BR112021015791A2

BR112021015791A2 - Uso de partículas de membrana plasmática, lipossomas e exossomas para testar a potência de células imunes

Info

Publication number: BR112021015791A2
Application number: BR112021015791-3A
Authority: BR
Inventors: Dean Anthony Lee; Aarohi Thakkar; Mark Hall; Jennifer Muszynski
Original assignee: Research Institute At Nationwide Children's Hospital
Priority date: 2019-02-14
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2021-10-05
Also published as: SG11202107973PA; CA3129843A1; MX2021009785A; AU2020221311A1; EP3923993A4; CN113795755A; EP3923993A1; IL285579A; JP2022520098A; US20220128541A1; CO2021011986A2; KR20210139246A; WO2020168254A1

Abstract

uso de partículas de membrana plasmática, lipossomas e exossomas para testar a potência de células imunes. a presente invenção refere-se a um método para determinar a potência de uma célula imune é descrito. o método inclui as etapas de colocar uma célula imune em contato com uma quantidade eficaz de um exossoma celular e detectar a quantidade de uma citocina produzida pela célula imune. também são descritos kits para testar a potência das células imunes. os ensaios de potência são importantes para satisfazer os requisitos da fda para novos agentes biológicos, como células imunoterapêuticas. métodos de uso de células imunes potentes como um tratamento imunoterapêutico são descritos.

Description

"USO DE PARTÍCULAS DE MEMBRANA PLASMÁTICA, LIPOSSOMAS E EXOSSOMAS PARA TESTAR A POTÊNCIA DE CÉLULAS IMUNES". PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. 62/805.359, depositado em 14 de fevereiro de 2019, que está incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

CAMPO

[002] A presente invenção refere-se a imunoterapia e, mais particularmente, ao teste da função efetora de células imunes.

ANTECEDENTES

[003] A imunoterapia é o tratamento de doenças ativando ou suprimindo o sistema imune. As células derivadas do sistema imune podem ser usadas para melhorar a funcionalidade e as características imunológicas. Nos últimos anos, a imunoterapia tornou-se de grande interesse para pesquisadores, médicos e empresas farmacêuticas, principalmente em sua promessa de tratar várias formas de câncer. Os regimes imunomoduladores costumam ter menos efeitos colaterais do que os medicamentos existentes, incluindo menos potencial para criar resistência no tratamento de doenças microbianas.

[004] Os tratamentos convencionais de câncer se concentram em matar ou remover células cancerosas com quimioterapia, cirurgia e/ou radiação. No entanto, o campo das células imunes terapêuticas está crescendo rapidamente e pode ser usado em conjunto com ou, em alguns casos, no lugar de tratamentos convencionais para tratar, prevenir ou retardar o aparecimento de um câncer. As células efetoras imune, como linfócitos, macrófagos, células dendríticas, células exterminadoras naturais (células NK), linfócitos T citotóxicos (CTL), etc., trabalham naturalmente juntas para defender o corpo contra o câncer, visando antígenos anormais expressos na superfície das células tumorais. Desenvolvimentos recentes no tratamento do câncer têm se concentrado em direcionar o sistema imune do paciente para atacar e destruir tumores. Uma variedade de estratégias está em uso ou em fase de pesquisa e teste.

[005] A transferência adotiva de células (ACT) é a transferência de células para um paciente e tem se mostrado promissora contra o câncer de pulmão, melanoma e outros tipos de câncer. As células podem ter se originado do próprio paciente (autólogo) ou de outro indivíduo (alogênico). As terapias alogênicas envolvem células isoladas e expandidas de um doador separado do paciente que recebe as células. Alternativamente, a transferência de células adotivas pode ser usada para cultivar e expandir células autólogas extraídas in vitro para transfusão posterior. Por exemplo, a terapia de intensificação imunológica autóloga envolve a extração de células exterminadoras naturais derivadas de sangue periférico do próprio indivíduo, linfócitos T citotóxicos, células epiteliais e outras células imunes relevantes, a expansão dessas células in vitro e, em seguida, a reinfusão dessas células no corpo do indivíduo.

[006] Em algumas terapias, as células (por exemplo, células T) são geneticamente modificadas e expandidas in vitro antes de serem devolvidas ao mesmo paciente. A terapia de células T de receptor de antígeno quimérico (CAR-T) envolve coletar células T de um indivíduo e, em seguida, infectar as células T com um retrovírus que contém uma cópia de um gene de receptor de célula T (TCR). O gene de TCR é especializado em reconhecer antígenos tumorais (por exemplo, um receptor de antígeno quimérico, ou CAR). O vírus integra o receptor no genoma das células T. As células são expandidas não especificamente e/ou estimuladas. As células são então reinfundidas e produzem uma resposta imune contra as células tumorais.

[007] Com a aprovação da primeira terapia CAR-T e várias empresas comerciais envolvidas em vários ensaios clínicos, este campo explodiu comercialmente e mostrou um futuro promissor para imunoterapias. Com o avanço do campo com novos testes clínicos a cada dois dias, a necessidade de um teste de potência confiável e reprodutível para essas células imunes terapêuticas tem crescido desde então. O "padrão ouro" da indústria para testar a função efetora das células imune é o ensaio de liberação de cromo, desenvolvido na década de 1960 e que ainda está em uso, mesmo com preocupações devido ao uso de material radioativo e à variabilidade causada pelas células tumorais alvo. A alternativa disponível é o ensaio baseado em Calceína, que ainda apresenta grande variabilidade causada pelo uso de diferentes alvos tumorais e devido ao aprisionamento da Calceína em corpos apoptóticos de alvos tumorais.

[008] Houve outros esforços para desenvolver maneiras diferentes de ver a função efetora dessas células imunes visualmente, mas esses métodos ainda usam células tumorais alvo. Outro método substituto para verificar a função efetora das células imunes verificar a citocina produzida por essas células, para a qual todos os métodos convencionais usam células tumorais alvo para induzir a produção de citocina a partir de células imunes. O uso de células tumorais alvo adiciona variabilidade biológica a todos esses testes devido à variabilidade entre os tipos de células tumorais. Além disso, esses ensaios requerem uma configuração tediosa, que introduz o efeito de lote nesses ensaios. O efeito de lote é causado pelas condições da célula alvo, variabilidade de pessoa para pessoa no carregamento da placa, condições da placa, variabilidade em vários reagentes, variabilidade de leitura, etc. Há uma necessidade clara de um teste de potência de células imunes que possa remover todas essas variabilidades e produzir resultados confiáveis e reproduzíveis.

[009] É necessário um teste de potência confiável e reprodutível para avaliar a qualidade dos produtos de terapia com células imunes. O processo de aprovação é intensamente regulamentado e os desenvolvedores do medicamento serão obrigados a enviar uma quantidade substancial de informações sobre o medicamento às autoridades regulatórias para obter a aprovação. Isso pode incluir informações sobre a potência do medicamento e testes para determinar essa potência. Conforme exigido pelo FDA (21 CFR 610.10), a potência do produto de terapia celular deve ser indicada por testes apropriados para mostrar a função efetora dessas células imunes terapêuticas para mostrar a potência, o que seria medir a produção de citocinas relevantes por essas células imunes.

SUMÁRIO

[0010] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados nas figuras anexas e na descrição a seguir. Outras características, objetos e vantagens da invenção ficarão evidentes na descrição e figuras e nas reivindicações.

[0011] Em um aspecto, são divulgados aqui métodos de ensaio da potência de uma célula imune (como, por exemplo, uma célula T, um macrófago, uma célula NK, célula T NK, célula T CAR e/ou célula NK CAR), compreendendo o contato de uma célula imune com uma quantidade eficaz de uma partícula de membrana plasmática, um lipossoma (incluindo lipossomas artificiais) ou um exossoma (incluindo, mas não limitado a exossomas projetadas) e a detecção da quantidade de uma ou mais citocinas (tais como, por exemplo, IL-2, IL-6, IFN-, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, quitinase tipo 3 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-11, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, Osteocalcina, OPN, Pentraxin-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1, MIP-1, RANTES e/ou TWEAK/TNFSF12) produzidos pela célula imune. Em um aspecto, o método pode compreender ainda a comparação da quantidade de citocina produzida com o nível de potência da citocina necessário para o uso da célula imune em imunoterapia.

[0012] Também são divulgados aqui métodos de ensaio da potência de uma célula imune de qualquer aspecto anterior, em que a quantidade de citocina é detectada usando um imunoensaio (tal como, por exemplo, ELISA, coloração de citocina intracelular, ELISpot, citometria de fluxo, Luminex xMAP®, PCR quantitativo (incluindo, mas não se limitando a qRT-PCR) e/ou arranjo de esferas).

[0013] Em um aspecto, são divulgados aqui métodos de teste da potência de uma célula imune de qualquer aspecto anterior, em que a célula imune é colocada em contato com uma quantidade eficaz de uma partícula de membrana plasmática, um lipossoma ou um exossoma (incluindo, mas não se limitando a exossomas projetados) por pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 150 minutos, 3, 4, 5,6 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 32, 36, 42, 48, 60 horas, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 45, 60, 61, 62 dias, 3, 4, 5 ou 6 meses.

[0014] Também são divulgados aqui métodos de teste da potência de uma célula imune de qualquer aspecto anterior, em que a partícula de membrana plasmática, o lipossoma ou o exossoma (incluindo, mas não se limitando a exossomas projetados) é fornecido a uma concentração de 5 µg/mL a 1000 µg/mL, incluindo, mas não se limitando a uma concentração de 50 µg/mL a 400 µg/mL.

