BR112021007555A2

BR112021007555A2 - conjugados anticorpo-fármaco (adcs) silenciados em fc e usos dos mesmos

Info

Publication number: BR112021007555A2
Application number: BR112021007555-0A
Authority: BR
Inventors: Rahul Palchaudhuri; Anthony Boitano; Michael Cooke; Charlotte Fenton McDonagh; Bradley R. Pearse; Ganapathy N. SARMA
Original assignee: Magenta Therapeutics, Inc.
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2021-08-03
Also published as: US20200255523A1; WO2020086776A1; EP3873930A4; EP3873930A1; CN113330026A; KR20210081393A; IL282292A; MX2021004231A; CA3115680A1; AU2019366960A1; CO2021006259A2; SG11202103568PA; JP2022512629A

Abstract

CONJUGADOS ANTICORPO-FÁRMACO (ADCS) SILENCIADOS EM FC E USOS DOS MESMOS. São divulgados anticorpos e conjugados anticorpo-fármaco tendo uma região Fc com substituições que resultam em essencialmente uma região Fc silenciosa. Os anticorpos e conjugados anticorpo-fármaco aqui descritos são úteis para a depleção de células e para o tratamento de várias doenças hematopoiéticas, transtornos metabólicos, cânceres, e.g., leucemia mieloide aguda (AML) e doenças autoimunes, entre outros. As composições e métodos aqui descritos podem ser usados para tratar um transtorno diretamente, por exemplo, pelo esgotamento de, e.g., uma população de células de câncer CD45+ ou CD117+ ou células autoimunes CD45+. As composições e métodos aqui descritos também podem ser usados para preparar um paciente para terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas e para melhorar o enxerto de transplante de células-tronco hematopoiéticas pelo esgotamento seletivo de células-tronco hematopoiéticas endógenas antes do procedimento de transplante.

Description

“CONJUGADOS ANTICORPO-FÁRMACO (ADCS) SILENCIADOS EM FC E USOS DOS MESMOS” Pedidos Relacionados

[001]Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório dos EUA No 62/749.662, depositado em 23 de outubro de 2018; Pedido Provisório dos EUA No 62/773.839, depositado em 30 de novembro de 2018; e Pedido Provisório dos EUA No 62/807.363, depositado em 19 de fevereiro de 2019. O conteúdo de cada um dos pedidos prioritários é aqui incorporado por referência. Campo

[002]A presente divulgação se refere ao campo de anticorpos ou conjugados anticorpo-fármaco dos mesmos compreendendo uma região Fc que tem as funções efetoras alteradas como um resultado de uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc. A presente divulgação se refere ainda ao tratamento de pacientes que sofrem de várias patologias, tais como doenças sanguíneas, transtornos metabólicos, cânceres e doenças autoimunes, entre outros, pela administração de um anticorpo ou conjugado fármaco-anticorpo (ADC) tendo uma região Fc modificada, em que o anticorpo ou ADC é capaz de se ligar a um antígeno expressado por uma célula hematopoiética, tal como uma célula-tronco hematopoiética ou células do sistema imunológico do hospedeiro. Antecedentes

[003]A região Fc de um anticorpo controla as atividades citotóxicas do anticorpo e pode impactar a meia-vida sérica do anticorpo. Em um contexto terapêutico, entretanto, a função efetora citotóxica de um anticorpo frequentemente não é desejável e pode criar preocupações de segurança e efeitos colaterais indesejados ao ativar as defesas imunes do hospedeiro. Várias alterações de aminoácidos na região Fc foram relatadas para silenciar ou reduzir a função efetora de anticorpos. Na verdade, estudos anteriores identificaram posições de aminoácidos dentro da região Fc de anticorpos que impactam a capacidade do anticorpo de se ligar a um receptor Fc (ver, por exemplo, Wang et al. (2018) Protein Cell. Janeiro de 2018; 9(1): 63-73). Por exemplo, mutações S239D e I332E de Fc foram descritas na literatura como intensificando a função de ADCC (ver, e.g., Lazar et al. (2006) Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci USA. 103: 4005-4010). Outras mutações estão associadas com a ligação reduzida de FcγR e C1q, e.g., em uma IgG1, as alterações de aminoácidos L234A/L235A, ou em uma IgG4, as alterações de aminoácidos F234A/L235A (Xu et al. In vitro characterization of five humanized OKT3 effector function variant antibodies. Cell Immunol. 2000; 200: 16-26). O que é menos conhecido, entretanto, é como mutações de Fc podem impactar os conjugados anticorpo-fármaco (ADCs), especialmente quando a toxina é conjugada ao anticorpo ou fragmento contendo Fc dentro da região Fc.

[004]Apesar dos avanços nas artes medicinais, permanece uma demanda pelo tratamento de patologias do sistema hematopoiético, tais como doenças de uma célula do sangue particular, transtornos metabólicos, cânceres e condições autoimunes, entre outros. Embora as células-tronco hematopoiéticas tenham potencial terapêutico significativo, uma limitação que tem impedido seu uso na clínica é a dificuldade associada com garantir o enxerto de transplantes de células-tronco hematopoiéticas (HSC) em um hospedeiro. Em particular, as terapias com célula- tronco hematopoiética envolvendo anticorpos que alvejam antígenos da superfície celular em HSC endógenas podem desencadear funções efetoras e imunoestimuladoras indesejadas que impedem o enxerto de um transplante de HSC exógena. Existe atualmente uma necessidade por composições e métodos para promover o enxerto de enxertos de células-tronco hematopoiéticas exógenas de tal modo que a multi-potência e funcionalidade hematopoiética dessas células sejam preservadas após o transplante. Existe também uma necessidade por ADCs aperfeiçoados, por exemplo, que podem ser usados para o condicionamento tendo função efetora reduzida para reduzir secreção potencial de citocina e possíveis efeitos colaterais. Sumário

[005]São aqui descritos anticorpos, e porções de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma região Fc que tem as funções efetoras alteradas como um resultado de uma ou mais substituições de aminoácidos na região Fc, bem como conjugados anticorpo-fármaco, composições e métodos de uso dos ditos anticorpos. Em particular, são aqui fornecidos anticorpos ou conjugados anticorpo-fármaco (ADC) que tenham regiões Fc modificadas, em que os anticorpos ou ADCs são capazes de se ligarem a um antígeno expressado por uma célula hematopoiética, tal como uma célula-tronco hematopoiética ou uma célula imune madura (e.g., células T). Além disso, são aqui fornecidos ADCs contendo mutações de Fc que fornecem um sítio de conjugação para a toxina e reduzem a função efetora, bem como fornecem estabilidade. Assim, a divulgação fornece combinações únicas de mutações de Fc para ADCs.

[006]Em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido nas posições L234 e L235 (índice EU) e a substituição de aminoácido D265C (índice EU), e em que o anticorpo é um anticorpo IgG intacto. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma substituição de aminoácido nas posições L234 e L235 (índice EU) e a substituição de aminoácido D265A (índice EU), e em que o anticorpo é um anticorpo IgG intacto. Em uma modalidade, a substituição de aminoácido L234 é L234A. Em uma modalidade, a substituição de aminoácido L235 é L235A.

[007]Em algumas modalidades, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H435 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido H435 é H435A. Em uma modalidade, o anticorpo compreendendo a substituição de aminoácido H435A tem uma meia-vida reduzida em relação a um anticorpo IgG intacto idêntico compreendendo uma região Fc não modificada.

[008]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo compreendendo uma região Fc tendo substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos L234A, L235A e D265C (índice EU), e em que o anticorpo é um anticorpo IgG intacto. Em uma modalidade, o anticorpo compreendendo uma região Fc tendo substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos L234A, L235A e D265A (índice EU), e em que o anticorpo é um anticorpo IgG intacto.

[009]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que as regiões Fc compreendem as substituições de aminoácidos nas posições L234, L235 (índice EU) e D265 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido D265 é D265C ou D265A (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido L234 é L234A ou L234V. Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido L235 é L235A. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição N297 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição E233 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma deleção de G236 (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P331 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido P331 é P331G. Em uma outra modalidade, a região Fc não inclui uma substituição na posição P331 (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P329 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido P329 é P329G. Em uma outra modalidade, a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição I253 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido I253 é I253A. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H310 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido H310 é H310A.

[010]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição N297 e D265 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido na posição D265 é D265C ou D265A (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido nas posições L234 e L235 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido L234 é L234A ou L234V. Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido L235 é L235A. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição E233 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma deleção de G236 (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P331 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido P331 é P331G. Em uma outra modalidade, a região Fc não inclui uma substituição na posição P331 (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P329 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido P329 é P329G. Em uma outra modalidade, a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição I253 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido I253 é I253A. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H310 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido H310 é H310A.

[011]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido nas posições E233, L234, L235 e D265 (índice EU) e uma deleção de G236 (índice EU), e uma substituição de aminoácido em D265 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido em D265 é D265C ou D265A (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido L234 é L234A ou L234V. Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido L235 é L235A. Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição N297 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P331 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido P331 é P331G. Em uma outra modalidade, a região Fc não inclui uma substituição na posição P331 (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P329 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido P329 é P329G. Em uma outra modalidade, a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição I253 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido I253 é I253A. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H310 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido H310 é H310A.

[012]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição H435 e D265 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido na posição D265 é D265C ou D265A (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido H435 é H435A. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição N297 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido nas posições L234 e L235 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido L234 é L234A ou L234V. Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido L235 é L235A. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição E233 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma deleção de G236 (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P331 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido P331 é P331G. Em uma outra modalidade, a região Fc não inclui uma substituição na posição P331 (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P329 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido P329 é P329G. Em uma outra modalidade, a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição I253 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido I253 é I253A. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H310 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido H310 é H310A.

[013]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido nas posições L234 e L235 (índice EU) e a substituição de aminoácido P329 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido L234 é L234A ou L234V. Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido L235 é L235A. Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição D265 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido D265 é D265C ou D265A (índice EU). Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição N297 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q (índice EU). Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição E233 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU). Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma deleção de G236 (índice EU). Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P331 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido P331 é P331G. Em uma modalidade, a região Fc não inclui uma substituição na posição P331 (índice EU). Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição I253 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido I253 é I253A. Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H310 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido H310 é H310A.

[014]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido nas posições L234 e L235 (índice EU) e a substituição de aminoácido P331 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido L234 é L234A ou L234V. Em uma modalidade, a substituição de aminoácido L235 é L235A. Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição D265 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido D265 é D265C ou D265A (índice EU). Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição N297 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q (índice EU). Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição E233 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU). Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma deleção de G236 (índice EU). Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P329 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido P329 é P329G. Em uma modalidade, a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU). Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição I253 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido I253 é I253A. Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H310 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido H310 é H310A.

[015]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido nas posições E233 e L234 e L235 (índice EU), uma deleção de G236 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido L234 é L234A ou L234V. Em uma modalidade, a substituição de aminoácido L235 é L235A. Em uma modalidade, a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU). Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H435 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido H435 é H435A. Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição N297 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q (índice EU). Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P331 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido P331 é P331G. Em uma modalidade, a região Fc não inclui uma substituição na posição P331 (índice EU). Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P329 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido P329 é P329G. Em uma modalidade, a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU). Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição I253 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido I253 é I253A. Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H310 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido H310 é H310A.

[016]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido nas posições I253, H310 e H345 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido I253 é I253A. Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido H310 é H310A. Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido H435 é H435A. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição N297 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição D265 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido D265 é D265C ou D265A

(índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição E233 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma deleção de G236 (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P329 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido P329 é P329G. Em uma outra modalidade, a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P331 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido P331 é P331G. Em uma outra modalidade, a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU).

[017]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição N297 (índice EU). Em uma modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido nas posições L234 e L235 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido L234 é L234A ou L234V. Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido L235 é L235A. Em uma outra modalidade, a região Fc não inclui uma substituição nas posições L234 e L235 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição E233 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma deleção de G236 (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P331 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido P331 é P331G. Em uma outra modalidade, a região Fc não inclui uma substituição na posição P331 (índice

EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P329 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido P329 é P329G. Em uma outra modalidade, a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição I253 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido I253 é I253A. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H310 (índice EU). Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido H310 é H310A.

[018]Em algumas modalidades, o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende qualquer combinação de substituições para a região Fc como aqui descrito.

[019]Em algumas modalidades, o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição S239 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido S239 é S239C.

[020]Em algumas modalidades, o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H435 (índice EU). Em uma modalidade, a substituição de aminoácido H435 é H435A. Em uma outra modalidade, o anticorpo compreende uma substituição de aminoácido H435A e tem uma meia-vida reduzida em relação a um anticorpo IgG intacto idêntico compreendendo uma região Fc não modificada.

[021]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A, S239C e D265A (índice EU).

[022]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A, S239C e D265C (índice EU).

[023]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos L234A, L235A e D265C (índice EU).

[024]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos L234A, L235A e D265A (índice EU).

[025]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos L234A, L235A, S239C e D265A (índice EU).

[026]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos H435A, L234A, L235A e D265C (índice EU).

[027]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos N297A e D265C (índice EU).

[028]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos N297G e D265C (índice EU).

[029]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos N297Q e D265C (índice EU).

[030]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos N297A e D265A (índice EU).

[031]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos N297G e D265A (índice EU).

[032]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos N297Q e D265A (índice EU).

[033]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo tem uma diminuição em uma função efetora definida como uma diminuição na ligação a um receptor Fc gama (FcγR) em relação à ligação de um anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada para o FcγR. Em algumas modalidades, a diminuição na ligação é pelo menos uma diminuição de 70 %, pelo menos uma diminuição de 80 %, pelo menos uma diminuição de 90 %, pelo menos uma diminuição de 95 %, pelo menos uma diminuição de 98 %, pelo menos uma diminuição de 99 % ou uma diminuição de 100 % na ligação de anticorpo a um FcγR em relação à ligação do anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada para o FcγR. Em uma outra modalidade, o anticorpo se liga de forma não detectável ao FcγR. Em uma outra modalidade, a ligação do anticorpo ao FcγR é avaliada por interferometria de biocamada (BLI). Em uma outra modalidade, a ligação do anticorpo ao FcγR é avaliada usando ensaios conhecidos por um especialista na técnica. Em uma outra modalidade, o FcγR é um receptor FcγR1. Em uma outra modalidade, o receptor FcγR é um receptor FcγR2 ou um receptor FcγR3. Em uma outra modalidade, o receptor FcγR2 é FcγR2A, FcγR2B ou FcγR2C. Em uma outra modalidade, o receptor FcγR3 é FcγR3A ou FcγR3B. Em uma outra modalidade, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em outras modalidades, o receptor FcγR é um receptor FcγR2A 167R. Em outras modalidades, o receptor FcγR é um receptor FcγR3A 176V. Em outras modalidades, o receptor FcγR é um receptor FcγR3A 176F.

[034]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, em que o anticorpo diminui a liberação de citocina em um ensaio de liberação de citocina in vitro com uma diminuição na liberação de citocina de pelo menos 50 % em relação à liberação de citocina de um anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada. Em uma modalidade, a diminuição na liberação de citocina é pelo menos uma diminuição de 60 %, pelo menos uma diminuição de 70 %, pelo menos uma diminuição de 80 %, pelo menos uma diminuição de 90 %, pelo menos uma diminuição de 95 %, pelo menos uma diminuição de 98 %, pelo menos uma diminuição de 99 % ou uma diminuição de 100 % na liberação de citocina em relação à liberação de citocina do anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada. Em uma outra modalidade, o anticorpo não apresenta liberação de citocina detectável. Em uma outra modalidade, o ensaio de liberação de citocina in vitro é um ensaio pró-inflamatório de cultura de tecido (TC) Meso Scale Discovery (MSD). Em uma outra modalidade, o ensaio de liberação de citocina in vitro é avaliado usando ensaios conhecidos por um especialista na técnica. Em uma outra modalidade, o anticorpo diminui a degranulação de mastócitos em um ensaio de degranulação de mastócitos in vitro com uma diminuição na degranulação de mastócitos de pelo menos 50 % em relação à degranulação de mastócitos de um anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada. Em uma outra modalidade, a diminuição na degranulação de mastócitos é pelo menos uma diminuição de 60 %, pelo menos uma diminuição de 70 %, pelo menos uma diminuição de 80 %, pelo menos uma diminuição de 90 %, pelo menos uma diminuição de 95 %, pelo menos uma diminuição de 98 %, pelo menos uma diminuição de 99 % ou uma diminuição de 100 % na degranulação de mastócitos em relação à degranulação de mastócitos do anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada. Em uma outra modalidade, o anticorpo não apresenta desganulação de mastócitos detectável. Em uma outra modalidade, o ensaio de degranulação de mastócitos in vitro é um ensaio de degranulação de mastócitos com base em beta-hexosaminidase.

[035]Em algumas modalidades, o isotipo IgG é um isotipo IgG1, um isotipo IgG2, um isotipo IgG3 ou um isotipo IgG4. Em uma outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo biespecífico. Em uma outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em uma outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG intacto. Em uma outra modalidade, o anticorpo se liga especificamente à CD117, CD45, CD2, CD5, CD137 ou CD252.

[036]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um conjugado fármaco-anticorpo (ADC) compreendendo o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, como definido aqui, em que o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, é conjugado com uma citotoxina por meio de um conector. Em uma modalidade, a citotoxina é um inibidor de RNA polimerase. Em uma outra modalidade, o inibidor de RNA polimerase é uma amatoxina. Em uma outra modalidade, a amatoxina é representada pela fórmula (III)

(III) em que R1 é H, OH, ORA ou ORC; R2 é H, OH, ORB ou ORC; RA e RB, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar um grupo heterocicloalquila de 5 membros opcionalmente substituído; R3 é H, RC ou RD; R4, R5, R6 e R7 são, cada um, independentemente H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R8 é OH, NH2, ORC, ORD, NHRC ou NRCRD; R9 é H, OH, ORC ou ORD; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; RC é -L-Z; RD é alquila C1-C6 opcionalmente substituída, heteroalquila C1-C6 opcionalmente substituída, alquenila C2-C6 opcionalmente substituída, heteroalquenila C2-C6 opcionalmente substituída, alquinila C2-C6 opcionalmente substituída, heteroalquinila C2-C6 opcionalmente substituída, cicloalquila opcionalmente substituída, heterocicloalquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída; L é alquileno C1-C6 opcionalmente substituído, heteroalquileno C1-C6 opcionalmente substituído, alquenileno C2-C6 opcionalmente substituído, heteroalquenileno C2-C6 opcionalmente substituído, alquinileno C2-C6 opcionalmente substituído, heteroalquinileno C2-C6 opcionalmente substituído, cicloalquileno opcionalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído, heteroarileno opcionalmente substituído, um peptídeo, um dipeptídeo, -(C=O)-, um dissulfeto, uma hidrazona ou uma combinação dos mesmos; e Z é uma porção química formada a partir de uma reação de acoplamento entre um substituinte reativo presente em L e um substituinte reativo presente dentro do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que Am compreende exatamente um substituinte RC.

Em uma outra modalidade, a amatoxina é representada pela fórmula (IB)

(IB) em que R1 é H, OH, ORA ou ORC; R2 é H, OH, ORB ou ORC; RA e RB, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar um grupo heterocicloalquila de 5 membros opcionalmente substituído; R3 é H, RC ou RD; R4, R5, R6 e R7 são, cada um, independentemente H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R8 é OH, NH2, ORC, ORD, NHRC ou NRCRD; R9 é H, OH, ORC ou ORD; X é -S-, -S(O)- ou -SO2- ; RC é -L-Z; RD é alquila C1-C6 opcionalmente substituída, heteroalquila C1-C6 opcionalmente substituída, alquenila C2-C6 opcionalmente substituída, heteroalquenila C2-C6 opcionalmente substituída, alquinila C2-C6 opcionalmente substituída, heteroalquinila C2-C6 opcionalmente substituída, cicloalquila opcionalmente substituída, heterocicloalquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída; L é alquileno C1- C6 opcionalmente substituído, heteroalquileno C1-C6 opcionalmente substituído, alquenileno C2-C6 opcionalmente substituído, heteroalquenileno C2-C6 opcionalmente substituído, alquinileno C2-C6 opcionalmente substituído, heteroalquinileno C2-C6 opcionalmente substituído, cicloalquileno opcionalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído,

heteroarileno opcionalmente substituído, um peptídeo, um dipeptídeo, -(C=O)-, um dissulfeto, uma hidrazona ou uma combinação dos mesmos; e Z é uma porção química formada a partir de uma reação de acoplamento entre um substituinte reativo presente em L e um substituinte reativo presente dentro do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que Am compreende exatamente um substituinte RC. Em uma outra modalidade, o inibidor de RNA polimerase é uma amanitina. Em uma outra modalidade, a amanitina é selecionada do grupo consiste em α-amanitina, β-amanitina, γ-amanitina, ε-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina, ácido amanulinaico e pró-amanulina. Em uma outra modalidade, a citotoxina selecionada do grupo que consiste em uma exotoxina A de pseudomonas, deBouganin, toxina da difteria, saporina, maitansina, um maitansinoide, uma auristatina, uma antraciclina, uma caliqueamicina, irinotecano, SN-38, uma duocarmicina, uma pirrolobenzodiazepina, um dímero de pirrolobenzodiazepina, uma indolinobenzodiazepina e um dímero de indolinobenzodiazepina. Em uma outra modalidade, a auristatina é MMAE ou MMAF. Em uma outra modalidade, o anticorpo, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, é conjugado com a citotoxina por meio de uma conjugação intercadeia com uma cisteína de dobradiça nativa. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, é conjugado com a citotoxina por meio de um resíduo de cisteína no domínio Fc do anticorpo. Em uma outra modalidade, o resíduo de cisteína é introduzido por meio de uma substituição de aminoácido no domínio Fc do anticorpo. Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido é D265C. Em uma outra modalidade, a substituição de aminoácido é S239C.

[037]Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo ou ADC de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 218 e um portador farmaceuticamente aceitável.

[038]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de esgotamento de uma população de células-tronco hematopoiéticas (HSC) em um paciente humano, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz do anticorpo ou ADC como aqui descrito. Em uma modalidade, o método compreende administrar ao paciente um transplante compreendendo as células-tronco hematopoiéticas. Em uma modalidade, o transplante é alogênico. Em uma modalidade, o transplante é autólogo.

[039]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método compreendendo administrar a um paciente humano um transplante compreendendo as células-tronco hematopoiéticas, em que o paciente foi previamente administrado com o anticorpo ou o ADC como aqui descrito, em uma quantidade suficiente para esgotar uma população de células-tronco hematopoiéticas no paciente. Em uma modalidade, a célula-tronco hematopoiética é uma célula CD117+ ou CD45+. Em uma outra modalidade, o paciente tem uma doença sanguínea, um transtorno metabólico, câncer ou uma doença autoimune ou doença de imunodeficiência combinada grave (SCID).

[040]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de tratar leucemia em um paciente humano, o dito método compreendendo administrar o anticorpo ou ADC como aqui descrito, ao paciente humano tendo leucemia.

[041]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método compreendendo administrar a um paciente humano um transplante compreendendo as células-tronco hematopoiéticas, em que o paciente foi previamente administrado com o anticorpo ou o ADC como aqui descrito, em uma quantidade suficiente para esgotar uma população de células imunes no paciente. Em uma modalidade, a célula imune é uma célula CD137+, CD2+ ou CD5+. Em uma outra modalidade, a célula imune é uma célula T.

[042]Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma composição compreendendo o anticorpo ou ADC como aqui descrito, em que a composição compreende menos de 25 % de degradante hidrofóbico após o estresse térmico. Em uma modalidade, a composição compreende menos de 20 % de degradante hidrofóbico após o estresse térmico. Em uma outra modalidade, a composição compreende menos de 15 % de degradante hidrofóbico após o estresse térmico. Em uma outra modalidade, a composição compreende menos de 10 % de degradante hidrofóbico após o estresse térmico. Em uma outra modalidade, a composição compreende menos de 5 % de degradante hidrofóbico após o estresse térmico.

[043]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de tratar um transtorno de célula-tronco em um paciente humano, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou ADC como aqui descrito.

[044]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de tratar um transtorno de imunodeficiência em um paciente humano, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou ADC como aqui descrito. Em uma modalidade, o transtorno de imunodeficiência é uma imunodeficiência congênita ou uma imunodeficiência adquirida.

[045]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de tratar um transtorno metabólico em um paciente humano, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou ADC como aqui descrito. Em uma modalidade, o transtorno metabólico é selecionado do grupo consiste em doenças de armazenamento de glicogênio, mucopolissacaridose, doença de Gaucher, doença de Hurlers, esfingolipidose e Leucodistrofia metacromática.

[046]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de tratar um transtorno autoimune em um paciente humano, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou ADC como aqui descrito. Em algumas modalidades, o transtorno autoimune é selecionado do grupo consiste em esclerose múltipla, lúpus sistêmico humano, artrite reumatoide, doença inflamatória intestinal, psoríase, diabetes mellitus Tipo 1, encefalomielite disseminada aguda, doença de Addison, alopecia universal, espondilite anquilosante, síndrome do anticorpo antifosfolipídeo, anemia aplásica, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, doença autoimune do ouvido interno, síndrome linfoproliferativa autoimune, ooforite autoimune, doença de Balo, doença de Behcet, penfigoide bolhoso, cardiomiopatia, doença de Chagas, síndrome de disfunção imune da fadiga crônica, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, doença de Crohn, penfigoide cicatricial, psilose celíaca-dermatite herpetiforme, doença da aglutinina fria, síndrome de CREST, doença de Degos, lúpus discoide, disautonomia, endometriose, crioglobulinemia mista essencial, fibromialgia-fibromiosite, síndrome de Goodpasture, doença de Grave, síndrome de Guillain-Barre, tireoidite de Hashimoto, Hidradenite supurativa, púrpura trombocitopênica idiopática e/ou aguda, fibrose pulmonar idiopática, neuropatia de IgA, cistite intersticial, artrite juvenil, doença de Kawasaki, líquen plano, doença de Lyme, doença de Meniere, doença mista do tecido conjuntivo, miastenia grave, neuromiotonia, síndrome opsoclônica mioclônica, neurite óptica, tireoidite de Ord, pênfigo vulgar, anemia perniciosa, policondrite, polimiosite e dermatomiosite, cirrose biliar primária, poliarterite nodosa, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, agamaglobulinemia primária, fenômeno de Raynaud, síndrome de Reiter, febre reumática, sarcoidose, esclerodermia, síndrome de Sjögren, síndrome da pessoa rígida, artrite de Takayasu, arterite temporal, colite ulcerativa, uveíte, vasculite, vitiligo, vulvodínia e granulomatose de Wegener.

[047]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de tratar câncer em um paciente humano, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou ADC como aqui descrito. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo consiste em leucemia, linfoma, mieloma múltiplo e neuroblastoma.

[048]Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima, o anticorpo tem uma diminuição em uma função efetora definida como uma diminuição na ligação a um receptor Fc gama (FcγR) em relação à ligação de um anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada para o FcγR. Em uma modalidade, a diminuição na ligação é pelo menos uma diminuição de 70 %, pelo menos uma diminuição de 80 %, pelo menos uma diminuição de 90 %, pelo menos uma diminuição de 95 %, pelo menos uma diminuição de 98 %, pelo menos uma diminuição de 99 % ou uma diminuição de 100 % na ligação de anticorpo a um FcγR em relação à ligação do anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada para o FcγR. Em certas modalidades, o anticorpo se liga de forma não detectável ao FcγR. Em algumas modalidades, a ligação do anticorpo ao FcγR é avaliada por interferometria de biocamada (BLI). Em algumas modalidades, o FcγR é um receptor FcγR1, um receptor FcγR2 ou um receptor FcγR3. Em algumas modalidades, o receptor FcγR1 é FcγR1A, FcγR1B ou FcγR1C. Em algumas modalidades, o receptor FcγR1 é FcγR2A, FcγR2B ou FcγR2C. Em algumas modalidades, o receptor FcγR1 é FcγR3A ou FcγR3B. Em algumas modalidades, o receptor Fc é um receptor Fc humano.

[049]Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima, o isotipo IgG é um isotipo IgG1, um isotipo IgG2, um isotipo IgG3 ou um isotipo IgG4.

[050]Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima, o anticorpo é um anticorpo humano.

[051]Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima, o anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado.

[052]Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[053]Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos acima, o anticorpo se liga especificamente à CD117, CD45, CD2, CD5, CD137 ou CD252.

[054]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um conjugado fármaco-anticorpo (ADC) compreendendo qualquer um dos anticorpos aqui, em que o anticorpo é conjugado com uma citotoxina por meio de um conector.

[055]Em algumas modalidades dos conjugados aqui, a citotoxina é um inibidor de RNA polimerase. Em algumas modalidades, o inibidor de RNA polimerase é uma amatoxina.

[056]Em algumas modalidades, a amatoxina é representada pela fórmula (IA) (IA) em que R1 é H, OH, ORA ou ORC; R2 é H, OH, ORB ou ORC; RA e RB, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar um grupo heterociclolalquila de 5 membros opcionalmente substituído; R3 é H, RC ou RD; R4, R5, R6 e R7 são, cada um, independentemente H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R8 é OH, NH2, ORC, ORD, NHRC ou NRCRD; R9 é H, OH, ORC ou ORD; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; RC é -L-Z;

RD é alquila C1-C6 opcionalmente substituída, heteroalquila C1-C6 opcionalmente substituída, alquenila C2-C6 opcionalmente substituída, heteroalquenila C2-C6 opcionalmente substituída, alquinila C2-C6 opcionalmente substituída, heteroalquinila C2-C6 opcionalmente substituída, cicloalquila opcionalmente substituída, heterocicloalquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída; L é alquileno C1-C6 opcionalmente substituído, heteroalquileno C1-C6 opcionalmente substituído, alquenileno C2-C6 opcionalmente substituído, heteroalquenileno C2-C6 opcionalmente substituído, alquinileno C2-C6 opcionalmente substituído, heteroalquinileno C2-C6 opcionalmente substituído, cicloalquileno opcionalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído ou heteroarileno opcionalmente substituído; e Z é uma porção química formada a partir de uma reação de acoplamento entre um substituinte reativo presente em L e um substituinte reativo presente dentro do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que Am compreende exatamente um substituinte RC.

[057]Em algumas modalidades, a amatoxina é representada pela fórmula (IB) (IB) em que R1 é H, OH, ORA ou ORC; R2 é H, OH, ORB ou ORC;

RA e RB, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar um grupo heterociclolalquila de 5 membros opcionalmente substituído; R3 é H, RC ou RD; R4, R5, R6 e R7 são, cada um, independentemente H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R8 é OH, NH2, ORC, ORD, NHRC ou NRCRD; R9 é H, OH, ORC ou ORD; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; RC é -L-Z; RD é alquila C1-C6 opcionalmente substituída, heteroalquila C1-C6 opcionalmente substituída, alquenila C2-C6 opcionalmente substituída, heteroalquenila C2-C6 opcionalmente substituída, alquinila C2-C6 opcionalmente substituída, heteroalquinila C2-C6 opcionalmente substituída, cicloalquila opcionalmente substituída, heterocicloalquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída; L é alquileno C1-C6 opcionalmente substituído, heteroalquileno C1-C6 opcionalmente substituído, alquenileno C2-C6 opcionalmente substituído, heteroalquenileno C2-C6 opcionalmente substituído, alquinileno C2-C6 opcionalmente substituído, heteroalquinileno C2-C6 opcionalmente substituído, cicloalquileno opcionalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído ou heteroarileno opcionalmente substituído; e Z é uma porção química formada a partir de uma reação de acoplamento entre um substituinte reativo presente em L e um substituinte reativo presente dentro do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que Am compreende exatamente um substituinte RC.

[058]Em algumas modalidades, o inibidor de RNA polimerase é uma amanitina. Em algumas modalidades, a amanitina é selecionada do grupo consiste em α-amanitina, β-amanitina, γ-amanitina, ε-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina, ácido amanulinaico e pró-amanulina.

[059]Em algumas modalidades, a citotoxina selecionada do grupo que consiste em uma exotoxina A de pseudomonas, deBouganin, toxina da difteria, saporina, maitansina, um maitansinoide, uma auristatina, uma antraciclina, uma caliqueamicina, irinotecano, SN-38, uma duocarmicina, uma pirrolobenzodiazepina, um dímero de pirrolobenzodiazepina, uma indolinobenzodiazepina e um dímero de indolinobenzodiazepina. Em algumas modalidades, a auristatina é MMAE ou MMAF.

[060]Em algumas modalidades dos conjugados aqui, o anticorpo é conjugado com a toxina por meio de um resíduo de cisteína no domínio Fc do anticorpo. Em algumas modalidades, o resíduo de cisteína é introduzido por meio de uma substituição de aminoácido no domínio Fc do anticorpo. Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido é D265C.

[061]Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou ADC aqui descrito e um portador farmaceuticamente aceitável.

[062]Ainda em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de esgotamento de uma população de células-tronco hematopoiéticas (HSC) em um paciente humano, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um anticorpo ou ADC aqui descrito,

[063]Em algumas modalidades dos métodos aqui descritos, o método compreende ainda administrar ao paciente um transplante compreendendo as células- tronco hematopoiéticas. Em algumas modalidades, o transplante é alogênico. Em algumas modalidades, o transplante é autólogo.

[064]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método compreendendo administrar a um paciente humano um transplante compreendendo as células-tronco hematopoiéticas, em que o paciente foi previamente administrado um anticorpo ou o

ADC aqui descrito em uma quantidade suficiente para esgotar uma população de células-tronco hematopoiéticas no paciente.

[065]Em algumas modalidades dos métodos aqui descritos, o paciente tem uma doença sanguínea, um transtorno metabólico, câncer ou uma doença autoimune ou doença de imunodeficiência combinada grave (SCID).

[066]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de tratar leucemia em um paciente humano, o dito método compreendendo administrar um anticorpo ou ADC aqui descrito ao paciente humano tendo leucemia.

[067]Em um aspecto, é aqui fornecido um método de esgotamento de uma população de células CD117+ em um paciente humano em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um conjugado fármaco-anticorpo (ADC) anti-CD117, em que o conjugado fármaco- anticorpo (ADC) compreende um anticorpo anti-CD117 conjugado com uma amatoxina por meio de um conector e é representado pela fórmula Ab-Z-L-Am, em que Ab é um anticorpo anti-CD117 compreendendo uma mutação H435A (índice EU) na região Fc do anticorpo, L é um conector, Z é uma porção química e Am é uma amatoxina. Em uma modalidade, o ADC é administrado antes de o paciente receber um transplante compreendendo as células-tronco hematopoiéticas. Em uma outra modalidade, o ADC é administrado ao mesmo tempo que o paciente recebe um transplante compreendendo as células-tronco hematopoiéticas.

[068]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método para administrar a um paciente humano um conjugado fármaco-anticorpo (ADC) anti-CD117 em uma quantidade suficiente para esgotar uma população de células CD117+ no paciente em necessidade do mesmo, em que o conjugado fármaco-anticorpo (ADC) compreende um anticorpo anti-CD117 conjugado com uma amatoxina por meio de um conector e é representado pela fórmula Ab-Z-L-Am, em que Ab é um anticorpo anti-CD117 compreendendo uma mutação H435A (índice EU) na região Fc do anticorpo, L é um conector, Z é uma porção química e Am é uma amatoxina; e subsequentemente administrar ao paciente um transplante compreendendo as células-tronco hematopoiéticas.

Em uma modalidade, o transplante compreendendo as células- tronco hematopoiéticas é administrado ao paciente depois que a concentração do ADC tenha sido substancialmente eliminada do sangue do paciente.

Em uma outra modalidade, as células-tronco hematopoiéticas ou progênie das mesmas maintêm o potencial funcional da célula-tronco hematopoiética depois de dois ou mais dias após o transplante das células-tronco hematopoiéticas no paciente.

Ainda em uma outra modalidade, as células-tronco hematopoiéticas ou progênie das mesmas são capazes de localizar o tecido hematopoiético e/ou reestabelecer a hematopoese após o transplante das células-tronco hematopoiéticas no paciente.

Em uma outra modalidade, o paciente tem um transtorno selecionado do grupo que consiste em deficiência de adenosina desaminase e imunodeficiência combinada grave, síndrome de hiperimunoglobulina M, doença de Chediak-Higashi, linfo-histiocitose hereditária, osteopetrose, osteogênese imperfeita, doenças de armazenamento, talassemia maior, esclerose sistêmica, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla e artrite reumatoide juvenil.

Em uma outra modalidade, o paciente tem um transtorno autoimune ou um câncer hematológico.

Em uma outra modalidade, o transtorno autoimune é selecionado do grupo consiste em esclerose múltipla, lúpus sistêmico humano, artrite reumatoide, doença inflamatória intestinal, psoríase, diabetes mellitus Tipo 1, encefalomielite disseminada aguda, doença de Addison, alopecia universal, espondilite anquilosante, síndrome do anticorpo antifosfolipídeo, anemia aplásica, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, doença autoimune do ouvido interno, síndrome linfoproliferativa autoimune, ooforite autoimune, doença de Balo, doença de Behcet, penfigoide bolhoso, cardiomiopatia, doença de Chagas, síndrome de disfunção imune da fadiga crônica, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, doença de Crohn, penfigoide cicatricial, psilose celíaca-dermatite herpetiforme, doença da aglutinina fria, síndrome de CREST, doença de Degos, lúpus discoide, disautonomia, endometriose, crioglobulinemia mista essencial, fibromialgia- fibromiosite, síndrome de Goodpasture, doença de Grave, síndrome de Guillain-Barre, tireoidite de Hashimoto, Hidradenite supurativa, púrpura trombocitopênica idiopática e/ou aguda, fibrose pulmonar idiopática, neuropatia de IgA, cistite intersticial, artrite juvenil, doença de Kawasaki, líquen plano, doença de Lyme, doença de Meniere, doença mista do tecido conjuntivo, miastenia grave, neuromiotonia, síndrome opsoclônica mioclônica, neurite óptica, tireoidite de Ord, pênfigo vulgar, anemia perniciosa, policondrite, polimiosite e dermatomiosite, cirrose biliar primária, poliarterite nodosa, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, agamaglobulinemia primária, fenômeno de Raynaud, síndrome de Reiter, febre reumática, sarcoidose, esclerodermia, síndrome de Sjögren, síndrome da pessoa rígida, artrite de Takayasu, arterite temporal, colite ulcerativa, uveíte, vasculite, vitiligo, vulvodínia e granulomatose de Wegener.

[069]Em um outro aspecto, é aqui fornecido um método de tratar um sujeito humano tendo um câncer hematológico compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um conjugado fármaco-anticorpo (ADC) anti-CD117 ao sujeito humano tendo o câncer hematológico, em que o conjugado fármaco-anticorpo (ADC) compreende um anticorpo anti-CD117 conjugado com uma amatoxina por meio de um conector e é representado pela fórmula Ab-Z-L-Am, em que Ab é um anticorpo anti- CD117 compreendendo uma mutação H435A (índice EU) na região Fc do anticorpo, L é um conector, Z é uma porção química e Am é uma amatoxina. Em uma modalidade, o câncer hematológico é leucemia. Em uma outra modalidade, a região Fc do anticorpo anti-CD117 compreende uma mutação D265C (índice EU). Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo anti-CD117 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 7, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 8 e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9; e compreendendo uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 10, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 11 e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos como apresentada na SEQ ID NO: 12. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-CD117 compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14. Em uma outra modalidade, o ADC é internalizado por uma célula de câncer, célula autoimune ou célula-tronco hematopoiética após a administração ao paciente.

Em uma outra modalidade, a Am- L-Z é representada pela fórmula (I)

(I) em que R1 é H, OH, ORA ou ORC; R2 é H, OH, ORB ou ORC; RA e RB, quando presente, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar um grupo heterocicloalquila de 5 membros opcionalmente substituído; R3 é H, RC ou RD; R4, R5, R6 e R7 são, cada um, independentemente H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R8 é OH, NH2, ORC, ORD, NHRC ou NRCRD; R9 é H, OH, ORC ou ORD; X é -S-, - S(O)- ou -SO2-; RC é -L-Z; RD é alquila C1-C6 opcionalmente substituída, heteroalquila

C1-C6 opcionalmente substituída, alquenila C2-C6 opcionalmente substituída, heteroalquenila C2-C6 opcionalmente substituída, alquinila C2-C6 opcionalmente substituída, heteroalquinila C2-C6 opcionalmente substituída, cicloalquila opcionalmente substituída, heterocicloalquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída; L é alquileno C1- C6 opcionalmente substituído, heteroalquileno C1-C6 opcionalmente substituído, alquenileno C2-C6 opcionalmente substituído, heteroalquenileno C2-C6 opcionalmente substituído, alquinileno C2-C6 opcionalmente substituído, heteroalquinileno C2-C6 opcionalmente substituído, cicloalquileno opcionalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído, heteroarileno opcionalmente substituído, um dipeptídeo, -C(=O)-, um peptídeo ou uma combinação dos mesmos; e Z é uma porção química formada a partir de uma reação de acoplamento entre um substituinte reativo presente em L e um substituinte reativo presente dentro do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que Am compreende exatamente um substituinte RC. Em uma outra modalidade a Am-L- Z é representada pela fórmula (IB).

(IB) em que R1 é H, OH, ORA ou ORC; R2 é H, OH, ORB ou ORC; RA e RB, quando presente, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar um grupo heterocicloalquila de 5 membros opcionalmente substituído; R3 é H,

RC ou RD; R4, R5, R6 e R7 são, cada um, independentemente H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R8 é OH, NH2, ORC, ORD, NHRC ou NRCRD; R9 é H, OH, ORC ou ORD; X é -S-, - S(O)- ou -SO2-; RC é -L-Z; RD é alquila C1-C6 opcionalmente substituída, heteroalquila C1-C6 opcionalmente substituída, alquenila C2-C6 opcionalmente substituída, heteroalquenila C2-C6 opcionalmente substituída, alquinila C2-C6 opcionalmente substituída, heteroalquinila C2-C6 opcionalmente substituída, cicloalquila opcionalmente substituída, heterocicloalquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída; L é alquileno C1- C6 opcionalmente substituído, heteroalquileno C1-C6 opcionalmente substituído, alquenileno C2-C6 opcionalmente substituído, heteroalquenileno C2-C6 opcionalmente substituído, alquinileno C2-C6 opcionalmente substituído, heteroalquinileno C2-C6 opcionalmente substituído, cicloalquileno opcionalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído, heteroarileno opcionalmente substituído, um dipeptídeo, -C(=O)-, um peptídeo ou uma combinação dos mesmos; e Z é uma porção química formada a partir de uma reação de acoplamento entre um substituinte reativo presente em L e um substituinte reativo presente dentro do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que Am compreende exatamente um substituinte RC. Em uma outra modalidade, o ADC é administrado ao paciente humano em uma dose de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 0,3 mg/kg. Breve Descrição das Figuras

[070]As Figs. 1A a 1E representam graficamente os resultados de um ensaio de interferometria de biocamada padrão (BLI) para avaliar a resposta de ligação de anticorpos tendo as substituições de aminoácidos indicadas aos receptores Fc gama indicados na legenda. A resposta de ligação normalizada de cada variante de anticorpo anti-CD117 em relação à ligação de IgG1 WT é mostrada na Fig. 1A e a quantificação da resposta de ligação normalizada de cada variante de anticorpo anti-

CD117 é mostrada na Fig. 1B. A Fig. 1C representa a quantificação das respostas de ligação normalizadas de variantes de anticorpo anti-CD45 em relação à ligação do anticorpo anti-CD45 WT (Fig. 1C; “ic”, como aqui usado, se refere a conjugados intercadeia para cisteínas de dobradiça nativas). A resposta de ligação normalizada de variantes de anticorpo anti-CD117 adicionais em relação à ligação de IgG1 WT (isotipo controle) é mostrada na Fig. 1D e a quantificação da resposta de ligação normalizada de cada variante de anticorpo anti-CD117 é mostrada na Fig. 1E.

[071]A Fig. 2 representa graficamente os resultados de um ensaio de degranulação de mastócitos, em que a Beta-hexosaminidase foi medida após a incubação de mastócitos com os anticorpos indicados. A Beta-hexosaminidase liberada de mastócitos foi medida monitorando-se a produção de para-nitrofenol do substrato 4-Nitrofenil N-acetil-β-D-glucosaminida e é apresentada como a absorvância de para-nitrofenol a 405 nm no eixo y.

[072]As Figs. 3A, 3B, 3C, 3D e 3E representam graficamente os resultados de um ensaio de liberação de citocina in vitro para medir a liberação de IL-6 (Fig. 3A), IL- 8 (Fig. 3B), TNFa (Fig. 3C), IL-1B (Fig. 3D) e GM-CSF (Fig. 3E) de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) após a incubação com os anticorpos indicados. As PBMCs humanas para as Figs. 3A a 3D foram isoladas de um dos quatro doadores, conforme demarcado na legenda.

[073]As Figs. 4A e 4B representam graficamente os resultados de um ensaio in vitro de fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) que mostra uma redução em atividade de ADCP devido ao silenciamento do efetor Fc em certas variantes de Fc em comparação com os controles. A Fig. 4A representa os resultados da análise por citometria de fluxo da co-expressão de coloração de CFSE e CD134. A Fig. 4B representa os resultados da incubação de uma mistura de células MDM e Kasumi-1 (razão molar 1:2) por duas horas a 37 °C com concentrações crescentes do anticorpo indicado.

[074]As Figs. 5A, 5B e 5C representam cromatogramas que demonstram os resultados de um ensaio de termoestabilidade em que a temperatura de fusão de cada anticorpo indicado foi avaliada.

[075]As Figs. 6A e 6B são tabelas que mostram a temperatura de fusão Tm1 (desdobramento de CH2) e Tm2 (desdobramento de fab/CH3) para cada anticorpo indicado conforme determinado no ensaio de termoestabilidade representado na Fig. 5A (ver Fig. 6A) e Figs. 5B e 5C (ver Fig. 6B).

[076]As Figs. 7A e 7B representam cromatogramas que demonstram o perfil de eluição dos anticorpos indicados no tempo = 0 na temperatura ambiente (condição sem estresse) ou após 30 minutos de incubação a 60 graus Celsius (condição de estresse) depois da análise por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). A Fig. 7A representa cromatogramas que demonstram o perfil de eluição do anticorpo Ab1 e certas variantes de Fc de Ab1 no tempo = 0 na temperatura ambiente (condição sem estresse; A Fig. 7A (cromatograma no painel inferior)) ou após 30 minutos de incubação a 60 graus Celsius (condição de estresse); A Fig. 7A (cromatograma no painel superior) depois da análise por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). A Fig. 7B representa um cromatograma que demonstram o perfil de eluição do anticorpo Ab2 e certas variantes de Fc de Ab2 no tempo = 0 na temperatura ambiente (condição sem estresse) ou após 30 minutos de incubação a 60 graus Celsius (condição de estresse) depois da análise por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC).

[077]As Figs. 8A a 8E representam graficamente os resultados dos ensaios de HIC das Figs. 7A e 7B, que mostram a área percentual máxima de monômero de anticorpo (i.e., “Principal”) (Figs. 8A e 8D) ou máxima de hidrofóbico degradante (Figs. 8B, 8C e 8E) para os anticorpos indicados depois da exposição a condições com estresse ou sem estresse.

[078]As Figs. 9A a 9E representam graficamente os resultados de um ensaio de cromatografia por exclusão de tamanho, em que a área percentual máxima de monômero de anticorpo (Fig. 9A e 9D) ou percentual máximo de agregado molecular alto (Fig. 9B, 9C e 9E) foi determinado para os anticorpos indicados depois de exposição ao tempo = 0 na temperatura ambiente (condição sem estresse) ou após 30 minutos de incubação a 60 graus Celsius (condição de estresse).

[079]As Figs. 10A e 10B representam graficamente os resultados de um ensaio farmacocinético de primata não humano expressado como a concentração (ng/mL) de um ADC anti-CD117-amatoxina de meia-vida rápida projetado em doses variáveis (0,1 mg/kg e 0,3 mg/kg) como um tempo de função (i.e., horas pós- administração; eixo x). A Fig. 10B ilustra que o momento da depleção e eliminação mediada por ADC fornece uma janela pós-administração para o condicionamento do transplante.

[080]As Figs. 11A-11E representam graficamente os resultados de ensaios que detectam a depleção de células-tronco hematopoiéticas fenotípicas (i.e., HSCs CD34+ CD90+ CD45RA) usando citometria de fluxo (Figs. 11A e Fig. 11C) ou uma determinação de unidades formadoras de colônia do aspirado de medula óssea (Figs. 11B e Fig. 11D) como uma função de doses variáveis do conjugado fármaco-anticorpo ADC1 (ADC) versus um controle (i.e., PBS) (eixo x). As Figs. 11C e 11D mostram ainda dados correspondentes ao anticorpo anti-CD117 não conjugado (“anti-CD117”). A Fig. 11E mostra uma análise fenotípica das células-tronco hematopoiéticas da medula óssea (tratadas versus não tratadas) usando citometria de fluxo (no dia 7 após a administração da dose).

[081]As Figs. 12A-12C representam graficamente os resultados de ensaios que detectam (Fig. 12A) a contagem de neutrófilos (103/mL) e (Figs. 12B e 12C) a contagem de linfócitos (103/mL) como uma função de dias após a administração da dose de doses variáveis do conjugado fármaco-anticorpo ADC1 (ADC) versus um controle (i.e., PBS). A Fig. 12C mostra ainda dados correspondentes à contagem de linfócitos para macacos cinomolgos administrados com um anticorpo anti-CD117 não conjugado (“anti-CD117”).

[082]As Figs. 13A a 13C representam graficamente os resultados de ensaios que detectam níveis de (Figs. 13A e 13C) alanina aminotransaminase plasmática (ALT; em U/mL) e (Fig. 13B) bilirrubina plasmática (em U/mL) como uma função de dias após a administração da dose de doses variáveis do conjugado fármaco- anticorpo ADC1 (ADC) versus um controle (i.e., PBS). A Fig. 13C mostra ainda dados correspondentes aos níveis plasmáticos de ALT em macacos cinomolgos administrados com um anticorpo anti-CD117 não conjugado (“anti-CD117”).

[083]A Fig. 14 mostra imagens de tecidos do fígado e rim isolados de macacos cinomolgos 35 dias após a administração do ADC1 (0,3 mg/kg) ou um controle (PBS).

[084]A Fig. 15 representa graficamente os resultados de um ensaio que detecta a contagem de reticulócitos (109/mL) como uma função de dias após a administração da dose de doses variáveis (0,1 mg/kg ou 0,3 mg/kg) de um conjugado fármaco-anticorpo ADC1 versus um controle (i.e., PBS) ou um anticorpo anti-CD117 não conjugado. Descrição Detalhada

[085]São aqui divulgados anticorpos, e conjugados dos mesmos (conjugados anticorpo-fármaco; ADC) tendo regiões Fc modificadas, em que as modificações diminuem ou eliminam substancialmente as funções efetoras do anticorpo. As modificações na região Fc podem ainda permitir a conjugação anticorpo-fármaco e/ou diminuir a meia-vida do anticorpo. A interação de anticorpos e complexos anticorpo- antígeno com células do sistema imunológico podem efetuar uma variedade de respostas, incluindo citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). A ligação da região Fc de um anticorpo aos receptores Fc em uma superfície celular pode desencadear várias respostas biológicas incluindo engolfamento e destruição de partículas revestidas de anticorpo, eliminação de complexos imunes, lise de células alvo revestidas de anticorpo por células exterminadoras (i.e., ADCC), liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentária e controle de produção de imunoglobulina. Ao reduzir ou eliminar substancialmente a função efetora do anticorpo, os anticorpos presentemente divulgados podem, por exemplo, evitar vantajosamente o desencadeamento de várias reações do sistema imunológico (e.g., evitar a liberação de citocina ou evitar a degranulação de mastócitos) que podem ser prejudiciais em certas terapias, e.g., as terapias com célula-tronco hematopoiética (por exemplo, terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas) e depleção de células hematopoiéticas (e.g., para o tratamento de cânceres do sangue, doenças e transtornos do sistema imunológico, doenças autoimunes, doença do enxerto contra hospedeiro, etc.).

[086]Consequentemente, estão incluídos aqui anticorpos anti-células hematopoiéticas (também referidos como anticorpos anti-HC) tendo regiões Fc modificadas que são úteis em terapias. Por exemplo, os anticorpos ou ADCs aqui são úteis em procedimentos de condicionamento, em que um paciente é preparado para receber um transplante compreendendo as células-tronco hematopoiéticas. Tais procedimentos promovem o enxerto de um transplante de células-tronco hematopoiéticas. De acordo com os métodos aqui descritos, em algumas modalidades um paciente pode ser condicionado (por exemplo, para terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas ou recomposição do sistema imunológico) pela administração ao paciente de um ADC, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, capaz de se ligar a um antígeno expressado por células hematopoiéticas (e.g., células-tronco hematopoiéticas, e.g., células-tronco hematopoiéticas e/ou células imunes maduras (e.g., células T)), tais como CD117 (e.g., CD117 GNNK+), CD45, CD2, CD5, CD137, CD252 e combinações das mesmas. Em algumas modalidades, os anticorpos ou ADCs aqui considerados podem ser usados para o tratamento de doenças ou transtornos do sistema hematopoiético. Por exemplo, em algumas modalidades, os anticorpos ou ADCs aqui considerados podem ser usados para o tratamento de cânceres do sangue. Em outro exemplo não limitativo, os anticorpos ou ADCs aqui considerados podem ser usados para o tratamento de doença do enxerto contra hospedeiro (“GvHD”). Em certas modalidades, os anticorpos ou ADCs aqui considerados podem ser usados para o tratamento de uma doença ou transtorno mediado por células T. Como aqui descrito, o anticorpo pode ser covalentemente conjugado com uma citotoxina de modo a formar um conjugado fármaco-anticorpo (ADC). A administração de um ADC, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, capaz de se ligar a um ou mais dos antígenos anteriores em um paciente em necessidade de terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas pode promover o enxerto de um enxerto de célula- tronco hematopoiética, por exemplo, pelo esgotamento seletivo de células-tronco hematopoiéticas endógenas, criando assim uma vaga preenchida por um transplante de células-tronco hematopoiéticas exógenas.

[087]Em um aspecto particular, a invenção fornece anticorpos anti-CD117 isolados, anticorpos anti-CD117 humanos especificamente isolados, que se ligam ao ectodomínio de CD117 humano, em que os anticorpos anti-CD117 isolados têm regiões Fc modificadas, em que as modificações diminuem ou eliminam substancialmente as funções efetoras do anticorpo. As regiões de ligação dos anticorpos anti-CD117 isolados aqui identificados são descritos abaixo.

[088]As seções que se seguem fornecem uma descrição dos anticorpos, ou conjugados dos mesmos, que podem ser administrados a um paciente, tal como um paciente sofrendo de um câncer ou doença autoimune, ou um paciente em necessidade de terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas de modo a promover o enxerto de enxertos de célula-tronco hematopoiética, bem como métodos de administrar tais terapêuticos a um paciente (e.g., antes do transplante de células- tronco hematopoiéticas).

Definições

[089]Como aqui usado, o termo “cerca de” se refere a um valor que está dentro de 5 % acima ou abaixo do valor sendo descrito.

[090]Como aqui usado, o termo “alogênico”, quando usado no contexto de transplante, é usado para definir células (ou tecido ou um órgão) que são transplantadas de um doador para um receptor da mesma espécie, mas que é geneticamente diferente. Assim, o termo “células alogênicas” se refere a tipos de célula que são geneticamente distintos entre dois indivíduos, ainda que pertençam à mesma espécie, e.g., humana. Tipicamente, o termo “alogênico” é usado para definir células, tais como células-troncos, que são transplantadas de um doador para um receptor não aparentado da mesma espécie.

[091]Como aqui usado, o termo “autólogo” se refere a células ou um enxerto onde o doador e o receptor são o mesmo sujeito.

[092]Como aqui usado, o termo “xenogênico” se refere a células onde a espécie doadora e receptora são diferentes.

[093]Como aqui usado, o termo “célula imune” é intencionado a incluir, mas não é limitado a uma célula que é de origem hematopoiética e que desempenha um papel na resposta imune. As células imunes incluem, mas não são limitadas a células T e células exterminadoras naturais (NK). As células exterminadoras naturais são bem conhecidas na técnica. Em uma modalidade, as células exterminadoras naturais incluem linhagens de células, tais como células NK-92. Outros exemplos de linhagens de células NK incluem NKG, YT, NK-YS, HANK-1, células YTS e células NKL. Uma célula imune pode ser alogênica ou autóloga.

[094]Como aqui usado, o termo “anticorpo” se refere a uma molécula de imunoglobulina que se liga especificamente a, ou é imunologicamente reativa com, um antígeno particular. Um anticorpo inclui, mas não é limitado a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (e.g., anticorpos biespecíficos), anticorpos geneticamente modificados e, de outro modo, formas modificadas de anticorpos incluindo, mas não limitadas a anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos heteroconjugados (e.g., anticorpos bi- tri- e quadri-específicos, diabodies, triabodies e tetrabodies) e fragmentos de anticorpo (i.e., fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos), incluindo, por exemplo, fragmentos Fab’, F(ab’)2, Fab, Fv, rlgG e scFv, desde que exibam a atividade de ligação ao antígeno desejada.

[095]Os anticorpos da presente divulgação são geralmente isolados ou recombinantes. “Isolado”, quando aqui usado se refere a um polipeptídeo, e.g., um anticorpo, que foi identificado e separado e/ou recuperado de uma célula ou cultura de células a partir da qual foi expressado. Comumente, um anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação. Assim, um “anticorpo isolado”, se refere a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes. Por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente à CD117 é substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente aos antígenos exceto CD117.

[096]O termo “anticorpo monoclonal”, como aqui usado, se refere a um anticorpo que é derivado de um único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, procariótico ou fago, por quaisquer meios disponíveis ou conhecidos na técnica, e não é limitado aos anticorpos produzidos por meio de tecnologia do hibridoma. Anticorpos monoclonais úteis para a presente divulgação podem ser preparados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo o uso de hibridoma, recombinante e tecnologias de exibição de fago ou uma combinação dos mesmos. A menos que de outro modo indicado, o termo “anticorpo monoclonal” (mAb) é intencionado a incluir moléculas intactas, bem como fragmentos de anticorpo (incluindo, por exemplo, fragmentos Fab e F(ab’)2) que são capazes de se ligarem especificamente a uma proteína alvo. Como aqui usado, os fragmentos Fab e F(ab’)2 se referem a fragmentos de anticorpo que carecem do fragmento Fc de um anticorpo intacto. Em uma modalidade, um fragmento de anticorpo compreende uma região Fc.

[097]Geralmente, os anticorpos compreendem cadeias leves e pesadas contendo regiões de ligação ao antígeno. Cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é composta por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta por uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é composta por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino para o terminal carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias leves e pesadas contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunológico (e.g., células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

[098]O termo “fragmento de ligação ao antígeno”, como aqui usado, se refere a uma ou mais porções de um anticorpo que mantêm a capacidade para se ligar especificamente a um antígeno alvo. A função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo comprimento total. Os fragmentos de anticorpo podem ser, por exemplo, um Fab, F(ab’)2, scFv, diabody, um triabody, um affibody, um nanobody, um aptâmero ou um anticorpo de domínio. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo incluem, mas não são limitados a: (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente contendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um dAb incluindo domínios VH e VL; (vi) um fragmento de dAb que consiste em um domínio VH (ver, e.g., Ward et al., Nature 341:544-546, 1989); (vii) um dAb que consiste em um domínio VH ou um VL; (viii) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR); e (ix) uma combinação de duas ou mais (e.g., duas, três, quatro, cinco ou seis) CDRs isoladas que podem opcionalmente estarem unidas por um conector sintético. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos usando métodos recombinantes por um conector que permite que sejam feitos como uma única cadeia de proteína em que as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); ver, por exemplo, Bird et al., Science 242: 423-426, 1988 e Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988). Esses fragmentos de anticorpo podem ser obtidos usando técnicas convencionais conhecidas pelos especialistas na técnica, e os fragmentos podem ser triados para utilidade da mesma maneira que os anticorpos intactos. Os fragmentos de ligação ao antígeno podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante, clivagem enzimática ou química de imunoglobulinas intactas, ou, em certos casos, por procedimentos químicos de síntese de peptídeo conhecidos na técnica. Em uma modalidade, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo compreende uma região Fc.

[099]Como aqui usado, o termo “anticorpo anti-CD117” ou “um anticorpo que se liga à CD117” se refere a um anticorpo que é capaz de se ligar a CD117 com afinidade suficiente tal que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico no alvejamento de CD117.

[0100]Como aqui usado, o termo “anticorpo anti-CD45” ou “um anticorpo que se liga a CD45” se refere a um anticorpo que é capaz de se ligar a CD45 com afinidade suficiente tal que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico no alvejamento de CD45.

[0101]Como aqui usado, o termo “anticorpo anti-CD2” ou “um anticorpo que se liga a CD2” ou um “anti-CD2 ADC” ou “um ADC que se liga a CD2” se refere a um anticorpo ou ADC que se liga especificamente ao CD2 humano visto que o CD2 é encontrado na superfície celular de células, tais como células T.

[0102]Como aqui usado, o termo “anticorpo anti-CD5” ou “um anticorpo que se liga a CD5” ou um “ADC anti-CD5” ou “um ADC que se liga a CD5” se refere a um anticorpo ou ADC que se liga especificamente à CD5 humano visto que a CD5 é encontrada na superfície celular de células, tais como células T.

[0103]Como aqui usado, o termo “anticorpo anti-CD137” ou um “anticorpo que se liga a CD137” se refere a um anticorpo que é capaz de se ligar a CD137 com afinidade suficiente tal que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico no alvejamento de CD137.

[0104]Como aqui usado, o termo “anticorpo anti-CD252” ou um “anticorpo que se liga a CD252” se refere a um anticorpo que é capaz de se ligar a CD252 com afinidade suficiente tal que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico no alvejamento de CD252. Em uma modalidade preferida, o anticorpo se liga especificamente ao CD252 humano (hCD252). A CD252 é encontrada em células apresentadoras de antígeno.

[0105]Como aqui usado, o termo “anticorpo biespecífico” se refere a, por exemplo, um anticorpo monoclonal, e.g., um humano ou humanizado, que é capaz de se ligar a pelo menos dois antígenos diferentes ou dois epítopos diferentes. Por exemplo, uma das especificidades de ligação pode ser direcionada para um epítopo em um antígeno de superfície de célula-tronco hematopoiética, CD117 (e.g., CD117

GNNK+), e a outra pode se ligar especificamente a um epítopo em um antígeno de superfície de célula-tronco hematopoiética diferente ou outra proteína da superfície celular, tal como um receptor ou subunidade de receptor envolvida em uma via de transdução de sinal que potencializa o crescimento da célula, entre outros. Em algumas modalidades, as especificidades de ligação podem ser direcionadas para epítopos únicos não sobrepostos no mesmo antígeno alvo (i.e., um anticorpo biparatópico).

