BR112021009463A2 - formulação de proteína de alta concentração - Google Patents

Abstract

FORMULAÇÃO DE PROTEÍNA DE ALTA CONCENTRAÇÃO. A presente invenção refere-se a composições e métodos de preparação de formulações de proteínas de alta concentração de uma proteína terapêutica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FOR- MULAÇÃO DE PROTEÍNA DE ALTA CONCENTRAÇÃO".

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a composições e métodos de preparação de formulações de proteínas de alta concentração de uma proteína terapêutica.

ANTECEDENTES

[002] Existem inúmeros benefícios no uso da administração sub- cutânea para biofármacos, incluindo formulações de proteínas de alta concentração. As vantagens das formulações administradas por via subcutânea incluem: (i) a capacidade de autoadministração, (ii) facili- dade de uso, (iii) redução da hospitalização e, portanto, dos custos de tratamento e (iv) aumento da adesão do paciente. Esses benefícios são especialmente importantes no tratamento de doenças crônicas, como asma, psoríase ou doenças artríticas. Como resultado, tem ha- vido um aumento nos biofármacos comercializados que dependem da administração subcutânea.

[003] Existem muitos desafios, no entanto, no desenvolvimento com sucesso de formulações de proteína de alta concentração para administração subcutânea, incluindo as propriedades físico-químicas das formulações, a estabilidade da proteína terapêutica na formulação, a correlação entre a agregação de proteína e a concentração da solu- ção e as limitações físicas em volume e força de injeção para disposi- tivos de distribuição subcutânea de drogas. Além disso, proteínas te- rapêuticas, como os anticorpos e as proteínas de fusão Fc do receptor, devem ser formuladas de uma maneira que não só torne as moléculas adequadas para administração aos pacientes, mas também mante- nham sua estabilidade durante o armazenamento e enquanto estive- rem no sítio de administração.

[004] Assim, há uma necessidade de superar os desafios que,

até o momento, têm limitado a disponibilidade de formulações de pro- teínas de alta concentração, com base na contribuição volumétrica da proteína.

SUMÁRIO

[005] A presente invenção refere-se a composições e métodos de preparação de formulações de proteínas de alta concentração de uma proteína terapêutica. Mais particularmente, a presente invenção ge- ralmente se refere a composições e métodos de preparação de formu- lações de proteína de alta concentração tendo pelo menos 200 mg/mL de proteína terapêutica com uma força de deslizamento de injeção in- ferior a cerca de 50 Newton (N). Estas formulações são particularmen- te adequadas para administração subcutânea.

[006] A presente invenção satisfaz a necessidade de formulação de proteína de alta concentração compreendendo pelo menos 200 mg/mL de uma proteína terapêutica ao superar os desafios tradicio- nalmente associados a formulações de proteína de alta concentração. A formulação de proteína de alta concentração da presente invenção pode compreender um veículo apropriado além da proteína terapêuti- ca. Por exemplo, em certas modalidades da presente invenção, a for- mulação de proteína de alta concentração pode compreender: (i) uma proteína terapêutica; (ii) um agente hidrofóbico; e (iii) um agente de redução de viscosidade.

[007] Por exemplo, em uma modalidade exemplificativa, a formu- lação de proteína de alta concentração pode compreender: (i) pelo menos 200 mg/mL de proteína terapêutica; (ii) agente hidrofóbico a 25%-75% v/v; e (iii) agente de redução de viscosidade a 25%-75% v/v. O agente hidrofóbico pode ser selecionado a partir de SASOL, óleo de girassol, óleo de rícino, glicerol, oleato de etila, triglicerídeos ou com- binações dos mesmos. Os triglicerídeos podem ser selecionados de Tricaprilato/Tricaprato de glicerila (Miglyol 812, Miglyol 810, Miglyol

818, Miglyol 829, Miglyol 840, CAPTEX 300, CAPTEX INJ 300, CAP- TEX INJ 335 e semelhantes), Tricaprilato de glicerila e triacetina ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade exemplificativa, o agente hidrofóbico é Miglyol 812 N. O agente de redução da viscosi- dade pode ser selecionado a partir de etanol, álcool benzílico, benzoa- to de benzila, acetato de etila, N-Metil-2-pirrolidona, lactato de etila, PEG400 ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade exempli- ficativa, o agente de redução da viscosidade é álcool benzílico. Em outro aspecto desta modalidade, a formulação de proteína de alta con- centração pode compreender mais de um triglicerídeo.

[008] Em um aspecto desta modalidade, a proteína terapêutica na formulação de proteína de alta concentração é micronizada para otimizar a seringabilidade e/ou estabilidade. Em uma modalidade exemplificativa, a proteína micronizada é produzida por secagem por pulverização. A concentração da proteína como um pó de proteína só- lida micronizada na formulação de proteína de alta concentração está entre cerca de 200 mg/mL a cerca de 600 mg/mL, de preferência entre cerca de 300 mg/mL a cerca de 600 mg/mL, mais preferencialmente entre cerca de 400 mg/mL a cerca de 600 mg/mL.

[009] Em um aspecto desta modalidade, a proteína terapêutica na proteína em pó micronizada contida na formulação de proteína de alta concentração é formulada com excipientes. Por exemplo, os exci- pientes na formulação de proteína de alta concentração podem incluir (i) um carboidrato; (ii) um aminoácido; e (iii) um surfactante não iônico. O carboidrato pode ser selecionado de sacarose, manitol, sorbitol, dextrano, maltodextrina, trealose ou combinações dos mesmos. O aminoácido pode ser selecionado de prolina, histidina, isoleucina, me- tionina, cisteína, glicina, arginina, lisina, L-leucina, Tri-leucina, alanina, ácido glutâmico, ácido aspártico, L-treonina, 2-fenilamina ou combina- ções dos mesmos. O surfactante não iônico pode ser selecionado a partir de polissorbato 20 (PS-20), polissorbato 28, polissorbato 40 (PS- 40), polissorbato 65, polissorbato 80 (PS-80), polissorbato 81, polis- sorbato 85, poloxamer 181, poloxamer 188, poloxamer 407, Triton X- 100, Brij-35, Brij-30, Tween 20, Tween 80, digitonina, (Ri-O-(CH2)x-R de alquil glicosídeos, onde R é independentemente CH3 ou (C6Hn) de ciclohexil; Ri é independentemente glicose ou maltose; e x = 3-15), Pluronic F127 ou combinações dos mesmos.

[0010] Em um aspecto desta modalidade, a formulação de proteí- na de alta concentração pode compreender aditivos para aumentar a dispersibilidade da formulação. O aditivo é selecionado a partir de ál- cool polivinílico, trileucina ou qualquer outro polímero conhecido com baixa solubilidade em água ou combinações dos mesmos.

[0011] Em um aspecto desta modalidade, a proteína terapêutica na formulação de proteína de alta concentração é micronizada para otimizar a seringabilidade e/ou estabilidade. Em uma modalidade exemplificativa, a proteína micronizada é produzida por secagem por pulverização. A concentração da proteína como um pó de proteína só- lida micronizada na formulação de proteína de alta concentração está entre cerca de 200 mg/mL a cerca de 600 mg/mL, de preferência entre cerca de 300 mg/mL a cerca de 600 mg/mL, mais preferencialmente entre cerca de 400 mg/mL a cerca de 600 mg/mL.

[0012] Em um aspecto desta modalidade, a proteína terapêutica na proteína em pó micronizada contida na formulação de proteína de alta concentração é formulada com excipientes. Por exemplo, os exci- pientes na formulação de proteína de alta concentração podem incluir (i) um carboidrato; (ii) um aminoácido; e (iii) um surfactante não iônico. O carboidrato pode ser selecionado de sacarose, manitol, sorbitol, dextrano, maltodextrina, trealose ou combinações dos mesmos. O aminoácido pode ser selecionado de prolina, histidina, isoleucina, me- tionina, cisteína, glicina, arginina, lisina, L-leucina, Tri-leucina, alanina,

ácido glutâmico, ácido aspártico, L-treonina, 2-fenilamina ou combina- ções dos mesmos. O surfactante não iônico pode ser selecionado a partir de polissorbato 20 (PS-20), polissorbato 28, polissorbato 40 (PS- 40), polissorbato 65, polissorbato 80 (PS-80), polissorbato 81, polis- sorbato 85, poloxamer 181, poloxamer 188, poloxamer 407, Triton X- 100, Brij-35, Brij-30, Tween 20, Tween 80, digitonina, (Ri-O-(CH2)x-R de alquil glicosídeos, onde R é independentemente CH3 ou (C6Hn) de ciclohexil; Ri é independentemente glicose ou maltose; e x = 3-15), Pluronic F127 ou combinações dos mesmos.

[0013] Em um aspecto desta modalidade, a formulação de proteí- na de alta concentração exibe uma força de injeção inferior a cerca de 50 N, ou inferior a 40 N, ou inferior a 35, ou inferior a 30 N, ou inferior a 25 N, ou inferior a 20 N.

[0014] Em uma modalidade exemplificativa da presente invenção, a formulação de proteína de alta concentração compreende: (i) pelo menos cerca de 200 mg/mL de proteína terapêutica; (ii) cerca de 25% a cerca de 75% de Miglyol 812 N; e (iii) cerca de 25% a cerca de 75% de álcool benzílico.

[0015] Em um aspecto desta modalidade, a proteína terapêutica na formulação de proteína de alta concentração é micronizada para otimizar a seringabilidade e/ou estabilidade. Em uma modalidade exemplificativa, a proteína micronizada é produzida por secagem por pulverização. A concentração da proteína como um pó de proteína só- lida micronizada na formulação de proteína de alta concentração está entre cerca de 200 mg/mL a cerca de 600 mg/mL, de preferência entre cerca de 300 mg/mL a cerca de 600 mg/mL, mais preferencialmente entre cerca de 400 mg/mL a cerca de 600 mg/mL.

[0016] Em um aspecto desta modalidade, a proteína terapêutica na proteína em pó micronizada contida na formulação de proteína de alta concentração é formulada com excipientes. Por exemplo, os exci-

pientes na formulação de proteína de alta concentração podem incluir (i) um carboidrato; (ii) um aminoácido; e (iii) um surfactante não iônico. O carboidrato pode ser selecionado de sacarose, manitol, sorbitol, dextrano, maltodextrina, trealose ou combinações dos mesmos. O aminoácido pode ser selecionado de prolina, histidina, isoleucina, me- tionina, cisteína, glicina, arginina, lisina, L-leucina, Tri-leucina, alanina, ácido glutâmico, ácido aspártico, L-treonina, 2-fenilamina ou combina- ções dos mesmos. O surfactante não iônico pode ser selecionado a partir de polissorbato 20 (PS-20), polissorbato 28, polissorbato 40 (PS- 40), polissorbato 65, polissorbato 80 (PS-80), polissorbato 81, polis- sorbato 85, poloxamer 181, poloxamer 188, poloxamer 407, Triton X- 100, Brij-35, Brij-30, Tween 20, Tween 80, digitonina, (Ri-O-(CH2)x-R de alquil glicosídeos, onde R é independentemente CH3 ou (C6Hn) de ciclohexil; Ri é independentemente glicose ou maltose; e x = 3-15), Pluronic F127 ou combinações dos mesmos.

[0017] Em um aspecto desta modalidade, a formulação de proteí- na de alta concentração exibe uma força de injeção inferior a cerca de 50 N, ou inferior a 40 N, ou inferior a 35, ou inferior a 30 N, ou inferior a 25 N, ou inferior a 20 N.

[0018] Em outra modalidade exemplificativa da presente invenção, a formulação de proteína de alta concentração compreende: (i) pelo menos cerca de 200 mg/mL de proteína terapêutica; (ii) cerca de 25% a cerca de 75% de Miglyol 812 N; e (iii) cerca de 25% a cerca de 75% de etanol.

[0019] Em um aspecto desta modalidade, a proteína terapêutica na formulação de proteína de alta concentração é micronizada para otimizar a seringabilidade e/ou estabilidade. Em uma modalidade exemplificativa, a proteína micronizada é produzida por secagem por pulverização. A concentração da proteína como um pó de proteína só- lida micronizada na formulação de proteína de alta concentração está entre cerca de 200 mg/mL a cerca de 600 mg/mL, de preferência entre cerca de 300 mg/mL a cerca de 600 mg/mL, mais preferencialmente entre cerca de 400 mg/mL a cerca de 600 mg/mL.

[0020] Em um aspecto desta modalidade, a proteína terapêutica na proteína em pó micronizada contida na formulação de proteína de alta concentração é formulada com excipientes. Por exemplo, os exci- pientes na formulação de proteína de alta concentração podem incluir (i) um carboidrato; (ii) um aminoácido; e (iii) um surfactante não iônico. O carboidrato pode ser selecionado de sacarose, manitol, sorbitol, dextrano, maltodextrina, trealose ou combinações dos mesmos. O aminoácido pode ser selecionado de prolina, histidina, isoleucina, me- tionina, cisteína, glicina, arginina, lisina, L-leucina, Tri-leucina, alanina, ácido glutâmico, ácido aspártico, L-treonina, 2-fenilamina ou combina- ções dos mesmos. O surfactante não iônico pode ser selecionado a partir de polissorbato 20 (PS-20), polissorbato 28, polissorbato 40 (PS- 40), polissorbato 65, polissorbato 80 (PS-80), polissorbato 81, polis- sorbato 85, poloxamer 181, poloxamer 188, poloxamer 407, Triton X- 100, Brij-35, Brij-30, Tween 20, Tween 80, digitonina, (Ri-O-(CH2)x-R de alquil glicosídeos, onde R é independentemente CH3 ou (C6Hn) de ciclohexil; Ri é independentemente glicose ou maltose; e x = 3-15), Pluronic F127 ou combinações dos mesmos.

[0021] Em um aspecto desta modalidade, a formulação de proteí- na de alta concentração exibe uma força de injeção inferior a cerca de 50 N, ou inferior a 40 N, ou inferior a 35, ou inferior a 30 N, ou inferior a 25 N, ou inferior a 20 N.

[0022] Em outra modalidade exemplificativa da presente invenção, a formulação de proteína de alta concentração compreende: (i) pelo menos cerca de 200 mg/mL de proteína terapêutica; (ii) cerca de 25% a cerca de 75% de Miglyol 810 N; e (iii) cerca de 25% a cerca de 75% de álcool benzílico.

