BR112021009043A2 - Plantas de canábis com um perfil de canabinóide enriquecido para delta-9-tetrahidrocanabinol e canabigerol - Google Patents

Plantas de canábis com um perfil de canabinóide enriquecido para delta-9-tetrahidrocanabinol e canabigerol Download PDF

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Abstract

plantas de canábis com um perfil de canabinóide enriquecido para delta-9-tetrahidrocanabinol e canabigerol. a presente invenção refere-se a novas plantas canabinóides, incluindo partes, extratos e suas utilizações, compreendendo um perfil canabinóide enriquecido para thc total (isto é, delta-tetrahidrocanabinol (thc) e ácido delta-9-tetrahidrocanabinólico (thca)) e cbg total (isto é, canabigerol (cbg) e ácido canabigerólico (cbga)).

Description

PLANTAS DE CANÁBIS COM UM PERFIL DE CANABINÓIDE ENRIQUECIDO PARA DELTA-9-TETRAHIDROCANABINOL E CANABIGEROL
[001] O presente pedido reivindica prioridade para os Pedidos Provisórios de Patente Australiana 2018904289, 2018904291, 2018904285 e 2018904286 depositados em 9 de novembro de 2018 e Pedidos Provisórios de Patente Australiana 2019900294, 2019900295, 2019900291 e 2019900293 depositados em 31 de janeiro de 2019, cujas revelações são pelo presente expressamente incorporadas nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade.
CAMPO
[002] A presente revelação está relacionada a novas plantas de canábis, incluindo partes, extratos e usos destas, que compreendem um perfil canabinóide enriquecido para THC total (ou seja, Δ-9-tetrahidrocanabinol (THC) e ácido Δ-9- tetrahidrocanabinólico (THCA)) e CBG total (ou seja, canabigerol (CBG) e ácido canabigerólico (CBGA)).
FUNDAMENTOS
[003] Canábis é uma planta herbácea de florescência do gênero Cannabis (Rosale), que tem sido usada por suas fibras e propriedades medicinais por milhares de anos. As qualidades medicinais de canábis foram reconhecidas desde pelo menos 2800 AC, com o uso de canábis sendo descritos em textos médicos antigos chineses e indianos. Embora o uso de canábis para fins medicinais seja conhecido há séculos, as pesquisas sobre as propriedades farmacológicas da planta foram limitadas em função de seu estado ilegal na maioria das jurisdições.
[004] O perfil químico de plantas de canábis é variado. Estima-se que plantas de canábis produzam mais do que 400 moléculas diferentes, incluindo fitocanabinóides, terpenos e fenólicos. Canabinóides, por exemplo, Δ-9- tetrahidrocanabinol (THC) e canabidiol (CBD), são tipicamente os canabinóides mais comumente conhecidos e pesquisados. CBD e THC estão naturalmente presentes em suas formas ácidas, ácido Δ-9-tetrahidrocanabinólico (THCA) e ácido canabidiólico (CBDA), que são produtos alternativos de um precursor compartilhado, ácido canabigerólico (CBGA).
[005] Muitos canabinóides interagem com o sistema endocanabinóide em mamíferos, incluindo humanos, para exercerem efeitos biológicos complexos sobre os sistemas neuronal, metabólico, imune e reprodutivo. Eles também interagem com receptores acoplados à proteína G (GPCRs), por exemplo, CB1 e CB2, no sistema endocanabinóide humano, onde se acredita que participem da regulação do apetite, dor, humor, memória, inflamação e sensibilidade à insulina. Canabinóides também foram implicados na sinalização neuronal, inflamação gastrintestinal, tumorigênese, infecção microbiana e diabetes.
[006] Embora haja um corpo de evidência crescente do potencial terapêutico de canábis e compostos derivados de canábis, em particular canabinóides, sua adoção na prática clínica tem sido impedida, pelo menos em parte, pelo fato de que seus mecanismos de ação permanecem em grande parte pouco definidos, observando também que canabinóides diferentes podem exercer efeitos biológicos diferentes. O potencial terapêutico de canábis e canabinóides derivados de canábis é ainda complicado pelo efeito de entourage, em que canabinóides diferentes atuam em combinação para exercer efeitos biológicos diferentes. Em vista dessa complexidade,
é vantajoso selecionar novas variedades de canábis que possuem um perfil canabinóide enriquecido para canabinóides específicos adequados para uso terapêutico.
[007] Estudos prévios do teor de canabinóide de plantas de canábis se concentraram, em grande parte, na diferenciação de variedades de canábis cultivadas para uso recreativo ou industrial. Por exemplo, em um estudo realizado por Turner e cols. (1979, Journal of Natural Products, 42: 319-21), material de folha de 85 variedades de canábis foi avaliado para canabicromeno (CBC), CBD e THC a fim de diferenciar entre variedades recreativas e industriais de canábis. As variedades recreativas foram submetidas à testagem de canabinóide adicional para identificar o tempo correto para amostragem em decorrência de variação significante da biossíntese de canabinóide ao longo da vida da planta. Mais recentemente, análise por espectroscopia por ressonância magnética nuclear (RMN) e RT-PCR foi usada para investigar o metaboloma e a biossíntese de canabinóide nos tricomas de Cannabis sativa “Bebiol” (Happyana e Kayser, 2016, Planta Medica, 82: 1.217-23). O objetivo desse estudo foi caracterizar a via biossintética de canabinóide ao longo do tempo, com os resultados mostrando que, sob as condições testadas, a biossíntese de canabinóide aumenta em cinco a seis semanas, mas permanece relativamente estática nas semanas posteriores após os tricomas terem maturados. Abordagens de metabolômica por RMN também foram usadas para investigar a diferença através de 12 variedades de canábis diferentes usando material de folha e flor (Choi e cols. 2004, Journal of Natural Products, 67: 953-7). Com a aplicação de análise de componente principal a esses resultados, foi demonstrado que os discriminadores principais dessas variedades eram THCA e CBDA, embora os níveis de carboidrato e aminoácido também fossem discriminadores importantes para controle de qualidade e fins de autenticação.
[008] Apesar desses avanços recentes, havia uma ausência de análise sistemática suficiente para o objetivo de melhoramento de precisão de plantas de canábis para uso medicinal. Permanece, portanto, uma necessidade urgente por melhoramento sistemático e seleção de variedades aprimoradas de canábis que compreendem um perfil canabinóide enriquecido para canabinóides específicos que as tornam adequadas para uso terapêutico.
SUMÁRIO
[009] Em um aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecida uma planta de canábis, ou uma parte desta, que compreende um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total, em que o perfil canabinóide compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), em que o THC total compreende Δ-9-tetrahidrocanabinol (THC) e ácido Δ-9- tetrahidrocanabinólico (THCA), em que o CBG total compreende canabigerol (CBG) e ácido canabigerólico (CBGA); e em que o nível de THC total e CBG total (THC + CBG) é maior do que o nível de um canabinóide de referência selecionado do grupo que consiste em: (i) CBD total, em que o CBD total compreende canabidiol (CBD) e ácido canabidiólico (CBDA); (ii) CBC total, em que o CBC total compreende canabicromeno (CBC) e ácido canabicromênico (CBCA);
(iii) CBN total, em que o CBN total compreende canabinol (CBN) e ácido canabinólico (CBNA); e (iv) THCV total, em que o THCV total compreende tetrahidrocanabivarina (THCV) e ácido tetrahidrocanabivarínico (THCVA).
[0010] A presente revelação também se estende às sementes produzidas pela planta de canábis, e plantas delas derivadas.
[0011] Em outro aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecida uma cultura de tecido de células regeneráveis derivadas da planta de canábis, como descrito nesse relatório descritivo, e plantas geradas a partir delas. Em uma modalidade, a planta expressa as características morfológicas e fisiológicas da planta de canábis como descrito nesse relatório descritivo.
[0012] Em outro aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecido um método para a produção de uma planta de canábis híbrida F1 com o uso de técnicas de melhoramento de plantas que empregam a planta de canábis descrita nesse relatório descritivo, ou uma parte desta, como uma fonte de melhoramento de plantas material. A presente revelação também se estende às plantas da prole e sementes produzidas por uma planta de canábis híbrida F1, como descrito nesse relatório descritivo.
[0013] Em outro aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecido um método para a produção de uma planta de canábis que compreende a transfecção da planta de canábis descrita nesse relatório descritivo, ou uma parte desta, com uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga para introduzir uma ou mais substituições, deleções ou adições de ácidos nucleicos no genoma da planta de canábis, como descrito acima. A revelação também se estende às plantas da prole e partes de plantas como, por exemplo, sementes, que são produzidas por uma planta de canábis transgênica que resulta do método revelado nesse relatório descritivo.
[0014] Em outro aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecido um método de produção de um extrato que compreende canabinóides de uma planta de canábis que compreende a colheita do material de planta da planta de canábis descrita nesse relatório descritivo, a secagem pelo menos parcial do material de planta colhido e a extração de canabinóides do material de planta pelo menos parcialmente seco produzindo, dessa forma, um extrato que compreende canabinóides.
[0015] Em outro aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecido um extrato derivado da planta de canábis descrita nesse relatório descritivo, ou parte desta, em que o extrato compreende um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total, em que o perfil canabinóide compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), e em que o nível de THC total e CBG total (THC + CBG) é maior do que o nível de um canabinóide de referência selecionado do grupo que consiste em: CBD total, CBC total, CBN total e THCV total.
[0016] Em outro aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecido um extrato enriquecido em THC total e CBG total derivado da planta de canábis descrita nesse relatório descritivo, ou de uma parte desta, em que o extrato compreende THC total, CBG total, e um ou mais canabinóides menores selecionados do grupo que consiste em: CBD total,
CBC total, CBN total, THCV total, CBL total e Δ8-THC total, em que o extrato compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), e em que o nível dos (um ou mais) outros canabinóides é de cerca de 0,01% até cerca de 10% por peso do teor total de canabinóide do extrato.
[0017] Em outro aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecido um método para a seleção de uma planta de canábis que compreende um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total de diversas plantas de canábis diferentes, o método compreendendo: (a) a colheita do material de planta de diversas plantas de canábis diferentes; (b) a secagem pelo menos parcial do material de planta colhido da etapa (a); (c) a medição no material de planta pelo menos parcialmente seco da etapa (b) de um nível de THC total, CBG total e um ou mais canabinóides de referência selecionados do grupo que consiste em THCV, CBDV, CBN, CBD, CBC, THCVA, CBDVA, CBNA, CBDA e CBCA, para gerar um perfil canabinóide para cada uma das diversas plantas de canábis; e (d) com base nas medições da etapa (c), a seleção entre as diversas plantas de canábis diferentes de uma planta de canábis que compreende um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total e que compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), em que o THC total compreende THC e THCA, em que o CBG total compreende CBG e CBGA, e em que o nível de THC total e CBG total (THC + CBG) é maior do que o nível de um canabinóide de referência selecionado do grupo que consiste em: (i) CBD total, em que o CBD total compreende CBD e CBDA; (ii) CBC total, em que o CBC total compreende CBC e CBCA; (iii) CBN total, em que o CBN total compreende CBN e CBNA; e (iv) THCV total, em que o THCV total compreende THCV e THCVA.
[0018] Em outro aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecido um método para a seleção de diversas plantas de canábis diferentes, uma planta de canábis que compreende um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total de diversas plantas de canábis diferentes, o método compreendendo: (a) a colheita do material de planta de diversas plantas de canábis diferentes; (b) a secagem pelo menos parcial do material de planta colhido da etapa (a); (c) a medição no material de planta pelo menos parcialmente seco da etapa (b) de um nível de THC total, CBG total e um ou mais canabinóides de referência selecionados do grupo que consiste em THCV, CBDV, CBN, CBD, CBC, THCVA, CBDVA, CBNA, CBDA e CBCA, para gerar um perfil canabinóide para cada uma das diversas plantas de canábis; (d) a medição no material de planta pelo menos parcialmente seco da etapa (b) de um nível de mirceno e um nível de β-pineno para gerar um perfil de terpeno para cada uma das diversas plantas de canábis; e (e) com base nas medições da etapa (c) e etapa (d), a seleção entre as diversas plantas de canábis diferentes de uma planta de canábis que compreende (i) um perfil de terpeno no qual o mirceno está presente em uma proporção de cerca de 60:1 e cerca de 1:1 para o nível de β-pineno e (ii) um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total e que compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), em que o THC total compreende THC e THCA, em que o CBG total compreende CBG e CBGA, e em que o nível de THC total e CBG total (THC + CBG) é maior do que o nível de um canabinóide de referência selecionado do grupo que consiste em: (i) CBD total, em que o CBD total compreende CBD e CBDA; (ii) CBC total, em que o CBC total compreende CBC e CBCA; (iii) CBN total, em que o CBN total compreende CBN e CBNA; e (iv) THCV total, em que o THCV total compreende THCV e THCVA.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0019] A Figura 1 mostra a intensidade relativa de CBDA e THCA em plantas de canábis com um perfil canabinóide enriquecido em THC total e CBG total.
[0020] A Figura 2 mostra o teor de canabinóide em plantas de canábis com um perfil canabinóide enriquecido em THC total e CBG total. (A) Uma representação gráfica da quantificação do teor de canabinóide (eixo-y; mg/g) contra canabinóide (eixo-x), incluindo de THCA, para as cepas Canábis-32, Canábis-34, Canábis-35, Canábis-36, Canábis-37, Canábis-38 e Canábis-39. (B) Uma representação gráfica da quantificação do teor de canabinóide menor (eixo-y; mg/g) contra canabinóide, excluindo de THCA, para as cepas Canábis-32,
Canábis-34, Canábis-35, Canábis-36, Canábis-37, Canábis-38 e Canábis-39.
[0021] A Figura 3 mostra o teor de canabinóide em plantas de canábis com um perfil canabinóide enriquecido em THC total e CBG total. (A) Uma representação gráfica da quantificação do teor de canabinóide (eixo-y; mg/g) contra canabinóide (eixo-x), incluindo de THCA, para as cepas Canábis-40, Canábis-41, Canábis-42, Canábis-43, Canábis-44, Canábis-45, Canábis-46, Canábis-47 e Canábis-48. (B) Uma representação gráfica da quantificação do teor de canabinóide menor (eixo- y; mg/g) contra canabinóide, excluindo de THCA, para as cepas Canábis-40, Canábis-41, Canábis-42, Canábis-43, Canábis-44, Canábis-45, Canábis-46, Canábis-47 e Canábis-48.
[0022] A Figura 4 mostra o teor de canabinóide em plantas de canábis com um perfil canabinóide enriquecido em THC total e CBG total. (A) Uma representação gráfica da quantificação do teor de canabinóide (eixo-y; mg/g) contra canabinóide (eixo-x), incluindo de THCA, para as cepas Canábis-49, Canábis-50, Canábis-51, Canábis-52, Canábis-53, Canábis-54, Canábis-55, Canábis-56 e Canábis-57. (B) Uma representação gráfica da quantificação do teor de canabinóide menor (eixo- y; mg/g) contra canabinóide, excluindo de THCA, para as cepas Canábis-49, Canábis-50, Canábis-51, Canábis-52, Canábis-53, Canábis-54, Canábis-55, Canábis-56 e Canábis-57.
[0023] A Figura 5 mostra uma representação gráfica do teor de terpeno (eixo-y; contagens vs. tempo de aquisição (min)) contra abundância relativa (eixo-x) em uma planta de canábis. (B-G) Uma representação gráfica do teor de terpeno (terpeno; eixo-x) contra área de pico (contagens; eixo-y) para as cepas Canábis-31, Canábis-32, Canábis-34, Canábis-
35, Canábis-36, Canábis-37, Canábis-38, Canábis-39, Canábis- 40, Canábis-41, Canábis-42, Canábis-43, Canábis-44, Canábis- 45, Canábis-46, Canábis-47, Canábis-48, Canábis-49, Canábis- 50, Canábis-51, Canábis-52, Canábis-53, Canábis-54, Canábis- 55, Canábis-56, Canábis-57, Canábis-58 e Canábis-59.
[0024] A Figura 6 mostra a distribuição do teor de terpeno em plantas de canábis. (A) Análise de componente principal (PCA) do teor de terpeno através de plantas de canábis, Pontuações de PCA em PC1 (eixo-x; 69,48%) contra Pontuações de PCA em PC2 (eixo-y; 16,62%). (B) Terpenos em abundância alta através de plantas de canábis, como determinado por PCA, PCA1 (eixo-y; 69,48%) contra variável (eixo-x).
[0025] A Figura 7 mostra a abundância relativa (eixo-y; área de pico) de (A) β-pineno e (B) mirceno em plantas de canábis diferentes.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0026] Ao longo desse relatório descritivo, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra “compreender”, ou variações como, por exemplo, “compreende” ou “que compreende”, será subentendida como implicando a inclusão de um elemento estabelecido ou número inteiro ou grupo de elementos ou números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro elemento ou número inteiro ou grupo de elementos ou números inteiros.
[0027] A referência nesse relatório descritivo a qualquer publicação prévia (ou informação dela derivada), ou a qualquer tema que é conhecido, não é, e não deve ser, considerada como reconhecimento ou admissão ou qualquer forma de sugestão de que aquela publicação prévia (ou informação dela derivada) ou tema conhecido forma parte do conhecimento geral comum no campo de empenho ao qual esse relatório descritivo está relacionado.
[0028] Salvo quando especificamente definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados nesse relatório descritivo devem assumir os mesmos significados que comumente compreendidos por aqueles habilitados na técnica.
[0029] Exceto quando indicado, as técnicas de biologia molecular, cultura de células, laboratoriais, de melhoramento e seleção de plantas utilizadas no presente relatório descritivo são procedimentos padronizados, bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Essas técnicas são descritas e explicadas por toda a literatura em fontes como, por exemplo, J. Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley e Sons (1984), J. Sambrook e cols., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), “Essential Molecular Biology: A Practical Approach”, Volumes 1 e 2, IRL Press (1991), D.M. Glover e B.D. Hames (editores), “DNA Cloning: A Practical Approach”, Volumes 1-4, IRL Press (1995 e 1996), e F.M. Ausubel e cols. (editores), “Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Pub. Associates e Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o presente); Janick, J. (2001) “Plant Breeding Reviews”, John Wiley & Sons, página 252; Jensen, N.F. ed. (1988) “Plant Breeding Methodology”, John Wiley & Sons, página 676, Richard, A.J. ed. (1990) “Plant Breeding Systems”, Unwin Hyman, página 529; Walter, F.R. ed. (1987) “Plant Breeding”, Vol. I “Theory and Techniques”, MacMillan Pub. Co.; Slavko,
B. ed. (1990) “Principles and Methods of Plant Breeding”, Elsevier, página 386; e Allard, R.W. ed. (1999) “Principles of Plant Breeding”, John-Wiley & Sons, página 240. “The ICAC Recorder”. Vol. XV Nº 2: 3-14; todos incorporados por referência. Acredita-se que os procedimentos descritos sejam bem conhecidos na técnica e sejam fornecidos para a conveniência do leitor. Todas as outras publicações mencionadas nesse relatório descritivo também são incorporadas por referência em sua totalidade.
