BR112021003095A2 - métodos relacionados à gravidade e progressão de lesão pré-maligna bronquial - Google Patents

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Marc Lenburg
Mary Reid
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Abstract

MÉTODOS RELACIONADOS À GRAVIDADE E PROGRESSÃO DE LESÃO PRÉ-MALIGNA BRONQUIAL. A tecnologia descrita no presente pedido é direcionada a métodos de tratamento e diagnóstico de lesões pré-malignas bronquiais, por exemplo, pela determinação do subtipo de lesão usando um ou mais biomarcadores descritos no presente documento.

Description

“MÉTODOS RELACIONADOS À GRAVIDADE E PROGRESSÃO DE LESÃO PRÉ- MALIGNA BRONQUIAL”. REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] O presente pedido reivindica benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido Provisório Norte-Americano nº 62/765,264, depositado em 20 de agosto de 2018, cujo conteúdo é incorporado ao presente documento a título de referência na íntegra.
SUPORTE GOVERNAMENTAL
[0002] A presente invenção foi realizada com o apoio do Governo sob o contrato nº CA196408, concedido pelos National Institutes of Health. O Governo tem determinados direitos sobre a invenção.
CAMPO TÉCNICO
[0003] A tecnologia descrita no presente pedido se refere ao tratamento, diagnóstico e monitoramento de tratamento para lesões pré-malignas bronquiais.
ANTECEDENTES
[0004] O câncer de células escamosas de pulmão se desenvolve a partir de lesões não cancerosas nas vias aéreas conhecidas como lesões pré-malignas bronquiais. A presença de lesões pré-malignas bronquiais displásicas persistentes ou progressivas é um marcador de risco aumentado de câncer de pulmão, tanto no local da lesão (onde elas são os precursores presumidos do câncer de pulmão de células escamosas) como em outras partes do pulmão. Nem todas as lesões pré-malignas bronquiais evoluem para câncer invasivo, e aquelas que evoluem, progridem em taxas variáveis com desfechos variáveis. No momento, não há ferramentas disponíveis na clínica para identificar quais lesões progredirão para câncer e quais não. Além disso, a tecnologia atual para detectar lesões pré-malignas bronquiais é por meio de autofluorescência e broncoscopia de luz branca. Um procedimento de broncoscopia é invasivo e é apenas moderadamente sensível e específico na detecção de pequenas lesões pré-malignas bronquiais, uma vez que requer a visualização das lesões. Por fim, até o momento, o único tratamento para lesões pré-malignas bronquiais é a remoção das lesões por meio de cirurgia ou broncoscopia.
SUMÁRIO
[0005] Os inventores desenvolveram agora: 1) testes para a presença de lesões pré-malignas bronquiais (algumas das quais não requerem broncoscopia e usam a descoberta surpreendente de que tecidos normais em outras partes das vias aéreas exibem biomarcadores que indicam a presença de lesões pré-malignas bronquiais no indivíduo), 2) métodos para determinar se as lesões pré-malignas bronquiais têm probabilidade de progredir para câncer, 3) novas terapias para lesões pré-malignas bronquiais que têm como alvo as alterações moleculares subjacentes que caracterizam as lesões pré-malignas bronquiais.
[0006] Consequentemente, um aspecto fornecido no presente documento é um método de tratamento de lesões pré- malignas bronquiais, o método compreendendo: administrar pelo menos um dentre: (i) um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; (ii) pelo menos a cada 6 meses, um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou (iii) pelo menos um fármaco antiproliferativo; a um indivíduo determinado como tendo pelo menos um dentre: (a) um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 5 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa; e (b) um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa.
[0007] Em uma modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, pelo menos um do gene do módulo 5 é selecionado a partir do grupo que consiste em: RACGAP1 e TPX2; e pelo menos um do gene do módulo 6 é selecionado a partir do grupo que consiste em: NEK11 e IFT88.
[0008] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o indivíduo é ainda determinado como tendo um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 7 ou módulo 4.
[0009] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, pelo menos um do gene do módulo 7 ou módulo 4 é selecionado a partir do grupo que consiste em: COX6A1; COX7A2; RPL26; e RPL23.
[0010] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o nível de expressão de cada um dos genes da Tabela 15 é determinado.
O método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, é caracterizado por pelo menos um do fármaco antiproliferativo ser selecionado a partir do grupo que consiste em: Antagonista do receptor de acetilcolina; Inibidores de acetilcolinesterase; Antagonistas do receptor de adenosina; Antagonistas do receptor adrenérgico; Inibidores de AKT; Antagonistas do receptor de angiotensina; Estimulantes de apoptose; Inibidores de quinase Aurora; Inibidores de CDK; Inibidores de ciclo-oxigenase; Inibidores da produção de citocinas; Inibidores de desidrogenase; Inibidores de proteína quinase de DNA; Inibidores de adesão focal; Antagonistas do receptor de dopamina; Inibidores de EGFR; Inibidores de fosforilação ERK1 e ERK2; Agonistas do receptor de estrogênio; Inibidores de EZH2; Inibidores de FLT3; Agonistas do receptor de glicocorticoide; Antagonistas do receptor de glutamato; Inibidores de HDAC; Antagonistas do receptor de histamina; Inibidores de histona lisina metiltransferase; Inibidores de HSP; Inibidores de IKK; Antagonistas do canal iônico; Inibidores de JAK; Inibidores de JNK; Inibidores de KIT; Inibidores de quinase com repetição rica em leucina; Inibidores de MDM; inibidores da liberação de mediador; Inibidores de MEK; Inibidores de MTOR; Inibidores de monoamina oxidase; Inibidores da via de NFB; Inibidores de nucleofosmina; Inibidores de PARP; Agonistas do receptor PPAR; Inibidores de PI3K; Inibidores de tirosina quinase; Inibidores de fosfodiesterase; Inibidores de proteína quinase; Inibidores de RAF; Inibidores de RNA polimerase; Inibidores de topoisomerase; Inibidores da síntese de RNA; Inibidores de SIRT; Bloqueadores do canal de sódio; Inibidores de VEGFR; e Agonistas do receptor de vitamina D.
[0011] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o fármaco antiproliferativo é administrado como uma formulação inalada ou formulação tópica.
[0012] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o fármaco antiproliferativo é administrado durante um procedimento com base em broncoscopia.
[0013] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o fármaco antiproliferativo é administrado sistemicamente.
[0014] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o fármaco antiproliferativo é administrado durante um procedimento com base em broncoscopia e sistemicamente.
[0015] Outro aspecto fornecido no presente documento se refere a um método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais, o método compreendendo: administrar pelo menos um de: (i) um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; (ii) pelo menos a cada 6 meses, um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou (iii) pelo menos um fármaco antiproliferativo; a um indivíduo determinado como tendo pelo menos um dentre: (a) um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 5 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa; e (b) um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa, em que o indivíduo é ainda determinado como tendo um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 9 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa e/ou um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 10 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa.
[0016] Em uma modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o indivíduo determinado como tendo um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 9 e/ou um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 10 recebe pelo menos um de: i. tanto um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central em que as lesões são submetidas à biópsia para remover o tecido anormal, quanto uma tomografia computadorizada do tórax; ii. pelo menos a cada 6 meses, um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central, em que as lesões são submetidas à biópsia para remover o tecido anormal e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou iii. pelo menos um fármaco imunoestimulante.
[0017] Também é fornecido no presente documento, em outro aspecto, um método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais, o método compreendendo: administrar pelo menos um de: (i) tanto um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central, em que as lesões são submetidas à biópsia para remover o tecido anormal, quanto uma tomografia computadorizada do tórax; (ii) pelo menos a cada 6 meses, um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central, em que as lesões são submetidas à biópsia para remover o tecido anormal e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou (iii) pelo menos um fármaco imunoestimulante; a um indivíduo determinado como tendo um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 9 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa e/ou um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 10 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa.
[0018] Em uma modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o gene do módulo 9 é selecionado a partir do grupo que consiste em: EPSTI1; UBE2L6; B2M e TAP1.
[0019] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, pelo menos um do gene do módulo 9 é selecionado a partir da Tabela 16.
[0020] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o gene do módulo
10 é selecionado a partir do grupo que consiste em: CACNB3 e MAPK10.
[0021] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, pelo menos um do fármaco imunoestimulante é selecionado a partir do grupo que consiste em: Inibidores do ponto de verificação imune (por exemplo, inibidores contra PD-1, PD-L1, CTLA4, e LAG3); Fármacos que estimulam a sinalização ao interferon (por exemplo, fármacos antivirais que melhoram a sinalização ao interferon); Inibidores da síntese de DNA; Inibidores de IMDH; Inibidores de CDK; Inibidores de ribonucleotídeo redutase; Inibidores de di-hidrofolato redutase; Inibidores de topoisomerase; Inibidores de FLT3; Inibidores de IGF-1; Inibidores de MEK; Inibidores de quinase Aurora; Inibidores de PKC; Inibidores de RAF; Inibidores de PDFGR/KIT; Inibidores de VEGFR; Inibidores de SRC; Agonistas do receptor de retinoide; Inibidores de HDAC; Inibidores de DNA metiltransferase; e Inibidores de EZH2.
[0022] Outro aspecto fornecido no presente documento se refere a um método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais, o método compreendendo: administrar pelo menos um de: (i) um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; (ii) pelo menos a cada 6 meses, um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou (iii) pelo menos um fármaco anti-inflamatório; a um indivíduo determinado como tendo pelo menos um dentre: (a) um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 2 comparado com um nível de referência não inflamatório; e (b) um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência não inflamatório.
[0023] Em uma modalidade deste aspecto e todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, pelo menos um do gene do módulo 2 é selecionado a partir do grupo que consiste em: MSANTD2, CCNL2 e LUC7L; e pelo menos um do gene do módulo 6 é selecionado a partir do grupo que consiste em: NEK11 e IFT88.
[0024] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o indivíduo é ainda determinado como tendo um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 7, gene do módulo 1 ou gene do módulo 8 e/ou nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 4 ou um gene do módulo 5.
[0025] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, pelo menos um do gene do módulo 7 é selecionado a partir do grupo que consiste em: RPL26 e RPL23.
[0026] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, pelo menos um do gene do módulo 1 é selecionado a partir do grupo que consiste em: KIRREL; PHLDB1; e MARVELD1.
[0027] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, pelo menos um do gene do módulo 8 é selecionado a partir do grupo que consiste em: DOC2; CD53; e LAPTM.
[0028] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, pelo menos um do gene do módulo 4 é selecionado a partir do grupo que consiste em: COX6A1 e COX7A2.
[0029] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, pelo menos um do gene do módulo 5 é selecionado a partir do grupo que consiste em: RACGAP1 e TPX2.
[0030] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, é determinado o nível de expressão de cada um dos genes da Tabela 15.
[0031] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, pelo menos um do fármaco anti-inflamatório é selecionado a partir do grupo que consiste em: Antagonistas do receptor de acetilcolina;
Inibidores de acetilcolinesterase; Antagonistas do receptor de adenosina; Antagonistas do receptor adrenérgico;
Antagonistas do receptor de angiotensina; Anticorpos anti-
IL1B; Estimulantes de apoptose; Inibidores de quinase
Aurora; Inibidores de CDK; Inibidores de ciclo-oxigenase;
Inibidores da produção de citocinas; Inibidores de desidrogenase; Antagonistas do receptor de dopamina;
Inibidores de EGFR; Inibidores de fosforilação ERK1 e ERK2;
Agonistas do receptor de estrogênio; Inibidores de FLT3;
Agonistas do receptor de glicocorticoide; Antagonistas do receptor de glutamato; Inibidores de HDAC; Antagonistas do receptor de histamina; Inibidores de histona lisina metiltransferase; Inibidores de HSP; Inibidores de IKK;
Antagonistas do canal iônico; Inibidores de KIT; Inibidores de quinase com repetição rica em leucina; Inibidores de MEK;
Inibidores de MDM; Inibidores de fosfodiesterase; Inibidores de monoamino oxidase; Inibidores de MTOR; Inibidores da via de NFB; Inibidores de nucleofosmina; Inibidores de PARP;
Inibidores de PI3K; Agonistas do receptor PPAR; Inibidores da síntese de proteínas (por exemplo, cloranfenicol);
Inibidores de RAF; Inibidores de SIRT; Bloqueadores dos canais de sódio; Inibidores do receptor de TGF beta;
Inibidores de topoisomerase; Inibidores de tirosina quinase; Inibidores de VEGFR; e Agonistas do receptor de vitamina D.
[0032] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o fármaco anti- inflamatório é administrado durante um procedimento com base em broncoscopia.
[0033] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o fármaco anti- inflamatório é administrado sistemicamente.
[0034] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o fármaco anti- inflamatório é administrado durante um procedimento com base em broncoscopia e sistemicamente.
[0035] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, pelo menos um do gene é selecionado a partir da Tabela 14.
[0036] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, é determinado o nível de expressão de cada um dos genes da Tabela 14.
[0037] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o desenvolvimento de câncer de pulmão ou carcinoma de células escamosas do pulmão é prevenido, retardado ou reduzido.
[0038] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o câncer de pulmão é carcinoma de células escamosas do pulmão.
[0039] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o nível de expressão é o nível de expressão em uma biópsia endobronquial, amostra de esfregaço endobrônquico, biópsia de vias aéreas superiores, amostra de esfregaço de vias aéreas superiores, células epiteliais nasais, expectoração ou sangue obtido do indivíduo.
[0040] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o nível de expressão é o nível de expressão em um esfregaço brônquico obtido do brônquio principal direito ou esquerdo.
[0041] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, a amostra de biópsia ou esfregaço compreende tecidos ou células morfologicamente normais.
[0042] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, a biópsia ou amostra de esfregaço consiste em células ou tecidos morfologicamente normais.
[0043] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o nível de expressão é o nível de expressão em uma amostra que compreende células de lesão bronquial pré-maligna.
[0044] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o nível de expressão é o nível de expressão em uma amostra que compreende células morfologicamente normais.
[0045] Em outra modalidade deste e de todos os outros aspectos fornecidos no presente documento, o indivíduo é um fumante ou ex-fumante.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0046] As Figuras 1A-1E demonstram que as biópsias endobronquiais se dividem em quatro subtipos moleculares distintos que se correlacionam com fenótipos clínicos e moleculares. (Figura 1A) Genes (n = 3.936) organizados em 9 módulos de coexpressão gênica foram usados para descobrir quatro subtipos moleculares (Proliferativo, Inflamatório, Secretor e Normal) nas 190 biópsias DC usando agrupamento de consenso. O mapa térmico mostra agrupamento hierárquico semi-supervisionado da expressão gênica normalizada com pontuação z entre os 3.936 genes e 190 biópsias DC. A barra superior representa os quatro subtipos moleculares: Proliferativo (n = 52 amostras), Inflamatório (n = 37 amostras), Secretor (n = 61 amostras) e Normal (n = 40 amostras). Ao longo de todas as figuras, os quatro subtipos de moléculas são representados por quatro tons de cinza, aumentando a luminosidade em relação à ordem fornecida na frase anterior. No lado esquerdo do mapa térmico, a média do primeiro componente principal calculado entre os genes do módulo é representada para cada subtipo. No lado direito do mapa térmico, um resumo das vias biológicas enriquecidas é listado para cada módulo. (Figura 1B) Gráficos de bolha que mostram associações significativas (p < 0,01 pelo Teste Exato de Fisher) entre os subtipos moleculares e tabagismo, grau histológico de biópsia e os subtipos moleculares de tumor LUSC previstos. As colunas representam os 4 subtipos moleculares (Proliferativo, Inflamatório, Secretor e Normal) e o diâmetro do círculo é proporcional ao número de amostras dentro de cada subtipo que têm o fenótipo na linha. (Figura 1C) Diagrama de caixas de valores de expressão de MKI67 em biópsias com histologia normal ou hiperplasia (n = 8, 16, 26, 18 em subtipos Proliferativo, Inflamatório, Secretor e Normal, respectivamente). Os níveis de expressão de MKI67 do subtipo Proliferativo são significativamente maiores do que as amostras de subtipo Não Proliferativo (FDR = 3.4e-10).
(Figura 1D) Diagrama de caixas de valores de expressão de MKI67 em biópsias com histologia displásica (n = 33, 11, 19, 9 nos subtipos Proliferativo, Inflamatório, Secretor e Normal, respectivamente). Os níveis de expressão de MKI67 do subtipo Proliferativo são significativamente maiores do que as amostras do subtipo Não Proliferativo (FDR = 3,1e-8).
(Figura 1E) Coloração imunofluorescente demonstrando a coloração aumentada de MKI67 e KRT5 e a coloração reduzida de TUB1A1 no subtipo Proliferativo em concordância com a expressão dos genes marcadores correspondentes. As amostras representativas mostradas para os subtipos Proliferativo e Inflamatório têm histologia de displasia, enquanto as amostras mostradas para os subtipos Secretor e Normal têm histologia normal (Ampliação 200X).
[0047] As Figuras 2A-2D demonstram que as associações fenotípicas com os subtipos moleculares são confirmadas em um conjunto independente de amostras. (Figura 2A) As 190 biópsias DC e os 3.936 genes foram usados para construir um classificador de subtipo molecular de centróide mais próximo de 22 genes. Agrupamento hierárquico semi-supervisionado da expressão gênica normalizada com pontuação z entre os 22 genes classificadores e 190 amostras de treinamento de biópsias DC. (Figura 2B) O classificador de subtipo molecular do centroide mais próximo de 22 genes foi usado para prever os subtipos moleculares das 105 biópsias VC. É representado o agrupamento hierárquico semi-supervisionado de expressão gênica normalizada com pontuação z em 22 genes e 105 VC. As linhas do mapa térmico fornecem o nome do gene e a associação do módulo, e a barra de cores da coluna mostra a associação do subtipo molecular. (Figura 2C) Gráficos de bolhas que mostram associações significativas (p < 0,01 pelo Teste Exato de Fisher) entre os subtipos moleculares VC e o estado de tabagismo, grau histológico de biópsia e os subtipos moleculares de tumor LUSC previstos. As colunas representam os 4 subtipos moleculares (Proliferativo, Inflamatório, Secretor e Normal) e o raio do círculo é proporcional ao número de amostras dentro de cada subtipo que tem o fenótipo na linha. (Figura 2D) Gráficos de bolhas que mostram associações significativas (p < 0,01 pelo Teste Exato de Fisher) entre os subtipos moleculares VC e o estado de tabagismo, grau histológico de biópsia e os subtipos moleculares de tumor LUSC previstos. As colunas representam os 4 subtipos moleculares (Proliferativo, Inflamatório, Secretor e Normal) e o raio do círculo é proporcional ao número de amostras dentro de cada subtipo que tem o fenótipo na linha.
[0048] As Figuras 3A-3C demonstram o desempenho do classificador de subtipo molecular nos esfregaços das vias aéreas superiores do epitélio de aparência normal coletado ao mesmo tempo que as biópsias endobronquiais. (Figura 3A) As coortes DC (esquerda) e VC (direita), mostrando o número de esfregaços (eixo y) previstos como positivos para o subtipo Proliferativo que têm pelo menos uma biópsia (eixo y) com uma classificação do subtipo Proliferativo no momento em que o esfregaço foi coletado. (Figura 3B) Diagrama de caixas de PC1 para os Módulos 4, 5, 6 e 7 (eixo y) através dos quatro subtipos moleculares para cada coorte (eixo x).
O asterisco indica diferenças significativas entre o subtipo Proliferativo versus todas as outras amostras (FDR < 0,05).
(Figura 3C) Diagrama de caixas de PC1 para os Módulos 4, 5, 6 e 7 (eixo y) através dos quatro subtipos moleculares para cada coorte (eixo x). O asterisco indica diferenças significativas entre o subtipo Proliferativo versus todas as outras amostras (FDR < 0,05).
[0049] As Figuras 4A-4H demonstram que o módulo enriquecido para sinalização ao interferon e processamento de antígeno está associado à progressão/persistência na biópsia e uma depleção de células imunes inatas e adaptativas no subtipo Proliferativo. (Figuras 4A e 4F) Expressão de metagene dos genes do Módulo 9 entre biópsias DC dentro do subtipo Proliferativo (p = 0,002 entre as biópsias progressivas/persistentes versus regressivas). A progressão/regressão na biópsia foi definida para cada biópsia com base na histologia da biópsia e na pior histologia registrada para a mesma localização anatômica pulmonar no futuro. As alterações histológicas entre normal,
hiperplasia e metaplasia foram classificadas como "normal estável", diminuições no grau de displasia histológica ou alterações de histologia displásica para normal/hiperplasia/metaplasia foram classificadas como
"regressivas", a falta de dados histológicos futuros foi classificada como "desconhecida" e todo o resto foi classificado como "progressivo/persistente". (Figuras 4B e
4G) Diagrama de caixas das porcentagens de células positivamente coradas para CD68 e CD163, CD68, CD163, CD4 e
CD8 entre biópsias progressivas/persistentes e regressivas
(p < 0,001 para todas as comparações). Os rótulos do eixo x indicam o número de regiões (R) enumeradas entre os indivíduos (P) para cada coloração e grupo de resultados representado no diagrama de caixas.
As biópsias foram incluídas na análise se seus resultados clínicos fossem concordantes com a pontuação para o Módulo 9. (Figura 4B)
Expressão de metagene de genes do Módulo 9 entre biópsias VC dentro do subtipo Proliferativo (p = 0,03 entre as biópsias progressivas/persistentes versus regressivas). (Figura 4C)
Acima: expressão gênica normalizada com pontuação Z nos 112 genes no Módulo 9, nas biópsias DC (à esquerda) e nas biópsias VC (à direita). Cada mapa térmico é supervisionado de acordo com as pontuações GSVA do Módulo 9. As barras superiores indicam o grau histológico das biópsias e seu estado de progressão. Abaixo: resultados de xCell que indicam a abundância relativa de tipos de células imunes nas biópsias DC (à esquerda) e nas biópsias VC (à direita). Os tipos de células imunes exibidos estão significativamente associados à progressão/persistência da lesão (FDR < 0,05 tanto na DC quanto na VC após o ajuste para diferenças no teor de células epiteliais). (Figura 4D) Histologia representativa em que a linha tracejada denotou a separação de epitélio e compartimento estromal. Painéis superiores: uma displasia grave progressiva reduziu a presença de células imunes demonstrada pela redução acentuada na expressão de macrófagos M2 (coloração de CD68/163, células duplamente positivas indicadas pelas setas) e células T CD8. (A amostra corresponde a *P na Figura 4C.) Painéis inferiores: uma displasia moderada regressiva aumentou a presença de células imunes, incluindo macrófagos M2 (coloração CD68/163 células duplamente positivas indicadas pelas setas) e células T CD8.
(as amostras correspondem a *P na Figura 4C.) (Figuras 4E e 4H) Diagrama de caixas das porcentagens de células coradas positivamente para CD68 e CD163, CD68, CD163, CD4 e CD8 entre biópsias progressivas/persistentes e regressivas (p < 0,001 para todas as comparações). Os rótulos do eixo x indicam o número de regiões (R) enumeradas entre os indivíduos (P) para cada coloração e o grupo de resultados representado no diagrama de caixas. As biópsias foram incluídas na análise se seus resultados clínicos fossem concordantes com a pontuação para o Módulo 9.
[0050] A Figura 5 representa Informações sobre Lote e Estatísticas de Alinhamento em Amostras em ambas as coortes de Descoberta e Validação. Os testes estatísticos entre as coortes de Descoberta e Validação foram realizados usando o Teste Exato de Fisher para variáveis categóricas e o teste t de Student para variáveis contínuas. As porcentagens são relatadas para variáveis categóricas e a média e os desvios padrão são relatados para variáveis contínuas.
[0051] A Figura 6 representa um resumo dos Módulos Genéticos. São relatados o número do módulo, número de genes no módulo, vias biológicas e genes selecionados associados ao módulo e um valor de FDR para a diferença nas pontuações GSVA para o módulo entre os subtipos moleculares.
[0052] A Figura 7 representa uma lista de amostras usadas para estudos de imunofluorescência.
[0053] A Figura 8 representa a distribuição de subtipos moleculares por indivíduo. As colunas representam os 4 subtipos moleculares (Proliferativo, Inflamatório, Secretor e Normal) e o raio do círculo é proporcional ao número de amostras dentro de cada subtipo.
[0054] A Figura 9 representa um gráfico de Quantificação de Proliferação por Coloração Imunofluorescente, Marcadores de Células Basais e Células Ciliadas Entre os Subtipos Moleculares. Diagrama de caixas da quantificação de coloração imunofluorescente de KI67 (proliferação), KRT5 (células basais) e TUB1A1 (células ciliadas) em amostras representativas de cada subtipo molecular (Proliferativo n = 4, Inflamatório n = 3, Secretor n = 1, Normal n = 1). A coloração de KI67 e KRT5 é significativamente maior em amostras no subtipo Proliferativo (p = 0,02 e p = 0,01, respectivamente, para diferenças de amostra entre o subtipo Proliferativo e outros subtipos). TUB1A1 foi menor nas amostras nos subtipos Proliferativo e Inflamatório, mas não atingiu a significância estatística (p = 0,07 para diferenças na amostra entre os subtipos Proliferativo e Inflamatório versus os subtipos Inflamatório e Secretor).
[0055] As Figuras 10A-10H representam diagrama de caixas de resultados de deconvolução de genes e tipos de célula selecionados nas coortes de Descoberta e Validação por subtipo molecular. (Figuras 10A-10D) Biópsias da coorte de Descoberta. (Figuras 10E-10H) Biópsias da coorte de Validação. (Figura 10A) e (Figura 10E) mostram diagrama de caixas dos níveis de expressão gênica de genes de disparo em
LUSC identificados por TCGA nos subtipos moleculares.
(Figura 10B) e (Figura 10F) mostram diagramas de caixas dos níveis de expressão gênica de genes marcadores de tipo de célula entre os subtipos moleculares. (Figura 10C) e (Figura 10G) mostram diagramas de caixas de pontuações GSVA calculadas usando conjuntos de genes de Dvorak et al. através dos subtipos moleculares. (Figura 10D) e (Figura 10H) mostram diagramas de caixas de pontuações do algoritmo ESTIMATE entre os subtipos moleculares. O algoritmo ESTIMATE estima as frações celulares estromais (StromalScore), imunes (ImmunScore) e epiteliais (ESTIMATScore) em cada amostra.
Pontuações imunes e estromais altas indicam uma alta fração de células do estroma e imunes, enquanto pontuações epiteliais baixas indicam uma alta fração de células epiteliais.
[0056] A Figura 11 representa um mapa térmico do Classificador de Subtipo Molecular de 22 genes nas Biópsias da Coorte de Descoberta e Validação. O agrupamento hierárquico semi-supervisionado da pontuação z normalizou a expressão gênica residual entre os 22 genes classificadores e 190 amostras de treinamento de biópsias DC (à esquerda) e 105 biópsias VC (à direita). As linhas do mapa térmico mostram a associação do módulo gênico. A primeira barra de cores da coluna mostra a associação do subtipo molecular na
DC e a associação de subtipo prevista para 22 genes na VC.
A segunda barra de cores da coluna representa as previsões corretas e incorretas na DC usando o classificador de 22 genes e subtipos moleculares derivados por meio da realização de agrupamento de consenso em toda a VC.
[0057] A Figura 12 representa gráficos do comportamento do módulo gênico através dos subtipos moleculares nas biópsias das coortes de Descoberta e Validação. A média do primeiro componente principal calculado entre os genes do módulo é traçada para cada subtipo molecular.
[0058] A Figura 13 representa a concordância entre o Módulo 9 e duas análises de deconvolução do tipo de célula.
Superior: Agrupamento hierárquico da expressão gênica normalizada com pontuação z nos 112 genes no módulo 9, nas biópsias DC (à esquerda) e nas biópsias VC (à direita). Cada mapa térmico é supervisionado de acordo com as pontuações GSVA do módulo 9. As barras superiores indicam o grau histológico das biópsias e seu estado de progressão.
Resultados de xCell (meio) e pontuações GSVA para conjuntos de genes descritos por Bindea et al. (inferior) indicando a abundância relativa de tipos de células imunes nas biópsias DC (esquerda) e nas biópsias VC (direita). Os tipos de células imunes exibidos estão significativamente associados à progressão/persistência da lesão (FDR < 0,05 em DC e VC).
[0059] A Figura 14 representa um mapa traqueobrônquico das localizações dos locais coletados através de biópsia endobronquial.
[0060] A Figura 15 representa a distribuição de indivíduos entre as biópsias endobronquiais da coorte de Descoberta entre os quatro subtipos moleculares. Genes (n =
3.936) organizados em 9 módulos de coexpressão gênica foram usados para descobrir quatro subtipos moleculares (Proliferativo, Inflamatório, Secretor e Normal) ao longo das 190 biópsias da coorte de Descoberta (DC) usando agrupamento de consenso. O mapa térmico mostra agrupamento hierárquico semi-supervisionado da expressão gênica normalizada com pontuação z entre os 3.936 genes e 190 biópsias DC. As barras de cores superiores representam o indivíduo do qual a amostra foi derivada e os membros do subtipo molecular: Proliferativo (n = 52 amostras), Inflamatório (n = 37 amostras), Secretor (n = 61 amostras) e Normal (n = 40 amostras). No lado esquerdo do mapa térmico, é representada a pontuação média do módulo GSVA para cada subtipo.
[0061] A Figura 16 representa a distribuição do subtipo molecular para cada indivíduo ao longo dos procedimentos de broncoscopia. O gráfico de barras mostra, para cada indivíduo e cada procedimento de broncoscopia, o número de biópsias coletadas e seu subtipo molecular correspondente. O eixo y indica o número do indivíduo e se este indivíduo tinha ou não uma história anterior de carcinoma de células escamosas do pulmão (LUSC) ou outro tipo de câncer de pulmão (Outro). A coorte de Descoberta inclui os indivíduos 1 a 32 e a coorte de Validação inclui os indivíduos 33 a 52. Não foi detectada diferença na diversidade de classificações de subtipos dentro de um indivíduo com base na história prévia de câncer de pulmão (entropia média de Shannon de classificações de subtipo em pacientes com uma história de câncer de pulmão = 1,12, n = 32 vs. pacientes sem história de câncer de pulmão = 1,25, n = 17; valor p pelo teste de Wilcoxon Rank Sum = 0,43).
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0062] Conforme descrito no presente documento, descobriu-se que lesões pré-malignas nas vias aéreas de um indivíduo podem ser caracterizadas como sendo um de cinco tipos: normais, secretoras, inflamatórias, proliferativas progressivas e proliferativas persistentes. Identificar a lesão pré-maligna como um destes tipos permite um tratamento mais eficaz do indivíduo, uma vez que diferentes tipos de lesões respondem a diferentes tratamentos e requerem diferentes tratamentos e regimes de monitoramento.
Consequentemente, no presente documento são fornecidos métodos de tratamento relacionados ao tratamento de lesões pré-malignas bronquiais em um indivíduo. Tais métodos podem compreender ensaios, testes e/ou identificação do tipo de lesão e administração de regimes terapêuticos apropriados para este tipo de lesão.
[0063] Conforme usado no presente documento, "lesão pré-maligna" se refere a uma lesão epitelial ou displasia que é um precursor ou pode ser um precursor de câncer. A membrana basal está intacta, sem possibilidade de disseminação metastática, ao contrário do câncer. Uma lesão bronquial pré-maligna é uma lesão pré-maligna presente no epitélio brônquico de um indivíduo. Lesões pré-malignas bronquiais são geralmente pequenas e podem ser difíceis de visualizar usando broncoscopia de luz branca convencional.
[0064] As lesões pré-malignas bronquiais podem exibir um dos cinco fenótipos descritos no presente documento, particularmente proliferativa progressiva, proliferativa persistente, secretora, inflamatória e normal. Os nomes dos subtipos fazem referência às principais diferenças na atividade da via molecular que diferencia os subtipos uns dos outros. Os diferentes fenótipos de lesão podem ser distinguidos uns dos outros e do tecido normal pelo uso dos padrões de expressão gênica descritos no presente documento.
Conforme explicado em detalhes em outra parte no presente documento, os padrões de expressão gênica identificados aqui se referem a 10 módulos gênicos, em que cada módulo é um grupo de genes com padrões de expressão similares entre os diferentes subtipos de lesões pré-malignas bronquiais. A identidade de cada um dos módulos, por exemplo, os genes que compreendem cada módulo, é fornecida na Tabela 13 no presente documento. Resumidamente, as lesões proliferativas (progressivas e persistentes) se distinguem por terem um aumento de expressão dos módulos 4, 5 e 7 e uma diminuição de expressão do módulo 6. Lesões proliferativas progressivas podem se distinguir de lesões proliferativas persistentes pelo fato de que têm uma diminuição de expressão do módulo 9 e/ou um aumento de expressão do módulo 10. Lesões secretoras se distinguem por um aumento na expressão do módulo 6 e uma diminuição na expressão do módulo 1 e, opcionalmente, um aumento na expressão do módulo 8 e uma diminuição na expressão dos módulos 2, 5 e 7. O tipo Normal se distingue por um aumento na expressão do módulo 6 e uma diminuição na expressão do módulo 9 e, opcionalmente, um aumento na expressão do módulo 1 e uma diminuição na expressão do módulo 8.
[0065] O tratamento padrão para indivíduos em risco de câncer de pulmão, ou que foram identificados com lesões pré-
malignas bronquiais, é o rastreio anual do câncer de pulmão
(por exemplo, uma broncoscopia e/ou tomografia computadorizada do tórax). Quando um indivíduo tem uma lesão bronquial proliferativa pré-maligna, tal tratamento não é mais suficiente e o indivíduo deve ser tratado de forma mais agressiva.
Consequentemente, em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é fornecido no presente documento um método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais, o método compreendendo administrar pelo menos um de: i) um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; ii)
pelo menos a cada 6 meses, pelo menos um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou iii) pelo menos um fármaco antiproliferativo a um indivíduo determinado como tendo pelo menos um de a) um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 5 comparado com um nível de referência; e b) um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência.
Em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é fornecido no presente documento um método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais, o método compreendendo determinar um indivíduo como tendo pelo menos um de a) um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 5 comparado com um nível de referência; e b) um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência e administrar pelo menos um de: i) um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; ii) pelo menos a cada 6 meses (por exemplo, pelo menos a cada 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 meses), pelo menos um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou iii) pelo menos um fármaco antiproliferativo ao indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o nível de referência é um nível de referência não proliferativo.
[0066] Em algumas modalidades, se o indivíduo for determinado como não tendo pelo menos um de a) um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 5 comparado com um nível de referência; e b) um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência, o indivíduo não recebe um fármaco antiproliferativo e recebe um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e/ou uma tomografia computadorizada do tórax não mais frequentemente do que a cada 6 meses (por exemplo, não mais frequentemente do que a cada 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses).
Em algumas modalidades, se for determinado que o indivíduo não tem a) um nível elevado de expressão de pelo menos um gene do módulo 5 comparado com um nível de referência; e b) um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência, o indivíduo não recebe um fármaco antiproliferativo e recebe um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e/ou uma tomografia computadorizada do tórax não mais frequentemente do que a cada 6 meses (por exemplo, não mais frequentemente do que a cada 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses).
[0067] A expressão gênica dos módulos 5 e 6, em uma amostra de esfregaço brônquico, é suficiente para identificar um indivíduo que tem uma lesão de subtipo Proliferativo. Isto evita a necessidade de visualizar e/ou coletar a lesão real. Consequentemente, em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é fornecido no presente documento um método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais, o método compreendendo administrar pelo menos um de: i) um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; ii) pelo menos a cada 6 meses, pelo menos um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax;
e/ou iii) pelo menos um fármaco antiproliferativo para um indivíduo determinado como tendo, em uma amostra de esfregaço brônquico, a) um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 5 comparado com um nível de referência; e b) um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência.
Em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é fornecido no presente documento um método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais, o método compreendendo determinar um indivíduo como tendo, em uma amostra de esfregaço brônquico obtida do indivíduo, a) um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 5 comparado com um nível de referência; e b) um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência e administrar pelo menos um de: i) um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; ii) pelo menos a cada 6 meses,
pelo menos um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou iii) pelo menos um fármaco antiproliferativo ao indivíduo.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o nível de referência é um nível de referência não proliferativo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, oesfregaço brônquico é tirado de uma localização morfologicamente normal no brônquio principal direito ou esquerdo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o esfregaço brônquico é tirado de um local visualmente normal no brônquio principal direito ou esquerdo.
[0068] Os genes do módulo 5 e 6 são fornecidos na Tabela 13. Pelo menos um do gene do módulo 5 e/ou gene do módulo 6 pode ser qualquer um ou mais dos genes do módulo 5 e 6 listados na Tabela 13.
