BR112021001010A2

BR112021001010A2 - terapia de aumento mitocondrial com células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais

Info

Publication number: BR112021001010A2
Application number: BR112021001010-6A
Authority: BR
Inventors: Natalie Yivgi Ohana; Uriel Halavee; Shmuel Bukshpan; Noa Sher
Original assignee: Minovia Therapeutics Ltd.
Priority date: 2018-07-22
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2021-04-20
Also published as: US20210322485A1; CN112601532A; MX2021000954A; IL280162A; EP3823642A4; CA3106188A1; WO2020021541A9; WO2020021541A1; KR20210035829A; EP3823642A1; AU2019311862A1; JP2022519409A

Abstract

TERAPIA DE AUMENTO MITOCONDRIAL COM CÉLULAS-TRONCO ENRIQUECIDAS COM MITOCÔNDRIAS FUNCIONAIS. Trata-se de células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais saudáveis e métodos terapêuticos que utilizam tais células para a atenuação de condições debilitantes, incluindo envelhecimento e doenças relacionadas à idade, bem como os efeitos debilitantes de terapias anticâncer em indivíduos com necessidade das mesmas.

Description

“TERAPIA DE AUMENTO MITOCONDRIAL COM CÉLULAS-TRONCO ENRIQUECIDAS COM MITOCÔNDRIAS FUNCIONAIS” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais e métodos terapêuticos que utilizam tais células para diminuir os efeitos debilitantes de várias afecções, incluindo envelhecimento e doenças relacionadas a idade, bem como os efeitos debilitantes de tratamentos de terapia anticâncer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A mitocôndria é uma organela ligada à membrana encontrada na maioria das células eucarióticas, estando na faixa de 0,5 a 1,0 μm de diâmetro. As mitocôndrias são encontradas em quase todas as células eucarióticas e variam em número e localização dependendo do tipo de célula. As mitocôndrias contêm seu próprio DNA (mtDNA) e seu próprio maquinário para sintetizar RNA e proteínas. O mtDNA contém apenas 37 genes, portanto, a maioria dos produtos gênicos no corpo dos mamíferos são codificados pelo DNA nuclear.

[003] As mitocôndrias realizam várias tarefas essenciais na célula eucariótica, como a oxidação do piruvato, o ciclo de Krebs e o metabolismo de aminoácidos, ácidos graxos e esteroides. No entanto, a função primária da mitocôndria é a geração de energia como trifosfato de adenosina (ATP) por meio da cadeia de transporte de elétrons e do sistema de fosforilação oxidativa (a “cadeia respiratória”). Processos adicionais nos quais as mitocôndrias estão envolvidas incluem produção de calor, armazenamento de íons de cálcio, sinalização de cálcio, morte celular programada (apoptose) e proliferação celular.

[004] A concentração de ATP dentro da célula é normalmente de 1 a 10 mM. O ATP pode ser produzido por reações redox usando-se açúcares simples e complexos (carboidratos) ou lipídios como fonte de energia. Para que combustíveis complexos sejam sintetizados em ATP, os mesmos precisam, primeiramente, ser quebrados em moléculas menores e mais simples. Os carboidratos complexos são hidrolisados em açúcares simples, como glicose e frutose. As gorduras (triglicerídeos) são metabolizadas para gerar ácidos graxos e glicerol.

[005] O processo geral de oxidação da glicose em dióxido de carbono é conhecido como respiração celular e pode produzir cerca de 30 moléculas de ATP a partir de uma única molécula de glicose. O ATP pode ser produzido por vários processos celulares distintos. As três principais vias usadas para gerar energia em organismos eucarióticos são a glicólise e o ciclo do ácido cítrico/fosforilação oxidativa, ambos componentes da respiração celular, e a beta-oxidação. A maior parte dessa produção de ATP por eucariotos não fotossintéticos ocorre na mitocôndria, que pode representar quase 25% do volume total de uma célula típica. Vários distúrbios mitocondriais são conhecidos por resultar de genes defeituosos no DNA mitocondrial.

[006] O documento WO 2016/135723 dos presentes inventores divulga células da medula óssea de mamíferos enriquecidas com mitocôndrias para o tratamento de doenças mitocondriais.

[007] O documento US 2012/0058091 divulga tratamentos diagnósticos e terapêuticos relacionados a distúrbios mitocondriais. O método envolve a microinjeção de mitocôndrias heterólogas em um oócito ou célula embrionária em que as mitocôndrias heterólogas têm capacidade para alcançar pelo menos níveis normais de potencial de membrana mitocondrial no oócito ou célula embrionária.

[008] O documento WO 2001/046401 divulga células embrionárias ou semelhantes a células-tronco produzidas por transplante nuclear entre espécies. A eficiência da transferência nuclear é aumentada pela introdução de citoplasma compatível ou DNA mitocondrial (mesma espécie ou semelhante à célula ou núcleo do doador).

[009] O documento WO 2013/002880 divulga composições e métodos que compreendem agentes bioenergéticos para restaurar a qualidade de oócitos envelhecidos, aumentando as células-tronco oogoniais ou melhorando seus derivados (por exemplo, citoplasma ou mitocôndrias isoladas) para uso em procedimentos de aumento da fertilidade.

[0010] O documento US 20130022666 divulga composições que compreendem um carreador de lipídio e mitocôndrias, bem como métodos de entrega de mitocôndrias exógenas a uma célula e métodos de tratamento ou reversão da progressão de um distúrbio associado à disfunção mitocondrial em um sujeito mamífero em necessidade do mesmo.

[0011] O documento WO 2017/124037 se refere a composições que compreendem mitocôndrias isoladas ou agentes mitocondriais combinados e métodos de tratamento de distúrbios usando tais composições.

[0012] O documento US 20080275005 se refere a compostos antioxidantes alvejado mitocondrialmente. Um composto da invenção compreende um cátion lipofílico covalentemente acoplado a uma porção química antioxidante.

[0013] O documento US 9855296 divulga um método para melhorar a função cardíaca ou cardiovascular em um sujeito humano em necessidade do mesmo, sendo que o dito método compreende a administração ao dito sujeito de uma composição farmacêutica que compreende mitocôndrias isoladas e substancialmente puras em uma quantidade suficiente para aumentar a dita função cardíaca ou cardiovascular, em que as ditas mitocôndrias são mitocôndrias singênicas ou mitocôndrias alogênicas.

[0014] O documento US 9603872 fornece métodos, kits e composições para substituição mitocondrial no tratamento de distúrbios decorrentes de disfunção mitocondrial. A invenção também apresenta métodos de diagnóstico de doenças neuropsiquiátricas (por exemplo, transtorno bipolar) e distúrbios neurodegenerativos com base em anormalidades estruturais mitocondriais.

[0015] O documento US 20180071337 divulga uma composição terapêutica compreendendo mitocôndrias humanas isoladas de células e um excipiente farmaceuticamente aceitável, em que a mitocôndria pode estar em um carreador que compreende uma bicamada lipídica, uma vesícula ou um lipossoma, com ou sem pelo menos um polipeptídeo ou glicoproteína.

[0016] O documento US 20010021526 fornece modelos celulares e animais para doenças associadas a defeitos mitocondriais. São descritas linhagens celulares cíbridas que têm utilidade como sistemas modelo para o estudo de distúrbios que stão associados a defeitos mitocondriais.

[0017] O documento WO 2013/035101 para os presentes inventores se refere a composições mitocondriais e métodos terapêuticos de uso dos mesmos, e divulga composições de mitocôndrias funcionais parcialmente purificadas e métodos de uso das composições para tratar afecções que se beneficiam de função mitocondrial aumentada pela administração das composições a um sujeito em necessidade das mesmas.

[0018] Têm sido relatadas tentativas de induzir a transferência de mitocôndrias para células ou tecidos hospedeiros. A maioria dos métodos requer transferência ativa das mitocôndrias por injeção (por exemplo, McCully et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2009, 296 (1): H94 a H105). A transferência de mitocôndrias engolfadas em um veículo, como um lipossoma, também é conhecida (por exemplo, Shi et al. Ethnicity and Disease, 2008; 18 (S1): 43).

[0019] Demonstrou-se que a transferência mitocondrial pode ocorrer espontaneamente entre as células in vitro, embora tenha sido apenas estabelecido que o mtDNA foi transferido em vez de mitocôndrias funcionais inteiras intactas (por exemplo, Plotnikov et al. Exp Cell Res. 2010, 316 (15): 2.447 a 2.455; Spees et al. Proc Natl Acad Sei, 2006; 103 (5): 1.283 a 1.288). A transferência mitocondrial in-vitro por endocitose ou internalização também foi demonstrada (Clark et al., Nature, 1982: 295: 605 a 607; Katrangi et al., Rejuvenation Research, 2007; 10(4): 561 a 570).

[0020] O documento US 20110105359 fornece composições criopreservadas de células na forma de corpos autossustentáveis,

bem como frações celulares e subcelulares. Por outro lado, uma tentativa de injetar mitocôndrias isoladas durante a reperfusão precoce para cardioproteção mostrou que a cardioproteção requer mitocôndrias recém-isoladas, na medida em que mitocôndrias congeladas falharam em fornecer cardioproteção e exibiram um consumo de oxigênio significativamente reduzido em comparação às mitocôndrias recém-isoladas (McCully et al., ibid).

[0021] O documento WO 2016/008937 se refere a métodos para a transferência intercelular de mitocôndrias isoladas de uma população de células doadoras para uma população de células receptoras. Os métodos mostram eficácia melhorada da transferência de uma quantidade de mitocôndrias.

[0022] O documento US 2012/0107285 é direcionado ao aperfeiçoamento mitocondrial de células. Determinadas modalidades incluem, sem limitação, métodos de modificação de células-tronco ou métodos de administração de células-tronco modificadas a pelo menos um tecido biológico.

[0023] O envelhecimento está entre os maiores fatores de risco conhecidos para muitas doenças humanas. Uma doença relacionada a idade é uma doença que é vista com maior frequência com a crescente senescência. Essencialmente, as doenças relacionadas a idade são complicações decorrentes da senescência. As doenças relacionadas a idade devem ser distinguidas do próprio processo de envelhecimento devido ao fato de que todos os animais adultos envelhecem, mas nem todos os animais adultos experimentam doenças relacionadas a idade.

[0024] Um declínio na qualidade e atividade mitocondrial foi associado ao envelhecimento normal e correlacionado ao desenvolvimento de uma ampla gama de doenças relacionadas a idade. As mitocôndrias contribuem para aspectos específicos do processo de envelhecimento, incluindo senescência celular, inflamação crônica e declínio dependente da idade na atividade das células-tronco. Uma grande quantidade de evidências de suporte demonstra que a disfunção mitocondrial ocorre com a idade devido ao acúmulo de mutações no DNA mitocondrial. Foi demonstrado que várias mutações pontuais do DNA mitocondrial aumentam significativamente com a idade no cérebro humano, coração, músculos esqueléticos e tecidos do fígado. O aumento da frequência de deleções/inserções de DNA mitocondrial também foi relatado com o aumento da idade em modelos animais e humanos. Postulou-se que o ciclo de replicação e o acúmulo de mutações de DNA mitocondrial podem ser um mecanismo conservado subjacente ao envelhecimento das células-tronco, de modo que as mitocôndrias influenciam ou regulam vários aspectos-chave do envelhecimento (Sun et al., Cell, 2016, 61: 654 a 666; Srivastava, Genes, 2017, 8: 398; Ren et al., Genes, 2017, 8: 397).

[0025] O câncer é causado pela proliferação descontrolada de células anormais em um órgão ou tecido do corpo. Vários tipos de tratamentos contra o câncer estão disponíveis, incluindo: cirurgia, quimioterapia, radioterapia, imunoterapia, terapia direcionada, terapia hormonal ou transplante de células-tronco. Os tratamentos de câncer costumam causar efeitos adversos graves, incluindo: fadiga, náuseas e vômitos, anemia, diarreia, perda de apetite, trombocitopenia, delírio, queda de cabelo, problemas de fertilidade, neuropatia periférica, dor, linfedema. Esses efeitos debilitantes diminuem significativamente a qualidade de vida do paciente com câncer. O uso de células da medula óssea para reabastecer a medula óssea de pacientes com câncer que sofrem de doenças hematopoiéticas que foram submetidas à ablação da medula óssea é bem conhecido. O transplante de medula óssea geralmente usa doadores saudáveis compatíveis. No entanto, em alguns casos, como a medula óssea autóloga de mieloma múltiplo, pode ser realizada. O uso de células da medula óssea para o tratamento de cânceres não hematopoiéticos não é rotina no tratamento desses pacientes.

[0026] Há uma necessidade não atendida de melhorar a qualidade de vida de sujeitos que sofrem de efeitos debilitantes devido a várias afecções, como envelhecimento e doenças relacionadas a idade, bem como pacientes com câncer submetidos a quimioterapia ou radioterapia. Reverter o declínio da função mitocondrial pode desacelerar os efeitos do envelhecimento e diminuir as doenças relacionadas a idade, bem como os efeitos debilitantes do tratamento anticâncer.

1. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0027] A presente invenção fornece células-tronco de mamíferos enriquecidas com mitocôndrias funcionais saudáveis e métodos para diminuir os efeitos debilitantes de muitas afecções, incluindo envelhecimento e doenças relacionadas a idade, bem como eventos adversos de tratamentos anticâncer. Inesperadamente, demonstrou-se pela primeira vez que o transplante de células revigorantes enriquecidas com mitocôndrias saudáveis pode retardar significativamente os sintomas de envelhecimento e o avanço de doenças relacionadas a idade. Além disso, a terapia de aumento mitocondrial que usa células-tronco enriquecidas com mitocôndrias saudáveis pode atenuar os efeitos debilitantes da quimioterapia, radioterapia e/ou imunoterapia com anticorpos monoclonais em pacientes com câncer submetidos a tratamentos anticâncer. Em particular, a presente invenção fornece composições compreendendo células-tronco incluindo células-tronco autólogas ou de doadores, que foram enriquecidas com mitocôndrias funcionais. Estas células são úteis para atenuar ou diminuir os efeitos de afecções debilitantes quando introduzidas no sujeito a ser tratado.

[0028] Em modalidades específicas, o sujeito é tratado com células-tronco que foram enriquecidas com mitocôndrias funcionais obtidas de doadores saudáveis. Uma fonte conveniente para mitocôndrias de doadores saudáveis inclui, mas não está limitada a mitocôndrias placentárias ou mitocôndrias derivadas de células sanguíneas. A presente invenção, portanto, fornece métodos para o uso de células-tronco “enriquecidas mitocondrialmente" alogênicas, autólogas ou singênicas para tratar ou diminuir os efeitos debilitantes do envelhecimento e doenças relacionadas a idade, bem como tratamentos anticâncer em pacientes com câncer.

[0029] A presente invenção se baseia, em parte, na constatação de que camundongos C57BL envelhecidos que recebem células da medula óssea enriquecidas com mitocôndrias saudáveis de placentas murinas apresentam uma melhoria em testes de sangue funcionais, cognitivos e fisiológicos em comparação aos camundongos da mesma idade que recebem medula óssea não enriquecida com mitocôndrias.

[0030] De acordo com várias modalidades, a fonte de células-tronco pode ser autóloga, singênica ou de um doador. O fornecimento de células-tronco de um sujeito com uma afecção debilitante enriquecido com mitocôndrias saudáveis ex-vivo e retornado ao mesmo sujeito fornece benefícios em relação a outros métodos que envolvem terapia celular alogênica. Por exemplo, os métodos fornecidos eliminam a necessidade de testar a população e encontrar um doador que é o antígeno leucocitário humano (HLA) compatível com o sujeito, o que é um processo longo e dispendioso, e nem sempre bem- sucedido. Os métodos eliminam ainda mais vantajosamente a necessidade de terapia de imunossupressão ao longo da vida do sujeito, de modo que seu corpo não rejeite populações de células alogênicas. Assim, a presente invenção fornece vantajosamente uma metodologia única de terapia ex-vivo, em que as células-tronco humanas são removidas do corpo do sujeito, enriquecidas ex-vivo com mitocôndrias funcionais saudáveis e devolvidas ao mesmo sujeito. Além disso, a presente invenção se refere à administração de células-tronco que, sem estarem vinculadas a qualquer teoria ou mecanismo, estão circulando por todo o corpo em diferentes tecidos, para aperfeiçoar o nível de energia do sujeito e, assim, melhorar a qualidade de vida dos sujeitos com afecções debilitantes.

[0031] A presente invenção se baseia, em parte, nas constataçãos surpreendentes de que mitocôndrias funcionais podem entrar em fibroblastos intactos, células-tronco hematopoiéticas e células da medula óssea, e que o tratamento de fibroblastos, células-tronco hematopoiéticas e células da medula óssea com mitocôndrias funcionais aumenta o teor mitocondrial, sobrevivência de células e produção de ATP.

[0032] A presente invenção fornece, pela primeira vez, células-tronco de sujeitos em envelhecimento ou pacientes com câncer com atividade mitocondrial aumentada ou aperfeiçoada. Essas células-tronco são enriquecidas com mitocôndrias funcionais saudáveis de uma fonte adequada. Tipicamente, as mitocôndrias podem ser obtidas a partir de células sanguíneas, células da placenta, culturas de células da placenta ou outras linhagens celulares adequadas. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0033] A presente invenção fornece, em um aspecto, um método para tratar ou diminuir os efeitos debilitantes de várias afecções, através da introdução de mitocôndrias humanas funcionais congeladas- descongeladas parcialmente purificadas em células-tronco obtidas ou derivadas de um sujeito afetado com uma afecção debilitante ou de um doador e transplantar pelo menos 105 a 2x107 células-tronco humanas "enriquecidas mitocondrialmente" por quilograma de peso corporal do paciente em um meio líquido farmaceuticamente aceitável com capacidade para suportar a viabilidade das células no sujeito afetado pela afecção debilitante.

[0034] De acordo com outro aspecto, a presente invenção fornece método para tratar ou diminuir afecções debilitantes em um sujeito, compreendendo a administração parenteral de uma composição farmacêutica que compreende pelo menos 5*105 a 5*109 células-tronco humanas enriquecidas com mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis congeladas-descongeladas ao sujeito, em que as afecções debilitantes são selecionadas a partir do grupo que consiste em envelhecimento, doenças relacionadas a idade e a sequela de tratamentos anticâncer.

[0035] De acordo com ainda outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento ou diminuição de afecções debilitantes em um sujeito, sendo que a composição farmacêutica é compreende pelo menos 105 a 2x107 células-tronco humanas por quilograma de peso corporal do sujeito, em que as células-tronco humanas são suspensas em um meio líquido farmaceuticamente aceitável com capacidade para suportar a viabilidade das células, em que as células-tronco humanas são enriquecidas com mitocôndrias exógenas saudável funcionais congeladas- descongeladas e em que as condições debilitantes são selecionadas a partir do grupo que consiste em envelhecimento, doenças relacionadas à idade e sequelas de tratamentos anticâncer. De acordo com algumas modalidades, o enriquecimento mitocondrial das células-tronco compreende a introdução nas células-tronco de uma dose de mitocôndria de pelo menos 0,088 a 176 miliunidades de atividade de CS por milhão de células. De acordo com modalidades adicionais, o enriquecimento mitocondrial das células-tronco compreende a introdução nas células-tronco de uma dose de mitocôndria de 0,88 a 17,6 miliunidades de atividade de CS por milhão de células.

[0036] Em algumas modalidades, o volume de mitocôndrias isoladas é adicionado às células receptoras na concentração desejada. A razão entre o número de células doadoras de mitocôndrias e o número de células receptoras de mitocôndrias é uma razão acima de 2:1 (células doadoras versus células receptoras). Em modalidades típicas, a razão é de pelo menos 5, alternativamente, pelo menos 10 ou mais. Em modalidades específicas, a razão entre células doadoras a partir das quais as mitocôndrias são coletadas e células receptoras é de pelo menos 20, 50, 100 ou superior. Cada possibilidade é uma modalidade separada.

[0037] Em algumas modalidades, o sujeito com a afecção debilitante é um sujeito em envelhecimento. Em determinadas modalidades, o sujeito com a afecção debilitante sofre de uma doença ou doenças relacionadas a idade. Em outras modalidades, o sujeito com a afecção debilitante é um paciente com câncer submetido a quimioterapia, radioterapia, imunoterapia com anticorpos monoclonais ou uma combinação dos mesmos. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0038] Em determinadas modalidades, as mitocôndrias exógenas humanas funcionais saudáveis são mitocôndrias alogênicas. Em outras modalidades, as mitocôndrias exógenas humanas funcionais saudáveis são autólogas ou singênicas, ou seja, da mesma linhagem materna.

[0039] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método ex-vivo para enriquecer células-tronco humanas com mitocôndrias saudáveis, em que o método compreende as etapas de (i) fornecer uma primeira composição, compreendendo uma pluralidade de células-tronco humanas obtidas ou derivadas de um indivíduo afetado com uma afecção debilitante ou de um doador saudável não afetado por uma afecção debilitante; (ii) fornecer uma segunda composição, compreendendo uma pluralidade de mitocôndrias exógenas saudáveis funcionais humanas congeladas-descongeladas, isoladas ou parcialmente purificadas obtidas de um doador saudável não afetado por uma afecção debilitante; (iii) colocar em contacto as células-tronco humanas da primeira composição com as mitocôndrias funcionais humanas congeladas- descongeladas da segunda composição em uma razão de 0,088 - 176 mU de actividade de CS por 106 células-tronco; e (iv) incubar a composição de (iii) sob condições que permitem que as mitocôndrias funcionais humanas congeladas- descongeladas entrem nas células-tronco humanas, enriquecendo assim as ditas células-tronco humanas congeladas-descongeladas com as ditas mitocôndrias funcionais humanas; em que o teor mitocondrial funcional das células-tronco humanas enriquecidas é detectavelmente maior do que o teor mitocondrial funcional saudável das células-tronco humanas na primeira composição.

[0040] Em modalidades específicas, o sujeito afetado com uma afecção debilitante é um paciente com câncer após o tratamento com tratamentos anticâncer debilitantes. Consequentemente, a presente invenção fornece um método ex-vivo para enriquecer células-tronco humanas com mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis, em que o método compreende as etapas de (i) fornecer uma primeira composição, compreendendo uma pluralidade de células-tronco humanas obtidas ou derivadas de um indivíduo afetado com uma afecção debilitante ou de um doador saudável não afetado por uma afecção debilitante; (ii) fornecer uma segunda composição, compreendendo uma pluralidade de mitocôndrias funcionais humanas congeladas- descongeladas, isoladas ou parcialmente purificadas obtidas do mesmo indivíduo afetado com a doença maligna antes dos tratamentos anticâncer ou de um sujeito saudável não afetado com uma doença maligna; (iii) contatar as células-tronco humanas da primeira composição com as mitocôndrias funcionais humanas congeladas-descongeladas da segunda composição em uma razão de 0,088 - 176 mU de actividade de CS por 106 células-tronco; e (iv) incubar a composição de (iii) sob condições que permitem que as mitocôndrias funcionais humanas congeladas-descongeladas entrem nas células-tronco humanas, enriquecendo assim as ditas células-tronco humanas congeladas- descongeladas com as ditas mitocôndrias funcionais humanas; em que o teor mitocondrial funcional das células-tronco humanas enriquecidas é detectavelmente maior do que o teor mitocondrial funcional saudável das células-tronco humanas na primeira composição.

[0041] Em algumas modalidades, as afecções que permitem que as mitocôndrias exógenas humanas funcionais saudáveis entrem nas células-tronco humanas compreendem a incubação das células-tronco humanas com as ditas mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis por um tempo que varia de 0,5 a 30 horas, a uma temperatura que varia de 16 a 37 ºC. Em algumas modalidades, as afecções que permitem que as mitocôndrias exógenas humanas funcionais saudáveis entrem nas células-tronco humanas compreendem incubar as células-tronco humanas com as ditas mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis por um tempo que varia de 0,5 a 30 horas, a uma temperatura que varia de 16 a 37 ºC, em um meio de cultura em um ambiente que suporta a sobrevivência celular. De acordo com algumas modalidades, o meio de cultura consiste em solução salina que contém albumina de soro humano. Em algumas modalidades, as condições para incubação incluem uma atmosfera contendo 5% de CO2. Em algumas modalidades, as condições para incubação não incluem CO2 adicionado acima do nível encontrado no ar. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0042] Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente a centrifugação das células-tronco humanas e das mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis antes, durante ou após a incubação. Em algumas modalidades, antes da incubação, o método compreende adicionalmente uma única centrifugação das células-tronco humanas e das mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis a uma força de centrifugação acima de 2.500xg. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0043] Em algumas modalidades, as mitocôndrias que foram submetidas a um ciclo de congelamento-descongelamento demonstram uma taxa de consumo de oxigênio comparável após o descongelamento, em comparação às mitocôndrias de controle que não foram submetidas a um ciclo de congelamento-descongelamento.

[0044] Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente o congelamento e, opcionalmente, ainda o descongelamento das células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente.

[0045] Em modalidades adicionais, as células-tronco humanas são expandidas antes ou após o aumento mitocondrial.

