BR112021016754A2

BR112021016754A2 - Métodos de obtenção de lipídios a partir de uma composição de células microbianas

Info

Publication number: BR112021016754A2
Application number: BR112021016754-4A
Authority: BR
Inventors: Negash Adugna
Original assignee: DSM IP Assets B.V.
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2020-03-13
Publication date: 2021-10-19
Also published as: CN113574045A; US20220145211A1; EP3938339A4; KR20210136113A; EP3938339A1; WO2020186128A1

Abstract

métodos de obtenção de lipídios a partir de uma composição de células microbianas. a presente invenção é direcionada a um processo para a obtenção de um lipídio a partir de uma composição que compreende células microbianas, o processo que compreende: tratar a composição que compreende células microbianas a uma temperatura de cerca de 60°c a cerca de 95°c a um ph de cerca de 9 a cerca de 11; separar as células microbianas tratadas em uma fase leve e uma fase pesada; sequencialmente, em um ou mais ciclos, aumentando o ph da composição de células microbianas concentradas para 10 ou acima, seguidos pela redução do ph da composição de células microbianas concentradas para um ph inferior a 6 para lisar a composição de células microbianas concentradas, em que o aumentar e diminuir o ph também desmulsifica a composição de células microbianas concentradas; separar o lipídio da composição de células desmulsificadas e recuperar o lipídio.

Description

MÉTODOS DE OBTENÇÃO DE LIPÍDIOS A PARTIR DE UMA COMPOSIÇÃO DE CÉLULAS MICROBIANAS REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido é um pedido internacional que reivindica prioridade para o Pedido Provisional US No. 62/818,500, depositado em 14 de Março de 2019 e Pedido Provisional US No. 62/818,915, depositado em 15 de Março de 2019, todo o conteúdo de cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a processos para a obtenção de um lipídio a partir de uma composição que compreende células microbianas, concentrando uma população de células microbianas, lisando a população de células microbianas, desmulsificando as células lisadas e recuperando o lipídio. A presente invenção também refere-se a lipídios preparados pelos processos da presente invenção.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

[003] Um processo típico para a obtenção de lipídios a partir de uma célula microbiana, tais como ácidos graxos poli-insaturados, envolve o crescimento de microrganismos que são capazes de produzir o lipídio desejado em um fermentador, lagoa ou biorreator, separando o caldo de fermentação que compreende uma biomassa de células microbianas, secando a biomassa de células microbianas e separando os lipídios por extração com solvente. As etapas na separação podem incluir diluir um caldo de fermentação com água, centrifugar o caldo diluído, lisar as células microbianas e extrair um lipídio intracelular a partir das células lisadas adicionando um solvente imiscível em água à mistura em que o lipídio é solúvel, por exemplo, hexano.

[004] Outro método de extração para remover um lipídio de uma célula microbiana é a lise de uma célula em um caldo de fermentação usando força mecânica (por exemplo, homogeneização), tratamento enzimático ou tratamento químico para romper as paredes celulares. O lipídio pode ser extraído a partir da composição resultante que compreende lipídios, biomassa de células microbianas e água usando um solvente orgânico, por exemplo, álcool isopropílico. O lipídio pode ser separado mecanicamente da composição e o álcool deve ser removido tanto do lipídio quanto do fluxo de resíduos de biomassa aquosa. Ver, por exemplo, Publicações Internacionais de documentos de Números WO 01/76385 e WO 01/76715.

[005] No entanto, a produção em escala industrial de lipídios usando qualquer um dos processos acima requer uma grande quantidade de solvente orgânico volátil e inflamável, criando assim condições operacionais perigosas. O uso de solventes orgânicos no processo de extração também pode exigir o uso de um sistema de recuperação de lipídios à prova de explosão, aumentando assim o custo da recuperação de lipídios. Além disso, o uso de um solvente orgânico na extração de lipídios a partir de uma célula microbiana pode gerar um fluxo de resíduos de solvente orgânico que requer um sistema de recuperação de solvente completo ou um método adequado de descarte, o que aumenta ainda mais o custo de produção geral da extração de lipídios. Por exemplo, limites estritos nas emissões de compostos orgânicos voláteis (VOC) exigem maior mão de obra e custo adicional para recipientes e outros equipamentos.

[006] Portanto, existe a necessidade de um processo de obtenção de lipídios a partir de uma célula que não utiliza um solvente orgânico, a fim de minimizar os problemas mencionados acima. Vários processos têm sido propostos para separar um lipídio de uma célula sem o uso de um solvente orgânico. Por exemplo, a Patente U.S. No. 6.750.048 descreve um processo de lavagem aquoso em que uma emulsão é lavada com soluções de lavagem aquosas até ser obtido um lipídio substancialmente não emulsionante. No entanto, em algumas modalidades, este processo requer várias etapas de lavagem, que requerem custos e tempo substanciais. A Patente U.S. No.

7.431.952 descreve um processo pelo qual as células lisadas são centrifugadas para remover resíduos da parede celular e, em seguida, os óleos são extraídos e purificados. No entanto, este processo fornece um óleo bruto que requer uma purificação adicional extensa.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] A presente invenção é direcionada a um processo para a obtenção de um lipídio a partir de uma composição que compreende células microbianas, o processo que compreende: tratar a composição que compreende as células microbianas por aquecimento da composição a uma temperatura de cerca de 60°C a cerca de 95°C a um pH de cerca de 9 a cerca de 11 sob agitação durante um período de tempo de cerca de 1 hora a cerca de 6 horas; separar as células microbianas tratadas em uma fase leve consistindo essencialmente em uma composição de células microbianas concentradas e uma fase pesada consistindo essencialmente em meio de fermentação e material aquoso; sequencialmente, em um ou mais ciclos, aumentando o pH da composição de células microbianas concentradas para 10 ou acima durante um período de tempo, seguido pela redução do pH da composição de células microbianas concentradas para um pH inferior a 6 durante um período de tempo para lisar a composição de células microbianas concentradas, em que o aumento e a redução do pH também desmulsificam a composição de células lisadas ("choque de pH"), opcionalmente na presença de sal; separar um lipídio da composição de células desmulsificadas e recuperar o lipídio.

[008] A presente invenção também é direcionada a um processo para a obtenção de um lipídio a partir de uma composição que compreende células microbianas, o processo que compreende: tratar a composição que compreende as células microbianas por aquecimento da composição a uma temperatura de cerca de 60°C a cerca de 95°C a um pH de cerca de 9 a cerca de 11 sob agitação durante um período de tempo de cerca de 1 hora a cerca de 6 horas; separar as células microbianas tratadas em uma fase leve consistindo essencialmente em uma composição de células microbianas concentradas e uma fase pesada consistindo essencialmente em meio de fermentação e material aquoso; ajustar o pH da composição de células microbianas concentradas para entre cerca de 10 a cerca de 12, seguido por redução do pH da composição de células microbianas concentradas para um pH de cerca de 3 a cerca de 6, durante um período de tempo para lisar a composição de células microbianas concentradas, em que o aumento e a redução do pH também desmulsificam a composição de células lisadas, opcionalmente na presença de sal; separar um lipídio da composição de células desmulsificadas e recuperar o lipídio.

[009] A presente invenção também é direcionada a um processo para a obtenção de um lipídio a partir de uma composição que compreende células microbianas, o processo que compreende: tratar a composição que compreende as células microbianas por aquecimento da composição a uma temperatura de cerca de 60°C a cerca de 95°C a um pH de cerca de 9 a cerca de 11 sob agitação durante um período de tempo de cerca de 1 hora a cerca de 6 horas; separar as células microbianas tratadas em uma fase leve consistindo essencialmente em uma composição de células microbianas concentradas e uma fase pesada consistindo essencialmente em meio de fermentação e material aquoso; lisar a composição de células concentradas da fase leve ajustando o pH da composição de células microbianas concentradas entre cerca de 7 a cerca de 8,5, aquecendo a composição de células microbianas concentradas a uma temperatura de cerca de 60°C a cerca de 80°C durante um período de tempo na presença de uma enzima capaz de romper a parede celular seguida por, sequencialmente, em um ou mais ciclos, elevar o pH da composição de células microbianas concentradas para 10 ou mais durante um período de tempo, seguido pela redução do pH da composição de células microbianas concentradas a um pH inferior a 6 durante um período de tempo para lisar a composição de células microbianas concentradas, em que o aumento e a redução do pH também desmulsificam a composição de células lisadas, opcionalmente na presença de sal; separar um lipídio da composição de células desmulsificadas e recuperar o lipídio.

[0010] A presente invenção também é direcionada a qualquer um dos processos da invenção em que o processo compreende ainda, durante a etapa de lise e desmulsificação e antes, entre ou após um ou mais ciclos de choque de pH,

fazer o ciclo da temperatura da composição de células microbianas concentradas de cerca de 4°C a cerca de 90°C durante um ou mais ciclos ("choque de temperatura"). Em algumas modalidades, o choque de temperatura compreende ajustar a temperatura de cerca de 80-90°C a cerca de 4-20°C e de volta a cerca de 80-90°C.

[0011] Em cada uma das modalidades anteriores, o lipídio recuperado contém opcionalmente menos de 5% em peso ou volume de um solvente orgânico.

[0012] Em cada uma das modalidades anteriores, menos de 5% em peso ou volume de um solvente orgânico é usado. Em algumas modalidades, nenhum solvente orgânico é usado.

[0013] Em algumas modalidades, o aumento do pH compreende a adição de uma base. Em algumas modalidades, a base tem um pKb de 1 a 12.

[0014] Em algumas modalidades, a redução do pH compreende a adição de um ácido. Em algumas modalidades, o ácido tem um pKa de 1 a 12.

[0015] Em algumas modalidades, o processo compreende agitar a composição de células lisadas por meio de agitação, mistura, formação de mistura, agitação, vibração ou uma combinação das mesmas.

[0016] Em algumas modalidades, a composição de células é lisada por ruptura mecânica, por exemplo, por homogeneização ou sonicação.

[0017] Em algumas modalidades, o sal é adicionado em uma quantidade de 0,1% a 20% em peso da composição de células lisadas. Em algumas modalidades, o sal é selecionado a partir do grupo que consiste em: sais de metais alcalinos, sais de metais alcalino-terrosos, sais de sulfato e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o sal é cloreto de sódio. Em algumas modalidades, o sal é sulfato de sódio.

[0018] Em algumas modalidades, o sal é omitido a partir da etapa de lise e desmulsificação.

[0019] Em algumas modalidades, a separação compreende centrifugação. Em algumas modalidades, a separação compreende centrifugar a uma temperatura de 30°C a 90°C. Em algumas modalidades, a separação compreende centrifugar a uma temperatura de 70 a 80°C. Em algumas modalidades, a separação compreende a centrifugação a um pH de cerca de 7 a cerca de 8,5.

[0020] Em algumas modalidades, o processo fornece um lipídio que compreende, pelo menos, 50% em peso de triglicerídeo.

[0021] Em algumas modalidades, o processo fornece um lipídio com um valor de anisidina de 26 ou menos.

[0022] Em algumas modalidades, o processo fornece um lipídio com um valor de peróxido de 5 ou menos.

[0023] Em algumas modalidades, o processo fornece um lipídio com um teor de fósforo de 100 ppm ou menos.

[0024] Em algumas modalidades, o processo fornece um lipídio com, pelo menos, 10% em peso de um ácido graxo poli- insaturado (PUFA) desejado. Em algumas modalidades, o processo fornece um lipídio com, pelo menos, 10% em peso de ácido docosahexaenóico ("DHA"), pelo menos, 5% em peso de ácido docosapentaenóico n-3 ("DPA n-3"), pelo menos, 10% em peso de ácido eicosapentaenóico ("EPA") e/ou, pelo menos, 10% em peso de ácido araquidônico ("ARA").

[0025] Em algumas modalidades, o processo compreende a concentração da composição de células lisadas.

[0026] Em algumas modalidades, o processo compreende refinação do lipídio. Em algumas modalidades, a refinação é selecionada a partir do grupo que consiste em: refinação cáustica, desgomagem, tratamento com ácido, tratamento alcalino, resfriamento, aquecimento, branqueamento, desodorização, desacidificação e combinações dos mesmos.

[0027] A presente invenção também é direcionada a um lipídio obtido por qualquer um dos processos da presente invenção.

[0028] Em algumas modalidades, o lipídio tem uma intensidade de aroma geral de 3 ou menos. Em algumas modalidades, o lipídio tem uma intensidade aromática geral de 2 ou menos.

[0029] Em algumas modalidades, o lipídio compreende pelo menos 10% em peso de um ácido graxo poli-insaturado (PUFA) desejado. Em algumas modalidades, o lipídio compreende pelo menos 10% em peso de ácido docosahexaenóico ("DHA"), pelo menos, 5% em peso de ácido docosapentaenóico n-3 ("DPA n- 3"), pelo menos, 10% em peso de ácido eicosapentaenóico ("EPA") e/ou, pelo menos, 10% em peso de ARA.

[0030] Em algumas modalidades, o lipídio compreende pelo menos 20% em peso de ácido eicosapentaenóico e menos de 5% em peso de cada um de ácido araquidônico, ácido docosapentaenóico n-6, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, ácido eicosaenóico, ácido erúcico e ácido estearidônico.

[0031] Em algumas modalidades, o lipídio tem um valor de anisidina de 26 ou menos.

[0032] Em algumas modalidades, o lipídio é um lipídio bruto. Em algumas modalidades, o lipídio bruto tem,

opcionalmente, menos de 5% em peso ou volume de um solvente orgânico. Em algumas modalidades, o lipídio bruto não tem solvente orgânico.

[0033] A presente invenção também é direcionada a um lipídio com um valor de anisidina de 26 ou menos, um valor de peróxido de 5 ou menos, um teor de fósforo de 100 ppm ou menos e, opcionalmente, menos de 5% em peso ou volume de um solvente orgânico.

[0034] A presente invenção também é direcionada a um lipídio extraído que compreende uma fração de triglicerídeo de, pelo menos, 70% em peso, em que o teor de ácido docosahexaenóico da fração de triglicerídeo é de, pelo menos, 40% em peso, em que o teor de ácido docosapentaenóico n-6 da fração de triglicerídeo é de, pelo menos, 0,5% em peso a 6% em peso, e em que o óleo tem um valor de anisidina de 26 ou menos. Em algumas modalidades, o lipídio extraído tem uma relação de ácido docosahexaenóico para ácido docosapentaenóico n-6 que é maior do que 6:1.

[0035] A presente invenção também é direcionada a um processo para a obtenção de um lipídio, o processo que compreende a refinação de um lipídio bruto da presente invenção. Em algumas modalidades, a refinação é selecionada a partir do grupo que consiste em: refinação cáustica, desgomagem, tratamento com ácido, tratamento alcalino, resfriamento, aquecimento, branqueamento, desodorização, desacidificação e combinações dos mesmos.

[0036] Os processos da presente invenção fornecem uma vantagem particular sobre os processos conhecidos na técnica, melhorando a quantidade e/ou qualidade da composição lipídica extraída, diminuindo o tempo de processamento para uma ou mais etapas no processo de obtenção do lipídio de uma composição de células, diminuindo a quantidade de reagentes necessários para a obtenção do lipídio de uma composição de células, reduzindo a quantidade de produtos químicos perigosos utilizados no processo, bem como, a quantidade de resíduos perigosos gerados pelo processo, aumentando o rendimento de óleo de RBDW (refinado, branqueado, desodorizado, invernizado), reduzindo a variabilidade na produção em escala comercial e reduzindo os custos monetários globais para a extração do lipídio. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS

[0037] Os desenhos anexos, que são aqui incorporados e fazem parte do relatório descritivo, ilustram a presente invenção e, juntamente com a descrição, servem ainda para explicar os princípios da invenção e permitir que um técnico no assunto pertinente faça e use a invenção.

[0038] A FIG. 1 fornece um fluxograma esquemático que descreve os processos da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0039] É aqui descrito um processo para a obtenção de um lipídio a partir de uma composição que compreende células microbianas, o processo que compreende: tratar a composição compreendendo as células microbianas por aquecimento da composição a uma temperatura de cerca de 60°C a cerca de 95°C a um pH de cerca de 9 a cerca de 11 sob agitação durante um período de tempo de cerca de 1 hora a cerca de 6 horas; separar as células microbianas tratadas em uma fase leve consistindo essencialmente em uma composição de células microbianas concentradas e uma fase pesada consistindo essencialmente em meio de fermentação e material aquoso;

sequencialmente, em um ou mais ciclos, aumentando o pH da composição de células microbianas concentradas para 10 ou acima durante um período de tempo, seguido pela redução do pH da composição de células microbianas concentradas para um pH inferior a 6 durante um período de tempo para lisar a composição de células microbianas concentradas, em que o aumento e a redução do pH também desmulsificam a composição de células lisadas ("choque de pH"), opcionalmente na presença de sal; separar um lipídio da composição de células desmulsificadas e recuperar o lipídio.

[0040] Em algumas modalidades, o processo compreende: (a) tratar uma composição que compreende as células microbianas aquecendo a composição a uma temperatura de cerca de 60°C a cerca de 95°C a um pH de cerca de 9 a cerca de 11 sob agitação durante um período de tempo de cerca de 1 hora a cerca de 6 horas; (b) separar as células microbianas tratadas em uma fase leve consistindo essencialmente em células microbianas concentradas e uma fase pesada consistindo essencialmente em meio de fermentação e material aquoso; (c) ajustar o pH da composição de células microbianas concentradas da fase leve a um pH de cerca de 10 a cerca de 12 adicionando uma base e mantendo o pH de cerca de 10 a cerca de 12 durante, pelo menos, 1 hora; (d) ajustar o pH da composição de (c) a um pH de cerca de 3 a cerca de 6 adicionando um ácido e mantendo o pH de cerca de 3 a cerca de 6 durante, pelo menos, 0,5 hora; (e) opcionalmente repetir as etapas (c) e (d) até que a composição esteja suficientemente desmulsificada; (f) separar o lipídio da composição de células lisadas desmulsificadas; e (g) recuperar o lipídio.

[0041] Em algumas modalidades, a composição que compreende células microbianas é aquecida durante a etapa de concentração (a) a uma temperatura de cerca de 60°C a cerca de 95°C a um pH de cerca de 9 a cerca de 11 sob agitação durante um período de tempo de cerca de 1 hora a cerca de 6 horas, cerca de 1 hora a cerca de 5 horas, cerca de 1 hora a cerca de 4 horas, cerca de 1 hora a cerca de 3 horas, cerca de 2 horas a cerca de 6 horas, cerca de 3 horas a cerca de 6 horas, cerca de 4 horas a cerca de 6 horas, ou cerca de 2 horas a cerca de 4 horas ou mais. Durante esta etapa, a química da superfície das células é interrompida, permitindo que as células se concentrem, o que pode facilitar a separação subsequente.

[0042] Em várias modalidades, a composição de células de (a) é resfriada a uma temperatura de cerca de 70-80°C e separada em uma fase leve consistindo essencialmente em células microbianas concentradas e uma fase pesada consistindo essencialmente em meio de fermentação e material aquoso por centrifugação a uma temperatura de cerca de 0°C a cerca de 100°C a 4000 x g a 11000 x g durante 10 segundos a 1 minuto. Em várias modalidades, a composição de células de (a) é resfriada a uma temperatura de cerca de 70-80°C e separada em uma fase leve e uma fase pesada por centrifugação a cerca de 4000 x g a cerca de 11000 x g durante 10 segundos a 3 minutos.