[0069] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 5 ou pelo menos um gene do módulo 6. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de dois ou mais genes do módulo 5 ou dois ou mais genes do módulo 6. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de cada gene do módulo 5 ou de cada gene do módulo 6 da Tabela 13.
[0070] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 5 e pelo menos um gene do módulo 6. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de dois ou mais genes do módulo 5 e dois ou mais genes do módulo 6. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de cada gene do módulo 5 e cada gene do módulo 6 da Tabela 13.
[0071] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 5 compreende ou é RACGAP1 ou TPX2. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 5 compreende ou é RACGAP1 e TPX2. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 6 compreende ou é NEK11 ou IFT88. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 6 compreende ou é NEK11 e IFT88.
[0072] O subtipo Proliferativo se distingue ainda pelo aumento da expressão do módulo 7 e/ou 4. Consequentemente, em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o indivíduo é ainda determinado como tendo um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 7 ou do módulo 4 comparado com um nível de referência. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o indivíduo é ainda determinado como tendo um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 7 e pelo menos um gene do módulo 4 comparado com um nível de referência. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o nível de referência é um nível de referência não proliferativo.
[0073] Os genes do módulo 4 e 7 são fornecidos na Tabela 13. Pelo menos um do gene do módulo 4 e/ou gene do módulo 7 pode ser qualquer um ou mais dos genes dos módulos 4 e 7 listados na Tabela 13.
[0074] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 4 ou pelo menos um gene do módulo 7. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de dois ou mais genes do módulo 4 ou dois ou mais genes do módulo 7. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de cada gene do módulo 4 ou cada gene do módulo 7 da Tabela 13.
[0075] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 4 e pelo menos um gene do módulo 7 é determinado. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o nível de expressão de dois ou mais genes do módulo 4 e dois ou mais genes do módulo 7 é determinado. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o nível de expressão de cada gene do módulo 4 e cada gene do módulo 7 da Tabela 13 é determinado.
[0076] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 4 compreende ou é COX6A1 ou COX7A2. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 4 compreende ou é COX6A1 e COX7A2. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 7 compreende ou é RPL26 ou RPL23. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 7 compreende ou é RPL26 e RPL23.
[0077] Quando o indivíduo apresenta lesão bronquial proliferativa pré-maligna progressiva, pode-se indicar um tratamento agressivo, mesmo além do previsto para a lesão bronquial proliferativa pré-maligna. Consequentemente, em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é fornecido no presente documento um método de tratamento de lesões pré- malignas bronquiais, o método compreendendo administrar pelo menos um de: i) um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; ii) pelo menos a cada 6 meses, pelo menos um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; iii) pelo menos um fármaco imunoestimulante e/ou iv) pelo menos um fármaco imunoestimulante e pelo menos um fármaco antiproliferativo a um indivíduo determinado como tendo um nível de expressão reduzida de pelo menos um gene do módulo 9 comparado com um nível de referência e/ou um nível de expressão aumentada de pelo menos um gene do módulo 10 comparado com um nível de referência.
Em um aspecto de qualquer uma das modalidades,
é fornecido no presente documento um método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais, o método compreendendo a)
determinar um indivíduo como tendo um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 9 comparado com um nível de referência e/ou um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 10 comparado com um nível de referência e b) administrar pelo menos um de: i) um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; ii)
pelo menos a cada 6 meses, pelo menos um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; iii) pelo menos um fármaco imunoestimulante e/ou iv) pelo menos um fármaco imunoestimulante e pelo menos um fármaco antiproliferativo ao indivíduo.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o nível de referência é um nível de referência não proliferativo.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o procedimento com base em broncoscopia compreende ainda biópsia das lesões para remover o tecido anormal.
[0078] Em algumas modalidades, se o indivíduo for determinado como não tendo um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 9 comparado com um nível de referência e/ou não tendo um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 10 comparado com um nível de referência, o indivíduo i) não recebe um fármaco imunoestimulante, ii) não recebe um fármaco imunoestimulante e um fármaco antiproliferativo, iii) recebe um procedimento com base em broncoscopia e/ou uma tomografia computadorizada do tórax não mais frequentemente do que a cada 6 meses (por exemplo, não mais frequentemente do que a cada 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses) e/ou iv) não recebe um procedimento com base em broncoscopia para biópsia de lesões para remover tecido anormal.
[0079] Os genes do módulo 9 são fornecidos na Tabela
13. Pelo menos um do gene do módulo 9 pode ser qualquer um ou mais dos genes do módulo 9 listados na Tabela 13. Os genes do módulo 9 são fornecidos na Tabela 16. Pelo menos um gene do módulo 9 pode ser qualquer um ou mais dos genes do módulo 9 listados na Tabela 16.
[0080] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de dois ou mais genes do módulo 9. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de cada gene do módulo 9 da Tabela 13. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de cada gene do módulo 9 da Tabela 16.
[0081] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 9 compreende ou é EPSTI1; UBE2L6; B2M e/ou TAP1. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 9 compreende ou é EPSTI1; UBE2L6; B2M; e TAP1. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 9 compreende ou é uma combinação de dois de qualquer um de: EPSTI1 e UBE2L6 EPSTI1 e B2M EPSTI1 e TAP1 UBE2L6 e B2M UBE2L6 e TAP1 B2M e TAP1.
[0082] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 9 compreende ou é uma combinação de três de qualquer um de: EPSTI1; UBE2L6; e B2M EPSTI1; UBE2L6; e TAP1 EPSTI1; B2M; e TAP1 TAP1; UBE2L6; e B2M.
[0083] Os genes do módulo 10 são fornecidos na Tabela
13. Pelo menos um do gene do módulo 10 pode ser qualquer um ou mais dos genes do módulo 10 listados na Tabela 13. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de ambos os genes de módulo
10. Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 10 compreende ou é CACNB3 ou MAPK10. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 10 compreende ou é CACNB3 e MAPK10.
[0084] Quando um indivíduo tem uma lesão inflamatória bronquial pré-maligna, um tratamento agressivo e/ou anti- inflamatório pode ser benéfico. Consequentemente, em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é fornecido no presente documento um método de tratamento de lesões pré- malignas bronquiais, o método compreendendo administrar pelo menos um de: i) um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; ii) pelo menos a cada 6 meses, pelo menos um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou iii) pelo menos um fármaco anti-inflamatório a um indivíduo determinado como tendo pelo menos um de a) um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 2 comparado com um nível de referência; e b) um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência. Em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é fornecido no presente documento um método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais, o método compreendendo determinar um indivíduo como tendo pelo menos um de a) um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 2 comparado com um nível de referência; e b) um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência e administrar pelo menos um de: i) um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; ii) pelo menos a cada 6 meses, pelo menos um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou iii) pelo menos um fármaco anti-inflamatório ao indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o nível de referência é um nível de referência não inflamatório.
[0085] Em algumas modalidades, se o indivíduo for determinado como não tendo pelo menos um de a) um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 2 comparado com um nível de referência; e b) um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência, o indivíduo não recebe um fármaco anti-inflamatório e recebe um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e/ou uma tomografia computadorizada do tórax não mais frequentemente do que a cada 6 meses (por exemplo, não mais frequentemente do que a cada 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses).
Em algumas modalidades, se for determinado que o indivíduo não tem a) um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 2 comparado com um nível de referência; e b) um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência, o indivíduo não recebe um fármaco anti-inflamatório e recebe um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e/ou uma tomografia computadorizada do tórax não mais frequentemente do que a cada 6 meses (por exemplo, não mais frequentemente do que a cada 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses).
[0086] Os genes dos módulos 2 e 6 são fornecidos na Tabela 13. Pelo menos um gene do gene do módulo 2 e/ou do módulo 6 pode ser qualquer um ou mais dos genes do módulo 2 e 6 listados na Tabela 13.
[0087] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 2 ou pelo menos um gene do módulo 6. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de dois ou mais genes do módulo 2 ou dois ou mais genes do módulo 6. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de cada gene do módulo 2 ou de cada gene do módulo 6 da Tabela 13.
[0088] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 2 compreende ou é MSANTD2, CCNL2 ou LUC7L. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 2 compreende ou é MSANTD2 e LUC7L. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 2 compreende ou é MSANTD2 e CCNL2. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 2 compreende ou é CCNL2 e LUC7L. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 2 compreende ou é MSANTD2, CCNL2 e LUC7L. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 6 compreende ou é NEK11 ou IFT88. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 6 compreende ou é NEK11 e IFT88.
[0089] O subtipo inflamatório se distingue ainda pelo aumento da expressão do módulo 7, 1 e/ou 8 e/ou diminuição da expressão do módulo 4 e/ou 5. Consequentemente, em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o indivíduo é ainda determinado como tendo pelo menos um dentre: i) um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 7, módulo 1 e/ou módulo 8 e ii) um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 4 ou módulo 5 comparado com um nível de referência. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o indivíduo é ainda determinado como tendo pelo menos um dentre: i) um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 7, módulo 1 e/ou módulo 8, e ii) um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 4 ou módulo 5 comparado com um nível de referência. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o nível de referência é um nível de referência não inflamatório.
[0090] Genes dos módulos 7, 1, 8, 4 e 5 são fornecidos na Tabela 13. Pelo menos um do gene do módulo 7, 1, 8, 4 e/ou 5 pode ser qualquer um ou mais dos genes do módulo 7, 1, 8, 4 e/ou 5 listados na Tabela 13. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de cada gene do módulo 7, 1, 8, 4 e/ou 5 da Tabela
13. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de cada gene do módulo 7, 1, 8, 4 e 5 da Tabela 13.
[0091] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 4 compreende ou é
COX6A1 ou COX7A2. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 4 compreende ou é
COX6A1 e COX7A2. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 7 compreende ou é
RPL26 ou RPL23. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 7 compreende ou é
RPL26 e RPL23. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 5 compreende ou é
RACGAP1 ou TPX2. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 5 compreende ou é
RACGAP1 e TPX2. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 1 compreende ou é
KIRREL; PHLDB1; ou MARVELD1. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 1 compreende ou é PHLDB1 e MARVELD1. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 1 compreende ou é KIRREL e PHLDB1. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 1 compreende ou é KIRREL e MARVELD1. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 1 compreende ou é KIRREL; PHLDB1; e MARVELD1. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 8 compreende ou é DCO2; CD53; ou LAPTM.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 8 compreende ou é CD53 e LAPTM. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 8 compreende ou é DCO2 e CD53. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 8 compreende ou é DCO2 e LAPTM. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene do módulo 8 compreende ou é DCO2; CD53; e LAPTM.
[0092] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de cada um dos genes da Tabela 15. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de cada um dos genes da Tabela 15 em uma amostra de esfregaço brônquico.
[0093] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de cada um dos genes da Tabela 14. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de expressão de cada um dos genes da Tabela 14 em uma amostra de esfregaço brônquico.
[0094] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os métodos descritos no presente documento podem compreender ainda determinar o nível de expressão de qualquer um dos seguintes genes: SOX2, NFE2L2, PIK3CA (os quais são genes marcadores de câncer escamoso), KRT5, MUC5AC, TUB1A1, SCGB1A1 e FOXK1 (os quais são genes marcadores epiteliais).
[0095] Conforme descrito no presente documento, os níveis de expressão gênica podem ser modulados (por exemplo, aumentados ou diminuídos) em indivíduos com lesões pré- malignas de diferentes subtipos.
[0096] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o método compreende administrar um tratamento descrito no presente documento a um indivíduo previamente determinado como tendo um nível de expressão conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é descrito no presente documento um método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método compreendendo: a) primeiro determinar o nível de expressão de pelo menos um gene em uma amostra obtida de um indivíduo; e b) em seguida, administrar um tratamento conforme descrito no presente documento ao indivíduo se o nível de expressão for modulado em relação a uma referência da maneira descrita no presente documento. Em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é descrito no presente documento um método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais em um indivíduo em necessidade do mesmo, o método compreendendo: a) determinar se o indivíduo tem uma modulação de um nível de expressão conforme descrito no presente documento e b) instruir ou orientar que o indivíduo receba o tratamento apropriado descrito no presente documento para a modulação particular da expressão que foi determinada.
[0097] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a etapa de determinar se o indivíduo tem modulação de um nível de expressão pode compreender i) obter ou ter obtido uma amostra do indivíduo e ii) realizar ou ter realizado um ensaio na amostra obtida do indivíduo para determinar/medir o nível de expressão no indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a etapa de determinar se o indivíduo tem uma modulação de um nível de expressão pode compreender realizar ou ter realizado um ensaio em uma amostra obtida do indivíduo para determinar/medir o nível de expressão no indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a etapa de determinar se o indivíduo tem uma modulação de um nível de expressão pode compreender pedir ou solicitar um ensaio em uma amostra obtida do indivíduo para determinar/medir o nível de expressão no indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a etapa de determinar se o indivíduo tem uma modulação de um nível de expressão pode compreender receber os resultados de um ensaio em uma amostra obtida do indivíduo para determinar/medir o nível de expressão no indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a etapa de determinar se o indivíduo tem uma modulação de um nível de expressão pode compreender receber um relatório, resultados ou outros meios de identificar o indivíduo como um indivíduo com uma modulação de um nível de expressão.
[0098] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a etapa de instruir ou orientar que o indivíduo receba um tratamento específico pode compreender fornecer um relatório dos resultados do ensaio. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a etapa de instruir ou orientar que o indivíduo receba um tratamento específico pode compreender fornecer um relatório dos resultados do ensaio e/ou recomendações de tratamento em vista dos resultados do ensaio.
[0099] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a medição do nível de um alvo e/ou detecção do nível ou presença de um alvo, por exemplo, de um produto de expressão (ácido nucleico ou polipeptídeo de um dos genes descritos no presente documento) ou uma mutação pode compreender uma transformação. Conforme usado no presente documento, o termo "transformar" ou "transformação" se refere à mudança de um objeto ou uma substância, por exemplo, amostra biológica, ácido nucleico ou proteína, em outra substância. A transformação pode ser física, biológica ou química. A transformação física exemplificativa inclui,
porém sem limitações, pré-tratamento de uma amostra biológica, por exemplo, de sangue total para soro sanguíneo por meio de centrifugação diferencial. Uma transformação biológica/química pode envolver a ação de pelo menos uma enzima e/ou um reagente químico em uma reação. Por exemplo, uma amostra de DNA pode ser digerida em fragmentos por uma ou mais enzimas de restrição ou uma molécula exógena pode ser ligada a uma amostra de DNA fragmentada com uma ligase.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, uma amostra de DNA pode sofrer replicação enzimática, por exemplo, por meio reação em cadeia de polimerase (PCR).
[0100] Transformação, medição e/ou detecção de uma molécula alvo, por exemplo, um mRNA ou polipeptídeo, pode compreender contatar uma amostra obtida de um indivíduo com um reagente (por exemplo, um reagente de detecção) que é específico para o alvo, por exemplo, um reagente específico para o alvo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o reagente específico para o alvo é marcado de forma detectável. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o reagente específico para o alvo é capaz de gerar um sinal detectável. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o reagente específico para o alvo gera um sinal detectável quando a molécula alvo está presente.
[0101] Métodos para medir produtos de expressão gênica são conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais métodos para medir produtos de expressão gênica, por exemplo, nível de proteína, incluem ELISA (ensaio de imunoabsorção enzimática), Western blot, imunoprecipitação e imunofluorescência usando reagentes de detecção, tais como um anticorpo ou agentes de ligação à proteína.
Alternativamente, um peptídeo pode ser detectado em um indivíduo mediante introdução de um anticorpo antipeptídeo marcado e outros tipos de agente de detecção. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado com um marcador detectável cuja presença e localização no indivíduo são detectadas por meio de técnicas de imagiologia padrão.
[0102] Por exemplo, anticorpos para os vários alvos descritos no presente documento estão comercialmente disponíveis e podem ser usados para fins da invenção para medir os níveis de expressão de proteínas. Alternativamente, uma vez que as sequências de aminoácidos para os alvos descritos no presente documento são conhecidas e estão publicamente disponíveis no site do NCBI, aqueles versados na técnica podem criar seus próprios anticorpos contra estes polipeptídeos de interesse para fins dos métodos descritos no presente documento.
[0103] As sequências de aminoácidos dos polipeptídeos descritos no presente documento foram atribuídas aos números de acesso NCBI e ENSBL para diferentes espécies, tais como seres humanos, camundongos e ratos. As sequências para qualquer um dos genes descritos no presente documento podem ser facilmente recuperadas de qualquer banco de dados por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a sequência de um gene, transcrito ou polipeptídeo descrito no presente documento é a sequência disponível no banco de dados NCBI ou ENSMBL a partir da data de depósito do presente pedido.
[0104] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, técnicas de imuno-histoquímica ("IHC") e imunocitoquímica ("ICC") podem ser usadas. IHC é a aplicação de imunoquímica a seções teciduais, enquanto ICC é a aplicação de imunoquímica a células ou impressões teciduais após terem sido submetidas a preparações citológicas específicas tais como, por exemplo, preparações com base em líquidos. A imunoquímica é uma família de técnicas com base no uso de um anticorpo, em que os anticorpos são usados para direcionar especificamente as moléculas dentro ou sobre a superfície das células. O anticorpo contém, tipicamente, um marcador que sofrerá uma reação bioquímica e, assim, experimentar uma mudança de cor, ao encontrar as moléculas alvo. Em alguns casos, a amplificação do sinal pode ser integrada ao protocolo particular, em que um anticorpo secundário, que inclui a mancha ou o sinal do marcador, segue a aplicação de um anticorpo primário específico.
[0105] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o ensaio pode ser uma análise de Western blot.
Alternativamente, as proteínas podem ser separadas por sistemas de eletroforese em gel bidimensional. A eletroforese em gel bidimensional é bem conhecida na técnica e envolve, tipicamente, focagem isoelétrica ao longo de uma primeira dimensão seguida por eletroforese SDS-PAGE ao longo de uma segunda dimensão. Estes métodos também requerem uma quantidade considerável de material celular. A análise de géis de SDS-PAGE 2D pode ser realizada ao determinar a intensidade de manchas de proteína no gel ou pode ser realizada usando detecção imune. Em outras modalidades, as amostras de proteínas são analisadas por meio de espectroscopia de massa.
[0106] Testes imunes podem ser usados com os métodos e ensaios descritos no presente documento e incluem, por exemplo, sistemas de ensaio competitivos e não competitivos usando técnicas tais como Western blots, radioimunoensaio (RIA), ELISA (ensaio imunoenzimático), imunoensaios em "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, por exemplo, aglutinação de látex, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, por exemplo, FIA (imunoensaio ligado à fluorescência), imunoensaios de quimioluminescência (CLIA), imunoensaio de eletroquimioluminescência (ECLIA), imunoensaio de contagem (CIA), testes ou imunoensaios de fluxo lateral (LFIA), imunoensaio magnético (MIA) e imunoensaios de proteína A.
Métodos para realizar tais ensaios são conhecidos na técnica, contanto que um reagente de anticorpo apropriado esteja disponível. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o imunoensaio pode ser um imunoensaio quantitativo ou semiquantitativo.
[0107] Um imunoensaio é um teste bioquímico que mede a concentração de uma substância em uma amostra biológica, tipicamente uma amostra de fluido, tal como sangue ou soro, usando a interação de um anticorpo ou anticorpos por seu antígeno. O ensaio tira vantagem da ligação altamente específica de um anticorpo com seu antígeno. Para os métodos e ensaios descritos no presente documento, a ligação específica dos polipeptídeos alvo às respectivas proteínas ou fragmentos de proteínas, ou um peptídeo isolado, ou uma proteína de fusão descrita no presente documento, ocorre no imunoensaio para formar um complexo de proteína/peptídeo alvo. O complexo é, então, detectado por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Um imunoensaio também envolve, frequentemente, o uso de um anticorpo de detecção.
[0108] O ensaio de imunoabsorção enzimática, também denominado ELISA, imunoensaio enzimático ou EIA, é uma técnica bioquímica usada principalmente em imunologia para detectar a presença de um anticorpo ou antígeno em uma amostra. O ELISA tem sido usado como ferramenta diagnóstica em medicina e fitopatologia, além de verificação de controle de qualidade em diversas indústrias.
[0109] Em uma modalidade, um ELISA envolvendo pelo menos um anticorpo com especificidade pelo antígeno desejado particular (por exemplo, qualquer um dos alvos conforme descrito no presente documento) também pode ser realizado.
Uma quantidade conhecida de amostra e/ou antígeno é imobilizada sobre um suporte sólido (geralmente uma placa de microtitulação de poliestireno). A imobilização pode ser não específica (por exemplo, através de adsorção à superfície) ou específica (por exemplo, onde outro anticorpo imobilizado sobre a superfície é usado para capturar o antígeno ou um anticorpo primário). Após imobilização do antígeno, o anticorpo de detecção é adicionado, formando um complexo com o antígeno. O anticorpo de detecção pode ser covalentemente ligado a uma enzima ou pode ser em si detectado por um anticorpo secundário que está ligado a uma enzima através de bioconjugação. Entre cada etapa, a placa é, tipicamente, lavada com uma solução de detergente neutro para remover quaisquer proteínas ou anticorpos que não estejam especificamente ligados. Após a etapa final de lavagem, a placa é revelada com a adição de um substrato enzimático para produzir um sinal visível, o qual indica a quantidade de antígeno na amostra. Os ELISAs mais antigos usam substratos cromogênicos, embora os ensaios mais recentes usem substratos fluorogênicos com sensibilidade muito maior.
[0110] Em outra modalidade, é usado um ELISA competitivo. Os anticorpos purificados que são direcionados contra um polipeptídeo alvo ou fragmento do mesmo são revestidos na fase sólida da placa com múltiplas cavidades, isto é, conjugados a uma superfície sólida. Um segundo lote de anticorpos purificados que não são conjugados a nenhum suporte sólido também é necessário. Estes anticorpos purificados não conjugados são marcados para fins de detecção, por exemplo, marcados com peroxidase de rábano para produzir um sinal detectável. Uma amostra (por exemplo, uma amostra de sangue) de um indivíduo é misturada com uma quantidade conhecida do antígeno desejado (por exemplo, um volume ou concentração conhecida de uma amostra que compreende um polipeptídeo alvo) juntamente com os anticorpos marcados com peroxidase de rábano e a mistura é, então, adicionada às cavidades revestidas para formar uma combinação competitiva. Após a incubação, se o nível de polipeptídeo estiver alto na amostra, um complexo de anticorpo reagente-antígeno marcado se formará. Este complexo está livre em solução e pode ser lavado. Lavar as cavidades removerá o complexo. Em seguida, as cavidades são incubadas com substrato de desenvolvimento de cor TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzideno) para localização de anticorpos conjugados com peroxidase de rábano nas cavidades. Haverá pouca ou nenhuma mudança de cor se o nível de polipeptídeo alvo for alto na amostra. Se houver pouco ou nenhum polipeptídeo alvo presente na amostra, um complexo diferente é formado, o complexo de suporte sólido ligado a reagentes de anticorpo-polipeptídeo alvo. Este complexo é imobilizado sobre a placa e não é lavado na etapa de lavagem.
A subsequente incubação com TMB produzirá uma mudança significativa de cor. Este ensaio ELISA competitivo é específico, sensível, reproduzível e fácil de operar.
[0111] Há outras formas diferentes de ELISA que são bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Métodos padrão conhecidos na técnica para ELISA são descritos em "Methods in Immunodiagnosis", 2ª edição, Rose e Bigazzi, eds. John Wiley & Sons, 1980; e Oellerich, M. 1984, J. Clin.
Chem. Clin. Biochem. 22: 895-904. Estas referências são incorporadas ao presente documento a título de referência na íntegra.
[0112] Em uma modalidade, os níveis de um polipeptídeo em uma amostra podem ser detectados através de um teste de imunoensaio de fluxo lateral (LFIA), também conhecido como ensaio imunocromatográfico ou teste de tira. LFIAs são dispositivos simples destinados a detectar a presença (ou ausência) de antígeno, por exemplo, um polipeptídeo, em uma amostra de fluido. Atualmente, há muitos testes LFIA usados para diagnósticos médicos, seja para testes caseiros, testagem em ponto de atendimento ou para uso em laboratório.
Os testes LFIA são uma forma de imunoensaio em que a amostra de teste flui ao longo de um substrato sólido por meio de ação capilar. Após a amostra ser aplicada à tira de teste, ela encontra um reagente colorido (geralmente compreendendo anticorpo específico para o antígeno alvo de teste) ligado a micropartículas que se mistura com a amostra e transita pelo substrato encontrando linhas ou zonas que foram pré- tratadas com outro anticorpo ou antígeno. Dependendo do nível de polipeptídeos alvo presentes na amostra, o reagente colorido pode ser capturado e ligado à linha ou zona de teste. Os LFIAs são essencialmente imunoensaios adaptados para operar ao longo de um único eixo para se adequar ao formato da tira de teste ou uma vareta. Os testes de tira são extremamente versáteis e podem ser facilmente modificados por aqueles versados na técnica para detectar uma enorme variedade de antígenos de amostras de fluidos, tais como urina, sangue, água e/ou amostras de tecido homogeneizado, etc. Os testes de tira também são conhecidos como testes de vareta, o nome derivado da ação literal de "mergulhar" a tira de teste em uma amostra de fluido a ser testada. Os testes de tira LFIA são fáceis de usar, requerem treinamento mínimo e podem ser facilmente incluídos como componentes diagnósticos de teste em pontos de atendimento (POCT) a serem usados no local no campo. Os testes LFIA podem ser operados como testes competitivos ou em sanduíche. LFIAs em sanduíche são similares ao ELISA em sanduíche. Primeiro, a amostra encontra partículas coloridas que são marcadas com anticorpos criados para o antígeno alvo. A linha de teste também conterá anticorpos para o mesmo alvo, embora possa se ligar a um epítopo diferente no antígeno. A linha de teste será exibida como uma faixa colorida nas amostras positivas.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o imunoensaio de fluxo lateral pode ser um ensaio em sanduíche de anticorpo duplo, um ensaio competitivo, um ensaio quantitativo ou variações dos mesmos. Os LFIAs competitivos são similares ao ELISA competitivo. Primeiro, a amostra encontra partículas coloridas que são marcadas com o antígeno alvo ou um análogo. A linha de teste contém anticorpos para o alvo/análogo do mesmo. O antígeno não marcado na amostra bloqueará os locais de ligação nos anticorpos, evitando a absorção das partículas coloridas. A linha de teste será exibida como uma faixa colorida nas amostras negativas. Há várias variações na tecnologia de fluxo lateral. Também é possível aplicar várias zonas de captura para criar um teste multiplex.
[0113] O uso de "varetas de imersão" ou tiras de teste LFIA e outros suportes sólidos foram descritos na técnica no contexto de um imunoensaio para uma série de biomarcadores de antígeno. As Patentes Norte-Americanas Nos 4,943,522; 6,485,982; 6,187,598; 5,770,460; 5,622,871; 6,565,808, o pedido de Patente Norte-Americano N° 10/278,676; Patente Norte-Americana N° 09/579,673 e Patente Norte-Americana N° 10/717,082, os quais são incorporados ao presente documento a título de referência na íntegra, são exemplos não limitativos de tais dispositivos de teste de fluxo lateral.
Exemplos de patentes que descrevem o uso de tecnologia de "vareta de imersão" para detectar antígenos solúveis por meio de ensaios imunoquímicos incluem, porém sem limitações, as Patentes Norte-Americanas Nos 4,444,880; 4,305,924; e 4,135,884; as quais são incorporados a título de referência ao presente documento na íntegra. Os dispositivos e métodos destas três patentes descrevem amplamente um primeiro componente fixado a uma superfície sólida em uma "vareta de imersão", a qual é exposta a uma solução que contém um antígeno solúvel que se liga ao componente fixado na "vareta de imersão", antes da detecção do complexo de componente- antígeno na vareta. Está dentro da habilidade daqueles versados na técnica modificar os ensinamentos desta tecnologia de "vareta de imersão" para a detecção de polipeptídeos usando reagentes de anticorpos conforme descrito no presente documento.
[0114] Outras técnicas podem ser usadas para detectar o nível de um polipeptídeo em uma amostra. Uma de tais técnicas é o dot blot, uma adaptação do Western blot (Towbin et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 76: 4350 (1979)). Em um Western blot, o polipeptídeo ou fragmento do mesmo pode ser dissociado com detergentes e calor e separado em um gel de SDS-PAGE antes de ser transferido para um suporte sólido, tal como uma membrana de nitrocelulose ou PVDF. A membrana é incubada com um reagente de anticorpo específico para o polipeptídeo alvo ou um fragmento do mesmo. A membrana é, então, lavada para remover proteínas não ligadas e proteínas com ligação não específica. Os anticorpos secundários de detecção ou ligados a enzima marcados de forma detectável podem, então, ser usados para detectar e avaliar a quantidade de polipeptídeo na amostra testada. Um dot blot imobiliza uma amostra de proteína em uma região definida de um suporte o qual é, então, hibridizado com anticorpo e anticorpo secundário marcado conforme no Western blot. A intensidade do sinal do marcador detectável em qualquer formato corresponde à quantidade de enzima presente e, portanto, à quantidade de polipeptídeo. Os níveis podem ser quantificados, por exemplo, por meio de densitometria.
[0115] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o nível de um alvo pode ser medido, a título de exemplo não limitativo, por meio de Western blot; imunoprecipitação; ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA); ensaio radioimunológico (RIA); ensaio em sanduíche; hibridização fluorescente in situ (FISH); coloração imuno- histológica; ensaio radioimunométrico; ensaio de imunofluorescência; espectroscopia de massa e/ou ensaio de imunoeletroforese.
[0116] Em determinadas modalidades, os produtos de expressão gênica conforme descritos no presente documento podem ser determinados, em vez disso, ao determinar o nível de expressão de RNA mensageiro (mRNA) dos genes descritos no presente documento. Estas moléculas podem ser isoladas, derivadas ou amplificadas a partir de uma amostra biológica,
tal como uma amostra de sangue. Técnicas para detecção de expressão de mRNA são conhecidas por aqueles versados na técnica e podem incluir, porém sem limitações, procedimentos de PCR, RT-PCR, análise de Northern blot, RT-PCR quantitativa, expressão de gene diferencial, ensaio de proteção de RNAse, análise com base em microarranjo, sequenciamento de última geração; métodos de hibridização, etc.
[0117] Em geral, o procedimento de PCR descreve um método de amplificação de genes que é composto por (i) hibridização específica de sequência de iniciadores para genes específicos ou sequências dentro de uma amostra de ácido nucleico ou biblioteca, (ii) amplificação subsequente envolvendo múltiplos ciclos de emparelhamento, alongamento e desnaturação usando uma DNA polimerase termoestável e (iii) triagem dos produtos de PCR para uma banda de tamanho correto. Os iniciadores usados são oligonucleotídeos de comprimento suficiente e sequência apropriada para permitir o início da polimerização, isto é, cada iniciador é especificamente concebido para ser complementar a um trecho do locus genômico a ser amplificado. Em uma modalidade alternativa, o nível de mRNA dos produtos de expressão gênica descritos no presente documento pode ser determinado por meio de métodos de PCR de transcrição reversa (RT) e RT-PCR quantitativa (QRT-PCR) ou PCR em tempo real. Métodos de RT- PCR e QRT-PCR são bem conhecidos na técnica.
[0118] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o nível de um mRNA pode ser medido através de uma tecnologia de sequenciamento quantitativo, por exemplo, uma tecnologia de sequência quantitativa de última geração.
Métodos de sequenciamento de uma sequência de ácidos nucleicos são bem conhecidos na técnica. Resumidamente, uma amostra obtida de um indivíduo pode ser contatada com um ou mais iniciadores que hibridizam especificamente com uma sequência de ácidos nucleicos de fita simples que flanqueia a sequência do gene alvo e uma fita complementar é sintetizada. Em algumas tecnologias de segunda geração, um adaptador (fita simples ou dupla) é ligado às moléculas de ácidos nucleicos na amostra e a síntese prossegue a partir do adaptador ou iniciadores compatíveis com o adaptador. Em algumas tecnologias de terceira geração, a sequência pode ser determinada, por exemplo, ao determinar a localização e o padrão da hibridização de sondas ou medir uma ou mais características de uma única molécula à medida que ela passa por um sensor (por exemplo, a modulação de um campo elétrico quando uma molécula de ácido nucleico passa por um nanoporo).
Métodos exemplificativos de sequenciamento incluem, porém sem limitações, sequenciamento de Sanger, terminação de cadeia didesóxi, sequenciamento de alto rendimento, sequenciamento de próxima geração, sequenciamento 454, sequenciamento SOLiD, sequenciamento Polony, sequenciamento Illumina, sequenciamento Ion Torrent, sequenciamento por hibridização, sequenciamento Nanopore, sequenciamento Helioscope, sequenciamento em tempo real de uma única molécula, sequenciamento RNAP e assim por diante. Métodos e protocolos para realizar estes métodos de sequenciamento são conhecidos na técnica; consulte, por exemplo, "Next Generation Genome Sequencing", Ed. Michal Janitz, Wiley-VCH; Eds. "High-Throughput Next Generation Sequencing", Eds. Kwon e Ricke, Humanna Press, 2011; e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4ª ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EUA (2012); os quais são incorporados a título de referência ao presente documento na íntegra.
[0119] Sequências de ácidos nucleicos dos genes descritos no presente documento foram atribuídas aos números de acesso NCBI e ENSBL para diferentes espécies, tais como ser humano, camundongo e rato. As sequências para qualquer um dos genes descritos no presente documento podem ser facilmente recuperadas a partir de qualquer banco de dados por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a sequência de um gene, transcrito ou polipeptídeo descrito no presente documento é a sequência disponível no banco de dados NCBI ou ENSMBL a partir da data de depósito do presente pedido. Consequentemente, aqueles versados na técnica podem conceber um iniciador apropriado com base na sequência conhecida para determinar o nível de mRNA do respectivo gene.
[0120] Moléculas de ácidos nucleicos e ácidos ribonucleicos (RNA) podem ser isoladas de uma amostra biológica particular usando qualquer um de uma série de procedimentos, os quais são bem conhecidos na técnica, o procedimento de isolamento escolhido em particular sendo apropriado para a amostra biológica em particular. Por exemplo, procedimentos de congelamento-descongelamento e lise alcalina podem ser úteis para a obtenção de moléculas de ácidos nucleicos a partir de materiais sólidos; os procedimentos de lise alcalina e térmica podem ser úteis para a obtenção de moléculas de ácidos nucleicos a partir da urina; e a extração com proteinase K pode ser usada para obter ácido nucleico a partir do sangue (Roiff, A. et al.
PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer (1994)).
[0121] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um ou mais dos reagentes (por exemplo, um reagente de anticorpo e/ou sonda de ácido nucleico) descritos no presente documento podem compreender um marcador detectável e/ou compreender a capacidade de gerar um sinal detectável (por exemplo, ao catalisar a reação de conversão de um composto em um produto detectável). Os marcadores detectáveis podem compreender, por exemplo, um corante que absorve a luz, um corante fluorescente ou um marcador radioativo. Marcadores detectáveis, métodos para detectá-los e métodos para incorporá-los em reagentes (por exemplo, anticorpos e sondas de ácidos nucleicos) são bem conhecidos na técnica.
[0122] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os marcadores detectáveis podem incluir marcadores que podem ser detectados por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, eletromagnéticos, radioquímicos ou químicos, tais como fluorescência, quimiofluorescência ou quimioluminescência ou qualquer outro meio apropriado. Os marcadores detectáveis usados nos métodos descritos no presente documento podem ser marcadores primários (onde o marcador compreende uma porção que é diretamente detectável ou que produz uma porção diretamente detectável) ou marcadores secundários (onde o marcador detectável se liga à outra porção para produzir um sinal detectável, por exemplo, conforme é comum em marcação imunológica usando anticorpos secundários e terciários). O marcador detectável pode ser ligado ao reagente através de meios covalentes ou não covalentes. Alternativamente, um marcador detectável pode ser ligado, por exemplo, ao marcar diretamente uma molécula que alcança a ligação ao reagente por meio de uma configuração de um par de ligação ligante- receptor ou outras moléculas de reconhecimento específicas.
Marcadores detectáveis podem incluir, porém sem limitações, radioisótopos, compostos bioluminescentes, cromóforos, anticorpos, compostos quimioluminescentes, compostos fluorescentes, quelatos de metal e enzimas.