[0030] Como usadas no presente relatório descritivo, as formas no singular “a”, “o”, “uma” e “um” incluem aspectos no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Dessa forma, por exemplo, referência a “uma planta” inclui uma única planta, bem como duas ou mais plantas; referência a “uma inflorescência” inclui uma única inflorescência, bem como duas ou mais inflorescências; e assim por diante.
[0031] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “e/ou” se refere e engloba qualquer uma e todas as combinações possíveis de um ou mais dos itens listados associados, bem como a ausência de combinações, quando interpretado na alternativa (ou).
[0032] A presente revelação se baseia, pelo menos em parte, no achado inesperado dos inventores de que pode ser gerada uma planta de canábis que compreende um perfil canabinóide enriquecido para THC total (ou seja, THC e THCA) e CBG total (ou seja, CBG e CBGA).
[0033] Portanto, em um aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecida uma planta de canábis, ou uma parte desta, que compreende um perfil canabinóide enriquecido para
THC total e CBG total, em que o perfil canabinóide compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), em que o THC total compreende Δ-9-tetrahidrocanabinol (THC) e ácido Δ-9- tetrahidrocanabinólico (THCA), em que o CBG total compreende canabigerol (CBG) e ácido canabigerólico (CBGA); e em que o nível de THC total e CBG total (THC + CBG) é maior do que o nível de um canabinóide de referência selecionado do grupo que consiste em: (a) CBD total, em que o CBD total compreende canabidiol (CBD) e ácido canabidiólico (CBDA); (b) CBC total, em que o CBC total compreende canabicromeno (CBC) e ácido canabicromênico (CBCA); (c) CBN total, em que o CBN total compreende canabinol (CBN) e ácido canabinólico (CBNA); e (d) THCV total, em que o THCV total compreende tetrahidrocanabivarina (THCV) e ácido tetrahidrocanabivarínico (THCVA). Canábis
[0034] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “planta de canábis” significa uma planta do gênero Cannabis, cujos exemplos ilustrativos incluem Cannabis sativa, Cannabis indica e Cannabis ruderalis. Cannabis é uma erva anual ereta com um sistema de reprodução dióica, embora existam plantas monóicas. Formas selvagens e cultivadas de cannabis são morfologicamente variáveis, o que resulta em uma dificuldade na definição da organização taxonômica do gênero. Em uma modalidade, a planta de canábis é C. sativa.
[0035] Os termos “planta”, “cultivar”, “variedade”, “cepa” ou “raça” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo para se referirem a uma planta ou a um grupo de plantas similares de acordo com suas características estruturais e desempenho (ou seja, características morfológicas e fisiológicas).
[0036] O genoma de referência para C. sativa no rascunho do genoma e transcriptoma montado de “Purple Kush” ou “PK” (van Bakal e cols. 2011, Genome Biology, 12: R102). C. sativa possui um genoma diplóide (2n = 20) com um cariótipo que compreende nove autossomos e um par de cromossomos sexuais (X e Y). Plantas-fêmea são homogaméticas (XX) e plantas- macho heterogaméticas (XY), com determinação sexual controlada por um sistema de equilíbrio X-para-autossomo. O tamanho estimado do genoma haplóide é de 818 Mb para plantas- fêmea e de 843 Mb para plantas-macho.
[0037] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “parte” se refere a qualquer parte da planta, cujos exemplos ilustrativos incluem um embrião, um broto, uma gema, uma raiz, um caule, uma semente, uma estípula, uma folha, uma pétala, uma inflorescência, um óvulo, uma bráctea, um tricoma, um ramo, um pecíolo, um internódio, casca, uma pubescência, um perfilho, um rizoma, uma folhagem, um limbo, pólen e estame. O termo “parte” também inclui qualquer material listado na “Tabela de Código de Partes de Plantas” como aprovada pelo “Australian Therapeutic Goods Administration” (TGA) “Business Services” (TBS). Em uma modalidade, a parte é selecionada do grupo que consiste em um embrião, um broto, uma gema, uma raiz, um caule, uma semente, uma estípula, uma folha, uma pétala, uma inflorescência, um óvulo, uma bráctea, um tricoma, um ramo, um pecíolo, um internódio, casca, uma pubescência, um perfilho, um rizoma, uma folhagem, um limbo, pólen e estame. Em uma modalidade preferida, a parte é uma gema de canábis. Canabinóides
[0038] O termo “canabinóide”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma família de compostos terpeno- fenólicos, dos quais sabe-se que existem na natureza mais do que 100 compostos. Canabinóides serão conhecidos por aqueles habilitados na técnica, cujos exemplos ilustrativos são fornecidos na Tabela 3, abaixo, incluindo formas ácidas e descarboxiladas destes.
Tabela 1. Canabinóides e suas propriedades. Propriedades químicas/ [M+H]+ Nome Estrutura
ESI MS Δ9-Tetrahidrocanabinol Psicoativo, produto da (THC) descarboxilação de THCA m/z 315,2319 Ácido Δ9- m/z 359,2217 tetrahidrocanabinólico (THCA) Canabidiol (CBD) Produto da descarboxilação de CH3
CBDA
OH m/z 315,2319 H2C HO CH3 H3C
Propriedades químicas/ [M+H]+ Nome Estrutura
ESI MS Ácido canabidiólico m/z 359,2217 (CBDA) Canabigerol (CBG) Não-intoxicante, produto da descarboxilação de CBGA m/z 317,2475 Ácido canabigerólico m/z 361,2373 (CBGA) Canabicromeno (CBC) Não-psicotrópico, converte em canabiciclol mediante a exposição à luz m/z 315,2319
Propriedades químicas/ [M+H]+ Nome Estrutura
ESI MS Ácido de canabicromeno m/z 359,2217 (CBCA) Canabiciclol (CBL) Não-psicoativo, 16 isômeros conhecidos, derivado da conversão não enzimática de
CBC m/z 315,2319 Canabinol (CBN) Provavelmente produto da degradação de THC m/z 311,2006
Propriedades químicas/ [M+H]+ Nome Estrutura
ESI MS Ácido canabinólico (CBNA) m/z 355,1904 Tetrahidrocanabivarina Produto da descarboxilação de (THCV) THCVA m/z 287,2006 Ácido m/z 331,1904 tetrahidrocanabivarínico (THCVA)
Propriedades químicas/ [M+H]+ Nome Estrutura
ESI MS Canabidivarina (CBDV) m/z 287,2006 Ácido canabidivarínico m/z 331,1904 (CBDVA) Δ8-Tetrahidrocanabinol m/z 315,2319 (d8-THC)
[0039] Canabinóides são sintetizados em plantas de canábis como ácidos carboxílicos. Embora alguma descarboxilação possa ocorrer na planta, a descarboxilação tipicamente ocorre pós-colheita e é aumentada por exposição do material de planta ao calor (Sanchez e Verpoote, 2008, Plant Cell Physiology, 49 (12): 1.767-82). A descarboxilação é normalmente obtida por secagem e/ou aquecimento do material de planta. Aqueles habilitados na técnica estariam familiarizados com métodos pelos quais a descarboxilação de canabinóides pode ser promovida, cujos exemplos ilustrativos incluem secagem ao ar, combustão, vaporização, cura, aquecimento e cozimento. Perfil canabinóide
[0040] O termo “perfil canabinóide” se refere a uma representação do tipo, quantidade, nível, razão e/ou proporção de canabinóides que estão presentes na planta de canábis ou parte desta, como tipicamente medidos dentro de material de planta derivado da planta ou parte, incluindo um extrato desta.
[0041] O termo “enriquecido” é usado nesse relatório descritivo para se referir a um nível seletivamente maior de um ou mais canabinóides na planta de canábis ou parte desta. Por exemplo, um perfil canabinóide enriquecido para CBD total se refere ao material de planta no qual a quantidade de CBD total (CBD total e CBDA total) é maior do que a quantidade de qualquer um dos outros canabinóides que também podem estar presentes (incluindo presentes constitutivamente) no material de planta.
[0042] O perfil canabinóide em uma planta de canábis tipicamente compreenderá predominantemente a forma ácida dos canabinóides, mas também pode compreender algumas formas descarboxiladas (neutras) destes, em várias concentrações ou níveis em certo momento (ou seja, na propagação, crescimento, colheita, secagem, cura etc.). Dessa forma, o termo “canabinóide total” é usado nesse relatório descritivo para se referir à forma descarboxilada e à forma ácida do referido canabinóide. Por exemplo, “CBD total” se refere ao CBD e CBDA, “THC total” se refere ao THC e THCA, “CBC total” se refere ao CBC e CBCA, “CBG total” se refere ao CBG e CBGA, “CBN total” se refere ao CBN e CBNA, “THCV total” se refere ao THCV e THCVA, “CBDV total” se refere ao CBDV e CBDVA, e assim por diante.
[0043] Os termos “nível”, “teor”, “concentração” e semelhantes, são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo para descrever uma quantidade do composto referenciado, e podem ser representados em termos absolutos (por exemplo, mg/g, mg/ml etc.) ou em termos relativos, por exemplo, uma proporção para qualquer um ou todos os outros compostos no material de planta de canábis ou como uma percentagem da quantidade (por exemplo, por peso, área de pico etc.) de qualquer um ou todos os outros compostos no material de planta de canábis.
[0044] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “material de planta” deve ser entendido como significando qualquer parte da planta de canábis, incluindo as folhas, caules, raízes e inflorescência, ou partes destes, como descrito em outro local nesse relatório descritivo, bem como extratos, cujos exemplos ilustrativos incluem kief ou haxixe, que inclui tricomas e glândulas. Em uma modalidade, o material de planta é inflorescência feminina.
[0045] O termo “inflorescência”, como usado nesse relatório descritivo, significa a cabeça da flor completa da planta de canábis, que compreende, talos, brácteas, flores e tricomas (ou seja, tricomas glandulares, sésseis e estaqueados).
[0046] “Ácido Δ-9-tetrahidrocanabinólico” ou “THCA” também é sintetizado a partir do precursor CBGA por THCA sintase. A forma neutra “Δ-9-tetrahidrocanabinol” está associada com os efeitos psicoativos de canábis, que são primariamente mediados por sua ativação de receptores CB1 acoplados à proteína G, o que resulta em uma diminuição na concentração de AMP cíclico (cAMP) por meio da inibição de adenilato ciclase. THC também exibe atividade agonista parcial nos receptores canabinóides CB1 e CB2. CB1 está principalmente associado com o sistema nervoso central, enquanto CB2 é expresso predominantemente nas células do sistema imune. Como resultado, THC também está associado com alívio da dor, relaxamento, fadiga, estimulação do apetite, e alteração dos sentidos visual, auditório e olfatório. Além disso, estudos mais recentes indicaram que THC medeia uma ação anticolinesterase, o que pode sugerir seu uso para o tratamento de doença de Alzheimer e miastenia (Eubanks e cols., 2006, Molecular Pharmaceuticals, 3 (6): 773-7).
[0047] Em uma modalidade, o nível de THC total é pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 81%, preferivelmente pelo menos 82%, preferivelmente pelo menos 83%, preferivelmente pelo menos 84%, preferivelmente pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 86%, preferivelmente pelo menos 87%, preferivelmente pelo menos 88%, preferivelmente pelo menos 89%, preferivelmente pelo menos 90%,
preferivelmente pelo menos 91%, preferivelmente pelo menos 92%, preferivelmente pelo menos 93%, preferivelmente pelo menos 94%, preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 96%, preferivelmente pelo menos 97%, preferivelmente pelo menos 98% ou, mais preferivelmente, pelo menos 99% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
[0048] “Ácido canabigerólico” ou “CBGA” é o precursor comum tanto de THCA quanto de ácido canabidiólico” ou “CBDA”. Sua forma neutra, “canabigerol” ou “CBG”, possui efeito agonista relativamente fraco sobre os receptores CB1 e CB2. No entanto, CBG atua como um inibidor da captação de AEA, agonista do adrenoceptor α-2 e um antagonista moderado de 5- HT1A. Como resultado, CBG foi sugerido para uso como um sedativo, antiinflamatório, antiansiedade, antináusea, antipsicótico atípico, antifúngico e como um tratamento de câncer.
[0049] Em uma modalidade, o nível de CBG total é pelo menos 1%, preferivelmente pelo menos 2%, preferivelmente pelo menos 3%, preferivelmente pelo menos 4%, preferivelmente pelo menos 5%, preferivelmente pelo menos 6%, preferivelmente pelo menos 7%, preferivelmente pelo menos 9% ou, mais preferivelmente, pelo menos 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
[0050] Em uma modalidade, THC total e CBG total estão presentes em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1, preferivelmente de cerca de 6:1 até cerca de 50:1, preferivelmente de cerca de 7:1 até cerca de 50:1, preferivelmente de cerca de 8:1 até cerca de 50:1,
preferivelmente de cerca de 9:10 até cerca de 50:1 ou, mais preferivelmente, de cerca de 10:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG).
[0051] A planta de canábis descrita nesse relatório descritivo compreende material de planta que compreende um perfil canabinóide que é caracterizado por níveis elevados de THC total, mas também possui níveis relativamente elevados de CBG total. Consequentemente, a planta de canábis da presente revelação pode ser variadamente descrita como “THC elevado/CBG elevado”, “THC/CBG elevado”, “enriquecida em THC/CBD” e semelhantes. Aqueles habilitados na técnica compreenderiam essa terminologia como significando uma planta de canábis que produziu níveis maiores de THC e THCA e CBG e CBGA em relação ao nível de outros canabinóides, por exemplo, CBD e CBDA.
[0052] Os canabinóides de referência revelados nesse relatório descritivo podem ser alternativamente descritos como “canabinóides menores” ou “canabinóides secundários”.
[0053] Foi demonstrado que canabinóides menores exibem propriedades medicinais únicas. Por exemplo, CBDV recebeu designação órfã pela “European Medicines Agency” para uso no tratamento de Síndrome de Rhett e Síndrome do X Frágil (EU/3/17/1921). THCV também foi reconhecido como novo tratamento potencial contra intolerância à glicose associada à obesidade (Wargent e cols., 2013, Nutrition & Diabetes, 3: e68). As aplicações terapêuticas de outros canabinóides menores, por exemplo, CBC, CBG e CBN, também foram revisadas, por exemplo, por Izzo e cols. (2009, Trends in Pharmacological Sciences, 30 (10): 515-527) e Morabito e cols. (2013, Current Addiction Reports, 3 (2): 230-238).
[0054] Em uma modalidade, o canabinóide de referência é CBD total. Em outra modalidade, THC total e CBG total (THC + CBG) estão presentes em uma proporção de cerca de 50:1 até cerca de 500:1 para o nível de CBD total, preferivelmente de cerca de 50:1 até cerca de 490:1, preferivelmente de cerca de 50:1 até cerca de 480:1, preferivelmente de cerca de 50:1 até cerca de 470:1, preferivelmente de cerca de 50:1 até cerca de 460:1, preferivelmente de cerca de 50:1 até cerca de 450:1, preferivelmente de cerca de 50:1 até cerca de 440:1, preferivelmente de cerca de 50:1 até cerca de 430:1, preferivelmente de cerca de 50:1 até cerca de 420:1, preferivelmente de cerca de 50:1 até cerca de 410:1, preferivelmente cerca de 50:1 até cerca de 400:1, preferivelmente de cerca de 60:1 até 500:1, preferivelmente de cerca de 70:1 até 500:1, preferivelmente de cerca de 80:1 até 500:1, preferivelmente de cerca de 90:1 até cerca de 500:1 ou, mais preferivelmente, de cerca de 100:1 até cerca de 400:1 (THC + CBG: CBD).
[0055] Em outra modalidade, o nível de CBD total é de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 1% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até 1% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
[0056] Em uma modalidade, o canabinóide de referência é
CBC total. Em outra modalidade, THC + CBG estão presentes em uma proporção de cerca de 10:1 até cerca de 120:1 para o nível de CBC total, preferivelmente de cerca de 11:1 até cerca de 120:1, preferivelmente de cerca de 12:1 até cerca de 120:1, preferivelmente de cerca de 13:1 até cerca de 120:1, preferivelmente de cerca de 14:1 até cerca de 120:1, preferivelmente de cerca de 15:1 até cerca de 120:1, preferivelmente de cerca de 10:1 até cerca de 119:1, preferivelmente de cerca de 10:1 até cerca de 118:1, preferivelmente de cerca de 10:1 até cerca de 117:1, preferivelmente de cerca de 10:1 até cerca de 116:1, preferivelmente de cerca de 10:1 até cerca de 115:1 ou, mais preferivelmente, de cerca de 15:1 até cerca de 115:1 (CBD + THC:CBC).
[0057] Em outra modalidade, o nível de CBC total é de cerca de 0,01% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 10% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até cerca de 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
[0058] Em uma modalidade, o canabinóide de referência é CBN total. Em outra modalidade, THC + CBG estão presentes em uma proporção de cerca de 200:1 até cerca de 1.500:1 para o nível de CBN total, preferivelmente de cerca de 200:1 até cerca de 1.400:1 ou, mais preferivelmente, de cerca de 200:1 até cerca de 1.300:1 (CBG + THC:CBN).
[0059] Em outra modalidade, o nível de CBN total é de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,9%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,8%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,7%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,6% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,01% até cerca de 0,5% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
[0060] Em uma modalidade, o canabinóide de referência é THCV total. Em outra modalidade, THC + CBG estão presentes em uma proporção de cerca de 50:1 até cerca de 700:1 para o nível de THCV total, preferivelmente de cerca de 60:1 até cerca de 700:1, preferivelmente de cerca de 70:1 até cerca de 700:1, preferivelmente de cerca de 80:1 até cerca de 700:1, preferivelmente de cerca de 90:1 até cerca de 700:1, preferivelmente de cerca de 50:1 até cerca de 650:1, preferivelmente de cerca de 50:1 até cerca de 600:1, preferivelmente de cerca de 50:1 até cerca de 550:1 ou, mais preferivelmente, de cerca de 90:1 até cerca de 550:1 (CBD + THC:THCV).
[0061] Em outra modalidade, o nível de THCV total é de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 1%,
preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 1% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até cerca de 1% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
[0062] Em uma modalidade, o perfil canabinóide não inclui CBDV total, em que CBDV total compreende canabidivarina (CBDV) e ácido canabidivarínico (CBDVA).
