RU2776489C2 - Antibody-drug conjugate - Google Patents
Antibody-drug conjugate Download PDFInfo
- Publication number
- RU2776489C2 RU2776489C2 RU2018128384A RU2018128384A RU2776489C2 RU 2776489 C2 RU2776489 C2 RU 2776489C2 RU 2018128384 A RU2018128384 A RU 2018128384A RU 2018128384 A RU2018128384 A RU 2018128384A RU 2776489 C2 RU2776489 C2 RU 2776489C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibody
- ggfg
- amino acid
- group
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 title 1
- 108091008116 antibody drug conjugates Proteins 0.000 title 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 206010017758 Gastric cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 abstract 1
- 206010025650 Malignant melanoma Diseases 0.000 abstract 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 abstract 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 208000008443 Pancreatic Carcinoma Diseases 0.000 abstract 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 abstract 1
- 230000003110 anti-inflammatory Effects 0.000 abstract 1
- 201000011231 colorectal cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 201000010915 glioblastoma multiforme Diseases 0.000 abstract 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 abstract 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 abstract 1
Images
Abstract
Description
Область техники, к которой относится изобретениеThe field of technology to which the invention belongs
Настоящее изобретение относится к конъюгату антитело-лекарственное средство, содержащему противоопухолевое лекарственное средство, конъюгированное через фрагмент линкерной структуры с антителом, способным обеспечивать направленную доставку лекарственного средства к опухолевым клеткам, при этом конъюгат применяют в качестве противоопухолевого лекарственного препарата.The present invention relates to an antibody-drug conjugate containing an antitumor drug conjugated via a linker structure fragment to an antibody capable of targeted drug delivery to tumor cells, the conjugate being used as an antitumor drug.
Уровень техникиState of the art
Конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), содержащий цитотоксическое лекарственное средство, конъюгированное с антителом, антиген которого экспрессируется на поверхности опухолевых клеток, и которое также связано с антигеном, способным к клеточной интернализации, позволяет селективно доставлять лекарственное средство в опухолевые клетки, и, предполагается, что в результате этого происходит аккумуляция лекарственного средства в опухолевых клетках и гибель опухолевых клеток (см., непатентные публикации 1-3). В качестве примера конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC) может быть приведен милотарг (гемтузумаб озогамицин), одобренный в качестве терапевтического средства при остром миелолейкозе, в котором калихеамицин конъюгирован с анти-CD33 антителом. Кроме того, недавно был одобрен в качестве терапевтического средства при лимфоме Ходжкина и анапластической крупноклеточной лимфоме адцетрис (брентуксимаб ведотин), в котором ауристатин E конъюгирован с анти-CD30 антителом (см., непатентную публикацию 4). Лекарственные средства, содержавшиеся в конъюгатах антитело-лекарственное средство, которые были одобрены до настоящего времени, осуществляют направленную доставку лекарственного средства в ДНК или тубулин.An antibody-drug conjugate (ADC) containing a cytotoxic drug conjugated to an antibody whose antigen is expressed on the surface of tumor cells, and which is also associated with an antigen capable of cellular internalization, allows selective drug delivery to tumor cells, and is expected to that this results in drug accumulation in tumor cells and tumor cell death (see Non-Patent Publications 1-3). An example of an antibody-drug conjugate (ADC) is mylotarg (gemtuzumab ozogamicin), approved as a therapeutic agent for acute myeloid leukemia, in which calicheamicin is conjugated to an anti-CD33 antibody. In addition, it has recently been approved as a therapeutic agent for Hodgkin's lymphoma and adcetris anaplastic large cell lymphoma (brentuximab vedotin), in which auristatin E is conjugated with an anti-CD30 antibody (see Non-Patent Publication 4). The drugs contained in the antibody-drug conjugates that have been approved to date target the drug to DNA or tubulin.
Что касается противоопухолевых средств, то известны низкомолекулярные соединения, производные камптотецина, соединения, которые ингибируют топоизомеразу I с проявлением противоопухолевого эффекта. Среди них, противоопухолевое соединение, представленное формулой нижеWith regard to antitumor agents, low molecular weight compounds derived from camptothecin are known, compounds that inhibit topoisomerase I with an antitumor effect. Among them, the antitumor compound represented by the formula below
(эксатекан, химическое название: (1S,9S)-1-амино-9-этил-5-фтор-2,3-дигидро-9-гидрокси-4-метил-1H,12H-бензо[де]пирано-[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-10,13(9H,15H)дион) представляет собой водорастворимое производное камптотецина (патентная публикация 1 и 2). В отличие от иринотекана, применяемого в клинике в настоящее время, для эксатекана требуется активация ферментом. Кроме того, его ингибирующая активность в отношении топоизомеразы II выше, чем в случае SN-38, который является основным фармацевтически активным веществом препаратов иринотекана и топотекана, также используемых в клинике, и он проявляет более сильное разрушающее действие in vitro в отношении различных опухолевых клеток. В частности, он проявляет активность против опухолевых клеток, которые обладают резистентностью к SN-38 или другим подобным веществам вследствие экспрессии P-гликопротеина. Кроме того, в модели опухоли человека, подкожно трансплантируемой мышам, эксатекан проявляет мощный противоопухолевый эффект и уже прошел клинические испытания, но еще не доступен на рынке фармацевтических препаратов (см., непатентные публикации 5-10). Пока остается неясным, может или не может эксатекан оказывать эффективное воздействие в форме конъюгата антитело-лекарственное средство.(exatecan, chemical name: (1S,9S)-1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo[de]pyrano-[3 ',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinoline-10,13(9H,15H)dione) is a water-soluble camptothecin derivative (
DE-310 представляет собой комплекс, в котором эксатекан конъюгирован с биоразлагаемым полимером карбоксиметилдекстран-полиспиртом через GGFG пептидный спейсер (патентная публикация 3). Превращая эксатекан в форму полимерного пролекарства, можно поддерживать сохранение на высоком уровне свойства крови, а также улучшать пассивную целенаправленную доставку в область опухоли вследствие повышенной проницаемости вновь образовавшихся кровеносных сосудов внутри опухоли и ретенции в тканях опухоли. В случае DE-310, в результате расщепления пептидного спейсера ферментом, эксатекан и эксатекан с глицином, соединенным с аминогруппой, непрерывно высвобождается в качестве основного активного вещества. Вследствие этого, улучшается фармакокинетика, и на основе доклинических исследований различных моделей оценки опухоли было обнаружено, что DE-310 обладает более высокой эффективностью, чем эксатекан, введенный в чистом виде, даже если доза эксатекана в форме DE-310 ниже, чем в случае введения эксатекана в чистом виде. Было проведено клиническое исследование препарата DE-310, и его эффективность была подтверждена на людях, причем в этом исследовании делалось предположение, что основное активное вещество накапливается в опухоли, а не в здоровых тканях, однако, также имеются данные, указывающие на то, что накопление DE-310 и основного активного вещества в опухоли сильно не отличается от накопления в здоровых тканях у людей, и, поэтому, пассивная целенаправленная доставка DE-310 у людей не наблюдается (см., непатентные публикации 11-14). В результате, DE-310 также не был внедрен в лечебную практику, но остается неясным вопрос о том, может или не может эксатекан эффективно выполнять функцию лекарственного средства, предназначенного для такой целенаправленной доставки.DE-310 is a complex in which exatecan is conjugated to a biodegradable carboxymethyldextran polyalcohol polymer via a GGFG peptide spacer (Patent Publication 3). By converting exatecan into a polymeric prodrug form, blood retention can be maintained as well as passive targeted delivery to the tumor site can be improved due to increased permeability of newly formed blood vessels within the tumor and retention in tumor tissues. In the case of DE-310, as a result of cleavage of the peptide spacer by the enzyme, exatecan and exatecan with glycine attached to the amino group are continuously released as the main active substance. As a result, pharmacokinetics are improved, and based on preclinical studies of various models of tumor evaluation, DE-310 was found to be more effective than exatecan administered alone, even if the dose of exatecan in the form of DE-310 is lower than when administered Exatecan in its purest form. A clinical study of DE-310 was conducted and its effectiveness was confirmed in humans, and in this study it was assumed that the main active substance accumulates in the tumor, and not in healthy tissues, however, there is also data indicating that the accumulation DE-310 and the main active substance in the tumor does not differ much from the accumulation in healthy tissues in humans, and therefore, passive targeted delivery of DE-310 in humans is not observed (see non-patent publications 11-14). As a result, DE-310 has also not been introduced into clinical practice, but it remains unclear whether exatecan may or may not be an effective drug for such targeted delivery.
В качестве соединения, имеющего отношение к DE-310, также известен комплекс, в котором структурный фрагмент, представленный -NH(CH2)4C(=O)-, вводят между -GGFG-спейсером и эксатеканом с образованием структуры -GGFG-NH(CH2)4C(=O)-, используемый в качестве спейсерной структуры, (патентная публикация 4). Однако противоопухолевое действие комплекса точно не известно.As a compound related to DE-310, a complex is also known in which a structural fragment represented by -NH(CH 2 ) 4 C(=O)- is introduced between a -GGFG-spacer and exatecan to form a structure -GGFG-NH (CH 2 ) 4 C(=O)- used as a spacer structure, (patent publication 4). However, the antitumor effect of the complex is not exactly known.
Список цитируемой литературыList of cited literature
Патентные публикацииPatent Publications
[Патентная публикация 1] Выложенный патент Японии № 5-59061.[Patent Publication 1] Japanese Patent Laid-Open No. 5-59061.
[Патентная публикация 2] Выложенный патент Японии № 8-337584.[Patent Publication 2] Japanese Patent Laid-Open No. 8-337584.
[Патентная публикация 3] Международная публикация № WO 1997/46260.[Patent Publication 3] International Publication No. WO 1997/46260.
[Патентная публикация 4] Международная публикация № WO 2000/25825.[Patent Publication 4] International Publication No.
Непатентные публикацииNon-Patent Publications
[Непатентная публикация 1] Ducry, L., et al. Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13; Antibody-Drug Conjugates: Linking cytotoxic payloads to monoclonal antibodies.[Non-Patent Publication 1] Ducry, L., et al. Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13; Antibody-Drug Conjugates: Linking cytotoxic payloads to monoclonal antibodies.
[Непатентная публикация 2] Alley, S. C., et al. Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537; Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer.[Non-Patent Publication 2] Alley, S. C., et al. Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537; Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer.
[Непатентная публикация 3] Damle N.K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452; Tumour-targeted chemotherapy with immunoconjugates of calicheamicin.[Non-Patent Publication 3] Damle N.K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452; Tumour-targeted chemotherapy with immunoconjugates of calicheamicin.
[Непатентная публикация 4] Senter P. D., et al. Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637; The discovery and development of brentuximab vedotin for use in relapsed Hodgkin lymphoma and systemic anaplastic large cell lymphoma.[Non-Patent Publication 4] Senter P. D., et al. Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637; The discovery and development of brentuximab vedotin for use in relapsed Hodgkin lymphoma and systemic anaplastic large cell lymphoma.
[Непатентная публикация 5] Kumazawa, E., Tohgo, A., Exp. Opin. Invest. Drugs (1998) 7, 625-632; Antitumour activity of DX-8951f: a new camptothecin derivative.[Non-Patent Publication 5] Kumazawa, E., Tohgo, A., Exp. Opin. Invest. Drugs (1998) 7, 625-632; Antitumour activity of DX-8951f: a new camptothecin derivative.
[Непатентная публикация 6] Mitsui, I., Kumazawa, E., Hirota, Y., et al. Jpn J. Cancer Res. (1995) 86, 776-786; A new water-soluble camptothecin derivative, DX-8951f, exhibits potent antitumor activity against human tumors in vitro and in vivo.[Non-Patent Publication 6] Mitsui, I., Kumazawa, E., Hirota, Y., et al. Jpn J. Cancer Res. (1995) 86, 776-786; A new water-soluble camptothecin derivative, DX-8951f, exhibits potent antitumor activity against human tumors in vitro and in vivo.
[Непатентная публикация 7] Takiguchi, S., Tohgo, A., et al. Jpn J. Cancer Res. (1997) 88, 760-769; Antitumor effect of DX-8951, a novel camptothecin analog, on human pancreatic tumor cells and their CPT-11-resistant variants cultured in vitro and xenografted into nude mice.[Non-Patent Publication 7] Takiguchi, S., Tohgo, A., et al. Jpn J. Cancer Res. (1997) 88, 760-769; Antitumor effect of DX-8951, a novel camptothecin analog, on human pancreatic tumor cells and their CPT-11-resistant variants cultured in vitro and xenografted into nude mice.
[Непатентная публикация 8] Joto, N. et al. Int J Cancer (1997) 72, 680-686; DX-8951f, a water-soluble camptothecin analog, exhibits potent antitumor activity against a human lung cancer cell line and its SN-38-resistant variant.[Non-Patent Publication 8] Joto, N. et al. Int J Cancer (1997) 72, 680-686; DX-8951f, a water-soluble camptothecin analog, exhibits potent antitumor activity against a human lung cancer cell line and its SN-38-resistant variant.
[Непатентная публикация 9] Kumazawa, E. et al. Cancer Chemother. Pharmacol. (1998) 42, 210-220; Potent and broad antitumor effects of DX-8951f, a water-soluble camptothecin derivative, against various human tumors xenografted in nude mice.[Non-Patent Publication 9] Kumazawa, E. et al. Cancer Chemother. Pharmacol. (1998) 42, 210-220; Potent and broad antitumor effects of DX-8951f, a water-soluble camptothecin derivative, against various human tumors xenografted in nude mice.
[Непатентная публикация 10] De Jager, R., et al. Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273; DX-8951f: summary of phase I clinical trials.[Non-Patent Publication 10] De Jager, R., et al. Ann N Y Acad Sci (2000) 922, 260-273; DX-8951f: summary of phase I clinical trials.
[Непатентная публикация 11] Inoue, K. et al. Polymer Drugs in the Clinical Stage, Edited by Maeda et al. (2003), 145-153; CM-dextran-polyalcohol-camptothecin conjugate, DE-310 with a novel carrier system and its preclinical data.[Non-Patent Publication 11] Inoue, K. et al. Polymer Drugs in the Clinical Stage, Edited by Maeda et al. (2003), 145-153; CM-dextran-polyalcohol-camptothecin conjugate, DE-310 with a novel carrier system and its preclinical data.
[Непатентная публикация 12] Kumazawa, E. et al. Cancer Sci (2004) 95, 168-175; DE-310, a novel macromolecular carrier system for the camptothecin analog DX-8951f: Potent antitumor activities in various murine tumor models.[Non-Patent Publication 12] Kumazawa, E. et al. Cancer Sci (2004) 95, 168-175; DE-310, a novel macromolecular carrier system for the camptothecin analog DX-8951f: Potent antitumor activities in various murine tumor models.
[Непатентная публикация 13] Soepenberg, O. et al. Clinical Cancer Research, (2005) 11, 703-711; Phase I and pharmacokinetic study of DE-310 in Patients with Advanced Solid Tumors.[Non-Patent Publication 13] Soepenberg, O. et al. Clinical Cancer Research, (2005) 11, 703-711; Phase I and pharmacokinetic study of DE-310 in Patients with Advanced Solid Tumors.
[Непатентная публикация 14] Wente M. N. et al. Investigational New Drugs (2005) 23, 339-347; DE-310, a macromolecular prodrug of the topoisomerase-I-inhibitor exatecan (DX-8951), in patients with operable solid tumors.[Non-Patent Publication 14] Wente M. N. et al. Investigational New Drugs (2005) 23, 339-347; DE-310, a macromolecular prodrug of the topoisomerase-I-inhibitor exatecan (DX-8951), in patients with operable solid tumors.
Сущность изобретенияThe essence of the invention
Техническая задачаTechnical task
При лечении опухоли с помощью антитела, неудовлетворительный противоопухолевый эффект может наблюдаться даже тогда, когда антитело распознает антиген и связывает опухолевые клетки, и существуют обстоятельства, при которых требуется более эффективное противоопухолевое антитело. Кроме того, многие противоопухолевые низкомолекулярные соединения имеют недостаток, связанный с их безопасностью, например, связанный с побочным эффектом и токсичностью, это свойственно даже соединениям, которые обладают отличным противоопухолевым действием, и, поэтому важной задачей остается достижение более высокого терапевтического эффекта за счет дополнительного повышения безопасности. Поэтому, задачей настоящего изобретения является создание противоопухолевого лекарственного средства, которое обладает высоким терапевтическим действием и которое характеризуется исключительными свойствами с точки зрения противоопухолевого действия и безопасности.When treating a tumor with an antibody, an unsatisfactory antitumor effect may be observed even when the antibody recognizes the antigen and binds the tumor cells, and there are circumstances in which a more effective antitumor antibody is required. In addition, many antitumor small molecule compounds have a disadvantage related to their safety, such as side effect and toxicity, even compounds that have excellent antitumor activity, and therefore it remains an important task to achieve a higher therapeutic effect by further increasing security. Therefore, it is an object of the present invention to provide an antitumor drug which has a high therapeutic effect and which has excellent properties in terms of antitumor activity and safety.
Способы решения задачиWays to solve the problem
Авторы изобретения считали, что если противоопухолевое соединение эксатекан превратить в конъюгат антитело-лекарственное средство путем конъюгирования при помощи фрагмента линкерной структуры с антителом, которое способно обеспечивать направленную доставку в опухолевые клетки, которое способно распознавать опухолевые клетки, способно связывать опухолевые клетки, способно к интернализации в опухолевых клетках, которое обладает активностью, приводящей к гибели опухолевых клеток, или характеризуется другими подобными свойствами, то противоопухолевое соединение может быть более надежно доставлено в опухолевые клетки с целью проявления его специфического противоопухолевого действия в опухолевых клетках, и за счет этого, несомненно, может быть достигнут противоопухолевый эффект, и можно также ожидать повышения активности антитела, приводящей к гибели опухолевых клеток, и может быть также уменьшена доза противоопухолевого соединения по сравнению с дозой при введении соединения в чистом виде, и, благодаря чему, может быть ослаблено воздействие противоопухолевого соединения на здоровые клетки, что позволяет достигать более высокой степени безопасности.The inventors believed that if the antitumor compound exatecan is converted into an antibody-drug conjugate by conjugation using a linker structure fragment with an antibody that is capable of targeting tumor cells, that is capable of recognizing tumor cells, is capable of binding tumor cells, is capable of internalizing into tumor cells which has a tumor cell death activity or other similar properties, the antitumor compound can be more reliably delivered to the tumor cells in order to exhibit its specific antitumor activity in the tumor cells, and thereby can certainly be an antitumor effect is achieved, and an increase in antibody activity leading to the death of tumor cells can also be expected, and the dose of the antitumor compound can also be reduced compared to the dose when the compound is administered in its pure form, and, thereby, the effect of the anticancer compound on healthy cells can be weakened, thereby achieving a higher degree of safety.
В связи с этим, авторы изобретения создали линкер со специфической структурой, смогли получить конъюгат антитело-лекарственное средство, в котором антитело и эксатекан конъюгированы друг с другом через линкер и продемонстрировали высокое противоопухолевое действие, оказываемое этим конъюгатом, в результате чего и было создано настоящее изобретение.In this regard, the inventors created a linker with a specific structure, were able to obtain an antibody-drug conjugate in which the antibody and exatecan are conjugated to each other through the linker, and demonstrated the high antitumor effect exerted by this conjugate, as a result of which the present invention was created. .
В частности, настоящее изобретение характеризуется приведенным ниже отличительным признаком.In particular, the present invention is characterized by the following feature.
[1] Конъюгат антитело-лекарственное средство, в котором противоопухолевое соединение, представленное следующей формулой:[1] An antibody-drug conjugate, wherein the antitumor compound represented by the following formula:
конъюгировано с антителом через линкер, имеющий структуру, представленную следующей формулой: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-.conjugated to the antibody through a linker having the structure represented by the following formula: -L 1 -L 2 -L P -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c -.
В данном случае, антитело присоединено к концу L1, противоопухолевое соединение присоединено к концу Lc с помощью атома азота аминогруппы в положение 1 в качестве положения для соединения,In this case, the antibody is attached to the end of L 1 , the antitumor compound is attached to the end of L c with the nitrogen atom of the amino group in
гдеwhere
n1 представляет целое число от 0 до 6,n 1 represents an integer from 0 to 6,
L1 представляет -(сукцинимид-3-ил-N)-(CH2)n2-C(=O)-, -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-, -C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)- или -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-,L 1 is -(succinimide-3-yl-N)-(CH 2 )n 2 -C(=O)-, -CH 2 -C(=O)-NH-(CH 2 )n 3 -C(= O)-, -C(=O)-cyc. Hex(1,4)-CH 2 -(N-li-3-diminiccus)- or -C(=O)-(CH 2 )n 4 -C( =O)-,
где n2 представляет целое число от 2 до 8, n3 представляет целое число от 1 до 8, n4 представляет целое число от 1 до 8,where n 2 is an integer from 2 to 8, n 3 is an integer from 1 to 8, n 4 is an integer from 1 to 8,
L2 представляет -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, -S-(CH2)n6-C(=O)- или одинарную химическую связь,L 2 is -NH-(CH 2 -CH 2 -O)n 5 -CH 2 -CH 2 -C(=O)-, -S-(CH 2 )n 6 -C(=O)- or a single chemical connection,
где n5 представляет целое число от 1 до 6, n6 представляет целое число от 1 до 6,where n 5 is an integer from 1 to 6, n 6 is an integer from 1 to 6,
LP представляет пептидный остаток, состоящий от 2 до 7 аминокислот,L P is a peptide residue consisting of 2 to 7 amino acids,
La представляет -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O- или одинарную химическую связь,L a represents -C(=O)-NH-, -NR 1 -(CH 2 )n 7 -, -O- or a single chemical bond,
где n7 представляет целое число от 1 до 6, R1 представляет атом водорода, алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, -(CH2)n8-COOH, или -(CH2)n9-OH, n8 представляет целое число от 1 до 4, n9 представляет целое число от 1 до 6,where n 7 is an integer from 1 to 6, R 1 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, -(CH 2 )n 8 -COOH, or -(CH 2 )n 9 -OH, n 8 represents an integer from 1 to 4, n 9 represents an integer from 1 to 6,
Lb представляет -CR2(-R3)-, -O-, -NR4-, или одинарную химическую связь,L b represents -CR 2 (-R 3 )-, -O-, -NR 4 -, or a single chemical bond,
где R2 и R3 каждый независимо представляет атом водорода, алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-COOH или -(CH2)nc-OH, R4 представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, na представляет целое число от 0 до 6, nb представляет целое число от 1 до 4, nc представляет целое число от 1 до 4, при условии, что когда na равняется 0, R2 и R3 не являются одинаковыми,where R 2 and R 3 each independently represents a hydrogen atom, an alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms, -(CH 2 )n a -NH 2 , -(CH 2 )n b -COOH or -(CH 2 )n c -OH, R 4 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, n a represents an integer from 0 to 6, n b represents an integer from 1 to 4, n c represents an integer from 1 to 4 , provided that when n a is 0, R 2 and R 3 are not the same,
Lc представляет -CH2- или -C(=O)-,L c represents -CH 2 - or -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, представленную следующей формулой:-(succinimide-3-yl-N)- has the structure represented by the following formula:
, ,
которая присоединена к антителу в ее положении 3 и присоединена к метиленовой группе в линкерной структуре, имея эту структуру на атоме азота в положении 1,which is attached to the antibody at its position 3 and is attached to the methylene group in the linker structure, having this structure on the nitrogen atom at
-(N-ли-3-диминицкус)- имеет структуру, представленную следующей формулой:-(N-li-3-diminickus)- has a structure represented by the following formula:
, ,
которая присоединена к L2 в ее положении 3 и присоединена к метиленовой группе в линкерной структуре, имея эту структуру на атоме азота в положении 1,which is attached to L 2 at its 3 position and is attached to the methylene group in the linker structure, having this structure on the nitrogen atom at
цик.Гекс(1,4) представляет 1,4-циклогексиленовую группу, и когда L2 представляет собой -S-(CH2)n6-C(=O)-, L1 представляет собой -C(=O)- цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-.cyclohex(1,4) is a 1,4-cyclohexylene group, and when L 2 is -S-(CH 2 )n 6 -C(=O)-, L 1 is -C(=O)- cyc.Hex(1,4)-CH 2 -(N-li-3-diminiccus)-.
Настоящее изобретение дополнительно характеризуется каждым из приведенных ниже отличительных признаков.The present invention is further characterized by each of the following features.
[2] Конъюгат антитело-лекарственное средство по пункту [1], где Lc представляет собой -C(=O)-.[2] The antibody-drug conjugate of [1], wherein L c is -C(=O)-.
[3] Конъюгат антитело-лекарственное средство по пункту [1] или [2], где связь между антителом и L1 является тиоэфирной связью, которая образуется на месте дисульфидной связи, присутствующей в шарнирной части антитела, дисульфидной связью, которая образуется на месте дисульфидной связи, присутствующей в шарнирной части антитела, или амидной связью, которая образуется на аминогруппе, присутствующей в боковой цепи аминокислоты, входящей в состав антитела, или на терминальной аминогруппе.[3] The antibody-drug conjugate of [1] or [2], wherein the bond between the antibody and L 1 is a thioether bond that forms at the site of a disulfide bond present at the hinge portion of the antibody, a disulfide bond that forms at the site of the disulfide a bond present in the hinge portion of an antibody, or an amide bond formed on an amino group present on the side chain of an amino acid constituting an antibody, or on a terminal amino group.
[4] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[3], где пептидный остаток в LP представляет собой аминокислотный остаток, включающий аминокислоту, выбранную из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты.[4] The antibody drug conjugate of any one of [1] to [3], wherein the peptide residue in L P is an amino acid residue including an amino acid selected from phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid and aspartic acid.
[5] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[3], где LP представляет собой пептидный остаток, состоящий из 4 аминокислот.[5] The antibody-drug conjugate of any one of [1] to [3], wherein L P is a peptide residue of 4 amino acids.
[6] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[3], где LP представляет собой -GGFG-.[6] The antibody-drug conjugate of any one of [1] to [3], wherein L P is -GGFG-.
[7] конъюгат антитело-лекарственное средство, где противоопухолевое соединение, представленное следующей формулой:[7] an antibody-drug conjugate, wherein the antitumor compound represented by the following formula:
конъюгировано с антителом через линкер, имеющий структуру, представленную следующей формулой: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-.conjugated to the antibody through a linker having the structure represented by the following formula: -L 1 -L 2 -L P -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c -.
В данном случае, антитело присоединено к концу L1, противоопухолевое соединение присоединено к концу Lc с помощью атома азота аминогруппы в положение 1 в качестве положения для соединения,In this case, the antibody is attached to the end of L 1 , the antitumor compound is attached to the end of L c with the nitrogen atom of the amino group in
гдеwhere
n1 представляет целое число от 0 до 6,n 1 represents an integer from 0 to 6,
L1 представляет -(сукцинимид-3-ил-N)-(CH2)n2-C(=O)-, -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-, -C(=O)- цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)- или -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-,L 1 is -(succinimide-3-yl-N)-(CH 2 )n 2 -C(=O)-, -CH 2 -C(=O)-NH-(CH 2 )n 3 -C(= O) -, -C (= O) - cyclic. Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiccus) - or -C (= O) - (CH 2 ) n 4 -C ( =O)-,
где n2 представляет целое число от 2 до 8, n3 представляет целое число от 1 до 8, n4 представляет целое число от 1 до 8,where n 2 is an integer from 2 to 8, n 3 is an integer from 1 to 8, n 4 is an integer from 1 to 8,
L2 представляет -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, -S-(CH2)n6-C(=O)- или одинарную химическую связь,L 2 is -NH-(CH 2 -CH 2 -O)n 5 -CH 2 -CH 2 -C(=O)-, -S-(CH 2 )n 6 -C(=O)- or a single chemical connection,
где n5 представляет целое число от 1 до 6, n6 представляет целое число от 1 до 6,where n 5 is an integer from 1 to 6, n 6 is an integer from 1 to 6,
LP представляет тетрапептидный остаток GGFG,L P is a tetrapeptide residue of GGFG,
La представляет -O- или одинарную химическую связь,L a represents -O- or a single chemical bond,
Lb представляет -CR2(-R3)- или одинарную химическую связь,L b represents -CR 2 (-R 3 )- or a single chemical bond,
где R2 и R3 каждый представляет атом водорода,where R 2 and R 3 each represents a hydrogen atom,
Lc представляет -C(=O)-,L c represents -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, представленную следующей формулой:-(succinimide-3-yl-N)- has the structure represented by the following formula:
, ,
которая присоединена к антителу в ее положении 3 и присоединена к метиленовой группе в линкерной структуре, имея эту структуру на атоме азота в положении 1,which is attached to the antibody at its position 3 and is attached to the methylene group in the linker structure, having this structure on the nitrogen atom at
-(N-ли-3-диминицкус)- имеет структуру, представленную следующей формулой:-(N-li-3-diminickus)- has a structure represented by the following formula:
, ,
которая присоединена к L2 в ее положении 3 и присоединена к метиленовой группе в линкерной структуре, имея эту структуру на атоме азота в положении 1,which is attached to L 2 at its 3 position and is attached to the methylene group in the linker structure, having this structure on the nitrogen atom at
цик.Гекс(1,4) представляет 1,4-циклогексиленовую группу, и когда L2 представляет собой -S-(CH2)n6-C(=O)-, L1 представляет собой -C(=O)- цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-.cyclohex(1,4) is a 1,4-cyclohexylene group, and when L 2 is -S-(CH 2 )n 6 -C(=O)-, L 1 is -C(=O)- cyc.Hex(1,4)-CH 2 -(N-li-3-diminiccus)-.
[8] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[7], где L1 представляет собой -(сукцинимид-3-ил-N)-(CH2)n2-C(=O)- или -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-.[8] The antibody-drug conjugate of any one of [1]-[7], wherein L 1 is -(succinimide-3-yl-N)-(CH 2 )n 2 -C(=O)- or -CH 2 -C(=O)-NH-(CH 2 )n 3 -C(=O)-.
[9] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[7], где L1 представляет собой -(сукцинимид-3-ил-N)-(CH2)n2-C(=O)-.[9] The antibody-drug conjugate of any one of [1]-[7], wherein L 1 is -(succinimide-3-yl-N)-(CH 2 )n 2 -C(=O)-.
[10] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[7], где L1 представляет собой -C(=O)- цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)- или -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-.[10] The antibody-drug conjugate of any one of [1]-[7], wherein L 1 is -C(=O)- cyc. Hex(1,4)-CH 2 -(N-li-3 -diminickus)- or -C(=O)-(CH 2 )n 4 -C(=O)-.
[11] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[9], где n2 представляет собой целое число от 2 до 5, и L2 представляет собой одинарную химическую связь.[11] The antibody-drug conjugate of any one of [1] to [9], wherein n 2 is an integer from 2 to 5 and L 2 is a single chemical bond.
[12] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[9], где n2 представляет собой целое число от 2 до 5, L2 представляет собой -NH-(CH2CH2O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, и n5 равняется 2 или 4.[12] The antibody-drug conjugate of any one of [1]-[9], wherein n 2 is an integer from 2 to 5, L 2 is -NH-(CH 2 CH 2 O)n 5 -CH 2 -CH 2 -C(=O)-, and n 5 is 2 or 4.
[13] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[12], где -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- представляет собой подструктуру, имеющую длину цепи от 4 до 7 атомов.[13] The antibody-drug conjugate of any one of [1]-[12], wherein -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c - is a substructure having a chain length of 4 to 7 atoms.
[14] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[12], где -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- представляет собой подструктуру, имеющую длину цепи в 5 или 6 атомов.[14] The antibody-drug conjugate of any one of [1]-[12], wherein -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c - is a substructure having a chain length of 5 or 6 atoms.
[15] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[14], где -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- представляет собой[15] The antibody-drug conjugate of any one of [1]-[14], wherein -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c - is
-NH-(CH2)3-C(=O)-,-NH-(CH 2 ) 3 -C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- или-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)- or
-NH-(CH2)2-O-CH2-C(=O)-.-NH-(CH 2 ) 2 -O-CH 2 -C(=O)-.
[16] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[15], где фрагмент лекарственное средство-линкерная структура представляет собой один фрагмент лекарственное средство-линкерная структура, выбранный из группы, состоящей из следующих фрагментов лекарственное средство-линкерная структура:[16] The antibody-drug conjugate of any one of [1] to [15], wherein the drug-linker structure moiety is one drug-linker structure moiety selected from the group consisting of the following drug-linker moiety :
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX) ,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - ( NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX ),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH -DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-C (= O) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-C (= O) -cyc.Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiscus) -S-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
где -(сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, представленную следующей формулой:where -(succinimide-3-yl-N)- has the structure represented by the following formula:
, ,
которая присоединена к антителу в ее положении 3 и присоединена к метиленовой группе в линкерной структуре, имея эту структуру на атоме азота в положении 1,which is attached to the antibody at its position 3 and is attached to the methylene group in the linker structure, having this structure on the nitrogen atom at
-(N-ли-3-диминицкус)- имеет структуру, представленную следующей формулой:-(N-li-3-diminickus)- has a structure represented by the following formula:
, ,
которая присоединена к L2 в ее положении 3 и присоединена к метиленовой группе в линкерной структуре, имея эту структуру на атоме азота в положении 1,which is attached to L 2 at its 3 position and is attached to the methylene group in the linker structure, having this structure on the nitrogen atom at
цик.Гекс(1,4) представляет 1,4-циклогексиленовую группу,cyc.Hex(1,4) represents a 1,4-cyclohexylene group,
-(NH-DX) представляет группу, представленную следующей формулой:-(NH-DX) represents a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота аминогруппы в положении 1 является положением присоединения, иwhere the nitrogen atom of the amino group in
-GGFG- представляет пептидный остаток -Gly-Gly-Phe-Gly-.-GGFG- represents the peptide residue -Gly-Gly-Phe-Gly-.
[17] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[9] и [11]-[14], где фрагмент лекарственное средство-линкерная структура, имеющий лекарственное средство, присоединенное к -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-, представляет собой один фрагмент лекарственное средство-линкерная структура, выбранный из следующей группы:[17] The antibody-drug conjugate of any one of [1]-[9] and [11]-[14], wherein the drug-linker structure fragment having the drug attached to -L 1 -L 2 -L P -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c - is one drug-linker moiety selected from the following group:
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX ),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH -DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX).
В приведенных выше фрагментах, -(сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, представленную следующей формулой:In the fragments above, -(succinimide-3-yl-N)- has the structure represented by the following formula:
, ,
которая присоединена к антителу в ее положении 3 и присоединена к метиленовой группе в линкерной структуре, имея эту структуру на атоме азота в положении 1, иwhich is attached to the antibody at its 3 position and is attached to the methylene group in the linker structure, having this structure on the nitrogen atom at
-(NH-DX) представляет группу, представленную следующей формулой:-(NH-DX) represents a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота аминогруппы в положении 1 является положением присоединения.where the nitrogen atom of the amino group in
[18] Конъюгат антитело-лекарственное средство, где противоопухолевое соединение, представленное следующей формулой:[18] An antibody-drug conjugate, wherein the anticancer compound represented by the following formula:
конъюгировано с антителом через линкер, имеющий структуру, представленную следующей формулой: -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-.conjugated to the antibody through a linker having the structure represented by the following formula: -L 1 -L 2 -L P -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c -.
В данном случае, антитело присоединено к концу L1, противоопухолевое соединение присоединено к концу Lc,In this case, the antibody is attached to the L 1 end, the antitumor compound is attached to the L c end,
гдеwhere
n1 представляет целое число от 0 до 6,n 1 represents an integer from 0 to 6,
L1 представляет -(сукцинимид-3-ил-N)-(CH2)n2-C(=O)- и присоединен к антителе через тиоэфирную связь, которая образуется на месте дисульфидной связи, присутствующей в шарнирной части антитела,L 1 represents -(succinimide-3-yl-N)-(CH 2 )n 2 -C(=O)- and is attached to the antibody through a thioether bond, which is formed in place of the disulfide bond present in the hinge portion of the antibody,
где n2 представляет целое число от 2 до 8,where n 2 is an integer from 2 to 8,
L2 представляет -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- или одинарную химическую связь,L 2 represents -NH-(CH 2 -CH 2 -O)n 5 -CH 2 -CH 2 -C(=O)- or a single chemical bond,
где n5 представляет целое число от 1 до 6,where n 5 represents an integer from 1 to 6,
LP представляет тетрапептидный остаток GGFG,L P is a tetrapeptide residue of GGFG,
La представляет -O- или одинарную химическую связь,L a represents -O- or a single chemical bond,
Lb представляет -CR2(-R3)- или одинарную химическую связь,L b represents -CR 2 (-R 3 )- or a single chemical bond,
где R2 и R3 каждый представляет атом водорода,where R 2 and R 3 each represents a hydrogen atom,
Lc представляет -C(=O)- иL c represents -C(=O)- and
-(сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, представленную следующей формулой:-(succinimide-3-yl-N)- has the structure represented by the following formula:
, ,
которая присоединена к антителу в ее положении 3 и присоединена к метиленовой группе в линкерной структуре, имея эту структуру на атоме азота в положении 1.which is attached to the antibody at its position 3 and attached to the methylene group in the linker structure, having this structure on the nitrogen atom at
[19] Конъюгат антитело-лекарственное средство по пункту [18], где[19] The antibody-drug conjugate of [18] wherein
n2 равняется 2, L2 представляет собой -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, n5 равняется 2, n1 равняется 3, и оба La и Lb представляют собой одинарные химические связи,n 2 is 2, L 2 is -NH-(CH 2 -CH 2 -O)n 5 -CH 2 -CH 2 -C(=O)-, n 5 is 2, n 1 is 3, and both L a and L b are single chemical bonds,
n2 равняется 5, L2 представляет собой одинарную химическую связь, n1 равняется 1, La представляет собой -O-, и Lb представляет собой -CR2(-R3)-, илиn 2 is 5, L 2 is a single chemical bond, n 1 is 1, L a is -O-, and L b is -CR 2 (-R 3 )-, or
n2 равняется 5, L2 представляет собой одинарную химическую связь, n1 равняется 2, La представляет собой -O-, и Lb представляет собой -CR2(-R3)-.n 2 is 5, L 2 is a single chemical bond, n 1 is 2, L a is -O-, and L b is -CR 2 (-R 3 )-.
[20] Конъюгат антитело-лекарственное средство по пункту [18] или [19], где n2 представляет собой целое число от 2 до 5, и L2 представляет собой одинарную химическую связь.[20] The antibody-drug conjugate of [18] or [19], wherein n 2 is an integer from 2 to 5 and L 2 is a single chemical bond.
[21] Конъюгат антитело-лекарственное средство по пункту [18] или [19], где n2 представляет собой целое число от 2 до 5, L2 представляет собой -NH-(CH2CH2O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, и n5 равняется 2 или 4.[21] The antibody-drug conjugate of [18] or [19], wherein n 2 is an integer from 2 to 5, L 2 is -NH-(CH 2 CH 2 O)n 5 -CH 2 - CH 2 -C(=O)-, and n 5 is 2 or 4.
[22] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [18]-[21], где -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- представляет собой[22] The antibody-drug conjugate of any one of [18]-[21], wherein -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c - is
-NH-(CH2)3-C(=O)-,-NH-(CH 2 ) 3 -C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)- или-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)- or
-NH-(CH2)2-O-CH2-C(=O)-.-NH-(CH 2 ) 2 -O-CH 2 -C(=O)-.
[23] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [18]-[22], где фрагмент лекарственное средство-линкерная структура представляет собой один фрагмент лекарственное средство-линкерная структура, выбранный из группы, состоящей из следующих фрагментов лекарственное средство-линкерная структура:[23] The antibody-drug conjugate of any one of [18]-[22], wherein the drug-linker structure moiety is one drug-linker structure moiety selected from the group consisting of the following drug-linker moiety :
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX) ,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - ( NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX ),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH -DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX).
В приведенных выше фрагментах, -(сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, представленную следующей формулой:In the fragments above, -(succinimide-3-yl-N)- has the structure represented by the following formula:
, ,
которая присоединена к антителу в ее положении 3 и присоединена к метиленовой группе в линкерной структуре, имея эту структуру на атоме азота в положении 1, иwhich is attached to the antibody at its 3 position and is attached to the methylene group in the linker structure, having this structure on the nitrogen atom at
-(NH-DX) представляет группу, представленную следующей формулой:-(NH-DX) represents a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота аминогруппы в положении 1 является положением присоединения.where the nitrogen atom of the amino group in
[24] Конъюгат антитело-лекарственное средство по пункту [23], где фрагмент лекарственное средство-линкерная структура, имеющий лекарственное средство, присоединенное к -L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-, представляет собой один фрагмент лекарственное средство-линкерная структура, выбранный из следующей группы:[24] The antibody-drug conjugate of [23], wherein the drug-linker structure fragment having the drug attached to -L 1 -L 2 -L P -NH-(CH 2 )n 1 -L a - L b -L c - is one fragment of the drug-linker structure selected from the following group:
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX ),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH -DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX).
В приведенных выше фрагментах, -(сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, представленную следующей формулой:In the fragments above, -(succinimide-3-yl-N)- has the structure represented by the following formula:
, ,
которая присоединена к антителу в ее положении 3 и присоединена к метиленовой группе в линкерной структуре, имея эту структуру на атоме азота в положении 1, иwhich is attached to the antibody at its 3 position and is attached to the methylene group in the linker structure, having this structure on the nitrogen atom at
-(NH-DX) представляет группу, представленную следующей формулой:-(NH-DX) represents a group represented by the following formula:
где атом азота аминогруппы в положении 1 является положением присоединения.where the nitrogen atom of the amino group in
[25] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[24], где среднее число единиц выбранного одного фрагмента лекарственное средство-линкерная структура, конъюгированного с одним антителом, находится в диапазоне от 1 до 10.[25] The antibody-drug conjugate of any one of [1] to [24], wherein the average number of units of the selected single drug-linker structure fragment conjugated to a single antibody is in the range of 1 to 10.
[26] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[24], где среднее число единиц выбранного одного фрагмента лекарственное средство-линкерная структура, конъюгированного с одним антителом, находится в диапазоне от 2 до 8.[26] The antibody-drug conjugate of any one of [1] to [24], wherein the average number of units of the selected single drug-linker structure fragment conjugated to a single antibody is between 2 and 8.
[27] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[24], где среднее число единиц выбранного одного фрагмента лекарственное средство-линкерная структура, конъюгированного с одним антителом, находится в диапазоне от 3 до 8.[27] The antibody-drug conjugate of any one of [1] to [24], wherein the average number of units of the selected single drug-linker structure fragment conjugated to a single antibody is between 3 and 8.
[28] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[27], где антитело представляет собой антитело, обладающее одним или более из свойств, таких как распознавание клетки-мишени, связывание клетки-мишени, интернализация в клетке-мишени и повреждение клетки-мишени.[28] The antibody-drug conjugate of any one of [1] to [27], wherein the antibody is an antibody having one or more of properties such as target cell recognition, target cell binding, internalization in the target cell and damage to the target cell.
[29] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[27], где клетка, которая является мишенью для конъюгата антитело-лекарственное средство, представляет собой опухолевую клетку.[29] The antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [27], wherein the cell that is the target of the antibody-drug conjugate is a tumor cell.
[30] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[27], где антитело представляет собой анти-A33 антитело, анти-B7-H3 антитело, анти-CanAg антитело, анти-CD20 антитело, анти-CD22 антитело, анти-CD30 антитело, анти-CD33 антитело, анти-CD56 антитело, анти-CD70 антитело, анти-CEA антитело, анти-Cripto антитело, анти-EphA2 антитело, анти-G250 антитело, анти-MUC1 антитело, анти-GPNMB антитело, анти-интегрин антитело, анти-PSMA антитело, анти-тенасцин-C антитело, анти-SLC44A4 антитело или анти-мезотелин антитело.[30] The antibody drug conjugate of any one of [1] to [27], wherein the antibody is an anti-A33 antibody, an anti-B7-H3 antibody, an anti-CanAg antibody, an anti-CD20 antibody, an anti-CD22 antibody , anti-CD30 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD56 antibody, anti-CD70 antibody, anti-CEA antibody, anti-Cripto antibody, anti-EphA2 antibody, anti-G250 antibody, anti-MUC1 antibody, anti-GPNMB antibody , an anti-integrin antibody, an anti-PSMA antibody, an anti-tenascin-C antibody, an anti-SLC44A4 antibody, or an anti-mesothelin antibody.
[31] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[27], где антитело представляет собой анти-B7-H3 антитело, анти-CD30 антитело, анти-CD33 антитело или анти-CD70 антитело.[31] The antibody drug conjugate of any one of [1] to [27], wherein the antibody is an anti-B7-H3 antibody, an anti-CD30 antibody, an anti-CD33 antibody, or an anti-CD70 antibody.
[32] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[27], где антитело представляет собой анти-B7-H3 антитело.[32] The antibody-drug conjugate of any one of [1] to [27], wherein the antibody is an anti-B7-H3 antibody.
[33] Лекарственное средство, содержащее конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[32], его соль или его гидрат.[33] A drug comprising the antibody-drug conjugate of any one of [1] to [32], a salt thereof, or a hydrate thereof.
[34] Противоопухолевое лекарственное средство и/или противораковое лекарственное средство, содержащее конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[32], его соль или его гидрат.[34] An antitumor drug and/or an anticancer drug, comprising the antibody-drug conjugate of any one of [1] to [32], a salt thereof, or a hydrate thereof.
[35] Противоопухолевое лекарственное средство и/или противораковое лекарственное средство по пункту [34], которое применяют при лечении рака легких, рака почки, рака уротелия, колоректального рака, рака предстательной железы, мультиформной глиобластомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, меланомы, рака печени, рака мочевого пузыря, рака желудка или рака пищевода.[35] An antitumor drug and/or an anticancer drug according to [34], which is used in the treatment of lung cancer, kidney cancer, urothelial cancer, colorectal cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer, pancreatic cancer, breast cancer cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer, stomach cancer, or esophageal cancer.
[36] Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[32], его соль или его гидрат в качестве активного компонента, и фармацевтически приемлемый компонент, используемый в качестве вспомогательного вещества.[36] A pharmaceutical composition comprising an antibody-drug conjugate according to any one of [1] to [32], a salt or hydrate thereof as an active ingredient, and a pharmaceutically acceptable ingredient used as an excipient.
[37] Фармацевтическая композиция по пункту [36], которую применяют при лечении рака легких, рака почки, рака уротелия, колоректального рака, рака предстательной железы, мультиформной глиобластомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, меланомы, рака печени, рака мочевого пузыря, рака желудка или рака пищевода.[37] The pharmaceutical composition according to [36], which is used in the treatment of lung cancer, kidney cancer, urothelial cancer, colorectal cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer, pancreatic cancer, breast cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer, stomach cancer, or esophageal cancer.
[38] Способ лечения опухоли и/или рака, включающий введение конъюгата антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [1]-[32], его соль или его гидрат.[38] A method for treating a tumor and/or cancer, comprising administering an antibody-drug conjugate according to any one of [1]-[32], a salt thereof, or a hydrate thereof.
[39] Промежуточное соединение лекарственное средство-линкер, представленное следующей формулой:[39] A drug-linker intermediate represented by the following formula:
Q-(CH2)nQ-C(=O)-L2a-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX).Q-(CH 2 )n Q -C(=O)-L 2a -L P -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c -(NH-DX).
В этой формуле, Q представляет (малеимид-N-ил)-, HS-, X-CH2-C(=O)-NH- или (пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-,In this formula, Q is (maleimide-N-yl)-, HS-, X-CH 2 -C(=O)-NH- or (pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O )-,
X представляет атом брома или атом йода,X represents a bromine atom or an iodine atom,
nQ представляет целое число от 2 до 8,n Q represents an integer from 2 to 8,
L2a представляет -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- или одинарную химическую связь,L 2a represents -NH-(CH 2 -CH 2 -O)n 5 -CH 2 -CH 2 -C(=O)- or a single chemical bond,
где n5 представляет целое число от 1 до 6,where n 5 represents an integer from 1 to 6,
LP представляет пептидный остаток, состоящий от 2 до 7 аминокислот, выбранных из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты,L P is a peptide residue consisting of 2 to 7 amino acids selected from phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid and aspartic acid,
n1 представляет целое число от 0 до 6,n 1 represents an integer from 0 to 6,
La представляет -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O- или одинарную химическую связь,L a represents -C(=O)-NH-, -NR 1 -(CH 2 )n 7 -, -O- or a single chemical bond,
где n7 представляет целое число от 1 до 6, R1 представляет атом водорода, алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, -(CH2)n8-COOH или -(CH2)n9-OH, n8 представляет целое число от 1 до 4, n9 представляет целое число от 1 до 6,where n 7 is an integer from 1 to 6, R 1 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, -(CH 2 )n 8 -COOH or -(CH 2 )n 9 -OH, n 8 represents an integer from 1 to 4, n 9 represents an integer from 1 to 6,
Lb представляет -CR2(-R3)-, -O-, -NR4- или одинарную химическую связь,L b represents -CR 2 (-R 3 )-, -O-, -NR 4 - or a single chemical bond,
где R2 и R3 каждый независимо представляет атом водорода, алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-COOH или -(CH2)nc-OH, R4 представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, na представляет целое число от 0 до 6, nb представляет целое число от 1 до 4, nc представляет целое число от 1 до 4, при условии, что когда na равняется 0, R2 и R3 не являются одинаковыми,where R 2 and R 3 each independently represents a hydrogen atom, an alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms, -(CH 2 )n a -NH 2 , -(CH 2 )n b -COOH or -(CH 2 )n c -OH, R 4 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, n a represents an integer from 0 to 6, n b represents an integer from 1 to 4, n c represents an integer from 1 to 4 , provided that when n a is 0, R 2 and R 3 are not the same,
Lc представляет -CH2- или -C(=O)-,L c represents -CH 2 - or -C(=O)-,
(малеимид-N-ил)- представляет собой группу, представленную следующей формулой:(maleimide-N-yl)- is a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота является положением присоединения,where the nitrogen atom is the attachment position,
(пирролидин-2,5-дион-N-ил) представляет собой группу, представленную следующей формулой:(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl) is a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота является положением присоединения, и -(NH-DX) представляет собой группу, представленную следующей формулой:where the nitrogen atom is the attachment position, and -(NH-DX) is a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота аминогруппы в положении 1 является положением присоединения.where the nitrogen atom of the amino group in
[40] Промежуточное соединение лекарственное средство-линкер по пункту [39], где Lc представляет собой -C(=O)-.[40] The drug-linker intermediate of [39], wherein L c is -C(=O)-.
[41] Промежуточное соединение лекарственное средство-линкер по пункту [39] или [40], где LP представляет собой пептидный остаток, состоящий из 4 аминокислот.[41] The drug-linker intermediate of [39] or [40], wherein LP is a 4 amino acid peptide residue.
[42] Промежуточное соединение лекарственное средство-линкер по любому из пунктов [39]-[41], где LP представляет собой -GGFG-.[42] The drug-linker intermediate of any one of [39]-[41], wherein L P is -GGFG-.
[43] Промежуточное соединение лекарственное средство-линкер по любому из пунктов [39]-[42], где -NH-(CH2)n1-La-Lb- представляет собой [43] The drug-linker intermediate of any one of [39]-[42], wherein -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b - is
-NH-CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2-O-CH2- или-NH-CH 2 -O-CH 2 - or
-NH-CH2CH2-O-CH2-.-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -.
[44] Промежуточное соединение лекарственное средство-линкер по любому из пунктов [39]-[42], где -NH-(CH2)n1-La-Lb- представляет собой[44] The drug-linker intermediate of any one of [39]-[42], wherein -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b - is
-NH-CH2CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2-O-CH2- или-NH-CH 2 -O-CH 2 - or
-NH-(CH2)2-O-CH2-.-NH-(CH 2 ) 2 -O-CH 2 -.
[45] Промежуточное соединение лекарственное средство-линкер по любому из пунктов [39]-[44], где nQ представляет собой целое число от 2 до 6.[45] The drug-linker intermediate of any one of [39]-[44], wherein n Q is an integer from 2 to 6.
[46] Промежуточное соединение лекарственное средство-линкер по пункту [43], где[46] The drug-linker intermediate of [43], wherein
Q представляет собой (малеимид-N-ил)-,Q is (maleimide-N-yl)-,
nQ представляет собой целое число от 2 до 5, иn Q is an integer from 2 to 5, and
L2a представляет собой одинарную химическую связь.L 2a is a single chemical bond.
[47] Промежуточное соединение лекарственное средство-линкер по пункту [44], где[47] The drug-linker intermediate of [44], wherein
Q представляет собой (малеимид-N-ил)-,Q is (maleimide-N-yl)-,
nQ представляет собой целое число от 2 до 5, иn Q is an integer from 2 to 5, and
L2a представляет собой одинарную химическую связь.L 2a is a single chemical bond.
[48] Промежуточное соединение лекарственное средство-линкер по любому из пунктов [39]-[42], где[48] A drug-linker intermediate according to any one of [39]-[42], wherein
Q представляет собой (малеимид-N-ил)-,Q is (maleimide-N-yl)-,
nQ представляет собой целое число от 2 до 5,n Q is an integer from 2 to 5,
L2a представляет собой -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-,L 2a is -NH-(CH 2 -CH 2 -O)n 5 -CH 2 -CH 2 -C(=O)-,
n5 представляет собой целое число от 2 до 4, иn 5 is an integer from 2 to 4, and
-NH-(CH2)n1-La-Lb- представляет собой-NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b - is
-NH-CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2-O-CH2- или-NH-CH 2 -O-CH 2 - or
-NH-CH2CH2-O-CH2-.-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -.
[49] Промежуточное соединение лекарственное средство-линкер по пункту [48], где[49] The drug-linker intermediate of [48] wherein
n5 представляет собой целое число 2 или 4, иn 5 is an integer 2 or 4, and
-NH-(CH2)n1-La-Lb- представляет собой-NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b - is
-NH-CH2CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2-O-CH2- или-NH-CH 2 -O-CH 2 - or
-NH-CH2CH2-O-CH2-.-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -.
[50] Соединение из следующих соединений:[50] A compound of the following compounds:
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX ),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX) ,
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX ),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX) ,
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX ),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH -DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX) ,
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH- Dx),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH -DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG -NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG -NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG -NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O)-(NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (=O)-(NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 - C(=O)-(NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX ),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH -DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl) -OC (=O) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O )-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C( =O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH -DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl) -OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (=O)- (NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl) -OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (=O )-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl) -OC (=O) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C ( =O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 - C(=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-( NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O) -(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(= O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl) -OC (=O) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl) -OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (=O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O) -(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(= O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl) -OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl) -OC (= O) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl) -OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O- CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O -CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O -CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O -CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O -CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O -CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O -CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), или(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O -CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX), or
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O -CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX).
В приведенных выше фрагментах, (малеимид-N-ил)- представляет собой группу, представленную следующей формулой:In the fragments above, (maleimide-N-yl)- represents a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота является положением присоединения,where the nitrogen atom is the attachment position,
X представляет атом галогена,X represents a halogen atom,
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)- представляет собой группу, представленную следующей формулой:(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl)- is a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота является положением присоединения, и -(NH-DX) представляет собой группу, представленную следующей формулой:where the nitrogen atom is the attachment position, and -(NH-DX) is a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота аминогруппы в положении 1 является положением присоединения.where the nitrogen atom of the amino group in
[51] Соединение, выбранное из следующих соединений:[51] A compound selected from the following compounds:
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX ),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX) ,
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), или(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX), or
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX).
В приведенных выше фрагментах, (малеимид-N-ил)- представляет собой группу, представленную следующей формулой:In the fragments above, (maleimide-N-yl)- represents a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота является положением присоединения, и -(NH-DX) представляет собой группу, представленную следующей формулой:where the nitrogen atom is the attachment position, and -(NH-DX) is a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота аминогруппы в положении 1 является положением присоединения.where the nitrogen atom of the amino group in
[52] Соединение, выбранное из следующих соединений:[52] A compound selected from the following compounds:
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) или(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX) or
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX).
В приведенных выше фрагментах, (малеимид-N-ил)- представляет собой группу, представленную следующей формулой:In the fragments above, (maleimide-N-yl)- represents a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота является положением присоединения, и -(NH-DX) представляет собой группу, представленную следующей формулой:where the nitrogen atom is the attachment position, and -(NH-DX) is a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота аминогруппы в положении 1 является положением присоединения.where the nitrogen atom of the amino group in
[53] Соединение, выбранное из следующей группы:[53] A compound selected from the following group:
NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),NH 2 -CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),NH 2 -CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),NH 2 -CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
NH2-CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) иNH 2 -CHCH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX) and
HO-CH2-C(=O)-(NH-DX)HO-CH 2 -C(=O)-(NH-DX)
где -(NH-DX) представляет собой группу, представленную следующей формулой:where -(NH-DX) is a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота аминогруппы в положении 1 является положением присоединения.where the nitrogen atom of the amino group in
[54] Соединение, представленное следующей формулой:[54] A compound represented by the following formula:
. .
[55] Соединение, представленное следующей формулой:[55] A compound represented by the following formula:
. .
[56] Соединение, представленное следующей формулой:[56] A compound represented by the following formula:
. .
[57] Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство, включающий взаимодействие соединения, представленного следующей формулой:[57] A method for producing an antibody-drug conjugate, comprising reacting a compound represented by the following formula:
Q-(CH2)nQ-C(=O)-L2a-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)Q-(CH 2 )n Q -C(=O)-L 2a -L P -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c -(NH-DX)
с антителом или его реакционноспособным производным и конъюгирование фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом с помощью способа формирования тиоэфирной связи на месте дисульфидной связи, присутствующей в шарнирной части антитела, или с помощью способа формирования амидной связи на месте аминогруппы, присутствующей в боковой цепи аминокислоты, входящей в состав антитела, или на концевой аминогруппе.with the antibody or its reactive derivative and conjugation of the drug-linker fragment with the antibody using the method of forming a thioether bond at the site of the disulfide bond present in the hinge part of the antibody, or using the method of forming an amide bond at the site of the amino group present in the side chain of the amino acid included in the composition of the antibody, or on the terminal amino group.
В этой формуле, Q представляет (малеимид-N-ил)-, HS-, X-CH2-C(=O)-NH- или (пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-,In this formula, Q is (maleimide-N-yl)-, HS-, X-CH 2 -C(=O)-NH- or (pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O )-,
X представляет атом брома или атом йода,X represents a bromine atom or an iodine atom,
nQ представляет целое число от 2 до 8,n Q represents an integer from 2 to 8,
L2a представляет -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- или одинарную химическую связь,L 2a represents -NH-(CH 2 -CH 2 -O)n 5 -CH 2 -CH 2 -C(=O)- or a single chemical bond,
где n5 представляет целое число от 1 до 6,where n 5 represents an integer from 1 to 6,
LP представляет пептидный остаток, состоящий от 2 до 7 аминокислот, выбранных из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты,L P is a peptide residue consisting of 2 to 7 amino acids selected from phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid and aspartic acid,
n1 представляет целое число от 0 до 6,n 1 represents an integer from 0 to 6,
La представляет -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O- или одинарную химическую связь,L a represents -C(=O)-NH-, -NR 1 -(CH 2 )n 7 -, -O- or a single chemical bond,
где n7 представляет целое число от 1 до 6, R1 представляет атом водорода, алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, -(CH2)n8-COOH или -(CH2)n9-OH, n8 представляет целое число от 1 до 4, n9 представляет целое число от 1 до 6,where n 7 represents an integer from 1 to 6, R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms, -(CH 2 )n 8 -COOH or -(CH 2 )n 9 -OH, n 8 represents an integer from 1 to 4, n 9 represents an integer from 1 to 6,
Lb представляет -CR2(-R3)-, -O-, -NR4- или одинарную химическую связь,L b represents -CR 2 (-R 3 )-, -O-, -NR 4 - or a single chemical bond,
где R2 и R3 каждый независимо представляет атом водорода, алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-COOH или -(CH2)nc -OH, R4 представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, na представляет целое число от 0 до 6, nb представляет целое число от 1 до 4, nc представляет целое число от 1 до 4, при условии, что когда na равняется 0, R2 и R3 не являются одинаковыми,where R 2 and R 3 each independently represents a hydrogen atom, an alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms, -(CH 2 )n a -NH 2 , -(CH 2 )n b -COOH or -(CH 2 )n c is OH, R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, n a is an integer from 0 to 6, n b is an integer from 1 to 4, n c is an integer from 1 to 4 , provided that when n a is 0, R 2 and R 3 are not the same,
Lc представляет -CH2- или -C(=O)-,L c represents -CH 2 - or -C(=O)-,
(малеимид-N-ил)- представляет собой группу, представленную следующей формулой:(maleimide-N-yl)- is a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота является положением присоединения,where the nitrogen atom is the attachment position,
(пирролидин-2,5-дион-N-ил) представляет собой группу, представленную следующей формулой:(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl) is a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота является положением присоединения, и -(NH-DX) представляет собой группу, представленную следующей формулой:where the nitrogen atom is the attachment position, and -(NH-DX) is a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота аминогруппы в положении 1 является положением присоединения.where the nitrogen atom of the amino group in
[58] Способ получения по пункту [57], где способ конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом представляет собой[58] The production method of [57], wherein the method of conjugating the drug-linker fragment to the antibody is
способ восстановления антитела и последующего образования тиоэфирной связи путем реакции с соединением, в котором Q представляет собой малеимидильную группу или X-CH2-C(=O)-NH-,a method for recovering an antibody and subsequently forming a thioether bond by reaction with a compound in which Q is a maleimidyl group or X-CH 2 -C(=O)-NH-,
способ образования амидной связи путем реакции с соединением, в котором Q представляет собой (пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-, илиa process for forming an amide bond by reaction with a compound wherein Q is (pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-O-C(=O)-, or
способ реакции антитела с соединением, представленным формулой Q1-L1a-Q2 method of reacting an antibody with a compound represented by the formula Q 1 -L 1a -Q 2
[где Q1 представляет (пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-, (3-сульфопирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-, RQ-O-C(=N)- или O=C=N-,[where Q 1 represents (pyrrolidin-2,5-dion-N-yl)-OC(=O)-, (3-sulfopyrrolidin-2,5-dion-N-yl)-OC(=O)-, R Q -OC(=N)- or O=C=N-,
L1a- представляет –цик.Гекс(1,4)-CH2-, алкиленовую группу, имеющую от 1 до 10 углеродных атомов, фениленовую группу, -(CH2)n4-C(=O)-, -(CH2)n4a-NH-C(=O)-(CH2)n4b- или -(CH2)n4a-NH-C(=O)- цик.Гекс(1,4)-CH2-,L 1a - represents -cyc. Hex (1,4) -CH 2 -, an alkylene group having from 1 to 10 carbon atoms, a phenylene group, - (CH 2 )n 4 -C (= O) -, - (CH 2 )n 4a -NH-C (= O) - (CH 2 ) n 4b - or - (CH 2 ) n 4a -NH-C (= O) - cyclic. Hex (1,4) -CH 2 -,
Q2 представляет (малеимид-N-ил), атом галогена или -S-S-(2-пиридил),Q 2 represents (maleimide-N-yl), a halogen atom or -SS-(2-pyridyl),
RQ представляет алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, n4 представляет целое число от 1 до 8,R Q represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, n 4 represents an integer from 1 to 8,
n4a представляет целое число от 0 до 6, n4b представляет целое число от 1 до 6,n 4a represents an integer from 0 to 6, n 4b represents an integer from 1 to 6,
(3-сульфопирролидин-2,5-дион-N-ил)- представляет собой группу, представленную следующей формулой:(3-sulfopyrrolidin-2,5-dione-N-yl)- is a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота является положением присоединения, и эта сульфоновая кислота способна образовывать литиевую соль, натриевую соль или калиевую соль,where the nitrogen atom is the attachment position and this sulfonic acid is capable of forming a lithium salt, a sodium salt or a potassium salt,
цик.Гекс(1,4) представляет 1,4-циклогексиленовую группу, и (2-пиридил) представляет 2-пиридильную группу],cyc. Hex(1,4) represents a 1,4-cyclohexylene group, and (2-pyridyl) represents a 2-pyridyl group],
и последующей реакцией с соединением, в котором Q представляет собой SH, с образованием лекарственное средство-линкерная структура за счет амидной связи.and subsequent reaction with a compound in which Q is SH to form a drug-linker structure via an amide bond.
[59] Способ получения по пункту [57] или [58], где среднее число единиц выбранного одного фрагмента лекарственное средство-линкерная структура, конъюгированного с одним антителом, находится в диапазоне от 1 до 10.[59] The production method of [57] or [58], wherein the average number of units of the selected single drug-linker structure fragment conjugated to a single antibody is in the range of 1 to 10.
[60] Способ получения по пункту [57] или [58], где среднее число единиц выбранного одного фрагмента лекарственное средство-линкерная структура, конъюгированного с одним антителом, находится в диапазоне от 2 до 8.[60] The production method of [57] or [58], wherein the average number of units of the selected single drug-linker structure fragment conjugated to a single antibody is between 2 and 8.
[61] Способ получения по пункту [57] или [58], где среднее число единиц выбранного одного фрагмента лекарственное средство-линкерная структура, конъюгированного с одним антителом, находится в диапазоне от 3 до 8.[61] The production method of [57] or [58], wherein the average number of units of the selected single drug-linker structure fragment conjugated to a single antibody is between 3 and 8.
[62] Способ получения по любому из пунктов [57]-[61], где клетка, которая является мишенью для конъюгата антитело-лекарственное средство, представляет собой опухолевую клетку.[62] The production method according to any one of [57] to [61], wherein the cell that is the target of the antibody-drug conjugate is a tumor cell.
[63] Способ получения по любому из пунктов [57]-[61], где антитело представляет собой анти-A33 антитело, анти-B7-H3 антитело, анти-CanAg антитело, анти-CD20 антитело, анти-CD22 антитело, анти-CD30 антитело, анти-CD33 антитело, анти-CD56 антитело, анти-CD70 антитело, анти-CEA антитело, анти-Cripto антитело, анти-EphA2 антитело, анти-G250 антитело, анти-MUC1 антитело, анти-GPNMB антитело, анти-интегрин антитело, анти-PSMA антитело, анти-тенасцин-C антитело, анти-SLC44A4 антитело или анти-мезотелин антитело.[63] The production method according to any one of [57] to [61], wherein the antibody is an anti-A33 antibody, anti-B7-H3 antibody, anti-CanAg antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD22 antibody, anti- CD30 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD56 antibody, anti-CD70 antibody, anti-CEA antibody, anti-Cripto antibody, anti-EphA2 antibody, anti-G250 antibody, anti-MUC1 antibody, anti-GPNMB antibody, anti- an integrin antibody, an anti-PSMA antibody, an anti-tenascin-C antibody, an anti-SLC44A4 antibody, or an anti-mesothelin antibody.
[64] Способ получения по любому из пунктов [57]-[61], где антитело представляет собой анти-B7-H3 антитело, анти-CD30 антитело, анти-CD33 антитело или анти-CD70 антитело.[64] The production method according to any one of [57] to [61], wherein the antibody is an anti-B7-H3 antibody, an anti-CD30 antibody, an anti-CD33 antibody, or an anti-CD70 antibody.
[65] Способ получения по любому из пунктов [57]-[61], где антитело представляет собой анти-B7-H3 антитело.[65] The production method according to any one of [57] to [61], wherein the antibody is an anti-B7-H3 antibody.
[66] Конъюгат антитело-лекарственное средство, полученный с помощью способа получения по любому из пунктов [57]-[65].[66] An antibody-drug conjugate obtained using the production method of any one of [57]-[65].
[67] Конъюгат антитело-лекарственное средство, полученный путем образования тиоэфирной связи на месте сульфидной связи в шарнирной части антитела, где антитело подвергают обработке в восстановительных условиях и затем подвергают реакции с соединением, выбранным из группы соединений, приведенной ниже:[67] An antibody-drug conjugate prepared by forming a thioether bond at the site of a sulfide bond in the hinge portion of an antibody, wherein the antibody is subjected to reducing conditions and then reacted with a compound selected from the group of compounds shown below:
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX ),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX) ,
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), или(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX), or
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX).
В приведенных выше фрагментах, (малеимид-N-ил)- представляет собой группу, представленную следующей формулой:In the fragments above, (maleimide-N-yl)- represents a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота является положением присоединения, и -(NH-DX) представляет собой группу, представленную следующей формулой:where the nitrogen atom is the position of attachment, and -(NH-DX) is a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота аминогруппы в положении 1 является положением присоединения.where the nitrogen atom of the amino group in
[68] Конъюгат антитело-лекарственное средство, полученный путем образования тиоэфирной связи на месте сульфидной связи в шарнирной части антитела, где антитело подвергают обработке в восстановительных условиях и затем подвергают реакции с соединением, выбранным из группы соединений, приведенной ниже:[68] An antibody-drug conjugate prepared by forming a thioether bond at the site of a sulfide bond in the hinge portion of an antibody, wherein the antibody is subjected to reducing conditions and then reacted with a compound selected from the group of compounds shown below:
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), или(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX), or
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX) .
В приведенных выше фрагментах, (малеимид-N-ил)- представляет собой группу, представленную следующей формулой:In the fragments above, (maleimide-N-yl)- represents a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота является положением присоединения, и -(NH-DX) представляет собой группу, представленную следующей формулой:where the nitrogen atom is the position of attachment, and -(NH-DX) is a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота аминогруппы в положении 1 является положением присоединения.where the nitrogen atom of the amino group in
[69] Конъюгат антитело-лекарственное средство по пункту [67] или [68], где среднее число единиц выбранного одного фрагмента лекарственное средство-линкерная структура, конъюгированного с одним антителом, находится в диапазоне от 1 до 10.[69] The antibody-drug conjugate of [67] or [68], wherein the average number of units of the selected single drug-linker structure fragment conjugated to a single antibody is between 1 and 10.
[70] Конъюгат антитело-лекарственное средство по пункту [67] или [68], где среднее число единиц выбранного одного фрагмента лекарственное средство-линкерная структура, конъюгированного с одним антителом, находится в диапазоне от 2 до 8.[70] The antibody-drug conjugate of [67] or [68], wherein the average number of units of the selected single drug-linker structure fragment conjugated to a single antibody is between 2 and 8.
[71] Конъюгат антитело-лекарственное средство по пункту [67] или [68], где среднее число единиц выбранного одного фрагмента лекарственное средство-линкерная структура, конъюгированного с одним антителом, находится в диапазоне от 3 до 8.[71] The antibody-drug conjugate of [67] or [68], wherein the average number of units of the selected single drug-linker structure fragment conjugated to a single antibody is between 3 and 8.
[72] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [67]-[71], где клетка, которая является мишенью для конъюгата антитело-лекарственное средство, представляет собой опухолевую клетку.[72] The antibody-drug conjugate according to any one of [67] to [71], wherein the cell that is the target of the antibody-drug conjugate is a tumor cell.
[73] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [67]-[71], где антитело представляет собой анти-A33 антитело, анти-B7-H3 антитело, анти-CanAg антитело, анти-CD20 антитело, анти-CD22 антитело, анти-CD30 антитело, анти-CD33 антитело, анти-CD56 антитело, анти-CD70 антитело, анти-CEA антитело, анти-Cripto антитело, анти-EphA2 антитело, анти-G250 антитело, анти-MUC1 антитело, анти-GPNMB антитело, анти-интегрин антитело, анти-PSMA антитело, анти-тенасцин-C антитело, анти-SLC44A4 антитело или анти-мезотелин антитело.[73] The antibody-drug conjugate of any one of [67]-[71], wherein the antibody is an anti-A33 antibody, an anti-B7-H3 antibody, an anti-CanAg antibody, an anti-CD20 antibody, an anti-CD22 antibody , anti-CD30 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD56 antibody, anti-CD70 antibody, anti-CEA antibody, anti-Cripto antibody, anti-EphA2 antibody, anti-G250 antibody, anti-MUC1 antibody, anti-GPNMB antibody , an anti-integrin antibody, an anti-PSMA antibody, an anti-tenascin-C antibody, an anti-SLC44A4 antibody, or an anti-mesothelin antibody.
[74] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [67]-[71], где антитело представляет собой анти-B7-H3 антитело, анти-CD30 антитело, анти-CD33 антитело или анти-CD70 антитело.[74] The antibody drug conjugate of any one of [67] to [71], wherein the antibody is an anti-B7-H3 antibody, an anti-CD30 antibody, an anti-CD33 antibody, or an anti-CD70 antibody.
[75] Конъюгат антитело-лекарственное средство по любому из пунктов [67]-[71], где антитело представляет собой анти-B7-H3 антитело.[75] The antibody-drug conjugate of any one of [67]-[71], wherein the antibody is an anti-B7-H3 antibody.
[76] Линкер, представленный следующей формулой:[76] A linker represented by the following formula:
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc--L 1 -L 2 -L P -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c -
для получения конъюгата антитело-лекарственное средство, в котором лекарственное средство конъюгировано с антителом через линкер.to obtain an antibody-drug conjugate in which the drug is conjugated to the antibody via a linker.
В приведенных выше фрагментах, L1 представляет собой положение присоединения для антитела, Lc представляет собой положение присоединения для противоопухолевого соединения,In the fragments above, L 1 is the attachment position for an antibody, L c is the attachment position for an anticancer compound,
гдеwhere
n1 представляет целое число от 0 до 6,n 1 represents an integer from 0 to 6,
L1 представляет -(сукцинимид-3-ил-N)-(CH2)n2-C(=O)-, -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-, -C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)- или -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-,L 1 is -(succinimide-3-yl-N)-(CH 2 )n 2 -C(=O)-, -CH 2 -C(=O)-NH-(CH 2 )n 3 -C(= O)-, -C(=O)-cyc. Hex(1,4)-CH 2 -(N-li-3-diminiccus)- or -C(=O)-(CH 2 )n 4 -C( =O)-,
где n2 представляет целое число от 2 до 8, n3 представляет целое число от 1 до 8, n4 представляет целое число от 1 до 8,where n 2 is an integer from 2 to 8, n 3 is an integer from 1 to 8, n 4 is an integer from 1 to 8,
L2 представляет -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, -S-(CH2)n6-C(=O)- или одинарную химическую связь,L 2 is -NH-(CH 2 -CH 2 -O)n 5 -CH 2 -CH 2 -C(=O)-, -S-(CH 2 )n 6 -C(=O)- or a single chemical connection,
где n5 представляет целое число от 1 до 6, n6 представляет целое число от 1 до 6,where n 5 is an integer from 1 to 6, n 6 is an integer from 1 to 6,
LP представляет пептидный остаток, состоящий от 2 до 7 аминокислот,L P is a peptide residue consisting of 2 to 7 amino acids,
La представляет -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O- или одинарную химическую связь,L a represents -C(=O)-NH-, -NR 1 -(CH 2 )n 7 -, -O- or a single chemical bond,
где n7 представляет целое число от 1 до 6, R1 представляет атом водорода, алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, -(CH2)n8-COOH или -(CH2)n9-OH, n8 представляет целое число от 1 до 4, n9 представляет целое число от 1 до 6,where n 7 represents an integer from 1 to 6, R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms, -(CH 2 )n 8 -COOH or -(CH 2 )n 9 -OH, n 8 represents an integer from 1 to 4, n 9 represents an integer from 1 to 6,
Lb представляет -CR2(-R3)-, -O-, -NR4- или одинарную химическую связь,L b represents -CR 2 (-R 3 )-, -O-, -NR 4 - or a single chemical bond,
где R2 и R3 каждый независимо представляет атом водорода, алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-COOH или -(CH2)nc -OH, R4 представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, na представляет целое число от 0 до 6, nb представляет целое число от 1 до 4, nc представляет целое число от 1 до 4, при условии, что когда na равняется 0, R2 и R3 не являются одинаковыми,where R 2 and R 3 each independently represents a hydrogen atom, an alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms, -(CH 2 )n a -NH 2 , -(CH 2 )n b -COOH or -(CH 2 )n c is OH, R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, n a is an integer from 0 to 6, n b is an integer from 1 to 4, n c is an integer from 1 to 4 , provided that when n a is 0, R 2 and R 3 are not the same,
Lc представляет -CH2- или -C(=O)-,L c represents -CH 2 - or -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)- имеет структуру, представленную следующей формулой:-(succinimide-3-yl-N)- has the structure represented by the following formula:
, ,
которая присоединена к антителу в ее положении 3 и присоединена к метиленовой группе в линкерной структуре, имея эту структуру на атоме азота в положении 1,which is attached to the antibody at its position 3 and is attached to the methylene group in the linker structure, having this structure on the nitrogen atom at
-(N-ли-3-диминицкус)- имеет структуру, представленную следующей формулой:-(N-li-3-diminickus)- has a structure represented by the following formula:
, ,
которая присоединена к L2 в ее положении 3 и присоединена к метиленовой группе в линкерной структуре, имея эту структуру на атоме азота в положении 1,which is attached to L 2 at its 3 position and is attached to the methylene group in the linker structure, having this structure on the nitrogen atom at
цик.Гекс(1,4) представляет 1,4-циклогексиленовую группу, иcyc. Hex(1,4) is a 1,4-cyclohexylene group, and
когда L2 представляет собой -S-(CH2)n6-C(=O)-, L1 представляет собой -C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-.when L 2 is -S-(CH 2 )n 6 -C(=O)-, L 1 is -C(=O)-cyc. Hex(1,4)-CH 2 -(N-li- 3-diminickus)-.
[77] Линкер по пункту [76], который выбирают из следующей группы, при условии, что левый конец является положением присоединения к антителу, а правый конец является положением присоединения к противоопухолевому соединению:[77] The linker according to [76], which is selected from the following group, provided that the left end is the position of attachment to the antibody, and the right end is the position of attachment to the antitumor compound:
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) -,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) -,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH- CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (=O )-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH- CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (=O )-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-.
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH- CH 2 -O-CH 2 -C (= O) -,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (=O )-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) -,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH- CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) -,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (=O )-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) -,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C (= O) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH 2 -(N-li-3-diminiscus)-S-CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (=O)-,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-C (= O) -cyc.Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiscus) -S-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-C (= O) -cyc.Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiscus) -S-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-C (= O) -cyc.Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiscus) -S-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH- CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-C (= O) -cyc. Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiscus) -S-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG- NH-CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-C (= O) -cyc. Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiccus) -S-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH 2 -(N-li-3-diminiscus)-S-CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C (= O) -cyc.Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiscus) -S-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C (= O) -cyc.Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiscus) -S-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C (= O) -cyc.Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiscus) -S-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH- CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C (= O) -cyc. Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiscus) -S-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG- NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.-C (= O) -cyc. Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiccus) -S-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-.
[78] Линкер по пункту [76], который выбирают из следующей группы, при условии, что левый конец является положением присоединения к антителу, а правый конец является положением присоединения к противоопухолевому соединению:[78] The linker according to [76], which is selected from the following group, provided that the left end is the position of attachment to the antibody, and the right end is the position of attachment to the antitumor compound:
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-.
[79] Линкер по пункту [76], который выбирают из следующей группы, при условии, что левый конец является положением присоединения к антителу, а правый конец является положением присоединения к противоопухолевому соединению:[79] The linker according to [76], which is selected from the following group, provided that the left end is the position of attachment to the antibody, and the right end is the position of attachment to the antitumor compound:
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-.
[80] Линкер по пункту [76], который выбирают из следующей группы, при условии, что левый конец является положением присоединения к антителу, а правый конец является положением присоединения к противоопухолевому соединению:[80] The linker according to [76], which is selected from the following group, provided that the left end is the position of attachment to the antibody, and the right end is the position of attachment to the antitumor compound:
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-.
Положительные эффекты изобретенияPositive effects of the invention
С помощью конъюгата антитело-лекарственное средство, состоящего из противоопухолевого соединения эксатекан, конъюгированного с антителом через линкер со специфической структурой, может быть получен сильный противоопухолевый эффект и достигнута высокая безопасность при применении.With the antibody-drug conjugate consisting of the antitumor compound exatecan conjugated to an antibody through a linker with a specific structure, a strong antitumor effect can be obtained and a high safety in use can be achieved.
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
[Фигура 1] На фигуре 1 приведена аминокислотная последовательность B7-H3 вариант 1 (SEQ ID NO: 1).[Figure 1] The figure 1 shows the amino acid sequence of B7-H3 option 1 (SEQ ID NO: 1).
[Фигура 2] На фигуре 2 приведена аминокислотная последовательность B7-H3 вариант 2 (SEQ ID NO: 2).[Figure 2] The figure 2 shows the amino acid sequence of B7-H3 option 2 (SEQ ID NO: 2).
[Фигура 3] На фигуре 3 приведена аминокислотная последовательность тяжелой цепи типа M30-H1 (SEQ ID NO: 9).[Figure 3] The figure 3 shows the amino acid sequence of the heavy chain type M30-H1 (SEQ ID NO: 9).
[Фигура 4] На фигуре 4 приведена аминокислотная последовательность тяжелой цепи типа M30-H2 (SEQ ID NO: 10).[Figure 4] Figure 4 shows the amino acid sequence of the M30-H2 type heavy chain (SEQ ID NO: 10).
[Фигура 5] На фигуре 5 приведена аминокислотная последовательность тяжелой цепи типа M30-H3 (SEQ ID NO: 11).[Figure 5] Figure 5 shows the amino acid sequence of the M30-H3 type heavy chain (SEQ ID NO: 11).
[Фигура 6] На фигуре 6 приведена аминокислотная последовательность тяжелой цепи типа M30-H4 (SEQ ID NO: 12).[Figure 6] Figure 6 shows the amino acid sequence of the M30-H4 type heavy chain (SEQ ID NO: 12).
[Фигура 7] На фигуре 7 приведена аминокислотная последовательность легкой цепи типа M30-L1 (SEQ ID NO: 13).[Figure 7] The figure 7 shows the amino acid sequence of the light chain type M30-L1 (SEQ ID NO: 13).
[Фигура 8] На фигуре 8 приведена аминокислотная последовательность легкой цепи типа M30-L2 (SEQ ID NO: 14).[Figure 8] The figure 8 shows the amino acid sequence of the light chain type M30-L2 (SEQ ID NO: 14).
[Фигура 9] На фигуре 9 приведена аминокислотная последовательность легкой цепи типа M30-L3 (SEQ ID NO: 15).[Figure 9] The figure 9 shows the amino acid sequence of the light chain type M30-L3 (SEQ ID NO: 15).
[Фигура 10] На фигуре 10 приведена аминокислотная последовательность легкой цепи типа M30-L4 (SEQ ID NO: 16).[Figure 10] The figure 10 shows the amino acid sequence of the light chain type M30-L4 (SEQ ID NO: 16).
[Фигура 11] На фигуре 11 приведена аминокислотная последовательность легкой цепи типа M30-L5 (SEQ ID NO: 17).[Figure 11] The figure 11 shows the amino acid sequence of the light chain type M30-L5 (SEQ ID NO: 17).
[Фигура 12] На фигуре 12 приведена аминокислотная последовательность легкой цепи типа M30-L6 (SEQ ID NO: 18).[Figure 12] The figure 12 shows the amino acid sequence of the light chain type M30-L6 (SEQ ID NO: 18).
[Фигура 13] На фигуре 13 приведена аминокислотная последовательность легкой цепи типа M30-L7 (SEQ ID NO: 19).[Figure 13] The figure 13 shows the amino acid sequence of the light chain type M30-L7 (SEQ ID NO: 19).
[Фигура 14] На фигуре 14 приведена аминокислотная последовательность тяжелой цепи M30 антитела (SEQ ID NO: 20).[Figure 14] Figure 14 shows the amino acid sequence of the M30 antibody heavy chain (SEQ ID NO: 20).
[Фигура 15] На фигуре 15 приведена аминокислотная последовательность легкой цепи M30 антитела (SEQ ID NO: 21).[Figure 15] Figure 15 shows the amino acid sequence of the M30 antibody light chain (SEQ ID NO: 21).
[Фигура 16] На фигуре 16 приведена нуклеотидная последовательность B7-H3 вариант 1 (SEQ ID NO: 26).[Figure 16] Figure 16 shows the nucleotide sequence of B7-H3 variant 1 (SEQ ID NO: 26).
