BR112021005464A2 - inibição de il-10 para vacinas e imunoterapia - Google Patents
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Abstract
INBIÇÃO DE IL-10 PARA VACINAS E
IMUNOTERAPIA. A presente invenção refere-se a métodos para indução de
uma resposta imune contra um antígeno em um indivíduo. Em algumas
modalidades, os métodos compreendem a administração de uma quantidade
terapeuticamente eficaz de uma vacina e um inibidor de interleucina 10
(IL-10) ao indivíduo. Em algumas modalidades, a vacina é uma vacina
deficiente de IL-10.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INIBI- ÇÃO DE IL-10 PARA VACINAS E IMUNOTERAPIA".
[0001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório de Patente U.S. No. 62/764.848, arquivado em 15 de agosto de 2018, e para o Pedido Provisório de Patente U.S. No. 62/845.671, arquivado em 9 de maio de 2019, cujas divulgações são por este incorporadas por meio de referência em sua totalidade para todos os fins.
[0002] Esta invenção foi produzida com suporte Governamental segundo a Concessão No. Al118451, concedido pelo National Institu- tes of Health (NIH). O Governo tem certos direitos na invenção.
[0003] Vacinas com vetor de Rhesus cytomegalovirus (RRCMV) foram desenhadas para explorar uma janela putativa de vulnerabilida- de em infecção por HIV/SIV inicial com base em sua capacidade para provocar e manter alta a frequência de células T, diferenciadas por efetor, amplamente direcionadas e específicas contra o vírus em sítios potenciais de replicação viral inicial. As vacinas de primeira geração de RhCMV/SIV protegem -50% dos macacos vacinados. Enquanto uma vacina contra o HIV com 50% de eficácia seria benéfica, um objetivo central no campo deve ser aprimorar este número, produzindo benefí- cio para a saúde humana adicional e potencialmente permitindo a er- radicação do HIV. Portanto, existe uma necessidade de vacinas apri- moradas, tais como vacinas contra o HIV, e métodos para aumentar a eficácia da vacina. Na verdade, muitas candidatas a vacina para pro- teção contra doenças infecciosas ou câncer não induzem respostas imunes suficientemente robustas, ou não induzem respostas imunes rápido o suficiente para proteção contra a condição alvo. Em alguns casos este problema é devido ao funcionamento de mecanismos imu- nológicos regulatórios tais como a produção de IL-10 pelo hospedeiro ou por um vírus tal como citomegalovírus, o qual codifica uma proteína I1L-10 viral. A presente invenção aborda esta necessidade, e também proporciona vantagens relacionadas.
[0004] Em um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um método para indução de uma resposta imune contra um antígeno em um indivíduo. Em algumas modalidades, o método compreende a administração, ao indivíduo, de uma quantidade terapeuticamente efi- caz de um inibidor de interleucina 10 (IL-10) e uma vacina. Em algu- mas modalidades, I1L-10 viral e/ou celular são inibidas. Em modalida- des particulares, são inibidas tanto I1L-10 viral quanto celular. Em al- gumas modalidades, é inibida a proteína STAT3 transdutora de sinali- zação de receptores de IL-10. Em modalidades particulares, é inibida substancialmente toda a sinalização de STAT3 a jusante do receptor de IL-10.
[0005] Em algumas modalidades, o inibidor de I1L-10 compreende uma proteína, uma sequência de ácido nucleico codificando uma pro- teína, uma molécula pequena, ou uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a proteína compreende um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-IL-10, um anticorpo anti-|IL10R, um anti- corpo anti-CD20, ou uma combinação dos mesmos). Em algumas mo- dalidades, o anticorpo é 1F11IRILALA anti-IL-10, rituximab, ou uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a proteína com- preende uma proteína de fusão Fc-IL-10R (por exemplo, Fc-IL-10R1). Em algumas modalidades, a proteína de fusão tem uma alta afinidade de ligação (por exemplo, mais forte do que cerca de 10º M, 107 M, 10º 8 M, 10º M) por IL-10. Em algumas modalidades, a proteína de fusão inibe IL-10 do hospedeiro e/ou viral. Em algumas modalidades, a pro- teína de fusão inibe a ligação de todas as proteínas a IL-10R (por exemplo, IL-10R1). Em algumas modalidades, a proteína de fusão ini- be a sinalização de receptores de IL-10.
[0006] Em algumas modalidades, a proteína compreende uma porção de uma proteína IL-10 que compreende uma ou mais mutações que aumentam a afinidade da porção da proteína IL-10 por um recep- tor de IL-10. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico codifica uma proteína a qual compreende uma porção de uma proteína IL-10 que compreende uma ou mais mutações que aumentam a afini- dade da porção da proteína IL-10 por um receptor de IL-10. Em algu- mas modalidades, a proteína compreende uma proteína receptora de IL-10 truncada. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nu- cleico codifica uma proteína a qual compreende uma proteína recepto- ra de I1L-10 truncada. Em alguns casos, a proteína receptora de IL-10 truncada compreende a sequência de aminoácidos estipulada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 5 A 6. Em algumas modalidades, a proteína compreende uma proteína truncada tendo atividade seme- lhante a 11-10. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nuclei- co codifica uma proteína a qual compreende uma proteína truncada tendo atividade semelhante a I1L-10. Em alguns casos, a proteína trun- cada tendo atividade semelhante a IL-10 compreende a sequência de aminoácidos estipulada em SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a proteína compreende uma proteína STAT3 dominante-negativa. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico codifica uma proteína a qual compreende uma proteína STAT3 dominante-negativa. Em alguns casos, a proteína STAT3 dominante-negativa compreende a sequência de aminoácidos estipulada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 8 A 10. Em algumas modalidades, a molécula pequena compre- ende AS-101.
[0007] Em algumas modalidades, a vacina compreende um poli- nucleotídeo recombinante o qual compreende um genoma de adenoví- rus, ou uma porção do mesmo, e uma sequência de ácido nucleico codificando o antígeno. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo recombinante adicionalmente compreende uma sequência de ácido nucleico codificando o inibidor de IL-10.
[0008] Em algumas modalidades, a vacina compreende um poli- nucleotídeo recombinante o qual compreende um genoma de citome- galovírus (CMV), ou uma porção do mesmo, e uma sequência de áci- do nucleico codificando o antígeno.
[0009] Em algumas modalidades, a vacina é uma vacina deficiente de IL-10. Em algumas modalidades, a vacina deficiente de IL-10 com- preende um polinucleotídeo recombinante o qual compreende um ge- noma de citomegalovírus (CMV), ou uma porção do mesmo, e uma sequência de ácido nucleico codificando o antígeno, em que o genoma de CMV ou porção do mesmo compreende uma ou mais mutações imunomoduladoras, em que a uma ou mais mutações imunomodulado- ras compreendem uma mutação dentro de uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína que tem atividade semelhante a in- terleucina-10 de CMV (IL-10 de CMV). Em algumas modalidades, a uma ou mais mutações imunomoduladoras estão localizadas em uma região regulatória e/ou uma região codificante de proteína da sequên- cia de ácido nucleico codificando a proteína que tem atividade seme- lhante a I1L-10 de CMV. O CMV pode ser, por exemplo, um CMV que pode infectar células humanas, de primata não humano, ou de camun- dongo.
[0010] Em algumas modalidades, a proteína que tem atividade semelhante a IL-10 de CMV é IL-10 do CMV humano (HCMVIL-10) ou IL-10 de CMV de macacos rhesus (RRCMVIL-10). Em algumas moda- lidades, a sequência de nucleotídeos codificando o antígeno está loca-
lizada dentro do genoma de CMV ou uma porção do mesmo. Em al- gumas modalidades, o antígeno é um antígeno não de CMV.
[0011] Em algumas modalidades, a uma ou mais mutações imu- nomoduladoras compreendem uma substituição, uma deleção, e/ou uma inserção de um ou mais nucleotídeos. Em algumas modalidades, a mutação dentro da sequência de ácido nucleico codificando a proteí- na que tem atividade semelhante a IL-10 de CMV compreende uma deleção dentro dos primeiros dois éxons da sequência de ácido nu- cleico codificando a proteína que tem atividade semelhante a I1L-10 de CMV. Em algumas modalidades, a mutação dentro da sequência de ácido nucleico codificando a proteína que tem atividade semelhante a IL-10 de CMV reduz ou inativa a atividade da proteína tendo atividade semelhante a I1L-10 de CMV. Em algumas modalidades, a uma ou mais mutações imunomoduladoras adicionalmente compreendem uma inserção de uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteí- na imunoestimuladora. Em algumas modalidades, a proteína imunoes- timuladora é uma citocina (por exemplo, IL-12, IL-15, ou uma combi- nação das mesmas).
[0012] Em algumas modalidades, o CMV é um CMV capaz de in- fectar células de macaco rhesus e a uma ou mais mutações imunomo- duladoras adicionalmente compreendem uma mutação dentro de uma região do genoma de CMV ou porção da mesma selecionada entre o grupo que consiste em Rh182, Rh183, Rh184, Rh185, Rh186, Rh187, Rh188, Rh189, e uma combinação das mesmas. Em algumas modali- dades, o CMV é um CMV capaz de infectar células humanas e a uma ou mais mutações imunomoduladoras adicionalmente compreendem uma mutação dentro de uma região do genoma de CMV ou porção da mesma selecionada entre o grupo que consiste em US2, US3, USA, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11, e uma combinação das mesmas.
[0013] Em algumas modalidades, a uma ou mais mutações imu- nomoduladoras adicionalmente compreendem uma mutação dentro de uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína que inibe a apresentação ao antígeno por uma molécula do complexo maior de histocompatibilidade (MHC). Em algumas modalidades, a uma ou mais mutações imunomoduladoras adicionalmente compreendem uma mu- tação que aumenta ou diminui a resposta da proteína desdobrada (UPR). Em algumas modalidades, a mutação que aumenta ou diminui a resposta da proteína desdobrada diminui ou aumenta a expressão de UL50 de Citomegalovírus humano, Rh81 de Rhesus cytomegalovi- rus, ou M50 de Citomegalovírus de camundongo.
[0014] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno de doença infecciosa (por exemplo, um antígeno bacteriano, viral, fúngi- co, de protozoário, e/ou helmíntico de doença infecciosa). Em algumas modalidades, o antígeno de doença infecciosa é um antígeno viral de doença infecciosa do vírus da imunodeficiência símia (SIV), do vírus da imunodeficiência humana (HIV), do vírus da hepatite C, do vírus herpes simplex, do vírus Epstein-Barr, ou uma combinação dos mes- mos. Em algumas modalidades, o antígeno de doença infecciosa compreende uma proteína do antígeno (gag) específico do grupo do HIV ou do SIV.
[0015] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno asso- ciado a tumor (por exemplo, antígeno específico da próstata, antígeno 4 associado ao melanoma (MAGEAA4), antígeno 10 associado ao me- lanoma (MAGEA10), NY-ESO-1, um neoantígeno, ou uma combinação dos mesmos).
[0016] Em algumas modalidades, o genoma de CMV ou porção do mesmo adicionalmente compreende uma mutação que aumenta o tro- pismo ou a seletividade para uma célula alvo. Em algumas modalida- des, a célula alvo é selecionada entre o grupo que consiste em uma célula de apresentação ao antígeno (por exemplo, uma célula dendríti- ca), uma célula tumoral, um fibroblasto, uma célula epitelial, uma célu- la endotelial, e uma combinação das mesmas. Em algumas modalida- des, a mutação que aumenta o tropismo ou a seletividade compreende uma mutação que modifica uma proteína, ou porção da mesma, que está posicionada no exterior do vírion de CMV. Em algumas modalida- des, a mutação que aumenta o tropismo ou a seletividade compreende uma inserção de uma sequência de nucleotídeos codificando um ligan- te de direcionamento celular. Em algumas modalidades, o ligante de direcionamento celular é selecionado entre o grupo que consiste em um fragmento de anticorpo que reconhece um antígeno de célula alvo, um ligante que é reconhecido por um receptor cognato de célula alvo, uma proteína do capsídeo viral que reconhece uma célula alvo, e uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, o ligante de dire- cionamento celular é CD154.
[0017] Em algumas modalidades, o CMV é um CMV capaz de in- fectar células de macaco rhesus e a mutação que aumenta o tropismo ou a seletividade compreende uma mutação dentro de um gene sele- cionado entre o grupo que consiste em Rh13.1, Rn61/Rh60, Rh157.4, Rh157.5, Rh157.6, e uma combinação dos mesmos. Em algumas mo- dalidades, o CMV é um CMV capaz de infectar células humanas e a mutação que aumenta o tropismo ou a seletividade compreende uma mutação dentro de um gene selecionado entre o grupo que consiste em RL13, UL36, UL130, UL128, UL131, e uma combinação dos mes- mos.
[0018] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo recombinante adicionalmente compreende uma sequência de ácido nucleico codifi- cando um marcador selecionável. Em algumas modalidades, a se- quência de ácido nucleico codificando o marcador selecionável está localizado dentro do genoma de CMV ou porção do mesmo. Em algu-
mas modalidades, a sequência de ácido nucleico codificando o marca- dor selecionável compreende uma sequência de ácido nucleico codifi- cando um gene de resistência a antibiótico e/ou uma proteína fluores- cente.
[0019] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo recombinante contém uma ou mais sequências regulatórias. Em algumas modalida- des, a uma ou mais sequências regulatórias controlam a expressão de: (i) um gene ou uma região dentro do genoma de CMV ou porção do mesmo, (ii) a sequência codificando antígeno, (ili) uma sequência codificando proteína imunoestimuladora, (iv) uma sequência codifican- do marcador selecionável, (v) uma variante das mesmas, ou (vi) uma combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências regulatórias compreendem um reforçador precoce de CMV, um promotor do gene de beta-actina de galinha, um primeiro éxon de um gene de beta-actina de galinha, um primeiro íntron de um gene de beta-actina de galinha, um aceitador de emenda de um gene de beta-globina de coelho, um promotor de EM7, um promotor de EF1a, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo recombinante adicionalmente compreende uma se- quência de ácido nucleico codificando o inibidor de IL-10. Em algumas modalidades, o inibidor de IL-10 compreende uma proteína codificada por uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, o inibidor de IL-10 é expresso por uma sequência de ácido nucleico de um vírus tal como um adenovírus).
[0020] Em algumas modalidades, o inibidor de I1L-10 é administra- do antes e/ou depois da vacina. Em algumas modalidades, o inibidor de I|L-10 e a vacina são administrados mais ou menos ao mesmo tem- po.
[0021] Em um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um método para prevenção ou tratamento de uma doença em um indi-
víduo, o método o qual compreende indução de uma resposta imune contra um antígeno no indivíduo de acordo com os métodos proporci- onados aqui, neste pedido de patente, (isto é, administração de um inibidor de IL-10 e de uma vacina ao indivíduo conforme descrito aqui, neste pedido de patente). Em algumas modalidades, a doença é uma doença infecciosa ou câncer.
[0022] Outros objectos, características, e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes para um perito na arte a partir da des- crição detalhada e das figuras que se seguem.
[0023] As FIGS. 1A a 1C mostra que as vacinas RHCMV/SIV tendo um gene de IL-10 viral intacto não são efetivas de maneira confiável em receptores wtRhCMV-soronegativos. A FIG. 1A mostra as cargas virais em 26 receptores de vacina wtRhCMV-soronegativos que de- monstram nenhum caso de rigoroso controle viral, isto é, controle até o ponto em que os genomas virais são consistentemente indetectáveis no sangue periférico (<30 cópias/mL). A FIG. 1B mostra um exemplo das células T Mamu-E-restritas observadas em receptores de vacina antes de estímulo com SIV, algumas vezes em alto nível. O citograma mostra células T que são responsivas ao "supertope" Gag69, o qual foi comprovado ser Mamu-E-restrito. A FIG. 1C mostra que a vacina RhCMV/SIVgag provoca respostas de anticorpos entre receptores wtRhCMV-soronegativos antes de estímulo co SIV. As FIGS. 1Be 1C demonstram que o regime de vacinação produziu respostas imunes, mas as cargas virais na FIG. 1C demonstram que estas respostas não foram protetoras contra altas cargas virais.
[0024] A FIG. 2 mostra que a vacina RICMVdIL10/gag protegeu 3/6 wWtRhoMV-seronegative infants. O estímulo foi baixa dose oral de SIVmac251, serial.
[0025] As FIGS. 3A a 3C mostram que macacos RhCMV-soro-
positivos produzem anticorpos de ligação a vIL-10 e neutralizantes, significando que os macacos referidos contêm um inibidor específico natural de IL-10 viral somente. A FIG. 3A mostra a presença universal de anticorpos de ligação. A FIG. 3B mostra que a atividade neutrali- zante de IL-10 viral é altamente variável. A ordenada mostra a percen- tagem de secreção de IL-12 restaurada em um bioensaio. A FIG. 3C mostra que os títulos de ligação e neutralização de I1L-10 viral estão correlacionados.
[0026] As FIGS. 4A a 4B mostram que as vacinas de RHCMV dele- tadas da IL-10 viral induzem respostas de células T equivalentes ou maiores do que as induzidas por vetores de primeira geração expres- sando IL-10 viral. A FIG. 4A mostra respostas de células T CD4+ a proteína 1 precoce imediata de RHOCMV (conjunto de peptídeos). To- das as respostas neste painel são respostas TNF-alfa. A FIG. 4B mos- tra que as respostas de células T CD4+ ao conjunto de peptídeos SIV Gag induzidas por RICMVdIL10/gag (rotulado "AIL-10") são superio- res às induzidas por RRCMV/gag (rotulado "1! G").
[0027] As FIGS. 5A a 5E mostram que RRNCMVAdlIL10 mas não ve- tores de primeira geração provocam regulação negativa de CD80 em receptores de vacina wtRhCMV-negativos. A FIG. 5A mostra a intensi- dade do imunofenótipo (listado ao longo da borda esquerda do mapa de calor) entre macacos wtRhCMV- (à esquerda) vs. wWtRhoMV+ (à direita). Notar a aumentada frequency of monócitos CD14+ e a reduzi- da expressão de CD80 em PBMCs de RhCMV+. A FIG. 5B mostra que a análise transcriptômica demonstra clara separação de céluas T, cé- luas NK, e APCs de macacos wtRhCMV- vs. wtRhoMV+. A FIG. 5C mostra que a regulação negativa de CD80 é evidente nos transcriptô- micos de macacos wtRhCMV+ (à direita). Esta regulação negativa es- pelha a "assinatura protetora" da vacinação com RROCMV/SIV. A FIG. 5D mostra que vetores de primeira geração não regulam negativamen-
te CD80 significativamente, quando administrados a receptores wtRhCMV-soronegativos. Vetores deficientes de IL-10 viral não reali- zam semelhante regulação negativa algumas vezes — e os macacos que manifestam regulação negativa são aqueles que foram protegidos contra SIV (FIG. 2). A FIG. 5E mostra que o nível absoluto de expres- são de CD80 (percentagem de monócitos CD80+) é baixo em estímulo de SIV, naqueles animais que acabaram por ser protegidos.
[0028] As FIGS. 6A a 6B mostram que a vacinação RHCMVAIL10 está associada com menor atividade de IL-10 do hospedeiro depois de 1a 2 semanas. A FIG. 6A mostra a atividade de IL-10, medida por su- pressão da secreção de IL-12 em um bioensaio, no sangue duas se- manas depois da vacinação primária com RHCMV/SIVgag de primeira geração (receptores CMV-soropositivos), RHCMV/SIVgag (receptores CMV-soronegativos), ou RICMV/dIL10/SIVgag deletada a I1L-10 viral. As vacinas de primeira geração carregando IL-10 viral provocam ativi- dade de IL-10 do hospedeiro mais geral em receptores wtRhCMV- soronegativos (coluna do meio). A atividade de IL-10 é expressa como secreção de IL-12 inversa em um bioensaio. Além disso, usando ma- cacos tratados com anticorpo neutralizante anti-|L10 ou com um ade- novírus expressando IL-10 do hospedeiro, foram identificados IP-10 como um correlato inverso significativo da atividade de IL-10, com me- nos IP-10 na presença de maior atividade de IL-10. A FIG. 6B mostra que a vacinação RNCMVdlIL10/SIVgag é acompanhada por maior |IP- circulante, sugerindo menos produção geral de IL-10.
[0029] A FIG. 7 mostra uma linha do tempo do Objetivo 1 no Exemplo 1.
[0030] A FIG. 8 mostra uma linha do tempo do Objetivo 2 no Exemplo 1.
[0031] A FIG. 9 mostra uma linha do tempo do Objetivo 3 no Exemplo 1.
[0032] A FIG. 10 mostra que animais vacinados recebendo anti- corpos neutralizantes contra I1L-10 têm atividade biológica de I1L-10 re- duzida no plasma. Uma função biológica conhecida da IL-10 é inibir a secreção de IL-12 e de outras citocinas. Portanto, IL-10 presente natu- ralmente em amostras de plasma de macaco pode ser supressiva da secreção de IL-12 que ocorre normalmente quando células do sangue periférico são incubadas com lipopolissacarídeo (LPS). Os traços infe- riores ilustram a reduzida indução de IL-12 na presença de plasma de macacos recebendo vacinação convencional, na ausência de anticor- po. Os traços superiores demonstram que os animais vacinados rece- bendo anti-IL-10 neutralizante não têm nenhuma atividade biológica de IL-10residual; na verdade, a adição de semelhantes amostras de plasma aumenta a secreção de IL-12, devido à presença contínua de anticorpos anti-IL-10 no plasma.
[0033] A FIG. 11 mostra respostas de células T CD4+ ao antígeno de vacina somente duas semanas depois da vacinação na presença de anticorpo neutralizante anti-IL-10. São mostradas a produção de interferon-gama (eixo y) e de TNF-alfa (eixo x) pelas PBMCs de ani- mais vacinados com inibição de IL-10, quando as células são estimu- ladas com peptídeos Gag (à direita) mas não quando deixadas sem estímulo (à esquerda).
[0034] A FIG. 12 mostra respostas de células T CD8+ baixas ou ausentes ao antígeno de vacina em oito semanas depois da vacinação na presença de anticorpo neutralizante anti-IL-10. São mostradas a produção de interferon-gama (eixo y) e de TNF-alfa (eixo x) pelas PBMCs de dois animais vacinados com inibição de IL-10, quando as células são deixadas sem estímulo (à esquerda), estimuladas com peptídeos Gag (meio), ou estimuladas com Gag69, um peptídeo da proteína Gag que se sabe que é apresentado na molécula classe |b, Mamu-E. Os dados mostram respostas robustas entre células T CD4+
(0,01% ou 0,09% das células produzindo citocinas, à esquerda), mas poucas respostas ou nenhuma resposta entre células T CD8+ (0% ou 0,004%, à direita). Respostas ao supertope Gag69 (Mamu-E restrito; vistas como pontos mais distantes da origem na linha 2, coluna 3) são observadas entre células T CD4+ do Animal 2 mas não em células T CDB8+ ou células do Animal 1.
[0035] A FIG. 13 demonstra um ambiente de citocina alterado de- pois da vacinação na presença de inibidor de IL-10. Ambos os grupos de animais nesta figura foram vacinados com um rhesus cytomegalovi- rus deficiente de IL-10 viral. Um grupo adicionalmente recebeu anti- corpo monoclonal anti-IL-10 do hospedeiro três dias antes da vacina- ção. Em seguida foi medida a concentração de IP-10 (proteína 10 in- duzida por interferon-gama, também conhecida como CXCL10) no plasma em várias vezes depois da vacinação. A figura mostra que os animais recebendo vacinação com inibição de IL-10 têm mais IP-10 em circulação, com a diferença mais dramática observada duas sema- nas depois da vacinação.
[0036] As FIGS. 14A a 14F mostram vacinas com vetor Ad26 ex- pressando SIVgag com ou sem receptor de IL-10 dominante-negativo (dnIL-10R). A FIG. 14A mostra que Ad26/SlVgag e Ad26/SIVgag- IRES-dnIL-10R expressam proteína SIV Gag sob controle do promotor EF1a humano e seu primeiro íntron endógeno. Ad26/SIVgag-IRES- dnIL-10R adicionalmente contém uma sequência codificante IL-10Ra truncada, carecendo do domínio intracelular que é requerido para sina- lização. A FIG. 14B mostra que os vetores expressam proteína SIV Gag imunorreativa, conforme demonstradao pela presença de uma banda SIV Gag depois da transdução de células 293 com Ad26/SIVgag-IRES-dnIL-10R. A FIG. 14C mostra que o IL-10R domi- nante-negativo em Ad26/SIVgag-IRES-dnIL-10R é expresso sobre a superfície de células HEK 293 transduzidas. As células transduzidas por um vetor Ad26 de controle (à esquerda) demonstram um aumento mínimo na fluorescência depois da adição de anticorpo anti-IL-10R1 (comparar o histograma cinzento para controle sem anticorpo com o histograma preto); as células transduzidas por Ad26/SIVgag-IRES- dnIL-10R (à direita) demonstram intensa coloração com anticorpo anti- IL-10R1 (histograma preto). A FIG. 14D mostra que IL-10R dominante- negativo é funcionalmente inibitório. PBMCs que são infectadas com Ad26 na presença de sinalização de IL-10 produzem mínima IL-12 em resposta (barras cinzentas); no entanto, a expressão de IL-10R domi- nante-negativo inibe o sinal de I1L-10 e permite maior expressão de |IL- 12 (barras pretas). A FIG. 14E mostra que a vacina Ad26/SIVgag- IRES-dnIL-10R provoca uma resposta imune ao gene Gag imunorrea- tivo in vivo, levando a células T CD4+ anti-Gag funcionais expressando tanto IFN-gama quanto TNF-alfa. O citograma à esquerda neste painel mostra o resultado de uma estimulação de controle negativo com DMSO somente; o painel à direita demonstra as células T CD4+ res- ponsivas vistas depois da estimulação com sobreposição de peptídeos Gag. A FIG. 14F mostra que as respostas imunes a vacinação com Ad26/SIVgag-IRES-dnIL-10R (traços pretos) são mantidas por no mi- nimo oito semanas depois da vacinação.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Introdução
[0037] A presente invenção se refere a proporcionar inibidores da sinalização de IL-10 concomitantemente com uma vacina ou outro imunoestímulo, de modo que ocorrem respostas (a vacinação na au- sência de semelhante sinalização, e se baseia, em parte, na surpreen- dente descoberta de que vacinas de RNCMV/SIV segunda geração carecendo do gene de IL-10 viral (RRCMVAdlIL10/SIV) protegem bebês primatas não humanos que não têm imunidade contra RHNCMV anteri- Or, ao passo que as vacinas de RHNCMV/SIV de primeira geração (IL-
10-intacta) não. Além disso, as vacinas de primeira geração se com- provaram eficazes somente um macacos RhCMV-soropositivos selva- gens (wt) tendo anticorpos neutralizantes para IL-10 viral gerados em resposta a infecção por wtRhCMV anterior. A presente invenção tam- bém se baseia, em parte, na descoberta de que a inibição da IL-10 vi- ral e/ou da IL-10 do hospedeiro (isto é, celular) pode aumentar a eficá- cia da vacina. Definições
[0038] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, os termos que se seguem têm os significados atribuídos aos mesmos a menos que especificado de modo diverso.
[0039] Os termos "um," "uma," ou "o", "a" conforme usado aqui, neste pedido de patente, não somente incluem aspectos com um membro, mas também incluem aspectos com mais de um membro. Por exemplo, as formas do singular "um," "uma," ou "o", "a" incluem referentes no plural a menos que o contexto claramente dite de modo diverso. Portanto, por exemplo, referência a "uma célula" inclui uma pluralidade de semelhantes células e referência a "o agente" inclui re- ferência a um ou mais agentes de conhecimento dos peritos na arte, e assim por diante.
[0040] Os termos "cerca de" e "aproximadamente" conforme usado aqui, neste pedido de patente, vão significar geralmente um grau de erro aceitável para a quantidade medida dada a natureza ou precisão das medições. Tipicamente, graus de erro de exemplo estão dentro de por cento (%), de modo preferencial dentro de 10%, e de modo pre- ferencial dentro de 5% de um dado valor ou faixa de valores. Qualquer referência a "cerca de X" especificamente indica no mínimo os valores X, 0,8X, 0,81X, 0,82X, 0,83X, 0,84X, 0,85X, 0,86X, 0,87X, 0,88X, 0,89X, 0,9X, 0,91X, 0,92X, 0,93X, 0,94X, 0,95X, 0,96X, 0,97X, 0,98X, 0,99X, 1,01X, 1,02X, 1,03X, 1,04X, 1,05X, 1,06X, 1,07X, 1,08X, 1,09X,
1,1X, 1,11X, 1,12X, 1,13X, 1,14X, 1,15X, 1,16X, 1,17X, 1,18X, 1,19X, e 1,2X. Portanto, "cerca de X" se destina a ensinar e proporcionar su- porte por escrito de descrição para limitação de uma reivindicação de, por exemplo, "0,98X."