[0063] Em uma modalidade, a planta de canábis compreende: (i) um nível de THC total de pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 81%, preferivelmente pelo menos 82%, preferivelmente pelo menos 83%, preferivelmente pelo menos 84%, preferivelmente pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 86%, preferivelmente pelo menos 87%, preferivelmente pelo menos 88%, preferivelmente pelo menos 89%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 91%, preferivelmente pelo menos 92%, preferivelmente pelo menos 93%, preferivelmente pelo menos 94%, preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 96%, preferivelmente pelo menos 97%, preferivelmente pelo menos 98% ou, mais preferivelmente, pelo menos 99% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; e (ii) um nível de CBG total de pelo menos 1%, preferivelmente pelo menos 2%, preferivelmente pelo menos 3%, preferivelmente pelo menos 4%, preferivelmente pelo menos 5%, preferivelmente pelo menos 6%, preferivelmente pelo menos 7%, preferivelmente pelo menos 9% ou, mais preferivelmente, pelo menos 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; (iii) opcionalmente, um nível de CBD total de cerca de
0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 1% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até 1% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; (iv) opcionalmente, um nível de CBC total de cerca de 0,01% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 10% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até cerca de 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; (v) opcionalmente, um nível de CBN total de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,9%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,8%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,7%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,6% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,01% até cerca de 0,5% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; e
(vi) opcionalmente, um nível de THCV total de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 1% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até cerca de 1% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
[0064] Em uma modalidade, a planta de canábis compreende: (i) um nível de THC total de pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 81%, preferivelmente pelo menos 82%, preferivelmente pelo menos 83%, preferivelmente pelo menos 84%, preferivelmente pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 86%, preferivelmente pelo menos 87%, preferivelmente pelo menos 88%, preferivelmente pelo menos 89%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 91%, preferivelmente pelo menos 92%, preferivelmente pelo menos 93%, preferivelmente pelo menos 94%, preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 96%, preferivelmente pelo menos 97%, preferivelmente pelo menos 98% ou, mais preferivelmente, pelo menos 99% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; e (ii) um nível de CBG total de pelo menos 1%, preferivelmente pelo menos 2%, preferivelmente pelo menos 3%, preferivelmente pelo menos 4%, preferivelmente pelo menos 5%, preferivelmente pelo menos 6%, preferivelmente pelo menos 7%, preferivelmente pelo menos 9% ou, mais preferivelmente, pelo menos 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
[0065] Em uma modalidade, a planta de canábis compreende: (i) um nível de THC total de pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 81%, preferivelmente pelo menos 82%, preferivelmente pelo menos 83%, preferivelmente pelo menos 84%, preferivelmente pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 86%, preferivelmente pelo menos 87%, preferivelmente pelo menos 88%, preferivelmente pelo menos 89%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 91%, preferivelmente pelo menos 92%, preferivelmente pelo menos 93%, preferivelmente pelo menos 94%, preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 96%, preferivelmente pelo menos 97%, preferivelmente pelo menos 98% ou, mais preferivelmente, pelo menos 99% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; (ii) um nível de CBG total de pelo menos 1%, preferivelmente pelo menos 2%, preferivelmente pelo menos 3%, preferivelmente pelo menos 4%, preferivelmente pelo menos 5%, preferivelmente pelo menos 6%, preferivelmente pelo menos 7%, preferivelmente pelo menos 9% ou, mais preferivelmente, pelo menos 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; e (iii) um nível de CBD total de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 1%,
preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 1% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até 1% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
[0066] Em uma modalidade, a planta de canábis compreende: (i) um nível de THC total de pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 81%, preferivelmente pelo menos 82%, preferivelmente pelo menos 83%, preferivelmente pelo menos 84%, preferivelmente pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 86%, preferivelmente pelo menos 87%, preferivelmente pelo menos 88%, preferivelmente pelo menos 89%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 91%, preferivelmente pelo menos 92%, preferivelmente pelo menos 93%, preferivelmente pelo menos 94%, preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 96%, preferivelmente pelo menos 97%, preferivelmente pelo menos 98% ou, mais preferivelmente, pelo menos 99% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; (ii) um nível de CBG total de pelo menos 1%, preferivelmente pelo menos 2%, preferivelmente pelo menos 3%, preferivelmente pelo menos 4%, preferivelmente pelo menos 5%, preferivelmente pelo menos 6%, preferivelmente pelo menos 7%, preferivelmente pelo menos 9% ou, mais preferivelmente, pelo menos 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; (iii) um nível de CBD total de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 1% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até 1% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; e (iv) um nível de CBC total de cerca de 0,01% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 10% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até cerca de 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
[0067] Em uma modalidade, a planta de canábis compreende: (i) um nível de THC total de pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 81%, preferivelmente pelo menos 82%, preferivelmente pelo menos 83%, preferivelmente pelo menos 84%, preferivelmente pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 86%, preferivelmente pelo menos 87%, preferivelmente pelo menos 88%, preferivelmente pelo menos 89%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 91%, preferivelmente pelo menos 92%, preferivelmente pelo menos 93%, preferivelmente pelo menos 94%, preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 96%, preferivelmente pelo menos 97%, preferivelmente pelo menos 98% ou, mais preferivelmente, pelo menos 99% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; (ii) um nível de CBG total de pelo menos 1%, preferivelmente pelo menos 2%, preferivelmente pelo menos 3%, preferivelmente pelo menos 4%, preferivelmente pelo menos 5%, preferivelmente pelo menos 6%, preferivelmente pelo menos 7%, preferivelmente pelo menos 9% ou, mais preferivelmente, pelo menos 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; (iii) um nível de CBD total de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 1% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até 1% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; (iv) um nível de CBC total de cerca de 0,01% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 10%,
preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 10% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até cerca de 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; e (v) um nível de CBN total de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,9%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,8%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,7%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,6% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,01% até cerca de 0,5% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
[0068] Em uma modalidade, a planta de canábis compreende: (i) um nível de THC total de pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 81%, preferivelmente pelo menos 82%, preferivelmente pelo menos 83%, preferivelmente pelo menos 84%, preferivelmente pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 86%, preferivelmente pelo menos 87%, preferivelmente pelo menos 88%, preferivelmente pelo menos 89%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 91%, preferivelmente pelo menos 92%, preferivelmente pelo menos 93%, preferivelmente pelo menos 94%, preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 96%, preferivelmente pelo menos 97%, preferivelmente pelo menos 98% ou, mais preferivelmente, pelo menos 99% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta;
(ii) um nível de CBG total de pelo menos 1%, preferivelmente pelo menos 2%, preferivelmente pelo menos 3%, preferivelmente pelo menos 4%, preferivelmente pelo menos 5%, preferivelmente pelo menos 6%, preferivelmente pelo menos 7%, preferivelmente pelo menos 9% ou, mais preferivelmente, pelo menos 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; (iii) um nível de CBD total de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 1% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até 1% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; (iv) um nível de CBC total de cerca de 0,01% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 10% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até cerca de 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; e
(v) um nível de CBN total de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,9%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,8%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,7%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,6% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,01% até cerca de 0,5% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
[0069] Em uma modalidade, a planta de canábis compreende: (i) um nível de THC total de pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 81%, preferivelmente pelo menos 82%, preferivelmente pelo menos 83%, preferivelmente pelo menos 84%, preferivelmente pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 86%, preferivelmente pelo menos 87%, preferivelmente pelo menos 88%, preferivelmente pelo menos 89%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 91%, preferivelmente pelo menos 92%, preferivelmente pelo menos 93%, preferivelmente pelo menos 94%, preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 96%, preferivelmente pelo menos 97%, preferivelmente pelo menos 98% ou, mais preferivelmente, pelo menos 99% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; (ii) o nível de CBG total de pelo menos 1%, preferivelmente pelo menos 2%, preferivelmente pelo menos 3%, preferivelmente pelo menos 4%, preferivelmente pelo menos 5%, preferivelmente pelo menos 6%, preferivelmente pelo menos 7%, preferivelmente pelo menos 9% ou, mais preferivelmente, pelo menos 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta;
(iii) um nível de CBD total de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 1% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até 1% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; (iv) um nível de CBC total de cerca de 0,01% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 10% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até cerca de 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; (v) um nível de CBN total de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,9%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,8%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,7%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,6% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,01% até cerca de 0,5% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; e (vi) um nível de THCV total de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 1% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até cerca de 1% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
[0070] Em uma modalidade, a planta de canábis compreende: (i) um nível de THC total de pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 81%, preferivelmente pelo menos 82%, preferivelmente pelo menos 83%, preferivelmente pelo menos 84%, preferivelmente pelo menos 85%, preferivelmente pelo menos 86%, preferivelmente pelo menos 87%, preferivelmente pelo menos 88%, preferivelmente pelo menos 89%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 91%, preferivelmente pelo menos 92%, preferivelmente pelo menos 93%, preferivelmente pelo menos 94%, preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 96%, preferivelmente pelo menos 97%, preferivelmente pelo menos 98% ou, mais preferivelmente, pelo menos 99% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; e/ou (ii) o nível de CBG total de pelo menos 1%, preferivelmente pelo menos 2%, preferivelmente pelo menos
3%, preferivelmente pelo menos 4%, preferivelmente pelo menos 5%, preferivelmente pelo menos 6%, preferivelmente pelo menos 7%, preferivelmente pelo menos 9% ou, mais preferivelmente, pelo menos 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; e/ou (iii) um nível de CBD total de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 1% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até 1% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; e/ou (iv) um nível de CBC total de cerca de 0,01% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 10%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 10% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até cerca de 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; e/ou (v) um nível de CBN total de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,9%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,8%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,7%, preferivelmente de cerca de 0,01% até cerca de 0,6% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,01% até cerca de 0,5% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta; e/ou (vi) um nível de THCV total de cerca de 0,01% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,02% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,03% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,04% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,05% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,06% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,07% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,08% até cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,09% até cerca de 1% ou, mais preferivelmente, de cerca de 0,1% até cerca de 1% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
[0071] Como observado em outro local nesse relatório descritivo, os inventores demonstraram surpreendentemente que a planta de canábis descrita nesse relatório descritivo compreende um perfil canabinóide enriquecido em THC e CBG. Isso é inesperado, pois CBG é um canabinóide de abundância relativamente baixa, particularmente quando comparado com outros canabinóides importantes, por exemplo, CBD.
[0072] Em outro aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecida uma semente da planta de canábis descrita nesse relatório descritivo. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “semente” se refere às sementes imaturas que estão sendo desenvolvidas in planta. De acordo com outro aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecida uma planta de canábis, ou uma parte desta, que é produzida a partir da semente.
[0073] Em outro aspecto, é fornecida uma semente das plantas de canábis descritas nesse relatório descritivo. Como usado nesse relatório descritivo, o termo “semente” se refere às sementes imaturas que estão sendo desenvolvidas in planta. De acordo com outro aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecida uma planta da prole, ou uma parte desta, que é produzida a partir da semente. Terpenos
[0074] O termo “terpeno”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma classe de compostos orgânicos de hidrocarboneto, que são produzidos por diversas plantas. Plantas de canábis produzem e acumulam diferentes terpenos, por exemplo, monoterpenos e sesquiterpenos, nos tricomas glandulares da inflorescência feminina. O termo “terpeno” inclui “terpenóides” ou “isoprenóides”, que são terpenos modificados que contêm grupos funcionais adicionais.
[0075] Terpenos são responsáveis por boa parte do odor de flores de canábis e contribuem para as qualidades de sabor únicas de produtos de canábis. Terpenos serão conhecidos aqueles habilitados na técnica, cujos exemplos ilustrativos são fornecidos na Tabela 2. Tabela 2. Terpenos e suas propriedades.
Número de Nome Estrutura massa/carga (m/z)* α-Felandreno m/z 93,0 α-Pineno (+/-) m/z 93,0
Canfeno m/z 93,0 β-Pineno (+/-) m/z 93,0
Mirceno m/z 93,0
Limoneno m/z 68,1
3-Careno
Número de Nome Estrutura massa/carga (m/z)* Eucaliptol m/z 81,0 γ-Terpineno m/z 93,1
Linalool m/z 93,0 γ-Elemeno m/z 121,0
Humuleno m/z 93,0
Nerolidol m/z 222,4
Número de Nome Estrutura massa/carga (m/z)* Guaia-3,9- m/z 161,1 dieno Cariofileno m/z 69,2 *O íon molecular não é necessariamente observado para todos os compostos
[0076] A biossíntese de terpeno em plantas tipicamente envolve duas vias para produzir os precursores gerais de 5 carbonos difosfato isoprenóide de todos os terpenos: a via plastidial de fosfato de metileritritol (MEP) e a via citosólica mevalonato (MEV). Essas vias controlam os diferentes pools de substrato disponíveis para terpeno sintases (TPS).
[0077] Foi demonstrado que terpenos exibem propriedades medicinais únicas, como descrito, por exemplo, por Brahmkshatriya e Brahmkshatriya (2013, em Ramawat e Mérillon (eds), Natural Products, Springer, Berlin, Heidelberg). Perfil de terpeno
[0078] O termo “perfil de terpeno”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma representação do tipo, quantidade, nível, razão e/ou proporção de terpenos que estão presentes na planta de canábis ou parte desta, como tipicamente medido dentro de material de planta derivado da planta ou parte de planta, incluindo um extrato dela.
[0079] O perfil de terpeno em uma planta de canábis será determinado com base em fatores genéticos, ambientais e do desenvolvimento; portanto, terpenos particulares podem estar presentes em várias quantidades, níveis, razões e/ou proporções em certo momento (ou seja, na propagação, crescimento, colheita, secagem, cura etc.).
[0080] Em uma modalidade, o perfil de terpeno compreende monoterpenos e sesquiterpenos.
[0081] Monoterpenos consistem em duas unidades de isopreno e podem ser lineares ou conter estruturas de anel. A função primária de monoterpenos é proteger as plantas de infecção por patógenos fúngicos e bacterianos e pragas de insetos. Monoterpenos seriam conhecidos por aqueles habilitados na técnica, cujas modalidades ilustrativas incluem α-felandreno, α-pineno, canfeno, β-pineno, mirceno, limoneno, eucaliptol, γ-terpineno e linalool.
[0082] Sesquiterpenos diferem de outros terpenos comuns, na medida em que contêm uma unidade de isopreno adicional, que cria uma estrutura de 15 carbonos. A função primária de sesquiterpenos é como um feromônio para a gema e flor. Sesquiterpenos seriam conhecidos por aqueles habilitados na técnica, cujas modalidades ilustrativas incluem γ-elemeno, humuleno, nerolidol, guaia-3,9-dieno e cariofileno.
[0083] Em uma modalidade, o perfil de terpeno compreende um nível de monoterpenos que se correlaciona com o nível de THC total. Em uma modalidade preferida, o perfil de terpeno compreende um nível elevado de monoterpenos que se correlaciona com um nível elevado de THC total.
[0084] Em uma modalidade, o perfil de terpeno na planta de canábis compreende terpenos selecionados do grupo que consiste em α-felandreno, α-pineno, canfeno, β-pineno, mirceno, limoneno, eucaliptol, γ-terpineno, linalool, γ- elemeno, humuleno, nerolidol, guaia-3,9-dieno e cariofileno.
[0085] Em uma modalidade preferida, o perfil de terpeno na planta de canábis compreende terpenos selecionados do grupo que consiste em mirceno e β-pineno.
[0086] “Mirceno” é um derivado monoterpenóide de β- pineno. Mirceno foi associado com os efeitos terapêuticos ou medicinais de canábis e foi sugerido para uso como um sedativo, hipnótico, analgésico e relaxante muscular. Foi formulada a hipótese de que mirceno atenua a atividade de outros canabinóides e terpenos como parte do “efeito de entourage” como descrito, por exemplo, em Russo, 2011, British Journal of Pharmacology, 163 (7): 1.344-1.364.
[0087] “β-pineno” é um monoterpeno que é caracterizado por um odor verde amadeirado, do tipo pinho. Foi demonstrado que β-pineno atua como um antisséptico tópico e um broncodilador. β-pineno também é capaz de cruzar a barreira hematencefálica e foi formulada a hipótese de que β-pineno inibe a influência de THC como parte do efeito de entourage, como descrito em outro local nesse relatório descritivo.
