BR112021000830A2 - Tratamento da mucopolissacaridose i com alfa-l-iduronidase (idus) humana totalmente humana e glicosilada - Google Patents

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Abstract

tratamento da mucopolissacaridose i com alfa-l-iduronidase (idus) humana totalmente humana e glicosilada. são descritas composições e métodos para a distribuição de uma a-l-iduronidase (idua) totalmente humana e glicosilada (hugly) ao líquido cefalorraquidiano do sistema nervoso central (snc) de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose i (mps i).

Description

TRATAMENTO DA MUCOPOLISSACARIDOSE I COM ALFA-L-IDURONIDASE (IDUA) HUMANA TOTALMENTE HUMANA E GLICOSILADA
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. Nº 62/699.923, depositado em 18 de julho de 2018, que é incorporado a este documento por referência em sua totalidade.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS DEPOSITADA ELETRONICAMENTE
[0002] Este pedido incorpora por referência uma Listagem de Sequências depositada com este pedido como um arquivo de texto intitulado “Sequence Listing 12656-113-228.txt”, criado em 8 de julho de 2019 e com um tamanho de 81.920 bytes.
1. INTRODUÇÃO
[0003] Composições e métodos são descritos para a distribuição de uma a-L-iduronidase (IDUA) totalmente humana e glicosilada (HuGly) ao líquido cefalorraquidiano do sistema nervoso central (SNC) de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I).
2. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0004] A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença genética recessiva rara com uma incidência estimada de 1 em
100.000 nascidos vivos (Moore D et al., 2008, Orphanet Journal of Rare Diseases 3). A MPS I é causada pela deficiência de a-l- iduronidase (IDUA), uma enzima necessária para o catabolismo lisossomal dos polissacarídeos complexos ubíquos sulfato de heparano e sulfato de dermatano. Esses polissacarídeos, chamados glicosaminoglicanos (GAGs), se acumulam em tecidos de pacientes com MPS I, resultando em lesões de armazenamento características e diversas sequelas da doença. Os pacientes podem apresentar baixa estatura, deformidades Ósseas e articulares, características faciais grosseiras, hepatoesplenomegalia, doença valvar cardíaca, apneia obstrutiva do sono, infecções respiratórias superiores recorrentes, deficiência auditiva, síndrome do túnel do carpo e deficiência visual devido à turvação da córnea (Beck M, et al., 2014, The natural history of MPS II: global perspectives from the MPS I Registry (A história natural da MPS I: perspectivas globais a partir do Registro de MPS 1) .Genetics in medicine: official journal of the American College of Medical Genetics 16 (10): 759-765). Além disso, muitos pacientes desenvolvem sintomas relacionados ao armazenamento de GAG no sistema nervoso central, que podem incluir hidrocefalia, compressão da medula espinhal e, em alguns pacientes, deficiência cognitiva.
[0005] Pacientes com MPS I abrangem um amplo espectro de gravidade da doença e extensão do envolvimento do SNC. Essa variabilidade na gravidade se correlaciona com a expressão residual de IDUA; pacientes com duas mutações que resultam em nenhuma expressão enzimática ativa — incluindo mutações sem sentido, deleções e algumas mutações de sentido trocado —- tipicamente apresentam sintomas antes dos dois anos de idade e universalmente exibem declínio cognitivo grave após um período inicial de desenvolvimento normal (Terlato NJ & Cox GF, 2003, Genetics in Medicine: official journal of the American College of Medical Genetics 5 (4): 286-294). Essa forma grave de MPS IL também é referida como síndrome de Hurler (H). Pacientes com pelo menos uma mutação que resulta na produção de uma pequena quantidade de IDUA ativa exibem um fenótipo atenuado, referido como síndrome de Hurler-Scheie (HS) ou síndrome de Scheie. Esses pacientes podem apresentar sintomas no início da infância Ou podem não ser identificados até depois da primeira década de vida. Embora o começo seja geralmente mais tarde e a gravidade possa ser reduzida, os pacientes com a forma atenuada de MPS II podem experienciar qualquer uma das mesmas características somáticas que aqueles com síndrome de Hurler (Vijay S & Wraith JE, 2005, Acta Paediatrica 94 (7): 872- 877). Pacientes com MPS I atenuada também experienciam altas taxas de complicações neurológicas, incluindo compressão da medula espinhal e hidrocefalia. Deficiência cognitiva é relatada em aproximadamente 30% dos pacientes classificados como tendo MPS I atenuada (Beck M, et al., 2014, Genetics in medicine: official journal of the American College of Medical Genetics 16 (10): 759-765).
[0006] Terapia de reposição enzimática (TRE) [AldurazymeO (laronidase)] foi aceita como padrão de tratamento para sintomas sistêmicos de MPS I, mas não trata as manifestações no SNC (de Ru MH, et al., 2011, Orphanet Journal of Rare Diseases 6: 9; Wraith JE, et al., 2007, Pediatrics 120 (1): E37-E46). O transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) afeta os sintomas neurocognitivos da MPS I, mas há limitações importantes ao procedimento. O TCTH para MPS I está associado a morbidade substancial e mortalidade de até 20%, e o tratamento é incompleto, pois os pacientes ainda encontram declínio neurocognitivo até 1 ano após o TCTH enquanto a expressão de IDUA se estabiliza (de Ru MH, et al., 2011, Orphanet Journal of Rare Diseases 6: 9; Fleming DR, et al., 1998, Pediatric transplantation 2 (4): 299-304; Boelens JJ, et al., 2007, Bone
Marrow Transplantation 40 (3): 225-233; Souillet G, et al., 2003, Bone Marrow Transplantation 31 (12): 1105-1117; Whitley CB, et al., 1993, American Journal of Medical Genetics 46 (2): 209- 218). Entre os pacientes enxertados com sucesso, a inteligência tipicamente permanece significativamente abaixo do normal.
3. —SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0007] À invenção envolve a distribuição de uma a-L- iduronidase (HuGlylDUA) totalmente humana e glicosilada (HuGly) ao líquido cefalorraquidiano (LCR) do sistema nervoso central de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS 1), incluindo, mas não limitado a, pacientes diagnosticados com síndrome de Hurler, Hurler-Scheie ou Scheie. Em uma modalidade preferencial, o tratamento é realizado por meio de terapia gênica — por exemplo, administrando um vetor viral ou outro construto de expressão de DNA que codifica IDUA humana (hIDUA), ou um derivado de hIDUA, ao LCR de um paciente (sujeito humano) diagnosticado com MPS I, de modo que um depósito permanente de células transduzidas seja gerado, o qual fornece continuamente o produto transgene totalmente humano e glicosilado ao SNC. A HuUuGlIyIDUA secretada a partir do depósito para o LCR será endocitada por células no SNC, resultando em “correção cruzada” do defeito enzimático nas células receptoras. Em uma modalidade alternativa, a HUGlIyIDUA pode ser produzida em cultura de células e administrada como uma terapia de reposição enzimática ("TRE"), por exemplo, injetando a enzima. No entanto, a abordagem de terapia gênica oferece várias vantagens em relação à TRE — distribuição sistêmica da enzima não resultará no tratamento do SNC porque a enzima não pode cruzar a barreira hematoencefálica; e, ao contrário da abordagem de terapia gênica da invenção, a distribuição direta da enzima ao SNC exigiria injeções repetidas que não só são onerosas, mas também representam um risco de infecção.
[0008] A HUGIyIDUA codificada pelo transgene pode incluir, mas não está limitada a, IDUA humana (hIDUA) com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 (como mostrado na FIG. 1) e derivados de hIDUA com substituições, deleções ou adições de aminoácidos, por exemplo, incluindo, mas não se limitando a, substituições de aminoácidos selecionados a partir de resíduos não conservados correspondentes em ortólogos de IDUA mostrados na FIG. 2, com a condição de que tais mutações não incluam nenhuma que tenha sido identificada em fenótipos de MPS I grave, grave-intermediária, intermediária ou atenuada mostrados na FIG. 3 (a partir de Saito et al., 2014, Mol Genet Metab 111: 107-112, Table 3 listing 57 MPS I mutations (Tabela 3 listando 57 mutações de MPS I), que é incorporado a este documento por referência em sua totalidade); ou relatado por Venturi et al., 2002, Human Mutation t522 Online ("Venturi 2002"), ou Bertola et al., 2011 Human Mutation 32: E2189-E2210 ("Bertola 2011"), cada um dos quais é incorporado a este documento por referência em sua totalidade.
[0009] Por exemplo, as substituições de aminoácidos em uma posição particular de hIDUA podem ser selecionadas a partir dos resíduos de aminoácidos não conservados correspondentes encontrados naquela posição nos ortólogos de IDUA representados na FIG. 2 (mostrando o alinhamento de ortólogos como relatou Maita et al., 2013, PNAS 110:14628, Fig. S8, que é incorporado a este documento por referência em sua totalidade), com a condição de que tais substituições não incluam nenhuma das mutações deletérias mostradas na FIG. 3 ou relatadas em Venturi
2002 ou Bertola 2011 acima.
O produto transgene resultante pode ser testado usando ensaios convencionais in vitro, em cultura de células ou animais de teste para garantir que a mutação não perturbe o funcionamento da IDUA.
As substituições, deleções ou adições de aminoácidos preferenciais devem ser aquelas que mantêm ou aumentam a atividade enzimática, estabilidade ou meia- vida de IDUA, como testado por ensaios convencionais in vitro, em cultura de células ou modelos animais para MPS I.
Por exemplo, a atividade enzimática do produto transgene pode ser avaliada usando um ensaio enzimático convencional com 4-metilumbeliferil a-L-iduronida como substrato (vide, por exemplo, Hopwood et al., 1979, Clin Chim Acta 92: 257-265; Clements et al., 1985, Eur J Biochem 152: 21-28; e Kakkis et al., 1994, Prot Exp Purif 5: 225-232 para ensaios de enzima IDUA exemplares que podem ser usados, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência em sua totalidade). A capacidade do produto transgene de corrigir fenótipos de MPS I pode ser avaliada em cultura de células; por exemplo, transduzindo células MPS I em cultura com um vetor viral ou outro construto de expressão de DNA que codifica hIDUA ou um derivado; adicionando a rHuGlyIDUA ou um derivado às células MPS I em cultura; ou co-cultivando células MPS I com células hospedeiras humanas modificadas para expressar e secretar rHuGlyIDUA ou um derivado e determinando a correção do defeito nas células cultivadas MPS I, por exemplo, detectando a atividade da enzima IDUA e/ou a redução no armazenamento de GAG nas células MPS I em cultura (vide, por exemplo, Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044-3048; e Anson et al. 1992, Hum Gene Ther 3: 371-379, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência em sua totalidade).
[0010] Modelos animais para MPS I foram descritos para camundongos (vide, por exemplo, Clarke et al., 1997, Hum Mol Genet 6 (4): 503-511), o gato doméstico de pelo curto (vide, por exemplo, Haskins et al., 1979, Pediatr Res 13 (11): 1294-97) e várias raças de cães (vide, por exemplo, Menon et al., 1992, Genomics 14 (3): 763-768; Shull et al., 1982, Am J Pathol 109 (2): 244-248). O modelo de MPS I em cães se assemelha à síndrome de Hurler, a forma mais grave de MPS I, uma vez que a mutação IDUA não resulta em nenhuma proteína detectável. Alta homologia gênica entre proteínas IDUA (vide alinhamento na FIG. 2) significa que hIDUA é funcional em animais e os tratamentos abrangendo hIDUA podem ser testados nesses modelos animais.
[0011] Preferencialmente, o transgene rHuGlyIDUA deve ser controlado por elementos de controle de expressão que funcionam em neurônios e/ou células gliais, por exemplo, o promotor CB7 (um promotor de fB-actina de frango e potenciador de CMV) e pode incluir outros elementos de controle de expressão que potencializam a expressão do transgene conduzido pelo vetor (por exemplo, íntron de B-actina de frango e sinal poli A de B-globina de coelho). O construto de cDNA para o transgene de hIDUA deve incluir uma sequência de codificação para um peptídeo sinal que garanta o processamento adequado de co- e pós-tradução (glicosilação e sulfatação de proteína) pelas células transduzidas do SNC. Tais peptídeos sinal usados por células do SNC podem incluir, mas não estão limitados a: * Peptídeo sinal de glicoproteína de oligodendrócito- mielina (hOMG): MEYQILKMSLCLFILLFLTPGILC (SEQ ID NO: 2)
* Repressor celular de peptídeo sinal de genes estimulados por E1lA 2 (hCREG2): MSVRRGRRPARPGTRLSWLLCCSALLSPAAG (SEQ ID NO: 3) * Conjunto de V e domínio transmembranar contendo peptídeo sinal 2B (hvSTM2B): MEQRNRLGALGYLPPLLLHALLLEVADA (SEQ ID NO: 4) * Peptídeo sinal de protocaderina alfa-l1 (hPCADHAIL): MVFSRRGGLGARDLLLWLLLLAAWEVGSG (SEQ ID NO: 5) * Peptídeo sinal FAMI9Al (TAFAL): MAMVSAMSWVLYLWISACA (SEQ ID NO: 6) * Peptídeo sinal de interleucina-2: MYRMOLLSCIALILALVTNS (SEQ ID NO: 14) Os peptídeos sinal também podem ser referidos neste documento como sequências líderes ou peptídeos líderes.
[0012] O vetor recombinante usado para distribuir o transgene deve ter um tropismo para células no SNC, incluindo, mas limitado a neurônios e/ou células gliais. Tais vetores podem incluir vetores de vírus adeno-associados recombinantes não replicantes ("rYAAV"), particularmente aqueles portando um capsídeo AAV9 ou AAVrhl10 são preferíveis. Os capsídeos variantes AAV podem ser usados, incluindo, mas não limitados àqueles descritos por Wilson na Patente US Nº 7.906.111, que é incorporada a este documento por referência em sua totalidade, com AAV/hu.31 e AAV/hu.32 sendo particularmente preferíveis; bem como capsídeos variantes AAV descritos por Chatterjee na Patente US Nº 8.628.966, Patente US Nº 8.927.514 e Smith et al., 2014, Mol Ther 22: 1625-1634, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência em sua totalidade. No entanto, outros vetores virais podem ser usados, incluindo, mas não se limitando a, vetores lentivirais, vetores virais de vaccinia ou vetores de expressão não virais referidos como construtos de "DNA nu" (vide Seção 5.2).
[0013] Composições farmacêuticas adequadas para administração ao LCR compreendem uma suspensão do vetor rHuGlyIDUA em um tampão de formulação compreendendo um tampão aquoso fisiologicamente compatível, um surfactante e excipientes opcionais. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para administração intratecal. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para administração intracisternal (injeção na cisterna magna). Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para injeção no espaço subaracnoide por meio de uma punção em Cl-2. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para administração intracerebroventricular. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para administração por meio de punção lombar.
[0014] Doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante devem ser administradas ao LCR por meio de administração intratecal (isto é, injeção no espaço subaracnoide de modo que os vetores recombinantes se distribuam através do LCR e transduzam células no SNC). Isso pode ser realizado de várias maneiras — por exemplo, por injeção intracraniana (cisternal ou ventricular) ou injeção na cisterna lombar. Por exemplo, a injeção intracisternal (IC) (na cisterna magna) pode ser realizada por punção suboccipital guiada por CT; ou a injeção no espaço subaracnoide pode ser realizada por meio de uma punção em Cl-2 quando viável para o paciente; ou punção lombar
(tipicamente procedimentos diagnósticos realizados a fim de coletar uma amostra de LCR) pode ser usada para acessar o LCR. Alternativamente, a administração intracerebroventricular (ICV) (uma técnica mais invasiva usada para a introdução de drogas anti-infecciosas ou anticâncer que não penetram na barreira hematoencefálica) pode ser usada para instilar os vetores recombinantes diretamente nos ventrículos do cérebro. Alternativamente, a administração intranasal pode ser usada para distribuir o vetor recombinante ao SNC. Doses que mantêm uma concentração de LCR de rHuGlyIDUA em uma Crmin de pelo menos 9,25 ug/mL ou concentrações variando de 9,25 a 277 pg/mL devem ser usadas.
[0015] As concentrações de LCR podem ser monitoradas medindo diretamente a concentração de rHuGlyIDUA no líquido LCR obtido a partir de punções occipitais ou lombares ou estimadas por extrapolação a partir de concentrações de rHuGlyIDUA detectadas no soro do paciente. Em certas modalidades, 10 ng/mL a 100 ng/mL de rHuGlyIDUA no soro é indicativo de 1 a 30 mg de rHuGlyIDUA no LCR. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém de 10 ng/mL a 100 ng/ml de rHuGlyIDUA no soro.
[0016] A título de contextualização, IDUA humana é traduzida como um polipeptídeo de 653 aminoácidos e é N-glicosilada em seis sítios potenciais (N110, N190, N336, N372, N415 e N451 representados na FIG. l. A sequência sinal é removida e o polipeptídeo é processado na forma madura em lisossomos: um precursor intracelular de 75 kDa é aparado para 72 kDa em várias horas e, eventualmente, ao longo de 4 a 5 dias, é processado para uma forma intracelular de 66 kDa. Uma forma segregada de
IDUA (76 kDa ou 82 kDa dependendo do ensaio usado) é prontamente endocitada pelas células por meio do receptor de manose-6- fosfato e similarmente processada para as formas intracelulares menores. (vide Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044- 3048; Clements et al., 1989, Biochem J. 259: 199-208; Taylor et al., 1991, Biochem J. 274: 263-268; e Zhao et al., 1997 J Biol Chem 272: 22758-22765, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência na sua totalidade).
[0017] A estrutura geral de hIDUA consiste em três domínios: os resíduos 42-396 formam um domínio de barril clássico (B/a triosefosfato isomerase (TIM); os resíduos 27-42 e 397-545 formam um domínio sanduíche B com uma hélice-alça-hélice curta (482-508); e os resíduos 546-642 formam um domínio semelhante a Ig. Os últimos dois domínios estão ligados através de uma ponte dissulfeto entre C**! e Cº””, Os domínios sanduíche À e semelhantes a Ig estão presos à primeira, sétima e oitava hélices a do barril TIM. Um grampo B (B12-813) é inserido entre a oitava fita B ea oitava hélice a do barril TIM, que inclui Nº”? N-glicosilado, que é necessário para ligação do substrato e atividade enzimática. (vide FIG. 1 e estrutura cristalina descrita em Maita et al., 2013, PNAS110: 14628-14633 e Saito et al., 2014, Mol Genet Metab 111: 107-112, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência em sua totalidade).
[0018] A invenção é baseada, em parte, nos seguintes princípios: (i) As células neuronais e gliais no SNC são células secretoras que possuem o maquinário celular para o processamento pós-tradução de proteínas secretadas — incluindo glicosilação e tirosina-O-sulfatação — processos robustos no SNC. Vide, por exemplo, Sleat et al., 2005, Proteomics 5: 1520-1532 e Sleat 1996, J Biol Chem 271: 19191-98, que descreve o glicoproteoma de manose-6-fosfato (M6P) do cérebro humano e observa que o cérebro contém mais proteínas com um número muito maior de isoformas individuais e proteínas manose-6-fosforiladas do que o encontrado em outros tecidos; e Kanan et al., 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567 e Kanan & Al-Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res. 133: 126-131, relatando a produção de glicoproteínas tirosina- sulfatadas secretadas por células neuronais, cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade para modificações pós-tradução feitas por células humanas do SNC.
(ii) A hIDUA tem seis sítios de glicosilação asparaginal ("N") identificados na FIG. 1 (N!ºFT; NICOVS; N336TT; N37º2NT; NLUSHT; Nº!RS). A N-glicosilação de Nº”? é necessária para ligação ao substrato e atividade enzimática e a manose-6-fosforilação é necessária para a absorção celular da enzima secretada e correção cruzada de células MPS I. Os sítios de glicosilação ligados a N contêm frações de carboidrato de manose complexa e alta e de manose fosforilada (FIG. 4), mas apenas a forma secretada é captada pelas células. (Myerowitz & Neufeld, 1981, acima). A abordagem de terapia gênica descrita neste documento deve resultar na secreção contínua de uma glicoproteína IDUA de 76- 82 kDa, medida por eletroforese em gel de poliacrilamida (dependendo do ensaio usado) que é 2,6-sialilada e manose-6- fosforilada. A IDUA glicosilada/fosforilada secretada deve ser captada e corretamente processada por células neurais e gliais não transduzidas no SNC.
(iii) O tráfego/a absorção celular e subcelular de proteínas lisossomais é através de M6P. É possível medir o conteúdo de M6P de uma proteína secretada, como feito em Daniele 2002 (Biochimica et Biophysica Acta 1588 (3): 203-9) para a enzima iduronato-2- sulfatase. Na presença de M6P inibitório (por exemplo, 5 mM), prevê-se que a absorção do precursor enzimático gerado por células não neuronais ou não gliais, tal como as células renais geneticamente modificadas de Daniele 2002, reduza para níveis próximos àquele das células controle, como foi mostrado em Daniele 2002. Enquanto na presença de M6P inibitório, prevê-se que a absorção de precursor enzimático gerado por células cerebrais, tal como células neuronais e gliais, permaneça em um nível alto, como foi mostrado em Daniele 2002, onde a absorção foi quatro vezes mais alta do que as células controle e comparável ao nível de atividade enzimática (ou absorção) do precursor enzimático gerado por células renais geneticamente modificadas sem a presença de M6P inibitório. Esse ensaio permite uma maneira de prever o conteúdo de M6P em um precursor enzimático gerado por células cerebrais e, particularmente, comparar o conteúdo de M6P em precursores enzimáticos gerados por diferentes tipos de células. A abordagem de terapia gênica descrita neste documento deve resultar na secreção contínua de hIDUA, que pode ser captada por células neuronais e gliais em um alto nível na presença de M6P inibitório em tal ensaio.
(iv) Além dos sítios de glicosilação ligados a N, a hIDUA contém um sítio de sulfatação de tirosina ("XY") (ADTPIY?º*NDEADPLVGWS) próximo ao domínio contendo Nº”? necessário para ligação e atividade. (Vide, por exemplo, Yang et al., 2015, Molecules 20: 2138-2164, especialmente na p. 2154, que é incorporado por referência em sua totalidade para a análise de aminoácidos em torno dos resíduos de tirosina submetidos à sulfatação de proteína tirosina As "regras" podem ser resumidas da seguinte forma: resíduos Y com E ou D entre as posições +5 e -5 de Y e onde a posição -1 de Y é um aminoácido neutro ou com carga ácida — mas não um aminoácido básico, por exemplo, R, K ou H que abole a sulfatação). Embora não pretenda estar limitado por nenhuma teoria, a sulfatação desse sítio em hIDUA pode ser crítica para a atividade, uma vez que se sabe que mutações dentro da região de sulfatação de tirosina (por exemplo, W306L) estão associadas à atividade enzimática reduzida e a doença. (Vide Maita et al., 2013, PNAS 110: 14628 nas pp. 14632-14633).
(v) A glicosilação de hIDUA por células humanas do SNC resultará na adição de glicanos que podem melhorar a estabilidade, a meia-vida e reduzir a agregação indesejada do produto transgene. Significativamente, os glicanos que são adicionados a HUGIyIDUA da invenção são N-glicanos biantenários de tipo complexo altamente processados que incluem ácido 2,6- siálico, incorporando Neu5Ac ("NANA"), mas não seu derivado hidroxilado, NeuGc (ácido N-glicolilneuramínico, isto é, “NGNA” ou “Neu5Gc”). Esses glicanos não estão presentes na laronidase, que é produzida em células CHO que não têm a 2,6- sialiltransferase necessária para fazer essa modificação pós- tradução, nem as células CHO produzem GlcNAc bissectante, embora adicionem Neu5SGc (NGNA) como ácido siálico não típico (e potencialmente imunogênico) para humanos em vez de Neu5Ac (NANA). Vide, por exemplo, Dumont et al., 2016, Critical Rev in Biotech 36 (6): 1110-1122 (Early Online pp. 1-13 na p. 5); e Hague et al., 1998 Electrophor 19: 2612-2630 (“[t]he CHO cell line is considered 'phenotypically restricted,' in terms of glycosylation, due to the lack of an a2,6-sialyl-transferase”
("[a] linhagem celular CHO é considerada 'fenotipicamente restrita', em termos de glicosilação, devido à falta de uma a2,6- sialil-transferase”)). Ademais, as células CHO também podem produzir um glicano imunogênico, o antígeno a-Gal, que reage com anticorpos anti-a-Gal presentes na maioria dos indivíduos e que, em altas concentrações, pode desencadear anafilaxia. Vide, por exemplo, Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156. O padrão de glicosilação humano da HUuGIyIDUA da invenção deve reduzir a imunogenicidade do produto transgene e melhorar a eficácia.
(vi) A sulfatação de tirosina de hIDUA — um processo pós- tradução robusto em células do SNC humano — deve resultar em processamento e atividade melhorados de produtos transgene. A significância da sulfatação de tirosina de proteínas lisossomais não foi elucidada; mas em outras proteínas mostrou aumentar a avidez de interações proteína-proteína (anticorpos e receptores) e promover o processamento proteolítico (hormônio peptídico) (Vide Moore, 2003, J Biol. Chem. 278: 24243-46; e Bundegaard et al., 1995, The EMBO J 14: 3073-79). A tirosilproteína sulfotransferase (TPST1) responsável pela sulfatação de tirosina (que pode ocorrer como uma etapa final no processamento de IDUA) é aparentemente expressa em níveis mais altos (baseado em mRNA) no cérebro (dados de expressão gênica para TPSTl podem ser encontrados, por exemplo, no EMBL-EBI Expression Atlas (Atlas de Expressão EMBL-EBI), acessível em http://www.ebi.ac.uk/gxa/home). Tal modificação pós-tradução, na melhor das hipóteses, está sub-representada na laronidase — um produto da célula CHO. Ao contrário das células do SNC humano, as células CHO não são células secretoras e têm uma capacidade limitada de sulfatação de tirosina pós-tradução. (Vide, por exemplo, Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537, especialmente a discussão na p. 1537).
(vii) A imunogenicidade de um produto transgene poderia ser induzida por vários fatores, incluindo a condição imunológica do paciente, a estrutura e as características da droga de proteína infundida, a via de administração e a duração do tratamento. Impurezas relacionadas ao processo, tais como proteína da célula hospedeira (HCP), DNA da célula hospedeira e resíduos químicos, e impurezas relacionadas ao produto, tais como degradantes de proteínas, e características estruturais, tais como glicosilação, oxidação e agregação (partículas subvisíveis), também podem aumentar a imunogenicidade, servindo como um adjuvante que potencializa a resposta imunológica. As quantidades de impurezas relacionadas ao processo e ao produto podem ser afetadas pelo processo de fabricação: cultura de células, purificação, formulação, armazenamento e manuseio, que podem afetar os produtos de IDUA fabricados comercialmente. Na terapia gênica, as proteínas são produzidas in vivo, de modo que as impurezas relacionadas ao processo não estejam presentes e os produtos proteicos provavelmente não contenham impurezas/degradantes relacionados ao produto associados a proteínas produzidas por tecnologias recombinantes, tais como agregação de proteínas e oxidação de proteínas. A agregação, por exemplo, está associada à produção e armazenamento de proteínas devido à alta concentração de proteínas, à interação da superfície com equipamentos e recipientes de fabricação e ao processo de purificação com certos sistemas tampão. Mas essas condições que promovem agregação não estão presentes quando um transgene é expresso in vivo. A oxidação, tal como a oxidação da metionina, triptofano e histidina, também está associada à produção e armazenamento de proteína, causada, por exemplo, por condições de cultura de células estressadas, contato com metal ear e impurezas em tampões e excipientes. As proteínas expressas in vivo também podem oxidar em uma condição de estresse, mas os humanos, como muitos organismos, são equipados com um sistema de defesa antioxidante, que não apenas reduz o estresse oxidativo, mas também pode reparar e/ou reverter a oxidação. Assim, as proteínas produzidas in vivo provavelmente não estarão na forma oxidada. Tanto a agregação quanto a oxidação poderiam afetar a potência, PK (depuração) e podem aumentar as preocupações com a imunogenicidade. A abordagem de terapia gênica descrita neste documento deve resultar na secreção contínua de hIDUA com uma imunogenicidade reduzida em comparação com produtos fabricados comercialmente.
[0019] Pelas razões precedentes, a produção de HuGlyIDUA deve resultar em uma molécula "biologicamente melhor" para o tratamento de MPS I realizado por meio de terapia gênica — por exemplo, administrando um vetor viral ou outro construto de expressão de DNA que codifica HUGlyIDUA para o LCR de um paciente (sujeito humano) diagnosticado com uma doença MPS I (incluindo, mas não se limitando a, Hurler, Hurler-Scheie ou Scheie) para criar um depósito permanente no SNC que forneça continuamente um produto transgene sulfatado, manose-6-fosforilado e totalmente humano e glicosilado secretado pelas células transduzidas do SNC. O produto transgene HuGlyIDUA secretado a partir do depósito para o LCR será endocitado por células no SNC, resultando em “correção cruzada” do defeito enzimático nas células receptoras MPS I.