[0046] O enriquecimento detectável das células- tronco com mitocôndrias funcionais pode ser determinado por ensaios funcionais e/ou enzimáticos, incluindo, mas não se limitando a, taxa de consumo de oxigênio (O2), nível de atividade de citrato sintase, taxa de produção de trifosfato de adenosina (ATP), teor de proteína mitocondrial (como o complexo succinato desidrogenase, subunidade A-SDHA e citocromo C oxidase-COX1), teor de DNA mitocondrial. Em alternativa, o enriquecimento das células-tronco com mitocôndrias de doadores saudáveis pode ser confirmado pela detecção do DNA mitocondrial (mtDNA) do doador. De acordo com algumas modalidades, a extensão do enriquecimento das células-tronco com mitocôndrias funcionais pode ser determinada pelo nível de mudança na heteroplasmia e/ou pelo número de cópias do mtDNA por célula. De acordo com determinadas modalidades exemplificativas, o enriquecimento das células-tronco com mitocôndrias funcionais saudáveis pode ser determinado por ensaios convencionais que são reconhecidos na técnica. Por exemplo, a presença de mitocôndrias de doador pode ser determinada por um método selecionado dentre (i) nível de atividade de citrato sintase; ou (ii) sequenciamento de mtDNA indicando mais de uma fonte de mtDNA. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0047] De acordo com algumas modalidades, as mitocôndrias podem ser correspondidas entre o doador e o sujeito tratado de acordo com o haplogrupo de mtDNA. De acordo com outras modalidades, as mitocôndrias são escolhidas de acordo com diferentes haplogrupos de mtDNA específicos antes do enriquecimento de células-tronco.

[0048] Em determinadas modalidades, o teor mitocondrial das células-tronco na primeira composição ou na quarta composição é determinado pela determinação do nível de atividade da citrato sintase. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0049] Em determinadas modalidades, o processo de enriquecimento das células-tronco humanas com mitocôndrias é realizado antes do congelamento das células. Em outras modalidades, o processo de enriquecimento das células-tronco humanas com mitocôndrias é realizado após o congelamento e descongelamento das células.

[0050] Em determinadas modalidades, as células- tronco humanas autólogas são congeladas e armazenadas antes de serem afetadas pela afecção debilitante. Em outras modalidades, o processo de enriquecimento das células-tronco humanas com mitocôndrias é realizado após o congelamento e descongelamento das células.

[0051] Em determinadas modalidades, as células- tronco são células-tronco pluripotentes (PSC). Em outras modalidades, as PSCs são células-tronco não embrionárias. Em algumas modalidades, as células- tronco são PSCs induzidas (iPSCs). Em determinadas modalidades, as células- tronco são derivadas de células da medula óssea. Em modalidades particulares, as células-tronco expressam o antígeno de células progenitoras hematopoéticas da medula óssea CD34 (CD34+). Em modalidades particulares, as células-tronco são células-tronco mesenquimais. Em outras modalidades, as células-tronco são derivadas de tecido adiposo. Em ainda outras modalidades, as células-tronco são derivadas de sangue. Em outras modalidades, as células-tronco são derivadas do sangue do cordão umbilical. Em outras modalidades, as células- tronco são derivadas da mucosa oral. . Em outras modalidades, as células-tronco compreendem células progenitoras mieloides comuns, células progenitoras linfoides comuns ou qualquer combinação das mesmas. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0052] Em determinadas modalidades, as células- tronco são células da medula óssea.

[0053] Em determinadas modalidades, as células- tronco são células-tronco derivadas da medula óssea que compreendem células mielopoiéticas. Em determinadas modalidades, as células-tronco derivadas da medula óssea compreendem células eritropoiéticas. Em determinadas modalidades, as células-tronco derivadas da medula óssea compreendem células-tronco hematopoiéticas (HSCs) multipotenciais. Em determinadas modalidades, as células-tronco derivadas da medula óssea compreendem células progenitoras mieloides comuns, células progenitoras linfoides comuns ou qualquer combinação das mesmas. Em determinadas modalidades, as células- tronco derivadas da medula óssea compreendem megacariócitos, eritrócitos, mastócitos, mioblastos, basófilos, neutrófilos, eosinófilos, monócitos, macrófagos, células exterminadoras naturais (NK), pequenos linfócitos, linfócitos T, linfócitos B, células plasmáticas, células reticulares ou qualquer combinação das mesmas. Em determinadas modalidades, as células-tronco derivadas da medula óssea compreendem células-tronco mesenquimais. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0054] Em modalidades particulares, as células- tronco são células CD34+. Em determinadas modalidades, as células que expressam CD34+são obtidas a partir do sangue do cordão umbilical (ou seja, células-tronco hematopoéticas não da medula óssea). Em algumas modalidades, as células utilizadas são células-tronco autólogas e podem ser congeladas e armazenadas antes da afecção debilitante relacionada ao envelhecimento ou terapia contra câncer. Em algumas modalidades, o processo de enriquecimento das células com mitocôndrias é realizado antes do congelamento. Em modalidades alternativas, o processo de enriquecimento das células com mitocôndrias é realizado após o congelamento e descongelamento das células-tronco.

[0055] Em determinadas modalidades, as células- tronco na primeira composição são obtidas de um sujeito em envelhecimento ou de um doador. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são células da medula óssea obtidas da medula óssea de um sujeito em envelhecimento ou de um doador. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são obtidas direta ou indiretamente da medula óssea do sujeito em envelhecimento ou da medula óssea de um doador. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são mobilizadas da medula óssea do sujeito em envelhecimento ou são mobilizadas da medula óssea de um doador. Em determinadas modalidades, as células- tronco na primeira composição são obtidas do sangue periférico do sujeito em envelhecimento ou são obtidas do sangue periférico de um doador. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0056] Em determinadas modalidades, as células- tronco na primeira composição são obtidas de um sujeito afetado com uma doença maligna. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são obtidas de um sujeito afetado com uma doença maligna não hematopoiética ou de um sujeito saudável não afetado com uma doença maligna. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são obtidas da medula óssea de um sujeito afetado com uma doença maligna não hematopoiética ou de um sujeito saudável não afetado com uma doença maligna. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são mobilizadas da medula óssea do sujeito afetado com uma doença maligna não hematopoiética ou são mobilizadas da medula óssea de um sujeito saudável não afetado com uma doença maligna. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são obtidas diretamente da medula óssea do sujeito afetado com uma doença maligna não hematopoiética ou são obtidas diretamente da medula óssea de um sujeito saudável não afetado com uma doença maligna. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são obtidas indiretamente da medula óssea do sujeito afetado com uma doença maligna não hematopoiética ou são indiretamente obtidas da medula óssea de um sujeito saudável não afetado por uma doença maligna. Em determinadas modalidades, as células da medula óssea na primeira composição são obtidas do sangue periférico do sujeito afetado com uma doença maligna não hematopoiética ou são obtidas do sangue periférico de um sujeito saudável não afetado com uma doença maligna. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0057] Em determinadas modalidades, as células- tronco são pelo menos parcialmente purificadas.

[0058] Em determinadas modalidades, as mitocôndrias funcionais saudáveis são derivadas de uma célula ou tecido selecionado a partir do grupo que consiste em: placenta, células da placenta cultivadas em cultura e células sanguíneas.

[0059] Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica é administrada ao sujeito que sofre de uma afecção debilitante selecionada a partir do grupo que consiste em envelhecimento, doenças relacionadas a idade e as sequelas de tratamentos anticâncer. Em outras modalidades, a composição farmacêutica é administrada a um tecido ou órgão específico. Em ainda outras modalidades, a composição farmacêutica é administrada por administração parenteral sistêmica. Em outras modalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos cerca de 106 células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente por quilograma de peso corporal do paciente. Em modalidades adicionais, a composição farmacêutica compreende um total de cerca de 5x105 a 5x109 células-tronco humanas enriquecidas com mitocôndrias humanas. Em determinadas modalidades, a administração da composição farmacêutica a um sujeito é por uma via parenteral selecionada a partir do grupo que consiste em injeção intravenosa, intra-arterial, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal e direta em um tecido ou órgão. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0060] Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente uma etapa anterior, em que a etapa compreende a administração ao sujeito afetado com a afecção debilitante, seja por envelhecimento ou uma doença maligna não hematopoiética, ou a um doador saudável, um agente que induz a mobilização do células-tronco da medula óssea para o sangue periférico. Em determinadas modalidades, o agente é selecionado do grupo que consiste em fator estimulador de colônia de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), 1,1′-[1,4-fenilenobis(metileno)]-bis[1,4,8,11- tetraazaciclotetradecano] (Plerixafor), um sal do mesmo e qualquer combinação dos mesmos. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção. Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente uma etapa de isolamento das células-tronco do sangue periférico do sujeito afetado com a afecção debilitante, seja por envelhecimento ou uma doença maligna não hematopoiética, ou do sangue periférico de um sujeito saudável. Em determinadas modalidades, o isolamento é realizado por aférese.

[0061] Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente uma etapa de administração ao sujeito que sofre de afecções debilitantes selecionadas a partir do grupo que consiste em envelhecimento, doenças relacionadas a idade e sequelas de tratamentos anticâncer, um agente que previne, retarda, minimiza ou elimina uma reação imunogênica adversa entre o sujeito e as células-tronco do doador alogênico. Em modalidades adicionais, as mitocôndrias funcionais na segunda composição são obtidas de um sujeito afetado com uma doença maligna antes dos tratamentos anticâncer.

[0062] Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente concentrar as células-tronco e as mitocôndrias funcionais na terceira composição antes ou durante a incubação. Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente a centrifugação da terceira composição antes, durante ou após a incubação. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0063] Em modalidades alternativas, o sujeito em envelhecimento ou sujeito que sofre de uma doença ou doenças relacionadas a idade é transplantado com células-tronco enriquecidas com mitocôndrias. Em determinadas modalidades, as células-tronco são de um doador não afetado com uma doença relacionada a idade. Em modalidades específicas, as células- tronco são células-tronco autólogas da medula óssea. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são mobilizadas da medula óssea do sujeito em envelhecimento ou sujeito afetado com doença ou doenças relacionadas a idade, ou são mobilizadas da medula óssea de um doador saudável não afetado com doenças relacionadas a idade. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são obtidas do sangue periférico do sujeito em envelhecimento ou sujeito afetado com doença ou doenças relacionadas a idade, ou são obtidas do sangue periférico de um doador saudável não afetado por doenças relacionadas a idade. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0064] Em modalidades alternativas, o sujeito sofre de uma malignidade hematopoiética e as células-tronco transplantadas para o sujeito são enriquecidas com mitocôndrias. Em determinadas modalidades, as células-tronco são de um doador saudável não afetado por uma doença maligna. Em modalidades específicas, as células-tronco são células-tronco autólogas da medula óssea, por exemplo, como as usadas em várias doenças malignas hematopoiéticas, incluindo mieloma múltiplo e certos tipos de linfoma. De acordo com essas modalidades, as células-tronco na primeira composição são obtidas da medula óssea do sujeito afetado com uma doença maligna hematopoiética ou são obtidas da medula óssea de um sujeito saudável não afetado por uma doença maligna. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são mobilizadas da medula óssea do sujeito afetado com uma doença maligna hematopoiética ou são mobilizadas da medula óssea de um sujeito saudável não afetado por uma doença maligna. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são obtidas do sangue periférico do sujeito afetado com uma doença maligna hematopoiética ou são obtidas do sangue periférico de um sujeito saudável não afetado com uma doença maligna. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0065] Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente uma etapa anterior, em que a etapa compreende a administração a um sujeito de um agente que induz a mobilização de células-tronco da medula óssea a partir da medula óssea para o sangue periférico. Em determinadas modalidades, o agente é selecionado do grupo que consiste em fator estimulador de colônia de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), 1,1′-[1,4- fenilenobis(metileno)]-bis[1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano] (Plerixafor), um sal do mesmo e qualquer combinação dos mesmos. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção. Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente uma etapa de isolamento das células-tronco do sangue periférico do sujeito afetado com uma doença maligna hematopoiética ou do sangue periférico de um sujeito saudável não afetado com uma doença maligna. Em determinadas modalidades, o isolamento é realizado por aférese.

[0066] Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente concentrar as células-tronco e as mitocôndrias funcionais na composição (iii) antes ou durante a incubação. Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente a centrifugação da composição (iii) antes, durante ou após a incubação. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0067] Em determinadas modalidades, as células- tronco na primeira composição são obtidas de um sujeito com uma afecção debilitante selecionada a partir de envelhecimento, doenças relacionadas a idade e uma doença maligna submetido a uma terapia debilitante e tem (i) uma taxa reduzida de consumo de oxigênio (O2); (ii) um nível de atividade diminuído da citrato sintase; (iii) uma diminuição da taxa de produção de trifosfato de adenosina (ATP); ou (iv) qualquer combinação de (i), (ii) e (iii), em comparação a um sujeito não afetado com a afecção debilitante. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0068] Em determinadas modalidades, as células- tronco na primeira composição são obtidas de um doador saudável não afetado por uma afecção debilitante, tendo (i) uma taxa normal de consumo de oxigênio (O2); (ii) um nível de atividade normal de citrato sintase; (iii) uma taxa normal de produção de trifosfato de adenosina (ATP); ou (iv) qualquer combinação de (i), (ii) e (iii). Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção. Em determinadas modalidades, as mitocôndrias humanas funcionais isoladas ou parcialmente purificadas na segunda composição são obtidas de um doador não afetado por uma afecção debilitante, com DNA mitocondrial normal. Conforme usado no presente documento, o termo "DNA mitocondrial normal" se refere ao DNA mitocondrial que não possui qualquer deleção ou mutação que é conhecida por estar associada a uma doença mitocondrial primária.

[0069] Em determinadas modalidades, as células- tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais saudáveis têm (i) uma taxa aumentada de consumo de oxigênio (O2); (ii) um nível de atividade maior da citrato sintase; (iii) uma taxa maior de produção de trifosfato de adenosina (ATP); (iv) um teor de DNA mitocondrial normal maior; ou (v) qualquer combinação de (i), (ii), (iii) e (iv), em comparação às células-tronco antes do enriquecimento mitocondrial. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0070] De acordo com determinadas modalidades exemplificativas, as células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais saudáveis têm (i) um nível de atividade aumentado de citrato sintase; e (ii) um teor de DNA mitocondrial normal maior; em comparação às células-tronco antes do enriquecimento mitocondrial.

[0071] Em determinadas modalidades, a quantidade total de proteínas mitocondriais nas mitocôndrias parcialmente purificadas está entre 20% a 80% da quantidade total de proteínas celulares na amostra. Os métodos exemplificativos para a obtenção dessas composições de mitocôndrias isoladas ou parcialmente purificadas são divulgados no documento WO 2013/035101.

[0072] A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, uma pluralidade de células-tronco humanas enriquecidas com mitocôndrias saudáveis, obtidas por qualquer uma das modalidades dos métodos descritos acima. Explicitamente, deve ser entendido que as células- tronco humanas enriquecidas com mitocôndrias funcionais de acordo com a presente invenção não são derivadas de um sujeito afetado com uma doença mitocondrial primária. De acordo com algumas modalidades específicas, as células-tronco enriquecidas com mitocôndrias saudáveis são outras que as células-tronco da medula óssea.

[0073] A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, uma pluralidade de células-tronco humanas enriquecidas ex- vivo com mitocôndrias, em que as células-tronco têm pelo menos uma propriedade selecionada a partir do grupo que consiste em (a) um aumento do teor de DNA mitocondrial; (b) um nível de atividade maior da citrato sintase; (c) um teor maior de pelo menos uma proteína mitocondrial selecionada de SDHA e COX1; (d) taxa maior de consumo de oxigênio (O2); (e) uma taxa aumentada de produção de ATP; ou (f) qualquer combinação dos mesmos, em relação ao nível correspondente nas células-tronco antes do enriquecimento mitocondrial. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0074] De acordo com algumas modalidades, as células-tronco são células-tronco CD34+. As células-tronco humanas enriquecidas ex-vivo com mitocôndrias funcionais de acordo com a presente invenção não são derivadas de um sujeito afetado com uma doença mitocondrial primária.

[0075] Em determinadas modalidades, a quantidade total de proteínas mitocondriais nas mitocôndrias parcialmente purificadas está entre 20% a 80% da quantidade total de proteínas celulares na amostra.

[0076] Em determinadas modalidades, a pluralidade de células-tronco humanas descritas acima são CD34+ e têm um teor mitocondrial maior; um teor maior de DNA mitocondrial; taxa maior de consumo de oxigênio (O2); um nível de atividade maior da citrato sintase, em comparação às células-tronco antes do enriquecimento mitocondrial. Em algumas modalidades, o teor ou atividade aumentada é maior do que aquele teor ou atividade nas células no momento do isolamento.

[0077] A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, uma composição farmacêutica que compreende uma pluralidade de células-tronco da medula óssea humana enriquecidas ex-vivo com mitocôndrias funcionais saudáveis como descrito acima.

[0078] A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, a composição farmacêutica descrita acima para uso no tratamento de um sujeito humano afetado com uma afecção debilitante. De acordo com determinadas modalidades, o sujeito afetado com uma afecção debilitante é um sujeito em envelhecimento. Em determinadas modalidades, o sujeito afetado com uma afecção debilitante sofre de doença ou doenças relacionadas a idade. Em algumas modalidades, o sujeito afetado com uma afecção debilitante sofre de uma doença maligna submetida a uma terapia debilitante. Em outras modalidades, a composição farmacêutica descrita acima é usada para tratar um sujeito humano em remissão ou após a recuperação de uma doença maligna.

[0079] A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, um método de tratamento de um sujeito humano afetado com uma afecção debilitante, compreendendo a etapa de administração ao paciente da composição farmacêutica descrita acima. De acordo com determinadas modalidades, o sujeito afetado com uma afecção debilitante é um sujeito em envelhecimento. Em determinadas modalidades, o sujeito afetado com uma afecção debilitante sofre de doença ou doenças relacionadas a idade. Em algumas modalidades, o sujeito afetado com uma afecção debilitante sofre de uma doença maligna submetida a uma terapia debilitante. Em outras modalidades, a composição farmacêutica descrita acima é usada para tratar um sujeito humano em remissão ou após a recuperação de uma doença maligna. Em determinadas modalidades, as células-tronco que compreendem a composição farmacêutica são autólogas ou singênicas para o sujeito afetado com a afecção debilitante. Em determinadas modalidades, as células-tronco que compreendem a composição farmacêutica são alogênicas para o sujeito afetado com a afecção debilitante. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[0080] Modalidades adicionais e o escopo completo de aplicabilidade da presente invenção ficarão evidentes a partir da descrição detalhada dada doravante. No entanto, deve-se entender que a descrição detalhada e exemplos específicos, embora indiquem modalidades preferenciais da invenção, são fornecidos apenas a título de ilustração, visto que várias alterações e modificações dentro do espírito e do escopo da invenção serão evidentes para os versados na técnica a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0081] A FIGURA 1 é três micrografias que mostram células de fibroblastos de camundongo expressando GFP mitocondrial (painel esquerdo), incubação com mitocôndrias marcadas com RFP isoladas (painel do meio) e uma sobreposição (painel direito), obtida por microscopia confocal de fluorescência.

[0082] A FIGURA 2 é um gráfico de barras que mostra uma comparação dos níveis de ATP em células de fibroblastos de camundongo que não foram tratadas (Controle), tratadas com um inibidor irreversível do complexo mitocondrial I (Rotenona) ou tratadas com Rotenona e mitocôndrias da placenta de camundongo (Rotenona + Mitocôndria). Os dados são apresentados como valores médios ± SEM, (*) valor de p <0,05. RLU - unidades de luminescência relativa.

[0083] A FIGURA 3 é quatro micrografias obtidas por microscopia confocal de fluorescência mostrando células de medula óssea de camundongo incubadas com mitocôndrias marcadas com GFP isoladas de células de melanoma de camundongo.

[0084] A FIGURA 4 é um gráfico de barras que ilustra o nível de mtDNA C57BL na medula óssea de camundongos FVB/N em vários pontos de tempo após a injeção IV de células da medula óssea enriquecidas com mitocôndrias exógenas de camundongo C57BL.

[0085] A FIGURA 5 é um gráfico de barras que mostra uma comparação da atividade da citrato sintetase (CS) em células da medula óssea (BM) de camundongo incubadas com quantidades variáveis de mitocôndrias marcadas com GFP isoladas de células de melanoma de camundongo, com ou sem centrifugação.

[0086] A FIGURA 6A é um gráfico de barras que mostra uma comparação da atividade de CS em células BM murinas após enriquecimento com quantidades crescentes de mitocôndrias marcadas com GFP. A FIGURA 6B é um gráfico de barras que mostra uma comparação da atividade da citocromo c redutase nestas células (barras pretas), em comparação à atividade em mitocôndrias marcadas com GFP (barra cinza).

[0087] A FIGURA 7A é um gráfico de barras que ilustra o número de cópias de C57BL mtDNA em células da medula óssea de FVB/N após a incubação das células com mitocôndrias exógenas de camundongo C57BL em várias concentrações (0,044, 0,44, 0,88, 2,2, 4,4, 8,8, 17,6 mUnidades Atividade CS), em comparação com células não tratadas (NT). A FIGURA 7B é um gráfico de barras que ilustra o teor de proteína codificada por mtDNA (COX1) em células de medula óssea de FVB/N após incubação das células com mitocôndrias exógenas de camundongo C57BL em várias concentrações (0,044, 0,44, 0,88, 2,2, 4,4, 8,8, 17,6 mUnits CS atividade), em comparação com células não tratadas (NT), normalizado para níveis de Janus. A Figura 7C é um gráfico de barras que ilustra o teor de proteína codificada por núcleo (SDHA) em células de medula óssea de FVB/N após incubação das células com mitocôndrias exógenas de camundongo C57BL em várias concentrações (0,044, 0,44, 0,88, 2,2, 4,4, 8,8, Atividade de 17,6 mUnits CS), em comparação com células não tratadas (NT), normalizado para níveis de Janus.

[0088] A FIGURA 8A é um gráfico de barras que mostra uma comparação de atividade de CS no controle, células BM humanas não tratadas e células BM humanas incubadas com mitocôndrias marcadas com GFP isoladas de células da placenta humana, com ou sem centrifugação. A FIGURA 8B é um gráfico de barras que mostra uma comparação dos níveis de

ATP no controle, células BM humanas não tratadas e células BM humanas incubadas com mitocôndrias marcadas com GFP isoladas de células da placenta humana, com centrifugação.

[0089] A FIGURA 9A representa o resultado de uma análise FACS em células BM humanas não incubadas com mitocôndrias marcadas com GFP. A FIGURA 9B representa o resultado de uma análise FACS em células BM humanas incubadas com mitocôndrias marcadas com GFP após centrifugação.

[0090] A FIGURA 10A é um gráfico de barras que mostra o teor de ATP de células CD34+ humanas de um doador saudável não tratado (NT) ou tratado com mitocôndrias derivadas de sangue (MNV-BLD). A FIGURA 10B é um gráfico de barras que mostra a atividade de CS de células CD34+ humanas de um doador saudável tratado ou não tratado com mitocôndrias derivadas de sangue.

[0091] A FIGURA 11 é três micrografias obtidas por microscopia confocal de fluorescência células CD34+ incubadas com mitocôndrias marcadas com GFP isoladas de células HeLa-TurboGFP- Mitocôndrias.

[0092] A Figura 12A é uma ilustração da deleção de mtDNA em células do cordão umbilical de pacientes Pearson, bem como uma análise de Southern blot mostrando a deleção. A Figura 12B é um gráfico de barras que ilustra o número de cópias de mtDNA humano na medula óssea de camundongos NSGS 2 meses após a terapia de aumento mitocondrial usando células do cordão umbilical de Pearson enriquecidas com mitocôndrias humanas (UCB + Mito), em comparação com camundongos injetados com sangue do cordão umbilical não aumentado células (UCB).

[0093] A FIGURA 13A é um gráfico de barras que mostra os níveis de mtDNA mutado de FVB/N ATP8 na medula óssea de camundongos FVB/N 1 mês após a administração de células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais saudáveis obtidas de placenta C57BL.

A FIGURA 13B é um gráfico de barras que mostra os níveis de mtDNA mutado de FVB/N ATP8 no fígados de camundongos FVB/N 3 meses após a administração de células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais saudáveis obtidas da placenta C57BL.

[0094] As FIGURAS 14A a 14C são barras de gráfico que ilustram a biodistribuição de células da medula óssea enriquecidas com mitocôndrias pela quantidade de mtDNA C57BL na medula óssea (FIGURA 14A), cérebro (FIGURA 14B) e coração (FIGURA 14C) de camundongos até 3 meses após ESTEIRA. Barras brancas e pontos associados indicam amostras de medula óssea aumentada, barras cinzas são controles.

[0095] A FIGURA 15 é um gráfico de barras que mostra uma comparação dos níveis de mtDNA mutado de FVB/N ATP8 nos cérebros de camundongos FVB/N 1 mês após a administração de células-tronco enriquecidas com mitocôndrias de tipo selvagem funcionais saudáveis (isoladas do fígado de camundongos C57BL), em camundongos FVB/N não tratados (Naive), camundongos FVB/N administrados com células-tronco enriquecidas com mitocôndrias de fígado saudável C57BL (C57BL Mito), camundongos FVB/N administrados com células-tronco enriquecidas com mitocôndrias C57BL saudáveis e foram submetidos a irradiação corporal total (TBI) antes da administração de células-tronco (TBI C57BL Mito) e camundongos FVB/N administrados com células-tronco enriquecidas com mitocôndrias C57BL saudáveis e foram submetidos ao agente quimioterápico Busulfan antes da administração de células-tronco (Busulfan C57BL Mito).