[0123] Em outras modalidades, o reagente de detecção é marcado com um composto fluorescente. Quando o reagente marcado com fluorescência é exposto à luz do comprimento de onda adequado, sua presença pode, então, ser detectada em virtude da fluorescência. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um marcador detectável pode ser uma molécula de corante fluorescente ou fluoróforo incluindo, porém sem limitações, fluoresceína, ficoeritrina, ficocianina, o- ftaldeído, fluorescamina, Cy3TM, Cy5TM, aloficocianina, Texas Red, clorofila de peridenina, cianina, conjugados em tandem, tal como ficoeritrina-Cy5TM, proteína fluorescente verde, rodamina, isotiocianato de fluoresceína (FITC) e Oregon GreenTM, rodamina e derivados (por exemplo, Texas Red e isotiocinato de tetrarodimina (TRITC)), biotina, ficoeritrina, AMCA, CyDyesTM, 6-carboxifioresceína
(comumente conhecida pelas abreviações FAM e F), 6-carboxi-
2',4',7',4,7-hexaclorofiuoresceína (HEX), 6-carboxi-4',5'-
dicloro-2',7'-dimetoxifiuoresceína (JOE ou J), N,N,N',N'-
tetrametil-6carboxirodamina (TAMRA ou T), 6-carboxi-X-
rodamina (ROX ou R), 5-carboxirrodamina-6G (R6G5 ou G5), 6-
carboxirrodamina-6G (R6G6 ou G6) e rodamina 110; corantes de cianina, por exemplo, Corantes Cy3, Cy5 e Cy7; cumarinas,
por exemplo, umbeliferona; corantes de benzimida, por exemplo, Hoechst 33258; corantes de fenantridina, por exemplo, Texas Red; corantes de etídio; corantes de acridina;
corantes de carbazol; corantes de fenoxazina; corantes de porfirina; tintas de polimetina, por exemplo, corantes de cianina, tais como Cy3, Cy5, etc.; corantes BODIPY e corantes de quinolina.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um marcador detectável pode ser um marcador radioativo incluindo, porém sem limitações,
3H, 125I, 35S, 14C, 32P e 33P.
Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um marcador detectável pode ser uma enzima incluindo, porém sem limitações, peroxidase de rábano e fosfatase alcalina.
Um marcador enzimático pode produzir, por exemplo, um sinal quimioluminescente, um sinal colorido ou um sinal fluorescente.
As enzimas consideradas para uso para marcar de forma detectável um reagente de anticorpo incluem, porém sem limitações, malato desidrogenase, nuclease estafilocócica, delta-V-esteroide isomerase, álcool desidrogenase de levedura, alfa- glicerofosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, asparaginase, glicose oxidase, beta-galactosidase, ribonuclease, urease, catalase, glicose VI-fosfato desidrogenase, glucoamilase e acetilcolinesterase. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um marcador detectável é um marcador quimioluminescente incluindo, porém sem limitações, lucigenina, luminol, luciferina, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazol, sal de acridínio e éster de oxalato. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um marcador detectável pode ser um marcador colorimétrico espectral incluindo, porém sem limitações, esferas de ouro coloidal ou vidro colorido ou plástico (por exemplo, poliestireno, polipropileno e látex).
[0124] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os reagentes de detecção também podem ser marcados com uma etiqueta detectável, tal como c-Myc, HA, VSV-G, HSV, FLAG, V5, HIS ou biotina. Outros sistemas de detecção também podem ser usados, por exemplo, um sistema de biotina- estreptavidina. Neste sistema, os anticorpos imunorreativos (isto é, específicos para) com o biomarcador de interesse são biotinilados. A quantidade de anticorpo biotinilado ligado ao biomarcador é determinada usando um conjugado de estreptavidina-peroxidase e um substrato cromogênico. Estes kits de detecção de estreptavidina peroxidase estão comercialmente disponíveis, por exemplo, a partir da DAKO; Carpinteria, CA. Um reagente também pode ser marcado de forma detectável usando metais que emitem fluorescência, tal como 152Eu, ou outros da série dos lantanídeos. Estes metais podem ser ligados ao reagente usando grupos quelantes de metal, tais como ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) ou ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
[0125] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o nível de expressão é o nível em uma amostra obtida a partir de um indivíduo. O termo "amostra" ou "amostra de teste", conforme usado no presente documento, denota uma amostra retirada ou isolada de um organismo biológico, por exemplo, uma amostra de sangue ou tecido de um indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a presente invenção abrange vários exemplos de uma amostra biológica. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a amostra biológica é de células, ou tecido, ou sangue periférico, ou fluido corporal. Amostras biológicas exemplificativas incluem, porém sem limitações, uma biópsia, uma amostra de tumor, uma amostra de fluido biológico; sangue; soro; plasma; urina; esperma; muco; biópsia de tecido; biópsia de órgãos; fluido sinovial; fluido biliar; líquido cefalorraquidiano; secreção mucosal; efusão; suor; saliva; e/ou amostra de tecido, etc. O termo também inclui uma mistura das amostras supracitadas. O termo "amostra de teste" também inclui amostras biológicas não tratadas ou pré-tratadas (ou pré-processadas). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, uma amostra de teste pode compreender células de um indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a amostra obtida de um indivíduo pode ser uma amostra de biópsia. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a amostra obtida de um indivíduo pode ser uma amostra de sangue ou soro.
[0126] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a amostra é uma biópsia endobronquial, amostra de esfregaço brônquico, biópsia bronquial, amostra de esfregaço endobrônquico, biópsia de vias aéreas superiores, amostra de esfregaço de vias aéreas superiores, células epiteliais nasais, expectoração e/ou sangue obtido do indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a amostra é uma esfregaço brônquico obtido a partir do brônquio principal direito ou esquerdo. A amostra de teste pode ser obtida ao remover uma amostra de um indivíduo, mas também pode ser realizada usando uma amostra previamente isolada
(por exemplo, isolada em um ponto de tempo anterior e isolada pela mesma ou por outra pessoa).
[0127] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a amostra de teste pode ser uma amostra de teste não tratada. Conforme usado no presente documento, a frase "amostra de teste não tratada" se refere a uma amostra de teste que não teve nenhum pré-tratamento prévio da amostra, exceto quanto à diluição e/ou suspensão em uma solução.
Métodos exemplificativos para o tratamento de uma amostra de teste incluem, porém sem limitações, centrifugação, filtração, sonicação, homogeneização, aquecimento, congelamento e descongelamento e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a amostra de teste pode ser uma amostra de teste congelada, por exemplo, um tecido congelado. A amostra congelada pode ser descongelada antes de empregar os métodos, ensaios e sistemas descritos no presente documento. Após o descongelamento, uma amostra congelada pode ser centrifugada antes de ser submetida aos métodos, ensaios e sistemas descritos no presente documento. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a amostra de teste é uma amostra de teste clarificada, por exemplo, por meio de centrifugação e coleta de um sobrenadante que compreende a amostra de teste clarificada. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, uma amostra de teste pode ser uma amostra de teste pré-processada, por exemplo, sobrenadante ou filtrado resultante de um tratamento selecionado a partir do grupo que consiste em centrifugação, filtração, descongelamento, purificação e quaisquer combinações dos mesmos. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a amostra de teste pode ser tratada com um reagente químico e/ou biológico.
Reagentes químicos e/ou biológicos podem ser empregados para proteger e/ou manter a estabilidade da amostra, incluindo biomoléculas (por exemplo, ácidos nucleicos e proteína) na mesma, durante o processamento. Um reagente exemplificativo é um inibidor de protease, que é geralmente usado para proteger ou manter a estabilidade da proteína durante o processamento. Aqueles versados na técnica estão bem cientes dos métodos e processos apropriados para o pré-processamento de amostras biológicas necessários para determinação do nível de um produto de expressão, conforme descrito no presente documento.
[0128] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, os métodos, ensaios e sistemas descritos no presente documento podem compreender ainda uma etapa de obtenção de uma amostra de teste de um indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o indivíduo pode ser um ser humano. Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos, o indivíduo pode ser um indivíduo em necessidade de tratamento para (por exemplo, que tem ou foi diagnosticado como tendo) lesões pré-malignas ou um indivíduo em risco ou com risco aumentado de desenvolver lesões pré-malignas bronquiais, conforme descrito em outra parte no presente documento.
[0129] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a amostra de biópsia ou esfregaço compreende tecidos ou células morfologicamente normais, por exemplo, os tecidos ou células não são de uma lesão e apresentam morfologia normal quanto à sua localização in vivo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a biópsia ou amostra de esfregaço consiste essencialmente em tecidos ou células morfologicamente normais. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a biópsia ou amostra de esfregaço consiste em tecidos ou células morfologicamente normais.
[0130] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a amostra de biópsia ou esfregaço compreende tecidos ou células visualmente normais, por exemplo, os tecidos ou células não são de uma lesão e têm, a olho nu, uma aparência normal quanto à sua localização. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a amostra de biópsia ou esfregaço consiste essencialmente em tecidos ou células visualmente normais. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a amostra de biópsia ou esfregaço consiste em tecidos ou células visualmente normais.
[0131] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a biópsia ou amostra de esfregaço compreende células de lesão bronquial pré-maligna. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a amostra de biópsia ou esfregaço consiste essencialmente em células de lesão bronquial pré-maligna. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a amostra de biópsia ou esfregaço consiste em células de uma lesão bronquial pré-maligna.
[0132] Um nível que é menor do que um nível de referência pode ser um nível que é menor em pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 % ou menos em relação ao nível de referência. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um nível que é menor do que um nível de referência pode ser um nível que é, de forma estatística, significativamente menor do que o nível de referência.
[0133] Um nível que é maior do que um nível de referência pode ser um nível que é maior em pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 100 %, pelo menos cerca de 200 %, pelo menos cerca de 300 %, pelo menos cerca de 500 % ou mais em relação ao nível de referência. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um nível que é maior do que um nível de referência pode ser um nível que é, de forma estatística, significativamente maior do que o nível de referência.
[0134] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a referência pode ser um nível da molécula alvo em uma população de indivíduos que não têm ou não foram diagnosticados como tendo e/ou não exibem sinais ou sintomas de lesões pré-malignas bronquiais. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a referência também pode ser um nível de expressão da molécula alvo em uma amostra de controle, uma amostra agrupada de indivíduos de controle ou um valor numérico ou faixa de valores com base no mesmo. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a referência pode ser o nível de uma molécula alvo em uma amostra obtida do mesmo indivíduo em um ponto anterior no tempo, por exemplo, os métodos descritos no presente documento podem ser usados para determinar se a sensibilidade ou a resposta de um indivíduo a uma determinada terapia muda com o tempo ou se o subtipo de suas lesões está mudando.
[0135] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de produtos de expressão de não mais do que 200 outros genes. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de produtos de expressão de não mais do que 100 outros genes. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de produtos de expressão de não mais do que 20 outros genes. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, é determinado o nível de produtos de expressão de não mais do que 10 outros genes.
[0136] Em algumas modalidades dos aspectos anteriores, o nível de expressão de um determinado gene pode ser normalizado em relação ao nível de expressão de um ou mais genes ou proteínas de referência.
[0137] Em algumas modalidades, o nível de referência pode ser o nível em uma amostra de um tipo de célula similar, tipo de amostra, processamento de amostra e/ou obtido de um indivíduo de idade, sexo e outros parâmetros demográficos similares àqueles da amostra/indivíduo para qual o nível de expressão deve ser determinado. Em algumas modalidades, a amostra de teste e a amostra de referência de controle são do mesmo tipo, isto é, obtidas a partir da mesma fonte biológica e compreendendo a mesma composição, por exemplo, o mesmo número e tipo de células.
[0138] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o nível de referência pode ser um nível de referência não proliferativo, por exemplo, o nível em um tecido ou célula que não compreende uma lesão proliferativa ou de um indivíduo que não tem uma lesão proliferativa. Por exemplo, o nível pode ser o nível de subtipos de lesão inflamatória, secretora ou normal ou uma média ou agrupamento dos mesmos.
[0139] Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento se referem ao tratamento de um indivíduo que tem ou foi diagnosticado como tendo lesões pré-malignas bronquiais. Os indivíduos que têm lesões pré-malignas bronquiais podem ser identificados por um médico usando os métodos atuais de diagnóstico de lesões pré-malignas bronquiais. Testes que podem auxiliar no diagnóstico, por exemplo, de lesões pré-malignas bronquiais incluem, porém sem limitações, broncoscopia, broncoscopia autofluorescente, etc. Uma história familiar de lesões pré-malignas bronquiais ou exposição a fatores de risco para lesões pré-malignas bronquiais (por exemplo, fumaça de cigarro) também pode ajudar a determinar se um indivíduo tem probabilidade de ter lesões pré-malignas bronquiais ou fazer um diagnóstico de lesões pré-malignas bronquiais.
[0140] As composições e métodos descritos no presente documento podem ser administrados a um indivíduo que tem ou foi diagnosticado como tendo lesões pré-malignas bronquiais.
Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento compreendem administrar uma quantidade eficaz das composições descritas no presente documento a um indivíduo a fim de aliviar um sintoma das lesões pré-malignas bronquiais. Conforme usado aqui, "aliviar um sintoma das lesões pré-malignas bronquiais" é melhorar qualquer condição ou sintoma associado às lesões pré-malignas bronquiais.
Comparado com um controle equivalente não tratado, esta redução é de pelo menos 5 %, 10 %, 20 %, 40 %, 50 %, 60 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % ou mais, conforme medido por meio de qualquer técnica padrão. Uma variedade de meios para administrar as composições descritas no presente documento a indivíduos são conhecidos por aqueles versados na técnica.
Tais métodos podem incluir, porém sem limitações, administração oral, parentérica, intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica, via aérea (aerossol), pulmonar, cutânea, tópica, injeção ou intratumoral. A administração pode ser local ou sistêmica.
[0141] Os métodos descritos no presente documento podem prevenir, retardar ou diminuir o desenvolvimento de câncer de pulmão, por exemplo, carcinoma de células escamosas do pulmão. Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos, o indivíduo tratado de acordo com os presentes métodos não é um indivíduo com câncer de pulmão. Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos, o indivíduo tratado de acordo com os presentes métodos é um indivíduo que não tem câncer de pulmão. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o indivíduo tratado de acordo com os presentes métodos é um indivíduo que não tem e não teve câncer de pulmão. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o indivíduo tratado de acordo com os presentes métodos está em risco de câncer de pulmão. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o indivíduo é um indivíduo que tem uma lesão bronquial pré-maligna.
[0142] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o indivíduo é um fumante. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o indivíduo é um ex-fumante. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o indivíduo é um não fumante.
[0143] Os tratamentos descritos no presente documento, por exemplo um fármaco antiproliferativo, fármaco anti- inflamatório ou fármaco imunoestimulante podem ser administrados sistemicamente, através de inalação e/ou topicamente a qualquer parte das vias respiratórias de um indivíduo (incluindo o nariz e a boca). Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um tratamento descrito no presente documento, por exemplo, um fármaco antiproliferativo, anti-inflamatório ou imunoestimulante pode ser administrado i) sistemicamente e ii) através de inalação ou topicamente a qualquer parte das vias aéreas de um indivíduo (incluindo o nariz e a boca) durante uma broncoscopia ou coleta de esfregaço.
[0144] Um fármaco antiproliferativo é um fármaco que inibe o crescimento e/ou divisão celular, por exemplo, agentes citostáticos, em que esta é a atividade primária do composto no contexto relevante. Exemplos não limitativos de fármacos antiproliferativos podem incluir Inibidores de CDK (por exemplo, purvalanol-a, palbociclibe, ribociclibe, abemaciclibe e olomoucina II); Inibidores de HDAC (por exemplo, THM-I-94, vorinostate, givinostate); Inibidores de PARP (por exemplo, AG-14361, olaparibe, rucaparibe, niraparibe, talazoparibe, veliparibe, pamiparibe, CEP 9722, E7016, iniparibe, 3-aminobenazmida); Inibidores de JAK (por exemplo, inibidor de JAK3-VI, ruxolitinibe, tofacitinibe, oclacitinibe, baricitinibe, peficitinibe, filgotinibe, cerdulatinibe, gandotinibe, lestaurtinibe, momelotinibe, pacritinibe, PF-04965842, cucitinibe, upurbadacitatina); Inibidores de JNK (por exemplo, ZG-10, AS-601245, AM-111); Inibidores de MTOR (por exemplo, AZD-8055, PI-103,
rapamicina, tensirolímus, everolímus, ridaforolímus,
rapálogos, sirolímus); Inibidores de FLT3 (por exemplo,
lestaurtinibe, TG-101348, gilteritinibe, quizartinibe,
midostaurina, sorafenibe, sunitinibe); Inibidores de PI3K
(por exemplo, GDC-0941, PI-828, wortmanina, LY294002,
hibiscona C, idelalisibe, copanlisibe, duvelisibe,
alpelisibe, taselisibe, perifosina, buparlisibe,
umbralisibe, PX-866, dactolisibe, CUDC-907, voxtalisibe;,
IPI-549, SF1126, PR6530, INK1117, pictilisibe, XL147,
palmoide 529, GSK1059615, ZSTK474, PWT33597, IC87114, TG100-
115, CAL263, RP6503, PI-103, GNE-477, AEZS-136); Inibidores de AKT (por exemplo, A-443644, pamoato de pirvínio, VQD-002,
perifosina, miltefosina, MK-2206, AZD5363, ipataseritibe);
Inibidores de tirosina quinase (por exemplo,
aminopurvalanol-a, SU-11652, imatinibe, gefitinibe,
erlotinibe, sunitinibe, adavosertibe, lapatinibe);
Inibidores de proteína quinase (por exemplo, HG-5-113-01,
adavosertibe, afatinibe, axitinibe, bosuntinibe, cetuximabe,
conbimetinibe, crizotinibe, cabozantinibe, dasatinibe,
entrectinibe, erdafitinibe, erlotinibe, fostamatinibe,
iibrutinibe, laputinibe, laputinibe, nilotinibe, pazopanibe,
pegaptanibe, ruxolitinibe, sorafenibe, sunitinibe, SU6656,
vandetanibe, vemurafenibe); Inibidores de RNA polimerase
(por exemplo, dactinomicina, triptolídeo); Inibidores de topoisomerase (por exemplo, pidorubicina, doxorrubicina,
campotecinas, indenosioquinolinas, indotecano,
imdimitecano, ansacrina, etoposídeo, teniposídeo, ICRF-193,
genisteína); Inibidores de HSP (por exemplo, inibidor de
HSP90, 17-N-Alilamino-17-desmetoxigeldanamicina (17AAG),
gamitrinibe); Inibidores de proteína quinase de DNA (por exemplo, PIK-75); Inibidores de quinase de adesão focal (por exemplo, PF-562271, PF573,228, PF-271, NVP-226, Y15, PND-
1186, GSK2256098, VS-6062, VS-6063, VS-4718); Inibidor da síntese de RNA (daunorrubicina); Inibidor da liberação de mediador (por exemplo, ER-27319); e Inibidores de EZH2
(DZNep, EPZ005687, EI1, GSK126, UNC1999, EPZ-6438,
tazemetostate). Outros exemplos não limitativos de fármacos antiproliferativos incluem antagonistas do receptor de acetilcolina (por exemplo, clozapina, quetiapina, atropina,
benztropina, biperideno, clorfeniramina, citalopram,
diclomina, dimentidrinato, difenidramina, doxepina,
doxilamina, glicopirrolamina, glicopirrona, glicopirrolato,
oxitrópio, oxibutinina, prometazina, brometo de propantelina, escopolamina, solifenacina, tolterodina,
tiotrópio, tri-hexifenidila, tropicamida, tubocurarina,
mecamilamina, hexametônio, doxacurioniana, dextrometório);
Inibidores de acetilcolinesterase (por exemplo,
fisostigmina, neostigmina, piridostigmina, ambenônio,
demecário, rivastigmina, derivados de fenantreno,
galantamina, alfa-pineno reversível não competitivo,
piperidinas, donepezila, tacrina, edrofílio, huperemzina,
lucotiamida, lucotiamida); Antagonistas do receptor de adenosina (por exemplo, teofilina e teobromina);
Antagonistas do receptor adrenérgico (por exemplo,
fentolamina, fenoxibenzamina, propranolol, Nebivilol,
Atenolol, Oxprenolol, Metoprolol, Timolol, Pindolol,
Nadolol, Pindolol, Esmolol, Acebutolol, Sotalol, Talinolol,
Betaxolol, Labetalol e Carvedalol); Antagonistas do receptor de angiotensina (por exemplo, candesartana, eprosartana,
irbesartana, losartana, olmesartana, telmisartana,
valsartana); Estimulantes de apoptose (por exemplo, ácido asiático, ácido glico-oxicoico); Inibidores de ciclo-
oxigenase (por exemplo, celecoxibe, rofecoxibe); Inibidores da produção de citocinas (por exemplo, sirolímus,
basiliximabe, daclizumabe); Inibidores de desidrogenase
((por exemplo, micofenolato-mofetil, ácido micofenólico);
Antagonistas do receptor de dopamina (por exemplo,
benperidol, clorpromazina, clopentixol, droperidol,
haloperidol, flufenazina, flupentixol, fluspirileno,
penfluridol, perazina, perfenazina, pimozida, espiperona,
sulpirida, tioridazina, amisulprida, aseanapina,
aripriprazol, clozapina, loxapina, nemonaprida, olanzapina,
quetiapina, paliperidona, remoxiprida, risperidona,
tiaprida, ziprasidona, domperidona, bromoprida,
metoclopramida, eticloprida, nafadida; Inibidores de EGFR
(por exemplo, gefitinibe, erlotinibe, iapatinibe,
osimertinibe, cetuximabe, neratinibe, pnaitumumabe,
vandetanibe, necitumumabe, dacomitinibe); Inibidores de fosforilação ERK1 e ERK2 (por exemplo, inibidores de RAF,
RAS ou MEK); Agonistas do receptor de estrogênio (por exemplo, etinilestradiol, dietilestilbestrol,
fitoestrogênios, tamoxifeno, clomifeno, raloxifeno);
Antagonistas do receptor de glutamato (por exemplo, AP5,
barbitúricos, dextrometorfano, dextrorfano, dizoclipina,
ibogaína, ifenprodil, cetamina, ácido cinurênico, memantina,
perampanel, fenciclidina); Antagonistas do receptor de histamina (por exemplo, cimetidina, ranitidina, famotidina,
nizatidina, roxatidina, lafutidina); Inibidores de histona lisina metiltransferase (EPZ004777, EPZ5676, BIX01294);
Inibidores de IKK (por exemplo, curcumina, embelina,
auranofina, buteína, IMD 0354, IKK 16, SC514, BAY 11-7082,
MRT67307, BMS-345541, amlexanox, MLN120B); Antagonistas do canal iônico (por exemplo, erastina); Inibidores de quinase com repetição rica em leucina (por exemplo, MLi-2, PF-
06447475, GSK2578215, LRKK2-IN1, HG 10/102/01, CZC-25146);
Inibidores de MDM (por exemplo, tenovin-2, idasanutlina,
SP141 MI-773, RO8994, AMG232, nutlina-3); Inibidores de monoamina oxidase (por exemplo, hidrazina, isocarboxazida,
nialamida, fenelzina, hidracarbazina, tnrilcipromina,
befemelano, moclobemida, pirlindol, toloxatona, rasagilina,
selegilina, safinamida); Inibidores de nucleofosmina (por exemplo, EAPB0503, NSC348884, Rev37-47 CIGB-300,
avrainvillamida, deguelina, EPTG, YTR107); Agonistas do receptor PPAR (por exemplo, clofibrato, genfibrozil,
ciprofibrato, bezafibrato, fenofibrato, tiazolidinadionas,
BW501516, aleglitazar, muraglitizar, tesaglitzar);
Inibidores de fosfodiesterase (por exemplo, vinpocetina,
ENHA, BAY 60-7550, oxindol, PDP, IBMX, aminofilina,
praxantina, pentoxifilina, teobromina, inamrinona,
milrinona, enoximona, anagrelida, cilostazol, pimobendana);
Inibidores de SIRT (por exemplo, (s)-2-fentil-6-cloro, 8-
bromo-croman-4-ona, 3'-fenetiloxi-2-anilinobenzamida);
Bloqueadores do canal de sódio (por exemplo, procainamida,
quinidina, disopiramida, lidocaína, mexiletina, tocainida,
fenitoína, encainida, flecainida, moricizina, propafenona);
e Agonistas do receptor de vitamina D (por exemplo, EB 1089,
BXL-01-0029, elocalcitol). Em algumas modalidades, os fármacos antiproliferativos sem atividade anti-inflamatória em qualquer contexto descrito no presente documento podem incluir inibidores de JAK, inibidores de JNK, inibidores de
AKT, inibidores de proteína quinase, inibidores de RNA polimerase, inibidores de HSP, inibidores de proteína quinase de DNA, inibidores de adesão focal, inibidores da síntese de RNA e inibidores de liberação de mediador.
[0145] Conforme usado no presente documento, o termo "anti-inflamatório" se refere a um composto capaz de reduzir ou inibir a inflamação, em que esta é a atividade primária do composto no contexto relevante. Conforme usado no presente documento, o termo "fármaco anti-inflamatório" ou "agente anti-inflamatório" é usado para descrever qualquer composto (incluindo análogos, derivados, pró-fármacos e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo) que podem ser usados para reduzir ou inibir a inflamação. Exemplos não limitativos de fármacos anti-inflamatórios podem incluir inibidores da via de NFB (por exemplo, 9-metil-5H-6-tia-4,5-diaza- criseno-6,6-dióxido, denosumabe, dissulfiram, olmesartana, ditiocarbamatos, anatabina, BAY 11-7082, palmitoiletanolamida, iguartimode); inibidores da síntese de proteínas (por exemplo, cloranfenicol); anticorpos anti-IL1B (por exemplo, Canaquinumabe); agonistas do receptor de glicocorticoides (por exemplo, dexametasona, mifepristona); e inibidores do receptor de TGF beta (por exemplo, LY-364947, GW-755.55, LY-2109761, galunisertibe, SB431542, SB-525334).
Outros exemplos não limitativos de fármacos antiproliferativos incluem Antagonistas do receptor de acetilcolina; Inibidores de acetilcolinesterase; Antagonistas do receptor de adenosina; Antagonistas do receptor adrenérgico; Antagonistas do receptor de angiotensina; Estimulantes de apoptose; Inibidores de ciclo- oxigenase; Inibidores da produção de citocinas; Inibidores de desidrogenase; Antagonistas do receptor de dopamina; Inibidores de EGFR; Inibidores de fosforilação ERK1 e ERK2; Agonistas do receptor de estrogênio; Antagonistas do receptor de glutamato; Antagonistas do receptor de histamina; Inibidores de histona lisina metiltransferase; Inibidores de IKK; Antagonistas do canal iônico; Inibidores de quinase com repetição rica em leucina; Inibidores de MDM; Inibidores de monoamina oxidase; Inibidores de nucleofosmina; Agonistas do receptor PPAR; Inibidores de fosfodiesterase; Inibidores de SIRT; Bloqueadores do canal de sódio; e Agonistas do receptor de vitamina D. Em algumas modalidades, os fármacos anti-inflamatórios sem atividade antiproliferativa em qualquer contexto descrito no presente documento podem incluir inibidores da síntese de proteínas e inibidores do receptor de TGF beta.
[0146] Deve ser observado no presente documento que um único composto pode exibir múltiplas atividades, por exemplo, dependendo do contexto. Exemplos não limitativos de agentes que podem exibir principalmente uma atividade anti-
inflamatória e/ou uma atividade antiproliferativa,
dependendo do contexto (por exemplo, o indivíduo ou célula que está sendo administrada/contatada com o agente) podem incluir antagonistas do receptor de acetilcolina, inibidores de acetilcolinesterase, antagonistas do receptor de adenosina, antagonistas do receptor adrenérgico,
antagonistas do receptor de angiotensina, estimulantes de apoptose, inibidores de aurora quinase, inibidores de cdk,
inibidores de ciclo-oxigenase, inibidores da produção de citocinas, inibidores de desidrogenase, antagonistas do receptor de dopamina, inibidores de EGFR, inibidores de fosforilação ERK1 e ERK2, agonistas de receptor de estrogênio, inibidores de FLT3, agonistas do receptor de glicocorticoide, antagonistas do receptor de glutamato,
inibidores de HDAC, antagonistas do receptor de histamina,
inibidores de histona lisina metiltransferase, inibidores de
HSP, inibidores de IKK, antagonistas do canal iônico,
inibidores de KIT, inibidores de quinase com repetição rica em leucina, inibidores de MEK, inibidores de MDM, inibidores de monoamina oxidase, inibidores de MTOR, inibidores da via de NFB, inibidores de nucleofosmina, inibidores de PARP,
inibidores de PI3K, agonista do receptor PPAR, inibidores de
RAF, inibidores de SIRT, bloqueadores do canal de sódio,
Inibidores de topoisomerase, inibidores de tirosina quinase, inibidores de VEGFR e agonistas do receptor de vitamina D.
[0147] Um fármaco imunoestimulante é um fármaco que aumenta a atividade do sistema imune, de preferência contra células cancerosas ou displásicas, em que esta é a atividade primária do composto no contexto relevante. Conforme usado no presente documento, o termo "fármaco imunoestimulante" ou "agente anti-inflamatório" é usado para descrever qualquer composto (incluindo análogos, derivados, pró-fármacos e sais farmaceuticamente aceitável do mesmo) que podem ser usados para estimular o sistema imune. Exemplos não limitativos de fármacos imunoestimulantes podem incluir inibidores do ponto de verificação imune (por exemplo, inibidores contra PD-1, PD-L1, CTLA4 e LAG3); fármacos que estimulam a sinalização ao interferon (por exemplo, fármacos antivirais que melhoram a sinalização ao interferon, tais como Pegintron, Pegasys, Referon A, Uniferon, Multiferon, Rebif, Avonex, Cinnovex, Betaseron, Actimmune, Reiferon, Pegetron); Inibidores da síntese de DNA (por exemplo, TAS-102, NC-6004, ganciclovir); Inibidores de CDK (por exemplo, purvalanol-a, palbociclibe, ribociclibe, abemaciclibe e olomoucina II); Inibidores de ribonucleotídeo redutase (por exemplo, motexafina, hidroxiureia, fludarabina, cladribina, gencitabina, tezacitabina, triapina, maltolato de gálio, nitrato de gálio); Inibidores de di-hidrofolato redutase (por exemplo,
metotrexato, piritrexam, cicloguanila, JPC-2056); Inibidores de topoisomerase (por exemplo, pidorrubicina, doxorrubicina,
campotecinas, indenosioquinolinas, indotecano,
imdimitecano, ansacrina, etoposídeo, teniposídeo, ICRF-193,
genisteína); Inibidores de FLT3 (por exemplo, lestaurtinibe,
TG-101348, gilteritinibe, quizartinibe, midostaurina,
sorafenibe, sunitinibe); Inibidores de IGF-1; Inibidores de
MEK (por exemplo, trametinibe, cobimetinibe, binimetinibe,
selumetinibe, PD-325901, TAK-733); Inibidores de quinase
Aurora (por exemplo, ZM447439, hesperidina, VX-680);
Inibidores de PKC (por exemplo, ruboxistaurina,
queleritrina, miabenol C, miricitrina, gossipol,
verbascosídeo, BIM-1, briostato 1, tamoxifeno); Inibidores de RAF (por exemplo, vemurafenibe, GDC-0879, PLX-4720,
sorafenibe, dabrafenibe, LGX818); Inibidores de PDFGR/KIT
(por exemplo, imatinibe, sunitinibe, sorafenibe, pazopanibe,
nilotinibe, motesanibe, linifenibe); Inibidores de VEGFR
(por exemplo, axitinibe, cabozantinibe, lenvatinibe,
pazopanibe, vandetanibe); Inibidores de SRC (por exemplo,
KX2-391, bosutinibe, saracatinibe, PP1, PP2, quercetina,
dastabinibe); Agonistas do receptor de retinoide (por exemplo, alitretinoína, isoretinoína); Inibidores de HDAC
(por exemplo, THM-I-94, vorinostate, givinostate);
Inibidores de DNA metiltransferase (por exemplo, azacitidina, decitabina, zeublarina); e Inibidores de EZH2 (DZNep, EPZ005687, EI1, GSK126, UNC1999, EPZ-6438, tazemetostate).
[0148] Em algumas modalidades, os fármacos estimulantes imunes sem atividade antiproliferativa/ inflamatória em qualquer contexto descrito no presente documento podem incluir inibidores do ponto de verificação imune (por exemplo, inibidores contra PD-1, PD-L1, CTLA4 e LAG3); fármacos que estimulam a sinalização ao interferon (por exemplo, fármacos antivirais que melhoram a sinalização ao interferon); Inibidores da síntese de DNA; Inibidores de IMDH; inibidores de ribonucleotídeo redutase; Inibidores de di-hidrofolato redutase; Inibidores de SRC; Agonistas do receptor de retinoide; Inibidores de HDAC; e Inibidores de DNA metiltransferase.
[0149] O termo "quantidade eficaz", conforme usado no presente documento, se refere à quantidade de uma composição necessária para aliviar pelo menos um ou mais sintomas da doença ou transtorno e se refere a uma quantidade suficiente de composição farmacológica para conferir o efeito desejado.
O termo "quantidade terapeuticamente eficaz", portanto, se refere a uma quantidade da composição que é suficiente para conferir um efeito terapêutico particular quando administrada a um indivíduo típico. Uma quantidade eficaz, conforme usado no presente documento em vários contextos, também incluiria uma quantidade suficiente para retardar o desenvolvimento de um sintoma da doença, alterar o curso de um sintoma da doença (por exemplo, porém sem limitações, retardar a progressão de um sintoma da doença) ou reverter um sintoma da doença. Assim, em geral, não é praticável especificar uma "quantidade eficaz" exata. No entanto, para qualquer caso, uma "quantidade eficaz" apropriada pode ser determinada por aqueles versados na técnica usando apenas experimentação de rotina.
[0150] Quantidades eficazes, toxicidade e eficácia terapêutica podem ser determinadas por meio de procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a DL50 (a dose letal para 50 % da população) e a DE50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50 % da população). A dosagem pode variar dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração usada. A proporção da dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a proporção DL50/DE50. Composições e métodos que exibem grandes índices terapêuticos são preferidos. Uma dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Além disso, uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração plasmática em circulação que inclui a IC50 (ou seja, a concentração do ingrediente ativo que atinge metade da inibição máxima dos sintomas) conforme determinado em cultura de células ou em um modelo animal apropriado. Os níveis plasmáticos podem ser medidos, por exemplo, através de cromatografia líquida de alta eficiência. Os efeitos de qualquer dosagem particular podem ser monitorados através de um bioensaio adequado, por exemplo, ensaio de expressão gênica conforme descrito no presente documento, dentre outros. A dosagem pode ser determinada por um médico e ajustada, conforme necessário, para se adequar aos efeitos observados do tratamento.
[0151] Em algumas modalidades, a tecnologia descrita no presente documento se refere a uma composição farmacêutica que compreende um fármaco conforme descrito no presente documento e, opcionalmente, um carreador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, os ingredientes ativos da composição farmacêutica compreendem o fármaco conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, os ingredientes ativos da composição farmacêutica consistem essencialmente no fármaco conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, os ingredientes ativos da composição farmacêutica consistem no fármaco conforme descrito no presente documento. Carreadores e diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina, soluções tampão aquosas, solventes e/ou meios de dispersão.
O uso de tais carreadores e diluentes é bem conhecido na técnica. Alguns exemplos não limitativos de materiais que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose e derivados da mesma, tais como carboximetilcelulose de sódio, metilcelulose, etilcelulose, celulose microcristalina e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, laurilsulfato de sódio e talco; (8) excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras para supositórios; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tal como propileno glicol; (11) polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol (PEG); (12) ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes de tamponamento, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água apirogênica; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20)
soluções com pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; (22) agentes de volume, tais como polipeptídeos e aminoácidos; (23) componente do soro, tais como albumina sérica, HDL e LDL; (24) C2-C12 álcoois, tal como etanol; e (25) outras substâncias não tóxicas compatíveis empregadas em formulações farmacêuticas. Agentes umectantes, agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes adoçantes, agentes flavorizantes, agentes aromatizantes, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes na formulação. Termos tais como "excipiente", "carreador", "carreador farmaceuticamente aceitável" ou similar são usados indistintamente aqui. Em algumas modalidades, o carreador inibe a degradação do agente ativo.
[0152] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica que compreende um fármaco conforme descrito no presente documento pode ser uma forma de dosagem parentérica.
Uma vez que a administração de formas de dosagem parentéricas tipicamente ignora as defesas naturais do paciente contra contaminantes, as formas de dosagem parentéricas são, de preferência, estéreis ou capazes de ser esterilizadas antes de administração a um paciente. Exemplos de formas de dosagem parentéricas incluem, porém sem limitações, soluções prontas para injeção, produtos secos prontos para serem dissolvidos ou suspensos em um veículo farmaceuticamente aceitável para injeção, suspensões prontas para injeção e emulsões. Além disso, formas de dosagem parentéricas com liberação controlada podem ser preparadas para administração a um paciente incluindo, porém sem limitações, formas de dosagem de tipo DUROS e com liberação rápida (dumping) da dose.