[0043] Em algumas modalidades, a composição de células microbianas concentradas da fase leve é reduzida para cerca de 5 a cerca de 25% em peso do caldo de fermentação, reduzindo significativamente o volume total da composição sem reduzir significativamente a população de células microbianas.

[0044] Após a concentração, a fase leve é lisada e desmulsificada usando um ou mais ciclos de choque de pH (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais). Em algumas modalidades, o pH da fase leve é primeiro ajustado para 10 ou mais pela adição de uma base durante o processo de lise e desmulsificação durante um período de tempo de cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 50 minutos, cerca de uma hora, cerca de 1,5 hora, cerca de 2 horas, cerca de 2,5 horas, cerca de 3 horas ou mais. O pH é, em seguida, ajustado para 6 ou menos por adição de um ácido durante o processo de lise e desmulsificação durante um período de tempo de cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 50 minutos, cerca de uma hora, cerca de 1,5 hora, cerca de 2 horas, cerca de 2,5 horas, cerca de 3 horas ou mais. Em algumas modalidades, o processo compreende o aquecimento da composição de células lisadas antes da adição de uma base durante 5 minutos a 10 horas, 10 minutos a 4 horas, 30 minutos a 2 horas, 30 minutos a 1 hora, 30 minutos a 1,5 hora, 1 hora a 1,5 hora, ou 1 hora a 2 horas.

[0045] Em algumas modalidades, uma enzima é adicionada à composição de células concentradas da fase leve antes dos ciclos de choque de pH. Nesta modalidade, o processo compreende a lise da composição de células da fase leve ajustando o pH da composição de células concentradas entre cerca de 7 a cerca de 8,5, aquecendo a composição de células a uma temperatura de cerca de 60°C a cerca de 80°C durante um período de tempo na presença de uma enzima capaz de romper a parede celular. Em várias modalidades, a temperatura é de cerca de 60°C a cerca de 65°C, cerca de 65°C a cerca de 70°C, cerca de 70°C a cerca de 75°C, cerca de 75°C a cerca de 80°C, cerca de 80°C a cerca de 85°C, cerca de 85°C a cerca de 90°C, cerca de 60°C, cerca de 65°C, cerca de 70°C, cerca de 75°C, cerca de 80°C, cerca de 85°C ou cerca de 90°C durante um período de tempo de 20 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 50 minutos, cerca de uma hora, cerca de 1,5 hora, cerca de 2 horas, cerca de 2,5 horas, cerca de 3 horas ou mais.

[0046] Em algumas modalidades, a etapa de lise não envolve uma enzima.

[0047] Em algumas modalidades, o processo compreende colocar em contato a composição de células microbianas concentradas ou a composição de células lisadas com um sal para facilitar a desmulsificação da composição de células lisadas. Em algumas modalidades, o sal é selecionado a partir do grupo que consiste em: sais de metais alcalinos, sais de metais alcalino-terrosos, sais de sulfato e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o sal é cloreto de sódio, cloreto de potássio ou sulfato de sódio. O sal pode ser adicionado antes ou durante os ciclos de choque de pH.

[0048] Após a desmulsificação, a composição é novamente separada em fases leve e pesada usando, por exemplo, centrifugação, filtração por membrana, filtração de tambor, decantação por gravidade, liofilização e similares. Em uma modalidade, a separação é realizada usando centrifugação a uma temperatura de 60°C a 85°C e uma velocidade de 4000 RPM a 8000 RPM. Após a separação, a fase leve consiste principalmente em óleo, enquanto a fase pesada consiste principalmente em meio de fermentação e material aquoso.

[0049] Em algumas modalidades, o processo compreende, antes da etapa de concentração: lavagem, diluição, centrifugação, evaporação, pasteurização, resfriamento ou uma combinação dos mesmos, um caldo de fermentação que inclui a célula. Em algumas modalidades, o processo compreende a concentração da composição de células lisadas.

[0050] A presente invenção também é direcionada a um processo para a obtenção de um lipídio, o processo que compreende a refinação de um lipídio bruto da presente invenção. Em algumas modalidades, a refinação é selecionada a partir do grupo que consiste em: refinação cáustica, desgomagem, tratamento com ácido, tratamento alcalino, resfriamento, aquecimento, branqueamento, desodorização, desacidificação e combinações dos mesmos.

[0051] Geralmente, os processos da presente invenção não utilizam um solvente orgânico para extrair ou de outra forma separar um lipídio. Assim, em algumas modalidades, um solvente orgânico não é adicionado a um caldo de fermentação que compreende uma célula microbiana, não é adicionado a uma composição de célula, não é adicionado a uma composição de célula lisada ou não é adicionado a um lipídio durante um processo da presente invenção em uma quantidade ou concentração suficiente para extrair um lipídio. Tal como aqui utilizado, um "solvente orgânico" refere-se a um solvente que inclui, pelo menos, um átomo de carbono. Tal como aqui utilizado, "solvente" refere-se a um agente que é hidrofóbico ou lipofílico e não é um lipídio. Tal como aqui utilizado, "hidrofóbico" refere-se a um agente que é repelido de uma massa de água. Tal como aqui utilizado, "lipofílico" refere-se a um agente que dissolve lipídios. Os solventes orgânicos que não são usados em um processo da presente invenção incluem, mas não estão limitados a solventes polares, solventes não polares, solventes miscíveis em água, solventes imiscíveis em água e combinações dos mesmos. Exemplos não limitativos de solventes orgânicos incluem C4- C8 alquils substituídos e não substituídos (por exemplo, hexano e similares), C5-C12 cicloalquils, C4-C12 alcenos, C1- C8 álcoois (por exemplo, isopropanol e similares), C1-C8 aldeídos, C4-C8 éteres, C1-C8 ésteres, C6-C12 arils, C1-C8 amidas, C5-C12 heteroarils e combinações dos mesmos.

[0052] Em algumas modalidades, um solvente orgânico pode ser adicionado a uma composição de célula microbiana, uma composição de célula lisada ou uma composição de célula desmulsificada. Em tais modalidades, o solvente orgânico é adicionado em uma concentração inferior a 5%, inferior a 4%, inferior a 3%, inferior a 2%, inferior a 1%, inferior a 0,5%, inferior a 0,1% ou inferior a 0,05% em volume. Um solvente orgânico, conforme aqui definido, pode ser opcionalmente adicionado a uma composição de célula lisada, por exemplo, como um componente de uma base e/ou um sal para entrar em contato com a composição de célula lisada. No entanto, em tais modalidades, o solvente orgânico está presente em uma concentração tal que o lipídio não é substancialmente extraído da composição de células microbianas, composição de células lisadas ou composição de células desmulsificadas pelo solvente (ou seja, em uma concentração de menos de 5%, menos de 4%, menos de 3%, menos de 2%, menos de 1%, menos de 0,5%, menos de 0,1% ou menos de 0,05% em volume ou peso).

[0053] Em algumas modalidades, o processo da presente invenção não inclui a lavagem, por exemplo, com água, ou o processo reduz o número de lavagens de uma composição de células lisadas ou uma composição de células desmulsificadas. "Lavagem" refere-se a um processo de diluição de uma composição com, por exemplo, água ou tampão e remoção da água ou tampão, por exemplo, por centrifugação. A lavagem de uma composição de células pode diminuir o rendimento geral de um lipídio obtido a partir de uma célula. Na presente invenção, a lavagem pode ser diminuída em 1 vez, 2 vezes, 3 vezes ou mais. Definições

[0054] Conforme usado aqui, "concentração" refere-se à remoção de água e/ou meio de fermentação de uma composição. A concentração pode incluir, mas não está limitada à evaporação, secagem química, centrifugação, filtração por membrana e similares, e combinações das mesmas.

[0055] Tal como aqui utilizado, "lipídio" ou "óleo" refere-se a um ou mais ácidos graxos (incluindo ácidos graxos livres e ésteres de ácidos graxos), fosfolipídios, triacilgliceróis (ou seja, triglicerídeos), diacilglicerídeos, monoacilglicerídeos, lisofosfolipídios, sabões, fosfatídeos, ceras, esteróis e ésteres de esterol, carotenóides, xantofilas, hidrocarbonetos e outros lipídios conhecidos por um técnico no assunto. Os lipídios incluem lipídios polares e lipídios neutros.

[0056] Tal como aqui utilizado, "lipídio polar" refere- se a lipídios que contêm um grupo polar e são mais facilmente solúveis em solventes polares. Os lipídios polares incluem fosfolipídios. Tal como aqui utilizado, "fosfolipídio" refere-se a lipídios com um grupo fosfato. Tal como aqui utilizado, "lipídio neutro" refere-se a lipídios que não contêm áreas de polaridade e são mais facilmente solúveis em solventes não polares. Lipídios neutros incluem triacilgliceróis (TAG).

[0057] Tal como aqui utilizado, as fases de separação após, por exemplo, centrifugação são com base na separação de acordo com a gravidade específica. Após a etapa de tratamento inicial, mas antes da desmulsificação, a "fase leve" consiste principalmente em material com uma gravidade específica mais baixa, por exemplo, a composição de célula concentrada (ou "biomassa"). A "fase pesada" consiste principalmente em material com uma gravidade específica mais elevada, por exemplo, a fase aquosa (por exemplo, água, sais, açúcar). Para os fins da presente invenção, a fase leve separada pode conter material aquoso residual mínimo. Após a desmulsificação e/ou lise, a fase leve consiste principalmente na composição de células microbianas concentradas, enquanto a fase pesada consiste principalmente em meio de fermentação e material aquoso. Nesta etapa, há também uma pequena quantidade de uma terceira fase que é similar em composição à fase pesada.

[0058] Os ácidos graxos são classificados com base nas características de comprimento e saturação da cadeia de carbono. Os ácidos graxos são chamados de ácidos graxos de cadeia curta, média ou longa, com base no número de carbonos presentes na cadeia. Os ácidos graxos são denominados ácidos graxos saturados quando não há ligações duplas entre os átomos de carbono, e são denominados ácidos graxos insaturados quando as ligações duplas estão presentes. Os ácidos graxos de cadeia longa insaturados são monoinsaturados quando apenas uma ligação dupla está presente e são poli-insaturados quando mais de uma ligação dupla está presente.

[0059] Os ácidos graxos presentes no lipídio podem ter de 4 a 28 átomos de carbono. Em algumas modalidades, um lipídio compreende um ou mais ácidos graxos poli- insaturados. Os ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) são classificados com base na posição da primeira ligação dupla da extremidade metil do ácido graxo: os ácidos graxos ômega- 3 (n-3) contêm uma primeira ligação dupla no terceiro carbono, enquanto os ácidos graxos ômega-6 (n-6) contêm uma primeira ligação dupla no sexto carbono. Por exemplo, o ácido docosahexaenóico ("DHA") é um ácido graxo poli-insaturado de cadeia longa ômega-3 (LC-PUFA) com um comprimento de cadeia de 22 carbonos e 6 ligações duplas, muitas vezes, designados como "22:6 n-3". Para os fins deste pedido, ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (LC-PUFAs) são definidos como ácidos graxos de 18 ou mais comprimentos de cadeia de carbono, e são de preferência, ácidos graxos de 20 ou mais comprimentos de cadeia de carbono, contendo 3 ou mais ligações duplas. LC-PUFAs da série ômega-6 incluem, mas não são limitados a ácido di-homo-gama-linoleico (C20:3n-6), ácido araquidônico (C20:4n-6) ("ARA"), ácido docosatetraenóico ou ácido adrênico (C22:4n-6) e ácido docosapentaenóico (C22:5n-6) ("DPA n-6"). Os LC-PUFAs da série ômega-3 incluem, mas não são limitados a ácido eicosatrienóico (C20:3n-3), ácido eicosatetraenóico (C20:4n- 3), ácido eicosapentaenóico (C20:5n-3) ("EPA"), ácido docosapentaenóico (C22:5n-3) ("DPA n-3") e ácido docosahexaenóico (C22:6n-3) ("DHA"). Os LC-PUFAs também incluem ácidos graxos com mais de 22 carbonos e 4 ou mais ligações duplas incluindo, mas não limitados a C24:6 (n-3) e C28:8 (n-3).

[0060] Os termos "ácido graxo", "ácido graxo poli- insaturado" e "PUFA" incluem não apenas a forma de ácido graxo livre, mas também outras formas, tais como a forma de triacilglicerol (TAG), a forma de fosfolipídio (PL) e outras formas esterificadas. Conforme usado aqui, os termos "éster" e "esterificado" referem-se à substituição do hidrogênio no grupo de ácido carboxílico de uma molécula de PUFA por outro substituinte. Os ésteres típicos são conhecidos pelos técnico no assunto, uma discussão dos quais é fornecida por Higuchi, T. et al., Pro-drug as Novel Delivery Systems, Vol. 14, A.C.S. Symposium Series, Bioreversible Carriers in Drug Design, Edward B. Roche ed., Amer. Pharma. Assoc., Pergamon Press (1987), e Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie ed., Plenum Press, New York (1973), cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Exemplos de ésteres comuns incluem metil, etil, tricloroetil, propil, butil, pentil, terc-butil, benzil, nitrobenzil, metoxibenzil e benzidril.

[0061] Em algumas modalidades, um lipídio compreende pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 80% em peso de PUFA. Em algumas modalidades, um lipídio compreende pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 80% em peso de DHA. Em algumas modalidades, um lipídio compreende menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10% ou menos de 5% em peso de EPA. Em algumas modalidades, um lipídio compreende menos de 10%, menos de 5%, menos de 2%, menos de 1% ou menos de 0,5% em peso de esteróis. Em algumas modalidades, um ou mais de PUFAs estão presentes em um lipídio em uma ou mais formas, tais como triglicerídeos, diglicerídeos, monoglicerídeos, fosfolipídios, ácidos graxos livres, ácidos graxos esterificados, sais de metais alcalinos de ácidos graxos, sais de metais alcalino-terrosos de graxos ácidos e combinações dos mesmos.

[0062] Em algumas modalidades, um lipídio separado após a centrifugação em um processo da presente invenção compreende pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 50% a 95%, 50% a 90%, 50% a 85%, 50% a 80%, 50% a 75%, 60% a 95%, 60% a 90%, 60% a 85%, 70% a 95%, 70% a 90%, 70% a 85%, 75% a 95%, 75% a 90% ou 75% a 85% em peso de triglicerídeos.

[0063] Em algumas modalidades, os triglicerídeos compreendem pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% ou pelo menos 80% em peso de DHA. Em algumas modalidades, os triglicerídeos compreendem pelo menos 50%, pelo menos 40%, pelo menos 30%, pelo menos 20%, pelo menos 15%, pelo menos 10% ou pelo menos 5% em peso de EPA.

[0064] Conforme discutido aqui, a refinação adicional de um lipídio após a centrifugação pode fornecer um lipídio compreendendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99%, ou 80% a 99,5%, 80% a 99%, 80% a 97%, 80% a 95%, 80% a 90%, 85% a 99,5%, 85% a 99%, 85% a 97%, 85% a 95%, 85% a 90%, 90% a 99,5%, 90% a

99%, 90% a 97%, 90% a 95%, 95% a 99,5%, 95% a 99%, 95% a 97%, 97% a 99,5%, ou 98% a 99,5% de triglicerídeo em peso.

[0065] Conforme usado aqui, uma "célula" refere-se a um biomaterial contendo lipídio, tal como biomaterial derivado de microrganismos.

[0066] Tal como aqui utilizado, uma "célula microbiana" ou "microrganismo" refere-se a organismos, tais como algas, bactérias, fungos, protistas e combinações dos mesmos, por exemplo, organismos unicelulares. Em algumas modalidades, uma célula microbiana é uma célula eucariótica. Uma célula microbiana adequada para uso com a presente invenção inclui, mas não está limitada a algas douradas (por exemplo, microrganismos do reino Stramenopiles), algas verdes, diatomáceas, dinoflagelados (por exemplo, microrganismos da ordem Dinophyceae incluindo membros do gênero Crypthecodinium tais como, por exemplo, Crypthecodinium cohnii ou C. cohnii), levedura (Ascomycetes ou Basidiomycetes), e fungos dos gêneros Mucor e Mortierella, incluindo mas não limitados a Mortierella alpina e Mortierella sect, schmuckeri. Uma célula microbiana adequada para uso com a presente invenção pode ainda incluir, mas não está limitada a gêneros encontrados nos seguintes grupos de organismos: Stramenopiles, Hamatores, Proteromonads, Opalines, Develpayella, Diplophrys, Labrinthulids, Thraustochytrids, Biosecids, Oomycetes, Hypochytridiomycetes, Commation, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola, Aureococcus, Parmales, Diatomáceas, Xanthophytes, Phaeophytes, Eustigmatophytes, Raphidophytes, Synurids, Axodines (incluindo Rhizochromulinaales, Pedinellales, Dictyochales),

Chrysomeridales, Sarcinochrysidales, Hydrurales, Hibberdiales, e Chromulinales.

[0067] Em algumas modalidades, uma célula microbiana para uso com a presente invenção é um microrganismo do filo Labyrinthulomycota. Em algumas modalidades, uma célula microbiana do filo Labyrinthulomycota é um thraustochytrid, tal como um Schizochytrium ou Thraustochytrium. De acordo com a presente invenção, o termo "thraustochytrid" refere- se a qualquer membro da ordem Thraustochytriales, que inclui a família Thraustochytriaceae, e o termo " labyrinthulid" refere-se a qualquer membro da ordem Labyrinthulales, que inclui a família Labyrinthulaceae.

[0068] Membros da família Labyrinthulaceae eram anteriormente considerados membros da ordem Thraustochytriales, mas em revisões mais recentes da classificação taxonômica de tais organismos, a família Labyrinthulaceae é agora considerada um membro da ordem Labyrinthulales. Ambos Labyrinthulales e Thraustochytriales são considerados membros do filo Labyrinthulomycota. Os teóricos taxonômicos agora geralmente colocam esses dois grupos de microrganismos com as algas ou protistas similares a algas da linhagem Stramenopile.

[0069] Para os fins da presente invenção, as cepas de células microbianas descritas como thraustochytrids incluem os seguintes organismos: Ordem: Thraustochytriales; Família: Thraustochytriaceae; Gênero: Thraustochytrium (Espécies: sp., arudimentale, aureum, benthicola, globosum, kinnei, motivum, multirudimentale, pachydermum, proliƒerum, roseum e striatum), Ulkenia (Espécies: sp., amoeboidea, kerguelensis, minuta, proƒunda, radiata, sailens,

sarkariana, schizochytrops, visurgensis, yorkensis e sp. BP- 5601), Schizochytrium (Espécies: sp., aggregatum, limnaceum, mangrovei, minutum e octosporum), Japonochytrium (Espécies: sp., marinam), Aplanochytrium (Espécies: sp., haliotidis, kerguelensis, proƒunda e stocchinoi), Althornia (Espécies: sp., crouchii) ou Elina (Espécies: sp., marisalba e sinoriƒicd). Para os fins desta invenção, as espécies descritas em Ulkenia serão consideradas membros do gênero Thraustochytrium. Aurantiacochytrium e Oblogospora são dois gêneros adicionais englobados pelo filo Labyrinthulomycota na presente invenção. Em algumas modalidades, uma célula microbiana é do gênero Thraustochystrium, Schizochytrium e misturas dos mesmos.