[0015] Em um aspecto, são divulgados aqui kits para avaliar a potência de uma célula imune (como, por exemplo, uma célula T, um macrófago, uma célula NK, célula T NK, célula T CAR e/ou célula NK CAR), compreendendo um recipiente (tal como, por exemplo, um tubo de microcentrífuga) incluindo uma quantidade eficaz de uma partícula de membrana plasmática e/ou um exossoma (incluindo, mas não se limitando a exossomas projetados) e um tampão adequado para células imunes. Em alguns aspectos, o kit pode compreender ainda instruções para usar o kit para estimular a produção de citocinas por uma célula imune

[0016] Também são divulgados aqui kits para teste da potência de uma célula imune de qualquer aspecto anterior, em que a partícula de membrana plasmática, o lipossoma ou o exossoma (incluindo, mas não se limitando a exossomas projetados) é fornecido a uma concentração de 5 µg/mL a 1000 µg/mL, incluindo, mas não se limitando a uma concentração de 50 µg/mL a 400 µg/mL.

[0017] Em um aspecto, divulgado aqui o método de imunoterapia que compreende a) realizar o método de ensaio da potência de uma célula imune (tal como, por exemplo, uma célula T, um macrófago, uma célula NK, célula T NK, célula T CAR, e/ou célula CAR NK) de qualquer aspecto anterior em múltiplas células imunes para determinar a potência de cada célula imune; b) selecionar pelo menos uma célula imune potente com base na quantidade de citocina (tal como, por exemplo, IL- 2, IL-6, IFN-, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, Quitinase 3 como 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, Osteocalcina, OPN, Pentraxina-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, RANTES e/ou TWEAK/TNFSF12) detectados; e c) administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da célula imune potente a um indivíduo em necessidade da mesma como um imunoterapêutico. Em um aspecto, o método pode compreender ainda extrair as múltiplas células imunes de um doador alogênico ou autólogo antes de testar a potência da célula imune.

[0018] Também são divulgados aqui métodos de imunoterapia de qualquer aspecto anterior, compreendendo ainda a expansão de pelo menos uma célula imune potente antes de entregar uma quantidade terapeuticamente eficaz da célula imune potente.

[0019] Em um aspecto, são divulgados aqui métodos de imunoterapia de qualquer aspecto anterior, compreendendo ainda o direcionamento das múltiplas células imunes ou da célula imune potente para responder a um antígeno especificado.

[0020] Também são divulgados aqui métodos de imunoterapia de qualquer aspecto anterior, compreendendo ainda alterar geneticamente as múltiplas células imunes ou a célula imune potente para apresentar um receptor de antígeno quimérico.

[0021] Em um aspecto, são divulgados aqui métodos de tratamento, inibição, redução, prevenção e/ou melhoria de um câncer e/ou metástase em um indivíduo que compreende a) obtenção de uma ou mais células imunes (como, por exemplo, uma célula T, um macrófago, uma célula NK, célula T NK, célula T CAR e/ou célula CAR NK) obtida de um doador alogênico ou autólogo); b) colocar uma célula imune em contato com uma quantidade eficaz de uma partícula de membrana plasmática, um lipossoma ou um exossoma (incluindo, mas não se limitando a exossomas projetados); c) detectar a quantidade de uma citocina (como, por exemplo, IL-2, IL-6, IFN-, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, quitinase tipo 3 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL- 8, IL-10, IL-11, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, Osteocalcina, OPN, Pentraxina-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1α, MIP- 1β, RANTES e/ou TWEAK/TNFSF12) produzido pela célula imune; d) selecionar pelo menos uma célula imune potente com base na quantidade de citocina detectada; e e) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da potente célula imune. Em alguns aspectos, o método pode compreender ainda a extração da célula imune de um doador autólogo ou alogênico.

[0022] Também são divulgados aqui métodos de tratamento, inibição, redução, prevenção e/ou melhoria de um câncer e/ou metástase de qualquer aspecto anterior, compreendendo ainda a expansão de pelo menos uma célula imune potente antes de entregar uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um célula imune potente.

[0023] Também são divulgados aqui métodos de determinação da identidade (tal como, por exemplo, diferenciação de Th1, Th2, Th3, Th9, Th17, células T de memória efetora (Tem), células T de memória central (Tcm), células T ou reguladoras Células T (Treg), células NK em repouso, células NK expandidas) de pelo menos uma célula imune ou uma população de células com base na assinatura de citocinas associada a esse tipo de célula.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0024] A Figura 1 fornece um gráfico que mostra a correlação entre a liberação de citocinas de células NK induzida por exossomas (derivadas de células K562) versus a liberação de citocinas de células NK induzida por PHA (em pg/milhão de células/h).

[0025] A Figura 2 fornece um gráfico que mostra a correlação entre a liberação de citocinas de células NK isoladas de fresco (induzida por exossomas K562) versus a liberação de citocinas de células NK expandidas induzida por exossomas (em pg/milhão de células/h).

[0026] A Figura 3 mostra a concentração total de citocinas após a exposição a 4 concentrações diferentes de exossoma (60, 100, 200 e 400 mg/mL).

[0027] A Figura 4 mostra a correlação de dose de duas concentrações diferentes de exossoma.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0028] A presente invenção fornece um método para determinar a potência de uma célula imune que inclui o contato de uma célula imune com uma quantidade eficaz de um exossoma e a detecção da quantidade de uma citocina produzida pela célula imune. Embora a divulgação seja dada no contexto de imunoterapias contra o câncer, os conceitos e inovações divulgados neste documento podem ser aplicados a imunoterapias para outras doenças e distúrbios. Por exemplo, uma célula imune usada em imunoterapia contra doenças autoimunes, doenças ou distúrbios inflamatórios, doenças virais e/ou infecções bacterianas também pode ser testada para potências usando os ensaios aqui divulgados. Definições

[0029] Para esclarecimento na compreensão e facilidade de referência, uma lista de termos usados em toda a seção de breve descrição e no restante do pedido foi compilada aqui. Alguns dos termos são bem conhecidos em todo o campo e são definidos aqui para fins de clareza, enquanto alguns dos termos são exclusivos para este aplicativo e, portanto, devem ser definidos para a compreensão adequada do pedido.

[0030] Tal como utilizado no relatório descritivo e nas reivindicações, a forma singular "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo suas misturas. Onde a forma plural é usada aqui, geralmente inclui o singular.

[0031] As faixas podem ser expressas neste documento como de "cerca de" um valor específico e/ou a "cerca de" outro valor específico. Quando tal faixa é expressa, uma outra modalidade inclui de um valor particular e/ou até outro valor particular. Da mesma forma, quando os valores são expressos como aproximações, pelo uso do antecedente "cerca de", será entendido que o valor particular forma uma outra modalidade. Deverá ser compreendido ainda que os pontos extremos de cada uma das faixas são significativos tanto em relação ao outro ponto extremo quanto independentemente do outro ponto extremo. As repetições de faixas numéricas por pontos extremos incluem todos os números compreendidos dentro dessa faixa (por exemplo, 1 a 5 inclui 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.). Compreende-se também que há inúmeros valores divulgados neste documento, e que cada valor também é divulgado neste documento como "cerca de" aquele determinado valor além do valor em si. Por exemplo, se o valor "10" é divulgado, então "cerca de 10" é também divulgado. Também é compreendido que quando um valor é divulgado "menor que ou igual ao" valor, "maior que ou igual ao valor" e possíveis faixas entre os valores também são divulgados, como apropriadamente compreendido pelo técnico versado. Por exemplo, se o valor "10" é divulgado, o "menor que ou igual a 10", bem como "maior que ou igual a 10" é também divulgado. Também é entendido que em todo o pedido, dados são fornecidos em inúmeros formatos diferentes e que esses dados representam pontos extremos e pontos de partida e faixas para qualquer combinação de pontos de dados. Por exemplo, se um determinado ponto de dados "10" e um determinado ponto de dados "15" são divulgados, compreende-se que maior que, maior que ou igual a, menor que, menor que ou igual a, e igual a 10 e 15 são considerados divulgados, bem como entre 10 e 15. Também é entendido que cada unidade entre duas unidades particulares também é divulgada. Por exemplo, se 10 e 15 são divulgados, então, 11, 12, 13 e 14 são também divulgados.

[0032] Tal como aqui utilizado, o termo "compreendendo" pretende significar que as composições e métodos incluem os elementos repetidos, mas não excluindo outros. "Consistindo essencialmente em'' quando usado para definir composições e métodos, deve significar excluindo outros elementos de qualquer significado essencial para a combinação. Assim, uma composição consistindo essencialmente nos elementos como aqui definidos não excluiria traços de contaminantes do método de isolamento e purificação e carreadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como solução salina tamponada com fosfato, conservantes e semelhantes. "Consistindo em'' deve significar a exclusão de mais do que elementos traços de outros ingredientes e etapas substanciais do método para administrar as composições desta invenção. As modalidades definidas por cada um desses termos de transição estão dentro do escopo desta invenção.

[0033] Um "aumento" pode se referir a qualquer mudança que resulte em uma quantidade maior de um sintoma, uma doença, uma composição, uma condição ou uma atividade. Um aumento pode ser qualquer aumento individual, mediano ou médio em uma condição, sintoma, atividade ou composição em uma quantidade estatisticamente significativa. Assim, o aumento pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100% de aumento, desde que o aumento seja estatisticamente significativo.

[0034] Uma "diminuição" pode se referir a qualquer mudança que resulte em uma quantidade menor de um sintoma, uma doença, uma composição, uma condição ou atividade. Uma substância também é entendida como diminuindo a produção genética de um gene quando a produção genética do produto de gene com a substância é menor em relação à produção do produto de gene sem a substância. Além disso, por exemplo, uma diminuição pode ser uma mudança nos sintomas de um distúrbio de forma que os sintomas sejam menores que os observados anteriormente. Uma diminuição pode ser qualquer diminuição individual, mediana ou média em uma condição, um sintoma, uma atividade, composição em uma quantidade estatisticamente significativa. Assim, a diminuição pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100% de diminuição, desde que a diminuição seja estatisticamente significativa.