[0153] Veículos adequados que podem ser usados para fornecer formas de dosagem parentéricas de um fármaco, conforme descrito, são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Exemplos incluem, sem limitação: água esterilizada; água para injetáveis USP; solução salina; solução de glicose; veículos aquosos tais como, porém sem limitações, injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção de dextrose, injeção de dextrose e cloreto de sódio e injeção de Ringer com lactato; veículos miscíveis em água tais como, porém sem limitações, álcool etílico, polietileno glicol e propileno glicol; e veículos não aquosos tais como, porém sem limitações, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de gergelim, oleato de etila, miristato de isopropila e benzoato de benzila. Compostos que alteram ou modificam a solubilidade de um sal farmaceuticamente aceitável do fármaco, conforme descrito no presente documento, também podem ser incorporados nas formas de dosagem parentérica da invenção, incluindo formas de dosagem parentéricas convencionais e com liberação controlada.
[0154] As composições farmacêuticas que compreendem um fármaco também podem ser formuladas de modo a serem adequadas para administração oral, por exemplo, como formas de dosagem distintas tais como, porém sem limitações, comprimidos (incluindo, sem limitação, comprimidos marcados ou revestidos), pílulas, pequenas cápsulas, cápsulas, comprimidos mastigáveis, pacotes de pó, hóstias, trociscos, wafers, sprays de aerossol ou líquidos tais como, porém sem limitações, xaropes, elixires, soluções ou suspensões em um líquido aquoso, um líquido não aquoso, uma emulsão óleo-em- água ou uma emulsão água-em-óleo. Tais composições contêm uma quantidade predeterminada do sal farmaceuticamente aceitável dos compostos descritos e podem ser preparadas por meio de métodos farmacêuticos bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Consulte, de modo genérico, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21ª Ed., Lippincott, Williams and Wilkins, Filadélfia PA. (2005).
[0155] As formas de dosagem convencionais geralmente permitem a liberação rápida ou imediata do fármaco a partir da formulação. Dependendo da farmacologia e da farmacocinética do fármaco, o uso de formas de dosagem convencionais pode levar a grandes flutuações nas concentrações do fármaco no sangue e em outros tecidos do paciente. Estas flutuações podem ter um impacto sobre uma série de parâmetros, tais como frequência de dose, início de ação, duração da eficácia, manutenção de níveis sanguíneos terapêuticos, toxicidade, efeitos colaterais e assim por diante. Vantajosamente, as formulações com liberação controlada podem ser usadas para controlar o início da ação de um fármaco, a duração da ação, os níveis plasmáticos dentro da janela terapêutica e os níveis sanguíneos máximos.
Em particular, as formas de dosagem ou formulações com liberação controlada ou prolongada podem ser usadas para assegurar que a eficácia máxima de um fármaco seja alcançada, minimizando os potenciais efeitos adversos e preocupações com a segurança, os quais podem ocorrer tanto por subdosagem de um fármaco (ou seja, indo abaixo dos níveis terapêuticos mínimos), bem como ultrapassar o nível de toxicidade do fármaco. Em algumas modalidades, o fármaco pode ser administrado em uma formulação com liberação sustentada.
[0156] Produtos farmacêuticos com liberação controlada têm um objetivo em comum de melhorar a terapia medicamentosa em relação àquela alcançada por suas contrapartes com liberação não controlada. De forma ideal, o uso de uma preparação com liberação controlada concebida de forma ideal para um tratamento médico é caracterizado por um mínimo de substância medicamentosa sendo empregada para curar ou controlar a condição em um período mínimo de tempo. As vantagens das formulações com liberação controlada incluem: 1) atividade prolongada do fármaco; 2) frequência de dosagem reduzida; 3) aumento da adesão do paciente; 4) uso de menos fármaco total; 5) redução dos efeitos colaterais locais ou sistêmicos; 6) minimização do acúmulo de fármaco; 7) redução das flutuações dos níveis sanguíneos; 8) melhora da eficácia do tratamento; 9) redução da potenciação ou perda da atividade do fármaco; e 10) melhoria na velocidade de controle de doenças ou condições. Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000).
[0157] A maioria das formulações com liberação controlada é concebida para liberar inicialmente uma quantidade de fármaco (ingrediente ativo) que produz prontamente o efeito terapêutico desejado e liberar gradual e continuamente outras quantidades de fármaco para manter este nível de efeito terapêutico ou profilático durante um período prolongado de tempo. A fim de manter este nível constante de fármaco no corpo, o fármaco deve ser liberado da forma de dosagem em uma taxa que reporá a quantidade de fármaco que está sendo metabolizada e excretada do corpo. A liberação controlada de um ingrediente ativo pode ser estimulada por várias condições incluindo, porém sem limitações, pH, intensidade iônica, pressão osmótica, temperatura, enzimas, água e outras condições ou compostos fisiológicos.
[0158] Uma variedade de formas de dosagem, formulações e dispositivos da liberação controlada ou prolongada podem ser adaptados para uso com os sais e composições da invenção.
Exemplos incluem, porém sem limitações, aqueles descritos nas Patentes Norte-Americanas Nos 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123; 4,008,719; 5,674,533; 5,059,595; 5,591,767; 5,120,548; 5,073,543; 5,639,476; 5,354,556; 5,733,566; e 6,365,185 B1; cada uma das quais é incorporada ao presente documento a título de referência. Estas formas de dosagem podem ser usadas para permitir a liberação lenta ou controlada de um ou mais ingredientes ativos usando, por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose, outras matrizes poliméricas, géis, membranas permeáveis, sistemas osmóticos (tal como OROS (Alza Corporation, Mountain View, Califórnia, EUA)) ou uma combinação dos mesmos para fornecer o perfil de liberação desejado em proporções variáveis.
[0159] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o fármaco descrito no presente documento é administrado como uma monoterapia, por exemplo, outro tratamento para as lesões pré-malignas bronquiais não é administrado ao indivíduo.
[0160] Em algumas modalidades de qualquer dos aspectos, os métodos descritos no presente documento podem compreender ainda a administração de um segundo agente e/ou tratamento ao indivíduo, por exemplo, como parte de uma terapia combinada.
[0161] Em determinadas modalidades, uma dose eficaz de uma composição que compreende um fármaco conforme descrito no presente documento pode ser administrada a um paciente uma vez. Em determinadas modalidades, uma dose eficaz de uma composição que compreende um fármaco pode ser administrada a um paciente repetidamente. Para administração sistêmica, os indivíduos podem receber uma quantidade terapêutica de uma composição que compreende um fármaco tal como, por exemplo, 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg ou mais.
[0162] Em algumas modalidades, após um regime de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados com menos frequência. Por exemplo, após o tratamento quinzenal durante três meses, o tratamento pode ser repetido uma vez por mês, por seis meses ou um ano ou mais. O tratamento de acordo com os métodos descritos no presente documento pode reduzir os níveis de um marcador ou sintoma de uma condição, por exemplo, por pelo menos 10 %, pelo menos 15 %, pelo menos 20 %, pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 % ou pelo menos 90 % ou mais.
[0163] A dosagem de uma composição conforme descrita no presente documento pode ser determinada por um médico e ajustada, conforme necessário, para se adequar aos efeitos observados do tratamento. Em relação à duração e frequência do tratamento, é típico para os médicos qualificados monitorarem os indivíduos a fim de determinar quando o tratamento está proporcionando um benefício terapêutico e determinar se deve aumentar ou diminuir a dosagem, aumentar ou diminuir a frequência de administração, interromper o tratamento, retomar o tratamento ou fazer outras alterações no regime de tratamento. O esquema de dosagem pode variar de uma vez por semana a diariamente, dependendo de uma série de fatores clínicos, tal como a sensibilidade do indivíduo ao ingrediente ativo. A dose ou quantidade de ativação desejada pode ser administrada de uma vez ou dividida em subdoses, por exemplo, 2-4 subdoses e administrada ao longo de um período de tempo, por exemplo, em intervalos apropriados ao longo do dia ou outro cronograma apropriado. Em algumas modalidades, a administração pode ser crônica, por exemplo,
uma ou mais doses e/ou tratamentos diários durante um período de semanas ou meses. Exemplos de dosagem e/ou esquemas de tratamento são administração diária, duas vezes ao dia, três vezes ao dia ou quatro ou mais vezes ao dia durante um período de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses ou 6 meses ou mais. Uma composição que compreende um fármaco descrito no presente documento pode ser administrada ao longo de um período de tempo, tal como durante um período de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos ou 25 minutos.
[0164] Os intervalos de dosagem para a administração de um fármaco, de acordo com os métodos descritos no presente documento dependem, por exemplo, da forma do fármaco, sua potência e até que ponto é desejado que os sintomas, marcadores ou indicadores de uma condição descrita no presente documento sejam reduzidos, por exemplo, a redução percentual desejada para o tamanho da lesão ou a extensão até a qual, por exemplo, se deseja induzir alterações do subtipo de lesão. A dosagem não deve ser tão grande a ponto de causar efeitos colaterais adversos. Em geral, a dosagem variará com a idade, condição e sexo do paciente e pode ser determinada por aqueles versados na técnica. A dosagem também pode ser ajustada pelo médico individual no caso de qualquer complicação.
[0165] A eficácia de um fármaco, por exemplo, no tratamento de uma condição descrita no presente documento ou para induzir uma resposta conforme descrita no presente documento (por exemplo, redução no tamanho da lesão) pode ser determinada pelo médico especialista. No entanto, um tratamento é considerado "tratamento eficaz", conforme o termo é usado no presente documento, se um ou mais dos sinais ou sintomas de uma condição descrita no presente documento forem alterados de maneira benéfica, outros sintomas clinicamente aceitos são melhorados, ou mesmo aliviados, ou uma resposta desejada é induzida, por exemplo, em pelo menos 10 % após o tratamento de acordo com os métodos descritos no presente documento. A eficácia pode ser avaliada, por exemplo, ao medir um marcador, indicador, sintoma e/ou a incidência de uma condição tratada de acordo com os métodos descritos no presente documento ou qualquer outro parâmetro mensurável apropriado. A eficácia também pode ser medida pela ausência de uma piora no indivíduo, conforme avaliado pela hospitalização ou necessidade de intervenções médicas (isto é, a progressão da doença é interrompida). Métodos para medir estes indicadores são conhecidos por aqueles versados na técnica e/ou são descritos no presente documento.
O tratamento inclui qualquer tratamento de uma doença em um indivíduo ou animal (alguns exemplos não limitativos incluem um ser humano ou um animal) e inclui: (1) inibir a doença, por exemplo, prevenir o agravamento dos sintomas (por exemplo, dor ou inflamação); ou (2) aliviar a gravidade da doença, por exemplo, causar a regressão dos sintomas. Uma quantidade eficaz para o tratamento de uma doença significa aquela quantidade que, quando administrada a um indivíduo que precisa, é suficiente para resultar em um tratamento eficaz conforme este termo é definido no presente documento para esta doença. A eficácia de um agente pode ser determinada ao avaliar indicadores físicos de uma condição ou resposta desejada. Está bem dentro da capacidade daqueles versados na técnica monitorar a eficácia da administração e/ou tratamento ao medir qualquer um de tais parâmetros ou qualquer combinação de parâmetros. A eficácia pode ser avaliada em modelos animais de uma condição descrita no presente documento, por exemplo, o tratamento de lesões pré- malignas bronquiais em um modelo de camundongo. Quando se usa um modelo animal experimental, a eficácia do tratamento é evidenciada quando se observa uma alteração estatisticamente significativa em um marcador, por exemplo, o tamanho da lesão ou expressão gênica.
[0166] Conforme usado no presente documento, "um procedimento com base em broncoscopia" se refere a qualquer técnica endoscópica que permita o exame dos brônquios e/ou pulmões. Os procedimentos com bases em broncoscopia podem incluir broncoscopia de luz branca, broncoscopia autofluorescente, broncoscopia flexível, broncoscopia rígida, lavagem broncoalveolar e assim por diante. Os procedimentos com bases em broncoscopia podem incluir biópsia, esfregaço ou amostragem de tecido.
[0167] Além dos métodos de tratamento, os métodos e assinaturas de biomarcadores de descritos no presente documento podem ser aplicados a métodos de previsão do risco de câncer de pulmão em um indivíduo e/ou determinação da eficácia do tratamento ou necessidade de tratamento adicional. Por exemplo, a transição de um subtipo Proliferativo ou Inflamatório para um subtipo Normal ou Secretor indicaria que um tratamento foi eficaz ou que o tratamento pode ser descontinuado.
[0168] Em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é descrito no presente documento um método para prever o risco ou a probabilidade de progressão para câncer de pulmão em um indivíduo, o método compreendendo: detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 5 e/ou pelo menos um gene do módulo 6 em uma amostra obtida do indivíduo, em que um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 5 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa; e/ou um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa indica um risco ou probabilidade aumentada de progredir para câncer de pulmão.
Em um aspecto de qualquer uma das modalidades. é descrito no presente documento um método para prever o risco ou a probabilidade de progressão para câncer de pulmão em um indivíduo, o método compreendendo: detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 5 e/ou pelo menos um gene do módulo 6 em uma amostra obtida do indivíduo em um primeiro ponto de tempo e detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 5 e/ou pelo menos um gene do módulo 6 em uma amostra obtida do indivíduo em um segundo ponto de tempo subsequente, em que um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 5 ao longo do tempo; e/ou um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 ao longo do tempo indica um risco ou probabilidade aumentada de progredir para câncer de pulmão.
[0169] Em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é descrito no presente documento um método para prever o risco ou a probabilidade de progressão para câncer de pulmão em um indivíduo, o método compreendendo: detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 9 e/ou pelo menos um gene do módulo 10 em uma amostra obtida do indivíduo, em que um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 10 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa; e/ou um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 9 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa indica um risco ou probabilidade aumentada de progredir para câncer de pulmão.
Em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é descrito no presente documento um método para prever o risco ou a probabilidade de progressão para câncer de pulmão em um indivíduo, o método compreendendo: detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 10 e/ou pelo menos um gene do módulo 9 em uma amostra obtida do indivíduo em um primeiro ponto de tempo e detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 9 e/ou pelo menos um gene do módulo 10 em uma amostra obtida do indivíduo em um segundo ponto de tempo subsequente, em que um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 10 ao longo do tempo; e/ou um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 9 ao longo do tempo indica um risco ou probabilidade aumentada de progredir para câncer de pulmão.
[0170] Em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é descrito no presente documento um método para prever o risco ou a probabilidade de progressão para câncer de pulmão em um indivíduo, o método compreendendo: detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 2 e/ou pelo menos um gene do módulo 6 em uma amostra obtida do indivíduo, em que um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 2 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa; e/ou um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa indica um risco ou probabilidade aumentada de progredir para câncer de pulmão.
Em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é descrito no presente documento um método para prever o risco ou a probabilidade de progressão para câncer de pulmão em um indivíduo, o método compreendendo: detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 2 e/ou pelo menos um gene do módulo 6 em uma amostra obtida do indivíduo em um primeiro ponto de tempo e detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 2 e/ou pelo menos um gene do módulo 6 em uma amostra obtida do indivíduo em um segundo ponto de tempo subsequente, em que um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 2 ao longo do tempo; e/ou um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 ao longo do tempo indica um risco ou probabilidade aumentada de progredir para câncer de pulmão.
[0171] Em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é descrito no presente documento um método para determinar a eficácia do tratamento, o método compreendendo: detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 5 e/ou pelo menos um gene do módulo 6 em uma amostra obtida do indivíduo em um primeiro ponto de tempo, administrar um tratamento ou tratamento candidato e detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 5 e/ou pelo menos um gene do módulo 6 em uma amostra obtida do indivíduo em um segundo ponto de tempo subsequente, em que um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 5 ao longo do tempo; e/ou um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 6 ao longo do tempo indica que o tratamento é eficaz.
[0172] Em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é descrito no presente documento um método para avaliar a eficácia de um tratamento, o método compreendendo: detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 10 e/ou pelo menos um gene do módulo 9 em uma amostra obtida do indivíduo em um primeiro ponto de tempo, administrar um tratamento ou tratamento candidato e detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 9 e/ou pelo menos um gene do módulo 10 em uma amostra obtida do indivíduo em um segundo ponto no tempo subsequente, em que um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 10 ao longo do tempo; e/ou um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 9 ao longo do tempo indica que o tratamento é eficaz.
[0173] Em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é descrito no presente documento um método para determinar a eficácia do tratamento, o método compreendendo: detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 2 e/ou pelo menos um gene do módulo 6 em uma amostra obtida do indivíduo em um primeiro ponto de tempo, administrar um tratamento ou tratamento candidato e detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 2 e/ou pelo menos um gene do módulo 6 em uma amostra obtida do indivíduo em um segundo ponto de tempo subsequente, em que um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 2 ao longo do tempo; e/ou um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 6 ao longo do tempo indica que o tratamento é eficaz.
[0174] Em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é descrito no presente documento um método que compreende: detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 5 e/ou pelo menos um gene do módulo 6 em uma amostra obtida de um indivíduo, em que é determinado o nível de expressão de não mais do que 1.000 (por exemplo, não mais do que 500, 400, 300, 200 ou 100) genes. Em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é descrito no presente documento um método que compreende: detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 9 e/ou pelo menos um gene do módulo 10 em uma amostra obtida de um indivíduo, em que é determinado o nível de expressão de não mais do que 1.000 (por exemplo, não mais do que 500, 400, 300, 200 ou 100) genes. Em um aspecto de qualquer uma das modalidades, é descrito aqui um método que compreende: detectar o nível de expressão de pelo menos um gene do módulo 2 e/ou pelo menos um gene do módulo 6 em uma amostra obtida de um indivíduo, em que é determinado o nível de expressão de não mais do que 1.000 (por exemplo, não mais do que 500, 400, 300, 200 ou 100) genes. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a amostra é uma amostra de esfregaço brônquico. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene é selecionado a partir da Tabela 14 ou 15.
Tabela 13 Módulo Gênico EnsemblID Símbolos do Gene 1 ENSG00000001084 GCLC 1 ENSG00000006210 CX3CL1 1 ENSG00000008256 CYTH3 1 ENSG00000010319 SEMA3G 1 ENSG00000011028 MRC2 1 ENSG00000011201 KAL1
1 ENSG00000011523 CEP68
1 ENSG00000012660 ELOVL5
1 ENSG00000017483 SLC38A5
1 ENSG00000019144 PHLDB1
1 ENSG00000019549 SNAI2
1 ENSG00000020181 GPR124
1 ENSG00000020577 SAMD4A
1 ENSG00000024422 EHD2
1 ENSG00000031081 ARHGAP31
1 ENSG00000035862 TIMP2
1 ENSG00000042832 TG
1 ENSG00000049130 KITLG
1 ENSG00000049540 ELN
1 ENSG00000050165 DKK3
1 ENSG00000053747 LAMA3
1 ENSG00000054965 FAM168A
1 ENSG00000060140 STYK1
1 ENSG00000061918 GUCY1B3
1 ENSG00000063180 CA11
1 ENSG00000064042 LIMCH1
1 ENSG00000064205 WISP2
1 ENSG00000064300 NGFR
1 ENSG00000064989 CALCRL
1 ENSG00000065054 SLC9A3R2
1 ENSG00000065320 NTN1
1 ENSG00000067445 TRO
1 ENSG00000069122 GPR116
1 ENSG00000069188 SDK2
1 ENSG00000069702 TGFBR3
1 ENSG00000071246 VASH1
1 ENSG00000072041 SLC6A15
1 ENSG00000072195 SPEG
1 ENSG00000072210 ALDH3A2
1 ENSG00000072840 EVC
1 ENSG00000073067 CYP2W1
1 ENSG00000073282 TP63
1 ENSG00000073712 FERMT2
1 ENSG00000074356 C17orf85
1 ENSG00000074590 NUAK1
1 ENSG00000074660 SCARF1
1 ENSG00000076706 MCAM
1 ENSG00000077782 FGFR1
1 ENSG00000078018 MAP2
1 ENSG00000079102 RUNX1T1
1 ENSG00000079308 TNS1
1 ENSG00000080573 COL5A3
1 ENSG00000081052 COL4A4
1 ENSG00000081913 PHLPP1
1 ENSG00000082497 SERTAD4
1 ENSG00000082781 ITGB5
1 ENSG00000085998 POMGNT1
1 ENSG00000087116 ADAMTS2
1 ENSG00000087245 MMP2
1 ENSG00000088367 EPB41L1
1 ENSG00000091136 LAMB1
1 ENSG00000091879 ANGPT2
1 ENSG00000092096 SLC22A17
1 ENSG00000092421 SEMA6A
1 ENSG00000092969 TGFB2
1 ENSG00000099953 MMP11
1 ENSG00000100154 TTC28
1 ENSG00000101331 CCM2L
1 ENSG00000101665 SMAD7
1 ENSG00000101825 MXRA5
1 ENSG00000102302 FGD1
1 ENSG00000102755 FLT1
1 ENSG00000103196 CRISPLD2
1 ENSG00000103241 FOXF1
1 ENSG00000103723 AP3B2
1 ENSG00000103852 TTC23
1 ENSG00000104953 TLE6
1 ENSG00000105088 OLFM2
1 ENSG00000105227 PRX
1 ENSG00000105371 ICAM4
1 ENSG00000105376 ICAM5
1 ENSG00000105419 MEIS3
1 ENSG00000105538 RASIP1
1 ENSG00000105738 SIPA1L3
1 ENSG00000105866 SP4
1 ENSG00000105974 CAV1
1 ENSG00000106070 GRB10
1 ENSG00000106123 EPHB6
1 ENSG00000106333 PCOLCE
1 ENSG00000106571 GLI3
1 ENSG00000106624 AEBP1
1 ENSG00000108821 COL1A1
1 ENSG00000108852 MPP2
1 ENSG00000108924 HLF
1 ENSG00000109099 PMP22
1 ENSG00000109107 ALDOC
1 ENSG00000109193 SULT1E1
1 ENSG00000109610 SOD3
1 ENSG00000110002 VWA5A
1 ENSG00000110200 ANAPC15
1 ENSG00000110799 VWF
1 ENSG00000110811 LEPREL2
1 ENSG00000111341 MGP
1 ENSG00000111452 GPR133
1 ENSG00000111799 COL12A1
1 ENSG00000112320 SOBP
1 ENSG00000112414 GPR126
1 ENSG00000112562 SMOC2
1 ENSG00000112769 LAMA4
1 ENSG00000112782 CLIC5
1 ENSG00000112902 SEMA5A
1 ENSG00000112936 C7
1 ENSG00000112964 GHR
1 ENSG00000113140 SPARC
1 ENSG00000113555 PCDH12
1 ENSG00000114270 COL7A1
1 ENSG00000114698 PLSCR4
1 ENSG00000114923 SLC4A3
1 ENSG00000115252 PDE1A
1 ENSG00000115306 SPTBN1
1 ENSG00000115380 EFEMP1
1 ENSG00000115414 FN1
1 ENSG00000116016 EPAS1
1 ENSG00000116678 LEPR
1 ENSG00000116774 OLFML3
1 ENSG00000116962 NID1
1 ENSG00000117013 KCNQ4
1 ENSG00000117122 MFAP2
1 ENSG00000117385 LEPRE1
1 ENSG00000117643 MAN1C1
1 ENSG00000118495 PLAGL1
1 ENSG00000119138 KLF9
1 ENSG00000119681 LTBP2
1 ENSG00000119699 TGFB3
1 ENSG00000119771 KLHL29
1 ENSG00000120156 TEK
1 ENSG00000120162 MOB3B
1 ENSG00000120318 ARAP3
1 ENSG00000120457 KCNJ5
1 ENSG00000121068 TBX2
1 ENSG00000121075 TBX4
1 ENSG00000122035 RASL11A
1 ENSG00000122642 FKBP9
1 ENSG00000122707 RECK
1 ENSG00000122778 KIAA1549
1 ENSG00000122786 CALD1
1 ENSG00000123094 RASSF8
1 ENSG00000123384 LRP1
1 ENSG00000124006 OBSL1
1 ENSG00000124406 ATP8A1
1 ENSG00000125266 EFNB2
1 ENSG00000125810 CD93
1 ENSG00000125848 FLRT3
1 ENSG00000126803 HSPA2
1 ENSG00000127329 PTPRB
1 ENSG00000127585 FBXL16
1 ENSG00000127920 GNG11
1 ENSG00000127946 HIP1
1 ENSG00000128052 KDR
1 ENSG00000128567 PODXL
1 ENSG00000128641 MYO1B
1 ENSG00000128656 CHN1
1 ENSG00000128791 TWSG1
1 ENSG00000128872 TMOD2
1 ENSG00000128917 DLL4
1 ENSG00000129009 ISLR
1 ENSG00000129038 LOXL1
1 ENSG00000129467 ADCY4
1 ENSG00000129474 AJUBA
1 ENSG00000129946 SHC2
1 ENSG00000129990 SYT5
1 ENSG00000130052 STARD8
1 ENSG00000130300 PLVAP
1 ENSG00000130508 PXDN
1 ENSG00000130635 COL5A1
1 ENSG00000131016 AKAP12
1 ENSG00000131477 RAMP2
1 ENSG00000131831 RAI2
1 ENSG00000132688 NES
1 ENSG00000133026 MYH10
1 ENSG00000133067 LGR6
1 ENSG00000133110 POSTN
1 ENSG00000133121 STARD13
1 ENSG00000133313 CNDP2
1 ENSG00000133687 TMTC1
1 ENSG00000134243 SORT1
1 ENSG00000134245 WNT2B
1 ENSG00000134318 ROCK2
1 ENSG00000134352 IL6ST
1 ENSG00000134569 LRP4
1 ENSG00000134590 FAM127A
1 ENSG00000134627 PIWIL4
1 ENSG00000134802 SLC43A3
1 ENSG00000134853 PDGFRA
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8 ENSG00000241839 PLEKHO2
8 ENSG00000241878 PISD
8 ENSG00000242539
8 ENSG00000244482 LILRA6
8 ENSG00000247774 PCED1B-AS1
8 ENSG00000250264
8 ENSG00000255398 HCAR3
8 ENSG00000256007 ARAP1-AS1
8 ENSG00000258227 CLEC5A
8 ENSG00000265206 MIR142
8 ENSG00000267121
8 ENSG00000268001
8 ENSG00000269215
8 ENSG00000269728
9 ENSG00000002549 LAP3
9 ENSG00000013374 NUB1
9 ENSG00000019582 CD74
9 ENSG00000026950 BTN3A1
9 ENSG00000055332 EIF2AK2
9 ENSG00000059378 PARP12
9 ENSG00000067066 SP100
9 ENSG00000068079 IFI35
9 ENSG00000089692 LAG3
9 ENSG00000092010 PSME1
9 ENSG00000100336 APOL4
9 ENSG00000100342 APOL1
9 ENSG00000100911 PSME2
9 ENSG00000106785 TRIM14
9 ENSG00000107201 DDX58
9 ENSG00000111331 OAS3
9 ENSG00000111335 OAS2
9 ENSG00000111801 BTN3A3
9 ENSG00000112763 BTN2A1
9 ENSG00000114127 XRN1
9 ENSG00000115267 IFIH1
9 ENSG00000115415 STAT1
9 ENSG00000117228 GBP1
9 ENSG00000119917 IFIT3
9 ENSG00000121858 TNFSF10
9 ENSG00000123240 OPTN
9 ENSG00000123609 NMI
9 ENSG00000124201 ZNFX1
9 ENSG00000124226 RNF114
9 ENSG00000124508 BTN2A2
9 ENSG00000125347 IRF1
9 ENSG00000126709 IFI6
9 ENSG00000128284 APOL3
9 ENSG00000128335 APOL2
9 ENSG00000130303 BST2
9 ENSG00000130487 KLHDC7B
9 ENSG00000130589 HELZ2
9 ENSG00000131203 IDO1
9 ENSG00000132109 TRIM21
9 ENSG00000132274 TRIM22
9 ENSG00000133106 EPSTI1
9 ENSG00000134326 CMPK2
9 ENSG00000135148 TRAFD1
9 ENSG00000136816 TOR1B
9 ENSG00000137628 DDX60
9 ENSG00000137959 IFI44L
9 ENSG00000137965 IFI44
9 ENSG00000138496 PARP9
9 ENSG00000138642 HERC6
9 ENSG00000138755 CXCL9
9 ENSG00000140105 WARS
9 ENSG00000140464 PML
9 ENSG00000140853 NLRC5
9 ENSG00000152778 IFIT5
9 ENSG00000156587 UBE2L6
9 ENSG00000157601 MX1
9 ENSG00000158773 USF1
9 ENSG00000160710 ADAR
9 ENSG00000160932 LY6E
9 ENSG00000162654 GBP4
9 ENSG00000163840 DTX3L
9 ENSG00000164136 IL15
9 ENSG00000165949 IFI27
9 ENSG00000166278 C2
9 ENSG00000166710 B2M
9 ENSG00000168062 BATF2
9 ENSG00000168394 TAP1
9 ENSG00000168961 LGALS9
9 ENSG00000169245 CXCL10
9 ENSG00000173193 PARP14
9 ENSG00000173821 RNF213
9 ENSG00000177409 SAMD9L
9 ENSG00000179344 HLA-DQB1
9 ENSG00000179583 CIITA
9 ENSG00000185338 SOCS1
9 ENSG00000185404 SP140L
9 ENSG00000185880 TRIM69
9 ENSG00000186470 BTN3A2
9 ENSG00000187608 ISG15
9 ENSG00000188282 RUFY4
9 ENSG00000188313 PLSCR1
9 ENSG00000196126 HLA-DRB1
9 ENSG00000196735 HLA-DQA1
9 ENSG00000197142 ACSL5
9 ENSG00000197536 C5orf56
9 ENSG00000204252 HLA-DOA
9 ENSG00000204257 HLA-DMA
9 ENSG00000204261 TAPSAR1
9 ENSG00000204264 PSMB8
9 ENSG00000204287 HLA-DRA
9 ENSG00000204525 HLA-C
9 ENSG00000204592 HLA-E
9 ENSG00000204642 HLA-F
9 ENSG00000205220 PSMB10
9 ENSG00000205436 EXOC3L4
9 ENSG00000206337 HCP5
9 ENSG00000206503 HLA-A
9 ENSG00000213886 UBD
9 ENSG00000213928 IRF9
9 ENSG00000221963 APOL6
9 ENSG00000223865 HLA-DPB1
9 ENSG00000225131 PSME2P2
9 ENSG00000225492 GBP1P1
9 ENSG00000231389 HLA-DPA1
9 ENSG00000231925 TAPBP
9 ENSG00000232629 HLA-DQB2
9 ENSG00000234745 HLA-B
9 ENSG00000237988 OR2I1P
9 ENSG00000240065 PSMB9
9 ENSG00000242574 HLA-DMB
9 ENSG00000263013
9 ENSG00000269640
10 ENSG00000167535 CACNB3
10 ENSG00000109339 MAPK10
Tabela 14. 22 genes que foram selecionados a partir de
3.936 para prever os subtipos moleculares na Coorte de Validação (biópsias endobronquiais) Módulo Gênico Nome do Gene EnsemblID 1 PHLDB1 ENSG00000019144 1 MARVELD1 ENSG00000155254 1 KIRREL1 ENSG00000183853 2 CCNL2 ENSG00000221978 2 MSANTD2 ENSG00000120458 2 LUC7L ENSG00000007392 3 BTG2 ENSG00000159388 3 ZFP36 ENSG00000128016 4 COX6A1 ENSG00000111775 4 COX7A2 ENSG00000112695 5 RACGAP1 ENSG00000161800 5 TPX2 ENSG00000088325 6 NEK11 ENSG00000114670 6 IFT88 ENSG00000032742 7 RPL26 ENSG00000161970 7 RPL23 ENSG00000125691 8 DOCK2 ENSG00000134516 8 CD53 ENSG00000143119 8 LAPTM5 ENSG00000162511
9 UBE2L6 ENSG00000156587 9 EPSTI1 ENSG00000133106 9 TAP1 ENSG00000168394 Tabela 15. 8 genes que foram selecionados a partir dos 22 genes (Tabela 14) para prever o subtipo Proliferativo ou não nos esfregaços brônquicos Módulo Gênico Nome do Gene EnsemblID 4 COX6A1 ENSG00000111775 4 COX7A2 ENSG00000112695 5 RACGAP1 ENSG00000161800 5 TPX2 ENSG00000088325 6 NEK11 ENSG00000114670 6 IFT88 ENSG00000032742 7 RPL26 ENSG00000161970 7 RPL23 ENSG00000125691 Tabela 16. 112 genes usados para prever progressão/persistência versus regressão em biópsias endobronquiais classificadas como estando no subtipo Proliferativo. Genes no Módulo 9 associados à progressão/regressão. Estes genes estão contidos na Tabela
13.
EnsemblID Símbolos do Gene
ENSG00000002549 LAP3
ENSG00000013374 NUB1
ENSG00000019582 CD74
ENSG00000026950 BTN3A1
ENSG00000055332 EIF2AK2
ENSG00000059378 PARP12
ENSG00000067066 SP100
ENSG00000068079 IFI35
ENSG00000089692 LAG3
ENSG00000092010 PSME1
ENSG00000100336 APOL4
ENSG00000100342 APOL1
ENSG00000100911 PSME2
ENSG00000106785 TRIM14
ENSG00000107201 DDX58
ENSG00000111331 OAS3
ENSG00000111335 OAS2
ENSG00000111801 BTN3A3
ENSG00000112763 BTN2A1
ENSG00000114127 XRN1
ENSG00000115267 IFIH1
ENSG00000115415 STAT1
ENSG00000117228 GBP1
ENSG00000119917 IFIT3
ENSG00000121858 TNFSF10
ENSG00000123240 OPTN
ENSG00000123609 NMI
ENSG00000124201 ZNFX1
ENSG00000124226 RNF114
ENSG00000124508 BTN2A2
ENSG00000125347 IRF1
ENSG00000126709 IFI6
ENSG00000128284 APOL3
ENSG00000128335 APOL2
ENSG00000130303 BST2
ENSG00000130487 KLHDC7B
ENSG00000130589 HELZ2
ENSG00000131203 IDO1
ENSG00000132109 TRIM21
ENSG00000132274 TRIM22
ENSG00000133106 EPSTI1
ENSG00000134326 CMPK2
ENSG00000135148 TRAFD1
ENSG00000136816 TOR1B
ENSG00000137628 DDX60
ENSG00000137959 IFI44L
ENSG00000137965 IFI44
ENSG00000138496 PARP9
ENSG00000138642 HERC6
ENSG00000138755 CXCL9
ENSG00000140105 WARS
ENSG00000140464 PML
ENSG00000140853 NLRC5
ENSG00000152778 IFIT5
ENSG00000156587 UBE2L6
ENSG00000157601 MX1
ENSG00000158773 USF1
ENSG00000160710 ADAR
ENSG00000160932 LY6E
ENSG00000162654 GBP4
ENSG00000163840 DTX3L
ENSG00000164136 IL15
ENSG00000165949 IFI27
ENSG00000166278 C2
ENSG00000166710 B2M
ENSG00000168062 BATF2
ENSG00000168394 TAP1
ENSG00000168961 LGALS9
ENSG00000169245 CXCL10
ENSG00000173193 PARP14
ENSG00000173821 RNF213
ENSG00000177409 SAMD9L
ENSG00000179344 HLA-DQB1
ENSG00000179583 CIITA
ENSG00000185338 SOCS1
ENSG00000185404 SP140L
ENSG00000185880 TRIM69
ENSG00000186470 BTN3A2
ENSG00000187608 ISG15
ENSG00000188282 RUFY4
ENSG00000188313 PLSCR1
ENSG00000196126 HLA-DRB1
ENSG00000196735 HLA-DQA1
ENSG00000197142 ACSL5
ENSG00000197536 C5orf56
ENSG00000204252 HLA-DOA
ENSG00000204257 HLA-DMA
ENSG00000204261 TAPSAR1
ENSG00000204264 PSMB8
ENSG00000204287 HLA-DRA
ENSG00000204525 HLA-C
ENSG00000204592 HLA-E
ENSG00000204642 HLA-F
ENSG00000205220 PSMB10
ENSG00000205436 EXOC3L4
ENSG00000206337 HCP5
ENSG00000206503 HLA-A
ENSG00000213886 UBD
ENSG00000213928 IRF9
ENSG00000221963 APOL6
ENSG00000223865 HLA-DPB1
ENSG00000225131 PSME2P2
ENSG00000225492 GBP1P1
ENSG00000231389 HLA-DPA1
ENSG00000231925 TAPBP
ENSG00000232629 HLA-DQB2
ENSG00000234745 HLA-B
ENSG00000237988 OR2I1P
ENSG00000240065 PSMB9
ENSG00000242574 HLA-DMB
ENSG00000263013 RP11-876N24.5
ENSG00000269640
[0175] Os métodos descritos no presente documento se referem à determinação do nível de expressão de pelo menos um gene. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, pelo menos um do gene pode ser um ou mais genes selecionados a partir das Tabelas 13, 14, 15 e/ou 16. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, as listas de genes das Tabelas 13, 14 e 16 são relevantes para amostras de biópsia endobronquial que variam, quanto à histologia, de normais a pré-malignas. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, onde a amostra é uma amostra de biópsia endobronquial, um ou mais genes são selecionados a partir da Tabela 13, 14 e/ou 16. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a Tabela 15 é relevante para esfregaços brônquicos normais. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, onde a amostra é uma amostra de esfregaço brônquico (por exemplo, de tecido normal), um ou mais genes são selecionados a partir da Tabela 15.