[Фигура 17] На фигуре 17 показано воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (2) на трансплантированные под кожу клетки меланомы человека линии A375. На чертеже, линия с незакрашенными ромбами иллюстрирует результаты для не подвергнутой лечению опухоли, линия с незакрашенными треугольниками иллюстрирует воздействие M30-H1-L4P антитела, и линия с незакрашенными кружками иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (2).[Figure 17] Figure 17 shows the effect of the antibody-drug conjugate (2) on A375 human melanoma cells transplanted under the skin. In the figure, the line with open diamonds illustrates the results for an untreated tumor, the line with open triangles illustrates the effect of the M30-H1-L4P antibody, and the line with open circles illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (2).
[Фигура 18] На фигуре 18 показано воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (2) на трансплантированные под кожу клетки меланомы человека линии A375. Линия с незакрашенными ромбами иллюстрирует результаты для не подвергнутой лечению опухоли, линия с закрашенными квадратами иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (2), введенного при дозе 0,1 мг/кг, линия со знаками в виде X иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (2), введенного при дозе 0,3 мг/кг, линия с закрашенными треугольниками иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (2), введенного при дозе 1 мг/кг, и линия с незакрашенными кружками иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (2), введенного при дозе 3 мг/кг.[Figure 18] Figure 18 shows the effect of the antibody-drug conjugate (2) on A375 human melanoma cells transplanted under the skin. The line with open diamonds illustrates the results for an untreated tumor, the line with solid squares illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (2) administered at a dose of 0.1 mg/kg, the line with X-marks illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (2) administered at a dose of 0.3 mg/kg, the line with filled triangles illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (2) administered at a dose of 1 mg/kg, and the line with open circles illustrates the effect of the antibody-drug conjugate ( 2) administered at a dose of 3 mg/kg.
[Фигура 19] На фигуре 19 показано воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (2) на трансплантированные под кожу клетки немелкоклеточного рака легкого человека линии Calu-6. Линия с незакрашенными ромбами иллюстрирует результаты для не подвергнутой лечению опухоли, линия с незакрашенными треугольниками иллюстрирует воздействие M30-H1-L4P антитела, и линия с незакрашенными кружками иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (2).[Figure 19] Figure 19 shows the effect of the antibody-drug conjugate (2) on Calu-6 human non-small cell lung cancer cells transplanted under the skin. The line with open diamonds illustrates the results for an untreated tumor, the line with open triangles illustrates the effect of the M30-H1-L4P antibody, and the line with open circles illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (2).
[Фигура 20] На фигуре 20 показаны воздействия конъюгатов антитело-лекарственное средство (1), (13), (41) и (55) на трансплантированные под кожу клетки меланомы человека линии A375. На чертеже, линия с незакрашенными ромбами иллюстрирует результаты для не подвергнутой лечению опухоли, линия с незакрашенными кружками иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (1), линия с незакрашенными треугольниками иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (13), линия со знаками в виде X иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (41), и линия с незакрашенными квадратами иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (55).[Figure 20] Figure 20 shows the effects of antibody-drug conjugates (1), (13), (41) and (55) on A375 human melanoma cells transplanted under the skin. In the drawing, the line with open diamonds illustrates the results for an untreated tumor, the line with open circles illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (1), the line with open triangles illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (13), the line with signs in the form X illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (41), and the line with open squares illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (55).
[Фигура 21] На фигуре 21 показаны воздействия конъюгатов антитело-лекарственное средство (13), (41) и (55) на трансплантированные под кожу клетки немелкоклеточного рака легкого человека линии Calu-6. Линия с незакрашенными ромбами иллюстрирует результаты для не подвергнутой лечению опухоли, линия с незакрашенными кружками иллюстрирует воздействие DE-310, линия с незакрашенными треугольниками иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (13), линия со знаками в виде X иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (41), и линия с незакрашенными квадратами иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (55).[Figure 21] Figure 21 shows the effects of antibody-drug conjugates (13), (41) and (55) on Calu-6 human non-small cell lung cancer cells transplanted under the skin. The line with open diamonds illustrates the results for an untreated tumor, the line with open circles illustrates the effect of DE-310, the line with open triangles illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (13), the line with X signs illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (41), and the line with open squares illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (55).
[Фигура 22] На фигуре 22 показаны воздействия конъюгатов антитело-лекарственное средство (17), (18), (19), (59), (60) и (61) на трансплантированные под кожу клетки меланомы человека линии A375. На чертеже, линия с закрашенными ромбами иллюстрирует результаты для не подвергнутой лечению опухоли, линия с закрашенными квадратами иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (17), линия с незакрашенными квадратами иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (18), линия с незакрашенными кружками иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (19), линия с закрашенными треугольникамии иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (59), линия с незакрашенными треугольниками иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (60), и линия со знаками в виде X иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (61).[Figure 22] Figure 22 shows the effects of antibody-drug conjugates (17), (18), (19), (59), (60) and (61) on A375 human melanoma cells transplanted under the skin. In the figure, the line with filled diamonds illustrates the results for an untreated tumor, the line with filled squares illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (17), the line with open squares illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (18), the line with open circles illustrates antibody drug conjugate exposure (19), the line with filled triangles illustrates the antibody drug conjugate exposure (59), the open triangle line illustrates the antibody drug conjugate exposure (60), and the X-shaped line illustrates the conjugate exposure antibody drug (61).
Описание вариантов осуществленияDescription of Embodiments
Конъюгат антитело-лекарственное средство настоящего изобретения представляет собой противоопухолевое лекарственное средство, в котором противоопухолевое антитело конъюгировано с противоопухолевым соединением с помощью фрагмента линкерной структуры, и далее он описывается более подробно.The antibody-drug conjugate of the present invention is an antitumor drug in which an antitumor antibody is conjugated to an antitumor compound by a linker structure fragment, and is described in more detail below.
АнтителоAntibody
Антитело, используемое в конъюгате антитело-лекарственное средство настоящего изобретения, является иммуноглобулином и представляет собой молекулу, содержащую антигенсвязывающий центр, иммуноспецифически связывающий антиген. Класс антитела настоящего изобретения может быть любым из IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY, и предпочтительным является IgG. Субкласс антитела настоящего изобретения может быть любым из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2, и предпочтительным является IgG1 или IgG2. Антитело может быть получено из любых биологических видов, и предпочтительные примеры биологических видов могут включать людей, крыс, мышей и кроликов. При получении антитела от видов, не относящихся к человеку, предпочтительно, чтобы антитело подвергали химеризации или гуманизации, используя хорошо известную методику. Антитело настоящего изобретения может представлять собой поликлональное антитело или моноклональное антитело и, предпочтительно, чтобы оно являлось моноклональным антителом.The antibody used in the antibody-drug conjugate of the present invention is an immunoglobulin and is a molecule containing an antigen-binding center that immunospecifically binds an antigen. The antibody class of the present invention may be any of IgG, IgE, IgM, IgD, IgA and IgY, and IgG is preferred. The subclass of an antibody of the present invention can be any of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2, and IgG1 or IgG2 is preferred. The antibody may be derived from any species, and preferred examples of species may include humans, rats, mice, and rabbits. When preparing an antibody from a non-human species, it is preferred that the antibody be chimerized or humanized using a well known technique. The antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and is preferably a monoclonal antibody.
Антитело настоящего изобретения может представлять собой антитело, которое способно целенаправленно воздействовать на опухолевые клетки. Так как антитело настоящего изобретения конъюгировано с обладающим противоопухолевым действием лекарственным средством с помощью линкера, предпочтительно, чтобы антитело обладало одним или более из свойств, таких как распознавание опухолевых клеток, связывание опухолевых клеток, интернализация в опухолевых клетках и повреждение опухолевых клеток.The antibody of the present invention may be an antibody that is capable of targeting tumor cells. Since the antibody of the present invention is conjugated to an antitumor drug via a linker, it is preferable that the antibody has one or more of the properties of tumor cell recognition, tumor cell binding, internalization in tumor cells, and tumor cell damage.
Связывающая активность антитела в отношении опухолевых клеток может быть подтверждена способом проточной цитометрии. Интернализация антитела в опухолевых клетках может быть подтверждена (1) путем визуализации антитела, введенного в клетки, с помощью флуоресцентного микроскопа, используя вторичное антитело (флуоресцентно меченое), которое связывает терапевтическое антитело (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) путем измерения величины флуоресценции, введенной в клетки, используя вторичное антитело (флуоресцентно меченое), которое связывает терапевтическое антитело (Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 5268-5282, December 2004) или путем (3) исследования Mab-ZAP (моноклональное антитело-маркерный белок), используя иммунотоксин, связывающий терапевтическое антитело, при котором токсин высвобождается при введении в клетки, ингибируя клеточный рост (Bio Techniques 28: 162-165, January 2000).The binding activity of the antibody against tumor cells can be confirmed by flow cytometry. Internalization of the antibody in tumor cells can be confirmed (1) by visualizing the antibody introduced into the cells under a fluorescent microscope using a secondary antibody (fluorescently labeled) that binds the therapeutic antibody (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761) , (2) by measuring the amount of fluorescence introduced into cells using a secondary antibody (fluorescently labeled) that binds the therapeutic antibody (Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 5268-5282, December 2004) or by (3) assaying Mab -ZAP (monoclonal antibody marker protein), using an immunotoxin that binds a therapeutic antibody, in which the toxin is released when injected into cells, inhibiting cell growth (Bio Techniques 28: 162-165, January 2000).
Под противоопухолевым действием антитела подразумевают цитотоксическое действие или разрушающее действие в отношении опухолевых клеток, и оно может быть подтверждено in vitro путем определения ингибирующей активности в отношении клеточного роста. Например, культивируют линию опухолевых клеток, сверхэкспрессирующих белок-мишень для антитела, и добавляют антитело при различных концентрациях в культуральную систему для определения ингибирующей активности в отношении образования очага, колониеобразования и сфероидного роста. Противоопухолевое действие может быть подтверждено in vivo, например, путем введения антитела "голой" мыши с трансплантированными опухолевыми клетками, которые высоко экспрессируют белок-мишень, и определения изменений в опухолевой клетке. Так как лекарственное средство, превращенное в конъюгат антитело-лекарственное средство, оказывает противоопухолевое действие, более предпочтительно, но не обязательно, чтобы само по себе антитело также имело бы противоопухолевое действие. Для того чтобы лекарственное средство оказывало противоопухолевое действие, а также специфически и селективно повреждало опухолевые клетки, важно, а также и предпочтительно, чтобы антитело обладало бы свойством интернализации для миграции в опухолевые клетки.By anti-tumor activity of an antibody is meant a cytotoxic effect or a destructive effect on tumor cells, and it can be confirmed in vitro by determining the inhibitory activity on cell growth. For example, a tumor cell line overexpressing a target protein for an antibody is cultured, and the antibody is added at various concentrations to the culture system to determine the inhibitory activity on lesion formation, colony formation, and spheroid growth. Antitumor activity can be confirmed in vivo , for example, by injecting an antibody into nude mice transplanted with tumor cells that highly express the target protein and detecting changes in the tumor cell. Since the drug converted into the antibody-drug conjugate has an antitumor effect, it is more preferable, but not necessary, that the antibody itself would also have an antitumor effect. In order for a drug to have an antitumor effect and to specifically and selectively damage tumor cells, it is important, as well as preferred, that the antibody has the property of internalization to migrate into tumor cells.
Примеры такого антитела могут включать, но этим не ограничивая, анти-A33 антитело, анти-B7-H3 антитело, анти-CanAg антитело, анти-CD20 антитело, анти-CD22 антитело, анти-CD30 антитело, анти-CD33 антитело, анти-CD56 антитело, анти-CD70 антитело, анти-CEA антитело, анти-Cripto антитело, анти-EphA2 антитело, анти-G250 антитело, анти-MUC1 антитело, анти-GPNMB антитело, анти-интегрин антитело, анти-PSMA антитело, анти-тенасцин-C антитело, анти-SLC44A4 антитело и анти-мезотелин антитело.Examples of such an antibody may include, but are not limited to, anti-A33 antibody, anti-B7-H3 antibody, anti-CanAg antibody, anti-CD20 antibody, anti-CD22 antibody, anti-CD30 antibody, anti-CD33 antibody, anti- CD56 antibody, anti-CD70 antibody, anti-CEA antibody, anti-Cripto antibody, anti-EphA2 antibody, anti-G250 antibody, anti-MUC1 antibody, anti-GPNMB antibody, anti-integrin antibody, anti-PSMA antibody, anti- tenascin-C antibody, anti-SLC44A4 antibody and anti-mesothelin antibody.
Предпочтительно, чтобы антитело настоящего изобретения представляло собой анти-CD30 антитело, анти-CD33 антитело, анти-CD70 антитело или анти-B7-H3 антитело, и, более предпочтительно, анти-B7-H3 антитело.Preferably, the antibody of the present invention is an anti-CD30 antibody, an anti-CD33 antibody, an anti-CD70 antibody, or an anti-B7-H3 antibody, and more preferably an anti-B7-H3 antibody.
Антитело настоящего изобретения может быть получено обычно применяемым в этой области науки способом, который включает иммунизирование животных полипептидом с антигенными свойствами и сбор, и очистку продуцируемых in vivo антител. Для людей, происхождение антигена не является ограничивающим фактором, и животные могут быть иммунизированы антигеном, полученным от не принадлежащего к человеческому роду животного, такого как мышь, крыса и другие подобные животные. В этом случае, может быть протестирована перекрестная отвечаемость антител, связывающих полученный гетерологичный антиген с человеческими антигенами, с целью выявления антитела, которое можно применять при заболевании у людей.The antibody of the present invention can be obtained by a method commonly used in this field of science, which includes immunizing animals with a polypeptide with antigenic properties and collecting and purifying antibodies produced in vivo . For humans, the origin of the antigen is not a limiting factor, and animals can be immunized with an antigen derived from a non-human animal such as a mouse, rat, and the like. In this case, the cross-response of antibodies binding the resulting heterologous antigen to human antigens can be tested to identify an antibody that can be used in human disease.
В качестве варианта, проводят слияние антитело-продуцирующих клеток, которые продуцируют антитела против антигена, с клетками миеломы в соответствии с хорошо известным в этой области науки способом (например, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; и Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) с образованием гибридом, из которых могут быть в свою очередь получены моноклональные антитела.Alternatively, antibody-producing cells that produce antibodies against the antigen are fused to myeloma cells according to a method well known in the art (e.g., Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; and Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, N. Y. (1980)) to form hybridomas, from which monoclonal antibodies can in turn be derived.
Антиген может быть получен из клеток-хозяина способом генной инженерии с продуцированием гена, кодирующего антигенный белок. В частности, приготавливают векторы, которые делают возможным экспрессию гена антигена, и переносят их в клетки-хозяина, в результате чего экспрессируется ген. Экспрессируемый таким образом ген может быть очищен.The antigen can be obtained from host cells by genetic engineering to produce a gene encoding an antigenic protein. In particular, vectors are prepared that allow expression of the antigen gene and transferred to host cells, whereby the gene is expressed. The gene thus expressed can be purified.
Анти-CD30 антитело, анти-CD33 антитело и анти-CD70 антитело могут быть получены известным в этой области науки способом, описанным в патентных документах WO2002/043661, U.S. 5773001 и WO2006/113909, соответственно.An anti-CD30 antibody, an anti-CD33 antibody, and an anti-CD70 antibody can be prepared in a manner known in the art as described in U.S. Patent Documents WO2002/043661. 5773001 and WO2006/113909, respectively.
Предпочтительно, чтобы используемое в настоящем изобретении B7-H3 антитело представляло собой антитело, обладающее приведенными ниже свойствами.Preferably, the B7-H3 antibody used in the present invention is an antibody having the following properties.
(1) Антитело, обладающее следующими свойствами:(1) An antibody having the following properties:
(a) специфического связывания с B7-H3,(a) specific binding to B7-H3,
(b) наличия антителозависимой клеточно-опосредованной фагоцитарной (ADCP) активности, и(b) the presence of antibody-dependent cell-mediated phagocytic (ADCP) activity, and
(c) наличия противоопухолевого действия in vivo.(c) having antitumor activity in vivo .
(2) Антитело по пункту (1), где B7-H3 представляет собой молекулу, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1 или 2.(2) The antibody of (1), wherein B7-H3 is a molecule comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
(3) Антитело по пункту (1) или (2), где антитело имеет CDRH1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 3, CDRH2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 4, и CDRH3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5, в качестве областей тяжелой цепи, определяющих комплементарность, и CDRL1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6, CDRL2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 7, и CDRL3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8, в качестве областей легкой цепи, определяющих комплементарность.(3) The antibody according to (1) or (2), wherein the antibody has a CDRH1 comprising the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 3, a CDRH2 including the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4, and a CDRH3 including the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4, set forth in SEQ ID NO: 5 as complementarity determining regions of the heavy chain, and CDRL1 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, CDRL2 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, and CDRL3 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7 shown in SEQ ID NO: 8 as light chain complementarity determining regions.
(4) Антитело по любому пункту из (1)-(3), где его константная область представляет собой полученную от человека константную область.(4) An antibody according to any one of (1) to (3), wherein its constant region is a human-derived constant region.
(5) Антитело по любому пункту из (1)-(4), где антитело представляет собой гуманизированное антитело.(5) An antibody according to any one of (1) to (4), wherein the antibody is a humanized antibody.
(6) Антитело по пункту (5), где антитело имеет вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (a) аминокислотной последовательности, описанной в позициях 20-141 аминокислоты в SEQ ID NO: 9, (b) аминокислотной последовательности, описанной в позициях 20-141 аминокислоты, в SEQ ID NO: 10, (c) аминокислотной последовательности, описанной в позициях 20-141 аминокислоты в SEQ ID NO: 11, (d) аминокислотной последовательности, описанной в позициях 20-141 аминокислоты в SEQ ID NO: 12, (e) аминокислотной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 95% или более высокую гомологию для любой из последовательностей (a)-(d), и (f) аминокислотной последовательности, полученной из любой из последовательностей (a)-(d) путем делеций, замен или добавлений, по меньшей мере, одной аминокислоты, и вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (g) аминокислотной последовательности, описанной в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 13, (h) аминокислотной последовательности, описанной в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 14, (i) аминокислотной последовательности, описанной в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 15, (j) аминокислотной последовательности, описанной в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 16, (k) аминокислотной последовательности, описанной в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 17, (l) аминокислотной последовательности, описанной в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 18, (m) аминокислотной последовательности, описанной в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 19, (n) аминокислотной последовательности, имеющей, по меньшей мере, 95% или более высокую гомологию для любой из последовательностей (g)-(m), и (o) аминокислотной последовательности, полученной из любой из последовательностей (g)-(m) путем делеций, замен или добавлений, по меньшей мере, одной аминокислоты.(6) The antibody of (5), wherein the antibody has a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of (a) the amino acid sequence described at amino acid positions 20-141 of SEQ ID NO: 9, (b ) the amino acid sequence described at amino acid positions 20-141 of SEQ ID NO: 10, (c) the amino acid sequence described at amino acid positions 20-141 of SEQ ID NO: 11, (d) the amino acid sequence described at positions 20- 141 amino acids in SEQ ID NO: 12, (e) an amino acid sequence having at least 95% or higher homology to any of the sequences (a)-(d), and (f) an amino acid sequence derived from any of sequences (a)-(d) by deletions, substitutions or additions of at least one amino acid, and a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of (g) an amino acid sequence of the sequence described at amino acid positions 21-128 of SEQ ID NO: 13, (h) the amino acid sequence described at amino acid positions 21-128 of SEQ ID NO: 14, (i) the amino acid sequence described at amino acid positions 21-128 of SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, (j) the amino acid sequence described at amino acid positions 21-128 of SEQ ID NO: 16, (k) the amino acid sequence described at amino acid positions 21-128 of SEQ ID NO: 17, (l) amino acid the sequence described at amino acid positions 21-128 of SEQ ID NO: 18, (m) the amino acid sequence described at amino acid positions 21-128 of SEQ ID NO: 19, (n) the amino acid sequence having at least 95% or higher homology for any of the sequences (g)-(m), and (o) an amino acid sequence derived from any of the sequences (g)-(m) by deletions, substitutions or additions of at least one amino acid.
(7) Антитело по пункту (6), где антитело имеет вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 20-141 аминокислоты в SEQ ID NO: 9, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 13, вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 20-141 аминокислоты в SEQ ID NO: 9, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 14, вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 20-141 аминокислоты в SEQ ID NO: 9, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 15, вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 20-141 аминокислоты в SEQ ID NO: 9, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 16, вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 20-141 аминокислоты в SEQ ID NO: 9, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 17, вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 20-141 аминокислоты в SEQ ID NO: 9, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 18, вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 20-141 аминокислоты в SEQ ID NO: 9, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 19, вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 20-141 аминокислоты в SEQ ID NO: 12, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 13, вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 20-141 аминокислоты в SEQ ID NO: 12, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 14, вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 20-141 аминокислоты в SEQ ID NO: 12, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 15, и вариабельной области тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 20-141 аминокислоты в SEQ ID NO: 12, и вариабельной области легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в позициях 21-128 аминокислоты в SEQ ID NO: 16.(7) The antibody of (6), wherein the antibody has a heavy chain variable region and a light chain variable region selected from the group consisting of a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 21-128 of SEQ ID NO: 13, a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-141 of SEQ ID NO: 9, and a light chain variable region comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 21-128 of SEQ ID NO: 14, a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-141 of SEQ ID NO: 9, and a light chain variable region chain comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 21-128 in SEQ ID NO: 15, variable about a heavy chain region comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 21-128 of SEQ ID NO: 16 of the heavy chain variable region , comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-141 of SEQ ID NO: 9, and the light chain variable region comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 21-128 of SEQ ID NO: 17, the heavy chain variable region comprising the amino acid the sequence described at amino acid positions 20-141 of SEQ ID NO: 9, and the light chain variable region comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 21-128 of SEQ ID NO: 18, the heavy chain variable region comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-141 of SEQ ID NO: 9, and the light chain variable region, including the amino acid sequence described at amino acid positions 21-128 of SEQ ID NO: 19, the heavy chain variable region comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-141 of SEQ ID NO: 12, and the light chain variable region comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 21-128 of SEQ ID NO: 13, a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-141 of SEQ ID NO: 12, and a light chain variable region comprising the amino acid sequence described in amino acid positions 21-128 of SEQ ID NO: 14, a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-141 of SEQ ID NO: 12, and a light chain variable region comprising the amino acid sequence described at positions 21- 128 amino acids in SEQ ID NO: 15, and a heavy chain variable region comprising the amino acid the sequence described at amino acid positions 20-141 of SEQ ID NO: 12 and the light chain variable region comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 21-128 of SEQ ID NO: 16.
(8) Антитело по пункту (6) или (7), где антитело включает тяжелую цепь и легкую цепь, выбранную из группы, состоящей из тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 20-471 аминокислоты в SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 13, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 20-471 аминокислоты в SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 14, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 20-471 аминокислоты в SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 15, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 20-471 аминокислоты в SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 16, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 20-471 аминокислоты в SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 17, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 20-471 аминокислоты в SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 18, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 20-471 аминокислоты в SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 19, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 20-471 аминокислоты в SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 13, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 20-471 аминокислоты в SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 14, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 20-471 аминокислоты в SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 15, и тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 20-471 аминокислоты в SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях 21-233 в SEQ ID NO: 16.(8) The antibody of (6) or (7), wherein the antibody comprises a heavy chain and a light chain selected from the group consisting of a heavy chain comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-471 of SEQ ID NO: 9, and a light chain comprising the amino acid sequence described at positions 21-233 of SEQ ID NO: 13, a heavy chain comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-471 of SEQ ID NO: 9, and a light chain comprising the amino acid sequence, described at positions 21-233 of SEQ ID NO: 14, a heavy chain comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-471 of SEQ ID NO: 9, and a light chain comprising the amino acid sequence described at positions 21-233 of SEQ ID NO: 15, a heavy chain comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-471 of SEQ ID NO: 9, and a light chain comprising the amino acid sequence described at position 21-233 of SEQ ID NO: 16, a heavy chain comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-471 of SEQ ID NO: 9, and a light chain comprising the amino acid sequence described at positions 21-233 of SEQ ID NO : 17, a heavy chain comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising the amino acid sequence described at positions 21-233 of SEQ ID NO: 18, a heavy chain comprising the amino acid the sequence described at amino acid positions 20-471 of SEQ ID NO: 9 and the light chain comprising the amino acid sequence described at positions 21-233 of SEQ ID NO: 19, the heavy chain comprising the amino acid sequence described at positions 20-471 amino acids in SEQ ID NO: 12, and a light chain comprising the amino acid sequence described at positions 21-233 in SEQ ID NO: 13, a heavy chain comprising the amino acid sequence described in sledge at amino acid positions 20-471 of SEQ ID NO: 12, and a light chain comprising the amino acid sequence described at positions 21-233 of SEQ ID NO: 14, a heavy chain comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-471 of SEQ ID NO: 14. SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising the amino acid sequence described at positions 21-233 of SEQ ID NO: 15 and a heavy chain comprising the amino acid sequence described at amino acid positions 20-471 of SEQ ID NO: 12, and a light chain comprising the amino acid sequence described at positions 21-233 of SEQ ID NO: 16.
(9) Антитело по любому пункту из (6)-(8), где антитело включает тяжелую цепь и легкую цепь, выбранную из группы, состоящей из тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 13, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 14, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 16, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 18, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 13, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 14, тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, и тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 16.(9) The antibody according to any one of (6) to (8), wherein the antibody comprises a heavy chain and a light chain selected from the group consisting of a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 13 of the heavy chain comprising the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 9 and the light chain comprising the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14 of the heavy chain comprising the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: : 9, and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, a heavy chain, comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17, a heavy chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, and a light chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, a heavy chain comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12, and a light chain comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 and a heavy chain comprising the amino acid sequence represented by 12, and a light chain comprising the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 16.
(10) Антитело по пункту (8) или (9), где антитело не имеет аминокислоты на карбоксильном конце аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 9 или 12, в тяжелой цепи.(10) The antibody of (8) or (9), wherein the antibody does not have an amino acid at the carboxyl terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 12 in the heavy chain.
(11) Антитело, полученное способом продуцирования антитела по любому пункту из (1)-(10), где способ включает стадии: культивирования клетки-хозяина, трансформированной в результате экспрессии вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий антитело; и сбора рассматриваемого антитела из культур, полученных на предыдущей стадии.(11) An antibody obtained by the antibody production method of any one of (1) to (10), wherein the method includes the steps of: culturing a host cell transformed by expression of a vector containing a polynucleotide encoding an antibody; and harvesting the antibody in question from the cultures obtained in the previous step.
(12) Антитело по любому пункту из (1)-(11), где контролируется модификация гликана с целью повышения антитело-зависимой цитотоксической активности.(12) An antibody according to any one of (1) to (11), wherein modification of the glycan is controlled to enhance antibody-dependent cytotoxic activity.
Далее описывается используемое в изобретении B7-H3 антитело.The following describes the B7-H3 antibody used in the invention.
Используемые в изобретении термины "рак" и "опухоль" являются взаимозаменяемыми.Used in the invention, the terms "cancer" and "tumor" are used interchangeably.
Используемый в изобретении термин "ген" включает не только ДНК, но также его матричную РНК, его комплементарную ДНК и его комплементарную РНК.As used herein, the term "gene" includes not only DNA, but also its messenger RNA, its complementary DNA, and its complementary RNA.
Используемый в изобретении термин "полинуклеотид" имеет то же самое значение, что и нуклеиновая кислота, и также включает ДНК, РНК, зонды, олигонуклеотиды и праймеры.As used herein, the term "polynucleotide" has the same meaning as nucleic acid and also includes DNA, RNA, probes, oligonucleotides and primers.
Используемые в изобретении термины "полипептид" и "белок" являются взаимозаменяемыми.Used in the invention, the terms "polypeptide" and "protein" are used interchangeably.
Используемый в изобретении термин "клетка" также включает клетки животного индивидуума и культивированные клетки.Used in the invention, the term "cell" also includes cells of an animal individual and cultured cells.
Используемый в изобретении термин "B7-H3" являются взаимозаменяемым с B7-H3 белком и, кроме того, относится к B7-H3 варианту 1 и/или B7-H3 варианту 2.The term "B7-H3" as used herein is interchangeable with B7-H3 protein and further refers to B7-
Используемый в изобретении термин "CDR" обозначает определяющую комплементарность область (CDR), и известно, что каждая тяжелая и легкая цепь молекулы антитела имеет три определяющих комплементарность области (CDR). Термином CDR также обозначают гипервариабельную область, и она присутствует в вариабельной области каждой тяжелой и легкой цепи антитела. Она является местом, которое имеет необычно высокую изменчивость ее первичной структуры, и имеется три отдельных CDR в первичной структуре каждой тяжелой и легкой полипептидной цепи. Что касается определяющих комплементарность областей антитела в этом изобретении, то определяющие комплементарность области антитела тяжелой цепи представлены CDRH1, CDRH2 и CDRH3 из амино-терминальной стороны аминокислотной последовательности тяжелой цепи, и определяющие комплементарность области легкой цепи представлены CDRL1, CDRL2 и CDRL3 из амино-терминальной стороны аминокислотной последовательности легкой цепи. Эти сайты находятся рядом друг с другом в трет-ичной структуре и определяют специфичность антигена, с которым связывается антитело.As used herein, the term "CDR" refers to a complementarity determining region (CDR), and each heavy and light chain of an antibody molecule is known to have three complementarity determining regions (CDRs). The term CDR also refers to the hypervariable region and is present in the variable region of each heavy and light chain of an antibody. It is a site that has unusually high variability in its primary structure, and there are three distinct CDRs in the primary structure of each heavy and light polypeptide chain. With respect to the complementarity-determining regions of an antibody in this invention, the complementarity-determining regions of a heavy chain antibody are represented by CDRH1, CDRH2, and CDRH3 from the amino-terminal side of the amino-terminal side of the heavy chain, and the complementarity-determining regions of the light chain are represented by CDRL1, CDRL2, and CDRL3 from the amino-terminal side. light chain amino acid sequence. These sites are adjacent to each other in the tertiary structure and determine the specificity of the antigen to which the antibody binds.
Используемое в изобретении выражение "гибридизацию осуществляют в строго соблюдаемых условиях" относится к способу, в котором гибридизацию проводят в условиях, при которых требуемый результат может быть достигнут путем проведения гибридизации при 68°C в выпускаемом промышленностью гибридизационном растворе ExpressHyb Hybridization Раствор (фирмы Clontech, Inc.) или путем проведения гибридизации при 68°C в присутствии от 0,7 до 1,0 М NaCl с использованием фильтра с иммобилизированной на нем ДНК, и затем промывки при 68°C, используя от 0,1 до 2х раствора SSC (1х SSC раствор состоит из 150 мМ NaCl и 15 мМ цитрата натрия), или в условиях, эквивалентных указанным выше.As used in the invention, "hybridization is carried out under strictly observed conditions" refers to a method in which hybridization is carried out under conditions under which the desired result can be achieved by carrying out hybridization at 68°C in a commercially available ExpressHyb Hybridization Solution Solution (manufactured by Clontech, Inc. .) or by carrying out hybridization at 68°C in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter with DNA immobilized on it, and then washing at 68°C using 0.1 to 2x SSC solution (1x The SSC solution consists of 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate), or under conditions equivalent to those above.
1. B7-H31.B7-H3
В7-Н3 является представителем семейства B7, который экспрессирует на антигенпредставляющих клетках в качестве ко-стимулирующей молекулы, и, который, как полагают, воздействует на рецептор Т-клеток с повышением или подавлением иммунной активности.B7-H3 is a member of the B7 family that is expressed on antigen presenting cells as a co-stimulatory molecule and is believed to act on the T cell receptor to increase or suppress immune activity.
В7-Н3 представляет собой белок, имеющий однопроходную трансмембранную структуру, и N-концевой внеклеточный домен В7-Н3 содержит два варианта. В7-Н3 вариант 1 (4Ig-В7-Н3) содержит V-подобный или С-подобный домен Ig в двух местах, соответственно, и Н3-В7 вариант 2 (2Ig-В7-Н3) содержит V-подобный или С-Ig-подобный домен в одном месте, соответственно.B7-H3 is a protein having a single-pass transmembrane structure, and the N-terminal extracellular domain of B7-H3 contains two variants. B7-H3 variant 1 (4Ig-B7-H3) contains a V-like or C-like Ig domain at two locations, respectively, and H3-B7 variant 2 (2Ig-B7-H3) contains a V-like or C-Ig- a similar domain in one place, respectively.
Что касается использования В7-Н3 в настоящем изобретении, то В7-Н3 может быть непосредственно очищен от В7-Н3-экспрессирующих клеток человека или не относящегося к человеку млекопитающего (например, крысы или мыши) и использован, или из вышеописанных клеток может быть получена и использована фракция клеточных мембран. Кроме того, В7-Н3 может быть получен in vitro синтезом или продуцированием в клетке-хозяине с помощью генной инженерии. При генной инженерии, в частности, после того как В7-Н3 кДНК встраивают в вектор, способный экспрессировать B7-H3 кДНК, В7-Н3 может быть получен путем синтеза в растворе, содержащем фермент, субстрат и энергетическое вещество, необходимые для транскрипции и трансляции, или путем экспрессии В7-Н3 в другой прокариотической или эукариотически-трансформированной клетке-хозяине.With regard to the use of B7-H3 in the present invention, B7-H3 can be directly purified from B7-H3 expressing cells of a human or non-human mammal (e.g. rat or mouse) and used, or from the above cells can be obtained and a fraction of cell membranes was used. In addition, B7-H3 can be obtained by in vitro synthesis or production in a host cell using genetic engineering. In genetic engineering, in particular, after B7-H3 cDNA is inserted into a vector capable of expressing B7-H3 cDNA, B7-H3 can be obtained by synthesis in a solution containing an enzyme, a substrate, and an energy substance necessary for transcription and translation, or by expressing B7-H3 in another prokaryotic or eukaryotic-transformed host cell.
Аминокислотная последовательность открытой рамки считывания (ORF) гена человеческого В7-Н3 вариант 1 представлена последовательностью SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей. Кроме того, последовательность SEQ ID NO: 1 приведена на фиг. 1.The amino acid sequence of the open reading frame (ORF) of the human B7-
Аминокислотная последовательность открытой рамки считывания (ORF) гена человеческого В7-Н3 вариант 2 представлена на SEQ ID NO: 2 в списке последовательностей. Кроме того, последовательность SEQ ID NO: 2 приведена на фиг. 2.The amino acid sequence of the open reading frame (ORF) of the human B7-H3 variant 2 gene is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. In addition, the sequence of SEQ ID NO: 2 is shown in FIG. 2.
Кроме того, белок, который состоит из аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько аминокислот замещены, удалены и/или добавлены в любую из описанных выше аминокислотных последовательностей В7-Н3, но также имеет биологическую активность, эквивалентную биологической активности белка, тоже относится к B7-H3.In addition, a protein that consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted and/or added to any of the B7-H3 amino acid sequences described above, but also has a biological activity equivalent to that of the protein, also belongs to B7 -H3.
Зрелый В7-Н3 вариант 1 человека, из которого была удалена сигнальная последовательность, соответствует аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 27-534 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 1. Кроме того, зрелый B7-H3 вариант 2 человека, из которого была удалена сигнальная последовательность, соответствует аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков 27-316 аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2.The mature human B7-
2. Получение анти-В7-Н3 антитела2. Obtaining anti-B7-H3 antibodies
Антитело против В7-Н3 по изобретению может быть получено путем иммунизации животного с помощью В7-Н3 или произвольного полипептида, выбранного из аминокислотной последовательности В7-Н3, и сбора и очистки антитела, полученного in vivo в соответствии с общеизвестной методикой. В случае человека, биологические виды B7-H3, используемые в качестве антигена, конкретно не ограничивают, и животное может быть иммунизировано с помощью B7-H3, полученного от животного, не относящегося к человеку, такого как мышь или крыса. В этом случае, антитело, которое можно применять при заболевании человека, может быть выбраны на основе анализа перекрестной реактивности между антителом, связывающим получаемый гетерологический B7-H3, и B7-H3 человека.An anti-B7-H3 antibody of the invention can be prepared by immunizing an animal with B7-H3 or an arbitrary polypeptide selected from the amino acid sequence of B7-H3, and harvesting and purifying the antibody generated in vivo according to a commonly known technique. In the case of a human, the B7-H3 species used as an antigen is not particularly limited, and an animal can be immunized with B7-H3 obtained from a non-human animal such as a mouse or a rat. In this case, an antibody that can be used in a human disease can be selected based on cross-reactivity analysis between an antibody that binds the resulting heterologous B7-H3 and human B7-H3.
Кроме того, моноклональное антитело может быть получено из гибридомы, образованной путем слияния антитело-продуцирующих клеток, которые продуцируют антитело против В7-Н3, с клетками миеломы в соответствии с известным способом (например, Kohler and Milstein, Nature, (1975) 256, pp. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)).In addition, a monoclonal antibody can be obtained from a hybridoma formed by fusing antibody-producing cells that produce anti-B7-H3 antibody with myeloma cells according to a known method (e.g., Kohler and Milstein, Nature, (1975) 256, pp 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)).
Используемый в качестве антигена В7-Н3 может быть получен путем экспрессии гена В7-Н3 в клетке-хозяине, используя способы генной инженерии.Used as an antigen, B7-H3 can be obtained by expressing the B7-H3 gene in a host cell using genetic engineering techniques.
В частности, получают вектор, способный экспрессировать ген В7-Н3, и полученный вектор трансфицируют в клетку-хозяина для экспрессии гена, а затем экспрессированный В7-Н3 очищают. Далее, конкретно описывается способ получения антитела против В7-Н3.Specifically, a vector capable of expressing the B7-H3 gene is prepared, and the resulting vector is transfected into a host cell to express the gene, and then the expressed B7-H3 is purified. Next, a method for producing an anti-B7-H3 antibody is specifically described.
(1) Получение антигена(1) Obtaining an antigen
Примеры антигена, используемого для получения анти-В7-Н3 антитела, включают B7-H3, полипептид, состоящий из частичной аминокислотной последовательности, содержащей, по меньшей мере, 6 последовательных аминокислот из В7-Н3, и производное, полученное путем добавления к нему заданной аминокислотной последовательности или носителя.Examples of an antigen used to produce an anti-B7-H3 antibody include B7-H3, a polypeptide consisting of a partial amino acid sequence containing at least 6 consecutive amino acids from B7-H3, and a derivative obtained by adding a given amino acid to it. sequence or carrier.
B7-H3 может быть непосредственно очищен от тканей опухолей человека или опухолевых клеток и использован. Кроме того, В7-Н3 может быть получен путем его in vitro синтеза или путем его продуцирования в клетке-хозяине способом генной инженерии.B7-H3 can be directly purified from human tumor tissues or tumor cells and used. In addition, B7-H3 can be obtained by its in vitro synthesis or by its production in the host cell by genetic engineering.
Что касается способов генной инженерии, в частности, после того как В7-Н3 кДНК встраивают в вектор, способный экспрессировать B7-H3 кДНК, В7-Н3 может быть получен путем синтеза в растворе, содержащем фермент, субстрат и энергетическое вещество, необходимые для транскрипции и трансляции, или путем экспрессии В7-Н3 в другой прокариотической или эукариотически-трансформированной клетке-хозяине.With regard to genetic engineering methods, in particular, after B7-H3 cDNA is inserted into a vector capable of expressing B7-H3 cDNA, B7-H3 can be obtained by synthesis in a solution containing an enzyme, a substrate, and an energy substance necessary for transcription and translation, or by expressing B7-H3 in another prokaryotic or eukaryotic-transformed host cell.
Кроме того, антиген может быть также получен в виде секреторного белка путем экспрессии слитого белка, полученного путем лигирования внеклеточного домена В7-Н3, который является мембранным белком, с константной областью антитела в соответствующей системе "хозяин - векторная ДНК".In addition, the antigen can also be obtained as a secretory protein by expressing a fusion protein obtained by ligating the extracellular domain of B7-H3, which is a membrane protein, with an antibody constant region in an appropriate host-vector DNA system.
В7-Н3 кДНК может быть получен, например, так называемым способом ПЦР, в котором проводят полимеразную цепную реакцию (далее обозначаемую в тексте как "ПЦР") с использованием библиотеки кДНК, экспрессирующей В7-Н3 кДНК в качестве матрицы и праймеров, которые специфически амплифицируют В7-Н3 кДНК (см. Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, pp. 487-489)).The B7-H3 cDNA can be obtained, for example, by the so-called PCR method in which a polymerase chain reaction (hereinafter referred to as "PCR") is carried out using a cDNA library expressing the B7-H3 cDNA as a template and primers that specifically amplify B7-H3 cDNA (see Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, pp. 487-489)).
Что касается in vitro синтеза полипептида, то, в качестве примера, но этим не ограничивая, может быть приведена система быстрой трансляции (РТС) фирмы Roche Diagnostics, Inc.With respect to in vitro synthesis of a polypeptide, by way of example, but not limitation, the Rapid Translation System (RTS) from Roche Diagnostics, Inc. may be cited.
Примеры прокариотических клеток-хозяев включают Escherichia coli (кишечную палочку) и Bacillus subtilis (сенную палочку). Что касается трансформирования клеток-хозяев с помощью гена-мишени, то клетки-хозяева трансформируют с помощью плазмидного вектора, содержащего репликон, то есть источника репликации, произведенного от видов, совместимых с хозяином, и регуляторную последовательность. Кроме того, предпочтительно, чтобы вектор имел последовательность, способную придавать трансформированной клетке фенотипическую селективность.Examples of prokaryotic host cells include Escherichia coli (E. coli) and Bacillus subtilis (hay bacillus). With regard to transforming host cells with a target gene, host cells are transformed with a plasmid vector containing a replicon, i.e., a source of replication derived from species compatible with the host, and a regulatory sequence. In addition, it is preferred that the vector has a sequence capable of conferring phenotypic selectivity on the transformed cell.
Примеры эукариотических клеток-хозяев включают клетки позвоночных, клетки насекомых и дрожжевые клетки. В качестве клеток позвоночных часто используют, например, но этим не ограничивая, клетки обезьяны линии COS (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), мышиные фибробласты NIH3T3 (АТСС CRL-1658) и дефицитные по дигидрофолат-редуктазе штаммы (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) из клеток яичников китайского хомячка (клетки СНО; ATCC: CCL-61); и другие подобные клетки.Examples of eukaryotic host cells include vertebrate cells, insect cells and yeast cells. Vertebrate cells are often used, for example, but not limited to, COS monkey cells (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), NIH3T3 mouse fibroblasts (ATCC CRL- 1658) and dihydrofolate reductase-deficient strains (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) from Chinese hamster ovary cells (CHO cells; ATCC: CCL-61); and other similar cells.
Полученный таким образом трансформант может быть подвергнут культивированию в соответствии с хорошо известной методикой, и в результате культивирования трансформанта получают внутриклеточно или внеклеточно целевой полипептид. The transformant thus obtained can be subjected to cultivation in accordance with a well-known technique, and as a result of cultivation of the transformant, the target polypeptide is obtained intracellularly or extracellularly.
Подходящая среда, используемая для культивирования, может быть выбрана из различных обычно применяемых культуральных сред в зависимости от используемых клеток-хозяев. Если используется Escherichia coli (кишечная палочка), то может быть использована, например, среда Лурия-Бертани (LB) с добавлением, в случае необходимости, антибиотика, такого как ампициллин или IPMG.The appropriate culture medium used may be selected from various culture media commonly used, depending on the host cells used. If Escherichia coli (E. coli) is used, for example, Luria-Bertani (LB) medium can be used with the addition, if necessary, of an antibiotic such as ampicillin or IPMG.
Рекомбинантный белок, продуцируемый внутриклеточно или внеклеточно трансформантом в результате такого культивирования, может быть выделен и очищен любым из различных известных способов разделения, использующих физические или химические свойства белка.The recombinant protein produced intracellularly or extracellularly by the transformant as a result of such culturing can be isolated and purified by any of the various known separation methods using the physical or chemical properties of the protein.
Конкретные примеры способов включают обработку с помощью традиционного осадителя белка, ультрафильтрацию, различные виды жидкостной хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография и аффинная хроматографии, диализ и их комбинации.Specific examples of methods include treatment with a conventional protein precipitator, ultrafiltration, various types of liquid chromatography such as molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography and affinity chromatography, dialysis, and combinations thereof.
Кроме того, путем присоединения хвоста из шести остатков гистидина к экспрессируемому рекомбинантному белку, белок может быть эффективно очищен аффинной хроматографии на колонке с ионами никеля. В качестве варианта, путем присоединения области IgG Fc к рекомбинантному экспрессируемому рекомбинантному белку, белок может быть эффективно очищен на колонке А.In addition, by attaching a tail of six histidine residues to the expressed recombinant protein, the protein can be efficiently purified by affinity chromatography on a nickel ion column. Alternatively, by attaching an IgG Fc region to a recombinant expressed recombinant protein, the protein can be efficiently purified on column A.
Путем объединения вышеописанных способов, может быть легко получено большое количество целевого полипептида с высоким выходом и с высокой степенью чистоты.By combining the above methods, a large amount of the target polypeptide can be easily obtained in high yield and high purity.
(2) Получение анти-B7-H3 моноклонального антитела(2) Preparation of anti-B7-H3 monoclonal antibody
Примеры антитела, специфически связывающего В7-Н3, включают моноклональное антитело, специфически связывающее В7-Н3, и способ получения антитела описан ниже.Examples of an antibody that specifically binds B7-H3 include a monoclonal antibody that specifically binds B7-H3, and the method for producing the antibody is described below.
Получение моноклонального антитела обычно требует проведения следующих стадий:Obtaining a monoclonal antibody usually requires the following steps:
(а) очистки биополимера, используемого в качестве антигена;(a) purification of the biopolymer used as antigen;
(b) приготовления продуцирующих антитело клеток путем иммунизации животного инъекцией антигена, сбора крови, анализа крови на титр антитела с целью определения момента удаления селезенки;(b) preparing antibody-producing cells by immunizing the animal with an antigen injection, collecting blood, testing the blood for antibody titer to determine when the spleen is removed;
(c) приготовления клеток миеломы (называемые в изобретении "миеломой");(c) preparing myeloma cells (referred to herein as "myeloma");
(d) слияния продуцирующих антитело клеток с миеломой;(d) fusion of antibody producing cells with myeloma;
(e) скрининга группы гибридом, продуцирующих требуемое антитело;(e) screening for a group of hybridomas producing the desired antibody;
(f) разделения гибридом на одноклеточные клоны (клонирование);(f) separating hybridomas into single cell clones (cloning);
(g) необязательно, культивирования гибридомы или выращивания животного с имплантированной гибридомой для получения большого количества моноклонального антитела;(g) optionally culturing the hybridoma or rearing the hybridoma-implanted animal to obtain a large amount of the monoclonal antibody;
(h) исследования полученного таким образом моноклонального антитела на биологическую активность и специфичность связывания, или анализа этих же свойств в форме меченого реагента; и других подобных исследований.(h) testing the thus obtained monoclonal antibody for biological activity and binding specificity, or analyzing the same properties in the form of a labeled reagent; and other similar studies.
Далее будет подробно описан способ получения моноклонального антитела в соответствии с приведенными выше стадиями, однако, этот способ не является ограничением для изобретения, и, например, кроме клеток селезенки и миеломы могут быть использованы другие продуцирующие антитело клетки.Next, the method for producing a monoclonal antibody according to the above steps will be described in detail, however, this method is not a limitation to the invention, and, for example, other antibody-producing cells can be used in addition to spleen and myeloma cells.
(a) Очистка антигена(a) Antigen purification
В качестве антигена может быть использован В7-Н3, полученный описанным выше способом, или его частичный пептид.As an antigen, B7-H3 obtained as described above, or a partial peptide thereof, can be used.
Кроме того, в качестве антигена могут быть также использованы мембранная фракция, полученная из рекомбинантных клеток, экспрессирующих B7-H3, или рекомбинантных клеток, экспрессирующих сами по себе B7-H3, а также неполный пептид белка настоящего изобретения, химически синтезированный с помощью способа, известного специалистам в этой области.In addition, a membrane fraction obtained from recombinant cells expressing B7-H3 or recombinant cells expressing B7-H3 itself, as well as a partial peptide of the protein of the present invention, chemically synthesized using a method known experts in this area.
(b) Получение клеток, продуцирующих антитело (b) Preparation of antibody-producing cells
Антиген, полученный на стадии (а), смешивают с адъювантом, таким как полный или неполный адъювант Фрейнда или алюмокалиевые квасцы, и полученную смесь используют в качестве иммуногена для иммунизации экспериментального животного. В качестве экспериментального животного может быть использовано без особых проблем любое животное, используемое в известном способе производства гибридомы. В частности, могут быть использованы, например, мышь, крыса, коза, овцы, крупный рогатый скот, лошадь или другие подобные животные. Но, с точки зрения легкости получения клеток миеломы, которые подвергают слиянию с выделенными клетками, продуцирующими антитело, в качестве животных, которых подвергают иммунизированию, предпочтительно использовать мышь или крысу.The antigen obtained in step (a) is mixed with an adjuvant such as complete or incomplete Freund's adjuvant or potassium alum, and the resulting mixture is used as an immunogen to immunize an experimental animal. As an experimental animal, any animal used in the known method for producing a hybridoma can be used without particular problems. In particular, for example, a mouse, a rat, a goat, a sheep, a cattle, a horse, or the like can be used. But, from the point of view of the ease of obtaining myeloma cells that are fused with isolated antibody-producing cells, it is preferable to use a mouse or a rat as an animal to be immunized.
Кроме того, на используемый штамм мыши или крысы не накладывают каких-либо конкретных ограничений, и в случае мыши могут быть использованы различные штаммы, например, такие как A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, и 129 и другие подобные штаммы, а в случае крысы могут быть использованы, например, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer и другие подобные штаммы.In addition, there are no particular restrictions on the mouse or rat strain used, and in the case of a mouse, various strains such as A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL can be used. , C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, and 129 and other similar strains, and in the case of a rat, for example, Wistar, Low, Lewis can be used , Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer and other similar strains.
Эти мыши и крысы могут быть приобретены у фирм-производителей/фирм-дистрибьюторов экспериментальных животных, например, у фирмы CLEA Japan, Inc. и фирмы Charles River Laboratories Japan, Inc.These mice and rats can be purchased from experimental animal manufacturers/distributors such as CLEA Japan, Inc. and Charles River Laboratories Japan, Inc.
Среди них, с точки зрения совместимости при слиянии с описанными ниже клетками миеломы, в качестве животного, подвергаемого иммунизированию, являются особенно предпочтительными, в случае мыши, штамм BALB/c, а в случае крысы, штаммы Wistar и Low.Among them, from the viewpoint of fusion compatibility with myeloma cells described below, as an animal to be immunized, in the case of a mouse, the BALB/c strain, and in the case of a rat, the Wistar and Low strains are particularly preferable.
Кроме того, с точки зрения антигенной гомологии между людьми и мышами, для удаления аутоантител также предпочтительно использовать мышь, имеющую сниженную биологическую функцию, то есть мышь с аутоиммунным заболеванием.In addition, from the point of view of antigenic homology between humans and mice, it is also preferable to use a mouse having reduced biological function, that is, a mouse with an autoimmune disease, to remove autoantibodies.
Предпочтительно, чтобы возраст такой мыши или крысы в момент иммунизации составлял от 5 до 12 недель, более предпочтительно, от 6 до 8 недель.Preferably, such a mouse or rat is 5 to 12 weeks old at the time of immunization, more preferably 6 to 8 weeks old.
Для иммунизации животного с помощью В7-Н3 или его рекомбинанта может быть использован известный способ, который подробно описан, например, в Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) или других подобных публикациях.To immunize an animal with B7-H3 or a recombinant thereof, a known method can be used, which is described in detail, for example, in Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) or other similar publications.
Среди этих способов иммунизации, предпочтительным является описанный в изобретении специфический способ, осуществляемый, например, следующим образом.Among these immunization methods, the specific method described in the invention is preferred, carried out, for example, as follows.
А именно, сначала животному вводят внутрикожно или внутрибрюшинно фракцию мембранного белка, служащую в качестве антигена, или клетки, вызывающие экспрессию антигена.Namely, first, the animal is injected intradermally or intraperitoneally with a fraction of the membrane protein serving as an antigen, or cells that cause the expression of the antigen.
Но для повышения эффективности иммунизации предпочтительно использовать комбинацию обоих способов введения, и путем внутрикожного введения первой половины дозы и внутрибрюшинного введения второй половины дозы или только внутрибрюшинного введения всей дозы может быть значительно повышена эффективность иммунизации.But in order to improve the efficiency of immunization, it is preferable to use a combination of both methods of administration, and by intradermal administration of the first half of the dose and intraperitoneal administration of the second half of the dose, or only intraperitoneal administration of the entire dose, the effectiveness of immunization can be significantly improved.
Режим введения антигена может изменяться в зависимости от вида животного, подвергаемого иммунизации, индивидуальной особенности или других подобных факторов. Однако, обычно, предпочтительным является режим введения, при котором частота введения антигена составляет от 3 до 6 раз, и период дозирования составляет от 2 до 6 недель, и более предпочтительным является режим введения, при котором частота введения антигена составляет от 3 до 4 раз, и период дозирования составляет от 2 до 4 недель.The mode of administration of the antigen may vary depending on the type of animal being immunized, individual characteristics or other similar factors. However, in general, an administration regimen in which the antigen administration frequency is 3 to 6 times and a dosing period is 2 to 6 weeks is preferable, and an administration regimen in which the antigen administration frequency is 3 to 4 times is more preferable. and the dosing period is 2 to 4 weeks.
Кроме того, доза антигена может изменяться в зависимости от вида животного, индивидуальных особенностей и других подобных факторов, однако, как правило, устанавливают дозу от 0,05 до 5 мг, предпочтительно, приблизительно от 0,1 до 0,5 мг.In addition, the dose of antigen may vary depending on the animal species, individual characteristics and other such factors, however, as a rule, the dose is set from 0.05 to 5 mg, preferably from about 0.1 to 0.5 mg.
Повторную иммунизацию проводят через 1-6 недель, предпочтительно, через 2-4 недели, более предпочтительно, через 2-3 недели после введения антигена, как описано выше.Re-immunization is carried out after 1-6 weeks, preferably 2-4 weeks, more preferably 2-3 weeks after antigen challenge, as described above.
Доза антигена при проведении повторной иммунизации может изменяться в зависимости от типа или размера животного или других подобных факторов, однако, в случае, например, мыши, дозу, как правило, устанавливают от 0,05 до 5 мг, предпочтительно, от 0,1 до 0,5 мг, более предпочтительно, приблизительно от 0,1 до 0,2 мг.The dose of antigen during booster immunization may vary depending on the type or size of the animal or other such factors, however, in the case of, for example, a mouse, the dose is usually set from 0.05 to 5 mg, preferably from 0.1 to 0.5 mg, more preferably about 0.1 to 0.2 mg.
Клетки или лимфоциты селезенки, включающие клетки, продуцирующие антитело, отбирают в асептических условиях у иммунизированных животных через 1-10 дней, предпочтительно, через 2-5 дней, более предпочтительно, через 2-3 дня, после повторной иммунизации. В это момент времени, измеряют титр антитела, и если в качестве источника получения клеток, продуцирующих антитело, используется животное, имеющее достаточно высокий титр антитела, то последующая процедура может быть проведена более эффективно.Spleen cells or lymphocytes, including antibody-producing cells, are aseptically harvested from immunized animals 1-10 days later, preferably 2-5 days, more preferably 2-3 days after booster immunization. At this point in time, the antibody titer is measured, and if an animal having a sufficiently high antibody titer is used as the source of obtaining antibody-producing cells, the subsequent procedure can be carried out more efficiently.
Примеры используемого в изобретении способа измерения титра антитела включают, но этим не ограничивая, способ радиоиммунологического анализа (RIA) и иммуносорбентный ферментный анализ (ELISA).Examples of the method used in the invention for measuring antibody titer include, but are not limited to, the method of radioimmunoassay (RIA) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Например, если используется способ ELISA, то измерение титра антитела может быть осуществлено в изобретении в соответствии с описанными ниже методиками.For example, if an ELISA method is used, then the measurement of antibody titer can be carried out in accordance with the methods described below.
Сначала, очищенный или частично очищенный антиген адсорбируют на поверхности твердой фазы, такой как 96-луночный планшет для способа ELISA, и на поверхность твердой фазы, не имеющей адсорбированного на ней антигена, наносят белок, не имеющий отношение к антигену, такой как бычий сывороточный альбумин (обозначаемый в тексте изобретения как "BSA"). После промывки поверхности, поверхность контактируют с последовательно разбавленным образцом (например, сывороткой мыши) в качестве первичного антитела для связывания антитела, содержащегося в образце, с антигеном. First, the purified or partially purified antigen is adsorbed on the surface of a solid phase, such as a 96-well ELISA plate, and a protein not related to the antigen, such as bovine serum albumin, is applied to the surface of the solid phase that does not have antigen adsorbed thereon. (referred to in the text of the invention as "BSA"). After washing the surface, the surface is contacted with a serially diluted sample (eg, mouse serum) as the primary antibody to bind the antibody contained in the sample to the antigen.
Затем, в качестве вторичного антитела, добавляют меченное ферментом антитело против мышиного антитела и дают возможность образоваться связи с мышиным антителом. После промывки, добавляют субстрат для фермента и измеряют изменение оптической плотности, которое возникает в результате развития окрашивания, вызываемого деградацией субстрата, или других подобных свойств, и на основе измерения рассчитывают титр антитела.Then, as a secondary antibody, an enzyme-labeled anti-mouse antibody is added and bonds are allowed to form with the mouse antibody. After washing, the enzyme substrate is added, and the change in optical density that occurs due to the development of coloring caused by degradation of the substrate or the like is measured, and an antibody titer is calculated from the measurement.
Отделение клеток, продуцирующих антитело, от клеток или лимфоцитов селезенки иммунизированных животных может быть проведено в соответствии с известным способом (описанным, например, в Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977), 6, p. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495). Например, в случае клеток селезенки, может быть использован общий способ, в котором клетки, продуцирующие антитело, отделяют путем гомогенизации селезенки с получением клеток в результате фильтрации через сетку из нержавеющей стали и суспендирования клеток в минимальной эссенциальной среде Игла (MEM).Separation of antibody-producing cells from spleen cells or lymphocytes of immunized animals can be carried out according to a known method (described, for example, in Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol (1977), 6, p.511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495). For example, in the case of spleen cells, a general method can be used in which antibody-producing cells are separated by homogenizing the spleen to obtain cells by filtering through a stainless steel mesh and suspending the cells in Minimum Essential Needle's Medium (MEM).
(c) Получение клеток миеломы (называемых в тексте изобретения "миеломой")(c) Production of myeloma cells (referred to as "myeloma" in the text of the invention)
На миеломные клетки, используемые для клеточного слияния, не накладывают каких-либо конкретных ограничений, и подходящие клетки могут быть выбраны из известных клеточных линий. Тем не менее, с точки зрения удобства при выборе гибридомы из слитых клеток, предпочтительно использовать штамм, дефицитный по HGPRT (гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазе), процедура отбора которого уже была описана.The myeloma cells used for cell fusion are not subject to any particular limitation, and suitable cells may be selected from known cell lines. However, from the point of view of convenience when choosing a hybridoma from fused cells, it is preferable to use a strain deficient in HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase), the selection procedure of which has already been described.
Более конкретно, примеры штамма, дефицитного по HGPRT, включают X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO, и BU.1, полученные от мышей; 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3), полученный от крыс; и UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) и 8226AR/NIP4-1(NP41), полученные от людей. Эти штаммы, дефицитные по HGPRT, могут быть приобретены, например, в Американской коллекции типовых культур (АТСС) или в других подобных научных фондах.More specifically, examples of an HGPRT deficient strain include X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0 -Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO, and BU.1 from mice; 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3) obtained from rats; and UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) and 8226AR/NIP4-1(NP41) from humans. These HGPRT-deficient strains can be purchased from, for example, the American Type Culture Collection (ATCC) or other similar scientific foundations.
Эти клеточные штаммы пересевают в соответствующую среду, такую как среда 8-азагуанина [среда, полученная путем добавления 8-азагуанина к среде RPMI 1640, дополненной глутамином, 2-меркаптоэтанолом, гентамицином и фетальной телячьей сывороткой (обозначаемой в тексте изобретения как "FCS")], среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков (обозначаемая в тексте изобретения как "IMDM") или среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко (обозначаемая в тексте изобретения как "DMEM"). В этом случае, за 3-4 дня перед проведением слияния клеток, клетки пересевают в нормальную среду [например, в среду ASF104 (фирмы Ajinomoto Co., Ltd.), содержащую 10% FCS] для обеспечения слияния не менее чем 2×107 клеток в сутки.These cell strains are subcultured in an appropriate medium such as 8-azaguanine medium [medium prepared by adding 8-azaguanine to RPMI 1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin and fetal calf serum (referred to in the text as "FCS") ], Iscove's modified Dulbecco's medium (referred to as "IMDM" in the text of the invention) or Dulbecco's modified medium (referred to as "DMEM" in the text of the invention). In this case, 3-4 days before cell fusion, the cells are subcultured in normal medium [eg, ASF104 medium (Ajinomoto Co., Ltd.) containing 10% FCS] to ensure fusion of at least 2×10 7 cells per day.
(d) Слияние клеток(d) Cell fusion
Слияние клеток, продуцирующих антитело, и миеломных клеток может быть соответствующим образом осуществлено в соответствии с известным способом (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.), при таких условиях, при которых не сильно снижается выживаемость клеток.The fusion of antibody-producing cells and myeloma cells can be appropriately carried out according to a known method (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer , M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.), under conditions that do not greatly reduce cell survival.
В качестве такого способа может быть использован, например, химический способ, в котором клетки, продуцирующие антитело, и миеломные клетки смешивают в растворе, содержащем полимер, такой как полиэтиленгликоль, при высокой концентрации, физический способ, в котором используется электрическая стимуляция, или другие подобные способы. Из этих способов, ниже описан конкретный пример химического способа.As such a method, for example, a chemical method in which antibody-producing cells and myeloma cells are mixed in a solution containing a polymer such as polyethylene glycol at a high concentration, a physical method in which electrical stimulation is used, or the like can be used. ways. Of these methods, a specific example of a chemical method is described below.
А именно, в случае, когда используют полиэтиленгликоль в растворе, содержащем полимер в высокой концентрации, клетки, продуцирующие антитело, и миеломные клетки смешивают в растворе полиэтиленгликоля, имеющего молекулярную массу от 1500 до 6000, более предпочтительно, от 2000 до 4000, при температуре от 30 до 40°С, предпочтительно, от 35 до 38°С, в течение от 1 до 10 минут, предпочтительно, от 5 до 8 минут.Namely, in the case where polyethylene glycol is used in a solution containing a high concentration of a polymer, antibody-producing cells and myeloma cells are mixed in a solution of polyethylene glycol having a molecular weight of 1500 to 6000, more preferably 2000 to 4000, at a temperature of 30 to 40°C, preferably 35 to 38°C, for 1 to 10 minutes, preferably 5 to 8 minutes.
(e) Отбор из группы гибридом(e) Selection from the hybridoma group
На способ отбора гибридом, полученных в результате описанного выше слияния клеток, не накладывают каких-либо конкретных ограничений. Обычно применяют способ отбора HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин), описанный в публикации Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550.The selection method for hybridomas obtained from the cell fusion described above is not subject to any particular limitation. Typically, the HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) selection method described in Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550.
Этот способ эффективен в тех случаях, когда гибридомы получают при использовании дефицитного по HGPRT штамма клеток миеломы, который не может выживать в присутствии аминоптерина.This method is effective when hybridomas are obtained using an HGPRT-deficient myeloma cell strain that cannot survive in the presence of aminopterin.
А именно, при культивировании неслитых клеток и гибридом в среде HAT, могут селективно выживать и пролиферировать только гибридомы, устойчивые к действию аминоптерина.Namely, when non-fused cells and hybridomas are cultured in HAT medium, only aminopterin-resistant hybridomas can selectively survive and proliferate.
(f) Разделение на одноклеточный клон (клонирование)(f) Separation into a single cell clone (cloning)
В качестве способа клонирования для гибридом может быть использован известный способ, такой как метилцеллюлозный способ, способ клонирования в мягкой агарозе или способ лимитирующих разведений (см., например, Barbara, B. M. and Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Среди этих способов особенно предпочтительным является способ трехмерного культивирования, такой как метилцеллюлдозный способ. Например, группу гибридом, полученных в результате слияния клеток, суспендируют в метилцеллюлозной среде, такой как ClonaCell-HY Selection Medium D (фирмы StemCell Technologies, inc., #03804), и культивируют. Затем образовавшиеся колонии гибридомы собирают, в результате чего могут быть получены моноклональные гибридомы. Собранные соответствующие колонии гибридомы культивируют, и гибридома, для которой было подтверждено, что она имеет стабильный титр антитела в полученной жидкости над осадком культуры гибридомы, выбирают в качестве штамма В7-Н3 гибридомы, продуцирующего моноклональное антитело.As a cloning method for hybridomas, a known method such as methylcellulose method, soft agarose cloning method, or limiting dilution method can be used (see, for example, Barbara, B. M. and Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company , San Francisco (1980)). Among these methods, a three-dimensional culture method such as a methyl cellulose method is particularly preferable. For example, a group of hybridomas resulting from cell fusion is suspended in a methylcellulose medium such as ClonaCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies, inc., #03804) and cultured. The resulting hybridoma colonies are then harvested, whereby monoclonal hybridomas can be obtained. The collected corresponding hybridoma colonies are cultured, and the hybridoma which has been confirmed to have a stable antibody titer in the obtained hybridoma culture pellet liquid is selected as the monoclonal antibody-producing B7-H3 hybridoma strain.
Примеры полученного таким образом штамма гибридомы включают B7-H3 гибридому M30. В этом изобретении, антитело, продуцируемое В7-Н3 гибридомой M30, обозначается как "М30 антитело" или просто "M30".Examples of the hybridoma strain thus obtained include B7-H3 hybridoma M30. In this invention, the antibody produced by the M30 B7-H3 hybridoma is referred to as "M30 antibody" or simply "M30".
Тяжелая цепь M30 антитела имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20 в списке последовательностей. Кроме того, легкая цепь M30 антитела имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21 в списке последовательностей. В тяжелой цепи, аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO: 20 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 1 по 19, является сигнальной последовательностью, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 20 по 141, является вариабельной областью, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 142 по 471, является константной областью. Кроме того, в легкой цепи, аминокислотная последовательность, представленная SEQ ID NO: 21 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 1 по 22, является сигнальной последовательностью, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 23 по 130, является вариабельной областью, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 131 по 235, является константной областью.The heavy chain of the M30 antibody has the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 20 in the sequence listing. In addition, the M30 antibody light chain has the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 21 in the sequence listing. In the heavy chain, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 in the sequence listing, the amino acid sequence consisting of
(g) Получение моноклонального антитела путем культивирования гибридомы(g) Obtaining a monoclonal antibody by culturing hybridoma
Путем культивирования выбранной таким образом гибридомы может быть эффективно получено моноклональное антитело. Но перед культивированием предпочтительно проводить скрининг гибридомы, которая продуцирует требуемое моноклональное антитело.By culturing the thus selected hybridoma, a monoclonal antibody can be efficiently obtained. But before cultivation, it is preferable to screen for a hybridoma that produces the desired monoclonal antibody.
Для такого скрининга может быть использован известный способ.For such screening, a known method can be used.
Измерение титра антитела в изобретении может быть проведено, например, способом ELISA, упомянутом в описанном выше пункте (b).The measurement of antibody titer in the invention can be carried out, for example, by the ELISA method mentioned in paragraph (b) above.
Гибридома, полученная описанным выше способом, может быть сохранена в замороженном состоянии в жидком азоте или в морозильнике при -80°C или ниже.The hybridoma obtained by the above method can be stored frozen in liquid nitrogen or in a freezer at -80°C or below.
После завершения клонирования, среду HT заменяют на нормальную среду, и гибридому культивируют.After cloning is complete, the HT medium is replaced with normal medium and the hybridoma is cultured.
Культивирование в больших количествах осуществляют путем культивирования при вращении, используя большую культуральную колбу, или путем культивирования при постоянном перемешивании. Из надосадочной жидкости, полученной в результате крупномасштабного культивирования, может быть получено моноклональное антитело, которое специфически связывает белок изобретения, с помощью известного специалистам в данной области способа очистки, такого как гель-фильтрация.Cultivation in large quantities is carried out by culturing while rotating, using a large culture flask, or by cultivating with constant stirring. From the supernatant resulting from large-scale culture, a monoclonal antibody that specifically binds the protein of the invention can be obtained using a purification method known to those skilled in the art, such as gel filtration.
Кроме того, гибридому вводят в брюшную полость мыши с тем же штаммом, что и у гибридомы (например, описанной выше мыши линии BALB/с), или мыши Nu/Nu для пролиферации гибридомы, в результате чего может быть получена асцитическая жидкость, содержащая большое количество моноклонального антитела изобретения.In addition, hybridoma is injected into the abdominal cavity of a mouse with the same strain as that of a hybridoma (for example, the BALB/c mouse described above) or a Nu/Nu mouse to proliferate the hybridoma, whereby ascitic fluid containing a large amount of the amount of the monoclonal antibody of the invention.
В случае введения гибридомы в брюшную полость, большее количество асцита может быть получено, если за 3-7 дней до этого вводить минеральное масло, такое как 2,6,10,14-тетраметилпентадекан (пристан).In case of insertion of hybridoma into the abdominal cavity, more ascites can be obtained if a mineral oil such as 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (pristane) is administered 3-7 days before.
Например, сначала в брюшную полость мыши того же штамма, что и гибридома, вводят иммунодепрессант для инактивации Т-клеток. Через 20 дней после этого, клон гибридомных клеток 106-107 суспендируют в бессывороточной среде (0,5 мл), и суспензию вводят в брюшную полость мыши. Как правило, когда живот расширяется и заполняется асцитом, асцит собирают из брюшной полости мышей. С помощью этого способа может быть получено моноклональное антитело при концентрации, которая примерно в 100 раз или более выше, чем в культуральном растворе.For example, an immunosuppressant is first injected into the abdomen of a mouse of the same strain as the hybridoma to inactivate the T cells. 20 days later, the clone of hybridoma cells 10 6 - 10 7 suspended in serum-free medium (0.5 ml), and the suspension is injected into the abdominal cavity of the mouse. Typically, when the abdomen expands and fills with ascites, the ascites is collected from the abdomen of mice. Using this method, a monoclonal antibody can be obtained at a concentration that is about 100 times or more higher than in the culture solution.
Полученное описанным выше способом моноклональные антитело может быть очищено способом, описанным, например, в справочнике Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).The monoclonal antibody obtained as described above can be purified by the method described, for example, in Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).
Полученное таким образом моноклональное антитело имеет высокую антигенную специфичность в отношении В7-Н3.The monoclonal antibody thus obtained has a high antigenic specificity for B7-H3.
(h) Исследование моноклонального антитела(h) Monoclonal antibody assay
Изотип и подкласс полученного таким образом моноклонального антитела могут быть определены следующим образом.The isotype and subclass of the thus obtained monoclonal antibody can be determined as follows.
Прежде всего, примеры способа идентификации включают способ Оухтерлони, способ иммуносорбентного ферментного анализа (ELISA) и способ радиоиммунологического анализа (RIA).First of all, examples of the identification method include the Ouchterlony method, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method, and the radioimmunoassay (RIA) method.
Способ Оухтерлони является достаточно простым, но, когда концентрация моноклонального антитела является низкой, требуется проведение операции конденсации.The Ouchterlony method is quite simple, but when the concentration of the monoclonal antibody is low, a condensation operation is required.
С другой стороны, путем использования способа ELISA или RIA, включающего непосредственную реакцию культуральной надосадочной жидкости с антигеном, адсорбированном на твердой фазе, и использование антител, соответствующих различным видам изотипов и подклассов иммуноглобулина, в качестве вторичных антител, может быть идентифицирован изотип и подкласс моноклонального антитела.On the other hand, by using an ELISA or RIA method involving directly reacting the culture supernatant with an antigen adsorbed on the solid phase and using antibodies corresponding to different kinds of immunoglobulin isotypes and subclasses as secondary antibodies, the isotype and subclass of a monoclonal antibody can be identified. .
Кроме того, в качестве простого способа может быть также использован выпускаемый промышленностью набор для идентификации (например, набор Mouse Typer фирмы Bio-Rad Laboratories, Inc.) или другие подобные наборы.In addition, a commercially available identification kit (eg, Mouse Typer kit from Bio-Rad Laboratories, Inc.) or the like can also be used as a simple method.
Кроме того, количественное определение белка может быть выполнено способом Лоури-Фолина с расчетом на основе результатов измерения оптической плотности при 280 нм [1,4 (оптическая плотность при 280 нм)=1 мг/мл иммуноглобулина].In addition, protein quantitation can be performed by the Lowry-Folin method, calculated based on the results of measuring the optical density at 280 nm [1.4 (optical density at 280 nm)=1 mg/ml of immunoglobulin].
Кроме того, даже если моноклональное антитело получают отдельно и независимо путем проведения снова стадий (a)-(h) в пункте (2), то, тем не менее, можно получить антитело, имеющее цитотоксическую активность, эквивалентную цитотоксической активности антитела М30. В качестве одного примера такого антитело, можно привести пример антитела, которое связывает тот же самый эпитоп, что и антитело М30. M30 распознает эпитоп в домене IgC1 или IgC2, который является доменом в В7-Н3 внеклеточном домене, и связывает домен IgC1 или домен IgC2, или и тот и другой. Поэтому, в качестве эпитопа для антитела изобретения, примером может служить, в частности, эпитоп, присутствующий в IgC1 или IgC2 домене В7-Н3. Если вновь полученное моноклональное антитело связывает частичный пептид или частичную трет-ичную структуру, которые связывают и антитело M30, то на основании этого можно сделать вывод, что моноклональное антитело связывает тот же самый эпитоп, что и антитело М30. Кроме того, путем подтверждения того, что моноклональное антитело конкурирует с антителом М30 при связывании В7-Н3 (то есть моноклональное антитело ингибирует связывание антитела М30 с В7-Н3), можно сделать вывод, что моноклональное антитело связывает тот же самый эпитоп, что и антитело M30, даже если не была определена конкретная последовательность или структура эпитопа. Когда подтверждается, что моноклональное антитело связывает тот же самый эпитоп, что и антитело M30, то можно с большой долей вероятности ожидать, что моноклональное антитело будет обладать цитотоксической активностью, эквивалентной цитотоксической активности антитела М30.In addition, even if a monoclonal antibody is obtained separately and independently by performing steps (a) to (h) in (2) again, it is still possible to obtain an antibody having a cytotoxic activity equivalent to that of the M30 antibody. As one example of such an antibody, an antibody that binds the same epitope as the M30 antibody can be exemplified. M30 recognizes an epitope in an IgC1 or IgC2 domain, which is a domain in the B7-H3 extracellular domain, and binds an IgC1 domain or an IgC2 domain, or both. Therefore, as an epitope for an antibody of the invention, an example is, in particular, an epitope present in the IgCl or IgC2 domain of B7-H3. If a newly generated monoclonal antibody binds a partial peptide or a partial tertiary structure that also binds the M30 antibody, then it can be concluded that the monoclonal antibody binds the same epitope as the M30 antibody. In addition, by confirming that the monoclonal antibody competes with the M30 antibody for binding B7-H3 (i.e., the monoclonal antibody inhibits the binding of the M30 antibody to B7-H3), it can be concluded that the monoclonal antibody binds the same epitope as the antibody M30, even if the specific sequence or structure of the epitope has not been determined. When a monoclonal antibody is confirmed to bind the same epitope as an M30 antibody, the monoclonal antibody can be expected to have a cytotoxic activity equivalent to that of the M30 antibody with a high degree of probability.
(3) Другие антитела(3) Other antibodies
Антитело изобретения включает не только описанное выше моноклональное антитело против В7-Н3, но также и рекомбинантное антитело, полученное путем искусственного модификации с целью уменьшения гетерологичной антигенности в отношении людей, такое как химерное антитело, гуманизированное антитело и человеческое антитело. Эти антитела могут быть получены известным способом.The antibody of the invention includes not only the anti-B7-H3 monoclonal antibody described above, but also a recombinant antibody artificially modified to reduce heterologous antigenicity to humans, such as a chimeric antibody, a humanized antibody, and a human antibody. These antibodies can be obtained in a known manner.
Примером химерного антитела является антитело, в котором вариабельные и константные области антитела получают от различных видов, например, химерное антитело, в котором вариабельная область антитела, полученная от мыши или крысы, соединена с константной областью антитела, полученной от человека (см. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855 (1984)).An example of a chimeric antibody is an antibody in which the variable and constant regions of an antibody are derived from different species, for example, a chimeric antibody in which an antibody variable region derived from a mouse or rat is fused to an antibody constant region derived from a human (see Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855 (1984)).
Примером гуманизированного антитела является антитело, полученное включением только определяющей комплементарность области (CDR) в антитело, полученное от человека (см. Nature (1986) 321, pp. 522-525), и антитело, полученное путем трансплантации части аминокислотных остатков каркаса, а также последовательностей CDR, в человеческое антитело с помощью способа CDR-трансплантации (WO 90/07861).An example of a humanized antibody is an antibody obtained by incorporating only a complementarity determining region (CDR) into an antibody obtained from a human (see Nature (1986) 321, pp. 522-525) and an antibody obtained by transplanting a portion of the amino acid residues of the framework, as well as CDR sequences into a human antibody using the CDR transplant method (WO 90/07861).
Однако для гуманизированного антитела не является конкретным ограничением гуманизированное антитело, полученное из антитела M30, но при условии, что гуманизированное антитело имеет все шесть типов CDR последовательностей антитела М30 и обладает противоопухолевым действием. Вариабельная область тяжелой цепи антитела M30 имеет CDRH1 (NYVMH), состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 3 в списке последовательностей, CDRH2 (YINPYNDDVKYNEKFKG), состоящей из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 4 в списке последовательностей, и CDRH3 (WGYYGSPLYYFDY), состоящей из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5 в списке последовательностей. Кроме того, вариабельная область легкой цепи антитела M30 имеет CDRL1 (RASSRLIYMH), состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6 в списке последовательностей, CDRL2 (ATSNLAS), состоящей из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 7 в списке последовательностей, и CDRL3 (QQWNSNPPT), состоящей из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8 в списке последовательностей.However, for a humanized antibody, a humanized antibody derived from an M30 antibody is not specifically limited, provided that the humanized antibody has all six types of CDR sequences of the M30 antibody and has an antitumor effect. The heavy chain variable region of the M30 antibody has CDRH1 (NYVMH) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, CDRH2 (YINPYNDDVKYNEKFKG) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, and CDRH3 ( WGYYGSPLYYFDY), consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 in the sequence listing. In addition, the light chain variable region of the M30 antibody has CDRL1 (RASSRLIYMH) consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6 in the sequence listing, CDRL2 (ATSNLAS) consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7 in the sequence listing, and CDRL3 (QQWNSNPPT) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
В качестве примера гуманизированного антитела мышиного антитела М30 может быть приведена произвольная комбинация тяжелой цепи, включающая вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из любой одной из (1) аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 до 141 последовательностей SEQ ID NO: 9, 10, 11 или 12 в списке последовательностей, (2) аминокислотной последовательности, имеющей гомологию, по меньшей мере, 95% или более с описанной выше аминокислотной последовательностью (1), и (3) аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько аминокислот в описанной выше аминокислотной последовательности (1) удалены, замещены или добавлены, и легкой цепи, включающая вариабельную область легкой цепи, состоящей из любой одной из (4) аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 128 последовательностей SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 в списке последовательностей, (5) аминокислотной последовательности, имеющей гомологию, по меньшей мере, 95% или более с описанной выше аминокислотной последовательностью (4), и (6) аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько аминокислот в описанной выше аминокислотной последовательности (4) удалены, замещены или добавлены.As an example of a humanized antibody of the mouse M30 antibody, an arbitrary combination of a heavy chain can be given, including a heavy chain variable region consisting of any one of (1) amino acid sequence consisting of amino acid residues from 20 to 141 of the sequences of SEQ ID NO: 9, 10, 11 or 12 in the sequence listing, (2) an amino acid sequence having at least 95% or more homology with the amino acid sequence described above (1), and (3) an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence described above sequences of (1) deleted, substituted or added, and a light chain comprising a light chain variable region consisting of any one of (4) amino acid sequences consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NOs: 13, 14, 15, 16, 17, 18, or 19 in the sequence listing, (5) amino acid sequence having homo at least 95% or more of the amino acid sequence described above (4), and (6) an amino acid sequence in which one or more amino acids in the amino acid sequence described above (4) are removed, substituted or added.
Используемый в изобретении термин "несколько" означает число от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3 или один или два.As used herein, the term "multiple" means a number from 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, 1 to 3, or one or two.
Что касается замещения аминокислоты в этом изобретении, то предпочтительным является консервативное замещение аминокислоты. Консервативное замещение аминокислоты относится к замещению, происходящему внутри группы аминокислот, относящихся к боковым цепям аминокислот. Предпочтительными группами аминокислот являются следующие: кислотная группа (аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота); основная группа (лизин, аргинин и гистидин); неполярная группа (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин и триптофан); и незаряженное полярное семейство (глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин и тирозин). Более предпочтительными группами аминокислот являются следующие: алифатическая гидроксильная группа (серин и треонин); амидосодержащая группа (аспарагин и глютамин); алифатическая группа (аланин, валин, лейцин и изолейцин); и ароматическая группа (фенилаланин, триптофан и тирозин). Такое замещение аминокислоты предпочтительно проводить внутри диапазона, при котором не ухудшаются свойства вещества с исходной аминокислотной последовательностью.With regard to amino acid substitution in this invention, conservative amino acid substitution is preferred. Conservative amino acid substitution refers to substitution occurring within a group of amino acids belonging to the amino acid side chains. Preferred amino acid groups are as follows: acid group (aspartic acid and glutamic acid); main group (lysine, arginine and histidine); non-polar group (alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine and tryptophan); and the uncharged polar family (glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine, and tyrosine). More preferred amino acid groups are as follows: aliphatic hydroxyl group (serine and threonine); amide-containing group (asparagine and glutamine); aliphatic group (alanine, valine, leucine and isoleucine); and an aromatic group (phenylalanine, tryptophan and tyrosine). Such amino acid substitution is preferably carried out within a range that does not degrade the properties of the substance with the original amino acid sequence.
В качестве примера антитела, которое имеет предпочтительную комбинацию описанных выше тяжелой цепи и легкой цепи, можно привести антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 до 141 последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 128 последовательности SEQ ID NO: 13; антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 до 141 последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 128 последовательности SEQ ID NO: 14; антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 до 141 последовательности SEQ ID NO: 9 и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 128 последовательности SEQ ID NO: 15; антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 до 141 последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 128 последовательности SEQ ID NO: 16; антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 до 141 последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 128 последовательности SEQ ID NO: 17; антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 до 141 последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 128 последовательности SEQ ID NO: 18; антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 до 141 последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 128 последовательности SEQ ID NO: 19; антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 до 141 последовательности SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 128 последовательности SEQ ID NO: 13; антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 до 141 последовательности SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 128 последовательности SEQ ID NO: 14; антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 до 141 последовательности SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 128 последовательности SEQ ID NO: 15; и антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 до 141 последовательности SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 128 последовательности SEQ ID NO: 16.As an example of an antibody that has a preferred combination of the heavy chain and light chain described above, an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 14; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acids residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 15; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 16; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 17; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 9 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 19; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 14; an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 15; and an antibody consisting of a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 141 of SEQ ID NO: 12 and a light chain comprising a light chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of from amino acid residues 21 to 128 of SEQ ID NO: 16.