[0096] As FIGURAS 16A a 16C mostram gráficos de linha que ilustram o desempenho de teste comportamental de campo aberto de camundongos C57BL/6J de 12 meses de idade tratados com: células BM enriquecidas com mitocôndrias (MNV-BM-PLC, 1x106 células), células da medula óssea (controle BM, 1x106 células) ou uma solução de veículo de controle (controle, 4,5% de albumina em 0,9% p/v NaCl), antes do tratamento e 9 meses após o tratamento. A FIGURA 16A mostra a quantificação da distância movida durante o teste de campo aberto. A FIGURA 16B mostra a duração do centro (tempo (s) ou% de alteração da linha de base); A FIGURA 16C mostra a duração da parede (tempo (s) ou% de mudança da linha de base).

[0097] A FIGURA 16D é um gráfico de linha que ilustra os níveis de nitrogênio da uréia no sangue (BUN) em camundongos C57BL/6J de 12 meses de idade tratados com: células BM enriquecidas com mitocôndrias (MNV-BM-PLC, 1x106 células), células da medula óssea (controle BM, 1x106 células) ou uma solução de veículo de controle (controle, 4,5% de albumina em 0,9% p/v NaCl), antes do tratamento e 9 meses após o tratamento.

[0098] As FIGURAS 16E a 16F mostram gráficos de barras que ilustram o teste Rotarod de camundongos C57BL/6J de 12 meses de idade administrados tratados com células da medula óssea (BM) aprimoradas pela mitocôndria (MNV-BM-PLC, 1x106 células), células da medula óssea (BM, 1x106 células) ou uma solução de veículo de controle (VEÍCULO, 4,5% de albumina em 0,9% p/v NaCl). Os resultados apresentados são antes do tratamento e 1 e 3 meses após o tratamento. A FIGURA 16E mostra a pontuação do Rotarod (em segundos (s)), dos vários grupos de teste tratados nos pontos de tempo indicados. A FIGURA 16F mostra a pontuação do Rotarod (apresentada como porcentagem da linha de base, dos vários grupos de teste tratados nos pontos de tempo indicados.

[0099] As FIGURAS 16G a 16J mostram o gráfico de barras que ilustra o teste de força de Camundongos C57BL/6J de 12 meses de idade administrados tratados com células da medula óssea (BM) aprimoradas pela mitocôndria (MNV-BM-PLC, 1x106 células), células da medula óssea (BM, 1x106 células) ou uma solução de veículo de controle (VEÍCULO, 4,5% de albumina em 0,9% p/v NaCl). Os resultados apresentados são antes do tratamento e 1 e 3 meses após o tratamento. FIGURAS 16G a 16H - força de preensão (força) (g ou variação% da linha de base); FIGURAS 16I a 16J - tempo de força de preensão (tempo (s) ou% de alteração da linha de base).

[00100] A FIGURA 17A é um esquema que descreve o curso de tratamento e avaliação no ensaio clínico realizado no paciente 1, um paciente jovem com Síndrome de Pearson (PS) e Síndrome de Fanconi relacionada com PS (FS), com uma mutação de deleção em seu mtDNA, abrangendo ATP8. A FIGURA 17B é um gráfico de barras que mostra a pontuação de Equivalente Metabólico de Tarefa (MET) aeróbica pré- administração de células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais, 2,5 meses e 8 meses após a administração das células-tronco enriquecidas.

A FIGURA 17C é um gráfico de barras que ilustra o nível de lactato no sangue de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e após a terapia.

A FIGURA 17D é um gráfico de linha que ilustra a pontuação do desvio padrão do peso e altura de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia.

A FIGURA 17E é um gráfico de linha que ilustra o nível de fosfatase alcalina (ALP) de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia.

A FIGURA 17F é um gráfico de linha que ilustra a elevação a longo prazo nos níveis de glóbulos vermelhos (RBC) em um paciente com PS antes e após a terapia fornecida pela presente invenção.

A FIGURA 17G é um gráfico de linha que ilustra a elevação a longo prazo nos níveis de hemoglobina no sangue (HGB) em um paciente com PS antes e depois da terapia fornecida pela presente invenção.

A FIGURA 17H é um gráfico de linha que ilustra a elevação a longo prazo nos níveis de hematócrito no sangue (HCT) em um paciente com PS antes e depois da terapia fornecida pela presente invenção.

A FIGURA 17I é um gráfico de linha que ilustra o nível de creatinina de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia.

A FIGURA 17J é um gráfico de linha que ilustra o nível de bicarbonato de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia.

A FIGURA 17K é um gráfico de linha que ilustra o nível de excesso de base de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia. A FIGURA 17L é um gráfico de barras que ilustra os níveis de magnésio no sangue em um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia, antes e depois da suplementação de magnésio. A FIGURA 17M é um gráfico de barras que ilustra a razão de glicose para creatinina na urina de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia. A FIGURA 17N é um gráfico de barras que ilustra a razão de potássio para creatinina na urina de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia. A FIGURA 17O é um gráfico de barras que ilustra a razão de cloreto para creatinina na urina de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia. A FIGURA 17P é um gráfico de barras que ilustra a razão de sódio para creatinina na urina de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia.

[00101] A FIGURA 18A é um gráfico de linha que ilustra o teor normal de mtDNA em 3 pacientes com PS (Pt.1, Pt.2 e Pt.3) tratados pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e após a terapia, conforme medido por PCR digital para a região deletada (em cada paciente) em comparação ao DNA genômico 18S que representa o número de mtDNA normal por célula e normalizado por linha de base.

[00102] A FIGURA 18B é um gráfico de linha que ilustra o nível de heteroplasmia (mtDNA deletado em comparação com mtDNA total) em 3 pacientes com PS (Pt.1, Pt.2 e Pt.3), na linha de base após MAT. A linha pontilhada representa a linha de base de cada paciente.

[00103] A FIGURA 19A é outro esquema dos diferentes estágios de tratamento de um paciente com Síndrome de Pearson (PS), conforme fornecido pela presente invenção. A FIGURA 19B é um gráfico de barras que ilustra o nível de lactato no sangue de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes (B) e após a terapia. A FIGURA 19C é um gráfico de barras que ilustra a pontuação sentado-para-levantado de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia. A FIGURA 19D é um gráfico de barras que ilustra a pontuação do teste de caminhada de seis minutos de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia. A FIGURA 19E é um gráfico de barras que ilustra a pontuação do dinamômetro de três repetições consecutivas (R1, R2, R3) de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e após a terapia. A FIGURA 19F é um gráfico de barras que ilustra a razão de magnésio para creatinina na urina em um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção como uma função do tempo antes e depois da terapia. A FIGURA 19G é um gráfico de barras que ilustra a razão de potássio para creatinina na urina em um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia. A FIGURA 19H é um gráfico de barras que ilustra a razão de cálcio na urina para creatinina em um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e após a terapia. A FIGURA 19I é um gráfico de barras que ilustra a razão do número de cópias de ATP8 para 18S na urina de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia. A FIGURA 19J é um gráfico de barras que ilustra o nível de ATP em linfócitos de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia.

[00104] A FIGURA 20A é ainda outro esquema dos diferentes estágios de tratamento de um paciente com síndrome de Pearson (PS) e de um paciente com síndrome de Kearns-Sayre (KSS), conforme fornecido pela presente invenção. A FIGURA 20B é um gráfico de barras que ilustra o nível de lactato no sangue de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes (B) e após a terapia. A FIGURA 20C é um gráfico de barras que ilustra os níveis de AST e ALT de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e após a terapia. A FIGURA 20D é um gráfico de barras que ilustra os níveis de triglicerídeo, colesterol total e colesterol VLDL de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia. A FIGURA 20E é um gráfico de barras que ilustra a pontuação da hemoglobina A1C (HbA1C) de um paciente com PS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e depois da terapia. A FIGURA 20F é um gráfico de linha que ilustra a pontuação sentado-para-levantado de um paciente com PS (Pt.3) tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção como uma função do tempo antes e depois da terapia. A FIGURA 20G é um gráfico de linha que ilustra a pontuação do teste de caminhada de seis minutos de um paciente com PS (Pt.3) tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção em função do tempo antes e após a terapia.

[00105] A FIGURA 21 é um gráfico de barras que ilustra o teor de ATP no sangue periférico de um paciente com KSS tratado pelos métodos fornecidos na presente invenção, antes e depois da terapia.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00106] A presente invenção fornece plataformas celulares, mais especificamente plataformas celulares derivadas de células- tronco, para distribuição direcionada e sistêmica de quantidades terapeuticamente significativas de mitocôndrias saudáveis totalmente funcionais e métodos para sua utilização em sujeitos com uma afecção debilitante, compreendendo sujeitos idosos e sujeitos que sofrem de doença ou doenças relacionadas a idade, bem como pacientes com câncer sofrendo de sequelas de tratamentos anticâncer, incluindo quimioterapia, radioterapia ou imunoterapia com anticorpos monoclonais. A presente invenção se baseia em várias constataçãos surpreendentes, entre as quais estão os resultados clínicos aqui exemplificados, mostrando que a injeção intravenosa de células-tronco hematopoiéticas derivadas da medula óssea enriquecidas com mitocôndrias normais, funcionais e saudáveis pode afetar beneficamente vários tecidos do sujeito. Em outras palavras, a melhora na função pode ser alcançada em vários órgãos e tecidos após a administração de células-tronco enriquecidas com mitocôndrias saudáveis.

[00107] A presente invenção se baseia em parte na constatação de que as células da medula óssea são receptivas para serem enriquecidas com mitocôndrias funcionais intactas e que as células da medula óssea humana são particularmente receptivas para serem enriquecidas com mitocôndrias, conforme divulgado, por exemplo, no documento WO 2016/135723. Sem estar vinculado a qualquer teoria ou mecanismo, postula-se que a coincubação de células-tronco com mitocôndrias saudáveis promove a transição de mitocôndrias funcionais intactas para as células-tronco.

[00108] Também foi descoberto que a extensão do enriquecimento de células-tronco, incluindo, mas não se limitando a células- tronco hematopoiéticas derivadas da medula óssea, com mitocôndrias e melhora na funcionalidade mitocondrial das células são dependentes das afecções usadas para o enriquecimento mitocondrial, incluindo, mas não limitado à concentração das mitocôndrias isoladas ou parcialmente purificadas, bem como às condições de incubação, podendo ser manipuladas, de forma a produzir o enriquecimento desejado.

[00109] A presente invenção fornece, em um aspecto, um método para tratar e/ou diminuir os efeitos debilitantes de várias afecções, através da introdução de mitocôndrias humanas saudáveis parcialmente purificadas ex vivo em células-tronco obtidas ou derivadas de um sujeito afetado com uma afecção debilitante ou de uma pessoa saudável doador e transplantando as células-tronco “enriquecidas mitocondrialmente” no sujeito afetado pela afecção debilitante.

[00110] Em determinadas modalidades, o sujeito afetado com a afecção debilitante sofre de envelhecimento ou de uma doença ou doenças relacionadas a idade. Em outras modalidades, o sujeito que sofre dos efeitos debilitantes é um paciente com câncer submetido a quimioterapia, radioterapia ou imunoterapia com anticorpos monoclonais. Em algumas modalidades, o paciente com câncer é um sujeito afetado com uma doença maligna não hematopoiética. Em outras modalidades, o paciente com câncer é um sujeito afetado com uma doença maligna hematopoiética.

[00111] Em outras modalidades, as células-tronco humanas administradas ao sujeito são autólogas ao sujeito. Em outras modalidades, as células-tronco humanas administradas ao sujeito são de um doador, ou seja, alogênicas ao sujeito.

[00112] Em algumas modalidades, as células-tronco humanas autólogas ou alogênicas são células-tronco pluripotentes (PSCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Em outras modalidades, as células-tronco humanas autólogas ou alogênicas são células-tronco mesenquimais.

[00113] De acordo com várias modalidades, as células- tronco humanas são derivadas de tecido adiposo, mucosa oral, sangue, sangue do cordão umbilical ou medula óssea. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em modalidades específicas, as células-tronco humanas são derivadas da medula óssea.

[00114] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica para uso no tratamento ou diminuição de afecções debilitantes em um sujeito, sendo que a composição farmacêutica compreende pelo menos 105 a 2x107 células-tronco humanas por quilograma de peso corporal do sujeito, as células-tronco humanas suspensas em um meio líquido farmaceuticamente aceitável com capacidade para suportar a viabilidade das células, em que as células-tronco humanas são enriquecidas com mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis congeladas e descongeladas e em que as afecções debilitantes são selecionadas a partir do grupo que consiste em envelhecimento, doenças relacionadas a idade e as sequelas de tratamentos anticâncer

[00115] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos 105 a 2x107 células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente por quilograma de peso corporal do paciente. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos 5x105 a 1,5x107 células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente por quilograma de peso corporal do paciente. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos 5x105 a 4x107 células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente por quilograma de peso corporal do paciente. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos 106 a 107 células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente por quilograma de peso corporal do paciente. Em outras modalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos 105 ou pelo menos 106 células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente por quilograma de peso corporal do paciente. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um total de pelo menos 5x105 até 5x109 células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um total de pelo menos 106 a 109 células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente. Em outras modalidades, a composição farmacêutica compreende um total de pelo menos 2x106 até 5x108 células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente.

[00116] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método ex-vivo para enriquecer células-tronco humanas com mitocôndrias funcionais, em que o método compreende as etapas de (i) fornecer uma primeira composição, compreendendo uma pluralidade de células-tronco humanas obtidas ou derivadas de um sujeito afetado com uma afecção debilitante ou de um doador saudável não afetado por uma afecção debilitante; (ii) fornecer uma segunda composição, compreendendo uma pluralidade de mitocôndrias funcionais humanas isoladas ou parcialmente purificadas obtidas de um doador saudável não afetado por uma afecção debilitante; (iii) contatar as células-tronco humanas da primeira composição com as mitocôndrias funcionais humanas da segunda composição, formando assim uma terceira composição; e (iv) incubar a terceira composição sob condições que permitem que as mitocôndrias funcionais humanas entrem nas células-tronco humanas, enriquecendo assim as ditas células-tronco humanas com as ditas mitocôndrias funcionais humanas, formando assim uma quarta composição; em que o teor mitocondrial das células- tronco humanas enriquecidas na quarta composição é detectavelmente maior do que o teor mitocondrial das células-tronco humanas na primeira composição.

[00117] A presente invenção fornece, em um aspecto, um método ex-vivo para enriquecer células da medula óssea humana com mitocôndrias funcionais, em que o método compreende as etapas de (i) fornecer uma primeira composição, compreendendo uma pluralidade de células da medula óssea humana obtidas ou derivado de um paciente afetado com uma doença maligna ou de um sujeito saudável não afetado com uma doença maligna; (ii) fornecer uma segunda composição, compreendendo uma pluralidade de mitocôndrias funcionais humanas isoladas obtidas do mesmo paciente afetado pela doença maligna antes dos tratamentos anticâncer ou de um indivíduo saudável não afetado por uma doença maligna; (iii) misturar as células da medula óssea humana da primeira composição com as mitocôndrias funcionais humanas da segunda composição, formando assim uma terceira composição; e (iv) incubar a terceira composição sob condições que permitem às mitocôndrias funcionais humanas entrar nas células da medula óssea humana, enriquecendo assim as ditas células da medula óssea humana com as ditas mitocôndrias funcionais humanas, formando assim uma quarta composição; em que o teor mitocondrial das células da medula óssea humana na quarta composição é detectavelmente maior do que o teor mitocondrial das células da medula óssea humana na primeira composição.

[00118] O termo "método ex-vivo", tal como usado no presente documento, se refere a um método que compreende etapas realizadas exclusivamente fora do corpo humano. Em particular, um método ex vivo compreende a manipulação de células fora do corpo que são subsequentemente reintroduzidas ou transplantadas no sujeito a ser tratado.

[00119] O termo "enriquecimento", tal como usado no presente documento, se refere a qualquer ação projetada para aumentar o teor mitocondrial, por exemplo, o número de mitocôndrias intactas ou a funcionalidade das mitocôndrias de uma célula de mamífero. Em particular, as células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais mostrarão função aprimorada em comparação às mesmas células-tronco antes do enriquecimento.

[00120] O termo "células-tronco", tal como usado no presente documento, geralmente se refere a quaisquer células-tronco de mamíferos. As células-tronco são células indiferenciadas que podem se diferenciar em outros tipos de células e podem se dividir para produzir mais do mesmo tipo de células-tronco. As células-tronco podem ser totipotentes ou pluripotentes.

[00121] O termo "células-tronco humanas", como usado no presente documento, geralmente se refere a todas as células-tronco encontradas naturalmente em humanos e a todas as células-tronco produzidas ou derivadas ex vivo e são compatíveis com humanos. Uma “célula progenitora”, como uma célula-tronco, tem tendência a se diferenciar em um tipo específico de célula, mas já é mais específica do que uma célula-tronco e é forçada a se diferenciar em sua célula "alvo". A diferença mais importante entre as células- tronco e as células progenitoras é que as células-tronco podem se replicar indefinidamente, enquanto as células progenitoras podem se dividir apenas um número limitado de vezes. O termo "células-tronco humanas", tal como usado no presente documento, inclui ainda "células progenitoras" e "células-tronco não totalmente diferenciadas".

[00122] Em algumas modalidades, o enriquecimento das células-tronco com mitocôndrias exógenas humanas funcionais saudáveis compreende a lavagem das células-tronco enriquecidas mitocondrialmente após a incubação das células-tronco humanas com as ditas mitocôndrias exógenas humanas funcionais saudáveis. Esta etapa fornece uma composição das células-tronco enriquecidas mitocondrialmente substancialmente desprovidas de restos celulares ou restos de membrana mitocondrial e mitocôndrias que não entraram nas células-tronco. Em algumas modalidades, a lavagem compreende a centrifugação das células-tronco enriquecidas mitocondrialmente após a incubação das células-tronco humanas com as ditas mitocôndrias exógenas humanas funcionais saudáveis. De acordo com algumas modalidades, sendo que a composição farmacêutica compreende as células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente é separada das mitocôndrias livres, isto é, mitocôndrias que não entraram nas células-tronco, ou outros fragmentos celulares. De acordo com algumas modalidades, sendo que a composição farmacêutica compreende as células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente não compreende uma quantidade detectável de mitocôndrias livres.

[00123] Conforme usado no presente documento, o termo "células-tronco pluripotentes (PSCs)" se refere a células que podem se propagar indefinidamente, bem como dar origem a uma pluralidade de tipos de células no corpo. As células-tronco totipotentes são células que podem dar origem a todos os outros tipos de células do corpo. As células-tronco embrionárias (ESCs) são células-tronco totipotentes e as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são células-tronco pluripotentes.

[00124] Conforme usado no presente documento, o termo "células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)" se refere a um tipo de célula-tronco pluripotente que pode ser gerada a partir de células somáticas humanas adultas.

[00125] Conforme usado no presente documento, o termo "células-tronco embrionárias (ESC)" se refere a um tipo de célula-tronco totipotente derivada da massa celular interna de um blastocisto.

[00126] O termo "células da medula óssea", tal como usado no presente documento, geralmente se refere a todas as células humanas naturalmente encontradas na medula óssea de humanos e a todas as populações de células encontradas naturalmente na medula óssea de humanos. O termo “células-tronco da medula óssea” e “células-tronco derivadas da medula óssea” referem-se à população de células-tronco derivadas da medula óssea.

[00127] Os termos "mitocôndrias funcionais" e "mitocôndrias saudáveis" são usados aqui indistintamente e referem-se a mitocôndrias que exibem parâmetros indicativos de mtDNA normal e níveis normais de atividade não patológicos. A atividade das mitocôndrias pode ser medida por uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica, tais como potencial de membrana, consumo de O2, produção de ATP e nível de atividade da citrato sintase (CS).

[00128] O sintagma "células-tronco obtidas de um sujeito afetado com uma afecção debilitante ou de um doador não afetado com uma afecção debilitante", tal como usado no presente documento, se refere a células que eram células-tronco no sujeito/doador no momento de seu isolamento do sujeito.

[00129] O sintagma "células-tronco derivadas de um sujeito acometido por uma afecção debilitante ou de um doador não afetado por uma afecção debilitante", tal como aqui utilizado, se refere a células que não eram células-tronco no sujeito/doador e foram manipuladas para se tornarem células-tronco. O termo "manipulado", conforme usado no presente documento, se refere ao uso de qualquer um dos métodos conhecidos na área (Yu J. et al., Science, 2007, Vol. 318 (5858), páginas 1.917 a 1.920) para reprogramar células somáticas a um estado indiferenciado e se tornar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e, opcionalmente, reprogramar ainda mais as iPSCs para se tornarem células de uma linhagem ou população desejada (Chen M. et al., IOVS, 2010, vol. 51 (11), páginas 5.970 a 5.978), como células da medula óssea (Xu Y. et al., PLoS ONE, 2012, Vol. 7 (4), página e34321).

[00130] O termo "células CD34+ ", tal como usado no presente documento, se refere a células-tronco hematopoéticas caracterizadas como sendo CD34 positivas que são obtidas de células-tronco ou mobilizadas da medula óssea ou obtidas do sangue do cordão umbilical.

[00131] O termo "um sujeito afetado com uma afecção debilitante", tal como usado no presente documento, se refere a um sujeito humano experimentando efeitos debilitantes causados por certas afecções. A afecção debilitante pode referir-se ao envelhecimento, doenças relacionadas a idade ou paciente com câncer submetido a tratamentos anticâncer, bem como outras afecções debilitantes.

[00132] O termo “envelhecimento” se refere a uma deterioração progressiva inevitável da função fisiológica com o aumento da idade, demograficamente caracterizada por um aumento dependente da idade na mortalidade e declínio de várias habilidades físicas e mentais.

[00133] O termo "doença relacionada com a idade", tal como usado no presente documento, se refere a "doenças dos idosos", doenças vistas com frequência crescente com o aumento da senescência. As doenças relacionadas a idade incluem, mas não estão limitadas a aterosclerose e doenças cardiovasculares, câncer, artrite, catarata, osteoporose, diabetes tipo 2, hipertensão e demência, como a doença de Alzheimer. A incidência de todas essas doenças aumenta cumulativamente com o avanço da idade.

[00134] O termo "um sujeito afetado com uma doença maligna", tal como usado no presente documento, se refere a um sujeito humano diagnosticado com uma doença maligna, com suspeita de ter uma doença maligna ou em um grupo de risco de desenvolver uma doença maligna. Como certos tipos de doenças malignas são herdadas, a progênie de indivíduos diagnosticados com uma doença maligna é considerada um grupo de risco de desenvolver uma doença maligna.

[00135] O termo "um sujeito/doador não afetado com uma doença maligna", tal como usado no presente documento, se refere a um sujeito humano não diagnosticado com uma doença maligna e/ou sem suspeita de ter uma doença maligna.

[00136] O termo "um sujeito afetado com uma doença maligna não hematopoiética", tal como usado no presente documento, se refere a um sujeito humano diagnosticado com uma doença maligna não hematopoiética e/ou suspeito de ter uma doença maligna não hematopoiética.

[00137] O termo "um sujeito afetado com uma doença maligna hematopoiética", tal como usado no presente documento, se refere a um sujeito humano diagnosticado com uma doença maligna hematopoiética e/ou suspeito de ter uma doença maligna hematopoiética.

[00138] Os termos "doador saudável" e "sujeito saudável" são usados indistintamente e se referem a um sujeito não afetado com a doença ou condição que está sendo tratada.

[00139] O termo "contato" se refere a trazer a composição de mitocôndrias e células em proximidade suficiente para promover a entrada das mitocôndrias nas células. O termo introdução de mitocôndrias nas células-alvo é usado indistintamente com o termo contato.

[00140] O termo "mitocôndrias funcionais humanas isoladas ou parcialmente purificadas", tal como usado no presente documento, se refere a mitocôndrias intactas isoladas de células obtidas de um sujeito saudável, não afetado por uma doença mitocondrial. A quantidade total de proteínas mitocondriais nas mitocôndrias parcialmente purificadas está entre 20% e 80% da quantidade total de proteínas celulares na amostra.

[00141] O termo "isolado" conforme usado aqui e nas reivindicações no contexto de mitocôndrias inclui mitocôndrias que foram purificadas, pelo menos parcialmente, de outros componentes encontrados na dita fonte. Em determinadas modalidades, a quantidade total de proteínas mitocondriais na segunda composição que compreende a pluralidade de mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis isoladas está entre 20% e 80%, 20 e 70%, 40 e 70%, 20 e 40% ou 20 e 30% da quantidade total de proteínas celulares na amostra. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em determinadas modalidades, a quantidade total de proteínas mitocondriais na segunda composição que compreende a pluralidade de mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis isoladas está entre 20% e 80% da quantidade total de proteínas celulares na amostra. Em determinadas modalidades, a quantidade total de proteínas mitocondriais na segunda composição que compreende a pluralidade de mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis isoladas está entre 20% e 80% do peso combinado das mitocôndrias e outras frações subcelulares. Em outras modalidades, a quantidade total de proteínas mitocondriais na segunda composição que compreende a pluralidade de mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis isoladas está acima de 80% do peso combinado das mitocôndrias e outras frações subcelulares.

[00142] De acordo com algumas modalidades, o método para enriquecer células-tronco humanas com mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis não compreende a medição do potencial de membrana da célula.