[0020] Não é essencial que todas as moléculas de hIDUA produzidas, na abordagem de terapia gênica ou na de terapia de proteína, sejam totalmente glicosiladas e sulfatadas. Em vez disso, a população de glicoproteínas produzidas deve ter glicosilação (incluindo 2,6-sialilação e manose-6-fosforilação) e sulfatação suficientes para demonstrar eficácia. O objetivo do tratamento de terapia gênica da invenção é retardar Ou interromper a progressão da doença. A eficácia pode ser monitorada medindo a função cognitiva (por exemplo, prevenção ou redução do declínio neurocognitivo); reduções em biomarcadores de doença (tal como GAG) no LCR e/ou soro; e/ou aumento da atividade da enzima IDUA no LCR e/ou soro. Sinais de inflamação e outros eventos de segurança também podem ser monitorados.
[0021] Como um tratamento alternativo ou adicional à terapia gênica, a glicoproteina rHuGlyIDUA pode ser produzida em linhagens celulares humanas por tecnologia de DNA recombinante e a glicoproteína pode ser administrada a pacientes diagnosticados com MPS I sistemicamente e/ou no LCR para TRE). As linhagens celulares humanas que podem ser usadas para tal produção de glicoproteína recombinante incluem, mas não estão limitadas a, HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, ReNcell VM, células 293 renais embrionárias humanas (HEK293), fibrossarcoma HT-1080, HKB-11, CAP, HuH-7 e linhagens celulares retinais, PER.C6 ou RPE, para citar algumas (vide, por exemplo, Dumont et al., 2016, Critical Rev in Biotech 36 (6): 1110-1122 “Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives” ("Linhagens celulares humanas para fabricação de biofarmacêuticos: história, status e perspectivas futuras"), que é incorporado por referência em sua totalidade para uma revisão das linhagens celulares humanas que poderiam ser usadas para a produção recombinante da glicoproteína rHuGlyIDUA). Para garantir glicosilação completa, especialmente sialilação e sulfatação de tirosina, a linhagem celular usada para produção pode ser aprimorada modificando as células hospedeiras para co-expressar a-2,6-sialiltransferase (ou tanto a-2,3- quanto a-2,6-sialiltransferases) e/ou enzimas TPST-1 e TPST-2 responsáveis pela O-sulfatação de tirosina.
[0022] Embora a distribuição de rHuGlyIDUA deva minimizar as reações imunológicas, a fonte potencial mais clara de toxicidade relacionada à terapia gênica direcionada ao SNC é a geração de imunidade contra a proteína hIDUA expressa em sujeitos humanos que são geneticamente deficientes em IDUA e, portanto, potencialmente não tolerantes à proteína e/ou ao vetor usados para distribuir o transgene.
[0023] Assim, em uma modalidade preferencial, é aconselhável co-tratar o paciente com terapia de imunossupressão — especialmente ao tratar pacientes com doença grave que tenham níveis próximos de zero de IDUA (por exemplo, Hurler). Terapias de imunossupressão envolvendo um regime de tacrolimo Ou rapamicina (sirolimo), por exemplo, em combinação com ácido micofenólico ou em combinação com um corticosteroide, tal como prednisolona e/ou metilprednisolona ou outros regimes de imunossupressão usados em procedimentos de transplante de tecidos podem ser empregados. Tal tratamento de imunossupressão pode ser administrado durante o curso da terapia gênica e, em certas — modalidades, o —pré-tratamento com terapia de imunossupressão pode ser preferido. A terapia de imunossupressão pode ser continuada subsequentemente ao tratamento de terapia gênica, baseado no julgamento do médico encarregado, e pode ser posteriormente retirada quando a tolerância imunológica é induzida; por exemplo, após 180 dias.
[0024] As combinações de distribuição da HuGlyIDUA ao LCR acompanhadas pela distribuição de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos da invenção. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, simultaneamente ou subsequentemente ao tratamento de terapia gênica. Os tratamentos disponíveis para MPS I que poderiam ser combinados com a terapia gênica da invenção incluem, mas não estão limitados a, terapia de substituição enzimática usando laronidase administrada sistemicamente ou ao LCR; e/ou terapia de TCTH.
MODALIDADES ILUSTRATIVAS
1. Método para o tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS 1), compreendendo a distribuição, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de a-L-iduronidase humana recombinante (IDUA) produzida por células neuronais humanas.
2. Método para o tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS 1I, compreendendo a distribuição, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de IDUA humana recombinante produzida por células gliais humanas.
3. Método, de acordo com o parágrafo 1 ou 2, compreendendo ainda a administração de uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes ou simultaneamente com o tratamento com IDUA humana e a continuação da terapia de imunossupressão posteriormente.
4, Método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: distribuir, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma IDUA humana a2,6-sialilada.
5. Método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS 1), compreendendo: distribuir, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma IDUA humana glicosilada que não contém NeuGc detectável.
6. Método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS 1), compreendendo: distribuir, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma IDUA humana glicosilada que não contém o antígeno NeuGc e/ou a-Gal detectável; e administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes ou simultaneamente com o tratamento com IDUA humana e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente.
7. Método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS 1), compreendendo: distribuir, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de IDUA humana que contém sulfatação de tirosina.
8. Método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo administrar, ao cérebro do referido sujeito humano, um vetor de expressão que codifica a IDUA humana, em que a referida IDUA é a2,6-sialilada após a expressão do referido vetor de expressão em uma célula neuronal humana imortalizada.
9. Método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo administrar, ao cérebro do referido sujeito humano, um vetor de expressão que codifica a IDUA humana, em que a referida IDUA é glicosilada, mas não contém NeuGc detectável após expressão do referido vetor de expressão em uma célula neuronal humana imortalizada.
10. Método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS 1), compreendendo administrar, ao cérebro do referido sujeito humano, um vetor de expressão que codifica a IDUA humana, em que a referida IDUA é glicosilada, mas não contém o antígeno NeuGc e/ou a-Gal detectável após a expressão do referido vetor de expressão em uma célula neuronal humana imortalizada.
11. Método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo administrar, ao cérebro do referido sujeito humano, um vetor de expressão que codifica a IDUA humana, em que a referida IDUA é sulfatada de tirosina após a expressão do referido vetor de expressão em uma célula neuronal humana imortalizada.
12. Método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS 1), compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica a IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libere a referida IDUA contendo um glicano a2,6-sialilado.
13. Método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS 1), compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica a IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libere a IDUA humana glicosilada que não contém NeuGc detectável.
14. Método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS 1), compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica a IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libere a IDUA humana glicosilada que não contém o antígeno NeuGc e/ou a-Gal detectável.
15. Método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS 1), compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica a IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libere a referida IDUA contendo sulfatação de tirosina.
16. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 3 a 15, compreendendo ainda a administração de uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito, compreendendo a administração de uma combinação de (a) tacrolimo e ácido micofenólico, (b) rapamicina e ácido micofenólico, ou (c) tacrolimo, rapamicina e um corticosteroide, tal como prednisolona e/ou metilprednisolona ao referido sujeito antes ou simultaneamente com o tratamento com IDUA humana e continuação posterior.
17. Método, de acordo com o parágrafo 16, em que a terapia de imunossupressão é retirada após 180 dias.
18. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 17, em que a IDUA humana compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.
19. Método, de acordo com o parágrafo 18, compreendendo ainda a administração de uma terapia de imunossupressão ao referido —“sujeito, compreendendo a administração de uma combinação de (a) tacrolimo e ácido micofenólico, (b) rapamicina e ácido micofenólico, ou (c) tacrolimo, rapamicina e um corticosteroide, tal como prednisolona e/ou metilprednisolona ao referido sujeito antes ou simultaneamente com o tratamento com IDUA humana.
20. Método, de acordo com o parágrafo 19, em que a terapia de imunossupressão é retirada após 180 dias.
21. Método, de acordo com o parágrafo 12, em que a produção da referida IDUA contendo um glicano a2,6-sialilado é confirmada pela transdução de uma linhagem celular neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante em cultura de células.
22. Método, de acordo com o parágrafo 13, em que a produção da referida IDUA glicosilada que não contém NeuGc detectável é confirmada pela transdução de uma linhagem celular neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante em cultura de células.
23. Método, de acordo com o parágrafo 14, em que a produção da referida IDUA glicosilada que não contém o antígeno NeuGc e/ou a-Gal detectável é confirmada pela transdução de uma linhagem celular neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante em cultura de células.
24. Método, de acordo com o parágrafo 15, em que a produção da referida IDUA contendo sulfatação de tirosina é confirmada pela transdução de uma linhagem celular neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante em cultura de células.
25. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 21- 24, em que a produção é confirmada na presença e ausência de manose-6-fosfato.
26. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 8-15 e 21-25, ou qualquer um dos parágrafos 16-17, quando dependente direta ou indiretamente de qualquer uma das reivindicações 8- 15, em que o vetor de expressão ou vetor de expressão de nucleotídeo recombinante codifica um peptídeo sinal.
27. Método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS 1), compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica a IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libere a referida IDUA contendo um glicano a2,6-sialilado;
em que o referido vetor recombinante, quando usado para transduzir células neuronais humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA contendo um glicano a2,6-sialilado na referida cultura de células.
28. Método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS 1), compreendendo: administrar ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica a IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libere a IDUA glicosilada que não contém NeuGc detectável; em que o referido vetor recombinante, quando usado para transduzir células neuronais humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA que é glicosilada, mas não contém NeuGc detectável na referida cultura de células.
29. Método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS 1), compreendendo: administrar ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica a IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libera a IDUA glicosilada que não contém o antígeno NeuGc e/ou a-Gal detectável; em que o referido vetor recombinante, quando usado para transduzir células neuronais humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA que é glicosilada, mas não contém o antígeno NeuGc e/ou a-Gal detectável na referida cultura de células.
30. Método de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS 1), compreendendo:
administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica a IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libere a referida IDUA que contém sulfatação de tirosina; em que o referido vetor recombinante, quando usado para transduzir células neuronais humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA que é tirosina sulfatada na referida cultura de células.
31. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 27 a 30, compreendendo ainda a administração de uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito, compreendendo a administração de uma combinação de (a) tacrolimo e ácido micofenólico, (b) rapamicina e ácido micofenólico, ou (c) tacrolimo, rapamicina e um corticosteroide, tal como prednisolona e/ou metilprednisolona ao referido sujeito antes ou simultaneamente com o tratamento com IDUA humana e continuação posterior.
32. Método, de acordo com o parágrafo 31, em que a terapia de imunossupressão é retirada após 180 dias.
33. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 32, em que o sujeito humano tem menos de 3 anos de idade.
34. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 8-15 e 21-33, ou qualquer um dos parágrafos 16-20, quando dependente direta ou indiretamente de qualquer uma das reivindicações 8- 15, em que o sujeito humano tem menos de 3 anos de idade e o vetor de expressão ou vetor de expressão de nucleotídeo recombinante é administrado (por exemplo, administração IC (tal como por injeção suboccipital)) numa dose de 2 x 10º GC/g de massa cerebral, 1 x 10ºº GC/g de massa cerebral ou 5 x 10*º GC/g de massa cerebral (por exemplo, como uma dose única plana).
35. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 8-15 e 21-33, ou qualquer um dos parágrafos 16-20, quando dependente direta ou indiretamente de qualquer uma das reivindicações 8- 15, em que o sujeito humano tem menos de 3 anos de idade e o vetor de expressão ou o vetor de expressão de nucleotídeo recombinante é administrado (por exemplo, por administração IC (tal como por injeção suboccipital)) numa dose variando de 2 x“ 10º GC/g de massa cerebral a 1 x 10ºº GC/g de massa cerebral (por exemplo, como uma dose única plana).
36. Método, de acordo com qualquer um dos parágrafos 8-15 e 21-33, ou qualquer um dos parágrafos 16-20, quando dependente direta ou indiretamente de qualquer uma das reivindicações 8- 15, em que o sujeito humano tem menos de 3 anos de idade e o vetor de expressão ou o vetor de expressão de nucleotídeo recombinante é administrado (por exemplo, por administração IC (tal como por injeção suboccipital)) em uma dose variando de 1 x 10!º GC/g de massa cerebral a 5 x 10!º GC/g de massa cerebral (por exemplo, como uma dose única plana).
4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0025] FIG. 1. A sequência de aminoácidos da IDUA humana. Seis sítios de glicosilação ligados a N (N) estão em negrito e sublinhados; um sítio de O-sulfatação de tirosina (Y) está em negrito e sublinhado, e a sequência de sítio de sulfatação completa (ADTPIYNDEADPLVGWS) está sombreada; e uma ligação dissulfeto (dois resíduos de cisteína; C) está em negrito e sublinhada. O terminal N do produto recombinante secretado feito em células CHO é Aº, enquanto o terminal N da enzima intracelular nativa do fígado humano é E” (Vide Kakkis et al., 1994, Prot Exp Purif 5: 225-232, na p. 230).
[0026] FIG. 2. Alinhamento de sequência múltipla de hIDUA com ortólogos conhecidos. As sequências foram alinhadas usando Clustal X ver.2 (Larkin MA, et al., 2007, Clustal W and Clustal xXx version 2.0 (Clustal W e Clustal X versão 2.0). Bioinformatics 23(21): 2947-2948). Os nomes das espécies e IDs de proteínas são os seguintes: humano (Homo sapiens; NP 000194.2), cachorro (Canis familiaris; M81893.1), vaca (Bos taurus; XP 002688492.1), camundongo (Mus musculus; NP 032351.2), rato (Rattus norvegicus; NP 001165555.1), ornitorrinco (Ornithorhynchus anatinus; XP 001514102.2), frango (Gallus gallus; NP 001026604.1), Xenopus (Xenopus laevis; NP 001087031.1), peixe-zebra (Danio rerio, XP 001923689.3), ouriço do mar (Strongylocentrotus purpuratus; XP 796813.3), ciona (Ciona intestinalis; XP 002120937.1) e mosca-das-frutas (Drosophila melanogaster; NP 609489.1). O sítio de N-glicosilação na proteína humana (N110, N190, N336, N372, T374, N415, N451); os resíduos envolvidos na ligação do substrato (R89, H91, N181, E182, H262, K264, E299, D349 e R363) e a interação com o N-glicano em N372 (P54, H58, W306, S307, Y355, R368 e 0370) são indicados por sombreamento. (Adaptado a partir de: Maita et al., 2013, PNAS 110: 14628-14633; Material Suplementar, Fig. S8).
[0027] FIG. 3. Mutações de MPS I, mudanças estruturais em IDUA e fenótipos. (De Saito et al., Mol Genet Metab 111: 107- 112, Tabela 3).
[0028] FIG. 4, Oligossacarídeos nos seis sítios de glicosilação de a-L-iduronidase humana recombinante secretada por células CHO. C, complexo; M, alta manose; P, alta manose fosforilada. As letras maiúsculas denotam oligossacarídeos principais bem identificados, enquanto as letras minúsculas denotam componentes secundários ou incompletamente caracterizados. (De, Zhao et al., 1997, J Biol Chem 272: 22758- 22765).
[0029] FIG. 5. Alinhamento de Sequência Múltipla Clustal de capsídeos AAV 1 - 9 (SEQ ID NOs: 16-26). As substituições de aminoácidos (mostradas em negrito nas linhas de baixo) podem ser feitas nos capsídeos AAV9 e AAV8 por "recrutamento" de resíduos de aminoácidos a partir da posição correspondente de outros capsídeos AAV alinhados. Regiões de sequência designadas por “HVR” = regiões hipervariáveis.
5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0030] À invenção envolve a distribuição de uma a-L- iduronidase (HuGlylDUA) totalmente humana e glicosilada (HuGly) ao líquido cefalorraquidiano (LCR) do sistema nervoso central de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS 1), incluindo, mas não limitado a, pacientes diagnosticados com síndrome de Hurler, Hurler-Scheie ou Scheie. Em uma modalidade preferencial, o tratamento é realizado por meio de terapia gênica — por exemplo, administrando um vetor viral ou outro construto de expressão de DNA que codifica IDUA humana (hIDUA), ou um derivado de hIDUA, ao LCR de um paciente (sujeito humano) diagnosticado com MPS I, de modo que um depósito permanente de células transduzidas seja gerado, o qual fornece continuamente o produto transgene totalmente humano e glicosilado ao SNC. A HuUuGlIyIDUA secretada a partir do depósito para o LCR será endocitada por células no SNC, resultando em “correção cruzada” do defeito enzimático nas células receptoras. Em uma modalidade alternativa, a HUGlIyIDUA pode ser produzida em cultura de células e administrada como uma terapia de reposição enzimática ("TRE"), por exemplo, injetando a enzima. No entanto, a abordagem de terapia gênica oferece várias vantagens em relação à TRE — distribuição sistêmica da enzima não resultará no tratamento do SNC porque a enzima não pode cruzar a barreira hematoencefálica; e, ao contrário da abordagem de terapia gênica da invenção, a distribuição direta da enzima ao SNC exigiria injeções repetidas que não só são onerosas, mas também representam um risco de infecção.
[0031] A HUGIyIDUA codificada pelo transgene pode incluir, mas não está limitada a, IDUA humana (hIDUA) com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 (como mostrado na FIG. 1) e derivados de hIDUA com substituições, deleções ou adições de aminoácidos, por exemplo, incluindo, mas não se limitando a, substituições de aminoácidos selecionados a partir de resíduos não conservados correspondentes em ortólogos de IDUA mostrados na FIG. 2, com a condição de que tais mutações não incluam nenhuma que tenha sido identificada em fenótipos de MPS I grave, grave-intermediária, intermediária ou atenuada mostrados na FIG. 3 (a partir de Saito et al., 2014, Mol Genet Metab 111: 107-112, Table 3 listing 57 MPS I mutations (Tabela 3 listando 57 mutações de MPS I), que é incorporado a este documento por referência em sua totalidade); ou relatado por Venturi et al., 2002, Human Mutation t522 Online ("Venturi 2002"), ou Bertola et al., 2011 Human Mutation 32: E2189-E2210 ("Bertola 2011"), cada um dos quais é incorporado a este documento por referência em sua totalidade.
[0032] Por exemplo, as substituições de aminoácidos em uma posição particular de hIDUA podem ser selecionadas a partir dos resíduos de aminoácidos não conservados correspondentes encontrados naquela posição nos ortólogos de IDUA representados na FIG. 2 (mostrando o alinhamento de ortólogos como relatou Maita et al., 2013, PNAS 110:14628, Fig.
S8, que é incorporado a este documento por referência em sua totalidade), com a condição de que tais substituições não incluam nenhuma das mutações deletérias mostradas na FIG. 3 ou relatadas em Venturi 2002 ou Bertola 2011 acima.
O produto transgene resultante pode ser testado usando ensaios convencionais in vitro, em cultura de células ou animais de teste para garantir que a mutação não perturbe o funcionamento da IDUA.
As substituições, deleções ou adições de aminoácidos preferíveis devem ser aquelas que mantêm ou aumentam a atividade enzimática, estabilidade ou meia-vida de IDUA, como testado por ensaios convencionais in vitro, em cultura de células ou modelos animais para MPS IL.
Por exemplo, a atividade enzimática do produto transgene pode ser avaliada usando um ensaio de enzimas convencional com 4-metilumbeliferil a-L-iduronida como substrato (vide, por exemplo, Hopwood et al., 1979, Clin Chim Acta 92: 257-265; Clements et al., 1985, Eur J Biochem 152: 21-28; e Kakkis et al., 1994, Prot Exp Purif 5: 225-232 para ensaios de enzimas IDUA exemplares que podem ser usados, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência em sua totalidade). A capacidade do produto transgene de corrigir fenótipos de MPS I pode ser avaliada em cultura de células; por exemplo, transduzindo células MPS I em cultura com um vetor viral ou outro construto de expressão de DNA que codifica hIDUA ou um derivado; adicionando a rHuGlyIDUA ou um derivado às células MPS I em cultura; ou co-cultivando células MPS I com células hospedeiras humanas modificadas para expressar e secretar rHuGlyIDUA ou um derivado e determinando a correção do defeito nas células cultivadas MPS I, por exemplo, detectando a atividade da enzima IDUA e/ou a redução no armazenamento de GAG nas células MPS I em cultura (vide, por exemplo, Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044-3048; e Anson et al. 1992, Hum Gene Ther 3: 371-379, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência em sua totalidade).
[0033] Modelos animais para MPS I foram descritos para camundongos (vide, por exemplo, Clarke et al., 1997, Hum Mol Genet 6(4): 503-511), o gato doméstico de pelo curto (vide, por exemplo, Haskins et al., 1979, Pediatr Res 13(11): 1294-97) e várias raças de cães (vide, por exemplo, Menon et al., 1992, Genomics 14 (3): 763-768; Shull et al., 1982, Am J Pathol 109 (2): 244-248). O modelo MPS I em cães se assemelha à síndrome de Hurler, a forma mais grave de MPS I, uma vez que a mutação da IDUA não resulta em nenhuma proteína detectável. Alta homologia gênica entre proteínas IDUA (vide alinhamento na FIG. 2) significa que hIDUA é funcional em animais e os tratamentos abrangendo hIDUA podem ser testados nesses modelos animais.
[0034] Preferencialmente, o transgene rHuGlyIDUA deve ser controlado por elementos de controle de expressão que funcionam em neurônios e/ou células gliais, por exemplo, o promotor CB7 (um promotor de fB-actina de frango e potenciador de CMV), e pode incluir outros elementos de controle de expressão que potencializam a expressão do transgene conduzido pelo vetor (por exemplo, íntron de B-actina de frango e sinal poli A de B-globina de coelho). O construto de cDNA para o transgene huIDUA deve incluir uma sequência de codificação para um peptídeo sinal que garanta o processamento adequado de co- e pós-tradução (glicosilação e sulfatação de proteína) pelas células transduzidas do SNC. Tais peptídeos sinal usados por células do SNC podem incluir, mas não estão limitados a: * Peptídeo sinal de glicoproteína de oligodendrócito- mielina (hOMG): MEYQILKMSLCLFILLFLTPGILC (SEQ ID NO: 2) * Repressor celular de peptídeo sinal de genes estimulados por E1lA 2 (hCREG2): MSVRRGRRPARPGTRLSWLLCCSALLSPAAG (SEQ ID NO: 3) * Conjunto de V e domínio transmembranar contendo peptídeo sinal 2B (hvSTM2B): MEQRNRLGALGYLPPLLLHALLLEVADA (SEQ ID NO: 4) * Peptídeo sinal de protocaderina alfa-l1 (hPCADHAIL): MVFSRRGGLGARDLLLWLLLLAAWEVGSG (SEQ ID NO: 5) * Peptídeo sinal FAMI9Al (TAFAL): MAMVSAMSWVLYLWISACA (SEQ ID NO: 6) * Peptídeo sinal de interleucina-2: MYRMOLLSCIALILALVTNS (SEQ ID NO: 14) Os peptídeos sinal também podem ser referidos neste documento como sequências líderes ou peptídeos líderes.
[0035] O vetor recombinante usado para distribuir o transgene deve ter um tropismo para células no SNC, incluindo, mas não limitado a neurônios e/ou células gliais. Tais vetores podem incluir vetores de vírus adeno-associados recombinantes não replicantes ("rAAV"), particularmente aqueles portando um capsídeo AAV9 ou AAVrhl10 são preferíveis. Os capsídeos variantes AAV podem ser usados, incluindo, mas não limitados a, aqueles descritos por Wilson na Patente US Nº 7.906.111, que é incorporada a este documento por referência em sua totalidade, com AAV/hu.31 e AAV/hu.32 sendo particularmente preferíveis; bem como capsídeos variantes AAV descritos por Chatterjee na Patente US Nº 8.628.966, Patente US Nº 8.927.514 e Smith et al., 2014, Mol Ther 22: 1625-1634, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência em sua totalidade. No entanto, outros vetores virais podem ser usados, incluindo, mas não se limitando a vetores lentivirais, vetores virais de vaccinia ou vetores de expressão não virais referidos como construtos de "DNA nu" (vide Seção 5.2).
[0036] Composições farmacêuticas adequadas para administração ao LCR compreendem uma suspensão do vetor rHuGlyIDUA em um tampão de formulação compreendendo um tampão aquoso fisiologicamente compatível, um surfactante e excipientes opcionais. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para administração intracisternal (injeção na cisterna magna). Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para injeção no espaço subaracnoide por meio de uma punção em C1l-2. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para administração intratecal. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para administração intracerebroventricular. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas são adequadas para administração por meio de punção lombar.
[0037] Doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante devem ser administradas ao LCR por meio de administração intratecal (isto é, injeção no espaço subaracnoide de modo que os vetores recombinantes se distribuam através do LCR e transduzam células no SNC). Isso pode ser realizado de várias maneiras — por exemplo, por injeção intracraniana (cisternal ou ventricular) ou injeção na cisterna lombar. Por exemplo, a injeção intracisternal (IC) (na cisterna magna) pode ser realizada por punção suboccipital guiada por CT; ou a injeção no espaço subaracnoide pode ser realizada por meio de uma punção em Cl-2 quando viável para o paciente; ou punção lombar (tipicamente procedimentos diagnósticos realizados a fim de coletar uma amostra de LCR) pode ser usada para acessar o LCR. Alternativamente, a administração intracerebroventricular (ICV) (uma técnica mais invasiva usada para a introdução de drogas anti-infecciosas ou anticâncer que não penetram na barreira hematoencefálica) pode ser usada para instilar os vetores recombinantes diretamente nos ventrículos do cérebro. Alternativamente, a administração intranasal pode ser usada para distribuir o vetor recombinante ao SNC. Doses que mantêm uma concentração de LCR de rHuGlyIDUA em uma Crmin de pelo menos 9,25 ug/mL ou concentrações variando de 9,25 a 277 pg/mL devem ser usadas.
[0038] As concentrações de LCR podem ser monitoradas medindo diretamente a concentração de rHuGlyIDUA no líquido LCR obtido a partir de punções occipitais ou lombares ou estimadas por extrapolação a partir de concentrações de rHuGlyIDUA detectadas no soro do paciente. Em certas modalidades, 10 ng/mL a 100 ng/mL de rHuGlyIDUA no soro é indicativo de 1 a 30 mg de rHuGlyIDUA no LCR. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém de 10 ng/mL a 100 ng/ml de rHuGlyIDUA no soro.
[0039] A título de contextualização, IDUA humana é traduzida como um polipeptídeo de 653 aminoácidos e é N-glicosilada em seis sítios potenciais (N110, N190, N336, N372, N415 e N451) representados na FIG. l. A sequência sinal é removida e o polipeptídeo é processado na forma madura em lisossomos: um precursor intracelular de 75 kDa é aparado para 72 kDa em várias horas e, eventualmente, ao longo de 4 a 5 dias, é processado para uma forma intracelular de 66 kDa. Uma forma segregada de IDUA (76 kDa ou 82 kDa, dependendo do ensaio usado) é prontamente endocitada pelas células por meio do receptor de manose-6- fosfato e similarmente processada para as formas intracelulares menores. (Vide Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044- 3048; Clements et al., 1989, Biochem J. 259: 199-208; Taylor et al., 1991, Biochem J. 274: 263-268; e Zhao et al., 1997 J Biol Chem 272: 22758-22765, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência na sua totalidade).
[0040] A estrutura geral de hIDUA consiste em três domínios: os resíduos 42-396 formam um domínio de barril clássico (B/a) triosefosfato isomerase (TIM); os resíduos 27-42 e 397-545 formam um domínio sanduíche B com uma hélice-alça-hélice curta (482-508); e os resíduos 546-642 formam um domínio semelhante a Ig. Os últimos dois domínios estão ligados através de uma ponte dissulfeto entre C**! e Cº””, Os domínios sanduíche À e semelhantes a Ig estão presos à primeira, sétima e oitava hélices a do barril TIM. Um grampo B (B12-813) é inserido entre a oitava fita B ea oitava hélice a do barril TIM, que inclui Nº”? N-glicosilado, que é necessário para ligação do substrato e atividade enzimática. (Vide FIG. 1 e estrutura cristalina descrita em Maita et al.,
2013, PNAS 110: 14628-14633 e Saito et al., 2014, Mol Genet Metab 111: 1107-112 cada um dos quais é incorporado a este documento por referência em sua totalidade).
[0041] A invenção é baseada, em parte, nos seguintes princípios: (i) As células neuronais e gliais no SNC são células secretoras que possuem o maquinário celular para o processamento pós-tradução de proteínas secretadas — incluindo glicosilação e O-sulfatação de tirosina — processos robustos no SNC. Vide, por exemplo, Sleat et al., 2005, Proteomics 5: 1520-1532 e Sleat 1996, J Biol Chem 271: 19191-98, que descreve o glicoproteoma de manose-6-fosfato (M6P) do cérebro humano e observa que o cérebro contém mais proteínas com um número muito maior de isoformas individuais e proteínas manose-6-fosforiladas do que o encontrado em outros tecidos; e Kanan et al., 2009, Exp. Eye Res. 89: 559-567 e Kanan & Al-Ubaidi, 2015, Exp. Eye Res. 133: 126-131, relatando a produção de glicoproteínas sulfatadas de tirosina secretadas por células neuronais, cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade para modificações pós-tradução feitas por células humanas do SNC.