Кроме того, в качестве примера антитела, которое имеет более предпочтительную комбинацию описанных выше тяжелой цепи и легкой цепи, можно привести антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 по 471 последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 233 последовательности SEQ ID NO: 13; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 по 471 последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 233 последовательности SEQ ID NO: 14; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 по 471 последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 233 последовательности SEQ ID NO: 15; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 по 471 последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 233 последовательности SEQ ID NO: 16; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 по 471 последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 233 последовательности SEQ ID NO: 17; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 по 471 последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 233 последовательности SEQ ID NO: 18; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 по 471 последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 233 последовательности SEQ ID NO: 19; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 по 471 последовательности SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 233 последовательности SEQ ID NO: 13; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 по 471 последовательности SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 233 последовательности SEQ ID NO: 14; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 по 471 последовательности SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 233 последовательности SEQ ID NO: 15; и антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 20 по 471 последовательности SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков с 21 по 233 последовательности SEQ ID NO: 16.In addition, as an example of an antibody that has a more preferred combination of the heavy chain and light chain described above, an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9, and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 14 ; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 15 ; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 16 ; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 17 ; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 18 ; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 19 ; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 13 ; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 14 ; an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 15 ; and an antibody consisting of a heavy chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 471 of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 233 of SEQ ID NO: 16.
Кроме того, в качестве примера антитела, которое имеет другую более предпочтительную комбинацию описанных выше тяжелой цепи и легкой цепи, можно привести антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15; и антитело, состоящее из тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, и легкой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16.In addition, as an example of an antibody that has another more preferred combination of the heavy chain and light chain described above, an antibody consisting of a heavy chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; an antibody consisting of a heavy chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; an antibody consisting of a heavy chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16; an antibody consisting of a heavy chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; an antibody consisting of a heavy chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18; an antibody consisting of a heavy chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19; an antibody consisting of a heavy chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13; an antibody consisting of a heavy chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14; an antibody consisting of a heavy chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15; and an antibody consisting of a heavy chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
Путем объединения последовательности, имеющей высокую гомологию с вышеописанной аминокислотной последовательностью тяжелой цепи, с последовательностью, имеющей высокую гомологию с вышеописанной аминокислотной последовательностью легкой цепи, можно подобрать антитело, имеющее цитотоксическую активность, эквивалентную цитотоксической активности каждого из описанных выше антител. Такой гомологией обычно является гомология порядка 80% или более, предпочтительно, гомология порядка 90% или более, более предпочтительно, гомология порядка 95% или более, наиболее предпочтительно, гомология порядка 99% или более. Кроме того, путем объединения аминокислотной последовательности, в которой в аминокислотной последовательности тяжелой цепи или легкой цепи замещены, удалены или добавлены от одного до нескольких аминокислотных остатков, можно также подобрать антитело, имеющее цитотоксическую активность, эквивалентную цитотоксической активности каждого из описанных выше антител.By combining a sequence having high homology to the heavy chain amino acid sequence described above with a sequence having high homology to the light chain amino acid sequence described above, an antibody having a cytotoxic activity equivalent to that of each of the antibodies described above can be selected. Such homology is typically on the order of 80% or more, preferably on the order of 90% or more, more preferably on the order of 95% or more, most preferably on the order of 99% or more. In addition, by combining an amino acid sequence in which one to more amino acid residues are substituted, deleted or added in the heavy chain or light chain amino acid sequence, it is also possible to select an antibody having a cytotoxic activity equivalent to that of each of the antibodies described above.
Гомология между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена путем использования алгоритма Blast версии 2.2.2 с заданными по умолчанию параметрами (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Алгоритм Blast можно использовать также в режиме реального масштаба времени с помощью интернета на сайте www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.Homology between two amino acid sequences can be determined using the Blast algorithm version 2.2.2 with default parameters (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). The Blast algorithm can also be used in real time via the Internet at www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.
В аминокислотной последовательности тяжелой цепи, представленной SEQ ID NO: 9, 10, 11 или 12 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 1 по 19, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 20 по 141, представляет собой вариабельную область, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 142 по 471, представляет собой константную область. Последовательности SEQ ID NO: 9, 10, 11 и 12 приведены на фигурах 3, 4, 5 и 6, соответственно. Кроме того, в аминокислотной последовательности легкой цепи, представленной SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 в списке последовательностей, аминокислотная последовательность, состоящей из аминокислотных остатков с 1 по 20, представляет собой сигнальную последовательность, аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 21 по 128, представляет собой вариабельную область, и аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков с 129 по 233, представляет собой константную область. Последовательности SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 и 19 приведены на фигурах 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13, соответственно.In the amino acid sequence of the heavy chain represented by SEQ ID NO: 9, 10, 11 or 12 in the sequence listing, the amino acid sequence consisting of
Кроме того, антитело изобретения включает гуманизированное антитело, которое связывает тот же самый эпитоп, что и антитело М30. Анти-В7-Н3 гуманизированное антитело относится к гуманизированному антителу, имеющему только последовательность антитела, полученную из хромосомы человека. Анти-В7-Н3 гуманизированное антитело может быть получено с помощью способа, в котором используют продуцирующую гумантизированное антитело мышь, имеющую фрагмент хромосомы человека, включающий гены тяжелой и легкой цепи гуманизированного антитела (см. Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, pp. 722-727, etc.).In addition, the antibody of the invention includes a humanized antibody that binds the same epitope as the M30 antibody. An anti-B7-H3 humanized antibody refers to a humanized antibody having only an antibody sequence derived from a human chromosome. An anti-B7-H3 humanized antibody can be produced by a method that uses a humanized antibody-producing mouse having a human chromosome fragment comprising the humanized antibody heavy and light chain genes (see Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997). ) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, pp. 722-727, etc.).
Такая продуцирующая гумантизированное антитело мышь может быть специально создана следующим образом. Генетически модифицированное животное, у которого был разрушен локус тяжелой и легкой цепи гена эндогенного иммуноглобулина и вместо него был введен локус тяжелой и легкой цепи гена иммуноглобулина человека с помощью вектора дрожжевой искусственной хромосомы (YAC) или другим подобным образом, может быть создано путем получения нокаутного животного и трансгенного животного и скрещивания этих животных.Such a humanized antibody-producing mouse can be custom designed as follows. A genetically modified animal in which the endogenous immunoglobulin gene heavy and light chain locus has been destroyed and the human immunoglobulin gene heavy and light chain locus has been introduced in its place by a yeast artificial chromosome (YAC) vector or the like can be generated by producing a knockout animal and transgenic animal and crossing these animals.
Кроме того, такие эукариотические клетки трансформируют способом рекомбинантной ДНК, в котором используются комплементарные ДНК, кодирующие каждую из такой тяжелой цепи и легкой цепи гуманизированного антитела и, предпочтительно, вектор, содержащий комплементарные ДНК, и трансформированные клетки, которые продуцируют рекомбинантное человеческое моноклональное антитело, культивируют, в результате чего из надосадочной жидкости культуры клеток может быть также получено антитело.In addition, such eukaryotic cells are transformed by a recombinant DNA method that uses complementary DNAs encoding each of such a humanized antibody heavy chain and light chain, and preferably a vector containing complementary DNAs, and the transformed cells that produce the recombinant human monoclonal antibody are cultured. , as a result of which an antibody can also be obtained from the cell culture supernatant.
В изобретении, в качестве клеток хозяина могут быть использованы, например, эукариотические клетки, предпочтительно, клетки млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (СНО), лимфоциты или клетки миеломы.In the invention, for example, eukaryotic cells, preferably mammalian cells such as Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, lymphocytes or myeloma cells, can be used as host cells.
Кроме того, также известен способ получения гуманизированного антитела из фагового отображения, выбранного из библиотеки гуманизированных антител (см. Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), pp. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), pp. 189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), pp. 427-431, etc.).In addition, a method for obtaining a humanized antibody from a phage display selected from a library of humanized antibodies is also known (see Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), pp. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), pp. 189-203 Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), pp. 427-431, etc.).
Например, может быть использован способ фагового отображения, в котором вариабельная область гуманизированного антитела экспрессируется на поверхности фага в виде одноцепочечного антитела (ScFv), и выбирают фаг, который связывает антиген (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), стр. 1105-1116).For example, a phage display method can be used in which the variable region of a humanized antibody is expressed on the surface of a phage as a single chain antibody (ScFv), and a phage that binds the antigen is selected (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), page 1105 -1116).
Путем анализа выбранного гена фага на основе связывания с антигеном может быть определена последовательность ДНК, кодирующая вариабельную область гуманизированного антитела, которое связано с антигеном.By analyzing a selected phage gene based on antigen binding, the DNA sequence encoding the variable region of a humanized antibody that is bound to the antigen can be determined.
Если определяют последовательность ДНК в ScFv, которая связывает антиген, то гуманизированное антитело может быть получено путем приготовления экспрессирующего вектора, содержащего эту последовательность, и введения вектора в подходящие клетки-хозяева с целью экспрессии гуманизированного антитела (WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, pp. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), pp. 1105-1116).If a DNA sequence is determined in a ScFv that binds an antigen, then a humanized antibody can be obtained by preparing an expression vector containing this sequence and introducing the vector into suitable host cells to express the humanized antibody (WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu Rev Immunol (1994) 12, pp 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9 ), pp. 1105-1116).
Если вновь полученное гуманизированное антитело связывает частичный пептид или частичную трет-ичную структуру, которые связывает и антитело M30, то на основании этого можно сделать вывод, что гуманизированное антитело связывает тот же самый эпитоп, что и антитело М30. Кроме того, путем подтверждения того, что гуманизированное антитело конкурирует с антитело М30 при связывании В7-Н3 (то есть гуманизированное антитело ингибирует связывание антитела М30 с В7-Н3), можно сделать вывод, что гуманизированное антитело связывает тот же самый эпитоп, что и антитело M30, даже если не была определена конкретная последовательность или структура эпитопа. Когда подтверждается, что гуманизированное антитело связывается с тем же эпитопом, что и антитело М30, то можно с большой долей вероятности ожидать, что гуманизированное антитело будет обладать цитотоксической активностью, эквивалентной цитотоксической активности антитела М30.If the newly generated humanized antibody binds a partial peptide or partial tertiary structure that the M30 antibody also binds, then it can be concluded that the humanized antibody binds the same epitope as the M30 antibody. In addition, by confirming that the humanized antibody competes with the M30 antibody for binding B7-H3 (i.e., the humanized antibody inhibits the binding of the M30 antibody to B7-H3), it can be concluded that the humanized antibody binds the same epitope as the antibody M30, even if the specific sequence or structure of the epitope has not been determined. When it is confirmed that a humanized antibody binds to the same epitope as an M30 antibody, then the humanized antibody can be expected to have a cytotoxic activity equivalent to that of the M30 antibody with a high degree of probability.
Полученные описанным выше способом химерные антитела, гуманизированные антитела или человеческие антитела подвергают оценке на их способность связывать антиген с помощью известного способа или другого подобного способа, и в результате может быть выбрано предпочтительное антитело.The chimeric antibodies, humanized antibodies or human antibodies obtained by the above method are evaluated for their ability to bind an antigen by a known method or the like, and as a result, a preferred antibody can be selected.
В качестве примера другого критерия оценки, использующегося для сравнения свойств антител, можно привести критерий стабильности антител. Способ дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) позволяет быстро и точно измерить среднюю температуру термической денатурации (Tm), используемую в качестве удобного критерия относительной конформационной стабильности белков. Путем измерения значений Tm способом ДСК и сравнения этих значений можно выявить разницу в термической стабильности. Известно, что стабильность антител при хранении в некоторой степени зависит от их термической стабильности (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, pp. 265-273), и использование в качестве критерия термическую стабильность позволяет выбрать предпочтительное антитело. Примеры других критериев для выбора антител включают следующие: высокий выход при продуцировании в соответствующей клетке-хозяине и низкая способность к агрегации в водном растворе. Например, антитело, которое характеризуется самым высоким выходом, не всегда проявляет самую высокую термическую стабильность, и, поэтому, для того чтобы выбрать наиболее подходящее антитело для введения человеку, необходимо проводить комплексную оценку антител на основе описанных выше критериев.As an example of another evaluation criterion used to compare the properties of antibodies, one can cite the criterion of antibody stability. The differential scanning calorimetry (DSC) method allows for rapid and accurate measurement of the average thermal denaturation temperature (Tm) used as a convenient measure of the relative conformational stability of proteins. By measuring the Tm values using the DSC method and comparing these values, a difference in thermal stability can be identified. It is known that the storage stability of antibodies depends to some extent on their thermal stability (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, pp. 265-273), and the use of thermal stability as a criterion allows you to choose the preferred antibody. Examples of other criteria for selecting antibodies include the following: high yield when produced in the appropriate host cell and low aggregation ability in aqueous solution. For example, the antibody that has the highest yield does not always exhibit the highest thermal stability, and therefore, in order to select the most suitable antibody for human administration, it is necessary to conduct a comprehensive assessment of antibodies based on the criteria described above.
Изобретение также включает в себя модифицированный вариант антитела. Модифицированный вариант относится к варианту, полученному путем химической или биологической модификации антитела изобретения. Примеры химически модифицированного варианта антитела включают химически модифицированные варианты в результате образования связи химического фрагмента со скелетом аминокислоты, химически модифицированные варианты в результате присоединения через атом азота или кислорода углеводной цепи и другие подобные варианты. Примеры биологически модифицированного варианта антитела включают биологически модифицированные варианты в результате посттрансляционной модификации (такой как, N-связанное или О-связанное гликозилирование, N-концевая или С-концевая обработка, деамидирование, изомеризация аспарагиновой кислоты или окисление метионина), и варианты, при которых остаток метионина был добавлен к N-концу в результате экспрессирования в прокариотической клетке-хозяине.The invention also includes a modified version of the antibody. A modified variant refers to a variant obtained by chemical or biological modification of an antibody of the invention. Examples of a chemically modified variant of an antibody include chemically modified variants by bonding a chemical moiety to an amino acid backbone, chemically modified variants by attaching through a nitrogen or oxygen atom of a carbohydrate chain, and the like. Examples of a biologically modified antibody variant include biologically modified variants resulting from post-translational modification (such as N-linked or O-linked glycosylation, N-terminal or C-terminal processing, deamidation, aspartic acid isomerization, or methionine oxidation), and variants in which a methionine residue was added to the N-terminus as a result of expression in a prokaryotic host cell.
Кроме того, понятие модифицированного варианта антитела также включает в себя меченое антитело, применяемое для обнаружения или выделения антитела или антигена изобретения, например, меченое ферментом антитело, флуоресцентно-меченное антитело и аффинное меченое антитело. Такой модифицированный вариант антитела изобретения применяют с целью улучшения стабильности и ретенции в крови исходного антитела изобретения, снижения его антигенности, обнаружения или выделения такого антитела или антигена и для других подобных целей.In addition, the term modified antibody also includes a labeled antibody used to detect or isolate an antibody or antigen of the invention, such as an enzyme labeled antibody, a fluorescently labeled antibody, and an affinity labeled antibody. Such a modified version of an antibody of the invention is used to improve the stability and blood retention of the original antibody of the invention, reduce its antigenicity, detect or isolate such an antibody or antigen, and for other similar purposes.
Кроме того, путем регулирования модификации гликана, который связан с антителом изобретения (путем гликозилирования, дефукозилирования и других подобных реакций), можно повысить антителозависимую клеточную цитотоксическую активность. Методика регулирования модификации гликана антител описана в патентных документах WO 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31140 и других подобных документах. Но эта методика не является ограничением для применения других методик. Антитело изобретения также включает в себя антитело, в котором регулируется модификация гликана.In addition, by controlling the modification of the glycan that is bound to the antibody of the invention (by glycosylation, defucosylation, and the like), antibody-dependent cellular cytotoxic activity can be increased. A technique for regulating antibody glycan modification is described in patent documents WO 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31140 and other similar documents. But this technique is not a limitation for the application of other techniques. The antibody of the invention also includes an antibody in which glycan modification is regulated.
В случае, когда антитело получают сначала путем выделения гена антитела и затем введения гена в подходящую клетку-хозяина, может быть использовано сочетание подходящего хозяина и соответствующего экспрессирующего вектора. Конкретные примеры гена антитела включают комбинацию гена, кодирующего последовательность тяжелой цепи антитела, описанного в изобретении, и гена, кодирующего последовательность его легкой цепи. При трансформировании клетки-хозяина можно вставить ген, кодирующий последовательность тяжелой цепи, и ген, кодирующий последовательность легкой цепи, в один и тот же экспрессирующий вектор, или же каждый по отдельности в различные экспрессирующие векторы.In the case where an antibody is obtained by first isolating the antibody gene and then introducing the gene into a suitable host cell, a combination of a suitable host and an appropriate expression vector can be used. Specific examples of an antibody gene include a combination of a gene encoding the heavy chain sequence of an antibody of the invention and a gene encoding its light chain sequence. When transforming the host cell, the gene encoding the heavy chain sequence and the gene encoding the light chain sequence can be inserted into the same expression vector, or each separately into different expression vectors.
При применении в качестве клеток-хозяев эукариотических клеток, могут быть использованы клетки животных, клетки растений и эукариотические микроорганизмы. Примеры клеток животных включают клетки млекопитающих, например, клетки обезьяны линии COS (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), мышиные фибробласты NIH3T3 (АТСС CRL-1658) и штаммы с дефицитом дигидрофолатредуктазы (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) клеток яичников китайского хомячка (клетки СНО; ATCC: CCL-61).When used as host cells of eukaryotic cells, animal cells, plant cells and eukaryotic microorganisms can be used. Examples of animal cells include mammalian cells, for example COS monkey cells (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), NIH3T3 mouse fibroblasts (ATCC CRL-1658), and strains with dihydrofolate reductase deficiency (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) of Chinese hamster ovary cells (CHO cells; ATCC: CCL-61).
Примером использования прокариотических клеток является применение Escherichia coli (кишечной палочки) и Bacillus subtilis (сенной палочки).An example of the use of prokaryotic cells is the use of Escherichia coli (E. coli) and Bacillus subtilis (hay bacillus).
Антитело может быть получено путем введения требуемого гена антитела в эти клетки в результате трансформации и культивирования in vitro трансформированных таким образом клеток. В случае фрагментарно описанного выше способа культивирования, выход может иногда изменяться в зависимости от последовательности антитела, и, поэтому, среди антител, имеющих эквивалентно связывающую активность, использование критерия высокого выхода позволяет выбрать антитело, которое можно легко получать в качестве фармацевтического средства. Таким образом, антитело изобретения также включает в себя антитело, получаемое способом продуцирования антитела, отличающимся тем, что способ включает стадию культивирования трансформированной клетки-хозяина и стадию сбора требуемого антитела из продукта культивирования, полученного на стадии культивирования.The antibody can be obtained by introducing the desired antibody gene into these cells by transformation and in vitro cultivation of the thus transformed cells. In the case of the culture method described above fragmentarily, the yield may sometimes vary depending on the sequence of the antibody, and therefore, among antibodies having equivalent binding activity, the use of a high yield criterion allows one to select an antibody that can be easily obtained as a pharmaceutical agent. Thus, an antibody of the invention also includes an antibody obtainable by a method for producing an antibody, characterized in that the method includes the step of culturing the transformed host cell and the step of collecting the desired antibody from the culture product obtained in the culturing step.
Известно, что удаляют лизиновый остаток на карбоксильном конце тяжелой цепи антитела, полученного в культивируемых клетках млекопитающих (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), и также известно, что удаляют два аминокислотных остатка (глициновый и лизиновый) на карбоксильном конце тяжелой цепи антитела, полученного в культивируемых клетках млекопитающих, и амидируют пролиновый остаток, вновь установленный на карбоксильном конца (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Тем не менее, такое удаление и модификация последовательности тяжелой цепи не влияют на антигенсвязывающую аффинность и эффекторную функцию (активацию комплемента, антителозависимую клеточную цитотоксичность и другие подобные характеристики. Поэтому, настоящее изобретение также включает в себя антитело, подвергнутое такой модификации и удалению, и в качестве примера может быть приведен вариант антитела, при котором на карбоксильном конце тяжелой цепи были удалены одна или две аминокислоты, вариант антитела, полученный путем амидирования варианта антитела с удалением (например, тяжелая цепь, в которой пролиновый остаток на карбоксильном конце был подвергнут амидированию), и другие подобные варианты. Тип варианта удаления, характеризующийся удалением на карбоксильном конце тяжелой цепи антитела изобретения, не ограничивается приведенными выше вариантами, при условии, что сохраняются антигенсвязывающее сродство и эффекторная функция. Две тяжелые цепи, составляющие антитело изобретения, могут быть одного типа, выбранные из группы, состоящей из полноразмерной тяжелой цепи и описанного выше варианта удаления, или могут быть двух типов в выбранной из них комбинации. Соотношение количества каждого варианта удаления может зависеть от типа культивируемых клеток млекопитающих, которые продуцируют антитело изобретения, и условий культивирования, и в качестве примера может быть приведен случай, когда был удален один аминокислотный остаток на карбоксильном конце каждой из двух тяжелых цепей, являющихся основными компонентами антитела изобретения.It is known to remove the lysine residue at the carboxyl end of the heavy chain of an antibody produced in cultured mammalian cells (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), and it is also known to remove two amino acid residues (glycine and lysine) on the carboxyl the end of the heavy chain of an antibody produced in cultured mammalian cells and amidate the proline residue newly installed at the carboxyl end (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). However, such removal and modification of the heavy chain sequence does not affect antigen-binding affinity and effector function (complement activation, antibody-dependent cellular cytotoxicity, and the like). Therefore, the present invention also includes an antibody subjected to such modification and removal, and as an example would be an antibody variant in which one or two amino acids have been removed from the carboxyl end of the heavy chain, an antibody variant obtained by amidation of the antibody variant with deletion (e.g., a heavy chain in which the proline residue at the carboxyl terminus has been amidated), and other similar variants The type of elimination variant characterized by removal at the carboxyl terminus of the heavy chain of the antibody of the invention is not limited to the above variants, so long as antigen-binding affinity and effector function are maintained. may be of the same type selected from the group consisting of a full-length heavy chain and the removal option described above, or may be of two types in a combination of them. The ratio of the amount of each removal option may depend on the type of cultured mammalian cells that produce the antibody of the invention and the culture conditions, and as an example, the case where one amino acid residue was removed at the carboxyl end of each of the two heavy chains that are the main components of the antibody inventions.
В качестве примеров изотипа антитела изобретения могут быть приведены IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), и предпочтительными являются IgG1 или IgG2.As examples of the isotype of the antibody of the invention, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) can be given, and IgG1 or IgG2 are preferred.
В качестве примеров функции антитела обычно могут быть приведены антигенсвязывающая активность, действие по нейтрализации активности антигена, действие по повышению активности антигена, антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и комплементзависимая цитотоксичность (CDC). Функция антитела изобретения представляет собой активность связывания В7-Н3, предпочтительно, активность в отношении антителозависимого клеточно-опосредованного фагоцитоза (ADCP), более предпочтительно, цитотоксическая активность (противоопухолевое действие) в отношении опухолевой клетки, опосредствованная активностью в отношении ADCP. Кроме того, антитело изобретения помимо активности ADCP может обладать активностью ADCC и/или активностью CDC.As examples of the function of an antibody, antigen-binding activity, antigen activity-neutralizing activity, antigen activity-enhancing activity, antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) and complement-dependent cytotoxicity (CDC) can generally be cited. The function of an antibody of the invention is a B7-H3 binding activity, preferably an antibody-dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP) activity, more preferably an ADCP-mediated cytotoxic activity (antitumor effect) on a tumor cell. Furthermore, an antibody of the invention may have ADCC activity and/or CDC activity in addition to ADCP activity.
Полученное антитело может быть очищено до состояния гомогенности. Разделение и очистка антитела может быть осуществлена обычным способом разделения и очистки белков. Например, антитело может быть выделено и очищено путем соответствующего выбора и комбинирования способов колоночной хроматографии, фильтрации, ультрафильтрации, осаждения солью, диализа, препаративного электрофореза в полиакриламидном геле, электрофореза с изоэлектрическим фокусированием и других подобных способов (Strategies for Protein purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), но эти способы не являются ограничениями для изобретения.The resulting antibody can be purified to a state of homogeneity. Separation and purification of antibodies can be carried out in the usual way of separation and purification of proteins. For example, an antibody can be isolated and purified by appropriate selection and combination of column chromatography, filtration, ultrafiltration, salt precipitation, dialysis, preparative polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing electrophoresis, and other similar methods (Strategies for Protein purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996), Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), but these methods are not intended to be inventions.
Примеры хроматографии включают аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-проникающую хроматографию, хроматографию с обращенной фазой и адсорбционную хроматографии.Examples of chromatography include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel permeation chromatography, reverse phase chromatography, and adsorption chromatography.
Хроматография может быть осуществлена способом жидкостной хроматографии, таким как способ высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) или способ жидкостной экспресс-хроматографии белков (FPLC).The chromatography may be carried out by a liquid chromatography method such as a high performance liquid chromatography (HPLC) method or a rapid protein liquid chromatography (FPLC) method.
В качестве примеров колонки, используемой в аффинной хроматографии, могут быть приведены колонка с белком A и колонка с белком G. Например, в качестве примера колонки с белком A могут быть приведены колонки Hyper D, POROS, Sepharose FF (фирмы Pharmacia) и другие подобные колонки.As examples of a column used in affinity chromatography, a protein A column and a protein G column can be given. columns.
Кроме того, антитело может быть также очищено на основе связывания антитела с антигеном путем использования носителя с иммобилизованным на нем антигеном.In addition, the antibody can also be purified based on the binding of the antibody to the antigen by using a carrier immobilized on it with the antigen.
Противоопухолевое соединениеAnticancer Compound
Далее описывается противоопухолевое соединение, которое преобразуют в конъюгат антитело-лекарственное средство настоящего изобретения. На противоопухолевое соединение не накладывают конкретных ограничений, при условии, что оно является соединением, обладающим противоопухолевым действием и имеющим заместительную группу или подструктуру, позволяющую соединяться с линкерной структурой. При разрушении части и всего линкера в опухолевых клетках, высвобождается фрагмент противоопухолевого соединения и оказывает противоопухолевое действие. Как только линкер разрушается в положении присоединения к лекарственному средству, противоопухолевое соединение высвобождается в форме свойственной ему структуры и оказывает свойственное ему противоопухолевое действие.The following describes an antitumor compound that is converted into an antibody-drug conjugate of the present invention. The antitumor compound is not particularly limited as long as it is a compound having an antitumor effect and having a substituent group or substructure capable of being connected to a linker structure. When part and all of the linker is destroyed in tumor cells, a fragment of the antitumor compound is released and has an antitumor effect. Once the linker is degraded at the position of attachment to the drug, the antitumor compound is released in its native form and exerts its intrinsic antitumor effect.
Примеры противоопухолевого соединения могут включать доксорубицин, даунорубицин, митомицин С, блеомицин, циклоцитидин, винкристин, винбластин, метотрексат, противоопухолевое средство на основе платины (цисплатин или его производные), таксол или его производные, и камптотецин или его производные (противоопухолевое средство, описанное в выложенном патенте Японии № 6-87746). В конъюгате антитело-лекарственное средство настоящего изобретения в качестве производного камптотецина может быть предпочтительно использован эксатекан (((1S,9S)-1-амино-9-этил-5-фтор-2,3-дигидро-9-гидрокси-4-метил-1H,12H-бензо[de]-пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-10,13(9H,15H)дион; представленный следующей формулой. Examples of the antitumor compound may include doxorubicin, daunorubicin, mitomycin C, bleomycin, cyclocytidine, vincristine, vinblastine, methotrexate, a platinum-based antitumor agent (cisplatin or derivatives thereof), taxol or derivatives thereof, and camptothecin or derivatives thereof (the antitumor agent described in Japanese Patent Laid-Open No. 6-87746). In the antibody-drug conjugate of the present invention, exatecan (((1S,9S)-1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl -1H,12H-benzo[de]-pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinoline-10,13(9H,15H)dione represented by the following formula.
. .
Несмотря на то, что эксатекан обладает сильным противоопухолевым действием, он еще не производится серийно промышленностью в качестве противоопухолевого лекарственного средства. Соединение может быть легко получено известным способом, и в качестве положения для его соединения с линкерной структурой может быть предпочтительно использована аминогруппа в положении 1. Кроме того, эксатекан может также высвобождаться в опухолевых клетках, когда к нему все еще присоединена часть линкера, и даже в этом случае он является эффективным соединением, которое проявляет сильное противоопухолевое действие.Despite the fact that exatecan has a strong antitumor effect, it is not yet commercially commercially available as an antitumor drug. The compound can be easily prepared by a known method, and the amino group at the 1-position can be preferably used as the position for its connection to the linker structure. in this case, it is an effective compound that exhibits a strong antitumor effect.
Что касается конъюгата антитело-лекарственное средство, то ключевым фактором, оказывающим влияние на его эффективность и безопасность, является число конъюгированных молекул лекарственного средства на молекуле антитела. При получении конъюгата антитело-лекарственное средство необходимо определить условия проведения реакции, в частности, количества используемых для реакции исходных материалов и реагентов, для того чтобы иметь постоянное число конъюгированных молекул лекарственного средства, и, в данном случае, в отличие от химической реакции с низкомолекулярными соединениями, получают, как правило, смесь, содержащую различное число конъюгированных молекул лекарственного средства. Число молекул лекарственного средства, конъюгированных с молекулой антитела, выражают или указывают в виде среднего значения, то есть среднего числа конъюгированных молекул лекарственного средства. Если специально не указано иначе, то, как правило, число конъюгированных молекул лекарственного средства означает их среднее число, за исключением случая, когда речь идет о конъюгате антитело-лекарственное средство, имеющего конкретное число конъюгированных молекул лекарственного средства, который входит в смесь конъюгатов антитело-лекарственное средство, имеющих различное число конъюгированных молекул лекарственного средства. Число молекул эксатекана, конъюгированных с молекулой антитела, можно регулировать, и, в среднем, число конъюгированных молекул лекарственного средства с молекулой антитела может составлять приблизительно от 1 до 10 молекул эксатекана. Предпочтительно, чтобы это число составляло от 2 до 8, и более предпочтительно, от 3 до 8. Специалист в данной области может осуществить реакцию конъюгации требуемого числа молекул лекарственного средства с молекулой антитела на основе описанных в изобретении примеров, и в результате чего им может быть получено антитело, конъюгированное с регулируемым числом молекул эксатекана.With respect to the antibody-drug conjugate, the number of conjugated drug molecules per antibody molecule is a key factor influencing its efficacy and safety. When preparing an antibody-drug conjugate, it is necessary to determine the reaction conditions, in particular, the amounts of starting materials and reagents used for the reaction, in order to have a constant number of conjugated drug molecules, and, in this case, in contrast to a chemical reaction with small molecular weight compounds , as a rule, a mixture containing a different number of conjugated drug molecules is obtained. The number of drug molecules conjugated to an antibody molecule is expressed or reported as an average, that is, the average number of conjugated drug molecules. Unless specifically stated otherwise, as a rule, the number of conjugated drug molecules means their average number, except when it comes to an antibody-drug conjugate having a specific number of conjugated drug molecules, which is included in a mixture of antibody-drug conjugates. drug having a different number of conjugated drug molecules. The number of exatecan molecules conjugated to an antibody molecule can be adjusted and, on average, the number of drug molecules conjugated to an antibody molecule can be from about 1 to 10 exatecan molecules. Preferably, this number is from 2 to 8, and more preferably, from 3 to 8. A person skilled in the art can perform a conjugation reaction of the required number of drug molecules with an antibody molecule based on the examples described in the invention, and as a result, it can be an antibody conjugated with a controlled number of exatecan molecules was obtained.
Так как эксатекан имеет структуру камптотецина, то по поводу него известно, что равновесие смещается в сторону образования структуры с замкнутым лактонным кольцом (замкнутым кольцом) в водной кислой среде (например, при рН 3 или около этого значения), и смещается в сторону образования структуры с открытым лактонным кольцом (открытым кольцом) в водной щелочной среде (например, при рН 10 или около этого значения). Кроме того, можно ожидать, что конъюгат лекарственного средства, в который вводят фрагмент эксатекана, соответствующий замкнутой кольцевой структуре и открытой кольцевой структуре, обладает одним и тем же противоопухолевым действием, и, само собой разумеется, что любой из этих конъюгатов входит в объем настоящего изобретения.Since exatecan has the structure of camptothecin, it is known that the equilibrium shifts towards the formation of a structure with a closed lactone ring (closed ring) in an aqueous acidic environment (for example, at pH 3 or about this value), and shifts towards the formation of a structure with an open lactone ring (open ring) in an aqueous alkaline environment (for example, at or near pH 10). In addition, a drug conjugate into which an exatecan moiety corresponding to a closed ring structure and an open ring structure is introduced can be expected to have the same antitumor activity, and it goes without saying that any of these conjugates are within the scope of the present invention. .
Линкерная структураLinker structure
Применительно к конъюгату антитело-лекарственное средство настоящего изобретения, далее описывается линкерная структура для конъюгирования противоопухолевого лекарственного средства с антителом. Линкер имеет следующую структуру:With reference to the antibody-drug conjugate of the present invention, a linker structure for conjugating an antitumor drug to an antibody will now be described. The linker has the following structure:
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-.-L 1 -L 2 -L P -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c -.
Антитело присоединено к концу L1 (конец напротив присоединения к L2), а противоопухолевое лекарственное средство присоединено к концу Lc (конец напротив присоединения к Lb).The antibody is attached to the end of L 1 (the end opposite the attachment to L 2 ), and the antitumor drug is attached to the end of L c (the end opposite to the attachment to L b ).
n1 представляет целое число от 0 до 6 и, предпочтительно, представляет собой целое число от 1 до 5, и, более предпочтительно, от 1 до 3.n 1 is an integer from 0 to 6 and preferably is an integer from 1 to 5, and more preferably from 1 to 3.
1. L1 1.L1
L1 представляет собой фрагмент в линкере, представленный следующей структурой:L 1 is a fragment in the linker, represented by the following structure:
-(сукцинимид-3-ил-N)-(CH2)n2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-(CH 2 )n 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-(CH 2 )n 3 -C(=O)-,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)- или-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH 2 -(N-li-3-diminiccus)- or
-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-.-C(=O)-(CH 2 )n 4 -C(=O)-.
В приведенных выше фрагментах, n2 представляет собой целое число от 2 до 8, n3 представляет собой целое число от 1 до 8, и n4 представляет собой целое число от 1 до 8.In the snippets above, n 2 is an integer from 2 to 8, n 3 is an integer from 1 to 8, and n 4 is an integer from 1 to 8.
В линкере, имеющем структуру, представленную с помощью -(сукцинимид-3-ил-N)-(CH2)n2-C(=O)- для L1, "-(сукцинимид-3-ил-N)-" имеет структуру, представленную следующей формулой:In a linker having the structure represented by -(succinimide-3-yl-N)-(CH 2 )n 2 -C(=O)- for L 1 , "-(succinimide-3-yl-N)-" has a structure represented by the following formula:
. .
Положение 3 приведенной выше подструктуры является положением присоединения к антителу. Связь с антителом в положении 3 характеризуется как связь в результате образования тиоэфира. С другой стороны, атом азота в положении 1 фрагмента структуры соединен с углеродным атомом метилена, который присутствует в линкере, включающем эту структуру. В частности, -(сукцинимид-3-ил-N)-(CH2)n2-C(=O)-L2- представляет собой структуру, представленную следующей формулой (здесь, "антитело-S-" берет начало от антитела).Position 3 of the above substructure is the position of attachment to the antibody. The bond to the antibody at position 3 is characterized as a bond resulting from the formation of a thioether. On the other hand, the nitrogen atom at
. .
В этой формуле, n2 представляет собой целое число от 2 до 8, и, предпочтительно, от 2 до 5.In this formula, n 2 is an integer from 2 to 8, and preferably from 2 to 5.
В линкере, имеющем структуру, представленную с помощью -CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)- для L1, n3 представляет собой целое число от 1 до 8, предпочтительно, от 2 до 6. Этот линкер присоединен к антителу на его углеродном атоме концевого метилена и имеет следующую структуру для присоединения за счет образования тиоэфира, как и в случае предыдущего линкера (здесь, "антитело-S-" берет начало от антитела). Антитело-S-CH2-C(=O)-NH-(CH2)n3-C(=O)-L2-.In a linker having a structure represented by -CH 2 -C(=O)-NH-(CH 2 )n 3 -C(=O)- for L 1 , n 3 is an integer from 1 to 8, preferably , 2 to 6. This linker is attached to the antibody at its terminal methylene carbon atom and has the following structure for attachment via thioether formation, as in the case of the previous linker (here, "antibody-S-" originates from antibody). Antibody-S-CH 2 -C(=O)-NH-(CH 2 )n 3 -C(=O)-L 2 -.
В линкере, имеющем структуру, представленную с помощью -C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)- для L1, "-(N-ли-3-диминицкус)-" имеет структуру, представленную следующей формулой:In a linker having a structure represented by -C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH 2 -(N-li-3-diminiccus)- for L 1 , "-(N-li-3 -diminickus)-" has a structure represented by the following formula:
. .
В этом фрагменте структуры, атом азота в положении 1 соединен с углеродным атомом метилена, присутствующего в линкерной структуре, включающей эту структуру. Углеродный атом в позиции 3 присоединен к концевому атому серы -S-(CH2)n6-C(=O)- для L2 в линкере. Этот фрагмент -S-(CH2)n6-C(=O)- для L2 в линкере образует объединенную линкерную структуру только с -C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)- для L1 в линкере. В приведенных выше фрагментах, "-цик.Гекс(1,4)-", содержащийся в линкере, представляет 1,4-циклогексиленовую группу. В линкере, -C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)- присоединен к антителу за счет образования амидной связи на его концевом карбонильном углероде (здесь, "антитело-NH-" берет начало от антитела).In this fragment of the structure, the nitrogen atom in
. .
Аминогруппа антитела для образования этой амидной связи является концевой аминогруппой боковой цепи лизинового остатка в антителе или аминогруппой на N конце антитела. Указанный линкер структуры может соединяться за счет образования эфирной связи с гидроксильной группой аминокислоты в антителе, а не за счет амидной связи.The amino group of the antibody to form this amide bond is the amino end of the side chain of the lysine residue in the antibody, or the amino group at the N terminus of the antibody. The specified structure linker can be connected by forming an ester bond with the hydroxyl group of an amino acid in the antibody, and not by an amide bond.
Структурный фрагмент "-цик.Гекс(1,4)-", содержащийся в указанном линкере, может представлять собой двухвалентную насыщенную циклическую алкиленовую группу, не являющуюся 1,4-циклогексиленовой группой, то есть, двухвалентную циклическую насыщенную углеводородную группу, такую как циклобутиленовая группа, циклопентиленовая группа, циклогепталеновая группа или циклоокталеновая группа, двухвалентную ароматическую углеводородную группу, такую как фениленовая группа или нафтиленовая группа, или 5- или 6-членную насыщенную, частично насыщенную или ароматическую двухвалентную гетероциклическую группу, содержащую 1 или 2 гетероатома. В качестве варианта, этот фрагмент может представлять собой двухвалентную алкиленовую группу, имеющую от 1 до 4 углеродных атомов. Присоединение к двухвалентной группе может возникать в смежных положениях или в положениях, которые не являются смежными.The "-cyc.Hex(1,4)-" structural moiety contained in said linker may be a divalent saturated cyclic alkylene group other than a 1,4-cyclohexylene group, that is, a divalent cyclic saturated hydrocarbon group such as cyclobutylene group, a cyclopentylene group, a cycloheptalene group or a cyclooctalene group, a divalent aromatic hydrocarbon group such as a phenylene group or a naphthylene group, or a 5- or 6-membered saturated, partially saturated or aromatic divalent heterocyclic group containing 1 or 2 heteroatoms. Alternatively, this fragment may be a divalent alkylene group having from 1 to 4 carbon atoms. Attachment to a divalent group may occur at adjacent positions or at positions that are not adjacent.
В линкере, имеющем структуру, представленную с помощью -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)- в качестве L1, n4 представляет собой целое число от 1 до 8, и, предпочтительно, от 2 до 6. Этот линкер присоединен также за счет образования амидной связи на его концевой карбонильной группе с аминогруппой антитела, как и в случае упомянутых выше линкеров (см. следующую формулу; в его структуре "антитело-NH-" берет начало от антитела).In a linker having a structure represented by -C(=O)-(CH 2 )n 4 -C(=O)- as L 1 , n 4 is an integer from 1 to 8, and preferably from 2 to 6. This linker is also attached by forming an amide bond at its terminal carbonyl group to the amino group of the antibody, as in the case of the linkers mentioned above (see the following formula; in its structure, "antibody-NH-" originates from antibody).
Антитело-NH-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-L2-.Antibody-NH-C(=O)-(CH 2 )n 4 -C(=O)-L 2 -.
Конкретные примеры L1 в линкере могут включатьSpecific examples of L 1 in a linker may include
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-CH2C(=O)NH-CH2-C(=O)-,-CH 2 C(=O)NH-CH 2 -C(=O)-,
-CH2C(=O)NH-CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 C(=O)NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 C (= O) NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 C (= O) NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-CH2C(=O)NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 C (= O) NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-,-C(=O)-cyc. Hex(1,4)-CH 2 -(N-li-3-diminiccus)-,
-C(=O)-арил-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-,-C(=O)-aryl-CH 2 -(N-li-3-diminiccus)-,
-C(=O)-цик.гет-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-,-C(=O)-cyc.het-CH 2 -(N-li-3-diminiccus)-,
-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.-C(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-.
(Арил представляет собой двухвалентную ароматическую углеводородную группу, а цик.гет представляет собой двухвалентную циклическую гетероциклическую группу).(Aryl is a divalent aromatic hydrocarbon group and cyc.het is a divalent cyclic heterocyclic group).
2. L2 2.L2
L2 является линкером, представленным следующей структурой:L 2 is a linker represented by the following structure:
-NH-(CH2CH2O)n5-CH2-CH2-C(=O)- или-NH-(CH 2 CH 2 O)n 5 -CH 2 -CH 2 -C(=O)- or
-S-(CH2)n6-C(=O)-,-S-(CH 2 )n 6 -C(=O)-,
L2 может отсутствовать, и в этом случае, L2 представляет собой одинарную химическую связь. В приведенных выше фрагментах, n5 представляет собой целое число от 1 до 6, и n6 представляет собой целое число от 1 до 6.L 2 may be absent, in which case L 2 is a single chemical bond. In the snippets above, n 5 is an integer from 1 to 6, and n 6 is an integer from 1 to 6.
В линкере, имеющем структуру -NH-(CH2CH2O)n5-CH2-CH2-C(=O)- в качестве L2, n5 представляет собой целое число от 1 до 6, и, предпочтительно, от 2 до 4. Этот фрагмент в линкере присоединен к L1 в месте его концевой аминогруппы и присоединен к LP в месте его карбонильной группы на другом конце.In a linker having the structure -NH-(CH 2 CH 2 O)n 5 -CH 2 -CH 2 -C(=O)- as L 2 , n 5 is an integer from 1 to 6, and preferably from 2 to 4. This fragment in the linker is attached to L 1 at its terminal amino group and is attached to L P at its carbonyl group at the other end.
В линкере, имеющем структуру -S-(CH2)n6-C(=O)- в качестве L2, n6 представляет собой целое число от 1 до 6, и, предпочтительно, от 2 до 4.In a linker having the structure -S-(CH 2 )n 6 -C(=O)- as L 2 , n 6 is an integer from 1 to 6, and preferably from 2 to 4.
Конкретные примеры L2 могут включатьSpecific examples of L 2 may include
-NH-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-,-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-.-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)- .
Когда L2 представляет собой -S-(CH2)n6-C(=O)-, то объединяемый с ним L1 представляет собой -C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-. Конкретные примеры -L1-L2- могут включатьWhen L 2 is -S-(CH 2 )n 6 -C(=O)-, then L 1 combined with it is -C(=O)-cyc. Hex(1,4)-CH 2 -( N-li-3-diminickus)-. Specific examples of -L 1 -L 2 - may include
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2-C(=O)-,-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH 2 -(N-li-3-diminiccus)-S-CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH 2 -(N-li-3-diminiscus)-S-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH 2 -(N-li-3-diminiscus)-S-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-C (= O) -cyc. Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiscus) -S-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-C (= O) -cyc. Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiscus) -S-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.-C (= O) -cyc. Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiccus) -S-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - .
3. LP 3. L P
Линкер LP представляет собой пептидный остаток, состоящий из от 2 до 7 аминокислот. В частности, он состоит из олигопептидного остатка, в котором от 2 до 6 аминокислот соединены пептидной связью. Линкер LP присоединен к L2 на его N конце и присоединен к аминогруппе -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- фрагмента линкера на его C конце. На аминокислоту, из которой состоит LP, в линкере не накладывают конкретных ограничений, но, тем не менее, ее примеры включают L- или D-аминокислоту, предпочтительно, L-аминокислоту. И она может быть аминокислотой, имеющей структуру, такую как β-аланин, ε-аминокапроновая кислота или γ-аминомасляная кислота, помимо структуры α-аминокислоты, и, кроме того, она может быть искусственной аминокислотой, такой как N-метилированная аминокислота.Linker L P is a peptide residue consisting of 2 to 7 amino acids. In particular, it consists of an oligopeptide residue in which 2 to 6 amino acids are connected by a peptide bond. Linker L P attached to L 2 at its N end and attached to the amino group -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c - fragment of the linker at its C end. The amino acid constituting L P in the linker is not particularly limited, but examples thereof include L- or D-amino acid, preferably L-amino acid. And it may be an amino acid having a structure such as β-alanine, ε-aminocaproic acid or γ-aminobutyric acid in addition to the structure of an α-amino acid, and furthermore it may be an artificial amino acid such as an N-methylated amino acid.
На аминокислотную последовательность LP не накладывают конкретных ограничений, но примеры аминокислоты, образующей LP, включают фенилаланин (Phe; F), тирозин (Tyr; Y), лейцин (Leu; L), глицин (Gly; G), аланин (Ala; A), валин (Val; V), лизин (Lys; K), цитруллин (Cit), серин (Ser; S), глутаминовую кислоту (Glu; E) и аспарагиновую кислоту (Asp; D). Среди них, предпочтительные примеры включают фенилаланин, глицин, валин, лизин, цитруллин, серин, глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту. Выбирая тот или иной тип аминокислоты, можно регулировать свойства лекарственного средства, связанные с его высвобождением. Число аминокислот может составлять от 2 до 7.The amino acid sequence of L P is not particularly limited, but examples of the amino acid forming L P include phenylalanine (Phe; F), tyrosine (Tyr; Y), leucine (Leu; L), glycine (Gly; G), alanine (Ala ; A), valine (Val; V), lysine (Lys; K), citrulline (Cit), serine (Ser; S), glutamic acid (Glu; E), and aspartic acid (Asp; D). Among them, preferred examples include phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid, and aspartic acid. By choosing one or another type of amino acid, you can control the properties of the drug associated with its release. The number of amino acids can be from 2 to 7.
Конкретные примеры LP могут включатьSpecific examples of L P may include
-GGF-,-GGF-,
-DGGF-,-DGGF-,
-(D-)D-GGF-,-(D-)D-GGF-,
-EGGF-,-EGGF-,
-GGFG-,-GGFG-,
-SGGF-,-SGGF-,
-KGGF-,-KGGF-,
-DGGFG-,-DGGFG-,
-GGFGG-,-GGFGG-,
-DDGGFG-,-DDGGFG-,
-KDGGFG-,-KDGGFG-,
-GGFGGGF--GGFGGGF-
[в приведенных выше фрагментах, "(D-)D" представляет D-аспарагиновую кислоту].Особенно предпочтительные примеры LP для конъюгата антитело-лекарственное средство настоящего изобретения могут включать -GGFG-.[in the fragments above, "(D-)D" represents D-aspartic acid]. Particularly preferred examples of L P for an antibody-drug conjugate of the present invention may include -GGFG-.
В структуре, представленной -NH-(CH2)n1- внутри линкера, n1 представляет собой целое число от 0 до 6 и, предпочтительно, представляет собой целое число от 1 до 5, и, более предпочтительно, от 1 до 3. Аминогруппа этого фрагмента присоединена к C концу в LP в линкере.In the structure represented by -NH-(CH 2 )n 1 - within the linker, n 1 is an integer from 0 to 6 and preferably is an integer from 1 to 5, and more preferably from 1 to 3. The amino group of this fragment is attached to the C end of the L P in the linker.
4. La 4. La
Линкер La представлен любой из структур -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7- и -O- или представляет собой одинарную химическую связь. В приведенных выше фрагментах, n7 представляет собой целое число от 1 до 6, R1 представляет собой атом водорода, алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, -(CH2)n8-COOH или -(CH2)n9-OH, n8 представляет собой целое число от 1 до 4, и n9 представляет собой целое число от 1 до 6.The linker L a is any of the structures -C(=O)-NH-, -NR 1 -(CH 2 )n 7 - and -O- or is a single chemical bond. In the above fragments, n 7 is an integer from 1 to 6, R 1 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, -(CH 2 )n 8 -COOH or -(CH 2 )n 9 -OH, n 8 is an integer from 1 to 4, and n 9 is an integer from 1 to 6.
Амидная структура -C(=O)-NH- внутри линкера La присоединена к Lb на стороне его атома азота. В структурном фрагменте -NR1-(CH2)n7- внутри La, n7 представляет собой целое число от 1 до 6, и, предпочтительно, от 1 до 3. Этот фрагмент присоединен к Lb на стороне его метилена. R1 представляет собой атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов. Алкильная группа, имеющая от 1 до 6 углеродных атомов, может быть линейной или разветвленной. Ее примеры могут включать метильную группу, этильную группу, пропильную группу, изопропильную группу, бутильную группу, изобутильную группу, втор-бутильную группу, трет-бутильную группу, пентильную группу, изопентильную группу, 2-метилбутильную группу, неопентильную группу, 1-этилпропильную группу, гексильную группу, изогексильную группу, 4-метилпентильную группу, 3-метилпентильную группу, 2-метилпентильную группу, 1-метилпентильную группу, 3,3-диметилбутильную группу, 2,2-диметилбутильную группу, 1,1-диметилбутильную группу, 1,2-диметилбутильную группу, 1,3-диметилбутильную группу, 2,3-диметилбутильную группу и 2-этилбутильную группу. Из них предпочтительными являются метильная группа или этильная группа. Когда R1 имеет структуру, представленную с помощью -(CH2)n8 -COOH, n8 представляет собой целое число от 1 до 4, и, предпочтительно, 1 или 2. Когда R1 имеет структуру, представленную с помощью -(CH2)n9 -OH, n9 представляет собой целое число от 1 до 6, и, предпочтительно, 1 или 2. Предпочтительно, чтобы R1 представлял собой атом водорода, метильную группу, этильную группу, -CH2COOH, -CH2CH2-COOH или -CH2CH2-OH, и, более предпочтительно, атом водорода, метильную группу или -CH2COOH. Атом водорода является еще более предпочтительным. La фрагмент линкера может представлять собой -O- или одинарную химическую связь.The -C(=O)-NH- amide structure within the L a linker is attached to L b on its nitrogen side. In the -NR 1 -(CH 2 )n 7 - moiety within L a , n 7 is an integer from 1 to 6, and preferably from 1 to 3. This moiety is attached to L b on its methylene side. R 1 represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms. An alkyl group having 1 to 6 carbon atoms may be linear or branched. Examples thereof may include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, isopentyl group, 2-methylbutyl group, neopentyl group, 1-ethylpropyl group. , hexyl group, isohexyl group, 4-methylpentyl group, 3-methylpentyl group, 2-methylpentyl group, 1-methylpentyl group, 3,3-dimethylbutyl group, 2,2-dimethylbutyl group, 1,1-dimethylbutyl group, 1, 2-dimethylbutyl group, 1,3-dimethylbutyl group, 2,3-dimethylbutyl group and 2-ethylbutyl group. Of these, a methyl group or an ethyl group is preferable. When R 1 has the structure represented by -(CH 2 )n 8 -COOH, n 8 is an integer from 1 to 4, and preferably 1 or 2. When R 1 has the structure represented by -(CH 2 )n 9 - OH, n 9 is an integer from 1 to 6, and preferably 1 or 2. Preferably, R 1 represents a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, -CH 2 COOH, -CH 2 CH 2 -COOH or -CH 2 CH 2 -OH, and more preferably a hydrogen atom, a methyl group or -CH 2 COOH. A hydrogen atom is even more preferred. The L a moiety of the linker can be -O- or a single chemical bond.
5. Lb 5.Lb
Линкер Lb представляет собой любую из структур -CR2(-R3)-, -O- и -NR4- или представляет собой одинарную химическую связь. В приведенных выше фрагментах, R2 и R3 каждый независимо представляет атом водорода, алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb -COOH или -(CH2)nc -OH, R4 представляет собой атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, na представляет собой целое число от 0 до 6, nb представляет собой целое число от 1 до 4, и nc представляет собой целое число от 0 до 4. Когда na или nc равняется 0, R2 и R3 не являются одинаковыми.Linker L b is any of the structures -CR 2 (-R 3 )-, -O- and -NR 4 - or represents a single chemical bond. In the above fragments, R 2 and R 3 each independently represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, -(CH 2 )n a -NH 2 , -(CH 2 )n b - COOH or -( CH 2 )n c - OH, R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, n a is an integer from 0 to 6, n b is an integer from 1 to 4, and n c is an integer from 0 to 4. When n a or n c is 0, R 2 and R 3 are not the same.
Когда каждый из R2 и R3 представляет собой алкильную группу, считается, что эта алкильная группа определяется так же, как алкильная группа для R1. Когда R2 и R3 имеют структуру -(CH2)na-NH2, na представляет собой целое число от 0 до 6, и, предпочтительно, 0, или равняется от 3 до 5. Когда na равняется 0, R2 и R3 не являются одинаковыми. Когда R2 и R3 имеют структуру -(CH2)nb -COOH, nb представляет собой целое число от 1 до 4, и, предпочтительно, 1 или 2. Когда R2 и R3 имеют структуру -(CH2)nc-OH, nc представляет собой целое число от 0 до 4, и, предпочтительно, 1 или 2.When each of R 2 and R 3 represents an alkyl group, this alkyl group is considered to be defined in the same way as the alkyl group for R 1 . When R 2 and R 3 have the structure -(CH 2 )n a -NH 2 , n a is an integer from 0 to 6, and preferably 0 or 3 to 5. When n a is 0, R 2 and R 3 are not the same. When R 2 and R 3 have the structure -(CH 2 )n b -COOH, n b is an integer from 1 to 4, and preferably 1 or 2. When R 2 and R 3 have the structure -(CH 2 ) n c -OH, n c is an integer from 0 to 4, and preferably 1 or 2.
Предпочтительно, чтобы каждый из R2 и R3 представлял собой атом водорода, метильную группу, этильную группу, -NH2, -CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2COOH, -CH2CH2-COOH, -CH2OH или -CH2CH2-OH, и, более предпочтительно, атом водорода, метильную группу, -NH2, -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2COOH, -CH2CH2-COOH, -CH2OH и -CH2CH2-OH. Еще более предпочтительно, чтобы они представляли собой атомы водорода.Preferably, each of R 2 and R 3 represents a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, -NH 2 , -CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 , -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 , -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 , -CH 2 COOH, -CH 2 CH 2 -COOH, -CH 2 OH or -CH 2 CH 2 -OH, and more preferably a hydrogen atom, a methyl group, -NH 2 , -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 , -CH 2 COOH, -CH 2 CH 2 -COOH, -CH 2 OH and -CH 2 CH 2 -OH. Even more preferably, they are hydrogen atoms.
Когда R4 представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, считается, что эта алкильная группа определяется так же, как алкильная группа для R1. Предпочтительно, чтобы R4 представлял собой атом водорода или метильную группу, и, более предпочтительно, атом водорода.When R 4 is an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, this alkyl group is considered to be defined in the same way as the alkyl group for R 1 . Preferably R 4 is a hydrogen atom or a methyl group, and more preferably a hydrogen atom.
Конкретные примеры структуры, представленной с помощью -NH-(CH2)n1-La-Lb- в качестве линкера, могут включатьSpecific examples of the structure represented by -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b - as a linker may include
-NH-CH2-,-NH-CH 2 -,
-NH-CH(-Me)-,-NH-CH(-Me)-,
-NH-C(-Me)2-,-NH-C (-Me) 2 -,
-NH-CH2-CHMe-,-NH-CH 2 -CHMe-,
-NH-CH(-CH2OH)-,-NH-CH(-CH 2 OH)-,
-NH-CH(-CH2COOH)-,-NH-CH(-CH 2 COOH)-,
-NH-CH(-CH2CH2COOH)-,-NH-CH(-CH 2 CH 2 COOH)-,
-NH-CH(-CH2CH2CH2CH2NH2)-,-NH-CH(-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 )-,
-NH-CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2-O-CH2-,-NH-CH 2 -O-CH 2 -,
-NH-CH2CH2-O-,-NH-CH 2 CH 2 -O-,
-NH-CH2CH2-O-CH2-,-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -,
-NH-CH2CH2C(-Me)2-,-NH-CH 2 CH 2 C (-Me) 2 -,
-NH-CH2CH2NH-,-NH-CH 2 CH 2 NH-,
-NH-CH2CH2NH-CH2-,-NH-CH 2 CH 2 NH-CH 2 -,
-NH-CH2CH2NMe-CH2-,-NH-CH 2 CH 2 NMe-CH 2 -,
-NH-CH2CH2NH-CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 NH-CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2NMe-CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 NMe-CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2N(-CH2COOH)-CH2-,-NH-CH 2 CH 2 N (-CH 2 COOH) -CH 2 -,
-NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2-,-NH-CH 2 CH 2 N (-CH 2 CH 2 OH) -CH 2 -,
-NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 N (-CH 2 CH 2 OH) -CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2OH)-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 C(=O)-NHCH(-CH 2 OH)-,
-NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2COOH)-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 C(=O)-NHCH(-CH 2 COOH)-,
-NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2CH2CH2CH2NH2)-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 C(=O)-NHCH(-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2 )-,
-NH-CH2CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH(NH2)-.-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH(NH 2 )-.
Из них, предпочтительные примеры могут включатьOf these, preferred examples may include
-NH-CH2-,-NH-CH 2 -,
-NH-CH2-CH(Me)-,-NH-CH 2 -CH(Me)-,
-NH-CH(-CH2OH)-,-NH-CH(-CH 2 OH)-,
-NH-CH(-CH2CH2COOH)-,-NH-CH(-CH 2 CH 2 COOH)-,
-NH-CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2-O-CH2-,-NH-CH 2 -O-CH 2 -,
-NH-CH2CH2-O-,-NH-CH 2 CH 2 -O-,
-NH-CH2CH2-O-CH2-,-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -,
-NH-CH2CH2C(-Me)2-,-NH-CH 2 CH 2 C (-Me) 2 -,
-NH-CH2CH2NH-,-NH-CH 2 CH 2 NH-,
-NH-CH2CH2NH-CH2-,-NH-CH 2 CH 2 NH-CH 2 -,
-NH-CH2CH2NMe-CH2-,-NH-CH 2 CH 2 NMe-CH 2 -,
-NH-CH2CH2NMe-CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 NMe-CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2N(-CH2COOH)-CH2-,-NH-CH 2 CH 2 N (-CH 2 COOH) -CH 2 -,
-NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2-,-NH-CH 2 CH 2 N (-CH 2 CH 2 OH) -CH 2 -,
-NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 N (-CH 2 CH 2 OH) -CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2OH)-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 C(=O)-NHCH(-CH 2 OH)-,
-NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2COOH)-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 C(=O)-NHCH(-CH 2 COOH)-,
-NH-CH2CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-.-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -.
Их более предпочтительные примеры могут включатьTheir more preferred examples may include
-NH-CH2-,-NH-CH 2 -,
-NH-CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2-O-CH2-,-NH-CH 2 -O-CH 2 -,
-NH-CH2CH2-O-,-NH-CH 2 CH 2 -O-,
-NH-CH2CH2-O-CH2-,-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -,
-NH-CH2CH2NH-,-NH-CH 2 CH 2 NH-,
-NH-CH2CH2NH-CH2-,-NH-CH 2 CH 2 NH-CH 2 -,
-NH-CH2CH2N(-CH2COOH)-CH2-,-NH-CH 2 CH 2 N (-CH 2 COOH) -CH 2 -,
-NH-CH2CH2N(-CH2CH2OH)-CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 N (-CH 2 CH 2 OH) -CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2CH2C(=O)-NHCH(-CH2COOH)-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 C(=O)-NHCH(-CH 2 COOH)-,
-NH-CH2CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2CH2CH2-,-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-.-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -.
Их еще более предпочтительные примеры могут включатьTheir even more preferred examples may include
-NH-(CH2)3-,-NH-(CH 2 ) 3 -,
-NH-CH2-O-CH2- и-NH-CH 2 -O-CH 2 - and
-NH-(CH2)2-O-CH2-.-NH-(CH 2 ) 2 -O-CH 2 -.
6. Lc 6.L c
Линкер Lc представляет собой -CH2- или -C(=O)-. Указанный линкер присоединен к противоопухолевому соединению. Более предпочтительно, чтобы Lc в линкере представлял собой -C(=O)-.Linker L c is -CH 2 - or -C(=O)-. Said linker is attached to an anticancer compound. More preferably, L c in the linker is -C(=O)-.
Предпочтительно, чтобы в линкере, длина цепи -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc составляла от 4 до 7 атомов, и, более предпочтительно, 5 или 6 атомов.Preferably, in the linker, the chain length of -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c is 4 to 7 atoms, and more preferably 5 or 6 atoms.
В отношении конъюгата антитело-лекарственное средство настоящего изобретения, когда его доставляют внутрь опухолевых клеток, линкерный фрагмент разрушается и производное лекарственного средства, имеющее структуру, представленную с помощью NH2-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX), высвобождается, оказывая противоопухолевое действие. Примеры противоопухолевого производного, оказывающего противоопухолевое действие в результате высвобождения из конъюгата антитело-лекарственное средство настоящего изобретения, включают противоопухолевое производное, имеющее структурный фрагмент, в котором структура линкера, представленная с помощью -NH-(CH2)n1-La-Lb-, соединена с Lc и имеет концевую аминогруппу, и, особенно предпочтительные примеры включают следующие структуры.With regard to the antibody-drug conjugate of the present invention, when it is delivered inside tumor cells, the linker fragment is destroyed and the drug derivative having the structure represented by NH 2 -(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c - (NH-DX), is released, providing an antitumor effect. Examples of an antitumor derivative having an antitumor effect as a result of being released from an antibody-drug conjugate of the present invention include an antitumor derivative having a structural fragment in which the linker structure represented by -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -, connected to L c and has an amino terminal group, and especially preferred examples include the following structures.
NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),NH 2 -CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),NH 2 -CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),NH 2 -CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
NH2-CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).NH 2 -CHCH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX).
При этом, в случае NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), было подтверждено, что, так как аминоацетальная структура в молекуле является нестабильной, она снова подвергается саморазрушению с высвобождением следующего фрагмента HO-CH2-C(=O)-(NH-DX). Эти соединения могут предпочтительно использоваться в качестве промежуточного соединения при получении конъюгата антитело-лекарственное средство настоящего изобретения.Meanwhile, in the case of NH 2 -CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX), it was confirmed that since the aminoacetal structure in the molecule is unstable, it again undergoes self-destruction with the release of the next fragment HO-CH 2 -C(=O)-(NH-DX). These compounds may preferably be used as an intermediate in the preparation of the antibody-drug conjugate of the present invention.
Для конъюгата антитело-лекарственное средство настоящего изобретения, в котором в качестве лекарственного средства используют эксатекан, предпочтительно, чтобы осколок лекарственное средство-фрагмент линкерной структуры, имеющий следующую структуру [-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)], присоединялся к антителу. Среднее число конъюгированных осколков лекарственное средство-фрагмент линкерной структуры с молекулой антитела может составлять от 1 до 10. Предпочтительно, чтобы это число составляло от 2 до 8, и, более предпочтительно, от 3 до 8.For the antibody-drug conjugate of the present invention in which exatecan is used as the drug, it is preferable that the drug fragment of the linker structure having the following structure [-L 1 -L 2 -L P -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c -(NH-DX)], attached to the antibody. The average number of conjugated fragments of the drug-linker structure fragment with the antibody molecule can be from 1 to 10. Preferably, this number is from 2 to 8, and more preferably from 3 to 8.
-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(Succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX) ,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - ( NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX ),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH -DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-C (= O) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).-C (= O) -cyc.Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiscus) -S-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX).
Более предпочтительными среди них являются следующие:The most preferred among them are the following:
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX) ,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX ),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH -DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),-C (= O) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).-C (= O) -cyc.Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiscus) -S-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX).
Особенно предпочтительными являются следующие:The following are especially preferred:
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX ),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH -DX),
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX).
В отношении линкерной структуры для конъюгирования антитела и лекарственного средства в конъюгат антитело-лекарственное средство настоящего изобретения, предпочтительный линкер может быть сформирован путем присоединения описанных выше предпочтительных структур, приведенных для каждой части линкера. Что касается линкерной структуры, то могут быть предпочтительно использованы следующие структуры. При этом левый конец структуры является положением соединения с антителом, а правый конец является положением соединения с лекарственным средством.With respect to the linker structure for conjugating an antibody and a drug in the antibody-drug conjugate of the present invention, a preferred linker can be formed by attaching the preferred structures described above for each part of the linker. With regard to the linker structure, the following structures can be preferably used. In this case, the left end of the structure is the position of connection with the antibody, and the right end is the position of connection with the drug.
-(Сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(Succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C (= O) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.-C (= O) -cyc.Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiscus) -S-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-.
Более предпочтительными среди них являются следующие:The most preferred among them are the following:
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-,
-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,-C (= O) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -,
-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.-C (= O) -cyc.Hex (1,4) -CH 2 - (N-li-3-diminiscus) -S-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-.
Особенно предпочтительные включают следующие:Particularly preferred include the following:
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-,
-(сукцинимид-3-ил-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.-(succinimide-3-yl-N)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH -CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-.
Способ полученияHow to obtain
Далее приводятся объяснения типичного способа получения конъюгата антитело-лекарственное средство настоящего изобретения или способа получения его промежуточного соединения. При этом далее описываются соединения с соответствующим номером, приводимым на каждой схеме реакции. В частности, их обозначают как "соединение формулы (1)", "соединение (1)" или другим подобным образом. Соединения с соответствующими номерами, отличающимися от этих номеров, также описываются аналогичным образом.The following are explanations of a typical method for preparing an antibody-drug conjugate of the present invention or a method for preparing an intermediate thereof. In this case, the compounds with the corresponding number given in each reaction scheme are described below. In particular, they are referred to as "compound of formula (1)", "compound (1)", or the like. Connections with corresponding numbers other than these numbers are also described in the same way.
1. Способ получения 11.
Конъюгат антитело-лекарственное средство, представленный формулой (1), в котором антитело соединено с линкерной структурой через тиоэфир, может быть получен, например, следующим способом.The antibody-drug conjugate represented by the formula (1), in which the antibody is connected to the linker structure through a thioether, can be obtained, for example, by the following method.
[На этой схеме, AB представляет антитело с сульфгидрильной группой, и L1' представляет линкерную структуру L1, в которой концевой линкер представляет собой малеимидильную группу (формула показана ниже)[In this scheme, AB represents an antibody with a sulfhydryl group, and L 1 ' represents an L 1 linker structure in which the terminal linker is a maleimidyl group (formula shown below)
(в этой формуле, атом азота является положением присоединения)(in this formula, the nitrogen atom is the attachment position)
или концевой группой является галоген, и представляет группу, в которой -(сукцинимид-3-ил-N)- фрагмент в -(сукцинимид-3-ил-N)-(CH2)n2-C(=O)- в L1 представляет собой малеимидильную группу или галоген-CH2C(=O)NH-(CH2)n3-C(=O)- группу, в которой концевой метилен в -CH2C(=O)NH-(CH2)n3-C(=O)- в L1 подвергнут галогенированию с образованием галогенацетамида. Кроме того, -(NH-DX) представляет структуру, представленную следующей формулой:or the end group is halogen, and represents a group in which -(succinimide-3-yl-N)- moiety in -(succinimide-3-yl-N)-(CH 2 )n 2 -C(=O)- in L 1 is a maleimidyl group or a halogen-CH 2 C(=O)NH-(CH 2 )n 3 -C(=O)- group in which the terminal methylene in -CH 2 C(=O)NH-(CH 2 )n 3 -C(=O)- in L 1 is subjected to halogenation with the formation of haloacetamide. In addition, -(NH-DX) represents the structure represented by the following formula:
и представляет группу, которую получают путем удаления одного атома водорода аминогруппы в положении 1 эксатекана. Кроме того, соединение формулы (1) в приведенных выше фрагментах схемы реакции описана как структура, в которой один структурный фрагмент от лекарственного средства до линкерного конца соединяется с одним антителом. Однако это только описание, приведенное для простоты изложения, а, на самом деле, имеют место много случаев, при которых множество структурных фрагментов присоединены к одной молекуле антитела. То же самое относится и к объяснению способа получения, описанного ниже].and represents a group that is obtained by removing one hydrogen atom of the amino group at the 1-position of exatecan. In addition, the compound of formula (1) in the above fragments of the reaction scheme is described as a structure in which one structural fragment from the drug to the linker end is connected to one antibody. However, this is only a description for simplicity, and in fact, there are many cases in which multiple structural fragments are attached to a single antibody molecule. The same applies to the explanation of the production method described below].
В частности, конъюгат антитело-лекарственное средство (1) может быть получен путем реакции соединения (2), которое может быть получено описанным ниже способом, с антителом (3a), имеющим сульфгидрильную группу.Specifically, the antibody-drug conjugate (1) can be obtained by reacting the compound (2), which can be obtained by the method described below, with an antibody (3a) having a sulfhydryl group.
Антитело (3a), имеющее сульфгидрильную группу, может быть получено хорошо известным способом (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Примеры включают, но этим не ограничивая, реакцию реагента Трота с аминогруппой антитела; реакции N-сукцинимидил S-ацетилтиоалканоатов с аминогруппой антитела с последующей реакцией с гидроксиламином; реакцию антитела с N-сукцинимидил 3-(пиридилдитио)пропионатом и затем реакцию с восстановителем; реакцию антитела с восстановителем, таким как дитиотреитол, 2-меркаптоэтанол и трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорид (TCEP), с целью восстановления дисульфидной связи в шарнирной части антитела для образования сульфгидрильной группы.The antibody (3a) having a sulfhydryl group can be prepared by a well known method (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Examples include, but are not limited to, the reaction of Troth's reagent with the amino group of an antibody; reaction of N-succinimidyl S-acetylthioalkanoates with the amino group of the antibody, followed by reaction with hydroxylamine; reacting the antibody with N-succinimidyl 3-(pyridyldithio)propionate and then reacting with a reducing agent; reacting an antibody with a reducing agent such as dithiothreitol, 2-mercaptoethanol, and tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) to reduce the disulfide bond at the hinge portion of the antibody to form a sulfhydryl group.
В частности, используя от 0,3 до 3 мольных эквивалентов TCEP в качестве восстановителя на моль дисульфида в шарнирной области антитела и осуществляя его реакцию с антителом в буферном растворе, содержащем хелатообразующий реагент, может быть получено антитело с частично или полностью восстановленным дисульфидом в шарнирной области антитела. Примеры хелатообразующего реагента включают этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) и диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA). Хелатообразующий реагент может быть использован при концентрации от 1 мМ до 20 мМ. Примеры буферного раствора, который может быть использован, включают раствор фосфата натрия, бората натрия или ацетата натрия. В качестве конкретного примера, антитело (3a), имеющее частично или полностью восстановленную сульфгидрильную группу, может быть получено путем реакции антитела с TCEP в течение от 1 до 4 часов при температуре от 4°C до 37°C.In particular, by using 0.3 to 3 mole equivalents of TCEP as a reducing agent per mole of disulfide in the hinge region of an antibody and reacting it with the antibody in a buffer solution containing a chelating agent, an antibody with partially or completely reduced disulfide in the hinge region can be obtained. antibodies. Examples of the chelating agent include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA). Chelating reagent can be used at a concentration of 1 mm to 20 mm. Examples of a buffer solution that can be used include a solution of sodium phosphate, sodium borate or sodium acetate. As a specific example, an antibody (3a) having a partially or completely reduced sulfhydryl group can be obtained by reacting the antibody with TCEP for 1 to 4 hours at 4°C to 37°C.
При этом, путем проведения реакции добавления сульфгидрильной группы к фрагменту лекарственное средство-линкер, фрагмент лекарственное средство-линкер может быть конъюгирован за счет образования тиоэфирной связи.Meanwhile, by carrying out the reaction of adding a sulfhydryl group to the drug-linker moiety, the drug-linker moiety can be conjugated by forming a thioether bond.
Далее, используя от 2 до 20 мольных эквивалентов соединения (2) на моль антитела (3a), имеющего сульфгидрильную группу, может быть получен конъюгат антитело-лекарственное средство (1), в котором от 2 до 8 молекул лекарственного средства конъюгированы с одной молекулой антитела. В частности, для осуществления реакции достаточно добавление раствора, содержащего растворенное в нем соединение (2), к буферному раствору, содержащему антитело (3a), имеющее сульфгидрильную группу. В данном случае, примеры буферного раствора, который может быть использован, включают раствор ацетата натрия, фосфата натрия и бората натрия. Значение pH для проведения реакции составляет от 5 до 9, и, более предпочтительно проводить реакции при значении pH около 7. Примеры растворителя для растворения соединения (2) включают органический растворитель, такой как диметилсульфоксид (DMSO), диметилформамид (DMF), диметилацетамид (DMA) и N-метил-2-пиридон (NMP). Для осуществления реакции достаточно добавление раствора в органическом растворителе, содержащем растворенное в нем соединение (2) при концентрации от 1 до 20% по объему, к буферному раствору, содержащему антитело (3a), имеющее сульфгидрильную группу. Температура реакции составляет от 0 до 37°C, более предпочтительно, от 10 до 25°C, и время реакции составляет от 0,5 до 2 часов. Реакция может быть прервана путем деактивации реакционноспособности непрореагировавшего соединения (2) с помощью тиолсодержащего реагента. Примеры тиолсодержащего реагента включают цистеин и N-ацетил-L-цистеин (NAC). Более конкретно, реакция может быть прервана путем добавления от 1 до 2 мольных эквивалентов NAC к используемому соединению (2) и инкубации при комнатной температуре в течение от 10 до 30 минут.Further, using 2 to 20 molar equivalents of compound (2) per mole of antibody (3a) having a sulfhydryl group, an antibody-drug conjugate (1) in which 2 to 8 drug molecules are conjugated to one antibody molecule can be obtained. . In particular, to carry out the reaction, it is sufficient to add a solution containing the compound (2) dissolved therein to a buffer solution containing an antibody (3a) having a sulfhydryl group. Here, examples of a buffer solution that can be used include a solution of sodium acetate, sodium phosphate, and sodium borate. The pH value for carrying out the reaction is from 5 to 9, and it is more preferable to carry out the reactions at a pH value of about 7. Examples of the solvent for dissolving the compound (2) include an organic solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide (DMA ) and N-methyl-2-pyridone (NMP). To carry out the reaction, it is sufficient to add a solution in an organic solvent containing the compound (2) dissolved therein at a concentration of 1 to 20% by volume to a buffer solution containing an antibody (3a) having a sulfhydryl group. The reaction temperature is 0 to 37°C, more preferably 10 to 25°C, and the reaction time is 0.5 to 2 hours. The reaction can be interrupted by deactivating the reactivity of the unreacted compound (2) with a thiol-containing reagent. Examples of the thiol-containing reagent include cysteine and N-acetyl-L-cysteine (NAC). More specifically, the reaction can be interrupted by adding 1 to 2 molar equivalents of NAC to the compound (2) used and incubating at room temperature for 10 to 30 minutes.
Полученный конъюгат антитело-лекарственное средство (1) может быть подвергнут, после концентрирования, замене буфера, очистке и определению концентрации антитела и среднего числа конъюгированных молекул лекарственного средства на одну молекулу антитела с помощью известных описанных ниже способов, и идентификации конъюгата антитело-лекарственное средство (1).The resulting antibody-drug conjugate (1) can be subjected, after concentration, to buffer exchange, purification and determination of the antibody concentration and the average number of conjugated drug molecules per antibody molecule using known methods described below, and identification of the antibody-drug conjugate ( one).
Общий способ A: Концентрирование водного раствора антитела или конъюгата антитело-лекарственное средствоGeneral Method A: Concentration of an Aqueous Solution of an Antibody or Antibody-Drug Conjugate
В центрифужный концентратор Amicon Ultra (номинальное отсечение по молекулярной массе (MWCO) 50000, фирмы Millipore Corporation) добавляли раствор антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство, и раствор антитела или конъюгата антитело-лекарственное средство концентрировали путем центрифугирования (центрифугирование в течение от 5 до 20 минут при величине от 2000 G до 3800 G), используя центрифугу Allegra X-15R, фирмы Beckman Coulter, Inc.An Amicon Ultra centrifuge concentrator (nominal molecular weight cutoff (MWCO) 50,000, Millipore Corporation) was added with the antibody or antibody drug conjugate solution, and the antibody or antibody drug conjugate solution was concentrated by centrifugation (centrifugation for 5 to 20 minutes at 2000 G to 3800 G) using an Allegra X-15R centrifuge from Beckman Coulter, Inc.
Общий способ B: Определение концентрации антитела General Method B: Determination of Antibody Concentration
Определение концентрации антитела проводили с помощью УФ детектора (Nanodrop 1000, фирмы Thermo Fisher Scientific Inc.) в соответствии с методикой, предлагаемой фирмой-производителем. В данном случае, использовали коэффициент поглощения при длине волны 280 нм, который отличался по величине для каждого антитела (от 1,3 млмг-1см-1 до 1,8 млмг-1см-1).The antibody concentration was determined using a UV detector (
Общий способ C-1: Замена буфера для антителаGeneral Method C-1: Replacement of antibody buffer
Колонку NAP-25 (номер по каталогу 17-0852-02 фирмы GE Healthcare Japan Corporation) с носителем Sephadex G-25 приводили в равновесие с фосфатным буфером (10 мМ, pH 6,0) (обозначается в описании изобретения как PBS6.0/EDTA), содержащим хлорид натрия (137 мМ) и этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA, 5 мМ), в соответствии с методикой, предлагаемой фирмой-производителем. Водный раствор антитела загружали в количестве 2,5 мл в одну колонку NAP-25, и затем собирали фракцию (3,5 мл), элюируемую с помощью 3,5 мл PBS6.0/EDTA. Полученную фракцию концентрировали с помощью общего способа A. После определения концентрации антитела общим способом B, концентрацию антитела доводили до 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA.A NAP-25 column (catalog number 17-0852-02 from GE Healthcare Japan Corporation) with Sephadex G-25 media was equilibrated with phosphate buffer (10 mM, pH 6.0) (denoted in the description of the invention as PBS6.0/ EDTA) containing sodium chloride (137 mm) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 5 mm), in accordance with the method proposed by the manufacturer. An aqueous solution of the antibody was loaded in an amount of 2.5 ml into one NAP-25 column, and then a fraction (3.5 ml) was collected, eluting with 3.5 ml of PBS6.0/EDTA. The resulting fraction was concentrated using general method A. After determining the antibody concentration by general method B, the antibody concentration was adjusted to 10 mg/ml using PBS6.0/EDTA.
Общий способ C-2: Замена буфера для антителаGeneral Method C-2: Replacement of antibody buffer
Колонку NAP-25 (номер по каталогу 17-0852-02 фирмы GE Healthcare Japan Corporation) с носителем Sephadex G-25 приводили в равновесие с фосфатным буфером (50 мМ, pH 6,5) (обозначается в описании изобретения как PBS6.5/EDTA), содержащим хлорид натрия (50 мМ) и EDTA (2 мМ), в соответствии с методикой, предлагаемой фирмой-производителем. Водный раствор антитела загружали в количестве 2,5 мл в одну колонку NAP-25, и затем собирали фракцию (3,5 мл), элюируемую с помощью 3,5 мл PBS6.5/EDTA. Полученную фракцию концентрировали с помощью общего способа A. После определения концентрации антитела общим способом B, концентрацию антитела доводили до 20 мг/мл с помощью PBS6.5/EDTA.A NAP-25 column (catalog number 17-0852-02 from GE Healthcare Japan Corporation) with Sephadex G-25 was equilibrated with phosphate buffer (50 mM, pH 6.5) (referred to in the specification as PBS6.5/ EDTA) containing sodium chloride (50 mm) and EDTA (2 mm), in accordance with the method proposed by the manufacturer. An aqueous solution of the antibody was loaded in an amount of 2.5 ml into one NAP-25 column, and then a fraction (3.5 ml) was collected, eluting with 3.5 ml of PBS6.5/EDTA. The resulting fraction was concentrated using general method A. After determining the antibody concentration by general method B, the antibody concentration was adjusted to 20 mg/ml using PBS6.5/EDTA.
Общий способ D-1: Очистка конъюгата антитело-лекарственное средствоGeneral Method D-1: Purification of the Antibody Drug Conjugate
Колонку NAP-25 приводили в равновесие с любым буфером, выбранным из производимого промышленностью фосфатного буфера (PBS7.4, номер по каталогу 10010-023, фирмы Invitrogen), буфера на основе фосфата натрия (10 мМ, pH 6,0; обозначаемого как PBS6.0), содержащего хлорид натрия (137 мМ), и ацетатного буфера, содержащего сорбит (5%) (10 мМ, pH 5,5; обозначаемого в описании изобретения как ABS). Полученный в результате реакции водный раствор конъюгата антитело-лекарственное средство загружали в количестве около 1,5 мл в колонку NAP-25, и затем собирали фракцию антитела, элюированную с помощью буфера в количестве, рекомендованном фирмой-производителем. Собранную фракцию снова загружали в колонку NAP-25 и, повторяя суммарно от 2 до 3 раз процесс гель-фильтрационной очистки элюируемой буфером фракции, получали конъюгат антитело-лекарственное средство, не содержащий неконъюгированного лекарственного средства, линкера и низкомолекулярных соединений (трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорид (TCEP), N-ацетил-L-цистеин (NAC) и диметилсульфоксид).The NAP-25 column was equilibrated with any buffer selected from commercially available phosphate buffer (PBS7.4, catalog number 10010-023, from Invitrogen), sodium phosphate buffer (10 mM, pH 6.0; referred to as PBS6 .0) containing sodium chloride (137 mm) and acetate buffer containing sorbitol (5%) (10 mm, pH 5.5; referred to in the description of the invention as ABS). The resulting aqueous solution of the antibody-drug conjugate was loaded in an amount of about 1.5 ml into a NAP-25 column, and then the antibody fraction was collected, eluted with a buffer in the amount recommended by the manufacturer. The collected fraction was again loaded into the NAP-25 column and, by repeating the process of gel filtration purification of the buffer-eluting fraction 2 to 3 times in total, an antibody-drug conjugate was obtained that did not contain unconjugated drug, linker, and low molecular weight compounds (tris(2-carboxyethyl )phosphine hydrochloride (TCEP), N-acetyl-L-cysteine (NAC) and dimethyl sulfoxide).
Общий способ E: Определение концентрации антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство и среднего числа конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела.General Method E: Determination of the concentration of antibody in the antibody-drug conjugate and the average number of conjugated drug molecules per antibody molecule.
Концентрация конъюгированного лекарственного средства в конъюгате антитело-лекарственное средство может быть рассчитана путем измерения УФ поглощения водного раствора конъюгата антитело-лекарственное средство при двух длинах волн 280 нм и 370 нм и затем проведения вычисления, проиллюстрированного ниже.The concentration of the conjugated drug in the antibody-drug conjugate can be calculated by measuring the UV absorbance of an aqueous solution of the antibody-drug conjugate at two wavelengths of 280 nm and 370 nm and then performing the calculation illustrated below.
