BR112021008949A2 - redução da contaminação microbiana em produtos lácteos por fosfolipase - Google Patents

Abstract

REDUÇÃO DA CONTAMINAÇÃO MICROBIANA EM PRODUTOS LÁCTEOS POR FOSFOLIPASE. A presente invenção está no campo da tecnologia de laticínios. Refere-se a métodos de inibição do crescimento de microrganismos indesejados, como bactérias Gram-negativas, leveduras ou bolores em produtos lácteos, usando fosfolipase para tratar a base do leite. A invenção também fornece produtos lácteos produzidos a partir desses métodos.

Description

REDUÇÃO DA CONTAMINAÇÃO MICROBIANA EM PRODUTOS LÁCTEOS POR FOSFOLIPASE CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a processos de produção de produtos lácteos, particularmente produtos lácteos frescos e produtos de queijo.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

[002] As bactérias gram-negativas, como os coliformes, estão entre os muitos grupos de microrganismos que normalmente estão presentes no leite cru. Elas são contaminantes comuns em queijos e outros produtos lácteos. É um problema bem conhecido que todos os produtos lácteos frescos com um pH mais alto são muito sensíveis ao crescimento de coliformes.

[003] Altos níveis de coliformes no leite cru podem indicar práticas anti-higiênicas na fazenda, como refrigeração inadequada. Portanto, as bactérias coliformes têm sido usadas como indicadores de higiene microbiana na indústria de laticínios.

[004] Os coliformes são bastonetes aeróbios ou facultativamente anaeróbicos, Gram negativos, não formadores de esporos, capazes de fermentar lactose para produzir gás e ácido em 48 horas a 32 a 35°C. Os padrões de coliformes estão incluídos em documentos regulatórios (por exemplo, o Regulamento do Leite Pasteurizado Grau "A" da Food and Drug Administration dos EUA). A maior parte dos gêneros bacterianos que compõem o grupo coliforme está na família Enterobacteriaceae, enquanto pelo menos um gênero com cepas reconhecidas como coliformes, Aeromonas, está na família Aeromonadaceae. Mais de 20 gêneros de Gram-negativos atendem aos critérios fenotípicos de coliformes, inclusive Escherichia, Klebsiella, Citrobacter, Serratia e Enterobacter.

[005] O crescimento ou morte de coliformes em produtos lácteos, como queijo, depende de uma variedade de parâmetros, como pH do queijo, idade, teor de umidade, teor de sal, teor de ácido graxo livre e outros fatores. Em particular, os coliformes são prevalentes em queijo com pH mais alto e atividade de água mais elevada (Trmčić, A., et al. “A detecção de coliformes no queijo está associada a características específicas do queijo, mas não foi encontrada associação com a detecção de patógenos.” Journal of dairy science 99 (2016): 6105-6120).

[006] Os esforços para melhorar a higiene e as práticas de obtenção de leite na fazenda são recomendados para reduzir os riscos de doenças de origem alimentar. Isso inclui práticas como verificações regulares da saúde animal, teste do leite e do equipamento de processamento e estabelecimento para atender aos requisitos de higiene e o monitoramento de pontos críticos no processo, como temperatura durante resfriamento e transporte.

[007] Uma estratégia para reduzir a ocorrência de bactérias Gram-negativas, como coliformes, em produtos lácteos é a pasteurização. Por exemplo, a pasteurização do leite antes da produção do queijo é realizada para eliminar pelo menos 105 unidades formadoras de colônias (UFC)/g de bactérias para garantir um produto mais seguro com uma vida útil prolongada. No entanto, a pasteurização pode afetar as propriedades do leite, como a desnaturação da proteína do soro de leite e as interações subsequentes com as caseínas kappa. A pasteurização do leite também pode levar ao desenvolvimento insuficiente de sabor no queijo, devido à inativação da enzima e perda da flora microbiana nativa presente no leite.

[008] Os produtos lácteos, como queijos, com pH superior a 6,0 são muito sensíveis ao crescimento de coliformes e, portanto, têm uma vida útil muito curta. Um desses queijos é o “Queso Fresco”, originário de países latino-americanos. É um queijo fresco, macio e branco, tradicionalmente feito com leite cru de vaca ou cabra e tem um sabor suave e salgado com textura farelenta. O Queso Fresco preparado com leite cru deve ser consumido em 1 a 2 semanas após a produção devido à formação de microrganismos contaminantes, incluindo bactérias, leveduras e fungos. O Queso Fresco preparado com leite pasteurizado, por outro lado, tem um prazo de validade inferior a 30 dias, mesmo quando armazenado a uma temperatura inferior a 6°C. O crescimento indesejado de microrganismos pode levar à formação de gás e soro de leite, bem como alterações na textura e no sabor, tornando o produto impróprio para consumo.

[009] Em muitos casos, a produção de Queso Fresco é bem manual e o risco de pós-contaminação por coliformes é alto. A contagem de coliformes no produto final costuma ser superior a 104 UFC/g de produto no final da vida útil. Não é surpresa que o Queso Fresco tenha sido implicado em vários surtos de doenças de origem alimentar.

[010] Aplicando práticas de fabricação, como boa higiene, é possível reduzir o risco de contaminação. Além disso, o processamento de alta pressão (HPP) na produção de leite foi proposto para o processo de fabricação de Queso Fresco (Sandra, S., M. A. Stanford e L. Meunier Goddik. "The use of high‐pressure processing in the production of queso fresco cheese." Journal of food science 69.4 (2004):153-158.). No entanto, foi constatado que o tratamento com HPP leva a perfis sensoriais alterados e à diminuição da firmeza, elasticidade e fragilidade durante o armazenamento, bem como irregularidades superficiais aumentadas e aparência oleosa.

[011] O documento US8241690 divulga um método para conservar queijo de alto nível de umidade por uma mistura conservante de ácido sórbico, nisina e o sistema enzimático sob o nome de Sea- i® da Bienca S.A (Bélgica). O Sea-i® baseia-se no sistema de lactoperoxidase (sistema LPS) e é descrito, por exemplo, em EP3030096 (Bienca, Bélgica), onde uma composição baseada no sistema LPS, compreendendo lactoperoxidase, tiocianato, glicose oxidase e glicose, é divulgada. A glicose oxidase gera peróxido de hidrogênio com base na oxidação da glicose.

[012] Tal como acontece com as peroxidases em geral, a lactoperoxidase (LP) catalisa reações nas quais o peróxido de hidrogênio é reduzido e um doador de elétrons adequado é oxidado. A LP em si não tem efeito antibacteriano, mas em combinação com certos substratos, tiocianato e peróxido de hidrogênio, forma um sistema antimicrobiano.

[013] No entanto, o possível efeito toxicológico do LPS e seus componentes constituintes não foram totalmente pesquisados. Como exemplo, foi reconhecido que o íon tiocianato pode interferir na absorção de iodo. Ainda existe a necessidade de uma estratégia eficaz para inibir microrganismos indesejados ou para prolongar a vida útil de produtos lácteos, de forma ideal sem comprometer o perfil sensorial e a aparência do produto.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[014] A presente invenção fornece um novo uso da enzima fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32) em um processo de preparação de um produto lácteo, particularmente um produto com um pH superior a 5,0 e um teor de umidade superior a 40%. Tal como aqui usado, e a menos que indicado de outra forma, o pH e o teor de umidade mencionados em relação a produtos lácteos aplicáveis na presente invenção referem-se ao valor de pH e ao teor de umidade determinados no momento, assim que o produto estiver pronto para ser consumido após a fabricação.

[015] O teor de umidade é determinado pela Determinação do teor total de sólidos do queijo e queijo processado da IDF (International Dairy Federation) (1982). Padrão FIL-IDF 4A:

1982. International Dairy Federation, Bruxelas, Bélgica.

[016] Produtos lácteos com um pH superior a 5,0 e um teor de umidade superior a 40% são propensos a contaminações microbianas, incluindo contaminação por bactérias Gram-negativas (por exemplo, coliformes), leveduras e bolores, que podem levar a doenças de origem alimentar se não forem controladas. Foi surpreendentemente descoberto que a fosfolipase A1 pode ser usada para reduzir o crescimento de bactérias Gram-negativas, leveduras e bolores em produtos lácteos, particularmente produtos lácteos frescos com vida útil mais curta.