(ii) hIDUA tem seis sítios de glicosilação asparaginal ("N") identificados na FIG. 1 (NUºFT; NICVS; N33ºTT; N3NT; NÍVHT; Nº!RS). A N-glicosilação de Nº”? é necessária para ligação ao substrato e atividade enzimática e a manose-6-fosforilação é necessária para a absorção celular da enzima secretada e correção cruzada de células MPS I. Os sítios de glicosilação ligados a N contêm frações de carboidrato de manose complexa e alta e de manose fosforilada (FIG. 4), mas apenas a forma secretada é captada pelas células. (Myerowitz & Neufeld, 1981, acima). A abordagem de terapia gênica descrita neste documento deve resultar na secreção contínua de uma glicoproteína IDUA de 76- 82 kDa, medida por eletroforese em gel de poliacrilamida (dependendo do ensaio usado) que é 2,6-sialilada e manose-6- fosforilada. A IDUA glicosilada/fosforilada secretada deve ser captada e corretamente processada por células neurais e gliais não transduzidas no SNC.
(iii) O tráfego/a absorção celular e subcelular de proteínas lisossomais é através de M6P. É possível medir o conteúdo de M6P de uma proteína secretada, como feito em Daniele 2002 para a enzima iduronato-2-sulfatase. Na presença de M6P inibitório (por exemplo, 5 mM), prevê-se que a absorção do precursor enzimático gerado por células não neuronais ou não gliais, tais como as células renais geneticamente modificadas de Daniele 2002, reduza para níveis próximos àquele das células controle, como foi mostrado em Daniele 2002. Enquanto na presença de M6P inibitório, prevê-se que a absorção de precursor enzimático gerado por células cerebrais, tais como células neuronais e gliais, permaneça em um nível alto, como foi mostrado em Daniele 2002, onde a absorção foi quatro vezes mais alta do que as células controle e comparável ao nível de atividade enzimática (ou absorção) de precursor enzimático gerado por células renais geneticamente modificadas sem a presença de M6P inibitório. Esse ensaio permite uma maneira de prever o conteúdo de M6P em um precursor enzimático gerado por células cerebrais e, particularmente, comparar o conteúdo de M6P em precursores enzimáticos gerados por diferentes tipos de células. A abordagem de terapia gênica descrita neste documento deve resultar na secreção contínua de hIDUA, que pode ser captada por células neuronais e gliais em um alto nível na presença de M6P inibitório em tal ensaio.
(iv) Além dos sítios de glicosilação ligados a N, hIDUA contém um sítio de sulfatação de tirosina ("XY") (ADTPIY?º*NDEADPLVGWS) próximo ao domínio contendo Nº”? necessário para ligação e atividade. (Vide, por exemplo, Yang et al., 2015, Molecules 20: 2138-2164, especialmente na p. 2154, que é incorporado por referência em sua totalidade para a análise de aminoácidos em torno dos resíduos de tirosina submetidos à sulfatação de proteína tirosina. As "regras" podem ser resumidas da seguinte forma: resíduos Y com E ou D entre as posições +5 e -5 de Y e onde a posição -1 de Y é um aminoácido neutro ou com carga ácida — mas não um aminoácido básico, por exemplo, R, K ou H que abole a sulfatação). Embora não pretenda estar limitado por nenhuma teoria, a sulfatação desse sítio em hIDUA pode ser crítica para a atividade, uma vez que se sabe que mutações dentro da região de sulfatação de tirosina (por exemplo, W306L) estão associadas à atividade enzimática reduzida e a doença. (Vide Maita et al., 2013, PNAS 110: 14628 nas pp. 14632-14633).
(v) A glicosilação de hIDUA por células humanas do SNC resultará na adição de glicanos que podem melhorar a estabilidade, a meia-vida e reduzir a agregação indesejada do produto transgene. Significativamente, os glicanos que são adicionados à HuGlyIDUA da invenção são N-glicanos biantenários de tipo complexo altamente processados que incluem ácido 2,6- siálico, incorporando Neu5Ac ("NANA"), mas não seu derivado hidroxilado, NeuGc (ácido N-glicolilneuramínico, isto é , “NGNA” ou “Neu5Gc”). Esses glicanos não estão presentes na laronidase, que é produzida em células CHO que não têm a 2,6-
sialiltransferase necessária para fazer essa modificação pós- tradução, nem as células CHO produzem GlcNAc bissectante, embora adicionem Neu5SGc (NGNA) como ácido siálico não típico (e potencialmente imunogênico) para humanos em vez de Neu5Ac (NANA). Vide, por exemplo, Dumont et al., 2016, Critical Rev in Biotech 36 (6): 1110-1122 (Early Online pp. 1-13 na p. 5); e Hague et al., 1998 Electrophor 19: 2612-2630 (“[t]he CHO cell line is considered 'phenotypically restricted,' in terms of glycosylation, due to the lack of an a2,6-sialyl-transferase” ("[a] linhagem celular CHO é considerada 'fenotipicamente restrita', em termos de glicosilação, devido à falta de uma a2,6- sialil-transferase")). Ademais, as células CHO também podem produzir um glicano imunogênico, o antígeno a-Gal, que reage com anticorpos anti-a-Gal presentes na maioria dos indivíduos e que, em altas concentrações, pode desencadear anafilaxia. Vide, por exemplo, Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156. O padrão de glicosilação humano da HUuGIyIDUA da invenção deve reduzir a imunogenicidade do produto transgene e melhorar a eficácia.
(vi) A sulfatação de tirosina de hIDUA — um processo pós- tradução robusto em células do SNC humano — deve resultar em processamento e atividade melhorados de produtos transgene. A significância da sulfatação de tirosina de proteínas lisossomais não foi elucidada; mas em outras proteínas mostrou aumentar a avidez de interações proteína-proteína (anticorpos e receptores) e promover o processamento proteolítico (hormônio peptídico). (Vide Moore, 2003, J Biol. Chem. 278: 24243-46; e Bundegaard et al., 1995, The EMBO J 14: 3073-79). A tirosilproteína sulfotransferase (TPST1) responsável pela sulfatação de tirosina (que pode ocorrer como uma etapa final no processamento de IDUA)
é aparentemente expressa em níveis mais altos (baseado em mRNA) no cérebro (dados de expressão gênica para TPSTl podem ser encontrados, por exemplo, no EMBL-EBI Expression Atlas (Atlas de Expressão EMBL-EBI), acessível em http://www.ebi.ac.uk/gxa/home). Tal modificação pós-tradução, na melhor das hipóteses, está sub-representada na laronidase — um produto da célula CHO. Ao contrário das células do SNC humano, as células CHO não são células secretoras e têm uma capacidade limitada de sulfatação de tirosina pós-tradução. (Vide, por exemplo, Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537, especialmente a discussão na p. 1537).
(vii) A imunogenicidade de um produto transgene poderia ser induzida por vários fatores, incluindo a condição imunológica do paciente, a estrutura e as características da droga de proteína infundida, a via de administração e a duração do tratamento. Impurezas relacionadas ao processo, tais como proteína da célula hospedeira (HCP), DNA da célula hospedeira e resíduos químicos, e impurezas relacionadas ao produto, tais como degradantes de proteínas, e características estruturais, tais como glicosilação, oxidação e agregação (partículas subvisíveis), também podem aumentar a imunogenicidade, servindo como um adjuvante que potencializa a resposta imunológica. As quantidades de impurezas relacionadas ao processo e ao produto podem ser afetadas pelo processo de fabricação: cultura de células, purificação, formulação, armazenamento e manuseio, que podem afetar os produtos IDUA fabricados comercialmente. Na terapia gênica, as proteínas são produzidas in vivo, de modo que as impurezas relacionadas ao processo não estejam presentes e os produtos de proteína provavelmente não contenham impurezas/degradantes relacionados ao produto associados a proteínas produzidas por tecnologias recombinantes, tais como agregação de proteínas e oxidação de proteínas. A agregação, por exemplo, está associada à produção e armazenamento de proteínas devido à alta concentração de proteínas, à interação da superfície com equipamento e recipientes de fabricação e ao processo de purificação com certos sistemas tampão. Mas essas condições que promovem agregação não estão presentes quando um transgene é expresso in vivo. Oxidação, tal como a oxidação da metionina, triptofano e histidina, também está associada à produção e armazenamento de proteína, causados, por exemplo, por condições de cultura de células estressadas, contato de metal e ar e impurezas em tampões e excipientes. As proteínas expressas in vivo também podem oxidar em uma condição estressada, mas os humanos, como muitos organismos, são equipados com um sistema de defesa antioxidante, que não apenas reduz o estresse oxidativo, mas também pode reparar e/ou reverter a oxidação. Assim, as proteínas produzidas in vivo provavelmente não estarão na forma oxidada. Tanto a agregação quanto a oxidação poderiam afetar a potência, PK (depuração) e podem aumentar as preocupações com a imunogenicidade. A abordagem de terapia gênica descrita neste documento deve resultar na secreção contínua de hIDUA com uma imunogenicidade reduzida em comparação com produtos fabricados comercialmente.
[0042] Pelas razões precedentes, a produção de HuGlyIDUA deve resultar em uma molécula "biologicamente melhor" para o tratamento de MPS I realizado por meio de terapia gênica — por exemplo, administrando um vetor viral ou outro construto de expressão de DNA que codifica HUGlyIDUA para o LCR de um paciente
(sujeito humano) diagnosticado com uma doença MPS I (incluindo, mas não se limitando a Hurler, Hurler-Scheie ou Scheie) para criar um depósito permanente no SNC que forneça continuamente um produto transgene sulfatado, manose-6-fosforilado e totalmente humano e glicosilado secretado pelas células transduzidas do SNC. O produto transgene HuGlyIDUA secretado a partir do depósito para o LCR será endocitado por células no SNC, resultando em “correção cruzada” do defeito enzimático nas células receptoras MPS I.
[0043] Não é essencial que todas as moléculas de hIDUA produzidas, na abordagem de terapia gênica ou na de terapia de proteína, sejam totalmente glicosiladas e sulfatadas. Em vez disso, a população de glicoproteínas produzidas deve ter glicosilação (incluindo 2,6-sialilação e manose-6-fosforilação) e sulfatação suficientes para demonstrar eficácia. O objetivo do tratamento de terapia gênica da invenção é retardar Ou interromper a progressão da doença. A eficácia pode ser monitorada medindo a função cognitiva (por exemplo, prevenção ou redução do declínio neurocognitivo); reduções em biomarcadores de doença (tal como GAG) no LCR e/ou soro; e/ou aumento da atividade da enzima IDUA no LCR e/ou soro. Sinais de inflamação e outros eventos de segurança também podem ser monitorados.
[0044] Como um tratamento alternativo ou adicional à terapia gênica, a glicoproteína rHuGlyIDUA pode ser produzida em linhagens celulares humanas por tecnologia de DNA recombinante e a glicoproteina pode ser administrada a pacientes diagnosticados com MPS I sistemicamente e/ou no LCR para TRE). As linhagens celulares humanas que podem ser usadas para tal produção de glicoproteína recombinante incluem, mas não estão limitadas a, HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, ReNcell VM, células 293 renais embrionárias humanas (HEK293), fibrossarcoma HT-1080, HKB-11, CAP, HuH-7 e linhagens celulares retinais, PER.C6 ou RPE, para citar alguns (vide, por exemplo, Dumont et al., 2016, Critical Rev in Biotech 36 (6): 1110-1122 “Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives” ("Linhagens celulares humanas para fabricação de biofarmacêuticos: história, status e perspectivas futuras"), que é incorporado por referência em sua totalidade para uma revisão das linhagens celulares humanas que poderiam ser usadas para a produção recombinante da glicoproteína rHuGlyIDUA). Para garantir glicosilação completa, especialmente sialilação e sulfatação de tirosina, a linhagem celular usada para produção pode ser aprimorada modificando as células hospedeiras para co-expressar a-2,6-sialiltransferase (ou tanto a-2,3- quanto a-2,6-sialiltransferases) e/ou enzimas TPST-1 e TPST-2 responsáveis pela O-sulfatação de tirosina.
[0045] Embora a distribuição de rHuGlyIDUA deva minimizar as reações imunológicas, a fonte potencial mais clara de toxicidade relacionada à terapia gênica direcionada ao SNC é a geração de imunidade contra a proteína hIDUA expressa em sujeitos humanos que são geneticamente deficientes em IDUA e, portanto, potencialmente não tolerantes à proteína e/ou ao vetor usados para distribuir o transgene.
[0046] Assim, em uma modalidade preferencial, é aconselhável co-tratar o paciente com terapia de imunossupressão — especialmente ao tratar pacientes com doença grave que têm níveis próximos de zero de IDUA (por exemplo, Hurler). Terapias de imunossupressão envolvendo um regime de tacrolimo ou rapamicina
(sirolimo), por exemplo, em combinação com ácido micofenólico e/ou em combinação com corticosteroides, tal como prednisolona e/ou metilprednisolona ou outros regimes de imunossupressão usados em procedimentos de transplante de tecidos podem ser empregados. Tal tratamento de imunossupressão pode ser administrado durante o curso da terapia gênica e, em certas modalidades, o pré-tratamento com terapia de imunossupressão pode ser preferido. A terapia de imunossupressão pode ser continuada subsequentemente ao tratamento de terapia gênica, baseado no julgamento do médico encarregado, e pode ser posteriormente retirada quando a tolerância imunológica for induzida; por exemplo, após 180 dias.
[0047] En uma modalidade, a imunossupressão compreende a administração de um corticosteroide, tal como prednisolona e/ou metilprednisolona e um regime de tacrolimo e/ou sirolimo, opcionalmente administrado com MMF. Por exemplo, uma injeção de um corticosteroide tal como a metilprednisolona é injetada, seguida pela administração de um corticosteroide oral que é gradualmente diminuído ao longo de 12 semanas e então descontinuado. Simultaneamente, tacrolimo e sirolimo podem ser administrados por via oral em combinação em uma dose baixa (por exemplo, mantendo a concentração sérica de 4 a 8 ng/mL), ou sozinhos na dose recomendada, ao longo de 24 a 48 semanas. O tacrolimo ou sirolimo também podem ser administrados na dose recomendada em combinação com MMF. Assim, o paciente recebe uma injeção inicial de um esteroide, que está disponível imediatamente, tal esteroide é então mantido através de administração oral e diminuído gradualmente por 12 semanas. Imunossupressão adicional por 48 semanas é mantida com tacrolimo e/ou sirolimo, opcionalmente em combinação com MMF.
[0048] As combinações de distribuição da HuGlyIDUA ao LCR acompanhadas pela distribuição de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos da invenção. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, simultaneamente ou subsequentemente ao tratamento de terapia gênica. Os tratamentos disponíveis para MPS I que poderiam ser combinados com a terapia gênica da invenção incluem, mas não estão limitados a, terapia de substituição enzimática usando laronidase administrada sistemicamente ou ao LCR; e/ou terapia de TCTH.
[0049] Em certas modalidades, está descrito neste documento um método para o tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo a distribuição, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de IDUA humana recombinante produzida por células neuronais humanas. Em certas modalidades, está descrito neste documento um método para o tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS 1, compreendendo a distribuição, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de IDUA humana recombinante produzida por células gliais humanas.
[0050] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I), compreendendo: administrar ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma a-L-iduronidase (IDUA) humana a2,6-sialilada; e administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes ou simultaneamente ao tratamento com IDUA humana e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente.
[0051] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: distribuir ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma IDUA humana glicosilada que não contém NeuGc detectável; e administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes ou simultaneamente ao tratamento com IDUA humana e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente.
[0052] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: a distribuição, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma IDUA humana glicosilada que não contém antígeno NeuGc e/ou a-Gal detectável; e administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes Ou simultaneamente ao tratamento com IDUA humana e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente.
[0053] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: distribuir ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de IDUA humana glicosilada que contenha sulfatação de tirosina; e administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes ou simultaneamente ao tratamento com IDUA humana e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente.
[0054] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar ao cérebro do referido sujeito humano um vetor de expressão que codifica IDUA humana, em que a referida IDUA é a2,6-sialilada após a expressão do referido vetor de expressão em uma célula neuronal humana imortalizada; e
[0055] administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes ou simultaneamente à administração do vetor de expressão e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente.
[0056] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar ao cérebro do referido sujeito humano um vetor de expressão que codifica IDUA humana, em que a referida IDUA é glicosilada, mas não contém NeuGc detectável após a expressão do referido vetor de expressão em uma célula neuronal humana imortalizada; e administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes ou simultaneamente à administração do vetor de expressão e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente.
[0057] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: etapa a) administrar ao cérebro do referido sujeito humano um vetor de expressão que codifica IDUA humana, em que a referida IDUA humana é glicosilada, mas não contém antígeno NeuGc e/ou a-Gal detectável após a expressão do referido vetor de expressão em um humano ou em uma célula neuronal imortalizada; e etapa Db) administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes e/ou simultaneamente e/ou após a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente.
[0058] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar ao cérebro do referido sujeito humano um vetor de expressão que codifica IDUA humana, em que a referida IDUA é sulfatada de tirosina após a expressão do referido vetor de expressão em uma célula neuronal humana imortalizada; e administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes ou simultaneamente à administração do vetor de expressão e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente.
[0059] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libere a referida IDUA contendo um glicano a2,6- sialilado; e administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes ou simultaneamente com a administração do vetor de expressão e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente.
[0060] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que seja formado um depósito que libere IDUA humana glicosilada que não contenha NeuGc detectável; e administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes ou simultaneamente à administração do vetor de expressão e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente.
[0061] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que é formado um depósito que libera IDUA humana glicosilada que não contém antígeno NeuGc e/ou a-Gal detectável; e administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes ou simultaneamente à administração do vetor de expressão e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente.
[0062] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que é formado um depósito que libera a referida IDUA contendo uma sulfatação de tirosina; e administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes ou simultaneamente à administração do vetor de expressão e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente.
[0063] Em certas modalidade, a produção da referida IDUA contendo um glicano a2,6-sialilado é confirmada pela transdução de uma linhagem celular neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante em cultura de células. Em certas modalidades, a produção da referida IDUA glicosilada que não contém NeuGc detectável é confirmada pela transdução de uma linhagem celular neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante em cultura de células. Em certas modalidades, a produção da referida IDUA glicosilada que não contém antígeno NeuGc e/ou a-Gal detectável é confirmada pela transdução de uma linhagem celular neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante em cultura de células. Em certas modalidade, a produção da referida IDUA contendo uma sulfatação de tirosina é confirmada pela transdução de uma linhagem celular neuronal humana com o referido vetor de expressão de nucleotídeo recombinante em cultura de células. Em modalidades específicas, o transgene IDUA codifica um peptídeo sinal. Em certas modalidades, a linhagem celular neuronal humana é HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11 ou ReNcell VM.
[0064] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que é formado um depósito que libera a referida IDUA contendo um glicano a2,6- sialilado; e administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes ou simultaneamente à administração do vetor de expressão e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente; em que o referido vetor recombinante, quando usado para transduzir células neuronais humanas em cultura resulta na produção da referida IDUA contendo o referido glicano a2,6-sialilado na referida cultura de células. Em certas modalidades, as células neuronais humanas são HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11 ou células ReNcell VM.
[0065] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que é formado um depósito que libera IDUA glicosilada que não contém NeuGc detectável; e administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes ou simultaneamente à administração do vetor de expressão e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente; em que o referido vetor recombinante, quando usado para transduzir células neuronais humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA que é glicosilada, mas não contém NeuGc detectável na referida cultura de células. Em certas modalidades, as células neuronais humanas são HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11 ou células ReNcell VM.
[0066] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que é formado um depósito que libera IDUA glicosilada que não contém antígeno NeuGc e/ou a-Gal detectável; e administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes ou simultaneamente à administração do vetor de expressão e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente; em que o referido vetor recombinante, quando usado para transduzir células neuronais humanas em cultura, resulta na produção da referida IDUA que é glicosilada, mas não contém antígeno NeuGc e/ou a-Gal detectável na referida cultura de células. Em certas modalidades, as células neuronais humanas são HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH- SY5y, hNSC11 ou células ReNcell VM.
[0067] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito humano diagnosticado com MPS I, compreendendo: administrar, ao líquido cefalorraquidiano do cérebro do referido sujeito humano, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vetor de expressão de nucleotídeo recombinante que codifica IDUA humana, de modo que é formado um depósito que libera a referida IDUA contendo uma sulfatação de tirosina; e administrar uma terapia de imunossupressão ao referido sujeito antes ou simultaneamente à administração do vetor de expressão e continuar a terapia de imunossupressão posteriormente; em que o referido vetor recombinante, quando usado para transduzir células neuronais humanas em cultura resulta na produção da referida IDUA que é tirosina-sulfatada na referida cultura de células. Em certas modalidades, as células neuronais humanas são HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH- SY5y, hNSC11 ou células ReNcell VM.
[0068] Em certas modalidades, a IDUA humana compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1. Em certas modalidades, a terapia de imunossupressão compreende a administração de uma combinação de (a) tacrolimo e ácido micofenólico, ou (b)
rapamicina e ácido micofenólico ao referido sujeito antes ou simultaneamente ao tratamento com IDUA humana e continuando posteriormente. Em certas modalidades, a terapia de imunossupressão é retirada após 180 dias.
[0069] Em modalidades preferíveis, a IDUA glicosilada não contém NeuGc e/ou a-Gal detectável. A frase "NeuGc e/ou a-Gal detectável" usada neste documento significa frações de NeuGc e/ou a-Gal detectáveis por métodos de ensaio padrão conhecidos na técnica. Por exemplo, NeuGc pode ser detectado por HPLC de acordo com Hara et al., 1989, "Highly Sensitive Determination of N-Acetyl-and N-Glycolylneuraminic Acids in Human Serum and Urine and Rat Serum by Reversed-Phase Liquid Chromatography with Fluorescence Detection”, J. Chromatogr., B: Biomed. 377: 111- 119, que é incorporado a este documento por referência para o método de detecção de NeuGc. Alternativamente, NeuGc pode ser detectado por espectrometria de massa. O a-Gal pode ser detectado usando um ELISA, vide, por exemplo, Galili et al., 1998, “A sensitive assay for measuring alpha-Gal epitope expression on cells by a monoclonal anti-Gal antibody". Transplantation. 65(8): 1129-32, ou por espectrometria de massa, vide, por exemplo, Ayoub et al., 2013, “Correct primary structure assessment and extensive glyco-profiling of cetuximab by a combination of intact, middle-up, middle-down and bottom-up ESI and MALDI mass spectrometry techniques”. Landes Bioscience. 5(5): 699-710. Vide também as referências citadas em Platts- Mills et al., 2015, “Anaphylaxis to the Carbohydrate Side-Chain Alpha-gal”, Immunol Allergy Clin North Am. 35(2): 247-260.
5.1 N-GLICOSILAÇÃO E SULFATAÇÃO DE TIROSINA
5.1.1. N-Glicosilação
[0070] As células neuronais e gliais no SNC são células secretoras que possuem o maquinário celular para o processamento pós-tradução de proteínas secretadas — incluindo glicosilação e O-sulfatação de tirosina. A hIDUA tem seis sítios de glicosilação asparaginal ("N") identificados na FIG. 1 (NUºFT; NIOVS; N326TT; N37 NT; NºSHT; NÍIRS). A N-glicosilação de Nº”? é necessária para ligar ao substrato e atividade enzimática e a manose-6- fosforilação é necessária para a absorção celular da enzima secretada e correção cruzada de células de MPS II. Os sítios de glicosilação ligados a N contêm frações de carboidrato de manose complexa e alta e de manose fosforilada (FIG. 4), mas apenas a forma secretada é captada pelas células. A abordagem de terapia gênica descrita neste documento deve resultar na secreção contínua de uma glicoproteína IDUA que é 2,6-sialilada e manose- 6-fosforilada. A IDUA glicosilada/fosforilada secretada deve ser captada e corretamente processada por células neurais e gliais não transduzidas no SNC.
[0071] À glicosilação de hIDUA por células humanas do SNC resultará na adição de glicanos que podem melhorar a estabilidade, meia-vida e reduzir a agregação indesejada do produto transgene. Significativamente, os glicanos que são adicionados à HuGlyIDUA da invenção são N-glicanos biantenários de tipo complexo altamente processados que incluem ácido 2,6- siálico, incorporando Neu5Ac ("NANA"), mas não seu derivado hidroxilado, NeuGc (ácido N-glicolilneuramínico, isto é, “NGNA” ou “Neu5Gc”). Tais glicanos não estão presentes na laronidase, que é feita em células CHO que não têm a 2,6-sialiltransferase necessária para fazer essa modificação pós-tradução, nem as células CHO produzem GlcNAc bissectante, embora adicionem Neu5Gc
(NGNA) como ácido siálico não típico (e potencialmente imunogênico) para humanos em vez de Neu5SAc (NANA). Ademais, as células CHO também podem produzir um glicano imunogênico, oO antígeno a-Gal, que reage com anticorpos anti-a-Gal presentes na maioria dos indivíduos e que, em altas concentrações, pode desencadear anafilaxia. Vide, por exemplo, Bosques, 2010, Nat Biotech 28: 1153-1156. O padrão de glicosilação humano da HuGl1yIDUA da invenção deve reduzir a imunogenicidade do produto transgene e melhorar a eficácia.
[0072] Não é essencial que todas as moléculas produzidas, na abordagem de terapia gênica ou de terapia de proteína, sejam totalmente glicosiladas e sulfatadas. Em vez disso, a população de glicoproteínas produzidas deve ter glicosilação e sulfatação suficientes para demonstrar eficácia.
[0073] Em uma modalidade específica, a HuUuGlIyIDUA usada em conformidade com os métodos descritos neste documento, quando expressa em um neurônio ou célula glial, in vivo ou in vitro, poderia ser glicosilada em 100% dos seus sítios de N- glicosilação. No entanto, um versado na técnica apreciará que nem todos os sítios de N-glicosilação de HuGlyIDUA precisam ser N-glicosilados a fim de que os benefícios da glicosilação sejam atingidos. Em vez disso, os benefícios da glicosilação podem ser realizados quando apenas uma porcentagem dos sítios de N- glicosilação são glicosilados e/ou quando apenas uma porcentagem de moléculas de IDUVA expressas são glicosiladas. Por conseguinte, em certas modalidades, a HuGlyIDUA usada em conformidade com os métodos descritos neste documento, quando expressa em um neurônio ou célula glial, in vivo ou in vitro, é glicosilada em 10% - 20%, 20% - 30%, 30% - 40%, 40% - 50%, 50%
— 60%, 60% - 70%, 70% - 80%, 80% - 90% ou 90% - 100% de seus sítios de N-glicosilação disponíveis. Em certas modalidades, quando expresso em um neurônio ou célula glial, in vivo ou in vitro, 10% - 20%, 20% - 30%, 30% - 40%, 40% - 50%, 50% - 60%, 60% - 70%, 70% - 80%, 80% - 90% ou 90% - 100% das moléculas de HuGl1yIDUA usadas em conformidade com os métodos descritos neste documento são glicosiladas em pelo menos um de seus sítios de N- glicosilação disponíveis.
[0074] En uma modalidade específica, pelo menos 10%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% dos sítios de N-glicosilação presentes em HuGlyIDUA usados em conformidade com os métodos descritos neste documento são glicosilados em um resíduo Asn (ou outro resíduo relevante) presente em um sítio de N-glicosilação, quando a HuGlyIDUA é expressa em um neurônio ou célula glial, in vivo ou in vitro. Ou seja, pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% dos sítios de N-glicosilação de HuGlyIDUA resultante são glicosilados.
[0075] Em outra modalidade específica, pelo menos 10%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% dos sítios de N-glicosilação presentes em uma molécula de HuGlyIDUA usada em conformidade com os métodos descritos neste documento são glicosilados com um glicano preso idêntico ligado ao resíduo Asn (ou outro resíduo relevante) presente em um sítio de N- glicosilação, quando a HuGlyIDUA é expressa em um neurônio ou célula glial, in vivo ou in vitro. Ou seja, pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% dos sítios de N-glicosilação da HuGlyIDUA resultante têm um glicano preso idêntico.
[0076] Importantemente, quando as proteínas IDUA usadas em conformidade com os métodos descritos neste documento são expressas em células neuronais ou gliais, a necessidade de produção in vitro em células hospedeiras procarióticas (por exemplo, E. coli) ou células hospedeiras eucarióticas (por exemplo, células CHO) é contornada. Em vez disso, como resultado dos métodos descritos neste documento (por exemplo, uso de células neuronais ou gliais para expressar IDUA), os sítios de N-glicosilação das proteínas IDUA são vantajosamente decorados com glicanos relevantes e benéficos para o tratamento de humanos. Tal vantagem é inatingível quando células CHO ou E. coli são utilizadas na produção de proteínas, porque, por exemplo, as células CHO (1) não expressam 2,6 sialiltransferase e, assim, não podem adicionar ácido 2,6 siálico durante a N-glicosilação e (2) podem adicionar Neu5Gc como ácido siálico em vez de Neu5Ac; e porque EF. coli não contém naturalmente componentes necessários para N-glicosilação. Por conseguinte, em uma modalidade, uma proteína IDUA expressa em um neurônio ou célula glial para dar origem a uma HuGlyIDUA usada nos métodos de tratamento descritos neste documento é glicosilada da maneira em que uma proteína é N-glicosilada em células neuronais ou gliais humanas, mas não é glicosilada da maneira em que proteínas são glicosiladas em células CHO. Em outra modalidade, uma proteína IDUA expressa em um neurônio ou célula glial para dar origem a uma HuGlyIDUA usada nos métodos de tratamento descritos neste documento é glicosilada da maneira em que uma proteína é N-glicosilada em um neurônio ou células gliais, em que tal glicosilação não é naturalmente possível usando uma célula hospedeira procariótica, por exemplo, usando E. coli.