[0106]Um anticorpo “intacto” ou de “comprimento total”, como aqui usado, se refere a um anticorpo tendo dois polipeptídeos de cadeia pesada (H) e dois polipeptídeos de cadeia leve (L) interconectados por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é composta por uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é composta por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta por uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é composta por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino para o terminal carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias leves e pesadas contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunológico (e.g., células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

[0107]Como aqui usado, o termo “região determinante de complementaridade” (CDR) se refere a uma região hipervariável encontrada nos domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada de um anticorpo. As porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são referidas como regiões de estrutura (FRs). As posições de aminoácidos que delineiam uma região hipervariável de um anticorpo podem variar, dependendo do contexto e das várias definições conhecidas na técnica. Algumas posições dentro de um domínio variável podem ser vistas como posições hipervariáveis híbridas em que essas posições podem ser consideradas como estando dentro de uma região hipervariável sob um conjunto de critérios, embora sejam consideradas fora de uma região hipervariável sob um conjunto diferente de critérios. Uma ou mais dessas posições também podem ser encontradas em regiões hipervariáveis extendidas. Os anticorpos aqui descritos podem conter modificações nessas posições hipervariáveis híbridas. Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas nativas contêm quatro regiões de estrutura que adotam principalmente uma configuração de folha β, conectadas por três CDRs, que formam loops que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura em folha β. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas regiões de estrutura na ordem FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 e, com as CDRs das outras cadeias de anticorpo, contribuem para a formação do sítio de ligação ao alvo de anticorpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD., 1987). Em certas modalidades, a numeração de resíduos de aminoácidos de imunoglobulina é realizada de acordo com o sistema de numeração de resíduos de aminoácidos de imunoglobulina de Kabat et al., a menos que de outro modo indicado (embora qualquer esquema de numeração de anticorpo, incluindo, mas não limitado a IMGT e Chothia, possam ser utilizados).

[0108]Como aqui usado, o termo “estresse térmico” se refere ao estresse criado por qualquer mudança na temperatura de uma molécula, e.g., um anticorpo, um Fc contendo fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou um ADC. Em uma modalidade, estresse térmico é a incubação de um anticorpo, um Fc contendo o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou um ADC a 60 graus Celsius por 30 minutos.

[0109]O termo “se liga especificamente”, como aqui usado, se refere à capacidade de um anticorpo (ou ADC) reconhecer e se ligar a uma estrutura de proteína específica (epítopo) em vez das proteínas em geral. Se um anticorpo é específico para o epítopo “A”, a presença de uma molécula contendo o epítopo A (ou livre, A não marcado), em uma reação contendo “A” marcado e o anticorpo, reduzirá a quantidade de A marcado ligado ao anticorpo. A título de exemplo, um anticorpo “se liga especificamente” a um alvo se o anticorpo, quando marcado, puder ser afastado de seu alvo pelo anticorpo não marcado correspondente. Em uma modalidade, um anticorpo se liga especificamente a um alvo, e.g., um antígeno expressado por células-tronco hematopoiéticas, tal como CD117 (e.g., CD117 GNNK+) ou CD45; ou um antígeno expressado por células imunes maduras (e.g., células T), tal como CD45, CD2, CD5, CD137 ou CD252, se o anticorpo tem uma KD para o alvo de pelo menos cerca de 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 M ou menos (menos significa um número que é menor que 10-12, e.g., 10-13). Em uma modalidade, o termo “se liga especificamente” se refere à capacidade de um anticorpo se ligar a um antígeno com uma KD de pelo menos cerca de 1x10-6 M, 1x10-7 M, 1x10- 8 M, 1x10-9 M, 1x10-10 M, 1x10-11 M, 1x10-12 M, ou mais e/ou se ligar a um antígeno com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior que sua afinidade para um antígeno não específico. Em uma modalidade, KD é determinada de acordo com interferometria de biocamada padrão (BLI). Deve ser entendido, entretanto, que o anticorpo pode ser capaz de se ligar especificamente a dois ou mais antígenos que estão relacionados na sequência. Por exemplo, em uma modalidade, um anticorpo pode se ligar especificamente a ortólogos humanos e não humanos (e.g., camundongo ou primata não humano) de um antígeno, e.g., CD117 (e.g., CD117 GNNK+), CD45, CD2, CD5, CD137 ou CD252.

[0110]O termo anticorpo “quimérico”, como aqui usado, se refere a um anticorpo tendo sequências variáveis derivadas de uma imunoglobulina não humana, tal como um anticorpo de rato ou camundongo e regiões constantes de imunoglobulina humana, tipicamente escolhidas a partir de um modelo de imunoglobulina humana. Métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Ver, e.g., Morrison, 1985, Science 229(4719): 1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214- 221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125: 191-202; Pat. dos EUA Nos

5.807.715; 4.816.567; e 4.816.397.

[0111]Os termos “Fc”, “região Fc”, “domínio Fc” e “domínio Fc de IgG” como aqui usados se referem à porção de uma imunoglobulina, e.g., uma molécula de IgG, que se correlaciona com um fragmento cristalizável obtido pela digestão com papaína de uma molécula de IgG. A região Fc compreende a metade do terminal C de duas cadeias pesadas de uma molécula de IgG que estão ligadas por ligações dissulfeto. Não tem atividade de ligação ao antígeno, mas contém a porção de carboidrato e sítios de ligação para complemento e receptores Fc, incluindo o receptor FcRn (ver abaixo). Por exemplo, um domínio Fc contém o segundo domínio constante CH2 (e.g., resíduos nas posições EU 231 a 340 de IgG1 humano) e o terceiro domínio constante CH3 (e.g., resíduos nas posições EU 341 a 447 de IgG1 humano). Como aqui usado, o domínio Fc inclui a “região de dobradiça inferior” (e.g., resíduos nas posições EU 233 a 239 de IgG1).

[0112]Fc pode se referir a essa região em isolamento ou essa região no contexto de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou proteína de fusão Fc. Polimorfismos foram observados em várias posições nos domínios Fc incluindo, mas não limitadas às posições EU 270, 272, 312, 315, 356 e 358 e, portanto, pequenas diferenças entre as sequências apresentadas no presente pedido e as sequências conhecidas na técnica podem existir. Assim, um “domínio Fc de IgG tipo selvagem” ou “domínio Fc de IgG WT” se refere a qualquer região Fc de IgG que ocorre naturalmente (i.e., qualquer alelo). As sequências das cadeias pesadas de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanos podem ser encontradas em vários bancos de dados de sequências, por exemplo, no banco de dados Uniprot (www.uniprot.org) sob os números de acesso P01857 (IGHG1_HUMAN), P01859 (IGHG2_HUMAN), P01860 (IGHG3_HUMAN) e P01861 (IGHG1_HUMAN), respectivamente. Um exemplo de uma região Fc “WT” é fornecido na SEQ ID NO: 15 (que fornece uma região constante de cadeia pesada contendo uma região Fc).

[0113]Os termos “região Fc modificada” ou “região Fc variante” como aqui usados se referem a um domínio Fc de IgG compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, deleções, inserções ou modificações introduzidas em qualquer posição dentro do domínio Fc. Em certos aspectos, um domínio Fc de IgG variante compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que resultam em afinidade de ligação diminuída ou ablacionada para um R Fc gama e/ou C1q em comparação com o domínio Fc de tipo selvagem não compreendendo a uma ou mais substituições de aminoácidos. Além disso, as interações de ligação de Fc são essenciais para uma variedade de funções efetoras e eventos de sinalização a jusante incluindo, mas não limitados à citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Consequentemente, em certos aspectos, um anticorpo compreendendo um domínio Fc variante (e.g., um anticorpo, proteína de fusão ou conjugado) pode exibir afinidade de ligação alterada para pelo menos um ou mais ligantes de Fc (e.g., R Fc gamas) em relação a um anticorpo correspondente de outro modo tendo a mesma sequência de aminoácidos, mas não compreendendo a uma ou mais substituições, deleções, inserções ou modificações de aminoácidos, tais como, por exemplo, uma região Fc não modificada contendo resíduos de aminoácido que ocorrem naturalmente na posição correspondente na região Fc.

[0114]Os domínios Fc variantes aqui descritos são definidos de acordo com as modificações de aminoácidos que os compõem. Para todas as substituições de aminoácidos aqui discutidas em relação à região Fc, a numeração é sempre de acordo com o índice EU como em Kabat. Assim, por exemplo, D265C é um Fc variante com o ácido aspártico (D) na posição EU 265 substituído por cisteína (C) em relação ao domínio Fc precursor. Do mesmo modo, e.g., D265C/L234A/L235A define uma variante de Fc variante com substituições nas posições EU 265 (D a C), 234 (L a A) e 235 (L a A) em relação ao domínio Fc precursor. Uma variante também pode ser designada de acordo com sua composição de aminoácido final nas posições EU mutadas de aminoácidos. Por exemplo, o mutante L234A.L235A pode ser referido como “LALA”. Como um outro exemplo, o mutante E233P.L234V.L235A.delG236 (deleção de 236) pode ser referido como “EPLVLAdelG”. Como ainda um outro exemplo, o mutante I253A.H310A.H435A pode ser referido como “IHH”. É observado que a ordem em que as substituições são fornecidas é arbitrária.

[0115]Os termos “receptor Fc gama” ou “R Fc gama” como aqui usados se referem a qualquer membro da família de proteínas que se ligam à região Fc de anticorpo IgG e são codificados pelos genes Fc.gama.R. Em humanos essa família inclui, mas não é limitada a Fc.gama.RI (CD64), incluindo isoformas Fc.gama.RIa, Fc.gama.RIb e Fc.gama.RIc; Fc.gama.RII (CD32), incluindo isoformas Fc.gama.RIIa (incluindo alotipos H131 e R131), Fc.gama.RIIb (incluindo Fc.gama.RIIb-1 e Fc.gama.RIIb-2) e Fc.gama.RIIc; e Fc.gama.RIII (CD16), incluindo isoformas Fc.gama.RIIIa (incluindo alotipos V158 e F158) e Fc.gama.RIIIb (incluindo alotipos Fc.gama.RIIIb-NA1 e Fc.gama.RIIIb-NA2), bem como quaisquer isoformas ou alotipos Fc.gama.Rs ou Fc.gama.R humanos não descobertos. Um Fc.gama.R pode ser de qualquer organismo incluindo, mas não limitado a humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos. Fc.gama.Rs de camundongo incluem, mas não são limitados a Fc.gama.RI (CD64), Fc.gama.RII (CD32), Fc.gama.RIII (CD16) e Fc.gama.RIII-2 (CD16-2), bem como quaisquer isoformas ou alotipos Fc.gama.Rs ou Fc.gama.R de camundongo não descobertos.

[0116]O termo “função efetora”, como aqui usado, se refere a um evento bioquímico que resulta da interação de um domínio Fc com um receptor Fc. As funções efetoras incluem, mas não são limitados a ADCC, ADCP e CDC. Por “célula efetora”, como aqui usado, entende-se uma célula do sistema imunológico que expressa ou um ou mais receptores Fc e medeia uma ou mais funções efetoras. Células efetoras incluem, mas não são limitadas a monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastócitos, plaquetas, células B, linfócitos granulares grandes, células de Langerhans, células exterminadoras naturais (NK) e células T .gama.delta., e podem ser de qualquer organismo incluindo, mas não limitado a humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos.

[0117]O termo “silencioso”, “silenciado” ou “silenciamento”, como aqui usado, se refere a um anticorpo tendo uma região Fc modificada aqui descrita que tem ligação diminuída a um receptor Fc gama (FcγR) em relação à ligação de um anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada para o FcγR (e.g., uma diminuição na ligação a um FcγR em pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % em relação à ligação do anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada para o FcγR conforme medida por, e.g., BLI). Em algumas modalidades, o anticorpo silenciado em Fc não tem ligação detectável a um FcγR. A ligação de um anticorpo tendo uma região Fc modificada a um FcγR pode ser determinada usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, mas não limitadas a métodos de equilíbrio (e.g., ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA); KinExA, Rathanaswami et al. Analytical Biochemistry, Vol. 373: 52-60, 2008; ou radioimunoensaio (RIA)) ou por um ensaio de ressonância plasmônica de superfície ou outro mecanismo de ensaio com base em cinética (e.g., análise BIACORE.RTM. ou análise Octet.RTM. (forteBIO)) e outros métodos, tais como ensaios de ligação indireta, ensaios de ligação competitiva, transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET), eletroforese em gel e cromatografia (e.g., filtração em gel). Esses e outros métodos podem utilizar um marcador em um ou mais dos componentes sendo examinados e/ou utilizar uma variedade de métodos de detecção incluindo, mas não limitados a marcadores cromogênicos, fluorescentes, luminescentes ou isotópicos. Uma descrição detalhada de afinidades de ligação e cinéticas pode ser encontrada em Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4a Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), que se concentra em interações anticorpo-imunógeno. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio compreendendo a incubação de antígeno marcado com o anticorpo de interesse na presença de quantidades crescentes de antígeno não marcado e a detecção do anticorpo ligado ao antígeno marcado. A afinidade do anticorpo de interesse para um antígeno particular e as taxas de dissociação podem ser determinadas a partir dos dados por análise de gráficos de scatchard. A competição com um segundo anticorpo também pode ser determinada usando radioimunoensaios. Nesse caso, o antígeno é incubado com anticorpo de interesse conjugado a um composto marcado na presença de quantidades crescentes de um segundo anticorpo não marcado.

[0118]Como aqui usado, o termo “anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada” se refere a um anticorpo que carece das substituições de aminoácidos citadas (e.g., D265C, L234A, L235A e/ou H435A), mas, de outro modo, tem a mesma sequência de aminoácidos que o anticorpo modificado em Fc ao qual está sendo comparado.

[0119]Os termos “citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo” ou “ADCC” se referem a uma forma de citotoxicidade em que um polipeptídeo compreendendo um domínio Fc, e.g., um anticorpo, ligado a receptores Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (e.g., principalmente células NK, neutrófilos e macrófagos) e permite que essas células citotóxicas efetoras se liguem especificamente a uma “célula alvo” portadora de antígeno e subsequentemente mate a célula alvo com citotoxinas. (Hogarth et al., Nature review Drug Discovery 2012, 11: 313) É considerado que, além de anticorpos e fragmentos dos mesmos, outros polipeptídeos compreendendo domínios Fc, e.g., proteínas de fusão Fc e proteínas conjugadas Fc, tendo a capacidade de se ligar especificamente a uma célula alvo portadora de antígeno serão capazes de efetuar a citotoxicidade mediada por célula.

[0120]Para simplificar, a citotoxicidade mediada por célula resultante da atividade de um polipeptídeo compreendendo um domínio Fc também é referida aqui como atividade de ADCC. A capacidade de qualquer polipeptídeo particular da presente divulgação mediar a lise da célula alvo por ADCC pode ser avaliada. Para avaliar a atividade de ADCC, um polipeptídeo de interesse (e.g., um anticorpo) é adicionado em células alvo em combinação com células efetoras imunes, resultando na citólise da célula alvo. Citólise é geralmente detectada pela liberação de marcador (e.g., substratos radioativos, corantes fluorescentes ou proteínas intracelulares naturais) das células lisadas. Células efetoras úteis para esses ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células exterminadoras naturais (NK). Exemplos específicos de ensaios de ADCC in vitro são descritos em Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166: 1351 (1987); Wilkinson et al., J. Immunol. Methods 258: 183 (2001); Patel et al., J. Immunol. Methods 184: 29 (1995). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC do anticorpo de interesse pode ser avaliada in vivo, e.g., em um modelo animal, tal como aqueles divulgados em Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 652 (1998).

[0121]Como aqui usado, os termos “condição” e “condicionamento” se referem a processos pelos quais um paciente é preparado para receber um transplante, e.g., um transplante contendo células-tronco hematopoiéticas. Tais procedimentos promovem o enxerto de um transplante de células-tronco hematopoiéticas (por exemplo, como inferido a partir de um aumento sustentado na quantidade de células-tronco hematopoiéticas viáveis dentro de uma amostra de sangue isolada de um paciente após um procedimento de condicionamento e subsequente transplante de células-tronco hematopoiéticas. De acordo com os métodos aqui descritos, um paciente pode ser condicionado para terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas pela administração ao paciente de um ADC, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a um antígeno expressado por células-tronco hematopoiéticas, tal como CD117 (e.g., CD117 GNNK+), CD45, CD2, CD5, CD137 ou CD252. Como aqui descrito, o anticorpo pode ser covalentemente conjugado com uma citotoxina de modo a formar um ADC. A administração de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou um ADC capaz de se ligar a um ou mais dos antígenos anteriores em um paciente em necessidade de terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas pode promover o enxerto de um enxerto de célula-tronco hematopoiética, por exemplo, pelo esgotamento seletivo de células-tronco hematopoiéticas endógenas, criando assim uma vaga preenchida por um transplante de células-tronco hematopoiéticas exógenas.

[0122]Como aqui usado, o termo “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere a uma quantidade que é suficiente para obter o resultado desejado ou para ter um efeito em uma doença autoimune ou câncer.

[0123]Como aqui usado, o termo “meia-vida” se refere ao tempo que leva para a concentração plasmática do fármaco de anticorpo no corpo ser reduzida pela metade ou 50 %. Essa redução de 50 % na concentração sérica reflete a quantidade de fármaco circulante.

[0124]Como aqui usado, o termo “anticorpo humano” é intencionado a incluir anticorpos tendo regiões constantes e variáveis derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Um anticorpo humano pode incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (e.g., mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou durante o reagrupamento genético ou por mutação somática in vivo). Entretanto, o termo “anticorpo humano”, como aqui usado, não é intencionado a incluir anticorpos em que as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências de estrutura humana. Um anticorpo humano pode ser produzido em uma célula humana (por exemplo, por expressão recombinante) ou por um animal não humano ou uma célula procariótica ou eucariótica que é capaz de expressar funcionalmente genes reorganizados de imunoglobulina humana (tal como cadeia pesada e/ou cadeia leve). Quando um anticorpo humano é um anticorpo de cadeia simples, pode incluir um peptídeo conector que não é encontrado em anticorpos humanos nativos. Por exemplo, um Fv pode conter um peptídeo conector, tal como duas a cerca de oito glicinas ou outros resíduos de aminoácido, que conecta a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve. Esses peptídeos conectores são considerados como sendo de origem humana. Anticorpos humanos podem ser feitos por uma variedade de métodos conhecidos na técnica incluindo métodos de exibição de fago usando bibliotecas de anticorpos derivadas de sequências de imunoglobulina humanas. Anticorpos humanos também podem ser produzidos usando camundongos transgênicos que são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, Publicação PCT Nos WO 1998/24893; WO 1992/01047; WO 1996/34096; WO 1996/33735; Patentes dos EUA Nos 5.413.923;

5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793;

5.916.771; e 5.939.598).

[0125]Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (e.g., murinos) são imunoglobulinas quiméricas que contêm sequências mínimas derivadas de imunoglobulina não humana. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas das regiões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma sequência consenso de imunoglobulina humana. Métodos de humanização de anticorpos são conhecidos na técnica. Ver, e.g., Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-7; Pat. dos EUA Nos 5.530.101;

5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; e 6.180.370 por Queen et al.; EP239400; Publicação PCT WO 91/09967; Pat. dos EUA No 5.225.539; EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28: 489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7: 805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 969-973; e Pat. dos EUA No 5.565.332.

[0126]Como aqui usado, o termo “enxerto potencial” é usado para se referir à capacidade de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas repovoarem um tecido, quer essas células estejam circulando naturalmente ou sejam fornecidas por transplante. O termo abrange todos os eventos que envolvem ou levam ao enxerto, tais como direcionamento de células ao tecido e colonização de células dentro do tecido de interesse. A eficiência do enxerto ou taxa de enxerto pode ser avaliada ou quantificada usando qualquer parâmetro clinicamente aceitável como conhecido por um especialista na técnica e pode incluir, por exemplo, avaliação de unidades de repovoamento competitivo (CRU); incorporação ou expressão de um marcador em tecidos nos quais as células-troncos se alojaram, colonizaram ou foram enxertadas; ou pela avaliação do progresso de um sujeito através da progressão da doença, sobrevivência das células-tronco e progenitoras hematopoiéticas ou sobrevivência de um receptor. O enxerto também pode ser determinado medindo as contagens de glóbulos brancos no sangue periférico durante um período de pós-transplante. O enxerto também pode ser avaliado medindo a recuperação de células da medula por células do doador em uma amostra aspirada da medula óssea.

[0127]Como aqui usado, o termo “células-tronco hematopoiéticas” (“HSCs”) se refere às células sanguíneas imaturas tendo a capacidade de se autorrenovar e se diferenciar em células sanguíneas maduras compreendendo diversar linhagens incluindo, mas não limitado a granulócitos (e.g., promielócitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos), eritrócitos (e.g., reticulócitos, eritrócitos), trombócitos (e.g., megacarioblastos, megacariócitos produtores de plaquetas, plaquetas), monócitos (e.g., monócitos, macrófagos), células dendríticas, microglia, osteoclastos e linfócitos (e.g., células NK, células B e células T). Essas células podem incluir células CD34+. As células CD34+ são células imaturas que expressam o marcador de superfície celular CD34. Em humanos, acredita-se que as células CD34+ incluem uma subpopulação de células com as propriedades das células-tronco definidas acima, enquanto que em camundongos, as HSCs são CD34-. Além disso, as HSCs também se referem a HSCs de repovoamento de longo prazo (LT-HSC) e HSCs de repovoamento de curto prazo (ST-HSC). LT-HSCs e ST-HSCs são diferenciadas, com base no potencial funcional e na expressão celular de marcadores de superfície. Por exemplo, HSCs humanas são CD34+, CD38-, CD45RA-, CD90+, CD49F+ e lin- (negativo para marcadores de linhagem madura incluindo CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD10, CD11B, CD19, CD20, CD56, CD235A). Em camundongos, as LT-HSCs da medula óssea são CD34-, SCA-1+, C-kit+, CD135-, Slamfl/CD150+, CD48- e lin- (negativo para marcadores de linhagem madura incluindo Ter119, CD11b, Gr1, CD3, CD4, CD8, B220, IL7ra), enquanto que as ST-HSCs são CD34+, SCA-1+, C-kit+, CD135-, Slamfl/CD150+ e lin-(negativo para marcadores de linhagem madura incluindo Ter119, CD11b, Gr1, CD3, CD4, CD8, B220, IL7ra). Além disso, as ST-HSCs são menos quiescentes e mais proliferativas que as LT-HSCs sob condições homeostáticas. Entretanto, as LT-HSC têm maior potencial de autorrenovação (i.e., elas sobrevivem ao longo da vida adulta e podem ser transplantadas em série para receptores sucessivos), enquanto que as ST-HSCs têm autorrenovação limitada (i.e., elas sobrevivem por apenas um período de tempo limitado e não possuem potencial de transplante em série). Qualquer uma dessas HSCs pode ser usada nos métodos aqui descritos. As ST-HSCs são particularmente úteis porque elas são altamente proliferativas e, assim, podem mais prontamente dar origem à progênie diferenciada.

[0128]Como aqui usado, o termo “anticorpo anti-célula hematopoiética” ou “anticorpo anti-HC” se refere a um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno expressado por células-tronco hematopoiéticas, tal como CD117 (e.g., CD117 GNNK+) ou CD45; ou um antígeno expressado por células imunes maduras (e.g., células T) tal como CD45, CD2, CD5, CD137 ou CD252.

[0129]Como aqui usado, o termo “potencial funcional da célula-tronco hematopoiética” se refere às propriedades funcionais das células-tronco hematopoiéticas que incluem 1) multi-potência (que se refere à capacidade de se diferenciar em múltiplas linhagens sanguíneas diferentes incluindo, mas não limitadas a granulócitos (e.g., promielócitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos), eritrócitos (e.g., reticulócitos, eritrócitos), trombócitos (e.g., megacarioblastos, megacariócitos produtores de plaquetas, plaquetas), monócitos (e.g., monócitos, macrófagos), células dendríticas, microglia, osteoclastos e linfócitos (e.g., células NK, células T e células B), 2) autorrenovação (que se refere à capacidade de células-tronco hematopoiéticas darem origem a células-filhas que tenham potencial equivalente ao da célula-mãe e ainda que essa capacidade possa ocorrer repetidamente ao longo da vida de um indivíduo sem exaustão) e 3) a capacidade de as células-tronco hematopoiéticas ou progênie das mesmas serem reintroduzidas em um receptor do transplante, após o que se alojam no nicho de células-tronco hematopoiéticas e reestabelecem a hematopoese produtiva e sustentada.

[0130]Como aqui usado, os termos “sujeito” e “paciente” se referem a um organismo, tal como um humano, que recebe tratamento para uma doença ou condição particular como aqui descrita. Por exemplo, um paciente, tal como um paciente humano, pode receber tratamento antes da terapia de transplante de células- tronco hematopoiéticas de modo a promover o enxerto de células-tronco hematopoiéticas exógenas.

[0131]Como aqui usado, o termo “doador” se refere a um humano ou animal a partir do qual uma ou mais células são isoladas antes da administração das células, ou progênie das mesmas, em um receptor. A uma ou mais células podem ser, por exemplo, uma população de células-tronco hematopoiéticas.

[0132]Como aqui usado, o termo “diabody” se refere a um anticorpo bivalente contendo duas cadeias polipeptídicas, em que cada cadeia polipeptídica inclui domínios VH e VL unidos por um conector que é muito curto (e.g., um conector composto por cinco aminoácidos) para permitir a associação intramolecular dos domínios VH e VL na mesma cadeia peptídica. Essa configuração força cada domínio a emparelhar com um domínio complementar em outra cadeia polipeptídica de modo a formar uma estrutura homodimérica. Consequentemente, o termo “triabody” se refere a anticorpos trivalentes contendo três cadeias peptídicas, cada uma da quais contém um domínio VH e um domínio VL unidos por um conector que é excessivamente curto (e.g., um conector composto por 1 a 2 aminoácidos) para permitir associação intramolecular dos domínios VH e VL dentro da mesma cadeia peptídica. A fim de dobrar em suas estruturas nativas, os peptídeos configurados dessa maneira tipicamente trimerizam de modo a posicionar os domínios VH e VL de cadeias peptídicas vizinhas espacialmente proximais entre si (ver, por exemplo, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-48, 1993).

[0133]Como aqui usado, o termo “endógeno” descreve uma substância, tal como uma molécula, célula, tecido ou órgão (e.g., uma célula-tronco hematopoiética ou uma célula de linhagem hematopoiética, tal como um megacariócito, trombócito, plaqueta, eritrócito, mastócito, mieoblasto, basófilo, neutrófilo, eosinófilo, célula microglial, granulócito, monócito, osteoclasto, célula apresentadora de antígeno, macrófago, célula dendrítica, célula exterminadora natural, linfócito T ou linfócito B) que é encontrado naturalmente em um organismo particular, tal como um paciente humano.

[0134]Como aqui usado, o termo “receptor” se refere a um paciente que recebe um transplante, tal como um transplante contendo uma população de células- tronco hematopoiéticas. As células transplantadas administradas a um receptor podem ser, e.g., células autólogas, singênicas ou alogênicas.

[0135]Como aqui usado, o termo “amostra” se refere a um espécime (e.g., sangue, componente do sangue (e.g., soro ou plasma), urina, saliva, fluido amniótico, fluido cerebroespinal, tecido (e.g., placentário ou dérmico), fluido pancreático, amostra de vilosidade cariônica e células) retirado de um sujeito.

[0136]Como aqui usado, o termo “scFv” se refere a um anticorpo com Fv de cadeia simples em que os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo foram unidos para formar uma cadeia. Os fragmentos scFv contêm uma única cadeia polipeptídica que inclui a região variável de uma cadeia leve de anticorpo (VL) (e.g., CDR-L1, CDR-L2 e/ou CDR-L3) e a região variável de uma cadeia pesada de anticorpo (VH) (e.g., CDR-H1, CDR-H2 e/ou CDR-H3) separadas por um conector. O conector que une as regiões VL e VH de um fragmento scFv pode ser um peptídeo conector composto por aminoácidos proteinogênicos. Os conectores alternativos podem ser usados de modo a aumentar a resistência do fragmento scFv à degradação proteolítica (por exemplo, os conectores contendo D-aminoácidos), de modo a intensificar a solubilidade do fragmento scFv (por exemplo, conectores hidrofílicos, tais como conectores contendo polietilenoglicol ou polipeptídeos contendo resíduos de glicina e serina em repetição), para melhorar a estabilidade biofísica da molécula (por exemplo, um conector contendo resíduos de cisteínas que formam ligações dissulfeto intramoleculares ou intermoleculares) ou para atenuar a imunogenicidade do fragmento scFv (por exemplo, conectores contendo sítios de glicosilação). Também será entendido por um especialista na técnica que as regiões variáveis das moléculas scFv aqui descritas podem ser modificadas de modo que variem em sequência de aminoácidos da molécula de anticorpo da qual foram derivadas. Por exemplo, podem ser feitas substituições de nucleotídeos ou aminoácidos levando a substituições ou alterações conservadoras nos resíduos de aminoácido (e.g., na CDR e/ou resíduos de estrutura) de modo a preservar ou intensificar a capacidade do scFv se ligar ao antígeno reconhecido pelo anticorpo correspondente.

[0137]Como aqui usado, a frase “substancialmente eliminado do sangue” se refere a um ponto no tempo após a administração de um agente terapêutico (tal como um anticorpo anti-CD117, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) a um paciente quando a concentração do agente terapêutico em uma amostra de sangue isolada do paciente é tal que o agente terapêutico não é detectável por meios convencionais (por exemplo, tal que o agente terapêutico não seja detectável acima do limite de ruído do dispositivo ou ensaio usado para detectar o agente terapêutico). Uma variedade de técnicas conhecidas na técnica pode ser usada para detectar anticorpos, fragmentos de anticorpo e ligantes de proteína, tais como ensaios de detecção com base em ELISA conhecidos na técnica ou aqui descritos. Ensaios adicionais que podem ser usados para detectar anticorpos, ou fragmentos de anticorpo, incluem técnicas de imunoprecipitação e ensaios de imunotransferência, entre outros conhecidos na técnica.

[0138]Como aqui usado, o termo “transfecção” se refere a qualquer uma de uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, tal como eletroporação, lipofecção, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de dextrano DEAE e semelhantes.

[0139]Como aqui usado “tratar” ou “tratamento” se refere a reduzir a severidade e/ou frequência de sintomas da doença, eliminar sintomas da doença e/ou a causa subjacente dos ditos sintomas, reduzir a frequência ou probabilidade de sintomas da doença e/ou sua causa adjacente e melhorar ou remediar os danos causados, diretamente ou indiretamente, pela doença, qualquer melhoria de qualquer consequência da doença, tal como sobrevivência prolongada, menos morbidade e/ou uma diminuição dos efeitos colaterais que são os subprodutos de uma modalidade terapêutica alternativa; como é prontamente avaliado na técnica, a erradicação total da doença é preferida, mas não um requisito para uma ação de tratamento.

Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não são limitados a promover o enxerto de células hematopoiéticas exógenas em um paciente após a terapia de condicionamento de anticorpo como aqui descrito e, subsequente, terapia de transplante de célula-tronco hematopoiética.

Os resultados benéficos adicionais incluem um aumento na contagem de células ou concentração relativa de células- tronco hematopoiéticas em um paciente em necessidade de um transplante de células-tronco hematopoiéticas após a terapia de condicionamento e subsequente administração de um enxerto exógeno de célula-tronco hematopoiética ao paciente.

Resultados benéficos da terapia aqui descrita também podem incluir um aumento na contagem de células ou concentração relativa de uma ou mais células de linhagem hematopoiética, tais como um megacariócito, trombócito, plaqueta, eritrócito, mastócitos, mieloblasto, basófilo, neutrófilo, eosinófilo, célula microglial, granulócito, monócito, osteoclasto, célula apresentadora de antígeno, macrófago, célula dendrítica, célula exterminadora natural, linfócito T ou linfócito B, após a terapia de condicionamento e subsequente terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Resultados benéficos adicionais podem incluir a redução na quantidade de uma população de célula que causa a doença, tal como uma população de células de câncer (e.g., células leucêmicas CD117+) ou células autoimunes (e.g., linfócitos autoimunes CD117+, tais como uma célula T CD117+ que expressa um receptor de célula T que reage de forma cruzada com um autoantígeno). Na medida em que os métodos da presente divulgação são dirigidos a prevenir transtornos, é entendido que o termo “prevenir” não requer que o estado da doença seja completamente frustrado. Em vez disso, como aqui usado, o termo prevenir se refere à capacidade do técnico habilitado para identificar uma população que é suscetível aos transtornos, tal que a administração dos compostos da presente divulgação possa ocorrer antes do início de uma doença. O termo não significa que o estado da doença é completamente evitado.

[0140]Como aqui usado, pacientes que estão “em necessidade de” um transplante de células-tronco hematopoiéticas incluem pacientes que exibem um defeito ou deficiência em um ou mais tipos de células do sangue, bem como pacientes tendo um transtorno de célula-tronco, doença autoimune, câncer ou outra patologia aqui descrita. As células-tronco hematopoiéticas geralmente exibem 1) multi-potência e podem, portanto, se diferenciar em múltiplas linhagens sanguíneas diferentes incluindo, mas não limitadas a granulócitos (e.g., promielócitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos), eritrócitos (e.g., reticulócitos, eritrócitos), trombócitos (e.g., megacarioblastos, megacariócitos produtores de plaquetas, plaquetas), monócitos (e.g., monócitos, macrófagos), células dendríticas, microglia, osteoclastos e linfócitos (e.g., células NK, células B e células T), 2) autorrenovação e podem, portanto, dar origem a células-filhas que têm potencial equivalente à célula-mãe e 3) a capacidade de serem reintroduzidas em um receptor do transplante, após o que elas se alojam no nicho de células-tronco hematopoiéticas e reestabelecem a hematopoese produtiva e sustentada. As células-tronco hematopoiéticas pode, portanto, serem administradas a um paciente defeituoso ou deficiente em um ou mais tipos de célula da linhagem hematopoiética de modo a reconstituir a população de células defeituosa ou deficiente in vivo. Por exemplo, o paciente pode estar sofrendo de câncer, e a deficiência pode ser causada pela administração de um agente quimioterapêutico ou outro medicamento que esgota, seletivamente ou não especificamente, a população de células cancerosas.

Além disso, ou alternativamente, o paciente pode estar sofrendo de uma hemoglobinopatia (e.g., uma hemoglobinopatia não maligna), tal como anemia falciforme, talassemia, anemia de Fanconi, anemia aplásica e síndrome de Wiskott- Aldrich.

O sujeito pode ser alguém que esteja sofrendo de imunodeficiência combinada grave de adenosina desaminase (ADA SCID), HIV/AIDS, Leucodistrofia metacromática, anemia de Diamond-Blackfan e síndrome de Schwachman-Diamond.

O sujeito pode ter ou ser afetado por um transtorno sanguíneo hereditário (e.g., anemia falciforme) ou um transtorno autoimune.

Além disso, ou alternativamente, o sujeito pode ter ou ser afetado por uma malignidade, tal como neuroblastoma ou um câncer hematológico.

Por exemplo, o sujeito pode ter uma leucemia, linfoma ou mieloma.

Em algumas modalidades, o sujeito tem leucemia mieloide aguda, leucemia linfoide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoide crônica, mieloma múltiplo, linfoma difuso de grandes células B ou linfoma não-Hodgkin.

Em algumas modalidades, o sujeito tem síndrome mielodisplásica.

Em algumas modalidades, o sujeito tem uma doença autoimune, tal como esclerodermia, esclerose múltipla, colite ulcerativa, doença de Crohn, diabetes Tipo 1 ou outra patologia autoimune aqui descrita.

Em algumas modalidades, o sujeito necessita de terapia de células T com receptor de antígeno quimérico (CART). Em algumas modalidades, o sujeito tem ou é de outro modo afetado por um transtorno de armazenamento metabólico.

O sujeito pode sofrer ou, de outro modo, ser afetado por um transtorno metabólico selecionado do grupo que consiste em doenças de armazenamento de glicogênio, mucopolissacaridose, doença de Gaucher, doença de Hurlers, esfingolipidose, Leucodistrofia metacromática ou quaisquer outras doenças ou transtornos que podem se beneficiar dos tratamentos e terapias aqui divulgados e incluindo, sem limitação, imunodeficiência combinada grave, síndrome de Wiscott-Aldrich, síndrome de hiperimunoglobulina M (IgM), doença de Chediak-Higashi, linfo-histiocitose hereditária, osteopetrose, osteogênese imperfeita, doenças de armazenamento, talassemia maior, doença falciforme, esclerose sistêmica, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, artrite reumatoide juvenil e aquelas doenças ou transtornos descritos em “Bone Marrow Transplantation for Non-Malignant Disease”, ASH Education Book, 1: 319-338 (2000), cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade no que se refere às patologias que podem ser tratadas pela administração de terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas. Adicionalmente ou alternativamente, um paciente “em necessidade de” um transplante de células-tronco hematopoiéticas pode ser aquele que está ou não sofrendo de uma das patologias anteriores, mas, no entanto, não exibe um nível reduzido (e.g., em comparação com equele de um sujeito de outro modo saudável) de um ou mais tipos de célula endógena dentro da linhagem hematopoiética, tal como megacariócitos, trombócitos, plaquetas, eritrócitos, mastócitos, mieoblastos, basófilos, neutrófilos, eosinófilos, microglia, granulócitos, monócitos, osteoclastos, células apresentadoras de antígeno, macrófagos, células dendríticas, células exterminadoras naturais, linfócitos T e linfócitos B. Um especialista na técnica pode prontamente determinar se o nível de uma ou mais dos tipos de células anteriores, ou outro tipo de célula do sangue, é reduzido em relação a um sujeito de outro modo saudável, por exemplo, por meio de citometria de fluxo e métodos de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), dentre outros procedimentos conhecidos na técnica.

[0141]Como aqui usado, os termos “variante” e “derivado” são usados permutavelmente e se referem a análogos que ocorrem naturalmente, sintéticos e semi-sintéticos de um composto, peptídeo, proteína ou outra substância aqui descrita. Uma variante ou derivado de um composto, peptídeo, proteína ou outra substância aqui descrita pode manter ou melhorar a atividade biológica do material original.

[0142]Como aqui usado, a frase “transtorno de célula-tronco” se refere amplamente a qualquer doença, transtorno ou condição que pode ser tratada ou curada pelo condicionamento dos tecidos alvo de um sujeito e/ou pela ablação de uma população de células-tronco endógenas em um tecido alvo (e.g., ablação de uma cepa hematopoiética endógena ou população de células progenitoras do tecido da medula óssea de um sujeito) e/ou pelo enxerto ou transplante de células-troncos em tecidos alvo de um sujeito.

Por exemplo, diabetes Tipo I demonstrou ser curado pelo transplante de células-tronco hematopoiéticas e pode se beneficiar do condicionamento de acordo com as composições e métodos aqui descritos.

Transtornos adicionais que podem ser tratados usando as composições e métodos aqui descritos incluem, sem limitação, anemia falciforme, talassemias, anemia de Fanconi, anemia aplásica, síndrome de Wiskott-Aldrich, ADA SCID, HIV/AIDS, Leucodistrofia metacromática, anemia de Diamond-Blackfan e síndrome de Schwachman-Diamond.

Doenças adicionais que podem ser tratadas usando os métodos de condicionamento do paciente e/ou transplante de células-tronco hematopoiéticas aqui descritos incluem transtornos sanguíneos hereditários (e.g., anemia falciforme) e transtornos autoimunes, tais como esclerodermia, esclerose múltipla, colite ulcerativa e doença de Crohn.

Doenças adicionais que podem ser tratadas usando os métodos de condicionamento e/ou transplante aqui descritos incluem uma malignidade, tal como um neuroblastoma ou um câncer hematológico, tal como leucemia, linfoma e mieloma.

Por exemplo, o câncer pode ser leucemia mieloide aguda, leucemia linfoide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoide crônica, mieloma múltiplo, linfoma difuso de grandes células B ou linfoma não- Hodgkin.

Doenças adicionais tratáveis usando os métodos de condicionamento e/ou transplante aqui descritos incluem síndrome mielodisplásica.

Em algumas modalidades, o sujeito tem ou é de outro modo afetado por um transtorno de armazenamento metabólico.

Por exemplo, o sujeito pode sofrer ou, de outro modo, ser afetado por um transtorno metabólico selecionado do grupo que consiste em doenças de armazenamento de glicogênio, mucopolissacaridose, doença de

Gaucher, doença de Hurlers, esfingolipidose, Leucodistrofia metacromática ou quaisquer outras doenças ou transtornos que podem se beneficiar dos tratamentos e terapias aqui divulgados e incluindo, sem limitação, imunodeficiência combinada grave, síndrome de Wiscott-Aldrich, síndrome de hiperimunoglobulina M (IgM), doença de Chediak-Higashi, linfo-histiocitose hereditária, osteopetrose, osteogênese imperfeita, doenças de armazenamento, talassemia maior, doença falciforme, esclerose sistêmica, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, artrite reumatoide juvenil e aquelas doenças ou transtornos descritos em “Bone Marrow Transplantation for Non-Malignant Disease”, ASH Education Book, 1: 319-338 (2000), cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade no que se refere às patologias que podem ser tratadas pela administração de terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas.

[0143]Como aqui usado, o termo “vetor” inclui um vetor de ácido nucleico, tal como um plasmídeo, um vetor de DNA, um plasmídeo, um vetor de RNA, vírus ou outro replicon adequado. Os vetores de expressão aqui descritos podem conter uma sequência polinucleotídica bem como, por exemplo, elementos adicionais de sequência usados para a expressão de proteínas e/ou a integração dessas sequências polinucleotídicas no genoma de uma célula de mamífero. Certos vetores que podem ser usados para a expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpo da invenção incluem plasmídeos que contêm sequências reguladoras, tais como regiões promotoras e intensificadoras, que direcionam a transcrição gênica. Outros vetores úteis para a expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpo contêm sequências polinucleotídicas que intensificam a taxa de translação desses genes ou melhoram a estabilidade ou exportação nuclear do mRNA que resulta da transcrição gênica. Esses elementos de sequência podem incluir, por exemplo, regiões não traduzidas 5’ e 3’ e um sítio de sinal de poliadenilação de modo a direcionar transcrição eficiente do gene transportado no vetor de expressão. Os vetores de expressão aqui descritos também podem conter um polinucleotídeo que codifica um marcador para a seleção de células que contêm esse vetor. Exemplos de um marcador adequado incluem genes que codificam resistência a antibióticos, tais como ampicilina, cloranfenicol, canamicina e nourseotricina.

[0144]Como aqui usado, o termo “conjugado” ou “conjugado fármaco- anticorpo” ou “ADC” se refere a um anticorpo que é ligado a uma citotoxina. Um ADC é formado pela união química de um grupo funcional reativo de uma molécula, tal como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, com um grupo funcional reativo apropriado de outra molécula, tal como uma citotoxina aqui descrita. Conjugados podem incluir um conector entre as duas moléculas ligadas uma à outra, e.g., entre um anticorpo e uma citotoxina. Exemplos de conectores que podem ser usados para a formação de um conjugado incluem conectores contendo peptídeo, tais como aqueles que contêm aminoácidos que ocorrem naturalmente ou que não ocorrem naturalmente, tais como D-aminoácidos. Os conectores podem ser preparados usando uma variedade de estratégias aqui descritas e conhecidas na técnica. Dependendo dos componentes reativos nele, um conector pode ser clivado, por exemplo, por hidrólise enzimática, fotólise, hidrólise sob condições ácidas, hidrólise sob condições básicas, oxidação, redução de dissulfeto, clivagem nucleofílica ou clivagem organometálica (ver, por exemplo, Leriche et al., Bioorg. Med. Chem., 20: 571-582, 2012).

[0145]Como aqui usado, o termo “agente de ligação a microtúbulos” se refere a um composto que atua rompendo a rede microtubular que é essencial para a função mitótica e de interfase celular em uma célula. Exemplos de agentes de ligação a microtúbulos incluem, mas não são limitados a maitasina, maitansinoides e derivados dos mesmos, tais como aqueles aqui descritos ou conhecidos na técnica, alcaloides da vinca, tais como vinblastina, sulfato de vinblastina, vincristina, sulfato de vincristina, vindesina e vinorelbina, taxanos, tais como docetaxel e paclitaxel, macrolídeos, tais como discodermolídeos, cochicina e epotilonas e derivados dos mesmos, tais como epotilona B ou um derivado desta.

[0146]Como aqui usado, o termo “amatoxina” se refere a um membro da família amatoxina de peptídeos produzidos por cogumelos Amanita phalloides, ou uma variante ou derivado da mesma, tal como uma variante ou derivado da mesma capaz de inibir atividade de RNA polimerase II. Amatoxinas úteis em conjunto com as composições e métodos aqui descritos incluem compostos tais como, mas não limitados aos compostos das Fórmulas (III), (IIIA), (IIIB) e (IIIC), cada um conforme aqui descrito abaixo (e.g., uma α-amanitina, β-amanitina, γ-amanitina, ε-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina, ácido amanulinaico ou pró-amanulina). Como aqui descrito, amatoxinas podem ser conjugadas a um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, por meio de uma porção conectora (L) (formando assim um ADC). Métodos exemplificativos de conjugação de amatoxina e conectores úteis para tais processos são descritos abaixo. Amatoxinas contendo conectores exemplificativas úteis para conjugação com um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com as composições e métodos também são aqui descritas.

[0147]O termo “acila”, como aqui usado, se refere a -C(=O)R, em que R é hidrogênio (“aldeído”), alquila C1-C12, alquenila C2-C12, alquinila C2-C12, carbociclila C3-C7, arila C6-C20, heteroarila de 5 a 10 membros ou heterociclila de 5 a 10 membros, como aqui definido. Exemplos não limitativos incluem formila, acetila, propanoila, benzoila e acriloila.

[0148]O termo “alquila C1-C12”, como aqui usado, se refere a um hidrocarboneto saturado de cadeia reta ou ramificada tendo de 1 a 12 átomos de carbono. Grupos representativos de alquila C1-C12 incluem, mas não são limitados a - metila, -etila, -n-propila, -n-butila, -n-pentila e -n-hexila; enquanto alquilas C1-C12 ramificadas incluem, mas não são limitadas a -isopropila, -sec-butila, -isobutila, -tert-

butila, -isopentila e 2-metilbutila. Um grupo alquila C1-C12 pode ser substituído ou não substituído.

[0149]O termo “alquenila”, como aqui usado, se refere ao hidrocarboneto C2- C12 contendo átomos de carbono normais, secundários ou terciários com pelo menos um sítio de insaturação, i.e., uma ligação dupla carbono-carbono sp2. Exemplos incluem, mas não são limitados a: etileno ou vinila, -alila, -1-butenila, -2-butenila, - isobutilenila, -1-pentenila, -2-pentenila, -3-metil-1-butenila, -2-metil-2-butenila, -2,3- dimetil-2-butenila e semelhantes. Um grupo alquenila pode ser substituído ou não substituído.

[0150]“Alquinila”, como aqui usado, se refere a um hidrocarboneto C2-C12 contendo átomos de carbono normais, secundários ou terciários com pelo menos um sítio de insaturação, i.e., uma ligação tripla carbono-carbono, sp. Exemplos incluem, mas não são limitados a acetilênico e propargil. Um grupo alquinila pode ser substituído ou não substituído.

[0151]“Arila”, como aqui usado, se refere a um grupo aromático carbocíclico C6-C20. Exemplos de grupos arila incluem, mas não são limitados a fenila, naftila e antracenila. Um grupo arila pode ser substituído ou não substituído.

[0152]“Arilalquila”, como aqui usado, se refere a um radical alquila acíclico em que um dos átomos de hidrogênio ligados a um átomo de carbono, tipicamente um terminal ou átomo de carbono sp3, é substituído por um radical arila. Grupos arilalquila típicos incluem, mas não são limitados a benzila, 2-feniletan-1-ila, 2-fenileten-1-ila, naftlmetila, 2-naftiletan-1-ila, 2-naftileten-1-ila, naftobenzila, 2-naftofeniletan-1-ila e semelhantes. O grupo arilalquila compreende 6 a 20 átomos de carbono, e.g., a porção alquila, incluindo o grupo alcanila, alquenila ou alquinila, do grupo arilalquila tem 1 a 6 átomos de carbono e a porção arila tem 5 a 14 átomos de carbono. Um grupo alcarila pode ser substituído ou não substituído.

[0153]“Cicloalquila”, como aqui usado, se refere a um radical carbocíclico saturado, que pode ser mono- ou bicíclico. Grupos cicloalquila incluem um anel tendo 3 a 7 átomos de carbono como um monociclo ou 7 a 12 átomos de carbono como um biciclo. Exemplos de grupos cicloalquila monocíclicos incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-heptila e ciclooctila. Um grupo cicloalquila pode ser substituído ou não substituído.

[0154]“Cicloalquenila”, como aqui usado, se refere a um radical carbocíclico insaturado, que pode ser mono- ou bicíclico. Grupos cicloalquenila incluem um anel tendo 3 a 6 átomos de carbono como um monociclo ou 7 a 12 átomos de carbono como um biciclo. Exemplos de grupos cicloalquenila monocíclicos incluem 1-ciclopent- 1-enila, 1-ciclopent-2-enila, 1-ciclopent-3-enila, 1-ciclo-hex-1-enila, 1-ciclo-hex-2-enila e 1-ciclo-hex-3-enila. Um grupo cicloalquenila pode ser substituído ou não substituído.

[0155]“Heteroaralquila”, como aqui usado, se refere a um radical alquila acíclico em que um dos átomos de hidrogênio ligados a um átomo de carbono, tipicamente um átomo de carbono terminal ou sp3, é substituído por um radical heteroarila. Grupos heteroarilalquila típicos incluem, mas não são limitados a 2- benzimidazolilmetila, 2-furiletila e semelhantes. O grupo heteroarilalquila compreende 6 a 20 átomos de carbono, e.g., a porção alquila, incluindo os grupos alcanila, alquenila ou alquinila, do grupo heteroarilalquila tem 1 a 6 átomos de carbono e a porção heteroarila tem 5 a 14 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P e S. A porção heteroarila do grupo heteroarilalquila pode ser um monociclo tendo de 3 a 7 membros no anel (2 a 6 átomos de carbono ou um biciclo tendo 7 a 10 membros no anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P e S), por exemplo: um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6].

[0156]“Heteroarila” e “heterocicloalquila” como aqui usados se referem a um sistema de anel aromático ou não aromático, respectivamente, em que um ou mais átomos no anel são heteroátomos, e.g., nitrogênio, oxigênio e enxofre. O radical heteroarila ou heterocicloalquila compreende 2 a 20 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P e S. Uma heteroarila ou heterocicloalquila pode ser um monociclo tendo 3 a 7 membros no anel (2 a 6 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P e S) ou um biciclo tendo 7 a 10 membros no anel (4 a 9 átomos de carbono e 1 a 3 heteroátomos selecionados de N, O, P e S), por exemplo: um sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] ou [6,6]. Heteroarila e heterocicloalquila podem ser substituídas ou não substituídas.

[0157]OS grupos heteroarila e heterocicloalquila são descritos em Paquette, Leo A.; “Principles of Modern Heterocyclic Chemistry” (W. A. Benjamin, New York, 1968), particularmente os Capítulos 1, 3, 4, 6, 7 e 9; “The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs” (John Wiley & Sons, New York, 1950 até o presente), em particular os Volumes 13, 14, 16, 19 e 28; e J. Am. Chem. Soc. (1960) 82: 5566.

[0158]Exemplos de grupos heteroarila incluem, a título de exemplo e não limitação, piridila, tiazolila, tetra-hidrotiofenila, pirimidinila, furanila, tienila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, tetrazolila, benzofuranila, tianaftalenila, indolila, indolenila, quinolinila, isoquinolinila, benzimidazolila, isoxazolila, pirazinila, piridazinila, indolizinila, isoindolila, 3H-indolila, 1H-indazolila, purinila, 4H-quinolizinila, ftalazinila, naftiridinila, quinoxalinila, quinazolinila, cinolinila, pteridinila, 4aH-carbazolila, carbazolila, fenantridinila, acridinila, pirimidinila, fenantrolinila, fenazinila, fenotiazinila, furazanila, fenoxazinila, isocromanila, cromanila, imidazolidinila, imidazolinila, pirazolidinila, pirazolinila, benzotriazolila, benzisoxazolila e isatinoila.

[0159]Exemplos de heterocicloalquilas incluem, a título de exemplo e não limitação, di-hidroipiridila, tetra-hidropiridila (piperidila), tetra-hidrotiofenila, piperidinila, 4-piperidonila, pirrolidinila, 2-pirrolidonila, tetra-hidrofuranila, tetra-hidropiranila, bis- tetra-hidropiranila, tetra-hidroquinolinila, tetra-hidroisoquinolinila, deca- hidroquinolinila, octa-hidroisoquinolinila, piperazinila, quinuclidinila e morfolinila.

[0160]A título de exemplo e não limitação, heteroarilas e heterocicloalquilas ligadas a carbono são ligadas na posição 2, 3, 4, 5 ou 6 de uma piridina, posição 3, 4, 5 ou 6 de uma piridazina, posição 2, 4, 5 ou 6 de uma pirimidina, posição 2, 3, 5 ou 6 de uma pirazina, posição 2, 3, 4, ou 5 de um furano, tetra-hidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol ou tetra-hidropirrol, posição 2, 4, ou 5 de um oxazol, imidazol ou tiazol, posição 3, 4, ou 5 de um isoxazol, pirazol ou isotiazol, posição 2 ou 3 de uma aziridina, posição 2, 3 ou 4 de uma azetidina, posição 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de uma quinolina ou posição 1, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 de uma isoquinolina. Ainda mais tipicamente, heterociclos ligados a carbono incluem 2-piridila, 3-piridila, 4-piridila, 5-piridila, 6-piridila, 3- piridazinila, 4-piridazinila, 5-piridazinila, 6-piridazinila, 2-pirimidinila, 4-pirimidinila, 5- pirimidinila, 6-pirimidinila, 2-pirazinila, 3-pirazinila, 5-pirazinila, 6-pirazinila, 2-tiazolila, 4-tiazolila ou 5-tiazolil.

[0161]A título de exemplo e não limitação, heteroarilas e heterocicloalquilas ligadas a nitrogênio são ligadas na posição 1 de uma aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H- indazol, posição 2 de um isoindol ou isoindolina, posição 4 de uma morfolina e posição 9 de um carbazol ou beta-carbolina. Ainda mais tipicamente, heterociclos ligados a nitrogênio incluem 1-aziridila, 1-azetedila, 1-pirrolila, 1-imidazolila, 1-pirazolila e 1- piperidinila.

[0162]“Substituído”, como aqui usado, e como aplicado a qualquer uma de alquila, alquenila, alquinila, arila, arilalquila, cicloalquila, heteroarila, heterociclila acima e semelhantes, significa que um ou mais átomos de hidrogênio são, cada um, independentemente substituídos por um substituinte. A menos que de outro modo restringido pela definição do substituinte individual, as porções químicas anteriores, tais como os grupos “alquila”, “heteroalquila”, “alquenila”, “heteroalquenila”, “alquinila”, “heteroalquinila”, “cicloalquila”, “heterociclolalquila”, “arila” e “heteroarila” podem ser opcionalmente substituídos com, por exemplo, de 1 a 5 substituintes selecionados do grupo que consiste em alquila, alquinila, cicloalquila, heterocicloalquila, alquil arila, alquil heteroarila, alquil cicloalquila, alquil heterocicloalquila, amino, amônio, acila, acilóxi, acilamino, aminocarbonila, alcóxicarbonila, ureido, carbamato, arila, heteroarila, sulfinila, sulfonila, alcóxi, sulfanila, halogênio, carbóxi, tri-halometila, ciano, hidróxi, mercapto, nitro e semelhantes. Substituintes típicos incluem, mas não são limitados a -X, -R, -OH, -OU, -SH, -SR, NH2, -NHR, -N(R)2, -N+(R)3, -CX3, -CN, - OCN, -SCN, -NCO, -NCS, -NO, -NO2, -N3, -NC(=O)H, -NC(=O)R, -C(=O)H, -C(=O)R, -C(=O)NH2, -C(=O)N(R)2, -SO3-, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NH2, - S(=O)2N(R)2, -S(=O)R, -OP(=O)(OH)2, -OP(=O)(OU)2, -P(=O)(OU)2, -PO3, -PO3H2, - C(=O)X, -C(=S)R, -CO2H, -CO2R, -CO2-, -C(=S)OU, -C(=O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NH2, -C(=O)N(R)2, -C(=S)NH2, -C(=S)N(R)2, -C(=NH)NH2, e -C(=NR)N(R)2; em que cada X é independentemente selecionado para cada ocasião de F, Cl, Br, e I; e cada R é independentemente selecionado para cada ocasião de alquila C1-C12, arila C6-C20, heterocicloalquila ou heteroarila C3-C14, grupo de proteção e porção pró-fármaco. Sempre que um grupo é descrito como “opcionalmente substituído”, o grupo pode ser substituído por um ou mais dos substituintes acima, independentemente para cada ocasião. A substituição pode incluir situações em que substituintes vizinhos têm sofreram fechamento de anel, tal como fechamento de anel de substituintes funcionais vicinais, para formar, por exemplo, lactamas, lactonas, anidridos cíclicos, acetais, hemiacetais, tioacetais, aminais e hemiaminais, formados pelo fechamento de anel, por exemplo, para fornecer um grupo de proteção.

[0163]Deve ser entendido que certas convenções de nomenclatura de radicais podem incluir um mono-radical ou um di-radical, dependendo do contexto. Por exemplo, onde um substituinte requer dois pontos de fixação ao restante da molécula, é entendido que o substituinte é um di-radical. Por exemplo, um substituinte identificado como alquila que requer dois pontos de fixação inclui di-radicais, tais como -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)CH2- e semelhantes. Outras convenções de nomenclatura de radical claramente indicam que o radical é um di-radical, tal como “alquileno”, “alquenileno”, “arileno”, “heterocicloalquileno” e semelhantes.

[0164]Como aqui usado, o termo “reação de acoplamento” se refere a uma reação química em que dois ou mais substituintes adequados para a reação um com o outro reagem de modo a formar uma porção química que une (e.g., covalentemente) os fragmentos moleculares ligados a cada substituinte. As reações de acoplamento incluem aquelas em que um substituinte reativo ligado a um fragmento que é uma citotoxina, tal como uma citotoxina conhecida na técnica ou aqui descrita, reage com um substituinte adequadamente reativo ligado a um fragmento que é um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tal como um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, específico para CD117 (tal como CD117 GNNK+) conhecido na técnica ou aqui descrito. Exemplos de substituintes adequadamente reativos incluem um par de nucleófilo/eletrófilo (e.g., um par de tiol/haloalquila, um par de amina/carbonila ou um par de tiol/carbonila α,β-insaturada, entre outros), um par de dieno/dienófilo (e.g., um par de azida/alcino, entre outros) e semelhantes. As reações de acoplamento incluem, sem limitação, alquilação de tiol, alquilação de hidroxila, alquilação de amina, condensação de amina, amidação, esterificação, formação de dissulfeto, cicloadição (e.g., cicloadição de Diels-Alder [4+2], cicloadição de Huisgen [3+2], entre outros), substituição nucleofílica aromática, substituição eletrofílica aromática e outras modalidades reativas conhecidas na técnica ou aqui descritas.

[0165]Como aqui usado, “CRU (unidade de repovoamento competitivo)” se refere a uma unidade de medida de enxerto células-troncos a longo prazo, que pode ser detectado depois do transplante in vivo.

[0166]Como aqui usado, “razão fármaco-anticorpo” ou “DAR” se refere ao número de citotoxinas, e.g., amatoxina, ligadas ao anticorpo de um ADC. A DAR de um ADC pode variar de 1 a 8, embora cargas maiores também sejam possíveis dependendo do número de sítios de ligação em um anticorpo. Assim, em certas modalidades, um ADC aqui descrito tem uma DAR de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[0167]Sempre que um substituinte é representado como um di-radical (i.e., tem dois pontos de fixação ao restante da molécula), deve ser entendido que o substituinte pode ser ligado em qualquer configuração direcional a menos que de outro modo indicado. Anticorpos Modificados em Fc

[0168]A presente divulgação tem como base, em parte, a descoberta de que anticorpos, ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, tendo modificações em Fc que permitem o silenciamento de Fc, capazes de se ligarem a um antígeno expressado por células hematopoiéticas podem ser usados como agentes terapêuticos. Por exemplo, a presente divulgação tem como base, em parte, a descoberta de que anticorpos, ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, tendo modificações em Fc que permitem o silenciamento de Fc, capazes de se ligarem a (i) um antígeno expressado por células hematopoiéticas incluindo, mas não limitado aCD117 (e.g., CD117 GNNK+) ou CD45; ou um antígeno expressado por células imunes maduras (e.g., células T), incluindo, mas não limitadas a CD45, CD2, CD5, CD137 ou CD252, podem ser usados como agentes terapêuticos (e.g., como anticorpos “nus” ou como ADCs para (i) tratar cânceres e doenças autoimunes caracterizados por células-tronco hematopoiéticas CD117+ (e.g., CD117 GNNK+) ou CD45+; ou células imunes CD45+, CD2+, CD5+, CD137+ ou CD252+ (e.g., células T) e (ii) promover o enxerto de células-tronco hematopoiéticas transplantadas em um paciente em necessidade de terapia de transplante. Essas atividades terapêuticas podem ser causadas, por exemplo, pela ligação de um anticorpo anti-célula hematopoiética (HC) (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti- CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137, anticorpo anti-CD252, etc.) ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a um antígeno (e.g., CD117

(e.g., CD117 GNNK+), CD45, CD2, CD5, CD137, CD252, etc.) expressado por uma célula hematopoiética (e.g., leucócito de célula-tronco hematopoiética, célula imune, e.g., célula imune madura (e.g., células T)), tal como uma célula de câncer, célula autoimune ou célula-tronco hematopoiética e, subsequentemente, induzir a morte celular. A depleção de células-tronco hematopoiéticas endógenas pode fornecer um nicho no qual as células-tronco hematopoiéticas transplantadas podem se alojar e, subsequentemente, estabelecer a hematopoese produtiva. Desta forma, células- tronco hematopoiéticas transplantadas podem ser enxertadas com êxito em um paciente, tal como paciente humano sofrendo de um transtorno de célula-tronco aqui descrito.

[0169]Os anticorpos, ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, aqui descrito também podem incluir modificações e/ou mutações que alteram as propriedades dos anticorpos e/ou fragmentos, tais como aquelas que aumentam a meia-vida ou aumentam ou diminuem a ADCC.