[017] A presente invenção também fornece produtos lácteos, preferencialmente produtos lácteos frescos, preparados a partir de base de leite, aos quais a fosfolipase A1 é adicionada para inibir contaminações microbianas.

[018] As fosfolipases têm sido usadas na indústria de laticínios para estabilizar a emulsão de gordura, melhorando a estabilidade da gordura, aumentando o rendimento, a interesterificação, a intensificação do sabor e a aceleração do envelhecimento (Casado, Víctor, et al. "Phospholipases in food industry: a review." Lipases and Phospholipases. Humana Press, 2012. 495- 523). Elas também têm sido usadas para degomar óleos vegetais, aumentando o rendimento da manteiga e modificando a gema de ovo. No entanto, o uso de fosfolipases como agentes bioprotetores em produtos lácteos para controlar a contaminação microbiana e prolongar a vida útil nunca foi sugerido.

[019] A presente invenção fornece, em um primeiro aspecto, métodos de inibição do crescimento de bactérias Gram-negativas, leveduras e bolores em um produto lácteo que compreende as etapas de a) adição de fosfolipase A1 a uma base de leite, e b) preparação da base de leite para obter um produto lácteo.

[020] A presente invenção fornece, em um segundo aspecto, o uso de fosfolipase A1 para inibir o crescimento de bactérias Gram- negativas (tais como coliformes), leveduras e bolores em produtos preparados a partir do leite. Em representações preferenciais, a fosfolipase A1 é usada para inibir o crescimento de bactérias coliformes em produtos lácteos com um teor de umidade superior a 40%, em que a enzima pode ser adicionada ao produto lácteo entre 0,1 e 50 LEU por grama de gordura. A contagem de coliformes é inferior a 105 ufc/g no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou dia 30 quando armazenados a uma temperatura entre 1-6°C.

[021] Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece produtos lácteos que compreendem a fosfolipase A1. Os produtos lácteos podem ser produtos fermentados ou não fermentados. De preferência, o produto é aquele que é propenso a contaminação por coliformes, como produtos de queijo e, particularmente, produtos de queijo que são menos ácidos e que têm teor de umidade mais elevado.

[022] Em representações preferenciais, os produtos lácteos são preparados a partir de leite fresco, que pode ser cru (ou seja, não pasteurizado) ou pasteurizado.

[023] Em outras representações preferenciais, a presente invenção fornece produtos lácteos, como produtos de queijo, que compreendem fosfolipase, em que os produtos lácteos não abrangem uma cultura inicial.

[024] Em representações preferenciais, a fosfolipase A1 é a fosfolipase YieldMAX® ou a fosfolipase YieldMAX®PL (Chr. Hansen A/S, Dinamarca).

[025] Os produtos lácteos preparados usando os métodos descritos no pedido presente podem ser caracterizados pelo fato de o nível de leveduras ser inferior ao do produto preparado pelo mesmo método, mas sem adição de fosfolipase.

[026] Os produtos lácteos preparados usando os métodos descritos no pedido presente podem ser caracterizados pelo fato de o nível de bolor ser inferior ao do produto preparado pelo mesmo método, mas sem adição de fosfolipase.

[027] Os produtos lácteos preparados usando os métodos descritos no pedido presente podem ser caracterizados pelo fato de o nível de bactérias Gram-negativas, como a contagem de coliformes, ser inferior ao do produto preparado pelo mesmo método, mas sem adição de fosfolipase.

[028] Em algumas representações, os produtos lácteos preparados usando os métodos descritos no pedido presente têm uma contagem de coliformes inferior a 105 ufc/g no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou dia 30 quando armazenados a uma temperatura entre 1-6°C.

[029] Em algumas representações, os produtos lácteos preparados usando os métodos descritos no pedido presente têm uma contagem de coliformes inferior a 104 ufc/g no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou no dia 20 quando armazenados a uma temperatura entre 1-6°C.

[030] A contagem de coliformes pode ser determinada pela Enumeração de coliformes da IDF (International Dairy Federation) (1985) (leite e derivados de leite) Padrão FIL-IDF 73A: 1985. International Dairy Federation, Bruxelas, Bélgica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[031] A Figura 1 mostra o perfil de acidificação do queijo minas frescal tratado com e sem fosfolipase A1.

[032] A Figura 2 mostra a formação de gás no queijo minas frescal tratado com fosfolipase (Lotes 1 e 2) e sem fosfolipase A1 (Lotes 3 e 4).

[033] A Figura 3 mostra o perfil de acidificação do queijo Queso Fresco tratado com (pontilhado) e sem (tracejado) fosfolipase A1 durante um período de 5 semanas.

[034] A Figura 4 mostra que o teor de umidade do queijo Queso Fresco tratado com (pontilhado) e sem (tracejada) fosfolipase A1 durante um período de 5 semanas.

[035] A Figura 5 mostra a aparência do queijo Queso Fresco tratado com (direita) e sem (esquerda) fosfolipase A1.

[036] A Figura 6 mostra a média de registro de coliformes no queijo Queso Fresco tratado com (direita) e sem (esquerda) fosfolipase A1 durante um período de 5 semanas.

[037] A Figura 7 mostra as placas de contagem de coliformes para o queijo Queso Fresco tratado com (esquerda) e sem (direita) fosfolipase A1.

[038] A Figura 8 mostra o efeito em amostras de queijo de coalho tratadas com (parte inferior) e sem (parte superior) fosfolipase A1 quando aquecidas na grelha.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[039] Um grande desafio na indústria de processamento de alimentos é a contaminação microbiana causada por bactérias e fungos. Destas, as bactérias Gram-negativas de origem alimentar são a principal preocupação, pois são capazes de causar doenças. Conservantes químicos são tradicionalmente usados para controlar a contaminação durante o processamento de alimentos. No entanto, há uma demanda cada vez maior da sociedade por alimentos menos processados ou sem conservantes.

[040] A presente invenção é baseada, em parte, na descoberta surpreendente de que a fosfolipase A1 tem efeitos positivos na redução da contaminação microbiana em produtos lácteos frescos. Os inventores descobriram surpreendentemente que, ao adicionar a fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32) durante o processo de preparação, é possível inibir o crescimento de bactérias gram-negativas, leveduras e bolores, prolongando assim a vida útil dos produtos. Essa constatação permite que a necessidade do uso de conservantes químicos seja reduzida ou eliminada.

[041] A presente invenção está relacionada à fosfolipase A1 (EC

3.1.1.32) e a seu uso como uma estratégia bioprotetora eficaz para produtos lácteos que são suscetíveis à contaminação microbiana por bactérias Gram-negativas, leveduras e bolores.

[042] As fosfolipases são enzimas fundamentais que desempenham um papel crucial nos organismos vivos em geral e no metabolismo e biossíntese de fosfolipídios. As enzimas participam da hidrólise de fosfolipídios, e vários tipos de atividades de fosfolipase podem ser distinguidos, incluindo fosfolipase A, B, C e D. A fosfolipase A pode ainda ser classificada como fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32) ou A2 (EC 3.1. 1.4.), que hidrolisa um grupo de acil graxo (na posição sn-1 e sn-2, respectivamente) para formar lisofosfolipídeo. A fosfolipase A1 tem uma especificidade muito mais ampla do que A2.

[043] A fosfolipase A1 é definida de acordo com a classificação EC da enzima padrão como EC 3.1.1.32:

[044] Nome oficial: fosfolipase A1

[045] Reação catalisada: fosfatidilcolina + água <=> 2- acilglicerofosfocolina + um ânion de ácido graxo.