[0077] Os ensaios para determinar o padrão de glicosilação de proteínas são conhecidos na técnica.
Por exemplo, a hidrazinólise pode ser usada para analisar glicanos.
Primeiro, os polissacarídeos são liberados a partir de sua proteína associada por incubação com hidrazina (o Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit (Kit de Liberação de Glicano de Hidrazinólise Liberada de Ludger), Oxfordshire, Reino Unido pode ser usado). A hidrazina nucleófila ataca a ligação glicosídica entre o polissacarídeo e a proteína carregadora e permite a liberação dos glicanos presos.
Os grupos N-acetil são perdidos durante esse tratamento e precisam ser reconstituídos por re-N-acetilação.
Os glicanos livres podem ser purificados em colunas de carbono e subsequentemente marcados na extremidade redutora com a fluoróforo 2-amino benzamida.
Os polissacarídeos marcados podem ser separados em uma coluna GlicoSep-N (GL Sciences) de acordo com o protocolo de HPLC de Royle et al, Anal Biochem 2002, 304 (1): 70-90. O cromatograma de fluorescência resultante indica o comprimento do polissacarídeo e o número de unidades de repetição.
As informações estruturais podem ser coletadas coletando picos individuais e realizando subsequentemente análises de MS/MS.
Desse modo, a composição de monossacarídeo e a sequência da unidade de repetição podem ser confirmadas e, adicionalmente, a homogeneidade da composição de polissacarídeo pode ser identificada.
Picos específicos de baixo peso molecular podem ser analisados por MALDI-MS/MS e o resultado, usado para confirmar a sequência de glicano.
Cada pico corresponde a um polímero consistindo em um certo número de unidades de repetição e fragmentos destas.
O cromatograma permite, assim, a medição da distribuição do comprimento do polímero.
O tempo de eluição é uma indicação do comprimento do polímero, enquanto a intensidade de fluorescência se correlaciona com a abundância molar do respectivo polímero.
[0078] A homogeneidade dos padrões de glicano associados às proteínas, no que se refere tanto ao comprimento do glicano quanto aos números de glicanos presentes pelos sítios de glicosilação, pode ser avaliada usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, métodos que medem o comprimento e o raio hidrodinâmico do glicano. O HPLC de exclusão de tamanho permite a medição do raio hidrodinâmico. Números mais altos de sítios de glicosilação em uma proteína levam a uma variação mais alta no raio hidrodinâmico em comparação com um carregador com menos sítios de glicosilação. No entanto, quando cadeias de glicano único são analisadas, elas podem ser mais homogêneas devido ao comprimento mais controlado. O comprimento do glicano pode ser medido por hidrazinólise, SDS PAGE e eletroforese em gel capilar. Além disso, a homogeneidade também pode significar que certos padrões de uso de sítio de glicosilação mudam para uma faixa mais ampla/estreita. Esses fatores podem ser medidos por LC- MS/MS de Glicopeptídeo.
[0079] À N-glicosilação confere numerosos benefícios à HuGlyIDUA usada nos métodos descritos neste documento. Tais benefícios são inatingíveis pela produção de proteínas em £E. coli, porque E. coli não possui naturalmente os componentes necessários para N-glicosilação. Ainda, alguns benefícios são inatingíveis através da produção de proteínas em, por exemplo, células CHO, porque células CHO carecem de componentes necessários para a adição de certos glicanos (por exemplo, ácido 2,6 siálico) e porque células CHO podem adicionar glicanos, por exemplo, NeuSGc não típico de humanos e o antígeno a-Gal, que é imunogênico na maioria dos indivíduos e em altas concentrações, podem desencadear anafilaxia. Assim, a expressão de IDUA em células neuronais ou gliais humanas resulta na produção de HuGlyIDUA compreendendo glicanos benéficos que de outra forma não estariam associados à proteína se produzidos em células CHO ou em E. coli.
5.1.2. Sulfatação de Tirosina
[0080] Além dos sítios de glicosilação ligados a N, hIDUA contém um sítio de sulfatação de tirosina ("XY") (ADTPIY?º*NDEADPLVGWS) próximo ao domínio contendo Nº”? necessário para ligação e atividade. (Vide, por exemplo, Yang et al., 2015, Molecules 20: 2138-2164, especialmente na p. 2154, que é incorporado por referência em sua totalidade para a análise de aminoácidos em torno dos resíduos de tirosina submetidos à sulfatação de proteína tirosina. As "regras" podem ser resumidas da seguinte forma: resíduos Y com E ou D entre as posições +5 e -5 de Y e onde a posição -1 de Y é um aminoácido neutro ou com carga ácida — mas não um aminoácido básico, por exemplo, R, K ou H que abole a sulfatação). Embora não pretenda estar limitado por nenhuma teoria, a sulfatação desse sítio em hIDUA pode ser crítica para a atividade, uma vez que se sabe que mutações dentro da região de sulfatação de tirosina (por exemplo, W306L) estão associadas à atividade enzimática reduzida e a doença. (Vide Maita et al., 2013, PNAS 110:14628 nas pp. 14632-14633).
[0081] Significativamente, proteínas sulfatadas com tirosina não podem ser produzidas em E. coli, que não possui naturalmente as enzimas necessárias para a sulfatação de tirosina. Ainda, células CHO são deficientes para sulfatação de tirosina — elas não são células secretoras e têm uma capacidade limitada para sulfatação de tirosina pós-tradução. Vide, por exemplo, Mikkelsen & Ezban, 1991, Biochemistry 30: 1533-1537. Vantajosamente, os métodos fornecidos neste documento exigem a expressão de IDUA, por exemplo, HuGlyIDUA, em neurônios ou células gliais, que são secretores e têm capacidade para sulfatação de tirosina. Os ensaios para detecção de sulfatação de tirosina são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Yang et al., 2015, Molecules 20: 2138-2164.
[0082] A sulfatação de tirosina de hIDUA — um processo pós- tradução robusto em células do SNC humano — deve resultar em processamento e atividade melhorados de produtos transgene. A significância da sulfatação de tirosina de proteínas lisossomais não foi elucidada; mas em outras proteínas mostrou aumentar a avidez de interações proteína-proteína (anticorpos e receptores) e promover o processamento proteolítico (hormônio peptídico) (Vide Moore, 2003, J Biol. Chem. 278: 24243-46; e Bundegaard et al., 1995, The EMBO JJ 14: 3073-79). A tirosilproteína sulfotransferase (TPST1) responsável pela sulfatação de tirosina (que pode ocorrer como uma etapa final no processamento de IDUA) é aparentemente expressa em níveis mais altos (baseado em mRNA) no cérebro (dados de expressão gênica para TPSTl podem ser encontrados, por exemplo, no EMBL-EBI Expression Atlas (Atlas de Expressão EMBL-EBI), acessível em http://www.ebi.ac.uk/gxa/home). Tal modificação pós-tradução, na melhor das hipóteses, está sub-representada na laronidase — um produto da célula CHO.
5.2 CONSTRUTOS E FORMULAÇÕES
[0083] Para uso nos métodos fornecidos neste documento, são os vetores virais ou outros construtos de expressão de DNA que codificam a-L-iduronidase (IDUA), por exemplo, IDUA humana (hIDUA). Os vetores virais e outros construtos de expressão de DNA fornecidos neste documento incluem qualquer método adequado para a distribuição de um transgene ao líquido cefalorraquidiano (LCR). Os meios de distribuição de um transgene incluem vetores virais, lipossomas, outros complexos contendo lipídios, outros complexos macromoleculares, mRNA modificado sintético, mRNA não modificado, pequenas moléculas, moléculas não biologicamente ativas (por exemplo, partículas de ouro), moléculas polimerizadas (por exemplo, dendrímeros), DNA nu, plasmídeos, fagos, transposons, cosmídeos ou epissomas. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor direcionado, por exemplo, um vetor direcionado para células neuronais.
[0084] Em alguns aspectos, a divulgação fornece um ácido nucleico para uso, em que o ácido nucleico codifica uma IDUA, por exemplo, hIDUA, operativamente ligada a um promotor selecionado a partir do grupo que consiste em: promotor do citomegalovírus (CMV), promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV), promotor de MMT, promotor de EF-1 alfa, promotor de UB6, promotor de beta-actina de frango, promotor CAG, promotor de RPE65 e promotor de opsina.
[0085] Em certas modalidades, são fornecidos neste documento vetores recombinantes que compreendem um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, polinucleotídeos). Os ácidos nucleicos podem compreender DNA, RNA ou uma combinação de DNA e RNA. Em certas modalidades, o DNA compreende uma ou mais das sequências selecionadas a partir do grupo consistindo em sequências promotoras, a sequência do gene de interesse (o transgene, por exemplo, IDUA), regiões não traduzidas e sequências de terminação. Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento compreendem um promotor operacionalmente ligado ao gene de interesse.
[0086] Em certas modalidades, os ácidos nucleicos (por exemplo, polinucleotídeos) e as sequências de ácido nucleico divulgadas neste documento podem ser otimizados por códons, por exemplo, por meio de qualquer técnica de otimização de códons conhecida por um versado na técnica (vide, por exemplo, revisão por Quax et al., 2015, Mol Cell 59: 149-161).
5.2.1. mMRNA
[0087] Em certas modalidades, os vetores fornecidos neste documento são mRNA modificado que codifica para o gene de interesse (por exemplo, o transgene, por exemplo, IDUA). A Síntese de mRNA modificado e não modificado para distribuição de um transgene ao LCR é ensinada, por exemplo, em Hocquemiller et al., 2016, Human Gene Therapy 27 (7): 478-496, que é incorporado a este documento por referência em sua totalidade. Em certas modalidades, é fornecida neste documento uma codificação de mRNA modificado para IDUA, por exemplo, hIDUA.
5.2.2. Vetores virais
[0088] Os vetores virais incluem adenovírus, vírus adeno- associado (AAV, por exemplo, AAV9), lentivírus, adenovírus dependente de ajudante, vírus de herpes simplex, poxvírus, vírus de hemaglutinina do Japão (HVJ), alfavírus, vírus vaccinia e vetores de retrovírus. Os vetores retrovirais incluem vírus da leucemia murina (MLV) - e vetores baseados no vírus da imunodeficiência humana (HIV). Os vetores de Alphavirus incluem o vírus da floresta semliki (SFV) e o vírus sindbis (SIN). Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento são vetores virais recombinantes. Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento são alterados de modo que sejam deficientes para replicação em humanos. Em certas modalidades, os vetores virais são vetores híbridos, por exemplo, um vetor AAV colocado em um vetor adenoviral "indefeso". Em certas modalidades, são fornecidos neste documento vetores virais que compreendem um capsídeo viral de um primeiro vírus e proteínas do envelope viral de um segundo vírus. Em modalidades específicas, o segundo vírus é o vírus do estomatito vesicular (VSV). Em modalidades mais específicas, a proteína do envelope é a proteína VSV-G.
[0089] Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento são vetores virais baseados em HIV. Em certas modalidades, os vetores baseados em HIV fornecidos neste documento compreendem pelo menos dois polinucleotídeos, em que os genes gag e pol são de um genoma de HIV e o gene env é de outro vírus.
[0090] Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento são vetores virais baseados em vírus de herpes simplex. Em certas modalidades, os vetores baseados em vírus herpes simplex fornecidos neste documento são modificados de modo que não compreendam um ou mais genes imediatamente iniciais (IE), tornando-os não citotóxicos.
[0091] Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento são vetores virais baseados em MLV. Em certas modalidades, os vetores baseados em MLIV fornecidos neste documento compreendem até 8 kb de DNA heterólogo no lugar dos genes virais.
[0092] Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento são vetores virais baseados em lentivírus. Em certas modalidades, os vetores lentivirais fornecidos neste documento são derivados de lentivírus humanos. Em certas modalidades, os vetores lentivirais fornecidos neste documento são derivados de lentivírus não humanos. Em certas modalidades, os vetores lentivirais fornecidos “neste documento são empacotados em um capsídeo lentiviral. Em certas modalidades, os vetores lentivirais fornecidos neste documento compreendem um ou mais dos seguintes elementos: repetições terminais longas, um sítio de ligação do primer, um trato de polipurina, sítios att e um sítio de encapsidação.
[0093] Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento são vetores virais baseados em alfavírus. Em certas modalidades, os vetores de alfavírus fornecidos neste documento são alfavírus recombinantes com defeito de replicação. Em certas modalidades, os replicons de alfavírus nos vetores de alfavírus fornecidos neste documento são direcionados a tipos de células específicos exibindo um ligante heterólogo funcional em sua superfície de vírion.
[0094] Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento são vetores virais baseados em AAV. Em modalidades preferíveis, os vetores virais fornecidos neste documento são vetores virais baseados em AAV9 ou AAVrh10. Em certas modalidades, os vetores virais baseados em AAV9 ou AAVrh10 fornecidos neste documento retêm tropismo para células do SNC. Múltiplos serotipos de AAV foram identificados. Em certas modalidades, os vetores baseados em AAV fornecidos neste documento compreendem componentes de um ou mais serotipos de
AAV. Em certas modalidades, vetores baseados em AAV fornecidos neste documento compreendem componentes de um ou mais dentre AAV1, AAV2, AAV3, AAVA4, AAV5, AAV6, AAV7T, AAV8, AAV9, AAVrhl1O0 ou AAV11. Em modalidades preferenciais, os vetores baseados em AAV fornecidos neste documento compreendem componentes de um ou mais dentre os serotipos AAV8, AAV9, AAVI1O ou AAVI11. Os vetores virais baseados em AAV9 são usados nos métodos descritos neste documento. Sequências de ácido nucleico de vetores virais baseados em AAV e métodos de produção de AAV recombinante e capsídeos AAV são ensinados, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos Nº 7.282.199 B2, Patente dos Estados Unidos Nº 7.790.449 B2, Patente dos Estados Unidos Nº 8.318.480 B2, Patente dos Estados Unidos Nº 8.962.332 B2 e Pedido de Patente Internacional Nº PCT/EP2014/076466, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência na sua totalidade. Em um aspecto, são fornecidos neste documento vetores virais baseados em AAV (por exemplo, AAV9 ou AAVrhl10) que codificam um transgene (por exemplo, IDUA). Em modalidades específicas, são fornecidos neste documento vetores virais baseados em AAV9 que codificam IDUA. Em modalidades mais específicas, são fornecidos neste documento vetores virais baseados em AAV9 que codificam hIDUA.
[0095] São fornecidos em modalidades particulares vetores AAV9 compreendendo um genoma artificial compreendendo (i) um cassete de expressão contendo o transgene sob o controle de elementos reguladores e flanqueado por ITRs; e (ii) um capsídeo viral que tem a sequência de aminoácidos da proteína do capsídeo AAV9 ou é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,9% idêntico à sequência de aminoácidos da proteína de capsídeo AAV9 (SEQ ID NO: 26), enquanto retém a função biológica do capsídeo AAV9. Em certas modalidades, o capsídeo AAV9 codificado tem a sequência da SEQ ID NO: 26 com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 substituições de aminoácidos e retendo a função biológica do capsídeo AAV9. A FIG. 5 fornece um alinhamento comparativo das sequências de aminoácidos das proteínas de capsídeo de diferentes serotipos de AAV com aminoácidos potenciais que podem ser substituídos em certas posições nas sequências alinhadas baseados na comparação na linha marcada SUBS. Por conseguinte, em modalidades específicas, o vetor AAV9 compreende uma variante de capsídeo AAV9 que tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 substituições de aminoácidos identificadas na linha SUBS da FIG. 5 que não estão presentes naquela posição na sequência AAV9 nativa.
[0096] Em certas modalidades, o AAV que é usado nos métodos descritos neste documento é Anc80 ou Anc80L65, como descrito em Zinn et al., 2015, Cell Rep. 12 (6): 1056-1068, que é incorporado por referência em sua totalidade. Em certas modalidades, o AAV que é usado nos métodos descritos neste documento compreende uma das seguintes inserções de aminoácidos: LGETTRP ou LALGETTRP como descrito nas Patentes dos Estados Unidos Nº 9.193.956; 9458517; e 9.587.282 e a publicação de pedido de patente US Nº 2016/0376323, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência em sua totalidade. Em certas modalidades, o AAV que é usado nos métodos descritos neste documento é AAV.'7m8 como descrito nas Patentes dos Estados Unidos Nº 9.193.956;
9.458.517; e 9.587.282 e a publicação de pedido de patente US Nº 2016/0376323, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência em sua totalidade. Em certas modalidades, o AAV que é usado nos métodos descritos neste documento é qualquer AAV divulgado na Patente dos Estados Unidos Nº 9.585.971, tal como AAV-PHP.B. Em certas modalidades, o AAV que é usado nos métodos descritos neste documento é um AAV divulgado em qualquer uma das seguintes patentes e pedidos de patentes, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência em sua totalidade: Patentes dos Estados Unidos Nº 7.906.111; 8.524.446; 8.999.678;
8.628.966; 8.927.514; 8.734.809; US 9.284.357; 9.409.953;
9.169.299; 9.193.956; 9458517; e 9.587.282. Publicação de Pedido de Patente US Nº 2015/0374803; 2015/0126588; 2017/0067908; 2013/0224836; 2016/0215024; 2017/0051257; e Pedidos de Patente Internacional Nº PCT/US2015/034799; PCT/EP2015/053335.
[0097] Em certas modalidades, um AAV de fita simples (sSSAAV) pode ser usado acima. Em certas modalidades, um vetor auto- complementar, por exemplo, sSCAAV, pode ser usado (vide, por exemplo, Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18 (2): 171-82, McCarty et al, 2001, Gene Therapy, Vol 8, Número 16, Páginas 1248-1254; e Patentes US Nº 6.596.535; 7.125.717; e 7.456.683, cada uma das quais é incorporada a este documento por referência em sua totalidade).
[0098] Em certas modalidades, os vetores virais usados nos métodos descritos neste documento são vetores virais baseados em adenovírus. Um vetor de adenovírus recombinante pode ser usado para transferência na IDUA. O adenovírus recombinante pode ser um vetor de primeira geração, com uma deleção em El, com ou sem uma deleção em E3 e com o cassete de expressão inserido em qualquer uma das regiões deletadas. O adenovírus recombinante pode ser um vetor de segunda geração, que contém deleções completas ou parciais das regiões E2 e E4. Um adenovírus dependente de ajudante retém apenas as repetições terminais invertidas de adenovírus e o sinal de empacotamento (phi). O transgene é inserido entre o sinal de empacotamento e o 3'ITR, com ou sem sequências stuffer para manter o genoma artificial próximo ao tamanho do tipo selvagem de aprox. 36 kb. Um protocolo exemplar para produção de vetores adenovirais pode ser encontrado em Alba et al., 2005, "Gutless adenovirus: last generation adenovirus for gene therapy", Gene Therapy 12: S18- 827, que é incorporado a este documento por referência em sua totalidade.
[0099] Em certas modalidades, os vetores virais usados nos métodos descritos neste documento são vetores virais baseados em lentivírus. Um vetor de lentivírus recombinante pode ser usado para transferência na IDUA. Quatro plasmídeos são usados para fazer o construto: plasmídeo contendo sequência Gag/pol, plasmídeos contendo sequência Rev, plasmídeo contendo proteína do Envelope (isto é, VSV-G) e plasmídeo Cis com os elementos de empacotamento e o gene IDUA.
[0100] Para a produção de vetor lentiviral, os quatro plasmídeos são cotransfectados em células (isto é, células baseadas em HEK293), em que polietilenimina ou fosfato de cálcio podem ser usados como agentes de transfecção, entre outros. O lentivírus é então colhido no sobrenadante (lentivírus precisam brotar a partir das células para serem ativos, nenhuma coleta de células, pois, precisa/deve ser feita). O sobrenadante é filtrado (0,45 pum) e então cloreto de magnésio e benzonase são adicionados. Processos a jusante adicionais podem variar amplamente, com o uso de TFF e cromatografia em coluna sendo os mais compatíveis com GMP. Outros usam ultracentrifugação com/sem cromatografia em coluna. Protocolos exemplares para a produção de vetores lentivirais podem ser encontrados em Lesch et al., 2011, “Production and purification of lentiviral vector generated in 293T suspension cells with baculoviral vectors”, Gene Therapy 18: 531-538 e Ausubel et al., 2012, "Production of CGMP-Grade Lentiviral Vectors" ("Produção de Vetores Lentivirais de Grau CGMP"), Bioprocess Int. 10 (2): 32-43, ambos os quais são incorporados a este documento por referência em sua totalidade.
[0101] Em uma modalidade específica, um vetor para uso nos métodos descritos neste documento é aquele que codifica uma IDUA (por exemplo, hIDUA) de modo que, após a transdução de células no SNC, ou uma célula relevante (por exemplo, uma célula neuronal in vivo ou in vitro), uma variante glicosilada de IDUA é expressa pela célula transduzida. Em uma modalidade específica, um vetor para uso nos métodos descritos neste documento é aquele que codifica uma IDUA (por exemplo, hIDUA) de modo que, após a transdução de uma célula no SNC, ou uma célula relevante (por exemplo, uma célula neuronal in vivo ou in vitro), uma variante sulfatada de IDUA é expressa pela célula.
5.2.3. Promotores e Modificadores da Expressão de Gene
[0102] Em certas modalidades, os vetores fornecidos neste documento compreendem componentes que modulam a distribuição ou expressão gênica (por exemplo, "elementos de controle de expressão"). Em certas modalidades, os vetores fornecidos neste documento compreendem componentes que modulam a expressão gênica. Em certas modalidades, os vetores fornecidos neste documento compreendem componentes que influenciam a ligação ou direcionamento às células. Em certas modalidades, os vetores fornecidos neste documento compreendem componentes que influenciam a localização do polinucleotídeo (por exemplo, oO transgene) dentro da célula após a absorção. Em certas modalidades, os vetores fornecidos neste documento compreendem componentes que podem ser usados como marcadores detectáveis ou selecionáveis, por exemplo, para detectar ou selecionar células que captaram o polinucleotídeo.
[0103] Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento compreendem um ou mais promotores. Em certas modalidades, o promotor é um promotor constitutivo. Em modalidades alternativas, o promotor é um promotor induzível. O gene IDUA nativo, como a maioria dos genes de manutenção, usa principalmente um promotor rico em GC. Em uma modalidade preferencial, promotores constitutivos fortes que fornecem expressão sustentada de hIDUA são usados. Esses promotores incluem promotores sintéticos “CAG” que contêm: “C” — o elemento potenciador inicial do citomegalovírus (CMV); “A” — o promotor, bem como o primeiro exon e íntron do gene da beta-actina de frango; e "G" — o aceitador de splice do gene da beta-globina de coelho (vide Miyazaki et al., 1989, Gene 79: 269-277; e Niwa et al., Gene 108: 193-199).
[0104] Em certas modalidades, o promotor é um promotor CB7 (vide Dinculescu et al., 2005, Hum Gene Ther 16: 649-663, incorporado a este documento por referência em sua totalidade). Em algumas modalidades, o promotor CB7 inclui outros elementos de controle de expressão que potencializam a expressão do transgene conduzido pelo vetor. Em certas modalidades, os outros elementos de controle de expressão incluem íntron de B-actina de frango e/ou sinal de polA de fB-globina de coelho. Em certas modalidades, o promotor compreende uma caixa TATA. Em certas modalidades, o promotor compreende um ou mais elementos. Em certas modalidades, os um ou mais elementos do promotor podem ser invertidos ou movidos em relação um ao outro. Em certas modalidades, os elementos do promotor são posicionados para funcionar cooperativamente. Em certas modalidades, os elementos do promotor são posicionados para funcionar independentemente. Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento compreendem um ou mais promotores selecionados a partir do grupo que consiste no promotor do gene inicial imediato do CMV humano, o promotor inicial de SV40, a repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous (RS) e o promotor da insulina de rato. Em certas modalidades, os vetores fornecidos neste documento compreendem um ou mais promotores de repetição terminal longa (LTR) selecionados a partir do grupo que consiste em LTRs de AAV, MLV, MMTV, SV40, RSV, HIV-1 e HIV-2. Em certas modalidades, os vetores fornecidos neste documento compreendem um ou mais promotores específicos de tecido (por exemplo, um promotor específico de células neuronais).
[0105] Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento compreendem um ou mais elementos reguladores além de um promotor. Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento compreendem um potenciador. Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento compreendem um repressor. Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento compreendem um íntron ou um íntron quimérico. Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento compreendem uma sequência de poliadenilação.
5.2.4. Peptídeos Sinal
[0106] Em certas modalidades, os vetores fornecidos neste documento compreendem componentes que modulam a distribuição de proteínas. Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento compreendem um ou mais peptídeos. Em certas modalidades, os peptídeos sinal permitem que o produto transgene (por exemplo, IDUA) alcance o empacotamento adequado (por exemplo, glicosilação) na célula. Em certas modalidades, os peptídeos sinal permitem que o produto do transgene (por exemplo, IDUA) alcance a localização adequada na célula. Em certas modalidades, os peptídeos sinal permitem que o produto transgene (por exemplo, IDUA) alcance secreção da célula. Exemplos de peptídeos sinal a serem usados em conexão com os vetores e transgenes fornecidos neste documento podem ser encontrados na Tabela 3. Os peptídeos sinal também podem ser referidos neste documento como sequências líderes ou peptídeos líderes. Tabela 3. Peptídeos sinal para uso com os vetores fornecidos neste documento. SEQ Peptídeo Sinal Sequência
ID NO. 2 Peptídeo sinal de MEYQILKMSLCLFILLFLTPGILC glicoproteína de oligodendrócito- mielina (hOMG) 3 Repressor celular MSVRRGRRPARPGTRLSWLLCCSALLSPAAG de peptídeo sinal de genes estimulados por ElA 2 (hCREG2) Conjunto de V e MEQRNRLGALGYLPPLLLHALLLFVADA domínio transmembranar contendo peptídeo sinal 2B (hVSTM2B)
Peptídeo sinal MVFSRRGGLGARDLLLWLLLLAAWEVGSG protocaderina alfa- 1 (hPCADHAIL) Peptídeo sinal MAMVSAMSWVLYLWISACA FAM19Al (TAFALl)
7 Peptídeo sinal MNFLLSWVHW SLALLLYLHH AKWSQA VEGF-A Peptídeo sinal MERAAPSRRV PLPLLLLGGL ALLAAGVDA fibulina-1 Peptídeo sinal MAPLRPLLIL ALLAWVALA vitronectina
Peptídeo sinal MRLLAKIICLMLWAICVA Complemento Fator H
11 Peptídeo sinal MRLLAFLSLL ALVLQETGT opticina
12 Peptídeo sinal MKWVTFISLLFLFSSAYS albumina
Peptídeo sinal MAFLWLLSCWALLGTTFG ms quimotripsinogeno | 14 Peptídeo sinal MYRMOLLSCIALILALVTNS interleucina-2 Peptídeo sinal MNLLLILTFVAAAVA tripsinogênio-2
5.2.5. Regiões não traduzidas
[0107] Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento compreendem uma ou mais regiões não traduzidas (UTRs), por exemplo, UTRs 3' e/ou 5'. Em certas modalidades, as UTRs são otimizadas para o nível desejado de expressão de proteína. Em certas modalidades, as UTRs são otimizadas para a meia-vida do mRNA do transgene. Em certas modalidades, as UTRs são otimizadas para a estabilidade do mRNA do transgene. Em certas modalidades, as UTRs são otimizadas para a estrutura secundária do mRNA do transgene.
5.2.6. Repetições terminais invertidas
[0108] Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento compreendem uma ou mais sequências de repetição terminal invertida (ITR). As sequências ITR podem ser usadas para empacotar o cassete de expressão gênica recombinante no vírion do vetor viral. Em certas modalidades, o ITR é de um AAV, por exemplo, AAV9 (vide, por exemplo, Yan et al., 2005, 4. Virol., 79 (1): 364-379; Patente dos Estados Unidos Nº 7.282.199 B2, Patente dos Estados Unidos Nº 7.790.449 B2, Patente dos Estados Unidos Nº 8.318.480 B2, Patente dos Estados Unidos Nº
8.962.332 B2 e Pedido de Patente Internacional Nº PCT/EP2014/076466, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência na sua totalidade).
5.2.7. Transgenes
[0109] Em certas modalidades, os vetores fornecidos neste documento codificam um transgene IDUA. Em modalidades específicas, a IDUA é controlada por elementos de controle de expressão apropriados para expressão em células neuronais: Em certas modalidades, o transgene IDUA (por exemplo, NhIDUA) compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, o transgene IDUA (por exemplo, hIDUA) compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 85%, 86%, 87% 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 1.