[0070] Células microbianas adequadas para uso com a presente invenção incluem, mas não são limitadas a Labyrinthulids selecionadas a partir de: Ordem: Labyrinthulales, Família: Labyrinthulaceae, Gêneros: Labyrinthula (Espécies: sp., algeriensis, coenocystis, chattonii, macrocystis, macrocystis atlantica, macrocystis, marina, minuta, roscoƒƒensis, valkanovii, vitellina, vitellina paciƒica, vitellina e zopƒii), Labyrinthuloides (Espécies: sp., haliotidis e yorkensis), Labyrinthomyxa (Espécies: sp. marina), Diplophrys (Espécies: sp., archeri), Pyrrhosorus (Espécies: sp., marinus), Sorodiplophrys (Espécies: sp., stercorea) e Chlamydomyxa (Espécies: sp., labyrinthuloides e montana) (embora atualmente não haja um consenso sobre a exata colocação taxonômica de Pyrrhosorus, Sorodiplophrys e Chlamydomyxa).

[0071] As células hospedeiras do filo Labyrinthulomycota incluem, mas não são limitadas a cepas depositadas PTA-10212,

PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215, PTA-9695, PTA-9696, PTA- 9697, PTA-9698, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210, PTA-10211, o microrganismo depositado como SAM2179 (denominado "Ulkenia SAME 179" pelo depositante), qualquer espécie de Thraustochytrium (incluindo espécies de Ulkenia antigas, tais como U visurgensis, U. amoeboida, U sarkariana, U proƒunda, U radiata, U. minuta e Ulkenia sp.

BP-5601), e incluindo Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium roseum; e qualquer espécie de Japonochytrium.

As cepas de Thraustochytriales incluem, mas não são limitadas a Thraustochytrium sp. (23B) (ATCC 20891); Thraustochytrium striatum (Schneider) (ATCC 24473); Thraustochytrium aureum (Goldstein) (ATCC 34304); Thraustochytrium roseum (Goldstein) (ATCC 28210); Japonochytrium sp. (LI) (ATCC 28207); ATCC 20890; ATCC 20892; uma cepa mutante derivada de qualquer um dos microrganismos acima mencionados; e misturas dos mesmos.

Schizochytrium inclui, mas não está limitado a Schizochytrium aggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium sp. (S31) (ATCC 20888), Schizochytrium sp. (S8) (ATCC 20889), Schizochytrium sp. (LC-RM) (ATCC 18915), Schizochytrium sp. (SR 21), cepa ATCC 28209 depositada, cepa IFO 32693 depositada de Schizochytrium limacinum, uma cepa mutante derivada de qualquer um dos microrganismos mencionados acima, e misturas dos mesmos.

Em algumas modalidades, a célula hospedeira é um Schizochytrium ou um Thraustochytrium.

O Schizochytrium pode se replicar tanto por bipartição sucessiva quanto pela formação de esporângios, que por fim liberam zoósporos.

O Thraustochytrium, entretanto, se replica apenas formando esporângios que, em seguida, libera zoósporos.

Em algumas modalidades, a célula hospedeira da invenção é uma célula hospedeira recombinante.

[0072] As condições de cultura eficazes para uma célula microbiana para uso com a invenção incluem, mas não são limitadas a meios eficazes, biorreator, temperatura, pH e condições de oxigênio que permitem a produção de lipídios. Um meio eficaz refere-se a qualquer meio, em que uma célula microbiana é tipicamente cultivada. Esses meios compreendem tipicamente um meio aquoso com fontes de carbono, nitrogênio e fosfato assimiláveis, bem como, sais, minerais, metais e outros nutrientes apropriados, tais como vitaminas. As células microbianas para uso com a presente invenção podem ser cultivadas em biorreatores de fermentação convencionais, frascos de agitação, tubos de ensaio, placas de microtitulação e placas de Petri. Em algumas modalidades, a cultura é realizada a uma temperatura, pH e teor de oxigênio apropriados para uma célula recombinante.

[0073] Em algumas modalidades, uma célula microbiana é capaz de crescer a um nível de salinidade de 12 g/L ou menos, 5 g/L ou menos, ou 3 g/L ou menos de cloreto de sódio.

[0074] Em algumas modalidades, uma célula microbiana produz um lipídio compreendendo PUFAs de ômega-3 e/ou ômega-

6. Em algumas modalidades, uma célula microbiana produz um lipídio compreendendo DHA, DPA (n-3), DPA (n-6), EPA, ácido araquidônico (ARA) ou similares e combinações dos mesmos. Exemplos não limitativos de microrganismos que produzem um lipídio compreendendo um PUFA são revelados acima e também são encontrados nas Patentes U.S. de Números 5.340.594,

5.340.742 e 5.583.019, cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[0075] Em algumas modalidades, uma célula microbiana compreende pelo menos 30% em peso de lipídios, pelo menos 35% em peso de lipídios, pelo menos 40% em peso de lipídios, pelo menos 50% em peso de lipídios, pelo menos 60% em peso de lipídios, pelo menos 70% em peso de lipídios, ou pelo menos 80% em peso de lipídios. Em algumas modalidades, uma célula microbiana para uso com a presente invenção é capaz de produzir, pelo menos, 0,1 grama por litro por hora (g/L/h) de DHA, pelo menos 0,2 g/L/h de DHA, pelo menos 0,3 g/L/h de DHA, ou pelo menos 0,4 g/L/h de DHA. Processos

[0076] Os processos da presente invenção compreendem a concentração de uma composição de células antes da lise e desmulsificação. O processo de concentração compreende o aquecimento de uma composição que compreende células microbianas, tal como um caldo de fermentação, a uma temperatura de cerca de 60°C a cerca de 95°C, cerca de 80°C a cerca de 95°C, cerca de 85°C a cerca de 90°C, cerca de 90°C a cerca de 95°C, cerca de 80°C, cerca de 85°C, cerca de 90°C, cerca de 95°C, ou superior, a um pH de cerca de 6 a cerca de 9, cerca de 9 a cerca de 11, cerca de 9 a cerca de 10,5, cerca de 9 a cerca de 10, ou cerca de 9 a cerca de 9,5 sob agitação durante um período de tempo de cerca de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas ou mais para concentrar a população de células microbianas; e separar as células microbianas concentradas em uma fase leve e uma fase pesada.

[0077] Os processos da presente invenção compreendem ainda lisar uma célula ou biomassa celular a partir da fase leve para formar uma composição de células lisadas. Tal como aqui utilizado, o termo "biomassa celular" refere-se a uma população de células microbianas. Tal como aqui utilizado, os termos "lise" e "lisar" referem-se a um processo de ruptura da parede celular e/ou membrana celular de uma célula. Em algumas modalidades, a lise compreende um processo tais como: tratamento mecânico, tratamento químico, tratamento enzimático, tratamento físico ou combinações dos mesmos. Em várias modalidades, a lise ocorre pela adição de uma enzima capaz de romper a parede celular das células microbianas.

[0078] Conforme usado aqui, "tratar mecanicamente" inclui, mas não está limitado a homogeneizar uma célula, aplicar ultrassom a uma célula, prensar a frio uma célula, moer uma célula ou similares, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o processo compreende a lise da célula por homogeneização. Em algumas modalidades, o processo compreende a lise da célula com um homogeneizador.

[0079] Em algumas modalidades, a etapa de concentração compreende um processo mecânico, tal como homogeneização ou sonicação, em que o processo mecânico resulta na lise de menos de cerca de 5% das células.

[0080] A homogeneização de uma célula pode incluir, mas não está limitada a processos que utilizam uma prensa de células de pressão Francesa, um sonicador, um homogeneizador, um moinho de bolas, um moinho de barras, um moinho de seixos, um moinho de esferas, um rolo de moagem de alta pressão, um impactador de eixo vertical, um misturador industrial, um misturador de alto cisalhamento, um misturador de pás, um homogeneizador polytron ou similares, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, uma célula flui através de um homogeneizador que é opcionalmente aquecido. Em algumas modalidades, a homogeneização adequada pode incluir 1 a 3 passagens através de um homogeneizador em altas e/ou baixas pressões. Em algumas modalidades, uma pressão durante a homogeneização pode ser de 150 bar a 1.400 bar (15 MPa a 140 MPa), 150 bar a 1.200 bar (15 MPa a 120 MPa), 150 bar a 900 bar (15 MPa a 90 MPa), 150 bar a 300 bar (15 MPa a 30 MPa), 300 bar a 1.400 bar (30 MPa a 140 MPa), 300 bar a 1.200 bar (30 MPa a 120 MPa), 300 bar a 900 bar (30 MPa a 90 MPa), 400 bar a 800 bar (40 MPa a 80 MPa), 500 bar a 700 bar (50 MPa a 70 MPa)ou 600 bar (60 MPa).

[0081] Tal como aqui utilizado, o tratamento físico pode incluir, mas não está limitado a aquecimento de uma célula, resfriamento de uma célula, secagem de uma célula ou similares, e combinações dos mesmos.

[0082] O aquecimento de uma célula pode incluir, mas não está limitado a aquecimento resistivo, aquecimento por convecção, aquecimento a vapor, aquecimento em um banho de fluido, aquecimento com energia solar, aquecimento com energia solar focalizada e similares, qualquer um dos quais pode ser realizado em um tanque, piscina, tubo, conduto, frasco ou outro dispositivo de contenção. Em algumas modalidades, uma célula é aquecida em um tanque que inclui bobinas resistivas em/sobre suas paredes. Em algumas modalidades, uma célula é aquecida em um banho líquido que inclui uma tubulação que passa por ali. Em algumas modalidades, uma célula é aquecida em um tanque com aquecimento encamisado, que é o tanque que usa uma "camisa" de aquecimento ao redor do tanque através do qual um fluido de aquecimento circula.

[0083] A secagem de uma célula pode incluir, mas não está limitada à exposição ao fluxo de ar, exposição ao calor (por exemplo, calor de convecção, uma superfície aquecida e similares), exposição à energia solar, secagem por congelamento (liofilização), secagem por atomização, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a secagem compreende a aplicação de uma célula a um tambor rotativo que é opcionalmente aquecido.

[0084] Tal como aqui utilizado, o tratamento químico inclui, mas não está limitado a aumentar ou diminuir o pH de uma célula ou composição de células, colocar em contato uma célula ou composição de células com um produto químico adequado ou similar.

[0085] O aumento do pH de uma célula ou composição de células pode incluir, mas não está limitado a adicionar uma base a uma composição de células. Em algumas modalidades, as bases adequadas para uso com a presente invenção incluem, mas não são limitadas a bases de hidróxido (por exemplo, LiOH, NaOH, KOH, Ca(OH)2 e similares, e combinações dos mesmos), bases de carbonato (por exemplo, Na2CO3, K2CO3, MgCO3 e similares, e combinações dos mesmos), bases de bicarbonato (por exemplo, LiHCO3, NaHCO3, KHCO3 e similares, e combinações dos mesmos) e combinações dos mesmos. Uma base pode estar na forma de um sólido (por exemplo, cristais, um granulado, péletes e similares) ou um líquido (por exemplo, uma solução aquosa, uma solução alcoólica, tais como uma base de hidróxido em metanol, etanol, propanol e similares), e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o pH da composição de células é aumentado para 8 ou acima, 9 ou acima, 10 ou acima, 11 ou acima, 12 ou acima, ou um pH de 7 a 13, 7 a 12, 7 a 11, 7 a 10, 7 a 9, 8 a 13, 8 a 12, 8 a 11, 8 a 10, 8 a 9, 9 a 12, 9 a 11, 9 a 10, 10 a 12 ou 10 a 11.

[0086] Em algumas modalidades, o aumento do pH de uma célula pode incluir, mas não está limitado a realizar um processo de cloroalcalino. Em algumas modalidades, um caldo de fermentação contendo cloreto de sódio e uma composição de células é submetido à eletrólise, o que resultaria na formação de hidróxido de sódio. A formação de hidróxido de sódio aumenta o pH da célula. Em algumas modalidades, um caldo de fermentação pode incluir cloreto de cálcio ou cloreto de potássio no lugar de ou em adição ao cloreto de sódio. Submeter esse caldo de fermentação à eletrólise resulta na formação de hidróxido de cálcio ou hidróxido de potássio, respectivamente, aumentando assim o pH da célula.

[0087] A lise enzimática refere-se à lise de uma parede celular ou membrana celular de uma célula por colocar em contato a célula com uma ou mais enzimas. As enzimas adequadas para uso com a presente invenção incluem, mas não são limitadas a beta-glucanases, xilanases, proteases, mananases, celulases, hemicelulases, quitinases, pectinases e combinações dos mesmos. Exemplos não limitativos de proteases incluem serina proteases, treonina proteases, cisteína proteases, aspartato proteases, metaloproteases, ácido glutâmico proteases, alacase e combinações dos mesmos. Os exemplos não limitativos de celulases incluem sucrase, maltase, lactase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, amilase, lisozima, neuraminidase, galactosidase, alfa- manosidase, glucuronidase, hialuronidase, pululanase, glucocerebrosidase, galactosilceramidase, acetilgalactosaminidase, fucosidase, hexosaminidase,

iduronidase, maltase-glucoamilase, e combinações dos mesmos. Um exemplo não limitativo de uma quitinase inclui quitotriosidase. Exemplos não limitativos de pectinases incluem pectoliase, pectozima, poligalacturonase, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, algumas enzimas são ativadas por aquecimento. Em algumas modalidades, a enzima é selecionada a partir de beta- glucanase, xilanase, celulase, protease, pectinase, mananase, amilase, e combinações das mesmas. Em algumas modalidades, a enzima é Alcalase®.

[0088] Tal como aqui utilizado, uma "composição de células lisadas" refere-se a uma composição que compreende uma ou mais células lisadas, incluindo detritos celulares e outros conteúdos da célula, em combinação com um lipídio (a partir das células lisadas) e, opcionalmente, caldo que contém células microbianas. Em algumas modalidades, uma célula microbiana está contida em um caldo ou meio de fermentação compreendendo a célula microbiana e água. Em algumas modalidades, uma composição de células lisadas refere-se a uma composição que compreende uma ou mais células lisadas, detritos celulares, um lipídio, os conteúdos naturais da célula, e componentes aquosos de um caldo. Em algumas modalidades, uma composição de células lisadas está na forma de uma emulsão de óleo em água que compreende uma mistura de uma fase aquosa contínua e uma fase lipídica dispersa. Em algumas modalidades, uma fase lipídica dispersa está presente em uma concentração de 1% a 60%, 1% a 50%, 1% a 40%, 1% a 30%, 1% a 20%, 5% a 60%, 5% a 50%, 5% a 40%, 5% a 30%, 5% a 20%, 10% a 60%, 10% a 50%, 10% a 40%, 20% a 60%, 20% a 50%, 20% a 40%, 30% a 60%, 30% a 50% ou 40% a 60% em peso de uma composição de células lisadas emulsionadas.

[0089] Embora não esteja vinculado a nenhuma teoria particular, acredita-se que os processos da presente invenção quebram ou desmulsificam uma composição de células lisadas emulsionadas, permitindo que um lipídio seja separado da composição de células lisadas. Tal como aqui utilizado, os termos "emulsão" e "emulsionante" referem-se a uma mistura de duas ou mais fases ou camadas imiscíveis, em que uma fase ou camada está dispersa em outra fase ou camada. Conforme usado aqui, os termos "quebrar", "dividir", "desmulsificar", "desmulsificação", "desmulsificador" e "quebrar" referem-se a um processo de separação de fases ou camadas imiscíveis de uma emulsão. Por exemplo, desmulsificar ou quebrar uma composição de células lisadas emulsionadas refere-se a um processo pelo qual uma composição de células lisadas emulsionadas muda de uma emulsão com uma ou mais fases ou camadas para uma composição com duas ou mais fases ou camadas. Por exemplo, em algumas modalidades, o processo da presente invenção quebra uma composição de células lisadas emulsionadas de uma fase única para duas ou mais fases. Em algumas modalidades, as duas ou mais fases incluem uma fase lipídica e uma fase aquosa. Em algumas modalidades, o processo da presente invenção quebra uma composição de células lisadas emulsionadas de uma ou mais fases para, pelo menos, três fases. Em algumas modalidades, as três fases incluem uma fase lipídica, uma fase aquosa e uma fase sólida. Em algumas modalidades, as três fases incluem uma fase lipídica, uma fase de emulsão e uma fase aquosa.

[0090] Em algumas modalidades, os processos da presente invenção desmulsificam uma composição de células lisadas para formar uma composição de células desmulsificadas removendo ou quebrando pelo menos 75% da emulsão, pelo menos 80% da emulsão, pelo menos 85% da emulsão, pelo menos 90% da emulsão, pelo menos 95% da emulsão, pelo menos 99% da emulsão. Em algumas modalidades, o processo da presente invenção desmulsifica uma composição de células lisadas removendo ou quebrando 75% da emulsão a 99% da emulsão, 75% da emulsão a 95% da emulsão, 75% da emulsão a 90% da emulsão, 75% da emulsão a 85% da emulsão, 75% da emulsão a 80% da emulsão, 80% da emulsão a 99% da emulsão, 80% da emulsão a 95% da emulsão, 80% da emulsão a 90% da emulsão, 80% da emulsão a 85% da emulsão, 85% da emulsão a 99% da emulsão, 85% da emulsão a 95% da emulsão, 85% da emulsão a 90% da emulsão, 90% da emulsão a 99% da emulsão, 90% da emulsão a 95% da emulsão, ou 95% da emulsão a 99% da emulsão em peso ou volume.

[0091] Em algumas modalidades, antes de concentrar a composição de células, a composição de células pode ser lavada e/ou pasteurizada.

[0092] Em algumas modalidades, a lavagem da célula inclui o uso de uma solução aquosa, tal como água, para remover quaisquer compostos extracelulares solúveis em água ou dispersíveis em água. Em algumas modalidades, a célula pode ser lavada uma, duas, três vezes ou mais. Em algumas modalidades, a pasteurização da célula inclui o aquecimento da célula a uma temperatura suficiente para inativar quaisquer enzimas indesejáveis ou para ativar quaisquer enzimas desejáveis, por exemplo, quaisquer enzimas que possam degradar lipídios ou reduzir o rendimento de PUFAs.

Em algumas modalidades, a temperatura de pasteurização é de cerca de 60°C a cerca de 80°C. Em algumas modalidades, a célula pode ser lavada primeiro e, em seguida, pasteurizada.

[0093] Em algumas modalidades, o tratamento de uma composição de células lisadas com, pelo menos, uma primeira base e, pelo menos, um primeiro ácido divide (isto é, desmulsifica) uma composição de células lisadas emulsionadas. Em algumas modalidades, o tratamento de uma composição de células lisadas com um sal quebra (isto é, desmulsifica) uma composição de células lisadas emulsionadas. Em algumas modalidades, o aquecimento de uma composição de células lisadas quebra (isto é, desmulsifica) uma composição de células lisadas emulsionadas. Em algumas modalidades, a agitação de uma composição de células lisadas quebra (isto é, desmulsifica) uma composição de células lisadas emulsionadas. Em algumas modalidades, o aquecimento e a agitação simultâneos de uma composição de células lisadas quebram (isto é, desmulsifica) uma composição de células lisadas emulsionadas. Em algumas modalidades, um ou mais dos tratamentos anteriores quebram (isto é, desmulsificam) uma composição de células lisadas emulsionadas.

