BR112021011276A2 - Peptídeos antimicrobianos - Google Patents

Abstract

peptídeos antimicrobianos. peptídeos antimicrobianos (amps), pequenos compostos que muitas vezes exibem atividade antimicrobiana de amplo espectro, estão ganhando interesse como potenciais terapêuticas contra patógenos bacterianos resistentes a antibióticos. o desenvolvimento de novas amps é árduo devido às limitações práticas das abordagens clássicas de descoberta baseada em proteínas. uma abordagem de bioinformática de alta eficiência é descrita, a qual é capaz de confirmar a identificação de amps conhecidos do genoma (rana (lithobates) catesbeiana) da rã-touro-americana e uma abordagem de bioinformática é usada para desenvolver novos amps. os amps descritos apresentam atividade antimicrobiana contra mycobacterium smegmatis através de ensaios de microtitulação de diluição de caldo, indicando eficácia mais ampla.

Description

PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisório dos EUA No. 62/778,450 depositado em 12 de dezembro de 2018, cuja matéria é incorporada por referência na presente invenção em sua totalidade.

DECLARAÇÃO SOBRE PESQUISA OU DESENVOLVIMENTO PATROCINADO FEDERALMENTE

[002] Esta invenção foi feita em parte com o apoio do governo dos Estados Unidos sob concessão No. R01HG007182, concedido pelos Institutos Nacionais da Saúde. O governo dos Estados Unidos possui certos direitos sobre a invenção.

CAMPO

[003] A presente invenção se refere geralmente a peptídeos antimicrobianos para o tratamento ou mitigação de doenças.

ANTECEDENTES

[004] Há uma necessidade de peptídeos e composições farmacêuticas dos mesmos que sejam úteis como terapias para infecções microbianas ou como agentes quimiopreventivos para retardar ou interromper a progressão de infecções microbianas.

[005] O uso de antibióticos no gado pode ter impacto direto e indireto no uso médico no tratamento de doenças humanas. O uso onipresente de antibióticos em todas as indústrias contribuiu para o surgimento de superbactérias que se tornaram resistentes aos antibióticos mais comuns. Algumas cepas ilustram a resistência a múltiplos fármacos, o que é uma preocupação global. Embora a busca por novas abordagens de antibióticos continue séria para enfrentar os desafios da saúde humana e animal.

[006] Os consumidores estão preocupados com o uso de antibióticos profiláticos devido ao potencial impacto ambiental, aumentando a resistência aos fármacos e o possível consumo de carne com antibióticos ou produtos lácteos. Restrições ao uso profilático de antibióticos em gado que foram implementadas para lidar com essas preocupações, mas têm consequências a jusante, como aumento nas taxas de infecções em animais, levando à perda de produtividade devido ao aumento da carga de doenças. Os animais doentes que são então tratados com antibióticos continuarão a contribuir para uma potencial resistência à fármacos. Aves e suínos criados em ambientes fechados são particularmente suscetíveis à rápida propagação de doenças. Diferentes abordagens para reduzir doenças infecciosas em animais de criação estão em desenvolvimento, incluindo investigação de novas abordagens de antibióticos e desenvolvimento de vacinas. Embora fármacos de moléculas pequenas tenham sido convencionalmente usados, abordagens terapêuticas de peptídeo antimicrobiano e polipeptídeo também estão sob consideração.

[007] É, portanto, desejável encontrar novas abordagens antimicrobianas para reduzir o aparecimento e a propagação de doenças em humanos e animais.

SUMÁRIO

[008] Os peptídeos e/ou sequências de aminoácidos com propriedades antimicrobianas são descritos na presente invenção. Uma abordagem de bioinformática, começando com sequências exibindo efeito e fazendo modificações estratégicas nas mesmas, levou à descoberta de peptídeos antimicrobianos. Em uma abordagem de bioinformática, similaridade suficiente entre as sequências pode ser mantida de modo a permitir a equivalência funcional. Sequências semelhantes a sequências isoladas das quais um consenso é derivado também são descritas. Essas sequências semelhantes contêm substituições de aminoácidos conservativas e um número limitado de modificações não conservativas.

[009] É um objetivo da presente invenção fornecer peptídeos antimicrobianos, que podem evitar ou mitigar pelo menos uma desvantagem das abordagens antimicrobianas anteriores.

[010] É descrito na presente invenção um peptídeo antimicrobiano compreendendo: uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:166, ou um fragmento ou variante das mesmas, tendo pelo menos 65% de identidade de sequência de aminoácidos com qualquer um de SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:166.

[011] Além disso, é descrita na presente invenção uma composição compreendendo o peptídeo antimicrobiano descrito junto com um excipiente adequado.

[012] A composição compreendendo o peptídeo antimicrobiano descrito pode ser uma composição para uso no tratamento ou prevenção de uma doença ou condição, como uma doença infecciosa.

[013] Um uso para o peptídeo antimicrobiano é fornecido, para o tratamento ou prevenção de uma doença ou condição em um indivíduo em necessidade do mesmo. Além disso, o uso do peptídeo antimicrobiano para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença ou condição em um indivíduo com necessidade do mesmo também é descrito na presente invenção. Adicionalmente, um método para tratar ou prevenção de uma doença ou condição é descrito, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz do peptídeo antimicrobiano ou composição do mesmo. A doença pode ser, por exemplo, uma doença infecciosa. O indivíduo pode ser um humano ou um animal, como um animal de criação ou um animal de estimação.

[014] Uma vesícula lipídica compreendendo o peptídeo antimicrobiano é descrita. Uma molécula de ácido nucleico que codifica o peptídeo antimicrobiano também é fornecida, assim como um vetor compreendendo essa molécula de ácido nucleico.

[015] É descrito um método para identificar uma molécula alvo associada a um agente infeccioso, no qual a molécula alvo se liga ao peptídeo antimicrobiano. O método compreende a etapa de triagem de uma biblioteca de moléculas alvo candidatas associadas ao agente infeccioso, para uma molécula que se liga ao peptídeo antimicrobiano. Um kit para conduzir tal método para identificar uma molécula alvo associada a um agente infeccioso também é descrito, em que o kit compreende o peptídeo antimicrobiano descrito na presente invenção junto com as instruções.

[016] Outros aspectos e características da presente invenção se tornarão evidentes para aqueles técnicos no assunto após a revisão da seguinte descrição de modalidades específicas em conjunto com as figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[017] As modalidades da presente invenção serão agora descritas, apenas a título de exemplo, com referência às Figuras anexas.

[018] A Figura 1 mostra alinhamentos Clustal ômega de sequências de precursores de AMP putativos com suas correspondências de AMP conhecidas mais próximas. O painel A compara ranatuerina-2PRc de Pseudacris regilla (SEQ ID NO:15) com HP2 de R. catesbeiana (SEQ ID NO:16). O painel B alinha sete sequências precursoras de ranatuerina (SEQ ID NO:17 a SEQ ID NO:23). O painel C alinha três sequências precursoras de ranaciclina de R. catesbeiana (SEQ ID NO:24 a SEQ ID NO:26). O painel D compara sequências precursoras de Catesbeianina-1 de R. catesbeiana (SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:28). O painel E alinha as sequências precursoras de Palustrin-Ca de R. catesbeiana (SEQ ID NO:29 e SEQ ID NO:30).

[019] A Figura 2 ilustra comparações de predição de estrutura secundária SABLE entre os peptídeos maduros derivados do Painel A - HP2; Painel B - HP3;

e Painel C - HP5 contra sequências de AMP maduras conhecidas. O painel D fornece uma legenda para as previsões SABLE com a posição do aminoácido (AA) indicada na parte superior, a estrutura secundária prevista no meio e a acessibilidade relativa ao solvente (RSA) na parte inferior.

[020] A Figura 3 ilustra que transcritos putativos e conhecidos que codificam AMP mostram expressão diferencial em pele do dorso (barras pretas), fígado (barras cinza escuro), epitélio olfatório (barras cinza claro) e barbatana caudal (barras brancas) do girino pré-metamórfico R. catesbeiana.

[021] A Figura 4 mostra alinhamentos Clustal ômega de sequências de precursores de AMP putativos com suas correspondências de AMP conhecidas mais próximas. O Painel A compara sequência de catelicidina-AL de Amolops loloensis (SEQ ID NO:31) com a sequência correspondente de catelicidina-AL de R. catesbeiana (SEQ ID NO:32). O Painel B compara sequência LEAP2 prevista de Nanorana Parkeri (SEQ ID NO:33) com a sequência LEAP2 de R. catesbeiana correspondente (SEQ ID NO:34).

[022] A Figura 5 mostra que dados de RNA-seq representando transcritos putativos e conhecidos que codificam os AMPs indicados são mostrados para o girino. Painel A - pele do dorso; Painel B - fígado; Painel C - epitélio olfatório; e barbatana caudal do Painel D dos controles (barras pretas) contra girinos expostos a T3 10 nM por 48h (barras cinza).

[023] A Figura 6 mostra os genes ranatuerina-1 e ranatuerina-3RC contendo 2 exões e que alternativamente sofrem splicing. A estrutura dos genes e transcritos derivados que codificam (Painel A) Ranatuerina-1 e Ranatuerina-1 (HP4), e (Painel B) Ranatuerina-3RC e ranatuerina-3RC (HP8), com a ilustração superior representando o gene desenhado para a escala indicada com as porções exônicas representadas como retângulos pretos e regiões intrônicas representadas pela linha preta espessa. As regiões intrônicas são mostradas como linhas finas que sofrem splicing nos transcritos marcados abaixo do gene. Retângulos cinza no transcrito que sofreu splicing indicam as regiões não traduzidas e retângulos hachurados indicam o quadro de leitura aberto.

[024] A Figura 7 mostra os genes ranatuerina-2PRc (HP2), ranatuerina-2RC e ranatuerina-4 tendo 3 exões. A estrutura dos genes e transcritos derivados que codificam (Painel A) Ranatuerina-2PRc (HP2), (Painel B) Ranatuerina-2RC e (Painel C) Ranatuerina-4 são mostradas.

[025] A Figura 8 mostra dois genes, um com 3 exões e outro com 1 exão, codificando ranaciclinas. A estrutura dos genes e transcritos derivados que codificam (Painel A) Ranaciclina-Ca e Ranaciclina-Cc, e (Painel B) Ranaciclina-Ca (HP3) são mostradas.

[026] A Figura 9 mostra Palustrin-Ca codificado por um gene de 2 exões, e Palustrin-Ca (HP9) e HP5 são codificados por genes de exão único. A estrutura dos genes e transcritos derivados que codificam (Painel A) Palustrin-Ca, (Painel B) Palustrin-Ca (HP9) e (Painel C) HP5 são mostradas.

[027] A Figura 10 ilustra LEAP2 e Catelicidina-AL como derivados de quatro exões. A estrutura dos genes e transcritos derivados que codificam LEAP2 (Painel A) e (Painel B) Catelicidina-AL de R. catesbeiana são mostradas.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[028] Os peptídeos e/ou sequências de aminoácidos com propriedades antimicrobianas são descritos na presente invenção. Uma abordagem de bioinformática, começando com sequências exibindo efeito e fazendo modificações estratégicas nas mesmas, levou à descoberta de peptídeos antimicrobianos. Em uma abordagem de bioinformática, similaridade suficiente entre as sequências pode ser mantida de modo a permitir a equivalência funcional. Sequências semelhantes a sequências isoladas das quais um consenso é derivado também são descritas. Essas sequências semelhantes podem conter substituições de aminoácidos conservativas junto com um número limitado de substituições não conservativas, tais como modificações ou deleções, mas ainda mantendo a funcionalidade.

[029] Estes peptídeos e suas composições farmacêuticas e modificações dos mesmos também são úteis como terapias para infecções microbianas ou como agentes quimiopreventivos para retardar ou interromper a progressão de infecções microbianas. As modificações de peptídeos descritas na presente invenção podem incluir, mas não estão limitadas à incorporação dos peptídeos ou suas modificações em vesículas lipídicas para distribuição terapêutica melhorada e a modulação de outras propriedades de ADMET (absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade) também.

[030] Modificações químicas dos peptídeos são descritas, as quais são conhecidas pelos técnicos no assunto da química de peptídeos como sendo úteis para aumentar a estabilidade e, de outra forma, tornar os peptídeos mais semelhantes a fármacos e úteis para as aplicações desejadas. Essas modificações incluem a ciclização de peptídeos e o uso de aminoácidos de quiralidade oposta - os chamados D-aminoácidos. Essas modificações também incluem químicas alternativas de cadeia principal e novas cadeias laterais que retêm a especificidade de ligação.

[031] Também é descrita a aplicação dos peptídeos e modificações dos peptídeos óbvias para os técnicos no assunto a outros alvos microbianos. Terapias antimicrobianas úteis e eficazes em um tipo de infecção podem ser úteis e eficazes em outras doenças.

[032] Também são descritos construtos de vetor que incorporam os peptídeos revelados e/ou suas sequências de aminoácidos e sequências de ácido nucleico codificantes para os fins da produção de peptídeos antimicrobianos.

[033] Os peptídeos descritos na presente invenção e as modificações dos mesmos também são úteis em combinação com outros agentes antimicrobianos para o tratamento ou prevenção de doenças, como uma doença infecciosa ou um câncer.

[034] Também são descritos os usos dos AMPs isoladamente ou como parte de um kit em um procedimento para isolar e identificar seus parceiros de ligação (moléculas alvo) associados ao agente infeccioso.

[035] Os peptídeos e/ou sequências de aminoácidos descritos na presente invenção têm propriedades antimicrobianas seletivas. Outros aspectos e vantagens se tornarão evidentes a partir da consideração da descrição que se segue de várias modalidades. Um técnico no assunto perceberá que outras modalidades, combinações e variações são possíveis e que os detalhes descritos na presente invenção podem ser modificados em uma série de aspectos, tudo sem se afastar do conceito geral. Assim, os seguintes desenhos, descrições e exemplos devem ser considerados como ilustrativos por natureza e não restritivos.

[036] O tratamento ou prevenção de uma doença ou condição abrange o tratamento antes e depois de sinais ou sintomas externos da doença ou condição estarem presentes no indivíduo. Por exemplo, um indivíduo exposto a um agente infeccioso pode ou não apresentar sintomas. Além disso, a prevenção ou profilaxia de uma doença ou condição pode abranger a prevenção parcial, diminuição da gravidade quando os primeiros sintomas ocorrem, diminuição da probabilidade de sinais ou sintomas externos ou prevenção da propagação da infecção, mantendo a gravidade tão baixa que seja indetectável ou insignificante. O tratamento e a prevenção podem envolver a modulação do sistema imunológico do indivíduo na medida em que as próprias defesas do indivíduo afastam a doença ou condição, como a infecção. Um efeito inflamatório ou anti-inflamatório dos peptídeos descritos na presente invenção pode modular os sinais ou sintomas externos de uma doença ou condição.

[037] A atividade anticâncer, tal como contra tumores sólidos ou tumores líquidos, pode ser modulada por peptídeos como descrito na presente invenção. O ataque indireto às células cancerosas pelos peptídeos descritos na presente invenção por meio de efeitos no sistema imunológico pelos peptídeos pode aliviar o crescimento das células cancerosas.

[038] Um peptídeo antimicrobiano é descrito compreendendo: uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:166, ou um fragmento ou variante das mesmas, tendo pelo menos 65% de identidade de sequência de aminoácidos com qualquer uma das SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:166. O limite de identidade de sequência de aminoácidos para a variante ou fragmento pode ser opcionalmente pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos para qualquer uma das SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:166.

[039] O peptídeo antimicrobiano pode ser modificado ou pode ser uma variante que compreende uma modificação que é uma substituição conservativa de aminoácidos. Essas sequências de aminoácidos, como são conhecidas no estado da técnica, podem incluir os seguintes candidatos, com as opções substituíveis mostradas entre parênteses: Ala (Gly, Ser); Arg (Gly, Gln); Asn (Gln, His); Asp (Glu); Cys (Ser); Gln (Asn, Lys); Glu (Asp); Gly (Ala, Pro); His (Asn, Gln); Ile (Leu, Val); Leu (Ile, Val); Lys (Arg, Gln); Met (Leu, Ile); Phe (Met, Leu, Tyr); Ser (Thr, Gly); Thr (Ser; Val); Trp (Tyr); Tyr (Trp, Phe); e Val (Ile, Leu). Além disso, variantes, mutações, inserções ou deleções "funcionais" abrangem sequências nas quais a atividade ou função é substancialmente a mesma que aquela da sequência de referência da qual a sequência alterada é derivada. A atividade ou função pode ser testada de acordo com os parâmetros descritos na presente invenção, como MIC ou MBC. Além disso, pode ser desejável reduzir a antigenicidade de um peptídeo, por exemplo, por PEGuilação ou o peptídeo pode compreender um D-aminoácido. O peptídeo pode ser ciclizado.

[040] O peptídeo antimicrobiano pode ser um peptídeo ou um fragmento que tem até 30 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, pode ser um peptídeo ou um fragmento de até 20 aminoácidos de comprimento. Um exemplo de peptídeo antimicrobiano pode ser aquele compreendendo ou consistindo em uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:65.

[041] É descrita na presente invenção uma composição que compreende o peptídeo antimicrobiano como descrito na presente invenção junto com um excipiente adequado, tal como um carreador farmaceuticamente aceitável. A composição pode ser adequada para uso no tratamento ou prevenção de uma doença ou condição, como uma doença infecciosa ou um câncer, tal como pode ser atribuída a um tumor sólido ou a um tumor líquido.