[0110] A HUGIyIDUA codificada pelo transgene pode incluir, mas não está limitada a, IDUA humana (hIDUA) com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 (como mostrado na FIG. 1) e derivados de hIDUA com substituições, deleções ou adições de aminoácidos, por exemplo, incluindo, mas não se limitando a, substituições de aminoácidos selecionados a partir de resíduos não conservados correspondentes em ortólogos de IDUA mostrados na FIG. 2, com a condição de que tais mutações não incluam nenhuma que tenha sido identificada em fenótipos de MPS I grave, grave-intermediária, intermediária ou atenuada mostrados na FIG. 3 (a partir de Saito et al., 2014, Mol Genet Metab 111: 107-112, Table 3 listing 57 MPS I mutations (Tabela 3 listando 57 mutações de MPS 1), que é incorporado a este documento por referência em sua totalidade); ou relatado por Venturi et al., 2002, Human Mutation $522 Online ("Venturi 2002"), ou Bertola et al., 2011 Human Mutation 32: E2189-E2210 ("Bertola 2011"), cada um dos quais é incorporado por referência a este documento em sua totalidade.
[0111] Por exemplo, as substituições de aminoácidos em uma posição particular de hIDUA podem ser selecionadas a partir dos resíduos de aminoácidos não conservados correspondentes encontrados naquela posição nos ortólogos de IDUA representados na FIG. 2 (mostrando o alinhamento de ortólogos como relatou Maita et al., 2013, PNAS 110:14628, Fig.
S8, que é incorporado a este documento por referência em sua totalidade), com a condição de que tais substituições não incluam nenhuma das mutações deletérias mostradas na FIG. 3 ou relatadas em Venturi 2002 ou Bertola 2011 acima.
O produto transgene resultante pode ser testado usando ensaios convencionais in vitro, em cultura de células ou animais de teste para garantir que a mutação não perturbe o funcionamento da IDUA.
As substituições, deleções ou adições de aminoácidos preferenciais devem ser aquelas que mantêm ou aumentam a atividade enzimática, estabilidade ou meia- vida de IDUA, como testado por ensaios convencionais in vitro, em cultura de células ou modelos animais para MPS I.
Por exemplo, a atividade enzimática do produto transgene pode ser avaliada usando um ensaio de enzimas convencional com 4-metilumbeliferil a-L-iduronida como substrato (vide, por exemplo, Hopwood et al., 1979, Clin Chim Acta 92: 257-265; Clements et al., 1985, Eur J Biochem 152: 21-28; e Kakkis et al., 1994, Prot Exp Purif 5: 225-232 para ensaios de enzimas IDUA exemplares que podem ser usados, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência em sua totalidade). A capacidade do produto transgene de corrigir fenótipos de MPS I pode ser avaliada em cultura de células; por exemplo, transduzindo células MPS I em cultura com um vetor viral ou outro construto de expressão de DNA que codifica hIDUA ou um derivado; adicionando a rHuGlyIDUA ou um derivado às células MPS I em cultura; ou co-cultivando células
MPS I com células hospedeiras humanas modificadas para expressar e secretar rHuGlyIDUA ou um derivado e determinando a correção do defeito nas células cultivadas MPS I, por exemplo, detectando a atividade da enzima IDUA e/ou a redução no armazenamento de GAG nas células MPS I em cultura (vide, por exemplo, Myerowitz & Neufeld, 1981, J Biol Chem 256: 3044-3048; e Anson et al. 1992, Hum Gene Ther 3: 371-379, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência em sua totalidade).
5.2.8. Construtos
[0112] Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento compreendem os seguintes elementos na seguinte ordem: a) uma primeira sequência de ITR, b) uma primeira sequência de ligante, c) uma sequência de promotor, d) uma segunda sequência de ligante, e) uma sequência de íntron, £f) uma terceira sequência de ligante, g) uma sequência que codifica o transgene (por exemplo, IDUA), h) uma quarta sequência de ligante, i) uma sequência poli A, j) uma quinta sequência de ligante e k) uma segunda sequência de ITR.
[0113] Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento compreendem os seguintes elementos na seguinte ordem: a) uma sequência de promotor e b) uma sequência que codifica o transgene (por exemplo, IDUA). Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento compreendem os seguintes elementos na seguinte ordem: a) uma sequência de promotor e b) uma sequência que codifica o transgene (por exemplo, IDUA), em que o transgene compreende um peptídeo sinal.
[0114] Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento compreendem os seguintes elementos na seguinte ordem: a) uma primeira sequência de ITR, b) uma primeira sequência de ligante, c) uma sequência de promotor, d) uma segunda sequência de ligante, e) uma sequência de íntron, £f) uma terceira sequência de ligante, g) uma primeira sequência de UTR, h) uma sequência que codifica o transgene (por exemplo, IDUA), i) uma segunda sequência de UTR, j) uma quarta sequência de ligante, k) uma sequência poli A, 1) uma quinta sequência de ligante e m) uma segunda sequência de ITR.
[0115] Em certas modalidades, os vetores virais fornecidos neste documento compreendem os seguintes elementos na seguinte ordem: a) uma primeira sequência de ITR, b) uma primeira sequência de ligante, c) uma sequência de promotor, d) uma segunda sequência de ligante, e) uma sequência de íntron, £f) uma terceira sequência de ligante, g) uma primeira sequência de UTR, h) uma sequência que codifica o transgene (por exemplo, IDUA), i) uma segunda sequência de UTR, j) uma quarta sequência de ligante, k) uma sequência poli A, 1) uma quinta sequência de ligante e m) uma segunda sequência de ITR, em que o transgene compreende um peptídeo sinal e em que o transgene codifica hIDUA.
5.2.9. Fabricação e teste de vetores
[0116] Os vetores virais fornecidos neste documento podem ser fabricados usando células hospedeiras. Os vetores virais fornecidos neste documento podem ser fabricados usando células hospedeiras de mamíferos, por exemplo, A549, WEHI, 10T1/2, BHK, MDCK, COS1, COS7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa, 293, Saos, c2C12, L, HT1080, HepG2, fibroblastos primários, hepatócitos e células de mioblastos. Os vetores virais fornecidos neste documento podem ser fabricados usando células hospedeiras de humano, macaco, camundongo, rato, coelho ou hamster.
[0117] As células hospedeiras são estavelmente transformadas com as sequências que codificam o transgene e elementos associados (isto é, o genoma do vetor) e os meios de produção de vírus nas células hospedeiras, por exemplo, os genes de replicação e de capsídeo (por exemplo, os genes rep e cap de AAV). Para um método de produção de vetores AAV recombinantes com capsídeos AAV8, vide Seção IV da Descrição Detalhada da Patente US Nº 7.282.199 B2, que é incorporada a este documento por referência em sua totalidade. Títulos de cópia do genoma dos referidos vetores podem ser determinados, por exemplo, por análise TAQMANO. Vírions podem ser recuperados, por exemplo, por sedimentação com CsCl>.
[0118] Os ensaios in vitro, por exemplo, ensaios de cultura de células, podem ser usados para medir a expressão de transgene de um vetor descrito neste documento, indicando, assim, por exemplo, a potência do vetor. Por exemplo, as linhagens celulares HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11 ou ReNcell VM, ou outras linhagens celulares que são derivadas a partir de células neuronais ou gliais ou progenitores de células neuronais ou gliais podem ser usadas para avaliar a expressão de transgene. Uma vez expresso, as características do produto expresso (isto é, HuGlIyIDUA) podem ser determinadas, incluindo a determinação dos padrões de glicosilação e sulfatação de tirosina associados à HuGlyIDUA.
5.2.10. Composições
[0119] Composições são descritas compreendendo um vetor que codifica um transgene descrito neste documento e um carregador adequado. Um carregador adequado (por exemplo, para administração ao LCR e, por exemplo, a células neuronais) seria prontamente selecionado por um versado na técnica.
5.3 TERAPIA GÊNICA
[0120] Métodos são descritos para a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um construto transgene a sujeitos humanos com MPS I. Mais particularmente, métodos para administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um construto transgene a pacientes com MPS I, particularmente, para administração ao LCR são descritos. Em modalidades particulares, tais métodos para administração ao LCR de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um construto transgene podem ser usados para tratar pacientes com síndrome de Hurler ou síndrome de Hurler-Scheie.
5.3.1. Populações de Pacientes Alvo
[0121] Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes diagnosticados com MPS IL. Em modalidades específicas, os pacientes foram diagnosticados com síndrome de Hurler-Scheie. Em modalidades específicas, os pacientes foram diagnosticados com síndrome de Scheie. Em modalidades específicas, os pacientes foram diagnosticados com síndrome de Hurler.
[0122] Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes diagnosticados com MPS I grave. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes diagnosticados com MPS I atenuada.
[0123] Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes diagnosticados com MPS 1L que foram identificados como responsivos ao tratamento com IDUA, por exemplo, hIDUA.
[0124] Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes pediátricos. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com menos de três anos de idade. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com 2 a 4 anos de idade. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com 3 a 8 anos de idade. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com 8 a 16 anos de idade. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com 6 a 18 anos de idade. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com 6 anos de idade ou mais. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com menos de 3 anos de idade. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com 4 meses ou mais, mas com menos de 9 meses. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com 9 meses ou mais, mas com menos de 18 meses. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com 18 meses ou mais, mas com menos de 3 anos. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes com mais de 10 anos de idade. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes adolescentes. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes adultos.
[0125] Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas a pacientes diagnosticados com MPS 1L que foram identificados como responsivos ao tratamento com IDUA, por exemplo, hIDUA, injetada no LCR antes do tratamento com terapia gênica.
5.3.2. Dosagem e Modo de Administração
[0126] Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas ao LCR por meio de administração intratecal (isto é, injeção no espaço subaracnoide de modo que os vetores recombinantes se distribuam através do LCR e transduzam células no SNC). Isso pode ser realizado de várias maneiras — por exemplo, por injeção intracraniana (cisternal ou ventricular) ou injeção na cisterna lombar. Em certas modalidades, a administração intratecal é realizada por meio de injeção intracisternal (IC) (por exemplo, na cisterna magna). Em modalidades específicas, a injeção intracisternal é realizada por punção suboccipital guiada por CT. Em modalidades específicas, a injeção intratecal é realizada por punção lombar. Em modalidades específicas, a injeção no espaço subaracnoide é realizada por punção em C1-2 quando viável para o paciente. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas ao SNC por meio de administração intranasal. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas ao SNC por meio de injeção intraparenquimal. Em certas modalidades, a injeção intraparenquimal é direcionada ao striatum. Em certas modalidades, a injeção intraparenquimal é direcionada à matéria branca. Em certas modalidades, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante são administradas ao LCR por qualquer meio conhecido na técnica, por exemplo, por qualquer meio divulgado em Hocquemiller et al., 2016, Human Gene Therapy 27 (7): 478-496, que é incorporado a este documento por referência em sua totalidade.
[0127] O vetor recombinante deve ser administrado ao LCR em uma dose que mantenha uma concentração de rHuGlyIDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 9,25 a 277 ug/mL. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém uma concentração de rHuGlyIDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 9,25, 16, 46, 92, 185 ou 277 pg/ml. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém uma concentração de rHuGlyIDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 9,25, 16, 46, 92, 185 ou 277 pg/ml. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém uma concentração de rHuGlyIDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 9,25 pg/ml. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém uma concentração de rHuGlyIDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 16 pg/mL. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém uma concentração de rHuGlyIDUA no LCR a uma Cnin de pelo menos 46 ug/mL. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém uma concentração de rHuGlyIDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 92 uvg/mL. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém uma concentração de rHuGlyIDUA no LCR a uma Cmin de pelo menos 185 pg/mL. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém uma concentração de rHuGlyIDUA no LCR a uma Cnin de pelo menos 277 upg/mL.
[0128] Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém 1,00 a 30,00 mg de rHuGlyIDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém 1,00, 1,74, 5,00 10,00, 20,00 ou 30,00 mg de rHuGlyIDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém 1,00 do total de rHuGlyIDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém 1,74 mg de rHuGlyIDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém 5,00 mg de rHuGlyIDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém 10,00 mg de rHuGlyIDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém 20,00 mg de rHuGlyIDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém 30,00 mg de rHuGlyIDUA total no LCR.
[0129] Em certas modalidades, para pacientes pediátricos, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém
1,29 a 38,88 mg de rHuGlyIDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes adultos, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém 1,29, 2,25, 8,40 12,96, 25,93 ou 38,88 mg de rHuGlyIDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes adultos, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém 1,29 mg de rHuGlyIDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes adultos, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém 2,25 mg de rHuGlyIDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes adultos, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém 8,40 mg de rHuGlyIDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes adultos, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém 12,96 mg de rHuGlyIDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes adultos, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém 25,93 mg de rHuGlyIDUA total no LCR. Em certas modalidades, para pacientes adultos, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém 38,88 mg de rHuGlyIDUA total no LCR.
[0130] Para administração intratecal, doses terapeuticamente eficazes do vetor recombinante devem ser administradas ao LCR em um volume de injeção, preferencialmente de até cerca de 20 mL. Um carregador adequado para injeção intratecal, tal como Solução Elliotts B, deve ser usado como veículo para os vetores recombinantes. A Solução Elliots B (nome genérico: cloreto de sódio, bicarbonato de sódio, dextrose anidra, sulfato de magnésio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio e fosfato de sódio) é uma solução estéril, não pirogênica e isotônica, sem conservantes bacteriostáticos e é usada como diluente para administração intratecal de quimioterapêuticos.
[0131] As concentrações de LCR podem ser monitoradas medindo diretamente a concentração de rHuGlyIDUA no líquido LCR obtido a partir de punções occipitais ou lombares ou estimadas por extrapolação a partir de concentrações de rHuGlyIDUA detectadas no soro do paciente. Em certas modalidades, 10 ng/mL a 100 ng/mL de rHuGlyIDUA no soro é indicativo de 1 a 30 mg de rHuGlyIDUA no LCR. Em certas modalidades, o vetor recombinante é administrado ao LCR em uma dose que mantém de 10 ng/ml a 100 ng/ml de rHuGlyIDUA no soro.
[0132] Em certas modalidades, as dosagens são medidas pelo número de cópias do genoma administradas ao LCR do paciente (por exemplo, injetadas por punção suboccipital ou punção lombar). Em certas modalidades, 1 x 10!? a 2 x 10!º cópias do genoma são administradas. Em certas modalidades, 5 x 10"? a 2 x 10º cópias do genoma são administradas. Em modalidades específicas, 1 x 10º? a 1 x 10!º cópias do genoma são administradas. Em modalidades específicas, 1 x 10º? a 2 x 101? cópias do genoma são administradas. Em modalidades específicas, 6 x 101? a 8 x 103 cópias do genoma são administradas. Em uma modalidade específica, 1,2 x 10"? cópias do genoma são administradas. Em outra modalidade específica, 2,0 x 10? cópias do genoma são administradas. Em outra modalidade específica, 2,2 x 10º? cópias do genoma são administradas. Em outra modalidade específica, 6,0 x 10!? cópias do genoma são administradas. Em outra modalidade específica, 1,0 x 10"? cópias do genoma são administradas. Em outra modalidade específica, 1,1 x 10"? cópias do genoma são administradas. Em outra modalidade específica, 3,0 x 10º? cópias do genoma são administradas. Em outra modalidade específica, 5,0 x 10!? cópias do genoma são administradas. Em outra modalidade específica, 5,5 x 10º? cópias do genoma são administradas. Em uma modalidade específica, 1,2 x 10"? a 6,0 x 10"? cópias do genoma são administradas. Em outra modalidade específica, 2,0 x 10"? a 1,0 x 10º? cópias do genoma são administradas. Em outra modalidade específica, 2,2 x 10º a 1,1 x 10"? cópias do genoma são administradas. Em outra modalidade específica, 6,0 x 10"? a 3,0 x 10!? cópias do genoma são administradas. Em outra modalidade específica, 1,0 x 101? a 5,0 x 10"? cópias do genoma são administradas. Em outra modalidade específica, 1,1 x 10"? a 5,5 x 10!? cópias do genoma são administradas.
[0133] Em certas modalidades, uma dose plana de 1 x 10º? de cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico. Em certas modalidades, uma dose fixa de 5,6 x 10º? cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico. Em certas modalidades, uma dose plana de 1 x 10!? a 5,6 x 10º"? de cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico. Em certas modalidades, uma dose fixa de 1 x 101? a 5,6 x 101? cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico. Em uma modalidade específica, uma dose fixa de 1,2 x 10"? cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico. Em outra modalidade específica, uma dose fixa de 2,0 x 10"? cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico. Em uma modalidade específica, uma dose fixa de 2,2 x 10”? cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico. Em outra modalidade específica, uma dose fixa de 6,0 x 10"? cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico. Em outra modalidade específica, uma dose fixa de 1,0 x 10"? cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico. Em outra modalidade específica, uma dose fixa de 1,1 x 10"? cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico.
Em outra modalidade específica, uma dose fixa de 3,0 x 10º"? cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico.
Em outra modalidade específica, uma dose fixa de 5,0 x 10º"? cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico.
Em outra modalidade específica, uma dose fixa de 5,5 x 10"? cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico.
Em uma modalidade específica, uma dose fixa de 1,2 x 10"? a 6,0 x 10"? cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico.
Em outra modalidade específica, uma dose fixa de 2,0 x 10"? a 1,0 x 103 cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico.
Em outra modalidade específica, uma dose fixa de 2,2 x 10º a 1,1 x 101? cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico.
Em outra modalidade específica, uma dose fixa de 6,0 x 10º? a 3,0 x 10º? cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico.
Em outra modalidade específica, uma dose fixa de 1,0 x 10º*? a 5,0 x 101? cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico.
Em outra modalidade específica, uma dose fixa de 1,1 x 10"? a 5,5 x 101? cópias do genoma é administrada a um paciente pediátrico.
Em certas modalidades, uma dose fixa de 2,6 x 10!”ºcópias do genoma é administrada a um paciente adulto.
Em certas modalidades, uma dose fixa de 1,3 x 10!? do genoma é administrada a um paciente adulto.
Em certas modalidades, uma dose plana de 1,4 x 10"? de cópias do genoma é administrada a um paciente adulto.
Em certas modalidades, uma dose fixa de 7,0 x 10º!? cópias do genoma é administrada a um paciente adulto.
Em certas modalidades, uma dose plana de 1,4 x 10"? a 7,0 x 10"? de cópias do genoma é administrada a um paciente adulto.
Em certas modalidades, uma dose plana de 1 x 10!? a 5,6 x 101? de cópias do genoma é administrada a um paciente adulto.
[0134] Em certas modalidades, as dosagens são medidas pelo número de cópias do genoma administradas ao LCR do paciente (por exemplo, injetadas por meio de punção suboccipital ou punção lombar) por grama de massa cerebral. Em certas modalidades, 2 x 10º cópias do genoma por grama de massa cerebral são administradas. Em certas modalidades, 1 x 10ºº cópias do genoma por grama de massa cerebral são administradas. Em certas modalidades, 5 x 10ºº cópias do genoma por grama de massa cerebral são administradas. Em certas modalidades, 1 x 10º a 2 x 10% cópias do genoma por grama de massa cerebral são administradas. Em certas modalidades, 2 x 10º a 1 x 10º cópias do genoma por grama de massa cerebral são administradas. Em certas modalidades, 5 x 10º a 2 x 10!º cópias do genoma por grama de massa cerebral são administradas. Em modalidades específicas, 9 x 10º a 1 x 10!º cópias do genoma por grama de massa cerebral são administradas. Em modalidades específicas, 1 x 10º a 1,5 x 10% cópias do genoma por grama de massa cerebral são administradas. Em modalidades específicas, 1 x 10!º a 5 x 10º cópias do genoma por grama de massa cerebral são administradas. Em modalidades específicas, 5 x 10ºº a 6 x 10!º cópias do genoma por grama de massa cerebral são administradas.
[0135] Em uma modalidade, um AAV recombinante não replicante do capsídeo do serotipo 9 contendo um cassete de expressão hIDUA (rYrAAV9.hIDUA) é usado para o tratamento. O serotipo AAV9 permite a expressão eficiente da proteína hIDUA no SNC após a administração IC. O genoma do vetor contém um cassete de expressão de hIDUA flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV 2. A expressão do cassete é conduzida por um promotor constitutivo forte.
[0136] Em certas modalidades, o vetor recombinante descrito neste documento (por exemplo, O rAAV9.hIDUA) pode ser administrado IC (por injeção suboccipital) como uma dose única plana variando de 1,4 x 10º? GC (1,1 x 10º!º GC/g de massa cerebral) a 7,0 x 103 GC (5,6 x 10º GC/g de massa cerebral) (preferencialmente em um volume de cerca de 5 a 20 ml ou em um volume de cerca de 5 ml ou menos). No caso de o paciente ter anticorpos neutralizantes para AAV, doses na faixa alta podem ser usadas. Em certas modalidades, o vetor recombinante descrito neste documento (por exemplo, O rAAV9.hIDUA) pode ser administrado IC (por injeção suboccipital) como uma dose única plana variando de 2,6 x 10"? GC (2 x 10º GC/g de massa cerebral) a 1,3 x 1083 GC (1 x 10º GC/g de massa cerebral) (preferencialmente, em um volume de cerca de 5 a 20 ml ou em um volume de cerca de 5 ml ou menos). Quando o paciente tem 4 meses ou mais, mas menos de 9 meses, em uma modalidade, o vetor recombinante descrito neste documento (por exemplo, o rAAV9.hIDUA) pode ser administrado IC (por injeção suboccipital) como uma dose única plana variando de 6,0 x 10º? GC (1,0 x 10º GC/g de massa cerebral) a 3,0 x 10º"? GC (5 x 10º GC/g de massa cerebral) (preferencialmente, em um volume de cerca de 5 a 20 ml, ou em um volume de cerca de 5ml ou menos) e, em outra modalidade, o vetor recombinante descrito neste documento (por exemplo, a rAAV9.hIDUVA) pode ser administrado IC (por injeção suboccipital) como uma dose única plana variando de 1,2 x 102 GC (2 x 10º GC/g de massa cerebral) a 6,0 x 10”GC (1 x 10º GC/g de massa cerebral) (preferencialmente, em um volume de cerca de a 20 ml, ou em um volume de cerca de 5 ml ou menos). Quando o paciente tem 9 meses ou mais, mas menos de 18 meses, em uma modalidade, o vetor recombinante descrito neste documento (por exemplo, a rAAV9.hIDUVA) pode ser administrado IC (por injeção suboccipital) como uma dose única plana variando de 1,0 x 103 GC (1,0 x 10!º GC/g de massa cerebral) a 5,0 x 10!3 GC (5 x 104º GC/g de massa cerebral) (preferencialmente, em um volume de cerca de 5 a 20 ml, ou em um volume de cerca de 5ml ou menos), e em outra modalidade, o vetor recombinante descrito neste documento (por exemplo, a rAAV9.hIDUA) pode ser administrado IC (por injeção suboccipital) como uma dose única plana variando de 2,0 x 10)? GC (2 x 10º GC/g de massa cerebral) a 1,0 x 10? GC (1 x 10!º GC/g de massa cerebral) (preferencialmente, em um volume de cerca de 5 a 20 ml ou em um volume de cerca de 5 ml ou menos). Quando o paciente tem 18 meses ou mais, mas menos de 3 anos, em uma modalidade, o vetor recombinante descrito neste documento (por exemplo, a rAAV9.hIDUA) pode ser administrado IC (por injeção suboccipital) como uma dose única plana variando de 1,1 x 101? GC (1,0 x 10!º GC/g massa cerebral) a 5,5 x 101? GC (5 x 10!º GC/g de massa cerebral) (preferencialmente, em um volume de cerca de 5 a 20 ml, ou em um volume de cerca de 5ml ou menos) e, em outra modalidade, o vetor recombinante descrito neste documento (por exemplo, a rAAV9.hIDUA) pode ser administrado IC (por injeção suboccipital) como uma dose única plana variando de 2,2 x 10º GC (2 x 10º GC/g de massa cerebral) a 1,1 x 10º? GC (1 x 10!º GC/g de massa cerebral) (preferencialmente, em um volume de cerca de 5 a 20 ml ou em um volume de cerca de 5 ml ou menos). Em uma modalidade específica, o vetor recombinante descrito neste documento (por exemplo, a rAAV9.hIDUA) pode ser administrado IC (por injeção suboccipital) como uma dose única plana na Dose 1 ou Dose 2, como listado em e de acordo com a Tabela 1 abaixo. Em outra modalidade específica, o vetor recombinante descrito neste documento (por exemplo, a rAAV9.hIDUA) pode ser administrado IC (por injeção suboccipital) como uma dose única plana na Dose 1 ou Dose 2 como listado em e de acordo com a Tabela 2 abaixo.
[0137] Tabela 1. Dose a ser administrada a um paciente baseada na idade do paciente na dosagem. Massa Dose 1 Dose 2 cerebral |cc total GC total Idade do presumida 9 10 Paciente na (9) (2x 10 (1 x 10!º GC/g de Dosagem GC/g de massa cerebral massa cerebral) [2 4 a < 9 meses [500 — | 1,2 x 10º 6,0 x 10º 1000 1,0 = 105 2 18 meses a < 3 |1100 1,1 x 1043 2,2 x 10%? anos
[0138] Tabela 2. Dose a ser administrada a um paciente baseada na idade do paciente na dosagem. Massa Dose 1 Dose 2 cerebral |cc total GC total Idade do presumida 10 Paciente na ta) (1,0 x 10% (5 x 104º GC/g de Dosagem GC/g de massa cerebral) massa cerebral)
> 4 a< 9 meses 600 6,0 x 102 3,0 x 103 ameno Jesse pec 1,1 x 103 anos
5.4 TERAPIAS DE COMBINAÇÃO
5.4.1. Co-terapia com imunossupressão
[0139] Embora a distribuição de rHuGlyIDUA deva minimizar as reações imunológicas, a fonte potencial mais clara de toxicidade relacionada à terapia gênica direcionada ao SNC é a geração de imunidade contra a proteína hIDUA expressa em sujeitos humanos que são geneticamente deficientes em IDUA e, portanto, potencialmente não tolerantes à proteína e/ou ao vetor usados para distribuir o transgene. Assim, em uma modalidade preferencial, é aconselhável co-tratar o paciente com terapia de imunossupressão — especialmente ao tratar pacientes com doença grave que têm níveis próximos de zero de IDUA (por exemplo, com síndrome de Hurler). Terapias de imunossupressão envolvendo um regime de tacrolimo ou rapamicina (sirolimo) em combinação com ácido micofenólico ou outros regimes de imunossupressão usados em procedimentos de transplante de tecidos podem ser empregadas. Tal tratamento de imunossupressão pode ser administrado durante o curso da terapia gênica e, em certas modalidades, o pré- tratamento com terapia de imunossupressão pode ser preferido. A terapia de imunossupressão pode ser continuada subsequentemente ao tratamento de terapia gênica, baseada no julgamento do médico encarregado, e pode ser posteriormente retirada quando a tolerância imunológica for induzida; por exemplo, após 180 dias.
[0140] Em certas modalidades, os métodos de tratamento fornecidos neste documento são administrados com um regime de imunossupressão compreendendo prednisolona, ácido micofenólico e tacrolimo. Em certas modalidades, os métodos de tratamento fornecidos neste documento são administrados com um regime de imunossupressão compreendendo prednisolona, ácido micofenólicoe rapamicina (sirolimo). Em certas modalidades, os métodos de tratamento fornecidos neste documento são administrados com um regime de imunossupressão que não compreende tacrolimo. Em certas modalidades, os métodos de tratamento fornecidos neste documento são administrados com um regime de imunossupressão compreendendo um ou mais corticosteroides, tal como metilprednisolona e/ou prednisolona, bem como tacrolimo e/ou sirolimo. Em certas modalidades, a terapia de imunossupressão compreende a administração de uma combinação de (a) tacrolimo e ácido micofenólico, ou (b) rapamicina e ácido micofenólico ao referido sujeito antes ou simultaneamente ao tratamento com IDUA humana e continuando posteriormente. Em certas modalidades, a terapia de imunossupressão é retirada após 180 dias. Em certas modalidades, a terapia de imunossupressão é retirada após 30, 60, 90, 120, 150 ou 180 dias.
[0141] Em certas modalidades, tacrolimo é administrado em uma dose que resulta em uma concentração sérica de 5 a 10 ng/mL. Em certas modalidades, tacrolimo é administrado em uma dose que resulta em uma concentração sérica de 4 a 8 ng/ml. Em certas modalidades, particularmente quando o paciente tem menos de 3 anos de idade, tacrolimo é administrado em uma dose que resulta em uma concentração sérica de 2 a 4 ng/mL. Em certas modalidades, MMF é administrado em uma dose que resulta em uma concentração sérica de 2 a 3,5 pg/ml. Em certas modalidades, tacrolimo é administrado em uma dose que resulta em uma concentração sérica de 5 a 10 ng/ml e MMF é administrado em uma dose que resulta em uma concentração sérica de 2 a 3,5 ug/mL. Em certas modalidades, a concentração sérica é alcançada por titulação de tacrolimo e/ou MMF após a medição dos níveis mínimos de tacrolimo e/ou MMF.