[0088] Em uma modalidade, o nível de mirceno está presente em uma proporção de cerca de 100:1 e cerca de 1:1 para o nível de β-pineno. A faixa “de cerca de 100:1 até cerca de 1:1” inclui, por exemplo, 100:1, 99:1, 98:1, 97:1, 96:1, 95:1, 94:1, 93:1, 92:1, 91:1, 90:1, 89:1, 88:1, 87:1, 86:1, 85:1, 84:1, 83:1, 82:1, 81:1, 80:1, 79:1, 78:1, 77:1,
76:1, 75:1, 74:1, 73:1, 72:1, 71:1, 70:1, 69:1, 68:1, 67:1, 66:1, 65:1, 64:1, 63:1, 62:1, 61:1, 60:1, 59:1, 58:1, 57:1, 56:1, 55:1, 54:1, 53:1, 52:1, 51:1, 50:1, 49:1, 48:1, 47:1, 46:1, 45:1, 44:1, 43:1, 42:1, 41:1, 40:1, 39:1, 38:1, 37:1, 36:1, 35:1, 34:1, 33:1, 32:1, 31:1, 30:1, 29:1, 28:1, 27:1, 26:1, 25:1, 24:1, 23:1, 22:1, 21:1, 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1 e 4:1. Dessa forma, em uma modalidade, a proporção do nível de mirceno para o nível de β-pineno é cerca de preferivelmente cerca de 100:1, preferivelmente cerca de 99:1, preferivelmente cerca de 98:1, preferivelmente cerca de 97:1, preferivelmente cerca de 96:1, preferivelmente cerca de 95:1, preferivelmente cerca de 94:1, preferivelmente cerca de 93:1, preferivelmente cerca de 92:1, preferivelmente cerca de 91:1, preferivelmente cerca de 90:1, preferivelmente cerca de 89:1, preferivelmente cerca de 88:1, preferivelmente cerca de 87:1, preferivelmente cerca de 86:1, preferivelmente cerca de 85:1, preferivelmente cerca de 84:1, preferivelmente cerca de 83:1, preferivelmente cerca de 82:1, preferivelmente cerca de 81:1, preferivelmente cerca de 80:1, preferivelmente cerca de 79:1, preferivelmente cerca de 78:1, preferivelmente cerca de 77:1, preferivelmente cerca de 76:1, preferivelmente cerca de 75:1, preferivelmente cerca de 74:1, preferivelmente cerca de 73:1, preferivelmente cerca de 72:1, preferivelmente cerca de 71:1, preferivelmente cerca de 70:1, preferivelmente cerca de 69:1, preferivelmente cerca de 68:1, preferivelmente cerca de 67:1, preferivelmente cerca de 66:1, preferivelmente cerca de 65:1, preferivelmente cerca de
64:1, preferivelmente cerca de 63:1, preferivelmente cerca de 62:1, preferivelmente cerca de 61:1, preferivelmente cerca de 60:1, preferivelmente cerca de 59:1, preferivelmente cerca de 58:1, preferivelmente cerca de 57:1, preferivelmente cerca de 56:1, preferivelmente cerca de 55:1, preferivelmente cerca de 54:1, preferivelmente cerca de 53:1, preferivelmente cerca de 52:1, preferivelmente cerca de 51:1, preferivelmente cerca de 50:1, preferivelmente cerca de 49:1, preferivelmente cerca de 48:1, preferivelmente cerca de 47:1, preferivelmente cerca de 46:1, preferivelmente cerca de 45:1, preferivelmente cerca de 44:1, preferivelmente cerca de 43:1, preferivelmente cerca de 42:1, preferivelmente cerca de 41:1, preferivelmente cerca de 40:1, preferivelmente cerca de 39:1, preferivelmente cerca de 38:1, preferivelmente cerca de 37:1, preferivelmente cerca de 36:1, preferivelmente cerca de 35:1, preferivelmente cerca de 34:1, preferivelmente cerca de 33:1, preferivelmente cerca de 32:1, preferivelmente cerca de 31:1, preferivelmente cerca de 30:1, preferivelmente cerca de 29:1, preferivelmente cerca de 28:1, preferivelmente cerca de 27:1, preferivelmente cerca de 26:1, preferivelmente cerca de 25:1, preferivelmente cerca de 24:1, preferivelmente cerca de 23:1, preferivelmente cerca de 22:1, preferivelmente cerca de 21:1, preferivelmente cerca de 20:1, preferivelmente cerca de 19:1, preferivelmente cerca de 18:1, preferivelmente cerca de 17:1, preferivelmente cerca de 16:1, preferivelmente cerca de 15:1, preferivelmente cerca de 14:1, preferivelmente cerca de 13:1, preferivelmente cerca de 12:1, preferivelmente cerca de 11:1, preferivelmente cerca de 10:1, preferivelmente cerca de 9:1, preferivelmente cerca de 8:1, preferivelmente cerca de 7:1, preferivelmente cerca de 6:1, preferivelmente cerca de 5:1, preferivelmente cerca de 4:1, preferivelmente cerca de 3:1, preferivelmente cerca de 2:1 ou, mais preferivelmente, cerca de 1:1.
[0089] Em uma modalidade, o nível de mirceno está presente em uma proporção de cerca de 60:1 e cerca de 1:1 para o nível de β-pineno. Cultura de tecido
[0090] Em um aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecida uma cultura de tecido de células regeneráveis derivadas da planta de canábis descrita nesse relatório descritivo, ou de uma parte desta. Em outro aspecto, é fornecida uma planta de canábis gerada pela cultura de tecido, em que a planta expressa as características morfológicas e fisiológicas da planta de canábis descrita nesse relatório descritivo.
[0091] Como usada nesse relatório descritivo, a frase “cultura de tecido” se refere a uma população de células ou protoplastos, incluindo calos de planta e grumos de tecido de planta, derivados da planta de canábis descrita nesse relatório descritivo que são mantidos in vitro e dos quais uma planta de canábis adicional pode ser gerada.
[0092] Técnicas adequadas para o estabelecimento de uma cultura de tecido e regeneração de plantas a partir dela serão bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica, cujos exemplos ilustrativos são descritos em Vasil (1984), “Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants”, “Vol. I, II, III Laboratory Procedures and Their Applications”,
Academic Press, Nova York; Green e cols. (1987), “Plant Tissue and Cell Culture”, Academic Press, Nova York; Weissbach e Weissbach (1989), “Methods for Plant Molecular Biology”, Academic Press; Gelvin e cols. (1990), “Plant Molecular Biology Manual”, Kluwer Academic Publishers; e Evans e cols. (1983) “Handbook of Plant Cell Culture”, MacMillian Publishing Company, Nova York.
[0093] Em uma modalidade, a cultura de tecido compreende uma população de células ou protoplasto de uma parte de planta selecionada do grupo que consiste em sementes, folhas, caules, pólen, anteras, óvulos, embriões, preferivelmente cotilédones ou hipocótilos. Em uma modalidade preferida, a população de células ou protoplasto são do escutelo de embriões imaturos, embrião maduro, calo derivado destes, ou tecido meristemático. Técnicas de melhoramento
[0094] Em outro aspecto, é fornecido um método para a produção de uma planta de canábis híbrida F1, o método compreendendo o cruzamento da planta de canábis, como descrita nesse relatório descritivo, com uma planta de canábis diferente para produzir um híbrido F1.
[0095] Apenas como exemplo, a planta de canábis descrita nesse relatório descritivo é cruzada manualmente com outras plantas de canábis. As plantas de “Geração filial 1” ou “F1” resultantes são autofertilizadas e as plantas da geração F2 resultantes, que tipicamente exibirão grande variabilidade por conta da segregação gênica, são plantadas em um campo de seleção. Essas plantas F2 são observadas durante a estação de crescimento para traços fenotípicos como, por exemplo, saúde, crescimento, vigor, tipo da planta, estrutura da planta, tipo de folha, florescência, maturidade e rendimento inflorescente. Plantas F2 com o traço(s) desejável são selecionadas, colhidas, e o inflorescente fêmea analisado para perfil canabinóide. As sementes das plantas F2 selecionadas podem ser limpas e armazenadas. Esse procedimento pode ser repetido, pelo qual as unidades de seleção e testagem aumentam de plantas individuais no F2, para múltiplas plantas que contêm ‘linhagens’ (descendentes de uma planta-mãe) no F5 e o número de unidades diminui de aproximadamente 500 plantas no F2 para 20 linhagens no F5 por seleção de cerca de 10-20% das unidades em cada ciclo de seleção. O tamanho aumentado das unidades, pelo qual mais sementes por unidade estão disponíveis, permite a seleção e testagem em experimentos replicados em mais do que uma localização com um ambiente diferente e uma análise mais extensa e precisa do perfil canabinóide. As linhagens ou variedades candidatas se tornam genotipicamente mais homozigotas e fenotipicamente mais homogêneas por seleção de tipos de plantas similares dentro de uma linhagem e por descarte dos chamados tipos off da geração F2 muito variáveis até a geração F7 ou F8 final. Dependendo dos resultados intermediários, o melhorista de plantas pode decidir variar o procedimento, por exemplo, por aceleração do processo por testagem de uma linhagem particular mais cedo ou por retestagem de uma linhagem. Ele também pode selecionar plantas para cruzamento posterior com plantas parentais existentes ou com outras plantas que resultam do procedimento de seleção atual.
[0096] A planta de canábis e partes desta, como descrita nesse relatório descritivo, incluindo de geração F1 e de gerações subsequentes dela derivadas, pode ainda ser exposta à mutagênese e/ou à seleção assistida por marcador, como é conhecido por aqueles habilitados na técnica, para gerar e/ou selecionar novas plantas com perfis fenotípicos, quimiotípicos e/ou genotípicos desejáveis. Isso pode fornecer plantas de canábis não transgênicas que são livres de moléculas de ácidos nucleicos exógenas evitando, dessa forma, as restrições que, de outro modo, se aplicam a organismos geneticamente modificados (GMO), incluindo plantas, em alguns países/regiões. Tipicamente, uma célula, tecido, semente de planta ou planta progenitora é exposta à mutagênese para produzir mutações pontuais únicas ou múltiplas, por exemplo, substituições, deleções, adições de nucleotídeos e/ou modificação de códon.
[0097] Aqueles habilitados na técnica estarão familiarizados com métodos para a realização de mutagênese em plantas ou partes de plantas, cujos exemplos ilustrativos incluem mutagênese química ou induzida por radiação, por exemplo, EMS ou tratamento de semente com azida de sódio, ou irradiação gama. A mutagênese química tipicamente favorece substituições de nucleotídeos, ao invés de deleções. A irradiação com feixe de íons pesados (HIB) reconhecidamente é uma técnica eficaz para melhoramento de mutação para produzir novos cultivares de plantas. A irradiação com feixe de íons possui dois fatores físicos, a dose (gy) e LET (transferência de energia linear, keV/um) para efeitos biológicos que determinam a quantidade de dano de DNA e o tamanho da deleção de DNA, e esses podem ser ajustados de acordo com a extensão de mutagênese desejada.
[0098] Agentes biológicos adequados para mutagênese sítio-dirigida incluem enzimas que incluem quebras de fita dupla no DNA que estimulam mecanismos endógenos de reparo. Exemplos ilustrativos incluem endonucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nuclease efetora TAL (TALENs), transposases e recombinases sítio-específicas. ZFNs, por exemplo, facilitam a clivagem sítio-específica dentro de um genoma permitindo mecanismos de reparo endógenos ou outros mecanismos de reparo de união de extremidades para introduzir deleções ou inserções para reparar a lacuna.
[0099] O isolamento de mutantes pode ser obtido por avaliação de plantas ou sementes mutagenizadas. Por exemplo, uma população mutagenizada de trigo pode ser avaliada diretamente quanto ao genótipo desejado ou indiretamente por avaliação para um fenótipo (ou seja, perfil canabinóide). A avaliação direta para o genótipo preferivelmente inclui a verificação da presença de mutações que podem ser observadas em ensaios de PCR pela ausência de marcadores, como esperado quando alguns dos genes estão deletados, ou ensaios baseados em heteroduplexos, ou por sequenciamento profundo. A avaliação para o fenótipo pode compreender a análise quantitativa de canabinóides, como fornecido pelos Exemplos. Com o uso dessa metodologia, grandes populações de cepas de canábis mutagenizadas podem ser avaliadas quanto a um perfil canabinóide desejado.
[00100] As mutações identificadas podem então ser introduzidas em fundos genéticos desejáveis por cruzamento do mutante com uma planta do fundo genético desejado e realização de um número adequado de retrocruzamentos para remover por cruzamento o fundo parental originalmente indesejado.
[00101] Uma mutação “induzida” ou “introduzida” deve ser entendida como significando uma variação genética induzida artificialmente que pode ser o resultado de tratamento químico ou com radiação de uma semente ou planta progenitora. Derivados por inserção de nucleotídeos incluem fusões dos terminais 5' e 3', bem como inserções intra-sequência de nucleotídeos únicas ou múltiplas. Variantes por inserção de sequência de nucleotídeos são aquelas nas quais um ou mais nucleotídeos são introduzidos em um sítio na sequência de nucleotídeos, em um sítio predeterminado, como é possível com ZFNs, TALENs ou métodos de recombinação homóloga, ou por inserção aleatória com avaliação adequada do produto resultante. Variantes por deleção são tipicamente caracterizadas pela remoção de um ou mais nucleotídeos da sequência. Um gene mutante pode ter somente uma inserção única de uma sequência de nucleotídeos em relação ao gene do tipo-selvagem e uma ou mais mutações por substituição. Variantes de nucleotídeos por substituição são tipicamente aquelas nas quais pelo menos um nucleotídeo na sequência foi removido e um nucleotídeo diferente inserido em seu lugar. De preferência, o número de nucleotídeos afetados por substituições em um gene mutante em relação ao gene do tipo- selvagem é de, no máximo, 10, preferivelmente no máximo 9, preferivelmente no máximo 8, preferivelmente no máximo 7, preferivelmente no máximo 6, preferivelmente no máximo 5, preferivelmente no máximo 4, preferivelmente no máximo 3, preferivelmente no máximo 2, preferivelmente no máximo 1 nucleotídeo.
[00102] O termo “mutação”, como usado nesse relatório descritivo, tipicamente não incluirá uma substituição de nucleotídeo silenciosa; ou seja, uma mutação que não afeta a atividade do gene e, portanto, inclui somente alterações na sequência do gene que afetam a atividade do gene. O termo “polimorfismo” se refere a qualquer alteração na sequência de nucleotídeos, incluindo essas substituições de nucleotídeos silenciosas. Os métodos de avaliação podem envolver primeiramente a avaliação quanto a polimorfismos e secundariamente mutações dentro de um grupo de variantes polimórficas.
[00103] A seleção assistida por marcador é um método bem reconhecido de seleção para plantas heterozigotas necessário quando é feito o retrocruzamento com um parente recorrente em um programa clássico de melhoramento. A população de plantas em cada geração de retrocruzamento será heterozigota para o gene de interesse normalmente presente em uma proporção de 1:1 em uma população de retrocruzamento, e o marcador molecular pode ser usado para distinguir os dois alelos do gene. Por extração de DNA, por exemplo, de brotos jovens, e testagem com um marcador específico para o traço desejável introgredido, é feita seleção inicial de plantas para retrocruzamento adicional enquanto energia e recursos são concentrados em menos plantas. Para acelerar ainda mais O programa de retrocruzamento, o embrião de sementes imaturas (25 dias pós-antese) pode ser excisado e desenvolvido em meios nutrientes sob condições estéreis, ao invés de permitir a maturidade completa da semente.
[00104] Em outro aspecto, é fornecido um método para a produção de uma planta de canábis transgênica, o método compreendendo a transfecção da planta de canábis descrita nesse relatório descritivo, ou de uma parte desta, com uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga. Em outro aspecto, é fornecida uma planta de canábis transgênica produzida pelos métodos revelados nesse relatório descritivo, ou uma semente ou planta da prole dela derivada.
[00105] Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos heteróloga transduzida introduz uma ou mais substituições, deleções ou adições de ácidos nucleicos no genoma da planta de canábis.
[00106] Construções de ácido nucleico úteis para a produção das plantas transgênicas mencionadas acima podem prontamente ser produzidas com o uso de técnicas padronizadas. Para assegurar a expressão apropriada do gene que codifica um mRNA de interesse, a construção de ácido nucleico tipicamente compreende um ou mais elementos reguladores como, por exemplo, promotores, intensificadores, bem como sequências de terminação da transcrição ou de poliadenilação. Esses elementos são bem conhecidos na técnica. A região de iniciação transcricional que compreende o elemento (ou elementos) regulador pode permitir a expressão regulada ou constitutiva na planta. Os elementos reguladores podem ser selecionados, por exemplo, de promotores semente- específicos, ou promotores não específicos para células da semente (por exemplo, promotor de ubiquitina ou promotores 35S CaMV35S ou intensificados). O promotor pode ser modulado por fatores como, por exemplo, temperatura, luz ou estresse. Normalmente, os elementos reguladores serão fornecidos 5’ da sequência genética a ser expressa. A construção também pode conter outros elementos que intensificam a transcrição como, por exemplo, as regiões de poliadenilação ou terminadores de transcrição nos 3’ ou ocs 3’.
[00107] Os termos “polinucleotídeo”, “sequência de polinucleotídeos”, “sequência de nucleotídeos”, “ácido nucleico” ou “sequência de ácidos nucleicos” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo para designar mRNA, RNA, cRNA, cDNA ou DNA. O termo tipicamente se refere à forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10 bases de comprimento, ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos ou uma forma modificada ou qualquer tipo de nucleotídeo. O termo inclui formas de RNA e DNA de fita simples e de fita dupla.
[00108] Como usados nesse relatório descritivo, os termos “codificar”, “que codifica” e semelhantes se referem à capacidade de um ácido nucleico para fornecer outro ácido nucleico ou um polipeptídeo. Por exemplo, é dito que uma sequência de ácidos nucleicos “codifica” um polipeptídeo se ela pode ser transcrita e/ou traduzida para produzir o polipeptídeo ou se ela pode ser processada em uma forma que pode ser transcrita e/ou traduzida para produzir o polipeptídeo. Uma sequência de ácidos nucleicos desse tipo pode incluir uma sequência codificadora ou tanto uma sequência codificadora quanto uma sequência não codificadora. Dessa forma, os termos “codificar”, “que codifica” e semelhantes incluem um produto de RNA que resulta da transcrição de uma molécula de DNA, uma proteína que resulta da tradução de uma molécula de RNA, uma proteína que resulta da transcrição de uma molécula de DNA para formar um produto de RNA e a tradução subsequente do produto de RNA, ou uma proteína que resulta da transcrição de uma molécula de DNA para fornecer um produto de RNA, processamento do produto de RNA para fornecer um produto de RNA processado
(por exemplo, mRNA) e a tradução subsequente do produto de RNA processado.
[00109] Tipicamente, a construção de ácido nucleico compreende um marcador selecionável. Marcadores selecionáveis auxiliam na identificação e avaliação de plantas ou células que foram transformadas com a molécula de ácido nucleico exógena. O gene marcador selecionável pode fornecer resistência antibiótica ou a herbicidas às células de canábis, ou permitir a utilização de substratos como, por exemplo, manose.
[00110] De preferência, a construção de ácido nucleico é incorporada estavelmente no genoma da planta. Consequentemente, o ácido nucleico compreende elementos apropriados que permitem que a molécula seja incorporada no genoma, ou a construção é colocada em um vetor apropriado que pode ser incorporado em um cromossomo de uma célula de planta.
[00111] Os termos “planta transgênica” e “planta de canábis transgênica”, como usados nesse relatório descritivo, tipicamente se referem a uma planta que contém uma construção gênica (“transgene”) não encontrada em uma planta do tipo-selvagem da mesma espécie, variedade ou cultivar. Ou seja, plantas transgênicas (plantas transformadas) contêm material genético que não continham antes da transformação. Um “transgene”, como referido nesse relatório descritivo, possui o significado normal na técnica de biotecnologia e se refere a uma sequência genética que foi produzida ou alterada por tecnologia de DNA ou RNA recombinante e que foi introduzida em uma célula de planta progenitora, cuja célula é usada para produzir uma nova planta.
O transgene pode incluir sequências genéticas obtidas ou derivadas de uma célula de planta, ou outra célula de planta, ou uma fonte não planta, ou uma sequência sintética.
Tipicamente, o transgene foi introduzido na planta por manipulação humana como, por exemplo, por transformação, mas qualquer método pode ser usado como aqueles habilitados na técnica reconhecem.
O material genético é tipicamente estavelmente integrado no genoma da planta.
O material genético introduzido pode compreender sequências que ocorrem naturalmente na mesma espécie, mas em uma ordem rearranjada ou em um arranjo de elementos diferente, por exemplo, uma sequência anti-senso ou uma sequência que codifica um RNA de fita dupla ou um precursor de microRNA artificial.
Plantas que contêm as sequências são incluídas nesse relatório descritivo em “plantas transgênicas”. O termo “plantas transgênicas”, como definido nesse relatório descritivo, inclui toda a prole de uma planta transformada e regenerada inicial (planta T0) que foi geneticamente modificada usando técnicas recombinantes, em que a prole compreende o transgene.