Так как суммарное поглощение при любой длине волны равно сумме поглощений каждого поглощающего свет химического соединения, которое присутствует в системе [аддитивность поглощения], то, когда молярные коэффициента поглощения антитела и лекарственного средства остаются одними и теми же до и после конъюгирования между антителом и лекарственным средством, концентрация антитела и концентрация лекарственного средства в конъюгате антитело-лекарственное средство выражаются следующими уравнениями:Since the total absorbance at any wavelength is equal to the sum of the absorbances of each light-absorbing chemical that is present in the system [absorbance additivity], when the molar absorbances of the antibody and drug remain the same before and after conjugation between the antibody and drug , antibody concentration, and drug concentration in the antibody-drug conjugate are expressed by the following equations:
A280=AD,280+AA,280=εD,280CD+εA,280CA уравнение (1),A 280 =A D,280 +A A,280 =ε D,280 C D +ε A,280 C A equation (1),
A370=AD,370+AA,370=εD,370CD+εA,370CA уравнение (2).A 370 =A D,370 +A A,370 =ε D,370 C D +ε A,370 C A equation (2).
В приведенных выше уравнениях, A280 представляет поглощение водного раствора конъюгата антитело-лекарственное средство при 280 нм, A370 представляет поглощение водного раствора конъюгата антитело-лекарственное средство при 370 нм, AA,280 представляет поглощение антитела при 280 нм, AA,370 представляет поглощение антитела при 370 нм, AD,280 представляет поглощение предшественника конъюгата при 280 нм, AD,370 представляет поглощение предшественника конъюгата при 370 нм, εA,280 представляет молярный коэффициент поглощения антитела при 280 нм, εA,370 представляет молярный коэффициент поглощения антитела при 370 нм, εD,280 представляет молярный коэффициент поглощения предшественника конъюгата при 280 нм, εD,370 представляет молярный коэффициент поглощения предшественника конъюгата при 370 нм, CA представляет концентрацию антитела в конъюгате антитело-лекарственное средство, и CD представляет концентрацию лекарственного средства в конъюгате антитело-лекарственное средство.In the above equations, A 280 represents the absorbance of an aqueous solution of the antibody-drug conjugate at 280 nm, A 370 represents the absorbance of an aqueous solution of the antibody-drug conjugate at 370 nm, A A,280 represents the absorbance of the antibody at 280 nm, A A,370 represents the absorbance of the antibody at 370 nm, A D,280 represents the absorbance of the precursor conjugate at 280 nm, A D,370 represents the absorbance of the precursor conjugate at 370 nm, ε A,280 represents the molar absorbance of the antibody at 280 nm, ε A,370 represents the molar the absorbance of the antibody at 370 nm, ε D.280 is the molar absorbance of the precursor conjugate at 280 nm, ε D.370 is the molar absorbance of the precursor conjugate at 370 nm, C A is the concentration of the antibody in the antibody-drug conjugate, and CD represents the drug concentration in the antibody-drug conjugate.
Что касается εA,280, εA,370, εD,280 и εD,370 в приведенных выше уравнениях, то используются ранее полученные значения (значение, полученное на основе расчета или измерения величины, полученной с помощью измерения УФ поглощения соединения). Например, величина εA,280 может быть оценена из аминокислотной последовательности антитела, используя известный способ расчета (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). Величина εA,370 обычно равна нулю. Величины εD,280 и εD,370 могут быть получены, исходя из закона Ламберта-Бера (Поглощение = молярная концентрация × молярный коэффициент поглощения × длина кюветы), путем измерения поглощения раствора, в котором растворяют используемый предшественник конъюгата при конкретной молярной концентрации. Значения CA и CD могут быть получены путем измерения A280 и A370 водного раствора конъюгата антитело-лекарственное средство и решения системы уравнений (1) и (2), использую эти измеренные величины. Кроме того, путем деления CD на CA, может быть получено среднее число молекул конъюгированного лекарственного средства на молекулу антитела.As for ε A.280 , ε A.370 , ε D.280 and ε D.370 in the above equations, the previously obtained values are used (the value obtained from the calculation or measurement of the value obtained by measuring the UV absorption of the compound) . For example, the value of ε A,280 can be estimated from the amino acid sequence of an antibody using a known calculation method (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). The value of ε A,370 is usually zero. The values of ε D.280 and ε D.370 can be obtained from the Lambert-Beer law (Absorption = molar concentration × molar absorption coefficient × cuvette length) by measuring the absorbance of a solution in which the conjugate precursor used is dissolved at a particular molar concentration. The C A and CD values can be obtained by measuring A 280 and A 370 in an aqueous solution of the antibody-drug conjugate and solving the system of equations (1) and (2) using these measured values. In addition, by dividing CD by C A , the average number of conjugated drug molecules per antibody molecule can be obtained.
Соединение, представленное формулой (2) в способе получения 1, представляет собой любое соединение, представленное следующей формулой:The compound represented by formula (2) in
. .
В этой формуле, n1, n2, n3, L2, LP, La, Lb, и Lc уже определены выше, и Lc является положением присоединения для лекарственного средства.In this formula, n 1 , n 2 , n 3 , L 2 , L P , L a , L b , and L c are already defined above, and L c is the attachment position for the drug.
Предпочтительно, чтобы в промежуточном соединении, используемом для получения соединения настоящего изобретения, n2 представлял собой целое число от 2 до 5, L2 представлял собой -NH-(CH2CH2O)n5-CH2CH2-C(=O)- или одинарную химическую связь, n5 представлял собой целое число от 2 до 4, LP представлял собой GGFG, и -NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc- представлял собой подструктуру -NH-CH2CH2-C(=O)-, NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)- или -NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-. Предпочтительным галогеном является бром или йод. Конкретные примеры этих соединений могут включать следующие [в данном случае, (малеимид-N-ил) представляет малеимидильную группу (2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ильную группу)].Preferably, in the intermediate used to prepare the compound of the present invention, n 2 is an integer from 2 to 5, L 2 is -NH-(CH 2 CH 2 O)n 5 -CH 2 CH 2 -C(= O)- or a single chemical bond, n 5 was an integer from 2 to 4, L P was GGFG, and -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c - was a substructure of -NH -CH 2 CH 2 -C(=O)-, NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-, -NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)- or -NH- CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) -. The preferred halogen is bromine or iodine. Specific examples of these compounds may include the following [in this case, (maleimid-N-yl) represents a maleimidyl group (2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl group)].
(Малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(Maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX)(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX)
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX ),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX) ,
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX ),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX) ,
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX ),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH -DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX) ,
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH- Dx),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH -DX),
X-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).X-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX).
В этой формуле, X представляет атом брома или атом йода. Предпочтительно, чтобы все эти соединения брома и йода могли бы использоваться в качестве промежуточных продуктов.In this formula, X represents a bromine atom or an iodine atom. Preferably, all of these bromine and iodine compounds could be used as intermediates.
Для наработки достаточного количества конъюгата, при получении новых больших партий могут быть смешаны множество конъюгатов, полученных при одинаковых условиях с целью содержания в них эквивалентного числа молекул лекарственного средства (например, приблизительно ±1). В этом случае, среднее число молекул лекарственного средства находится в диапазоне между средними числами молекул лекарственного средства в конъюгатах до смешения.To produce a sufficient amount of conjugate, when new large batches are made, multiple conjugates prepared under the same conditions can be mixed to contain an equivalent number of drug molecules (eg, approximately ±1). In this case, the average number of drug molecules is in the range between the average number of drug molecules in the conjugates before mixing.
2. Способ получения 22. Production method 2
Конъюгат антитело-лекарственное средство, представленный формулой (1), в котором антитело присоединено через амидную группу к линкеру и имеет тиоэфирную связь внутри линкера, в частности, структура, в которой -L1-L2- представляет собой -C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)-S-(CH2)n6-C(=O)-, может быть также получен следующим способом.The antibody-drug conjugate represented by formula (1), wherein the antibody is attached via an amide group to a linker and has a thioether bond within the linker, specifically, a structure in which -L 1 -L 2 - is -C(=O) -cyc.Hex(1,4)-CH 2 -(N-li-3-diminiccus)-S-(CH 2 )n 6 -C(=O)-, can also be obtained by the following method.
. .
В этой схеме реакции, AB-L1' представляет группу, которая соединяет антитело и линкер L1 и, кроме того, конец L1 превращается в N-малеимидильную группу. Эта группа, в частности, имеет структуру, в которой -(N-ли-3-диминицкус)- в AB-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-(N-ли-3-диминицкус)- превращается в малеимидильную группу. L2' представляет HS-(CH2)n6-C(=O)- группу, в которой конец представляет собой меркаптогруппу, и AB представляет антитело.In this reaction scheme, AB-L 1 ' represents a group that connects the antibody and the L 1 linker and, in addition, the L 1 end is converted into an N-maleimidyl group. This group, in particular, has a structure in which -(N-li-3-diminiccus)- in AB-C(=O)-cyc. Hex(1,4)-CH 2 -(N-li-3- diminickus) - turns into a maleimidyl group. L 2 ' is an HS-(CH 2 )n 6 -C(=O)- group in which the end is a mercapto group, and AB is an antibody.
В частности, конъюгат антитело-лекарственное средство (1) может быть получен путем реакции соединения (2a), которое получают описанным ниже способом, с имеющим малеимидильную группу антителом (3b), которое присоединено к линкеру.In particular, the antibody-drug conjugate (1) can be obtained by reacting the compound (2a), which is obtained by the method described below, with a maleimidyl group-containing antibody (3b) that is attached to a linker.
Антитело (3b), имеющее малеимидильную группу, может быть также получено известным способом (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Примеры включают, но этим не ограничивая: бифункциональный линкер, такой как сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), который способен образовывать связь с аминогруппой или гидроксильной группой и имеет малеимидильную группу, и он способен взаимодействовать с аминогруппой лиганда с введением малеимидильной группы.An antibody (3b) having a maleimidyl group can also be prepared in a known manner (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)). Examples include, but are not limited to: a bifunctional linker such as succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) which is capable of forming a bond with an amino group or a hydroxyl group and has a maleimidyl group, and it is capable of reacting with the amino group of the ligand with the introduction of a maleimidyl group.
Например, можно предпочтительно использовать соединение, имеющее фрагмент с реакционноспособной аминогруппой и фрагмент с реакционноспособной тиольной группой, связанные через линкер. В данном случае, фрагмент с реакционноспособной аминогруппой может представлять собой активный эфир, имидный эфир или другой подобный фрагмент, а фрагмент с реакционноспособной тиольной группой может представлять собой малеимидил, ацетилгалогенид, алкилгалогенид, дитиопиридил или другой подобный фрагмент.For example, a compound having a reactive amino moiety and a reactive thiol moiety linked through a linker can be preferably used. Here, the amino-reactive moiety may be an active ester, imide ester or the like, and the thiol-reactive moiety may be maleimidyl, acetyl halide, alkyl halide, dithiopyridyl or the like.
Что касается способа создания линкера с аминогруппой или гидроксильной группой аминокислоты, входящей в структуру антитела, в частности, через образование амидной связи с аминогруппой, то соединение, которое сначала реагирует с антителом, может являться соединением, представленным следующей формулой:With regard to the method of creating a linker with an amino group or a hydroxyl group of an amino acid included in the structure of an antibody, in particular, through the formation of an amide bond with an amino group, the compound that first reacts with the antibody may be a compound represented by the following formula:
Q1-L1a-Q2.Q 1 -L 1a -Q 2 .
[В этой формуле, Q1 представляет (пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-, (3-сульфопирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-, RQ-O-C(=N)- или O=C=N-,[In this formula, Q 1 is (pyrrolidin-2,5-dion-N-yl)-OC(=O)-, (3-sulfopyrrolidin-2,5-dion-N-yl)-OC(=O) -, R Q -OC(=N)- or O=C=N-,
L1a- представляет -цик.Гекс(1,4)-CH2-, алкиленовую группу, имеющую от 1 до 10 углеродных атомов, фениленовую группу, -(CH2)n4-C(=O)-, -(CH2)n4a-NH-C(=O)-(CH2)n4b- или -(CH2)n4a-NH-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-,L 1a - represents -cyc. Hex(1,4) -CH 2 -, an alkylene group having from 1 to 10 carbon atoms, a phenylene group, -(CH 2 )n 4 -C (=O) -, -(CH 2 )n 4a -NH-C(=O)-(CH 2 )n 4b - or -(CH 2 )n 4a -NH-C(=O)-cyc. Hex(1,4)-CH 2 -,
Q2 представляет (малеимид-N-ил), атом галогена или -S-S-(2-пиридил),Q 2 represents (maleimide-N-yl), a halogen atom or -SS-(2-pyridyl),
RQ представляет алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, n4 представляет целое число от 1 до 8, n4a представляет целое число от 0 до 6, и n4b представляет целое число от 1 до 6].R Q represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, n 4 represents an integer from 1 to 8, n 4a represents an integer from 0 to 6, and n 4b represents an integer from 1 to 6].
В приведенных выше фрагментах, RQ представляет целое алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, и, более предпочтительно, метильную группу или этильную группу.In the above fragments, R Q represents an integer alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and more preferably a methyl group or an ethyl group.
Алкиленовая группа для L1a может представлять собой группу, имеющую от 1 до 10 углеродных атомов. Фениленовая группа может быть любой из орто, мета и пара-конфигураций и, более предпочтительной является пара- или мета-фениленовая группа.The alkylene group for L 1a may be a group having 1 to 10 carbon atoms. The phenylene group may be any of the ortho, meta, and para configurations, and para- or meta-phenylene is more preferred.
Предпочтительные примеры L1a могут включать -цик.Гекс(1,4)-CH2-, -(CH2)5-NH-C(=O)-цик.Гекс(1,4)-CH2-, -(CH2)2-NH-C(=O)-CH2-, -(CH2)5-NH-C(=O)-(CH2)2-, -CH2-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)5-, -(CH2)10-, -(пара-Ph)-, -(мета-Ph)-, -(пара-Ph)-CH(-CH3)-, -(CH2)3-(мета-Ph)- и -(мета-Ph)-NH-C(=O)-CH2-.Preferred examples of L 1a may include -cyc.Hex(1,4)-CH 2 -, -(CH 2 ) 5 -NH-C(=O)-cyc.Hex(1,4)-CH 2 -, -( CH 2 ) 2 -NH-C(=O)-CH 2 -, -(CH 2 ) 5 -NH-C(=O)-(CH 2 ) 2 -, -CH 2 -, -(CH 2 ) 2 -, -(CH 2 ) 3 -, -(CH 2 ) 5 -, -(CH 2 ) 10 -, -(para-Ph)-, -(meta-Ph)-, -(para-Ph)-CH (-CH 3 )-, -(CH 2 ) 3 -(meta-Ph)- and -(meta-Ph)-NH-C(=O)-CH 2 -.
Предпочтительно, чтобы Q1 представлял собой (пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-, предпочтительно, чтобы Q2 представлял собой (малеимид-N-ил) или -S-S-(2-пиридил), в случае их использования для образования дисульфидной связи.Preferably Q 1 is (pyrrolidin-2,5-dion-N-yl)-OC(=O)-, preferably Q 2 is (maleimide-N-yl) or -SS-(2-pyridyl ), if used to form a disulfide bond.
В приведенных выше фрагментах, (пирролидин-2,5-дион-N-ил)- представляет собой группу, представленную следующей формулой:In the fragments above, (pyrrolidin-2,5-dion-N-yl)- represents a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота служит в качестве положения для соединения, и (3-сульфопирролидин-2,5-дион-N-ил)- представляет собой группу, представленную следующей формулой:where the nitrogen atom serves as the position for the compound, and (3-sulfopyrrolidin-2,5-dion-N-yl)- is a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота является положением присоединения, и эта сульфоновая кислота способна образовывать литиевую соль, натриевую соль или калиевую соль, и, предпочтительно, натриевую соль,where the nitrogen atom is the attachment position and this sulfonic acid is capable of forming a lithium salt, a sodium salt or a potassium salt, and preferably a sodium salt,
цик.Гекс(1,4) представляет 1,4-циклогексиленовую группу,cyc.Hex(1,4) represents a 1,4-cyclohexylene group,
(малеимид-N-ил) является группой, представленной следующей формулой:(maleimide-N-yl) is a group represented by the following formula:
, ,
где атом азота является положением присоединения,where the nitrogen atom is the attachment position,
(2-пиридил) представляет 2-пиридильную группу, (пара-Ph) представляет пара-фениленовую группу и (мета-Ph) представляет мета-фениленовую группу.(2-pyridyl) represents a 2-pyridyl group, (para-Ph) represents a para-phenylene group, and (meta-Ph) represents a meta-phenylene group.
Примеры такого соединения включают сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидилметил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC), N-сукцинимидил-4-(N-малеимидилметил)циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроат) (LC-SMCC), κ-малеимидила ундекановой кислоты N-сукцинимидиловый эфир (KMUA), γ-малеимидила масляной кислоты N-сукцинимидиловый эфир (GMBS), ε-малеимидила капроновой кислоты N-гидроксисукцинимидовый эфир (EMCS), м-малеимидилбензоил-N-гидроксисукцинимидовый эфир (MBS), N-(α-малеимидилацетокси)-сукцинимидовый эфир (AMAS), сукцинимидил-6-(β-малеимидилпропионамид)гексаноат (SMPH), N-сукцинимидил 4-(п-малеимидилфенил)бутират (SMPB), N-(п-малеимидилфенил)изоцианат (PMPI), N-сукцинимидил-4-(йодацетил)аминобензоат (SIAB), N-сукцинимидилйодацетат (SIA), N-сукцинимидилбромацетат (SBA), N-сукцинимидил 3-(бромацетамид)пропионат (SBAP), N-сукцинимидил-3-(2-пиридодитио)пропионат (SPDP) и сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуол (SMPT).Examples of such a compound include sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidylmethyl)cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), N-succinimidyl-4-(N-maleimidylmethyl)cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate) (LC-SMCC ), κ-maleimidyl undecanoic acid N-succinimidyl ester (KMUA), γ-maleimidyl butyric acid N-succinimidyl ester (GMBS), ε-maleimidyl caproic acid N-hydroxysuccinimide ester (EMCS), m-maleimidylbenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester ( MBS), N-(α-maleimidylacetoxy)-succinimide ester (AMAS), succinimidyl-6-(β-maleimidylpropionamide)hexanoate (SMPH), N-succinimidyl 4-(p-maleimidylphenyl)butyrate (SMPB), N-(p -maleimidylphenyl)isocyanate (PMPI), N-succinimidyl-4-(iodoacetyl)aminobenzoate (SIAB), N-succinimidyliodoacetate (SIA), N-succinimidyl bromoacetate (SBA), N-succinimidyl 3-(bromoacetamide)propionate (SBAP), N -succinimidyl-3-(2-pyridodithio)propionate (SPDP); and succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-α-(2-pyridyldithio)toluene (SMPT).
В частности, например, в результате взаимодействия от 2 до 6 эквивалентов SMCC с антителом (3) в фосфатном буфере с pH от 6 до 7 в течение от 1 до 6 часов при комнатной температуре, активированный эфир SMCC может реагировать с антителом с образованием антитела (3b), имеющего малеимидильную группу. Полученное антитело (3b) может быть очищено общим способом D-2, описанным ниже, и использовано для следующей реакции с соединением (2a).In particular, for example, by reacting 2 to 6 equivalents of SMCC with antibody (3) in phosphate buffer pH 6 to 7 for 1 to 6 hours at room temperature, the activated SMCC ester can react with the antibody to form an antibody ( 3b) having a maleimidyl group. The resulting antibody (3b) can be purified by the general method D-2 described below and used for the next reaction with compound (2a).
Общий способ D-2: Очистка сукцинимидил 4-(N-малеимидилметил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC)-дериватизированного антителаGeneral Method D-2: Purification of succinimidyl 4-(N-maleimidylmethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)-derivatized antibody
Колонку NAP-25 приводили в равновесие с PBS6.5/EDTA. В колонку NAP-25 загружали в количестве около 0,5 мл реакционный раствор, содержащий сукцинимидил 4-(N-малеимидилметил)циклогексан-1-карбоксилат (в описании изобретения обозначаемый как SMCC)-дериватизированное антитело и затем собирали фракцию антитела для очистки, элюируемую с помощью буфера в рекомендованном фирмой-производителем количестве.The NAP-25 column was equilibrated with PBS6.5/EDTA. A reaction solution containing succinimidyl 4-(N-maleimidylmethyl)cyclohexane-1-carboxylate (referred to as SMCC)-derivatized antibody was loaded into a NAP-25 column in an amount of about 0.5 ml, and then the antibody fraction was collected for purification, eluted using a buffer in the amount recommended by the manufacturer.
Аминогруппа антитела для соединения с линкером может представлять собой, но этим не ограничивая, N-концевую аминогруппу и/или аминогруппу, принадлежащую лизиновому остатку. В качестве варианта, антитело может быть присоединено к линкеру за счет образования эфирной связи путем использования гидроксильной группы, принадлежащей сериновому остатку.The amino group of an antibody for connection to a linker may be, but is not limited to, an N-terminal amino group and/or an amino group belonging to a lysine residue. Alternatively, the antibody can be attached to the linker through the formation of an ether bond through the use of a hydroxyl group belonging to a serine residue.
Реакция соединения (2a) с антителом (3b), присоединенным к линкеру, имеющим малеимидильную группу, может быть осуществлена таким же образом, как и в способе проведения реакции соединения (2) с антителом (3a), имеющим сульфгидрильную группу, упомянутом в способе получения 1.The reaction of the compound (2a) with the antibody (3b) attached to the linker having a maleimidyl group can be carried out in the same manner as in the method for carrying out the reaction of the compound (2) with the antibody (3a) having a sulfhydryl group mentioned in the production method one.
Для полученного конъюгата антитело-лекарственное средство (1) может быть осуществлено концентрирование, замена буфера, очистка и идентификация конъюгата антитело-лекарственное средство (1) путем определения концентрации антитела и среднего числа конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела таким же образом, как в способе получения 1.For the obtained antibody-drug conjugate (1), concentration, buffer exchange, purification and identification of the antibody-drug conjugate (1) can be carried out by determining the concentration of the antibody and the average number of conjugated drug molecules per antibody molecule in the same manner as in the method receiving 1.
Соединение, представленное формулой (3b) в способе получения 2, имеет следующую структуру (см. следующую формулу; в этой структуре, "антитело-NH-" берет начало от антитела).The compound represented by formula (3b) in production method 2 has the following structure (see the following formula; in this structure, "antibody-NH-" originates from antibody).
. .
Соединение, которое является промежуточным соединением при получении конъюгата антитело-лекарственное средство настоящего изобретения и имеет приведенную выше структуру, описано ниже (в этой формуле, n представляет собой целое число от 1 до 10, предпочтительно, от 2 до 8, и, более предпочтительно, от 3 до 8).The compound which is an intermediate in the preparation of the antibody-drug conjugate of the present invention and has the above structure is described below (in this formula, n is an integer from 1 to 10, preferably from 2 to 8, and more preferably, from 3 to 8).
Кроме того, примеры соединения настоящего изобретения, в котором концевой группой является меркаптогруппа, могут включать следующие:In addition, examples of the compound of the present invention in which the end group is a mercapto group may include the following:
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (=O)-(NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) - GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX).
3. Способ получения 33. Production method 3
Конъюгат антитело-лекарственное средство, представленный формулой (1), в котором антитело конъюгировано с фрагментов лекарственное средство-линкер за счет амидной связи, может быть получено способом, описанным ниже. Например, что касается -C(=O)-(CH2)n4-C(=O)- для L1, то предпочтительно использовать его активный эфир L1', например, (пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-. Когда L2 представляет собой одинарную химическую связь, конъюгат антитело-лекарственное средство (1) может быть получен, например, следующим способом.An antibody-drug conjugate represented by formula (1), in which an antibody is conjugated to drug-linker fragments through an amide bond, can be produced by the method described below. For example, with regard to -C(=O)-(CH 2 )n 4 -C(=O)- for L 1 , it is preferable to use its active ester L 1 ', for example, (pyrrolidine-2,5-dione-N -yl)-OC(=O)-(CH 2 )n 4 -C(=O)-. When L 2 is a single chemical bond, the antibody-drug conjugate (1) can be obtained, for example, by the following method.
. .
В частности, конъюгат антитело-лекарственное средство (1) может быть получен реакцией соединения (2b), которое можно получить описанным ниже способом, с антителом (3).Specifically, the antibody-drug conjugate (1) can be obtained by reacting a compound (2b), which can be obtained by the method described below, with an antibody (3).
Соединение (2b) способно присоединяться к аминогруппе или гидроксильной группе антитела. Аминогруппа и гидроксильная группа антитела относятся к группам, уже описанным в способе получения 2, например, но этим не ограничивая, к N-концевой аминогруппе, содержащейся в антителе и/или аминогруппе, содержащейся в лизиновом остатке, и гидроксильной группе, содержащейся в сериновом остатке, соответственно.Compound (2b) is capable of attaching to an amino group or a hydroxyl group of an antibody. The amino group and the hydroxyl group of an antibody refer to the groups already described in Preparation Method 2, for example, but not limited to, the N-terminal amino group contained in the antibody and/or the amino group contained in the lysine residue and the hydroxyl group contained in the serine residue , respectively.
Соединение (2b) представляет собой активный эфир, состоящий из N-гидроксисукцинимидиловой эфирной группы. В качестве варианта, могут быть использованы другие активные эфиры, например, сульфосукцинимидиловая эфирная группа, N-гидроксифталимидиловый эфир, N-гидроксисульфофталимидиловый эфир, орто-нитрофениловый эфир, пара-нитрофениловый эфир, 2,4-динитрофенилоый эфир, 3-сульфонил-4-нитрофениловый эфир, 3-карбокси-4-нитрофениловый эфир и пентафторфениловый эфир.Compound (2b) is an active ester consisting of an N-hydroxysuccinimidyl ester group. Alternatively, other active esters can be used, e.g. nitrophenyl ether, 3-carboxy-4-nitrophenyl ether and pentafluorophenyl ether.
Путем использования от 2 до 20 мольных эквивалентов соединения (2b) на моль антитела (3) в реакции соединения (2b) с антителом (3) может быть получен конъюгат антитело-лекарственное средство (1), в котором от 1 до 10 молекул лекарственного средства конъюгированы с одной молекулой антитела. В частности, раствор, содержащий растворенное в нем соединение (2b), может быть добавлен к буферному раствору, содержащему антитело (3), для проведения реакции с получением в результате конъюгата антитело-лекарственное средство (1). В данном случае, примеры буферного раствора, который может быть использован, включают раствор ацетата натрия, фосфата натрия и бората натрия. Значение pH для реакции может составлять от 5 до 9, и более предпочтительно проводить реакцию при значении pH около 7. Примеры растворителя для растворения соединения (2b) включают органический растворитель, такой как диметилсульфоксид (DMSO), диметилформамид (DMF), диметилацетамид (DMA) и N-метил-2-пиридон (NMP). Для проведения реакции достаточно, чтобы раствор в органическом растворителе, содержащий растворенное в нем соединение (2b), добавляли при концентрации от 1 до 20% по объему к буферному раствору, содержащему антитело (3). Температура реакции составляет от 0 до 37°C, более предпочтительно, от 10 до 25°C, и время реакции составляет от 0,5 до 20 часов.By using 2 to 20 molar equivalents of compound (2b) per mole of antibody (3) in the reaction of compound (2b) with antibody (3), an antibody-drug conjugate (1) can be obtained in which 1 to 10 drug molecules conjugated to a single antibody molecule. Specifically, the solution containing the compound (2b) dissolved therein can be added to the buffer solution containing the antibody (3) to react to obtain an antibody-drug conjugate (1). Here, examples of a buffer solution that can be used include a solution of sodium acetate, sodium phosphate, and sodium borate. The pH value for the reaction may be from 5 to 9, and it is more preferable to carry out the reaction at a pH value of about 7. Examples of the solvent for dissolving the compound (2b) include an organic solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide (DMA) and N-methyl-2-pyridone (NMP). To carry out the reaction, it is sufficient that the organic solvent solution containing the compound (2b) dissolved therein is added at a concentration of 1 to 20% by volume to the buffer solution containing the antibody (3). The reaction temperature is 0 to 37°C, more preferably 10 to 25°C, and the reaction time is 0.5 to 20 hours.
Для полученного конъюгата антитело-лекарственное средство (1) может быть осуществлено концентрирование, замена буфера, очистка и идентификация конъюгата антитело-лекарственное средство (1) путем определения концентрации антитела и среднего числа конъюгированных молекул лекарственного средства на молекулу антитела таким же образом, как в способе получения 1.For the obtained antibody-drug conjugate (1), concentration, buffer exchange, purification and identification of the antibody-drug conjugate (1) can be carried out by determining the concentration of the antibody and the average number of conjugated drug molecules per antibody molecule in the same manner as in the method receiving 1.
Фрагмент (пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)- в способе получения 3 имеет следующую структуру.The (pyrrolidin-2,5-dion-N-yl)-OC(=O)-(CH 2 )n 4 -C(=O)- fragment in Production Method 3 has the following structure.
. .
Примеры соединения настоящего изобретения, имеющего приведенную выше подструктуру, могут включать следующие:Examples of a compound of the present invention having the above substructure may include the following:
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX ),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH -DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl) -OC (=O) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C(=O )-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C( =O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH -DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl) -OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 -C (=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (=O)- (NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl) -OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (=O )-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl) -OC (=O) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C ( =O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 - C(=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-( NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O) -(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(= O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl) -OC (=O) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl) -OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (=O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O) -(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(= O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl) -OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dion-N-yl) -OC (= O) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl) -OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O- CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O -CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 -C(=O)-NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O -CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX).
4. Способ получения 44. Production method 4
Соединение, представленное формулой (2) или (2b) в качестве промежуточного соединения, используемого в предыдущем способе получения, и его фармакологически приемлемая соль могут быть получены, например, следующим способом.The compound represented by formula (2) or (2b) as an intermediate used in the previous production method and a pharmacologically acceptable salt thereof can be produced, for example, by the following method.
В этой формуле, Lc представляет собой -C(=O)- и присоединяется к -(NH-DX) с образованием амидной связи, L1' представляет L1 структуру, конец которой превращают в малеимидильную группу или галогенацетильную группу, или в (пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-(CH2)n4-C(=O)-, и каждый P1, P2 и P3 представляют защитную группу.In this formula, L c represents -C(=O)- and adds to -(NH-DX) to form an amide bond, L 1 ' represents an L 1 structure, the end of which is converted to a maleimidyl group or a haloacetyl group, or to ( pyrrolidin-2,5-dion-N-yl)-OC(=O)-(CH 2 )n 4 -C(=O)-, and each P 1 , P 2 and P 3 represent a protective group.
Соединение (6) может быть получено путем дериватизации карбоновой кислоты (5) в активный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид или другое подобное соединение и реакции его с NH2-DX [обозначающее эксатекан; химическое название: (1S,9S)-1-амино-9-этил-5-фтор-2,3-дигидро-9-гидрокси-4-метил-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино-[1,2-b]хинолин-10,13(9H,15H)-дион] (4) или его фармакологически приемлемой солью.The compound (6) can be obtained by derivatizing the carboxylic acid (5) to an active ester, a mixed acid anhydride, an acid halide or the like, and reacting it with NH 2 -DX [denoting exatecan; chemical name: (1S,9S)-1-amino-9-ethyl-5-fluoro-2,3-dihydro-9-hydroxy-4-methyl-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4' :6,7]indolizino-[1,2-b]quinoline-10,13(9H,15H)-dione] (4) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
Для этой реакции могут быть использованы реагенты и условия проведения реакции, которые обычно применяют для синтеза пептидов. Существуют различные типы активного эфира. Например, он может быть получен реакцией фенолов, таких как п-нитрофенол, N-гидроксибензотриазол, N-гидроксисукцинимид или другие подобные фенолы, с карбоновой кислотой (5) при использовании конденсирующего реагента, такого как N,N'-дициклогексилкарбодиимид или 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид. Кроме того, активный эфир может быть также получен реакцией карбоновой кислоты (5) с пентафторфенилтрифторацетатом или другим подобным соединением; реакцией карбоновой кислоты (5) с 1-бензотриазолилокситрипирролидинофосфония гексафторфосфитом; реакцией карбоновой кислоты (5) с диэтилцитанофосфонатом (способом всаливания); реакцией карбоновой кислоты (5) с трифенилфосфином и 2,2'-дипиридилдисульфидом (способом Мукайямы); реакцией карбоновой кислоты (5) с производным триазина, таким как 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (DMTMM); или другим подобным способом. Кроме того, реакция может быть осуществлена, например, галогенангидридным способом, при котором карбоновую кислоту (5) обрабатывают галогенангидридом, таким как тионилхлорид и оксалилхлорид, в присутствии основания. В результате реакции активного эфира, смешанного галогенангидрила или галогенангидрида карбоновой кислоты (5) с соединением (4) в присутствии подходящего основания в инертном растворителе при температуре от -78°C до 150°C может быть получено соединение (6). (При этом термин "инертный растворитель" означает растворитель, который не препятствует протеканию реакции, для которой этот растворитель используется).For this reaction, reagents and reaction conditions that are commonly used for peptide synthesis can be used. There are different types of active ether. For example, it can be obtained by reacting phenols such as p-nitrophenol, N-hydroxybenzotriazole, N-hydroxysuccinimide or the like with carboxylic acid (5) using a condensing agent such as N,N'-dicyclohexylcarbodiimide or 1-ethyl -3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride. In addition, the active ester can also be obtained by reacting the carboxylic acid (5) with pentafluorophenyl trifluoroacetate or the like; reaction of carboxylic acid (5) with 1-benzotriazolyloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphite; reaction of carboxylic acid (5) with diethylcytanophosphonate (salting-in method); reaction of carboxylic acid (5) with triphenylphosphine and 2,2'-dipyridyl disulfide (Mukayama method); reacting the carboxylic acid (5) with a triazine derivative such as 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM); or in some other similar way. In addition, the reaction can be carried out, for example, by an acid halide method in which the carboxylic acid (5) is treated with an acid halide such as thionyl chloride and oxalyl chloride in the presence of a base. By reacting the active ester, mixed acid halide or carboxylic acid halide (5) with compound (4) in the presence of a suitable base in an inert solvent at -78°C to 150°C, compound (6) can be obtained. (The term "inert solvent" means a solvent that does not interfere with the reaction for which this solvent is used).
Конкретные примеры основания, используемого на каждой описанной выше стадии, включают карбонат щелочного металла или щелочноземельного металла, алкоксид щелочного металла, гидроксид или гидрид щелочного металла, в том числе карбонат натрия, карбонат калия, этоксид натрия, бутоксид калия, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидрид натрия и гидрид калия, металлоорганическое основание, представленное алкиллитием, в том числе н-бутиллитий, диалкиламинолитий, в том числе диизопропиламид лития; металлоорганическое основание биссилиламина, в том числе бис(триметилсилил)амид лития; и органическое основание, в том числе пиридин, 2,6-лутидин, коллидин, 4-диметиламинопиридин, триэтиламин, N-метилморфолин, диизопропилэтиламин и диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен (DBU).Specific examples of the base used in each step above include an alkali metal or alkaline earth metal carbonate, an alkali metal alkoxide, an alkali metal hydroxide or hydride, including sodium carbonate, potassium carbonate, sodium ethoxide, potassium butoxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium hydride and potassium hydride, an organometallic base represented by alkyllithium, including n-butyllithium, dialkylaminolithium, including lithium diisopropylamide; an organometallic base of bissilylamine, including lithium bis(trimethylsilyl)amide; and an organic base including pyridine, 2,6-lutidine, collidine, 4-dimethylaminopyridine, triethylamine, N-methylmorpholine, diisopropylethylamine, and diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene (DBU).
Примеры инертного растворителя, который используют для реакции настоящего изобретения, включают галогенированный углеводородный растворитель, такой как дихлорметан, хлороформ, и тетрахлорид углерода; эфирный растворитель, такой как тетрагидрофуран, 1,2-диметоксиэтан и диоксан; ароматический углеводородный растворитель, такой как бензол и толуол; и амидный растворитель, такой как N,N-диметилформамид, N,N-диметилацетамид и N-метилпирролидин-2-он. Помимо них, в зависимости от ситуации, может быть использован сульфоксидный растворитель, такой как диметилсульфоксид и сульфолан; и кетонный растворитель, такой как ацетон и метилэтилкетон.Examples of the inert solvent that is used for the reaction of the present invention include a halogenated hydrocarbon solvent such as dichloromethane, chloroform, and carbon tetrachloride; an ether solvent such as tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane and dioxane; aromatic hydrocarbon solvent such as benzene and toluene; and an amide solvent such as N,N-dimethylformamide, N,N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidin-2-one. In addition to these, depending on the situation, a sulfoxide solvent such as dimethyl sulfoxide and sulfolane can be used; and a ketone solvent such as acetone and methyl ethyl ketone.
Гидроксильная группа, карбоксильная группа, аминогруппа или другая подобная группа в La и Lb в соединении (6) может быть защищена с помощью описанной ниже защитной группы, которую обычно применяют в органическом синтезе. В частности, примеры защитной группы для гидроксильной группы включают алкоксиметильную группу, такую как метоксиметильная группа; арилметильную группу, такую как бензильная группа, 4-метоксибензильная группа и трифенилметильная группа; алканоильную группу, такую как ацетильная группа; ароильную группу, такую как бензоильная группа; и силильную группу, такую как трет-бутилдифенилсилильная группа. Карбоксильная группа может быть защищена, например, в виде эфира с алкильной группой, такой как метильная группа, этильная группа и трет-бутильная группа, аллильной группой или арилметильной группой, такой как бензильная группа. Аминогруппа может быть защищена с помощью защитной группы для аминогруппы, которую обычно используют в пептидном синтезе, например, алкоксикарбонильной группы, такой как трет-бутилоксикарбонильная группа, метоксикарбонильная группа и этоксикарбонильная группа; арилметильной группы, такой как аллилоксикарбонил, 9-флуоренилметилоксикарбонильная группа, бензилоксикарбонильная группа, параметоксибензилоксикарбонильная группа и пара- (или орто-)нитробензилоксикарбонильная группа; алканоильной группы, такой как ацетильная группа; арилметильной группы, такой как бензильная группа и трифенилметильная группа; ароильной группы, такой как бензоильная группа; и арилсульфонильной группы, такой как 2,4-динитробензолсульфонильная группа или ортонитробензолсульфонильная группа. Защита с помощью защитной группы или снятие защиты может быть осуществлено обычным хорошо известным способом.The hydroxyl group, carboxyl group, amino group, or the like in L a and L b in the compound (6) can be protected with the following protective group, which is generally used in organic synthesis. Specifically, examples of a protecting group for a hydroxyl group include an alkoxymethyl group such as a methoxymethyl group; an arylmethyl group such as a benzyl group, a 4-methoxybenzyl group and a triphenylmethyl group; an alkanoyl group such as an acetyl group; an aroyl group such as a benzoyl group; and a silyl group such as a tert-butyldiphenylsilyl group. The carboxyl group may be protected, for example, as an ester with an alkyl group such as a methyl group, an ethyl group and a tert-butyl group, an allyl group or an arylmethyl group such as a benzyl group. The amino group may be protected with an amino protecting group that is commonly used in peptide synthesis, for example, an alkoxycarbonyl group such as a t-butyloxycarbonyl group, a methoxycarbonyl group, and an ethoxycarbonyl group; an arylmethyl group such as an allyloxycarbonyl group, a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group, a benzyloxycarbonyl group, a paramethoxybenzyloxycarbonyl group, and a para-(or ortho-)nitrobenzyloxycarbonyl group; an alkanoyl group such as an acetyl group; an arylmethyl group such as a benzyl group and a triphenylmethyl group; an aroyl group such as a benzoyl group; and an arylsulfonyl group such as a 2,4-dinitrobenzenesulfonyl group or an orthonitrobenzenesulfonyl group. Protecting with a protecting group or deprotection can be carried out in the usual well-known manner.
Что касается защитной группы P1 для концевой аминогруппы соединения (6), то может быть использована защитная группа для аминогруппы, которую обычно используют в пептидном синтезе, например, трет-бутоксикарбонильная группа, 9-флуоренилметилоксикарбонильная группа и бензилоксикарбонильная группа. Примеры другой защитной группы для аминогруппы включают алканоильную группу, такую как ацетильная группа; алкоксикарбонильную группу, такую как метоксикарбонильная группа и этоксикарбонильная группа; арилметоксикарбонильную группу, такую как параметоксибензилоксикарбонильная группа и пара- (или орто-)нитробензилоксикарбонильная группа; арилметильную группу, такую как бензильная группа и трифенилметильная группа; ароильную группу, такую как бензоильная группа; и арилсульфонильную группу, такую как 2,4-динитробензолсульфонильная группа и ортонитробензолсульфонильная группа. Защитная группа P1 может быть выбрана в зависимости, например, от свойств соединения, имеющего аминогруппу, которую требуется защитить.As for the protecting group P 1 for the terminal amino group of compound (6), an amino protecting group which is commonly used in peptide synthesis, such as t-butoxycarbonyl group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group and benzyloxycarbonyl group, can be used. Examples of another protecting group for an amino group include an alkanoyl group such as an acetyl group; an alkoxycarbonyl group such as a methoxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group; an arylmethoxycarbonyl group such as a paramethoxybenzyloxycarbonyl group and a para- (or ortho-)nitrobenzyloxycarbonyl group; an arylmethyl group such as a benzyl group and a triphenylmethyl group; an aroyl group such as a benzoyl group; and an arylsulfonyl group such as a 2,4-dinitrobenzenesulfonyl group and an orthonitrobenzenesulfonyl group. The protecting group P 1 may be selected depending, for example, on the properties of the compound having the amino group to be protected.
Путем удаления защитной группы P1 для концевой аминогруппы полученного соединения (6), может быть получено соединение (7). Реагенты и условия могут быть выбраны в зависимости от используемой защитной группы.By removing the protecting group P 1 for the terminal amino group of the resulting compound (6), compound (7) can be obtained. Reagents and conditions may be selected depending on the protecting group used.
Соединение (9) может быть получено путем дериватизации содержащей пептидной карбоновой кислоты (8), имеющей N конец, защищенный с помощью P2, в активный эфир, смешанный ангидрид кислоты или другое подобное соединение и реакции его с полученным соединением (7). Условия проведения реакции, реагенты, основание и инертный растворитель, используемые для формирования пептидной связи между содержащей пептид карбоновой кислотой (8) и соединением (7) могут быть соответствующим образом выбраны из уже описанных для синтеза соединения (6). Защитная группа P2 может быть соответствующим образом выбрана из защитных групп, описанных для соединения (6), и выбор может быть основан, например, на свойствах соединения, имеющего аминогруппу, которую требуется защитить. Таким же способом, который обычно используют в синтезе пептидов с целью элонгации, то есть путем последовательного повторения реакции и удаления защиты с аминокислоты или пептида, входящего в состав содержащей пептид карбоновой кислоты (8), может быть также получено соединение (9).Compound (9) can be obtained by derivatizing a peptidic carboxylic acid-containing (8) having an N terminus protected with P 2 into an active ester, a mixed acid anhydride or the like, and reacting it with the resulting compound (7). The reaction conditions, reagents, base and inert solvent used to form a peptide bond between the peptide-containing carboxylic acid (8) and the compound (7) can be appropriately selected from those already described for the synthesis of compound (6). The protecting group P 2 may be appropriately selected from the protecting groups described for compound (6) and the choice may be based, for example, on the properties of the compound having the amino group to be protected. Compound (9) can also be obtained in the same way that is commonly used in the synthesis of peptides for the purpose of elongation, that is, by successively repeating the reaction and deprotecting the amino acid or peptide constituting the carboxylic acid containing the peptide (8).
В результате удаления P2 в качестве защитной группы для аминогруппы полученного соединения (9) может быть получено соединение (10). Реагенты и условия могут быть выбраны в зависимости от используемой защитной группы.By removing P 2 as a protecting group for the amino group of the resulting compound (9), compound (10) can be obtained. Reagents and conditions may be selected depending on the protecting group used.
Можно получить соединение (2) или (2b) путем дериватизации карбоновой кислоты (11) или (11b) в активный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид или другое подобное соединение и реакции его с полученным соединением (10). Условия проведения реакции, реагенты, основание и инертный растворитель, используемые для образования пептидной связи между карбоновой кислотой (11) или (11b) и соединением (10) могут быть соответствующим образом выбраны из уже описанных для синтеза соединения (6).It is possible to obtain the compound (2) or (2b) by derivatizing the carboxylic acid (11) or (11b) into an active ester, a mixed acid anhydride, an acid halide or the like, and reacting it with the resulting compound (10). The reaction conditions, reagents, base and inert solvent used to form the peptide bond between the carboxylic acid (11) or (11b) and compound (10) can be appropriately selected from those already described for the synthesis of compound (6).
Соединение (9) может быть также получено, например, следующим способом.Compound (9) can also be obtained, for example, by the following method.
Соединение (13) может быть получено путем дериватизации содержащей пептид карбоновой кислоты (8), имеющей N конец, защищенный с помощью P2, в активный эфир, смешанный ангидрид кислоты или другое подобное соединение и его реакции с соединением амина (12), имеющим карбоксильную группу, защищенную с помощью P3, в присутствии основания. Условия проведения реакции, реагенты, основание и инертный растворитель, используемые для образования пептидной связи между содержащей пептид карбоновой кислотой (8) и соединением (12) могут быть соответствующим образом выбраны из уже описанных для синтеза соединения (6). Защитная группа P2 для аминогруппы соединения (13) может быть соответствующим образом выбрана из защитных групп, описанных для соединения (6). Что касается защитной группы P3 для карбоксильной группы, то может быть использована защитная группа, которая обычно применяется в качестве защитной группы для карбоксильной группы в органическом синтезе, в частности, при синтезе пептидов. В частности, она может быть соответствующим образом выбрана из защитных групп, описанных для соединения (6), например, эфиров с алкильной группой, такой как метильная группа, этильная группа или трет-бутил, аллильных эфиров и бензильных эфиров. В этом случае, необходимо, чтобы защитная группа для аминогруппы и защитная группа для карбоксильной группы могли быть удалены с помощью отличающихся способов или при отличающихся условиях. Например, типичный пример включает комбинацию, при которой P2 является трет-бутилоксикарбонильной группой и P3 является бензильной группой. Защитные группы могут быть выбраны из упомянутых выше защитных групп в зависимости, например, от свойств соединения, имеющего аминогруппу и карбоксильную группу, которые требуется защитить. Для удаления защитных групп, реагенты и условия могут быть выбраны в зависимости от используемой защитной группы.Compound (13) can be obtained by derivatizing a peptide-containing carboxylic acid (8) having an N terminus protected with P 2 into an active ester, a mixed acid anhydride or the like, and reacting it with an amine compound (12) having a carboxyl a group protected with P 3 in the presence of a base. The reaction conditions, reagents, base and inert solvent used to form a peptide bond between the peptide-containing carboxylic acid (8) and compound (12) can be appropriately selected from those already described for the synthesis of compound (6). The protecting group P 2 for the amino group of the compound (13) may be appropriately selected from the protecting groups described for the compound (6). With regard to the protecting group P 3 for a carboxyl group, a protecting group which is generally used as a protecting group for a carboxyl group in organic synthesis, in particular in peptide synthesis, can be used. In particular, it may be appropriately selected from the protecting groups described for the compound (6), for example, esters with an alkyl group such as a methyl group, an ethyl group or t-butyl, allyl ethers, and benzyl ethers. In this case, it is necessary that the amino protecting group and the carboxyl protecting group can be removed by different methods or under different conditions. For example, a typical example includes a combination in which P 2 is a tert-butyloxycarbonyl group and P 3 is a benzyl group. The protecting groups may be selected from the above-mentioned protecting groups depending on, for example, the properties of the compound having the amino group and the carboxyl group to be protected. For deprotection, reagents and conditions can be selected depending on the protecting group used.
Путем удаления защитной группы P3 для карбоксильной группы полученного соединения (13), может быть получено соединение (14). Реагенты и условия выбирают в зависимости от используемой защитной группы.By removing the protecting group P 3 for the carboxyl group of the obtained compound (13), compound (14) can be obtained. Reagents and conditions are selected depending on the protecting group used.
Соединение (9) может быть получено путем дериватизации полученного соединения (14) в активный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид или другое подобное соединение и его реакции с соединением (4) в присутствии основания. Для реакции, могут быть также использованы реагенты и условия, которые обычно применяют при синтезе пептидов, и условия проведения реакции, реагенты, основание и инертный растворитель, используемые для реакции, могут быть соответствующим образом выбраны из уже описанных для синтеза соединения (6).Compound (9) can be obtained by derivatizing the resulting compound (14) into an active ester, mixed acid anhydride, acid halide or the like, and reacting it with compound (4) in the presence of a base. For the reaction, the reagents and conditions that are commonly used in the synthesis of peptides can also be used, and the reaction conditions, the reagents, the base and the inert solvent used for the reaction can be appropriately selected from those already described for the synthesis of compound (6).
Соединение (2) или (2b) может быть также получено, например, следующим способом.Compound (2) or (2b) can also be obtained, for example, by the following method.
В результате удаления защитной группы P2 для аминогруппы соединения (13), может быть получено соединение (15). Реагенты и условия выбирают в зависимости от используемой защитной группы.By removing the protecting group P 2 for the amino group of compound (13), compound (15) can be obtained. Reagents and conditions are selected depending on the protecting group used.
Соединение (16) или (16b) может быть получено путем дериватизации производного карбоновой кислоты (11) или (11b) в активный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид или другое подобное соединение и его реакции с полученным соединением (15) в присутствии основания. Условия проведения реакции, реагенты, основание и инертный растворитель, используемые для образования амидной связи между содержащей пептид карбоновой кислотой (11) или (11b) и соединением (15) могут быть соответствующим образом выбраны из уже описанных для синтеза соединения (6).Compound (16) or (16b) can be obtained by derivatizing a carboxylic acid derivative (11) or (11b) into an active ester, a mixed acid anhydride, an acid halide or the like, and reacting it with the resulting compound (15) in the presence of a base. The reaction conditions, reagents, base and inert solvent used to form the amide bond between the peptide-containing carboxylic acid (11) or (11b) and compound (15) can be appropriately selected from those already described for the synthesis of compound (6).
В результате удаления защитной группы для карбоксильной группы полученного соединения (16) или (16b), может быть получено соединение (17) или (17b). Это удаление может быть проведено так же, как удаление защитной группы для карбоксильной группы для получения соединения (14).By removing the protecting group for the carboxyl group of the obtained compound (16) or (16b), the compound (17) or (17b) can be obtained. This removal can be carried out in the same way as the deprotection of the carboxyl group to obtain compound (14).
Соединение (2) или (2b) может быть получено путем дериватизации соединения (17) или (17b) в активный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид или другое подобное соединение и его реакции с соединением (4) в присутствии основания. Для реакции, могут быть также использованы реагенты и условия, которые обычно применяют при синтезе пептидов, и условия проведения реакции, реагенты, основание и инертный растворитель, используемые для реакции, могут быть соответствующим образом выбраны из уже описанных для синтеза соединения (6).Compound (2) or (2b) can be obtained by derivatizing compound (17) or (17b) into an active ester, mixed acid anhydride, acid halide or the like, and reacting it with compound (4) in the presence of a base. For the reaction, the reagents and conditions that are commonly used in the synthesis of peptides can also be used, and the reaction conditions, the reagents, the base and the inert solvent used for the reaction can be appropriately selected from those already described for the synthesis of compound (6).
5. Способ получения 55.
Промежуточное соединение, представленное формулой (2), может быть также получено следующим способом.The intermediate compound represented by formula (2) can also be obtained by the following method.
. .
В этой схеме реакции, L1' соответствует L1, имеющему структуру, в которой конец превращают в малеимидильную группу или галогенацетильную группу, и P4 представляет защитную группу.In this reaction scheme, L 1 ' corresponds to L 1 having a structure in which the end is converted to a maleimidyl group or a haloacetyl group, and P 4 represents a protective group.
Соединение (19) может быть получено путем дериватизации соединения (11) в активный эфир, смешанный ангидрид кислоты или другое подобное соединение и его реакции с содержащей пептид карбоновой кислотой (18), имеющей C конец, защищенный с помощью P4, в присутствии основания. Условия проведения реакции, реагенты, основание и инертный растворитель, используемые для образования пептидной связи между содержащей пептид карбоновой кислотой (18) и соединением (11), могут быть соответствующим образом выбраны из уже описанных для синтеза соединения (6). Защитная группа P4 для карбоксильной группы соединения (18) может быть соответствующим образом выбрана из защитных групп, описанных для соединения (6).Compound (19) can be obtained by derivatizing compound (11) to an active ester, a mixed acid anhydride, or the like, and reacting it with a peptide-containing carboxylic acid (18) having a C-terminus protected with P 4 in the presence of a base. The reaction conditions, reagents, base and inert solvent used to form a peptide bond between the peptide-containing carboxylic acid (18) and compound (11) can be appropriately selected from those already described for the synthesis of compound (6). The protecting group P 4 for the carboxyl group of the compound (18) may be appropriately selected from the protecting groups described for the compound (6).
В результате удаления защитной группы для карбоксильной группы полученного соединения (19), может быть получено соединение (20). Это удаление может быть осуществлено так же, как удаление защитной группы для карбоксильной группы при получении соединения (14).By deprotecting the carboxyl group of the resulting compound (19), compound (20) can be obtained. This removal can be carried out in the same way as the deprotection of the carboxyl group in the preparation of compound (14).
Соединение (2) может быть получено путем дериватизации полученного соединения (20) в активный эфир, смешанный ангидрид кислоты или другое подобное соединение и его реакции с соединением (7). Для реакции, могут быть также использованы реагенты и условия, которые обычно применяют при синтезе пептидов, и условия проведения реакции, реагенты, основание и инертный растворитель, используемые для реакции, могут быть соответствующим образом выбраны из уже описанных для синтеза соединения (6).Compound (2) can be obtained by derivatizing the resulting compound (20) into an active ester, mixed acid anhydride or the like, and reacting it with compound (7). For the reaction, the reagents and conditions that are commonly used in the synthesis of peptides can also be used, and the reaction conditions, the reagents, the base and the inert solvent used for the reaction can be appropriately selected from those already described for the synthesis of compound (6).
6. Способ получения 66. Production method 6
Получение промежуточного соединения (2a), описанного в способе получения 2, в котором L2' соответствует L2, имеющему структуру, в которой конец превращают в меркаптоалканоильную группу, может быть осуществлено следующим способом.Obtaining the intermediate compound (2a) described in the production method 2, in which L 2' corresponds to L 2 having a structure in which the end is converted into a mercaptoalkanoyl group, can be carried out by the following method.
Соединение (2a) может быть получено путем дериватизации карбоновой кислоты (21), имеющей концевую меркаптогруппу, в активный эфир, смешанный ангидрид кислоты или другое подобное соединение и его реакции с соединением (10). Для реакции, могут быть также использованы реагенты и условия, которые обычно применяют при синтезе пептидов, и условия проведения реакции, реагенты, основание и инертный растворитель, используемые для реакции, могут быть соответствующим образом выбраны из уже описанных для синтеза соединения (4).The compound (2a) can be obtained by derivatizing a mercapto-terminated carboxylic acid (21) into an active ester, a mixed acid anhydride or the like, and reacting it with a compound (10). For the reaction, the reagents and conditions that are commonly used in the synthesis of peptides can also be used, and the reaction conditions, the reagents, the base and the inert solvent used for the reaction can be appropriately selected from those already described for the synthesis of compound (4).
Кроме того, соединение (23) может быть получено путем дериватизации соединения (21) в активный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид или другое подобное соединение, реакции его с соединением (15) и удаления защитной группы для карбоксильной группы полученного соединения (22).In addition, compound (23) can be obtained by derivatizing compound (21) into an active ester, mixed acid anhydride, acid halide or the like, reacting it with compound (15), and deprotecting the carboxyl group of the obtained compound (22).
Соединение (2a) может быть получено путем дериватизации соединения (23) в активный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид или другое подобное соединение и его реакции с соединением (4) в присутствии основания. Для реакции, могут быть также использованы реагенты и условия, которые обычно применяют при синтезе пептидов, и условия проведения реакции, реагенты, основание и инертный растворитель, используемые для реакции, могут быть соответствующим образом выбраны из уже описанных для синтеза соединения (6).Compound (2a) can be obtained by derivatizing compound (23) into an active ester, mixed acid anhydride, acid halide or the like, and reacting it with compound (4) in the presence of a base. For the reaction, the reagents and conditions that are commonly used in the synthesis of peptides can also be used, and the reaction conditions, the reagents, the base and the inert solvent used for the reaction can be appropriately selected from those already described for the synthesis of compound (6).
7. Способ получения 77. Production method 7
Далее подробно описан способ получения соединения (10c), имеющего n1=1, La=O, и Lb=CR2(-R3), при получении промежуточного соединения (10), описанного в способе получения 4. Соединение, представленное формулой (10c), его соль или сольват могут быть получены, например, следующим способом.The following describes in detail the method for producing the compound (10c) having n 1 =1, L a =O, and L b =CR 2 (-R 3 ), while obtaining the intermediate compound (10) described in the production method 4. The compound represented formula (10c), its salt or solvate can be obtained, for example, by the following method.
В этой схеме реакции, LP, R2 и R3 определены выше, L представляет ацетильную группу, атом водорода или другую подобную группу, X и Y каждый представляет олигопептид, состоящий из от 1 до 3 аминокислот, P5 и P7 каждый представляет защитную группу для аминогруппы, и P6 представляет защитную группу для карбоксильной группы.In this reaction scheme, L P , R 2 and R 3 are as defined above, L represents an acetyl group, a hydrogen atom or the like, X and Y each represent an oligopeptide consisting of 1 to 3 amino acids, P 5 and P 7 each represent a protecting group for an amino group; and P 6 represents a protecting group for a carboxyl group.
Соединение, представленное формулой (24), может быть получено путем использования или применения способа, описанного в выложенном патенте Японии № 2002-60351 или в литературе (J. Org. Chem., Vol. 51, page 3196, 1986), и, при необходимости, путем удаления защитных групп или модификации функциональных групп. В качестве варианта, оно может быть также получено путем обработки альдегидом или кетоном аминокислоты с защищенной концевой аминогруппой или амида кислоты олигопептида с защищенной аминогруппой.The compound represented by formula (24) can be obtained by using or applying the method described in Japanese Patent Laid-Open No. 2002-60351 or literature (J. Org. Chem., Vol. 51, page 3196, 1986), and, when necessary, by removing the protecting groups or modifying the functional groups. Alternatively, it can also be prepared by aldehyde or ketone treatment of an amino-terminally protected amino acid or acid amide of an amino-protected oligopeptide.
Путем реакции соединения (24) с соединением (25), имеющим гидроксильную группу при температуре, изменяющей при охлаждении до комнатной температуры, в инертном растворителе в присутствии кислоты или основания может быть получено соединение (26). Примеры кислоты, которая может быть использована, включают неорганическую кислоту, такую как фтористоводородная кислота, хлористоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и борная кислота; органическую кислоту, такую как уксусная кислота, лимонная кислота, паратолуолсульфоновая кислота и метансульфоновая кислота; и кислоту Льюиса, такую как тетрафторборат, хлорид цинка, хлорид олова, хлорид алюминия и хлорид железа. Паратолуолсульфоновая кислота является особенно предпочтительной. Что касается используемого основания, то может быть соответствующим образом выбрано и использовано любое из упомянутых выше оснований. Его предпочтительные примеры включают алкоксид щелочного металла, такой как трет-бутоксид калия, гидроксид щелочного металла, такой как гидроксид натрия и гидроксид калия; гидрид щелочного металла, такой как гидрид натрия и гидрид калия; металлоорганическое основание, представленное диалкиламинолитием, таким как диизопропиламид лития; и металлоорганическое основание биссилиламина, такое как бис(триметилсилил)амид лития. Примеры растворителя, используемого для реакции, включают эфирный растворитель, такой как тетрагидрофуран и 1,4-диоксан; и ароматический углеводородный растворитель, такой как бензол и толуол. Эти растворители могут быть приготовлены в виде смеси с водой. Кроме того, на защитную группу для аминогруппы, например, защитную группу P5, не накладывают конкретных ограничений, при условии, что она является группой, обычно используемой для защиты аминогруппы. Типичные примеры включают защитные группы для аминогруппы, которые описаны в способе получения 4. Однако, в данной реакции, защитная группа для аминогруппы, примером которой является группа P5, может быть расщепляемой. В этом случае, необходимо проводить реакцию с подходящим реагентом для защиты аминогруппы, если это требуется.By reacting a compound (24) with a compound (25) having a hydroxyl group at a temperature changing upon cooling to room temperature in an inert solvent in the presence of an acid or a base, compound (26) can be obtained. Examples of the acid that can be used include an inorganic acid such as hydrofluoric acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, and boric acid; an organic acid such as acetic acid, citric acid, p-toluenesulfonic acid and methanesulfonic acid; and a Lewis acid such as tetrafluoroborate, zinc chloride, tin chloride, aluminum chloride and iron chloride. P-toluenesulfonic acid is particularly preferred. As for the base to be used, any one of the bases mentioned above can be appropriately selected and used. Its preferred examples include an alkali metal alkoxide such as potassium tert-butoxide, an alkali metal hydroxide such as sodium hydroxide and potassium hydroxide; an alkali metal hydride such as sodium hydride and potassium hydride; an organometallic base represented by a dialkylaminolithium such as lithium diisopropylamide; and an organometallic base of bissilylamine such as lithium bis(trimethylsilyl)amide. Examples of the solvent used for the reaction include an ether solvent such as tetrahydrofuran and 1,4-dioxane; and an aromatic hydrocarbon solvent such as benzene and toluene. These solvents may be prepared as a mixture with water. In addition, a protecting group for an amino group, for example, a protecting group P 5 , is not particularly limited as long as it is a group commonly used to protect an amino group. Representative examples include amino protecting groups, which are described in Production Method 4. However, in this reaction, an amino protecting group, exemplified by the P 5 group, may be cleavable. In this case, it is necessary to carry out the reaction with a suitable amino group protection reagent, if required.
Соединение (27) может быть получено путем удаления защитной группы P6 в соединении (26). В данном случае, несмотря на то, что типичные примеры защитной группы для карбоксильной группы, например, группы P6, описаны в способе получения 4, тем не менее, в этом случае желательно, чтобы защитная группа P5 для аминогруппы и защитная группа P6 для карбоксильной группы являлись защитными группами, которые могут быть удалены с помощью отличающегося способа или при отличающихся условиях. Например, типичный пример включает комбинацию, при которой P5 является 9-флуоренилметилоксикарбонильной группой, а P6 является бензильной группой. Защитные группы могут быть выбраны в зависимости, например, от свойств соединения, имеющего аминогруппу и карбоксильную группу, которые требуется защитить. Для удаления защитных групп, реагенты и условия выбирают в зависимости от используемой защитной группы.Compound (27) can be obtained by removing the protecting group P 6 in compound (26). In this case, although typical examples of a protecting group for a carboxyl group, for example, a P 6 group, are described in the production method 4, nevertheless, in this case, it is desirable that the P 5 protecting group for an amino group and the P 6 protecting group for the carboxyl group were protecting groups that can be removed using a different method or under different conditions. For example, a typical example includes a combination in which P 5 is a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group and P 6 is a benzyl group. The protecting groups may be selected depending on, for example, the properties of the compound having the amino group and the carboxyl group to be protected. For deprotection, reagents and conditions are selected depending on the protecting group used.
Соединение (29) может быть получено путем дериватизации карбоновой кислоты (27) в активный эфир, смешанный ангидрид кислоты, галогенангидрид или другое подобное соединение и его реакции с соединением (4) и его фармакологически приемлемой соли с получением соединения (28) и затем удаления защитной группы P5 в полученном соединении (28). Для реакции между соединением (4) и карбоновой кислотой (27) и реакции для удаления защитной группы P6, могут быть использованы такие же реагенты и условия реакции, как описанные для способа получения 4.Compound (29) can be obtained by derivatizing a carboxylic acid (27) to an active ester, a mixed acid anhydride, an acid halide, or the like, and reacting it with a compound (4) and a pharmacologically acceptable salt thereof to obtain a compound (28), and then removing the protective group P 5 in the resulting compound (28). For the reaction between the compound (4) and the carboxylic acid (27) and the reaction to remove the protecting group P 6 , the same reagents and reaction conditions as those described for the production method 4 can be used.
Соединение (10c) может быть получено путем реакции соединения (29) с аминокислотой с защищенной концевой аминогруппой или с олигопептидом (30) с защищенной аминогруппой с получением соединения (9c) и удаления защитной группы P7 в полученном соединении (9c). На защитную группу для аминогруппы, например, защитную группу P7, не накладывают конкретных ограничений, при условии, что она является группой, обычно используемой для защиты аминогруппы. Ее типичные примеры включают защитные группы для аминогруппы, которые описаны в способе получения 4. Для удаления защитной группы, реагенты и условия выбирают в зависимости от используемой защитной группы. Для реакции между соединением (29) и соединением (30), могут быть использованы реагенты и условия, которые обычно используют при синтезе пептидов. Соединение (10c), полученное упомянутым выше способом, может быть дериватизировано в соединение (1) настоящего изобретения с помощью описанного выше способа.Compound (10c) can be obtained by reacting a compound (29) with a protected amino terminal amino acid or an oligopeptide (30) with a protected amino group to obtain a compound (9c) and deprotecting the P 7 group in the resulting compound (9c). A protecting group for an amino group, for example, a protecting group P 7 , is not particularly limited as long as it is a group commonly used to protect an amino group. Representative examples thereof include amino protecting groups, which are described in Preparation Method 4. To remove the protecting group, the reagents and conditions are selected depending on the protecting group used. For the reaction between compound (29) and compound (30), the reagents and conditions commonly used in peptide synthesis can be used. The compound (10c) obtained by the above method can be derivatized into the compound (1) of the present invention by the method described above.
8. Способ получения 88. Production method 8
Далее подробно описан способ получения соединения (2c), имеющего n1=1, La=O и Lb=CR2(-R3), при получении промежуточного соединения (2), описанного в способе получения 4. Соединение, представленное формулой (2c), его соль или сольват могут быть получены, например, следующим способом.The following describes in detail a method for producing a compound (2c) having n 1 =1, L a =O, and L b =CR 2 (-R 3 ) in the preparation of intermediate (2) described in the production method 4. The compound represented by the formula (2c), its salt or solvate can be obtained, for example, by the following method.
В этой схеме реакции, L1', L2, LP, R2 и R3 определены выше, Z представляет олигопептид, состоящий из от 1 до 3 аминокислот, P8 представляет защитную группу для аминогруппы, и P9 представляет защитную группу для карбоксильной группы.In this reaction scheme, L 1 ', L 2 , L P , R 2 and R 3 are as defined above, Z is an oligopeptide consisting of 1 to 3 amino acids, P 8 is a protecting group for an amino group, and P 9 is a protecting group for carboxyl group.
Соединение (33) может быть получено путем удаления защитной группы P8 в аминокислоте или олигопептиде (31) с защищенной концевой аминогруппой и карбоксильной группой с получением соединения (32) и реакции полученной аминной формы (32) с соединением (11). На защитную группу для аминогруппы, примером которой является P8, не накладывают конкретных ограничений, при условии, что она является группой, обычно используемой для защиты аминогруппы. Типичные примеры включают защитные группы для аминогруппы, которые описаны в способе получения 4. Кроме того, для удаления защитной группы P8, реагенты и условия выбирают в зависимости от используемой защитной группы. Для реакции между соединением (32) и карбоновой кислотой (11) могут быть использованы такие же реагенты и реакционные условия, как описанные в способе получения 4.Compound (33) can be obtained by removing the protecting group P 8 in amino acid or oligopeptide (31) with a protected terminal amino group and carboxyl group to obtain compound (32) and reacting the resulting amine form (32) with compound (11). A protecting group for an amino group, exemplified by P 8 , is not particularly limited as long as it is a group commonly used to protect an amino group. Representative examples include amino protecting groups, which are described in Preparation Method 4. In addition, to remove the P 8 protecting group, the reagents and conditions are selected depending on the protecting group used. For the reaction between compound (32) and carboxylic acid (11), the same reagents and reaction conditions as those described in Preparation Method 4 can be used.
Промежуточный продукт (2c) может быть получен путем удаления защитной группы P9 в соединении (33) с получением соединения (34) и реакции полученной карбоновой кислоты (34) с соединением (29). Типичные примеры защитной группы для карбоксильной группы, примером которой является группа P9, описаны в способе получения 4. Для проведения реакции ее удаления, могут быть использованы такие же реагенты и реакционные условия, как описанные для способа получения 4. Для реакции между соединением (29) и карбоновой кислотой (34), могут быть также использованы реагенты и условия реакции, которые обычно используют при синтезе пептидов. Соединение (2c), полученное упомянутым выше способом, может быть дериватизировано в соединение (1) настоящего изобретения описанным выше способом.Intermediate (2c) can be obtained by removing the protecting group P 9 in compound (33) to give compound (34) and reacting the resulting carboxylic acid (34) with compound (29). Representative examples of a protecting group for a carboxyl group, exemplified by the P 9 group, are described in Production Method 4. The same reagents and reaction conditions as those described for Production Method 4 can be used to carry out the reaction to remove it. ) and carboxylic acid (34), reagents and reaction conditions that are commonly used in peptide synthesis can also be used. The compound (2c) obtained by the method mentioned above can be derivatized to the compound (1) of the present invention by the method described above.
9. Способ получения 99. Production method 9
Далее подробно описан способ получения соединения (17c), имеющего n1=1, La=O, и Lb=CR2(-R3), при получении промежуточного соединения (17), описанного в способе получения 4. Соединение, представленное формулой (17c), его соль или сольват могут быть также получены, например, следующим способом.The following describes in detail the method for producing the compound (17c) having n 1 =1, L a =O, and L b =CR 2 (-R 3 ), while obtaining the intermediate compound (17) described in the production method 4. The compound represented formula (17c), its salt or solvate can also be obtained, for example, by the following method.
В этой схеме реакции, L1', L2, LP, R2, R3, X, Y, P5, P6 и P7 определены выше.In this reaction scheme, L 1 ', L 2 , L P , R 2 , R 3 , X, Y, P 5 , P 6 and P 7 are defined above.
Соединение (36) может быть получено в результате удаления защитной группы P5 для аминогруппы в соединении (26) с защищенной концевой аминогруппой и карбоксильной группой с получением соединения (35) и реакции полученной аминной формы (35) с олигопептидом (30) с защищенной концевой аминогруппой или защищенной аминогруппой. На защитную группу для аминогруппы, примером которой является P5, не накладывают конкретных ограничений, при условии, что она является группой, обычно используемой для защиты аминогруппы. Типичные примеры включают защитные группы для аминогруппы, которые описаны в способе получения 4. Кроме того, для удаления защитной группы P5, реагенты и условия выбирают в зависимости от используемой защитной группы. В данном случае, несмотря на то, что типичные примеры защитной группы для карбоксильной группы, примером которой является группа P6, и защитной группы для аминогруппы, примером которой является группа P7, включают защитные группы для карбоксильной группы и аминогруппы, которые описаны в способе получения 4, тем не менее, желательно, чтобы защитная группа P6 для карбоксильной группы и защитная группа P7 для аминогруппы являлись защитными группами, которые могут быть удалены одним и тем же способом или при одних и тех же условиях. Например, типичный пример включает комбинацию, при которой P6 является бензиловой эфирной группой, и P7 является бензилоксикарбонильной группой.Compound (36) can be obtained by removing the protecting group P 5 for the amino group in the compound (26) with a protected terminal amino group and a carboxyl group to obtain a compound (35) and reacting the resulting amine form (35) with an oligopeptide (30) with a protected terminal an amino group or a protected amino group. A protecting group for an amino group, exemplified by P 5 , is not particularly limited as long as it is a group commonly used to protect an amino group. Representative examples include amino protecting groups, which are described in Preparation Method 4. In addition, to remove the P 5 protecting group, reagents and conditions are selected depending on the protecting group used. Here, although typical examples of a protecting group for a carboxyl group, exemplified by the P 6 group, and a protecting group for an amino group, exemplified by the P 7 group, include protecting groups for a carboxyl group and an amino group, which are described in Method 4, however, it is desirable that the carboxyl protecting group P 6 and the amino protecting group P 7 are protecting groups that can be removed by the same method or under the same conditions. For example, a typical example includes a combination in which P 6 is a benzyl ether group and P 7 is a benzyloxycarbonyl group.
Соединение (37) может быть получено путем удаления защитной группы P6 для карбоксильной группы в соединении (36) и защитной группы P7 для аминогруппы в соединении (36). Соединение (37) может быть также получено путем последовательного удаления защитной группы P6 для карбоксильной группы и защитной группы P7 для аминогруппы, или соединение (37) может быть получено путем одновременного удаления обеих защитных групп P6 и P7, которые могут быть удалены одним и тем же способом или при одних и тех же условиях.Compound (37) can be obtained by removing the P 6 protecting group for the carboxyl group in the compound (36) and the P 7 protecting group for the amino group in the compound (36). Compound (37) can also be obtained by sequentially removing the P 6 protecting group for the carboxyl group and the P 7 protecting group for the amino group, or compound (37) can be obtained by simultaneously removing both P 6 and P 7 protecting groups, which can be removed in the same way or under the same conditions.
Соединение (17c) может быть получено путем реакции полученного соединения (37) с соединением (11). Для реакции между соединением (37) и соединением (11), могут быть использованы такие же реагенты и условия реакции, как описанные для способа получения 4.Compound (17c) can be obtained by reacting the resulting compound (37) with compound (11). For the reaction between compound (37) and compound (11), the same reagents and reaction conditions as those described for Production Method 4 can be used.
Далее описывается соединение, представленное следующей формулой:The following describes the compound represented by the following formula:
в качестве промежуточного продукта, применяемого для получения конъюгата антитело-лекарственное средство настоящего изобретения. Кроме того, группа соединений, представленных следующей формулой:as an intermediate used to prepare the antibody-drug conjugate of the present invention. In addition, a group of compounds represented by the following formula:
Q-(CH2)nQ-C(=O)-L2a-LP-NH-(CH2)n1-La-Lb-Lc-(NH-DX)Q-(CH 2 )n Q -C(=O)-L 2a -L P -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -L c -(NH-DX)
являются также соединениями, которые служат в качестве промежуточных продуктов, используемых для получения конъюгата антитело-лекарственное средство настоящего изобретения.are also compounds that serve as intermediates used to prepare the antibody-drug conjugate of the present invention.
В частности, в приведенных выше фрагментах формулы, Q представляет собой (малеимид-N-ил)-, HS-, X-CH2-C(=O)-NH- или (пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-,In particular, in the above fragments of the formula, Q represents (maleimide-N-yl)-, HS-, X-CH 2 -C(=O)-NH- or (pyrrolidin-2,5-dion-N-yl )-OC(=O)-,
X представляет собой атом брома или атом йода,X represents a bromine atom or an iodine atom,
nQ представляет собой целое число от 2 до 8,n Q is an integer from 2 to 8,
L2a представляет -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)- или одинарную химическую связь, где n5 представляет целое число от 1 до 6,L 2a represents -NH-(CH 2 -CH 2 -O)n 5 -CH 2 -CH 2 -C(=O)- or a single chemical bond, where n 5 represents an integer from 1 to 6,
LP представляет пептидный остаток, состоящий от 2 до 7 аминокислот,L P is a peptide residue consisting of 2 to 7 amino acids,
n1 представляет целое число от 0 до 6,n 1 represents an integer from 0 to 6,
La представляет -C(=O)-NH-, -NR1-(CH2)n7-, -O- или одинарную химическую связь,L a represents -C(=O)-NH-, -NR 1 -(CH 2 )n 7 -, -O- or a single chemical bond,
где n7 представляет целое число от 1 до 6, R1 представляет атом водорода, алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, -(CH2)n8-COOH или -(CH2)n9-OH, n8 представляет целое число от 1 до 4, n9 представляет целое число от 1 до 6,where n 7 represents an integer from 1 to 6, R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms, -(CH 2 )n 8 -COOH or -(CH 2 )n 9 -OH, n 8 represents an integer from 1 to 4, n 9 represents an integer from 1 to 6,
Lb представляет -CR2(-R3)-, -O-, -NR4- или одинарную химическую связь,L b represents -CR 2 (-R 3 )-, -O-, -NR 4 - or a single chemical bond,
где R2 и R3 каждый независимо представляет атом водорода, алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, -(CH2)na-NH2, -(CH2)nb-COOH или -(CH2)nc -OH, R4 представляет атом водорода или алкильную группу, имеющую от 1 до 6 углеродных атомов, na представляет целое число от 0 до 6, nb представляет целое число от 1 до 4, nc представляет целое число от 1 до 4, при условии, что когда na равняется 0, R2 и R3 не являются одинаковыми,where R 2 and R 3 each independently represents a hydrogen atom, an alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms, -(CH 2 )n a -NH 2 , -(CH 2 )n b -COOH or -(CH 2 )n c is OH, R 4 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, n a is an integer from 0 to 6, n b is an integer from 1 to 4, n c is an integer from 1 to 4 , provided that when n a is 0, R 2 and R 3 are not the same,
Lc представляет -CH2- или -C(=O)-,L c represents -CH 2 - or -C(=O)-,
(малеимид-N-ил)- представляет собой группу, имеющую структуру, представленную следующей формулой:(maleimide-N-yl)- is a group having the structure represented by the following formula:
(в этой формуле, атом азота является положением присоединения), (пирролидин-2,5-дион-N-ил)- представляет собой группу, имеющую структуру, представленную следующей формулой:(in this formula, the nitrogen atom is the attachment position), (pyrrolidin-2,5-dion-N-yl)- is a group having the structure represented by the following formula:
(в этой формуле, атом азота является положением присоединения), -(NH-DX) представляет собой группу, имеющую структуру, представленную следующей формулой:(in this formula, the nitrogen atom is the attachment position), -(NH-DX) is a group having the structure represented by the following formula:
(в этой формуле, атом азота аминогруппы в положении 1 является положением присоединения).(in this formula, the nitrogen atom of the amino group in
Соединение, в котором Lc представляет собой -C(=O)-, является предпочтительным в качестве промежуточного продукта.A compound in which L c is -C(=O)- is preferred as an intermediate.
Что касается пептидного остатка в LP, то соединение аминокислотного остатка, состоящего из аминокислоты, выбранной из фенилаланина, глицина, валина, лизина, цитруллина, серина, глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, является предпочтительным в качестве промежуточного продукта. Среди этих пептидных остатков, соединение, в котором LP представляет собой пептидный остаток, состоящий из 4 аминокислот, является предпочтительным в качестве промежуточного продукта. Более конкретно, соединение, в котором LP представляет собой -GGFG-, является предпочтительным в качестве промежуточного продукта.As for the peptide residue in L P , the compound of an amino acid residue consisting of an amino acid selected from phenylalanine, glycine, valine, lysine, citrulline, serine, glutamic acid and aspartic acid is preferred as an intermediate. Among these peptide residues, a compound in which L P is a 4 amino acid peptide residue is preferred as an intermediate. More specifically, a compound in which L P is -GGFG- is preferred as an intermediate.
Кроме того, что касается -NH-(CH2)n1-La-Lb-, то соединение -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- или -NH-CH2CH2-O-CH2- является предпочтительным в качестве промежуточного продукта. Соединение NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- или -NH-(CH2)2-O-CH2-C(=O)- является более предпочтительным.In addition, with regard to -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b -, the compound -NH-CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 -O-CH 2 - or -NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 - is preferred in as an intermediate product. The connection NH-CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 -O-CH 2 - or -NH-(CH 2 ) 2 -O-CH 2 -C(=O)- is more preferred.
Что касается nQ, то соединение, в котором nQ представляет собой целое число от 2 до 6, является предпочтительным в качестве промежуточного продукта.As for n Q , a compound in which n Q is an integer from 2 to 6 is preferred as an intermediate.
Соединение, в котором L2a представляет собой одинарную химическую связь или n5 представляет собой целое число от 2 до 4, является предпочтительным в качестве промежуточного продукта.A compound in which L 2a is a single chemical bond or n 5 is an integer from 2 to 4 is preferred as an intermediate.
Когда Q представляет собой (малеимид-N-ил)-, соединение, в котором nQ представляет собой целое число от 2 до 5, L2a представляет собой одинарную химическую связь, и -NH-(CH2)n1-La-Lb- представляет собой -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- или -NH-CH2CH2-O-CH2-, является предпочтительным в качестве промежуточного продукта. Соединение, в котором -NH-(CH2)n1-La-Lb- представляет собой -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- или -NH-CH2CH2-O-CH2-, является более предпочтительным. Соединение, в котором nQ представляет собой целое число, равное 2 или 5, является еще более предпочтительным.When Q is (maleimide-N-yl)-, a compound in which n Q is an integer from 2 to 5, L 2a is a single chemical bond, and -NH-(CH 2 )n 1 -L a - L b - is -NH-CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2- , -NH-CH 2 -O-CH 2 - or -NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 - is preferred as an intermediate. The compound in which -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b - is -NH-CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 -O- CH 2 - or -NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 - is more preferred. A compound in which n Q is an integer equal to 2 or 5 is even more preferred.
Кроме того, когда Q представляет собой (малеимид-N-ил)-, соединение, в котором nQ представляет собой целое число от 2 до 5, L2a представляет собой -NH-(CH2-CH2-O)n5-CH2-CH2-C(=O)-, n5 представляет собой целое число от 2 до 4, и -NH-(CH2)n1-La-Lb- представляет собой -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- или -NH-CH2CH2-O-CH2-, является предпочтительным в качестве промежуточного продукта. Соединение, в котором n5 представляет собой целое число, равное 2 или 4, является более предпочтительным. Соединение, в котором -NH-(CH2)n1-La-Lb- представляет собой -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- или -NH-CH2CH2-O-CH2-, является еще более предпочтительным.In addition, when Q is (maleimide-N-yl)-, a compound in which n Q is an integer from 2 to 5, L 2a is -NH-(CH 2 -CH 2 -O)n 5 - CH 2 -CH 2 -C(=O)-, n 5 is an integer from 2 to 4, and -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b - is -NH-CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 -O-CH 2 - or -NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 - is preferred as an intermediate. A compound in which n 5 is an integer equal to 2 or 4 is more preferred. The compound in which -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b - is -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 -O-CH 2 - or -NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 - is even more preferred.
Когда Q представляет собой HS-, соединение, в котором nQ представляет собой целое число от 2 до 5, L2a представляет собой одинарную химическую связь, и -NH-(CH2)n1-La-Lb- представляет собой -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- или -NH-CH2CH2-O-CH2-, является предпочтительным в качестве промежуточного продукта. Соединение, в котором -NH-(CH2)n1-La-Lb- представляет собой -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- или -NH-CH2CH2-O-CH2-, является более предпочтительным.When Q is HS-, a compound in which n Q is an integer from 2 to 5, L 2a is a single chemical bond, and -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b - is - NH-CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH- CH 2 -O-CH 2 - or -NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 - is preferred as an intermediate. The compound in which -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b - is -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 -O-CH 2 - or -NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 - is more preferred.
Когда Q представляет собой X-CH2-C(=O)-NH-, соединение, в котором X представляет собой атом брома, является предпочтительным в качестве промежуточного продукта. Соединение, в котором nQ представляет собой целое число от 2 до 8, является предпочтительным, кроме того, соединение, в котором L2a представляет собой одинарную химическую связь, является предпочтительным, и соединение, в котором -NH-(CH2)n1-La-Lb- представляет собой -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- или -NH-CH2CH2-O-CH2-, является предпочтительным в качестве промежуточного продукта.When Q is X-CH 2 -C(=O)-NH-, a compound in which X is a bromine atom is preferred as an intermediate. A compound in which n Q is an integer from 2 to 8 is preferred, in addition, a compound in which L 2a is a single chemical bond is preferred, and a compound in which -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b - is -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 -O-CH 2 - or -NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 - is preferred as intermediate product.