[042] A composição pode ser formulada para distribuição oral, injetável, retal, tópica, transdérmica, nasal ou ocular. Essas composições podem assim ser administradas a indivíduos em necessidade das mesmas por qualquer via aceitável, tal como topicamente (como em pós, pomadas ou gotas); comprimidos orais, cápsulas, géis ou líquidos; ou supositórios retais. Outros modos de distribuição incluem mucosa, sublingual, parenteral, intravaginal, intraperitoneal, bucal, ocular ou intranasal.

[043] Quando formulados para uso oral ou administração em uma formulação líquida, os excipientes ou ingredientes podem incluir, mas não estão limitados aos aceitos na arte de formulações farmacêuticas, por exemplo, emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires. As formas de dosagem líquidas podem conter diluentes inertes, tais como água ou outros solventes, agentes solubilizantes, emulsificantes, álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol ou dimetilformamida. Além disso, uma formulação líquida pode compreender óleos tais como óleo de semente de algodão, amendoim, milho, gérmen, azeitona, rícino e gergelim; glicerol, álcool tetra-hidrofurfurílico, polietilenoglicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitano; e misturas dos mesmos. Além dos diluentes inertes, essas composições orais também podem incluir adjuvantes, tais como agentes umectantes, agentes emulsionantes e suspensores, edulcorantes, aromatizantes e agentes perfumantes.

[044] A composição pode ser liofilizada. A composição pode compreender um conservante adequado.

[045] A composição pode ser aquela que é distribuída uniformemente em uma dieta destinada a gado, como suínos ou aves. Tal composição pode ser pulverizada ou misturada em um ingrediente moído ou em pó e, em seguida, misturada uniformemente em uma ração animal mais grossa para garantir uma distribuição uniforme.

[046] Um uso do peptídeo antimicrobiano é fornecido na presente invenção, para o tratamento ou prevenção de uma doença ou condição em um indivíduo em necessidade do mesmo, tal como uma doença infecciosa. A doença ou condição pode ser um câncer, como um tumor sólido ou um tumor líquido.

[047] Além disso, é fornecido um uso para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de tal doença ou condição em um indivíduo em necessidade do mesmo. Um método para tratar ou prevenir tal doença ou condição também é descrito na presente invenção, o qual compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz do peptídeo ou da composição descrita na presente invenção.

[048] A doença ou condição pode ser atribuída a bactérias Gram-negativas ou pode ser uma doença ou condição atribuível a bactérias Gram-positivas. A doença ou condição pode ser atribuível a bactérias álcool-ácido resistentes ou atribuível a bactérias que se tornaram resistentes a outros fármacos. Essas doenças ou condições podem ser atribuíveis a bactérias E. coli, S. enterica, S. aureus, P. aeruginosa, S. pyogenes, M. smegmatis, MRSA, S. enteritidis ou S. heidelberg.

[049] Além disso, a doença ou condição pode ser um câncer, como um tumor sólido ou um tumor líquido.

[050] Uma vesícula lipídica pode ser usada para distribuir o peptídeo antimicrobiano descrito na presente invenção. Uma molécula de ácido nucleico que codifica o peptídeo antimicrobiano descrito também é prevista. Um vetor que compreende a molécula de ácido nucleico também é abrangido.

[051] É descrito um método para identificar uma molécula alvo associada a um agente infeccioso, em que a molécula alvo se liga ao peptídeo antimicrobiano descrito na presente invenção. Tal método envolve a etapa de triagem de uma biblioteca de moléculas alvo candidatas associadas ao agente infeccioso, para uma molécula que se liga ao peptídeo antimicrobiano. O agente infeccioso pode ser uma bactéria Gram-negativa ou pode ser uma bactéria Gram-positiva. Além disso, o agente infeccioso pode ser bactéria álcool-ácido resistente ou bactéria que se tornou resistente a outros fármacos. Agentes infecciosos exemplares incluem, mas não estão limitados a bactérias E. coli, S. enterica, S. aureus, P. aeruginosa, S. pyogenes, M. smegmatis, MRSA, S. enteritidis ou S. heidelberg. Além disso, é descrito um método para identificar uma molécula alvo para modular a atividade biológica, em que a molécula alvo se liga a um peptídeo como descrito na presente invenção. O método compreende a etapa de triagem de uma biblioteca de moléculas alvo candidatas para uma molécula que se liga ao peptídeo. A modulação da atividade biológica pode compreender ação antitumoral, ação anti-inflamatória ou ação inflamatória. Em tais métodos de identificação de alvo, a triagem de uma biblioteca de moléculas alvo candidatas pode compreender triagem in silico.

[052] Um kit é incluído na presente invenção para identificar uma molécula alvo associada a um agente infeccioso. Tal kit compreende um peptídeo antimicrobiano conforme descrito na presente invenção junto com instruções para conduzir o método descrito na presente invenção para identificar uma molécula alvo associada ao agente infeccioso. Opcionalmente, reagentes adicionais podem ser fornecidos com o kit. Um kit para identificar uma molécula alvo para modular a atividade biológica também é descrito. Tal kit compreende um peptídeo, conforme descrito na presente invenção junto com instruções para conduzir um método de triagem para moléculas que se ligam ao peptídeo.

EXEMPLOS

[053] Os exemplos a seguir descrevem modalidades exemplares e/ou estudos conduzidos a respeito das mesmas. Embora os exemplos sejam ilustrativos, eles não devem ser vistos como limitantes. EXEMPLO 1 ABORDAGEM DE BIOINFORMÁTICA: PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS DE TRANSCRITOS DE R. CATESBEIANA

[054] Sumário. Peptídeos antimicrobianos (AMPs) exibem atividade antimicrobiana de amplo espectro e são promissores como novos agentes terapêuticos. Enquanto a rã-touro norte americana adulta (Rana [Lithobates] catesbeiana) é uma fonte prolífica de AMPs de alta potência, o girino aquático representa uma fonte relativamente inexplorada para novas descobertas de AMP. A recente publicação do genoma da rã-touro e recursos transcriptômicos fornece uma ponte oportuna entre AMPs conhecidos e a descoberta de AMP baseada em bioinformática. O objetivo do presente estudo foi identificar novos AMPs com potencial terapêutico usando uma bioinformática combinada e uma abordagem baseada em laboratório úmido. No presente estudo, foram identificados sete novos transcritos que codificam o precursor de AMP expressos no girino. A comparação de suas sequências de aminoácidos com AMPs conhecidos revelou evidências de conservação de sequência de peptídeo maduro com variação na sequência prepro. Duas sequências de peptídeos maduros foram únicas e demonstraram atividade bacteriostática e bactericida contra micobactéria, mas não bactérias Gram-negativas ou Gram-positivas. Nove conhecidos e sete novos transcritos que codificam AMP foram detectados na pele do dorso, epitélio olfatório, fígado e/ou barbatana caudal do girino pré- metamórfico. O tratamento de girinos com 10 nM de 3,5,3'-triiodotironina por 48h não afetou a abundância de transcritos na pele do dorso e teve impacto limitado sobre esses transcritos nos outros três tecidos. O mapeamento de genes revelou uma diversidade considerável em tamanho (1,6-15 kbp) e número de exão (um a quatro) de genes que codificam AMP com evidência clara de splicing alternativo levando a diversidade de sequência de aminoácidos prepro e maduro. Essas descobertas verificam a precisão e a utilidade da montagem do genoma da rã-touro e estabelecem uma base sólida para a descoberta de AMP baseada em bioinformática.

INTRODUÇÃO

[055] A resistência aos antibióticos entre os patógenos bacterianos que causam doenças globais prevalentes surgiu como uma das ameaças públicas mais críticas que o mundo enfrenta hoje1-3. Uma análise realizada pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças estima que pelo menos 23.000 mortes nos Estados Unidos a cada ano são atribuídas a infecções causadas por organismos resistentes a antibióticos1. Em 2015, a Organização Mundial da Saúde endossou um plano de ação global para combater a resistência antimicrobiana com objetivos estratégicos que incluem a otimização do uso de agentes antimicrobianos e investimento sustentável no combate à resistência antimicrobiana4. Consequentemente, a descoberta e o desenvolvimento de antimicrobianos alternativos são uma necessidade global urgente. Como uma alternativa à terapia antibiótica tradicional, os peptídeos antimicrobianos (AMPs) estão ganhando interesse como potenciais terapêuticos5. Os AMPs são uma classe diversa de peptídeos produzidos por todos os organismos multicelulares como defesa contra um amplo espectro de patógenos, incluindo bactérias, fungos e vírus, e são considerados componentes centrais do sistema imunológico inato6-8.

[056] Embora os AMPs gerais exibam sequência e diversidade estrutural notáveis, as semelhanças incluem um comprimento típico menor que 100 aminoácidos, uma carga líquida positiva e associação em um dos quatro grupos distintos com base em suas estruturas secundárias: fita-β, α-hélice, bobina estendida e loop. Desses grupos, os AMPs de α-hélice são os mais estudados e mais comuns6,9,10. A natureza catiônica dos AMPs, junto com uma distribuição de resíduos hidrofóbicos, permite que esses peptídeos interajam e neutralizem os patógenos e contribuam para sua função geral6,11.

[057] A estrutura de AMP pode mostrar variabilidade na árvore da vida12. Os AMPs de anfíbios são geralmente compostos por uma pré-sequência do peptídeo sinal N-terminal, uma pró sequência adjacente que funciona para manter o AMP em uma conformação inativa e uma sequência peptídica madura de C-terminal. Todos os AMPs eucarióticos são sintetizados como precursores que são processados proteoliticamente por propeptídeo convertase para produzir peptídeos maduros ativos8,13-15. Embora os peptídeos de sinal de AMP e as pró sequências sejam normalmente conservados dentro de famílias, as sequências de peptídeos maduros variam consideravelmente e constituem a porção funcional do peptídeo antimicrobiano8. Essas características podem ser exploradas para identificar e caracterizar novos AMPs a partir de um grande conjunto de dados10. Além disso, devido aos mecanismos multifacetados de ação antimicrobiana empregados pelos AMPs, como a destruição de membranas microbianas16, inibição da síntese de macromoléculas17, e modulação induzida por peptídeo do sistema imunológico18, os micróbios têm menos probabilidade de desenvolver resistência contra esses peptídeos do que contra os antibióticos convencionais. Vários AMPs são usados atualmente em um ambiente clínico, e muitos mais AMPs estão passando por ensaios clínicos para verificar seu potencial terapêutico11.

[058] As abordagens predominantes para isolar novos AMPs envolvem análises baseadas em cromatografia e/ou espectrometria de massa de amostras de proteínas de fluidos ou tecidos corporais em combinação com ensaios antimicrobianos, sequenciamento de peptídeos e síntese de peptídeos de novo. No entanto, a expressão da proteína específica ao contexto, o custo de implementação e a experimentação de baixo rendimento associada aos métodos tradicionais de identificação de AMP que empregam química analítica têm impedido o progresso da descoberta de AMP. Isso enfatiza a necessidade de desenvolver uma abordagem alternativa para a identificação de novos AMPs com potencial terapêutico.

[059] A pele da rã adulta é uma fonte abundante de AMPs devido às glândulas granulares especializadas na derme que sintetizam e armazenam esses peptídeos, que são secretados na superfície da pele ao primeiro sinal de lesão ou desafio microbiano6,9,19. De uma perspectiva de sobrevivência evolutiva, este rico repertório de AMPs dentro da pele de sapo é uma adaptação benéfica para seus ambientes úmidos e lamacentos, onde os patógenos são abundantes. No momento em que este texto foi escrito, o banco de dados de peptídeos antimicrobianos (APD) com curadoria19 contém sequências para 978 peptídeos ativos originários da pele de sapo (de 1043 peptídeos de anfíbios). Isso representa 34% do compêndio do banco de dados de AMP, que inclui sequências de peptídeos derivadas de seis reinos, incluindo bactérias, arqueias, protistas, fungos, plantas e animais, bem como alguns peptídeos sintéticos (http://aps.unmc.edu/AP/main.php). Além disso, a utilidade e eficácia de alguns AMPs de sapo como potencial terapêutico foi demonstrada anteriormente20-22.

[060] A secreção de AMP não se limita apenas aos anfíbios, nem à pele ou a um estágio de desenvolvimento específico. Por exemplo, os peptídeos antimicrobianos expressos no fígado (LEAPs) são altamente abundantes no fígado e no intestino e, em humanos e peixes, são secretados no sangue 23-25. Como anfíbios, a maioria das rãs vivencia a vida em duas formas pós embrionárias distintas: como um girino larval aquático de vida livre e como uma rã terrestre que respira ar. As demandas sobre o sistema imunológico inato diferem, pois os tipos de patógenos que vivem em cada ambiente podem diferir substancialmente. Portanto, há uma oportunidade para identificar novos AMPs expressos na fase larval. Os estudos específicos de girinos conduzidos até agora se concentraram em testar secreções naturais da pele coletadas de uma mistura de diferentes girinos envelhecidos após imersão ou injeção de norepinefrina. Isso estabeleceu que essas secreções da pele poderiam defender contra a infecção por vermes parasitas e sobrevivência26. Usando espectrometria de massa, Woodhams e colegas de trabalho27 compararam as secreções cutâneas induzidas por norepinefrina de 17 espécies de rãs e descobriram que Ranatuerina-2, -4, -6, -7, -8 e -9, Palustrina-2CBa, Bradicinina, Temporina-1P e Ranalexina eram os peptídeos mais abundantes. Geralmente, os girinos tinham uma proporção menor de AMPs em relação aos adultos, mas seus perfis são distintos entre si27. Destes, Ranatuerina-2, -7, -8, -9 e Ranalexina foram encontrados mesmo na ausência de indução de norepinefrina27. Um achado interessante foi que girinos com períodos larvais mais longos, como o de R. catesbeiana, produziu uma resposta de defesa de AMP maior do que girinos com períodos larvais curtos, mostrando investimento diferencial na resposta imune inata nesta fase de desenvolvimento aquático27.

[061] Na presente invenção, é demonstrado o desenvolvimento de uma abordagem de bioinformática para a identificação e caracterização de AMPs putativos com base na homologia de peptídeos. Um banco de dados de sequência de AMP com curadoria manual foi usado para pesquisar os ricos recursos genômicos compilados para a rã-touro norte americana, Rana (Lithobates) catesbeiana28. Dois novos AMPs de rã-touro foram identificados demonstrando atividade antimicrobiana por um método de microtitulação de diluição de caldo estabelecido29. Por meio de métodos computacionais aplicados a dados de transcriptômica e genoma, o perfil de expressão e as estruturas gênicas de vinte transcritos que codificam AMP foram examinadas, dezesseis das quais são encontradas em tecidos de girinos.

RESULTADOS

[062] Identificação de transcritos putativos que codificam AMP. Um passo a passo sistemático in silico consultado do banco dados do Transcriptoma de Referência Anotado da Rã-touro (BART28) está delineado na seção Métodos e resultou na identificação de sete transcritos de R. catesbeiana que codificam novos AMPs precursores (mostrado na Tabela 1) e onze AMPs precursores conhecidos (mostrado na Tabela 2).

[063] A Tabela 1 mostra as características de sequências de AMP putativos identificadas por meio de análise de bioinformática de dados de RNA-seq de girino de rã-touro. Cada sequência de peptídeo é separada na sequência prepro e na sequência de peptídeo maduro presumida. As previsões computacionais de carga líquida, peso molecular (MW) e ponto isoelétrico (pI) do peptídeo maduro são mostradas, bem como uma ID de peptídeo para fácil referência. Tabela 1 Sequências Prepro e Sequências de Peptídeo Putativo Maduro Sequência de Peptídeo Cobrança ID do Sequência Prepro MW pI Putativo Maduro Efetiva Peptídeo

MFTMKKSLLLLFFLGTIS AFLSTVKNTLTNVAGTMI

LSLCEQERNADDDQGE DTFKCKITGVC (SEQ ID +2 3077,7 8,6 HP2 VIEQKVKR (SEQ ID NO:2) NO:1)

VLLYLIITVSFPRRDAND

SLSGCWTKSFPRKPCLRN EDGGEVTKEVVKR +5 2236,6 10,9 HP3 R (SEQ ID NO:4) (SEQ ID NO:3)

MSSFCEITNVALTISLSS SMLSVLKNLGKVGLGFV PRRGADEEEGNGEKEIK ACKINKQC (SEQ ID +4 2651,3 9,6 HP4 R (SEQ ID NO:5) NO:6)

MTQSTQKWFKTKYWR NPSNLRALEELVKEECSEI

VRNRPAMSPDLNPIEH PVERCKKLIYGYRK (SEQ +1 3908,5 8,0 HP5 LWRDLKKVVGKR (SEQ ID NO:8) ID NO:7)

MRKRMTMRRMMKKK MMRVMRRKTKVIWEKK KSEKERRERGKR (SEQ DFIGLYSID (SEQ ID +4 3144,8 10,2 HP6 ID NO:9) NO:10)

MFFMSSPRRDADEVKE GFLDIIKNLGKTFAGHML VKR DKIKCTIGTCPPSP +2 3417,1 8,6 HP8 (SEQ ID NO:11) (SEQ ID NO:12)

MITVSSPRRDADGDEG GFLDIIKDTGKEFAVKILN EVEEVKR (SEQ ID NLKCKLAGGCPP (SEQ ID +2 3304,0 8,6 HP9 NO:13) NO:14)

[064] Os AMPs precursores "novos" traduzidos incluem um sítio de clivagem de tripsina (um sítio de clivagem de convertase comum em AMPs) e, além de uma sequência que começa com uma valina (HP3), todos têm uma metionina no N-terminal (Tabela 1). Além disso, todos os peptídeos putativos maduros possuem uma carga líquida positiva prevista em pH neutro, têm entre 19 e 33 AA de comprimento e têm pontos isoelétricos (pI) entre 8,0 e 10,9 (tabela 1). Todas essas propriedades físico-químicas são consistentes com as dos AMPs conhecidos19.