[0094] Em algumas modalidades, o processo da invenção compreende aumentar o pH de uma composição de células para lisar e/ou desmulsificar a composição de células. Em algumas modalidades, o processo da invenção compreende aumentar o pH de uma composição de células lisadas para desmulsificar a composição de células lisadas. Em algumas modalidades, o aumento do pH compreende colocar em contato uma composição de células ou composição de células lisadas com uma base. Em algumas modalidades, o processo da invenção compreende colocar em contato uma composição de células lisadas com uma base para desmulsificar a composição de células lisadas. Tal como aqui utilizado, "colocar em contato" refere-se a combinar uma composição de célula ou uma composição de célula lisada com uma segunda composição (por exemplo, adicionando uma composição a uma composição de célula ou uma composição de célula lisada, adicionando uma composição de célula ou uma composição de célula lisada a uma composição e similares). Tal como aqui utilizado, uma "composição" pode compreender um material puro ou incluir uma combinação de dois ou mais materiais, substâncias, excipientes, porções e similares. Colocar em contato uma composição de células lisadas com uma primeira base aumenta o pH da composição de células lisadas.

[0095] Em algumas modalidades, uma composição de células lisadas é colocada em contato com uma primeira base durante um período de tempo seguido por um primeiro ácido durante um período de tempo, em seguida, aquecida, agitada ou uma combinação dos mesmos e, subsequentemente, colocada em contato com uma segunda ou subsequente base seguida por um segundo ou subsequente ácido para fornecer uma composição desmulsificada.

[0096] Em algumas modalidades, a base tem um pKb de 1 a 12, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 5, 2 a 12, 2 a 10, 2 a 8, 2 a 6, 2 a 5, 3 a 10, 3 a 6, 3 a 5, 4 a 10, 4 a 8, 4 a 6, 5 a 10 ou 5 a 8. Tal como aqui utilizado, o termo "pKb" refere-se ao logaritmo negativo da constante de associação de base, Kb da base. Kb refere-se à constante de equilíbrio para a ionização da base na água.

[0097] As bases adequadas para uso com a presente invenção incluem, mas não são limitadas a bases de hidróxido (por exemplo, LiOH, NaOH, KOH, Ca(OH)2 e similares, e combinações dos mesmos), bases de carbonato (por exemplo, Na2CO3, K2CO3, MgCO3 e similares, e combinações dos mesmos), bases de bicarbonato (por exemplo, LiHCO3, NaHCO3, KHCO3 e similares, e combinações dos mesmos), e combinações dos mesmos.

[0098] Uma base pode estar na forma de um sólido (por exemplo, cristais, um granulado, péletes e similares) ou um líquido (por exemplo, uma solução aquosa, uma solução alcoólica, tais como uma base de hidróxido em metanol, etanol, propanol e similares), e combinações dos mesmos. Assim, um solvente pode estar opcionalmente presente em uma base para uso com a presente invenção. Tal como aqui utilizado, "solvente" refere-se a um agente que é hidrofóbico ou lipofílico. Tal como aqui utilizado, "hidrofóbico" refere-se a um agente que é repelido de uma massa de água. Tal como aqui utilizado, "lipofílico" refere-se a um agente que se dissolve em lipídios.

[0099] Em algumas modalidades, colocar em contato uma composição de células ou uma composição de células lisadas com uma base aumenta o pH da composição de células lisadas. Em algumas modalidades, colocar em contato uma composição de células lisadas com uma base aumenta o pH da composição de células lisadas para 9 ou acima, 10 ou acima, 11 ou acima, 12 ou acima, ou um pH de cerca de 9 a cerca de 14, cerca de 9 a cerca de 13,5, cerca de 9 a cerca de 13, cerca de 9 a cerca de 12,5, cerca de 9 a cerca de 12, cerca de 9 a cerca de 11,5, cerca de 9 a cerca de 11, cerca de 9 a cerca de 10,5, cerca de 9 a cerca de 10, cerca de 9 a cerca de 9,5,

cerca de 9,5 a cerca de 14, cerca de 9,5 a cerca de 13,5, cerca de 9,5 a cerca de 13, cerca de 9,5 a cerca de 12,5, cerca de 9,5 a cerca de 12, cerca de 9,5 a cerca de 11,5, cerca de 9,5 a cerca de 11, cerca de 9,5 a cerca de 10,5, cerca de 9,5 a cerca de 10, cerca de 10 a cerca de 14, cerca de 10 a cerca de 13,5, cerca de 10 a cerca de 13, cerca de 10 a cerca de 12,5, cerca de 10 a cerca de 12, cerca de 10 a cerca de 11,5, cerca de 10 a cerca de 11, cerca de 10 a cerca de 10,5, cerca de 10,5 a cerca de 14, cerca de 10,5 a cerca de 13,5, cerca de 10,5 a cerca de 13, cerca de 10,5 a cerca de 12,5, cerca de 10,5 a cerca de 12, cerca de 10,5 a cerca de 11,5, cerca de 10,5 a cerca de 11, cerca de 11 a cerca 14, cerca de 11 a cerca de 13,5, cerca de 11 a cerca de 13, cerca de 11 a cerca de 12,5, cerca de 11 a cerca de 12, cerca de 11 a cerca de 11,5, cerca de 11,5 a cerca de 14, cerca de 11,5 a cerca de 13,5, cerca de 11,5 a cerca de 13, cerca de 11,5 a cerca de 12,5, cerca de 11,5 a cerca de 12, cerca de 12 a cerca de 14, cerca de 12 a cerca de 13,5, cerca de 12 a cerca de 13, cerca de 12 a cerca de 12,5, cerca de 12,5 a cerca de 14, cerca de 12,5 a cerca de 13,5, cerca de 12,5 a cerca de 13, cerca de 13 a cerca de 14, cerca de 13 a cerca de 13,5 ou cerca de 13,5 a cerca de 14.

[00100] Em algumas modalidades, uma base é adicionada em uma quantidade de cerca de 2% a cerca de 10%, cerca de 2% a cerca de 9%, cerca de 2% a cerca de 8%, cerca de 2% a cerca de 7%, cerca de 2% a cerca de 6%, cerca de 3% a cerca de 6%, cerca de 4% a cerca de 6%, cerca de 5% a cerca de 6%, cerca de 2% a cerca de 5%, cerca de 2% a cerca de 4%, cerca de 2% a cerca de 3%, cerca de 3% a cerca de 5%, cerca de 3% a cerca de 4%, ou cerca de 4% a cerca de 5% em peso (ou volume) do caldo celular para aumentar o pH.

[00101] Em algumas modalidades, o pH é reduzido pela adição de um ácido. Em algumas modalidades, o ácido tem um pKa de 1 a 12, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 5, 2 a 12, 2 a 10, 2 a 8, 2 a 6, 2 a 5, 3 a 10, 3 a 6, 3 a 5, 4 a 10, 4 a 8, 4 a 6, 5 a 10 ou 5 a 8. Tal como aqui utilizado, o termo "pKa" refere-se ao logaritmo negativo da constante de associação de base, Ka, do ácido. Ka refere-se à constante de equilíbrio para a ionização do ácido na água.

[00102] Os ácidos incluem, mas não são limitados a sulfúrico; fosfórico; clorídrico; bromídrico; iodídrico; hipocloroso; cloroso; clórico; perclórico; fluorossulfúrico; nítrico; fluoroantimônico; fluorobórico; hexafluorofosfórico; crômico; bórico; acético; cítrico; fórmico; e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o pH é selecionado a partir de cerca de 6,5 ou menos; cerca de 6 ou menos; cerca de 5,5 ou menos; cerca de 5 ou menos; cerca de 4,5 ou menos; cerca de 4 ou menos; cerca de 3,5 ou menos; cerca de 3 ou menos; cerca de 2,5 ou menos; cerca de 2 ou menos; cerca de 1,5 ou menos; cerca de 1 ou menos; e cerca de 0,5 ou menos. Em outras modalidades, o pH é selecionado a partir de cerca de 0,5 a cerca de 6,5; cerca de 0,5 a cerca de 6; cerca de 0,5 a cerca de 5,5; cerca de 0,5 a cerca de 5; cerca de 0,5 a cerca de 4,5; cerca de 0,5 a cerca de 4; cerca de 0,5 a cerca de 3,5; cerca de 0,5 a cerca de 3; cerca de 0,5 a cerca de 2,5; cerca de 0,5 a cerca de 2; cerca de 0,5 a cerca de 1,5; cerca de 0,5 a cerca de 1; cerca de 1 a cerca de 7; cerca de 1 a cerca de 6,5; cerca de 1 a cerca de 6; cerca de 1 a cerca de 5,5; cerca de 1 a cerca de 5; cerca de 1 a cerca de 4,5; cerca de 1 a cerca de

4; cerca de 1 a cerca de 3,5; cerca de 1 a cerca de 3; cerca de 1 a cerca de 2,5; cerca de 1 a cerca de 2; cerca de 1 a cerca de 1,5; cerca de 1,5 a cerca de 7; cerca de 1,5 a cerca de 6,5; cerca de 1,5 a cerca de 6; cerca de 1,5 a cerca de 5,5; cerca de 1,5 a cerca de 5; cerca de 1,5 a cerca de 4,5; cerca de 1,5 a cerca de 4; cerca de 1,5 a cerca de 3,5; cerca de 1,5 a cerca de 3; cerca de 1,5 a cerca de 2,5; cerca de 1,5 a cerca de 2; cerca de 2 a cerca de 7; cerca de 2 a cerca de 6,5; cerca de 2 a cerca de 6; cerca de 2 a cerca de 5,5; cerca de 2 a cerca de 5; cerca de 2 a cerca de 4,5; cerca de 2 a cerca de 4, cerca de 2 a cerca de 3,5; cerca de 2 a cerca de 3; cerca de 2 a cerca de 2,5; cerca de 2,5 a cerca de 7; cerca de 2,5 a cerca de 6,5; cerca de 2,5 a cerca de 6; cerca de 2,5 a cerca de 5,5; cerca de 2,5 a cerca de 5; cerca de 2,5 a cerca de 4,5; cerca de 2,5 a cerca de 4; cerca de 2,5 a cerca de 3,5; cerca de 2,5 a cerca de 3; cerca de 3 a cerca de 7; cerca de 3 a cerca de 6,5; cerca de 3 a cerca de 6; cerca de 3 a cerca de 5,5; cerca de 3 a cerca de 5; cerca de 3 a cerca de 4,5; cerca de 3 a cerca de 4; cerca de 3 a cerca de 3,5; cerca de 3,5 a cerca de 7; cerca de 3,5 a cerca de 6,5; cerca de 3,5 a cerca de 6; cerca de 3,5 a cerca de 5,5; cerca de 3,5 a cerca de 5; cerca de 3,5 a cerca de 4,5; cerca de 3,5 a cerca de 4; cerca de 4 a cerca de 7; cerca de 4 a cerca de 6,5; cerca de 4 a cerca de 6; cerca de 4 a cerca de 5,5; cerca de 4 a cerca de 5; cerca de 4 a cerca de 4,5; cerca de 4,5 a cerca de 7; cerca de 4,5 a cerca de 6,5; cerca de 4,5 a cerca de 6; cerca de 4,5 a cerca de 5,5; cerca de 4,5 a cerca de 5; cerca de 5 a cerca de 7; cerca de 5 a cerca de 6,5; cerca de 5 a cerca de 6; cerca de 5 a cerca de 5,5; cerca de 5,5 a cerca de 7; cerca de 5,5 a cerca de 6,5; cerca de 5,5 a cerca de 6; e cerca de 6 a cerca de 6,5.

[00103] Em algumas modalidades, um ácido é adicionado em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 1%, cerca de 1% a cerca de 2%, cerca de 2% a cerca de 10%, cerca de 2% a cerca de 9%, cerca de 2% a cerca de 8%, cerca de 2% a cerca de 7%, cerca de 2% a cerca de 6%, cerca de 3% a cerca de 6%, cerca de 4% a cerca de 6%, cerca de 5% a cerca de 6%, cerca de 2% a cerca de 5%, cerca de 2% a cerca de 4%, cerca de 2% a cerca de 3%, cerca de 3% a cerca de 5%, cerca de 3% a cerca de 4%, ou cerca de 4% a cerca de 5% em peso (ou volume) do caldo celular para diminuir o pH.

[00104] Em algumas modalidades, o processo compreende colocar em contato uma composição de célula concentrada ou composição de célula lisada com um sal para facilitar a desmulsificação da composição de célula lisada. Tal como aqui utilizado, um "sal" refere-se a um composto iônico formado pela substituição de um íon de hidrogênio de um ácido por um metal (por exemplo, um metal alcalino, um metal alcalino-terroso, um metal de transição e similares) ou um composto carregado positivamente (por exemplo, NH4+ e similares). Sais adequados para uso com a presente invenção incluem, mas não são limitados a sais de metais alcalinos, sais de metais alcalino-terrosos ou similares, e combinações dos mesmos. As espécies iônicas carregadas negativamente presentes em um sal para uso com o presente incluem, mas não são limitadas a halogenetos, sulfato, bissulfato, sulfito, fosfato, hidrogeno fosfato, dihidrogeno fosfato, carbonato, bicarbonato ou similares, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, um sal para uso com a presente invenção é selecionado a partir de: cloreto de sódio, sulfato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de cálcio, sulfato de potássio, sulfato de magnésio, glutamato monossódico, sulfato de amônio, cloreto de potássio, cloreto de ferro, sulfato de ferro, sulfato de alumínio, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, um sal não inclui NaOH. Um sal pode ser adicionado como um sólido (por exemplo, na forma cristalina, amorfa, peletizada e/ou granulada) e/ou como uma solução (por exemplo, uma solução diluída, uma solução saturada ou uma solução supersaturada) contendo, por exemplo, água, um álcool e similares, e combinações dos mesmos.

[00105] Em algumas modalidades, o sal é adicionado em uma quantidade de 5 g/l a 25 g/l, 5 g/l a 10 g/l, 10 g/l a 15 g/l, 15 g/l a 20 g/l, 20 g/l a 25 g/l ou 10 g/l a 20 g/l.

[00106] Em algumas modalidades, a temperatura da composição de células concentradas ou da composição de células lisadas é menor ou igual a 60°C, menor ou igual a 55°C, menor ou igual a 45°C, menor ou igual a 40°C, menor ou igual a 35°C, menor ou igual a 30°C, ou menor ou igual a 25°C quando um sal é adicionado para desmulsificar a composição de células ou a composição de células lisadas. Em algumas modalidades, a temperatura da composição de células lisadas é de 0°C a 60°C, 0°C a 55°C, 0°C a 50°C, 0°C a 45°C, 0°C a 40°C, 0°C a 35°C, 0°C a 30°C, 0°C a 25°C, 20°C a 60°C, 20°C a 55°C, 20°C a 50°C, 20°C a 45°C, 20°C a 40°C, 20°C a 35°C, 20°C a 30°C, 30°C a 60°C, 30°C a 55°C, 30°C a 50°C, 30°C a 45°C, 30°C a 40°C, 30°C a 40°C, 40°C a 60°C, 40°C a 55°C, 40°C a 50°C ou 50°C a 60°C quando um sal é adicionado para desmulsificar a composição de células ou a composição de células lisadas.

[00107] Em algumas modalidades, o processo compreende um ciclo de choque de temperatura antes, durante ou após um ou mais dos ciclos de choque de pH. Um "ciclo de choque de temperatura" refere-se aqui a um ciclo, em que a composição de células ou composição de células lisadas é elevada a uma temperatura de cerca de 80°C, cerca de 85°C, cerca de 90°C, cerca de 95°C ou superior, durante um período de tempo (por exemplo, cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 50 minutos, cerca de uma hora, cerca de 1,5 hora, cerca de 2 horas, cerca de 2,5 horas, cerca de 3 horas ou mais), em seguida, diminuiu para uma temperatura de cerca de 30°C, cerca de 25°C, cerca de 20°C, cerca de 15°C, cerca de 10°C, cerca de 5°C ou cerca de 4°C durante um período de tempo (por exemplo, cerca de 5 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 50 minutos, cerca de uma hora, cerca de 1,5 hora, cerca de 2 horas, cerca de 2,5 horas, cerca de 3 horas ou mais) para facilitar a desmulsificação. Em algumas modalidades, o ciclo de choque de temperatura ocorre antes do ciclo de choque de pH. Em outras modalidades, o ciclo de choque de temperatura ocorre após o ciclo de choque de pH. Em ainda outras modalidades, o ciclo de choque de temperatura ocorre entre dois ou mais dos ciclos de choque de pH.

[00108] Em algumas modalidades, o processo compreende colocar em contato uma composição de células concentradas ou uma composição de células lisadas com 20% ou menos, 15% ou menos, 10% ou menos, 7,5% ou menos, 5% ou menos, ou 2% ou menos de sal em peso, da composição de células lisadas ou da composição de células. Em algumas modalidades, um processo compreende colocar em contato uma composição de células concentradas ou uma composição de células lisadas com 0,1% a 20%, 0,1% a 15%, 0,1% a 10%, 0,5% a 20%, 0,5% a 15%, 0,5% a 10%, 0,5% a 5%, 0,5% a 4%, 0,5% a 3%, 0,5% a 2,5%, 0,5% a 2%, 0,5% a 1,5%, 0,5% a 1%, 1% a 20%, 1% a 15%, 1% a 10%, 1% a 5%, 1% a 4%, 1% a 3%, 1% a 2,5%, 1% a 2%, 1% a 1,5%, 1,5% a 5%, 1,5% a 4%, 1,5% a 3%, 1,5% a 2,5%, 1,5% a 2%, 2% a 20%, 2% a 15%, 2% a 10%, 2% a 5%, 2% a 4%, 2% a 3%, 2% a 2,5%, 2,5% a 5%, 2,5% a 4%, 2,5% a 3%, 3% a 5%, 3% a 4 %, 4% a 5%, 5% a 20%, 5% a 15%, 5% a 10%, 10% a 20%, 10% a 15%, ou 15% a 20% de sal em peso da composição de células concentradas ou composição de células lisadas (por exemplo, peso do caldo total). Por exemplo, quando uma composição de célula lisada pesa 1.000 kg, colocar em contato com 0,5% a 20% de sal em peso, requer a combinação de 5 kg a 200 kg de sal com a composição de célula lisada.