[0041] O termo "inibidor de interleucina 10" ou "inibidor de IL-10" se refere a um composto ou fármaco, ou uma pró-droga do mesmo, que diminui a função ou atividade de uma proteína que tem atividade semelhante a IL-10 (por exemplo, IL-10) e/ou diminui a sinalização de IL-10. Em algumas modalidades, um inibidor de I1L-10 diminui a ex- pressão (por exemplo, transcrição ou translação) de uma proteína que tem atividade semelhante a IL-10. Em algumas modalidades, um inibi- dor de IL-10 diminui a expressão de uma proteína receptora de IL-10. Em algumas modalidades, um inibidor de I1L-10 inibe a ligação entre uma proteína que tem atividade semelhante a I1L-10 e uma proteína receptora de IL-10. Em algumas modalidades, um inibidor de I1L-10 di- minui a função, atividade, ou expressão de um componente a jusante da via de sinalização de IL-10. Como um exemplo não limitante, um inibidor de IL-10 pode inibir a sinalização de STAT3 a jusante. Um "ini- bidor de IL-10 de molécula pequena" se refere a um inibidor de IL-10 que é uma molécula pequena (isto é, tendo um baixo peso molecular, por exemplo, menos de cerca de 900 daltons).
[0042] Os termos "interleucina 10 viral," "IL-10 viral," e "vIL-10" se referem a uma proteína tendo atividade semelhante a IL-10 que é codi- ficada por ou expressa a partir de uma sequência de ácido nucleico que é endógena a um genoma viral ou porção do mesmo. Em algumas modalidades, o termo se refere a uma proteína tendo atividade seme- lhante a I1L-10 que é codificada por ou expressa a partir de uma se- quência de ácido nucleico que é endógena a um vetor de expressão viral, tal como um vetor que é usado como parte de uma vacina (por exemplo, uma vacina que compreende um vetor de expressão à base de CMV).
[0043] Os termos "interleucina 10 celular," "IL-10 celular," "inter- leucina 10 do hospedeiro," "lIL-10 do hospedeiro," e "cIL-10" se refe- rem a uma proteína tendo atividade semelhante a IL-10 que é expres- sa por uma célula que está localizada dentro de, ou isolada ou deriva- da de, um hospedeiro ou indivíduo que seja o receptor de um inibidor de IL-10 e uma vacina de acordo com os métodos da presente inven- ção. Os termos incluem proteínas tendo atividade semelhante a IL-10 que são expressas endogenamente pela célula (por exemplo, célula hospedeira), bem como proteínas não virais tendo atividade semelhan- te a IL-10 que são expressas de maneira recombinante pela célula. Os termos também se referem a uma proteína endógena ou não viral ten- do atividade semelhante a IL-10 que é circulante (por exemplo, no sangue ou em outro fluido corporal) dentro do hospedeiro ou indivíduo.
[0044] O termo "citomegalovírus" ou "CMV" se refere a vírus que incluem membros do gênero de vírus Cytomegalovirus (dentro da or- dem Herpesvirales, família Herpesviridae, subfamília Betaherpesviri- nae). O termo inclui, mas não está limitado a, Citomegalovírus humano (HCMV; também conhecido como Herpesvírus humano 5 (HHV-5)), Citomegalovírus símio (SCCMV ou AGMCMV), Citomegalovírus de babuíno (BaCMV), Citomegalovírus de macaco-coruja (OMCMV), Ci- tomegalovírus de macaco-esquilo (SMCMV), e Rhesus cytomegalovi- rus (RRCMV) que infecta macacos.
[0045] O termo "proteína que tem atividade semelhante a interleu- cina-10" ou "proteína que tem atividade semelhante a IL-10" se refere a qualquer proteína que funciona em um modo similar a interleucina- (IL-10) ou produz um efeito similar (por exemplo, tem um efeito imunomodulador similar) a IL-10. O termo inclui, mas não está limitado a, proteínas codificadas por genes de IL-10 viral (por exemplo, genes de IL-10 de CMV) tais como HCMVIL-10 em HCMV e RROMVIL-10 em
RhCMV, proteínas que se ligam a um receptor de IL-10, proteínas que estimulam a sinalização de receptores de IL-10 a jusante, e porções funcionais dos mesmos. O termo também inclui, mas não está limitado a, proteínas codificadas por genes de IL-10 viral correspondentes em SCCMV/AGMCMV, BaCMV, OMCMV, e SMCMV, bem como homólo- gos dos mesmos. Uma proteína que tem atividade semelhante a IL-10 pode regular negativamente, por exemplo, a expressão de Th1 e cito- cinas de macrófagos (por exemplo, interferon-gama, IL-1-beta, IL-2, IL- 6, I1L-12, TNF-alfa, e GM-CSF), antígenos MHC classe Il, e/ou molécu- las co-estimuladoras de macrófagos, promover o bloqueio da atividade de NF-«B, e/ou reforçar a sobrevida de células B, a proliferação, e/ou a produção de anticorpos.
[0046] O termo "citocina" se refere a uma ampla categoria de pro- teínas pequenas, tipicamente entre cerca de 5 kDa e cerca de 20 kDa de tamanho, que são tipicamente secretadas e que funcionam na sina- lização celular, tipicamente por ligação a receptores celulares que transmitem sinais para o ambiente intracelular de células alvo. Citoci- nas incluem interleucinas, quimiocinas, interferons, linfocinas, monoci- nas, e fatores de necrose tumoral. As citocinas são produzidas por cé- lulas imunes (por exemplo, monócitos, macrófagos, linfócitos B, linfóci- tos T, e mastócitos), células endoteliais, fibroblastos, e células estro- mais. As citocinas têm funções diversas nas respostas imunes, infla- mação, e nas respostas a infecção, trauma, e sepse, bem como no câncer. No contexto de função imune, as citocinas regulaem, entre ou- tras coisas, o equilíbrio entre a imunidade humoral e a imunidade celu- lar, bem como o equilíbrio entre diferentes tipos de imunidade celular, por exemplo, imunidade celular predominante Th1i versus Th2. As cito- cinas também regulam a maturação e o crescimento de células imu- nes. As citocinas podem ou aumentar ou reduzir uma resposta imune, dependendo da citocina em particular.
[0047] O termo "interleucina" se refere a um grupo de citocinas que desempenham papéis importantes na função do sistema imune inato e adaptivo. Por exemplo, algumas interleucinas promovem o de- senvolvimento e a diferenciação de linfócitos B, linfócitos T, e células hematopoiéticas. A maioria das interleucinas são produzidas por linfó- citos T CD4 helper, monócitos, macrófagos, e células endoteliais. As interleucinas podem ou reforçar ou inibir a função imune, dependendo da interleucina particular.
[0048] Exemplos de interleucinas (ILs) incluem IL-1 (a qual tem por alvo células T helper, células B, células natural killer (NK), macrófagos, e células endoteliais, entre outras), IL-2 (a qual tem por alvo células T ativadas e células B, células T regulatórias, células NK, macrófagos, e oligodendrócitos), IL-3 (a qual tem por alvo células tronco hematopoié- ticas e mastócitos), IL-4 (a qual tem por alvo células B ativadas, célu- las T, e células endoteliais), IL-5 (a qual tem por alvo células B e eosi- nófilos), IL-6 (a qual tem por alvo células B ativadas, células plasmáti- cas, células hematopoiéticas, e células T, entre outra), IL-7 (a qual tem por alvo células pré/pró-B e células pré/pró-T, bem como células NK), IL-8 (também conhecida como CXCLB8, a qual tem por alvo neutrófilos, basófilos, e linfócitos), IL-9 (a qual tem por alvo células T e células B), IL-10 (a qual tem por alvo macrófagos, células B, mastócitos, células Th1, e células Th2), IL-11 (a qual tem por alvo células estromais da medula óssea), IL-12 (a qual tem por alvo células T ativadas e células NK), I1L-13 (a qual tem por alvo células Th2, células B, e macrófagos), IL-14 (a qual tem por alvo células B ativadas), IL-15 (a qual tem por alvo células T e células B ativadas), IL-16 (a qual tem por alvo células T CD4+), IL-17 (a qual tem por alvo células epiteliais e endoteliais, en- tre outras), IL-18 (a qual tem por alvo células Th1 e células NK), IL-19, IL-20, I1L-21 (a qual tem por alvo células dendríticas e todos os linfóci- tos), 11-22, 11-23, 11-24, I1L-25, 11-26, 11-27, 11-28, 11-29, 11-30, 11-31,
11-32, 11-33, IL-34, 11-35, e 11-36.
[0049] "Interleucina-4" ou "IL-4" induz a diferenciação de células T helper nativas (células ThO cells) para células Th2. Subsequentemen- te, depois de ativação por IL-4, as células Th2 produzem IL-4 adicional em um loop de feedback positivo. A IL-4 também funciona estimulando a proliferação de células B e T ativadas, a diferenciação de células B em células plasmáticas, a indução da classe de células B trocando pa- ra IgE, e a regulação positiva da produção de MHC classe Il. A IL-4 também reduz a produção de células Th1, macrófagos, interferon- gama, e célula dendrítica 11-12. Exemplos não limitantes de sequên- cias de aminoácidos de IL-4 humana são estipuladas sob os números de Sequência de Referência NCBI NP 000580, NP 758858, e NP 001341919.
[0050] "Interleucina-5" ou "IL-5" é produzida por células Th2 e mastócitos, e funciona estimulando o crescimento de células B e au- mentando a secreção de imunoglobulinas. A I|L-5 também é um impor- tante mediacor da ativação de eosinófilos. Um exemplo não limitante de uma sequência de aminoácidos de IL-5 humana é estipulado sob o número de Sequência de Referência NCBI NP 000870.
[0051] "Interleucina-6" ou "IL-6" é produzida por macrófagos, célu- las Th2, células B, astrócitos, e células endoteliais. A IL-6 age como uma citocina pró-inflamatória (por exemplo, em resposta a infecção ou dano tecidual oriundo, por exemplo, de trauma ou queimaduras), em- bora também possa agir como uma miocina anti-inflamatória. Exem- plos não limitantes de sequências de aminoácidos de IL-6 humanas são estipuladas sob os números de Sequência de Referência NCBI NP 000591 e NP 001305024.
[0052] "Interleucina-10" ou "IL-10" é uma citocina anti-inflamatória que é codificada pelo gene /L10 em seres humanos. IL-10, a qual é um homodímero tendo subunidades que têm cada uma 178 aminoácidos de comprimento, se liga a um complexo receptor que consiste em du- as proteínas de receptor-1 de IL-10 e duas proteínas de receptor-2 de IL-10. A ligação de IL-10 ao complexo receptor induz a sinalização de STAT3, através da fosforilação por JAK1 das caudas citoplasmáticas do receptor-1 de IL-10 e fosforilação por Tyk2 das caudas citoplasmá- ticas do receptor-2 de IL-10. A I1L-10 é produzida por subgrupos de monócitos, células Th2, células T CD8+, mastócitos, macrófagos, e células B. A I1L-10 tem múltiplos efeitos, incluindo, mas não limitados a, regulação negativa da expressão de Th1 e citocinas de macrófagos (por exemplo, interferon-gama, IL-1-beta, IL-2, IL-6, 11-12, TNF-alfa, e GM-CSF), MHC class Il antígenos, e/ou moléculas co-estimuladoras de macrófagos; bloqueio da atividade de NF-«xB; e/ou reforço da sobre- vida de células B, proliferação, e/ou produção de anticorpos. Um exemplo não limitante de uma sequência de aminoácidos de IL-10 humana é estipulado sob o número de Sequência de Referência NCBI NP 000563 e SEQ ID NO: 2. Um exemplo não limitante de uma se- quência de aminoácidos de IL-10 de macaco rhesus é estipulado sob SEQ ID NO: 1.
[0053] Muitos patógenos, incluindo CMV, exploram a via da IL-10 poara reforçar a persistência dos patógenos. Por exemplo, muitos CMVs codificam sua própria IL-10 (por exemplo, HCMVIL-10, também conhecida como UL111, para HCMV e RROMVIL-10, também conheci- da como Rh143, para RRCMV). Estas proteínas de IL-10 viral têm dife- rentes sequências de aminoácidos da proteína IL-10 humana, mas, não obstante, são capazes de ligar receptores de IL-10. Portanto, célu- las infectadas com CMV vão produzir IL-10 viral, a qual por sua vez inibe a resposta imune contra infecção por CMV e reforça a persistên- cia de CMV dentro do hospedeiro.
[0054] "Interleucina-12" ou "IL-12" é produzida por células dendríti- cas, macrófagos, neutrófilos, e células B-linfoblastóides em resposta a estimulação antigênica. A IL-12 está envolvida na diferenciação de cé- lulas T naive em células Th1, e também tem um papel no reforço da atividade citotóxica de células NK e de células T CD8+.
[0055] "Interleucina-15" ou "IL-15" é secretada por fagócitos mo- nonucleares, entre outras células, em resposta a infecção viral e induz a proliferação de células NK, da qual uma importante função é matar células infectaads com vírus. Exemplos não limitantes de sequências de aminoácidos de IL-15 humanas são estipuladas sob os números de Sequência de Referência NCBI NP 000576 e NP 751915.
[0056] O termo "fator de necrose tumoral-alfa" ou "TNF-alfa" se refere à citocina que é codificada pelo gene TNFA em seres humanos. O TNF-alfa é produzida por macrófagos ativados, células T CD4+, cé- lulas NK, neutrófilos, eosinófilos, mastócitos, e neurônios. O TNF-alfa está envolvido em processos tais como a indução de febre, apoptose, caquexia, e inflamação, bem como a inibição de tumorigênese e repli- cação viral. O TNF-alfa também funciona na estimulação de respostas a sepse. Um exemplo não limitante de uma sequência de aminoácidos de TNF-alfa humano é estipulado sob o número de Sequência de Re- ferência NCBI NP 000585.
[0057] O termo "proteína C-reativa" ou "CRP" se refere a uma pro- teína em forma de anel pentamérico que é codificada pelo CRP e é um membro da família das pentraxinas de proteínas. A proteína C-reativa é sintetizada pelo fígado e os níveis da proteína aumentam em respos- ta a secreção de IL-6 por macrófagos e células T. A proteína C-reativa se liga à fosfocolina que está presente sobre a superfície de células mortas ou morrendo, bem como algumas bactérias, deste modo ati- vando o sistema do complemento e promovendo fagocitose por macró- fagos. Exemplos não limitantes de sequências de aminoácidos de pro- teína C-reativa humana são estipuladas sob os números de Sequência de Referência NCBI NP 000558, NP 001315986, e NP 001315987.
[0058] O termo "interferon-gama" ou "IFN-y" se refere a uma cito- cina que é um membro da classe de interferons do tipo Il e é codifica- da pelo gene /FNG. O IFN-y desempenha funções importantes nas imunidades inata e adaptiva contra infecções virais, bacterianas, e por protozoários. Em particular, o IFN-y é um ativador de macrófagos e induz a expressão de moléculas de MHC da classe Il. O IFN-y é pro- duzido por células natural killer, células T natural killer, células Th1 CD4*, células T de linfócitos citotóxicos CD8*, e células linfóides inatas não citotóxicas. Um exemplo não limitante de uma sequência de ami- noácidos de IFN-y humano é estipulado sob o número de Sequência de Referência NCBI NP 000610.
[0059] O termo "mutação imunomoduladora" se refere a qualquer mutação que aumenta ou diminui a magnitude, o caráter, e/ou a efeti- vidade de uma resposta imune em uma células hospedeira ou orga- nismo (por exemplo, um indivíduo no qual uma resposta imune contra um antígeno esteja sendo induzida). O termo inclui mutações que au- mentam a expressão e/ou atividade de proteínas envolvidas na modu- lação da resposta imune em uma células hospedeira ou organismo. Como um exemplo não limitante, uma mutação imunomoduladora po- de aumentar ou diminuir a expressão e/ou atividade de uma citocina (por exemplo, uma interleucina, uma quimiocina, um interferon, uma linfocina, e/ou um fator de necrose tumoral). Em alguns casos, uma mutação imunomoduladora diminui ou abole a função de uma proteína que inibe a função imune (por exemplo, IL-10). Em outros casos, uma mutação imunomoduladora aumenta a expressão ou atividade de uma proteína imunoestimuladora (por exemplo, IL-12 ou IL-15). Como outro exemplo não limitante, uma mutação imunomoduladora pode diminuir ou aumentar a função de uma proteína que seja associada com apre- sentação ao antígeno ou vigilância imunológica. Em alguns casos, uma mutação imunomoduladora diminui a inibição mediada por vírus de apresentação ao antígeno associada com o complexo maior de his- tocompatibilidade (MHC). Como um exemplo não limitante adicional, uma mutação imunomoduladora pode aumentar ou diminuir a expres- são e/ou atividade de uma proteína que esteja envolvida na modula- ção da resposta da proteína desdobrada (UPR). O termo inclui inser- ções, deleções, e/ou substituições de um ou mais nucleotídeos, inclu- indo inserções de uma ou mais sequências genéticas parciais ou intei- ras, bem como deleções de sequências genéticas parciais ou inteiras.
[0060] O termo "antígeno" se refere a uma molécula que é capaz de indução de uma resposta imune (por exemplo, em um indivíduo). Enquanto em muitos casos uma resposta imune envolve a produção de um anticorpo que tem por alvo ou se liga especificamente ao antí- geno, conforme usado aqui, neste pedido de patente, um antígeno também se refere a moléculas que induzem respostas imunes diferen- tes das que envolvem especificamente a produção de um anticorpo que tem por alvo o antígeno, por exemplo, uma resposta imune medi- ada por células envolvendo a expansão de células T que visam peptí- deos derivados de antígenos apresentados sobre a superfície de célu- las alvo. O antígeno pode se originar de um organismo estranho, tal como um vírus ou micróbio (por exemplo, organismo bacteriano), ou pode se originar de um tecido estranho. Alternativamente, o antígeno pode se originar de dentro de um indivíduo (isto é, um indivíduo no qual o antígeno induz uma resposta imune). Como um exemplo não limitante, um antígeno pode se originar de uma célula em um indivíduo que tenha sido ferido, tenha sido infectado com um patógeno (por exemplo, um virus ou micróbio, tal como um organismo bacteriano), ou seja aberrante ou danificado (por exemplo, uma célula cancerosa). O termo também se refere a moléculas que não induzem necessariamen- te respostas imunes por si mesmas.
[0061] O termo "célula de apresentação ao antígeno" ou "APC" se refere a uma célula que mostra ou apresenta um antígeno, ou uma porção do mesmo, on the surface da célula. Tipicamente, antígenos são mostrados ou apresentados com uma molécula do complexo mai- or de histocompatibilidade (MHC). Quase todos os tipos de células po- dem servir como células de apresentação ao antígeno, e as células de apresentação ao antígeno são encontradas em um grande número de diferentes tipos de tecidos. As células de apresentação ao antígeno profissionais, tais como células dendríticas, macrófagos, e células B, apresentam antígenos às células T em um contexto que leva de modo mais eficaz à ativação de células T e subsequente proliferação. Muitos tipos de células apresentam antígenos a células T citotóxicas.
[0062] O termo "doença infecciosa" se refere a qualquer doença ou distúrbio provocado por um organismo, (por exemplo, vírus, bacté- rias, fungos, protozoários, helmintos, e organismos parasitários). O termo inclui doenças e distúrbios que são transmitidos de um indivíduo para o outro (por exemplo, de ser humano para ser humano, de animal não humano para ser humano, e de ser humano para animal não hu- mano), bem como os causados por ingestão de comida ou água con- taminada ou por exposição a organismos patogênicos (por exemplo, no meio ambiente).
[0063] Um "antígeno de doença infecciosa" se refere a qualquer molécula originária de um organismo que causa uma doença infeccio- sa que pode induzir uma resposta imune (por exemplo, em um indiví- duo). Por exemplo, um antígeno de doença infecciosa pode se originar de um vírus, bactéria, fungo, protozoário, helminto, ou parasita, e pode ser, por exemplo, uma proteína da parede bacteriana, uma proteína do capsídeo viral ou estrutural (por exemplo, uma proteína do antígeno (gag) específica retroviral, tal como uma proteína gag específica do HIV ou do SIV), ou uma porção do mesmo.
[0064] O termo "câncer" se refere a qualquer um de vários neo-
plasmas malignos caracterizados pela proliferação de células anaplá- sicas que tendem a invadir o tecido em torno e metastatizar para no- vos sítios corporais. Exemplos não limitantes de diferentes tipos de câncer adequado para tratamento usando os métodos e as composi- ções da presente invenção incluem câncer colorretal, câncer do cólon, câncer anal, câncer hepático, câncer de ovário, câncer de mama, cân- cer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de tiróide, câncer pleural, câncer pancreático, câncer cervical, câncer de próstata, câncer testicu- lar, câncer do duto biliar, tumores carcinoides gastrointestinais, câncer de esôfago, câncer da vesícula biliar, câncer retal, câncer de apêndice, câncer do intestino delgado, câncer de estômago (gástrico), câncer renal (por exemplo, carcinoma de células renais), câncer do sistema nervoso central, câncer de pele, carcinoma de células escamosas da cavidade oral, coriocarcinomas, câncer de cabeça e pescoços, câncer Ósseo, sarcoma osteogênicos, fibrossarcoma, neuroblastoma, glioma, melanoma, leucemia (por exemplo, leucemia linfocítica aguda, leuce- mia linfocítica crônica, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, ou leucemia de células cabeludas), linfoma (por exemplo, lin- foma não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma de células B, ou linfo- ma de Burkitt), e mieloma múltiplo.
[0065] O termo "antígeno associado a tumor" ou "TAA" se refere a qualquer antígeno que seja produzido por uma célula tumoral (isto é, qualquer proteína ou molécula produzida por uma célula tumoral que pode induzir uma resposta imune, por exemplo, em um indivíduo). TAAs incluem, mas não estão limitados a, produtos de oncogenes mu- tados e genes supressores tumorais mutados, proteínas celulares ex- pressas superexpressas ou de maneira aberrante, antígenos que são produzidos por vírus oncogênicos, antígenos oncofetais, glicolipídeos e glicoproteínas da superfície celular alterados, e antígenos que são específicos de tipos celulares.
[0066] Exemplos não limitantes de TAAs incluem os antígenos as- sociados a melanoma (MAGEs). As proteínas de MAGE contêm um domínio conservado que tem cerca de 200 aminoácidos de compri- mento e geralmente está localizado próximo à extremidade C-terminal da proteína, embora o domínio conservado esteja locaçizado mais próximo à porção central de algumas proteínas de MAGESs. Proteínas de MAGEs humanos incluem MAGEA1, MAGEA2, MAGEAZB, MA- GEA3, MAGEA4, MAGEAS5, MAGEA6, MAGEATP, MAGEA8, MA- GEA9, MAGEA9B, MAGEA1O0, MAGEA11, MAGEA12, MAGEA13P, MAGEB1, MAGEB2, MAGEB3, MAGEB4, MAGEB5, MAGEBS, MAGEB10, MAGEB16, MAGEB17, MAGEB18, MAGEC1, MAGEC?, MAGEC3, MAGED1, MAGED2, MAGED3 (também conhecida como "trofina" ou "TRO"), MAGED4, MAGED4B, MAGEE1, MAGEE?, MAGEF1, MAGEEG1 (também conhecida como "NSMCE3"), MAGEH1, MAGEL?2, e NDN.
[0067] A proteína "antígeno 4 associado ao melanoma" ou "MA- GEA4" é codificada pelo gene MAGEA4 em seres humanos, localizado na localização cromossômica Xq28. Exemplos não limitantes de se- quências de aminoácidos de MAGEA4 humana são estipuladas sob os números de Sequência de Referência NCBI NP 001011548, NP 001011549, NP 001011550, e NP 002353.
[0068] A proteína "antígeno 10 associado ao melanoma" ou "MA- GEA10" é codificada pelo gene MAGEA1O em seres humanos, locali- zado na localização cromossômica Xq28. Exemplos não limitantes de sequências de aminoácidos de MAGEA1O humana são estipuladas sob os números de Sequência de Referência NCBI NP 001011543, NP 001238757, e NP 066386.
[0069] O termo "antígeno específico da próstata" ou "PSA" se refe- re a uma glicoproteína codificada pelo gene KLK3 em seres humanos, e também é conhecida como "gama-seminoproteína" e "calicreína-3."
O PSA está presente em pequenas quantidades no soro dos homens com próstatas normais, mas frequentemente está elevado na presença de câncer de próstata ou de outros distúrbios da próstata. Exemplos não limitantes de sequências de aminoácidos de PSA humano são es- tipuladas sob os números de Sequência de Referência NCBI NP 001025218, NP 001025219, NP 001639.
[0070] O termo "NY-ESO-1" se refere ao antígeno tumoral da famí- lia câncer / testículo que também é conhecido como "antígeno câncer / testículo 1" e é codificado pelo gene CTAG1B em seres humanos. O NY-ESO-1 é altamente expresso em muitos melanomas de mau prog- nóstico. Um exemplo não limitante de uma sequência de aminoácidos de NY-ESO-1 humano é estipulado sob o número de Sequência de Referência NCBI NP 001318.1.
[0071] O termo "complexo maior de histocompatibilidade" ou "MHC" se refere a um grupo de proteínas da superfície celular que são essenciais para o reconhecimento de moléculas estranhas pelo siste- ma imune adaptativo. A função primária das moléculas do MHC é se ligarem a antígenos ou peptídeos derivados de antígenos que são de- rivados de patógenos e subsequentemente apresentar os antígenos sobre a superfície das células, de modo a facilitar o reconhecimento por células T. A moléculas do MHC também participam de interações entre leucócitos e outros leucócitos, bem como entre leucócitos e ou- tros tipos celulares dentro do corpo. Nos seres humanos, o MHC tam- bém é conhecido como o "complexo de antígeno leucocitário humano" ou "complexo HLA."
[0072] Moléculas MHC classe |, as quais predominantemente apre- sentam peptídeos do interior da célula, são codificadas pelos genes HLA- A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, e os genes HLA-G. HLA-A, HLA-B, e HLA-C são mais polimórficos, ao passo que os genes HLA-E, HLA-F, e HLA-G são menos polimórficos. HLA-K e HLA-L também são conhecidos por existirem como pseudogenes. Além disso, a beta-2-microglobulina é uma proteína MHC classe |, codificada pelo gene B2M. Exemplos não limitantes de sequências de nucleotídeos HLA-A são estipuladas sob os números de Sequência de Referência NCBI NM 001242758 e NM 002116. Um exemplo não limitante de uma sequência de nucleotí- deos HLA-B é estipulado sob o número de Sequência de Referência NCBI NM 005514. Exemplos não limitantes de sequências de nucleotí- deos HLA-C são estipulados sob os números de Sequência de Referên- cia NCBI NM 001243042 e NM 002117. Um exemplo não limitante de uma sequência de nucleotídeos HLA-E é estipulado sob o número de Sequência de Referência NCBI NM 005516. Um exemplo não limitante de uma sequência de nucleotídeos HLA-F é estipulado sob o número de Sequência de Referência NCBI NM 018950. Um exemplo não limitante de uma sequência de nucleotídeos HLA-G é estipulado sob o número de Sequência de Referência NCBI NM 002127. Um exemplo não limi- tante de uma sequência de nucleotídeos B2M é estipulado sob o nú- mero de Sequência de Referência NCBI NM 004048.
[0073] Moléculas MHC classe |l, as quais predominantemente apresentam peptídeos do exterior da célula para linfócitos T, são codi- ficadas pelos genes HLA-DP, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DQ, e HLA-DR. Os genes HLA-DM incluem HLA-DMA e HLA-DMB. Os genes HLA-DO incluem HLA-DOA e HLA-DOB. Os genes HLA-DP incluem HLA-DPA1 e HLA-DPB1. Os genes HLA-DQ incluem HLA-DQA1, HLA-DQA?Z, HLA-DQB1, e HLA-DQB2. Os genes HLA-DR incluem HLA-DRA, HLA- DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4, e HLA-DRB5. Exemplos não limitantes de sequências de nucleotídeos HLA-DMA e HLA-DMB são estipulados sob os números de Sequência de Referência NCBI NM 006120 e NM 002118, respectivamente. Exemplos não limitantes de sequências de nucleotídeos HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRBA, e HLA- DRB5 são estipulados nos números de Sequência de Referência NCBI
NM 01911, NM 002124, NM 022555, NM 021983, NM 002125, res- pectivamente.
[0074] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "tropismo se refere à capacidade de uma composição da presente in- venção (por exemplo, um polinucleotídeo recombinante da presente invenção ou uma partícula viral a qual compreende ou é codificada por um polinucleotídeo recombinante da presente invenção) para entrar, infectar, ou replicar em um tipo de célula ou tecido em particular (por exemplo, um tipo de célula ou tecido alvo encontrado em um indivíduo no qual esteja sendo induzida uma resposta imune contra um antíge- no). Como exemplos não limitantes, o tropismo pode ser amplo (isto é, um polinucleotídeo recombinante da presente invenção pode entrar em um grande número de diferentes tipos de células ou tecidos, ou um vírus o qual compreende ou é codificado por um polinucleotídeo re- combinante da presente invenção pode infectar ou replicar em um grande número de diferentes tipos de células ou tecidos) ou pode ser limitado (isto é, um polinucleotídeo recombinante da presente invenção pode entrar somente em um pequeno número de diferentes tipos de células ou tecidos, ou um virus o qual compreende ou é codificado por um polinucleotídeo recombinante da presente invenção pode infectar ou replicar em somente um pequeno número de diferentes tipos de células ou tecidos). Além disso, conforme adicionalmente descrito aqui, neste pedido de patente, os polinucleotídeos recombinantes da presente invenção podem ser modificados de tal modo que possuam tropismo para um ou mais tipos de células ou tecidos desejados espe- cíficos (isto é, um polinucleotídeo recombinante pode entrar em um ou mais tipos de células ou tecidos desejados específicos, ou uma partí- cula viral a qual compreende ou é codificada por um polinucleotídeo recombinante da presente invenção pode entrar em um ou mais tipos de células ou tecidos desejados específicos). Em alguns casos, o tro-
pismo para um tipo de célula ou tecido específicoé aumentado ou transmitido pela adição de uma sequência de ácido nucleico que codi- fica um ligante de direcionamento celular.