[0170]Em uma modalidade, os anticorpos compreendendo um ou mais aminoácidos radiomarcados são fornecidos. Um anticorpo radiomarcado pode ser usado para fins de diagnóstico e terapêuticos (conjugação com moléculas radiomarcadas é outra característica possível). Exemplos não limitativos de marcadores para polipeptídeos incluem, mas não são limitados a 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, e 125I, 131I e 186Re. Os métodos para preparar aminoácidos radiomarcados e derivados de peptídeos relacionados são conhecidos na técnica (ver por exemplo, Junghans et al., em Cancer Chemoterapy and Biotherapy 655-686 (2a edição, Chafner e Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) e Pat. dos EUA No 4.681.581, Pat. dos EUA No 4.735.210, Pat. dos EUA No 5.101.827, Pat. dos EUA No 5.102.990 (U.S. RE35.500), Pat. dos EUA No 5.648.471 e Pat. dos EUA No 5.697.902. Por exemplo, um radioisótopo pode ser conjugado por um método de cloramina T.

[0171]Em uma modalidade, o anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117,

anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti-CD252), ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região Fc modificada, em que a dita região Fc modificada compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em relação a uma região Fc de tipo selvagem, tal que a dita molécula tenha uma afinidade alterada para ou ligação a um FcgamaR (FcγR). Certas posições de aminoácidos dentro da região Fc são conhecidas por meio de estudos de cristalografia para fazer um contato direto com FcγR.

Especificamente, os aminoácidos 234 a 239 (região de dobradiça), aminoácidos 265 a 269 (B/C loop), aminoácidos 297 a 299 (C’/E loop) e aminoácidos 327 a 332 (F/G) loop. (ver Sondermann et al., 2000 Nature, 406: 267-273). Em algumas modalidades, os anticorpos aqui descritos podem compreender regiões Fc variantes compreendendo a modificação de pelo menos um resíduo que faz um contato direto com um FcγR com base em análise estrutural e cristalográfica.

Em uma modalidade, a região Fc do anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti- CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137, anticorpo anti-CD252, etc.), ou fragmento de antígeno do mesmo, compreende uma substituição de aminoácido no aminoácido 265 de acordo com o índice EU como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed.

Public Health Service, NH1, MD (1991), expressamente incorporado aqui por referências.

O “índice EU como em Kabat” se refere à numeração do anticorpo IgG1 EU humano.

Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265A.

Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C.

Em algumas modalidades, a região Fc do anticorpo (ou fragmento do mesmo) compreende uma substituição de aminoácido no aminoácido 234 de acordo com o índice EU como em Kabat.

Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação L234A.

Em algumas modalidades, a região Fc do anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti-CD252), ou fragmento de antígeno do mesmo, compreende uma substituição de aminoácido no aminoácido 235 de acordo com o índice EU como em Kabat.

Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação L235A.

Ainda em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação L234A e L235A (também referida aqui como “L234A.L235A” ou como “LALA”). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação L234A e L235A, em que a região Fc não inclui uma mutação P329G.

Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C, L234A e L235A (também referida aqui como “D265C.L234A.L235A”). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C, L234A e L235A, em que a região Fc não inclui uma mutação P329G.

Em ainda uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C, L234A, L235A e H435A (também referida aqui como “D265C.L234A.L235A.H435A”). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C, L234A, L235A e H435A, em que a região Fc não inclui uma mutação P329G.

Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C e H435A (também referida aqui como “D265C.H435A”). Ainda em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265A, S239C, L234A e L235A (também referida aqui como “D265A.S239C.L234A.L235A”). Ainda em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265A, S239C, L234A e L235A, em que a região Fc não inclui uma mutação P329G.

Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C, N297G e H435A (também referida aqui como “D265C.N297G.H435A”). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C, N297Q e H435A (também referida aqui como “D265C.N297Q.H435A”). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação E233P, L234V, L235A e delG236 (deleção de 236) (também referida aqui como “E233P.L234V.L235A.delG236” ou como “EPLVLAdelG”). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação E233P, L234V, L235A e delG236 (deleção de 236), em que a região Fc não inclui uma mutação P329G.

Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação E233P, L234V, L235A, delG236 (deleção de 236) e H435A (também referida aqui como “E233P.L234V.L235A.delG236.H435A” ou como “EPLVLAdelG.H435A”). Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação E233P, L234V, L235A, delG236 (deleção de 236) e H435A, em que a região Fc não inclui uma mutação P329G. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação L234A, L235A, S239C e D265A. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação L234A, L235A, S239C e D265A, em que a região Fc não inclui uma mutação P329G. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação H435A, L234A, L235A e D265C. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação H435A, L234A, L235A e D265C, em que a região Fc não inclui uma mutação P329G.

[0172]Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região Fc modificada tal que, o anticorpo diminui uma função efetora em um ensaio de função efetora in vitro com uma diminuição na ligação a um receptor Fc (Fc R) em relação à ligação de um anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada ao FcR. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região Fc modificada tal que o anticorpo diminui uma função efetora em um ensaio de função efetora in vitro com uma diminuição na ligação a um receptor Fc gama (FcγR) em relação à ligação de um anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada para o FcγR. Em algumas modalidades, o FcγR é FcγR1. Em algumas modalidades, o FcγR é FcγR2A. Em algumas modalidades, o FcγR é FcγR2B. Em outras modalidades, o FcγR é FcγR2C. Em algumas modalidades, o FcγR é FcγR3A. Em algumas modalidades, o FcγR é FcγR3B. Em outras modalidades, a diminuição na ligação é pelo menos uma diminuição de 70 %, pelo menos uma diminuição de 80 %, pelo menos uma diminuição de 90 %, pelo menos uma diminuição de 95 %, pelo menos uma diminuição de 98 %, pelo menos uma diminuição de 99 % ou uma diminuição de 100 % na ligação de anticorpo a um FcγR em relação à ligação do anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada para o FcγR. Em outras modalidades, a diminuição na ligação é pelo menos de 70 % a uma diminuição de 100 %, pelo menos de 80 % a uma diminuição de 100 %, pelo menos de 90 % a uma diminuição de 100 %, pelo menos de 95 % a uma diminuição de 100 % ou pelo menos de 98 % a uma diminuição de 100 %, na ligação de anticorpo a um FcγR em relação à ligação do anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada para o FcγR.

[0173]Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região Fc modificada tal que o anticorpo diminui a liberação de citocina em um ensaio de liberação de citocina in vitro com uma diminuição na liberação de citocina de pelo menos 50 % em relação à liberação de citocina de um anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada. Em algumas modalidades, a diminuição na liberação de citocina é pelo menos uma diminuição de 70 %, pelo menos uma diminuição de 80 %, pelo menos uma diminuição de 90 %, pelo menos uma diminuição de 95 %, pelo menos uma diminuição de 98 %, pelo menos uma diminuição de 99 % ou uma diminuição de 100 % na liberação de citocina em relação à liberação de citocina do anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada. Em algumas modalidades, a diminuição na liberação de citocina é pelo menos de 70 % a uma diminuição de 100 %, pelo menos de 80 % a uma diminuição de 100 %, pelo menos de 90 % a uma diminuição de 100 %, pelo menos de 95 % a uma diminuição de 100 % na liberação de citocina em relação à liberação de citocina do anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada. Em modalidades preferidas, a liberação de citocina é por células imunes.

[0174]Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região Fc modificada tal que o anticorpo diminui a degranulação de mastócitos em um ensaio de degranulação de mastócitos in vitro com uma diminuição na degranulação de mastócitos de pelo menos 50 % em relação à degranulação de mastócitos de um anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada. Em algumas modalidades, a diminuição na degranulação de mastócitos é pelo menos uma diminuição de 70 %, pelo menos uma diminuição de 80 %, pelo menos uma diminuição de 90 %, pelo menos uma diminuição de 95 %, pelo menos uma diminuição de 98 %, pelo menos uma diminuição de 99 % ou uma diminuição de 100 % na degranulação de mastócitos em relação à degranulação de mastócitos do anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada. Em algumas modalidades, a diminuição na degranulação de mastócitos é pelo menos de 70 % a uma diminuição de 100 %, pelo menos de 80 % a uma diminuição de 100 %, pelo menos de 90 % a uma diminuição de 100 % ou pelo menos de 95 % a uma diminuição de 100 % na degranulação de mastócitos em relação à degranulação de mastócitos do anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada.

[0175]Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma região Fc modificada tal que o anticorpo diminui ou evita a fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) em um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpo in vitro, com uma diminuição na ADCP de pelo menos 50 % em relação à ADCP de um anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada. Em algumas modalidades, a diminuição na ADCP é pelo menos uma diminuição de 70 %, pelo menos uma diminuição de 80 %, pelo menos uma diminuição de 90 %, pelo menos uma diminuição de 95 %, pelo menos uma diminuição de 98 %, pelo menos uma diminuição de 99 % ou uma diminuição de 100 % na fagocitose celular dependente de anticorpo para a fagocitose celular dependente de anticorpo do anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada.

[0176]Em algumas modalidades, o anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti- CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti- CD137 ou anticorpo anti-CD252) aqui descrito compreende uma região Fc compreendendo uma das seguintes modificações ou combinações de modificações:

D265A, D265C, D265C/H435A, D265C/LALA, D265C/LALA/H435A, D265A/S239C/L234A/L235A/H435A, D265A/S239C/L234A/L235A, D265C/N297G, D265C/N297G/H435A, D265C (EPLVLAdelG *), D265C (EPLVLAdelG)/H435A, D265C/N297Q/H435A, D265C/N297Q, EPLVLAdelG/H435A, EPLVLAdelG/D265C, EPLVLAdelG/D265A, N297A, N297G ou N297Q.

[0177]A ligação ou afinidade entre uma região Fc modificada e um receptor Fc gama pode ser determinada usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, mas não limitadas a métodos de equilíbrio (e.g., ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA); KinExA, Rathanaswami et al. Analytical Biochemistry, Vol. 373: 52-60, 2008; ou radioimunoensaio (RIA)) ou por um ensaio de ressonância plasmônica de superfície ou outro mecanismo de ensaio com base em cinética (e.g., análise BIACORE.RTM. ou análise Octet.RTM. (forteBIO)) e outros métodos, tais como ensaios de ligação indireta, ensaios de ligação competitiva, transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET), eletroforese e cromatografia em gel (e.g., filtração em gel). Esses e outros métodos podem utilizar um marcador em um ou mais dos componentes sendo examinados e/ou utilizar uma variedade de métodos de detecção incluindo, mas não limitados a marcadores cromogênicos, fluorescentes, luminescentes ou isotópicos. Uma descrição detalhada de afinidades de ligação e cinéticas pode ser encontrada em Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4a Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), que se concentra em interações anticorpo-imunógeno. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio compreendendo a incubação de antígeno marcado com o anticorpo de interesse na presença de quantidades crescentes de antígeno não marcado e a detecção do anticorpo ligado ao antígeno marcado. A afinidade do anticorpo de interesse para um antígeno particular e as taxas de dissociação podem ser determinadas a partir dos dados por análise de gráficos de scatchard. A competição com um segundo anticorpo também pode ser determinada usando radioimunoensaios. Nesse caso, o antígeno é incubado com anticorpo de interesse conjugado a um composto marcado na presença de quantidades crescentes de um segundo anticorpo não marcado.

[0178]Em uma modalidade, um anticorpo tendo as modificações em Fc aqui descritas (e.g., D265C, L234A, L235A e/ou H435A) tem pelo menos uma diminuição de 70 %, pelo menos uma diminuição de 75 %, pelo menos uma diminuição de 80 %, pelo menos uma diminuição de 85 %, pelo menos uma diminuição de 90 %, pelo menos uma diminuição de 95 %, pelo menos uma diminuição de 98 %, pelo menos uma diminuição de 99 % ou uma diminuição de 100 % na ligação a um receptor Fc gama em relação à ligação do anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada ao receptor Fc gama (e.g., conforme avaliado por interferometria de biocamada (BLI), e.g., como descrito no exemplo 1).

[0179]Sem desejar estar limitado por qualquer teoria, acredita-se que as interações de ligação da região Fc com um receptor Fc gama são essenciais para uma variedade de funções efetoras e eventos de sinalização a jusante incluindo, mas não limitados à citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Consequentemente, em certos aspectos, um anticorpo compreendendo uma região Fc modificada (e.g., compreendendo um L234A, L235A e/ou uma mutação D265C) tem funções efetoras substancialmente reduzidas ou abolidas. As funções efetoras podem ser avaliadas usando uma variedade de métodos conhecidos na técnica, e.g., medindo as respostas celulares (e.g., degranulação de mastócitos ou liberação de citocina) em resposta ao anticorpo de interesse. Por exemplo, usando métodos padrão na técnica, os anticorpos modificados em Fc podem ser avaliados para a sua capacidade de desencadear a degranulação de mastócitos in vitro (e.g., como descrito no exemplo 2) ou para a sua capacidade de desencadear a liberação de citocina, e.g., por células mononucleares humanas do sangue periférico (e.g., como descrito no exemplo 3).

[0180]Assim, em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação que resulta em uma diminuição da meia-vida (e.g., em relação a um anticorpo tendo uma região Fc não modificada). Um anticorpo tendo uma meia-vida curta pode ser vantajoso em certos casos onde é esperado que o anticorpo funcione como um terapêutico de curta duração, e.g., a etapa de condicionamento aqui descrita onde o anticorpo é administrado seguido por HSCs. Idealmente, o anticorpo deve ser substancialmente eliminado antes da liberação das HSCs, que geralmente também expressam um antígeno alvo (e.g., CD117 (e.g., CD117 GNNK+), CD45, CD2, CD5, CD137 ou CD252) mas não são o alvo do anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti- CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti- CD137 ou anticorpo anti-CD252), ao contrário das células-tronco endógenas. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação na posição 435 (índice EU de acordo com Kabat). Em uma modalidade, a mutação é uma mutação H435A.

[0181]Em uma modalidade, o anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti-CD252) aqui descrito tem uma meia-vida (e.g., em humanos) igual a ou menor que cerca de 24 horas, igual a ou menor que cerca de 23 horas, igual a ou menor que cerca de 22 horas, igual a ou menor que cerca de 21 horas, igual a ou menor que cerca de 20 horas, igual a ou menor que cerca de 19 horas, igual a ou menor que cerca de 18 horas, igual a ou menor que cerca de 17 horas, igual a ou menor que cerca de 16 horas, igual a ou menor que cerca de 15 horas, igual a ou menor que cerca de 14 horas, igual a ou menor que cerca de 13 horas, igual a ou menor que cerca de 12 horas, ou igual a ou menor que cerca de 11 horas.

[0182]Em uma modalidade, o anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti-CD252) aqui descrito tem uma meia-vida (e.g., em humanos) de cerca de 1 a 5 horas, cerca de 5 a 10 horas, cerca de 10 a 15 horas, cerca de 15 a 20 horas ou cerca de 20 a 25 horas.

[0183]Em alguns aspectos, a região Fc compreende duas ou mais mutações que conferem meia-vida reduzida e reduzem uma função efetora do anticorpo. Em algumas modalidades, a região Fc compreende uma mutação que resulta em uma diminuição da meia-vida e uma mutação de pelo menos um resíduo que pode fazer contato direto com um FcγR (e.g., como com base em análise estrutural e cristalográfica). Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação H435A, uma mutação L234A e uma mutação L235A. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação H435A e uma mutação D265C. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação H435A, uma mutação L234A, uma mutação L235A e uma mutação D265C.

[0184]Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é conjugado com uma citotoxina (e.g., amatoxina) por meio de um resíduo de cisteína no domínio Fc do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o resíduo de cisteína é introduzido por meio de uma mutação no domínio Fc do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Por exemplo, o resíduo de cisteína pode ser selecionado do grupo que consiste em Cys118, Cys239 e Cys265. Em uma modalidade, a região Fc do anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti- CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti-CD252), ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma substituição de aminoácido no aminoácido 265 de acordo com o índice EU como em Kabat. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C e H435A. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C, uma L234A e uma L235A. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C, uma L234A, uma L235A e uma H435A. Em uma modalidade, a região Fc do anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117,

anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti-CD252), ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma substituição de aminoácido no aminoácido 239 de acordo com o índice EU como em Kabat. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação S239C. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação L234A, uma mutação L235A, uma mutação S239C e uma mutação D265A. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação S239C e H435A. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação L234A, uma mutação L235A e mutação S239C. Ainda em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação H435A, uma mutação L234A, uma mutação L235A, e mutação S239C. Ainda em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação H435A, uma mutação L234A, uma mutação L235A, uma mutação S239C e mutação D265A.

[0185]Notavelmente, as posições de aminoácidos de Fc são em referência ao índice de numeração EU a menos que de outro modo indicado.

[0186]Métodos de engenharia de anticorpos para incluir qualquer uma das modificações em Fc aqui são bem conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas não são limitados à preparação por mutagênese sítio-dirigida (ou mediada por oligonucleotídeo), mutagênese por PCR e mutagênese de cassette de uma molécula de DNA preparada que codifica o anticorpo ou pelo menos a região constante do anticorpo. A mutagênese sítio-dirigida é bem conhecida na técnica (ver, e.g., Carter et al., Nucleic acids Res., 13: 4431-4443 (1985) e Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488 (1987)). A mutagênese por PCR também é adequada para fabricar variantes da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de partida. Ver Higuchi, em PCR Protocols, páginas 177 a 183 (Academic Press, 1990); e Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17: 723-733 (1989). Outro método para preparar variantes de sequências, a mutagênese de cassette é fundamentada na técnica descrita por Wells et al., Gene, 34: 315-323 (1985).

Anticorpos anti-CD117

[0187]A presente divulgação também tem como base, em parte, a descoberta de que anticorpos, ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, capazes de se ligarem a CD117, tais como CD117 GNNK+, podem ser usados como agentes terapêuticos sozinhos ou como ADCs para (i) tratar cânceres (tais como leucemia mielógena aguda ou síndrome mielodisplásica) e doenças autoimunes caracterizadas por células CD117+ e (ii) promover o enxerto de células-tronco hematopoiéticas transplantadas em um paciente em necessidade de terapia de transplante. Essas atividades terapêuticas podem ser causadas, por exemplo, pela ligação de anticorpos anti-CD117, ou dos fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, ao CD117 (e.g., CD117 GNNK+) expressado na superfície de uma célula, tal como uma célula de câncer, célula autoimune ou célula-tronco hematopoiética e, subsequentemente, induzir a morte celular. A depleção de células-tronco hematopoiéticas endógenas pode fornecer um nicho no qual as células-tronco hematopoiéticas transplantadas podem se alojar e, subsequentemente, estabelecer a hematopoese produtiva. Desta forma, as células-tronco hematopoiéticas transplantadas podem ser enxertadas com êxito em um paciente, tal como paciente humano sofrendo de um transtorno de célula- tronco aqui descrito.

[0188]Os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno capazes de se ligarem ao CD117 humano (também referido como c-Kit, Sequência de Referência de mRNA NCBI: NM_000222.2, Sequência de Referência de Proteína NCBI: NP_0002131), incluindo aqueles capazes de se ligarem a CD117 GNNK+, podem ser usados em conjunto com as composições e métodos aqui descritos de modo a condicionar um paciente para a terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas. Os polimorfismos que afetam a região de codificação ou domínio extracelular de CD117 em uma porcentagem significativa da população não são atualmente bem conhecidos em indicações não oncológicas. Existem pelo menos quatro isoformas de CD117 que foram identificadas, com o potencial de isoformas adicionais expressadas em células tumorais. Duas das isoformas de CD117 estão localizadas no domínio intracelular da proteína, e duas estão presentes na região de justamembrana externa. As duas isoformas extracelulares, GNNK+ e GNNK-, diferem na presença (GNNK+) ou ausência (GNNK-) de uma sequência de 4 aminoácidos. Essas isoformas são relatadas como tendo a mesma afinidade para o ligante (SCF), mas foi relatado que a ligação ao ligante para a isoforma GNNK- aumenta a internalização e degradação. A isoforma GNNK+ pode ser usada como um imunógeno de modo a gerar anticorpos capazes de se ligarem a CD117, pois os anticorpos gerados contra essa isoforma incluirão as proteínas GNNK+ e GNNK-.

[0189]Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD117, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14.

[0190]Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-CD117, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende as três sequências de CDR da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) e as três sequências de CDR da sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (LH) de Ab85.

[0191]Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-CD117, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) e a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (LH) de Ab85 (também referido aqui permutavelmente como Ab2).

[0192]A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) fornecida abaixo como SEQ ID NO: 13. As sequências de aminoácidos da CDR de VH de Ab85 são sublinhadas abaixo e são como se segue: NYWIG (CDR1 VH; SEQ ID NO: 7); IINPRDSDTRYRPSFQG (CDR2 VH; SEQ ID NO: 8); e HGRGYEGYEGAFDI (CDR3 VH; SEQ ID NO: 9).

Sequência de VH de Ab85

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTNYWIGWVRQMPGKGLEWMAI

INPRDSDTRYRPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRGYEGY EGAFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 13)

[0193]A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VL) de Ab85 é fornecida abaixo como SEQ ID NO 14. As sequências de aminoácidos da CDR de VL de Ab85 são sublinhadas abaixo e são como se segue: RSSQGIRSDLG (CDR1 VL; SEQ ID NO: 10); DASNLET (CDR2 VL; SEQ ID NO: 11; e QQANGFPLT (CDR3 VL; SEQ ID NO: 12). Sequência de VL de Ab85

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQGIRSDLGWYQQKPGKAPKLLIYDA

SNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANGFPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 14)

[0194]Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-CD117, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) e a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (LH) de Ab249 (também referido aqui permutavelmente como Ab3).

[0195]A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) de Ab249 é fornecida abaixo como SEQ ID NO: 346. As sequências de aminoácidos da CDR de VH de Ab249 são sublinhadas abaixo e são como se segue: TSWIG (CDR1 VH; SEQ ID NO: 340); IIYPGDSDTRYSPSFQG (CDR2 VH; SEQ ID NO: 341); e HGLGYNGYEGAFDI (CDR3 VH; SEQ ID NO: 342). Sequência de VH de Ab249

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYRFTTSWIGWVRQMPGKGLEWMGI

IYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGLGYNGY EGAFDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 346)

[0196]A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VL) de

Ab249 é fornecida abaixo como SEQ ID NO: 347. As sequências de aminoácidos da CDR de VL de Ab249 são sublinhadas abaixo e são como se segue: RASQGIGSALA (CDR1 VL; SEQ ID NO: 343); DASNLET (CDR2 VL; SEQ ID NO: 344); e QQLNGYPLT (CDR3 VL; SEQ ID NO: 345). Sequência de VL de Ab249

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGSALAWYQQKPGKAPKLLIYDA

SNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNGYPLTFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 347)

[0197]Anticorpos humanos Ab85 e Ab249 foram ambos derivados do anticorpo CK6, que é um anticorpo anti-CD117 antagonista. Ab85 e Ab249 têm propriedades aperfeiçoadas, e.g., características de ligação aperfeiçoadas, em relação a CK6.

[0198]Assim, em certas modalidades, um anticorpo anti-CD117 compreende uma cadeia pesada compreendendo um conjunto de CDR (CDR1, CDR2 e CDR3) como apresentado nas SEQ ID NOs: 7, 8 e 9 e uma cadeia leve compreendendo um conjunto de CDR como apresentado nas SEQ ID NOs: 10, 11, e 12. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD117 compreende uma cadeia pesada compreendendo um conjunto de CDR (CDR1, CDR2 e CDR3) como apresentado nas SEQ ID NOs: 340, 341 e 342 e uma cadeia leve compreendendo um conjunto de CDR como apresentado nas SEQ ID NOs: 343, 344 e 345.

[0199]Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-CD117, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) e a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (LH) de Ab67 (um anticorpo neutro; também referido aqui permutavelmente como Ab1).

[0200]A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) de Ab67 é fornecida abaixo como SEQ ID NO: 354. As sequências de aminoácidos da CDR de VH de Ab67 são sublinhadas abaixo e são como se segue: FTFSDADMD (CDR1 VH; SEQ ID NO: 348); RTRNKAGSYTTEYAASVKG (CDR2 VH; SEQ ID NO: 349); e AREPKYWIDFDL (CDR3 VH; SEQ ID NO: 350). Sequência de VH de Ab67

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDADMDWVRQAPGKGLEWV

GRTRNKAGSYTTEYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAREPKY WIDFDLWGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 354)

[0201]A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VL) de Ab67 é fornecida abaixo como SEQ ID NO: 355. As sequências de aminoácidos da CDR de VL de Ab67 são sublinhadas abaixo e são como se segue: RASQSISSYLN (CDR1 VL; SEQ ID NO: 351); AASSLQS (CDR2 VL; SEQ ID NO: 352); e QQSYIAPYT (CDR3 VL; SEQ ID NO: 353). Sequência de VL de Ab67

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS

SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYIAPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 355)

[0202]Assim, em certas modalidades, um anticorpo anti-CD117 compreende uma cadeia pesada compreendendo um conjunto de CDR (CDR1, CDR2 e CDR3) como apresentado nas SEQ ID NOs: 348, 349 e 350 e uma cadeia leve compreendendo um conjunto de CDR como apresentado nas SEQ ID NOs: 351, 352 e 353.

[0203]Sequências adicionais para anticorpos anti-CD117 ou fragmentos de ligação, aqui descritos, são fornecidas na Tabela 5.

[0204]Os anticorpos anti-CD117 ou fragmentos de ligação aqui descritos também podem incluir modificações e/ou mutações que alteram as propriedades dos anticorpos e/ou fragmentos, tais como aquelas que aumentam a meia-vida, aumentam ou diminuem a ADCC, etc., como é conhecido na técnica.

[0205]Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD117, ou fragmento de ligação do mesmo, compreende uma região Fc variante, em que a dita região Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em relação a uma região Fc de tipo selvagem, tal que a dita molécula tenha uma afinidade alterada para um FcgamaR. Certas posições de aminoácidos dentro da região Fc são conhecidas por meio de estudos de cristalografia para fazer um contato direto com FcγR. Especificamente, os aminoácidos 234 a 239 (região de dobradiça), aminoácidos 265 a 269 (loop B/C), aminoácidos 297 a 299 (loop C’/E) e aminoácidos 327 a 332 loop (F/G). (ver Sondermann et al., 2000 Nature, 406: 267-273). Por exemplo, as substituições de aminoácidos nas posições de aminoácidos 234 e 235 da região Fc foram identificadas como afinidade decrescente de um anticorpo IgG para ligação a um receptor Fc, particularmente um receptor Fc gama (FcγR). Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD117 aqui descrito compreende uma região Fc compreendendo uma substituição de aminoácido em L234 e/ou L235, e.g., L234A e L235A (índice EU). Assim, os anticorpos anti-CD117 aqui descritos podem compreender regiões Fc variantes compreendendo a modificação de pelo menos um resíduo que faz um contato direto com um FcγR com base em análise estrutural e cristalográfica. Em uma modalidade, a região Fc do anticorpo anti-CD117 (ou fragmento contendo Fc do mesmo) compreende uma substituição de aminoácido no aminoácido 265 de acordo com o índice EU como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991), expressamente incorporado aqui por referências. O “índice EU como em Kabat” ou “índice EU” se refere à numeração do anticorpo IgG1 EU humano e é aqui usado em referência às posições de aminoácidos de Fc a menos que de outro modo indicado.

[0206]Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265A. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C.

[0207]Em algumas modalidades, a região Fc do anticorpo anti-CD117 (ou fragmento do mesmo) compreende uma substituição de aminoácido no aminoácido 234 de acordo com o índice EU como em Kabat. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação L234A. Em algumas modalidades, a região Fc do anticorpo anti-CD117 (ou fragmento do mesmo) compreende uma substituição de aminoácido no aminoácido 235 de acordo com o índice EU como em Kabat. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação L235A. Ainda em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação L234A e L235A. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C, L234A e L235A.

[0208]Em certos aspectos, um domínio Fc de IgG variante compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que resultam em afinidade de ligação diminuída ou ablacionada para um FcgamaR e/ou C1q em comparação com o domínio Fc de tipo selvagem não compreendendo a uma ou mais substituições de aminoácidos. As interações de ligação de Fc são essenciais para uma variedade de funções efetoras e eventos de sinalização a jusante incluindo, mas não limitados a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Consequentemente, em certos aspectos, um anticorpo compreendendo uma região Fc modificada (e.g., compreendendo uma mutação L234A, L235A e D265C) tem funções efetoras substancialmente reduzidas ou abolidas.

[0209]A afinidade para uma região Fc pode ser determinada usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, mas não limitadas a métodos de equilíbrio (e.g., ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA); KinExA, Rathanaswami et al. Analytical Biochemistry, Vol. 373: 52-60, 2008; ou radioimunoensaio (RIA)) ou por um ensaio de ressonância plasmônica de superfície ou outro mecanismo de ensaio com base em cinética (e.g., análise BIACORETM ou análise OctetTM (forteBIO)) e outros métodos, tais como ensaios de ligação indireta, ensaios de ligação competitiva, transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET), eletroforese e cromatografia em gel (e.g., filtração em gel). Esses e outros métodos podem utilizar um marcador em um ou mais dos componentes sendo examinados e/ou utilizar uma variedade de métodos de detecção incluindo, mas não limitados a marcadores cromogênicos, fluorescentes, luminescentes ou isotópicos. Uma descrição detalhada de afinidades de ligação e cinéticas pode ser encontrada em Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4a Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), que se concentra em interações anticorpo-imunógeno. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio compreendendo a incubação de antígeno marcado com o anticorpo de interesse na presença de quantidades crescentes de antígeno não marcado e a detecção do anticorpo ligado ao antígeno marcado. A afinidade do anticorpo de interesse para um antígeno particular e as taxas de dissociação podem ser determinadas a partir dos dados por análise de gráficos de scatchard. A competição com um segundo anticorpo também pode ser determinada usando radioimunoensaios. Nesse caso, o antígeno é incubado com anticorpo de interesse conjugado a um composto marcado na presença de quantidades crescentes de um segundo anticorpo não marcado.

[0210]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD117 aqui descrito compreende uma região Fc compreendendo L235A, L235A e D265C (índice EU). Os anticorpos da invenção podem ser ainda projetados para modular ainda mais a meia- vida do anticorpo introduzindo mutações adicionais de Fc, tais como aquelas descritas, por exemplo, em (Dall’Acqua et al. (2006) J Biol Chem 281: 23514-24), (Zalevsky et al. (2010) Nat Biotechnol 28: 157-9), (Hinton et al. (2004) J Biol Chem 279: 6213-6), (Hinton et al. (2006) J Immunol 176: 346-56), (Shields et al. (2001) J Biol Chem 276: 6591-604), (Petkova et al. (2006) Int Immunol 18: 1759-69), (Datta-Mannan et al. (2007) Drug Metab Dispos 35: 86-94), (Vaccaro et al. (2005) Nat Biotechnol 23: 1283-8), (Yeung et al. (2010) Cancer Res 70: 3269-77) e (Kim et al. (1999) Eur J Immunol 29: 2819-25), e incluem as posições 250, 252, 253, 254, 256, 257, 307, 376,

380, 428, 434 e 435. Mutações exemplificativas que podem ser feitas individualmente ou em combinação são as mutações T250Q, M252Y, 1253A, S254T, T256E, P2571, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A e H435R.

[0211]Assim, em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação que resulta em uma diminuição da meia-vida. Um anticorpo tendo uma meia-vida curta (também referido aqui como uma meia-vida “rápida”) pode ser vantajoso em certos casos onde é esperado que o anticorpo funcione como um terapêutico de curta duração, e.g., a etapa de condicionamento aqui descrita onde o anticorpo é administrado seguido por HSCs. Idealmente, o anticorpo deve ser substancialmente eliminado antes da liberação das HSCs, que geralmente também expressam CD117, mas não são o alvo do anticorpo anti-CD117, ao contrário das células-tronco endógenas. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação na posição 435 (índice EU de acordo com Kabat). Em uma modalidade, a mutação é uma mutação H435A. Em uma outra modalidade, a mutação é uma mutação D265C. Ainda em uma outra modalidade, as mutações são uma mutação H435A e uma mutação D265C.

[0212]Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD117 aqui descrito tem uma meia-vida igual a ou menor que 24 horas, igual a ou menor que 22 horas, igual a ou menor que 20 horas, igual a ou menor que 18 horas, igual a ou menor que 16 horas, igual a ou menor que 14 horas, igual a ou menor que 13 horas, igual a ou menor que 12 horas, igual a ou menor que 11 horas, igual a ou menor que 10 horas, igual a ou menor que 9 horas, igual a ou menor que 8 horas, igual a ou menor que 7 horas, igual a ou menor que 6 horas, ou igual a ou menor que 5 horas. Em uma modalidade, a meia-vida do anticorpo é de 5 horas a 7 horas; é de 5 horas a 9 horas; é de 15 horas a 11 horas; é de 5 horas a 13 horas; é de 5 horas a 15 horas; é de 5 horas a 20 horas; é de 5 horas a 24 horas; é de 7 horas a 24 horas; é de 9 horas a 24 horas; é de 11 horas a 24 horas; 12 horas a 22 horas; 10 horas a 20 horas; 8 horas a 18 horas; ou 14 horas a 24 horas.

[0213]Anticorpos anti-CD117 que podem ser usados em conjunto com os métodos de condicionamento do paciente aqui descritos incluem, por exemplo, anticorpos produzidos e liberados do ATCC No de Acesso 10716 (depositado como BA7.3C.9), tal como o anticorpo SR-1, que é descrito, por exemplo, na Patente dos EUA No 5.489.516, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere aos anticorpos anti-CD117.

[0214]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD117 aqui descrito compreende uma região Fc compreendendo L235A, L235A, D265C e H435A (índice EU).

[0215]Anticorpos anti-CD117 adicionais que podem ser usados em conjunto com os métodos de condicionamento do paciente aqui descritos incluem aqueles descritos na Patente dos EUA No 7.915.391, que descreve, e.g., anticorpos SR-1 humanizados; Patente dos EUA No 5.808.002, que descreve, e.g., o anticorpo anti- CD117 A3C6E2, bem como aqueles descritos em, por exemplo, WO 2015/050959, que descreve anticorpos anti-CD117 que se ligam aos epítopos contendo Pro317, Asn320, Glu329, Val331, Asp332, Lus358, Glue360, Glue376, His378 e/ou Thr380 de CD117 humano; e US 2012/0288506 (também publicada como Patente dos EUA No

8.552.157), que descreve, e.g., o anticorpo anti-CD117 CK6 (também referido aqui permutavelmente como Ab4), tendo as sequências de CDR de: uma CDR-H1 tendo a sequência de aminoácidos SYWIG (SEQ ID NO: 1); uma CDR-H2 tendo a sequência de aminoácidos IIYPGDSDTRYSPSFQG (SEQ ID NO: 2); uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoácidos HGRGYNGYEGAFDI (SEQ ID NO: 3); uma CDR-L1 tendo a sequência de aminoácidos RASQGISSALA (SEQ ID

NO: 4); uma CDR-L2 tendo a sequência de aminoácidos DASSLES (SEQ ID NO: 5); e uma CDR-L3 tendo a sequência de aminoácidos CQQFNSYPLT (SEQ ID NO: 6)

[0216]A região variável de sequência de aminoácidos de cadeia pesada de CK6 é fornecida na SEQ ID NO: 27):

QVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGSGYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMG IIYPGDSDTRYSPSFQGQVTI

SAGKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRGYNGYEGAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 27; as CDRs estão sublinhadas e em negrito).

[0217]A sequência variável de aminoácidos de cadeia leve de CK6 é fornecida na SEQ ID NO: 28:

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDAS

SLESGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 28; as CDRs estão sublinhadas e em negrito).

[0218]Anticorpos anti-CD117 adicionais e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que podem ser usados em conjunto com as composições e métodos aqui descritos incluem aqueles descritos em US 2015/0320880, tais como os clones 9P3, NEG024, NEG027, NEG085, NEG086 e 20376.

[0219]As divulgações de cada uma das publicações anteriores são aqui incorporadas por referência, uma vez que se referem aos anticorpos anti-CD117. Os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno que podem ser usados em conjunto com as composições e métodos aqui descritos incluem os anticorpos acima descritos e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, bem como variantes humanizadas daqueles anticorpos não humanos e os fragmentos de ligação ao antígeno descritos acima e anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam ao mesmo epítopo como aqueles descritos acima, conforme avaliado, por exemplo, por meio de um ensaio de ligação de CD117 competitivo.

[0220]Os fragmentos de ligação ao antígeno exemplificativos dos anticorpos anteriores incluem um domínio de imunoglobulina variável duplo, uma molécula de Fv de cadeia simples (scFv), um diabody, um triabody, um nanobody, um esqueleto de proteína semelhante a anticorpo, um fragmento Fv, um fragmento Fab, uma molécula F(ab’)2 e um di-scFv em tandem, entre outros.

[0221]Anticorpos podem ser produzidos usando métodos e composições recombinantes, e.g., como descrito na Pat. dos EUA No 4.816.567. Em uma modalidade, o ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-CD117 aqui descrito é fornecido. Esse ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL e/ou uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo (e.g., as cadeias leves e/ou pesadas do anticorpo). Em uma outra modalidade, um ou mais vetores (e.g., vetores de expressão) compreendendo tal ácido nucleico são fornecidos. Em uma outra modalidade, uma célula hospedeira compreendendo tal ácido nucleico é fornecida. Em uma modalidade, uma célula hospedeira compreende (e.g., foi transformada com): (1) um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL do anticorpo e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo. Em uma modalidade, a célula hospedeira é eucariótica, e.g., uma célula do Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfoide (e.g., célula Y0, NS0, Sp20). Em uma modalidade, um método de produção de um anticorpo anti-CLL-1 é fornecido, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo, como fornecido acima, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo e, opcionalmente, recuperar o anticorpo da célula hospedeira (ou meio de cultura da célula hospedeira).

[0222]Para a produção recombinante de um anticorpo anti-CD117, o ácido nucleico que codifica um anticorpo, e.g., como descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem e/ou expressão adicional em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (e.g., usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligarem especificamente aos genes que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo).

[0223]Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem células procarióticas ou eucarióticas aqui descritas. Por exemplo, anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e função efetora de Fc não são necessárias. Para a expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, ver, e.g., Pat. dos EUA Nos

5.648.237, 5.789.199 e 5.840.523. (Ver também Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), páginas 245 a 254, descrevendo a expressão de fragmentos de anticorpo em E. coli.). Depois da expressão, o anticorpo pode ser isolado da massa de célula bacteriana em uma fração solúvel e pode ser posteriormente purificado.

[0224]As células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, linhagens de células de mamíferos que são adaptadas para crescerem em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 como descrito, e.g., em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster neonato (BHK); células de sertoli de camundongo (células TM4 como descrito, e.g., em Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células renais caninas (MDCK; células do fígado de rato buffalo (BRL 3A); células do pulmão humano (W138); células do fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, como descrito, e.g., em Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem células do ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); e linhagens de células do mieloma, tais como Y0, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamífero adequadas para a produção de anticorpo, ver, e.g., Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), páginas 255 a 268 (2003).

[0225]Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD117, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende regiões variáveis tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à SEQ ID Nos aqui divulgada. Alternativamente, o anticorpo anti-CD117, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende CDRs compreendendo a SEQ ID Nos aqui divulgada com regiões de estrutura das regiões variáveis aqui descritas tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à SEQ ID Nos aqui divulgada.

[0226]Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD117, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos que é aqui divulgada. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-CD117, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região variável de cadeia leve e uma região constante de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que é aqui divulgada. Ainda em uma outra modalidade, o anticorpo anti-CD117, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada, uma região variável de cadeia leve, uma região constante de cadeia pesada e uma região constante de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos que é aqui divulgada.

[0227]Anticorpos anti-CD117 adicionais são descritos em US 2019/0153114 A1 e US 2019/0144558 A1, cujo conteúdo dos pedidos são aqui expressamente incorporados por referência em sua totalidade.

[0228]Os anticorpos anti-CD117 e ADCs aqui descritos podem ser usados em métodos de tratar uma variedade de transtornos, tais como doenças de um tipo de célula na linhagem hematopoiética, cânceres, doenças autoimunes, transtornos metabólicos e transtornos de células-tronco, entre outros. As composições e métodos aqui descritos podem (i) esgotar diretamente uma população de células que dão origem a uma patologia, tal como uma população de células de câncer (e.g., células de leucemia) e células autoimunes (e.g., células T autorreativas) e/ou (ii) esgotar uma população de células-tronco hematopoiéticas endógenas de modo a promover o enxerto de células-tronco hematopoiéticas transplantadas fornecendo um nicho no qual as células transplantadas podem se alojar. As atividades anteriores podem ser obtidas pela administração de um ADC, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, capaz de se ligar a um antígeno expressado por uma célula endógena que causa doença, uma célula autoimune ou uma célula-tronco hematopoiética. No caso de tratamento direto de uma doença, essa administração pode causar uma redução na quantidade das células que dão origem à patologia de interesse. No caso de preparar um paciente para terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas, essa administração pode causar a depleção seletiva de uma população de células- tronco hematopoiéticas endógenas, criando assim uma vacância no tecido hematopoiético, tal como a medula óssea, que pode subsequentemente ser preenchida pelas células-tronco hematopoiéticas exógenas transplantadas. A invenção tem como base, em parte, a descoberta de que os ADCs, anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, capazes de se ligarem a CD117 (tal como CD117 GNNK+) podem ser administrados a um paciente para afetar ambas as atividades acima. Os ADCs, anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a CD117 podem ser administrados a um paciente sofrendo de um câncer ou doença autoimune para esgotar diretamente uma população de células cancerosas ou células autoimunes, e também podem ser administrados a um paciente em necessidade de terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas de modo a promover a sobrevivência e enxerto potencial de células-tronco hematopoiéticas transplantadas.

[0229]O enxerto de transplante de células-tronco hematopoiéticas devido à administração de ADCs, anticorpos anti-CD117 ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, pode se manifestar em uma variedade de medições empíricas. Por exemplo, o enxerto de células-tronco hematopoiéticas transplantadas pode ser avaliado avaliando a quantidade de unidades de repovoamento competitivo (CRU) presente dentro da medula óssea de um paciente após a administração de um ADC, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a CD117 e subsequente administração de um transplante de células-tronco hematopoiéticas. Além disso, pode-se observar o enxerto de um transplante de células-tronco hematopoiéticas incorporando um gene repórter, tal como uma enzima que catalisa uma reação química produzindo um produto fluorescente, cromofórico ou luminescente, em um vetor com o qual as células-tronco hematopoiéticas do doador foram transfectadas e subsequentemente monitorar o sinal correspondente em um tecido no qual as células-tronco hematopoiéticas se alojaram, tal como a medula óssea. Também pode-se observar o enxerto de célula-tronco hematopoiética pela avaliação da quantidade e sobrevivência das células-tronco e progenitoras hematopoiéticas, por exemplo, conforme determinado por métodos de análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) conhecidos na técnica. O enxerto também pode ser determinado medindo contagens de glóbulos brancos no sangue periférico durante um período de pós-transplante e/ou medindo a recuperação de células da medula por células do doador em uma amostra aspirada da medula óssea. Anticorpos anti-CD2

[0230]O CD2 humano também é referido como antígeno de superfície de células T T11/Leu-5, T11, antígeno CD2 (p50) e Receptor de Glóbulos Vermelhos de Ovelha (SRBC). O CD2 é expressado em células T. Duas isoformas de CD2 humano foram identificadas. A isoforma 1 contém 351 aminoácidos é descrito em Seed, B. et al. (1987) 84: 3365-69 (ver também Sewell et al. (1986) 83: 8718 - 22) e abaixo (Sequência de Referência NCBI: NP_001758.2): msfpckfvas fllifnvssk gavskeitna letwgalgqd inldipsfqm sddiddikwe ktsdkkkiaq frkeketfke kdtyklfkng tlkikhlktd dqdiykvsiy dtkgknvlek ifdlkiqerv skpkiswtci nttltcevmn gtdpelnlyq dgkhlklsqr vithkwttsl sakfkctagn kvskessvep vscpekgldi yliigicggg sllmvfvall vfyitkrkkq rsrrndeele trahrvatee rgrkphqipa stpqnpatsq hpppppghrs qapshrpppp ghrvqhqpqk rppapsgtqv hqqkgpplpr prvqpkpphg aaenslspss n (SEQ ID NO: 29)

[0231]Uma segunda isoforma de CD2 tem 377 aminoácidos e é aqui identificada como Sequência de Referência NCBI: NP_001315538.1.

[0232]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD2 que pode ser usado em conjunto com as composições e métodos aqui descritos incluem aqueles que têm uma ou mais, ou todas as seguintes CDRs: a. Uma CDR-H1 tendo a sequência de aminoácidos EYYMY (SEQ ID NO: 30); b. Uma CDR-H2 tendo a sequência de aminoácidos RIDPEDGSIDYVEKFKK

(SEQ ID NO: 31); c. Uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoácidos GKFNYRFAY (SEQ ID NO: 32); d. Uma CDR-L1 tendo a sequência de aminoácidos RSSQSLLHSSGNTYLN (SEQ ID NO: 33); e. Uma CDR-L2 tendo a sequência de aminoácidos LVSKLES (SEQ ID NO: 34); e f. Uma CDR-L3 tendo a sequência de aminoácidos MQFTHYPYT (SEQ ID NO: 35).

[0233]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD2, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37.

[0234]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD2 que pode ser usado em conjunto com as composições e métodos aqui descritos incluem aqueles que têm uma ou mais, ou todas as seguintes CDRs: a. Uma CDR-H1 tendo a sequência de aminoácidos GFTFSSY (SEQ ID NO: 38); b. Uma CDR-H2 tendo a sequência de aminoácidos SGGGF (SEQ ID NO: 39); c. Uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoácidos SSYGEIMDY (SEQ ID NO: 40); d. Uma CDR-L1 tendo a sequência de aminoácidos RASQRIGTSIH (SEQ ID NO: 42); e. Uma CDR-L2 tendo a sequência de aminoácidos YASESIS (SEQ ID NO: 43); e f. Uma CDR-L3 tendo a sequência de aminoácidos QQSHGWPFTF (SEQ ID NO: 44).

[0235]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD2, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47.

[0236]Em uma outra modalidade, um anticorpo anti-CD2 que pode ser usado em conjunto com as composições e métodos aqui descritos incluem aqueles que têm uma ou mais, ou todas as seguintes CDRs: a. Uma CDR-H1 tendo a sequência de aminoácidos GFTFSSY (SEQ ID NO: 38); b. Uma CDR-H2 tendo a sequência de aminoácidos SGGGF (SEQ ID NO: 39); c. Uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoácidos SSYGELMDY (SEQ ID NO: 41); d. Uma CDR-L1 tendo a sequência de aminoácidos RASQRIGTSIH (SEQ ID NO: 42); e. Uma CDR-L2 tendo a sequência de aminoácidos YASESIS (SEQ ID NO: 43); e f. Uma CDR-L3 tendo a sequência de aminoácidos QQSHGWPFTF (SEQ ID NO: 44).

[0237]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD2, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 47.

[0238]Anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos contendo as sequências de CDR anteriores são descritos, e.g., na Patente dos EUA No. 6.849.258, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere aos anticorpos anti-CD2 e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.

[0239]Além disso, em certas modalidades, o ADC anti-CD2 tem uma meia-

vida sérica em um sujeito humano de 3 dias ou menos.

[0240]Sequências adicionais para anticorpos anti-CD2 ou fragmentos de ligação, aqui descritos são fornecidas na Tabela 5.

[0241]Anticorpos anti-CD2 adicionais, os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos ou ADCs dos mesmos que podem ser usados nas composições e métodos como aqui descritos podem ser identificados usando técnicas conhecidas na técnica, tais como produção de hibridoma. Hibridomas podem ser preparados usando um sistema murino. Os protocolos para imunização e subsequente isolamento de esplenócitos para fusão são conhecidos na técnica. Os padrões e procedimentos de fusão para geração de hibridoma também são conhecidos. Alternativamente, os anticorpos anti-CD2 podem ser gerados usando o HuMAb-Mouse® ou XenoMouse™. Na fabricação de anticorpos anti-CD2 adicionais, o antígeno CD2 é isolado e/ou purificado. O antígeno CD2 pode ser um fragmento de CD2 do domínio extracelular de CD2. A imunização de animais pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica. Ver, e.g., Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Os métodos para imunizar animais, tais como camundongos, ratos, ovelhas, cabras, porcos, gado e cavalos são bem conhecidos na técnica. Ver, e.g., Harlow e Lane, supra, e Pat. dos EUA No 5.994.619. O antígeno CD2 pode ser administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Os adjuvantes conhecidos na técnica incluem adjuvante de Freund completo ou incompleto, RIBI (dipeptídeos muramil) ou ISCOM (complexos imunoestimulantes). Depois da imunização de um animal com um antígeno CD2, linhagens de células imortalizadas produtoras de anticorpos são preparadas a partir de células isoladas do animal imunizado. Depois da imunização, o animal é sacrificado e os linfonodos e/ou células B esplênicas são imortalizados por métodos conhecidos na técnica (e.g., transferência de oncogene, transdução de vírus oncogênico, exposição a compostos carcinogênicos ou mutantes, fusão com uma célula imortalizada, e.g., uma célula do mieloma e inativação de um gene supressor de tumor. Ver, e.g., Harlow e Lane, supra. Os hibridomas podem ser selecionados, clonados e ainda triados para características desejáveis, incluindo crescimento robusto, alta produção de anticorpos e características desejáveis de anticorpo.

[0242]Anticorpos anti-CD2 para o uso nos ADCs anti-CD2 aqui descritos também podem ser identificados usando triagem de alto rendimento de bibliotecas de anticorpos ou fragmentos de anticorpo para moléculas capazes de se ligarem a CD2. Tais métodos incluem técnicas de exibição in vitro conhecidas na técnica, tais como exibição de fago, exibição bacteriana, exibição de levedura, exibição de célula de mamífero, exibição de ribossoma, exibição de mRNA e exibição de CDNA, entre outros. O uso de exibição de fago para isolar anticorpos, os fragmentos de ligação ao antígeno ou ligantes que se ligam a moléculas biologicamente relevantes foi revisado, por exemplo, em Felici et al., Biotechnol. Annual Rev. 1: 149-183, 1995; Katz, Annual Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 27-45, 1997; e Hoogenboom et al., Immunotechnology 4: 1-20, 1998, as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência, uma vez que dizem respeito às técnicas de exibição in vitro. Bibliotecas de peptídeos combinatórios randomizados foram construídas para selecionar polipeptídeos que se ligam aos antígenos da superfície celular como descrito em Kay, Perspect. Drug Discovery Des. 2: 251-268, 1995 e Kay et al., Mol. Divers. 1: 139-140, 1996, as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência, na medida em que se referem à descoberta de moléculas de ligação ao antígeno. Proteínas, tais como proteínas multiméricas, foram exibidas com êxito em fagos como moléculas funcionais (ver, por exemplo, EP 0349578; EP 4527839; e EP 0589877, bem como Chiswell e McCafferty, Trends Biotechnol. 10: 80- 4 1992, as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência, na medida em que se referem ao uso de técnicas de exibição in vitro para a descoberta de moléculas de ligação ao antígeno. Além disso, fragmentos funcionais de anticorpo,

tais como fragmentos Fab e scFv, foram expressados em formatos de exibição in vitro (ver, por exemplo, McCafferty et al., Nature 348: 552-554, 1990; Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982, 1991; e Clackson et al., Nature 352: 624-628, 1991, as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência, uma vez que se referem a plataformas de exibição in vitro para a descoberta de moléculas de ligação ao antígeno).

[0243]Além de técnicas de exibição in vitro, técnicas de modelagem computacional podem ser usadas para projetar e identificar anticorpos anti-CD2 ou fragmentos de anticorpo in silico, por exemplo, usando os procedimentos descritos em US 2013/0288373, cuja divulgação é aqui incorporada, uma vez que se refere aos métodos de modelagem molecular para identificar anticorpos anti-CD2. Por exemplo, usando técnicas de modelagem computacional, um especialista na técnica pode rastrear bibliotecas de anticorpos ou fragmentos de anticorpo in silico para moléculas capazes de se ligarem a epítopos específicos em CD2, tais como epítopos extracelulares de CD2.

[0244]Em uma modalidade, os anticorpos anti-CD2 usados nos ADCs aqui descritos são capazes de internalizar na célula. Na identificação de um anticorpo anti- CD2 (ou fragmento do mesmo) técnicas adicionais podem ser usadas para identificar anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a CD2 na superfície de uma célula (e.g., uma célula T) e ainda são capazes de serem internalizados pela célula, por exemplo, por endocitose mediada por receptor. Por exemplo, as técnicas de exibição in vitro descritas acima podem ser adaptadas para rastrear anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a CD2 na superfície de uma célula-tronco hematopoiética e que são subsequentemente internalizados. A exibição de fago representa uma técnica que pode ser usada em conjunto com este paradigma de triagem. Para identificar anticorpos anti-CD2 ou fragmentos dos mesmos que se ligam a CD2 e são subsequentemente internalizados uma célula

CD2+, um especialista na técnica pode usar as técnicas de exibição de fagos descritas em Williams et al., Leukemia 19: 1432-1438, 2005, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0245]A capacidade de internalização de um anticorpo anti-CD2 ou fragmento do mesmo pode ser avaliada, por exemplo, usando ensaios de internalização de radionuclídeos conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo anti-CD2 ou fragmento do mesmo, identificado usando técnicas de exibição in vitro aqui descritas ou conhecidas na técnica pode ser funcionalizado pela incorporação de um radioativo isótopo, tal como 18F, 75Br, 77Br, 122I, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I, 211At, 67Ga, 111In, 99Tc, 169Yb, 186Re, 64Cu, 67Cu, 177Lu, 77As, 72As, 86Y, 90Y, 89Zr, 212Bi, 213Bi ou 225Ac. Por exemplo, halogênios radioativos, tais como 18F, 75Br, 77Br, 122I, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I, 211At, podem ser incorporados em anticorpos, fragmentos dos mesmos ou ligantes usando microesferas, tais como microesferas de poliestireno, contendo reagentes eletrofílicos de halogênio (e.g., Iodination Beads, Thermo Fisher Scientific, Inc., Cambridge, MA). Anticorpos radiomarcados, ou fragmentos dos mesmos, podem ser incubados com células-tronco hematopoiéticas por um tempo suficiente para permitir a internalização. Anticorpos internalizados, ou fragmentos dos mesmos, podem ser identificados pela detecção da radiação emitida (e.g., radiação γ) das células-tronco hematopoiéticas resultantes em comparação com a radiação emitida (e.g., radiação γ) do tampão de lavagem recuperado. Os ensaios de internalização anteriores também podem ser usados para caracterizar ADCs.

[0246]Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD2 (ou fragmento do mesmo) tem uma meia-vida sérica definida. Por exemplo, um anticorpo anti-CD2 (ou fragmento do mesmo) pode ter uma meia-vida sérica de cerca de 1 a 24 horas no paciente humano. ADCs contendo tais anticorpos anti-CD2 também podem, por exemplo, ter uma meia-vida sérica de cerca de 1 a 24 horas em um paciente humano. A análise farmacocinética pela medição de níveis séricos pode ser realizada por ensaios conhecidos na técnica.

[0247]Para a produção recombinante de um anticorpo anti-CD2, o ácido nucleico que codifica um anticorpo, e.g., como descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem e/ou expressão adicional em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (e.g., usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligarem especificamente aos genes que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo).

[0248]Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem células procarióticas ou eucarióticas aqui descritas. Por exemplo, anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e função efetora de Fc não são necessárias. Para a expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, ver, e.g., Pat. dos EUA Nos.

[0249]As células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, linhagens de células de mamíferos que são adaptadas para crescerem em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 como descrito, e.g., em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster neonato (BHK); células de sertoli de camundongo (células TM4 como descrito, e.g., em Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células renais caninas (MDCK; células do fígado de rato buffalo (BRL 3A); células do pulmão humano (W138); células do fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, como descrito, e.g., em Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem células do ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); e linhagens de células do mieloma, tais como Y0, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamífero adequadas para a produção de anticorpo, ver, e.g., Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), páginas 255 a 268 (2003). Em uma modalidade, a célula hospedeira é eucariótica, e.g., uma célula do Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfoide (e.g., célula Y0, NS0, Sp20). Anticorpos anti-CD5

[0250]O CD5 humano também é referido como Antígeno de Linfócito T1, T1, Leu-1 e LEU1. O CD5 é expressado em células T humanas. Duas isoformas de CD5 humano foram identificadas. A isoforma 1 contém 495 aminoácidos e é descrita em Gladkikh et al. (2017) Cancer Med, 6(12): 2984 e Jones et al. (1986) Nature 323 (6086): 346). A sequência de aminoácidos de CD5 (isoforma 1) é fornecida abaixo (Sequência de Referência NCBI: NP_055022.2): mpmgslqpla tlyllgmlva sclgrlswyd pdfqarltrs nskcqgqlev ylkdgwhmvc sqswgrsskq wedpsqaskv cqrlncgvpl slgpflvtyt pqssiicygq lgsfsncshs rndmchslgl tclepqkttp pttrpppttt peptapprlq lvaqsggqhc agvvefysgs lggtisyeaq dktqdlenfl cnnlqcgsfl khlpeteagr aqdpgepreh qplpiqwkiq nssctslehc frkikpqksg rvlallcsgf qpkvqsrlvg gssicegtve vrqgaqwaal cdsssarssl rweevcreqq cgsvnsyrvl dagdptsrgl fcphqklsqc helwernsyc kkvfvtcqdp npaglaagtv asiilalvll vvllvvcgpl aykklvkkfr qkkqrqwigp tgmnqnmsfh rnhtatvrsh aenptashvd neysqpprns hlsaypaleg alhrssmqpd nssdsdydlh gaqrl (SEQ ID NO: 48)

[0251]Uma segunda isoforma (SEQ ID NO: 339) de CD5 humano tem 438 aminoácidos (ver parte sublinhada acima) e é identificada como Sequência de Referência NCBI: NP_001333385.1. Ao contrário da isoforma 1, isoforma 2 de CD5 é uma proteína intracelular. A isoforma 2 contém uma UTR 5’ distinta e carece de uma porção in-frame da região de codificação 5’, em comparação com a isoforma 1. A isoforma 2 resultante tem um terminal N mais curto em comparação com a isoforma

1. A isoforma 2 de CD5 carece do peptídeo líder em comparação com a isoforma 1 e representa uma isoforma intracelular encontrada em um subconjunto de linfócitos B. Os ADCs aqui descritos são específicos para isoforma 1 de CD5 humano que representa a versão extracelular de CD5 humano.

[0252]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD5 que pode ser usado nos métodos e composições aqui descritos é Anticorpo 5D7v (Ab5D7v). A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) de Ab5D7v é fornecida abaixo como SEQ ID NO: 49.

QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQAPGKGLEWV

AHIWWDDDVYYNPSLKSRLTITKDASKDQVSLKLSSVTAADTAVYYCVRRRATGTG FDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 49)

[0253]As sequências de aminoácidos da CDR de VH de Ab5D7v são sublinhadas acima e são como se segue: FSLSTSGMG (CDR1 VH; SEQ ID NO: 51); WWDDD (CDR2 VH; SEQ ID NO: 52); e RRATGTGFDY (CDR3 VH; SEQ ID NO: 53).

[0254]A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VL) de Ab5D7v é fornecida abaixo como SEQ ID NO 50.

NIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDVGTAVAWYQQKPDQSPKLLIYWT

STRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYFCHQYNSYNTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 50)

[0255]As sequências de aminoácidos da CDR de VL de Ab5D7v são sublinhadas acima e são como se segue: QDVGTA (CDR1 VL; SEQ ID NO: 54); WTSTRHT (CDR2 VL; SEQ ID NO: 55); e YNSYNT (CDR3 VL; SEQ ID NO: 56).

[0256]Em uma modalidade, um ADC anti-CD5 compreende um anticorpo anti- CD5 compreendendo uma cadeia pesada compreendendo um domínio CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 51, um domínio CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 52, e um domínio CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 53, e compreende uma cadeia leve compreendendo um domínio CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 54, um domínio CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 55, e um domínio CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 56, em que o anticorpo é conjugado com uma citotoxina por meio de um conector.

[0257]Em uma modalidade, um ADC anti-CD5 compreende um anticorpo anti- CD5 compreendendo uma cadeia pesada compreendendo uma região variável compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 49 e uma cadeia leve compreendendo uma região variável compreendendo uma sequência de aminoácidos como apresentado na SEQ ID NO: 50, em que o anticorpo é conjugado com uma citotoxina por meio de um conector.

[0258]Em uma outra modalidade, um anticorpo anti-CD5 usado nos ADCs aqui descritos é o anticorpo 5D7 (ver, e.g., US 20080254027, cuja divulgação é aqui incorporada por referência). Em uma outra modalidade, um anticorpo anti-CD5 que pode ser usado nos métodos e composições (incluindo ADCs) aqui descritos é uma variante do anticorpo 5D7 (ver, e.g., US 20080254027, cuja divulgação é aqui incorporada por referência).

[0259]Além disso, em certas modalidades, o ADC anti-CD5 tem uma meia-

vida sérica em um sujeito humano de 3 dias ou menos.

[0260]Sequências adicionais para anticorpos anti-CD5 ou fragmentos de ligação, aqui descritos, são fornecidas na Tabela 5.

[0261]Anticorpos anti-CD5 adicionais que podem ser usados nos ADCs aqui descritos podem ser identificados usando técnicas conhecidas na técnica, tais como produção de hibridoma. Hibridomas podem ser preparados usando um sistema murino. Os protocolos para imunização e subsequente isolamento de esplenócitos para fusão são conhecidos na técnica. Os padrões e procedimentos de fusão para geração de hibridoma também são conhecidos. Alternativamente, anticorpos anti-CD5 podem ser gerados usando o HuMAb-Mouse® ou XenoMouse™. Na fabricação de anticorpos adicionais anti-CD5, o antígeno CD5 é isolado e/ou purificado. O antígeno CD5 pode ser um fragmento de CD5 do domínio extracelular de CD5. A imunização de animais pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica. Ver, e.g., Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Os métodos para imunizar animais, tais como camundongos, ratos, ovelhas, cabras, porcos, gado e cavalos são bem conhecidos na técnica. Ver, e.g., Harlow e Lane, supra, e Pat. dos EUA No 5.994.619. O antígeno CD5 pode ser administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Adjuvantes conhecidos na técnica incluem adjuvante de Freund completo ou incompleto, RIBI (dipeptídeos muramil) ou ISCOM (complexos imunoestimulantes). Depois da imunização de um animal com um antígeno CD5, linhagens de células imortalizadas produtoras de anticorpos são preparadas a partir de células isoladas do animal imunizado. Depois da imunização, o animal é sacrificado e os linfonodos e/ou células B esplênicas são imortalizados por métodos conhecidos na técnica (e.g., transferência de oncogene, transdução de vírus oncogênico, exposição a compostos carcinogênicos ou mutantes, fusão com uma célula imortalizada, e.g., uma célula do mieloma e inativação de um gene supressor de tumor. Ver, e.g., Harlow e Lane, supra.

Os hibridomas podem ser selecionados, clonados e ainda triados para características desejáveis, incluindo crescimento robusto, alta produção de anticorpos e características desejáveis de anticorpo.