[00109] Em algumas modalidades, o processo compreende o aquecimento de uma composição de células concentradas ou uma composição de células lisadas para desmulsificar a composição de células lisadas. Em algumas modalidades, a composição de células ou a composição de células lisadas é aquecida durante um período de tempo suficiente para uma base e/ou um sal para desmulsificar uma composição de células ou uma composição de células lisadas. Em algumas modalidades, o processo compreende o aquecimento de uma composição de célula ou uma composição de célula lisada durante, pelo menos 5 minutos, pelo menos 10 minutos, pelo menos 20 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 8 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 18 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 30 horas, pelo menos 36 horas, pelo menos 42 horas, pelo menos

48 horas, pelo menos 54 horas, pelo menos 60 horas, pelo menos 66 horas, pelo menos 72 horas, pelo menos 78 horas, pelo menos 84 horas, pelo menos 90 horas ou pelo menos 96 horas. Em algumas modalidades, o processo compreende o aquecimento de uma composição de células lisadas durante 5 minutos a 96 horas, 5 minutos a 4 horas, 5 minutos a 2 horas, 5 minutos a 1 hora, 10 minutos a 4 horas, 10 minutos a 2 horas, 10 minutos a 1 hora, 1 hora a 2 horas, 1 hora a 96 horas, 1 hora a 84 horas, 1 hora a 72 horas, 1 hora a 60 horas, 1 hora a 48 horas, 1 hora a 36 horas, 1 hora a 24 horas, 1 hora a 4 horas, 4 horas a 96 horas, 4 horas a 84 horas, 4 horas a 72 horas, 4 horas a 60 horas, 4 horas a 48 horas, 4 horas a 36 horas, 4 horas a 24 horas, 8 horas a 96 horas, 8 horas a 84 horas, 8 horas a 72 horas, 8 horas a 60 horas, 8 horas a 48 horas, 8 horas a 36 horas, 8 horas a 24 horas, 8 horas a 12 horas, 12 horas a 96 horas, 12 horas a 84 horas, 12 horas a 72 horas, 12 horas a 60 horas, 12 horas a 48 horas, 12 horas a 36 horas, 12 horas a 24 horas, 24 horas a 96 horas, 24 horas a 84 horas, 24 horas a 72 horas, 24 horas a 60 horas, 24 horas a 48 horas, ou 24 horas a 36 horas.

[00110] Em algumas modalidades, uma composição de célula ou uma composição de célula lisada pode ser aquecida a uma temperatura de pelo menos 10°C, pelo menos 20°C, pelo menos 25°C, pelo menos 30°C, pelo menos 35°C, pelo menos 40°C, pelo menos 45°C, pelo menos 50°C, pelo menos 55°C, pelo menos 60°C, pelo menos 65°C, pelo menos 70°C, pelo menos 75°C, pelo menos 80°C, pelo menos 85°C, pelo menos 90°C, pelo menos 95°C ou pelo menos 100°C. Em algumas modalidades, um processo compreende o aquecimento de uma composição de célula ou uma composição de célula lisada a uma temperatura de 10°C a 100°C, 10°C a 90°C, 10°C a 80°C, 10°C a 70°C, 20°C a 100°C, 20°C a 90°C, 20°C a 80°C, 20°C a 70°C, 30°C a 100°C, 30°C a 90°C, 30°C a 80°C, 30°C a 70°C, 40°C a 100°C, 40°C a 90°C, 40°C a 80°C, 50°C a 100°C, 50°C a 90°C, 50°C a 80°C, 50°C a 70°C, 60°C a 100°C, 60°C a 90°C, 60°C a 80°C, 70°C a 100°C, 70°C a 90°C, 80°C a 100°C, 80°C a 90°C ou 90°C a 100°C. Em algumas modalidades, um sal pode ser adicionado à composição de células ou à composição de células lisadas durante o aquecimento. Em várias modalidades, agentes coagulantes tais como sulfato de alumínio e quitosana, podem ser adicionados à composição de células para facilitar a etapa de concentração. Nessas modalidades, a biomassa concentrada se separa na fase pesada, enquanto a fase leve consiste principalmente em material aquoso.

[00111] Em algumas modalidades, uma composição de células ou uma composição de células lisadas pode ser aquecida em um sistema fechado ou em um sistema com um evaporador. Em algumas modalidades, uma composição de célula ou composição de célula lisada pode ser aquecida em um sistema com um evaporador de modo que uma porção da água presente na composição de célula ou a composição de célula lisada seja removida por evaporação. Em algumas modalidades, um processo compreende o aquecimento de uma composição de célula ou uma composição de célula lisada em um sistema com um evaporador para remover até 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou 50% em peso de água presente na composição de células ou composição de células lisadas. Em algumas modalidades, um processo compreende o aquecimento de uma composição de célula ou uma composição de célula lisada em um sistema com um evaporador para remover 1% a 50%, 1% a 45%, 1% a 40%, 1% a 35%, 1% a 30%, 1% a 25%, 1% a 20%, 1% a 15%, 1% a 10%, 1% a 5%, 5% a 50%, 5% a 45%, 5% a 40%, 5% a 35%, 5% a 30%, 5% a 25%, 5% a 20%, 5% a 15%, 5% a 10%, 10% a 50%, 10% a 45%, 10% a 40%, 10% a 35%, 10% a 30%, 10% a 25%, 10% a 20%, 10% a 15%, 15% a 50%, 15% a 45%, 15% a 40%, 15% a 35%, 15% a 30%, 15% a 25%, 15% a 20%, 20% a 50%, 20% a 45%, 20% a 40%, 20% a 35%, 20% a 30%, 20% a 25%, 25% a 50%, 25% a 45%, 25% a 40%, 25% a 35%, 25% a 30%, 30% a 50%, 30% a 45%, 30% a 40%, 30% a 35%, 35% a 50%, 35% a 45%, 35% a 40%, 40% a 50%, 40% a 45% ou 45% a 50%.

[00112] Em algumas modalidades, o processo compreende manter uma composição de células concentradas ou uma composição de células lisadas em um recipiente por um tempo predeterminado para desmulsificar a composição de células lisadas. Em algumas modalidades, o processo compreende manter uma composição de células ou uma composição de células lisadas em um recipiente durante pelo menos 5 minutos, pelo menos 10 minutos, pelo menos 20 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 8 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 18 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 30 horas, pelo menos 36 horas, pelo menos 42 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 54 horas, pelo menos 60 horas, pelo menos 66 horas, pelo menos 72 horas, pelo menos 78 horas, pelo menos 84 horas, pelo menos 90 horas ou pelo menos 96 horas. Em algumas modalidades, o processo compreende manter uma composição de células ou uma composição de células lisadas em cada um dos níveis de pH no ciclo durante 5 minutos a 96 horas, 5 minutos a 4 horas, 5 minutos a 2 horas, 5 minutos a 1 hora, 10 minutos a 4 horas, 10 minutos a 2 horas, 10 minutos a 1 hora, 1 hora a 96 horas, 1 hora a 84 horas, 1 hora a 72 horas, 1 hora a 60 horas, 1 hora a 48 horas, 1 hora a 36 horas, 1 hora a 24 horas, 1 hora a 4 horas, 1 hora a 2 horas, 4 horas a 96 horas, 4 horas a 84 horas, 4 horas a 72 horas, 4 horas a 60 horas, 4 horas a 48 horas, 4 horas a 36 horas, 4 horas a 24 horas, 8 horas a 96 horas, 8 horas a 84 horas, 8 horas a 72 horas, 8 horas a 60 horas, 8 horas a 48 horas, 8 horas a 36 horas, 8 horas a 24 horas, 8 horas a 12 horas, 12 horas a 96 horas, 12 horas a 84 horas, 12 horas a 72 horas, 12 horas a 60 horas, 12 horas a 48 horas, 12 horas a 36 horas, 12 horas a 24 horas, 24 horas a 96 horas, 24 horas a 84 horas, 24 horas a 72 horas, 24 horas a 60 horas, 24 horas a 48 horas ou 24 horas a 36 horas.

[00113] Em algumas modalidades, o processo compreende colocar em contato uma emulsão de células lisadas com um antioxidante, opcionalmente antes e/ou após a pasteurização. Os antioxidantes adequados para uso com a presente invenção incluem, mas não são limitados a um tocoferol, um tocotrienol, um polifenol, resveratrol, um flavonóide, um carotenóide, licopeno, um caroteno, luteína, ácido ascórbico, palmitato de ascorbil ou similares, e combinações dos mesmos.

[00114] Tal como aqui utilizado, os termos "agitar" e "agitação" referem-se a um processo de afetar o movimento em uma composição de células lisadas por meio de uma aplicação de força. Em algumas modalidades, o processo da invenção compreende a agitação de uma composição de células ou uma composição de células lisadas por meio de agitação, mistura, formação de mistura, agitação, vibração ou uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, o processo de agitação de uma composição de célula ou uma composição de célula lisada desmulsifica a composição de célula ou a composição de célula lisada.

[00115] Em algumas modalidades, o processo da invenção compreende a agitação de uma composição de células ou uma composição de células lisadas em 0,1 hp/1.000 gal a 10 hp/1.000 gal (19,7 m-1.kg.s-3 a 1.969,9 m-1.kg.s-3), 0,5 hp/1.000 gal a 8 hp/1.000 gal (98,5 m-1.kg.s-3 a 1.575,9 m-

1.kg.s-3), 1 hp/1.000 gal a 6 hp/1.000 gal (196,9 m-1.kg.s-3 a

1.181,9 m-1.kg.s-3), ou 2 hp/1.000 gal a 5 hp/1.000 gal (393,9 m-1.kg.s-3 a 984,9 m-1.kg.s-3)de composição de células lisadas.

[00116] Em algumas modalidades, o processo da invenção compreende a agitação de uma composição de células ou uma composição de células lisadas usando um agitador. Em algumas modalidades, o agitador é um agitador de estilo de dispersão que dispersa uma base e/ou sal na composição de células ou na composição de células lisadas. Em algumas modalidades, um agitador tem um ou mais impulsores. Tal como aqui utilizado, "impulsor" refere-se a um dispositivo disposto para transmitir movimento a uma composição de células ou uma composição de células lisadas quando girada. Impulsores adequados para uso com a presente invenção incluem impulsores de pás retas, impulsores de pás Rushton, impulsores com fluxo axial, impulsores com fluxo radial, impulsores de disco de pás côncavos, impulsores de alta eficiência, hélices, pás, turbinas ou similares, e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, um processo inclui a agitação de uma composição de células ou uma composição de células lisadas usando um agitador com uma velocidade de ponta do impulsor de 90 pés/min a 1.200 pés/min (27,4 m/min a 365,8 m/min), 200 pés/min a 1.000 pés/min (60,9 m/min a 304,8 m/min), 300 pés/min a 800 pés/min (91,4 m/min a 243,8 m/min), 400 pés/min a 700 pés/min (121,9 m/min a 213,4 m/min) ou 500 pés/min a 600 pés/min (152,4 m/min a 182,9 m/min). Em algumas modalidades, um processo inclui a agitação de uma composição de células ou uma composição de células lisadas usando um agitador com uma velocidade de ponta do impulsor de 350 centímetros/segundo a 900 centímetros por segundo, 350 centímetros/segundo a 850 centímetros por segundo, 350 centímetros/segundo a 800 centímetros/segundo, 350 centímetros/segundo a 750 centímetros/segundo, 350 centímetros/segundo a 700 centímetros/segundo, 350 centímetros/segundo a 650 centímetros/segundo, 350 centímetros/segundo a 600 centímetros/segundo, 350 centímetros/segundo a 550 centímetros/segundo, 350 centímetros/segundo a 500 centímetros/segundo, 350 centímetros/segundo a 450 centímetros/segundo, 350 centímetros/segundo a 400 centímetros/segundo, 400 centímetros/segundo a 900 centímetros por segundo, 400 centímetros/segundo a 850 centímetros por segundo, 400 centímetros/segundo a 800 centímetros/segundo, 400 centímetros/segundo a 750 centímetros/segundo, 400 centímetros/segundo a 700 centímetros/segundo, 400 centímetros/segundo a 650 centímetros/segundo, 400 centímetros/segundo a 600 centímetros/segundo, 400 centímetros/segundo a 550 centímetros/segundo, 400 centímetros/segundo a 500 centímetros/segundo, 400 centímetros/segundo a 450 centímetros/segundo, 450 centímetros/segundo a 900 centímetros por segundo, 450 centímetros/segundo a 850 centímetros por segundo, 450 centímetros/segundo a 800 centímetros/segundo, 450 centímetros/segundo a 750 centímetros/segundo, 450 centímetros/segundo a 700 centímetros/segundo, 450 centímetros/segundo a 650 centímetros/segundo, 450 centímetros/segundo a 600 centímetros/segundo, 450 centímetros/segundo a 550 centímetros/segundo, 450 centímetros/segundo a 500 centímetros/segundo, 500 centímetros/segundo a 900 centímetros por segundo, 500 centímetros/segundo a 850 centímetros por segundo, 500 centímetros/segundo a 800 centímetros/segundo, 500 centímetros/segundo a 750 centímetros/segundo, 500 centímetros/segundo a 700 centímetros/segundo, 500 centímetros/segundo a 650 centímetros/segundo, 500 centímetros/segundo a 600 centímetros/segundo, 500 centímetros/segundo a 550 centímetros/segundo, 550 centímetros/segundo a 900 centímetros por segundo, 550 centímetros/segundo a 850 centímetros por segundo, 550 centímetros/segundo a 800 centímetros/segundo, 550 centímetros/segundo a 750 centímetros/segundo, 550 centímetros/segundo a 700 centímetros/segundo, 550 centímetros/segundo a 650 centímetros/segundo, 550 centímetros/segundo a 600 centímetros/segundo, 600 centímetros/segundo a 900 centímetros por segundo, 600 centímetros/segundo a 850 centímetros por segundo, 600 centímetros/segundo a 800 centímetros/segundo, 600 centímetros/segundo a 750 centímetros/segundo, 600 centímetros/segundo a 700 centímetros/segundo, 600 centímetros/segundo a 650 centímetros/segundo, 650 centímetros/segundo a 900 centímetros por segundo, 650 centímetros/segundo a 850 centímetros por segundo, 650 centímetros/segundo a 800 centímetros/segundo, 650 centímetros/segundo a 750 centímetros/segundo, 650 centímetros/segundo a 700 centímetros/segundo, 700 centímetros/segundo a 900 centímetros por segundo, 700 centímetros/segundo a 850 centímetros por segundo, 700 centímetros/segundo a 800 centímetros/segundo, 700 centímetros/segundo a 750 centímetros/segundo, 750 centímetros/segundo a 900 centímetros por segundo, 750 centímetros/segundo a 850 centímetros por segundo, 750 centímetros/segundo a 800 centímetros/segundo, 800 centímetros/segundo a 900 centímetros por segundo, 800 centímetros/segundo a 850 centímetros por segundo, ou 850 centímetros/segundo a 900 centímetros/segundo. Tal como aqui utilizado, "velocidade de ponta do impulsor" refere-se à velocidade da parte mais externa do impulsor conforme ele gira em torno de seu eixo central.

[00117] Em algumas modalidades, a agitação (e, opcionalmente, etapas adicionais, conforme descritas aqui) é realizada em um contêiner que compreende um impulsor, em que uma relação do diâmetro do impulsor para o volume do contêiner é de 0,1 a 0,5, 0,1 a 0,4, 0,2 a 0,5, 0,2 a 0,4, 0,3 a 0,5 ou 0,3 a 0,4.

[00118] Em algumas modalidades, a agitação (e, opcionalmente etapas adicionais, conforme descritas aqui) é realizada em um contêiner que compreende um impulsor, em que uma relação do diâmetro do impulsor para o diâmetro interno do contêiner é de pelo menos 0,25, pelo menos 0,34, pelo menos 0,65, 0,25 a 0,65, 0,25 a 0,33, 0,3 a 0,6, 0,3 a 0,5, 0,3 a 0,4, 0,34 a 0,65, 0,34 a 0,6, 0,34 a 0,55, 0,37 a 0,55,

0,4 a 0,65, 0,4 a 0,6, 0,4 a 0,5 ou 0,42 a 0,55.

[00119] Em algumas modalidades, a agitação compreende a mistura de uma composição de células ou uma composição de células lisadas de modo que a composição de células ou a composição de células lisadas seja colocada sob condições de fluxo descritas por um número de Reynolds de 10 a 10.000,

1.000 a 10.000, 1.500 a 10.000, ou 2.000 a 10.000. Em algumas modalidades, uma emulsão de células lisadas durante a agitação tem um número de Reynolds de 2.000 ou mais, 3.000 ou mais, ou 5.000 ou mais, ou 2.000 a 10.000, 3.000 a 10.000 ou 5.000 a 10.000.

[00120] Em algumas modalidades, um processo compreende agitar uma composição de células ou uma composição de células lisadas durante pelo menos 5 minutos, pelo menos 10 minutos, pelo menos 20 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 8 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 18 horas, pelo menos 24 horas, pelo menos 30 horas, pelo menos 36 horas, pelo menos 42 horas, pelo menos 48 horas, pelo menos 54 horas, pelo menos 60 horas, pelo menos 66 horas, pelo menos 72 horas, pelo menos 78 horas, pelo menos 84 horas, pelo menos 90 horas ou pelo menos 96 horas. Em algumas modalidades, um processo compreende agitar uma composição de células ou uma composição de células lisadas durante 5 minutos a 96 horas, 5 minutos a 4 horas, 5 minutos a 2 horas, 5 minutos a 1 hora, 10 minutos a 4 horas, 10 minutos a 2 horas, 10 minutos a 1 hora, 1 hora a 96 horas, 1 hora a 84 horas, 1 hora a 72 horas, 1 hora a 60 horas, 1 hora a 48 horas, 1 hora a 36 horas, 1 hora a 24 horas, 1 hora a 4 horas, 4 horas a 96 horas, 4 horas a 84 horas, 4 horas a 72 horas, 4 horas a 60 horas, 4 horas a 48 horas, 4 horas a 36 horas, 4 horas a 24 horas, 8 horas a 96 horas, 8 horas a 84 horas, 8 horas a 72 horas, 8 horas a 60 horas, 8 horas a 48 horas, 8 horas a 36 horas, 8 horas a 24 horas, 8 horas a 12 horas, 12 horas a 96 horas, 12 horas a 84 horas, 12 horas a 72 horas, 12 horas a 60 horas, 12 horas a 48 horas, 12 horas a 36 horas, 12 horas a 24 horas, 20 horas a 40 horas, 24 horas a 96 horas, 24 horas a 84 horas, 24 horas a 72 horas, 24 horas a 60 horas, 24 horas a 48 horas, ou 24 horas a 36 horas.

[00121] Em algumas modalidades, um processo compreende agitar e aquecer simultaneamente uma composição de células concentradas ou uma composição de células lisadas para desmulsificar a composição de células ou a composição de células lisadas. Em algumas modalidades, um processo compreende agitar uma composição de células ou uma composição de células lisadas a uma temperatura de pelo menos 10°C, pelo menos 20°C, pelo menos 25°C, pelo menos 30°C, pelo menos 35°C, pelo menos 40°C, pelo menos 45°C, pelo menos 50°C, pelo menos 55°C, pelo menos 60°C, pelo menos 65°C, pelo menos 70°C, pelo menos 75°C, pelo menos 80°C, pelo menos 85°C, pelo menos 90°C, pelo menos 95°C ou pelo menos 100°C. Em algumas modalidades, um processo compreende agitar uma composição de células ou uma composição de células lisadas a uma temperatura de 10°C a 100°C, 10°C a 90°C, 10°C a 80°C, 10°C a 70°C, 20°C a 100°C, 20°C a 90°C, 20°C a 80°C, 20°C a 70°C, 30°C a 100°C, 30°C a 90°C, 30°C a 80°C, 30°C a 70°C, 40°C a 100°C, 40°C a 90°C, 40°C a 80°C, 50°C a 100°C, 50°C a 90°C, 50°C a 80°C, 50°C a 70°C, 60°C a 100°C, 60°C a 90°C, 60°C a 80°C, 70°C a 100°C, 70°C a 90°C, 80°C a 1000°C, 80°C a 90°C ou 90°C a 100°C.