[0023] Em um aspecto desta modalidade, a proteína terapêutica na formulação de proteína de alta concentração é micronizada para otimizar a seringabilidade e/ou estabilidade. Em uma modalidade exemplificativa, a proteína micronizada é produzida por secagem por pulverização. A concentração da proteína como um pó de proteína só- lida micronizada na formulação de proteína de alta concentração está entre cerca de 200 mg/mL a cerca de 600 mg/mL, de preferência entre cerca de 300 mg/mL a cerca de 600 mg/mL, mais preferencialmente entre cerca de 400 mg/mL a cerca de 600 mg/mL.

[0024] Em um aspecto desta modalidade, a proteína terapêutica na proteína em pó micronizada contida na formulação de proteína de alta concentração é formulada com excipientes. Por exemplo, os exci- pientes na formulação de proteína de alta concentração podem incluir (i) um carboidrato; (ii) um aminoácido; e (iii) um surfactante não iônico. O carboidrato pode ser selecionado de sacarose, manitol, sorbitol, dextrano, maltodextrina, trealose ou combinações dos mesmos. O aminoácido pode ser selecionado de prolina, histidina, isoleucina, me- tionina, cisteína, glicina, arginina, lisina, L-leucina, Tri-leucina, alanina, ácido glutâmico, ácido aspártico, L-treonina, 2-fenilamina ou combina- ções dos mesmos. O surfactante não iônico pode ser selecionado a partir de polissorbato 20 (PS-20), polissorbato 28, polissorbato 40 (PS- 40), polissorbato 65, polissorbato 80 (PS-80), polissorbato 81, polis- sorbato 85, poloxamer 181, poloxamer 188, poloxamer 407, Triton X- 100, Brij-35, Brij-30, Tween 20, Tween 80, digitonina, (Ri-O-(CH2)x-R de alquil glicosídeos, onde R é independentemente CH3 ou (C6Hn) de ciclohexil; Ri é independentemente glicose ou maltose; e x = 3-15), Pluronic F127 ou combinações dos mesmos.

[0025] Em um aspecto desta modalidade, a formulação de proteí- na de alta concentração exibe uma força de injeção inferior a cerca de 50 N, ou inferior a 40 N, ou inferior a 35, ou inferior a 30 N, ou inferior a 25 N, ou inferior a 20 N.

[0026] Em outra modalidade exemplificativa da presente invenção, a formulação de proteína de alta concentração compreende: (i) pelo menos cerca de 200 mg/mL de proteína terapêutica; (ii) cerca de 25% a cerca de 75% de triacetina; e (iii) cerca de 25% a cerca de 75% de álcool benzílico.

[0027] Em um aspecto desta modalidade, a proteína terapêutica na formulação de proteína de alta concentração é micronizada para otimizar a seringabilidade e/ou estabilidade. Em uma modalidade exemplificativa, a proteína micronizada é produzida por secagem por pulverização. A concentração da proteína como um pó de proteína só- lida micronizada na formulação de proteína de alta concentração está entre cerca de 200 mg/mL a cerca de 600 mg/mL, de preferência entre cerca de 300 mg/mL a cerca de 600 mg/mL, mais preferencialmente entre cerca de 400 mg/mL a cerca de 600 mg/mL.

[0028] Em um aspecto desta modalidade, a proteína terapêutica na proteína em pó micronizada contida na formulação de proteína de alta concentração é formulada com excipientes. Por exemplo, os exci- pientes na formulação de proteína de alta concentração podem incluir (i) um carboidrato; (ii) um aminoácido; e (iii) um surfactante não iônico. O carboidrato pode ser selecionado de sacarose, manitol, sorbitol, dextrano, maltodextrina, trealose ou combinações dos mesmos. O aminoácido pode ser selecionado de prolina, histidina, isoleucina, me- tionina, cisteína, glicina, arginina, lisina, L-leucina, Tri-leucina, alanina, ácido glutâmico, ácido aspártico, L-treonina, 2-fenilamina ou combina- ções dos mesmos. O surfactante não iônico pode ser selecionado a partir de polissorbato 20 (PS-20), polissorbato 28, polissorbato 40 (PS- 40), polissorbato 65, polissorbato 80 (PS-80), polissorbato 81, polis- sorbato 85, poloxamer 181, poloxamer 188, poloxamer 407, Triton X- 100, Brij-35, Brij-30, Tween 20, Tween 80, digitonina, (Ri-O-(CH2)x-R de alquil glicosídeos, onde R é independentemente CH3 ou (C6Hn) de ciclohexil; Ri é independentemente glicose ou maltose; e x = 3-15), Pluronic F127 ou combinações dos mesmos.

[0029] Em um aspecto desta modalidade, a formulação de proteí- na de alta concentração exibe uma força de injeção inferior a cerca de 50 N, ou inferior a 40 N, ou inferior a 35, ou inferior a 30 N, ou inferior a 25 N, ou inferior a 20 N.

[0030] Em outra modalidade exemplificativa da presente invenção, a formulação de proteína de alta concentração compreende: (i) pelo menos cerca de 200 mg/mL de proteína terapêutica; (ii) cerca de 25% a cerca de 75% de triglicerídeos; e (iii) cerca de 25% a cerca de 75% de álcool benzílico.

[0031] Em um aspecto desta modalidade, a proteína terapêutica na formulação de proteína de alta concentração é micronizada para otimizar a seringabilidade e/ou estabilidade. Em uma modalidade exemplificativa, a proteína micronizada é produzida por secagem por pulverização. A concentração da proteína como um pó de proteína só- lida micronizada na formulação de proteína de alta concentração está entre cerca de 200 mg/mL a cerca de 600 mg/mL, de preferência entre cerca de 300 mg/mL a cerca de 600 mg/mL, mais preferencialmente entre cerca de 400 mg/mL a cerca de 600 mg/mL.

[0032] Em um aspecto desta modalidade, a proteína terapêutica na proteína em pó micronizada contida na formulação de proteína de alta concentração é formulada com excipientes. Por exemplo, os exci- pientes na formulação de proteína de alta concentração podem incluir (i) um carboidrato; (ii) um aminoácido; e (iii) um surfactante não iônico. O carboidrato pode ser selecionado de sacarose, manitol, sorbitol, dextrano, maltodextrina, trealose ou combinações dos mesmos. O aminoácido pode ser selecionado de prolina, histidina, isoleucina, me- tionina, cisteína, glicina, arginina, lisina, L-leucina, Tri-leucina, alanina,

ácido glutâmico, ácido aspártico, L-treonina, 2-fenilamina ou combina- ções dos mesmos. O surfactante não iônico pode ser selecionado a partir de polissorbato 20 (PS-20), polissorbato 28, polissorbato 40 (PS- 40), polissorbato 65, polissorbato 80 (PS-80), polissorbato 81, polis- sorbato 85, poloxamer 181, poloxamer 188, poloxamer 407, Triton X- 100, Brij-35, Brij-30, Tween 20, Tween 80, digitonina, (Ri-O-(CH2)x-R de alquil glicosídeos, onde R é independentemente CH3 ou (C6Hn) de ciclohexil; Ri é independentemente glicose ou maltose; e x = 3-15), Pluronic F127 ou combinações dos mesmos.

[0033] Em um aspecto desta modalidade, a formulação de proteí- na de alta concentração exibe uma força de injeção inferior a cerca de 50 N, ou inferior a 40 N, ou inferior a 35, ou inferior a 30 N, ou inferior a 25 N, ou inferior a 20 N.

[0034] As formulações de proteína de alta concentração, da pre- sente invenção, podem estar contidas em qualquer recipiente adequa- do útil para armazenar formulações farmacêuticas. Exemplos de tais recipientes adequados incluem, por exemplo, frascos de vidro ou plás- tico, seringas e cartuchos. O recipiente pode ser transparente ou opa- co (por exemplo, cor de âmbar). Em certas modalidades exemplificati- vas, os frascos ou seringas são revestidos com silicone, como dióxido de silicone. Em certas modalidades exemplares, o espaço superior nos frascos é preenchido com um gás inerte para deslocar qualquer oxigê- nio presente que possa ter um efeito adverso na estabilidade do anti- corpo. Esse gás inerte pode ser selecionado a partir de nitrogênio ou argônio. Em uma modalidade exemplificativa, a formulação de proteína de alta concentração pode estar contida em uma seringa pré-cheia.

[0035] Estas, e outras, aspectos da invenção serão melhor apreci- adas e entendidas quando consideradas em conjunto com a seguinte descrição e as figuras anexas. A seguinte descrição, embora indique várias modalidades e vários detalhes específicos das mesmas, é dada a título de ilustração e não de limitação. Muitas substituições, modifi- cações, acréscimos ou rearranjos podem ser feitos dentro do escopo da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0036] A FIG. 1 é um resumo exemplificativa de fatores que impac- tam a estabilidade da proteína e seringabilidade de formulações de suspensão de alta concentração de acordo com uma modalidade da presente invenção.

[0037] A FIG. 2 é um gráfico de linha que ilustra a força de desli- zamento em Newton (N) para os veículos que compreendem agente de redução de viscosidade (solvente) em Miglyol 810N. O eixo X re- presenta a porcentagem do agente de redução da viscosidade (solven- te) no veículo (como % de solvente). Os pontos de dados com losango fechado ( ) representam um veículo compreendendo NMP em Miglyol 810N; os pontos de dados com quadrados fechados ( ) representam um veículo compreendendo acetato de etila em Miglyol 810N; e os pontos de dados com triângulos fechados ( ) representam um veículo compreendendo etanol em Miglyol 810N. O eixo Y representa a força de distribuição em Newton (N).

[0038] A FIG. 3 é um gráfico de linha que ilustra a força de distri- buição (por exemplo, força sustentada) para veículos constituídos por agente hidrofóbico e agente de redução de viscosidade (por exemplo, solvente) de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção. O eixo X representa a porcentagem do agente de redução da viscosidade no veículo (como % de solvente). Os pontos de dados com quadrados fechados ( ) representam um veículo compreendendo álcool benzílico em Miglyol 812N; os pontos de dados com triângulos fechados ( ) representam um veículo compreendendo oleato de etila em Miglyol 812N; os pontos de dados com círculos fechados ( ) repre- sentam um veículo compreendendo etanol em Miglyol 812N; os pontos de dados com cruz ( ) representam o veículo com 25% de etanol, 25% de PEG400 e 50% de Miglyol 812N; e os pontos de dados com círculos abertos ( ) representam um veículo que compreende etanol em Miglyol 810N. O eixo Y representa a força de distribuição em New- ton (N).

[0039] A FIG. 4 é um gráfico de dispersão que ilustra a força de distribuição para suspensões de alta concentração contendo mAb1 preparadas de acordo com uma modalidade exemplificativa da presen- te invenção. O eixo X representa a porcentagem do agente de redução da viscosidade (solvente) no veículo (como % de solvente). Os pontos de dados com círculos fechados ( ) representam um veículo compre- endendo álcool benzílico em Miglyol 812N; os pontos de dados com losangos fechados ( ) representam um veículo compreendendo etanol em Miglyol 812N; e os pontos de dados com losangos abertos ( ) re- presentam um veículo compreendendo etanol em Miglyol 810N. O eixo Y representa a força de distribuição em Newton (N).

[0040] A FIG. 5 é um gráfico de barras que ilustra o impacto da concentração de suspensão de proteína em pó micronizada na força de distribuição para suspensões de alta concentração contendo mAb1 preparada de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção. O eixo X representa o peso em mg do pó seco por pulveri- zação por mL do veículo. O eixo Y representa a força de distribuição em Newton (N).

[0041] A FIG. 6 é um gráfico de barras que ilustra o comportamen- to de diferentes pós de proteínas na seringabilidade. O eixo Y repre- senta a força de distribuição em Newton (N).

[0042] A FIG. 7 é um gráfico de barras que ilustra a estabilidade física de mAb1 em veículos de suspensão preparados de acordo com uma modalidade exemplificativa da presente invenção. O eixo X repre- senta os diferentes agentes de redução da viscosidade (por exemplo,

solvente): amostra de controle com Miglyol 812N e nenhum agente de redução da viscosidade (por exemplo, solvente); com veículo compre- endendo 25% de etanol (EtOH) em Miglyol 812N; veículo compreen- dendo 25% de lactato de etila (EL) em Miglyol 812N; um veículo com- preendendo 25% de benzoato de benzila (BB) em Miglyol 812N como três preparações independentes; um veículo que compreende 75% de álcool benzílico em Miglyol 812N. O eixo Y representa a porcentagem relativa da proteína mAb1 com conformação nativa (raio hidrodinâmico esperado) em 1 dia à temperatura ambiente por cromatografia de ultra- alto desempenho de exclusão de tamanho (SEC-UPLC).

[0043] A FIG. 8 é um gráfico de linha que ilustra a estabilidade de uma proteína terapêutica em um veículo preparado de acordo com uma modalidade exemplificativo da presente invenção. O eixo X repre- senta o tempo de incubação à temperatura ambiente em horas. Os pontos de dados com quadrados abertos ( ) representam uma formu- lação de mAb1 em veículo compreendendo álcool benzílico a 50% v/v e Miglyol 812N; os pontos de dados com losangos fechados ( ) repre- sentam uma formulação de mAb3 em veículo compreendendo álcool benzílico a 50% v/v e Miglyol 812N; e os pontos de dados com círculos fechados ( ) representam uma formulação de mAb2 em veículo com- preendendo álcool benzílico a 50% v/v e Miglyol 812N. O eixo Y repre- senta a porcentagem relativa de proteína mAb1 com conformação na- tiva (raio hidrodinâmico esperado) por SEC-UPLC.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0044] Deve ser entendido que esta invenção não está limitada a métodos particulares, condições experimentais descritas, porque tais métodos e condições podem variar. Também se deve entender que a terminologia usada neste documento tem a finalidade de descrever somente modalidades em particular, e não se destina a ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações em anexo.

