BR112021007256A2 - métodos para o tratamento da distrofia muscular oculofaríngea (opmd) - Google Patents

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Abstract

MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DA DISTROFIA MUSCULAR OCULOFARÍNGEA (OPMD). A presente divulgação se refere a métodos de administração de uma construção para terapia gênica compreendendo reagentes de interferência por RNA (RNAi), tais como microRNA curto em grampo (shmiR), em combinação com reagentes de substituição de PABPN1, tais como polinucleotídeos que codificam a proteína PABPN1 funcional que não são alvo dos reagentes de RNAi, para o tratamento da distrofia muscular oculofaríngea (OPMD) em indivíduos que sofrem de OPMD ou que sejam predispostos à mesma. Em certos aspectos, o método compreende a injeção direta nos músculos faríngeos de um indivíduo.

Description

“MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DA DISTROFIA MUSCULAR OCULOFARÍNGEA (OPMD)” Referência a Pedidos Relacionados
[001] Este pedido reivindica o direito de prioridade ao Pedido Provisório U.S. No. 62/747,089, depositado em 17 de outubro de 2018, cujo conteúdo completo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
Campo da Invenção
[002] A presente divulgação se refere a métodos para o tratamento da distrofia muscular oculofaríngea (OPMD) em indivíduos que sofrem de OPMD ou que sejam predispostos à mesma.
Histórico da Invenção
[003] A OPMD é um distúrbio muscular degenerativo hereditário autossômico dominante, de início tardio e evolução lenta. A doença é caracterizada principalmente pela queda progressiva das pálpebras (ptose) e dificuldades de deglutição (disfagia). Os músculos faríngeos e cricofaríngeos são alvos específicos na OPMD. A fraqueza proximal dos membros tende a ocorrer em um estágio posterior da progressão da doença. A mutação que causa a doença é uma expansão anormal de uma repetição de trinucleotídeos (GCN) na região codificante do gene da proteína nuclear de ligação a poli(A) 1 (PABPN1). Essa expansão leva a um trato de polialanina expandido na região N-terminal da proteína PABPN1: 10 alaninas estão presentes na proteína normal, sendo expandidas para 11 a 18 alaninas na forma mutante (expPABPN1). A principal característica patológica da doença são os agregados nucleares de expPABPN1. Um dobramento incorreto da PABPN1 expandida resulta no acúmulo de agregados fibrilares poliméricos insolúveis dentro dos núcleos das células afetadas. A PABPN1 é uma proteína propensa à agregação e a PABPN1 com alanina expandida mutante na OPMD tem uma taxa de agregação mais alta do que a da proteína normal do tipo selvagem. No entanto, ainda não está claro se os agregados nucleares na OPMD têm função patológica ou protetora como consequência de um mecanismo de defesa celular.
[004] Nenhum tratamento, farmacológico ou qualquer outro, encontra-se disponível atualmente para OPMD. Intervenções cirúrgicas sintomáticas podem corrigir parcialmente a ptose e melhorar a deglutição em indivíduos moderada a gravemente afetados. Por exemplo, a miotomia cricofaríngea é atualmente o único tratamento possível para melhorar a deglutição nesses pacientes. No entanto, isso não corrige a degradação progressiva da musculatura faríngea, que muitas vezes leva à morte após dificuldades de deglutição e asfixia.
[005] Consequentemente, ainda existe a necessidade por agentes terapêuticos para o tratamento da OPMD em pacientes que sofrem da mesma e/ou que sejam predispostos à mesma.
Descrição Resumida da Invenção
[006] A presente divulgação é baseada, em parte, no reconhecimento pelos inventores de que nenhum agente terapêutico aprovado existe atualmente para o tratamento da OPMD. A presente divulgação, portanto, proporciona métodos para administrar reagentes de RNAi direcionados às regiões do transcrito de RNAm de PABPN1, que é a causadora da OPMD. Além disso, a presente divulgação proporciona métodos para administrar reagentes para a expressão da proteína PABPN1 humana do tipo selvagem com um transcrito de RNAm que não seja alvo dos reagentes de RNAi da divulgação (doravante "reagentes de substituição de PABPN1").
[007] Certos aspectos da divulgação são direcionados a um método para o tratamento de um indivíduo que sofre de distrofia muscular oculofaríngea (OPMD), o qual compreende administrar, ao referido indivíduo, uma composição que compreende:
(a) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de DNA que codifica um microRNA curto em grampo (shmiR - short hairpin microRNA); e (b) uma construção de PABPN1 compreendendo uma sequência de DNA que codifica uma proteína PABPN1 funcional tendo um transcrito de RNAm que não é alvo do(s) shmiR(s) codificado(s) pelo ácido nucleico; em que a composição é administrada por injeção direta em um músculo faríngeo do indivíduo.
[008] Certos aspectos são direcionados a um método para inibição da expressão de uma proteína PABPN1 que é causadora da distrofia muscular oculofaríngea (OPMD) em um indivíduo, o referido método compreendendo administrar, ao indivíduo, uma composição que compreende: (a) uma construção de ddRNAi compreendendo um ácido nucleico que compreende uma sequência de DNA que codifica um microRNA curto em grampo (shmiR); e (b) uma construção de PABPN1 compreendendo uma sequência de DNA que codifica uma proteína PABPN1 funcional tendo um transcrito de RNAm que não é alvo do(s) shmiR(s) codificado(s) pela construção de ddRNAi; em que a composição é administrada por injeção direta em um músculo faríngeo do indivíduo.
[009] Em um exemplo, o indivíduo melhorou a deglutição após a administração da composição por injeção direta em um músculo faríngeo do indivíduo.
[0010] Em um exemplo, a composição compreende um vetor de expressão compreendendo a construção de ddRNAi, a construção de PABPN1 ou uma combinação das mesmas.
[0011] Em um exemplo, o vetor de expressão compreende, em uma direção 5’ a 3’, a construção de ddRNAi e a construção de PABPN1.
[0012] Em um exemplo, o vetor de expressão compreende, em uma direção 5’ a 3’, a construção de PABPN1 e a construção de ddRNAi.
[0013] Em um exemplo, o vetor de expressão é um plasmídeo ou minicírculo.
[0014] Em um exemplo, o vetor de expressão é um vetor viral selecionado do grupo que consiste em um vetor viral adenoassociado (AAV), um vetor retroviral, um vetor adenoviral (AdV) e um vetor lentiviral (LV). Por exemplo, o vetor de expressão pode ser um vetor AAV, por exemplo, um AAV do sorotipo AAV2, AAV8 ou AAV9.
[0015] Em um exemplo, o ácido nucleico, a construção de ddRNAi e/ou a construção de PABPN1 é/são constituídos por uma construção de expressão e a construção de expressão compreende repetições terminais invertidas (ITRs) de um sorotipo de AAV.
[0016] Em um exemplo, a sequência de DNA que codifica a proteína PABPN1 funcional é códon-otimizada, de modo que seu transcrito de RNAm não seja alvo dos shmiRs codificados pelo ácido nucleico ou pela construção de ddRNAi. Por exemplo, a sequência de DNA que codifica a proteína PABPN1 funcional pode ser a sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 73.
[0017] Em um exemplo, a sequência de DNA que codifica a proteína PABPN1 funcional está operacionalmente ligada a um promotor compreendido na construção de PABPN1 e posicionado a montante da sequência de DNA que codifica a proteína PABPN1 funcional. Por exemplo, o promotor compreendido dentro da construção de PABPN1 pode ser um promotor específico de músculo.
[0018] Em um exemplo, o ácido nucleico compreende uma sequência de DNA que codifica um shmiR que tem como alvo um transcrito de RNA de PABPN1 humana, em que o shmiR compreende: uma sequência efetora de pelo menos 17 nucleotídeos de comprimento; uma sequência complementar efetora; uma sequência em haste-alça (stem-loop sequence); e estrutura principal de microRNA primário (pri-miRNA); em que a sequência efetora é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA de PABPN1 humana. Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente dentro da sequência apresentada na SEQ ID NO: 87 (ou seja, o transcrito de RNA mensageiro que codifica PABPN1 humana).
[0019] Em alguns exemplos, o ácido nucleico compreende uma sequência de DNA que codifica um shmiR compreendendo: uma sequência efetora de pelo menos 17 nucleotídeos de comprimento; uma sequência complementar efetora; uma sequência em haste-alça; e estrutura de pri-miRNA; em que a sequência efetora é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-13.
[0020] Preferencialmente, a sequência efetora terá menos de 30 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, uma sequência efetora adequada pode estar na faixa de 17-29 nucleotídeos de comprimento. Preferencialmente, a sequência efetora terá 20 nucleotídeos de comprimento. Mais preferencialmente, a sequência efetora terá 21 nucleotídeos de comprimento e a sequência complementar efetora terá 20 nucleotídeos de comprimento.
[0021] Em certos exemplos, o shmiR codificado pelo ácido nucleico compreende uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-13 (ou seja, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13). Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-13 e conter 4 bases em mismatch ou mal pareadas em relação à mesma. Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-13 e conter 3 bases mal pareadas em relação à mesma. Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-13 e conter 2 bases mal pareadas em relação à mesma. Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-13 e conter 1 base mal pareada em relação às mesmas. Por exemplo, a sequência efetora pode ser 100% complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-13. Onde houver mal pareamentos, é preferível que elas não estejam localizadas dentro da região correspondente à região semente do shmiR, isto é, os nucleotídeos 2-8 da sequência efetora.
[0022] Exemplos de ácidos nucleicos que podem ser úteis no método da divulgação podem compreender uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma combinação de sequência complementar efetora/efetora conforme descrito na Tabela 2.
[0023] Em um exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico é um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 14. Por exemplo, um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 14.
[0024] Em um exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico é um shmiR que compreende uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 16. Por exemplo, um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 17 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 16.
[0025] Em um exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico é um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 18. Por exemplo, um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 19 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 18.
[0026] Em um exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico é um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 20. Por exemplo, um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 21 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 20.
[0027] Em um exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico é um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 22. Por exemplo, um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 23 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 22.
[0028] Em um exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico é um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 24. Por exemplo, um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 25 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 24.
[0029] Em um exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico é um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 26. Por exemplo, um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 27 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 26.
[0030] Em um exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico é um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 28. Por exemplo, um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 29 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 28.
[0031] Em um exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico é um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 30. Por exemplo, um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 30.
[0032] Em um exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico é um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 32. Por exemplo, um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 33 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 32.
[0033] Em um exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico é um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 34. Por exemplo, um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 35 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 34.
[0034] Em um exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico é um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 36. Por exemplo, um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 37 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 36.
[0035] Em um exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico é um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 38. Por exemplo, um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 39 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 38.
[0036] Em um exemplo, o shmiR compreende, em uma direção 5’ a 3’: uma sequência flanqueadora 5’ da estrutura principal do pri-miRNA; a sequência complementar efetora; a sequência em haste-alça; a sequência efetora; e uma sequência flanqueadora 3' da estrutura principal do pri-miRNA.
[0037] Em um exemplo, o shmiR compreende, em uma direção 5’ a 3’: uma sequência flanqueadora 5’ da estrutura principal do pri-miRNA; a sequência efetora; a sequência em haste-alça; a sequência complementar efetora; e uma sequência flanqueadora 3’ da estrutura principal do pri-miRNA.
[0038] Em um exemplo, a sequência em haste-alça pode ser a sequência apresentada na SEQ ID NO: 40.
[0039] Em um exemplo, a estrutura principal do pri-miRNA é uma estrutura principal de pri-miR-30a. Por exemplo, a sequência flanqueadora 5’ da estrutura principal do pri-miRNA pode ser a sequência apresentada na SEQ ID NO: 41 e a sequência flanqueadora 3' da estrutura principal do pri-miRNA pode ser a apresentada na SEQ ID NO: 42.
[0040] Exemplos de ácidos nucleicos que podem ser úteis no método da divulgação podem compreender uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência conforme descrita na Tabela 3 e/ou codificado por uma sequência na Tabela 4. Por exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico da divulgação pode compreender uma sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 43-55. O shmiR pode ser codificado por uma sequência de DNA apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 56-68.
[0041] Em alguns exemplos, o método compreende administrar pelo menos dois ácidos nucleicos que codificam shmiRs, ou administrar uma construção de ddRNAi compreendendo os pelo menos dois ácidos nucleicos, em que cada shmiR compreende uma sequência efetora que é substancialmente complementar a um transcrito de RNA que corresponde a uma proteína PABPN1, que é a causadora da OPMD, e em que cada shmiR compreende uma sequência efetora diferente.
[0042] Os pelo menos dois ácidos nucleicos podem ser administrados separadamente ou dentro de uma única construção de ddRNAi. Em um exemplo,
cada um dos pelo menos dois ácidos nucleicos codifica um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado em uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 7, 9, 10 e 13. Por exemplo, os pelo menos dois ácidos nucleicos podem ser selecionados do grupo que consiste em: um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 14 (shmiR2); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 17 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 16 (shmiR3); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 21 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 20 (shmiR5); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 27 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 26 (shmiR9); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 30 (shmiR13); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 33 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 32 (shmiR14); e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 39 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 38 (shmiR17).
[0043] Em um exemplo, os pelo menos dois ácidos nucleicos são selecionados do grupo que consiste em: um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 56 (shmiR2); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 (shmiR3); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 59 (shmiR5); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 62 (shmiR9); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 (shmiR14); e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17).
[0044] Em um exemplo, cada um dos pelo menos dois ácidos nucleicos codifica um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado em uma das SEQ ID NOs: 2, 9, 10 e 13. Por exemplo, os pelo menos dois ácidos nucleicos podem ser selecionados do grupo que consiste em: um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 17 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 16 (shmiR3); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 30 (shmiR13); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 33 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 32 (shmiR14); e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 39 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 38 (shmiR17).
[0045] Em um exemplo, os pelo menos dois ácidos nucleicos são selecionados do grupo que consiste em: um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 (shmiR3); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 (shmiR14); e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17).
[0046] Em um exemplo, os pelo menos dois ácidos nucleicos ou construção de ddRNAi contendo os mesmos compreende: (a) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 30 (shmiR13); e (b) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 39 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 38 (shmiR17).
[0047] Em um exemplo, os pelo menos dois ácidos nucleicos ou construção de ddRNAi contendo os mesmos compreende: (a) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo na sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13); e (b) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo na sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17).
[0048] A composição descrita em qualquer exemplo deste documento pode compreender ainda um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis.
[0049] Em algum exemplo, em que o músculo faríngeo compreende um ou mais de um músculo constritor inferior, um músculo constritor médio, um músculo constritor superior, um músculo palatofaríngeo, um músculo salpingofaríngeo, um músculo estilofaríngeo ou qualquer combinação dos mesmos.
[0050] De acordo com um exemplo particular, a presente divulgação proporciona métodos para administrar, a um músculo faríngeo de um indivíduo que necessita dos mesmos, uma construção de DNA compreendendo: (a) uma construção de ddRNAi conforme descrito aqui; e (b) uma construção de PABPN1 compreendendo uma sequência de DNA que codifica uma proteína PABPN1 funcional tendo um transcrito de RNAm que não é alvo do(s) shmiR(s) codificado(s) pela construção de ddRNAi. Preferencialmente, a sequência de DNA que codifica a proteína PABPN1 funcional é códon-otimizada, de modo que seu transcrito de RNAm não seja alvo dos shmiRs da construção de ddRNAi. Em um exemplo, a proteína PABPN1 funcional é uma proteína PABPN1 humana do tipo selvagem, por exemplo, tendo uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 74. Em um exemplo, uma sequência de DNA códon-otimizada, que codifica a proteína PABPN1 funcional, é apresentada na SEQ ID NO: 73. Em algumas formas de realização, a construção de DNA pode compreender um ou mais promotores. Exemplos de promotores para uso nas construções de DNA da divulgação são promotores específicos de músculo, como por exemplo, Spc512 e CK8. Em algumas formas de realização, a construção de DNA compreende um promotor que está operacionalmente ligado à construção de PABPN1 e à construção de ddRNAi, em que o promotor está posicionado a montante da construção de PABPN1 e da construção de ddRNAi.
[0051] Em algumas formas de realização, a construção de DNA compreende, em uma direção 5’ a 3’: (a) um promotor específico de músculo, por exemplo, Spc512; (b) uma construção de PABPN1, conforme descrito aqui, compreendendo uma sequência de DNA que codifica uma proteína PABPN1 funcional tendo um transcrito de RNAm que não é alvo dos shmiRs codificados pela construção de ddRNAi; e
(c) uma construção de ddRNAi da divulgação compreendendo um ácido nucleico que compreende uma sequência de DNA que codifica shmiR13, conforme descrito aqui, e um ácido nucleico que compreende uma sequência de DNA que codifica shmiR17, conforme descrito aqui.
[0052] Em algumas formas de realização, o músculo faríngeo compreende um ou mais de um músculo constritor inferior, um músculo constritor médio, um músculo constritor superior, um músculo palatofaríngeo, um músculo salpingofaríngeo, um músculo estilofaríngeo ou qualquer combinação dos mesmos.
Breve Descrição das Figuras
[0053] A Figura 1A é um esquema que ilustra uma construção para o silenciamento gênico simultâneo de PABPN1 endógena e a substituição por PABPN1 códon-otimizada gerada pela subclonagem de dois shmiRs direcionados a wtPABPN1 na região 3' não traduzida do transcrito de PABPN1 códon-otimizado entre duas pAAV2 ITRs.
[0054] A Figura 1B é um esquema que ilustra a construção 'silenciar e substituir' (construção SR) projetada para o silenciamento gênico simultâneo de PABPN1 endógena e a substituição por PABPN1 códon-otimizada gerada pela subclonagem de dois shmiRs direcionados a wtPABPN1 (shmiR17 e shmiR13) na região 3' não traduzida do transcrito de PABPN1 códon-otimizado na estrutura do vetor pAAV2.
[0055] A Figura 1C ilustra a estrutura secundária prevista de uma construção representativa de shmiR compreendendo uma região flanqueadora 5', uma fita senso de siRNA; uma sequência de junção haste-alça, uma fita antissenso de siRNA e uma região flanqueadora 3'.
[0056] A Figura 2 é um esquema que ilustra uma construção SR. Na construção SR, os cassetes 'substituir' e 'silenciar' são todos inseridos em um único vetor com o promotor específico de músculo Spc512. Duas sequências shmiR são inseridas na 3'UTR do cassete de PABPN1 códon-otimizado.
[0057] A Figura 3A ilustra a expressão de shRNA em músculos TA (tibial anterior) de camundongos A17 injetados com a construção SR. O RNA foi extraído de amostras de TA 14 semanas após a administração da construção SR.
[0058] A Figura 3B ilustra o silenciamento da expressão de PABPN1 (incluindo expPABPN1) em músculos TA de camundongos A17 tratados com a construção SR. O RNA foi extraído de amostras de TA 14 semanas após a administração da construção SR.
[0059] A Figura 3C ilustra a restauração dos níveis normais de PABPN1 no modelo de camundongo A17 após o tratamento com a construção SR. O RNA foi extraído de amostras de músculo TA 14 semanas após a administração da construção SR.
[0060] A Figura 4A ilustra a formação significativamente reduzida de agregados insolúveis (inclusões intranucleares (INIs)) contendo PABPN1 com um efeito de dose da construção SR. A construção SR foi injetada nos músculos TA de camundongos A17. Os músculos foram coletados e montados para estudos histológicos 14 semanas após a administração da construção SR. A imunofluorescência para PABPN1 é mostrada em verde e a imunofluorescência para laminina é mostrada em vermelho.
[0061] A Figura 4B ilustra a quantificação da porcentagem de núcleos contendo INIs em seções musculares, indicando que o tratamento com a construção SR reduz significativamente a quantidade de INIs em comparação com os músculos A17 TA não tratados (teste One-way ANOVA com teste post- hoc de Bonferroni, *** p <0,001, ns: não significativo).
[0062] A Figura 5A ilustra um aumento significativo na força máxima gerada pelos músculos TA de camundongos A17 de uma maneira dose-dependente da construção SR. A força máxima foi medida por fisiologia muscular in situ.
[0063] A Figura 5B ilustra o peso muscular normalizado pelo peso corporal (PC) dos músculos TA de camundongos A17 tratados com a construção SR. O peso muscular normalizado foi comparável ao dos camundongos controle FvB em doses acima de 1e10 vg por TA injetado (média ± SEM n = 10, teste One- way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni, * p <0,05, *** p <0,001, ** p <0,01, ns: não significativo).
[0064] A Figura 6A ilustra a força máxima gerada pelos músculos TA de camundongos A17 14 semanas após a administração da construção SR. A força máxima foi medida por fisiologia muscular in situ.
[0065] A Figura 6B ilustra a força máxima gerada pelos músculos TA de camundongos A17 20 semanas após a administração da construção SR. A força máxima foi medida por fisiologia muscular in situ.
[0066] A Figura 7A ilustra a injeção direta da construção SR nos músculos faríngeos de ovelhas. A Figura 7B ilustra imagens de rádio usando um creme radiomarcado ilustrando disfagia grave em pacientes humanos com OPMD com risco de "fausse route". Chave para a Listagem de Sequências
[0067] SEQ ID NO: 1: sequência de RNA para a região dentro do transcrito de RNAm correspondente à proteína PABPN1 denominada de Região 2 do RNAm de PABPN1.
[0068] SEQ ID NO: 2: sequência de RNA para a região dentro do transcrito de RNAm correspondente à proteína PABPN1 denominada de Região 3 do RNAm de PABPN1.
[0069] SEQ ID NO: 3: sequência de RNA para a região dentro do transcrito de RNAm correspondente à proteína PABPN1 denominada de Região 4 do RNAm de PABPN1.
[0070] SEQ ID NO: 4: sequência de RNA para a região dentro do transcrito de RNAm correspondente à proteína PABPN1 denominada de Região 5 do RNAm de PABPN1.
[0071] SEQ ID NO: 5: sequência de RNA para a região dentro do transcrito de RNAm correspondente à proteína PABPN1 denominada de Região 6 do RNAm de PABPN1.
[0072] SEQ ID NO: 6: sequência de RNA para a região dentro do transcrito de RNAm correspondente à proteína PABPN1 denominada de Região 7 do RNAm de PABPN1.
[0073] SEQ ID NO: 7: sequência de RNA para a região dentro do transcrito de RNAm correspondente à proteína PABPN1 denominada de Região 9 do RNAm de PABPN1.
[0074] SEQ ID NO: 8: sequência de RNA para a região dentro do transcrito de RNAm correspondente à proteína PABPN1 denominada de Região 11 do RNAm de PABPN1.
[0075] SEQ ID NO: 9: sequência de RNA para a região dentro do transcrito de RNAm correspondente à proteína PABPN1 denominada de Região 13 do RNAm de PABPN1.
[0076] SEQ ID NO: 10: sequência de RNA para a região dentro do transcrito de RNAm correspondente à proteína PABPN1 denominada de Região 14 do RNAm de PABPN1.