Когда Q представляет собой (пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-, соединение, в котором nQ представляет собой целое число от 2 до 5, L2a представляет собой одинарную химическую связь, и -NH-(CH2)n1-La-Lb- представляет собой -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- или -NH-CH2CH2-O-CH2-, является предпочтительным в качестве промежуточного продукта. Соединение, в котором -NH-(CH2)n1-La-Lb- представляет собой -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2- или -NH-CH2CH2-O-CH2-, является более предпочтительным.When Q is (pyrrolidin-2,5-dion-N-yl)-OC(=O)-, a compound in which n Q is an integer from 2 to 5, L 2a is a single chemical bond, and - NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b - is -NH-CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 -O-CH 2 - or -NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 - is preferred as an intermediate. The compound in which -NH-(CH 2 )n 1 -L a -L b - is -NH-CH 2 CH 2 CH 2 -, -NH-CH 2 -O-CH 2 - or -NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 - is more preferred.
Более конкретно, следующие соединения являются предпочтительными в качестве промежуточного продукта:More specifically, the following compounds are preferred as an intermediate:
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX ),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -O-CH 2 -C (= O) - (NH-DX) ,
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl) -CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(малеимид-N-ил)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),(maleimid-N-yl)-CH 2 CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 O-CH 2 CH 2 - C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-(NH-DX),
HS-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),HS-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
Br-CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),Br-CH 2 -C (= O) -NH-CH 2 CH 2 -C (= O) -GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 -C (= O) - (NH-DX),
(пирролидин-2,5-дион-N-ил)-O-C(=O)-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).(pyrrolidin-2,5-dione-N-yl)-OC(=O)-CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -C(=O)-GGFG-NH-CH 2 CH 2 CH 2 - C(=O)-(NH-DX).
При этом конъюгат антитело-лекарственное средство настоящего изобретения, когда его оставляют на воздухе или перекристаллизовывают, может абсорбировать влагу и содержать абсорбционную воду или превращаться в гидрат, и такое соединение и его соль, содержащие воду, также входят в объем настоящего изобретения.Meanwhile, the antibody-drug conjugate of the present invention, when left in the air or recrystallized, can absorb moisture and contain absorption water or become a hydrate, and such a compound and its water-containing salt are also within the scope of the present invention.
Изобретение, меченое различными радиоактивными и нерадиоактивными изотопами, также входит в объем настоящего изобретения. Один или более атомов, образующих конъюгат антитело-лекарственное средство настоящего изобретения, могут содержать изотоп атома при соотношении, которое является несвойственным при его нахождении в природе. Примеры изотопа атома включают дейтерий (2H), тритий (3H), йод-125 (125I) и углерод-14 (14C). Кроме того, соединение настоящего изобретения может быть радиоактивномеченым с помощью радиоактивного изотопа, такого как тритий (3H), йод-125 (125I), углерод-14 (14C), медь-64 (64Cu), цирконий-89 (89Zr), йод-124 (124I), фтор-18 (18F), индий-111 (111I), углерод-11 (11C) и йод-131 (131I). Соединение, меченое радиоактивным изотопом, применяют в качестве терапевтического или профилактического средства, реагента для исследований, такого как реагент для анализа и реагент для диагностики, такой как in vivo диагностический визуализирующий реагент. Любой тип, даже не связанного с радиоактивностью, изотопного варианта конъюгата антитело-лекарственное средство настоящего изобретения входит в объем настоящего изобретения.The invention labeled with various radioactive and non-radioactive isotopes is also within the scope of the present invention. One or more of the atoms forming the antibody-drug conjugate of the present invention may contain an isotope of the atom in a ratio that is unusual when found in nature. Examples of an isotope of an atom include deuterium ( 2 H), tritium ( 3 H), iodine-125 ( 125 I), and carbon-14 ( 14 C). In addition, the compound of the present invention can be radioactively labeled with a radioactive isotope such as tritium ( 3 H), iodine-125 ( 125 I), carbon-14 ( 14 C), copper-64 ( 64 Cu), zirconium-89 ( 89 Zr), iodine-124 ( 124 I), fluorine-18 ( 18 F), indium-111 ( 111 I), carbon-11 ( 11 C) and iodine-131 ( 131 I). The radioactively labeled compound is used as a therapeutic or prophylactic agent, a research reagent such as an assay reagent, and a diagnostic reagent such as an in vivo diagnostic imaging reagent. Any type, even if not associated with radioactivity, isotopic variant of the antibody-drug conjugate of the present invention is within the scope of the present invention.
Лекарственные средстваMedicines
Конъюгат антитело-лекарственное средство настоящего изобретения проявляет цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток, и, поэтому, он может быть использован в качестве лекарственного средства, в частности, в качестве противоракового терапевтического средства и/или профилактического средства.The antibody-drug conjugate of the present invention exhibits a cytotoxic effect on tumor cells, and therefore, it can be used as a drug, in particular as an anti-cancer therapeutic agent and/or a prophylactic agent.
Примеры типов рака, при которых применяется конъюгат антитело-лекарственное средство настоящего изобретения, включают рак легких, рак почки, рак уротелия, колоректальный рак, рак предстательной железы, мультиформную глиобластому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, меланому, рак печени, рак мочевого пузыря, рак желудка или рак пищевода, однако, эти примеры типов рака не являются ограничениями, при условии, что в опухолевых клетках, являющихся объектом лечения, существуют опухолевые клетки, экспрессирующие белок, который антитело в конъюгате антитело-лекарственное средство может распознать.Examples of cancer types for which the antibody-drug conjugate of the present invention is used include lung cancer, kidney cancer, urothelial cancer, colorectal cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer, pancreatic cancer, breast cancer, melanoma, liver cancer. , bladder cancer, stomach cancer, or esophageal cancer, however, these examples of cancer types are not limited, provided that there are tumor cells in the tumor cells being treated that express a protein that the antibody in the antibody-drug conjugate can recognize .
Предпочтительно, чтобы конъюгат антитело-лекарственное средство настоящего изобретения можно было вводить млекопитающему, но более предпочтительно, чтобы его можно было вводить человеку.Preferably, the antibody-drug conjugate of the present invention can be administered to a mammal, but more preferably, it can be administered to a human.
Вещества, применяемые в фармацевтической композиции, содержащей конъюгат антитело-лекарственное средство настоящего изобретения, могут быть соответствующим образом выбраны из фармацевтических вспомогательных веществ или из других подобных веществ, которые обычно используют в фармацевтике, с учетом дозы или концентрации при введении.Substances used in the pharmaceutical composition containing the antibody-drug conjugate of the present invention may be appropriately selected from pharmaceutical excipients or from other similar substances that are commonly used in pharmaceuticals, taking into account the dose or concentration upon administration.
Конъюгат антитело-лекарственное средство настоящего изобретения может быть введен в виде фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, один фармацевтически подходящий ингредиент. The antibody-drug conjugate of the present invention may be administered as a pharmaceutical composition containing at least one pharmaceutically acceptable ingredient.
Например, упомянутая выше фармацевтическая композиция обычно содержит, по меньшей мере, один фармацевтический носитель (например, стерилизованную жидкость), например, воду и масло (минеральное масло и масло животного происхождения, растительного происхождения или синтетического происхождения (масло, например, может представлять собой арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, сезамовое масло или другое подобное масло)). Вода является наиболее часто используемым носителем, когда упомянутую выше фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Физиологический раствор, водный раствор декстрозы и водный раствор глицерина могут также быть использованы в качестве жидкого носителя, в частности, для инъецируемого раствора. В фармацевтике является хорошо известной подходящая фармацевтическая среда. Если требуется, то упомянутая выше композиция может также содержать незначительное количество увлажняющего средства, эмульгатора или буферирующего величину pH вещества. Примеры подходящего фармацевтического носителя приводятся в "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin. Лекарственные формы соответствуют способу введения.For example, the pharmaceutical composition mentioned above usually contains at least one pharmaceutical carrier (for example, a sterilized liquid), for example, water and oil (mineral oil and oil of animal, vegetable or synthetic origin (oil, for example, may be peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil or other similar oil)). Water is the most commonly used carrier when the above pharmaceutical composition is administered intravenously. Saline solution, aqueous dextrose solution and aqueous glycerol solution can also be used as a liquid carrier, in particular for an injectable solution. In the pharmaceutical industry, a suitable pharmaceutical medium is well known. If required, the composition mentioned above may also contain a minor amount of wetting agent, emulsifier or pH buffering agent. Examples of a suitable pharmaceutical carrier are provided in "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin. Dosage forms correspond to the route of administration.
Известны различные системы доставки лекарственных средств, и они могут быть использованы для введения конъюгата антитело-лекарственное средство настоящего изобретения. Примеры способов введения включают, но этим не ограничивая, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное введение. Введение может быть осуществлено, например, путем инъекции или болюсной инъекции. Согласно конкретному предпочтительному варианту осуществления, введение конъюгата антитело-лекарственное средство осуществляют путем инъекции. Парентеральное введение является предпочтительным способом введения.Various drug delivery systems are known and can be used to administer the antibody drug conjugate of the present invention. Examples of routes of administration include, but are not limited to, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, and subcutaneous administration. Administration may be by, for example, injection or bolus injection. According to a particular preferred embodiment, administration of the antibody-drug conjugate is by injection. Parenteral administration is the preferred route of administration.
Согласно типичному варианту осуществления, предлагается фармацевтическая композиция в качестве фармацевтической композиции, применяемой для внутривенного введения человеку с помощью традиционных способов. Обычно, композиция для внутривенного введения представляет собой раствор в стерильном и изотоническом водном буферном растворе. При необходимости, лекарственное средство может содержать солюбилизирующее вещество и местные анестетики для облегчения болевых ощущений в месте инъекции (например, лигнокаин). Обычно упомянутый выше ингредиент выпускается отдельно в виде либо лиофилизированного порошка, либо безводного концентрата, содержащегося в упаковке, которая представляет собой герметичную ампулу или пакетик, содержащие количество активного средства, или в виде смеси в виде единичной лекарственной формы. При введении лекарственного средства путем инъекции, оно может быть введено из специального инъекционного флакона, содержащего стерильную воду или стерильный физиологический раствор фармацевтической степени чистоты. При введении лекарственного средства путем инъекции, может прилагаться ампула со стерильной водой или стерильным физиологическим раствором для инъекции, для того чтобы смешивать упомянутые выше ингредиенты друг с другом перед введением.In an exemplary embodiment, the pharmaceutical composition is provided as a pharmaceutical composition for intravenous administration to a human using conventional methods. Typically, the composition for intravenous administration is a solution in a sterile and isotonic aqueous buffer solution. If necessary, the medicinal product may contain a solubilizing agent and local anesthetics to relieve pain at the injection site (for example, lignocaine). Usually, the ingredient mentioned above is presented separately as either a lyophilized powder or an anhydrous concentrate contained in a package, which is a sealed ampoule or sachet containing an amount of the active agent, or as a mixture in the form of a unit dosage form. When the drug is administered by injection, it can be administered from a special injection vial containing sterile pharmaceutical grade water or sterile saline. When administering the drug by injection, an ampoule of sterile water or sterile saline for injection may be provided in order to mix the above-mentioned ingredients with each other before administration.
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может представлять собой фармацевтическую композицию, содержащую только конъюгат антитело-лекарственное средство настоящего изобретения, или фармацевтическую композицию, содержащую конъюгат антитело-лекарственное средство и, по меньшей мере, одно противораковое средство помимо конъюгата. Конъюгат антитело-лекарственное средство настоящего изобретения может быть введен с другим противораковым средством. Соответственно, в результате этого, противораковое действие может быть усилено. Другое противораковое средство, используемое для этой цели, может быть введено индивидууму одновременно, раздельно или последовательно с конъюгатом антитело-лекарственное средство, и может быть введено с изменяющимся для каждого интервалом введения. Примеры противоракового средства включают, но этим не ограничивая, при условии, что это лекарственное средство обладает противоопухолевым действием, абраксан, карбоплатин, цисплатин, гемцитабин, иринотекан (CPT-11), паклитаксел, пеметрексед, сорафениб, винорелбин, лекарственные средства, описанные в международной публикации № WO 2003/038043, аналоги LH-RH (лейпрорелин, гозерелин или другие подобные средства), эстрамустина фосфат, антагонист эстрогена (тамоксифен, ралоксифен или другие подобные средства) и ингибитор ароматазы (анастрозол, летрозол, эксеместан и другие подобные средства).The pharmaceutical composition of the present invention may be a pharmaceutical composition containing only the antibody-drug conjugate of the present invention, or a pharmaceutical composition containing the antibody-drug conjugate and at least one anti-cancer agent in addition to the conjugate. The antibody-drug conjugate of the present invention may be administered with another anti-cancer agent. Accordingly, as a result, the anti-cancer effect can be enhanced. The other anti-cancer agent used for this purpose may be administered to the individual simultaneously, separately or sequentially with the antibody-drug conjugate, and may be administered at a varying administration interval for each. Examples of an anticancer agent include, but are not limited to, provided that the drug has an antitumor effect, abraxane, carboplatin, cisplatin, gemcitabine, irinotecan (CPT-11), paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vinorelbine, drugs described in the International Publication No. WO 2003/038043, LH-RH analogs (leuprorelin, goserelin, or the like), estramustine phosphate, an estrogen antagonist (tamoxifen, raloxifene, or the like), and an aromatase inhibitor (anastrozole, letrozole, exemestane, and the like).
Фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде лиофилизированной лекарственной формы или жидкой лекарственной формы в качестве формы, имеющей требуемый состав и требуемую чистоту. При приготовлении лиофилизированной лекарственной формы, она может представлять собой лекарственную форму, содержащую соответствующие вспомогательные вещества, которые используют в фармацевтике. То же самое и для жидкой лекарственной формы, она может быть приготовлена в виде жидкой лекарственной формы, содержащей различные вспомогательные вещества, которые используют в фармацевтике.The pharmaceutical composition may be formulated as a lyophilized dosage form or as a liquid dosage form having the desired composition and purity. When preparing a lyophilized dosage form, it can be a dosage form containing the appropriate excipients that are used in pharmaceuticals. The same is true for a liquid dosage form, it can be prepared in the form of a liquid dosage form containing various excipients that are used in pharmaceuticals.
Состав и концентрация фармацевтической композиции может изменяться в зависимости от способа введения. Однако, конъюгат антитело-лекарственное средство, который содержится в фармацевтической композиции настоящего изобретения, может оказывать фармацевтическое действие даже при небольшой дозе, если конъюгат антитело-лекарственное средство имеет более высокую аффинность к антигену, то есть, более высокую аффинность (= более низкое значение Kd), выражаемую через константу диссоциации (то есть, значение Kd), к антигену. Поэтому, для определения дозы конъюгата антитело-лекарственное средство, доза может быть определена с учетом аффинности конъюгата антитело-лекарственное средство к антигену. Например, при введении конъюгата антитело-лекарственное средство настоящего изобретения человеку, может быть введено однократно или введено несколько раз приблизительно от 0,001 до 100 мг/кг с интервалом при одноразовом введении, составляющем от 1 до 180 дней.The composition and concentration of the pharmaceutical composition may vary depending on the route of administration. However, the antibody-drug conjugate contained in the pharmaceutical composition of the present invention can produce a pharmaceutical effect even at a low dose if the antibody-drug conjugate has a higher affinity for the antigen, i.e., higher affinity (=lower Kd value ), expressed in terms of the dissociation constant (i.e., the Kd value), to the antigen. Therefore, in order to determine the dose of the antibody-drug conjugate, the dose may be determined based on the affinity of the antibody-drug conjugate for the antigen. For example, when administering the antibody-drug conjugate of the present invention to a human, it may be administered once or administered multiple times from about 0.001 to 100 mg/kg with a single administration interval of 1 to 180 days.
ПримерыExamples
Далее настоящее изобретение конкретно описывается с помощью приведенных ниже примеров. Однако эти примеры не ограничивают настоящее изобретение. Более того, их ни в коей мере не следует интерпретировать в качестве ограничения. Кроме того, если специально не указано иное, то реагенты, растворители и исходные материалы, описанные в изобретении, могут быть приобретены у фирм-поставщиков и фирм-производителей.Further, the present invention is specifically described using the following examples. However, these examples do not limit the present invention. Moreover, they should in no way be interpreted as limiting. In addition, unless specifically indicated otherwise, the reagents, solvents and starting materials described in the invention can be purchased from suppliers and manufacturers.
Справочный пример 1. M30-H1-L4 антителоReference Example 1 M30-H1-L4 antibody
Из гуманизированных антител для анти-B7-H3 антитела синтезировали известным способом антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях аминокислот 20-471 в SEQ ID NO: 9, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, описанную в положениях аминокислот 21-233 в SEQ ID NO: 16, с получением гуманизированного анти-B7-H3 антитела, обозначаемого как M30-H1-L4 антитело (или просто обозначаемого как "M30-H1-L4").From humanized antibodies for anti-B7-H3 antibodies, an antibody was synthesized in a known manner, consisting of a heavy chain comprising the amino acid sequence described in amino acid positions 20-471 in SEQ ID NO: 9, and a light chain comprising the amino acid sequence described in amino acid positions 21-233 in SEQ ID NO: 16 to give a humanized anti-B7-H3 antibody, referred to as an M30-H1-L4 antibody (or simply referred to as "M30-H1-L4").
Справочный пример 2. M30-H1-L4P антителоReference Example 2 M30-H1-L4P antibody
Регулировали модификацию гликана, связанного с M30-H1-L4 антителом, полученным выше, путем дефукозилирования с помощью известного способа с получением антитела с регулированной модификацией гликана, обозначаемого как M30-H1-L4P антитело (или просто обозначаемого как "M30-H1-L4P").The modification of the glycan associated with the M30-H1-L4 antibody obtained above was regulated by defucosylation using a known method to obtain an antibody with regulated modification of the glycan, referred to as the M30-H1-L4P antibody (or simply referred to as "M30-H1-L4P" ).
Справочный пример 3. Анти-CD30 антителоReference Example 3 Anti-CD30 antibody
Анти-CD30 антитело получали в соответствии с методикой, приведенной в национальной публикации международной заявки на патент № 2005-506035. Его последовательность приведена в SEQ ID NO: 27 и 28.Anti-CD30 antibody was obtained in accordance with the methodology described in the national publication of the international patent application No. 2005-506035. Its sequence is given in SEQ ID NOs: 27 and 28.
Справочный пример 4. Анти-CD33 антителоReference Example 4 Anti-CD33 antibody
Анти-CD33 антитело получали в соответствии с методикой, приведенной в выложенном патенте Японии № 8-48637. Его последовательность приведена в SEQ ID NO: 29 и 30.An anti-CD33 antibody was prepared according to the procedure described in Japanese Patent Laid-open No. 8-48637. Its sequence is given in SEQ ID NOs: 29 and 30.
Справочный пример 5. Анти-CD70 антителоReference Example 5 Anti-CD70 antibody
Анти-CD70 антитело получали в соответствии с методикой, приведенной в национальной публикации международной заявки на патент № 2008-538292. Его последовательность приведена в SEQ ID NO: 31 и 32.Anti-CD70 antibody was obtained in accordance with the methodology described in the national publication of the international patent application No. 2008-538292. Its sequence is given in SEQ ID NOs: 31 and 32.
Пример 1. 4-Амино-N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]-пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]бутанамид Example 1 4-Amino-N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahydro-1H,12H-benzo[de]-pyrano[3 ' ,4 ' :6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]butanamide
Синтез 1: Трет-бутил (4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо-[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)карбаматSynthesis 1: Tert-butyl (4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15 -hexahydro-1H,12H-benzo-[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl)carbamate
4-(Трет-бутоксикарбониламино)бутановую кислоту (0,237 г, 1,13 ммоль) растворяли в дихлорметане (10 мл), добавляли N-гидроксисукцинимид (0,130 г, 1,13 ммоль) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (0,216 г, 1,13 ммоль) и перемешивали в течение 1 часа. Реакционный раствор добавляли по каплям к раствору мезилата соединения (4) (0,500 г, 0,94 ммоль) и триэтиламина (0,157 мл, 1,13 ммоль) в N,N-диметилформамиде (10 мл) и перемешивали в течение 1 дня при комнатной температуре. Растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-хлороформ:метанол=8:2 (по объему)] с получением названного соединения (0,595 г, количественно).4-(T-butoxycarbonylamino)butanoic acid (0.237 g, 1.13 mmol) was dissolved in dichloromethane (10 ml), N-hydroxysuccinimide (0.130 g, 1.13 mmol) and 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) were added )carbodiimide hydrochloride (0.216 g, 1.13 mmol) and stirred for 1 hour. The reaction solution was added dropwise to a solution of compound (4) mesylate (0.500 g, 0.94 mmol) and triethylamine (0.157 ml, 1.13 mmol) in N,N-dimethylformamide (10 ml) and stirred for 1 day at room temperature. temperature. The solvent was removed under reduced pressure, and the resulting residue was purified by silica gel column chromatography [chloroform-chloroform:methanol=8:2 (v/v)] to obtain the title compound (0.595 g, quantitatively).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,2 Гц), 1,31 (9H, с), 1,58 (1H, т, J=7,2 Гц), 1,66 (2H, т, J=7,2 Гц), 1,82-1,89 (2H, м), 2,12-2,21 (3H, м), 2,39 (3H, с), 2,92 (2H, т, J=6,5 Гц), 3,17 (2H, с), 5,16 (1H, d, J=18,8 Гц), 5,24 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,42 (2H, с), 5,59-5,55 (1H, м), 6,53 (1H, с), 6,78 (1H, т, J=6,3 Гц), 7,30 (1H, с), 7,79 (1H, д, J=11,0 Гц), 8,40 (1H, д, J=8,6 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.31 (9H, s), 1.58 (1H, t, J= 7.2 Hz), 1.66 (2H, t, J=7.2 Hz), 1.82-1.89 (2H, m), 2.12-2.21 (3H, m), 2, 39 (3H, s), 2.92 (2H, t, J=6.5 Hz), 3.17 (2H, s), 5.16 (1H, d, J=18.8 Hz), 5, 24 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.59-5.55 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.78 (1H , t, J=6.3 Hz), 7.30 (1H, s), 7.79 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.40 (1H, d, J=8.6 Hz ).
MS (APCI) m/z: 621 (M+H)+.MS (APCI) m/z: 621 (M+H) + .
Синтез 2: 4-Амино-N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]-пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]бутанамидSynthesis 2: 4-Amino-N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahydro-1H,12H-benzo[de]-pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]butanamide
Соединение (0,388 г, 0,61 ммоль), полученное в синтезе 1, растворяли в дихлорметане (9 мл). Добавляли трифторуксусную кислоту (9 мл) и перемешивали в течение 4 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-отделенный слой хлороформа:метанол:вода=7:3:1 (по объему)] с получением трифторацетата названного соединения (0,343 г, количественно). Присутствие этого соединения было подтверждено в опухоли мыши с инкорпорированным раком, которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (13) или (14).The compound (0.388 g, 0.61 mmol) obtained in
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,2 Гц), 1,79-1,92 (4H, м), 2,10-2,17 (2H, м), 2,27 (2H, т, J=7,0 Гц), 2,40 (3H, с), 2,80-2,86 (2H, м), 3,15-3,20 (2H, м), 5,15 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,26 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,42 (2H, с), 5,54-5,61 (1H, м), 6,55 (1H, с), 7,32 (1H, с), 7,72 (3H, шир.с), 7,82 (1H, д, J=11,0 Гц), 8,54 (1H, д, J=8,6 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.79-1.92 (4H, m), 2.10-2, 17(2H, m), 2.27(2H, t, J=7.0 Hz), 2.40(3H, s), 2.80-2.86(2H, m), 3.15-3 .20 (2H, m), 5.15 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5 .54-5.61(1H, m), 6.55(1H, s), 7.32(1H, s), 7.72(3H, br s), 7.82(1H, d, J =11.0 Hz), 8.54 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (APCI) m/z: 521 (M+H)+.MS (APCI) m/z: 521 (M+H) + .
Пример 2. Конъюгат антитело-лекарственное средство (1)Example 2 Antibody Drug Conjugate (1)
Синтез 1: N-(трет-бутоксикарбонил)глицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано-[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)-глицинамидSynthesis 1: N-(tert-butoxycarbonyl)glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo -2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano-[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl] amino}-4-oxobutyl)-glycinamide
N-(Трет-бутоксикарбонил)глицилглицил-L-фенилаланилглицин (0,081 г, 0,19 ммоль) растворяли в дихлорметане (3 мл), добавляли N-гидроксисукцинимид (0,021 г, 0,19 ммоль) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (0,036 г, 0,19 ммоль) и затем перемешивали в течение 3,5 часов. Реакционный раствор добавляли по каплям к раствору соединения примера 1 (0,080 г, 0,15 ммоль) в N,N-диметилформамиде (1,5 мл) и перемешивали в течение 4 часов при комнатной температуре. Растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-хлороформ:метанол=8:2 (по объему)] с получением названного соединения (0,106 г, 73%).N-(T-butoxycarbonyl)glycylglycyl-L-phenylalanylglycine (0.081 g, 0.19 mmol) was dissolved in dichloromethane (3 ml), N-hydroxysuccinimide (0.021 g, 0.19 mmol) and 1-ethyl-3-( 3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (0.036 g, 0.19 mmol) and then stirred for 3.5 hours. The reaction solution was added dropwise to a solution of the compound of Example 1 (0.080 g, 0.15 mmol) in N,N-dimethylformamide (1.5 ml) and stirred for 4 hours at room temperature. The solvent was removed under reduced pressure, and the resulting residue was purified by silica gel column chromatography [chloroform-chloroform:methanol=8:2 (v/v)] to obtain the title compound (0.106 g, 73%).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,36 (9H, с), 1,71 (2H, м), 1,86 (2H, т, J=7,8 Гц), 2,15-2,19 (4H, м), 2,40 (3H, с), 2,77 (1H, дд, J=12,7, 8,8 Гц), 3,02 (1H, дд, J=14,1, 4,7 Гц), 3,08-3,11 (2H, м), 3,16-3,19 (2H, м), 3,54 (2H, д, J=5,9 Гц), 3,57-3,77 (4H, м), 4,46-4,48 (1H, м), 5,16 (1H, д, J=19,2 Гц), 5,25 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,42 (2H, с), 5,55-5,60 (1H, м), 6,53 (1H, с), 7,00 (1H, т, J=6,3 Гц), 7,17-7,26 (5H, м), 7,31 (1H, с), 7,71 (1H, т, J=5,7 Гц), 7,80 (1H, д, J=11,0 Гц), 7,92 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,15 (1H, д, J=8,2 Гц), 8,27 (1H, т, J=5,5 Гц), 8,46 (1H, д, J=8,2 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.36 (9H, s), 1.71 (2H, m), 1 .86 (2H, t, J=7.8 Hz), 2.15-2.19 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.77 (1H, dd, J=12.7 , 8.8 Hz), 3.02 (1H, dd, J=14.1, 4.7 Hz), 3.08-3.11 (2H, m), 3.16-3.19 (2H, m), 3.54 (2H, d, J=5.9 Hz), 3.57-3.77 (4H, m), 4.46-4.48 (1H, m), 5.16 (1H , d, J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, s), 5.55-5.60 (1H, m), 6 .53 (1H, s), 7.00 (1H, t, J=6.3 Hz), 7.17-7.26 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.71 ( 1H, t, J=5.7 Hz), 7.80(1H, d, J=11.0 Hz), 7.92(1H, t, J=5.7 Hz), 8.15(1H, d, J=8.2 Hz), 8.27 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.46 (1H, d, J=8.2 Hz).
MS (APCI) m/z: 939 (M+H)+.MS (APCI) m/z: 939 (M+H) + .
Синтез 2: Глицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]-хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамид трифторацетатSynthesis 2: Glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9, 10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]-quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl) glycinamide trifluoroacetate
Соединение (1,97 г, 2,10 ммоль), полученное в синтезе 1, растворяли в дихлорметане (7 мл). После добавления трифторуксусной кислоты (7 мл), перемешивали в течение 1 часа. Растворитель удаляли при пониженном давлении, и добавляли толуол для проведения азеотропной дистилляции. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-отделенный органический слой хлороформа:метанол:вода=7:3:1 (по объему)] с получением названного соединения (1,97 г, 99%).The compound (1.97 g, 2.10 mmol) obtained in
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,71-1,73 (2H, м), 1,82-1,90 (2H, м), 2,12-2,20 (4H, м), 2,40 (3H, с), 2,75 (1H, дд, J=13,7, 9,4 Гц), 3,03-3,09 (3H, м), 3,18-3,19 (2H, м), 3,58-3,60 (2H, м), 3,64 (1H, д, J=5,9 Гц), 3,69 (1H, д, J=5,9 Гц), 3,72 (1H, д, J=5,5 Гц), 3,87 (1H, дд, J=16,8, 5,9 Гц), 4,50-4,56 (1H, м), 5,16 (1H, д, J=19,2 Гц), 5,25 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,42 (2H, с), 5,55-5,60 (1H, м), 7,17-7,27 (5H, м), 7,32 (1H, с), 7,78-7,81 (2H, м), 7,95-7,97 (3H, м), 8,33-8,35 (2H, м), 8,48-8,51 (2H, м). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.71-1.73 (2H, m), 1.82-1.90 (2H, m), 2.12-2.20 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.75 (1H, dd, J=13.7, 9.4 Hz), 3, 03-3.09(3H, m), 3.18-3.19(2H, m), 3.58-3.60(2H, m), 3.64(1H, d, J=5.9 Hz), 3.69 (1H, d, J=5.9 Hz), 3.72 (1H, d, J=5.5 Hz), 3.87 (1H, dd, J=16.8, 5 .9 Hz), 4.50-4.56 (1H, m), 5.16 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42(2H, s), 5.55-5.60(1H, m), 7.17-7.27(5H, m), 7.32(1H, s), 7.78-7, 81(2H, m), 7.95-7.97(3H, m), 8.33-8.35(2H, m), 8.48-8.51(2H, m).
MS (APCI) m/z: 839 (M+H)+.MS (APCI) m/z: 839 (M+H) + .
Синтез 3: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]глицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]-хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамидSynthesis 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)- 9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4 ':6,7]indolizino[1,2-b]-quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl)glycinamide
К раствору соединения (337 мг, 0,353 ммоль), полученного в синтезе 2, в N,N-диметилформамиде (1,2 мл) добавляли триэтиламин (44,3 мл, 0,318 ммоль) и N-сукцинимидил 6-малеимидкапроновую кислоту (119,7 мг, 0,388 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-хлороформ:метанол=5:1 (по объему)] с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (278,0 мг, 76%).Triethylamine (44.3 ml, 0.318 mmol) and N-succinimidyl 6-maleimid-caproic acid (119, 7 mg, 0.388 mmol) and stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was removed under reduced pressure, and the resulting residue was purified by silica gel column chromatography [chloroform-chloroform:methanol=5:1 (v/v)] to give the title compound as a pale yellow solid (278.0 mg, 76%).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,3 Гц), 1,12-1,22 (2H, м), 1,40-1,51 (4H, м), 1,66-1,76 (2H, м), 1,80-1,91 (2H, м), 2,05-2,21 (6H, м), 2,39 (3H, с), 2,79 (1H, дд, J=14,0, 9,8 Гц), 2,98-3,21 (5H, м), 3,55-3,77 (8H, м), 4,41-4,48 (1H, м), 5,15 (1H, д, J=18,9 Гц), 5,24 (1H, д, J=18,9 Гц), 5,40 (1H, д, J=17,1 Гц), 5,44 (1H, д, J=17,1 Гц), 5,54-5,60 (1H, м), 6,53 (1H, с), 6,99 (2H, с), 7,20-7,27 (5H, м), 7,30 (1H, с), 7,70 (1H, т, J=5,5 Гц), 7,80 (1H, д, J=11,0 Гц), 8,03 (1H, т, J=5,8 Гц), 8,08 (1H, т, J=5,5 Гц), 8,14 (1H, д, J=7,9 Гц), 8,25 (1H, т, J=6,1 Гц), 8,46 (1H, д, J=8,5 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.12-1.22 (2H, m), 1.40-1, 51 (4H, m), 1.66-1.76 (2H, m), 1.80-1.91 (2H, m), 2.05-2.21 (6H, m), 2.39 ( 3H, s), 2.79 (1H, dd, J=14.0, 9.8 Hz), 2.98-3.21 (5H, m), 3.55-3.77 (8H, m) , 4.41-4.48 (1H, m), 5.15 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.24 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.40 ( 1H, d, J=17.1 Hz), 5.44 (1H, d, J=17.1 Hz), 5.54-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.20-7.27 (5H, m), 7.30 (1H, s), 7.70 (1H, t, J=5.5 Hz), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.8 Hz), 8.08 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.14 (1H , d, J=7.9 Hz), 8.25 (1H, t, J=6.1 Hz), 8.46 (1H, d, J=8.5 Hz).
MS (APCI) m/z: 1032 (M+H)+.MS (APCI) m/z: 1032 (M+H) + .
Синтез 4: Конъюгат антитело-лекарственное средство (1)Synthesis 4: Antibody Drug Conjugate (1)
Восстановление антитела: приготавливали M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6.0/EDTA, используя общий способ C-1 и общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1), описанные в способе получения 1. Раствор (1,25 мл) помещали в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,025 мл; 3,0 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0625 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации в течение 1 часа при 37°C.Recovery of antibody: M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL by changing the medium to PBS6.0/EDTA using General Method C-1 and General Method B (as absorbance at 280 nm, the value of 1.61 mlmg -1 cm -1 ) described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксида (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,109 мл) и диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 3 (0,039 мл; 4,6 эквивалентов на молекулу антитела), к описанному выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) при комнатной температуре в течение 40 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем, добавляли водный раствор (0,008 мл), содержащий 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC), и перемешивали при комнатной температуре в течение еще 20 минут для прерывания реакции с фрагментом лекарственное средство-линкер.Conjugation of antibody to drug-linker moiety: after addition of dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.109 ml) and dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 3 (0.039 ml; 4.6 equivalents per antibody molecule), to the above solution at room temperature, stirring was carried out using a rotary tube shaker (MTR-103, AS ONE Corporation) at room temperature for 40 minutes in order to conjugate the drug-linker fragment with the antibody. Then, an aqueous solution (0.008 ml) containing 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was added and stirred at room temperature for another 20 minutes to terminate the reaction with the drug-linker moiety.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство. После чего раствор концентрировали с помощью общего способа A.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 13,02 мг/мл, выход антитела: 9,1 мг (73%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,4.Antibody concentration: 13.02 mg/mL, antibody yield: 9.1 mg (73%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.4.
Пример 3. Конъюгат антитело-лекарственное средство (2)Example 3 Antibody Drug Conjugate (2)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (2)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (2)
Восстановление антитела: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (4,0 мл) собирали в пробирку объемом 15 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,118 мл; 4,6 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,200 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of antibody: M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using General Method B (Absorbance at 280 nm was 1.61 mlmg -1 cm -1 ) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после инкубации раствора в течение 10 минут при 22°C, к нему добавляли диметилсульфоксидный раствор (0,236 мл; 9,2 эквивалентов на молекулу антитела), содержащий 10 мМ соединения, полученного в синтезе 3 примера 2, и инкубировали при 22°C в течение 40 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,00471 мл), содержащий 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC), и инкубировали при 22°C в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of the antibody to the drug-linker fragment: after the solution was incubated for 10 minutes at 22°C, a dimethyl sulfoxide solution (0.236 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in synthesis 3 of example 2 was added to it , and incubated at 22° C. for 40 minutes to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.00471 ml) containing 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at 22° C. for another 20 minutes to interrupt the drug-linker fragment reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 17,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,80 мг/мл, выход антитела: 26,1 мг (65%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 5,9.Antibody concentration: 1.80 mg/mL, antibody yield: 26.1 mg (65%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.9.
Пример 4. Конъюгат антитело-лекарственное средство (3)Example 4 Antibody Drug Conjugate (3)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (3)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (3)
Восстановление антитела: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6.0/EDTA, используя общий способ C-1 и общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1), описанные в способе получения 1. Раствор (1,25 мл) помещали в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,051 мл; 6,0 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0625 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of antibody: M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml by changing the medium to PBS6.0/EDTA using General Method C-1 and General Method B (as absorbance at 280 nm, the value of 1.61 mlmg -1 cm -1 ) described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксида (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,067 мл) и диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 3 примера 2 (0,085 мл; 10,0 эквивалентов на молекулу антитела) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) при комнатной температуре в течение 60 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,013 мл), содержащий 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC), и перемешивали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of antibody to drug-linker moiety: after addition of dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.067 ml) and dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 3 of Example 2 (0.085 ml; 10.0 equivalents per antibody molecule ) to the above solution at room temperature, mixing was carried out using a rotary tube shaker (MTR-103, AS ONE Corporation) at room temperature for 60 minutes in order to conjugate the drug-linker fragment with the antibody. An aqueous solution (0.013 ml) containing 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and stirred at room temperature for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker moiety reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,67 мг/мл, выход антитела: 10,02 мг (80%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 6,3.Antibody concentration: 1.67 mg/ml, antibody yield: 10.02 mg (80%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.3.
Пример 5. Конъюгат антитело-лекарственное средство (4)Example 5 Antibody Drug Conjugate (4)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (4)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (4)
Восстановление антитела: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6.0/EDTA, используя общий способ C-1 и общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1), описанный в способе получения 1. Раствор (1,25 мл) помещали в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,051 мл; 6,0 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0625 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of antibody: M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml by changing the medium to PBS6.0/EDTA using General Method C-1 and General Method B (as absorbance at 280 nm, the value of 1.61 mlmg -1 cm -1 ) described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксида (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,025 мл) и диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 3 примера 2 (0,127 мл; 15,0 эквивалентов на молекулу антитела) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) при комнатной температуре в течение 60 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,019 мл), содержащий 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC), и перемешивали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of antibody to drug-linker moiety: after addition of dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.025 ml) and dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 3 of Example 2 (0.127 ml; 15.0 equivalents per antibody molecule ) to the above solution at room temperature, mixing was carried out using a rotary tube shaker (MTR-103, AS ONE Corporation) at room temperature for 60 minutes in order to conjugate the drug-linker fragment with the antibody. An aqueous solution (0.019 ml) containing 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and stirred at room temperature for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker moiety reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство. После чего, раствор концентрировали с помощью общего способа A.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,19 мг/мл, выход антитела: 7,14 мг (57%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 7,5.Antibody concentration: 1.19 mg/ml, antibody yield: 7.14 mg (57%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 7.5.
Пример 6. Конъюгат антитело-лекарственное средство (5)Example 6 Antibody Drug Conjugate (5)
Смешивали почти все количества конъюгатов антитело-лекарственное средство, полученные в примерах 4 и 5. Раствор концентрировали с помощью общего способа A с получением названного конъюгата антитело-лекарственное средство.Nearly all of the antibody-drug conjugates prepared in Examples 4 and 5 were mixed. The solution was concentrated using General Method A to give the title antibody-drug conjugate.
Концентрация антитела: 10,0 мг/мл, выход антитела: 15,37 мг, и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 6,7.Antibody concentration: 10.0 mg/ml, antibody yield: 15.37 mg, and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.7.
Пример 7. Конъюгат антитело-лекарственное средство (6)Example 7 Antibody Drug Conjugate (6)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (6)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (6)
Восстановление антитела: анти-CD30 антитело, полученное в справочном примере 3, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,75 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (1,0 мл) собирали в пробирку объемом 2 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0297 мл; 4,6 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,050 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of the antibody: The anti-CD30 antibody obtained in Reference Example 3 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.75 mlmg -1 was used as the absorbance at 280 nm cm -1 ) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после инкубации раствора при 22°C в течение 10 минут, к нему добавляли диметилсульфоксидный раствор (0,0593 мл; 9,2 эквивалентов на молекулу антитела), содержащий 10 мМ соединения, полученного в синтезе 3 примера 2, и инкубировали при 22°C в течение 40 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0119 мл; 18,4 эквивалентов на молекулу антитела), содержащий 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC), и инкубировали при 22°C в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of an antibody to a drug-linker fragment: after the solution was incubated at 22°C for 10 minutes, a dimethyl sulfoxide solution (0.0593 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 3 was added to it. Example 2 and incubated at 22° C. for 40 minutes to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.0119 ml; 18.4 equivalents per antibody molecule) containing 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at 22° C. for an additional 20 minutes to interrupt the reaction of the drug moiety. linker agent.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=270400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physical and chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =270400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 0,99 мг/мл, выход антитела: 5,94 мг (59%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,3.Antibody concentration: 0.99 mg/ml, antibody yield: 5.94 mg (59%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.3.
Пример 8. Конъюгат антитело-лекарственное средство (7)Example 8 Antibody Drug Conjugate (7)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (7)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (7)
Восстановление антитела: анти-CD30 антитело, полученное в справочном примере 3, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,75) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (1,0 мл) собирали в пробирку объемом 2 мл и добавляли к нему водный раствор 30 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0148 мл; 6,9 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,050 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody recovery: The anti-CD30 antibody obtained in Reference Example 3 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using the general method B (1.75 was used as the absorbance at 280 nm) and the total Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после инкубации раствора в течение 10 минут при 22°C, к нему добавляли диметилсульфоксидный раствор (0,0297 мл; 13,8 эквивалентов на молекулу антитела), содержащий 30 мМ соединения, полученного в синтезе 3 примера 2, и инкубировали в течение 40 минут при 22°C с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0178 мл; 27,6 эквивалентов на молекулу антитела) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при 22°C в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of the antibody to the drug-linker fragment: after the solution was incubated for 10 minutes at 22°C, a dimethyl sulfoxide solution (0.0297 ml; 13.8 equivalents per antibody molecule) containing 30 mM of the compound obtained in synthesis 3 was added to it. Example 2 and incubated for 40 minutes at 22°C to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.0178 ml; 27.6 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at 22° C. for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker fragment reaction. .
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=270400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physical and chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =270400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 0,99 мг/мл, выход антитела: 5,94 мг (59%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,8.Antibody concentration: 0.99 mg/mL, antibody yield: 5.94 mg (59%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.8.
Пример 9. Конъюгат антитело-лекарственное средство (8)Example 9 Antibody Drug Conjugate (8)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (8)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (8)
Восстановление антитела: анти-CD33 антитело, полученное в справочном примере 4, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,66) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (1,0 мл) собирали в пробирку объемом 2 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0297 мл; 4,6 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,050 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody recovery: The anti-CD33 antibody obtained in Reference Example 4 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using the general method B (1.66 was used as the absorbance at 280 nm) and the total method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после инкубации раствора в течение 10 минут при 22°C, к нему добавляли диметилсульфоксидный раствор (0,0593 мл; 9,2 эквивалентов на молекулу антитела), содержащий 10 мМ соединения, полученного в синтезе 3 примера 2, и инкубировали при 22°C в течение 40 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0119 мл; 18,4 эквивалентов на молекулу антитела) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при 22°C в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of the antibody to the drug-linker fragment: after the solution was incubated for 10 minutes at 22°C, a dimethyl sulfoxide solution (0.0593 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 3 was added to it. Example 2 and incubated at 22° C. for 40 minutes to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.0119 ml; 18.4 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at 22° C. for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker fragment reaction. .
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=256400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =256400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,06 мг/мл, выход антитела: 6,36 мг (64%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,4.Antibody concentration: 1.06 mg/mL, antibody yield: 6.36 mg (64%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.4.
Пример 10. Конъюгат антитело-лекарственное средство (9)Example 10 Antibody Drug Conjugate (9)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (9)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (9)
Восстановление антитела: анти-CD33 антитело, полученное в справочном примере 4, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,66) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (1,0 мл) собирали в пробирку объемом 2 мл и добавляли к нему водный раствор 30 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0148 мл; 6,9 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,050 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody recovery: The anti-CD33 antibody obtained in Reference Example 4 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using the general method B (1.66 was used as the absorbance at 280 nm) and the total Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после инкубации раствора в течение 10 минут при 22°C, к нему добавляли диметилсульфоксидный раствор (0,0297 мл; 13,8 эквивалентов на молекулу антитела), содержащий 30 мМ соединения, полученного в синтезе 3 примера 2, и инкубировали при 22°C в течение 40 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0178 мл; 27,6 эквивалентов на молекулу антитела) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при 22°C в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of the antibody to the drug-linker fragment: after the solution was incubated for 10 minutes at 22°C, a dimethyl sulfoxide solution (0.0297 ml; 13.8 equivalents per antibody molecule) containing 30 mM of the compound obtained in synthesis 3 was added to it. Example 2 and incubated at 22° C. for 40 minutes to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.0178 ml; 27.6 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at 22° C. for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker fragment reaction. .
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=256400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =256400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 0,95 мг/мл, выход антитела: 5,70 мг (57%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,7.Antibody concentration: 0.95 mg/ml, antibody yield: 5.70 mg (57%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.7.
Пример 11. Конъюгат антитело-лекарственное средство (10)Example 11 Antibody Drug Conjugate (10)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (10)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (10)
Восстановление антитела: анти-CD70 антитело, полученное в справочном примере 5, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,69) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (1,0 мл) собирали в пробирку объемом 2 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0297 мл; 4,6 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,050 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody recovery: The anti-CD70 antibody prepared in Reference Example 5 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using the general method B (1.69 was used as the absorbance at 280 nm) and the total method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после инкубации раствора при 22°C в течение 10 минут, к нему добавляли диметилсульфоксидный раствор (0,0593 мл; 9,2 эквивалентов на молекулу антитела), содержащий 10 мМ соединения, полученного в синтезе 3 примера 2, и инкубировали при 22°C в течение 40 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0119 мл; 18,4 эквивалентов на молекулу антитела) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при 22°C в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of an antibody to a drug-linker fragment: after the solution was incubated at 22°C for 10 minutes, a dimethyl sulfoxide solution (0.0593 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 3 was added to it. Example 2 and incubated at 22° C. for 40 minutes to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.0119 ml; 18.4 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at 22° C. for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker fragment reaction. .
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=262400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =262400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,00 мг/мл, выход антитела: 6,00 мг (60%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,2.Antibody concentration: 1.00 mg/ml, antibody yield: 6.00 mg (60%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.2.
Пример 12. Конъюгат антитело-лекарственное средство (11)Example 12 Antibody Drug Conjugate (11)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (11)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (11)
Восстановление антитела: анти-CD70 антитело, полученное в справочном примере 5, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,69) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (1,0 мл) собирали в пробирку объемом 2 мл и добавляли к нему водный раствор 30 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0148 мл; 6,9 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,050 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody recovery: The anti-CD70 antibody prepared in Reference Example 5 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using the general method B (1.69 was used as the absorbance at 280 nm) and the total Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после инкубации раствора при 22°C в течение 10 минут, к нему добавляли диметилсульфоксидный раствор (0,0297 мл; 13,8 эквивалентов на молекулу антитела), содержащий 30 мМ соединения, полученного в синтезе 3 примера 2, и инкубировали в течение 40 минут при 22°C с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0178 мл; 27,6 эквивалентов на молекулу антитела) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при 22°C в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of the antibody to the drug-linker fragment: after the solution was incubated at 22°C for 10 minutes, a dimethyl sulfoxide solution (0.0297 ml; 13.8 equivalents per antibody molecule) containing 30 mM of the compound obtained in Synthesis 3 was added to it. Example 2 and incubated for 40 minutes at 22°C to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.0178 ml; 27.6 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at 22° C. for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker fragment reaction. .
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=262400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =262400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 0,96 мг/мл, выход антитела: 5,76 мг (58%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,6.Antibody concentration: 0.96 mg/ml, antibody yield: 5.76 mg (58%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.6.
Пример 13. Конъюгат антитело-лекарственное средство (12)Example 13 Antibody Drug Conjugate (12)
Синтез 1: N-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]глицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]-хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамидSynthesis 1: N-[3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)propanoyl]glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)- 9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4 ':6,7]indolizino[1,2-b]-quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl)glycinamide
Соединение (80 мг, 0,084 ммоль), полученное в синтезе 2 примера 2, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 3 примера 2, используя N-сукцинимидил 3-малеимидпропиоат (24,6 мг, 0,0924 ммоль) вместо N-сукцинимидил 6-малеимидгексаноата, с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (60,0 мг, 73%).The compound (80 mg, 0.084 mmol) obtained in Synthesis 2 of Example 2 was reacted in the same manner as in Synthesis 3 of Example 2 using N-succinimidyl 3-maleimide propioate (24.6 mg, 0.0924 mmol) instead of N- succinimidyl 6-maleimide hexanoate to give the title compound as a pale yellow solid (60.0 mg, 73%).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,89 (3H, т, J=7,3 Гц), 1,70-1,78 (2H, м), 1,81-1,94 (2H, м), 2,12-2,23 (4H, м), 2,42 (3H, с), 2,81 (1H, дд, J=13,7, 9,8 Гц), 3,01-3,15 (3H, м), 3,16-3,23 (2H, м), 3,30-3,35 (1H, м), 3,58-3,71 (6H, м), 3,71-3,79 (1H, м), 4,44-4,51 (1H, м), 5,19 (1H, д, J=19,0 Гц), 5,27 (1H, д, J=19,0 Гц), 5,43 (1H, д, J=17,6 Гц), 5,47 (1H, д, J=17,6 Гц), 5,57-5,63 (1H, м), 6,56 (1H, с), 7,02 (2H, с), 7,17-7,22 (1H, м), 7,22-7,30 (5H, м), 7,34 (1H, с), 7,73 (1H, т, J=5,6 Гц), 7,83 (1H, д, J=10,7 Гц), 8,08 (1H, т, J=5,6 Гц), 8,15 (1H, д, J=7,8 Гц), 8,30 (2H, дт, J=18,7, 5,7 Гц), 8,49 (1H, д, J=8,8 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.89 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.70-1.78 (2H, m), 1.81-1, 94 (2H, m), 2.12-2.23 (4H, m), 2.42 (3H, s), 2.81 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 3 .01-3.15 (3H, m), 3.16-3.23 (2H, m), 3.30-3.35 (1H, m), 3.58-3.71 (6H, m) , 3.71-3.79 (1H, m), 4.44-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.0 Hz), 5.27 (1H, d , J=19.0 Hz), 5.43 (1H, d, J=17.6 Hz), 5.47 (1H, d, J=17.6 Hz), 5.57-5.63 (1H , m), 6.56(1H, s), 7.02(2H, s), 7.17-7.22(1H, m), 7.22-7.30(5H, m), 7, 34 (1H, s), 7.73 (1H, t, J=5.6 Hz), 7.83 (1H, d, J=10.7 Hz), 8.08 (1H, t, J=5 .6 Hz), 8.15 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.30 (2H, dt, J=18.7, 5.7 Hz), 8.49 (1H, d, J = 8.8 Hz).
MS (APCI) m/z: 990 (M+H)+.MS (APCI) m/z: 990 (M+H) + .
Синтез 2: Конъюгат антитело-лекарственное средство (12)Synthesis 2: Antibody Drug Conjugate (12)
Используя M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, и соединение, полученное в синтезе 1, получали названный конъюгат антитело-лекарственное средство таким же образом, как в синтезе 4 примера 2.Using the M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 and the compound obtained in
Концентрация антитела: 12,16 мг/мл, выход антитела: 8,5 мг (68%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,4.Antibody concentration: 12.16 mg/ml, antibody yield: 8.5 mg (68%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.4.
Пример 14. Конъюгат антитело-лекарственное средство (13)Example 14 Antibody Drug Conjugate (13)
Синтез 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино}этокси)этокси]пропаноил}глицил-глицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо-[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамидSynthesis 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)propanoyl]amino}ethoxy)ethoxy]propanoyl}glycyl -glycyl-L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10, 13,15-hexahydro-1H,12H-benzo-[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl)glycinamide
Соединение (100 мг, 0,119 ммоль), полученное в синтезе 2 примера 2, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 3 примера 2, используя диизопропилэтиламин (20,8 мкл, 0,119 ммоль) вместо триэтиламина и N-сукцинимидил 3-(2-(2-(3-малеинимидпропанамид)этокси)этокси)пропаноат (50,7 мг, 0,119 ммоль) вместо N-сукцинимидил 6-малеимидгексаноата, с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (66,5 мг, 48%).The compound (100 mg, 0.119 mmol) obtained in Synthesis 2 of Example 2 was reacted in the same manner as in Synthesis 3 of Example 2 using diisopropylethylamine (20.8 μL, 0.119 mmol) in place of triethylamine and N-succinimidyl 3-(2 -(2-(3-maleimidepropanamide)ethoxy)ethoxy)propanoate (50.7mg, 0.119mmol) instead of N-succinimidyl 6-maleimidehexanoate to give the title compound as a pale yellow solid (66.5mg, 48% ).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,85 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,65-1,74 (2H, м), 1,77-1,90 (2H, м), 2,07-2,19 (4H, м), 2,30 (2H, т, J=7,2 Гц), 2,33-2,36 (2H, м), 2,38 (3H, с), 2,76 (1H, дд, J=13,7, 9,8 Гц), 2,96-3,18 (9H, м), 3,42-3,44 (4H, м), 3,53-3,76 (10H, м), 4,43 (1H, тд, J=8,6, 4,7 Гц), 5,14 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,23 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,38 (1H, д, J=17,2 Гц), 5,42 (1H, д, J=17,2 Гц), 5,52-5,58 (1H, м), 6,52 (1H, с), 6,98 (2H, с), 7,12-7,17 (1H, м), 7,18-7,25 (4H, м), 7,29 (1H, с), 7,69 (1H, т, J=5,5 Гц), 7,78 (1H, д, J=11,3 Гц), 7,98-8,03 (2H, м), 8,11 (1H, д, J=7,8 Гц), 8,16 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,23 (1H, т, J=5,9 Гц), 8,44 (1H, д, J=9,0 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.85 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.65-1.74 (2H, m), 1.77-1, 90 (2H, m), 2.07-2.19 (4H, m), 2.30 (2H, t, J=7.2 Hz), 2.33-2.36 (2H, m), 2 .38 (3H, s), 2.76 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 2.96-3.18 (9H, m), 3.42-3.44 (4H , m), 3.53-3.76 (10H, m), 4.43 (1H, td, J=8.6, 4.7 Hz), 5.14 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.23 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.38 (1H, d, J=17.2 Hz), 5.42 (1H, d, J=17.2 Hz) , 5.52-5.58(1H, m), 6.52(1H, s), 6.98(2H, s), 7.12-7.17(1H, m), 7.18-7 .25 (4H, m), 7.29 (1H, s), 7.69 (1H, t, J=5.5 Hz), 7.78 (1H, d, J=11.3 Hz), 7 .98-8.03 (2H, m), 8.11 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.16 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.23 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.44 (1H, d, J=9.0 Hz).
MS (APCI) m/z: 1149 (M+H)+.MS (APCI) m/z: 1149 (M+H) + .
Синтез 2: Конъюгат антитело-лекарственное средство (13)Synthesis 2: Antibody Drug Conjugate (13)
Используя M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, и соединение, полученное в синтезе 1, получали названный конъюгат антитело-лекарственное средство таким же образом, как в синтезе 4 примера 2.Using the M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 and the compound obtained in
Концентрация антитела: 12,76 мг/мл, выход антитела: 8,9 мг (71%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,4.Antibody concentration: 12.76 mg/ml, antibody yield: 8.9 mg (71%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.4.
Пример 15. Конъюгат антитело-лекарственное средство (14)Example 15 Antibody Drug Conjugate (14)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (14)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (14)
Используя M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, и соединение, полученное в синтезе 1 примера 14, получали названный конъюгат антитело-лекарственное средство таким же образом, как в синтезе 1 примера 4.Using the M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 and the compound obtained in
Концентрация антитела: 1,60 мг/мл, выход антитела: 9,60 мг (77%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 6,1.Antibody concentration: 1.60 mg/ml, antibody yield: 9.60 mg (77%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.1.
Пример 16. Конъюгат антитело-лекарственное средство (15)Example 16 Antibody Drug Conjugate (15)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (15)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (15)
Используя M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, и соединение, полученное в синтезе 1 примера 14, получали названный конъюгат антитело-лекарственное средство таким же образом, как в синтезе 1 примера 5.Using the M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 and the compound obtained in
Концентрация антитела: 1,64 мг/мл, выход антитела: 9,84 мг (79%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 7,1.Antibody concentration: 1.64 mg/ml, antibody yield: 9.84 mg (79%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 7.1.
Пример 17. Конъюгат антитело-лекарственное средство (16)Example 17 Antibody Drug Conjugate (16)
Смешивали практически все количества конъюгатов антитело-лекарственное средство, полученных в примерах 15 и 16. Раствор концентрировали с помощью общего способа A с получением названного конъюгата антитело-лекарственное средство.Substantially all amounts of the antibody-drug conjugates prepared in Examples 15 and 16 were mixed. The solution was concentrated using General Method A to give the title antibody-drug conjugate.
Концентрация антитела: 10,0 мг/мл, выход антитела: 17,30 мг, и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 6,5.Antibody concentration: 10.0 mg/ml, antibody yield: 17.30 mg, and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.5.
Пример 18. Конъюгат антитело-лекарственное средство (17)Example 18 Antibody Drug Conjugate (17)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (17)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (17)
Восстановление антитела: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (100 мл, 1 г антитела) помещали в колбу объемом 250 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (2,43 мл; 3,6 эквивалентов на молекулу антитела) и затем водный раствор 1 М вторичного кислого фосфата калия (5 мл). После подтверждения того, что раствор имеет значение рН около 7,4 с помощью рН-метра, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of antibody: M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using General Method B (Absorbance at 280 nm was 1.61 mlmg -1 cm -1 ) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксида (2,14 мл) и диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 примера 14 (3,51 мл; 5,2 эквивалентов на молекулу антитела) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, его перемешивали с помощью мешалки на водяной бане при 15°C в течение 130 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,547 мл) 100 мМ NAC и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of the antibody to the drug-linker fragment: after adding dimethyl sulfoxide (2.14 ml) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in
Очистка: Упомянутый выше раствор подвергали ультрафильтрационной очистке, используя устройство для ультрафильтрации, состоящее из ультрафильтрационной мембраны (фирмы Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), трубного насоса (фирмы Cole-Parmer International, MasterFlex Pump model 77521-40, Pump Head model 7518-00), и трубки (фирмы Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). В частности, при добавлении к реакционному раствору по каплям ABS (суммарно 800 мл) в качестве буферного раствора для очистки, проводили ультрафильтрационную очистку для удаления неконъюгированных фрагментов лекарственное средство-линкер и других низкомолекулярных реагентов, заменяя также ABS на буферный раствор и затем концентрируя раствор, с получением около 70 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was subjected to ultrafiltration purification using an ultrafiltration apparatus consisting of an ultrafiltration membrane (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), a tubular pump (Cole-Parmer International, MasterFlex Pump model 77521-40, Pump Head model 7518-00) and tubing (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Specifically, when ABS (800 ml in total) was added dropwise to the reaction solution as a purification buffer, ultrafiltration purification was performed to remove unconjugated drug-linker fragments and other low molecular weight reagents by also replacing ABS with the buffer solution and then concentrating the solution, to obtain about 70 ml of a solution containing the named antibody-drug conjugate.
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=4964 (измеренное значение) и εD,370=18982 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =4964 (measured value) and ε D,370 =18982 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 14,5 мг/мл, выход антитела: 1,0 г (около 100%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,5.Antibody concentration: 14.5 mg/ml, antibody yield: 1.0 g (about 100%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.5.
Пример 19. Конъюгат антитело-лекарственное средство (18)Example 19 Antibody Drug Conjugate (18)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (18)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (18)
Восстановление антитела: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (5 мл, 50 мг антитела) помещали в пробирку объемом 15 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,135 мл; 4 эквивалентов на молекулу антитела). После подтверждения того, что раствор имеет значение рН около 7,4 с помощью рН-метра, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of antibody: M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using General Method B (Absorbance at 280 nm was 1.61 mlmg -1 cm -1 ) and general method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксида (0,064 мл) и диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 примера 14 (0,219 мл; 6,5 эквивалентов на молекулу антитела) к упомянутому выше раствору, его инкубировали на водяной бане при 15°C в течение 90 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,033 мл; 9,8 эквивалентов на молекулу антитела) 100 мМ NAC и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of an antibody to a drug-linker moiety: After adding dimethyl sulfoxide (0.064 ml) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 19 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=4964 (измеренное значение) и εD,370=18982 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =4964 (measured value) and ε D,370 =18982 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 2,17 мг/мл, выход антитела: 41 мг (82%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 5,0.Antibody concentration: 2.17 mg/mL, antibody yield: 41 mg (82%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.0.
Пример 20. Конъюгат антитело-лекарственное средство (19)Example 20 Antibody Drug Conjugate (19)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (19)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (19)
Восстановление антитела: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (4 мл, 40 мг антитела) помещали в пробирку объемом 15 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,140 мл; 5,2 эквивалентов на молекулу антитела). После подтверждения того, что раствор имеет значение рН около 7,4 с помощью рН-метра, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of antibody: M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using General Method B (Absorbance at 280 nm was 1.61 mlmg -1 cm -1 ) and general method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 примера 14 (0,232 мл; 8,6 эквивалентов на молекулу антитела), к упомянутому выше раствору, его инкубировали на водяной бане при 15°C в течение 90 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,035 мл; 12,9 эквивалентов на молекулу антитела) 100 мМ NAC и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of antibody to drug-linker fragment: after adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 13 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=4964 (измеренное значение) и εD,370=18982 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =4964 (measured value) and ε D,370 =18982 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 2,36 мг/мл, выход антитела: 31 мг (77%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 5,9.Antibody concentration: 2.36 mg/ml, antibody yield: 31 mg (77%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.9.
Пример 21. Конъюгат антитело-лекарственное средство (20)Example 21 Antibody Drug Conjugate (20)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (20)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (20)
Восстановление антитела: M30-H1-L4 антитело, полученное в справочном примере 1, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (1,25 мл, 12,5 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0287 мл; 3,4 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0625 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody Recovery: M30-H1-L4 The antibody obtained in Reference Example 1 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.61 mlmg was used as the absorbance at 280 nm -1 cm -1 ) and general method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксида (0,0267 мл) и диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 примера 14 (0,0439 мл; 5,2 эквивалентов на молекулу антитела) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, его инкубировали на водяной бане при 15°C в течение 1 часа с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0066 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of the antibody to the drug-linker fragment: after adding dimethyl sulfoxide (0.0267 ml) and dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство. После чего, раствор концентрировали с помощью общего способа A.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=4964 (измеренное значение) и εD,370=18982 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =4964 (measured value) and ε D,370 =18982 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 10,0 мг/мл, выход антитела: 8,7 мг (70%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,5.Antibody concentration: 10.0 mg/mL, antibody yield: 8.7 mg (70%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.5.
Пример 22. Конъюгат антитело-лекарственное средство (21)Example 22 Antibody Drug Conjugate (21)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (21)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (21)
Восстановление антитела: M30-H1-L4 антитело, полученное в справочном примере 1, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (1,25 мл, 12,5 мг антитело) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0439 мл; 5,2 эквивалентов на молекулу антитела) (0,0287 мл; 3,4 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0625 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody Recovery: M30-H1-L4 The antibody obtained in Reference Example 1 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.61 mlmg was used as the absorbance at 280 nm -1 cm -1 ) and general method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора, содержащий 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 примера 14 (0,0726 мл; 8,6 эквивалентов на молекулу антитела) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, его инкубировали на водяной бане при 15°C в течение 1 часа с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,011 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of an antibody to a drug-linker fragment: after adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство. После чего, раствор концентрировали с помощью общего способа A.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=4964 (измеренное значение) и εD,370=18982 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =4964 (measured value) and ε D,370 =18982 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 10,0 мг/мл, выход антитела: 8,3 мг (66%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 5,5.Antibody concentration: 10.0 mg/mL, antibody yield: 8.3 mg (66%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.5.
Пример 23. Конъюгат антитело-лекарственное средство (22)Example 23 Antibody Drug Conjugate (22)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (22)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (22)
Восстановление антитела: анти-CD30 антитело, полученное в справочном примере 3, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,75 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (0,4 мл, 4 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 мл; 2,5 эквивалентов на молекулу антитела). Восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of the antibody: The anti-CD30 antibody obtained in Reference Example 3 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.75 mlmg -1 was used as the absorbance at 280 nm cm -1 ) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксида (0,0098 мл) и диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 примера 14 (0,0116 мл; 4,5 эквивалентов на молекулу антитела), к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0017 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of an antibody to a drug-linker fragment: after adding dimethyl sulfoxide (0.0098 ml) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 2,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=270400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=4964 (измеренное значение) и εD,370=18982 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physical and chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =270400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =4964 (measured value) and ε D,370 =18982 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 0,86 мг/мл, выход антитела: 2,2 мг (54%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 2,5.Antibody concentration: 0.86 mg/ml, antibody yield: 2.2 mg (54%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 2.5.
Пример 24. Конъюгат антитело-лекарственное средство (23)Example 24 Antibody Drug Conjugate (23)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (23)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (23)
Восстановление антитела: анти-CD30 антитело, полученное в справочном примере 3, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.5/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,75 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (0,35 мл, 3,5 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0113 мл; 5 эквивалентов на молекулу антитела). Восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of the antibody: The anti-CD30 antibody obtained in Reference Example 3 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.5/EDTA using General Method B (1.75 mlmg -1 was used as the absorbance at 280 nm cm -1 ) and general method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 примера 14 (0,0204 мл; 9 эквивалентов на молекулу антитела), и пропиленгликоля (фирмы Kanto Chemical Co., Inc., 0,18 мл) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0031 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of an antibody to a drug-linker fragment: after adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 2,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=270400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=4964 (измеренное значение) и εD,370=18982 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physical and chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =270400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =4964 (measured value) and ε D,370 =18982 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 0,41 мг/мл, выход антитела: 1,0 мг (29%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 7,1.Antibody concentration: 0.41 mg/mL, antibody yield: 1.0 mg (29%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 7.1.
Пример 25. Конъюгат антитело-лекарственное средство (24)Example 25 Antibody Drug Conjugate (24)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (24)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (24)
Восстановление антитела: анти-CD33 антитело, полученное в справочном примере 4, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,66 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (0,4 мл, 4 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 мл; 2,5 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0058 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,0±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody recovery: The anti-CD33 antibody obtained in Reference Example 4 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.66 mlmg -1 was used as the absorbance at 280 nm cm -1 ) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксида (0,0101 мл) и диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 примера 14 (0,0116 мл; 4,5 эквивалентов на молекулу антитела), к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с цельюConjugation of an antibody to a drug-linker fragment: after adding dimethyl sulfoxide (0.0101 ml) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in
конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0017 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.conjugation of the drug-linker fragment with the antibody. An aqueous solution (0.0017 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at room temperature for an additional 20 minutes to terminate the drug-linker fragment reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 2,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=256400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=4964 (измеренное значение) и εD,370=18982 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =256400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =4964 (measured value) and ε D,370 =18982 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,25 мг/мл, выход антитела: 3,1 мг (78%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,7.Antibody concentration: 1.25 mg/ml, antibody yield: 3.1 mg (78%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.7.
Пример 26. Конъюгат антитело-лекарственное средство (25)Example 26 Antibody Drug Conjugate (25)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (25)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (25)
Восстановление антитела: анти-CD33 антитело, полученное в справочном примере 4, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,66 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (0,4 мл, 4 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 мл; 5 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,006 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,0±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody recovery: The anti-CD33 antibody obtained in Reference Example 4 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.66 mlmg -1 was used as the absorbance at 280 nm cm -1 ) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 примера 14 (0,0233 мл; 9 эквивалентов на молекулу антитела), к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0035 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of an antibody to a drug-linker moiety: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 2,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=256400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=4964 (измеренное значение) и εD,370=18982 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =256400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =4964 (measured value) and ε D,370 =18982 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,17 мг/мл, выход антитела: 2,9 мг (73%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 7,3.Antibody concentration: 1.17 mg/ml, antibody yield: 2.9 mg (73%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 7.3.
Пример 27. Конъюгат антитело-лекарственное средство (26)Example 27 Antibody Drug Conjugate (26)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (26)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (26)
Восстановление антитела: анти-CD70 антитело, полученное в справочном примере 5, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,69 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (0,4 мл, 4 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 мл; 2,5 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0058 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,0±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody recovery: The anti-CD70 antibody obtained in Reference Example 5 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.69 mlmg -1 was used as the absorbance at 280 nm cm -1 ) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксида (0,0101 мл) и диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 примера 14 (0,0116 мл; 4,5 эквивалентов на молекулу антитела) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0017 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of the antibody to the drug-linker fragment: after adding dimethyl sulfoxide (0.0101 ml) and dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 2,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=262400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=4964 (измеренное значение) и εD,370=18982 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =262400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =4964 (measured value) and ε D,370 =18982 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,14 мг/мл, выход антитела: 2,9 мг (71%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,8.Antibody concentration: 1.14 mg/ml, antibody yield: 2.9 mg (71%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.8.
Пример 28. Конъюгат антитело-лекарственное средство (27)Example 28 Antibody Drug Conjugate (27)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (27)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (27)
Восстановление антитела: анти-CD70 антитело, полученное в справочном примере 5, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,69 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (0,4 мл, 4 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 мл; 5 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,006 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,0±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody recovery: The anti-CD70 antibody obtained in Reference Example 5 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.69 mlmg -1 was used as the absorbance at 280 nm cm -1 ) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора (0,0233 мл; 9 эквивалентов на молекулу антитела) содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 примера 14, к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0035 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of the antibody to the drug-linker moiety: after adding a dimethyl sulfoxide solution (0.0233 ml; 9 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 2,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=262400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=4964 (измеренное значение) и εD,370=18982 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =262400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =4964 (measured value) and ε D,370 =18982 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,13 мг/мл, выход антитела: 2,8 мг (71%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 7,4.Antibody concentration: 1.13 mg/ml, antibody yield: 2.8 mg (71%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 7.4.
Пример 29. Конъюгат антитело-лекарственное средство (28)Example 29 Antibody Drug Conjugate (28)
Синтез 1: N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраоксо-16-азанонадекан-1-оил]глицил-глицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо-[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамидSynthesis 1: N-[19-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-17-oxo-4,7,10,13-tetraoxo-16-azanonedecane-1- oil]glycyl-glycyl-L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9 ,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo-[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl )glycinamide
Соединение (90 мг, 0,107 ммоль), полученное в синтезе 2 примера 2, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 3 примера 2, используя диизопропилэтиламин (18,7 мкл, 0,107 ммоль) вместо триэтиламина и N-сукцинимидил 1-малеинимид-3-оксо-7,10,13,16-тетраокса-4-азанонадекан-19-оат (55,1 мг, 0,107 ммоль) вместо N-сукцинимидил 6-малеимидгексаноата с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (50 мг, 37%).The compound (90 mg, 0.107 mmol) obtained in Synthesis 2 of Example 2 was reacted in the same manner as in Synthesis 3 of Example 2 using diisopropylethylamine (18.7 µl, 0.107 mmol) in place of triethylamine and N-succinimidyl 1-maleimide- 3-oxo-7,10,13,16-tetraoxa-4-azanonedecane-19-oate (55.1 mg, 0.107 mmol) in place of N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate to give the title compound as a pale yellow solid (50 mg, 37%).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,85 (3H, т, J=7,2 Гц), 1,64-1,74 (2H, м), 1,77-1,90 (2H, м), 2,06-2,19 (4H, м), 2,27-2,32 (2H, м), 2,33-2,37 (2H, м), 2,38 (3H, с), 2,72-2,80 (3H, м), 2,96-3,19 (6H, м), 3,39-3,48 (10H, м), 3,52-3,75 (10H, м), 4,39-4,48 (1H, м), 5,14 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,23 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,38 (1H, д, J=17,0 Гц), 5,42 (1H, д, J=17,0 Гц), 5,52-5,58 (1H, м), 6,52 (1H, с), 6,98 (1H, с), 7,13-7,24 (5H, м), 7,29 (1H, с), 7,69 (1H, т, J=5,5 Гц), 7,78 (1H, д, J=10,9 Гц), 7,98-8,03 (2H, м), 8,10 (1H, д, J=7,8 Гц), 8,16 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,23 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,44 (1H, д, J=8,6 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.85 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.64-1.74 (2H, m), 1.77-1, 90(2H, m), 2.06-2.19(4H, m), 2.27-2.32(2H, m), 2.33-2.37(2H, m), 2.38( 3H, s), 2.72-2.80(3H, m), 2.96-3.19(6H, m), 3.39-3.48(10H, m), 3.52-3, 75(10H, m), 4.39-4.48(1H, m), 5.14(1H, d, J=18.8Hz), 5.23(1H, d, J=18.8Hz) ), 5.38 (1H, d, J=17.0 Hz), 5.42 (1H, d, J=17.0 Hz), 5.52-5.58 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.98 (1H, s), 7.13-7.24 (5H, m), 7.29 (1H, s), 7.69 (1H, t, J=5.5 Hz), 7.78 (1H, d, J=10.9 Hz), 7.98-8.03 (2H, m), 8.10 (1H, d, J=7.8 Hz), 8, 16 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.23 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.44 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (APCI) m/z: 1237 (M+H)+.MS (APCI) m/z: 1237 (M+H) + .
Синтез 2: Конъюгат антитело-лекарственное средство (28)Synthesis 2: Antibody Drug Conjugate (28)
Восстановление антитела: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6.0/EDTA, используя общий способ C-1 и общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1), описанный в способе получения 1. Раствор (1,25 мл) помещали в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,025 мл; 3,0 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0625 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of antibody: M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml by changing the medium to PBS6.0/EDTA using General Method C-1 and General Method B (as absorbance at 280 nm, the value of 1.61 mlmg -1 cm -1 ) described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксида (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,102 мл) и диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 (0,047 мл; 5,5 эквивалентов на молекулу антитела), к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 40 минут с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,009 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и перемешивали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of the antibody to the drug-linker moiety: after adding dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.102 ml) and dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 1 (0.047 ml; 5.5 equivalents per antibody molecule), to the above solution at room temperature, stirring was carried out at room temperature for 40 minutes using a rotary tube shaker (MTR-103, AS ONE Corporation) to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.009 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and stirred at room temperature for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker moiety reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство. После чего, раствор концентрировали с помощью общего способа A.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 13,60 мг/мл, выход антитела: 9,5 мг (76%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,3.Antibody concentration: 13.60 mg/ml, antibody yield: 9.5 mg (76%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.3.
Пример 30. Конъюгат антитело-лекарственное средство (29)Example 30 Antibody Drug Conjugate (29)
Синтез 1: N-(трет-бутоксикарбонил)-β-аланилглицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано-[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамидSynthesis 1: N-(tert-butoxycarbonyl)-β-alanylglycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10, 13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano-[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinoline-1 -yl]amino}-4-oxobutyl)glycinamide
Соединение (0,839 г, 1,00 ммоль), полученное в синтезе 2 примера 2, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 1 примера 1, используя N-(трет-бутоксикарбонил)-β-аланин вместо 4-(трет-бутоксикарбониламино)бутановой кислоты. Полученный неочищенный продукт использовали в следующем синтезе без проведения очистки.The compound (0.839 g, 1.00 mmol) obtained in Synthesis 2 of Example 2 was reacted in the same manner as in
Синтез 2: β-Аланилглицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]-индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамидSynthesis 2: β-Alanylglycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3, 9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]-indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-4- oxobutyl)glycinamide
Полученный неочищенный продукт в синтез 1 подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 2 примера 2, с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (0,610 г, 67%).The resulting crude product in
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,67-1,77 (2H, м), 1,79-1,92 (2H, м), 2,09-2,22 (4H, м), 2,40 (3H, с), 2,46-2,55 (2H, м), 2,82-2,73 (1H, м), 2,95-3,13 (5H, м), 3,14-3,21 (2H, м), 3,55-3,80 (6H, м), 4,44-4,52 (1H, м), 5,20 (2H, дд, J=35,0, 19,0 Гц), 5,42 (2H, с), 5,53-5,60 (1H, м), 6,54 (1H, с), 7,14-7,28 (5H, м), 7,31 (1H, с), 7,67 (2H, шир.с), 7,72-7,78 (1H, м), 7,80 (1H, д, J=11,0 Гц), 8,10-8,17 (2H, м), 8,29 (1H, т, J=5,9 Гц), 8,42 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,47 (1H, д, J=8,6 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.67-1.77 (2H, m), 1.79-1, 92(2H, m), 2.09-2.22(4H, m), 2.40(3H, s), 2.46-2.55(2H, m), 2.82-2.73( 1H, m), 2.95-3.13(5H, m), 3.14-3.21(2H, m), 3.55-3.80(6H, m), 4.44-4, 52 (1H, m), 5.20 (2H, dd, J=35.0, 19.0 Hz), 5.42 (2H, s), 5.53-5.60 (1H, m), 6 .54(1H, s), 7.14-7.28(5H, m), 7.31(1H, s), 7.67(2H, br s), 7.72-7.78(1H , m), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.10-8.17 (2H, m), 8.29 (1H, t, J=5.9 Hz), 8 .42 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.47 (1H, d, J=8.6 Hz).
Синтез 3: N-(бромацетил)-β-аланилглицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано-[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамидSynthesis 3: N-(bromoacetyl)-β-alanylglycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13- dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano-[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl ]amino}-4-oxobutyl)glycinamide
К дихлорметановому (4,5 мл) раствору 2-бромуксусной кислоты (96,3 мг, 0,693 ммоль) добавляли N-гидроксисукцинимид (79,7 мг, 0,693 ммоль) и 1,3-диизопропилкарбодиимид (0,107 мл, 0,693 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре. Реакционный раствор добавляли к раствору соединения (473 мг, 0,462 ммоль), полученное в синтезе 2, и триэтиламина (0,154 мл, 1,11 ммоль) в N,N-диметилформамиде (4,5 мл), при 0°C и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционный раствор очищали колоночной хроматографией на силикагеле [растворитель для элюирования: хлороформ-хлороформ:метанол=85:15 (по объему)]. Полученное твердое вещество промывали смешанным растворителем хлороформ:метанол:диэтиловый эфир с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (191 мг, 40%).To a dichloromethane (4.5 ml) solution of 2-bromoacetic acid (96.3 mg, 0.693 mmol) was added N-hydroxysuccinimide (79.7 mg, 0.693 mmol) and 1,3-diisopropylcarbodiimide (0.107 ml, 0.693 mmol) and stirred at room temperature. The reaction solution was added to a solution of the compound (473 mg, 0.462 mmol) obtained in Synthesis 2 and triethylamine (0.154 ml, 1.11 mmol) in N,N-dimethylformamide (4.5 ml) at 0°C and stirred at room temperature for 1 hour. The reaction solution was purified by silica gel column chromatography [elution solvent: chloroform-chloroform:methanol=85:15 (v/v)]. The resulting solid was washed with a mixed solvent of chloroform:methanol:diethyl ether to give the title compound as a pale yellow solid (191 mg, 40%).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,67-1,77 (2H, м), 1,79-1,92 (2H, м), 2,08-2,22 (4H, м), 2,33 (2H, т, J=7,0 Гц), 2,40 (3H, с), 2,74-2,83 (1H, м), 2,99-3,12 (3H, м), 3,14-3,21 (2H, м), 3,24-3,30 (2H, м), 3,56-3,77 (6H, м), 3,82 (2H, с), 4,41-4,51 (1H, м), 5,20 (2H, кв, J=18,9 Гц), 5,42 (2H, с), 5,54-5,60 (1H, м), 6,54 (1H, с), 7,15-7,27 (5H, м), 7,31 (1H, с), 7,69-7,74 (1H, м), 7,80 (1H, д, J=10,9 Гц), 8,06 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,13 (1H, д, J=7,8 Гц), 8,21-8,34 (3H, м), 8,46 (1H, д, J=8,6 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.67-1.77 (2H, m), 1.79-1, 92 (2H, m), 2.08-2.22 (4H, m), 2.33 (2H, t, J=7.0 Hz), 2.40 (3H, s), 2.74-2 .83(1H, m), 2.99-3.12(3H, m), 3.14-3.21(2H, m), 3.24-3.30(2H, m), 3.56 -3.77(6H, m), 3.82(2H, s), 4.41-4.51(1H, m), 5.20(2H, q, J=18.9Hz), 5, 42(2H, s), 5.54-5.60(1H, m), 6.54(1H, s), 7.15-7.27(5H, m), 7.31(1H, s) , 7.69-7.74 (1H, m), 7.80 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.06 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.13 ( 1H, d, J=7.8 Hz), 8.21-8.34 (3H, m), 8.46 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 1030, 1032 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 1030, 1032 (M+H) + .
Синтез 4: Конъюгат антитело-лекарственное средство (29)Synthesis 4: Antibody Drug Conjugate (29)
Восстановление антитела: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6.0/EDTA, используя общий способ C-1 и общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1), описанный в способе получения 1. Раствор (1,25 мл) помещали в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,025 мл; 3,0 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0625 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of antibody: M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml by changing the medium to PBS6.0/EDTA using General Method C-1 and General Method B (as absorbance at 280 nm, the value of 1.61 mlmg -1 cm -1 ) described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксида (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,09 мл) и диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 3 (0,059 мл; 7,0 эквивалентов на молекулу антитела), к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 40 минут с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,009 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и перемешивали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of antibody to drug-linker moiety: after addition of dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.09 ml) and dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM compound from Synthesis 3 (0.059 ml; 7.0 equivalents per antibody molecule) ) to the above solution at room temperature was stirred at room temperature for 40 minutes using a rotary tube shaker (MTR-103, AS ONE Corporation) to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.009 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and stirred at room temperature for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker moiety reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство. После чего, раствор концентрировали с помощью общего способа A.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 13,9 мг/мл, выход антитела: 9,7 мг (78%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,2.Antibody concentration: 13.9 mg/ml, antibody yield: 9.7 mg (78%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.2.
Пример 31. Конъюгат антитело-лекарственное средство (30)Example 31 Antibody Drug Conjugate (30)
Используя M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, и соединение, полученное в синтезе 3 примера 30, получали названный конъюгат антитело-лекарственное средство таким же образом, как в синтезе 1 примера 4.Using the M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 and the compound obtained in Synthesis 3 of Example 30, the title antibody-drug conjugate was prepared in the same manner as in
Концентрация антитела: 1,94 мг/мл, выход антитела: 11,64 мг (93%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 5,6.Antibody concentration: 1.94 mg/ml, antibody yield: 11.64 mg (93%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.6.
Пример 32. Конъюгат антитело-лекарственное средство (31)Example 32 Antibody Drug Conjugate (31)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (31)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (31)
Используя M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, и соединение, полученное в синтезе 3 примера 30, получали названный конъюгат антитело-лекарственное средство таким же образом, как в синтезе 1 примера 5.Using the M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 and the compound obtained in Synthesis 3 of Example 30, the title antibody-drug conjugate was prepared in the same manner as in
Концентрация антитела: 1,90 мг/мл, выход антитела: 11,40 мг (91%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 6,7.Antibody concentration: 1.90 mg/ml, antibody yield: 11.40 mg (91%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.7.
Пример 33. Конъюгат антитело-лекарственное средство (32)Example 33 Antibody Drug Conjugate (32)
Смешивали практически все количества конъюгатов антитело-лекарственное средство, полученных в примерах 31 и 32. Раствор концентрировали с помощью общего способа A с получением названного конъюгата антитело-лекарственное средство.Substantially all amounts of the antibody-drug conjugates prepared in Examples 31 and 32 were mixed. The solution was concentrated using General Method A to give the title antibody-drug conjugate.
Концентрация антитела: 10,0 мг/мл, выход антитела: 21,06 мг, и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 6,0.Antibody concentration: 10.0 mg/mL, antibody yield: 21.06 mg, and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.0.