[0075] O termo "ligante de direcionamento celular" se refere a qualquer proteína, molécula, ou porção da mesma que aumenta a ca- pacidade de uma composição da presente invenção para entrar, infec- tar, ou replicar em um tipo de célula ou tecido específico. Como um exemplo não limitante, um ligante de direcionamento celular pode au- mentar a capacidade de uma composição da presente invenção (por exemplo, um polinucleotídeo recombinante da presente invenção, ou uma partícula viral a qual compreende ou é codificada por um polinu- cleotídeo recombinante da presente invenção) para ser reconhecida por um um tipo de célula ou tecido alvo específico, ou para reconhecer um tipo de célula ou tecido alvo específico. Ligantes de direcionamen- to celular incluem, mas não estão limitados a, fragmentos de anticorpo que reconhecem um antígeno de célula alvo, ligantes que são reco- nhecidos por um receptor cognato de célula alvo, e proteínas do cap- sídeo viral que reconhecem uma célula alvo.
[0076] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, os termos "polinucleotídeo," "ácido nucleico," e "nucleotídeo," se referem a áci- dos desoxirribonucleicos (DNA) ou ácidos ribonucleicos (RNA) e polí- meros dos mesmos. O termo inclui, mas não está limitado a, DNA ou RNA de cadeia única, de cadeia dupla, ou multi-cadeia, DNA genômi- co, cDNA, e híbridos de DNA-RNA, bem como outros polímeros os quais compreendem bases de purina e/ou pirimidina ou outras bases de nucleotídeos naturais, quimicamente modificadas, bioquimicamente modificadas, não-naturais, sintéticas, ou derivadas. A menos que es- pecificamente limitado, o termo engloba ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que tenham proprieda- des de ligação similares ao ácido nucleico de referência. A menos que indicado de modo diverso, uma sequência de ácido nucleico em parti- cular também engloba implicitamente variantes das mesmas modifica- das de maneira conservadora (por exemplo, substituições de códons degenerados), homólogos, e sequências complementares bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, substituições de códons degenerados podem ser realizadsa gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou de todos os códons) é substituída com resíduos de base mista e/ou de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsu- ka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
[0077] O termo "sequência de nucleotídeos codificando um peptí- deo" se refere a um segmento de DNA, o qual em algumas modalida- des pode ser um gene ou uma porção do mesmo, envolvido na produ- ção de uma cadeia peptídica. Um gene geralmente vai incluir regiões precedendo e seguindo a região codificante (lider e trailer) envolvida na transcrição / translação do produto genético e a regulação da trans- crição / translação. Um gene também pode incluir sequências interve- nientes (íntrons) entre segmentos codificantes individuais (éxons). Li- deres, trailers, e íntrons podem incluir elementos reguladores que são necessários durante a transcrição e a translação de um gene (por exemplo, promotores, terminadores, sequências regulatórias translaci- onais tais como sítios de ligação ao ribossoma e sítios de entrada no ribossoma interno, reforçadores, silenciadores, isoladores, elementos de limite, origens de replicação, sítios de fixação à matriz e regiões de controle de locus, etc.). Um "produto genético" pode se referir ou ao MRNA ou à proteína expressa a partir de um gene em particular.
[0078] Os termos "expressão" e "expresso" no contexto de um ge- ne se referem ao produto transcricional e/ou translacional do gene. O nível de expressão de uma molécula de DNA em uma célula pode ser avaliado com base na quantidade de mMRNA correspondente que está presente dentro da célula ou a quantidade de proteína codificada por aquele DNA produzido pela célula.
[0079] O termo "recombinante" quando usado com referência, por exemplo, a um polinucleotídeo, a uma proteína, a um vetor, ou a uma célula, indica que o polinucleotídeo, a proteína, o vetor, ou a célula foi modificado pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heterólo- go ou a alteração de um ácido nucleico ou proteína nativo, ou que a célula é derivada de uma célula modificada desse modo. Por exemplo, polinucleotídeos recombinantes contêm sequências de ácido nucleico que não são encontradas dentro da forma nativa (não recombinante) do polinucleotídeo.
[0080] Os termos "vetor" e "vetor de expressão" se referem a um cons- tructo polinucleotídico, gerado de maneira recombinante ou de manei- ra sintética, com uma série de elementos de ácidos nucleicos especifi- cados que permitem a transcrição de uma sequência de ácido nucleico em particular (por exemplo, dentro de um genoma viral (por exemplo, de CMV) ou uma porção do mesmo) em uma célula hospedeira. Con- forme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "vetor de CMV" ou "vetor à base de CMV" se refere a um vetor que é derivado de ou compreende um polinucleotídeo (por exemplo, polinucleotídeo recom- binante) o qual compreende um genoma de CMV ou uma porção do mesmo. Tipicamente, um vetor inclui uma sequência de ácido nucleico a ser transcrita, ligada operacionalmente a um promotor. Outros ele- mentos que podem estar presentes em um vetor incluem os que refor- çam a transcrição (por exemplo, reforçadores) e terminam a transcri- ção (por exemplo, terminadores), os que conferem certa afinidade de ligação ou antigenicidade a uma proteína (por exemplo, proteína re- combinante) produzida a partir do vetor, e os que permitem a replica- ção do vetor e seu acondicionamento dentro de uma partícula viral
(por exemplo, uma partícula de CMV). Os polinucleotídeos recombi- nantes usados nos métodos da presente invenção que são vetores à base de vírus (por exemplo, vetores à base de CMV) podem ser usa- dos como vetores de vacinas virais.
[0081] Os termos "polipeptídeo," "peptídeo," e "proteína" são usa- dos de modo intercambiável aqui, neste pedido de patente, para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Todos os três ter- mos se aplicam a aminoácido polímeros nos quais um ou mais resí- duos de aminoácidos são um mimético químico artificial de um amino- ácido que ocorre naturalmente correspondente, bem como a polímeros de aminoácidos que ocorrem naturalmente e polímeros de aminoáci- dos que não ocorrem naturalmente. Conforme usado aqui, neste pedi- do de patente, os termos englobam cadeias de aminoácidos de qual- quer comprimiento, incluindo proteínas de comprimiento total, em que os resíduos de aminoácidos são ligados por ligações peptídicas cova- lentes.
[0082] Os termos "indivíduo," "indivíduo," e "paciente" são usados de modo intercambiável aqui, neste pedido de patente, para se referir a um vertebrado, de modo preferencial um mamífero, de modo prefe- rencial um ser humano. Mamíferos incluem, mas não estão limitados a, murinos, camundongos, ratos, símios, seres humanos, animais de fa- zenda, animais de esporte, e animais de estimação. Também são en- globados tecidos, células e sua progênie de uma entidade biológica obtida in vivo ou cultivada in vitro.
[0083] Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "administração" inclui administração oral, contato tópico, administração como um supositório, administração intravenosa, intraperitoneal, in- tramuscular, intralesional, intratumoral, intratecal, intranasal, intra- óssea, ou subcutânea a um indivíduo. A administração é por qualquer via, incluindo parenteral e transmucosa (por exemplo, bucal, sublin-
gual, palatal, gengival, nasal, vaginal, retal, ou transdérmica). Adminis- tração parenteral inclui, por exemplo, intravenosa, intramuscular, in- traarterial, intradérmica, subcutânea, intraperitoneal, intraventricular, intra-óssea, e intracraniana. Outros modos de liberação incluem, mas não estão limitados a, o uso de formulações lipossômicas, infusão in- travenosa, emplastros transdérmicos, formulações de depósito, etc.
[0084] O termo "tratamento" se refere a uma abordagem para ob- ter resultados benéficos ou desejados incluindo, mas não limitados a, um benefício terapêutico e/ou um benefício profilático. "Benefício tera- pêutico" significa qualquer melhora terapeuticamente relevante em ou efeito sobre uma ou mais doenças, condições, ou sintomas sob trata- mento. Benefício terapêutico também pode significar efetuar uma cura de uma ou mais doenças, condições, ou sintomas sob tratamento. Além disso, benefício terapêutico também pode significar aumentar a sobrevida. Para benefício profilático, as composições podem ser ad- ministradas a um indivíduo em risco de desenvolver uma doença, con- dição, ou sintoma em particular, ou a um indivíduo reportando um ou mais dos sintomas fisiológicos de uma doença, muito embora a doen- ça, condição, ou sintoma possa ainda não estar presente.
[0085] O termo "sobrevida" se refere à extensão de tempo depois do diagnóstico de uma doença e/ou início ou conclusão de o curso de uma terapia em particular para uma doença (por exemplo, câncer ou uma doença infecciosa). O termo "sobrevida geral" inclui o desfecho clínico descrevendo pacientes que estão vivos por um período de tem- po definido depois de terem sido diagnosticados com ou tratados para uma doença, tal como o câncer. O termo "sobrevida livre de doença" inclui à extensão de tempo depois de tratamento para uma doença es- pecífica durante o qual um paciente sobrevive sem nenhum sinal da doença (por exemplo, sem recidiva). Em determinadas modalidades, sobrevida livre de doença é um parâmetro clínico usado para avaliar a eficácia de uma terapia em particular, a qual em alguns casos é medi- da em unidades de 1 ou 5 anos. O termo "sobrevida livre de progres- são" inclui a extensão de tempo durante e depois de tratamento para uma doença específica, no qual um paciente está vivendo com a do- ença sem sintomas adicionais da doença. Em algumas modalidades, sobrevida é expressa como uma median ou valor médio.
[0086] O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quanti- dade suficiente" se refere à quantidade de um polinucleotídeo recom- binante ou composição que é suficiente para efetuar resultados bené- ficos ou desejados. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar dependendo de um ou mais entre: o indivíduo e a condição de doença sendo tratada, o peso e a idade do indivíduo, a gravidade da condição de doença, o estado imune do indivíduo, o modo de administração e semelhantes, os quais podem ser prontamente determinados por uma pessoa com conhecimento regular na arte. A quantidade específica pode variar dependendo de um ou mais entre: o agente em particular escolhido, o tipo de célula alvo, a localização da célula alvo no indiví- duo, o regime de dosagem a ser seguido, se é administrado em com- binação com outros compostos, o momento da administração, e o sis- tema de liberação física no qual é realizada.
[0087] Para os fins aqui, neste pedido de patente, uma quantidade eficaz é determinada por semelhantes considerações conforme pode ser de conhecimento na arte. A quantidade deve ser eficaz na obten- ção do efeito terapêutico desejado em um indivíduo sofrendo de uma doença tal como uma doença infecciosa ou um câncer. O efeito tera- pêutico desejado pode incluir, por exemplo, melhora de sintomas inde- sejados associados com a doença, prevenção da manifestação de semelhantes sintomas antes deles ocorreram, desaceleração da pro- gressão de sintomas associados com a doença, desaceleração ou li- mitação de qualquer dano irreversível causado pela doença, atenua-
ção da gravidade ou cura da doença, ou melhora da taxa de sobrevida ou prover uma recuperação mais rápida da doença. Além disso, no contexto de tratamento profilático, a quantidade também pode ser efi- caz para evitar o desenvolvimento da doença.
[0088] O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a uma substância que ajuda na administração de um agente ativo a uma célula, um organismo, ou um indivíduo. "Veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um veículo ou excipiente que pode ser incluído nas composições da invenção e que não causa nenhum efeito toxicológi- co adverso importante sobre o paciente. Exemplos não limitantes de veí- culos farmaceuticamente aceitáveis incluem água, cloreto de sódio (NaCl), soluções salinas normais, solução de Ringer lactada, sacarose normal, glicose normal, ligantes, enchimentos, desintegrantes, lubrifican- tes, revestimentos, adoçantes, aromatizantes e colorantes, lipossomas, meios de dispersão, microcápsulas, veículos lipídicos catiônicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção, e semelhantes. O veículo também pode compreender ou consistir em substâncias para prover a formulação com estabilidade, esterilidade e isotonicidade (por exemplo, preservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e tam- pões), para prevenir a ação de microorganismos (por exemplo, agentes antimicrobianos e antifúngicos, tais como parabenos, clorobutanol, fe- nol, ácido sórbico e semelhantes) ou para prover a formulação com um sabor comestível, etc. Em alguns casos, o veículo é um agente que facilita a liberação de um inibidor de IL-10 e/ou uma vacina a uma cé- lula ou tecido alvo. Uma pessoa versada na arte vai reconhecer que outros veículos farmacêuticos são úteis na presente invenção.
[0089] O termo "vacina" se refere a uma composição biológica a qual, quando administrada a um indivíduo, tem a capacidade de pro- duzir uma imunidade adquirida para um patógeno ou doença em parti- cular no indivíduo. Tipicamente, um ou mais antígenos, fragmentos de antígenos, ou polinucleotídeos codificando antígenos ou fragmentos de antígenos que são associados com o patógeno ou a doença de in- teresse são administrados ao indivíduo. As vacinas podem compreen- der, por exemplo, organismos inativados ou atenuados (por exemplo, bactérias ou vírus), células, proteínas que são expressas a partir de ou sobre células (por exemplo, proteínas da superfície celular ou outras proteínas produzidas por células (por exemplo, células tumorais)), pro- teínas que que são produzidas por organismos (por exemplo, toxinas), ou porções de organismos (por exemplo, proteínas do envelope viral ou genes virais codificando vários antígenos). Em alguns casos, célu- las são manipuladas para expressar proteínas de tal modo que, quan- do administradas como uma vacina, reforçam a capacidade de um in- divíduo para adquirir imunidade para aquele tipo de célula em particu- lar (por exemplo, reforçam a capacidade de um indivíduo para adquirir imunidade para uma célula cancerosa ou para um organismo que cau- sa uma doença infecciosa tal como um vírus, uma bactéria, um orga- nismo fúngico, um protozoário, ou um helminto). Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "vacina" inclui, mas não está limitado a, polinucleotídeos recombinantes da presente invenção (por exemplo, vetores de base viral, tais como vetores à base de CMV ou outros ve- tores virais descritos aqui, neste pedido de patente) que podem ser usados em vacinas de vetores virais), bem como partículas virais, cé- luas hospedeiras, e composições farmacêuticas que compreendem polinucleotídeos recombinantes da presente invenção.
[0090] O termo "resposta da proteína desdobrada" ou "UPR" se refere a uma resposta ao estresse celular que é conservada através de muitas espécies, incluindo mamíferos, levedura, e vermes, e é ati- vada em resposta à acumulação de proteínas desdobradas ou mal do- bradas no retículo endoplasmático de uma célula. Inicialmente, a UPR funciona diminuindo a translação de proteínas, degradando proteínas mal dobradas, e facilitando a ativação de vias de sinalização que le- vam a aumento da produção de chaperones (acompanhantes) molecu- lares. Se a UPR for sustentada, eventualmente seu funcionamento po- de induzir apoptose. Dentro da luz do retículo endoplasmático, a UPR é iniciada como chaperones BIP/Grp78, os quais normalmente se as- sociam com os domínios luminais de proteínas transmembrana de ati- vação de UPR (deste modo prevenindo a ativação da UPR), se tornam dissociados destas proteínas à medida que BIP/Grp78 é forçado a se associar com proteínas desdobradas ou mal dobradas. Os citomegalo- vírus contêm genes que inibem a UPR (por exemplo, UL50 de Citome- galovírus humano, Rh81 de Rhesus cytomegalovirus, e M50 de Cito- megalovírus de camundongo), da qual alguns produtos protéicos su- primem emenda XBP1 mediada por IRE1 através de sequências con- servadas localizadas em suas extremidades do terminal amino.
[0091] O termo "antígeno de grupo específico" ou "gag" se refere a uma proteína codificada por um gene gag retroviral. Os genes Gag co- dificam as proteínas estruturais do núcleo dos retrovírus. No vírus da imunodeficiência humana (HIV) e no vírus da imunodeficiência símia (SIV) intimamente relacionado, o gene gag codifica um precursor da poliproteína gag (conhecido no caso de HIV como Pr55º%*), o qual é em seguida processado proteoliticamente dentro da proteína da matriz P17 (MA), da proteína do capsídeo p24 (CA), da proteína do nucleoca- psídeo p7 (NC), dos peptídeos espaçadores SP1 e SP2, e do polipep- tídeo p6 que está localizado no término amino da poliproteína gag. Exemplos não limitantes de sequências de proteínas gag de HIV e de SIV são estipulados sob os números de referência UniProt PO4591 e P89153, respectivamente. Métodos para Indução de uma Resposta Imune e Prevenção ou Tra- tamento de Doença
[0092] Em um aspecto, são proporcionados aqui, neste pedido de patente, métodos para indução de uma resposta imune contra um an- tígeno em um indivíduo. Em algumas modalidades, o método compre- ende a administração, ao indivíduo, de uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um inibidor de interleucina 10 (IL-10) e uma vacina. Em modalidades particulares, são administrados mais de um inibidor de IL-10. O um ou mais inibidores de IL-10 podem inibir a I1L-10 viral, a IL-10 celular, ou uma combinação das mesmas. Em algumas modali- dades, o método adicionalmente compreende a administração de um veículo farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, a liberação do ini- bidor de IL-10 e/ou da vacina pode ser facilitada pelo uso de um veícu- lo farmaceuticamente aceitável tal como os descritos aqui, neste pedi- do de patente.
[0093] Em um segundo aspecto, são proporcionados aqui, neste pedido de patente, métodos para prevenção ou tratamento de uma doença (por exemplo, uma doença infecciosa e/ou câncer) em um in- divíduo (por exemplo, um paciente). Em algumas modalidades, o mé- todo compreende a indução de uma resposta imune contra um antíge- no (por exemplo, um antígeno associado com um organismo ou célula que causa a doença) no indivíduo (isto é, a administração, ao indiví- duo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de IL- e de uma vacina), conforme descrito aqui, neste pedido de patente.
[0094] Pode ser usado qualquer número de inibidores de IL-10 nos métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, o inibidor de IL-10 compreende uma proteína (por exemplo, um anticorpo, uma proteína de fusão, uma proteína dominante-negativa, ou uma proteína truncada). Em algumas modalidades, o inibidor de IL-10 compreende uma molécula pequena. Em algumas modalidades, são usados uma proteína de inibição de IL-10 e um inibidor de I1L-10 de molécula pe- quena.
[0095] Em algumas modalidades, a proteína compreende um anti-
corpo. O anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo policlonal, um anticorpo monocional, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anti- corpo monovalente, ou um anticorpo bi-específico. O anticorpo tam- bém pode ser um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo (por exemplo, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, ou scFv bivalente). Como exem- plos não limitantes, o anticorpo pode ser um anticorpo anti-IL-10, um anticorpo anti-receptor de IL-10 (IL-10R), ou um anticorpo anti-CD20. Um exemplo não limitante de um anticorpo anti-IL-10 adequado é o anticorpo anti-IL-10 1F11R1ILALA que está disponível no National Insti- tutes of Health Non-human Primate Reagent Resource, descrito no Exemplo 2 abaixo. Outros anticorpos anti-IL-10 estão disponíveis co- mercialmente. Exemplos não limitantes de anticorpos anti-CD20 inclu- em rituximab, obinutuzumab, ocaratuzumab, ocrelizumab, e veltuzu- mab. Em algumas modalidades, é usada uma combinação de dois ou mais anticorpos diferentes para inibir IL-10.
[0096] Em algumas modalidades, a proteína de inibição de I1L-10 compreende uma proteína de fusão. Em algumas modalidades, a pro- teína de fusão se liga a IL-10, deste modo tornando IL-10 indisponível para interagir com e ativar receptores de IL-10. Como um exemplo não limitante, pode ser usada uma proteína de fusão que compreende um polipeptídeo Fc e uma subunidade de receptor de IL-10 (Fc-IL-10R), ou uma porção do mesmo. Em alguns casos, a proteína de fusão é uma proteína de fusão Fc-IL-10R1. Em algumas modalidades, a prote- ína de fusão inibe a ligação de todas as proteínas a IL-10R (por exem- plo, IL-10R1). Em algumas modalidades, a proteína de fusão tem uma alta afinidade de ligação (por exemplo, mais forte do que cerca de 10º M, 107 M, 108 M, 10º M) por IL-10. Em algumas modalidades, a prote- ína de fusão inibe IL-10 do hospedeiro e/ou viral. Em algumas modali- dades, a proteína de fusão inibe a sinalização de receptores de IL-10.
[0097] Em algumas modalidades, a proteína de inibição de I1L-10 compreende uma porção de uma proteína IL-10 que compreende uma ou mais mutações que aumentam a afinidade da porção da proteína IL-10 por um receptor de IL-10. Por exemplo, a substituição da I1L-10 do vírus Epstein-Barr de alanina para isoleucina na posição 87 reforça sua capacidade de ligação ao receptor, com redução no valor da con- centração inibitória 50% efetiva (para ligação competitiva contra I1L-10 humana marcada com *º*I) de -200 nM para -6nM (Ding Y. et al. J. Exp. Med. (2000) 191:213-224).
[0098] Em algumas modalidades, a proteína de inibição de I1L-10 compreende uma proteína receptora de IL-10 truncada (por exemplo, uma proteína receptora truncada da subunidade IL-10 alfa (IL1ORA)). Em algumas modalidades, a proteína receptora de IL-10 truncada fun- ciona como uma proteína receptora de IL-10 dominante-negativa. Co- mo um exemplo não limitante, uma proteína receptora de IL-10 trunca- da pode reter os domínios extracelular e transmembrana, mas ser de- ficiente em uma ou mais porções da proteína que são necessárias pa- ra sinalização intracelular. As proteínas receptoras truncadas referidas podem ser vantajosas pelo fato de que, em algumas modalidades, po- dem ser expressas em uma célula e localizar para a membrana celu- lar, mas ser deficientes em sua capacidade para ativar a sinalização de IL-10 quando ligadas por um ligante. Exemplos não limitantes de sequências de aminoácidos de proteínas receptoras de IL-10 truncada adequadas são estipuladas em SEQ ID NO: 5 (isto é, uma proteína IL10RA truncada de Macaca mulatta) e SEQ ID NO: 6 (isto é, uma pro- teína IL10RA humana truncada) e incluem sequências de aminoácidos tendo no mínimo 80%, 85%, 90%, ou 95% de identidade com SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. Além disso, em algumas modalidades, uma proteína receptora de IL-10 truncada pode ser expressa na mesma célula que o antígeno. O Exemplo 3 descreve uma modalidade seme-
lhante, onde uma proteína receptora de IL-10 truncada e expressa a partir de um vetor de vacina à base de adenovírus.
[0099] Em algumas modalidades, a proteína de inibição de I1L-10 compreende uma proteína truncada tendo atividade semelhante a IL-
10. Como um exemplo não limitante, pode ser usada uma proteína truncada de interleucina-10 de rhesus cytomegalovirus, a qual é o ortó- logo da sequência LACmvIL-10 de CMV humano (isto é, uma proteína truncada semelhante a IL-10 que é expressa naturalmente em infec- ção por CMV humano). Um exemplo não limitante de uma sequência de aminoácidos de uma proteína truncada adequada tendo atividade semelhante a IL-10 é estipulado em SEQ ID NO: 7 e inclui sequências de aminoácidos tendo no mínimo 80%, 85%, 90%, ou 95% de identi- dade com SEQ ID NO: 7. Além disso, em algumas modalidades, uma proteína truncada tendo atividade semelhante a IL-10 pode ser ex- pressa na mesma célula que o antígeno. O Exemplo 4 descreve uma modalidade semelhante, onde uma proteína truncada de rhesus CMV é expressa a partir de um vetor de vacina à base de adenovírus.
[0100] Em algumas modalidades, a proteína de inibição de I1L-10 compreende uma proteína STAT3 dominante-negativa. Em determina- das modalidades, a proteína STAT3 dominante-negativa interfere com a função de STAT3 normal expressa em uma célula de tal modo que é inibida a proteína STAT3 transdutora de sinalização de receptores de IL-10. Como um exemplo não limitante, uma vacina descrita aqui, nes- te pedido de patente, pode expressar um antígeno e uma proteína STAT3 carregando uma mutação de tirosina para fenilalanina (STAT3- YF) em uma posição geralmente fosforilada na cascata de sinalização de IL-10 (por exemplo, tirosina 705 na proteína STAT3 humana). STAT3-YF mostra um acentuado efeito dominante-negativo sobre a ativação de STAT3 selvagem em células estimuladas. Um exemplo não limitante de uma sequência de aminoácidos de STAT3 humana contendo a mutação Y705F é estipulada em SEQ ID NO: 8 e inclui se- quências de aminoácidos tendo no mínimo 80%, 85%, 90%, ou 95% de identidade com SEQ ID NO: 8 e contendo a mutação Y705F. Como outro exemplo não limitante, uma vacina descrita aqui, neste pedido de patente, pode expressar um antígeno e uma proteína STAT3 carre- gando uma mutação no domínio de ligação ao DNA, conforme obser- vado em alguns casos humanos de síndrome de hiper-lgE. Um exem- plo não limitante de uma sequência de aminoácidos de STAT3 huma- na contendo uma mutação semelhante (isto é, uma deleção de valina 463) é estipulado em SEQ ID NO: 9 e inclui sequências de aminoáci- dos tendo no mínimo 80%, 85%, 90%, ou 95% de identidade com SEQ ID NO: 9 e contendo a deleção V463. Como ainda outro exemplo não limitante, uma vacina descrita aqui, neste pedido de patente, pode ex- pressar um antígeno e uma proteína STAT3 carregando uma mutação no domínio SH2, conforme observado em outros casos humanos de síndrome de hiper-lgE. Um exemplo não limitante de uma sequência de aminoácidos de STAT3 humana contendo uma mutação semelhan- te (isto é, uma mutação V637M) é estipulado em SEQ ID NO: 10 e in- clui sequências de aminoácidos tendo no mínimo 80%, 85%, 90%, ou 95% de identidade com SEQ ID NO: 10 e contendo a mutação V637M. Uma vacina descrita aqui, neste pedido de patente, pode expressar qualquer outra forma dominante-negativa de uma proteína STAT3 co- nhecida na arte.
[0101] Em algumas modalidades, o inibidor de I1L-10 compreende um inibidor de I1L-10 de molécula pequena. Um exemplo não limitante de um inibidor de IL-10 de molécula pequena é AS-101. AS-101 (triclo- ro[1,2-etanodiolato-O,O']-telurato de amônio) é um imunomodulador que tem a seguinte estrutura:
NZ Te —— ec! NH O Da : AS-101 inibe a liberação de IL-10 pelos macrófagos e pelos monóci- tos, e bloqueia a transcrição de IL-10 (vide, por exemplo, Strassmann et al. Cell. Immunol. (1997) 176(2):180-185)) AS-101 também é um agonista de interferon-gama parcial e augmenta a liberação de TNF- alfa.
[0102] Em algumas modalidades, a vacina compreende um poli- nucleotídeo recombinante o qual compreende um genoma viral, ou uma porção do mesmo, e uma sequência de ácido nucleico codifican- do um antígeno. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo recombi- nante adicionalmente compreende uma sequência de ácido nucleico codificando o inibidor de IL-10. Em alguns casos, o antígeno e o inibi- dor de I|L-10 são expressos a partir do mesmo polinucleotídeo recom- binante (isto é, o vetor da vacina também expressa o inibidor de IL-10). Exemplos não limitantes de genomas virais adequados (isto é, que podem ser usados como vetores de vacinas virais) incluem os de cito- megalovírus (CMV), adenovírus, vírus adeno-associado, lentivírus, herpes vírus, alfavírus, um retrovírus, poxvírus, e o vírus da estomatite vesicular. Em alguns casos, a vacina compreende um polinucleotídeo recombinante o qual compreende o genoma de um CMV, ou uma por- ção do mesmo, e uma sequência de ácido nucleico codificando o antí- geno.
[0103] Em algumas modalidades, a vacina é uma vacina deficiente de IL-10. Em algumas modalidades, a vacina deficiente de IL-10 com- preende um polinucleotídeo recombinante o qual compreende um ge- noma viral (por exemplo, um genoma de CMV, genoma de herpes ví- rus, ou genoma de poxvírus), ou uma porção do mesmo, e uma se- quência de ácido nucleico codificando um antígeno, em que o genoma viral ou porção do mesmo compreende uma ou mais mutações imu- nomoduladoras, em que a uma ou mais mutações imunomoduladoras compreendem uma mutação dentro de uma sequência de ácido nu- cleico codificando uma proteína viral que tem atividade semelhante a interleucina-10. A uma ou mais mutações imunomoduladoras podem ser, por exemplo, em uma região regulatória e/ou uma região codifi- cante de proteína da sequência de ácido nucleico codificando a proteí- na viral que tem atividade semelhante a I1L-10. Em algumas modalida- des, a vacina deficiente de IL-10 compreende um polinucleotídeo re- combinante o qual compreende um genoma de citomegalovírus (CMV), ou uma porção do mesmo, e uma sequência de ácido nucleico codificando o antígeno, em que o genoma de CMV ou porção do mesmo compreende uma ou mais mutações imunomoduladoras, em que a uma ou mais mutações imunomoduladoras compreendem uma mutação dentro de uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína que tem atividade semelhante a interleucina-10 de CMV (IL- de CMV).