[0077] SEQ ID NO: 11: sequência de RNA para a região dentro do transcrito de RNAm correspondente à proteína PABPN1 denominada de Região 15 do RNAm de PABPN1.
[0078] SEQ ID NO: 12: sequência de RNA para a região dentro do transcrito de RNAm correspondente à proteína PABPN1 denominada de Região 16 do RNAm de PABPN1.
[0079] SEQ ID NO: 13: sequência de RNA para a região dentro do transcrito de RNAm correspondente à proteína PABPN1 denominada de Região 17 do RNAm de PABPN1.
[0080] SEQ ID NO: 14: sequência complementar efetora de RNA para shmiR denominado shmiR2.
[0081] SEQ ID NO: 15: sequência efetora de RNA para shmiR denominado shmiR2.
[0082] SEQ ID NO: 16: sequência complementar efetora de RNA para shmiR denominado shmiR3.
[0083] SEQ ID NO: 17: sequência efetora de RNA para shmiR denominado shmiR3.
[0084] SEQ ID NO: 18: sequência complementar efetora de RNA para shmiR denominado shmiR4.
[0085] SEQ ID NO: 19: sequência efetora de RNA para shmiR denominado shmiR4.
[0086] SEQ ID NO: 20: sequência complementar efetora de RNA para shmiR denominado shmiR5.
[0087] SEQ ID NO: 21: sequência efetora de RNA para shmiR denominado shmiR5.
[0088] SEQ ID NO: 22: sequência complementar efetora de RNA para shmiR denominado shmiR6.
[0089] SEQ ID NO: 23: sequência efetora de RNA para shmiR denominado shmiR6.
[0090] SEQ ID NO: 24: sequência complementar efetora de RNA para shmiR denominado shmiR7.
[0091] SEQ ID NO: 25: sequência efetora de RNA para shmiR denominado shmiR7.
[0092] SEQ ID NO: 26: sequência complementar efetora de RNA para shmiR denominado shmiR9.
[0093] SEQ ID NO: 27: sequência efetora de RNA para shmiR denominado shmiR9.
[0094] SEQ ID NO: 28: sequência complementar efetora de RNA para shmiR denominado shmiR11.
[0095] SEQ ID NO: 29: sequência efetora de RNA para shmiR denominado shmiR11.
[0096] SEQ ID NO: 30: sequência complementar efetora de RNA para shmiR denominado shmiR13.
[0097] SEQ ID NO: 31: sequência efetora de RNA para shmiR denominado shmiR13.
[0098] SEQ ID NO: 32: sequência complementar efetora de RNA para shmiR denominado shmiR14.
[0099] SEQ ID NO: 33: sequência efetora de RNA para shmiR denominado shmiR14.
[00100] SEQ ID NO: 34: sequência complementar efetora de RNA para shmiR denominado shmiR15.
[00101] SEQ ID NO: 35: sequência efetora de RNA para shmiR denominado shmiR15.
[00102] SEQ ID NO: 36: sequência complementar efetora de RNA para shmiR denominado shmiR16.
[00103] SEQ ID NO: 37: sequência efetora de RNA para shmiR denominado shmiR16.
[00104] SEQ ID NO: 38: sequência complementar efetora de RNA para shmiR denominado shmiR17.
[00105] SEQ ID NO: 39: sequência efetora de RNA para shmiR denominado shmiR17.
[00106] SEQ ID NO: 40: sequência de RNA em haste-alça para shmiRs
[00107] SEQ ID NO: 41: sequência flanqueadora 5' da estrutura principal do pri-miRNA.
[00108] SEQ ID NO: 42: sequência flanqueadora 3' da estrutura principal do pri-miRNA
[00109] SEQ ID NO: 43: sequência de RNA para shmiR denominado shmiR2.
[00110] SEQ ID NO: 44: sequência de RNA para shmiR denominado shmiR3.
[00111] SEQ ID NO: 45: sequência de RNA para shmiR denominado shmiR4.
[00112] SEQ ID NO: 46: sequência de RNA para shmiR denominado shmiR5.
[00113] SEQ ID NO: 47: sequência de RNA para shmiR denominado shmiR6.
[00114] SEQ ID NO: 48: sequência de RNA para shmiR denominado shmiR7.
[00115] SEQ ID NO: 49: sequência de RNA para shmiR denominado shmiR9.
[00116] SEQ ID NO: 50: sequência de RNA para shmiR denominado shmiR11.
[00117] SEQ ID NO: 51: sequência de RNA para shmiR denominado shmiR13.
[00118] SEQ ID NO: 52: sequência de RNA para shmiR denominado shmiR14.
[00119] SEQ ID NO: 53: sequência de RNA para shmiR denominado shmiR15.
[00120] SEQ ID NO: 54: sequência de RNA para shmiR denominado shmiR16.
[00121] SEQ ID NO: 55: sequência de RNA para shmiR denominado shmiR17.
[00122] SEQ ID NO: 56: sequência de DNA que codifica shmiR denominado shmiR2.
[00123] SEQ ID NO: 57: sequência de DNA que codifica shmiR denominado shmiR3.
[00124] SEQ ID NO: 58: sequência de DNA que codifica shmiR denominado shmiR4.
[00125] SEQ ID NO: 59: sequência de DNA que codifica shmiR denominado shmiR5.
[00126] SEQ ID NO: 60: sequência de DNA que codifica shmiR denominado shmiR6.
[00127] SEQ ID NO: 61: sequência de DNA que codifica shmiR denominado shmiR7.
[00128] SEQ ID NO: 62: sequência de DNA que codifica shmiR denominado shmiR9.
[00129] SEQ ID NO: 63: sequência de DNA que codifica shmiR denominado shmiR11.
[00130] SEQ ID NO: 64: sequência de DNA que codifica shmiR denominado shmiR13.
[00131] SEQ ID NO: 65: sequência de DNA que codifica shmiR denominado shmiR14.
[00132] SEQ ID NO: 66: sequência de DNA que codifica shmiR denominado shmiR15.
[00133] SEQ ID NO: 67: sequência de DNA que codifica shmiR denominado shmiR16.
[00134] SEQ ID NO: 68: sequência de DNA que codifica shmiR denominado shmiR17.
[00135] SEQ ID NO: 69: sequência de DNA para construção dupla versão 1 que codifica shmiR3 e shmiR14 sob o controle do promotor específico de músculo CK8 e PABPN1 códon-otimizada sob o controle de Spc512
[00136] SEQ ID NO: 70: sequência de DNA para construção dupla versão 1 que codifica shmiR17 e shmiR13 sob o controle do promotor específico de músculo CK8 e PABPN1 códon-otimizada sob o controle de Spc512
[00137] SEQ ID NO: 71: sequência de DNA para construção dupla versão 2 que codifica coPABPN1 e shmiRs denominados shmiR3 e shmiR14 sob o controle de Spc512.
[00138] SEQ ID NO: 72: sequência de DNA para construção dupla versão 2 que codifica coPABPN1 e shmiRs denominados shmiR17 e shmiR13 sob o controle de Spc512.
[00139] SEQ ID NO: 73: sequência de DNA para a sequência de cDNA de PABPN1 humana códon-otimizada.
[00140] SEQ ID NO: 74: Sequência de aminoácidos para a proteína PABPN1 humana códon-otimizada.
[00141] SEQ ID NO: 75: sequência de aminoácidos para a proteína PABPN1 humana do tipo selvagem com FLAG-tag.
[00142] SEQ ID NO: 76: Sequência de aminoácidos para a proteína PABPN1 humana códon-otimizada com FLAG-tag.
[00143] SEQ ID NO: 77: sequência de DNA para o iniciador/primer denominado wtPABPN1-Fwd.
[00144] SEQ ID NO: 78: sequência de DNA para o iniciador denominado wtPABPN1-Rev
[00145] SEQ ID NO: 79: sequência de DNA para a sonda denominada wtPABPN1-Probe
[00146] SEQ ID NO: 80: sequência de DNA para o iniciador denominado optPABPN1-Fwd
[00147] SEQ ID NO: 81: sequência de DNA para o iniciador denominado optPABPN1-Rev
[00148] SEQ ID NO: 82: sequência de DNA para a sonda denominada optPABPN1-Probe
[00149] SEQ ID NO: 83: sequência de DNA para o iniciador denominado shmiR3-FWD
[00150] SEQ ID NO: 84: sequência de DNA para o iniciador denominado shmiR13-FWD
[00151] SEQ ID NO: 85: sequência de DNA para o iniciador denominado shmiR14-FWD
[00152] SEQ ID NO: 86: sequência de DNA para o iniciador denominado shmiR17-FWD
[00153] SEQ ID NO: 87: sequência de RNA que codifica a proteína PABPN1 humana do tipo selvagem
[00154] SEQ ID NO: 88: Sequência consenso para o domínio da fosfolipase A2 modificado (PLA2) de AAV VP1
[00155] SEQ ID NO: 89: Domínio de PLA2 modificado para AAV8
[00156] SEQ ID NO: 90 Domínio de PLA2 modificado para AAV9 Descrição Detalhada da Invenção Geral
[00157] Ao longo deste relatório descritivo, a menos que especificamente indicado de outra forma ou o contexto exija o contrário, a referência a uma única etapa, característica, composição da matéria, grupo de etapas ou grupo de características ou composições da matéria deve ser considerada como abrangendo uma e uma pluralidade (ou seja, uma ou mais) dessas etapas,
características, composições da matéria, grupos de etapas ou grupos de características ou composições da matéria.
[00158] Os técnicos no assunto compreenderão que a presente divulgação é suscetível a variações e modificações além daquelas especificamente descritas. Deve ser entendido que a divulgação inclui todas essas variações e modificações. A divulgação também inclui todas as etapas, características, composições e compostos referidos ou indicados neste relatório descritivo, individual ou coletivamente, e quaisquer e todas as combinações ou quaisquer duas ou mais das referidas etapas ou características.
[00159] A presente divulgação não deve ser limitada em escopo pelos exemplos específicos descritos neste documento, que se destinam apenas para fins de exemplificação. Produtos, composições e métodos funcionalmente equivalentes estão claramente dentro do escopo da presente divulgação.
[00160] Qualquer exemplo da presente divulgação neste documento deve ser considerado como aplicável mutatis mutandis a qualquer outro exemplo da divulgação, a menos que especificamente indicado de outra forma.
[00161] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento devem ser considerados como tendo o mesmo significado como o comumente entendido por um técnico no assunto (por exemplo, em cultura de células, genética molecular, imunologia, imuno- histoquímica, química de proteínas e bioquímica).
[00162] Salvo indicação em contrário, o DNA recombinante, proteína recombinante, cultura de células e técnicas imunológicas utilizadas na presente divulgação são procedimentos padrão, bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Tais técnicas são descritas e explicadas na literatura em fontes como J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley e Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover e B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press
(1995 e 1996), e F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o momento), Ed Harlow e David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988), e J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluindo todas as atualizações até o momento).
[00163] Ao longo deste relatório descritivo, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra "compreende", ou variações como "compreender" ou "compreendendo", é entendida como implicando a inclusão de uma etapa ou elemento declarado ou número inteiro ou grupo de etapas ou elementos ou números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outra etapa ou elemento ou número inteiro ou grupo de elementos ou números inteiros.
[00164] O termo "e/ou", por exemplo, "X e/ou Y" deve ser entendido no sentido de "X e Y" ou "X ou Y" e deve ser interpretado como um suporte explícito para ambos os significados ou para qualquer um dos significados. Definições Selecionadas
[00165] Entende-se por "RNA" uma molécula compreendendo pelo menos um resíduo de ribonucleotídeo. Entende-se por "ribonucleotídeo" um nucleotídeo com um grupo hidroxila na posição 2' de uma porção β-D-ribo-furanose. Os termos incluem RNA de fita dupla, RNA de fita simples, RNA isolado, como RNA parcialmente purificado, RNA essencialmente puro, RNA sintético, RNA produzido de forma recombinante, bem como RNA alterado que difere do RNA de ocorrência natural pela adição, deleção, substituição e/ou alteração de um ou mais nucleotídeos. Essas alterações podem incluir a adição de material não nucleotídico, tal como à(s) extremidade(s) do siNA ou internamente, por exemplo, em um ou mais nucleotídeos do RNA. Os nucleotídeos nas moléculas de RNA da presente divulgação também podem compreender nucleotídeos não padrão, tais como nucleotídeos de ocorrência não natural ou nucleotídeos sintetizados quimicamente ou desoxinucleotídeos. Esses RNAs alterados podem ser referidos como análogos ou análogos de RNA de ocorrência natural.
[00166] O termo "interferência por RNA" ou "RNAi" refere-se geralmente ao silenciamento dependente de RNA da expressão gênica iniciado por moléculas de RNA de fita dupla (dsRNA) no citoplasma de uma célula. A molécula de dsRNA reduz ou inibe os produtos de transcrição de uma sequência de ácido nucleico alvo, silenciando, assim, o gene ou reduzindo a expressão desse gene.
[00167] Conforme utilizado neste documento, o termo "RNA de fita dupla" ou "dsRNA" refere-se a uma molécula de RNA tendo uma estrutura duplex e compreendendo uma sequência efetora e uma sequência complementar efetora que possuem comprimento semelhante entre si. A sequência efetora e a sequência complementar efetora podem estar em uma única fita de RNA ou em fitas de RNA separadas. A "sequência efetora" (muitas vezes referida como uma "fita guia") é substancialmente complementar a uma sequência alvo, que, no presente caso, é uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. A "sequência efetora" também pode ser referida como a "sequência antissenso". A "sequência complementar efetora" será suficientemente complementar à sequência efetora, de modo que possa se anelar com a sequência efetora para formar um duplex. Nesse sentido, a sequência complementar efetora será substancialmente homóloga a uma região da sequência alvo. Como será evidente para o técnico no assunto, o termo "sequência complementar efetora" pode ser referida também como o "complemento da sequência efetora" ou a sequência senso.
[00168] Conforme utilizado neste documento, o termo "duplex" refere-se a regiões em dois ácidos nucleicos complementares ou substancialmente complementares (por exemplo, RNAs), ou em duas regiões complementares ou substancialmente complementares de um ácido nucleico de fita simples (por exemplo, RNA), que formam pares de base entre si, seja pelo pareamento de bases de Watson-Crick ou qualquer outra maneira que permita um duplex estabilizado entre as sequências de nucleotídeos que são complementares ou substancialmente complementares. Será entendido pelo técnico no assunto que dentro de uma região de duplex, 100% de complementaridade não é necessária;
a complementaridade substancial é admissível. A complementaridade substancial inclui pode incluir 79% ou mais de complementaridade. Por exemplo, um único pareamento incorreto (ou mismatch) em uma região de duplex que consiste em 19 pares de bases (ou seja, 18 pares de bases e um pareamento incorreto) resulta em 94,7% de complementaridade, tornando a região de duplex substancialmente complementar. Em outro exemplo, dois pareamentos incorretos em uma região de duplex que consiste em 19 pares de bases (ou seja, 17 pares de bases e dois pareamentos incorretos) resulta em 89,5% de complementaridade, tornando a região de duplex substancialmente complementar. Ainda em outro exemplo, três pareamentos incorretos em uma região de duplex que consiste em 19 pares de bases (ou seja, 16 pares de bases e três pareamentos incorreto) resultam em 84,2% de complementaridade, tornando a região de duplex substancialmente complementar e assim por diante.
[00169] O dsRNA pode ser proporcionado como uma estrutura em grampo (hairpin) ou haste-alça (stem loop), com uma região de duplex composta por uma sequência efetora e uma sequência complementar efetora ligada por pelo menos 2 sequências nucleotídicas que é denominada como haste-alça. Quando um dsRNA é proporcionado como uma estrutura em grampo ou haste-alça, ele pode ser referido como um "RNA em grampo" ou "agente de RNAi curto em grampo" ou "shRNA". Outras moléculas de dsRNA proporcionadas em, ou que dão origem a, uma estrutura em grampo ou haste-alça incluem os transcritos de miRNA primários (pri-miRNA) e microRNA precursor (pre-miRNA). Os pré-miRNA shRNAs podem ser produzidos naturalmente a partir do pri-miRNA pela ação das enzimas Drosha e Pasha que reconhecem e liberam regiões do transcrito de miRNA primário que formam uma estrutura em haste-alça. De forma alternativa, o transcrito de pri-miRNA pode ser desenhado para substituir a estrutura em haste-alça natural por uma estrutura em haste-alça artificial/recombinante. Ou seja, uma estrutura em haste-alça artificial/recombinante pode ser inserida ou clonada em uma sequência da estrutura de pri-miRNA que não possui sua estrutura em haste-alça natural. No caso das sequências em haste-alça desenhadas para serem expressas como parte de uma molécula de pri-miRNA, Drosha e Pasha reconhecem e liberam o shRNA artificial. As moléculas de dsRNA produzidas usando esta abordagem são conhecidas como “shmiRNAs”, “shmiRs” ou “microRNA framework shRNAs”.
[00170] Conforme utilizado neste documento, o termo "complementar", em relação a uma sequência, refere-se a um complemento da sequência por pareamento de bases Watson-Crick, em que a guanina (G) pareia com a citosina (C) e a adenina (A) pareia com a uracila (U) ou timina (T). Uma sequência pode ser complementar ao comprimento total de outra sequência ou pode ser complementar a uma determina porção ou comprimento de outra sequência. Um técnico no assunto reconhecerá que U pode estar presente no RNA e que T pode estar presente no DNA. Portanto, um A dentro de uma sequência de RNA ou DNA pode parear com uma U em uma sequência de RNA ou T em uma sequência de DNA. Um técnico no assunto também reconhecerá que uma G presente no RNA pode parear com C ou U no RNA.
[00171] Conforme utilizado neste documento, o termo "substancialmente complementar" é usado para indicar um grau suficiente de complementaridade ou pareamento preciso de modo que uma ligação estável e específica ocorra entre as sequências de ácido nucleico, por exemplo, entre a sequência efetora e a sequência complementar efetora ou entre a sequência efetora e a sequência alvo. Entende-se que a sequência de um ácido nucleico não precisa ser 100% complementar à de seu alvo ou complementar. O termo abrange uma sequência complementar a outra sequência, com exceção de uma saliência. Em alguns casos, a sequência é complementar à outra sequência, com exceção de 1-2 pareamentos incorretos. Em alguns casos, as sequências são complementares, exceto por 1 pareamento incorreto. Em alguns casos, as sequências são complementares, exceto por 2 pareamentos incorretos. Em outros casos, as sequências são complementares, exceto por 3 pareamentos incorretos. Em ainda outros casos, as sequências são complementares, exceto por 4 pareamentos incorretos.
[00172] O termo "codificado", conforme usado no contexto de um shRNA ou shmiR da divulgação, deve ser entendido no sentido de um shRNA ou shmiR que é capaz de ser transcrito a partir de um molde de DNA. Consequentemente, um ácido nucleico que codifica um shRNA ou shmiR da divulgação compreenderá uma sequência de DNA que serve como um modelo para a transcrição do respectivo shRNA ou shmiR.
[00173] O termo "construção de RNAi dirigida por DNA" ou "construção de ddRNAi" refere-se a um ácido nucleico compreendendo a sequência de DNA que, quando transcrita, produz um shRNA ou molécula shmiR (preferencialmente, um shmiR) que produz o RNAi. A construção de ddRNAi pode compreender um ácido nucleico que é transcrito como um único RNA que é capaz de auto-hibridização em uma estrutura em grampo com uma região de duplex ligada por uma haste-alça de pelo menos 2 nucleotídeos, isto é, shRNA ou shmiR, ou como um único RNA com vários shRNAs ou shmiRs, ou como vários transcritos de RNA, cada um capaz de se dobrar como um único shRNA ou shmiR, respectivamente. A construção de ddRNAi pode ser proporcionada dentro de uma "construção de DNA" maior compreendendo uma ou mais sequências de DNA adicionais. Por exemplo, a construção de ddRNAi pode ser proporcionada em uma construção de DNA compreendendo uma sequência de DNA adicional que codifica a proteína PABPN1 funcional que foi códon- otimizada, de modo que seu transcrito de RNAm não seja alvo dos shmiRs da construção de ddRNAi. A construção de ddRNAi e/ou a construção de DNA compreendendo o mesmo pode estar dentro de um vetor de expressão, por exemplo, operacionalmente ligado a um promotor.
[00174] Conforme utilizado neste documento, o termo "operacionalmente ligado" ou "ligação operável" (ou semelhante) significa que uma sequência de ácido nucleico codificante está ligada a, ou em associação com, uma sequência reguladora, por exemplo, um promotor, de uma maneira que facilita a expressão da sequência codificante. As sequências regulatórias incluem promotores, intensificadores ou enhancers e outros elementos de controle de expressão que são reconhecidos na arte e são selecionados para direcionar a expressão da sequência codificante.
[00175] Um "vetor" será entendido no sentido de um veículo para introduzir um ácido nucleico em uma célula. Os vetores incluem, mas não estão limitados aos plasmídeos, fagomídeos, vírus, bactérias e veículos derivados de fontes virais ou bacterianas. Um “plasmídeo” é uma molécula de DNA circular de fita dupla. Um tipo útil de vetor para uso de acordo com a presente divulgação é um vetor viral, em que sequências de DNA heterólogas são inseridas em um genoma viral que pode ser modificado para deletar um ou mais genes virais ou partes dos mesmos. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira (por exemplo, vetores tendo uma origem de replicação que funciona na célula hospedeira). Outros vetores podem ser integrados de forma estável no genoma de uma célula hospedeira e, portanto, são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Conforme utilizado neste documento, o termo "vetor de expressão" será entendido como um vetor capaz de expressar uma molécula de RNA da divulgação.
[00176] Uma "proteína PABPN1 funcional" deve ser entendida como uma proteína PABPN1 com as propriedades funcionais de uma proteína PABPN1 do tipo selvagem, por exemplo, uma capacidade de controlar o sítio de poliadenilação de RNAm e/ou splicing de íntron em uma célula de mamífero. Consequentemente, uma "proteína PABPN1 funcional" será entendida como uma proteína PABPN1 que não é causadora da OPMD quando expressa ou está presente em um indivíduo. Em um exemplo, uma referência aqui a "proteína PABPN1 funcional" é uma referência à proteína PABPN1 humana do tipo selvagem. A sequência da proteína PABPN1 humana do tipo selvagem é definida no NCBI RefSeq NP_004634. Consequentemente, uma proteína PABPN1 humana funcional pode ter as propriedades funcionais in vivo da proteína PABPN1 humana definida no NCBI RefSeq NP_004634.
[00177] Conforme utilizado neste documento, os termos "tratando", "tratar" ou "tratamento" e suas variações, referem-se à intervenção clínica destinada a alterar o curso natural do indivíduo ou célula a ser tratada durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem a diminuição da taxa de evolução da doença, a amenização ou paliação do estado da doença e a remissão ou melhora do prognóstico. Portanto, o tratamento da OPMD inclui a redução ou inibição da expressão de uma proteína PABPN1 que é causadora da OPMD no indivíduo e/ou a expressão no indivíduo de uma proteína PABPN1 com o comprimento normal de resíduos de polialanina. Preferencialmente, o tratamento da OPMD inclui a redução ou inibição da expressão da proteína PABPN1 que é causadora da OPMD no indivíduo e a expressão no indivíduo de uma proteína PABPN1 com o comprimento normal de resíduos de polialanina. Um indivíduo é "tratado" com sucesso, por exemplo, se um ou mais dos desfechos de tratamento acima mencionados forem alcançados.