[00143] Em algumas modalidades, o enriquecimento das células-tronco com mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis compreende a introdução nas células-tronco de uma dose de mitocôndria de pelo menos 0,044 até 176 miliunidades de atividade de CS por milhão de células. Em algumas modalidades, o enriquecimento das células-tronco com mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis compreende a introdução nas células-tronco de uma dose de mitocôndria de pelo menos 0,088 até 176 miliunidades de atividade de CS por milhão de células. Em outras modalidades, o enriquecimento das células-tronco com mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis compreende a introdução nas células-tronco de uma dose de mitocôndria de pelo menos 0,2 até 150 miliunidades de atividade de CS por milhão de células. Em outras modalidades, o enriquecimento das células-tronco com mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis compreende a introdução nas células-tronco de uma dose de mitocôndrias de pelo menos 0,4 até 100 miliunidades de atividade de CS por milhão de células. Em algumas modalidades, o enriquecimento das células- tronco com mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis compreende a introdução nas células-tronco de uma dose de mitocôndria de pelo menos 0,6 até 80 miliunidades de atividade de CS por milhão de células. Em algumas modalidades, o enriquecimento das células-tronco com mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis compreende a introdução nas células-tronco de uma dose de mitocôndria de pelo menos 0,7 até 50 miliunidades de atividade de CS por milhão de células. Em algumas modalidades, o enriquecimento das células- tronco com mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis compreende a introdução nas células-tronco de uma dose de mitocôndria de pelo menos 0,8 até 20 miliunidades de atividade de CS por milhão de células. Em algumas modalidades, o enriquecimento das células-tronco com mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis compreende a introdução nas células-tronco de uma dose de mitocôndria de pelo menos 0,88 até 17,6 miliunidades de atividade de CS por milhão de células. Em algumas modalidades, o enriquecimento das células- tronco com mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis compreende a introdução nas células-tronco de uma dose de mitocôndria de pelo menos 0,44 até 17,6 miliunidades de atividade de CS por milhão de células.

[00144] A dose mitocondrial pode ser expressa em termos de unidades de atividade de CS ou número de cópias de mtDNA de outras medições quantificáveis da quantidade de mitocôndrias funcionais saudáveis, conforme explicado no presente documento. Uma "unidade de atividade de CS" é definida como a quantidade que permite a conversão de um substrato de micromole em 1 minuto em um volume de reação de 1 ml.

[00145] Em algumas modalidades, a identificação/discriminação de mitocôndrias endógenas de mitocôndrias exógenas, após a última ter sido introduzida na célula alvo, pode ser realizada por vários meios, incluindo, por exemplo, mas não limitado a: identificação de diferenças nas sequências de mtDNA, por exemplo diferentes haplótipos, entre as mitocôndrias endógenas e mitocôndrias exógenas, identificando proteínas mitocondriais específicas originárias do tecido de origem das mitocôndrias exógenas, como, por exemplo, citocromo p450 clivagem da cadeia lateral do colesterol (P450SCC) da placenta, UCP1 do tecido adiposo marrom, e semelhantes, ou qualquer combinação dos mesmos.

[00146] O termo "exógeno" em relação às mitocôndrias se refere às mitocôndrias que são introduzidas em uma célula-alvo (por exemplo, células-tronco), a partir de uma fonte que é externa à célula. Por exemplo, em algumas modalidades, as mitocôndrias exógenas são comumente derivadas ou isoladas de uma célula doadora que é diferente da célula alvo. Por exemplo, as mitocôndrias exógenas podem ser produzidas/feitas em uma célula doadora, purificadas/isoladas obtidas a partir da célula doadora e posteriormente introduzidas na célula alvo.

[00147] O termo "endógeno" em relação às mitocôndrias se refere às mitocôndrias que estão sendo feitas/expressas/produzidas pela célula e não são introduzidas a partir de uma fonte externa na célula. Em algumas modalidades, as mitocôndrias endógenas contêm proteínas e/ou outras moléculas que são codificadas pelo genoma da célula. Em algumas modalidades, o termo "mitocôndria endógena" é equivalente ao termo "mitocôndria hospedeira".

[00148] Conforme usado no presente documento, o termo "células autólogas" ou "células que são autólogas, se refere a serem células do próprio paciente. O termo "mitocôndrias autólogas" se refere a mitocôndrias obtidas das próprias células do paciente ou de células maternas. Os termos “células alogênicas” ou “mitocôndrias alogênicas” referem-se a ser de um indivíduo doador diferente.

[00149] O termo "singênico", conforme usado no presente documento e nas reivindicações, se refere à identidade genética ou quase identidade genética suficiente para permitir o enxerto entre indivíduos sem rejeição. O termo singeneico no contexto de mitocôndrias é usado aqui indistintamente com o termo mitocôndria autóloga, significando a mesma linhagem materna

[00150] O termo "mitocôndria exógena" se refere a uma mitocôndria ou DNA mitocondrial que é introduzido em uma célula-alvo (ou seja, célula-tronco), a partir de uma fonte externa à célula. Por exemplo, em algumas modalidades, uma mitocôndria exógena pode ser derivada ou isolada de uma célula que é diferente da célula alvo. Por exemplo, uma mitocôndria exógena pode ser produzida/feita em uma célula doadora, purificada/isolada obtida da célula doadora e posteriormente introduzida na célula alvo.

[00151] O sintagma "afecções que permitem que as mitocôndrias funcionais humanas entrem nas células-tronco humanas", tal como usado no presente documento, geralmente se refere a parâmetros como tempo, temperatura, meio de cultura e proximidade entre a mitocôndria e as células- tronco. Por exemplo, as células humanas e linhagens celulares humanas são rotineiramente incubados em meio líquido, e mantidos em ambientes estéreis, tais como em incubadoras de cultura de tecidos, a 37 ºC e atmosfera de 5% de CO2. De acordo com modalidades alternativas divulgadas e exemplificadas aqui, as células podem ser incubadas à temperatura ambiente em solução salina suplementada com albumina de soro humano. De acordo com algumas modalidades, a incubação das mitocôndrias funcionais humanas com as células- tronco humanas é precedida por centrifugação. De acordo com outras modalidades, a incubação ocorre antes da centrifugação. Em ainda outras modalidades, a centrifugação ocorre durante a dita incubação. Em determinadas modalidades, a velocidade de centrifugação é de 8.000 g. Em determinadas modalidades, a velocidade de centrifugação é de 7.000 g. De acordo com outras modalidades, a centrifugação está a uma velocidade entre 5.000 a 10.000 g. De acordo com outras modalidades, a centrifugação está a uma velocidade entre

7.000 a 8.000 g.

[00152] Em determinadas modalidades, as células- tronco humanas são incubadas com as mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis por um tempo que varia de 0,5 a 30 horas, a uma temperatura que varia de cerca de 16 a cerca de 37 ºC. Em determinadas modalidades, as células-tronco humanas são incubadas com as mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis por um tempo que varia de 1 a 30 ou de 5 a 25 horas. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em modalidades específicas, a incubação é de 20 a 30 horas. Em algumas modalidades, a incubação é de pelo menos 1, 5, 10, 15 ou 20 horas. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em outras modalidades, a incubação é de até 5, 10, 15, 20 ou 30 horas. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em modalidades específicas, a incubação é de 24 horas. Em algumas modalidades, a incubação é à temperatura ambiente (16 ºC a 30 ºC). Em outras modalidades, a incubação é a 37 ºC. Em algumas modalidades, a incubação ocorre em uma atmosfera de 5% de CO2. Em outras formas de realização, a incubação não incluem adicionado CO2 acima do nível encontrado no ar. Em determinadas modalidades, a incubação ocorre até que o teor mitocondrial nas células-tronco aumente em média 1% a 45% em comparação com seu teor mitocondrial inicial.

[00153] Em outras modalidades, a incubação é realizada em meio de cultura suplementado com albumina de soro humano (HSA). Em modalidades adicionais, a incubação é realizada em solução salina suplementada com HSA. De acordo com determinadas modalidades exemplificativas, as afecções que permitem que as mitocôndrias funcionais entrem nas células-tronco humanas, enriquecendo assim as ditas células-tronco humanas com as ditas mitocôndrias funcionais humanas incluem incubação à temperatura ambiente em solução salina suplementada com 4,5% de albumina de soro humano.

[00154] Ao manipular as condições de incubação, pode-se manipular as características do produto. Em determinadas modalidades, a incubação é realizada em 37 ºC. Em determinadas modalidades, a incubação é realizada por pelo menos 6 horas. Em determinadas modalidades, a incubação é realizada por pelo menos 12 horas. Em determinadas modalidades, a incubação é realizada por 12 a 24 horas. Em determinadas modalidades, a incubação é realizada em uma razão de 1*105 a 1*107 células- tronco puras por quantidade de mitocôndria exógena tendo ou exibindo 4,4 miliunidades de CS. Em determinadas modalidades, a incubação é realizada a uma razão de 1*106 células-tronco puras por quantidade de mitocôndrias exógenas com ou exibindo 4,4 milliunidades de CS. Em determinadas modalidades, as afecções são suficientes para aumentar o teor mitocondrial das células-tronco puras em pelo menos cerca de 3%, 5% ou 10%, conforme determinado pela atividade de CS. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[00155] O termo "teor mitocondrial", tal como usado no presente documento, se refere à quantidade de mitocôndrias funcionais dentro de uma célula ou à quantidade média de mitocôndrias funcionais dentro de uma pluralidade de células.

[00156] Conforme usado aqui e nas reivindicações, o termo "doença mitocondrial" e o termo "doença mitocondrial primária" podem ser usados alternadamente. O termo "doença mitocondrial primária", tal como usado no presente documento, se refere a uma doença mitocondrial que é diagnosticada por um mutação conhecida ou indiscutivelmente patogênica no DNA mitocondrial, ou por mutações em genes do DNA nuclear, cujos produtos gênicos são importados para a mitocôndria. De acordo com algumas modalidades, a doença mitocondrial primária é uma doença congênita. De acordo com algumas modalidades, a doença mitocondrial primária não é uma disfunção mitocondrial secundária. Os termos “disfunção mitocondrial secundária” e “disfunção mitocondrial adquirida” são usados alternadamente ao longo do aplicativo.

[00157] Em determinadas modalidades, os métodos descritos acima em várias modalidades das mesmas incluem ainda centrifugação antes, durante ou após a incubação das células-tronco com a mitocôndria exógena. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em algumas modalidades, os métodos descritos acima em várias modalidades das mesmas incluem uma única etapa de centrifugação antes, durante ou após a incubação das células-tronco com as mitocôndrias exógenas. Em algumas modalidades, a força de centrifugação varia de 1.000 g a 8.500 g. Em algumas modalidades, a força de centrifugação varia de 2.000 g a 4.000 g. Em algumas modalidades, a força de centrifugação está acima de

2.500 g. Em algumas modalidades, a força de centrifugação varia de 2.500 g a

8.500 g. Em algumas modalidades, a força de centrifugação varia de 2.500 g a

8.000 g. Em algumas modalidades, a força de centrifugação varia de 3.000 g a

8.000 g. Em outras modalidades, a força de centrifugação varia de 4.000 g a

8.000 g. Em modalidades específicas, a força de centrifugação é de 7.000 g. Em outras modalidades, a força de centrifugação é de 8.000 g. Em algumas modalidades, a centrifugação é realizada por um tempo que varia de 2 minutos a 30 minutos. Em algumas modalidades, a centrifugação é realizada por um tempo que varia de 3 minutos a 25 minutos. Em algumas modalidades, a centrifugação é realizada por um tempo que varia de 5 minutos a 20 minutos. Em algumas modalidades, a centrifugação é realizada por um tempo que varia de 8 minutos a 15 minutos.

[00158] Em algumas modalidades, a centrifugação é realizada em uma temperatura que varia de 4 a 37 ºC. Em determinadas modalidades, a centrifugação é realizada em uma temperatura que varia de 4 a 10 ºC ou 16 a 30 ºC. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em modalidades específicas, a centrifugação é realizada a 2 a 6 ºC. Em modalidades específicas, a centrifugação é realizada a 4 ºC. Em algumas modalidades, os métodos descritos acima em várias modalidades das mesmas incluem uma única centrifugação antes, durante ou após a incubação das células-tronco com as mitocôndrias exógenas, seguido pelo repouso das células a uma temperatura inferior a 30 ºC. Em algumas modalidades, as afecções que permitem que as mitocôndrias funcionais humanas entrem nas células-tronco humanas incluem uma única centrifugação antes, durante ou após a incubação das células-tronco com as mitocôndrias exógenas, seguido pelo repouso das células a uma temperatura variando entre 16 e 28 ºC.

[00159] Em determinadas modalidades, a primeira composição é fresca. Em determinadas modalidades, a primeira composição foi congelada e, em seguida, descongelada antes da incubação. Em determinadas modalidades, a segunda composição é fresca. Em determinadas modalidades, a segunda composição foi congelada e, em seguida, descongelada antes da incubação. Em determinadas modalidades, a quarta composição é fresca. Em determinadas modalidades, a quarta composição foi congelada e, em seguida, descongelada antes da administração.

[00160] Em modalidades específicas, as células-tronco obtidas de um paciente afetado com uma doença maligna ou de um sujeito saudável são células da medula óssea ou células-tronco derivadas da medula óssea.

[00161] O termo "células-tronco de mamíferos enriquecidas com mitocôndrias funcionais" se refere a mamíferos humanos e não humanos.

[00162] De acordo com os princípios da presente invenção, mitocôndrias exógenas humanas funcionais saudáveis são introduzidas em células-tronco humanas, enriquecendo assim essas células com mitocôndrias humanas funcionais saudáveis. Deve ser entendido que tal enriquecimento altera o teor mitocondrial das células-tronco humanas: enquanto as células-tronco humanas ingênuas têm substancialmente uma população de mitocôndrias hospedeiras/autólogas, as células-tronco humanas enriquecidas com mitocôndrias exógenas têm substancialmente duas populações de mitocôndrias, uma primeira população de mitocôndrias hospedeiras/autólogas/endógenas e outra população das mitocôndrias introduzidas (isto é, as mitocôndrias exógenas). Assim, o termo “enriquecido” se refere ao estado das células após receber/incorporar mitocôndrias exógenas. Determinar o número e/ou razão entre as duas populações de mitocôndrias é simples, pois as duas populações podem diferir em vários aspectos, por exemplo, em seu DNA mitocondrial. Portanto, o sintagma “células-tronco humanas enriquecidas com mitocôndrias humanas funcionais saudáveis” é equivalente ao sintagma “células-tronco humanas compreendendo mitocôndrias endógenas e mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis”. Por exemplo, as células-tronco humanas que compreendem pelo menos 1% de mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis da mitocôndria total, são consideradas mitocôndrias hospedeiras/autólogas/endógenas e mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis em uma razão de 99:1. Por exemplo, "3% da mitocôndria total" significa que após o enriquecimento, o teor mitocondrial original (endógeno) é 97% da mitocôndria total e a mitocôndria introduzida (exógena) é 3% da mitocôndria total - isso é equivalente a (3/97 =) 3,1% de enriquecimento. Outro exemplo - "33% da mitocôndria total" significa que após o enriquecimento, o teor mitocondrial original (endógeno) é 67% da mitocôndria total e a mitocôndria introduzida (exógena) é 33% da mitocôndria total - isso é equivalente a (33/67 =) enriquecimento de 49,2%.

[00163] Heteroplasmia é a presença de mais de um tipo de DNA mitocondrial dentro de uma célula ou indivíduo. O nível de heteroplasmia é a razão de moléculas de mtDNA mutantes vs. moléculas de mtDNA de tipo selvagem/funcionais e é um fator importante ao se considerar a gravidade das doenças mitocondriais. Enquanto níveis mais baixos de heteroplasmia (quantidade suficiente de mitocôndrias são funcionais) estão associados a um fenótipo saudável, níveis mais altos de heteroplasmia (quantidade insuficiente de mitocôndrias são funcionais) estão associados a patologias. Em determinadas modalidades, o nível de heteroplasmia das células-tronco na quarta composição é pelo menos 1% menor do que o nível de heteroplasmia das células-tronco na primeira composição. Em determinadas modalidades, o nível de heteroplasmia das células-tronco na quarta composição é pelo menos 3% menor do que o nível de heteroplasmia das células-tronco na primeira composição. Em determinadas modalidades, o nível de heteroplasmia das células-tronco na quarta composição é pelo menos 5% menor do que o nível de heteroplasmia das células-tronco na primeira composição. Em determinadas modalidades, o nível de heteroplasmia das células-tronco na quarta composição é pelo menos 10% menor do que o nível de heteroplasmia das células-tronco na primeira composição. Em determinadas modalidades, o nível de heteroplasmia das células-tronco na quarta composição é pelo menos 15% menor do que o nível de heteroplasmia das células-tronco na primeira composição. Em determinadas modalidades, o nível de heteroplasmia das células-tronco na quarta composição é pelo menos 20% menor do que o nível de heteroplasmia das células-tronco na primeira composição. Em determinadas modalidades, o nível de heteroplasmia das células-tronco na quarta composição é pelo menos 25% menor do que o nível de heteroplasmia das células-tronco na primeira composição. Em determinadas modalidades, o nível de heteroplasmia das células-tronco na quarta composição é pelo menos 30% menor do que o nível de heteroplasmia das células-tronco na primeira composição.

[00164] Em determinadas modalidades, o teor mitocondrial das células-tronco humanas enriquecidas com mitocôndrias saudáveis (também ditas aqui como células da quarta composição) é detectavelmente maior do que o teor mitocondrial das células-tronco humanas na primeira composição. De acordo com várias modalidades, o teor mitocondrial da quarta composição é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200% ou mais, maior do que o teor mitocondrial de a primeira composição. Em determinadas modalidades, a primeira composição é usada fresca.

[00165] Em determinadas modalidades, a primeira composição é congelada e, em seguida, armazenada e usada após o descongelamento. Em outras modalidades, a segunda composição que compreende uma pluralidade de mitocôndrias humanas funcionais é usada fresca. Em outras modalidades, a segunda composição é congelada e descongelada antes do uso. Em outras modalidades, a quarta composição é usada sem congelamento e armazenamento. Em ainda outras modalidades, a quarta composição é usada após congelamento, armazenamento e descongelamento. Os métodos adequados para o congelamento e descongelamento de preparações de células a fim de preservar a viabilidade são bem conhecidos na técnica. Os métodos adequados para congelamento e descongelamento de mitocondriais a fim de preservar a estrutura e função são divulgados nos documentos WO 2013/035101 e WO 2016/135723 para os presentes inventores e nas referências aí citadas.

[00166] A citrato sintase (CS) está localizada na matriz mitocondrial, mas é codificada pelo DNA nuclear. A citrato sintase está envolvida na primeira etapa do ciclo de Krebs e é comumente usada como um marcador enzimático quantitativo para a presença de mitocôndrias intactas (Larsen S. et al., J. Physiol., 2012, Vol. 590 (14), páginas 3 349 a 3.360; Cook GA et al., Biochim. Biophys. Acta., 1983, vol. 763 (4), páginas 356 a 367).

[00167] Em determinadas modalidades, o teor mitocondrial das células-tronco na primeira composição, na segunda composição ou na quarta composição é determinado pela determinação do teor de citrato sintase. Em determinadas modalidades, o teor mitocondrial das células-tronco na primeira composição, na segunda composição ou na quarta composição é determinado pela determinação do nível de atividade da citrato sintase. Em determinadas modalidades, o teor mitocondrial das células-tronco na primeira composição, na segunda composição ou na quarta composição se correlaciona com o teor de citrato sintase. Em determinadas modalidades, o teor mitocondrial das células-tronco na primeira composição, na segunda composição ou na quarta composição se correlaciona com o nível de atividade da citrato sintase. A atividade de CS pode ser medida por kits disponíveis comercialmente, por exemplo, usando o kit de atividade de CS CS0720 (Sigma).

[00168] A NADPH-citocromo C redutase eucariótica (citocromo C redutase) é uma flavoproteína localizada no retículo endoplasmático. Transfere elétrons do NADPH para várias oxigenases, sendo as mais importantes a família de enzimas do citocromo P450, responsável pela desintoxicação dos xenobióticos. A citocromo C redutase é amplamente utilizada como marcador de retículo endoplasmático. Em determinadas modalidades, a segunda composição é substancialmente livre de atividade da citocromo C redutase ou citocromo C redutase. Em determinadas modalidades, a quarta composição não é enriquecida com citocromo C redutase ou atividade de citocromo C redutase em comparação à primeira composição

[00169] Em determinadas modalidades, as células- tronco são células-tronco pluripotentes (PSC). Em outras modalidades, as PSCs são células-tronco não embrionárias. De acordo com algumas modalidades, as células-tronco embrionárias são explicitamente excluídas do escopo da invenção. Em algumas modalidades, as células-tronco são PSCs induzidas (iPSCs). Em determinadas modalidades, as células-tronco são células-tronco embrionárias. Em determinadas modalidades, as células-tronco são derivadas de células da medula óssea. Em modalidades particulares, as células-tronco são células CD34+. Em modalidades particulares, as células-tronco são células- tronco mesenquimais. Em outras modalidades, as células-tronco são derivadas de tecido adiposo. Em ainda outras modalidades, as células-tronco são derivadas de sangue. Em outras modalidades, as células-tronco são derivadas do sangue do cordão umbilical. Em outras modalidades, as células-tronco são derivadas da mucosa oral.

[00170] Em determinadas modalidades, as células- tronco derivadas da medula óssea compreendem células mielopoiéticas. O termo "células mielopoiéticas", tal como usado no presente documento, se refere a células envolvidas na mielopoiese, por exemplo, na produção de medula óssea e de todas as células que surgem a partir dela, ou seja, todas as células sanguíneas.

[00171] Em determinadas modalidades, as células- tronco derivadas da medula óssea compreendem células eritropoiéticas. O termo "células eritropoiéticas", tal como usado no presente documento, se refere a células envolvidas na eritropoiese, por exemplo, na produção de glóbulos vermelhos (eritrócitos).

[00172] Em determinadas modalidades, as células- tronco derivadas da medula óssea compreendem células-tronco hematopoiéticas (HSCs) de multipotenciais. O termo "células-tronco hematopoiéticas multipotenciais" ou "hemocitoblastos", tal como usado no presente documento, se refere às células-tronco que dão origem a todas as outras células sanguíneas através do processo de hematopoiese.

[00173] Em determinadas modalidades, as células- tronco derivadas da medula óssea compreendem células progenitoras mieloides comuns, células progenitoras linfoides comuns ou qualquer combinação das mesmas. . Em determinadas modalidades, as células-tronco derivadas da medula óssea compreendem células-tronco mesenquimais. O termo "progenitor de mieloide comum", tal como usado no presente documento, se refere às células que geram células mieloides. O termo "progenitor de linfoide comum", tal como usado no presente documento, se refere às células que geram linfócitos.

[00174] Em determinadas modalidades, as células- tronco derivadas da medula óssea da primeira composição compreendem ainda megacariócitos, eritrócitos, mastócitos, mioblastos, basófilos, neutrófilos, eosinófilos, monócitos, macrófagos, células exterminadoras naturais (NK), pequenos linfócitos, linfócitos T, linfócitos B, células plasmáticas, células reticulares ou qualquer combinação dos mesmos. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[00175] Em determinadas modalidades, as células- tronco derivadas da medula óssea compreendem células-tronco mesenquimais. O termo "células-tronco mesenquimais", tal como usado no presente documento, se refere a células estromais multipotentes que podem se diferenciar em uma variedade de tipos de células, incluindo osteoblastos (células ósseas), condrócitos (células de cartilagem), miócitos (células musculares) e adipócitos (células de gordura).

[00176] Em determinadas modalidades, as células- tronco derivadas da medula óssea consistem em células mielopoiéticas. Em determinadas modalidades, as células-tronco derivadas da medula óssea consistem em células eritropoiéticas. Em determinadas modalidades, as células- tronco derivadas da medula óssea consistem em células-tronco hematopoéticas (HSCs) de multipotenciais. Em determinadas modalidades, as células-tronco derivadas da medula óssea consistem em células progenitoras mieloides comuns, células progenitoras linfoides comuns ou qualquer combinação das mesmas. Em determinadas modalidades, as células-tronco derivadas da medula óssea consistem em megacariócitos, eritrócitos, mastócitos, mioblastos, basófilos, neutrófilos, eosinófilos, monócitos, macrófagos, células exterminadoras naturais (NK), pequenos linfócitos, linfócitos T, linfócitos B, células plasmáticas, células reticulares ou qualquer combinação das mesmas. Em determinadas modalidades, as células-tronco derivadas da medula óssea consistem em células-tronco mesenquimais. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[00177] O antígeno de célula progenitora hematopoiética CD34, também conhecido como antígeno CD34, é uma proteína que em humanos é codificada pelo gene CD34. CD34 é um agrupamento de diferenciação em uma glicoproteína de superfície celular e funciona como um fator de adesão célula-célula. Em determinadas modalidades, as células-tronco da medula óssea expressam o antígeno da célula progenitora da medula óssea CD34 (são CD34+). Em determinadas modalidades, as células-tronco da medula óssea apresentam o antígeno da célula progenitora da medula óssea CD34 em sua membrana externa. Em determinadas modalidades, as células CD34+ são do sangue do cordão umbilical.

[00178] Em determinadas modalidades, as células- tronco na primeira composição são derivadas diretamente do sujeito afetado com uma afecção debilitante. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são derivadas diretamente de um doador não afetado com uma afecção debilitante. O termo "derivado diretamente", tal como usado no presente documento, se refere a células-tronco que foram derivadas diretamente de outras células. Em determinadas modalidades, as células-tronco hematopoiéticas (HSC) foram derivadas de células da medula óssea. Em determinadas modalidades, as células-tronco hematopoiéticas (HSC) foram derivadas de sangue periférico.