[0104] Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico codificando o antígeno está localizada dentro do genoma viral (por exemplo, de CMV) ou porção do mesmo. Em outras modalidades, a sequência de ácido nucleico codificando o antígeno está localizada fora do genoma viral ou porção do mesmo (por exemplo, 5' e/ou 3' do genoma viral ou porção do mesmo). Em algumas modalidades, se- quências de ácido nucleico codificando o um ou mais antígenos estão localizadas tanto dentro quanto fora (por exemplo, 5' a e/ou 3' a) do genoma viral ou porção do mesmo. Em algumas modalidades, o poli- nucleotídeo recombinante compreende 1, 2, 3, 4, 5, ou mais genomas virais, ou porções dos mesmos. Quando o polinucleotídeo recombinan- te compreende mais de um genoma viral ou uma porção do mesmo, podem ser feitas mutações imunomoduladoras em sequências de áci-
do nucleico codificando proteínas que tenham atividade semelhante a IL-10 viral (por exemplo, de CMV) em um, alguns, ou todos os geno- mas virais ou porções dos mesmos (por exemplo, uma, algumas, ou todas as sequências de ácido nucleico codificando proteínas que te- nham atividade semelhante a I1L-10 viral).
[0105] Em algumas modalidades, quando se usa um genoma de CMV ou porção do mesmo, o CMV é um CMV que pode infectar célu- las humanas. Em modalidades particulares, o CMV é um CMV que po- de replicar em células humanas. Em alguns casos, o CMV é um CMV que pode somente entrar ou replicar em células humanas. Em algu- mas modalidades, o CMV é um CMV que pode infectar células de pri- mata não humano (por exemplo, células de símio, células de chimpan- zé, ou células de macaco rhesus). Em modalidades particulares, o CMV é um CMV que pode replicar em células de primata não humano. Em alguns casos, o CMV é um CMV que pode somente entrar ou re- plicar em células de primata não humano. Em algumas modalidades, o CMV é um CMV que pode infectar células de roedores (por exemplo, células de camundongo ou células de rato). Em modalidades particula- res, o CMV é um CMV que pode replicar em células de roedores. Em alguns casos, o CMV é um CMV que pode somente entrar ou replicar em células de roedores. Em algumas modalidades, o CMV é selecio- nado entre o grupo que consiste em Citomegalovírus humano (HCMV), Citomegalovírus símio (SCCMV ou AGMCMV), Citomegalovírus de babuíno cytomegalovirus (BaCMV), Citomegalovírus de macaco coruja (OMCMV), Citomegalovírus de macaco esquilo (SMCMV), e Rhesus cytomegalovirus (RRCMV). Exemplos não limitantes de sequências de ácido nucleico que codificam genomas virais adequados incluem as estipuladas sob os números de Sequência de Referência NCBI NC 0062732 (HCMV), FJ4839692 (SCCMV) NC 006150.1 (RhCMV), AY186194.1 (RHCMV cepa 68-1), e DQ120516.1 (Cerco-
pithecine herpesvirus 8 isolado CMV 180.92).
[0106] Em algumas modalidades, a proteína tendo atividade seme- lhante a I1L-10 é uma proteína que tem atividade semelhante a IL-10 de CMV tal como a IL-10 do CMV humano (HCMVIL-10) ou a IL-10 de CMV de macacos rhesus (RRCMVIL-10). Mutações imunomoduladoras podem ser introduzidas em genes para outras proteínas (por exemplo, homólogas), tais como os genes que codificam proteínas tendo ativi- dade semelhante a I1L-10 em SCCMV/AGMCMV, BaCMV, OMCMV, ou SMCMV, dependendo do genoma de CMV em particular sendo usado para construir um polinucleotídeo recombinante para uso em uma va- cina de acordo com os métodos da presente invenção. Em algumas modalidades, uma proteína que tem atividade semelhante a I1L-10 de CMV é codificada pela sequência de ácido nucleico estipulada em SEQ ID NO: 3 ou 4.
[0107] Mutações (por exemplo, mutações imunomoduladoras) in- troduzidas em polinucleotídeos recombinantes para uso em vacinas de acordo com os métodos da presente invenção podem compreender deleções, inserções, e/ou substituições (por exemplo, substituições conservadoras ou não-conservadoras) de um ou mais nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma mutação (por exemplo, uma mutação imunomoduladora) compreende a inserção de um gene, ou uma por- ção de um gene. Em outras modalidades, uma mutação compreende uma inserção de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína, ou uma porção de uma proteína. Em algumas modalidades, uma mutação compreende uma deleção de uma sequência genética inteira, ou uma porção da mesma. Como um exemplo não limitante, um, dois ou mais éxons de um gene podem ser deletados. Em algu- mas modalidades, um polinucleotídeo recombinante compreende a deleção dos primeiros dois éxons de um gene para uma proteína que tem atividade semelhante a IL-10 viral, tal como uma proteína que tem atividade semelhante a IL-10 de CMV (por exemplo, os primeiros dois éxons de RHNCMVIL-10 são deletados).
[0108] Mutações (por exemplo, mutações imunomoduladoras) in- troduzidas em polinucleotídeos recombinantes para uso em vacinas de acordo com os métodos da presente invenção podem aumentar ou diminuir a expressão (por exemplo, expressão de mRNA e/ou proteína) e/ou atividade de um gene. Em algumas modalidades, uma mutação dentro de um gene para uma proteína que tem atividade semelhante a I1L-10 viral, tal como uma proteína que tem atividade semelhante a |IL- de CMV (por exemplo, uma mutação a qual compreende a deleção dos primeiros dois éxons de um gene codificando uma proteína que tem atividade semelhante a I1L-10 de CMV), diminui ou elimina a ativi- dade da proteína tendo atividade semelhante a IL-10 viral (por exem- plo, de CMV). Em algumas modalidades, a redução ou inativação da proteína tendo atividade semelhante a IL-10 viral produz um efeito si- nérgico quando combinada com uma ou mais mutações imunomodu- ladoras diversas.
[0109] As vacinas usadas nos métodos da presente invenção po- dem conter ou codificar qualquer antígeno, ou uma porção do mesmo, contanto que produzam uma resposta imune contra o tipo celular ou organismo patogênico desejado. Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno não de CMV. Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno de doença infecciosa. Em outras modalidades, o antígeno é um antígeno associado a tumor (TAA).
[0110] Em algumas modalidades, o antígeno de doença infecciosa é um antígeno de doença infecciosa bacteriana. Em algumas modali- dades, o antígeno de doença infecciosa é um antígeno viral de doença infecciosa. Em algumas modalidades, o antígeno de doença infecciosa é um antígeno fúngico de doença infecciosa. Em algumas modalida- des, o antígeno de doença infecciosa é um antígeno de protozoário de doença infecciosa. Em algumas modalidades, o antígeno de doença infecciosa é um antígeno helmíntico de doença infecciosa. Em algu- mas modalidades, o antígeno de doença infecciosa é um antígeno bacteriano, viral, fúngico, de protozoário, e/ou helmíntico de doença infecciosa. Em alguns casos, o antígeno é de um parasita. Exemplos não limitantes de antígenos de doenças infecciosas virais adequados são os derivados do vírus da imunodeficiência símia (SIV), do vírus da imunodeficiência humana (HIV), do vírus da hepatite C, do vírus her- pes simplex, do vírus Epstein-Barr, ou qualquer combinação dos mes- mos. Como exemplos não limitantes adicionais, o antígeno de doença infecciosa pode compreender uma proteína do antígeno (gag) especí- fico retroviral (por exemplo, uma proteína gag específica do HIV ou do SIV). Em algumas modalidades, o antígeno de doença infecciosa é um antígeno de doença infecciosa bacteriana de Mycobacterium tubercu- losis.
[0111] Um antígeno associado a tumor (TAA) pode ser derivado de qualquer célula cancerosa. Os antígenos associados a tumor inclu- em, mas não estão limitados a, produtos de oncogenes mutados e ge- nes supressores tumorais mutados, proteínas celulares superexpres- sas ou expressas de maneira aberrante, antígenos que são produzidos por vírus oncogênicos, antígenos oncofetais, glicolipídeos e glicoprote- íÍnas da superfície celular alterados, antígenos que são processados de maneira aberrante em células tumorais para apresentação sobre moléculas do MHC, e antígenos que são específicos do tipo de células tumorais. Em algumas modalidades, um antígeno associado a tumor é um antígeno que recém surge em um tumor (por exemplo, um tumor de um indivíduo). Os neoantígenos referidos podem surgir, por exem- plo, em consequência de uma mutação específica do tumor. Em algu- mas modalidades, um antígeno associado a tumor é uma proteína da superfície celular (por exemplo, que normalmente está presente sobre a superfície de uma célula), ou uma porção da mesma, que é alterada em consequência de uma mutação em um gene codificando a proteína da superfície celular.
[0112] Um antígeno associado a tumor pode ser derivado de, por exemplo, uma célula de câncer colorretal, uma célula de câncer do có- lon, uma célula de câncer anal, uma célula de câncer hepático, uma célula de câncer de ovário, uma célula de câncer de mama, uma célula de câncer de pulmão, uma célula de câncer de bexiga, uma célula de câncer de tiróide, uma célula de câncer pleural, uma célula de câncer pancreático, uma célula de câncer cervical, uma célula de câncer de próstata, uma célula de câncer testicular, uma célula de câncer do du- to biliar, uma célula de tumor carcinoide gastrointestinal, uma célula de câncer de esôfago, uma célula de câncer da vesícula biliar, uma célula de câncer retal, uma célula de câncer de apêndice, uma célula de cân- cer do intestino delgado, uma célula de câncer de estômago (gástrico), uma célula de câncer renal (por exemplo, carcinoma de células re- nais), uma célula de câncer do sistema nervoso central, uma célula de câncer de pele, uma célula de carcinoma de células escamosas da cavidade oral, uma célula de coriocarcinoma, uma célula de câncer de cabeça e pescoço, uma célula de câncer ósseo, uma célula de sarco- ma osteogênico, uma célula de fibrossarcoma, uma célula de neu- roblastoma, uma célula de glioma, uma célula de melanoma, uma cé- lula de leucemia (por exemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crôni- ca, ou leucemia de células cabeludas), uma célula de linfoma (por exemplo, linfoma não Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma de células B, ou linfoma de Burkitt), uma célula de mieloma múltiplo, ou qualquer combinação das mesmas. Em modalidades particulares, o TAA é deri- vado de uma célula de câncer de ovário, uma célula de melanoma, uma célula de câncer de próstata, ou uma combinação das mesmas.
[0113] Exemplos não limitantes de antígenos associados a tumor incluem os antígenos associados a melanoma (MAGESs). As proteínas de MAGEs contêm um domínio conservado que tem cerca de 200 aminoácidos de comprimento e geralmente está localizado próximo à extremidade C-terminal da proteína, embora o domínio conservado esteja localizado mais próximo à porção central de algumas proteínas de MAGEs. Proteínas de MAGEs humanos incluem MAGEA1, MA- GEA2, MAGEAZB, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA5, MAGEA6, MA- GEATP, MAGEA8, MAGEA9, MAGEA9B, MAGEA1O, MAGEA11, MA- GEA12, MAGEA1I3P, MAGEB1, MAGEB2, MAGEB3, MAGEBA, MAGEB5, MAGEB6, MAGEB10, MAGEB16, MAGEB17, MAGEB18, MAGEC1, MAGEC2, MAGEC3, MAGED1, MAGED2, MAGED3 (also known as "trophin" ou "TRO"), MAGED4, MAGED4B, MAGEE1, MAGEE2, MAGEF1, MAGEEG1 (também conhecido como "NSMCE3"), MAGEH1, MAGEL?2, e NDN. Exemplos não limitantes adicionais de antígenos associados a tumor que são úteis para os mé- todos da presente invenção incluem NY-ESO-1 e antígeno específico da próstata (PSA).
[0114] Os métodos da presente invenção podem ser usados para tratar câncer em qualquer estágio. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer avançado. Em algumas modalidades, o câncer é um cân- cer metastático. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer re- sistente a fármacos.
[0115] De modo a aprimorar a magnitude e/ou o caráter de uma resposta imune induzida (por exemplo, em um indivíduo) por uma va- cina usada nos métodos da presente invenção, uma ou mais mutações imunomoduladoras podem compreender uma mutação que aumenta a expressão ou atividade de uma proteína imunoestimuladora. Em al- gumas modalidades, a uma ou mais mutações imunomoduladoras compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica uma pro-
teína imunoestimuladora (por exemplo, a inserção de uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína imunoestimuladora). Con- forme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "proteína imu- noestimuladora" se refere a qualquer proteína que aumenta a magni- tude de uma resposta imune (por exemplo, em um indivíduo) e/ou mo- difica o caráter de uma resposta imune de tal modo que é reforçada a imunidade adquirida (por exemplo, contra um tipo celular ou patógeno desejado).
[0116] Como um exemplo não limitante, a proteína imunoestimula- dora pode ser uma citocina. Em algumas modalidades, a citocina é uma interleucina. Em algumas modalidades, a citocina é uma quimio- cina. Em algumas modalidades, a citocina é um interferon (por exem- plo, um interferon tipo |, um interferon tipo Il (interferon-gama em seres humanos), e/ou outro interferon tipo II). Em algumas modalidades, a citocina é uma linfocina. Em algumas modalidades, a citocina é um fator de necrose tumoral (por exemplo, fator de necrose tumoral-alfa). Em algumas modalidades, a citocina é uma interleucina, uma quimio- cina, um interferon, uma linfocina, um fator de necrose tumoral, ou qualquer combinação dos mesmo. Em modalidades particulares, a ci- tocina codificada por uma sequência de ácido nucleico dentro de um polinucleotídeo recombinante da presente invenção compreende iuma interleucina. Interleucinas adequadas incluem as interleucinas que es- timulam a resposta imune tais como a interleucina-2 (IL-2), a interleu- cina-12 (IL-12), a interleucina-15 (IL-15), ou uma combinação das mesmas.
[0117] Em algumas modalidades, uma mutação imunomoduladora é introduzida em uma sequência de ácido nucleico dentro de um poli- nucleotídeo recombinante (isto é, para ser usado como uma vacina de acordo com os métodos da presente invenção), em que a sequência de ácido nucleico codifica uma proteína que em seu estado não muta-
do produz um ou mais produtos genéticos que inibem a apresentação ao antígeno por uma molécula do complexo maior de histocompatibili- dade. Mutações imunomoduladoras adicionais que podem ser introdu- zidas em polinucleotídeos recombinantes a serem usados como vaci- nas de acordo com os métodos da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, mutações introduzidas nas regiões Rh182, Rh183, Rh184, Rh185, Rh186, Rh187, Rh188, e/ou Rh189 do genoma do RhOCMV ou porção do mesmo, US2, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, e/ou US11 do genoma do HCMV ou porção do mesmo, e homólogos dos mesmos (vide, por exemplo, Hansen et al. J. Virol. (2003) 77:6620-6636). A introdução de mutações nas regiões Rh182, Rh184, Rh185, ou Rh189 do RNOCMV ou nas regiões US2, US3, US6, ou US11 do HOCMV são úteis, por exemplo, para reduzir a capacidade do CMV para inibir a apresentação ao antígeno pelas mo- léculas do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) (por exem- plo, moléculas do MHC classe | e/ou classe 1I). Rh187 e US8 esatão envolvidas na ligação de moléculas do MHC (vide, por exemplo, Tira- bassi et al. J. Virol. (2002) 76:6832-6835) e portanto podem ser usa- das para modular apresentação ao antígeno associada ao MHC.
[0118] Em alguns casos, é útil aumentar o tropismo ou a seletivi- dade para um ou mais tipos de células ou tecidos alvo em particular. Isto pode realizado, por exemplo, introduzindo uma ou mais mutações em um polinucleotídeo recombinante que aumente o tropismo ou a se- letividade para o um ou mais tipos de células ou tecidos desejados. Em algumas modalidades, uma mutação que aumenta ou confere tro- pismo ou seletividade (por exemplo, para uma célula ou tecido alvo) é introduzida em um polinucleotídeo recombinante o qual compreende um genoma viral (por exemplo, genoma de CMV), ou uma porção do mesmo, que é usado como um vetor de vacina. Exemplos não limitan- tes de células alvo adequadas são células de apresentação ao antíge-
no, células tumorais, fibroblastos, células epiteliais, células endoteliais, e combinações das mesmas. Células de apresentação ao antígeno adequadas incluem, mas não estão limitadas a, células dendríticas, macrófagos, e células B. Em modalidades particulares, a célula de apresentação ao antígeno é uma célula dendrítica.
[0119] Outra abordagem para aumentar ou transmitir tropismo ou seletividade para célula ou tecido alvo é introduzir mutações em um polinucleotídeo recombinante (por exemplo, o qual compreende um genoma viral (por exemplo, genoma de CMV), ou uma porção do mesmo, que é usado como um vetor de vacina) que resultem na modi- ficação de proteínas que estão posicionadas no exterior de um vírion. Como um exemplo não limitante, uma proteína do envelope viral pode ser modificada pela adição de um domínio de bloqueio que diminua ou evite a entrada do vírus dentro de uma célula, a menos que o domínio de bloqueio seja clivado, por exemplo, por uma protease expressa por uma célula alvo. Por exemplo, proteases tais como metaloproteases da matriz que são expressas por células tumorais de interesse podem clivar os domínios de bloqueio da proteína de envelope, deste modo possibilitando a entrada do vírus dentro das células tumorais de inte- resse e aumentando o tropismo ou a seletividade para aquelas células alvo.
[0120] Além disso, o tropismo ou a seletividade para um tipo de célula ou tecido alvo pode ser aumentado ou conferido introduzindo uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, dentro de um polinu- cleotídeo recombinante o qual compreende um genoma viral (por exemplo, genoma de de CMV), ou uma porção do mesmo, que é usa- do como um vetor de vacina) que codifica um ligante de direcionamen- to celular. Para servir como exemplos não limitantes, um ligante de direcionamento celular pode ser um anticorpo ou fragmento do mesmo que reconhece um antígeno de célula alvo, um ligante que é reconhe-
cido por um receptor cognato de célula alvo, uma proteína do capsídeo viral que reconhece uma célula alvo, ou qualquer combinação dos mesmos. Exemplos não limitantes de anticorpos e fragmentos dos mesmos que reconhecem antígenos de células alvo incluem anticor- pos que reconhecem DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular ad- hesion molecule-3-grabbing non-integrinl; também conhecida como CD209), CD40, CD64, moléculas do MHC classe Il, e DEC205 (tam- bém conhecida como CD205), todos os quais são expressos por célu- las dendríticas.
[0121] Ligantes que são reconhecidos por receptores cognatos de células alvo incluem, mas não estão limitados a, CD40L (o qual tam- bém é conhecido como CD154 e se liga a CD40, o qual é expresso, por exemplo, por células dendríticas) e ICAM3 (o qual tem alta afinida- de por DC-SIGN que é expresso, por exemplo, por APCs tais como células dendríticas). Em modalidades particulares, o ligante de direcio- namento celular é CD40L/CD154.
[0122] Exemplos não limitantes de proteínas do capsídeo viral que são reconhecidas por células alvo incluem proteínas de fibra de vírus Ad16, Ad35, e Ad37 (isto é, para direcionamento para células dendríti- cas) e glicoproteínas do envelope do Sindbis vírus (as quais também podem ser usadas para direcionamento para células dendríticas, atra- vés de DC-SIGN).
[0123] Mutações adicionais para aumentar o tropismo ou a seleti- vidade alvo que podem ser introduzidas em um polinucleotídeo re- combinante usado em uma vacina de acordo com os métodos da pre- sente invenção incluem mutações (por exemplo, deleções) dentro dos genes Rh13.1, Rh61/Rh60, Rh157.4, Rh157.5, e/ou Rh157.6 de RhCMV, ou homólogos dos mesmos. Ortólogos de CMV humano de Rh13.1, Rh61/Rh60, Rh157.4, Rh157.5, e Rh157.6 incluem, mas não estão limitados a, RL13, UL36 (também conhecido como inibidor viral de apoptose induzida por caspase-8 (vICA)), UL130, UL128, e UL131, respectivamente. Rh13.1 e RL13 estão envolvidos, por exemplo, em inibição do crescimento do vírus em fibroblastos. Rh157.4, Rh157.5, Rh157.6, UL130, UL128, e UL131 codificam três componentes de um receptor de entrada para células não fibroblastos (por exemplo, células endoteliais e epiteliais).
[0124] Os genomas virais (por exemplo, CMV) tipicamente contêm sequências de ácido nucleico que codificam para proteínas que supri- mem a resposta da proteína desdobrada (UPR) em um hospedeiro. Em alguns casos, é desejável adicionalmente suprimir a UPR (por exemplo, em um hospedeiro ao qual está sendo administrado um ini- bidor de IL-10 e uma vacina de acordo com os métodos da presente invenção), por exemplo aumentando mais a expressão ou atividade de uma proteína viral (por exemplo, de CMV) que suprime a UPR. EM ou- tros casos, é desejável diminuir ou eliminar a capacidade de um vírus (por exemplo, CMV) para suprimir a UPR, por exemplo, dminuindo a expressão ou atividade de uma proteína viral (por exemplo, de CMV) que suprime a UPR. Em CMV, proteínas que se sabe que suprimem a UPR incluem, UL50 de Citomegalovírus humano, Rh81 de Rhesus cytomegalovirus, e M50 de Citomegalovírus de camundongo. Em al- gumas modalidades, um polinucleotídeo recombinante usado em uma vacina de acordo com os métodos da presente invenção compreende ou adicionalmente compreende uma mutação imunomoduladora que aumenta ou diminui a resposta da proteína desdobrada (por exemplo, em um indivíduo). Em modalidades variáveis, a mutação imunomodu- ladora que aumenta ou diminui a resposta da proteína desdobrada di- minui ou aumenta a expressão e/ou atividade de UL5O de Citomegalo- vírus humano, Rh81 de Rhesus cytomegalovirus, M50 de Citomegalo- vírus de camundongo, ou um homólogo do mesmo.
[0125] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo recombinan-
te usado em uma vacina de acordo com os métodos da presente in- venção contém uma sequência de ácido nucleico que codifica um marcador selecionável.
A sequência de ácido nucleico pode estar loca- lizada dentro de um genoma viral (por exemplo, de CMV) ou porção do mesmo, fora (por exemplo, 5' e/ou 3' ao) do genoma viral ou porção do mesmo, ou uma combinação dos mesmos.
Um marcador selecionável é útil, por exemplo, quando um polinucleotídeo a ser usado em uma vacina está sendo modificado de modo recombinante, especialmente quando é desejável triar uma população de polinucleotídeos modifica- dos (por exemplo, usando células bacterianas, de levedura, de plan- tas, ou de animais) para os que tenham incorporado a uma ou mais modificações desejadas (por exemplo, inserção, deleção, ou uma combinação das mesmas). Como um exemplo não limitante, um ou mais éxons de um gene de interesse (por exemplo, um gene viral (por exemplo, de CMV) codificando uma proteína que tem atividade seme- lIhante a I1L-10) em um polinucleotídeo recombinante pode ser deletado substituindo de modo recombinante o um ou mais éxons com uma se- quência de ácido nucleico codificando um marcador selecionável (por exemplo, um gene de resistência a antibiótico tal como um gene que codifica resistência a Zeocina). A sequência de ácido nucleico codifi- cando o marcador selecionável opcionalmente pode estar sob o con- trole de um promotor (por exemplo, promotor de EM7) e/ou uma ou mais sequências regulatórias diversas.
Se o polinucleotídeo for modifi- cado de modo recombinante dentro de uma célula (por exemplo, uma célula bacteriana, por exemplo, usando recombinação Red/ET) ou for modificado de modo recombinante e subsequentemente introduzido dentro de uma célula (por exemplo, célula bacteriana, de levedura, ve- getal, ou animal) para triagem, o marcador selecionável pode ser usa- do para identificar quais células contêm polinucleotídeos que tenham incorporado uma modificação de interesse.
O tratamento das células que contêm os polinucleotídeos recombinantes com Zeocina vai identi- ficar quais células contêm polinucleotídeos recombinantes que tenham incorporado o gene de resistência a antibiótico (isto é, as células que sobrevivem depois de tratamento com Zeocina devem ter incorporado o gene de resistência a antibiótico). Caso desejado, os polinucleotí- deos recombinantes podem ser adicionalmente triados (por exemplo, purificados das células, amplificados, e sequênciados), de modo a ve- rificar que a modificação desejada foi introduzida de modo recombi- nante dentro do polinucleotídeo na posição correta.
[0126] Quando o marcador selecionável é um gene de resistência a antibiótico, o gene pode conferir resistência a Zeocina, ampicilina, tetraciclina, ou outro antibiótico apropriado que vai ser de conhecimen- to de uma pessoa versada na arte. Em algumas modalidades, é usado um marcador selecionável que produz um fenótipo visível, tal como a cor de um organismo ou população de organismos. Como um exemplo não limitante, o fenótipo pode ser examinado cultivando os organismos (por exemplo, células ou outros organismos que contenham o polinu- cleotídeo recombinante) e/ou sua progênie sob condições que resul- tem em um fenótipo, em que o fenótipo pode não ser visível sob con- dições de crescimento ordinárias.
[0127] Em algumas modalidades, o marcador selecionável usado para identificar células que contenham um polinucleotídeo contendo uma modificação de interesse é uma proteína com marcador fluores- cente, uma marca química, um indicador químico, ou uma combinação das mesmas. Em outras modalidades, o marcador selecionável res- ponde a um estímulo, a um bioquímico, ou a uma alteração nas condi- ções ambientais. Em alguns casos, o marcador selecionável responde à concentração de um produto metaboólico, um produto protéico, um fármaco, um fenótipo celular de intereses, um produto celular de inte- resse, ou uma combinação dos mesmos.
[0128] Comumente, polinucleotídeos recombinantes que são usa- dos em vacinas vão conter uma ou mais sequências regulatórias. À uma ou mais sequências regulatórias podem estar localizadas dentro de um genoma viral (por exemplo, de CMV) ou porção do mesmo, fora (por exemplo, 5' e/ou 3' ao) do genoma viral ou porção do mesmo, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências regulatórias são introduzidas de modo recombinante dentro do polinucleotídeo. Por exemplo, uma ou mais sequências re- gulatórias podem ser introduzidas dentro de um genoma viral ou por- ção do mesmo, as quais não estão presentes no genoma viral natural. Alternativamente, uma sequência regulatória que está presente no ge- noma viral natural pode ser deletada ou modificada de modo diverso.
[0129] Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências regu- latórias controlam a expressão e/ou atividade de um gene ou uma re- gião dentro de um genoma viral (por exemplo, de CMV), ou uma por- ção do mesmo. Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências regulatórias controlam a expressão e/ou atividade de uma sequência codificando antígeno. Em algumas modalidades, a uma ou mais se- quências regulatórias controlam a expressão e/ou atividade de uma sequência codificando proteína imunoestimuladora. Em algumas mo- dalidades, a uma ou mais sequências regulatórias controlam a expres- são e/ou atividade de uma sequência codificando marcador selecioná- vel. Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências regulatórias controlam a expressão e/ou atividade de um gene ou uma região den- tro de um genoma viral ou uma porção do mesmo, uma sequência co- dificando antígeno, uma sequência codificando proteína imunoestimu- ladora, uma sequência codificando marcador selecionável, uma varian- te das mesmas, ou uma combinação das mesmas.
[0130] Dependendo do sistema celular usado, a uma ou mais se- quências regulatórias podem compreendem um ou mais elementos de controle de transcrição e translação, incluindo promotores, reforçado- res de transcrição, terminadores de transcrição, iniciadores de transla- ção (por exemplo, sequências Kozak, sequências de entrada ribossô- mica interna), sequências intrônicas, e semelhantes.
Promotores úteis podem ser derivados de vírus ou de qualquer outro organismo, por exemplo, organismos procarióticos ou eucarióticos.
Os promotores também podem ser indutíveis (isto é, capazes de responder a fatores ambientais e/ou estímulos externos que possam ser controlados artifi- cialmente). Exemplos não limitantes de promotores incluem promoto- res bacterianos T7 não modificados e modificados tais como o promo- tor de EM7, o promotor de EF1a, promotores de RNA polimerase || (por exemplo, pGAL7 e pTEF1), promotores de RNA polimerase Ill (por exemplo, RPR-tetO, SNR52, e tRNA-tyr), o promotor precoce do SVA40, o promotor de repetição de terminal longo do vírus do tumor mamário de camundongo (LTR); o promotor tardio maior do adenoví- rus (Ad MLP); um promotor do vírus herpes simplex (HSV), um promo- tor de citomegalov[irus (CMV) tal como a região do promotor precoce imediato do CMV (CMVIE), um promotor do vírus de sarcoma de rous (RSV), um promotor nuclear pequeno humano U6 (U6), um promotor U6 reforçado, um promotor H1 humano (H1), etc.
Sequências de poli- adenilação e terminadores adequados incluem, mas não estão limita- dos a, sequências de poliadenilação e terminadoras SV40, hGH, BGH, rbGlob SNR52, e RPR.
Adicionalmente, vários sítios de ligação de primer podem ser incorporados em um vetor para facilitar a clonagem, o sequênciamento, a genotipagem do vetor, e semelhantes.