[0142] Em — certas “modalidades, a metilprednisolona é administrada em uma dose de 10 mg/kg por via intravenosa uma vez. Em certas modalidades, prednisolona é administrada em uma dose de 0,5 mg/kg por via oral uma vez ao dia. Em certas modalidades, prednisolona é gradualmente reduzida e então descontinuada. Em certas modalidades, tacrolimo é administrado 1 mg pela boca, duas vezes ao dia, para manter um nível sanguíneo alvo de 4-8 ng/ml. Em certas modalidades, particularmente quando o paciente tem menos de 3 anos de idade, tacrolimo é administrado 0,05 mg/kg pela boca duas vezes ao dia para manter um nível sanguíneo alvo de 2-4 ng/ml. Em certas modalidades, sirolimo também é administrado. O paciente pode ser pré-dosado com sirolimo, que é então mantido em um nível sanguíneo alvo de 4-8 ng/ml durante o regime. No entanto, em certas modalidades, quando o paciente tem menos de 3 anos de idade, o paciente é preferencialmente pré-dosado com sirolimo que é então mantido em um nível sanguíneo alvo de 1-3 ng/ml durante o regime. Em certas modalidades, a metilprednisolona é administrada em uma dose de mg/kg por via intravenosa uma vez, prednisolona é administrada em uma dose de 0,5 mg/kg por via oral uma vez ao dia, tacrolimo é administrado 0,2 mg/kg pela boca uma vez ao dia e sirolimo é administrado.
[0143] Em certas modalidades, a rapamicina é administrada em uma dose de 2 ou 4 mg/kg por via oral uma vez ao dia. Em certas modalidades, MMF é administrado em uma dose de 25 mg/kg por via oral, duas vezes ao dia. Em certas modalidades, rapamicina é administrada em uma dose de 2 ou 4 mg/kg por via oral uma vez ao dia e MMF é administrado em uma dose de 25 mg/kg por via oral duas vezes ao dia. Em certas modalidades, rapamicina é administrada em uma dose que resulta em uma concentração sérica de 5 a 15 ng/ml. Em certas modalidades, MMF é administrado em uma dose que resulta em uma concentração sérica de 2 a 3,5 pg/mL. Em certas modalidades, rapamicina é administrada em uma dose que resulta em uma concentração sérica de 5 a 15 ng/ml e MMF é administrado em uma dose que resulta em uma concentração sérica de 2 a 3,5 ug/mL. Em certas modalidades, a concentração sérica é alcançada por titulação de rapamicina e/ou MMF após a medição dos níveis mínimos de rapamicina e/ou MMF.
5.4.2. Co-terapia com outros tratamentos, incluindo padrão de atendimento
[0144] As combinações de administração da HuGlyIDUA ao LCR acompanhadas pela administração de outros tratamentos disponíveis são abrangidas pelos métodos da invenção. Os tratamentos adicionais podem ser administrados antes, simultaneamente ou subsequentemente ao tratamento de terapia gênica. Os tratamentos disponíveis para MPS I que poderiam ser combinados com a terapia gênica da invenção incluem, mas não estão limitados a, terapia de substituição enzimática (TRE) usando laronidase administrada sistemicamente ou ao LCR; e/ou terapia de TCTH. Em outra modalidade, TRE pode ser administrado usando a glicoproteina rHuGlyIDUA produzida em linhagens celulares humanas por tecnologia de DNA recombinante. As linhagens celulares humanas que podem ser usadas para tal produção de glicoproteína recombinante incluem, mas não estão limitadas a, HT-22, SK-N-MC, HCN-1A, HCN-2, NT2, SH-SY5y, hNSC11, ReNcell VM, células 293 renais embrionárias humanas (HEK293), fibrossarcoma HT-1080, HKB-11, CAP, HuH-7 e linhagens celulares retinais, PER.C6 ou RPE, para citar alguns (vide, por exemplo, Dumont et al., 2016, Critical Rev in Biotech 36 (6): 1110-1122 “Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives” ("Linhagens celulares humanas para fabricação de biofarmacêuticos: história, status e perspectivas futuras"), que é incorporado por referência em sua totalidade para uma revisão das linhagens celulares humanas que poderiam ser usadas para a produção recombinante da glicoproteína rHuGlyIDUA). Para garantir glicosilação completa, especialmente sialilação e sulfatação de tirosina, a linhagem celular usada para produção pode ser aprimorada modificando as células hospedeiras para co-expressar a-2,6-sialiltransferase (ou tanto a-2,3- quanto a- 2,6-sialiltransferases) e/ou enzimas TPST-1 e TPST-2 responsáveis pela tirosina-O-sulfatação.
5.5 BIOMARCADORES/AMOSTRAGEM/EFICÁCIA DE MONITORAMENTO
[0145] À eficácia pode ser monitorada medindo a função cognitiva (por exemplo, prevenção ou redução do declínio neurocognitivo); reduções em biomarcadores de doença (tal como GAG) no LCR e/ou soro; e/ou aumento da atividade da enzima IDUA no LCR e/ou soro. Sinais de inflamação e outros eventos de segurança também podem ser monitorados.
5.5.1. Marcadores de Doença
[0146] Em certas modalidades, a eficácia do tratamento com o vetor recombinante é monitorada medindo o nível de um biomarcador da doença no paciente. Em certas modalidades, o nível do biomarcador da doença é medido no LCR do paciente. Em certas modalidades, o nível do biomarcador da doença é medido no soro do paciente. Em certas modalidades, o nível do biomarcador da doença é medido na urina do paciente. Em certas modalidades, o biomarcador da doença é GAG. Em certas modalidades, o biomarcador da doença é a atividade da enzima IDUA. Em certas modalidades, o biomarcador da doença é inflamação. Em certas modalidades, o biomarcador da doença é um evento de segurança.
5.5.2. Testes de Função neurocognitiva
[0147] Em certas modalidades, a eficácia do tratamento com o vetor recombinante é monitorada medindo o nível de função cognitiva no paciente. A função cognitiva pode ser medida por qualquer método conhecido por um versado na técnica. Em certas modalidades, a função cognitiva é medida por meio de um instrumento validado para medir o quociente de inteligência (QI). Em modalidades específicas, o QI é medido pela Wechsler Abbreviated Scale of Intelligence, Second Edition (WASI-II) (Escala Abreviada de Inteligência de Wechsler, Segunda Edição). Em certas modalidades, a função cognitiva é medida por meio de um instrumento validado para medir memória. Em modalidades específicas, a memória é medida pelo Hopkins Verbal Learning Test (HVLT) (Teste de Aprendizado Verbal de Hopkins). Em certas modalidades, a função cognitiva é medida por meio de um instrumento validado para medir atenção. Em modalidades específicas, a atenção é medida pelo Test Of Variables of Attention (TOVA) (Teste de Variáveis de Atenção). Em certas modalidades, a função cognitiva é medida por meio de um instrumento validado para medir um ou mais dentre QI, memória e atenção.
5.5.3. Alterações físicas
[0148] Em certas modalidades, a eficácia do tratamento com o vetor recombinante é monitorada medindo as características físicas associadas à deficiência de armazenamento lisossomal no paciente. Em certas modalidades, as características físicas são lesões de armazenamento. Em certas modalidades, a característica física é a baixa estatura. Em certas modalidades, a característica física são traços faciais grosseiros. Em certas modalidades, a característica física é a apneia obstrutiva do sono. Em certas modalidades, a característica física é deficiência auditiva. Em certas modalidades, a característica física é deficiência visual. Em modalidades específicas, a deficiência visual é devido à turvação da córnea. Em certas modalidades, a característica física é a hidrocefalia. Em certas modalidades, a característica física é a compressão da medula espinhal. Em certas modalidades, a característica física é hepatosplenomegalia. Em certas modalidades, as características físicas são deformidades ósseas e articulares. Em certas modalidades, a característica física é doença da válvula cardíaca. Em certas modalidades, as características físicas são infecções respiratórias superiores recorrentes. Em certas modalidades, a característica física é a síndrome do túnel do carpo. Em certas modalidades, a característica física é macroglossia (língua ampliada). Em certas modalidades, a característica física é cordas vocais ampliadas e/ou mudança na voz. Tais características físicas podem ser medidas por qualquer método conhecido por um versado na técnica.
TABELA DE SEQUÊNCIAS SEQ ID | Descrição Sequência NO: 1 Sequência de|MRPLRPRAAL LALLASLLAA PPVAPAEAPH aminoácidos LVHVDAARAL WPLRRFWRST GFCPPLPHSQO de IDUA | ADOYVLSWDO “QLNLAYVGAV PHRGIKQVRT humana HWLLELVTTR GSTGRGLSYN FTHLDGYLDL
LRENQLLPGF ELMGSASGHF TDFEDKQQVF EWKDLVSSLA RRYIGRYGLA HVSKWNFETW NEPDHHDFDN VSMTMOGFLN YYDACSEGLR AASPALRLGG PGDSFHTPPR SPLSWGLLRH CHDGTNFFTG EAGVRLDYIS LHRKGARSSI SILEQEKVVA QQIRQLFPKF ADTPIYNDEA DPLVGWSLPQ PWRADVTYAA MVVKVIAQHO NLLLANTTSA FPYALLSNDN AFLSYHPHPF AQRTLTARFOQ VNNTRPPHVO LLRKPVLTAM GLLALLDEEQ LWAEVSQAGT VLDSNHTVGV LASAHRPQOGP ADAWRAAVLI YASDDTRAHP NRSVAVTLRL RGVPPGPGLV YVTRYLDNGL CSPDGEWRRL GRPVFPTAEQ FRRMRAAEDP VAAAPRPLPA GGRLTLRPAL RLPSLLLVHV CARPEKPPGQ VTRLRALPLT QGQOLVLVWSD EHVGSKCLWT YEIQFSQDGK AYTPVSRKPS TFNLFEVFSPD TGAVSGSYRV RALDYWARPG
PFSDPVPYLE VPVPRGPPSP o e 2 Peptídeo MEYQILKMSL CLFILLFLTP GILC sinal de glicoproteína de oligodendróci to-mielina (hoMG) 3 Repressor MSVRRGRRPA RPGTRLSWLL CCSALLSPAA G celular de peptídeo sinal de genes estimulados por E1lA 2 (hCREG2) Conjunto de V |MEQRNRLGAL GYLPPLLLHA LLLFVADA e domínio transmembrana r contendo peptídeo sinal 2B (hVSTM2B) Peptídeo MVFSRRGGLG ARDLLLWLLL LAAWEVGSG sinal protocaderina alfa-1 (hPCADHA1l)
Peptídeo MAMVSAMSWV LYLWISACA sinal FAM19Al (TAFA1)
7 Peptídeo MNFLLSWVHW SLALLLYLHH AKWSQA sinal VEGF-A Peptídeo MERAAPSRRV PLPLLLLGGL ALLAAGVDA sinal fibulina-l Peptídeo MAPLRPLLIL ALLAWVALA sinal vitronectina
Peptídeo MRLLAKIICL MLWAICVA sinal Complemento Fator H
11 Peptídeo MRLLAFLSLL ALVLQETGT sinal opticina
12 Peptídeo MKWVTFISLL FLFSSAYS sinal albumina
13 Peptídeo MAFLWLLSCW ALLGTTFG sinal de quimotripsino geno
14 Peptídeo MYRMQOLLSCI ALILALVTNS sinal de interleucina- 2 Peptídeo MNLLLILTFV AAAVA sinal tripsinogênio -2 16 AAV1 MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPK
ANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVN AADAAALEHDKAYDQOQLKAGDNPYLRYNHADAE FOERLQEDTSFGGNLGRAVFOAKKRVLEPLGLV EEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGOQO PAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAV GPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCD STWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSAS TGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDW QRLINNNWGFRPKRLNFKLENIQVKEVTTNDGV TTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHOGCL PPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSEFYCL EYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPFHSSYAHSQ SLDRLMNPLIDQOYLYYLNRTONQSGSAQNKDLL FSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQORVSKTKTD NNNSNEFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHK DDEDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMIT DEEEIKATNPVATERFGTVAVNFOSSSTDPATG DVHAMGALPGMVWODRDVYLQOGPIWAKIPHTDG HFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPA EFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSK RWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRP
LAOL 17 AAV2 MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPK
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6. EXEMPLOS
6.1 EXEMPLO 1: cDNA de hIDUA
[0149] Un vetor baseado em cDNA de hIDUA é construído compreendendo um transgene compreendendo hIDUA (SEQ ID NO: 1). O transgene também compreende ácidos nucleicos compreendendo um peptídeo sinal escolhido a partir do grupo listado na Tabela 3. Opcionalmente, o vetor compreende adicionalmente um promotor.
6.2 EXEMPLO 2: CcDNAs de hIDUA substituídos
[0150] Un vetor baseado em cDNA de hIDUA é construído compreendendo um transgene compreendendo hIDUA com substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com a sequência de hIDUA de SEQ ID NO: 1, por exemplo, incluindo, mas não se limitando a, substituições de aminoácidos selecionadas a partir de resíduos não conservados correspondentes em ortólogos de IDUA mostrados na FIG. 2, com a condição de que tais mutações não incluam nenhuma que tenha sido identificada nos fenótipos de MPS I grave, grave-intermediária, intermediária ou atenuada mostrados na FIG. 3 (de Saito et al., 2014, Mol Genet Metab 111: 107-112, Table 3 listing 57 MPS 1 mutations (Tabela 3 listando 57 mutações de MPS LI), que é incorporado a este documento por referência em sua totalidade); ou relatado por Venturi et al., 2002, Human Mutation * 522 Online ("Venturi 2002"), ou Bertola et al., 2011 Human Mutation 32: E2189-E2210 ("Bertola 2011"), cada um dos quais é incorporado a estre documento por referência em sua totalidade. O transgene também compreende ácidos nucleicos compreendendo um peptídeo sinal escolhido a partir do grupo listado na Tabela 3. Opcionalmente, o vetor compreende adicionalmente um promotor.
6.3 EXEMPLO 3: Tratamento de MPS I em modelos animais com hIDUA ou hIDUA substituída
[0151] Um vetor baseado em cDNA de hIDUA é considerado útil para o tratamento de MPS I quando expresso como um transgene. A um modelo animal para MPS I, por exemplo, um modelo animal descrito em Clarke et al., 1997, Hum Mol Genet 6 (4): 503-511 (camundongos), Haskins et al., 1979, Pediatr Res 13 (11): 1294- 97 (gato doméstico de pelo curto), Menon et al., 1992, Genomics 14 (3): 763-768 (cachorro), ou Shull et al., 1982, Am J Pathol 109 (2): 244-248 (cachorro), é administrado um vetor recombinante que codifica hIDUA intratecalmente em uma dose suficiente para distribuir e manter uma concentração do produto transgene a uma Crin de pelo menos 9,25 pg/mL no LCR do animal. Após o tratamento, o animal é avaliado quanto à melhora nos sintomas consistente com a doença no modelo animal específico.
6.4 EXEMPLO 4: Tratamento de MPS I com hIDUA ou hIDUA substituída
[0152] Um vetor baseado em cDNA de hIDUA é considerado útil para o tratamento de MPS I quando expresso como um transgene. A um sujeito apresentando MPS I é administrado um vetor baseado em CDNA que codifica hIDUA intratecalmente em uma dose suficiente para distribuir e manter uma concentração do produto transgene em uma Cmin de pelo menos 9,25 pg/ml no LCR. Após o tratamento, o sujeito é avaliado quanto à melhora nos sintomas de MPS [. Antes, simultaneamente ou após a administração do vetor baseado em cDNA que codifica hIDUA, ao paciente é administrada terapia de imunossupressão que compreende rapamicina, MMF e prednisolona.
6.5 EXEMPLO 5: Protocolo Clínico de Tratamento de MPS 1
[0153] O exemplo a seguir estabelece um protocolo que pode ser usado para tratar sujeitos humanos com um vetor rAAV9.hIDUA para tratar MPS [.
[0154] População de Pacientes. Os pacientes a serem tratados podem incluir homens ou mulheres que tenham: * um diagnóstico de MPS I confirmado pela atividade enzimática, medida em plasma, fibroblastos ou leucócitos.
* déficit neurocognitivo em estágio inicial devido à MPS 1, definido como qualquer um dentre os seguintes, se não for explicável por nenhum outro fator neurológico ou psiquiátrico: º Uma pontuação de 21 de desvio padrão abaixo da média no teste de QI ou em 1 domínio de função neuropsicológica (compreensão verbal, memória, atenção ou raciocínio perceptivo).
º Evidência histórica documentada (registros médicos) de um declínio de >1 desvio padrão em teste sequencial.
[0155] Os pacientes podem incluir aqueles que seguem um regime estável de TRE (por exemplo, ALDURAZYME [laronidase] IV). Mulheres com potencial para engravidar devem apresentar um teste de gravidez de soro negativo no dia do tratamento. Sujeitos sexualmente ativos (tanto mulheres quanto homens) devem usar um método de contracepção de barreira medicamente aceito (por exemplo, preservativo, diafragma ou abstinência) até 24 semanas após a administração do vetor. Os pacientes que podem ser excluídos do tratamento intracisternal (IC) podem incluir sujeitos que têm contraindicação para injeção IC ou punção lombar. Contraindicações para uma injeção IC podem incluir qualquer um dos seguintes: * Histórico de cirurgia anterior na cabeça/pescoço que resultou em uma contraindicação para injeção IC.
* Ter alguma contraindicação para CT (ou contraste) ou para anestesia geral.
* Ter alguma contraindicação para RMI (ou gadolínio).
* Ter taxa de filtração glomerular estimada (eTFG) de <30 mL/min/1,73 mº.
[0156] Pacientes que receberam tratamento IT a qualquer momento e experienciaram uma reação adversa significativa considerada relacionada à administração IT não devem ser tratados com IC.
[0157] Pacientes com qualquer condição que o médico encarregado acredite não ser apropriada para terapia imunossupressora não devem receber tratamento (por exemplo, contagem absoluta de neutrófilos <1,3 x 10º/uL, contagem de plaquetas <100 x 10º?/ uL e hemoglobina <12 g/dL [homem] ou <10 g/dL [mulher]). Um regime alternativo de imunossupressão deve ser usado em qualquer paciente que tenha qualquer histórico de reação de hipersensibilidade ao sirolimo, MMF ou prednisolona.
[0158] Pacientes com histórico de linfoma ou outro câncer, exceto carcinoma de células escamosas ou basocelular da pele, não devem ser tratados, a menos que estejam em remissão completa por pelo menos 3 meses antes do tratamento.
[0159] Pacientes com alanina aminotransferase (ALT) ou aspartato aminotransferase (AST) >3 x limite superior ao normal (LSN) ou bilirrubina total >1,5 x LSN não devem ser tratados, a menos que o sujeito tenha um histórico previamente conhecido de síndrome de Gilbert e uma bilirrubina fracionada que mostre bilirrubina conjugada <35% da bilirrubina total.
[0160] Pacientes com um histórico de doenças infecciosas ou abuso de substâncias podem não ser candidatos ao tratamento. Por exemplo, um histórico de teste positivo para o vírus da imunodeficiência humana (HIV), histórico de hepatite B Ou hepatite C ativa ou recorrente ou testes de triagem positivos para hepatite B, hepatite C ou HIV; um histórico de abuso de álcool ou substâncias dentro de 1 ano antes do tratamento.
[0161] En uma modalidade, os pacientes são pacientes adultos. Em outra modalidade, os pacientes são pacientes pediátricos.
[0162] Tratamentos —“Administrados — Pré-tratamento com Terapia Imunossupressora. Antes da terapia gênica, oO paciente deve ser tratado com uma terapia imunossupressora para prevenir respostas imunológicas ao transgene e/ou capsídeo AAV. Tal terapia imunossupressora inclui prednisolona (60 mg PO QD Dias -2 a 8), MMF (1 gq PO BID Dias -2 a 60) e sirolimo (6 mg PO Dia -2, então, 2 mg QD à partir do Dia-l até a Semana 48). Os ajustes de dose de sirolimo são feitos para manter as concentrações sanguíneas mínimas totais dentro de 16-24 ng/mL. Na maioria dos sujeitos, os ajustes de dose podem ser baseados na equação: nova dose = dose atual x (concentração alvo/concentração atual). Os participantes devem continuar com a nova dose de manutenção por pelo menos 7-14 dias antes de um ajuste adicional da dosagem com monitoramento da concentração. Se desenvolver neutropenia (contagem absoluta de neutrófilos <1,3 x 10º3/UL), a dosagem de MMF deve ser interrompida ou a dose, reduzida.
[0163] Terapia Gênica. Um AAV recombinante não replicante do capsídeo do serotipo 9 contendo um cassete de expressão hIDUA (rYrAAV9.hIDUA) é usado para o tratamento. O serotipo AAV9 permite a expressão eficiente da proteína hIDUA no SNC após a administração IC. O genoma do vetor contém um cassete de expressão de hIDUA flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV 2. A expressão a partir do cassete é conduzida por um promotor CAG constitutivo forte. O vetor rAAV9.hIDUA é suspenso em solução Elliotts B para injeção intratecal.
[0164] O rAAV9.hIDUA é administrado como uma dose única plana por administração IC: uma dose baixa de 1,4 x 10º? GC (1,1 x 10º GC/g de massa cerebral) ou uma dose alta de 7,0 x 10º? GC (5,6 x 10º GC/g de massa cerebral) pode ser usada em um volume de cerca de 5 a 20 ml. No caso de o paciente ter anticorpos neutralizantes para AAV, a dose alta pode ser usada.
[0165] Para administração de rAAV9.IDUA, o sujeito é submetido a anestesia geral. Uma punção lombar é realizada, primeiro para remover 5 cc de LCR e, posteriormente, para injetar contraste IT para auxiliar na visualização da cisterna magna. A CT (com contraste) é utilizada para guiar a inserção da agulha e a administração da dose selecionada de rAAV9.IDUA no espaço suboccipital.
6.6 EXEMPLO 6: Protocolo Clínico de Tratamento de MPS 1
[0166] O exemplo a seguir estabelece um protocolo que pode ser usado para tratar sujeitos humanos com um vetor rAAV9.hIDUA para tratar MPS [.
[0167] População de Pacientes. Os pacientes a serem tratados podem incluir homens ou mulheres de 6 anos de idade ou mais que tenham: * um diagnóstico de MPS II confirmado por atividade enzimática, medido no plasma, fibroblastos ou leucócitos (isso inclui aqueles que podem ter previamente recebido TCTH ou ter previamente recebido ou estarem recebendo atualmente tratamento com laronidase).
* déficit neurocognitivo em estágio inicial devido à MPS 1, definido como qualquer um dentre os seguintes, se não for explicável por nenhum outro fator neurológico ou psiquiátrico: º Uma pontuação de 21 de desvio padrão abaixo da média no teste de QI ou em 1 domínio de função neuropsicológica (compreensão verbal, memória, atenção ou raciocínio perceptivo).
º Um declínio de >1 desvio padrão em testes sequenciais.
[0168] Os pacientes devem ter capacidade auditiva e visual suficiente, com ou sem auxílio, para completar o teste de protocolo necessário e estarem dispostos a estar em conformidade com o uso do auxílio, se aplicável, nos dias de teste.
[0169] Mulheres com potencial para engravidar devem apresentar um teste de gravidez de soro negativo no dia do tratamento. Todos os sujeitos sexualmente ativos devem estar dispostos a usar um método de contracepção de barreira medicamente aceito a partir da consulta de triagem até 24 semanas após a administração do vetor. Mulheres sexualmente ativas devem estar dispostas a usar um método anticoncepcional eficaz a partir da consulta de triagem até 12 semanas após a última dose de sirolimo, o que ocorrer mais tarde. Os pacientes que podem ser excluídos do tratamento intracisternal (IC) podem incluir sujeitos que têm uma contraindicação para injeção IC ou punção lombar. Contraindicações para uma injeção IC podem incluir qualquer um dos seguintes:
* Histórico de cirurgia anterior na cabeça/pescoço que resultou em uma contraindicação para injeção IC.
* Ter alguma contraindicação para CT (ou contraste) ou para anestesia geral.
* Ter alguma contraindicação para RMI (ou gadolínio).
* Ter taxa de filtração glomerular estimada (eTFG) de <30 mL/min/1,73 mº.
[0170] Pacientes que receberam tratamento IT a qualquer momento e experienciaram uma reação adversa significativa considerada relacionada à administração IT não devem ser tratados com IC. Pacientes com qualquer condição que o médico encarregado acredite não ser apropriada para terapia imunossupressora não devem receber tratamento (por exemplo, contagem absoluta de neutrófilos <1,3 x 10º/puL, contagem de plaquetas 100 x 10º/ nuL e hemoglobina 12 g/dL [homem] ou 10 g/dL [mulher]). Um regime alternativo de imunossupressão deve ser usado em qualquer paciente que tenha qualquer histórico de reação de hipersensibilidade ao sirolimo, MMF ou prednisolona.
[0171] Pacientes com histórico de linfoma ou outro câncer, exceto carcinoma de células escamosas ou basocelular da pele, não devem ser tratados, a menos que estejam em remissão completa por pelo menos 3 meses antes do tratamento.
[0172] Pacientes com hipertensão não controlada (PA sistólica >180 mmHg, PA diastólica >100 mmHg) apesar de tratamento médico máximo não devem ser tratados.
[0173] Pacientes com alanina aminotransferase (ALT) ou aspartato aminotransferase (AST) >3 x limite superior ao normal (LSN) ou bilirrubina total >1,5 x LSN não devem ser tratados, a menos que o sujeito tenha um histórico previamente conhecido de síndrome de Gilbert e uma bilirrubina fracionada que mostre bilirrubina conjugada <35% da bilirrubina total.
[0174] Pacientes com um histórico de doenças infecciosas ou abuso de substâncias podem não ser candidatos ao tratamento. Por exemplo, um histórico de vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou infecção pelo vírus da hepatite B ou da hepatite C, ou testes de triagem positivos para antígeno de superfície da hepatite B ou anticorpo do núcleo da hepatite B ou anticorpos da hepatite C ou do HIV; um histórico de abuso de álcool ou substâncias dentro de 1 ano antes da triagem.
[0175] Pacientes que receberam qualquer produto experimental dentro de 30 dias ou 5 meias-vidas antes, o que for maior, não devem ser tratados, exceto pacientes administrados com laronidase IT, que pode ser administrada em qualquer momento anterior.
[0176] Pacientes que estão grávidas, com menos de seis semanas “pós-parto, amamentando na triagen ou planejando engravidar em qualquer momento até a semana 52 não devem ser tratadas.
[0177] Pacientes com uma anormalidade de ECG clinicamente significativa que comprometeria a segurança do sujeito não devem ser tratados. Pacientes com uma condição médica ou psicológica séria ou instável que comprometeria a segurança do sujeito não devem ser tratados.
[0178] Tratamentos —Administrados — Pré-tratamento com Terapia Imunossupressora. Antes da terapia gênica, O paciente deve ser tratado com uma terapia imunossupressora para prevenir respostas imunológicas ao transgene e/ou capsídeo AAV. Tal terapia imunossupressora inclui prednisolona (60 mg PO QD Dias -2 a 8), MMF (1 gq PO BID Dias -2 a 60) e sirolimo (6 mg PO Dia -2, então, 2 mg QD à partir do Dia-l até a Semana 48). Os ajustes de dose de sirolimo são feitos para manter as concentrações sanguíneas mínimas totais dentro de 16-24 ng/mL. Na maioria dos sujeitos, os ajustes de dose podem ser baseados na equação: nova dose = dose atual x (concentração alvo/concentração atual). Os sujeitos devem continuar com a nova dose de manutenção por pelo menos 7-14 dias antes de um ajuste adicional da dosagem com monitoramento da concentração.
[0179] O princípio subjacente para o regime de imunossupressão é administrar corticosteroides para suprimir totalmente a imunidade — começando com uma metilprednisolona IV para carregar a dose e seguindo com prednisolona oral que é gradualmente reduzida para que o paciente pare com os esteroides na semana 12. O tratamento com corticosteroides é suplementado com tacrolimo (por 24 semanas) e/ou sirolimo (por 12 semanas) e pode ser ainda suplementado com MMF. Ao usar tanto tacrolimo quanto sirolimo, a dose de cada um deve ser uma dose baixa ajustada para manter um nível sanguíneo mínimo de 4-8 ng/ml. Se apenas um dos agentes for usado, a dose recomendada (dose mais alta) deve ser empregada; por exemplo, tacrolimo a 0,15-0,20 mg/kg/dia dado em duas doses divididas a cada 12 horas; e sirolimo a 1 mg/mº/dia; a dose de carga deve ser de 3 mg/m?. Se MMF for adicionado ao regime, a dose de tacrolimo e/ou sirolimo pode ser mantida, uma vez que os mecanismos de ação diferem.