Пример 34. Конъюгат антитело-лекарственное средство (33)Example 34 Antibody Drug Conjugate (33)
Синтез 1: Трет-бутил 4-({N6-(трет-бутоксикарбонил)-N2-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-лизил}амино)бутаноатSynthesis 1: Tert-butyl 4-({N 6 -(tert-butoxycarbonyl)-N 2 -[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-lysyl}amino)butanoate
К раствор Nε-(трет-бутоксикарбонил)-Nα-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-лизина (1,00 г, 2,14 ммоль), N-гидроксисукцинимида (0,370 г, 3,20 ммоль) и гидрохлориду трет-бутилового эфира 4-аминобутановой кислоты (0,830 г, 4,27 ммоль) в N,N-диметилформамиде (10,0 мл) добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (0,610 г, 3,20 ммоль) и N,N-диизопропилэтиламин (0,410 мл, 2,35 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Реакционный раствор разбавляли этилацетатом и промывали водным раствором 10% лимонной кислоты и насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным солевым раствором, и затем органический слой сушили над безводным сульфатом магния. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением названного соединения в виде бесцветного твердого вещества (1,35 г, количественно).To a solution of Nε - (tert-butoxycarbonyl) -Nα - [(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl] -L-lysine (1.00 g, 2.14 mmol), N-hydroxysuccinimide (0.370 g, 3.20 mmol) and 4-aminobutanoic acid tert-butyl ester hydrochloride (0.830 g, 4.27 mmol) in N,N-dimethylformamide (10.0 mL) was added 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (0.610 g , 3.20 mmol) and N,N-diisopropylethylamine (0.410 ml, 2.35 mmol) and stirred at room temperature for 3 days. The reaction solution was diluted with ethyl acetate and washed with an aqueous solution of 10% citric acid and an aqueous saturated sodium hydrogen carbonate solution and a saturated brine, and then the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. The solvent was removed under reduced pressure to give the title compound as a colorless solid (1.35 g, quantitatively).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 1,14-1,42 (4H, м), 1,36 (9H, с), 1,37 (9H, с), 1,48-1,67 (4H, м), 2,18 (2H, т, J=7,6 Гц), 2,84-2,93 (2H, м), 2,99-3,11 (2H, м), 3,84-3,94 (1H, м), 4,18-4,30 (3H, м), 6,76 (1H, т, J=5,4 Гц), 7,33 (2H, т, J=7,3 Гц), 7,39-7,45 (3H, м), 7,73 (2H, дд, J=7,3, 2,7 Гц), 7,85-7,92 (3H, м). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 1.14-1.42 (4H, m), 1.36 (9H, s), 1.37 (9H, s), 1.48- 1.67(4H, m), 2.18(2H, t, J=7.6Hz), 2.84-2.93(2H, m), 2.99-3.11(2H, m) , 3.84-3.94(1H, m), 4.18-4.30(3H, m), 6.76(1H, t, J=5.4Hz), 7.33(2H, t , J=7.3 Hz), 7.39-7.45 (3H, m), 7.73 (2H, dd, J=7.3, 2.7 Hz), 7.85-7.92 ( 3H, m).
Синтез 2: Трет-бутил 4-{[N6-(трет-бутоксикарбонил)-L-лизил]амино}бутаноатSynthesis 2: Tert-butyl 4-{[N 6 -(tert-butoxycarbonyl)-L-lysyl]amino}butanoate
К раствору соединения (1,35 г, 2,22 ммоль), полученного в синтезе 1, в N,N-диметилформамиде (8,00 мл), добавляли пиперидин (2,00 мл) и перемешивали в течение 1,5 часов при комнатной температуре. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением смеси, содержащей названное соединение. Смесь использовали для следующей реакции без проведения дополнительной очистки.To a solution of the compound (1.35 g, 2.22 mmol) obtained in
Синтез 3: N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-N-(4-трет-бутокси-4-оксобутил)-L-лизинамидSynthesis 3: N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-valyl-N 6 -(tert-butoxycarbonyl)-N-(4-tert-butoxy-4-oxobutyl)-L-lysinamide
К раствору смеси (2,22 ммоль), полученной в синтезе 2, в N,N-диметилформамиде (30,0 мл) добавляли N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-валин (1,13 г, 3,32 ммоль), N-гидроксисукцинимид (0,310 г, 2,66 ммоль) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (0,550 г, 2,88 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Реакционный раствор разбавляли этилацетатом и промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным солевым раствором, и затем органический слой сушили над безводным сульфатом магния. Растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-хлороформ:метанол=9:1 (по объему)] с получением названного соединения в виде бесцветного твердого вещества (0,363 г, 23%).N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-valine (1.13 g, 3.32 mmol), N-hydroxysuccinimide (0.310 g, 2.66 mmol) and 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (0.550 g, 2.88 mmol) and stirred at room temperature for 18 hours. The reaction solution was diluted with ethyl acetate and washed with an aqueous saturated sodium hydrogen carbonate solution and a saturated brine, and then the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. The solvent was removed under reduced pressure, and the resulting residue was purified by silica gel column chromatography [chloroform-chloroform:methanol=9:1 (v/v)] to give the title compound as a colorless solid (0.363 g, 23%).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,84 (6H, т, J=6,0 Гц), 1,12-1,64 (8H, м), 1,34 (9H, с), 1,38 (9H, с), 1,90-2,04 (1H, м), 2,17 (2H, т, J=7,3 Гц), 2,79-2,90 (2H, м), 2,99-3,09 (2H, м), 3,83-3,91 (1H, м), 4,08-4,44 (4H, м), 6,71 (1H, т, J=5,4 Гц), 7,32 (2H, т, J=7,3 Гц), 7,42 (3H, т, J=7,3 Гц), 7,74 (2H, т, J=7,0 Гц), 7,85-7,91 (4H, м). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.84 (6H, t, J=6.0 Hz), 1.12-1.64 (8H, m), 1.34 (9H, s), 1.38 (9H, s), 1.90-2.04 (1H, m), 2.17 (2H, t, J=7.3 Hz), 2.79-2.90 (2H , m), 2.99-3.09 (2H, m), 3.83-3.91 (1H, m), 4.08-4.44 (4H, m), 6.71 (1H, t , J=5.4 Hz), 7.32(2H, t, J=7.3 Hz), 7.42(3H, t, J=7.3 Hz), 7.74(2H, t, J = 7.0 Hz), 7.85-7.91 (4H, m).
MS (ESI) m/z: 709 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 709 (M+H) + .
Синтез 4: N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-валил-N-(3-карбоксипропил)-L-лизинамида формиатSynthesis 4: N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-valyl-N-(3-carboxypropyl)-L-lysinamide formate
К соединению (0,363 мг, 0,512 ммоль), полученному в синтезе 3, добавляли муравьиную кислоту (10,0 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением названного соединения. Соединение использовали для следующей реакции без проведения дополнительной очистки.To the compound (0.363 mg, 0.512 mmol) obtained in Synthesis 3 was added formic acid (10.0 ml) and stirred at room temperature for 4 hours. The solvent was removed under reduced pressure to give the title compound. The compound was used for the next reaction without further purification.
Синтез 5: N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-N-(3-карбоксипропил)-L-лизинамидSynthesis 5: N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-valyl-N 6 -(tert-butoxycarbonyl)-N-(3-carboxypropyl)-L-lysinamide
К суспензии соединения (0,512 ммоль), полученного в синтезе 4, в 1,4-диоксане (5,00 мл) добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия (20,0 мл) и дитрет-бутилдикарбонат (0,178 мл, 0,769 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционный раствор разбавляли этилацетатом и промывали водным раствором 10% лимонной кислоты и насыщенным солевым раствором, и затем органический слой сушили над безводным сульфатом магния. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением названного соединения в виде бесцветного твердого вещества (0,295 г, 88%).To a suspension of the compound (0.512 mmol) obtained in synthesis 4 in 1,4-dioxane (5.00 ml) was added a saturated aqueous solution of sodium hydrogen carbonate (20.0 ml) and ditert-butyl dicarbonate (0.178 ml, 0.769 mmol) and stirred at room temperature for 3 hours. The reaction solution was diluted with ethyl acetate and washed with an aqueous solution of 10% citric acid and saturated brine, and then the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. The solvent was removed under reduced pressure to give the title compound as a colorless solid (0.295 g, 88%).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,84 (6H, т, J=6,7 Гц), 1,13-1,39 (4H, м), 1,35 (9H, с), 1,48-1,62 (4H, м), 1,91-2,04 (1H, м), 2,20 (2H, т, J=7,3 Гц), 2,80-2,89 (2H, м), 2,99-3,11 (2H, м), 3,87 (1H, дд, J=8,5, 6,7 Гц), 4,06-4,35 (4H, м), 6,71 (1H, т, J=6,0 Гц), 7,32 (2H, т, J=7,6 Гц), 7,39-7,46 (3H, м), 7,74 (2H, т, J=7,6 Гц), 7,83-7,94 (4H, м). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.84 (6H, t, J=6.7 Hz), 1.13-1.39 (4H, m), 1.35 (9H, s), 1.48-1.62 (4H, m), 1.91-2.04 (1H, m), 2.20 (2H, t, J=7.3 Hz), 2.80-2 .89 (2H, m), 2.99-3.11 (2H, m), 3.87 (1H, dd, J=8.5, 6.7 Hz), 4.06-4.35 (4H , m), 6.71 (1H, t, J=6.0 Hz), 7.32 (2H, t, J=7.6 Hz), 7.39-7.46 (3H, m), 7 .74 (2H, t, J=7.6 Hz), 7.83-7.94 (4H, m).
MS (ESI) m/z: 653 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 653 (M+H) + .
Синтез 6: N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо-[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)-L-лизинамидSynthesis 6: N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-valyl-N 6 -(tert-butoxycarbonyl)-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5- fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo-[de]pyrano[3',4':6,7 ]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl)-L-lysinamide
Мезилат соединения (4) (0,240 г, 0,452 ммоль) подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 1 примера 1, используя соединение (0,295 г, 0,452 ммоль), полученное в синтезе 5, вместо 4-(трет-бутоксикарбониламино)бутановой кислоты с получением названного соединения в виде бледно-оранжевого твердого вещества (0,208 г, 43%).Compound (4) mesylate (0.240 g, 0.452 mmol) was reacted in the same manner as in
MS (ESI) m/z: 1071 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 1071 (M+H) + .
Синтез 7: L-Валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]-хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)-L-лизинамидSynthesis 7: L-Valyl-N 6 -(tert-butoxycarbonyl)-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo -2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]-quinolin-1-yl] amino}-4-oxobutyl)-L-lysinamide
Соединение (0,208 г, 0,194 ммоль), полученное в синтезе 6, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 2, с получением смеси, содержащей названное соединение. Смесь использовали для следующей реакции без проведения дополнительной очистки.The compound (0.208 g, 0.194 mmol) obtained in Synthesis 6 was reacted in the same manner as in Synthesis 2 to give a mixture containing the title compound. The mixture was used for the next reaction without further purification.
Синтез 8: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N6-(трет-бутоксикарбонил)-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]-хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)-L-лизинамидSynthesis 8: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]-L-valyl-N 6 -(tert-butoxycarbonyl)-N-(4- {[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[ de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]-quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl)-L-lysinamide
Смесь (0,194 ммоль), полученную в синтезе 7, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 3 примера 2, с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (0,133 г, 56%).The mixture (0.194 mmol) obtained in Synthesis 7 was reacted in the same manner as in Synthesis 3 of Example 2 to give the title compound as a pale yellow solid (0.133 g, 56%).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,77 (6H, т, J=5,7 Гц), 0,87 (3H, т, J=7,3 Гц), 1,14-1,71 (10H, м), 1,35 (9H, с), 1,77-1,95 (3H, м), 2,02-2,23 (7H, м), 2,40 (3H, с), 2,84 (3H, кв, J=6,4 Гц), 3,05 (2H, д, J=6,7 Гц), 3,17 (2H, с), 3,26-3,39 (3H, м), 4,01-4,16 (2H, м), 5,15 (1H, д, J=18,7 Гц), 5,24 (1H, д, J=18,7 Гц), 5,36-5,48 (2H, м), 5,51-5,60 (1H, м), 6,52 (1H, с), 6,72 (1H, т, J=6,0 Гц), 6,99 (2H, с), 7,31 (1H, с), 7,71-7,85 (5H, м), 8,41 (1H, д, J=9,1 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.77 (6H, t, J=5.7 Hz), 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.14 -1.71(10H, m), 1.35(9H, s), 1.77-1.95(3H, m), 2.02-2.23(7H, m), 2.40(3H , s), 2.84 (3H, q, J=6.4 Hz), 3.05 (2H, d, J=6.7 Hz), 3.17 (2H, s), 3.26-3 .39 (3H, m), 4.01-4.16 (2H, m), 5.15 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.24 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.36-5.48(2H, m), 5.51-5.60(1H, m), 6.52(1H, s), 6.72(1H, t, J=6, 0 Hz), 6.99 (2H, s), 7.31 (1H, s), 7.71-7.85 (5H, m), 8.41 (1H, d, J=9.1 Hz) .
MS (ESI) m/z: 1041 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 1041 (M+H) + .
Синтез 9: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо-[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)-L-лизинамид трифторацетатSynthesis 9: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]-L-valyl-N-(4-{[(1S,9S)-9 -ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo-[de]pyrano[3',4 ':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl)-L-lysinamide trifluoroacetate
К раствору соединения (0,110 мг, 0,106 ммоль), полученного в синтезе 8, в дихлорметане (10,0 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (4,00 мл) и перемешивали в течение 5 часов при комнатной температуре. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (70,0 мг, 64%).To a solution of the compound (0.110 mg, 0.106 mmol) obtained in Synthesis 8 in dichloromethane (10.0 ml) was added trifluoroacetic acid (4.00 ml) and stirred for 5 hours at room temperature. The solvent was removed under reduced pressure to give the title compound as a pale yellow solid (70.0 mg, 64%).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,76-0,81 (6H, м), 0,87 (3H, т, J=7,3 Гц), 1,12-1,31 (4H, м), 1,39-1,56 (8H, м), 1,57-1,74 (3H, м), 1,79-1,96 (3H, м), 2,06-2,18 (7H, м), 2,40 (3H, с), 2,70-2,80 (2H, м), 3,01-3,10 (2H, м), 3,13-3,22 (2H, м), 4,04 (1H, т, J=7,6 Гц), 4,10-4,20 (1H, м), 5,15 (1H, д, J=18,7 Гц), 5,24 (1H, д, J=18,7 Гц), 5,36-5,47 (2H, м), 5,52-5,60 (1H, м), 6,53 (1H, с), 7,00 (2H, с), 7,32 (1H, с), 7,61 (3H, шир.с), 7,75-7,88 (4H, м), 8,43 (1H, д, J=8,5 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.76-0.81 (6H, m), 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.12-1, 31(4H, m), 1.39-1.56(8H, m), 1.57-1.74(3H, m), 1.79-1.96(3H, m), 2.06- 2.18(7H, m), 2.40(3H, s), 2.70-2.80(2H, m), 3.01-3.10(2H, m), 3.13-3, 22 (2H, m), 4.04 (1H, t, J=7.6 Hz), 4.10-4.20 (1H, m), 5.15 (1H, d, J=18.7 Hz ), 5.24 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.36-5.47 (2H, m), 5.52-5.60 (1H, m), 6.53 (1H, s), 7.00(2H, s), 7.32(1H, s), 7.61(3H, br s), 7.75-7.88(4H, m), 8.43(1H , d, J=8.5 Hz).
MS (ESI) m/z: 941 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 941 (M+H) + .
Синтез 10: Конъюгат антитело-лекарственное средство (33)Synthesis 10: Antibody Drug Conjugate (33)
Используя M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, и соединение, полученное в синтезе 9, получали названный конъюгат антитело-лекарственное средство таким же образом, как в синтезе 2 примера 29.Using the M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 and the compound obtained in Synthesis 9, the title antibody-drug conjugate was prepared in the same manner as in Synthesis 2 of Example 29.
Концентрация антитела: 12,0 мг/мл, выход антитела: 8,4 мг (67%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,2.Antibody concentration: 12.0 mg/mL, antibody yield: 8.4 mg (67%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.2.
Пример 35. Конъюгат антитело-лекарственное средство (34)Example 35 Antibody Drug Conjugate (34)
Синтез 1: N-(3-сульфанилпропаноил)глицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано-[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамидSynthesis 1: N-(3-sulfanylpropanoyl)glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo -2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano-[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl] amino}-4-oxobutyl)glycinamide
Соединение (84,0 мг, 0,100 ммоль), полученное в синтезе 2 примера 2, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 3 примера 2, используя N-сукцинимидил 3-меркаптопропионат вместо N-сукцинимидил 6-малеимидгексаноата, с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (61,2 мг, 66%).The compound (84.0 mg, 0.100 mmol) obtained in Synthesis 2 of Example 2 was reacted in the same manner as in Synthesis 3 of Example 2 using N-succinimidyl 3-mercaptopropionate instead of N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate to give the title compound as a pale yellow solid (61.2 mg, 66%).
1H-ЯМР (DMSO-D6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,77-1,66 (2H, м), 1,79-1,92 (2H, м), 2,07-2,24 (4H, м), 2,31-2,47 (3H, м), 2,40 (3H, с), 2,59-2,69 (2H, м), 2,78 (1H, дд, J=13,7, 9,8 Гц), 2,98-3,13 (3H, м), 3,14-3,23 (2H, м), 3,54-3,79 (6H, м), 4,40-4,50 (1H, м), 5,20 (2H, дд, J=36,8, 19,2 Гц), 5,36-5,47 (2H, м), 5,52-5,63 (1H, м), 6,54 (1H, с), 7,14-7,28 (5H, м), 7,31 (1H, с), 7,68-7,74 (1H, м), 7,80 (1H, д, J=10,9 Гц), 8,03-8,09 (1H, м), 8,13 (1H, д, J=7,8 Гц), 8,19-8,29 (2H, м), 8,46 (1H, д, J=8,6 Гц). 1 H-NMR (DMSO-D 6 ) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.77-1.66 (2H, m), 1.79-1.92 (2H , m), 2.07-2.24 (4H, m), 2.31-2.47 (3H, m), 2.40 (3H, s), 2.59-2.69 (2H, m ), 2.78 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 2.98-3.13 (3H, m), 3.14-3.23 (2H, m), 3, 54-3.79 (6H, m), 4.40-4.50 (1H, m), 5.20 (2H, dd, J=36.8, 19.2 Hz), 5.36-5, 47(2H, m), 5.52-5.63(1H, m), 6.54(1H, s), 7.14-7.28(5H, m), 7.31(1H, s) , 7.68-7.74(1H, m), 7.80(1H, d, J=10.9 Hz), 8.03-8.09(1H, m), 8.13(1H, d , J=7.8 Hz), 8.19-8.29(2H, m), 8.46(1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 927 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 927 (M+H) + .
Синтез 2: Конъюгат антитело-лекарственное средство (34)Synthesis 2: Antibody Drug Conjugate (34)
Дериватизация антитела с помощью SMCC: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 20 мг/мл путем замены среды на PBS6.5/EDTA, используя общий способ C-2 и общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1). Раствор (0,25 мл) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему раствор (0,0063 мл; что соответствует приблизительно 2,55 эквивалентам на молекулу антитела), содержащий 27,6 мМ сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.), в DMSO при комнатной температуре и подвергали взаимодействию при комнатной температуре в течение 2 часов. Этот реакционный раствор подвергали очистке, используя общий способ D-2, с получением 0,7 мл раствора, содержащего около 5 мг SMCC-дериватизированного антитела.Antibody derivatization with SMCC: M30-H1-L4P antibody prepared in Reference Example 2 was prepared at 20 mg/mL antibody concentration by medium change to PBS6.5/EDTA using General Method C-2 and General Method B (as absorption coefficient at 280 nm used the value of 1.61 mlmg -1 cm -1 ). The solution (0.25 ml) was placed in a 1.5 ml tube and a solution (0.0063 ml; corresponding to approximately 2.55 equivalents per antibody molecule) containing 27.6 mM succinimidyl-4-(N- maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.), in DMSO at room temperature and reacted at room temperature for 2 hours. This reaction solution was purified using the general method D-2 to obtain 0.7 ml of a solution containing about 5 mg of SMCC-derivatized antibody.
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления DMSO (0,045 мл) и раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 (0,015 мл; что соответствует 2,4 эквивалентов на молекулу антитела), в DMSO к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 16 часов с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом.Conjugation of the antibody to the drug-linker moiety: after adding DMSO (0.045 ml) and a solution containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 1 (0.015 ml; corresponding to 2.4 equivalents per antibody molecule) in DMSO to the above solution at room temperature, stirring was carried out at room temperature for 16 hours using a rotary tube shaker (MTR-103, AS ONE Corporation) to conjugate the drug-linker fragment to the antibody.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий метод D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), с получением 3,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство. После чего, раствор концентрировали с помощью общего способа A.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) to obtain 3.5 ml of a solution containing the named antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated using the general method A.
Физико-химические характеристики: используя общий способ E (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 ( measured average value) and ε D,370 =19000 (mean average value), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 3,85 мг/мл, выход антитела: 0,8 мг (16%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 2,9.Antibody concentration: 3.85 mg/ml, antibody yield: 0.8 mg (16%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 2.9.
Пример 36. Конъюгат антитело-лекарственное средство (35)Example 36 Antibody Drug Conjugate (35)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (35)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (35)
Дериватизация антитела с помощью SMCC: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 20 мг/мл путем замены среды на PBS6.5/EDTA, используя общий способ C-2 и общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1). Раствор (0,25 мл) помещали в пробирку объемом 1,5 мл, и добавляли к нему раствор (0,0125 мл; что соответствует приблизительно 5,1 эквивалентам на молекулу антитела), содержащий 27,6 мМ сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.), в DMSO при комнатной температуре и подвергали взаимодействию при комнатной температуре в течение 2 часов. Этот реакционный раствор подвергали очистке, используя общий способ D-2, с получением 0,7 мл раствора, содержащего около 5 мг SMCC-дериватизированного антитела.Antibody derivatization with SMCC: M30-H1-L4P antibody prepared in Reference Example 2 was prepared at 20 mg/mL antibody concentration by medium change to PBS6.5/EDTA using General Method C-2 and General Method B (as absorption coefficient at 280 nm used the value of 1.61 mlmg -1 cm -1 ). The solution (0.25 ml) was placed in a 1.5 ml tube and a solution (0.0125 ml; corresponding to approximately 5.1 equivalents per antibody molecule) containing 27.6 mM succinimidyl-4-(N -maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC, Thermo Fisher Scientific Inc.), in DMSO at room temperature and reacted at room temperature for 2 hours. This reaction solution was purified using the general method D-2 to obtain 0.7 ml of a solution containing about 5 mg of SMCC-derivatized antibody.
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления DMSO (0,03 мл) и раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 примера 35 (0,03 мл; что соответствует приблизительно 4,8 эквивалентам на молекулу антитела) в DMSO к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 16 часов с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом.Conjugation of an antibody to a drug-linker moiety: after adding DMSO (0.03 ml) and a solution containing 10 mM of the compound obtained in
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), с получением 3,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство. После чего, раствор концентрировали с помощью общего способа A.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) to obtain 3.5 ml of a solution containing the named antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated using the general method A.
Физико-химические характеристики: используя общий способ E (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 ( measured average value) and ε D,370 =19000 (mean average value), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 2,43 мг/мл, выход антитела: 0,5 мг (10%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 4,2.Antibody concentration: 2.43 mg/ml, antibody yield: 0.5 mg (10%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 4.2.
Пример 37. Конъюгат антитело-лекарственное средство (36)Example 37 Antibody Drug Conjugate (36)
Синтез 1: N-{8-[(2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси]-8-оксооктаноил}глицилглицил-L-фенилаланил-N-(4-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]-хинолин-1-ил]амино}-4-оксобутил)глицинамидSynthesis 1: N-{8-[(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy]-8-oxooctanoyl}glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-(4-{[(1S,9S)-9-ethyl- 5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6, 7]indolizino[1,2-b]-quinolin-1-yl]amino}-4-oxobutyl)glycinamide
Соединение (84,0 мг, 0,100 ммоль), полученное в синтезе 2 примера 2, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 3 примера 2, используя ди(N-сукцинимидил)суберат вместо N-сукцинимидил 6-малеимидгексаноата, с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (77,1 мг, 71%).The compound (84.0 mg, 0.100 mmol) obtained in Synthesis 2 of Example 2 was reacted in the same manner as in Synthesis 3 of Example 2 using di(N-succinimidyl)suberate instead of N-succinimidyl 6-maleimidehexanoate to give the title compounds as a pale yellow solid (77.1 mg, 71%).
1H-ЯМР (DMSO-D6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,2 Гц), 1,21-1,38 (4H, м), 1,43-1,50 (2H, м), 1,55-1,63 (2H, м), 1,68-1,76 (2H, м), 1,80-1,91 (2H, м), 2,07-2,22 (6H, м), 2,40 (3H, с), 2,60-2,67 (2H, м), 2,76-2,84 (5H, м), 2,97-3,22 (5H, м), 3,56-3,76 (6H, м), 4,40-4,50 (1H, м), 5,20 (2H, кв, J=18,8 Гц), 5,37-5,48 (2H, м), 5,53-5,62 (1H, м), 6,54 (1H, с), 7,15-7,28 (5H, м), 7,31 (1H, с), 7,71 (1H, т, J=5,5 Гц), 7,80 (1H, д, J=10,9 Гц), 8,04 (1H, т, J=5,9 Гц), 8,09 (1H, т, J=5,9 Гц), 8,14 (1H, д, J=7,8 Гц), 8,26 (1H, т, J=5,9 Гц), 8,47 (1H, д, J=8,6 Гц). 1 H-NMR (DMSO-D 6 ) δ: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.21-1.38 (4H, m), 1.43-1.50 (2H , m), 1.55-1.63 (2H, m), 1.68-1.76 (2H, m), 1.80-1.91 (2H, m), 2.07-2.22 (6H, m), 2.40 (3H, s), 2.60-2.67 (2H, m), 2.76-2.84 (5H, m), 2.97-3.22 (5H , m), 3.56-3.76 (6H, m), 4.40-4.50 (1H, m), 5.20 (2H, q, J=18.8 Hz), 5.37- 5.48(2H, m), 5.53-5.62(1H, m), 6.54(1H, s), 7.15-7.28(5H, m), 7.31(1H, s), 7.71 (1H, t, J=5.5 Hz), 7.80 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.04 (1H, t, J=5.9 Hz) , 8.09 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.14 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.26 (1H, t, J=5.9 Hz), 8 .47 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 1092 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 1092 (M+H) + .
Синтез 2: Конъюгат антитело-лекарственное средство (36)Synthesis 2: Antibody Drug Conjugate (36)
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 20 мг/мл путем замены среды на PBS6.5/EDTA, используя общий способ C-2 и общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1). Раствор (0,25 мл) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему раствор, содержащий 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 (0,025 мл; что соответствует приблизительно 3,7 эквивалентам на молекулу антитела), в DMSO при комнатной температуре, и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, используя роторный встряхиватель пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation), с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом.Conjugation of Antibody to Drug-Linker Fragment: M30-H1-L4P The antibody obtained in Reference Example 2 was prepared at an antibody concentration of 20 mg/mL by changing the medium to PBS6.5/EDTA using General Method C-2 and General Method B (the value of 1.61 mlmg -1 cm -1 was used as the absorption coefficient at 280 nm). The solution (0.25 ml) was placed in a 1.5 ml tube and a solution containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 1 (0.025 ml; corresponding to approximately 3.7 equivalents per antibody molecule) in DMSO was added to it at room temperature. temperature, and stirred at room temperature for 16 hours using a rotary tube shaker (MTR-103, AS ONE Corporation) to conjugate the drug-linker fragment to the antibody.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), с получением 3,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство. После чего, раствор концентрировали с помощью общего способа A.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) to obtain 3.5 ml of a solution containing the named antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated using the general method A.
Физико-химические характеристики: используя общий способ E (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 ( measured average value) and ε D,370 =19000 (mean average value), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 6,25 мг/мл, выход антитела: 1,3 мг (26%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,2.Antibody concentration: 6.25 mg/ml, antibody yield: 1.3 mg (26%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.2.
Пример 38. Конъюгат антитело-лекарственное средство (37)Example 38 Antibody Drug Conjugate (37)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (37)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (37)
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 20 мг/мл путем замены среды на PBS6.5/EDTA, используя общий способ C-2 и общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1). Раствор (0,5 мл) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и затем добавляли DMSO (0,025 мл) и раствор, содержащий 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 примера 37 (0,025 мл; что соответствует приблизительно 7,4 эквивалентов на молекулу антитела) в DMSO при комнатной температуре, и перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов, используя роторный встряхиватель пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation), с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом.Conjugation of Antibody to Drug-Linker Fragment: M30-H1-L4P The antibody obtained in Reference Example 2 was prepared at an antibody concentration of 20 mg/mL by changing the medium to PBS6.5/EDTA using General Method C-2 and General Method B (the value of 1.61 mlmg -1 cm -1 was used as the absorption coefficient at 280 nm). The solution (0.5 ml) was placed in a 1.5 ml tube and then DMSO (0.025 ml) and a solution containing 10 mM of the compound obtained in
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), с получением 3,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство. После чего, раствор концентрировали с помощью общего способа A.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) to obtain 3.5 ml of a solution containing the named antibody-drug conjugate. Thereafter, the solution was concentrated using the general method A.
Физико-химические характеристики: используя общий способ E (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 ( measured average value) and ε D,370 =19000 (mean average value), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 4,36 мг/мл, выход антитела: 0,9 мг (18%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 4,1.Antibody concentration: 4.36 mg/ml, antibody yield: 0.9 mg (18%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 4.1.
Пример 39. Конъюгат антитело-лекарственное средство (38)Example 39 Antibody Drug Conjugate (38)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (38)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (38)
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: анти-CD30 антитело, полученное в справочном примере 3, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6.5/EDTA, используя общий способ C-2 и общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,75 млмг-1см-1). Раствор (0,4 мл, 4 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл, затем добавляли DMSO (0,017 мл) и раствор, содержащий 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 примера 37 (0,023 мл; что соответствует 9 эквивалентам на молекулу антитела) в DMSO при комнатной температуре, и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов, используя роторный встряхиватель пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation), с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом.Conjugation of Antibody to Drug-Linker Fragment: The anti-CD30 antibody obtained in Reference Example 3 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL by changing the medium to PBS6.5/EDTA using General Method C-2 and General Method B (in 1.75 mlmg -1 cm -1 was used as the absorbance at 280 nm). The solution (0.4 ml, 4 mg antibody) was placed in a 1.5 ml tube, followed by the addition of DMSO (0.017 ml) and a solution containing 10 mM of the compound from Example 37 Synthesis 1 (0.023 ml; corresponding to 9 equivalents per antibody molecule) in DMSO at room temperature, and stirred at room temperature for 4 hours using a rotary tube shaker (MTR-103, from AS ONE Corporation) to conjugate the drug-linker fragment to the antibody.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), с получением 2,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) to obtain 2.5 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
Физико-химические характеристики: используя общий способ E (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=270400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=2670 (измеренное значение) и εD,370=15820 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =270400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =2670 ( measured value) and ε D,370 =15820 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 0,55 мг/мл, выход антитела: 1,4 мг (34%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 2,7.Antibody concentration: 0.55 mg/ml, antibody yield: 1.4 mg (34%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 2.7.
Пример 40. Конъюгат антитело-лекарственное средство (39)Example 40 Antibody Drug Conjugate (39)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (39)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (39)
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: анти-CD33 антитело, полученное в справочном примере 4, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6.5/EDTA, используя общий способ C-2 и общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,66 млмг-1см-1). Раствор (0,4 мл, 4 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и затем добавляли DMSO (0,017 мл) и раствор, содержащий 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 примера 37 (0,023 мл; что соответствует 9 эквивалентам на молекулу антитела), в DMSO при комнатной температуре, и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов, используя роторный встряхиватель пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation), с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом.Conjugation of Antibody to Drug-Linker Fragment: The anti-CD33 antibody prepared in Reference Example 4 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL by changing the medium to PBS6.5/EDTA using General Method C-2 and General Method B (in 1.66 mlmg -1 cm -1 was used as the absorbance at 280 nm). The solution (0.4 ml, 4 mg antibody) was placed in a 1.5 ml tube and then DMSO (0.017 ml) and a solution containing 10 mM of the compound obtained in
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), с получением 2,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) to obtain 2.5 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
Физико-химические характеристики: используя общий способ E (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=256400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=2670 (измеренное значение) и εD,370=15820 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E (the following values were used as absorbance values: ε A,280 =256400 (calculated estimate), ε A,370 =0 (calculated estimate), ε D,280 =2670 ( measured value) and ε D,370 =15820 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 0,93 мг/мл, выход антитела: 2,3 мг (58%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 4,0.Antibody concentration: 0.93 mg/mL, antibody yield: 2.3 mg (58%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 4.0.
Пример 41. Конъюгат антитело-лекарственное средство (40)Example 41 Antibody Drug Conjugate (40)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (40)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (40)
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: анти-CD70 антитело, полученное в справочном примере 5, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6.5/EDTA, используя общий способ C-2 и общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,69 млмг-1см-1). Раствор (0,4 мл, 4 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл, затем добавляли DMSO (0,017 мл) и раствор, содержащий 10 мМ соединения, полученного в синтезе 1 примера 37 (0,023 мл; что соответствует 9 эквивалентам на молекулу антитела), в DMSO при комнатной температуре, и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов, используя роторный встряхиватель пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation), с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом.Conjugation of Antibody to Drug-Linker Fragment: The anti-CD70 antibody obtained in Reference Example 5 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL by changing the medium to PBS6.5/EDTA using General Method C-2 and General Method B (in the value of 1.69 mlmg -1 cm -1 was used as the absorption coefficient at 280 nm). The solution (0.4 ml, 4 mg antibody) was placed in a 1.5 ml tube, followed by the addition of DMSO (0.017 ml) and a solution containing 10 mM of the compound from Example 37 Synthesis 1 (0.023 ml; corresponding to 9 equivalents per antibody molecule) in DMSO at room temperature and stirred at room temperature for 4 hours using a rotary tube shaker (MTR-103, from AS ONE Corporation) to conjugate the drug-linker fragment to the antibody.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), с получением 2,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) to obtain 2.5 ml of a solution containing the title antibody-drug conjugate.
Физико-химические характеристики: используя общий способ E (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=262400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=2670 (измеренное значение) и εD,370=15820 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =262400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =2670 ( measured value) and ε D,370 =15820 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,04 мг/мл, выход антитела: 2,6 мг (65%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 4,1.Antibody concentration: 1.04 mg/mL, antibody yield: 2.6 mg (65%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 4.1.
Пример 42. 2-(2-Аминоэтокси)-N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]ацетамид Example 42 2-(2-Aminoethoxy)-N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10, 13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3 ' ,4 ' :6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]acetamide
Синтез 1: Трет-бутил [2-(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)этил]карбаматSynthesis 1: Tert-butyl [2-(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10, 13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)ethyl]carbamate
Мезилат соединения (4) (3,10 г, 5,47 моль) подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 1 примера 1, используя {2-[(трет-бутоксикарбонил)амино]этокси}уксусную кислоту (J. Med. Chem., 1992, vol. 35, pp. 2928) (1,55 г, 6,01 ммоль) вместо 4-(трет-бутоксикарбониламино)бутановой кислоты, с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (2,56 г, 73%).Compound (4) mesylate (3.10 g, 5.47 mol) was reacted in the same manner as in
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,3 Гц), 1,26 (9H, с), 1,81-1,91 (2H, м), 2,13-2,22 (2H, м), 2,40 (3H, с), 3,08-3,26 (4H, м), 3,43-3,53 (2H, м), 4,00 (1H, д, J=15,1 Гц), 4,05 (1H, д, J=15,1 Гц), 5,14 (1H, д, J=18,7 Гц), 5,22 (1H, д, J=18,7 Гц), 5,40 (1H, д, J=16,6 Гц), 5,44 (1H, д, J=16,6 Гц), 5,59-5,66 (1H, м), 6,53 (1H, с), 6,86 (1H, т, J=5,4 Гц), 7,31 (1H, с), 7,79 (1H, д, J=10,9 Гц), 8,49 (1H, д, J=9,1 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.26 (9H, s), 1.81-1.91 (2H, m), 2.13-2.22(2H, m), 2.40(3H, s), 3.08-3.26(4H, m), 3.43-3.53(2H, m) , 4.00 (1H, d, J=15.1 Hz), 4.05 (1H, d, J=15.1 Hz), 5.14 (1H, d, J=18.7 Hz), 5 .22 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.40 (1H, d, J=16.6 Hz), 5.44 (1H, d, J=16.6 Hz), 5.59 -5.66(1H, m), 6.53(1H, s), 6.86(1H, t, J=5.4Hz), 7.31(1H, s), 7.79(1H, d, J=10.9 Hz), 8.49 (1H, d, J=9.1 Hz).
MS (APCI) m/z: 637 (M+H)+.MS (APCI) m/z: 637 (M+H) + .
Синтез 2: 2-(2-Аминоэтокси)-N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]ацетамидSynthesis 2: 2-(2-Aminoethoxy)-N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10, 13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]acetamide
Соединение (1,50 г, 2,36 моль), полученное в синтезе 1, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 2 примера 1, с получением трифторгидрохлорида названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (1,50 г, количественно). Было подтверждено присутствие этого соединения в опухоли мыши с инкорпорированным раком, которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (41).The compound (1.50 g, 2.36 mol) obtained in
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,5 Гц), 1,81-1,92 (2H, м), 2,15-2,23 (2H, м), 2,41 (3H, с), 3,05 (2H, т, J=5,1 Гц), 3,15-3,23 (2H, м), 3,71 (2H, т, J=5,1 Гц), 4,10 (2H, с), 5,19 (1H, д, J=18,7 Гц), 5,24 (1H, д, J=18,7 Гц), 5,43 (2H, с), 5,58-5,66 (1H, м), 6,55 (1H, с), 7,33 (1H, с), 7,73-7,84 (4H, м), 8,55 (1H, д, J=9,1 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.87 (3H, t, J=7.5 Hz), 1.81-1.92 (2H, m), 2.15-2, 23 (2H, m), 2.41 (3H, s), 3.05 (2H, t, J=5.1 Hz), 3.15-3.23 (2H, m), 3.71 (2H , t, J=5.1 Hz), 4.10 (2H, s), 5.19 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.24 (1H, d, J=18.7 Hz ), 5.43(2H, s), 5.58-5.66(1H, m), 6.55(1H, s), 7.33(1H, s), 7.73-7.84( 4H, m), 8.55 (1H, d, J=9.1 Hz).
MS (APCI) m/z: 537 (M+H)+.MS (APCI) m/z: 537 (M+H) + .
Пример 43. Конъюгат антитело-лекарственное средство (41)Example 43 Antibody Drug Conjugate (41)
Синтез 1: N-(Трет-бутоксикарбонил)глицил-глицил-L-фенилаланил-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]-пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)этил]глицинамидSynthesis 1: N-(T-butoxycarbonyl)glycyl-glycyl-L-phenylalanyl-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl- 10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]-pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinoline -1-yl]amino}-2-oxoethoxy)ethyl]glycinamide
Соединение (554 мг, 0,85 ммоль) примера 42 подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 1 примера 2, с получением названного соединения (775 мг, 95%).The compound (554 mg, 0.85 mmol) of Example 42 was reacted in the same manner as in
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,85 (3H, т, J=7,3 Гц), 1,36 (9H, с), 1,78-1,89 (2H, м), 2,13-2,22 (2H, м), 2,39 (3H, с), 2,71 (1H, дд, J=13,4, 9,8 Гц), 2,95 (1H, дд, J=13,4, 4,3 Гц), 3,09-3,23 (1H, м), 3,23-3,32 (2H, м), 3,40-3,62 (8H, м), 3,73 (1H, дд, J=16,5, 5,5 Гц), 4,03 (2H, с), 4,39-4,47 (1H, м), 5,17 (1H, д, J=18,9 Гц), 5,25 (1H, д, J=18,9 Гц), 5,41 (1H, д, J=16,8 Гц), 5,45 (1H, д, J=16,8 Гц), 5,57-5,64 (1H, м), 6,54 (1H, с), 6,99 (1H, т, J=5,8 Гц), 7,13-7,26 (5H, м), 7,31 (1H, с), 7,76-7,82 (2H, м), 7,90 (1H, т, J=5,2 Гц), 8,13 (1H, д, J=7,9 Гц), 8,27 (1H, т, J=5,8 Гц), 8,49 (1H, д, J=8,5 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.85 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.36 (9H, s), 1.78-1.89 (2H, m), 2.13-2.22 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.71 (1H, dd, J=13.4, 9.8 Hz), 2.95 (1H , dd, J=13.4, 4.3 Hz), 3.09-3.23 (1H, m), 3.23-3.32 (2H, m), 3.40-3.62 (8H , m), 3.73 (1H, dd, J=16.5, 5.5 Hz), 4.03 (2H, s), 4.39-4.47 (1H, m), 5.17 ( 1H, d, J=18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.41 (1H, d, J=16.8 Hz), 5.45 (1H, d, J=16.8 Hz), 5.57-5.64 (1H, m), 6.54 (1H, s), 6.99 (1H, t, J=5.8 Hz), 7, 13-7.26(5H, m), 7.31(1H, s), 7.76-7.82(2H, m), 7.90(1H, t, J=5.2 Hz), 8 .13 (1H, d, J=7.9 Hz), 8.27 (1H, t, J=5.8 Hz), 8.49 (1H, d, J=8.5 Hz).
MS (APCI) m/z: 955 (M+H)+.MS (APCI) m/z: 955 (M+H) + .
Синтез 2: Глицил-глицил-L-фенилаланил-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]-хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)этил]глицинамид трифторацетатSynthesis 2: Glycyl-glycyl-L-phenylalanyl-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2 ,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]-quinolin-1-yl]amino} -2-oxoethoxy)ethyl]glycinamide trifluoroacetate
Соединение (630 мг, 0,659 ммоль), полученное в синтезе 1, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 2 примера 2, с получением названного соединения (588 мг, 92%).The compound (630 mg, 0.659 mmol) obtained in
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, т, J=7,3 Гц), 1,79-1,90 (2H, м), 2,13-2,22 (2H, м), 2,39 (3H, с), 2,71 (1H, дд, J=13,4, 10,1 Гц), 2,99 (1H, дд, J=13,4, 4,3 Гц), 3,09-3,23 (1H, м), 3,24-3,32 (3H, м), 3,41-3,71 (7H, м), 3,86 (1H, дд, J=16,8, 5,8 Гц), 4,04 (2H, с), 4,52 (1H, тд, J=9,0, 4,1 Гц), 5,17 (1H, д, J=18,9 Гц), 5,25 (1H, д, J=18,9 Гц), 5,41 (1H, д, J=16,5 Гц), 5,45 (1H, д, J=16,5 Гц), 5,56-5,65 (1H, м), 6,55 (1H, с), 7,13-7,26 (5H, м), 7,32 (1H, с), 7,80 (1H, д, J=11,0 Гц), 7,87-8,01 (4H, м), 8,29-8,36 (2H, м), 8,46-8,55 (2H, м). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.86 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.79-1.90 (2H, m), 2.13-2, 22 (2H, m), 2.39 (3H, s), 2.71 (1H, dd, J=13.4, 10.1 Hz), 2.99 (1H, dd, J=13.4, 4.3 Hz), 3.09-3.23(1H, m), 3.24-3.32(3H, m), 3.41-3.71(7H, m), 3.86(1H , dd, J=16.8, 5.8 Hz), 4.04 (2H, s), 4.52 (1H, td, J=9.0, 4.1 Hz), 5.17 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.25(1H, d, J=18.9 Hz), 5.41(1H, d, J=16.5 Hz), 5.45(1H, d, J=16.5 Hz), 5.56-5.65(1H, m), 6.55(1H, s), 7.13-7.26(5H, m), 7.32(1H, s ), 7.80 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.87-8.01 (4H, m), 8.29-8.36 (2H, m), 8.46-8, 55 (2H, m).
MS (APCI) m/z: 855 (M+H)+.MS (APCI) m/z: 855 (M+H) + .
Синтез 3: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]глицил-глицил-L-фенилаланил-N-[2-(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]-хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)этил]глицинамидSynthesis 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]glycyl-glycyl-L-phenylalanyl-N-[2-(2-{[( 1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano [3',4':6,7]indolizino[1,2-b]-quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)ethyl]glycinamide
Соединение (240 мг, 0,247 ммоль), полученное в синтезе 2, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 3 примера 2, с получением названного соединения (162 мг, 62%).The compound (240 mg, 0.247 mmol) obtained in Synthesis 2 was reacted in the same manner as in Synthesis 3 of Example 2 to give the title compound (162 mg, 62%).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, т, J=7,6 Гц), 1,13-1,22 (2H, м), 1,40-1,51 (4H, м), 1,78-1,90 (2H, м), 2,09 (2H, т, J=7,6 Гц), 2,14-2,21 (2H, м), 2,39 (3H, с), 2,74 (1H, дд, J=13,6, 9,7 Гц), 2,96 (1H, дд, J=13,6, 4,5 Гц), 3,08-3,24 (1H, м), 3,24-3,30 (1H, м), 3,33-3,40 (4H, м), 3,47-3,68 (7H, м), 3,72 (1H, дд, J=16,6, 5,7 Гц), 4,03 (2H, с), 4,42 (1H, тд, J=8,6, 4,2 Гц), 5,17 (1H, д, J=18,7 Гц), 5,25 (1H, д, J=18,7 Гц), 5,40 (1H, д, J=17,2 Гц), 5,44 (1H, д, J=17,2 Гц), 5,57-5,64 (1H, м), 6,52 (1H, с), 6,99 (2H, с), 7,13-7,25 (5H, м), 7,31 (1H, с), 7,74-7,81 (2H, м), 7,99 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,03-8,11 (2H, м), 8,22 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,47 (1H, д, J=9,1 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.86 (3H, t, J=7.6 Hz), 1.13-1.22 (2H, m), 1.40-1, 51 (4H, m), 1.78-1.90 (2H, m), 2.09 (2H, t, J=7.6 Hz), 2.14-2.21 (2H, m), 2 .39 (3H, s), 2.74 (1H, dd, J=13.6, 9.7 Hz), 2.96 (1H, dd, J=13.6, 4.5 Hz), 3, 08-3.24 (1H, m), 3.24-3.30 (1H, m), 3.33-3.40 (4H, m), 3.47-3.68 (7H, m), 3.72 (1H, dd, J=16.6, 5.7 Hz), 4.03 (2H, s), 4.42 (1H, td, J=8.6, 4.2 Hz), 5 .17 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.7 Hz), 5.40 (1H, d, J=17.2 Hz), 5.44 (1H, d, J=17.2 Hz), 5.57-5.64 (1H, m), 6.52 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7.13-7, 25(5H, m), 7.31(1H, s), 7.74-7.81(2H, m), 7.99(1H, t, J=5.7Hz), 8.03-8 .11 (2H, m), 8.22 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.47 (1H, d, J=9.1 Hz).
MS (APCI) m/z: 1048 (M+H)+.MS (APCI) m/z: 1048 (M+H) + .
Синтез 4: Конъюгат антитело-лекарственное средство (41)Synthesis 4: Antibody Drug Conjugate (41)
Используя M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, и соединение, полученное в синтезе 3, получали названный конъюгат антитело-лекарственное средство таким же образом, как в синтезе 2 примера 29.Using the M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 and the compound obtained in Synthesis 3, the title antibody-drug conjugate was prepared in the same manner as in Synthesis 2 of Example 29.
Концентрация антитела: 12,0 мг/мл, выход антитела: 8,4 мг (67%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,5.Antibody concentration: 12.0 mg/ml, antibody yield: 8.4 mg (67%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.5.
Пример 44. Конъюгат антитело-лекарственное средство (42)Example 44 Antibody Drug Conjugate (42)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (42)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (42)
Используя M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, и соединение, полученное в синтезе 3 примера 43, получали названный конъюгат антитело-лекарственное средство таким же образом, как в синтезе 1 примера 5.Using the M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 and the compound obtained in Synthesis 3 of Example 43, the title antibody-drug conjugate was prepared in the same manner as in
Концентрация антитела: 0,83 мг/мл, выход антитела: 4,98 мг (40%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 7,2.Antibody concentration: 0.83 mg/ml, antibody yield: 4.98 mg (40%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 7.2.
Пример 45. Конъюгат антитело-лекарственное средство (43)Example 45 Antibody Drug Conjugate (43)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (43)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (43)
Используя M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, и соединение, полученное в синтезе 3 примера 43, получали названный конъюгат антитело-лекарственное средство таким же образом, как в синтезе 1 примера 4.Using the M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 and the compound obtained in Synthesis 3 of Example 43, the title antibody-drug conjugate was prepared in the same manner as in
Концентрация антитела: 1,06 мг/мл, выход антитела: 6,36 мг (51%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 6,3.Antibody concentration: 1.06 mg/ml, antibody yield: 6.36 mg (51%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.3.
Пример 46. Конъюгат антитело-лекарственное средство (44)Example 46 Antibody Drug Conjugate (44)
Смешивали практически все количества конъюгатов антитело-лекарственное средство, полученных в примерах 44 и 45. Раствор концентрировали с помощью общего способа A с получением названного конъюгата антитело-лекарственное средство.Substantially all amounts of the antibody-drug conjugates prepared in Examples 44 and 45 were mixed. The solution was concentrated using General Method A to give the title antibody-drug conjugate.
Концентрация антитела: 10,0 мг/мл, выход антитела: 10,21 мг, и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 6,6.Antibody concentration: 10.0 mg/mL, antibody yield: 10.21 mg, and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.6.
Пример 47.Example 47. Конъюгат антитело-лекарственное средство (45)Antibody drug conjugate (45)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (45)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (45)
Восстановление антитела: M30-H1-L4 антитело, полученное в справочном примере 1, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (1,25 мл, 12,5 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0287 мл; 3,4 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0625 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody Recovery: M30-H1-L4 The antibody obtained in Reference Example 1 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.61 mlmg was used as the absorbance at 280 nm -1 cm -1 ) and general method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксида (0,0267 мл) и диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 3 примера 43 (0,0439 мл; 5,2 эквивалентов на молекулу антитела), к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, его инкубировали на водяной бане при 15°C в течение 1 часа с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0066 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of the antibody to the drug-linker fragment: after adding dimethyl sulfoxide (0.0267 ml) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in synthesis 3 of example 43 (0.0439 ml; 5.2 equivalents per antibody molecule), to the mentioned above solution at room temperature, it was incubated in a water bath at 15°C for 1 hour in order to conjugate the drug-linker fragment with the antibody. An aqueous solution (0.0066 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at room temperature for an additional 20 minutes to terminate the drug-linker fragment reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство. После чего, раствор концентрировали с помощью общего способа A.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5193 (измеренное значение) и εD,370=20347 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physical and chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5193 (measured value) and ε D,370 =20347 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 10,0 мг/мл, выход антитела: 9,3 мг (74%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,7.Antibody concentration: 10.0 mg/mL, antibody yield: 9.3 mg (74%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.7.
Пример 48. Конъюгат антитело-лекарственное средство (46)Example 48 Antibody Drug Conjugate (46)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (46)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (46)
Восстановление антитела: M30-H1-L4 антитело, полученное в справочном примере 1, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (1,25 мл, 12,5 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0439 мл; 5,2 эквивалентов на молекулу антитела) (0,0287 мл; 3,4 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0625 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody Recovery: M30-H1-L4 The antibody obtained in Reference Example 1 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.61 mlmg was used as the absorbance at 280 nm -1 cm -1 ) and general method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора (0,0726 мл; 8,6 эквивалентов на молекулу антитела), содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 3 примера 43, к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, его инкубировали на водяной бане при 15°C в течение 1 часа с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,011 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of an antibody to a drug-linker fragment: after adding a dimethyl sulfoxide solution (0.0726 ml; 8.6 equivalents per antibody molecule) containing 10 mM of the compound obtained in synthesis 3 of example 43 to the above solution at room temperature, it was incubated in a water bath at 15°C for 1 hour to conjugate the drug-linker fragment with the antibody. An aqueous solution (0.011 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at room temperature for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker fragment reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство. После чего, раствор концентрировали с помощью общего способа A.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5193 (измеренное значение) и εD,370=20347 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5193 (measured value) and ε D,370 =20347 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 10,0 мг/мл, выход антитела: 7,8 мг (62%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 5,2.Antibody concentration: 10.0 mg/ml, antibody yield: 7.8 mg (62%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.2.
Пример 49. N-[(1S,9S)-9-Этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано-[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]-β-аланинамид Example 49 N-[(1S,9S)-9-Ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo[de]pyrano-[3 ' ,4 ' :6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]-β-alanineamide
Синтез 1: Трет-бутил (3-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо-[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-3-оксопропил)карбаматSynthesis 1: Tert-butyl (3-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15 -hexahydro-1H,12H-benzo-[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-3-oxopropyl)carbamate
Мезмлат соединения (4) (500 мг, 0,941 ммоль) подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 1 примера 1, используя N-(трет-бутоксикарбонил)-β-аланин вместо 4-(трет-бутоксикарбониламино)бутановой кислоты, с получением названного соединения в виде желтовато-коричневого твердого вещества (616 мг, количественно).Compound (4) mezmlate (500 mg, 0.941 mmol) was reacted in the same manner as in
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,2 Гц), 1,29 (9H, с), 1,86 (2H, дт, J=15,1, 7,3 Гц), 2,04-2,22 (2H, м), 2,31 (2H, т, J=6,8 Гц), 2,40 (3H, с), 3,10-3,26 (4H, м), 5,15 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,26 (1H, д, J=19,2 Гц), 5,42 (2H, дд, J=18,8, 16,4 Гц), 5,57 (1H, дт, J=8,5, 4,2 Гц), 6,53 (1H, с), 6,78 (1H, т, J=5,5 Гц), 7,30 (1H, с), 7,80 (1H, д, J=11,0 Гц), 8,46 (1H, д, J=8,6 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.29 (9H, s), 1.86 (2H, dt, J= 15.1, 7.3 Hz), 2.04-2.22 (2H, m), 2.31 (2H, t, J=6.8 Hz), 2.40 (3H, s), 3, 10-3.26 (4H, m), 5.15 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.26 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.42 (2H, dd , J=18.8, 16.4 Hz), 5.57 (1H, dt, J=8.5, 4.2 Hz), 6.53 (1H, s), 6.78 (1H, t, J=5.5 Hz), 7.30(1H, s), 7.80(1H, d, J=11.0 Hz), 8.46(1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 607 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 607 (M+H) + .
Синтез 2: N-[(1S,9S)-9-Этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано-[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]-β-аланинамидSynthesis 2: N-[(1S,9S)-9-Ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo[de]pyrano-[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]-β-alanine amide
Соединение, полученное в синтезе 1, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 2 примера 1, с получением трифторацетата названного соединения в виде желтого твердого вещества (499 мг, 86%).The compound obtained in
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,2 Гц), 1,86 (2H, дквин, J=14,6, 7,2, 7,2, 7,2, 7,2 Гц), 2,06-2,27 (1H, м), 2,41 (3H, с), 2,46-2,57 (2H, м), 3,08 (2H, т, J=6,8 Гц), 3,14-3,24 (2H, м), 5,22 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,29 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,43 (2H, с), 5,58 (1H, дт, J=8,5, 4,5 Гц), 6,55 (1H, с), 7,32 (1H, с), 7,74 (3H, шир.с), 7,82 (1H, д, J=11,0 Гц), 8,67 (1H, д, J=8,6 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.87 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.86 (2H, dquin, J=14.6, 7.2, 7 .2, 7.2, 7.2 Hz), 2.06-2.27 (1H, m), 2.41 (3H, s), 2.46-2.57 (2H, m), 3, 08 (2H, t, J=6.8 Hz), 3.14-3.24 (2H, m), 5.22 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.29 (1H, d , J=18.8 Hz), 5.43(2H, s), 5.58(1H, dt, J=8.5, 4.5 Hz), 6.55(1H, s), 7.32 (1H, s), 7.74 (3H, br s), 7.82 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.67 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 507 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 507 (M+H) + .
Пример 50. Конъюгат антитело-лекарственное средство (47)Example 50 Antibody Drug Conjugate (47)
Синтез 1: N-(трет-бутоксикарбонил)глицил-глицил-L-фенилаланилглицил-N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]-пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]-β-аланинамидSynthesis 1: N-(tert-butoxycarbonyl)glycyl-glycyl-L-phenylalanylglycyl-N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2 ,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]-pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]-β -alanineamide
Соединение (484 мг, 0,780 ммоль) примера 49 подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 1 примера 2, с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (626 мг, 87%).The compound (484 mg, 0.780 mmol) of Example 49 was reacted in the same manner as in
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,27-1,42 (9H, м), 1,77-1,93 (2H, м), 2,06-2,22 (2H, м), 2,36 (2H, т, J=7,2 Гц), 2,40 (3H, д, J=1,6 Гц), 2,44-2,54 (2H, м), 2,76 (1H, дд, J=14,5, 10,2 Гц), 3,02 (1H, дд, J=13,9, 4,5 Гц), 3,12-3,22 (2H, м), 3,52 (6H, д, J=6,3 Гц), 4,42-4,54 (1H, м), 5,19 (1H, д, J=19,2 Гц), 5,26 (1H, д, J=18,4 Гц), 5,42 (1H, дд, J=18,4, 16,4 Гц), 5,57 (1H, дт, J=8,7, 4,4 Гц), 6,53 (1H, с), 6,98 (1H, т, J=5,9 Гц), 7,14-7,28 (5H, м), 7,31 (1H, с), 7,77-7,84 (1H, м), 7,91 (1H, т, J=5,5 Гц), 8,16 (1H, д, J=7,8 Гц), 8,27 (1H, т, J=5,1 Гц), 8,52 (1H, д, J=9,0 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.27-1.42 (9H, m), 1.77-1, 93(2H, m), 2.06-2.22(2H, m), 2.36(2H, t, J=7.2Hz), 2.40(3H, d, J=1.6Hz) ), 2.44-2.54 (2H, m), 2.76 (1H, dd, J=14.5, 10.2 Hz), 3.02 (1H, dd, J=13.9, 4 .5 Hz), 3.12-3.22 (2H, m), 3.52 (6H, d, J=6.3 Hz), 4.42-4.54 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.4 Hz), 5.42 (1H, dd, J=18.4, 16.4 Hz), 5 .57(1H, dt, J=8.7, 4.4Hz), 6.53(1H, s), 6.98(1H, t, J=5.9Hz), 7.14-7, 28 (5H, m), 7.31 (1H, s), 7.77-7.84 (1H, m), 7.91 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.16 (1H , d, J=7.8 Hz), 8.27 (1H, t, J=5.1 Hz), 8.52 (1H, d, J=9.0 Hz).
Синтез 2: Глицил-глицил-L-фенилаланилглицил-N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]-хинолин-1-ил]-β-аланинамида трифторацетатSynthesis 2: Glycyl-glycyl-L-phenylalanylglycyl-N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10, 13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]-quinolin-1-yl]-β-alanine amide trifluoroacetate
Соединение (624 мг, 0,675 ммоль), полученное в синтезе 1, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 2 примера 2, с получением названного соединения в виде желтого твердого вещества (626 мг, 92%).The compound (624 mg, 0.675 mmol) obtained in
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,86 (2H, тт, J=14,5, 7,2 Гц), 2,07-2,22 (2H, м), 2,36 (2H, т, J=7,2 Гц), 2,40 (3H, с), 2,44-2,54 (2H, м), 2,75 (1H, дд, J=13,7, 9,8 Гц), 3,04 (1H, дд, J=13,7, 4,3 Гц), 3,12-3,22 (2H, м), 3,58 (2H, д, J=4,7 Гц), 3,69 (3H, тд, J=11,2, 5,7 Гц), 3,87 (1H, дд, J=17,0, 5,7 Гц), 4,54 (1H, м, J=17,8, 4,5 Гц), 5,19 (1H, д, J=19,2 Гц), 5,26 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,43 (2H, с), 5,51-5,60 (1H, м), 6,55 (1H, с), 7,14-7,29 (5H, м), 7,32 (1H, с), 7,81 (1H, д, J=10,9 Гц), 7,88 (1H, т, J=5,7 Гц), 7,97 (3H, шир.с), 8,29-8,38 (2H, м), 8,50 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,55 (1H, д, J=8,6 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.86 (2H, tt, J=14.5, 7.2 Hz) , 2.07-2.22(2H, m), 2.36(2H, t, J=7.2 Hz), 2.40(3H, s), 2.44-2.54(2H, m ), 2.75 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 3.04 (1H, dd, J=13.7, 4.3 Hz), 3.12-3.22 ( 2H, m), 3.58 (2H, d, J=4.7 Hz), 3.69 (3H, td, J=11.2, 5.7 Hz), 3.87 (1H, dd, J =17.0, 5.7 Hz), 4.54 (1H, m, J=17.8, 4.5 Hz), 5.19 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.43 (2H, s), 5.51-5.60 (1H, m), 6.55 (1H, s), 7.14-7, 29 (5H, m), 7.32 (1H, s), 7.81 (1H, d, J=10.9 Hz), 7.88 (1H, t, J=5.7 Hz), 7, 97 (3H, br s), 8.29-8.38 (2H, m), 8.50 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.55 (1H, d, J=8, 6 Hz).
MS (ESI) m/z: 825 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 825 (M+H) + .
Синтез 3: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-гексаноил]глицил-глицил-L-фенилаланилглицил-N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]-хинолин-1-ил]-β-аланинамидSynthesis 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-hexanoyl]glycyl-glycyl-L-phenylalanylglycyl-N-[(1S,9S)-9 -ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4' :6,7]indolizino[1,2-b]-quinolin-1-yl]-β-alanineamide
Соединение (60,0 мг, 0,0646 ммоль), полученное в синтезе 2, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 3 примера 2, с получением названного соединения в виде твердого вещества (14,0 мг, 21%).The compound (60.0 mg, 0.0646 mmol) obtained in Synthesis 2 was reacted in the same manner as in Synthesis 3 of Example 2 to give the title compound as a solid (14.0 mg, 21%).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, т, J=7,2 Гц), 1,12-1,22 (2H, м), 1,39-1,51 (4H, м), 1,79-1,91 (2H, м), 2,02-2,20 (2H, м), 2,07 (2H, т, J=7,4 Гц), 2,30-2,42 (4H, м), 2,40 (3H, с), 2,78 (1H, дд, J=14,1, 9,4 Гц), 3,02 (1H, дд, J=14,7, 4,9 Гц), 3,12-3,21 (2H, м), 3,26-3,42 (2H, м), 3,50-3,80 (6H, м), 4,40-4,51 (1H, м), 5,19 (1H, д, J=19,6 Гц), 5,26 (1H, д, J=19,2 Гц), 5,42 (2H, шир.с), 5,51-5,62 (1H, м), 6,53 (1H, с), 6,99 (2H, с), 7,13-7,28 (5H, м), 7,31 (1H, с), 7,74-7,84 (2H, м), 8,01 (1H, т, J=5,3 Гц), 8,06 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,14 (1H, д, J=8,2 Гц), 8,25 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,53 (1H, д, J=8,6 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.86 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.12-1.22 (2H, m), 1.39-1, 51 (4H, m), 1.79-1.91 (2H, m), 2.02-2.20 (2H, m), 2.07 (2H, t, J=7.4 Hz), 2 .30-2.42 (4H, m), 2.40 (3H, s), 2.78 (1H, dd, J=14.1, 9.4 Hz), 3.02 (1H, dd, J =14.7, 4.9 Hz), 3.12-3.21(2H, m), 3.26-3.42(2H, m), 3.50-3.80(6H, m), 4.40-4.51(1H, m), 5.19(1H, d, J=19.6Hz), 5.26(1H, d, J=19.2Hz), 5.42(2H , br s), 5.51-5.62(1H, m), 6.53(1H, s), 6.99(2H, s), 7.13-7.28(5H, m), 7.31(1H, s), 7.74-7.84(2H, m), 8.01(1H, t, J=5.3Hz), 8.06(1H, t, J=5, 7 Hz), 8.14 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.25 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.53 (1H, d, J=8.6 Hz ).
MS (ESI) m/z: 1018 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 1018 (M+H) + .
Синтез 4: Конъюгат антитело-лекарственное средство (47)Synthesis 4: Antibody Drug Conjugate (47)
Используя M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, и соединение, полученное в синтезе 3, получали названный конъюгат антитело-лекарственное средство таким же образом, как в синтезе 4 примера 2.Using the M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 and the compound obtained in Synthesis 3, the title antibody-drug conjugate was prepared in the same manner as in Synthesis 4 of Example 2.
Концентрация антитела: 12,27 мг/мл, выход антитела: 8,6 мг (69%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,4.Antibody concentration: 12.27 mg/ml, antibody yield: 8.6 mg (69%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.4.
Пример 51. Конъюгат антитело-лекарственное средство (48)Example 51 Antibody Drug Conjugate (48)
Синтез 1: N-[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-пропаноил]глицил-глицил-L-фенилаланилглицил-N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]-хинолин-1-ил]-β-аланинамидSynthesis 1: N-[3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-propanoyl]glycyl-glycyl-L-phenylalanylglycyl-N-[(1S,9S)-9 -ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4' :6,7]indolizino[1,2-b]-quinolin-1-yl]-β-alanineamide
Соединение (60,0 мг, 0,0646 ммоль), полученное в синтезе 2 примера 50, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 3 примера 2, используя N-сукцинимидил 3-малеимидпропионат вместо N-сукцинимидил 6-малеимидгексаноата, с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (36,0 мг, 57%).The compound (60.0 mg, 0.0646 mmol) obtained in Synthesis 2 of Example 50 was reacted in the same manner as in Synthesis 3 of Example 2 using N-succinimidyl 3-maleimide propionate instead of N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate to give of the title compound as a pale yellow solid (36.0 mg, 57%).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,85 (2H, дт, J=14,4, 7,5 Гц), 2,05-2,22 (2H, м), 2,40 (3H, с), 2,30-2,44 (5H, м), 2,73-2,84 (1H, м), 3,02 (1H, дд, J=13,9, 4,5 Гц), 3,17 (3H, д, J=5,1 Гц), 3,26-3,40 (2H, м), 3,41-3,81 (6H, м), 4,40-4,51 (1H, м), 5,19 (1H, д, J=19,2 Гц), 5,26 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,42 (2H, шир.с), 5,52-5,61 (1H, м), 6,53 (1H, с), 6,99 (2H, с), 7,13-7,28 (5H, м), 7,31 (1H, с), 7,80 (2H, д, J=10,2 Гц), 8,03 (1H, т, J=5,5 Гц), 8,12 (1H, д, J=8,2 Гц), 8,20-8,31 (2H, м), 8,52 (1H, д, J=8,6 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.86 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.85 (2H, dt, J=14.4, 7.5 Hz) , 2.05-2.22(2H, m), 2.40(3H, s), 2.30-2.44(5H, m), 2.73-2.84(1H, m), 3 .02 (1H, dd, J=13.9, 4.5 Hz), 3.17 (3H, d, J=5.1 Hz), 3.26-3.40 (2H, m), 3, 41-3.81 (6H, m), 4.40-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J= 18.8 Hz), 5.42 (2H, br s), 5.52-5.61 (1H, m), 6.53 (1H, s), 6.99 (2H, s), 7, 13-7.28(5H, m), 7.31(1H, s), 7.80(2H, d, J=10.2Hz), 8.03(1H, t, J=5.5Hz) ), 8.12 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.20-8.31 (2H, m), 8.52 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 976 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 976 (M+H) + .
Синтез 2: Конъюгат антитело-лекарственное средство (48)Synthesis 2: Antibody Drug Conjugate (48)
Используя M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, и соединение, полученное в синтезе 1, получали названный конъюгат антитело-лекарственное средство таким же образом, как в синтезе 4 примера 2.Using the M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 and the compound obtained in
Концентрация антитела: 11,59 мг/мл, выход антитела: 8,1 мг (65%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,7.Antibody concentration: 11.59 mg/mL, antibody yield: 8.1 mg (65%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.7.
Пример 52. Конъюгат антитело-лекарственное средство (49)Example 52 Antibody Drug Conjugate (49)
Синтез 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)пропаноил]амино})этокси]пропаноил}глицил-глицил-L-фенилаланилглицил-N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано-[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]-β-аланинамидSynthesis 1: N-{3-[2-(2-{[3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)propanoyl]amino})ethoxy]propanoyl}glycyl- glycyl-L-phenylalanylglycyl-N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro -1H,12H-benzo[de]pyrano-[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]-β-alanine amide
Соединение (60,0 мг, 0,0646 ммоль), полученное в синтезе 2 примера 50, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 3 примера 2, используя N-сукцинимидил 3-(2-(2-(3-малеинимидпропанамид)этокси)этокси)пропаноат вместо N-сукцинимидил 6-малеимидгексаноата, с получением названного соединения в виде твердого вещества (23,0 мг, 31%).The compound (60.0 mg, 0.0646 mmol) obtained in Synthesis 2 of Example 50 was reacted in the same manner as in Synthesis 3 of Example 2 using N-succinimidyl 3-(2-(2-(3-maleimide propanamide) ethoxy)ethoxy)propanoate instead of N-succinimidyl 6-maleimidehexanoate to give the title compound as a solid (23.0 mg, 31%).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,77-1,92 (2H, м), 2,07-2,21 (2H, м), 2,27-2,42 (6H, м), 2,40 (3H, с), 2,74-2,84 (1H, м), 2,97-3,06 (1H, м), 3,09-3,21 (4H, м), 3,25-3,39 (6H, м), 3,45 (4H, с), 3,50-3,80 (8H, м), 4,41-4,51 (1H, м), 5,19 (1H, д, J=18,4 Гц), 5,26 (1H, м, J=18,4 Гц), 5,42 (2H, шир.с), 5,51-5,61 (1H, м), 6,54 (1H, с), 7,00 (2H, с), 7,13-7,28 (5H, м), 7,31 (1H, с), 7,74-7,87 (2H, м), 7,93-8,07 (2H, м), 8,09-8,21 (2H, м), 8,26 (1H, шир.с), 8,54 (1H, д, J=8,6 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.86 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.77-1.92 (2H, m), 2.07-2, 21(2H, m), 2.27-2.42(6H, m), 2.40(3H, s), 2.74-2.84(1H, m), 2.97-3.06( 1H, m), 3.09-3.21(4H, m), 3.25-3.39(6H, m), 3.45(4H, s), 3.50-3.80(8H, m), 4.41-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=18.4 Hz), 5.26 (1H, m, J=18.4 Hz), 5, 42 (2H, br s), 5.51-5.61 (1H, m), 6.54 (1H, s), 7.00 (2H, s), 7.13-7.28 (5H, m), 7.31(1H, s), 7.74-7.87(2H, m), 7.93-8.07(2H, m), 8.09-8.21(2H, m) , 8.26 (1H, br s), 8.54 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 1135 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 1135 (M+H) + .
Синтез 2: Конъюгат антитело-лекарственное средство (49)Synthesis 2: Antibody Drug Conjugate (49)
Используя M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, и соединение, полученное в синтезе 1, получали названный конъюгат антитело-лекарственное средство таким же образом, как в синтезе 2 примера 29.Using the M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 and the compound obtained in
Концентрация антитела: 14,50 мг/мл, выход антитела: 10,2 мг (82%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,8.Antibody concentration: 14.50 mg/ml, antibody yield: 10.2 mg (82%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.8.
Пример 53. Конъюгат антитело-лекарственное средство (50)Example 53 Antibody Drug Conjugate (50)
Синтез 1: N-[19-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-17-оксо-4,7,10,13-тетраокса-16-азанонадекан-1-оил]глицил-глицил-L-фенилаланилглицил-N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]-β-аланинамидSynthesis 1: N-[19-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-17-oxo-4,7,10,13-tetraoxa-16-azanonedecane-1- oil]glycyl-glycyl-L-phenylalanylglycyl-N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13 ,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]-β-alanine amide
Соединение (60,0 мг, 0,0646 ммоль), полученное в синтезе 2 примера 50, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 3 примера 2, используя N-сукцинимидил 1-малеинимид-3-оксо-7,10,13,16-тетраокса-4-азанонадеканоат вместо N-сукцинимидил 6-малеимидгексаноата, с получением названного соединения в виде твердого вещества (23,0 мг, 29%).The compound (60.0 mg, 0.0646 mmol) obtained in Synthesis 2 of Example 50 was reacted in the same manner as in Synthesis 3 of Example 2 using N-succinimidyl 1-maleimide-3-oxo-7,10,13 ,16-tetraoxa-4-azanonedecanoate in place of N-succinimidyl 6-maleimidehexanoate to give the title compound as a solid (23.0 mg, 29%).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,86 (3H, т, J=7,0 Гц), 1,85 (2H, тт, J=14,6, 7,1 Гц), 2,06-2,22 (2H, м), 2,40 (3H, с), 2,28-2,43 (6H, м), 2,78 (1H, дд, J=13,7, 9,4 Гц), 3,02 (1H, дд, J=14,1, 3,9 Гц), 3,09-3,22 (4H, м), 3,27-3,41 (4H, м), 3,47 (12H, д, J=8,6 Гц), 3,53-3,81 (10H, м), 4,41-4,51 (1H, м), 5,19 (1H, д, J=19,2 Гц), 5,26 (1H, д, J=18,8 Гц), 5,42 (2H, шир.с), 5,53-5,61 (1H, м), 6,54 (1H, с), 7,00 (2H, с), 7,12-7,29 (5H, м), 7,31 (1H, с), 7,74-7,85 (2H, м), 8,03 (2H, д, J=6,6 Гц), 8,11-8,21 (2H, м), 8,27 (1H, т, J=5,9 Гц), 8,54 (1H, д, J=8,6 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.86 (3H, t, J=7.0 Hz), 1.85 (2H, tt, J=14.6, 7.1 Hz) , 2.06-2.22(2H, m), 2.40(3H, s), 2.28-2.43(6H, m), 2.78(1H, dd, J=13.7, 9.4 Hz), 3.02 (1H, dd, J=14.1, 3.9 Hz), 3.09-3.22 (4H, m), 3.27-3.41 (4H, m ), 3.47 (12H, d, J=8.6 Hz), 3.53-3.81 (10H, m), 4.41-4.51 (1H, m), 5.19 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.26 (1H, d, J=18.8 Hz), 5.42 (2H, br.s), 5.53-5.61 (1H, m), 6.54(1H, s), 7.00(2H, s), 7.12-7.29(5H, m), 7.31(1H, s), 7.74-7.85(2H, m), 8.03 (2H, d, J=6.6 Hz), 8.11-8.21 (2H, m), 8.27 (1H, t, J=5.9 Hz), 8, 54 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 1224 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 1224 (M+H) + .
Синтез 2: Конъюгат антитело-лекарственное средство (50)Synthesis 2: Antibody Drug Conjugate (50)
Используя M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, и соединение, полученное в синтезе 1, получали названный конъюгат антитело-лекарственное средство таким же образом, как в синтезе 4 примера 2.Using the M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 and the compound obtained in
Концентрация антитела: 13,47 мг/мл, выход антитела: 9,4 мг (75%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,1.Antibody concentration: 13.47 mg/ml, antibody yield: 9.4 mg (75%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.1.
Пример 54. Конъюгат антитело-лекарственное средство (51)Example 54 Antibody Drug Conjugate (51)
Синтез 1: Трет-бутил (6-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо-[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-6-оксогексил)карбаматSynthesis 1: Tert-butyl (6-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15 -hexahydro-1H,12H-benzo-[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-6-oxohexyl)carbamate
Мезилат соединения (4) (0,500 г, 0,882 ммоль) подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 1 примера 1, используя 6-(трет-бутоксикарбониламино)капроновую кислоту вместо 4-(трет-бутоксикарбониламино)бутановой кислоты, с получением названного соединения (0,620 г, количественно).Compound (4) mesylate (0.500 g, 0.882 mmol) was reacted in the same manner as in
1H-ЯМР (DMSO-d6) δ: 0,83 (3H, т, J=7,8 Гц), 1,14-1,28 (2H, м), 1,31 (9H, с), 1,47-1,61 (2H, м), 1,75-1,89 (2H, м), 2,04-2,17 (4H, м), 2,35 (3H, с), 2,81-2,88 (2H, м), 3,09-3,16 (2H, м), 5,10 (1H, д, J=19,4 Гц), 5,16 (1H, д, J=19,4 Гц), 5,39 (2H, с), 5,48-5,55 (1H, м), 6,50 (1H, с), 6,73-6,78 (1H, м), 7,26 (1H, с), 7,74 (1H, д, J=10,9 Гц), 8,39 (1H, д, J=9,0 Гц). 1 H-NMR (DMSO-d 6 ) δ: 0.83 (3H, t, J=7.8 Hz), 1.14-1.28 (2H, m), 1.31 (9H, s), 1.47-1.61(2H, m), 1.75-1.89(2H, m), 2.04-2.17(4H, m), 2.35(3H, s), 2, 81-2.88 (2H, m), 3.09-3.16 (2H, m), 5.10 (1H, d, J=19.4 Hz), 5.16 (1H, d, J= 19.4 Hz), 5.39(2H, s), 5.48-5.55(1H, m), 6.50(1H, s), 6.73-6.78(1H, m), 7.26 (1H, s), 7.74 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.39 (1H, d, J=9.0 Hz).
Синтез 2: 6-Амино-N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]-пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]гексанамида трифторацетатSynthesis 2: 6-Amino-N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15- hexahydro-1H,12H-benzo[de]-pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]hexanamide trifluoroacetate
Соединение (0,397 г, 0,611 ммоль), полученное в синтезе 1, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 2 примера 1, с получением названного соединения (0,342 г, 84%).The compound (0.397 g, 0.611 mmol) obtained in
1H-ЯМР (DMSO-d6) δ: 0,88 (3H, т, J=7,2 Гц), 1,31-1,41 (2H, м), 1,52-1,70 (4H, м), 1,80-1,94 (2H, м), 2,05-2,18 (2H, м), 2,21 (2H, т, J=7,4 Гц), 2,40 (3H, с), 2,81 (2H, т, J=7,4 Гц), 3,10-3,25 (2H, м), 3,33 (2H, шир.с), 5,18 (1H, д, J=19,8 Гц), 5,22 (1H, д, J=19,8 Гц), 5,41 (2H, д, J=16,6 Гц), 5,45 (2H, д, J=16,6 Гц), 5,53-5,60 (1H, м), 6,55 (1H, с), 7,32 (1H, с), 7,80 (1H, д, J=10,9 Гц), 8,49 (1H, д, J=9,2 Гц). 1 H-NMR (DMSO-d 6 ) δ: 0.88 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.31-1.41 (2H, m), 1.52-1.70 (4H , m), 1.80-1.94 (2H, m), 2.05-2.18 (2H, m), 2.21 (2H, t, J=7.4 Hz), 2.40 ( 3H, s), 2.81(2H, t, J=7.4Hz), 3.10-3.25(2H, m), 3.33(2H, br s), 5.18(1H , d, J=19.8 Hz), 5.22 (1H, d, J=19.8 Hz), 5.41 (2H, d, J=16.6 Hz), 5.45 (2H, d , J=16.6 Hz), 5.53-5.60(1H, m), 6.55(1H, s), 7.32(1H, s), 7.80(1H, d, J= 10.9 Hz), 8.49 (1H, d, J=9.2 Hz).
Синтез 3: N-(трет-бутоксикарбонил)глицил-глицил-L-фенилаланил-N-(6-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано-[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-6-оксогексил)глицинамидSynthesis 3: N-(tert-butoxycarbonyl)glycyl-glycyl-L-phenylalanyl-N-(6-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10.13 -dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano-[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinoline-1- yl]amino}-6-oxohexyl)glycinamide
Соединение (0,170 г, 0,516 ммоль), полученное в синтезе 2, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 1 примера 2, с получением названного соединения (0,225 г, 91%).The compound (0.170 g, 0.516 mmol) obtained in Synthesis 2 was reacted in the same manner as in
1H-ЯМР (DMSO-d6) δ: 0,88 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,43-1,70 (6H, м), 1,87 (2H, тд, J=15,0, 7,4 Гц), 2,10-2,22 (3H, м), 2,28-2,37 (1H, м), 2,42 (3H, с), 2,78-2,85 (1H, м), 3,01-3,10 (3H, м), 3,15-3,22 (2H, м), 3,54-3,61 (5H, м), 3,62-3,69 (1H, м), 4,44-4,53 (1H, м), 5,17 (1H, д, J=19,2 Гц), 5,25 (1H, д, J=19,2 Гц), 5,45 (2H, с), 5,54-5,61 (1H, м), 6,55 (1H, с), 7,02 (1H, т, J=6,1 Гц), 7,11-7,28 (5H, м), 7,33 (1H, с), 7,63-7,69 (1H, м), 7,82 (1H, д, J=11,0 Гц), 7,90-7,96 (1H, м), 8,17 (1H, д, J=7,8 Гц), 8,28 (1H, т, J=5,5 Гц), 8,46 (1H, д, J=9,0 Гц). 1 H-NMR (DMSO-d 6 ) δ: 0.88 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.43-1.70 (6H, m), 1.87 (2H, td, J =15.0, 7.4 Hz), 2.10-2.22(3H, m), 2.28-2.37(1H, m), 2.42(3H, s), 2.78- 2.85(1H, m), 3.01-3.10(3H, m), 3.15-3.22(2H, m), 3.54-3.61(5H, m), 3, 62-3.69 (1H, m), 4.44-4.53 (1H, m), 5.17 (1H, d, J=19.2 Hz), 5.25 (1H, d, J= 19.2 Hz), 5.45(2H, s), 5.54-5.61(1H, m), 6.55(1H, s), 7.02(1H, t, J=6.1 Hz), 7.11-7.28(5H, m), 7.33(1H, s), 7.63-7.69(1H, m), 7.82(1H, d, J=11, 0 Hz), 7.90-7.96 (1H, m), 8.17 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.28 (1H, t, J=5.5 Hz), 8 .46 (1H, d, J=9.0 Hz).
Синтез 4: Глицил-глицил-L-фенилаланил-N-(6-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-6-оксогексил)глицинамидSynthesis 4: Glycyl-glycyl-L-phenylalanyl-N-(6-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-10,13-dioxo-2,3,9,10, 13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-6-oxohexyl)glycinamide
Соединение (0,105 г, 0,108 ммоль), полученное в синтезе 3, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 2 примера 2, с получением названного соединения (0,068 мг, 65%).The compound (0.105 g, 0.108 mmol) obtained in Synthesis 3 was reacted in the same manner as in Synthesis 2 of Example 2 to give the title compound (0.068 mg, 65%).
1H-ЯМР (DMSO-d6) δ: 0,89 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,15-1,67 (6H, м), 1,79-1,97 (2H, м), 2,08-2,24 (4H, м), 2,42 (3H, с), 2,76-2,82 (1H, м), 3,00-3,10 (5H, м), 3,19 (1H, с), 3,50-3,63 (2H, м), 3,64-3,76 (3H, м), 3,84-3,92 (1H, м), 4,51-4,59 (1H, м), 5,17 (1H, д, J=19,4 Гц), 5,24 (1H, д, J=19,4 Гц), 5,44 (2H, с), 5,53-5,61 (1H, м), 6,55 (1H, шир.с), 7,15-7,29 (5H, м), 7,33 (1H, с), 7,72-7,78 (1H, м), 7,82 (1H, д, J=11,0 Гц), 7,96-8,08 (2H, м), 8,30-8,38 (2H, м), 8,46-8,56 (2H, м). 1 H-NMR (DMSO-d 6 ) δ: 0.89 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.15-1.67 (6H, m), 1.79-1.97 (2H , m), 2.08-2.24 (4H, m), 2.42 (3H, s), 2.76-2.82 (1H, m), 3.00-3.10 (5H, m ), 3.19(1H, s), 3.50-3.63(2H, m), 3.64-3.76(3H, m), 3.84-3.92(1H, m), 4.51-4.59(1H, m), 5.17(1H, d, J=19.4Hz), 5.24(1H, d, J=19.4Hz), 5.44(2H , s), 5.53-5.61(1H, m), 6.55(1H, br s), 7.15-7.29(5H, m), 7.33(1H, s), 7.72-7.78 (1H, m), 7.82 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.96-8.08 (2H, m), 8.30-8.38 ( 2H, m), 8.46-8.56 (2H, m).