[0035] "Inibir", "inibindo" e "inibição" significa diminuir uma atividade, resposta, condição, doença ou outro parâmetro biológico. Isso pode incluir, mas não se limita à completa ablação da atividade, resposta, condição ou doença. Isso também pode incluir, por exemplo, uma redução de 10% na atividade, resposta, condição ou doença em comparação com o nível nativo ou de controle. Assim, a redução pode ser de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% ou qualquer quantidade de redução entre elas em comparação com níveis nativos ou de controle.

[0036] Por "reduzir" ou outras formas da palavra, tal como "reduzir" ou "redução", queremos dizer abaixamento de um evento ou uma característica (por exemplo, crescimento de tumor). É entendido que isto é tipicamente em relação a algum valor padrão ou esperado, em outras palavras, ele é relativo, mas que não é sempre necessário para o valor padrão ou relativo ser referido ao mesmo. Por exemplo, "reduz crescimento de tumor" significa reduzir a taxa de crescimento de um tumor em relação a um padrão ou controle.

[0037] Por "prevenir" ou outras formas da palavra, tal como "prevenir" ou "prevenção", pretende-se interromper um evento ou uma característica particular, estabilizar ou retardar o desenvolvimento ou a progressão de um evento ou uma característica particular, ou minimizar as chances de que um evento ou uma característica particular ocorra. Prevenir não requer comparação com um controle, pois é tipicamente mais absoluto do que, por exemplo, reduzir. Conforme usado aqui, algo poderia ser reduzido, mas não evitado, mas algo que é reduzido também poderia ser evitado. Da mesma forma, algo poderia ser evitado, mas não reduzido, mas algo que é evitado também poderia ser reduzido. É entendido que onde reduzir ou prevenir são usados, a menos que especificamente indicado de outra forma, o uso da outra palavra também é expressamente divulgado.

[0038] O termo "terapeuticamente eficaz" destina-se a qualificar o número ou a quantidade de um agente ativo (como células imunoterapêuticas) que irá atingir o objetivo de diminuir a gravidade da doença, evitando efeitos colaterais adversos, como os tipicamente associados a terapias alternativas. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser administrada em uma ou mais doses. Os tratamentos que são terapeuticamente eficazes incluem aqueles que melhoram a qualidade de vida de um indivíduo, mesmo que não melhorem o resultado da doença em si.

[0039] Uma "quantidade eficaz" geralmente significa uma quantidade que proporciona o efeito local ou sistêmico desejado, por exemplo, eficaz para estimular a formação de citocinas, incluindo a obtenção dos efeitos específicos desejados descritos neste pedido. Por exemplo, uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para efetuar um resultado clínico benéfico ou desejado.

[0040] O termo "indivíduo" refere-se a qualquer indivíduo que seja o alvo de administração ou tratamento. O indivíduo pode ser um vertebrado, por exemplo, um mamífero. Em um aspecto, o indivíduo pode ser humano, primata não humano, bovino, equino, porcino, canino ou felino. O indivíduo também pode ser uma cobaia, rato, hamster, coelho, camundongo ou toupeira. Assim, o indivíduo pode ser um paciente humano ou veterinário. O termo "paciente" refere-se a um indivíduo sob o tratamento de um clínico, por exemplo, médico.

[0041] O termo "carreador terapeuticamente aceitável" significa um carreador ou excipiente que é útil na preparação de uma composição que é geralmente segura e não tóxica e inclui um carreador que é aceitável para uso veterinário e/ou humano. Os métodos de administração intravenosa irão utilizar um carreador terapeuticamente aceitável que é fisiologicamente equilibrado (por exemplo, em um nível osmótico e de pH que é seguro para uso intravenoso). Conforme usado neste documento, o termo "carreador terapeuticamente aceitável" abrange qualquer um dos carreadores padrão, tais como soro fisiológico, Ringers, uma solução salina tamponada com fosfato, água, dextrose em água e emulsões, como uma emulsão de óleo/água ou água/óleo e vários tipos de agentes umectantes. Conforme usado neste documento, o termo "carreador" abrange qualquer excipiente, diluente, enchimento, sal, tampão, estabilizador, solubilizante, lipídeo, estabilizador ou outro material bem conhecido na técnica para uso em formulações terapêuticas. O carreador terapeuticamente aceitável também pode incluir conservantes (incluindo criopreservantes), tais como os que preservariam a viabilidade e/ou potência de uma célula imune. Um "carreador terapeuticamente aceitável", conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações, inclui um e mais de um desses carreadores.

[0042] O termo "tratamento" refere-se ao gerenciamento médico de um paciente com a intenção de curar, melhorar, estabilizar ou prevenir uma doença, condição patológica ou um distúrbio. Este termo inclui tratamento ativo, isto é, tratamento dirigido especificamente para a melhoria de uma doença, uma condição patológica, ou distúrbio, e inclui também tratamento causal, isto é, tratamento dirigido para remoção da causa da doença, condição patológica ou distúrbio associado. Além disso, esse termo inclui tratamento paliativo, isto é, tratamento planejado para o alívio de sintomas em vez da cura da doença, condição patológica ou do distúrbio; tratamento preventivo, isto é, tratamento dirigido para minimizar ou inibir parcialmente ou completamente o desenvolvimento da doença, condição patológica ou do distúrbio associados; e tratamento de suporte, isto é, tratamento usado para suplementar outra terapia específica dirigida para a melhoria da doença, condição patológica ou do distúrbio associado.

[0043] "Administração" a um indivíduo inclui qualquer rota de introdução ou distribuição a um indivíduo um agente.

A administração pode ser realizada por qualquer rota adequada, incluindo oral, tópica, intravenosa, subcutânea, transcutânea, transdérmica, intramuscular, intra-articular, parenteral, intra-arteríola, intradérmica, intraventricular, intracraniana, intraperitoneal, intralesional, intranasal, retal, vaginal, por inalação, via um reservatório implantado, parenteral (por exemplo, injeções subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra- sinovial, intraesternal, intratecal, intraperitoneal, intra-hepática, intralesional e intracraniana ou técnicas de infusão) e semelhantes. "Administração concomitante", "administração em combinação", "administração simultânea" ou "administrado simultaneamente" como utilizado neste documento, significa que os compostos são administrados no mesmo ponto no tempo ou essencialmente imediatamente após um ao outro.

No último caso, os dois compostos são administrados em momentos suficientemente próximos para que os resultados observados sejam indistinguíveis dos obtidos quando os compostos são administrados ao mesmo tempo. "Administração sistêmica" refere-se à introdução ou distribuição a um indivíduo de um agente por meio de uma rota que introduz ou distribui o agente a áreas extensas do corpo do indivíduo (por exemplo, mais de 50% do corpo), por exemplo, através da entrada no sistema circulatório ou sistemas linfáticos.

Em contraste, "administração local" refere-se à introdução ou distribuição a um indivíduo de um agente via uma rota que introduz ou distribui o agente na área ou área imediatamente adjacente ao ponto de administração e não introduz o agente sistemicamente em uma quantidade terapeuticamente significativa.

Por exemplo, agentes administrados localmente são facilmente detectáveis na vizinhança local do ponto de administração, mas são indetectáveis ou detectáveis em quantidades insignificantes em partes distais do corpo do indivíduo.

A administração inclui autoadministração e a administração por outro.

[0044] "Tratar", "tratando", "tratamento" e variações gramaticais dos mesmos, conforme usado neste documento, incluem a administração de uma composição com a intenção ou o propósito de prevenir, retardar, curar, curar, aliviar, aliviar, alterar, remediar, melhorar, melhorar, estabilizar, mitigar e/ou reduzir a intensidade ou frequência de uma ou mais doenças ou condições, um sintoma de uma doença ou condição, ou uma causa subjacente de uma doença ou condição. Tratamentos de acordo com a invenção podem ser aplicados preventivamente, profilaticamente, paliativamente ou remediadoramente. Tratamentos profiláticos são administrados a um indivíduo antes do início (por exemplo, antes de sinais óbvios de câncer), durante o início precoce (por exemplo, mediante sinais iniciais e sintomas iniciais de câncer) ou após um desenvolvimento estabelecido de câncer. A administração profilática pode ocorrer por dia(s) a anos antes da manifestação dos sintomas de uma doença ou uma infecção.

[0045] Em todo este pedido, é feita referência a várias publicações. As divulgações dessas publicações em suas totalidades estão, por meio deste, incorporadas por referência neste pedido a fim de descrever mais completamente o estado da técnica ao qual este pertence. As referências divulgadas também estão individual e especificamente incorporadas por referência neste documento para o material contido nelas que é discutido no período em que a referência é invocada. Teste de Potência Imune

[0046] Em um aspecto, a invenção fornece um método para determinar a potência de uma célula imune. O método inclui as etapas de colocar uma célula imune em contato com uma quantidade eficaz de uma partícula de membrana plasmática, um lipossoma ou um exossoma (por exemplo, um exossoma de célula cancerosa ou exossoma projetado) e detectar a quantidade de uma citocina produzida pela célula imune. Por exemplo, a célula imune pode ser colocada em contato com uma partícula de membrana plasmática ou exossoma (incluindo, mas não se limitando a exossomas projetados), suspendendo o exossoma em um meio celular e expondo as células imunes ao meio celular.

[0047] Em algumas modalidades, o método inclui a etapa de comparação da quantidade de citocina produzida com o nível de potência de citocina necessário para o uso da célula imune em imunoterapia. Um teste de potência serve para caracterizar o produto (ou seja, células imunes), para monitorar a consistência lote a lote e garantir a estabilidade do produto e, portanto, deve ser suficientemente sensível para detectar diferenças que podem impactar o mecanismo de ação e função do produto e são, portanto, de potencial importância clínica. O teste também pode ser usado como um biomarcador preditivo ou teste farmacodinâmico para imunoterapia mediada por células. É preferível que o teste de potência tenha a relação mais próxima possível com a atividade fisiológica/farmacológica putativa do produto. O teste de potência aqui descrito fornece a capacidade de medir o valor de potência dentro das especificações do produto; alta sensibilidade para detecção de diferenças de potencial importância clínica; relação estreita com o mecanismo de ação e a atividade fisiológica/farmacológica putativa do produto. Preferencialmente, o teste de potência também satisfaz os seguintes critérios secundários: variação intra e interteste suficientemente baixa (para obter a precisão necessária para suportar as especificações do produto); robustez suficiente; e passível de análise de alto rendimento. Em algumas modalidades, o teste é usado como um ensaio clínico para quantificar células T, macrófagos, células NK, células T NK, células T CAR e/ou função das células CAR NK (diagnóstico para deficiência imunológica de células NK, biomarcador para monitorar imunossupressores ou eficácia do imunativador).