[0045] Existem inúmeros benefícios no uso da administração sub- cutânea para biofarmacêuticos, como a capacidade de autoadminis- tração, facilidade de uso, redução da hospitalização e, portanto, dos custos de tratamento e aumento da adesão do paciente. Além disso, como as proteínas são normalmente mais estáveis no estado sólido do que em solução e são esperadas interações moleculares mínimas no estado sólido entre as partículas de proteína, pode-se esperar que as proteínas sejam mais estáveis em tal suspensão de alta concentração em comparação com uma solução de concentração equivalente de alta. Existem muitos desafios, no entanto, no desenvolvimento bem- sucedido de formulações de proteínas de alta concentração para ad- ministração subcutânea (Das et al. (2015) "Commercializing High- Concentration mAbs". BioPharm International 29(11): 47-49; Johnson, B., & Rostovtsev, A (2017) "High Concentration Biologic Formulations: Challenges and Solutions. Drug Discov. Develop." p. Online; S.J., S., Shahrokh, Z., & Liu, J. (2004) "Challenges in the development of high protein concentration formulations." J. Pharm. Sci. 93(6): 1390-1402).

[0046] Para administração subcutânea, a viscosidade e a estabili- dade da proteína podem ser limitações primárias para formulações de proteína de alta concentração viáveis (por exemplo, >200 mg/mL), par- ticularmente no que diz respeito a considerações de fabricação e pro- cessamento, estabilidade de armazenamento, bem como compatibili- dade com dispositivos de dosagem de seringa pré-cheia. Por exemplo, proteínas terapêuticas (por exemplo, anticorpos) em uma formulação são propensas à degradação, agregação e/ou modificações químicas indesejadas, a menos que a solução seja formulada adequadamente. A estabilidade de uma proteína em uma formulação depende não ape- nas dos tipos de excipiente utilizados na formulação, mas das quanti- dades e proporções desses excipientes em relação uns aos outros jun-

tamente com a concentração da proteína solúvel.

[0047] Devido a esses desafios, a maioria dos medicamentos de anticorpos monoclonais aprovados comercialmente são formulados em baixa concentração de proteína (por exemplo, abaixo de 100 mg/ml) e administrados por via intravenosa por meio de infusões, especialmente para oncologia (Wang (1999) "Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals." Intl. J. Pharm. 185, 129-188; Shire (2004) "Formulation and manufacturability of biologics." Curr. Opin. Bi- otechnol. 20 (6), 708-714; Garidel e Bassarab (2008) In Quality for Bio- logics: Critical Quality Attributes, Process and Change Control, Produc- tion Variation, characterization, Impurities and Regulatory Concerns pp. 94-113. Publishing, London, UK). Assim, há a necessidade de su- perar os desafios que, até o momento, têm limitado a disponibilidade de formulações de proteínas de alta concentração, com base na con- tribuição volumétrica da proteína. (Garidel et al. "High-concentration protein formulations: how high is high?" Eur. J. Pharm. e Biopharm. (2017) 119: 353-360; Johnson, B., & Rostovtsev, A (2017, 06 29) "High Concentration Biologic Formulations: Challenges and Solutions." Drug Discov. Develop. p. Online).

[0048] O desenvolvimento de uma formulação de proteína de alta concentração de uma proteína terapêutica requer avaliação da estabi- lidade da proteína, viscosidade da solução, toxicidade do veículo, jun- tamente com a força de injeção. Permanece uma necessidade na téc- nica de tais formulações de proteína de alta concentração que podem fornecer pelo menos 200 mg/mL de uma proteína enquanto mantêm a estabilidade para administração subcutânea a pacientes.

[0049] O desenvolvimento de formulações de proteínas altamente concentradas acima de 200 mg/mL pode ser associado a uma série de desafios, que foram discutidos extensivamente na técnica, por exem- plo em: Shire (2004) "Formulation and manufacturability of biologics."

Curr. Opin. Biotechnol. 20 (6), 708-714; Warne et al. (2011) Deve- lopment of high concentration protein biopharmaceuticals: The use of platform approaches in formulation development. Eur. J. Pharm. Bi- opharm. 78, 208-212; Garidel et al. (2015) Prediction of colloidal stabi- lity of high concentration protein formulations. Pharm Dev. Technol. 20(3), 367-374; Allmendinger et al. (2015) Sterile Filtration of Highly Concentrated Protein Formulations: Impact of Protein Concentration, Formulation Composition, and Filter Material. Pharm. Biotechnol. 104, 3319-3329).

[0050] Existem alguns fatores-chave que podem ser considerados para as composições e métodos de fazer formulações de proteínas de alta concentração. O primeiro é a escolha do veículo. O veículo pode ter um efeito nas propriedades reológicas e de seringabilidade de for- mulações de proteína de alta concentração. A maioria dos veículos combina um agente hidrofóbico com um agente de redução de visco- sidade. Pode ser importante que a proteína e os excipientes da formu- lação sejam insignificantemente solúveis em ambos os componentes para garantir a estabilidade da proteína. A escolha do veículo e a pro- porção do agente de redução da viscosidade para o agente hidrofóbico podem depender de vários fatores, incluindo estabilidade da proteína, viscosidade da solução, estabilidade coloidal e toxicidade do veículo.

[0051] A presente invenção inclui a identificação de uma composi- ção de veículo que é adequada para a preparação de formulações de proteína de alta concentração e na qual a proteína terapêutica é está- vel. Os critérios usados para avaliar os veículos incluem a estabilidade e recuperação da proteína após 3-24 horas à temperatura ambiente (por exemplo, a duração do tempo necessário para suspender e admi- nistrar) e a força de injeção (por exemplo, no platô) necessária para dispensar a suspensão por meio de um Agulha de 27g TW em uma seringa pré-cheia BD Hypak (PFS) de 1mL. A justificativa para a esta-

bilidade limitada é que, pelo menos, a proteína terapêutica deve ser estável quando suspensa e administrada no veículo. Embora a formu- lação seja idealmente carregada e armazenada em um PFS, existem outras abordagens potenciais para a formulação que podem ser usa- das, incluindo suspensão no agente hidrofóbico para armazenamento e adição do agente de redução de viscosidade para reduzir a viscosi- dade imediatamente antes da administração, ou suspensão no agente hidrofóbico/veículo do agente de redução de viscosidade imediatamen- te antes da administração usando um dispositivo personalizado. A composição do veículo com agente hidrofóbico e agente de redução de viscosidade serve a um propósito distinto. O agente hidrofóbico ga- rante uma suspensão com estabilidade coloidal durante o armazena- mento e administração e o agente de redução de viscosidade atua pa- ra reduzir a viscosidade.

[0052] Em algumas modalidades exemplificativas selecionadas a partir de SASOL, óleo de girassol, óleo de rícino, glicerol, oleato de etila, triglicerídeos ou combinações dos mesmos. Em algumas modali- dades, o agente hidrofóbico é um triglicerídeo, tal como, mas não limi- tado a Miglyol 810 N, Miglyol 812 N, triacetina ou combinações dos mesmos e o agente de redução de viscosidade é selecionado a partir de etanol, álcool benzílico, acetato de etila, N-Metil-2-pirrolidona, ou combinações dos mesmos.

[0053] O segundo fator a considerar para composições e métodos de fazer formulações de suspensão de alta concentração são as pro- priedades físicas da proteína terapêutica. Uma formulação otimizada neste contexto tem um alto teor de proteína e excipientes mínimos pa- ra maximizar a concentração de proteína na suspensão. A instabilida- de coloidal de formulações de proteína altamente concentrada é mais pronunciada em concentrações mais altas (Wagner et al. (2012) Col- loids and Surfaces: Physicochem. Eng. Aspects 415, 421-430; Shire

(2004) "Formulation and manufacturability of biologics." Curr. Opin. Bi- otechnol. 20 (6), 708-714; Warne et al. (2011) "Development of high concentration protein biopharmaceuticals: The use of platform approa- ches in formulation development." Eur. J. Pharm. Biopharm. 78, 208- 212; Garidel et al. (2015) "Prediction of colloidal stability of high con- centration protein formulations." Pharm Dev. Technol. 20(3), 367-374; and Wagner et al. (2012) "The electrokinetic potential of therapeutic proteins and its modulation: Impact on protein stability" Colloids and Surfaces: Physicochem. Eng. Aspects 415, 421-430). Em certos ca- sos, para superar a estabilidade da proteína, formulações liofilizadas foram desenvolvidas para formulação de alta concentração como uma alternativa às formulações líquidas (Cao et al. (2013) "Rational design of lyophilized high concentration protein formulations-mitigating the challenge of slow reconstitution with multidisciplinary strategies" Eur. J. Pharm. Biopharm. 85, 287-293). No entanto, observou-se que os tem- pos de reconstituição de formulações de proteínas liofilizadas de alta concentração são extremamente prolongados, até 30 minutos e mais (Garidel et al. (2015) "Stability of buffer-free freeze-dried formulations: A feasibility study of a monoclonal antibody at high protein concentra- tions" Eur. J. Pharm. Biopharm. 97, 125-139).

[0054] Embora a secagem por pulverização tenha surgido como uma abordagem viável para estabilizar proteínas, outros métodos para estabilizar proteínas também podem ser utilizados. As propriedades físicas da proteína e as propriedades coloidais correspondentes da formulação podem depender dos processos, como a secagem por pul- verização. Por exemplo, foi demonstrado que o aumento do tamanho de partícula na faixa de mícrons pode de fato diminuir a força de inje- ção, particularmente em concentrações de suspensão mais elevadas (ver, por exemplo, Patente U.S. Nº 9.072.668), e foi demonstrado in silico que espera-se que partículas hemisféricas se dispersem mais lentamente do que as partículas esféricas para uma determinada força de injeção e são mais propensos a obstruir uma agulha durante a dis- tribuição do que as partículas esféricas do mesmo tamanho e compo- sição. (Whitaker et al. (2011) "Particle size and shape effects in medi- cal syringe needles: experiments and simulations for polymer micropar- ticle injection." Mater Sci: Mater Med, 22: 1975-1983). Embora esses relatórios se refiram especificamente a suspensões coloidais dispen- sadas por meio de dispositivos médicos, também existe uma varieda- de de pesquisas sobre como as propriedades do pó, o tamanho das partículas e as propriedades do fluido de suspensão de impacto líquido das suspensões coloidais. Por exemplo, um artigo publicado na revista Powder Technology investigando suspensões coloidais no contexto de equipamentos de dragagem destaca como, ao aumentar o tamanho das partículas na faixa de 15 a 40 µm, a dependência da viscosidade da suspensão no conteúdo sólido diminui e a propensão para espes- samento por cisalhamento em alta suspensão as concentrações dimi- nuem com o aumento das partículas menores (6 µm). (Konijin et al (2014) "Experimetnal study of the viscosity of suspensions: effect of solid fraction, particle size and suspending liquid." Powder Technology 266:61-59). Um resumo dos fatores que impactam a estabilidade da proteína e seringabilidade de formulações de proteína de alta concen- tração é fornecido na FIG. 1.

[0055] Vários aditivos podem melhorar a dispersibilidade das par- tículas de proteína secas por pulverização e a seleção desses aditivos depende da proteína terapêutica e da quantidade de proteína terapêu- tica na formulação. Por exemplo, os aditivos podem incluir aminoáci- dos, carboidratos, surfactantes e/ou polímeros solúveis em água.

[0056] A presente invenção não está limitada a métodos específi- cos e a condições experimentais descritas, uma vez que tais métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a termino-

logia usada neste documento é para a finalidade de descrever modali- dades particulares, e não pretende ser limitante.

[0057] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais seme- lhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste, os métodos e materiais específicos são agora descritos. Todas as publicações mencionadas estão incorpora- das, por meio deste documento, por referência. Definições

[0058] Os termos usados neste documento devem ter os seguintes significados para fornecer contexto e não se destinam a alterar ou limi- tar o significado comum e costumeiro, a menos que indicado de outra forma em outro lugar neste documento.

[0059] O termo "um" deve ser entendido como significando "pelo menos um"; e os termos "cerca de" e "aproximadamente" devem ser entendidos para permitir a variação padrão como seria entendido por aqueles versados na técnica; e onde os intervalos são fornecidos, os terminais são incluídos.

[0060] Tal conforme usado neste documento, os termos "inclui" e "incluindo" destinam-se a ser não limitativos e são entendidos como significando "compreende" e "compreendendo", respectivamente.

[0061] O desenvolvimento de formulação de proteína de alta con- centração resulta em vários desafios de fabricação, estabilidade, analí- ticos e de distribuição. A formulação de proteína de alta concentração da presente invenção tenta superar o desafio. Formulações de proteína de alta concentração

[0062] Conforme usado neste documento, o termo "alta concentra- ção" significa uma concentração final de pelo menos cerca de 200 mg/mL de uma proteína terapêutica na formulação. Em modalidades exemplificativas, a alta concentração da proteína terapêutica pode ser de cerca de 200 mg/mL ou mais.

[0063] Tal conforme usado neste documento, o termo "formulação de proteína" refere-se a uma proteína terapêutica que é formulada em conjunto com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, a proteína terapêutica está presente em uma quantidade de dose unitária apropriada para administração em um re- gime terapêutico.

[0064] Tal conforme usado neste documento, o termo "suspensão" refere-se a uma formulação na qual partículas sólidas insignificante- mente solúveis são dispersas ao longo de uma segunda fase, o veícu- lo que é geralmente um líquido. O termo suspensão descreve a dis- persão sem referência ao tamanho de partícula do material sólido. No entanto, o tamanho de partícula do material sólido pode afetar seu comportamento físico e químico, portanto, geralmente é feita uma dis- tinção entre um coloide ou suspensão coloidal com uma faixa de ta- manho de partícula de até cerca de 1 μm e uma 'dispersão grosseira' com partículas maiores. O termo suspensão usado neste documento abrange ambos os tipos de suspensão, além das suspensões com partículas sólidas geralmente na faixa de cerca de 0,1 μm a cerca de 10 μm. As suspensões são compostas por várias partículas, o que leva a várias interações de partículas. Essas interações podem, até certo ponto, ser pensadas como as interações das camadas difusas em tor- no das partículas individuais e, portanto, a camada elétrica dupla for- nece a base para a compreensão das interações entre as partículas. O comportamento das partículas em suspensão é complexo, mesmo quando apenas duas partículas individuais em interação são conside- radas; sendo o comportamento, em última análise, dependente da contribuição relativa das energias repulsiva e atrativa em qualquer dis-

tância de separação. O raio da partícula parece afetar as energias atrativa e repulsiva. Pode ser controlado com relativa facilidade por moagem ou micronização de partículas maiores para atingir um tama- nho de partícula pequeno desejado, ou por técnicas de manipulação de cristal, destinadas a produzir pequenas partículas diretamente de uma solução.