[00122] Em algumas modalidades, as várias combinações de formação de uma composição de célula lisada, colocando em contato uma composição de célula lisada com uma primeira base ou aumentando o pH de uma composição de célula lisada, colocando em contato uma composição de célula lisada com um sal, aquecendo a composição de célula lisada, e a agitação de uma composição de célula lisada pode ocorrer em um único recipiente. Em algumas modalidades, as várias combinações de formação de uma composição de células, colocando em contato uma composição de células com uma base ou aumento do pH de uma composição de células, colocando em contato uma composição de células com um sal, aquecimento da composição de células e agitação de uma composição de células podem ocorrer em um único recipiente. Em algumas modalidades, o único recipiente inclui um recipiente de fermentação. Em algumas modalidades, o recipiente de fermentação pode ter um volume de pelo menos 20.000 litros, pelo menos 50.000 litros, pelo menos 100.000 litros, pelo menos 120.000 litros, pelo menos 150.000 litros, pelo menos 200.000 litros ou pelo menos

220.000 litros. Em algumas modalidades, o recipiente de fermentação pode ter um volume de 20.000 litros a 220.000 litros, 20.000 litros a 100.000 litros, 20.000 litros a

50.000 litros, 50.000 litros a 220.000 litros, 50.000 litros a 150.000 litros, 50.000 litros a 100.000 litros, 100.000 litros a 220.000 litros, 100.000 litros a 150.000 litros,

100.000 litros a 120.000 litros, 150.000 litros a 220.000 litros, 150.000 litros a 200.000 litros ou 200.000 litros a

220.000 litros.

[00123] Em algumas modalidades, uma quantidade de composição de células ou composição de células lisadas formada em um recipiente pode ser transferida para um ou mais recipientes de agitação. Em algumas modalidades, os recipientes de agitação podem ter um volume de pelo menos

20.000 litros, pelo menos 30.000 litros, pelo menos 40.000 litros ou pelo menos 50.000 litros, pelo menos 100.000 litros, pelo menos 150.000 litros, pelo menos 200.000 litros ou mais. Em algumas modalidades, os recipientes de agitação podem ter um volume de 20.000 litros a 50.000 litros, 20.000 litros a 40.000 litros, 20.000 litros a 30.000 litros, 30.000 litros a 50.000 litros, 30.000 litros a 40.000 litros ou

40.000 litros a 50.000 litros ou superior.

[00124] Em algumas modalidades, os recipientes de agitação podem ter qualquer combinação das seguintes propriedades. Em algumas modalidades, os recipientes de agitação podem ter dois impulsores. Em algumas modalidades, os impulsores são impulsores de lâmina Rushton. Em algumas modalidades, os impulsores são separados uns dos outros por uma distância, pelo menos, igual a um diâmetro do menor impulsor. Em algumas modalidades, os impulsores são de 30 polegadas a 40 polegadas, 33 polegadas a 37 polegadas, 33 polegadas, 34 polegadas, 35 polegadas, 36 polegadas ou 37 polegadas de ponta a ponta. Em algumas modalidades, os recipientes de agitação têm um volume de pelo menos 10.000 litros, pelo menos 20.000 litros, pelo menos 30.000 litros, pelo menos 40.000 litros ou pelo menos 50.000 litros. Em algumas modalidades, os recipientes de agitação têm um diâmetro interno de 90 polegadas a 110 polegadas, 95 polegadas a 105 polegadas, 98 polegadas, 99 polegadas, 100 polegadas, 101 polegadas ou 102 polegadas. Em algumas modalidades, um primeiro impulsor está localizado de 15 polegadas a 20 polegadas, 16 polegadas a 19 polegadas, ou 17 polegadas a 18 polegadas de um fundo do recipiente de agitação e um segundo impulsor está localizado de 60 polegadas a 80 polegadas, 65 polegadas a 75 polegadas, 68 polegadas, 69 polegadas, 70 polegadas, 71 polegadas, 72 polegadas, 73 polegadas, 74 polegadas ou 75 polegadas acima do primeiro impulsor. Em algumas modalidades, uma composição de células lisadas é agitada a pelo menos 50 rpm, pelo menos 60 rpm, ou pelo menos 70 rpm. Em algumas modalidades, uma composição de células lisadas é agitada a 50 rpm a 70 rpm, 50 rpm a 60 rpm, 60 rpm a 70 rpm, 70 rpm a 100 rpm, 100 rpm a 150 rpm, 150 rpm a 200 rpm, 200 rpm a 250 rpm ou superior.

[00125] Em algumas modalidades, a composição da célula, a composição da célula lisada ou o lipídio é colhido de um recipiente por bombeamento da composição da célula, a composição da célula lisada ou o lipídio do recipiente. Em algumas modalidades, a composição de células, a composição de células lisadas ou o lipídio é colhido de um recipiente sem agitar o recipiente. Em algumas modalidades, a composição de células, a composição de células lisadas ou o lipídio é colhido de um recipiente por bombeamento, sem agitação, a composição de células, a composição de células lisadas ou o lipídio do recipiente. Em algumas modalidades, a composição de células, a composição de células lisadas ou o lipídio é colhido de um recipiente sem soprar ar. Em algumas modalidades, a colheita da composição de células, da composição de células lisadas ou do lipídio pelas técnicas descritas acima resulta em um lipídio bruto com um baixo valor de anisidina (por exemplo, 26 ou menos, 25 ou menos, 20 ou menos, 15 ou menos, 10 ou menos, 5 ou menos, 2 ou menos, ou 1 ou menos) e/ou um baixo teor de fósforo (por exemplo, 100 ppm ou menos, 95 ppm ou menos, 90 ppm ou menos, 85 ppm ou menos, 80 ppm ou menos, 75 ppm ou menos, 70 ppm ou menos, 65 ppm ou menos, 60 ppm ou menos, 55 ppm ou menos, 50 ppm ou menos, 45 ppm ou menos, 40 ppm ou menos, 35 ppm ou menos, 30 ppm ou menos, 25 ppm ou menos, 20 ppm ou menos, 15 ppm ou menos, 10 ppm ou menos, 5 ppm ou menos, 4 ppm ou menos, 3 ppm ou menos, 2 ppm ou menos, ou 1 ppm ou menos).

[00126] Em algumas modalidades, a separação compreende a centrifugação de uma composição de célula tratada ou uma composição de célula lisada tratada (por exemplo, a uma temperatura de 30°C a 100°C), pelo que a centrifugação separa um lipídio da composição de célula tratada ou composição de células lisadas tratadas.

[00127] Em algumas modalidades, um processo compreende a centrifugação de uma composição de células tratadas ou uma composição de células lisadas tratadas a uma temperatura de pelo menos 10°C, pelo menos 20°C, pelo menos 25°C, pelo menos 30°C, pelo menos 35°C, pelo menos 40°C, pelo menos 45°C, pelo menos 50°C, pelo menos 55°C, pelo menos 60°C, pelo menos 65°C, pelo menos 70°C, pelo menos 75°C, pelo menos 80°C, pelo menos 85°C, pelo menos 90°C, pelo menos 95°C, ou pelo menos 100°C. Em algumas modalidades, um processo compreende a centrifugação de uma composição de células tratadas ou uma composição de células lisadas tratadas a uma temperatura de 10°C a 100°C, 10°C a 90°C, 10°C a 80°C, 20°C a 100°C, 20°C a 90°C, 20°C a 80°C, 25°C a 100°C, 25°C a 90°C, 25°C a 80°C, 25°C a 75°C, 30°C a 100°C, 30°C a 90°C, 30°C a 80°C, 40°C a 100°C, 40°C a 90°C, 40°C a 80°C, 50°C a 100°C, 50°C a 90°C, 50°C a 80°C, 50°C a 70°C, 60°C a 100°C, 60°C a 90°C, 60°C a

80°C, 60°C a 70°C, 70°C a 100°C ou 70°C a 90°C.

[00128] Em algumas modalidades, a centrifugação é conduzida a uma taxa de alimentação (de uma composição de célula tratada ou uma composição de célula lisada tratada em uma centrífuga) de 1 quilograma por minuto (kg/min) a 500 kg/min, 1 kg/min a 400 kg/min, 1 kg/min a 300 kg/min, 1 kg/min a 200 kg/min, 1 kg/min a 100 kg/min, 1 kg/min a 75 kg/min, 1 kg/min a 50 kg/min, 1 kg/min a 40 kg/min, 1 kg/min a 30 kg/min, 1 kg/min a 25 kg/min, 1 kg/min a 10 kg/min, 10 kg/min a 500 kg/min, 10 kg/min a 400 kg/min, 10 kg/min a 300 kg/min, 10 kg/min a 200 kg/min, 10 kg/min a 100 kg/min, 10 kg/min a 75 kg/min, 10 kg/min a 50 kg/min, 10 kg/min a 40 kg/min, 10 kg/min a 30 kg/min, 20 kg/min a 500 kg/min, 20 kg/min a 400 kg/min, 20 kg/min a 300 kg/min, 20 kg/min a 200 kg/min, 20 kg/min a 100 kg/min, 20 kg/min a 75 kg/min, 20 kg/min a 50 kg/min, 20 kg/min a 40 kg/min, 25 kg/min a 500 kg/min, 25 kg/min a 400 kg/min, 25 kg/min a 300 kg/min, 25 kg/min a 200 kg/min, 25 kg/min a 100 kg/min, 25 kg/min a 75 kg/min, 25 kg/min a 50 kg/min, 30 kg/min a 60 kg/min, 30 kg/min a 50 kg/min, 30 kg/min a 40 kg/min, 50 kg/min a 500 kg/min, 100 kg/min a 500 kg/min ou 200 kg/min a 500 kg/min.

[00129] O tempo total necessário para a separação pode variar dependendo do volume da composição de células tratadas ou da composição de células lisadas tratadas. O tempo total típico para separação (por exemplo, tempo de centrifugação) é de pelo menos 30 segundos, pelo menos 60 segundos, pelo menos 2 minutos, pelo menos 3 minutos, pelo menos 4 minutos, pelo menos 5 minutos, pelo menos 0,1 hora, pelo menos 0,2 hora, pelo menos 0,5 hora, pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 8 horas, pelo menos 10 horas, pelo menos 12 horas, ou 0,1 hora a 24 horas, 0,5 hora a 24 horas, 1 hora a 12 horas, 2 horas a 10 horas ou 4 horas a 8 horas.

[00130] Em algumas modalidades, o processo da invenção compreende a centrifugação de uma composição de células tratadas ou uma composição de células lisadas tratadas a uma força centrífuga de 1.000 g a 25.000 g, 1.000 g a 20.000 g,

1.000 g a 10.000 g, 2.000 g a 25.000 g, 2.000 g a 20.000 g,

2.000 g a 15.000 g, 3.000 g a 25.000 g, 3.000 g a 20.000 g,

5.000 g a 25.000 g, 5.000 g a 20.000 g, 5.000 g a 15.000 g,

5.000 g a 10.000 g, 5.000 g a 8.000 g, 10.000 g a 25.000 g,

15.000 g a 25.000 g, ou pelo menos 1.000 g, pelo menos 2.000 g, pelo menos 4.000 g, pelo menos 5.000 g, pelo menos 7.000 g, pelo menos 8.000 g, pelo menos 10.000 g, pelo menos 15.000 g, pelo menos 20.000 g, ou pelo menos 25.000 g. Tal como aqui utilizado, "g" refere-se à gravidade padrão ou aproximadamente 9,8 m/s2. Em algumas modalidades, um processo da invenção compreende a centrifugação de uma composição de células tratadas ou uma composição de células lisadas tratadas de 4.000 rpm a 14.000 rpm, 4.000 rpm a 10.000 rpm,

6.000 rpm a 14.000 rpm, 6.000 rpm a 12.000 rpm, 8.000 rpm a

14.000 rpm, 8.000 rpm a 12.000 rpm, ou 8.000 rpm a 10.000 rpm.

[00131] Em algumas modalidades, um processo da invenção compreende a secagem de um lipídio após a separação do lipídio de uma composição de células tratadas ou uma composição de células lisadas tratadas, a fim de remover a água do lipídio. Em algumas modalidades, a secagem do lipídio pode incluir, mas não está limitada a aquecimento do lipídio para evaporar a água. Em algumas modalidades, após a secagem,

o lipídio tem um teor de água por porcentagem em peso de lipídio que é inferior a 3%, inferior a 2,5%, inferior a 2%, inferior a 1,5%, inferior a 1%, inferior a 0,5%, inferior a 0,1% ou 0%. Em algumas modalidades, após a secagem, o lipídio tem um teor de água por porcentagem em peso de lipídio de 0% a 3%, 0% a 2,5%, 0% a 2%, 0% a 1,5%, 0% a 1%, 0% a 0,5%, 0,1% a 3%, 0,1% a 2,5%, 0,1% a 2%, 0,1% a 1,5%, 0,1% a 1%, 0,1% a 0,5%, 0,5% a 3%, 0,5% a 2,5%, 0,5% a 2%, 0,5% a 1,5%, 0,5% a 1%, 1% a 3%, 1% a 2,5%, 1% a 2%, 1% a 1,5%, 1,5% a 3%, 1,5% a 2,5%, 1,5% a 2%, 2% a 3%, 2% a 2,5% ou 2,5% a 3%.

[00132] Em algumas modalidades, o processo compreende ainda a refinação de um lipídio por um ou mais processos selecionados a partir de refinação cáustica, desgomagem, refinação alcalina, branqueamento, desodorização, desacidificação ou similares, e combinações dos mesmos para remover um ou mais fosfolipídios, ácidos graxos livres, fosfatídeos, corpos coloridos, esteróis, odores e outras impurezas. Tal como aqui utilizado, um "óleo refinado" é um lipídio bruto ou óleo bruto que foi refinado. Em algumas modalidades, os processos da presente invenção melhoram o rendimento de um óleo RBD (refinado, branqueado, desodorizado) ou RBDW (refinado, branqueado, desodorizado e de inverno) gerado a partir dos lipídios extraídos usando a presente invenção. Em várias modalidades, o rendimento é melhorado em uma ou mais das etapas de refinação, branqueamento, desodorização ou de inverno no refinamento.

[00133] Tal como aqui utilizado, "um lipídio bruto" ou "um óleo bruto" é um lipídio ou óleo que não foi refinado. Em algumas modalidades, o lipídio separado de uma composição de células desmulsificadas é um lipídio bruto.

[00134] Vários processos exemplares da presente invenção são descritos esquematicamente na FIG. 1.

[00135] Em algumas modalidades, um caldo que compreende uma célula microbiana é concentrado para fornecer uma concentração de lipídios de pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, ou pelo menos 30% em peso do caldo. Em algumas modalidades, um caldo que compreende uma célula microbiana é concentrado para fornecer uma concentração de lipídios de 4% a 40%, 4% a 30%, 4% a 20%, 4% a 15%, 5% a 40%, 5% a 30%, 5% a 20%, 10% a 40%, 10% a 30%, 10% a 20%, 15% a 40%, 15% a 30%, 20% a 40%, 20% a 30%, 25% a 40% ou 30% a 40% em peso do caldo.

[00136] Em algumas modalidades, uma composição de células ou uma composição de células lisadas é concentrada para fornecer uma concentração de lipídios de pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55% ou pelo menos 60% em peso da composição de células lisadas. Em algumas modalidades, uma composição de células ou uma composição de células lisadas é concentrada para fornecer uma concentração de lipídios de 4% a 40%, 4% a 30%, 4% a 20%, 4% a 15%, 5% a 40%, 5% a 30%, 5% a 20%, 10% a 40%, 10% a 30%, 10% a 20%, 15% a 40%, 15% a 30%, 20% a 40%, 20% a 30%, 25% a 40% ou 30% a 40% em peso da composição de células lisadas.

[00137] Em algumas modalidades, um lipídio preparado por um processo da presente invenção tem uma intensidade de aroma geral de 2 ou menos. Tal como aqui utilizado, o termo

"intensidade de aroma geral " refere-se à avaliação sensorial olfativa atribuída ao lipídio por um painel de analistas sensoriais. Tal como aqui utilizado, o termo "analista sensorial" refere-se a um indivíduo treinado que fornece feedback e/ou classifica as características sensoriais de uma substância.

[00138] Em algumas modalidades, um lipídio preparado por um processo da presente invenção tem uma intensidade aromática geral de 3 ou menos. Tal como aqui utilizado, o termo "intensidade aromática geral" refere-se à avaliação sensorial gustativa, ou de sabor, atribuída ao lipídio por um painel de analistas sensoriais. Em algumas modalidades, o método de análise descritiva de Espectro Universal é usado para avaliar o aroma e as características aromáticas das amostras. Este método usa uma escala de intensidade de 0 - 15, onde 0 = nenhum detectado e 15 = intensidade muito alta, para medir o aroma e os atributos aromáticos dos óleos.

[00139] Em algumas modalidades, um lipídio preparado por um processo da presente invenção não tem um gosto residual caracterizado como de peixe. Tal como aqui utilizado, o termo "gosto residual" refere-se à persistência de uma sensação de sabor no lipídio, conforme caracterizado por um painel de analistas sensoriais.

[00140] Em algumas modalidades, o processo da presente invenção fornece um lipídio bruto com um valor de peróxido (PV) de 5 ou menos, 4,5 ou menos, 4 ou menos, 3,5 ou menos, 3 ou menos, 2,5 ou menos, 2 ou menos, 1,5 ou menos, 1 ou menos, 0,5 ou menos, 0,2 ou menos, ou 0,1 ou menos. Tal como aqui utilizado, o termo "valor de peróxido" ou "PV" refere- se à medida dos produtos de reação primários, tais como peróxidos e hidroperóxido que ocorrem durante a oxidação do lipídio. Em algumas modalidades, o PV é um indicador da qualidade do lipídio e a extensão da oxidação que ocorreu no lipídio com um PV baixo (ou seja, 5 ou menos) demonstra maior estabilidade e perfis sensoriais do que os lipídios com PV maior que 5. Em algumas modalidades, a adição de uma base a uma composição de células lisadas, como discutido acima, aumenta o pH da composição de células lisadas e inibe a oxidação de lipídios, minimizando assim o número de radicais livres na composição de células lisadas de modo que o lipídio bruto obtido dos processos da invenção tem um PV baixo (isto é, 5 ou menos).

[00141] Em algumas modalidades, o processo da presente invenção fornece um lipídio bruto com um valor de anisidina (AV) de 26 ou menos, 25 ou menos, 20 ou menos, 15 ou menos, 10 ou menos, 5 ou menos, 2 ou menos, ou 1 ou menos. Tal como aqui utilizado, o termo "valor de anisidina" ou "AV" refere- se à medida dos produtos de reação secundários, tais como aldeídos e cetonas que ocorrem durante a oxidação do lipídio. Em algumas modalidades, o AV é um indicador da qualidade do lipídio e da extensão da oxidação que ocorreu no lipídio. Um lipídio com um AV baixo (ou seja, 26 ou menos) demonstra maior estabilidade e perfis sensoriais do que os lipídios com um AV maior que 26. Em algumas modalidades, a adição de uma base a uma composição de células lisadas, como discutido acima, aumenta o pH da composição de células lisadas e inibe a oxidação de lipídios, minimizando assim o número de radicais livres na composição de células lisadas de modo que o lipídio bruto obtido a partir dos processos da invenção tenha um AV baixo (isto é, 26 ou menos).