Синтез 5: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-гексаноил]глицил-глицил-L-фенилаланил-N-(6-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-6-оксогексил)глицинамидSynthesis 5: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-hexanoyl]glycyl-glycyl-L-phenylalanyl-N-(6-{[(1S, 9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4' :6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-6-oxohexyl)glycinamide
Соединение (58 мг, 0,060 ммоль), полученное в синтезе 4, подвергали взаимодействию таким же образом, как в синтезе 3 примера 2, с получением названного соединения (39 мг, 62%).The compound (58 mg, 0.060 mmol) obtained in Synthesis 4 was reacted in the same manner as in Synthesis 3 of Example 2 to give the title compound (39 mg, 62%).
1H-ЯМР (CD3OD) δ: 0,99 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,27 (2H, тд, J=11,6, 6,1 Гц), 1,38-1,44 (2H, м), 1,50-1,63 (6H, м), 1,65-1,80 (2H, м), 1,89-1,98 (2H, м), 2,17-2,25 (3H, м), 2,26-2,36 (3H, м), 2,40 (3H, с), 2,95 (1H, дд, J=14,3, 9,2 Гц), 3,12 (1H, дд, J=13,7, 5,7 Гц), 3,15-3,25 (4H, м), 3,44 (2H, т, J=7,2 Гц), 3,65 (1H, д, J=17,2 Гц), 3,76 (1H, д, J=17,2 Гц), 3,79-3,86 (4H, м), 4,43 (1H, дд, J=8,9, 6,0 Гц), 5,10 (1H, д, J=18,9 Гц), 5,25 (1H, д, J=18,9 Гц), 5,35 (1H, д, J=16,6 Гц), 5,56 (1H, д, J=16,0 Гц), 5,60-5,64 (1H, м), 6,76 (2H, с), 7,12-7,24 (6H, м), 7,58 (1H, с), 7,60 (1H, д, J=10,9 Гц), 7,68 (1H, т, J=5,7 Гц). 1 H-NMR (CD 3 OD) δ: 0.99 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.27 (2H, td, J=11.6, 6.1 Hz), 1.38 -1.44(2H, m), 1.50-1.63(6H, m), 1.65-1.80(2H, m), 1.89-1.98(2H, m), 2 .17-2.25(3H, m), 2.26-2.36(3H, m), 2.40(3H, s), 2.95(1H, dd, J=14.3, 9, 2 Hz), 3.12 (1H, dd, J=13.7, 5.7 Hz), 3.15-3.25 (4H, m), 3.44 (2H, t, J=7.2 Hz), 3.65 (1H, d, J=17.2 Hz), 3.76 (1H, d, J=17.2 Hz), 3.79-3.86 (4H, m), 4, 43 (1H, dd, J=8.9, 6.0 Hz), 5.10 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.25 (1H, d, J=18.9 Hz), 5.35 (1H, d, J=16.6 Hz), 5.56 (1H, d, J=16.0 Hz), 5.60-5.64 (1H, m), 6.76 (2H , s), 7.12-7.24 (6H, m), 7.58 (1H, s), 7.60 (1H, d, J=10.9 Hz), 7.68 (1H, t, J=5.7 Hz).
MS (ESI) m/z: 1060 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 1060 (M+H) + .
Синтез 6: Конъюгат антитело-лекарственное средство (51)Synthesis 6: Antibody drug conjugate (51)
Восстановление антитела: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (1,0 мл) собирали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0147 мл; 2,3 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,050 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody recovery: M30-H1-L4P antibody prepared in Reference Example 2 was prepared at 10 mg/mL antibody concentration with PBS6.0/EDTA using General Method B (Absorbance at 280 nm was 1.61) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после инкубации раствора в течение 10 минут при 22°C, добавляли диметилсульфоксидный раствор, содержащий 10 мМ соединения, полученного в синтезе 5 (0,0295 мл; 4,6 эквивалентов на молекулу антитела), и инкубировали при 22°C в течение 40 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,00590 мл; 9,2 эквивалентов на молекулу антитела) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при 22°C в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of the antibody to the drug-linker moiety: after incubating the solution for 10 minutes at 22°C, a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound from Synthesis 5 (0.0295 ml; 4.6 equivalents per antibody molecule) was added, and incubated at 22° C. for 40 minutes to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.00590 ml; 9.2 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at 22° C. for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker fragment reaction. .
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (PBS7.4 использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (PBS7.4 was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 0,97 мг/мл, выход антитела: 5,82 мг (58%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 1,7.Antibody concentration: 0.97 mg/ml, antibody yield: 5.82 mg (58%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 1.7.
Пример 55. Конъюгат антитело-лекарственное средство (52)Example 55 Antibody Drug Conjugate (52)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (52)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (52)
Восстановление антитела: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (1,0 мл) собирали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0295 мл; 4,6 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,050 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody recovery: M30-H1-L4P antibody prepared in Reference Example 2 was prepared at 10 mg/mL antibody concentration with PBS6.0/EDTA using General Method B (Absorbance at 280 nm was 1.61) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после инкубации раствора в течение 10 минут при 22°C, добавляли к нему диметилсульфоксидный раствор, содержащий 10 мМ соединения, полученного в синтезе 5 примера 54 (0,0590 мл; 9,2 эквивалентов на молекулу антитела), и инкубировали при 22°C в течение 40 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0118 мл; 18,4 эквивалентов на молекулу антитела) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при 22°C в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of the antibody to the drug-linker moiety: After the solution was incubated for 10 minutes at 22°C, a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (PBS7.4 использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (PBS7.4 was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 0,94 мг/мл, выход антитела: 5,64 мг (56%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,1.Antibody concentration: 0.94 mg/ml, antibody yield: 5.64 mg (56%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.1.
Пример 56. Конъюгат антитело-лекарственное средство (53)Example 56 Antibody Drug Conjugate (53)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (53)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (53)
Восстановление антитела: M30-H1-L4 антитело, полученное в справочном примере 1, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (1,0 мл) собирали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0147 мл; 2,3 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,050 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of antibody: M30-H1-L4 antibody obtained in Reference Example 1 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using General Method B (Absorbance at 280 nm was 1.61) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после инкубации раствора при 22°C в течение 10 минут, добавляли к нему диметилсульфоксидный раствор, содержащий 10 мМ соединения, полученного в синтезе 5 примера 54 (0,0295 мл; 4,6 эквивалентов на молекулу антитела) и инкубировали при 22°C в течение 40 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,00590 мл; 9,2 эквивалентов на молекулу антитела) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при 22°C в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of the antibody to the drug-linker moiety: After the solution was incubated at 22°C for 10 minutes, a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (PBS7.4 использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (PBS7.4 was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,22 мг/мл, выход антитела: 7,32 мг (73%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 1,5.Antibody concentration: 1.22 mg/ml, antibody yield: 7.32 mg (73%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 1.5.
Пример 57. Конъюгат антитело-лекарственное средство (54)Example 57 Antibody Drug Conjugate (54)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (54)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (54)
Восстановление антитела: M30-H1-L4 антитело, полученное в справочном примере 1, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (1,0 мл) собирали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0295 мл; 4,6 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,050 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of antibody: M30-H1-L4 antibody obtained in Reference Example 1 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using General Method B (Absorbance at 280 nm was 1.61) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после инкубации раствора в течение 10 минут при 22°C, добавляли к нему диметилсульфоксидный раствор, содержащий 10 мМ соединения, полученного в синтезе 5 примера 54 (0,0590 мл; 9,2 эквивалентов на молекулу антитела), и инкубировали при 22°C в течение 40 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0118 мл; 18,4 эквивалентов на молекулу антитела) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при 22°C в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of the antibody to the drug-linker moiety: After the solution was incubated for 10 minutes at 22°C, a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (PBS7.4 использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (PBS7.4 was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physical and chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,06 мг/мл, выход антитела: 6,36 мг (64%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,0.Antibody concentration: 1.06 mg/ml, antibody yield: 6.36 mg (64%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.0.
Пример 58. Конъюгат антитело-лекарственное средство (55)Example 58 Antibody Drug Conjugate (55)
Синтез 1: ({N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]глицил}амино)метилацетатSynthesis 1: ({N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycyl}amino)methyl acetate
К смеси, содержащей N-9-флуоренилметоксикарбонилглицил-глицин (4,33 г, 12,2 ммоль), тетрагидрофуран (120 мл) и толуол (40,0 мл), добавляли пиридин (1,16 мл, 14,7 ммоль) и тетраацетат свинца (6,84 г, 14,7 ммоль) и кипятили с обратным холодильником в течение 5 часов. Затем реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры, нерастворимые вещества удаляли фильтрацией через целит, и раствор концентрировали при пониженном давлении. Полученный остаток растворяли в этилацетате и промывали водой и насыщенным солевым раствором, и затем органический слой сушили над безводным сульфатом магния. После удаления растворителя при пониженном давлении, полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [гексан:этилацетат=9:1 (по объему)-этилацетат] с получением названного соединения в виде бесцветного твердого вещества (3,00 г, 67%).Pyridine (1.16 ml, 14.7 mmol) was added to a mixture containing N-9-fluorenylmethoxycarbonylglycyl-glycine (4.33 g, 12.2 mmol), tetrahydrofuran (120 ml) and toluene (40.0 ml) and lead tetraacetate (6.84 g, 14.7 mmol) and refluxed for 5 hours. Then, the reaction solution was cooled to room temperature, insoluble matters were removed by filtration through Celite, and the solution was concentrated under reduced pressure. The resulting residue was dissolved in ethyl acetate and washed with water and brine, and then the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. After removing the solvent under reduced pressure, the resulting residue was purified by silica gel column chromatography [hexane:ethyl acetate=9:1 (v/v)-ethyl acetate] to give the title compound as a colorless solid (3.00 g, 67%).
1H-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 2,07 (3H, с), 3,90 (2H, д, J=5,1 Гц), 4,23 (1H, т, J=7,0 Гц), 4,46 (2H, д, J=6,6 Гц), 5,26 (2H, д, J=7,0 Гц), 5,32 (1H, brs), 6,96 (1H, шир.с), 7,32 (2H, т, J=7,3 Гц), 7,41 (2H, т, J=7,3 Гц), 7,59 (2H, д, J=7,3 Гц), 7,77 (2H, д, J=7,3 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 2.07 (3H, s), 3.90 (2H, d, J=5.1 Hz), 4.23 (1H, t, J=7, 0 Hz), 4.46 (2H, d, J=6.6 Hz), 5.26 (2H, d, J=7.0 Hz), 5.32 (1H, brs), 6.96 (1H , br s), 7.32 (2H, t, J=7.3 Hz), 7.41 (2H, t, J=7.3 Hz), 7.59 (2H, d, J=7, 3 Hz), 7.77 (2H, d, J=7.3 Hz).
Синтез 2: Бензил [({N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]глицил}амино)метокси]ацетатSynthesis 2: Benzyl [({N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycyl}amino)methoxy]acetate
К раствору соединения (3,68 г, 10,0 ммоль), полученного в синтезе 1, и бензилгликолата (4,99 г, 30,0 ммоль) в тетрагидрофуране (40,0 мл) добавляли при 0°C трет-бутоксид калия (2,24 г, 20,0 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. К реакционному раствору добавляли этилацетат и воду при 0°C и экстрагировали этилацетатом и хлороформом. Полученный органический слой сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении. Полученный остаток растворяли в диоксане (40,0 мл) и воде (10,0 мл), добавляли гидрокарбонат натрия (1,01 г, 12,0 ммоль) и 9-флуоренилметилхлороформиат (2,59 г, 10,0 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. К реакционному раствору добавляли воду и экстрагировали этилацетатом. Полученный органический слой сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [гексан:этилацетат=100:0 (по объему)-0:100] с получением названного соединения в виде бесцветного маслянистого вещества (1,88 г, 40%).To a solution of the compound (3.68 g, 10.0 mmol) obtained in
1H-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 3,84 (2H, д, J=5,5 Гц), 4,24 (3H, т, J=6,5 Гц), 4,49 (2H, д, J=6,7 Гц), 4,88 (2H, д, J=6,7 Гц), 5,15-5,27 (1H, м), 5,19 (2H, с), 6,74 (1H, шир.с), 7,31-7,39 (7H, м), 7,43 (2H, т, J=7,4 Гц), 7,61 (2H, д, J=7,4 Гц), 7,79 (2H, д, J=7,4 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 3.84 (2H, d, J=5.5 Hz), 4.24 (3H, t, J=6.5 Hz), 4.49 (2H , d, J=6.7 Hz), 4.88 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.15-5.27 (1H, m), 5.19 (2H, s), 6 .74 (1H, br s), 7.31-7.39 (7H, m), 7.43 (2H, t, J=7.4 Hz), 7.61 (2H, d, J=7 .4 Hz), 7.79 (2H, d, J=7.4 Hz).
Синтез 3: [({N-[(9H-Флуорен-9-илметокси)карбонил]глицил}амино)метокси]уксусная кислотаSynthesis 3: [({N-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycyl}amino)methoxy]acetic acid
Соединение (1,88 г, 3,96 ммоль), полученное в синтезе 2, растворяли в этаноле (40,0 мл) и этилацетате (20,0 мл). После добавления катализатора палладий на угле (376 мг), раствор перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре в течение 2 часов. Нерастворимые вещества удаляли фильтрацией через целит, и растворитель удаляли при пониженном давлении с получением названного соединения в виде бесцветного твердого вещества (1,52 г, количественно).The compound (1.88 g, 3.96 mmol) obtained in Synthesis 2 was dissolved in ethanol (40.0 ml) and ethyl acetate (20.0 ml). After adding the palladium-carbon catalyst (376 mg), the solution was stirred under a hydrogen atmosphere at room temperature for 2 hours. The insolubles were removed by filtration through Celite and the solvent was removed under reduced pressure to give the title compound as a colorless solid (1.52 g, quantitatively).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 3,62 (2H, д, J=6,3 Гц), 3,97 (2H, с), 4,18-4,32 (3H, м), 4,60 (2H, д, J=6,7 Гц), 7,29-7,46 (4H, м), 7,58 (1H, т, J=5,9 Гц), 7,72 (2H, д, J=7,4 Гц), 7,90 (2H, д, J=7,4 Гц), 8,71 (1H, т, J=6,5 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 3.62 (2H, d, J=6.3 Hz), 3.97 (2H, s), 4.18-4.32 (3H, m), 4.60 (2H, d, J=6.7 Hz), 7.29-7.46 (4H, m), 7.58 (1H, t, J=5.9 Hz), 7, 72 (2H, d, J=7.4 Hz), 7.90 (2H, d, J=7.4 Hz), 8.71 (1H, t, J=6.5 Hz).
Синтез 4: 9H-Флуорен-9-илметил(2-{[(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]-хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]амино}-2-оксоэтил)карбаматSynthesis 4: 9H-Fluoren-9-ylmethyl(2-{[(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2, 3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]-quinolin-1-yl]amino}- 2-oxoethoxy)methyl]amino}-2-oxoethyl)carbamate
При охлаждении льдом, к раствору мезилата соединения (4) (0,283 г, 0,533 ммоль), N-гидроксисукцинимида (61,4 мг, 0,533 ммоль) и соединения (0,205 г, 0,533 ммоль), полученное в синтезе 3, в N,N-диметилформамиде (10,0 мл), добавляли N,N-диизопропилэтиламин (92,9 мкл, 0,533 ммоль) и N,N'-дициклогексилкарбодиимид (0,143 г, 0,693 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-отделенный органический слой хлороформа:метанол:вода=7:3:1 (по объему)] с получением названного соединения в виде бледно-коричневого твердого вещества (0,352 г, 82%).Under ice cooling, to a solution of compound (4) mesylate (0.283 g, 0.533 mmol), N-hydroxysuccinimide (61.4 mg, 0.533 mmol) and compound (0.205 g, 0.533 mmol) obtained in synthesis 3, in N,N -dimethylformamide (10.0 ml), N,N-diisopropylethylamine (92.9 μl, 0.533 mmol) and N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (0.143 g, 0.693 mmol) were added and stirred at room temperature for 3 days. The solvent was removed under reduced pressure, and the resulting residue was purified by silica gel column chromatography [chloroform-separated organic layer of chloroform:methanol:water=7:3:1 (v/v)] to give the title compound as a pale brown solid (0.352 g , 82%).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,81 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,73-1,87 (2H, м), 2,06-2,20 (2H, м), 2,34 (3H, с), 3,01-3,23 (2H, м), 3,58 (2H, д, J=6,7 Гц), 3,98 (2H, с), 4,13-4,25 (3H, м), 4,60 (2H, д, J=6,7 Гц), 5,09-5,22 (2H, м), 5,32-5,42 (2H, м), 5,50-5,59 (1H, м), 6,49 (1H, с), 7,24-7,30 (3H, м), 7,36 (2H, т, J=7,4 Гц), 7,53 (1H, т, J=6,3 Гц), 7,66 (2H, д, J=7,4 Гц), 7,75 (1H, д, J=11,0 Гц), 7,84 (2H, д, J=7,4 Гц), 8,47 (1H, д, J=8,6 Гц), 8,77 (1H, т, J=6,7 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.81 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.73-1.87 (2H, m), 2.06-2, 20(2H, m), 2.34(3H, s), 3.01-3.23(2H, m), 3.58(2H, d, J=6.7Hz), 3.98(2H , s), 4.13-4.25 (3H, m), 4.60 (2H, d, J=6.7 Hz), 5.09-5.22 (2H, m), 5.32- 5.42(2H, m), 5.50-5.59(1H, m), 6.49(1H, s), 7.24-7.30(3H, m), 7.36(2H, t, J=7.4 Hz), 7.53(1H, t, J=6.3 Hz), 7.66(2H, d, J=7.4 Hz), 7.75(1H, d, J=11.0 Hz), 7.84(2H, d, J=7.4 Hz), 8.47(1H, d, J=8.6 Hz), 8.77(1H, t, J= 6.7 Hz).
MS (ESI) m/z: 802 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 802 (M+H) + .
Синтез 5: N-[(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]-пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамидSynthesis 5: N-[(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15 -hexahydro-1H,12H-benzo[de]-pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)methyl]glycinamide
К раствору соединения (0,881 г, 1,10 ммоль), полученного в синтезе 4, в N,N-диметилформамиде (11,0 мл) добавляли пиперидин (1,1 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением смеси, содержащей названное соединение. Смесь использовали для следующей реакции без проведения дополнительной очистки.To a solution of the compound (0.881 g, 1.10 mmol) obtained in Synthesis 4 in N,N-dimethylformamide (11.0 ml) was added piperidine (1.1 ml) and stirred at room temperature for 2 hours. The solvent was removed under reduced pressure to give a mixture containing the title compound. The mixture was used for the next reaction without further purification.
Синтез 6: N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]глицил-глицил-L-фенилаланил-N-[(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо-[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамидSynthesis 6: N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycyl-glycyl-L-phenylalanyl-N-[(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy -4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo-[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1, 2-b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)methyl]glycinamide
При охлаждении льдом, к раствору смеси (0,439 ммоль), полученной в синтезе 5, N-гидроксисукцинимида (0,101 г, 0,878 ммоль) и N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]глицилглицил-L-фенилаланина (то есть, соединения, описанного в выложенном патенте Японии № 2002-60351) (0,440 г, 0,878 ммоль) в N,N-диметилформамиде (50,0 мл) добавляли N,N'-дициклогексилкарбодиимид (0,181 г, 0,878 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 дней. Растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-хлороформ:метанол=9:1 (по объему)] с получением названного соединения в виде бледно-оранжевого твердого вещества (0,269 г, 58%).Under ice-cooling, to a solution of the mixture (0.439 mmol) obtained in the synthesis of 5, N-hydroxysuccinimide (0.101 g, 0.878 mmol) and N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycylglycyl-L-phenylalanine (i.e. , the compound described in Japanese Patent Laid-Open No. 2002-60351) (0.440 g, 0.878 mmol) in N,N-dimethylformamide (50.0 ml) was added N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (0.181 g, 0.878 mmol) and stirred at room temperature for 4 days. The solvent was removed under reduced pressure, and the resulting residue was purified by silica gel column chromatography [chloroform-chloroform:methanol=9:1 (v/v)] to give the title compound as a pale orange solid (0.269 g, 58%).
MS (ESI) m/z: 1063 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 1063 (M+H) + .
Синтез 7: Глицил-глицил-L-фенилаланил-N-[(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]-хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамидSynthesis 7: Glycyl-glycyl-L-phenylalanyl-N-[(2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3 ,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]-quinolin-1-yl]amino}-2 -oxoethoxy)methyl]glycinamide
К раствору соединения (0,269 г, 0,253 ммоль), полученного в синтезе 6, в N,N-диметилформамиде (4,00 мл) добавляли пиперидин (0,251 мл, 2,53 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением смеси, содержащей названное соединение. Смесь использовали для следующей реакции без проведения дополнительной очистки.To a solution of the compound (0.269 g, 0.253 mmol) obtained in Synthesis 6 in N,N-dimethylformamide (4.00 ml) was added piperidine (0.251 ml, 2.53 mmol) and stirred at room temperature for 2 hours. The solvent was removed under reduced pressure to give a mixture containing the title compound. The mixture was used for the next reaction without further purification.
Синтез 8: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]глицилглицил-L-фенилаланил-N-[(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]-хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамидSynthesis 8: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]glycylglycyl-L-phenylalanyl-N-[(2-{[(1S,9S) -9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3', 4':6,7]indolizino[1,2-b]-quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)methyl]glycinamide
К раствору соединения (0,253 ммоль), полученного в синтезе 7, в N,N-диметилформамиде (10,0 мл) добавляли N-сукцинимидил 6-малеимидгексаноат (0,156 г, 0,506 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-хлороформ:метанол=9:1 (по объему)] с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (0,100 г, 38%).To a solution of the compound (0.253 mmol) obtained in synthesis 7 in N,N-dimethylformamide (10.0 ml) was added N-succinimidyl 6-maleimide hexanoate (0.156 g, 0.506 mmol) and stirred at room temperature for 3 days. The solvent was removed under reduced pressure, and the resulting residue was purified by silica gel column chromatography [chloroform-chloroform:methanol=9:1 (v/v)] to give the title compound as a pale yellow solid (0.100 g, 38%).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,83 (3H, т, J=7,2 Гц), 1,09-1,21 (2H, м), 1,33-1,47 (4H, м), 1,75-1,90 (2H, м), 2,00-2,23 (4H, м), 2,36 (3H, с), 2,69-2,81 (1H, м), 2,94-3,03 (1H, м), 3,06-3,22 (2H, м), 3,23-3,74 (8H, м), 3,98 (2H, с), 4,39-4,50 (1H, м), 4,60 (2H, д, J=6,7 Гц), 5,17 (2H, с), 5,39 (2H, с), 5,53-5,61 (1H, м), 6,50 (1H, с), 6,96 (2H, с), 7,11-7,24 (5H, м), 7,28 (1H, с), 7,75 (1H, д, J=11,0 Гц), 7,97 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,03 (1H, т, J=5,9 Гц), 8,09 (1H, д, J=7,8 Гц), 8,27 (1H, т, J=6,5 Гц), 8,48 (1H, д, J=9,0 Гц), 8,60 (1H, т, J=6,5 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.83 (3H, t, J=7.2 Hz), 1.09-1.21 (2H, m), 1.33-1, 47(4H, m), 1.75-1.90(2H, m), 2.00-2.23(4H, m), 2.36(3H, s), 2.69-2.81( 1H, m), 2.94-3.03(1H, m), 3.06-3.22(2H, m), 3.23-3.74(8H, m), 3.98(2H, s), 4.39-4.50(1H, m), 4.60(2H, d, J=6.7 Hz), 5.17(2H, s), 5.39(2H, s), 5.53-5.61(1H, m), 6.50(1H, s), 6.96(2H, s), 7.11-7.24(5H, m), 7.28(1H, s), 7.75 (1H, d, J=11.0 Hz), 7.97 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.9 Hz) , 8.09 (1H, d, J=7.8 Hz), 8.27 (1H, t, J=6.5 Hz), 8.48 (1H, d, J=9.0 Hz), 8 .60 (1H, t, J=6.5 Hz).
MS (ESI) m/z: 1034 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 1034 (M+H) + .
Синтез 9: Конъюгат антитело-лекарственное средство (55)Synthesis 9: Antibody drug conjugate (55)
Восстановление антитела: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6.0/EDTA, используя общий способ C-1 и общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1), описанный в способе получения 1. Раствор (1,25 мл) помещали в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,025 мл; 3,0 эквивалента на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0625 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of antibody: M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml by changing the medium to PBS6.0/EDTA using General Method C-1 and General Method B (as absorbance at 280 nm, the value of 1.61 mlmg -1 cm -1 ) described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксида (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,109 мл) и диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 8 (0,039 мл; 4,6 эквивалентов на молекулу антитела) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 40 минут с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,008 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и перемешивали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of an antibody to a drug-linker fragment: after adding dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.109 ml) and a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 8 (0.039 ml; 4.6 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature was stirred at room temperature for 40 minutes using a rotary tube shaker (MTR-103, AS ONE Corporation) to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.008 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and stirred at room temperature for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker moiety reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство. После чего, раствор концентрировали с помощью общего способа A, описанного в способе получения 1.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 12,57 мг/мл, выход антитела: 8,8 мг (70%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,2.Antibody concentration: 12.57 mg/ml, antibody yield: 8.8 mg (70%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.2.
Пример 59. Конъюгат антитело-лекарственное средство (56)Example 59 Antibody Drug Conjugate (56)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (56)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (56)
Восстановление антитела: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6.0/EDTA, используя общий способ C-1 и общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1), описанный в способе получения 1. Раствор (1,25 мл) помещали в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,051 мл; 6,0 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0625 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of antibody: M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml by changing the medium to PBS6.0/EDTA using General Method C-1 and General Method B (as absorbance at 280 nm, the value of 1.61 mlmg -1 cm -1 ) described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксида (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,067 мл) и диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 8 примера 58 (0,085 мл; 10,0 эквивалентов на молекулу антитела), к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 60 минут с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,013 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и перемешивали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of antibody to drug-linker moiety: after addition of dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.067 ml) and dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 8 of Example 58 (0.085 ml; 10.0 equivalents per antibody molecule ) to the above solution at room temperature was stirred at room temperature for 60 minutes using a rotary tube shaker (MTR-103, AS ONE Corporation) to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.013 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and stirred at room temperature for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker moiety reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,33 мг/мл, выход антитела: 7,98 мг (64%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 4,9.Antibody concentration: 1.33 mg/mL, antibody yield: 7.98 mg (64%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 4.9.
Пример 60. Конъюгат антитело-лекарственное средство (57)Example 60 Antibody Drug Conjugate (57)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (57)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (57)
Восстановление антитела: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 2, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл путем замены среды на PBS6.0/EDTA, используя общий способ C-1 и общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1), описанный в способе получения 1. Раствор (1,25 мл) помещали в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,051 мл; 6,0 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0625 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of antibody: M30-H1-L4P antibody obtained in Reference Example 2 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml by changing the medium to PBS6.0/EDTA using General Method C-1 and General Method B (as absorbance at 280 nm, the value of 1.61 mlmg -1 cm -1 ) described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксида (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC; 0,025 мл) и диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 8 примера 58 (0,127 мл; 15,0 эквивалентов на молекулу антитела), к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 60 минут с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,019 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и перемешивали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of antibody to drug-linker moiety: after addition of dimethyl sulfoxide (Sigma-Aldrich Co. LLC; 0.025 ml) and dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 8 of Example 58 (0.127 ml; 15.0 equivalents per antibody molecule ) to the above solution at room temperature was stirred at room temperature for 60 minutes using a rotary tube shaker (MTR-103, AS ONE Corporation) to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.019 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and stirred at room temperature for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker moiety reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство. После чего, раствор концентрировали с помощью общего способа A описанный в способе получения 1.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5000 (измеренное среднее значение) и εD,370=19000 (измеренное среднее значение), были получены следующие характеристики.Physical and chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5000 (measured average) and ε D,370 =19000 (measured average), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 0,91 мг/мл, выход антитела: 5,46 мг (44%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 6,3.Antibody concentration: 0.91 mg/ml, antibody yield: 5.46 mg (44%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.3.
Пример 61. Конъюгат антитело-лекарственное средство (58)Example 61 Antibody Drug Conjugate (58)
Смешивали практически все количества конъюгатов антитело-лекарственное средство, полученных в примерах 59 и 60. Раствор концентрировали с помощью общего способа A, описанного в способе получения 1, с получением названного конъюгата антитело-лекарственное средство.Substantially all amounts of the antibody-drug conjugates prepared in Examples 59 and 60 were mixed. The solution was concentrated using General Method A described in
Концентрация антитела: 10,0 мг/мл, выход антитела: 12,30 мг, и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 5,4.Antibody concentration: 10.0 mg/ml, antibody yield: 12.30 mg, and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.4.
Пример 62. Конъюгат антитело-лекарственное средство (59)Example 62 Antibody Drug Conjugate (59)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (59)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (59)
Восстановление антитела: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 1, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (100 мл, 1 г антитела) помещали в колбу объемом 250 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (2,43 мл; 3,6 эквивалентов на молекулу антитела) и затем водный раствор 1 М вторичного кислого фосфата калия (5 мл). После подтверждения того, что раствор имеет значение рН около 7,4 с помощью рН-метра, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody Recovery: M30-H1-L4P The antibody obtained in Reference Example 1 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using General Method B (Absorbance at 280 nm was 1.61 mlmg -1 cm -1 ) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 8 примера 58 (3,51 мл; 5,2 эквивалентов на молекулу антитела), и диметилсульфоксида (2,14 мл) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, его перемешивали на водяной бане при 15°C в течение 130 минут с помощью мешалки с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,547 мл) 100 мМ NAC и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of an antibody to a drug-linker fragment: after adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in synthesis 8 of example 58 (3.51 ml; 5.2 equivalents per antibody molecule) and dimethyl sulfoxide (2.14 ml) to the mentioned above solution at room temperature, it was stirred in a water bath at 15°C for 130 minutes with a stirrer to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.547 ml) of 100 mM NAC was then added and incubated at room temperature for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker moiety reaction.
Очистка: Упомянутый выше раствор подвергали ультрафильтрационной очистке, используя устройство для ультрафильтрации, состоящее из ультрафильтрационной мембраны (фирмы Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), трубного насоса (фирмы Cole-Parmer International, MasterFlex Pump model 77521-40, Pump Head model 7518-00), и трубки (фирмы Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). В частности, при добавлении к реакционному раствору по каплям ABS (суммарно 800 мл) в качестве буферного раствора для очистки, проводили ультрафильтрационную очистку для удаления неконъюгированных фрагментов лекарственное средство-линкер и других низкомолекулярных реагентов, заменяя также ABS на буферный раствор и затем концентрируя раствор, с получением около 70 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was subjected to ultrafiltration purification using an ultrafiltration device consisting of an ultrafiltration membrane (Merck Japan, Pellicon XL Cassette, Biomax 50 KDa), a tubular pump (Cole-Parmer International, MasterFlex Pump model 77521-40, Pump Head model 7518-00) and tubing (Cole-Parmer International, MasterFlex Tube L/S16). Specifically, when ABS (800 ml in total) was added dropwise to the reaction solution as a purification buffer, ultrafiltration purification was performed to remove unconjugated drug-linker fragments and other low molecular weight reagents by also replacing ABS with the buffer solution and then concentrating the solution, to obtain about 70 ml of a solution containing the named antibody-drug conjugate.
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5178 (измеренное значение) и εD,370=20217 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5178 (measured value) and ε D,370 =20217 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 14,2 мг/мл, выход антитела: 1,0 г (приблизительно 100%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,2.Antibody concentration: 14.2 mg/ml, antibody yield: 1.0 g (approximately 100%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.2.
Пример 63. Конъюгат антитело-лекарственное средство (60)Example 63 Antibody Drug Conjugate (60)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (60)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (60)
Восстановление антитела: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 1, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (5 мл, 50 мг антитела) помещали в пробирку объемом 15 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,075 мл; 4 эквивалентов на молекулу антитела). После подтверждения того, что раствор имеет значение рН около 7,0 с помощью рН-метра, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody Recovery: M30-H1-L4P The antibody obtained in Reference Example 1 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using General Method B (Absorbance at 280 nm was 1.61 mlmg -1 cm -1 ) and general method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 8 примера 58 (0,219 мл; 6,5 эквивалентов на молекулу антитела), и диметилсульфоксида (0,064 мл) к упомянутому выше раствору, его инкубировали на водяной бане при 15°C в течение 90 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,033 мл; 9,8 эквивалентов на молекулу антитела) 100 мМ NAC и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of an antibody to a drug-linker moiety: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 8 of Example 58 (0.219 ml; 6.5 equivalents per antibody molecule) and dimethyl sulfoxide (0.064 ml) to the above solution, its incubated in a water bath at 15° C. for 90 minutes to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.033 ml; 9.8 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC was then added and incubated at room temperature for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker fragment reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 19 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5178 (измеренное значение) и εD,370=20217 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5178 (measured value) and ε D,370 =20217 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 2,19 мг/мл, выход антитела: 42 мг (83%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 4,7.Antibody concentration: 2.19 mg/mL, antibody yield: 42 mg (83%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 4.7.
Пример 64. Конъюгат антитело-лекарственное средство (61)Example 64 Antibody Drug Conjugate (61)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (61)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (61)
Восстановление антитела: M30-H1-L4P антитело, полученное в справочном примере 1, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (4 мл, 40 мг антитела) помещали в пробирку объемом 15 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,14 мл; 5,2 эквивалентов на молекулу антитела). После подтверждения того, что раствор имеет значение рН около 7,0 с помощью рН-метра, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody Recovery: M30-H1-L4P The antibody obtained in Reference Example 1 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using General Method B (Absorbance at 280 nm was 1.61 mlmg -1 cm -1 ) and general method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 8 примера 58 (0,232 мл; 8,6 эквивалентов на молекулу антитела) к упомянутому выше раствору, его инкубировали на водяной бане при 15°C в течение 60 минут с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,035 мл; 12,9 эквивалентов на молекулу антитела) 100 мМ NAC и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of the antibody to the drug-linker fragment: after adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in synthesis 8 of example 58 (0.232 ml; 8.6 equivalents per antibody molecule) to the above solution, it was incubated in a water bath at 15° C for 60 minutes to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.035 ml; 12.9 equivalents per antibody molecule) of 100 mM NAC was then added and incubated at room temperature for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker fragment reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 13 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5178 (измеренное значение) и εD,370=20217 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5178 (measured value) and ε D,370 =20217 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 2,03 мг/мл, выход антитела: 26 мг (66%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 5,7.Antibody concentration: 2.03 mg/mL, antibody yield: 26 mg (66%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.7.
Пример 65. Конъюгат антитело-лекарственное средство (62)Example 65 Antibody Drug Conjugate (62)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (62)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (62)
Восстановление антитела: M30-H1-L4 антитело, полученное в справочном примере 1, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (1,25 мл, 12,5 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0287 мл; 3,4 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0625 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody Recovery: M30-H1-L4 The antibody obtained in Reference Example 1 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.61 mlmg was used as the absorbance at 280 nm -1 cm -1 ) and general method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 8 примера 58 (0,0439 мл; 5,2 эквивалентов на молекулу антитела), и диметилсульфоксида (0,0267 мл) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, его инкубировали на водяной бане при 15°C в течение 1 часа с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0066 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of an antibody to a drug-linker fragment: after adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in synthesis 8 of example 58 (0.0439 ml; 5.2 equivalents per antibody molecule) and dimethyl sulfoxide (0.0267 ml) to the mentioned above solution at room temperature, it was incubated in a water bath at 15°C for 1 hour in order to conjugate the drug-linker fragment with the antibody. An aqueous solution (0.0066 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at room temperature for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker fragment reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство. После чего, раствор концентрировали с помощью общего способа A.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5178 (измеренное значение) и εD,370=20217 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5178 (measured value) and ε D,370 =20217 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 10,0 мг/мл, выход антитела: 7,8 мг (62%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,4.Antibody concentration: 10.0 mg/mL, antibody yield: 7.8 mg (62%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.4.
Пример 66. Конъюгат антитело-лекарственное средство (63)Example 66 Antibody Drug Conjugate (63)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (63)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (63)
Восстановление антитела: M30-H1-L4 антитело, полученное в справочном примере 1, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,61 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (1,25 мл, 12,5 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0439 мл; 5,2 эквивалентов на молекулу антитела) (0,0287 мл; 3,4 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0625 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,4±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody Recovery: M30-H1-L4 The antibody obtained in Reference Example 1 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.61 mlmg was used as the absorbance at 280 nm -1 cm -1 ) and general method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 8 примера 58 (0,0726 мл; 8,6 эквивалентов на молекулу антитела) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, его инкубировали на водяной бане при 15°C в течение 1 часа с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,011 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of an antibody to a drug-linker moiety: After adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 8 of Example 58 (0.0726 ml; 8.6 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, it was incubated for water bath at 15° C. for 1 hour to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.011 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at room temperature for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker fragment reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 6 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство. После чего, раствор концентрировали с помощью общего способа A.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=235300 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5178 (измеренное значение) и εD,370=20217 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =235300 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5178 (measured value) and ε D,370 =20217 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 10,0 мг/мл, выход антитела: 7,3 мг (58%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 5,4.Antibody concentration: 10.0 mg/mL, antibody yield: 7.3 mg (58%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 5.4.
Пример 67. Конъюгат антитело-лекарственное средство (64)Example 67 Antibody Drug Conjugate (64)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (64)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (64)
Восстановление антитела: анти-CD30 антитело, полученное в справочном примере 3, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.5/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,75 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (0,4 мл, 4 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 мл; 2,5 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0058 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,0±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of the antibody: The anti-CD30 antibody obtained in Reference Example 3 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.5/EDTA using General Method B (1.75 mlmg -1 was used as the absorbance at 280 nm cm -1 ) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 8 примера 58 (0,0116 мл; 4,5 эквивалентов на молекулу антитела), и диметилсульфоксида (0,0101 мл) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0017 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of an antibody to a drug-linker fragment: after adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in synthesis 8 of example 58 (0.0116 ml; 4.5 equivalents per antibody molecule) and dimethyl sulfoxide (0.0101 ml) to the mentioned above solution at room temperature, stirring was carried out at room temperature for 1 hour using a rotary tube shaker (MTR-103, AS ONE Corporation) to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.0017 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at room temperature for an additional 20 minutes to terminate the drug-linker fragment reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 2,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=270400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5178 (измеренное значение) и εD,370=20217 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physical and chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =270400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5178 (measured value) and ε D,370 =20217 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 0,96 мг/мл, выход антитела: 2,4 мг (60%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,7.Antibody concentration: 0.96 mg/ml, antibody yield: 2.4 mg (60%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.7.
Пример 68. Конъюгат антитело-лекарственное средство (65)Example 68 Antibody Drug Conjugate (65)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (65)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (65)
Восстановление антитела: анти-CD30 антитело, полученное в справочном примере 3, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,75 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (0,4 мл, 4 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 мл; 5 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,006 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,0±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Recovery of the antibody: The anti-CD30 antibody obtained in Reference Example 3 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.75 mlmg -1 was used as the absorbance at 280 nm cm -1 ) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 8 примера 58 (0,0233 мл; 9 эквивалентов на молекулу антитела) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0035 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of antibody to drug-linker fragment: After adding dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 8 of Example 58 (0.0233 ml; 9 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, stirring was carried out at room temperature for 1 hour using a rotary tube shaker (MTR-103, AS ONE Corporation) to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.0035 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at room temperature for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker fragment reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 2,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=270400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5178 (измеренное значение) и εD,370=20217 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physical and chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =270400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5178 (measured value) and ε D,370 =20217 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 0,39 мг/мл, выход антитела: 1,0 мг (24%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 6,8.Antibody concentration: 0.39 mg/ml, antibody yield: 1.0 mg (24%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 6.8.
Пример 69. Конъюгат антитело-лекарственное средство (66)Example 69 Antibody Drug Conjugate (66)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (66)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (66)
Восстановление антитела: анти-CD33 антитело, полученное в справочном примере 4, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,66 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (0,4 мл, 4 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 мл; 2,5 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0058 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,0±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody recovery: The anti-CD33 antibody obtained in Reference Example 4 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.66 mlmg -1 was used as the absorbance at 280 nm cm -1 ) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 8 примера 58 (0,0116 мл; 4,5 эквивалентов на молекулу антитела), и диметилсульфоксида (0,0101 мл) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0017 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of an antibody to a drug-linker fragment: after adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in synthesis 8 of example 58 (0.0116 ml; 4.5 equivalents per antibody molecule) and dimethyl sulfoxide (0.0101 ml) to the mentioned above solution at room temperature, stirring was carried out at room temperature for 1 hour using a rotary tube shaker (MTR-103, AS ONE Corporation) to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.0017 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at room temperature for an additional 20 minutes to terminate the drug-linker fragment reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 2,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=256400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5178 (измеренное значение) и εD,370=20217 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =256400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5178 (measured value) and ε D,370 =20217 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,19 мг/мл, выход антитела: 3,0 мг (74%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,8.Antibody concentration: 1.19 mg/ml, antibody yield: 3.0 mg (74%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.8.
Пример 70. Конъюгат антитело-лекарственное средство (67)Example 70 Antibody Drug Conjugate (67)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (67)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (67)
Восстановление антитела: анти-CD33 антитело, полученное в справочном примере 4, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,66 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (0,4 мл, 4 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 мл; 5 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,006 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,0±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody recovery: The anti-CD33 antibody obtained in Reference Example 4 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/mL with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.66 mlmg -1 was used as the absorbance at 280 nm cm -1 ) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 8 примера 58 (0,0233 мл; 9 эквивалентов на молекулу антитела) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0035 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of antibody to drug-linker fragment: After adding dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 8 of Example 58 (0.0233 ml; 9 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, stirring was carried out at room temperature for 1 hour using a rotary tube shaker (MTR-103, AS ONE Corporation) to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.0035 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at room temperature for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker fragment reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 2,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=256400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5178 (измеренное значение) и εD,370=20217 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =256400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5178 (measured value) and ε D,370 =20217 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,24 мг/мл, выход антитела: 3,1 мг (78%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 7,0.Antibody concentration: 1.24 mg/ml, antibody yield: 3.1 mg (78%), and average number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 7.0.
Пример 71. Конъюгат антитело-лекарственное средство (68)Example 71 Antibody Drug Conjugate (68)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (68)Synthesis 1: Antibody Drug Conjugate (68)
Восстановление антитела: анти-CD70 антитело, полученное в справочном примере 5, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,69 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (0,4 мл, 4 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0065 мл; 2,5 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,0058 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,0±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody recovery: The anti-CD70 antibody obtained in Reference Example 5 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.69 mlmg -1 was used as the absorbance at 280 nm cm -1 ) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 8 примера 58 (0,0116 мл; 4,5 эквивалентов на молекулу антитела), и диметилсульфоксида (0,0101 мл) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0017 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of an antibody to a drug-linker fragment: after adding a dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in synthesis 8 of example 58 (0.0116 ml; 4.5 equivalents per antibody molecule) and dimethyl sulfoxide (0.0101 ml) to the mentioned above solution at room temperature, stirring was carried out at room temperature for 1 hour using a rotary tube shaker (MTR-103, AS ONE Corporation) to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.0017 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at room temperature for an additional 20 minutes to terminate the drug-linker fragment reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 2,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=262400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5178 (измеренное значение) и εD,370=20217 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =262400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5178 (measured value) and ε D,370 =20217 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,10 мг/мл, выход антитела: 2,8 мг (69%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 3,8.Antibody concentration: 1.10 mg/mL, antibody yield: 2.8 mg (69%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 3.8.
Пример 72. Конъюгат антитело-лекарственное средство (69)Example 72 Antibody Drug Conjugate (69)
Синтез 1: Конъюгат антитело-лекарственное средство (69)Synthesis 1: Antibody drug conjugate (69)
Восстановление антитела: анти-CD70 антитело, полученное в справочном примере 5, приготавливали с концентрацией антитела 10 мг/мл с помощью PBS6.0/EDTA, используя общий способ B (в качестве коэффициента поглощения при 280 нм использовали значение 1,69 млмг-1см-1) и общий способ C-1, описанный в способе получения 1. Раствор (0,4 мл, 4 мг антитела) помещали в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли к нему водный раствор, содержащий 10 мМ TCEP (фирмы Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (0,0129 мл; 5 эквивалентов на молекулу антитела), и водный раствор 1 M вторичного кислого фосфата калия (фирмы Nacalai Tesque, Inc; 0,006 мл). После подтверждения того, что раствор имеет величину рН 7,0±0,1, восстанавливали дисульфидную связь в шарнирной части антитела путем инкубации при 37°C в течение 1 часа.Antibody recovery: The anti-CD70 antibody obtained in Reference Example 5 was prepared at an antibody concentration of 10 mg/ml with PBS6.0/EDTA using General Method B (1.69 mlmg -1 was used as the absorbance at 280 nm cm -1 ) and General Method C-1 described in
Конъюгирование антитела с фрагментом лекарственное средство-линкер: после добавления диметилсульфоксидного раствора, содержащего 10 мМ соединения, полученного в синтезе 8 примера 58 (0,0233 мл; 9 эквивалентов на молекулу антитела) к упомянутому выше раствору при комнатной температуре, осуществляли перемешивание при комнатной температуре в течение 1 часа с помощью роторного встряхивателя пробирок (MTR-103, фирмы AS ONE Corporation) с целью конъюгирования фрагмента лекарственное средство-линкер с антителом. Затем добавляли водный раствор (0,0035 мл) 100 мМ NAC (фирмы Sigma-Aldrich Co. LLC) и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 20 минут с целью прерывания реакции фрагмента лекарственное средство-линкер.Conjugation of antibody to drug-linker fragment: After adding dimethyl sulfoxide solution containing 10 mM of the compound obtained in Synthesis 8 of Example 58 (0.0233 ml; 9 equivalents per antibody molecule) to the above solution at room temperature, stirring was carried out at room temperature for 1 hour using a rotary tube shaker (MTR-103, AS ONE Corporation) to conjugate the drug-linker fragment to the antibody. An aqueous solution (0.0035 ml) of 100 mM NAC (Sigma-Aldrich Co. LLC) was then added and incubated at room temperature for an additional 20 minutes to interrupt the drug-linker fragment reaction.
Очистка: упомянутый выше раствор подвергали очистке, используя общий способ D-1 (ABS использовали в качестве буферного раствора), описанный в способе получения 1, с получением 2,5 мл раствора, содержащего названный конъюгат антитело-лекарственное средство.Purification: The above solution was purified using the general method D-1 (ABS was used as a buffer solution) described in
Физико-химические характеристики: используя общий способ E, описанный в способе получения 1 (в качестве значений коэффициента поглощения использовали следующие значения: εA,280=262400 (рассчитанное оценочное значение), εA,370=0 (рассчитанное оценочное значение), εD,280=5178 (измеренное значение) и εD,370=20217 (измеренное значение)), были получены следующие характеристики.Physico-chemical characteristics: using the general method E described in the production method 1 (the following values were used as absorption coefficient values: ε A,280 =262400 (calculated estimated value), ε A,370 =0 (calculated estimated value), ε D,280 =5178 (measured value) and ε D,370 =20217 (measured value)), the following characteristics were obtained.
Концентрация антитела: 1,16 мг/мл, выход антитела: 2,9 мг (73%), и среднее число конъюгированных молекул лекарственного средства (n) на молекулу антитела: 7,0.Antibody concentration: 1.16 mg/mL, antibody yield: 2.9 mg (73%), and mean number of conjugated drug molecules (n) per antibody molecule: 7.0.
Пример 73. (Другой способ синтеза для соединения, получаемого с помощью синтеза 8 примера 58)Example 73 (Another Synthesis Method for the Compound Obtained by Synthesis 8 of Example 58)
Синтез 1: Трет-бутил N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]глицил-глицил-L-фенилаланинатSynthesis 1: tert-Butyl N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]glycyl-glycyl-L-phenylalaninate
При охлаждении льдом, к раствору трет-бутил N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]глицил-глицил-L-фенилаланината (J. Pept. Res., 1999, vol. 53, pp. 393) (0.400 г, 0,717 ммоль) в THF (12,0 мл) добавляли 1,8-диазабицикло[5.4.0]-7-ундецен (0,400 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 дней, и затем добавляли N-сукцинимидил 6-малеимидгексаноат (0,221 г, 0,717 ммоль) и перемешивали в течение 3 часов. Реакционный раствор разбавляли этилацетатом и промывали водным раствором 10% лимонной кислоты, насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным солевым раствором, и затем органический слой сушили над безводным сульфатом магния. После удаления растворителя при пониженном давлении, полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-хлороформ:метанол=9:1 (по объему)] с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (0,295 г, 78%).Under ice cooling, to a solution of tert-butyl N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycyl-glycyl-L-phenylalaninate (J. Pept. Res., 1999, vol. 53, pp. 393) (0.400 g, 0.717 mmol) in THF (12.0 ml) was added 1,8-diazabicyclo[5.4.0]-7-undecene (0.400 ml) and stirred at room temperature for 4 days, and then N-succinimidyl 6- maleimide hexanoate (0.221 g, 0.717 mmol) and stirred for 3 hours. The reaction solution was diluted with ethyl acetate and washed with an aqueous solution of 10% citric acid, an aqueous saturated sodium hydrogen carbonate solution and a saturated brine, and then the organic layer was dried over anhydrous magnesium sulfate. After removing the solvent under reduced pressure, the resulting residue was purified by silica gel column chromatography [chloroform-chloroform:methanol=9:1 (v/v)] to obtain the title compound as a pale yellow solid (0.295 g, 78%).
1H-ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 1,28-1,36 (2H, м), 1,41 (9H, с), 1,57-1,71 (4H, м), 2,23 (2H, т, J=7,6 Гц), 3,09 (2H, д, J=6,0 Гц), 3,51 (2H, т, J=7,6 Гц), 3,85-4,02 (4H, м), 4,69-4,78 (1H, м), 6,15 (1H, т, J=4,6 Гц), 6,33 (1H, д, J=7,3 Гц), 6,60 (1H, т, J=5,0 Гц), 6,68 (2H, с), 7,10-7,16 (2H, м), 7,22-7,31 (3H, м). 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ: 1.28-1.36 (2H, m), 1.41 (9H, s), 1.57-1.71 (4H, m), 2, 23 (2H, t, J=7.6 Hz), 3.09 (2H, d, J=6.0 Hz), 3.51 (2H, t, J=7.6 Hz), 3.85- 4.02(4H, m), 4.69-4.78(1H, m), 6.15(1H, t, J=4.6Hz), 6.33(1H, d, J=7, 3 Hz), 6.60 (1H, t, J=5.0 Hz), 6.68 (2H, s), 7.10-7.16 (2H, m), 7.22-7.31 ( 3H, m).
MS (ESI) m/z: 529 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 529 (M+H) + .
Синтез 2: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]глицил-глицил-L-фенилаланинSynthesis 2: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]glycyl-glycyl-L-phenylalanine
К раствору соединения (0,295 г, 0,558 ммоль), полученного в синтезе 1, в дихлорметане (8,00 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (4,00 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (0,240 г, 91%).To a solution of the compound (0.295 g, 0.558 mmol) obtained in
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 1,15-1,23 (2H, м), 1,40-1,53 (4H, м), 2,10 (2H, т, J=7,6 Гц), 2,88 (1H, дд, J=13,7, 8,9 Гц), 3,04 (1H, дд, J=13,7, 5,0 Гц), 3,35-3,43 (2H, м), 3,58-3,77 (4H, м), 4,41 (1H, тд, J=7,8, 5,0 Гц), 7,00 (2H, с), 7,16-7,31 (5H, м), 8,00 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,06 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,13 (1H, д, J=7,8 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 1.15-1.23 (2H, m), 1.40-1.53 (4H, m), 2.10 (2H, t, J =7.6 Hz), 2.88 (1H, dd, J=13.7, 8.9 Hz), 3.04 (1H, dd, J=13.7, 5.0 Hz), 3.35 -3.43 (2H, m), 3.58-3.77 (4H, m), 4.41 (1H, td, J=7.8, 5.0 Hz), 7.00 (2H, s ), 7.16-7.31 (5H, m), 8.00 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.06 (1H, t, J=5.7 Hz), 8.13 (1H, d, J=7.8 Hz).
Синтез 3: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-гексаноил]глицил-глицил-L-фенилаланил-N-[(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]-хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамидSynthesis 3: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)-hexanoyl]glycyl-glycyl-L-phenylalanyl-N-[(2-{[(1S ,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[ 3',4':6,7]indolizino[1,2-b]-quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)methyl]glycinamide
Соединение (0,572 г, 1,21 ммоль), полученное в синтезе 2, растворяли в дихлорметане (12,0 мл) и добавляли к нему N-гидроксисукцинимид (0,152 г, 1,32 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид (0,253 г, 1,32 ммоль) и перемешивали в течение 1 часа. Реакционный раствор добавляли к раствору смеси (1,10 ммоль), полученной в синтезе 5 примера 58, в N,N-диметилформамиде (22,0 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. К реакционному раствору добавляли водный раствор 10% лимонной кислоты и экстрагировали хлороформом. Полученный органический слой сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-хлороформ:метанол=8:2 (по объему)] с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (0,351 г, 31%). Данные инструментальных исследований соединения были идентичными данным для соединения, полученного в синтезе 8 примера 58.The compound (0.572 g, 1.21 mmol) obtained in Synthesis 2 was dissolved in dichloromethane (12.0 ml) and N-hydroxysuccinimide (0.152 g, 1.32 mmol) and 1-(3-dimethylaminopropyl)- 3-ethylcarbodiimide hydrochloride (0.253 g, 1.32 mmol) and stirred for 1 hour. The reaction solution was added to a solution of the mixture (1.10 mmol) obtained in
Пример 74. (Другой способ синтеза для соединения, получаемого с помощью синтеза 8 примера 58)Example 74 (Another Synthesis Method for the Compound Obtained by Synthesis 8 of Example 58)
Синтез 1: Бензил [({N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]глицил}амино)метокси]ацетатSynthesis 1: Benzyl [({N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]glycyl}amino)methoxy]acetate
К раствору соединения (7,37 г, 20,0 ммоль), полученного в синтезе 1, примера 58, в тетрагидрофуране (200 мл) добавляли при 0°C бензилгликолат (6,65 г, 40,0 ммоль) и моногидрат п-толуолсульфоновой кислоты (0,381 г, 2,00 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов и 30 минут. К реакционному раствору добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и экстрагировали этилацетатом. Полученный органический слой сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [гексан:этилацетат=100:0 (по объему)-0:100] с получением названного соединения в виде бесцветного твердого вещества (6,75 г, 71%). Данные инструментальных исследований соединения были идентичными данным для соединения, полученного в синтезе 2 примера 58.To a solution of the compound (7.37 g, 20.0 mmol) obtained in
Синтез 2: N-[(Бензилокси)карбонил]глицил-глицил-L-фенилаланин-N-{[(2-(бензилокси)-2-оксоэтокси]метил}глицинамидSynthesis 2: N-[(Benzyloxy)carbonyl]glycyl-glycyl-L-phenylalanine-N-{[(2-(benzyloxy)-2-oxoethoxy]methyl}glycinamide
К раствору соединения (6,60 г, 13,9 ммоль), полученного в синтезе 1, в N,N-диметилформамиде (140 мл), добавляли при 0°C 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен (2,22 г, 14,6 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. К реакционному раствору добавляли перемешенный заранее при комнатной температуре в течение 1 часа раствор N-[(бензилокси)карбонил]глицил-глицил-L-фенилаланина (6,33 г, 15,3 ммоль), N-гидроксисукцинимида (1,92 г, 16,7 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорида (3,20 г, 16,7 ммоль) в N,N-диметилформамиде (140 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. К реакционному раствору добавляли 0,1 N хлористоводородную кислоту и экстрагировали хлороформом. Полученный органический слой сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-хлороформ:метанол=8:2 (по объему)] с получением названного соединения в виде бесцветного твердого вещества (7,10 г, 79%).To a solution of the compound (6.60 g, 13.9 mmol) obtained in
1H-ЯМР (DMSO-D6) δ: 2,78 (1H, дд, J=13,9, 9,6 Гц), 3,05 (1H, дд, J=13,9, 4,5 Гц), 3,56-3,80 (6H, м), 4,15 (2H, с), 4,47-4,55 (1H, м), 4,63 (2H, д, J=6,6 Гц), 5,03 (2H, с), 5,15 (2H, с), 7,16-7,38 (15H, м), 7,52 (1H, т, J=5,9 Гц), 8,03 (1H, т, J=5,5 Гц), 8,17 (1H, д, J=8,2 Гц), 8,36 (1H, т, J=5,7 Гц), 8,61 (1H, т, J=6,6 Гц). 1 H-NMR (DMSO-D 6 ) δ: 2.78 (1H, dd, J=13.9, 9.6 Hz), 3.05 (1H, dd, J=13.9, 4.5 Hz ), 3.56-3.80(6H, m), 4.15(2H, s), 4.47-4.55(1H, m), 4.63(2H, d, J=6.6 Hz), 5.03 (2H, s), 5.15 (2H, s), 7.16-7.38 (15H, m), 7.52 (1H, t, J=5.9 Hz), 8.03 (1H, t, J=5.5 Hz), 8.17 (1H, d, J=8.2 Hz), 8.36 (1H, t, J=5.7 Hz), 8. 61 (1H, t, J=6.6 Hz).
Синтез 3: Глицил-глицил-L-фенилаланил-N-[(карбоксиметокси)метил]глицинамидSynthesis 3: Glycyl-glycyl-L-phenylalanyl-N-[(carboxymethoxy)methyl]glycinamide
К раствору соединения (7,00 г, 10,8 ммоль), полученного в синтезе 2, в N,N-диметилформамиде (216 мл) добавляли катализатор палладий на угле (7,00 г) и перемешивали в атмосфере водорода при комнатной температуре в течение 24 часов. Нерастворимые вещества удаляли фильтрацией через целит, и растворитель удаляли при пониженном давлении. Полученный остаток растворяли в воде, нерастворимые вещества удаляли фильтрацией через целит, и растворитель удаляли при пониженном давлении. Эти манипуляции повторяли два раза с получением названного соединения в виде бесцветного твердого вещества (3,77 г, 82%).To a solution of the compound (7.00 g, 10.8 mmol) obtained in synthesis 2 in N,N-dimethylformamide (216 ml) was added palladium-carbon catalyst (7.00 g) and stirred under hydrogen atmosphere at room temperature in within 24 hours. Insoluble matters were removed by filtration through Celite, and the solvent was removed under reduced pressure. The resulting residue was dissolved in water, insoluble matters were removed by filtration through Celite, and the solvent was removed under reduced pressure. These manipulations were repeated twice to give the title compound as a colorless solid (3.77 g, 82%).
1H-ЯМР (DMSO-D6) δ: 2,84 (1H, дд, J=13,7, 9,8 Гц), 3,08 (1H, дд, J=13,7, 4,7 Гц), 3,50-3,72 (4H, м), 3,77-3,86 (2H, м), 3,87 (2H, с), 4,52-4,43 (1H, м), 4,61 (2H, д, J=6,6 Гц), 7,12-7,30 (5H, м), 8,43 (1H, т, J=5,9 Гц), 8,54 (1H, д, J=7,8 Гц), 8,70 (1H, т, J=6,3 Гц), 8,79 (1H, т, J=5,5 Гц). 1 H-NMR (DMSO-D 6 ) δ: 2.84 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 3.08 (1H, dd, J=13.7, 4.7 Hz ), 3.50-3.72(4H, m), 3.77-3.86(2H, m), 3.87(2H, s), 4.52-4.43(1H, m), 4.61(2H, d, J=6.6Hz), 7.12-7.30(5H, m), 8.43(1H, t, J=5.9Hz), 8.54(1H , d, J=7.8 Hz), 8.70 (1H, t, J=6.3 Hz), 8.79 (1H, t, J=5.5 Hz).
Синтез 4: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]глицил-глицил-L-фенилаланил-N-[(карбоксиметокси)метил]глицинамидSynthesis 4: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]glycyl-glycyl-L-phenylalanyl-N-[(carboxymethoxy)methyl]glycinamide
К раствору соединения (3,59 г, 8,48 ммоль), полученного в синтезе 3, в N,N-диметилформамиде (85,0 мл) добавляли N-сукцинимидил 6-малеимидкапроновую кислоту (2,88 г, 9,33 ммоль) и триэтиламин (0,858 г, 8,48 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. К реакционному раствору добавляли 0,1 N хлористоводородную кислоту и экстрагировали хлороформом и смешанным растворителем из хлороформа и метанола [хлороформ:метанол=4:1 (по объему)]. Полученный органический слой сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-отделенный органический слой хлороформа:метанол:вода=7:3: 1 (по объему)] с получением названного соединения в виде бесцветного твердого вещества (3,70 г, 71%).To a solution of the compound (3.59 g, 8.48 mmol) obtained in Synthesis 3 in N,N-dimethylformamide (85.0 ml) was added N-succinimidyl 6-maleimid-caproic acid (2.88 g, 9.33 mmol ) and triethylamine (0.858 g, 8.48 mmol) and stirred at room temperature for 1 hour. 0.1 N hydrochloric acid was added to the reaction solution, and extracted with chloroform and a mixed solvent of chloroform and methanol [chloroform:methanol=4:1 (by volume)]. The resulting organic layer was dried over sodium sulfate and filtered. The solvent was removed under reduced pressure, and the resulting residue was purified by silica gel column chromatography [chloroform-separated organic layer of chloroform:methanol:water=7:3:1 (v/v)] to give the title compound as a colorless solid (3.70 g , 71%).
1H-ЯМР (DMSO-D6) δ: 1,13-1,24 (2H, м), 1,42-1,53 (4H, м), 2,11 (2H, т, J=7,4 Гц), 2,80 (1H, дд, J=13,7, 9,8 Гц), 3,06 (1H, дд, J=13,9, 4,5 Гц), 3,37 (2H, т, J=7,2 Гц), 3,56-3,78 (6H, м), 3,97 (2H, с), 4,46-4,53 (1H, м), 4,61 (2H, д, J=6,3 Гц), 7,00 (2H, с), 7,15-7,29 (5H, м), 8,03-8,20 (3H, м), 8,32 (1H, т, J=5,9 Гц), 8,60 (1H, т, J=6,7 Гц). 1 H-NMR (DMSO-D 6 ) δ: 1.13-1.24 (2H, m), 1.42-1.53 (4H, m), 2.11 (2H, t, J=7, 4 Hz), 2.80 (1H, dd, J=13.7, 9.8 Hz), 3.06 (1H, dd, J=13.9, 4.5 Hz), 3.37 (2H, t, J=7.2 Hz), 3.56-3.78(6H, m), 3.97(2H, s), 4.46-4.53(1H, m), 4.61(2H , d, J=6.3 Hz), 7.00 (2H, s), 7.15-7.29 (5H, m), 8.03-8.20 (3H, m), 8.32 ( 1H, t, J=5.9 Hz), 8.60 (1H, t, J=6.7 Hz).
Синтез 5: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]глицил-глицил-L-фенилаланил-N-[(2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]-хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтокси)метил]глицинамидSynthesis 5: N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-1-yl)hexanoyl]glycyl-glycyl-L-phenylalanyl-N-[(2-{[(1S, 9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H,12H-benzo[de]pyrano[3 ',4':6,7]indolizino[1,2-b]-quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethoxy)methyl]glycinamide
К раствору мезилата соединения (4) (1,14 г, 2,00 ммоль) в N,N-диметилформамиде (40,0 мл) добавляли при 0°C триэтиламин (0,202 г, 2,00 ммоль), соединение (1,48 г, 2,40 ммоль), полученное в синтезе 4, и 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния хлорид (0,993 г, 3,00 ммоль), содержащий 16,4% воды, и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-хлороформ:метанол=8:2 (по объему)] с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (1,69 г, 82%). Данные инструментальных исследований соединения были идентичными данным для соединения, полученного в синтезе 8 примера 58.Triethylamine (0.202 g, 2.00 mmol), compound (1, 48 g, 2.40 mmol) from Synthesis 4 and 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (0.993 g, 3.00 mmol) containing 16.4% water and stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was removed under reduced pressure, and the resulting residue was purified by silica gel column chromatography [chloroform-chloroform:methanol=8:2 (v/v)] to give the title compound as a pale yellow solid (1.69 g, 82%). The instrumental data for the compound were identical to those for the compound prepared in Synthesis 8 of Example 58.
Пример 75. N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано-[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]-2-гидроксиацетамид Example 75 N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo[de]pyrano-[3 ' ,4 ' :6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]-2-hydroxyacetamide
Синтез 1: 2-{[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано-[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]амино}-2-оксоэтилацетатSynthesis 1: 2-{[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H ,12H-benzo[de]pyrano-[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]amino}-2-oxoethyl acetate
При охлаждении льдом, к суспензии мезилата соединения (4) (0,500 г, 0,941 ммоль) в N,N-диметилформамиде (20,0 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,492 мл, 2,82 ммоль) и ацетоксиацетилхлорид (0,121 мл, 1,13 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Растворитель удаляли при пониженном давлении и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-отделенный органический слой хлороформа:метанол:вода=7:3: 1 (по объему)] с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (0,505 г, количественно).Under ice-cooling, to a suspension of compound (4) mesylate (0.500 g, 0.941 mmol) in N,N-dimethylformamide (20.0 ml) was added N,N-diisopropylethylamine (0.492 ml, 2.82 mmol) and acetoxyacetyl chloride (0.121 ml , 1.13 mmol) and stirred at room temperature for 1 hour. The solvent was removed under reduced pressure, and the resulting residue was purified by silica gel column chromatography [chloroform-separated organic layer of chloroform:methanol:water=7:3:1 (v/v)] to give the title compound as a pale yellow solid (0.505 g, quantitatively).
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,4 Гц), 1,81-1,92 (2H, м), 2,08 (3H, с), 2,08-2,22 (2H, м), 2,41 (3H, с), 3,14-3,21 (2H, м), 4,51 (2H, дд, J=19,4, 14,7 Гц), 5,22 (2H, дд, J=40,1, 19,0 Гц), 5,43 (2H, с), 5,56-5,61 (1H, м), 6,53 (1H, с), 7,31 (1H, с), 7,81 (1H, д, J=11,0 Гц), 8,67 (1H, д, J=8,6 Гц). 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.87 (3H, t, J=7.4 Hz), 1.81-1.92 (2H, m), 2.08 (3H, s), 2.08-2.22(2H, m), 2.41(3H, s), 3.14-3.21(2H, m), 4.51(2H, dd, J=19, 4, 14.7 Hz), 5.22 (2H, dd, J=40.1, 19.0 Hz), 5.43 (2H, s), 5.56-5.61 (1H, m), 6.53 (1H, s), 7.31 (1H, s), 7.81 (1H, d, J=11.0 Hz), 8.67 (1H, d, J=8.6 Hz).
MS (ESI) m/z: 536 (M+H)+.MS (ESI) m/z: 536 (M+H) + .
Синтез 2: N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано-[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]-2-гидроксиацетамидSynthesis 2: N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo[de]pyrano-[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]-2-hydroxyacetamide
К суспензии соединения (0,504 г, 0,941 ммоль), полученного в синтезе 1, в метаноле (50,0 мл) добавляли тетрагидрофуран (20,0 мл) и водный раствор 1 N гидроксида натрия (4,00 мл, 4,00 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакцию прерывали путем добавления 1 N хлористоводородной кислоты (5,00 мл, 5,00 ммоль), и растворитель удаляли при пониженном давлении. Полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-отделенный органический слой хлороформа:метанол:вода=7:3:1 (по объему)] с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (0,412 г, 89%). Присутствие этого соединения было подтверждено в опухоли мыши с инкорпорированным раком, которой вводили конъюгат антитело-лекарственное средство (55) или (56).To a suspension of the compound (0.504 g, 0.941 mmol) obtained in
1H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ: 0,87 (3H, т, J=7,3 Гц), 1,78-1,95 (2H, м), 2,09-2,28 (2H, м), 2,39 (3H, с), 3,07-3,27 (2H, м), 3,96 (2H, д, J=6,0 Гц), 5,11-5,26 (2H, м), 5,42 (2H, с), 5,46-5,54 (1H, м), 5,55-5,63 (1H, м), 6,52 (1H, с), 7,30 (1H, с), 7,78 (1H, д, J=10,9 Гц), 8,41 (1H, д, J=9,1 Гц). MS (ESI) m/z: 494 (M+H)+. 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 0.87 (3H, t, J=7.3 Hz), 1.78-1.95 (2H, m), 2.09-2, 28 (2H, m), 2.39 (3H, s), 3.07-3.27 (2H, m), 3.96 (2H, d, J=6.0 Hz), 5.11-5 .26(2H, m), 5.42(2H, s), 5.46-5.54(1H, m), 5.55-5.63(1H, m), 6.52(1H, s ), 7.30 (1H, s), 7.78 (1H, d, J=10.9 Hz), 8.41 (1H, d, J=9.1 Hz). MS (ESI) m/z: 494 (M+H) + .
Пример 76. (Другой способ синтеза соединения примера 75)Example 76 (Another way to synthesize the compound of example 75)
Синтез 1: N-[(1S,9S)-9-этил-5-фтор-9-гидрокси-4-метил-10,13-диоксо-2,3,9,10,13,15-гексагидро-1H,12H-бензо[de]пирано-[3',4':6,7]индолизино[1,2-b]хинолин-1-ил]-2-гидроксиацетамидSynthesis 1: N-[(1S,9S)-9-ethyl-5-fluoro-9-hydroxy-4-methyl-10,13-dioxo-2,3,9,10,13,15-hexahydro-1H, 12H-benzo[de]pyrano-[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolin-1-yl]-2-hydroxyacetamide
Гликолевую кислоту (0,0201 г, 0,27 ммоль) растворяли в N,N-диметилформамиде (1,0 мл), добавляли N-гидроксисукцинимид (0,0302 г, 0,27 ммоль) и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида гидрохлорид (0,0508 г, 0,27 ммоль) и перемешивали в течение 1 часа. Реакционный раствор добавляли к суспензии N,N-диметилформамида (1,0 мл), к которому добавляли мезилат соединения (4) (0,1 г, 0,176 ммоль) и триэтиламин (0,025 мл, 0,18 ммоль), и перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Растворитель удаляли при пониженном давлении, и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле [хлороформ-хлороформ:метанол=10:1 (по объему)] с получением названного соединения в виде бледно-желтого твердого вещества (0,080 г, 92%). Данные инструментальных исследований соединения были идентичными данным для соединения, полученного в синтезе 2 примера 75.Glycolic acid (0.0201 g, 0.27 mmol) was dissolved in N,N-dimethylformamide (1.0 ml), N-hydroxysuccinimide (0.0302 g, 0.27 mmol) and 1-(3-dimethylaminopropyl) were added -3-ethylcarbodiimide hydrochloride (0.0508 g, 0.27 mmol) and stirred for 1 hour. The reaction solution was added to a suspension of N,N-dimethylformamide (1.0 ml) to which compound (4) mesylate (0.1 g, 0.176 mmol) and triethylamine (0.025 ml, 0.18 mmol) were added, and stirred at room temperature. temperature within 24 hours. The solvent was removed under reduced pressure, and the resulting residue was purified by silica gel column chromatography [chloroform-chloroform:methanol=10:1 (v/v)] to give the title compound as a pale yellow solid (0.080 g, 92%). The instrumental data for the compound were identical to those for the compound prepared in Synthesis 2 of Example 75.
(Пример испытания 1). Получение вектора, экспрессирующего человеческий полноразмерный B7-H3 вариант 1 (Test example 1). Generation of a vector expressing human full-length B7-
Комплементарную ДНК, кодирующую человеческий B7-H3 вариант 1, амплифицировали с помощью реакции ПЦР, используя в качестве матрицы комплементарную ДНК, синтезированную из суммарной РНК клеток LNCaP (Американская коллекция типовых культур: ATCC), и следующий набор праймеров:Complementary DNA encoding human B7-
праймер 1:primer 1:
5'-ctatagggagacccaagctggctagcatgctgcgtcggcggggcag-3' (SEQ ID NO: 22) и5'-ctatagggagacccaagctggctagcatgctgcgtcggcggggcag-3' (SEQ ID NO: 22) and
праймер 2:primer 2:
5'-aacgggccctctagactcgagcggccgctcaggctatttcttgtccatcatcttctttgct gtcag-3' (SEQ ID NO: 23).5'-aacgggccctctagactcgagcggccgctcaggctatttcttgtccatcatcttctttgct gtcag-3' (SEQ ID NO: 23).
Затем полученный продукт ПЦР очищали, используя набор для очистки MagExtractor PCR & Gel clean up (фирмы Toyobo Co., Ltd.). Очищенный продукт затем расщепляли рестрикционными ферментами (NheI/NotI) и очищали, используя набор для очистки MagExtractor PCR & Gel clean up (фирмы Toyobo Co., Ltd.). ДНК плазмиду pcDNA3.1(+)(фирмы Life Technologies) расщепляли теми же самыми рестрикционными ферментами, что и упомянутые выше (NheI/NotI), и затем очищали, используя набор для очистки MagExtractor PCR & Gel clean up (фирмы Toyobo Co., Ltd.).Then, the resulting PCR product was purified using a MagExtractor PCR & Gel clean up kit (Toyobo Co., Ltd.). The purified product was then digested with restriction enzymes (NheI/NotI) and purified using MagExtractor PCR & Gel clean up (Toyobo Co., Ltd.). DNA plasmid pcDNA3.1(+) (Life Technologies) was digested with the same restriction enzymes as mentioned above (NheI/NotI) and then purified using the MagExtractor PCR & Gel clean up kit (Toyobo Co., Ltd.).
Эти растворы очищенных ДНК смешивали, затем добавляли к ним реагент для лигирования Ligation high (фирмы Toyobo Co., Ltd.) и инкубировали при 16°C в течение 8 часов с целью лигирования.These purified DNA solutions were mixed, then Ligation high ligation reagent (Toyobo Co., Ltd.) was added thereto, and incubated at 16°C for 8 hours for ligation.
Компетентные клетки Escherichia coli DH5α (фирмы Life Technologies) трансформировали путем добавления полученного продукта реакции.Competent Escherichia coli DH5α cells (Life Technologies) were transformed by adding the resulting reaction product.
Полученные таким образом колонии подвергали прямому анализу колоний с помощью ПЦР, используя ПЦР праймеры и BGH обратный праймер для отбора перспективных клонов.The colonies thus obtained were subjected to direct colony analysis by PCR using PCR primers and BGH reverse primer to select promising clones.
Полученные перспективные клоны культивировали в жидкой среде (LB/Amp), и плазмидную ДНК экстрагировали с помощью набора MagExtractor-Plasmid- (фирмы Toyobo Co., Ltd.).The obtained promising clones were cultured in liquid medium (LB/Amp), and plasmid DNA was extracted with a MagExtractor-Plasmid- kit (Toyobo Co., Ltd.).
Каждый полученный клон сравнивали с предоставляемой CDS последовательностью путем анализа секвенирования междуEach resulting clone was compared to the CDS-provided sequence by sequencing analysis between
праймером 3 (праймер промотора CMV):primer 3 (CMV promoter primer):
5'-cgcaaatgggcggtaggcgtg-3' (SEQ ID NO: 24) и5'-cgcaaatgggcggtaggcgtg-3' (SEQ ID NO: 24) and
праймером 4 (BGH обратный праймер):primer 4 (BGH reverse primer):
5'-tagaaggcacagtcgagg-3' (SEQ ID NO: 25)5'-tagaaggcacagtcgagg-3' (SEQ ID NO: 25)
с полученной плазмидной ДНК в качестве матрицы.with the resulting plasmid DNA as a template.
После подтверждения последовательности, полученный клон культивировали в 200 мл среды LB/Amp, и плазмидную ДНК экстрагировали, используя набор VioGene Plasmid Midi V-100.After sequence confirmation, the resulting clone was cultured in 200 ml of LB/Amp medium, and plasmid DNA was extracted using the VioGene Plasmid Midi V-100 kit.
Конструировали вектор в виде pcDNA3.1-B7-H3. Последовательность сайта открытой рамки считывания (ORF site) гена B7-H3 вариант 1, клонированного в вектор, показана в нуклеотидных положениях с 1 до 1602 последовательности SEQ ID NO: 26 (фигура 16) в списке последовательностей. Кроме того, аминокислотная последовательность для B7-H3 вариант 1 показана в последовательности SEQ ID NO: 1 в списке последовательностей.A vector was constructed as pcDNA3.1-B7-H3. The sequence of the open reading frame site (ORF site) of the B7-
(Пример испытания 2). Получение CCRF-CEM клеток, стабильно экспрессирующих ген B7-H3 вариант 1(Test example 2). Generation of CCRF-CEM cells stably expressing the B7-
Вектор pcDNA3.1-B7-H3, полученный в примере испытания 1, трансфицировали в CCRF-CEM клетки (ATCC) путем электропорации, используя аппарат для нуклеофекции Nucleofector II (фирмы Lonza group Ltd.). Затем клетки культивировали в течение двух ночей в среде RPMI1640 (фирмы Life Technologies), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (далее обозначаемой как 10% FBS-RPMI1640), при 37°C и 5% CO2.The pcDNA3.1-B7-H3 vector obtained in Test Example 1 was transfected into CCRF-CEM cells (ATCC) by electroporation using a Nucleofector II nucleofection apparatus (Lonza group Ltd.). Cells were then cultured for two nights in RPMI1640 medium (Life Technologies) containing 10% fetal bovine serum (FBS) (hereinafter referred to as 10% FBS-RPMI1640) at 37°C and 5% CO 2 .
После двухдневного культивирования, культура была помещена в среду 10% FBS-RPMI1640, содержащую 750 мкг/мл G418 (фирмы Life Technologies), с целью отбора CCRF-CEM клеток, в которые был стабильно интегрирован вектор pcDNA3.1-B7-H3.After two days of culture, the culture was placed in 10% FBS-RPMI1640 medium containing 750 μg/ml G418 (Life Technologies) to select CCRF-CEM cells into which the pcDNA3.1-B7-H3 vector was stably integrated.
После культивирования в течение одного месяца, проводили клонирование способом серийных разведений для получения одноклеточного клона. В частности, клетки, резистентные к G418, разбавляли до 10 клеток/мл, высевали в 96-луночном планшете при концентрации 100 мкл/лунка и культивировали, и пролиферирующие клетки извлекали из индивидуальных лунок.After culturing for one month, cloning was performed by the serial dilution method to obtain a single cell clone. Specifically, G418 resistant cells were diluted to 10 cells/ml, plated in a 96-well plate at a concentration of 100 μl/well, and cultured, and proliferating cells were recovered from individual wells.
Для подтверждения экспрессии B7-H3 в каждом извлеченном клоне использовали проточную цитометрии. В частности, каждый извлеченный клон промывали два раза с помощью PBS, содержащего 5% FBS, после чего суспендировали путем добавления PBS, содержащего 5% FBS и 10 мкг/мл M30, и выдерживали при 4°C в течение 30 минут. Клон промывали два раза с помощью PBS, содержащего 5% FBS, после чего суспендировали путем добавления фракции конъюгированного с флуоресцеином козьего IgG для мышиного IgG (полномолекулярного) (#55493, фирмы ICN Pharmaceuticals, Inc.), разбавленного в 1000 раз с помощью PBS, содержащего 5% FBS, и выдерживали при 4°C в течение 30 минут. Клон промывали два раза с помощью PBS, содержащего 5% FBS, после чего ресуспендировали в PBS, содержащем 5% FBS, и проводили анализ, используя проточный цитометр (FC500: фирмы Beckman Coulter, Inc.).Flow cytometry was used to confirm B7-H3 expression in each clone retrieved. In particular, each recovered clone was washed twice with PBS containing 5% FBS, and then suspended by adding PBS containing 5% FBS and 10 μg/ml M30, and kept at 4°C for 30 minutes. The clone was washed twice with PBS containing 5% FBS and then suspended by adding a fraction of fluorescein-conjugated goat IgG for mouse IgG (whole molecular weight) (#55493, ICN Pharmaceuticals, Inc.) diluted 1000-fold with PBS, containing 5% FBS, and kept at 4°C for 30 minutes. The clone was washed twice with PBS containing 5% FBS, then resuspended in PBS containing 5% FBS and analyzed using a flow cytometer (FC500: from Beckman Coulter, Inc.).
CCRF-CEM клетки, стабильно экспрессирующие ген B7-H3 вариант 1, полученные с помощью этих методик, обозначали как CEM_V1_3.1_2 клетки. Исходную линию CCRF-CEM клеток использовали в качестве клеточной линии, в которой отсутствовала экспрессия B7-H3.CCRF-CEM cells stably expressing the B7-
(Пример испытания 3). Испытание на цитотоксичность (1) конъюгата антитело-лекарственное средство(Test example 3). Cytotoxicity Test (1) Antibody Drug Conjugate
Клетки CEM_V1_3.1_2, полученные в примере испытания 2, или Клетки CCRF-CEM (ATCC) культивировали в среде RPMI1640 (GIBCO), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (MOREGATE) (далее называемой средой). Клетки CEM_V1_3.1_2 или клетки CCRF-CEM приготавливали, используя среду, так, чтобы их концентрация составляла 8×104 клеток/мл, и добавляли при концентрации 25 мкл/лунка в 96-луночный микропланшет для культивирования клеток, в который добавляли 65 мкл/лунка среды, и культивировали в течение ночи. На следующий день, M30-H1-L4 антитело, M30-H1-L4P антитело и конъюгат антитело-лекарственное средство, каждые разбавленные с помощью среды до 1000 нМ, 200 нМ, 40 нМ, 8 нМ, 1,6 нМ, 0,32 нМ и 0,064 нМ, добавляли при концентрации 10 мкл/лунка в микропланшет. В лунки, в которые не было добавлено испытуемого соединения, добавляли среду при концентрации 10 мкл/лунка. Клетки культивировали при 5% CO2 и 37°C в течение 3 дней. После культивирования, микропланшет вынимали из термостата и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут. В культуральный раствор добавляли равное количество реагента для определения жизнеспособности клеток CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (фирмы Promega) и перемешивали. Затем микропланшет выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут, и определяли величину излучения света, используя планшет-ридер (фирмы Perkin Elmer). Значение IC50 рассчитывали по следующему уравнению:CEM_V1_3.1_2 cells obtained in Test Example 2 or CCRF-CEM (ATCC) cells were cultured in RPMI1640 (GIBCO) medium containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (hereinafter referred to as medium). CEM_V1_3.1_2 cells or CCRF-CEM cells were prepared using the medium so that their concentration was 8×10 4 cells/ml, and added at a concentration of 25 μl/well to a 96-well cell culture microplate, to which 65 μl /well medium, and cultured overnight. The next day, M30-H1-L4 antibody, M30-H1-L4P antibody, and antibody-drug conjugate each diluted with medium to 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM and 0.064 nM were added at a concentration of 10 μl/well to a microplate. In the wells to which no test compound was added, medium was added at a concentration of 10 µl/well. Cells were cultured at 5% CO 2 and 37°C for 3 days. After cultivation, the microplate was removed from the thermostat and kept at room temperature for 30 minutes. An equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) was added to the culture solution and mixed. Then, the microplate was kept at room temperature for 10 minutes, and the amount of light emission was determined using a plate reader (manufactured by Perkin Elmer). The IC 50 value was calculated using the following equation:
IC50 (нМ)=антилогарифм((50-d)×(LOG10b-LOG10a)/(d-c)+LOG10b),IC 50 (nM)=antilog((50-d)×(LOG 10 b-LOG 10 a)/(dc)+LOG 10 b),
a: Концентрация a испытуемого соединения,a: Concentration a of the test compound,
b: Концентрация b испытуемого соединения,b: Concentration b of the test compound,
c: Доля живых клеток, к которым было добавлено испытуемое соединение при концентрации a,c: Proportion of living cells to which the test compound was added at concentration a,
d: Доля живых клеток, к которым было добавлено испытуемое соединение при концентрации b.d: Proportion of living cells to which the test compound was added at concentration b.