[0065] Tal conforme usado neste documento, o termo "proteína" inclui todo polímero de aminoácidos com mais de cerca de 50 aminoá- cidos ligados covalentemente através de ligações de amido. As proteí- nas contêm uma ou mais cadeias poliméricas de aminoácidos, geral- mente conhecidas na técnica como "polipeptídeos". Uma proteína po- de conter um ou vários polipeptídeos para formar uma única biomolé- cula funcional. Os "polipeptídeos" geralmente contêm mais de 50 ami- noácidos, enquanto os "peptídeos" geralmente contêm 50 aminoácidos ou menos.

[0066] Conforme usado neste documento, "proteína terapêutica" inclui qualquer uma das proteínas, proteínas recombinantes usadas em pesquisa ou terapia, proteínas de armadilha e outras proteínas de fusão de Fc de receptor quimérico, proteínas quiméricas, anticorpos, anticorpos monoclônicos, anticorpos policlônicos, anticorpos humanos e anticorpos biespecíficos. Em outro aspecto, uma proteína pode inclu- ir fragmentos de anticorpo, nanocorpos, quimeras de anticorpo recom- binante, citocinas, quimiocinas, hormônios peptídicos e semelhantes. As proteínas podem ser produzidas usando sistemas de produção ba- seados em células recombinantes, como o sistema de bacculovírus de insetos, sistemas de levedura (por exemplo, Pichia sp.) e sistemas mamíferos (por exemplo, células CHO e derivados de CHO, como cé- lulas CHO-K1). Para uma revisão recente discutindo proteínas biotera- pêuticas e sua produção, ver Ghaderi et al., "Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation," 28 Biotechnol Genet Eng. Rev. 147-75 (2012). Em algumas modalidades exemplificativas, as proteínas contêm modi- ficações, adutos e outras unidades com ligação covalente. Essas mo- dificações, adutos e frações incluem, por exemplo, avidina, estreptavi- dina, biotina, glicanos (por exemplo, N-acetilgalactosamina, galactose, ácido neuramínico, N-acetilglucosamina, fucose, manose e outros mo- nossacarídeos), PEG, poli-histidina, marcações FLAG, proteína de li- gação à maltose (MBP), proteína de ligação à quitina (CBP), glutatio- na-S-transferase (GST) myc-epítopo, marcações fluorescentes e ou- tros corantes e semelhantes.

[0067] O termo "anticorpo", tal conforme usado neste documento, inclui moléculas de imunoglobulina compreendendo quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) in- terligadas por ligações dissulfeto, bem como multímeros das mesmas (por exemplo, IgM). Cada cadeia pesada compreende uma região va- riável de cadeia pesada (abreviada neste documento como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada compreende três domínios CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (abreviada neste documento como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um domínio (CL1). As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hiperva- riabilidade, denominadas regiões determinantes de complementarida- de (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, de- nominadas regiões de framework (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, arranjadas da extremidade amino terminal até a extremidade carbóxi terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em diferentes modalidades exemplifi- cativas da invenção, as FRs do anticorpo anti-grande-ET-1 (ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo) podem ser idênticas às se-

quências da linhagem germinativa humana, ou podem ser natural ou artificialmente modificadas. Uma sequência consenso de aminoácidos pode ser definida com base em uma análise lado a lado de duas ou mais CDRs. O termo "anticorpo", conforme usado neste documento, também inclui fragmentos de ligação ao antígeno de moléculas de an- ticorpo completas. Os termos "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo e seme- lhantes, conforme usados neste documento, incluem qualquer polipep- tídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, obtenível enzimaticamen- te, sintético ou manipulado geneticamente que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo. Os fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de mo- léculas de anticorpo completas usando quaisquer técnicas padrões adequadas, tais como digestão proteolítica ou técnicas de manipula- ção genética recombinante envolvendo a manipulação e expressão de DNA codificador de anticorpos variáveis e opcionalmente domínios constantes. Tal DNA é conhecido e/ou está prontamente disponível a partir de, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluin- do, por exemplo, bibliotecas de fago-anticorpo), ou pode ser sintetiza- do. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou pela utilização de técnicas de biologia molecular, por exemplo, para arranjar um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada, ou para introduzir códons, criar resíduos de cisteína, modi- ficar, adicionar ou deletar aminoácidos, etc.

[0068] Tal conforme usado neste documento, um "fragmento de anticorpo" inclui uma porção de um anticorpo intacto, tal como, por exemplo, a ligação ao antígeno ou região variável de um anticorpo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limita- dos a um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento scFv, um fragmento Fv, um diacorpo dsFv, um fragmen-

to dAb, um fragmento Fd', um fragmento Fd e uma região de determi- nação de complementaridade (CDR) isolada, bem como triacorpos, tetracorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Os fragmentos Fv são a combinação das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, e as proteínas ScFv são moléculas polipeptídicas de cadeia simples recombinantes nas quais as regiões variáveis da cadeia leve e pesada de imunoglobulina estão conectadas por um ligante peptídico. Em algumas modalidades exemplificativas, um fragmento de anticorpo contém sequência de aminoácidos suficiente do anticorpo de origem do qual é um fragmento que se liga ao mesmo antígeno que o anticorpo de origem; em algu- mas modalidades exemplificativas, um fragmento se liga ao antígeno com uma afinidade comparável à do anticorpo de origem e/ou compete com o anticorpo de origem pela ligação ao antígeno. Um fragmento de anticorpo pode ser produzido por qualquer meio. Por exemplo, um fra- gmento de anticorpo pode ser produzido enzimaticamente ou quimi- camente por fragmentação de um anticorpo intacto e/ou pode ser re- combinantemente produzido a partir de um gene que codifica a se- quência de anticorpo parcial. Alternativa ou adicionalmente, um frag- mento de anticorpo pode ser totalmente ou parcialmente sinteticamen- te produzido. Um fragmento de anticorpo pode opcionalmente com- preender um fragmento de anticorpo de cadeia única. Alternativa ou adicionalmente, um fragmento de anticorpo pode compreender múlti- plas cadeias que são ligadas entre si, por exemplo, por ligações dissul- feto. Um fragmento de anticorpo pode compreender opcionalmente um complexo multi-molecular. Um fragmento de anticorpo funcional com- preende tipicamente pelo menos cerca de 50 aminoácidos e mais tipi- camente compreende pelo menos cerca de 200 aminoácidos.

[0069] Em certas modalidades exemplificativas da presente inven-

ção, a formulação de proteína de alta concentração compreende (i) pelo menos 200 mg/mL de proteína terapêutica e (ii) veículo. O "veícu- lo" pode ser um carreador no qual a proteína terapêutica é formulada e/ou administrada. O veículo pode incluir um agente hidrofóbico, agen- te de redução de viscosidade, água ou combinações dos mesmos.

[0070] Em certas modalidades da presente invenção, a formulação de proteína de alta concentração compreende (i) pelo menos 200 mg/mL de proteína terapêutica; (ii) agente hidrofóbico; e (iii) agente de redução de viscosidade.

[0071] Tal conforme usado neste documento, o termo "agente hi- drofóbico" refere-se a um material com um valor de equilíbrio hidrofí- lico-lipofílico (HLB) de 0-13. Agentes hidrofóbicos exemplificativos são óleos vegetais, ácidos graxos com 8-24 carbonos, cera, polímeros bio- degradáveis e materiais anfifílicos. Óleos vegetais exemplificativos são óleo de amêndoa, óleo de anis, óleo de semente de damasco, óleo de amendoim, óleo de argan, óleo de abacate, óleo de borragem, óleo de cajuput, óleo de canola, óleo de cominho, óleo de cássia, óleo de ríci- no, óleo de canela, óleo de citronela, óleo de cravo, óleo de coco, óleo de coentro, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de euca- lipto, óleo de prímula, óleo de erva-doce, óleo de gerânio, óleo de uva, óleo de avelã, óleo de cânhamo, óleo de jojoba, óleo de zimbro, óleo de lavanda, óleo de limão, óleo de macadâmia, óleo de moscadeira, óleo de melaleuca, óleo de nim, óleo de neroli, óleo de niaouli, óleo de noz-moscada, azeite de oliva, óleo de laranja, óleo de palma, óleo de palmiste, óleo de pinho, óleo de semente de papoula, óleo de pule- gium, óleo de semente de abóbora, óleo de colza, óleo de farelo de arroz, óleo de rosa mosqueta, óleo de alecrim, óleo de arruda, óleo de cártamo, óleo de gergelim (SO), óleo de hortelã, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de tomilho, óleo de noz ou óleo de germe de trigo. Áci- dos graxos exemplificativos são ácido caprílico, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquí- dico, ácido linoléico, ácido miristoléico, ácido palmitoléico, ácido sapiê- nico, ácido oleico, ácido α-linolênico, ácido araquidônico, ácido eicosa- pentaenoico, ácido erúcico, ácido docosahexaenoico, ácido eicosapen- taenoico, ácido docosahexaenoico, ácido docosapentaenóico e glicerí- deo (monoglicerídeo; diglicerídeo; triglicerídeo) com diferentes com- primentos de cadeia. Polímeros biodegradáveis exemplificativos são ácido polilático (PLA), ácido poliglicólico (PGA), ácido polilático-co- glicólico (PLGA), poli ε-caprolactona (PCL), poliortoésteres, polihidro- xibutirato (PHB), polidioxanona, polianidrido-carbonosato de polietileno e polifosfazenos. Os materiais anfifílicos exemplificativos são um óleo de rícino polietoxilado ou um derivado do mesmo (coletivamente refe- rido como um "óleo de rícino polietoxilado"), um éter alquílico de poli- oxietileno, um éster de ácido graxo de polioxietileno sorbitano, um es- tearato de polioxietileno, um copolímero em bloco de óxido de polieti- leno ("PEO") -óxido de polipropileno ("PPO") - PEO, um copolímero em bloco de PPO-PEO-PPO, um copolímero em bloco tetra-funcional de PEO-PPO, tal como (PEO-PPO)2— (PPO-PEO)2, ou um copolímero de bloco tetra-funcional de PPO-PEO, tal como (PPO-PEO)2—(PEO- PPO)2. A quantidade de agente hidrofóbico presente nas formulações pode variar de cerca de 0,2% a 99,9%, por exemplo 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.

[0072] Conforme usado neste documento, o termo "triglicerídeo" se refere a um éster derivado de glicerol e três ácidos graxos. Triglice- rídeos exemplificativos podem ser selecionados de Tricaprila- to/Tricaprato de glicerila (Miglyol 812, Miglyol 810, Miglyol 818, Miglyol 829, Miglyol 840, CAPTEX 300, CAPTEX INJ 300, CAPTEX INJ 335 e semelhantes), Tricaprilato de glicerila e triacetina.

[0073] "Viscosidade", conforme usado neste documento, pode ser

"viscosidade cinemática" ou "viscosidade absoluta". "Viscosidade ci- nemática" é uma medida do fluxo resistivo de um fluido sob a influên- cia da gravidade. Quando dois fluidos de igual volume são colocados em viscosímetros capilares idênticos e podem fluir por gravidade, um fluido viscoso leva mais tempo do que um fluido menos viscoso para fluir através do capilar. Por exemplo, se um fluido leva 200 segundos para completar seu fluxo e outro fluido leva 400 segundos, o segundo fluido é duas vezes mais viscoso que o primeiro em uma escala de viscosidade cinemática. "Viscosidade absoluta", às vezes chamada de viscosidade dinâmica ou simples, é o produto da viscosidade cinemáti- ca e da densidade do fluido (Viscosidade Absoluta = Viscosidade Ci- nemática × Densidade). A dimensão da viscosidade cinemática é L2/T, onde L é um comprimento e T é um tempo. Normalmente, a viscosida- de cinemática é expressa em centistokes (cSt). A unidade SI de visco- sidade cinemática é mm2/s, que é 1 cSt. A viscosidade absoluta é ex- pressa em unidades de centipoise (cP). A unidade SI de viscosidade absoluta é o miliPascal-segundo (mPa-s), onde 1 cP = 1 mPa-s.

[0074] Tal conforme usado neste documento, "um agente de redu- ção de viscosidade" refere-se a um agente que, quando presente em um veículo ou formulação, reduz a viscosidade ou força de injeção do veículo ou formulação em comparação com a viscosidade ou força de injeção de um veículo ou formulação sem agente de redução de visco- sidade. A quantidade de agente de redução de viscosidade presente nos veículos de viscosidade reduzida ou formulações da invenção po- de variar de cerca de 0,2% a cerca de 99,9% da formulação, por exemplo 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. O agente de redução de viscosidade pode reduzir a viscosidade ou força de injeção de um veículo ou formulação em pelo menos 5%, por exemplo 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,

55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90%. Os agentes de redu- ção de viscosidade não limitativos exemplificativos são dietil sebacato, dietilenoglicol monoetiléter, acetato de etila, oleato de etila (EO), iso- propil miristato, ácido linoléico, ácido propiônico, trietil citrato, propile- noglicol, etanol, propanol, isopropanol, polietilenoglicol, poliperfluoroé- teres, fluorocarbono (halotano, metoxiflurano, enflurano, isoflurano, sevoflurano e desflurano, etc.), cetona fluorada, perfluorodecalina, per- fluoroacrilato, perfluorometacrilato, álcool benzílico, álcool laurílico, perfluorodecalina, N-Metil-2-pirrolidona, glicofurol, pelietilenoglicol (PEG), alquil cetona, alquil inferior de éster de ácido cítrico, benzoato de benzil, benzoato de metil, benzoato de etila, benzoato de n-propil, benzoato de isopropil, benzoato de butil, benzoato de isobutil, benzoa- to de sec-butil, benzoato de terc-butil e benzoato de isoamil. O termo "solvente", tal conforme usado neste documento, é usado indistinta- mente com "agente de redução de viscosidade".

[0075] Os termos "formulação de proteína de alta concentração não aquosa", "formulação de proteína de alta concentração", "formula- ção de proteína de alta concentração" e "formulação de suspensão de alta concentração" são usados indistintamente.