Essa prole pode ser obtida por autofertilização da planta transgênica primária ou por cruzamento dessas plantas com outra planta da mesma espécie.
Em uma modalidade, a planta transgênica compreende a introdução de uma ou mais substituições, deleções ou adições de ácidos nucleicos no genoma da planta de canábis da invenção.
Em outra modalidade, as plantas transgênicas são homozigotas entre elas e cada gene que foi introduzido (transgene), de modo que sua prole não segrega o fenótipo desejado.
Partes de plantas transgênicas incluem todas as partes e células das referidas plantas que compreendem o transgene como, por exemplo, sementes, tecidos cultivados, calo e protoplastos. Uma “planta não-transgênica”, preferivelmente uma planta de canábis não-transgênica, é aquela que não foi geneticamente modificada pela introdução de material genético por técnicas de DNA recombinante.
[00112] Em uma modalidade, as plantas transgênicas são produzidas por transfecção da planta de canábis da invenção com uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga.
[00113] A transformação de uma molécula de ácido nucleico em uma célula pode ser obtida por qualquer método pelo qual uma molécula de ácido nucleico possa ser inserida na célula. Exemplos ilustrativos de técnicas de transformação adequadas incluem transfecção, eletroporação, microinjeção, lipofecção, adsorção e fusão de protoplasto. Uma célula recombinante pode permanecer unicelular ou pode crescer em um tecido, órgão ou em um organismo multicelular. As moléculas de ácido nucleico transformadas da presente invenção podem permanecer extracromossômicas ou podem se integrar em um ou mais sítios dentro de um cromossomo da célula transformada (ou seja, recombinante), de tal forma que sua habilidade para ser expressa seja retida. Células hospedeiras preferidas são células de plantas, mais preferivelmente células de uma planta de canábis.
[00114] Qualquer um de vários métodos pode ser empregado para determinar a presença de um transgene em uma planta transformada, como são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Apenas como exemplo, a reação em cadeia de polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar sequências que são únicas para a planta transformada, com detecção dos produtos amplificados por eletroforese em gel ou por outros métodos. DNA pode ser extraído das plantas com o uso de métodos convencionais e a reação de PCR realizada com o uso de iniciadores que distinguirão as plantas transformadas e não transformadas. Um método alternativo para confirmar um transformante positivo é por hibridização Southern blot, bem conhecido na técnica. Plantas de canábis que são transformadas também podem ser identificadas (ou seja, distinguidas de plantas de canábis não transformadas ou do tipo-selvagem) por seu fenótipo, pela presença de um gene marcador selecionável, por imunoensaios que detectam ou quantificam a expressão de uma enzima codificada pelo transgene, ou qualquer outro fenótipo conferido pelo transgene.
[00115] Plantas transgênicas, como descritas nesse relatório descritivo, incluem plantas e sua prole que foram geneticamente modificadas com o uso de técnicas recombinantes. Isso geralmente iria modular a produção de pelo menos um polipeptídeo definido nesse relatório descritivo na planta ou órgão de planta desejado. Partes de plantas transgênicas incluem todas as partes e células das referidas plantas como, por exemplo, tecidos cultivados, calo e protoplastos. As plantas transformadas contêm material genético que não continham antes da transformação. O material genético é preferivelmente estavelmente integrado no genoma da planta. O material genético introduzido pode compreender sequências que ocorrem naturalmente na mesma espécie, mas em uma ordem rearranjada ou em um arranjo de elementos diferente, por exemplo, uma sequência anti-senso. Essas plantas estão incluídas nesse relatório descritivo como “plantas transgênicas”. Uma “planta não-transgênica” é aquela que não foi geneticamente modificada com a introdução de material genético por técnicas de DNA recombinante. Em uma modalidade preferida, as plantas transgênicas são homozigotas para cada um e todos os genes que foram introduzidos (transgene), de modo que sua prole na segrega para o fenótipo desejado. Extratos de canábis
[00116] Em outro aspecto, é fornecido um método de produção de um extrato que compreende canabinóides de uma planta de canábis, o método compreendendo as etapas de: (a) a colheita do material de planta da planta de canábis descrita nesse relatório descritivo; (b) a secagem pelo menos parcial do material de planta colhido da etapa (a); e (c) extração de canabinóides do material de planta pelo menos parcialmente seco da etapa (b) produzindo, dessa forma, um extrato que compreende canabinóides.
[00117] Em uma modalidade, o extrato compreende um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total, em que o perfil canabinóide compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), e em que o nível de THC total e CBG total (THC + CBG) é maior do que o nível de um canabinóide de referência selecionado do grupo que consiste em: CBD total, CBC total, CBN total e THCV total.
[00118] Em outra modalidade, o extrato compreende THC total, CBG total, e um ou mais canabinóides menores selecionados do grupo que consiste em: CBD total; CBC total; CBN total; THCV total; CBL total; e Δ8-THC total, em que o extrato compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), e em que o nível dos (um ou mais) outros canabinóides é de cerca de 0,01% até cerca de 10% por peso do teor total de canabinóide do extrato.
[00119] O termo “extrato”, como usado nesse relatório descritivo, deve ser subentendido como incluindo um extrato de canábis inteiro, por exemplo, resina, haxixe e keif, bem como compostos substancialmente purificados isolados do material de planta colhido, por exemplo, canabinóides, terpenos e/ou flavonóides.
[00120] Como usado nesse relatório descritivo, o termo “substancialmente purificado” se refere a um composto ou molécula que foi isolado de outros componentes com os quais está tipicamente associado em seu estado nativo (ou seja, dentro do material de planta). De preferência, a molécula substancialmente purificada é pelo menos 60% livre, mais preferivelmente pelo menos 75% livre e, mais preferivelmente, pelo menos 90% livre de outros componentes com os quais está naturalmente associada. O termo “isolado” significa um material que é substancialmente ou basicamente livre de componentes que normalmente o acompanham em seu estado nativo.
[00121] Aqueles habilitados na técnica reconheceriam que canabinóides isolados podem existir como diversas espécies químicas diferentes, cujos exemplos ilustrativos incluem sais, solvatos, pró-fármacos, estereoisômeros ou tautômeros destas.
[00122] O termo “secagem”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a qualquer método para secagem do material de planta. Exemplos ilustrativos incluem secagem ao ar, cura e secagem por calor. Em uma modalidade, o material de planta é seco em um ambiente com temperatura, luz e umidade controladas, por exemplo, uma temperatura de cerca de 21°C e uma umidade de cerca de 38% e 45% de RH. Em outra modalidade, calor é aplicado ao material de planta durante o processo de secagem para curar o material de planta seco. Temperaturas adequadas para a cura do material de planta seco seriam conhecidas por aqueles habilitados na técnica, cujos exemplos ilustrativos incluem uma temperatura de cerca de 60°C até cerca de 225°C, preferivelmente de cerca de 100°C até cerca de 150°C, preferivelmente de cerca de 110°C até cerca de 130°C ou, mais preferivelmente, cerca de 120°C. Em uma modalidade, o material de planta seco é curado por aquecimento do material de planta seco em torno de 120°C por 2 horas.
[00123] Deve ser subentendido que os termos “seco”, “secagem” e semelhantes não visam significar a ausência de umidade no material de planta e, portanto, inclui qualquer estado no qual pelo menos alguma umidade foi removida do material de planta. Aqueles habilitados na técnica estarão familiarizados com a extensão até a qual o material de planta de canábis pode ser seco para permitir a extração do composto (ou compostos) desejável, incluindo canabinóides descarboxilados. Em uma modalidade, o material de planta colhido é seco sob condições e por um período de tempo que dão origem a uma perda de pelo menos 5%, preferivelmente pelo menos 10%, preferivelmente pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 30%, preferivelmente pelo menos 40%, preferivelmente pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 91%, preferivelmente pelo menos 92%, preferivelmente pelo menos 93%, preferivelmente pelo menos 94%, preferivelmente pelo menos 95%, preferivelmente pelo menos 96%, preferivelmente pelo menos 97%, preferivelmente pelo menos 98% ou, mais preferivelmente, pelo menos 99% do teor de umidade do material de planta no momento da colheita.
[00124] Métodos de extração de canabinóides de material de planta seriam conhecidos por aqueles habilitados na técnica, cujos exemplos ilustrativos incluem extração com fluido supercrítico (SFE). Os princípios de SFE se relacionam com o desaparecimento da fronteira gás-líquido quando a temperatura de certos materiais era aumentada por seu aquecimento em um recipiente de vidro fechado. Isso permite que o material alcance seu ponto crítico, que é a temperatura acima da qual uma substância ou composto pode coexistir nas fases gasosa, líquida e sólida. Levando-se substâncias até seu ponto crítico e sob pressão, SFE pode ser usada como solventes sofisticados para extração e fracionamento de misturas complexas. SFE é comumente usada no processamento de óleo e também foi aplicada para a purificação e separação de óleos vegetais e de peixe. Mais recentemente, SFE tem sido usada para extrair canabinóides de material de planta, por exemplo, um método para a extração de canabinóides farmaceuticamente ativos de material de planta é fornecido em WO/2004/016277, cujos teores são incorporados nesse relatório descritivo por referência.
[00125] Em uma modalidade, canabinóides são extraídos do material de planta seco por SFE.
[00126] Em uma modalidade, o material de planta compreende inflorescência feminina.
[00127] Em outro aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecido um extrato produzido pelos métodos descritos nesse relatório descritivo.
[00128] A presente revelação fornece um extrato derivado da planta de canábis descrita nesse relatório descritivo, ou de uma parte desta, que compreende um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total, em que o perfil canabinóide compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), e em que o nível de THC total e CBG total (THC + CBG) é maior do que o nível de um canabinóide de referência selecionado do grupo que consiste em: CBD total, CBC total, CBN total e THCV total.
[00129] A presente revelação também fornece um extrato enriquecido em THC total e CBG total derivado da planta de canábis descrita nesse relatório descritivo, ou de uma parte desta, em que o extrato compreende THC total, CBG total, e um ou mais canabinóides menores selecionados do grupo que consiste em: CBD total, CBC total, CBN total, THC total, CBL total e Δ8-THC total, em que o extrato compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), e em que o nível dos (um ou mais) outros canabinóides é de cerca de 0,01% até cerca de 10% por peso do teor total de canabinóide do extrato. Em uma modalidade, o extrato não compreende CBDV total. Métodos para a seleção de plantas de cannabis
[00130] A presente revelação capacita a identificação e seleção de plantas de canábis com um perfil canabinóide benéfico particular (ou seja, um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total).
[00131] Em uma modalidade, as plantas de canábis selecionadas, ou partes destas, podem ser usadas para fins médicos. Em outra modalidade, as plantas de canábis selecionadas, ou partes destas, podem ser usadas no tratamento, ou para a melhora de sintomas associados com uma doença. Doenças adequadas serão conhecidas por aqueles habilitados na técnica, cujos exemplos ilustrativos incluem hipotireoidismo adquirido, gastrite aguda, agorafobia, enfermidade relacionada à AIDS, uso abusivo de álcool, alcoolismo, alopecia areata, doença de Alzheimer, dependência de anfetaminas, amiloidose, esclerose lateral amiotrófica (ALS), angina do peito, anquilose, anorexia, anorexia nervosa, transtornos de ansiedade, qualquer sintoma médico crônico que limite atividades diárias importantes, doença cardíaca arteriosclerótica, artrite, artropatia, gota, asma, distúrbio de hiperatividade-déficit de atenção (ADD/ADHD), autismo/síndrome de Asperger, doença autoimune, dor lombar, entorse nas costas, paralisia de Bell, transtorno bipolar, bruxismo, bulimia, caquexia, câncer, síndrome do túnel do carpo, paralisia cerebral, doença discal cervical, síndrome cervicobraquial, síndrome de fadiga crônica, dor crônica, insuficiência renal crônica, dependência de cocaína, colite, conjuntivite, constipação, doença de Crohn, fibrose cística, doença de Darier, delirium tremens, dermatomiosite, diabetes, neuropatia diabética, doença vascular periférica diabética, diarréia, diverticulite, transtorno distímico, eczema, enfisema, endometriose,
epidermólise bolhosa, epididimite, epilepsia, Síndrome de Felty, fibromialgia, ataxia de Friedreich, gastrite, herpes genital, doença de Graves, dores de cabeça, Hemofilia A, púrpura de Henoch-Schonlein, Hepatite C, ataxia espinhal hereditária, HIV/AIDS, doença de Huntington, hipertensão, hiperventilação, hipoglicemia, impotência, artrite inflamatória de mediação autoimune, doença inflamatória do intestino (IBD), insônia, transtorno explosivo intermitente (IED), doença de Lou Gehrig, doença de Lyme, melorreostose, doença de Menière, cinetose, mucopolissacaridose (MPS), esclerose múltipla (MS), espasmos musculares, distrofia muscular, síndrome de Nail-Patella, pesadelos, obesidade, transtorno obsessivo-compulsivo, dependência de opiáceos, osteoartrite, transtorno do pânico, doença de Parkinson, neuropatia periférica, dor, insônia persistente, porfiria, síndrome pós-pólio (PPS), transtorno de estresse pós- traumático (PTSD), síndrome pré-menstrual (PMS), prostatite, psoríase, fibrose pulmonar, doença de Raynaud, síndrome de Reiter, síndrome das pernas inquietas (RLS), rosácea, transtorno esquizoafetivo, esquizofrenia, escoliose, dependência de sedativos, convulsões, demência senil, náuseas severas, cobreiro (herpes-zoster), sinusite, espasticidade muscular esquelética, apnéia do sono, transtornos do sono, espasticidade, estenose espinhal, síndrome de Sturge-Weber (SWS), gagueira, discinesia tardia (TD), distúrbio da articulação temporomandibular (TMJ), tenossinovite, tireoidite, síndrome de Tietze, zumbidos, dependência de tabaco, síndrome de Tourette, tricotilomania, hepatite viral, síndrome de emaciação, síndrome de Wittmaack-Ekbom, náuseas e vômitos.
[00132] Consequentemente, em outro aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecido um método para a seleção de uma planta de canábis que compreende um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total de diversas plantas de canábis diferentes, o método compreendendo: (a) a colheita do material de planta de diversas plantas de canábis diferentes; (b) a secagem pelo menos parcial do material de planta colhido da etapa (a); (c) a medição no material de planta pelo menos parcialmente seco da etapa (b) de um nível de THC total, CBG total e um ou mais canabinóides de referência selecionados do grupo que consiste em THCV, CBDV, CBN, CBD, CBC, THCVA, CBDVA, CBNA, CBDA e CBCA, para gerar um perfil canabinóide para cada uma das diversas plantas de canábis; e (d) com base nas medições da etapa (c), a seleção entre as diversas plantas de canábis diferentes de uma planta de canábis que compreende um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total e que compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), em que o THC total compreende THC e THCA, em que o CBG total compreende CBG e CBGA, e em que o nível de THC total e CBG total (THC + CBG) é maior do que o nível de um canabinóide de referência selecionado do grupo que consiste em: (i) CBD total, em que o CBD total compreende CBD e CBDA; (ii) CBC total, em que o CBC total compreende CBC e CBCA; (iii) CBN total, em que o CBN total compreende CBN e
CBNA; e (iv) THCV total, em que o THCV total compreende THCV e THCVA.
[00133] Os termos “selecionar” ou “seleção”, como usado nesse relatório descritivo, significa a seleção de uma ou mais plantas de canábis das diversas plantas de canábis diferentes com base no perfil canabinóide da planta de canábis individual. O termo “diversas” deve ser entendido como significando mais do que 1 (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 etc.).
[00134] Em uma modalidade, o método ainda compreende: (a) a medição no material de planta pelo menos parcialmente seco da etapa (b) de um nível de mirceno e um nível de β-pineno para gerar um perfil de terpeno para cada uma das diversas plantas de canábis; e (b) com base nas medições da etapa (e), seleção entre as diversas plantas de canábis diferentes de uma planta de canábis que compreende um perfil de terpeno no qual o mirceno está presente em uma proporção de cerca de 60:1 até cerca de 1:1 para o nível de β-pineno.
[00135] Dessa forma, em outro aspecto revelado nesse relatório descritivo, é fornecido um método para a seleção de uma planta de canábis que compreende um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total de diversas plantas de canábis diferentes, o método compreendendo: (a) a colheita do material de planta de diversas plantas de canábis diferentes; (b) a secagem pelo menos parcial do material de planta colhido da etapa (a); (c) a medição no material de planta pelo menos parcialmente seco da etapa (b) de um nível de THC total, CBG total e um ou mais canabinóides de referência selecionados do grupo que consiste em THCV, CBDV, CBN, CBD, CBC, THCVA, CBDVA, CBNA, CBDA e CBCA, para gerar um perfil canabinóide para cada uma das diversas plantas de canábis; (d) a medição no material de planta pelo menos parcialmente seco da etapa (b) de um nível de mirceno e um nível de β-pineno para gerar um perfil de terpeno para cada uma das diversas plantas de canábis; e (e) com base nas medições da etapa (c) e etapa (d), a seleção entre as diversas plantas de canábis diferentes de uma planta de canábis que compreende (i) um perfil de terpeno no qual o mirceno está presente em uma proporção de cerca de 60:1 até cerca de 1:1 para o nível de β-pineno e (ii) um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total e que compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), em que o THC total compreende THC e THCA, em que o CBG total compreende CBG e CBGA, e em que o nível de THC total e CBG total (THC + CBG) é maior do que o nível de um canabinóide de referência selecionado do grupo que consiste em: (i) CBD total, em que o CBD total compreende CBD e CBDA; (ii) CBC total, em que o CBC total compreende CBC e CBCA; (ii) CBN total, em que o CBN total compreende CBN e CBNA; e (iii) THCV total, em que o THCV total compreende THCV e THCVA.
[00136] Em uma modalidade, a planta de canábis selecionada é cruzada com uma planta de canábis diferente para produzir um híbrido F1.
[00137] Em uma modalidade, células regeneráveis isoladas da planta de canábis selecionada são transformadas com uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga e cultivadas por um tempo e sob condições adequadas para produzir uma planta de canábis transgênica.
[00138] Em uma modalidade, células regeneráveis isoladas da planta de canábis selecionada são transfectadas com uma construção de edição gênica que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma porção de reconhecimento de DNA e cultivadas por um tempo e sob condições adequadas para produzir uma planta de canábis não-transgênica com expressão gênica modificada.
[00139] Aqueles habilitados na técnica compreenderiam que a porção de reconhecimento de DNA pode ser DNA, RNA ou um polipeptídeo.