[0176] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um ou mais genes selecionados a partir da Tabela 13 ou 16 não são B2M, HLA-DRA, HLA-DRB1 ou HLA-DPA1. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, se um ou mais genes selecionados a partir da Tabela 13 ou 16 incluem B2M, HLA-DRA, HLA-DRB1 e/ou HLA-DPA1, pelo menos um gene adicional da Tabela 13 ou 16 é selecionado.
[0177] Por conveniência, o significado de alguns termos e frases usados no relatório descritivo, exemplos e reivindicações anexas são fornecidos abaixo. A menos que indicado de outra forma, ou implícito a partir do contexto, os termos e frases a seguir incluem os significados fornecidos abaixo. As definições são fornecidas para auxiliar na descrição de modalidades particulares e não se destinam a limitar a invenção reivindicada, uma vez que o escopo da invenção é limitado apenas pelas reivindicações.
A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual a presente invenção pertence. Se houver uma discrepância evidente entre o uso de um termo na técnica e sua definição fornecida no presente documento, a definição fornecida no relatório descritivo deve prevalecer.
[0178] Por conveniência, determinados termos empregados no presente documento, no relatório descritivo, exemplos e reivindicações anexas são compilados aqui.
[0179] Conforme usado no presente documento, o termo "câncer" se refere, de modo geral, a uma classe de doenças ou condições nas quais células anormais se dividem sem controle e podem invadir tecidos próximos. As células cancerosas também podem se espalhar para outras partes do corpo por meio dos sistemas sanguíneo e linfático. Há vários tipos principais de câncer. O carcinoma é um câncer que começa na pele ou nos tecidos que revestem ou cobrem os órgãos internos. O sarcoma é um câncer que começa no osso, cartilagem, gordura, músculo, vasos sanguíneos ou outro tecido conjuntivo ou de suporte. A leucemia é um câncer que começa no tecido formador de sangue, tal como a medula óssea, e faz com que um grande número de células sanguíneas anormais seja produzido e entre no sangue. O linfoma e o mieloma múltiplo são cânceres que começam nas células do sistema imune. Os cânceres do sistema nervoso central são cânceres que começam nos tecidos do cérebro e da medula espinhal.
[0180] Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o câncer é um câncer primário. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, o câncer é um câncer maligno. Conforme usado no presente documento, o termo "maligno" se refere a um câncer em que um grupo de células tumorais exibe um ou mais de crescimento descontrolado (isto é, divisão além dos limites normais), invasão (isto é, intrusão e destruição de tecidos adjacentes) e metástase (isto é, disseminado para outros locais do corpo via a linfa ou sangue). Conforme usado no presente documento, o termo "metástase" se refere à disseminação do câncer de uma parte do corpo para outra. Um tumor formado por células que se espalharam é denominado de "tumor metastático" ou "metástase". O tumor metastático contém células similares àquelas do tumor original (primário). Conforme usado no presente documento, o termo "benigno" ou "não maligno" se refere a tumores que podem crescer maiores, mas não se espalham para outras partes do corpo. Os tumores benignos são autolimitados e normalmente não invadem ou metastatizam.
[0181] Uma "célula cancerosa" ou "célula tumoral" se refere a uma célula individual de um tecido ou crescimento canceroso. Um tumor se refere, em geral, a um inchaço ou lesão formada por um crescimento anormal de células, o qual pode ser benigno, pré-maligno ou maligno. A maioria das células cancerosas forma tumores, porém algumas, por exemplo, em leucemia, não necessariamente formam tumores.
Para as células cancerosas que formam tumores, os termos câncer (célula) e tumor (célula) são usados alternadamente.
[0182] Conforme usado no presente documento, o termo "neoplasia" se refere a qualquer crescimento novo e anormal de tecido, por exemplo, uma massa anormal de tecido, cujo crescimento excede e não está coordenado àquele dos tecidos normais. Assim, uma neoplasia pode ser uma neoplasia benigna, uma neoplasia pré-maligna ou uma neoplasia maligna.
[0183] Um indivíduo que tem um câncer ou um tumor é um indivíduo com células cancerosas objetivamente mensuráveis presentes no corpo do indivíduo. Incluídos nesta definição estão cânceres malignos ativamente proliferativos, bem como tumores potencialmente dormentes ou micrometástases. Os cânceres que migram de seu local original e proliferam para outros órgãos vitais podem levar à morte do paciente por meio da deterioração funcional dos órgãos afetados.
[0184] Exemplos de câncer incluem, porém sem limitações, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, leucemia, carcinoma basocelular, câncer do trato biliar; câncer de bexiga; câncer nos ossos; câncer do cérebro e do SNC; câncer de mama; câncer do peritônio; câncer cervical; coriocarcinoma; câncer de cólon e reto; câncer do tecido conjuntivo; câncer do sistema digestivo; câncer do endométrio; câncer de esôfago; câncer de olho; câncer de cabeça e pescoço; câncer gástrico (incluindo câncer gastrintestinal); glioblastoma (GBM); carcinoma hepático; hepatoma; neoplasia intraepitelial; câncer de rim ou renal; câncer de laringe; leucemia; câncer de fígado; câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão); linfoma, incluindo linfoma de Hodgkin e não-Hodgkin; melanoma; mieloma; neuroblastoma; câncer de cavidade oral (por exemplo, lábio, língua, boca e faringe); câncer de ovário; câncer de pâncreas; câncer de próstata; retinoblastoma; rabdomiossarcoma; câncer retal; câncer do sistema respiratório; carcinoma de glândula salivar; sarcoma; câncer de pele; câncer de células escamosas; câncer de estômago; câncer de testículo; câncer de tireoide; câncer uterino ou endometrial; câncer do sistema urinário; câncer vulvar; bem como outros carcinomas e sarcomas; bem como linfoma de células B (incluindo linfoma não-Hodgkin de baixo grau/folicular (NHL); NHL linfocítico pequeno (SL); NHL de grau intermediário/folicular; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de alto grau; NHL linfoblástico de alto grau; NHL de células pequenas não clivadas de alto grau; NHL de doença volumosa; linfoma de células do manto; linfoma relacionado à AIDS; e macroglobulinemia de Waldenstrom; leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crônica; e transtorno linfoproliferativo pós-transplante (PTLD), bem como proliferação vascular anormal associada a facomatoses, edema (tal como aquele associado a tumores cerebrais) e síndrome de Meigs.
[0185] Uma "célula de câncer" é uma célula cancerosa, pré-cancerosa ou transformada, seja in vivo, ex vivo ou em cultura tecidual, que tem alterações fenotípicas espontâneas ou induzidas que não necessariamente envolvem a absorção de novo material genético. Embora a transformação possa surgir da infecção com um vírus transformador e incorporação de novo ácido nucleico genômico ou absorção de ácido nucleico exógeno, ela também pode surgir espontaneamente ou após exposição a um carcinógeno, causando, assim, mutação em um gene endógeno. A transformação/câncer está associada(o), por exemplo, a alterações morfológicas, imortalização de células, controle de crescimento aberrante, formação de focos, independência de ancoragem, malignidade, perda de inibição de contato e limitação de densidade de crescimento, fator de crescimento ou independência de soro, marcadores específicos para tumor, invasividade ou metástases e crescimento tumoral em animais hospedeiros adequados, tais como camundongos nus.
[0186] Os termos "diminuir", "reduzido", "redução" ou "inibir" são todos usados no presente documento para significar uma diminuição em uma quantidade estatisticamente significativa. Em algumas modalidades, "reduzir", "redução" ou "diminuir" ou "inibir" normalmente significa uma diminuição de pelo menos 10 % comparado com um nível de referência (por exemplo, a ausência de um determinado tratamento ou agente) e pode incluir, por exemplo, uma diminuição de pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de
20 %, pelo menos cerca de 25 %, pelo menos cerca de 30 %, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40 %, pelo menos cerca de 45 %, pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 55 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 % ou mais. Conforme usado aqui, "redução" ou "inibição" não abrange uma inibição ou redução completa comparado com um nível de referência.
"Inibição completa" é uma inibição de 100 % comparado com um nível de referência. Uma diminuição pode ser, de preferência, até um nível aceito como dentro da faixa normal para um indivíduo sem um determinado transtorno.
[0187] Os termos "aumentado", "aumentar", "melhorar" ou "ativar" são todos usados no presente documento para significar um aumento em uma quantidade estaticamente significativa. Em algumas modalidades, os termos "aumentado", "aumentar", "melhorar" ou "ativar" podem significar um aumento de pelo menos 10 % comparado com um nível de referência, por exemplo, um aumento de pelo menos cerca de 20 %, ou pelo menos cerca de 30 %, ou pelo menos cerca de 40 %, ou pelo menos cerca de 50 %, ou pelo menos cerca de 60 %, ou pelo menos cerca de 70 %, ou pelo menos cerca de 80 %, ou pelo menos cerca de 90 % ou até e incluindo um aumento de 100 % ou qualquer aumento entre 10-100 % comparado com um nível de referência, ou um aumento de pelo menos cerca de 2 vezes, ou pelo menos cerca de 3 vezes, ou pelo menos cerca de 4 vezes, ou pelo menos cerca de 5 ou pelo menos cerca de 10 vezes, ou qualquer aumento entre 2 vezes e 10 vezes ou mais comparado com um nível de referência. No contexto de um marcador ou sintoma, um "aumento" é um aumento estatisticamente significativo deste nível.
[0188] Conforme usado no presente documento, um "indivíduo" significa um ser humano ou animal. Normalmente, o animal é um vertebrado, tal como um primata, roedor, animal doméstico ou animal de caça. Primatas incluem chimpanzés, macacos cinomólogos, macacos-aranha e micos, por exemplo, Rhesus. Roedores incluem camundongos, ratos, marmotas, furões, coelhos e hamsters. Animais domésticos e de caça incluem vacas, cavalos, porcos, veados, bisões, búfalos, espécies felinas, por exemplo, gato doméstico, espécies caninas, por exemplo, cachorro, raposa, lobo, espécies aviárias, por exemplo, galinha, ema, avestruz e peixes, por exemplo, truta, peixe-gato e salmão. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um primata, por exemplo, um ser humano. Os termos, "indivíduo", "paciente"
e "pessoa" são usados de forma alternada no presente documento.
[0189] De preferência, o indivíduo é um mamífero. O mamífero pode ser um ser humano, primata não humano, camundongo, rato, cachorro, gato, cavalo ou vaca, mas não está limitado a estes exemplos. Mamíferos diferentes de seres humanos podem ser vantajosamente usados como indivíduos que representam modelos animais de lesões pré-malignas bronquiais. Um indivíduo pode ser um homem ou mulher.
[0190] Um indivíduo pode ser aquele que foi previamente diagnosticado ou identificado como sofrendo ou tendo uma condição que precisa de tratamento (por exemplo, lesões pré-malignas bronquiais) ou uma ou mais complicações relacionadas a tal condição e, opcionalmente, já sofreram tratamento para lesões pré-malignas bronquiais ou uma ou mais complicações relacionadas a lesões pré-malignas bronquiais. Alternativamente, um indivíduo também pode ser aquele que não foi previamente diagnosticado como tendo lesões pré-malignas bronquiais ou uma ou mais complicações relacionadas a lesões pré-malignas bronquiais. Por exemplo, um indivíduo pode ser aquele que exibe um ou mais fatores de risco para lesões pré-malignas bronquiais ou uma ou mais complicações relacionadas a lesões pré-malignas bronquiais ou um indivíduo que não exibe fatores de risco.
[0191] Um "indivíduo em necessidade" de tratamento para uma condição particular pode ser um indivíduo que tem tal condição, diagnosticado como tendo tal condição ou em risco de desenvolver tal condição.
[0192] Conforme usado no presente documento, os termos "proteína" e "polipeptídeo" são usados indistintamente no presente documento para designar uma série de resíduos de aminoácidos, conectados entre si através de ligações peptídicas entre os grupos alfa-amino e carbóxi de resíduos adjacentes. Os termos "proteína" e "polipeptídeo" se referem a um polímero de aminoácidos, incluindo aminoácidos modificados (por exemplo, fosforilados, glicosilados, aglicosilados, etc.) e análogos de aminoácidos, independentemente de seu tamanho ou função. "Proteína" e "polipeptídeo" são frequentemente usados em referência a polipeptídeos relativamente grandes, enquanto o termo "peptídeo" é frequentemente usado em referência a pequenos polipeptídeos, porém, o uso destes termos na técnica se sobrepõe. Os termos "proteína" e "polipeptídeo" são usados indistintamente no presente documento quando de referência a um produto gênico e fragmentos do mesmo. Assim, polipeptídeos ou proteínas exemplificativos incluem produtos gênicos, proteínas de ocorrência natural, homólogos,
ortólogos, parálogos, fragmentos e outros equivalentes, variantes, fragmentos e análogos dos anteriores.
[0193] Nas várias modalidades descritas no presente documento, considera-se ainda que estão incluídos variantes (de ocorrência natural ou de outra forma), alelos, homólogos, variantes modificadas de forma conservativa e/ou variantes de substituição conservativa de qualquer um dos polipeptídeos específicos descritos. Quanto às sequências de aminoácidos, aqueles versados na técnica reconhecerão que as substituições, eliminações ou adições individuais a uma sequência de ácidos nucleicos, peptídeo, polipeptídeo ou proteína que troca um único aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidos na sequência codificada é uma "variante modificada de forma conservativa", em que a alteração resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente similar e retém a atividade desejada do polipeptídeo. Estas variantes modificadas de forma conservativa são adicionais a e não excluem variantes polimórficas, homólogos interespécies e alelos consistentes com a invenção.
[0194] Um determinado aminoácido pode ser substituído por um resíduo com características físico-químicas similares, por exemplo, ao substituir um resíduo alifático por outro (tal como Ile, Val, Leu ou Ala um pelo outro) ou a substituição de um resíduo polar por outro (tal como entre Lys e Arg; Glu e Asp; ou Gln e Asn). Outras substituições conservativas, por exemplo, substituições de regiões inteiras com características de hidrofobicidade similares, são bem conhecidas. Os polipeptídeos que compreendem substituições conservativas de aminoácidos podem ser testados em qualquer um dos ensaios descritos no presente documento para confirmar que uma atividade desejada, por exemplo, a atividade e a especificidade de um polipeptídeo nativo ou de referência, são retidas.
[0195] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, em Biochemistry, segunda ed., páginas 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) não polar: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I ), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) polar sem carga: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) ácido: Asp (D), Glu (E); (4) básico: Lys (K), Arg (R), His (H).
Alternativamente, os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base nas propriedades em comum da cadeia lateral: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe. As substituições não conservativas implicarão na troca de um membro de uma destas classes por outra classe. Substituições conservativas particulares incluem, por exemplo; Ala por Gly ou por Ser; Arg por Lys; Asn por Gln ou por His; Asp por Glu; Cys por Ser; Gln por Asn; Glu por Asp; Gly por Ala ou Pro; His por Asn ou por Gln; Ile por Leu ou por Val; Leu por Ile ou por Val; Lys por Arg, por Gln ou por Glu; Met por Leu, por Tyr ou por Ile; Phe por Met, por Leu ou por Tyr; Ser por Thr; Thr por Ser; Trp por Tyr; Tyr por Trp; e/ou Phe por Val, por Ile ou por Leu.
[0196] Em algumas modalidades, o polipeptídeo descrito no presente documento (ou um ácido nucleico que codifica tal polipeptídeo) pode ser um fragmento funcional de uma das sequências de aminoácidos descritas no presente documento.
Conforme usado no presente documento, um "fragmento funcional" é um fragmento ou segmento de um peptídeo que retém pelo menos 50 % da atividade do polipeptídeo de referência de tipo selvagem de acordo com os ensaios descritos abaixo no presente documento. Um fragmento funcional pode compreender substituições conservativas das sequências descritas no presente documento.
[0197] Em algumas modalidades, o polipeptídeo descrito no presente documento pode ser uma variante de uma sequência descrita no presente documento. Em algumas modalidades, a variante é uma variante modificada de forma conservativa.
Variantes de substituição conservativa podem ser obtidas através de mutações de sequências de nucleotídeos nativas, por exemplo. Uma "variante", conforme citado no presente documento, é um polipeptídeo substancialmente homólogo a um polipeptídeo nativo ou de referência, mas que tem uma sequência de aminoácidos diferente daquela do polipeptídeo nativo ou de referência em virtude de uma ou uma pluralidade de eliminações, inserções ou substituições. Sequências de DNA que codificam polipeptídeos variantes abrangem sequências que compreendem uma ou mais adições, eliminações ou substituições de nucleotídeos quando comparado com uma sequência de DNA nativa ou de referência, mas que codificam uma proteína variante ou fragmento da mesma que retém a atividade. Uma ampla variedade de abordagens de PCR por mutagênese específica para local é conhecida na técnica e pode ser aplicada por aqueles versados na técnica.
[0198] Uma sequência de aminoácidos ou DNA variante pode ser pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou mais idêntica a uma sequência nativa ou de referência. O grau de homologia (porcentagem de identidade) entre uma sequência nativa e mutante pode ser determinado, por exemplo, ao comparar as duas sequências usando programas de computador gratuitamente disponíveis comumente empregados para esta finalidade na rede mundial (por exemplo, BLASTp ou BLASTn com configurações padrão).
[0199] As alterações da sequência nativa de aminoácidos podem ser realizadas através de qualquer uma de uma série de técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica. As mutações podem ser introduzidas, por exemplo, em loci particulares ao sintetizar oligonucleotídeos que contêm uma sequência mutante, flanqueada por sítios de restrição que permitem a ligação a fragmentos da sequência nativa.
Após a ligação, a sequência reconstruída resultante codifica um análogo que tem a inserção, substituição ou eliminação de aminoácidos desejada. Alternativamente, procedimentos de mutagênese específica para local por oligonucleotídeo podem ser empregados para fornecer uma sequência de nucleotídeos alterada com códons específicos alterados de acordo com a substituição, eliminação ou inserção necessária. Técnicas para fazer tais alterações estão muito bem estabelecidas e incluem, por exemplo, aquelas descritas por Walder et al.
(Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, janeiro de 1985, 12-19); Smith et al.
(Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press,
1981); e Patentes Norte-Americanas Nos 4,518,584 e 4,737,462, que são incorporados ao presente documento a título de referência na íntegra. Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do polipeptídeo também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar a ligação cruzada aberrante. Por outro lado, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao polipeptídeo para melhorar sua estabilidade ou facilitar a oligomerização.
[0200] Conforme usado aqui, o termo "ácido nucleico" ou "sequência de ácidos nucleicos" se refere a qualquer molécula, de preferência uma molécula polimérica, que incorpora unidades de ácidos ribonucleicos, ácidos desoxirribonucleicos ou um análogo dos mesmos. O ácido nucleico pode ser fita simples ou dupla. Um ácido nucleico fita simples pode ser uma fita de ácido nucleico de um DNA fita dupla desnaturado. Alternativamente, ele pode ser um ácido nucleico fita simples não derivado de nenhum DNA fita dupla. Em um aspecto, o ácido nucleico pode ser DNA. Em outro aspecto, o ácido nucleico pode ser RNA. O DNA adequado pode incluir, por exemplo, DNA genômico ou cDNA. O RNA adequado pode incluir, por exemplo, mRNA.
[0201] O termo "expressão" se refere aos processos celulares envolvidos na produção de RNA e proteínas e, conforme apropriado, proteínas secretoras, incluindo, quando aplicável, porém sem limitações, por exemplo, transcrição, processamento de transcrição, tradução e dobramento de proteína, modificação e processamento. Expressão pode se referir à transcrição e acumulação estável de derivados de um fragmento ou fragmentos de ácido nucleico sense (mRNA) ou RNA antissense da invenção e/ou à tradução de mRNA em um polipeptídeo.
[0202] Em algumas modalidades, a expressão de (um) biomarcador(es), alvo(s) ou gene(s)/polipeptídeo(s) descrito(s) no presente documento é específica para o tecido.
Em algumas modalidades, a expressão de (um) biomarcador(es), alvo(s) ou gene(s)/polipeptídeo(s) descrito(s) no presente documento é global. Em algumas modalidades, a expressão de (um) biomarcador(es), alvo(s) ou gene(s)/polipeptídeo(s) descrito(s) no presente documento é sistêmica.
[0203] "Produtos de expressão" incluem RNA transcrito a partir de um gene e polipeptídeos obtidos por meio de tradução de mRNA transcrito a partir de um gene. O termo "gene" significa a sequência de ácidos nucleicos que é transcrita (DNA) em RNA in vitro ou in vivo quando operativamente ligada a sequências reguladoras apropriadas.
O gene pode ou não incluir regiões anteriores e posteriores à região codificadora, por exemplo, sequências 5' não traduzidas (5’UTR) ou sequências "líderes" e sequências 3' UTR ou "trailer", bem como sequências intervenientes (íntrons) entre segmentos codificadores individuais (éxons).
[0204] "Marcador", no contexto da presente invenção, se refere a um produto de expressão, por exemplo, ácido nucleico ou polipeptídeo, que está diferencialmente presente em uma amostra retirada de indivíduos com lesões pré-malignas bronquiais de um subtipo particular comparado com uma amostra comparável retirada de indivíduos de controle (por exemplo, um indivíduo saudável). O termo "biomarcador" é usado alternadamente com o termo "marcador".
[0205] Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento se referem à medição, detecção ou determinação do nível de pelo menos um marcador. Conforme usado no presente documento, o termo "detecção" ou "medição" se refere a observar um sinal, por exemplo, proveniente de uma sonda, marcador ou molécula alvo para indicar a presença de um analito em uma amostra. Qualquer método conhecido na técnica para detectar uma porção de marcador particular pode ser usado para detecção. Métodos de detecção exemplificativos incluem, porém sem limitações, métodos espectroscópicos, fluorescentes, fotoquímicos, bioquímicos,
imunoquímicos, elétricos, ópticos ou químicos. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, a medição pode ser uma observação quantitativa.
[0206] Conforme usado no presente documento, os termos "tratar", "tratamento", "tratado" ou "melhoria" se referem a tratamentos terapêuticos, em que o objetivo é reverter, aliviar, melhorar, inibir, desacelerar ou interromper a progressão ou gravidade de uma condição associada a uma doença ou transtorno, por exemplo, lesões pré-malignas bronquiais. O termo "tratar" inclui reduzir ou aliviar pelo menos um efeito adverso ou sintoma de uma condição, doença ou transtorno associado a uma lesão pré-maligna bronquial.
O tratamento é geralmente "eficaz" se um ou mais sintomas ou marcadores clínicos forem reduzidos. Alternativamente, o tratamento é "eficaz" se a progressão de uma doença for reduzida ou interrompida. Ou seja, "tratamento" inclui não apenas melhora dos sintomas ou marcadores, mas também a cessação, ou pelo menos desaceleração, da progressão ou piora de sintomas comparado com o que seria de esperar na ausência do tratamento. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, porém sem limitações, alívio de um ou mais sintomas, diminuição da extensão da doença, estado patológico estabilizado (ou seja, sem agravamento), retardo ou desaceleração da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado patológico, remissão (parcial ou total) e/ou diminuição da mortalidade, detectável ou indetectável. O termo "tratamento" de uma doença também inclui o alívio dos sintomas ou efeitos colaterais da doença (incluindo tratamento paliativo).
[0207] Conforme usado no presente documento, o termo "composição farmacêutica" se refere ao agente ativo em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um carreador comumente usado na indústria farmacêutica. A frase "farmaceuticamente aceitável" é empregada no presente documento para se referir aos compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do julgamento médico sensato, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade, irritação, resposta alérgica excessiva ou outro problema ou complicação comensurável com uma proporção risco/benefício razoável. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um carreador farmaceuticamente aceitável pode ser um carreador diferente de água. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um carreador farmaceuticamente aceitável pode ser um creme, emulsão, gel, lipossoma, nanopartícula e/ou pomada. Em algumas modalidades de qualquer um dos aspectos, um carreador farmaceuticamente aceitável pode ser um carreador artificial ou projetado, por exemplo, um carreador cujo ingrediente ativo não ocorreria na natureza.
[0208] Conforme usado no presente documento, o termo "administração" se refere à colocação de um composto, conforme descrito no presente documento, em um indivíduo através de um método ou via que resulta pelo menos na distribuição parcial do agente a um local desejado. As composições farmacêuticas que compreendem os compostos descritos no presente documento podem ser administradas através de qualquer via apropriada que resulte em um tratamento eficaz no indivíduo. Em algumas modalidades, a administração compreende uma atividade física humana, por exemplo, uma injeção, um ato de ingestão, um ato de aplicação e/ou manipulação de um dispositivo ou máquina de distribuição. Tal atividade pode ser realizada, por exemplo, por um profissional médico e/ou o indivíduo a ser tratado.
[0209] Conforme usado no presente documento, "contato" se refere a qualquer meio adequado para distribuir ou expor um agente a pelo menos uma célula. Métodos de distribuição exemplificativos incluem, porém sem limitações, distribuição direta ao meio de cultura celular, perfusão, injeção ou outro método de distribuição bem conhecido por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, o contato compreende uma atividade física humana, por exemplo, uma injeção; um ato de distribuição, mistura e/ou decantação; e/ou manipulação de um dispositivo ou máquina de distribuição.
[0210] Conforme usado no presente documento, o termo "inibidor" se refere a um agente que pode diminuir a expressão e/ou atividade da molécula ou atividade ou processo alvo, por exemplo, em pelo menos 10 % ou mais, por exemplo, em 10 % ou mais, 50 % ou mais, 70 % ou mais, 80 % ou mais, 90 % ou mais, 95 % ou mais ou 98 % ou mais.
[0211] Conforme usado no presente documento, os termos "fármaco", "composto" ou "agente" são usados indistintamente e se referem a moléculas e/ou composições. Os compostos/agentes incluem, porém sem limitações, compostos químicos e misturas de compostos químicos, por exemplo, pequenas moléculas orgânicas ou inorgânicas; sacarinas; oligossacarídeos; polissacarídeos; macromoléculas biológicas, por exemplo, peptídeos, proteínas e análogos e derivados de peptídeos; peptideomiméticos; ácidos nucleicos; análogos e derivados de ácido nucleico; extratos feitos de materiais biológicos, tais como bactérias, plantas, fungos ou células ou tecidos animais; composições de ocorrência natural ou sintéticas; peptídeos; aptâmeros; e anticorpos e intracorpos, ou fragmentos dos mesmos. Em algumas modalidades, "fármaco", conforme usado no presente documento, se refere a um agente aprovado para uso médico, por exemplo, pela FDA.
[0212] O termo "estatisticamente significativo" ou "significativamente" se refere à significância estatística e geralmente significa um desvio padrão de dois (2SD) ou uma diferença maior.
[0213] Exceto quanto aos exemplos operacionais, ou onde de outra forma indicado, todos os números que expressam quantidades de ingredientes ou condições de reação usados no presente documento devem ser entendidos como modificados, em todos os casos, pelo termo "cerca de". O termo "cerca de", quando usado em relação a porcentagens, pode significar ± 1 %.
[0214] Conforme usado no presente documento, o termo "compreende" significa que outros elementos também podem estar presentes além dos elementos definidos apresentados.
O uso de "compreende" indica inclusão, em vez de limitação.
[0215] O termo "que consiste(m) em" se refere a composições, métodos e respectivos componentes, conforme descrito no presente documento, que são exclusivos de qualquer elemento não citado nesta descrição da modalidade.
[0216] Conforme usado no presente documento, o termo "que consiste(m) essencialmente em" se refere aos elementos necessários para uma determinada modalidade. O termo permite a presença de elementos adicionais que não afetam materialmente as características básicas e novas ou funcionais desta modalidade da invenção.
[0217] Os termos no singular "um", "uma" e "o/a" incluem as referências no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra "ou" se destina a incluir "e", a menos que o contexto indique claramente o contrário. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser usados na prática ou testagem da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. A abreviatura, "e.g." é derivada do latim exempli gratia e é usada no presente documento para indicar um exemplo não limitativo. Assim, a abreviatura "e.g." é sinônimo do termo "por exemplo".
[0218] Os agrupamentos de elementos alternativos ou modalidades da invenção descritas no presente documento não devem ser interpretados como limitações. Cada membro do grupo pode ser citado e reivindicado individualmente ou em qualquer combinação com outros membros do grupo ou outros elementos encontrados no presente documento. Um ou mais membros de um grupo podem ser incluídos ou excluídos de um grupo por razões de conveniência e/ou patenteabilidade. Quando ocorre qualquer inclusão ou exclusão, o relatório descritivo é considerado no presente documento como contendo o grupo modificado, satisfazendo, assim, a descrição por escrito de todos os grupos de Markush usados nas reivindicações anexas.
[0219] A menos que definido de outra forma no presente documento, os termos científicos e técnicos usados em relação ao presente pedido devem ter os significados que são comumente compreendidos por aqueles versados na técnica à qual a presente invenção pertence. Deve ser entendido que a presente invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes particulares etc., descritos no presente documento e, como tal, podem variar. A terminologia usada no presente documento tem a finalidade de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, o qual é definido apenas pelas reivindicações. As definições de termos comuns em imunologia e biologia molecular podem ser encontradas em The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 20ª Edição, publicado por Merck Sharp & Dohme Corp., 2018 (ISBN 0911910190, 978- 0911910421); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, publicado por Blackwell Science Ltda., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology de Werner Luttmann, publicado pela Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), W. W. Norton & Company, 2016 (ISBN 0815345054, 978- 0815345053); Genes XI de Lewin, publicado por Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green e Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EUA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, EUA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; e Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737), os conteúdos dos quais são todos incorporados a título de referência ao presente documento na íntegra.
[0220] Outros termos são definidos no presente documento dentro da descrição dos vários aspectos da invenção.
[0221] Todas as patentes e outras publicações; incluindo referências da literatura, patentes concedidas, pedidos de patentes publicados e pedidos de patentes copendentes, citados ao longo do presente pedido são expressamente incorporados ao presente documento a título de referência com a finalidade de descrever e divulgar, por exemplo, as metodologias descritas em tais publicações que podem ser usadas em associação com a tecnologia descrita no presente documento. Estas publicações são fornecidas apenas por sua descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada a este respeito deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm direito de antecipar tal divulgação em virtude de invenção anterior ou por qualquer outro motivo. Todas as declarações quanto à data ou representação quanto ao conteúdo destes documentos são com base nas informações disponíveis para os requerentes e não constituem qualquer admissão quanto à exatidão das datas ou do conteúdo destes documentos.
[0222] A descrição das modalidades da invenção não se destina a ser exaustiva ou a limitar a invenção à forma precisa descrita. Embora modalidades e exemplos específicos da invenção sejam descritos no presente documento para fins ilustrativos, várias modificações equivalentes são possíveis dentro do escopo da invenção, conforme aqueles versados na técnica relevante reconhecerão. Por exemplo, embora as etapas ou funções do método sejam apresentadas em uma determinada ordem, modalidades alternativas podem executar funções em uma ordem diferente ou as funções podem ser executadas de modo substancialmente simultâneo. Os ensinamentos da invenção fornecidos no presente documento podem ser aplicados a outros procedimentos ou métodos conforme apropriado. As várias modalidades descritas no presente documento podem ser combinadas para fornecer outras modalidades. Aspectos da invenção podem ser modificados, se necessário, para empregar as composições, funções e conceitos das referências e pedidos acima para fornecer ainda outras modalidades da invenção. Estas e outras alterações podem ser feitas na invenção à luz da descrição detalhada.
Todas estas modificações devem ser incluídas no escopo das reivindicações anexas.
[0223] Elementos específicos de qualquer uma das modalidades anteriores podem ser combinados ou substituídos por elementos em outras modalidades. Além disso, embora as vantagens associadas a determinadas modalidades da invenção tenham sido descritas no contexto destas modalidades, outras modalidades também podem exibir tais vantagens, e nem todas as modalidades precisam necessariamente apresentar tais vantagens para estar no escopo da invenção.
[0224] A tecnologia descrita no presente documento é ainda ilustrada pelos exemplos a seguir, os quais de forma alguma devem ser interpretados como sendo limitativos.
[0225] Algumas modalidades da tecnologia descrita no presente documento podem ser definidas de acordo com qualquer um dos seguintes parágrafos numerados:
1. Método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais caracterizado por compreender: administrar pelo menos um de: um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; pelo menos a cada 6 meses, um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou pelo menos um fármaco antiproliferativo; a um indivíduo determinado como tendo pelo menos um dentre: um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 5 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa; e um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa.
2. Método de acordo com o item 1, em que o pelo menos um gene do módulo 5 é selecionado a partir do grupo que consiste em: RACGAP1 e TPX2; e pelo menos um do gene do módulo 6 é selecionado a partir do grupo que consiste em: NEK11 e IFT88.
3. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-2, em que o indivíduo é ainda determinado como tendo um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 7 ou gene do módulo 4.
4. Método de acordo com o item 3, em que pelo menos um do gene do módulo 7 ou módulo 4 é selecionado a partir do grupo que consiste em: COX6A1; COX7A2; RPL26; e RPL23.
5. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-4, em que o nível de expressão de cada um dos genes da Tabela 15 é determinado.
6. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-5, em que o pelo menos um fármaco antiproliferativo é selecionado a partir do grupo que consiste em: Antagonistas do receptor de acetilcolina; Inibidores de acetilcolinesterase; Antagonistas do receptor de adenosina; Antagonistas do receptor adrenérgico; Inibidores de AKT;
Antagonistas do receptor de angiotensina; Estimulantes de apoptose; Inibidores de quinase Aurora; Inibidores de CDK;
Inibidores de ciclo-oxigenase; Inibidores da produção de citocinas; Inibidores de desidrogenase; Inibidores de proteína quinase de DNA; Inibidores de adesão focal;
Antagonistas do receptor de dopamina; Inibidores de EGFR;
Inibidores de fosforilação ERK1 e ERK2; Agonistas do receptor de estrogênio; Inibidores de EZH2; Inibidores de FLT3;
Agonistas do receptor de glicocorticoide; Antagonistas do receptor de glutamato; Inibidores de HDAC; Antagonistas do receptor de histamina; Inibidores de histona lisina metiltransferase; Inibidores de HSP; Inibidores de IKK;
Antagonistas do canal iônico; Inibidores de JAK; Inibidores
JNK; Inibidores de KIT; Inibidores de quinase com repetição rica em leucina; Inibidores de MDM; Inibidores da liberação de mediador; Inibidores de MEK; Inibidores de MTOR;
Inibidores de monoamina oxidase; Inibidores da via de NFB;
Inibidores de nucleofosmina; Inibidores de PARP; Agonistas do receptor PPAR; Inibidores de PI3K; Inibidores de tirosina quinase; Inibidores de fosfodiesterase; Inibidores de proteína quinase; Inibidores de RAF; Inibidores de RNA polimerase; Inibidores de topoisomerase; Inibidores da síntese de RNA; Inibidores de SIRT; Bloqueadores do canal de sódio; Inibidores de VEGFR; e Agonistas do receptor de vitamina D.
7. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-6, em que o fármaco antiproliferativo é administrado como uma formulação inalada ou formulação tópica.
8. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-7, em que o fármaco antiproliferativo é administrado durante um procedimento com base em broncoscopia.
9. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-8, em que o fármaco antiproliferativo é administrado sistemicamente.
10. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-9, em que o fármaco antiproliferativo é administrado durante um procedimento com base em broncoscopia e sistemicamente.
11. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-10, em que o indivíduo é ainda determinado como tendo um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 9 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa e/ou um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 10 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa.