[065] A Tabela 2 mostra características de transcrito, proteína e gene de 20 AMPs conhecidos e putativos avaliados no presente estudo. Tabela 2 Características de transcrito, proteína e gene de 20 AMPs conhecidos e putativos avaliados no presente estudo. Novos Sequência de Sequência de transcritos de Informações do nucleotídeos proteína Rana gene de Rana NCBI mais precursora NCBI catesbeiana do catesbeiana próxima mais próxima

BART Suporte do genoma/Fita/ Comprimento do Número de Número de suporte Número de Acesso/ Acesso/ (bp)/[Intervalo de Nome acesso/ Comprimento Comprimento sobreposição com a do AMP comprimento (nt)/ (AA)/ sequência de (nt) Comprimento Espécie consulta pela (AA) posição do suporte nt]/Número do Exão catesbeianina-1 FJ830640/ ACR84056/42/ N/Aa Nenhum 324 Rana/catesbeiana catesbeianina-1 FJ830640/ ACR84056/42/ GFBS014792 Nenhum

(HP6) 324 Rana/catesbeiana 82/626/51 catelicidina- KF766531/ AHW58221/ MH800186/ Nenhum tipo-2 700 156/Rana/ 753/155 catesbeiana catelicidina-AL JF923766/ AEI69698/179/ MH800187/ Rc- 648 Amolops/loloensis 1019/181 03r170621s387134 /Rc- 03r170621s67282 /+/- /1650/14834/[1- 400/9076-8969, 7977-7888, 5747- 5490]/4 catelicidina- KF766530/ AHW58220/ MH800188 Nenhum RC1 677 151/Rana /926/151 catesbeiana catelicidina- KF766531/ AHW58221 MH800189/ Nenhum RC2 700 /156/Rana 753/155 catesbeiana HP5 Nenhum Nenhum GFBS01753449 Rc- /1523/76 03r170621s32519/ +/36533/[3251- 4772]/1 leap2 XM_0185632 XP_018418722 MH800190/ Rc- 20/469 81/Nanorana 3507/81 03r170621s1377; parkeri Rc- 03r170621s5616/+/ +/[279751/ 290780]/[62065- 62169, 73789- 73937, 77722- 79756/141039- 142257]/4 palustrina-Ca FJ830669/ ACR84085/ N/A Rc- 322 71/Rana 03r170621s223822 catesbeiana /Rc- 03r170621s451975/ +/+/[2611/1423]/[2 144-2217/128- 343]/2 palustrina-Ca FJ830669/ ACR84085/ GFBS01150567 Rc- (HP9) 322 71/Rana /527/54 03r170621s46320b catesbeiana /+/24012/[18718- 19222]/1 ranaciclina-Ca FJ830643/ ACR84059/ N/A Rc- 311 63/Rana 03r170621s43867 catesbeiana /+/25684/[10079- 10152, 12881- 13068]/2 ranaciclina-Ca FJ830643/ ACR84059/63/ GFBS01071740 Rc- (HP3) 311 Rana catesbeiana /1143 / 50c 03r170621s29221 / - / 41060 / [20482- 19341] / 1 ranaciclina-Cc FJ830653/ ACR84069/67/ GFBS01607132 Rc- 296 Rana catesbeiana / 524 / 62 03r170621s43867 /-/25684/[8419- 8475, 10070-10152, 12881-13075]/3 ranatuerina-1 FJ842524/ ACR46972/66/ N/A Rc- 314 Rana catesbeiana 03r170621s168979 /-/3446/[2612- 2539, 1247-1038]/2 ranatuerina-1 KZ060483/ PIO12229/61/ N/A Rc- (HP4) 3446 Rana catesbeiana 03r170621s168979 /-/3446/[1475- 1107]/1 ranatuerina- JQ511836/ AFR43665/71/ GFBS01116610 Rc-03r170621s5461 2PRc (HP2) 253 Pseudacris regilla /772/71 /-/149396/[114249- 114211/108748- 108668/100045- 99394]/3 ranatuerina- FJ830657/ ACR84073/74/ GFBS01229 Rc- 2RC 335 Rana catesbeiana 406/500/74 03r170621s59711/ Rc- 03r170621s128997 /+/-/[17230/5085]/ [7179-7319, 11174- 11256/4558- 4326]/3 ranatuerina- FJ830656/ ACR84072/68 N/A Rc- 3RC 309 Rana catesbeiana 03r170621s223822 /Rc- 03r170621s584290/ +/- /[2611/1023]/[2144 -2217/734-530]/2 ranatuerina- FJ830656/ PIO09118/51/ GFBS01228991 Rc- 3RC (HP8) 309 Rana catesbeiana /519/51 03r170621s584290 /-/1023/[1007- 532]/1 ranatuerina-4 BT081520/ ACO51651/70/ GFBS01229 Rc- 332 Rana catesbeiana 403/504/70 03r170621s71023/ Rc- 03r170621s251277 /+/-/[13560/2355]/ [8821-8968, 10977- 11059/2198- 1964]/3 a - N/A indica que a sequência encontrada no banco de dados BART tinha o mesmo comprimento que a sequência Rana catesbeiana já presente no banco de dados NCBI ou que essa sequência não foi encontrada no banco de dados BART. b - Este suporte continha sequência que era 93% idêntica à sequência HP9, mas tinha 17 alterações AA e uma deleção no quadro de V36. c - A tradução começa com um V em vez de M.

[066] Exame de sequências de proteínas de AMP putativos. As análises de Blastx dos sete transcritos identificaram correspondências de sequência de proteína no banco de dados NCBI nr variando de 49-77% de identidade de sequência (Tabela 3) e uma sequência (HP5) não teve correspondência notável com nenhum AMP conhecido.

[067] A Figura 1 mostra alinhamentos Clustal ômega de sequências de precursores de AMP putativos com suas correspondências de AMP conhecidos mais próximos. O Painel A mostra uma comparação da sequência de Ranatuerina-2PRc de Pseudacris regilla (parte superior) (SEQ ID NO:15) com a sequência de HP2 de R. catesbeiana (parte inferior) (SEQ ID NO:16). O Painel B mostra alinhamentos de sete sequências precursoras de Ranatuerina (SEQ ID NO:17 a SEQ ID NO:23) de R. catesbeiana. O Painel C alinha três sequências precursoras de Ranaciclina de R. catesbeiana (SEQ ID NO:24 a SEQ ID NO:26). O Painel D mostra alinhamentos de sequências precursoras de Catesbeianina-1 (SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:28) de R. catesbeiana. O Painel E mostra alinhamentos de sequências precursoras de Palustrina-Ca (SEQ ID NO:29 e SEQ ID NO:30) de R. catesbeiana. O sítio de clivagem proteolítica conservado é mostrado em negrito e sublinhado. Este sítio de clivagem indica a fronteira para a sequência prepro N-terminal e a sequência madura C-terminal. Os comprimentos do peptídeo precursor estão indicados à direita de cada sequência. Os pontos representam substituições conservativas de aminoácidos e os asteriscos indicam correspondências exatas. Traços foram introduzidos para maximizar os alinhamentos de sequência. Mais detalhes sobre os números de acesso NCBI estão na Tabela 2.

[068] A Tabela 3 mostra uma comparação de identidades de sequência (%) dos candidatos a AMP com suas correspondências de blastp de AMP mais conhecidas em toda a sequência (precursor), ou por sequência prepro ou sequências maduras. Não houve correspondência de AMP com HP5. Tabela 3 Identidades de sequência de peptídeos Identidade de sequência (%) Correspondência com ID do maior pontuação Precursor Prepro Maduro Peptídeo blastp HP2 Ranatuerina-2PRc 77 83 69 HP3 Ranaciclina-Ca 49 41 68 HP4 Ranatuerina-1 68 49 100 HP5 Nenhum Nenhum Nenhum Nenhum HP6 Catesbeianina-1 76 54 100 HP8 Ranatuerina-3RC 65 33 100 HP9 Palustrina-Ca 65 38 100

[069] Um exame mais atento das sequências de peptídeos revelou que quatro dos peptídeos maduros previstos (HP4, HP6, HP8, HP9) são idênticos aos AMPs conhecidos (Tabela 3 e Figura 1), enquanto as regiões prepro correspondentes exibem identidades que variam de 65-76% (Tabela 3 e Figura 1). Os dois peptídeos AMP candidatos restantes (HP2 e HP3) exibiram 69% (HP2) e 68% (HP3) de identidade com suas correspondências de sequência de peptídeo maduro AMP mais conhecido (Tabela 3). As sequências prepro HP2 e HP3 também mostram divergência considerável de sua correspondência AMP mais conhecida (identidades de aminoácidos de 77% e 49%, respectivamente; Tabela 3).

[070] A sequência HP2 é a contrapartida de R. catesbeiana da sequência de Ranatuerina-2PRc de Pseudacris regilla (Figura 1, Painel A). Quando comparada com os outros precursores de AMP conhecidos ou putativos, a sequência de Ranatuerina-2PRc (HP2) exibe um grau razoável de conservação de sequência com outras Ranatuerinas na sequência prepro, mas divergência considerável no peptídeo maduro (Figura 1, Painel B). As sequências de peptídeo putativo maduro de HP4 e HP8 são idênticas aos peptídeos maduros de Ranatuerina-1 e Ranatuerina-3RC, respectivamente, mas cada uma tem uma sequência prepro distinta (Figura 1, Painel B). A região do peptídeo maduro de HP3 é 68% idêntica a Ranaciclina-Ca, com divergência de sequência substancial na sequência prepro (41% de identidade; Figura 1, Painel C). As regiões de peptídeo maduro de HP6 e HP9 são idênticas a Catesbeianaina-1 e Palustrina-Ca, respectivamente, mas têm extremidades N-terminais divergentes nas sequências prepro (Figura 1, Painel D e Painel E).

[071] A Figura 2 mostra comparações de predição de estrutura secundária SABLE entre os peptídeos maduros derivados de Painel A - HP2; Painel B - HP3; e Painel C - HP5 contra sequências AMP maduras conhecidas. O Painel D mostra a legenda para as previsões SABLE com a posição do aminoácido (AA) indicada na parte superior, a estrutura secundária prevista no meio e a acessibilidade relativa ao solvente (RSA) na parte inferior. As previsões de confiança estão abaixo da estrutura secundária prevista e RSA. Para a estrutura secundária prevista, linhas vermelhas, α-hélices; setas verdes, folhas-β; linhas azuis, bobinas estendidas. RSA é indicado pela escala de cinza de preto (0-9% RSA) a branco (90-100% RSA), onde cada caixa representa um aminoácido.

[072] A estrutura secundária do peptídeo HP2 putativo maduro contém uma α-hélice, bobina estendida, arranjo de fita-β que se assemelha a uma mistura de estrutura secundária de Ranatuerina-1 e Ranatuerina-2RC, Figura 2, Painel A. O peptídeo HP3 putativo maduro é apenas uma bobina estendida semelhante a Ranaciclina-Ca (Figura 2, Painel B), enquanto o peptídeo HP5 putativo maduro é composto por duas α-hélices separadas por uma pequena bobina estendida (Figura 2, Painel C).

[073] Ensaios de microtitulação de diluição de caldo. Os peptídeos HP2, HP3 e HP5 são constituídos por novas sequências que ainda não foram descritas na literatura de AMP. Um método comum para estabelecer a atividade antimicrobiana de peptídeos é realizar ensaios microtitulação de caldo. Métodos de microtitulação de diluição de caldo foram implementados para determinação da concentração inibitória mínima (MIC) e concentração bactericida mínima (MBC). HP3 e HP5 foram testados além do peptídeo Ranatuerina-1/HP4 como um controle positivo. HP2 não pôde ser testado porque várias tentativas de síntese de peptídeos falharam. A catelicidina humana, LL-3730 foi usada como um controle positivo adicional, e um peptídeo catiônico não relacionado de tamanho semelhante da proteína Tp0751 de T. pallidum foi usado como controle negativo. Os AMPs potenciais foram testados contra bactérias representativas de todos os três tipos de envelope celular conhecido (Gram-positivo, negativo e o único e complexo envelope/parede celular micobacteriana), dado que um mecanismo principal usado pelos AMPs é dirigido a parede celular/membrana.

[074] Cinco espécies bacterianas foram testadas, abrangendo Gram- negativas (Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa), Gram-positivas (Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes), e Mycobacterium smegmatis (nem um verdadeiro Gram-positivo, nem Gram-negativo). O peptídeo Ranatuerina-1 teve alguma atividade contra E. coli e S. aureus (MIC: 48 e 97 μM, respectivamente), que é maior do que o relatado anteriormente31 e alguma atividade bactericida foi observada (MBC: 12-48 e 97 μM, respectivamente). Este peptídeo não teve efeito sobre S. pyogenes ou P. aeruginosa. HP3 e HP5 não tiveram efeito sobre a atividade inibitória ou bacteriostática contra E. coli, S. aureus, S. pyogenes ou P. aeruginosa.

[075] A Tabela 4 mostra as concentrações inibitórias mínimas (MIC) e as concentrações bactericidas mínimas (MBC) em μM contra M. smegmatis para AMPs testados putativos e conhecidos de um mínimo de cinco (MIC) e três (MBC) experimentos independentes. LL-37 é um controle positivo de catelicidina humana e Tp0751 é um peptídeo de controle negativo de T. pallidum. “-“, nenhum efeito observado. Tabela 4 Concentrações Inibitórias Mínimas e Concentrações Bactericidas Mínimas Nome do Peptídeo µM

MIC MBC HP3 4-14 7-14 HP4/Ranatuerina-1 2-12 3-48 HP5 66 ≥66 LL-37 0,4-2 1-28 Tp0751 - -

[076] Exceto para o peptídeo de controle negativo, todos os peptídeos tiveram atividade bacteriostática contra M. smegmatis (Tabela 4). Em comparação com a Ranatuerina-1, HP3 teve atividade bacteriostática comparável (MIC: 4-14 contra 2-12 µM; Tabela 4), e melhor atividade bactericida (MBC: 7-14 contra 3-48 µM; Tabela 4). HP5 exibiu fraca atividade bacteriostática e bactericida contra M. smegmatis (Tabela 4).

[077] Expressão de transcritos que codificam AMP em tecidos de girino R.

CATESBEIANA. Os níveis de abundância de vinte transcritos de codificação de AMP (treze conhecidos e sete novos identificados acima; listados na Tabela 2) foram avaliados em pele do dorso do girino, fígado, epitélio olfatório e barbatana caudal de R. catesbeiana pré-metamórfico, usando dados de RNA-seq normalizados de estudos anteriores28,32,33.

[078] A Figura 3 mostra que transcritos que codificam AMP putativos e conhecidos mostram expressão diferencial na pele do dorso, fígado, epitélio olfatório e barbatana caudal do girino pré-metamórfico R. catesbeiana. Os dados de RNA-seq que representam transcritos que codificam os AMPs putativos e conhecidos indicados são mostrados para a pele do dorso (barras pretas, n=3), fígado (barras cinza escuro, n=15), epitélio olfatório (barras cinza claro, n=15) e barbatana caudal (barras brancas, n=15) do girino. Barras representam contagens de leitura mediana normalizada por milhão e cristais capilares representam desvio absoluto médio. ND, não detectado.

[079] A Figura 4 mostra alinhamentos Clustal ômega de sequências de precursores de AMP putativos com suas correspondências de AMP conhecidas mais próximas. O Painel A mostra uma comparação da sequência de Catelicidina- AL de Amolops loloensis (número de acesso NCBI AEI69698; parte superior) com a sequência correspondente de Catelicidina-AL de R. catesbeiana (parte inferior). O Painel B mostra uma comparação da sequência prevista de LEAP2 de Nanorana parkeri (número de acesso NCBI XP_018418722; parte superior) com a sequência correspondente de LEAP2 de R. catesbeiana (parte inferior). O sítio de clivagem proteolítica conservado está em negrito e sublinhado. Este sítio de clivagem indica a fronteira para a sequência prepro N-terminal e a sequência madura C-terminal. Os comprimentos do peptídeo precursor estão indicados à direita de cada sequência. Os pontos representam substituições conservativas de aminoácidos e os asteriscos indicam correspondências exatas. Traços foram introduzidos para maximizar os alinhamentos de sequência. Mais detalhes sobre os números de acesso do NCBI estão na Tabela 2.

[080] Dezesseis desses transcritos estão em um ou mais desses tecidos (Figura 3). Todos os transcritos indicados na Figura 3 foram verificados em sequência a partir de contigs de R. catesbeiana incluindo transcritos que codificam Cathelicidina-AL (87% de identidade com a proteína precursora de Amolops loloensis; Figura 4) e LEAP2 (88% de identidade com proteína precursora prevista de Nanorana parkeri; Figura 4). Em vários casos, as sequências derivadas de RNA-seq forneceram melhorias substanciais no comprimento em relação às sequências de transcritos já curadas no GenBank (Tabela 2).

[081] Todos os dezesseis transcritos estão presentes na pele do dorso do girino, enquanto 11 estão no fígado e no epitélio olfatório e 12 na barbatana caudal (Figura 3). Os transcritos mais abundantes são ranatuerina-4, ranaciclina- Cc, ranatuerina-2RC, e ranatuerina-1 (HP4) na pele do dorso; leap2, catelicidina- AL, catelicidina-RC2, e catesbeianina-1 (HP6) no fígado; leap2, catelicidina-AL, catesbeianina-1 (HP6), e catelicidina-tipo-2 no epitélio olfatório; e catelicidina- AL, catesbeianina-1 (HP6), leap2, e catelicidina-tipo-2 na barbatana caudal (Figura 3). Digno de nota são os transcritos que não estão nesses tecidos de girinos pré-metamórficos, como catesbeianina-1, ranaciclina-Ca, ranatuerina-1 e palustrina-Ca. Esses transcritos, que são detectados na pele de sapo adulto31, são substituídos por catesbeianina-1 (HP6), ranaciclina-Ca (HP3), ranatuerina-1 (HP4), ranatuerina-3RC (HP8) e palustrina-Ca (HP9) (Figura 3).