[00140] Exemplos ilustrativos de moléculas de DNA adequadas incluem moléculas de DNA anti-senso, bem como senso (por exemplo, codificadoras e/ou reguladoras). Moléculas de DNA anti-senso incluem oligonucleotídeos curtos. Outros exemplos de moléculas de DNA inibidoras incluem aquelas que codificam RNAs interferentes, por exemplo, shRNA e siRNA. Ainda outro exemplo ilustrativo de um inibidor da expressão gênica é DNA catalítico, também denominado DNAzimas.
[00141] Exemplos ilustrativos de moléculas de RNA adequadas incluem siRNA, dsRNA, stRNA, shRNA e miRNA (por exemplo, RNAs temporais curtos e RNAs moduladores pequenos), ribozimas, e RNAs-guias (ou seja, gRNA ou RNA-guia-único (sgRNA)) ou repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR) usados em combinação com a endonuclease Cas ou outras endonucleases (van der Oost e cols. 2014, Nature Reviews Microbiology, 12 (7): 479-92).
[00142] Em uma modalidade, a porção de reconhecimento de DNA é um RNA CRISPR. RNA CRISPR adequado será conhecido por aqueles habilitados na técnica, cujos exemplos ilustrativos incluem RNA-guia (gRNA) e RNA-guia-único (sgRNA).
[00143] Em uma modalidade the porção de reconhecimento de DNA é um polipeptídeo. Exemplos ilustrativos de moléculas de polipeptídeo adequadas são “nucleases de Dedo de zinco” ou “ZFN”, como descrito em outro local nesse relatório descritivo.
[00144] Os termos “RNA-guia” ou “gRNA” se referem a uma sequência de RNA que é complementar a um DNA-alvo e dirige uma endonuclease CRISPR ao DNA-alvo. gRNA compreende CRISPR RNA (crRNA) e a RNA TRACR (tracrRNA). crRNA é uma sequência de 17-20 nucleotídeos que é complementar ao DNA-alvo, enquanto o tracrRNA fornece um arcabouço de ligação para a endonuclease. crRNA e tracrRNA existem na natureza como duas moléculas de RNA separadas, que foram adaptadas para técnicas de biologia molecular usando, por exemplo, gRNAs de dois pedaços como, por exemplo, RNAs traçadores CRISPR (cr:tracrRNAs).
[00145] Os termos “RNA-guia-único” ou “sgRNA” se referem a uma sequência de RNA única que compreende o crRNA fundido ao tracrRNA.
[00146] Consequentemente, aqueles habilitados na técnica compreenderiam que o termo “gRNA” descreve todos os formatos de guia CRISPR, incluindo duas moléculas de RNA separadas ou uma única molécula de RNA. Em contraste, o termo “sgRNA” deve ser subentendido como se referindo às moléculas de RNA únicas que combinam os elementos de crRNA e tracrRNA em uma única sequência de nucleotídeos.
[00147] Em uma modalidade preferida, a porção de reconhecimento de DNA é um RNA-guia-único (sgRNA).
[00148] Em uma modalidade, a construção de direcionamento de edição gênica ainda compreende um ácido nucleico que codifica uma endonuclease.
[00149] Endonucleases adequadas serão conhecidas por aqueles habilitados na técnica, cujos exemplos ilustrativos incluem uma endonuclease de DNA guiado por RNA, nuclease de dedo de zinco (ZFN), nuclease com efetores do tipo ativador transcricional (TALEN), nucleases CRISPR-associadas (Cas).
[00150] Em uma modalidade, a nuclease é selecionada do grupo que consiste em uma endonuclease de DNA guiado por RNA, ZFN, e uma TALEN.
[00151] “Nucleases com efetores do tipo ativador transcricional” ou “TALEN” são enzimas de restrição que podem ser modificadas geneticamente para cortar sequências de DNA específicas. Elas são feitas por fusão de um domínio de ligação ao DNA efetor TAL a um domínio de clivagem de DNA (uma nuclease que corta fitas de DNA). Efetores do tipo ativador transcricional (TALEs) podem ser modificados geneticamente para se ligarem a praticamente qualquer sequência de DNA desejada para, quando combinados com uma nuclease, o DNA possa ser cortado em localizações específicas. As enzimas de restrição podem ser introduzidas em células, para uso em edição gênica ou para edição do genoma in situ, uma técnica conhecida como edição do genoma com nucleases modificadas geneticamente. O mecanismo da clivagem mediada por TALEN de sequências de DNA-alvo seria conhecido por aqueles habilitados na técnica e foi descrito, por exemplo, by Boch (2011, Nature Biotechnology, 29: 135- 136), Juong e cols. (2013, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 14: 49-55) e Sune e cols. (2013, Biotechnology and Bioengineering, 110: 1.811-1.821).
[00152] “Nucleases de Dedo de zinco” ou “ZFN” são proteínas que compreendem domínios de ligação ao ácido nucleico que são estabelecidos por zinco. Os domínios de ligação ao DNA individuais são tipicamente referidos como “dedos”, de modo que uma ZFN possui pelo menos um dedo, preferivelmente dois dedos, preferivelmente três dedos, preferivelmente quatro dedos, preferivelmente cinco dedos ou, mais preferivelmente, seis dedos. Cada dedo se liga a dois a quatro pares de bases de uma sequência de DNA-alvo, e tipicamente compreende uma região de ligação ao DNA quelante de zinco com cerca de 30 aminoácidos. ZFN facilitam a clivagem sítio-específica dentro de uma sequência de DNA- alvo, permitindo que mecanismos de reparo de união de extremidades endógenos ou outros introduzam inserções ou deleções para reparar a lacuna. O mecanismo da clivagem mediada por ZFN de sequências de DNA-alvo seria conhecido por aqueles habilitados na técnica e foi descrito, por exemplo, por Liu e cols. (2010, Biotechnology and Bioengineering, 106: 97-105).
[00153] Em uma modalidade, a endonuclease de DNA guiado por RNA é uma endonuclease CRISPR-associada (Cas).
[00154] O sistema CRISPR-Cas se desenvolveu em bactérias e arquéias como um sistema imune adaptivo para defesa contra um ataque viral. Mediante exposição a um vírus, segmentos curtos de DNA viral são integrados no lócus das repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (ou seja, CRISPR). O RNA é transcrito por uma porção do lócus CRISPR que inclui a sequência viral. Aquele RNA, que contém complementaridade de sequência para o genoma viral, medeia o direcionamento de uma endonuclease Cas para a sequência no genoma viral. A endonuclease Cas cliva a sequência-alvo viral para evitar a integração ou expressão da sequência viral.
[00155] Os mecanismos da edição gênica mediada por CRISPR seriam conhecidos por aqueles habilitados na técnica e foram descritos, por exemplo, por Doudna e cols. (2014, “Methods in Enzymology”, 546) e Belhaj e cols., (2013, Plant Methods, 9: 39) e em WO 2013/188638 e WO 2014/093622.
[00156] Endonucleases Cas adequadas seriam conhecidas por aqueles habilitados na técnica, cujos exemplos ilustrativos incluem Cas9, Cas12a (também referida como Cpf1), Cas12b (também referida como C2c1), Cas13a (também referida como C2c2), Cas13b, CasX, Cas3 e Cas10. O termo “endonucleases Cas”, como usado nesse relatório descritivo, também contempla o uso de endonucleases Cas naturais e modificadas geneticamente, descritas, por exemplo, por Wu e cols. (2018, Nature Chemical Biology, 14: 642-651).
[00157] Em uma modalidade preferida, a endonuclease Cas é Cas9.
[00158] Aqueles habilitados na técnica observarão que a invenção descrita nesse relatório descritivo é suscetível a variações e modificações além daquelas especificamente descritas. Deve ser subentendido que a invenção inclui todas essas variações e modificações que se enquadram dentro do espírito e escopo. A invenção também inclui todas as etapas, características, composições e compostos citados ou indicados nesse relatório descritivo, individualmente ou coletivamente, e qualquer uma e todas as combinações de quaisquer duas ou mais das referidas etapas ou características.
[00159] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados nesse relatório descritivo possuem os mesmos significados que comumente subentendidos por aqueles habilitados na técnica à qual essa invenção pertence.
[00160] As diversas modalidades habilitadas nesse relatório descritivo são adicionalmente descritas pelos exemplos não limitantes seguintes.
EXEMPLOS A. Materiais Plantas
[00161] As plantas de canábis foram desenvolvidas sob uma licença do “Office of Drug Control” na “Victorian Government Medicinal Canábis Cultivation Facility”, Victoria, Austrália. As instalações de crescimento em estufa em recinto fechado foram equipadas com controle climático total (ou seja, temperatura, umidade e iluminação de alta intensidade) para assegurar que os cultivos fossem produzidos em condições de crescimento quase idênticas.
[00162] As plantas de canábis foram propagadas assexuadamente a partir de estacas retiradas de plantas-mães vegetativas originárias de uma única fonte de semente. As estacas foram mantidas por 2 semanas a 22°C em um ambiente de alta umidade (ou seja, 50% de umidade relativa) sob 18 horas de luz do dia em meio de enraizamento para estimular o desenvolvimento da raiz antes de serem transferidas para meio de substrato para crescimento hidropônico. As plantas foram desenvolvidas por mais 5 semanas sob as mesmas condições de crescimento antes de serem transferidas para um meio de substrato maior para induzir florescência.
[00163] As condições de florescência foram idênticas às condições de enraizamento e de crescimento, com a exceção de que a duração da luz do dia foi reduzida para 12 horas. As plantas foram mantidas em condições de florescência por 9 semanas para permitir a florescência e maturação.
[00164] As plantas foram irrigadas ao longo de seu ciclo de crescimento com água de qualidade potável e fertilizante em liberação sustentada é aplicado ao meio livre de solo.
[00165] Mediante maturação, as plantas foram colhidas na base da planta e secas em um ambiente com temperatura e umidade controladas (ou seja, aproximadamente 21°C a aproximadamente 38-45% de umidade) por entre 3 a 5 semanas antes da extração ou análise, como descrito abaixo. Reagentes e padrões
[00166] Todos os reagentes de grau de HPLC, água com ácido fórmico 0,1% (fase móvel A), acetonitrila com ácido fórmico 0,1% (fase móvel B) e metanol foram obtidos de Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ). Padrões primários para CBDA e THCA em acetonitrila, e CBD, CBN, CBC, THC em metanol, a
1.000 µg/ml, foram adquiridos comercialmente de Novachem Pty Ltd (Heidelberg West, Austrália) como distribuidor para Cerilliant Corporation (Round Rock, Texas). Um padrão de estoque misto a 125 µg/ml de CBDA, CBN, CBC, THCA e 250 µg/ml de CBD, THC em metanol foi preparado com padrões de trabalho a 0,05, 0,125, 0,25, 0,5, 1,25, 2.5 e 50,0 µg/ml para CBDA, CBN, CBC e THCA; e 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 e 100,0 µg/ml para CBD e THC preparado a partir do estoque misto. Padrões primários para THCV, CBDV, CBG, THCVA, CBNA, CBCA, CBGA, CBL e Δ8-THC em metanol, a 1.000 µg/ml, foram adquiridos comercialmente de Novachem Pty Ltd (Heidelberg West, Austrália) como distribuidor para Cerilliant Corporation (Round Rock, Texas). Esses foram combinados para produzir uma estoque de 100 µg/ml (ou seja, 100 µl removidos e misturados de cada). Esse padrão misto foi diluído até 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 e 100 µg/ml. Todos os padrões foram armazenados a -80°C. B. Preparação de amostras
[00167] As inflorescências foram separadas do material de planta de 69 cultivares-fêmeas de canábis diferentes. As amostras foram trituradas até um pó fino com nitrogênio líquido usando um “SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder” por 1 minuto a 1.500 rpm. Após trituração, 10 mg de cada amostra foram pesados em um tubo de microcentrífuga de 2,0 ml Axygen em uma balança analítica Sartorius BP210D. Cada amostra foi extraída com 1 ml de metanol, turbilhonada por 30 segundos, sonificadas por 5 minutos e centrifugada a 13.000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi transferido para um frasco de HPLC âmbar de 2 ml e diluído 1:3 para análise.
[00168] Quando necessário, material de planta foi curado por aquecimento do material de planta seco triturado a 120°C por 2 horas. C. Análise por Cromatografia líquida/Espectroscopia de massa
[00169] As amostras foram analisadas usando um espectrômetro de massa Q Exactive Plus Orbitrap (MS) Thermo Scientific (Waltham, MA) acoplado com um sistema de cromatografia líquida de desempenho super alto (UHPLC) Vanquish Thermo Scientific equipado com desgaseificador, bomba binária, auto-amostrador com temperatura controlada e compartimento de coluna e detector de arranjo de fotodiodo (PDA).
[00170] A separação foi realizada usando uma coluna C18 (Phenomenex Luna Omega, 1,6 µm, 150 mm x 2,1 mm) mantida a 30°C com água e acetonitrila (ambos com ácido fórmico 0,1%) como fases móveis e uma taxa de fluxo de 0,3 ml/min. O gradiente de separação é descrito na Tabela 3.
[00171] O MS foi ajustado para adquirir um espectro de faixa completa (80 – 1.200 m/z), seguido por um espectro MS2 de dados independente em polaridade positiva com resolução ajustada em 35.000. A temperatura capilar foi ajustada para 320°C com gás da bainha e auxiliar em 28 e 15 unidades, respectivamente, e uma voltagem de spray de 4 kV. A aquisição de dados de PDA foi ajustada para uma taxa coleta de dados de 5 Hz de 190 e 680 nm. Tabela 3. Gradiente de separação para análise por LCMS. Tempo % de A (Água com % de B (Acetonitrila com (min) ácido fórmico 0,1%) ácido fórmico 0,1%) 0 60,0 40,0 2,0 60,0 40,0 3,0 25,0 75,0 10,0 10,0 90,0 11,0 0,0 100,0 15,0 0,0 100,0 15,1 60,0 40,0 20,0 60,0 40,0 D. Microextração por fase sólida de headspace estático,
extração de líquido e análise por Cromatografia a gás/Espectroscopia de massa
[00172] Terpenos foram extraídos de 20 mg de biomassa de canábis seca, moída, usando headspace estático com injeção direta, microextração de headspace em fase sólida (SPME) ou extração líquida usando hexano, seguida por separação cromatográfica em um Agilent 7000 GC-QQQ usando uma coluna GC capilar DB-5, DB-17 ou VF-35. A coluna ótima para separação dos voláteis foi a coluna DB-5. Headspace estático foi eficaz para a análise de monoterpenos do extrato, enquanto sesquiterpenos foram mais eficazmente extraídos usando um método de extração líquida à base de hexano. As condições analíticas finais para a análise de headspace estático são fornecidas na Tabela 6 e as condições finais para a extração líquida são apresentadas na Tabela 5. Tabela 4. Parâmetros de HS e GC-MC usados para determinação relativa de terpenos de canábis. Parâmetros de GC-MS para análise de headspace estático Amostra Vinte mg de gema de canábis seca, moída Incubação (pré- 5 min extração) Extração 30 min Dessorção 2 min Fibra pós- 30 min cozimento Parâmetros de GC-MS Coluna DB-5, DB-17, VF-35 Forno Tempo (min) Temperatura (°C) 0 60
13,5 125 18,5 125 26 200 28 300 31 300 TEMPO DE 31 min
EXECUÇÃO
TOTAL Gás Hélio, Fluxo: 1,6221 ml/min a 10,34 kPa transportador Injetor Dividido 10:1, 250°C, volume de injeção
1.000 µl Headspace Temperatura de incubação 130°C por 5 min, volume de injeção 1.000 μl Faixa de 29-350 varredura Tabela 5. Extração líquida e parâmetros de GC-MS usados para determinação quantitativa de terpenos de canábis. Parâmetros de GC-MS for líquido injeção análise Amostra Vinte mg de gema de canábis seca, moída, extraída duas vezes com 200 μl de hexano. Extratos combinados para análise Forno Tempo (min) Temperatura (°C) 0 60 2 60 30 200 31 320
TEMPO DE 35 min
EXECUÇÃO TOTAL Gás Hélio, Fluxo: 1.6221 ml/min a 10,34 kPa transportador Injetor Dividido 1:5, 250°C, 1 μl Taxas de Execução principal fluxo e Coluna 1: fluxo 1,3801 ml/min; velocidade Configurações média 32.251 cm/s; de backflush Coluna 2: 0.50013 psi, fluxo 1,428 ml/min; velocidade média 151,6 cm/s Backflush Coluna 1: 3 min (pós-execução) – 1,9815 ml/min; Coluna 2: 3 min (pós-execução) – 7,0194 ml/min. E. Processamento de dados Análise quimiométrica
[00173] Os dados de LCMS foram alinhados, os picos selecionados e o isótopos agrupados em MS Genedata Refiner (Genedata Expressionist® 11.0.0a, Basel, Suíça). Os volumes agrupados subsequentes foram analisados em Genedata Analyst. Um total de 2.734 grupos foi identificado e cultivares com perfis canabinóides enriquecidos para CBD total foram identificados por comparação com 14 canabinóides (para os quais estavam disponíveis padrões), que foram usados como informação de entrada para o agrupamento (Tabela 6). Tabela 6. Padrões de canabinóides usados para caracterização de perfil.
Canabinóide Fórmula Carga m/z RT Tetrahidrocanabivarina C19H26O2 1 287,2004 7,90 (THCV) Canabidivarina (CBDV) C19H26O2 1 287,2006 6,45 Canabinol (CBN) C21H26O2 1 311,2005 8,92 Canabidiol (CBD) C21H30O2 1 315,2316 7,65 (-)-Δ9-Tetrahidrocanabinol C21H30O2 1 315,2317 9,76 (THC) Canabicromeno (CBC) C21H32O2 1 317,2110 10,89 Canabigerol (CBG) C21H32O2 1 317,2473 7,52 Ácido C20H26O4 1 331,1902 8,70 tetrahidrocanabivarínico (THCVA) Ácido canabidivarínico C20H26O4 1 331,1902 6,19 (CBDVA) Ácido canabinólico (CBNA) C22H26O4 1 355,1901 9,73 Ácido canabidiólico (CBDA) C22H30O4 1 359,2214 7,16 Ácido canabicromênico C22H30O4 1 359,2216 11,18 (CBCA) Ácido Δ9- C22H30O4 1 359,4439 10,73 tetrahidrocanabinólico (THCA) Ácido canabigerólico C22H32O4 1 361,2371 7,41 (CBGA) Análise de identificação de pico de terpeno
[00174] Identificações de pico foram determinadas usando combinação espectral de MS contra espectros de referência nas bibliotecas NIST/Wiley e Kovats Indicies. A identificação confirmatória foi feita com base no índice de retenção, que foi calculado para os compostos identificados em cada amostra usando um padrão externo analisado sob as mesmas condições de GC. Os padrões externos (Tabela 9) permitiram a designação de picos de voláteis principais nas cepas de canábis. Vários picos não foram capazes de serem identificados com certeza por combinação de bibliotecas ou por comparação com os padrões. Esses incluem tanto os supostos monoterpenos (M01-M13) quanto sesquiterpenos (S01- S08). Os dados foram comparados com os valores publicados e identificações de picos foram determinadas (Tabela 7; Figura 5).