Em algu- mas modalidades, um "promotor CAG" é usado como a sequência re- gulatória, a qual compreende um reforçador precoce de CMV, um promotor do gene de beta-actina de galinha, um primeiro éxon do gene de beta-actina de galinha, um primeiro íntron do gene de beta-actina de galinha, e um aceitador de emenda do gene de beta-globina de co-
elho. Promotores podem conter sequências intrônicas (por exemplo, uma sequência de íntron A de EF1a). Outras sequências de promotor, reforçador, terminador, e de ligação a primer adequadas serão pron- tamente de conhecimento de uma pessoa versada na arte.
[0131] Em algumas modalidades, o inibidor de I1L-10 e a vacina são administrados ao indivíduo antes de se desenvolverem quaisquer sintomas ou sequelas da doença (por exemplo, doença infecciosa, ou câncer). Em outras modalidades, o indivíduo tem sinais, sintomas, ou sequelas da doença. Em alguns casos, o tratamento resulta em uma redução ou eliminação dos sinais, sintomas, ou sequelas da doença.
[0132] Em algumas modalidades, prevenção e/ou tratamento inclui a administração de um inibidor de IL-10 e de uma vacina diretamente a um indivíduo. Como um exemplo não limitante, o inibidor de IL-10e a vacina podem ser liberados diretamente para um indivíduo, por exem- plo, por injeção local ou administração sistêmica. Em alguns casos, é usada injeção intratumoral. Em algumas modalidades, a vacina e o inibidor de IL-10 estão presentes na mesma composição (por exemplo, presentes em uma única composição farmacêutica que inclui um veí- culo farmaceuticamente aceitável). Em alguns casos, um antígeno (ou uma porção do mesmo) e um inibidor de IL-10 (por exemplo, um inibi- dor de IL-10 de molécula pequena ou uma proteína inibidora de IL-10) são combinados em uma única composição. Em alguns casos, um ve- tor de vacina e um inibidor de IL-10 são combinados em uma única composição. Em alguns casos, um antígeno e um inibidor de IL-10 são expressos a partir de um único polinucleotídeo recombinante.
[0133] O inibidor de IL-10 e a vacina podem ser administrados mais ou menos ao mesmo tempo (por exemplo, dentro de cerca de 1, 2,3,4,5,6,7,8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, ou 24 horas um do outro), ou podem ser administrados sequenci- almente. Em algumas modalidades, o inibidor de I1L-10 é administrado antes da vacina (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais dias antes da vacina ser administrada). Em algumas modali- dades, o inibidor de IL-10 é administrado depois da vacina (por exem- plo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais dias depois da vacina ser administrada). Em algumas modalidades, o inibidor de IL-10 é administrado tanto antes quanto depois da vacina ser administrada. Em algumas modalidades, somente é administrada uma dose do inibi- dor de IL-10. Em algumas modalidades, são administradas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais doses do inibidor de IL-10. Em algumas modali- dades, é administrada somente uma dose da vacina. Em algumas mo- dalidades, são administradas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais doses da vacina (por exemplo, são administradas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais doses de reforço). Quando são administradas 2 ou mais doses da vacina, algumas ou todas as doses da vacina podem ser precedi- das e/ou seguidas por uma dose do inibidor de IL-10.
[0134] Se o inibidor de IL-10 e a vacina forem administrados mais ou menos ao mesmo tempo ou sequencialmente, o inibidor de IL-10 e a vacina podem ser administrados por vias diferentes, ou pela mesma via.
[0135] Uma dose particular do inibidor de IL-10 e/ou da vacina po- de ser administrada de uma vez, ou pode ser dividida em 2, 3,4, 5,6, 7, 8, ou mais subdoses. As subdoses podem ser administradas com cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24, ou mais horas de diferença, com cerca de 1,2,3,4, 5, 6, 7, ou mais dias de diferença, ou outro intervalo apropriado.
[0136] Em algumas modalidades, uma dose do inibidor de I1L-10 (por exemplo, uma proteína tal como um anticorpo ou proteína de fu- são) é administrada em uma concentração de cerca de 1,2,3,4,5,
10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 mg/mL. Em alguns casos, é usada uma concentração de cerca de mg/mL.
[0137] Em algumas modalidades, uma dose da vacina compreen- de entre cerca de 10º e cerca de 10º? unidades formadoras de placa (pfu) (por exemplo, cerca de 10º, 105, 106, 107, 108, 10º, 10%º, 10, 1072, ou 10º pfu). Em algumas modalidades, uma dose compreende cerca de 10º pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 107 pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 108 pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10? pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10? pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 107 pfu, cerca de 105 pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10" pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º? pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º? pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 107 pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 108 pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10? pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10? pfu, cerca de 107 pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 107 pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 107 pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 107 pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 107 pfu a cerca de 10? pfu, cerca de 107 pfu a cerca de 10º? pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 108 pfu a cerca de 10" pfu, cerca de 108 pfu a cerca de 10? pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º? pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10"? pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 103 pfu, cerca de 10%º pfu a cerca de 10 pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º? pfu, cerca de 10º pfu a cerca de 10º? pfu, cerca de 10! pfu a cerca de 10"? pfu, cer-
ca de 10º pfu a cerca de 103 pfu, ou cerca de 10º? pfu a cerca de 103 pfu. Em modalidades particulares, uma dose compreende entre cerca de 10º e cerca de 2 x 10"! pfu.
[0138] Em algumas modalidades, compostos ou medicações adi- cionais podem ser co-administrados ao indivíduo. Os compostos ou medicações podem ser co-administrados para o fim de aliviar sinais ou sintomas da doença sendo tratada, reduzir efeitos colaterais causdos por indução da resposta imune, etc. A dose do inibidor de I1L-10, da vacina, e/ou de quaisquer compostos ou medicações adicionais vai variar dependendo de fatores tais como o antígeno em particular para o qual uma resposta imune esteja sendo induzida, as características do inibidor de IL-10 escolhido, da vacina, ou de outro composto, o es- tado imune do indivíduo, a idade do indivíduo, o peso do indivíduo, condições médicas concomitantes, via de administração, etc.
[0139] Em algumas modalidades, uma amostra (por exemplo, uma amostra de teste ou uma amostra de referência) é obtida de um indiví- duo (por exemplo, um indivíduo no qual deve ser induzida uma respos- ta imune contra um antígeno ou um indivíduo no qual uma doença de- ve ser prevenida e/ou tratada). Em modalidades particulares, a amos- tra é obtida para os fins de determinar a presença ou o nível de um ou mais biomarcadores. A determinação da presença ou o nível de um ou mais biomarcadores pode ser usada para, como exemplos não limitan- tes, determinar a resposta ao tratamento ou selecionar uma composi- ção apropriada ou método apropriado para a prevenção ou para o tra- tamento de uma doença.
[0140] Em algumas modalidades, é obtida uma amostra de teste de um indivíduo. A amostra de teste pode ser obtida antes e/ou depois de ser administrado um inibidor de IL-10 e/ou uma vacina ao indivíduo. Exemplos não limitantes de amostras adequadas incluem sangue, so- ro, plasma, líquido cefalorraquidiano (CSF), tecido, saliva, urina, e combinações dos mesmos. Em alguns casos, a amostra compreende tecido normal. Em outros casos, a amostra compreende tecido anor- mal (por exemplo, tecido cancerígeno). A amostra também pode ser composta de uma combinação de células normais e anormais (por exemplo, células cancerosas). Em alguns casos, a amostra é obtida como uma amostra de biópsia ou uma amostra de aspirado de agulha fina (FNA). Em algumas modalidades, o tecido compreende um ou mais tipos de células imunes.
[0141] Em algumas modalidades, é obtida uma amostra de refe- rência. A amostra de referência pode ser obtida, por exemplo, do indi- víduo (isto é, o indivíduo sendo tratado ou no qual esteja sendo induzi- da uma resposta imune). A amostra de referência também pode ser obtida de um indivíduo diferente e/ou de uma população de indivíduos. Em alguns casos, a amostra de referência ou é obtida do indivíduo, de um indivíduo diferente, ou de uma população de indivíduos antes e/ou depois do inibidor de IL-10 e/ou da vacina ser administrado ao indiví- duo, e compreende tecido normal. Em outros casos, a amostra de re- ferência compreende tecido anormal e é obtida do indivíduo e/ou de um indivíduo diferente ou de uma população de indivíduos.
[0142] Em algumas modalidades, o nível d eum ou mais biomar- cadores é determinado na amostra de teste e/ou na amostra de refe- rência. Exemplos não limitantes de biomarcadores adequados incluem antígenos, anticorpos contra antígenos, números e/ou níveis de ativa- ção de células imunes, capacidade para respostas de células imunes a um antígeno depois de estimulação in vitro, proteínas imunoestimula- tórias, citocinas, interleucinas, fatores de necrose tumoral, interferons, e outras moléculas que têm funções na modulação de respostas imu- nes. Exemplos não limitantes adicionais de biomarcadores adequados incluem proteína C-reativa, interferon-gama, IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, I1L-10, IP-10, I1L-12, I1L-15, I1L-13, I1L-17, 11-21, 11-23, I1P-10, M-
CSF, MCP-1, MIP-1alfa, MIP-1beta, fator de crescimento transforman- te-beta, fator de necrose tumoral-alfa, IFN-y CXCL13, CXCR5, CCR7, CD3, CD4, CD8, CD27, CD45RA, CD80, CD83, prostaglandina E2, e combinações dos mesmos.
[0143] Tipicamente, o nível de um biomarcador em uma amostra (por exemplo, uma amostra de teste) é comparado com o nível do bi- omarcador em uma amostra de referência. Dependendo do biomarca- dor, um aumento ou uma diminuição em relação a uma amostra de referência ou controle normal pode ser indicativo dea presença de uma doença, ou de resposta ao tratamento para uma doença. Em algumas modalidades, um nível aumentado de um biomarcador em uma amos- tra (por exemplo, uma amostra de teste), e, portanto, a presença de uma doença (por exemplo, uma doença infecciosa ou câncer), risco aumentado da doença, ou resposta ao tratamento é determinado quando os níveis do biomarcador são no mínimo, por exemplo, cerca de 1,1 vez, 1,2 vez, 1,3 vez, 1,4 vez, 1,5 vez, 1,6 vez, 1,7 vez, 1,8 vez, 1,9 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 ve- zes, 1,000 vezes, ou 10,000 vezes maiores em comparação com um controle negativo. Em outras modalidades, um nível diminuído de um biomarcador na amostra de teste, e, portanto, a presença da doença, risco aumentado da doença, ou resposta ao tratamento é determinado quando os níveis do biomarcador são no mínimo, por exemplo, cerca de 1,1 vez, 1,2 vez, 1,3 vez, 1,4 vez, 1,5 vez, 1,6 vez, 1,7 vez, 1,8 vez, 1,9 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 ve- zes, 1,000 vezes, ou 10,000 vezes menores em comparação com um controle negativo.
[0144] Os níveis de biomarcador podem ser detectados usando qualquer método conhecido na arte, incluindo o uso de anticorpos es- pecíficos para os biomarcadores. Métodos de exemplo incluem, sem limitação, POR, Western Blot, dot blot, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), imunoprecipitação, imunoflu- orescência, análise FACS, eletroquimiluminescência, e ensaios de múltiplas microesferas (por exemplo, usando microesferas fluorescen- tes ou Luminex). Em alguns casos, é empregado sequênciamento de ácido nucleico.
[0145] Em determinadas modalidades, a presença de níveis dimi- nuídos ou aumentados de um ou mais biomarcadores é indicada por um sinal detectável (por exemplo, um blot, fluorescência, quimilumi- nescência, cor, radioatividade) em um imunoensaio ou reação de PCR (por exemplo, PCR quantitativo). Este sinal detectável pode ser com- parado com o sinal de uma amostra de referência ou com um valor limite.
[0146] Em algumas modalidades, os resultados das determina- ções dos níveis de biomarcadores são registrados em um meio tangí- vel. Por exemplo, podem ser registrados os resultados de ensaios de diagnóstico (por exemplo, a observação da presença ou redução ou aumento da presença de um ou mais biomarcadores) e o diagnóstico de se ou não existe um aumento do risco ou a presença de uma doen- ça (por exemplo, uma doença infecciosa ou câncer) ou se ou não um indivíduo está respondendo a tratamento, por exemplo, em papel ou em meio eletrônico (por exemplo, fita de áudio, um disco de computa- dor, um CD, um pen drive, etc.).
[0147] Em outras modalidades, os métodos adicionalmente com- preendem a etapa de proporcionar um diagnóstico ou um prognóstico para o paciente (isto é, o indivíduo) e/ou os resultados do tratamento. Kits
[0148] Em outro aspecto, são proporcionados kits aqui, neste pe- dido de patente. Em algumas modalidades, o kit compreende um inibi- dor de IL-10 descrito aqui, neste pedido de patente, e uma vacina des- crita aqui, neste pedido de patente. Em algumas modalidades, o kit é para indução de uma resposta imune contra um antígeno (por exem- plo, em um indivíduo). Em outras modalidades, o kit é para o kit é para prevenção ou tratamento de uma doença. Em modalidades particula- res, o kit é para prevenção ou tratamento de uma doença infecciosa descrita ed aqui, neste pedido de patente, e/ou de um câncer descrito aqui, neste pedido de patente.
[0149] Os kits da presente invenção podem ser acondicionados em um modo que permite o armazenamento ou uso seguro ou conve- niente (por exemplo, em uma caixa ou outro recipiente tendo uma tampa). Tipicamente, os kits da presente invenção incluem um ou mais recipientes, cada recipiente armazenando um componente em particu- lar do kit, tal como um inibidor de 11-10, uma vacina, um reagente, uma amostra de controle, e assim por diante. A escolha do recipiente vai depender da forma particular de seu conteúdo, por exemplo, um com- ponente do kit que esteja em forma líquida, em forma de pó, etc. Além disso, os recipientes podem ser feitos de materiais que são desenha- dos para maximizar a vida útil dos componentes do kit. Como um exemplo não limitante, componentes do kit que sejam sensíveis à luz podem ser armazenados em recipientes que sejam opacos.
[0150] Em algumas modalidades, o kit contém um ou mais reagen- tes. Em alguns casos, os reagentes são úteis para preparar um inibi- dor de IL-10 e/ou uma vacina para administração a um indivíduo (por exemplo, veículos farmaceuticamente aceitáveis), ou para obter ou processar uma amostra (por exemplo, para a medição de biomarcado- res). Em algumas modalidades, o kit contém parafernália para adminis- tração do inibidor de IL-10 e/ou da vacina ao indivíduo (por exemplo,
seringas, agulhas, frasquinhos), para obtenção de uma amostra de um indivíduo (por exemplo, tubos de sangue ou tubos de outros fluidos biológicos, seringas, equipamento descartável para preparar um local de punção venosa), ou para processamento de amostra obtida de um indivíduo (por exemplo, tubos de teste, lâminas). Em ainda outras mo- dalidades, o kit também contém instruções para utilização. Exemplos
[0151] A presente invenção será descrita em maiores detalhes por meio de exemplos específicos. Os exemplos que se seguem são ofe- recidos para fins ilustrativos somente, e não se destinam a limitar a invenção de qualquer maneira. Os peritos na arte vão prontamente reconhecer uma variedade de parâmetros não críticos os quais podem ser alterados ou modificados para produzir essencialmente os mesmos resultados. Exemplo 1. Modulação da via de IL-10 para aprimoramento da eficácia da vacina Objetivos específicos
[0152] A meta deste projeto é demonstrar o aprimoramento das vacinas de SIV à base de rhesus cytomegalovirus (RRCMV/SIV) atra- vés da modulação da via da IL-10, por exemplo, de modo a obter efi- cácia protetora significativamente maior do que 50%, respostas imu- nes mais rápidas, uma maior concentração de semelhantes respostas em células T CD4+, ou um ambiente de citocina alterado permitindo maior eficácia das respostas induzidas.
[0153] FOi descoberto que as vacinas de RHCMV/SIV de segunda geração carecendo do gene de IL-10 viral (RROCMVAIL10/SIV) prote- gem bebês primatas não humanos que não têm imunidade contra RhCMV anterior, ao passo que as vacinas de RHCMV/SIV de primeira geração (IL-10-intacta) não. As vacinas de primeira geração se com- provaram eficazes somente em macacos RhCMV-soropositivos selva-
gens (wt) tendo anticorpos neutralizantes para IL-10 viral gerados em resposta a infecção por wtRhCMV anteior.
[0154] A importância deste trabalho é que proporciona (i) novas vacinas contra HIV candidatas com maior eficácia em alguns ou em todos os segmentos da população, (ii) uma explicação mecanicista co- erente para padrões previamente obscuros de proteção da vacina de RhoMV/SIV, (iii) insight imunológico das consequências da modulação da via de IL-10 celular e viral (clL-10 e vIL-10, respectivamente), e (iv) novas ferramentas farmacológicas para controle osbre a sinalização de IL-10.
[0155] Os dados preliminares do presente estudo mostram que macacos rhesus infectados por rhesus cytomegalovirus selvagem (wtRhCoMV) montam respostas imunes para interleucina-10 viral (vIL- 10), a qual na maioria dos casos leva à geração de anticorpos neutra- lizantes. A vacina RRCMV/SIV protege rigosoramente -50% de seme- lhantes macacos wtRhCMV-soropositivos mas não wtRhCMV- soronegativos contra estímulo com SIV. No entanto, uma vacina de RhCMV/SIV de segunda geração carecendo do gene de IL-10 viral, não protege macacos soronegativos. Além disso, uma série de expe- rimentos mostra que a vacinação com RhCMVdIL10/SIV está associa- da com reduzida sinalização de IL-10 no hospedeiro geral, sugerindo que a completa inibição de IL-10 do hospedeiro e/ou IL-10 viral pode levar a ganhos de eficácia adicional tanto para vacinas contendo viL- quanto deficientes de vIL-10.
[0156] Vão ser empregadas amostras de animais vacinados em um modo tal para produzir uma gama de função de IL-10 viral a partir de nenhuma (em animais recebendo RHCMVdIL10), até intermediária (em macacos wtRhoMV+ com níveis variáveis de anticorpos neutrali- zantes anti-viL-10), até máxima (em macacos wtRhCMV- recebendo RhCoMV/SIV). Além disso serão testadas a efiácia de RRCMVdIL10 em animais bebês e em adultos, na presença ou ausência de inibição de IL-10 do hospedeiro.
[0157] Foi sugerida a hipótese de que a vacinação com RhCMV/SIV no contexto de sinalização de IL-10 do hospedeiro inibida vai atingir respostas imunes mais rápidas, concentradas em células T CD4+ com atividade anti-HIV conhecida (Emu et al., J. Virol. (2005) 79:14169-14178), no contexto de um ambiente de citocinas inatas alte- rado. Coletivamente estes aprimoramentos vão proporcionar uma va- cina mais eficaz. Os objetivos específicos do presente estudo são:
[0158] Objetivo 1. Definir as assinaturas transcriptômica e imuno- lógica de diminuição da sinalização de IL-10 usando amostras previa- mente coletadas. Aqui, é determinada a verdadeira assinatura trans- criptômica da sinalização de I1L-10 do hospedeiro usando amostras de animais que receberam anticorpo anti-IL-10. Em seguida são avaliadas as respostas do hospedeiro a vacinação com RNCMV/SIV na presença de níveis variáveis de neutralização da IL-10 viral para determinar co- mo a neutralização referida afeta (i) a sinalização de IL-10 do hospe- deiro, (ii) a probabilidade de gerar uma assinatura transcriptômica as- sociada com proteção, e (iii) a eficácia da vacina.
[0159] Objetivo 2. Testar o efeito da inibição de IL-10 celular sobre as respostas imunes para e a eficácia anti-SIV de vacinas deficientes de I1L-10 viral em macacos bebês (wtRhCMV-soronegativos). 50% dos macacos rhesus bebês foram protegidos contra SIV por uma vacina RhCoMVdIL10/SIVgag carecendo de IL-10 viral, mas nenhum foi prote- gido por vacina RHCMV/SIVgag de primeira geração. IL-10 viral incen- tiva a expressão de IL-10 celular disseminada pelo hospedeiro, resul- tando em maiores níveis de clL-10 circulante, respostas imunes ate- nuadas, e persistência viral. Como a deleção de IL-10 viral presumi- velmente interfere com a resposta de IL-10 do hospedeiro, foi racioci- nado que interferência adicional (através da administração de anticor-
po neutralizante anti-IL-10) vai aumentar mais a eficácia da vacina. Neste objetivo é administrada RHCMVdIL10/SIVgag isolada ou na pre- sença de anticorpo anti-clL-10 neutralizante, para determinar se o úl- timo regime vai alterar o caráter da resposta imune resultante e/ou atingir >50% de eficácia da vacina em bebês.
[0160] Objetivo 3. Testar o efeito da inibição de IL-10 celular sobre as respostas imunes para e a eficácia anti-SIV de vacinas deficientes de I1L-10 viral em macacos adultos (wtRhCMV-soropositivos). As vaci- nas RhOMV/SIVgag de primeira geração (com vIL-10 intacta) foram eficazes em -50% dos macacos adultos previamente infectados com RhCMV e, portanto, tendo níveis variáveis de anticorpos neutralizantes anti-vIL-10. Neste objetivo vai ser testado se a completa inibição de IL- viral e/ou celular vai atingir uma eficácia significativamente maior. Macacos adultos vão ser testados para aprimoradas respostas imunes e/ou capacidade para controlar rigorosamente o estímulo por SIV de- pois de vacinação com RNCMVdIL10/SIVgag na presença ou ausência de anticorpos anti-clL-10 neutralizantes.
[0161] Juntos, estes estudos vão delinear as vantagens de sinali- zação de IL-10 inibida na eficácia da vacina RICMV/SIV e apontar o modo para novos regimes de vacina que sejam eficazes para proteção contra doenças infecciosas e câncer. Significância Vacinas de RRCMV/SIV de primeira geração protegem 50% dos ani- mais wtRhCMV+ adultos
[0162] Vacinas com vetor de Rhesus cytomegalovirus (RRCMV) foram desenhadas para trabalhar durante uma janela de vulnerabilida- de hipotética em infecção inicial por HIV/SIV (1-6) com base em sua capacidade para provocar células T específicas para o vírus de alta frequência, diferenciadas efetoras, em sítios de replicação viral inicial (7-9). Na verdade, o padrão de proteção observado em aproximada-
mente 50% dos macacos rhesus vacinados com vetor de RICMV/SIV depois de estímulo com SIVmac239 intrarretal não foi inconsistente com intercepção imunológica do reservatório de SIV nascente no por- tal de entrada viral, antes da disseminação sistêmica (7). Os macacos protegidos manifestaram viremia transitória no início da infecção, se- guida por controle dos níveis plasmáticos de SIV até abaixo do nível de detecção, exceto por "desvios" virais plasmáticos ocasionais que diminuíram ao longo do tempo, e na necrópsia demonstraram somente níveis traço de RNA e DNA de SIV associado ao tecido usando ensai- os ultrassensíveis.
[0163] Uma característica chave deste trabalho foi a decisão de vacinar animais wWtRhCMV-soropositivos, devido à necessidade de va- cinar uma população humana adulta que é predominantemente infec- tada por citomegalovírus e aos efeitos associados prováveis da imuni- dade anti-vetor pré-existente. Apesar desta imunidade pré-existente, animais wtRhCMV-soropositivos montam respostas de células T para o antígeno de vacina, as quais se assumiu que formam parte do me- canismo de proteção. No entanto, agora ficou claro que as respostas de células T são insuficientes isoladas para explicar a proteção — que também é requerida alguma outra característica do hospedeiro pré- existente ou característica da resposta imune inata (10,11). Neste con- texto, a natureza da resposta imune do hospedeiro para infecção por CMV prévia se torna uma variável experimental chave, uma vez que se sabe que a infecção por CMV tem um impacto importante sobre a mai- oria dos parâmetros imunes (12,13). Correlatos de proteção mediada por RRCMV/SIV
[0164] O mecanismo de proteção mediada por RICMV/SIV ainda não foi completamente entendido. Uma resposta imune adaptiva para o antígeno da vacinação é requerida, porque vacinas "vazias" care- cendo de antígeno não provocam imunidade (14). Na verdade, as va-
cinas intactas provocam respostas de céluals T unicamente amplas com fenótipo de células de memória efetoras e restrição de MHC não- canônica (8,9,15); além disso, nenhuma vacina candidata RHCMV/SIV que não tenha êxito em provocar células T restritas a Mamu-E foi de- monstrada como sendo protetora. No entanto, a frequência de seme- lhantes células T dentro de uma coorte vacinada não prevê quantitati- vamente a eficácia da vacina.
[0165] Um estudo transcriptômico para identificar novos potenciais correlatos de proteção foi empreendido previamente (11). Os resulta- dos demonstram uma notável separação entre animais protegidos e não animais protegidos muito cedo depois da vacinação. A assinatura transcriptômica de proteção derivada da análise aparece dentro de um dia da primeira administração da vacina e é mais forte por três dias depois da vacinação primária — apontando para uma resposta imune inata que separa animais protegidos de não protegidos. As respostas imunes inatas referidas envolvem padrões moleculares associados com deteção de patógeno do hospedeiro - e a resultante produção de citocinas e quimiocinas tais como IP-10.
[0166] A análise de genes que compõem a assinatura protetora produz, conforme esperado, uma rica rede de genes envolvidos na função imune inata. Nós altamente conectados nesta rede incluem CD80 (regulado negativamente), STAT1, IRF1, IRF7, TLR3, TLRA, e TLR7. A presença de CD80 em particular é interessante para este es- tudo, porque previamente foram identificados CD80 como entre as mo- léculas mais altamente reguladas negativamente em macacos wtRhCMV-soropositivos vs. wtRhoMV-soronegativos (vide, Dados Pre- liminares e (13)). Além disso, foi identificada uma sub-rede com muitos genes relacionados com a sinalização de citocina e reportada como sendo particularmente rica em genes relacionados com a função da |IL-
10. Nós altamente conectados nesta rede incluem TNF, JUN, MAP3K,
e STAT3. De maneira interessante, é demonstrado que CD14 está re- gulado positivamente nesta rede, e a expansão de células T CD14+ é outro efeito da infecção por wtRhCMV. O receptor de IL-10 (IL1ORA) também é mostrado como um membro periférico da rede, o qual é re- gulado positivamente em animais protegidos. A regulação positiva de receptores é uma resposta homeostática possível à ausência de uma determinada citocina. RhCMV carrega um gene de IL-10 viral que limita a imunidade do hos- pedeiro
[0167] Foi descoberto em 2000 que os citomegalovírus de prima- tas codificam e expressam uma proteína semelhante a I1L-10 (16). A IL- celular é uma citocina multifuncional que tem efeitos supressores sobre inflamação e a produção de citocinas (17). Proteínas I1L-10 vi- rais, como seus homólogos de proteína do hospedeiro, inibem a sínte- se de citocinas por células T ativadas, inibem a proliferação de células T específicas do antígeno e induzem a proliferação e a secreção de Ig em células B ativadas (18,19). Está bem documentado que a infecção com CMV pode ter efeitos imunossupressores in vitro (20-22). Portan- to, faz sentido que a posse de um gene semelhante a IL-10 vai permitir que o CMV subverta respostas imunes mediadas por células antivirais no serviço de estabelecer uma infecção latente. Na verdade, atual- mente os presentes requerentes sabem que a IL-10 viral altera as res- postas precoces do hospedeiro para antígenos virais mitigando a res- posta de células efetoras inatas para infecção primária por RICMV (23). Existe uma redução proporcional na qualidade e na quantidade de respostas imunes adaptativas específicas para RHCMV.
[0168] Crucialmente, as respostas imunes para RHCMV incluem níveis variáveis de anticorpos neutralizantes anti-viL-10 (vide, Dados Preliminares abaixo). De modo interessante, esta informação significa que uma primeira infecção por CMV na maioria dos casos é imunologi-
camente distinta de superinfecções subsequentes, as quais normal- mente ocorrem no contexto de algum nível de neutralização de IL-10 viral. De modo similar, a vacinação de macacos wtRhCMV-soronega- tivos é essencialmente uma primeira exposição, cujas consequências imunológicas vão ser diferentes das consequências das exposições subsequentes. Implicações
[0169] Vacinas à base de citomegalovírus são promissoras candi- datas de vacinas contra o HIV, mas também apresentam imensa com- plexidade imunológica. Contra o pano de fundo de respostas anti- wtRhCMV e anti-vetores extraordinariamente diversas e profundas, vai ser difícil definir as respostas imunes que separam indivíduos protegi- dos de não protegidos. Além disso, a configuração pré-clínica para o desenvolvimento de vacinas de RHCMV/SIV financeiramente impede um teste rápido e de baixo custo de novas candidatas a vacina.
[0170] Dadas estas dificuldades, a identificação de IL-10 viral co- mo um impedimento para a eficácia da vacina em macacos bebês wtRhCMV-soronegativos é favorável. Como macacos wtRhCMV+ pro- duzem anticorpos anti-vIL-10, a descoberta do presente pedido sugere imediatamente um mecanismo chave que é importante para a eficácia da vacina RKCMV/SIV de modo geral. Os presentes inventores inven- taram métodos e ferramentas necessários para investigar esta possibi- lidade, a partir de ensaios de anticorpos específicos contra vIL-10até fármacos anti-IL-10 únicos para imunogênios vIL-10 imunologicamente inativos.