[046] A fosfolipase A1 útil no presente pedido pode ser de qualquer origem, por ex., de origem animal (como, por exemplo, mamífero), por ex., do pâncreas (por exemplo, pâncreas bovino ou suíno) ou veneno de cobra ou veneno de abelha. Como alternativa, a fosfolipase pode ser de origem microbiana, por ex., de fungos filamentosos, leveduras ou bactérias, como o gênero ou espécie Aspergillus, por ex., A. niger; Dictyostelium, por ex. D. discoideum; Mucor, por ex. M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, por ex. N. crassa; Rhizomucor, por ex. R. pusillus; Rhizopus, por ex. R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, por ex. S. libertiana; Trichophyton, por ex. T. rubrum; Whetzelinia, por ex. W. sclerotiorum;

Bacillus, por ex. B. megaterium, B. subtilis; Citrobacter, por ex., C. freundii; Enterobacter, por ex., E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, por ex. E. herbicola; Escherichia, por ex., E. coli; Klebsiella, por ex., K. pneumoniae; Proteus, por ex. P. vulgaris; Providencia, por ex., P. stuartii; Salmonella, por ex., S. typhimurium; Serratia, por ex., S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, por ex., S. flexneri; Streptomyces, por ex., S. violeceoruber; Yersinia, por ex., Y. enterocolitica. A fosfolipase pode ser fúngica, por ex., da classe Pyrenomycetes, como o gênero Fusarium, como uma cepa de F. culmorum, F. heterosporum, F. solani, F. venenatum ou uma cepa de F. oxysporum. A fosfolipase também pode ser de uma cepa de fungo filamentoso dentro do gênero Aspergillus, como uma cepa de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae. Uma fosfolipase preferida é derivada de uma cepa de Fusarium, particularmente de F. venenatum ou F. oxysporum, por ex., da cepa DSM 2672 como descrito em WO 98/26057, especialmente descrito na reivindicação 36 do documento WO 98/26057. Em outras representações, a fosfolipase é uma fosfolipase conforme divulgado no documento WO 00/32758 (Novozymes A/S, Dinamarca).

[047] As fosfolipases estão disponíveis comercialmente. A fosfolipase A1 de Thermomyces lanuginosus / Fusarium oxysporum expressa em Aspergillus oryzae está disponível sob a marca comercial Lecitase®Ultra (Novozymes A/S, Dinamarca). Outra fosfolipase A1 preferida está disponível sob a marca comercial YieldMAX® ou YieldMAX®PL (Chr. Hansen A/S, Dinamarca), produzido a partir da fermentação submersa de uma cepa de Aspergillus oryzae. Outra fosfolipase preferencial é a fosfolipase A1 de Fusarium spp.

[048] Outras fosfolipases de nível alimentar são bem conhecidas por um especialista na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, em Casado, Víctor, et al. "Phospholipases in food industry: a review." Lipases and Phospholipases: Methods and Protocols (2012): 495-523.

[049] A presente invenção fornece um novo uso de fosfolipase A1 para inibir o crescimento de bactérias Gram-negativas (como bactérias Gram-negativas de origem alimentar), leveduras e bolores. A fosfolipase A1 pode ser usada para inibir bactérias coliformes. Exemplos de bactérias Gram-negativas de origem alimentar incluem, mas não se limitam a, Aeromonas spp. (por ex., Aeromonas caviae, Aeromonas hydrophila, Aeromonas sobria), Campylobacter spp. (por ex., Campylobacter jejuni), Citrobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp. (por ex., Escherichia coli, incluindo Escherichia coli enteroinvasiva, enteropatogênica e enterotoxigênica, bem como Escherichia coli 0157:H7, O26:H11, O111:H-, O103:H2), Plesiomonas shigelloides, Vibrio cholerae e Yersinia enterocolitica.

[050] “Inibição” geralmente significa uma diminuição, seja parcial ou total, na função e atividade das células ou microrganismos. Como usado neste documento, os termos “para inibir” ou “inibir” em relação a bactérias, leveduras ou bolores significam que o crescimento, o número ou a concentração das bactérias é o mesmo ou reduzido. Isso pode ser medido por quaisquer métodos conhecidos no campo da microbiologia. A inibição pode ser observada comparando o crescimento, número ou concentração com um valor de referência ou um controle. O controle pode ser o mesmo produto preparado da mesma forma, mas sem o tratamento com fosfolipase. O termo “inibir”, conforme usado na presente invenção, também se refere a retardar o crescimento dos microrganismos. O termo “retardar” em geral significa o ato de parar, adiar, impedir ou fazer com que algo ocorra mais lentamente do que o normal. Como usado neste documento, “retardar o crescimento de bactérias, leveduras ou bolores” refere-se ao ato de adiar o crescimento de bactérias, leveduras ou bolores. Isso pode ser observado comparando-se o tempo necessário para os microrganismos crescerem até um determinado nível em dois produtos, um dos quais tratado com fosfolipase e o outro sem (mas, de outra forma, o mesmo).

[051] O nível de crescimento do microrganismo, incluindo o crescimento bacteriano, pode ser avaliado por meio de quaisquer métodos convencionais conhecidos na técnica, por exemplo, usando os métodos descritos no Manual Analítico Bacteriológico (BAM, Bacteriological Analytical Manual) da FDA dos EUA, que apresenta os procedimentos laboratoriais preferenciais da agência para análises microbiológicas de alimentos e cosméticos. Por exemplo, a análise de coliformes pode ser realizada de acordo com Feng, Peter, et al. “BAM: Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria.” Bacteriological analytical manual (2002): 13-19.

[052] Outra vantagem da presente invenção é o prolongamento da vida útil dos produtos lácteos. Como usado neste documento, o termo “vida útil” significa o período que um produto alimentar permanece à venda a clientes do varejo. No processamento de laticínios frescos, a vida útil dos produtos lácteos é de cerca de 30 a 40 dias após a preparação, às vezes até mais curta, por exemplo, se o leite cru for usado como material inicial. Produtos Leite fresco

[053] Em uma representação preferencial, o produto lácteo do presente pedido é leite fresco. Como o leite fresco é conhecido por ser suscetível à contaminação por coliformes, é possível empregar a fosfolipase A1 no leite para reduzir o risco de contaminação. Produtos de queijo

[054] Em outras representações preferenciais, o produto lácteo do presente pedido é um produto de queijo, particularmente um produto de queijo com vida útil curta (por exemplo, menor que 2 meses). “Produto de queijo” é um termo definido de acordo com os regulamentos oficiais relevantes. Os padrões para esses produtos são bem conhecidos na área.

[055] O método aqui divulgado é especialmente aplicável a produtos de queijo com um pH superior a 5,0 e/ou um teor de umidade superior a 40%.

[056] Em representações preferenciais, o produto lácteo tem um pH superior a 5,1, mas inferior a 7,0, como superior a 5,2, como superior a 5,3, como superior a 5,4, como superior a 5,5, como superior a 5,6, como superior a 5,7, como superior a 5,8, como superior a 5,9, como superior a 6,0, como superior a 6,1, como superior a 6,2, como superior a 6,3, como superior a 6,4, como superior a 6,5, como superior a 6,6, como superior a 6,7, como superior a 6,8, como superior a 6,9.

[057] Em representações preferenciais, o produto lácteo tem um teor de umidade que é superior a 40%, como superior a 41%, como superior a 42%, como superior a 43%, como superior a 44%, como superior a 45%, como superior a 46%, como superior a 47%, como superior a 48%, como superior a 49%, como superior a 50%, como superior a 51%, como superior a 52 %, como superior a 53%, como superior a 54%, como superior a 55%, como superior a 56%, como superior a 57%, como superior a 58%, como superior a 59% , como superior a 60%, como superior a 61%, como superior a 62%, como superior a 63%, como superior a 64%, como superior a 65%, como superior a 66%, como superior a 67%, como superior a 68%, como superior a 69%, como superior a 70%, como superior a 71%, como superior a 72%, como superior a 73%, tal como superior a 74%, como superior a 75%, como superior a 76%, como superior a 77%, como superior a 78%, como superior a 79%, como superior a 80%, como superior a 90% ou superior a 95%. A medição do teor de umidade é bem conhecida e pode ser realizada por um especialista na técnica.

[058] O pH pode ser medido por quaisquer métodos conhecidos na técnica, como sondas, eletrodos ou medidores de pH.

[059] Em algumas representações preferenciais, o produto lácteo tem um pH superior a 5,5 e um teor de umidade superior a 45%, como superior a 50%, 55% ou 60%

[060] Em algumas representações preferenciais, o produto lácteo tem um pH superior a 6,0 e um teor de umidade superior a 45%, como superior a 50%, 55% ou 60%.