12. Método de acordo com o item 11, em que o indivíduo determinado como tendo um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 9 e/ou um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 10 recebe pelo menos um de: tanto um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central em que as lesões são submetidas à biópsia para remover o tecido anormal quanto uma tomografia computadorizada do tórax; pelo menos a cada 6 meses, um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central em que as lesões são submetidas à biópsia para remover o tecido anormal e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou pelo menos um fármaco imunoestimulante.
13. Método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais caracterizado por compreender: administrar pelo menos um de: tanto um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central em que as lesões são submetidas à biópsia para remover o tecido anormal quanto uma tomografia computadorizada do tórax; pelo menos a cada 6 meses, um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central em que as lesões são submetidas à biópsia para remover o tecido anormal e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou pelo menos um fármaco imunoestimulante;
a um indivíduo determinado como tendo um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 9 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa e/ou um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 10 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa.
14. Método de acordo com qualquer um dos itens 11-13, em que o gene do módulo 9 é selecionado a partir do grupo que consiste em: EPSTI1; UBE2L6; B2M e TAP1.
15. Método de acordo com qualquer um dos itens 11-14, em que pelo menos um gene do módulo 9 é selecionado a partir da Tabela 16.
16. Método de acordo com qualquer um dos itens 11-15, em que o gene do módulo 10 é selecionado a partir do grupo que consiste em: CACNB3 e MAPK10.
17. Método de acordo com qualquer um dos itens 11-16, em que o pelo menos um fármaco imunoestimulante é selecionado a partir do grupo que consiste em: Inibidores do ponto de verificação imune (por exemplo, inibidores contra PD-1, PD-L1, CTLA4 e LAG3); Fármacos que estimulam a sinalização ao interferon (por exemplo, fármacos antivirais que melhoram a sinalização ao interferon);
Inibidores da síntese de DNA; Inibidores de IMDH; Inibidores de CDK; Inibidores de ribonucleotídeo redutase; Inibidores de di-hidrofolato redutase; Inibidores de topoisomerase; Inibidores de FLT3; Inibidores de IGF-1; Inibidores de MEK; Inibidores de quinase Aurora; Inibidores de PKC; Inibidores de RAF; Inibidores de PDFGR/KIT; Inibidores de VEGFR; Inibidores de SRC; Agonistas do receptor de retinoide; Inibidores de HDAC; Inibidores de DNA metiltransferase; e Inibidores de EZH2.
18. Método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais caracterizado por compreender: administrar pelo menos um de: um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; pelo menos a cada 6 meses, um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou pelo menos um antiiinflamatório; a um indivíduo determinado como tendo pelo menos um dentre: um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 2 comparado com um nível de referência não inflamatório; e um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência não inflamatório.
19. Método de acordo com o item 17, em que o pelo menos um gene do módulo 2 é selecionado a partir do grupo que consiste em: MSANTD2, CCNL2 e LUC7L; e pelo menos um do gene do módulo 6 é selecionado a partir do grupo que consiste em: NEK11 e IFT88.
20. Método de acordo com qualquer um dos itens 17-18, em que o indivíduo é ainda determinado como tendo um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 7, gene do módulo 1 ou gene do módulo 8 e/ou nível de expressão reduzido de em pelo menos um gene do módulo 4 ou um gene do módulo 5.
21. Método de acordo com o item 19, em que pelo menos um do gene do módulo 7 é selecionado a partir do grupo que consiste em: RPL26 e RPL23.
22. Método de acordo com o item 19, em que pelo menos um do gene do módulo 1 é selecionado a partir do grupo que consiste em: KIRREL; PHLDB1; e MARVELD1.
23. Método de acordo com o item 19, em que pelo menos um gene do módulo 8 é selecionado a partir do grupo que consiste em: DOC2; CD53; e LAPTM.
24. Método de acordo com o item 19, em que pelo menos um do gene do módulo 4 é selecionado a partir do grupo que consiste em: COX6A1 e COX7A2
25. Método de acordo com o item 19, em que pelo menos um do gene do módulo 5 é selecionado a partir do grupo que consiste em: RACGAP1 e TPX2
26. Método de acordo com qualquer um dos itens 17-24, em que o nível de expressão de cada um dos genes da Tabela 15 é determinado.
27. Método de acordo com qualquer um dos itens 17-25, em que pelo menos um do fármaco anti-inflamatório é selecionado a partir do grupo que consiste em: Antagonistas do receptor de acetilcolina; Inibidores de acetilcolinesterase; Antagonistas do receptor de adenosina; Antagonistas do receptor adrenérgico; Inibidores de AKT; Antagonistas do receptor de angiotensina; Estimulantes de apoptose; Inibidores de quinase Aurora; Inibidores de CDK; Inibidores de ciclo-oxigenase; Inibidores da produção de citocinas; Inibidores de desidrogenase; Inibidores de proteína quinase de DNA; Inibidores de adesão focal; Antagonistas do receptor de dopamina; Inibidores de EGFR;
Inibidores de fosforilação ERK1 e ERK2; Agonistas do receptor de estrogênio; Inibidores de EZH2; Inibidores de FLT3; Agonistas do receptor de glicocorticoide; Antagonistas do receptor de glutamato; Inibidores de HDAC; Antagonistas do receptor de histamina; Inibidores de histona lisina metiltransferase; Inibidores de HSP; Inibidores de IKK; Antagonistas do canal iônico; Inibidores de JAK; Inibidores JNK; Inibidores de KIT; Inibidores de quinase com repetição rica em leucina; Inibidores de MDM; Inibidores da liberação de mediador; Inibidores de MEK; Inibidores de MTOR; Inibidores de monoamina oxidase; Inibidores da via de NFB; Inibidores de nucleofosmina; Inibidores de PARP; Agonistas do receptor PPAR; Inibidores de PI3K; Inibidores de tirosina quinase; Inibidores de fosfodiesterase; Inibidores de proteína quinase; Inibidores de RAF; Inibidores de RNA polimerase; Inibidores de topoisomerase; Inibidores da síntese de RNA; Inibidores de SIRT; Bloqueadores do canal de sódio; Inibidores de VEGFR; e Agonistas do receptor de vitamina D.
28. Método de acordo com qualquer um dos itens 17-26, em que o fármaco anti-inflamatório é administrado durante um procedimento com base em broncoscopia.
29. Método de acordo com qualquer um dos itens 17-27, em que o fármaco anti-inflamatório é administrado sistemicamente.
30. Método de acordo com qualquer um dos itens 17-28, em que o fármaco anti-inflamatório é administrado durante um procedimento com base em broncoscopia e sistemicamente.
31. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-29, em que pelo menos um do gene é selecionado a partir da Tabela
14.
32. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-30, em que o nível de expressão de cada um dos genes da Tabela 14 é determinado.
33. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-31, em que o desenvolvimento de câncer de pulmão, carcinoma de células escamosas do pulmão é prevenido, retardado ou diminuído.
34. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-32, em que o câncer de pulmão é carcinoma de células escamosas do pulmão.
35. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-33, em que o nível de expressão é o nível de expressão em uma biópsia endobronquial, amostra de esfregaço endobrônquico, biópsia de vias aéreas superiores, amostra de esfregaço de vias aéreas superiores, células epiteliais nasais, expectoração ou sangue obtido do indivíduo.
36. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-34, em que o nível de expressão é o nível de expressão em um esfregaço brônquico obtido do brônquio principal direito ou esquerdo.
37. Método de acordo com qualquer um dos itens 34-35, em que a biópsia ou amostra de esfregaço compreende tecidos ou células morfologicamente normais.
38. Método de acordo com qualquer um dos itens 34-35, em que a biópsia ou amostra de esfregaço consiste em tecidos ou células morfologicamente normais.
39. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-34, em que o nível de expressão é o nível de expressão em uma amostra que compreende células de lesão pré-maligna bronquial.
40. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-35, em que o nível de expressão é o nível de expressão em uma amostra que compreende células morfologicamente normais.
41. Método de acordo com qualquer um dos itens 1-36, em que o indivíduo é um fumante ou ex-fumante.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Subtipagem molecular revela alterações imunes associadas à progressão de lesões pré-malignas bronquiais
[0226] É descrito aqui a caracterização molecular de lesões pré-malignas bronquiais e as alterações epiteliais e imunes identificadas no campo de lesão das vias aéreas associadas à displasia bronquial progressiva/persistente que podem ser aproveitadas para desenvolver biomarcadores de risco e estratégias de interceptação em câncer de pulmão.
[0227] Lesões pré-malignas bronquiais (PMLs) são precursores do carcinoma de células escamosas do pulmão, mas têm resultados variáveis e faltam ferramentas para identificar e tratar PMLs com maior risco de progressão para câncer invasivo. O perfil de biópsias endobronquiais de PMLs obtidas de fumantes de alto risco por RNA-Seq identificou quatro subtipos de PML com diferenças nos processos epiteliais e imunes. Um subtipo molecular (Proliferativo) é enriquecido com lesões displásicas e exibe regulação positiva das vias metabólicas e do ciclo celular e regulação negativa dos processos ciliares. Perfis de RNA-Seq de esfregaços das vias aéreas superiores não envolvidas de aparência normal podem identificar indivíduos com lesões proliferativas com alta especificidade. A expressão de vias de sinalização ao interferon e vias de processamento/
apresentação de antígeno é diminuída em lesões progressivas/persistentes proliferativas e imunofluorescência indica uma depleção de células imunes inatas e adaptativas nestas lesões. Biomarcadores moleculares medidos em PMLs ou nas vias aéreas não envolvidas podem aumentar a graduação histopatológica e indicam que as estratégias de imunoprevenção podem ser eficazes na interceptação da progressão de PMLs para câncer de pulmão.
Introdução
[0228] O câncer de pulmão (LC) é a principal causa de morte por câncer, levando cerca de 160.000 vidas nos EUA a cada ano, mais do que os cânceres colorretal, pancreático, de mama e de próstata combinados. A fim de diminuir a mortalidade, estratégias inovadoras são necessárias para interceptar o desenvolvimento do câncer, diagnosticando a doença em seu estágio inicial e potencialmente mais curável.
Avanços recentes com bases nos resultados do National Lung Screening Trial (1) estão alterando drasticamente o panorama da detecção precoce de LC, uma vez que o rastreamento por tomografia computadorizada (TC) de indivíduos de alto risco reduz significativamente a mortalidade. Apesar deste progresso, biomarcadores são necessários para selecionar indivíduos para triagem de LC, uma vez que os critérios de elegibilidade representam menos de 27 % dos indivíduos com diagnóstico de LC nos EUA (2) e para distinguir entre nódulos pulmonares indeterminados benignos ou cancerosos, uma vez que o rastreamento tem uma taxa muito alta de falsos positivos (> 90 %). Também há necessidade urgente e não atendida de desenvolver terapias personalizadas no início do processo da doença para "interceptar" o LC antes de seu desenvolvimento nesta população de alto risco.
[0229] O desenvolvimento de biomarcadores de risco de LC e estratégias de interceptação de LC requer uma compreensão detalhada das primeiras alterações moleculares envolvidas na carcinogênese pulmonar que ocorrem no epitélio respiratório (3, 4). A exposição à fumaça do cigarro cria um campo de lesão em todo o trato respiratório, induzindo a uma variedade de alterações genômicas que podem levar a uma via aérea "em risco", onde lesões pré-malignas (PMLs) e LC se desenvolvem. O carcinoma de células escamosas do pulmão (LUSC) surge na camada epitelial das vias aéreas bronquiais e é frequentemente precedido pelo desenvolvimento de PMLs através de uma progressão histológica gradual de epitélio normal para hiperplasia, metaplasia escamosa, displasia (leve, moderada e grave), carcinoma in situ (CIS), e finalmente para LUSC invasivo e depois metastático (5). Na verdade, a presença de displasia persistente ou progressiva de alto grau (moderada ou grave) é um marcador de risco aumentado para CL tanto no local da lesão (onde são os presumíveis precursores do câncer de pulmão de células escamosas) e em outras partes do pulmão, embora muitas lesões displásicas tenham resultados variados (6). Atualmente, no entanto, ferramentas eficazes para identificar PMLs não apresentam maior risco de progressão para carcinoma invasivo (7). O desenvolvimento de marcadores de progressão da doença identificaria pacientes de alto risco, sugeriria novos agentes de quimioprevenção do câncer de pulmão e forneceria biomarcadores moleculares para monitorar o resultado em estudos de prevenção do câncer de pulmão.
[0230] É teorizado, no presente documento, que a caracterização molecular de biópsias bronquiais que contêm uma mistura de células epiteliais e imunes nos permitiria identificar alterações transcriptômicas associadas à histologia de alto grau e progressão de lesão pré-maligna.
Neste estudo, sequenciamento de mRNA foi usado para traçar o perfil de biópsias endobronquiais e esfregaço obtidos por meio de broncoscopias em série de fumantes de alto risco submetidos ao rastreamento do câncer de pulmão por meio de broncoscopia autofluorescente e tomografia computadorizada do tórax. Usando as biópsias bronquiais, foram identificados quatro subtipos moleculares associados a fenótipos clínicos e processos biológicos. Um subtipo (subtipo Proliferativo)
é enriquecido com biópsias com histologia displásica, altos sinais de células basais e baixos sinais de células ciliadas e expressão de vias associadas à proliferação. Genes envolvidos na sinalização ao interferon e imunidade mediada por células T eram negativamente regulados entre lesões progressivas/persistentes dentro do subtipo Proliferativo comparado com lesões regressivas e estas vias se correlacionavem a diminuições nos tipos de células imunes inatas e adaptativas. A classificação molecular de biópsias em um grupo de doenças progressivas/de alto grau pode ser usada para estratificar os pacientes em estudos de prevenção e monitorar a eficácia do tratamento. Os resultados também indicam que a quimioprevenção personalizada do câncer de pulmão visando vias específicas relacionadas ao câncer ou o sistema imune pode ter benefícios terapêuticos potenciais.
Resultados População de Indivíduos
[0231] Neste estudo, sequenciamento de mRNA foi usado para traçar o perfil de biópsias endobronquiais e esfregaços obtidos por meio de broncoscopia em série de fumantes de alto risco que passaram por rastreamento de câncer de pulmão através de broncoscopia de autofluorescência e tomografia computadorizada do tórax no Roswell Park Comprehensive Cancer Center (Roswell) em Buffalo, NY. As amostras da Coorte de Descoberta foram obtidas dos indivíduos no Roswell entre 2010 e 2012 (DC; n = 29 pacientes, n = 191 biópsias, n = 91 esfregaços) e as amostras da Coorte de Validação foram obtidas entre 2012 e 2015 (VC; n = 20 pacientes, n = 111 biópsias e 49 esfregaços). Os indivíduos são fumantes predominantemente mais velhos, muitos dos quais têm histórico de câncer de pulmão, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) e exposições ocupacionais que conferem um alto risco de desenvolver câncer de pulmão. As características clínicas relatadas no início do estudo, tais como sexo, idade, tabagismo (alguma vez ou nunca) relatado na consulta inicial, anos de tabagismo, história anterior de câncer de pulmão, estado de COPD e exposições ocupacionais não foram significativamente diferentes entre as duas coortes (Tabela 1). Após filtração da amostra com base em várias medidas de qualidade, a DC teve 190 biópsias e 89 esfregaços, enquanto a VC teve 105 biópsias e 48 esfregaços.
Noventa e quatro por cento dos indivíduos tiveram pelo menos uma localização anatômica pulmonar coletada 2 ou mais vezes por meio de biópsia endobronquial. As DC e VC continham 37,9 % e 35,2 % de biópsias com grau histológico de displasia ou superior e 23,1 % e 19,0 % com displasia progressiva/ persistente, respectivamente (Tabela 2). Uma assinatura associada ao tabagismo previamente descrita (8) foi usada para prever o tabagismo de cada amostra, uma vez que o tabagismo estava disponível apenas no início do estudo, e descobriu-se que a CD tinha uma porcentagem maior de biópsias previstas para serem fumantes (62,6 %) comparado com a VC (36,2 %). Não há diferença significativa no estado de fumante entre os esfregaços brônquicos entre as duas coortes, uma vez que apenas 1 esfregaço é coletado por ponto de tempo. O estado de tabagismo previsto foi consistente em todos os procedimentos para 63 % e 70 % dos indivíduos na DC e VC, respectivamente. Em termos de qualidade de sequenciamento de RNA, a DC teve leituras totais significativamente maiores, leituras de mapeamento de porcentagem de forma exclusiva e pontuações de número de integridade de transcrição mediana entre as biópsias do que a VC, porém, estas diferenças entre as coortes não foram refletidas nos esfregaços (Figura 5).
PMLs em LUSC dentro da coorte de descoberta se dividem em subtipos moleculares distintos
[0232] A fim de identificar diferenças de expressão gênica associadas à gravidade histológica de PMLs em LUSC usando as biópsias endobronquiais, uma abordagem com base na descoberta foi usada para identificar subtipos moleculares de novo com base em padrões distintos de coexpressão gênica (módulos gênicos). A abordagem foi escolhida dado que há heterogeneidade histológica dentro das biópsias e as análises patológicas foram conduzidas usando biópsias adjacentes a biópsias perfiladas via mRNA-Seq. Primeiro, procurou-se selecionar um conjunto de módulos gênicos que estão presentes em diferentes conjuntos de dados em LUSC.
Usando a análise ponderada de rede de coexpressão de genes (9) (WGCNA), os módulos gênicos foram derivados das biópsias na DC (n = 190 amostras, n = 16653 genes, n = 15 módulos gênicos), esfregaços da DC (n = 89 amostras, n = 16058 genes, n = 47 módulos gênicos), tumores de carcinoma de células escamosas TCGA (LUSC) (10) (n = 471 amostras, n = 17887 genes, n = 55 módulos gênicos) e amostras traqueobronquiais de camundongos tratados com n-nitrosotris-(2-cloroetil)ureia (NTCU) (n = 25 amostras, n = 14897 genes, n = 40 módulos gênicos). Módulos gênicos de biópsia de DC que estavam altamente correlacionados (coeficiente de correlação absoluto de Pearson r > 0,85) com pelo menos um outro módulo de biópsia não DC dentro de cada um dos 4 conjuntos de dados foram selecionados. Os genes nos módulos selecionados foram filtrados, requerendo que cada gene também estivesse presente em pelo menos um dos módulos de biópsia não-DC correlacionados, resultando em um conjunto de 9 módulos gênicos que consistiam em 3.936 genes no total (Figura 6).
Estes módulos gênicos identificaram 4 subtipos moleculares nas biópsias na DC via agrupamento de consenso: Proliferativo
(azul escuro, n = 52 amostras, 27,4 %), Inflamatório (verde escuro, n = 37 amostras, 19,5 %), Secretor (azul claro, n = 61 amostras, 32,1 %) e Normal (verde claro, n = 40 amostras, 21,1 %) (Figura 1A, Tabela 3).
[0233] A fim de caracterizar cada subtipo molecular, o primeiro foco foi na identificação de vias biológicas super-representadas nos genes que compõem cada módulo gênico, uma vez que o padrão de expressão do módulo gênico define cada subtipo de PML. Descobriu-se que cada módulo gênico está associado a processos biológicos epiteliais e imunes distintos (Figura 1A, Figura 6 e Tabela 5). O subtipo Proliferativo é especificamente caracterizado pelo aumento da expressão de genes envolvidos no metabolismo energético e nas vias do ciclo celular (Módulos 4 e 5). Os subtipos Secretor e Normal têm expressão aumentada de genes nas vias associadas ao cílio (Módulo 6), no entanto, o subtipo Normal tem especificamente expressão diminuída de genes envolvidos na inflamação, regulação de linfócitos e leucócitos e processamento de antígenos e vias de apresentação (Módulos 8 e 9). O subtipo Secretor exibe diminuição da expressão de genes envolvidos na tradução de proteínas (Módulo 7), enquanto os genes de processamento de RNA (Módulo 2) são expressos mais fortemente no subtipo Inflamatório.
[0234] Os subtipos moleculares foram ainda caracterizados por suas associações a fenótipos clínicos e subtipos moleculares estabelecidos em tumor LUSC (11, 12).
O status da amostra de tabagismo, o indivíduo de quem a amostra foi derivada e a histologia da amostra demonstraram associações significativas ao subtipo (p < 0,01, Figura 1B, Tabela 6, Figura 8). Os subtipos Proliferativo e Secretor são enriquecidos para fumantes atuais e esta associação conduz ao enriquecimento do indivíduo, uma vez que 79 % dos indivíduos mantêm seu estado de fumante ao longo do estudo.
Além disso, o subtipo Proliferativo está enriquecido em biópsias com histologia de displasia (Figura 1B). O subtipo Proliferativo tem alta expressão de genes envolvidos nos processos do ciclo celular, incluindo o marcador de proliferação MKI67, o qual é significativamente regulado positivamente entre as amostras neste subtipo comparado com as amostras em outros subtipos (FDR = 1.0e-30, modelo linear, com base em análise de expressão diferencial entre as amostras nos subtipos Proliferativo versus não Proliferativo em todos os genes). O gene permaneceu significativamente regulado positivamente no subtipo Proliferativo em amostras com histologia normal/hiperplasia (FDR = 3,4e-10, modelo linear) e amostras com histologia de displasia (FDR = 3,1e- 8, modelo linear), e estas observações são suportadas por um aumento na expressão da proteína em amostras representativas (p = 0,02) (Figuras 1C-1E e Figura 9). As amostras do subtipo Proliferativo também tiveram alta concordância com o subtipo LUSC-Clássico (Figura 1B). Nos tumores TCGA LUSC, o subtipo LUSC-Clássico estava associado a alterações e superexpressão de KEAP1 e NFE2L2, bem como amplificação de 3q26 com superexpressão de SOX2, TP63 e PIK3CA (11). Da mesma forma, nossas PMLs proliferativas aumentaram a expressão de KEAP1, NFE2L2, TP63 e PIK3CA (FDR = 1,4e-6, 4,5e-12, 1,4e-9 e 0,03, respectivamente, modelo linear) (Figura 10A). Além disso, descobriu-se que o subtipo LUSC-Clássico estava associado à expressão aumentada de genes envolvidos no metabolismo energético e nosso subtipo Proliferativo é, em parte, definido pela alta expressão do Módulo 4, o qual é enriquecido em genes associados à fosforilação oxidativa e à cadeia de transporte de elétrons. Em contraste, os subtipos de PML Inflamatório e Secretor demonstram enriquecimento no subtipo LUSC-Secretor. O subtipo LUSC-Secretor estava associado a processos relacionados à resposta imune, e as PMLs de tipo Inflamatório e Secretor têm a maior expressão do Módulo 8, o qual é enriquecido em genes nestas mesmas vias.
[0235] Finalmente, examinou-se a extensão até onde os subtipos moleculares de PML eram direcionados por diferenças na composição do tipo de célula epitelial e imune ao avaliar a expressão de uma série de marcadores de tipo celulares canônicos. Os subtipos Inflamatório e Secretor têm níveis mais elevados de expressão do marcador de glóbulos brancos PTPRC (CD45), consistente com o enriquecimento no subtipo LUSC-Secretor (Figura 10B, FDR = 0,12 e 0,01, respectivamente, modelo linear). Consistente com o comportamento e as vias enriquecidas no Módulo 6, a expressão do marcador de células ciliadas TUB1A1 está diminuída nos subtipos Inflamatório e Proliferativo (FDR = 1.1e-4 e 3.5e- 19, respectivamente, modelo linear), e isto também é mostrado por uma diminuição na coloração de -tubulina acetilada em amostras histológicas representativas (Figura 1E, Figura 9).
O subtipo Proliferativo tem a expressão mais alta (FDR = 2,4e-15, modelo linear l) do marcador de células basais (KRT5), indicando enriquecimento em lesões com histologia de alto grau que se correlaciona estreitamente com a expressão de proteínas em amostras histológicas representativas (p = 0,01) (Figura 1E, Figura 9, Figura 10B, Tabela 7). Além disso, a expressão gênica de MUC5AC, um marcador de células epiteliais caliciformes, é aumentada em subtipos enriquecidos para fumantes atuais (Proliferativo e Secretor), mas é mais significativamente aumentada no subtipo Secretor (FDR = 3.4e-5, modelo linear). Em contraste,
a expressão gênica de SCGB1A1, um marcador de células caliciformes, é a mais baixa no subtipo Proliferativo (FDR = 6.1e-5, modelo linear). O subtipo Normal é suportado pela expressão de todos os tipos de células epiteliais e tem a expressão mais baixa de CD45 (FDR = 7,6e-4, modelo linear).
Os níveis de expressão destes genes marcadores concordam com os métodos de deconvolução do tipo de célula para examinar o teor de células epiteliais e imunes (Figuras 10C-10D). A soma destas caracterizações destaca as vias epiteliais e imunes associadas às células que são moduladas pelo tabagismo e pela histologia de PML e identifica o subtipo Proliferativo como um subconjunto de PMLs de alto grau que expressam vias proliferativas e relacionadas ao ciclo celular.
Associações Fenotípicas Com os Subtipos Moleculares São Confirmadas na Coorte de Validação
[0236] Em seguida, desejou-se determinar se a heterogeneidade capturada nos subtipos moleculares derivados da biópsia de DC era reproduzível na VC. Um preditor de subtipo molecular de centroide de 22 genes mais próximo foi desenvolvido mediante seleção de genes representativos de cada um dos 9 módulos gênicos. O preditor tem 84,7 % de precisão em biópsias na DC (conjunto de treinamento, Figura 2A e Figura 11) com as seguintes taxas de classificação incorreta por subtipo 5/52 (9,6 %) em Proliferativo, 7/37
(18,9 %) em Inflamatório, 9/61 (14,8 %) em Secretor e 8/40 (20 %) em Normal. O classificador de 22 genes foi usado para prever o subtipo molecular das 105 biópsias na VC (Figura 2B). As previsões do subtipo na VC foram avaliadas ao examinar a concordância das pontuações do metagene para cada um dos 9 módulos (usando o conjunto completo de genes para cada módulo) entre os subtipos na VC previstos comparado com os subtipos na DC. O comportamento médio do Componente Principal 1 (PC1) entre os subtipos foi altamente similar (Figura 12), com poucas exceções (a saber, o Módulo 3 que teve o menor número de genes). Além disso, as previsões do subtipo na VC do classificador de 22 genes foram comparadas com os subtipos derivados das biópsias na VC usando a mesma metodologia usada para derivar os subtipos na DC e foi descoberta uma concordância significativa (p = 1,0e-7, com o subtipo Proliferativo tendo a maior concordância entre as previsões, Figura 11).
[0237] As associações estatísticas entre os subtipos na VC (por meio do classificador de 22 genes) e os fenótipos clínicos e moleculares nas biópsias na VC são análogas àquelas observadas nas biópsias na DC (Figura 2C, Tabela 6, Figura 8 e Figuras 10A-10H). Resumidamente, o subtipo Proliferativo é enriquecido em fumantes atuais, biópsias com histologia de displasia e o subtipo de tumor LUSC-Clássico
(Figura 2C, Tabela 6). A expressão do gene marcador epitelial e de glóbulos brancos através das biópsias na VC revela níveis mais elevados do marcador de glóbulos brancos PTPRC (expressão de CD45) no subtipo Inflamatório (FDR = 0,002), consistente com o enriquecimento do subtipo Secretor LUSC (Figura 10F).
[0238] Os subtipos Inflamatório e Proliferativo reduziram a expressão do marcador de células ciliadas (FOXJ1), consistente com o Módulo 6 (FOXJ1 FDR = 0,0005 e FDR = 2,62e-6 e Módulo 6 FDR = 5,73e-6 e FDR = 4,34e-10, respectivamente). O subtipo Proliferativo tem a maior expressão do marcador de células basais KRT5 (FDR = 1,67e- 7), marcador de proliferação MKI67 (FDR = 3,03e-10) e o Módulo 5 associado ao ciclo celular (FDR = 1,23e-18), indicando enriquecimento de lesões que expressam características associadas à histologia de alto grau. A expressão gênica de SCGB1A1, um marcador de células caliciformes, é mais baixa no subtipo Proliferativo (FDR =
1.8e-4). A expressão gênica de MUC5AC, um marcador de células epiteliais caliciformes, era aumentada em fumantes atuais e mais significativamente no subtipo Secretor nas biópsias na DC; no entanto, nas biópsias na VC, esta tendência não é preservada, uma vez que os fumantes atuais não são enriquecidos no subtipo Secretor. Os níveis de expressão destes genes marcadores concordam com outros métodos de deconvolução para examinar o teor de células epiteliais e imunes (Figuras 10E-10H).
Esfregaços de campo das vias aéreas de aparência normal refletem o subtipo molecular da biópsia
[0239] Anteriormente, foi mostrado que esfregaços brônquicos de áreas de aparência normal do brônquio principal podem prever a presença de PMLs (13); no entanto, este estudo não teve biópsias e esfregaços dos mesmos indivíduos. Acima, nas biópsias na DC e VC, o subtipo Proliferativo, representa um subtipo distinto de PMLs enriquecido em histologia displásica que expressa vias metabólicas e proliferativas.
As biópsias classificadas como subtipo Proliferativo podem representar um grupo de PMLs que requerem monitoramento e intervenção cuidadosos. Como um resultado, buscou-se explorar se era ou não possível prever a presença de biópsias do subtipo Proliferativo usando os esfregaços. O subtipo Proliferativo é definido pelo comportamento dos Módulos 4, 5, 6 e 7 (Tabela 3) e, portanto, o subconjunto de 8 genes (do preditor de 22 genes) que correspondem a estes módulos foi usado para prever a presença do subtipo Proliferativo nas biópsias e esfregaços na DC e VC. A previsão do subtipo Proliferativo em um esfregaço é específica (91 % e 92 % nas biópsias na DC e VC, respectivamente), mas não sensível (39
% e 32 % das biópsias na DC e VC, respectivamente) em indicar a presença de pelo menos uma PML proliferativa detectada no mesmo ponto de tempo (Figura 3A). A fim de compreender o desempenho do classificador na previsão do subtipo Proliferativo em esfregaços, as pontuações da Análise de Variação do Conjunto Genético (GSVA) (14) foram examinadas para os Módulos 4, 5, 6 e 7, que definem o subtipo Proliferativo nos esfregaços na DC e VC (Figura 3B). Nos esfregaços na DC e VC, as pontuações GSVA foram significativamente diferentes (FDR < 0,05) no subtipo Proliferativo comparado com todas as outras amostras apenas para os Módulos 5 e 6 e, portanto, provavelmente contribuem mais fortemente para a classificação do subtipo Proliferativo nos esfregaços. O Módulo 5 contém genes associados ao ciclo e proliferação celular, enquanto o Módulo 6 contém genes associados à montagem e organização ciliar.
A regulação negativa dos Módulos 5 e 6 nos esfregaços prevê especificamente a presença de uma PML de subtipo Proliferativo; entretanto, a ausência destes sinais no campo de lesão das vias aéreas não impede o desenvolvimento de uma PML de subtipo Proliferativo.
Genes associados ao sistema imune separam PMLs Progressivas/Persistentes de subtipos proliferativos e regressivos
[0240] Estudos anteriores de PMLs bronquiais sugerem que lesões de alto grau (as quais ocorrem com mais frequência em fumantes atuais) têm maior probabilidade de progredir para carcinoma invasivo (6). Portanto, buscou-se identificar alterações moleculares associadas à subsequente progressão/persistência de PML (n = 15) versus regressão (n
= 15) entre as biópsias na DC do subtipo Proliferativo, uma vez que estas podem ser clinicamente relevantes para identificar estratégias de interceptação adequadas.
Usando as pontuações GSVA calculadas em todas as biópsias na DC para cada um dos 9 módulos, foi calculado quais pontuações eram estatisticamente diferentes entre doença progressiva/persistente versus regressiva nas amostras pertencentes ao subtipo Proliferativo (Figura 7). Descobriu-
se que as pontuações do Módulo GSVA da biópsia na DC para o
Módulo 9 eram significativamente maiores entre as PMLs
Proliferativas regressivas (p = 0,002, modelo linear, Figura
4A) comparado com as PMLs Proliferativas progressivas/persistentes.
A associação entre baixa pontuação para o Módulo 9 e progressão/persistência é replicada nas biópsias na VC (n = 7 progressivas/persistentes e n = 13 biópsias regressivas; p = 0,03, modelo linear Figura
4B). A capacidade das pontuações GSVA do Módulo 9 para discriminar entre biópsias regressivas versus progressivas/persistentes, conforme medido pela área sob a característica de operação do receptor (ROC) foi de 0,809 e 0,802 nas biópsias na DC e VC, respectivamente.
[0241] Os genes no Módulo 9 incluem uma série de genes que codificam para proteínas envolvidas na sinalização ao interferon, bem como processamento e apresentação de antígenos (SP100, CIITA, CXCL10, SOCS1, GBP1, GBP4, B2M, TAP1, TAPBP, TRIM 14, TRIM21, TRIM22, STAT1, PML, OAS2, OAS3, MX1, ADAR, ISG15, IFI35, IFIT3, IFI27, PSMB8, PSMB9, BST2, IRF1, IRF9, CD74, PSME1, PSME2, HLA- DQA1/DPA1/DPB1/DRA/DQB2/DRB1/DQB1/DMA/DMB/DOA, HLA- A/B/C/E/F) e incluem o receptor inibidor LAG3. Como um resultado, desejou-se avaliar se a presença ou ausência de células imunes inatas ou adaptativas estava associada à expressão do Módulo 9 dentro do subtipo Proliferativo. Em um esforço para deconvoluir a presença potencial de tipos de células imunes, pontuações GSVA foram geradas usando assinaturas de células imunes anteriormente descritas (15) e pontuações para 64 tipos de células diferentes usando o algoritmo xCell (16), separadamente para ambas as biópsias na DC e VC. Associações significativas (FDR < 0,05) foram identificadas entre a pontuação do tipo de célula e o Módulo 9 que estavam em comum entre as biópsias na DC e VC (Figura 13) e 8 tipos de células identificados (via xCell), incluindo células dendríticas, células dendríticas ativadas, células dendríticas plasmocitoides, macrófagos, macrófagos M1, bem como células T de memória efetoras CD8+, células T de memória central CD8+ e células T reguladoras (Figura 4C). Juntas, as biópsias progressivas/persistentes no subtipo Proliferativo regularam negativamente a expressão do Módulo 9 comparado com biópsias regressivas que se correlacionam a sinais reduzidos de populações de células imunes inatas e adaptativas.
Imunofluorescência revela a modulação associada à progressão de macrófagos e células T em PMLs proliferativas
[0242] A fim de confirmar a relação entre os tipos de células imunes associados ao Módulo 9 e progressão/ persistência histológica de PMLs no subtipo Proliferativo, coloração imunofluorescente de macrófagos/monócitos (n = 52 regiões enumeradas de n = 16 indivíduos), CD4 (n = 50 regiões enumeradas de n = 17 indivíduos) e células T CD8 (n = 47 regiões enumeradas de n = 16 indivíduos) foram realizadas (Tabela 7). Os resultados foram analisados em todos os indivíduos ensaiados dentro do subtipo Proliferativo e no subconjunto de indivíduos onde o resultado da lesão (progressão/persistência versus regressão) foi concordante com a pontuação GSVA do Módulo 9 (denotado como conjunto concordante). A coloração de CD68, um marcador de pan macrófagos (e macrófagos associados a tumor), sugestivo de macrófagos do tipo M1, estava aumentada em lesões progressivas/persistentes (p < 0,001 no conjunto concordante). Em contraste, a coloração de CD163 em combinação com CD68, considerada sugestiva de macrófagos de tipo M2, diminuiu entre as lesões progressivas/persistentes no subtipo Proliferativo (p < 0,001 usando todos os indivíduos e p = 0,0007 no conjunto concordante, respectivamente, modelo linear) (Figuras 4D-4E). Além disso, células T CD4 estavam aumentadas (p < 0,001 no conjunto concordante, modelo linear) e as células T CD8 diminuíram (p < 0,001 no conjunto concordante) em PMLs que progridem/ persistem. Curiosamente, entre as lesões progressivas/ persistentes, as células T CD8 tinham um padrão de localização distinto (p = 0,07 no conjunto concordante, modelo linear), em que as células T CD8 revestiam e estavam embutidas no epitélio em áreas onde a displasia está presente (Figura 4D). Os resultados da imunofluorescência não alcançaram significância, com exceção de CD163, quando apenas o desfecho da lesão foi usado sem levar em consideração a pontuação para o Módulo 9.
Discussão
[0243] O carcinoma de células escamosas do pulmão (LUSC) é a segunda forma mais comum de câncer de pulmão e surge na camada epitelial das vias aéreas bronquiais.