[0262]Anticorpos anti-CD5 para o uso nos ADCs anti-CD5 aqui descritos também podem ser identificados usando triagem de alto rendimento de bibliotecas de anticorpos ou fragmentos de anticorpo para moléculas capazes de se ligarem a CD5. Tais métodos incluem técnicas de exibição in vitro conhecidas na técnica, tais como exibição de fago, exibição bacteriana, exibição de levedura, exibição de célula de mamífero, exibição de ribossoma, exibição de mRNA e exibição de CDNA, entre outros. O uso de exibição de fago para isolar anticorpos, os fragmentos de ligação ao antígeno ou ligantes que se ligam moléculas biologicamente relevantes foi revisado, por exemplo, em Felici et al., Biotechnol. Annual Rev. 1: 149-183, 1995; Katz, Annual Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 27-45, 1997; e Hoogenboom et al., Immunotechnology 4: 1-20, 1998, as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência, uma vez que dizem respeito às técnicas de exibição in vitro. Bibliotecas de peptídeos combinatórios randomizados foram construídas para selecionar polipeptídeos que se ligam aos antígenos da superfície celular como descrito em Kay, Perspect. Drug Discovery Des. 2: 251-268, 1995 e Kay et al., Mol. Divers. 1: 139-140, 1996, as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência, na medida em que se referem à descoberta de moléculas de ligação ao antígeno. Proteínas, tais como proteínas multiméricas, foram exibidas com êxito em fagos como moléculas funcionais (ver, por exemplo, EP 0349578; EP 4527839; e EP 0589877, bem como Chiswell e McCafferty, Trends Biotechnol. 10: 80- 4 1992, as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência, na medida em que se referem ao uso de técnicas de exibição in vitro para a descoberta de moléculas de ligação ao antígeno. Além disso, fragmentos funcionais de anticorpo, tais como fragmentos Fab e scFv, foram expressados em formatos de exibição in vitro

(ver, por exemplo, McCafferty et al., Nature 348: 552-554, 1990; Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982, 1991; e Clackson et al., Nature 352: 624-628, 1991, as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência, uma vez que se referem a plataformas de exibição in vitro para a descoberta de moléculas de ligação ao antígeno).

[0263]Além de técnicas de exibição in vitro, as técnicas de modelagem computacional podem ser usadas para projetar e identificar anticorpos anti-CD5 ou fragmentos de anticorpo in silico, por exemplo, usando os procedimentos descritos em US 2013/0288373, cuja divulgação é aqui incorporada, uma vez que se refere aos métodos de modelagem molecular para identificar anticorpos anti-CD5. Por exemplo, usando técnicas de modelagem computacional, um especialista na técnica pode rastrear bibliotecas de anticorpos ou fragmentos de anticorpo in silico para moléculas capazes de se ligarem a epítopos específicos em CD5, tais como epítopos extracelulares de CD5.

[0264]Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD5 usado nos ADCs aqui descritos são capazes de internalizar na célula. Na identificação de um anticorpo anti- CD5 (ou fragmento do mesmo) técnicas adicionais podem ser usadas para identificar anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a CD5 na superfície de uma célula (e.g., uma célula T) e ainda são capazes de serem internalizados pela célula, por exemplo, por endocitose mediada por receptor. Por exemplo, as técnicas de exibição in vitro descritas acima podem ser adaptadas para rastrear anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a CD5 na superfície de uma célula-tronco hematopoiética e que são subsequentemente internalizados. A exibição de fago representa uma técnica que pode ser usada em conjunto com este paradigma de triagem. Para identificar anticorpos anti-CD5 ou fragmentos dos mesmos que se ligam a CD5 e são subsequentemente internalizados uma célula CD5+, um especialista na técnica pode usar as técnicas de exibição de fagos descritas em Williams et al., Leukemia 19: 1432-1438, 2005, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0265]A capacidade de internalização de um anticorpo anti-CD5 ou fragmento do mesmo pode ser avaliada, por exemplo, usando ensaios de internalização de radionuclídeos conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo anti-CD5 ou fragmento do mesmo, identificado usando técnicas de exibição in vitro aqui descritas ou conhecidas na técnica pode ser funcionalizado pela incorporação de um radioativo isótopo, tal como 18F, 75Br, 77Br, 122I, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I, 211At, 67Ga, 111In, 99Tc, 169Yb, 186Re, 64Cu, 67Cu, 177Lu, 77As, 72As, 86Y, 90Y, 89Zr, 212Bi, 213Bi ou 225Ac. Por exemplo, halogênios radioativos, tais como 18F, 75Br, 77Br, 122I, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I, 211At, podem ser incorporados em anticorpos, fragmentos dos mesmos ou ligantes usando microesferas, tais como microesferas de poliestireno, contendo reagentes eletrofílicos de halogênio (e.g., Iodination Beads, Thermo Fisher Scientific, Inc., Cambridge, MA). Anticorpos radiomarcados, ou fragmentos dos mesmos, podem ser incubados com células-tronco hematopoiéticas por um tempo suficiente para permitir a internalização. Anticorpos internalizados, ou fragmentos dos mesmos, podem ser identificados pela detecção da radiação emitida (e.g., radiação γ) das células-tronco hematopoiéticas resultantes em comparação com a radiação emitida (e.g., radiação γ) do tampão de lavagem recuperado. Os ensaios de internalização anteriores também podem ser usados para caracterizar ADCs.

[0266]Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD5 (ou fragmento do mesmo) tem uma meia-vida sérica definida. Por exemplo, um anticorpo anti-CD5 (ou fragmento do mesmo) pode ter uma meia-vida sérica de cerca de 1 a 24 horas no paciente humano. ADCs contendo tais anticorpos anti-CD5 também podem, por exemplo, ter uma meia-vida sérica de cerca de 1 a 24 horas em um paciente humano. A análise farmacocinética pela medição de níveis séricos pode ser realizada por ensaios conhecidos na técnica.

[0267]Para a produção recombinante de um anticorpo anti-CD5, o ácido nucleico que codifica um anticorpo, e.g., como descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem e/ou expressão adicional em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (e.g., usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligarem especificamente aos genes que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo).

[0268]Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem células procarióticas ou eucarióticas aqui descritas. Por exemplo, anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e função efetora de Fc não são necessárias. Para a expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, ver, e.g., Pat. dos EUA Nos

[0269]As células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, linhagens de células de mamíferos que são adaptadas para crescerem em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 como descrito, e.g., em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster neonato (BHK); células de sertoli de camundongo (células TM4 como descrito, e.g., em Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células renais caninas (MDCK; células do fígado de rato buffalo (BRL 3A); células do pulmão humano (W138); células do fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, como descrito, e.g., em Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem células do ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); e linhagens de células do mieloma, tais como Y0, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamífero adequadas para a produção de anticorpo, ver, e.g., Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), páginas 255 a 268 (2003). Em uma modalidade, a célula hospedeira é eucariótica, e.g., uma célula do Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfoide (e.g., célula Y0, NS0, Sp20).

[0270]Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD5 que podem ser usados em conjunto com as composições e métodos aqui descritos incluem aqueles que contêm uma combinação de regiões CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 apresentados na Tabelas 1 e 2, abaixo. Tabela 1. Ab No Nome CDRH1 SEQ ID CDRH2 SEQ CDRH3 SEQ ID NO: ID NO: NO: 1 1D8 SGYSFTGYTM 57 LINPYNGGTT 94 CARDYYGSSPDFDYW 131 2 3I21 SGYSFTDYTM 58 LINPYNGGTM 95 CARDNYGSSPDFDYW 132 3 4H10 SGYSFTGYTM 59 LINPYNGGTM 96 CARDNYGSSPYFDYW 133 4 8J23 SGYSFTGYTM 60 LINPYNGGTM 97 CARDNYGSSPYFDYW 134 5 5O4 SGYSFTGYTM 61 LINPYNGGTT 98 CARDYYGSSPDFDYW 135 6 4H2 SGFTFSNYAM 62 SISSGGNTF 99 CVRYYYGVTYWYFDVW 136 7 5G2 SGFTFSSYAM 63 SISSGGSTY 100 CVRYYYGIRYWYFDVW 137 8 8G8 SGYSFTAYNI 64 SIDPYYGDTK 101 CARRMITMGDWYFDVW 138 9 6M4 SGYSFTAYSM 65 SIDPYYGDTK 102 CARRMITTGDWYFDVW 139 10 2E3 SGYTFTNFAI 66 LISSNSGDVS 103 CARHYGAHNYFDYW 140 11 4E24 SGYTFTNFAI 67 LISTSSGDVS 104 CARHYGANNYFDYW 141 12 4F10 SGYTFTNFAI 68 LISSNSGDVS 105 CARHYGAHNYFDYW 142 13 7J9 SGYTFTNFAI 69 LISSNSGDVS 106 CARHYGAHNYFDYW 143 14 7P9 SGFNIKDTYM 70 RIDPANGNTK 107 CAREENYYGTYYFDYW 144 15 8E24 SGYSFTSYWM 71 MIHPSDSETR 108 CARWGDHDDAMDFW 145

16 6L18 SGFSLTNYDV 72 VIWSGGNTD 109 CARNHGDGYFNWYFDVW 146 17 7H7 SGFSLTNYDV 73 VIWSGGNTD 110 CARNHGDGYYNWYFDVW 147 18 1E7 SGFTFSNYGM 74 AINSNGDITY 111 CARGTAWFTYW 148 19 8J21 SGYSFTGYTM 75 LINPYNGGTR 112 CARDGDDGWDIDVW 149 20 7I11 SGYIFANYGM 76 WINTYTGEPT 113 CARRGTYWHFDVW 150 21 8M9 SGYNFTNYGM 77 WINTYTGEPT 114 CARRGSYWHFDVW 151 22 1P21 SGYTFTNYGM 78 WINTYTGEPT 115 CARRSTLVFDYW 152 23 2H11 SGYTFTDYYI 79 WIYPGGGNTR 116 CARNGYWYFDVW 153 24 3M22 SGYTFTDYYI 80 WIYPGGGNTR 117 CARNGYWYFDVW 154 25 5M6 SGNTFTNFYL 81 CIYPGNVKTK 118 CAKEGDYDGTAYFDYW 155 26 5H8 SGYTFTNYGM 82 WINTYTGEPT 119 CARRRDGNFDYW 156 27 7I19 SEFTFSNYAM 83 TISSGGSYTY 120 CVRHGYFDVW 157 28 1A20 SGYTFTSYRM 84 RIDPYDSGTH 121 CAFYDGAYW 158 29 8E15 SGFNIKDTYM 85 RIDPANGNTK 122 CASYDPDYW 159 30 8C10 SGYSFTDYTM 86 LINPYNGGTR 123 CARDTTATYYFDYW 160 31 3P16 SGYMFTNHGM 87 WINTYTGEPT 124 CARRVATYFDVW 161 32 4F3 SGYMFTNYGM 88 WINTYTGEPT 125 CTRRSHITLDYW 162 33 5M24 SGYIFTNYGM 89 WINTYTGEPT 126 CARRRTTAFDYW 163 34 5O24 SGFNIKDYYI 90 WIDPENGRTE 127 CNNGNYVRHYYFDYW 168 35 7B16 SGYTFINYGM 91 WINTYTGEPT 128 CTRRREITFDYW 164 36 1E8 SGYTFTDYFI 92 EIYPGSSNTY 129 CARSGISPFTYW 165 37 2H16 SGYIFTGYNI 93 AVYPGNGDTS 130 CAKYDRFFASW 166

Tabela 2. Ab No Nome CDRL1 SEQ CDRL2 SEQ CDRL3 SEQ ID NO: ID ID NO: NO: 1 1D8 SQGISNHL 167 YFTSS 204 CQQYSNLPYTF 241 2 3I21 SQGIRNYL 185 YFTSS 205 CQQYSNLPYTF 242 3 4H10 SQGISNHL 169 YFTSS 206 CQQYSNLPYTF 243 4 8J23 SQGINNYL 170 YYTSS 207 CQQYSKIPYTC 244 5 5O4 SQGISNHL 171 YFTSS 208 CQQYSNLPYTF 245 6 4H2 SQSVDHDGDSYM 172 YAASN 209 CQQNYEDPTF 246 7 5G2 SQSVDYDGDSYM 173 YAASN 210 CQQSNEDPTF 247 8 8G8 SQDISNYL 174 YYTSR 211 CQQGDALPWTF 248 9 6M4 SQDISTYL 175 FYTSR 212 CQQGNSLPFTF 249 10 2E3 TSSISSSYL 176 YGTSN 213 CQQWSSRPPTF 250 11 4E24 NSSVSSSYL 177 YGTSN 214 CQQYSGYPLTF 251 12 4F10 TSSISSSYL 178 YGTSN 215 CQQYSDYPLTF 252 13 7J9 TSSISSSYL 179 YGTSN 216 CQQRSYFPFTF 253 14 7P9 SENIYYNL 180 YNANS 217 CKQVYDVPFTF 254 15 8E24 SENIYGYF 181 YNAKT 218 CQHHYGTPFTF 255 16 6L18 SQDINNYI 182 HYTST 219 CLQYDNLWTF 256 17 7H7 SQDINKYI 183 HYTST 220 CLQYDNLWTF 257 18 1E7 SENIYSYL 184 YNAKT 221 CQHHYGYPYTF 258 19 8J21 SQGIRNYL 185 YHTST 222 CQQYSNLPLTF 259 20 7I11 SQDVRTDV 186 YSASF 223 CQQHYTSPWTF 260

21 8M9 SQDVITAV 187 YSASY 224 CQQHYSTPWTF 261 22 1P21 SQSIGTSI 188 KSASE 225 CQQSNRWPLTF 262 23 2H11 SSQSLLNQKNYL 189 YWAST 226 CQNDYDYPYTF 263 24 3M22 SSSVSSSYL 190 YSTSN 227 CHQYHRSPLTF 264 25 5M6 SENIYYNL 191 YNANS 228 CQQTFDVPWTF 265 26 5H8 SQTIGTSI 192 KNASE 229 CQQSNSWPLTY 266 27 7I19 SQSLLYSSDQKNYL 193 YWAST 230 CQQYYNYPLTF 267 28 1A20 NSSVSYM 194 YDTSK 231 CQQWSSNPFTF 268 29 8E15 SENIYYNL 195 YNANS 232 CKQAYDVPWTF 269 30 8C10 SSSLSYM 196 YDTSN 233 CQQWSSFPPTF 270 31 3P16 SQRIGTSM 197 KSASE 234 CQQSNSWPLTF 271 32 4F3 SQSIGTSI 198 KSASE 235 CQQSNSWPLTF 272 33 5M24 SQNIGTSI 199 KDASE 236 CQQSDSWPLTF 273 34 5O24 ISSVSYM 200 YATSN 237 CQQWSSNPRTF 274 35 7B16 SQTIATSI 201 KNASE 238 CQQSNSWPLTF 275 36 1E8 SQSLVHSNGNTYL 202 YKVSN 239 CWQNTHFPQTF 276 37 2H16 NESVEYSGTSLM 203 SAASN 240 CQQSRQVPLTF 277 Anticorpos anti-CD137

[0271]CD137 também é referido como CDw137, TNFRSF9, 4-1BB e ILA. Os anticorpos anti-CD137, os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos e ADCs dos mesmos podem ser usados como agentes terapêuticos para prevenir e tratar GVHD de células-tronco hematopoiéticas em um paciente sofrendo de ou em risco para GVHD ou uma doença autoimune. Além disso, foi descoberto que os ligantes que se ligam a CD137, tal como CD137L humano, podem ser usados como um agente terapêutico para prevenir ou tratar um paciente sofrendo de ou em risco para GVHD. Esses ligantes, tais como CD137 humano solúvel, podem ser ligados covalentemente a um domínio efetor, tal como um domínio Fc, por exemplo, de modo a promover a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC).

[0272]Foi demonstrado que as células T expressam CD137, visto que esse antígeno é uma superfamília de receptores TNF transmembrana de moléculas coestimuladoras e é expressado em uma variedade de células hematopoiéticas e promove a ativação de células T e regula a proliferação e sobrevivência das células T (ver, e.g., Cannons et al., J. Immunol. 167: 1313-1324, 2001, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere à expressão de CD137 por células T). Os anticorpos, e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, podem ser identificados usando técnicas conhecidas na técnica e aqui descritas, tais como por imunização, técnicas de modelagem computacional e métodos de seleção in vitro, tais como a exibição de fago e plataformas de exibição com base em células descritas abaixo.

[0273]Os anticorpos anti-CD137 que podem ser usados para prevenir e tratar GVHD ou uma doença autoimune pelos métodos aqui divulgados incluem aqueles que têm uma ou mais, ou todas as seguintes CDRs: a. Uma CDR-H1 tendo a sequência de aminoácidos STYWIS (SEQ ID NO: 278); b. Uma CDR-H2 tendo a sequência de aminoácidos KIYPGDSYTNYSPSFQG (SEQ ID NO: 279); c. Uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoácidos RGYGIFDY (SEQ ID NO: 280); d. Uma CDR-L1 tendo a sequência de aminoácidos SGDNIGDQYAH (SEQ ID NO: 281) e. Uma CDR-L2 tendo a sequência de aminoácidos QDKNRPS (SEQ ID NO: 282); e f. Uma CDR-L3 tendo a sequência de aminoácidos ATYTGFGSLAV (SEQ ID NO: 283)

[0274]Anticorpos anti-CD137 adicionais que podem ser usados para prevenir e tratar GVHD e doenças autoimunes pelos métodos aqui divulgados incluem aqueles que têm uma ou mais, ou todas as seguintes CDRs: a. Uma CDR-H1 tendo a sequência de aminoácidos STYWIS (SEQ ID NO: 278); b. Uma CDR-H2 tendo a sequência de aminoácidos KIYPGDSYTNYSPSFQG (SEQ ID NO: 279);

c. Uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoácidos RGYGIFDY (SEQ ID NO: 280); d. Uma CDR-L1 tendo a sequência de aminoácidos SGDNIGDQYAH (SEQ ID NO: 281) e. Uma CDR-L2 tendo a sequência de aminoácidos QDKNRPS (SEQ ID NO: 282); e f. Uma CDR-L3 tendo a sequência de aminoácidos STYTFVGFTTV (SEQ ID NO: 284)

[0275]Anticorpos adicionais anti-CD137 incluem aqueles que têm uma ou mais, ou todas as seguintes CDRs: a. Uma CDR-H1 tendo a sequência de aminoácidos NSYAIS (SEQ ID NO: 285); b. Uma CDR-H2 tendo a sequência de aminoácidos GIIPGFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 286); c. Uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoácidos RKNEEDGGFDH (SEQ ID NO: 287); d. Uma CDR-L1 tendo a sequência de aminoácidos SGDNLGDYYAS (SEQ ID NO: 288) e. Uma CDR-L2 tendo a sequência de aminoácidos DDSNRPS (SEQ ID NO: 289); e f. Uma CDR-L3 tendo a sequência de aminoácidos QTWDGTLHFV (SEQ ID NO: 290)

[0276]Anticorpos adicionais anti-CD137 ou ADCs incluem aqueles que têm uma ou mais, ou todas as seguintes CDRs: a. Uma CDR-H1 tendo a sequência de aminoácidos SDYYMH (SEQ ID NO: 291); b. Uma CDR-H2 tendo a sequência de aminoácidos VISGSGSNTYYADSVKG

(SEQ ID NO: 292); c. Uma CDR-H3 tendo a sequência de aminoácidos RLYAQFEGDF (SEQ ID NO: 293); d. Uma CDR-L1 tendo a sequência de aminoácidos SGDNIGSKYVS (SEQ ID NO: 294) e. Uma CDR-L2 tendo a sequência de aminoácidos SDSERPS (SEQ ID NO: 295); e f. Uma CDR-L3 tendo a sequência de aminoácidos QSWDGSISRV (SEQ ID NO: 296)

[0277]Os anticorpos anteriores são descritos, e.g., na Patente dos EUA No

9.468.678, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere aos anticorpos anti-CD137 e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Os anticorpos e fragmentos dos mesmos divulgados na Patente dos EUA No 9.468.678 podem ser usados em conjunto com os métodos aqui divulgados.

[0278]Em uma outra modalidade, um anticorpo anti-CD137 que pode ser usado nos métodos e composições (incluindo ADCs) aqui descritos é o anticorpo murino anti-CD137 BBK2 (Thermo Fisher; MS621PABX) ou um anticorpo anti-CD137 compreendendo as regiões de ligação ao antígeno correspondentes ao anticorpo BBK2. O anticorpo BBK2 (que também pode ser referido como um anticorpo BBK-2 ou um anticorpo anti-4-1BB), é um anticorpo monoclonal de camundongo (IgG1, kappa) que se liga ao ectodomínio da proteína recombinante 4-1BB humana (4-1BB também é conhecida como CD137). Em certas modalidades, os métodos e composições da divulgação incluem um anticorpo anti-CD137 compreendendo as regiões de ligação (e.g., as CDRs) do anticorpo BBK2. Em uma outra modalidade, os métodos e composições da divulgação compreendem um anticorpo que inibe competitivamente a ligação do anticorpo BBK2 ao seu epítopo em CD137. Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD137 é BBK2 humanizado ou BBK2 quimérico.

[0279]Em uma modalidade, os métodos e composições aqui descritos incluem um anticorpo anti-CD137 quimérico (ch-BBK2) compreendendo as regiões variáveis de cadeia leve e pesada de BBK2. Em certas modalidades, o anticorpo BBK2 quimérico é um anticorpo IgG1 compreendendo as regiões constantes humanas. A sequência de aminoácidos de cadeia pesada de ch-BBK2 é descrita na SEQ ID NO: 297, e a sequência de aminoácidos de cadeia leve de ch-BBK2 é descrita na SEQ ID NO: 298. As regiões CDR (CDR1, CDR2 e CDR3) de cada uma das sequências de cadeia leve e pesada são descritas abaixo em negrito. As regiões variáveis estão em itálico.

QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIG NIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTVYMQLNSPTSEDSAVYYCTRNGVEGYP HYYAMEYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV

EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 297)

DIQMTQTTSALSASLGDRVTIGCRASQDLSNHLYWYQQKPDGTVKLLIYYT SRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIRNLEQEDVATYFCQQGYTLPYTFGGGTKLEIK

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 298)

[0280]As regiões CDR anteriores (e anticorpo BBK2) são descritas em Lee et al. (2002) European J of Immunogenetics 29(5): 449-452. Assim, em uma modalidade, as sequências de aminoácidos da CDR de VH de anticorpo anti-CD137 BBK2 (incluindo ch-BBK2) são como se segue: SGYTFTSYW (CDR1 VH; SEQ ID NO: 299);

NIYPSDSYT (CDR2 VH; SEQ ID NO: 300) e TRNGVEGYPHYYAME (CDR3 VH; SEQ ID NO: 301). As sequências de aminoácidos da CDR de VL de anticorpo anti-CD137 BBK2 (incluindo ch-BBK2) são como se segue: SQDLSNH (CDR1 VL; SEQ ID NO: 302); YYTS (CDR2 VL; SEQ ID NO: 303) e CQQGYTLPY (CDR3 VL; SEQ ID NO: 304).

[0281]Alternativamente, as regiões CDR de BBK2 podem ser definidas de acordo com a numeração de Kabat. As CDRs conforme definidas pela numeração de Kabat são descritas abaixo para cada uma das sequências de cadeia leve e pesada (descrito abaixo em negrito). As regiões variáveis de BBK2 estão em itálico.

EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (cadeia pesada de ch-BBK2; SEQ ID NO: 297)

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (cadeia leve de ch-BBK2; SEQ ID NO: 298)

[0282]Assim, em uma modalidade, as sequências de aminoácidos da CDR de VH de anticorpo anti-CD137 BBK2 (incluindo ch-BBK2) são como se segue: SYWIN (CDR1 VH; SEQ ID NO: 305); NIYPSDSYTNYNQKFKD (CDR2 VH; SEQ ID NO: 306) e NGVEGYPHYYAMEY (CDR3 VH; SEQ ID NO: 307), e as sequências de aminoácidos da CDR de VL de anticorpo anti-CD137 BBK2 (incluindo ch-BBK2) são como se segue: RASQDLSNHLY (CDR1 VL; SEQ ID NO: 308); YTSRLHS (CDR2 VL; SEQ ID NO: 309) e QQGYTLPYT (CDR3 VL; SEQ ID NO: 310).

[0283]A região variável de cadeia pesada de BBK2 é apresentada na SEQ ID NO: 311 como

QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSD

SYTNYNQKFKDKATLTVDKSSNTVYMQLNSPTSEDSAVYYCTRNGVEGYPHYYAM EYWGQGTSVTVSS. A região variável de cadeia leve de BBK2 é apresentada na SEQ ID NO: 312 como

DIQMTQTTSALSASLGDRVTIGCRASQDLSNHLYWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSG VPSRFSGSGSGTDYSLTIRNLEQEDVATYFCQQGYTLPYTFGGGTKLEIK. Os anticorpos anti-CD137 (incluindo ADCs anti-CD137) podem compreender as sequências de aminoácidos da região variável de cadeia leve e pesada como apresentado nas SEQ ID NOs: 311 e 312, respectivamente.

[0284]Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD137, e.g., um anticorpo quimérico (ch-BBK2) ou um anticorpo BBK2 humanizado, compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 305, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 306 e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 307; e compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 308, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 309 e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 310.

[0285]Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD137, e.g., um anticorpo quimérico (ch-BBK2) ou um anticorpo BBK2 humanizado, compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 299, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 300 e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 301; e compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 302, uma CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 303 e uma CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 304.

[0286]Assim, anticorpos BBK2, BBK2 humanizado ou BBK2 quimérico, podem ser usados no ADCs anti-CD137 e métodos aqui descritos. Cada um desses anticorpos pode ser conjugado com qualquer uma das citotoxinas descritas abaixo usando métodos conhecidos na técnica e aqueles aqui descritos.

[0287]Sequências adicionais para anticorpos anti-CD137 ou fragmentos de ligação, aqui descrito, são fornecidas na tabela 5.

[0288]Outros anticorpos anti-CD137 que podem ser usados em conjunto com uma citotoxina aqui descrita podem ser identificados usando técnicas conhecidas na técnica (e.g., produção de hibridoma). Hibridomas podem ser preparados usando um sistema murino. Os protocolos para imunização e subsequente isolamento de esplenócitos para fusão são conhecidos na técnica. Os padrões e procedimentos de fusão para geração de hibridoma também são conhecidos. Os anticorpos anti-CD137 humanos também podem ser gerados no HuMAb-Mouse® ou XenoMouse™. Na fabricação de anticorpos anti-CD137, o antígeno CD137 é isolado e/ou purificado. O antígeno CD137 pode ser um fragmento de CD137 do domínio extracelular de CD137. A imunização de animais pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica. Ver, e.g., Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Os métodos para imunizar animais, tais como camundongos, ratos, ovelhas, cabras, porcos, gado e cavalos são bem conhecidos na técnica. Ver, e.g., Harlow e Lane, supra, e Pat. dos EUA No 5.994.619. O antígeno CD137 pode ser administrado com um adjuvante para estimular a resposta imune. Adjuvantes conhecidos na técnica incluem adjuvante de Freund completo ou incompleto, RIBI (dipeptídeos muramil) ou ISCOM (complexos imunoestimulantes). Depois da imunização de um animal com um antígeno CD137, linhagens de células imortalizadas produtoras de anticorpos são preparadas a partir de células isoladas do animal imunizado. Depois da imunização, o animal é sacrificado e os linfonodos e/ou células B esplênicas são imortalizados por métodos conhecidos na técnica (e.g., transferência de oncogene, transdução de vírus oncogênico, exposição a compostos carcinogênicos ou mutantes, fusão com uma célula imortalizada, e.g., uma célula do mieloma e inativação de um gene supressor de tumor. Ver, e.g., Harlow e Lane, supra. Os hibridomas podem ser selecionados, clonados e ainda triados para características desejáveis, incluindo crescimento robusto, alta produção de anticorpos e características desejáveis de anticorpo.

[0289]Anticorpos anti-CD137 podem ser gerados a partir de uma molécula isolada de ácido nucleico que compreende uma sequência nucleotídica que codifica uma sequência de aminoácidos de uma molécula de ligação a CD137 fornecida pela presente divulgação. A sequência de aminoácidos codificada pela sequência nucleotídica pode ser qualquer porção de um anticorpo, tal como uma CDR, uma sequência compreendendo uma, duas ou três CDRs, uma região variável de uma cadeia pesada, região variável de uma cadeia leve ou pode ser uma cadeia pesada de comprimento total ou cadeia leve de comprimento total. Um ácido nucleico da divulgação pode ser, por exemplo, DNA ou RNA, e pode ou não conter sequências intrônicas. Tipicamente, o ácido nucleico é uma molécula de cDNA.

[0290]Além de anticorpos, e os fragmentos de ligação ao antígeno, ligantes CD137 solúveis, tais como ligante CD137 humano, podem ser administrados a um paciente de acordo com os métodos aqui descritos para condicionar um paciente antes da terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas. Por exemplo, ligantes CD137, tais como ligante CD137 humano, podem ser conjugados com uma citotoxina (e.g., de acordo com os métodos descritos abaixo ou conhecidos na técnica)

ou outra molécula efetora, tal como um domínio Fc. Citotoxinas de maitansina para o uso com os métodos aqui descritos incluem, por exemplo, conjugados ligante CD137 humano-Fc de IgG1, conjugados ligante CD137 humano-Fc de IgG2, conjugados ligante CD137 humano-Fc de IgG3, conjugados ligante CD137 humano-Fc IgG4, conjugados ligante CD137 humano-Fc de IgA, conjugados ligante CD137 humano-Fc de IgE, conjugados ligante CD137 humano-Fc de IgM e conjugados ligante CD137 humano-Fc de IgD.

[0291]Anticorpos e ligantes para o uso em conjunto com as composições e métodos aqui descritos incluem variantes daqueles anticorpos descritos acima, tais como fragmentos de anticorpo que contêm ou carecem de um domínio Fc, bem como variantes humanizadas de anticorpos não humanos aqui descritos e esqueletos de proteínas semelhantes a anticorpos (e.g., domínios 10Fn3) contendo uma ou mais, ou todas as CDRs ou regiões equivalentes de um anticorpo, fragmento de anticorpo ou ligante solúvel aqui descrito. Anticorpos anti-CD252

[0292]A presente invenção também fornece anticorpos, ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, capazes de se ligarem a CD252 (também referido como ligante OX40 (OX40L), Sequência de Referência de Proteína NCBI: NP_003317.1; No de Acesso Uniprot: P23510; SEQ ID NOs: 313 ou 314) podem ser usados como um agente terapêutico para prevenir e tratar GVHD. Tais anticorpos podem ser usados sozinhos ou conjugados a uma citotoxina como um conjugado fármaco-anticorpo (ADC).

[0293]Em uma modalidade, métodos e composições (e.g., ADCs) aqui descritos incluem um anticorpo anti-CD252 cujas sequências de aminoácidos de cadeia leve e pesada são apresentadas nas SEQ ID NOs. 315 e 316, respectivamente. Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD252, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 315 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 316. Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD252, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo as CDRs como apresentadas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 315 e uma região variável de cadeia leve compreendendo as CDRs como apresentadas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 316. As sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 315 e 316 são fornecidas abaixo.

[0294]Em certas modalidades, um anticorpo anti-CD252, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo as CDRs como apresentadas na sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 317 a 319 e uma região variável de cadeia leve compreendendo as CDRs como apresentadas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 320 a 322. As sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 3 a 8 são fornecidas abaixo. Sequência de aminoácidos de VH anti-CD252 (as seguintes sequências de CDR são definidas por IMGT)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVS

TISGSGGATRYADSVKGRFTISRDNSRNTVYLQMNSLRVEDTAVFYCTKDRLIMATV RGPYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 315) CDR-H1: GFTFSNYA (SEQ ID NO: 317) CDR-H2: ISGSGGAT (SEQ ID NO: 318) CDR-H3: TKDRLIMATVRGPYYYGMDV (SEQ ID NO: 319) Sequência de aminoácidos de VL anti-CD252 (as seguintes sequências de CDR são definidas por IMGT)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPNLLIYAAS

SLQSGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHSVSFTFGPGTKVDIK (SEQ ID NO: 316)

CDR-L1: QSISSY (SEQ ID NO: 320) CDR-L2: AAS (SEQ ID NO: 321) CDR-L3: QQSHSVSFT (SEQ ID NO: 322)

[0295]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD252 usado nos métodos e composições aqui divulgados é um anticorpo intacto compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 315 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 316. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD252 é projetado para ter uma meia-vida curta.

[0296]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD252 que pode ser usado nos métodos e composições (incluindo ADCs) aqui descritos é um anticorpo selecionado de 11C3.1 (Biolegend, Catálogo #326302), 159403 (R&D Systems, Catálogo #MAB10541), 159408 (R&D Systems, Catálogo #MAB1054), MM0505-8S23 (Novus, Catálogo #NBP2-11969) ou oxelumabe (Novus, Catálogo #NBP2-52687-0.1).

[0297]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD252 que pode ser usado nos métodos e composições (incluindo ADCs) aqui descritos é o anticorpo monoclonal murino anti-CD252 11C3.1 ou um anticorpo anti-CD252 compreendendo as regiões de ligação ao antígeno correspondentes ao anticorpo 11C3.1. 11C3.1 (vendido pela Biolegend Cat. No 326302 (data 27 de fevereiro de 2019)).

[0298]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD252 compreende uma cadeia pesada compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo anti-CD252 11C3.1 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo anti-CD252 11C3.1. Em uma outra modalidade, um anticorpo anti- CD252 usado nas composições e métodos aqui divulgados é um anticorpo 11C3.1 humanizado.

[0299]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD252 que pode ser usado nos métodos e composições (incluindo ADCs) aqui descritos é o anticorpo monoclonal murino anti-CD252 159403 ou um anticorpo anti-CD252 compreendendo as regiões de ligação ao antígeno correspondentes ao anticorpo 159403. 159403 (vendido pela R&D Systems, Catálogo #MAB10541 (data 27 de fevereiro de 2019)).

[0300]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD252 compreende uma cadeia pesada compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo anti-CD252 159403 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo anti-CD252 159403. Em uma outra modalidade, um anticorpo anti- CD252 usado nas composições e métodos aqui divulgados é um anticorpo 159403 humanizado.

[0301]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD252 que pode ser usado nos métodos e composições (incluindo ADCs) aqui descritos é o anticorpo monoclonal murino anti-CD252 159408 ou um anticorpo anti-CD252 compreendendo as regiões de ligação ao antígeno correspondentes ao 159408 anticorpo. 159408 (vendido pela R&D Systems, Catálogo #MAB1054 (data 27 de fevereiro de 2019)).

[0302]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD252 compreende uma cadeia pesada compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo anti-CD252 159408 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo anti-CD252 159408. Em uma outra modalidade, um anticorpo anti- CD252 usado nas composições e métodos aqui divulgados é um 159408 anticorpo humanizado.

[0303]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD252 que pode ser usado nos métodos e composições (incluindo ADCs) aqui descritos é o anticorpo monoclonal murino anti-CD252 MM0505-8S23 ou um anticorpo anti-CD252 compreendendo as regiões de ligação ao antígeno correspondentes ao anticorpo MM0505-8S23. MM0505-8S23 (vendido pela Novus, Catálogo #NBP2-11969 (data 27 de fevereiro de 2019)). Esse anticorpo foi produzido a partir de um hibridoma (mieloma de camundongo fundido com células do baço de um camundongo imunizado com

TNFSF4 humano, também chamado ligante OX40.

[0304]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD252 compreende uma cadeia pesada compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo anti-CD252 MM0505-8S23 e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo anti-CD252 MM0505-8S23. Em uma outra modalidade, um anticorpo anti-CD252 usado nas composições e métodos aqui divulgados é um anticorpo MM0505-8S23 humanizado.

[0305]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD252 que pode ser usado nos métodos e composições (incluindo ADCs) aqui descritos é o anticorpo monoclonal de coelho anti-CD252 oxelumabe ou um anticorpo anti-CD252 compreendendo as regiões de ligação ao antígeno correspondentes ao anticorpo oxelumabe. Oxelumabe (vendido pela Novus, Catálogo #NBP2-52687-0.1 (data 27 de fevereiro de 2019)).

[0306]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD252 compreende uma cadeia pesada compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo anti-CD252 oxelumabe e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 do anticorpo anti-CD252 oxelumabe. Em uma outra modalidade, um anticorpo anti-CD252 usado nas composições e métodos aqui divulgados é um anticorpo oxelumabe humanizado. Em alguma modalidade, o anticorpo anti-CD252, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma cadeia pesada como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 323 e uma cadeia leve como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 324. Em alguma modalidade, o anticorpo anti-CD252, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 331 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 332. Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD252, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo as CDRs como apresentadas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 325 a 327 e uma região variável de cadeia leve compreendendo as CDRs como apresentadas na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 328 a 330. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo intacto compreendendo uma região variável de cadeia pesada como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 331 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 332. As sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 323 a 330 são fornecidas abaixo.

[0307]Sequência de cadeia pesada de comprimento total do oxelumabe (as seguintes sequências de CDR são definidas por IMGT; a região variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 331) foi sublinhada):

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNSYAMSWVRQAPGKGLEWVSIISGSG GFTYYADSVKGRFTISRDNSRTTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRLVAPGTFDYWG QGALVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE

NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG (SEQ ID NO: 323) CDR-H1: GFTFNSYA (SEQ ID NO: 325) CDR-H2: ISGSGGFT (SEQ ID NO: 326) CDR-H3: AKDRLVAPGTFDY (SEQ ID NO: 327)

[0308]Sequência de cadeia leve de comprimento total do oxelumabe (as seguintes sequências de CDR são definidas por IMGT; a região variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 332) foi sublinhada):

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAP

SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 324) CDR-L1: QGISSW (SEQ ID NO: 328) CDR-L2: AAS (SEQ ID NO: 329) CDR-L3: QQYNSYPYT (SEQ ID NO: 330)

[0309]Os anticorpos anti-CD252 ou fragmentos de ligação aqui descritos também podem incluir modificações e/ou mutações que alteram as propriedades dos anticorpos e/ou fragmentos, tais como aquelas que aumentam a meia-vida, aumentam ou diminuem a ADCC, etc., como é conhecido na técnica.

[0310]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD252, ou fragmento de ligação do mesmo, usado nos métodos e composições aqui divulgados compreende uma região Fc variante, em que a dita região Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácido em relação a uma região Fc de tipo selvagem, tal que a dita molécula tenha uma afinidade alterada para um FcgamaR. Certas posições de aminoácidos dentro da região Fc são conhecidas por meio de estudos de cristalografia para fazer um contato direto com FcγR. Especificamente, os aminoácidos 234 a 239 (região de dobradiça), aminoácidos 265 a 269 (loop B/C), aminoácidos 297 a 299 (loop C’/E) e aminoácidos 327 a 332 loop (F/G). (ver Sondermann et al., 2000 Nature, 406: 267-273). Assim, os anticorpos anti-CD252 aqui descritos podem compreender regiões Fc variantes compreendendo a modificação de pelo menos um resíduo que faz um contato direto com um Fc.γ.R com base em análise estrutural e cristalográfica. Em uma modalidade, a região Fc do anticorpo anti-CD252 (ou fragmento do mesmo) compreende uma substituição de aminoácido no aminoácido 265 de acordo com o índice EU como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991), expressamente incorporado aqui por referências. O “índice EU como em Kabat” se refere à numeração do anticorpo IgG1

EU humano. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265A. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C. Em algumas modalidades, a região Fc do anticorpo anti-CD252 (ou fragmento do mesmo) compreende uma substituição de aminoácido no aminoácido 234 de acordo com o índice EU como em Kabat. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação L234A. Em algumas modalidades, a região Fc do anticorpo anti-CD252 (ou fragmento do mesmo) compreende uma substituição de aminoácido no aminoácido 235 de acordo com o índice EU como em Kabat. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação L235A. Ainda em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação L234A e L235A. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C, L234A e L235A.

[0311]Em certos aspectos, um domínio Fc de IgG variante compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que resultam em afinidade de ligação diminuída ou ablacionada para um Fc.gama.R e/ou C1q em comparação com o domínio Fc de tipo selvagem não compreendendo a uma ou mais substituições de aminoácidos. As interações de ligação de Fc são essenciais para uma variedade de funções efetoras e eventos de sinalização a jusante incluindo, mas não limitado à citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Consequentemente, em certos aspectos, um anticorpo anti- CD252 compreendendo uma região Fc modificada (e.g., compreendendo uma mutação L234A, L235A e D265C) tem funções efetoras substancialmente reduzidas ou abolidas.

[0312]A afinidade para uma região Fc pode ser determinada usando uma variedade de técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, mas não limitadas a métodos de equilíbrio (e.g., ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA); KinExA, Rathanaswami et al. Analytical Biochemistry, Vol. 373: 52-60, 2008; ou radioimunoensaio (RIA)) ou por um ensaio de ressonância plasmônica de superfície ou outro mecanismo de ensaio com base em cinética (e.g., análise BIACORETM ou análise OctetTM (forteBIO)) e outros métodos, tais como ensaios de ligação indireta, ensaios de ligação competitiva, transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET), eletroforese e cromatografia em gel (e.g., filtração em gel). Esses e outros métodos podem utilizar um marcador em um ou mais dos componentes sendo examinados e/ou utilizar uma variedade de métodos de detecção incluindo, mas não limitados a marcadores cromogênicos, fluorescentes, luminescentes ou isotópicos. Uma descrição detalhada de afinidades de ligação e cinéticas pode ser encontrada em Paul, W. E., ed., Fundamental Immunology, 4a Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999), que se concentra em interações anticorpo-imunógeno. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio compreendendo a incubação de antígeno marcado com o anticorpo de interesse na presença de quantidades crescentes de antígeno não marcado e a detecção do anticorpo ligado ao antígeno marcado. A afinidade do anticorpo de interesse para um antígeno particular e as taxas de dissociação podem ser determinadas a partir dos dados por análise de gráficos de scatchard. A competição com um segundo anticorpo também pode ser determinada usando radioimunoensaios. Nesse caso, o antígeno é incubado com anticorpo de interesse conjugado a um composto marcado na presença de quantidades crescentes de um segundo anticorpo não marcado.

[0313]Os anticorpos da invenção podem ser ainda projetados para modular ainda mais a meia-vida do anticorpo introduzindo mutações adicionais de Fc, tais como aquelas descritas, por exemplo, em (Dall’Acqua et al. (2006) J Biol Chem 281: 23514-24), (Zalevsky et al. (2010) Nat Biotechnol 28: 157-9), (Hinton et al. (2004) J Biol Chem 279: 6213-6), (Hinton et al. (2006) J Immunol 176: 346-56), (Shields et al. (2001) J Biol Chem 276: 6591-604), (Petkova et al. (2006) Int Immunol 18: 1759-69), (Datta-Mannan et al. (2007) Drug Metab Dispos 35: 86-94), (Vaccaro et al. (2005) Nat Biotechnol 23: 1283-8), (Yeung et al. (2010) Cancer Res 70: 3269-77) e (Kim et al.

(1999) Eur J Immunol 29: 2819-25), e incluem as posições 250, 252, 253, 254, 256, 257, 307, 376, 380, 428, 434 e 435. Mutações exemplificativas que podem ser feitas individualmente ou em combinação são as mutações T250Q, M252Y, 1253A, S254T, T256E, P2571, T307A, D376V, E380A, M428L, H433K, N434S, N434A, N434H, N434F, H435A e H435R.

[0314]Assim, em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação que resulta em uma diminuição da meia-vida. Um anticorpo tendo uma meia-vida curta pode ser vantajoso em certos casos onde é esperado que o anticorpo funcione como um terapêutico de curta duração, e.g., a etapa de condicionamento aqui descrita onde o anticorpo é administrado seguido por HSCs. Idealmente, o anticorpo deve ser substancialmente eliminado antes da liberação das HSCs, que geralmente também expressam CD252, mas não são o alvo do anticorpo anti-CD252, ao contrário das células-tronco endógenas. Em uma modalidade, as regiões Fc compreendem uma mutação na posição 435 (índice EU de acordo com Kabat). Em uma modalidade, a mutação é uma mutação H435A.

[0315]Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD252 aqui descrito tem uma meia-vida igual a ou menor que cerca de 14 horas, igual a ou menor que cerca de 13 horas, igual a ou menor que cerca de 12 horas, ou igual a ou menor que cerca de 11 horas. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD252 aqui descrito tem uma meia-vida igual a ou menor que cerca de 24 horas, uma meia-vida igual a ou menor que cerca de 22 horas, uma meia-vida igual a ou menor que cerca de 20 horas, uma meia-vida igual a ou menor que cerca de 18 horas, uma meia-vida igual a ou menor que cerca de 16 horas, uma meia-vida igual a ou menor que cerca de 14 horas, igual a ou menor que cerca de 13 horas, igual a ou menor que cerca de 12 horas, ou igual a ou menor que cerca de 11 horas. Em uma modalidade, a meia-vida do anticorpo está entre cerca de 1 hora a cerca de 20 horas, entre cerca de 2 horas a cerca de 18 horas, entre cerca de 4 horas a cerca de 16 horas, entre cerca de 6 horas a cerca de 14 horas, entre cerca de 8 horas a cerca de 12 horas, entre cerca de 11 horas a cerca de 12 horas, entre cerca de 11 horas a cerca de 24 horas; entre cerca de 12 horas a cerca de 22 horas; entre cerca de 10 horas a cerca de 20 horas; entre cerca de 8 horas a cerca de 18 horas; entre cerca de 1 hora a cerca de 6 horas, entre cerca de 2 horas a cerca de 5 horas, entre cerca de 3 horas a cerca de 4 horas, ou entre cerca de 14 horas a cerca de 24 horas.

[0316]Em alguns aspectos, a região Fc compreende duas ou mais mutações que conferem meia-vida reduzida e diminuem gradamente ou abolem completamente uma função efetora do anticorpo. Em algumas modalidades, a região Fc compreende uma mutação que resulta em uma diminuição da meia-vida e uma mutação de pelo menos um resíduo que pode fazer contato direto com um FcγR (e.g., como com base em análise estrutural e cristalográfica). Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação H435A, uma mutação L234A e uma mutação L235A. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação H435A e uma mutação D265C. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação H435A, uma mutação L234A, uma mutação L235A e uma mutação D265C.

[0317]Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é conjugado com uma citotoxina (e.g., amatoxina) por meio de um resíduo de cisteína no domínio Fc do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o resíduo de cisteína é introduzido por meio de uma mutação no domínio Fc do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Por exemplo, o resíduo de cisteína pode ser selecionado do grupo que consiste em Cys118, Cys239 e Cys265. Em uma modalidade, a região Fc do anticorpo anti-CD252 (ou fragmento do mesmo) compreende uma substituição de aminoácido no aminoácido 265 de acordo com o índice EU como em Kabat. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C e H435A. Em uma modalidade, a região

Fc compreende uma mutação D265C, uma L234A e uma L235A. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma mutação D265C, uma L234A, uma L235A e uma H435A.

[0318]Em algumas modalidades desses aspectos, o resíduo de cisteína ocorre naturalmente no domínio Fc do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Por exemplo, o domínio Fc pode ser um domínio Fc de IgG, tal como um domínio Fc de IgG1 humano, e o resíduo de cisteína pode ser selecionado do grupo que consiste em Cys261, Csy321, Cys367 e Cys425.

[0319]Os domínios Fc variantes aqui descritos são definidos de acordo com as modificações de aminoácidos que os compõem. Para todas as substituições de aminoácidos aqui discutidas em relação à região Fc, a numeração é sempre de acordo com o índice EU. Assim, por exemplo, D265C é um Fc variante com o ácido aspártico (D) na posição EU 265 substituído por cisteína (C) em relação ao domínio Fc precursor. Do mesmo modo, e.g., D265C/L234A/L235A define uma variante de Fc variante com substituições nas posições EU 265 (D a C), 234 (L a A) e 235 (L a A) em relação ao domínio Fc precursor. Uma variante também pode ser designada de acordo com sua composição de aminoácido final nas posições EU mutadas de aminoácidos. Por exemplo, o mutante L234A/L235A pode ser referido como LALA. É observado que a ordem em que substituições são fornecidas é arbitrária.

[0320]Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD252, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende regiões variáveis tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à SEQ ID Nos aqui divulgada. Alternativamente, o anticorpo anti-CD252, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende CDRs compreendendo a SEQ ID Nos aqui divulgada com regiões de estrutura das regiões variáveis aqui descritas tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à SEQ ID Nos aqui divulgada.

[0321]Em certas modalidades, um anticorpo anti-CD252, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tem uma certa taxa de dissociação que é particularmente vantajosa quando usada como uma parte de um conjugado. Por exemplo, um anticorpo anti-CD252 tem, em certas modalidades, uma constante de taxa de dissociação (Koff) para CD252 humano e/ou CD252 de rhesus de 1 x 10-2 a 1 x 10-3, 1 x 10-3 a 1 x 10-4, 1 x 10-5 a 1 x 10-6, 1 x 10-6 a 1 x 10-7 ou 1 x 10-7 a 1 x 10-8, como medido por interferometria de biocamada (BLI). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a CD252 (e.g., CD252 humano e/ou CD252 de rhesus) com uma KD de cerca de 100 nM ou menos, cerca de 90nM ou menos, cerca de 80 nM ou menos, cerca de 70 nM ou menos, cerca de 60 nM ou menos, cerca de 50 nM ou menos, cerca de 40 nM ou menos, cerca de 30 nM ou menos, cerca de 20 nM ou menos, cerca de 10 nM ou menos, cerca de 8 nM ou menos, cerca de 6 nM ou menos, cerca de 4 nM ou menos, cerca de 2 nM ou menos, cerca de 1 nM ou menos como determinada por um ensaio de Interferometria de biocamada (BLI). Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga a CD252 (e.g., CD252 humano e/ou CD252 de rhesus) com uma KD entre cerca de 90 nM a 100 nM, entre cerca de 80 nM a 90nM, entre cerca de 70 nM a 80 nM, entre cerca de 60 nM a 70 nM, entre cerca de 50 nM a 60 nM, entre cerca de 40 nM a 50 nM, entre cerca de 30 nM a 40 nM, entre cerca de 20 nM a 30 nM, entre cerca de 10 nM a 20 nM, entre cerca de 8 nM a 10 nM, entre cerca de 6 nM a 8 nM, entre cerca de 4 nM a 6 nM, entre cerca de 2 nM a 4 nM, entre cerca de 1 nM a 2 nM, ou cerca de 1 nM ou menos como determinada por um ensaio de Interferometria de biocamada (BLI).

[0322]Os anticorpos, e fragmentos de ligação dos mesmos, aqui divulgados podem ser usados em conjugados, como descrito em mais detalhe abaixo.

[0323]Fragmentos de ligação ao antígeno exemplificativos dos anticorpos anteriores incluem um domínio de imunoglobulina variável duplo, uma molécula de Fv de cadeia simples (scFv), um diabody, um triabody, um nanobody, um esqueleto de proteína semelhante a anticorpo, um fragmento Fv, um fragmento Fab, uma molécula F(ab’)2 e um di-scFv em tandem, entre outros. Os anticorpos anti-CD252 aqui descritos podem estar na forma de anticorpos de comprimento total, anticorpos biespecíficos, anticorpos de domínio variável duplo, anticorpos de múltiplas cadeias ou cadeia simples e/ou fragmentos de ligação que se ligam especificamente a CD252 humano incluindo, mas não limitados a Fab, Fab’, (Fab’)2, Fv), scFv (Fv de cadeia simples), surrobodies (incluindo construto de cadeia leve substituto), anticorpos de domínio único, anticorpos camelizados e semelhantes. Eles também podem ser de, ou derivado de, qualquer isotipo, incluindo, por exemplo, IgA (e.g., IgA1 ou IgA2), IgD, IgE, IgG (e.g., IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) ou IgM. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD252 é um IgG (e.g., IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4).

[0324]Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD252, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende regiões variáveis tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à SEQ ID Nos aqui divulgada. Alternativamente, o anticorpo anti-CD252, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende CDRs compreendendo a SEQ ID Nos aqui divulgada com regiões de estrutura das regiões variáveis aqui descritas tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95 %, 96 %, 97 % ou 99 % idêntica à SEQ ID Nos aqui divulgada. Anticorpos anti-CD45

[0325]Os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno capazes de se ligarem ao CD45 humano (Sequência de Referência de mRNA NCBI: NM_080921.3, Sequência de Referência de Proteína NCBI: NP_563578.2), incluindo aqueles capazes de se ligarem à isoforma CD45RO, podem ser usados em conjunto com as composições e métodos aqui divulgados, tais como para promover o enxerto de enxertos de célula-tronco hematopoiética em um paciente em necessidade de terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas. Em uma modalidade, as composições e métodos aqui divulgados incluem um anticorpo anti-CD45 ou ADC que se liga ao CD45RO humano como apresentado na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 336. Anticorpos que se ligam às várias isoformas de CD45 aqui divulgados também são considerados para o uso nos métodos e composições aqui divulgados. Múltiplas isoformas de CD45 surgem do splicing alternativo de 34 éxons no transcrito primário. O splicing de éxons 4, 5, 6 e, potencialmente, 7 dar origem a múltiplas variações de CD45. A expressão seletiva de éxon é observada nas isoformas de CD45 descritas na Tabela 3, abaixo. Tabela 3. Expressão de éxon em várias isoformas de CD45 Isoforma de CD45 Expressão Padrão de Éxon CD45RA (SEQ ID NO: 333) Expressa éxon 4 apenas CD45RB (SEQ ID NO: 334) Expressa éxon 5 apenas CD45RC (SEQ ID NO: 335) Expressa éxon 6 apenas CD45RO (SEQ ID NO: 336) Não expressa éxons 4 a 6

[0326]O splicing alternativo pode resultar em éxons individuais ou combinações de éxons expressados em várias isoformas da proteína CD45 (por exemplo, CD45RA, CD45RAB, CD45RABC). Ao contrário, CD45RO carece da expressão de éxons 4 a 6 e é gerado a partir de uma combinação dos éxons 1 a 3 e 7 a 34. Existe evidências de que o éxon 7 também pode ser excluído da proteína, resultando no splicing dos éxons 1 a 3 e 8 a 34. Essa proteína, designado E3-8, foi detectada ao nível do mRNA, mas não foi atualmente identificada por citometria de fluxo.

[0327]CD45RO é atualmente a única isoforma de CD45 conhecida expressada em células-tronco hematopoiéticas. CD45RA e CD45RABC não foram detectados ou estão excluídos do fenótipo de células-tronco hematopoiéticas. Existe evidências de estudos conduzidos em camundongos que a CD45RB é expressada em células-tronco hematopoiéticas fetais, mas não está presente em células-tronco hematopoiéticas da medula óssea de adultos. Notavelmente, a CD45RC tem uma alta taxa de polimorfismo no éxon 6 encontrado dentro das populações asiáticas (um polimorfismo no éxon 6 em CD45RC é encontrado em aproximadamente 25 % da população japonesa). Esse polimorfismo leva à alta expressão de CD45RO e níveis diminuídos de CD45RA, CD45RB e CD45RC. Além disso, as variantes de CD45RA (tais como CD45RAB e CD45RAC) exibem um polimorfismo no éxon 4 que foi associado com doenças autoimunes.

[0328]A presença de CD45RO em células-tronco hematopoiéticas e sua expressão comparativamente limitada em outras células imunes (tais como subconjuntos de linfócitos T e B e vários mielócitos) torna a CD45RO um alvo particularmente adequado para a terapia de condicionamento para pacientes em necessidade de um transplante de células-tronco hematopoiéticas. Como a CD45RO apenas carece da expressão dos éxons 4, 5 e 6, seu uso como um imunógeno permite a triagem de pan Abs CD45 e anticorpos específicos de CD45RO.

[0329]Anticorpos anti-CD45 que podem ser usados em conjunto com os métodos de condicionamento do paciente aqui descritos incluem anticorpos anti-CD45 e porções de ligação ao antígeno dos mesmos. As porções de ligação ao antígeno de anticorpos são bem conhecidas na técnica e podem ser prontamente construídas com base na região de ligação ao antígeno do anticorpo. Em modalidades exemplificativas, o anticorpo anti-CD45 usado em conjunto com os métodos de condicionamento aqui descritos pode ser um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo policlonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo completamente humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo quimérico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo biespecífico ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um domínio de imunoglobulina variável duplo, uma molécula de Fv de cadeia simples (scFv), um diabody, um triabody, um nanobody, um esqueleto de proteína semelhante a anticorpo, um fragmento Fv, um fragmento Fab, uma molécula F(ab’)2 ou um di-scFv em tandem. Os anticorpos anti-CD45 exemplificativos que podem ser usados no todo ou em parte dos ADCs ou métodos aqui descritos são fornecidos abaixo.

[0330]Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD45 é ou é derivado do clone HI30, que é comercialmente disponível da BIOLEGEND® (San Diego, CA), ou uma variante humanizada do mesmo. A humanização de anticorpos pode ser realizada pela substituição de resíduos de estrutura e resíduos da região constante de um anticorpo não humano com aqueles de um anticorpo humano linhagem germinativa de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica (como descrito, por exemplo, no exemplo 7, abaixo). Anticorpos anti-CD45 adicionais que podem ser usados em conjunto com os métodos aqui descritos incluem os anticorpos anti-CD45 ab10558, EP322Y, MEM-28, ab10559, 0.N,125, F10-89-4, HIe-1, 2B11, YTH24,5, PD7/26/16, F10-89-4, 1B7, ab154885, B-A11, S1007 fosforescente, ab170444, EP350, Y321, GA90, D3/9, X1 6/99 e LT45, que são comercialmente disponíveis na ABCAM® (Cambridge, MA), bem como variantes humanizadas dos mesmos. Outros anticorpos anti-CD45 que podem ser usados em conjunto com os procedimentos de condicionamento do paciente aqui descritos incluem anticorpo anti-CD45 HPA000440, que é comercialmente disponível da SIGMA-ALDRICH® (St. Louis, MO) e variantes humanizadas do mesmo. Anticorpos anti-CD45 adicionais que podem ser usados em conjunto com os métodos de condicionamento do paciente aqui descritos incluem anticorpo monoclonal BC8 murino, que é descrito, por exemplo, em Matthews et al., Blood 78: 1864-1874, 1991, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere aos anticorpos anti-CD45, bem como variantes humanizadas dos mesmos. Outros anticorpos anti-CD45 que podem ser usados em conjunto com os métodos aqui descritos incluem o anticorpo monoclonal YAML568, que é descrito, por exemplo, em Glatting et al., J. Nucl. Med. 8: 1335-1341, 2006, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere aos anticorpos anti-CD45, bem como variantes humanizadas do mesmo. Anticorpos anti-CD45 adicionais que podem ser usados em conjunto com os procedimentos de condicionamento do paciente aqui descritos incluem anticorpos monoclonais YTH54.12 e YTH25.4, que são descritos, por exemplo, em Brenner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 996: 80-88, 2003, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere aos anticorpos anti-CD45, bem como variantes humanizadas dos mesmos. Anticorpos anti-CD45 adicionais para o uso com os métodos de condicionamento do paciente aqui descritos incluem UCHL1, 2H4, SN130, MD4,3, MBI e MT2, que são descritos, por exemplo, em Brown et al., Immunology 64: 331-336, 1998, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere aos anticorpos anti-CD45, bem como variantes humanizadas dos mesmos. Anticorpos anti-CD45 adicionais que podem ser usados em conjunto com os métodos aqui descritos incluem aqueles produzidos e liberados pela American Type Culture Collection (ATCC) Nos de Acesso RA3-6132, RA3-2C2 e TIB122, bem como anticorpos monoclonais C363.16A e 13/2, que são descritos, por exemplo, em Johnson et al., J. Exp. Med. 169: 1179-1184, 1989, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere aos anticorpos anti-CD45, bem como variantes humanizadas dos mesmos. Outros anticorpos anti-CD45 que podem ser usados em conjunto com os métodos de condicionamento do paciente aqui descritos incluem os anticorpos monoclonais AHN-12,1, AHN-12, AHN-12,2, AHN-12,3, AHN-12,4, HLe-1 e KC56(T200), que são descritos, por exemplo, em Harvath et al., J. Immunol. 146: 949-957, 1991, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere aos anticorpos anti-CD45, bem como variantes humanizadas dos mesmos.

[0331]Anticorpos anti-CD45 adicionais que podem ser usados em conjunto com os métodos de condicionamento do paciente aqui descritos incluem aqueles descritos, por exemplo, nas Patentes dos EUA Nos 7.265.212 (que descreve, e.g., anticorpos anti-CD45 39E11, 16C9 e 1G10, dentre outros clones); 7.160.987 (que descreve, e.g., anticorpos anti-CD45 produzidos e liberados pela ATCC No de Acesso HB-11873, tal como o anticorpo monoclonal 6G3); e 6.099.838 (que descreve, e.g.,

anticorpo anti-CD45 MT3, bem como anticorpos produzidos e liberados pela ATCC Nos de Acesso HB220 (também designado MB23G2) e HB223), bem como US 2004/0096901 e US 2008/0003224 (que descreve, e.g., anticorpos anti-CD45 produzidos e liberados pela ATCC No de Acesso PTA-7339, tal como o anticorpo monoclonal 17.1), as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência, uma vez que se referem aos anticorpos anti-CD45.

[0332]Outros anticorpos anti-CD45 que podem ser usados em conjunto com os métodos de condicionamento do paciente aqui descritos incluem anticorpos produzidos e liberados pela ATCC Nos de Acesso MB4B4, MB23G2, 14.8, GAP 8.3, 74-9-3, I/24.D6, 9.4, 4B2, M1/9.3.4.HL.2, bem como variantes humanizadas e/ou maturadas por afinidade dos mesmos. A maturação por afinidade pode ser realizada, por exemplo, usando técnicas de exibição in vitro aqui descritas ou conhecidas na técnica, tais como exibição de fago, como descrito no exemplo 6, abaixo.

[0333]Anticorpos anti-CD45 adicionais que podem ser usados em conjunto com os métodos de condicionamento do paciente aqui descritos incluem anticorpo anti-CD45 T29/33, que é descrito, por exemplo, em Morikawa et al., Int. J. Hematol. 54: 495-504, 1991, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere aos anticorpos anti-CD45.

[0334]Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD45 é selecionado de apamistamabe (também conhecido 90Y-BC8, Iomab-B, BC8; como descrito em, e.g., US20170326259, WO2017155937 e Orozco et al. Blood. 127.3 (2016): 352-359.) ou BC8-B10 (como descrito, e.g., em Li et al. PloS one 13.10 (2018): e0205135.), cada um dos quais é incorporado por referência. Outros anticorpos anti-CD45 foram descrito, por exemplo, em WO2003/048327, WO2016/016442, US2017/0226209, US2016/0152733, US9,701,756; US2011/0076270 ou US7,825,222, cada um dos quais é incorporado por referência em sua totalidade.