[061] Em algumas representações preferenciais, o produto lácteo tem um pH superior a 6,5 e um teor de umidade superior a 45%, como superior a 50%, 55% ou 60%.

[062] Em algumas representações preferenciais, o produto lácteo tem um pH superior a 6,7 e um teor de umidade superior a 45%, como superior a 50%, 55% ou 60%.

[063] Em algumas representações preferenciais, o produto lácteo tem um pH entre 5,5-6,8 e um teor de umidade entre 45% a 80%.

[064] Em algumas representações preferenciais, o produto lácteo tem um pH entre 6,1-6,7 e um teor de umidade entre 50% a 75%.

[065] Esses produtos lácteos podem ser produtos de queijo, como produtos de queijo fresco com ou sem adição de cultura inicial.

[066] De preferência, o produto lácteo é um produto de queijo com pH superior a 6,0 e um teor de umidade superior a 50%. O pH quase neutro e o alto teor de umidade em produtos de queijo fresco não curados são muito suscetíveis ao crescimento de contaminação microbiana por bactérias, leveduras ou bolores. Queso Fresco

[067] Em algumas representações preferenciais, o produto lácteo do presente pedido é Queso Fresco. O Queso Fresco é um queijo não curado originário de países da América Latina que está pronto para o consumo imediatamente ou logo após sua fabricação. Outros queijos semelhantes ao Queso Fresco incluem minas frescal do Brasil, burgos da Espanha, panela do México, quesito da Colômbia. Um especialista na técnica pode facilmente determinar e identificar esses queijos, por exemplo, de acordo com os regulamentos regionais, como o Regulamento Técnico MERCOSUL de Identidade e Qualidade de Queijos. Queijo de Coalho

[068] Em algumas representações preferenciais, o produto lácteo do presente pedido é o queijo de coalho brasileiro. É um queijo artesanal do Nordeste do Brasil, feito originalmente com leite cru. Seu consumo se espalhou por todo o país principalmente no litoral. É um queijo semiduro com umidade média a alta (como 40- 42%), com uma massa semicozida ou cozida e um teor de gordura nos sólidos totais variando de 35% a 60% (como 40-46 %). É um queijo firme e leve, amarelado, de textura elástica, que costuma ser vendido no palito e consumido assado no espeto. Quando assado, o queijo não deve derreter.

[069] Foi descoberto que o queijo de coalho tratado com fosfolipase tem um pH mais alto em comparação com os produtos não tratados. Isso tem o surpreendente benefício de que o produto é menos propenso a derreter quando aquecido, tornando-o adequado para consumo. Produtos lácteos sem cultura inicial

[070] A invenção é particularmente útil para inibir o crescimento de bactérias Gram-negativas (como coliformes), leveduras e fungos em produtos lácteos onde nenhuma cultura inicial é adicionada, por exemplo, produtos de queijo onde nenhuma cultura inicial é adicionada. Devido à falta de cultura inicial e ao alto teor de água, esses produtos apresentam maior risco de contaminação microbiológica. A fosfolipase A1 pode servir como uma estratégia útil para reduzir a contaminação. Sobremesa láctea

[071] Em outras representações preferenciais, os produtos lácteos do presente pedido incluem creme de sobremesa (opcionalmente com sabores como caramelo, chocolate, creme de baunilha) ou pudim, bem como sobremesas lácteas, como espuma de leite (opcionalmente com chocolate, baunilha e outros sabores), sobremesa de leite coalhado, manjar ou crème brulée. Métodos

[072] A presente invenção fornece métodos para inibir o crescimento de bactérias Gram-negativas (como bactérias coliformes), leveduras e bolores em um produto lácteo, que inclui a etapa de adição de fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32) a uma base de leite. Base de Leite

[073] Para preparar produtos de acordo com o presente pedido, uma base de leite é fornecida primeiramente como material inicial. A “base de leite" é amplamente usada no presente pedido para se referir a uma composição à base de leite ou componentes do leite que podem ser usados para preparar produtos lácteos.

[074] “Leite” geralmente refere-se à secreção láctea obtida pela ordenha de qualquer mamífero, como vacas, ovelhas, cabras, búfalas ou camelas. A base de leite pode ser obtida de qualquer leite cru e/ou processado, bem como de leite em pó reconstituído. A base de leite também pode ser à base de vegetais, ou seja, preparada a partir de matéria-prima vegetal, por ex., leite de soja, leite de amêndoa, leite de caju ou leite de coco. É preferida a base de leite preparada com leite ou componentes do leite de vacas.

[075] A base de leite inclui, mas não está limitada a, soluções/suspensões de qualquer leite ou produtos semelhantes ao leite compreendendo proteínas, como leite integral ou com baixo teor de gordura, leite desnatado, leitelho, leite em pó reconstituído, leite condensado e leite em pó.

[076] Em algumas representações preferenciais, a base de leite é o leite cru (isto é, não pasteurizado) obtido de vacas, ovelhas, cabras, búfalas ou camelas. O leite cru é ligeiramente ácido, geralmente na faixa de pH 6,5 a 6,7 devido à presença de fosfato, citrato e outros sais tamponantes.

[077] A presente invenção pode ser usada de maneira vantajosa para tratar leite cru para controlar o crescimento microbiano ou prolongar sua vida útil, o que permite a administração na produção, especialmente quando o armazenamento temporário é necessário ou quando o risco de contaminação é alto (por exemplo, devido a problemas de temperatura, contaminação do tanque, má qualidade do leite, etc.).

[078] Além disso, para produzir muitos queijos que devem ser rotulados de acordo com a designação de origem protegida, a lei exige leite não pasteurizado na matéria-prima. Seria, portanto, especialmente vantajoso usar a fosfolipase A1 para controlar o crescimento de microrganismos indesejados nesses produtos, uma vez que o uso de pasteurização é limitado.

[079] Em algumas representações preferenciais, a base de leite é pasteurizada de acordo com métodos conhecidos na técnica. Preferencialmente, a pasteurização é obtida pela manutenção de uma temperatura específica por um determinado período. Os especialistas na técnica são capazes de selecionar a temperatura e a duração para matar ou inativar certos microrganismos. Uma etapa de resfriamento rápido pode ocorrer.

[080] Em outras representações preferenciais, a base de leite é homogeneizada. A homogeneização é um procedimento comum para dar boa textura aos produtos lácteos fermentados. É executado para quebrar a gordura do leite em tamanhos menores. Glóbulos menores de gordura criados neste processo podem ser facilmente suspensos na solução, de forma que não existam como uma camada separada do leite. A homogeneização pode ser realizada, por exemplo, forçando o leite através de um filtro fino ou válvula restritiva em altas pressões, formando assim uma emulsão com tamanho de partícula diminuído. Adição de fosfolipase A1

[081] De acordo com as representações preferenciais da presente invenção, a fosfolipase A1 é adicionada a uma base de leite em condições adequadas. Se o leite for pasteurizado ou homogeneizado, a fosfolipase A1 será adicionada após a pasteurização ou a homogeneização.

[082] As condições adequadas para realizar o tratamento de fosfolipase podem ser determinadas por um especialista usando métodos conhecidos na técnica para otimizar reações enzimáticas. É possível ajustar vários parâmetros, como a temperatura e o pH da base do leite e a quantidade de fosfolipase A1 para atingir os resultados desejados, levando em consideração os exemplos fornecidos neste pedido, bem como as propriedades desejadas do produto. Fatores que podem ser considerados incluem força da atividade enzimática, teor de gordura, tempo de reação, atividade de água, prazo de validade, condições de armazenamento, embalagem, etc. As quantidades podem ser determinadas por um especialista na técnica usando experimentação de rotina.

[083] A fosfolipase pode ser adicionada à base de leite em qualquer temperatura e depois aquecendo o leite a uma temperatura que seja adequada para ativar a fosfolipase. Os intervalos de temperatura adequados são conhecidos por um especialista na técnica ou podem ser determinados usando experimentação de rotina.