[082] Trabalhos anteriores indicaram que os mRNAs que codificam alguns AMPs aumentam de níveis muito baixos ou indetectáveis em girinos para níveis elevados na rã como consequência da metamorfose dependente do hormônio tireoidiano34-37. Essas determinações foram feitas com homogenatos de girinos inteiros34,36 ou pele35,37.

[083] A Figura 5 mostra que transcritos que codificam AMP putativos e conhecidos de girinos geralmente não são responsivos ao tratamento com 10 nM de T3. Os dados de RNA-seq que representam transcritos que codificam os AMPs putativos e conhecidos indicados são mostrados para girinos (Painel A) pele do dordo (n=3), (Painel B) fígado (n=5), (Painel C) epitélio olfatório (n=5), e (Painel D) barbatana caudal (n=5) dos controles do veículo (barras pretas) ou girinos expostos a 10 nM de T3 por 48h (barras cinza). Barras representam contagens de leitura mediana e bigodes representam desvio absoluto mediano. O asterisco indica significância estatística entre os tratamentos em p <0,05. ND, não detectado.

[084] Girinos pré-metamórficos foram imersos em triiodotironina a 10 nM (T3) por 48h, o que induz precocemente metamorfose por meio da alteração de programas de expressão gênica específicos de tecido28,32,33, e determinou a abundância dos transcritos que codificam AMP (Figura 5). Nenhum desses transcritos foi responsivo a T3 na pele do dorso (Figura 5, Painel A). Embora a grande maioria dos transcritos também não respondesse a tratamento com T3 no fígado, epitélio olfatório e barbatana caudal (Figura 5, Painel B para Painel D), transcritos de ranatuerina-3RC (HP8) apareceram no fígado e no epitélio olfatório (Figura 5, Painel B e Painel C). Aumentos significativos na abundância de mRNA foram observados para catelicidina-RC2 (2 vezes) no fígado; ranatuerina-2PRc (HP2) (2 vezes) e palustrina-Ca (HP9) (4 vezes) no epitélio olfatório; e ranatuerina-4 (2 vezes) na barbatana caudal (Figura 5, Painel B para Painel D). Uma diminuição leve, mas significativa (1,3 vezes) em transcritos de HP5 foi observada no epitélio olfatório (Figura 5, Painel C). mRNA de Palustrina- Ca (HP9) desapareceu na barbatana caudal após tratamento com T3, mas isso não foi significativo (Figura 5, Painel D).

[085] Estruturas de genes que codificam AMP no genoma da rã-tourO. É possível que as novas versões dos transcritos acima sejam produtos de splicing alternativo dos genes. Usando o esboço do genoma da rã-touro publicado recentemente28, gmap e blastn foram usados para criar modelos de genes a partir das sequências de transcritos.

[086] A Figura 6 mostra que os genes ranatuerina-1 e ranatuerina-3RC contêm 2 exões e sofrem splicing alternativo. A estrutura dos genes e os transcritos derivados que codificam Painel A - Ranatuerina-1 e Ranatuerina-1 (HP4), e Painel B - Ranatuerina-3RC e Ranatuerina-3RC (HP8) são mostradas. A ilustração superior representa o gene correspondente desenhado na escala indicada com as porções exônicas representadas como retângulos pretos e as regiões intrônicas representadas pela linha preta espessa. As sequências não gênicas adicionais que flanqueiam os genes indicados estavam presentes em todos os casos, exceto onde indicado. O identificador de cada suporte do NCBI v3.0 do genoma da rã-touro é indicado no canto superior esquerdo de cada suporte. Vários suportes são indicados por uma quebra de linha. As regiões intrônicas são mostradas como linhas finas que sofrem splicing processadas nos transcritos marcados abaixo do gene. Os retângulos cinza no transcrito que sofreu splicing indicam as regiões não traduzidas e os retângulos hachurados indicam o quadro de leitura aberto.

[087] Um gene de dois exões de 1,6 kbp dá origem a ranatuerina-1 e ranatuerina-1 (HP4) por meio de splicing alternativo (Figura 6, Painel A) e uma estrutura gênica de dois exões semelhante dá origem a ranatuerina-3RC e ranatuerina-3RC (HP8) por meio de splicing alternativo (Figura 6, Painel B). Em contraste, as três ranatuerinas, ranatuerina-2PRc (HP2), ranatuerina-2RC, e ranatuerina-4, são cada, derivadas de genes de três exões distintos que são muito maiores (por exemplo, 15 kbp para ranatuerina-2PRc (HP2); vide Figura

7).

[088] A Figura 7 mostra que os genes da ranatuerina-2PRc (HP2), ranatuerina-2RC e ranatuerina-4 são compostos por 3 exões. A estrutura dos genes e transcritos derivados que codificam Painel A - Ranatuerina-2PRc (HP2), Painel B - Ranatuerina-2RC, e Painel C - Ranatuerina-4 são mostradas. As ilustrações são desenhadas na escala indicada. Os números em itálico indicam o número de pares de bases intermediários onde a região intrônica era grande. Vide Figura 6 para maiores informações.

[089] A Figura 8 mostra dois genes, um com 3 exões e outro com 1 exão, codificam Ranaciclinas. A estrutura dos genes e transcritos derivados que codificam Painel A - Ranaciclina-Ca e Ranaciclina-Cc, e Painel B - Ranaciclina-Ca (HP3) são mostradas. As ilustrações são desenhadas na escala indicada. Os números em itálico indicam o número de pares de bases intermediários onde a região intrônica era grande. Referir-se para Figura 6 para maiores informações. A linha pontilhada em “A” indica que a extremidade 5’ do suporte terminou antes das informações de transcrito disponíveis.

[090] Os transcritos que codificam Ranaciclina-Ca e Ranaciclina-CC vêm do mesmo gene de 3 exões, enquanto o gene que codifica ranaciclina-Ca (HP3) é composto por um único exão em um suporte diferente (Figura 8). Uma relação semelhante ocorre para Palustrina-Ca. Aqui a palustrina-Ca transcrita é derivada de dois exões (Figura 8, Painel A) e palustrina-Ca (HP9) de um único exão diferente (Figura 8, Painel B) do mesmo gene.

[091] A Figura 9 mostra Palustrina-Ca, codificado por um gene de 2 exon, Palustrina-Ca (HP9) e HP5 são codificados por genes de exão único. A estrutura dos genes e transcritos derivados que codificam Painel A - Palustrina-Ca; Painel B - Palustrina-Ca (HP9); e Painel C - HP5 são mostradas. Os desenhos animados são ilustrações na escala indicada. Os números em itálico indicam o número de pares de bases intermediários onde a região intrônica era grande. Referir-se para Figura 6 para maiores informações.

[092] O gene que codifica HP5 é composto por um único exão (Figura 9, Painel C). Finalmente, os transcritos leap2 e catelicidina-AL são exemplos derivados do splicing de quatro exões (Figura 10). O fato de que todas as sequências de transcrição montadas acima se alinham com o genoma de rã- touro derivado de forma independente com locais de splice canônico ainda suporta a legitimidade das sequências de transcrito de AMP identificadas.

[093] A Figura 10 mostra que LEAP2 e Catelicidina-AL são derivados de quatro exões. A estrutura dos genes e os transcritos derivados que codificam Painel A - LEAP2 e Painel B - Catelicidina-AL de R. catesbeiana são mostrados. As ilustrações são desenhadas na escala indicada. Os números em itálico indicam o número de pares de bases intermediários onde a região intrônica era grande. A Figura 6 fornece informações adicionais.

DISCUSSÃO

[094] Ao utilizar homologia de sequência conhecida e características estruturais de AMPs de peptídeos empiricamente validados, uma abordagem de bioinformática foi aplicada a um transcriptoma de referência de girino de rã- touro montado e identificou os transcritos que codificam supostos novos AMPs e aumentou as informações de sequência disponíveis para AMPs conhecidos. Historicamente, os sapos são uma fonte rica de AMPs. No entanto, os estudos sobre os estágios larvais de girinos têm sido limitados, particularmente aqueles relativos a estudos de expressão gênica.

[095] O presente estudo teve como foco o girino pré-metamórfico como um organismo que depende principalmente do sistema imune inato para proteção microbiana. Semelhante ao que foi observado na rã, os tecidos dos girinos expressam vários AMPs com maior concentração na pele do dorso. O trabalho anterior em Xenopus laevis indicou que os transcritos que codificam magainina e "peptídeo com glicina amino-terminal e leucinamida carbóxi- terminal" (PGLa) não são detectados até o clímax metamórfico e no estágio de rã34. A abundância desses mRNAs aumenta em girinos pré-metamórficos inteiros por imersão prolongada em 5 nM de T3 por 7d, induzindo metamorfose precoce34. Outros estudos estabeleceram que os mRNAs que codificam Ranalexina em R. catesbeiana35, Brevinina-1SY em R. sylvatica36 e Preprotemporina em R. ornativentris37 geralmente passam de níveis indetectáveis ou muito baixos no girino, através da metamorfose dependente do hormônio tireoidiano, para níveis elevados na rã. Uma indução de mRNA que codifica Préprotemporina após injetar T3 a 2X10-9 M no R. ornativentris adulto foi observado37. Os níveis de abundância de vinte transcritos que codificam AMP putativos e conhecidos foram examinados, dos quais dezesseis foram expressos em pelo menos um dos quatro tecidos de girino pré-metamórfico no presente estudo. A grande maioria dos transcritos que codificam AMP não foi afetada por tratamento com T3 após 48h e nenhum foi responsivo ao hormônio na pele do dorso. É difícil comparar os estudos anteriores com os resultados atuais por várias razões: o uso de homogenatos de girinos inteiros em vez de tecidos específicos e/ou o uso de adultos em vez de girinos para estudos de injeção com T3. É possível que tempos de exposição de T3 mais longos possam resultar na modulação de mais transcritos que codificam AMP, mas isso ainda precisa ser determinado. Os dados sugerem que a alteração dependente da metamorfose na expressão do AMP pode ser uma resposta indireta e tardia dependente do hormônio tireoidiano, levando a um restabelecimento do sistema imunológico inato, coincidindo com a transição da vida.

[096] As propriedades antimicrobianas de Catesbeianina-1, Ranaciclina-Ca, Ranatuerina-1, Ranatuerina-3RC e Palustrina-Ca são conhecidas há algum tempo6-8. Este exemplo representa a descoberta de que pode haver diversidade em suas sequências prepro enquanto retém a sequência do peptídeo maduro do respectivo AMP como consequência do splicing alternativo. Uma possibilidade intrigante é que as variantes de splice do gene podem ser reguladas no desenvolvimento como parte da redefinição do sistema imunológico durante o desenvolvimento pós embrionário. A consequência desta mudança incorpora uma mudança na sequência prepro em vez do peptídeo maduro do respectivo AMP. Isso pode ter consequências regulatórias para a localização, processamento e/ou ativação de peptídeos que ainda precisam ser determinados e pode, possivelmente, refletir uma mudança de desenvolvimento nas proteases ativadoras expressas também38. Um exame adicional dos perfis de expressão das variantes de emenda durante o desenvolvimento e em diferentes tecidos é garantido.

[097] Embora esforços consideráveis tenham sido colocados em comparações filogenéticas de AMPs no nível da proteína (por exemplo,39,40), muito menos é compreendido no que diz respeito à estrutura dos genes que dão origem a transcritos que codificam AMP. O presente estudo apresenta as primeiras informações da estrutura do gene de AMPs com funcionalidade antimicrobiana conhecida em rãs, e foi descoberto que uma variedade de estruturas de genes de AMP foram representadas. A estrutura do gene de quatro exões observada na catelicidina de R. catesbeiana é conservada com o gene humano catelicidina LL37 no cromossomo 3 (Número de Acesso NCBI NM_004345.4) enquanto o gene leap2 de R. catesbeiana tem quatro exões em comparação com três em peixes e humanos41. Esta aparente discrepância pode ser devido ao quarto exão composto inteiramente de região não traduzida (Figura 10). Como a estrutura do gene leap2 de R. catesbeiana é atualmente composta por dois suportes, a possibilidade não pode ser definitivamente descartada de que o transcrito de leap2 pode ser um artefato de montagem, mas melhorias de rotina na montagem do genoma da rã-touro resolverão essa possibilidade remota.

[098] Os genes que codificam Ranatuerina estão sujeitos a splicing alternativo e possuem dois ou três exões em R. catesbeiana, e a estreita relação entre Ranatuerinas e Ranaciclinas são refletidas na retenção da estrutura do gene dos três exões. Além disso, a diversidade de sequências de peptídeos maduros de AMP foi sugerida como uma consequência das duplicações de genes de um gene ancestral42. O presente estudo fornece suporte para isso, além de splicing alternativo como outro mecanismo para diversidade de AMP.

[099] Dois novos candidatos de sequência de AMP maduro, além de Ranatuerina-1, demonstraram atividade antimicrobiana contra M. smegmatis. De particular interesse, o HP3 e o AMP estabelecido, Ranatuerin-1, exibiram atividade antimicrobiana semelhante contra a micobactéria M. smegmatis. Esta espécie foi usada para estabelecer que os novos AMPs descritos na presente invenção são ativos contra micobactérias. Uma vez que todas as espécies de Mycobacterium têm uma estrutura celular semelhante, a demonstração de atividade contra uma espécie não patogênica clássica nos forneceu a evidência de que vale a pena avaliar a atividade dos novos AMPs contra espécies patogênicas em experimentos futuros.

[100] Embora haja alguma variabilidade nos resultados da atividade apresentados na presente invenção, este exemplo ilustra claramente o processo de criação de AMPs otimizados que exibem consistência, reprodutibilidade, estabilidade e atividade aprimoradas43. A análise de sequência dos novos candidatos a AMP revelou diversidade dentro do prepro e das sequências de peptídeos maduros adicionadas ao crescente sortimento de AMPs. A ligação de sequências de AMP conhecidas a novas sequências prepro abre novas possibilidades para a descoberta de candidatos a AMP adicionais. Teste funcional bem sucedido de AMPs identificados por métodos de bioinformática usados no presente estudo afirmam o valor do uso de uma abordagem de bioinformática para minerar o genoma da rã-touro, conforme descrito na presente invenção.

[101] Porque os AMPs desempenham um papel crítico na imunidade inata6,44, um exame mais aprofundado das circunstâncias de sua expressão e dos fatores que podem interromper seu funcionamento normal pode informar os esforços de conservação. Os anfíbios estão experimentando uma redução drástica no número da população em todo o mundo devido a patógenos infecciosos44,45. A interação entre AMPs e patógenos é um importante determinante da sobrevivência do hospedeiro após a infecção, e alguns AMPs de anfíbios são conhecidos, por exemplo, por matar o fungo quitrídio, Batrachochytrium dendrobatidis46,47. A resistência pode ser conferida pela secreção fúngica de uma protease que cliva e interrompe a função AMP dos anfíbios33 revelando a necessidade de mais investigações sobre os mecanismos de regulação de AMP e sua relação com a proteção de doenças e evasão de patógenos. Além disso, as investigações contínuas sobre a riqueza de compostos antibióticos naturais produzidos por anfíbios também resultarão, sem dúvida, em novas descobertas de novos AMPs que podem levar ao desenvolvimento de terapêuticas eficazes para combater a principal e crescente ameaça à saúde global da resistência aos antibióticos.

DISPONIBILIDADE DE SEQUÊNCIA

[102] Todas as sequências biológicas referenciadas na presente invenção por números de acesso, tais como estão disponíveis através do NCBI, são incorporadas por meio deste por referência, como se a sequência fosse recitada em sua totalidade dentro do texto do assunto, figura ou tabelas.

MÉTODOS

[103] Mais detalhes dos métodos usados na presente invenção são fornecidos abaixo. As citações são fornecidas para indicar mais detalhes, e todas as referências relativas às metodologias utilizadas na presente invenção são incorporadas por meio deste por referência.

[104] Predição in silico e caracterização de peptídeos antimicrobianos putativos. Sete novos candidatos a AMP foram inicialmente identificados a partir do transcriptoma de referência anotado em rã-touro (BART versão 3, acesso NCBI TSA GFBS01000000)28,33 usando as três etapas a seguir.

[105] Primeiro, as sequências de transcrito BART, todas as quais foram montadas de novo com Trans-ABySS48 de bibliotecas de RNA-Seq específicas de filamento28, foram traduzidas in silico usando Transdecoder (-m 20 -S; versão

2.0.1) (https://github.com/TransDecoder/TransDecoder) e quadros de leitura aberto previstos completos de até 100 aminoácidos de comprimento foram retidos.

[106] Segundo, os modelos de Markov ocultos (HMMs) que representam as características salientes dos AMPs de 35 famílias de proteínas foram baixados do banco de dados Collection of Antimicrobial Peptides (http://www.camp.bicnirrh.res.in/pattern_hmm.php?q=HMM_fam), e hmmer49 foi usado para identificar sequências de peptídeos BART com semelhança a um ou mais HMM (configurações padrão, significância considerada em E <0,001). Esses acessos foram posteriormente refinados usando InterProScan50 configurações padrão com o banco de dados Pfam51 de HMMs de domínio da proteína (versão 29.0).