[00142] Em algumas modalidades, o processo da presente invenção fornece um lipídio bruto com um teor de fósforo de 100 ppm ou menos, 95 ppm ou menos, 90 ppm ou menos, 85 ppm ou menos, 80 ppm ou menos, 75 ppm ou menos, 70 ppm ou menos, 65 ppm ou menos, 60 ppm ou menos, 55 ppm ou menos, 50 ppm ou menos, 45 ppm ou menos, 40 ppm ou menos, 35 ppm ou menos, 30 ppm ou menos, 25 ppm ou menos, 20 ppm ou menos, 15 ppm ou menos, 10 ppm ou menos, 5 ppm ou menos, 4 ppm ou menos, 3 ppm ou menos, 2 ppm ou menos, ou 1 ppm ou menos.

[00143] Em algumas modalidades, o processo da presente invenção fornece um lipídio bruto que tem um valor de anisidina inferior, valor de peróxido inferior, teor de fósforo inferior e/ou um rendimento de extração mais alto do que se a extração fosse realizada usando um solvente (por exemplo, extração de hexano atípica ou um processo FRIOLEX® (Westfalia Separator AG, Alemanha)). O processo FRIOLEX® que é um processo de extração de lipídios com um solvente orgânico solúvel em água, conforme descrito na Patente U.S. No. 5.928.696 e nas Publicações Internacionais de documentos de Números WO 01/76385 e WO 01/76715, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[00144] Em algumas modalidades, o aquecimento da composição de células lisadas faz com que os produtos de reação secundários (por exemplo, aldeídos e cetonas) participem de uma reação similar à reação de Maillard com proteínas presentes na composição de células lisadas. Acredita-se que a reação crie produtos que possuem atividade antioxidante, o que reduz a oxidação do lipídio. Em algumas modalidades, proteína adicional, por exemplo, proteína de soja, pode ser adicionada à composição de células lisadas para aumentar a atividade antioxidante. A redução na oxidação do lipídio reduz o AV do lipídio, reduz qualquer gosto residual do lipídio e/ou aumenta a estabilidade do lipídio. Em algumas modalidades, a estabilidade é aumentada em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20%.

[00145] Em algumas modalidades, um lipídio extraído por um processo da presente invenção, a biomassa remanescente após a extração do lipídio, ou combinações dos mesmos podem ser usados diretamente como um alimento ou ingrediente alimentar, tal como um ingrediente na comida para bebês, fórmula infantil, bebidas, molhos, alimentos à base de laticínios (tais como leite, iogurte, queijo e sorvete), óleos (por exemplo, óleos de cozinha ou molhos para salada) e produtos assados; suplementos nutricionais (por exemplo, em formas de cápsulas ou comprimidos); alimento ou suplemento alimentar para qualquer animal não humano (por exemplo, aqueles cujos produtos (por exemplo, carne, leite ou ovos) são consumidos por seres humanos); suplemento alimentar; e produtos farmacêuticos (em aplicação de terapia direta ou adjuvante); e em biocombustíveis. O termo "animal" refere- se a qualquer organismo pertencente ao reino Animalia e inclui qualquer animal humano e animal não humano a partir do qual produtos (por exemplo, leite, ovos, carne de aves, boi, porco ou cordeiro) são derivados. Em algumas modalidades, o lipídio e/ou biomassa podem ser usados em frutos do mar. Frutos do mar são derivados, sem limitação, de peixe, camarão e marisco. O termo "produtos" inclui qualquer produto derivado de tais animais, incluindo, sem limitação, carne, ovos, leite ou outros produtos. Quando o lipídio e/ou biomassa são fornecidos a tais animais, os lipídios poli-insaturados podem ser incorporados na carne, leite, ovos ou outros produtos de tais animais para aumentar o seu teor nestes lipídios. Composições Lipídicas

[00146] Em algumas modalidades, a presente invenção é direcionada a um lipídio microbiano extraído de acordo com os processos da presente invenção. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano tem um valor de anisidina de 26 ou menos, 25 ou menos, 20 ou menos, 15 ou menos, 10 ou menos, 5 ou menos, 2 ou menos, ou 1 ou menos, e/ou um valor de peróxido de 5 ou menos, 4,5 ou menos, 4 ou menos, 3,5 ou menos, 3 ou menos, 2,5 ou menos, 2 ou menos, 1,5 ou menos, 1 ou menos, 0,5 ou menos, 0,2 ou menos, ou 0,1 ou menos, e/ou um teor de fósforo de 100 ppm ou menos, 95 ppm ou menos, 90 ppm ou menos, 85 ppm ou menos, 80 ppm ou menos, 75 ppm ou menos, 70 ppm ou menos, 65 ppm ou menos, 60 ppm ou menos, 55 ppm ou menos, 50 ppm ou menos, 45 ppm ou menos, 40 ppm ou menos, 35 ppm ou menos, 30 ppm ou menos, 25 ppm ou menos, 20 ppm ou menos, 15 ppm ou menos, 10 ppm ou menos, 5 ppm ou menos, 4 ppm ou menos, 3 ppm ou menos, 2 ppm ou menos, ou 1 ppm ou menos. Em algumas modalidades, o lipídio tem menos de 5%, menos de 4%, menos de 3%, menos de 2% ou menos de 1% em peso ou volume de um solvente orgânico. Em algumas modalidades, o lipídio tem pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45% ou pelo menos 50% em peso de um PUFA desejado. Em algumas modalidades, o lipídio tem pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, ou pelo menos 50% em peso de DHA, e/ou pelo menos 10%, pelo menos 15%, ou pelo menos 20% em peso de DPA n-6, e/ou pelo menos 10%, pelo menos 15%, ou pelo menos 20% em peso de EPA, e/ou pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, ou pelo menos 50% em peso de ARA. Em algumas modalidades, o lipídio extraído de acordo com os processos da presente invenção resulta em um menor valor de anisidina, menor valor de peróxido, menor teor de fósforo e/ou um maior rendimento de extração do que se a extração fosse realizada usando um solvente (por exemplo, uma extração de hexano típica ou um processo FRIOLEX® (Westfalia Separator AG, Alemanha)).

[00147] Um lipídio microbiano da invenção pode ser qualquer lipídio derivado de um microrganismo, incluindo, por exemplo: um óleo bruto extraído da biomassa do microrganismo sem processamento posterior; um óleo refinado que é obtido pelo tratamento de um óleo microbiano bruto com outras etapas de processamento, tais como refinação, branqueamento e/ou desodorização; um óleo microbiano diluído obtido por diluição de um óleo microbiano bruto ou refinado; ou um óleo enriquecido que é obtido, por exemplo, tratando um óleo microbiano bruto ou refinado com outros métodos de purificação para aumentar a concentração de um ácido graxo (tal como, DHA) no óleo.

[00148] Em algumas modalidades, o lipídio microbiano compreende uma fração de ésteres de esterol de 0%, pelo menos 0,1%, pelo menos 0,2%, pelo menos 0,5%, pelo menos cerca de 1%, pelo menos 1,5%, pelo menos 2%, ou pelo menos 5% em peso. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano compreende uma fração de ésteres de esterol de 0% a 1,5%, 0% a 2%, 0% a 5%,

1% a 1,5%, 0,2% a 1,5%, 0,2% a 2%, ou 0,2% a 5% em peso. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano compreende uma fração de ésteres de esterol inferior a 5%, inferior a 4%, inferior a 3% ou inferior a 2% em peso.

[00149] Em algumas modalidades, o lipídio microbiano compreende uma fração de triglicerídeos de pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% ou pelo menos 90% em peso. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano compreende uma fração de triglicerídeos de 65% a 95%, 75% a 95%, ou 80% a 95% em peso, ou 97% em peso ou 98% em peso.

[00150] Em algumas modalidades, o lipídio microbiano compreende uma fração de ácido graxo livre (FFA) de pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 1,5%, pelo menos 2%, pelo menos 2,5% ou pelo menos 5% em peso. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano compreende uma fração de ácido graxo livre de 0,5% a 5%, 0,5% a 2,5%, 0,5% a 2%, 0,5% a 1,5%, 0,5% a 1%, 1% a 2,5%, 1% a 5%, 1,5% a 2,5%, 2% a 2,5%, ou 2% a 5% em peso. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano compreende uma fração de ácido graxo livre inferior a 5%, inferior a 4%, inferior a 3%, inferior a 2%, ou inferior a 1% em peso.

[00151] Em algumas modalidades, o lipídio microbiano compreende uma fração de esterol de pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 1,5%, pelo menos 2%, ou pelo menos 5% em peso. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano compreende uma fração de esterol de 0,5% a 1,5%, 1% a 1,5%, 0,5% a 2%, 0,5% a 5%, 1% a 2% ou 1% a 5% em peso. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano compreende uma fração de esterol inferior a 5%, inferior a 4%, inferior a 3%, inferior a 2% ou inferior a 1% em peso.

[00152] Em algumas modalidades, o lipídio microbiano compreende uma fração de diglicerídeo de pelo menos 1,5%, pelo menos 2%, pelo menos 2,5%, pelo menos 3%, pelo menos 3,5% ou pelo menos 5% em peso. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano compreende uma fração de diglicerídeo de 1,5% a 3%, 2% a 3%, 1,5% a 3,5%, 1,5% a 5%, 2,5% a 3%, 2,5% a 3,5%, ou 2,5% a 5% em peso.

[00153] Em algumas modalidades, o lipídio microbiano compreende insaponificáveis inferior a 2%, inferior a 1,5%, inferior a 1% ou inferior a 0,5% em peso do óleo.

[00154] As classes de lipídios presentes no óleo microbiano, tal como a fração de triglicerídeos, podem ser separadas por cromatografia flash e analisadas por cromatografia em camada fina (TLC), ou separadas e analisadas por outros métodos conhecidos na técnica.

[00155] Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de triglicerídeos, a fração de ácidos graxos livres, a fração de esterol, a fração de diglicerídeos e combinações dos mesmos compreendem pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75% ou pelo menos 80% em peso de DHA. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de triglicerídeo, a fração de ácido graxo livre, a fração de esterol, a fração de diglicerídeo e combinações dos mesmos compreendem de 40% a 45%, 40% a 50%, 40% a 60%, 50% a 60%, 55% a 60%, 40% a 65%, 50% a 65%, 55% a 65%, 40% a 70%, 40% a 80%, 50% a 80%, 55% a 80%, 60% a 80% ou 70% a 80% em peso de DHA.

Em algumas modalidades, o lipídio microbiano compreende uma fração de ésteres de esterol compreendendo 45% ou menos, 40% ou menos, 35% ou menos, 30% ou menos, 25% ou menos, 20% ou menos, 15% ou menos, ou 13% ou menos em peso de DHA.

Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de triglicerídeo, a fração de ácido graxo livre, a fração de esterol, a fração de diglicerídeo e combinações dos mesmos compreendem 10% ou menos, 9% ou menos, 8% ou menos, 7% ou menos, 6% ou menos, 5% ou menos, 4% ou menos, 3% ou menos, 2% ou menos, ou 1% ou menos em peso de EPA.

Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de triglicerídeos, a fração de ácidos graxos livres, a fração de esterol, a fração de diglicerídeos e combinações dos mesmos compreendem de 2% a 3%, 2% a 3,5%, 2,5% a 3,5%, 2% a 6%, 2,5% a 6%, 3,0% a 6%, 3,5% a 6%, 5% a 6% ou 2% a 10% em peso de EPA.

Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de ésteres de esterol, a fração de triglicerídeo, a fração de ácido graxo livre, a fração de esterol, a fração de diglicerídeo, a fração polar (incluindo a fração de fosfolipídio), e combinações dos mesmos são substancialmente livres de EPA.

Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de ésteres de esterol, a fração de triglicerídeo, a fração de ácido graxo livre, a fração de esterol, a fração de diglicerídeo, a fração polar (incluindo a fração de fosfolipídio), e combinações dos mesmos compreendem uma relação em peso de DHA para EPA de pelo menos 5:1, pelo menos

7:1, pelo menos 9:1, pelo menos 10:1, pelo menos 15:1, pelo menos 20:1, pelo menos 25:1, pelo menos 30:1, ou pelo menos 50:1, em que o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos compreendem 10% ou menos em peso de EPA.

Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de ésteres de esterol, a fração de triglicerídeo, a fração de ácido graxo livre, a fração de esterol, a fração de diglicerídeo, a fração polar (incluindo a fração de fosfolipídio), e combinações dos mesmos compreendem uma relação em peso de DHA para EPA de pelo menos 5:1, mas inferior a 20:1. Em algumas modalidades, a relação em peso de DHA para EPA é de 5:1 a 18:1, de 7:1 a 16:1 ou de 10:1 a 15:1. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de ésteres de esterol, a fração de triglicerídeo, a fração de ácido graxo livre, a fração de esterol, a fração de diglicerídeo, a fração polar (incluindo a fração de fosfolipídio), e combinações dos mesmos compreendem de 0,1% a 0,25%, 0,2% a 0,25%, 0,1% a 0,5% ou 0,1% a 1,5% em peso de ARA.

Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de ésteres de esterol, a fração de triglicerídeo, a fração de ácido graxo livre, a fração de esterol, a fração de diglicerídeo, a fração polar (incluindo a fração de fosfolipídio), e combinações dos mesmos compreendem 1,5% ou menos, 1% ou menos, 0,5% ou menos, 0,2% ou menos, ou 0,1% ou menos em peso de ARA.

Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de ésteres de esterol, a fração de triglicerídeo, a fração de ácido graxo livre, a fração de esterol, a fração de diglicerídeo, a fração polar (incluindo a fração de fosfolipídio), e combinações dos mesmos são substancialmente livres de ARA.

Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de ésteres de esterol, a fração de triglicerídeo, a fração de ácido graxo livre, a fração de diglicerídeo, a fração polar (incluindo a fração de fosfolipídio) e combinações dos mesmos compreendem uma relação em peso de DHA para ARA de pelo menos 20:1, pelo menos 30:1, pelo menos 35:1, pelo menos 40:1, pelo menos 60:1, pelo menos 80:1, pelo menos 100:1, pelo menos 150:1, pelo menos 200:1, pelo menos 250:1, ou pelo menos 300:1. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de ésteres de esterol, a fração de triglicerídeo, a fração de ácido graxo livre, a fração de esterol, a fração de diglicerídeo, a fração polar (incluindo a fração de fosfolipídio) e combinações dos mesmos compreendem de 0,5% a 1%, 0,5% a 2%, 0,5% a 2,5%, 0,5% a 3%, 0,5% a 3,5%, 0,5% a 5%, 0,5% a 6%, 1% a 2%, 2% a 3%, 2% a 3,5%, 1% a 2,5%, 1% a 3%, 1% a 3,5%, 1% a 5%, ou 1% a 6% em peso de DP A n-6. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de ésteres de esterol, a fração de triglicerídeo, a fração de ácido graxo livre, a fração de esterol, a fração de diglicerídeo, a fração polar (incluindo a fração de fosfolipídio), e combinações dos mesmos compreendem 6% ou menos, 5% ou menos, 3% ou menos, 2,5% ou menos, 2% ou menos, 1% ou menos, ou 0,5% ou menos em peso de DPA n-6. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de ésteres de esterol, a fração de triglicerídeo, a fração de ácido graxo livre, a fração de esterol, a fração de diglicerídeo, a fração polar (incluindo a fração de fosfolipídio), e combinações dos mesmos são substancialmente livres de DPA n-6. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de ésteres de esterol, a fração de triglicerídeo, a fração de ácido graxo livre, a fração de esterol, a fração de diglicerídeo, a fração polar (incluindo a fração de fosfolipídio), e combinações dos mesmos compreendem uma relação em peso de DHA para DPA n-6 maior do que 6:1, pelo menos 8:1, pelo menos 10:1, pelo menos 15:1, pelo menos 20:1, pelo menos 25:1, pelo menos 50:1, ou pelo menos 100:1. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de ésteres de esterol, a fração de triglicerídeos, a fração de ácido graxo livre, a fração de esterol, a fração de diglicerídeo, a fração polar (incluindo a fração de fosfolipídio) e combinações dos mesmos compreendem 5% ou menos, 4% ou menos, 3% ou menos, 2% ou menos, 1,5% ou menos, 1% ou menos, ou 0,5% ou menos em peso de cada ácido linoleico (18:2 n-6), ácido linolênico (18:3 n-3), ácido eicosaenóico (20:1 n-9) e ácido erúcico (22:1 n-9). Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos selecionados a partir da fração de ésteres de esterol, a fração de triglicerídeo, a fração de ácido graxo livre, a fração de esterol, a fração de diglicerídeo, a fração polar (incluindo a fração de fosfolipídio), e combinações dos mesmos compreendem 5% ou menos, 4% ou menos,

3% ou menos, 2% ou menos, 1,5% ou menos, ou 1% ou menos em peso de ácido heptadecanóico (17:0). Em algumas modalidades, o lipídio microbiano e/ou uma ou mais frações dos mesmos compreendem 0,01% a 5% em peso, 0,05% a 3% em peso ou 0,1% a 1% em peso de ácido heptadecanóico.

[00156] Em algumas modalidades, um lipídio microbiano extraído compreende uma fração de triglicerídeo de pelo menos 70% em peso, em que o teor de ácido docosahexaenóico da fração de triglicerídeo é de pelo menos 50% em peso, em que o teor de ácido docosapentaenóico n-6 da fração de triglicerídeos é de pelo menos 0,5% em peso a 6% em peso, e em que o óleo tem um valor de anisidina de 26 ou menos. Em algumas modalidades, um lipídio microbiano extraído compreende uma fração de triglicerídeo de pelo menos 70% em peso, em que o teor de ácido docosahexaenóico da fração de triglicerídeo é de pelo menos 40% em peso, em que o teor de ácido docosapentaenóico n-6 da fração de triglicerídeo é de pelo menos 0,5% em peso a 6% em peso, em que a relação de ácido docosahexaenóico para ácido docosapentaenóico n-6 é maior do que 6:1, e em que o lipídio tem um valor de anisidina de 26 ou menos. Em algumas modalidades, um lipídio microbiano extraído compreende uma fração de triglicerídeo de pelo menos 70% em peso, em que o teor de ácido docosahexaenóico da fração de triglicerídeo é de pelo menos 60% em peso e em que o lipídio tem um valor de anisidina de 26 ou menos. Em algumas modalidades, um lipídio microbiano extraído com qualquer um dos perfis de ácidos graxos acima tem um valor de anisidina de 26 ou menos, 25 ou menos, 20 ou menos, 15 ou menos, 10 ou menos, 5 ou menos, 2 ou menos, ou 1 ou menos e/ou um valor de peróxido de 5 ou menos, 4,5 ou menos, 4 ou menos, 3,5 ou menos, 3 ou menos, 2,5 ou menos, 2 ou menos, 1,5 ou menos, 1 ou menos, 0,5 ou menos, 0,2 ou menos, ou 0,1 ou menos, e/ou um teor de fósforo de 100 ppm ou menos, 95 ppm ou menos, 90 ppm ou menos, 85 ppm ou menos, 80 ppm ou menos, 75 ppm ou menos, 70 ppm ou menos, 65 ppm ou menos, 60 ppm ou menos, 55 ppm ou menos, 50 ppm ou menos, 45 ppm ou menos, 40 ppm ou menos, 35 ppm ou menos, 30 ppm ou menos, 25 ppm ou menos, 20 ppm ou menos, 15 ppm ou menos, 10 ppm ou menos, 5 ppm ou menos, 4 ppm ou menos, 3 ppm ou menos, 2 ppm ou menos, ou 1 ppm ou menos. Em algumas modalidades, um lipídio microbiano extraído com qualquer um dos perfis de ácidos graxos acima é extraído de um microrganismo thraustochytrid isolado com as características das espécies de thraustochytrid depositadas sob o Nº de Acesso ATCC PTA- 9695, PTA-9696, PTA-9697 ou PTA-9698. Em algumas modalidades, um lipídio microbiano extraído com qualquer um dos perfis de ácidos graxos acima é um lipídio bruto. Em algumas modalidades, o lipídio bruto tem menos de 5% em peso ou volume de um solvente orgânico. Em algumas modalidades, o lipídio microbiano extraído de acordo com os processos da presente invenção resulta em um menor valor de anisidina, menor valor de peróxido, menor teor de fósforo e/ou maior rendimento de extração se a extração foi realizada usando um solvente (por exemplo, extração de hexano atípica ou um processo FRIOLEX® (Westfalia Separator AG, Alemanha)).