[0171] Portanto, as técnicas do presente estudo representam um maior avanço em um campo complexo. Este trabalho vai proporcionar novo entendimento mecanicista, novas ferramentas farmacológicas para controle sobre a sinalização de vIL-10 e/ou cIL-10, novas vacinas de HIV candidatas com maior eficácia em alguns ou todos os recepto-
res de vacina, e instruções promissoras para pesquisa futura. Inovação Nova vacina de RICMWV/SIV aprimorada
[0172] Os vetores de RHOCMV/SIV de primeira geração carregam um gene de IL-10 viral intacto e endógeno, o qual é desenhado evolu- cionariamente para suprimir respostas imunes do hospedeiro (23-25). A descoberta deste gene em citomegalovírus de primatas levou ao es- tudo de sua função e possível utilidade como um alvo de vacina (26,27). Com base neste trabalho, foi criada uma plataforma de vetor de RhCMV de segunda geração que tem características imunológicas únicas e pode proteger macacos bebês wtRhCMV-soronegativos en- quanto as vacinas de primeira geração não (23). Além disso, a respos- ta imune inata para estes vetores de RRCMVdAIL10 inclui a expansão de monócitos mais consistente e a regulação negativa de CD80 — ambas as características da assinatura transcriptômica protetora deri- vadas de vacinas de RKCMV/SIV. Desenho de gasto-alfa permite teste powered de vacinas de RRCMV/ SIV aprimoradas em primatas não-humanos
[0173] As vacinas RROMV/SIV de primeira geração protegem —-50% dos macacos vacinados. Uma vacina contra o HIV com 50% de eficácia vai produzir tremendo benefício mundialmente; não obstante, um objetivo central no campo deve ser melhorar este número, produ- zindo benefício de saúde humana adicional e potencialmente permitin- do a erradicação do HIV. Infelizmente, os estudos não-adaptativos powered de vacinas RHCMV/SIV modestamente aprimoradas são ca- ros, o que vai impedir iteração e aprimoramento. A obtenção de 80% de potência para detectar uma diferença significativa entre vacinas com 50% e 70% de eficácia necessita de 102 animais por grupo, ou um total de 204 animais, para somente dois braços experimentais. Em contraste, a detecção dos primeiros 50% de eficácia (isto é, de 1% a
50% de proteção) necessita de somente 13 animais por grupo.
[0174] De modo a lidar com este problema e permitir o uso parci- monioso de primatas não humanos, foi criado um desenho de estudo "adaptativo" usando uma abordagem de gasto alfa. Esta abordagem cria valores alfa ajustados (mais rigorosos) para análises interinas de modo a que o estudo possa ser terminado quando tiver sido atingida significância, sem inflar a taxa de erro tipo | global. Portanto, por exemplo, os presentes requerentes projetaram a necessidade de vaci- nar e estimular 21 animais por grupo no Objetivo 2, mas o esquema do estudo possibilita terminação precoce depois de qualquer uma das du- as análises interinas anteriores (se a diferença entre grupos é maior do que o esperado e portanto comprovada significante mais cedo). O de- senho também possibilita continuar o estudo caso necessário até se- rem tratados 33 animais por grupo e ser obtida potência total de 80%. Abordagem Dados Preliminares As vacinas de RICMV/SIV não são eficazes de maneira confiável em receptores wtRhCMV-soronegativos
[0175] Em estudos de vacinas de animais wtRhCMV-soronega- tivos recém-nascidos, bebês, e adultos, animais recém-nascidos e be- bês foram vacinados duas vezes com RhCMV/SIVgag somente e es- timulados com baixa dose serial oral de SIV; animais adultos foram vacinados três vezes (por via subcutânea e por via oral) com RHCMV/ SIVgag, -SIVRetanef, e -SIV env e estimulados com baixa dose serial de SIV vaginal. As cargas virais resultanets e respostas imunes adap- tativas são detalhadas na FIG. 1. Não foi observado qualquer caso de controle viral rigoroso conforme previamente descrito depois da vaci- nação de macacos wtRhCMV+. Essa forma de controle se manifestou como rápida obtenção de carga viral indetectável dentro de duas se- manas da primeira viremia, seguida por carga viral indetectável em no mínimo 4 de 5 semanas subsequentes (7). No grupo adulto, houve ca- sos de relativo controle sobre a viremia, mas estes casos foram obser- vados infrequentemente e não se encaixam no perfil previamente des- crito (FIG. 1A, gráfico mais à direita). Foram observadas respostas de células T restritas a Mamu-E robustas, as quais apresentaram um pa- drão de inibição por anticorpos e peptídeos que se encaixam perfeita- mente com a descrição publicada de semelhantes células (FIG. 1B). Surpreendentemente, a administração de RRCMV/SIV a estes recepto- res wtRhoMV-soronegativos produziu claras respostas de anticorpo, em contraste com os resultados publicados depois da vacinação de animais soropositivos (FIG. 1C). Proteção de macacos bebês RhCMV-soronegativos contra SIV usando RhCMVAIL10/SIVgag
[0176] RhCMV e muitos outros patógenos exploram a via da IL-10, como parte de seu ciclo infeccioso, quer através de sua própria IL-10 codificada (rhemvIL-10 para RHOCMV) ou através de manipulação da sinalização celular da cascata de IL-10. Os presentes requerentes pre- viamente demonstraram que rhemvlIL-10 altera as respostas iniciais do hospedeiro a antígenos virais diminuindo a magnitude e a especifici- dade de células efetoras inatas para infecção primária por RHCMV (36). Além disso, existe uma redução proporcional na qualidade e na quantidade de respostas imunes adaptivas, iniciais e de longa dura- ção, específicas para RHCMV (36).
[0177] As vacinas de RRNCMV/SIV de primeira geração incluem o gene rhemvlIL-10, o qual pode ter um impacto significativo sobre a a frequência de células T responsivas. Portanto, os presentes requeren- tes criaram novos vetores de RHCMV carecendo do gene de IL-10 viral usando técnicas, das quais foram previamente pioneiros (35), junto com novos vetores de vacina deletada vIL-10 expressando SIV Gag. Em um estudo preliminar, a vacina RHCMVdlIL10/SIVgag foi adminis-
trada a seis macacos bebês RhCMV-soronegativos (-10 meses de idade), usando um protocolo de estudo idêntico ao usado paa a vacina de primeira geração, descrita acima. Esta vacina protegeu rigorosa- mente 3/6 animais, cujo perfil de carga viral é idêntico ao perfil previa- mente observado em macacos wtRhCMV+ protegidos (FIG. 2). Macacos wtRhCMV-soropositivos têrm níveis variáveis de anticorpos neutralizantes para IL-10 viral
[0178] A clara eficácia protetora da vacina RHCMVAlIL10/SIVgag na primeira tentativa do estudo, em uma pequena coorte, ficou em dramático contraste com o fracasso da vacina expressar IL-10 viral em 26 macacos RhCMV-soropositivos de várias idades (FIG. 1). Este re- sultado inesperado indica um local central para sinalização de I1L-10 na eficácia da vacina. Esta indicação também é amplamente congruente com a concepção de IL-10 como uma citocina imunossupressora. Des- te modo, a diferença entre a eficácia da vacina RHNCMV/SIV de primei- ra geração aparente em animais wtRhCMV+ e wtRhCMV- (isto é, (7) vs. FIG. 1) pode ser explicada por diferentes níveis de atividade de vIL-10 eficaz.
[0179] A presença de anticorpos de ligação anti-vIL-10 e neutrali- zantes foi avaliada em coortes de macacos wtRhCMV-soropositivos e wtRhCMV-soronegativos (33). Os resultados mostram que todo maca- co RhnOMV+ produz anticorpos de ligação a vIL-10 (FIG. 3A). Um en- saio in vitro para anticorpo neutralizante anti-vIL-10 também foi plane- jado, no qual plasma de macaco é testado para a capacidade para atenuar a supressão, mediada por vIL-10, de IL-12 induzida por LPS. Este teste demonstra uma gama de neutralização de vIL-10 em plas- ma de macacos wtRhCMV+, a partir de nenhuma neutralização até neutralização aparentemente completa (100%) no contexto do teste (FIG. 3B). As atividades de ligação anti-IL-10 e neutralizantes estão correlacionadas, conforme pode ser esperado se os anticorpos neutra-
lizantes forem um subgrupo de todos os anticorpos anti-vIL-10 e tive- rem atividade desprezível quando o título total é baixo (FIG. 3C). Digno de nota, o ensaio in vitro mede a presença de algum nível de anticorpo neutralizante no plasma, mas a eficácia in vivo correspondente de an- ticorpos anti-vIL-10 circulantes é desconhecida. Pode-se imaginar oua completa inibição da atividade de vIL-10 devido à expressão de proteí- na relativamente baixa in vivo, ou inibição muito modesta devido a al- tas concentrações de vIL-10 local em tecidos aos quais o anticorpo pode ter acesso insuficiente.
[0180] O dramático resultado experimental in vivo do presente pe- dido (FIG. 2) e os resultados do ensaio de anticorpos anti-vIL-10 (FIG. 3) sugere imediatamente que as vacinas RHCMV/SIV de primeira ge- ração não têm êxito em receptores wtRhCMV-soronegativos devido a ação não inibida de IL-10 viral. Além disso, se a atividade inibitória in vivo prática de anticorpo neutralizante anti-vIL-10 variar entre recepto- res de vacina CMV+, então esta variação pode explicar a eficácia da vacina variável nestes receptores. Respostas de células T aumentadas depois da administração de vaci- na RhRCMVdA10/SIV
[0181] A administração destas vacinas aos macacos resultou em respostas imunes celulares significativamente aumentadas, em com- paração com vacinas vIL-10-intactas (FIG. 4). Foi observado pelos presentes um aumento significativo na frequência de células T CD4+ RhCMV-específicas e SIVgag-específicas (FIGS. 4A e 4B). Macacos bebês protegidos por RhCMVAliL10/SIVgag demonstram perda de CD80 que é congruente com a assinatura transcriptômica protetora
[0182] Conforme mencionado acima, CD80 está entre os nós mais altamente conectados na assinatura transcriptômica de proteção (11). CD80 também é dramaticamente e de modo durável regulada negati-
vamente depois de infecção por RICMV selvagem (FIG. 5A). Em uma análise transcriptômica preliminar de células T, células NK, e APCs sortidas de macacos wtRhCMV-soropositivos, de fato, a expressão de CD80 é descontínua, ordenadamente separando os dois grupos por conta própria (FIGS. 5B e 5C). Digno de nota, esta similaridade entre a assinatura transcriptômica de proteção e os efeitos de infecção por wtRhCMV pode sugerir que a assinatura é reflexiva da replicação e disseminação do vetor da vacina, mas muitas características da assi- natura transcriptômica não são vistas depois de infecção selvagem. Por exemplo, a transcrição de IL-1beta está aumentada no sangue de animais protegidos por RHCMV/SIV, mas diminuiu depois de infecção por RHCMV selvagem (FIG. 5C, painel à direita).
[0183] De modo importante, a vacina RHCMV/SIVgag de primeira geração não tem êxito em atingir regulação negativa de CD80 em re- ceptores wtRhcMV-soronegativos — mas o sucesso da vacinação RhCoMVdIL10/SIVgag leva à perda de CD80 (FIGS. 5D e 5E). Os ní- veis de expressão de CD80 por ocarião do estímulo de SIV são meno- res entre os animais protegidos (FIG. 5E), e esta diferença é um resul- tado da maior regulação negativa depois da vacinação. Estas modifi- cações sugerem que o mecanismo de proteção mediada por RHCMV- dIL10/SIVgag de animais soronegativos é similar ao de proteção me- diada por RHCMV/SIV de animais soropositivos. Os resultados tam- bém sugerem fortemente que RHCMV/SIVgag não tem êxito em recep- tores soronegativos devido à incapacidade para provocar uma respos- ta imune inata necessária. Respostas imunes alteradas para RICMVAIL10/SIVgag refletem redu- zida sinalização de IL-10 do hospedeiro
[0184] O receptor de IL-10 é o único receptor conheci8do para pro- teínas I1L-10 de citomegalovírus e as proteínas têm atividade in vitro que parece idêntica à da IL-10 do hospedeiro. Além disso, macacos wtRhCMV+ demonstram um pequeno aumento na IL-10 circulante do hospedeiro e uma maior tendência a produção de IL-10 por linfócitos não estimulados (33). Portanto, o aumento da sinalização de IL-10 pa- rece ser uma parte normal de no mínimo infecção primária por CMV, a qual presumivelmente é benéfica para o vírus. No entanto, além disso, a infecção por CMV parece aumentar de maneira durável a sinalização de IL-10 do hospedeiro durante um período de anos. Dada a baixa abundância de genomas de CMV, este aumento secundário é prova- velmente devido à maior produção global de IL-10 do hospedeiro (isto é, não-viral). Portanto, foi sugerida a hipótese de que a IL-10 viral é prejudicial para a eficácia da vacina de RRCMV/SIV devid não somen- te a sua própria atividade, mas também à sinalização de IL-10 do hos- pedeiro consequente.
[0185] Esta hipótese prevê que a sinalização de IL-10 do hospe- deiro e efeitos a jusante são mais proeminentes depois de vacinação com RhcoMV/SIVgag de primeira geração do que depois de vacinação com RhCMVdlIL10/SIV gag. De modo a testar esta ideia, foram reali- zados dois experimentos. Primeiro, foi usado um bioensaio para testar o nível global de atividade de IL-10 no sangue periférico depois de va- cinação com RhCMV/SIVgag ou RhCMVdIL10/SIVgag, divulgando uma tendência para maior atividade depois da administração das vaci- nas de primeira geração (FIG. 6A). Em seguida, foi realizado um expe- rimento de controle para identificar outros biomarcadores que estão associados com a sinalização de IL-10, com a intenção de testar pos- teriormente estes biomarcadores em macacos vacinados. A quatro macacos foram administrados anticorpo neutralizante anti-lIL-10 ou 10** partículas de um vetor adenoviral expressando IL-10 de macaco rhesus. O vetor adenoviral foi confirmado antes do uso para expressar proteína IL-10 bioativa em nossos ensaios. Amostras destes macacos foram coletadas antes da vacinação ou 3, 14, e 28 dias depois. Estas amostras foram em seguida avaliadas para bioatividade de IL-10 do hospedeiro e uma variedade de outros biomarcadores (por Luminex), para determinar se quaisquer são reflexivos de sinalização ou inibição de IL-10 do hospedeiro. Foi demonstrado que IP-10 é o melhor corre- lato (inverso). Em seguida foram avaliadas amostras de plasma de animais vacinados com RhCMV/SIV ou com RhCMVdlIL10/SIV e foi visto que a vacinação com a vacina RICMVdIL10/SIVgag deletada o IL-10 viral está associada com muito maior indução de I1P-10, sugerin- do fortemente que estes vetores estão associados com menor sinali- zação global de IL-10 in vivo (FIG. 6B). Sumário
[0186] Dados preliminares dos presentes estudos demonstram que as vacinas de RNCMV/SIV de primeira geração não são confia- velmente eficazes em macacos wtRhCMV-soronegativos. Na verdade, embora macacos soronegativos gerem células T restritas para Mamu- E, as respostas imunes aparecem fundamentalmente diferentes de modo diverso, incluindo robustas respostas de anticorpos, falha em expandir monócitos CD14+ circulantes, e manutenção da expressão dCD80. No entanto, a vacina RICMVdIL10/SIVgag deletada a IL-10 viral gerou robustas respostas de células T e proteção contra estímulo por SIV em 3/6 receptores. Além disso, os animais protegidos manifes- taram expansão de monócitos CD14+, regulação negativa de CD80, e produção de anticorpos anti-p27 ausente, todas as características re- miniscentes de proteção mediada por vacina, conforme descrito previ- amente. Algumas linhas de evidência argumentam que respostas imu- nes alteradas para RHCMVdIL10/SIVgag refletem um menor nível de sinalização geral de IL-10 do hospedeiro, por exemplo, aumento da produção de IP-10 e respostas de anticorpos ausentes.
[0187] Estes achados são importantes porque apontam para dois alvos para aprimoramento das vacinas à base de RHCMV: IL-10 viral e
IL-10 do hospedeiro. O primeiro pode ser tratado por usod e estruturas de vetores deletada a IL-10 viral. O último pode ser tratado por uso de anticorpos neutralizantes anti-IL-10 ou proteína de fusão IL-10R1-Fc de ligação a IL-10, administrados sistemicamente ou localmente, um um sítio de injeção da vacina. Em uma primeira tentativa, foi utilizado anticorpo neutralizante anti-IL-10 sistêmico.
[0188] Também é importante ter em mente que os presentes resul- tados podem ser importantes para vacinas à base de RHCMV tendo por alvo outras doenças, tais como tuberculose e malária (37). Em um estudo que empregou somente macacos adultos RhCMV-soroposi- tivos, foi demonstrado que as vacinas RHCMV/TB podem reduzir a ex- tensão geral de infecção e doença por Mtb por 68%, em comparação com a extensão em controles não vacinados. Bebês e crianças, os quais são menos frequentemente soropositivos para CMV, carregam uma grande fração de cargas de doença malárica e TB. Em áreas de alta transmissão de malária, a maioria da doença malárica, e doença particularmente grave com rápida progressão para o óbito, ocorre em crianças pequenas sem imunidade adquirida; a tuberculose é particu- larmente letal em crianças abaixo de cinco anos (vide, Dodd et al., "The global burden of tuberculosis mortality in children: a mathematical modelling study", Lancet Global Health 5:PE898). Anemia grave, hipo- glicemia, e malária cerebral são características de malária grave mais comumente vistas em crianças do que em adultos. Deste modo, as boas candidatas a vacinas contra malária e TB devem ser efetivas em adultos e crianças, independente do sero-estado de CMV. Portanto, a demonstração de que a sinalização de IL-10 viral e/ou do hospedeiro impede a eficácia da vacina vai ter grande importância além do campo das vacinas de HIV. Desenho e Mêtodos do Estudo Objetivo Específico 1: Definir as assinaturas transcriptômica e imuno-
lógica de sinalização de IL-10 aumentada ou diminuída usando amos- tras previamente coletadas Hipótese
[0189] Receptores de vacina RHCMV/SIV manifestam ativação va- riável de sinalização de IL-10 celular conforme avaliado por análise transcriptômica e imunofenotípica, com a menor sinalização de IL-10 demonstrada em animais protegidos que receberam ou (i) vacina RhCoMVdIL10/SIVgag ou (ii) vacinas de RICMV/SIV no contexto de robustos anticorpos anti-IL-10 viral pré-existentes. Fundamento lógico
[0190] As respostas do hospedeiro a infecção por RICMV selva- gem e/ou vacinação com vetor de RHCMV podem incluir um aumento da frequência de monócitos CD14+ circulantes; uma alteração do pro- grama transcricional incluindo redução da expressão de moléculas co- estimulatórias tais como CD80; aumento da expressão de STAT3 e IL10RA; robustas respostas de células T; e supressão da produção de anticorpos para o antígeno da vacina. Embora muitos fatores prova- velmente colidam com estes resultados, a IL-10 é um tópico comum. AO realizar transcriptômicas depois de proporcionar ou anticorpo neu- tralizante contra IL-10 ou expressão de IL-10 constituitiva, foam defini- dos os resultados polares extremos relevantes para IL-10. Em seguida pode-se mapear os transcriptomas de animais vacinados (e protegidos ou não protegidos) sobre estes extremos, permitindo inferir o nível de ativação da via cIL-10 in vivo. Abordagem experimental
[0191] No Objetivo 1, foram usadas amostras já à mão para definir assinaturas de sinalização de IL-10 do hospedeiro. Estão disponíveis amostras dos seguintes grupos: (A) tratados com Ab neutralizante clL- 10; (B) tratados com Ad-cIL-10 e comprovados para expressar níveis suprafisiológicos de cIL-10 circulante; (C) vacinados com RhCMV/
SIVgag; e (D) vacinados com RROMVdAIL10/SIV gag. Macacos rhesus tratados com anticorpo neutralizante anti-IL-10 ou com adenovírus expressando IL-10
[0192] Macacos wtRhCMV-soronegativos são obtidos para estes experimentos por triagem de rotina de animais jovens, de 6 a 8 meses de idade, de uma colônia convencional. Macacos soronegativos são em seguida alojados separadamente antes de triar novamente cerca de um mês depois para confirmar a soronegatividade. Foi obtido clone neutralizante anti-IL-10 1IF11R1ILALA do recurso de reagente de pri- mata não humano NIH. Este anticorpo foi administrado por via intrave- nosa nos dias O e 7 em uma dose de 30 mg/mL. Não foram observa- dos efeitos adversos. Amostras de sangue foram coletadas nos dias O, 3, 7, 14, 21, 28, e em seguida a cada duas semanas até o dia 56. O RNA do sangue e/ou células sanguíneas foi preservado. O plasma do volume remanescente foi separado e congelado em alíquotas. PBMCs foram em seguida isoladas e quaisquer células não usadas imediata- mente foram criopreservadas. A neutralização de IL-10 nos animais tratados foi confirmada por perda de bioatividade de IL-10 do plasma e por modificações em outros biomarcadores, tais como IP-10. Ad5-celular-IL-10 expressa 11-10 de macaco rhesus sob controle do promotor EF1alfa
[0193] O vírus foi criado por preparação de um cassete de expres- são, transferência para o plasmídeo de vaivém (shuttle plasmid) AdE- asy, recombinação em células bacterianas BJ5183 supridas com o kit (39), e resgate do vírus em células C7 (39,40). A expressão da proteí- na apropriada foi confirmada por análise de MRNA, ELISA, e bioensaio para proteína IL-10 funcional. O vetor foi em seguida cultivado até alto título, purificdo por centrifugação de gradiente de equilíbrio de CsCI, dialisado contra sacarose a 5% tamponada, e titulado. Em seguida macacos wtRhCMV-soronegativos foram injetados por via intramuscu-
lar com 3 x 10! partículas. O aumento da IL-10 circulante foi confir- mado nos animais tratados por bioensaio. Macacos RhCMV-soronegativos sevagens vacinados com RhCMV/ SIVgag de primeira geração ou RICMVdIL10/SIVgag deletada a IL-10 viral
[0194] RhCoMVdIL10/SIVgag foi criada por deleção dos primeiros dois éxons do gene UL111 viral. Ambos os vírus foram resgatados em fibroblastos telomerizados de rhesus (telos), passados sobre telos, pu- rificados por ultracentrifugação, e titulados por ensaio de placa. 10º pfu foram injetados por via subcutânea no dia O (vacinação primária) e 10º pfu no dia 28 (reforço). Amostras de sangue foram coletadas conforme descrito acima para os grupos A e B, exceto que foi continuada a amostragem bi-semanalmente até o primeiro estímulo oral com SIV no dia 126. O protocolo e esquema de estímulo estão descritos abaixo conforme serão usados para os grupos E e F.
[0195] Foi realizado sequênciamento de RNA inicialmente para amostras coletadas em 0, 3, 14, 28, e 56 ou 126 dias. O sequência- mento de mRNA de células sanguíneas ou monócitos purificados vai ser realizado usando biblilotecas de MRNA lllumina Tru-seq stranded. Imunofenotipagem
[0196] As característidcas fenotípicas e funcionais de células imu- nes isoladas foram avaliadas usando um conjunto de quatro painéis de citometria de fluxo usados em trabalho dos requerentes previamente publicado para examinar células de apresentação ao antígeno, células B, células T, e células NK. Os mesmos painéis foram usados em análi- ses mais recentes dos requerentes sobre os efeitsod e infecção por RhCMV selvagem sobre o sistema imune do macaco (vide Dados Pre- liminares e (13)), proporcionando uma riqueza de dados comparativos. Os anticorpos a serm usados nestes painéis em ótimas concentrações incluem os reativos para CD3, CD4, CD8, CD95, CD28, CCR5, CCR7,
Ki-67, PD-1, CD127, CD25, CD196, CD194, CD123, HLA-DR, CD14, CD16, CD38, CD83, CD80, CD86, CD20, CD21, CD27, CD11b, CD11c, FceeRly, 1gD, IgM, FOXP3, TORyô, CD56, Mamu-E, NKG2A, Eomes, e T-bet. Biomarcadores plasmáticos
[0197] Um painel de biomarcadores plasmáticos relacionados com inflamação, efeitos conhecidos de IL-10, ou diferenças previamente notadas entre animais wWtRhCMV+ e wtRhCMV- vai ser avaliado por Luminex ou ELISA. Estes incluem IL-10 celular, CXCL13, IL-1beta, IL- 4, IL-8, IL-17A, I1L-21, IP-10, M-CSF, MCP-1, prostaglandin E2, e TNF- alfa.
[0198] A atividade neutralizante de anticorpos contra IL-10 viral vai ser medida em amostras conforme descrito em (31). Em resumo, PBMCs são estimuladas com LPS na presença de RHNCMV vIL-10, que suprime a produção de IL-12. Plasma contendo anticorpos neutralizan- tes contra I1L-10 viral alivia esta supressão e restaura |L-12. Interpretação de dados
[0199] Foi definido e será refinado um conjunto de caractetísticas (mensagens ou biomarcadores) cuja expressão é influenciada por si- nalização de IL-10 celular. A expressão de genes no conjunto varia entre grupos experimentais (por exemplo, protegidos vs. não protegi- dos ou RHNCMV/SIV vs. RICMVdIL10/SIV) e o exame quantitativo de genes no conjunto vai divulgar a menor sinalização de I1L-10 em ani- mais protegidos recebendo a vacina RICMVAlIL10/SIVgag. A análise para o Objetivo 1 vai prosseguir em etapas. Primeiro, o conjunto de características reguladas por I|L-10 vai ser definido por análise da ex- pressão diferencial das informações dos biomarcadores (RNAseg, ci- tometria, e analitos plasmáticos) coletada dos grupos A e B. Com base nos dados preliminares citométricos e de biomarcadores, por exemplo, na FIG. 6B, os requerentes estão confiantes de que pode ser definido um conjunto de características diferenciais. Este conjunto de caracte- rísticas também vai sugerir uma pontuação quantitativa para avaliar a sinalização de IL-10 nos outros grupos experimentais, o que é definido com base em distâncias multivariadas até os centroides dos grupos À e B. Segundo, será testado o enriquecimento de características regu- ladas por IL-10entre os animais nos grupos C e D. De maneira mais importante, será testado o enriquecimento de alterações relacionadas com IL-10 em (i) receptores de vacina RHCMV/SIVgag de primeira ge- ração vs. receptores de vacina RICMVdIL10/SIVgag e (ii) receptores de vacina protegidos vs. não protegidos. Análise estatística
[0200] De modo a definir a sinalização do conjunto de característi- cas associadas com IL-10, cada conjunto de datados é submetido a uma transformação de estabilização de variância e em seguida anali- sado diferencialmente usando o pipeline limma para calcular t estatísticas moderadas e p valores para Bayes empíricos. Dados de RNA-seqg são submetidos antes de modelagem linear a modelagem de variância no nível observacional (limma-voom). Em seguida p valores ajustados são calculados para cada conjunto de dados e as caracterís- ticas associadas com IL-10 são selecionadas com base em um p valor ajustado < 0,02. Para grupos experimentais nos quais se deseja avali- ar a sinalização de IL-10, alterações no conjunto de características as- sociadas com IL-10 são avaliadas por meio de teste de conjunto de dados por rotação (função roast do pacote limma R) com pesos carac- terísticos ajustados para log-fold ou outras alterações transformadas vistas no experimento de controle. Características importantes são identificadas quando é vista significância destes testes entre os grupos C e D (vacinas de primeira geração vs. delta IL-10) ou entre animais protegidos e não protegidos.
[0201] Pontuações de sinalização de IL-10 quantitativa podem sewr planejadas como uma proporção de distâncias multivariadas (dis- tância Euclideana de dados escalonados) até o centroide IL-10-inibido (a) vs. o centroide Ad5-IL-10 (b), isto é, a/(a+b). Sumário
[0202] Os dados do presente estudo apontam para atividade de IL- viral como um impedimento para proteção mediada por vacina — mas também mostram que a IL-10 do hospedeiro é importante, tam- bém, e que sua inibição adicionalmente melhora as respostas imunes para vacinas de RHCMV/SIV. Objetivo Específico 2: Testar se a inibição da IL-10 celular aumenta a eficácia da vacina em macacos bebês (RNCMV-negativos) Hipótese
[0203] A inibição da sinalização de IL-10 celular pós vacinação com RhCMVdliIL10/SIVgag vai proporcionar um aumento da frequência de (i) a assinatura transcriptômica protetora, (ii) rápida indução de res- postas de células T protetoras, (ili) um ambiente de citocinas inatas alteradas que é importante para proteção e também refletido na assi- natura transcriptômica protetora (item i), e (iv) proteção mediada por vacina. Fundamento lógico
[0204] A vacina RNCMV/SIVgag é ineficaz entre macacos bebês RhCMV-soronegativos a menos que o gene de IL-10 viral seja removi- do. A única função conhecida da proteína IL-10 viral é se ligar aos re- ceptores de I1L-10 do hospedeiro; a sinalização a jusante e as conse- quências funcionais parecem idênticas. Portanto, barrar uma função previamente não suspeita de vIL-10, os dados mostram claramente que a sinalização de IL-10 é prejudicial para a eficácia da vacina de RhCMV/SIV. Se a IL-10 do hospedeiro (isto é, celular) também contri- bui para sinalização prejudicial, então a inibição de I1L-10 celular vai aumentar mais a eficácia da vacina. Igualmente de modo tão importan-
te, a inibição conjunta de sinalização devido a proteínas IL-10 do hos- pedeiro e IL-10 viral proporciona respostas de células T mais rápidas e eficazes bem como uma resposta imune inata aprimorada, refletida na produção de citocinas por células imunes inatas. Respostas imunes aprimoradas rápidas para vacinação são importantes para proteção de bebês, cujo risco de infecção é maior durante a amamentação, e para proteção de todos os indivíduos previamente não infectados com CMV. Abordagem experimental
[0205] Macacos rhesus bebês RhCMV-soronegativos selvagens (10 meses) vão receber vacina RICMVd10/SIVgag isolada (Grupo E) ou precedida por anticorpo anti-IL-10 de macaco neutralizante (Grupo F; 30 mg/mL por via intravenosa como no Objetivo 1, Grupo A). Duas doses de vacina vão ser administradas em O e 4 semanas e estímulos em baixa dose oral vão se iniciar 18 semanas depois da vacinação. Os animais do Grupo F vão receber anticorpo anti-IL-10 três dias antes da vacinação primária e novamente três dias antes do reforço. O resulta- do primário é proteção contra infecção por SIV no modo previamente descrito e também visto no experimento anterior dos requerentes (FIG. 2): rápido controle dentro de 2 semanas de carga viral periférica inicial, seguido por controle durável até abaixo do nível de deteção de vírus no sangue. Os requerentes estão interessados adicionalmente na ra- pidez da resposta imune bem como em muitas medidas das respostas imunes inata e adaptativa à vacina e ao vírus de estímulo.