[00179] Em determinadas modalidades, as células- tronco na primeira composição são indiretamente derivadas do sujeito afetado com uma afecção debilitante. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são indiretamente derivadas de um doador não afetado com uma afecção debilitante. O termo "derivado indiretamente", tal como usado no presente documento, se refere a células-tronco derivadas de células não- tronco. Em determinadas modalidades, as células-tronco foram derivadas de células somáticas que foram manipuladas para se tornar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).

[00180] Em determinadas modalidades, as células- tronco na primeira composição são obtidas diretamente da medula óssea do sujeito afetado com uma afecção debilitante. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são obtidas diretamente da medula óssea de um doador não afetado com uma afecção debilitante. O termo "obtido diretamente", tal como usado no presente documento, se refere a células-tronco que foram obtidas da própria medula óssea, por exemplo, por meio de cirurgia ou sucção por meio de uma agulha por uma seringa.

[00181] Em determinadas modalidades, as células- tronco na primeira composição são obtidas indiretamente da medula óssea do paciente afetado com uma afecção debilitante. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são obtidas indiretamente da medula óssea de um doador não afetado com uma afecção debilitante. O termo "obtido indiretamente", tal como usado no presente documento, se refere a células da medula óssea que foram obtidas de um local diferente da própria medula óssea.

[00182] Em determinadas modalidades, as células- tronco da primeira composição são obtidas a partir do sangue periférico do sujeito afetado com uma afecção debilitante. Em determinadas modalidades, as células-tronco na primeira composição são obtidas a partir do sangue periférico do sujeito não afetado com uma afecção debilitante ou do sangue periférico do sujeito não afetado por uma afecção debilitante. O termo "sangue periférico", tal como usado no presente documento, se refere ao sangue que circula no sistema sanguíneo.

[00183] Em determinadas modalidades, a primeira composição compreende uma pluralidade de células-tronco da medula óssea humana obtidas de sangue periférico, em que a dita primeira composição compreende adicionalmente megacariócitos, eritrócitos, mastócitos, mieloblastos, basófilos, neutrófilos, eosinófilos, monócitos, macrófagos, assassino natural (NK) células, pequenos linfócitos, linfócitos T, linfócitos B, células plasmáticas, células reticulares ou qualquer combinação dos mesmos. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[00184] Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente uma etapa anterior, em que a etapa compreende a administração ao sujeito afetado com uma afecção debilitante de um agente que induz a mobilização de células da medula óssea para o sangue periférico. Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente uma etapa anterior, em que a etapa compreende a administração a um doador não afetado por uma afecção debilitante de um agente que induz a mobilização de células da medula óssea para o sangue periférico.

[00185] Em determinadas modalidades, o agente que induz a mobilização de células da medula óssea/células-tronco produzidas na medula óssea para o sangue periférico é selecionado do grupo que consiste em fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), 1,1′-[1,4- fenilenobis(metileno)]bis[1,4,8,11-tetra-azaciclotetradecano] (Plerixafor, número CAS 155148-31-5), um sal do mesmo, e qualquer combinação dos mesmos. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[00186] Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente uma etapa de isolamento das células-tronco do sangue periférico do sujeito afetado com uma afecção debilitante. Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente uma etapa de isolamento das células-tronco do sangue periférico de um doador não afetado com uma doença debilitante. O termo "isolamento do sangue periférico", conforme usado no presente documento, se refere ao isolamento de células-tronco de outros constituintes do sangue.

[00187] Durante a aférese, o sangue de um sujeito ou doador é passado por um aparelho que separa um constituinte particular e retorna o restante à circulação. É, portanto, um procedimento médico realizado fora do corpo. Em determinadas modalidades, o isolamento é realizado por aférese.

[00188] Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente concentrar as células-tronco e as mitocôndrias funcionais na terceira composição antes da incubação. Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente concentrar as células-tronco e as mitocôndrias funcionais na terceira composição durante a incubação.

[00189] Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente a centrifugação da terceira composição antes da incubação. Em outras modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente a centrifugação da terceira composição durante a incubação. Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente a centrifugação da terceira composição após a incubação.

[00190] Em determinadas modalidades, as células- tronco na primeira composição são obtidas de um sujeito afetado com uma afecção debilitante e as células-tronco têm (i) uma taxa normal de consumo de oxigênio (O2); (ii) um teor normal ou nível de atividade de citrato sintase; (iii) uma taxa normal de produção de trifosfato de adenosina (ATP); ou (iv) qualquer combinação de (i), (ii) e (iii). Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[00191] Em determinadas modalidades, as células- tronco na primeira composição são obtidas de um sujeito afetado com uma afecção debilitante e as células-tronco têm (i) uma taxa diminuída de consumo de oxigênio (O2); (ii) uma diminuição do teor ou nível de atividade da citrato sintase; (iii) uma diminuição da taxa de produção de trifosfato de adenosina (ATP); ou (iv) qualquer combinação de (i), (ii) e (iii), em comparação a um sujeito não afetado com uma afecção debilitante. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[00192] Deve ser enfatizado que qualquer referência a qualquer característica mensurável ou característica ou aspecto direcionado a uma pluralidade de células ou mitocôndrias é direcionada à característica média mensurável ou característica ou aspecto da pluralidade de células ou mitocôndrias.

[00193] Em determinadas modalidades, as células- tronco na primeira composição são obtidas de um doador não afetado com uma afecção debilitante e têm (i) uma taxa normal de consumo de oxigênio (O2); (ii)

um teor normal ou nível de atividade de citrato sintase; (iii) uma taxa normal de produção de trifosfato de adenosina (ATP); ou (iv) qualquer combinação de (i), (ii) e (iii). Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[00194] Em determinadas modalidades, as mitocôndrias funcionais humanas isoladas na segunda composição são obtidas de um sujeito saudável, com DNA mitocondrial normal e têm (i) uma taxa normal de consumo de oxigênio (O2); (ii) um teor normal ou nível de atividade de citrato sintase; (iii) uma taxa normal de produção de trifosfato de adenosina (ATP); ou (iv) qualquer combinação de (i), (ii) e (iii). Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[00195] Em determinadas modalidades, as células- tronco na quarta composição têm (i) uma taxa aumentada de consumo de oxigênio (O2); (ii) um teor aumentado ou nível de atividade de citrato sintase; (iii) uma taxa maior de produção de trifosfato de adenosina (ATP); (iv) um teor maior de DNA mitocondrial ou (v) qualquer combinação de (i), (ii), (iii) e (iv), em comparação às células-tronco na primeira composição. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[00196] O termo "taxa aumentada de consumo de oxigênio (O2)", tal como usado no presente documento, se refere a uma taxa de consumo de oxigênio (O2) que é detectavelmente maior do que a taxa de consumo de oxigênio (O2) na primeira composição, antes do enriquecimento mitocondrial.

[00197] O termo "aumento do teor ou nível de atividade de citrato sintase", tal como usado no presente documento, se refere a um teor ou nível de atividade de citrato sintase que é detectavelmente maior do que o valor de teor ou nível de atividade de citrato sintase na primeira composição, antes do enriquecimento mitocôndria.

[00198] O termo "taxa maior de produção de trifosfato de adenosina (ATP)", tal como usado no presente documento, se refere a uma taxa de produção de trifosfato de adenosina (ATP) que é detectavelmente maior do que a taxa de produção de trifosfato de adenosina (ATP) na primeira composição, antes do enriquecimento da mitocôndria.

[00199] O termo "teor maior de DNA mitocondrial", tal como usado no presente documento, se refere ao teor de DNA mitocondrial que é detectavelmente maior do que o teor de DNA mitocondrial na primeira composição, antes do enriquecimento mitocondrial. O teor mitocondrial pode ser determinado medindo o teor de SDHA ou COX1. "DNA mitocondrial normal" no contexto do relatório descritivo e das reivindicações se refere ao DNA mitocondrial que não carrega/tem uma mutação ou deleção que é conhecida por estar associada a uma doença mitocondrial. O termo "taxa normal de consumo de oxigênio (O2)", conforme usado no presente documento, se refere ao consumo médio de O2 de células de indivíduos saudáveis. O termo "nível de atividade normal de citrato sintase", tal como usado no presente documento, se refere ao nível de atividade médio de citrato sintase em células de indivíduos saudáveis. O termo "taxa normal de produção de trifosfato de adenosina (ATP)", tal como usado no presente documento, se refere à taxa média de produção de ATP em células de indivíduos saudáveis.

[00200] De acordo com alguns aspectos, a presente invenção fornece um método de tratamento de afecções debilitantes ou um sintoma dos mesmos em um paciente humano em necessidade de tal tratamento, em que o método compreende a etapa de administração de uma composição farmacêutica que compreende uma pluralidade de células-tronco humanas ao paciente, em que as células-tronco humanas são enriquecidas com mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis e congeladas sem uma mutação patogênica no DNA mitocondrial.

[00201] Em determinadas modalidades, o sintoma é selecionado a partir do grupo que consiste em capacidade de caminhar prejudicada, habilidades motoras prejudicadas, habilidades de linguagem prejudicadas, memória prejudicada, perda de peso, caquexia, níveis baixos de fosfatase alcalina no sangue, níveis baixos de magnésio no sangue, níveis elevados de creatinina no sangue, baixo níveis de bicarbonato no sangue, níveis baixos de excesso de base sangüínea, altas taxas de glicose/creatinina na urina, altas taxas de cloreto/creatinina na urina, altas taxas de sódio/creatinina na urina, altos níveis de lactato no sangue, altas taxas de magnésio/creatinina na urina, altas taxas de potássio/creatinina na urina, altas razões de cálcio/creatinina na urina, glicosúria, magnesúria, altos níveis de uréia no sangue, baixo nível de peptídeo C, alto nível de HbA1C, hipoparatireoidismo, ptose, perda auditiva, distúrbio de condução cardíaca, baixo teor de ATP e consumo de oxigênio em linfócitos, distúrbios de humor, incluindo bipolar transtorno, transtorno obsessivo- compulsivo, transtornos depressivos, bem como transtornos de personalidade. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Deve ser entendido que a definição de sintomas como "alto" e "baixo" corresponde a "detectavelmente maior do que o normal" e "detectavelmente menor do que o normal", respectivamente, em que o nível normal é o nível correspondente em uma pluralidade de indivíduos não afetados com um doença mitocondrial.

[00202] Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica é administrada a um tecido ou órgão específico. Em certas formas de realização, a composição compreende farmacêuticas pelo menos 104 células- tronco humanas mitocôndrias-enriquecida. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica compreende cerca de 104 a cerca de 108 células- tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente.

[00203] Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica é administrada por administração parenteral. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica é administrada por administração sistêmica. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica é administrada por injeção intravenosa. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica é administrada por infusão intravenosa. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos 105 células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica compreende cerca de 106 a cerca de 108 células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos cerca de 105-2*107 células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente por quilograma de peso corporal do paciente. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica compreende pelo menos cerca de 105 células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente por quilograma de peso corporal do paciente. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica compreende cerca de 105 a cerca de 2*107 células- tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente por quilograma de peso corporal do paciente. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica compreende cerca de 106 a cerca de 5*106 células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente por quilograma de peso corporal do paciente.

[00204] O teor de DNA mitocondrial pode ser medido realizando PCR quantitativo de um gene mitocondrial antes e após o enriquecimento mitocondrial, normalizado para um gene nuclear.

[00205] Em situações específicas, as mesmas células, antes do enriquecimento das mitocôndrias, servem como controle para medir a atividade de CS e ATP e determinar o nível de enriquecimento.

[00206] Em determinadas modalidades, o termo "detectavelmente mais alto", tal como usado no presente documento, se refere a um aumento estatisticamente significativo entre os valores normais e aumentados. Em determinadas modalidades, o termo "detectavelmente mais alto", conforme usado no presente documento, se refere a um aumento não patológico, ou seja, a um nível em que nenhum sintoma patológico associado ao valor substancialmente mais alto se torna aparente. Em determinadas modalidades, o termo "aumentado", conforme usado no presente documento, se refere a um valor que é 1,05 vezes, 1,1 vezes, 1,25 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes ou maior que o valor correspondente encontrado em células correspondentes ou mitocôndrias correspondentes de um sujeito saudável ou de uma pluralidade de sujeitos saudáveis ou nas células- tronco da primeira composição antes do enriquecimento mitocondrial. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[00207] Em determinadas modalidades, as células- tronco na quarta composição têm pelo menos um de (i) um teor de DNA mitocondrial normal aumentado em comparação ao teor de DNA mitocondrial nas células-tronco antes do enriquecimento mitocondrial; (ii) uma taxa aumentada de consumo de oxigênio (O2) em comparação à taxa de consumo de oxigênio (O2) em células-tronco antes do enriquecimento mitocondrial; (iii) um teor ou nível de atividade aumentado de citrato sintase em comparação ao teor ou nível de atividade de citrato sintase em células-tronco antes do enriquecimento mitocondrial; (iv) uma taxa maior de produção de trifosfato de adenosina (ATP) em comparação à taxa de produção de trifosfato de adenosina (ATP) em células-tronco antes do enriquecimento mitocondrial; ou (v) qualquer combinação de (i), (ii), (iii) e (iv). Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[00208] Em determinadas modalidades, a quantidade total de proteínas mitocondriais na segunda composição está entre 20% e 80% da quantidade total de proteínas celulares na amostra.

[00209] Conforme usado no presente documento, o termo "cerca de" se refere a ± 10% do valor numérico indicado. Normalmente, os valores numéricos como usados aqui se referem a ± 10% do valor numérico indicado.

[00210] Em determinadas modalidades, o método compreende adicionalmente o congelamento da quarta composição. Em determinadas modalidades, o método compreende adicionalmente congelar e, em seguida, descongelar a quarta composição.

[00211] A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, uma pluralidade de células-tronco humanas enriquecidas com mitocôndrias funcionais, obtidas pelo método descrito acima.

[00212] Em determinadas modalidades, a pluralidade de células-tronco é congelada antes do enriquecimento com mitocôndrias funcionais. Em outras modalidades, a pluralidade de células-tronco é congelada e, em seguida, descongelada antes do enriquecimento com mitocôndrias funcionais. Em outras modalidades, a pluralidade de células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais é congelada. Em outras modalidades, a pluralidade de células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais é congelada e, em seguida, descongelada antes do uso.

[00213] A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, uma pluralidade de células-tronco humanas, em que as células-tronco têm pelo menos uma propriedade selecionada a partir do grupo que consiste em (a) um teor mitocondrial maior (b) uma taxa aumentada de oxigênio (O2) consumo; (c) um teor ou nível de atividade aumentado de citrato sintase; (d) aumento do teor de DNA mitocondrial ou (e) qualquer combinação de (a), (b), (c) e (d), em comparação com células-tronco humanas da mesma fonte antes do enriquecimento com mitocôndrias saudáveis, de acordo com os princípios da invenção. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção. De acordo com algumas modalidades, as células-tronco são células-tronco CD34+.

[00214] O termo "teor mitocondrial maior", tal como usado no presente documento, se refere a um teor mitocondrial que é detectavelmente maior do que o teor mitocondrial da primeira composição, antes do enriquecimento das mitocôndrias.

[00215] Em determinadas modalidades, a pluralidade de células é congelada. Em determinadas modalidades, a pluralidade de células é congelada e, em seguida, descongelada antes do uso.

[00216] Em determinadas modalidades, a pluralidade de células-tronco humanas é CD34+ e tem um teor mitocondrial maior; um nível aumentado de DNA mitocondrial normal; taxa maior de consumo de oxigênio

(O2); um nível de atividade maior da citrato sintase. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[00217] Em determinadas modalidades, a pluralidade de células-tronco humanas tem um teor mitocondrial maior; um nível aumentado de DNA mitocondrial normal; taxa maior de consumo de oxigênio (O2); e tendo um nível de atividade aumentado de citrato sintase.

[00218] A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, uma composição farmacêutica que compreende uma pluralidade de células-tronco humanas enriquecido com mitocôndrias funcionais conforme descrito acima.

[00219] O termo "composição farmacêutica", tal como usado no presente documento, se refere a qualquer composição que compreende células compreendendo ainda um meio ou carreador no qual as células são mantidas em um estado viável.

[00220] Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica é congelada. Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica é congelada e, em seguida, descongelada antes do uso.

[00221] Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica descrita acima é para uso em um método de tratamento de certos sintomas em um sujeito humano com uma afecção debilitante. O termo "tratar", conforme usado no presente documento, inclui a diminuição, o alívio ou a melhoria de pelo menos um sintoma associado ou induzido pelos efeitos debilitantes da condição afligida no sujeito.

[00222] A presente invenção fornece adicionalmente, em outro aspecto, um método de aliviar ou diminuir as afecções de efeitos debilitantes, incluindo, mas não se limitando a envelhecimento, doenças relacionadas a idade ou terapias anticâncer em um sujeito humano afetado com uma doença maligna, compreendendo a etapa de administração ao sujeito da composição farmacêutica descrita acima.

[00223] Conforme usado no presente documento, o termo "método" se refere a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para realizar uma determinada tarefa, incluindo, sem limitação, essas maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos ou prontamente desenvolvidos a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por profissionais das técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas.

[00224] Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica é congelada e o método descrito acima compreende adicionalmente descongelar a composição farmacêutica congelada antes do uso.

[00225] Em determinadas modalidades, as células- tronco são autólogas para o sujeito afetado com a afecção debilitante.

[00226] O contato das mitocôndrias funcionais com células-tronco autólogas ao sujeito afetado com uma afecção debilitante resulta no rejuvenescimento/revitalização das células-tronco.

[00227] Em algumas modalidades, os métodos descritos acima em várias modalidades das mesmas compreendem ainda expandir as células-tronco da primeira composição cultivando as ditas células- tronco em um meio de proliferação com capacidade para expandir as células- tronco. Em outras modalidades, o método compreende adicionalmente expandir as células-tronco enriquecidas mitocondrialmente da quarta composição cultivando as ditas células em um meio de cultura ou proliferação com capacidade para expandir células-tronco. Conforme usado ao longo deste pedido, o termo "meio de cultura ou proliferação" é um meio fluido, tal como meio de cultura de células, meio de crescimento de células, tampão que fornece sustento às células. Conforme usado ao longo deste pedido e nas reivindicações, o termo "composição farmacêutica" compreende um transportador fluido, tal como meio de cultura de células, meio de crescimento celular, tampão que fornece sustento às células.

[00228] Em determinadas modalidades, a administração de células-tronco rejuvenescidas por mitocôndrias funcionais no sujeito afetado com efeitos debilitantes pode diminuir esses efeitos.

Em algumas modalidades, a administração das células-tronco rejuvenescidas pode restaurar a organização e distribuição das células epiteliais nas vilosidades intestinais do sujeito afetado com uma afecção debilitante.

Em outras modalidades, a administração das células-tronco rejuvenescidas pode restaurar a atividade das células-tronco epiteliais nas criptas intestinais do sujeito.

Em outras modalidades, a administração das células-tronco rejuvenescidas pode restaurar a espessura dérmica no sujeito.

Em outras modalidades, a administração das células-tronco rejuvenescidas pode restaurar a atividade do folículo capilar no sujeito.

Em modalidades adicionais, a administração das células-tronco rejuvenescidas pode restaurar a atividade de cicatrização de feridas no tecido dérmico de um sujeito.

De acordo com algumas modalidades, as células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais podem rejuvenescer as células precursoras do sangue em um enxerto autólogo de células-tronco hematopoiéticas.

De acordo com outras modalidades, as células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais podem rejuvenescer as células precursoras do sangue em um enxerto de células-tronco hematopoiéticas alogênico.

De acordo com ainda outras modalidades, as células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais podem rejuvenescer células precursoras epiteliais dérmicas ou intestinais.

Em modalidades adicionais, a administração das células-tronco rejuvenescidas pode restaurar a função pancreática das células β em um sujeito.

De acordo com algumas modalidades, as células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais podem rejuvenescer os hepatócitos do fígado.

De acordo com outras modalidades, as células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais podem retardar a deterioração da função renal.

De acordo com ainda outras modalidades, as células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais podem diminuir a degeneração macular.

[00229] Em determinadas modalidades, as células- tronco são alogênicas para o sujeito afetado com a afecção debilitante. O termo "alogênico para o sujeito", "de um doador" e "de um doador saudável" são usados aqui indistintamente e referem-se às células-tronco ou mitocôndrias sendo de um indivíduo doador diferente. Se possível, as células-tronco do doador são, de preferência, HLA compatível com as células do paciente ou, pelo menos, parcialmente HLA compatível. De acordo com determinadas modalidades, o doador é correspondido ao paciente de acordo com a identificação de um haplogrupo de DNA mitocondrial específico.

[00230] O termo "HLA compatível", tal como usado no presente documento, se refere ao desejo de que o paciente e o doador das células-tronco tenham HLA compatível tanto quanto possível, pelo menos até o grau em que o paciente não desenvolva uma resposta imune aguda contra as células-tronco do doador. A prevenção e/ou terapia de tal resposta imune pode ser alcançada com ou sem o uso agudo ou crônico de imunossupressores. Em determinadas modalidades, as células-tronco do doador são HLA-combinadas com o paciente a um grau em que o paciente não rejeita as células-tronco.

[00231] Em certa modalidade, o paciente é ainda tratado por uma terapia imunossupressora para evitar a rejeição imunológica do enxerto de células-tronco.

[00232] Em determinadas modalidades, as mitocôndrias são de haplogrupos idênticos.

[00233] Em outras modalidades, as mitocôndrias são de diferentes haplogrupos.

[00234] Em determinadas modalidades, o método descrito acima compreende adicionalmente uma etapa anterior de administração ao sujeito de um agente de condicionamento pré-transplante antes da administração da composição farmacêutica. O termo "agente condicionador pré- transplante", tal como usado no presente documento, se refere a qualquer agente com capacidade para matar células da medula óssea dentro da medula óssea de um sujeito humano. Em determinadas modalidades, o agente de condicionamento pré-transplante é Busulfan.

[00235] Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica é administrada sistemicamente. Em determinadas modalidades, a administração da composição farmacêutica a um sujeito é por uma via selecionada a partir do grupo que consiste em injeção intravenosa, intra-arterial, intramuscular, subcutânea, intravítrea e direta em um tecido ou órgão. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção. De acordo com determinadas modalidades, a composição farmacêutica é injetada diretamente nos tecidos e órgãos afetados pelas afecções debilitantes da presente invenção. Tecidos ou órgãos específicos que são conhecidos por mostrar função prejudicada associada a um declínio na qualidade e atividade mitocondrial incluem, mas não estão limitados a: olhos, rins, fígado, pâncreas, cérebro e coração.

[00236] Em determinadas modalidades, as mitocôndrias funcionais são obtidas a partir de uma célula humana ou de um tecido humano selecionado do grupo que consiste em placenta, células da placenta cultivadas em cultura e células sanguíneas. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[00237] De acordo com determinadas modalidades, as mitocôndrias funcionais foram submetidas a um ciclo de congelamento- descongelamento. Sem desejar ser limitado por qualquer teoria ou mecanismo, as mitocôndrias que passaram por um ciclo de congelamento-descongelamento demonstram uma taxa de consumo de oxigênio comparável após o descongelamento, em comparação às mitocôndrias de controle que não foram submetidas a um ciclo de congelamento-descongelamento.

[00238] De acordo com algumas modalidades, o ciclo de congelamento-descongelamento compreende congelar as ditas mitocôndrias funcionais por pelo menos 24 horas antes do descongelamento. De acordo com outras modalidades, o ciclo de congelamento-descongelamento compreende congelar as ditas mitocôndrias funcionais por pelo menos 1 mês antes do descongelamento, vários meses antes do descongelamento ou mais. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. De acordo com outra modalidade, o consumo de oxigênio das mitocôndrias funcionais após o ciclo de congelamento-descongelamento é igual ou maior do que o consumo de oxigênio das mitocôndrias funcionais antes do ciclo de congelamento-descongelamento.

[00239] Conforme usado no presente documento, o termo "ciclo de congelamento-descongelamento" se refere ao congelamento das mitocôndrias funcionais a uma temperatura abaixo de 0 ºC, mantendo as mitocôndrias em uma temperatura abaixo de 0 ºC por um período de tempo definido e descongelando as mitocôndrias à temperatura ambiente ou temperatura corporal ou qualquer temperatura acima de 0 ºC que possibilite o tratamento das células-tronco com as mitocôndrias. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. O termo "temperatura ambiente", tal como usado no presente documento, se refere tipicamente a uma temperatura entre 18 ºC e 25 ºC. O termo "temperatura corporal", tal como usado no presente documento, se refere a uma temperatura entre 35,5 ºC e 37,5 ºC, de preferência 37 ºC. Em outra modalidade, as mitocôndrias que sofreram um ciclo de congelamento-descongelamento são mitocôndrias funcionais.

[00240] Em outra modalidade, as mitocôndrias que passaram por um ciclo de congelamento-descongelamento foram congeladas a uma temperatura de -70 ºC ou inferior. Em outra modalidade, as mitocôndrias que sofreram um ciclo de congelamento-descongelamento foram congeladas a uma temperatura de -20 ºC ou inferior. Em outra modalidade, as mitocôndrias que sofreram um ciclo de congelamento-descongelamento foram congeladas a uma temperatura de -4 ºC ou inferior. De acordo com outra modalidade, o congelamento das mitocôndrias é gradual. De acordo com alguma modalidade, o congelamento das mitocôndrias é por congelamento instantâneo. Conforme usado no presente documento, o termo "congelamento rápido" se refere ao congelamento rápido das mitocôndrias, submetendo-as a temperaturas criogênicas.