[107] Terceiro, os candidatos a AMPs precisavam atender aos seguintes critérios: 1) o quadro de leitura aberto putativo começou com um resíduo de metionina ou valina confirmado por análise com Virtual Ribosome 2.052, e 2) a sequência da proteína continha um sítio de clivagem de convertase de pró- peptídeo canônico Lys-Arg (KR) conforme determinado por ExPASy Peptide Cutter (http://web.expasy.org/peptide_cutter). Com exceção de um candidato AMP, todas as sequências de peptídeos também tinham forte alinhamento com um precursor AMP conhecido definido como uma pontuação de valor E <10-4 usando blastx ou blastp no banco de dados NCBI nr. Se a sequência de AMP candidata tivesse um alinhamento de precursor completo com uma sequência no banco de dados nr do NCBI com pontuações de identidade e positividade superiores a 90%, então a sequência foi considerada "conhecida". Um conjunto final de sete "novos" e onze "conhecidos" transcritos de R. catesbeiana que codificam AMP foram encontrados em tecidos de girino (Tabela 2). Duas sequências de AMP adicionais que já estavam presentes no banco de dados NCBI nr de estudos anteriores em sapos adultos também foram examinadas no presente estudo (Tabela 2). Os alinhamentos finais de proteínas foram gerados usando Clustal Ômega versão 1.4.2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)53.

[108] As estruturas secundárias dos peptídeos AMP maduros foram avaliadas usando a previsão de proteína SABLE (http://sable.cchmc.org/). A carga líquida, o peso molecular e os pontos isoelétricos (pI) dos peptídeos maduros foram determinados usando ExPASy ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/).

[109] Análise de expressão gênica. Os níveis de vinte transcritos de R. catesbeiana que codificam AMP (Tabela 2) foram determinados em pele do dorso, barbatana caudal, epitélio olfatório e tecidos do fígado do girino pré- metamórfico R. catesbeiana por meio de dados de RNA-seq derivados de estudos anteriores de tecidos de girino28,32,33. Bibliotecas de mRNA específicas de cadeia foram construídas e sequenciadas através de Illumina HiSeq e alinhado ao transcriptoma de referência BART28 para gerar contagens. Todos os experimentos de RNA-seq tiveram profundidade de sequenciamento comparável e foram normalizados para o número total de leituras por amostra. Para normalizar as contagens, o número de leituras foi dividido pelo número total de leituras na amostra correspondente e multiplicado por 100 milhões.

[110] Determinação da estrutura do gene. A sequência de cDNA mais longa de cada um dos vinte transcritos de R. catesbeiana que codificam AMPs (Tabela 2) foi usada para consultar o esboço do genoma da rã-touro de alta qualidade (número de acesso NCBI LIAG00000000, BioProject PRJNA285814)28 usando gmap versão de 13 de abril de 201754. Os suportes relevantes são indicados na Tabela 2.

[111] Ensaios de microtitulação de diluição de caldo. Para testar a atividade antimicrobiana, HP3, HP4/Ranatuerina-1 e HP5, os peptídeos foram sintetizados por GenScript (Piscataway, New Jersey, EUA). HP2 não foi testado porque o provedor de serviços não foi capaz de sintetizar esse peptídeo, apesar de várias tentativas. Um peptídeo não relacionado de tamanho semelhante da proteína Tp0751 de Treponema pallidum55 foi usado como um controle negativo e a catelicidina humana, LL-3730, foi incluída como um controle positivo. Os peptídeos foram dissolvidos em água ultrapura esterilizada por filtro e testados quanto à esterilidade por plaqueamento em placas de ágar não seletivas seguido por uma incubação de 48h a 37°C. Diluições em série de duas vezes de cada peptídeo foram preparadas para obter uma série correspondente a dez vezes as concentrações de teste necessárias (2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10 e 5 µg/mL) 29.

[112] Métodos de microtitulação de diluição de caldo foram implementados para a determinação da concentração inibitória mínima (MIC) e concentração bactericida mínima (MBC) dos quatro AMPs putativos e do peptídeo de controle negativo usando procedimentos adaptados do R.E.W. Laboratório Hancock para AMPs catiônicos29 e os métodos CLSI para testes de sensibilidade antimicrobiana de diluição56.

[113] Para avaliar a atividade antimicrobiana em uma ampla gama de espécies bacterianas, as colônias foram cultivadas durante a noite em placas de ágar Mueller Hinton (MHA; 5% de sangue de carneiro para S. pyogenes) 56 a partir do estoque de glicerol congelado. As bactérias testadas incluem bastonetes Gram-negativos (Escherichia coli: ATCC 9723H; Pseudomonas aeruginosa: ATCC 10148), cocos Gram-positivos (Staphylococcus aureus: ATCC 6538P; Streptococcus pyogenes: cepa desconhecida, isolado de hospital) e Mycobacterium smegmatis (MC2155; classificado como nem Gram-positivo, nem Gram-negativo). As suspensões bacterianas foram preparadas colocando 3-5 colônias morfologicamente semelhantes da placa cultivada em tubos de cultura de vidro estéreis contendo 2 mL de caldo Mueller Hinton (MHB; 5% de sangue de cavalo lisado S. pyogenes) 56. Inóculos microbianos de suspensões bacterianas foram preparados através de um ajuste espectrofotométrico de turbidez para 0,08-0,1 a 600 nm para atingir uma turbidez equivalente à de um padrão 0,5 de McFarland (1-2 x 108 CFU/mL) 29. Os inóculos bacterianos padronizados foram então diluídos em MHB para obter densidades celulares finais de aproximadamente 5,0 x 105 CFU/mL.

[114] Placas de microtitulação de noventa e seis poços (Fisher Cat. No. CS003790; Nepean, Ontário, Canadá) foram preparados com 100 µL de suspensão bacteriana (5 x 105 CFU/mL) de E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, S. pyogenes, ou M. smegmatis) dispensada em cada poço das colunas 1 a 11. Onze microlitros da série de diluições 10x AMP para todos os quatro peptídeos foram adicionados a cada poço da coluna 1 (2560 µg/mL) a coluna 10 (5 µg/mL) em todas as placas. A coluna 11 funcionou como um controle positivo para o crescimento bacteriano na ausência de AMPs. A coluna 12 em cada placa continha 100 µL de MHB como um controle de esterilidade (5% de sangue de cavalo lisado para S. pyogenes)56. As placas foram incubadas a 37°C durante 16- 24h dentro de 15 min após a adição do inóculo.

[115] Os valores de MIC foram determinados visualmente comparando a quantidade de crescimento bacteriano (turbidez) em poços contendo AMPs com o crescimento nos poços de controle que não continham qualquer quantidade de peptídeo. Os valores de MBC foram determinados por plaqueamento de todo o conteúdo dos poços contendo a mistura de peptídeo/bactéria que representa a MIC e todo o conteúdo dos dois poços anteriores contendo diluições de AMP/misturas de bactérias 2 vezes e 4 vezes mais concentradas em placas não seletivas de MHA, seguido de incubação durante 24 h a 37°C. EXEMPLO 2

PEPTÍDEOS ANTIMICROBIANOS

[116] As seguintes sequências de peptídeos, localizadas conforme descrito na presente invenção, podem ser usadas para aplicações antimicrobianas conforme descrito. Os peptídeos foram preparados e testados conforme descrito abaixo. GRUPO P1

[117] XXXPXXXXXGGK (SEQ ID NO:66).

[118] FYFPXXXXXGGK (SEQ ID NO:67).

[119] XYFXXSRKXXXX (SEQ ID NO:68).

[120] FXFXVSRKXXXX (SEQ ID NO:69).

[121] XYFXXXXKFXXK (SEQ ID NO:70).

[122] XXXXXXXXFGGK (SEQ ID NO:71).

[123] FYXPVXRXFXXX (SEQ ID NO:72).

[124] Sequência de exemplo P1_CCH, 'natural'.

[125] FYFPVSRKFGGK (SEQ ID NO:35).

[126] Sequência de exemplo P1_CCH_F9R_Y2P, 'sintético'.

[127] FPFPVSRKRGGK (SEQ ID NO:36). GRUPO P2

[128] FFPRXXXXXXXFLPTXXXXXXXSVGN (SEQ ID NO:73).

[129] XXXXVLPLANKXXXXIYCXXXXXXXX (SEQ ID NO:74).

[130] FFPXXLPLANXXLPXXXXXLPXXVGN (SEQ ID NO:75).

[131] XXPRVLXXXXXXXXXXXXXXPKSXXX (SEQ ID NO:76).

[132] FXXXXXXLANKXXXTIYCXXXXSVXX (SEQ ID NO:77).

[133] FFXXVLPXXXXXLXTXYCALPKXVXN (SEQ ID NO:78).

[134] XXXXXXXLANXFXPXIXXALPKXXGX (SEQ ID NO:79).

[135] Sequência de exemplo P2_CCH, 'natural'.

[136] FFPRVLPLANKFLPTIYCALPKSVGN (SEQ ID NO:37).

[137] Sequência de exemplo P2_CCH_T15K_P7R, 'sintético'.

[138] FFPRVLRLANKFLPKIYCALPKSVGN (SEQ ID NO:38). GRUPO P3

[139] GLLXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCPPSS (SEQ ID NO:80).

[140] XXXXXXKXXXKXXGXLMXXXXXXMXGXXPPXS (SEQ ID NO:81).

[141] GLLXIIXXXGXTTGILMXXLXXXMXGXXPPXX (SEQ ID NO:82).

[142] XLXXXXXXXXKXXXXXXXTLKCQMTXXCXXSS (SEQ ID NO:83).

[143] GLLXIIKXTGKTTGILMXXLKXXXXGXXXXXX (SEQ ID NO:84).

[144] GXLXIIKXTGXXTXIXMXTLKCQXTGRXPPSS (SEQ ID NO:85).

[145] GLLXXXKXTGKXTXIXXXTLKXQXTGRXXXXX (SEQ ID NO:86).

[146] XXXXIIXXTXXTXGXLXXTXXCQXTXRXXXXX (SEQ ID NO:87).

[147] Sequência de exemplo P3_CCH, 'natural'.

[148] GLLDIIKDTGKTTGILMDTLKCQMTGRCPPSS (SEQ ID NO:39).

[149] Sequência de exemplo P3_CCH_D8K_Q23C, 'sintético'.

[150] GLLDIIKKTGKTTGILMDTLKCCMTGRCPPSS (SEQ ID NO:40). GRUPO P4

[151] GLLXIIXXXGXXXXXXILXXLXXXLAGGXXX (SEQ ID NO:88).

[152] GLLXXXKTTGKXFAVKILXNLXXXXXXXXPP (SEQ ID NO:89).

[153] XXXXIIKTXXXXFAVXXXXXXKCKLAGGXXX (SEQ ID NO:90).

[154] XXXXIIXXXXKXXXXKXXXNLKCKXXXXCPP (SEQ ID NO:91).

[155] GLLXXXKTTGXXXXXXXLXNLKCXXAXXCXX (SEQ ID NO:92).

[156] GLLXXXKXXXXXFAVXXLXXLXXXXXXXXPP (SEQ ID NO:93).

[157] Sequência de exemplo P4_CCH, 'natural'.

[158] GLLDIIKTTGKDFAVKILDNLKCKLAGGCPP (SEQ ID NO:41).

[159] Sequência de exemplo P4_CCH_P31K, 'sintético'.

[160] GLLDIIKTTGKDFAVKILDNLKCKLAGGCPK (SEQ ID NO:42). GRUPO P5

[161] XXXXXXXLAAKXXXSLVXXXXKKC (SEQ ID NO:94).

[162] XFPIIAXLAAXVIPXLVXAVTXXX (SEQ ID NO:95).

[163] FFPXXAXXXXKXXPXXXXXXXXXX (SEQ ID NO:96).

[164] XXXXXXXLAAXVIPXLXXXXTXXX (SEQ ID NO:97).

[165] FFPIIAXXXXXXXXXXVCAVTKKC (SEQ ID NO:98).

[166] XXXIIXRXXXKVIXSXVCXVTKKC (SEQ ID NO:99).

[167] FFPIIARLAAXVIXSLXCAVXXXX (SEQ ID NO:100).

[168] Sequência de exemplo P5_CCH, 'natural'.

[169] FFPIIARLAAKVIPSLVCAVTKKC (SEQ ID NO:43).

[170] Sequência de exemplo P5_CCH_A19K, 'sintético'.

[171] FFPIIARLAAKVIPSLVCKVTKKC (SEQ ID NO:44). GRUPO P6

[172] GLWETIKXXXKXXXXXXXXKXXXXXXGGCPP (SEQ ID NO:101).

[173] XXXXXXXTTGXXXXXXXXXXXKCKXXXXCXX (SEQ ID NO:102).

[174] XXXXTIXXXGXXIALXLLXXIXXXIAXXXPP (SEQ ID NO:103).

[175] GLWETXKTTXXSXXLNLLDKIXXKIAXXXPP (SEQ ID NO:104).

[176] XXXXXIKXXGKSIALXXXXKXKXKXXGGXXX (SEQ ID NO:105).

[177] XXXXXXXXXXKSIAXNLLXXIXCXIAGGXXX (SEQ ID NO:106).

[178] Sequência de exemplo P6_CCH, 'natural'.

[179] GLWETIKTTGKSIALNLLDKIKCKIAGGCPP (SEQ ID NO:45).

[180] Sequência de exemplo P6_CCH_S12K, 'sintético'.

[181] GLWETIKTTGKKIALNLLDKIKCKIAGGCPP (SEQ ID NO:46). GRUPO P7

[182] ATAWXIXXXGMXXIIXIXIXXLXGXX (SEQ ID NO:107).

[183] XXXWXIXXXGMQXXXXXXXXXXCGKQ (SEQ ID NO:108).

[184] XXXXXXPPPXXQPXXPXXXXPXXXXX (SEQ ID NO:109).

[185] ATAXXXPPPXXXPXXPXXXXPXCXKQ (SEQ ID NO:110).

[186] XXXWXIXXXGMXXXXXIXIXXLXGXX (SEQ ID NO:111).

[187] XXXXXXXXXXXXPXXPXXIXXLXGXX (SEQ ID NO:112).

[188] ATAXRXXXXXXQXIIXIRIRXLCXKQ (SEQ ID NO:113).

[189] Sequência de exemplo P7_CCH, 'natural'.

[190] ATAWRIPPPGMQPIIPIRIRPLCGKQ (SEQ ID NO:47).

[191] Sequência de exemplo P7_CCH_P9R_R5M, 'sintético'.

[192] ATAWMIPPRGMQPIIPIRIRPLCGKQ (SEQ ID NO:48). GRUPO P8

[193] FPAIIXXXXXXX (SEQ ID NO:114).

[194] FXXXXCXXXKXC (SEQ ID NO:115).

[195] XXAIIXXVSKXX (SEQ ID NO:116).

[196] XPAXXCKXXXXX (SEQ ID NO:117).

[197] FPXXXXXVSKNC (SEQ ID NO:118).

[198] XXXIICKVSXNX (SEQ ID NO:119).

[199] Sequência de exemplo P8_CCH, 'natural'.

[200] FPAIICKVSKNC (SEQ ID NO:49).

[201] Sequência de exemplo P8_CCH_N11K, 'sintético'.

[202] FPAIICKVSKKC (SEQ ID NO:50). GRUPO P9

[203] FLTFXGXXFGXXXGX (SEQ ID NO:120).

[204] XXXXPGMXFXXLLXX (SEQ ID NO:121).

[205] XXXXPGMXXXKXXXK (SEQ ID NO:122).

[206] FLTFXXXXXXXLLGX (SEQ ID NO:123).

[207] FXXFXXXTFGKXXXK (SEQ ID NO:124).

[208] XLTXXXXTFGKLLGK (SEQ ID NO:125).

[209] Sequência de exemplo P9_CCH, 'natural'.

[210] N/A.

[211] Sequência de exemplo P9_CCH_2, 'sintético'.

[212] FLTKPGMTFGKLLGK (SEQ ID NO:51). GRUPO P10

[213] XXXXFFXVNIFXLXX (SEQ ID NO:126).

[214] SNXXXXXVXXXRXXX (SEQ ID NO:127).

[215] XXXXFFXXXIFXLCG (SEQ ID NO:128).

[216] SNXXXXKXXXXXLCG (SEQ ID NO:129).

[217] XXRXXXKVNIFXXCX (SEQ ID NO:130).

[218] SXXXFFXVXIXXXXG (SEQ ID NO:131).

[219] SXRDFFKXNXXRXCX (SEQ ID NO:132).

[220] Sequência de exemplo P10_CCH, 'natural'.

[221] SNRDFFKVNIFRLCG (SEQ ID NO:52).

[222] Sequência de exemplo P10_CCH_2, 'sintético'.

[223] SNRKFFKVRIFRLCG (SEQ ID NO:53).

GRUPO P11

[224] XXXXXIQKXXXXNTLKXXKXXLXXX (SEQ ID NO:133).

[225] ALVAKXXXFPVFXXXXLCXLXXXXX (SEQ ID NO:134).

[226] ALVAKIQKXXXXXXXXXXKLXXXII (SEQ ID NO:135).

[227] XXXXXXXKXPXXNTLKXCKXEXEXX (SEQ ID NO:136).

[228] XXXXXXQXFXVFXTLKLXKLXLXXX (SEQ ID NO:137).

[229] XLVAKIXXXPVXNXXXLXXXXLXII (SEQ ID NO:138).

[230] AXXAXIXXFXXFXXXXXCXXEXEII (SEQ ID NO:139).

[231] Sequência de exemplo P11_CCH, 'natural'.

[232] ALVAKIQKFPVFNTLKLCKLELEII (SEQ ID NO:54).

[233] Sequência de exemplo P11_CCH_E21K_E23R, 'sintético'.