[0206] Este é um desenho de estudo adaptativo, portanto os nú- meros mostrados são estimativas. Doze novos bebês vãro ser atribuí- dos no início de cada ano e uma análise interina será realizada ao final de cada ano. e modo a evitar inflação de erro tipo |, o valor alfa para cada análise interina será ajustado de acordo com a função gasto alfa Lan-DeMets com limites do tipo Pocock. Em uma diferença significati-
va entre grupos é observado então que este experimento vai concluir e o trabalho no Objetivo 3 vai se iniciar. Macacos rhesus, vacinação, e amostragem
[0207] Macacos bebês RhnCMV-soronegativos são obtidos por tria- gem conforme descrito no Objetivo 1 e vacinados de acordo com o mesmo protocolo estabelecido. O esquema de amostragem de sangue pré-estímulo é conforme descrito acima. Em seguida são realizados estímulos a cada duas semanas conforme descrito abaixo e são cole- tadas amostras de sangue coletadas a cada semana alternada para testar para infecção. Depois de ser detectada viremia, o sangue é co- lhido semanalmente até um máximo de 12 mL/kg/mês. Os linfonodos (LN) são coletados antes da vacinação primária, 8 semanas depois da vacinação primária, e 18 semanas depois da vacinação primária (antes do estímulo com SIV). Estímulos orais seriais, de baixa dose
[0208] Os experimentos prévios de vacinação e estímulo dos re- querentes (vide, Dados Preliminares) confirmaram que o esquema de estímulo oral dos requerentes infecta somente 25% dos animais em cada semana consecutiva. Os estímulos orais administrados são 2K, 2K, 2K, 4K, 4K, 4K, 8K, 8K, 8K, 40K, 40K, 100K, e 100K TCIDso. Nos experimentos prévios dos requerentes todos os animais foram infecta- dos antes do fim desta série. Análise de ácido nucleico viral no plasma e em PBMCs
[0209] RNA do plasma viral serão avaliados essencialmente usan- do RT-PCR quantitativo (Quantitative Molecular Diagnostics Core, Fre- derick National Laboratory). O RNA extraído vai ser rodado em 12 re- plicatas em um formato de 384 cavidades, o qual reforça a confiabili- dade de determinações positivas e reduz o limiar de detecção. O limite inferior de detecção em uma amostra de 100 microlitros é 16 có- pias/mL.
[0210] Também está disponível ensaio ultrassensível, o qual pode ser usado, por exemplo, quando o clearance viral é suspeito. Esta abordagem usa uma técnica de PCR híbrida em tempo real e digital para permitir a entrada de uma grande quantidade de amostra de teste na primeira rodada do experimento, crucial para deteção de raras se- quências em uma grande quantidade de amostras. Mais significante é a capacidade para quantificar níveis alvo muito baixos, da ordem de 1 cópia por número de alíquotas de teste (isto é, uma cópia por 107 a 10º células), com boa confiabilidade.
[0211] Será realizado sequênciamento de RNA e biomarcadores plasmáticos serão avaliados conforme descrito no Objetivo 1, e nos mesmos pontos do tempo.
[0212] Os fenótipos imunes do hospedeiro, incluindo subpopula- ções de células T, ativação, exaustão, e marcadores de homing (por exemplo, CXCR5 e CCR7) vão ser seguidos por técnicas de rotina de citometria de fluxo usando. Para avaliação de respostas de células T específicas do antígeno, cavidades de teste contendo até IM de PBMCs ou LNMCs vão ser estimuladas com veículo (controle negativo para toxicidade de DMSO), sobreposição de peptídeos de SIV, peptí- deos específicos com restrição de Mamu-E conhecida (por exemplo, Gag69, Gag18, ou Gag120), ou PMA/ionomicina (controle positivo). Todas as cavidades também vão receber anti-CD28 e anti-CD49d em uma concentração de 2 ug/mL. Inibidores tais como peptídeo VL9 ou anticorpos anti-HLA são aplicados uma hora antes da estimulação se iniciar e adicionados de novo com o estímulo de peptídeo. GolgiPlug (BD Biosciences) vai ser adicionado uma hora depois do início da in- cubação. Cinco horas depois, as amostras vão ser colhidas por por centrifugação, fixadas, permeabilizadas, e coradas usando corante vi- vo-morto fixável bem como anticorpos reativos para CD3, CD4, CD8, CD27, CD45RA, 1IL-2, IL-17, IFN-y, e TNF-a. A fração de células T
CD4+ e CD8+ secretoras de citocinas vai ser determinada por citome- tria de fluxo em um BD Fortessa. Ensaio de co-cultura para vírus competente para replicação
[0213] Em casos de clearance viral suspeito, os números avalia- dos de células mononucleares (isto é, células 103, 10º, ou 10%) vão ser testados para a presença de vírus competente para replicação por cul- tura com 10º CEMx174 células em placas de 24 cavidades, seguida por análise por citometria de fluxo da expressão de SIV-Gag p27 intra- celular. Células cocultivadas são colhidas e analisadas nos dias 13 a
36. Depleção de células T CD8+ de macacos protegidos
[0214] Uma característica chave de controle de SIV associado a vetor de RHCMV de longa duração em sua insensibilidade para deple- ção de linfócitos CD8+. De modo a testar se esta característica é nota- da depois de controle mediado por vacina RNCMVdIL10/gag, dois a quatro macacos de controle vão ser tratados com anticorpo monoclo- nal cM-T807 (10, 5, 5, e 5 mg por kg de peso corporal nos dias 0, 3, 7, e 10) e foi observado o efeito sobre a viremia. Interpretação de dados
[0215] A hipótese dos requerentes prevê respostas imunes mais rápidas e maior eficácia da vacina no grupo F (tratado com anti-clL-10) do que no grupo E (controle). A hipótese dos requerentes também prevê que a inibição de sinalização de I1L-10 celular vai aumentar a frequência com a qual é observada a assinatura transcriptômica de proteção. A suposição dos requerentes é que a sinalização de IL-10 viral e do hospedeiro são prejudiciais para o estabelecimento desta assinatura, a qual em si favorece a proteção através de influência so- bre qualquer das respostas imunes adaptivas para a vacina ou condi- ções inatas que influenciam replicação viral precoce.
[0216] Muitos outros resultados são de interesse. Para a hipótese abrangente dos requerentes, os mesmos desejam saber se o sucesso da vacinação está associado com uma redução na sinalização de |IL- 10, conforme definido pelo conjunto de características reunidos no Ob- jetivo 1. É possível avaliar alterações neste conjunto de características de IL-10 entre animais protegidos e não protegidos, ou associação com outros correlatos de proteção previamente definidos (por exem- plo, expressão de CD80 reduzida). Análise estatística
[0217] Teste Exato de Fisher vai ser usado para comparar estatis- ticamente proporções de macacos que atingem cura funcional (con- forme definido acima) nos dois grupos. Para cálculos de potência, foi assumido que a inibição de IL-10 do hospedeiro vai aprimorar a eficá- cia da vacina de 50% para 85%, isto é, um menor impacto do que a deleção do gene de IL-10 viral. Em cinco análises interinas com confi- guração de valores alfa ajustados usando uma função de gasto de Lan-DeMets com limites do tipo Pocock e informação de frações refle- tindo o número de animais estimulados depois de cada anos, a potên- cia do Teste Exato de Fisher para detectar uma diferença entre os grupos nos Anos 1 a 5 é de 3%, 29%, 52%, 72%, e 83%, respectiva- mente. Portanto, foi previsto que o experimento do Objetivo 2 vai ser concluído depois do Ano 3, mas caso necessário então o experimento será continuado nos Anos 4 a 5.
[0218] A hipótese dos requerentes também prevê que a inibição de sinalização de IL-10 celular no grupo F vai levar a alterações trans- criptômicas incluindo (i) redução nas características associadas com IL-10 do Objetivo 1 e (ii) aumento da frequência de transcriptos asso- ciados a proteção. Estas previsões vão ser testadas usando a estrutu- ra de análise delineada acima. Em resumo, enriquecimento em ani- mais recebendo anti-IL-10 vs. controles (grupo F vs. E), ou em maca- cos protegidos vs. não protegidos, vão ser testados por teste rotacio-
nal de conjuntos genéticos. Se estes testes forem significativos, então podem ser usadas pontuações quantitativas conforme definido no Ob- jetivo 1 em modelos lineares generalizados (GLMs) para exploração adicional. Por exemplo, GLMs com um link logit podem ser usadas pa- ra avaliar uma relação quantitative entre sinalização de I1L-10 restrita depois da vacinação e eventual proteção.
[0219] Digno de nota, os requerentes esperam que entre os 42 animais vacinados neste experimento, no mínimo 21 serão protegidos contra SIV. Se esta previsão estiver correta, então se terá suficiente potência para definir novas assinaturas transcriptômica e imunológica de proteção mediada por RHCMVdIL10/SIVgag. Como as técnicas de análise dos requerentes aproveitam modelagem linear sofisticada, to- dos os 42 animais podem ser modelados juntos para proporcionar maior potência para identificação de características associadas com proteção. Esta assinatura associada com proteção pode ser introduzi- da no pipeline de análise mencionado acima e também pode ser be comparada com assinaturas previamente definidas. Possíveis armadilhas e abordagens alternativas
[0220] Também se tem a opção de uma abordagem alternativa para neutralização de IL-10: uma fusão ILI0R1-Fc. Esta proteína se liga a e neutraliza proteínas de IL-10 viral do hospedeiro com afinida- des nanomolares. A molécula é menor do que um anticorpo neutrali- zante e, portanto, pode atingir penetração tecidual superior. Os reque- rentes estão testando a farmacocinética e a farmacodinâmica deste reagente agora e vão considerar o uso deste, ao invés de anticorpo, se for observada uma vantagem significativa, por exemplo, na intensidade ou na duração do efeito. Possivelmente esta proteína é uma ferramen- ta farmacológica superior para controle sobre a sinalização de IL-10, a qual pode ser útil como um adjuvante para isto e possivelmente outras vacinas.
Objetivo Específico 3: Testar se a inibição de IL-10 celular e/ou viral aumenta a eficácia da vacina em macacos adultos (RNCMV-positivos) Hipótese
[0221] A inibição da sinalização de I1L-10 viral e celular pós vacina- ção contra SIV à base de RHNCMV vai aumentar cooperativamente a frequência (i) da assinatura protetora transcriptômica e imunológica, (ii) rápida indução de respostas de células T protetoras, (ili) um ambiente de citocinas inatas alterado que é importante para proteção e também refletido na assinatura transcriptômica protetora (item i), e (iv) proteção mediada por vacina. Fundamento lógico
[0222] As vacinas de RKCMV/SIV demonstram um curioso padrão de eficácia protetora em 50% dos adultos animais (RHOCMV soropositi- vos). O sucesso da vacinação requer a inserção da vacina, demons- trando que a proteção é mediada por uma resposta imune adaptativa, mas também é associada a um extraordinário grau com transcriptômi- ca específica e respostas imunes vistas tão cedo quanto um dia depois da vacinação, demonstrando a contribuição de uma resposta inata. Esta resposta inata está relacionada com a resposta vista depois de infecção por RICMV selvagem. As questões mais importantes sobre estas vacinas à medida que fazem transição para testes clínicos hu- manos são (i) se os seres humanos vão gerar respostas imunes inatas e adaptativas protetoras similares às vistas em macacos, e em caso positivo (ii) quão rapidamente protegem bebês e adultos de modo a que sejam protegidos contra exposições logo depois da vacinação, (iii) como proteger todos os segmentos da população humana, incluindo os não previamente infectados com CMV selvagem, e (iii) como au- mentar a eficácia da vacina até acima de 50%.
[0223] Os experimentos preliminares dos presentes requerentes produziram uma pista importante: os receptores de vacina RNCMV-
soronegativos não são protegidos, a menos que seja deletado o gene de IL-10 viral. Vacinas de RRCMVAdliIL10 mas não vacinas RHCMV/SIV intactas geraram respostas imunes inatas e adaptativas similares às vistas em macacos RhnCMV soropositivos; além disso, as respostas foram protetoras contra estímulo com SIV. Esta informação aponta pa- ra a sinalização de IL-10 como um importante determinante da respos- ta inata requerida que está faltando entre macacos não protegidos por vacinas de RHCMV/SIV. Além disso, foi demonstrado em experimentos prévios dos requerentes que a sinalização de IL-10 em infecção por RhCMV deriva de duas fontes: IL-10 viral e IL-10 do hospedeiro (isto é, celular). Foi raciocinado que a inibição de qualquer uma ou de ambas estas fontes de IL-10 vai agmentar a eficácia da vacina de RRKCMV/SIV em macacos adultos RHCMV-soropositivos. Abordagem experimental
[0224] Dois grupos de animais adultos vão ser vacinados exata- mente conforme descrito no Objetivo 2 e estimulados ao no mesmo ponto do tempo, 18 semanas depois da vacinação primária. Os estímulos serão administrados por via intrarretal. Macacos rhesus e vacinação
[0225] Macacos wtRhCMV-soropositivos, de 3,25 a 6 anos de ida- de, serão atribuídos a estes estudos. O protocolo de vacinação será exatamente conforme descrito acima para o Objetivo 2. Estímulos seriais de baixa dose intrarretal serão realizados com SIVmac239 de acordo com um protocolo publicado (7). 300 unidades formadoras de foco de vírus são administradas semanalmente para os primeiros oito estímulos e, em seguida, caso necessário, cionco estímu- los semanais adicionais são realizados em 1.000 unidades formadoras de foco. A viremia é testada semanalmente, com o estímulo sendo des- continuado na semana deopis de deteção de > 30 cópias/mL.
[0226] Será realizado seguimento virológico e imunológico até a vacinação e estímulo com SIV conforme descrito acima. Na fase de vacina, as respostas imunes adaptativas serão seguidas junto com transcriptômica, imunofenótipos, e biomarcadores plasmáticos. Na fa- se de estímulo, serão enfatizados os ensaios de carga viral e de res- posta imune, mas também serão realizados rigorosos testes de clea- rance viral. Interpretação de dados
[0227] A hipótese dos presentes prevê que a inibição da sinaliza- ção de IL-10 viral e celular pós vacinação de SIV à base de RICMV vai produzir uma eficácia da vacina que é significativamente maior do que 50%. Especificamente, foi esperado que a eficácia da vacina em ambos os grupos (G e H da FIG. 9) venha a exceder 50%. Também se pode observar uma indicação preliminar de que a eficácia no grupo H excede a eficácia no grupo G, mas não será observada uma diferença significativa, a menos que a eficácia no Grupo G seja inesperadamen- te baixa.
[0228] Outros resultados de interesse incluem todos os menciona- dos no objetivo anterior, particularmente correlações entre proteção, redução de sinalização de IL-10 conforme avaliado pelas característi- cas associadas a IL-10 definidas no Objetivo 1, e correlatos previa- mente observados tais como baixa expressão de CD80. Deseja-se sa- ber se estas características são invariavelmente correlacionadas uma com a outra ou se a relação falha algumas vezes.
[0229] Adicionalmente se será capaz de realizar uma série de comparações interessantes entre adultos e bebês, quer RHCMV-soro- positivos ou RhCMV-soronegativos selvagens, comparando dados deste objetivo com os do Objetivo 2 ou de experimentos anteriores. Por exemplo, anti-clL-10 pode ter um impacto diferente em animais mais velhos. Foi demonstrado em um trabalho não publicado que os níveis de cIL-10 no plasma declinam com a idade, de modo que se pode imaginar um menor efieto geral do anti-clL-10. Finalmente, o ní- vel de eficácia geral da vacina pode ser diferente em adultos em com- paração com bebês, por exemplo, nos grupos E vs. G ou F vs. H. Análise estatística
[0230] Serão usados testes binomiais exatos para comparar a fra- ção de animais protegidos em cada grupo com o valor previamente publicado de 50%. Os dois grupos neste Objetivo vão ser animais atri- buídos sequencialmente. Isto é, depois do Objetivo 2 ser concluído, então todos os 12 animais serão atribuídos no ano seguinte para o Grupo G. Para cálculos de potência, foi assumido que anticorpos anti- IL-10 viral foram a determinante primária de proteção em estudo publi- cado anteriormente e, portanto, que uma alta fração dos animais vaci- nados com RhCMVdIL10/SIV vão ser protegidos (85%). Assumindo que 12 animais são atribuídos no Ano 4 e 12 no Ano 5 e usando uma função de gastos Lan-DeMets com limites do tipo de Pocock, a potên- cia de um teste binomial exato para detectar eficácia acima de 50% no Grupo G nos Anos 4 e 5 é de 45% e 94%, respectivamente.
[0231] Se a eficácia no Grupo G for considerado que exceda 50% depois do Ano 4, então os 12 animais atribuídos no Ano 5 serão atribu- ídos para o Grupo H. Assumindo uma eficácia de 90% par ao regime combinado em macacos adultos, a potência para detectar eficácia ex- cedendo 50% usando somente 12 animais será de 89%. Linha do tempo
[0232] 60 adicionais animais serão usados em cinco anos, com 12 designados a cada ano. Nos Anos 1 a 3, foi previsto que um total de 36 bebês serão designados para os Grupos E e F. Cada ano os ani- mais serão designados, vacinados, estimulados, e a proteção será avaliada de modo a que possa ocorrer a análise interina antes do ano seguinte. No Ano 4 foi previsto designar 12 animais de três a seis anos de idade para o Grupo G. No Ano 5 foi previsto designar 12 animais de três a seis anos de idade para o Grupo H.
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[0233] Este exemplo descreve um experimento realizado para tes- tar o impacto da administração de inibidor de IL-10 sobre as respostas imunes do hospedeiro para, e a eficácia de, umvacina à base de rhe- sus CMV deficiente de IL-10 viral.
[0234] Dois macacos jovens (8 a 13 meses de idade) foram desig- nados para receber anticorpo anti-IL10 seguido três dias depois por vacina RICMVdiIL10/SIVgag (isto é, carecendo de IL-10 viral). O anti- corpo anti-IL10 foi o clone 1F11RILALA do recurso de reagente de primata não humano NIH. O anticorpo foi IIG1 kappa enxertado com rhesus CDR contendo as mutações de silenciamento de Fc L234A e L235A. Foi um anticorpo recombinante derivado de um clone de mAb de camundongo anti-IL-10 humana que possui reação cruzada com |IL- de rhesus. CDRs de camundongo foram enxertadas em estruturas de Fv humano. As regiões constantes foram cadeias de IgG1 (pe- sadas) e kappa (leves) de rhesus. O anticorpo foi produzido a partir de células CHO transduzidas cultivadas em meio livre de soro, e purifica- das por afinidade de proteína A e cromatografia de permuta de ânions.
[0235] Ambos os animais receberam 30 mg/kg de anticorpo 1F11R1ILALA anti-IL-10 nos dias -3 e 25, em cada caso três dias antes da administração da vacina RRCMVdIL10/SIVgag. A todos os animais foi administrada a vacina de SIV em uma dose de 105 pfu por via sub- cutânea, em não mais de 2 mL de volume no dia 0. Em seguida todos os animais receberam uma dose de reforço aproximadamente 4 semanas depois da primeira dose. Finalmente, iniciando > 16 semanas depois da primeira dose da vacina, todos os animais são estimulados com doses crescentes de SIV. Os estímulos foram administrados a cada duas semanas, por via oral, em um volume máximo de 2,5 mL. Uma semana depois de cada estímulo, foram colhidas amostras de sangue e foram analisados usando técnicas à base de PCR sensíveis para a presença de SIV. Quando foi detectada infecção em uma amos- tra de sangue, os estímulos foram descontinuados para aquele animal. Em seguida as amostras de sangue foram colhidas aproximadamente a cada semana e as cargas virais foram testadas, para determinar co- mo muitos animais em cada grupo foram capazes de controlar a vire- mia, o que é um indicador do sucesso da proteção mediada por vac- ina.
[0236] Primeiro foi verificado que a administração de anticorpo 1F11R1LALA anti-IL-10 levou à inibição de IL-10 do hospedeiro. O bi- oensaio que foi empregado testa se a adição de uma amostra de plasma a PBMCs estimuladas com LPS pode suprimir a produção de IL-12; a supressão referida é um efeito biológico normal de IL-10. Na verdade, foi descoberto que as amostras de plasma de receptores de anticorpo anti-IL-10 foram incapazes de suprimir a produção de I|L-12 e ao invés causaram aumento da produção (FIG. 10), indicando que o anticorpo presente no plasma neutralizou a I1L-10 endógena in vivo e além disso suprimiur qualquer IL-10 adicional produzida pelas PBMCs estimuladas por LPS.
[0237] Análise das respostas imunes depois da administração da vacina revelou três efeitos notáveis do anticorpo anti-IL-10: (i) indução muito rápida de respostas de células T — por duas semanas depois da primeira vacinação (FIG. 11), (ii) inibição quase completa de respostas entre células T CD8+ por oito semanas (FIG. 12) e (iii) um ambiente de citocina alterada (FIG. 13).
[0238] Portanto, o uso de um agente anti-IL-10 como adjuvante neste caso pode auxiliar na proteção contra doença em casos quando é desejável uma resposta rápida (por exemplo, para permitir uma pro- teção mais rápida contra uma doença infecciosa), quando a resposta de células T CD4+ classicamente restrita é mais necessári, ou quando respostas de células T CD8+ são indesejáveis. Exemplo 3. Expressão de um antígeno e receptor de IL-10 dominante- negativo em uma vacina
[0239] É preparada uma vacina de vetor à base de adenovírus com deleções nas regiões E1 e E3 (por exemplo, um adenoviírus tipo 5) que adicionalmente carrega um promotor EF1alfa, uma sequência codificante otimizada para SIVgag, um sítio de entrada ribossômica interna (IRES) do vírus de encefalomiocardite (EMCV), e uma sequên- cia codificante por um receptor de IL-10 do hospedeiro (receptor de vacina) que é truncado de modo que resíduos de aminoácidos chave para sinalização do receptor estão ausentes. A proteína expressa neste exemplo em particular tem a sequência truncada da proteína da subunidade alfa de receptor de interleucina 10 (ILIORA) de Macaca mulatta:
KVKHENFSLLTSGEVGEFCVQVKPSVTSRTNKGMWSKEECVSLTRQ YFTVTNVIIFFAFVLLLSGALAYCLALQLYVRRR (SEQ ID NO: 5).
[0240] O antígeno e o receptor de IL-10 truncado podem ser ex- pressos juntos em uma célula de apresentação ao antígeno. A presen- ça do receptor de IL-10 truncado faz com que a célula de apresen- tação ao antígeno seja menos sensível a aplicação de uma proteína exógena que tem atividade semelhante a IL-10; isto é, alguns efeitos da proteína que tem atividade semelhante a IL-10 sobre a célula de apresentação ao antígeno são reduzidos ou eliminados. A admin- istração desta vacina ao hospedeiro resulta em uma resposta imune benéfica mais intensa (por exemplo, maiores respostas de células T CD8+ em algum ponto depois da administração da vacina) e/ou a vac- ina resulta em respostas imunes benéficas em uma maior fração de receptores de vacina, em comparação com uma vacina carecendo do receptor de IL-10 truncado. Exemplo 4. Expressão de um antígeno e proteína semelhante a I1L-10 truncada em uma vacina
[0241] É preparada uma vacina de vetor à base de adenovírus com deleções nas regiões E1 e E3 (por exemplo, um adenoviírus tipo 5) que adicionalmente carrega um promotor EF1alfa, uma sequência codificante otimizada para SIVgag, um sítio de entrada ribossômica interno (IRES) do vírus da encefalomiocardite (EMCV), e uma sequên- cia codificante para uma proteína semelhante a IL-10 truncada. À proteína expressa neste exemplo em particular tem a sequência trun- cada da proteína interleucina-10de rhesus cytomegalovirus, a qual é uma forma truncada do ortólogo da sequência de LAcmvIL-10 do CMV humano (uma proteína semelhante a IL-10 truncada que é expressa naturalmente em infecção por CMV humano):
NELMEHYLDGVLPRASHLDYDNSTLNGLHVFASSMQALYQHMLKCV SVSGSITPRYDT (SEQ ID NO: 7).
[0242] A truncação da sequência de aminoácidos da proteína se- melhante a IL-10, possivelmente com a adição de um pequeno número de novos aminoácidos, faz com que a proteína tenha atividade restrita ou reduzida, em relação a uma proteína que tem atividade semelhante a 11-10 intacta. A presença da proteína semelhante a I1L-10 truncada isolada e/ou complexos da proteína semelhante a IL-10 truncada com outras moléculas parcialmente ou completamente inibe alguns efeitos de uma proteína que tem atividade semelhante a IL-10. Por exemplo, a presença de excessiva proteína semelhante a IL-10 truncada pode ser inibitória para a atividade de uma proteína que tem atividade sem- elhante a IL-10 e/ou a co-expressão em uma célula da proteína sem- elhante a I1L-10 truncada com uma proteína que tem atividade sem- elhante a IL-10 resulta em menor função da proteína tendo atividade semelhante a IL-10 (por exemplo, em uma base em peso). A admin- istração desta vacina ao hospedeiro resulta em uma resposta imune benéfica mais intensa (por exemplo, maiores respostas de células T CD8+ em algums ponto depois da administração da vacina) e/ou a vacina resulta em respostas imunes benéficas em uma maior fração dos receptores de vacina, em comparação com uma vacina carecendo da proteína semelhante a IL-10 truncada.
Exemplo 5. Uma vacina de SIV com vetor de Ad26 expressando SIVgag e receptor de IL-10 dominante-negativo
[0243] Uma abordagem para inibição da via de I1L-10 é usar anti- corpos neutralizantes de IL-10. No entanto, a inibição em todo o siste- ma de IL-10 provavelmente é inaceitável para bebês, dado que a deficiência de IL-10 está associada com a doença intestinal inflamató- ria e psoríase. Qualquer aumento do risco destas condições para fins de vacinação seria inaceitável. Portanto, os presentes perseguiram a estratégia inovadora de inibir a sinalização de IL-10 somente em célu- las transduzidas pela vacina e particularmente em células de apresen- tação ao antígeno (APCs) cuja expressão de receptores co-estimula- tórios e citocinas é inibida por IL-10. Foi empregada uma forma dom- inante-negativa do receptor de IL-10 carecendo de seu domínio in- tracelular. A sinalização normal do complexo ativo de IL-10-receptor requer fosforilação por Jak1 e Tyk2 dos resíduos Y446 e Y496 de |IL- 10R1. Estas fosfotirosinas proporcionam sítios de encaixe que recru- tam e ativam, através de fosforilação adicional, o fator de transcrição STAT3. A molécula IL-10R1 carecendo de seu domínio intracelular carece destas tirosinas crucias; portanto, não pode ocorrer sinalização.
[0244] Foram vetorizados adenovírus tipo 26 por captura recombi- natorial em uma estrutura de plasmídeo, deleção das regiões E1 e E3, e substituição do Ad26 E4orf6ê com Ad5 E4orf6, para permitir a interação necessária com E1B. Em seguida foram manipulados dois cassetes de expressão, ambos contendo a sequência otimizada SIVmac239 Gag, e um codificando adicionalmente para o receptor de IL-10 dominante- negativo (DNIL-10R) carecendo de seu domínio intracelular, sob con- trole translacional da sequência IRES de ECMV (FIG. 14A). Estes ve- tores foram testados para assegurar expressão da proteína e atividade funcional. Ambos os vetores expressam Gag, conforme esperado (FIG. 14B), ao passo que somente Ad26/SIVgag-DNIL-10R expressou o re- ceptor de IL-10 truncado, o qual foi detectado por citometria de fluxo sobre a superfície de células HEK 293 transduzidas (FIG. 14C). Além disso, a expressão do receptor truncado provocou insensibilidade para os efeitos inibitórios da IL-10 sobre a produção de citocinas in vitro (FIG. 14D). Finalmente, foi confirmado que o vetor Ad26/SIVgag-DNIL- 10R é imunogênico em dois macacos receptores durante oito semanas de seguimento depois da administração da vacina (1012 partículas; FIGS. 14E e 14F). Modalidades de Exemplo
[0245] Modalidades de exemplo proporcionadas de acordo com o tema presentemente divulgado incluem, porém sem limitação, as rei- vindicações e as modalidades que se seguem:
1. "Método para indução de uma resposta imune contra um antígeno em um indivíduo, o método em que compreende a administração, ao indivíduo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de interleucina 10 (IL-10) e uma vacina.