[00178] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é pelo menos a concentração ou quantidade mínima necessária para realizar uma melhora mensurável na condição de OPMD, tal como uma melhora mensurável em um ou mais sintomas de OPMD, por exemplo, incluindo, mas não se limitando à ptose, disfagia e fraqueza muscular no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz aqui pode variar de acordo com fatores, tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do paciente e a capacidade de o shmiR, o ácido nucleico que codifica o mesmo, a construção de ddRNAi, a construção de DNA, o vetor de expressão ou a composição compreendendo os mesmos induzir uma resposta desejada no indivíduo e/ou a capacidade de o vetor de expressão expressar a proteína PABPN1 funcional no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou adversos do shmiR, do ácido nucleico que codifica o mesmo, da construção de ddRNAi, da construção de DNA, do vetor de expressão ou da composição compreendendo os mesmos, são compensados pelos efeitos terapeuticamente benéficos do shmiR, do ácido nucleico que codifica o mesmo, da construção de ddRNAi, da construção de DNA, do vetor de expressão ou da composição compreendendo os mesmos, de inibir, suprimir ou reduzir a expressão da proteína PABPN1 causadora da OPMD considerada isoladamente ou em combinação com os efeitos terapeuticamente benéficos da expressão da proteína PABPN1 funcional no indivíduo.
[00179] Conforme usado neste documento, o "indivíduo" ou "paciente" pode ser um animal humano ou não humano que sofre de ou é geneticamente predisposto a OPMD, ou seja, possui uma variante do gene PABPN1 que é causador da OPMD. O "animal não humano" pode ser um primata, gado (por exemplo, ovelhas, cavalos, gado, porcos, burros), animal de companhia (por exemplo, animais de estimação, como cães e gatos), animais de laboratório (por exemplo, camundongos, coelhos, ratos, cobaias, drosófilas, C. elegans, peixe- zebra), animais de desempenho (por exemplo, cavalos de corrida, camelos, galgos) ou animais selvagens em cativeiro. Em um exemplo, o indivíduo ou paciente é um mamífero. Em um exemplo, o indivíduo ou paciente é um humano.
[00180] Os termos "expressão reduzida", "redução na expressão" ou semelhante, referem-se à ausência ou uma diminuição observável no nível de produto proteico e/ou de RNAm a partir do gene alvo, por exemplo, o gene PABPN1. A diminuição não precisa ser absoluta, mas pode ser uma diminuição parcial suficiente para que haja uma mudança detectável ou observável como resultado da RNAi realizada pelo shmiR, ácido nucleico que codifica o mesmo, construção de ddRNAi, construção de DNA, vetor de expressão ou composição compreendendo os mesmos, da divulgação. A diminuição pode ser medida ao se determinar uma diminuição no nível de produto proteico e/ou de RNAm a partir de um ácido nucleico alvo em relação a uma célula sem shmiR, ácido nucleico que codifica o mesmo, construção de ddRNAi, construção de DNA, vetor de expressão ou composição compreendendo os mesmos, e pode ser apenas 1%, 5% ou 10%, ou pode ser absoluta, isto é, 100% de inibição. Os efeitos da diminuição podem ser determinados pelo exame das propriedades externas, ou seja, fenótipo quantitativo e/ou qualitativo da célula ou organismo, e também podem incluir a detecção da presença ou uma mudança na quantidade de agregados nucleares de expPABPN1 na célula ou organismo após a administração de um shmiR, ácido nucleico que codifica o mesmo, construção de ddRNAi, construção de DNA, vetor de expressão ou composição compreendendo os mesmos, da divulgação.
[00181] Um "sistema de entrega", conforme utilizado neste documento, refere- se a um vetor para empacotar material genético externo, como DNA ou RNA, e que pode ser introduzido em uma célula. Os sistemas de entrega podem incluir vetores virais, por exemplo, um vetor viral adenoassociado (AAV), um vetor retroviral, um vetor adenoviral (AdV) e um vetor lentiviral (LV). Conforme descrito neste documento, os vetores virais podem ser usados para entregar e expressar o material genético externo na célula. Consequentemente, um vetor de expressão viral, conforme descrito neste documento, pode ser usado como um sistema de entrega.
[00182] Um "músculo faríngeo", conforme aqui utilizado, refere-se a um ou mais do grupo de músculos que formam a faringe. O músculo faríngeo pode incluir um ou mais do músculo constritor inferior, músculo constritor médio, músculo constritor superior, músculo palatofaríngeo, músculo salpingofaríngeo e/ou músculo estilofaríngeo. Métodos de Tratamento
[00183] Certos aspectos da divulgação são direcionados à administração a um indivíduo humano que necessita de um ou mais ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de ddRNAi, construções de DNA, vetor(es) de expressão, sistema(s) de entrega ou composição(ões) compreendendo os mesmos, conforme descrito neste documento, a ser(em) usado(s) para tratar o indivíduo e/ou inibir a expressão da proteína PABPN1 endógena, incluindo uma proteína PABPN1 que é causadora da OPMD, no indivíduo, em que a composição é administrada por injeção direta em um músculo faríngeo do indivíduo.
[00184] Em algumas formas de realização, um ou mais ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de ddRNAi, construções de DNA, vetor(es) de expressão, sistema(s) de entrega ou composição(ões) compreendendo os mesmos, conforme descrito neste documento, pode(m) ser usado(s) para tratar a OPMD em um indivíduo que sofre da mesma. Da mesma forma, um ou mais ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de ddRNAi, construções de DNA, vetor(es) de expressão, sistema(s) de entrega ou composição(ões) compreendendo os mesmos, conforme descrito neste documento, pode(m) ser usado(s) para prevenir o desenvolvimento ou progressão de um ou mais sintomas da OPMD em um indivíduo que sofre da mesma ou é predisposto à mesma.
[00185] Em algumas formas de realização, o indivíduo melhorou a deglutição após a administração de um ou mais ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de ddRNAi, construções de DNA, vetor(es) de expressão, sistema(s) de entrega ou composição(ões) compreendendo os mesmos, conforme descrito neste documento, por injeção direta em um músculo faríngeo do indivíduo.
[00186] Em certas formas de realização, o vetor de expressão e/ou a composição da divulgação pode compreender uma construção de ddRNAi da divulgação e um ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional da divulgação. Consequentemente, a administração do vetor de expressão ou da composição pode ser eficaz para (i) inibir, reduzir ou realizar o knockdown da expressão de PABPN1 endógena, incluindo a proteína PABPN1 compreendendo um trato de polialanina expandido que é causador da OPMD, e (ii) proporcionar a expressão de uma proteína PABPN1 funcional que não é alvo dos shmiRs ou shRNAs que inibem, reduzem ou realizam o knockdown da expressão de PABPN1 endógena. Uma composição da divulgação pode, assim, restaurar a função da proteína PABPN1, por exemplo, pelo processamento pós- transcricional de RNA em uma célula ou animal ao qual é administrada.
[00187] Em certas formas de realização, o tratamento da OPMD pode compreender administrar por injeção direta a um músculo faríngeo de um indivíduo separadamente ao indivíduo (i) um ou mais agentes para inibir a expressão de uma proteína PABPN1 que é causadora da OPMD, e (ii) um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional da divulgação ou a composição compreendendo o mesmo. Conforme descrito neste documento, o um ou mais agentes para inibir a expressão de uma proteína PABPN1 que é causadora da OPMD podem ser um ácido nucleico, uma construção de ddRNAi, um vetor de expressão ou composição compreendendo os mesmos, conforme descrito neste documento, ou uma pluralidade de qualquer um ou mais dos mesmos. Os componentes (i) e (ii) podem ser administrados ao indivíduo, simultânea ou consecutivamente.
[00188] Em algumas formas de realização, o tratamento da OPMD pode compreender administrar por injeção direta a um músculo faríngeo do indivíduo um ácido nucleico códon-otimizado que codifica uma proteína PABPN1 funcional da divulgação, em que o indivíduo recebeu previamente um ou mais agentes para inibir a expressão de uma proteína PABPN1 que é causadora da OPMD, mas que não inibe a expressão do ácido nucleico códon-otimizado. Por exemplo, o indivíduo pode ter recebido previamente um ácido nucleico, uma construção de ddRNAi, um vetor de expressão ou composição compreendendo os mesmos, conforme descrito neste documento, ou uma pluralidade de qualquer um ou mais destes.
[00189] Em algumas formas de realização, a via de administração é IM (por exemplo, injeção direta em um músculo faríngeo do indivíduo) e alcança a efetiva entrega ao tecido muscular e transfecção das construções de ddRNAi e/ou ácidos nucleicos códon-otimizados que codificam PABPN1 da divulgação, e expressão de shmiRs ou shRNA e/ou o ácido nucleico códon-otimizado no mesmo.
[00190] O nível de dose terapeuticamente eficaz para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo: a composição empregada; a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração; a via de administração; a taxa de sequestro do ácido nucleico, uma construção de ddRNAi, uma construção de DNA, um vetor de expressão ou composição compreendendo os mesmos, conforme descrito neste documento, ou uma pluralidade de qualquer um ou mais destes, a duração do tratamento, juntamente com outros fatores relacionados.
[00191] A eficácia de um ácido nucleico, uma construção de ddRNAi, uma construção de DNA, um vetor de expressão, sistema de entrega ou composição compreendendo os mesmos da divulgação em reduzir ou inibir a expressão da proteína PABPN1 causadora da OPMD e em expressar a proteína PABPN1 funcional que não é causadora da OPMD em uma quantidade suficiente para restaurar a função da PABPN1, pode ser determinada avaliando-se as propriedades contráteis do músculo e/ou dificuldades de deglutição no indivíduo tratado. Os métodos para testar a capacidade de deglutição e as propriedades contráteis do músculo são conhecidos na arte. Por exemplo, as dificuldades de deglutição podem ser avaliadas utilizando-se videofluoroscopia, endoscopia do TGS ou manometria esofágica e teste de impedância. Outros métodos para avaliar as características clínicas da OPMD encontram-se descritos em Rüegg et al. (2005) Swiss Medical Weekly, 135: 574-586. Agentes para RNAi
[00192] Conforme descrito neste documento, um ácido nucleico útil em um método da invenção compreende uma sequência de DNA que codifica um microRNA curto em grampo (shmiR) que tem como alvo uma região do transcrito de RNA mensageiro da PABPN1 humana, em que o shmiR compreende: uma sequência efetora de pelo menos 17 nucleotídeos de comprimento; uma sequência complementar efetora; uma sequência em haste-alça; e estrutura de microRNA primário (pri-miRNA); em que a sequência efetora é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente dentro do transcrito de RNA da PABPN1 humana. Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente dentro da sequência apresentada na SEQ ID NO: 87. Em alguns exemplos, a presente divulgação proporciona um ácido nucleico que compreende uma sequência de DNA que codifica um shmiR, o referido shmiR compreendendo: uma sequência efetora de pelo menos 17 nucleotídeos de comprimento;
uma sequência complementar efetora; uma sequência em haste-alça; e estrutura de pri-miRNA; em que a sequência efetora é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-13. Preferencialmente, a sequência efetora terá menos de 30 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, uma sequência efetora adequada pode estar na faixa de 17-29 nucleotídeos de comprimento. Em um exemplo particularmente preferencial, a sequência efetora terá 21 nucleotídeos de comprimento. Mais preferencialmente, a sequência efetora terá 21 nucleotídeos de comprimento e a sequência complementar efetora terá 20 nucleotídeos de comprimento.
[00193] Em certas formas de realização, o shmiR compreende uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-13 (ou seja, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 13). Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-13 e conter 4 bases mal pareadas em relação à mesma. Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-13 e conter 3 bases mal pareadas em relação à mesma. Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-13 e conter 2 bases mal pareadas em relação à mesma. Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-13 e conter 1 base mal pareada em relação às mesmas. Por exemplo, a sequência efetora pode ser 100% complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-13.
[00194] Em um exemplo, o shmiR compreende uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 9. Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e contém 4 bases mal pareadas em relação à mesma. Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e conter 3 bases mal pareadas em relação à mesma. Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e conter 2 bases mal pareadas em relação à mesma. Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 e conter 1 base mal pareada em relação à mesma. Por exemplo, a sequência efetora pode ser 100% complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 9.
[00195] Em um exemplo, o shmiR compreende uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 13. Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 13 e contém 4 bases mal pareadas em relação à mesma. Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 13 e conter 3 bases mal pareadas em relação à mesma. Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 13 e conter 2 bases mal pareadas em relação à mesma. Por exemplo, a sequência efetora pode ser substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 13 e conter 1 base mal pareada em relação às mesmas. Por exemplo, a sequência efetora pode ser 100% complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 13.
[00196] De acordo com um exemplo em que a sequência efetora de um shmiR da divulgação é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de PABPN1 miRNA descrito aqui e contém 1, 2, 3 ou 4 bases mal pareadas em relação à mesma, é preferível que a(s) base(s) mal pareada(s) não esteja(m) localizada(s) dentro da região correspondente à região semente do shmiR, isto é, os nucleotídeos 2-8 da sequência efetora.
[00197] Em algumas formas de realização, o ácido nucleico descrito aqui pode compreender uma sequência de DNA que codifica um shmiR compreendendo: (i) uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 14, com exceção de 1, 2, 3 ou 4 bases mal pareadas, desde que a sequência efetora seja capaz de formar um duplex com uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 14; e (ii) uma sequência complementar efetora compreendendo uma sequência que é substancialmente complementar à sequência efetora. Por exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico pode compreender uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 15 e capaz de formar um duplex com a mesma. A sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 15 pode ser a sequência apresentada na SEQ ID NO: 14. Um shmiR de acordo com este exemplo é doravante denominado “shmiR2”.
[00198] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui pode compreender uma sequência de DNA que codifica um shmiR compreendendo: (i) uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 16, com exceção de 1, 2, 3 ou 4 bases mal pareadas, desde que a sequência efetora seja capaz de formar um duplex com uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 16; e (ii) uma sequência complementar efetora compreendendo uma sequência que é substancialmente complementar à sequência efetora. Por exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico pode compreender uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 17 e uma sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 17 e capaz de formar um duplex com a mesma. A sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 17 pode ser a sequência apresentada na SEQ ID NO: 16. Um shmiR de acordo com este exemplo é doravante denominado “shmiR3”.
[00199] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui pode compreender uma sequência de DNA que codifica um shmiR compreendendo: (i) uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 18, com exceção de 1, 2, 3 ou 4 bases mal pareadas, desde que a sequência efetora seja capaz de formar um duplex com uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 18; e (ii) uma sequência complementar efetora compreendendo uma sequência que é substancialmente complementar à sequência efetora. Por exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico pode compreender uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 19 e uma sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 19 e capaz de formar um duplex com a mesma. A sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 19 pode ser a sequência apresentada na SEQ ID NO: 18. Um shmiR de acordo com este exemplo é doravante denominado “shmiR4”.
[00200] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui pode compreender uma sequência de DNA que codifica um shmiR compreendendo: (i) uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 20, com exceção de 1, 2, 3 ou 4 bases mal pareadas, desde que a sequência efetora seja capaz de formar um duplex com uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 20; e (ii) uma sequência complementar efetora compreendendo uma sequência que é substancialmente complementar à sequência efetora. Por exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico pode compreender uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 21 e uma sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 21 e capaz de formar um duplex com a mesma. A sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 21 pode ser a sequência apresentada na SEQ ID NO: 20. Um shmiR de acordo com este exemplo é doravante denominado “shmiR5”.
[00201] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui pode compreender uma sequência de DNA que codifica um shmiR compreendendo: (i) uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 22, com exceção de 1, 2, 3 ou 4 bases mal pareadas, desde que a sequência efetora seja capaz de formar um duplex com uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 22; e (ii) uma sequência complementar efetora compreendendo uma sequência que é substancialmente complementar à sequência efetora. Por exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico pode compreender uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 23 e uma sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 23 e capaz de formar um duplex com a mesma. A sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 23 pode ser a sequência apresentada na SEQ ID NO: 22. Um shmiR de acordo com este exemplo é doravante denominado “shmiR6”.
[00202] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui pode compreender uma sequência de DNA que codifica um shmiR compreendendo: (i) uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 24, com exceção de 1, 2, 3 ou 4 bases mal pareadas, desde que a sequência efetora seja capaz de formar um duplex com uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 24; e (ii) uma sequência complementar efetora compreendendo uma sequência que é substancialmente complementar à sequência efetora. Por exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico pode compreender uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 25 e uma sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 25 e capaz de formar um duplex com a mesma. A sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 25 pode ser a sequência apresentada na SEQ ID NO: 24. Um shmiR de acordo com este exemplo é doravante denominado “shmiR7”.
[00203] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui pode compreender uma sequência de DNA que codifica um shmiR compreendendo: (i) uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 26, com exceção de 1, 2, 3 ou 4 bases mal pareadas, desde que a sequência efetora seja capaz de formar um duplex com uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 26; e (ii) uma sequência complementar efetora compreendendo uma sequência que é substancialmente complementar à sequência efetora. Por exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico pode compreender uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 27 e uma sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 27 e capaz de formar um duplex com a mesma. A sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 27 pode ser a sequência apresentada na SEQ ID NO: 26. Um shmiR de acordo com este exemplo é doravante denominado “shmiR9”.
[00204] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui pode compreender uma sequência de DNA que codifica um shmiR compreendendo: (i) uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 28, com exceção de 1, 2, 3 ou 4 bases mal pareadas, desde que a sequência efetora seja capaz de formar um duplex com uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 28; e (ii) uma sequência complementar efetora compreendendo uma sequência que é substancialmente complementar à sequência efetora. Por exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico pode compreender uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 29 e uma sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 29 e capaz de formar um duplex com a mesma. A sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 29 pode ser a sequência apresentada na SEQ ID NO: 28. Um shmiR de acordo com este exemplo é doravante denominado “shmiR11”.
[00205] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui pode compreender uma sequência de DNA que codifica um shmiR compreendendo: (i) uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 30, com exceção de 1, 2, 3 ou 4 bases mal pareadas, desde que a sequência efetora seja capaz de formar um duplex com uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 30; e (ii) uma sequência complementar efetora compreendendo uma sequência que é substancialmente complementar à sequência efetora. Por exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico pode compreender uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 31 e capaz de formar um duplex com a mesma. A sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 31 pode ser a sequência apresentada na SEQ ID NO: 30. Um shmiR de acordo com este exemplo é doravante denominado “shmiR13”.
[00206] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui pode compreender uma sequência de DNA que codifica um shmiR compreendendo: (i) uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 32, com exceção de 1, 2, 3 ou 4 bases mal pareadas, desde que a sequência efetora seja capaz de formar um duplex com uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 32; e (ii) uma sequência complementar efetora compreendendo uma sequência que é substancialmente complementar à sequência efetora. Por exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico pode compreender uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 33 e uma sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 33 e capaz de formar um duplex com a mesma. A sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 33 pode ser a sequência apresentada na SEQ ID NO: 32. Um shmiR de acordo com este exemplo é doravante denominado “shmiR14”.
[00207] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui pode compreender uma sequência de DNA que codifica um shmiR compreendendo: (i) uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 34, com exceção de 1, 2, 3 ou 4 bases mal pareadas, desde que a sequência efetora seja capaz de formar um duplex com uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 34; e (ii) uma sequência complementar efetora compreendendo uma sequência que é substancialmente complementar à sequência efetora. Por exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico pode compreender uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 35 e uma sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 35 e capaz de formar um duplex com a mesma. A sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 35 pode ser a sequência apresentada na SEQ ID NO: 34. Um shmiR de acordo com este exemplo é doravante denominado “shmiR15”.
[00208] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui pode compreender uma sequência de DNA que codifica um shmiR compreendendo: (i) uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 36, com exceção de 1, 2, 3 ou 4 bases mal pareadas, desde que a sequência efetora seja capaz de formar um duplex com uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 36; e (ii) uma sequência complementar efetora compreendendo uma sequência que é substancialmente complementar à sequência efetora. Por exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico pode compreender uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 37 e uma sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 37 e capaz de formar um duplex com a mesma. A sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 37 pode ser a sequência apresentada na SEQ ID NO: 36. Um shmiR de acordo com este exemplo é doravante denominado “shmiR16”.
[00209] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui pode compreender uma sequência de DNA que codifica um shmiR compreendendo: (i) uma sequência efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 38, com exceção de 1, 2, 3 ou 4 bases mal pareadas, desde que a sequência efetora seja capaz de formar um duplex com uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 38; e (ii) uma sequência complementar efetora compreendendo uma sequência que é substancialmente complementar à sequência efetora. Por exemplo, o shmiR codificado pelo ácido nucleico pode compreender uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 39 e uma sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 39 e capaz de formar um duplex com a mesma. A sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 39 pode ser a sequência apresentada na SEQ ID NO: 38. Um shmiR de acordo com este exemplo é doravante denominado “shmiR17”.
[00210] Em qualquer um dos exemplos descritos aqui, o shmiR codificado pelo ácido nucleico da divulgação pode compreender, em uma direção 5’ a 3’: uma sequência flanqueadora 5’ da estrutura principal do pri-miRNA; a sequência complementar efetora; a sequência em haste-alça; a sequência efetora; e uma sequência flanqueadora 3’ da estrutura principal do pri-miRNA.
[00211] Em qualquer um dos exemplos descritos aqui, o shmiR codificado pelo ácido nucleico da divulgação pode compreender, em uma direção 5’ a 3’: uma sequência flanqueadora 5’ da estrutura principal do pri-miRNA; a sequência efetora; sequência em haste-alça; sequência complementar efetora; e uma sequência flanqueadora 3’ da estrutura principal do pri-miRNA.
[00212] Sequências em alça adequadas podem ser selecionadas a partir daquelas conhecidas na arte. No entanto, um exemplo de sequência em haste- alça é apresentado na SEQ ID NO: 40.
[00213] As estruturas principais de microRNA primário (pri-miRNA ou pri-R) adequadas para uso em um ácido nucleico da divulgação podem ser selecionados daqueles conhecidos na arte. Por exemplo, a estrutura principal de pri-miRNA pode ser selecionada de uma estrutura principal de pri-miR-30a, uma estrutura principal de pri-miR-155, uma estrutura principal de pri-miR-21 e uma estrutura principal de pri-miR-136. Preferencialmente, no entanto, a estrutura principal de pri-miRNA é uma estrutura principal de pri-miR-30a. De acordo com um exemplo em que a estrutura principal do pri-miRNA é uma estrutura principal de pri-miR-30a, a sequência flanqueadora 5’ da estrutura principal do pri-miRNA é apresentada na SEQ ID NO: 41 e a sequência flanqueadora 3' da estrutura principal de pri-miRNA é apresentada na SEQ ID NO: 42. Assim, o ácido nucleico que codifica os shmiRs da divulgação (por exemplo, shmiR-1 a shmiR-17 descritos aqui) pode compreender a sequência de DNA que codifica a sequência apresentada na SEQ ID NO: 41 e a sequência de DNA que codifica a sequência apresentada na SEQ ID NO: 42.