[234] ALVAKIQKFPVFNTLKLCKLKLRII (SEQ ID NO:55). GRUPO P12

[235] XXGQVXXXKXKXX (SEQ ID NO:140).

[236] IAXXXAAAXXXXX (SEQ ID NO:141).

[237] XXGXXXXXKXKHI (SEQ ID NO:142).

[238] IXXQVXXXKQKHI (SEQ ID NO:143).

[239] XXXQVXXXXQXHI (SEQ ID NO:144).

[240] Sequência de exemplo P12_CCH, 'natural'.

[241] IAGQVAAAKQKHI (SEQ ID NO:56).

[242] Sequência de exemplo P12_CCH2, 'sintético'.

[243] IAGQKARAKQKHI (SEQ ID NO:57). GRUPO P13

[244] XXRXPXXXXXKLWKXXLXXX (SEQ ID NO:145).

[245] IQXXXVXXXLXXXXLXXXII (SEQ ID NO:146).

[246] XXXLXXXNMXXXWKXXXXXX (SEQ ID NO:147).

[247] XXXLPXINMXKLXXXXLXXX (SEQ ID NO:148).

[248] Sequência de exemplo P13_CCH, 'natural'.

[249] IQRLPVINMLKLWKLELEII (SEQ ID NO:58).

[250] Sequência de exemplo P13_CCH_N8K_E18K, 'sintético'.

[251] IQRLPVIKMLKLWKLELKII (SEQ ID NO:59). GRUPO P14

[252] IQRLXXXXXXXSLYXXXCRTC (SEQ ID NO:149).

[253] XXXLPVXVXLPSLYXXXXXXX (SEQ ID NO:150).

[254] IQRXXXIVIXXXXXCVIXXXX (SEQ ID NO:151).

[255] XXXXPVXXXXPSLYXXXCRTC (SEQ ID NO:152).

[256] IQRLXVIXILXXXXCXXCXXC (SEQ ID NO:153).

[257] XXXLPXXXXXPXXXXVIXXTX (SEQ ID NO:154).

[258] XXXLXVIVILXSLYCVICRTC (SEQ ID NO:155).

[259] Sequência de exemplo P14_CCH, 'natural'.

[260] IQRLPVIVILPSLYCVICRTC (SEQ ID NO:60).

[261] Sequência de exemplo P14_CCH_2, 'sintético'.

[262] IQRLPVIVILPSLYCVICRKK (SEQ ID NO:61). GRUPO P15

[263] LXXPXPXYXFXXGIGXXXXWXXXWLNAQQMXXXXX (SEQ ID NO:156).

[264] XXCPTPXXXFXXXXXNHLXXXIIWLXXXXMXXXXX (SEQ ID NO:157).

[265] LRCXXXXXXXENGXXXXXMWNXXXXXXXXXSYKNK (SEQ ID NO:158).

[266] XXXXTXHYNXENGIGNHLMXNXXXXNXQXXXXKXK (SEQ ID NO:159).

[267] LXCXXXHXNXXXXXGNHXXWXXXWLXXXXMSXXNX (SEQ ID NO:160).

[268] XRXPXPHXXFXXXXXXXXXXXIIXXXAXQXSYXXX (SEQ ID NO:161).

[269] Sequência de exemplo P15_CCH, 'natural'.

[270] LRCPTPHYNFENGIGNHLMWNIIWLNAQQMSYKNK (SEQ ID NO:62).

[271] Sequência de exemplo P15_CCH_2, 'sintético'.

[272] LRCPTPHYRFENGIGNHLMWNIIWLNAQQMSYCNK (SEQ ID NO:63).

GRUPO P16

[273] SNRXXXMXXXXGLXGPXXIMXXXXX (SEQ ID NO:162).

[274] XXXXFFMXXXXXXCXXFGXXXXKXX (SEQ ID NO:163).

[275] SNRDXXXXXIFGLXGPXXIMXRKRR (SEQ ID NO:164).

[276] SXXXXXXVNXXXXCXXFGXXEXXXX (SEQ ID NO:165).

[277] XXXXXXXVNIFXXXXPXXXXXRXRR (SEQ ID NO:166).

[278] Sequência de exemplo P16_CCH, 'natural'.

[279] SNRDFFMVNIFGLCGPFGIMERKRR (SEQ ID NO:64).

[280] Sequência de exemplo P16_CCH_2, 'sintético'.

[281] SNRKFFMVNIFGLCGPFGIMKRKRR (SEQ ID NO:65).

MÉTODOS

[282] Os peptídeos foram testados quanto à atividade usando como determinações a concentração inibitória mínima (MIC) e concentração bactericida mínima (MBC). Para certos peptídeos, um teste de hemólise também foi conduzido para determinar HC50 (µg/mL) como um indicador de atividade hemolítica com base na concentração de um composto antimicrobiano que mata 50% dos glóbulos vermelhos.

[283] Os peptídeos foram testados quanto à atividade contra E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, S. pyogenes e M. smegmatis.

[284] Experimentos independentes foram conduzidos com quatro cepas de E. coli, incluindo ATCC E. coli (Escherichia coli - ATCC 25922 "tipo selvagem"); ESBL E. coli (Escherichia coli - beta-lactamase de espectro estendido); CPO E. coli (KPC) (Escherichia coli - Organismo produtor de carbapenemase; Klebsiella pneumoniae carbapenemase); e CPO E. coli (NDM) (Escherichia coli - Organismo produtor de carbapenemase; metalobetalactamase Nova-Dehli).

[285] Experimentos independentes foram conduzidos com diferentes cepas de Staphylococcus aureus - ATCC 29213 "tipo selvagem"; e Staphylococcus aureus - Staphylococcus aureus resistente à meticilina.

[286] As cepas da ATCC (Coleção de Microrganismos Norte Americana) recebidas de Cedarlane. Cepas multirresistentes a fármacos (MDR), como isolados clínicos, foram recebidas do laboratório da Dra. Linda Hoang.

[287] Peptídeos antimicrobianos putativos foram sintetizados por GeneScript. Peptídeos antimicrobianos de lista A ressintetizados por GeneScript. P2_CCH, P5_CCH e P5_CCH_A19K foram sintetizados em duas condições: síntese padrão usando TFA e a outra com remoção de TFA usando acetato como um contra-íon. Um método MIC, adaptado para uso com peptídeos antimicrobianos catiônicos, foi usado para avaliar a atividade antimicrobiana MIC (Hancock, 1999).

RESULTADOS

[288] Os resultados de MIC e MBC são fornecidos nas tabelas abaixo. As unidades de concentração são µg/mL para MIC e MBC, salvo indicação do contrário. Tabela 5 P1_CCH - Resultados de MIC e MBC P1_CCH Peptídeo MIC (pg/mL) MBC (pM/mL) E. coli >256 >256 S. aureus >256 >256 P. aeruginosa >256 >256 S. pyogenes >256 >256 M. smegmatis 256->256 >256 Tabela 6 P2_CCH - Resultados de MIC e MBC P2_CCH Peptídeo MIC MBC E. coli 256->256 256->256 S. aureus >256 >256

P. aeruginosa >256 >256 S. pyogenes >256 >256 M. smegmatis 16 64->256 Tabela 7 P3_CCH - Resultados de MIC e MBC P3_CCH Peptídeo MIC MBC E. coli >256 >256 S. aureus >256 >256 P. aeruginosa >256 >256 S. pyogenes >256 >256 M. smegmatis >256 >256 Tabela 8 P4_CCH - Resultados de MIC e MBC P4_CCH Peptídeo MIC MBC E. coli 128 128 S. aureus >256 >256 P. aeruginosa >256 >256 S. pyogenes 256 256 M. smegmatis 8 >256 Tabela 9 P5_CCH - Resultados de MIC e MBC P5_CCH Peptídeo MIC MBC E. coli 16 32 S. aureus 4 16 P. aeruginosa 256->256 256->256 S. pyogenes 128 128 M. smegmatis 2 >256 Tabela 10 P6_CCH - Resultados de MIC e MBC P6_CCH

Peptídeo MIC MBC E. coli 16-64 16-64 S. aureus 128-256 256 P. aeruginosa 256->256 256->256 S. pyogenes 128 128 M. smegmatis 2 2->256 Tabela 11 P7_CCH - Resultados de MIC e MBC P7_CCH Peptídeo MIC MBC E. coli >256 >256 S. aureus >256 >256 P. aeruginosa >256 >256 S. pyogenes >256 >256 M. smegmatis 32 >256 Tabela 12 P8_CCH - Resultados de MIC e MBC P8_CCH Peptídeo MIC MBC E. coli >256 >256 S. aureus >256 >256 P. aeruginosa >256 >256 S. pyogenes >256 >256 M. smegmatis 128 128->256 Tabela 13 P9_CCH, P10_CCH, P11_CCH - Resultados de MIC e MBC P9_CCH P10_CCH P11_CCH Peptídeo MIC MBC MIC MBC MIC MBC E. coli >256 >256 >256 >256 >256 >256 S. aureus >256 >256 >256 >256 >256 >256 P. aeruginosa >256 >256 >256 >256 >256 >256 S. pyogenes >256 >256 >256 >256 >256 >256 M. smegmatis >256 >256 >256 >256 >256 >256

Tabela 14 P12_CCH, P13_CCH, P14_CCH - Resultados de MIC e MBC P12_CCH P13_CCH P14_CCH Peptídeo MIC MBC MIC MBC MIC MBC E. coli >256 >256 >256 >256 >256 >256 S. aureus >256 >256 >256 >256 >256 >256 P. aeruginosa >256 >256 >256 >256 >256 >256 S. pyogenes >256 >256 >256 >256 >256 >256 M. smegmatis >256 >256 >256 >256 >256 >256 Tabela 15 P15_CCH e P16_CCH - Resultados de MIC e MBC P15_CCH P16_CCH Peptídeo MIC MBC MIC MIC E. coli >256 >256 >256 >256 S. aureus >256 >256 >256 >256 P. aeruginosa >256 >256 >256 >256 S. pyogenes >256 >256 >256 >256 M. smegmatis >256 >256 >256 >256 Tabela 16 H3, H4, H5 - Resultados de MIC e MBC H3 H4 H5 Peptídeo MIC MBC MIC MBC MIC MBC E. coli >256 >256 128 128 >256 >256 S. aureus >256 >256 256 >256 >256 >256 P. aeruginosa >256 >256 >256 >256 >256 >256 S. pyogenes >256 >256 >256 >256 >256 >256 M. smegmatis 8 >256 8 >256 256 >256 Tabela 17 R4 e R4_AcOH - Resultados de MIC e MBC R4 R4_AcOH Peptídeo MIC MBC MIC MBC E. coli 16 16 - - S. aureus 4 4 - - P. aeruginosa >256 >256 >256 >256

S. pyogenes - - - - M. smegmatis 4 4 - - Tabela 18 LL37/Tp - Resultados de MIC & MBC LL37 +ve LL37 +ve_AcOH Tp -ve Peptídeo MIC MBC MIC MBC MIC MBC E. coli 64 64 64 64 >256 >256 S. aureus 256 >256 256 >256 >256 >256 P. aeruginosa 256- 256->256 >256 >256 >256 >256 S. pyogenes >256 >256 >256 - - >256 >256 M. smegmatis 4 4->256 4 4 >256 >256

[289] Os dados a seguir são apresentados para mostrar a atividade (MIC/MBC em µg/mL) de certos peptídeos antimicrobianos descritos na presente invenção em relação a uma versão modificada/sintética com uma substituição especificada. Embora os dados apresentados nas tabelas acima possam ser apresentados novamente ou possam ser representados nos dados fornecidos nas tabelas abaixo, acredita-se que tal duplicação ajude o leitor a notar comparações prontamente. Números de execução diferentes observados nas tabelas a seguir indicam experimentos realizados em dias diferentes, com cada execução refletindo vários valores de n. Tabela 19 TCC E. coli - Análise de MIC/MBC Execução No. 1 2 3 4 5 Peptídeo # P1_CCH 1 Nl P1_CCH_F9R_Y2P 2 Nl P2_CCH 3 16/16 Nl Nl 128/128 128/128 P2_CCH_T15K_P7R 4 4/4 4/4 4/4 8/8 8/8 P3_CCH 5 Nl Nl Nl Nl Nl P3_CCH_D8K_Q23C 6 64/64 64/64 64/64 64/64 64/64 P4_CCH 7 64/128 32/64 32/64 32/32 32/32 P4_CCH_P31K 8 32/32 32/32 16/32 16/32 16/32

P5_CCH 9 8/8 8/8 8/16 16/16 16/16 P5_CCH_A19K 10 16/16 4/4 4/4 4/4 4/4 P6_CCH 11 16/16 8/8 8/8 8/16 16/16 P6_CCH_S12K 12 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 P7_CCH 13 Nl P7_CCH_P9R_R5M 14 256 P8_CCH 15 Nl P8_CCH_N11K 16 Nl P11_CCH 17 Nl Nl Nl Nl Nl P11_CCH_E21 18 32/32 64 64 64 64 P13_CCH 19 Nl Nl Nl Nl Nl K_E23R P13_CCH_N8K_E18K 20 32 Nl Nl Nl Nl HP1 21 2/2 4/4 4/4 4/4 4/4 HP1delta7 22 8 16/16 16/16 16/16 16/16 HP3 23 Nl HP3_S3R 24 128 HP5 25 Nl HP5_E10K_E14R 26 Nl LL37 positivo 27 8/8 8/8 16/16 16/16 P5_Tp Negativo 28 Nl Nl Nl Nl Tabela 20 ESBL E. coli - Análise de MIC/MBC Execução No. 1 2 3 4 5 Peptídeo P1_CCH Nl P1_CCH_F9R_Y2P Nl P2_CCH 16/16 16/16 16/16 64/128 128/128 P2_CCH_T15K_P7R 2/2 4/4 4/4 8/8 8/8 P3_CCH Nl Nl Nl Nl Nl P3_CCH_D8K_Q23C 64/64 64/64 64/64 64/128 64/128 P4_CCH 64/128 64/128 64/128 64/64 64/64 P4_CCH_P31 K 32/32 32/32 32/32 32/32 32/32 P5_CCH 8/32 8/8 8/8 16/64 32/64 P5_CCH_A19K 16/16 16/16 16/16 8/8 4/4 P6_CCH 16/64 8/32 16/32 16/16 16/16 P6_CCH_S12K 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 P7_CCH Nl

P7_CCH_P9R_R5M 128/128 P8_CCH Nl P8_CCH_N11K 128/128 P11_CCH Nl Nl Nl Nl Nl P11_CCH_E21 32/64 16 16 32/128 32/128 P13_CCH Nl Nl Nl Nl Nl K_E23R P13_CCH_N8K_E18K Nl Nl Nl Nl Nl HP1 8/8 4/4 4/4 4/4 4/4 HP1delta7 32/32 32/32 32/32 64/128 64/128 HP3 Nl HP3_S3R Nl HP5 Nl HP5_E10K_E14R Nl LL37 positivo 8/8 4/4 8/8 P5_Tp Negativo Nl Nl Nl Tabela 21 CPO E. coli (KPC) - Análise MIC/MBC Execução No. 1 2 3 4 5 Peptídeo P1_CCH Nl P1_CCH_F9R_Y2P Nl P2_CCH 32/32 16/16 16/16 64/64 64/64 P2_CCH_T15K_P7R 8/8 8/8 8/8 8/8 8/8 P3_CCH Nl Nl Nl Nl Nl P3_CCH_D8K_Q23C 64/128 128/128 128/128 64/64 64/64 P4_CCH 32/64 32/64 32/64 Nl Nl P4_CCH_P31K 32/32 16/32 16/32 16/32 16/32 P5_CCH 4/4 4/4 4/4 16/16 16/16 P5_CCH_A19K 16/16 16/16 16/16 4/4 4/4 P6_CCH 8/16 8/32 8/16 8/8 8/8 P6_CCH_S12K 4/8 4/4 4/4 4/4 4/4 P7_CCH Nl P7_CCH_P9R_R5M 256/256 P8_CCH Nl P8_CCH_N11K Nl P11_CCH Nl Nl Nl Nl Nl

P11_CCH_E21 K_E23R 64 32 32 32 32 P13_CCH Nl Nl Nl Nl Nl P13_CCH_N8K_E18K 64 64 64 Nl Nl HP1 8/8 4/4 4/16 4/4 4/4 HP1delta7 16 16/32 16/64 32/32 32/32 HP3 Nl HP3_S3R 256/256 HP5 Nl HP5_E10K_E14R Nl LL37 positivo 16/16 16/16 8/8 P5_Tp Negativo Nl Nl Nl Tabela 22 CPO E. coli (NDM) - Análise MIC/MBC Execução No. 1 22 3 4 5 Peptídeo P1_CCH Nl P1_CCH_F9R_Y2P Nl P2_CCH 16/16 16/16 16/16 128/128 128/128 P2_CCH_T15K_P7R 4/4 4/4 4/4 8/8 8/8 P3_CCH Nl Nl Nl Nl Nl P3_CCH_D8K_Q23C 128/128 128/128 128/128 128/128 Nl P4_CCH 128/256 128/128 64/128 64/64 64/64 P4_CCH_P31K 32 32/32 32/32 64/64 32/64 P5_CCH 8/8 4/8 8/16 32/32 32/32 P5_CCH_A19K 16/16 16/16 16/16 8/8 4/4 P6_CCH 16/16 16/16 16/16 32/64 32/64 P6_CCH_S12K 4/4 4/8 4/8 8/8 8/8 P7_CCH 256 P7_CCH_P9R_R5M 256 P8_CCH Nl P8_CCH_N11K 128/128 P11_CCH Nl Nl Nl Nl Nl P11_CCH_E21 32/128 32/128 32/128 64 64 P13_CCH K_E23R 256 Nl Nl Nl Nl P13_CCH_N8K_E18K 128 64 64 64? 64?