[0335]Por exemplo, em uma modalidade, o anticorpo anti-CD45, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo as regiões de ligação, e.g., CDRs, regiões variáveis, que correspondem às do apamistamabe. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (VH) de apamistamabe é apresentada na SEQ ID NO: 337. A sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve (VL) de apamistamabe é descrita na SEQ ID NO: 338. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD45, ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma cadeia pesada variável compreendendo os resíduos de aminoácido apresentados na SEQ ID NO: 337 e uma região variável de cadeia leve como apresentada na SEQ ID NO: 338. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD45 compreende uma cadeia pesada compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 de apamistamabe e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 de apamistamabe.

[0336]Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD45 compreende uma cadeia pesada de um anticorpo anti-CD45 aqui descrito e uma região variável de cadeia leve de anticorpo anti-CD45 aqui descrito. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD45 compreende uma cadeia pesada compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 de um anticorpo anti-CD45 aqui descrito e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 de um anticorpo anti-CD45 aqui descrito.

[0337]Em uma outra modalidade, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95 % de identidade com um anticorpo anti-CD45 aqui, e.g., pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % de identidade com um anticorpo anti-CD45 aqui. Em certas modalidades, um anticorpo compreende uma região variável cadeia pesada (HC) modificada compreendendo um domínio variável de HC de um anticorpo anti-CD45 aqui, ou uma variante do mesmo, cuja variante (i) difere do anticorpo anti-CD45 em 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições, adições ou deleções de aminoácidos; (ii) difere do anticorpo anti-CD45 em no máximo 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições, adições ou deleções de aminoácidos; (iii) difere do anticorpo anti-CD45 em 1 a 5, 1 a 3, 1 a 2, 2 a 5 ou 3 a 5 substituições, adições ou deleções de aminoácidos e/ou (iv) compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica ao anticorpo anti-CD45, em que em qualquer um de (i)-(iv), uma substituição de aminoácido pode ser uma substituição conservadora de aminoácido ou uma substituição não conservadora de aminoácido; e em que a região variável de cadeia pesada modificada pode ter uma atividade biológica intensificada em relação à região variável de cadeia pesada do anticorpo anti-CD45, enquanto mantém a especificidade de ligação a CD45 do anticorpo.

[0338]As divulgações de cada uma das publicações anteriores são incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno que podem ser usados em conjunto com as composições e métodos aqui descritos incluem os anticorpos acima descritos e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, bem como variantes humanizadas daqueles anticorpos não humanos e os fragmentos de ligação ao antígeno descritos acima e anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam ao mesmo epítopo como aqueles descritos acima, conforme avaliado, por exemplo, por meio de um ensaio de ligação competitiva a CD45. Métodos de Identificação de Anticorpos

[0339]Métodos para triagem de alto rendimento de anticorpo ou bibliotecas de fragmentos de anticorpos para moléculas capazes de se ligarem a um antígeno (e.g., CD117 (e.g., CD117 GNNK+) ou CD45) expressado por células-tronco hematopoiéticas ou um antígeno (e.g., CD2, CD5, CD137 ou CD252) expressado por células imunes maduras (e.g., células T) podem ser usados para identificar e a afinidade de anticorpos maduros úteis para tratar cânceres, doenças autoimunes e condicionamento de um paciente (e.g., um paciente humano) em necessidade de terapia de célula-tronco hematopoiética como aqui descrita.

Tais métodos incluem técnicas de exibição in vitro conhecidas na técnica, tais como exibição de fago, exibição bacteriana, exibição de levedura, exibição de célula de mamífero, exibição de ribossoma, exibição de mRNA e exibição de CDNA, entre outros.

O uso de exibição de fago para isolar anticorpos, ou os fragmentos de ligação ao antígeno, que se ligam a moléculas biologicamente relevantes foi revisado, por exemplo, em Felici et al., Biotechnol.

Annual Rev. 1: 149-183, 1995; Katz, Annual Rev.

Biophys.

Biomol.

Struct. 26: 27-45, 1997; e Hoogenboom et al., Immunotechnology 4: 1-20, 1998, as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência, uma vez que dizem respeito às técnicas de exibição in vitro.

Bibliotecas de peptídeos combinatórios randomizados foram construídas para selecionar polipeptídeos que se ligam aos antígenos da superfície celular como descrito em Kay, Perspect.

Drug Discovery Des. 2: 251-268, 1995 e Kay et al., Mol.

Divers. 1: 139-140, 1996, as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência, na medida em que se referem à descoberta de moléculas de ligação ao antígeno.

Proteínas, tais como proteínas multiméricas, foram exibidas com êxito em fagos como moléculas funcionais (ver, por exemplo, EP 0349578; EP 4527839; e EP 0589877, bem como Chiswell e McCafferty, Trends Biotechnol. 10: 80-4 1992, as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência, na medida em que se referem ao uso de técnicas de exibição in vitro para a descoberta de moléculas de ligação ao antígeno.

Além disso, fragmentos funcionais de anticorpo, tais como fragmentos Fab e scFv, foram expressados em formatos de exibição in vitro (ver, por exemplo, McCafferty et al., Nature 348: 552-554, 1990; Barbas et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 88: 7978-7982, 1991; e Clackson et al., Nature 352: 624-628, 1991, as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência, uma vez que se referem a plataformas de exibição in vitro para a descoberta de moléculas de ligação ao antígeno). Anticorpos humanos anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-

CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti- CD252) também podem ser gerados, por exemplo, no HuMAb-Mouse® ou XenoMouse™. Essas técnicas, entre outras, podem ser usadas para identificar e melhorar a afinidade de anticorpos, anticorpos ou fragmentos, capazes de se ligarem a um antígeno (e.g., CD117 (e.g., CD117 GNNK+) ou CD45) expressado por células- tronco hematopoiéticas ou um antígeno (e.g., CD2, CD5, CD137 ou CD252) expressado por células imunes maduras (e.g., células T) que podem, por sua vez, serem usados para esgotar células-tronco hematopoiéticas endógenas em um paciente (e.g., um paciente humano) em necessidade de terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas.

[0340]Além das técnicas de exibição in vitro, as técnicas de modelagem computacional podem ser usadas para projetar e identificar anticorpos capazes de se ligarem a um antígeno (e.g., CD117 (e.g., CD117 GNNK+) ou CD45) expressado por células-tronco hematopoiéticas ou um antígeno (e.g., CD2, CD5, CD137 ou CD252) expressado por células imunes maduras (e.g., células T), ou fragmentos de anticorpo in silico. Por exemplo, usando técnicas de modelagem computacional, um especialista na técnica pode rastrear bibliotecas de anticorpos, ou fragmentos de anticorpo, in silico para moléculas capazes de se ligarem a epítopos específicos em um antígeno expressado por células-tronco hematopoiéticas (e.g., CD117 (e.g., CD117 GNNK+) ou CD45) ou um antígeno expressado por células imunes maduras, tal como células T (e.g., CD2, CD5, CD137 ou CD252), tais como epítopos extracelulares do antígeno. Os anticorpos, ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, identificados pelas técnicas computacionais podem ser usados em conjunto com os métodos terapêuticos aqui descritos, tais como, e.g., os métodos de tratamento de câncer e doença autoimune aqui descritos e os procedimentos de condicionamento do paciente aqui descritos.

[0341]Técnicas adicionais podem ser usadas para identificar anticorpos, ou fragmentos de anticorpo, capazes de se ligarem a um antígeno expressado por células-tronco hematopoiéticas (e.g., CD117 (e.g., CD117 GNNK+) ou CD45) ou um antígeno expressado por células imunes maduras, tais como células T (e.g., CD2, CD5, CD137 ou CD252) e que são internalizados pela célula, por exemplo, por endocitose mediada por receptor.

Por exemplo, as técnicas de exibição in vitro descritas acima podem ser adaptadas para rastrear anticorpos, ou fragmentos de anticorpo, que se ligam a um antígeno expressado por células-tronco hematopoiéticas (e.g., CD117 (e.g., CD117 GNNK+) ou CD45) ou um antígeno expressado por células imunes maduras, tais como células T (e.g., CD2, CD5, CD137 ou CD252) e que são subsequentemente internalizados.

A exibição de fago representa uma técnica que pode ser usada em conjunto com este paradigma de triagem.

Para identificar um anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti- CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti-CD252), ou fragmento de anticorpo, e são subsequentemente internalizados por células-tronco hematopoiéticas (ou células imunes), um especialista na técnica pode usar as técnicas de exibição de fagos descritas, por exemplo, em Williams et al., Leukemia 19: 1432- 1438, 2005, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

Por exemplo, usando métodos de mutagênese conhecidos na técnica, podem ser produzidas bibliotecas de fago recombinantes que codificam anticorpos, fragmentos de anticorpo, tais como fragmento scFvs, fragmentos Fab, diabodies, triabodies e domínios 10Fn3, entre outros, ou ligantes que contêm cassettes de aminoácidos randomizados (e.g., em uma ou mais, ou todas, as CDRs ou regiões equivalentes ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo). As regiões de estrutura, dobradiça, domínio Fc e outras regiões dos anticorpos ou fragmentos de anticorpo podem ser projetadas de tal modo que que não sejam imunogênicas em humanos, por exemplo, em virtude de terem sequências de anticorpo de linhagem germinativa humana ou sequências que exibem apenas variações menores em relação aos anticorpos de linhagem germinativa humana.

[0342]Usando as técnicas de exibição de fagos aqui descritas ou conhecidas na técnica, a biblioteca de fagos contendo anticorpos randomizados, ou fragmentos de anticorpo, ligados covalentemente às partículas de fago pode ser incubada com um antígeno (e.g., CD117 (e.g., CD117 GNNK+), CD45, CD2, CD5, CD137 ou CD252), por exemplo, primeiro incubando a biblioteca de fagos com agentes de bloqueio (tais como, por exemplo, proteína do leite, albumina do soro bovino e/ou IgG de modo a remover o fago que codifica anticorpos, ou fragmentos de anticorpo, que exibem ligação de proteína não específica e fago que codifica anticorpos ou fragmentos dos mesmos que se ligam aos domínios Fc, e então incubar a biblioteca de fagos com uma população de células-tronco hematopoiéticas ou células imunes maduras (e.g., células T), que expressam, e.g., CD117 (e.g., CD117 GNNK+), CD45, CD2, CD5, CD137 ou CD252. A biblioteca de fagos pode ser incubada com as células alvo, tais como células de câncer, células autoimunes ou células-tronco hematopoiéticas por um tempo suficiente para permitir que os anticorpos anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti-CD252) ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, se liguem ao antígeno cognato da superfície celular (e.g., CD117 (e.g., CD117 GNNK+), CD45, CD2, CD5, CD137 ou CD252) e sejam subsequentemente internalizados pelas células-tronco hematopoiéticas (e.g., de 30 minutos a 6 horas a 4 °C, tal como 1 hora a 4 °C). Fagos contendo anticorpos, ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, que não exibem afinidade suficiente para o antígeno (CD117 (e.g., CD117 GNNK+), CD45, CD2, CD5, CD137 ou CD252) de modo a permitir a ligação e internalização pelas células alvo, tais como células de câncer, células autoimunes ou células-tronco hematopoiéticas, podem subsequentemente serem removidos pela lavagem das células, por exemplo, com 0,1 M de tampão glicina frio (4 °C) em pH 2,8. Fagos ligados a anticorpos, ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, que foram internalizados pelas células alvo, tais como células de câncer, células autoimunes ou células-tronco hematopoiéticas, podem ser identificados, por exemplo, pela lise das células e recuperação do fago internalizado do meio de cultura de células. O fago pode então ser amplificado em células bacterianas, por exemplo, incubando-se as células bacterianas com o fago recuperado em meio 2xYT usando métodos conhecidos na técnica. O fago recuperado deste meio pode então ser caracterizado, por exemplo, determinando a sequência de ácido nucleico dos genes que codificam os anticorpos, ou fragmentos de anticorpo, inseridos dentro do genoma do fago. Os anticorpos codificados, ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, podem subsequentemente serem preparados de novo por síntese química (por exemplo, de fragmentos de anticorpo dos mesmos, tais como fragmentos scFv) ou por expressão recombinante (por exemplo, de anticorpos de comprimento total).

[0343]A capacidade de internalização dos anticorpos preparados, ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, pode ser avaliada, por exemplo, usando ensaios de internalização de radionuclídeos conhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti- CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti-CD252) ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, identificados usando técnicas de exibição in vitro aqui descritas ou conhecidas na técnica podem ser funcionalizados pela incorporação de um isótopo radioativo, tal como 18F, 75Br, 77Br, 122I, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I, 211At, 67Ga, 111In, 99Tc, 169Yb, 186Re, 64Cu, 67Cu, 177Lu, 77As, 72As, 86Y, 90Y, 89Zr, 212Bi, 213Bi ou 225Ac. Por exemplo, halogênios radioativos, tais como 18F, 75Br, 77Br, 122I, 123I, 124I, 125I, 129I, 131I, 211At, podem ser incorporados em anticorpos, ou fragmentos de anticorpo, usando microesferas, tais como microesferas de poliestireno, contendo reagentes eletrofílicos de halogênio (e.g., Iodination Beads, Thermo Fisher Scientific, Inc., Cambridge, MA). Anticorpos radiomarcados, fragmentos dos mesmos, ou ADCs podem ser incubados com células alvo, tais como células de câncer, células autoimunes ou células-tronco hematopoiéticas, por um tempo suficiente para permitir a internalização (e.g., de 30 minutos a 6 horas a 4 °C, tal como 1 hora a 4 °C). As células podem então ser lavadas para remover anticorpos não internalizados ou fragmentos dos mesmos, (e.g., usando 0,1 M de tampão glicina frio (4 °C) em pH 2,8). Os anticorpos internalizados, ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, podem ser identificados detectando-se a radiação emitida (e.g., radiação γ) das células alvo resultantes, tais como células de câncer, células autoimunes ou células-tronco hematopoiéticas em comparação com a radiação emitida (e.g., radiação γ) do tampão de lavagem recuperado. Os ensaios de internalização anteriores também podem ser usados para caracterizar ADCs.

[0344]Os anticorpos podem ser produzidos usando métodos e composições recombinantes, e.g., como descrito na Pat. dos EUA No 4.816.567. Em uma modalidade, o ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti-CD252) aqui descrito é fornecido. Esse ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL e/ou uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo (e.g., as cadeias leves e/ou pesadas do anticorpo). Em uma outra modalidade, um ou mais vetores (e.g., vetores de expressão) compreendendo tal ácido nucleico são fornecidos. Em uma outra modalidade, uma célula hospedeira compreendendo tal ácido nucleico é fornecida. Em uma modalidade, uma célula hospedeira compreende (e.g., foi transformada com): (1) um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL do anticorpo e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo. Em uma modalidade, a célula hospedeira é eucariótica, e.g., uma célula do Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfoide (e.g., célula Y0, NS0, Sp20). Em uma modalidade, um método de produção de um anticorpo anti-CLL-1 é fornecido, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica o anticorpo, conforme fornecido acima, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo e, opcionalmente, recuperar o anticorpo da célula hospedeira (ou meio de cultura da célula hospedeira).

[0345]Para a produção recombinante de um anticorpo anti-HC (e.g., um anticorpo anti-CD117, um anticorpo anti-CD45, um anticorpo anti-CD2, um anticorpo anti-CD5, um anticorpo anti-CD137 ou um anticorpo anti-CD252), um ácido nucleico que codifica um anticorpo, e.g., como descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem e/ou expressão adicional em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (e.g., usando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligarem especificamente aos genes que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo).

[0346]Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem células procarióticas ou eucarióticas aqui descritas. Por exemplo, anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e função efetora de Fc não são necessárias. Para a expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, ver, e.g., Pat. dos EUA Nos

[0347]As células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, linhagens de células de mamíferos que são adaptadas para crescerem em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 como descrito, e.g., em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster neonato (BHK); células de sertoli de camundongo (células TM4 como descrito, e.g., em Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células renais caninas (MDCK; células do fígado de rato buffalo (BRL 3A); células do pulmão humano (W138); células do fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, como descrito, e.g., em Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis incluem células do ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); e linhagens de células do mieloma, tais como Y0, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens de células hospedeiras de mamífero adequadas para a produção de anticorpo, ver, e.g., Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), páginas 255 a 268 (2003). Em uma modalidade, a célula hospedeira é eucariótica, e.g., uma célula do Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfoide (e.g., célula Y0, NS0, Sp20). Conjugados anticorpo-fármaco (ADCs)

[0348]Anticorpos (incluindo anticorpos anti-CD117) e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos podem ser conjugados (ligados) com uma citotoxina por meio de um conector. Em algumas modalidades, a molécula citotóxica é conjugada com um anticorpo de internalização celular, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como aqui divulgado, tal que após a captura celular do anticorpo, ou fragmento do mesmo, a citotoxina pode acessar seu alvo intracelular e mediar a morte celular hematopoiética. Qualquer número de citotoxinas pode ser conjugada com o anticorpo anti-CD117, e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[0349]Citotoxinas adequadas para o uso com as composições e métodos aqui descritos incluem agentes intercalantes de DNA, (e.g., antraciclinas), agentes capazes de interromperem o aparelho do fuso mitótico (e.g., alcaloides da vinca, maitansina, maitansinoides e derivados dos mesmos), inibidores de RNA polimerase (e.g., uma amatoxina, tal como α-amanitina e derivados da mesma), e agentes capazes de interromperem a biossíntese de proteína (e.g., agentes que exibem atividade N- glicosidase de rRNA, tais como saporina e cadeia A de ricina), entre outros conhecidos na técnica. Citotoxinas

[0350]Várias citotoxinas podem ser conjugadas a um anticorpo anti-HC (e.g., um anticorpo anti-CD117, um anticorpo anti-CD45, um anticorpo anti-CD2, um anticorpo anti-CD5, um anticorpo anti-CD137 ou um anticorpo anti-CD252) por meio de um conector para o uso nas terapias aqui descritas. Em particular, os ADCs anti- HC (e.g., ADC anti-CD117, ADC anti-CD45, ADC anti-CD2, ADC anti-CD5, ADC anti- CD137 ou ADC anti-CD252) incluem um anticorpo (ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) conjugado (i.e., covalentemente ligado por um conector) com uma porção citotóxica (ou citotoxina). Em várias modalidades, a porção citotóxica exibe citotoxicidade reduzida ou nenhuma citotoxicidade quando ligada em um conjugado, mas recupera a citotoxicidade depois da clivagem do conector. Em várias modalidades, a porção citotóxica mantém a citotoxicidade sem a clivagem do conector. Em algumas modalidades, a molécula citotóxica é conjugada com um anticorpo de internalização celular, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como aqui divulgado, tal que após a captura celular do anticorpo, ou fragmento do mesmo, a citotoxina pode acessar seu alvo intracelular e, e.g., mediar a morte de células T.

[0351]Os ADCs da presente divulgação podem, portanto, serem da fórmula geral Ab-(Z-L-D)n, em que um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (Ab) é conjugado (covalentemente ligado) ao conector (L), por meio de uma porção química (Z), a uma porção citotóxica (“fármaco”, D), cada qual como aqui divulgado.

[0352]Consequentemente, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser conjugado com várias porções de fármaco como indicado pelo número inteiro n, que representa o número médio de citotoxinas por anticorpo, que pode variar, e.g., de cerca de 1 a cerca de 20. Em algumas modalidades, n é de 1 a

4. Em algumas modalidades, n é 1. O número médio de porções de fármaco por anticorpo em preparações de ADC a partir das reações de conjugação pode ser caracterizado por meios convencionais, tais como espectroscopia de massa, ensaio ELISA e HPLC. A distribuição quantitativa de ADC em termos de n também pode ser determinada. Em alguns casos, a separação, purificação e caracterização de ADC homogêneo onde n é um certo valor de ADC com outras cargas de fármaco, podem ser obtidas por meios, tais como HPLC de fase reversa ou eletroforese.

[0353]Alguns ADCs anti-HC (e.g., ADC anti-CD117, ADC anti-CD45, ADC anti-CD2, ADC anti-CD5, ADC anti-CD137 ou ADC anti-CD252) podem ser limitados pelo número de sítios de fixação no anticorpo. Por exemplo, onde a fixação é um tiol de cisteína, um anticorpo pode ter apenas um ou vários grupos tiol de cisteína, ou pode ter apenas um ou vários grupos tiol suficientemente reativos através dos quais um conector pode ser ligado. Geralmente, os anticorpos não contêm muitos grupos tiol de cisteína livres e reativos que podem ser ligados a uma porção de fármaco; principalmente, os resíduos tiol de cisteína em anticorpos existem como pontes dissulfeto. Em certas modalidades, um anticorpo pode ser reduzido com um agente redutor, tal como ditiotreitol (DTT) ou tricarboniletilfosfina (TCEP), sob condições de redução parcial ou total, para gerar grupos tiol de cisteína reativos. Em certas modalidades, maior carga de fármaco, e.g., n>5, pode causar agregação, insolubilidade, toxicidade ou perda de permeabilidade celular de certos conjugados anticorpo-fármaco.

[0354]Em certas modalidades, menos que o máximo teórico de porções de fármaco são conjugados a um anticorpo durante uma reação de conjugação. Um anticorpo pode conter, por exemplo, resíduos de lisina que não reagem com o intermediário conector de fármaco ou reagente conector, como discutido abaixo. Apenas os grupos de lisina mais reativos podem reagir com um reagente conector reativo a amina. Em certas modalidades, um anticorpo é submetido a condições desnaturantes para revelar grupos nucleofílicos reativos, tais como lisina ou cisteína.

[0355]A carga (razão fármaco/anticorpo) de um ADC pode ser controlada de diferentes maneiras, e.g.: (i) limitar o excesso molar do intermediário conector de fármaco ou reagente conector em relação ao anticorpo, (ii) limitar o tempo ou temperatura da reação de conjugação, (iii) condições redutoras parciais ou limitantes para modificação de tiol de cisteína, (iv) engenharia por técnicas recombinantes da sequência de aminoácidos do anticorpo tal que o número e posição dos resíduos de cisteína seja modificado para o controle do número e/ou posição das fixações de fármaco do conector.

[0356]As citotoxinas adequadas para o uso com as composições e métodos aqui descritos incluem agentes intercalantes de DNA, (e.g., antraciclinas), agentes capazes de interromperem o aparelho do fuso mitótico (e.g., alcaloides da vinca, maitansina, maitansinoides e derivados dos mesmos), inibidores de RNA polimerase (e.g., uma amatoxina, tal como α-amanitina e derivados da mesma), e agentes capazes de interromperem a biossíntese de proteína (e.g., agentes que exibem atividade N-glicosidase de rRNA, tal como saporina e cadeia A de ricina), entre outros conhecidos na técnica.

[0357]Em algumas modalidades, a citotoxina é um agente de ligação a microtúbulos (por exemplo, maitansina ou um maitansinoide), uma amatoxina, pseudomonas exotoxina A, deBouganin, toxina da difteria, saporina, uma auristatina, uma antraciclina, uma caliqueamicina, irinotecano, SN-38, uma duocarmicina, uma pirrolobenzodiazepina, um dímero de pirrolobenzodiazepina, uma indolinobenzodiazepina, um dímero de indolinobenzodiazepina, um pseudodímero de indolinobenzodiazepina ou uma variante do mesmo, ou outro composto citotóxico aqui descrito ou conhecido na técnica.

[0358]Em algumas modalidades, a citotoxina do conjugado anticorpo-fármaco é um inibidor de RNA polimerase. Em algumas modalidades, o inibidor de RNA polimerase é uma amatoxina ou derivado da mesma. Em algumas modalidades, a citotoxina do conjugado anticorpo-fármaco como aqui divulgado é uma amatoxina ou derivado da mesma, tal como uma α-amanitina, β-amanitina, γ-amanitina, ε-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina, ácido amanulinaico, pró-amanulina ou um derivado da mesma.

[0359]Detalhes adicionais a respeito das citotoxinas que podem ser usadas nos ADCs anti-HC (e.g., ADC anti-CD117, ADC anti-CD45, ADC anti-CD2, ADC anti- CD5, ADC anti-CD137 ou ADC anti-CD252) úteis nos métodos da invenção são descritos abaixo. Amatoxinas

[0360]Os métodos e composições aqui divulgados incluem ADCs compreendendo um inibidor de RNA polimerase, e.g., uma amatoxina, como a citotoxina conjugada com um anticorpo anti-HC (e.g., um anticorpo anti-CD117). Em algumas modalidades, a citotoxina do conjugado anticorpo-fármaco é um inibidor de RNA polimerase. Em algumas modalidades, o inibidor de RNA polimerase é uma amatoxina ou derivado da mesma. Em algumas modalidades, a citotoxina do conjugado anticorpo-fármaco como aqui divulgado é uma amatoxina ou derivado da mesma, tal como um α-amanitina, β-amanitina, γ-amanitina, ε-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina, ácido amanulinaico, pró-amanulina ou um derivado da mesma. Amatoxinas adequadas são divulgadas em, e.g., Zanotti et al., Int. J. Peptide Protein Res. 30, 1987, 450-459.

[0361]Amatoxinas útéis em conjunto com as composições e métodos aqui descritos incluem compostos de acordo com, mas não são limitados à fórmula (III), incluindo α-amanitina, β-amanitina, γ-amanitina, ε-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina, ácido amanulinaico ou pró-amanulina. A Fórmula (III) é como se segue: (III) em que R1 é H, OH ou ORA; R2 é H, OH ou ORB; RA e RB, quando presente, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar um grupo heterocicloalquila de 5 membros opcionalmente substituído; R3 é H ou RD; R4 é H, OH, ORD ou RD; R5 é H, OH, ORD ou RD; R6 é H, OH, ORD ou RD; R7 é H, OH, ORD ou RD; R8 é OH, NH2 ou ORD;

R9 é H, OH ou ORD; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; e RD é alquila opcionalmente substituída (e.g., alquila C1-C6), heteroalquila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquila C1-C6), alquenila opcionalmente substituída (e.g., alquenila C2-C6), heteroalquenila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquenila C2-C6), alquinila opcionalmente substituída (e.g., alquinila C2-C6), heteroalquinila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquinila C2-C6), cicloalquila opcionalmente substituída, heterocicloalquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída.

[0362]Por exemplo, em uma modalidade, as amatoxinas úteis em conjunto com as composições e métodos aqui descritos incluem os compostos de acordo com fórmula (IIIA) (IIIA), em que R4, R5, X e R8 são, cada um, como definidos acima.

[0363]Por exemplo, em uma modalidade, as amatoxinas úteis em conjunto com as composições e métodos aqui descritos incluem os compostos de acordo com fórmula (IIIB), abaixo:

(IIIB) em que R1 é H, OH ou ORA; R2 é H, OH ou ORB; RA e RB, quando presente, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar um grupo heterocicloalquila de 5 membros opcionalmente substituído; R3 é H ou RD; R4 é H, OH, ORD ou RD; R5 é H, OH, ORD ou RD; R6 é H, OH, ORD ou RD; R7 é H, OH, ORD ou RD; R8 é OH, NH2 ou ORD; R9 é H, OH ou ORD; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; e RD é alquila opcionalmente substituída (e.g., alquila C1-C6), heteroalquila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquila C1-C6), alquenila opcionalmente substituída (e.g., alquenila C2-C6), heteroalquenila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquenila C2-C6), alquinila opcionalmente substituída (e.g., alquinila C2-C6), heteroalquinila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquinila C2-C6), cicloalquila opcionalmente substituída, heterocicloalquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída.

[0364]Em uma modalidade, as amatoxinas úteis em conjunto com as composições e métodos aqui descritos também incluem os compostos de acordo com fórmula (IIIC), abaixo: R2 R1

H

N R6 R7 NH O R5 O

O

HN R4 HN O R3N

X O N H O

N NH R9 O N

O H

O R8 (IIIC) em que R1 é H, OH ou ORA; R2 é H, OH ou ORB; RA e RB, quando presente, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar um grupo heterocicloalquila de 5 membros opcionalmente substituído; R3 é H ou RD; R4 é H, OH, ORD ou RD; R5 é H, OH, ORD ou RD; R6 é H, OH, ORD ou RD; R7 é H, OH, ORD ou RD; R8 é OH, NH2 ou ORD; R9 é H, OH ou ORD; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; e RD é alquila opcionalmente substituída (e.g., alquila C1-C6), heteroalquila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquila C1-C6), alquenila opcionalmente substituída (e.g., alquenila C2-C6), heteroalquenila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquenila C2-C6), alquinila opcionalmente substituída (e.g., alquinila C2-C6), heteroalquinila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquinila C2-C6), cicloalquila opcionalmente substituída, heterocicloalquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída.

[0365]Em uma modalidade, a citotoxina é uma amanitina. Por exemplo, os anticorpos, e os fragmentos de ligação ao antígeno, aqui descritos podem estar ligados a uma amatoxina de modo a formar um conjugado representado pela fórmula Ab-Z-L-Am, em que Ab é o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, L é um conector, Z é uma porção química e Am é uma amatoxina. Muitas posições em amatoxinas ou derivados das mesmas podem servir como a posição para ligar covalentemente a porção de ligação L e, consequentemente, os anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Métodos exemplificativos de conjugação de amatoxina e conectores úteis para tais processos são descritos abaixo. Amatoxinas exemplificativas contendo conectores úteis para a conjugação com um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com as composições e métodos aqui descritos são mostradas nas fórmulas estruturais (I), (IA), (IB), (II), (IIA) e (IIB), aqui citadas.

[0366]Em algumas modalidades, o conjugado amatoxina-conector Am-L-Z é representado pela fórmula (I)

em que R1 é H, OH, ORA ou ORC; R2 é H, OH, ORB ou ORC; RA e RB, quando presente, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar um grupo heterocicloalquila de 5 membros opcionalmente substituído; R3 é H, RC ou RD; R4 é H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R5 é H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R6 é H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R7 é H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R8 é OH, NH2, ORC, ORD, NHRC ou NRCRD; R9 é H, OH, ORC ou ORD; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; RC é -L-Z; RD é alquila opcionalmente substituída (e.g., alquila C1-C6), heteroalquila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquila C1-C6), alquenila opcionalmente substituída (e.g., alquenila C2-C6), heteroalquenila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquenila C2-C6), alquinila opcionalmente substituída (e.g., alquinila C2-C6), heteroalquinila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquinila C2-C6), cicloalquila opcionalmente substituída, heterocicloalquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída; L é um conector, tal como alquileno opcionalmente substituído (e.g., alquileno C1-C6), heteroalquileno opcionalmente substituído (heteroalquileno C1-C6), alquenileno opcionalmente substituído (e.g., alquenileno C2-C6), heteroalquenileno opcionalmente substituído (e.g., heteroalquenileno C2-C6), alquinileno opcionalmente substituído (e.g., alquinileno C2-C6), heteroalquinileno opcionalmente substituído (e.g., heteroalquinileno C2-C6), cicloalquileno opcionalmente substituído,

heterocicloalquileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído, heteroarileno opcionalmente substituído, um peptídeo, um dipeptídeo, -(C=O)-, um dissulfeto, uma hidrazona ou uma combinação dos mesmos; e Z é uma porção química formada a partir de uma reação de acoplamento entre um substituinte reativo presente em L e um substituinte reativo presente dentro de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a um antígeno alvo (e.g., CD117).

[0367]Em algumas modalidades, Am contém exatamente um substituinte RC.

[0368]Em algumas modalidades, L-Z é onde S é um átomo de enxofre que representa o substituinte reativo presente dentro de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a um antígeno alvo (e.g., do grupo -SH de um resíduo de cisteína).

[0369]Em algumas modalidades, o conjugado Am-L-Z-Ab é representado por uma das Fórmulas IV, IVA ou IVB: (IV) (IVA) (IVB) onde X é S, SO ou SO2 e Ab é mostrado para indicar o ponto de fixação de Ab.

[0370]Em algumas modalidades, Am-L-Z-Ab é onde Ab é mostrado para indicar o ponto de fixação de Ab.

[0371]Em algumas modalidades, Am-L-Z-Ab é onde Ab é mostrado para indicar o ponto de fixação de Ab.

[0372]Em algumas modalidades, Am-L-Z-Ab é onde Ab é mostrado para indicar o ponto de fixação de Ab.

[0373]Em algumas modalidades, o precursor de Am-L-Z-Ab, Am-L-Z’, é em que a maleimida reage com um grupo tiol encontrado em uma cisteína no anticorpo.

[0374]Em algumas modalidades, o precursor de Am-L-Z-Ab, Am-L-Z’, é em que a maleimida reage com um grupo tiol encontrado em uma cisteína no anticorpo.

[0375]Em algumas modalidades, Am-L-Z é representada pela fórmula (IA) em que R1 é H, OH, ORA ou ORC; R2 é H, OH, ORB ou ORC; RA e RB, quando presente, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar um grupo heterocicloalquila de 5 membros opcionalmente substituído; R3 é H, RC ou RD; R4 é H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R5 é H, OH, ORC, ORD, RC ou RD;

R6 é H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R7 é H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R8 é OH, NH2, ORC, ORD, NHRC ou NRCRD; R9 é H, OH, ORC ou ORD; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; RC é -L-Z; RD é alquila opcionalmente substituída (e.g., alquila C1-C6), heteroalquila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquila C1-C6), alquenila opcionalmente substituída (e.g., alquenila C2-C6), heteroalquenila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquenila C2-C6), alquinila opcionalmente substituída (e.g., alquinila C2-C6), heteroalquinila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquinila C2-C6), cicloalquila opcionalmente substituída, heterocicloalquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída; L é um conector, tal como alquileno opcionalmente substituído (e.g., alquileno C1-C6), heteroalquileno opcionalmente substituído (heteroalquileno C1-C6), alquenileno opcionalmente substituído (e.g., alquenileno C2-C6), heteroalquenileno opcionalmente substituído (e.g., heteroalquenileno C2-C6), alquinileno opcionalmente substituído (e.g., alquinileno C2-C6), heteroalquinileno opcionalmente substituído (e.g., heteroalquinileno C2-C6), cicloalquileno opcionalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído, heteroarileno opcionalmente substituído, um peptídeo, um dipeptídeo, -(C=O)-, um dissulfeto, uma hidrazona ou uma combinação dos mesmos; Z é uma porção química formada a partir de uma reação de acoplamento entre um substituinte reativo presente em L e um substituinte reativo presente dentro de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a um antígeno HC (i.e., um anticorpo anti-HC, e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti-

CD252); e em que Am contém exatamente um substituinte RC.

[0376]Em algumas modalidades, L-Z é

O O O H O N N

S N N N ou or H H

O O O S

[0377]Em algumas modalidades, L-Z é

[0378]Em algumas modalidades, Am-L-Z é representada pela fórmula (IB) em que R1 é H, OH, ORA ou ORC; R2 é H, OH, ORB ou ORC; RA e RB, quando presente, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar um grupo heterocicloalquila de 5 membros opcionalmente substituído; R3 é H, RC ou RD; R4 é H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R5 é H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R6 é H, OH, ORC, ORD, RC ou RD;

R7 é H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R8 é OH, NH2, ORC, ORD, NHRC ou NRCRD; R9 é H, OH, ORC ou ORD; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; RC é -L-Z; RD é alquila opcionalmente substituída (e.g., alquila C1-C6), heteroalquila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquila C1-C6), alquenila opcionalmente substituída (e.g., alquenila C2-C6), heteroalquenila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquenila C2-C6), alquinila opcionalmente substituída (e.g., alquinila C2-C6), heteroalquinila opcionalmente substituída (e.g., heteroalquinila C2-C6), cicloalquila opcionalmente substituída, heterocicloalquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída; L é um conector, tal como alquileno opcionalmente substituído (e.g., alquileno C1-C6), heteroalquileno opcionalmente substituído (heteroalquileno C1-C6), alquenileno opcionalmente substituído (e.g., alquenileno C2-C6), heteroalquenileno opcionalmente substituído (e.g., heteroalquenileno C2-C6), alquinileno opcionalmente substituído (e.g., alquinileno C2-C6), heteroalquinileno opcionalmente substituído (e.g., heteroalquinileno C2-C6), cicloalquileno opcionalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído, heteroarileno opcionalmente substituído, um peptídeo, um dipeptídeo, -(C=O)-, um dissulfeto, uma hidrazona ou uma combinação dos mesmos; Z é uma porção química formada a partir de uma reação de acoplamento entre um substituinte reativo presente em L e um substituinte reativo presente dentro de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a um antígeno HC (i.e., um anticorpo anti-HC, e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti- CD252); e em que Am contém exatamente um substituinte RC.

[0379]Em algumas modalidades, L-Z é

O O O H O N N

S N N N ou or H H

O O O S

[0380]Em algumas modalidades, L-Z é

[0381]Em algumas modalidades, RA e RB, quando presente, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar um grupo heterocicloalquila de 5 membros da fórmula: em que Y é -(C=O)-, -(C=S)-, -(C=NRE)- ou -(CRERE’)-; e RE e RE’ são, cada um, independentemente alquileno-RC C1-C6 opcionalmente substituído, heteroalquileno-RC C1-C6 opcionalmente substituído, alquenileno-RC C2- C6 opcionalmente substituído, heteroalquenileno-RC C2-C6 opcionalmente substituído, alquinileno-RC C2-C6 opcionalmente substituído, heteroalquinileno-RC C2-C6 opcionalmente substituído, cicloalquileno-RC opcionalmente substituído, heterocicloalquileno-RC opcionalmente substituído, arileno-RC opcionalmente substituído ou heteroarileno-RC opcionalmente substituído.

[0382]Em algumas modalidades, Am-L-Z é representada pela fórmula (IA) ou fórmula (IB), em que R1 é H, OH, ORA ou ORC; R2 é H, OH, ORB ou ORC; RA e RB, quando presente, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar:

R3 é H ou RC; R4 é H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R5 é H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R6 é H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R7 é H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R8 é OH, NH2, ORC ou NHRC; R9 é H ou OH; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; e em que RC e RD são, cada um, como definidos acima.

[0383]Em algumas modalidades, Am-L-Z é representada pela fórmula (IA) ou fórmula (IB), em que R1 é H, OH, ORA ou ORC; R2 é H, OH, ORB ou ORC; RA e RB, quando presente, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar: R3 é H ou RC; R4 e R5 são, cada um, independentemente H, OH, ORC, RC ou ORD; R6 e R7 são, cada um, H; R8 é OH, NH2, ORC ou NHRC; R9 é H ou OH; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; e em que RC é como definido acima.

[0384]Em algumas modalidades, Am-L-Z é representada pela fórmula (IA) ou fórmula (IB), em que R1 é H, OH ou ORA; R2 é H, OH ou ORB; RA e RB, quando presente, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar: R3, R4, R6 e R7 são, cada um, H; R5 é ORC; R8 é OH ou NH2; R9 é H ou OH; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; e em que RC é como definido acima. Tais conjugados amatoxina são descritos, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente dos EUA No 2016/0002298, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0385]Em algumas modalidades, Am-L-Z é representada pela fórmula (IA) ou fórmula (IB), em que R1 e R2 são, cada um, independentemente H ou OH; R3 é RC; R4, R6 e R7 são, cada um, H; R5 é H, OH, ou alquila OC1-C6; R8 é OH ou NH2; R9 é H ou OH; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; e em que RC é como definido acima. Tais conjugados amatoxina são descritos, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente dos EUA No 2014/0294865, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0386]Em algumas modalidades, Am-L-Z é representada pela fórmula (IA) ou fórmula (IB), em que R1 e R2 são, cada um, independentemente H ou OH; R3, R6 e R7 são, cada um, H; R4 e R5 são, cada um, independentemente H, OH, ORC ou RC; R8 é OH ou NH2; R9 é H ou OH; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; e em que RC é como definido acima. Tais conjugados amatoxina são descritos, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente dos EUA No 2015/0218220, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0387]Em algumas modalidades, Am-L-Z é representada pela fórmula (IA) ou fórmula (IB), em que R1 e R2 são, cada um, independentemente H ou OH; R3, R6 e R7 são, cada um, H; R4 e R5 são, cada um, independentemente H ou OH; R8 é OH, NH2, ORC ou NHRC; R9 é H ou OH; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; e em que RC é como definido acima. Tais conjugados amatoxina são descritos, por exemplo, nas Patentes dos EUA Nos 9.233.173 e 9.399.681, bem como em US 2016/0089450, as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

[0388]Em algumas modalidades, Am-L-Z’ é

.

[0389]Amatoxinas adicionais que podem ser usadas para a conjugação com um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com as composições e métodos aqui descritos são descritos, por exemplo, em WO 2016/142049; WO 2016/071856; WO 2017/149077; WO 2018/115466; e WO 2017/046658, as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

[0390]Em algumas modalidades, Am-L-Z é representada pela fórmula (II), fórmula (IIA) ou fórmula (IIB)

em que X é S, SO, ou SO2; R1 é H ou um conector ligado covalentemente ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo por meio de uma porção química Z formada a partir de uma reação de acoplamento entre um substituinte reativo Z’ presente no conector e um substituinte reativo presente dentro de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e R2 é H ou um conector ligado covalentemente ao anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo por meio de uma porção química Z formada a partir de uma reação de acoplamento entre um substituinte reativo Z’ presente no conector e um substituinte reativo presente dentro de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; em que quando R1 é H, R2 é o conector, e quando R2 é H, R1 é o conector.

Em algumas modalidades, R1 é o conector e R2 é H, e o conector e a porção química, juntos como L-Z, são ou .

[0391]Em algumas modalidades, L-Z é .

[0392]Em uma modalidade, Am-L-Z-Ab é:

OH HO H N O NH O S O O

N O Ab O N

O H 5 HN

N O HO N S O H O O H NH N N H O

O NH2

[0393]Em uma modalidade, Am-L-Z-Ab é:

[0394]Em algumas modalidades, o precursor de Am-L-Z-Ab (i.e., Am-L-Z’) é um de:

; em que a maleimida reage com um grupo tiol encontrado em uma cisteína no anticorpo.

[0395]Em algumas modalidades, a citotoxina é um α-amanitina. Em algumas modalidades, a α-amanitina é um composto da fórmula III. Em algumas modalidades, a α-amanitina da fórmula III está ligada a um anticorpo anti-HC por meio de um conector L. O conector L pode estar ligado à α-amanitina da fórmula III em qualquer uma das várias posições possíveis (e.g., qualquer uma de R1-R9) para fornecer um conjugado α-amanitina-conector da fórmula I, IA, IB, II, IIA ou IIB. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R1. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R2. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R3. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R4. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R5. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R6. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R7. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R8. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R9. Em algumas modalidades, o conector inclui uma hidrazina, um dissulfeto, um tioéter ou um dipeptídeo. Em algumas modalidades, o conector inclui um dipeptídeo selecionado de Val-Ala e Val-Cit. Em algumas modalidades, o conector inclui um grupo para- aminobenzila (PAB). Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Cit- Val. Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Ala-Val. Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -((C=O)(CH2)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 6.

[0396]Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -(CH2)n -, onde n é um número inteiro de 2 a 6. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Cit-Val- ((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Ala-Val-((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector L e a porção química Z, tomados juntos como L-Z, são ou .

[0397]Em algumas modalidades, a citotoxina é uma β-amanitina. Em algumas modalidades, a α-amanitina é um composto da fórmula III. Em algumas modalidades, a β-amanitina da fórmula III está ligada a um anticorpo anti-HC por meio de um conector L. O conector L pode estar ligado à β-amanitina da fórmula III em qualquer uma das várias posições possíveis (e.g., qualquer uma de R1-R9) para fornecer um conjugado β-amanitina-conector da fórmula I, IA, IB, II, IIA ou IIB. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R1. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R2. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R3. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R4. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R5. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R6. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R7. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R8. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R9. Em algumas modalidades, o conector inclui uma hidrazina, um dissulfeto, um tioéter ou um dipeptídeo. Em algumas modalidades, o conector inclui um dipeptídeo selecionado de Val-Ala e Val-Cit. Em algumas modalidades, o conector inclui um grupo para- aminobenzila (PAB). Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Cit- Val. Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Ala-Val. Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -((C=O)(CH2)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 6.

[0398]Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -(CH2)n -, onde n é um número inteiro de 2 a 6. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Cit-Val- ((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Ala-Val-((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector L e a porção química Z, tomados juntos como L-Z, são ou .

[0399]Em algumas modalidades, a citotoxina é uma γ-amanitina. Em algumas modalidades, a γ-amanitina é um composto da fórmula III. Em algumas modalidades, a γ-amanitina da fórmula III está ligada a um anticorpo anti-HC por meio de um conector L. O conector L pode estar ligado à γ-amanitina da fórmula III em qualquer uma das várias posições possíveis (e.g., qualquer uma de R1-R9) para fornecer um conjugado γ-amanitina-conector da fórmula I, IA, IB, II, IIA ou IIB. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R1. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R2. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R3. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R4. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R5. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R6. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R7. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R8. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R9. Em algumas modalidades, o conector inclui uma hidrazina, um dissulfeto, um tioéter ou um dipeptídeo. Em algumas modalidades, o conector inclui um dipeptídeo selecionado de Val-Ala e Val-Cit. Em algumas modalidades, o conector inclui um grupo para- aminobenzila (PAB). Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Cit- Val. Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Ala-Val. Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -((C=O)(CH2)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 6.

[0400]Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -(CH2)n -, onde n é um número inteiro de 2 a 6. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Cit-Val- ((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Ala-Val-((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector L e a porção química Z, tomados juntos como L-Z, são ou .

[0401]Em algumas modalidades, a citotoxina é uma ε-amanitina. Em algumas modalidades, a ε-amanitina é um composto da fórmula III. Em algumas modalidades, a ε-amanitina da fórmula III está ligada a um anticorpo anti-HC por meio de um conector L. O conector L pode estar ligado à ε-amanitina da fórmula III em qualquer uma das várias posições possíveis (e.g., qualquer uma de R1-R9) para fornecer um conjugado ε-amanitina-conector da fórmula I, IA, IB, II, IIA ou IIB. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R1. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R2. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R3. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R4. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R5. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R6. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R7. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R8. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R9. Em algumas modalidades, o conector inclui uma hidrazina, um dissulfeto, um tioéter ou um dipeptídeo. Em algumas modalidades, o conector inclui um dipeptídeo selecionado de Val-Ala e Val-Cit. Em algumas modalidades, o conector inclui um grupo para- aminobenzila (PAB). Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Cit- Val. Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Ala-Val. Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -((C=O)(CH2)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 6.

[0402]Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -(CH2)n -, onde n é um número inteiro de 2 a 6. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Cit-Val- ((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Ala-Val-((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector L e a porção química Z, tomados juntos como L-Z, são ou .

[0403]Em algumas modalidades, a citotoxina é um amanina. Em algumas modalidades, a amanina é um composto da fórmula III. Em algumas modalidades, a amanina da fórmula III está ligada a um anticorpo anti-HC por meio de um conector L. O conector L pode estar ligado à amanina da fórmula III em qualquer uma das várias posições possíveis (e.g., qualquer uma de R1-R9) para fornecer um conjugado amanina-conector da fórmula I, IA, IB, II, IIA ou IIB. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R1. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R2. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R3. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R4. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R5. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R6. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R7. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R8. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R9. Em algumas modalidades, o conector inclui uma hidrazina, um dissulfeto, um tioéter ou um dipeptídeo. Em algumas modalidades, o conector inclui um dipeptídeo selecionado de Val-Ala e Val-Cit. Em algumas modalidades, o conector inclui um grupo para- aminobenzila (PAB). Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Cit-

Val. Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Ala-Val. Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -((C=O)(CH2)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 6.

[0404]Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -(CH2)n -, onde n é um número inteiro de 2 a 6. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Cit-Val- ((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Ala-Val-((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector L e a porção química Z, tomados juntos como L-Z, são ou .

[0405]Em algumas modalidades, a citotoxina é um amaninamida. Em algumas modalidades, a amaninamida é um composto da fórmula III. Em algumas modalidades, a amaninamida da fórmula III está ligada a um anticorpo anti-HC por meio de um conector L. O conector L pode estar ligado à amaninamida da fórmula III em qualquer uma das várias posições possíveis (e.g., qualquer uma de R1-R9) para fornecer um conjugado amaninamida-conector da fórmula I, IA, IB, II, IIA ou IIB. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R1. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R2. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R3. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R4. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R5. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R6. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R7. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R8. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R9. Em algumas modalidades, o conector inclui uma hidrazina, um dissulfeto, um tioéter ou um dipeptídeo. Em algumas modalidades, o conector inclui um dipeptídeo selecionado de Val-Ala e Val-Cit. Em algumas modalidades, o conector inclui um grupo para-aminobenzila (PAB). Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Cit-Val. Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Ala- Val. Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -((C=O)(CH2)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 6.

[0406]Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -(CH2)n -, onde n é um número inteiro de 2 a 6. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Cit-Val- ((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Ala-Val-((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector L e a porção química Z, tomados juntos como L-Z, são ou .

[0407]Em algumas modalidades, a citotoxina é uma amanulina. Em algumas modalidades, a amanulina é um composto da fórmula III. Em algumas modalidades, a amanulina da fórmula III está ligada a um anticorpo anti-HC por meio de um conector L. O conector L pode estar ligado à amanulina da fórmula III em qualquer uma das várias posições possíveis (e.g., qualquer uma de R1-R9) para fornecer um conjugado amanulina-conector da fórmula I, IA, IB, II, IIA ou IIB. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R1. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R2. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R3. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R4. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R5. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R6. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R7. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R8. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R9. Em algumas modalidades, o conector inclui uma hidrazina, um dissulfeto, um tioéter ou um dipeptídeo. Em algumas modalidades, o conector inclui um dipeptídeo selecionado de

Val-Ala e Val-Cit. Em algumas modalidades, o conector inclui um grupo para- aminobenzila (PAB). Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Cit- Val. Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Ala-Val. Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -((C=O)(CH2)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 6.

[0408]Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -(CH2)n-, onde n é um número inteiro de 2 a 6. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Cit-Val- ((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Ala-Val-((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector L e a porção química Z, tomados juntos como L-Z, são ou .

[0409]Em algumas modalidades, a citotoxina é um ácido amanulinaico. Em algumas modalidades, o ácido amanulinaico é um composto da fórmula III. Em algumas modalidades, o ácido amanulinaico da fórmula III está ligado a um anticorpo anti-HC por meio de um conector L. O conector L pode estar ligado ao ácido amanulinaico da fórmula III em qualquer uma das várias posições possíveis (e.g., qualquer uma de R1-R9) para fornecer um conjugado ácido amanulinaico-conector da fórmula I, IA, IB, II, IIA ou IIB. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R1. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R2. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R3. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R4. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R5. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R6. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R7. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R8. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R9. Em algumas modalidades, o conector inclui uma hidrazina, um dissulfeto, um tioéter ou um dipeptídeo. Em algumas modalidades, o conector inclui um dipeptídeo selecionado de Val-Ala e Val-Cit. Em algumas modalidades, o conector inclui um grupo para-aminobenzila (PAB). Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Cit-Val. Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Ala-Val. Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -((C=O)(CH2)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 6.

[0410]Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -(CH2)n-, onde n é um número inteiro de 2 a 6. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Cit-Val- ((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Ala-Val-((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector L e a porção química Z, tomados juntos como L-Z, são ou .

[0411]Em algumas modalidades, a citotoxina é uma pró-amanulina. Em algumas modalidades, a pró-amanulina é um composto da fórmula III. Em algumas modalidades, a pró-amanulina da fórmula III está ligada a um anticorpo anti-HC por meio de um conector L. O conector L pode estar ligado à pró-amanulina da fórmula III em qualquer uma das várias posições possíveis (e.g., qualquer uma de R1-R9) para fornecer um conjugado pró-amanulina-conector da fórmula I, IA, IB, II, IIA ou IIB. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R1. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R2. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R3. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R4. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R5. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R6. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R7. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R8. Em algumas modalidades, o conector está ligado na posição R9. Em algumas modalidades, o conector inclui uma hidrazina, um dissulfeto, um tioéter ou um dipeptídeo. Em algumas modalidades, o conector inclui um dipeptídeo selecionado de Val-Ala e Val-Cit. Em algumas modalidades, o conector inclui um grupo para-aminobenzila (PAB). Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Cit-Val. Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Ala- Val. Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -((C=O)(CH2)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 6.

[0412]Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -(CH2)n-, onde n é um número inteiro de 2 a 6. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Cit-Val- ((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Ala-Val-((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector L e a porção química Z, tomados juntos como L-Z, são ou .

[0413]Métodos sintéticos de fabricar amatoxina são descritos na Patente dos EUA No 9.676.702, que é incorporada aqui por referência.

[0414]Os anticorpos, ou os fragmentos de ligação ao antígeno, para o uso com as composições e métodos aqui descritos podem ser conjugados com uma amatoxina, tal como α-amanitina ou uma variante da mesma, usando técnicas de conjugação conhecidas na técnica ou aqui descritas. Por exemplo, os anticorpos, ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que reconhecem e se ligam a um antígeno alvo (um anticorpo anti-HC, e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti- CD252) podem ser conjugados com uma amatoxina, tal como α-amanitina ou uma variante da mesma, como descrito em US 2015/0218220, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere, por exemplo, às amatoxinas, tais como α-amanitina e variantes da mesma, bem como conectores covalentes que podem ser usados para conjugação covalente. Auristatinas

[0415]Os anticorpos anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti- CD252) e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos podem ser conjugados com uma citotoxina que é uma auristatina (Pat. dos EUA Nos

5.635.483; 5.780.588). Auristatinas são agentes anti-mitóticos que interferem na dinâmica de microtúbulos, hidrólise de GTP e divisão nuclear e celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584) e têm atividade anticâncer (Pat. dos EUA No 5.663.149) e antifúngica (Pettit et al. (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965). (Pat. dos EUA Nos 5.635.483; 5.780.588). A porção de fármaco de auristatina pode estar ligada ao anticorpo por meio do terminal N (amino) ou o terminal C (carboxila) da porção peptídica de fármaco (WO 02/088172).

[0416]Modalidades de auristatina exemplificativas incluem as porções de fármaco de monometilauristatina ligadas ao terminal N DE e DF, divulgadas em Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Resumo Número 623, apresentado em 28 de março de 2004, cuja divulgação é expressamente incorporada por referência em sua totalidade.

[0417]Uma modalidade de auristatina exemplificativa é MMAE, em que a linha ondulada indica o ponto de fixação covalente ao conector de um conjugado anticorpo- conector (-L-Z-Ab ou -L-Z′, como aqui descrito).

[0418]Outra modalidade de auristatina exemplificativa é MMAF, em que a linha ondulada indica o ponto de fixação covalente ao conector de um conjugado anticorpo-conector (-L-Z-Ab ou -L-Z′, como aqui descrito), como divulgado em US 2005/0238649:

[0419]As auristatinas podem ser preparadas de acordo com os métodos de: Pat. dos EUA No 5.635.483; Pat. dos EUA No 5.780.588; Pettit et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465; Pettit et al. (1998) Anti-Cancer Drug Desing 13: 243-277; Pettit, G. R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al. (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15: 859-863; e Doronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7): 778-784. Maitansinoides

[0420]Os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos podem ser conjugados com uma citotoxina que é um agente de ligação de microtúbulos. Em algumas modalidades, o agente de ligação de microtúbulos é uma maitansina, um maitansinoide ou um análogo de maitansinoide. Os maitansinoides são inibidores mitotóticos que se ligam a microtúbulos e agem inibindo a polimerização de tubulina. A maitansina foi isolada pela primeira vez de arbusto do leste africano Maytenus serrata (Pat. dos EUA No 3.896.111). Subsequentemente, foi descoberto que certos micróbios também produzem maitansinoides, tais como maitansinol e ésteres de maitansinol C-3 (Pat. dos EUA No 4.151.042). Maitansinol sintético e derivados e análogos dos mesmos são divulgados, por exemplo, nas Pat. dos EUA Nos 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016;

4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348;

4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533.

Porções de fármaco maitansinoide são porções atrativas de fármaco em conjugados anticorpo-fármaco porque elas são: (i) relativamente acessíveis para preparar, por fermentação ou modificação química, derivatização de produtos de fermentação, (ii) passíveis de derivatização com grupos funcionais adequados para conjugação por meio de conectores não dissulfeto para anticorpos, (iii) estáveis no plasma e (iv) eficazes contra uma variedade de linhagens de células tumorais.

[0421]Exemplos de maitansinoides adequados incluem ésteres de maitansinol, maitansinol sintético e análogos e derivados de maitansinol. Estão incluídos aqui quaisquer citotoxinas que inibem a formação de microtúbulos e que são altamente tóxicas para as células de mamíferos, como são os maitansinoides, maitansinol e análogos e derivados de maitansinol.

[0422]Exemplos de ésteres de maitansinol adequados incluem aqueles tendo um anel aromático modificado e aqueles tendo modificações em outras posições. Tais maitansinoides adequados são divulgados na Pat. dos EUA Nos 4.137.230; 4.151.042;

4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268;

4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598;

4.361.650; 4.362.663; 4.364.866; 4.424.219 ;4.450.254; 4.322.348; 4.362.663;

4.371.533; 5.208.020; 5.416.064; 5.475.092; 5.585.499; 5.846.545; 6.333.410;

7.276.497; e 7.473.796, as divulgações de cada uma das quais são aqui incorporadas por referência, uma vez que se referem a maitansinoides e derivados dos mesmos.

[0423]Em algumas modalidades, os conjugados anticorpo-fármaco (ADCs) da presente divulgação utilizam o maitansinoide contendo tiol (DM1), formalmente denominado N2′-deacetil-N2′-(3-mercapto-1-oxopropil)-maitansina, como o agente citotóxico. O DM1 é representado pela seguinte fórmula estrutural V:

(V)

[0424]Em uma outra modalidade, os conjugados da presente divulgação utilizam o maitansinoide contendo tiol N2′-deacetil-N2′(4-metil-4-mercapto-1- oxopentil)-maitansina (e.g., DM4) como o agente citotóxico. O DM4 é representado pela seguinte fórmula estrutural VI: (VI)

[0425]Outro maitansinoide compreendendo uma cadeia lateral que contém uma ligação tiol estericamente impedida é N2′-deacetil-N-2′(4-mercapto-1-oxopentil)- maitansina (denominado DM3), representado pela seguinte fórmula estrutural VII: (VII)

[0426]Cada um dos maitansinoides ensinados nas Pat. dos EUA Nos

5.208.020 e 7.276.497 também podem ser usados nos conjugados da presente divulgação. A este respeito, toda a divulgação de 5.208.020 e 7.276.697 é aqui incorporada por referência.

[0427]Muitas posições em maitansinoides podem servir como a posição para ligar covalentemente a porção de ligação e, consequentemente os anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos (-L-Z-Ab ou -L-Z′, como aqui descrito). Por exemplo, espera-se que a posição C-3 tendo um grupo hidroxila, a posição C-14 modificada com hidroximetila, a posição C-15 modificada com hidróxi e a posição C- 20 tendo um grupo hidróxi sejam úteis. Em algumas modalidades, a posição C-3 serve como a posição para ligar covalentemente a porção conectora e, em algumas modalidades particulares, a posição C-3 de maitansinol serve como a posição para ligar covalentemente a porção de ligação. Existem muitos grupos de ligação conhecidos na técnica para fabricar conjugados anticorpo-maitansinoide, incluindo, por exemplo, aqueles divulgados nas Pat. dos EUA Nos 5.208.020, 6.441.163 e Patente EP No 0425235 B1; Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992); e U.S. 2005/0169933 A1, as divulgações dos quais são aqui expressamente incorporadas por referência. Grupos de ligação adicionais são descritos e exemplificados aqui.

[0428]A presente divulgação também inclui vários isômeros e misturas de maitansinoides e conjugados. Certos compostos e conjugados da presente divulgação podem existir em várias formas estereoisoméricas, enantioméricas e diastereoméricas. Várias descrições para produzir tais conjugados anticorpo- maitansinoide são fornecidas nas Pat. dos EUA Nos 5.208.020; 5.416.064; 6.333.410;

6.441.163; 6.716.821; e 7.368.565, cada uma das quais é aqui incorporada em sua totalidade. Antraciclinas

[0429]Em outras modalidades, os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos podem ser conjugados com uma citotoxina que é uma molécula de antraciclina. Antraciclinas são compostos antibióticos que exibem atividade citotóxica. Estudos têm indicado que as antraciclinas podem operar para matar células por vários mecanismos diferentes incluindo: 1) intercalação das moléculas de fármaco no DNA da célula inibindo assim a síntese de ácido nucleico dependente de DNA; 2) produção pelo fármaco de radicais livres que então reagem com as macromoléculas celulares para causar danos às células ou 3) interações das moléculas de fármaco com a membrana da célula [ver, e.g., C. Peterson et al.”, Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia” em Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy; N.R. Bachur, “Free Radical Damage” id. nas páginas 97 a 102]. Por causa do seu potencial citotóxico, as antraciclinas foram usadas no tratamento de numerosos cânceres, tais como leucemia, carcinoma de mama, carcinoma de pulmão, adenocarcinoma de ovário e sarcomas [ver e.g., P.H- Wiernik, em Anthracycline: Current Status And New Developments p 11]. As antraciclinas comumente usadas incluem doxorrubicina, epirubicina, idarrubicina e daunomicina.

[0430]Acredita-se que o análogo de antraciclina, doxorrubicina (ADRIAMICINA) interage com o DNA pela intercalação e inibição da progressão da enzima topoisomerase II, que desenrola o DNA para transcrição. A doxorrubicina estabiliza o complexo topoisomerase II depois de quebrar a cadeia de DNA para replicação, evitando que a dupla hélice de DNA seja selada novamente e, desse modo, parando o processo de replicação. A doxorrubicina e daunorrubicina (DAUNOMICINA) são protótipos do produto natural citotóxico de antraciclinas quimioterapêuticas (Sessa et al., (2007) Cardiovasc. Toxicol. 7: 75-79).

[0431]Antraciclinas comumente usadas incluem doxorrubicina, epirubicina, idarrubicina e daunomicina. Em algumas modalidades, a citotoxina é uma antraciclina selecionada do grupo que consiste em daunorrubicina, doxorrubicina, epirubicina e idarrubicina.

[0432]Exemplos representativos de antraciclinas incluem, mas não são limitados a daunorrubicina (Cerubidina; Bedford Laboratories), doxorrubicina

(Adriamicina; Bedford Laboratories; também referida como cloridreto de doxorrubicina, hidróxi-daunorrubicina e Rubex), epirubicina (Ellence; Pfizer) e idarrubicina (Idamicina; Pfizer Inc.). Acredita-se que o análogo de antraciclina, doxorrubicina (ADRIAMICINA) interage com o DNA pela intercalação e inibição da progressão da enzima topoisomerase II, que desenrola o DNA para transcrição. A doxorrubicina estabiliza o complexo topoisomerase II depois de quebrar a cadeia de DNA para replicação, evitando que a dupla hélice de DNA seja selada novamente e, desse modo, parando o processo de replicação. A doxorrubicina e a daunorrubicina (DAUNOMICINA) são protótipos do produto natural citotóxico de antraciclinas quimioterapêuticas (Sessa et al., (2007) Cardiovasc. Toxicol. 7: 75-79).