[00175] Os dados de GC-MS foram analisados por PCA usando PLSToolbox (Versão 8.6.1, Eigenvetor Research, Inc.) executado em MatLaw (Versão R2018a, Mathworks).
Tabela 7. Padrões de terpeno usados para identificar terpenos em canábis.
Nº do RT (min) Nome m/z Índice de Estado pico retenção (calculado) 1 8,849 α-Felandreno 93,0 928 specID 2 9,092 α-Pineno (+/-) 93,0 937 Confirmado 3 9,590 Canfeno 93,0 955 Confirmado 4 10,383 β-Pineno (+/-) 93,0 983 Confirmado 5 10,570 Mirceno 93,0 990 Confirmado 6 11,481 α-Terpineno 93,0 1021 Confirmado 7 11,848 Limoneno 68,1 1033 Confirmado
8 11,930 β-Felandreno 93,1 1036 specID
9 11,983 Eucaliptol 81,0 1038 Confirmado
10 12,264 Isômero de ocimeno 93,1 1047 Confirmado
11 12,700 γ-Terpineno 93,1 1061 Confirmado
12 13,088 4-Tujanol 93,1 1074 specID
13 13,531 Terpinoleno 93,1 1089 Confirmado
Nº do RT (min) Nome m/z Índice de Estado pico retenção (calculado) 14 13,708 Fencheno 81,1 1095 Confirmado
15 13,868 Linalool 93,0 1101 Confirmado
16 14,615 Fenchol 81,1 1126 specID
17 14,844 Trans-2-Pinanol 93,1 1133 specID
18 16,219 Borneol 95,1 1180 Confirmado
19 16,835 α-Terpineol 93,1 1200 Confirmado
20 22,511 α-Bergamoteno 93,1 1406 specID
21 22,854 β-Bergamoteno 119,1 1419 specID
22 23,148 trans-Cariofileno 93,0 1431 Confirmado
23 23,280 γ-Elemeno isso 1 121,0 1436 specID
24 23,360 Bergamonteno isso 3 93,1 1439 specID
25 23,467 α-Guaieno 105,0 1443 specID
Nº do RT (min) Nome m/z Índice de Estado pico retenção (calculado) 26 23,748 Farneseno 69,2 1454 Confirmado, RI
27 24,083 Humuleno 93,0 1467 specID
28 24,780 (-)-α-Selineno 105,1 1494 specID
29 24,932 epi-β-selineno 93,1 1500 specID
30 25,050 Sesqui T-co-eluição 01 93,1 1510 specID
31 25,174 δ-Guaieno 107,0 1520 specID
32 25,999 α-Bisaboleno 93,1 1545 specID
33 26,099 Guaia-3,9-dieno 161,1 1549 specID
34 26,210 3,7(11)-Selinadieno 161,1 1553 specID
35 26,456 β-cis-Cariofileno 69,2 1563 specID
36 26,660 γ-Elemeno isso 2 121,1 1572 specID
37 27,242 Óxido de cariofileno 79,0 1596 Confirmado
Nº do RT (min) Nome m/z Índice de Estado pico retenção (calculado) 38 27,474 Guaiol 105,1 1606 Confirmado
39 28,187 β-Cadineno 189,1 1637 specID
40 28,922 γ-Guriuneno 59,1 1669 specID
41 29,081 sesquiterpeno 107,0 1676 specID
42 29,455 α-Bisabolol 93,0 1692 Confirmado
Quantificação
[00176] Os cromatogramas de LCMS foram processados usando o software Thermo LCQuan v. 2.7 por íon extraído usando os valores de m/z especificados na Tabela 7 com uma janela de 5 ppm ou por análise de PDA a 280 nm. Foram desenvolvidas curvas de calibração usando os padrões seriais diluídos e a quantidade de cada canabinóide nos cultivares calculada
[00177] Os cromatogramas de GC-MS foram processados usando o software Agilent MassHunter usando o tempo de retenção e perfis de m/z dos padrões especificados na Tabela
2. F. Extração com fluido supercrítico (SCE) de canabinóides
[00178] Extratos que compreendem canabinóides foram preparados a partir de material de planta madura seco ao ar e curado usando extração com fluido supercrítico (SCE) com CO2, como descrito previamente em Khaw e cols. (Molecules, 2017, 22: 1.186). Resumidamente, biomassa curada foi extraída usando SFE com CO2 com utilização dos seguintes parâmetros: - Temperatura de 60°C; - Taxa de fluxo de 150 g/min; e - Pressão de 150 bar. Resultados Quimiotipagem
[00179] Foi efetuada análise por LCMS para identificar plantas com perfis canabinóides enriquecidos para THC total e CBG total. Para análise não direcionada, o valor de corte da intensidade foi rigoroso, o que significa que somente picos que eram relativamente intensos seriam selecionados. Após alinhamento de picos e agrupamento de isótopos, um total de 2.734 grupos isótopos foi identificado no conjunto de dados combinados. Como os padrões foram executados sob as mesmas condições juntamente com os extratos de planta, foram gerados perfis canabinóides que correspondem aos canabinóides conhecidos (Tabela 5). Para essa análise, o material de planta não tinha sido aquecido e, portanto, as formas ácidas estavam presentes em níveis maiores do que as respectivas espécies neutras (Citti e cols. 2018, Phytochemical Analysis, 29: 539-48).
[00180] A análise de agrupamento hierárquico tanto do conjunto de dados inteiro quanto dos 14 canabinóides identificou 29 cepas de canábis com um perfil canabinóide enriquecido para CBD total e THC total, no qual THC total e CBG total eram relativamente altos, quando comparado com os outros padrões canabinóides. Esse desfecho foi inesperado, na medida em que CBG geralmente só está presente em abundância baixa, particularmente quando considerado em relação ao CBD. Análise quantitativa
[00181] Para descrever totalmente o perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total, foi feita análise quantitativa nas 29 cepas de canábis com um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG. Os resultados obtidos por essa análise são fornecidos na Tabela 8, abaixo.
Tabela 8. Análise quantitativa de canabinóides em canábis enriquecida para THC e CBG. Cepa de Canabinóides
CBD THC CBG CBC CBN CBDV THCV canábis # totais (mg/g) 31 0,55 80,74 4,82 2,94 0,16 0 0,27 89,48 32 0,51 110,11 6,15 3,51 0,2 0 0,24 120,72 33 0,37 66,23 2,31 3,85 0,29 0 0,13 73,18 34 0,68 84,22 2,33 3,45 0,26 0 0,16 91,1 35 0,52 76,54 2,04 4,02 0,23 0 0,19 83,54 36 0,27 66,44 3,99 3,38 0,17 0 0,3 74,55 37 0,99 119,9 5,39 4,85 0,14 0 0,66 131,93 38 0,7 134,54 6,8 3,28 0,21 0 0,75 146,28 39 0,41 134,24 6,23 2,67 0,18 0 0,93 144,66 40 0,46 119,75 8,98 2,9 0,24 0 0,91 133,24 41 0,38 99,17 4,54 1,6 0,18 0 0,49 106,36 42 0,55 93,37 4,34 0,88 0,21 0 0,62 99,97 43 0,38 129,29 8,28 4,89 0,17 0 1,41 144,42 44 0,34 105,7 3,53 1,62 0,15 0 0,78 112,12 45 0,25 71,53 2,23 1,65 0,21 0 0,29 76,16 46 0,36 81,72 1,67 1,1 0,18 0 0,38 85,41
Cepa de Canabinóides
CBD THC CBG CBC CBN CBDV THCV canábis # totais (mg/g) 47 0,39 124,4 3,49 2,97 0,23 0 0,71 132,19 48 0,41 115,05 4,87 2,26 0,17 0 0,69 123,45 49 1,05 146,94 4,26 3,6 0,25 0 1,2 157,3 50 0,61 142,55 7,59 3,31 0,26 0 1,02 155,34 51 0,42 123,04 4,37 1,53 0,32 0 1,12 130,8 52 0,62 134,96 9,7 1,58 0,21 0 0,85 147,92 53 0,35 79,75 1,8 1,07 0,18 0 0,51 83,66 54 0,54 103,51 6,01 1,81 0,09 0 0,52 112,48 55 0,46 116,04 5,28 1,73 0,13 0 0,75 124,39 56 0,49 91,75 4,56 0,97 0,13 0 0,47 98,37 57 0,49 114,39 4,47 1,38 0,14 0 0,76 121,63 58 0,5 132,04 7,74 1,69 0,11 0 0,67 142,75 59 0,77 203,58 4,81 1,98 0,21 0 0,95 212,3
[00182] Usando o teor total de canabinóide (mg/g) para cada uma das cepas de canábis analisadas, a proporção de cada canabinóide no teor total de canabinóide do material de planta foi derivada para caracterizar ainda mais o perfil canabinóide das cepas de canábis, apresentado como uma percentagem (%) do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta (Tabela 9).
Tabela 9. Major e teor de canabinóide menor em canábis enriquecida para THC e CBG.
Cepa de canábis # % de CBD % de THC % de CBG % de CBC % de CBN % de CBDV % de THCV 31 0,61 90,23 5,39 3,29 0,18 0,00 0,30 32 0,42 91,21 5,09 2,91 0,17 0,00 0,20 33 0,51 90,50 3,16 5,26 0,40 0,00 0,18 34 0,75 92,45 2,56 3,79 0,29 0,00 0,18 35 0,62 91,62 2,44 4,81 0,28 0,00 0,23 36 0,36 89,12 5,35 4,53 0,23 0,00 0,40 37 0,75 90,88 4,09 3,68 0,11 0,00 0,50 38 0,48 91,97 4,65 2,24 0,14 0,00 0,51 39 0,28 92,80 4,31 1,85 0,12 0,00 0,64 40 0,35 89,88 6,74 2,18 0,18 0,00 0,68 41 0,36 93,24 4,27 1,50 0,17 0,00 0,46 42 0,55 93,40 4,34 0,88 0,21 0,00 0,62 43 0,26 89,52 5,73 3,39 0,12 0,00 0,98 44 0,30 94,27 3,15 1,44 0,13 0,00 0,70 45 0,33 93,92 2,93 2,17 0,28 0,00 0,38 46 0,42 95,68 1,96 1,29 0,21 0,00 0,44
Cepa de canábis # % de CBD % de THC % de CBG % de CBC % de CBN % de CBDV % de THCV 47 0,30 94,11 2,64 2,25 0,17 0,00 0,54 48 0,33 93,20 3,94 1,83 0,14 0,00 0,56 49 0,67 93,41 2,71 2,29 0,16 0,00 0,76 50 0,39 91,77 4,89 2,13 0,17 0,00 0,66 51 0,32 94,07 3,34 1,17 0,24 0,00 0,86 52 0,42 91,24 6,56 1,07 0,14 0,00 0,57 53 0,42 95,33 2,15 1,28 0,22 0,00 0,61 54 0,48 92,03 5,34 1,61 0,08 0,00 0,46 55 0,37 93,29 4,24 1,39 0,10 0,00 0,60 56 0,50 93,27 4,64 0,99 0,13 0,00 0,48 57 0,40 94,05 3,68 1,13 0,12 0,00 0,62 58 0,35 92,50 5,42 1,18 0,08 0,00 0,47 59 0,36 95,89 2,27 0,93 0,10 0,00 0,45
[00183] Finalmente, as cepas de canábis são frequentemente avaliadas e discutidas em termos de suas proporções relativas de canabinóides principais ou menores, e a proporção de canabinóides THC e CBG para menores (THC + CBG:canabinóides menores) é descrita na Tabela 10.
Tabela 10. Proporção de THC + CBG:canabinóides menores para canábis enriquecida para THC e CBG.
Cepa de THC + Proporção de Proporção de Proporção de Proporção de Proporção de canábis CBG totais THC + CBG: THC + CBG: THC + CBG: THC + CBG: THC + CBG: # (mg/g) CBD CBC CBN CBDV THCV 31 85,56 155,56 29,10 534,75 NA 316,89 32 116,26 227,96 33,12 581,30 NA 484,42 33 68,54 185,24 17,80 236,34 NA 527,23 34 86,55 127,28 25,09 332,88 NA 540,94 35 78,58 151,12 19,55 341,65 NA 413,58 36 70,43 260,85 20,84 414,29 NA 234,77 37 125,29 126,56 25,83 894,93 NA 189,83 38 141,34 201,91 43,09 673,05 NA 188,45 39 140,47 342,61 52,61 780,39 NA 151,04 40 128,73 279,85 44,39 536,38 NA 141,46 41 103,71 272,92 64,82 576,17 NA 211,65 42 97,71 177,65 111,03 465,29 NA 157,60 43 137,57 362,03 28,13 809,24 NA 97,57 44 109,23 321,26 67,43 728,20 NA 140,04 45 73,76 295,04 44,70 351,24 NA 254,34
Cepa de THC + Proporção de Proporção de Proporção de Proporção de Proporção de canábis CBG totais THC + CBG: THC + CBG: THC + CBG: THC + CBG: THC + CBG: # (mg/g) CBD CBC CBN CBDV THCV 46 83,39 231,64 75,81 463,28 NA 219,45 47 127,89 327,92 43,06 556,04 NA 180,13 48 119,92 292,49 53,06 705,41 NA 173,80 49 151,20 144,00 42,00 604,80 NA 126,00 50 150,14 246,13 45,36 577,46 NA 147,20 51 127,41 303,36 83,27 398,16 NA 113,76 52 144,66 233,32 91,56 688,86 NA 170,19 53 81,55 233,00 76,21 453,06 NA 159,90 54 109,52 202,81 60,51 1216,89 NA 210,62 55 121,32 263,74 70,13 933,23 NA 161,76 56 96,31 196,55 99,29 740,85 NA 204,91 57 118,86 242,57 86,13 849,00 NA 156,39 58 139,78 279,56 82,71 1270,73 NA 208,63 59 208,39 270,64 105,25 992,33 NA 219,36
Perfil de terpeno
[00184] Para definir ainda mais o quimiotipo das plantas de canábis, os perfis de terpeno foram avaliados usando GC- MS. Com o uso de Análise de Componente Principal (PCA), PC1 explicava 69,48% de variância, e PC2 explicava 16,62% de variância nos dados (total 86,1%) (Figura 6A). PC1 é caracterizada por plantas enriquecidas para mirceno, ou seja, enriquecidas em mirceno (Figura 6B). A abundância de mirceno variou entre as diferentes cepas de canábis (Figura 7B). A abundância de β-pineno também foi quantificada para análise comparativa (Figura 7A).
[00185] Em plantas identificadas como compreendendo um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total, a abundância de mirceno e β-pineno foi determinada de acordo com a área de pico (Figura 7). A abundância relativa (proporção) de mirceno para β-pineno nessas cepas de canábis foi determinada como sendo de cerca de 60:1 e 1:1. Conclusão
[00186] A análise quantitativa de extratos retirados de plantas de canábis identificadas como tendo um perfil canabinóide enriquecido em THC e CBG confirmou que essas plantas são caracterizadas por níveis elevados de THC e níveis relativamente elevados de CBG. Considerando que CBG foi identificado como um canabinóide com potencial terapêutico elevado, é provável que essas novas variedades de canábis forneçam um benefício terapêutico. Análise comparativa
[00187] As características quimiotípicas dessas novas variedades de canábis enriquecidas em THC e CBG podem ser usadas para distinguir variedades de canábis enriquecidas em
THC e CBG de outras variedades de canábis. Plantas de canábis com um perfil canabinóide enriquecido para CBD total e THC total
[00188] Foi realizada a análise quantitativa nas 27 cepas de canábis com um perfil canabinóide enriquecido para CBD total e THC total. Os resultados obtidos por essa análise são fornecidos na Tabela 11, abaixo (mg/g).
Tabela 11. Análise quantitativa de canabinóides em canábis enriquecida em CBD e THC Canabinóides Cepa # CBD THC CBG CBC CBN CBDV THCV totais 2 53,33 33,96 1,21 3,12 0,1 0,23 0,24 92,19 3 91,42 57,2 2,52 5,39 0,05 0,2 0,32 157,1 6 55,49 31,36 2,38 3,08 0,09 0,3 0,35 93,05 7 69,26 36,69 2,36 4,01 0,11 0,33 0,29 113,05 8 74,14 29,76 3,64 4,39 0,15 0,37 0,34 112,79 9 69,51 33,38 2,55 3,77 0,13 0,32 0,35 110,01 10 51,97 22,68 2,11 2,71 0,09 0,29 0,26 80,11 11 65,71 35,09 2,24 3,46 0,09 0,32 0,29 107,2 12 70,87 33,14 3,72 3,99 0,1 0,37 0,36 112,55 13 64,27 30,26 1,9 3,04 0,13 0,35 0,32 100,27 14 78,37 41,58 4,48 3,94 0,16 0,41 0,42 129,36 15 73,06 38,33 2,37 3,77 0,07 0,39 0,45 118,44 16 96,97 74,48 5,12 5,22 0,13 0,47 0,49 182,88 17 76,72 36,42 2,86 4,05 0,1 0,37 0,31 120,83 18 67,57 22,29 2,14 3,7 0,08 0,41 0,41 96,6 19 76,61 37,91 3,64 4,75 0,1 0,39 0,35 123,75
Canabinóides Cepa # CBD THC CBG CBC CBN CBDV THCV totais 20 86,25 36,4 3,13 5,07 0,11 0,43 0,54 131,93 21 56,72 20,86 1,06 3,07 0,08 0,1 0,27 82,16 22 68,15 25,38 1,17 4,12 0,11 0,12 0,29 99,34 23 51,19 20,49 1,9 3,16 0,09 0,09 0,16 77,08 24 74,74 27,35 1,26 4,24 0,1 0,14 0,27 108,1 25 73,92 38,55 1,95 4,27 0,12 0,13 0,25 119,19 26 82,46 43,34 1,46 6,21 0,11 0,2 0,27 134,05 27 70,43 50,77 2,77 4,04 0,08 0,41 0,33 128,83 28 65,4 33,14 0,94 3,41 0,19 0,31 0,35 103,74 29 43,1 22,39 1,17 2,56 0,11 0,2 0,21 69,74 30 42,82 28,36 1,3 2,22 0,12 0,23 0,28 75,33
[00189] Em plantas identificadas como compreendendo um perfil canabinóide enriquecido para CBD total e THC total, a abundância de mirceno e β-pineno foi determinada de acordo com área de pico (Figura 7). A abundância relativa (proporção) de mirceno para β-pineno nessas cepas de canábis foi determinada como sendo de cerca de 40:1 e cerca de 1:1. Plantas de canábis com um perfil canabinóide enriquecido para THC total, CBG total e THCV total
[00190] Foi realizada a análise quantitativa nas 12 cepas de canábis com um perfil canabinóide enriquecido para THC total, CBG e THCV. Os resultados obtidos por essa análise são fornecidos na Tabela 12, abaixo.