Frequentemente, é precedido pelo desenvolvimento de lesões pulmonares escamosas pré-malignas (PMLs). A presença de PMLs persistentes e ou progressivas displásicas é um marcador de risco aumentado para LUSC (6). Atualmente, no entanto, faltam ferramentas eficazes para identificar PMLs com maior risco de progressão para carcinoma invasivo (7). O desenvolvimento de marcadores preditivos de progressão da doença será importante na identificação de pacientes com maior risco de desenvolvimento de LUSC e na identificação de vias biológicas exploráveis para quimioprevenção de LUSC. Para esta finalidade, é descrito no presente documento o perfil através de esfregaços brônquicos por RNA-Seq e biópsias endobronquiais obtidas de indivíduos submetidos à triagem longitudinal do câncer de pulmão através de tomografia computadorizada (TC) de tórax e broncoscopia autofluorescente. Quatro grupos transcricionalmente distintos de biópsias são identificados, um deles marcado como proliferativo e associado à displasia de alto grau.
Pacientes com PMLs proliferativas também podem ser identificados por meio da expressão gênica medida a partir de células no epitélio das vias aéreas superiores não envolvido. Descobriu-se ainda que as PMLs proliferativas persistentes/progressivas são caracterizadas pela diminuição da expressão de genes envolvidos na sinalização ao interferon e nas vias de processamento/apresentação de antígenos.
Consistente com estes achados de expressão gênica, descobriu-se que as PMLs proliferativas progressivas/ persistentes são esgotadas para macrófagos CD68+/CD163+ e células T CD8 através de imunofluorescência. Coletivamente, estes dados indicam o potencial para identificar um subconjunto de pacientes com LUSC progressivo/persistente, os quais estão em risco de desenvolver câncer de pulmão invasivo, com base na expressão do gene das vias aéreas; bem como o potencial de diminuir o risco de progressão nestes pacientes, aumentando a resposta imune associada à regressão.
[0244] Estudos anteriores indicam uma variedade de alterações genômicas associadas à displasia bronquial. O aumento da expressão de EGFR e coloração Ki67 de células epiteliais está associado a um aumento da gravidade histológica e subsequente progressão histológica (6, 17).
Níveis alterados de proteínas TP53, CCND1, CCNE1, BAX e BCL2 estavam associados à ocorrência de CIS ou câncer de pulmão independente do grau histológico (18). Encurtamento e manutenção de telômeros (19) e perda de heterozigosidade em regiões frequentemente detectadas em câncer de pulmão (3p, 5q, 9p, 13q, 17p) foram observados em lesões de hiperplasia/metaplasia precoce (20-22) e aumentaram em frequência e tamanho na displasia de alto grau. Ganhos genômicos em loci contendo SOX2, TP63, EGFR, MYC, CEP3 e CEP5 também estão associados à progressão da displasia de alto grau (23). Apesar das numerosas alterações genômicas associadas ao grau histológico e progressão de PML, falta um sistema de classificação molecular abrangente para PMLs para complementar a classificação patológica de PMLs. O uso de uma abordagem de descoberta de classe não supervisionada que levou à identificação de quatro subtipos moleculares distintos de PML (Proliferativo, Inflamatório, Secretor e Normal).
[0245] Os padrões de transcrição que diferenciam os subtipos de PML são robustos e um painel de 22 genes identificado na Coorte de Descoberta pode ser usado para distinguir entre os diferentes subtipos moleculares em uma Coorte de Validação independente. Curiosamente, embora a história anterior de câncer de pulmão possa influenciar a expressão do gene das vias aéreas e cerca de dois terços dos indivíduos tenham uma história anterior de câncer de pulmão, não detectamos uma associação significativa entre a história de câncer de pulmão e o subtipo molecular, e há uma diversidade similar de subtipos moleculares entre biópsias coletadas de indivíduos com e sem histórico de câncer de pulmão. O subtipo Proliferativo é enriquecido com PMLs displásicas de fumantes atuais e é caracterizado por regulação positiva das vias metabólicas (OXPHOS/ETC/TCA) e do ciclo celular e regulação negativa das vias associadas aos cílios. Trabalhos anteriores indicam aumentos nas vias metabólicas nas vias aéreas de indivíduos com lesões displásicas (13), em PMLs adjacentes ao tumor LUSC (24) e em fumantes com alto risco de câncer de pulmão (25), bem como aumentos na proliferação (via Níveis de Ki67, conforme mencionado acima) que foram usados como um ponto final na quimioprevenção do câncer de pulmão (26, 27). A identificação de pacientes com lesões proliferativas é útil para enriquecer os ensaios de quimioprevenção do câncer de pulmão com indivíduos de alto risco ou para identificar pacientes que se beneficiariam de um rastreamento mais frequente do câncer de pulmão. O subtipo Inflamatório é predominante em PMLs de ex-fumantes, porém, curiosamente, não é significativamente enriquecido em displasia, apesar da expressão diminuída de vias associadas aos cílios, sugerindo um epitélio anormal.
O subtipo Inflamatório também mostra expressão aumentada de um módulo gênico enriquecido em genes envolvidos na inflamação e regulação de linfócitos e leucócitos (Módulo 8). Este módulo gênico também é elevado em lesões Secretoras predominadas por lesões de fumantes atuais e que exibe expressão aumentada de marcadores de células caliciformes.
Curiosamente, o IL1B faz parte deste módulo gênico relacionado à inflamação, o que é de grande interesse, visto que foi demonstrado recentemente que a inibição de IL1B reduz a incidência de câncer de pulmão (28).
[0246] Nosso trabalho anterior estudou extensivamente as alterações da expressão gênica no epitélio das vias aéreas de aparência normal por meio do perfil de células obtidas através de esfregaço do brônquio principal durante a broncoscopia (8, 29 35, 35). Como parte deste trabalho, foram descritas alterações na expressão gênica que refletem a presença de displasia bronquial (31). No estudo atual, pela primeira vez, tanto esfregaços brônquicos quanto biópsias endobronquiais foram coletados durante o mesmo procedimento, permitindo a identificação de diferenças de expressão gênica em esfregaços brônquicos das vias aéreas de aparência normal que indicam a presença de PMLs do subtipo Proliferativo.
Tanto na Coorte de Descoberta quanto na Coorte de Validação, a aplicação do preditor usado para identificar PMLs do subtipo Proliferativo (com base na expressão gênica na biópsia de PMLs) aos dados de expressão gênica dos esfregaços de aparência normal das vias aéreas resultou em previsões do subtipo Proliferativo que eram muito específicas (91 %), mas não sensíveis (31-38 %). Esfregaços classificados como
Proliferativos tinham aumento de expressão das vias do ciclo celular e redução de expressão de genes associados aos cílios, sugerindo que eles são mais similares à metaplasia escamosa do que o epitélio normal. Potencialmente, um subconjunto de pacientes pode apresentar danos generalizados nas vias aéreas que servem como um marcador quanto à presença deste tipo de PML de alto grau, levando a uma sensibilidade modesta, mas com alta especificidade. Em outros casos, a área de dano que dá origem a estas PMLs proliferativas pode ser mais localizada e, portanto, potencialmente mais difícil de detectar, contribuindo para a diminuição da sensibilidade. Estas descobertas indicam que uma terapia que tem como alvo as variações ao longo de todo o epitélio das vias aéreas pode ser necessária em alguns indivíduos, enquanto ablação mais específica do local (por exemplo, terapia fotodinâmica) pode ser mais eficaz em determinados casos. Outra possibilidade e área de futura pesquisa é que um esfregaço do subtipo Proliferativo seja um preditor de LUSC incidente.
[0247] A caracterização de perfil molecular de PMLs e a identificação de módulos de coexpressão gênica também fornecem uma oportunidade para identificar os determinantes moleculares da subsequente progressão de PMLs. Um dos nove módulos de coexpressão gênica usados para definir os subtipos moleculares era significativamente diferente entre as biópsias que progridem ou persistem comparado com as biópsias que regridem dentro do subtipo Proliferativo em ambas as coortes DC e VC. O módulo contém genes cuja expressão está diminuída nas biópsias persistentes/progressivas que estão envolvidas na sinalização ao interferon e no processamento e apresentação de antígeno. Estas variações na expressão gênica estavam correlacionadas a uma diminuição da abundância de células imunes inatas e adaptativas por meio de predição computacional. Através de coloração imunofluorescente de seções de biópsia FFPE, foi confirmado que as lesões proliferativas progressivas/persistentes com baixas pontuações GSVA para o Módulo 9 tinham menos macrófagos CD163+ e células T CD8+ e as células T CD8+ tinham um padrão de localização distinto. Estas lesões também continham um maior número de células T CD4+ e será importante em trabalhos futuros avaliar se estas células são células T reguladoras que promovem um ambiente imunossupressor.
[0248] A presença de macrófagos associados ao tumor com os fenótipos polarizados (M1 como pró-inflamatório ou M2 como anti-inflamatório) estava associada ao prognóstico de câncer de pulmão. A presença predominantemente de macrófagos M2, marcados pela expressão de CD163, tem sido associada a uma pior sobrevida. No entanto, no contexto de PMLs pulmonares, esta relação não é bem estudada. O presente achado de que PMLs proliferativas regressivas têm mais células CD163+ e expressão aumentada de genes envolvidos na sinalização ao IFN é consistente com o que foi observado nas PMLs que precedem o carcinoma de células escamosas oral, onde a presença de macrófagos CD163+ com sinalização ativa ao IFN está associada a melhores resultados (36). Além disso, menos células T CD8+ e menor expressão de genes do HLA de Classe I e B2M foram observadas em lesões progressivas/persistentes dentro do subtipo Proliferativo.
As interrupções na imunovigilância mediada por células T adequadas foram descritas em vários estudos que mostram que o processamento e apresentação do antígeno HLA Classe I comprometidos, incluindo a regulação negativa ou perda de B2M (37, 38) e sinalização ao interferon (39) em tumores de pulmão afeta a resposta e a resistência adquirida a inibidores do ponto de verificação. Os tumores pulmonares sem um complexo HLA-I apresentaram menor infiltração de linfócitos CD8+ citotóxicos, e isto também estava associado a níveis mais baixos de PD-L1. Além disso, estudos também sugeriram impactos negativos sobre a eficácia de inibidores do ponto de verificação, bem como na sobrevida em pacientes com LC que têm tumores com células T CD4+ aumentadas que expressam marcadores T reguladores (FOXP3, CD25) resultando em estado imunossupressor sugerido para impedir o recrutamento e as funções efetoras das células T CD8+ (40,
41). Futuros dados de sequenciamento de DNA sobre as PMLs cujo perfil foi caracterizado no presente documento podem indicar perda heterozigótica ou homozigótica de B2M ou mutações em outros genes nas vias de apresentação e processamento de antígeno e interferon; no entanto, mesmo no caso de resistência adquirida, mutações e alterações no número de cópias não poderiam explicar a regulação negativa destas vias em todos os indivíduos, sugerindo que outras alterações epigenéticas ou vias de sinalização podem desempenhar um papel.
Na verdade, foi demonstrado que a terapia epigenética, especificamente os inibidores de metiltransferase de DNA (42), aumenta a resposta à terapia do ponto de verificação imune e regula positivamente muitos dos genes negativamente regulados em lesões progressivas/persistentes dentro do subtipo Proliferativo,
incluindo genes do HLA classe I (HLA-B e HLA-C), B2M, CD58,
TAP1, subunidades de imuno-proteassoma PSMB9 e PSMB8 e o fator de transcrição IRF9. Desvendar os mecanismos de regulação imune inata e adaptativa neste subconjunto de PMLs será importante para identificar potenciais terapias de imunoprevenção.
[0249] Os presentes dados indicam que há alterações transcriptômicas específicas de subtipo preditivas de progressão de lesão pré-maligna de LUSC subsequente que são o resultado de uma falta de células imunes infiltradas no microambiente da lesão. Estes dados sugerem que os biomarcadores para determinar o subtipo de PML e avaliar a infiltração imune podem ter utilidade para a detecção de PMLs agressivas que requerem manejo clínico mais intensivo e os genes alterados nestas PMLs podem servir como candidatos à quimioprevenção pulmonar. Estes biomarcadores podem ser medidos diretamente no tecido da PML ou, conforme indicado pelos dados presentes, eles podem ser medidos em um tecido substituto, tal como o epitélio das vias aéreas bronquiais.
Um benefício dos biomarcadores que predizem o comportamento agressivo de PMLs medido em um tecido substituto é o potencial de que estes biomarcadores também podem prever o comportamento de PMLs não observados diretamente durante a broncoscopia.
Materiais e Métodos População de indivíduo na coleta de amostras
[0250] Biópsias endobronquiais e esfregaços foram obtidos de indivíduos de alto risco submetidos a rastreamento de câncer de pulmão em intervalos de aproximadamente 1 ano através de broncoscopia de luz branca e broncoscopia de autofluorescência e tomografia computadorizada em Roswell.
A broncoscopia incluiu visualização das cordas vocais, traqueia, carina principal e orifícios brônquicos subsegmentais visíveis sem causar trauma na parede bronquial. Todas as áreas anormais e suspeitas são submetidas à biópsia duas vezes e a localização anatômica pulmonar é registrada (Figura 14, Tabela 8). Uma biópsia foi usada para avaliação patológica de rotina e a outra para caracterização de perfil molecular. Além disso, um esfregaço foi obtido de uma área de aparência normal do brônquio principal esquerdo ou direito para pesquisa. Os critérios morfológicos usados para avaliar as biópsias estão de acordo com as orientações da Organização Mundial da Saúde (OMS) (43). A elegibilidade para o rastreamento inclui uma história anterior de câncer aerodigestivo e nenhuma doença no momento da inscrição ou idade superior a 50, uma história atual ou anterior de tabagismo para uma exposição mínima de 20 anos-maço e pelo menos um fator de risco adicional, incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) moderada (definida como volume expiratório forçado (VEF1) < 70 %), doença pulmonar relacionada ao amianto confirmada ou uma forte história familiar de câncer de pulmão (pelo menos 1-2 parentes de primeiro grau). Todas as amostras de pesquisa foram armazenadas no RNA Allprotect (Qiagen) e armazenadas a -80 graus C.
[0251] Foram selecionados indivíduos que tiveram biópsias coletadas em locais repetidos por meio de broncoscopias em série; no entanto, após o isolamento do RNA, as amostras de 3 indivíduos tiveram uma única biópsia e 1 indivíduo teve um único esfregaço. O sequenciamento de mRNA foi realizado em uma Coorte de Descoberta (DC) de amostras que compreendem biópsias endobronquiais e esfregaços coletados entre 2010 e 2012 (n = 30 indivíduos, n = 197 biópsias e n = 91 esfregaços). Sequenciamento de mRNA foi subsequentemente realizado em uma Coorte de Validação (VC) de amostras que compreendem biópsias endobronquiais e esfregaços coletados entre 2012 e 2015 (n = 20 indivíduos, n = 111 biópsias e n = 49 esfregaços). A histologia do esfregaço foi definida pela pior histologia da biópsia observada no mesmo ponto de tempo. A progressão/ regressão da biópsia foi definida para cada biópsia com base na histologia da biópsia e na pior histologia registrada para a mesma localização anatômica pulmonar no futuro. As alterações histológicas entre normal, hiperplasia e metaplasia foram classificadas como "normal estável", diminuições no grau de displasia histológica ou alterações de histologia displásica para normal/hiperplasia/metaplasia foram classificadas como "regressivas", a falta de dados histológicos futuros foi classificada como "desconhecida" e todo o resto foi classificado como "progressivo/ persistente". O Institutional Review Boards no Boston University Medical Center and Roswell aprovou o estudo e todos os indivíduos que forneceram consentimento informado por escrito.
Preparação, sequenciamento e processamento de dados da biblioteca de RNA-Seq
[0252] O RNA total foi extraído de biópsias endobronquiais e esfregaços brônquicos usando o kit miRNeasy™ Mini ou o kit AllPrep™ DNA/RNA/miRNA Universal (Qiagen). Os sequenciamentos das bibliotecas foram preparados a partir de amostras de RNA total usando o kit Illumina TruSeq™ RNA Kit v2 e multiplexadas em grupos de quatro usando o kit Illumina TruSeq™ Paired-End Cluster.
Cada amostra foi sequenciada no Illumina HiSeq™ 2500 para gerar leituras de 100 nucleotídeos de extremidade emparelhada. A demultiplexação e a criação de arquivos FASTQ foram realizadas usando Illumina CASAVA™ 1.8.2 ou BaseSpace.
As amostras foram alinhadas usando hg19 e alinhamento STAR (44) de 2 passagens. As contagens a nível de gene e transcrição foram calculadas usando RSEM (45) usando a anotação Ensembl™ v74. As métricas de qualidade foram calculadas por STAR e RSeQC (46). Foram excluídas amostras nas quais a anotação de sexo não se correlacionava com a expressão gênica através de CYorf15A (ENSG00000131002), DDX3Y (ENSG00000067048), KDM5D (ENSG00000012817), RPS4Y1 (ENSG00000129824), USP9Y (ENSG00000114374) e UTY (ENSG00000183878) (n=4 amostras). A relação da amostra dentro de um paciente foi confirmada usando o software Peddy™ (47).
[0253] Amostras com uma alta taxa de heterozigosidade (mais de 3 desvios padrão acima da mediana) ou amostras com baixa relação com as amostras do mesmo paciente (mais de 3 desvios padrão abaixo da mediana) foram removidas de análises adicionais (n = 11 amostras, 2 esfregaços e 9 biópsias). As amostras foram subsequentemente divididas em coortes de Descoberta e Validação (conforme descrito acima) e por tipo de tecido (biópsia ou esfregaço). Subsequente coleta e filtração de genes foram conduzidas separadamente em cada conjunto da seguinte forma: primeiro, EdgeR™ (48) foi usado para computar dados normalizados (tamanhos de biblioteca normalizados usando TMM, média aparada de M valores e contagens log2 por milhão computado) e foram excluídos aqueles genes que tinham um intervalo interquartil igual a zero ou uma soma entre as amostras igual ou menor do que 1.
As amostras foram excluídas com base em valores maiores do que 2 desvios padrão da média para mais de um dos seguintes critérios: 1) correlação média de Pearson com todas as outras amostras calculadas em todos os genes filtrados, 2) os primeiro ou segundo componentes principais calculados usando a matriz de expressão gênica filtrada, 3) o número de integridade do transcrito (TIN, calculado por RSeQC). Após filtração da amostra, a filtração do gene foi recalculada conforme descrito acima no conjunto final de amostras de alta qualidade. Os dados estão disponíveis no Gene Expression Omnibus do NCBI usando o acesso GSE109743.
Derivação de subtipos moleculares
[0254] Biópsias (n = 190 amostras, n = 16653 genes) e esfregaços (n = 89 amostras, n = 16058 genes) na DC foram usados para derivar os subtipos moleculares. Dois conjuntos de dados adicionais de RNA-Seq foram usados durante a derivação dos subtipos moleculares: os tumores de carcinoma de células escamosas TCGA (LUSC) (10) (n = 471 amostras, n = 17887 genes) e um conjunto de dados de amostras traqueobronquiais de camundongos tratados com n-nitrosotris- (2-cloroetil)ureia (NTCU) (n = 25 amostras, n = 14897 genes).
Os camundongos desenvolvem lesões que são histológica e molecularmente comparáveis às lesões humanas e que progridem para LUSC e as amostras representam uma variedade de histologia (normal, displasia leve, displasia moderada,
displasia grave, carcinoma in situ (CIS) e tumor LUSC). Os dados de camundongos estão disponíveis no Gene Expression Omnibus do NCBI usando a ID de acesso GSE111091. A amostra e a filtração de genes dos tumores TCGA LUSC e do tecido de camundongo foram processados conforme descrito em outra parte no presente documento.
[0255] Análise de rede de correlação ponderada (9) (WGCNA) foi usada com parâmetros padrão para derivar Módulos de coexpressão gênica através dos 4 conjuntos de dados descritos acima. Os valores residuais de expressão gênica ajustados para qualidade de RNA (TIN mediano) e lote (célula de fluxo Illumina) foram usados como entrada para WGCNA para os conjuntos de dados de biópsia e esfregaço. Para o conjunto de dados de camundongo, valores de expressão gênica residual ajustados para qualidade de RNA (TIN mediana), cepa de camundongo e tipo de amostra (captura a laser microdissecada versus tecido inteiro) foram usados como entrada para WGCNA.
Valores log2 de contagens por milhão (cpm) foram usados como entrada para WGCNA para as amostras de tumor LUSC. Conjuntos de genes foram criados para cada módulo de coexpressão para cada conjunto de dados e, em seguida, combinados para criar um compêndio de conjuntos de genes gerados a partir de cada um dos 4 conjuntos de dados. Para cada gene definido no compêndio, o primeiro componente principal (PC1) foi calculado em cada conjunto de dados normalizado de pontuação z. Para cada conjunto de dados, uma matriz de correlação de Pearson dos valores de PC1 em todos os conjuntos de genes no compêndio foi calculada e os limites foram definidos da seguinte forma: r > 0,85 foi definido como 1 e r <= 0,85 definido como 0. As quatro matrizes foram subsequentemente somadas e os conjuntos de genes derivados de Módulos de coexpressão de biópsia que foram correlacionados a outro conjunto de genes não derivados de biópsia em todos os conjuntos de dados foram retidos (n = 9 Módulos retidos). Os genes que definem os módulos de biópsia retidos deveriam estar presentes no Módulo de biópsia e pelo menos em um dos conjuntos de genes correlacionados.
[0256] O processo de filtração acima rendeu um conjunto reduzido de genes (n = 3.936) que foi usado para definir os subtipos moleculares nos dados de biópsia. Os valores residuais de expressão gênica no conjunto reduzido de genes para as biópsias de Descoberta foram usados como entrada para agrupamento de consenso (49). O agrupamento de consenso foi realizado ao definir k (número de grupos) para 10, o número de iterações para 1000, a subamostragem para 80 %, o algoritmo de agrupamento para particionamento em torno de medíodos e a métrica de distância para correlação de Pearson. O valor ideal para k foi 4 com base na variação relativa na área sob a função de distribuição cumulativa calculada com base na matriz de consenso para cada k.
Preditor de subtipo molecular
[0257] As biópsias na DC através dos genes filtrados foram usadas para derivar um preditor de subtipo molecular.
Primeiro, as métricas de correlação de Pearson foram determinadas entre cada gene e o Módulo Eigengene (PC1 para cada um dos 9 Módulos). Os genes eram retidos como parte de um módulo se o valor de correlação fosse mais alto para o módulo ao qual ele foi atribuído. A correlação de Pearson média dos genes retidos para o Módulo Eigengene foi calculada, e o número de genes escolhidos de cada módulo para o preditor foi inversamente proporcional a esta métrica.
Em seguida, os genes mais altamente correlacionados aos genes do Módulo Eigengene foram escolhidos para representar o módulo no preditor. Os 22 genes resultantes desta análise nos dados de biópsia na DC foram usados para treinar um preditor de centroide mais próximo usando o pacote pamr com um limite de zero e prever o subtipo molecular nas biópsias na VC. Antes de prever o subtipo molecular destes conjuntos de teste, os conjuntos de treinamento e de teste foram ajustados em combate (50) e a pontuação z normalizada entre os dados de treinamento e teste combinados. Usando os métodos descritos acima, derivamos subtipos moleculares usando agrupamento de consenso entre as biópsias na VC e os comparamos aos subtipos previstos.
Identificação de processos biológicos associados a módulos gênicos e subtipos moleculares
[0258] Os processos biológicos e as vias enriquecidas em cada um dos nove módulos usados para descobrir os subtipos moleculares nas DC foram identificados usando EnrichR (51).
Cada módulo foi separado em genes correlacionados positiva ou negativamente com o Módulo Eigengene, os IDs do Ensembl foram convertidos em Símbolos Genéticos usando biomaRt e os seguintes bancos de dados foram consultados: GO Biological Process 2015, KEGG 2016, WikiPathways 2016, microRNA TargetScan, Fator de Transcrição PPIs, TRANSFAC e JASPAR PWMs, OMIM Disease, Reactome 2016 e Biocarta 2016.
Processos/vias com um FDR < 0,05 foram considerados significativamente enriquecidos. A contribuição de cada módulo gênico para os subtipos moleculares de biópsia na DC foi avaliada testando se as pontuações GSVA (14) para cada módulo estavam significativamente (FDR < 0,05) associadas aos subtipos moleculares usando um modelo de efeito linear misto com o paciente como um efeito aleatório limma.
Identificação de associações de fenótipo clínico e biológico com o subtipo molecular
[0259] Os subtipos moleculares nas biópsias na DC foram anotados de acordo com o comportamento de cada módulo gênico, calculando se as pontuações de GSVA (14) para cada módulo eram significativamente reguladas positiva ou negativamente (FDR < 0,05) em um determinado subtipo molecular versus todas as outras amostras usando um modelo linear de efeitos mistos com o paciente como um efeito aleatório via limma. Além disso, as vias biológicas e os fatores de transcrição associados a cada subtipo foram identificados usando conjuntos de genes GSEA (52) e mSigDB (53) usando genes classificados pela estatística t quanto à sua associação com cada subtipo. As listas classificadas foram criadas usando os pacotes limma (54) e edgeR (48) para identificar genes diferencialmente expressos associados à associação de subtipo.
[0260] Cada modelo linear usou dados voom- transformados (55) e incluiu a associação no subtipo de interesse, lote e qualidade de RNA (TIN) como covariáveis e o paciente como um efeito aleatório. Vias enriquecidas nas listas classificadas (FDR < 0,05) foram usadas para anotar os subtipos moleculares. Os valores de FDR para genes individuais foram derivados a partir desta análise ou modelos análogos usando apenas amostras de histologia normal/hiperplasia ou histologia de displasia.
[0261] Para as biópsias na DC e VC, os valores de expressão gênica residual foram usados para prever o estado de tabagismo, o subtipo de tumor LUSC e a abundância relativa de células epiteliais e imunes para cada amostra. O tabagismo (atual versus anterior/nunca) foi previsto para cada amostra conforme anteriormente descrito (13). O estado de tabagismo foi determinado em cada ponto de tempo para cada indivíduo calculando a média das pontuações de predição (> 0 para predição atual e < 0 para predição anterior/nunca) em todas as biópsias e esfregaços coletados. O subtipo de tumor LUSC foi determinado conforme anteriormente descrito (11) através dos genes preditivos do subtipo molecular LUSC (12). O algoritmo ESTIMATE (56) foi usado para inferir o teor relativo de células epiteliais, estromais e imunes.
Assinaturas específicas do tipo de célula imune de Bindea et al. (15) e assinaturas específicas do tipo de célula epitelial de Dvorak et al. (50) foram usados para gerar pontuações GSVA (14) em amostras para cada assinatura. Além disso, valores residuais de expressão gênica calculados usando valores log RPKM foram inseridos no xCell (16) para inferir as abundâncias relativas de 64 diferentes tipos de células. Os fenótipos categóricos acima, juntamente com variáveis clínicas adicionais, tais como histologia da biópsia, indivíduo, história anterior de câncer de pulmão,
sexo e estado de progressão/regressão da biópsia foram associados ao subtipo molecular usando o Teste Exato de Fisher. Variáveis contínuas foram associadas ao subtipo molecular usando um modelo linear via limma.
[0262] A fim de caracterizar as alterações moleculares associadas ao resultado da lesão, um modelo de efeitos mistos linear foi usado para avaliar as diferenças de pontuação para o Módulo GSVA entre lesões progressivas/persistentes versus regressivas dentro de cada subtipo molecular com o paciente como um efeito aleatório via limma. Estimamos as diferenças no teor de células imunes (separadamente para xCell e Bindea et al.) entre lesões progressivas/ persistentes versus regressivas no subtipo Proliferativo por meio de um modelo de efeitos mistos linear que corrige o teor de células epiteliais ('Epitelial' em xCell e 'Mucosa Normal' em Bindea et al.) e o paciente como um efeito aleatório. Nós nos concentramos em tipos de células que eram significativamente diferentes (FDR < 0,05) entre lesões progressivas/persistentes versus regressivas no subtipo Proliferativo tanto na Coorte de Descoberta como na Coorte de Validação.
Relação entre as biópsias e esfregaços
[0263] Desejou-se quantificar o desempenho preditivo do esfregaço em relação à presença de uma biópsia do subtipo
Proliferativo. Um subconjunto de preditores de subtipo molecular de 22 genes foi usado para prever a presença ou ausência do subtipo Proliferativo nos esfregaços e biópsias na DC e VC. Especificamente, foram usados 8 genes (de 22) que correspondiam aos Módulos 4 a 7 (significativamente regulados positiva ou negativamente no subtipo Proliferativo) para classificar as amostras como proliferativas ou não usando a mesma metodologia descrita acima para o preditor de subtipo molecular. As métricas de desempenho de sensibilidade e especificidade foram calculadas com base na capacidade de uma previsão do subtipo Proliferativo nos esfregaços na DC ou VC para indicar a presença de pelo menos uma biópsia do subtipo Proliferativo.
A fim de compreender melhor as previsões do subtipo Proliferativo nos esfregaços, o comportamento dos módulos que definem o subtipo Proliferativo nas biópsias na DC (com base nos métodos acima) foi analisado nos esfregaços na DC e VC.
[0264] Coloração imunofluorescente e quantificação
[0265] Técnicas padrão de fixação e incorporação de formalina foram empregadas em Roswell, onde seções de 5 mícrons foram cortadas das amostras FFPE usadas para a avaliação patológica de rotina em Roswell (Tabela 7). Antes da coloração, as amostras foram removidas da cera com xileno e reidratadas por meio de uma série graduada de soluções de etanol. AR ou tampão de citrato foi usado para recuperação de antígeno, o tecido foi incubado com anticorpos primários durante a noite a 4°C e hibridizado com anticorpos secundários com conjugados fluorescentes (Invitrogen Alexa Fluor 488, 594, 647) durante 1 hora em temperatura ambiente.
A imunocoloração foi realizada usando os anticorpos primários listados na Tabela 9. A imagem foi realizada usando um Scanner Aperio Slide para pontuação e um Carl Zeiss Axio (objetivas de 20x e 40x) e um microscópio confocal Carl Zeiss LSM 710 NLO para capturar imagens adicionais. As lâminas digitais foram analisadas com o Definiens Tissue Studio (Definiens Inc.) para a enumeração da coloração de imunofluorescência. A enumeração da imunofluorescência pontuou cada coloração, incluindo células DAPI positivas. A contagem foi realizada em diferentes regiões (áreas independentes de tecido) presentes em uma lâmina (1-5 regiões/biópsia) para cada biópsia. Para cada região, a porcentagem de células com coloração positiva para uma determinada proteína foi calculada ao dividir o número de células com coloração positiva pelo número total de células positivas para DAPI. Um modelo de efeitos mistos binomial através do pacote lme4 R foi usado para avaliar as diferenças nas percentagens de células com coloração positiva para uma determinada proteína em cada região entre biópsias progressivas/persistentes versus regressivas usando o total de células coradas em cada região como pesos e ajustando para o número da lâmina como um efeito aleatório. Os modelos foram usados em amostras do subtipo Proliferativo e em amostras do subtipo Proliferativo onde o resultado da biópsia (progressiva/persistente versus regressiva) concordou com a pontuação GSVA do Módulo 9 (pontuações menores que 0 estão associadas à progressão/persistência e pontuações maiores do que 0 estão associados à regressão). Cada região também foi avaliada qualitativamente como positiva ou negativa ao ter um padrão de localização de células T CD8 distinto, em que as células revestiram e foram incorporadas ao epitélio.
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Tabela 1. Anotação demográfica e clínica sobre indivíduos em ambas as coortes de Descoberta e Validação. Os testes estatísticos entre as coortes de Descoberta e Validação foram realizados usando o Teste Exato de Fisher para variáveis categóricas e o teste t de Student para variáveis contínuas.
As porcentagens são relatadas para variáveis categóricas e a média e os desvios padrão são relatados para variáveis contínuas Coorte de Coorte de Descoberta Validação (n=20 Variável (n=30 indivíduos) Valor p indivíduos) Média # Biópsias/Indivíduo 6,6 (5,7) 5,25 (2,9) 0,3 Média # Broncoscopias/ Indivíduo 2,8 (1,5) 2,4 (0,8) 0,27 Tempo Médio Entre as Broncoscopias (Dias) 368,2 (201,4) 360,1 (212,5) 0,87 Homens 15/30 (50) 12/20 (60) 0,57 Brancos 27/30 (90) 17/20 (85) 0,67 Idade (na Visita Clínica de Linha de Base) 58,8 (7,6) 58,7 (8,3) 0,97 Ex-fumante (na Visita Clínica de Linha de 29/30 (96,7) 19/20 (95) 1 Base) História Anterior de Câncer de Pulmão 21/30 (70) 12/20 (60) 0,55 COPD (FEV1/FVC <= 0,7, na Visita Clínica de 17/27 (63,0) 8/18 (44,4) 0,24 Linha de Base) GOLD 1 (FEV1 % > 80) 2/27 (7,4) 2/18 (11,1) 1 GOLD 2 (FEV1 % < 80 e > 50) 12/27 (44,4) 5/18 (27,8) 0,35 GOLD 3 (FEV1 % < 50 e > 30) 3/27 (11,1) 1/18 (5,6) 0,64 Amianto Ocupacional 13/30 (43,3) 9/20 (45) 1 Trabalho Ocupacional de Alto Risco 14/30 (46,7) 12/20 (60) 0,4
Coorte de Descoberta Coorte de Validação Variável P-valor (n=30) (n=20)
Média # Biópsias/Indivíduo 6,6 (5,7) 5,25 (2,9) 0,3
Média # Broncoscopias/ Indivíduo 3,1 (1,6) 2,5 (0,7) 0,08
Tempo Médio Entre as Broncoscopias (Dias) 348,6 (197,5) 366,8 (208,3) 0,69
Homens 15/30 (50) 12/20 (60) 0,81
Brancos 27/30 (90) 17/20 (85) 1
Idade (na Visita Clínica de Linha de 58,8 (7,6) 58,7 (8,3) 0,97 Base)
Ex-fumante (na Visita Clínica de Linha de 29/30 (96,7) 19/20 (95) 1 Base)
Maços-anos 49,8 (22,1) 41,3 (20,7) 0,17
História Anterior de Câncer de Pulmão 21/30 (70) 12/20 (60) 0,82
LUSC 5/30 (16,7) 5/20 (25) 0,73
Other 16/30 (53,3) 7/20 (35) 0,6
COPD (FEV1/FVC <= 0,7, na Visita Clínica 17/27 (63,0) 8/18 (44,4) 0,61 de Linha de Base)
GOLD 1 (FEV1 % > 80) 2/27 (7,4) 2/18 (11,1) 1
GOLD 2 (FEV1 % < 80 e > 50) 12/27 (44,4) 5/18 (27,8) 0,56
GOLD 3 (FEV1 % < 50 e > 30) 3/27 (11,1) 1/18 (5,6) 1
Amianto Ocupacional 13/30 (43,3) 9/20 (45) 1
Trabalho Ocupacional de Alto Risco 14/30 (46,7) 12/20 (60) 0,62
Tabela 2. Anotação clínica em amostras em ambas as coortes de Descoberta e Validação.