Концентрации a и b удовлетворяют требованию соотношения a > b, которое соответствует 50% живых клеток.The concentrations a and b satisfy the requirement of the ratio a > b, which corresponds to 50% of living cells.
Процент выживания клеток при каждой концентрации рассчитывали по следующему уравнению:The percentage of cell survival at each concentration was calculated using the following equation:
Процент выживания клеток (%)=a/b×100,Percentage of cell survival (%)=a/b×100,
a: Средняя величина излучения лунок, в которые было добавлено испытуемое соединение (n=2),a: Average irradiance of the wells to which the test compound was added (n=2),
b: Средняя величина излучения лунок, в которые не было добавлено испытуемого соединения (n=10).b: Average irradiance of wells to which no test compound was added (n=10).
Конъюгаты антитело-лекарственное средство (5), (16), (21), (32), (44), (45), (46), (52) и (54) проявляли цитотоксическую активность порядка IC50<0,1 (нМ) в отношении клеток CEM_V1_3.1_2. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (1), (12), (13), (20), (28), (29), (35), (36), (37), (41), (49) и (53) проявляли цитотоксическую активность порядка 0,1<IC50<1 (нМ) в отношении клеток. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (33), (34), (47), (48), (50) и (51) проявляли цитотоксическую активность порядка 1<IC50<100 (нМ) в отношении клеток. С другой стороны, ни один из этих конъюгатов не проявлял цитотоксической активности в отношении клеток CCRF-CEM (>100 (нМ)). Ни M30-H1-L4 антитело, ни M30-H1-L4P антитело не проявляли цитотоксической активности в отношении и той, и другой линии клеток (>100 (нМ)).Antibody-drug conjugates (5), (16), (21), (32), (44), (45), (46), (52) and (54) showed cytotoxic activity of the order of IC 50 <0.1 (nM) against CEM_V1_3.1_2 cells. Antibody drug conjugates (1), (12), (13), (20), (28), (29), (35), (36), (37), (41), (49) and ( 53) showed cytotoxic activity of the order of 0.1<IC 50 <1 (nM) against cells. The antibody-drug conjugates (33), (34), (47), (48), (50) and (51) showed cytotoxic activity on the order of 1<IC 50 <100 (nM) against cells. On the other hand, none of these conjugates showed cytotoxic activity against CCRF-CEM cells (>100 (nM)). Neither the M30-H1-L4 antibody nor the M30-H1-L4P antibody exhibited cytotoxic activity against either cell line (>100 (nM)).
(Пример испытания 4). Испытание на цитотоксичность (2) конъюгата антитело-лекарственное средство(Test example 4). Cytotoxicity test (2) antibody-drug conjugate
Антиген-положительные клетки линии клеток SR (ATCC) или антиген-отрицательные клетки линии клеток Daudi (ATCC) культивировали в среде RPMI1640 (GIBCO), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (MOREGATE) (далее называемой средой). Клетки SR или клетки Daudi приготавливали, используя среду, так, чтобы они имели концентрацию 2,8×104 клеток/мл, и добавляли при концентрации 90 мкл/лунка в 96-луночный микропланшет для культивирования клеток. Через два часа, анти-CD30 антитело и конъюгаты антитело-лекарственное средство (6) и (7), каждые разбавленные с помощью среды до 40 нМ, 8 нМ, 1,6 нМ, 320 пМ, 64 пМ, 12,8 пМ и 2,6 пМ, добавляли при концентрации 10 мкл/лунка в микропланшет. В лунки, в которые не добавляли испытуемого соединения, добавляли среду при концентрации 10 мкл/лунка. Клетки культивировали при 5% CO2 и 37°C в течение 3 дней. После культивирования, микропланшет вынимали из термостата и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут. В культуральный раствор добавляли равное количество реагента для определения жизнеспособности клеток CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (фирмы Promega) и перемешивали. Затем микропланшет выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут, и определяли величину излучения света, используя планшет-ридер (фирмы Perkin Elmer). Значение IC50 рассчитывали по следующему уравнению:Antigen-positive cells of the SR cell line (ATCC) or antigen-negative cells of the Daudi cell line (ATCC) were cultured in RPMI1640 (GIBCO) medium containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (hereinafter referred to as medium). SR cells or Daudi cells were prepared using the medium so that they had a concentration of 2.8×10 4 cells/ml and added at a concentration of 90 μl/well to a 96-well cell culture microplate. Two hours later, anti-CD30 antibody and antibody-drug conjugates (6) and (7), each diluted with medium to 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 320 pM, 64 pM, 12.8 pM and 2.6 pM was added at a concentration of 10 μl/well to a microplate. In wells to which no test compound was added, medium was added at a concentration of 10 µl/well. Cells were cultured at 5% CO 2 and 37°C for 3 days. After cultivation, the microplate was removed from the thermostat and kept at room temperature for 30 minutes. An equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) was added to the culture solution and mixed. Then, the microplate was kept at room temperature for 10 minutes, and the amount of light emission was determined using a plate reader (manufactured by Perkin Elmer). The IC 50 value was calculated using the following equation:
IC50 (нМ)=антилогарифм((50-d)×(LOG10b-LOG10a)/(d-c)+LOG10b),IC 50 (nM)=antilog((50-d)×(LOG 10 b-LOG 10 a)/(dc)+LOG 10 b),
a: Концентрация a испытуемого соединения,a: Concentration a of the test compound,
b: Концентрация b испытуемого соединения,b: Concentration b of the test compound,
c: Доля живых клеток, к которым было добавлено испытуемое соединение при концентрации a,c: Proportion of living cells to which the test compound was added at concentration a,
d: Доля живых клеток, к которым было добавлено испытуемое соединение при концентрации b.d: Proportion of living cells to which the test compound was added at concentration b.
Концентрации a и b удовлетворяют требованию соотношения a>b, которое соответствует 50% живых клеток.The concentrations a and b satisfy the requirement of the ratio a>b, which corresponds to 50% of living cells.
Процент выживания клеток при каждой концентрации рассчитывали по следующему уравнению:The percentage of cell survival at each concentration was calculated using the following equation:
Процент выживания клеток (%)=a/b×100,Percentage of cell survival (%)=a/b×100,
a: Средняя величина излучения лунок, в которые было добавлено испытуемое соединение (n=2),a: Average irradiance of the wells to which the test compound was added (n=2),
b: Средняя величина излучения лунок, в которые не было добавлено испытуемого соединения (n=12).b: Average irradiance of wells to which no test compound was added (n=12).
Конъюгаты антитело-лекарственное средство (6) и (7) проявляли цитотоксическую активность порядка IC50<0,01 (нМ) в отношении клеток SR. С другой стороны, конъюгаты антитело-лекарственное средство (6) и (7) не проявляли никакой цитотоксической активности в отношении клеток Daudi (>4,0 (нМ)). Анти-CD30 антитело не проявляло цитотоксической активности в отношении и тех, и других клеток (>4,0 (нМ)).The antibody-drug conjugates (6) and (7) showed cytotoxic activity of the order of IC 50 <0.01 (nM) against SR cells. On the other hand, the antibody-drug conjugates (6) and (7) did not show any cytotoxic activity against Daudi cells (>4.0 (nM)). The anti-CD30 antibody showed no cytotoxic activity against both cells (>4.0 (nM)).
(Пример испытания 5). Испытание на цитотоксичность (3) конъюгата антитело-лекарственное средство(Test example 5). Cytotoxicity Test (3) Antibody Drug Conjugate
Антиген-положительные клетки линии клеток SR (ATCC) культивировали в среде RPMI1640 (GIBCO), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (MOREGATE) (далее называемой средой). Клетки SR приготавливали, используя среду, так, чтобы они имели концентрацию 2,8×104 клеток/мл, и добавляли при концентрации 90 мкл/лунка в 96-луночный микропланшет для культивирования клеток. Через два часа, анти-CD30 антитело и конъюгаты антитело-лекарственное средство (22), (23), (38), (64) и (65), каждые разбавленные с помощью среды до 1000 нМ, 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 100 пМ, 10 пМ и 1 пМ, добавляли при концентрации 10 мкл/лунка в микропланшет. В лунки, в которые не добавляли испытуемого соединения, добавляли среду при концентрации 10 мкл/лунка. Клетки культивировали при 5% CO2 и 37°C в течение 6 дней. После культивирования, микропланшет вынимали из термостата и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут. В культуральный раствор добавляли равное количество реагента для определения жизнеспособности клеток CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (фирмы Promega) и перемешивали. Затем микропланшет выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут, и определяли величину излучения света, используя планшет-ридер (фирмы Perkin Elmer). Значение IC50 рассчитывали по следующему уравнению:Antigen positive cells of the SR cell line (ATCC) were cultured in RPMI1640 medium (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (hereinafter referred to as medium). SR cells were prepared using the medium so that they had a concentration of 2.8×10 4 cells/ml and added at a concentration of 90 μl/well to a 96-well cell culture microplate. Two hours later, anti-CD30 antibody and antibody-drug conjugates (22), (23), (38), (64) and (65), each diluted with medium to 1000 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM and 1 pM were added at a concentration of 10 μl/well to a microplate. In wells to which no test compound was added, medium was added at a concentration of 10 µl/well. Cells were cultured at 5% CO 2 and 37°C for 6 days. After cultivation, the microplate was removed from the thermostat and kept at room temperature for 30 minutes. An equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) was added to the culture solution and mixed. Then, the microplate was kept at room temperature for 10 minutes, and the amount of light emission was determined using a plate reader (manufactured by Perkin Elmer). The IC 50 value was calculated using the following equation:
IC50 (нМ)=антилогарифм((50-d)×(LOG10b-LOG10a)/(d-c)+LOG10b),IC 50 (nM)=antilog((50-d)×(LOG 10 b-LOG 10 a)/(dc)+LOG 10 b),
a: Концентрация a испытуемого соединения,a: Concentration a of the test compound,
b: Концентрация b испытуемого соединения,b: Concentration b of the test compound,
c: Доля живых клеток, к которым было добавлено испытуемое соединение при концентрации a,c: Proportion of living cells to which the test compound was added at concentration a,
d: Доля живых клеток, к которым было добавлено испытуемое соединение при концентрации b.d: Proportion of living cells to which the test compound was added at concentration b.
Концентрации a и b удовлетворяют требованию соотношения a > b, которое соответствует 50% живых клеток.The concentrations a and b satisfy the requirement of the ratio a > b, which corresponds to 50% of living cells.
Процент выживания клеток при каждой концентрации рассчитывали по следующему уравнению:The percentage of cell survival at each concentration was calculated using the following equation:
Процент выживания клеток (%)=a/b×100,Percentage of cell survival (%)=a/b×100,
a: Средняя величина излучения лунок, в которые было добавлено испытуемое соединение (n=2),a: Average irradiance of the wells to which the test compound was added (n=2),
b: Средняя величина излучения лунок, в которые не было добавлено испытуемого соединения (n=12).b: Average irradiance of wells to which no test compound was added (n=12).
Конъюгаты антитело-лекарственное средство (23), (38), (64) и (65) проявляли цитотоксическую активность порядка IC50<0,01 (нМ) в отношении клеток SR. Конъюгат антитело-лекарственное средство (22) проявлял цитотоксическую активность порядка IC50<0,1 (нМ) в отношении клеток SR. Анти-CD30 антитело не проявляло цитотоксической активности в отношении клеток SR (>4,0 (нМ)).The antibody-drug conjugates (23), (38), (64) and (65) showed cytotoxic activity of the order of IC 50 <0.01 (nM) against SR cells. The antibody-drug conjugate (22) showed cytotoxic activity of the order of IC 50 <0.1 (nM) against SR cells. The anti-CD30 antibody showed no cytotoxic activity against SR cells (>4.0 (nM)).
(Пример испытания 6). Испытание на цитотоксичность (4) конъюгата антитело-лекарственное средство(Test example 6). Cytotoxicity Test (4) Antibody Drug Conjugate
Антиген-положительные клетки линии клеток HL-60 (ATCC) или антиген-отрицательные клетки линии клеток Raji (ATCC) культивировали в среде RPMI1640 (GIBCO), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (MOREGATE) (далее называемой средой). Клетки HL-60 или клетки Raji приготавливали, используя среду, так, чтобы они имели концентрацию 8×104 клеток/мл, и добавляли при концентрации 25 мкл/лунка в 96-луночный микропланшет для культивирования клеток, в который было добавлено 65 мкл/лунка среды. Анти-CD33 антитело и конъюгаты антитело-лекарственное средство (8) и (9), каждые разбавленные с помощью среды до 1000 нМ, 200 нМ, 40 нМ, 8 нМ, 1,6 нМ, 0,32 нМ и 0,064 нМ, добавляли при концентрации 10 мкл/лунка в микропланшет. В лунки, в которые не добавляли испытуемого соединения, добавляли среду при концентрации 10 мкл/лунка. Клетки культивировали в течение 3 дней при 5% CO2 и 37°C. После культивирования, микропланшет вынимали из термостата и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут. В культуральный раствор добавляли равное количество реагента для определения жизнеспособности клеток CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (фирмы Promega) и перемешивали. Затем микропланшет выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут, и определяли величину излучения света, используя планшет-ридер (фирмы Perkin Elmer). Значение IC50 рассчитывали по следующему уравнению:Antigen positive HL-60 cell line (ATCC) or antigen negative Raji cell line (ATCC) were cultured in RPMI1640 (GIBCO) medium containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (hereinafter referred to as medium). HL-60 cells or Raji cells were prepared using the medium so that they had a concentration of 8×10 4 cells/ml, and added at a concentration of 25 μl/well to a 96-well cell culture microplate to which 65 μl/ml was added. medium well. Anti-CD33 antibody and antibody-drug conjugates (8) and (9), each diluted with medium to 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM and 0.064 nM, were added at a concentration of 10 µl/well in a microplate. In wells to which no test compound was added, medium was added at a concentration of 10 µl/well. Cells were cultured for 3 days at 5% CO 2 and 37°C. After cultivation, the microplate was removed from the thermostat and kept at room temperature for 30 minutes. An equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) was added to the culture solution and mixed. Then, the microplate was kept at room temperature for 10 minutes, and the amount of light emission was determined using a plate reader (manufactured by Perkin Elmer). The IC 50 value was calculated using the following equation:
IC50 (нМ)=антилогарифм((50-d)×(LOG10b-LOG10a)/(d-c)+LOG10b),IC 50 (nM)=antilog((50-d)×(LOG 10 b-LOG 10 a)/(dc)+LOG 10 b),
a: Концентрация a испытуемого соединения,a: Concentration a of the test compound,
b: Концентрация b испытуемого соединения,b: Concentration b of the test compound,
c: Доля живых клеток, к которым было добавлено испытуемое соединение при концентрации a,c: Proportion of living cells to which the test compound was added at concentration a,
d: Доля живых клеток, к которым было добавлено испытуемое соединение при концентрации b.d: Proportion of living cells to which the test compound was added at concentration b.
Концентрации a и b удовлетворяют требованию соотношения a>b, которое соответствует 50% живых клеток.The concentrations a and b satisfy the requirement of the ratio a>b, which corresponds to 50% of living cells.
Процент выживания клеток при каждой концентрации рассчитывали по следующему уравнению:The percentage of cell survival at each concentration was calculated using the following equation:
Процент выживания клеток (%)=a/b×100,Percentage of cell survival (%)=a/b×100,
a: Средняя величина излучения лунок, в которые было добавлено испытуемое соединение (n=2),a: Average irradiance of the wells to which the test compound was added (n=2),
b: Средняя величина излучения лунок, в которые не было добавлено испытуемого соединения (n=5).b: Average irradiance of wells to which no test compound was added (n=5).
Конъюгаты антитело-лекарственное средство (8) и (9) проявляли цитотоксическую активность порядка IC50<0,1 (нМ) в отношении клеток HL-60. С другой стороны, конъюгаты антитело-лекарственное средство (8) и (9) не проявляли цитотоксической активности в отношении клеток Raji (>100 (нМ)). Анти-CD33 антитело не проявляло цитотоксической активности в отношении ни тех, ни других клеток (>100 (нМ)).The antibody-drug conjugates (8) and (9) showed cytotoxic activity of the order of IC 50 <0.1 (nM) against HL-60 cells. On the other hand, the antibody-drug conjugates (8) and (9) showed no cytotoxic activity against Raji cells (>100 (nM)). The anti-CD33 antibody showed no cytotoxic activity against either cell (>100 (nM)).
(Пример испытания 7). Испытание на цитотоксичность (5) конъюгата антитело-лекарственное средство(Test example 7). Cytotoxicity Test (5) Antibody-Drug Conjugate
Антиген-положительные клетки клеточной линии NOMO-1 (HSRRB) культивировали в среде RPMI1640 (GIBCO), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (MOREGATE) (далее называемой средой). Клетки NOMO-1 приготавливали, используя среду, так, чтобы они имели концентрацию 2,8×104 клеток/мл, и добавляли при концентрации 90 мкл/лунка в 96-луночный микропланшет для культивирования клеток. Через два часа, анти-CD33 антитело и конъюгаты антитело-лекарственное средство (24), (25) и (67), каждые разбавленные с помощью среды до 1000 нМ, 200 нМ, 40 нМ, 8 нМ, 1,6 нМ, 0,32 нМ и 0,064 нМ, добавляли при концентрации 10 мкл/лунка в микропланшет. В лунки, в которые не добавляли испытуемого соединения, добавляли среду при концентрации 10 мкл/лунка. Клетки культивировали при 5% CO2 и 37°C в течение 6 дней. После культивирования, микропланшет вынимали из термостата и выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре. В культуральный раствор добавляли равное количество реагента для определения жизнеспособности клеток CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (фирмы Promega) и перемешивали. Затем микропланшет выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут, и определяли величину излучения света, используя планшет-ридер (фирмы Perkin Elmer). Значение IC50 рассчитывали по следующему уравнению:Antigen positive NOMO-1 cell line (HSRRB) cells were cultured in RPMI1640 medium (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (hereinafter referred to as medium). NOMO-1 cells were prepared using the medium so that they had a concentration of 2.8×10 4 cells/ml and added at a concentration of 90 μl/well to a 96-well cell culture microplate. Two hours later, anti-CD33 antibody and antibody-drug conjugates (24), (25), and (67), each diluted with medium to 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0 .32 nM and 0.064 nM were added at a concentration of 10 μl/well to a microplate. In wells to which no test compound was added, medium was added at a concentration of 10 µl/well. Cells were cultured at 5% CO 2 and 37°C for 6 days. After cultivation, the microplate was removed from the thermostat and kept for 30 minutes at room temperature. An equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) was added to the culture solution and mixed. Then, the microplate was kept at room temperature for 10 minutes, and the amount of light emission was determined using a plate reader (manufactured by Perkin Elmer). The IC 50 value was calculated using the following equation:
IC50 (нМ)=антилогарифм((50-d)×(LOG10b-LOG10a)/(d-c)+LOG10b),IC 50 (nM)=antilog((50-d)×(LOG 10 b-LOG 10 a)/(dc)+LOG 10 b),
a: Концентрация a испытуемого соединения,a: Concentration a of the test compound,
b: Концентрация b испытуемого соединения,b: Concentration b of the test compound,
c: Доля живых клеток, к которым было добавлено испытуемое соединение при концентрации a,c: Proportion of living cells to which the test compound was added at concentration a,
d: Доля живых клеток, к которым было добавлено испытуемое соединение при концентрации b.d: Proportion of living cells to which the test compound was added at concentration b.
Концентрации a и b удовлетворяют требованию соотношения a>b, которое соответствует 50% живых клеток.The concentrations a and b satisfy the requirement of the ratio a>b, which corresponds to 50% of living cells.
Процент выживания клеток при каждой концентрации рассчитывали по следующему уравнению:The percentage of cell survival at each concentration was calculated using the following equation:
Процент выживания клеток (%)=a/b×100,Percentage of cell survival (%)=a/b×100,
a: Средняя величина излучения лунок, в которые было добавлено испытуемое соединение (n=2),a: Average irradiance of the wells to which the test compound was added (n=2),
b: Средняя величина излучения лунок, в которые не было добавлено испытуемого соединения (n=5).b: Average irradiance of wells to which no test compound was added (n=5).
Конъюгат антитело-лекарственное средство (25) проявлял цитотоксическую активность порядка IC50<0,1 (нМ) в отношении клеток NOMO-1. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (24) и (67) проявляли цитотоксическую активность порядка 1<IC50<100 (нМ) в отношении клеток NOMO-1. Анти-CD33 антитело не проявляло цитотоксической активности в отношении клеток NOMO-1 (>100 (нМ)).The antibody-drug conjugate (25) showed cytotoxic activity of the order of IC 50 <0.1 (nM) against NOMO-1 cells. The antibody-drug conjugates (24) and (67) exhibited cytotoxic activity of the order of 1<IC 50 <100 (nM) against NOMO-1 cells. The anti-CD33 antibody showed no cytotoxic activity against NOMO-1 cells (>100 (nM)).
(Пример испытания 8). Испытание на цитотоксичность (6) конъюгата антитело-лекарственное средство(Test example 8). Cytotoxicity Test (6) Antibody-Drug Conjugate
Антиген-положительные клетки клеточной линии U251 (ATCC) или антиген-отрицательные клетки клеточной линии MCF-7 (ATCC) культивировали в среде RPMI1640 (GIBCO), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (MOREGATE) (далее называемой средой). Клетки U251 или клетки MCF-7 приготавливали, используя среду, так, чтобы они имели концентрацию 2,8×104 клеток/мл, и добавляли при концентрации 90 мкл/лунка в 96-луночный микропланшет для культивирования клеток, и культивировали в течение ночи. На следующий день, анти-CD70 антитело и конъюгаты антитело-лекарственное средство (10) и (11), каждые разбавленные с помощью среды до 1000 нМ, 200 нМ, 40 нМ, 8 нМ, 1,6 нМ, 0,32 нМ и 0,064 нМ, добавляли при концентрации 10 мкл/лунка в микропланшет. В лунки, в которые не добавляли испытуемого соединения, добавляли среду при концентрации 10 мкл/лунка. Клетки культивировали при 5% CO2 и 37°C в течение 6 дней. После культивирования, микропланшет вынимали из термостата и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут. В культуральный раствор добавляли равное количество реагента для определения жизнеспособности клеток CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (фирмы Promega) и перемешивали. Затем микропланшет выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут, и определяли величину излучения света, используя планшет-ридер (фирмы Perkin Elmer). Значение IC50 рассчитывали по следующему уравнению:U251 antigen positive cell line (ATCC) or MCF-7 antigen negative cell line (ATCC) were cultured in RPMI1640 (GIBCO) medium containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (hereinafter referred to as medium). U251 cells or MCF-7 cells were prepared using the medium so that they had a concentration of 2.8×10 4 cells/ml, and added at a concentration of 90 μl/well to a 96-well cell culture microplate, and cultured overnight . The following day, anti-CD70 antibody and antibody-drug conjugates (10) and (11), each diluted with media to 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM and 0.064 nM was added at a concentration of 10 μl/well to a microplate. In wells to which no test compound was added, medium was added at a concentration of 10 µl/well. Cells were cultured at 5% CO 2 and 37°C for 6 days. After cultivation, the microplate was removed from the thermostat and kept at room temperature for 30 minutes. An equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) was added to the culture solution and mixed. Then, the microplate was kept at room temperature for 10 minutes, and the amount of light emission was determined using a plate reader (manufactured by Perkin Elmer). The IC 50 value was calculated using the following equation:
IC50 (нМ)=антилогарифм((50-d)×(LOG10b-LOG10a)/(d-c)+LOG10b),IC 50 (nM)=antilog((50-d)×(LOG 10 b-LOG 10 a)/(dc)+LOG 10 b),
a: Концентрация a испытуемого соединения,a: Concentration a of the test compound,
b: Концентрация b испытуемого соединения,b: Concentration b of the test compound,
c: Доля живых клеток, к которым было добавлено испытуемое соединение при концентрации a,c: Proportion of living cells to which the test compound was added at concentration a,
d: Доля живых клеток, к которым было добавлено испытуемое соединение при концентрации b.d: Proportion of living cells to which the test compound was added at concentration b.
Концентрации a и b удовлетворяют требованию соотношения a>b, которое соответствует 50% живых клеток.The concentrations a and b satisfy the requirement of the ratio a>b, which corresponds to 50% of living cells.
Процент выживания клеток при каждой концентрации рассчитывали по следующему уравнению:The percentage of cell survival at each concentration was calculated using the following equation:
Процент выживания клеток (%)=a/b×100,Percentage of cell survival (%)=a/b×100,
a: Средняя величина излучения лунок, в которые было добавлено испытуемое соединение (n=2),a: Average irradiance of the wells to which the test compound was added (n=2),
b: Средняя величина излучения лунок, в которые не было добавлено испытуемого соединения (n=12).b: Average irradiance of wells to which no test compound was added (n=12).
Конъюгаты антитело-лекарственное средство (10) и (11) проявляли цитотоксическую активность порядка IC50<1 (нМ) в отношении клеток U251. С другой стороны, конъюгаты антитело-лекарственное средство (10) и (11) не проявляли цитотоксической активности в отношении клеток MCF-7 (≥90 (нМ)). Анти-CD70 антитело не проявляло цитотоксической активности в отношении ни тех, ни других клеток (>100 (нМ)).The antibody-drug conjugates (10) and (11) showed cytotoxic activity of the order of IC 50 <1 (nM) against U251 cells. On the other hand, the antibody-drug conjugates (10) and (11) showed no cytotoxic activity against MCF-7 cells (≥90 (nM)). The anti-CD70 antibody showed no cytotoxic activity against either cell (>100 (nM)).
(Пример испытания 9) Испытание на цитотоксичность (7) конъюгата антитело-лекарственное средство(Test Example 9) Cytotoxicity Test (7) of Antibody-Drug Conjugate
Антиген-положительные клетки линии клеток U251 (ATCC) культивировали в среде RPMI1640 (GIBCO), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (MOREGATE) (далее называемой средой). Клетки U251 приготавливали, используя среду, так, чтобы они имели концентрацию 2,8×104 клеток/мл, и добавляли при концентрации 90 мкл/лунка в 96-луночный микропланшет для культивирования клеток. Через два часа, анти-CD70 антитело и конъюгаты антитело-лекарственное средство (26), (27), (40), (68) и (69), каждые разбавленные с помощью среду до 1000 нМ, 200 нМ, 40 нМ, 8 нМ, 1,6 нМ, 0,32 нМ и 0,064 нМ, добавляли при концентрации 10 мкл/лунка в микропланшет. В лунки, в которые не добавляли испытуемого соединения, добавляли среду при концентрации 10 мкл/лунка. Клетки культивировали при 5% CO2 и 37°C в течение 6 дней. После культивирования, микропланшет вынимали из термостата и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут. В культуральный раствор добавляли равное количество реагента для определения жизнеспособности клеток CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (фирмы Promega) и перемешивали. Затем микропланшет выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут, и определяли величину излучения света, используя планшет-ридер (фирмы Perkin Elmer). Значение IC50 рассчитывали по следующему уравнению:Antigen positive cells of the U251 cell line (ATCC) were cultured in RPMI1640 medium (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (hereinafter referred to as medium). U251 cells were prepared using the medium so that they had a concentration of 2.8×10 4 cells/ml and added at a concentration of 90 μl/well to a 96-well cell culture microplate. Two hours later, anti-CD70 antibody and antibody-drug conjugates (26), (27), (40), (68), and (69), each diluted with media to 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, and 0.064 nM were added at a concentration of 10 μl/well to a microplate. In wells to which no test compound was added, medium was added at a concentration of 10 µl/well. Cells were cultured at 5% CO 2 and 37°C for 6 days. After cultivation, the microplate was removed from the thermostat and kept at room temperature for 30 minutes. An equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) was added to the culture solution and mixed. Then, the microplate was kept at room temperature for 10 minutes, and the amount of light emission was determined using a plate reader (manufactured by Perkin Elmer). The IC 50 value was calculated using the following equation:
IC50 (нМ)=антилогарифм((50-d)×(LOG10b-LOG10a)/(d-c)+LOG10b),IC 50 (nM)=antilog((50-d)×(LOG 10 b-LOG 10 a)/(dc)+LOG 10 b),
a: Концентрация a испытуемого соединения,a: Concentration a of the test compound,
b: Концентрация b испытуемого соединения,b: Concentration b of the test compound,
c: Доля живых клеток, к которым было добавлено испытуемое соединение при концентрации a,c: Proportion of living cells to which the test compound was added at concentration a,
d: Доля живых клеток, к которым было добавлено испытуемое соединение при концентрации b.d: Proportion of living cells to which the test compound was added at concentration b.
Концентрации a и b удовлетворяют требованию соотношения a > b, которое соответствует 50% живых клеток.The concentrations a and b satisfy the requirement of the ratio a > b, which corresponds to 50% of living cells.
Процент выживания клеток при каждой концентрации рассчитывали по следующему уравнению:The percentage of cell survival at each concentration was calculated using the following equation:
Процент выживания клеток (%)=a/b×100,Percentage of cell survival (%)=a/b×100,
a: Средняя величина излучения лунок, в которые было добавлено испытуемое соединение (n=2),a: Average irradiance of the wells to which the test compound was added (n=2),
b: Средняя величина излучения лунок, в которые не было добавлено испытуемого соединения (n=12).b: Average irradiance of wells to which no test compound was added (n=12).
Конъюгаты антитело-лекарственное средство (26), (27), (40) и (69) проявляли цитотоксическую активность порядка 1<IC50<10 (нМ) в отношении клеток U251. Конъюгат антитело-лекарственное средство (68) проявлял цитотоксическую активность порядка 10<IC50<100 (нМ) в отношении клеток U251. Анти-CD70 антитело не проявляло цитотоксической активности в отношении коеток U251 (>100 (нМ)).The antibody-drug conjugates (26), (27), (40) and (69) showed cytotoxic activity of the order of 1<IC 50 <10 (nM) against U251 cells. The antibody-drug conjugate (68) showed cytotoxic activity of the order of 10<IC 50 <100 (nM) against U251 cells. The anti-CD70 antibody showed no cytotoxic activity against U251 beds (>100 (nM)).
(Пример испытания 10). Испытание на цитотоксичность (8) высвобождающегося лекарственного средства(Test example 10). Released drug cytotoxicity test (8)
Клетки A375 (ATCC) культивировали в среде DMEM (GIBCO), содержащией 10% фетальной бычьей сыворотки (MOREGATE) (далее называемой средой). Клетки A375 приготавливали, используя среду, так, чтобы они имели концентрацию 4×104 клеток/мл, и добавляли при концентрации 25 мкл/лунка в 96-луночный микропланшет для культивирования клеток (фирмы CORNING), в который было добавлено 65 мкл/лунка среды, и культивировали в тчение ночи. На следующий день, каждое испытуемое соединение, разбавленное с помощью DMSO до 1000 нМ, 200 нМ, 40 нМ, 8 нМ, 1,6 нМ, 0,32 нМ и 0,064 нМ, добавляли при концентрации 0,5 мкл/лунка в микропланшет. В лунки, в которое не было добавлено испытуемое соединение, добавляли DMSO при концентрации 0,5 мкл/лунка. Объем среды в каждой лунке доводили до 100 мкл путем добавления 10 мкл/лунка среды, и культивировали клетки в течение 6 дней при 5% CO2 и 37°C. После культивирования, микропланшет вынимали из термостата и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут. В культуральный раствор добавляли равное количество реагента для определения жизнеспособности клеток CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (фирмы Promega) и перемешивали. Затем микропланшет выдерживали при комнатной температуре в течение 10 минут, и измеряли величину излучения света, используя планшет-ридер. Значение IC50 рассчитывали по следующему уравнению:A375 cells (ATCC) were cultured in DMEM (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum (MOREGATE) (hereinafter referred to as medium). A375 cells were prepared using the medium so that they had a concentration of 4×10 4 cells/ml, and added at a concentration of 25 μl/well to a 96-well cell culture microplate (CORNING) to which 65 μl/well was added medium and cultured overnight. The next day, each test compound diluted with DMSO to 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM and 0.064 nM was added at a concentration of 0.5 μl/well to the microplate. To wells to which no test compound was added, DMSO was added at a concentration of 0.5 µl/well. The volume of medium in each well was adjusted to 100 μl by adding 10 μl/well of medium, and the cells were cultured for 6 days at 5% CO 2 and 37°C. After cultivation, the microplate was removed from the thermostat and kept at room temperature for 30 minutes. An equal amount of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega) was added to the culture solution and mixed. Then, the microplate was kept at room temperature for 10 minutes, and the amount of light emission was measured using a plate reader. The IC 50 value was calculated using the following equation:
IC50 (нМ)=антилогарифм((50-d)×(LOG10b-LOG10a)/(d-c)+LOG10b),IC 50 (nM)=antilog((50-d)×(LOG 10 b-LOG 10 a)/(dc)+LOG 10 b),
a: Концентрация a испытуемого соединения,a: Concentration a of the test compound,
b: Концентрация b испытуемого соединения,b: Concentration b of the test compound,
c: Доля живых клеток, к которым было добавлено испытуемое соединение при концентрации a,c: Proportion of living cells to which the test compound was added at concentration a,
d: Доля живых клеток, к которым было добавлено испытуемое соединение при концентрации b.d: Proportion of living cells to which the test compound was added at concentration b.
Концентрации a и b удовлетворяют требованию соотношения a>b, которое соответствует 50% живых клеток.The concentrations a and b satisfy the requirement of the ratio a>b, which corresponds to 50% of living cells.
Процент выживания клеток рассчитывали по следующему уравнению:The percentage of cell survival was calculated using the following equation:
Процент выживания клеток (%)=a/b×100,Percentage of cell survival (%)=a/b×100,
a: Средняя величина излучения лунок, в которые было добавлено испытуемое соединение (n=2),a: Average irradiance of the wells to which the test compound was added (n=2),
b: Средняя величина излучения лунок, в которые не было добавлено испытуемого соединения (n=10).b: Average irradiance of wells to which no test compound was added (n=10).
Соединение примера (75) и эксатекан проявляли цитотоксическую активность порядка 0,1<IC50<1 (нМ) в отношении клеток A375. Соединение примера (42) проявляло цитотоксическую активность порядка 1<IC50<10 (нМ) в отношении клеток A375. Соединение примера (1) проявляло цитотоксическую активность порядка 10<IC50<100 (нМ) в отношении клеток A375.The compound of example (75) and exatecan showed cytotoxic activity of the order of 0.1<IC 50 <1 (nM) against A375 cells. The compound of example (42) showed cytotoxic activity of the order of 1<IC 50 <10 (nM) against A375 cells. The compound of example (1) showed cytotoxic activity of the order of 10<IC 50 <100 (nM) against A375 cells.
(Пример испытания 11). Испытание на противоопухолевую активность (1)(Test example 11). Test for antitumor activity (1)
Мышь: перед использованием в эксперименте, самок в возрасте от 5 до 6 недель линии бестимусных мышей BALB/c (фирмы Charles River Laboratories Japan, Inc.) акклиматизировали в течение от 4 до 7 дней в условиях, не содержащих специфической патогенной микрофлоры. Мышей кормили стерилизованным твердым кормом (FR-2, фирмы Funabashi Farms Co., Ltd) и давали стерилизованную водопроводную воду (полученную путем добавления от 5 до 15 м.д. раствора гипохлорита натрия).Mouse: 5 to 6 week old female BALB/c athymic mice (Charles River Laboratories Japan, Inc.) were acclimatized for 4 to 7 days under specific pathogen-free conditions prior to use in the experiment. Mice were fed sterilized solid chow (FR-2, Funabashi Farms Co., Ltd) and sterilized tap water (prepared by adding 5 to 15 ppm sodium hypochlorite solution).
Исследование и формула для расчета: во всех исследованиях, измеряли два раза в неделю длинную ось и короткую ось опухоли, используя штангенциркуль с электронным цифровым отсчетом (CD-15C, фирмы Mitutoyo Corp.), и рассчитывали объем опухоли (мм3). Формула для расчета приведена ниже.Study and Calculation Formula: In all studies, the long axis and short axis of the tumor were measured twice a week using an electronic digital caliper (CD-15C, from Mitutoyo Corp.), and the tumor volume (mm 3 ) was calculated. The formula for the calculation is given below.
Объем опухоли (мм3)=1/2 × длинная ось (мм) × [короткая ось (мм)]2.Tumor volume (mm 3 )=1/2 × long axis (mm) × [short axis (mm)] 2 .
Все конъюгаты антитело-лекарственное средство разбавляли физиологическим раствором (фирмы Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) и использовали при дозе 10 мл/кг для внутривенного введения в хвост каждой мыши. Меланомные клетки человека линии A375 приобретали у Американской коллекции типовых культур (ATCC). Суспендированные в физиологическом растворе 8×106 клеток подкожно трансплантировали в правую часть брюшной полости каждой самки линии бестимусных мышей (день 0), и мышей группировали случайным образом на день 11. M30-H1-L4P антитело и конъюгат антитело-лекарственное средство (2) каждый вводили внутривенно в дозе 10 мг/кг в хвост каждой мыши на день 11, 18 и 25.All antibody-drug conjugates were diluted with saline (Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.) and used at a dose of 10 ml/kg for intravenous injection into the tail of each mouse. A375 human melanoma cells were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). 8×10 6 cells suspended in saline were transplanted subcutaneously into the right abdominal cavity of each female nude mouse line (day 0), and mice were randomly grouped on day 11. M30-H1-L4P antibody and antibody-drug conjugate (2) each was administered intravenously at a dose of 10 mg/kg to the tail of each mouse on
Результаты приведены на фигуре 17. На чертеже, линия с незакрашенными ромбами представляет результаты для не подвергнутой лечению опухоли, линия с незакрашенными треугольниками иллюстрирует воздействие M30-H1-L4P антитела, и линия с незакрашенными кружками иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (2).The results are shown in Figure 17. In the figure, the line with open diamonds represents the results for the untreated tumor, the line with open triangles illustrates the effect of the M30-H1-L4P antibody, and the line with open circles illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (2).
Как видно из этих результатов, введение конъюгата антитело-лекарственное средство (2) заметно уменьшает объем опухоли, и после последнего введения последующий рост опухоли не отмечался. В отличие от этого, введение M30-H1-L4P антитела приводило к прогрессии роста опухоли.As can be seen from these results, administration of the antibody-drug conjugate (2) markedly reduced tumor volume, and no further tumor growth was noted after the last administration. In contrast, administration of the M30-H1-L4P antibody resulted in progressive tumor growth.
Кроме того, у мышей, которые получали конъюгат антитело-лекарственное средство (2), не наблюдались такие характерные признаки, как потеря веса, что позволяло предположить, что конъюгат антитело-лекарственное средство (2) является малотоксичным и исключительно безопасным.In addition, mice that received the antibody-drug conjugate (2) did not show any characteristic signs such as weight loss, suggesting that the antibody-drug conjugate (2) is of low toxicity and extremely safe.
(Пример испытания 12). Испытание на противоопухолевую активность (2)(Test example 12). Test for antitumor activity (2)
Меланомные клетки человека линии A375 приобретали у Американской коллекции типовых культур (ATCC). Суспендированные в физиологическом растворе 6×106 клеток подкожно трансплантировали в правую часть брюшной полости каждой самки линии бестимусных мышей (день 0), и мышей группировали случайным образом на день 18. Конъюгат антитело-лекарственное средство (2) вводили внутривенно при каждой дозе дозе (0,1, 0,3 и 1,3 мг/кг) в хвост каждой мыши на день 18, 25 и 32 по схеме один раз в неделю на протяжении трех недель.A375 human melanoma cells were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). Saline-suspended 6×10 6 cells were transplanted subcutaneously into the right abdominal cavity of each female nude mouse line (day 0), and mice were randomly grouped on day 18. The antibody-drug conjugate (2) was administered intravenously at each dose dose ( 0.1, 0.3 and 1.3 mg/kg) in the tail of each mouse on
Результаты приведены на фигуре 18. На чертеже, линия с незакрашенными ромбами представляет результаты для не подвергнутой лечению опухоли, линия с закрашенными квадратами иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (2), вводимого при дозе 0,1 мг/кг, линия с символами X иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (2), вводимого при дозе 0,3 мг/кг, линия с закрашенными треугольниками иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (2), вводимого при дозе 1 мг/кг, и линия с незакрашенными кружками иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (2), вводимого при дозе 3 мг/кг. Конъюгат антитело-лекарственное средство (2) проявлял зависимую от дозы эффективность с точки зрения уменьшения опухоли.The results are shown in Figure 18. In the drawing, the line with open diamonds represents the results for the untreated tumor, the line with filled squares illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (2) administered at a dose of 0.1 mg/kg, the line with symbols X illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (2) administered at a dose of 0.3 mg/kg, the line with filled triangles illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (2) administered at a dose of 1 mg/kg, and the line with open circles illustrates exposure to an antibody-drug conjugate (2) administered at a dose of 3 mg/kg. The antibody-drug conjugate (2) showed a dose-dependent efficacy in terms of tumor reduction.
(Пример испытания 13). Испытание на противоопухолевую активность (3)(Test example 13). Test for antitumor activity (3)
Клетки линии Calu-6 немелкоклеточного рака легкого у человека приобретали у Американской коллекции типовых культур (ATCC). Суспендированные в физиологическом растворе 5×106 клеток подкожно трансплантировали в правую часть брюшной полости каждой самки линии бестимусных мышей (день 0), и мышей группировали случайным образом на день 11. M30-H1-L4P антитело и конъюгат антитело-лекарственное средство (2) каждый вводили внутривенно в дозе 10 мг/кг в хвост каждой мыши на день 11, 18 и 25 по схеме один раз в неделю на протяжении трех недель.Human non-small cell lung cancer Calu-6 cells were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). Saline-suspended 5×10 6 cells were subcutaneously transplanted into the right abdominal cavity of each female nude mouse line (day 0), and mice were randomly grouped on day 11. M30-H1-L4P antibody and antibody-drug conjugate (2) each was injected intravenously at 10 mg/kg into the tail of each mouse on
Результаты приведены на фигуре 19. На чертеже, линия с незакрашенными ромбами представляет результаты для не подвергнутой лечению опухоли, линия с незакрашенными треугольниками иллюстрирует воздействие M30-H1-L4P антитела, и линия с незакрашенными кружками иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (2). Введение конъюгата антитело-лекарственное средство (2) заметно уменьшает объем опухоли, и последующий рост опухоли после последнего введения не отмечался. В отличие от этого, введение M30-H1-L4P антитела приводило к прогрессии роста опухоли.The results are shown in Figure 19. In the figure, the line with open diamonds represents the results for the untreated tumor, the line with open triangles illustrates the effect of the M30-H1-L4P antibody, and the line with open circles illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (2). Administration of the antibody-drug conjugate (2) markedly reduced tumor volume, and no subsequent tumor growth was observed after the last administration. In contrast, administration of the M30-H1-L4P antibody resulted in progressive tumor growth.
Кроме того, у мышей, которые получали конъюгат антитело-лекарственное средство (2) не наблюдались такие характерные признаки, как потеря веса, что позволяло предположить, что конъюгат антитело-лекарственное средство (2) является малотоксичным и исключительно безопасным.In addition, mice that received the antibody-drug conjugate (2) did not show any characteristic signs such as weight loss, suggesting that the antibody-drug conjugate (2) is of low toxicity and extremely safe.
(Пример испытания 14). Испытание на противоопухолевую активность (4)(Test example 14). Test for antitumor activity (4)
Меланомные клетки человека линии A375 приобретали у Американской коллекции типовых культур (ATCC). Суспендированные в физиологическом растворе 8×106 клеток подкожно трансплантировали в правую часть брюшной полости каждой самки линии бестимусных мышей (день 0), и мышей группировали случайным образом на день 21. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (1), (13), (41) и (55) каждый вводили внутривенно при дозе 10 мг/кг в хвост каждой мыши на день 21.A375 human melanoma cells were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). 8×10 6 cells suspended in saline were transplanted subcutaneously into the right abdominal cavity of each female nude mouse strain (day 0), and the mice were randomly grouped on day 21. Antibody-drug conjugates (1), (13), (41 ) and (55) were each injected intravenously at a dose of 10 mg/kg into the tail of each mouse on day 21.
Результаты приведены на фигуре 20. На чертеже, линия с незакрашенными ромбами представляет результаты для не подвергнутой лечению опухоли, линия с незакрашенными кружками иллюстрирует воздействие введенного конъюгата антитело-лекарственное средство (1), линия с незакрашенными треугольниками иллюстрирует воздействие введенного конъюгата антитело-лекарственное средство (13), линия с символами X иллюстрирует воздействие введенного конъюгата антитело-лекарственное средство (41), и линия с незакрашенными квадратами иллюстрирует воздействие введенного конъюгата антитело-лекарственное средство (55). Введение конъюгата антитело-лекарственное средство (1), (13), (41) или (55) заметно уменьшает объем опухоли, и все эти конъюгаты антитело-лекарственное средство проявляют ингибирующее воздействие на рост опухоли.The results are shown in Figure 20. In the drawing, the line with open diamonds represents the results for an untreated tumor, the line with open circles illustrates the effect of the administered antibody-drug conjugate (1), the line with open triangles illustrates the effect of the administered antibody-drug conjugate ( 13), the X line illustrates the effect of the administered antibody-drug conjugate (41), and the line with open squares illustrates the effect of the administered antibody-drug conjugate (55). The administration of the antibody-drug conjugate (1), (13), (41) or (55) markedly reduces tumor volume, and all of these antibody-drug conjugates exhibit an inhibitory effect on tumor growth.
Кроме того, у мышей, которые получали конъюгат антитело-лекарственное средство (1), (13), (41) или (55), не наблюдались такие характерные признаки, как потеря веса, что позволяло предположить, что конъюгаты антитело-лекарственное средство (1), (13), (41) и (55) являются малотоксичными и исключительно безопасными.In addition, mice that received antibody-drug conjugates (1), (13), (41), or (55) did not show signs such as weight loss, suggesting that antibody-drug conjugates ( 1), (13), (41) and (55) are of low toxicity and extremely safe.
(Пример испытания 15). Испытание на противоопухолевую активность (5)(Test example 15). Test for antitumor activity (5)
Клетки линии Calu-6 немелкоклеточного рака легкого у человека приобретали у Американской коллекции типовых культур (ATCC). Суспендированные в физиологическом растворе 5×106 клеток подкожно трансплантировали в правую часть брюшной полости каждой самки линии бестимусных мышей (день 0), и мышей группировали случайным образом на день 12. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (13), (41) и (55) внутривенно вводили при дозе 10 мг/кг в хвост каждой мыши на день 12. В качестве контроля для сравнения, внутривенно вводили DE-310 при дозе 0,1 мг/кг в хвост каждой мыши на день 12. В данном случае, упомянутая выше доза конъюгата антитело-лекарственное средство была обусловлена количеством антитела в конъюгате, а упомянутая выше доза DE-310 обуславливалась количеством содержащимся в нем лекарственного средства. В связи с этим, количества лекарственных средств, содержавшихся в конъюгате антитело-лекарственное средство и DE-310, соответственно, соотносились друг к другу как 1:100. Это означает, что дозы конъюгата антитело-лекарственное средство и DE-310 были равными с точки зрения количеств содержавшихся в них лекарственных средств.Human non-small cell lung cancer Calu-6 cells were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). Saline-suspended 5×10 6 cells were subcutaneously transplanted into the right abdominal cavity of each female nude mouse strain (day 0), and mice were randomly grouped on day 12. Antibody-drug conjugates (13), (41) and (55 ) was intravenously administered at a dose of 10 mg/kg to the tail of each mouse on day 12. As a control for comparison, DE-310 was intravenously administered at a dose of 0.1 mg/kg to the tail of each mouse on day 12. In this case, the above-mentioned the dose of the antibody-drug conjugate was determined by the amount of antibody in the conjugate, and the dose of DE-310 mentioned above was determined by the amount of drug it contained. In this regard, the amounts of drugs contained in the antibody-drug conjugate and DE-310, respectively, were related to each other as 1:100. This means that the doses of the antibody-drug conjugate and DE-310 were equal in terms of the amounts of drugs they contained.
Результаты приведены на фигуре 21. На чертеже, линия с незакрашенными ромбами представляет результаты для не подвергнутой лечению опухоли, линия с незакрашенными кружками иллюстрирует воздействие DE-310, линия с незакрашенными треугольниками иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (13), линия с символами X иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (41), и линия с незакрашенными квадратами иллюстрирует воздействие конъюгата антитело-лекарственное средство (55). Введение конъюгата антитело-лекарственное средство (13), (41) или (55) заметно уменьшает объем опухоли, в то время как введение DE-310 не приводило к уменьшению объема опухоли.The results are shown in Figure 21. In the figure, the line with open diamonds represents the results for an untreated tumor, the line with open circles illustrates the effect of DE-310, the line with open triangles illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (13), the line with symbols X illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (41), and the line with open squares illustrates the effect of the antibody-drug conjugate (55). Administration of the antibody-drug conjugate (13), (41) or (55) markedly reduced tumor volume, while administration of DE-310 did not reduce tumor volume.
Кроме того, у мышей, которые получали конъюгат антитело-лекарственное средство (13), (41) или (55), не наблюдались такие характерные признаки, как потеря веса, что позволяло предположить, что эти конъюгаты антитело-лекарственное средство являются малотоксичными и исключительно безопасными.In addition, mice that received antibody drug conjugates (13), (41) or (55) did not exhibit such characteristic signs as weight loss, suggesting that these antibody drug conjugates are of low toxicity and are exceptionally safe.
(Пример испытания 16). Испытание на противоопухолевую активность (6)(Test example 16). Test for antitumor activity (6)
Меланомные клетки человека линии A375 приобретали у Американской коллекции типовых культур (ATCC). Суспендированные в физиологическом растворе 1×107 клеток подкожно трансплантировали в правую часть брюшной полости каждой самки линии бестимусных мышей (день 0), и мышей группировали случайным образом на день 11. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (17), (18), (19), (59), (60) и (61) каждый внутривенно вводили при дозе 3 мг/кг в хвост каждой мыши на день 11 и 18 по схеме один раз в неделю в течение двух недель.A375 human melanoma cells were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). 1×10 7 cells suspended in saline were transplanted subcutaneously into the right abdominal cavity of each female nude mouse strain (day 0), and mice were randomly grouped on day 11. Antibody-drug conjugates (17), (18), (19 ), (59), (60), and (61) were each intravenously administered at a dose of 3 mg/kg to the tail of each mouse on days 11 and 18 on a once-weekly schedule for two weeks.
Результаты приведены на фигуре 22. На чертеже, линия с закрашенными ромбами представляет результаты для не подвергнутой лечению опухоли, линия с закрашенными квадратами иллюстрирует воздействие введенного конъюгата антитело-лекарственное средство (17), линия с незакрашенными треугольниками иллюстрирует воздействие введенного конъюгата антитело-лекарственное средство (18), линия с незакрашенными кружками иллюстрирует воздействие введенного конъюгата антитело-лекарственное средство (19), линия с закрашенными треугольниками иллюстрирует воздействие введенного конъюгата антитело-лекарственное средство (59), линия с незакрашенными квадратами иллюстрирует воздействие введенного конъюгата антитело-лекарственное средство (60), и линия с символами X иллюстрирует воздействие введенного конъюгата антитело-лекарственное средство (61).The results are shown in Figure 22. In the figure, the line with filled diamonds represents the results for an untreated tumor, the line with solid squares illustrates the effect of the administered antibody-drug conjugate (17), the line with open triangles illustrates the effect of the administered antibody-drug conjugate (17). 18), the line with open circles illustrates the effect of the administered antibody-drug conjugate (19), the line with solid triangles illustrates the effect of the administered antibody-drug conjugate (59), the line with open squares illustrates the effect of the administered antibody-drug conjugate (60) , and the X line illustrates the effect of the administered antibody-drug conjugate (61).
Введение конъюгата антитело-лекарственное средство (17), (18), (19), (59), (60) или (61) заметно уменьшает объем опухоли, и все эти конъюгаты антитело-лекарственное средство проявляют ингибирующее воздействие на рост опухоли.The administration of the antibody-drug conjugate (17), (18), (19), (59), (60) or (61) markedly reduces tumor volume, and all of these antibody-drug conjugates exhibit an inhibitory effect on tumor growth.
Кроме того, у мышей, которые получали конъюгат антитело-лекарственное средство (17), (18), (19), (59), (60) или (61), не наблюдались такие характерные признаки, как потеря веса, что позволяло предположить, что эти конъюгаты антитело-лекарственное средство являются малотоксичными и исключительно безопасными.In addition, mice that received antibody-drug conjugate (17), (18), (19), (59), (60), or (61) did not show signs such as weight loss, suggesting that these antibody-drug conjugates are of low toxicity and exceptionally safe.
Свободный текст списка последовательностейFree text sequence listing
SEQ ID NO: 1 - Аминокислотная последовательность B7-H3 вариант 1.SEQ ID NO: 1 - Amino acid sequence of B7-
SEQ ID NO: 2 - Аминокислотная последовательность B7-H3 вариант 2.SEQ ID NO: 2 - Amino acid sequence of B7-H3 variant 2.
SEQ ID NO: 3 - Аминокислотная последовательность CDRH1 в M30 антителе.SEQ ID NO: 3 - Amino acid sequence of CDRH1 in M30 antibody.
SEQ ID NO: 4 - Аминокислотная последовательность CDRH2 в M30 антителе.SEQ ID NO: 4 - Amino acid sequence of CDRH2 in M30 antibody.
SEQ ID NO: 5 - Аминокислотная последовательность CDRH3 в M30 антителе.SEQ ID NO: 5 - Amino acid sequence of CDRH3 in M30 antibody.
SEQ ID NO: 6 - Аминокислотная последовательность CDRL1 в M30 антителе.SEQ ID NO: 6 - Amino acid sequence of CDRL1 in M30 antibody.
SEQ ID NO: 7 - Аминокислотная последовательность CDRL2 в M30 антителе.SEQ ID NO: 7 - Amino acid sequence of CDRL2 in M30 antibody.
SEQ ID NO: 8 - Аминокислотная последовательность CDRL3 в M30 антителе.SEQ ID NO: 8 - Amino acid sequence of CDRL3 in M30 antibody.
SEQ ID NO: 9 - Аминокислотная последовательность M30-H1-типа тяжелой цепи.SEQ ID NO: 9 - Amino acid sequence of M30-H1-type heavy chain.
SEQ ID NO: 10 - Аминокислотная последовательность M30-H2-типа тяжелой цепи.SEQ ID NO: 10 - Amino acid sequence of M30-H2-type heavy chain.
SEQ ID NO: 11 - Аминокислотная последовательность M30-H3-типа тяжелой цепи.SEQ ID NO: 11 - Amino acid sequence of M30-H3-type heavy chain.
SEQ ID NO: 12 - Аминокислотная последовательность M30-H4-типа тяжелой цепи.SEQ ID NO: 12 - Amino acid sequence of M30-H4-type heavy chain.
SEQ ID NO: 13 - Аминокислотная последовательность M30-L1-типа легкой цепи. SEQ ID NO: 13 - Amino acid sequence of M30-L1-type light chain.
SEQ ID NO: 14 - Аминокислотная последовательность M30-L2-типа легкой цепи.SEQ ID NO: 14 - Light chain type M30-L2 amino acid sequence.
SEQ ID NO: 15 - Аминокислотная последовательность M30-L3-типа легкой цепи.SEQ ID NO: 15 - Light chain type M30-L3 amino acid sequence.
SEQ ID NO: 16 - Аминокислотная последовательность M30-L4-типа легкой цепи.SEQ ID NO: 16 - Light chain type M30-L4 amino acid sequence.
SEQ ID NO: 17 - Аминокислотная последовательность M30-L5-типа легкой цепи.SEQ ID NO: 17 - Light chain type M30-L5 amino acid sequence.
SEQ ID NO: 18 - Аминокислотная последовательность M30-L6-типа легкой цепи.SEQ ID NO: 18 - Light chain type M30-L6 amino acid sequence.
SEQ ID NO: 19 - Аминокислотная последовательность M30-L7-типа легкой цепи.SEQ ID NO: 19 - Light chain type M30-L7 amino acid sequence.
SEQ ID NO: 20 - Аминокислотная последовательность тяжелой цепи в M30 антителе.SEQ ID NO: 20 - Amino acid sequence of the heavy chain in the M30 antibody.
SEQ ID NO: 21 - Аминокислотная последовательность легкой цепи в M30 антителеSEQ ID NO: 21 - Light chain amino acid sequence in M30 antibody
SEQ ID NO: 22 - ПЦР праймер 1.SEQ ID NO: 22 -
SEQ ID NO: 23 - ПЦР праймер 2.SEQ ID NO: 23 - PCR primer 2.
SEQ ID NO: 24 - праймер промотора CMV: праймер 3.SEQ ID NO: 24 - CMV promoter primer: primer 3.
SEQ ID NO: 25 - BGH обратный праймер: праймер 4.SEQ ID NO: 25 - BGH reverse primer: primer 4.
SEQ ID NO: 26 - Нуклеотидная последовательность B7-H3 вариант 1.SEQ ID NO: 26 - Nucleotide sequence of B7-
SEQ ID NO: 27 - Аминокислотная последовательность тяжелой цепи в анти-CD30 антителе.SEQ ID NO: 27 - Heavy chain amino acid sequence in an anti-CD30 antibody.
SEQ ID NO: 28 - Аминокислотная последовательность легкой цепи в анти-CD30 антителе.SEQ ID NO: 28 - Light chain amino acid sequence in an anti-CD30 antibody.
SEQ ID NO: 29 - Аминокислотная последовательность тяжелой цепи в анти-CD33 антителе.SEQ ID NO: 29 - Heavy chain amino acid sequence in an anti-CD33 antibody.
SEQ ID NO: 30 - Аминокислотная последовательность легкой цепи в анти-CD33 антителе.SEQ ID NO: 30 - Light chain amino acid sequence in an anti-CD33 antibody.
SEQ ID NO: 31 - Аминокислотная последовательность тяжелой цепи в анти-CD70 антителе.SEQ ID NO: 31 - Amino acid sequence of the heavy chain in an anti-CD70 antibody.
SEQ ID NO: 32 - Аминокислотная последовательность легкой цепи в анти-CD70 антителе.SEQ ID NO: 32 - Light chain amino acid sequence in an anti-CD70 antibody.
--->--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ SEQUENCE LIST
<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED
<120> КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО <120> ANTIBODY-DRUG CONJUGATE
<130> PD20-9003WO<130>PD20-9003WO
<150> JP2012-225887<150>JP2012-225887
<151> 2012-10-11<151> 2012-10-11
<160> 32 <160> 32
<170> PatentIn version 3.5<170>PatentIn version 3.5
<210> 1<210> 1
<211> 534<211> 534
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 1<400> 1
Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln
20 25 30 20 25 30
Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu
35 40 45 35 40 45
Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn
50 55 60 50 55 60
Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe
85 90 95 85 90 95
Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val
100 105 110 100 105 110
Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp
115 120 125 115 120 125
Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys
130 135 140 130 135 140
Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr
145 150 155 160 145 150 155 160
Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val
165 170 175 165 170 175
Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr
180 185 190 180 185 190
Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Ile Leu Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Ile Leu
195 200 205 195 200 205
Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn
210 215 220 210 215 220
Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Ser Ser Val Thr Ile Thr Pro Gln Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Ser Ser Val Thr Ile Thr Pro Gln
225 230 235 240 225 230 235 240
Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val
245 250 255 245 250 255
Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro
260 265 270 260 265 270
Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr
275 280 285 275 280 285
Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly
290 295 300 290 295 300
Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln
305 310 315 320 305 310 315 320
Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly
325 330 335 325 330 335
Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val
340 345 350 340 345 350
Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu
355 360 365 355 360 365
Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser
370 375 380 370 375 380
Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln
385 390 395 400 385 390 395 400
Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu
405 410 415 405 410 415
Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala
420 425 430 420 425 430
Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp
435 440 445 435 440 445
Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Pro Pro Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Pro Pro
450 455 460 450 455 460
Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser Val Cys Leu Ile Ala Leu Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser Val Cys Leu Ile Ala Leu
465 470 475 480 465 470 475 480
Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg Lys Ile Lys Gln Ser Cys Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg Lys Ile Lys Gln Ser Cys
485 490 495 485 490 495
Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Glu Gly
500 505 510 500 505 510
Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His Ser Asp Ser Lys Glu Asp Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His Ser Asp Ser Lys Glu Asp
515 520 525 515 520 525
Asp Gly Gln Glu Ile Ala Asp Gly Gln Glu Ile Ala
530 530
<210> 2<210> 2
<211> 316<211> 316
<212> PRT<212> PRT
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 2<400> 2
Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala
1 5 10 15 1 5 10 15
Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln
20 25 30 20 25 30
Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu
35 40 45 35 40 45
Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn
50 55 60 50 55 60
Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe
85 90 95 85 90 95
Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val
100 105 110 100 105 110
Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp
115 120 125 115 120 125
Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys
130 135 140 130 135 140
Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr
145 150 155 160 145 150 155 160
Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val
165 170 175 165 170 175
Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr
180 185 190 180 185 190
Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu
195 200 205 195 200 205
Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn
210 215 220 210 215 220
Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln
225 230 235 240 225 230 235 240
Pro Met Thr Phe Pro Pro Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser Pro Met Thr Phe Pro Pro Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser
245 250 255 245 250 255
Val Cys Leu Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg Val Cys Leu Ile Ala Leu Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg
260 265 270 260 265 270
Lys Ile Lys Gln Ser Cys Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln Lys Ile Lys Gln Ser Cys Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln
275 280 285 275 280 285
Asp Gly Glu Gly Glu Gly Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His Asp Gly Glu Gly Glu Gly Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His
290 295 300 290 295 300
Ser Asp Ser Lys Glu Asp Asp Gly Gln Glu Ile Ala Ser Asp Ser Lys Glu Asp Asp Gly Gln Glu Ile Ala
305 310 315 305 310 315
<210> 3<210> 3
<211> 5<211> 5
<212> PRT<212> PRT
<213> Mus musculus<213> Mus musculus
<400> 3<400> 3
Asn Tyr Val Met His Asn Tyr Val Met His
1 5 fifteen
<210> 4<210> 4
<211> 17<211> 17
<212> PRT<212> PRT
<213> Mus musculus<213> Mus musculus
<400> 4<400> 4
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Val Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Val Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly gly
<210> 5<210> 5
<211> 13<211> 13
<212> PRT<212> PRT
<213> Mus musculus<213> Mus musculus
<400> 5<400> 5
Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 1 5 10
<210> 6<210> 6
<211> 10<211> 10
<212> PRT<212> PRT
<213> Mus musculus<213> Mus musculus
<400> 6<400> 6
Arg Ala Ser Ser Arg Leu Ile Tyr Met His Arg Ala Ser Ser Arg Leu Ile Tyr Met His
1 5 10 1 5 10
<210> 7<210> 7
<211> 7<211> 7
<212> PRT<212> PRT
<213> Mus musculus<213> Mus musculus
<400> 7<400> 7
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5 fifteen
<210> 8<210> 8
<211> 9<211> 9
<212> PRT<212> PRT
<213> Mus musculus<213> Mus musculus
<400> 8<400> 8
Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Pro Thr Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Pro Thr
1 5 fifteen
<210> 9<210> 9
<211> 471<211> 471
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Гуманизированная тяжелая цепь антитела M30<223> Humanized M30 antibody heavy chain
<400> 9<400> 9
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30 20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45 35 40 45
Thr Asn Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Thr Asn Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60 50 55 60
Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Val Lys Tyr Asn Glu Trp Met Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Val Lys Tyr Asn
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser
85 90 95 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe
115 120 125 115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140 130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175 165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190 180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205 195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220 210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240 225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255 245 250 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270 260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285 275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300 290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320 305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335 325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350 340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365 355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380 370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400 385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415 405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430 420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445 435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460 450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 465 470
<210> 10<210> 10
<211> 471<211> 471
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Гуманизированная тяжелая цепь антитела M30<223> Humanized M30 antibody heavy chain
<400> 10<400> 10
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30 20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45 35 40 45
Thr Asn Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Thr Asn Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60 50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Val Lys Tyr Asn Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Val Lys Tyr Asn
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser
85 90 95 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe
115 120 125 115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140 130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175 165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190 180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205 195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220 210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240 225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255 245 250 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270 260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285 275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300 290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320 305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335 325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350 340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365 355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380 370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400 385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415 405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430 420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445 435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460 450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 465 470
<210> 11<210> 11
<211> 471<211> 471
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Гуманизированная тяжелая цепь антитела M30<223> Humanized M30 antibody heavy chain
<400> 11<400> 11
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30 20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45 35 40 45
Thr Asn Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Thr Asn Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60 50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Val Lys Tyr Asn Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Val Lys Tyr Asn
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser
85 90 95 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe
115 120 125 115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140 130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175 165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190 180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205 195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220 210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240 225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255 245 250 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270 260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285 275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300 290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320 305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335 325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350 340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365 355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380 370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400 385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415 405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430 420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445 435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460 450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 465 470
<210> 12<210> 12
<211> 471<211> 471
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Гуманизированная тяжелая цепь антитела M30<223> Humanized M30 antibody heavy chain
<400> 12<400> 12
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30 20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45 35 40 45
Thr Asn Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Thr Asn Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60 50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Val Lys Tyr Asn Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Val Lys Tyr Asn
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Gln Thr Ser Asp Lys Ser Thr Ser Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Gln Thr Ser Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe
115 120 125 115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140 130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175 165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190 180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205 195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220 210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240 225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255 245 250 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270 260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285 275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300 290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320 305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335 325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350 340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365 355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380 370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400 385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415 405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430 420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445 435 440 445
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
450 455 460 450 455 460
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 465 470
<210> 13<210> 13
<211> 233<211> 233
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Гуманизированная легкая цепь антитела M30<223> Humanized M30 antibody light chain
<400> 13<400> 13
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Arg Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Arg
35 40 45 35 40 45
Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
50 55 60 50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
85 90 95 85 90 95
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser
100 105 110 100 105 110
Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125 115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140 130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160 145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175 165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190 180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205 195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220 210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 225 230
<210> 14<210> 14
<211> 233<211> 233
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Гуманизированная легкая цепь антитела M30<223> Humanized M30 antibody light chain
<400> 14<400> 14
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Arg Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Arg
35 40 45 35 40 45
Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
50 55 60 50 55 60
Leu Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Leu Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg
85 90 95 85 90 95
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser
100 105 110 100 105 110
Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125 115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140 130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160 145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175 165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190 180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205 195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220 210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 225 230
<210> 15<210> 15
<211> 233<211> 233
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Гуманизированная легкая цепь антитела M30<223> Humanized M30 antibody light chain
<400> 15<400> 15
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Gly Ala Tyr Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Ser Arg Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Ser Arg
35 40 45 35 40 45
Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro Lys
50 55 60 50 55 60
Leu Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Leu Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg
85 90 95 85 90 95
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser
100 105 110 100 105 110
Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125 115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140 130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160 145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175 165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190 180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205 195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220 210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 225 230
<210> 16<210> 16
<211> 233<211> 233
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Гуманизированная легкая цепь антитела M30<223> Humanized M30 antibody light chain
<400> 16<400> 16
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Arg Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Arg
35 40 45 35 40 45
Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
50 55 60 50 55 60
Pro Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Pro Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
85 90 95 85 90 95
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser
100 105 110 100 105 110
Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125 115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140 130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160 145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175 165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190 180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205 195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220 210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 225 230
<210> 17<210> 17
<211> 233<211> 233
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Гуманизированная легкая цепь антитела M30<223> Humanized M30 antibody light chain
<400> 17<400> 17
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Gly Ala Tyr Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Ser Arg Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Ser Arg
35 40 45 35 40 45
Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro Lys
50 55 60 50 55 60
Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg
85 90 95 85 90 95
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser
100 105 110 100 105 110
Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125 115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140 130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160 145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175 165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190 180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205 195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220 210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 225 230
<210> 18<210> 18
<211> 233<211> 233
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Гуманизированная легкая цепь антитела M30<223> Humanized M30 antibody light chain
<400> 18<400> 18
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Arg Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Arg
35 40 45 35 40 45
Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
50 55 60 50 55 60
Pro Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Pro Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
85 90 95 85 90 95
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser
100 105 110 100 105 110
Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125 115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140 130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160 145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175 165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190 180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205 195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220 210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 225 230
<210> 19<210> 19
<211> 233<211> 233
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Гуманизированная легкая цепь антитела M30<223> Humanized M30 antibody light chain
<400> 19<400> 19
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser
20 25 30 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Arg Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Arg
35 40 45 35 40 45
Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
50 55 60 50 55 60
Pro Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Pro Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg
65 70 75 80 65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg
85 90 95 85 90 95
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser
100 105 110 100 105 110
Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125 115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140 130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160 145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175 165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190 180 185 190
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
195 200 205 195 200 205
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
210 215 220 210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 225 230
<210> 20<210> 20
<211> 471<211> 471
<212> PRT<212> PRT
<213> Mus musculus<213> Mus musculus
<400> 20<400> 20
Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15 1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20 25 30 20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45 35 40 45
Thr Asn Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Thr Asn Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60 50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Val Lys Tyr Asn Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Val Lys Tyr Asn
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Gln Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Gln Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe
115 120 125 115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr
130 135 140 130 135 140
Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu
165 170 175 165 170 175
Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His
180 185 190 180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser
195 200 205 195 200 205
Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn
210 215 220 210 215 220
Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro
225 230 235 240 225 230 235 240
Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro
245 250 255 245 250 255
Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys
260 265 270 260 265 270
Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285 275 280 285
Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn
290 295 300 290 295 300
Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr
305 310 315 320 305 310 315 320
Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp
325 330 335 325 330 335
Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu
340 345 350 340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg
355 360 365 355 360 365
Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380 370 375 380
Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp
385 390 395 400 385 390 395 400
Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys
405 410 415 405 410 415
Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser
420 425 430 420 425 430
Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser
435 440 445 435 440 445
Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser
450 455 460 450 455 460
Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
465 470 465 470
<210> 21<210> 21
<211> 235<211> 235
<212> PRT<212> PRT
<213> Mus musculus<213> Mus musculus
<400> 21<400> 21
Met Asp Phe Leu Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser Met Asp Phe Leu Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Thr Ile Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Thr Ile
20 25 30 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45 35 40 45
Ser Arg Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Ser Arg Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser
50 55 60 50 55 60
Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65 70 75 80 65 70 75 80
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95 85 90 95
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
100 105 110 100 105 110
Asn Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Asn Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125 115 120 125
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
130 135 140 130 135 140
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160 145 150 155 160
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
165 170 175 165 170 175
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190 180 185 190
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
195 200 205 195 200 205
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
210 215 220 210 215 220
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230 235 225 230 235
<210> 22<210> 22
<211> 46<211> 46
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Праймер ПЦР<223> PCR primer
<400> 22<400> 22
ctatagggag acccaagctg gctagcatgc tgcgtcggcg gggcag 46ctatagggag acccaagctg gctagcatgc tgcgtcggcg gggcag 46
<210> 23<210> 23
<211> 66<211> 66
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Праймер ПЦР<223> PCR primer
<400> 23<400> 23
aacgggccct ctagactcga gcggccgctc aggctatttc ttgtccatca tcttctttgc 60aacggggccct ctagactcga gcggccgctc aggctatttc ttgtccatca tcttctttgc 60
tgtcag 66tgtcag 66
<210> 24<210> 24
<211> 21<211> 21
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Праймер ПЦР<223> PCR primer
<400> 24<400> 24
cgcaaatggg cggtaggcgt g 21cgcaaatggg cggtaggcgt g 21
<210> 25<210> 25
<211> 18<211> 18
<212> ДНК<212> DNA
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> Праймер ПЦР<223> PCR primer
<400> 25<400> 25
tagaaggcac agtcgagg 18tagaaggcac agtcgagg 18
<210> 26<210> 26
<211> 1815<211> 1815
<212> ДНК<212> DNA
<213> Homo sapiens<213> Homo sapiens
<400> 26<400> 26
atgctgcgtc ggcggggcag ccctggcatg ggtgtgcatg tgggtgcagc cctgggagca 60atgctgcgtc ggcggggcag ccctggcatg ggtgtgcatg tgggtgcagc cctgggagca 60
ctgtggttct gcctcacagg agccctggag gtccaggtcc ctgaagaccc agtggtggca 120ctgtggttct gcctcacagg agccctggag gtccaggtcc ctgaagaccc agtggtggca 120
ctggtgggca ccgatgccac cctgtgctgc tccttctccc ctgagcctgg cttcagcctg 180ctggtgggca ccgatgccac cctgtgctgc tccttctccc ctgagcctgg cttcagcctg 180
gcacagctca acctcatctg gcagctgaca gataccaaac agctggtgca cagctttgct 240gcacagctca acctcatctg gcagctgaca gataccaaac agctggtgca cagctttgct 240
gagggccagg accagggcag cgcctatgcc aaccgcacgg ccctcttccc ggacctgctg 300gagggccagg accagggcag cgcctatgcc aaccgcacgg ccctcttccc ggacctgctg 300
gcacagggca acgcatccct gaggctgcag cgcgtgcgtg tggcggacga gggcagcttc 360gcacagggca acgcatccct gaggctgcag cgcgtgcgtg tggcggacga gggcagcttc 360
acctgcttcg tgagcatccg ggatttcggc agcgctgccg tcagcctgca ggtggccgct 420acctgcttcg tgagcatccg ggatttcggc agcgctgccg tcagcctgca ggtggccgct 420
ccctactcga agcccagcat gaccctggag cccaacaagg acctgcggcc aggggacacg 480ccctactcga agcccagcat gaccctggag cccaacaagg acctgcggcc aggggacacg 480
gtgaccatca cgtgctccag ctaccagggc taccctgagg ctgaggtgtt ctggcaggat 540gtgaccatca cgtgctccag ctaccagggc taccctgagg ctgaggtgtt ctggcaggat 540
gggcagggtg tgcccctgac tggcaacgtg accacgtcgc agatggccaa cgagcagggc 600gggcagggtg tgcccctgac tggcaacgtg accacgtcgc agatggccaa cgagcagggc 600
ttgtttgatg tgcacagcat cctgcgggtg gtgctgggtg caaatggcac ctacagctgc 660ttgtttgatg tgcacagcat cctgcgggtg gtgctgggtg caaatggcac ctacagctgc 660
ctggtgcgca accccgtgct gcagcaggat gcgcacagct ctgtcaccat cacaccccag 720ctggtgcgca accccgtgct gcagcaggat gcgcacagct ctgtcaccat cacaccccag 720
agaagcccca caggagccgt ggaggtccag gtccctgagg acccggtggt ggccctagtg 780agaagcccca caggagccgt ggaggtccag gtccctgagg acccggtggt ggccctagtg 780
ggcaccgatg ccaccctgcg ctgctccttc tcccccgagc ctggcttcag cctggcacag 840ggcaccgatg ccaccctgcg ctgctccttc tcccccgagc ctggcttcag cctggcacag 840
ctcaacctca tctggcagct gacagacacc aaacagctgg tgcacagttt caccgaaggc 900ctcaacctca tctggcagct gacagacacc aaacagctgg tgcacagttt caccgaaggc 900
cgggaccagg gcagcgccta tgccaaccgc acggccctct tcccggacct gctggcacaa 960cgggaccagg gcagcgccta tgccaaccgc acggccctct tcccggacct gctggcacaa 960
ggcaatgcat ccctgaggct gcagcgcgtg cgtgtggcgg acgagggcag cttcacctgc 1020ggcaatgcat ccctgaggct gcagcgcgtg cgtgtggcgg acgagggcag cttcacctgc 1020
ttcgtgagca tccgggattt cggcagcgct gccgtcagcc tgcaggtggc cgctccctac 1080ttcgtgagca tccgggattt cggcagcgct gccgtcagcc tgcaggtggc cgctccctac 1080
tcgaagccca gcatgaccct ggagcccaac aaggacctgc ggccagggga cacggtgacc 1140tcgaagccca gcatgaccct ggagcccaac aaggacctgc ggccagggga cacggtgacc 1140
atcacgtgct ccagctaccg gggctaccct gaggctgagg tgttctggca ggatgggcag 1200atcacgtgct ccagctaccg gggctaccct gaggctgagg tgttctggca ggatgggcag 1200
ggtgtgcccc tgactggcaa cgtgaccacg tcgcagatgg ccaacgagca gggcttgttt 1260ggtgtgcccc tgactggcaa cgtgaccacg tcgcagatgg ccaacgagca gggcttgttt 1260
gatgtgcaca gcgtcctgcg ggtggtgctg ggtgcgaatg gcacctacag ctgcctggtg 1320gatgtgcaca gcgtcctgcg ggtggtgctg ggtgcgaatg gcacctacag ctgcctggtg 1320
cgcaaccccg tgctgcagca ggatgcgcac ggctctgtca ccatcacagg gcagcctatg 1380cgcaaccccg tgctgcagca ggatgcgcac ggctctgtca ccatcacagg gcagcctatg 1380
acattccccc cagaggccct gtgggtgacc gtggggctgt ctgtctgtct cattgcactg 1440acattccccc cagaggccct gtgggtgacc gtggggctgt ctgtctgtct cattgcactg 1440
ctggtggccc tggctttcgt gtgctggaga aagatcaaac agagctgtga ggaggagaat 1500ctggtggccc tggctttcgt gtgctggaga aagatcaaac agagctgtga ggaggagaat 1500
gcaggagctg aggaccagga tggggaggga gaaggctcca agacagccct gcagcctctg 15601560
aaacactctg acagcaaaga agatgatgga caagaaatag cctgagcggc cgccactgtg 16201620
ctggatatct gcagaattcc accacactgg actagtggat ccgagctcgg taccaagctt 1680ctggatatct gcagaattcc accacactgg actagtggat ccgagctcgg taccaagctt 1680
aagtttaaac cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 1740aagtttaaac cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 1740
cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 1800cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 1800
aaatgaggaa attgc 1815aaatgaggaa attgc 1815
<210> 27<210> 27
<211> 466<211> 466
<212> PRT<212> PRT
<213> <213>
<220><220>
<223> <223>
<400> 27<400> 27
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys Val Leu Ser Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Val Val Lys
20 25 30 20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45 35 40 45
Thr Asp Tyr Tyr Ile Thr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Thr Asp Tyr Tyr Ile Thr Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60 50 55 60
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn
65 70 75 80 65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser
85 90 95 85 90 95
Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110 100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Asn Tyr Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Tyr Phe Cys Ala Asn Tyr Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
115 120 125 115 120 125
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
130 135 140 130 135 140
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
145 150 155 160 145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
165 170 175 165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190 180 185 190
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
195 200 205 195 200 205
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
210 215 220 210 215 220
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
225 230 235 240 225 230 235 240
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
245 250 255 245 250 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260 265 270 260 265 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
275 280 285 275 280 285
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290 295 300 290 295 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
305 310 315 320 305 310 315 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325 330 335 325 330 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
340 345 350 340 345 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355 360 365 355 360 365
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370 375 380 370 375 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385 390 395 400 385 390 395 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405 410 415 405 410 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
420 425 430 420 425 430
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435 440 445 435 440 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
450 455 460 450 455 460
Gly Lys Gly Lys
465 465
<210> 28<210> 28
<211> 238<211> 238
<212> PRT<212> PRT
<213> <213>
<220><220>
<223> <223>
<400> 28<400> 28
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala
20 25 30 20 25 30
Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser
35 40 45 35 40 45
Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60 50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Gln Pro Pro Lys Val Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95 85 90 95
Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110 100 105 110
Gln Gln Ser Asn Gln Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Gln Gln Ser Asn Gln Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125 115 120 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140 130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175 165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190 180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205 195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220 210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 225 230 235
<210> 29<210> 29
<211> 465<211> 465
<212> PRT<212> PRT
<213> <213>
<220><220>
<223> <223>
<400> 29<400> 29
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30 20 25 30
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile
35 40 45 35 40 45
Thr Asp Ser Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Thr Asp Ser Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu
50 55 60 50 55 60
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn
65 70 75 80 65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn Gln Lys Phe Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn
85 90 95 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe
100 105 110 100 105 110
Tyr Tyr Cys Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Tyr Tyr Cys Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125 115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
130 135 140 130 135 140
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
165 170 175 165 170 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
180 185 190 180 185 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
195 200 205 195 200 205
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
210 215 220 210 215 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
225 230 235 240 225 230 235 240
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
245 250 255 245 250 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
260 265 270 260 265 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
275 280 285 275 280 285
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
290 295 300 290 295 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
305 310 315 320 305 310 315 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
325 330 335 325 330 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
340 345 350 340 345 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
355 360 365 355 360 365
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
370 375 380 370 375 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
385 390 395 400 385 390 395 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
405 410 415 405 410 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
420 425 430 420 425 430
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
435 440 445 435 440 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455 460 450 455 460
Lys Lys
465 465
<210> 30<210> 30
<211> 238<211> 238
<212> PRT<212> PRT
<213> <213>
<220><220>
<223> <223>
<400> 30<400> 30
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
20 25 30 20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
35 40 45 35 40 45
Leu Asp Asn Tyr Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Leu Asp Asn Tyr Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro
50 55 60 50 55 60
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
85 90 95 85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
100 105 110 100 105 110
Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125 115 120 125
Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140 130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175 165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190 180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205 195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220 210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 225 230 235
<210> 31<210> 31
<211> 467<211> 467
<212> PRT<212> PRT
<213> <213>
<220><220>
<223> <223>
<400> 31<400> 31
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15 1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30 20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45 35 40 45
Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60 50 55 60
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala
65 70 75 80 65 70 75 80
Asp Ala Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Asp Ala Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser
85 90 95 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly
115 120 125 115 120 125
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130 135 140 130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145 150 155 160 145 150 155 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175 165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180 185 190 180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195 200 205 195 200 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210 215 220 210 215 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
225 230 235 240 225 230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245 250 255 245 250 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260 265 270 260 265 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275 280 285 275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290 295 300 290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305 310 315 320 305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325 330 335 325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340 345 350 340 345 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355 360 365 355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
370 375 380 370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385 390 395 400 385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405 410 415 405 410 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420 425 430 420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435 440 445 435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450 455 460 450 455 460
Pro Gly Lys Pro Gly Lys
465 465
<210> 32<210> 32
<211> 238<211> 238
<212> PRT<212> PRT
<213> Искусственная последовательность<213> Artificial sequence
<220><220>
<223> <223>
<400> 32<400> 32
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15 1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30 20 25 30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser
35 40 45 35 40 45
Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60 50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
65 70 75 80 65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95 85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110 100 105 110
Gln His Ser Arg Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Gln His Ser Arg Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
115 120 125 115 120 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140 130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160 145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175 165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190 180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205 195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220 210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235225 230 235
<---<---
Claims (9)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012-225887 | 2012-10-11 | ||
JP2012225887 | 2012-10-11 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015113767A Division RU2664465C2 (en) | 2012-10-11 | 2013-10-10 | Antibody-drug conjugate |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2022119352A Division RU2022119352A (en) | 2012-10-11 | 2022-07-15 | ANTIBODY-DRUG CONJUGATE |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2018128384A RU2018128384A (en) | 2018-10-02 |
RU2018128384A3 RU2018128384A3 (en) | 2021-12-20 |
RU2776489C2 true RU2776489C2 (en) | 2022-07-21 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006065533A2 (en) * | 2004-11-29 | 2006-06-22 | Seattle Genetics, Inc. | Engineered antibodies and immunoconjugates |
US20080050310A1 (en) * | 2006-05-30 | 2008-02-28 | Genentech, Inc. | Antibodies and immunoconjugates and uses therefor |
RU2450008C2 (en) * | 2006-07-26 | 2012-05-10 | Индена С.П.А. | Camptothecin derivatives with anticancer activity |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006065533A2 (en) * | 2004-11-29 | 2006-06-22 | Seattle Genetics, Inc. | Engineered antibodies and immunoconjugates |
US20080050310A1 (en) * | 2006-05-30 | 2008-02-28 | Genentech, Inc. | Antibodies and immunoconjugates and uses therefor |
RU2450008C2 (en) * | 2006-07-26 | 2012-05-10 | Индена С.П.А. | Camptothecin derivatives with anticancer activity |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7170812B2 (en) | Antibody-drug conjugate | |
JP6272230B2 (en) | Antibody-drug conjugate conjugated with a linker containing a hydrophilic structure | |
RU2776489C2 (en) | Antibody-drug conjugate |