[00214] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui pode compreender uma sequência de DNA selecionada a partir da sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 56-68.
[00215] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 56 e codifica um shmiR (shmiR2) que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 43.
[00216] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 e codifica um shmiR (shmiR3) que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 44.
[00217] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 58 e codifica um shmiR (shmiR4) que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 45.
[00218] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 59 e codifica um shmiR (shmiR5) que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 46.
[00219] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 60 e codifica um shmiR (shmiR6) que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 47.
[00220] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 61 e codifica um shmiR (shmiR7) que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 48.
[00221] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 62 e codifica um shmiR (shmiR9) que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 49.
[00222] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 63 e codifica um shmiR (shmiR11) que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 50.
[00223] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 e codifica um shmiR (shmiR13) que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 51.
[00224] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 e codifica um shmiR (shmiR14) que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 52.
[00225] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 66 e codifica um shmiR (shmiR15) que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 53.
[00226] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 67 e codifica um shmiR (shmiR16) que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 54.
[00227] Em um exemplo, o ácido nucleico descrito aqui compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 e codifica um shmiR (shmiR17) que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 55.
[00228] Exemplos de ácidos nucleicos da divulgação codificam um shmiR selecionado dentre shmiR2, shmiR3, shmiR5, shmiR9, shmiR13, shmiR14 e shmiR17, como descrito aqui. Os ácidos nucleicos da divulgação que codificam shmiRs selecionados dentre shmiR3, shmiR13, shmiR14 e shmiR17, conforme descrito neste documento, são particularmente preferenciais.
[00229] Será entendido por um técnico no assunto que um ácido nucleico de acordo com a presente divulgação pode ser combinado ou usado em conjunto com um ou mais outros ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shRNA ou shmiR compreendendo uma sequência efetora de pelo menos 17 nucleotídeos contíguos que são substancialmente complementares a uma região de um transcrito de RNA correspondente a uma proteína PABPN1 que é causadora da OPMD. Em um exemplo, uma pluralidade de ácidos nucleicos é proporcionada, compreendendo: (a) pelo menos um ácido nucleico conforme descrito neste documento; e (b) pelo menos um outro ácido nucleico selecionado a partir de: (i) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shmiR como descrito aqui; ou (ii) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de DNA que codifica um RNA curto em grampo (shRNA) compreendendo sequências complementares efetoras e efetoras cognatas de um shmiR como descrito aqui;
em que o shmiR codificado pelo ácido nucleico em (a) e o shmiR ou shRNA codificado pelo ácido nucleico em (b) compreendem diferentes sequências efetoras.
[00230] Por conseguinte, em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos da divulgação pode compreender dois ou mais ácidos nucleicos que codificam shmiRs como descrito aqui, tais como dois, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis, ou sete, ou oito, ou nove, ou dez ácidos nucleicos que codificam shmiRs como descrito aqui.
[00231] Em outro exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos da divulgação compreende pelo menos um ácido nucleico que codifica um shmiR como descrito aqui e pelo menos um ácido nucleico que compreende uma sequência de DNA que codifica um shRNA compreendendo sequências complementares efetoras e efetoras cognatas de um shmiR como descrito aqui. Por exemplo, um shRNA compreendendo a sequência efetora e a sequência complementar efetora de shmiR2 é doravante denominado “shRNA2”. Por exemplo, um shRNA compreendendo a sequência efetora e a sequência complementar efetora de shmiR3 é doravante denominado “shRNA3”. Por exemplo, um shRNA compreendendo a sequência efetora e a sequência complementar efetora de shmiR4 é doravante denominado “shRNA4”. Por exemplo, um shRNA compreendendo a sequência efetora e a sequência complementar efetora de shmiR5 é doravante denominado “shRNA5”. Por exemplo, um shRNA compreendendo a sequência efetora e a sequência complementar efetora de shmiR6 é doravante denominado “shRNA6”. Por exemplo, um shRNA compreendendo a sequência efetora e a sequência complementar efetora de shmiR7 é doravante denominado “shRNA7”. Por exemplo, um shRNA compreendendo a sequência efetora e a sequência complementar efetora de shmiR9 é doravante denominado “shRNA9”. Por exemplo, um shRNA compreendendo a sequência efetora e a sequência complementar efetora de shmiR11 é doravante denominado “shRNA11”. Por exemplo, um shRNA compreendendo a sequência efetora e a sequência complementar efetora de shmiR13 é doravante denominado “shRNA13”. Por exemplo, um shRNA compreendendo a sequência efetora e a sequência complementar efetora de shmiR14 é doravante denominado “shRNA14”. Por exemplo, um shRNA compreendendo a sequência efetora e a sequência complementar efetora de shmiR15 é doravante denominado “shRNA15”. Por exemplo, um shRNA compreendendo a sequência efetora e a sequência complementar efetora de shmiR16 é doravante denominado “shRNA16”. Por exemplo, um shRNA compreendendo a sequência efetora e a sequência complementar efetora de shmiR17 é doravante denominado “shRNA17”.
[00232] De acordo com qualquer exemplo, no qual um ou mais dos ácidos nucleicos na pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui codificam um shRNA, o shRNA pode compreender uma sequência em alça ou haste-alça posicionada entre as sequências complementares efetoras e as efetoras cognatas. Sequências em alça adequadas podem ser selecionadas dentre aquelas conhecidas na arte. De forma alternativa, haste-alças adequadas podem ser desenvolvidas de novo. Em um exemplo, um ácido nucleico da pluralidade descrita aqui que codifica um shRNA pode compreender uma sequência de DNA que codifica uma haste-alça posicionada entre as sequências de DNA que codificam a sequência efetora e a sequência complementar efetora, respectivamente.
[00233] Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR2, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR2 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 56 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 43, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Por exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 56 (shmiR2), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR3-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles.
[00234] Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR3, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR3 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 44, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Por exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 (shmiR3), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2, shmiR4-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles.
[00235] Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR4 e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR4 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 58 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 45, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Por exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 58 (shmiR4), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2, shmiR3, shmiR5- shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles.
[00236] Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR5, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR5 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 59 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 46, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Por exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 59 (shmiR5), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR4, shmiR6- shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles.
[00237] Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR6 e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR6 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 60 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 47, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Por exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 60 (shmiR6), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR5, shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles.
[00238] Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR7, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR7 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 61 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 48, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Por exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 61 (shmiR7), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR6, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles.
[00239] Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR9, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR9 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 62 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 49, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Por exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 62 (shmiR9), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles.
[00240] Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR11, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR11 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 63 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 50, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Por exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 63 (shmiR11), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles.
[00241] Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR13, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR13 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 51, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Por exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR14-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles.
[00242] Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR14, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR14 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 52, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Por exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 (shmiR14), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13, shmiR15-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles.
[00243] Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR15, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR15 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 66 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 53, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Por exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 66 (shmiR15), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR14, ou shmiR16-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles.
[00244] Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR16 e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR16 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 67 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 54, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Por exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 67 (shmiR16), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR15, ou shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles.
[00245] Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR17 e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR17 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 55, e pelo menos um outro ácido nucleico da divulgação que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1. Por exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR16 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles.
[00246] De acordo com qualquer exemplo de uma pluralidade de ácidos nucleicos como descrito aqui, a pluralidade de ácidos nucleicos pode compreender dois ou mais ácidos nucleicos que codificam shmiRs ou shRNAs como descritos aqui, tais como dois, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis, ou sete, ou oito, ou nove ou dez ácidos nucleicos que codificam shmiRs como descrito aqui, desde que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiRs da divulgação.
[00247] Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos compreende dois ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos compreende três ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos compreende quatro ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos compreende cinco ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos compreende seis ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos compreende sete ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos compreende oito ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos compreende nove ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui. Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos compreende dez ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui.
[00248] Em um exemplo de uma pluralidade de ácidos nucleicos descrita aqui, um dos ácidos nucleicos compreende uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 1. Ácidos nucleicos adequados que codificam um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 1 são descritos neste documento, por exemplo, para shmiR2.
[00249] Em um exemplo de uma pluralidade de ácidos nucleicos descrita aqui, um dos ácidos nucleicos compreende uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 2. Ácidos nucleicos adequados que codificam um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 2 são descritos neste documento, por exemplo, para shmiR3.
[00250] Em um exemplo de uma pluralidade de ácidos nucleicos descrita aqui, um dos ácidos nucleicos compreende uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 4. Ácidos nucleicos adequados que codificam um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 4 são descritos neste documento, por exemplo, para shmiR5.
[00251] Em um exemplo de uma pluralidade de ácidos nucleicos descrita aqui, um dos ácidos nucleicos compreende uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 7. Ácidos nucleicos adequados que codificam um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 7 são descritos neste documento, por exemplo, para shmiR9.
[00252] Em um exemplo de uma pluralidade de ácidos nucleicos descrita aqui, um dos ácidos nucleicos compreende uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 9. Os ácidos nucleicos adequados que codificam um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 9 são descritos neste documento, por exemplo, para shmiR13.
[00253] Em um exemplo de uma pluralidade de ácidos nucleicos descrita aqui, um dos ácidos nucleicos compreende uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 10. Ácidos nucleicos adequados que codificam um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 10 são descritos neste documento, por exemplo, para shmiR14.
[00254] Em um exemplo de uma pluralidade de ácidos nucleicos descrita aqui, um dos ácidos nucleicos compreende uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 13. Os ácidos nucleicos adequados que codificam um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 13 são descritos neste documento, por exemplo, para shmiR17.
[00255] Um exemplo de pluralidade de ácidos nucleicos da divulgação compreende pelo menos dois ácidos nucleicos, cada um compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shmiR da divulgação, em que cada shmiR compreende uma sequência efetora diferente.
[00256] Em um exemplo, cada um dos pelo menos dois ácidos nucleicos codifica um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado em uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 7, 9, 10 e 13. Exemplos de ácidos nucleicos da divulgação que codificam shmiRs compreendendo sequências efetoras que são substancialmente complementares às regiões de comprimento correspondente nos transcritos de RNA apresentados na SEQ ID NO: 1, 2, 4, 7, 9, 10 e 13 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00257] Em um exemplo, os pelo menos dois ácidos nucleicos são selecionados do grupo que consiste em: um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID
NO: 14, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 56 (shmiR2); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 17 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 16, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 (shmiR3); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 21 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 20, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 59 (shmiR5); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 27 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 26, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 62 (shmiR9); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 30, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 33 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 32, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 (shmiR14); e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 39 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID
NO: 38, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17).
[00258] Em um exemplo, cada um dos pelo menos dois ácidos nucleicos codifica um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado em uma das SEQ ID NOs: 2, 9, 10 e 13. Exemplos de ácidos nucleicos da divulgação que codificam shmiRs compreendendo sequências efetoras que são substancialmente complementares às regiões de comprimento correspondente nos transcritos de RNA apresentados na SEQ ID NO: 2, 9, 10 e 13 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00259] Em um exemplo, os pelo menos dois ácidos nucleicos são selecionados do grupo que consiste em: um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 17 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 16, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 (shmiR3); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 30, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 33 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 32, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 (shmiR14); e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 39 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 38, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17).
[00260] Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos compreende um ácido nucleico que codifica um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado na SEQ ID NO: 9, e um ácido nucleico que codifica um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado na SEQ ID NO: 13. Por exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos pode compreender: (a) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 30, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13); e (b) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 39 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 38, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17).
[00261] Um exemplo de pluralidade de ácidos nucleicos da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13) e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17).
[00262] Em um exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos compreende um ácido nucleico que codifica um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado na SEQ ID NO: 2 e um ácido nucleico que codifica um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado na SEQ ID NO: 10. Por exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos pode compreender: (a) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 17 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 16, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 (shmiR3); e (b) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 33 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 32, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo na sequência apresentada na SEQ ID NO: 65 (shmiR14).
[00263] Um exemplo de pluralidade de ácidos nucleicos da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 (shmiR3) e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 (shmiR14).
[00264] De acordo com um exemplo, no qual uma pluralidade de ácidos nucleicos é fornecida, dois ou mais dos ácidos nucleicos podem formar partes separadas do mesmo polinucleotídeo. Em outro exemplo, dois ou mais dos ácidos nucleicos na pluralidade formam partes de diferentes polinucleotídeos, respectivamente. Em outro exemplo, a pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui é fornecida como componentes múltiplos, por exemplo, composições múltiplas. Por exemplo, cada um dos ácidos nucleicos da pluralidade pode ser proporcionado separadamente. De forma alternativa, em um exemplo onde três ou mais ácidos nucleicos da divulgação são fornecidos, pelo menos um dos ácidos nucleicos pode ser proporcionado separadamente e dois ou mais da pluralidade, proporcionados juntos.
[00265] Em alguns exemplos, o ou cada ácido nucleico de acordo com a presente divulgação pode compreender, ou estar em ligação operável com, elementos adicionais, por exemplo, para facilitar a transcrição do shmiR ou shRNA. Por exemplo, o ou cada ácido nucleico pode compreender um promotor operacionalmente ligado à sequência que codifica um shmiR ou shRNA descrito aqui. Outros elementos, por exemplo, terminadores e iniciadores transcricionais, são conhecidos na arte e/ou descritos neste documento.
[00266] De forma alternativa ou adicional, o ou cada ácido nucleico de acordo com a presente divulgação pode compreender um ou mais sítios de restrição, por exemplo, para facilitar a clonagem do(s) ácido(s) nucleico(s) em vetores de clonagem ou expressão. Por exemplo, os ácidos nucleicos descritos aqui podem incluir um sítio de restrição a montante e/ou a jusante da sequência que codifica um shmiR ou shRNA da divulgação. As sequências de reconhecimento de enzimas de restrição adequadas serão conhecidas por um técnico no assunto. No entanto, em um exemplo, o(s) ácido(s) nucleico(s) da invenção podem incluir um sítio de restrição BamH1 (GGATCC) na extremidade 5' ou seja, a montante da sequência que codifica o shmiR ou shRNA, e um sítio de restrição EcoR1 (GAATTC) na extremidade 3', isto é, a jusante da sequência que codifica o shmiR ou shRNA. Construções de ddRNAi
[00267] Em um exemplo, o ou cada ácido nucleico da divulgação é proporcionado na forma de, ou está compreendido em, uma construção de RNAi dirigida por DNA (ddRNAi). Por conseguinte, em um exemplo, a presente divulgação proporciona uma construção de ddRNAi compreendendo um ácido nucleico como descrito aqui. Em outro exemplo, a presente divulgação proporciona uma construção de ddRNAi compreendendo uma pluralidade de ácidos nucleicos descrita aqui. Ainda em outro exemplo, a presente divulgação proporciona uma pluralidade de construções de ddRNAi, cada uma compreendendo um ácido nucleico da pluralidade de ácidos nucleicos como descrito aqui (isto é, de modo que todos os ácidos nucleicos da pluralidade sejam representados na pluralidade de construções de ddRNAi). Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiRs ou shRNAs compreendendo sequências efetoras direcionadas a um transcrito de RNAm de PABPN1, que é causadora da OPMD, são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00268] Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende um ácido nucleico da divulgação operacionalmente ligado a um promotor.
[00269] De acordo com um exemplo, no qual a construção de ddRNAi compreende uma pluralidade dos ácidos nucleicos descrita aqui, cada um dos ácidos nucleicos pode ser operacionalmente ligado a um promotor. Em um exemplo, os ácidos nucleicos na construção de ddRNAi podem estar operacionalmente ligados ao mesmo promotor. Em um exemplo, os ácidos nucleicos na construção de ddRNAi podem ser operacionalmente ligados a diferentes promotores.
[00270] Em um exemplo, uma construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR2. Por exemplo, a construção de ddRNAi pode compreender um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 1. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR2 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 56 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 43. A construção de ddRNAi pode compreender um ou mais ácidos nucleicos adicionais da divulgação compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1, tal como um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR3-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles, como descrito aqui. Por exemplo, a construção de ddRNAi descrita aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 56 (shmiR2), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR3-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiRs denominados shmiR3-shmiR7, shmiR9, shmiR11 e shmiR13- shmiR17 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00271] Em um exemplo, uma construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR3. Por exemplo, a construção de ddRNAi pode compreender um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 2. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR3 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 44. A construção de ddRNAi pode compreender um ou mais ácidos nucleicos adicionais da divulgação compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de
RNAm de PABPN1, tal como um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2, shmiR4-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles, como descrito aqui. Por exemplo, a construção de ddRNAi descrita aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 (shmiR3), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2, shmiR4-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiRs denominados shmiR2, shmiR4-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00272] Em um exemplo, uma construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR4. Por exemplo, a construção de ddRNAi pode compreender um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 3. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR4 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 58 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 45. A construção de ddRNAi pode compreender um ou mais ácidos nucleicos adicionais da divulgação compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1, tal como um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2, shmiR3, shmiR5- shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles, como descrito aqui. Por exemplo, a construção de ddRNAi descrita aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 58 (shmiR4), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2, shmiR3, shmiR5-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiRs denominados shmiR2, shmiR3, shmiR5-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13- shmiR17 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00273] Em um exemplo, uma construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR5. Por exemplo, a construção de ddRNAi pode compreender um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 4. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR5 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 59 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 46. A construção de ddRNAi pode compreender um ou mais ácidos nucleicos adicionais da divulgação compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1, tal como um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR4, shmiR6-
shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles, como descrito aqui. Por exemplo, a construção de ddRNAi descrita aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 59 (shmiR5), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR4, shmiR6-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiRs denominados shmiR2-shmiR4, shmiR6-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13- shmiR17 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00274] Em um exemplo, uma construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR6. Por exemplo, a construção de ddRNAi pode compreender um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 5. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR6 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 60 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 47. A construção de ddRNAi pode compreender um ou mais ácidos nucleicos adicionais da divulgação compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1, tal como um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR5, shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles, como descrito aqui. Por exemplo, a construção de ddRNAi descrita aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 60 (shmiR6), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR5, shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiRs denominados shmiR2-shmiR5, shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00275] Em um exemplo, uma construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR7. Por exemplo, a construção de ddRNAi pode compreender um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 6. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR7 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 61 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 48. A construção de ddRNAi pode compreender um ou mais ácidos nucleicos adicionais da divulgação compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1, tal como um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR6, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles, como descrito aqui. Por exemplo, a construção de ddRNAi descrita aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 61 (shmiR7), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR6, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiRs denominados shmiR2-shmiR6, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13- shmiR17 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00276] Em um exemplo, uma construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR9. Por exemplo, a construção de ddRNAi pode compreender um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 7. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR9 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 62 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 49. A construção de ddRNAi pode compreender um ou mais ácidos nucleicos adicionais da divulgação compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1, tal como um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles, como descrito aqui. Por exemplo, a construção de ddRNAi descrita aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 62 (shmiR9), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR11 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiRs denominados shmiR2-shmiR7, shmiR11 ou shmiR13- shmiR17 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00277] Em um exemplo, uma construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR11. Por exemplo, a construção de ddRNAi pode compreender um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 8. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR11 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 63 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 50. A construção de ddRNAi pode compreender um ou mais ácidos nucleicos adicionais da divulgação compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1, tal como um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles, como descrito aqui. Por exemplo, a construção de ddRNAi descrita aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 63 (shmiR11), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9 ou shmiR13-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiRs denominados shmiR2-shmiR7, shmiR9 ou shmiR13-shmiR17 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00278] Em um exemplo, uma construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR13. Por exemplo, a construção de ddRNAi pode compreender um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 9. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR13 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 51. A construção de ddRNAi pode compreender um ou mais ácidos nucleicos adicionais da divulgação compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1, tal como um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR14-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles, como descrito aqui. Por exemplo, a construção de ddRNAi descrita aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR14-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiRs denominados shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR14-
shmiR17 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00279] Em um exemplo, uma construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR14. Por exemplo, a construção de ddRNAi pode compreender um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 10. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR14 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 52. A construção de ddRNAi pode compreender um ou mais ácidos nucleicos adicionais da divulgação compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1, tal como um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13, shmiR15-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles, como descrito aqui. Por exemplo, a construção de ddRNAi descrita aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 (shmiR14), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13, shmiR15-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiRs denominados shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13, shmiR15-shmiR17 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00280] Em um exemplo, uma construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR15. Por exemplo, a construção de ddRNAi pode compreender um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 11. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR15 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 66 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 53. A construção de ddRNAi pode compreender um ou mais ácidos nucleicos adicionais da divulgação compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1, tal como um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR14, ou shmiR16-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles, como descrito aqui. Por exemplo, a construção de ddRNAi descrita aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 66 (shmiR15), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR14, ou shmiR16-shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiRs denominados shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-
shmiR14, ou shmiR16-shmiR17 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00281] Em um exemplo, uma construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR16. Por exemplo, a construção de ddRNAi pode compreender um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 12. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR16 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 67 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 54. A construção de ddRNAi pode compreender um ou mais ácidos nucleicos adicionais da divulgação compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1, tal como um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR15, ou shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles, como descrito aqui. Por exemplo, a construção de ddRNAi descrita aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 67 (shmiR16), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR15, ou shmiR17 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiRs denominados shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR15 ou shmiR17 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00282] Em um exemplo, uma construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR17. Por exemplo, a construção de ddRNAi pode compreender um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR tendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 13. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiR17 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 e que codifica um shmiR que compreende ou consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 55. A construção de ddRNAi pode compreender um ou mais ácidos nucleicos adicionais da divulgação compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shmiR ou shRNA direcionado a uma região de um transcrito de RNAm de PABPN1, tal como um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR16 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles, como descrito aqui. Por exemplo, a construção de ddRNAi descrita aqui pode compreender (i) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17), e (ii) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um dentre shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13-shmiR16 ou o shRNA correspondente de qualquer um deles. Exemplos de ácidos nucleicos que codificam shmiRs denominados shmiR2-shmiR7, shmiR9, shmiR11 ou shmiR13- shmiR16 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00283] De acordo com qualquer exemplo de uma construção de ddRNAi compreendendo uma pluralidade de ácidos nucleicos como descrito aqui, a construção de ddRNAi pode compreender dois ou mais ácidos nucleicos que codificam shmiRs ou shRNAs, como descrito aqui, tais como dois, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis, ou sete, ou oito, ou nove, ou dez ácidos nucleicos que codificam shmiRs ou shRNAs como descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui.
[00284] Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende dois ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende três ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende quatro ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende cinco ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende seis ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende sete ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende oito ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende nove ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui. Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende dez ácidos nucleicos que codificam um shmiR ou shRNA descrito aqui, com a condição de que pelo menos um dos ácidos nucleicos codifique um shmiR como descrito aqui.