[0048] Como observado acima, os métodos divulgados fornecem a determinação da potência de uma célula imune. Células imunes,

conforme definido neste documento, são quaisquer células do sistema imune que produzem citocinas (isto é, células imunes produtoras de citocinas). Exemplos de células imunes produtoras de citocinas incluem linfócitos, neutrófilos, macrófagos e células exterminadoras naturais. Os linfócitos incluem células B e células T (incluindo células T CD4 e CD8). Em um aspecto, a célula imune pode compreender um linfócito infiltrante de tumor (TIL), célula T, célula exterminadora natural (NK), célula T NK, célula T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e/ou NK CAR. As células imunes podem ser obtidas a partir de cultura de células ou podem ser obtidas de um indivíduo (como, por exemplo, um doador alogênico ou doador autólogo).

[0049] Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula T. As células T desempenham um papel central na imunidade mediada por células e podem ser distinguidas de outros linfócitos, como células B e células exterminadoras naturais, pela presença de um receptor de células T na superfície da célula. Exemplos de células T incluem células T auxiliares (células TH), células T citotóxicas (células TC), células T de memória, células T reguladoras ou "supressoras" e células T exterminadoras naturais (células NKT, que são distintas das células NK e reconhecer um antígeno glicolipídio em vez de peptídeos apresentados pela molécula de MHC. Diferentes tipos de células T diferem umas das outras em seu padrão de produção de citocinas). As células T podem ser células T CD4 ou CD8. Além disso, as células T podem compreender células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) ou linfócitos infiltrantes de tumor (TILs).

[0050] Em algumas modalidades, a célula imune é uma célula NK. As células exterminadoras naturais são um tipo de linfócito citotóxico do sistema imune. As células NK fornecem respostas rápidas às células infectadas por vírus e respondem às células transformadas. Normalmente, as células imunes detectam peptídeos de patógenos apresentados por moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) na superfície das células infectadas, desencadeando a liberação de citocinas, causando lise ou apoptose. As células NK são únicas, no entanto, pois têm a capacidade de reconhecer células estressadas, independentemente de os peptídeos de patógenos estarem presentes nas moléculas de MHC. Elas foram chamadas de "exterminadoras naturais" por causa da noção inicial de que não requerem ativação prévia para matar o alvo. As células NK são grandes linfócitos granulares (LGL) e são conhecidas por se diferenciar e amadurecer na medula óssea, de onde então entram na circulação. Em algum aspecto, a célula NK pode ser uma célula NK CAR.

[0051] Assim, em um aspecto, são divulgados aqui métodos de ensaio da potência de uma célula imune (tal como, por exemplo, uma célula T, um macrófago, uma célula NK, célula T NK, célula T CAR e/ou célula NK CAR), compreendendo o contato de uma célula imune com uma quantidade eficaz de uma partícula de membrana plasmática, um lipossoma ou um exossoma (incluindo, mas não se limitando a exossomas projetados) e a detecção da quantidade de uma ou mais citocinas produzidas pela célula imune. Em um aspecto, o método pode compreender ainda a comparação da quantidade de citocina produzida com o nível de potência da citocina necessário para o uso da célula imune em imunoterapia.

[0052] O teste inclui a etapa de detecção da quantidade de uma citocina produzida pela célula imune após estimular as células imunes com exossoma. Tal como aqui utilizado, o termo "citocina" refere-se a uma pequena proteína (~5-20 kDa) que é importante na sinalização celular e, em particular, imunomodulação que pode ser produzida por uma célula imune. Exemplos de citocinas incluem quimiocinas, interferons, interleucinas, linfocinas e fatores de necrose tumoral. As citocinas detectadas podem incluir citocinas conhecidas por serem produzidas pelas células imunes sendo avaliadas, ou a detecção pode abranger uma variedade mais ampla de citocinas, incluindo citocinas não conhecidas por serem produzidas pelas células imunes.

[0053] Em algumas modalidades, as citocinas sendo detectadas incluem citocinas conhecidas por serem produzidas por células T ou células exterminadoras naturais. Em algumas modalidades, as citocinas incluem as conhecidas por serem produzidas por células T. As células T incluem células Th1 e Th2; as células Th1 produzem predominantemente interferon (IFN)-γ (IFN-γ), fator de necrose tumoral (TNF)-α (TNF-α) e IL-2; As células Th2 produzem interleucina (IL)-2 (IL- 2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-13 e IL-22. Exemplos de citocinas produzidas por células exterminadoras naturais estimuladas incluem IL-la, IL-1β, IL- 2, IL-5, IL-8, IL-10, IL-13, IFN-γ, TNF-α, colônia de granulócitos- macrófagos -fator estimulador (GM-CSF), fator inibidor de leucemia (LIF) e a proteína inflamatória de macrófagos quimiocinas (MIP)-1α (MIP-1α), MIP-1β e RANTES. Outras citocinas úteis para determinar a potência de uma célula imune incluem, mas não estão limitadas a, fator de ativação de células B/fator de necrose tumoral (TNF) membro da superfamília 13B (BAFF/TNFSF13B), grupo de diferenciação (CD) 163 (CD163), CD30/TNFRSF8, quitinase 3 semelhante a 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-11, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-20, IL-26, IL- 29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, metaloproteinase-1 da matriz (MMP-1), Osteocalcina, Osteopontina (OPN), Pentraxina-3, receptor 1 do fator de necrose tumoral (TNF) (TNF -R1), TNF-R2, linfopoetina estromal tímica (TSLP) ou indutor fraco de apoptose relacionado ao TNF (TWEAK)/ membro da superfamília 12 do TNF (TWEAK/TNFSF12). Assim, em um aspecto, são divulgados aqui métodos de teste da potência de uma célula imune (tal como, por exemplo, uma célula T, um macrófago, uma célula NK, célula T NK, célula T CAR e/ou célula NK CAR), compreendendo o contato de uma célula imune com uma quantidade eficaz de uma partícula de membrana plasmática, um lipossoma ou um exossoma (incluindo, mas não se limitando a exossomas projetados) e a detecção da quantidade de uma ou mais citocinas (como, por exemplo, IL-2, IL-6, IFN-, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, quitinase 3 semelhante a 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL- 10, IL-11, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-I1, IL-32, IL-34, IL- 35, MMP- 1, Osteocalcina, OPN, Pentraxin-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, LIF, MIP-1α, MIP-1β, RANTES e/ou TWEAK/TNFSF12) produzidos pelo sistema imunológico célula. são divulgados aqui métodos de ensaio da potência de uma célula imune (tal como, por exemplo, uma célula T, um macrófago, uma célula NK, célula T NK, célula T CAR e/ou célula NK CAR), compreendendo o contato de um célula imune com uma quantidade eficaz de uma partícula de membrana plasmática, um lipossoma ou um exossoma (incluindo, mas não se limitando a exossomas projetados) e detectando a quantidade de uma ou mais citocinas (como, por exemplo, IL-2, IL- 6, IFN-, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, quitinase 3 semelhante a 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL- 20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-11, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, Osteocalcina, OPN, Pentraxina-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, RANTES e/ou TWEAK/TNFSF12) produzida pela célula imune. Em um aspecto, o método pode compreender ainda a comparação da quantidade de citocina produzida com o nível de potência da citocina necessário para o uso da célula imune em imunoterapia. Em algumas modalidades, os níveis de uma pluralidade de citocinas são determinados. Em outras modalidades, a citocina é selecionada a partir do grupo que consiste em interleucina-2, interleucina-6 e interferon-γ.

[0054] O ensaio inclui a etapa de detecção da quantidade de uma citocina produzida pela célula imune. Uma ampla variedade de métodos é conhecida pelos versados na técnica para detectar citocinas, que podem variar dependendo da citocina a ser detectada. Em algumas modalidades, um método ou métodos podem ser usados para detectar e/ou quantificar a presença de uma pluralidade de diferentes citocinas. As citocinas podem ser detectadas, por exemplo, pelo uso de kits de reagentes específicos ou imunoensaios. As citocinas podem ser detectadas usando kits disponíveis de fornecedores comerciais, como Miltenyi Biotec™, Luminex e Thermo Fisher Scientific™. Exemplos de kits adequados para detectar citocinas são o kit inspetor rápido de citocinas (CD4/CD8) ou o kit T/NK de citocina MACSPlex, que pode detectar citocinas formadas por células T ou células NK, ambas vendidas por Miltenyi Biotec™.

[0055] Em algumas modalidades, a quantidade de citocina é detectada usando um imunoensaio. Os imunoensaios vêm em muitos formatos e variações diferentes. Os imunoensaios podem ser executados em várias etapas com reagentes sendo adicionados e removidos por lavagem ou separados em diferentes pontos do ensaio. Os imunoensaios incluem imunoensaios heterogêneos, que incluem várias etapas, e imunoensaios homogêneos, que envolvem simplesmente misturar os reagentes e a amostra e fazer uma medição física. Os imunoensaios geralmente usam um calibrador, que é uma solução conhecida por conter o analito em questão, e a concentração desse analito é geralmente conhecida. A comparação da resposta de um ensaio a uma amostra real com a resposta do ensaio produzida pelos calibradores torna possível interpretar a força do sinal em termos da presença ou concentração do analito na amostra. Os tipos de imunoensaios incluem imunoensaios homogêneos competitivos, imunoensaios heterogêneos competitivos, imunoensaios não competitivos em um local e imunoensaios não competitivos em dois locais. Os imunoensaios também incluem ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA), imunoensaios de fluxo lateral, ensaios de ponto de imunoabsorção enzimática (ELIspot), citometria de fluxo, coloração de citocina intracelular, ensaios de matriz de anticorpos e ensaios baseados em grânulos, imunoensaios magnéticos, radioimunoensaios e PCR quantitativo (incluindo, mas não se limitando a qRT-PCR). Em um aspecto, o ensaio compreende um Luminex xMAP®.