[0433]Um exemplo não limitativo de uma antraciclina adequada para o uso aqui é PNU-159682 (“PNU”). PNU exibe citotoxicidade superior a 3000 vezes em relação à nemorrubicina precursora (Quintieri et al., Clinical Cancer Research 2005, 11, 1608-1617). PNU é representada pela fórmula estrutural: .

[0434]Múltiplas posições em antraciclinas, tais como PNU, podem servir como a posição para ligar covalentemente a porção de ligação e, consequentemente os anticorpos anti-CD117 ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos como aqui descrito. Por exemplo, conectores podem ser introduzidos através de modificações na cadeia lateral de hidroximetil cetona.

[0435]Em algumas modalidades, a citotoxina é um derivado de PNU representado pela fórmula estrutural:

, em que a linha ondulada indica o ponto de fixação covalente ao conector do ADC como aqui descrito.

[0436]Em algumas modalidades, a citotoxina é um derivado de PNU representado pela fórmula estrutural: , em que a linha ondulada indica o ponto de fixação covalente ao conector do ADC como aqui descrito. Pirrolobenzodiazepinas (PBDs)

[0437]Em outras modalidades, os anticorpos anti-HC (e.g., anticorpo anti- CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti- CD137 ou anticorpo anti-CD252) ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos podem ser conjugados com uma citotoxina que é uma pirrolobenzodiazepina (PBD) ou uma citotoxina que compreende uma PBD. As PBDs são produtos naturais produzidos por certos actinomicetos e foram mostrados como sendo compostos alquilantes seletivos de sequências de DNA. As citotoxinas PBD incluem, mas não são limitadas a antramicina, PBDs diméricas e aquelas divulgadas em, por exemplo, Hartley, JA (2011) The development of pyrrolobenzodiazepines as antitumour agents. Expert Opin Inv Drug, 20(6), 733-744 e Antonow D, Thurston DE (2011) Synthesis of DNA-interactive pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepines (PBDs). Chem

Rev 111: 2815-2864.

[0438]Em algumas modalidades, a citotoxina é um dímero de pirrolobenzodiazepina representado pela fórmula estrutural: , em que a linha ondulada indica o ponto de fixação do conector.

[0439]Em algumas modalidades, a citotoxina é conjugada com o anticorpo, ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por meio de um conector maleimidocaproil.

[0440]Em algumas modalidades, o conector compreende um ou mais de um peptídeo, oligossacarídeo, -(CH2)p-, -(CH2CH2O)q-, -(C=O)(CH2)r-, -(C=O)(CH2CH2O)t- , -(NHCH2CH2)u-, -PAB, Val-Cit-PAB, Val-Ala-PAB, Val-Lys(Ac)-PAB, Phe-Lys-PAB, Phe-Lys(Ac)-PAB, D-Val-Leu-Lys, Gly-Gly-Arg, Ala-Ala-Asn-PAB ou Ala-PAB, em que cada um de p, q, r, t e u são inteiros de 1 a 12, selecionados independentemente para cada ocorrência.

[0441]Em algumas modalidades, o conector tem a estrutura da fórmula: , em que R1 é CH3 (Ala) ou (CH2)3NH(CO)NH2 (Cit).

[0442]Em algumas modalidades, o conector, antes da conjugação com o anticorpo e incluindo o substituinte reativo Z’, tomados juntos como L-Z’, tem a estrutura: ,

em que a linha ondulada indica o ponto de fixação da citotoxina (e.g., uma PBD). Em certas modalidades, R1 é CH3.

[0443]Em algumas modalidades, o conjugado citotoxina-conector, antes da conjugação com o anticorpo e incluindo o substituinte reativo Z’, tomados juntos como Cy-L-Z’, tem a fórmula estrutural: .

[0444]Esse conjugado citotoxina-conector particular é conhecido como tesirina (SG3249), e foi descrito em, por exemplo, Howard et al., ACS Med. Chem. Lett. 2016, 7(11), 983-987, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0445]Em algumas modalidades, a citotoxina é um dímero de pirrolobenzodiazepina representado pela fórmula estrutural: , em que a linha ondulada indica o ponto de fixação do conector.

[0446]Em algumas modalidades, o conjugado citotoxina-conector, antes da conjugação com o anticorpo e incluindo o substituinte reativo Z’, tomados juntos como Cy-L-Z’, tem a fórmula estrutural:

O N O O NH N O O N H H

O OMe MeO N

HN N

O O OMe

O N H .

[0447]Esse conjugado citotoxina-conector particular é conhecido como talirina, e foi descrito, por exemplo, em relação à talirina do ADC Vadastuximabe (SGN-CD33A), Mantaj et al., Angewandte Chemie International Edition English 2017,56, 462-488, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0448]Em algumas modalidades, a citotoxina é um pseudodímero de indolinobenzodiazepina tendo a fórmula estrutural: , em que a linha ondulada indica o ponto de fixação do conector.

[0449]Em algumas modalidades, o conjugado citotoxina-conector, antes da conjugação com o anticorpo e incluindo o substituinte reativo Z’, tomados juntos como Cy-L-Z’, tem a fórmula estrutural:

, que compreende o ADC IMGN632, divulgado em, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Internacional No WO2017004026, que é aqui incorporado por referência. Caliqueamicina

[0450]Em outras modalidades, os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos podem ser conjugados com uma citotoxina que é um antibiótico antitumor de enedina (e.g., caliqueamicinas, ozogamicina). A família caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir quebras de DNA de filamento duplo em concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família caliqueamicina, ver Pat. dos EUA Nos 5.712.374; 5.714.586; 5.739.116; 5.767.285;

5.770.701; 5.770.710; 5.773.001; e 5.877.296 (todos da American Cyanamid Company). Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser usados incluem, mas não são limitados àqueles divulgados em, por exemplo, Hinman et al., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998), e as patentes do EUA anteriormente mencionadas da American Cyanamid.

[0451]Uma caliqueamicina exemplificativa é designada γ1, que é aqui referenciada simplesmente como gama, e tem a fórmula estrutural:

.

[0452]Em algumas modalidades, a caliqueamicina é um derivado de caliqueamicina gama ou um derivado de N-acetil caliqueamicina gama. Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser usados incluem, mas não são limitados àqueles divulgados em, por exemplo, Hinman et al., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998), e as patentes dos EUA anteriormente mencionadas. As caliqueamicinas contêm uma porção de metiltrissulfeto que pode ser reagida com tióis apropriados para formar dissulfetos, ao mesmo tempo introduzir um grupo funcional que é útil na fixação de um derivado de caliqueamicina a um anticorpo anti-CD117 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como aqui descrito, por meio de um conector. Para a preparação de conjugados da família caliqueamicina, ver Pat. dos EUA Nos 5.712.374; 5.714.586;

5.739.116; 5.767.285; 5.770.701; 5.770.710; 5.773.001; e 5.877.296 (todos da American Cyanamid Company). Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser usados incluem, mas não são limitados àqueles divulgados em, por exemplo, Hinman et al., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998), e as patentes dos EUA anteriormente mencionadas da American Cyanamid.

[0453]Em uma modalidade, a citotoxina do ADC, como aqui divulgado, é um derivado de dissulfeto de caliqueamicina representado pela fórmula estrutural:

, em que a linha ondulada indica o ponto de fixação do conector. Citotoxinas Adicionais

[0454]Em outras modalidades, os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos aqui descritos podem ser conjugados com uma citotoxina diferente ou além daquelas citotoxinas aqui divulgadas acima. Citotoxinas adicionais adequadas para o uso com as composições e métodos aqui descritos incluem, sem limitação, 5-etiniluracila, abiraterona, acilfulveno, adecipenol, adozelesina, aldesleucina, altretamina, ambamustina, amidox, amifostina, ácido aminolevulínico, anrubicina, ansacrina, anagrelida, anastrozol, andrografólido, inibidores da angiogênese, antarelix, proteína-1 morfogenética anti-dorsalizante, antiandrogênio, carcinoma prostático, antiestrogênio, antineoplaston, oligonucleotídeos antisenso, glicinato de afidicolina, genes modulatores da apoptose, reguladores da apoptose, ácido apurínico, asulacrina, atamestano, atrimustina, axinastatina 1, axinastatina 2, axinastatina 3, azasetrona, azatoxina, azatirosina, derivados de bacatina III, balanol, batimastato, antagonistas BCR/ABL, benzoclorinas, benzoilestaurosporina, derivados de beta lactama, beta-aletina, betaclamicina B, ácido betulínico, inibidores bFGF, bicalutamida, bisantreno, bisaziridinilespermina, bisnafida, bistrateno A, bizelesina, breflato, bleomicina A2, bleomicina B2, bropirimina, budotitano, butionina sulfoximina, calcipotriol, calfostina C, derivados de camptotecina (e.g., 10-hidróxi-camptotecina), capecitabina, carboxamida-amino-triazol, carboxiamidotriazol, carzelesina, inibidores de caseína cinase, castanospermina, cecropina B, cetrorrelix, clorinas, sulfonamida de cloroquinoxalina, cicaprosta, cis-porfirina, cladribina, clomifeno e análogos do mesmo, clotrimazol, colismicina A, colismicina B, combretastatina A4, análogos de combretastatina, conagenina, crambescidina 816, crisnatol, criptoficina 8, derivados de criptoficina A, curacina A, ciclopentantraquinonas, cicloplatam, cipemicina, ocfosfato de citarabina, fator citolítico, citostatina, dacliximabe, decitabina, desidrodidemnina B, 2’desoxicoformicina (DCF), deslorelina, dexifosfamida, dexrazoxano, dexverapamil, diaziquona, didemnina B, didox, dietilnorspermina, di- hidro-5-azacitidina, di-hidrotaxol, dioxamicina, difenil espiromustina, discodermolida, docosanol, dolasetron, doxifluridina, droloxifeno, dronabinol, duocarmicina SA, ebseleno, ecomustina, edelfosina, edrecolomabe, eflornitina, elemeno, emitefur, epotilonas, epitilones, epristerida, estramustina e análogos do mesma, etoposídeo, 4’- fosfato de etoposídeo (também referido como etopofos), exemestano, fadrozol, fazarabina, fenretinida, filgrastim, finasteride, flavopiridol, flezelastina, fluasterona, fludarabina, cloridreto de fluorodaunorunicina, forfenimex, formestano, fostriecina, fotemustina, gadolínio texafirina, nitrato de gálio, galocitabina, ganirelix, inibidores da gelatinase, gemcitabina, inibidores de glutationa, hepsulfam, homoharringtonina (HHT), hipericina, ácido ibandrônico, idoxifeno, idramantona, ilmofosina, ilomastat, imidazoacridonas, imiquimod, peptídeos imunoestimulantes, iobenguane, iododoxorrubicina, ipomeanol, irinotecano, iroplact, irsogladina, isobengazol, jasplaquinolídeo, kahalalida F, triacetato de lamelarina-N, lanreotida, leinamicina, lenograstima, sulfato de lentinana, leptolstatina, letrozol, compostos de platina lipofílica, lissoclinamida 7, lobaplatina, lometrexol, lonidamina, losoxantrona, loxoribina, lurtotecano, lutécio texafirina, lisofilina, masoprocol, maspina, inibidores da metaloproteinase da matriz, menogarila, merbarone, meterelina, metioninase, metoclopramida, inibidor da MIF, ifepristona, miltefosina, mirimostim, mitracin, mitoguazona, mitolactol, mitomicina e análogos da mesma, mitonafida, mitoxantrona, mofaroteno, molgramostim, micaperóxido B, miriaporona, N-acetildinalina, N-

benzamidas substituídas, nafarelina, nagrestip, napavina, nafterpina, nartograstim, nedaplatina, nemorrubicina, ácido neridrônico, nilutamida, nisamicina, nitrolin, octreotide, okicenone, onapristona, ondansetrona, oracina, ormaplatina, oxaliplatina, oxaunomicina, paclitaxel e análogos do mesmo, palauamina, palmitoilrizoxina, ácido pamidrônico, panaxitriol, panomifeno, parabactina, pazeliptina, pegaspargase, peldesina, pentosan polissulfato sódico, pentostatina, pentrozol, perflubron, perfosfamida, fenazinomicina, picibanila, pirarrubicina, piritrexim, podofilotoxina, porfiromicina, inibidores da fosforilase de nucleosídeos de purina, raltitrexede, rizoxina, rogletimida, roituquina, rubiginona B1, ruboxyl, safingol, saintopina, sarcofitol A, sargramostima, sobuzoxane, sonermina, ácido esparfósico, espiramicina D, espiromustina, estipiamida, sulfinosina, talimustina, tegafur, temozolomida, teniposídeo, taliblastina, tiocoralina, tirapazamina, topotecano, topsentina, triciribina, trimetrexato, veramina, vinorelbina, vinxaltine, vorozol, zeniplatina e zilascorbe, entre outros. Conectores

[0455]Uma variedade de conectores pode ser usada para conjugar os anticorpos, ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, aqui descritos (e.g., um anticorpo anti-CD117, um anticorpo anti-CD45, um anticorpo anti-CD2, um anticorpo anti-CD5, um anticorpo anti-CD137 ou um anticorpo anti-CD252) com uma molécula citotóxica.

[0456]O termo “conector”, como aqui usado, significa uma porção química divalente compreendendo uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que fixa covalentemente um anticorpo anti-HC (e.g., um anticorpo anti-CD117, um anticorpo anti-CD45, um anticorpo anti-CD2, um anticorpo anti-CD5, um anticorpo anti-CD137 ou um anticorpo anti-CD252) dos conjugados fármacos (ADC) da presente divulgação (ADCs; Ab-Z-L-D, onde D é uma citotoxina). Os conectores adequados têm dois terminais reativos, um para a conjugação com um anticorpo e o outro para a conjugação com uma citotoxina. O reativo terminal para conjugação com anticorpo do conector (porção reativa, Z′) é tipicamente um sítio que é capaz de conjugar com o anticorpo por meio de um grupo tiol de cisteína ou lisina amina no anticorpo e, portanto, é tipicamente um grupo reativo com tiol, tal como uma ligação dupla (como em maleimida) ou um grupo de partida, tal como um cloro, bromo, iodo ou um grupo R-sulfanila, ou um grupo reativo com amina, tal como um grupo carboxila; enquanto o terminal reativo para conjugação com anticorpo do conector é tipicamente um sítio que é capaz de conjugar com a citotoxina através da formação de uma ligação amida com uma amina básica ou grupo carboxila na citotoxina e, portanto, é tipicamente um grupo carboxila ou amina básica. Quando o termo “conector” é usado para descrever o conector na forma conjugada, um ou ambos os terminais reativos serão ausentes (tal como porção reativa Z′, tendo sido convertida em porção química Z) ou incompletos (tal como sendo apenas a carbonila do ácido carboxílico) por causa da formação das ligações entre o conector e/ou a citotoxina, e entre o conector e/ou o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Tais reações de conjugação são descritas mais adiante neste documento.

[0457]Em algumas modalidades, o conector é clivável sob condições intracelulares, de tal modo que a clivagem do conector libere a unidade de fármaco do anticorpo no ambiente intracelular. Em ainda outras modalidades, a unidade de conexão não é clivável e o fármaco é liberado, por exemplo, por degradação do anticorpo. Os conectores úteis para os presentes ADCs são preferivelmente estáveis extracelularmente, evitam a agregação de moléculas do ADC e mantêm o ADC livremente solúvel em meios aquosos e em um estado monomérico. Antes do transporte ou liberação em uma célula, o ADC é preferivelmente estável e permanece intacto, i.e. o anticorpo permanece ligado à porção de fármaco. Os conectores são estáveis fora da célula alvo e podem ser clivados em alguma taxa eficaz dentro da célula. Um conector eficaz irá: (i) manter as propriedades de ligação específicas do anticorpo; (ii) permitir a liberação intracelular do conjugado ou porção de fármaco; (iii) permanecer estável e intacto, i.e. não clivado até que o conjugado tenha sido liberado ou transportado para seu sítio alvo; e (iv) manter um efeito citotóxico de morte celular ou um efeito citostático da porção citotóxica. A estabilidade do ADC pode ser medida por técnicas analíticas padrão, tais como espectroscopia de massa, HPLC e a técnica de separação/análise LC/MS. A fixação covalente do anticorpo e a porção de fármaco exige que o conector tenha dois grupos funcionais reativos, i.e. bivalência em um sentido reativo. Os conectores reagentes bivalentes que são úteis para fixar duas ou mais porções funcional ou biologicamente ativas, tais como peptídeos, ácidos nucleicos, fármacos, toxinas, anticorpos, haptenos e grupos repórter são conhecidos, e métodos foram descritos para seus conjugados resultantes (Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate Technics; Academic Press: New York, p. 234-242).

[0458]Os conectores incluem aqueles que podem ser clivados, por exemplo, por hidrólise enzimática, fotólise, hidrólise sob condições ácidas, hidrólise sob condições básicas, oxidação, redução de dissulfeto, clivagem nucleofílica ou clivagem organometálica (ver, por exemplo, Leriche et al., Bioorg. Med. Chem., 20: 571-582, 2012, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere aos conectores adequados para conjugação covalente). Os conectores cliváveis adequados podem incluir, por exemplo, porções químicas, tais como uma hidrazina, um dissulfeto, um tioéter ou um dipeptídeo.

[0459]Conectores hidrolisáveis sob condições ácidas incluem, por exemplo, hidrazonas, semicarbazonas, tiosemicarbazonas, amidas cis-aconíticas, ortoésteres, acetais, cetais ou semelhantes. (Ver, e.g., Pat. dos EUA Nos 5.122.368; 5.824.805;

5.622.929; Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264: 14653-14661, a divulgação de cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade no que se refere aos conectores adequados para conjugação covalente. Tais conectores são relativamente estáveis sob condições de pH neutro, tais como aquelas no sangue, mas são instáveis abaixo do pH 5,5 ou 5,0, o pH aproximado do lisossoma.

[0460]Conectores cliváveis sob condições de redução incluem, por exemplo, um dissulfeto. Uma variedade de conectores de dissulfeto são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, aqueles que podem ser formados usando SATA (N- succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) e SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil- alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno), SPDB e SMPT (Ver, e.g., Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47: 5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press,

1987. Ver também Pat. dos EUA No 4.880.935, a divulgação de cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade no que se refere aos conectores adequados para conjugação covalente.

[0461]Conectores suscetíveis a hidrólise enzimática podem ser, e.g., um conector contendo peptídeo que é clivado por uma peptidase intracelular ou enzima protease, incluindo, mas não limitada a uma protease lisossomal ou endossomal. Uma vantagem de usar liberação proteolítica intracelular do agente terapêutico é que o agente é tipicamente atenuado quando conjugado e as estabilidades séricas dos conjugados são tipicamente altas. Em algumas modalidades, a conector peptidil tem pelo menos dois aminoácidos de comprimento ou pelo menos três aminoácidos de comprimento. Os conectores de aminoácidos exemplificativos incluem um dipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo ou um pentapeptídeo. Exemplos de peptídeos adequados incluem aqueles contendo aminoácidos, tais como Valina, Alanina, Citrulina (Cit), Fenilalanina, Lisina, Leucina e Glicina. Os resíduos de aminoácido que compreendem um componente conector de aminoácido incluem aqueles que ocorrem naturalmente, bem como aminoácidos menores e análogos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente, tais como citrulina. Dipeptídeos exemplificativos incluem valina-citrulina (vc ou val-cit) e alanina-fenilalanina (af ou ala-fe). Tripeptídeos exemplificativos incluem glicina-valina-citrulina (gli-val-cit) e glicina-glicina-glicina (gli- gli-gli). Em algumas modalidades, o conector inclui um dipeptídeo, tal como Val-Cit, Ala-Val, ou Phe-Lys, Val-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Phe-Arg ou Trp-Cit. Os conectores contendo dipeptídeos, tais como Val-Cit ou Phe-Lys são divulgados em, por exemplo, Pat. dos EUA No 6.214.345, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade no que se refere aos conectores adequados para conjugação covalente. Em algumas modalidades, o conector inclui um dipeptídeo selecionado de Val-Ala e Val-Cit.

[0462]Os conectores adequados para conjugar os anticorpos, ou fragmentos de anticorpo dos mesmos, aqui descritos com uma molécula citotóxica incluem aqueles capazes de liberar uma citotoxina por um processo de eliminação 1,6 (um grupo “autoimolativo”). Porções químicas capazes deste processo de eliminação incluem o grupo p-aminobenzila (PAB), ácido 6-maleimido-hexanoico, carbonatos sensíveis ao pH e outros reagentes como descrito em Jain et al., Pharm. Res. 32: 3526-3540, 2015, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade no que se refere aos conectores adequados para conjugação covalente.

[0463]Em algumas modalidades, o conector inclui um grupo “autoimolativo”, tal como o PAB ou PABC (para-aminobenziloxicarbonila) anteriormente mencionado, que são divulgados em, por exemplo, Carl et al., J. Med. Chem. (1981) 24: 479-480; Chakravarty et al. (1983) J. Med. Chem. 26: 638-644; US 6214345; US20030130189; US20030096743; US6759509; US20040052793; US6218519; US6835807; US6268488; US20040018194; W098/13059; US20040052793; US6677435; US5621002; US20040121940; W02004/032828). Outras dessas porções químicas capazes deste processo (“conectores autoimolativos”) incluem carbamatos de metileno e grupos heteroarila, tais como aminotiazóis, aminoimidazóis, aminopirimidinas e semelhantes. Os conectores contendo tais grupos autoimolativos heterocíclicos são divulgados em, por exemplo, Publicação de Patente dos EUA Nos 20160303254 e 20150079114 e Patente dos EUA No 7.754.681; Hay et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 2237; US 2005/0256030; de Groot et al. (2001) J. Org. Chem. 66: 8815-8830; e US 7223837. Em algumas modalidades, um dipeptídeo é usado em combinação com um conector autoimolativo.

[0464]Conectores adequados para o uso aqui podem incluir ainda um ou mais grupos selecionados de alquileno C1-C6, heteroalquileno C1-C6, alquenileno C2-C6, heteroalquenileno C2-C6, alquinileno C2-C6, heteroalquinileno C2-C6, cicloalquileno C3- C6, heterocicloalquileno, arileno, heteroarileno e combinações dos mesmos, cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído. Exemplos não limitativos de tais grupos incluem as unidades (CH2)p, (CH2CH2O)p e -(C=O)(CH2)p -, em que p é um número inteiro de 1 a 6, independentemente selecionado para cada ocasião.

[0465]Os conectores adequados podem conter grupos tendo propriedades de intensificamento de solubilidade. Os conectores incluindo a unidade (CH2CH2O)p (polietilenoglicol, PEG), por exemplo, podem intensificar a solubilidade, assim como as cadeias alquila substituídas por resíduos de amino, ácido sulfônico, ácido fosfônico ou ácido fosfórico. Os conectores incluindo tais porções são divulgados em, por exemplo, Patentes dos EUA Nos 8.236.319 e 9.504.756, a divulgação de cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade no que se refere aos conectores adequados para conjugação covalente. Outros grupos de intensificamento de solubilidade incluem, por exemplo, os grupos acil e carbamoil sulfamida, tendo a estrutura: em que a é 0 ou 1; e R10 é selecionado do grupo consiste em hidrogênio, grupos alquila C1-C24, grupos cicloalquila C3-C24, grupos (hetero)arila C1-C24, grupos alquil(hetero)arila

C1-C24 e grupos (hetero)arilalquila C1-C24, os grupos alquila C1-C24, grupos cicloalquila C3-C24, grupos (hetero)arila C2-C24, grupos alquil(hetero)arila C3-C24 e grupos (hetero)arilalquila C3-C24, cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído e/ou opcionalmente interrompido por um ou mais heteroátomos selecionados de O, S e NR11R12, em que R11 e R12 são independentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio e grupos alquila C1-C4; ou R10 é uma citotoxina, em que a citotoxina está opcionalmente conectada a N por meio de uma porção espaçadora. Os conectores contendo tais grupos são descritos, por exemplo, na Patente dos EUA No 9.636.421 e Publicação de Pedido de Patente dos EUA No 2017/0298145, as divulgações dos quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade no que se refere aos conectores adequados para conjugação covalente com citotoxinas e anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.

[0466]Em algumas modalidades, o conector pode incluir um ou mais de uma hidrazina, um dissulfeto, um tioéter, um dipeptídeo, um grupo p-aminobenzila (PAB), um grupo autoimolativo heterocíclico, uma alquila C1-C6 opcionalmente substituída, uma heteroalquila C1-C6 opcionalmente substituída, uma alquenila C2-C6 opcionalmente substituída, uma heteroalquenila C2-C6 opcionalmente substituída, uma alquinila C2-C6 opcionalmente substituída, uma heteroalquinila C2-C6 opcionalmente substituída, uma cicloalquila C3-C6 opcionalmente substituída, uma heterocicloalquila opcionalmente substituída, uma arila opcionalmente substituída, uma heteroarila opcionalmente substituída, um grupo de intensificamento de solubilidade, acila, grupo -(C=O)- ou -(CH2CH2O)p-, em que p é um número inteiro de 1 a 6. Um especialista na técnica reconhecerá que um ou mais dos grupos listados podem estar presentes na forma de uma espécie bivalente (diradical), e.g., alquileno C1-C6 e semelhantes.

[0467]Em algumas modalidades, o conector inclui um grupo p-aminobenzila

(PAB). Em uma modalidade, o grupo p-aminobenzila está disposto entre o fármaco citotóxico e um sítio de clivagem de protease no conector. Em uma modalidade, o grupo p-aminobenzila é parte de uma unidade p-aminobenziloxicarbonila. Em uma modalidade, o grupo p-aminobenzila é parte de uma unidade p-aminobenzilamido.

[0468]Em algumas modalidades, o conector compreende PAB, Val-Cit-PAB, Val-Ala- PAB, Val-Lys(Ac)-PAB, Phe-Lys-PAB, Phe-Lys(Ac)-PAB, D-Val-Leu-Lys, Gly- Gly-Arg, Ala-Ala-Asn-PAB ou Ala-PAB.

[0469]Em algumas modalidades, o conector compreende uma combinação de um ou mais de um peptídeo, oligossacarídeo, -(CH2)p-, -(CH2CH2O)p-, PAB, Val-Cit- PAB, Val-Ala-PAB, Val-Lys(Ac)-PAB, Phe-Lys-PAB, Phe-Lys(Ac)-PAB, D-Val-Leu- Lys, Gly-Gly-Arg, Ala-Ala-Asn-PAB ou Ala-PAB.

[0470]Em algumas modalidades, o conector compreende uma unidade - (C=O)(CH2)p-, em que p é um número inteiro de 1 a 6.

[0471]Em algumas modalidades, o conector compreende uma unidade - (CH2)n-, em que n é um número inteiro de 2 a 6.

[0472]Em certas modalidades, o conector do ADC é maleimidocaproil-Val-Ala- para-aminobenzila (mc-Val-Ala-PAB).

[0473]Em certas modalidades, o conector do ADC é maleimidocaproil-Val-Cit- para-aminobenzila (mc-vc-PAB).

[0474]Em algumas modalidades, o conector compreende .

[0475]Em algumas modalidades, o conector compreende MCC (4-[N- maleimidometil]cicloexano-1-carboxilato).

[0476]Em uma modalidade específica, o conector compreende a estrutura em que as linhas onduladas indicam os pontos de fixação da citotoxina e da porção reativa Z′. Em outra modalidade específica, o conector compreende a estrutura em que as linhas onduladas indicam os pontos de fixação da citotoxina e da porção reativa Z′. Tais conectores PAB-dipeptídeo-propionil são divulgados em, e.g., Publicação de Pedido de Patente No WO2017/149077, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Além disso, as citotoxinas divulgadas em WO2017/149077 são incorporadas aqui por referência.

[0477]Os conectores que podem ser usados para conjugar um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, com um agente citotóxico incluem aqueles que são ligados covalentemente ao agente citotóxico em uma extremidade do conector e, na outra extremidade do conector, contêm uma porção química formada a partir de uma reação de acoplamento entre um substituinte reativo presente no conector e um substituinte reativo presente dentro do anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a CD117 (tal como CD117 GNNK+). Substituintes reativos que podem estar presentes dentro de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a CD117 (tal como CD117 GNNK+) incluem, sem limitação, porções hidroxila de resíduos de serina, treonina e tirosina; porções amino de resíduos de lisina; porções carboxila de resíduos de ácido aspártico e ácido glutâmico; e porções tiol de resíduos de cisteína, bem como porções de propargil, azido, haloarila (e.g., fluoroarila), halo-heteroarila (e.g., fluoro- heteroarila), haloalquila e halo-heteroalquila de aminoácidos que não ocorrem naturalmente.

[0478]Exemplos de conectores úteis para a síntese de conjugados fármaco- anticorpo incluem aqueles que contêm eletrófilos, tais como aceptores de Michael (e.g., maleimidas), ésteres ativados, compostos carbonila deficientes em elétrons e aldeídos, entre outros, adequados para a reação com os substituintes nucleofílicos presentes dentro de anticorpos ou dos fragmentos de ligação ao antígeno, tais como porções amina e tiol. Por exemplo, os conectores adequados para a síntese de conjugados fármaco-anticorpo incluem, sem limitação, succinimidil 4-(N- maleimidometil)-cicloexano-L-carboxilato (SMCC), N-succinimidil iodoacetato (SIA), sulfo-SMCC, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimidil (MBS), sulfo-MBS e succinimidil iodoacetato, entre outros descrito, por exemplo, Liu et al., 18: 690-697, 1979, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere aos conectores para conjugação química. Conectores adicionais incluem os conectores maleimidocaproil não cliváveis, que são particularmente úteis para a conjugação de agentes de rompimento de microtúbulos, tais como auristatinas, são descritos por Doronina et al., Bioconjugate Chem. 17: 14-24, 2006, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere aos conectores para conjugação química.

[0479]Será reconhecido por um especialista na técnica que qualquer um ou mais dos grupos químicos, porções e características aqui divulgados podem ser combinados de múltiplas maneiras para formar conectores úteis para a conjugação dos anticorpos e citotoxinas como aqui divulgado. Outros conectores úteis em conjunto com as composições e métodos aqui descritos, são descritos, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente dos EUA No 2015/0218220, cuja divulgação é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0480]Em certas modalidades, um intermediário, que é o precursor do conector, é reagido com a porção de fármaco sob condições apropriadas. Em certas modalidades, os grupos reativos são usados no fármaco e/ou no intermediário ou conector. O produto da reação entre o fármaco e o intermediário, ou o fármaco derivatizado, é subsequentemente reagido com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno sob condições apropriadas. Alternativamente, o conector ou intermediário pode primeiro ser reagido com o anticorpo ou um anticorpo derivatizado e depois reagido com o fármaco ou fármaco derivatizado. Tais reações de conjugação serão agora descritas de forma mais completa.

[0481]Várias reações diferentes estão disponíveis para a fixação covalente de conectores ou conjugados fármaco-conector com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Os pontos de fixação adequados na molécula de anticorpo incluem os grupos amina de lisina, os grupos de ácido carboxílico livres de ácido glutâmico e ácido aspártico, os grupos sulfidrila de cisteína e as várias porções dos aminoácidos aromáticos. Por exemplo, a fixação covalente não específica pode ser realizada usando uma reação de carbodi-imida para ligar um grupo carbóxi (ou amino) em um composto a um grupo amino (ou carbóxi) em uma porção de anticorpo. Além disso, agentes bifuncionais, tais como dialdeídos ou imidoésteres também podem ser usados para ligar o grupo amino em um composto a um grupo amino em uma porção de anticorpo. Também disponível para a fixação de fármacos a agentes de ligação é a reação de base de Schiff. Este método envolve a oxidação de periodato de um fármaco que contém grupos glicol ou hidróxi, formando assim um aldeído que é então reagido com o agente de ligação. A fixação ocorre por meio da formação de uma base de Schiff com grupos amino do agente de ligação. Os isotiocianatos também podem ser usados como agentes de acoplamento para fixar covalentemente fármacos aos agentes de ligação. Outras técnicas são conhecidas pelo especialista e dentro do escopo da presente divulgação.

[0482]Conectores úteis para conjugação com os anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno como aqui descritos incluem, sem limitação, conectores contendo porções químicas Z formadas por reações de acoplamento como representado na Tabela 4, abaixo.

As linhas curvadas designam os pontos de fixação do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, e da molécula citotóxica, respectivamente.

Tabela 4. Porções químicas Z exemplificativas formadas por reações de acoplamento na formação de conjugados anticorpo-fármaco Reações de Acoplamento Porção Química Z Formada por Reações de Acoplamento Exemplificativas [3+2] Cicloadição

[3+2] Cicloadição

[3+2] Cicloadição, Esterificação

[3+2] Cicloadição, Esterificação [3+2] Cicloadição, Esterificação [3+2] Cicloadição Adição de Michael Adição de Michael Condensação de Imina, Amidação Condensação de Imina Formação de dissulfeto Alquilação de tiol Condensação, Adição de Michael

[0483]Um especialista na técnica reconhecerá que um substituinte reativo Z′ ligado ao conector e um substituinte reativo no anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, estão envolvidos na reação de acoplamento covalente para produzir a porção química Z, e reconhecerão a porção reativa Z′. Portanto, os conjugados anticorpo-fármaco úteis em conjunto com os métodos aqui descritos podem ser formados pela reação de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, com um conector ou conjugado citotoxina-conector, como aqui descrito, o conector ou conjugado citotoxina-conector incluindo um substituinte reativo Z′, adequado para reação com um substituinte reativo no anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, para formar a porção química Z.

[0484]Como representado na tabela 4, exemplos de substituintes adequadamente reativos no conector e anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo incluem um nucleófilo/eletrófilo par (e.g., um par tiol/haloalquila, um par amina/carbonila ou um par tiol/α,β-carbonila insaturada, e semelhantes), um par dieno/dienófilo (e.g., um par azida/alcino ou um par dieno/α,β-carbonila insaturada, entre outros), e semelhantes. As reações de acoplamento entre os substituintes reativos para formar a porção química Z incluem, sem limitação, alquilação de tiol, alquilação de hidroxila, alquilação de amina, condensação de amina ou hidroxilamina, formação de hidrazina, amidação, esterificação, formação de dissulfeto, cicloadição (e.g., [4+2] cicloadição de Diels-Alder, cicloadição de Huisgen [3+2], entre outros), substituição nucleofílica aromática, substituição eletrofílica aromática e outras modalidades reativas conhecidas na técnica ou aqui descritas. Preferivelmente, o conector contém um grupo funcional eletrofílico para reação com um grupo funcional nucleofílico no anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0485]Substituintes reativos que podem estar presentes dentro de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como aqui divulgado incluem, sem limitação, grupos nucleofílicos tais como (i) grupos amina N-terminais, (ii) grupos amina de cadeia lateral, e.g., lisina, (iii) grupos tiol de cadeia lateral, e.g., cisteína e (iv) grupos hidroxila ou amino de açúcar onde o anticorpo é glicosilado.

Substituintes reativos que podem estar presentes dentro de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como aqui divulgado incluem, sem limitação, porções hidroxila de resíduos de serina, treonina e tirosina; porções amino de resíduos de lisina; porções carboxila de resíduos de ácido aspártico e ácido glutâmico; e porções tiol de resíduos de cisteína, bem como porções de propargil, azido, haloarila (e.g., fluoroarila), halo-heteroarila (e.g., fluoro-heteroarila), haloalquila e halo-heteroalquila de aminoácidos que não ocorrem naturalmente. Em algumas modalidades, os substituintes reativos presentes dentro de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como aqui divulgado incluem, porções de amina ou tiol. Certos anticorpos têm dissulfetos intercadeia reduzíveis, i.e. pontes de cisteína. Os anticorpos podem ser tornados reativos para conjugação com reagentes conectores pelo tratamento com um agente redutor, tal como DTT (ditiotreitol). Cada ponte de cisteína, portanto, formará, teoricamente, dois nucleófilos de tiol reativos. Grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos em anticorpos por meio da reação de lisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut) que resulta na conversão de uma amina em um tiol. Grupos tiol reativos podem ser introduzidos no anticorpo (ou fragmento do mesmo) introduzindo um, dois, três, quatro ou mais resíduos de cisteína (e.g., preparar anticorpos mutantes compreendendo um ou mais resíduos de aminoácido de cisteína não nativos). A Pat. dos EUA No 7.521.541 ensina a engenharia de anticorpos pela introdução de aminoácidos de cisteína reativos.

[0486]Em algumas modalidades, a porção reativa Z′ ligada ao conector é um grupo nucleofílico que é reativo com um grupo eletrofílico presente em um anticorpo. Grupos eletrofílicos úteis em um anticorpo incluem, mas não são limitados aos grupos aldeído e carbonil cetona. O heteroátomo de um grupo nucleofílico pode reagir com um grupo eletrofílico em um anticorpo e formar uma ligação covalente com o anticorpo. Grupos nucleofílicos úteis incluem, mas não são limitados a hidrazida, oxima, amino, hidroxila, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e ari-lhidrazida.

[0487]Em algumas modalidades, Z é o produto de uma reação entre substituintes nucleofílicos reativos presentes dentro dos anticorpos, ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, tais como porções amina e tiol e um substituinte eletrofílico reativo Z′. Por exemplo, Z′ pode ser um aceptor de Michael (e.g., maleimida), éster ativado, composto carbonila deficiente em elétrons e aldeído, entre outros.

[0488]Por exemplo, conectores adequados para a síntese de ADCs incluem, sem limitação, substituintes reativos Z′ tais como grupos maleimida ou haloalquila. Esses podem estar ligados ao conector por reagentes, tais como succinimidil 4-(N- maleimidometil)-cicloexano-L-carboxilato (SMCC), N-succinimidil iodoacetato (SIA), sulfo-SMCC, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimidil (MBS), sulfo-MBS e succinimidil iodoacetato, entre outros descritos, em por exemplo, Liu et al., 18: 690- 697, 1979, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere aos conectores para conjugação química.

[0489]Em algumas modalidades, o substituinte reativo Z′ ligado ao conector L é um maleimida, azida ou alcino. Um exemplo de um conector contendo maleimida é o conector à base de maleimidocaproil não clivável, que é particularmente útil para a conjugação de agentes de rompimento de microtúbulos, tais como auristatinas. Esses conectores são descritos por Doronina et al., Bioconjugate Chem. 17: 14-24, 2006, cuja divulgação é aqui incorporada por referência no que se refere aos conectores para conjugação química.

[0490]Em algumas modalidades, o substituinte reativo Z′ é -(C=O)- ou - NH(C=O)-, tal que o conector pode ser unido ao anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por uma porção amida ou ureia, respectivamente, resultante da reação do grupo -(C=O)- ou -NH(C=O)- com um grupo amino do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0491]Em algumas modalidades, o substituinte reativo é um grupo N-

maleimidil, grupo N-alquilamido halogenado, grupo sulfoniloxi N-alquilamido, grupo carbonato, grupo haleto de sulfonila, grupo tiol ou derivado do mesmo, grupo alquinila compreendendo uma ligação tripla carbono-carbono interna, grupo (hetero)cicloalquinila, grupo biciclo[6,1,0]non-4-in-9-ila, grupo alquenila compreendendo uma ligação dupla carbono-carbono interna, grupo cicloalquenila, grupo tetrazinila, grupo azido, grupo fosfina, grupo óxido de nitrila, grupo nitrona, grupo nitrila imina, grupo diazo, grupo cetona, grupo (O-alquila)hidroxilamino, grupo hidrazina, grupo N-maleimidil halogenado, grupo 1,1-bis (sulfonilmetil)metilcarbonila ou derivados de eliminação dos mesmos, grupo haleto de carbonila ou um grupo alenamida, cada um dos quais pode ser opcionalmente substituído. Em algumas modalidades, o substituinte reativo compreende um grupo cicloalqueno, um grupo cicloalquino ou um grupo (hetero)cicloalquinila opcionalmente substituído.

[0492]Exemplos não limitativos de conjugados amatoxina-conector contendo um substituinte reativo Z′ adequado para reação com um resíduo reativo no anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo incluem, sem limitação, 7’C-(4-(6- (maleimido)hexanoil)piperazin-1-il)-amatoxina; 7’C-(4-(6- (maleimido)hexanamido)piperidin-1-il)-amatoxina; 7’C-(4-(6-(6- (maleimido)hexanamido)hexanoil)piperazin-1-il)-amatoxina; 7’C-(4-(4- ((maleimido)metil)ciclo-hexanocarbonil)piperazin-1-il)-amatoxina; 7’C-(4-(6-(4- ((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)hexanoil)piperazin-1-il)-amatoxina; 7’C- (4-(2-(6-(maleimido)hexanamido)etil)piperidin-1-il)-amatoxina; 7’C-(4-(2-(6-(6- (maleimido)hexanamido)hexanamido)etil)piperidin-1-il)-amatoxina; 7’C-(4-(2-(4- ((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)etil)piperidin-1-il)-amatoxina; 7’C-(4-(2- (6-(4-((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)hexanamido)etil)piperidin-1-il)- amatoxina; 7’C-(4-(2-(3-carboxipropanamido)etil)piperidin-1-il)-amatoxina; 7’C-(4-(2- (2-bromoacetamido)etil)piperidin-1-il)-amatoxina; 7’C-(4-(2-(3-(piridin-2- ildissulfanil)propanamido)etil)piperidin-1-il)-amatoxina; 7’C-(4-(2-(4-

(maleimido)butanamido)etil)piperidin-1-il)-amatoxina; 7’C-(4-(2- (maleimido)acetil)piperazin-1-il)-amatoxina; 7’C-(4-(3-(maleimido)propanoil)piperazin- 1-il)-amatoxina; 7’C-(4-(4-(maleimido)butanoil)piperazin-1-il)-amatoxina; 7’C-(4-(2-(6- (4-((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)hexanamido)etil)piperidin-1-il)- amatoxina; 7’C-(3-((6-(maleimido)hexanamido)metil)pirrolidin-1-il)-amatoxina; 7’C-(3- ((6-(6-(maleimido)hexanamido)hexanamido)metil)pirrolidin-1-il)-amatoxina; 7’C-(3- ((4-((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)metil)pirrolidin-1-il)-amatoxina; 7’C- (3-((6-((4-(maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)hexanamido)metil)pirrolidin-1- il)-amatoxina; 7’C-(4-(2-(6-(2-(amino-óxi)acetamido)hexanamido)etil)piperidin-1-il)- amatoxina; 7’C-(4-(2-(4-(2-(amino-óxi)acetamido)butanamido)etil)piperidin-1-il)- amatoxina; 7’C-(4-(4-(2-(amino-óxi)acetamido)butanoil)piperazin-1-il)-amatoxina; 7’C- (4-(6-(2-(amino-óxi)acetamido)hexanoil)piperazin-1-il)-amatoxina; 7’C-((4-(6- (maleimido)hexanamido)piperidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(6- (maleimido)hexanamido)etil)piperidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(6- (maleimido)hexanoil)piperazin-1-il)metil)-amatoxina; (R)-7’C-((3-((6- (maleimido)hexanamido)metil)pirrolidin-1-il)metil)-amatoxina; (S)-7’C-((3-((6- (maleimido)hexanamido)metil)pirrolidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(6-(6- (maleimido)hexanamido)hexanamido)etil)piperidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2- (4-((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)etil)piperidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(6-(4-((maleimido)metil)ciclo- hexanocarboxamido)hexanamido)etil)piperidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(6- (maleimido)hexanamido)etil)piperazin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(6-(6- (maleimido)hexanamido)hexanamido)etil)piperazin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2- (4-((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)etil)piperazin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(6-(4-((maleimido)metil)ciclo- hexanocarboxamido)hexanamido)etil)piperazin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((3-((6-(6- (maleimido)hexanamido)hexanamido)-S-metil)pirrolidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((3-

((6-(6-(maleimido)hexanamido)hexanamido)-R-metil)pirrolidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((3-((4-((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)-S-metil)pirrolidin-1-il)metil)- amatoxina; 7’C-((3-((4-((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)-R-metil)pirrolidin- 1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((3-((6-(4-((maleimido)metil)ciclo- hexanocarboxamido)hexanamido)metil)pirrolidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(3- carboxipropanamido)etil)piperazin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(6-(6- (maleimido)hexanamido)hexanoil)piperazin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(6-(4- ((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)hexanoil)piperazin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(maleimido)acetil)piperazin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(3- (maleimido)propanoil)piperazin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(4- (maleimido)butanoil)piperazin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(2- (maleimido)acetamido)etil)piperidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(4- (maleimido)butanamido)etil)piperidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(6-(4- ((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)hexanamido)etil)piperidin-1-il)metil)- amatoxina; 7’C-((3-((6-(maleimido)hexanamido)metil)azetidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((3-(2-(6-(maleimido)hexanamido)etil)azetidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((3-((4- ((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)metil)azetidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C- ((3-(2-(4-((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)etil)azetidin-1il)metil)- amatoxina; 7’C-((3-(2-(6-(4-((maleimido)metil)ciclo- hexanocarboxamido)hexanamido)etil)azetidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-(((2-(6- (maleimido)-N-metil-hexanamido)etil)(metil)amino)metil)-amatoxina; 7’C-(((4-(6- (maleimido)-N-metil-hexanamido)butil(metil)amino)metil)-amatoxina; 7’C-((2-(2-(6- (maleimido)hexanamido)etil)aziridin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((2-(2-(6-(4- ((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)hexanamido)etil)aziridin-1-il)metil)- amatoxina; 7’C-((4-(6-(6-(2-(amino-óxi)acetamido)hexanamido)hexanoil)piperazin-1- il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(1-(amino-óxi)-2-oxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-aza- heptadecan-17-oil)piperazin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(2-(amino-

óxi)acetamido)acetil)piperazin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(3-(2-(amino- óxi)acetamido)propanoil)piperazin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(4-(2-(amino- óxi)acetamido)butanoil)piperazin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(6-(2-(amino- óxi)acetamido)hexanamido)etil)piperidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(2-(2- (amino-óxi)acetamido)acetamido)etil)piperidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(4-(2- (amino-óxi)acetamido)butanamido)etil)piperidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(20- (amino-óxi)-4,19-dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3,18-diazaicosil)piperidin-1-il)metil)- amatoxina; 7’C-(((2-(6-(2-(amino-óxi)acetamido)-N-metil- hexanamido)etil)(metil)amino)metil)-amatoxina; 7’C-(((4-(6-(2-(amino-óxi)acetamido)- N-metil-hexanamido)butil)(metil)amino)metil)-amatoxina; 7’C-((3-((6-(4- ((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)hexanamido)metil)pirrolidin-1-il)-S-metil)- amatoxina; 7’C-((3-((6-(4-((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)hexanamido)- R-metil)pirrolidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(2-bromoacetamido)etil)piperazin-1- il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(2-bromoacetamido)etil)piperidin-1-il)metil)-amatoxina; 7’C-((4-(2-(3-(piridina-2-ildissulfanil)propanamido)etil)piperidin-1-il)metil)-amatoxina; 6’O-(6-(6-(maleimido)hexanamido)hexil)-amatoxina; 6’O-(5-(4- ((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)pentil)-amatoxina; 6’O-(2-((6- (maleimido)hexil)óxi)-2-oxoetil)-amatoxina; 6’O-((6-(maleimido)hexil)carbamoil)- amatoxina; 6’O-((6-(4-((maleimido)metil)ciclo-hexanocarboxamido)hexil)carbamoil)- amatoxina; 6’O-(6-(2-bromoacetamido)hexil)-amatoxina; 7’C-(4-(6- (azido)hexanamido)piperidin-1-il)-amatoxina; 7’C-(4-(hex-5-inoilamino)piperidin-1-il)- amatoxina; 7’C-(4-(2-(6-(maleimido)hexanamido)etil)piperazin-1-il)-amatoxina; 7’C-(4- (2-(6-(6-(maleimido)hexanamido)hexanamido)etil)piperazin-1-il)-amatoxina; 6’O-(6- (6-(11,12-dide-hidro-5,6-di-hidro-dibenz[b,f]azocin-5-il)-6-oxo-hexanamido)hexil)- amatoxina; 6’O-(6-(hex-5-inoilamino)hexil)-amatoxina; 6’O-(6-(2-(amino- óxi)acetilamido)hexil)-amatoxina; 6’O-((6-amino-óxi)hexil)-amatoxina; e 6’O-(6-(2- iodoacetamido)hexil)-amatoxina.

[0493]Um especialista na técnica reconhecerá que a estrutura do grupo substituinte reativo ao conector, antes da conjugação com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, inclui uma maleimida como o grupo Z’. As porções conectoras e conjugados amatoxina-conector anteriores, entre outros úteis em conjunto com as composições e métodos aqui descritos, são descritos, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente dos EUA No 2015/0218220 e Publicação de Pedido de Patente No WO2017/149077, a divulgação de cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0494]Em algumas modalidades, a estrutura do grupo substituinte reativo ao conector L-Z’, antes da conjugação com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é: ou .

[0495]Em algumas modalidades, uma amatoxina como aqui divulgada é conjugada a uma porção reativa ao conector -L-Z′ tendo a seguinte fórmula: .

[0496]Em algumas modalidades, uma amatoxina como aqui divulgada é conjugada a uma porção reativa ao conector -L-Z′ tendo a seguinte fórmula: .

[0497]As porções conectoras e conjugados amatoxina-conector anteriores, entre outros úteis em conjunto com as composições e métodos aqui descritos, são descritos, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente dos EUA No

2015/0218220 e Publicação de Pedido de Patente No WO2017/149077, a divulgação de cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0498]As porções conectoras e conjugados amatoxina-conector anteriores, entre outros úteis em conjunto com as composições e métodos aqui descritos, são descritos, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente dos EUA No 2015/0218220 e Publicação de Pedido de Patente No WO2017/149077, a divulgação de cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0499]Em algumas modalidades, o ADC compreende um anticorpo anti- CD117 conjugado com uma amatoxina incluindo, mas não limitado a uma amatoxina de qualquer uma das fórmulas I, IA, IB, II, IIA ou IIB como aqui divulgado, por meio de um conector e uma porção química Z. Em algumas modalidades, o conector inclui uma hidrazina, um dissulfeto, um tioéter ou um dipeptídeo. Em algumas modalidades, o conector inclui um dipeptídeo selecionado de Val-Ala e Val-Cit. Em algumas modalidades, o conector inclui um grupo para-aminobenzila (PAB). Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Cit-Val. Em algumas modalidades, o conector inclui a porção PAB-Ala-Val. Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -((C=O)(CH2)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 6. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Cit-Val-((C=O)(CH2)n -.

[0500]Em algumas modalidades, o conector inclui uma unidade -(CH2)n -, onde n é um número inteiro de 2 a 6. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Cit-Val- ((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector é -PAB-Ala-Val-((C=O)(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector é -(CH2)n -. Em algumas modalidades, o conector é -((CH2)n-, em que n é 6.

[0501]Em algumas modalidades, a porção química Z é selecionada da Tabela

4. Em algumas modalidades, a porção química Z é ,

onde S é um átomo de enxofre que representa o substituinte reativo presente dentro de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga a CD117 (e.g., do grupo -SH de um resíduo de cisteína).

[0502]Em algumas modalidades, o conector L e a porção química Z, tomados juntos como L-Z, são ou Preparação de Conjugados Anticorpo-Fármaco

[0503]Nos ADCs da presente divulgação (ADCs; D-L-Z-Ab, onde D é uma citotoxina) como aqui divulgado, um anticorpo anti-HC (e.g., um anticorpo anti-CD117, um anticorpo anti-CD45, um anticorpo anti-CD2, um anticorpo anti-CD5, um anticorpo anti-CD137 ou um anticorpo anti-CD252) ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, é conjugado a uma ou mais porções citotóxicas de fármaco (D), e.g., cerca de 1 a cerca de 20 porções de fármaco por anticorpo, por meio de um conector L e uma porção química Z como aqui divulgado. Os ADCs da presente divulgação podem ser preparados por várias vias, utilizando reações de química orgânica, condições e reagentes conhecidos pelos especialistas na técnica, incluindo: (1) reação de um substituinte reativo de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com um reagente conector bivalente para formar Ab-Z-L como aqui descrito acima, seguida por reação com uma porção de fármaco D; ou (2) reação de um substituinte reativo de uma porção de fármaco com um reagente conector bivalente para formar D-L-Z′, seguida por reação com um substituinte reativo de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como aqui descrito acima para formar um ADC da fórmula D-L-Z-Ab, tal como Am-Z-L-Ab. Métodos adicionais para preparar ADC são aqui descritos.

[0504]Em um outro aspecto, o anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117,

anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti-CD252), ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, tem um ou mais resíduos de lisina que podem ser quimicamente modificados para introduzir um ou mais grupos sulfidrila. O ADC é então formado pela conjugação por meio de átomos de enxofre do grupo sulfidrila como aqui descrito acima. Os reagentes que podem ser usados para modificar lisina incluem, mas não são limitados a N- succinimidil S-acetiltioacetato (SATA) e cloridreto de 2-Iminotiolano (Reagente de Traut).

[0505]Em um outro aspecto, o anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti-CD252), ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ter um ou mais grupos de carboidratos que podem ser quimicamente modificados para terem um ou mais grupos sulfidrila. O ADC é então formado pela conjugação por meio de átomos de enxofre do grupo sulfidrila como aqui descrito acima.

[0506]Ainda em um outro aspecto, o anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti- CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti- CD137 ou anticorpo anti-CD252), ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ter um ou mais grupos de carboidratos que podem ser oxidados para fornecer um grupo aldeído (-CHO) (ver, for e.g., Laguzza, et al., J. Med. Chem. 1989, 32(3), 548-55). O ADC é então formado pela conjugação por meio do aldeído correspondente como aqui descrito acima. Outros protocolos para a modificação de proteínas para a fixação ou associação de citotoxinas são descritos em Coligan et al., Current Protocols in Protein Science, vol. 2, John Wiley & Sons (2002), incorporado aqui por referência.

[0507]Métodos para a conjugação de porções de conector-fármaco com proteínas de alvejamento de células, tais como anticorpos, imunoglobulinas ou fragmentos dos mesmos são encontrados, por exemplo, na Pat. dos EUA No

5.208.020; Pat. dos EUA No 6.441.163; WO2005037992; WO2005081711; e WO2006/034488, todas as quais são aqui expressamente incorporadas por referência em sua totalidade.

[0508]Alternativamente, uma proteína de fusão compreendendo o anticorpo e agente citotóxico pode ser feita, e.g., por técnicas recombinantes ou síntese peptídica. O comprimento do DNA pode compreender regiões respectivas que codificam as duas porções do conjugado adjacentes uma à outra ou separadas por uma região que codifica um peptídeo conector que não destrói as propriedades desejadas do conjugado.

[0509]Os ADCs aqui descritos podem ser administrados a um paciente (e.g., um paciente humano sofrendo de uma doença imune ou câncer) em uma variedade de formas de dosagem. Por exemplo, os ADCs aqui descritos podem ser administrados a um paciente sofrendo de uma doença imune ou câncer na forma de uma solução aquosa, tal como uma solução aquosa contendo um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados para o uso com as composições e métodos aqui descritos incluem agentes de modificação de viscosidade. A solução aquosa pode ser esterilizada usando técnicas conhecidas na técnica.

[0510]As formulações farmacêuticas compreendendo ADCs anti-HC (e.g., ADC anti-CD117, ADC anti-CD45, ADC anti-CD2, ADC anti-CD5, ADC anti-CD137 ou ADC anti-CD252) como são aqui descritos preparados pela mistura de tais ADC com um ou mais portadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações ou soluções aquosas liofilizadas. Os portadores farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para receptores nas dosagens e concentrações utilizadas, e incluem, mas não são limitados a: tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3- pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos metálicos (e.g., complexos de proteína Zn); e/ou tensoativos não iônicos, tais como polietilenoglicol (PEG). Métodos de Tratamento

[0511]Também são aqui divulgados composições e métodos de tratar uma variedade de transtornos, tais como doenças de um tipo de célula na linhagem hematopoiética, cânceres, doenças autoimunes, transtornos metabólicos, transtornos de células-tronco, doença do enxerto contra hospedeiro, entre outros. As composições e métodos aqui descritos podem (i) esgotar diretamente uma população de células que dão origem a uma patologia, tal como uma população de células de câncer (e.g., células de leucemia) e células autoimunes (e.g., células T autorreativas) e/ou (ii) esgotar uma população de células-tronco hematopoiéticas endógenas de modo a promover o enxerto de células-tronco hematopoiéticas transplantadas fornecendo um nicho no qual as células transplantadas podem se alojar. As atividades anteriores podem ser obtidas pela administração de um ADC, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, capaz de se ligar a um antígeno expressado por uma célula endógena que causa doença ou uma célula-tronco hematopoiética. No caso de tratamento direto de uma doença, essa administração pode causar uma redução na quantidade das células que dão origem à patologia de interesse. No caso de preparar um paciente para terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas, essa administração pode causar a depleção seletiva de uma população de células-tronco hematopoiéticas endógenas, criando assim uma vacância no tecido hematopoiético, tal como a medula óssea, que pode subsequentemente ser preenchida pelas células- tronco hematopoiéticas exógenas transplantadas. A invenção tem como base, em parte, a descoberta de que os ADCs, anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, capazes de se ligarem a um antígeno expressado por células- tronco hematopoiéticas (e.g., CD117 (e.g., CD117 GNNK+) ou CD45) ou um antígeno expressado por células imunes maduras, tais como células T (e.g., CD45, CD2, CD5, CD137 ou CD252) podem ser administrados a um paciente para efetuar ambas as atividades acima. Os ADCs, anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam a um antígeno expressado por células-tronco hematopoiéticas (e.g., CD117 (e.g., CD117 GNNK+) ou CD45) ou um antígeno expressado por células imunes (e.g., células imunes maduras), tal como células T (e.g., CD45, CD2, CD5, CD137 ou CD252) podem ser administrados a um paciente sofrendo de um câncer ou doença autoimune para esgotar diretamente uma população de células cancerosas ou células autoimunes, e também podem ser administrados a um paciente em necessidade de terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas de modo a promover a sobrevivência e enxerto potencial de células-tronco hematopoiéticas transplantadas.

[0512]Como aqui descrito, a terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas pode ser administrada a um sujeito em necessidade de tratamento de modo a povoar ou repovoar um ou mais tipos de células do sangue. As células- tronco hematopoiéticas geralmente exibem multi-potência e podem, portanto, se diferenciar em múltiplas linhagens sanguíneas diferentes incluindo, mas não limitadas a granulócitos (e.g., promielócitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos), eritrócitos (e.g., reticulócitos, eritrócitos), trombócitos (e.g., megacarioblastos, megacariócitos produtores de plaquetas, plaquetas), monócitos (e.g., monócitos, macrófagos), células dendríticas, microglia, osteoclastos e linfócitos (e.g., células NK, células B e células T). As células-tronco hematopoiéticas são adicionalmente capazes de autorrenovação e podem, portanto, dar origem a células-filhas que têm potencial equivalente à célula- mãe, e também apresentam a capacidade de serem reintroduzidas em um receptor do transplante, após o que elas se alojam no nicho de células-tronco hematopoiéticas e reestabelecem a hematopoese produtiva e sustentada.

[0513]As células tronco hematopoiéticas podem, portanto, serem administradas a um paciente defeituoso ou deficiente em um ou mais tipos de célula da linhagem hematopoiética de modo a reconstituir a população de células defeituosa ou deficiente in vivo tratando assim a patologia associada com o defeito ou depleção na população de células do sangue endógenas. As composições e métodos aqui descritos pode, portanto, serem usados para tratar uma hemoglobinopatia não maligna (e.g., uma hemoglobinopatia selecionada do grupo que consiste em anemia falciforme, talassemia, anemia de Fanconi, anemia aplásica e síndrome de Wiskott- Aldrich). Além disso, ou alternativamente, as composições e métodos aqui descritos podem ser usados para tratar uma imunodeficiência, tal como uma imunodeficiência congênita. Além disso, ou alternativamente, as composições e métodos aqui descritos podem ser usados para tratar uma imunodeficiência adquirida (e.g., uma imunodeficiência adquirida selecionada do grupo que consiste em HIV e AIDS). As composições e métodos aqui descritos podem ser usados para tratar um transtorno metabólico (e.g., um transtorno metabólico selecionado do grupo que consiste em doenças de armazenamento de glicogênio, mucopolissacaridose, doença de Gaucher, doença de Hurlers, esfingolipidose e Leucodistrofia metacromática).

[0514]Além disso, ou alternativamente, as composições e métodos aqui descritos podem ser usados para tratar uma malignidade ou transtorno proliferativo, tal como um câncer hematológico e doença mieloproliferativa. No caso do tratamento de câncer, as composições e métodos aqui descritos podem ser administrados a um paciente de modo a esgotar uma população de células-tronco hematopoiéticas endógenas antes da terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas, caso este em que as células transplantadas podem se alojar em um nicho criado pela etapa de depleção de células endógenas e estabelecer a hematopoese produtiva. Isso, por sua vez, podem reconstituir uma população de células esgotadas durante a eradicação de células de câncer, tal como durante a quimioterapia sistêmica. Os cânceres hematológicos exemplificativos que podem ser tratados usando as composições e métodos aqui descritos incluem, sem limitação, leucemia mieloide aguda, leucemia linfoide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoide crônica, mieloma múltiplo, linfoma difuso de grandes células B e linfoma não-Hodgkin, bem como outras condições cancerosas, incluindo neuroblastoma.

[0515]Doenças adicionais que podem ser tratadas com as composições e métodos aqui descritos incluem, sem limitação, deficiência de adenosina desaminase e imunodeficiência combinada grave, síndrome de hiperimunoglobulina M, doença de Chediak-Higashi, linfo-histiocitose hereditária, osteopetrose, osteogênese imperfeita, doenças de armazenamento, talassemia maior, esclerose sistêmica, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose múltipla e artrite reumatoide juvenil.

[0516]Os anticorpos, ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, e conjugados aqui descritos podem ser usados para induzir a tolerância ao transplante de órgão sólido. Por exemplo, as composições e métodos aqui descritos podem ser usados para esgotar ou ablacionar uma população de células de um tecido alvo (e.g., para esgotar células-tronco hematopoiéticas do nicho de células-tronco da medula óssea). Após essa depleção de células dos tecidos alvo, uma população de cepa ou células progenitoras de um órgão doador (e.g., células-tronco hematopoiéticas do órgão doador) pode ser administrada ao receptor do transplante, e após o enxerto de tal cepa ou células progenitoras, um quimerismo misto temporário ou estável pode ser obtido, possibilitando assim a tolerância a longo prazo do órgão de transplante sem a necessidade de outros agentes imunossupressores. Por exemplo, as composições e métodos aqui descritos podem ser usados para induzir a tolerância do transplante em um receptor do transplante de órgão sólido (e.g., um transplante de rim, transplante de pulmão, transplante de fígado e transplante de coração, entre outros). As composições e métodos aqui descritos são bem adequados para o uso em conexão com a indução de tolerância ao transplante de órgão sólido, por exemplo, porque uma baixa porcentagem enxerto do doador temporário ou estável é suficiente para induzir tolerância a longo prazo do órgão transplantado.