[00241] Em outra modalidade, as mitocôndrias que passaram por um ciclo de congelamento-descongelamento foram congeladas por pelo menos 30 minutos antes do descongelamento. De acordo com outra modalidade, o ciclo de congelamento-descongelamento compreende congelar as mitocôndrias funcionais por pelo menos 30, 60, 90, 120, 180, 210 minutos antes do descongelamento. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Em outra modalidade, as mitocôndrias que passaram por um ciclo de congelamento-descongelamento foram congeladas por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 24, 48, 72, 96 ou 120 horas antes do descongelamento. Cada tempo de congelamento representa uma modalidade separada da presente invenção. Em outra modalidade, as mitocôndrias que sofreram um ciclo de congelamento-descongelamento foram congeladas por pelo menos 4, 5, 6, 7, 30, 60, 120, 365 dias antes do descongelamento. Cada tempo de congelamento representa uma modalidade separada da presente invenção. De acordo com outra modalidade, o ciclo de congelamento- descongelamento compreende congelar as mitocôndrias funcionais por pelo menos 1, 2, 3 semanas antes do descongelamento. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. De acordo com outra modalidade, o ciclo de congelamento-descongelamento compreende o congelamento das mitocôndrias funcionais por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 meses antes do descongelamento. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[00242] Em outra modalidade, as mitocôndrias que foram submetidas a um ciclo de congelamento-descongelamento foram congeladas a -70 ºC por pelo menos 30 minutos antes do descongelamento. Sem querer se limitar a qualquer teoria ou mecanismo, a possibilidade de congelar mitocôndrias e descongelá-las após um longo período permite fácil armazenamento e uso das mitocôndrias com resultados reproduzíveis mesmo após um longo período de armazenamento.

[00243] De acordo com determinadas modalidades, o descongelamento ocorre à temperatura ambiente. Em outra modalidade, o descongelamento é à temperatura corporal. De acordo com outra modalidade, o descongelamento é a uma temperatura que permite a administração das mitocôndrias de acordo com os métodos da invenção. De acordo com outra modalidade, o descongelamento é realizado gradualmente.

[00244] De acordo com outra modalidade, as mitocôndrias que passaram por um ciclo de congelamento-descongelamento foram congeladas dentro de um tampão de congelamento. De acordo com outra modalidade, as mitocôndrias que passaram por um ciclo de congelamento- descongelamento foram congeladas dentro do tampão de isolamento. Conforme usado no presente documento, o termo "tampão de isolamento" se refere a um tampão no qual as mitocôndrias da invenção foram isoladas. Em um exemplo não limitativo, o tampão de isolamento é um tampão de sacarose. Sem desejar ser limitado por qualquer mecanismo ou teoria, o congelamento de mitocôndrias dentro do tampão de isolamento economiza tempo e etapas de isolamento, pois não há necessidade de substituir o tampão de isolamento por um tampão de congelamento antes do congelamento ou de substituir o tampão de congelamento após o descongelamento.

[00245] De acordo com outra modalidade, o tampão de congelamento compreende um crioprotetor. De acordo com algumas modalidades, o crioprotetor é um sacarídeo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. De acordo com outra modalidade, a concentração de sacarídeo no tampão de congelamento é uma concentração de sacarídeo suficiente que atua para preservar a função mitocondrial. De acordo com outra modalidade, o tampão de isolamento compreende um sacarídeo. De acordo com outra modalidade, a concentração de sacarídeo no tampão de isolamento é uma concentração de sacarídeo suficiente que atua para preservar a função mitocondrial. De acordo com outra modalidade, o sacarídeo é sacarose.

[00246] Em determinadas modalidades, o método compreende adicionalmente as etapas anteriores de (a) congelar as células- tronco humanas enriquecidas com mitocôndrias exógenas humanas funcionais saudáveis, (b) descongelar as células-tronco humanas enriquecidas com mitocôndrias exógenas humanas funcionais saudáveis e (c) administrar o células-tronco humanas enriquecidas com mitocôndrias exógenas humanas funcionais saudáveis para o paciente.

[00247] Em determinadas modalidades, as mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis constituem pelo menos 3% do total de mitocôndrias na célula enriquecida mitocondrialmente. Em determinadas modalidades, as mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis constituem pelo menos 10% do total de mitocôndrias no enriquecido mitocondrialmente célula. Em algumas modalidades, as mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis constituem pelo menos cerca de 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% ou 30% do total de mitocôndrias no célula enriquecida mitocondrialmente. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[00248] A extensão do enriquecimento das células- tronco com mitocôndrias funcionais pode ser determinada por ensaios funcionais e/ou enzimáticos, incluindo, mas não se limitando a, taxa de consumo de oxigênio (O2), teor ou nível de atividade de citrato sintase, taxa de adenosina trifosfato (ATP) Produção. Em alternativa, o enriquecimento das células-tronco com mitocôndrias de doador saudável pode ser confirmado pela detecção do DNA mitocondrial do doador. De acordo com algumas modalidades, a extensão do enriquecimento das células-tronco com mitocôndrias funcionais pode ser determinada pelo nível de mudança na heteroplasmia e/ou pelo número de cópias do mtDNA por célula. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção.

[00249] TMRM (éster metílico de tetrametilrodamina) ou o relacionado TMRE (éster etílico de tetrametilrodamina) são corantes fluorogênicos permeantes de células comumente usados para avaliar a função mitocondrial em células vivas, identificando alterações no potencial de membrana mitocondrial. De acordo com algumas modalidades, o nível de enriquecimento pode ser determinado por coloração com TMRE ou TMRM.

[00250] De acordo com algumas modalidades, a integridade de uma membrana mitocondrial pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica. Em um exemplo não limitativo, a integridade de uma membrana mitocondrial é medida usando sondas fluorescentes de éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM) ou éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE). Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. As mitocôndrias que foram observadas ao microscópio e mostram coloração de TMRM ou TMRE têm uma membrana mitocondrial externa intacta. Conforme usado no presente documento, o termo "uma membrana mitocondrial" se refere a uma membrana mitocondrial selecionada a partir do grupo que consiste na membrana mitocondrial interna, a membrana mitocondrial externa e ambas.

[00251] Em determinadas modalidades, o nível de enriquecimento mitocondrial nas células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente é determinado pelo sequenciamento de pelo menos uma porção estatisticamente representativa do DNA mitocondrial total nas células e determinação dos níveis relativos de hospedeiro/DNA mitocondrial endógeno e DNA mitocondrial exógeno. Em determinadas modalidades, o nível de enriquecimento mitocondrial nas células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente é determinado por análise de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP). Em determinadas modalidades, a maior população mitocondrial e/ou a maior população de DNA mitocondrial é a população de hospedeiro/mitocondrial endógena e/ou a população de hospedeiro/DNA mitocondrial endógeno; e/ou a segunda maior população mitocondrial e/ou a segunda maior população de DNA mitocondrial é a população mitocondrial exógena e/ou a população de DNA mitocondrial exógeno. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[00252] De acordo com determinadas modalidades, o enriquecimento das células-tronco com mitocôndrias funcionais saudáveis pode ser determinado por ensaios convencionais que são reconhecidos na técnica. Em determinadas modalidades, o nível de enriquecimento mitocondrial nas células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente é determinado por (i) os níveis de hospedeiro/DNA mitocondrial endógeno e DNA mitocondrial exógeno; (ii) o nível de proteínas mitocondriais selecionadas a partir do grupo que consiste em citrato sintase (CS), citocromo C oxidase (COX1), subunidade A da flavoproteína do complexo succinato desidrogenase (SDHA) e qualquer combinação destes; (iii) o nível de atividade da SC; ou (iv) qualquer combinação de (i), (ii) e (iii). Cada possibilidade representa uma modalidade separada da invenção.

[00253] Em determinadas modalidades, o nível de enriquecimento mitocondrial nas células-tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente é determinado por pelo menos um de: (i) os níveis de DNA mitocondrial hospedeiro e DNA mitocondrial exógeno no caso de mitocôndrias alogênicas; (ii) o nível de atividade da citrato sintase; (iii) o nível de subunidade A da flavoproteína do complexo succinato desidrogenase (SDHA) ou da oxidase do citocromo C (COX1); (iv) a taxa de consumo de oxigênio (O2); (v) a taxa de produção de trifosfato de adenosina (ATP) ou (vi) qualquer combinação dos mesmos. Cada possibilidade representa uma modalidade separada da presente invenção. Métodos para medir estes vários parâmetros são bem conhecidos na técnica.

[00254] Em alguns aspectos, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende células-tronco humanas enriquecidas com mitocôndrias funcionais saudáveis para uso no tratamento ou diminuição dos efeitos debilitantes de afecções em um sujeito, em que os efeitos debilitantes das afecções são selecionados a partir do grupo que consiste, mas não limitado a, envelhecimento, doenças relacionadas com a idade e as sequelas de tratamentos anticancerígenos.

[00255] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método para tratar ou diminuir os efeitos debilitantes de afecções em um sujeito, compreendendo a administração de uma composição farmacêutica que compreende células-tronco humanas enriquecidas com mitocôndrias funcionais saudáveis ao sujeito, em que os efeitos debilitantes das afecções são selecionados a partir de grupo que consiste, mas não se limita ao envelhecimento, doenças relacionadas a idade e a sequela de tratamentos anticâncer. Em modalidades específicas, os tratamentos anticâncer são selecionados do grupo que consiste em radiação, quimioterapia, imunoterapia com anticorpos monoclonais ou qualquer combinação dos mesmos.

[00256] De acordo com determinadas modalidades, as mitocôndrias funcionais saudáveis são isoladas de um doador selecionado de um haplogrupo de mitocôndrias específico, de acordo com a afecção debilitante do sujeito. Por exemplo, para o sujeito em envelhecimento, a administração de células-tronco enriquecidas com mitocôndrias funcionais do haplogrupo mitocondrial J é adequada devido à sua associação com longevidade e pressão arterial mais baixa (De Benedictis et al., FASEB J. 1999; 13 (12): 1.532 a 1.536; Rea et al., AGE 2013; 34 (4): 1.445 a 1.456). Os haplogrupos H e N estão associados a uma melhor funcionalidade e força muscular (Larsen et al., Biochim Biophys Acta. 2014; 1837 (2): 226 a 231; Fuku et al., Int J Sports Med. 2012; 33 (5): 410 a 414). O haplogrupo D4b pode ser protetor contra acidente vascular cerebral (Yang et al., Mol Genet Genomics. 2014; 289 (6): 1.241 a 1.246), os haplogrupos K, U, H e V podem conferir proteção contra deficiência cognitiva (Colicino et al., Environ Health. 2014; 13 (1): 42) e o haplogrupo R demonstrou conferir melhor prognóstico de recuperação da encefalopatia séptica (Yang et al., Intensive Care Med. 2011; 37 (10): 1.613 a 1.619). O Haplogrupo N9a confere resistência ao diabetes (Fuku et al., Am J Hum Genet. 2007; 80 (3): 407 a 415)

e à síndrome metabólica (Tanaka et al., Diabetes 2007; 56 (2): 518 a 521). O haplogrupo H é protetor contra o desenvolvimento de doenças oculares, incluindo degeneração macular relacionada à idade (DMRI) (Mueller et al., PloS one 2012; 7 (2): e30874).

[00257] De acordo com determinadas modalidades, as células-tronco da primeira composição são de um doador selecionado de um haplogrupo mitocondrial específico, de acordo com a afecção debilitante do sujeito. Por exemplo, o sujeito afetado com efeitos debilitantes de tratamentos anticâncer, os haplogrupos J, K2 e U podem ser considerados, uma vez que se mostraram melhores doadores para o transplante de células-tronco hematopoéticas alogênicas, provocando menos GVHD e/ou recidiva (Ross et al., Biol Blood Marrow Transplant 2015; 21: 81 a 88).

[00258] O termo "haplogrupo", conforme usado no presente documento, se refere a um grupo de população genética de pessoas que compartilham um ancestral comum na matrilínea. O haplogrupo mitocondrial é determinado por sequenciamento.

[00259] Em certos casos, podemos querer combinar haplótipos entre doador e aceitador.

[00260] O termo "cerca de", conforme usado no presente documento, significa uma faixa de 10% abaixo a 10% acima do número inteiro indicado, ou quantidade. Por exemplo, o sintagma “cerca de 1*105” significa “1,1*105 a 9*104”.

[00261] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência a determinadas modalidades, será entendido por aqueles versados na técnica que várias alterações podem ser feitas e equivalentes podem ser substituídos sem se afastar do escopo da presente invenção. Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma situação ou material particular aos ensinamentos da presente invenção sem se afastar de seu escopo. Portanto, pretende-se que a presente invenção não seja limitada à modalidade específica divulgada, mas que a presente invenção inclua todas as modalidades que caem dentro do escopo das reivindicações anexas.

[00262] Os seguintes exemplos são apresentados para fornecer uma compreensão mais completa da invenção. As técnicas específicas, afecções, materiais, proporções e dados relatados estabelecidos para ilustrar os princípios da invenção são exemplares e não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção.

EXEMPLOS EXEMPLO 1. MITOCÔNDRIAS HUMANAS ISOLADAS: PREPARAÇÃO E CRIOPRESERVAÇÃO.

[00263] As mitocôndrias podem ser isoladas e preservadas conforme divulgado anteriormente nos documentos WO 2013/035101 e WO 2016/135723.

[00264] A seguir estão protocolos exemplificativos usados para o isolamento de mitocôndrias de células do sangue periférico (MNV- BLD) e enriquecimento de células CD34+ (MNV-BM-BLD):

[00265] Primeira estágio - produção de MNV-BLD: O creme leucocitário é isolado do sangue periférico (500 ml) obtido do paciente ou doado por um doador. O creme leucocitário é então aplicado em camadas sobre o Lymphoprep™ e centrifugado. Os glóbulos brancos (creme leucocitário no topo do Lymphoprep™) são coletados e, em seguida, centrifugados. O pélete celular (linfócitos) é lavado e o pélete celular é congelado e suspenso em solução tampão de sacarose a 250 mM gelada (sacarose a 250 mM, Tris a 10 mM, EDTA a 1 mM) pH = 7,4. A suspensão de células é recolhida e passada por uma agulha 30G 3 vezes, seguindo-se a homogeneização. O homogenato é centrifugado. O sobrenadante é coletado e mantido em gelo, e o pélete é lavado com solução de sacarose, homogeneizado e centrifugado. O segundo sobrenadante do pélete lavado é coletado e combinado com o sobrenadante anterior. O sobrenadante combinado é filtrado através de um filtro de 5 µm e centrifugado a 8.000 g. Os péletes são lavados com solução de sacarose e ressuspensos em 1 ml de solução tampão de sacarose a 250 mM fria pH = 7,4. A solução de mitocôndria resultante (denotada aqui como MNV-BLD) é criopreservada em um tanque de nitrogênio em fase de vapor até o uso.

[00266] Segundo estágio - geração de MNV-BM-BLD: células CD34+ do paciente ou doador são isoladas do sangue coletado via leucaferese usando o sistema CliniMACS™, após a mobilização de células da medula óssea para o sangue periférico. O pélete de células CD34+ é suspenso em HSA a 4,5% em solução de NaCl a 0,9% até uma concentração final de 1x106 células/ml. O MNV-BLD (suspensão de mitocôndria) é descongelado à temperatura ambiente e adicionado às células CD34+ a 4,4 miliunidades de atividade da citrato sintase (CS) por ml de suspensão de células (1X106 células). As células MNV-BLD e CD34+ são misturadas em tubos de 2 ml e centrifugadas a 7.000 g por 5 minutos a 4 oC. Após a centrifugação, as células são suspensas com o mesmo HSA a 4,5% em solução de NaCl a 0,9%, combinadas e semeadas em um frasco e incubadas à temperatura ambiente por 24 horas. Após a incubação, as células CD34+ enriquecidas são lavadas duas vezes com solução de HSA a 4,5% e centrifugadas a 300 g durante 10 min. O pélete celular é ressuspenso em 100 ml HSA a 4,5% em NaCl a 0,9%, e colocado em um saco de infusão. EXEMPLO 2. MITOCÔNDRIAS ISOLADAS PODEM ENTRAR NAS CÉLULAS DE FIBROBLASTOS.

[00267] Células de fibroblastos de camundongo (3T3) que expressam proteína fluorescente verde (GFP) em suas mitocôndrias (painel esquerdo) foram incubadas por 24 horas com mitocôndrias marcadas com proteína fluorescente vermelha (RFP) isoladas de fibroblastos de camundongo (3T3) expressando RFP em suas mitocôndrias (painel do meio). Microscopia confocal fluorescente foi usada para identificar fibroblastos marcados com GFP e RFP, que aparecem em amarelo (painel direito) (FIGURA 1), conforme descrito anteriormente no documento WO 2016/135723.

[00268] Os resultados demonstrados na Figura 1 indicam que as mitocôndrias podem entrar nas células de fibroblastos. EXEMPLO 3. AS MITOCÔNDRIAS AUMENTAM A

PRODUÇÃO DE ATP EM CÉLULAS COM ATIVIDADE MITOCONDRIAL INIBIDA.

[00269] Células de fibroblastos de camundongo (104, 3T3) não foram tratadas (controle) ou tratadas com mRotenona a 0,5 µM (Rotenona, inibidor irreversível do complexo mitocondrial I, número CAS 83-79- 4) por 4 horas, lavadas e posteriormente tratadas com 0,02 mg/ml de mitocôndria da placenta de camundongo (Rotenona + Mitocôndria) por 3 horas. As células foram lavadas e o nível de ATP foi determinado usando o kit Perkin Elmer ATPlite (FIGURA 2), conforme mostrado anteriormente em WO 2016/135723. Como visto na FIGURA 2, a produção de ATP foi completamente resgatada em células incubadas com mitocôndrias em comparação ao controle.

[00270] Os resultados demonstrados na Figura 2 indicam claramente que enquanto a Rotenona sozinha diminuiu os níveis de ATP em cerca de 50%, a adição de mitocôndrias teve capacidade para cancelar substancialmente o efeito inibitório da Rotenona, atingindo os níveis de ATP das células de controle. O experimento fornece evidências da capacidade das mitocôndrias de aumentar a produção de ATP mitocondrial em células com atividade mitocondrial prejudicada ou comprometida. EXEMPLO 4. AS MITOCÔNDRIAS PODEM ENTRAR NAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA MURINA.

[00271] Células de medula óssea de camundongo (105) foram incubadas por 24 horas com mitocôndrias marcadas com GFP, isoladas de células de melanoma de camundongo. A microscopia confocal de fluorescência foi usada para identificar mitocôndrias marcadas com GFP dentro das células da medula óssea (FIGURA 3), conforme descrito anteriormente no documento WO 2016/135723.

[00272] Os resultados demonstrados na Figura 3 indicam que as mitocôndrias podem entrar nas células da medula óssea.

[00273] As células da medula óssea de tipo selvagem (ICR) e camundongos de mitocôndrias mutadas (FVB/N, carrega uma mutação em ATP8) foram incubados em DMEM por 24 horas a 37 ºC e atmosfera de CO2 a 5% com mitocôndrias isoladas de diferentes origens para aumentar seu teor e atividade mitocondrial. A Tabela 1 descreve os resultados representativos do processo de aumento mitocondrial, determinado pelo aumento relativo na atividade de CS das células após o processo em comparação à atividade de CS das células antes do processo. TABELA 1.

Origem das células Origem da Atividade de CS das Aumento relativo mitocôndria mitocôndrias/númer na atividade de o de células CS das células Camundongo ICR - Mitocôndrias 4,4 mU de CS/1X10^ + 41% isolado da medula óssea humanas 6 células inteira Camundongo FVB/N - Mitocôndrias 4,4 mU de CS/1X10^ + 70% isolado da medula óssea placentárias 6 células inteira C57BL Camundongo FVB/N - Mitocôndrias do 4,4 mU de CS/1X10^ + 25% Isolado de medula óssea fígado C57BL 6 células inteira

[00274] A fim de examinar in vivo o efeito da terapia de aumento mitocondrial, células da medula óssea de FVB/N (1x106) enriquecidas com atividade de CS de 4,4 mUnidades de mitocôndrias placentárias C57/BL foram injetadas IV em camundongos FVB/N. A medula óssea foi coletada dos camundongos 1 dia, 1 semana, 1 mês e 3 meses após o tratamento e o nível de mtDNA WT foi detectado usando dPCR. Como pode ser visto na Figura 4, uma quantidade significativa de mtDNA WT foi detectada na medula óssea 1 dia após o tratamento.

EXEMPLO 5. AS MITOCÔNDRIA ENTRAM NAS

CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA DE UMA MANEIRA DEPENDENTE DA CONCENTRAÇÃO.

[00275] As células de medula óssea de camundongo (106) foram não tratadas ou incubadas por 15 horas com diferentes quantidades de mitocôndrias marcadas com GFP isoladas de células de melanoma de camundongo. Antes de plaquear as células, as mitocôndrias foram misturadas com as células e deixadas em repouso por 5 minutos à temperatura ambiente ((- ) Cent) ou centrifugadas por 5 minutos a 8.000 g a 4 0C ((+) Cent). As células foram então colocadas em placas em 24 poços (106 células/poço). Após 15 horas de incubação, as células foram lavadas duas vezes para remover quaisquer mitocôndrias que não entraram nas células. A atividade da citrato sintase foi determinada usando o kit CS0720 Sigma (FIGURA 5), conforme descrito anteriormente em WO 2016/135723. Os níveis de atividade de CS medidos nas condições especificadas acima estão resumidos na Tabela 2. TABELA 2.

(+) Cent, (-) Cent, (+) Cent (-) Cent normalizado normalizado Células 0,013368 0,013368 1 1 Células + Mitocôndrias 0,041512 0,025473 3,1 1,9 (2,2 miliunidades) Células + Mitocôndrias 0,085606 0,04373 6,4 3,2 (24 miliunidades)

[00276] Os resultados demonstrados na Figura 5 indicam que as mitocôndrias adicionadas aumentam a atividade de CS celular de uma maneira dependente da dose e que o aumento da concentração e, portanto, presumivelmente o contato entre a mitocôndria e as células, por exemplo, por centrifugação, resultou em um aumento adicional na atividade de CS.

[00277] Células de medula óssea de camundongo (106) foram não tratadas ou incubadas por 24 horas com mitocôndrias marcadas com GFP isoladas de células de melanoma de camundongo (17 miliunidades ou 34 miliunidades, indicando o nível de atividade de citrato sintase como um marcador para o teor de mitocôndrias). As células foram misturadas com mitocôndrias, centrifugadas a 8.000 g e ressuspensas. Após incubação de 24 horas, as células foram lavadas duas vezes com PBS e o nível de atividade de citrato sintase (CS) (FIGURA 6A) e atividade de citocromo c redutase (FIGURA 6B) foram medidos usando os kits CS0720 e CYOIOO (Sigma), respectivamente, como anteriormente descrito no documento WO 2016/135723.

[00278] As células da medula óssea de FVB/N (carregando uma mutação no mtDNA ATP8) foram incubadas com mitocôndrias C57/BL de tipo selvagem (WT) isoladas da placenta em várias doses (0,044, 0,44, 0,88, 2,2, 4,4, 8,8, 17,6 mUnidades de atividade de CS por 1 M células em 1 ml). Como pode ser visto na FIGURA 7A, o dPCR usando sequências específicas do WT mostrou um aumento no mtDNA WT de uma maneira dependente da dose para a maioria das dosagens. As células enriquecidas também mostraram um aumento dependente da dose no teor de mtDNA codificado (COX1) (FIGURA 7B) e codificado por núcleo (SDHA) (FIGURA 7C). EXEMPLO 6. AS MITOCÔNDRIAS PODEM ENTRAR NAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA HUMANA.

[00279] As células CD34+ humanas (1,4*105, ATCC PCS-800-012) foram não tratadas ou incubadas por 20 horas com mitocôndrias marcadas com GFP isoladas de células da placenta humana. Antes do plaqueamento das células, as mitocôndrias foram misturadas com as células, centrifugadas a 8.000 g e ressuspensas. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS e a atividade de CS foi medida usando o kit CS0720 Sigma (FIGURA 8A). O teor de ATP foi medido usando ATPlite (Perkin Elmer) (FIGURA 8B). Os níveis de atividade de CS (FIGURA 8A) medidos nas afecções especificadas acima estão resumidos na Tabela 3.

TABELA 3.

(+) Cent, (-) Cent, (+) Cent (-) Cent normalizado normalizado Células 0,001286445 1 Células + 0,003003348 2,33 Mitocôndrias Células + Mitocôndrias + 0,011202225 8,7 Centrifugação

[00280] Os resultados demonstrados na Figura 8 (consulte a Tabela 3) indicam claramente que o teor mitocondrial de células da medula óssea humana pode ser aumentado muitas vezes por interação e coincubação com mitocôndrias humanas isoladas, em uma extensão além das capacidades de fibroblastos humanos ou murinos ou células de medula óssea murina.

[00281] As populações de células representadas na FIGURA 8B foram avaliadas adicionalmente por análise FACS. Enquanto nas células CD34+ não incubadas com mitocôndrias marcadas com GFP apenas uma porção menor (0,9%) das células eram fluorescentes (FIGURA 9A), as células CD34+ incubadas com mitocôndrias marcadas com GFP após a centrifugação eram substancialmente fluorescentes (28,4%) (FIGURA 9B), conforme mostrado anteriormente no documento WO 2016/135723. EXEMPLO 7. AS MITOCÔNDRIAS PODEM ENTRAR NAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA CD34+ HUMANAS.