[0056] O método de determinação da potência de uma célula imune inclui a etapa de colocar uma célula imune em contato com uma quantidade eficaz de uma partícula de membrana plasmática e/ou um exossoma (como, por exemplo, um exossoma projetado). Partículas de membrana plasmática (PM) são vesículas feitas da membrana plasmática de uma célula ou feitas artificialmente (isto é, lipossomas). Uma partícula de PM pode conter uma bicamada lipídica ou simplesmente uma única camada de lipídios. Uma partícula de PM pode ser preparada em forma lamelar simples, multilamelar ou invertida. Partículas de PM podem ser preparadas de células alimentadoras ligadas a Fc, conforme descrito neste documento, usando protocolos de preparação de membrana plasmática conhecidos ou protocolos para preparar lipossomas, tal como aqueles descritos na Patente US

9.623.082, toda a divulgação da qual é aqui incorporada por referência. Em certos aspectos, partículas de PM, conforme divulgadas neste documento, variam em diâmetro médio de cerca de 170 a cerca de 300 nm.

[0057] Os exossomas são vesículas derivadas de células que estão presentes em muitos e talvez em todos os fluidos eucarióticos. Os exossomas contêm RNA, proteínas, lipídios e metabólitos que refletem o tipo de célula de origem. O diâmetro relatado dos exossomas está entre 30 e 100 nm. Os exossomas são liberados da célula quando os corpos multivesiculares se fundem com a membrana plasmática ou são liberados diretamente da membrana plasmática. Em algumas modalidades, os exossomas são obtidos a partir de células cancerosas.

Em algumas modalidades, os exossomas são exossomas de células leucêmicas. Embora esta divulgação seja dada no contexto do uso de exossomas para determinar a potência de uma célula imune, outras vesículas extracelulares também podem ser usadas para determinar a potência de uma célula imune. Conforme usado aqui, o termo "vesícula extracelular" inclui, mas não está limitado a, todas as vesículas liberadas das células por qualquer mecanismo. "Vesículas extracelulares" incluem exossomas que são liberados de corpos multivesiculares e microvesículas que se desprendem da superfície celular. "Vesículas extracelulares" incluem vesículas criadas por exocitose ou ectocitose. "Vesículas extracelulares" abrangem exossomas liberados de corpos multivesiculares, vesículas liberadas por brotamento reverso, fissão de membrana(s), endossomas multivesiculares, ectossomas, microvesículas, micropartículas e vesículas liberadas por corpos apoptóticos, e vesículas híbridas contendo componentes da membrana plasmática. As vesículas extracelulares podem conter proteínas, ácidos nucléicos, lipídios e outras moléculas comuns à célula de origem.

[0058] Em um aspecto, as partículas de membrana plasmática ou exossomas podem ser purificados a partir de células alimentadoras que estimulam células imunes (como, por exemplo, células NK). Células alimentadoras de estimulação de células imunes para uso na invenção reivindicada, para uso na produção de partículas de membrana plasmática ou na produção de exossomas aqui divulgados podem ser células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) autólogas irradiadas ou alogênicas ou PBMCs autólogas ou alogênicas não irradiadas, RPMI8866, HFWT, 721.221, células K562, EBV-LCLs, células T transfectadas com uma ou mais IL-21 ligada à membrana, IL- 15 ligada à membrana, 4-1BBL ligada à membrana, OX40L ligada à membrana e/ou TNF-α da membrana, (tal como para exemplo, células T transfectadas com IL-21 ligado à membrana, células T transfectadas com 4-1BBL ligado à membrana, células T transfectadas com IL-15 e 4- 1BBL ligado à membrana, células T transfectadas com IL-21 ligado à membrana e 4-1BBL), células NK (incluindo, mas não se limitando a PBMCs, RPMI8866, NK-92, NK-92MI, NK-YTS, NK, NKL, KIL, KIL C.2, NK 3.3, células NK-YS, HFWT, K562) transfectadas com IL-21 ligada à membrana, células NK (incluindo, mas não se limitando a PBMCs, RPMI8866, NK-92, NK-92MI, NK-YTS, NK, NKL, KIL, KIL C.2, NK 3.3, NK-YS, HFWT, células K562) transfectadas com células 4-1BBL ligadas à membrana (incluindo, mas não se limitando a PBMCs, RPMI8866, NK- 92, NK-92MI, NK-YTS, células NK, NKL, KIL, KIL C.2, NK 3.3, NK-YS, HFWT, K562) transfectadas com IL-15 e 4-1BBL ligadas à membrana, ou células NK (incluindo, mas não se limitando a, PBMCs, RPMI8866, NK-92, NK-92MI, NK-YTS, NK, NKL, KIL, KIL C.2, NK 3.3, NK-YS, HFWT, células K562) transfectadas com IL-21 ligada à membrana e 4- 1BBL, bem como outras linhas celulares que expressam não HLA ou HLA baixo ou tumores primários derivados de pacientes.

[0059] As partículas de membrana plasmática e/ou exossomas usados nos métodos divulgados podem compreender ainda agentes efetores adicionais para expandir e/ou ativar células imunes (tais como, por exemplo, células NK). Assim, em um aspecto divulgado neste documento estão métodos de ensaio da potência de células imunes, em que as células alimentadoras usadas para gerar os exossomas divulgados ou partículas de membrana plasmática compreendem ainda pelo menos um agente efetor de célula imune adicional em sua superfície celular, em que o em pelo menos um agente efetor de células imunes adicional é uma citocina, uma molécula de adesão ou um agente de ativação de células imunes (como, por exemplo, 4-1BBL, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL- 21, MICA, LFA-1, 2B4, CCR7, OX40L, UBLP2, BCM1/SLAMF2, agonistas NKG2D, CD155, CD112, Jagged1, Jagged2, Delta-1, Pref-1, DNER, Jedi, SOM-11, sem asas, CCN3, MAGP2,

MAGP1, TSP2, YB-1, EGFL7, CCR7, DAP12 e DAP10, ligantes Notch, agonistas NKp46, agonistas NKp44, agonistas NKp30, outros agonistas NCR, agonistas CD16). Em um aspecto, o pelo menos um agente efetor de células imunes adicional compreende IL-21, 4-1BBL, IL-15, IL-21 e 4-1BBL, IL-21 e IL-15, ou IL-15 e 4-1BBL. Por conseguinte, em um aspecto, as partículas de membrana plasmática e exossomas gerados pelas referidas células de alimentação e usados nos métodos de ensaio da potência de células imunes divulgados neste documento podem compreender versões ligadas à membrana de qualquer combinação dos agentes de ativação de células imunes (tal como, para exemplo, 4- 1BBL, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, MICA, LFA-1, 2B4, CCR7, OX40L, UBLP2, BCM1/SLAMF2, agonistas NKG2D, CD155, CD112, Jagged1, Jagged2, Delta-1, Pref-1, DNER, Jedi, SOM-11, wingless, CCN3, MAGP2, MAGP1, TSP2, YB-1, EGFL7, CCR7, DAP12 e DAP10, ligantes Notch, agonistas NKp46, agonistas NKp44, agonistas NKp30, outros agonistas NCR, agonistas CD16). Por exemplo, os exossomas ou partículas de membrana plasmática podem ter IL-15, IL-21 e/ou 4- 1BBL em sua membrana.

[0060] É entendido e contemplado aqui que as células imunes devem ser expostas à partícula ou exossoma por um período de tempo para serem induzidas a produzir citocinas. Em um aspecto, são divulgados aqui métodos de teste da potência de uma célula imune, em que a célula imune é colocada em contato com uma quantidade eficaz de uma partícula de membrana plasmática, um lipossoma ou um exossoma (incluindo, mas não se limitando a exossomas projetados) por pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 150 minutos, 3, 4, 5,6 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 32, 36, 42, 48, 60 horas, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 45, 60, 61, 62 dias,

3, 4, 5 ou 6 meses.

[0061] Também são divulgados aqui métodos de ensaio da potência de uma célula imune de qualquer aspecto anterior, em que a partícula de membrana plasmática, o lipossoma ou o exossoma (incluindo, mas não se limitando a exossomas projetados) é fornecido a uma concentração de 5 µg/mL a 1000 µg/mL, Em um aspecto, a concentração da partícula ou exossoma é 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou 1000 1000 µg/mL. Em um aspecto, a concentração do exossoma ou partícula é de cerca de 50 µg/mL a 100 µg/mL, 50 µg/mL a 200 µg/mL, 50 µg/mL a 300 µg/mL, 50 µg/mL a 500 µg/mL ou 100 µg/mL a 500 µg/mL. Preferencialmente, a concentração do exossoma ou partícula é de cerca de 50 µg/mL a 400 µg/mL.

[0062] Em algumas modalidades, as células imunes são estimuladas usando exossomas de células cancerosas não modificadas, como K562 não modificado. No entanto, em outras modalidades, as células específicas do antígeno são estimuladas usando exossomas de células que expressam o antígeno. Por exemplo, células terapêuticas específicas do antígeno (por exemplo, células CAR-T, células CAR-NK) podem ser estimuladas com exossomas de K562 que expressam antígeno ou engajadores de células alvo (engajadores biespecíficos, BiTEs, BiKEs, TriNKETs) usando exossomas que expressam antígeno e células sanguíneas do paciente.