[084] Por exemplo, a fosfolipase pode ser adicionada ao leite em um tanque ou base de leite a uma temperatura superior a 3°C, como 3-12°C, e aquecida a uma temperatura adequada.

[085] Em outras representações, a fosfolipase é adicionada ao leite ou à base de leite a uma temperatura de 30-55°C, como 30- 50°C, como 31-45°C, como 32-50°C, como 35-43°C, como 35-40°C.

[086] A quantidade de fosfolipase a ser usada no método da invenção pode depender da atividade da fosfolipase específica nos fosfolipídeos presentes nas condições de tratamento específicas. Por exemplo, quando uma fosfolipase A1 é usada como mostrado no exemplo, a quantidade de fosfolipase adicionada pode estar entre 0,1 e 50 LEU por grama de gordura, como entre 0,5 e 25, entre 1 e 10 LEU por grama de gordura ou entre 3 e 8 LEU por grama de gordura.

[087] A atividade de uma fosfolipase pode ser determinada como a taxa de consumo de hidróxido de sódio durante a neutralização do ácido graxo. Essa atividade pode ser expressa em unidades de Lecitase (LEU) em relação a um padrão de Lecitase (fosfolipase). Os procedimentos são conhecidos na técnica. Por exemplo, a atividade da fosfolipase A1 pode ser medida em relação a um padrão de fosfolipase usando lecitina como substrato. A fosfolipase A1 catalisa a hidrólise da lecitina em liso-lecitina e um ácido graxo livre. O ácido graxo liberado é titulado com hidróxido de sódio 0,1 N em condições padrão (pH = 8,0; 40° ± 0,5). 1 LEU é definido como a quantidade de enzima que sob condições padrão (pH = 8,0; 40° ±0,5) resulta na mesma taxa de consumo de hidróxido de sódio (em microeq /min) que o padrão de Lecitase diluído para uma atividade nominal de 1 LEU/g. O método pode ser realizado usando um sistema automatizado ou equipamento de laboratório padrão para a realização de experimentos de titulação. Cultura Inicial

[088] A invenção é particularmente útil para inibir o crescimento de bactérias Gram-negativas, leveduras e bolores em produtos lácteos onde nenhuma cultura inicial é adicionada. Esses produtos podem ser não fermentados. No entanto, também está dentro do escopo do presente pedido que o produto lácteo pode ser opcionalmente inoculado com culturas iniciais para obter produtos fermentados. Culturas iniciais, de preferência bactérias de ácido láctico, podem ser usadas para fermentar a base de leite sob condições controladas, produzindo ácido láctico a partir dos açúcares que estão naturalmente presentes. A fermentação diminui o pH e permite o desenvolvimento de sabores. O termo “inicial” ou “cultura Inicial”, conforme usado no presente contexto, refere-se a uma cultura de um ou mais microrganismos de qualidade alimentar, particularmente bactérias de ácido láctico, que são responsáveis pela acidificação da base do leite. As culturas iniciais podem ser frescas, congeladas ou liofilizadas. Está dentro das habilidades dos especialistas determinar o tipo de cultura inicial e as quantidades a serem usadas, dependendo do produto lácteo desejado a ser produzido. Coagulação

[089] Para fazer queijo, coagulantes são usados para coagular a base do leite. Um coagulante é uma enzima capaz de separar o leite em componentes sólidos e líquidos. O componente sólido resultante é conhecido como coalhada, enquanto o componente líquido é chamado de soro de leite.

[090] Métodos de coagulação incluem o contato do leite com a quimosina originada do abomaso, de um bezerro ou com um coagulante comercialmente disponível, como a quimosina (EC

3.4.23.4), são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis comercialmente, por exemplo CHY-MAX® ou CHY-MAX® M (Chr. Hansen A/S, Dinamarca).

[091] Outros coagulantes úteis podem ser o coagulante microbiano mucorpepsina produzido por fermentação usando o fungo Rhizomucor miehei, que está comercialmente disponível como Hannilase® ou Microlant® (Chr. Hansen A/S, Dinamarca).

[092] Depois de adicionar o coagulante e submeter a base de leite a uma condição adequada, o processo de coagulação começa e continua por um período. Um especialista na técnica pode selecionar prontamente as condições de processo adequadas, como o tipo de queijo, temperatura, oxigênio, adição de carboidratos, quantidade e características da base de leite e o tempo de processamento. Este processo pode levar de duas, três, quatro, cinco, seis horas ou mais. De preferência, a coagulação é realizada a 30 a 40°C, como a 32 a 39°C, como 34 a 38°C.

[093] Uma vez que o leite é coagulado, a coalhada pode ser fermentada até que um pH predeterminado (por exemplo 6,4) seja alcançado. Em seguida, é separada do soro de leite e deixada para se formar em uma base. Neste ponto, a base é cortada em seções e em camadas para expelir mais líquido. A fermentação continua nesta forma em camadas até que o pH caia ainda mais, atingindo, por exemplo, o pH 5,1 a 5,7. A coalhada é então salgada ou tratada com salmoura. O tratamento adicional pode ser realizado com base no tipo desejado do queijo antes que o produto seja armazenado, curado e embalado. É preferível que o produto seja armazenado sob temperatura fria (abaixo de 15°C, como abaixo de 10°C ou abaixo de 6°C) para ajudar a estender a vida útil.

[094] Em uma representação preferencial, o método consiste em adicionar a fosfolipase A1 disponível sob a marca comercial YieldMAX® ou YieldMAX®PL (Chr. Hansen A/S, Dinamarca), por exemplo, a uma dosagem de 5-10 LEU-P/g de gordura do leite. A fosfolipase A1 pode ser adicionada à base de leite após a pasteurização do leite e durante o enchimento do tonel. É preferido que a temperatura do leite esteja entre 30°C - 40°C enquanto a fosfolipase é adicionada. A seguir, resta à base de leite um período para a reação enzimática, como 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 minutos.

[095] As etapas a seguir podem ser usadas para fazer um produto Queso Fresco de acordo com uma representação da presente invenção: a) fornecer uma base de leite e pasteurizar a base de leite, b) adicionar fosfolipase A1 à base de leite, c) aquecer a base de leite a uma temperatura de coagulação e adição de coagulante para obter uma coalhada,

d) cortar a coalhada, e) remover o soro de leite, f) adicionar água e mexer, g) moldar a coalhada, h) resfriar e tratar a coalhada com salmoura e i) embalar o queijo.

[096] O método pode consistir também na embalagem do produto lácteo para reduzir o contato com microrganismos indesejados.

[097] Incluídos no presente pedido estão os produtos lácteos obtidos pelos métodos descritos neste documento.

[098] Em algumas representações, os produtos lácteos preparados por meio dos métodos descritos no presente pedido têm uma contagem de coliformes inferior a 106 ufc/g no dia 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou dia 60 quando armazenados a uma temperatura entre 1-6°C.

[099] Em algumas representações, os produtos lácteos preparados usando os métodos descritos no pedido presente têm uma contagem de coliformes inferior a 105 ufc/g no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou dia 30 quando armazenados a uma temperatura entre 1-6°C.

[100] Em algumas representações, os produtos lácteos preparados usando os métodos descritos no pedido presente têm uma contagem de coliformes inferior a 104 ufc/g no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou no dia 20 quando armazenados a uma temperatura entre 1-6°C.

[101] Em algumas representações, os produtos lácteos preparados usando os métodos descritos no pedido presente têm uma contagem de coliformes inferior a 103 ufc/g no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou no dia 20 quando armazenados a uma temperatura entre 1-6°C.

[102] Em algumas representações, os produtos lácteos preparados usando os métodos descritos no pedido presente têm uma contagem de coliformes inferior a 102 ufc/g no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou no dia 20 quando armazenado a uma temperatura entre 1-6°C.

ITENS

[103] Os seguintes itens são representações preferenciais da presente invenção:

1. Método para inibir o crescimento de bactérias gram-negativas, leveduras e/ou bolores em um produto lácteo que consiste a adição de fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32) em uma base de leite.

2. Método de acordo com o item 1, em que a base de leite é leite cru ou leite pasteurizado.

3. Método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o método não compreende a etapa de adição de culturas iniciais à base de leite.