[00282] As células humanas CD34+ de um doador saudável tratadas com GCS-F foram obtidas por aférese, purificadas usando o sistema CliniMACS e congeladas. As células foram descongeladas e tratadas com mitocôndrias derivadas do sangue (MNV-BLD) (4,4 miliunidades de atividade de CS mitocondrial por 1x106 células), ou não tratadas (NT), centrifugadas a 8.000 g e incubadas por 24 h. As células foram então lavadas com PBS e atividade de CS (FIGURA 10B) e o teor de ATP (FIGURA 10A) foram medidos (usando o kit CS0720 Sigma e ATPlite Perkin Elmer, respectivamente).

[00283] As células CD34+ tratadas com mitocôndrias derivadas do sangue mostraram um aumento notável na atividade mitocondrial, conforme medido pela atividade de CS (FIGURA 10B) e teor de ATP (FIGURA 10A).

[00284] As células CD34+ de doadores saudáveis foram tratadas com Mitotracker Orange (MTO) e lavadas antes da MAT, usando mitocôndrias isoladas de células HeLa-TurboGFP-Mitocôndria (CellTrend GmbH). As células foram fixadas com PFA a 2% durante 10 minutos e fixadas com DAPI. As células foram digitalizadas usando microscópio confocal equipado com uma objetiva de imersão em óleo 60X/1,42.

[00285] Como pode ser visto na FIGURA 11, as mitocôndrias exógenas entram na célula CD34+ tão rapidamente quanto 0,5 hora após a MAT (brilhantes, quase brancas, manchas dentro da célula) e continua durante as 8 e 24 horas testadas. EXEMPLO 8. CULTIVAR CÉLULAS CD34+ À

TEMPERATURA AMBIENTE COM SOLUÇÃO SALINA MELHORA SUA VIABILIDADE.

[00286] As células CD34+ não foram tratadas (NT) ou incubadas com mitocôndrias derivadas de sangue (MNV-BLD). As células foram cultivadas à temperatura ambiente (RT) ou 37 ºC em meio de cultura (CellGro™) ou solução salina (Zenalb™) com albumina de soro humano (HSA) a 4,5%.

[00287] A viabilidade celular em diferentes condições de cultura está resumida na Tabela 4. TABELA 4.

% de viabilidade CellGro™ 37 ºC NT 55,3 CellGro™ 37 ºC MNV-BLD 59,6

% de viabilidade CellGro™ RT NT 72,5 CellGro™ RT MNV-BLD 78,2 Zenalb™ RT NT 93,9 Zenalb™ RT MNV-BLD 94,7

[00288] Os resultados demonstrados na Tabela 4 indicam que a viabilidade das células CD34+ é melhorada quando cultivadas à RT usando albumina de soro humano em solução salina em vez de meio de cultura. EXEMPLO 9. A MEDULA ÓSSEA DE CAMUNDONGOS

NSGS ENXERTADOS COM SANGUE DE CORDÃO UMBILICAL HUMANO CONTÉM MAIS MTDNA HUMANO 2 MESES APÓS MAT

[00289] Células do sangue do cordão umbilical de paciente Pearson foram incubadas com 0,88 mU de mitocôndrias humanas por 24 horas, após o qual o meio foi removido e as células foram lavadas e ressuspensas em HSA a 4,5%. As células enriquecidas foram injetadas IV em camundongos NSGS (100.000 células CD34+ por camundongo).

[00290] A FIGURA 12A é uma ilustração da deleção de mtDNA nas células do cordão umbilical do paciente de Pearson mostrando 4.978 kb deletada da região do mtDNA de UCB (esquerda), bem como uma análise de Southern blot mostrando a deleção (direita).

[00291] A medula óssea foi coletada de camundongos 2 meses após a MAT, e o número de cópias do mtDNA WT não deletado foi analisado em dPCR usando iniciadores e sonda, identificando sequências de mtDNA WT não deletada de UCB.

[00292] Como pode ser visto na FIGURA 12B, 2 meses após a terapia de aumento mitocondrial, a medula óssea dos camundongos continha ~100% mais mtDNA humano em comparação à medula óssea de camundongos injetados com células do cordão umbilical não aumentadas. EXEMPLO 10. SEGURANÇA IN VIVO E ESTUDO DE

BIODISTRIBUIÇÃO EM ANIMAIS

[00293] As mitocôndrias são introduzidas nas células da medula óssea de camundongos saudáveis de controle de duas origens diferentes: a fonte de mitocôndrias será de camundongos com diferentes sequências de mtDNA (Jenuth JP et al., Nature Genetics, 1996, Vol. 14, páginas 146 a 151).

[00294] As mitocôndrias de placenta de camundongo selvagem (C57BL) foram isoladas. As células da medula óssea foram isoladas de camundongos FVB/N. As células mutadas da medula óssea de FVB/N (106) foram carregadas com as mitocôndrias C57BL funcionais saudáveis (4,4 mU) e administradas IV a camundongos FVB/N.

[00295] As etapas do método são: (1) isolar mitocôndrias da placenta de camundongos C57BL, congelar a -80 ºC e descongelar, ou usar fresco; (2) obter células da medula óssea de camundongos FVB/N mutados com mtDNA; (3) entrar em contato com as células da mitocôndria e da medula óssea, centrifugar a 8.000 g por 5 minutos, ressuspender e incubar por 24 horas; (4) lavar as células da medula óssea duas vezes com PBS e injetar na veia da cauda de camundongos FVB/N. Em vários pontos no tempo, por exemplo, após 24 horas, uma semana, um mês e 3 meses após o transplante, tecidos (sangue, medula óssea, linfócitos, cérebro, coração, rim, fígado, pulmão, baço, músculo esquelético, olho, ovário/testículos) foram coletados e o DNA extraído para posterior análise da sequência.

[00296] Os níveis diminuídos de FVB/N na medula óssea 1 mês após o transplante são representados na FIGURA 13A. Como visto na FIGURA 13B, os níveis de mtDNA em fígados de camundongos FVB/N 3 meses após o transplante também foram diminuídos.

[00297] A medula óssea colhida de fêmeas FVB/N foi enriquecida com mitocôndrias de placenta C57BL/6 (atividade de 4,4 mU de CS por 1X10^6 células). Os camundongos receptores foram submetidos à administração IV de 1 milhão de células aumentadas por animal. PCR digital foi usado para detectar um SNP específico de C57BL/6. A FIGURA 14A demonstra a presença de mtDNA C57BL/6 na medula óssea de camundongos FVBN, 1 dia pós-MAT, com alguns dos camundongos mostrando persistência até 3 meses após o tratamento. As FIGURAS 14B e 14C mostram a presença de mtDNA derivado de C57BL/6 nos corações e cérebros de camundongos 3 meses após a MAT. EXEMPLO 11. ESTUDO PRÉ-CLÍNICO EM ANIMAIS IN VIVO: EFEITO DO PRÉ-CONDICIONAMENTO NO ENXERTO DE

MITOCÔNDRIAS ESTRANHAS

[00298] Isolaram-se mitocôndrias de fígados de camundongos do tipo selvagem (C57BL). As células da medula óssea foram isoladas de camundongos com mitocôndrias mutadas (camundongos FVB/N). As células da medula óssea de FVB/N mutadas foram carregadas com as mitocôndrias C57BL funcionais saudáveis. Camundongos FVB/N não tratados (controle), camundongos FVB/N administrados com a mitocôndria enriquecida, camundongos FVB/N tratados com um agente quimioterapêutico (Busulfan) antes da administração da mitocôndria enriquecida e camundongos FVB/N que foram submetidos a irradiação corporal total (TBI) antes da administração das mitocôndrias enriquecidas foram comparados.

[00299] As etapas do método são: (1) isolar mitocôndrias de fígados de camundongos C57BL, congelar a -80 ºC e descongelar, ou usando fresco; (2) obtenção de células da medula óssea de camundongos FVB/N mutados com mtDNA; (3) entrar em contato com as células da mitocôndria e da medula óssea, centrifugar a 8.000 g por 5 minutos, ressuspender e incubar por 24 horas; (4) lavar as células da medula óssea duas vezes com PBS. (5) Administração de busulfan ou irradiação corporal total (TBI)

aos grupos pretendidos. (6) injetar na veia da cauda de camundongos FVB/N as células da medula óssea de camundongos FVB/N enriquecidas com mitocôndrias saudáveis de camundongos C57BL. 1 mês após o transplante, os tecidos (sangue, medula óssea, linfócitos, cérebro, coração, rim, fígado, pulmão, baço, pâncreas, músculo esquelético, olho, ovário/testículo) foram coletados e o DNA extraído para posterior análise de sequência.

[00300] Os níveis diminuídos de FVB/N nos cérebros de camundongos tratados com mitocôndrias, TBI e Busulfan 1 mês após o transplante são representados na FIGURA 15. EXEMPLO 12. EFEITO DO ENRIQUECIMENTO MITOCONDRIAL SOBRE CAMUNDONGOS EM ENVELHECIMENTO.

[00301] As mitocôndrias foram isoladas da placenta murina C57BL. Foram obtidas células da medula óssea de camundongos C57BL com 12 meses de idade. Células da medula óssea enriquecidas com mitocôndrias (MNV-BM-PLC, 1x106 células), células da medula óssea sozinhas (BM, 1x106 células) ou uma solução de veículo de controle (VEÍCULO, 4,5% de albumina em 0,9% p/v NaCl) foram injetadas IV na veia da cauda de camundongos C57BL com 12 meses de idade no início do experimento e novamente com cerca de 15 meses, 18 meses, 21 meses de idade. O teste de sangue BUN foi realizado 1, 3, 4 e 6 meses após a primeira injeção IV. O teste de campo aberto foi realizado 9 meses após a primeira injeção IV. O teste de sangue BUN foi realizado 2, 4 e 6 meses após a injeção IV.

[00302] Como pode ser visto nas FIGURAS 16A a 16D, camundongos em envelhecimento (12 meses) transplantados com células da medula óssea enriquecidas com mitocôndrias saudáveis (MNV-BM-PLC) demonstraram atividade física melhorada e comportamento exploratório em comparação com camundongos da mesma idade transplantados com medula óssea não enriquecida com mitocôndrias (controle BM) e em camundongos não transplantados (controle). Camundongos tratados com MNV-BM-PLC mostraram: maior distância movida (FIGURA 16A), passando mais tempo no centro (FIGURA 16B) e menos tempo próximo às paredes (FIGURA 16C) da gaiola, em comparação com seus controles, padrão comportamental típico de camundongos mais jovens. Além disso, a administração de medula óssea enriquecida com mitocôndrias funcionais a camundongos em envelhecimento interrompeu a deterioração do rim, conforme retratado na FIGURA 16D.

[00303] O aumento do tempo gasto na zona central da arena indica um extenso comportamento exploratório de camundongos que foram submetidos à terapia de aumento mitocondrial. Junto com a redução da timotaxia, que está associada a comportamentos do tipo ansiedade, atesta um efeito ansiolítico do aumento mitocondrial.

[00304] O desempenho motor bruto e a coordenação também foram avaliados, usando um dispositivo Rotarod nesses camundongos.

[00305] Conforme mostrado nas FIGURAS 16E a 16F, 1 mês após a administração, os grupos de controle VEÍCULO e BM mostraram uma diminuição na latência para cair da haste rotativa (-2,82% e -2,18% da linha de base, ns) que diminuiu ainda mais em 14,15% e 21,79% (***p=0,0008) em relação à linha de base 3 meses após a administração. Os camundongos MNV- BM-PLC exibiram uma redução de 16,17% na latência para cair da haste 1 mês após a terapia de enriquecimento de mitocôndrias (*p=0,0464), interrompido 3 meses após o enriquecimento (-8,72% da linha de base, ns).

[00306] Os resultados demonstram mais comprometimento da função motora moderado em camundongos de meia-idade enriquecidos com mitocôndrias em relação aos controles da mesma idade, implicando que a terapia de enriquecimento mitocondrial pode atenuar a deterioração da função motora relacionada à idade.

[00307] A função do músculo esquelético também foi avaliada pelo teste de força de preensão do membro anterior nesses camundongos.

[00308] Como mostrado nas FIGURAS 16G a 16H, camundongos MNV-BM-PLC mantiveram sua pontuação de força de preensão constante em 1 mês e 3 meses após a terapia de aumento (enriquecimento) de mitocôndrias (-1,29% e -1,40% da linha de base, respectivamente, e exibiram um resultado mais lento deterioração no tempo de força de preensão (latência para liberar a preensão) começando 3 meses após a administração (+ 6,07% e -0,69% da linha de base 1 e 3 meses após a administração.

[00309] Conforme mostrado nas FIGURAS 16I a 16J em comparação aos grupos de controle VEÍCULO e BM, nos quais um declínio de -4,80% e -0,9% da linha de base observada 1 mês após a administração agravado 2 meses depois (-15,3% e -6,35% da linha de base, ns, respectivamente). A força de preensão basal dos camundongos de controle de VEÍCULO e BM foi aumentada 1 mês após a administração (+ 6,01% e + 4,06% da linha de base, ns), diminuindo 2 meses depois para -6,03% (**p=0,0084) e - 17,77% (*p=0,0404) da linha de base, respectivamente.

[00310] Estes resultados mostram uma deterioração mais lenta/reduzida na força de preensão e tempo de retenção em camundongos tratados com mitocôndrias enriquecidas, sugerindo que a terapia de enriquecimento de mitocôndrias pode melhorar o comprometimento relacionado à idade na função muscular. EXEMPLO 13. DIMINUINDO OS EFEITOS

DEBILITANTES DO ENVELHECIMENTO E DOENÇAS RELACIONADAS A IDADE EM SUJEITOS HUMANOS

[00311] As etapas do método para a diminuição dos efeitos debilitantes em sujeitos humanos em envelhecimento ou sujeitos afetados com doenças ou doenças relacionadas com a idade são: (1) administrar ao sujeito em envelhecimento ou doador de G-CSF em uma dosagem de 10 a 16 µg/kg durante 5 dias; (2) no dia 5, considerar a administração ao Mozobil em questão por 1 a 2 dias; (3) no dia 6, realizar aférese no sangue do sujeito para obter células da medula óssea. Se a quantidade de células-tronco for insuficiente, a aférese pode ser realizada novamente no dia 7; (4) em paralelo, isolar mitocôndrias funcionais de uma amostra de sangue ou placenta de um doador saudável. O isolamento das mitocôndrias funcionais também pode ser realizado previamente a este processo, armazenando as mitocôndrias congeladas a -80 ºC (pelo menos) e descongeladas antes do uso; (5) incubação de células da medula óssea com mitocôndrias funcionais por 24 horas; (6) lavar as células da medula óssea; e (7) infusão de células da medula óssea enriquecidas com mitocôndrias ao sujeito em envelhecimento. Durante todo o período, avaliar alterações no consumo alimentar do paciente, peso corporal, acidose láctica, hemograma e marcadores bioquímicos sanguíneos.

[00312] Outro método para A diminuição dos efeitos debilitantes do envelhecimento de sujeitos humanos ou sujeitos afetados com doença ou doenças relacionadas a idade são: (1) obtenção de tecido adiposo do sujeito em envelhecimento usando um procedimento cirúrgico, como lipoaspiração; (2) isolamento de células-tronco mesenquimais (MSCs), propagação das células em cultura e, opcionalmente, criopreservação das células; (3) em paralelo, isolar mitocôndrias funcionais de uma amostra de sangue ou placenta de um doador saudável. O isolamento das mitocôndrias funcionais também pode ser realizado previamente a este processo, armazenando as mitocôndrias congeladas a -80 ºC (pelo menos) e descongeladas antes do uso; (5) incubação de MSCs com mitocôndrias funcionais por 24 horas; (6) lavar os MSCs; e (7) infusão de MSCs enriquecidas com mitocôndrias ao sujeito. Durante todo o período, avaliar alterações no consumo alimentar do paciente, peso corporal, acidose láctica, hemograma e marcadores bioquímicos sanguíneos. EXEMPLO 14. TERAPIA DE PACIENTES HUMANOS AFETADOS POR UMA DOENÇA NEOPLÁSICA NÃO HEMATOPOIÉTICA.

[00313] As etapas do método para a terapia de pacientes humanos que sofrem de uma doença neoplásica não hematopoiética consiste em (1) administrar a um paciente afetado com uma doença neoplásica G-CSF em uma dosagem de 10 a 16 µg/kg durante 5 dias; (2) no dia 6, realizar aférese no sangue do paciente para obtenção de células da medula óssea; (3)

em paralelo, isolar mitocôndrias funcionais de uma amostra de sangue de um doador saudável; (4) incubar células da medula óssea com mitocôndrias funcionais por 24 horas; (5) lavar as células da medula óssea; e (6) infundir células da medula óssea carregadas com mitocôndrias ao paciente. Durante todo o período, avaliar alterações no consumo alimentar do paciente, peso corporal, acidose láctica, hemograma e marcadores bioquímicos sanguíneos. EXEMPLO 15. TRATAMENTO COMPASSIVO USANDO CÉLULAS CD34+ AUTÓLOGAS ENRIQUECIDAS COM MNV-BLD (MITOCÔNDRIAS DERIVADAS DO SANGUE) PARA UM PACIENTE JOVEM COM SÍNDROME DE PEARSON (PS).

[00314] Paciente do sexo masculino, 6,5 anos (paciente 1), foi diagnosticado com Síndrome de Pearson, apresentando deleção dos nucleotídeos 5.835 a 9.753 em seu mtDNA. Antes da terapia de aumento mitocondrial (MAT), seu peso era de 14,5 kg, ele não conseguia andar mais de 100 metros ou subir escadas. Seu crescimento foi significativamente atrasado por 3 anos antes do tratamento e, no início do estudo, seu peso era de -4,1 pontuação de desvio padrão (SDS) e altura de -3,2 SDS (em relação à população), sem melhora, apesar de ser alimentado por um tubo de gastrostomia (G -tube) por mais de um ano. Ele tinha insuficiência renal (TFG 22 ml/min) e tubulopatia proximal com necessidade de suplementação eletrolítica. Ele tinha hipoparatireoidismo com necessidade de suplementação de cálcio e bloqueio incompleto de ramo direito (ICRBB) na eletrocardiografia.

[00315] A mobilização de células-tronco hematopoéticas e células progenitoras (HSPC) foi realizada por administração subcutânea de GCSF (10 µg/kg), dado sozinho por 5 dias. A leucaferese foi realizada (n = 2) em sistema Spectra Optia (TerumoBCT), via veia periférica, de acordo com as normas institucionais. A seleção de CD34 positiva foi realizada em células derivadas de sangue periférico mobilizadas usando o reagente de CD34 CliniMACS de acordo com as instruções do fabricante. As mitocôndrias foram isoladas de células mononucleares de sangue periférico materno (PBMCs)

usando tampão de sacarose a 250 mM pH 7,4 por centrifugação diferencial. Para a terapia de aumento mitocondrial (MAT), as células autólogas CD34+ foram incubadas com as mitocôndrias saudáveis da mãe do paciente (1*106 células por quantidade de mitocôndrias com 4,4 miliunidades de citrato sintase (CS)), resultando em um aumento de 1,56 vez no teor mitocondrial das células (aumento de 56% no teor mitocondrial conforme demonstrado pela atividade de CS). A incubação com mitocôndrias foi realizada por 24 horas à TA em solução salina contendo HSA a 4,5%. As células enriquecidas foram suspensas em albumina de soro humano a 4,5% em solução salina. O paciente recebeu uma única rodada de tratamento, por infusão IV, de 1,1*106 células autólogas CD34+ enriquecidas com mitocôndrias saudáveis por quilograma de peso corporal, de acordo com a linha do tempo apresentada na FIGURA 17A.

[00316] Como pode ser visto na FIGURA 17B, a pontuação de Equivalente Metabólico de Tarefa (MET) aeróbia do paciente foi aumentada 4 meses após o transplante de células enriquecidas mitocondrialmente, um efeito que permaneceu inalterado 8 meses após o transplante. Os dados ensinam que a pontuação de MET aeróbio do paciente aumentou significativamente após a terapia ao longo do tempo, de 5 (atividades de intensidade moderada, como caminhar e andar de bicicleta) a 8 (atividades de intensidade vigorosa, como correr, correr e pular corda). O MET é uma medida fisiológica que expressa o custo energético das atividades físicas. A capacidade do transplante de células enriquecidas para melhorar este parâmetro é encorajadora para indivíduos que envelhecem, uma vez que o escore MET aeróbio diminui com a idade.

[00317] A Figura 17C apresenta o nível de lactato encontrado no sangue do paciente em função do tempo após a injeção IV. O lactato sanguíneo é o ácido láctico que aparece no sangue como resultado do metabolismo anaeróbio quando as mitocôndrias são danificadas ou quando o fornecimento de oxigênio aos tecidos é insuficiente para suportar as demandas metabólicas normais, uma das marcas da disfunção mitocondrial. Como pode ser visto na Figura 4C, após a MAT, o nível de lactato sanguíneo do paciente 1 diminuiu para valores normais. O lactato é oxidado na mitocôndria, que é parcialmente responsável pela renovação do lactato no corpo humano. À medida que a qualidade e a atividade mitocondrial diminuem com a idade, os níveis de lactato aumentam. Portanto, a capacidade das células-tronco da medula óssea enriquecidas de reduzir os níveis de lactato implica um efeito potencial no envelhecimento do sujeito.

[00318] A Tabela 5 apresenta os resultados da Escala Pediátrica de Doença Mitocondrial (IPMDS) - Questionário de Qualidade de Vida (QV) do paciente como uma função do tempo pós-terapia celular. Em ambas as categorias “Reclamações e sintomas” e “Exame físico”, 0 representa “normal” para o atributo relevante, enquanto as afecções agravadas são pontuadas como 1-5, dependendo da gravidade. TABELA 5. Pré-tratamento +6 meses Reclamações e sintomas 24 11 Exame físico 13,4 4,6

[00319] Ressalta-se que o paciente não ganhou peso nos 3 anos anteriores ao tratamento, ou seja, não ganhou peso desde os 3,5 anos. Os dados apresentados em Figura 17D mostra o crescimento medido por pontuação de desvio padrão do peso e altura do paciente, com dados começando 4 anos antes do MAT e durante o período de acompanhamento. Os dados indicam que aproximadamente 15 meses após um único tratamento, houve aumento de altura e peso nessa paciente.

[00320] Outra evidência para o crescimento do paciente vem de seu Níveis de fosfatase alcalina. Um teste de nível de fosfatase alcalina (teste ALP) mede a quantidade da enzima fosfatase alcalina na corrente sanguínea. Ter níveis de ALP abaixo do normal no sangue pode indicar desnutrição, que pode ser causada por uma deficiência em certas vitaminas e minerais. Os dados apresentados em Figura 17E indica que um único tratamento foi suficiente para elevar os níveis de Fosfatase Alcalina do paciente de 159 para 486 IU/l em apenas 12 meses. A reversão da tendência de perda de peso, bem como a elevação de ALP, são relevantes tanto para o envelhecimento quanto para os tratamentos anticâncer, que podem levar à perda de peso e à desnutrição.

[00321] Como pode ser visto nas FIGURAS 17F a 17H, o tratamento resultou em melhorias pronunciadas nos níveis de glóbulos vermelhos (FIGURA 17F), níveis de hemoglobina (FIGURA 17G) e níveis de hematócrito (FIGURA 17H). Esses resultados mostram que um único tratamento foi suficiente para amenizar os sintomas da anemia

[00322] A FIGURA 17I demonstra a parada na deterioração dos rins, conforme ilustrado pelos níveis de creatinina na urina após o transplante celular. Como pode ser visto em Figuras 17J e 17K, o tratamento celular também resultou em melhorias pronunciadas nos níveis de bicarbonato (Figura 17J) e excesso de base (Figura 17K) sem suplementação com bicarbonato. A Figura 17L apresenta o nível de magnésio no sangue do paciente em função da suplementação de magnésio e do tempo pós-terapia celular. Os dados mostram que o nível de magnésio no sangue do paciente aumentou significativamente ao longo do tempo, de modo que a suplementação de magnésio não foi mais necessária. Atingir altos níveis de magnésio, sem suplementação de magnésio, é evidência de absorção melhorada de magnésio, bem como reabsorção no túbulo proximal do rim. Como pode ser visto nas Figuras 17M a 17P, um único tratamento também resultou em redução pronunciada nos níveis de vários indicadores de tubulopatia renal, como os níveis de glicose (Figura 17M) e certos níveis de sal na urina (Figura 17N - potássio; Figura 17O - cloreto; Figura 17P - sódio). As Figuras 17I a 17P são todas relevantes para o sujeito em envelhecimento, pois a função renal se deteriora com a idade.

[00323] Uma indicação genética para o sucesso da terapia utilizada é a prevalência de mtDNA normal em comparação ao mtDNA total por célula. Conforme ilustrado na FIGURA 18A (Pt.1), a prevalência de mtDNA normal total no sangue periférico do paciente foi aumentada de cerca de 1 para 1,6 (+ 60%) em apenas 4 meses, e para 1,9 (+ 90%) após 20 meses do tratamento e acima do nível basal na maioria dos pontos de tempo. Notavelmente, os níveis normais de mtDNA estavam acima do nível da linha de base na maioria dos pontos de tempo.

[00324] Outra indicação para a eficácia do transplante de células enriquecidas com mitocôndrias funcionais saudáveis é apresentada na FIGURA 18B. Há uma ligeira diminuição na heteroplasmia (menos mtDNA deletado) após MAT no paciente 1 que tinha níveis relativamente altos de heteroplasmia no início do estudo. Isso continuou durante todo o período de acompanhamento.