[00285] Um exemplo de construção de ddRNAi da divulgação compreende pelo menos dois ácidos nucleicos, cada um compreendendo uma sequência de DNA que codifica um shmiR da divulgação, em que cada shmiR compreende uma sequência efetora diferente. Em um exemplo, cada um dos pelo menos dois ácidos nucleicos na construção de ddRNAi codifica um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado em uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 7, 9, 10 e 13. Exemplos de ácidos nucleicos da divulgação que codificam shmiRs compreendendo sequências efetoras que são substancialmente complementares às regiões de comprimento correspondente nos transcritos de RNA apresentados na SEQ ID NO: 1, 2, 4, 7, 9, 10 e 13 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação que descreve as construções de ddRNAi.
[00286] Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende pelo menos dois ácidos nucleicos selecionados do grupo que consiste em: um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 14, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 56 (shmiR2); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 17 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID
NO: 16, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 (shmiR3); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 21 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 20, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 59 (shmiR5); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 27 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 26, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 62 (shmiR9); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 30, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 33 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 32, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 (shmiR14); e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 39 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 38, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17).
[00287] Em um exemplo, cada um dos pelo menos dois ácidos nucleicos na construção de ddRNAi codifica um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado em uma das SEQ ID NOs: 2, 9, 10 e 13. Exemplos de ácidos nucleicos da divulgação que codificam shmiRs compreendendo sequências efetoras que são substancialmente complementares às regiões de comprimento correspondente nos transcritos de RNA apresentados na SEQ ID NO: 2, 9, 10 e 13 são descritos neste documento e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação que descreve construções de ddRNAi.
[00288] Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende pelo menos dois ácidos nucleicos selecionados do grupo que consiste em: um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 17 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 16, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 (shmiR3); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 30, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 33 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 32, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 (shmiR14); e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 39 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 38, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17).
[00289] Em um exemplo, a construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico que codifica um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado na SEQ ID NO: 9, e um ácido nucleico que codifica um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado na SEQ ID NO: 13. Por exemplo, a construção de ddRNAi pode compreender: (a) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 30, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13); e (b) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 39 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 38, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17).
[00290] Um exemplo de construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13) e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17).
[00291] Em um exemplo, a construção de ddRNAi compreende um ácido nucleico que codifica um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado na SEQ ID NO: 2 e um ácido nucleico que codifica um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado na SEQ ID NO: 10. Por exemplo, a construção de ddRNAi pode compreender: (a) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 17 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 16, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 (shmiR3); e (b) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 33 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 32, por exemplo, um ácido nucleico compreendendo ou consistindo na sequência apresentada na SEQ ID NO: 65 (shmiR14).
[00292] Um exemplo de construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 (shmiR3) e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 (shmiR14).
[00293] Em cada um dos exemplos anteriores que descrevem uma construção de ddRNAi da divulgação, o ou cada ácido nucleico nela compreendido pode estar operacionalmente ligado a um promotor. Por exemplo, a construção de ddRNAi como descrito aqui pode compreender um único promotor que está operacionalmente ligado ao ou a cada ácido nucleico nela compreendido, por exemplo, para direcionar a expressão de um ou mais shmiRs e/ou shRNAs da construção de ddRNAi.
[00294] Em outro exemplo, cada ácido nucleico que codifica um shmiR ou shRNA da divulgação compreendido na construção de ddRNAi está operacionalmente ligado a um promotor separado.
[00295] De acordo com um exemplo em que múltiplos promotores estão presentes, os promotores podem ser iguais ou diferentes. Por exemplo, a construção pode compreender várias cópias do mesmo promotor com cada cópia operacionalmente ligada a um ácido nucleico diferente da divulgação. Em outro exemplo, cada promotor operacionalmente ligado a um ácido nucleico da divulgação é diferente. Por exemplo, em uma construção de ddRNAi que codifica dois shmiRs, cada um dos dois ácidos nucleicos que codificam os shmiRs está operacionalmente ligado a um promotor diferente. Da mesma forma, em um exemplo em que uma construção de ddRNAi codifica um shmiR e um shRNA, cada um dos respectivos ácidos nucleicos que codifica o shmiR e shRNA está operacionalmente ligado a um promotor diferente.
[00296] Em um exemplo, o promotor é um promotor constitutivo. O termo "constitutivo", ao se referir a um promotor, significa que o promotor é capaz de direcionar a transcrição de uma sequência de ácido nucleico operacionalmente ligada na ausência de um estímulo específico (por exemplo, choque térmico, produtos químicos, luz etc.). Normalmente, os promotores constitutivos são capazes de direcionar a expressão de uma sequência codificante em substancialmente qualquer célula e qualquer tecido. Os promotores usados para transcrever shmiRs ou shRNAs do(s) ácido(s) nucleico(s) da divulgação incluem os promotores da ubiquitina, CMV, β-actina, histona H4, EF-1α ou genes pgk controlados pela RNA polimerase II ou elementos promotores controlados pela RNA polimerase I.
[00297] Em um exemplo, utiliza-se um promotor de Pol II, como CMV, SV40, U1, β-actina ou um promotor de Pol II híbrido. Outros promotores de Pol II adequados são conhecidos na arte e podem ser usados de acordo com este exemplo da divulgação. Por exemplo, um sistema promotor de Pol II pode ser preferencial em uma construção de ddRNAi da divulgação que expressa um pri- miRNA que, pela ação das enzimas Drosha e Pasha, é processado em um ou mais shmiRs. Um sistema promotor de Pol II pode ser preferencial também em uma construção de ddRNAi da divulgação compreendendo a sequência que codifica uma pluralidade de shRNAs ou shmiRs sob o controle de um único promotor. Um sistema promotor de Pol II pode ser preferencial também onde a especificidade do tecido é desejada.
[00298] Em outro exemplo, um promotor controlado pela RNA polimerase III é usado, tal como um promotor U6 (U6-1, U6-8, U6-9), promotor H1, promotor 7SL, um promotor Y humano (hY1, hY3, hY4 (vide Maraia, et al., Nucleic Acids Res 22 (15): 3045-52 (1994)) e hY5 (vide Maraia, et al., Nucleic Acids Res 24 (18): 3552-59 (1994)), um promotor humano MRP-7-2, um promotor de VA1 de Adenovírus, um promotor de tRNA humano ou um promotor de RNA ribossômico 5s.
[00299] Promotores adequados para uso em uma construção de ddRNAi da divulgação encontram-se descritos na Patente US No. 8,008,468 e Patente US No. 8,129,510.
[00300] Em um exemplo, o promotor é um promotor de RNA pol III. Por exemplo, o promotor é um promotor U6 (por exemplo, um promotor U6-1, U6-8 ou U6-9). Em outro exemplo, o promotor é um promotor H1.
[00301] No caso de uma construção de ddRNAi da divulgação que codifica uma pluralidade de shmiRs, ou que codifica um ou mais shmiRs e um shRNA, como descrito aqui, cada um dos ácidos nucleicos na construção de ddRNAi está operacionalmente ligado a um promotor U6, por exemplo, um promotor U6.
[00302] Em um exemplo, o promotor em uma construção é um promotor U6. Por exemplo, o promotor é um promotor U6-1. Por exemplo, o promotor é um promotor U6-8. Por exemplo, o promotor é um promotor U6-9.
[00303] Em alguns exemplos, são empregados promotores de força variável. Por exemplo, o uso de dois ou mais promotores fortes (como um promotor do tipo Pol III) pode sobrecarregar a célula, por exemplo, esgotando o pool de nucleotídeos disponíveis ou outros componentes celulares necessários para a transcrição. Além disso, ou de forma alternativa, o uso de vários promotores fortes pode levar a um nível tóxico de expressão de agentes de RNAi, por exemplo, shmiRs ou shRNAs, na célula. Assim, em alguns exemplos, um ou mais dos promotores na construção de ddRNAi de promotor múltiplo é mais fraco do que outros promotores na construção, ou todos os promotores na construção podem expressar os shmiRs ou shRNAs a uma taxa menor que a máxima. Os promotores também podem ser modificados utilizando-se várias técnicas moleculares, ou de outra forma, por exemplo, através da modificação de vários elementos reguladores, para atingir níveis mais fracos ou níveis mais fortes de transcrição. Um meio de se alcançar a transcrição reduzida é modificando os elementos de sequência dentro de promotores conhecidos por controlar a atividade do promotor. Por exemplo, o Elemento de Sequência Proximal (PSE) é conhecido por afetar a atividade de promotores U6 humanos (vide Domitrovich, et al., Nucleic Acids Res 31: 2344-2352 (2003). A substituição dos elementos PSE presentes em promotores fortes, tais como os promotores U6-1, U6-8 ou U6-9 humanos, pelo elemento de um promotor fraco, como o promotor U6-7 humano, reduz a atividade dos promotores híbridos U6-1, U6-8 ou U6-9. Esta abordagem foi usada nos exemplos descritos neste pedido, mas outros meios para se alcançar este resultado são conhecidos na arte.
[00304] Promotores úteis em alguns exemplos da presente divulgação podem ser específicos de tecido ou específicos de célula. O termo "específico de tecido", quando aplicado a um promotor, refere-se a um promotor que é capaz de direcionar a transcrição seletiva de um ácido nucleico de interesse em um tipo específico de tecido (por exemplo, tecido do olho ou músculo) na ausência relativa de expressão da mesma sequência nucleotídica de interesse em um tipo diferente de tecido (por exemplo, fígado). O termo "específico de célula", quando aplicado a um promotor, refere-se a um promotor que é capaz de direcionar a transcrição seletiva de um ácido nucleico de interesse em um tipo específico de célula na ausência relativa de expressão da mesma sequência nucleotídica de interesse em um tipo diferente de célula no mesmo tecido. De acordo com um exemplo, um promotor específico de músculo é usado, como Spc512 ou CK8. No entanto, outros promotores específicos de músculo são conhecidos na arte e são contemplados para uso em uma construção de ddRNAi da divulgação.
[00305] Em um exemplo, uma construção de ddRNAi da divulgação pode compreender ainda um ou mais intensificadores para aumentar a expressão dos shmiRs ou shRNAs codificados pelos ácidos nucleicos descritos aqui.
Intensificadores apropriados para uso nos exemplos da presente divulgação incluem o intensificador Apo E HCR, um intensificador de CMV (Xia et al., Nucleic Acids Res 31-17 (2003)) e outros intensificadores conhecidos pelos técnicos no assunto. Intensificadores adequados para uso em uma construção de ddRNAi da divulgação encontram-se descritos na Patente US No. 8,008,468.
[00306] Em outro exemplo, uma construção de ddRNAi da divulgação pode compreender um terminador transcricional ligado a um ácido nucleico que codifica um shmiR ou shRNA da divulgação. No caso de uma construção de ddRNAi compreendendo uma pluralidade de ácidos nucleicos descrita aqui, isto é, que codifica vários shmiRs e/ou shRNAs, os terminadores ligados a cada ácido nucleico podem ser iguais ou diferentes. Por exemplo, em uma construção de ddRNAi da divulgação em que um promotor de RNA pol III é empregado, o terminador pode ser um trecho contíguo de 4 ou mais ou 5 ou mais ou 6 ou mais resíduos de T. No entanto, quando diferentes promotores são usados, os terminadores podem ser diferentes e são combinados com o promotor do gene do qual o terminador é derivado. Esses terminadores incluem, mas não estão limitados ao SV40 poli A, o gene AdV VA1, o gene de RNA ribossômico 5S e os terminadores para t-RNAs humanos. Outras combinações de promotor e terminador são conhecidas na arte e são contempladas para uso em uma construção de ddRNAi da divulgação.
[00307] Além disso, os promotores e terminadores podem ser misturados e combinados, como é comumente feito com terminadores e promotores de RNA pol II.
[00308] Em um exemplo, as combinações de promotor e terminador usadas para cada ácido nucleico em uma construção de ddRNAi compreendendo uma pluralidade de ácidos nucleicos é diferente de modo a diminuir a probabilidade de eventos de recombinação de DNA entre os componentes.
[00309] Um exemplo de construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR13, como descrito aqui, operacionalmente ligado a um promotor e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR17, como descrito aqui, operacionalmente ligado a um promotor. Por exemplo, um exemplo de construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 operacionalmente ligado a um promotor e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 operacionalmente ligado a um promotor. Em um exemplo, cada ácido nucleico na construção de ddRNAi que codifica um shmiR está operacionalmente ligado a um promotor separado. Em outro exemplo, cada ácido nucleico na construção de ddRNAi que codifica um shmiR está operacionalmente ligado ao mesmo promotor. Por exemplo, o ou cada promotor pode ser um promotor U6, por exemplo, um promotor U6-1, U6-8 ou U6-9. Por exemplo, o ou cada promotor pode ser um promotor específico de músculo, por exemplo, um promotor Spc512 ou CK8.
[00310] De acordo com um exemplo no qual os ácidos nucleicos na construção de ddRNAi que codifica shmiR13 e shmiR17 estão operacionalmente ligados ao mesmo promotor Spc512, a construção de ddRNAi compreende ou consiste na sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 72. De acordo com um exemplo no qual os ácidos nucleicos na construção de ddRNAi que codifica shmiR13 e shmiR17 estão operacionalmente ligados ao mesmo promotor CK8, a construção de ddRNAi compreende ou consiste na sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 70.
[00311] Outro exemplo de construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR3, como descrito aqui, operacionalmente ligado a um promotor e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica shmiR14, como descrito aqui, operacionalmente ligado a um promotor. Por exemplo, um exemplo de construção de ddRNAi da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 operacionalmente ligado a um promotor e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 operacionalmente ligado a um promotor. Em um exemplo, cada ácido nucleico na construção de ddRNAi que codifica um shmiR está operacionalmente ligado a um promotor separado. Em outro exemplo, cada ácido nucleico na construção de ddRNAi que codifica um shmiR está operacionalmente ligado ao mesmo promotor. Por exemplo, o ou cada promotor pode ser um promotor U6, por exemplo, um promotor U6-1, U6-8 ou U6-9. Por exemplo, o ou cada promotor pode ser um promotor específico de músculo, por exemplo, um promotor Spc512 ou CK8.
[00312] De acordo com um exemplo em que os ácidos nucleicos na construção de ddRNAi que codifica shmiR3 e shmiR14 estão operacionalmente ligados ao mesmo promotor Spc512, a construção de ddRNAi compreende ou consiste na sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 71. De acordo com um exemplo no qual os ácidos nucleicos na construção de ddRNAi que codifica shmiR3 e shmiR14 estão operacionalmente ligados ao mesmo promotor CK8, a construção de ddRNAi compreende ou consiste na sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 69.
[00313] Uma pluralidade de construções de ddRNAi também é proporcionada. Por exemplo, uma pluralidade de ácidos nucleicos que codifica shmiRs, como descrito aqui, pode ser proporcionada dentro de uma pluralidade de construções de ddRNAi, em que cada construção de ddRNAi compreende um ou mais da pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui. Combinações de ácidos nucleicos que codificam shmiR foram descritas e devem ser consideradas como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Em um exemplo, cada ácido nucleico na pluralidade de ácidos nucleicos descritos aqui é provido dentro de sua própria construção de ddRNAi.
[00314] De acordo com qualquer exemplo no qual uma pluralidade de construções de ddRNAi é proporcionada, cada construção de ddRNAi pode compreender também um ou mais promotores operacionalmente ligados ao(s) ácido(s) nucleico(s) que codificam o(s) shmiR(s) nela compreendidos. Em um exemplo, cada construção de ddRNAi compreende um único ácido nucleico que codifica um shmiR e um promotor operacionalmente ligado ao mesmo. De acordo com um exemplo no qual uma ou mais da pluralidade de construções de ddRNAi compreende dois ou mais ácidos nucleicos que codificam shmiRs, cada ácido nucleico em uma ou mais construções de ddRNAi está operacionalmente ligado a um promotor separado. Em outro exemplo em que uma ou mais da pluralidade de construções de ddRNAi compreende dois ou mais ácidos nucleicos que codificam shmiRs, os dois ou mais ácidos nucleicos estão operacionalmente ligados ao mesmo promotor na construção de ddRNAi.
[00315] Um exemplo de pluralidade de construções de ddRNAi da divulgação compreende uma construção de ddRNAi compreendendo um ácido nucleico que compreende ou consiste em uma sequência de DNA que codifica shmiR13, como descrito aqui, operacionalmente ligado a um promotor e uma construção de ddRNAi compreendendo um ácido nucleico que compreende ou consiste em uma sequência de DNA que codifica shmiR17, como descrito aqui, operacionalmente ligado a um promotor. Por exemplo, um exemplo de pluralidade de construções de ddRNAi da divulgação compreende uma construção de ddRNAi compreendendo um ácido nucleico que compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 operacionalmente ligado a um promotor e uma construção de ddRNAi compreendendo um ácido nucleico que compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 operacionalmente ligado a um promotor. Em um exemplo, os promotores são promotores U6, por exemplo, selecionados dentre um promotor U6-1, U6-8 ou U6-9. Em outro exemplo, os promotores são promotores específicos de músculo, por exemplo, promotores Spc512 ou CK8.
[00316] Outro exemplo de pluralidade de construções de ddRNAi da divulgação compreende uma construção de ddRNAi compreendendo um ácido nucleico que compreende ou consiste em uma sequência de DNA que codifica shmiR3, como descrito aqui, operacionalmente ligado a um promotor e uma construção de ddRNAi compreendendo um ácido nucleico que compreende ou consiste em uma sequência de DNA que codifica shmiR14, como descrito aqui, operacionalmente ligado a um promotor. Por exemplo, um exemplo de pluralidade de construções de ddRNAi da divulgação compreende uma construção de ddRNAi compreendendo um ácido nucleico que compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 operacionalmente ligado a um promotor e uma construção de ddRNAi compreendendo um ácido nucleico que compreende ou consiste em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 operacionalmente ligado a um promotor. Em um exemplo, os promotores são promotores U6, por exemplo, selecionados dentre um promotor U6-1, U6-8 ou U6-9. Em outro exemplo, os promotores são promotores específicos de músculo, por exemplo, promotores Spc512 ou CK8.
[00317] Além disso, a ou cada construção de ddRNAi pode compreender um ou mais sítios múltiplos de clonagem e/ou sítios exclusivos de restrição que estão localizados estrategicamente, de modo que o promotor, o ácido nucleico que codifica o shmiR ou shRNA e/ou outros elementos reguladores sejam facilmente removidos ou substituídos. A ou cada construção de ddRNAi pode ser montada a partir de componentes oligonucleotídicos menores por meio de sítios de restrição estrategicamente localizados e/ou extremidades coesivas complementares. O vetor base para uma abordagem de acordo com a presente divulgação compreende plasmídeos com um multi-ligante (multilinker) em que todos os sítios são únicos (embora este não seja um requisito absoluto). Sequencialmente, cada promotor é inserido entre seus sítios únicos designados, resultando em um cassete base com um ou mais promotores, todos os quais podendo ter orientação variável. Sequencialmente, novamente, pares de iniciadores anelados são inseridos nos sítios únicos a jusante de cada um dos promotores individuais, resultando em uma construção de cassete de expressão única, dupla ou múltipla. A inserção pode ser movida para, por exemplo, uma estrutura AdV ou uma estrutura AAV utilizando-se dois sítios de enzima de restrição únicos (iguais ou diferentes) que flanqueiam o inserto do cassete de expressão única, dupla ou múltipla.
[00318] A geração da ou de cada construção de ddRNAi pode ser realizada utilizando-se quaisquer técnicas de engenharia genética adequadas conhecidas na arte, incluindo, sem limitação, as técnicas padrão de PCR, síntese de oligonucleotídeos, digestão com endonuclease de restrição, ligação, transformação, purificação de plasmídeo e sequenciamento de DNA. Se a ou cada construção for uma construção viral, a construção compreende, por exemplo, sequências necessárias para empacotar a construção de ddRNAi em partículas virais e/ou sequências que permitam a integração da construção de ddRNAi no genoma da célula alvo. Em alguns exemplos, a ou cada construção viral contém ainda genes que permitem a replicação e propagação do vírus, no entanto, tais genes serão fornecidos no arranjo trans. Além disso, a ou cada construção viral pode conter genes ou sequências genéticas do genoma de qualquer organismo conhecido incorporado na forma nativa ou modificada. Por exemplo, uma construção viral pode compreender sequências úteis para a replicação da construção em bactérias.
[00319] A ou cada construção também pode conter elementos genéticos adicionais. Os tipos de elementos que podem ser incluídos na construção não são limitados de forma alguma e podem ser escolhidos por um técnico no assunto. Por exemplo, elementos genéticos adicionais podem incluir um gene repórter, como um ou mais genes para uma proteína marcadora fluorescente, como GFP ou RFP; uma enzima facilmente testada, como beta-galactosidase, luciferase, beta-glucuronidase, cloranfenicol acetiltransferase ou fosfatase alcalina embrionária secretada; ou proteínas para as quais os imunoensaios se encontram facilmente disponíveis, como hormônios ou citocinas.
[00320] Outros elementos genéticos que podem encontrar utilização nas formas de realização da presente divulgação incluem aqueles que codificam proteínas que conferem às células uma vantagem de crescimento seletivo, tais como adenosina desaminase, aminoglicosídeo fosfotransferase, di-hidrofolato redutase, higromicina-B-fosfotransferase, resistência a drogas ou aqueles genes que codificam proteínas que fornecem uma capacidade biossintética ausente em um auxotrófico. Se um gene repórter for incluído junto com a ou cada construção, uma sequência do sítio interno de entrada ribossomal (IRES) pode ser incluída. Em um exemplo, os elementos genéticos adicionais são operacionalmente ligados e controlados por um promotor/intensificador independente. Além disso, uma origem de replicação adequada para a propagação da construção em bactérias pode ser utilizada. A sequência da origem de replicação geralmente é separada da construção de ddRNAi e outras sequências genéticas. Essas origens de replicação são conhecidas na arte e incluem as origens de replicação pUC, ColE1, 2-micron ou SV40. Vetores de Expressão
[00321] Em um exemplo, uma construção de ddRNAi da divulgação é incluída dentro de um vetor de expressão.
[00322] Em um exemplo, o vetor de expressão é um plasmídeo, por exemplo, como é conhecido na arte. Em um exemplo, um vetor de expressão plasmidial adequado é um vetor pAAV, por exemplo, um vetor plasmidial pAAV auto- complementar (pscAAV) ou vetor plasmidial pAAV de fita simples (pssAAV). Conforme descrito neste documento, o plasmídeo pode compreender um ou mais promotores (exemplos adequados dos quais são descritos) para direcionar a expressão de um ou mais shmiRs da divulgação.