[0180] Terapia Gênica. Um AAV recombinante não replicante do capsídeo do serotipo 9 contendo um cassete de expressão hIDUA
(rYrAAV9.hIDUA) é usado para o tratamento. O serotipo AAV9 permite a expressão eficiente da proteína hIDUA no SNC após a administração IC. O genoma do vetor contém um cassete de expressão de hIDUA flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV 2. A expressão a partir do cassete é conduzida por um promotor CAG constitutivo forte. O vetor rAAV9.hIDUA é suspenso em solução Elliotts B para injeção intratecal.
[0181] A rAAV9.hIDUA é administrada como uma dose única plana por administração IC: ou uma dose de 2 x 10º GC/g de massa cerebral (2,6 x 10"? GC) ou uma dose de 1 x 10º GC/g de massa cerebral (1,3 x 10!? GC). A dose pode ser em um volume de cerca de 5 a 20 ml.
[0182] Para administração de rAAV9.IDUA, o sujeito é submetido a anestesia geral.
6.7 EXEMPLO 7: Protocolo Clínico de Tratamento de MPS 1
[0183] O exemplo a seguir estabelece um protocolo que pode ser usado para tratar sujeitos humanos com um vetor rAAV9.hIDUA para tratar MPS [.
[0184] População de Pacientes. Os pacientes a serem tratados podem incluir homens ou mulheres que tenham: * um diagnóstico de MPS II confirmado por atividade enzimática, medido no plasma, fibroblastos ou leucócitos (isso inclui aqueles que podem ter recebido previamente ou atualmente TCTH ou tratamento com laronidase).
* déficit neurocognitivo em estágio inicial devido à MPS 1, definido como qualquer um dentre os seguintes, se não for explicável por nenhum outro fator neurológico ou psiquiátrico:
º Uma pontuação de 21 de desvio padrão abaixo da média no teste de QI ou em 1 domínio de função neuropsicológica (compreensão verbal, memória, atenção ou raciocínio perceptivo).
º Um declínio de >1 desvio padrão em testes sequenciais.
[0185] Os pacientes devem ter capacidade auditiva e visual suficiente, com ou sem auxílio, para completar o teste de protocolo necessário e estarem dispostos a estar em conformidade com o uso do auxílio, se aplicável, nos dias de teste.
[0186] Mulheres com potencial para engravidar devem apresentar um teste de gravidez de soro negativo no dia do tratamento. Todos os sujeitos sexualmente ativos devem estar dispostos a usar um método de contracepção de barreira medicamente aceito a partir da consulta de triagem até 24 semanas após a administração do vetor. Mulheres sexualmente ativas devem estar dispostas a usar um método anticoncepcional eficaz a partir da consulta de triagem até 12 semanas após a última dose de sirolimo, o que ocorrer mais tarde. Os pacientes que podem ser excluídos do tratamento intracisternal (IC) podem incluir sujeitos que têm uma contraindicação para injeção IC ou punção lombar. Contraindicações para uma injeção IC podem incluir qualquer um dos seguintes: * Histórico de cirurgia anterior na cabeça/pescoço que resultou em uma contraindicação para injeção IC.
* Ter alguma contraindicação para CT (ou contraste) ou para anestesia geral.
* Ter alguma contraindicação para RMI (ou gadolínio).
* Ter taxa de filtração glomerular estimada (eTFG) de <30 mL/min/1,73 mº.
[0187] Pacientes que receberam tratamento IT a qualquer momento e experienciaram uma reação adversa significativa considerada relacionada à administração IT não devem ser tratados com IC. Pacientes com qualquer condição que o médico encarregado acredite não ser apropriada para terapia imunossupressora não devem receber tratamento (por exemplo, contagem absoluta de neutrófilos <1,3 x 10º/uL, contagem de plaquetas 100 x 10º/uL e hemoglobina 12 g/dL [homem] ou 10 g/dL [mulher]).
[0188] Un regime alternativo de imunossupressão deve ser usado em qualquer paciente que tenha qualquer histórico de reação de hipersensibilidade a tacrolimo, sirolimo ou prednisolona. Pacientes com um histórico de imunodeficiência primária, esplenectomia ou qualquer condição subjacente que predisponha o sujeito a infecção não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com infecção por herpes zoster, citomegalovírus ou vírus Epstein-Barr (EBV) que não tenha sido completamente resolvida por pelo menos 12 semanas antes da triagem não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com (1) qualquer infecção que requeira hospitalização ou tratamento com anti-infecciosos parentais não resolvidos pelo menos 8 semanas antes da segunda consulta ou (2) qualquer infecção ativa que requeira anti-infecciosos orais (incluindo antivirais) dentro de dez dias antes da segunda visita ou com um histórico de tuberculose ativa ou (3) um teste Quantiferon TB Gold positivo durante a triagem, ou (4) qualquer vacina viva dentro de 8 semanas antes de assinar o termo de consentimento informado, ou (5) cirurgia de grande porte dentro de 8 semanas antes de assinar o consentimento informado ou (6) cirurgia de grande porte planejada durante o período de estudo não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com contagem absoluta de neutrófilos de <1,3 x 10º/uL não devem ser tratados com terapia imunossupressora.
[0189] Pacientes com histórico de linfoma ou outro câncer, exceto carcinoma de células escamosas ou basocelular da pele, não devem ser tratados, a menos que estejam em remissão completa por pelo menos 3 meses antes do tratamento.
[0190] Pacientes com hipertensão não controlada (PA sistólica >180 mmHg, PA diastólica >100 mmHg) apesar de tratamento médico máximo não devem ser tratados.
[0191] Pacientes com alanina aminotransferase (ALT) Ou aspartato aminotransferase (AST) >3 x limite superior ao normal (LSN) ou bilirrubina total >1,5 x LSN não devem ser tratados, a menos que o sujeito tenha um histórico previamente conhecido de síndrome de Gilbert e uma bilirrubina fracionada que mostre bilirrubina conjugada <35% da bilirrubina total.
[0192] Pacientes com um histórico de doenças infecciosas ou abuso de substâncias podem não ser candidatos ao tratamento. Por exemplo, um histórico de vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou infecção pelo vírus da hepatite B ou da hepatite C, ou testes de triagem positivos para antígeno de superfície da hepatite B ou anticorpo do núcleo da hepatite B ou anticorpos de hepatite C ou HIV; um histórico de abuso de álcool ou substâncias dentro de 1 ano antes da triagem.
[0193] En uma modalidade, os pacientes são pacientes adultos. Em outra modalidade, os pacientes são pacientes pediátricos.
[0194] Tratamentos —“Administrados — Pré-tratamento com Terapia Imunossupressora. Antes da terapia gênica, oO paciente deve ser tratado com uma terapia imunossupressora para prevenir respostas imunológicas ao transgene e/ou capsídeo AAV. Essa terapia imunossupressora inclui corticosteroides (metilprednisolona 10 mg/kg por via intravenosa [IV] uma vez no Dia 1 pré-dose e prednisona oral começando com 0,5 mg/kg/dia no Dia 2 com diminuição gradual e descontinuação na Semana 12) tacrolimo (1 mg duas vezes ao dia [BID] pela boca [PO] do Dia 2 à Semana 24 com nível sanguíneo alvo de 4-8 ng/ml e diminuindo ao longo de 8 semanas entre a Semana 24 e 32 e sirolimo (uma dose de carga de 1 mg/m?º a cada 4 horas x 3 doses no Dia -2 e então a partir do Dia -l1: sirolimo 0,5 mg/m2/ dia dividido em dosagem BID com nível sanguíneo alvo de 4-8 ng/ml até a Semana
48. Avaliações neurológicas e monitoramento dos níveis sanguíneos de tacrolimo/sirolimo serão conduzidos. As doses de sirolimo e tacrolimo serão ajustadas para manter os níveis sanguíneos na faixa alvo. Nenhuma terapia de imunossupressão está planejada após a semana 48. Na maioria dos sujeitos, os ajustes de dose podem ser baseados na equação: nova dose = dose atual *x (concentração alvo/concentração atual). Os sujeitos devem continuar com a nova dose de manutenção por pelo menos 7- 14 dias antes de um ajuste adicional da dosagem com monitoramento da concentração.
[0195] Terapia Gênica. Um AAV recombinante não replicante do capsídeo do serotipo 9 contendo um cassete de expressão hIDUA (rYrAAV9.hIDUA) é usado para o tratamento. O serotipo AAV9 permite a expressão eficiente da proteína hIDUA no SNC após a administração IC. O genoma do vetor contém um cassete de expressão de hIDUA flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV 2. A expressão a partir do cassete é conduzida por um promotor CAG constitutivo forte. O vetor rAAVO9.hIDUA é suspenso em solução Elliotts B para injeção intratecal.
[0196] A rAAV9.hIDUA é administrada como uma dose única plana por administração IC: ou uma dose de 2 x 10º GC/g de massa cerebral (2,6 x 10º”? GC) ou uma dose de 1 x 10ºº GC/g de massa cerebral (1,3 x 10º? GC). A dose pode ser em um volume de cerca de 5 a 20 ml.
[0197] Para administração de rAAV9.IDUA, o sujeito é submetido a anestesia geral.
6.8 EXEMPLO 8: Protocolo Clínico de Tratamento de MPS 1
[0198] O exemplo a seguir estabelece um protocolo que pode ser usado para tratar sujeitos humanos com um vetor rAAV9.hIDUA para tratar MPS [.
[0199] População de Pacientes. Os pacientes a serem tratados podem incluir homens ou mulheres de 6 anos de idade ou mais que tenham: * um diagnóstico de MPS II confirmado por atividade enzimática, medido no plasma, fibroblastos ou leucócitos (isso inclui aqueles que podem ter recebido previamente ou atualmente TCTH ou tratamento com laronidase).
* déficit neurocognitivo em estágio inicial devido à MPS 1, definido como qualquer um dentre os seguintes, se não for explicável por nenhum outro fator neurológico ou psiquiátrico: º Uma pontuação de 21 de desvio padrão abaixo da média no teste de QI ou em 1 domínio de função neuropsicológica (compreensão verbal, memória, atenção ou raciocínio perceptivo).
º Um declínio de >1 desvio padrão em testes sequenciais.
[0200] Os pacientes devem ter capacidade auditiva e visual suficiente, com ou sem auxílio, para completar o teste de protocolo necessário e estarem dispostos a estar em conformidade com o uso do auxílio, se aplicável, nos dias de teste.
[0201] Mulheres com potencial para engravidar devem apresentar um teste de gravidez de soro negativo no dia do tratamento. Todos os sujeitos sexualmente ativos devem estar dispostos a usar um método de contracepção de barreira medicamente aceito a partir da consulta de triagem até 24 semanas após a administração do vetor. Mulheres sexualmente ativas devem estar dispostas a usar um método anticoncepcional eficaz a partir da consulta de triagem até 12 semanas após a última dose de sirolimo, o que ocorrer mais tarde. Os pacientes que podem ser excluídos do tratamento intracisternal (IC) podem incluir sujeitos que tenham uma contraindicação para injeção IC ou punção lombar. Contraindicações para uma injeção IC podem incluir qualquer um dos seguintes: * Histórico de cirurgia anterior na cabeça/pescoço que resultou em uma contraindicação para injeção IC.
* Ter alguma contraindicação para CT (ou contraste) ou para anestesia geral.
* Ter alguma contraindicação para RMI (ou gadolínio).
* Ter taxa de filtração glomerular estimada (eTFG) de <30 mL/min/1,73 mº.
[0202] Pacientes que receberam tratamento IT a qualquer momento e experienciaram uma reação adversa significativa considerada relacionada à administração IT não devem ser tratados com IC. Pacientes com qualquer condição que o médico encarregado acredite não ser apropriada para terapia imunossupressora não devem receber tratamento (por exemplo, contagem absoluta de neutrófilos <1,3 x 10º/uL, contagem de plaquetas 100 x 10º/uL e hemoglobina 12 g/dL [homem] ou 10 g/dL [mulher]).
[0203] Un regime alternativo de imunossupressão deve ser usado em qualquer paciente que tenha qualquer histórico de reação de hipersensibilidade a tacrolimo, sirolimo ou prednisolona. Pacientes com um histórico de imunodeficiência primária, esplenectomia ou qualquer condição subjacente que predisponha o sujeito a infecção não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com infecção por herpes zoster, citomegalovírus ou vírus Epstein-Barr (EBV) que não tenha sido completamente resolvida por pelo menos 12 semanas antes da triagem não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com (1) qualquer infecção que requeira hospitalização ou tratamento com anti-infecciosos parentais não resolvidos pelo menos 8 semanas antes da segunda consulta ou (2) qualquer infecção ativa que requeira anti-infecciosos orais (incluindo antivirais) dentro de dez dias antes da segunda visita ou com um histórico de tuberculose ativa ou (3) um teste Quantiferon TB Gold positivo durante a triagem, ou (4) qualquer vacina viva dentro de 8 semanas antes de assinar o termo de consentimento informado, ou (5) cirurgia de grande porte dentro de 8 semanas antes de assinar o consentimento informado ou (6) cirurgia de grande porte planejada durante o período de estudo não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com contagem absoluta de neutrófilos de <1,3 x 10º/uL não devem ser tratados com terapia imunossupressora.
[0204] Pacientes com histórico de linfoma ou outro câncer, exceto carcinoma de células escamosas ou basocelular da pele, não devem ser tratados, a menos que estejam em remissão completa por pelo menos 3 meses antes do tratamento.
[0205] Pacientes com hipertensão não controlada (PA sistólica >180 mmHg, PA diastólica >100 mmHg) apesar de tratamento médico máximo não devem ser tratados.
[0206] Pacientes com alanina aminotransferase (ALT) ou aspartato aminotransferase (AST) >3 x limite superior ao normal (LSN) ou bilirrubina total >1,5 x LSN não devem ser tratados, a menos que o sujeito tenha um histórico previamente conhecido de síndrome de Gilbert e uma bilirrubina fracionada que mostre bilirrubina conjugada <35% da bilirrubina total.
[0207] Pacientes com um histórico de doenças infecciosas ou abuso de substâncias podem não ser candidatos ao tratamento. Por exemplo, um histórico de vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou infecção pelo vírus da hepatite B ou da hepatite C, ou testes de triagem positivos para antígeno de superfície da hepatite B ou anticorpo do núcleo da hepatite B ou anticorpos de hepatite C ou HIV; um histórico de abuso de álcool ou substâncias dentro de 1 ano antes do tratamento.
[0208] Tratamentos —“Administrados — Pré-tratamento com Terapia Imunossupressora. Antes da terapia gênica, oO paciente deve ser tratado com uma terapia imunossupressora para prevenir respostas imunológicas ao transgene e/ou capsídeo AAV. Essa terapia imunossupressora inclui corticosteroides (metilprednisolona 10 mg/kg por via intravenosa [IV] uma vez no Dia 1 pré-dose e prednisona oral começando com 0,5 mg/kg/ dia no Dia 2 com diminuição gradual e descontinuação na Semana 12) tacrolimo (1 mg duas vezes ao dia [BID] pela boca [PO] Dia 2 à Semana 24 com nível sanguíneo alvo de 4-8 ng/mL e diminuindo ao longo de 8 semanas entre a Semana 24 e 32 e sirolimo (uma dose de carga de 1 mg/m?: a cada 4 horas x 3 doses no Dia -2 e então a partir do Dia -1: sirolimo 0,5 mg/mº/dia dividido em dosagem BID com nível sanguíneo alvo de 4-8 ng/ml até a Semana 48 Avaliações neurológicas e monitoramento dos níveis sanguíneos de tacrolimo/sirolimo serão conduzidos. As doses de sirolimo e tacrolimo serão ajustadas para manter os níveis sanguíneos na faixa alvo. Nenhuma terapia de imunossupressão está planejada após a semana 48. Na maioria dos sujeitos, os ajustes de dose podem ser baseados na equação: nova dose = dose atual <+ (concentração alvo/concentração atual). Os sujeitos devem continuar com a nova dose de manutenção por pelo menos 7-14 dias antes de um ajuste adicional da dosagem com monitoramento da concentração.
[0209] Terapia Gênica. Um AAV recombinante não replicante do capsídeo do serotipo 9 contendo um cassete de expressão hIDUA (FYAAV9.hIDUA) é usado para o tratamento. O serotipo AAV9 permite a expressão eficiente da proteína hIDUA no SNC após a administração IC. O genoma do vetor contém um cassete de expressão de hIDUA flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV 2. A expressão a partir do cassete é conduzida por um promotor CAG constitutivo forte. O vetor rAAV9.hIDUA é suspenso em solução Elliotts B para injeção intratecal.
[0210] A rAAV9.hIDUA é administrada como uma dose única plana por administração IC: ou uma dose de 2 x 10º GC/g de massa cerebral (2,6 x 10"? GC) ou uma dose de 1 x 10º GC/g de massa cerebral (1,3 x 10!? GC). A dose pode ser em um volume de cerca de 5 a 20 ml.
[0211] Para administração de rAAV9.IDUA, o sujeito é submetido a anestesia geral.
6.9 EXEMPLO 9: Protocolo Clínico de Tratamento de MPS 1
[0212] O exemplo a seguir estabelece um protocolo que pode ser usado para tratar sujeitos humanos com um vetor rAAV9.hIDUA para tratar MPS [.
[0213] População de Pacientes. Os pacientes a serem tratados podem incluir homens ou mulheres com 6 anos ou mais e homens ou mulheres menores de 3 anos de idade que têm: * um diagnóstico de MPS II confirmado por atividade enzimática, medido no plasma, fibroblastos ou leucócitos (isso inclui aqueles que podem ter recebido previamente ou atualmente TCTH ou tratamento com laronidase).
* déficit neurocognitivo em estágio inicial devido à MPS 1, definido como qualquer um dentre os seguintes, se não for explicável por nenhum outro fator neurológico ou psiquiátrico: º Uma pontuação de 21 de desvio padrão abaixo da média no teste de QI ou em 1 domínio de função neuropsicológica (compreensão verbal, memória, atenção ou raciocínio perceptivo).
º Um declínio de >1 desvio padrão em testes sequenciais.
* pacientes com menos de 3 anos de idade têm a forma grave de MPS I (síndrome de Hurler) confirmada por mutação(ões), conhecida por causar síndrome de Hurler com declínio neurocognitivo.
[0214] Os pacientes devem ter capacidade auditiva e visual suficiente, com ou sem auxílio, para completar o teste de protocolo necessário e estarem dispostos a estar em conformidade com o uso do auxílio, se aplicável, nos dias de teste.
[0215] Mulheres com potencial para engravidar devem apresentar um teste de gravidez de soro negativo no dia do tratamento. Todos os sujeitos sexualmente ativos devem estar dispostos a usar um método de contracepção de barreira medicamente aceito a partir da consulta de triagem até 24 semanas após a administração do vetor. Mulheres sexualmente ativas devem estar dispostas a usar um método anticoncepcional eficaz a partir da consulta de triagem até 12 semanas após a última dose de sirolimo, o que ocorrer mais tarde. Os pacientes que podem ser excluídos do tratamento intracisternal (IC) podem incluir sujeitos que tenham uma contraindicação para injeção IC ou punção lombar. Contraindicações para uma injeção IC podem incluir qualquer um dos seguintes: * Histórico de cirurgia anterior na cabeça/pescoço que resultou em uma contraindicação para injeção IC.
* Ter alguma contraindicação para CT (ou contraste) ou para anestesia geral.
* Ter alguma contraindicação para RMI (ou gadolínio).
* Ter taxa de filtração glomerular estimada (eTFG) de <30 mL/min/1,73 m?.
[0216] Pacientes que receberam tratamento IT a qualquer momento e experienciaram uma reação adversa significativa considerada relacionada à administração IT não devem ser tratados com IC. Pacientes com qualquer condição que o médico encarregado acredite não ser apropriada para terapia imunossupressora não devem receber tratamento (por exemplo, contagem absoluta de neutrófilos <1,3 x 10º/uL, contagem de plaquetas 100 x 10º/uL e hemoglobina 12 g/dL [homem] ou 10 g/dL [mulher]).
[0217] Um regime alternativo de imunossupressão deve ser usado em qualquer paciente, ou o paciente deve ser excluído, que tenha qualquer histórico de reação de hipersensibilidade a tacrolimo, sirolimo ou prednisolona. Pacientes com um histórico de imunodeficiência primária, esplenectomia ou qualquer condição subjacente que predisponha o sujeito a infecção não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com infecção por herpes zoster, citomegalovírus ou vírus Epstein-Barr (EBV) que não tenha sido completamente resolvida por pelo menos 12 semanas antes da triagem não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com (1) qualquer infecção que requeira hospitalização ou tratamento com anti-infecciosos parentais não resolvidos pelo menos 8 semanas antes da segunda consulta ou (2) qualquer infecção ativa que requeira anti- infecciosos orais (incluindo antivirais) dentro de dez dias antes da segunda visita ou com um histórico de tuberculose ativa ou (3) um teste Quantiferon TB Gold positivo durante a triagem, ou (4) qualquer vacina viva dentro de 8 semanas antes de assinar o termo de consentimento informado, ou (5) cirurgia de grande porte dentro de 8 semanas antes de assinar o consentimento informado ou (6) cirurgia de grande porte planejada durante o período de estudo não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com contagem absoluta de neutrófilos de <l1,3 x 10º/phL não devem ser tratados com terapia imunossupressora.
[0218] Pacientes com histórico de linfoma ou outro câncer, exceto carcinoma de células escamosas ou basocelular da pele, não devem ser tratados, a menos que estejam em remissão completa por pelo menos 3 meses antes do tratamento.
[0219] Pacientes com hipertensão não controlada (PA sistólica >180 mmHg, PA diastólica >100 mmHg) apesar de tratamento médico máximo não devem ser tratados.
[0220] Pacientes com alanina aminotransferase (ALT) ou aspartato aminotransferase (AST) >3 x limite superior ao normal (LSN) ou bilirrubina total >1,5 x LSN não devem ser tratados, a menos que o sujeito tenha um histórico previamente conhecido de síndrome de Gilbert e uma bilirrubina fracionada que mostre bilirrubina conjugada <35% da bilirrubina total.
[0221] Pacientes com um histórico de doenças infecciosas ou abuso de substâncias podem não ser candidatos ao tratamento. Por exemplo, um histórico de vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou infecção pelo vírus da hepatite B ou da hepatite C, ou testes de triagem positivos para antígeno de superfície da hepatite B ou anticorpo do núcleo da hepatite B ou anticorpos de hepatite C ou HIV; um histórico de abuso de álcool ou substâncias dentro de 1 ano antes do tratamento.
[0222] Tratamentos —Administrados — Pré-tratamento com Terapia Imunossupressora. Antes da terapia gênica, oO paciente deve ser tratado com uma terapia imunossupressora para prevenir respostas imunológicas ao transgene e/ou capsídeo AAV. Tal terapia imunossupressora, para pacientes com 6 anos ou mais, inclui corticosteroides (metilprednisolona 10 mg/kg por via intravenosa [IV] uma vez no Dia 1 pré-dose e prednisona oral começando com 0,5 mg/kg/ dia no Dia 2 com diminuição gradual e descontinuação na Semana 12), tacrolimo (1 mg duas vezes ao dia [BID] pela boca [PO] Dia 2 à Semana 24 com nível sanguíneo alvo de 4-8 ng/ml e diminuindo ao longo de 8 semanas entre a Semana 24 e 32 e sirolimo (uma dose de carga de 1 mg/m?' a cada 4 horas x 3 doses no Dia -2 e então a partir do Dia -1: sirolimo 0,5 mg/m?º/dia dividido em dosagem BID com nível sanguíneo alvo de 4- 8 ng/ml até a Semana 48. Tal terapia imunossupressora, para pacientes com menos de 3 anos de idade, inclui corticosteroides (metilprednisolona 10 mg/kg por via intravenosa [IV] uma vez no Dia 1 pré-dose e prednisona oral começando com 0,5 mg/kg/ dia no Dia 2 com diminuição gradual e descontinuação na Semana 12) tacrolimo (0,05 mg duas vezes ao dia [BID] pela boca [PO] Dia 2 à Semana 24 com nível sanguíneo alvo de 2-4 ng/ml e diminuindo ao longo de 8 semanas entre a Semana 24 e 32 e sirolimo (uma dose de carga de 1 mg/m?: a cada 4 horas x 3 doses no Dia -2 e então a partir do Dia -1: sirolimo 0,5 mg/mº/dia dividido em dosagem BID com nível sanguíneo alvo de 1-3 ng/ml até a Semana
48. Avaliações neurológicas e monitoramento dos níveis sanguíneos de tacrolimo/sirolimo serão conduzidos. As doses de sirolimo e tacrolimo serão ajustadas para manter os níveis sanguíneos na faixa alvo. Nenhuma terapia de imunossupressão está planejada após a semana 48. Na maioria dos sujeitos, os ajustes de dose podem ser baseados na equação: nova dose = dose atual *x (concentração alvo/concentração atual). Os sujeitos devem continuar com a nova dose de manutenção por pelo menos 7- 14 dias antes de um ajuste adicional da dosagem com monitoramento da concentração.
[0223] Terapia Gênica. Um AAV recombinante não replicante do capsídeo do serotipo 9 contendo um cassete de expressão hIDUA (rYrAAV9.hIDUA) é usado para o tratamento. O serotipo AAV9 permite a expressão eficiente da proteína hIDUA no SNC após a administração IC. O genoma do vetor contém um cassete de expressão de hIDUA flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV 2. A expressão a partir do cassete é conduzida por um promotor CAG constitutivo forte. O vetor rAAV9.hIDUA é suspenso em solução Elliotts B para injeção intratecal.
[0224] Para pacientes com 6 anos ou mais, rAAV9.hIDUA é administrada como uma dose única plana por administração IC: uma dose de 2 x 10º GC/g de massa cerebral (2,6 x 10"? GC) ou uma dose de 1 x 10!º GC/g de massa cerebral (1,3 x 10"? GC). A dose pode ser em um volume de cerca de 5 ml ou menos.
[0225] Para pacientes com menos de 3 anos de idade, rAAVO9.hIDUA é administrada como uma dose única plana por administração IC: uma dose de 1 x 10*º GC/g de massa cerebral (6,0 x 10!? GC para pacientes com 4 meses ou mais, mas com menos de 9 meses; 1,0 x 10!? GC para pacientes com 9 meses ou mais, mas menores de 18 meses; 1,1 x 10!? GC para pacientes com 18 meses ou mais, mas com menos de 3 anos), ou uma dose de 5 x 10*º GC/g de massa cerebral (3,0 x 10!? GC para pacientes com 4 meses ou mais, mas menores de 9 meses; 5,0 x 10!? GC para pacientes com 9 meses ou mais, mas com menos de 18 meses; 5,5 x 10!? GC para pacientes com 18 meses ou mais, mas com menos de 3 anos). A dose pode ser em um volume de cerca de 5 ml ou menos.
[0226] Para administração de rAAV9.IDUA, o sujeito é submetido a anestesia geral.
6.10 EXEMPLO 10: Protocolo Clínico de Tratamento de MPS 1
[0227] O exemplo a seguir estabelece um protocolo que pode ser usado para tratar sujeitos humanos com um vetor rAAV9.hIDUA para tratar MPS [.
[0228] População de Pacientes. Os pacientes a serem tratados podem incluir homens ou mulheres com menos de 3 anos de idade que têm: * um diagnóstico de MPS I-Hurler grave confirmado pela presença de sinais clínicos e sintomas compatíveis com MPS I-H e/ou homozigosidade ou heterozigosidade composta para mutações exclusivamente associadas ao fenótipo grave.
* uma pontuação de quociente de inteligência (QI) de 255
[0229] Os pacientes devem ter capacidade auditiva e visual suficiente, com ou sem auxílio, para completar o teste de protocolo necessário e estarem dispostos a estar em conformidade com o uso do auxílio, se aplicável, nos dias de teste.
[0230] Os pacientes que podem ser excluídos do tratamento intracisternal (IC) podem incluir sujeitos que têm contraindicação para injeção IC ou punção lombar. Contraindicações para uma injeção IC podem incluir qualquer um dos seguintes: * Histórico de cirurgia anterior na cabeça/pescoço que resultou em uma contraindicação para injeção IC.
* Ter alguma contraindicação para CT (ou contraste) ou para anestesia geral.
* Ter alguma contraindicação para RMI (ou gadolínio).
* Ter taxa de filtração glomerular estimada (eTFG) de <30 mL/min/1,73 mº.
[0231] Pacientes que receberam tratamento IT a qualquer momento e experienciaram uma reação adversa significativa considerada relacionada à administração IT não devem ser tratados com IC. Pacientes com qualquer condição que o médico encarregado acredite não ser apropriada para terapia imunossupressora não devem receber tratamento (por exemplo, contagem absoluta de neutrófilos <l1,3 x 10º/uL, contagem de plaquetas 100 x 10º3/ 1uL) e a hemoglobina será avaliada.