[00157] Tendo geralmente descrito a invenção, um entendimento adicional pode ser obtido por referência aos exemplos aqui fornecidos. Esses exemplos são fornecidos apenas para fins ilustrativos e não têm a intenção de ser limitantes. Os exemplos seguintes são ilustrativos, mas não limitativos, de um processo e de um lipídio preparados por um processo da presente invenção. Outras modificações e adaptações adequadas da variedade de condições e parâmetros normalmente encontrados na extração de um lipídio de uma célula, e que se tornariam evidentes para os técnicos no assunto, e estão dentro do espírito e escopo da invenção.

EXEMPLOS EXPERIMENTAIS Exemplo 1. Concentração de biomassa em escala de laboratório

[00158] Três amostras de 445 g de um caldo de fermentação pasteurizado contendo células microbianas de Schizochytrium foram aquecidas a 90°C e o pH ajustado a 10,2 com 50% de hidróxido de sódio em três reatores de vidro de 0,5 L. O tratamento de temperatura e pH continuou durante 1,5 hora e, em seguida, a temperatura foi diminuída para 60°C e o pH ajustado para 8,0 com 25% de solução de ácido sulfúrico. Cloreto de sódio (2,9 g) foi adicionado ao terceiro reator para determinar se a separação foi aperfeiçoada. Amostras de quinze ml de cada reator e amostras de 15 ml de caldo não tratado (controle) foram centrifugadas a 8.000 rpm durante 3 minutos e a separação de biomassa comparada. O resultado mostrou que houve má separação para o controle e os outros três experimentos tiveram cerca de 36% em volume de biomassa mais a fase aquosa claramente separados na parte superior do caldo. Exemplo 2. Concentração de biomassa em ensaio piloto e desmulsificação de laboratório

[00159] 1.536 kg de caldo de fermentação pasteurizado contendo Schizochytrium foram aquecidos a 9°C e o pH ajustado a 10,5 com 50% de solução de hidróxido de sódio. Após 1 hora,

o pH desviou para 8,4 e foi posteriormente reajustado para 9,0. Após 1 hora adicional, a temperatura foi diminuída para 8°C e o pH ajustado para 8,4 com 75% de ácido fosfórico. O caldo tratado foi centrifugado a ~ 7.000 x g e o caldo foi separado em três fases: a fase leve consistindo principalmente na biomassa (principalmente células microbianas, com algum meio de fermentação), a fase pesada consistindo principalmente em meio de fermentação (água, sais, açúcar e algumas células microbianas residuais) e uma terceira fase com composição similar à fase pesada. Da centrífuga coletou-se uma quantidade de 146,7 kg da fase leve (biomassa concentrada) com 33,4% de umidade, 1.381 kg da fase pesada com 88,6% de umidade e 5,01 kg de uma terceira fase com 84,64 kg de umidade. Amostras da fase leve foram desmulsificadas com enzima e sem enzima. Experimento A (lise com enzima)

[00160] Uma quantidade de 338,7 g de biomassa concentrada (fase leve) do ensaio piloto foi aquecida a 66°C e o pH foi ajustado de 8,3 a 7,55 por 50% de solução de ácido cítrico sob agitação. 37 mg de Alcalase® 2.4 FG (disponível a partir de Novozymes (Franklinton, N.C.)) foram adicionados e a lise continuou durante 2 horas. Ao fim de duas horas, a temperatura foi aumentada para 73°C e foram adicionados 10,1 g de cloreto de sódio. O aquecimento continuou e, a 81°C, o pH foi aumentado para 9,49. Quando a temperatura atingiu 90°C, o pH desviou para 8,5 e foi reajustado para 10,3. Após 0,5 hora, o pH foi ajustado para 7,4 com 50% de solução de ácido cítrico. A centrifugação de 15 ml mostrou desmulsificação completa e a massa de reação foi coletada em 50 ml de frascos de centrífuga e centrifugada a 8.000 rpm durante 2,5 minutos. Dos 338,7 g de fase leve inicial, foram recolhidos 203,2 g de óleo. Experimento B (lise química)

[00161] 338,4 gm de biomassa concentrada (fase leve) do ensaio piloto foram aquecidos a 91°C e o pH foi ajustado de 8,0 a 10,5 por 50% de solução de hidróxido de sódio. Após 12 minutos, foram adicionados 10,1 g de cloreto de sódio. Após 1 hora e 15 minutos, o pH foi ajustado para 8,5 com 50% de ácido cítrico. A centrifugação de 15 ml mostrou desmulsificação completa e a massa de reação foi coletada em frascos de 50 ml e centrifugada a 8000 rpm durante 2,5 minutos. Dos 338,7 g de fase leve inicial, foram coletados 198,7 g de óleo. Um resumo dos dados de qualidade do óleo bruto e rendimento do óleo de Experimento A e Experimento B é mostrado nas Tabelas 1 e 2. Tabela 1: Dados de qualidade do óleo bruto Experimento A Experimento B % de Ácido graxo 1,13 0,42 livre Valor de peróxido 0,47 0,71 (meq/kg) Valor de anisidina 2,8 4,1 (meq/kg) % de umidade 0,58 0,57 Tabela 2: Dados de rendimento de % de óleo

Método de Peso % % % Ácido desmulsificação inicial recuperada perdida perdida graxo na fase na fase na livre leve pesada terceira (%) fase Biomassa 146,7 92,3 13,4 0,4 0,56 concentrada - kg Ex. 1 Biomassa 338,7 g 94,3 5,9 ND 1,1 concentrada – Ex. 2, Exp. A (lise enzimática) Biomassa 338,4 g 91,0 9,7 ND 0,4 concentrada – Ex. 2, Exp. B (lise química) Exemplo 3. Concentração de biomassa em ensaio piloto seguida por choque de pH

[00162] 2.200,4 kg de caldo de fermentação pasteurizado contendo células microbianas de Schizochytrium foram aquecidos a 60°C e o pH ajustado a 10,3 com 50% de hidróxido de sódio. Assim que a temperatura atingiu 86,5°C, o pH desviou para 8,7 e foi ajustado para 10,2 pela adição de 50% de solução de hidróxido de sódio sob agitação. A temperatura atingiu 90°C e esta condição de tratamento continuou durante 1,5 hora. O pH era de 8,8. Esses tratamentos de temperatura e pH foram realizados para quebrar a química da superfície das células, a fim de facilitar a concentração subsequente da biomassa. A centrifugação foi de ~ 7.000 x g. A centrifugação separou o caldo de fermentação tratado na fase leve consistindo principalmente na biomassa (principalmente células microbianas, com alguns meios de fermentação), a fase pesada consistindo principalmente em meio de fermentação e algumas células microbianas residuais, e a terceira fase consistindo em uma composição similar para a fase pesada. 191,2 kg de biomassa concentrada com 31,5% de umidade, 1.995,6 kg de fase pesada com 9,5% de umidade e 16,5 kg de terceira fase com 16,2% de umidade, foram recuperados da centrífuga trifásica.

A fase leve foi coletada em um tambor e deixada à temperatura ambiente durante a noite.

No dia seguinte, o conteúdo do tambor foi transferido para dois tanques de 100 L e a temperatura de aquecimento ajustada para 90°C.

Quando a temperatura atingiu 77°C, o pH foi ajustado para 10,7 com 50% de hidróxido de sódio e o aquecimento continuou até a temperatura atingir 90°C.

A 90°C, o pH desviou para 9,9 e foi reajustado para 10,7. Após 2 horas de tratamento a 90°C, a temperatura foi reduzida para 82°C e o pH ajustado para 5,1 com 50% de ácido cítrico.

Após 30 minutos nesta condição, o pH foi ajustado para 10,6. Este ciclo de choque de pH foi repetido mais 2 vezes e o pH ajustado para 8,0. Foi adicionado cloreto de sódio (1,8 kg) a cada tanque e misturado durante 30 minutos. 15 ml de amostra de cada tanque foram centrifugados e a conclusão da desmulsificação foi confirmada.

O caldo desmulsificado foi centrifugado e separado em fase leve (consistindo principalmente em óleo bruto) e fase pesada (consistindo principalmente em meio de fermentação e material aquoso). Uma quantidade de 117 kg de óleo bruto (fase leve), 65,9 kg de fase pesada e 7,73 kg de terceira fase foi coletada da amostra centrifugada.

Exemplo 4. Ensaio piloto (choque de temperatura incluído para lise e desmulsificação)

[00163] 2.247,8 kg de caldo de fermentação pasteurizado com 86,1% de umidade contendo a cepa Schizochytrium de células de microalgas foram aquecidos a 80°C em 3.000 L de tanque agitado. Uma vez que a temperatura atingiu 80°C, o pH foi ajustado para 10,7 pela adição de 50% de solução de hidróxido de sódio sob agitação. O caldo foi, em seguida, aquecido durante 2 horas. Ao final de 2 horas, o pH caiu para 9,5. O pH foi ajustado para 8,7 pela adição de 50% de ácido cítrico. Esses tratamentos de temperatura e pH tinham como objetivo quebrar a química da superfície das células para facilitar a concentração subsequente da biomassa. O caldo tratado foi centrifugado a ~ 7.000 x g. A centrifugação separou o caldo de fermentação tratado na fase leve consistindo principalmente na biomassa com alguns meios de fermentação, fase pesada consistindo principalmente em meio de fermentação e algumas células microbianas residuais, e a terceira fase, consistindo em uma composição similar à fase pesada. 187,4 kg da fase leve com 37,1% de umidade, 2.051 kg da fase pesada com 89,6% de umidade e 11,7 kg da terceira fase com 84,5% de umidade, foram coletados da saída da centrífuga. A biomassa concentrada na fase leve foi coletada em um tanque de 750 L, onde foi resfriada a 10°C durante a noite.

[00164] No segundo dia, 2.215 kg de caldo de fermentação pasteurizado do mesmo lote acima foram aquecidos a 70°C e o pH foi ajustado para 10,7. O aquecimento continuou a 80°C e o pH ajustado para 10,7 novamente. Após 2 horas de tratamento, o pH foi ajustado para 8,7 com uma solução de 50% de ácido cítrico. O caldo tratado foi centrifugado. Aproximadamente na metade da etapa de centrifugação, o pH foi ajustado para 7,6 enquanto a centrifugação estava em andamento. 240,5 kg da fase leve com 46,7% de umidade,

1.999,3 kg da fase pesada com 89,9% de umidade e 8,9 kg da terceira fase com 85,7% de umidade, foram coletados da saída da centrífuga. A biomassa concentrada na fase leve foi coletada no mesmo tanque de 750 L acima, onde foi resfriada a 10°C durante a noite. A biomassa concentrada suficiente foi coletada para lise e desmulsificação no tanque de 750 L. A biomassa concentrada de dois lotes foi aquecida a 80°C no tanque de 750 L sob agitação. O pH era de 8,3. O pH foi ajustado para 7,8 com 50% de ácido cítrico sob agitação. Uma amostra de 15 ml foi avaliada, e a centrifugação mostrou desmulsificação completa. No entanto, 4 kg de sal de NaCl foram adicionados e misturados durante 30 minutos. O pH caiu para 5,9 com 50% de ácido cítrico. Após mistura durante 30 minutos, o pH aumentou para 8,2. Uma amostra de 15 ml centrifugada em centrífuga de bancada mostrou desmulsificação completa.

[00165] A composição desmulsificada foi centrifugada em uma centrífuga piloto. Uma quantidade de 225,6 kg de óleo bruto com 3,16% de umidade (fase leve), 182,6 kg de fase pesada com 87,06% de umidade e 2,76 kg de terceira fase com 82,5% de umidade, foi coletada do material centrifugado. Tabela 3: Dados de recuperação para ensaio piloto de concentração de biomassa AEX-O- AEX-O-1216 Mistura de fase 1216 Dia 2 de luz – Dia 1 Desmulsificação Dia 1 e Dia 2 Peso inicial 2.246,8 2.213,8 434,63

(kg) Total inicial 87,03 78,98 141,51 DHA +EPA +DPA n- 3 (kg) Fase de peso 186,4 240,5 227,73 (óleo leve (Biomassa bruto) concentrada)- (kg) Fase leve total 68,48 71,28 130,76 DHA+EPA+DPA n-3 (kg) Peso - Fase 2.051 1.999,3 182,6 pesada(kg) Fase pesada 15,45 10,79 1,32 total DHA+EPA+DPA n-3 (kg) Peso – Terceira 11,68 8,94 2,76 fase (kg) Terceira fase 0,31 0,14 0,08 total DHA+EPA+DPA n-3 (kg) % de produto 78,7 90,2 92,4 recuperado na fase leve % de produto 17,8 13,7 0,9 recuperado na fase pesada % de perda de 0,4 0,2 0,1 produto na terceira fase

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a obtenção de um lipídio a partir de uma composição que compreende células microbianas, o processo caracterizado pelo fato de que compreende: a. tratar a composição que compreende as células microbianas aquecendo a composição a uma temperatura de cerca de 60°C a cerca de 95°C a um pH de cerca de 9 a cerca de 11 sob agitação durante um período de tempo de cerca de 1 hora a cerca de 6 horas; b. separar as células microbianas tratadas em uma fase leve consistindo essencialmente em uma composição de células microbianas concentradas e uma fase pesada consistindo essencialmente em meio de fermentação e material aquoso; c. ajustar o pH da composição de células microbianas concentradas a um pH de cerca de 10 a cerca de 12 adicionando uma base e mantendo o pH de cerca de 10 a cerca de 12 durante, pelo menos, 1 hora; d. ajustar o pH da composição de (c) a um pH de cerca de 3 a cerca de 6 adicionando um ácido e mantendo o pH de cerca de 3 a cerca de 6 durante, pelo menos, 0,5 hora; e. opcionalmente repetir as etapas (c) e (d) até que a composição esteja suficientemente desmulsificada; f. separar o lipídio da composição de células lisadas desmulsificadas; e g. recuperar o lipídio.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (a) compreende aquecer a composição a uma temperatura de cerca de 80°C a cerca de 95°C.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que (c) e (d) compreendem aquecer a composição a cerca de 70°C a cerca de 90°C.

4. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que, antes de (c), uma ou mais enzimas capazes de romper a parede celular das células microbianas são adicionadas à composição de células microbianas concentradas durante um tempo suficiente para a lise das células microbianas.

5. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que a composição é submetida a um ou mais ciclos de choque de temperatura antes (c), após (c), antes (d), após (d) ou uma combinação dos mesmos.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o choque de temperatura compreende ajustar a temperatura de cerca de 80-90°C a cerca de 4-20°C e de volta a cerca de 80-90°C.

7. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que (b), (c) e/ou (d) compreendem ainda adicionar um sal em uma quantidade de cerca de 0,05% a cerca de 20% em peso, da composição de células microbianas concentradas.

8. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que (a) compreende ainda a ruptura mecânica das células, em que a ruptura mecânica resulta na lise de menos de 5% das células.

9. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que as células de (a)

não são lavadas.

10. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que as células de (a) estão contidas em um caldo de fermentação.

11. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que (f) compreende centrifugação ou filtração por membrana da composição de células lisadas desmulsificadas.

12. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o pH é ajustado para 7,5-8,5 antes de (b).

13. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que a temperatura é ajustada para 70-80°C antes de (b).

14. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o lipídio compreende um ácido graxo poli-insaturado.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo poli-insaturado é selecionado a partir de um ácido graxo ômega-3, um ácido graxo ômega-6 e misturas dos mesmos.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 14 ou reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo poli-insaturado é selecionado a partir de ácido docosahexaenóico (DHA), ácido eicosapentaenóico (EPA), ácido docosapentaenóico (DPA), ácido araquidônico (ARA), ácido gama-linolênico (GLA), ácido di-homo-gama-linolênico (DGLA), ácido estearidônico (SDA) e misturas dos mesmos.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo poli-insaturado é o ácido docosahexaenóico (DHA).

18. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo poli-insaturado é o ácido eicosapentaenóico (EPA).

19. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo poli-insaturado é o ácido araquidônico (ARA).

20. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que as células microbianas são uma ou mais células de algas, leveduras, fungos, protistas ou bactérias.

21. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que as células microbianas são do gênero Mortierella, gênero Crypthecodinium ou ordem Thraustochytriales.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que as células microbianas são da ordem Thraustochytriales.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que as células microbianas são do gênero Thraustochytrium, Schizochytrium ou misturas dos mesmos.

24. Processo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que as células microbianas são de Mortierella Alpina.

25. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que a composição de células lisadas compreende líquido, detritos celulares e óleo microbiano.

26. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que um solvente orgânico não é usado para obter o lipídio das células.

27. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 26, caracterizado pelo fato de que a enzima é selecionada a partir de beta-glucanase, xilanase, celulase, protease, pectinase, mananase, amilase e combinações dos mesmos.

28. Processo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a enzima é uma protease.

29. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 28, caracterizado pelo fato de que a enzima é adicionada em uma quantidade de cerca de 0,05% a cerca de 10% em peso da composição de células lisadas.

30. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 29, caracterizado pelo fato de que o sal é selecionado a partir do grupo que consiste em sais de metais alcalinos, sais de metais alcalino-terrosos, sais de sulfato e combinações dos mesmos.

31. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o lipídio de (g) é um lipídio bruto.

32. Processo, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que (g) compreende ainda refinar o lipídio bruto para obter um lipídio refinado.

33. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o lipídio compreende, pelo menos, 30% em peso de ácido docosahexaenóico.

34. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o lipídio compreende, pelo menos, 20% em peso de ácido eicosapentaenóico (EPA).

35. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o lipídio compreende, pelo menos, 30% em peso de ácido araquidônico.

36. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o lipídio tem um valor de anisidina inferior a cerca de 26.

37. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o lipídio tem um teor de fósforo de cerca de 100 ppm ou menos.

38. Processo, de acordo com qualquer reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de que o lipídio tem um valor de peróxido inferior a cerca de 5 meq/kg.

39. Lipídio, caracterizado pelo fato de ser obtido pelo processo, conforme definido em qualquer reivindicação anterior.