[00323] Em um exemplo, o vetor de expressão é do tipo DNA em minicírculo. O DNA em minicírculo é descrito na Publicação de Patente US No. 2004/0214329. O DNA em minicírculo é útil para níveis persistentemente elevados de transcrição de ácido nucleico. Os vetores circulares são caracterizados por serem desprovidos de sequências bacterianas que silenciam a expressão. Por exemplo, os vetores em minicírculos diferem dos vetores plasmidiais bacterianos pelo fato de não possuírem uma origem de replicação e não possuírem marcadores de seleção de drogas comumente encontrados em plasmídeos bacterianos, por exemplo, β-lactamase, tet e semelhantes.
Consequentemente, o DNA em minicírculo torna-se menor em tamanho, permitindo uma entrega mais eficiente.
[00324] Em um exemplo, o vetor de expressão é um vetor viral.
[00325] Um vetor viral baseado em qualquer vírus apropriado pode ser usado para entregar um ddRNAi da divulgação. Além disso, os sistemas virais híbridos podem ser úteis. A escolha do sistema de entrega viral dependerá de vários parâmetros, tais como o tecido alvo da entrega, eficiência de transdução do sistema, patogenicidade, questões imunológicas e de toxicidade e semelhantes.
[00326] As classes comumente usadas de sistemas virais usados em terapia gênica podem ser categorizadas em dois grupos dependendo se seus genomas se integram à cromatina celular do hospedeiro (oncoretrovírus e lentivírus) ou se persistem no núcleo da célula predominantemente como epissomas extracromossômicos (vírus adenoassociados, adenovírus e herpesvírus). Em um exemplo, um vetor viral da divulgação se integra na cromatina de uma célula hospedeira. Em outro exemplo, um vetor viral da divulgação persiste no núcleo de uma célula hospedeira como um epissoma extracomossômico.
[00327] Em um exemplo, um vetor viral é um vetor adenoviral (AdV). Os adenovírus são vírus de DNA de fita dupla, sem envelope, de tamanho médio, com genomas lineares entre 26-48 Kbp. Os adenovírus ganham entrada em uma célula alvo por meio da ligação e internalização mediada por receptor, penetrando no núcleo tanto de células que não se dividem quanto que se dividem. Os adenovírus são fortemente dependentes da célula hospedeira para sobrevivência e replicação e são capazes de se replicar no núcleo das células de vertebrados pelo uso da maquinaria de replicação do hospedeiro.
[00328] Em um exemplo, um vetor viral é da família Parvoviridae. Parvoviridae é uma família de pequenos vírus de DNA de fita simples, sem envelope, com genomas de aproximadamente 5000 nucleotídeos de comprimento. O vírus adenoassociado (AAV) está incluído entre os membros dessa família. Em um exemplo, um vetor viral da divulgação é um AAV. AAV é um parvovírus dependente que geralmente requer coinfecção com outro vírus (tipicamente um adenovírus ou herpesvírus) para iniciar e manter um ciclo infeccioso produtivo.
Na ausência de tal vírus auxiliar, o AAV ainda é competente para infectar ou transduzir uma célula alvo por ligação e internalização mediada por receptor, penetrando no núcleo tanto de células que não se dividem quanto que se dividem.
Como a progênie do vírus não é produzida a partir da infecção do AAV na ausência do vírus auxiliar, a extensão da transdução é restrita apenas às células iniciais que estão infectadas com o vírus.
É esta característica que torna AAV um vetor desejável para a presente divulgação.
Além disso, ao contrário do retrovírus, adenovírus e vírus herpes simplex, o AAV parece não apresentar patogenicidade e toxicidade humanas (Kay, et al., Nature. 424: 251 (2003)). Como o genoma codifica normalmente apenas dois genes, não é surpreendente que, como um veículo de entrega, AAV seja limitado por uma capacidade de empacotamento de 4,5 quilobases de fita simples (kb). No entanto, embora essa restrição de tamanho possa limitar os genes que podem ser entregues para terapias de substituição gênica, ela não afeta negativamente o empacotamento e a expressão de sequências mais curtas, como shmiRs e shRNAs.
Preferencialmente, o AAV usado como um vetor de expressão e sistema de entrega é de um sorotipo que seja capaz de infectar humanos, por exemplo, um AAV selecionado do grupo que consiste em AAV de sorotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 e 13. Em um exemplo particular, um AAV de sorotipo 8 ou 9 é usado como um vetor.
Em um exemplo, o AAV é do sorotipo 8. Em outro exemplo, o AAV é do sorotipo 9. De acordo com qualquer exemplo em que o AAV é de um sorotipo diferente do sorotipo 2, o AAV pode compreender repetições terminais invertidas (ITRs) do sorotipo 2 de AAV, por exemplo, para melhorar a eficiência de transdução do AAV.
De forma alternativa ou adicional, o AAV pode compreender uma proteína de capsídeo modificada, por exemplo, para auxiliar na produção do AAV em células de inseto utilizando-se um sistema de baculovírus.
Por exemplo, o AAV pode compreender uma proteína de capsídeo viral compreendendo uma subunidade 1 (VP1) com uma sequência de domínio da fosfolipase modificado (PL). Por exemplo, o domínio PL do VP1 pode compreender uma sequência compreendendo uma serina na posição 1, um ácido glutâmico na posição 26, uma arginina na posição 40, um ácido aspártico na posição 43, uma serina na posição 44 e uma lisina na posição 64, em que as posições de aminoácidos são definidas em relação à sequência não modificada apresentada na SEQ ID NO: 88, em que os aminoácidos em qualquer uma ou mais das posições 1, 26, 40, 43, 44 e 64 são modificados em relação a um sequência do tipo selvagem correspondente.
[00329] Em um exemplo, o vetor viral é um AAV do sorotipo 8, ou um AAV pseudotipado com um capsídeo do sorotipo 8, compreendendo ITRs do sorotipo 2 de AAV e uma proteína de capsídeo modificada, em que a VP1 compreende uma sequência de domínio PL compreendendo uma serina na posição 1, um ácido glutâmico na posição 26, uma arginina na posição 40, um ácido aspártico na posição 43, uma serina na posição 44 e uma lisina na posição 64, em que as posições de aminoácidos são definidas em relação à sequência apresentada na SEQ ID NO: 88. Por exemplo, a proteína de capsídeo modificada de AAV8 pode compreender uma VP1 que compreende um domínio PL compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 89. Em outro exemplo, o vetor viral é um AAV do sorotipo 9, ou um AAV pseudotipado com um capsídeo do sorotipo 9, compreendendo ITRs do sorotipo 2 de AAV e uma proteína de capsídeo modificada, em que a VP1 compreende uma sequência de domínio PL compreendendo uma serina na posição 1, um ácido glutâmico na posição 26, uma arginina na posição 40, um ácido aspártico na posição 43 e uma serina na posição 44 e uma lisina na posição 64, em que as posições de aminoácidos são definidas em relação à sequência não modificada apresentada na SEQ ID NO:
88. Por exemplo, a proteína de capsídeo modificada de AAV9 pode compreender um VP1 que compreende um domínio PL compreendendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 90.
[00330] Os métodos de produção de AAV adequados para uso em terapia gênica (por exemplo, AAV incompetente para replicação) são bem conhecidos na arte e contemplados aqui. Por exemplo, o AAV pode ser produzido em células de inseto utilizando-se um sistema de baculovírus, por exemplo, conforme descrito nos documentos US20120028357 A1, WO2007046703, US20030148506 A1, WO2017184879, US20040197895 A1 e WO2007148971, cujo conteúdo é descrito aqui por referência. O AAV recombinante também pode ser produzido em células de mamífero, tanto em células aderentes quanto em células em suspensão, métodos para os quais se encontram descritos nos documentos WO2015031686, WO2009097129, WO2007127264, WO1997009441 e WO2001049829, cujo conteúdo é descrito aqui por referência. Os métodos de produção de AAV recombinante para uso em terapia gênica também estão descritos em Berns KI e Giraud C (1996) Biology of adeno- associated virus. Curr Top Microbiol Immunol 218: 1-23, Snyder e Flotte (2002) Curr. Opin. Biotechnol., 13: 418–423, e Synder RO e Moullier P, Adeno- associated virus; methods and protocols. New York: Humana Press (2011), cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.
[00331] Outro sistema de entrega viral útil com as construções ddRNAi da divulgação é um sistema baseado em vírus da família Retroviridae. Os retrovírus compreendem vírus animais de RNA de fita simples que são caracterizados por duas características únicas. Primeiro, o genoma de um retrovírus é diploide, consistindo em duas cópias do RNA. Em segundo lugar, esse RNA é transcrito pela transcriptase reversa da enzima associada ao vírion em DNA de fita dupla. Este DNA de fita dupla ou provírus pode então se integrar no genoma do hospedeiro e ser passado da célula parental para as células da progênie como um componente integrado de forma estável do genoma do hospedeiro.
[00332] Em alguns exemplos, um vetor viral é um lentivírus. Os vetores de lentivírus são frequentemente pseudotipados com a glicoproteína do vírus da somatite vesicular (VSV-G) e foram derivados do vírus da imunodeficiência humana (HIV); Maedi-Visna, que causa encefalite (visna) ou pneumonia em ovelhas; vírus da anemia infecciosa equina (EIAV), que causa anemia hemolítica autoimune e encefalopatia em cavalos; vírus da imunodeficiência felina (FIV), que causa imunodeficiência em gatos; vírus da imunodeficiência bovina (BIV),
que causa linfadenopatia e linfocitose em bovinos; e o vírus da imunodeficiência símia (SIV), que causa imunodeficiência e encefalopatia em primatas não- humanos. Os vetores baseados no HIV geralmente retêm <5% do genoma parental e <25% do genoma é incorporado em construções de empacotamento, o que minimiza a possibilidade de gerar a reversão para HIV competente para replicação. A biossegurança foi aumentada ainda mais pelo desenvolvimento de vetores auto-inativadores que contêm deleções dos elementos reguladores na sequência de repetição terminal longa a jusante, esta modificação elimina a transcrição a partir de provírus integrados necessária para a mobilização do vetor. Uma das principais vantagens do uso de vetores lentivirais é que a transferência gênica é persistente na maioria dos tecidos ou tipos de células, mesmo após a divisão celular da célula transduzida.
[00333] Uma construção baseada em lentivírus usada para expressar shmiRs e/ou shRNAs dos ácidos nucleicos e construções de ddRNAi da divulgação compreende as sequências das repetições terminais longas 5' e 3' (LTRs) de um lentivírus. Em um exemplo, a construção viral compreende uma LTR 3' inativada ou auto-inativada de um lentivírus. A LTR 3' pode ser feita auto-inativante por qualquer método conhecido na arte. Por exemplo, o elemento U3 da LTR 3' contém uma deleção de sua sequência intensificadora, por exemplo, o TATA box, os sítios para Sp1 e NF-kappa B. Como resultado da LTR 3' auto-inativante, o provírus que está integrado no genoma do hospedeiro compreenderá uma LTR 5' inativada. As sequências LTR podem ser sequências LTR de qualquer lentivírus de qualquer espécie. A construção baseada em lentivírus pode incorporar também sequências de genes de MMLV ou MSCV, RSV ou de mamíferos. Além disso, a sequência U3 da LTR 5' lentiviral pode ser substituída por uma sequência promotora na construção viral. Isso pode aumentar o título de vírus recuperados das linhagens celulares de empacotamento. Uma sequência intensificadora também pode ser incluída.
[00334] Outros sistemas virais ou não virais conhecidos pelos técnicos no assunto podem ser usados para entregar o ddRNAi ou ácido nucleico da presente invenção às células de interesse, incluindo, mas não se limitando a vetores transposon-adenovírus com deleção gênica (vide Yant, et al., Nature Biotech. 20: 999-1004 (2002)); sistemas derivados do vírus Sindbis ou vírus da floresta de Semliki (vide Perri, et al., J. Virol. 74 (20): 9802-07 (2002)); sistemas derivados do vírus da doença de Newcastle ou vírus Sendai. Testando uma Construção de shmiR ou ddRNAi da Divulgação Modelos de Cultura Celular
[00335] Um exemplo de linhagem celular útil como um modelo de cultura celular para OPMD é a linhagem celular HEK293T (HEK293T, ATCC, Manassas, EUA) que foi transfectada com um vetor que expressa Ala10-humanPABPN1- FLAG normal (Ala10) ou Ala17-humanPABPN1-FLAG mutante (Ala17), sendo esta última a marca registrada da OPMD.
[00336] Outros exemplos de linhagens celulares úteis como modelos de cultura de células para OPMD são a célula de músculo de camundongo C2C12 e as células de retina humana ARPE-19.
[00337] Outro exemplo de uma linhagem celular útil como um modelo de cultura de células para OPMD é a linhagem celular de mioblasto de camundongo primário (IM2) estavelmente transfectada para expressar Ala10-humanPABPN1- FLAG normal (Ala10) ou Ala17-humanPABPN1-FLAG mutante (Ala17). Um exemplo de linhagem celular derivada de IM2 que expressa de forma estável Ala17-humanPABPN1-FLAG mutante (Ala17) é a linhagem celular H2kB-D7e. A linhagem celular H2kB-D7e também é descrita em Raz et al., (2011) American Journal of Pathology, 179 (4): 1988-2000.
[00338] Outras linhagens celulares adequadas para modelos de cultura de células de OPMD são conhecidas na arte, como descrito em Fan et al., (2001) Human Molecular Genetics, 10: 2341–2351, Bao et al., (2002) The Journal of Biological Chemistry, 277: 12263-12269, e Abu-Baker et al., (2003) Human Molecular Genetics, 12: 2609–2623.
[00339] Conforme exemplificado neste documento, a atividade de um shmiR da divulgação é determinada pela administração de um ácido nucleico que codifica o shmiR, ou uma construção de ddRNAi ou vetor de expressão compreendendo os mesmos, à célula e, subsequentemente, pela medição do nível de expressão de um RNA ou proteína codificada pelo gene PABPN1. Por exemplo, a expressão do gene PABPN1 intracelular pode ser avaliada por qualquer um ou mais dentre RT-PCR, PCR quantitativo, PCR semiquantitativo ou hibridização in situ sob condições estringentes, utilizando-se uma ou mais sondas ou iniciadores que são específicos para PABPN1. O RNAm ou DNA de PABPN1 pode ser testado também por PCR por meio de uma ou mais sondas ou iniciadores que são específicos para PABPN1 ou Western blots ou ELISA pode ser usado para detectar a proteína PABPN1.
[00340] Os polinucleotídeos que podem ser usados nas técnicas de RT-PCR, PCR quantitativo ou PCR semiquantitativo para detectar a expressão de PABPN1 são conhecidos e estão disponíveis comercialmente (Thermo Fisher). No entanto, polinucleotídeos úteis para os métodos de detecção baseados em PCR podem ser desenhados com base na informação da sequência disponível para PABPN1 por um método e/ou software conhecido na arte. Em um exemplo, a presença ou ausência de RNAm de PABPN1 pode ser detectada por RT-PCR através das metodologias padrão conhecidas na arte. Em um exemplo, a presença ou ausência ou quantidade relativa de polipeptídeo ou proteína PABPN1 pode ser detectada usando qualquer um ou mais de Western blotting, ELISA ou outras técnicas quantitativas ou semiquantitativas padrão disponíveis na arte, ou uma combinação de tais técnicas. Técnicas baseadas no reconhecimento de PABPN1 por anticorpo são contempladas e descritas aqui. Em um exemplo, a presença ou ausência ou quantidade relativa do polipeptídeo PABPN1 pode ser detectada por técnicas que compreendam a captura dos polipeptídeos de PABPN1 por anticorpos em combinação com a resolução eletroforética dos polipeptídeos de PABPN1 capturados, por exemplo, utilizando- se o Ensaio Isonostic™ (Target Discovery, Inc.). Os anticorpos para a proteína PABPN1 encontram-se disponíveis comercialmente.
[00341] Vários meios para normalizar diferenças na eficiência de transfecção ou transdução e recuperação de amostra são conhecidos na arte.
[00342] Um ácido nucleico, construção de ddRNAi ou vetor de expressão da divulgação que reduz a expressão de um RNAm ou proteína codificada por PABPN1 ou que reduz a presença de agregados nucleares da proteína PABPN1, em relação a um nível de expressão de RNAm ou proteína codificada por PABPN1 ou uma quantidade de agregados nucleares da proteína PABPN1 na ausência do RNA da divulgação, é considerado útil para aplicações terapêuticas, por exemplo, como o tratamento da OPMD pela redução da expressão de PABPN1 endógena e substituição de algumas ou todas as PABPN1 endógenas por uma proteína PABPN1 que não é causadora da OPMD como descrito aqui. Modelos Animais
[00343] Existem vários modelos de pequenos animais disponíveis para estudar OPMD, exemplos dos quais são descritos em Uyama et al., (2005) Acta Myologica, 24 (2): 84-88 e Chartier e Simonelig (2013) Drug Discovery Today: technologies, 10: e103-107. Um exemplo de modelo animal é o modelo de camundongo transgênico A17.1 que foi descrito anteriormente em Davies et al., (2005) Nature Medicine, 11: 672-677 e Trollet et al., (2010) Human Molecular Genetics, 19 (11): 2191-2207.
[00344] Qualquer um dos modelos animais anteriores pode ser usado para determinar a eficácia de uma construção de shmiR ou ddRNAi da divulgação para realizar o knockdown, reduzir ou inibir a expressão de um RNA ou proteína codificada pelo gene PABPN1.
[00345] Métodos para avaliar a expressão do gene PABPN1 foram descritos neste documento com relação aos modelos de células e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação. Agentes para Substituição por PABPN1 Funcional
[00346] Em um exemplo, a presente divulgação proporciona um agente para substituição por proteína PABPN1 funcional, por exemplo, em uma célula ou animal. A proteína PABPN1 funcional não será causadora da OPMD, nem será codificada por um transcrito de RNAm que é alvo do(s) shmiR(s) ou shRNA(s) da divulgação.
[00347] Em um exemplo, o agente para substituição pela proteína PABPN1 funcional em uma célula ou animal é um ácido nucleico, por exemplo, como DNA ou cDNA, que codifica a proteína PABPN1 funcional. Por exemplo, o ácido nucleico que codifica a proteína PABPN1 funcional pode ser códon-otimizado, por exemplo, conter uma ou mais bases degeneradas ou oscilantes em relação ao ácido nucleico da PABPN1 do tipo selvagem, mas que codifica aminoácidos idênticos, de modo que a sequência de RNAm correspondente que codifica a proteína PABPN1 funcional não é reconhecida pelo(s) shmiR(s) ou shRNA(s) da divulgação. Por exemplo, um ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional pode compreender uma ou mais bases degeneradas ou oscilantes em relação ao ácido nucleico da PABPN1 do tipo selvagem na região alvo do(s) shmiR(s) ou shRNA(s) da divulgação. Em um exemplo, uma ou mais bases degeneradas ou oscilantes residem dentro de uma região semente de uma sequência efetora de shmiR ou shRNA da divulgação.
[00348] Em um exemplo, um ácido nucleico que codifica a proteína PABPN1 funcional é códon-otimizado de modo que sua sequência de RNAm correspondente não seja reconhecida pelo(s) shmiR(s) ou shRNA(s) da divulgação. Preferencialmente, a proteína PABPN1 funcional codificada pela sequência de ácido nucleico códon-otimizado compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 74, isto é, a sequência de aminoácidos da proteína PABPN1 humana do tipo selvagem. Um técnico no assunto apreciará que há uma série de combinações de sequência nucleotídica que podem ser usadas para codificar a proteína PABPN1 funcional e a escolha da sequência nucleotídica dependerá, em última análise, da sequência efetora do(s) shmiR(s) ou shRNA(s), ou seja, de modo que o ácido nucleico códon-otimizado não seja reconhecido pelo(s) shmiR(s) ou shRNA(s). Em um exemplo, o agente para substituição por proteína PABPN1 funcional é um ácido nucleico que compreende a sequência apresentada na SEQ ID NO: 73. Em um exemplo, o ácido nucleico que codifica a proteína PABPN1 funcional pode compreender também uma sequência Kozak.
[00349] Em um exemplo, o ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional está operacionalmente ligado a um promotor adequado para a expressão da proteína PABPN1 funcional. Os promotores adequados para a expressão da proteína PABPN1 funcional no músculo podem ser particularmente adequados. Um exemplo de promotor adequado para uso com o ácido nucleico que codifica a proteína PABPN1 funcional é um promotor Spc512. Outro exemplo de promotor adequado para uso com o ácido nucleico que codifica a proteína PABPN1 funcional é um promotor CK8. No entanto, qualquer promotor adequado conhecido na arte pode ser usado. Por exemplo, outros promotores adequados para uso com o ácido nucleico que codifica a proteína PABPN1 funcional são descritos no documento US 20110212529 A1.
[00350] Conforme descrito neste documento, os promotores úteis em alguns exemplos da presente divulgação podem ser específicos de tecido ou específicos de célula.
[00351] Em um exemplo, um ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional da divulgação pode compreender ainda um ou mais intensificadores para aumentar a expressão da proteína PABPN1 funcional e seu transcrito de RNAm correspondente. Intensificadores apropriados para uso neste exemplo da presente divulgação serão conhecidos pelos técnica no assunto.
[00352] Um ácido nucleico que codifica a proteína PABPN1 funcional pode estar compreendido em um vetor de expressão. Exemplos de vetores de expressão foram descritos no contexto das construções de ácido nucleico e ddRNAi da divulgação e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo.
[00353] Por conseguinte, em um exemplo, um agente para substituição por proteína PABPN1 funcional em uma célula ou animal pode ser um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional. Por exemplo, um vetor de expressão da divulgação pode compreender o ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional e um promotor para sua expressão, por exemplo, um promotor SpC512 ou um promotor CK8. Em um exemplo, o ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional pode compreender também uma sequência de Kozak.
[00354] Em um exemplo, o ácido nucleico que codifica a proteína PABPN1 funcional, como descrito aqui, pode estar compreendido dentro de um vetor de expressão plasmidial. Vetores de expressão plasmidiais adequados foram descritos aqui e serão conhecidos na arte. Em um exemplo, um vetor de expressão plasmidial adequado é um vetor pAAV, por exemplo, um vetor plasmidial pscAAV ou vetor plasmidial pssAAV.
[00355] Em um exemplo, o vetor de expressão é do tipo DNA em minicírculo. Os vetores de DNA em minicírculo foram descritos neste documento.
[00356] Em um exemplo, o vetor de expressão é um vetor viral. Por exemplo, um vetor viral com base em qualquer vírus apropriado pode ser usado para entregar um ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional da divulgação. Além disso, os sistemas virais híbridos podem ser úteis. A escolha do sistema de entrega viral dependerá de vários parâmetros, como o tecido alvo da entrega, eficiência de transdução do sistema, patogenicidade, questões imunológicas e de toxicidade e semelhantes.
[00357] Exemplos de sistemas virais para entrega de material genético a uma célula ou animal foram descritos no contexto dos RNAs e construções de ddRNAi da divulgação e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo.
[00358] Em um exemplo, o vetor viral é um AAV (por exemplo, AAV9 ou um AAV9 modificado).
[00359] Em um exemplo, o vetor viral é um vetor AdV.