[0076] Em certas modalidades exemplificativas da presente inven- ção, a formulação de proteína de alta concentração pode incluir um ingrediente ou excipiente adicional. "Excipientes" incluem várias subs- tâncias usadas para vários fins, incluindo tamponamento, solubiliza- ção, estabilização, umectação e/ou proteção da proteína e para man- ter ou ajustar a tonicidade da formulação, estabilizar a formulação química e fisicamente. Exemplos de tais excipientes são bem conheci- dos na técnica.

[0077] Em certas modalidades da presente invenção, a proteína terapêutica na formulação de proteína de alta concentração é pratica- mente insolúvel no veículo. "Praticamente insolúvel", tal conforme usa-

do neste documento, refere-se a uma solubilidade inferior a cerca de 1 mg em 10.000 mL.

[0078] A degradação da proteína terapêutica na formulação de proteína de alta concentração é um dos principais desafios enfrenta- dos durante o desenvolvimento dessas formulações. As proteínas são menos suscetíveis à degradação química no estado coloide, em com- paração com o estado líquido. Como resultado, a proteína terapêutica contida no estado sólido gera maior estabilidade à formulação de pro- teína de alta concentração. Em certas modalidades da presente inven- ção, a proteína terapêutica na formulação de proteína de alta concen- tração está presente como uma formulação de proteína sólida microni- zada, produzida por secagem por pulverização. As partículas de prote- ína podem ser reduzidas em tamanho por micronização. Conforme usado neste documento, o termo "micronização" é usado para descre- ver a técnica de redução de tamanho em que a distribuição de tama- nho de partícula resultante é inferior a cerca de 50 µm. A formulação de proteína de alta concentração pode ser preparada por qualquer um dos métodos de micronização conhecidos, tais como, mas não se limi- tando a, micronização in situ, moagem, homogeneização de alta pres- são, secagem por pulverização e fluido supercrítico (SCF). Conforme usado neste documento, o termo "formulação de proteína sólida mi- cronizada" é uma formulação sólida que compreende uma proteína e que pode ser suspensa em um veículo para preparar a formulação de proteína de alta concentração. Os termos "formulação sólida" e "formu- lação de proteína sólida micronizada" são usados indistintamente. Além da proteína, a formulação de proteína sólida micronizada pode incluir solventes, aditivos, aminoácidos, excipientes, estabilizadores térmicos e diluentes.

[0079] Conforme usado neste documento, "secagem por pulveri- zação" é uma técnica que transforma um estado fluido em uma forma de particulado seco, pulverizando-o em um meio de secagem quente.

A secagem por pulverização pode ser realizada por secador por pulve- rização, como, mas não se limitando a, secador por pulverização de estágio único, secador por pulverização de dois estágios, secador por pulverização de formato curto e secador por pulverização de formato alto.

Algumas modalidades exemplificativas compreendem uma formu- lação compreendendo uma proteína sólida micronizada que é produzi- da por secagem por pulverização.

As modalidades exemplificativas preferidas compreendem a proteína seca por pulverização na forma de um pó.

Os pós divulgados da proteína sólida micronizada fornecem várias vantagens, incluindo, mas não se limitando a, aumentos na es- tabilidade da suspensão, tamanho de partícula uniforme e dispersibili- dade melhorada.

As propriedades físicas das partículas de proteína e as propriedades coloidais correspondentes da suspensão dependem muito do processo de secagem por pulverização e da formulação (Vehring, R. (2008) "Pharamceutical particle engineering via spray drying" 25(5): 999-1022). Em algumas modalidades exemplificativas, a formulação de proteína sólida micronizada compreende um carboidra- to, um aminoácido e um surfactante.

Carboidratos exemplificativos são sacarose, manitol, sorbitol, dextrano, maltodextrina ou trealose.

A quantidade de carboidrato na formulação de proteína sólida microniza- da pode variar de cerca de 0,01 a cerca de 50%, por exemplo, cerca de 0,01%, cerca de 0,05%, cerca de 0,1%, cerca de 0,5%, cerca de 1%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45% ou cerca de 50%. Aminoácidos exemplificativos são prolina, histidina, iso- leucina, metionina, cisteína, glicina, arginina, lisina, leucina, tri-leucina, alanina, ácido glutâmico, ácido aspártico, treonina e 2-fenilamina.

A quantidade de aminoácidos na formulação de proteína sólida microni- zada pode variar de cerca de 0,01 a cerca de 20%, por exemplo, cerca de 0,01%, cerca de 0,05%, cerca de 0,1%, cerca de 0,5%, cerca de 1%, cerca de 2%, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15% ou cerca de 20%. Surfactantes não iônicos exem- plificativos são polissorbato 20 (PS-20), polissorbato 28, polissorbato 40 (PS-40), polissorbato 65, polissorbato 80 (PS-80), polissorbato 81, polissorbato 85, poloxamer 181, poloxamer 188, poloxamer 407, Triton X-100, Brij-35, Brij-30, Tween 20, Tween 80, digitonina, (Ri-O-(CH2)x-R de alquil glicosídeos, onde R é independentemente CH3 ou (C6Hn) de ciclohexil; Ri é independentemente glicose ou maltose; e x = 3-15), Pluronic F127 ou combinações dos mesmos. A quantidade de surfac- tante não iônico na formulação de proteína sólida micronizada pode variar de cerca de 0,01% a cerca de 5%, por exemplo, cerca de 0,01%, cerca de 0,02%, cerca de 0,03%, cerca de 0,04%, cerca de 0,05%, cerca de 1%, cerca de 1%, cerca de 3%, cerca de 4% ou cerca de 5%.

[0080] A fim de manter uma formulação de proteína de alta con- centração uniforme, a formulação de proteína sólida micronizada deve permanecer dispersível no veículo ao longo do tempo. Conforme usa- do neste documento, "dispersibilidade" é usado para descrever o grau de dispersão de um pó em partículas individuais ou aglomerados me- diante o exercício de uma força de dispersão externa. A abordagem tradicional para melhorar a dispersibilidade de pós coesos é misturá- los com excipientes ou aditivos que modificam as forças interpartícu- las. Em algumas modalidades, a formulação de proteína sólida micro- nizada compreende uma proteína em pó seca por pulverização que inclui aditivos para melhorar a dispersibilidade das partículas secas por pulverização. Aditivos exemplificativos que melhoram a dispersibilida- de das partículas secas por pulverização são aminoácidos, lecitina, estearato de magnésio, amido, carboximetilcelulose de sódio, alginato de sódio, polietilenoglicol, (PEG), polivinilpirrolidona (PVP), hidroxi propil metil celulose, (HPMC), Álcool polivinílico (PVA), b-ciclodextrina, manitol, quitosana, carragenina, óxidos de polietileno (PEO)/copolímeros de polipropilenoglicol (PPG), amidos modificados por PEG, copolímeros aleatórios de acetato de vinil/vinilpirrolidona, ácido poliacrílico e poliacrilato de albuminato de alumínio, trucilato de amônio, surfactantes ou carboidratos. Em modalidades exemplificati- vos, os aditivos usados para preparar a proteína sólida micronizada, na forma de um pó de proteína seca por pulverização, e são selecio- nados a partir de trileucina, aminoácidos, álcool polivinílico, polietile- noglicol, polímeros solúveis em água ou combinações dos mesmos. Estabilidade da formulação de proteína de alta concentração

[0081] A estabilidade de uma formulação de proteína de alta con- centração pode compreender a avaliação da estabilidade química, es- tabilidade física ou estabilidade funcional. As formulações da presente invenção exibem tipicamente níveis elevados de estabilidade da prote- ína. O termo "estável", conforme usado neste documento em referên- cia às formulações, significa que as proteínas dentro das formulações podem reter um grau aceitável de estrutura química ou função biológi- ca após armazenamento sob condições exemplificativas definidas nes- te documento. Uma formulação pode ser estável mesmo que a proteí- na nela contida não mantenha 100% de sua estrutura química ou fun- ção biológica após armazenamento por um período de tempo definido. Em certas circunstâncias, a manutenção de cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% da estrutura ou função da proteína após armazenamento por uma quanti- dade de tempo definida pode ser considerada como "estável". A esta- bilidade pode ser medida, inter alia, determinando a porcentagem de proteína nativa que permanece na formulação após armazenamento durante um período de tempo definido a uma temperatura definida. A porcentagem de proteína nativa pode ser determinada por, inter alia,

cromatografia de exclusão de tamanho (por exemplo, cromatografia líquida de alta eficiência por exclusão de tamanho [SE-HPLC]), de mo- do que "nativa" significa não agregada e não degradada. Um "grau aceitável de estabilidade", conforme essa frase é usada neste docu- mento, significa que pelo menos 90% da forma nativa da proteína po- de ser detectada na formulação após o armazenamento por um perío- do de tempo definido a uma determinada temperatura. Em certas mo- dalidades, pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da forma nativa da proteína pode ser detectada em a formulação após armazenamento por um determinado período de tempo a uma temperatura definida. A quantidade definida de tempo após o qual a estabilidade é medida pode ser pelo menos 14 dias, pelo menos 28 dias, pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 7 meses, pelo menos 8 meses, pelo me- nos 9 meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 11 meses, pelo me- nos 12 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 24 meses ou mais.

[0082] A temperatura definida na qual a formulação farmacêutica pode ser armazenada ao avaliar a estabilidade pode ser qualquer temperatura de cerca de -80°C a cerca de 45°C, por exemplo, arma- zenamento a cerca de -80°C, cerca de -30°C, cerca de -20°C, cerca de 0°C, cerca de 4°-8°C, cerca de 5°C, cerca de 25°C, cerca de 35°C, cerca de 37°C ou cerca de 45°C. Por exemplo, uma formulação farma- cêutica pode ser considerada estável se após 6 meses de armazena- mento a 5°C, mais do que cerca de 95%, 96%, 97% ou 98% da proteí- na nativa é detectada por SE-HPLC. Uma formulação farmacêutica também pode ser considerada estável se após 6 meses de armaze- namento a 25°C, mais do que cerca de 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% da proteína nativa é detectada por SE-HPLC. Uma formulação farma- cêutica também pode ser considerada estável se após 28 dias de ar-

mazenamento a 45°C, mais do que cerca de 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% da proteína nativa for detectada por SE- HPLC. Uma formulação farmacêutica também pode ser considerada estável se após três meses de armazenamento a -20°C, mais do que cerca de 96%, 97% ou 98% da proteína nativa é detectada por SE- HPLC. Uma formulação farmacêutica também pode ser considerada estável se após três meses de armazenamento a -30°C, mais do que cerca de 96%, 97% ou 98% da proteína nativa é detectada por SE- HPLC. Uma formulação farmacêutica também pode ser considerada estável se após três meses de armazenamento a -80°C, mais do que cerca de 96%, 97% ou 98% da proteína nativa é detectada por SE- HPLC.

[0083] A estabilidade pode ser medida, inter alia, determinando a porcentagem de proteína que se forma em um agregado dentro da formulação após armazenamento por um período de tempo definido a uma temperatura definida, em que a estabilidade é inversamente pro- porcional à porcentagem de agregado que é formado. Esta forma de estabilidade também é referida como "estabilidade coloidal" neste do- cumento. A porcentagem de proteína agregada pode ser determinada por, inter alia, cromatografia de exclusão de tamanho (por exemplo, cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão de tamanho [SE- HPLC]). Um "grau aceitável de estabilidade", conforme essa frase é usada neste documento, significa que no máximo 6% da proteína está em uma forma agregada detectada na formulação após o armazena- mento por um período de tempo definido a uma determinada tempera- tura. Em certas modalidades, um grau aceitável de estabilidade signifi- ca que no máximo cerca de 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% da proteína pode ser detectada em um agregado na formulação após armazenamento por um determinado período de tempo em uma de- terminada temperatura. A quantidade definida de tempo após o qual a estabilidade é medida pode ser pelo menos 2 semanas, pelo menos 28 dias, pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 me- ses, pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 7 meses, pelo menos 8 meses, pelo menos 9 meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 11 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 24 meses ou mais. A temperatura na qual a formulação farmacêutica pode ser armazenada ao avaliar a es- tabilidade pode ser qualquer temperatura de cerca de -80°C a cerca de 45°C, por exemplo, armazenamento a cerca de -80°C, cerca de -30°C, cerca de -20°C, cerca de 0°C, cerca de 4°-8°C, cerca de 5°C, cerca de 25°C, cerca de 35°C, cerca de 37°C ou cerca de 45°C. Por exemplo, uma formulação farmacêutica pode ser considerada estável se após seis meses de armazenamento a 5°C, menos de cerca de 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% da proteína é detectada em uma forma agregada. Uma formulação farmacêutica também pode ser considerada estável se após seis meses de armazenamento a 25°C, menos de cerca de 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% da proteína é detectada em uma for- ma agregada. Por exemplo, uma formulação farmacêutica pode ser considerada estável se após 28 dias de armazenamento a 45°C, me- nos de cerca de 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% da proteína é detectada em uma forma agregada. Uma formulação farmacêutica também pode ser considerada estável se após três meses de armaze- namento a -20°C, -30°C ou -80°C menos do que cerca de 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% da proteína é detectada em uma forma agregada.

[0084] A estabilidade também pode ser medida, inter alia, determi- nando a porcentagem de proteína que se forma em um agregado den- tro da formulação após armazenamento por um período de tempo de- finido a uma temperatura definida, em que a estabilidade é inversa- mente proporcional à porcentagem de agregado que é formado. Esta forma de estabilidade também é referida como "estabilidade coloidal"

neste documento.

A porcentagem de proteína agregada pode ser de- terminada por, inter alia, cromatografia de exclusão de tamanho (por exemplo, cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão de tama- nho [SE-HPLC]). Um "grau aceitável de estabilidade", conforme essa frase é usada neste documento, significa que no máximo 6% da prote- ína está em uma forma agregada detectada na formulação após o ar- mazenamento por um período de tempo definido a uma determinada temperatura.

Em certas modalidades, um grau aceitável de estabilida- de significa que no máximo cerca de 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% da proteína pode ser detectada em um agregado na formula- ção após armazenamento por um determinado período de tempo em uma determinada temperatura.

A quantidade definida de tempo após o qual a estabilidade é medida pode ser pelo menos 2 semanas, pelo menos 28 dias, pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses, pelo menos 6 me- ses, pelo menos 7 meses, pelo menos 8 meses, pelo menos 9 meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 11 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 24 meses ou mais.