4. Método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o produto lácteo tem um pH superior a 5,0, de preferência 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3 , 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8 ou 6,9.

5. Método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o produto lácteo tem um teor de umidade superior a 40%, de preferência superior a 50%, como 40-90%, 42-80%, 45-70%, 50-65% ou 55-60%.

6. Método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o produto lácteo é um produto de queijo, de preferência um produto de queijo preparado a partir de leite cru.

7. Método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o produto lácteo é um produto de queijo, de preferência Queso Fresco, minas frescal, burgos, panela, quesito ou queijo de coalho.

8. Método de acordo com qualquer um dos itens anteriores 4-6, compreendendo ainda a etapa de coagulação da base de leite que consiste na fosfolipase.

9. Método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a fosfolipase A1 é de Aspergillus oryzae.

10. Método de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que as bactérias Gram-negativas são coliformes.

11. Uso de fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32) para inibir o crescimento de bactérias Gram-negativas, leveduras e/ou bolores em um produto lácteo.

12. Uso de acordo com o item 11, em que a fosfolipase A1 (EC

3.1.1.32) é adicionada a uma base de leite para preparar o produto lácteo e, opcionalmente, em que a base de leite é leite cru ou leite pasteurizado.

13. Uso de acordo com qualquer um dos itens 11-13, em que o produto lácteo não compreende culturas iniciais adicionadas à base de leite.

14. Uso de acordo com qualquer um dos itens 11-13, em que o produto lácteo tem um pH superior a 5,0, de preferência 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8 ou 6,9.

15. Uso de acordo com qualquer um dos itens 11-14, em que o produto lácteo tem um teor de umidade que é superior a 40%, de preferência superior a 50%, como 40-90%, 42-80%, 45-70%, 50-65% ou 55-60%.

16. Uso de acordo com qualquer um dos itens 11-15, em que o produto lácteo é um produto de queijo, de preferência um produto de queijo preparado a partir de leite cru.

17. Uso de acordo com qualquer um dos itens 11-16, em que o produto lácteo é um produto de queijo, de preferência Queso Fresco, minas frescal, burgos, panela, quesito ou queijo de coalho.

18. Uso de acordo com qualquer um dos itens 11-17, em que a base de leite que compreende a fosfolipase é coagulada com o uso de um coagulante.

19. Uso de acordo com qualquer um dos itens 11-18, em que a fosfolipase A1 é de Aspergillus oryzae.

20. Uso de acordo com qualquer um dos itens 11-19, em que as bactérias Gram-negativas são coliformes.

21. Um produto lácteo que consiste em fosfolipase A1 ou um produto lácteo preparado a partir dos métodos de acordo com qualquer um dos itens 1-10.

22. Produto de acordo com o item 21, em que o produto lácteo é preparado a partir de uma base de leite que consiste em fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32).

23. Produto de acordo com o item 22, em que a base de leite é leite cru ou leite pasteurizado.

23. Produto de acordo com qualquer um dos itens 21-23, em que o produto lácteo não compreende culturas iniciais adicionadas à base de leite.

24. Produto de acordo com qualquer um dos itens 21-23, em que o produto lácteo tem um pH superior a 5,0, de preferência 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8 ou 6,9.

25. Produto de acordo com qualquer um dos itens 21-24, em que o produto lácteo tem um teor de umidade que é superior a 40%, de preferência superior a 50%, como 40-90%, 42-80%, 45-70%, 50-65% ou 55-60%.

26. Produto acordo com qualquer um dos itens 21-25, em que o produto lácteo é um produto de queijo, de preferência um produto de queijo preparado a partir de leite cru.

27. Produto de acordo com qualquer um dos itens 21-26, em que o produto lácteo é um produto de queijo, de preferência Queso Fresco, minas frescal, burgos, panela, quesito ou queijo de coalho.

28. Produto de acordo com qualquer um dos itens 21-27, em que a base de leite que compreende a fosfolipase é coagulada com o Produção de um coagulante.

29. Produto de acordo com qualquer um dos itens 21-28, em que a fosfolipase A1 é de Aspergillus oryzae.

30. Produto de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que as bactérias Gram-negativas são coliformes.

31. Produto, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, caracterizado pelo fato de a contagem de coliformes do produto ser inferior a 105 ufc/g no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou dia 30 quando armazenado a uma temperatura entre 1-6°C .

32. Produto, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, caracterizado pelo fato de a contagem de coliformes do produto ser inferior a 104 ufc/g no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou dia 20 quando armazenado a uma temperatura entre 1-6°C.

33. Produto, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, caracterizado pelo fato de a contagem de coliformes do produto ser inferior a 103 ufc/g no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou dia 20 quando armazenado a uma temperatura entre 1-6°C.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 EFEITO BIOPROTETOR DA FOSFOLIPASE NO MINAS FRESCAL Exemplo 1.1 Preparação de queijo minas frescal

[104] As etapas a seguir foram realizadas para a produção do queijo minas frescal: - pasteurizar leite em processo de curta duração em alta temperatura (HTST) e padronizar com 3,0% de gordura e 3% de proteína, - encher o tanque com leite a 34°C, - adicionar fosfolipase A1 (YieldMAX®PL Chr. Hansen A/S, Dinamarca, a uma dosagem de 5 LEU/g de gordura), - adicionar cloreto de cálcio, ácido lático e corante de clorofila, - aquecer até 38-39°C até o final do enchimento, - adicionar coagulante (CHY-MAX®M da Chr. Hansen A/S, Dinamarca), - cortar a coalhada e deixar descansar por 10 minutos, - agitar por 35-45 minutos, - moldar em formas e torneamento, - esfriar, - embalar para armazenamento.

[105] O queijo de controle foi preparado com as mesmas etapas, mas sem a adição de fosfolipase A1. Resultados - Perfil de pH

[106] A Figura 1 mostra o perfil de acidificação das amostras de queijo tratadas com fosfolipase A1 (queijo testado) e sem fosfolipase (queijo de controle). O pH dos queijos no dia da fabricação estava entre 6,35 e 6,45. É possível observar na figura que o queijo de controle apresentou uma diminuição mais rápida do pH. Isso ocorreu devido à presença de contaminação por bactérias, principalmente coliformes, que se desenvolveram ao longo da vida útil. Os coliformes não apenas baixaram o pH rapidamente, mas também geraram enzimas e gases que modificaram o sabor do queijo desfavoravelmente. No entanto, o queijo tratado com fosfolipase tem uma diminuição mais lenta do pH. Esta diferença de pH no final do prazo de validade é muito perceptível para os consumidores. Este exemplo demonstra que o tratamento enzimático teve uma influência positiva na melhoria do perfil de redução do pH e pode ser usado para estender a vida útil. Resultados - avaliação sensorial

[107] A percepção de frescor é outro fator importante muito apreciado pelos consumidores. Para avaliar isso, uma análise sensorial discriminatória bilateral foi conduzida para encontrar a amostra “mais fresca” ou “mais jovem” entre duas amostras de queijo que são codificadas aleatoriamente. Mais especificamente, duas amostras foram apresentadas a cada avaliador: o queijo testado (tratado com fosfolipase) e o queijo de controle (sem tratamento com fosfolipase) no último dia de vida de prateleira (D+30).

[108] Constatou-se que 90% dos avaliadores identificaram o queijo tratado com fosfolipase como o mais fresco (erro estatístico calculado 0,001%). Resultados - formação de gás

[109] Além disso, menos formação de gás foi observada em queijos tratados com fosfolipase durante a vida útil. A Figura 2 mostra a formação de gás no queijo tratado com fosfolipase (Lotes 1 e 2) e sem (Lotes 3 e 4). Todos os lotes foram feitos com o uso de leite de composição idêntica, armazenados no mesmo silo e fabricados nos mesmos tanques.