[0063] Em um aspecto, entende-se e contempla-se aqui que as mesmas citocinas produzidas para determinar a potência de uma célula imune também podem ser usadas para identificar as células que produzem as citocinas. As células imunes têm perfis de expressão distintos que são bem conhecidos na técnica. Também são divulgados aqui métodos para determinar a identidade de pelo menos uma célula imune ou uma população de células (como, por exemplo, diferenciação Th1, Th2, Th3, Th9, Th17, células T de memória efetoras (Tem), memória central T (células Tcm), células T ou células T reguladoras (Treg), células NK em repouso, células NK expandidas) com base na assinatura de citocinas associada a esse tipo de célula. Em um aspecto, são divulgados aqui métodos de ensaio da potência de uma célula imune (como, por exemplo, uma célula T, um macrófago, uma célula NK, célula T NK, célula T CAR e/ou célula NK CAR), compreendendo o contato de uma célula imune com uma quantidade eficaz de uma partícula de membrana plasmática, um lipossoma (incluindo lipossomas artificiais) ou um exossoma (incluindo, mas não limitado a exossomas projetadas) e a detecção da quantidade de uma ou mais citocinas (tais como, por exemplo, IL-2, IL-6, IFN-, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, quitinase tipo 3 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-I1, IL-32, IL- 34, IL-35, MMP-1, Osteocalcina, OPN, Pentraxin-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, RANTES e/ou TWEAK/TNFSF12) produzidos pela célula imune, em que a identidade da célula imune é divulgada com base no perfil das citocinas expressas. Kits para Avaliar a Potência das Células Imune

[0064] Outro aspecto da invenção fornece um kit para determinar a potência de uma célula imune (tal como, por exemplo, uma célula T, um macrófago, uma célula NK, célula T NK, célula T CAR e/ou célula NK CAR), compreendendo um recipiente incluindo uma quantidade eficaz de uma partícula ou exossoma (tal como, por exemplo, um exossoma (incluindo, mas não se limitando a exossomas projetados) ou partícula de membrana plasmática) e um tampão adequado para células imunes. Em algumas modalidades, o exossoma no kit é fornecido em uma concentração de 5 µg/mL a 1000 µg/mL. Em um aspecto, a concentração da partícula ou exossoma é 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 , 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200 , 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou

1.000 1.000 µg/mL. Em um aspecto, a concentração do exossoma ou partícula é de cerca de 50 µg/mL a 100 µg/mL, 50 µg/mL a 200 µg/mL, 50 µg/mL a 300 µg/mL, 50 µg/mL a 500 µg/mL ou 100 µg/mL a 500 µg/mL. Preferencialmente, a concentração do exossoma ou partícula é de cerca de 50 µg/mL a 400 µg/mL. Em algumas modalidades, o recipiente é um tubo de microcentrífuga (como, por exemplo, um tubo de microcentrífuga Eppendorf). Os kits também podem incluir uma ferramenta para obter uma amostra de um indivíduo, como uma seringa para obter uma amostra incluindo uma ou mais células imunes. Um tampão adequado é RPMI.

[0065] Os kits também podem incluir os componentes necessários para a realização de um imunoensaio, como uma fase sólida, à qual os anticorpos que funcionam como anticorpos de captura e/ou anticorpos de detecção em um formato de imunoensaio em sanduíche estão ligados. A fase sólida pode ser um material como uma partícula magnética, uma esfera, um tubo de ensaio, uma placa de microtitulação, uma cubeta, uma membrana, uma molécula de andaime, um cristal de quartzo, uma película, um papel de filtro, um disco ou um chip. O kit também pode incluir um marcador detectável que pode ser ou é conjugado a um anticorpo, tal como um anticorpo funcionando como um anticorpo de detecção. O marcador detectável pode ser, por exemplo, um marcador direto, que pode ser uma enzima, oligonucleotídeo, quimiluminóforo de nanopartículas, fluoróforo, inibidor de fluorescência, inibidor de quimioluminescência ou biotina. Os kits de teste podem incluir opcionalmente quaisquer reagentes adicionais necessários para detectar a marca.

[0066] O kit pode ainda incluir instruções para usar o kit para estimular a produção de citocinas por uma célula imune, a fim de avaliar a potência da célula imune. Em algumas modalidades, o kit inclui ainda instruções para usar a quantidade de citocina para determinar a potência da célula. Instruções incluídas nos kits podem ser afixadas no material de embalagem ou podem ser incluídas como um folheto informativo. Embora as instruções sejam tipicamente materiais escritos ou impressos, elas não se limitam a isso. Qualquer meio capaz de armazenar tais instruções e comunicá-las a um usuário final é contemplado por esta divulgação. Esses meios incluem, mas não estão limitados a, meio de armazenamento eletrônico (por exemplo, discos magnéticos, fitas, cartuchos, chips), meio óptico (por exemplo, CD- ROM) e semelhantes. Conforme usado neste documento, o termo "instruções" pode incluir o endereço de um site da internet que fornece as instruções. Métodos de imunoterapia

[0067] O método de determinado da potência de uma célula imune pode ser realizado antes do uso da célula imune como um agente imunoterapêutico. Por exemplo, o método de determinação da potência de uma ou múltiplas células imunes pode ser realizado conforme descrito acima, após o qual pelo menos uma célula imune potente pode ser selecionada (com base na quantidade de citocina detectada) e uma quantidade terapeuticamente eficaz do potente a célula imune pode ser entregue a um indivíduo como um imunoterapêutico. Assim, em um aspecto, é divulgado aqui métodos de imunoterapia que compreende a) realizar o método de ensaio da potência de uma célula imune (tal como, por exemplo, uma célula T, um macrófago, uma célula NK, célula T NK, célula T CAR, e/ou célula CAR NK) de qualquer aspecto anterior em múltiplas células imunes para determinar a potência de cada célula imune; b) selecionar pelo menos uma célula imune potente com base na quantidade de citocina (tal como, por exemplo, IL-2, IL-6, IFN-, TNF- α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, Quitinase 3 como 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, Osteocalcina, OPN, Pentraxina-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, RANTES e/ou TWEAK/TNFSF12) detectados; e c) administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da célula imune potente a um indivíduo em necessidade da mesma como um imunoterapêutico. Em um aspecto, o método pode compreender ainda extrair as múltiplas células imunes de um doador alogênico ou autólogo antes de testar a potência da célula imune.

[0068] Em algumas modalidades, as células imunes são células imunes imunoterapêuticas. As células imunes imunoterapêuticas são as que são úteis para o tratamento de doenças como o câncer. Becker et al., Cancer Immunol. Immunother 65, 477-484 (2016). O uso de células NK expandidas para o tratamento do câncer foi descrito. Rezvani et al., Front Immunol., 6, 578 (2015). Como é útil ser capaz de administrar um grande número de células imunes durante a imunoterapia, em algumas modalidades as células imunes são células imunes expandidas. Células imunes expandidas são as que são cultivadas ex vivo para desenvolver um grande número de células imunes. Em algumas modalidades, as células imunes expandidas são células autólogas que podem ser facilmente administradas a um indivíduo sem provocar uma resposta imune. No entanto, em algumas modalidades, as células imunes expandidas são células imunes alogênicas, nas quais sua alorreatividade inerente pode ser um benefício. Em outras modalidades, as células imunes expandidas são geneticamente modificadas para incluir receptores de antígenos quiméricos para ajudar as células imunes a atingirem o tecido doente. A preparação de células imunes expandidas inclui a ativação e expansão das células imunes. Koepsell et al., Transfusion, 53 (2): 404-10 (2013). Foi demonstrado que várias citocinas (IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IFNs tipo I e TGF-β) são úteis para ativar e expandir células imunes ex vivo. Por exemplo, em algumas modalidades, as células NK sendo avaliadas são células NK expandidas de IL-21. Por conseguinte, em um aspecto, são divulgados aqui métodos de imunoterapia compreendendo ainda a expansão de pelo menos uma célula imune potente antes de entregar uma quantidade terapeuticamente eficaz da célula imune potente.

[0069] Expansão refere-se à proliferação ex vivo de células NK de modo que a população de células NK seja aumentada. As células NK podem ser expandidas, por exemplo, a partir de células mononucleares do sangue periférico. No entanto, as células NK também podem ser expandidas a partir de outros tipos de células, como células-tronco hematopoiéticas ou células progenitoras. O sangue ou células-tronco iniciais podem ser isolados de uma variedade de fontes diferentes, como placenta, sangue do cordão umbilical, sangue da placenta, sangue periférico, baço ou fígado. A expansão ocorre em um meio de cultura de células. Os meios de cultura de células adequados são conhecidos pelos versados na técnica. As células expandidas podem ser fornecidas como uma linha celular, que é uma pluralidade de células que podem ser mantidas em cultura de células. Assim, em um aspecto, são divulgados aqui métodos de imunoterapia compreendendo ainda a expansão de pelo menos uma célula imune potente antes de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da célula imune potente. Em alguns aspectos, a célula imune foi extraída de um indivíduo usando métodos conhecidos antes de realizar o método de determinação da potência da célula imune. Alternativamente, a célula imune pode ser proveniente da expansão de uma cultura de células.

[0070] Em alguns aspectos, uma célula imune é direcionada para responder a um antígeno especificado. A célula imune pode ser direcionada para responder antes do método de determinação de sua potência ou após o método de determinação de sua potência. Em algumas modalidades, a célula imune é geneticamente alterada para responder a um antígeno especificado. O antígeno pode ser um antígeno específico do tumor, por exemplo. Em alguns aspectos, os métodos de imunoterapia incluem alterar geneticamente as células imunes para apresentar um receptor de antígeno quimérico (antes ou depois de determinar a potência da célula imune).

[0071] Conforme observado ao longo do método de determinação da potência de uma célula imune, pode ser usado como parte de um tratamento de transferência de células adotivo. A célula imune potente pode ser administrada a um indivíduo usando um carreador terapeuticamente aceitável. A administração intravenosa é convencionalmente usada para administrar células imunoterapêuticas, mas outros métodos também podem ser considerados (transplante direto para uma área localizada do corpo que necessita de imunoterapia, por exemplo).