HP1 8/8 8/8 8/8 8/8 4/4 HP1delta7 64/128 16/32 16/32 64/64 64/64 HP3 Nl HP3_S3R 128 HP5 Nl HP5_E10K_E14R Nl LL37 positivo 8/8 16/16 8/8 P5_Tp Negativo 256/256 Nl Nl Tabela 23 ATCC S. aureus - Análise de MIC/MBC Execução No. 1 2 3 4 5 Peptídeo P1_CCH Nl P1_CCH_F9R_Y2P Nl P2_CCH Nl Nl Nl Nl Nl P2_CCH_T15K_P7R 64/64 128/128 128/128 64/128 64/128 P3_CCH Nl Nl Nl Nl Nl P3_CCH_D8K_Q23C Nl Nl Nl Nl Nl P4_CCH Nl Nl Nl Nl Nl P4_CCH_P31 K Nl Nl Nl Nl Nl P5_CCH 4/4 8/8 8/8 8/8 8/8 P5_CCH_A19K 8/8 2/2 2/2 2/2 2/2 P6_CCH 256 128 128 Nl Nl P6_CCH_S12K 64/64 64/64 64/64 128/128 128/128 P7_CCH Nl P7_CCH_P9R_R5M 128 P8_CCH Nl P8_CCH_N11K Nl P11_CCH 64 Nl Nl Nl Nl P11_CCH_E21 128 Nl Nl Nl Nl P13_CCH 128 Nl Nl Nl Nl K_E23R P13_CCH_N8K_E18K 256 Nl Nl Nl Nl HP1 4/8 4/4 4/4 4/4 4/4 HP1delta7 8/16 32/32 32/32 32/32 32/32 HP3 Nl HP3_S3R Nl HP5 Nl

HP5_E10K_E14R Nl LL37 positivo 128 128 Nl Nl P5_Tp Negativo Nl Nl Nl Nl Tabela 24 MRSA - Análise de MIC/MBC Execução No. 1 2 3 4 5 Peptídeo P1_CCH Nl P1_CCH_F9R_Y2P Nl P2_CCH Nl Nl Nl Nl Nl P2_CCH_T15K_P7R 64/64 32/64 64/64 32/32 32/32 P3_CCH Nl Nl Nl P3_CCH_D8K_Q23C Nl Nl Nl P4_CCH Nl Nl Nl P4_CCH_P31 K Nl Nl Nl P5_CCH 2/2 2/2 4/4 8/8 4/4 P5_CCH_A19K 8/8 8/8 8/8 2/2 2/2 P6_CCH 256/256 256/256 256/256 128 128 P6_CCH_S12K 128/128 64/64 64/128 64/64 64/64 P7_CCH Nl P7_CCH_P9R_R5M Nl P8_CCH Nl P8_CCH_N11K Nl P11_CCH Nl Nl Nl Nl Nl P11_CCH_E21 Nl Nl Nl Nl Nl P13_CCH Nl Nl Nl Nl Nl K_E23R P13_CCH_N8K_E18K Nl Nl Nl Nl Nl HP1 4/4 2/2 4/4 4/8 4/8 HP1delta7 8 8/8 8/8 16/64 16/16 HP3 Nl HP3_S3R Nl HP5 Nl HP5_E10K_E14R Nl LL37 positivo 256 Nl Nl Nl P5_Tp Negativo Nl Nl Nl Nl Tabela 25 Salmonella enteritidis - Análise de MIC/MBC

Execução Nº. 1 2 3 4 5 Peptídeo P1_CCH Nl P1_CCH_F9R_Y2P Nl P2_CCH 64/64 Nl Nl Nl Nl P2_CCH_T15K_P7R 32/32 64/64 64/64 32/128 32/128 P3_CCH Nl Nl Nl Nl Nl P3_CCH_D8K_Q23C Nl Nl Nl Nl Nl P4_CCH Nl Nl Nl Nl Nl P4_CCH_P31 K 256/256 Nl Nl Nl Nl P5_CCH 64/64 128/128 128/128 128/128 128/128 P5_CCH_A19K 64/64 16/16 32/32 16/16 16/16 P6_CCH 128/128 64/64 64/64 64/128 128/128 P6_CCH_S12K 16/16 32/32 32/32 32/32 16/32 P7_CCH Nl P7_CCH_P9R_R5M Nl P8_CCH Nl P8_CCH_N11K Nl P11_CCH 32 32 32 Nl Nl P11_CCH_E21 64 Nl Nl Nl Nl P13_CCH 16 16 16 Nl Nl K_E23R P13_CCH_N8K_E18K 16 16 16 Nl Nl HP1 32 32/32 16/16 16/16 16/16 HP1delta7 256 Nl Nl Nl Nl HP3 Nl HP3_S3R Nl HP5 Nl HP5_E10K_E14R Nl LL37 positivo Nl 128 64/64 64/64 P5_Tp Negativo Nl Nl Nl Nl Tabela 26 Salmonella heidelberg (MDR) - Análise de MIC/MBC Execução Nº. 1 2 3 4 5 Peptídeo P1_CCH Nl P1_CCH_F9R_Y2P Nl P2_CCH 128/128 Nl Nl Nl Nl

P2_CCH_T15K_P7R 16/16 64/64 32/64 64/64 32/64 P3_CCH Nl Nl Nl Nl Nl P3_CCH_D8K_Q23C 256 Nl Nl Nl Nl P4_CCH 256 Nl Nl Nl Nl P4_CCH_P31K 128 128 128 Nl Nl P5_CCH 32/64 128/128 128/128 128/128 128/128 P5_CCH_A19K 64/64 16/16 16/16 16/16 16/16 P6_CCH 64/256 64/64 64/64 64/64 64/64 P6_CCH_S12K 32/64 32/64 16/64 16/32 16/32 P7_CCH Nl P7_CCH_P9R_R5M Nl P8_CCH Nl P8_CCH_N11K Nl P11_CCH 128 Nl Nl Nl Nl P11_CCH_E21K_E23R 128 Nl Nl Nl Nl P13_CCH 32 32? 32? Nl Nl P13_CCH_N8K_E18K 32 16? 16? Nl Nl HP1 32/32 16/16 32/32 16/16 16/16 HP1delta7 128 128 128 128 128 HP3 Nl HP3_S3R Nl HP5 Nl HP5_E10K_E14R Nl LL37 positivo Nl Nl 128 Nl P5_Tp Negativo Nl Nl

[290] A Tabela 27 mostra o teste de atividade de peptídeos selecionados descritos na presente invenção, para as métricas de Concentração Inibitória Mínima (MIC), bem como por teste de hemólise para determinar HC50 (µg/mL) como um indicador de atividade hemolítica com base na concentração de um composto antimicrobiano que mata 50% dos glóbulos vermelhos usando metodologia padrão. Na Tabela 27, as designações P2, P2M, P3, P3M, P4, P4M, P5, P5M, P6, e P6M referem-se a peptídeos P2_CCH, P2_CCH_T15K_P7R, P3_CCH, P3_CCH_D8K_Q23C, P4_CCH, P4_CCH_P31K, P5_CCH, P5_CCH_A19K, P6_CCH, e P6_CCH_S12K, respectivamente, conforme definido acima.

Tabela 27 - Selecionar os parâmetros de atividade para AMPs Teste de Atividade Concentração Inibitória Mínima (MIC) (ug/mL) Isolado Bacteriano P2 P2M P3 P3M P4 P4M P5 P5M P6 P6M Ran-4 Ran-4M LL37 (+ve) Tp_P5 (-ve) Gram negativo E. coli ATCC 25922 16 4-8 - 64 32-64 16-32 4-16 4-16 8-16 4 2-4 8-16 8-16 - ESBL E. coli 16 2-8 - 64 64 32 8-32 4-16 8-16 4 4-8 32-64 4-8 - CPO E. coli NDM 16 4-8 - 128+ 64-128 32-64 4-32 4-16 16-32 4-8 4-8 16-64 8-16 - CPO E. coli KPC 16-32 8 - 64-128 32 16-32 4-16 4-16 8 4 4-8 16-32 8-16 - S. enterica spp.

Enteritidis 64 32-64 - - - - 64-128 16-64 64-128 16-32 16-32 - 64+ - S. enterica spp. heidelberg 128 16-64 - - - 128+ 32-128 16-64 64 16-32 16-32 128 - -

63/79 Gram positivo S. aureus ATCC 29213 - 64-128 - - - - 4-8 2-8 128+ 64-128 64-128 8-23 128+ - MRSA - 32-64 - - - - 2-8 2-8 128+ 64-128 64-128 8-16 - - Teste de Hemólise P2 P2M P3 P3M P4 P4M P5 P5M P6 P6M Ran-4 Ran-4M LL37 (+ve) Tp_P5 (-ve) HC50(ug/mL)-lX PBS - - - - - - 128 - - - 128 - - - HC50(ug/mL)-RPMI - 64 - - - - 8-64 64-128 - - 16-64 - - -

[291] A Tabela 28 fornece uma visão geral das sequências descritas na presente invenção e as SEQ ID NOs correspondentes. Onde “X” é mostrado na listagem de sequência, é igual ao código de três letras “Xaa”, o que significa que qualquer sequência pode estar presente. Onde as tabelas ou figuras que ilustram os alinhamentos podem mostrar um traço “-“, isso indica um resíduo ausente, no lugar para manter o melhor alinhamento possível com as sequências comparáveis mostradas. A menos que especificado de outra maneira, as sequências são sintéticas e/ou derivadas do transcriptoma de referência anotado da rã-touro (BART) da rã-touro norte americana, Rana (Lithobates) catesbeiana. Peptídeos sintéticos e/ou são sequências isoladas. Tabela 28 Sequências descritas na presente invenção e SEQ ID Nos. correspondentes Tabela/Figura SEQ ID No. Tabela 1 SEQ ID NO: 1-14 são fornecidas abaixo. SEQ ID NO:1 é:

MFTMKKSLLLLFFLGTISLSLCEQERNADDDQGEVIEQKVKR SEQ ID NO:2 é:

AFLSTVKNTLTNVAGTMIDTFKCKITGVC SEQ ID NO:3 é:

VLLYLIITVSFPRRDANDEDGGEVTKEVVKR SEQ ID NO:4 é:

SLSGCWTKSFPRKPCLRNR SEQ ID NO:5 é:

MSSFCEITNVALTISLSSPRRGADEEEGNGEKEIKR SEQ ID NO:6 é:

SMLSVLKNLGKVGLGFVACKINKQC SEQ ID NO:7 é:

MTQSTQKWFKTKYWRVRNRPAMSPDLNPIEHLWRDLKKVVGKR SEQ ID NO:8 é: NPSNLRALEELVKEECSEIPVERCKKLIYGYRK SEQ ID NO:9 é:

MRKRMTMRRMMKKKKSEKERRERGKR SEQ ID NO:10 é:

MMRVMRRKTKVIWEKKDFIGLYSID SEQ ID NO:11 é:

MFFMSSPRRDADEVKEVKR SEQ ID NO:12 é:

GFLDIIKNLGKTFAGHMLDKIKCTIGTCPPSP SEQ ID NO:13 é:

MITVSSPRRDADGDEGEVEEVKR SEQ ID NO:14 é:

GFLDIIKDTGKEFAVKILNNLKCKLAGGCPP Figura 1 SEQ ID NO: 15-30 são fornecidas abaixo. SEQ ID NO:15 é:

MFTMKKSLLLFFFLGTISLSLCEEERDADDDQGEVVKKEVKR

AFFTTVKNLVTNVAGTVIDKMKCKLTGQC SEQ ID NO:16 é:

MFTMKKSLLLLFFLGTISLSLCEQERNADDDQGEVIEQKVKR

AFLSTVKNTLTNVAGTMIDTFKCKITGVC SEQ ID NO:17 é:

MFTLKKSLLLLFFLGTITLSLCEQERGADEEEGNGEKEIKR

SMLSVLKNLGKVGLGFVACKINKQC SEQ ID NO:18 é:

MSSFCEITNVALTISLSSPRRGADEEEGNGEKEIKR

SMLSVLKNLGKVGLGFVACKINKQC SEQ ID NO:19 é:

MFFMSSPRRDADEVKEVKR

GFLDIIKNLGKTFAGHMLDKIKCTIGTCPPSP SEQ ID NQ:20 é:

MFTMKKSLLLLFFLGTISLSLCEPQRDADEVKEVKR

GFLDIIKNLGKTFAGHMLDKIKCTIGTCPPSP SEQ ID NO:21 é:

MFTLKKSLLLLFFLGTINLSLCEEERDAEEERRDNPDERDVEVEKR

FLPFIARLAAKVFPSIICSVTKKC SEQ ID NO:22 é:

MFTMKKSLLLLFFLGTISLSLCEQERNADDDQGEVIEQKVKR

AFLSTVKNTLTNVAGTMIDTFKCKITGVC SEQ ID NO:23 é:

MFTLKKSLLLLFFLGTITLSLCEQERGADEDNGGEMTEEEVKR

GLFLDTLKGAAKDVAGKLLEGLKCKITGCKP SEQ ID NO:24 é:

MFTMKKSLLLLFFLGIISLSLCEQERDANDEEDGGEVTKEVVKR

SLRGCWTKSFPPQPCLGKRLNMN SEQ ID NO:25 é:

MFTLKKSLLLLFFFGIISLSFCEQERDANDEEDGGEVTKEVVKR

SLRGCWTKSYPPQPCLGKR SEQ ID NO:26 é:

VLLYLIITVSFPRRDANDEDGGEVTKEVVKR

SLSGCWTKSFPRKPCLRNR SEQ ID NO:27 é:

MFTMKKSEKERRERGKR

MMRVMRRKTKVIWEKKDFIGLYSID SEQ ID NO:28 é:

MRKRMTMRRMMKKKKS E KE RRE RGKR

MMRVMRRKTKVIWEKKDFIGLYSID SEQ ID NO:29 é:

MFTMKKSLLLLFFLGTISLSLCEQERDADGDEGEVEEVKR

GFLDIIKDTGKEFAVKILNNLKCKLAGGCPP SEQ ID NQ:30 é:

MITVSSPRRDADGDEGEVEEVKR GFLDIIKDTGKEFAVKILNNLKCKLAGGCPP. Figura 4 SEQ ID NO: 31-34 são fornecidas abaixo SEQ ID NO:31 é:

MGLSATLWFLMGVAAGSMASPLLQWSEDDISVMALYSTDYYNKVS GEDVLYGLQENNTEYITDEKSRFHQLSFPIQKTVCQKSDNALTDD CAFKEGGVVKSCTSYFFEEDDRDIIVVTCQSQDGHREHSRVRRSR

RGRGGGRRGGSGGRGGRGGGGRSGAGSSIAGVGSRGGGGGRHYA SEQ ID NO:32 é:

MGLSATFWFLMGLAASSMASPLLQWSEDDAAVMALYSADHYNKV SGEDVLYGLLENDTEYITDEKSRFHQLSFPIQETVCQKSDNNAP TDDCAFKEGGVVKSCTSYFFEEDDRDIVVVNCQSQDSHREHSRV

RRSRSGRGGGGRGGGGRGGSRGGSRSGSRSSIAGGGSRGGSRGGGTRYA SEQ ID NO:33 é:

MIPQLRKWMAIFVMCIVLIHQLEGAPMNSNDGSKTALRLRR

MTPFWRGLSLRPVGASCRDDTECLTRLCRNQRCSLKTFAD SEQ ID NO:34 é:

MTPQLRKWTAIFVICIVLIHQLEGAPMSNTAGSKTLLRLRR MTPFWRGLSLRPVGASCRDDTECLTRLCRKERCSLKTFAD. P1 a P16 sequências SEQ ID NO: 35 - 65 são fornecidas abaixo. de exemplo “naturais” SEQ ID NO:35 é: FYFPVSRKFGGK e “sintéticas” SEQ ID NO:36 é: FPFPVSRKRGGK SEQ ID NO:37 é:

FFPRVLPLANKFLPTIYCALPKSVGN SEQ ID NO:38 é:

FFPRVLRLANKFLPKIYCALPKSVGN SEQ ID NO:39 é:

GLLDIIKDTGKTTGILMDTLKCQMTGRCPPSS SEQ ID NO:40 é:

GLLDIIKKTGKTTGILMDTLKCCMTGRCPPSS SEQ ID NO:41 é:

GLLDIIKTTGKDFAVKILDNLKCKLAGGCPP SEQ ID NO:42 é:

GLLDIIKTTGKDFAVKILDNLKCKLAGGCPK SEQ ID NO:43 é:

FFPIIARLAAKVIPSLVCAVTKKC SEQ ID NO:44 é:

FFPIIARLAAKVIPSLVCKVTKKC SEQ ID NO:45 é:

GLWETIKTTGKSIALNLLDKIKCKIAGGCPP SEQ ID NO:46 é:

GLWETIKTTGKKIALNLLDKIKCKIAGGCPP SEQ ID NO:47 é:

ATAWRIPPPGMQPIIPIRIRPLCGKQ SEQ ID NO:48 é:

ATAWMIPPRGMQPIIPIRIRPLCGKQ SEQ ID NO:49 é:FPAIICKVSKNC SEQ ID NO:50 é:FPAIICKVSKKC SEQ ID NO:51 é:FLTKPGMTFGKLLGK SEQ ID NO:52 é:SNRDFFKVNIFRLCG SEQ ID NO:53 é:SNRKFFKVRIFRLCG SEQ ID NO:54 é:ALVAKIQKFPVFNTLKLCKLELEII SEQ ID NO:55 é:ALVAKIQKFPVFNTLKLCKLKLRII SEQ ID NO:56 é:IAGQVAAAKQKHI SEQ ID NO:57 é:IAGQKARAKQKHI SEQ ID NO:58 é:IQRLPVINMLKLWKLELEII SEQ ID NO:59 é:IQRLPVIKMLKLWKLELKII SEQ ID NO:60 é:IQRLPVIVILPSLYCVICRTC SEQ ID NO:61 é:IQRLPVIVILPSLYCVICRKK SEQ ID NO:62 é:

LRCPTPHYNFENGIGNHLMWNIIWLNAQQMSYKNK SEQ ID NO:63 é:

LRCPTPHYRFENGIGNHLMWNIIWLNAQQMSYCNK SEQ ID NO:64 é:SNRDFFMVNIFGLCGPFGIMERKRR SEQ ID NO:65 é:SNRKFFMVNIFGLCGPFGIMKRKRR. Grupos P1 – SEQ ID NO: 66-166 são fornecidas abaixo.