[110] Pode-se observar na Figura 2 que nenhum orifício aparente foi mostrado para o queijo tratado com enzima (Lotes 1 e 2). O teste sensorial também não revelou quaisquer sabores estranhos que se desenvolveram durante a vida útil. Isso demonstra que a fosfolipase A1 é capaz de inibir o crescimento de microrganismos formadores de gás. Exemplo 1.2 Preparação de queijo minas frescal

[111] As etapas a seguir foram realizadas para a produção do queijo minas frescal: - pasteurizar o leite HTST e padronizar com gordura a 2,80% (relação gordura/proteína = 0,93), - encher o tanque com leite a 39°C, - adicionar fosfolipase A1 (YieldMAX®PL Chr. Hansen A/S, Dinamarca, a uma dosagem de 5 LEU/g de gordura), - adicionar cloreto de cálcio e ácido láctico (pH 6,45), - adicionar coagulante (CHY-MAX® M, Chr. Hansen A/S, Dinamarca), - coagular por 30 minutos, - cortar a coalhada e deixar descansar por 2-3 minutos, - agitar por 18 minutos, - salgar a coalhada (1,2% com base no volume de leite), - moldar em formas e torneamento, - esfriar, - embalar para armazenamento.

[112] Produtos de queijo nos dias 22 e dia 43 foram avaliados em relação ao pH, teor de gordura, teor de umidade e contagem de coliformes.

[113] O teor de gordura foi determinado pelo método de queijo e produto de queijo processado da IDF (International Dairy Federation) (1986). Determinação do Conteúdo de Gordura - Método Gravimétrico (Método de Referência). Padrão FIL-IDF 5B: 1986. International Dairy Federation, Bruxelas, Bélgica.

[114] O teor de umidade foi especificado pela Determinação do teor total de sólidos do queijo e queijo processado do método da IDF (International Dairy Federation) (1982). Padrão FIL-IDF 4A:

1982. International Dairy Federation, Bruxelas, Bélgica.

[115] A contagem de coliformes foi determinada pela Enumeração de coliformes do método da IDF (International Dairy Federation)

(1985) (leite e produtos lácteos) Padrão FIL- 73A: 1985. International Dairy Federation, Bruxelas, Bélgica.

[116] Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo. Tabela 1 Amostra pH Gordura Umidade Coliforme ufc/g Controle 5,34 20,5% 56,4% 1,7 x 106 Dia 22 Tratado 5,40 20,0% 58,4% 1,2 x 105 Controle 5,28 20,5% 53,9% 1,1 x 107 Dia 43 Tratado 5,44 20,0% 58,2% 9,2 x 105

[117] A avaliação sensorial também mostrou que as amostras de queijo tratadas mantiveram suas características mesmo no final da vida útil. As amostras de controle apresentaram algumas alterações sensoriais desfavoráveis. Exemplo 1.3 Preparação de queijo minas frescal

[118] As etapas a seguir foram realizadas para a produção do queijo minas frescal: - pasteurizar leite HTST e padronizar com gordura a 3,0% e proteína a 3%, - encher o tanque com leite a 34°C, - adicionar fosfolipase A1 (YieldMAX®PL, Chr. Hansen A/S, Dinamarca, a uma dosagem de 5 LEU/g de gordura), - adicionar cloreto de cálcio, ácido lático e corante de clorofila, - aquecer até 38-39°C até o final do enchimento, - adicionar coagulante (CHY-MAX® M, Chr. Hansen A/S, Dinamarca), - cortar a coalhada e deixar descansar por 10 minutos, - agitar por 35-45 minutos, - moldar em formas e torneamento, - esfriar, - embalar para armazenamento.

[119] As contagens de coliformes foram determinadas nos dias 9, 15, 20 e 30, por meio do mesmo método descrito no exemplo 1.2. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

Tabela 2 Coliforme Amostra ufc/g Controle 2,8 x 103 Dia 9 Tratado 1,3 x 103 Controle 6,3 x 103 Dia 15 Tratado 5,8 x 103 Controle 1,8 x 104 Dia 20 Tratado 6,6 x 103 Controle 6,6 x 104 Dia 30 Tratado 7,4 x 103

[120] Como pode ser visto na tabela, o crescimento de coliformes foi inibido em amostras de queijo tratadas com fosfolipase.

[121] A avaliação sensorial mostrou que os queijos apresentaram notável diferença no sabor. A amostra tratada manteve suas características até o final da vida útil, ao contrário do queijo de controle que apresentou alteração desfavorável de textura e sabor. Exemplo 1.4 Preparação de queijo minas frescal

[122] As etapas a seguir foram realizadas para a produção do queijo minas frescal: - pasteurizar leite HTST e padronizar com gordura a 2,50% (relação gordura/proteína = 0,81), - encher o tanque com leite a 39°C, - adicionar fosfolipase A1 (YieldMAX® PL, Chr. Hansen A/S, Dinamarca), - adicionar cloreto de cálcio e ácido láctico (pH 6,45), - adicionar coagulante (CHY-MAX® M, Chr. Hansen A/S, Dinamarca), - coagular por 18 minutos, - cortar a coalhada e deixar descansar por 2-3 minutos, - agitar por 15 minutos, - moldar em formas e torneamento, - salgar com salmoura a 20%, - esfriar,

- embalar para armazenamento.

[123] As contagens de coliformes foram determinadas no dia 16 com o mesmo método descrito no exemplo 1.2. As contagens de bolor e levedura foram medidas pela Enumeração de levedura e bolor do método da IDF (International Dairy Federation) (1995) (leite e produtos lácteos) Padrão FIL-IDF 94B: 1995. International Dairy Federation, Bruxelas, Bélgica.

[124] Os resultados são mostrados na Tabela 3. Tabela 3 Bolor e Amostra pH Gordura Umidade levedura ufc/g Dia Controle 4,82 16,5% 61,8% 2,4 x 105 16 Tratado 4,89 15,0% 66,8% 6,0 x 104

[125] Este exemplo demonstra que a fosfolipase A1 pode ser usada para inibir bolor e levedura, embora os produtos tratados apresentem maior umidade. EXEMPLO 2 EFEITO BIOPROTETOR DA FOSFOLIPASE NO QUESO FRESCO Preparação de queijo Queso Fresco

[126] As etapas a seguir foram usadas para produzir Queso Fresco - pasteurizar leite HTST e padronizar com gordura a 3,00% (relação gordura/proteína = 0,93), - encher o tanque com leite a 40°C, - adicionar fosfolipase A1 (YieldMAX® PL, Chr. Hansen A/S, Dinamarca a 5 LEU/g de gordura do leite), - adicionar cloreto de cálcio e ácido láctico (pH 6,45), - adicionar coagulante (CHY-MAX® M, Chr. Hansen A/S, Dinamarca), - coagular por 30 minutos, - cortar a coalhada e deixar descansar por 2-3 minutos, - agitar por 20 minutos, - moldar em formas e torneamento, - salgar com salmoura a 20%, - esfriar, - embalar para armazenamento.

Resultados - perfil de acidificação

[127] A vida útil normal do Queso Fresco é de cerca de 4 semanas. O pH do queijo tratado com fosfolipase e do queijo de controle foi medido semanalmente por um período de 5 semanas. Os resultados são mostrados no gráfico de intervalo na Figura 3 (CI 95% para a média). Uma vez que nenhuma cultura inicial foi usada ao fazer o Queso Fresco, os produtos tinham pH alto durante a vida útil (pH cerca de 6,6-6,9 na semana 1). Pode ser visto claramente que o pH do queijo tratado (pontilhado) foi constantemente mais alto do que o queijo de controle (tracejado) ao longo da vida útil. Isso demonstra que a fosfolipase pode manter o valor do pH alto e prolongar a vida útil. Resultados - teor de umidade

[128] O Queso Fresco é um queijo com alto teor de umidade, normalmente em torno de 60%. O teor de umidade do queijo tratado e do queijo de controle foi medido pela Determinação do teor total de sólidos do queijo e queijo processado do método da IDF (International Dairy Federation) (1982). Padrão FIL-IDF 4A:

1982. International Dairy Federation, Bruxelas, Bélgica.

[129] Os resultados são mostrados no gráfico de intervalo na Figura 4 (CI 95% para a média). O teor de umidade no Queso Fresco tratado com fosfolipase A1 foi maior do que no queijo de controle durante o período de 5 semanas. Isso demonstra que a fosfolipase pode manter alto o teor de umidade.

