do an-ticorpo M30 SEQ ID NO: 22 - PCR iniciador 1 SEQ ID NO: 23 - PCR iniciador 2 SEQ ID NO: 24 - iniciador promotor de CMV : iniciador 3 SEQ ID NO: 25 - iniciador reverso de BGH : iniciador 4 SEQ ID NO: 26 - Sequência de nucleotídeo do B7-H3 variante 1 SEQ ID NO: 27 - Sequência de aminoácido de uma cadeia pesada do anticorpo anti-CD30 SEQ ID NO: 28 - Sequência de aminoácido de uma cadeia leve do an-ticorpo anti-CD30 SEQ ID NO: 29 - Sequência de aminoácido de uma cadeia pesada do anticorpo anti-CD33 SEQ ID NO: 30 - Sequência de aminoácido de uma cadeia leve do an-ticorpo anti-CD33 SEQ ID NO: 31 - Sequência de aminoácido de uma cadeia pesada do anticorpo anti-CD70 SEQ ID NO: 32 - Sequência de aminoácido de uma cadeia leve do an-ticorpo anti-CD70[00790] Furthermore, mice that received the antibody-drug conjugate (17), (18), (19), (59), (60), or (61) were free of notable signs such as weight loss. , suggesting that these antibody-drug conjugates are low-toxic and highly safe. Free Text Sequence Listing SEQ ID NO: 1 - B7-H3 variant 1 amino acid sequence SEQ ID NO: 2 - B7-H3 variant 2 amino acid sequence SEQ ID NO: 3 - CDRH1 amino acid sequence of the M30 antibody SEQ ID NO: 4 - CDRH2 amino acid sequence of the M30 antibody SEQ ID NO: 5 - CDRH3 amino acid sequence of the M30 antibody SEQ ID NO: 6 - CDRL1 amino acid sequence of the M30 antibody SEQ ID NO: 7 - Sequence of M30 antibody CDRL2 amino acid SEQ ID NO: 8 - M30 antibody CDRL3 amino acid sequence SEQ ID NO: 9 - M30-H1-type heavy chain amino acid sequence SEQ ID NO: 10 - Type heavy chain amino acid sequence M30-H2 SEQ ID NO: 11 - M30-H3 type heavy chain amino acid sequence SEQ ID NO: 12 - M30-H4 type heavy chain amino acid sequence SEQ ID NO: 13 - M30 type light chain amino acid sequence- L1 SEQ ID NO: 14 - Light chain amino acid sequence type M30-L2 SEQ ID NO: 15 - cad amino acid sequence eia light M30-L3 type SEQ ID NO: 16 - M30-L4 type light chain amino acid sequence SEQ ID NO: 17 - M30-L5 type light chain amino acid sequence SEQ ID NO: 18 - Light chain amino acid sequence type M30-L6 SEQ ID NO: 19 - Amino acid sequence of the light chain type M30-L7 SEQ ID NO: 20 - Amino acid sequence of the heavy chain of the antibody M30 SEQ ID NO: 21 - Amino acid sequence of a light chain of anti-body M30 SEQ ID NO: 22 - PCR primer 1 SEQ ID NO: 23 - PCR primer 2 SEQ ID NO: 24 - CMV promoter primer: primer 3 SEQ ID NO: 25 - BGH reverse primer: primer 4 SEQ ID NO: 26 - Nucleotide sequence of B7-H3 variant 1 SEQ ID NO: 27 - Amino acid sequence of an anti-CD30 antibody heavy chain SEQ ID NO: 28 - Amino acid sequence of an anti-antibody light chain -CD30 SEQ ID NO: 29 - Amino acid sequence of an anti-CD33 antibody heavy chain SEQ ID NO: 30 - Amino acid sequence of an antibody light chain anti-CD33 SEQ ID NO: 31 - Amino acid sequence of an anti-CD70 antibody heavy chain SEQ ID NO: 32 - Amino acid sequence of an anti-CD70 antibody light chain
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