[00325] De acordo com o relatório do neurologista do Hospital, a melhora neurológica foi demonstrada após o transplante de células autólogas com mitocôndrias saudáveis sem a mutação de deleção; o paciente melhorou sua deambulação, subir degraus, usar tesouras e desenhar. Melhorias substanciais foram observadas na execução de comandos e tempo de resposta, bem como nas habilidades motoras e de linguagem. Além disso, a mãe relatou uma melhora na memória. Esses achados são particularmente relevantes e importantes para o idoso, uma vez que a deterioração neurológica das habilidades motoras e da memória costuma ocorrer na velhice.

[00326] Como os dados apresentados acima indicam, uma única rodada do método terapêutico de administração de células-tronco da medula óssea enriquecida com mitocôndrias funcionais foi bem-sucedida no tratamento de várias afecções debilitantes afetadas pelo envelhecimento. EXEMPLO 16. TRATAMENTO COMPASSIVO USANDO CÉLULAS CD34+ AUTÓLOGAS ENRIQUECIDAS COM MNV-BLD

(MITOCÔNDRIAS DERIVADAS DO SANGUE) PARA UM JOVEM COM SÍNDROME DE PEARSON (PS).

[00327] Uma paciente do sexo feminino de 7 anos (paciente 2) foi diagnosticada com Síndrome de Pearson, apresentando uma deleção de 4.977 nucleotídeos em seu mtDNA. A paciente também sofre de anemia, insuficiência pancreática endócrina e é diabética (HbA1C 7,1%). A paciente 2 tem altos níveis de lactato (>25 mg/dl), baixo peso corporal e problemas para comer e ganhar peso. A paciente sofre ainda de hipermagnesúria (altos níveis de magnésio na urina, baixos níveis no sangue). A paciente tem problemas de memória e aprendizagem, astigmatismo e baixa atividade mitocondrial em linfócitos periféricos, conforme determinado pelo TMRE, teor de ATP e taxa de consumo de O2 (em relação à mãe saudável).

[00328] A mobilização da medula óssea foi feita usando G-CSF (10 µg/kg) e 1 dose de Plerixafor Mozobil™ (0,24 mg/ml). A paciente iniciou o tratamento com 1,8*106 células/kg de células CD34+ autólogas enriquecidas com mitocôndrias saudáveis isoladas de sua mãe, de acordo com a linha do tempo apresentada na mobilização de HSPC, leucaferese e seleção de CD34 positivo foram realizadas semelhantes ao paciente 1 (Exemplo 18) com a adição de plerixafor (n = 2) administração 1 dia antes da leucaferese. As mitocôndrias foram isoladas de células mononucleares de sangue periférico materno (PBMCs) usando tampão de sacarose a 250 mM pH 7,4 por centrifugação diferencial. Para MAT, as células autólogas CD34+ foram incubadas com as mitocôndrias saudáveis da mãe do paciente (106 células por quantidade de mitocôndrias tendo 4,4 miliunidades de citrato sintase (CS)), resultando em um aumento de 1,62 vez no teor mitocondrial das células (62% de aumento no teor mitocondrial conforme demonstrado pela atividade de CS). A incubação com mitocôndrias foi realizada por 24 horas à TA em solução salina contendo 4,5% de HSA. Deve-se notar que após o enriquecimento mitocondrial, as células CD34+ do paciente aumentaram a taxa de formação de colônias em 26%.

[00329] A Paciente 2 (15 KG no dia do tratamento) foi tratada, por infusão IV, com 1,8*106 células autólogas CD34+ enriquecidas com mitocôndrias saudáveis por quilograma de peso corporal, de acordo com a linha do tempo apresentada na FIGURA 19A.

[00330] A FIGURA 19B retrata o efeito benéfico do transplante de células enriquecidas mitocondrialmente nos níveis de lactato sanguíneo, que é diminuído 5 meses após o tratamento.

[00331] Sabe-se que a força e a massa musculares se deterioram com o envelhecimento. As FIGURAS 19C a 19E demonstram o efeito notável do transplante de células enriquecidas sobre esses parâmetros em uma série de testes funcionais. A FIGURA 19C mostra os resultados do teste sentar e levantar. Idosos que são incapazes de se levantar de uma cadeira sem apoio correm o risco de se tornarem mais inativos e, portanto, de ter mais problemas de mobilidade. Os sujeitos testados são convidados a realizar o máximo possível de ciclos de sentar e levantar em um período de 30 segundos. O paciente 2 teve capacidade para realizar mais ciclos de sentar e levantar 5 meses após o transplante. A FIGURA 19D retrata um teste de caminhada de 6 minutos (TC6) e mede a distância em metros que o sujeito passou nos 6 minutos alocados. O paciente 2 ultrapassou a distância normal 5 meses após o transplante. A FIGURA 19E mostra melhora da força muscular 5 meses após o transplante de células, como fica evidente pelas unidades dinamométricas elevadas, mesmo após a 3ª repetição consecutiva contra a resistência do dinamômetro.

[00332] As Figuras 19F, 19G e 19H apresentam a função renal melhorada ilustrada por razões de magnésio, potássio e cálcio em comparação à creatinina encontrada na urina do paciente em função do tempo após a injeção IV, respectivamente.

[00333] A Figura 19I apresenta a razão entre ATP8 e 18S na urina do paciente em função do tempo após a injeção IV. O sistema imunológico está se deteriorando com a idade. Entre os componentes do sistema imunológico mais afetados pelo envelhecimento estão os linfócitos T. Nos jovens, as células T puras podem metabolizar glicose, aminoácidos e lipídios para alimentar catabolicamente a geração de ATP na mitocôndria. Uma vez que a função mitocondrial também é conhecida por estar comprometida com o envelhecimento, uma possível conexão entre as células T e o declínio mitocondrial foi sugerida e está sendo estudada. A FIGURA 19J mostra um aumento no teor de ATP nos linfócitos do paciente.

[00334] A FIGURA 18A (Pt.2) apresenta a prevalência de mtDNA normal em função do tempo após a injeção IV. Como pode ser visto na Figura 18A (Pt.2), a prevalência de mtDNA normal foi aumentada de uma linha de base de cerca de 1 para tão alta quanto 2 (+ 100%) em apenas 1 mês, permanecendo relativamente alta até 10 meses após o tratamento. Notavelmente, os níveis normais de mtDNA estavam acima do nível basal em todos os pontos de tempo

[00335] A FIGURA 18B (Pt.2) apresenta a mudança no nível de heteroplasmia em função do tempo após a MAT. Pode ser visto que houve uma diminuição na heteroplasmia (menos mtDNA deletado) após a MAT no paciente 2. Isso continuou durante todo o período de acompanhamento. EXEMPLO 17. TRATAMENTO COMPASSIVO USANDO CÉLULAS CD34+ AUTÓLOGAS ENRIQUECIDAS COM MNV-BLD (MITOCÔNDRIAS DERIVADAS DO SANGUE) PARA UM PACIENTE JOVEM COM SÍNDROME DE PEARSON (PS) E SÍNDROME DE FANCONI RELACIONADA A PS (FS).

[00336] Uma paciente do sexo feminino de 10,5 anos (paciente 3) foi diagnosticada com Síndrome de Pearson, apresentando uma deleção dos nucleotídeos 12.113 a 14.421 em seu mtDNA. A paciente também sofre de anemia e da Síndrome de Fanconi que evoluiu para o estágio 4 de insuficiência renal. A paciente é tratada com diálise três vezes por semana. Recentemente, a paciente também sofre de um distúrbio visual grave, estreitamento do campo de visão e perda da visão de perto. A paciente não tem capacidade para qualquer atividade física (nada de andar, senta-se em um carrinho)

[00337] Paciente com níveis elevados de lactato (>50 mg/dl) e distúrbio pancreático que foi tratado com insulina. A MRI do cérebro mostrou muitas lesões e regiões atróficas. A paciente foi alimentada apenas por meio de gastrostomia. A paciente apresentava problemas de memória e aprendizagem. A paciente apresentou baixa atividade mitocondrial em linfócitos periféricos, conforme determinado pelos testes de Tetrametilrodamina Etil Ester (TMRE), teor de ATP e taxa de consumo de O2 (em relação à mãe saudável).

[00338] A mobilização de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPC), bem como leucaferese e seleção de CD34 positivo foram realizadas de forma semelhante ao paciente 1 (Exemplo 3) com a adição de plerixafor (n = 1) no dia -1 antes da leucaferese. A leucaferese foi realizada por meio de um cateter de diálise permanente. As mitocôndrias foram isoladas de células mononucleares de sangue periférico materno (PBMCs) usando tampão de sacarose a 250 mM pH 7,4 por centrifugação diferencial. Para MAT, as células autólogas CD34+ foram incubadas com mitocôndrias saudáveis da mãe do paciente (1*106 células por quantidade de mitocôndrias com 4,4 miliunidades de citrato sintase (CS)), resultando em um aumento de 1,14 vez no teor mitocondrial das células (Aumento de 14% no teor mitocondrial, conforme demonstrado pela atividade de CS). As células foram incubadas com mitocôndrias durante 24 horas à TA em solução salina contendo HSA a 4,5%. Deve-se notar que após o enriquecimento mitocondrial, as células CD34+ do paciente aumentaram a taxa de formação de colônias em 52%.

[00339] O paciente 3 (21 KG) foi tratado, por infusão IV, com 2,8*106 células autólogas CD34+ enriquecidas com mitocôndrias saudáveis de sua mãe por quilograma de peso corporal, de acordo com a linha do tempo apresentada na FIGURA 20A.

[00340] A FIGURA 202B retrata o efeito benéfico do transplante de células enriquecidas mitocondrialmente nos níveis de lactato sanguíneo, que diminuem 2 e 3 meses após o transplante. A linha abaixo de 20 mg/dl representa os níveis normais de lactato sanguíneo.

[00341] A FIGURA 20C apresenta os níveis de enzimas hepáticas AST e ALT no sangue do paciente em função do tempo antes e depois da terapia celular. Atingir níveis baixos de enzimas hepáticas no sangue é evidência de diminuição da lesão hepática.

[00342] A FIGURA 20D apresenta os níveis de triglicerídeos, colesterol total e colesterol de lipoproteína de densidade muito baixa (VLDL) no sangue do paciente em função do tempo antes e após a terapia celular. A obtenção de níveis baixos de triglicerídeos, colesterol total e colesterol VLDL no sangue é evidência de aumento da função hepática e melhora do metabolismo lipídico.

[00343] A hemoglobina glicada (às vezes também chamada de hemoglobina A1c, HbA1c, A1C, Hb1c, Hb1c ou HGBA1C) é uma forma de hemoglobina medida principalmente para identificar a concentração média de glicose no plasma em três meses. O teste é limitado a uma média de três meses devido ao fato de que a vida útil de um glóbulo vermelho é de quatro meses (120 dias). A FIGURA 20E apresenta o resultado do teste A1C do paciente em função do tempo antes e depois da terapia.

[00344] As FIGURAS 20F e 20G apresentam os resultados dos testes “Sentado para levantado” (20F) e “Caminhada de 6 minutos” (20G) do paciente em função do tempo pós-injeção IV, mostrando uma melhora em ambos os parâmetros 5 meses após o tratamento.

[00345] A FIGURA 18A (Pt.3) apresenta a prevalência de mtDNA normal em função do tempo após a injeção IV. Como pode ser visto na Figura 18A (Pt.3), a prevalência de mtDNA normal foi aumentada em 50% 7 meses após o tratamento. Notavelmente, os níveis normais de mtDNA estavam acima do nível basal na maioria dos pontos de tempo

[00346] A FIGURA 18B (Pt.3) apresenta a mudança no nível de heteroplasmia em função do tempo após a MAT. Pode ser visto que houve uma diminuição na heteroplasmia (menos mtDNA deletado) após MAT no paciente 3 que tinha níveis relativamente baixos de heteroplasmia no início do estudo. Isso continuou durante todo o período de acompanhamento. EXEMPLO 18. TRATAMENTO COMPASSIVO USANDO CÉLULAS CD34+ AUTÓLOGAS ENRIQUECIDAS COM MNV-BLD (MITOCÔNDRIAS DERIVADAS DO SANGUE) PARA UM JOVEM COM SÍNDROME DE KEARNS-SAYRE (KSS).

[00347] O paciente 4 era uma paciente de 14 anos, 19,5 kg do sexo feminino, com diagnóstico de síndrome de Kearns-Sayre, apresentando visão de túnel, ptose, oftalmoplegia e atrofia retiniana. O paciente tinha problemas de visão, CPEO, convulsões epilépticas, EEG patológico, miopatia severa com incapacidade para sentar ou andar, arritmia cardíaca. A paciente apresentou uma deleção de 7,4 Kb em seu DNA mitocondrial, incluindo os seguintes genes: TK, NC8, ATP8, ATP6, CO3, TG, ND3, TR, ND4L, TH, TS2, TL2, ND5, ND6, TE, NC9 e CYB.

[00348] A mobilização de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC), bem como leucaferese e seleção de CD34 positivoforam realizadas de forma semelhante ao paciente 3 (Exemplo 5). Para MAT, as células autólogas CD34+ foram incubadas por 24 horas à RT com mitocôndrias saudáveis da mãe do paciente (1*106 células por quantidade de mitocôndria com 4,4 miliunidades de citrato sintase (CS)), em solução salina contendo 4,5% de HSA. O enriquecimento resultou em um aumento de 1,03 vez no teor mitocondrial das células (aumento de 3% no teor mitocondrial conforme demonstrado pela atividade de CS).

[00349] O paciente 4 foi tratado com 2,2*106 células autólogas CD34+ enriquecidas com mitocôndrias saudáveis por quilograma de peso corporal, de acordo com a linha do tempo apresentada na FIGURA 20A.

[00350] Inesperadamente, 4 meses após um único tratamento com CD34+ que foi enriquecido em apenas 3% com mitocôndrias saudáveis, o paciente apresentou melhora no EEG e sem crises epilépticas.

Cinco meses após o tratamento, o paciente sofreu bloqueio atrioventricular (AV) relacionado à doença e foi instalado um marca-passo. O paciente se recuperou e a melhora continuou. O teor de ATP no sangue periférico foi medido 6 meses após o tratamento, mostrando um aumento de cerca de 100% no teor de ATP em comparação àquele antes do tratamento, como mostrado na FIGURA 21. Sete meses após o tratamento, a paciente conseguiu sentar-se sozinha, deambular com auxílio, conversar, apresentou melhor apetite e ganhou 3,6 kg.

[00351] A descrição anterior das modalidades específicas revelará tão completamente a natureza geral da invenção que outros podem, aplicando o conhecimento atual, prontamente modificar e/ou adaptar para várias aplicações tais modalidades específicas sem experimentação indevida e sem se afastar do conceito genérico, e, portanto, tais adaptações e modificações devem e se destinam a ser compreendidas dentro do significado e faixa de equivalentes das modalidades divulgadas. Deve ser entendido que a fraseologia ou terminologia empregada no presente documento tem o propósito de descrição e não de limitação. Os meios, materiais e etapas para realizar várias funções divulgadas podem assumir uma variedade de formas alternativas sem se afastar da invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição farmacêutica para uso no tratamento ou diminuição de condições debilitantes em um indivíduo, sendo que a composição farmacêutica é caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 105 a 2x107 células-tronco humanas por quilograma de peso corporal do indivíduo, em que as células-tronco humanas são suspensas em um meio líquido farmaceuticamente aceitável com capacidade para suportar a viabilidade das células, em que as células-tronco humanas são enriquecidas com mitocôndrias exógenas saudáveis funcionais congeladas-descongeladas, e em que as condições debilitantes são selecionadas a partir do grupo que consiste em envelhecimento, doenças relacionadas à idade e sequelas de tratamentos anticâncer.

2. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o enriquecimento compreende a introdução nas células-tronco de uma dose de mitocôndria de pelo menos 0,088 até 176 miliunidades de atividade CS por milhão de células.

3. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o enriquecimento compreende o contato das células-tronco com uma dose de mitocôndria de 0,88 a 17,6 miliunidades de atividade de CS por milhão de células.

4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os tratamentos anticâncer são selecionados a partir do grupo que consiste em radiação, quimioterapia e imunoterapia com anticorpos monoclonais.

5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as células-tronco são autólogas, singênicas ou de um doador.

6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as células-tronco são células- tronco pluripotentes (PSCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).

7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as células-tronco são células- tronco mesenquimais.

8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as células-tronco são derivadas de tecido adiposo, mucosa oral, sangue ou sangue do cordão umbilical.

9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as células-tronco são derivadas de células da medula óssea.

10. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que as células-tronco humanas compreendem células progenitoras mieloides comuns, células progenitoras linfoides comuns ou qualquer combinação das mesmas.

11. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que as células- tronco são células CD34+.

12. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que as células- tronco são pelo menos parcialmente purificadas.

13. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que as mitocôndrias funcionais saudáveis são derivadas de uma célula ou um tecido selecionado a partir do grupo que consiste em: placenta, células da placenta cultivadas em cultura e células do sangue.

14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita composição farmacêutica é administrada ao indivíduo que sofre de uma condição debilitante selecionada a partir do grupo que consiste em envelhecimento, doenças relacionadas à idade e sequelas de tratamentos anticâncer.

15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a dita composição farmacêutica é administrada a um tecido ou órgão específico.

16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a dita composição farmacêutica é administrada por administração parenteral sistêmica.

17. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos cerca de 106 células estaminais humanas enriquecidas mitocondrialmente por quilograma de peso corporal do paciente.

18. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que compreende um total de cerca de 5x105 a 5x109 células-tronco humanas enriquecidas com mitocôndrias humanas.

19. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que a administração da composição farmacêutica a um indivíduo é por uma via parenteral selecionada a partir do grupo que consiste em injeção intravenosa, intra- arterial, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal e direta em um tecido ou órgão.

20. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que as células- tronco humanas enriquecidas mitocondrialmente têm: (i) um teor de DNA mitocondrial maior; (ii) um nível de atividade de CS maior; (iii) um teor maior de pelo menos uma proteína mitocondrial selecionada a partir do complexo Succinato desidrogenase, subunidade A (SDHA) e citocromo C oxidase (COX1); (iv) uma taxa de consumo de O2 maior; (v) uma taxa de produção de ATP maior; ou (vi) qualquer combinação dos mesmos,

em relação ao nível correspondente nas células-tronco antes do enriquecimento mitocondrial.

21. Método ex-vivo para enriquecimento de células- tronco humanas com mitocôndrias exógenas funcionais, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) fornecer uma primeira composição, compreendendo uma pluralidade de células-tronco humanas isoladas ou parcialmente purificadas de um indivíduo que sofre de uma condição debilitante ou de um doador; (ii) fornecer uma segunda composição, compreendendo uma pluralidade de mitocôndrias funcionais humanas congeladas- descongeladas isoladas ou parcialmente purificadas obtidas de um doador saudável; (iii) contatar as células-tronco humanas da primeira composição com as mitocôndrias funcionais humanas congeladas- descongeladas da segunda composição a uma razão de 0,088 - 176 mU de atividade de CS por 106 células-tronco; e (iv) incubar a composição de (iii) em condições que permitem às mitocôndrias funcionais humanas congeladas-descongeladas entrar nas células-tronco humanas, enriquecendo assim as ditas células estaminais humanas com as ditas mitocôndrias funcionais humanas; em que o teor mitocondrial funcional das células-tronco humanas enriquecidas é detectavelmente maior do que o teor mitocondrial funcional das células-tronco humanas na primeira composição.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que as células-tronco na primeira composição são obtidas de um indivíduo que está envelhecendo ou de um doador.

23. Método ex-vivo para enriquecimento de células- tronco humanas com mitocôndrias exógenas funcionais, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(i) fornecer uma primeira composição, compreendendo uma pluralidade de células-tronco humanas isoladas ou parcialmente purificadas de um indivíduo que sofre de uma doença maligna ou de um doador saudável; (ii) fornecer uma segunda composição, compreendendo uma pluralidade de mitocôndrias funcionais humanas congeladas- descongeladas isoladas ou parcialmente purificadas obtidas do mesmo indivíduo ou de um doador saudável; (iii) colocar as células-tronco humanas da primeira composição em contato com as mitocôndrias funcionais humanas congeladas- descongeladas da segunda composição a uma razão de 0,088 - 176 mU de atividade de CS por 106 células-tronco; e (iv) incubar a composição de (iii) em condições que permitem às mitocôndrias funcionais humanas entrar nas células estaminais humanas, enriquecendo assim as ditas células estaminais humanas com as ditas mitocôndrias funcionais humanas; em que o teor mitocondrial funcional das células-tronco humanas enriquecidas é detectavelmente maior do que o teor mitocondrial funcional das células-tronco humanas na primeira composição.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que as células-tronco na primeira composição são obtidas de um indivíduo que sofre de uma doença maligna não hematopoiética ou de um doador saudável não que sofre de uma doença maligna.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24, caracterizado pelo fato de que as condições que permitem que as mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis entrem nas células-tronco humanas compreendem a incubação das células-tronco humanas com as ditas mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis por um tempo que está na faixa de 0,5 a 30 horas, a uma temperatura que varia de 16 a 37°C.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que antes da incubação, o método compreende adicionalmente uma única centrifugação das células-tronco humanas e mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis acima de 2.500 xg.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 e 26, caracterizado pelo fato de que as células-tronco são células da medula óssea.

28. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que as mitocôndrias funcionais na segunda composição são obtidas de um indivíduo que sofre de uma doença maligna antes dos tratamentos anticâncer.

29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 28, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente expandir as células-tronco antes ou depois do enriquecimento com as mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 28, caracterizado pelo fato de que as células-tronco humanas autólogas são congeladas e armazenadas antes da aflição com a condição debilitante.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 28, caracterizado pelo fato de que o processo de enriquecimento das células-tronco humanas com mitocôndrias é realizado antes do congelamento das células.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 28, caracterizado pelo fato de que o processo de enriquecimento das células-tronco humanas com mitocôndrias é realizado após o congelamento e descongelamento das células.

33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 e 23, caracterizado pelo fato de que o enriquecimento detectável de teor de mitocondrial funcional das células-tronco antes do enriquecimento mitocondrial ou pós-enriquecimento mitocondrial é determinado por ensaios selecionados a partir do grupo que consiste em: (i) teor de pelo menos um proteína mitocondrial selecionada de SDHA e COX1; (ii) nível de atividade da citrato sintase; (iii) taxa de consumo de oxigênio (O2); (iv) taxa de produção de trifosfato de adenosina (ATP); (v) teor de DNA mitocondrial; e qualquer combinação dos mesmos.

34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 e 23, caracterizado pelo fato de que as células-tronco são células-tronco pluripotentes (PSCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).

35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 e 23, caracterizado pelo fato de que as células-tronco são células-tronco mesenquimais.

36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 e 23, caracterizado pelo fato de que as células-tronco são derivadas de tecido adiposo, fibroblastos de pele, mucosa oral, sangue ou sangue do cordão umbilical.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 e 23, caracterizado pelo fato de que as células-tronco são células CD34+.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 e 23, caracterizado pelo fato de que as células-tronco humanas são derivadas de tecido adiposo, mucosa oral, sangue, sangue do cordão umbilical ou medula óssea.

39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 e 23, caracterizado pelo fato de que as células-tronco são derivadas de células da medula óssea.

40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 39, caracterizado pelo fato de que as células-tronco enriquecidas com mitocôndrias têm:

(i) um teor maior de pelo menos uma proteína mitocondrial selecionada a partir de SDHA e COX1. (ii) uma taxa de consumo de oxigênio (O2) maior; (iii) um nível de atividade maior da citrato sintase; (iv) uma taxa maior de produção de trifosfato de adenosina (ATP); (v) um teor maior de DNA mitocondrial; ou (vi) qualquer combinação dos mesmos. em comparação às células-tronco antes do enriquecimento mitocondrial.

41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 e 23, caracterizado pelo fato de que a quantidade total de proteínas mitocondriais nas mitocôndrias parcialmente purificadas está entre 20% a 80% da quantidade total de proteínas celulares na amostra.

42. Pluralidade de células-tronco humanas enriquecidas com mitocôndrias funcionais caracterizada pelo fato de que é obtida pelo método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 e 23.

43. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de células-tronco humanas, de acordo com a reivindicação 42.

44. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que se destina ao uso no tratamento ou diminuição de uma condição debilitante em um indivíduo humano, em que a condição debilitante é selecionada a partir do grupo que consiste em envelhecimento, doenças relacionadas à idade e sequelas de tratamentos anticâncer.

45. Método de tratamento de uma condição debilitante em um indivíduo humano com necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar ao indivíduo a composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 43.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que as células-tronco são autólogas ou singênicas para o indivíduo que sofre da condição debilitante.

47. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que as células-tronco são alogênicas para o indivíduo que sofre da condição debilitante.

48. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa de administrar ao indivíduo que sofre de condições debilitantes selecionadas a partir do grupo que consiste em envelhecimento, doenças relacionadas com a idade e as sequelas de tratamentos anticâncer, um agente que previne, retarda, minimiza ou anula uma reação imunogênica adversa entre o indivíduo e as células-tronco do doador alogênico.

49. Método para tratar ou diminuir condições debilitantes em um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende a administração parenteral de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos 5*105 a 5*109 células-tronco humanas enriquecidas com mitocôndrias exógenas funcionais saudáveis congeladas-descongeladas ao indivíduo, em que as condições debilitantes são selecionadas a partir do grupo que consiste em envelhecimento, doenças relacionadas à idade e as sequelas de tratamentos anticâncer.