[130] A redução do teor de umidade é uma indicação de perda de soro na embalagem e alterações na textura do queijo, algo não valorizado pelos consumidores. A Figura 5 mostra a aparência de ambas as amostras de queijo. O queijo tratado com a enzima apresentou menos perda de soro e tinha uma aparência mais agradável, o que é preferido pelo consumidor. Resultados - contagens de coliformes

[131] As contagens de coliformes para ambas as amostras de queijo foram medidas todas as semanas durante 5 semanas pela Enumeração de coliformes do método da IDF (International Dairy Federation) (1985) (leite e produtos lácteos) Padrão FIL-IDF 73A: 1985. International Dairy Federation, Bruxelas, Bélgica.

[132] A Figura 6 mostra o a média de registro de coliformes em queijo tratado com (direita) e sem (esquerda) fosfolipase. Uma clara inibição pode ser observada no queijo tratado.

[133] Além disso, ambas as amostras de queijo da semana 4 foram testadas quanto à presença de coliformes nas placas, determinado pela Enumeração de coliformes do método da IDF (International Dairy Federation) (1985) (leite e produtos lácteos) Padrão FIL- IDF 73A: 1985. International Dairy Federation, Bruxelas, Bélgica.

[134] A Figura 7 mostra as placas de contagem de coliformes para Queso Fresco tratado com fosfolipase (esquerda) e sem (direita) (2 repetições cada). Cada ponto preto indica uma colônia de coliformes. Há uma redução clara da formação de coliformes em Queso Fresco tratado com fosfolipase. EXEMPLO 3 EFEITO BIOPROTETOR DA FOSFOLIPASE NO QUEIJO DE COALHO Exemplo 3.1 Preparação de queijo de coalho

[135] As etapas a seguir foram realizadas para produzir queijo de coalho - pasteurizar leite HTST e padronizar com gordura a 3,2% (relação gordura/proteína 1,0), - encher o tanque com leite a 34°C, - adicionar fosfolipase A1 (YieldMAX® PL, Chr. Hansen A/S, Dinamarca), - adicionar cloreto de cálcio (20g/100 L de leite para queijo), - adicionar coagulante (28 IMCU/L) e coagular cerca de 30 minutos, - cortar a coalhada em cubos de 5-7 mm, - agitar por 20 minutos, - escaldar a 42°C (1°C/1,5 minutos), - agitar por 45-50 minutos, - drenar, - salgar (1 a 2% do volume inicial de leite), - pré-prensar (20 minutos), - moldar em formas e torneamento, - prensar 4 - 6 kg /cm2 por 1,5-2 horas,

- embalar para armazenamento. Resultados - pH, teor de umidade e contagens de coliformes

[136] O pH, o teor de umidade e as contagens de coliformes das amostras de queijo foram medidos nos dias 41 e 62.

[137] O teor de umidade foi especificado pela Determinação do teor total de sólidos do queijo e queijo processado do método da IDF (International Dairy Federation) (1982). Padrão FIL-IDF 4A:

1982. International Dairy Federation, Bruxelas, Bélgica.

[138] Os coliformes foram determinados pela Enumeração de coliformes do método da IDF (International Dairy Federation) (1985) (leite e produtos lácteos) Padrão FIL-IDF 73A: 1985. International Dairy Federation, Bruxelas, Bélgica.

[139] A tabela abaixo mostra o total de coliformes, umidade e pH das amostras de queijo. Tabela 4 Amostra pH Umidade Coliforme ufc/g Controle 5,66 47,9% 1,2 x 107 Dia 41 Tratado 6,35 49,3% 6,0 x 102 Controle 5,51 47,9% 7,2 x 107 Dia 62 Tratado 6,19 48,2% 4,0 x 105 Resultados - testes de fusão

[140] O pH do produto tem efeito na hipótese de derretimento do produto quando aquecido. Ambas as amostras de queijo de coalho do dia 41 (esquerda) e dia 62 (direita) foram testadas em grelha aquecida. Conforme mostrado na Figura 8, em ambos os ensaios, o queijo tratado com enzima (parte inferior) não derreteu, em contraste com o queijo de controle (parte superior). Exemplo 3.2 Preparação de queijo de coalho

[141] As etapas a seguir foram realizadas para produzir queijo de coalho: - pasteurizar leite HTST e padronizar com gordura a 3,2% (relação gordura/proteína 1,0), - encher o tanque com leite a 34°C,

- adicionar fosfolipase A1 (YieldMAX® PL, Chr. Hansen A/S, Dinamarca), - adicionar cloreto de cálcio (20g/100 L de leite para queijo), - adicionar coagulante (28 IMCU/L) e coagular cerca de 30 minutos, - cortar a coalhada em cubos de 5-7 mm, - agitar por 20 minutos, - escaldar a 42°C (1°C/1,5 minutos), - agitar por 45-50 minutos, - drenar, - salgar (1 a 2% do volume inicial de leite), - pré-prensar (20 minutos), - moldar em formas e torneamento, - prensar 4 - 6 kg/cm2 por 1,5-2 horas, - embalar para armazenamento. Resultados- pH, gordura, teor de umidade e contagens de coliformes

[142] O pH, a gordura, o teor de umidade e contagens de coliformes das amostras de queijo foram medidos nos dias 6, 27 e 63 por meio dos métodos conforme descritos no Exemplo 1.2.

[143] A tabela abaixo mostra o total de coliformes, umidade, gordura e pH das amostras de queijo. Para o dia 6, as contagens de coliformes para as amostras de controle e tratadas não podem ser calculadas devido à diluição insuficiente. No entanto, a densidade menor de coliformes pode ser observada visualmente para a amostra tratada. Tabela 5 Amostra pH Gordura Umidade Coliforme ufc/g 6,13 29,0 46,6 > 3,0 x Controle 104 Dia 6 6,19 31,0 45,0 > 3,0 x Tratado 104 Controle NA NA 46,3 1,3 x 106 Dia 27 Tratado NA NA 46,0 4,2 x 105

Controle 5,07 29,0 NA 1,9 x 106 Dia 63 Tratado 5,60 30,0 NA 6,2 x 105

[144] Este exemplo demonstra que a fosfolipase pode ser usada na preparação de queijo de coalho para inibir o crescimento de coliformes.

Claims (14)

Reivindicações

1. Método para inibir o crescimento de bactérias gram- negativas, preferencialmente bactérias de coliformes, leveduras e/ou bolores em um produto lácteo, caracterizado por compreender a adição de fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32) em uma base de leite.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela base de leite ser leite cru ou leite pasteurizado.

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por não compreender adição de cultura inicial à base de leite.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo produto lácteo ter um pH superior a 5,0, de preferência 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3 , 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8 ou 6,9.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo produto lácteo ter um teor de umidade superior a 40%, de preferência superior a 50%, como 40- 90%, 42-80%, 45-70%, 50-65% ou 55-60%.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo produto lácteo ser um produto de queijo, de preferência um produto de queijo preparado a partir de leite cru.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo produto lácteo ser um produto de queijo, de preferência queijo fresco, minas frescal, burgos, panela, quesito ou queijo coalho.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 4-6, caracterizado por consistir ainda na etapa de coagulação da base de leite que compreende a fosfolipase.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela fosfolipase A1 ser de Aspergillus oryzae.

10. Produto lácteo, obtido pelos métodos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por compreender a fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32) como um inibidor do crescimento de bactérias Gram-negativas, preferencialmente bactérias coliformes, leveduras e/ou bolores em um produto lácteo.

11. Produto lácteo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela fosfolipase A1 (EC 3.1.1.32) ser adicionada a uma base de leite.

12. Produto lácteo, de acordo com as reivindicações 10 a 11, caracterizado por não compreender culturas iniciais adicionadas à base de leite.

13. Produto lácteo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado por - o produto lácteo ter um pH superior a 5,0, de preferência 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8 ou 6,9, e/ou - o produto lácteo ter um teor de umidade superior a 40%, de preferência superior a 50%, como 40-90%, 42-80%, 45-70%, 50-65% ou 55-60%.

14. Produto lácteo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado por ser um produto de queijo, preferencialmente um produto de queijo preparado a partir de leite cru ou queijo fresco, minas frescal, burgos, panela, quesito ou queijo coalho.