[0072] A quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determinada comparando a quantidade de citocina produzida pela célula imune com o nível de potência da citocina necessário para o uso da célula imune em imunoterapia. Entende-se e contempla-se aqui que a quantidade terapeuticamente eficaz depende da célula imune a ser administrada, do indivíduo a ser tratado e da doença, distúrbio e/ou condição que está sendo tratada. Os versados na técnica saberão a dosagem apropriada de células imunes para usar que será terapeuticamente eficaz para o indivíduo a ser tratado.

[0073] Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma célula imune potente abrange uma pluralidade de células imunes potentes. Por exemplo, depois de selecionar pelo menos uma célula imune potente, a célula selecionada pode ser expandida in vitro para produzir uma pluralidade de células imunes potentes.

[0074] O indivíduo que recebe as células imunes potentes pode ser qualquer indivíduo que se beneficiaria de imunoterapia (como, por exemplo, um indivíduo com uma doença autoimune, doenças ou distúrbios inflamatórios, doenças virais e/ou infecções bacterianas). Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser um paciente com câncer. Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser um indivíduo com alto risco de desenvolver câncer, diagnosticado com câncer, sendo tratado para câncer ou se recuperando do câncer após a cirurgia. Em algumas modalidades, as células imunes potentes podem ser administradas a um indivíduo como um agente profilático para prevenir, inibir ou retardar o início do câncer ou uma metástase. Métodos de Tratamento de Doenças

[0075] É entendido e aqui contemplado que as células imunes potentes identificadas neste documento podem ser usadas no tratamento de qualquer doença ou distúrbio em que a imunoterapia adotiva pode ser usada para tratamento incluindo, mas não se limitando a doenças autoimunes, doenças inflamatórias ou distúrbios, doenças virais e/ou infecções bacterianas. Assim, em um aspecto, são divulgados aqui métodos de tratamento, inibição, redução, prevenção e/ou melhoria de um câncer e/ou metástase em um indivíduo que compreende a) obtenção de uma ou mais células imunes (como, por exemplo, uma célula T, um macrófago, uma célula NK, célula T NK, célula T CAR e/ou célula CAR NK) obtida de um doador alogênico ou autólogo); b) colocar uma célula imune em contato com uma quantidade eficaz de uma partícula de membrana plasmática, um lipossoma ou um exossoma (incluindo exossomas projetados); c) detectar a quantidade de uma citocina (como, por exemplo, IL-2, IL-6, IFN-, TNF-α, BAFF/TNFSF13B, CD163, CD30/TNFRSF8, quitinase tipo 3 1, gp130, IFN-α2, IL-6Rα, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-20, IL-22,

IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, MMP-1, Osteocalcina, OPN, Pentraxina-3, TNF-R1, TNF-R2, TSLP, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, RANTES e/ou TWEAK/TNFSF12) produzido pela célula imune; d) selecionar pelo menos uma célula imune potente com base na quantidade de citocina detectada; e e) administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da potente célula imune. Em alguns aspectos, o método pode compreender ainda a extração da célula imune de um doador autólogo ou alogênico.

[0076] É entendido e contemplado aqui que é útil ser capaz de administrar um grande número de células imunes durante a imunoterapia, em algumas modalidades as células imunes são células imunes expandidas. Células imunes expandidas são as que são cultivadas ex vivo para desenvolver um grande número de células imunes. Por conseguinte, são divulgados aqui métodos de tratamento, inibição, redução, prevenção e/ou melhoria de uma doença autoimune, doença inflamatória ou distúrbio, doença viral, infecção bacteriana, câncer e/ou metástase, compreendendo ainda a expansão de pelo menos uma célula imune potente antes para administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma célula imune potente.

[0077] É entendido e aqui contemplado que os métodos de tratamento divulgados podem ser usados para tratar qualquer doença ou condição onde ocorre a proliferação celular descontrolada, incluindo, mas não se limitando a, câncer e metástase. Uma lista representativa, mas não limitativa, de câncer que os métodos divulgados de usar células imune potentes podem ser usados para tratar é a seguinte: linfoma, linfoma de células B, linfoma de células T, micose fungoide, doença de Hodgkin, leucemia mieloide, câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer do sistema nervoso, cabeça e câncer de pescoço, carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, como câncer de pulmão de pequenas células e câncer de pulmão de células não pequenas, neuroblastoma/glioblastoma, câncer de ovário, câncer de pele, câncer de pele, câncer de fígado, melanoma carcinomas espinocelulares da boca, garganta, laringe e pulmão, câncer cervical, carcinoma cervical, câncer de mama e câncer epitelial, câncer renal, câncer geniturinário, câncer pulmonar, carcinoma esofágico, carcinoma de cabeça e pescoço, câncer de intestino grosso cancros hematopoiéticos; câncer de testículo; câncer de cólon, câncer retal, câncer de próstata ou câncer de pâncreas.

[0078] Exemplos de doenças autoimunes que podem ser tratadas usando os métodos divulgados incluem, mas não estão limitados a, Acalasia, Encefalomielite aguda disseminada, Neuropatia axonal motora aguda, Doença de Addison, Adipose dolorosa, Doença de Still do Adulto, Agammaglobulinemia, Alopecia areata, Doença de Alzheimer, Amiloidose, Espondilite anquilosante, Nefrite Anti-GBM/Anti- TBM, Síndrome antifosfolipídica, Anemia aplástica, Angioedema autoimune, Disautonomia autoimune, Encefalomielite autoimune, Enteropatia autoimune, Anemia hemolítica autoimune, Doença autoimune hemolítica, Hepatite autoimune, Hepatite autoimune, Orquite autoimune, Pancreatite autoimune, Síndrome polendócrina autoimune, Retinopatia autoimune, Urticária autoimune, Neuropatia axonal e neuronal (AMAN), Doença de Baló, Doença de Behçet, Enfigóide benigno da mucosa, Encefalite de Bickerstaff, Doença de Castle (CD), Doença de Castle, Celmanídeo Doença de Chagas, fati crônica Síndrome de gue, Polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP), Osteomielite multifocal recorrente crônica (CRMO), Síndrome de Churg-Strauss (CSS), Granulomatose Eosinofílica (EGPA), Penfigóide Cicatricial, Síndrome de Cogan, Doença de aglutinina fria, Bloqueio cardíaco congênito, Coxitis Síndrome CREST, doença de Crohn, Dermatite herpetiforme, Dermatomiosite, Doença de Devic

(neuromielite óptica), Diabetes mellitus tipo 1, Lúpus discóide, Síndrome de Dressler, Endometriose, Entesite, Esofagite Eosinofílica (EoE), Fasinoglobulina criulínica, Fasinofilia síndrome, Síndrome de Felty, Fibromialgia, Alveolite fibrosante, Arterite de células gigantes (arterite temporal), Miocardite de células gigantes, Glomerulonefrite, Síndrome de Goodpasture, Granulomatose com poliangiite, Doença de Graves, Síndrome de Guillain-Barre, Encefalopatia de Hashimoto, Ancefalopatia de Hashimoto, Hemimoto-Sconleína púrpura (HSP), herpes gestacional ou pemp higoide gestationis (PG), Hidradenite Supurativa (HS) (Acne Inversa), Hipogammalglobulinemia, IgA Nefropatia, Doença esclerosante relacionada a IgG4, Púrpura trombocitopênica imunológica (ITP), Miosite do corpo de inclusão (IBM), Cistite intersticial (CI), Doença inflamatória intestinal (IBD), artrite juvenil, diabetes juvenil (diabetes tipo 1), miosite juvenil (JM), doença de Kawasaki, síndrome de Lambert- Eaton, vasculite leucocitoclástica, líquen plano, líquen escleroso, conjuntivite lenhosa, doença por IgA linear (LAD), lúpus nefrite, Vasculite lúpica, doença de Lyme crônica, doença de Meniere, poliangiite microscópica (MPA), doença mista do tecido conjuntivo (MCTD), úlcera de Mooren, doença de Mucha-Habermann, Neuropatia motora multifocal (MMN) ou MMNCB, esclerose múltipla, miastenia gravis, miosite, Narcolepsia, Lúpus Neonatal, Neuromielite óptica, Neutropenia, Penfigoide cicatricial ocular, Neurite óptica, Tireoidite de Ord, Reumatismo Palindrômico (PR), PANDAS, Degeneração cerebelar paraneoplásica (PCD), Hemoglobinúria paroxística noturna (HPN), síndrome de Parry Romberg, Pars planitis (uveíte periférica), síndrome de Parsonnage-Turner, pênfigo, neuropatia periférica, encefalomielite perivenosa, anemia perniciosa (PA), síndrome de POEMS, síndrome de poliarterite tipo I, síndrome de poliarterite I, II, III, Polimialgia reumática, Polimiosite, Síndrome pós-infarto do miocárdio, Síndrome pós- pericardiotomia, Cirrose biliar primária, Colangite esclerosante primária,

Dermatite de progesterona, Psoríase, Artrite psoriática, Aplasia eritrocitária pura (PRCA), Pioderma gangrenoso, fenômeno de Raynaud Distrofia simpática reflexa, policondrite recorrente, síndrome das pernas inquietas (RLS), fibrose retroperitoneal, febre reumática, artrite reumatoide, vasculite reumatoide, sarcoidose, síndrome de Schmidt, síndrome de Schnitzler, esclerite, escleroderma, síndrome de Sjögren, autoimunidade ao esperma e testículo, síndrome da pessoa rígida (SPS), endocardite bacteriana subaguda (SBE), síndrome de Susac roma, coreia de Sydenham, oftalmia simpática (SO), lúpus eritematoso sistêmico, esclerodermia sistêmica, arterite de Takayasu, arterite temporal/arterite de células gigantes, púrpura trombocitopênica (TTP), síndrome de Tolosa-Hunt (THS), Mielite transversa, Mielite transversa, tipo 1 colite (UC), doença indiferenciada do tecido conjuntivo (UCTD), urticária, vasculite urticariforme, uveíte, vasculite, vitiligo, doença de Vogt-Koyanagi-Harada e granulomatose de Wegener (ou granulomatose com poliangiite (GPA)).