Os testes estatísticos entre as coortes de Descoberta e Validação nas biópsias ou nos esfregaços foram realizados usando o Teste Exato de Fisher e as porcentagens são relatadas Variável Coorte de Descoberta Coorte de Validação P-valor
Tipo de amostra Biópsias Esfregaços Biópsias Esfregaços Biópsias Esfregaços
Histologia 0,05 0,42
Normal 38/190 (20) 6/89 (6,7) 23/105 (21,9) 0/48 (0)
Hiperplasia 30/190 (15,8) 11/89 (12,4) 31/105 (29,5) 9/48 (18,8)
Metaplasia 46/190 (24,2) 15/89 (16,9) 14/105 (13,3) 9/48 (18,8)
Displasia Leve 21/190 (11,1) 9/89 (10,1) 13/105 (12,4) 6/48 (12,5)
Displasia Moderada 38/190 (20) 130/89 (33,7) 20/105 (19,0) 8/48 (37,5)
Displasia Grave 12/190 (6,3) 17/89 (19,1) 4/105 (3,8) 8/48 (12,5)
CIS 1/190 (0,5) 0/89 (0) 0/105 (0) 0/48 (0)
Tumor 0/190 (0) 1/89 (1,1) 0/10S (0) 0/48 (0)
Histologia 4/190 (2,1) 0/89 (0) 0/10S (0) 0/48 (0) Desconhecida
Fumante Atual 122/190 (64,3) 50/89 (56,2) 53/105 (50,5) 27/48 (56,3) 0,03 1 (Previsão Genômica)
Estado de Progressão 0,39
Normal/Estável 47/190 (24,7) 35/105 (33,3)
Progressiva/ 44/190 (23,2) 20/105 (19,0) Persistente
Regressiva 30/190 (15,8) 18/105 (17,1)
Desconhecida 69/190 (36,3) 32/105 (30,5)
Variável Coorte de Descoberta Coorte de Validação Valor p
Tipo de amostra Biópsias Esfregaços Biópsias Esfregaços Biópsias Esfregaços
Histologia 0,05 0,42
Normal 38/190 (20) 6/89 (6,7) 23/105 (21,9) 0/48 (0)
30/190 (15,8) 11/89 Hiperplasia 31/105 (29,5) 9/48 (18,8) (12,4)
46/190 (24,2) 15/89 Metaplasia 14/105 (13,3) 9/48 (18,8) (16,9)
Displasia Leve 21/190 (11,1) 9/89 (10,1) 13/105 (12,4) 6/48 (12,5)
38/190 (20) 130/89 Displasia Moderada 20/105 (19,0) 8/48 (37,5) (33,7)
Displasia Grave 12/190 (6,3) 17/89 (19,1) 4/105 (3,8) 8/48 (12,5)
CIS 1/190 (0,5) 0/89 (0) 0/105 (0) 0/48 (0)
Tumor 0/190 (0) 1/89 (1,1) 0/10S (0) 0/48 (0)
Histologia 4/190 (2,1) 0/10S (0) 0/48 (0) Desconhecida 0/89 (0)
Fumante Atual 119/190 (62,5) 38/105 (36,2) 20/48 (41,7) 1,80E-05 0,47 (Previsão Genômica) 44/89 (49,4)
Estado de Progressão 0,39
Normal/Estável 47/190 (24,7) 35/105 (33,3) Progressiva/ 44/190 (23,2) 20/105 (19,0) Persistente Regressiva 30/190 (15,8) 18/105 (17,1) Desconhecida 69/190 (36,3) 32/105 (30,5) Tabela 3. Resumo das características do subtipo molecular na coorte de Descoberta. Para cada subtipo molecular, associações significativas são relatadas com cada um dos 9 módulos gênicos, características clínicas, marcadores de genes epiteliais e de glóbulos brancos do tipo de célula canônica, vias
PROLIFERATIVO Módulos positivamente 4, 5, 7 regulados Módulos negativamente 6 regulados Características Clínicas Fumante atual (88 %), biópsias displásicas (63 %) Características Subtipos de SCC – Basal e Clássico; TUB5A1, SCG8141 Biológicas negativamente regulado; KRT5, KI67 positivamente regulado Vias Ciclo Celular: BUB1B/1/3, CHEK1/2, CDK1/2/4/6, E2F1/3/2/4, MCM4/3/5/6/7, TP53, RB1 Reparo de DNA: TP53, PARP1, RAD51, BRCA2, FANCA/D2/G/E/M/C, XRCC5/6, ERCC6 Fosforilação oxidativa e cadeia de transporte de elétrons: ATP sintases, NADH ubiquinona oxidorredutases, citocroma C oxidases TFs E2
INFLAMATÓRIO
Módulos positivamente 1, 2, 7, 8 regulados Módulos negativamente 4, 5, 6 regulados Características Clínicas Fumante anterior (59 %), biópsias não displásicas (68 %) Características Subtipos de LUSC – Secretor: TUB1A1, MUC5AC negativamente Biológicas regulado Vias Matriz extracelular, adesão focal e vias de integrina: genes de colágeno, integrina e laminina Citocina/quimiocina: CCL2/14/19/21/28, CVCX12/14/5, CCR1/2/3/4/5, IL18, IL11RA, IL18RB, IL3RA, EGF, IL15, CX3CR1, TGFB1/B2/B3, KIT Regulação negativa de fosforilação oxidativa, transporte de elétrons respiratório, ciclo celular TFs SRF
SECRETOR Módulos positivamente 6, 8 regulados Módulos negativamente 1, 2, 5, 7 regulados Características Clínicas Fumante atual (63 %), biópsias não displásicas (68 %) Características Subtipos de SCC – Secretor: CD45, MUC5AC, TUB2A1 Biológicas positivamente regulado, KI67, KR15 negativamente regulado Vias Regulação negativa da matriz extracelular, adesão focal e vias de integrina TFs Regulação negativa de E2F
NORMAL Módulos positivamente 1, 6 regulados Módulos negativamente 8, 9 regulados
Características Clínicas Fumante anterior (65 %), biópsias não displásicas (75 %) Características CD45, MUC5AC, KI67 negativamente regulado; SCGB1A1, KRT5, Biológicas TUB1A1 positivamente regulado Vias Genes da matriz extracelular central: genes de colágeno e laminina, WISP1/2 Regulação negativa de imunidade inata e adaptativa: Genes de HLA, IRF1/4/7/8, TLR2/4/6/8/10, IK8KB TFs Regulação negativa de PEA3, IRF, NFkB
PROLIFERATIVO Módulos positivamente 4, 5, 7 regulados Módulos negativamente 6 regulados Características Clínicas Fumante atual (88 %), biópsias displásicas (63 %) Características Subtipos LUSC – Basal e Clássico; TUB5A1, SCG8141 Biológicas negativamente regulado; KRT5, KI67 positivamente regulado Vias Ciclo Celular: BUB1B/1/3, CHEK1/2, CDK1/2/4/6, E2F1/3/2/4, MCM4/3/5/6/7, TP53, RB1 Reparo de DNA: TP53, PARP1, RAD51, BRCA2, FANCA/D2/G/E/M/C, XRCC5/6, ERCC6 Fosforilação oxidativa e cadeia de transporte de elétrons: ATP sintases, NADH ubiquinona oxidorredutases, citocroma C oxidases Fatores de Transcrição E2F
INFLAMATÓRIO Módulos positivamente 1, 2, 7, 8 regulados Módulos negativamente 4, 5, 6 regulados Características Clínicas Fumante anterior (59 %), biópsias não displásicas (68 %)
Características Subtipos de SCC – Secretor: TUB1A1, MUC5AC negativamente Biológicas regulado Vias Matriz extracelular, adesão focal e vias de integrina: genes de colágeno, integrina e laminina Citocina/quimiocina: CLL2/14/19/21/28, CCR1/2/3/4/5, IL18, IL11RA, IL17RB, IL3RA, EGF, IL15, CX3CR1, TGFB1/B2/B3, KIT Regulação negativa de fosforilação oxidativa, transporte de elétrons respiratório, ciclo celular Fatores de Transcrição SRF
SECRETOR Módulos positivamente 6, 8 regulados Módulos negativamente 1, 2, 5, 7 regulados Características Clínicas Fumante atual (77 %), biópsias não displásicas (66 %) Características Subtipos de LUSC – Secretor: CD45, MUC5AC, TUB1A1 Biológicas positivamente regulado, KI67, KR15 negativamente regulado Vias Regulação negativa da matriz extracelular, adesão focal e vias de integrina Fatores de Transcrição Regulação negativa de E2F NORMAL-LIKE Módulos positivamente 1, 6 regulados Módulos negativamente 8, 9 regulados Características Clínicas Fumante anterior (65 %), biópsias não displásicas (75 %) Características CD45, MUC5AC, KI67 negativamente regulado; SCGB1A1, KRT5, Biológicas TUB1A3 positivamente regulado Vias Genes da matriz extracelular central: genes de colágeno e laminina, WISP1/2
Regulação negativa de imunidade inata e adaptativa: Genes de HLA, IRF1/4/7/8, TLR2/4/6/8/10, IK8KB Fatores de Transcrição Regulação negativa de PEA3, IRF, NFkB EXEMPLO 2: Material Suplementar para o Exemplo 1 Materiais e Métodos N-nitrosotris-(2-cloroetil)ureia (NTCU) para coleta de amostra de camundongo e preparação de biblioteca
[0266] Coletamos previamente e armazenamos RNA de 40 seções de pulmão inteiro congeladas frescas (cachos) e tecido microdissecado a laser (LCM) isolado com um instrumento Acrutus Pixcell™ II de camundongos SWR/J e A/J tratados com NTCU. Os camundongos foram tratados topicamente com 15 ou 25 μmol de NTCU (25 μl de NTCU a 40 mM durante 15 ou 25 semanas) como parte de um estudo realizado de acordo com o protocolo aprovado pelo IACUC no RPCC. As amostras incluem exemplos de: normal (SWR/J n = 3 LCM & 3 cachos e A/J n = 2 LCM e 1 cachos), metaplasia/displasia leve (SWR/J n = 5 LCM e 2 cachos), displasia moderada (SWR/J n = 7 LCM e 4 cachos e A/J n = 2 LCM e 1 cachos) e displasia grave (SWR/J n = 3 LCM e 2 cachos) e carcinoma in situ/LUSC (A/J n = 2 LCM e 2 cachos). As amostras foram extraídas usando o kit Qiagen mi- RNAeasy de acordo com o protocolo do fabricante. Bibliotecas de sequenciamento serão preparadas a partir de amostras de RNA total usando o kit de preparação de amostra Illumina TruSeq v2. Cada amostra foi sequenciada em cinco por fileira no Illumina HiSeq 2500 para gerar leituras de 50 nucleotídeos de extremidade única.
Classificação histológica de RNA de amostras de camundongos NTCU sequenciadas (n = coletadas / n = passadas QC após sequenciamento) Displasia Tumor Linhagem de Tipo de Displasia Displasia Normal Moderada/ CIS/SCC Total camundongo amostra Leve Grave Grave A/J LCM 2/2 - 2/2 - 2/1 6/5 A/J 1/1 - 1/1 - 2/1 4/3 Cachos SWR/J LCM 4/1 5/3 7/3 3/1 19/8 SWR/J 11/9 3/3 2/2 4/3 2/1 Total Cachos 40/25 Valores RIN médios 4,0 3,4 3,8 (0,5) 3,3 (0,6) 2,55 (0,1) (SD) (1,8) (1,2) Processamento de Dados do Camundongo NTCU
[0267] A desmultiplexação e a criação de arquivos FASTQ foram realizadas usando Illumina CASAVA 1.8.2.
Trimmomatic foi usado para cortar sequências do adaptador, bem como para cortar leituras de baixa qualidade usando os seguintes parâmetros: ILLUMINACLIP: TruSeq3-SE.fa: 2: 30: 10, LEADING: 20, TRAILING: 20, SLIDINGWINDOW: 4:20, e MINLEN:
20. Após o corte, mais de 99 % das leituras foram retidas em todas as amostras. As amostras foram subsequentemente alinhadas usando alinhamento STAR (44) mm9 e 2 passagens. As contagens de nível de gene e transcrição foram calculadas usando RSEM (45) usando anotação Ensembl. As métricas de qualidade foram calculadas por STAR e RSeQC (46).
Inicialmente, 15 amostras foram removidas com base na porcentagem de leituras exclusivamente alinhadas (comparado com o total de leituras) inferior a 15 %. Subsequente amostragem e filtração de genes foram conduzidas separadamente em cada conjunto da seguinte forma: primeiro, EdgeR (48) foi usado para computar dados normalizados (tamanhos de biblioteca normalizados usando TMM, média aparada de M valores e contagens log2 por milhão computadas) e foram excluídos os genes que tinham um intervalo interquartil igual a zero ou uma soma nas amostras igual ou menor do que 1. As amostras foram excluídas com base em valores maiores do que 2 desvios padrão da média para 1) correlação média de Pearson com todas as outras amostras calculadas em todos os genes filtrados, 2) os primeiro ou segundo componentes principais calculados usando a matriz de expressão gênica filtrada, 3) número de integridade do transcrito (TIN, calculado por RSeQC). Após filtração da amostra, a filtração do gene foi recalculada conforme descrito acima no conjunto final de amostras de alta qualidade. Os dados estão disponíveis no Gene Expression Omnibus do NCBI usando o acesso GSE111091.
Quantificação por Imunofluorescência do Tipo de Célula e Marcadores Proliferativos
[0268] Os marcadores de tipo de célula basal e ciliada (KRT5 e TUB1A1) e o marcador proliferativo (KI67) foram enumerados manualmente para todo o epitélio em uma biópsia em referência à coloração de DAPI, com um mínimo de 500 células contadas por biópsia. A contagem foi realizada em diferentes regiões (áreas independentes de tecido) presentes em uma lâmina (1-4 regiões/biópsia) para cada biópsia. Uma porcentagem de células positivamente coradas foi calculada para cada marcador em cada região enumerada. Um modelo de efeitos mistos binomial por meio do pacote lme4 R foi usado para avaliar as diferenças nas porcentagens de células com coloração positiva para uma determinada proteína em cada região entre os subtipos moleculares usando o total de células coradas em cada região como pesos e ajustando para o paciente como um efeito.
Processamento de Dados de Tumores TCGA SCC
[0269] A transcrição Log2 por milhão de dados em 20.500 genes de 476 tumores LUSC foi obtida de Campbell (10) et al.
Foram excluídos os genes que tinham um intervalo interquartil igual a zero ou uma soma entre as amostras igual ou menor do que 1. As amostras foram excluídas com base em valores maiores do que 2 desvios padrão da média para mais de um dos seguintes critérios: 1) correlação média de Pearson com todas as outras amostras calculadas em todos os genes filtrados,
2) os primeiro ou segundo componentes principais calculados usando a matriz de expressão de gene filtrada, 3) número de integridade do transcrito (TIN, calculado por RSeQC). Após filtração da amostra, a filtração de genes foi recalculada conforme descrito acima (n = 17.887 genes) no conjunto final de amostras de alta qualidade (n = 471 tumores).
[0270] A Tabela 5 descreve as vias enriquecidas nos Módulos Genéticos.
Tabela 5. Resultados enriquecidos (FDR < 0,05) para vias selecionadas associadas a cada módulo gênico FDR para Número de Número de Vias Biológicas Associadas e diferença entre Genes Chave Módulo Genes Módulos Gênicos subtipos moleculares Colágenos, Matriz Extracelular / Adesão 1 514 Lamininas, 2,70E-36 Celular TGFb Processamento e Emenda de 2 939 RBMs & SRSF 7,20E-05 mRNA Regulação Transcricional em Resposta a Estímulos - (AP- 3 20 1) JUN & FOS 1,90E-01 Genes de Resposta Imediata / Precoce COXs & 4 64 OXPHOS / ETC / TCA 3,30E-07 NDUFs PCNA, Ciclo Celular / Replicação TOP2A, CDC, 5 209 2,00E-31 de DNA / Reparo de DNA AURK, RAD,
XRCC
Organização e montagem 6 1295 FOXJ1, DYNC 6,60E-57 ciliar
Proteínas Ribossômicas / 7 180 RPLs & RPSs 1,90E-13 Tradução
CD8A, CD86, Ativação Imune e Resposta GATA, STAT, 8 603 Inflamatória (regulação de 3,30E-07 IL1B, leucócitos/linfócitos) CD163, CD68
Sinalização a Interferon e SP100, 9 112 Processamento e Apresentação 1,30E-02 HLAs, STAT1 de Antígeno
Tabela 6. Associações de subtipo molecular a características clínicas e biológicas dentro da Coorte de Descoberta (DC) e da Coorte de Validação (VC). Os testes estatísticos nas coortes de Descoberta e Validação foram realizados usando o
Teste Exato de Fisher
Teste Exato de Fisher para Subtipo Molecular V.
Variável
Variável valor P para DC valor P para VC
Estado genômico fumante 1,00E-07 9,64E-03
Indivíduo 9,66E-05 5,87E-03
Individuo/Tempo 6,96E-04 1,40E-02
Histologia 6,75E-03 9,99E-08
Localização 2,57E-02 6,69E-01
Indivíduo/Localização 6,01E-02 1,95E-01
Exposição ao Amianto 1,23E-01 7,47E-02
História de Câncer de Pulmão 1,32E-01 9,92E-01
Estado de Progressão 1,60E-01 1,67E-05
Trabalho de Alto Risco 4,31E-01 8,30E-01
Sexo 5,62E-01 8,90E-01
Subtipo de Tumor LUSC 9,99E-08 1,80E-06
COPD 1,62E-01 9,38E-03 Variável valor P para DC valor P para VC Estado genômico fumante 2,71E-09 2,72E-04 Indivíduo 9,66E-05 5,87E-03 Individuo/Tempo 6,96E-04 1,40E-02 Histologia 6,75E-03 9,99E-08 Localização 2,57E-02 6,69E-01 Indivíduo/Localização 6,01E-02 1,95E-01 Exposição ao Amianto 1,23E-01 7,47E-02 História de Câncer de Pulmão 1,32E-01 9,92E-01 Estado de Progressão 1,60E-01 1,67E-05 Trabalho de Alto Risco 4,31E-01 8,30E-01 Sexo 5,62E-01 8,90E-01 Subtipo de Tumor LUSC 9,99E-08 1,80E-06 Status de COPD 1,62E-01 9,38E-03 Tabela 7. Associações estatísticas entre Progressão/Persistência versus Regressão dentro de cada Subtipo Molecular e Coorte (DC e VC) para cada Módulo gênico.
P valores abaixo de 0,05 são relatados. ns = não significativo e N/A = amostras insuficientes em cada grupo para conduzir a análise. Para o subtipo molecular, N = normal, S = secretor, I = inflamatório e P = proliferativo Subtipo Molecular N N S S I I P P Coorte DC VC DC VC DC VC DC VC Número de Lesões Progressivas/Persistentes 5 1 17 7 7 5 15 7 Número de Lesões Regressivas 3 3 8 1 4 1 15 13 Número do Módulo 1 ns N/A ns N/A ns N/A ns ns
2 ns N/A ns N/A ns N/A ns ns
3 ns N/A ns N/A ns N/A 0,047 ns
4 0,026 N/A ns N/A ns N/A ns ns
5 ns N/A ns N/A ns N/A ns ns
6 ns N/A ns N/A ns N/A ns ns
7 ns N/A ns N/A ns N/A ns ns
8 0,027 N/A ns N/A 0,005 N/A ns ns
9 ns N/A ns N/A ns N/A 0,0017 0,03
Subtipo Molecular N N S S I I P P
Coorte DC VC DC VC DC VC DC VC
Número de Lesões Progressivas/Persistentes 5 1 17 7 7 5 15 7
Número de Lesões Regressivas 3 3 8 1 4 1 15 13
Número do Módulo
1 ns N/A ns N/A ns N/A ns ns
2 ns N/A ns N/A ns N/A ns ns
3 ns N/A ns N/A ns N/A 0.047 ns
4 0,026 N/A ns N/A ns N/A ns ns
5 ns N/A ns N/A ns N/A ns ns
6 ns N/A ns N/A ns N/A ns ns
7 ns N/A ns N/A ns N/A ns ns
8 0,027 N/A ns N/A 0,005 N/A ns ns
9 ns N/A ns N/A ns N/A 0,0017 0,03
Tabela 8. Locais pulmonares onde as biópsias endobronquiais foram obtidas.
O código, o nome e a descrição do local são relatados para cada local
ID Nome Descrição
096 VC Cordas vocais verdadeiras, pescoço
051 Bucal Assoalho bucal
007 EPIG Epiglote
005 ART Aritenoides
008 FVC Cordas vocais falsas
095 TR Traqueia
050 MC Carina principal, Carina NOS
086 RMB Brônquio principal direito, incl.
Carina secundária direita
091 RUL Lobo superior direito
093 RULO Orifício ou abertura do lobo superior direito
094 RULS Coto do lobo superior direito
092 RULB Brônquio do lobo superior direito
087 RML Lobo mediano direito
089 RMLO Orifício ou abertura do lobo mediano direito
090 RMLS Coto do lobo mediano direito
088 RMLB Brônquio do lobo mediano direito
082 RLL Lobo inferior direito
084 RLLO Orifício do lobo inferior direito
085 RLLS Coto do lobo inferior direito
083 RLLB Brônquio do lobo inferior direito
006 BI Brônquio Intermediário
052 RB1 Segmento apical RUL (AS)
060 RB2 Segmento posterior RUL (PS)
063 RB3 Segmento anterior RUL (ANTS)
053 RB1/2 Carina RUL entre RB1 e RB2
054 RB1/3 Carina RUL entre RB1 e RB3
061 RB2/3 Carina RUL entre RB2 e RB3
059 RB1A/B Carina RUL AS entre RB1 A e B
062 RB2A/B Carina RUL PS entre RB2 A e B
064 RB3A/B Carina RUL ANTS entre RB3 A e B
065 RB4 Segmento lateral RML (LS)
068 RB5 Segmento medial RML (MS)
066 RB4/5 Carina RML LS entre RB4 e RB5
067 RB4A/B Carina RML LS entre RB4 A e B
069 RB5A/B Carina RML MS entre RB5 A e B
070 RB6 Segmento RLL Superior Basal (SBS)
071 RB6A/B Carina RLL SBS entre RB6A e B
072 RB6A/C Carina RLL SBS entre RB6A e C
073 RB6B/C Carina RLL SBS entre RB6B e C
074 RB7 Segmento RLL Medial Basal (MBS)
075 RB7A/B Carina RLL MBS entre RB7A e B
076 RB8 Segmento RLL Anterior Basal (ABS)
077 RB8/9 Carina RLL ABS entre RB8 e RB9
078 RB8A/B Carina RLL ABS entre RB8A e B
079 RB9 Segmento RLL Lateral Basal (LBS)
080 RB9/10 Carina RLL LBS entre RB9 e RB10
081 RB9A/B Carina RLL LBS entre RB9A e B
055 RB10 Segmento RLL Posterior Basal (PBS)
056 RB10A/B Carina RLL PBS entre RB10A e B
057 RB10A/C Carina RLL PBS entre RB10A e C
058 RB10B/C Carina RLL PBS entre RB10B e C
001 666 Localização foi cirurgicamente alterada ou removida
002 777 Abstrator precisa de ajuda clínica para codificar
003 888 Código de localização é desconhecido, ilegível
004 999 Código de localização está em branco, não anotado
043 LMB Brônquio principal esquerdo, incl.
Carina secundária esquerda
044 LMBD Brônquio principal esquerdo, Distal
046 LUL Lobo superior esquerdo
048 LULO Orifício ou abertura do lobo superior esquerdo
049 LULS Coto do lobo superior esquerdo
035 LGL Língula
037 LGLO Orifício ou abertura lingular
038 LGLS Coto lingular
047 LULB Brônquio do lobo superior esquerdo
045 LUDB Brônquio da divisão superior esquerda
036 LGLDB Brônquio da divisão lingular, brônquio lingular
039 LLL Lobo inferior esquerdo
041 LLLO Orifício ou abertura do lobo inferior esquerdo
042 LLLS Coto do lobo inferior esquerdo
040 LLLB Brônquio do lobo inferior esquerdo
009 LB1+2 Segmento LUL Apical-Posterior (APS)
018 LB3 Segmento LUL Anterior
011 LB1/2 Carina LUL APS entre LB1 e LB2
010 LB1+2/3 Carina LUL APS entre LB1+2 e LB3
016 LB2A/C Carina LUL APS entre LB2 A e C
017 LB2B/C Carina LUL APS entre LB2B e C
019 LB3A/B Carina LUL ANTS entre LB3A e B
020 LB4 Segmento lingular LUL Superior (SLS)
023 LB5 Segmento lingular LUL Inferior (ILS)
021 LB4/5 Carina LUL SLS entre LB4 e LB5
022 LB4A/B Carina LUL SLS entre LB4A e B
024 LB5A/B Carina LUL ILS entre LB5A e B
025 LB6 Segmento LLL Superior (SS)
026 LB6A/B Carina LLL SS entre LB6A e B
027 LB6A/C Carina LLL SS entre LB6A e C
028 LB6B/C Carina LLL SS entre LB6B e C
029 LB8 Segmento LLL Antero Medial Basal (AMBS)
030 LB8/9 Carina LLL AMBS entre LB8 e LB9
031 LB8A/B Carina LLL AMBS entre LB8A e B
032 LB9 Segmento LLL Lateral Basal (LBS)
033 LB9/10 Carina LLL LBS entre LB9 e LB10
034 LB9A/B Carina LLL LBS entre LB9A e B
012 LB10 Segmento LLL Posterior Basal (PBS)
013 LB10A/B Carina LLL PBS entre LB10A e B
014 LB10A/C Carina LLL PBS entre LB10A e C
015 LB10B/C Carina LLL PBS entre LB10B e C
Tabela 9. Anticorpos usados nos estudos de imunofluorescência
Marcadores de tipo de célula imune
Anticorpo Companhia Catálogo Diluição Recuperação de Antígeno Espécie
CD68 Dako m0876 1- 250 AR6 camundongo
CD163 Cell Marque 163m-16 1-100 AR9 camundongo CD4 Thermo Fisher ms1528S 1-100 AR9 camundongo CD8 Dako M7103 1-100 AR9 camundongo Marcadores de proliferação e tipo de célula epitelial Ac-α-Tub Sigma T6793 1-100 Citrato camundongo KRT5 BioLegend 905-901 1-100 Citrato galinha KI67 Abcam ab16667 1-100 Citrato coelho Tabela 10. Estado genômico de tabagismo ao longo do tempo por indivíduo
[0271] O estado de tabagismo de cada indivíduo em cada momento foi calculado com base em uma assinatura gênica associada ao tabagismo anteriormente publicada (consulte os métodos para obter detalhes). As linhas indicam o estado de fumante em todos os momentos de amostras para cada paciente.
O símbolo → indica variações no estado de fumante ao longo do tempo. Não há diferença estatística entre a distribuição dos indivíduos nas categorias de tabagismo entre as coortes de Descoberta e Validação por um Teste Exato de Fisher bilateral (p = 0,90). Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de dados de origem.
Coorte de Descoberta Coorte de Validação Estado de fumante genômico ao longo do tempo Número de indivíduos Número de indivíduos Atual 9 9 Ex-fumante 10 5 Atual → ex-fumante 7 4 Ex-fumante → atual 3 2
Atual → ex-fumante → atual 1 0 Tabela 12. Associações de subtipo molecular com história prévia de câncer de pulmão: A história anterior de câncer de pulmão (LC) foi categorizada da seguinte forma: sem história (Sem história de LC), uma história anterior de LC que inclui um carcinoma de células escamosas do pulmão (História de LC - LUSC) e uma história anterior de LC que não inclui um carcinoma de células escamosas do pulmão (História de LC - Outros). Os testes estatísticos nas coortes de Descoberta e Validação foram realizados usando os testes exatos de Fisher bilaterais.
Biópsias da Coorte de Descoberta Biópsias da Coorte de Validação (n=190) (n=105) Sem História História Sem História História P- P- Variável história de LC - de LC - história de LC - de LC - Valor Valor de LC LUSC Outros de LC LUSC Outros Subtipo molecular Proliferativo 14 5 33 12 9 7 Inflamatório 10 6 21 12 4 14 Secretor 26 8 27 14 13 7 Normal 9 3 28 p=0,19 6 1 6 p=0,10

Claims (41)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais caracterizado por compreender: administrar pelo menos um de: i. tanto um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central quanto uma tomografia computadorizada do tórax; ii. pelo menos a cada 6 meses, um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou iii. pelo menos um fármaco antiproliferativo; a um indivíduo determinado como tendo pelo menos um dentre: um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 5 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa; e um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos um gene do módulo 5 ser selecionado a partir do grupo que consiste em: RACGAP1 e TPX2; e pelo menos um do gene do módulo 6 ser selecionado a partir do grupo que consiste em: NEK11 e IFT88.
3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por o indivíduo ser ainda determinado como tendo um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 7 ou do módulo 4.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por pelo menos um do gene do módulo 7 ou do módulo 4 ser selecionado a partir do grupo que consiste em: COX6A1; COX7A2; RPL26; e RPL23.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o nível de expressão de cada um dos genes da Tabela 15 ser determinado.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por pelo menos um do fármaco antiproliferativo ser selecionado a partir do grupo que consiste em: antagonistas do receptor de acetilcolina; inibidores de acetilcolinesterase; antagonistas do receptor de adenosina; antagonistas do receptor adrenérgico; inibidores de AKT; antagonistas do receptor de angiotensina; estimulantes de apoptose; inibidores de quinase Aurora; inibidores de CDK; inibidores de ciclo-oxigenase; inibidores da produção de citocinas; inibidores de desidrogenase; inibidores de proteína quinase de DNA; inibidores de adesão focal; antagonistas do receptor de dopamina; inibidores de EGFR; inibidores de fosforilação ERK1 e ERK2; agonistas do receptor de estrogênio; inibidores de EZH2; inibidores de FLT3; agonistas do receptor de glicocorticoide; antagonistas do receptor de glutamato; inibidores de HDAC; antagonistas do receptor de histamina; inibidores de histona lisina metiltransferase; inibidores de HSP; inibidores de IKK; antagonistas de canal iônico; inibidores de JAK; inibidores JNK; inibidores de KIT; inibidores de quinase com repetição rica em leucina; inibidores de MDM; inibidores da liberação de mediador; inibidores de MEK; inibidores de MTOR; inibidores de monoamina oxidase; inibidores da via de NFB; inibidores de nucleofosmina; inibidores de PARP; agonistas do receptor PPAR; inibidores de PI3K; inibidores de tirosina quinase; inibidores de fosfodiesterase; inibidores de proteína quinase; inibidores de RAF; inibidores de RNA polimerase; inibidores de topoisomerase; inibidores da síntese de RNA; inibidores de SIRT; bloqueadores do canal de sódio; inibidores de VEGFR; e agonistas do receptor de vitamina D.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por o fármaco antiproliferativo ser administrado como uma formulação inalada ou formulação tópica.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o fármaco antiproliferativo ser administrado durante um procedimento com base em broncoscopia.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o fármaco antiproliferativo ser administrado sistemicamente.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por o fármaco antiproliferativo ser administrado durante um procedimento com base em broncoscopia e sistemicamente.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por o indivíduo ser ainda determinado como tendo um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 9 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa e/ou um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 10 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o indivíduo determinado como tendo um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 9 e/ou um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 10 ser administrado com pelo menos um de: i. tanto um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central em que as lesões são submetidas à biópsia para remover o tecido anormal, quanto uma tomografia computadorizada do tórax; ii. pelo menos a cada 6 meses, um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central em que as lesões são submetidas à biópsia para remover o tecido anormal e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou iii. pelo menos um fármaco imunoestimulante.
13. Método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais caracterizado por compreender: administrar pelo menos um de: i. tanto um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central em que as lesões são submetidas à biópsia para remover o tecido anormal, quanto uma tomografia computadorizada do tórax; ii. pelo menos a cada 6 meses, um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central em que as lesões são submetidas à biópsia para remover o tecido anormal e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou iii. pelo menos um fármaco imunoestimulante; a um indivíduo determinado como tendo um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 9 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa e/ou um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 10 comparado com um nível de referência de lesão não proliferativa.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado por o gene do módulo 9 ser selecionado a partir do grupo que consiste em: EPSTI1; UBE2L6; B2M e TAP1.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 14, caracterizado por pelo menos um do gene do módulo 9 ser selecionado a partir da Tabela 16.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado por o gene do módulo 10 ser selecionado a partir do grupo que consiste em: CACNB3 e MAPK10.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizado por pelo menos um do fármaco imunoestimulante ser selecionado a partir do grupo que consiste em: inibidores do ponto de verificação imune (por exemplo, inibidores contra PD-1, PD-L1, CTLA4 e LAG3); fármacos que estimulam a sinalização ao interferon (por exemplo, fármacos antivirais que melhoram a sinalização ao interferon); inibidores da síntese de DNA; inibidores de IMDH; inibidores de CDK; inibidores de ribonucleotídeo redutase; inibidores de di-hidrofolato redutase; inibidores de topoisomerase; inibidores de FLT3; inibidores de IGF-1; inibidores de MEK; inibidores de quinase Aurora; inibidores de PKC; inibidores de RAF; inibidores de PDFGR/KIT; inibidores de VEGFR; inibidores de SRC; agonistas do receptor de retinoide; inibidores de HDAC; inibidores de DNA metiltransferase; e inibidores de EZH2.
18. Método de tratamento de lesões pré-malignas bronquiais caracterizado por compreender: administrar pelo menos um de: iv. tanto um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central quanto uma tomografia computadorizada do tórax; v. pelo menos a cada 6 meses, um de um procedimento com base em broncoscopia para examinar a via aérea central e uma tomografia computadorizada do tórax; e/ou vi. pelo menos um anti-inflamatório; a um indivíduo determinado como tendo pelo menos um dentre:
um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 2 comparado com um nível de referência não inflamatório; e um nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 6 comparado com um nível de referência não inflamatório.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por pelo menos um gene do módulo 2 ser selecionado a partir do grupo que consiste em: MSANTD2, CCNL2 e LUC7L; e pelo menos um do gene do módulo 6 é selecionado a partir do grupo que consiste em: NEK11 e IFT88.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 18, caracterizado por o indivíduo ser ainda determinado como tendo um nível de expressão aumentado de pelo menos um gene do módulo 7, gene do módulo 1 ou gene do módulo 8 e/ou nível de expressão reduzido de pelo menos um gene do módulo 4 ou um gene do módulo 5.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por pelo menos um do gene do módulo 7 ser selecionado a partir do grupo que consiste em: RPL26 e RPL23.
22. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por pelo menos um do gene do módulo 1 ser selecionado a partir do grupo que consiste em: KIRREL; PHLDB1; e MARVELD1.
23. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por pelo menos um do gene do módulo 8 ser selecionado a partir do grupo que consiste em: DOC2; CD53; e LAPTM.
24. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por pelo menos um do gene do módulo 4 ser selecionado a partir do grupo que consiste em: COX6A1 e COX7A2
25. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por pelo menos um do gene do módulo 5 ser selecionado a partir do grupo que consiste em: RACGAP1 e TPX2
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizado por o nível de expressão de cada um dos genes da Tabela 15 ser determinado.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 25, caracterizado por pelo menos um do fármaco anti-inflamatório ser selecionado a partir do grupo que consiste em: antagonistas do receptor de acetilcolina; inibidores de acetilcolinesterase; antagonistas do receptor de adenosina; antagonistas do receptor adrenérgico; antagonistas do receptor de angiotensina; anticorpos anti-IL1B; estimulantes de apoptose; inibidores de quinase Aurora; inibidores de CDK; inibidores de ciclo-oxigenase; inibidores da produção de citocinas; antagonistas do receptor de dopamina; inibidores de EGFR; inibidores de fosforilação ERK1 e ERK2; agonistas do receptor de estrogênio; inibidores de FLT3; agonistas do receptor de glicocorticoide; antagonistas do receptor de glutamato; inibidores de HDAC; antagonistas do receptor de histamina; inibidores de histona lisina metiltransferase; inibidores de HSP; inibidores de IKK; antagonistas do canal iônico; inibidores de KIT; inibidores de quinase com repetição rica em leucina; inibidores de MEK; inibidores de MDM; inibidores de fosfodiesterase; inibidores de monoamino oxidase; inibidores de MTOR; inibidores da via de NFB; inibidores de nucleofosmina; inibidores de PARP; inibidores de PI3K; agonistas do receptor PPAR; inibidores da síntese de proteínas (por exemplo, cloranfenicol); inibidores de RAF; inibidores de SIRT; bloqueadores dos canais de sódio; inibidores do receptor de TGF beta; inibidores de topoisomerase; inibidores de tirosina quinase; inibidores de VEGFR; e agonistas do receptor de vitamina D.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 26, caracterizado por o fármaco anti-
inflamatório ser administrado durante um procedimento com base em broncoscopia.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 27, caracterizado por o fármaco anti- inflamatório ser administrado sistemicamente.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 28, caracterizado por o fármaco anti- inflamatório ser administrado durante um procedimento com base em broncoscopia e sistemicamente.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado por pelo menos um do gene ser selecionado a partir da Tabela 14.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado por o nível de expressão de cada um dos genes da Tabela 14 ser determinado.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado por o desenvolvimento de câncer de pulmão, carcinoma de células escamosas de pulmão ser prevenido, retardado ou diminuído.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado por o câncer de pulmão ser carcinoma de células escamosas do pulmão.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizado por o nível de expressão ser o nível de expressão em uma biópsia endobronquial, amostra de esfregaço endobronquial, biópsia de via aérea superior, amostra de esfregaço de via aérea superior, células epiteliais nasais, expectoração ou sangue obtido do indivíduo.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado por o nível de expressão ser o nível de expressão em um esfregaço bronquial obtido do brônquio principal direito ou esquerdo.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 35, caracterizado por a biópsia ou amostra de esfregaço compreender tecidos ou células morfologicamente normais.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 35, caracterizado por a biópsia ou amostra de esfregaço consistir em tecidos ou células morfologicamente normais.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado por o nível de expressão ser o nível de expressão em uma amostra que compreende células de lesão pré-maligna bronquial.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizado por o nível de expressão ser o nível de expressão em uma amostra que compreende células morfologicamente normais.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado por o indivíduo ser um fumante ou ex-fumante.
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