2. “Método da modalidade 1, em que IL-10 viral e/ou celular são ini- bidas.
3. Método da modalidade 1 ou 2, em que é inibida a proteína STAT3 transdutora de sinalização de receptores de IL-10.
4. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 3, em que o ini- bidor de IL-10 compreende uma proteína, uma sequência de ácido nu- cleico codificando uma proteína, uma molécula pequena, ou uma combinação das mesmas.
5. “Método da modalidade 4, em que a proteína compreende um an- ticorpo.
6. “Método da modalidade 5, em que o anticorpo é um anticorpo anti- IL-10, um anticorpo anti-receptor de IL-10 (IL-10R), um anticorpo anti- CD20, ou uma combinação dos mesmos.
7. Método da modalidade 5 ou 6, em que o anticorpo é selecionado entre o grupo que consiste em 1F11R1ILALA anti-IL-10, rituximab, e uma combinação dos mesmos.
8. Método da modalidade 4, em que a proteína compreende uma proteína de fusão Fc-IL-10R.
9. “Método da modalidade 8, em que a proteína de fusão inibe a liga- ção de todas as proteínas a IL-10R.
10. Método da modalidade 8 ou 9, em que a proteína de fusão tem uma alta afinidade de ligação para IL-10.
11. Método de qualquer uma das modalidades 8 a 10, em que a pro- teína de fusão inibe a sinalização de receptores de IL-10.
12. Método de qualquer uma das modalidades 8 a 11, em que a pro- teína de fusão inibe IL-10 do hospedeiro e/ou viral.
13. Método da modalidade 4, em que a proteína compreende uma porção de uma proteína IL-10 que compreende uma ou mais mutações que aumentam a afinidade da porção da proteína IL-10 por um recep- tor de I1L-10.
14. Método da modalidade 4, em que a sequência de ácido nucleico codifica uma proteína a qual compreende uma porção de uma proteína IL-10 que compreende uma ou mais mutações que aumentam a afini- dade da porção da proteína IL-10 por um receptor de IL-10.
15. Método da modalidade 4, em que a proteína compreende uma proteína receptora de IL-10 truncada.
16. Método da modalidade 4, em que a sequência de ácido nucleico codifica uma proteína a qual compreende uma proteína receptora de I1L-10 truncada.
17. Método da modalidade 15 ou 16, em que a proteína receptora de IL-10 truncada compreende a sequência de aminoácidos estipulada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 5 A 6.
18. Método da modalidade 4, em que a proteína compreende uma proteína truncada tendo atividade semelhante a I1L-10.
19. Método da modalidade 4, em que a sequência de ácido nucleico codifica uma proteína a qual compreende uma proteína truncada tendo atividade semelhante a IL-10.
20. Método da modalidade 18 ou 19, em que a proteína truncada ten- do atividade semelhante a IL-10 compreende a sequência de aminoá- cidos estipulada em SEQ ID NO: 7.
21. Método da modalidade 4, em que a proteína compreende uma proteína STAT3 dominante-negativa.
22. Método da modalidade 4, em que a sequência de ácido nucleico codifica uma proteína a qual compreende uma proteína STAT3 domi- nante-negativa.
23. Método da modalidade 21 ou 22, em que a proteína STAT3 domi- nante-negativa compreende a sequência de aminoácidos estipulada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 8 A 10.
24. Método da modalidade 4, em que a molécula pequena compre- ende AS-101.
25. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que a vacina compreende um polinucleotídeo recombinante o qual compre- ende um genoma de adenovírus, ou uma porção do mesmo, e uma sequência de ácido nucleico codificando o antígeno.
26. Método da modalidade 25, em que o polinucleotídeo recombinan- te adicionalmente compreende uma sequência de ácido nucleico codi- ficando o inibidor de IL-10.
27. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que a vacina compreende um polinucleotídeo recombinante o qual compre- ende um genoma de citomegalovírus (CMV), ou uma porção do mes- mo, e uma sequência de ácido nucleico codificando o antígeno.
28. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 24, em que a vacina é uma vacina deficiente de IL-10.
29. Método da modalidade 28, em que a vacina deficiente de IL-10 compreende um polinucleotídeo recombinante o qual compreende um genoma de citomegalovírus (CMV), ou uma porção do mesmo, e uma sequência de ácido nucleico codificando o antígeno, em que o genoma de CMV ou porção do mesmo compreende uma ou mais mutações imunomoduladoras, em que a uma ou mais mutações imunomodulado- ras compreendem uma mutação dentro de uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína que tem atividade semelhante a in- terleucina-10 de CMV (IL-10 de CMV).
30. Método da modalidade 29, em que a uma ou mais mutações imu- nomoduladoras estão localizadas em uma região regulatória e/ou uma região codificante de proteína da sequência de ácido nucleico codifi- cando a proteína que tem atividade semelhante a IL-10 de CMV.
31. Método da modalidade 27, 29, ou 30, em que o CMV é um CMV que pode infectar células humanas, de primata não humano, ou de camundongo.
32. Método de qualquer uma das modalidades 29 a 31, em que a pro- teína que tem atividade semelhante a IL-10 de CMV é IL-10 do CMV humano (HCMVIL-10) ou IL-10 de CMV de macacos rhesus (RhCOMVIL-10).
33. Método de qualquer uma das modalidades 27 e 29 a 32, em que a sequência de nucleotídeos codificando o antígeno está localizada dentro do genoma de CMV ou porção do mesmo.
34. Método de qualquer uma das modalidades 27 e 29 a 33, em que o antígeno é um antígeno não de CMV.
35. Método de qualquer uma das modalidades 29 a 34, em que a uma ou mais mutações imunomoduladoras compreendem uma substi- tuição, uma deleção, e/ou uma inserção de um ou mais nucleotídeos.
36. Método de qualquer uma das modalidades 29 a 35, em que a mu- tação dentro da sequência de ácido nucleico codificando a proteína que tem atividade semelhante a IL-10 de CMV compreende uma dele- ção dentro dos primeiros dois éxons da sequência de ácido nucleico codificando a proteína que tem atividade semelhante a IL-10 de CMV.
37. Método de qualquer uma das modalidades 29 a 36, em que a mu- tação dentro da sequência de ácido nucleico codificando a proteína que tem atividade semelhante a IL-10 de CMV reduz ou inativa a ativi- dade da proteína tendo atividade semelhante a IL-10 de CMV.
38. Método de qualquer uma das modalidades 29 a 37, em que a uma ou mais mutações imunomoduladoras adicionalmente compreen- dem uma inserção de uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína imunoestimuladora.
39. Método da modalidade 38, em que a proteína imunoestimuladora é uma citocina.
40. Método da modalidade 39, em que a citocina é selecionada entre o grupo que consiste em interleucina-12 (IL-12), interleucina-15 (IL-
15), e uma combinação das mesmas.
41. Método de qualquer uma das modalidades 29 a 40, em que o CMV é um CMV capaz de infectar células de macaco rhesus e em que a uma ou mais mutações imunomoduladoras adicionalmente compre- endem uma mutação dentro de uma região do genoma de CMV ou porção da mesma selecionada entre o grupo que consiste em Rh182, Rh183, Rh184, Rh185, Rh186, Rh187, Rh188, Rh189, e uma combi- nação das mesmas.
42. Método de qualquer uma das modalidades 29 a 40, em que o CMV é um CMV capaz de infectar células humanas e em que a uma ou mais mutações imunomoduladoras adicionalmente compreendem uma mutação dentro de uma região do genoma de CMV ou porção da mesma selecionada entre o grupo que consiste em US2, US3, USA, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11, e uma combinação das mesmas.
43. Método de qualquer uma das modalidades 29 a 42, em que a uma ou mais mutações imunomoduladoras adicionalmente compreen- dem uma mutação dentro de uma sequência de ácido nucleico codifi- cando uma proteína que inibe a apresentação ao antígeno por uma molécula do complexo maior de histocompatibilidade (MHC).
44. Método de qualquer uma das modalidades 29 a 43, em que a uma ou mais mutações imunomoduladoras adicionalmente compreen- dem uma mutação que aumenta ou diminui a resposta da proteína desdobrada (UPR).
45. Método da modalidade 44, em que a mutação que aumenta ou diminui a resposta da proteína desdobrada diminui ou aumenta a ex- pressão de UL50 de Citomegalovírus humano, Rh81 de Rhesus cyto- megalovirus, ou M50 de Citomegalovírus de camundongo.
46. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 45, em que o antígeno é um antígeno de doença infecciosa.
47. Método da modalidade 46, em que o antígeno de doença infecci- osa é um antígeno bacteriano, viral, fúngico, de protozoário, e/ou helmíntico de doença infecciosa.
48. Método da modalidade 46 ou 47, em que o antígeno de doença infecciosa é um antígeno viral de doença infecciosa do vírus da imu- nodeficiência símia (SIV), do vírus da imunodeficiência humana (HIV), do vírus da hepatite C, do vírus herpes simplex, do vírus Epstein-Barr, ou uma combinação dos mesmos.
49. Método de qualquer uma das modalidades 46 a 48, em que o an- tígeno de doença infecciosa compreende uma proteína do antígeno (gag) específico do grupo do HIV ou do SIV.
50. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 45, em que o antígeno é um antígeno associado a tumor.
51. Método da modalidade 50, em que o antígeno associado a tumor é selecionado entre o grupo que consiste em antígeno específico da próstata, antígeno 4 associado ao melanoma (MAGEA4), antígeno 10 associado ao melanoma (MAGEA10), NY-ESO-1, um neoantígeno, e uma combinação dos mesmos.
52. Método de qualquer uma das modalidades 27 e 29 a 51, em que o genoma de CMV ou porção do mesmo adicionalmente compreende uma mutação que aumenta o tropismo ou a seletividade para uma cé- lula alvo.
53. Método da modalidade 52, em que a célula alvo é selecionada entre o grupo que consiste em uma célula de apresentação ao antíge- no, uma célula tumoral, um fibroblasto, uma célula epitelial cell, uma célula endotelial, e uma combinação das mesmas.
54. Método da modalidade 53, em que a célula de apresentação ao antígeno é uma célula dendrítica.
55. Método de qualquer uma das modalidades 52 a 54, em que a mu- tação que aumenta o tropismo ou a seletividade compreende uma mu-
tação que modifica uma proteína, ou porção da mesma, que está posi- cionada no exterior do vírion de CMV.
56. Método de qualquer uma das modalidades 52 a 55, em que a mu- tação que aumenta o tropismo ou a seletividade compreende uma in- serção de uma sequência de nucleotídeos codificando um ligante de direcionamento celular.
57. Método da modalidade 56, em que o ligante de direcionamento celular é selecionado entre o grupo que consiste em um fragmento de anticorpo que reconhece um antígeno de célula alvo, um ligante que é reconhecido por um receptor cognato de célula alvo, uma proteína do capsídeo viral que reconhece uma célula alvo, e uma combinação das mesmas.
58. Método da modalidade 56 ou 57, em que o ligante de direciona- mento celular é CD154.
59. Método de qualquer uma das modalidades 52 a 58, em que o CMV é um CMV capaz de infectar células de macaco rhesus e em que a mutação que aumenta o tropismo ou a seletividade compreende uma mutação dentro de um gene selecionado entre o grupo que consiste em Rh13.1, Rh61/Rh60, Rh157.4, Rh157.5, Rh157.6, e uma combina- ção dos mesmos.
60. Método de qualquer uma das modalidades 52 a 58, em que o CMV é um CMV capaz de infectar células humanas e em que a muta- ção que aumenta o tropismo ou a seletividade compreende uma muta- ção dentro de um gene selecionado entre o grupo que consiste em RL13, UL36, UL130, UL128, UL131, e uma combinação dos mesmos.
61. Método de qualquer uma das modalidades 27 e 29 a 60, em que o polinucleotídeo recombinante adicionalmente compreende uma se- quência de ácido nucleico codificando um marcador selecionável.
62. Método da modalidade 61, em que a sequência de ácido nucleico codificando o marcador selecionável está localizado dentro do genoma de CMV ou porção do mesmo.
63. Método da modalidade 61 ou 62, em que a sequência de ácido nucleico codificando o marcador selecionável compreende uma se- quência de ácido nucleico codificando um gene de resistência a anti- biótico e/ou uma proteína fluorescente.
64. Método de qualquer uma das modalidades 27 e 29 a 63, em que o polinucleotídeo recombinante contém uma ou mais sequências regu- latórias.
65. Método da modalidade 64, em que a uma ou mais sequências regulatórias controlam a expressão de um gene ou uma região dentro do genoma de CMV ou porção do mesmo, a sequência codificando antígeno, uma sequência codificando proteína imunoestimuladora, uma sequência codificando marcador selecionável, uma variante das mesmas, ou uma combinação das mesmas.
66. Método da modalidade 64 ou 65, em que a uma ou mais sequên- cias regulatórias compreendem um reforçador precoce de CMV, um promotor do gene de beta-actina de galinha, um primeiro éxon de um gene de beta-actina de galinha, um primeiro íntron de um gene de be- ta-actina de galinha, um aceitador de emenda de um gene de beta- globina de coelho, um promotor de EM7, um promotor de EF1a, ou uma combinação dos mesmos.
67. Método de qualquer uma das modalidades 27 a 66, em que o po- linucleotídeo recombinante adicionalmente compreende uma sequên- cia de ácido nucleico codificando o inibidor de IL-10.
68. Método de qualquer uma das modalidades 27 a 66, em que o ini- bidor de IL-10 compreende uma proteína codificada por uma sequên- cia de ácido nucleico.
69. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 68, em que o inibidor de I1L-10 e a vacina são administrados mais ou menos ao mesmo tempo.
70. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 68, em que o inibidor de IL-10 é administrado antes e/ou depois da vacina.
71. Método para prevenção ou tratamento de uma doença em um in- divíduo, o método em que compreende a indução de uma resposta imune contra um antígeno no indivíduo de acordo com o método de qualquer uma das modalidades 1 a 70.
72. Método da modalidade 71, em que a doença é uma doença infec- ciosa ou câncer.
[0246] Deve ser entendido que os exemplos e modalidades descri- tos aqui, neste pedido de patente, são para fins ilustrativos somente e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão suge- ridas aos peritos na arte e devem ser incluídas dentro do espírito e do alcance deste pedido e do âmbito das reivindicações anexadas. Todas as publicações, patentes, pedidos de patente, e números de referência de sequência citados aqui, neste pedido de patente, são por este in- corporado por meio de referência em sua totalidade para todos os fins.
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Claims (72)
1. Método para indução de uma resposta imune contra um antígeno em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao indivíduo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de interleucina 10 (IL-10) e uma vacina.
2. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que IL-10 viral e/ou celular são inibidas.
3. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que é inibida a proteína STAT3 transdutora de sinalização de receptores de IL-10.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 33, caracterizado pelo fato de que o inibidor de IL-10 compreende uma proteína, uma sequência de ácido nucleico codificando uma pro- teína, uma molécula pequena, ou uma combinação das mesmas.
5. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a proteína compreende um anticorpo.
6. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo anti-IL-10, um anticorpo anti-receptor de IL-10 (IL-10R), um anticorpo anti-CD20, ou uma com- binação dos mesmos.
7. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado entre o grupo que consiste em 1F11R1ILALA anti-IL-10, rituximab, e uma combinação dos mes- mos.
8. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a proteína compreende uma proteína de fusão Fc-lL- 10R.
9. Método de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão inibe a ligação de todas as proteí- nas a IL-10R.
10. Método de acordo com a reivindicação 88, caracteriza- do pelo fato de que a proteína de fusão tem uma alta afinidade de liga- ção para IL-10.
11. Método de acordo com a reivindicação 88, caracteriza- do pelo fato de que a proteína de fusão inibe a sinalização de recepto- res de IL-10.
12. Método de acordo com a reivindicação 88, caracteriza- do pelo fato de que a proteína de fusão inibe IL-10 do hospedeiro e/ou viral.
13. Método de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que a proteína compreende uma porção de uma prote- ína IL-10 que compreende uma ou mais mutações que aumentam a afinidade da porção da proteína IL-10 por um receptor de IL-10.
14. Método de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codifica uma proteí- na a qual compreende uma porção de uma proteína IL-10 que com- preende uma ou mais mutações que aumentam a afinidade da porção da proteína IL-10 por um receptor de IL-10.
15. Método de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que a proteína compreende uma proteína receptora de I1L-10 truncada.
16. Método de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codifica uma proteí- na a qual compreende uma proteína receptora de IL-10 truncada.
17. Método de acordo com a reivindicação 1515 ou 1616, caracterizado pelo fato de que a proteína receptora de IL-10 truncada compreende a sequência de aminoácidos estipulada em qualquer uma de SEQID NOS: 5A6.
18. Método de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que a proteína compreende uma proteína truncada tendo atividade semelhante a IL-10.
19. Método de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codifica uma proteí- na a qual compreende uma proteína truncada tendo atividade seme- lhante a I1L-10.
20. Método de acordo com a reivindicação 1818 ou 1919, caracterizado pelo fato de que a proteína truncada tendo atividade semelhante a IL-10 compreende a sequência de aminoácidos estipu- lada em SEQ ID NO: 7.
21. Método de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que a proteína compreende uma proteína STAT3 do- minante-negativa.
22. Método de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codifica uma proteí- na a qual compreende uma proteína STAT3 dominante-negativa.
23. Método de acordo com a reivindicação 2121 ou 2222, caracterizado pelo fato de que a proteína STAT3 dominante-negativa compreende a sequência de aminoácidos estipulada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 8 A 10.
24. Método de acordo com a reivindicação 44, caracteriza- do pelo fato de que a molécula pequena compreende AS-101.
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 11 a 33, caracterizado pelo fato de que a vacina compreende um polinucleotídeo recombinante o qual compreende um genoma de ade- novírus, ou uma porção do mesmo, e uma sequência de ácido nuclei- co codificando o antígeno.
26. Método de acordo com a reivindicação 2525, caracteri- zado pelo fato de que o polinucleotídeo recombinante adicionalmente compreende uma sequência de ácido nucleico codificando o inibidor de IL-10.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 11 a 33, caracterizado pelo fato de que a vacina compreende um polinucleotídeo recombinante o qual compreende um genoma de cito- megalovírus (CMV), ou uma porção do mesmo, e uma sequência de ácido nucleico codificando o antígeno.
28. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 11 a 33, caracterizado pelo fato de que a vacina é uma vacina deficiente de IL-10.
29. Método de acordo com a reivindicação 2828, caracteri- zado pelo fato de que a vacina deficiente de IL-10 compreende um po- linucleotídeo recombinante o qual compreende um genoma de citome- galovírus (CMV), ou uma porção do mesmo, e uma sequência de áci- do nucleico codificando o antígeno, em que o genoma de CMV ou por- ção do mesmo compreende uma ou mais mutações imunomodulado- ras, em que a uma ou mais mutações imunomoduladoras compreen- dem uma mutação dentro de uma sequência de ácido nucleico codifi- cando uma proteína que tem atividade semelhante a interleucina-10 de CMV (IL-10 de CMV).
30. Método de acordo com a reivindicação 2929, caracteri- zado pelo fato de que a uma ou mais mutações imunomoduladoras estão localizadas em uma região regulatória e/ou uma região codifi- cante de proteína da sequência de ácido nucleico codificando a proteí- na que tem atividade semelhante a IL-10 de CMV.
31. Método de acordo com a reivindicação 2727, caracteri- zado pelo fato de que o CMV é um CMV que pode infectar células hu- manas, de primata não humano, ou de camundongo.
32. Método de acordo com a reivindicação 2929, caracteri- zado pelo fato de que a proteína que tem atividade semelhante a IL-10 de CMV é IL-10 do CMV humano (HCMVIL-10) ou IL-10 de CMV de macacos rhesus (RRCMVIL-10).
33. Método de acordo com a reivindicação 2727, caracteri- zado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codificando o antí- geno está localizada dentro do genoma de CMV ou porção do mesmo.
34. Método de acordo com a reivindicação 2727, caracteri- zado pelo fato de que o antígeno é um antígeno não de CMV.
35. Método de acordo com a reivindicação 2929, caracteri- zado pelo fato de que a uma ou mais mutações imunomoduladoras compreendem uma substituição, uma deleção, e/ou uma inserção de um ou mais nucleotídeos.
36. Método de acordo com a reivindicação 2929, caracteri- zado pelo fato de que a mutação dentro da sequência de ácido nuclei- co codificando a proteína que tem atividade semelhante a I1L-10 de CMV compreende uma deleção dentro dos primeiros dois éxons da sequência de ácido nucleico codificando a proteína que tem atividade semelhante a IL-10 de CMV.
37. Método de acordo com a reivindicação 2929, caracteri- zado pelo fato de que a mutação dentro da sequência de ácido nuclei- co codificando a proteína que tem atividade semelhante a I1L-10 de CMV reduz ou inativa a atividade da proteína tendo atividade seme- lhante a I1L-10 de CMV.
38. Método de acordo com a reivindicação 2929, caracteri- zado pelo fato de que a uma ou mais mutações imunomoduladoras adicionalmente compreendem uma inserção de uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína imunoestimuladora.
39. Método de acordo com a reivindicação 3838, caracteri- zado pelo fato de que a proteína imunoestimuladora é uma citocina.
40. Método de acordo com a reivindicação 3939, caracteri- zado pelo fato de que a citocina é selecionada entre o grupo que con- siste em interleucina-12 (IL-12), interleucina-15 (IL-15), e uma combi- nação das mesmas.
41. Método de acordo com a reivindicação 2929, caracteri- zado pelo fato de que o CMV é um CMV capaz de infectar células de macaco rhesus e em que a uma ou mais mutações imunomoduladoras adicionalmente compreendem uma mutação dentro de uma região do genoma de CMV ou porção da mesma selecionada entre o grupo que consiste em Rh182, Rh183, Rh184, Rh185, Rh186, Rh187, Rh188, Rh189, e uma combinação das mesmas.
42. Método de acordo com a reivindicação 2929, caracteri- zado pelo fato de que o CMV é um CMV capaz de infectar células hu- Mmanas e em que a uma ou mais mutações imunomoduladoras adicio- nalmente compreendem uma mutação dentro de uma região do ge- noma de CMV ou porção da mesma selecionada entre o grupo que consiste em US2, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11, e uma combinação das mesmas.
43. Método de acordo com a reivindicação 2929, caracteri- zado pelo fato de que a uma ou mais mutações imunomoduladoras adicionalmente compreendem uma mutação dentro de uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína que inibe a apresentação ao antígeno por uma molécula do complexo maior de histocompatibili- dade (MHC).
44. Método de acordo com a reivindicação 2929, caracteri- zado pelo fato de que a uma ou mais mutações imunomoduladoras adicionalmente compreendem uma mutação que aumenta ou diminui a resposta da proteína desdobrada (UPR).
45. Método de acordo com a reivindicação 4444, caracteri- zado pelo fato de que a mutação que aumenta ou diminui a resposta da proteína desdobrada diminui ou aumenta a expressão de UL50 de Citomegalovírus humano, Rh81 de Rhesus cytomegalovirus, ou M50 de Citomegalovírus de camundongo.
46. Método de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 11 a 33, caracterizado pelo fato de que o antígeno é um antígeno de doença infecciosa.
47. Método de acordo com a reivindicação 4646, caracteri- zado pelo fato de que o antígeno de doença infecciosa é um antígeno bacteriano, viral, fúngico, de protozoário, e/ou helmíntico de doença infecciosa.
48. Método de acordo com a reivindicação 4646, caracteri- zado pelo fato de que o antígeno de doença infecciosa é um antígeno viral de doença infecciosa do vírus da imunodeficiência símia (SIV), do vírus da imunodeficiência humana (HIV), do vírus da hepatite C, do vírus herpes simplex, do vírus Epstein-Barr, ou uma combinação dos mesmos.
49. Método de acordo com a reivindicação 4646, caracteri- zado pelo fato de que o antígeno de doença infecciosa compreende uma proteína do antígeno (gag) específico do grupo do HIV ou do SIV.
50. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 11 a 33, caracterizado pelo fato de que o antígeno é um antígeno associado a tumor.
51. Método de acordo com a reivindicação 5050, caracteri- zado pelo fato de que o antígeno associado a tumor é selecionado en- tre o grupo que consiste em antígeno específico da próstata, antígeno 4 associado ao melanoma (MAGEAA4), antígeno 10 associado ao me- lanoma (MAGEA10), NY-ESO-1, um neoantígeno, e uma combinação dos mesmos.
52. Método de acordo com a reivindicação 2727, caracteri- zado pelo fato de que o genoma de CMV ou porção do mesmo adicio- nalmente compreende uma mutação que aumenta o tropismo ou a se- letividade para uma célula alvo.
53. Método de acordo com a reivindicação 5252, caracteri- zado pelo fato de que a célula alvo é selecionada entre o grupo que consiste em uma célula de apresentação ao antígeno, uma célula tu- moral, um fibroblasto, uma célula epitelial cell, uma célula endotelial, e uma combinação das mesmas.
54. Método de acordo com a reivindicação 5353, caracteri- zado pelo fato de que a célula de apresentação ao antígeno é uma cé- lula dendrítica.
55. Método de acordo com a reivindicação 5252, caracteri- zado pelo fato de que a mutação que aumenta o tropismo ou a seleti- vidade compreende uma mutação que modifica uma proteína, ou por- ção da mesma, que está posicionada no exterior do vírion de CMV.
56. Método de acordo com a reivindicação 5252, caracteri- zado pelo fato de que a mutação que aumenta o tropismo ou a seleti- vidade compreende uma inserção de uma sequência de nucleotídeos codificando um ligante de direcionamento celular.
57. Método de acordo com a reivindicação 5656, caracteri- zado pelo fato de que o ligante de direcionamento celular é seleciona- do entre o grupo que consiste em um fragmento de anticorpo que re- conhece um antígeno de célula alvo, um ligante que é reconhecido por um receptor cognato de célula alvo, uma proteína do capsídeo viral que reconhece uma célula alvo, e uma combinação das mesmas.
58. Método de acordo com a reivindicação 5656, caracteri- zado pelo fato de que o ligante de direcionamento celular é CD154.
59. Método de acordo com a reivindicação 5252, caracteri- zado pelo fato de que o CMV é um CMV capaz de infectar células de macaco rhesus e em que a mutação que aumenta o tropismo ou a se- letividade compreende uma mutação dentro de um gene selecionado entre o grupo que consiste em Rh13.1, Rn61/Rh60, Rh157.4, Rh157.5, Rh157.6, e uma combinação dos mesmos.
60. Método de acordo com a reivindicação 5252, caracteri- zado pelo fato de que o CMV é um CMV capaz de infectar células hu-
manas e em que a mutação que aumenta o tropismo ou a seletividade compreende uma mutação dentro de um gene selecionado entre o grupo que consiste em RL13, UL36, UL130, UL128, UL131, e uma combinação dos mesmos.
61. Método de acordo com a reivindicação 2727, caracteri- zado pelo fato de que o polinucleotídeo recombinante adicionalmente compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um marca- dor selecionável.
62. Método de acordo com a reivindicação 6161, caracteri- zado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codificando o marcador selecionável está localizado dentro do genoma de CMV ou porção do mesmo.
63. Método de acordo com a reivindicação 6161, caracteri- zado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico codificando o marcador selecionável compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um gene de resistência a antibiótico e/ou uma proteína flu- orescente.
64. Método de acordo com a reivindicação 2727, caracteri- zado pelo fato de que o polinucleotídeo recombinante contém uma ou mais sequências regulatórias.
65. Método de acordo com a reivindicação 6464, caracteri- zado pelo fato de que a uma ou mais sequências regulatórias contro- lam a expressão de um gene ou uma região dentro do genoma de CMV ou porção do mesmo, a sequência codificando antígeno, uma sequência codificando proteína imunoestimuladora, uma sequência codificando marcador selecionável, uma variante das mesmas, ou uma combinação das mesmas.
66. Método de acordo com a reivindicação 6464, caracteri- zado pelo fato de que a uma ou mais sequências regulatórias compre- endem um reforçador precoce de CMV, um promotor do gene de beta-
actina de galinha, um primeiro éxon de um gene de beta-actina de ga- linha, um primeiro íntron de um gene de beta-actina de galinha, um aceitador de emenda de um gene de beta-globina de coelho, um pro- motor de EM7, um promotor de EF1a, ou uma combinação dos mes- mos.
67. Método de acordo com a reivindicação 2727, caracteri- zado pelo fato de que o polinucleotídeo recombinante adicionalmente compreende uma sequência de ácido nucleico codificando o inibidor de IL-10.
68. Método de acordo com a reivindicação 2727, caracteri- zado pelo fato de que o inibidor de IL-10 compreende uma proteína codificada por uma sequência de ácido nucleico.
69. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 11 a 33, caracterizado pelo fato de que o inibidor de IL-10 e a va- cina são administrados mais ou menos ao mesmo tempo.
70. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 11 a 33, caracterizado pelo fato de que o inibidor de IL-10 é ad- ministrado antes e/ou depois da vacina.
71. Método para prevenção ou tratamento de uma doença em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a indu- ção de uma resposta imune contra um antígeno no indivíduo de acor- do com o método como definido em qualquer uma das reivindicações 11a33.
72. Método de acordo com a reivindicação 7171, caracteri- zado pelo fato de que a doença é uma doença infecciosa ou câncer.
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