[00360] Em um exemplo, o vetor viral é um lentivírus.
[00361] Outros sistemas virais ou não virais conhecidos pelos técnicos no assunto podem ser usados para entregar o ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional da presente divulgação às células de interesse, incluindo, mas não se limitando a vetores transposon-adenovírus com deleção gênica (vide Yant, et al., Nature Biotech. 20: 999-1004 (2002)); sistemas derivados do vírus Sindbis ou vírus da floresta de Semliki (vide Perri, et al., J. Virol. 74 (20): 9802-07 (2002)); sistemas derivados do vírus da doença de Newcastle ou vírus Sendai.
[00362] De acordo com um exemplo em que o ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional, como descrito aqui, é fornecido com um ácido nucleico, construção de ddRNAi ou vetor de expressão da divulgação, o ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional pode estar compreendido no mesmo vetor de expressão que o ácido nucleico ou construção de ddRNAi. Assim, o ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional e o ácido nucleico ou construção de ddRNAi da divulgação podem ser proporcionados como uma única construção de DNA, por exemplo, dentro de um vetor de expressão.
[00363] Em um exemplo alternativo, no qual um ácido nucleico códon- otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional da divulgação e um ácido nucleico ou construção de ddRNAi da divulgação devem ser proporcionados juntos, o ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional e o ácido nucleico ou a construção de ddRNAi pode estar compreendido em diferentes vetores de expressão. Quando o ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional e o ácido nucleico ou construção de ddRNAi estão compreendidos em diferentes vetores de expressão, os respectivos vetores de expressão podem ser o mesmo tipo de vetor ou diferentes tipos de vetores. Teste para PABPN1 Funcional Modelos Animais
[00364] Exemplos de modelos animais para estudar OPMD foram descritos.
[00365] Qualquer um dos modelos animais anteriores pode ser usado para determinar a eficácia de um agente da divulgação para substituir por proteína
PABPN1 funcional in vivo na presença de um ou mais ácido(s) nucleico(s), construção(ões) ddRNAi ou vetor(es) de expressão da divulgação (expressando um ou mais shmiR(s) da divulgação).
[00366] Métodos para testar a expressão de PABPN1 foram descritos neste documento com relação aos modelos de células e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo da divulgação.
[00367] Em um exemplo, as análises histológicas e morfológicas podem ser usadas para determinar a eficácia de um agente da divulgação para substituir por proteína PABPN1 funcional in vivo na presença de um ou mais ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de ddRNAi ou vetor(es) de expressão da divulgação (expressando um ou mais shmiR(s) da divulgação). Outros ensaios que podem ser usados para determinar a eficácia de um agente da divulgação para substituir por proteína PABPN1 funcional in vivo são descritos em Trollet et al., (2010) Human Molecular Genetics, 19 (11): 2191-2207. Construção Única de DNA para ddRNAi e Substituição por PABPN1 Funcional
[00368] A presente divulgação também fornece uma construção única de DNA compreendendo o ácido nucleico que codifica a proteína PABPN1 funcional como descrito aqui e uma ou mais construção(ões) de ddRNAi da divulgação. Um exemplo de construção de DNA compreendendo um ácido nucleico que codifica a proteína PABPN1 funcional e a construção de ddRNAi da divulgação é descrito no Exemplo 2. Em um exemplo, a construção de DNA pode compreender uma única construção de ddRNAi como descrito aqui em combinação com o ácido nucleico que codifica a proteína PABPN1 funcional. Em outro exemplo, a construção de DNA pode compreender uma pluralidade de construções de ddRNAi em combinação com o ácido nucleico que codifica a proteína PABPN1 funcional. Em cada exemplo da construção de DNA, a sequência de DNA que codifica a proteína PABPN1 funcional é códon-otimizada de modo que seu transcrito de RNAm não seja alvo do(s) shmiR(s) da(s) construção(ões) de ddRNAi.
[00369] Em um exemplo, a proteína PABPN1 funcional é uma proteína PABPN1 humana do tipo selvagem, por exemplo, tendo uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 74. Compreender-se-á que a sequência de DNA códon-otimizada que codifica a proteína PABPN1 funcional pode variar dependendo do(s) shmiR(s) codificado(s) pela construção de ddRNAi. Ou seja, os códons específicos dentro do transcrito de RNAm de PABPN1 a ser modificado podem variar dependendo da(s) sequência(s) efetora(s) de shmiR(s) codificada(s) pela construção de ddRNAi. Em um exemplo, uma sequência de DNA códon-otimizada que codifica a proteína PABPN1 funcional é apresentada na SEQ ID NO: 73.
[00370] A construção de DNA pode compreender também um ou mais promotores, por exemplo, para direcionar a expressão da proteína PABPN1 funcional e/ou shmiRs codificados pela construção de ddRNAi. Promotores úteis em alguns exemplos da presente divulgação podem ser específicos de tecido ou específicos de célula. Exemplos de promotores para uso nas construções de DNA da divulgação são promotores específicos de músculo, tais como, por exemplo, Spc512 e CK8. No entanto, qualquer promotor adequado conhecido na arte é contemplado para uso na construção de DNA aqui descrita, por exemplo, tal como aqueles descritos no documento US 20110212529 A1.
[00371] A construção de DNA pode ser proporcionada na forma de um vetor de expressão ou pode estar compreendida em um vetor de expressão. Os vetores de expressão adequados foram descritos neste documento e serão conhecidos na arte.
[00372] Em um exemplo, o vetor de expressão é um vetor viral. Por exemplo, um vetor viral com base em qualquer vírus apropriado pode ser usado para entregar a única construção de DNA da divulgação. Além disso, os sistemas virais híbridos podem ser úteis. A escolha do sistema de entrega viral dependerá de vários parâmetros, como o tecido alvo da entrega, eficiência de transdução do sistema, patogenicidade, questões imunológicas e de toxicidade e semelhantes.
[00373] Em outro exemplo, um vetor de expressão plasmidial adequado é um vetor pAAV, por exemplo, um vetor plasmidial pscAAV ou vetor plasmidial pssAAV. Outros exemplos de sistemas virais para entrega de material genético a uma célula ou animal foram descritos no contexto das construções de ddRNAi da divulgação e devem ser considerados como aplicáveis mutatis mutandis a este exemplo.
[00374] Em um exemplo, a construção de DNA é proporcionada na forma de um vetor de expressão pAAV compreendendo, em uma direção 5’ a 3’, um promotor específico de músculo, por exemplo, um promotor Spc512, uma construção de ddRNAi como descrito aqui e uma construção de PABPN1 como descrito aqui, por exemplo, em que a construção de ddRNAi está posicionada na região 3' não traduzida (UTR) do ácido nucleico que codifica a proteína PABPN1 funcional. Uma construção de DNA de acordo com este exemplo é ilustrada na Figura 1A.
[00375] Um exemplo de construção de DNA de acordo com este exemplo é um vetor de expressão pAAV compreendendo, em uma direção 5’ a 3’: (a) um promotor específico de músculo, por exemplo, Spc512; (b) uma construção de PABPN1 como descrito aqui compreendendo uma sequência de DNA que codifica uma proteína PABPN1 funcional tendo um transcrito de RNAm que não é alvo dos shmiRs codificados pela construção de ddRNAi; e (c) uma construção de ddRNAi da divulgação compreendendo um ácido nucleico que compreende uma sequência de DNA que codifica shmiR17 como descrito aqui e um ácido nucleico que compreende uma sequência de DNA que codifica shmiR13 como descrito aqui.
[00376] De acordo com este exemplo, a construção de DNA pode compreender ou consistir na sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 72.
[00377] Um exemplo de construção de ddRNAi que codifica shmiR13 e shmiR17 para inclusão em uma construção de DNA da divulgação compreende um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 31, por exemplo, uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 30 (shmiR13) e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende um conjunto de sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 39 e uma sequência complementar efetora que é substancialmente complementar à sequência apresentada na SEQ ID NO: 39, por exemplo, uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 38 (shmiR17). Por exemplo, a construção de ddRNAi de acordo com este exemplo da construção de DNA pode compreender um ácido nucleico compreendendo ou consistindo na sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13) e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo na sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17).
[00378] Embora certos exemplos tenham sido descritos, compreende-se que uma construção de DNA de acordo com a presente divulgação pode incluir qualquer construção de ddRNAi aqui descrita que codifica um ou mais shmiRs. Por exemplo, as construções de ddRNAi que codificam shmiRs descritos nos Exemplos 1 a 5 podem ser particularmente adequadas para inclusão em uma construção de DNA da divulgação. Composições e Carreadores
[00379] Em alguns exemplos, o(s) ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de ddRNAi, construção de DNA, ou vetor(es) de expressão da divulgação é/são proporcionados em uma composição. Em alguns exemplos, um ácido nucleico que codifica uma proteína PABPN1 funcional da divulgação é proporcionado em uma composição. Em alguns exemplos, o(s) ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de ddRNAi ou vetor(es) de expressão da divulgação é/são proporcionados em uma composição em conjunto com um ácido nucleico que codifica uma proteína funcional PABPN1 da divulgação. Em alguns exemplos, o um ou mais ácido(s) nucleico(s) ou construção(ões) de ddRNAi e o ácido nucleico que codifica uma proteína PABPN1 funcional são proporcionados no mesmo vetor de expressão dentro de uma composição (por exemplo, dentro de uma construção de DNA da divulgação).
[00380] Conforme descrito neste documento, o vetor de expressão pode compreender uma construção de ddRNAi da divulgação isoladamente ou em combinação com um ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional da divulgação. A referência aqui a um vetor de expressão e/ou composição compreendendo o mesmo será, portanto, entendida como englobando: (i) um vetor de expressão compreendendo uma construção de ddRNAi da divulgação, ou uma composição compreendendo o mesmo; (ii) um vetor de expressão compreendendo uma construção de ddRNAi da divulgação e um ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional da divulgação, ou uma composição compreendendo o mesmo; ou (iii) um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional da divulgação, ou uma composição compreendendo o mesmo.
[00381] Consequentemente, uma composição da divulgação pode compreender (i) um vetor de expressão compreendendo uma construção de ddRNAi da divulgação e (ii) um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional da divulgação. De forma alternativa, uma composição da divulgação pode compreender um único vetor de expressão compreendendo a construção de ddRNAi da divulgação e um ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional da divulgação.
[00382] Ainda em outro exemplo, um vetor de expressão compreendendo uma construção de ddRNAi da divulgação pode ser fornecido em uma composição e um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico códon-otimizado que codifica a proteína PABPN1 funcional da divulgação pode ser fornecido dentro de outra composição, por exemplo, que são embaladas juntas.
[00383] Uma composição da divulgação pode compreender também um ou mais carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Por exemplo, a composição pode compreender um carreador adequado para a entrega do(s) ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de ddRNAi, construção de DNA ou vetor(es) de expressão da divulgação ao músculo de um indivíduo após sua administração.
[00384] Em alguns exemplos, o carreador é um carreador baseado em lipídios, lipídio catiônico ou complexo de ácido nucleico de lipossoma, um lipossoma, uma micela, um virossoma, uma nanopartícula de lipídio ou uma mistura dos mesmos.
[00385] Em alguns exemplos, o carreador é um carreador à base de polímero biodegradável, de modo que um complexo de polímero catiônico-ácido nucleico seja formado. Por exemplo, o carreador pode ser uma micropartícula de polímero catiônico adequada para entrega de um ou mais ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de ddRNAi, construção de DNA ou vetor(es) de expressão da divulgação às células musculares ou tecido do olho. O uso de polímeros catiônicos para administrar composições às células é conhecido na arte, tal como descrito em Judge et al. Nature 25: 457-462 (2005), cujo conteúdo é aqui incorporado por referência. Um exemplo de carreador baseado em polímero catiônico é um polímero catiônico de ligação a DNA, tal como polietilenimina. Outros polímeros catiônicos adequados para complexação com, e entrega de ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de ddRNAi ou vetor(es) de expressão da divulgação incluem poli (L-lisina) (PLL), quitosana, dendrímeros PAMAM e poli (2-dimetilamino) etil metacrilato (pDMAEMA). Outros polímeros incluem poli- beta-aminoésteres. Estes são outros polímeros catiônicos adequados conhecidos na arte e se encontram descritos em Mastrobattista e Hennink, Nature Materials, 11: 10-12 (2012), nos documentos WO/2003/097107 e WO/2006/041617, cujos conteúdos completos são incorporados aqui por referência. Tais formulações carreadoras foram desenvolvidas para várias vias de entrega, incluindo injeção parenteral subcutânea, injeção intravenosa e inalação.
[00386] Em outro exemplo, o carreador é um carreador à base de ciclodextrina, como um complexo de polímero de ciclodextrina-ácido nucleico.
[00387] Em outro exemplo, o carreador é um carreador à base de proteína, como um complexo catiônico de peptídeo-ácido nucleico.
[00388] Em outro exemplo, o carreador é uma nanopartícula de lipídio. Exemplos de nanopartículas são descritos, por exemplo, no documento US7514099.
[00389] Em alguns exemplos, o(s) ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de de ddRNAi ou vetor(es) de expressão da divulgação é/são formulados com uma composição de nanopartículas lipídicas compreendendo um lipídio catiônico/colesterol/PEG-C-DMA/DSPC (por exemplo, em uma proporção de 40/48/2/10), um lipídio catiônico/colesterol/PEG-DMG/DSPC (por exemplo, em uma proporção de 40/48/2/10) ou um lipídio catiônico/colesterol/PEG-DMG (por exemplo, em uma proporção de 60/38/2). Em alguns exemplos, o lipídio catiônico é Octyl CL em DMA, DL em DMA, L-278, DLinKC2DMA ou MC3.
[00390] Em outro exemplo, o(s) ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de ddRNAi ou vetor(es) de expressão da divulgação é/são formulados com qualquer uma das formulações lipídicas catiônicas descritas nos documentos WO 2010/021865; WO 2010/080724; WO 2010/042877; WO 2010/105209 ou WO 2011/022460.
[00391] Em outro exemplo, o(s) ácido(s) nucleico(s) ou construção(ões) de ddRNAi ou vetor(es) de expressão da divulgação é/são conjugados ou complexados com outro composto, por exemplo, para facilitar a entrega do(s) ácido(s) nucleico(s), construção(ões) ddRNAi ou vetor(es) de expressão. Exemplos não limitativos de tais conjugados são descritos nos documentos US 2008/0152661 e US 2004/0162260 (por exemplo, CDM-LBA, CDM-Pip-LBA, CDM-PEG, CDM-NAG etc.).
[00392] Em outro exemplo, o polietilenoglicol (PEG) é covalentemente ligado a um ácido nucleico ou construção de ddRNAi ou construção de DNA ou vetor de expressão da divulgação. O PEG ligdo pode ter qualquer peso molecular, por exemplo, de cerca de 100 a cerca de 50.000 daltons (Da).
[00393] Ainda em outro exemplo, o(s) ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de ddRNAi, construção de DNA ou vetor(es) de expressão da divulgação é/são formulados com um carreador compreendendo lipossomas de superfície modificada contendo poli (etilenoglicol) lipídios (PEG-modificado, ou lipossomas de longa circulação ou lipossomas furtivos), tal como é divulgado, por exemplo, nos documentos WO 96/10391; WO 96/10390; ou WO 96/10392.
[00394] Em alguns exemplos, o(s) ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de ddRNAi, construção de DNA ou vetor(es) de expressão da divulgação também podem ser formulados ou complexados com polietilenoimina ou um derivado desta, tal como derivados de polietilenoimina-polietilenoglicol-N- acetilgalactosamina (PEI-PEG-GAL) ou polietilenoimina-polietilenoglicol-tri-N- acetilgalactosamina (PEI-PEG-triGAL).
[00395] Em outros exemplos, o(s) ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de ddRNAi, construção de DNA ou vetor(es) de expressão da divulgação é/são complexados com agentes perturbadores de membrana, tais como aqueles descritos na Publicação do Pedido de Patente US No. 2001/0007666.
[00396] Outros carreadores incluem ciclodextrinas (vide, por exemplo, Gonzalez et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074; ou documento WO 03/46185), ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA) e microesferas de PLCA (vide, por exemplo, documento US 2002130430).
[00397] As composições incluirão desejavelmente materiais que aumentam a estabilidade biológica do(s) ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de ddRNAi, construção de DNA ou vetor(es) de expressão da divulgação e/ou materiais que aumentam a capacidade das composições em localizar e/ou penetrar nas células musculares de forma seletiva. As composições terapêuticas da divulgação podem ser administradas em carreadores farmaceuticamente aceitáveis (por exemplo, soro fisiológico), que são selecionados com base no modo e na via de administração e na prática farmacêutica padrão. Um técnico no assunto pode facilmente formular uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais ácido(s) nucleico(s), construção(ões) de ddRNAi, construção de DNA ou vetor(es) de expressão da divulgação. Em alguns casos, uma formulação isotônica é usada. Geralmente, os aditivos para isotonicidade podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose. Em alguns casos, soluções isotônicas, como solução tampão fosfato salino, são preferenciais. Os estabilizadores incluem gelatina e albumina. Em alguns exemplos, um agente de vasoconstrição é adicionado à formulação. As composições de acordo com a presente divulgação são fornecidas estéreis e apirogênicas. Os carreadores farmacêuticos adequados, bem como as necessidades farmacêuticas para uso em formulações farmacêuticas, são descritos em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (anteriormente Remington's Pharmaceutical Sciences), Mack Publishing Co., um texto de referência padrão neste campo, e na USP/NF.
[00398] O volume, a concentração e a formulação da composição farmacêutica, bem como o esquema de dosagem/administração, podem ser ajustados especificamente para maximizar a entrega celular ao mesmo tempo em que minimiza a toxicidade, como uma resposta inflamatória, por exemplo, volumes relativamente grandes (5, 10, 20, 50 mL ou mais) com baixas concentrações correspondentes de ingredientes ativos, bem como a inclusão de um composto anti-inflamatório, como um corticosteroide, podem ser utilizados se desejado.
[00399] As composições da divulgação podem ser formuladas para administração por qualquer via adequada (por exemplo, adequada para distribuição ao músculo faríngeo de um indivíduo). Por exemplo, as vias de administração incluem, mas não estão limitadas à intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intraocular e oral, bem como transdérmica ou por inalação ou supositório. Exemplos de vias de administração incluem a injeção intravenosa (IV), intramuscular (IM), oral,
intraperitoneal, intradérmica, intra-arterial e subcutânea.
Em um exemplo, a composição da divulgação é formulada para administração IM (por exemplo, formulada para administração ao músculo faríngeo). Em uma forma de realização preferencial, a administração é diretamente ao músculo faríngeo de um indivíduo.
Tais composições são úteis para aplicações farmacêuticas e podem ser prontamente formuladas em um veículo estéril, apirogênico adequado, por exemplo, solução tampão salina para injeção, para administração parenteral, por exemplo, IM (por exemplo, diretamente no músculo faríngeo), por via intravenosa (incluindo infusão intravenosa), SC e para administração intraperitoneal.
Em uma forma de realização preferencial, a via de administração, tal como IM (por exemplo, diretamente ao músculo faríngeo) atinge a entrega eficaz ao tecido muscular e transfecção das construções de ddRNAi e/ou ácidos nucleicos códon-otimizados que codificam a PABPN1 da divulgação e expressão de RNA e/ou o ácido nucleico códon-otimizado nas mesmas.