A temperatura na qual a formulação farmacêutica pode ser armazenada ao avaliar a estabilidade pode ser qualquer temperatura de cerca de -80°C a cerca de 45°C, por exemplo, armazenamento a cerca de -80°C, cerca de - 30°C, cerca de -20°C, cerca de 0°C, cerca de 4°-8°C, cerca de 5°C, cerca de 25°C, cerca de 35°C, cerca de 37°C ou cerca de 45°C.

Por exemplo, uma formulação farmacêutica pode ser considerada estável se após seis meses de armazenamento a 5°C, menos de cerca de 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% da proteína é detectada em uma forma agre- gada.

Uma formulação farmacêutica também pode ser considerada estável se após seis meses de armazenamento a 25°C, menos de cer- ca de 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% da proteína é detectada em uma forma agregada.

Por exemplo, uma formulação farmacêutica po-

de ser considerada estável se após 28 dias de armazenamento a 45°C, menos de cerca de 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% da proteína é detectada em uma forma agregada. Uma formulação far- macêutica também pode ser considerada estável se após três meses de armazenamento a -20°C, -30°C ou -80°C menos do que cerca de 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% da proteína é detectada em uma forma agregada.

[0085] A estabilidade também pode ser medida, inter alia, determi- nando a porcentagem de proteína que migra em uma fração mais áci- da durante a troca iônica ("forma ácida") do que na fração principal da proteína ("forma de carga principal"), em que a estabilidade é inversa- mente proporcional à fração de proteína na forma ácida. Embora não desejando estar limitado pela teoria, a desamidação da proteína pode fazer com que a proteína se torne mais carregada negativamente e, portanto, mais ácida em relação à proteína não desamidada (ver, por exemplo, Robinson, N. (2002) "Protein Deamidation" PNAS, 99(8):5283-5288). A porcentagem de proteína "acidificada" pode ser determinada por, inter alia, cromatografia de troca iônica (por exemplo, cromatografia líquida de alta eficiência de troca catiônica [CEX- HPLC]). Um "grau aceitável de estabilidade", conforme essa frase é usada neste documento, significa que no máximo 49% da proteína es- tá em uma mais ácida detectada na formulação após o armazenamen- to por um período de tempo definido a uma temperatura definida. Em certas modalidades exemplificativas, um grau aceitável de estabilidade significa que no máximo cerca de 49%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, ou 0,1% da proteína po- de ser detectada em uma forma ácida na formulação após armazena- mento por um período de tempo definido em uma dada temperatura. A quantidade definida de tempo após o qual a estabilidade é medida po- de ser de pelo menos 2 semanas, pelo menos 28 dias, pelo menos 1 mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 4 meses, pelo menos 5 meses, pelo menos 6 meses, pelo menos 7 meses, pelo menos 8 meses, pelo menos 9 meses, pelo menos 10 meses, pelo menos 11 meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos 24 meses ou mais.

[0086] A temperatura na qual a formulação farmacêutica pode ser armazenada ao avaliar a estabilidade pode ser qualquer temperatura de cerca de -80°C a cerca de 45°C, por exemplo, armazenamento a cerca de -80°C, cerca de -30°C, cerca de -20°C, cerca de 0°C, cerca de 4°-8°C, cerca de 5°C, cerca de 25°C, ou cerca de 45°C. Por exem- plo, uma formulação farmacêutica pode ser considerada estável se após três meses de armazenamento a -80°C, -30°C ou -20°C menos do que cerca de 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% da proteína está em uma forma mais ácida. Uma formulação farmacêutica também pode ser considerada estável se após seis meses de armazenamento a 5°C, menos de cerca de 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23 %, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% da proteí- na está em uma forma mais ácida. Uma formulação farmacêutica tam- bém pode ser considerada estável se após seis meses de armazena- mento a 25°C, menos de cerca de 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% da proteína está em uma forma mais ácida. Uma formulação farmacêutica também pode ser considerada estável se após 28 dias de armazenamento a 45°C, menos de cerca de 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40 %, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%,

33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% , 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% da proteína pode ser detectada em uma forma mais ácida.

[0087] Outros métodos podem ser usados para avaliar a estabili- dade das formulações da presente invenção, tal como, por exemplo, calorimetria exploratória diferencial (DSC) para determinar a estabili- dade térmica, agitação controlada para determinar a estabilidade me- cânica, e absorção a cerca de 350 nm ou cerca de 405 nm para de- terminar turbidez da solução. Por exemplo, uma formulação da presen- te invenção pode ser considerada estável se, após 6 ou mais meses de armazenamento a cerca de 5°C a cerca de 25°C, a mudança na OD405 da formulação for inferior a cerca de 0,05 (por exemplo, 0,04, 0,03, 0,02, 0,01 ou menos) do OD405 da formulação no tempo zero. A medição da atividade biológica ou afinidade de ligação da proteína ao seu alvo também pode ser usada para avaliar a estabilidade. Por exemplo, uma formulação da presente invenção pode ser considerada estável se, após armazenamento a, por exemplo, 5°C, 25°C, 45°C, etc. por um período de tempo definido (por exemplo, 1 a 12 meses), a pro- teína contida na formulação se liga ao seu alvo com uma afinidade que é pelo menos 90%, 95% ou mais da afinidade de ligação da proteína antes do referido armazenamento. A afinidade de ligação pode ser de- terminada por exemplo, ELISA ou ressonância de plasmon. A ativida- de biológica pode ser determinada por um ensaio de atividade de pro- teína, tal como, por exemplo, o contato de uma célula que expressa a proteína com a formulação que compreende a proteína a. A ligação da proteína a tal célula pode ser medida diretamente, por exemplo, por meio de análise FACS. Alternativamente, a atividade a jusante do sis- tema de proteína pode ser medida na presença da proteína e compa- rada com a atividade do sistema de proteína na ausência de proteína.

Métodos adicionais para avaliar a estabilidade de uma proteína na formulação são demonstrados nos Exemplos apresentados abaixo. Recipientes para formulação de proteína de alta concentração

[0088] As formulações de proteína de alta concentração, da pre- sente invenção, podem estar contidas em qualquer recipiente adequa- do para armazenamento de medicamentos e outras composições te- rapêuticas. Por exemplo, as formulações farmacêuticas podem estar contidas em um recipiente de plástico ou vidro selado e esterilizado com um volume definido, tal como um frasco, ampola, seringa, cartu- cho ou frasco. Diferentes tipos de frascos podem ser usados para con- ter as formulações da presente invenção incluindo, por exemplo, fras- cos de vidro ou plástico transparentes e opacos (por exemplo, âmbar). Da mesma forma, qualquer tipo de seringa pode ser usado para conter e/ou administrar as formulações farmacêuticas da presente invenção. A formulação dentro do recipiente pode ser tratada usando qualquer método conhecido na técnica para remover o oxigênio para melhorar a estabilidade da proteína, se necessário. O oxigênio no espaço superior (o espaço gasoso acima de um líquido em um recipiente fechado) po- de ser substituído por um gás inerte, como nitrogênio ou argônio.

[0089] As formulações de proteína de alta concentração podem ser administradas a um paciente por vias parentéricas, tais como inje- ção (por exemplo, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperito- neal, etc.) ou administração percutânea, mucosa, nasal, pulmonar e/ou oral. Numerosos dispositivos de distribuição de caneta e/ou autoinjetor reutilizáveis podem ser usados para distribuir por via subcutânea as formulações farmacêuticas da presente invenção. Os exemplos inclu- em, mas não estão limitados a AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Unido), caneta DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suíça), caneta HUMALOG MIX 75/25™, caneta HUMALOG™, caneta HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianapo-

lis, IN), NOVOPENTM I, II e III (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamar- ca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), caneta BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ e OPTICLIK™ (sanofi- aventis, Frankfurt, Alemanha), para citar apenas alguns. Exemplos de caneta descartável e/ou dispositivos de distribuição de autoinjetor com aplicações na distribuição subcutânea de uma composição farmacêuti- ca da presente invenção incluem, mas não estão limitados à caneta SOLOSTARTM (Sanofi-Aventis), o FLEXPEN™ (Novo Nordisk) e o KWIKPEN™ (Eli Lilly), o Autoinjetor SURECLICK ™ (Amgen, Thou- sand Oaks, Califórnia), o PUSHCLICK™ (Scandinavian Health Ltd. (SHL) Group), o PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemanha), o EPI- PEN (Dey, LP) e o HUMIRATM Pen (Abbott Labs, Abbott Park, Ill.), para citar apenas alguns.

[0090] O uso de um microinfusor para distribuir as formulações de proteína de alta concentração da presente invenção também é con- templado neste documento. Conforme usado neste documento, o ter- mo "microinfusor" significa um dispositivo de distribuição subcutânea projetado para administrar lentamente grandes volumes (por exemplo, até cerca de 2,5 mL ou mais) de uma formulação terapêutica durante um período de tempo prolongado (por exemplo, cerca de 10, 15, 20, 25, 30 ou mais minutos). Ver, por exemplo, U.S. Pat. Nº 6.629.949; U.S. Pat. Nº 6.659.982; e Meehan et al., J. Controlled Release 46: 107- 116 (1996), que são incorporados neste documento na sua totalidade. Microinfusores são particularmente úteis para a distribuição de gran- des doses de proteínas terapêuticas contidas em alta concentração (por exemplo, cerca de 100, 125, 150, 175, 200 ou mais mg/mL) e/ou soluções viscosas.

[0091] Em certas modalidades exemplificativas da presente inven- ção, uma seringa pré-cheia para distribuir a formulação de proteína de alta concentração também é contemplada neste documento. Seringas exemplificativas disponíveis em Vetter GmbH, Ravensburg, Alemanha; Hamilton Robotics, Nevada, Estados Unidos da América; Terumo, Tó- quio, Japão; ou Becton, Dickinson and Company, New Jersey, Estados Unidos da América. Em algumas modalidades exemplares da presente invenção, uma seringa pré-cheia pode compreender uma câmara du- pla para formar a suspensão antes da injeção. Em algumas modalida- des, uma das câmaras na câmara dupla pode compreender o agente hidrofóbico e o agente de redução de viscosidade e a outra pode com- preender a proteína terapêutica. Em algumas outras modalidades, o da câmara na câmara dupla pode compreender agente terapêutico suspenso em agente hidrofóbico e o outro pode compreender agente de redução de viscosidade.

[0092] Tal como usado neste documento, "seringabilidade" refere- se ao atributo da formulação que reflete a facilidade com que a formu- lação flui através da agulha. Pode ser calculada como a força neces- sária para a injeção de uma solução a uma determinada taxa de inje- ção por meio de uma agulha de calibre e comprimento predetermina- dos. Os termos de forças distintos usados para descrever a seringabi- lidade são força da seringa, força máxima da seringa e força de desa- gregação. Tal conforme usado neste documento, "força da seringa" refere-se à força necessária para sustentar o movimento do êmbolo a uma taxa constante para expelir o conteúdo da seringa. Os termos "força da seringa", "força sustentada", "força de deslizamento", "força de injeção" e "força de distribuição" podem ser usados alternadamen- te. A força da seringa é hipotetizada como dependente da concentra- ção de sólidos em suspensão, propriedades do pó e velocidade de dis- tribuição. A força da seringa pode ser medida pela célula de carga ins- talada em um sistema Instron. Conforme usado neste documento, "for- ça de deslizamento da seringa" se refere à força média necessária pa-

ra manter o movimento do êmbolo a uma taxa constante em seu curso até a extremidade frontal da seringa. Conforme usado neste documen- to, "força máxima da seringa" se refere à força mais alta medida antes do êmbolo terminar seu curso na extremidade frontal da seringa. Con- forme usado neste documento, "força de ruptura" se refere à força ne- cessária para iniciar o movimento do êmbolo. Conforme ilustrado nos exemplos, para a maioria das formulações de proteína altamente con- centrada, há uma correlação direta entre a força máxima da seringa e a força da seringa conforme determinado a partir dos dados da Instron.

[0093] Em certas modalidades exemplificativas da presente inven- ção, a força da seringa necessária para empurrar a formulação de pro- teína de alta concentração através de uma seringa de vidro de prote- ção de agulha rígida com um diâmetro interno de 0,25 polegadas, equipada com uma agulha de calibre 26½ de 0,5 polegadas a uma in- jeção de 4 mm/segundo a velocidade é menor do que cerca de 50 N, por exemplo, menos do que cerca de 45 N, menos do que cerca de 40 N, menos do que cerca de 35 N, menos do que cerca de 25 N, ou me- nos do que cerca de 25 N. Em modalidades preferidas, a força da se- ringa é menor do que cerca de 30 N. Usos terapêuticos das formulações farmacêuticas

[0094] As formulações farmacêuticas da presente invenção são úteis, inter alia, para o tratamento, prevenção e/ou melhoria de uma doença ou distúrbio. Doenças e distúrbios exemplificativos e não limi- tantes que podem ser tratados e/ou prevenidos pela administração das formulações farmacêuticas da presente invenção incluem infecções; doenças respiratórias; dor resultante de qualquer condição associada a dor neurogênica, neuropática ou nociceptiva; distúrbio genético; dis- túrbio congênito; câncer; herpetiforme; urticariforme idiopática crônica; esclerodermia, cicatriz hipertrófica; Doença de Whipple; hiperplasia benigna da próstata; distúrbios pulmonares, como asma leve, modera-

da ou grave, reações alérgicas; Doença de Kawasaki, doença falcifor- me; Síndrome de Churg-Strauss; Doença de Grave; pré-eclâmpsia; Síndrome de Sjogren; síndrome linfoproliferativa autoimune; anemia hemolítica autoimune; Esôfago de Barrett; uveíte autoimune; tubercu- lose; nefrose; artrite, incluindo artrite reumatoide crônica; doenças in- flamatórias do intestino, incluindo doença de Crohn e colite ulcerativa; lúpus eritematoso sistêmico; doenças inflamatórias; infecção por HIV; AIDS; aférese de LDL; distúrbios devido a mutações ativadoras de PCSK9 (mutações de ganho de função, "GOF"), distúrbios devido a hipercolesterolemia familiar heterozigótica (heFH); hipercolesterolemia primária; dislipidemia; doenças hepáticas colestáticas; síndrome nefró- tica; hipotireoidismo; obesidade; aterosclerose; doenças cardiovascu- lares; doenças neurodegenerativas; Transtorno Inflamatório Multissis- têmico de Início Neonatal (NOM ID/CINCA); Síndrome de Muckle- Wells (MWS); Síndrome Autoinflamatória Familiar por Frio (FCAS); fe- bre mediterrânea familiar (FMF); síndrome da febre periódica associa- da ao receptor do fator de necrose tumoral (TRAPS); artrite idiopática juvenil de início sistêmico (doença de Still); diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2; doenças autoimunes; doença do neurônio motor; doenças ocu- lares; doenças sexualmente transmissíveis; tuberculose, doença ou condição que é melhorada, inibida ou reduzida por um antagonista de VEGF; doença ou condição que é melhorada, inibida ou reduzida por um inibidor de PD-1; doença ou condição que é melhorada, inibida ou reduzida por um anticorpo de interleucina; doença ou condição que é melhorada, inibida ou reduzida por um anticorpo de NGF; doença ou condição que é melhorada, inibida ou reduzida por um anticorpo PCSK9; doença ou condição que é melhorada, inibida ou reduzida por um anticorpo ANGPTL; doença ou condição que é melhorada, inibida ou reduzida por um anticorpo de ativina; doença ou condição que é melhorada, inibida ou reduzida por um anticorpo GDF; doença ou con-

dição que é melhorada, inibida ou reduzida por um anticorpo contra Fel d 1; doença ou condição que é melhorada, inibida ou reduzida por um anticorpo CD; doença ou condição que é melhorada, inibida ou re- duzida por um anticorpo C5 ou suas combinações dos mesmos. Formulações Exemplificativas