Sequências variantes XXXPXXXXXGGK (SEQ ID NO:66) do grupo P16 FYFPXXXXXGGK (SEQ ID NO:67) XYFXXSRKXXXX (SEQ ID NO:68) FXFXVSRKXXXX (SEQ ID NO:69) XYFXXXXKFXXK (SEQ ID NO:70) XXXXXXXXFGGK (SEQ ID NO:71) FYXPVXRXFXXX (SEQ ID NO:72) FFPRXXXXXXXFLPTXXXXXXXSVGN (SEQ ID NO:73) XXXXVLPLANKXXXXIYCXXXXXXXX (SEQ ID NO:74) FFPXXLPLANXXLPXXXXXLPXXVGN (SEQ ID NO:75) XXPRVLXXXXXXXXXXXXXXPKSXXX (SEQ ID NO:76) FXXXXXXLANKXXXTIYCXXXXSVXX (SEQ ID NO:77) FFXXVLPXXXXXLXTXYCALPKXVXN (SEQ ID NO:78) XXXXXXXLANXFXPXIXXALPKXXGX (SEQ ID NO:79) GLLXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCPPSS (SEQ ID NQ:80) XXXXXXKXXXKXXGXLMXXXXXXMXGXXPPXS (SEQ ID NO:81) GLLXIIXXXGXTTGILMXXLXXXMXGXXPPXX (SEQ ID NO:82) XLXXXXXXXXKXXXXXXXTLKCQMTXXCXXSS (SEQ ID NO:83) GLLXIIKXTGKTTGILMXXLKXXXXGXXXXXX (SEQ ID NO:84) GXLXIIKXTGXXTXIXMXTLKCQXTGRXPPSS (SEQ ID NO:85) GLLXXXKXTGKXTXIXXXTLKXQXTGRXXXXX (SEQ ID NO:86) XXXXIIXXTXXTXGXLXXTXXCQXTXRXXXXX (SEQ ID NO:87) GLLXIIXXXGXXXXXXILXXLXXXLAGGXXX (SEQ ID NO:88) GLLXXXKTTGKXFAVKILXNLXXXXXXXXPP (SEQ ID NO:89) XXXXIIKTXXXXFAVXXXXXXKCKLAGGXXX (SEQ ID NO:90) XXXXIIXXXXKXXXXKXXXNLKCKXXXXCPP (SEQ ID NO:91) GLLXXXKTTGXXXXXXXLXNLKCXXAXXCXX (SEQ ID NO:92) GLLXXXKXXXXXFAVXXLXXLXXXXXXXXPP (SEQ ID NO:93) XXXXXXXLAAKXXXSLVXXXXKKC (SEQ ID NO:94) XFPIIAXLAAXVIPXLVXAVTXXX (SEQ ID NO:95) FFPXXAXXXXKXXPXXXXXXXXXX (SEQ ID NO:96)

XXXXXXXLAAXVIPXLXXXXTXXX (SEQ ID NO:97) FFPIIAXXXXXXXXXXVCAVTKKC (SEQ ID NO:98) XXXIIXRXXXKVIXSXVCXVTKKC (SEQ ID NO:99) FFPIIARLAAXVIXSLXCAVXXXX (SEQ ID NO:100) GLWETIKXXXKXXXXXXXXKXXXXXXGGCPP (SEQ ID NO:101) XXXXXXXTTGXXXXXXXXXXXKCKXXXXCXX (SEQ ID NO:102) XXXXTIXXXGXXIALXLLXXIXXXIAXXXPP (SEQ ID NO:103) GLWETXKTTXXSXXLNLLDKIXXKIAXXXPP (SEQ ID NO:104) XXXXXIKXXGKSIALXXXXKXKXKXXGGXXX (SEQ ID NO:105) XXXXXXXXXXKSIAXNLLXXIXCXIAGGXXX (SEQ ID NO:106) ATAWXIXXXGMXXIIXIXIXXLXGXX (SEQ ID NO:107) XXXWXIXXXGMQXXXXXXXXXXCGKQ (SEQ ID NO:108) XXXXXXPPPXXQPXXPXXXXPXXXXX (SEQ ID NO:109) ATAXXXPPPXXXPXXPXXXXPXCXKQ (SEQ ID NO:110) XXXWXIXXXGMXXXXXIXIXXLXGXX (SEQ ID NO:111) XXXXXXXXXXXXPXXPXXIXXLXGXX (SEQ ID NO:112) ATAXRXXXXXXQXIIXIRIRXLCXKQ (SEQ ID NO:113) FPAIIXXXXXXX (SEQ ID NO:114) FXXXXCXXXKXC (SEQ ID NO:115) XXAIIXXVSKXX (SEQ ID NO:116) XPAXXCKXXXXX (SEQ ID NO:117) FPXXXXXVSKNC (SEQ ID NO:118) XXXIICKVSXNX (SEQ ID NO:119) FLTFXGXXFGXXXGX (SEQ ID NO:120) XXXXPGMXFXXLLXX (SEQ ID NO:121) XXXXPGMXXXKXXXK (SEQ ID NO:122) FLTFXXXXXXXLLGX (SEQ ID NO:123) FXXFXXXTFGKXXXK (SEQ ID NO:124) XLTXXXXTFGKLLGK (SEQ ID NO:125) XXXXFFXVNIFXLXX (SEQ ID NO:126) SNXXXXXVXXXRXXX (SEQ ID NO:127)

XXXXFFXXXIFXLCG (SEQ ID NO:128) SNXXXXKXXXXXLCG (SEQ ID NO:129) XXRXXXKVNIFXXCX (SEQ ID NO:130) SXXXFFXVXIXXXXG (SEQ ID NO:131) SXRDFFKXNXXRXCX (SEQ ID NO:132) XXXXXIQKXXXXNTLKXXKXXLXXX (SEQ ID NO:133) ALVAKXXX FPVFXXXXLCXLXXXXX (SEQ ID NO:134) ALVAKIQKXXXXXXXXXXKLXXXII (SEQ ID NO:135) XXXXXXXKXPXXNTLKXCKXEXEXX (SEQ ID NO:136) XXXXXXQXFXVFXTLKLXKLXLXXX (SEQ ID NO:137) XLVAKIXXXPVXNXXXLXXXXLXII (SEQ ID NO:138) AXXAXIXXFXXFXXXXXCXXEXEII (SEQ ID NO:139) XXGQVXXXKXKXX (SEQ ID NO:140) IAXXXAAAXXXXX (SEQ ID NO:141) XXGXXXXXKXKHI (SEQ ID NO:142) IXXQVXXXKQKHI (SEQ ID NO:143) XXXQVXXXXQXHI (SEQ ID NO:144) XXRXPXXXXXKLWKXXLXXX (SEQ ID NO:145) IQXXXVXXXLXXXXLXXXII (SEQ ID NO:146) XXXLXXXNMXXXWKXXXXXX (SEQ ID NO:147) XXXLPXINMXKLXXXXLXXX (SEQ ID NO:148) IQRLXXXXXXXSLYXXXCRTC (SEQ ID NO:149) XXXLPVXVXLPSLYXXXXXXX (SEQ ID NO:150) IQRXXXIVIXXXXXCVIXXXX (SEQ ID NO:151) XXXXPVXXXXPSLYXXXCRTC (SEQ ID NO:152) IQRLXVIXILXXXXCXXCXXC (SEQ ID NO:153) XXXLPXXXXXPXXXXVIXXTX (SEQ ID NO:154) XXXLXVIVILXSLYCVICRTC (SEQ ID NO:155)

LXXPXPXYXFXXGIGXXXXWXXXWLNAQQMXXXXX (SEQ ID NO:156)

XXCPTPXXXFXXXXXNHLXXXIIWLXXXXMXXXXX

(SEQ ID NO:157)

LRCXXXXXXXENGXXXXXMWNXXXXXXXXXSYKNK (SEQ ID NO:158)

XXXXTXHYNXENGIGNHLMXNXXXXNXQXXXXKXK (SEQ ID NO:159)

LXCXXXHXNXXXXXGNHXXWXXXWLXXXXMSXXNX (SEQ ID NO:160)

XRXPXPHXXFXXXXXXXXXXXIIXXXAXQXSYXXX (SEQ ID NO:161) SNRXXXMXXXXGLXGPXXIMXXXXX (SEQ ID NO:162) XXXXFFMXXXXXXCXXFGXXXXKXX (SEQ ID NO:163) SNRDXXXXXIFGLXGPXXIMXRKRR (SEQ ID NO:164) SXXXXXXVNXXXXCXXFGXXEXXXX (SEQ ID NO:165) XXXXXXXVNIFXXXXPXXXXXRXRR (SEQ ID NO:166). Outros AMPs KSKLSLKKQGTIHLDAQSSCDVMHFPKCDLAPNVQRQAWLFKVA putativos SKEAKELRYYLLNPYLDVSARNVGSKV (SEQ ID NO:167)

KAGEGERGEREVLNHQKTILEPSSCPLISPHSTGLGHRPSLFRLTLA (SEQ ID NO:168)

LKGIKNAAQLLRFPPNCKLCSCTVFVHKDHCVVQEASGVFRF (SEQ ID NO:169)

NAARDHSATRCKQRSARLQIAAQDYRSQRSARLQIATQRKITDRNTA (SEQ ID NQ:170) LKPSNIQVKLQYIYW (SEQ ID NO:171). Precursores de AMP MNCGSFPCDACDVCEYVDAKTKLKLPNGRWHSIQFRVTCQTPG putativos adicionais VIYLAQCLCGGFYIGKTKRQFFKRIRDHIKPIRKNKMDTAISR

HVGIHHNFNPQFIKFSALEHIPQTLAVAALIASCYN (SEQ ID NO:172) MEEIVFPLQHPFHLDCLFFLLRHLSWEKT (SEQ ID NO:173)

MSIKKKEEMIQVKGMLKWKNDFYQLLERFSVLCLEKNPEMLKL (SEQ ID NO:174) MIQVKGMLKWKNDFYQLLERFSVLCLEKNPEMLKL (SEQ ID NO:175)

MPKKKEETIQMKGMLKWKNDFFQLLHA (SEQ ID NO:176)

MSGSRIGLPLALFPVTFVKISLFILLSSSSSAFLLGEHSYC (SEQ ID NO:177)

MSSPRRDANEEERRDDPDERDVEVEKRLLPVTTSENVLV

HRGGQKAGMDHREVTQGWREDLGHQEELSLNLQENNGGHPQFMPFQ (SEQ ID NO:178)

[292] Na descrição anterior, para fins de explicação, inúmeros detalhes são apresentados a fim de fornecer uma compreensão completa das modalidades. No entanto, será evidente para um técnico no assunto que estes detalhes específicos não são necessários.

[293] As modalidades acima descritas destinam-se a ser apenas exemplos. Alterações, modificações e variações podem ser efetuadas nas modalidades particulares pelos técnicos no assunto. O escopo das reivindicações não deve ser limitado pelas modalidades particulares estabelecidas na presente invenção, mas deve ser interpretado de uma maneira consistente com o relatório descritivo como um todo.

REFERÊNCIAS

[294] As seguintes publicações são incorporadas na presente invenção por referência.

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Claims (56)

REIVINDICAÇÕES

1. Peptídeo antimicrobiano, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:166, ou um fragmento ou variante das mesmas, tendo pelo menos 65% de identidade da sequência de aminoácidos com qualquer uma das SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:166.

2. Peptídeo antimicrobiano de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento ou variante tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade da sequência de aminoácidos com qualquer uma das SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:166.

3. Peptídeo antimicrobiano de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a variante compreende uma modificação que é uma substituição conservativa de aminoácidos.

4. Peptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreende um D-aminoácido.

5. Peptídeo antimicrobiano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem até 30 aminoácidos de comprimento.

6. Peptídeo antimicrobiano de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem até 20 aminoácidos de comprimento.

7. Peptídeo antimicrobiano de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:166 ou um fragmento ou variante das mesmas.

8. Peptídeo antimicrobiano de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:65 ou um fragmento ou variante das mesmas.

9. Peptídeo antimicrobiano de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o peptídeo consiste em uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:65 ou um fragmento ou variante das mesmas.

10. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo antimicrobiano definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e um excipiente adequado.

11. Composição de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de ser para uso em tratamento ou prevenção de uma doença ou condição.

12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a doença ou condição é infecciosa.

13. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a doença ou condição é atribuível a bactérias álcool-ácido resistentes.

14. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a doença ou condição é atribuível a bactérias resistentes a outros fármacos.

15. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a doença ou condição é atribuível a um tumor sólido.

16. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a doença ou condição é atribuível a um tumor líquido.

17. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16, caracterizada pelo fato de ser formulada para distribuição oral, injetável, retal, tópica, transdérmica, nasal ou ocular.

18. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16,

caracterizada pelo fato de que a composição é liofilizada.

19. Uso do peptídeo antimicrobiano definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser para tratamento ou prevenção de uma doença ou condição em um indivíduo em necessidade do mesmo.

20. Uso do peptídeo antimicrobiano definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser para preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de uma doença ou condição em um indivíduo em necessidade do mesmo.

21. Uso de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a referida doença ou condição é infecciosa.

22. Uso de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a referida doença ou condição é atribuível a bactérias Gram-negativas.

23. Uso de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a referida doença ou condição é atribuível a bactérias Gram-positivas.

24. Uso de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a referida doença ou condição é atribuível a bactérias álcool-ácido resistentes.

25. Uso de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a referida doença ou condição é atribuível a bactérias resistentes a outros fármacos.

26. Uso de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a referida doença ou condição é atribuível a um tumor sólido.

27. Uso de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a referida doença ou condição é atribuível a um tumor líquido.

28. Uso de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que a referida doença ou condição é atribuível a bactérias E. coli, S. enterica, S.

aureus, P. aeruginosa, S. pyogenes, M. smegmatis, MRSA, S. enteritidis ou S. heidelberg.

29. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 28, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.

30. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 28, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um animal.

31. Método para tratar ou prevenir uma doença ou condição, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz do peptídeo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou a composição definida na reivindicação 10.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a referida doença ou condição é atribuível a bactérias Gram-negativas.

33. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a referida doença ou condição é atribuível a bactérias Gram-positivas.

34. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a referida doença ou condição é atribuível a bactérias álcool-ácido resistentes.

35. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a referida doença ou condição é atribuível a bactérias resistentes a outros fármacos.

36. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a referida doença ou condição é atribuível a um tumor sólido.

37. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a referida doença ou condição é atribuível a um tumor líquido.

38. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a referida doença ou condição é atribuível a bactérias E. coli, S. enterica, S. aureus, P. aeruginosa, S. pyogenes, M. smegmatis, MRSA, S. enteritidis ou S.

heidelberg.

39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 38, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um humano.

40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 38, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um animal.

41. Vesícula lipídica, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo antimicrobiano definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

42. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica o peptídeo antimicrobiano definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

43. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico definida na reivindicação 42.

44. Método para identificar uma molécula alvo associada a um agente infeccioso, em que a referida molécula alvo se liga ao peptídeo antimicrobiano definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de triagem de uma biblioteca de moléculas alvo candidatas associadas ao agente infeccioso para uma molécula que se liga ao peptídeo antimicrobiano.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o referido agente infeccioso é uma bactéria Gram-negativa.

46. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o referido agente infeccioso é uma bactéria Gram-positiva.

47. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o referido agente infeccioso é uma bactéria álcool-ácido resistente.

48. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o referido agente infeccioso é uma bactéria resistente a outros fármacos.

49. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o referido agente infeccioso é uma bactéria E. coli, S. enterica, S. aureus, P.

aeruginosa, S. pyogenes, M. smegmatis, MRSA, S. enteritidis ou S. heidelberg.

50. Método para identificar uma molécula alvo para modular a atividade biológica, em que a referida molécula alvo se liga ao peptídeo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de triagem de uma biblioteca de moléculas alvo candidatas para uma molécula que se liga ao peptídeo.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que modular a atividade biológica compreende ação antitumoral, anti- inflamatória ou inflamatória.

52. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a ação antitumoral é para um tumor sólido.

53. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a ação antitumoral é para um tumor líquido.

54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 53, caracterizado pelo fato de que a triagem de uma biblioteca de moléculas alvo candidatas compreende triagem in silico.

55. Kit para identificar uma molécula alvo associada a um agente infeccioso, o referido kit caracterizado pelo fato de que compreende o peptídeo antimicrobiano definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 junto com instruções para conduzir o método definido em qualquer uma das reivindicações 44 a 49.

56. Kit para identificar uma molécula alvo para modular a atividade biológica, o referido kit caracterizado pelo fato de que compreende o peptídeo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 junto com instruções para conduzir o método definido em qualquer uma das reivindicações 50 a 53.