[0079] O exemplo a seguir é incluído para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Deve ser compreendido pelos versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam técnicas descobertas pelo inventor que funcionam bem na prática da invenção e, assim, podem ser consideradas para constituir modos preferidos para sua prática. No entanto, os versados na técnica devem, à luz da presente divulgação, compreender que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado igual ou semelhante, sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.

EXEMPLO

[0080] Os ensaios aqui divulgados pretendem testar a potência das células imunes terapêuticas que iriam resolver os problemas existentes para os métodos padrão atuais e satisfazer os requisitos da FDA. Para conseguir isso, exossomas derivados de K562 são usados como substitutos para induzir a produção de citocinas em células do sistema imune. K562 (linha de células de leucemia mieloide crônica) está sendo amplamente utilizado como linha de células alvo de controle universal em ensaios de citotoxicidade para células do sistema imune. Essas células K562 liberam regularmente exossomas - corpos multivesiculares formados por brotamento interno das membranas endossômicas. Os exossomas induziriam a produção de citocinas como as células K562, mas removeriam as variabilidades causadas pelo uso de células tumorais alvo. O ensaio eliminaria a necessidade de ter um laboratório de pesquisa totalmente operacional para testar a potência das células imunes terapêuticas em vários locais de infusão clínica e proporcionaria um tempo de resposta mais rápido para esses testes. Teste da Potência de Células Imunes Terapêuticas usando Exossomas Derivados de K562 como um Agente Estimulador

[0081] A capacidade dos exossomas para testar a potência das células imunes é demonstrada nas FIGS. 1 e 2. A FIG. 1 fornece um gráfico que as células NK terapêuticas podem produzir IL-2 ou IFN-γ através de qualquer um do teste de potência-PHA ou teste de potência de exossoma ou exossomas, demonstrando que o teste de potência de exossoma pode ser usado para células NK terapêuticas. A FIG. 2 fornece um gráfico que mostra que o ensaio de potência de exossoma também pode ser usado para identificar células NK terapêuticas expandidas por meio de alta produção de IL-2 e IFN-g. Além disso, células NK isoladas de doador saudável são estimuladas por este teste de potência e secretam outras citocinas, como APRIL/TNSF13, CD163 e BAFF, que podem ser usadas para o diagnóstico de deficiências de células NK em pacientes.

[0082] Testamos a produção de 29 citocinas e quimiocinas diferentes por células NK de 9 doadores diferentes em resposta a concentrações variáveis de exossomas CSTX002. Não houve diferença nos padrões de expressão entre as concentrações (Figura 3). Para avaliar especificamente a reprodutibilidade de cada citocina e a variação entre as concentrações de exossomas, foi testada a correlação de concentrações baixas (50 ug/mL) e altas (400 ug/mL) de exossomas em 29 citocinas e quimiocinas por células NK de 9 doadores diferentes. Houve uma correlação muito alta (r2 = 0,964) e menos de 2% de variação (declive - 1), indicando que uma ampla gama de concentrações de exossomo produzirá resultados idênticos (Figura 4).

[0083] A menos que definidos de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que compreendido geralmente pelos versados na técnica a qual esta invenção pertence. As publicações citadas neste documento e os materiais para os quais eles são citados especificamente estão incorporados por referência. No entanto, deve ser compreendido que qualquer patente, publicação ou outro material de divulgação, no todo ou em parte, que é dito estar incorporado por referência aqui está incorporado aqui apenas na medida em que o material incorporado não entra em conflito com as definições existentes, declarações ou outro material de divulgação estabelecido nesta divulgação. Como tal, e na medida do necessário, a divulgação conforme explicitamente estabelecida neste documento substitui qualquer material conflitante incorporado neste documento por referência. Qualquer material, ou parte do mesmo, que é dito como incorporado a título de referência aqui, mas que entra em conflito com as definições, declarações ou outros materiais de divulgação existentes estabelecidos no presente documento, será apenas incorporado na medida em que nenhum conflito surja entre esse material incorporado e o material de divulgação existente.

[0084] Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de confirmar usando não mais que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descritas no presente documento.

Embora a invenção tenha sido descrita com referência a modalidades e implementações particulares, será entendido que várias mudanças e variações adicionais podem ser feitas e equivalentes podem ser substituídos por elementos da mesma, sem se afastar do escopo da invenção ou do conceito inventivo da mesma.

Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma situação ou dispositivo específico aos ensinamentos da invenção sem se afastar do escopo essencial da mesma.

Tais equivalentes se destinam a ser abrangidos pelas seguintes reivindicações.

Pretende-se que a invenção não seja limitada às implementações particulares divulgadas aqui, mas que a invenção incluirá todas as implementações caindo dentro do escopo das reivindicações apensas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de teste da potência de uma célula imune, caracterizado pelo fato de que compreende o contato de uma célula imune com uma quantidade eficaz de uma partícula de membrana plasmática, um lipossoma ou um exossoma e a detecção da quantidade de uma citocina produzida pela célula imune.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de comparar a quantidade de citocina produzida com o nível de potência de citocina necessário para o uso da célula imune em imunoterapia.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade de uma pluralidade de citocinas é determinada.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula imune é uma célula T, um macrófago, uma célula exterminadora natural (NK), célula T NK, célula T do receptor de antígeno quimérico (CAR) ou célula NK CAR.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula imune é uma célula NK.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o exossoma é um exossoma de células cancerosas.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade de citocina é detectada usando um imunoensaio.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a citocina é selecionada a partir do grupo que compreende interleucina (IL)-2 (IL-2), IL-6, interferon (IFN)-γ (IFN- γ), membro da superfamília de ligante 13B de fator de ativação de células B/fator de necrose tumoral (TNF) (BAFF/TNFSF13B), TNF-α, cluster de diferenciação (CD) 163 (CD163), CD30/TNFRSF8, quitinase 3-tipo 1,

gp130, IFN-a2, IL-6Ra, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-20, IL-22, IL-26, IL-29/IFN-l1, IL-32, IL-34, IL-35, metaloproteinase-1 da matriz (MMP-1), Osteocalcina, Osteopontina (OPN), Pentraxina-3, fator de necrose tumoral (TNF) - receptor 1 (TNF-R1), TNF-R2, linfopoetina estromal tímica (TSLP), fator estimulador de colônia de granulócitos- macrófagos (GM-CSF), fator inibidor de leucemia (LIF) e a proteína inflamatória de macrófagos quimiocinas (MIP)-1α (MIP-1α), MIP-1β, RANTES e/ou indutor fraco de apoptose relacionado ao TNF (TWEAK)/ membro 12 da superfamília do TNF (TWEAK/TNFSF12).

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula imune é colocada em contato com uma quantidade eficaz da partícula de membrana plasmática, o lipossoma ou o exossoma por pelo menos 4 horas.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a partícula de membrana plasmática, o lipossoma ou o exossoma é fornecido em uma concentração de 50 µg/mL a 400 µg/mL.

11. Kit para avaliar a potência de uma célula imune, caracterizado pelo fato de que compreende um recipiente que inclui uma quantidade eficaz de uma partícula de membrana plasmática e/ou um exossoma e um tampão adequado para células imunes.

12. Kit, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a partícula de membrana plasmática, o lipossoma ou o exossoma é fornecido em uma concentração de 50 µg/mL a 400 µg/mL.

13. Kit, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o recipiente é um tubo de microcentrífuga Eppendorf.

14. Kit, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o kit compreende ainda instruções para usar o kit para estimular a produção de citocinas por uma célula imune.

15. Método de imunoterapia, caracterizado pelo fato de que compreende;

a. realizar o método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 em múltiplas células imunes para determinar a potência de cada célula imune; b. selecionar pelo menos uma célula imune potente com base na quantidade de citocina detectada; e c. administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da célula imune potente a um indivíduo em necessidade da mesma como um imunoterapêutico.

16. Método de imunoterapia, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende ainda extrair as múltiplas células imunes de um doador alogênico ou autólogo antes de testar a potência da célula imune.

17. Método de imunoterapia, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende ainda expandir a pelo menos uma célula imune potente antes de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da célula imune potente.

18. Método de imunoterapia, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende ainda direcionar as células imunes múltiplas ou a célula imune potente para responder a um antígeno especificado.

19. Método de imunoterapia, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que compreende ainda alterar geneticamente as múltiplas células imunes ou a célula imune potente para apresentar um receptor de antígeno quimérico.

20. Método para tratar, inibir, reduzir, prevenir e/ou melhorar um câncer e/ou metástase em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: a. obter uma ou mais células imunes; b. colocar uma célula imune em contato com uma quantidade eficaz de uma partícula de membrana plasmática, um lipossoma ou um exossoma; c. detectar a quantidade de uma citocina produzida pela célula imune; d. selecionar pelo menos uma célula imune potente com base na quantidade de citocina detectada; e e. administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz da célula imune potente.

21. Método para tratar, inibir, reduzir, prevenir e/ou melhorar um câncer e/ou metástase em um indivíduo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais células imunes é obtida de um doador alogênico ou autólogo.

22. Método para tratar, inibir, reduzir, prevenir e/ou melhorar um câncer e/ou metástase em um indivíduo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que compreende ainda extrair as múltiplas células imunes de um doador alogênico ou autólogo.

23. Método para tratar, inibir, reduzir, prevenir e/ou melhorar um câncer e/ou metástase em um indivíduo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que a célula imune é uma célula T, um macrófago, uma célula exterminadora natural (NK), célula T NK, célula T do receptor de antígeno quimérico (CAR) ou célula CAR NK.

24. Método para tratar, inibir, reduzir, prevenir e/ou melhorar um câncer e/ou metástase em um indivíduo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a expansão de pelo menos uma célula imune potente antes de administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma célula imune potente.