[0095] Em certas modalidades exemplificativas da presente inven- ção, a formulação de proteína de alta concentração compreende pelo menos 200 mg/mL de proteína terapêutica. Por exemplo, as formula- ções descritas por essas modalidades exemplificativas compreendem a proteína terapêutica a uma concentração de pelo menos, pelo me- nos cerca de 200 mg/mL, pelo menos cerca de 210 mg/mL, pelo me- nos cerca de 220 mg/mL, pelo menos cerca de 230 mg/mL pelo menos cerca de 250 mg/mL, pelo menos cerca de 250 mg/mL, pelo menos cerca de 260 mg/mL, pelo menos cerca de 270 mg/mL, pelo menos cerca de 280 mg/mL, pelo menos cerca de 290 mg/mL, em pelo me- nos cerca de 300 mg/mL, pelo menos cerca de 320 mg/mL, pelo me- nos cerca de 340 mg/mL, pelo menos cerca de 350 mg/mL, pelo me- nos cerca de 380 mg/mL, pelo menos cerca de 400 mg/mL, pelo me- nos cerca de 420 mg/mL, pelo menos cerca de 450 mg/mL, pelo me- nos cerca de 480 mg/mL, pelo menos cerca de 500 mg/mL.

[0096] Em certas modalidades exemplificativas da presente inven- ção, a proteína terapêutica em formulação de proteína de alta concen- tração está na forma de uma formulação de proteína sólida microniza- da. Em modalidades preferidas, a formulação de proteína sólida mi- cronizada é preparada usando um processo de secagem por pulveri- zação. Em um aspecto, a concentração de proteína na formulação de proteína sólida micronizada varia de 1% a 99%. Em outro aspecto, a concentração de proteína na formulação de proteína sólida microniza- da é de pelo menos cerca de 50%, por exemplo, pelo menos cerca de 51%, pelo menos cerca de 52%, por exemplo, pelo menos cerca de

53%, pelo menos cerca de 54%, para exemplo, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo me- nos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, em pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99,5%, pelo menos cerca de 99,9%.

[0097] Os aditivos podem ser adicionados durante o processo de secagem por pulverização para melhorar a dispersibilidade da formu- lação de proteína sólida micronizada. Os aditivos que podem ser inclu- ídos na formulação de proteína sólida micronizada em questão inclu- em aminoácidos, carboidratos, surfactantes e/ou polímeros solúveis em água. O carboidrato que pode ser incluído na formulação de prote- ína sólida micronizada em questão é selecionado a partir de manitol, sacarose, trealose, maltodextrina, sorbitol ou combinações dos mes- mos. A concentração de carboidrato na formulação de proteína sólida micronizada é inferior a cerca de 50%, por exemplo, menos do que cerca de 45%, menos do que cerca de 40%, menos do que cerca de 35%, menos do que cerca de 30%, menos do que cerca de 25%, me- nos do que cerca de 20%, menos do que cerca de 18%, menos do que cerca de 15%, menos do que cerca de 12%, menos do que cerca de 10%, menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 2%, menos do que cerca de 1%, menos do que cerca de 0,5% ou menos do que cerca de 0,1%. O aminoácido que pode ser incluído na formulação de proteína sólida micronizada em questão é selecionado a partir de ami- noácidos de ocorrência natural e derivados dos mesmos. Em modali- dades preferidas, o aminoácido é selecionado de histidina, isoleucina, leucina, trileucina, glicina ou combinações dos mesmos. A concentra- ção de aminoácido na formulação de proteína sólida micronizada é inferior a cerca de 20%, por exemplo, inferior a cerca de 18%, inferior a cerca de 15%, inferior a cerca de 12%, inferior a cerca de 10%, infe-

rior a cerca de 5%, menos do que cerca de 3%, menos do que cerca de 2%, menos do que cerca de 1,5%, menos do que cerca de 1,2%, menos do que cerca de 1,0%, menos do que cerca de 0,5%, menos do que cerca de 0,4%, menos do que cerca de 0,3%, menos do que cerca de 0,2%, menos do que cerca de 0,1% ou menos do que cerca de 0,05%. O surfactante que pode ser incluído na formulação de proteína sólida micronizada em questão é selecionado a partir de polissorbato 20, polissorbato 80, polissorbato 60, poloxâmero, polietilenoglicol ou combinações dos mesmos. A concentração de surfactante na formula- ção de proteína sólida micronizada é inferior a 5%, por exemplo, inferi- or a cerca de 5%, inferior a cerca de 4,5%, inferior a cerca de 4%, infe- rior a cerca de 3,5%, inferior a cerca de 3%, inferior do que cerca de 2,5%, menos do que cerca de 2%, menos do que cerca de 1,5%, me- nos do que cerca de 1%, menos do que cerca de 0,9%, menos do que cerca de 0,8%, menos do que cerca de 0,7%, menos do que cerca de 0,6%, menos do que cerca de 0,5%, menos do que cerca de 0,4%, menos do que cerca de 0,3%, menos do que cerca de 0,2% ou menos do que cerca de 0,1%.

[0098] Em certas modalidades exemplares da presente invenção, a proteína terapêutica em formulação de proteína de alta concentração é distribuída por administração parenteral. A formulação pode ser ad- ministrada por via subcutânea. Em uma modalidade exemplificativa, a formulação pode estar contida em uma seringa pré-cheia. Seringas exemplificativas pré-cheias estão disponíveis em Vetter GmbH, Ra- vensburg, Alemanha; Hamilton Robotics, Nevada, Estados Unidos da América; Terumo, Tóquio, Japão; ou Becton, Dickinson and Company, New Jersey, Estados Unidos da América. A formulação pode ser pré- carregada em uma seringa e, portanto, está pronta para injeção sem mistura ou reconstituição.

[0099] Todas as citações de literatura e documentos de patentes aqui são incorporadas aqui por referência em sua totalidade.

[00100] A presente invenção será mais completamente compreen- dida pelas referências aos seguintes exemplos. Eles não devem, no entanto, ser interpretados como limitantes do escopo da invenção

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Composição e carregamento da suspensão

[00101] Os seguintes exemplos são apresentados de modo a forne- cer àqueles versados na técnica uma divulgação e descrição comple- tas de como fazer e utilizar os métodos e composições da invenção, e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção

[00102] Várias formulações (Tabela 1) compreendendo diferentes veículos foram preparadas seguindo o procedimento descrito abaixo. As proteínas terapêuticas exemplificativas utilizadas nas formulações são três anticorpos monoclonais. TABELA 1 Veículo Proteína Formulação 75% de Miglyol 812N, 25% de álcool benzílico 50% de Miglyol 812N, 50% de álcool benzílico 75% de Miglyol 812N, 25% de etanol (390 mg/mL de formulação de 50% de Miglyol 812N, 50% proteína sólida micronizada; 82% mAb1 de etanol de proteína em pó seco por pul- 75% de Miglyol 810N, 25% verização) de etanol 50% de Miglyol 810N, 50% de etanol 25% de Miglyol 810N, 75% de etanol

Veículo Proteína Formulação 50% de Miglyol 812N, 50% (Formulação de proteína sólida mAb1 de álcool benzílico micronizada de 397 mg/mL) 50% de Miglyol 812N, 50% (Formulação de proteína sólida mAb1 de álcool benzílico micronizada de 516 mg/mL) 50% de Miglyol 812N, 50% (Formulação de proteína sólida mAb1 de álcool benzílico micronizada a 35% p/v) 50% de Miglyol 812N, 50% (Formulação de proteína sólida mAb2 de álcool benzílico micronizada a 29% p/v) 50% de Miglyol 812N, 50% (Formulação de proteína sólida mAb3 de álcool benzílico micronizada a 36% p/v) (274 mg/mL de proteína na for- mulação; teor de proteína de 0,82 p/p na formulação de prote- 75% de Miglyol 812N, 25% mAb3 ína sólida micronizada; 0,335 p/p de álcool benzílico de formulação de proteína sólida micronizada na formulação de proteína de alta concentração) (304 mg/mL de proteína na for- mulação; teor de proteína de 0,82 p/p na formulação de prote- 50% de Miglyol 812N, 50% mAb3 ína sólida micronizada; 0,355 p/p de álcool benzílico de formulação de proteína sólida micronizada na alta concentra- ção) (231 mg/mL de proteína na for- mulação; teor de proteína de 0,82 p/p na formulação de prote- 75% de Miglyol 812N, 25% mAb1 ína sólida micronizada; 0,291 p/p de álcool benzílico de formulação de proteína sólida micronizada na formulação de proteína de alta concentração)

Veículo Proteína Formulação (232 mg/mL de proteína na for- mulação; teor de proteína de 0,82 p/p na formulação de prote- 50% de Miglyol 812N, 50% mAb1 ína sólida micronizada; 0,286 p/p de álcool benzílico de formulação de proteína sólida micronizada na formulação de proteína de alta concentração) (278 mg/mL de proteína na for- mulação; teor de proteína de 0,82 p/p na formulação de prote- 50% de Miglyol 812N, 50% mAb1 ína sólida micronizada; 0,342 p/p de álcool benzílico de formulação de proteína sólida micronizada na formulação de proteína de alta concentração) (232 mg/mL de proteína na for- mulação; teor de proteína de 0,80 p/p na formulação de prote- 50% de Miglyol 812N, 50% mAb2 ína sólida micronizada; 0,285 p/p de álcool benzílico de formulação de proteína sólida micronizada na formulação de proteína de alta concentração) Miglyol 812 N 75% de Miglyol 812N, 25% de etanol 75% de Miglyol 812N, 25% de oleato de etila 75% de Miglyol 812N, 25% 400-500 mg/mL de formulação de álcool benzílico mAb1 de proteína sólida micronizada 75% de Miglyol 812N, 25% (82% p/ p mAb1) benzoato de benzil 50% de Miglyol 812N, 50% de álcool benzílico 25% de Miglyol 812N, 75% de álcool benzílico

Veículo Proteína Formulação (274 mg de proteína na formula- ção; teor de proteína de 0,78 p/p na formulação de proteína sólida 75% de Miglyol 812N, 25% micronizada; 0,335 p/p de formu- mAb3 de álcool benzílico lação de proteína sólida microni- zada na formulação de proteína de alta concentração mais trileu- cina a 0,05 p/p) (304 mg de proteína na formula- ção; teor de proteína de 0,78 p/p na formulação de proteína sólida 50% de Miglyol 812N, 50% micronizada; 0,355 p/p de formu- mAb3 de álcool benzílico lação de proteína sólida microni- zada na formulação de proteína de alta concentração mais trileu- cina a 0,05 p/p)

[00103] Os veículos constituídos por óleo e solvente foram compos- tos em volume para as composições alvo. Os veículos foram prepara- dos diariamente para garantir que não houvesse perda de solvente devido à evaporação.

[00104] A proteína seca por pulverização foi pesada em um tubo de centrífuga Eppendorf de 2mL de fundo redondo. Veículo apropriado foi adicionado em volume à proteína seca por pulverização de acordo com uma massa alvo de sólido por mL de veículo.

[00105] O pó seco por pulverização foi misturado ao veículo por vórtice vigoroso (vórtice, inverter e vórtice, repetir). Após agitação no vórtex, a amostra foi brevemente colocada em centrífuga para girar a suspensão das paredes do tubo para o fundo. Foi evitada demasiada centrifugação para evitar a separação de fases da suspensão. Após a centrifugação, a amostra foi sonicada durante 1-2 minutos e, se ne- cessário, o procedimento de mistura foi repetido.

[00106] As suspensões foram carregadas de volta na seringa de vidro de 1 mL usando uma espátula, para as suspensões mais visco- sas do tipo pasta, ou uma pipeta para as suspensões menos viscosas. Para dispensar usando o Instron, a distância foi planejada para ser cerca de 10 mm e, portanto, uma quantidade adequada de suspensão para permitir 10 mm de distância dispensada foi direcionada. Após o recarregamento para a seringa, a tampa da agulha foi removida e o êmbolo foi utilizado para remover o ar e empurrar a suspensão para o fundo da seringa. Isso era particularmente importante para as suspen- sões mais viscosas que, quando carregadas de volta com uma espátu- la, tendiam a aderir às laterais do corpo da seringa. Antes de dispen- sar a rolha, o êmbolo foi inspecionado quanto a qualquer suspensão presa nas saliências da rolha durante o processo de carregamento. Se a suspensão estava presa nas saliências da rolha, a rolha era substitu- ída por uma rolha limpa. EXEMPLO 2: Identificação de sistemas de solventes não aquosos adequados como veículos para suspensões de proteínas de alta con- centração para administração subcutânea.