[0517]Além disso, as composições e métodos aqui descritos podem ser usados para tratar cânceres diretamente, tais como cânceres caracterizados por células que são CD117+ (e.g., CD117 GNNK+), CD45+, CD2+, CD5+, CD137+ ou CD252+. Por exemplo, as composições e métodos aqui descritos podem ser usados para tratar leucemia, tal como em pacientes que exibem células leucêmicas CD117+. Ao esgotar as células cancerosas CD117+, tais como células leucêmicas, as composições e métodos aqui descritos podem ser usados para tratar diretamente vários cânceres. Os cânceres exemplificativos que podem ser tratados desta forma incluem cânceres hematológicos, tais como leucemia mieloide aguda, leucemia linfoide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfoide crônica, mieloma múltiplo, linfoma difuso de grandes células B e linfoma não-Hodgkin.

[0518]A leucemia mieloide aguda (AML) é um câncer da linhagem mieloide de células do sangue, caracterizado pelo rápido crescimento de glóbulos brancos anormais que se acumulam na medula óssea e interferem na produção de células sanguíneas normais. A AML é a leucemia aguda mais comum que afeta adultos e sua incidência aumenta com a idade. Os sintomas da AML são causados pela substituição da medula óssea normal por células leucêmicas, que causa uma queda nos glóbulos vermelhos, plaquetas e glóbulos brancos normais. Como uma leucemia aguda, a AML progride rapidamente e pode ser fatal dentro de semanas ou meses se não tratada. Em uma modalidade, os ADCs anti-CD117 aqui descritos são usados para tratar AML em um paciente humano em necessidade dos mesmos. Em certas modalidades, o tratamento com ADC anti-CD117 esgota as células de AML nos sujeitos tratados. Em algumas modalidades 50 % ou mais das células de AML são esgotadas. Em outras modalidades, 60 % ou mais das células de AML são esgotadas, ou 70 % ou mais das células de AML são esgotadas, ou 80 % ou mais, ou 90 % ou mais, ou 95 % ou mais das células de AML são esgotadas. Em certas modalidades, os tratamentos com ADC anti-CD117 são um tratamento de dose única. Em certas modalidades, o tratamento de dose única com ADC anti-CD117 esgota 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 95 % ou mais das células de AML.

[0519]Além disso, as composições e métodos aqui descritos podem ser usados para tratar transtornos autoimunes. Por exemplo, um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser administrado a um sujeito, tal como um paciente humano sofrendo de um transtorno autoimune, de modo a matar as células imunes CD45+, CD2+, CD5+, CD137+ ou CD252+. Por exemplo, uma célula imune CD45+, CD2+, CD5+, CD137+ ou CD252+ pode ser um linfócito autorreativo, tal como uma célula T que expressa um receptor de célula T que se liga especificamente e monta uma resposta imune contra um autoantígeno. Ao esgotar as células autorreativas CD45+, CD2+, CD5+, CD137+ ou CD252+, as composições e métodos aqui descritos podem ser usados para tratar patologias autoimunes, tais como aquelas descritas abaixo. Além disso, ou alternativamente, as composições e métodos aqui descritos podem ser usados para tratar uma doença autoimune esgotando uma população de células-tronco hematopoiéticas endógenas antes da terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas, caso este em que as células transplantadas podem se alojar em um nicho criado pela etapa de depleção de células endógenas e estabelecer a hematopoese produtiva. Isso, por sua vez, pode reconstituir uma população de células esgotadas durante a erradicação de células autoimunes.

[0520]As doenças autoimunes que podem ser tratadas usando as composições e métodos aqui descritos incluem, sem limitação, psoríase, artrite psoriática, diabetes mellitus Tipo 1 (Tipo 1 diabetes), artrite reumatoide (RA), lúpus sistêmico humano (SLE), esclerose múltipla (MS), doença inflamatória intestinal (IBD), colite linfocítica, encefalomielite disseminada aguda (ADEM), doença de Addison, alopecia universal, espondilite anquilosante, síndrome do anticorpo antifosfolipídeo (APS), anemia aplásica, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, doença autoimune do ouvido interno (AIED), síndrome linfoproliferativa autoimune (ALPS), ooforite autoimune, doença de Balo, doença de Behcet, penfigoide bolhoso, cardiomiopatia, doença de Chagas, síndrome da disfunção imune por fadiga crônica (CFIDS), polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, doença de Crohn, penfigoide cicatricial, psilose celíaca-dermatite herpetiforme, doença da aglutinina fria, síndrome de CREST, doença de Degos, lúpus discoide, disautonomia, endometriose, crioglobulinemia mista essencial, fibromialgia-fibromiosite, síndrome de Goodpasture, doença de Grave, síndrome de Guillain-Barre (GBS), tireoidite de Hashimoto, Hidradenite supurativa, púrpura trombocitopênica idiopática e/ou aguda, fibrose pulmonar idiopática, neuropatia de IgA, cistite intersticial, artrite juvenil, doença de Kawasaki, líquen plano, doença de Lyme, doença de Meniere, doença mista do tecido conjuntivo (MCTD), miastenia grave, neuromiotonia, síndrome opsoclônica mioclônica (OMS), neurite óptica, tireoidite de Ord, pênfigo vulgar, anemia perniciosa, policondrite, polimiosite e dermatomiosite, cirrose biliar primária, poliarterite nodosa, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, agamaglobulinemia primária, fenômeno de Raynaud, síndrome de Reiter, febre reumática, sarcoidose, esclerodermia, síndrome de Sjögren, síndrome da pessoa rígida, artrite de Takayasu, arterite temporal (também conhecida como “arterite de células gigantes”), colite ulcerativa, colite colagenosa, uveíte, vasculite, vitiligo, vulvodínia (“vestibulite vulvar”) e granulomatose de Wegener.

[0521]Além disso, são aqui fornecidos métodos de prevenir e tratar doença do enxerto-vs-hospedeiro (GVHD) e doenças autoimunes pela administração de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou ADC, capaz de se ligar a um antígeno (e.g., CD137, CD2 ou CD5) expressado por células hematopoiéticas, em que o anticorpo compreende uma região Fc compreendendo uma mutação D265C, L234A, L235A e/ou H435A. Essa administração pode causar a depleção seletiva de uma população de células T que são reativas contra o hospedeiro. Por exemplo, um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou ADC capaz de se ligar a CD137 pode ser administrado a um paciente de modo a prevenir e tratar GVHD e doenças autoimunes, tais como aquelas decorrentes da terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas. Os anticorpos anti-CD137 e conjugados dos mesmos e métodos de uso relacionados são encontrados, por exemplo, no Pedido de Pat. dos EUA No 62/448.741 e Publicação PCT No WO 2018/134787, que são aqui expressamente incorporados por referência em sua totalidade.

[0522]As composições e métodos aqui descritos podem ser usados para esgotar células T ativadas (e.g., expressar CD137, CD252, CD134, etc.) que estão associadas à falha do enxerto e doenças autoimunes de modo a obter tolerância do transplante. As composições e métodos aqui descritos são particularmente úteis para prevenir e tratar GVHD e doenças autoimunes. Os métodos e composições aqui divulgados também são úteis em reduzir o risco de falha do transplante em um paciente humano que recebe um transplante alogênico. O sujeito preferido é humano. A quantidade de anticorpo, conjugado anticorpo-fármaco ou conjugado ligante- fármaco administrado deve ser suficiente para esgotar células, e.g., células T ativadas, que promovem GVHD ou doença autoimune.

[0523]O anticorpo ou conjugado anticorpo-fármaco pode ser administrado ao paciente humano em necessidade antes, concomitantemente ou depois do transplante de células ou um órgão sólido ao paciente. Em uma modalidade, um ADC anti-CD137 é administrado ao paciente humano em necessidade do mesmo antes (e.g., cerca de 3 dias antes, cerca de 2 dias antes, cerca de 12 horas antes, cerca de 12 horas a 3 dias antes, cerca de 1 a 3 dias antes, cerca de 12 horas a 2 dias antes, ou cerca de 1 a 2 dias antes) do transplante de células ou um órgão sólido. Em uma modalidade, um ADC anti-CD137 é administrado ao paciente humano em necessidade do mesmo depois (e.g., cerca de 1 dias depois, cerca de 2 dias depois, cerca de 3 dias depois ou cerca de 4 dias depois) do transplante de células ou um órgão sólido. Uma dose única de um ADC anti-CD137 pode ser administrada ao paciente humano antes, concomitantemente ou depois do transplante de células ou um órgão, onde tal dose única é suficiente para tratar ou prevenir GVHD ou falha do enxerto.

[0524]Os métodos e composições aqui divulgados podem ser usados para prevenir ou tratar falha do enxerto. A falha do enxerto ou rejeição do enxerto, incluindo falha depois do transplante de células-tronco hematopoiéticas alogênicas, pode ser manifestada geralmente como falta do enxerto inicial de células do doador ou perda de células do doador depois do enxerto inicial (para revisão ver Mattsson et al. (2008) Biol Blood Marrow Transplant. 14 (Suppl 1): 165-170). Por exemplo, as composições e métodos aqui divulgados podem ser usados para esgotar células T ativadas que expressam CD137 em um cenário de enxerto ou transplante onde a falha do enxerto é motivo de preocupação, e.g., onde o paciente humano está em risco de desenvolver a falha do enxerto após o transplante de um órgão sólido ou células, particularmente onde as células transplantadas ou órgão são alogênicos.

[0525]Em uma modalidade, um anticorpo anti-CD137, conjugado anticorpo- fármaco ou conjugado ligante-fármaco é usado para esgotar células do doador que expressam CD137, e.g., células T ativadas que expressam CD137, contatando as células, enxerto ou órgão sólido com o anticorpo anti-CD137, conjugado anticorpo- fármaco ou conjugado ligante-fármaco antes do transplante das células, enxerto ou órgão em um paciente humano. Em uma modalidade, as células, enxerto ou órgão são alogênicos.

[0526]O risco de GVHD permanece alto após o transplante com as terapias atuais. Os métodos e composições aqui divulgados podem ser usados para inibir a doença do enxerto contra hospedeiro (GVHD) em um paciente humano. Os ADCs anti-CD137 podem ser usados para alvejar seletivamente células T ativadas em um paciente que irá receber um transplante, tal como um transplante de células-tronco. Os ADCs anti-CD137, como aqui descritos, também podem ser usados para reduzir o risco de GVHD pelo alvejamento e esgotamento de células positivas para CD137 em um paciente humano que vai receber ou já recebeu um transplante tal como, mas não limitado a um transplante de HSC. Os ADCs anti-CD252, como aqui descritos, também podem ser usados para reduzir o risco de GVHD pelo alvejamento e esgotamento de células positivas para CD137 em um paciente humano que vai receber ou já recebeu um transplante tal como, mas não limitado a um transplante de HSC. Em certas modalidades, as composições e métodos são aqui divulgados para tratar GVHD antes da aparência de sintomas de GVHD em um paciente após uma terapia de transplante, e.g., HSCs alogênicas.

[0527]Os métodos aqui descritos também são úteis para prevenir reações do hospedeiro versus enxerto (HvG). Por exemplo, um ADC anti-CD137 também pode ser usado como um imunossupressor para prevenir reações do hospedeiro versus enxerto (HvG) prevenindo ou reduzindo assim o risco de falha do enxerto alogênico. O uso de um ADC anti-CD137 em um paciente em risco para uma reação HvG permitiria o enxerto de células do doador com um maior grau de incompatibilidade de HLA. Usos adicionais incluem a indução de tolerância em transplante de órgão sólido, onde as reações hospedeiro versus enxerto são evitadas ou reduzidas pelo ADC de

CD137. Isso incluiria transplantes de órgãos sólidos feitos com ou sem transplante de células-tronco hematopoiéticas, incluindo xeno-transplantes onde o órgão é de origem não humana e/ou geneticamente modificada.

[0528]Em uma modalidade, um ADC anti-CD137 é usado para prevenir enxerto versus enxerto (GvG) no contexto de transplantes alogênicos onde dois doadores são usados. Exemplos incluem o uso de 2 doadores de células-tronco do sangue do cordão umbilical em pacientes adultos e pediátricos. A prevenção de GvG permitiria a reconstituição hematopoiética mais rápida (e.g., neutrófilo e plaqueta) pós- transplante, uma vez que ambas as fontes de células-tronco enxertariam com êxito.

[0529]Outros métodos de tratamento usando os anticorpos anti-CD137 ou ADCs são descritos em US 10.434.185, que é aqui incorporado por referência.

[0530]Outros métodos de tratamento usando os anticorpos anti-CD252 ou ADCs, incluindo prevenção de doença do enxerto contra hospedeiro ou indução de tolerância do enxerto após o transplante, são descritos em US WO 2019/173780, que é aqui incorporado por referência.

[0531]Outros métodos de tratamento usando os anticorpos anti-CD2 ou ADCs são descritos em WO 2019/108860, que é aqui incorporado por referência.

[0532]Outros métodos de tratamento usando os anticorpos anti-CD5 ou ADCs são descritos em WO 2019/108863, que é aqui incorporado por referência.

[0533]Em algumas modalidades, o transplante é alogênico. Em algumas modalidades, o transplante é autólogo.

[0534]Em algumas modalidades, o transplante é um transplante de medula óssea, um transplante de sangue periférico ou um transplante de sangue do cordão umbilical.

[0535]Em algumas modalidades, o transplante inclui células hematopoiéticas (e.g., células-tronco hematopoiéticas).

[0536]Em qualquer uma das modalidades aqui descritas, o transplante pode ser de qualquer órgão sólido ou transplante de pele. Em algumas modalidades, o transplante é selecionado do grupo consiste em transplante de rim, transplante de coração, transplante de fígado, transplante de pâncreas, transplante de pulmão, transplante de intestino e transplante de pele.

[0537]Além disso, são aqui divulgados métodos de tratar ou prevenir a rejeição de células alogênicas transplantadas em um sujeito humano, i.e., tratamento ou prevenção de doença hospedeiro versus enxerto (HvG) usando os anticorpos, ou conjugados dos mesmos, tendo as regiões Fc modificadas aqui divulgados. Por exemplo, os métodos aqui divulgados incluem administração de um conjugado fármaco-anticorpo anti-CD137 (ADC) (que se liga a células imunes CD137+ endógenas, e.g., células T ativadas) e terapia de células alogênicas, em que o anticorpo anti-CD137 compreende uma região Fc compreendendo uma mutação D265C, L234A, L235A e/ou H435A. Ao administrar um ADC anti-CD137 a um paciente humano recebendo um transplante de células alogênicas, as células T CD137+ endógenas são esgotadas, reduzindo assim o risco de uma reação pelas células endógenas contra a terapia de células alogênicas. Vias de Administração e Dosagem

[0538]Os anticorpos, os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos ou os ADCs aqui descritos podem ser administrados a um paciente (e.g., um paciente humano sofrendo de câncer, uma doença autoimune ou em necessidade de terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas) em uma variedade de formas de dosagem. Por exemplo, os anticorpos, os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos ou ADCs aqui descritos podem ser administrados a um paciente sofrendo de câncer, uma doença autoimune ou em necessidade de terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas na forma de uma solução aquosa, tal como uma solução aquosa contendo um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis para o uso com as composições e métodos aqui descritos incluem agentes de modificação de viscosidade. A solução aquosa pode ser esterilizada usando técnicas conhecidas na técnica.

[0539]As formulações farmacêuticas compreendendo um anticorpo anti-HC (e.g., um anticorpo anti-CD117, um anticorpo anti-CD45, um anticorpo anti-CD2, um anticorpo anti-CD5, um anticorpo anti-CD137 ou um anticorpo anti-CD252), ou conjugados dos mesmos (e.g., ADCs como aqui descritos) são preparadas misturando-se tal anticorpo ou ADC com um ou mais portadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações ou soluções aquosas liofilizadas. Os portadores farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem, mas não são limitados a: tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos metálicos (e.g., complexos de proteína Zn); e/ou tensoativos não iônicos, tais como polietilenoglicol (PEG).

[0540]Os anticorpos, os fragmentos de ligação ao antígeno ou ADCs aqui descritos podem ser administrados por uma variedade de vias, tais como oral, transdérmica, subcutânea, intranasal, intravenosa, intramuscular, intraocular ou parenteral. A via mais adequada para administração em qualquer caso dependerá do anticorpo particular, ou fragmento de ligação ao antígeno, administrado, do paciente, dos métodos de formulação farmacêutica, dos métodos de administração (e.g., tempo de administração e via de administração), idade do paciente, peso corpóreo, sexo, severidade das doenças sendo tratadas, da dieta do paciente e da taxa de excreção do paciente.

[0541]A dose eficaz de um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, aqui descrita pode variar, por exemplo, de cerca de 0,001 a cerca de 100 mg/kg de peso corpóreo por administração única (e.g., bolus), múltiplas administrações ou administração contínua, ou para obter uma concentração sérica ótima (e.g., uma concentração sérica de 0,0001 a 5000 μg/mL) do anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. A dose pode ser administrada uma ou mais vezes (e.g., 2 a 10 vezes) por dia, semana ou mês a um sujeito (e.g., um humano) sofrendo de câncer, uma doença autoimune ou submetido a terapia de condicionamento em preparação para receber um transplante de células-tronco hematopoiéticas.

[0542]Em uma modalidade, a dose de um ADC anti-HC (e.g, um anticorpo anti-CD117 conjugado por meio de um conector com uma amatoxina) administrada ao paciente humano é de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 0,3 mg/kg.

[0543]Em uma modalidade, a dose de um ADC anti-HC (e.g, um anticorpo anti-CD117 conjugado por meio de um conector com uma amatoxina) administrada ao paciente humano é de cerca de 0,15 mg/kg a cerca de 0,3 mg/kg.

[0544]Em uma modalidade, a dose de um ADC anti-HC (e.g, um anticorpo anti-CD117 conjugado por meio de um conector com uma amatoxina) administrada ao paciente humano é de cerca de 0,15 mg/kg a cerca de 0,25 mg/kg.

[0545]Em uma modalidade, a dose de um ADC anti-HC (e.g, um anticorpo anti-CD117 conjugado por meio de um conector com uma amatoxina) administrada ao paciente humano é de cerca de 0,2 mg/kg a cerca de 0,3 mg/kg.

[0546]Em uma modalidade, a dose de um ADC anti-HC (e.g, um anticorpo anti-CD117 conjugado por meio de um conector com uma amatoxina) administrada ao paciente humano é de cerca de 0,25 mg/kg a cerca de 0,3 mg/kg.

[0547]Em uma modalidade, a dose de um ADC anti-HC (e.g, um anticorpo anti-CD117 conjugado por meio de um conector com uma amatoxina) administrada ao paciente humano é de cerca de 0,1 mg/kg.

[0548]Em uma modalidade, a dose de um ADC anti-HC (e.g, um anticorpo anti-CD117 conjugado por meio de um conector com uma amatoxina) administrada ao paciente humano é de cerca de 0,2 mg/kg.

[0549]Em uma modalidade, a dose de um ADC anti-HC (e.g, um anticorpo anti-CD117 conjugado por meio de um conector com uma amatoxina) administrada ao paciente humano é de cerca de 0,3 mg/kg.

[0550]Em uma modalidade, a dose de um ADC anti-HC aqui descrito administrada ao paciente humano é de cerca de 0,001 mg/kg a 10 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a 9,5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 9 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 8,5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 8 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 7,5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 7 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 6,5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 6 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 5,5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 4,5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 4 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg a 3,5 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg a 3 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a 10 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a 9 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a 8 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a 7 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a 6 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a 5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a 4 mg/kg ou cerca de 1 mg/kg a 3 mg/kg.

[0551]Em uma modalidade, o ADC anti-HC aqui descrito que é administrado a um paciente humano para o tratamento ou condicionamento tem uma meia-vida igual ou menor que 24 horas, igual ou menor que 22 horas, igual ou menor que 20 horas, igual ou menor que 18 horas, igual ou menor que 16 horas, igual ou menor que

14 horas, igual ou menor que 13 horas, igual ou menor que 12 horas, igual ou menor que 11 horas, igual ou menor que 10 horas, igual ou menor que 9 horas, igual ou menor que 8 horas, igual ou menor que 7 horas, igual ou menor que 6 horas ou igual ou menor que 5 horas. Em uma modalidade, a meia-vida do ADC anti-HC é de 5 horas a 7 horas; é de 5 horas a 9 horas; é de 15 horas a 11 horas; é de 5 horas a 13 horas; é de 5 horas a 15 horas; é de 5 horas a 20 horas; é de 5 horas a 24 horas; é de 7 horas a 24 horas; é de 9 horas a 24 horas; é de 11 horas a 24 horas; 12 horas a 22 horas; 10 horas a 20 horas; 8 horas a 18 horas; ou 14 horas a 24 horas.

[0552]Em uma modalidade, os métodos aqui divulgados minimizam a toxicidade hepática no paciente que recebe o ADC para o condicionamento. Por exemplo, em certas modalidades, os métodos aqui divulgados resultam em um nível de marcador hepático permanecendo abaixo de um nível tóxico conhecido no paciente por mais de 24 horas, 48 horas, 72 horas ou 96 horas. Em outras modalidades, os métodos aqui divulgados resultam em um nível de marcador hepático remanescente dentro de uma faixa de referência no paciente por mais de 24 horas, 48 horas, 72 horas ou 96 horas. Em certas modalidades, os métodos aqui divulgados resultam em um nível de marcador hepático aumentando não mais que 1,5 vezes acima de uma faixa de referência, não mais que 3 vezes acima de uma faixa de referência, não mais que 5 vezes acima de uma faixa de referência ou não mais que 10 vezes acima de uma faixa de referência por mais de 24 horas, 48 horas, 72 horas ou 96 horas. Exemplos de marcadores hepáticos que podem ser usados para testar a toxicidade incluem alanina aminotransaminase (ALT), lactato desidrogenase (LDH) e aspartato aminotransaminase (AST). Em certas modalidades, a administração de um ADC como aqui descrito, i.e., onde duas doses são administradas em vez de uma dose única, resulta em um aumento transitório em um marcador hepático, e.g., AST, LDH e/ou ALT. Em alguns casos, um nível elevado de um marcador hepático indicando toxicidade pode ser alcançado, mas dentro de um certo período de tempo, e.g., cerca de 12 horas, cerca de 18 horas, cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas, cerca de 72 horas, acima de 3 dias, cerca de 3,5 dias, cerca de 4 dias, cerca de 4,5 dias, cerca de 5 dias, cerca de 5,5 dias, cerca de 6 dias, cerca de 6,5 dias, cerca de 7 dias, cerca de 7,5 dias ou menos de uma semana, o nível de marcador hepático retorna a um nível normal não associado à toxicidade hepática. Por exemplo, em um humano (homem adulto médio), um nível normal, não tóxico, de ALT é de 7 a 55 unidades por litro (U/L); e um nível normal, não tóxico, de AST é de 8 a 48 U/L. Em certas modalidades, pelo menos um dos níveis de AST, ALT ou LDH no sangue do paciente não atinge um nível tóxico entre a administração de uma primeira dose do ADC e 14 dias depois da administração da primeira dose ao paciente. Por exemplo, o paciente pode ser administrado com uma primeira dose e subsequentemente uma segunda dose, uma terceira dose, uma quarta dose ou mais doses dentro de, e.g., 5, 10 ou 14 dias após a administração da primeira dose, ainda pelo menos um dos níveis de AST, ALT ou LDH no sangue do paciente não atinge um nível tóxico entre a administração de uma primeira dose do ADC e 14 dias depois da administração da primeira dose ao paciente.

[0553]Em certas modalidades, pelo menos um dos níveis de AST, ALT ou LDH no sangue do paciente não sobe acima dos níveis normais, não sobe mais que 1,5 vezes acima dos níveis normais, não sobe mais que 3 vezes acima dos níveis normais, não sobe mais que 5 vezes acima dos níveis normais ou não sobe mais que 10 vezes acima dos níveis normais.

[0554]A presente invenção inclui regimes de dosagem que reduzem eventos adversos e toxicidade usando ADCs que são capazes de se ligarem a um antígeno expressado por uma célula hematopoiética, tal como uma célula-tronco hematopoiética, uma célula imune ou uma célula de câncer. Exemplos de tais antígenos incluem, mas não são limitados a CD117, CD2, CD5, CD45, CD252, CD134 e CD137.

[0555]No caso de um procedimento de condicionamento antes do transplante de células-tronco hematopoiéticas, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser administrado ao paciente em um momento que otimamente promova o enxerto das células-tronco hematopoiéticas exógenas, por exemplo, de cerca de 1 hora a cerca de 1 semana (e.g., cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas, cerca de 24 horas, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 6 dias, cerca de 7 dias) ou mais antes da administração do transplante de células-tronco hematopoiéticas exógenas. Faixas incluindo os números aqui citados também estão incluídas nos métodos considerados.

[0556]As faixas de dosagem descritas acima podem ser combinadas com ADCs anti-HC tendo as meias-vidas aqui citadas.

[0557]Usando os métodos aqui divulgados, um médico versado na técnica pode administrar a um paciente humano em necessidade de terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas um ADC, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a um antígeno expressado por células-tronco hematopoiéticas (e.g., CD117 (e.g., CD117 GNNK+) ou CD45) ou um antígeno expressado por células imunes maduras, tais como células T (e.g., CD45, CD2, CD5, CD137 ou CD252). Desta forma, uma população de células-tronco hematopoiéticas endógenas pode ser esgotada antes da administração de um enxerto exógeno de célula-tronco hematopoiética de modo a promover o enxerto do enxerto de célula- tronco hematopoiética. O anticorpo pode ser covalentemente conjugado com uma toxina, tal como uma molécula citotóxica aqui descrita ou conhecida na técnica. Por exemplo, um anticorpo anti-CD117 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo (tal como um anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti- CD252) ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) pode ser covalentemente conjugado com uma citotoxina, tal como exotoxina A de pseudomonas, deBouganin, toxina da difteria, uma amatoxina, tal como γ-amanitina, α-amanitina, saporina, maitansina, um maitansinoide, uma auristatina, uma antraciclina, uma caliqueamicina, irinotecano, SN-38, uma duocarmicina, uma pirrolobenzodiazepina, um dímero de pirrolobenzodiazepina, uma indolinobenzodiazepina, um dímero de indolinobenzodiazepina ou uma variante dos mesmos. Essa conjugação pode ser realizada usando as técnicas de formação de ligação covalente aqui descritas ou conhecidas na técnica. O anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou conjugado fármaco-anticorpo pode ser subsequentemente administrado ao paciente, por exemplo, por administração intravenosa, antes do transplante de células-tronco hematopoiéticas exógenas (tal como células-tronco hematopoiéticas autólogas, singênicas ou alogênicas) ao paciente.

[0558]O anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti- CD252), um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou ADC pode ser administrado em uma quantidade suficiente para reduzir a quantidade de células- tronco hematopoiéticas endógenas, por exemplo, em cerca de 10 %, cerca de 20 %, cerca de 30 %, cerca de 40 %, cerca de 50 %, cerca de 60 %, cerca de 70 %, cerca de 80 %, cerca de 90 %, cerca de 95 % ou mais antes da terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas. A redução na contagem de células-tronco hematopoiéticas pode ser monitorada usando técnicas convencionais conhecidas na técnica, tais como por análise de FACS de células que expressam antígeno característico da superfície de células-tronco hematopoiéticas em uma amostra de sangue retirada do paciente em intervalos variáveis durante a terapia de condicionamento. Por exemplo, um médico versado na técnica pode retirar uma amostra de sangue do paciente em vários pontos no tempo durante a terapia de condicionamento e determinar a extensão da redução de endógeno células-tronco hematopoiéticas conduzindo uma análise de FACS para elucidar as concentrações relativas de células-tronco hematopoiéticas na amostra usando os anticorpos que se ligam a antígenos marcadores de células-tronco hematopoiéticas. De acordo com algumas modalidades, quando a concentração de células-tronco hematopoiéticas atingir um mínimo valor em resposta à terapia de condicionamento com um anticorpo anti-HC (e.g., um anticorpo anti-CD117, um anticorpo anti-CD45, um anticorpo anti- CD2, um anticorpo anti-CD5, um anticorpo anti-CD137 ou um anticorpo anti-CD252), um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou ADC, o médico pode concluir a terapia de condicionamento e pode começar a preparar o paciente para a terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas.

[0559]O anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti- CD252), fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou ADC pode ser administrado ao paciente em uma solução aquosa contendo um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como um agente de modificação de viscosidade. A solução aquosa pode ser esterilizada usando técnicas aqui descritas ou conhecidas na técnica. O anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou conjugado fármaco-anticorpo pode ser administrado ao paciente em uma dosagem de, por exemplo, de cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, de cerca de 0,001 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,01 mg/kg a 9,5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 9 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 8,5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 8 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 7,5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 7 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 6,5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 6 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 5,5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 5 mg/kg,

cerca de 0,1 mg/kg a 4,5 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a 4 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg a 3,5 mg/kg, cerca de 0,5 mg/kg a 3 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a 10 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a 9 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a 8 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a 7 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a 6 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a 5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a 4 mg/kg, ou cerca de 1 mg/kg a 3 mg/kg, antes da administração de um enxerto de célula-tronco hematopoiética ao paciente. O anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou conjugado fármaco-anticorpo pode ser administrado ao paciente em um momento que otimamente promova o enxerto das células-tronco hematopoiéticas exógenas, por exemplo, de cerca de 1 hora a cerca de 1 semana (e.g., cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas, cerca de 24 horas, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 6 dias, ou cerca de 7 dias) ou mais antes da administração do transplante de células-tronco hematopoiéticas exógenas.

[0560]Após a conclusão da terapia de condicionamento, o paciente pode então receber uma infusão (e.g., uma infusão intravenosa) de células-tronco hematopoiéticas exógenas, como do mesmo médico que realizou a terapia de condicionamento ou de um médico diferente. O médico pode administrar ao paciente uma infusão de células-tronco hematopoiéticas autólogas, singênicas ou alogênicas, por exemplo, em uma dosagem de 1 x 103 a 1 x 109 células-tronco hematopoiéticas/kg. O médico pode monitorar o enxerto do transplante de células-tronco hematopoiéticas, por exemplo, retirando uma amostra de sangue do paciente e determinando o aumento na concentração de células-tronco hematopoiéticas ou células da linhagem hematopoiética (tais como megacariócitos, trombócitos, plaquetas, eritrócitos,

mastócitos, mieloblastos, basófilos, neutrófilos, eosinófilos, microglia, granulócitos, monócitos, osteoclastos, células apresentadoras de antígeno, macrófagos, células dendríticas, células exterminadoras naturais, linfócitos T e linfócitos B) após a administração do transplante.

Essa análise pode ser conduzida, por exemplo, de cerca de 1 hora a cerca de 6 meses, ou mais, após a terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas (e.g., cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas, cerca de 6 horas, cerca de 7 horas, cerca de 8 horas, cerca de 9 horas, cerca de 10 horas, cerca de 11 horas, cerca de 12 horas, cerca de 13 horas, cerca de 14 horas, cerca de 15 horas, cerca de 16 horas, cerca de 17 horas, cerca de 18 horas, cerca de 19 horas, cerca de 20 horas, cerca de 21 horas, cerca de 22 horas, cerca de 23 horas, cerca de 24 horas, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 5 dias, cerca de 6 dias, cerca de 7 dias, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas, cerca de 5 semanas, cerca de 6 semanas, cerca de 7 semanas, cerca de 8 semanas, cerca de 9 semanas, cerca de 10 semanas, cerca de 11 semanas, cerca de 12 semanas, cerca de 13 semanas, cerca de 14 semanas, cerca de 15 semanas, cerca de 16 semanas, cerca de 17 semanas, cerca de 18 semanas, cerca de 19 semanas, cerca de 20 semanas, cerca de 21 semanas, cerca de 22 semanas, cerca de 23 semanas, cerca de 24 semanas ou mais). Uma descoberta de que a concentração de células-tronco hematopoiéticas ou células da linhagem hematopoiética aumentou (e.g., em cerca de 1 %, cerca de 2 %, cerca de 3 %, cerca de 4 %, cerca de 5 %, cerca de 6 %, cerca de 7 %, cerca de 8 %, cerca de 9 %, cerca de 10 %, cerca de 20 %, cerca de 30 %, cerca de 40 %, cerca de 50 %, cerca de 60 %, cerca de 70 %, cerca de 80 %, cerca de 90 %, cerca de 100 %, cerca de 200 %, cerca de 500 % ou mais) após a terapia de transplante em relação à concentração do tipo de célula correspondente antes da terapia de transplante fornece uma indicação de que tratamento com o anticorpo anti-HC (e.g., anticorpo anti-CD117, anticorpo anti-CD45, anticorpo anti-CD2, anticorpo anti-CD5, anticorpo anti-CD137 ou anticorpo anti-CD252), um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou um ADC promoveu com êxito o enxerto do enxerto de células-tronco hematopoiéticas transplantadas.

[0561]O enxerto do transplante de células-tronco hematopoiéticas devido à administração de um anticorpo anti-HC (e.g., um anticorpo anti-CD117, um anticorpo anti-CD45, um anticorpo anti-CD2, um anticorpo anti-CD5, um anticorpo anti-CD137 ou um anticorpo anti-CD252), os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos ou ADCs, pode se manifestar em uma variedade de medições empíricas. Por exemplo, o enxerto de células-tronco hematopoiéticas transplantadas pode ser avaliado avaliando a quantidade de unidades de repovoamento competitivo (CRU) presente dentro da medula óssea de um paciente após a administração de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo capaz de se ligar a um antígeno expressado por células-tronco hematopoiéticas (e.g., CD117 (e.g., CD117 GNNK+) ou CD45) ou um antígeno expressado por células imunes maduras, tais como células T (e.g., CD2, CD5, CD137 ou CD252) e subsequente administrando um transplante de células-tronco hematopoiéticas. Além disso, pode-se observar o enxerto de um transplante de células-tronco hematopoiéticas incorporando um gene repórter, tal como uma enzima que catalisa uma reação química produzindo um produto fluorescente, cromofórico ou luminescente, em um vetor com o qual as células-tronco hematopoiéticas do doador foram transfectadas e subsequentemente monitorar o sinal correspondente em um tecido no qual as células-tronco hematopoiéticas se alojaram, tal como a medula óssea. Também pode-se observar o enxerto de célula- tronco hematopoiética pela avaliação da quantidade e sobrevivência das células- tronco e progenitoras hematopoiéticas, por exemplo, conforme determinado por métodos de análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) conhecido na técnica. O enxerto também pode ser determinado medindo as contagens de glóbulos brancos no sangue periférico durante um período de pós-

transplante e/ou medindo a recuperação de células da medula por células do doador em uma amostra aspirada da medula óssea. Exemplos

[0562]Os exemplos seguintes são apresentados de modo a fornecer àqueles de habilidade comum na técnica com uma descrição de como as composições e métodos aqui descritos podem ser usados, feitos e avaliados e se destinam a ser puramente exemplificativos da invenção e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção. Ab1 se refere a um anticorpo anti-CD117 tendo as regiões variáveis do anticorpo anti-CD117 Ab67, cujas sequências são fornecidas na Tabela 5. Ab2 se refere a um anticorpo anti-CD117 tendo as regiões variáveis do anticorpo anti-CD117 Ab85, cujas sequências são fornecidas na Tabela

5. Ab3 se refere a um anticorpo anti-CD117 tendo as regiões variáveis do anticorpo anti-CD117 Ab249, cujas sequências são fornecidas na Tabela 5. Ab4 se refere a um anticorpo anti-CD117 tendo as regiões variáveis do anticorpo anti-CD117 CK6, cujas sequências são fornecidas na Tabela 5. Ab5 se refere a um anticorpo monoclonal dirigida contra CD45 (i.e., um anticorpo anti-CD45)). Além disso, “ADC1” e “ADC2” se referem a dois conjugados anticorpo-fármaco compreendendo um anticorpo (como aqui divulgado) conjugado a pelo menos um fármaco, em que o fármaco é uma variante de amatoxina divulgada aqui, em que a variante de amatoxina de ADC1 é diferente da variante de amatoxina de ADC2. O ADC anti-CD117 usado no Exemplo 7 ao Exemplo 11 é referido como ADC1 e é anticorpo anti-CD117 Ab85 (i.e., Ab2) tendo mutações de Fc D265C e H435A (definidas pelo índice EU)) conjugado com uma amatoxina por meio de um conector clivável. Exemplo 1. Estudos de ligação Fc in vitro com variantes de Fc

[0563]Para identificar modificações em Fc que anulam a ligação do receptor Fc gama e, desse modo, silenciam as funções efetoras do anticorpo, anticorpos IgG contendo uma ou mais substituição de aminoácido na região Fc foram avaliados em um ensaio de ligação de Octeto para medir sua capacidade de se ligar a diferentes receptores Fc gama.

As seguintes substituições de aminoácidos dentro da região Fc de uma IgG1 foram testadas (posições de aminoácidos se referem à região Fc de acordo com o índice EU): D265A D265C D265C/H435A D265C/LALA D265A/LALA D265C/LALA/H435A D265C/N297G D265C/N297G/H435A D265C (EPLVLAdelG; também referido aqui como “IgG2*”) D265C (EPLVLAdelG; também referido aqui como “IgG2*”)/H435A D265C/N297Q/H435A D265C/N297Q EPLVLAdelG/H435A N297A N297G N297Q D265C/N297A/H435A LALA/P329G EPLVLAdelG LALA/P331G D265A/H435A D265C/LALA/P331G/H435A N297A.IHH (i.e., N297A.I253A.H310A.H435A)

CH2 suprimido D265C/LALA D265C/LALA/P329A/H435A

[0564]“IgG2*”, como usado no contexto de modificações em Fc nestes exemplos, se refere a uma região Fc tendo as seguintes mutações: E233P, L234V, L235A, deleção de G236 em uma estrutura hIgG1 (i.e., EPLVLAdelG).

[0565]Tipo selvagem (WT) como usado nestes exemplos se refere a uma região Fc de IgG1 que não têm quaisquer substituições (a menos que de outro modo especificado), incluindo aquelas substituições aqui descritas. “LALA” como usado ao longo dos exemplos se refere a duas substituições de aminoácidos nas posições 234 e 235, especificamente L234A e L235A. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- CD117 (ou anticorpo anti-CD45) aqui compreende uma região Fc compreendendo uma das seguintes modificações ou combinações de modificações: D265A, D265C, D265C/H435A, D265C/LALA, D265C/LALA/H435A, D265C/N297G, D265C/N297G/H435A, D265C (EPLVLAdelG em IgG1), D265C (EPLVLAdelG em IgG1)/H435A, D265C/N297Q/H435A, D265C/N297Q, EPLVLAdelG/H435A, N297A, N297G, N297Q, D265C/N297A/H435A, LALA/P329G, EPLVLAdelG, LALA/P331G, D265A/H435A, D265C/LALA/P331G/H435A, N297A.IHH, CH2 suprimido, D265C/LALA, ou D265C/LALA/P329A/H435A. As várias substituições e combinações de substituições foram testadas em vários diferentes anticorpos anti-CD117 (ver Figs. 1A a 1E), incluindo um anticorpo neutro anti-CD117 humano (i.e., Ab1), CK6 (também referido como 3100 (i.e., Ab4)), anticorpos anti-CD117 humanos antagonistas (i.e., Ab2 e Ab3; tanto Ab2 quanto Ab3 são diferentes anticorpos antagonistas do que CK6) e um anticorpo monoclonal dirigido contra CD45 (i.e., Ab5 (um anticorpo anti-CD45)).

[0566]Os ensaios de ligação foram realizados a 25 °C em solução salina tamponada com fosfato com (BSA a 0,1 %, Tween-20 a 0,02 %) usando Bio-Layer Interferometry Device (ForteBio). Vários receptores Fc gama (i.e., FcγR1 humano

(hFcγR1), FcγRI cinomolgo (FcγR1 cino), hFcγR2A 167R, hFcγR2A 167H, hFcγR2B, hFcγR2A 167F, hFcγR3A 176V ou hFcγR3B) foram marcados com biotina (“Bio”) ou histidina (“His”) e imobilizados em biossensores de estreptavidina ou biossensores anti-histidina, respectivamente, a uma concentração de 10 a 25 nM. Para a etapa de associação, o anticorpo indicado foi adicionado a uma concentração de 25 nM para os estudos de ligação de FcγR1 ou a uma concentração de 300 nM para o FcγR2A, estudos de ligação de 2B ou 3A. A resposta de ligação medida para cada variante de anticorpo foi normalizada ao nível de ligação de WT IgG1 sob condições similares.

[0567]A resposta de ligação normalizada de cada variante de anticorpo em relação à ligação de WT IgG1 é mostrada na Fig. 1A e quantificação da resposta de ligação normalizada de cada variante de anticorpo é mostrada na Fig. 1B.

[0568]Os ensaios de ligação adicionais foram realizados como descritos acima para testar várias mutações de Fc e combinações de mutações de Fc com base em um anticorpo anti-CD45 (i.e., Ab5) e ADCs anti-CD45 correspondentes (ver Fig. 1C) bem como um anticorpo anti-CD117 (i.e., Ab2) e ADCs anti-CD117 correspondentes (ver Figs. 1D e 1E) normalizadas ao nível de ligação de WT IgG1 sob condições similares.

[0569]Estes resultados demonstram que D265C sozinho não anula completamente a ligação do receptor Fc gama (ver Figs. 1A e 1B). Os dados sugerem que, de modo a abolir a ligação do receptor Fc gama, a mutação D265C deve ser combinada com outras mutações, tais como as substituições de aminoácidos L234A e L235A (“LALA”) (ver Figs. 1A e 1B). Notavelmente, os anticorpos contendo as mutações D265C LALA não puderam substancialmente se ligar aos receptores Fc gama e foram, portanto, silenciados em relação às funções efetoras (ver Figs. 1A e 1B). De fato, o nível de ligação para um anticorpo anti-CD117 (ver Figs. 1A e 1B) tendo uma região Fc com as mutações D265C LALA, foi essencialmente zero ou indetectável. Além disso, os dados na Fig. 1C indicam que, embora a variante de

D265A (sozinha) ou a variante de LALA (sozinha) mostre alguma ligação observável a Fc gama R1 (i.e., “Hu Fc1”), a combinação de D265A e LALA, bem como a combinação de D265C, N297A e H435A (i.e., “D265C.N297A.H435A”) não pode substancialmente se ligar aos receptores Fc gama e foram, portanto, silenciados em relação às funções efetoras. O anticorpo “YTH24,5 rIgG2b” é um anticorpo anti-CD45 controle conhecido por ter função efetora. Os dados mostram que a ordem de silenciamento em Fc gama R1 humano (i.e., “Hu Fc1”) é mais significativo para a combinação de D265A e LALA (i.e., “D265A.LALA”) e a combinação de D265C e N297A (dados não fornecidos), seguido por LALA (sozinho), N297A (sozinho; dados não fornecidos), D265A (sozinho) e tipo selvagem (WT) (ver Fig. 1C). Os dados também sugerem que tanto a ligação do anticorpo Ab5 nu (não conjugado) quanto o ADC correspondente (i.e., anticorpo conjugado) foram similares (ver Fig. 1C), indicando que a toxina não afeta significativamente o silenciamento de Fc e sugerindo ainda que os ADCs Fc silenciosos correspondentes minimizam toxicidade fora do alvo. Os dados nas Figs. 1D e 1E indicam que a combinação de D265C, LALA e H435A (i.e., “D265C.LALA.H435A”) não poderiam se ligar substancialmente aos receptores Fc gama e foram, portanto, silenciados em relação às funções efetoras. Os dados também demonstram que tanto o anticorpo nu (não conjugado) (i.e., o isotipo controle) quanto os Ab2 ADCs (i.e., anticorpo conjugado) não poderiam se ligar substancialmente aos receptores Fc gama testados e foram, portanto, silenciados em relação às funções efetoras (ver Figs. 1D e 1E), indicando que a toxina não afeta o silenciamento de Fc e sugerindo ainda que os ADCs Fc silenciosos correspondentes minimizam a toxicidade fora do alvo. Exemplo 2. Análise in vitro de variantes de Fc usando ensaio de degranulação de mastócitos

[0570]Para analisar o grau em que as modificações em Fc podem reduzir degranulação de mastócitos desencadeada por anticorpo, os anticorpos tendo as mutações de Fc descritas no Exemplo 1 foram avaliadas usando um ensaio de degranulação de mastócitos in vitro.

[0571]Os mastócitos foram derivados de células CD34+ do sangue periférico mobilizadas após 8 a 12 semanas de cultura in vitro na presença de IL-6 e SCF. As células foram cultivadas durante a noite na ausência de IL-6 e SCF e na presença de 150 ng/ml de interferon gama (IFNy). 100 nM de cada anticorpo indicado foram incubados ao lado de mastócitos a 37 °C por 30 minutos. A degranulação de mastócitos foi avaliada medindo a liberação de beta-hexosaminidase em sobrenadantes de cultura depois de tratar mastócitos com anticorpos controle positivo (i.e., “NEG085” e “104D2”), um anticorpo controle negativo (hIgG1), ou cada uma das variantes de anticorpo neutro ou antagonista indicadas.

[0572]A liberação de beta-hexosaminidase foi medida combinando-se sobrenadantes com p-nitrofenil N-acetil-β-D-glucosamida (PNAG) por 60 a 90 minutos a 37 °C seguida pela adição de glicina e é apresentada como absorvância a 405 nm na Fig. 2. Esses resultados mostram que a combinação de mutações D265C LALA (i.e., “D265C.LALA”) que foram identificadas como mutações de silenciamento de Fc no exemplo 1 também foram capazes de reduzir a ativação da degranulação de mastócitos no contexto de um anticorpo neutro (i.e., Ab1), uma vez que os níveis determinados foram similares àqueles do controle negativo (isotipo compatível IgG1). Exemplo 3. Análise in vitro de variantes de Fc usando ensaio de liberação de citocina

[0573]Os anticorpos com regiões Fc modificadas foram avaliados para a capacidade de cada anticorpo (e.g., Ab1, Ab2, Ab4 e Ab5) desencadear a liberação de citocina usando um ensaio in vitro de liberação de citocina (CRA) com células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC).

[0574]As PBMCs humanas isoladas de quatro doadores foram recolocadas em suspensão em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) com 2 % de soro autólogo (Figs. 3A-3D). Os anticorpos anti-CD117 indicados (i.e., Ab1 e Ab2) e variantes (i.e., variantes Ab1 e Ab2) ou um controle positivo (OKT3) foram imobilizados por revestimento úmido (procedimento descrito abaixo) do anticorpo a 37 °C por 1 h em uma placa de cultura de não tecido antes da adição de PBMCs humanas (Figs. 3A-3D). As PBMCs foram incubadas com o anticorpo revestido durante a noite. Os sobrenadantes foram colhidos e analisados com kit pró-inflamatório de cultura de tecidos (TC) Meso Scale Discovery (MSD) para avaliar a liberação de citocina em comparação com o controle positivo (i.e., isotipo hIgG1, OKT3 (controle positivo), alentuzumabe (controle positivo)).

[0575]As citocinas testadas foram IL-6 (Fig. 3A), IL-8 (Fig. 3B), TNFa (Fig. 3C), IL-1B (Fig. 3D), IL12p70 (dados não mostrados), IL-10 (dados não mostrados) e IFNg (dados não mostrados). Os níveis de IL12p70, IL10 e IFNg estavam abaixo do limite de quantificação.

[0576]Para todas as citocinas testadas (Figs. 3A-3D), uma redução significativa na liberação de citocina foi observada nos anticorpos anti-CD117 silenciados em Fc (e.g., D265C LALA).

[0577]Foram realizados ensaios in vitro adicionais de liberação de citocinas para avaliar a capacidade de variantes de anticorpos adicionais (i.e., Ab4 e Ab5) desencadearem a liberação de citocina (e.g., fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF)) usando um ensaio in vitro de liberação de citocina (CRA) com células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) (i.e., Fig. 3E).

[0578]Para esses ensaios de citocina in vitro, três diferentes métodos de apresentação de anticorpos foram usados. Para o método de revestimento úmido, 10 µg do anticorpo em 100 a150 µL de PBS foram usados para a placa de 96 poços de fundo redondo tratada com cultura não tecido de revestimento úmido por uma a duas horas a 37 °C. Após o revestimento úmido o anticorpo, o excesso de anticorpo foi removido e lavado com 1x de 200 µL de PBS. As PBMCs humanas frescas foram isoladas do sangue total de quatro doadores. As PBMCs foram recolocadas em suspensão em meio RPMI com 2 % de soro autólogo. 250.000 PBMCs em 200 µL de meio foram então adicionadas a cada poço e incubadas com os anticorpos revestidos por via úmida durante a noite a 37 °C em uma incubadora de cultura de tecido com 5 % de CO2. A placa de 96 poços foi depois centrifugada a 500G por 10 min e 100 µL do sobrenadante foi coletado e analisado usando um kit Pró-inflamatório de TC Humano de ensaio multiplexado de descoberta de mesoescala (MSD) (Meso Scala Diagnostics, LLC; Produto No K15008B). O clone OKT3 de mAb anti-CD3 foi usado como um controle positivo para o ensaio de liberação de citocina.

[0579]Para o método de revestimento seco, 1 ou 10 µg do anticorpo em 20 µL de PBS foram adicionados a uma placa de 96 poços de fundo redondo tratada com cultura não tecido e incubados durante a noite na temperatura ambiente para evaporar a solução e revestimento seco do anticorpo. As PBMCs humanas frescas foram isoladas do sangue total de doadores e recolocadas em suspensão. 250.000 PBMCs em 200 µL de 2 % de soro autólogo com 1 % Pen-strep em meio RPMI 1640 foram adicionadas a cada poço na placa e foram incubadas durante a noite a 37 °C em uma incubadora de cultura de tecido com 5 % de CO2. A placa de 96 poços foi depois centrifugada a 500G por 10 min e 100 µL do sobrenadante foi coletado e analisado usando um kit Pró-inflamatório de TC Humano de ensaio multiplexado de descoberta de mesoescala (MSD) (Meso Scala Diagnostics, LLC; Produto No K15008B). O clone OKT3 de mAb anti-CD3 foi usado como um controle positivo para o ensaio de liberação de citocina.

[0580]Para o método de revestimento de solução, as PBMCs humanas frescas foram isoladas do sangue total dos doadores. 250.000 células foram suspensas em 200 µL de 2 % de soro autólogo com 1 % Pen-strep em meio RPMI

1640. As células foram então colocadas em placa de 96 poços de fundo redondo tratada com cultura não tecido. 10 µg de anticorpo foram adicionados aos poços contendo PBMCs e incubados durante a noite a 37 °C em uma incubadora de cultura de tecido com 5 % de CO2. A placa foi depois centrifugada a 500G por 10 min e 100 µL do sobrenadante foi coletado e analisado usando um kit Pró-inflamatório de TC Humano de ensaio multiplexado de descoberta de mesoescala (MSD) (Meso Scala Diagnostics, LLC; Produto No K15008B). O clone OKT3 de mAb anti-CD3 foi usado como um controle positivo para o ensaio de liberação de citocina.

[0581]Os resultados na Fig. 3E demonstram uma redução significativa na liberação da citocina GM-CSF no anticorpo anti-CD45 silenciado em Fc (i.e., Ab5) (e.g., D265C.H435A) e Ab4 para cada um dos três métodos de apresentação de anticorpos. Resultados semelhantes mostrando que o anticorpo anti-CD45 silenciado em Fc (i.e., Ab5) evita a liberação de citocina in vitro foram observados para TNFα, IL-1β, IFNγ e IL-6 (dados não mostrados). Exemplo 4. Análise in vitro de variantes de Fc usando ensaio de fagocitose

[0582]Para analisar o grau em que as modificações em Fc podem reduzir fagocitose celular dependente de anticorpo, anticorpos anti-CD117 (i.e., Ab2) tendo as mutações de Fc D265C.LALA.H435A ou D265C.H435A foram avaliados usando um ensaio in vitro de fagocitose celular dependente de anticorpo em comparação com controles.

[0583]Os monócitos foram isolados do sangue total humano recém-colhido usando um kit RosetteSep (StemCell Technologies), seguido por incubação por 6 dias na presença de fator estimulador de colônia de macrófagos (M-CSF) para gerar macrófagos derivados de monócitos (MDMs). Os MDMs resultantes foram marcados pela coloração de CD14 exposto à superfície e incubados por 2 horas com células Kasumi-1 marcadas com CFSE e uma razão molar 1:2 de MDM para células Kasumi-

1. A mistura resultante foi incubada com concentrações crescentes do anticorpo indicado por duas horas a 37 °C. A fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP)

foi avaliada usando citometria de fluxo determinando a co-expressão de CFSE e coloração de CD134 (Fig. 4A) depois da incubação com o anticorpo indicado (i.e., Ab2 (WT), Ab2 D265C.LALA.H435A e Ab2 D265C.H435A), controle positivo (i.e., anticorpo anti-CD117 intensificado pelo efetor) ou controle negativo (i.e., isotipo hIgG4 e isotipo hIgG1).

[0584]Os resultados indicam que o anticorpo anti-CD117 intensificado pelo efetor (controle positivo) e Ab2 (WT) facilitam a atividade robusta de ADCP (Fig. 4B). Além disso, uma redução parcial na atividade de ADCP devido ao aumento do silenciamento do efetor de Fc foi observada para Ab2 D265C.H435A (i.e., EC50 aumenta de um EC50 de 14,7 pM para o anticorpo anti-CD117 intensificado pelo efetor e um EC50 de 23,7 pM para Ab2 (WT) a um EC50 de 36,4 pM para Ab2 D265C.H435A), enquanto os resultados para Ab2 D265C.LALA.H435A indicam uma redução significativa na atividade de ADCP devido ao silenciamento robusto do efetor de Fc quando comparado com os controles apropriados (Fig. 4B). Juntos, esses dados demonstram que a atividade de ADCP pode ser reduzida aos níveis basais com anticorpos projetados para serem silenciosos em Fc. Exemplo 5. Análise in vitro de termostabilidade de variantes de Fc

[0585]Anticorpos modificados em Fc foram avaliados por fluorimetria de varredura diferencial (DSF) para avaliar a termostabilidade de cada anticorpo tendo as substituições de aminoácidos indicadas. 20 microgramas do anticorpo combinado com o tampão de deslocamento térmico de proteína e corante de acordo com as especificações do kit de deslocamento térmico de proteína (Applied biosystems, Protein Thermal Shift Dye kit (Part # 4461146) foram analisados usando o instrumento Applied Biosystems Quant Studio 7 Flex da Life Technologies e a temperatura de fusão (Tm) de cada anticorpo foi determinada (ver Figs. 5A, 5B e 5C e Figs. 6A e 6B).

[0586]As mutações na mesma estrutura principal do anticorpo causaram alterações apenas nas temperaturas de desdobramento do domínio CH2. As temperaturas de desdobramento de Fab permaneceram constantes (Figs. 6A e 6B). A introdução de D265C diminuiu a estabilidade térmica do WT (Fig. 6A). H435A também causou declínio adicional na estabilidade (Fig. 6A). Entretanto, a introdução da mutação LALA na região Fc modificada não causou instabilidade adicional (Fig. 6A e 6B). Exemplo 6: Análise in vitro da estabilidade acelerada das variantes de Fc

[0587]A estabilidade acelerada de cada anticorpo indicado (e variantes de anticorpos) foi avaliada depois da incubação a 60 graus Celsius por 30 minutos por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) e cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). Para avaliar o nível de hidrofóbicos degradantes após o tratamento de cada anticorpo indicado 30 minutos a 60 graus Celsius, 25 µg do anticorpo indicado foi injetado em uma coluna Tosoh TSKgel Phenil-5PW, 7,5mm ID x 7,5cm, 10µM em um sistema Waters ACQUITY Arc HPLC. A proteína eluída foi detectada usando absorvância UV a 280 nm e os resultados foram relatados como a área percentual máxima do monômero de anticorpo (Figs. 7A, 7B, 8A e 8D) ou máximo do degradante hidrofóbico (Figs. 7A, 7B, 8B, 8C e 8E). As variantes D265C LALA e D265C H435A LALA exibiram baixos níveis de degradantes hidrofóbicos após o estresse térmico (Fig. 8A). Além disso, a variante D265C.H435A.LALA demonstrou estabilidade significativamente aperfeiçoada em comparação com a variante D265C.H435A (Fig. 8C).

[0588]Cada variante de anticorpo foi também testada para percentual de formação de espécie de alto peso molecular (HMW), uma indicação de propensão de agregação, usando SEC após o tratamento de cada anticorpo 30 minutos a 60 graus Celsius. A análise de SEC foi realizada em um sistema Waters ACQUITY Arc HPLC com uma coluna Waters ACQUITY UPLC Protein BEH SEC Column, 200Å, 1,7 µm, 4,6 mm X 150 mm. 25 µg do anticorpo indicado foi injetado na coluna e a proteína eluída foi detectada usando absorvância UV a 280 nm. Os resultados foram relatados como a área percentual máxima do monômero de anticorpo (Figs. 9A e 9D) ou percentual máximo de agregado de HMW (Figs. 9B, 9C e 9E). As variantes D265C LALA e D265C H435A LALA exibiram um baixo nível de agregados após o estresse térmico (Fig. 9B). Além disso, a variante D265C.H435A.LALA demonstrou estabilidade aperfeiçoada com nível mais baixo de agregados em comparação com a variante D265C.H435A (Fig. 9C). Exemplo 7. Análise da Farmacocinética de Primata Não Humano

[0589]Um ensaio farmacocinético de primata não humano foi realizado para determinas as taxas de eliminação de um ADC anti-CD117 compreendendo o anticorpo anti-CD117 Ab85 (também referido aqui permutavelmente como Ab2) tendo mutações de Fc D265C e H435A (definidas pelo índice EU, i.e., Ab2 D265C.H435A) conjugado por meio de um conector (clivável) com amatoxina. Os resultados nas Figs. 10A e 10B mostram que o ADC com o anticorpo Ab85 modificado em Fc (i.e., Ab2) apresentou eliminação rápida em macacos cinomolgos com uma meia-vida adequada para a preparação do paciente para transplante (n=3/grupo). As taxas de eliminação foram semelhantes para a detecção de ADC total (linhas sólidas) e amatoxina (linhas tracejadas). A Fig. 10A mostra as taxas de eliminação para o ADC total (linhas sólidas) e amatoxina (linhas tracejadas). Como mostrado nas Figs. 10A e 10B, o ADC não é mais detectável depois de três dias após a administração. Isso fornece uma janela após a depleção da célula alvo e eliminação rápida do ADC para a infusão segura do enxerto. Exemplo 8. Análise de Depleção de População Células Alvo em um Estudo de Escalonamento de Dose In Vivo

[0590]Um ADC anti-CD117 compreendendo o anticorpo anti-CD117 Ab2 conjugado por meio de um conector com amatoxina foi projetado para possuir as mutações D265C e H435A (i.e., ADC1), que resultam em um ADC anti-CD117 de meia-vida rápida. Coortes de macacos cinomolgos (3 macacos por coorte) foram administrados com doses variáveis de ADC1 ou um controle (i.e., 0,1 mg/kg; 0,3 mg/kg; ou um controle (PBS)) no dia 0. Aspirados de medula óssea foram coletados no dia 7 pós-dose. HSCs fenotípicas foram quantificadas por citometria de fluxo (dados resultantes fornecidos na Fig. 11A e 11C) e por avaliação de unidades formadoras de colônia (CFU) do aspirado da medula óssea (dados resultantes fornecidos na Fig. 11B e 11D). Os dados foram graficamente representados como uma função de doses variáveis do conjugado fármaco-anticorpo ADC1 (ADC) versus um controle (i.e., PBS) (eixo x) como mostrado nas Figs. 11A-11D. As Figs. 11C e 11D mostram ainda os dados correspondentes ao anticorpo anti-CD117 não conjugado (“anti-CD117”). A Fig. 11E mostra a análise fenotípica da medula óssea coletada no dia 7 e examinada por citometria de fluxo (Fig. 11E).

[0591]Os resultados nas Figs. 11A-11D indicam que o ADC anti-CD117- amatoxina de meia-vida rápida projetado (i.e., ADC1) esgota seletivamente as populações de célula alvo em macacos cinomolgos. Especificamente, os dados mostram que foi observada depleção dose-dependente no alvejamento de HSC (Fig. 11A e 11C) e CFU (Fig. 11B e 11D). Portanto, esses dados demonstram que o ADC1 exibiu eliminação seletiva potente de NHP HSCs e progenitoras in vivo, em que o ADC1 de meia-vida rápida fornece um modelo para depleção da célula alvo e eliminação rápida antes do transplante de medula óssea, que potencialmente fornece uma melhoria significativa nas abordagens de padrão de cuidado para a preparação do paciente antes do transplante de medula óssea e permite que mais pacientes recebem um transplante. Exemplo 9. Análise de Contagem de Células de Neutrófilos e Contagem de Células de Linfócitos em um Estudo de Escalonamento de Dose In Vivo

[0592]Coortes de macacos cinomolgos (3 macacos por coorte) foram administrados com doses variáveis do ADC1 (i.e., 0,1 mg/kg; 0,3 mg/kg; ou um controle (PBS)) no dia 0. O sangue periférico foi coletado ao longo do curso do estudo.

A hematologia foi avaliada ao longo do curso do estudo. A contagem de células de neutrófilos (103/mL) e contagem de células de linfócitos (103/mL) foi medida e foi graficamente representada como uma função de dias após a administração da dose como mostrado nas Figs. 12A-12C. A Fig. 12C mostra ainda os dados correspondentes à contagem de linfócitos para macacos cinomolgos administrados com um anticorpo anti-CD117 não conjugado (“anti-CD117”).

[0593]Os resultados nas Figs. 12A-12C mostram a depleção dose- dependente no alvejamento observada para neutrófilos enquanto os linfócitos são poupados (i.e., as contagens de linfócitos permaneceram dentro da faixa normal). Esses dados também indicam a preservação do sistema imunológico adaptativo com retardação do início de nadir de neutrófilos (18 dias), potencialmente encurtando o período de neutropenia. Exemplo 10. Análise de ALT e Bilirrubina no Plasma em um Estudo de Escalonamento de Dose In Vivo

[0594]Coortes de macacos cinomolgos (3 macacos por coorte) foram administrados com doses variáveis do ADC1 projetado para possuir mutações D265C e H435A, que resultam em um ADC anti-CD117 de meia-vida rápida (i.e., 0,1 mg/kg; 0,3 mg/kg; ou um controle (PBS)) no dia 0. As químicas clínicas foram avaliadas ao longo do curso do estudo. Os níveis plasmáticos de ALT (alanina aminotransaminase) e Bilirrubina foram medidos e foram graficamente representados como uma função de dias após a administração da dose como mostrado nas Figs. 13A a 13C. A Fig. 13C mostra ainda os dados correspondentes aos níveis plasmáticos de ALT em macacos cinomolgos administrados com um anticorpo anti-CD117 não conjugado (“anti- CD117”). Os tecidos do fígado e rim foram adicionalmente avaliados 35 dias após o tratamento (Fig. 14). Os tecidos foram fixados em formalina, embebidos em parafina, corados com hematoxilina e eosina (H&E) e representados visualmente com um scanner de alto rendimento Aperio AT2 (Fig. 14).