[0232] Um regime alternativo de imunossupressão deve ser usado em qualquer paciente, ou o paciente deve ser excluído, que tenha qualquer histórico de reação de hipersensibilidade a tacrolimo, sirolimo ou prednisolona. Pacientes com um histórico de imunodeficiência primária, esplenectomia ou qualquer condição subjacente que predisponha o sujeito a infecção não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com infecção por herpes zoster, citomegalovírus ou vírus Epstein-Barr (EBV) que não tenha sido completamente resolvida por pelo menos 12 semanas antes da triagem não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com (1) qualquer infecção que requeira hospitalização ou tratamento com anti-infecciosos parentais não resolvidos pelo menos 8 semanas antes da segunda consulta ou (2) qualquer infecção ativa que requeira anti- infecciosos orais (incluindo antivirais) dentro de dez dias antes da segunda visita ou com um histórico de tuberculose ativa ou (3) um teste Quantiferon TB Gold positivo durante a triagem, ou (4) qualquer vacina viva dentro de 8 semanas antes de assinar o termo de consentimento informado, ou (5) cirurgia de grande porte dentro de 8 semanas antes de assinar o consentimento informado ou (6) cirurgia de grande porte planejada durante o período de estudo não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com contagem absoluta de neutrófilos de <1,3 x 103/hL não devem ser tratados com terapia imunossupressora.
[0233] Pacientes com histórico de linfoma ou outro câncer, exceto carcinoma de células escamosas ou basocelular da pele, não devem ser tratados, a menos que estejam em remissão completa por pelo menos 3 meses antes do tratamento.
[0234] Pacientes com hipertensão não controlada (PA sistólica >180 mmHg, PA diastólica >100 mmHg) apesar de tratamento médico máximo não devem ser tratados.
[0235] Pacientes com alanina aminotransferase (ALT) ou aspartato aminotransferase (AST) >3 x limite superior do normal (LSN) ou bilirrubina total >1,5 x LSN não devem ser tratados, a menos que o sujeito tenha um histórico previamente conhecido de síndrome de Gilbert.
[0236] Pacientes com um histórico de doenças infecciosas ou abuso de substâncias podem não ser candidatos ao tratamento. Por exemplo, um histórico de vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou infecção pelo vírus da hepatite B ou da hepatite C, ou testes de triagem positivos para antígeno de superfície da hepatite B ou anticorpo do núcleo da hepatite B ou anticorpos de hepatite
C ou HIV; um histórico de abuso de álcool ou substâncias dentro de 1 ano antes do tratamento.
[0237] Tratamentos —“Administrados — Pré-tratamento com Terapia Imunossupressora. Antes da terapia gênica, oO paciente deve ser tratado com uma terapia imunossupressora para prevenir respostas imunológicas ao transgene e/ou capsídeo AAV. A dosagem de prednisona começará com 0,5 mg/kg/dia e será gradualmente diminuída até a visita da Semana 12. Os ajustes de dose de tacrolimo serão feitos para manter as concentrações sanguíneas mínimas totais entre 2 e 4 ng/mL durante as primeiras 24 Semanas. Na semana 24, a dose será reduzida em aproximadamente 50%. Na semana 28, a dose será ainda reduzida em aproximadamente 50%. O tacrolimo será descontinuado na Semana 32. Os ajustes de dose do sirolimo serão feitos para manter as concentrações sanguíneas mínimas totais entre 1 e 3 ng/ml. Na maioria dos sujeitos, os ajustes de dose podem ser baseados na equação: nova dose = dose atual *x (concentração alvo/concentração atual). Os sujeitos devem continuar com a nova dose de manutenção por pelo menos 7 a 14 dias antes de um ajuste adicional da dosagem com monitoramento da concentração. Veja abaixo para mais detalhes.
[0238] Corticosteroides
[0239] Na manhã da administração do vetor (Dia 1 pré-dose), os pacientes receberão metilprednisolona 10 mg/kg IV (máximo de 500 mg) ao longo de pelo menos 30 minutos. A metilprednisolona deve ser administrada antes da punção lombar e da injeção IC de IP. A pré-medicação com acetaminofeno e um anti-histamínico é opcional, a critério do investigador.
[0240] No Dia 2, a prednisona oral será iniciada com o objetivo de descontinuar a prednisona até a Semana 12. A dose de prednisona será a seguinte: Dia 2 ao final da Semana 2: 0,5 mg/kg/dia Semana 3 e 4: 0,35 mg/kg/dia Semana 5-8: 0,2 mg/kg/dia Semana 9-12: 0,1 mg/kg A prednisona será descontinuada após a Semana 12. A dose exata de prednisona pode ser ajustada para a próxima dose clinicamente prática mais alta.
[0241] Sirolimo
[0242] 2 dias antes da administração do vetor (Dia -2): uma dose de carga de sirolimo 1 mg/m2 a cada 4 horas x 3 doses será administrada
[0243] A partir do Dia -1: sirolimo 0,5 mg/mº/dia dividido em duas doses ao dia com nível sanguíneo alvo de 1-3 ng/ml
[0244] Sirolimo será descontinuado após a visita da Semana
48.
[0245] Tacrolimo
[0246] O tacrolimo será iniciado no Dia 2 (o dia seguinte à administração IP) em uma dose de 0,05 mg/kg duas vezes ao dia e ajustada para alcançar um nível sanguíneo de 2-4 ng/mL por 24 Semanas.
[0247] À partir da visita da Semana 24, o tacrolimo será diminuído ao longo de 8 semanas. Na semana 24, a dose será reduzida em aproximadamente 50%. Na semana 28, a dose será ainda reduzida em aproximadamente 50%. O tacrolimo será descontinuado na Semana 32.
[0248] Terapia Gênica. Um AAV recombinante não replicante do capsídeo do serotipo 9 contendo um cassete de expressão hIDUA (rYrAAV9.hIDUA) é usado para o tratamento. O serotipo AAV9 permite a expressão eficiente da proteína hIDUA no SNC após a administração IC. O genoma do vetor contém um cassete de expressão de hIDUA flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV 2. A expressão a partir do cassete é conduzida por um promotor CAG constitutivo forte. O vetor rAAV9.hIDUA é suspenso em solução Elliotts B para injeção intratecal.
[0249] A rAAV9.hIDUA é administrada como uma dose única plana por administração IC: uma dose de 1 x 10ºº GC/g de massa cerebral (6,0 x 10"? GC para pacientes com 4 meses ou mais, mas com menos de 9 meses; 1 x 10!? GC para pacientes com 9 meses ou mais, mas com menos de 18 meses; 1,1 x 10º? GC para pacientes com 18 meses ou mais, mas com menos de 3 anos) ou uma dose de 5 x 10!º GC/g de massa cerebral (3 x 10!? GC para pacientes com 4 meses ou mais, mas com menos de 9 meses; 5 x 10!? GC para pacientes com 9 meses ou mais, mas com menos de 18 meses; 5,5 x 10º? GC para pacientes com 18 meses ou mais, mas com menos de 3 anos). A dose pode ser em um volume de cerca de 5 a 20 ml.
[0250] Para administração de rAAV9.IDUA, o sujeito é submetido a anestesia geral.
6.11 EXEMPLO 11: Protocolo Clínico de Tratamento de MPS 1
[0251] O exemplo a seguir estabelece um protocolo que pode ser usado para tratar sujeitos humanos com um vetor rAAV9.hIDUA para tratar MPS [.
[0252] População de Pacientes. Os pacientes a serem tratados podem incluir homens ou mulheres com 6 anos ou mais e homens ou mulheres menores de 3 anos de idade que têm: * um diagnóstico de MPS II confirmado por atividade enzimática, medido no plasma, fibroblastos ou leucócitos (isso inclui aqueles que podem ter recebido previamente ou atualmente TCTH ou tratamento com laronidase).
* déficit neurocognitivo em estágio inicial devido à MPS 1, definido como qualquer um dentre os seguintes, se não for explicável por nenhum outro fator neurológico ou psiquiátrico: º Uma pontuação de 21 de desvio padrão abaixo da média no teste de QI ou em 1 domínio de função neuropsicológica (compreensão verbal, memória, atenção ou raciocínio perceptivo).
º Um declínio de >1 desvio padrão em testes sequenciais.
* pacientes com menos de 3 anos de idade têm a forma grave de MPS I (síndrome de Hurler) confirmada por mutação(ões), conhecida por causar síndrome de Hurler com declínio neurocognitivo.
[0253] Os pacientes devem ter capacidade auditiva e visual suficiente, com ou sem auxílio, para completar o teste de protocolo necessário e estarem dispostos a estar em conformidade com o uso do auxílio, se aplicável, nos dias de teste.
[0254] Mulheres com potencial para engravidar devem apresentar um teste de gravidez de soro negativo no dia do tratamento. Todos os sujeitos sexualmente ativos devem estar dispostos a usar um método de contracepção de barreira medicamente aceito a partir da consulta de triagem até 24 semanas após a administração do vetor. Mulheres sexualmente ativas devem estar dispostas a usar um método anticoncepcional eficaz a partir da consulta de triagem até 12 semanas após a última dose de sirolimo, o que ocorrer mais tarde. Os pacientes que podem ser excluídos do tratamento intracisternal (IC) podem incluir sujeitos que tenham uma contraindicação para injeção IC ou punção lombar. Contraindicações para uma injeção IC podem incluir qualquer um dos seguintes: * Histórico de cirurgia anterior na cabeça/pescoço que resultou em uma contraindicação para injeção IC.
* Ter alguma contraindicação para CT (ou contraste) ou para anestesia geral.
* Ter alguma contraindicação para RMI (ou gadolínio).
* Ter taxa de filtração glomerular estimada (eTFG) de <30 mL/min/1,73 m?.
[0255] Pacientes que receberam tratamento IT a qualquer momento e experienciaram uma reação adversa significativa considerada relacionada à administração IT não devem ser tratados com IC. Pacientes com qualquer condição que o médico encarregado acredite não ser apropriada para terapia imunossupressora não devem receber tratamento (por exemplo, contagem absoluta de neutrófilos <1,3 x 10º/puL, contagem de plaquetas 100 x 10º/uL e hemoglobina 12 g/dL [homem] ou 10 g/dL [mulher]).
[0256] Un regime alternativo de imunossupressão deve ser usado em qualquer paciente, ou o paciente deve ser excluído, que tenha qualquer histórico de reação de hipersensibilidade a tacrolimo, sirolimo ou prednisolona. Pacientes com um histórico de imunodeficiência primária, esplenectomia ou qualquer condição subjacente que predisponha o sujeito a infecção não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com infecção por herpes zoster, citomegalovírus ou vírus Epstein-Barr (EBV) que não tenha sido completamente resolvida por pelo menos 12 semanas antes da triagem não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com (1) qualquer infecção que requeira hospitalização ou tratamento com anti-infecciosos parentais não resolvidos pelo menos 8 semanas antes da segunda consulta ou (2) qualquer infecção ativa que requeira anti- infecciosos orais (incluindo antivirais) dentro de dez dias antes da segunda visita ou com um histórico de tuberculose ativa ou (3) um teste Quantiferon TB Gold positivo durante a triagem, ou (4) qualquer vacina viva dentro de 8 semanas antes de assinar o termo de consentimento informado, ou (5) cirurgia de grande porte dentro de 8 semanas antes de assinar o consentimento informado ou (6) cirurgia de grande porte planejada durante o período de estudo não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com contagem absoluta de neutrófilos de <1,3 x 103/hL não devem ser tratados com terapia imunossupressora.
[0257] Pacientes com histórico de linfoma ou outro câncer, exceto carcinoma de células escamosas ou basocelular da pele, não devem ser tratados, a menos que estejam em remissão completa por pelo menos 3 meses antes do tratamento.
[0258] Pacientes com hipertensão não controlada (PA sistólica >180 mmHg, PA diastólica >100 mmHg) apesar de tratamento médico máximo não devem ser tratados.
[0259] Pacientes com alanina aminotransferase (ALT) ou aspartato aminotransferase (AST) >3 x limite superior ao normal
(LSN) ou bilirrubina total >1,5 x LSN não devem ser tratados, a menos que o sujeito tenha um histórico previamente conhecido de síndrome de Gilbert e uma bilirrubina fracionada que mostre bilirrubina conjugada <35% da bilirrubina total.
[0260] Pacientes com um histórico de doenças infecciosas ou abuso de substâncias podem não ser candidatos ao tratamento. Por exemplo, um histórico de vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou infecção pelo vírus da hepatite B ou da hepatite C, ou testes de triagem positivos para antígeno de superfície da hepatite B ou anticorpo do núcleo da hepatite B ou anticorpos de hepatite C ou HIV; um histórico de abuso de álcool ou substâncias dentro de 1 ano antes do tratamento.
[0261] Tratamentos —“Administrados — Pré-tratamento com Terapia Imunossupressora. Antes da terapia gênica, O paciente deve ser tratado com uma terapia imunossupressora para prevenir respostas imunológicas ao transgene e/ou capsídeo AAV. Tal terapia imunossupressora, para pacientes com 6 anos ou mais, inclui corticosteroides (metilprednisolona 10 mg/kg por via intravenosa [IV] uma vez no Dia 1 pré-dose e prednisona oral começando com 0,5 mg/kg/dia no Dia 2 com diminuição gradual e descontinuação na Semana 12), tacrolimo (1 mg duas vezes ao dia [BID] pela boca [PO] Dia 2 à Semana 24 com nível sanguíneo alvo de 4-8 ng/ml e diminuindo ao longo de 8 semanas entre a Semana 24 e 32 e sirolimo (uma dose de carga de 1 mg/m?' a cada 4 horas x 3 doses no Dia -2 e então a partir do Dia -1: sirolimo 0,5 mg/mº/dia dividido em dosagem BID com nível sanguíneo alvo de 4- 8 ng/ml até a Semana 48. Tal terapia imunossupressora, para pacientes com menos de 3 anos de idade, inclui corticosteroides (metilprednisolona 10 mg/kg por via intravenosa [IV] uma vez no
Dia 1 pré-dose e prednisona oral começando com 0,5 mg/kg/dia no Dia 2 com diminuição gradual e descontinuação na Semana 12), tacrolimo (0,05 mg/kg duas vezes ao dia [BID] pela boca [PO] Dia 2 à Semana 24 com nível sanguíneo alvo de 2-4 ng/mL e diminuindo ao longo de 8 semanas entre a Semana 24 e 32 e sirolimo (uma dose de carga de 1 mg/m?: a cada 4 horas x 3 doses no Dia -2 e então a partir do Dia -1: sirolimo 0,5 mg/mº/dia dividido em dosagem BID com nível sanguíneo alvo de 1-3 ng/ml até a Semana
48. Avaliações neurológicas e monitoramento dos níveis sanguíneos de tacrolimo/sirolimo serão conduzidos. As doses de sirolimo e tacrolimo serão ajustadas para manter os níveis sanguíneos na faixa alvo. Nenhuma terapia de imunossupressão está planejada após a semana 48. Na maioria dos sujeitos, os ajustes de dose podem ser baseados na equação: nova dose = dose atual *x (concentração alvo/concentração atual). Os sujeitos devem continuar com a nova dose de manutenção por pelo menos 7- 14 dias antes de um ajuste adicional da dosagem com monitoramento da concentração.
[0262] Terapia Gênica. Um AAV recombinante não replicante do capsídeo do serotipo 9 contendo um cassete de expressão hIDUA (rYrAAV9.hIDUA) é usado para o tratamento. O serotipo AAV9 permite a expressão eficiente da proteína hIDUA no SNC após a administração IC. O genoma do vetor contém um cassete de expressão de hIDUA flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV 2. A expressão a partir do cassete é conduzida por um promotor CAG constitutivo forte. O vetor rAAV9.hIDUA é suspenso em solução Elliotts B para injeção intratecal.
[0263] Para pacientes com 6 anos ou mais, rAAV9.hIDUA é administrada como uma dose única plana por administração IC: uma dose de 2 x 10º GC/g de massa cerebral (2,6 x 10"? GC) ou uma dose de 1 x 10ºº GC/g de massa cerebral (1,3 x 10º? GC). A dose pode ser em um volume de cerca de 5 ml ou menos.
[0264] Para pacientes com menos de 3 anos de idade, rAAVO9.hIDUA é administrada como uma dose única plana por administração IC: ou uma dose de 2 x 10º GC/g de massa cerebral (1,2 x 10º? GC para pacientes com 4 meses ou mais, mas com menos de 9 meses; 2,0 x 10!? GC para pacientes com 9 meses ou mais, mas com menos de 18 meses; 2,2 x 10!? GC para pacientes com 18 meses ou mais, mas com menos de 3 anos) ou uma dose de 1 x 10º GC/g de massa cerebral (6,0 x 10”GC para pacientes com 4 meses ou mais, mas com menos de 9 meses; 1,0 x 10!? GC para pacientes com 9 meses ou mais, mas com menos de 18 meses; 1,1 x 10º? GC para pacientes com 18 meses ou mais, mas com menos de 3 anos). A dose pode ser em um volume de cerca de 5 ml ou menos.
[0265] Para administração de rAAV9.IDUA, o sujeito é submetido a anestesia geral.
6.12 EXEMPLO 12: Protocolo Clínico de Tratamento de MPS 1
[0266] O exemplo a seguir estabelece um protocolo que pode ser usado para tratar sujeitos humanos com um vetor rAAV9.hIDUA para tratar MPS [.
[0267] População de Pacientes. Os pacientes a serem tratados podem incluir homens ou mulheres com menos de 3 anos de idade que têm: * um diagnóstico de MPS I-Hurler grave confirmado pela presença de sinais clínicos e sintomas compatíveis com MPS I-H e/ou homozigosidade ou heterozigosidade composta para mutações exclusivamente associadas ao fenótipo grave.
* uma pontuação de quociente de inteligência (QI) de 255
[0268] Os pacientes devem ter capacidade auditiva e visual suficiente, com ou sem auxílio, para completar o teste de protocolo necessário e estarem dispostos a estar em conformidade com o uso do auxílio, se aplicável, nos dias de teste.
[0269] Os pacientes que podem ser excluídos do tratamento intracisternal (IC) podem incluir sujeitos que têm contraindicação para injeção IC ou punção lombar. Contraindicações para uma injeção IC podem incluir qualquer um dos seguintes: * Histórico de cirurgia anterior na cabeça/pescoço que resultou em uma contraindicação para injeção IC.
* Ter alguma contraindicação para CT (ou contraste) ou para anestesia geral.
* Ter alguma contraindicação para RMI (ou gadolínio).
* Ter taxa de filtração glomerular estimada (eTFG) de <30 mL/min/1,73 mº.
[0270] Pacientes que receberam tratamento IT a qualquer momento e experienciaram uma reação adversa significativa considerada relacionada à administração IT não devem ser tratados com IC. Pacientes com qualquer condição que o médico encarregado acredite não ser apropriada para terapia imunossupressora não devem receber tratamento (por exemplo, contagem absoluta de neutrófilos <l1,3 x 10º/uL, contagem de plaquetas de 100 x 10º/UuL) e a hemoglobina serão avaliadas.
[0271] Un regime alternativo de imunossupressão deve ser usado em qualquer paciente, ou o paciente deve ser excluído, que tenha qualquer histórico de reação de hipersensibilidade a tacrolimo, sirolimo ou prednisolona. Pacientes com um histórico de imunodeficiência primária, esplenectomia ou qualquer condição subjacente que predisponha o sujeito a infecção não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com infecção por herpes zoster, citomegalovírus ou vírus Epstein-Barr (EBV) que não tenha sido completamente resolvida por pelo menos 12 semanas antes da triagem não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com (1) qualquer infecção que requeira hospitalização ou tratamento com anti-infecciosos parentais não resolvidos pelo menos 8 semanas antes da segunda consulta ou (2) qualquer infecção ativa que requeira anti- infecciosos orais (incluindo antivirais) dentro de dez dias antes da segunda visita ou com um histórico de tuberculose ativa ou (3) um teste Quantiferon TB Gold positivo durante a triagem, ou (4) qualquer vacina viva dentro de 8 semanas antes de assinar o termo de consentimento informado, ou (5) cirurgia de grande porte dentro de 8 semanas antes de assinar o consentimento informado ou (6) cirurgia de grande porte planejada durante o período de estudo não devem ser tratados com terapia imunossupressora. Pacientes com contagem absoluta de neutrófilos de <1,3 x 103/hL não devem ser tratados com terapia imunossupressora.
[0272] Pacientes com histórico de linfoma ou outro câncer, exceto carcinoma de células escamosas ou basocelular da pele, não devem ser tratados, a menos que estejam em remissão completa por pelo menos 3 meses antes do tratamento.
[0273] Pacientes com hipertensão não controlada (PA sistólica >180 mmHg, PA diastólica >100 mmHg) apesar de tratamento médico máximo não devem ser tratados.
[0274] Pacientes com alanina aminotransferase (ALT) ou aspartato aminotransferase (AST) >3 x limite superior do normal (LSN) ou bilirrubina total >1,5 x LSN não devem ser tratados, a menos que o sujeito tenha um histórico previamente conhecido de síndrome de Gilbert.
[0275] Pacientes com um histórico de doenças infecciosas ou abuso de substâncias podem não ser candidatos ao tratamento. Por exemplo, um histórico de vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou infecção pelo vírus da hepatite B ou da hepatite C, ou testes de triagem positivos para antígeno de superfície da hepatite B ou anticorpo do núcleo da hepatite B ou anticorpos de hepatite C ou HIV; um histórico de abuso de álcool ou substâncias dentro de 1 ano antes do tratamento.
[0276] Tratamentos —“Administrados — Pré-tratamento com Terapia Imunossupressora. Antes da terapia gênica, oO paciente deve ser tratado com uma terapia imunossupressora para prevenir respostas imunológicas ao transgene e/ou capsídeo AAV. A dosagem de prednisona começará com 0,5 mg/kg/dia e será gradualmente diminuída até a visita da Semana 12. Os ajustes de dose de tacrolimo serão feitos para manter as concentrações sanguíneas mínimas totais entre 2 e 4 ng/mL durante as primeiras 24 Semanas. Na semana 24, a dose será reduzida em aproximadamente 50%. Na semana 28, a dose será ainda reduzida em aproximadamente 50%. O tacrolimo será descontinuado na Semana 32. Os ajustes de dose do sirolimo serão feitos para manter as concentrações sanguíneas mínimas totais entre 1 e 3 ng/ml. Na maioria dos sujeitos, os ajustes de dose podem ser baseados na equação: nova dose = dose atual *x (concentração alvo/concentração atual). Os sujeitos devem continuar com a nova dose de manutenção por pelo menos 7 a 14 dias antes de um ajuste adicional da dosagem com monitoramento da concentração. Veja abaixo para mais detalhes.
[0277] Corticosteroides
[0278] Na manhã da administração do vetor (Dia 1 pré-dose), os pacientes receberão metilprednisolona 10 mg/kg IV (máximo de 500 mg) ao longo de pelo menos 30 minutos. A metilprednisolona deve ser administrada antes da punção lombar e da injeção IC de IP. A pré-medicação com acetaminofeno e um anti-histamínico é opcional, a critério do investigador.
[0279] No Dia 2, a prednisona oral será iniciada com o objetivo de descontinuar a prednisona até a Semana 12. A dose de prednisona será a seguinte: Dia 2 ao final da Semana 2: 0,5 mg/kg/dia Semana 3 e 4: 0,35 mg/kg/dia Semana 5-8: 0,2 mg/kg/dia Semana 9-12: 0,1 mg/kg A prednisona será descontinuada após a Semana 12. A dose exata de prednisona pode ser ajustada para a próxima dose clinicamente prática mais alta.
[0280] Sirolimo
[0281] 2 dias antes da administração do vetor (Dia -2): uma dose de carga de sirolimo 1 mg/m2 a cada 4 horas x 3 doses será administrada
[0282] A partir do Dia -1: sirolimo 0,5 mg/mº/dia dividido em duas doses ao dia com nível sanguíneo alvo de 1-3 ng/ml
[0283] Sirolimo será descontinuado após a visita da Semana
48.
[0284] Tacrolimo
[0285] O tacrolimo será iniciado no Dia 2 (o dia seguinte à administração IP) em uma dose de 0,05 mg/kg duas vezes ao dia e ajustada para alcançar um nível sanguíneo de 2-4 ng/mL por 24 Semanas.
[0286] A partir da visita da Semana 24, o tacrolimo será diminuído ao longo de 8 semanas. Na semana 24, a dose será reduzida em aproximadamente 50%. Na semana 28, a dose será ainda reduzida em aproximadamente 50%. O tacrolimo será descontinuado na Semana 32.
[0287] Terapia Gênica. Um AAV recombinante não replicante do capsídeo do serotipo 9 contendo um cassete de expressão hIDUA (rYrAAV9.hIDUA) é usado para o tratamento. O serotipo AAV9 permite a expressão eficiente da proteína hIDUA no SNC após a administração IC. O genoma do vetor contém um cassete de expressão de hIDUA flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV 2. A expressão a partir do cassete é conduzida por um promotor CAG constitutivo forte. O vetor rAAV9.hIDUA é suspenso em solução Elliotts B para injeção intratecal.
[0288] A rAAV9.hIDUA é administrada como uma dose única plana por administração IC: uma dose de 2 x 10º GC/g de massa cerebral (1,2 x 10!? GC para pacientes com 4 meses ou mais, mas com menos de 9 meses; 2,0 x 10!? GC para pacientes com 9 meses ou mais, mas com menos de 18 meses; 2,2 x 10!? GC para pacientes com 18 meses ou mais, mas com menos de 3 anos), ou uma dose de 1 x 10º GC/g de massa cerebral (6,0 x10!? GC para pacientes com 4 meses ou mais, mas com menos de 9 meses; 1,0 x 10º? GC para pacientes com 9 meses ou mais, mas com menos de 18 meses; 1,1 x 10!? GC para pacientes com 18 meses ou mais, mas com menos de 3 anos). A dose pode ser em um volume de cerca de 5 a 20 ml.
[0289] Para administração de rAAV9.IDUA, o sujeito é submetido a anestesia geral.
EQUIVALENTES
[0290] Embora a invenção seja descrita em detalhes com referência a modalidades específicas desta, será entendido que variações que são funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas neste documento, se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição precedente e das figuras que acompanham. Tais modificações se destinam a cair dentro do escopo das reivindicações anexadas. Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar usando não mais do que a experimentação de rotina, muitos equivalentes para as modalidades específicas da invenção descritas neste documento. Pretende-se abranger tais equivalentes pelas seguintes reivindicações.
[0291] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são incorporados a este relatório descritivo por referência na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse indicado específica e individualmente para ser incorporado integralmente a este documento por referência em sua totalidade.
Alfa-L-iduronidase Humana (huIDUA) — Sinal --> Alfa-L-iduronidase 40 50 V AA ALLA 44 PPYAPAEAPH LVHVDAARAL WPLRRFWRST 60 70 80 90 100
GFCPPLPHSQ ADQYVLSWDQ QLNLAYVGAV PHRGIKQVRT HWLLELVTTR 110 120 130 140 150
GSTGRGLSYN FTHLDGYLDL LRENQLLPGF ELMGSASGHF TDFEDKQQVF 160 170 180 190 200
EWKDLVSSLA RRYIGRYGLA HVSKWNFETW NEPDHHDFDN VSMTMQGFLN 210 220 230 240 250
YYDACSEGLR AASPALRLGG PGDSFHTPPR SPLSWGLLRH CHDGTNFFTG 260 270 280 290 300
EAGVRLDYIS LHRKGARSSI SILEQEKVVA QQIRQLFPKF ADTPIYNDEA 310 320 330 340 350
DPLVGWSLPQ PWRADVTYAA MVYVKVIAQHQ NLLLANTTSA FPYALLSNDN N—-372 . nec. para ligação e atividade 360 370 380 390 400
AFLSYHPHPF AQRTLTARFQ VNNTRPPHVQ LLRKPYLTAM GLLALLDEEQ 410 420 430 440 450
LWAEVSQAGT VLDSNHTVGV LASAHRPQGP ADAWRAAVLI YASDDTRAHP 460 470 480 490 500
NRSVAVTLRL RGVPPGPGLV YVTRYLDNGL CSPDGEWRRL GRPVFPTAEQ Dissulfeto 510 520 530 540 550
FRRMRAAEDP VAAAPRPLPA GGRLTLRPAL RLPSLLLVHV CARPEKPPGQ Bond 560 570 580 590 600
VTRLRALPLT QGQLVLVWSD EHVGSKCLWT YEIQFSQDGK AYTPVSRKPS 610 620 630 640 650
TFNLFVFSPD TGAVSGSYRV RALDYWARPG PFSDPVPYLE VPVPRGPPSP
GNP N = Sítio de glicosilação ligado a N (GICNAc...) Y =Sítio de sulfatação de Y C =Ligação Dissulfeto FIG. 1
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N Y R OD FIG. 5 continuação
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E A T FIG. 5 continuação
RESUMO TRATAMENTO DA MUCOPOLISSACARIDOSE I COM ALFA-L-IDURONIDASE (IDUS) HUMANA TOTALMENTE HUMANA E GLICOSILADA
São descritas composições e métodos para a distribuição de uma ar-L-iduronidase (IDUA) totalmente humana e glicosilada (HuGly) ao líquido cefalorraquidiano do sistema nervoso central (SNC) de um sujeito humano diagnosticado com mucopolissacaridose I (MPS I).
Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas.
Código de Controle Campo 1 Campo 2 Outras Informações: - Nome do Arquivo: P4441 Listagem de Sequências.txt - Data de Geração do Código: 16/03/2021 - Hora de Geração do Código: 18:59:57 - Código de Controle: - Campo 1: D9694B6C693CB322 - Campo 2: C6150D849AAD124C
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