[00107] Neste conjunto de experimentos, todas as avaliações foram realizadas com base no mAb1 como proteína modelo e seringabilidade por meio de uma seringa de vidro de 1mL equipada com uma agulha TW BD de 27g e dispensada a 4mm/s. Miglyol 810N foi usado para avaliação preliminar. Os critérios para um sistema de solvente apropri- ado foram baseados na força da seringa, pureza (UP-SEC) da proteí- na reconstituída da suspensão em veículo e uso de componentes do veículo em produtos aprovados pela FDA para injeção subcutânea. Com base no uso em produtos aprovados pela FDA (Tabela 2), N- metil-2-pirrolidona e etanol foram identificados como solventes apro- priados.

TABELA 2 Solvente Óleo Faixa de con- Produto aprovado centração (sol- pela FDA vente v/v) Acetato de etila Miglyol 810N 25%-100% Nenhum N-metil-2- Miglyol 810N 25%-100% Atrigel (0,375 mL de pirrolidona N-metil-2-pirrolidona); Etanol Miglyol 810N 25%-100% Faslodex (100mg/ml Etanol x 5mL)

[00108] Para estudar a força de deslizamento, doze formulações exemplificativas foram avaliadas (FIG. 2). O estudo mostrou que o sol- vente puro provavelmente não era adequado como veículo devido à instabilidade coloidal e à instabilidade da proteína. Todos os três sol- ventes mostraram uma redução semelhante na força da seringa em 25-50% com benefício adicional de etanol e N-metil-2-pirrolidona na redução da força de deslizamento em > 50% da composição. O efeito máximo de redução da viscosidade para o acetato de etila-Miglyol foi observado com 25% de acetato de etila. Um ligeiro aumento na força de deslizamento ao longo da distância após o ponto de interrupção foi observado para soluções de acetato de etila, enquanto um platô está- vel foi observado para soluções de N-metil-2-pirrolidona ou etanol e para Miglyol sozinho. Com base na força da seringa, todos os três sis- temas de solventes eram adequados. Para acetato de etila/Miglyol, não mais do que 25% de acetato de etila foi necessário, para N-metil- 2-pirrolidona ou etanol, aumentar a concentração de solvente tanto quanto possível foi o ideal para reduzir a força da seringa. EXEMPLO 3: Determinando a força da seringa

[00109] Instron foi usado para determinar a força da seringa neces- sária para dispensar suspensões por meio de uma seringa de vidro de 1mL equipada com uma agulha TW de 27g. Salvo indicação em con- trário, a velocidade de dispensação foi de 4 mm/s e a força da seringa foi relatada como a força sustentada necessária para dispensar. Em muitos casos, com as formulações preparadas seguindo o exemplo 1, a força sustentada e a força máxima eram equivalentes - uma força de rompimento não foi observada para a forma como essas seringas fo- ram carregadas

[00110] Uma avaliação inicial da força da seringa para diferentes veículos foi realizada usando 100% Miglyol 810N, 100% Miglyol 812N, etanol a 100%, álcool benzílico a 25% v/v em Miglyol 812N, álcool benzílico a 75% v/v em Miglyol 812N, oleato de etila a 25% v/v em Mi- glyol 812N, oleato de etila a 75% v/v em Miglyol 812N, etanol a 25% v/v em Miglyol 812N, etanol a 75% v/v em Miglyol 812N, etanol a 25% v/v em Miglyol 810N, etanol a 50% v/v em Miglyol 810N, etanol a 75% v/v em Miglyol 810N e etanol a 25% v/v com PEG400 a 25% v/v em Miglyol 812N. Embora o Miglyol 810N tenha uma viscosidade mais baixa do que o Miglyol 812N, o Miglyol 812N foi o preferido devido ao seu precedente anterior em várias formulações comerciais aprovadas pela FDA. Etanol, álcool benzílico e oleato de etila foram todos igual- mente eficazes na redução da força da seringa para Miglyol 812N (ou seja, viscosidade) (FIG. 3).

[00111] A força de distribuição para formulações de proteína de alta concentração também foi considerada dependente da escolha do agente de redução de viscosidade e sua concentração. Em um conjun- to de experimentos, o etanol foi mais eficaz na redução da força da seringa em suspensões do que o álcool benzílico na mesma concen- tração de solvente (FIG. 4). A variabilidade nos resultados com o mesmo teor de solvente pode ser devido à mistura não uniforme e/ou teor de sólido real vs. alvo em suspensão.

[00112] A força de distribuição para formulações de proteína de alta concentração foi ainda encontrada para ser dependente da concentra- ção sólida da proteína terapêutica (FIG. 5). Em um conjunto de expe- rimentos, a suspensão de mAb1 em álcool benzílico a 50% v/v em Mi-

glyol 812N demonstrou maior força de distribuição com aumento na concentração de sólidos.

[00113] A força de distribuição para formulações de proteína de alta concentração também foi encontrada para ser dependente das propri- edades do pó que podem ser dependentes da molécula (FIG. 6). As diferenças nas forças de distribuição podem ser devidas a diferenças nas propriedades do pó da molécula e/ou tamanho de partícula seca por pulverização, distribuição de tamanho e morfologia. Em um conjun- to de experiências, mAb1, mAb2 e mAb3 no mesmo veículo (álcool benzílico + Miglyol (50/50 v/v)) demonstraram diferentes forças de dis- tribuição. mAb2 em concentração de sólidos de 29% demonstrou uma força de distribuição mais alta do que mAb1 em concentração de sóli- dos de 34%. A força da seringa pode, portanto, ser dependente da concentração de sólidos em suspensão, propriedades do pó que po- dem ser dependentes da molécula e do veículo (Tabela 3). TABELA 3. Força da seringa de formulações exemplificativas Molécu- Veículo Concen- Conte- Densidade concentra- força la tração de údo de da suspen- ção efetiva de inje- suspen- proteí- são (mas- de proteína ção (N)* são (p/p) na no sa/volume em sus- sólido dispensa- pensão (p/p) do, g/mL) (mg/mL) mAb3 25% BA 0,335 0,82 1,0 (medido) 274 54 mAb3 50% BA 0,355 0,82 1,0 (medido) 304 43 mAb1 25% BA 0,291 0,82 1,0 (teórico) 231 35 mAb1 50% BA 0,286 0,82 1,0 (teórico) 232 20,5 mAb1 50% BA 0,342 0,82 1,0 (teórico) 278 31 mAb2 50% BA 0,285 0,82 1,0 (teórico) 232 27 *Força de injeção de 4 mm/s por meio de seringa TW BD Hypak de 1 mL de 27g.

EXEMPLO 3: Recuperação e estabilidade de proteína

[00114] A recuperação e estabilidade da proteína das formulações de proteína de alta concentração preparadas para uso no exemplo 1 foram avaliadas quanto à estabilidade a longo prazo. Água para inje- ção (WFI) foi adicionada à suspensão para atingir um total de 10 mg/ml ou 50 mg/ml como indicado com base no teor de proteína p/p da suspensão determinado durante a composição e o peso da amostra da suspensão. Após a adição de WFI à amostra da suspensão, a amostra foi suavemente misturada por turbilhonamento/inversão para extrair a proteína seca por pulverização na fase aquosa para dissolu- ção. Após a mistura, a amostra foi centrifugada para separar as fases aquosa e oleosa (para Miglyol, o óleo é menos denso que a água e cria uma camada superior). Uma amostra da fase aquosa foi removida e filtrada através de um filtro de 0,22 µm para remover quaisquer gotí- culas ou partículas de óleo insolúvel antes da análise via UPLC.

[00115] Em um conjunto de experimentos, o teste de estabilidade física em veículos de suspensão demonstrou que a agregação foi a principal via de degradação observada (FIG. 7). A formulação de mAb1 foi formulada usando mAb1 400-500 mg/mL de pó seco por pul- verização (81,9% p/p de mAb1). A reconstituição foi realizada usando WFI. Uma recuperação total da proteína foi observada em todas as amostras. mAb1 foi mais estável em veículos contendo álcool benzílico do que etanol para uma dada concentração de solvente.

[00116] Em outro conjunto de experiências, a estabilidade em sus- pensão era específica da molécula (FIG.8). mAb2 não foi estável em 50% do veículo BA por mais de 1 hora em condições ambientais, ape- sar de uma concentração de suspensão mais baixa; exigia uma força de distribuição maior do que mAb1 no mesmo veículo.

[00117] A "recuperação da proteína" foi afetada tanto pela hetero- geneidade da suspensão, o que leva a uma diferença no conteúdo real e teórico da proteína na amostra, quanto por qualquer perda de proteí-

na devido à precipitação irreversível ou aprisionamento na fase oleosa. Em geral, este método resultou na recuperação total (por exemplo, ≥90%) da proteína, sugerindo que o método para extrair a proteína da fase oleosa é adequado. EXEMPLO 4: Pureza (UP-SEC) e recuperação de proteína reconstitu- ída da suspensão em veículo.

[00118] Pureza e recuperação de proteína para formulações exem- plificativas foram realizadas com formulações contendo 350 mg/mL de mAb1, que foram reconstituídas usando PBS, pH 7,4 a uma concen- tração de 10 mg/mL (Tabela 4). A N-metil-2-pirrolidona não foi incluída nos resultados porque a proteína precipitou irreversivelmente após a reconstituição e não foi analisada posteriormente por UP-SEC. O ace- tato de etila e o etanol causaram agregação de proteínas como solven- tes puros, mas na presença de Miglyol 75%, os solventes não causa- ram qualquer degradação física aparente da proteína (Tabela 4). Com base na pureza da proteína, 25% de acetato de etila/75% de Miglyol e 25% de etanol/75% de Miglyol foram selecionados como sistemas de solventes adequados. O etanol-Miglyol foi um dos sistemas de solven- tes que atendeu aos três critérios de avaliação. TABELA 4 Veículo % Nativa % de recupera- ção WFI 94.6% 95 Miglyol 810N 95,0% 95 Acetato de etila 90,0% 90 25% de acetato de etila; 75% de 94,0% 121 Miglyol WFI 95,8% 96 Etanol 91,3% 96 25% de etanol / 75% de Miglyol 95,5% 95

Claims (38)

REIVINDICAÇÕES

1. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, caracterizada pelo fato de que compreende: a. pelo menos cerca de 200 mg/mL de uma proteína tera- pêutica como uma formulação de proteína sólida micronizada, b. um agente hidrofóbico, e c. um agente de redução de viscosidade.

2. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a formulação de proteína sólida micronizada é produzida por se- cagem por pulverização.

3. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente hidrofóbico é um triglicerídeo.

4. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente hidrofóbico é selecionado do grupo que consiste em Mi- glyol 810 N, Miglyol 812 N, triacetina ou combinações dos mesmos.

5. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido agente hidrofóbico é Miglyol 812 N.

6. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido agente hidrofóbico é Miglyol 810 N.

7. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente de redução de viscosidade é selecionado a partir do gru- po que consiste em etanol, álcool benzílico, acetato de etila, N-Metil-2- pirrolidona ou combinações dos mesmos.

8. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o referido agente de redução de viscosidade é etanol.

9. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o referido agente de redução de viscosidade é álcool benzílico.

10. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o referido agente de redução de viscosidade é acetato de etila.

11. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida formulação de proteína sólida micronizada é desprezi- velmente solúvel no agente hidrofóbico e no agente de redução da vis- cosidade.

12. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida formulação de proteína sólida micronizada está na for- ma de um pó.

13. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o referido pó é formulado usando trileucina.

14. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a concentração do referido pó está entre cerca de 200 mg/mL a cerca de 500 mg/mL.

15. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a razão em peso (p/p) do referido pó para a formulação de proteí- na de alta concentração não aquosa é maior do que cerca de 0,250.

16. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o referido pó compreende a proteína terapêutica, um carboidrato, um aminoácido ou um surfactante não iônico.

17. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o carboidrato é sacarose, manitol ou trealose.

18. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o aminoácido é histidina ou prolina.

19. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o surfactante não iônico é um polissorbato.

20. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o polissorbato é selecionado a partir de um grupo que consiste em polissorbato 20, polissorbato 40, polissorbato 60, polissorbato 80 ou combinações dos mesmos.

21. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a concentração (% p/p) da proteína é de pelo menos cerca de 70%.

22. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a formulação de proteína de alta concentração não aquosa tem uma força de deslizamento de injeção inferior a cerca de 50 Newton (N).

23. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a força de deslizamento da injeção é inferior a cerca de 30 Newton (N).

24. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida proteína terapêutica é um anticorpo monoclonal.

25. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, caracterizada pelo fato de que compreende: a. pelo menos cerca de 200 mg/mL de uma proteína tera- pêutica como uma formulação de proteína sólida micronizada, b. Miglyol 812 N e c. álcool benzílico.

26. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a formulação de proteína sólida micronizada é produzida por se- cagem por pulverização.

27. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a referida formulação de proteína sólida micronizada é desprezi- velmente solúvel no agente hidrofóbico e no agente de redução da vis- cosidade.

28. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que a referida formulação de proteína sólida micronizada está na for- ma de um pó.

29. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que o referido pó é formulado usando trileucina.

30. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a quantidade do referido pó está entre cerca de 200 mg/mL a cer- ca de 500 mg/mL.

31. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a razão em peso (p/p) do pó para a formulação de proteína de alta concentração não aquosa é maior do que cerca de 0,250.

32. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que o referido pó compreende uma proteína terapêutica, um carboidra- to, um aminoácido ou um surfactante não iônico.

33. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o carboidrato é sacarose, manitol ou trealose.

34. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o aminoácido é histidina ou prolina.

35. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que o surfactante não iônico é um polissorbato.

36. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que o polissorbato é selecionado a partir de um grupo que consiste em polissorbato 20, polissorbato 40, polissorbato 60, polissorbato 80 ou combinações dos mesmos.

37. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que a concentração (% p/p) da proteína é de pelo menos cerca de 70%.

38. Formulação de proteína de alta concentração não aquosa, caracterizada pelo fato de que compreende: a. pelo menos cerca de 200 mg/mL de uma proteína tera- pêutica como uma formulação de proteína sólida micronizada, b. um agente hidrofóbico selecionado a partir do grupo que consiste em Miglyol 810 N, Miglyol 812 N, ou combinações dos mesmos, e c. um agente de redução de viscosidade selecionado a partir do grupo que consiste em etanol, álcool benzílico, benzoato de benzila, acetato de etila, N-metil-2-pirrolidona ou combinações dos mesmos.