[0595]Os resultados nas Figs. 13A-13C mostram que foi observada uma elevação dose-dependente transitória de enzimas hepáticas e bilirrubina em grupos tratados com as doses mais altas do isotipo-AM (dados não mostrados) e as várias doses de ADC1 (* p<0,05, ** p<0,01 ao comparar o ADC1 com o veículo). Nenhuma mudança acima do limite superior normal (ULN) para os parâmetros adicionais, i.e., GGT, albumina, BUN, PT, ALP, creatinina, glicose, LDH ou PTT foi observada. Além disso, nenhuma alteração histopatológica foi observada nos tecidos do fígado e rim 35 dias após o tratamento, como mostrado em Fig. 14. Exemplo 11. Análise de Contagem de Células de Reticulócitos em um Estudo In Vivo

[0596]Coortes de macacos cinomolgos foram administrados com doses variáveis do ADC1 projetado para possuir mutações D265C e H435A, que resultam em um ADC anti-CD117 de meia-vida rápida (0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg), um anticorpo de CD117 não conjugado ou um controle (PBS) no dia 0. A contagem de células de reticulócitos (109/L) foi medida usando um analisador de hematologia e foi graficamente representada como uma função de dias após a administração da dose como mostrado na Fig. 15.

[0597]Os resultados na Fig. 15 indicam uma depleção dose-dependente de reticulócitos após a administração do ADC1 de meia-vida rápida (0,1 mg/kg dose - 0,3 mg/kg dose) em coparação com a contagem de reticulócitos basal (i.e., PBS). Nenhuma depleção foi observada para um isotipo-AM controle (dados não mostrados) indicando depleção de reticulócitos no alvo. TABELA 5: SUMÁRIO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS Identificador de Sequência Descrição Sequência de Aminoácidos SEQ ID NO: 1 CDR-H1 de CK6 SYWIG SEQ ID NO: 2 CDR-H2 de CK6 IIYPGDSDTRYSPSFQG SEQ ID NO: 3 CDR-H3 de CK6 HGRGYNGYEGAFDI SEQ ID NO: 4 CDR-L1 de CK6 RASQGISSALA SEQ ID NO: 5 CDR-L2 de CK6 DASSLES SEQ ID NO: 6 CDR-L3 de CK6 CQQFNSYPLT SEQ ID NO: 7 CDR-H1 de Ab85 NYWIG

SEQ ID NO: 8 CDR-H2 de Ab85 IINPRDSDTRYRPSFQG SEQ ID NO: 9 CDR-H3 de Ab85 HGRGYEGYEGAFDI SEQ ID NO: 10 CDR-L1 de Ab85 RSSQGIRSDLG SEQ ID NO: 11 CDR-L2 de Ab85 DASNLET SEQ ID NO: 12 CDR-L3 de Ab85 QQANGFPLT SEQ ID NO: 13 Região variável de cadeia pesada de EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSG Ab85 YSFTNYWIGWVRQMPGKGLEWMAII

NPRDSDTRYRPSFQGQVTISADKSIS TAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRG

YEGYEGAFDIWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 14 Região variável de cadeia leve de Ab85 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSS

QGIRSDLGWYQQKPGKAPKLLIYDAS NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQANGFPLTFGGGTK

VEIK SEQ ID NO: 15 Região constante de cadeia pesada ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG (Tipo selvagem (WT)) CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH

TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC

SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 16 Região constante de cadeia pesada ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG com mutações L234A, L235A (LALA) CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH (mutações em negrito)* TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG

TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC

SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 17 Região constante de cadeia pesada ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG com mutação D265C (mutação em CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH negrito)* TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG

TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVCVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC

SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 18 Região constante de cadeia pesada ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG com mutação H435A (mutação em CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH negrito)* TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG

TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC

SVMHEALHNAYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 19 Região constante de cadeia pesada: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG região Fc modificada com mutações CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH L234A, L235A, D265C (mutações em TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG negrito)* TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC

DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVCVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC

SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 20 Região constante de cadeia pesada: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG região Fc modificada com mutações CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH L234A, L235A, D265C, H435A TFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG (mutações em negrito)* TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC

SVMHEALHNAYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 21 Sequência de cadeia pesada de EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSG comprimento total Ab85; região YSFTNYWIGWVRQMPGKGLEWMAII constante sublinhada NPRDSDTRYRPSFQGQVTISADKSIS

TAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRG YEGYEGAFDIWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

EALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 22 Sequência de cadeia pesada de EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSG comprimento total Ab85; região YSFTNYWIGWVRQMPGKGLEWMAII constante sublinhada; região Fc NPRDSDTRYRPSFQGQVTISADKSIS modificada com mutações L234A, TAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRG L235A (mutações em negrito)* YEGYEGAFDIWGQGTLVTVSSASTK

GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

EALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 23 Sequência de cadeia pesada de EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSG comprimento total Ab85: região YSFTNYWIGWVRQMPGKGLEWMAII constante sublinhada; região Fc NPRDSDTRYRPSFQGQVTISADKSIS modificada com mutações L234A, TAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRG L235A, D265C (mutações em negrito)* YEGYEGAFDIWGQGTLVTVSSASTK

GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVCVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

EALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 24 Sequência de cadeia pesada de EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSG comprimento total Ab85 (mutante LALA YSFTNYWIGWVRQMPGKGLEWMAII - D265C - H435A); região constante NPRDSDTRYRPSFQGQVTISADKSIS sublinhada TAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGRG

YEGYEGAFDIWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTH TCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVCVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

EALHNAYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 25 Região constante de cadeia leve RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV

CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF

NRGEC SEQ ID NO: 26 Comprimento total cadeia leve Ab85; DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSS região constante sublinhada QGIRSDLGWYQQKPGKAPKLLIYDAS

NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQANGFPLTFGGGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT

KSFNRGEC SEQ ID NO: 27 Região variável de sequência de QVQLVQSGAAVKKPGESLKISCKGS aminoácidos de cadeia pesada CK6 GYRFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMG (CDRs em negrito) IIYPGDSDTRYSPSFQGQVTI

SAGKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYC ARHGRGYNGYEGAFDIWGQGTMVT

VSS SEQ ID NO: 28 Região variável de sequência de AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQ aminoácidos de cadeia leve CK6 GISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASS (CDRs em negrito) LESGVPSRFSGSGSGTD

FTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLT

FGGGTKVEIK SEQ ID NO: 29 Sequência de CD2 humana MSFPCKFVAS FLLIFNVSSK

GAVSKEITNA LETWGALGQD INLDIPSFQM SDDIDDIKWE KTSDKKKIAQ FRKEKETFKE KDTYKLFKNG TLKIKHLKTD DQDIYKVSIY DTKGKNVLEK IFDLKIQERV SKPKISWTCI NTTLTCEVMN GTDPELNLYQ DGKHLKLSQR VITHKWTTSL SAKFKCTAGN KVSKESSVEP VSCPEKGLDI YLIIGICGGG SLLMVFVALL VFYITKRKKQ RSRRNDEELE TRAHRVATEE RGRKPHQIPA STPQNPATSQ HPPPPPGHRS QAPSHRPPPP GHRVQHQPQK RPPAPSGTQV HQQKGPPLPR PRVQPKPPHG

AAENSLSPSS N SEQ ID NO: 30 CDR-H1 de anticorpo anti-CD2 EYYMY SEQ ID NO: 31 CDR-H2 de anticorpo anti-CD2 RIDPEDGSIDYVEKFKK SEQ ID NO: 32 CDR-H3 de anticorpo anti-CD2 GKFNYRFAY SEQ ID NO: 33 CDR-L1 de anticorpo anti-CD2 RSSQSLLHSSGNTYLN SEQ ID NO: 34 CDR-L2 de anticorpo anti-CD2 LVSKLES SEQ ID NO: 35 CDR-L3 de anticorpo anti-CD2 MQFTHYPYT SEQ ID NO: 36 Região variável de cadeia pesada anti- QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS CD2 GYTFTEYYMYWVRQAPGQGLELMG

RIDPEDGSIDYVEKFKKKVTLTADTSS STAYMELSSLTSDDTAVYYCARGKFN

YRFAYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 37 Região variável de cadeia leve anti- DVVMTQSPPSLLVTLGQPASISCRSS CD2 QSLLHSSGNTYLNWLLQRPGQSPQP

LIYLVSKLESGVPDRFSGSGSGTDFT LKISGVEAEDVGVYYCMQFTHYPYTF

GQGTKLEIK SEQ ID NO: 38 CDR-H1 anti-CD2 (RPA-2,10) GFTFSSY SEQ ID NO: 39 CDR-H2 anti-CD2 (RPA-2,10) SGGGF SEQ ID NO: 40 CDR-H3 anti-CD2 (RPA-2,10) SSYGEIMDY Variante 1 SEQ ID NO: 41 CDR-H3 anti-CD2 (RPA-2,10) SSYGELMDY Variante 2 SEQ ID NO: 42 CDR-L1 anti-CD2 (RPA-2,10) RASQRIGTSIH SEQ ID NO: 43 CDR-L2 anti-CD2 (RPA-2,10) YASESIS SEQ ID NO: 44 CDR-L3 anti-CD2 (RPA-2,10) QQSHGWPFTF SEQ ID NO: 45 Região variável de cadeia pesada anti- EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAAS CD2 (RPA-2,10) GFTFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAS Variante 1 ISGGGFLYYLDSVKGRFTISRDNARNI

LYLHMTSLRSEDTAMYYCARSSYGEI

MDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 46 Região variável de cadeia pesada anti- EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAAS

CD2 (RPA-2,10) GFTFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAS Variante 2 ISGGGFLYYLDSVKGRFTISRDNARNI

LYLHMTSLRSEDTAMYYCARSSYGEL

MDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 47 Região variável de cadeia leve anti- DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQ CD2 (RPA-2,10) RIGTSIHWYQQRTTGSPRLLIKYASES

ISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESE DVADYYCQQSHGWPFTFGGGTKLEI

E SEQ ID NO: 48 Sequência de aminoácidos de CD5 Mpmgslqplatlyllgmlvasclgrlswydpdfqarlt humano (isoforma 1) rsnskcqgqlevylkdgwh mvcsqswgrs skqwedpsqa skvcqrlncg vplslgpflv tytpqssiic ygqlgsfsncshsrndmchs lgltclepqk ttppttrppp tttpeptapp rlqlvaqsgg qhcagvvefysgslggtisy eaqdktqdle nflcnnlqcg sflkhlpete agraqdpgep rehqplpiqwkiqnssctsl ehcfrkikpq ksgrvlallc sgfqpkvqsr lvggssiceg tvevrqgaqwaalcdsssar sslrweevcr eqqcgsvnsy rvldagdpts rglfcphqkl sqchelwernsyckkvfvtc qdpnpaglaa gtvasiilal vllvvllvvc gplaykklvk kfrqkkqrqwigptgmnqnm sfhrnhtatv rshaenptas hvdneysqpp rnshlsaypa legalhrssmqpdnssdsdy dlhgaqrl SEQ ID NO: 49 Região variável de cadeia pesada anti- QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTFSGF CD5 (5D7 humanizado) (CDRs em SLSTSGMGVGWIRQAPGKGLEWVAH negrito) IWWDDDVYYNPSLKSRLTITKDASKD

QVSLKLSSVTAADTAVYYCVRRRATG

TGFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 50 Região variável de cadeia leve anti- NIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQAS CD5 (5D7 humanizado) QDVGTAVAWYQQKPDQSPKLLIYWT (CDRs em negrito) STRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISS

LQPEDIATYFCHQYNSYNTFGSGTKL

EIK SEQ ID NO: 51 CDR-H1 anti-CD5 (5D7 humanizado) FSLSTSGMG SEQ ID NO: 52 CDR-H2 anti-CD5 (5D7 humanizado) WWDDD SEQ ID NO: 53 CDR-H3 anti-CD5 (5D7 humanizado) RRATGTGFDY SEQ ID NO: 54 CDR-L1 anti-CD5 (5D7 humanizado) QDVGTA SEQ ID NO: 55 CDR-L2 anti-CD5 (5D7 humanizado) WTSTRHT SEQ ID NO: 56 CDR-L3 anti-CD5 (5D7 humanizado) YNSYNT SEQ ID NOs: 57 - 277 Sequências de aminoácidos de CDR para vários anticorpos anti-CD5 SEQ ID NO: 278 CDR-H1 de anticorpo anti-CD137 STYWIS SEQ ID NO: 279 CDR-H2 de anticorpo anti-CD137 KIYPGDSYTNYSPSFQG SEQ ID NO: 280 CDR-H3 de anticorpo anti-CD137 RGYGIFDY SEQ ID NO: 281 CDR-L1 de anticorpo anti-CD137 SGDNIGDQYAH SEQ ID NO: 282 CDR-L2 de anticorpo anti-CD137 QDKNRPS

SEQ ID NO: 283 CDR-L3 de anticorpo anti-CD137 ATYTGFGSLAV SEQ ID NO: 284 CDR-L3 de anticorpo anti-CD137 STYTFVGFTTV SEQ ID NO: 285 CDR-H1 de anticorpo anti-CD137 NSYAIS SEQ ID NO: 286 CDR-H2 de anticorpo anti-CD137 GIIPGFGTANYAQKFQG SEQ ID NO: 287 CDR-H3 de anticorpo anti-CD137 RKNEEDGGFDH SEQ ID NO: 288 CDR-L1 de anticorpo anti-CD137 SGDNLGDYYAS SEQ ID NO: 289 CDR-L2 de anticorpo anti-CD137 DDSNRPS SEQ ID NO: 290 CDR-L3 de anticorpo anti-CD137 QTWDGTLHFV SEQ ID NO: 291 CDR-H1 de anticorpo anti-CD137 SDYYMH SEQ ID NO: 292 CDR-H2 de anticorpo anti-CD137 VISGSGSNTYYADSVKG SEQ ID NO: 293 CDR-H3 de anticorpo anti-CD137 RLYAQFEGDF SEQ ID NO: 294 CDR-L1 de anticorpo anti-CD137 SGDNIGSKYVS SEQ ID NO: 295 CDR-L2 de anticorpo anti-CD137 SDSERPS SEQ ID NO: 296 CDR-L3 de anticorpo anti-CD137 QSWDGSISRV SEQ ID NO: 297 Sequência de cadeia pesada anti- QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKAS CD137 (ch-BBK2) (CDRs em negrito) GYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGN

IYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSS NTVYMQLNSPTSEDSAVYYCTRNGV EGYPHYYAMEYWGQGTSVTVSSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

HEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 298 Sequência de cadeia leve anti-CD137 DIQMTQTTSALSASLGDRVTIGCRAS (ch-BBK2) (CDRs em negrito) QDLSNHLYWYQQKPDGTVKLLIYYTS

RLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIRNL EQEDVATYFCQQGYTLPYTFGGGTK LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT

KSFNRGEC SEQ ID NO: 299 CDR-H1 anti-CD137 (ch-BBK2) SGYTFTSYW SEQ ID NO: 300 CDR-H2 anti-CD137 (ch-BBK2) NIYPSDSYT SEQ ID NO: 301 CDR-H3 anti-CD137 (ch-BBK2) TRNGVEGYPHYYAME SEQ ID NO: 302 CDR-L1 anti-CD137 (ch-BBK2) SQDLSNH SEQ ID NO: 303 CDR-L2 anti-CD137 (ch-BBK2) YYTS SEQ ID NO: 304 CDR-L3 anti-CD137 (ch-BBK2) CQQGYTLPY

SEQ ID NO: 305 CDR-H1 anti-CD137 (ch-BBK2) SYWIN SEQ ID NO: 306 CDR-H2 anti-CD137 (ch-BBK2) NIYPSDSYTNYNQKFKD SEQ ID NO: 307 CDR-H3 anti-CD137 (ch-BBK2) NGVEGYPHYYAMEY SEQ ID NO: 308 CDR-L1 anti-CD137 (ch-BBK2) RASQDLSNHLY SEQ ID NO: 309 CDR-L2 anti-CD137 (ch-BBK2) YTSRLHS SEQ ID NO: 310 CDR-L3 anti-CD137 (ch-BBK2) QQGYTLPYT SEQ ID NO: 311 Sequência de região variável de cadeia QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKAS pesada anti-CD137 (BBK2) GYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGN

IYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSS NTVYMQLNSPTSEDSAVYYCTRNGV

EGYPHYYAMEYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO: 312 Sequência de região variável de cadeia DIQMTQTTSALSASLGDRVTIGCRAS leve anti-CD137 (BBK2) QDLSNHLYWYQQKPDGTVKLLIYYTS

RLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIRNL EQEDVATYFCQQGYTLPYTFGGGTK

LEIK SEQ ID NO: 313 CD252 humano (i.e., OX40L) - Isoforma MERVQPLEENVGNAARPRFERNKLL 1 LVASVIQGLGLLLCFTYICLHFSALQV

SHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTS QKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLK GYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKV RSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNT

SLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL SEQ ID NO: 314 CD252 humano (i.e., OX40L) - Isoforma MVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFIL 2 TSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLIS

LKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLK KVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTD NTSLDDFHVNGGEL

ILIHQNPGEFCVL SEQ ID NO: 315 Sequência de aminoácidos de VH anti- EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS CD252 GFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVS

TISGSGGATRYADSVKGRFTISRDNS RNTVYLQMNSLRVEDTAVFYCTKDRL IMATVRGPYYYGMDVWGQGTTVTVS

S SEQ ID NO: 316 Sequência de aminoácidos de VL anti- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS CD252 QSISSYLNWYQQKPGKAPNLLIYAAS

SLQSGVPSRFSGSGSETDFTLTISSL QPEDFATYYCQQSHSVSFTFGPGTK

VDIK SEQ ID NO: 317 Sequência de aminoácidos de CDR-H1 GFTFSNYA anti-CD252 SEQ ID NO: 318 Sequência de aminoácidos de CDR-H2 ISGSGGAT anti-CD252 SEQ ID NO: 319 Sequência de aminoácidos de CDR-H3 TKDRLIMATVRGPYYYGMDV anti-CD252

SEQ ID NO: 320 Sequência de aminoácidos de CDR-L1 QSISSY anti-CD252 SEQ ID NO: 321 Sequência de aminoácidos de CDR-L2 AAS anti-CD252 SEQ ID NO: 322 Sequência de aminoácidos de CDR-L3 QQSHSVSFT anti-CD252 SEQ ID NO: 323 Sequência de aminoácidos de cadeia EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS pesada de comprimento total de GFTFNSYAMSWVRQAPGKGLEWVSI oxelumabe ISGSGGFTYYADSVKGRFTISRDNSR

TTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRLV APGTFDYWGQGALVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL

HNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 324 Sequência de aminoácidos de cadeia DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS leve de comprimento total de QGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAAS oxelumabe SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL

QPEDFATYYCQQYNSYPYTFGQGTK LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT

KSFNRGEC SEQ ID NO: 325 Sequência de aminoácidos de CDR-H1 GFTFNSYA de oxelumabe SEQ ID NO: 326 Sequência de aminoácidos de CDR-H2 ISGSGGFT de oxelumabe SEQ ID NO: 327 Sequência de aminoácidos de CDR-H3 AKDRLVAPGTFDY de oxelumabe SEQ ID NO: 328 Sequência de aminoácidos de CDR-L1 QGISSW de oxelumabe

SEQ ID NO: 329 Sequência de aminoácidos de CDR-L2 AAS de oxelumabe SEQ ID NO: 330 Sequência de aminoácidos de CDR-L3 QQYNSYPYT de oxelumabe SEQ ID NO: 331 Sequência de aminoácidos de VH de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS oxelumabe GFTFNSYAMSWVRQAPGKGLEWVSI

ISGSGGFTYYADSVKGRFTISRDNSR TTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRLV

APGTFDYWGQGALVTVSS SEQ ID NO: 332 Sequência de aminoácidos de VL de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS oxelumabe QGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYAAS

SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQYNSYPYTFGQGTK

LEIK SEQ ID NO: 333 CD45RA (Isoforma de CD45 humano) MTMYLWLKLLAFGFAFLDTEVFVTGQ

SPTPSPTGLTTAKMPSVPLSSDPLPT HTTAFSPASTFERENDFSETTTSLSP DNTSTQVSPDSLDNASAFNTTDAYLN ASETTTLSPSGSAVISTTTIATTPSKPT CDEKYANITVDYLYNKETKLFTAKLNV NENVECGNNTCTNNEVHNLTECKNA SVSISHNSCTAPDKTLILDVPPGVEKF QLHDCTQVEKADTTICLKWKNIETFT CDTQNITYRFQCGNMIFDNKEIKLENL EPEHEYKCDSEILYNNHKFTNASKIIK TDFGSPGEPQIIFCRSEAAHQGVITW NPPQRSFHNFTLCYIKETEKDCLNLD KNLIKYDLQNLKPYTKYVLSLHAYIIAK VQRNGSAAMCHFTTKSAPPSQVWN MTVSMTSDNSMHVKCRPPRDRNGP HERYHLEVEAGNTLVRNESHKNCDF RVKDLQYSTDYTFKAYFHNGDYPGE PFILHHSTSYNSKALIAFLAFLIIVTSIAL LVVLYKIYDLHKKRSCNLDEQQELVE RDDEKQLMNVEPIHADILLETYKRKIA DEGRLFLAEFQSIPRVFSKFPIKEARK PFNQNKNRYVDILPYDYNRVELSEIN GDAGSNYINASYIDGFKEPRKYIAAQ GPRDETVDDFWRMIWEQKATVIVMV TRCEEGNRNKCAEYWPSMEEGTRA FGDVVVKINQHKRCPDYIIQKLNIVNK KEKATGREVTHIQFTSWPDHGVPED PHLLLKLRRRVNAFSNFFSGPIVVHC SAGVGRTGTYIGIDAMLEGLEAENKV DVYGYVVKLRRQRCLMVQVEAQYILI HQALVEYNQFGETEVNLSELHPYLHN MKKRDPPSEPSPLEAEFQRLPSYRS WRTQHIGNQEENKSKNRNSNVIPYD YNRVPLKHELEMSKESEHDSDESSD DDSDSEEPSKYINASFIMSYWKPEVM IAAQGPLKETIGDFWQMIFQRKVKVIV MLTELKHGDQEICAQYWGEGKQTYG DIEVDLKDTDKSSTYTLRVFELRHSKR KDSRTVYQYQYTNWSVEQLPAEPKE LISMIQVVKQKLPQKNSSEGNKHHKS TPLLIHCRDGSQQTGIFCALLNLLESA ETEEVVDIFQVVKALRKARPGMVSTF EQYQFLYDVIASTYPAQNGQVKKNN HQEDKIEFDNEVDKVKQDANCVNPL GAPEKLPEAKEQAEGSEPTSGTEGP

EHSVNGPASPALNQGS SEQ ID NO: 334 CD45RB (Isoforma de CD45 humano) MTMYLWLKLLAFGFAFLDTEVFVTGQ

SPTPSPTGVSSVQTPHLPTHADSQTP SAGTDTQTFSGSAANAKLNPTPGSN AISDAYLNASETTTLSPSGSAVISTTTI ATTPSKPTCDEKYANITVDYLYNKETK LFTAKLNVNENVECGNNTCTNNEVH NLTECKNASVSISHNSCTAPDKTLILD VPPGVEKFQLHDCTQVEKADTTICLK WKNIETFTCDTQNITYRFQCGNMIFD NKEIKLENLEPEHEYKCDSEILYNNHK FTNASKIIKTDFGSPGEPQIIFCRSEAA HQGVITWNPPQRSFHNFTLCYIKETE KDCLNLDKNLIKYDLQNLKPYTKYVLS LHAYIIAKVQRNGSAAMCHFTTKSAP PSQVWNMTVSMTSDNSMHVKCRPP RDRNGPHERYHLEVEAGNTLVRNES HKNCDFRVKDLQYSTDYTFKAYFHN GDYPGEPFILHHSTSYNSKALIAFLAF LIIVTSIALLVVLYKIYDLHKKRSCNLDE QQELVERDDEKQLMNVEPIHADILLE TYKRKIADEGRLFLAEFQSIPRVFSKF PIKEARKPFNQNKNRYVDILPYDYNR VELSEINGDAGSNYINASYIDGFKEPR KYIAAQGPRDETVDDFWRMIWEQKA TVIVMVTRCEEGNRNKCAEYWPSME EGTRAFGDVVVKINQHKRCPDYIIQKL NIVNKKEKATGREVTHIQFTSWPDHG VPEDPHLLLKLRRRVNAFSNFFSGPIV VHCSAGVGRTGTYIGIDAMLEGLEAE NKVDVYGYVVKLRRQRCLMVQVEAQ YILIHQALVEYNQFGETEVNLSELHPY LHNMKKRDPPSEPSPLEAEFQRLPSY RSWRTQHIGNQEENKSKNRNSNVIP YDYNRVPLKHELEMSKESEHDSDES SDDDSDSEEPSKYINASFIMSYWKPE VMIAAQGPLKETIGDFWQMIFQRKVK VIVMLTELKHGDQEICAQYWGEGKQT YGDIEVDLKDTDKSSTYTLRVFELRH SKRKDSRTVYQYQYTNWSVEQLPAE PKELISMIQVVKQKLPQKNSSEGNKH HKSTPLLIHCRDGSQQTGIFCALLNLL ESAETEEVVDIFQVVKALRKARPGMV STFEQYQFLYDVIASTYPAQNGQVKK NNHQEDKIEFDNEVDKVKQDANCVN PLGAPEKLPEAKEQAEGSEPTSGTE

GPEHSVNGPASPALNQGS SEQ ID NO: 335 CD45RC (Isoforma de CD45 humano) MTMYLWLKLLAFGFAFLDTEVFVTGQ

SPTPSPTDVPGERSTASTFPTDPVSP LTTTLSLAHHSSAALPARTSNTTITAN TSDAYLNASETTTLSPSGSAVISTTTIA TTPSKPTCDEKYANITVDYLYNKETKL FTAKLNVNENVECGNNTCTNNEVHN LTECKNASVSISHNSCTAPDKTLILDV PPGVEKFQLHDCTQVEKADTTICLKW KNIETFTCDTQNITYRFQCGNMIFDNK EIKLENLEPEHEYKCDSEILYNNHKFT NASKIIKTDFGSPGEPQIIFCRSEAAH QGVITWNPPQRSFHNFTLCYIKETEK DCLNLDKNLIKYDLQNLKPYTKYVLSL HAYIIAKVQRNGSAAMCHFTTKSAPP SQVWNMTVSMTSDNSMHVKCRPPR DRNGPHERYHLEVEAGNTLVRNESH KNCDFRVKDLQYSTDYTFKAYFHNG DYPGEPFILHHSTSYNSKALIAFLAFLII VTSIALLVVLYKIYDLHKKRSCNLDEQ QELVERDDEKQLMNVEPIHADILLETY KRKIADEGRLFLAEFQSIPRVFSKFPIK EARKPFNQNKNRYVDILPYDYNRVEL SEINGDAGSNYINASYIDGFKEPRKYI AAQGPRDETVDDFWRMIWEQKATVI VMVTRCEEGNRNKCAEYWPSMEEG TRAFGDVVVKINQHKRCPDYIIQKLNI VNKKEKATGREVTHIQFTSWPDHGV PEDPHLLLKLRRRVNAFSNFFSGPIVV HCSAGVGRTGTYIGIDAMLEGLEAEN KVDVYGYVVKLRRQRCLMVQVEAQY ILIHQALVEYNQFGETEVNLSELHPYL HNMKKRDPPSEPSPLEAEFQRLPSY RSWRTQHIGNQEENKSKNRNSNVIP YDYNRVPLKHELEMSKESEHDSDES SDDDSDSEEPSKYINASFIMSYWKPE VMIAAQGPLKETIGDFWQMIFQRKVK VIVMLTELKHGDQEICAQYWGEGKQT YGDIEVDLKDTDKSSTYTLRVFELRH SKRKDSRTVYQYQYTNWSVEQLPAE PKELISMIQVVKQKLPQKNSSEGNKH HKSTPLLIHCRDGSQQTGIFCALLNLL ESAETEEVVDIFQVVKALRKARPGMV STFEQYQFLYDVIASTYPAQNGQVKK NNHQEDKIEFDNEVDKVKQDANCVN PLGAPEKLPEAKEQAEGSEPTSGTE

GPEHSVNGPASPALNQGS SEQ ID NO: 336 CD45RO (Isoforma de CD45 humano) MTMYLWLKLLAFGFAFLDTEVFVTGQ

SPTPSPTDAYLNASETTTLSPSGSAVI STTTIATTPSKPTCDEKYANITVDYLY NKETKLFTAKLNVNENVECGNNTCTN NEVHNLTECKNASVSISHNSCTAPDK TLILDVPPGVEKFQLHDCTQVEKADT TICLKWKNIETFTCDTQNITYRFQCGN MIFDNKEIKLENLEPEHEYKCDSEILY NNHKFTNASKIIKTDFGSPGEPQIIFC RSEAAHQGVITWNPPQRSFHNFTLC YIKETEKDCLNLDKNLIKYDLQNLKPY TKYVLSLHAYIIAKVQRNGSAAMCHFT TKSAPPSQVWNMTVSMTSDNSMHV KCRPPRDRNGPHERYHLEVEAGNTL VRNESHKNCDFRVKDLQYSTDYTFK AYFHNGDYPGEPFILHHSTSYNSKALI AFLAFLIIVTSIALLVVLYKIYDLHKKRS CNLDEQQELVERDDEKQLMNVEPIH ADILLETYKRKIADEGRLFLAEFQSIPR VFSKFPIKEARKPFNQNKNRYVDILPY DYNRVELSEINGDAGSNYINASYIDGF KEPRKYIAAQGPRDETVDDFWRMIW EQKATVIVMVTRCEEGNRNKCAEYW PSMEEGTRAFGDVVVKINQHKRCPD YIIQKLNIVNKKEKATGREVTHIQFTS WPDHGVPEDPHLLLKLRRRVNAFSN FFSGPIVVHCSAGVGRTGTYIGIDAML EGLEAENKVDVYGYVVKLRRQRCLM VQVEAQYILIHQALVEYNQFGETEVNL SELHPYLHNMKKRDPPSEPSPLEAEF QRLPSYRSWRTQHIGNQEENKSKNR NSNVIPYDYNRVPLKHELEMSKESEH DSDESSDDDSDSEEPSKYINASFIMS YWKPEVMIAAQGPLKETIGDFWQMIF QRKVKVIVMLTELKHGDQEICAQYWG EGKQTYGDIEVDLKDTDKSSTYTLRV FELRHSKRKDSRTVYQYQYTNWSVE QLPAEPKELISMIQVVKQKLPQKNSS EGNKHHKSTPLLIHCRDGSQQTGIFC ALLNLLESAETEEVVDIFQVVKALRKA RPGMVSTFEQYQFLYDVIASTYPAQN GQVKKNNHQEDKIEFDNEVDKVKQD ANCVNPLGAPEKLPEAKEQAEGSEP

TSGTEGPEHSVNGPASPALNQGS SEQ ID NO: 337 Região variável de cadeia pesada de evkllesggglvqpggslklscaasgfdfsrywmsw apamistamabe vrqapgkglewigeinptsstinftpslkdkvfisrdna kntlylqmskvrsedtalyycargnyyrygdamdy wgqgtsvtvssa SEQ ID NO: 338 Região variável de cadeia leve de dialtqspaslavslgqratiscrasksvstsgysylh apamistamabe wyqqkpgqppklliylasnlesgvparfsgsgsgtdf tlnihpveeedaatyycqhsrelpftfgsgtkleikr SEQ ID NO: 339 Sequência de aminoácidos de CD5 mvcsqswgrsskqwedpsqaskvcqrlncgvpl humano (isoforma 2) slgpflvtytpqssiicygqlgsfsncshsrndmchsl gltclepqkttppttrppptttpeptapprlqlvaqsgg qhcagvvefysgslggtisyeaqdktqdlenflcnnl qcgsflkhlpeteagraqdpgeprehqplpiqwkiq nssctslehcfrkikpqksgrvlallcsgfqpkvqsrlv ggssicegtvevrqgaqwaalcdsssarsslrwee vcreqqcgsvnsyrvldagdptsrglfcphqklsqc helwernsyckkvfvtcqdpnpaglaagtvasiilal vllvvllvvcgplaykklvkkfrqkkqrqwigptgmnq nmsfhrnhtatvrshaenptashvdneysqpprns hlsaypalegalhrssmqpdnssdsdy dlhgaqrl SEQ ID NO: 340 CDR-H1 de Ab249 TSWIG SEQ ID NO: 341 CDR-H2 de Ab249 IIYPGDSDTRYSPSFQG SEQ ID NO: 342 CDR-H3 de Ab249 HGLGYNGYEGAFDI SEQ ID NO: 343 CDR-L1 de Ab249 RASQGIGSALA SEQ ID NO: 344 CDR-L2 de Ab249 DASNLET SEQ ID NO: 345 CDR-L3 de Ab249 QQLNGYPLT SEQ ID NO: 346 Região variável de cadeia pesada de EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSG Ab249 YRFTTSWIGWVRQMPGKGLEWMGII

YPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIS TAYLQWSSLKASDTAMYYCARHGLG

YNGYEGAFDIWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 347 Região variável de cadeia leve de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS Ab249 QGIGSALAWYQQKPGKAPKLLIYDAS

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LEIK SEQ ID NO: 348 CDR-H1 de Ab67 FTFSDADMD SEQ ID NO: 349 CDR-H2 de Ab67 RTRNKAGSYTTEYAASVKG SEQ ID NO: 350 CDR-H3 de Ab67 AREPKYWIDFDL SEQ ID NO: 351 CDR-L1 de Ab67 RASQSISSYLN SEQ ID NO: 352 CDR-L2 de Ab67 AASSLQS SEQ ID NO: 353 CDR-L3 de Ab67 QQSYIAPYT SEQ ID NO: 354 Região variável de cadeia pesada de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS

Ab67 GFTFSDADMDWVRQAPGKGLEWVG

RTRNKAGSYTTEYAASVKGRFTISRD DSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARE

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QSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDFATYYCQQSYIAPYTFGGGTKV

EIK Outras Modalidades

[0598]Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo estão aqui incorporados por referência na mesma medida como se cada publicação independente ou pedido de patente foi especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

[0599]Embora a invenção tenha sido descrita em relação às modalidades específicas da mesma, será entendido que ela é capaz de modificações adicionais e este pedido se destina a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais desvios da invenção que caem dentro da prática conhecida ou habitual dentro da técnica à qual a invenção pertence e podem ser aplicados às características essenciais aqui expostas, e seguem no escopo das reivindicações.

[0600]Outras modalidades estão dentro das reivindicações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que as regiões Fc compreendem as substituições de aminoácidos nas posições L234, L235 (índice EU) e D265 (índice EU).

2. Anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido D265 é D265C ou D265A (índice EU).

3. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido L234 é L234A ou L234V.

4. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido L235 é L235A.

5. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição N297 (índice EU).

6. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q (índice EU).

7. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição E233 (índice EU).

8. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU).

9. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma deleção de G236 (índice EU).

10. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P331 (índice EU).

11. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido P331 é P331G.

12. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição na posição P331 (índice EU).

13. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P329 (índice EU).

14. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido P329 é P329G.

15. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU).

16. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição I253 (índice EU).

17. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido I253 é I253A.

18. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H310 (índice EU).

19. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido H310 é H310A.

20. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição N297 e D265 (índice EU).

21. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido na posição D265 é D265C ou D265A (índice EU).

22. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q (índice EU).

23. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido nas posições L234 e L235 (índice EU).

24. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido L234 é L234A ou L234V.

25. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido L235 é L235A.

26. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição E233 (índice EU).

27. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU).

28. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma deleção de G236 (índice EU).

29. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P331 (índice EU).

30. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido P331 é P331G.

31. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição na posição P331 (índice EU).

32. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 31, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P329 (índice EU).

33. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido P329 é P329G.

34. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 31, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU).

35. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 34, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição I253 (índice EU).

36. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido I253 é I253A.

37. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 36, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H310 (índice EU).

38. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido H310 é H310A.

39. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido nas posições E233, L234, L235 e D265 (índice EU) e uma deleção de G236 (índice EU), e uma substituição de aminoácido em D265 (índice EU).

40. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido em D265 é D265C ou D265A (índice EU).

41. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 39 ou 40, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido L234 é L234A ou L234V.

42. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 41, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido L235 é L235A.

43. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 42, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU).

44. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 43, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição N297 (índice EU).

45. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q (índice EU).

46. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 45, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P331 (índice EU).

47. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido P331 é P331G.

48. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 45, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição na posição P331 (índice EU).

49. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 48, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P329 (índice EU).

50. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido

P329 é P329G.

51. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 48, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU).

52. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 51, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição I253 (índice EU).

53. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 52, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido I253 é I253A.

54. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 53, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H310 (índice EU).

55. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido H310 é H310A.

56. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição H435 e D265 (índice EU).

57. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido na posição D265 é D265C ou D265A (índice EU).

58. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 56 ou 57, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido H435 é H435A.

59. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 58, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição N297 (índice EU).

60. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q (índice EU).

61. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 60, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido nas posições L234 e L235 (índice EU).

62. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 61, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido L234 é L234A ou L234V.

63. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 61 ou 62, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido L235 é L235A.

64. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 63, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição E233 (índice EU).

65. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 64, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU).

66. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 65, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma deleção de G236 (índice EU).

67. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 66, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P331 (índice EU).

68. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 67, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido P331 é P331G.

69. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 66, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição na posição P331 (índice EU).

70. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 69, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P329 (índice EU).

71. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 70, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido P329 é P329G.

72. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 69, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU).

73. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 72, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição I253 (índice EU).

74. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 73, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido I253 é I253A.

75. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 a 74, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H310 (índice EU).

76. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 75, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido H310 é H310A.

77. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido nas posições L234 e L235 (índice EU) e a substituição de aminoácido P329 (índice EU).

78. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 77, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido L234 é L234A ou L234V.

79. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 77 ou 78, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido L235 é L235A.

80. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 79, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição D265 (índice EU).

81. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 80, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido D265 é D265C ou D265A (índice EU).

82. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 81, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição N297 (índice

EU).

83. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 82, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q (índice EU).

84. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 83, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição E233 (índice EU).

85. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 84, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU).

86. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 85, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma deleção de G236 (índice EU).

87. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 86, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P331 (índice EU).

88. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 87, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido P331 é P331G.

89. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 86, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição na posição P331 (índice EU).

90. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 89, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição I253 (índice

EU).

91. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 90, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido I253 é I253A.

92. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 77 a 91, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H310 (índice EU).

93. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 92, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido H310 é H310A.

94. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido nas posições L234 e L235 (índice EU) e a substituição de aminoácido P331 (índice EU).

95. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 94, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido L234 é L234A ou L234V.

96. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 94 ou 95, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido L235 é L235A.

97. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 96, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição D265 (índice EU).

98. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 97, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido

D265 é D265C ou D265A (índice EU).

99. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 98, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição N297 (índice EU).

100. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 99, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q (índice EU).

101. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 100, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição E233 (índice EU).

102. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 101, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU).

103. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 102, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma deleção de G236 (índice EU).

104. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 103, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P329 (índice EU).

105. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 104, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido P329 é P329G.

106. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 103, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU).

107. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 106, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição I253 (índice EU).

108. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 107, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido I253 é I253A.

109. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 94 a 108, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H310 (índice EU).

110. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 109, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido H310 é H310A.

111. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido nas posições E233 e L234 e L235 (índice EU), uma deleção de G236 (índice EU).

112. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 111, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido L234 é L234A ou L234V.

113. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 112 ou 113, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido L235 é L235A.

114. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 113, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU).

115. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 114, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H435 (índice EU).

116. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 115, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido H435 é H435A.

117. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 116, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição N297 (índice EU).

118. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 117, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q (índice EU).

119. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 118, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P331 (índice EU).

120. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 119, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido P331 é P331G.

121. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 118, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição na posição P331 (índice EU).

122. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 121, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P329 (índice EU).

123. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 122, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido P329 é P329G.

124. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 121, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU).

125. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 124, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição I253 (índice EU).

126. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 125, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido I253 é I253A.

127. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 126, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H310 (índice EU).

128. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 127, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido H310 é H310A.

129. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido nas posições I253, H310 e H345 (índice EU).

130. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 129, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido I253 é I253A.

131. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 129 ou 130, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido H310 é H310A.

132. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 129 a 131, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido H435 é H435A

133. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 129 a 132, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição N297 (índice EU).

134. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 133, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q (índice EU).

135. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 129 a 134, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição D265 (índice EU).

136. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 135, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido D265 é D265C ou D265A (índice EU).

137. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 129 a 136, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição E233 (índice EU).

138. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 137, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU).

139. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 129 a 138, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma deleção de G236 (índice EU).

140. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 129 a 139, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P329 (índice EU).

141. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 140, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido P329 é P329G.

142. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 129 a 139, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU).

143. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 129 a 142, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P331 (índice EU).

144. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 143, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido P331 é P331G.

145. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 129 a 142, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU).

146. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende uma substituição de aminoácido na posição N297 (índice EU).

147. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 146, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido nas posições L234 e L235 (índice EU).

148. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 147, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido L234 é L234A ou L234V.

149. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 147 ou 148, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido L235 é L235A.

150. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 146, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição nas posições L234 e L235 (índice EU).

151. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 150, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido N297 é selecionada do grupo consiste em N297A, N297G e N297Q.

152. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 151, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição E233 (índice EU).

153. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 152, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido E233 é E233P (índice EU).

154. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 153, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma deleção de G236 (índice EU).

155. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 154, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P331 (índice EU).

156. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 155, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido P331 é P331G.

157. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 154, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição na posição P331 (índice EU).

158. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 157, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição P329 (índice EU).

159. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 158, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido P329 é P329G.

160. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 159, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc não inclui uma substituição na posição P329 (índice EU).

161. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 160, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição I253 (índice EU).

162. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 161, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido I253 é I253A.

163. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 146 a 162, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H310 (índice EU).

164. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 163, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido H310 é H310A.

165. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 164, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição S239 (índice EU).

166. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 165, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido S239 é S239C.

167. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 55, 77 a 114, 117 a 132 e 134 a 166, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende ainda uma substituição de aminoácido na posição H435 (índice EU).

168. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 165, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido H435 é H435A.

169. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 166, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreendendo a substituição de aminoácido H435A tem uma meia-vida reduzida em relação a um anticorpo IgG intacto idêntico compreendendo uma região Fc não modificada.

170. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A, S239C e D265A (índice EU).

171. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, em que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos L234A, L235A, S239C e D265C (índice EU).

172. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos L234A, L235A e D265C (índice EU).

173. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos L234A, L235A e D265A (índice EU).

174. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos L234A, L235A, S239C e D265A (índice EU).

175. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos H435A, L234A, L235A e D265C (índice EU).

176. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos N297A e D265C (índice EU).

177. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos N297G e D265C (índice EU).

178. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos N297Q e D265C (índice EU).

179. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos N297A e D265A (índice EU).

180. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos N297G e D265A (índice EU).

181. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreendendo uma região Fc, CARACTERIZADO pelo fato de que a região Fc compreende as substituições de aminoácidos que consistem essencialmente em substituições de aminoácidos N297Q e D265A (índice EU).

182. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 181, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo tem uma diminuição em uma função efetora definida como uma diminuição na ligação a um receptor Fc gama (FcγR) em relação à ligação de um anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada para o FcγR.

183. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 182, CARACTERIZADO pelo fato de que a diminuição na ligação é pelo menos uma diminuição de 70 %, pelo menos uma diminuição de 80 %, pelo menos uma diminuição de 90 %, pelo menos uma diminuição de 95 %, pelo menos uma diminuição de 98 %, pelo menos uma diminuição de 99 % ou uma diminuição de 100 % na ligação de anticorpo a um FcγR em relação à ligação do anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada para o FcγR.

184. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 182, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se liga de forma não detectavel ao FcγR.

185. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 182 a 184, CARACTERIZADO pelo fato de que anticorpo ligação para o FcγR é avaliado por interferometria de biocamada (BLI).

186. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 182 a 185, CARACTERIZADO pelo fato de que o FcγR é um receptor FcγR1.

187. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 182 a 186, CARACTERIZADO pelo fato de que o receptor FcγR é um receptor FcγR2 ou um receptor FcγR3.

188. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 187, CARACTERIZADO pelo fato de que o receptor FcγR2 é FcγR2A, FcγR2B ou FcγR2C.

189. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 187, CARACTERIZADO pelo fato de que o receptor FcγR3 é FcγR3A ou FcγR3B.

190. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 182 a 189, CARACTERIZADO pelo fato de que o receptor Fc é um receptor Fc humano.

191. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 181, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo diminui a liberação de citocina em um ensaio de liberação de citocina in vitro com uma diminuição na liberação de citocina de pelo menos 50 % em relação à liberação de citocina de um anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada.

192. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 191, CARACTERIZADO pelo fato de que a diminuição na liberação de citocina é pelo menos uma diminuição de 60 %, pelo menos uma diminuição de 70 %, pelo menos uma diminuição de 80 %, pelo menos uma diminuição de 90 %, pelo menos uma diminuição de 95 %, pelo menos uma diminuição de 98 %, pelo menos uma diminuição de 99 % ou uma diminuição de 100 % na liberação de citocina em relação à liberação de citocina do anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada.

193. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 191, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo não apresenta liberação de citocina detectável.

194. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 191 a 193, CARACTERIZADO pelo fato de que ensaio de liberação de citocina in vitro é um ensaio pró-inflamatório de cultura de tecido (TC) Meso Scale Discovery (MSD).

195. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 181, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo diminui a degranulação de mastócitos em um ensaio de degranulação de mastócitos in vitro com uma diminuição na degranulação de mastócitos de pelo menos 50 % em relação à degranulação de mastócitos de um anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada.

196. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 195, CARACTERIZADO pelo fato de que a diminuição na degranulação de mastócitos é pelo menos uma diminuição de 60 %, pelo menos uma diminuição de 70 %, pelo menos uma diminuição de 80 %, pelo menos uma diminuição de 90 %, pelo menos uma diminuição de 95 %, pelo menos uma diminuição de 98 %, pelo menos uma diminuição de 99 % ou uma diminuição de 100 % na degranulação de mastócitos em relação à degranulação de mastócitos do anticorpo idêntico compreendendo uma região Fc não modificada.

197. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 196, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo não apresenta degranulação de mastócitos detectável.

198. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 195 a 197, CARACTERIZADO pelo fato de que o in vitro ensaio de degranulação de mastócitos é um ensaio de degranulação de mastócitos com base em beta-hexosaminidase.

199. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 198, CARACTERIZADO pelo fato de que o isotipo IgG é um isotipo IgG1, um isotipo IgG2, um isotipo IgG3 ou um isotipo IgG4.

200. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 199, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado.

201. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 200, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo biespecífico.

202. Anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 201, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

203. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 202, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgG intacto.

204. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 203, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo se liga especificamente à CD117, CD45, CD2, CD5, CD137 ou CD252.

205. Conjugado fármaco-anticorpo (ADC) compreendendo o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 204, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, é conjugado a uma citotoxina por meio de um conector.

206. ADC, de acordo com a reivindicação 205, CARACTERIZADO pelo fato de que a citotoxina é um inibidor de RNA polimerase.

207. ADC, de acordo com a reivindicação 206, CARACTERIZADO pelo fato de que o inibidor de RNA polimerase é uma amatoxina.

208. ADC, de acordo com a reivindicação 207, CARACTERIZADO pelo fato de que a amatoxina é representada pela fórmula (III) (III) em que R1 é H, OH, ORA ou ORC; R2 é H, OH, ORB ou ORC; RA e RB, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar um grupo heterocicloalquila de 5 membros opcionalmente substituído; R3 é H, RC ou RD; R4, R5, R6 e R7 são, cada um, independentemente H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R8 é OH, NH2, ORC, ORD, NHRC ou NRCRD;

R9 é H, OH, ORC ou ORD; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; RC é -L-Z; RD é alquila C1-C6 opcionalmente substituída, heteroalquila C1-C6 opcionalmente substituída, alquenila C2-C6 opcionalmente substituída, heteroalquenila C2-C6 opcionalmente substituída, alquinila C2-C6 opcionalmente substituída, heteroalquinila C2-C6 opcionalmente substituída, cicloalquila opcionalmente substituída, heterocicloalquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída; L é alquileno C1-C6 opcionalmente substituído, heteroalquileno C1-C6 opcionalmente substituído, alquenileno C2-C6 opcionalmente substituído, heteroalquenileno C2-C6 opcionalmente substituído, alquinileno C2-C6 opcionalmente substituído, heteroalquinileno C2-C6 opcionalmente substituído, cicloalquileno opcionalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído, heteroarileno opcionalmente substituído, um peptídeo, um dipeptídeo, -(C=O)-, um dissulfeto, uma hidrazona ou uma combinação dos mesmos; e Z é uma porção química formada a partir de uma reação de acoplamento entre um substituinte reativo presente em L e um substituinte reativo presente dentro do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que Am compreende exatamente um substituinte RC.

209. ADC, de acordo com a reivindicação 207, CARACTERIZADO pelo fato de que a amatoxina é representada pela fórmula (IB)

(IB) em que R1 é H, OH, ORA ou ORC; R2 é H, OH, ORB ou ORC; RA e RB, junto com os átomos de oxigênio aos quais estão ligados, combinam para formar um grupo heterocicloalquila de 5 membros opcionalmente substituído; R3 é H, RC ou RD; R4, R5, R6 e R7 são, cada um, independentemente H, OH, ORC, ORD, RC ou RD; R8 é OH, NH2, ORC, ORD, NHRC ou NRCRD; R9 é H, OH, ORC ou ORD; X é -S-, -S(O)- ou -SO2-; RC é -L-Z; RD é alquila C1-C6 opcionalmente substituída, heteroalquila C1-C6 opcionalmente substituída, alquenila C2-C6 opcionalmente substituída, heteroalquenila C2-C6 opcionalmente substituída, alquinila C2-C6 opcionalmente substituída, heteroalquinila C2-C6 opcionalmente substituída, cicloalquila opcionalmente substituída, heterocicloalquila opcionalmente substituída, arila opcionalmente substituída ou heteroarila opcionalmente substituída; L é alquileno C1-C6 opcionalmente substituído, heteroalquileno C1-C6 opcionalmente substituído, alquenileno C2-C6 opcionalmente substituído,

heteroalquenileno C2-C6 opcionalmente substituído, alquinileno C2-C6 opcionalmente substituído, heteroalquinileno C2-C6 opcionalmente substituído, cicloalquileno opcionalmente substituído, heterocicloalquileno opcionalmente substituído, arileno opcionalmente substituído, heteroarileno opcionalmente substituído, um peptídeo, um dipeptídeo, -(C=O)-, um dissulfeto, uma hidrazona ou uma combinação dos mesmos; e Z é uma porção química formada a partir de uma reação de acoplamento entre um substituinte reativo presente em L e um substituinte reativo presente dentro do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que Am compreende exatamente um substituinte RC.

210. ADC, de acordo com a reivindicação 206, CARACTERIZADO pelo fato de que o inibidor de RNA polimerase é uma amanitina.

211. ADC, de acordo com a reivindicação 210, CARACTERIZADO pelo fato de que a amanitina é selecionada do grupo consiste em α-amanitina, β-amanitina, γ- amanitina, ε-amanitina, amanina, amaninamida, amanulina, ácido amanulinaico e pró- amanulina.

212. ADC, de acordo com a reivindicação 205, CARACTERIZADO pelo fato de que a citotoxina selecionada do grupo que consiste em uma exotoxina A de pseudomonas, deBouganina, toxina da difteria, saporina, maitansina, um maitansinoide, uma auristatina, uma antraciclina, uma caliqueamicina, irinotecano, SN-38, uma duocarmicina, uma pirrolobenzodiazepina, um dímero de pirrolobenzodiazepina, uma indolinobenzodiazepina e um dímero de indolinobenzodiazepina.

213. ADC, de acordo com a reivindicação 212, CARACTERIZADO pelo fato de que a auristatina é MMAE ou MMAF.

214. ADC, de acordo com qualquer uma das reivindicações 205 a 213, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, é conjugado com a citotoxina por meio de uma conjugação intercadeia com uma cisteína de dobradiça nativa.

215. ADC, de acordo com qualquer uma das reivindicações 205 a 214, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, é conjugado com a citotoxina por meio de um resíduo de cisteína no domínio Fc do anticorpo.

216. ADC, de acordo com a reivindicação 215, CARACTERIZADO pelo fato de que o resíduo de cisteína é introduzido por meio de uma substituição de aminoácido no domínio Fc do anticorpo.

217. ADC, de acordo com a reivindicação 216, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido é D265C.

218. ADC, de acordo com a reivindicação 216, CARACTERIZADO pelo fato de que a substituição de aminoácido é S239C.

219. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o anticorpo ou ADC, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 218 e um portador farmaceuticamente aceitável.

220. Método de esgotamento de uma população de células-tronco hematopoiéticas (HSC) em um paciente humano, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz do anticorpo ou ADC de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 218.

221. Método, de acordo com a reivindicação 220, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda administrar ao paciente um transplante compreendendo as células-tronco hematopoiéticas.

222. Método, de acordo com a reivindicação 221, CARACTERIZADO pelo fato de que o transplante é alogênico.

223. Método, de acordo com a reivindicação 221, CARACTERIZADO pelo fato de que o transplante é autólogo.

224. Método, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar a um paciente humano um transplante compreendendo as células-tronco hematopoiéticas, em que o paciente foi previamente administrado com o anticorpo ou o ADC de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 218 em uma quantidade suficiente para esgotar uma população de células-tronco hematopoiéticas no paciente.

225. Método, de acordo com a reivindicação 224, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula-tronco hematopoiética é uma célula CD117+ ou CD45+.

226. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 220 a 224, CARACTERIZADO pelo fato de que o paciente tem uma doença sanguínea, um transtorno metabólico, câncer ou uma doença autoimune ou doença de imunodeficiência combinada grave (SCID).

227. Método de tratar leucemia em um paciente humano, o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar o anticorpo ou ADC, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 218 ao paciente humano tendo leucemia.

228. Método, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar a um paciente humano um transplante compreendendo as células-tronco hematopoiéticas, em que o paciente foi previamente administrado com o anticorpo ou o ADC, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 218 em uma quantidade suficiente para esgotar uma população de células imunes no paciente.

229. Método, de acordo com a reivindicação 228, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula imune é uma célula CD137+, CD2+ ou CD5+.

230. Método, de acordo com a reivindicação 228 ou 229, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula imune é uma célula T.

231. Composição compreendendo o anticorpo ou ADC, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 218, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende menos de 25 % de degradante hidrofóbico após o estresse térmico.

232. Composição, de acordo com a reivindicação 231, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende menos de 20 % de degradante hidrofóbico após o estresse térmico.

233. Composição, de acordo com a reivindicação 231, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende menos de 15 % de degradante hidrofóbico após o estresse térmico.

234. Composição, de acordo com a reivindicação 231, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende menos de 10 % de degradante hidrofóbico após o estresse térmico.

235. Composição, de acordo com a reivindicação 231, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende menos de 5 % de degradante hidrofóbico após o estresse térmico.

236. Método de tratar um transtorno de célula-tronco em um paciente humano, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou ADC de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 218.

237. Método de tratar um transtorno de imunodeficiência em um paciente humano, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou ADC de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 218.

238. Método, de acordo com a reivindicação 237, CARACTERIZADO pelo fato de que o transtorno de imunodeficiência é uma imunodeficiência congênita ou uma imunodeficiência adquirida.

239. Método de tratar um transtorno metabólico em um paciente humano, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou ADC de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 218.

240. Método, de acordo com a reivindicação 239, CARACTERIZADO pelo fato de que o transtorno metabólico é selecionado do grupo consiste em doenças de armazenamento de glicogênio, mucopolissacaridose, doença de Gaucher, doença de Hurlers, esfingolipidose e Leucodistrofia metacromática.

241. Método de tratar um transtorno autoimune em um paciente humano, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou ADC de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 218.

242. Método, de acordo com a reivindicação 241, CARACTERIZADO pelo fato de que o transtorno autoimune é selecionado do grupo consiste em esclerose múltipla, lúpus sistêmico humano, artrite reumatoide, doença inflamatória intestinal, psoríase, diabetes mellitus Tipo 1, encefalomielite disseminada aguda, doença de Addison, alopecia universal, espondilite anquilosante, síndrome do anticorpo antifosfolipídeo, anemia aplásica, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, doença autoimune do ouvido interno, síndrome linfoproliferativa autoimune, ooforite autoimune, doença de Balo, doença de Behcet, penfigoide bolhoso, cardiomiopatia, doença de Chagas, síndrome de disfunção imune da fadiga crônica, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, doença de Crohn, penfigoide cicatricial, psilose celíaca-dermatite herpetiforme, doença da aglutinina fria, síndrome de CREST, doença de Degos, lúpus discoide, disautonomia, endometriose, crioglobulinemia mista essencial, fibromialgia-fibromiosite, síndrome de Goodpasture, doença de Grave, síndrome de Guillain-Barre, tireoidite de Hashimoto, Hidradenite supurativa, púrpura trombocitopênica idiopática e/ou aguda, fibrose pulmonar idiopática, neuropatia de IgA, cistite intersticial, artrite juvenil, doença de Kawasaki, líquen plano, doença de Lyme, doença de Meniere, doença mista do tecido conjuntivo, miastenia grave,

neuromiotonia, síndrome de opsoclonus myoclonus, neurite óptica, tireoidite de Ord, pênfigo vulgar, anemia perniciosa, policondrite, polimiosite e dermatomiosite, cirrose biliar primária, poliarterite nodosa, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, agamaglobulinemia primária, fenômeno de Raynaud, síndrome de Reiter, febre reumática, sarcoidose, esclerodermia, síndrome de Sjögren, síndrome da pessoa rígida, artrite de Takayasu, arterite temporal, colite ulcerativa, uveíte, vasculite, vitiligo, vulvodínia e granulomatose de Wegener.

243. Método de tratar câncer em um paciente humano, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou ADC de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 218.

244. Método, de acordo com a reivindicação 243, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo consiste em leucemia, linfoma, mieloma múltiplo e neuroblastoma.

Petição 870210035981, de 20/04/2021, pág. 337/381 FcR1 humano FcR1 cino FcR2A 167R humano FcR2A 167H humano FcR2B humano FcR3A 175V humano

(% de WT Neutro) Resposta Normalizada 1/43

Bio-hFcR1 Resposta de Resposta de Normalizado His-hFcR1 His- cinoFcR1

FcR2A FcR2A FcR3A FcR1 FcR1 FcR1 167R 167H FcR2B 177R Anticorpo humano humano cino humano humano humano humano

Isotipo WT

Anticorpo

Petição 870210035981, de 20/04/2021, pág. 339/381 Ab5 CH2 deletado 3/43 rlgG2a (isotipo controle de IgG2a de rato)

Ab5 ACD (WT) intercadeia DAR4 Ab5 ACD1 D265A,HA35A intercadeia DAR4 Ab5 ACD1 D265A intercadeia DAR4

Isotipo controle

% de Ligação vs hIgG1 do Tipo Selvagem

Anticorpo

Isotipo controle

Petição 870210035981, de 20/04/2021, pág. 342/381 Liberação de beta-hexosaminidase (Absovância a 405 nm) positivos Controles

Controles negativos Variantes neutrais Variantes de antagonista 6/43

Petição 870210035981, de 20/04/2021, pág. 343/381 Doador 1 Doador 1 Doador 2 Doador 2 Doador 3 Doador 3 Doador 4 Doador 4

Multiplicação em PBS Multiplicação em PBS 7/43

10 µg de revestimento 10 µg de revestimento de Ab total de Ab total

Petição 870210035981, de 20/04/2021, pág. 344/381 Doador 1 Doador 1 Doador 2 Doador 2 Doador 3 Doador 3 Doador 4 Doador 4

Multiplicação em PBS Multiplicação em PBS 8/43

10 µg de revestimento 10 µg de revestimento de Ab total de Ab total

Solução Úmido Seco

10 µg Ab Total

Multiplicação em PBS

Isotipo Controle (hlgG4)

Petição 870210035981, de 20/04/2021, pág. 347/381 Isotipo Controle (hlgG1)

Efetor Intensificado Anti-CD117

% DE FAGOCITOSE 11/43

CONCENTRAÇÃO [M]

Ordem de estabilidade térmica

Petição 870210035981, de 20/04/2021, pág. 348/381 (superior para inferior): 12/43

Reporter Derivado (-Rn) Temperatura (°C)

Petição 870210035981, de 20/04/2021, pág. 349/381 Ordem de estabilidade térmica (superior para inferior): 13/43

Reporter Derivado (-Rn’) Temperatura (°C)

Temperatura (°C)

Reporter Derivado (-Rn’)

Tm 1 (Desdobramento Tm 2 (Desdobramento de Anticorpo de CH2) Fab/CH3)

Petição 870210035981, de 20/04/2021, pág. 351/381 15/43

Petição 870210035981, de 20/04/2021, pág. 352/381 Tm 1 (Desdobramento Tm 2 (Desdobramento de Anticorpo de CH2) Fab/CH3) 16/43

Degradante hidrofóbico

Minutos

Minutos por 30 min

Minutos por 30 min por 30 min por 30 min

% de Pico Principal

% de degradante hidrofóbico estressado estressado

% de degradante hidrofóbico estressado Estres- sado Estres- sado estressado

% de Pico Principal estressado Estres- sado Estres- sado Estres- sado

% de degradante hidrofóbico

% de Monômero estressado Estres- sado estressado Estres- sado Estres- sado estressado

% de Monômero estressado Estres- sado Estres- sado Estres- sado

Linhas sólidas: Ab total Linhas tracejadas: Amatoxina Fármaco no Plasma (ng/ml) Concentração Média de

Horas após a dose

ADC não detectável no soro

Petição 870210035981, de 20/04/2021, pág. 366/381 N=3 por grupo Ab total Amatoxina 30/43

Concentração Média de Nenhuma morte de célula

Fármaco no Plasma (ng/ml) alvo com ADC tratado com Janela de infusão de enxerto soro de NHP

Dias após a dose

NSC (células/ml)

% de Depleção

Células remanescentes (% de PBS controle)

Veículo

Tratado

Dias após a dose

Contagem de neutrófilos (103/ml)

Dias após a dose

Contagem de linfócitos (103/ml)

Dias após a dose

Contagem de linfócitos (103/ml)

Dias após a dose

ATL (Unidades/ml)

Dias após a dose

Bilirrubina (mg/dl)

Dias após a dose

ATL (Unidades/ml)

Tecido (magnificação)

Fígado (10x)

Rim (10x)

Dias após a dose

Reticulócitos (109/ml)