Tabela 12. Análise quantitativa de canabinóides em canábis enriquecida em THC/CBG/THCV. Cepa de Canabinóides
CBD THC CBG CBC CBN CBDV THCV canábis # totais (mg/g) 60 0,73 124,09 1,83 1,77 0,21 0,02 5,47 134,12 61 0,68 96,31 2,74 2,29 0,3 0,02 4,54 106,88 62 0,46 120,87 5,3 2,13 0,24 0,02 3,26 132,28 63 0,8 104,57 8,89 1,94 0,18 0,03 6,57 122,98 64 0,42 139,17 4,47 2,32 0,2 0,02 5,63 152,23 65 0,29 85,67 1,47 1,21 0,12 0,02 2,74 91,52 66 0,66 99,73 1,37 1,32 0,12 0,02 2,79 106,01 67 0,61 86,69 1,5 0,99 0,14 0,02 3,12 93,07 68 0,38 96,7 2,08 5,74 0,25 0,02 2,68 107,85 69 0,5 81,06 3,08 1,58 0,22 0,02 2,3 88,76 70 0,27 78,86 1,5 3,23 0,3 0,02 2,23 86,41 71 0,45 83,39 2,01 1,97 0,26 0,02 2,49 90,59
[00191] Em plantas identificadas como compreendendo um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total, a abundância de mirceno e β-pineno foi determinada de acordo com área de pico (Figura 7). A abundância relativa (proporção) de mirceno para β-pineno nessas cepas de canábis foi determinada como sendo de cerca de 50:1 e 2,5:1. Plantas de canábis com um perfil canabinóide enriquecido para CBD total
[00192] Foi realizada a análise quantitativa em uma cepa de canábis com um perfil canabinóide enriquecido para CBD total. Os resultados obtidos por essa análise são fornecidos na Tabela 13, abaixo. Tabela 13. Análise quantitativa de canabinóides em canábis enriquecida em CBD. % do teor Proporção Concentração total de (CBD:Canabinóide) Canabinóide (mg/g) canabinóide CBD 55,1 1 90,42 THC 1,89 29,15 3,10 CBG 0,71 77,61 1,17 CBC 2,29 24,06 3,76 CBN 0,02 2755 0,03 CBDV 0,83 66,39 1,36 THCV 0,1 551 0,16 TOTAL 60,94
[00193] Em plantas identificadas como compreendendo um perfil canabinóide enriquecido para CBD total, a abundância de mirceno e β-pineno foi determinada de acordo com área de pico (Figura 7). A abundância relativa (proporção) de mirceno para β-pineno nessas cepas de canábis foi cerca de 5:1.

Claims (67)

REIVINDICAÇÕES
1. Planta de canábis, ou uma parte desta, caracterizada por compreender um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total, em que o perfil canabinóide compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), em que o THC total compreende Δ-9-tetrahidrocanabinol (THC) e ácido Δ-9- tetrahidrocanabinólico (THCA), em que o CBG total compreende canabigerol (CBG) e ácido canabigerólico (CBGA); e em que o nível de THC total e CBG total (THC + CBG) é maior do que o nível de um canabinóide de referência selecionado do grupo que consiste em: (a) CBD total, em que o CBD total compreende canabidiol (CBD) e ácido canabidiólico (CBDA); (b) CBC total, em que o CBC total compreende canabicromeno (CBC) e ácido canabicromênico (CBCA); (c) CBN total, em que o CBN total compreende canabinol (CBN) e ácido canabinólico (CBNA); e (d) THCV total, em que o THCV total compreende tetrahidrocanabivarina (THCV) e ácido tetrahidrocanabivarínico (THCVA).
2. Planta de canábis de acordo com a reivindicação 1, ou uma parte desta, caracterizada pelo fato de que a parte é uma inflorescência feminina.
3. Planta de canábis de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, ou uma parte desta, caracterizada pelo fato de que o nível de THC total é pelo menos 80% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
4. Planta de canábis de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou uma parte desta, caracterizada pelo fato de que o nível de CBG total é pelo menos 1% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
5. Planta de canábis de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou uma parte desta, caracterizada pelo fato de que o canabinóide de referência é CBD total.
6. Planta de canábis de acordo com a reivindicação 5, ou parte desta, caracterizada pelo fato de que o THC + CBG e o CBD totais estão presentes em uma proporção de cerca de 50:1 até cerca de 500:1 (THC + CBG: CBD).
7. Planta de canábis de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou uma parte desta, caracterizada pelo fato de que o nível de CBD total é de cerca de 0,1% até cerca de 1% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
8. Planta de canábis de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou uma parte desta, caracterizada pelo fato de que o canabinóide de referência é CBC total.
9. Planta de canábis de acordo com a reivindicação 8, ou parte desta, caracterizada pelo fato de que o THC + CBG e o CBC totais estão presentes em uma proporção de cerca de 10:1 até cerca de 120:1 (THC + CBG: CBC).
10. Planta de canábis de acordo com a reivindicação 8 ou reivindicação 9, ou uma parte desta, caracterizada pelo fato de que o nível de CBC total é de cerca de 0,01% até cerca de 10% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
11. Planta de canábis de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou uma parte desta, caracterizada pelo fato de que o canabinóide de referência é CBN total.
12. Planta de canábis de acordo com a reivindicação 11,
ou uma parte desta, caracterizada pelo fato de que o THC + CBG e o CBN totais estão presentes em uma proporção de cerca de 200:1 até cerca de 1.500:1 (THC + CBG: CBN).
13. Planta de canábis de acordo com a reivindicação 11 ou reivindicação 12, ou uma parte desta, caracterizada pelo fato de que o nível de CBN total é de cerca de 0,01% até cerca de 1% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
14. Planta de canábis de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, ou uma parte desta, caracterizada pelo fato de que o canabinóide de referência é THCV total.
15. Planta de canábis de acordo com a reivindicação 14, ou uma parte desta, caracterizada pelo fato de que o THC + CBG e o THCV totais estão presentes em uma proporção de cerca de 50:1 até cerca de 700:1 (THC + CBG: THCV).
16. Planta de canábis de acordo com a reivindicação 14 ou reivindicação 15, ou uma parte desta, caracterizada pelo fato de que o nível de THCV total é de cerca de 0,01% até cerca de 1% por peso do teor total de canabinóide do peso seco de material de planta.
17. Planta de canábis de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou uma parte desta, caracterizada pelo fato de que o perfil canabinóide não inclui CBDV total, em que CBDV total compreende canabidivarina (CBDV) e ácido canabidivarínico (CBDVA).
18. Planta de canábis de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, ou uma parte desta, caracterizada por compreender um ou mais terpenos selecionados do grupo que consiste em α-felandreno, α-pineno, canfeno, β-pineno, mirceno, limoneno, eucaliptol, γ-terpineno, linalool, γ-
elemeno, humuleno, nerolidol, guaia-3,9-dieno e cariofileno.
19. Planta de canábis de acordo com a reivindicação 18, ou uma parte desta, caracterizada por compreender um ou mais terpenos selecionados do grupo que consiste em mirceno e β- pineno.
20. Planta de canábis de acordo com a reivindicação 19, ou uma parte desta, caracterizada pelo fato de que o nível de mirceno está presente em uma proporção de cerca de 60:1 e 1:1 para o nível de β-pineno.
21. Semente da planta de canábis de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20.
22. Planta de canábis caracterizada por ser produzida pela semente de acordo com a reivindicação 21.
23. Cultura de tecido de células regeneráveis caracterizadas por serem derivadas da planta de canábis, ou uma parte desta, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20.
24. Planta de canábis gerada pela cultura de tecido de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a planta expressa as características morfológicas e fisiológicas da planta de canábis de qualquer uma das reivindicações 1 a 20.
25. Cultura de tecido de acordo com a reivindicação 23, caracterizada por compreender uma população de células ou protoplastos derivada da planta de canábis, em que a população de células ou protoplastos é isolada de uma parte selecionada do grupo que consiste em uma semente, uma folha, um caule, pólen, uma antera, um óvulo, um embrião, um cotilédone e um hipocótilo.
26. Método para a produção de uma planta de canábis híbrida F1, o método caracterizado por compreender o cruzamento da planta de canábis de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20 com uma planta de canábis diferente para produzir um híbrido F1.
27. Semente caracterizada por ser derivada da planta de canábis híbrida F1 produzida pelo método de acordo com a reivindicação 26, ou de plantas da prole ou sementes de uma geração subsequente.
28. Planta de canábis híbrida caracterizada por ser produzida pela semente de acordo com a reivindicação 27.
29. Método de produção de uma planta de canábis transgênica, o método caracterizado por compreender a transdução da planta de canábis de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, ou uma parte desta, com uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga.
30. Método de produção de uma planta de canábis transgênica, o método caracterizado por compreender a introdução de uma ou mais substituições, deleções ou adições de ácidos nucleicos no genoma da planta de canábis de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos heteróloga também compreende uma ou mais sequências reguladoras.
32. Planta de canábis transgênica caracterizada por ser produzida pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 31, ou uma parte desta.
33. Semente caracterizada por ser derivada da planta de canábis transgênica de acordo com a reivindicação 32.
34. Planta da prole caracterizada por ser produzida pela semente de acordo com a reivindicação 33.
35. Método de produção de um extrato que compreende canabinóides de uma planta de canábis, o método caracterizado por compreender as etapas de: (a) a colheita do material de planta da planta de canábis de qualquer uma das reivindicações 1 a 20; (b) a secagem pelo menos parcial do material de planta colhido da etapa (a); e (c) extração de canabinóides do material de planta pelo menos parcialmente seco da etapa (b) produzindo, dessa forma, um extrato que compreende canabinóides.
36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o extrato compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), e em que o nível de THC total e CBG total (THC + CBG) é maior do que o nível de um canabinóide de referência selecionado do grupo que consiste em: CBD total, CBC total, CBN total e THCV total.
37. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o extrato compreende THC total, CBG total, e um ou mais canabinóides menores selecionados do grupo que consiste em: CBD total, CBC total, CBN total, THCV total, CBL total e Δ8-THC total, em que o extrato compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), e em que o nível dos (um ou mais) outros canabinóides é de cerca de 0,01% até cerca de 10% por peso do teor total de canabinóide do extrato.
38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 37, caracterizado pelo fato de que o material de planta compreende inflorescência feminina.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 38, caracterizado pelo fato que compreende ainda a cura do material de planta seco da etapa (b) antes da etapa (c).
40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 39, caracterizado pelo fato de que canabinóides são extraídos do material de planta seco na etapa (c) por extração com fluido supercrítico.
41. Extrato caracterizado por ser produzido pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 40.
42. Extrato derivado da planta de canábis de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, ou uma parte desta, caracterizado pelo fato de que o extrato compreende um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total, em que o perfil canabinóide compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), e em que o nível de THC total e CBG total (THC + CBG) é maior do que o nível de um canabinóide de referência selecionado do grupo que consiste em: CBD total, CBC total, CBN total e THCV total.
43. Extrato enriquecido em THC total e CBG total derivado da planta de canábis de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, ou uma parte desta, caracterizado pelo fato de que o extrato compreende THC total, CBG total, e um ou mais canabinóides menores selecionados do grupo que consiste em: CBD total, CBC total, CBN total, THCV total, CBL total e Δ8-THC total, em que o extrato compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), e em que o nível dos (um ou mais) outros canabinóides é de cerca de 0,01% até cerca de 10% por peso do teor total de canabinóide do extrato.
44. Método para a seleção de uma planta de canábis que compreende um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total de diversas plantas de canábis diferentes, o método caracterizado por compreender: (a) a colheita do material de planta de diversas plantas de canábis diferentes; (b) a secagem pelo menos parcial do material de planta colhido da etapa (a); (c) a medição no material de planta pelo menos parcialmente seco da etapa (b) de um nível de THC total, CBG total e um ou mais canabinóides de referência selecionados do grupo que consiste em THCV, CBDV, CBN, CBD, CBC, THCVA, CBDVA, CBNA, CBDA e CBCA, para gerar um perfil canabinóide para cada uma das diversas plantas de canábis; e (d) com base nas medições da etapa (c), a seleção entre as diversas plantas de canábis diferentes de uma planta de canábis que compreende um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total e que compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), em que o THC total compreende THC e THCA, em que o CBG total compreende CBG e CBGA, e em que o nível de THC total e CBG total (THC + CBG) é maior do que o nível de um canabinóide de referência selecionado do grupo que consiste em: (i) CBD total, em que o CBD total compreende CBD e CBDA; (ii) CBC total, em que o CBC total compreende CBC e CBCA; (iii) CBN total, em que o CBN total compreende CBN e
CBNA; e (iv) THCV total, em que o THCV total compreende THCV e THCVA.
45. Método para a seleção de uma planta de canábis que compreende um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total de diversas plantas de canábis diferentes, o método caracterizado por compreender: (a) a colheita do material de planta de diversas plantas de canábis diferentes; (b) a secagem pelo menos parcial do material de planta colhido da etapa (a); (c) a medição no material de planta pelo menos parcialmente seco da etapa (b) de um nível de THC total, CBG total e um ou mais canabinóides de referência selecionados do grupo que consiste em THCV, CBDV, CBN, CBD, CBC, THCVA, CBDVA, CBNA, CBDA e CBCA, para gerar um perfil canabinóide para cada uma das diversas plantas de canábis; (d) a medição no material de planta pelo menos parcialmente seco da etapa (b) de um nível de mirceno e um nível de β-pineno para gerar um perfil de terpeno para cada uma das diversas plantas de canábis; e (e) com base nas medições da etapa (c), a seleção entre as diversas plantas de canábis diferentes de uma planta de canábis que compreende (i) um perfil de terpeno no qual o mirceno está presente em uma proporção de entre cerca de 60:1 e cerca de 1:1 para o nível de β-pineno e (ii) um perfil canabinóide enriquecido para THC total e CBG total e que compreende um nível de THC total e um nível de CBG total em uma proporção de cerca de 5:1 até cerca de 50:1 (THC:CBG), em que o THC total compreende THC e THCA, em que o CBG total compreende CBG e CBGA, e em que o nível de THC total e CBG total (THC + CBG) é maior do que o nível de um canabinóide de referência selecionado do grupo que consiste em: (i) CBD total, em que o CBD total compreende CBD e CBDA; (ii) CBC total, em que o CBC total compreende CBC e CBCA; (iii) CBN total, em que o CBN total compreende CBN e CBNA; e THCV total, em que o THCV total compreende THCV e THCVA.
46. Método de acordo com a reivindicação 44 ou reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o material de planta compreende inflorescência feminina.
47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 46, caracterizado pelo fato de que o nível de THC total é pelo menos 80% por peso do teor total de canabinóide do peso pelo menos parcialmente seco do material de planta.
48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 47, caracterizado pelo fato de que o nível de CBG total é pelo menos 1% por peso do teor total de canabinóide do peso pelo menos parcialmente seco do material de planta.
49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 48, caracterizado pelo fato de que o canabinóide de referência é CBD total.
50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o THC + CBG e o CBD totais estão presentes em uma proporção de cerca de 50:1 até cerca de 500:1 (THC + CBG: CBD) no material de planta.
51. Método de acordo com a reivindicação 49 ou reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o nível de CBD total é de cerca de 0,1% até cerca de 1% por peso do teor total de canabinóide do peso pelo menos parcialmente seco do material de planta.
52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 51, caracterizado pelo fato de que o canabinóide de referência é CBC total.
53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o THC + CBG e o CBC totais estão presentes em uma proporção de cerca de 10:1 até cerca de 120:1 (THC + CBG: CBC) no material de planta.
54. Método de acordo com a reivindicação 52 ou reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o nível de CBC total é de cerca de 0,01% até cerca de 10% por peso do teor total de canabinóide do peso pelo menos parcialmente seco do material de planta.
55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 54, caracterizado pelo fato de que o canabinóide de referência é CBN total.
56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o THC + CBG e o CBN totais estão presentes em uma proporção de cerca de 200:1 até cerca de 1.500:1 (THC + CBG: CBN) no material de planta.
57. Método de acordo com a reivindicação 55 ou reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o nível de CBN total é de cerca de 0,01% até cerca de 1% por peso do teor total de canabinóide do peso pelo menos parcialmente seco do material de planta.
58. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 57, caracterizado pelo fato de que o canabinóide de referência é THCV total.
59. Método de acordo com a reivindicação 58,
caracterizado pelo fato de que o THC + CBG e o THCV totais estão presentes em uma proporção de cerca de 50:1 até cerca de 700:1 (THC + CBG: THCV) no material de planta.
60. Método de acordo com a reivindicação 58 ou reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o nível de THCV total é de cerca de 0,01% até cerca de 1% por peso do teor total de canabinóide do peso pelo menos parcialmente seco do material de planta.
61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 60, caracterizado pelo fato de que o perfil canabinóide não inclui CBDV total, em que CBDV total compreende canabidivarina (CBDV) e ácido canabidivarínico (CBDVA).
62. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado ainda por compreender a medição no material de planta pelo menos parcialmente seco da etapa (b) um ou mais terpenos selecionados do grupo que consiste em α-felandreno, α-pineno, canfeno, β-pineno, mirceno, limoneno, eucaliptol, γ-terpineno, linalool, γ-elemeno, humuleno, nerolidol, guaia-3,9-dieno e cariofileno.
63. Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que os (um ou mais terpenos) são selecionados do grupo que consiste em mirceno e β-pineno.
64. Método de acordo com a reivindicação 45 ou reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o nível de mirceno está presente em uma proporção de cerca de 60:1 e 1:1 para o nível de β-pineno.
65. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 64, caracterizado pelo fato de que the planta de canábis selecionada é cruzada com uma planta de canábis diferente para produzir um híbrido F1.
66. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 64, caracterizado pelo fato de que células regeneráveis isoladas da planta de canábis selecionada são transformadas com uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga e cultivadas por um tempo e sob condições adequadas para produzir uma planta de canábis transgênica.
67. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 64, caracterizado pelo fato de que células regeneráveis isoladas da planta de canábis selecionada são transfectadas com uma construção de edição gênica que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma porção de reconhecimento de DNA e cultivadas por um tempo e sob condições adequadas para produzir uma planta de canábis não- transgênica com expressão gênica modificada.
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