TABELA 1 - Regiões Alvo em PABPN1 ID da Região Sequência da Região (5’ – 3’) SEQ ID NO: Região 2 GAGAAGCAGAUGAAUAUGAGUCCACCUC SEQ ID NO: 1 Região 3 GAACGAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUG SEQ ID NO: 2 Região 4 GAAGCUGAGAAGCUAAAGGAGCUACAGA SEQ ID NO: 3 Região 5 GGGCUAGAGCGACAUCAUGGUAUUCCCC SEQ ID NO: 4 Região 6 CUGUGUGACAAAUUUAGUGGCCAUCCCA SEQ ID NO: 5 Região 7 GACUAUGGUGCAACAGCAGAAGAGCUGG SEQ ID NO: 6 Região 9 CGAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUGAGU SEQ ID NO: 7 Região 11 CAGUGGUUUUAACAGCAGGCCCCGGGGU SEQ ID NO: 8 Região 13 AGAGCGACAUCAUGGUAUUCCCCUUACU SEQ ID NO: 9 Região 14 GGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUGAGUCCA SEQ ID NO: 10 Região 15 AUUGAGGAGAAGAUGGAGGCUGAUGCCC SEQ ID NO: 11 Região 16 GGAGGAAGAAGCUGAGAAGCUAAAGGAG SEQ ID NO: 12 Região 17 AACGAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUGA SEQ ID NO: 13
TABELA 2 - Sequências Efetoras e Complementares Efetoras de shmiR ID de Sequência Complementar Efetora SEQ ID SEQ ID Sequência Efetora (5’ – 3’) shmiR (5’ – 3’) NO: NO:
AGCAGAUGAAUAUGAGUCCA SEQ ID UGGACUCAUAUUCAUCUGCUU SEQ ID shmiR2 NO: 14 NO: 15
GAGGUAGAGAAGCAGAUGAA SEQ ID UUCAUCUGCUUCUCUACCUCG SEQ ID shmiR3 NO: 16 NO: 17
CUGAGAAGCUAAAGGAGCUA SEQ ID UAGCUCCUUUAGCUUCUCAGC SEQ ID shmiR4 NO: 18 NO: 19
UAGAGCGACAUCAUGGUAUU SEQ ID AAUACCAUGAUGUCGCUCUAG SEQ ID shmiR5 NO: 20 NO: 21
GUGACAAAUUUAGUGGCCAU SEQ ID AUGGCCACUAAAUUUGUCACA SEQ ID shmiR6 NO: 22 NO: 23
AUGGUGCAACAGCAGAAGAG SEQ ID CUCUUCUGCUGUUGCACCAUA SEQ ID shmiR7 NO: 24 NO: 25
GUAGAGAAGCAGAUGAAUAU SEQ ID AUAUUCAUCUGCUUCUCUACC SEQ ID shmiR9 NO: 26 NO: 27
GGUUUUAACAGCAGGCCCCG SEQ ID CGGGGCCUGCUGUUAAAACCA SEQ ID shmiR11 NO: 28 NO: 29
CGACAUCAUGGUAUUCCCCU SEQ ID AGGGGAAUACCAUGAUGUCGC SEQ ID shmiR13 NO: 30 NO: 31
GAGAAGCAGAUGAAUAUGAG SEQ ID CUCAUAUUCAUCUGCUUCUCU SEQ ID shmiR14 NO: 32 NO: 33
AGGAGAAGAUGGAGGCUGAU SEQ ID AUCAGCCUCCAUCUUCUCCUC SEQ ID shmiR15 NO: 34 NO: 35
GAAGAAGCUGAGAAGCUAAA SEQ ID UUUAGCUUCUCAGCUUCUUCC SEQ ID shmiR16 NO: 36 NO: 37
AGGUAGAGAAGCAGAUGAAU SEQ ID AUUCAUCUGCUUCUCUACCUC SEQ ID shmiR17 NO: 38 NO: 39 TABELA 3 - Sequências de shmiR ID de Sequências de shmiR (5’ – 3’) SEQ ID NO: shmiR
GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGUAGCAGAUGAAUAUGAGUCCAACUG shmiR2 UGAAGCAGAUGGGUUGGACUCAUAUUCAUCUGCUUCGCCUACUGCCUCGG SEQ ID NO: 43
ACUUCAA
GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAGAGGUAGAGAAGCAGAUGAAACUG shmiR3 UGAAGCAGAUGGGUUUCAUCUGCUUCUCUACCUCGCGCCUACUGCCUCGG SEQ ID NO: 44
ACUUCAA
GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGACUGAGAAGCUAAAGGAGCUAACUG shmiR4 UGAAGCAGAUGGGUUAGCUCCUUUAGCUUCUCAGCCGCCUACUGCCUCGG SEQ ID NO: 45
ACUUCAA
GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAUAGAGCGACAUCAUGGUAUUACUG shmiR5 UGAAGCAGAUGGGUAAUACCAUGAUGUCGCUCUAGCGCCUACUGCCUCGG SEQ ID NO: 46
ACUUCAA
GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAGUGACAAAUUUAGUGGCCAUACUG shmiR6 UGAAGCAGAUGGGUAUGGCCACUAAAUUUGUCACACGCCUACUGCCUCGG SEQ ID NO: 47
ACUUCAA
GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAAUGGUGCAACAGCAGAAGAGACUG shmiR7 UGAAGCAGAUGGGUCUCUUCUGCUGUUGCACCAUACGCCUACUGCCUCGG SEQ ID NO: 48
ACUUCAA
GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAGUAGAGAAGCAGAUGAAUAUACUG shmiR9 UGAAGCAGAUGGGUAUAUUCAUCUGCUUCUCUACCCGCCUACUGCCUCGG SEQ ID NO: 49
ACUUCAA
GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAGGUUUUAACAGCAGGCCCCGACUG shmiR11 UGAAGCAGAUGGGUCGGGGCCUGCUGUUAAAACCACGCCUACUGCCUCGG SEQ ID NO: 50
ACUUCAA
GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGACGACAUCAUGGUAUUCCCCUACUG shmiR13 UGAAGCAGAUGGGUAGGGGAAUACCAUGAUGUCGCCGCCUACUGCCUCGG SEQ ID NO: 51
ACUUCAA
ID de Sequências de shmiR (5’ – 3’) SEQ ID NO: shmiR
GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGUGAGAAGCAGAUGAAUAUGAGACUG shmiR14 UGAAGCAGAUGGGUCUCAUAUUCAUCUGCUUCUCUCGCCUACUGCCUCGG SEQ ID NO: 52
ACUUCAA
GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAAGGAGAAGAUGGAGGCUGAUACUG shmiR15 UGAAGCAGAUGGGUAUCAGCCUCCAUCUUCUCCUCCGCCUACUGCCUCGG SEQ ID NO: 53
ACUUCAA
GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAGAAGAAGCUGAGAAGCUAAAACUG shmiR16 UGAAGCAGAUGGGUUUUAGCUUCUCAGCUUCUUCCCGCCUACUGCCUCGG SEQ ID NO: 54
ACUUCAA
GGUAUAUUGCUGUUGACAGUGAGCGAAGGUAGAGAAGCAGAUGAAUACUG shmiR17 UGAAGCAGAUGGGUAUUCAUCUGCUUCUCUACCUCCGCCUACUGCCUCGG SEQ ID NO: 55
ACUUCAA TABELA 4 - Cassetes de Codificação de shmiR ID de Cassetes de Codificação de shmiR (5’ – 3’) SEQ ID NO: shmiR
GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGTAGCAGATGAATATGAGTCCAACTGTGA shmiR2 AGCAGATGGGTTGGACTCATATTCATCTGCTTCGCCTACTGCCTCGGACTTCA SEQ ID NO: 56
A
GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAGAGGTAGAGAAGCAGATGAAACTGTG shmiR3 AAGCAGATGGGTTTCATCTGCTTCTCTACCTCGCGCCTACTGCCTCGGACTTC SEQ ID NO: 57
AA
GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACTGAGAAGCTAAAGGAGCTAACTGTG shmiR4 AAGCAGATGGGTTAGCTCCTTTAGCTTCTCAGCCGCCTACTGCCTCGGACTT SEQ ID NO: 58
CAA
GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGATAGAGCGACATCATGGTATTACTGTGA shmiR5 AGCAGATGGGTAATACCATGATGTCGCTCTAGCGCCTACTGCCTCGGACTTC SEQ ID NO: 59
AA
GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAGTGACAAATTTAGTGGCCATACTGTGA shmiR6 AGCAGATGGGTATGGCCACTAAATTTGTCACACGCCTACTGCCTCGGACTTC SEQ ID NO: 60
AA
GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAATGGTGCAACAGCAGAAGAGACTGTG shmiR7 AAGCAGATGGGTCTCTTCTGCTGTTGCACCATACGCCTACTGCCTCGGACTT SEQ ID NO: 61
CAA
GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAGTAGAGAAGCAGATGAATATACTGTGA shmiR9 AGCAGATGGGTATATTCATCTGCTTCTCTACCCGCCTACTGCCTCGGACTTCA SEQ ID NO: 62
A
GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAGGTTTTAACAGCAGGCCCCGACTGTG shmiR11 AAGCAGATGGGTCGGGGCCTGCTGTTAAAACCACGCCTACTGCCTCGGACTT SEQ ID NO: 63
CAA
GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACGACATCATGGTATTCCCCTACTGTGA shmiR13 AGCAGATGGGTAGGGGAATACCATGATGTCGCCGCCTACTGCCTCGGACTTC SEQ ID NO: 64
AA
GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGTGAGAAGCAGATGAATATGAGACTGTG shmiR14 AAGCAGATGGGTCTCATATTCATCTGCTTCTCTCGCCTACTGCCTCGGACTTC SEQ ID NO: 65
AA
GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAAGGAGAAGATGGAGGCTGATACTGTG shmiR15 AAGCAGATGGGTATCAGCCTCCATCTTCTCCTCCGCCTACTGCCTCGGACTT SEQ ID NO: 66
CAA
GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAGAAGAAGCTGAGAAGCTAAAACTGTG shmiR16 AAGCAGATGGGTTTTAGCTTCTCAGCTTCTTCCCGCCTACTGCCTCGGACTTC SEQ ID NO: 67
AA
GGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAAGGTAGAGAAGCAGATGAATACTGTG shmiR17 AAGCAGATGGGTATTCATCTGCTTCTCTACCTCCGCCTACTGCCTCGGACTTC SEQ ID NO: 68
AA
Exemplo 1 - Desenho de shmiRs direcionados a PABPN1
[00400] Sequências que representam alvos potenciais para o desenho das construções de siRNA foram identificadas a partir da sequência de RNAm de PABPN1 por meio de algoritmos de desenho de siRNA disponíveis publicamente (incluindo Ambion, Promega, Invitrogen, Origene e MWG): as sequências selecionadas eram conservadas em humanos, espécies de primatas não- humanos, bovinos e camundongos. As sequências que codificam os siRNAs candidatos foram incorporadas em um arcabouço de pré-miR30a a fim de criar uma sequência que codifica um microRNA curto em grampo (shmiR) compreendendo uma região flanqueadora 5' (SEQ ID NO: 41), uma sequência da fita senso de siRNA (sequência complementar efetora), uma sequência de junção haste/alça (SEQ ID NO: 40), uma fita antissenso de siRNA (sequência efetora) e uma região flanqueadora 3' (SEQ ID NO: 42). A estrutura secundária prevista de um shmiR representativo é mostrada na Figura 1C. As regiões alvo do transcrito de RNAm de PABPN1 para os shmiRs desenhados são apresentadas na Tabela 1 e as sequências efetoras de shmiR correspondentes (fita antissenso) são apresentadas na Tabela 2. Exemplo 2 - Geração de uma única "construção de silenciamento e substituição" para o silenciamento gênico simultâneo de PABPN1 endógena e substituição por PABPN1 códon-otimizada.
[00401] Criou-se um plasmídeo de vírus adenoassociado tipo 2 de fita simples que expressa shmiR17 e shmiR13 (por exemplo, conforme descrito nas Tabelas 3 e 4) em combinação com a sequência optPABPN1.
[00402] A construção de silenciamento e substituição (doravante "construção SR") foi gerada pela subclonagem das sequências de DNA que codificam shmiR17 e shmiR13 (conforme descrito na Tabela 4) na região 3' não traduzida do transcrito optPABPN1 na estrutura principal do vetor pAAV2 (plasmídeo viral pAAV-shmiR). A expressão de optPABPN1 e dos dois shmiRs em um único transcrito é direcionada pelo promotor específico de músculo Spc512. Um esquema da construção SR é apresentado na Figura 1(A), Figura 1(B) e Figura
2.
[00403] Estoques de vetores AAV pseudotipados recombinantes foram então gerados. Resumidamente, as células HEK293T foram cultivadas em fábricas de células, em meio Eagle modificado por Dulbecco, suplementado com 10% de SFB, e incubadas a 37°C e 5% de CO2. O plasmídeo viral pAAV-shmiR (a construção SR) e um plasmídeo pAAVhelper e pAAVrepcap8 ou pAAVhelper e plasmídeo pAAVrepcap9 ou pAAVhelper e pAAVRH74 (como descrito no documento WO2013123503A1) foram complexados com Fosfato de Cálcio de acordo com as instruções do fabricante. As transfecções triplas foram então realizadas com o plasmídeo pAAV-shmiR (a construção SR) em combinação com o pAAVhelper e um dos seguintes capsídeos; pAAVrepcap8, pAAVrepcap9 ou pAAVRH74, nas células HEK293T. As células HEK293T foram então cultivadas por um período de 72 horas a 37°C e 5% de CO2, e após esse período, as células foram lisadas e as partículas que expressam a construção SR foram purificadas por ultracentrifugação com gradiente escalonado de iodixanol (Sigma-Aldrich) seguida por ultracentrifugação com cloreto de césio. O número de genomas de vetores foi quantificado pela reação quantitativa em cadeia da polimerase (Q-PCR). Exemplo 3 - Estudos in vivo com uma abordagem de vetor único “de silenciamento e substituição”.
[00404] A fim de testar a eficácia in vivo da construção SR descrita no Exemplo 2 em um modelo de doença relevante de OPMD, a construção SR foi administrada individualmente, em uma faixa de doses, por meio de injeção intramuscular no músculo tibial anterior (TA) de camundongos A17 com 10-12 semanas de idade. As doses foram estabelecidas em 7,5x10 11, 2,5x1011, 5x1010, 1x1010, 2x109 e 4x108 genomas de vetor (vg) por músculo. Camundongos A17 de mesma idade injetados com solução salina serviram como o grupo não tratado. Os camundongos foram sacrificados 14 ou 20 semanas após o tratamento.
Exemplo 4 - Medições quantitativas de produção de shmiR, silenciamento de PABPN1 e expressão de PABPN1 códon-otimizada em camundongos A17 tratados com a construção SR.
[00405] Quatorze semanas após o tratamento com a construção SR, os músculos TA dos camundongos A17 do Exemplo 3 foram coletados e o RNA, extraído. A expressão dependente da construção SR de shmiRs em músculos TA foi quantificada (Figura 3A). O nível de expressão quantificado de shmiRs foi dependente da dose da construção SR, assim como o silenciamento de PABPN1 (incluindo expPABPN1) (Figura 3B) e restauração dos níveis normais de PABPN1 (Figura 3C). Exemplo 5 - Redução das inclusões intranucleares (INIs) em camundongos A17 tratados com a construção SR.
[00406] O impacto da construção SR na persistência de inclusões intranucleares (INIs) foi testado na semana 14 em camundongos A17 do Exemplo 3. Os camundongos FvB do tipo selvagem também foram incluídos como comparadores saudáveis. Quatorze semanas após a injeção de AAV, os músculos foram coletados e montados para estudos histológicos. As seções foram pré-tratadas com KCl a 1M para eluir preferencialmente toda a PABPN1 solúvel do tecido. Imunofluorescência para PABPN1 (verde) e laminina (vermelho), uma proteína abundante na matriz extracelular de células musculares, foi detectada em seções de músculos tratados e mostrou uma redução significativa no número de inclusões intranucleares PABPN1-positivas (INIs) em músculos tratados com a construção SR com um efeito de dose (Figura 4A). A quantificação da porcentagem de núcleos contendo INIs em seções musculares indica que o tratamento com a construção SR reduz significativamente a quantidade de INIs em comparação com músculos A17 não tratados (teste One-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni, *** p <0,001, ns: não significativo) (Figura 4B). Exemplo 6 - Tratamento com a construção SR melhora as propriedades fisiológicas e a funcionalidade dos músculos tratados.
[00407] As propriedades fisiológicas e a funcionalidade dos músculos tratados foram medidas na semana 14 em camundongos A17 do Exemplo 3. Os camundongos FvB do tipo selvagem também foram incluídos como comparadores saudáveis. A força máxima gerada pelos músculos TA foi medida pela fisiologia muscular in situ (Figura 5A). A construção SR aumentou significativamente a força máxima gerada pelos músculos TA de uma maneira dependente da dose. O peso muscular normalizado pelo peso corporal (PC) também foi medido 14 semanas após a administração da construção SR (Figura 5B). O peso muscular normalizado pelo peso corporal dos músculos tratados com SR foi comparável ao do camundongo controle FvB em doses acima de 1e10 vg por TA injetado (média ± SEM n = 10, teste One-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni, * p < 0,05, *** p <0,001, ** p <0,01, ns: não significativo). Exemplo 7 - Restauração da função muscular ao longo do tempo
[00408] A força máxima gerada pelos músculos TA de camundongos A17 tratados com a construção SR e camundongos do tipo selvagem FvB foi medida pela fisiologia muscular in situ em 14 semanas após a administração da construção SR (Figura 6A) e 20 semanas após a administração da construção SR (Figura 6B). Para doses intermediárias (1e10 vg e 6e10 vg por TA), o efeito benéfico na força muscular foi muito mais pronunciado em 20 semanas em comparação com 14 semanas após a injeção (média ± SEM n = 10, teste One- way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni, *** p <0,001, ** p <0,01). Exemplo 8 - Administração direta ao músculo faríngeo de ovelha
[00409] A injeção direta da construção SR nos músculos faríngeos de ovelhas foi testada. PABPN1 é altamente conservada de ovelha para humanos, incluindo todos, exceto um resíduo de aminoácido na posição 95.
[00410] A construção SR foi injetada diretamente nos músculos faríngeos de ovelhas (Figura 7A). Dois animais no estudo com ovelhas foram injetados cada um com 1,5e13 vg de construção SR no músculo cricofaríngeo (CP) e um 1,0e13 vg SR-construção adicional nos músculos faríngeos (faringe). Os 10 animais restantes tratados com a construção SR (1,0e10 vg a 1,0e13 vg) receberam apenas injeções no CP. O CP foi injetado com volume total de 1,5 mL (3 injeções de 0,5 mL cada). Injetou-se um volume total de 6 mL na faringe (2 injeções de 1,5 mL à direita e à esquerda).
[00411] A radioimagem usando um creme radiomarcado ilustra a disfagia grave em pateintes humanos de OPMD com riscos de "fausse route" (Figura 7B).
[00412] Os técnicos no assunto considerarão que numerosas variações e/ou modificações podem ser realizadas nas formas de realização descritas acima, sem se afastar do amplo escopo geral da presente divulgação. As presentes formas de realização devem, portanto, ser consideradas em todos os aspectos como ilustrativas e não restritivas.

Claims (35)

Reivindicações
1. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO QUE SOFRE DE DISTROFIA MUSCULAR OCULOFARÍNGEA (OPMD), caracterizado por compreender administrar, ao referido indivíduo, uma COMPOSIÇÃO que compreende: (a) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de DNA que codifica um microRNA curto em grampo (shmiR); e (b) uma construção de PABPN1 compreendendo uma sequência de DNA que codifica uma proteína PABPN1 funcional tendo um transcrito de RNAm que não é alvo do(s) shmiR(s) codificado(s) pelo ácido nucleico; em que a composição é administrada pela injeção direta em um músculo faríngeo do indivíduo.
2. MÉTODO PARA INIBIÇÃO DA EXPRESSÃO DE UMA PROTEÍNA PABPN1, que é a causadora da distrofia muscular oculofaríngea (OPMD) em um indivíduo, o referido método caracterizado por compreender administrar, ao referido indivíduo, uma COMPOSIÇÃO que compreende: (a) uma construção de ddRNAi compreendendo um ácido nucleico que compreende uma sequência de DNA que codifica um microRNA curto em grampo (shmiR); e (b) uma construção de PABPN1 compreendendo uma sequência de DNA que codifica uma proteína PABPN1 funcional tendo um transcrito de RNAm que não é alvo do(s) shmiR(s) codificado(s) pela construção de ddRNAi; em que a composição é administrada por injeção direta em um músculo faríngeo do indivíduo.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo indivíduo ter melhorado a deglutição após a administração da composição por injeção direta em um músculo faríngeo do indivíduo.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela composição compreender um vetor de expressão compreendendo a construção de ddRNAi, a construção de PABPN1 ou uma combinação das mesmas.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo vetor de expressão compreender, na direção 5' a 3', a construção de ddRNAi e a construção de PABPN1.
6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo vetor de expressão compreender, na direção 5’ a 3’, a construção de PABPN1 e a construção de ddRNAi.
7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo vetor de expressão ser um plasmídeo ou minicírculo.
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo vetor de expressão ser um vetor viral selecionado do grupo que consiste em um vetor viral adenoassociado (AAV), um vetor retroviral, um vetor adenoviral (AdV) e um vetor lentiviral (LV).
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado por o ácido nucleico, a construção de ddRNAi e/ou a construção de PABPN1 estar/estarem compreendidos dentro de uma construção de expressão e a construção de expressão compreender repetições terminais invertidas (ITRs) de um sorotipo de AAV.
10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizado pelo sorotipo de AAV ser AAV2, AAV8 ou AAV9.
11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pela sequência de DNA que codifica a proteína PABPN1 funcional ser códon-otimizada, de modo que seu transcrito de RNAm não seja alvo dos shmiRs da construção de ddRNAi.
12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pela sequência de DNA que codifica a proteína PABPN1 funcional ser apresentada na SEQ ID NO: 73.
13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pela sequência de DNA que codifica a proteína PABPN1 funcional estar operacionalmente ligada a um promotor compreendido na construção de PABPN1 e posicionado a montante da sequência de DNA que codifica a proteína PABPN1 funcional.
14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo promotor compreendido na construção de PABPN1 ser um promotor específico de músculo.
15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo shmiR compreender: uma sequência efetora de pelo menos 17 nucleotídeos de comprimento; uma sequência complementar efetora; uma sequência em haste-alça; e estrutura principal de microRNA primário (pri-miRNA); em que a sequência efetora é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA de PABPN1 humana.
16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo shmiR compreender uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente dentro da sequência de RNA apresentada na SEQ ID NO: 87.
17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo shmiR compreender uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-13.
18. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo shmiR ser selecionado do grupo que consiste em: um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 14; um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 17 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 16; um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 19 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 18;
um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 21 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 20; um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 23 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 22; um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 25 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 24; um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 27 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 26; um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 29 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 28; um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 30; um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 33 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 32; um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 35 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 34; um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 37 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 36; e um shmiR compreendendo uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 39 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 38.
19. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo shmiR compreender, na direção 5' a 3': uma sequência flanqueadora 5' da estrutura principal do pri-miRNA; a sequência complementar efetora; a sequência em haste-alça; a sequência efetora; e uma sequência flanqueadora 3' da estrutura principal do pri-miRNA.
20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pela sequência em haste-alça ser a sequência apresentada na SEQ ID NO: 40.
21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pela estrutura principal do pri-miRNA ser uma estrutura principal de pri-miR-30a.
22. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pela sequência flanqueadora 5’ da estrutura principal do pri- miRNA ser apresentada na SEQ ID NO: 41 e a sequência flanqueadora 3' da estrutura principal do pri-miRNA ser apresentada na SEQ ID NO: 42.
23. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo shmiR compreender uma sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 43-55.
24. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pela sequência de DNA que codifica o shmiR ser apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 56-68.
25. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado por compreender administrar pelo menos dois ácidos nucleicos que codificam shmiRs ou administrar uma construção de ddRNAi compreendendo os pelo menos dois ácidos nucleicos, em que cada shmiR compreende uma sequência efetora que é substancialmente complementar a um transcrito de RNA correspondente a uma proteína PABPN1, que é a causadora da OPMD, e em que cada shmiR compreende uma sequência efetora diferente.
26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por cada um dos pelo menos dois ácidos nucleicos codificar um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado em uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 7, 9, 10 e 13.
27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por os pelo menos dois ácidos nucleicos serem selecionados do grupo que consiste em: um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 15 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 14 (shmiR2);
um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 17 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 16 (shmiR3); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 21 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 20 (shmiR5); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 27 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 26 (shmiR9); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 30 (shmiR13); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 33 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 32 (shmiR14); e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 39 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 38 (shmiR17).
28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por os pelo menos dois ácidos nucleicos serem selecionados do grupo que consiste em: um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 56 (shmiR2); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 (shmiR3);
um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 59 (shmiR5); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 62 (shmiR9); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 (shmiR14); e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17).
29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por cada um dos pelo menos dois ácidos nucleicos codificar um shmiR compreendendo uma sequência efetora que é substancialmente complementar a uma região de comprimento correspondente em um transcrito de RNA apresentado em uma das SEQ ID NOs: 2, 9, 10 e 13.
30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por os pelo menos dois ácidos nucleicos serem selecionados do grupo que consiste em: um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 17 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 16 (shmiR3); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 30 (shmiR13); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 33 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 32 (shmiR14); e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 39 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 38 (shmiR17).
31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por os pelo menos dois ácidos nucleicos serem selecionados do grupo que consiste em: um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 57 (shmiR3); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13); um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 65 (shmiR14); e um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17).
32. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pela referida construção de ddRNAi compreender: (a) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 31 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 30 (shmiR13); e (b) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo em uma sequência de DNA que codifica um shmiR que compreende uma sequência efetora apresentada na SEQ ID NO: 39 e uma sequência complementar efetora apresentada na SEQ ID NO: 38 (shmiR17).
33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pela referida construção de ddRNAi compreender: (a) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo na sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 64 (shmiR13); e (b) um ácido nucleico compreendendo ou consistindo na sequência de DNA apresentada na SEQ ID NO: 68 (shmiR17).
34. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado pela composição compreender ainda um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis.
35. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pelo músculo faríngeo compreender um ou mais de um músculo constritor inferior, um músculo constritor médio, um músculo constritor superior, um músculo palatofaríngeo, um músculo salpingofaríngeo, um músculo estilofaríngeo ou qualquer combinação dos mesmos.
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