BR112021000801A2 - Produtos alimentícios estáveis em temperatura ambiente - Google Patents
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Abstract
"produtos alimentícios estáveis em temperatura ambiente". a presente invenção refere-se a um processo para fabricar um produto alimentício estável em temperatura ambiente com base na inoculação, em um produto alimentício, de bactérias de ácido lático estáveis capazes de manter a viabilidade e diminuir ligeiramente o ph quando armazenadas em temperatura ambiente. a invenção também se refere ao uso dessas bactérias de ácido lático estáveis para inoculação em um produto alimentício.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRO- DUTOS ALIMENTÍCIOS ESTÁVEIS EM TEMPERATURA AMBIEN- TE".
[001] O pedido refere-se a um processo para fabricar um produto alimentício estável em temperatura ambiente com base na inoculação de um produto alimentício com uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis com a capacidade para manter a viabilidade e diminuir ligei- ramente o pH quando armazenadas à temperatura ambiente. A inven- ção refere-se também ao uso dessa uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis para inoculação em um produto alimentício.
[002] Nos últimos anos, uma tendência emergiu para produtos alimentícios, em particular produtos lácteos, contendo alto nível de bactérias vivas (por seus benefícios para saúde) que, ao mesmo tem- po, possam ser armazenados à temperatura ambiente. De fato, os consumidores estão procurando por produto alimentícios saudáveis que sejam fáceis de serem consumidos, isto é, fáceis de serem trans- portados e armazenados. Tais produtos estáveis à temperatura ambi- ente são também vantajosos em países em que a cadeia fria durante a distribuição e o armazenamento de produtos alimentícios contendo alto nível de bactérias vivas é complexa, para não dizer econômica ou tecnicamente impossível.
[003] Os dois maiores problemas resultantes do armazenamento à temperatura ambiente de produtos alimentícios contendo alto nível de bactérias vivas são: (1) a multiplicação das bactérias vivas no pro- duto alimentício resultando na produção de metabólitos indesejados que impactam finalmente a qualidade do produto alimentício (como um exemplo, as bactérias de ácido lático têm a capacidade de produzir ácido lático à temperatura ambiente resultando em uma diminuição de pH não aceitável do produto final, tal como um produto lácteo), e então (2) a morte das bactérias que não têm a capacidade para sobreviver na matriz alimentícia à temperatura ambiente, resultando na perda dos benefícios associados às bactérias.
[004] O pedido WO2017/194650 descreve as cepas de Lactoba- cillus das espécies paracasei, rhamnosus, fermentum ou delbrueckii subsp bulgaricus que têm a capacidade para reter a viabilidade em uma quantidade de pelo menos 103 cfu/g (começando a partir de um nível de 2,5x107 cfu/g) e não diminuir o pH de um produto de teste mais do que 0,8 unidade, após armazenamento por 150 dias (5 me- ses) a 25 °C.
[005] Entretanto, os produtores de alimentos estão procurando por meios para constantemente aumentar o nível de bactérias de ácido lático (em particular reduzindo-se o nível de diminuição de viabilidade em comparação ao nível de inoculação) e para reduzir a diminuição de pH em produtos alimentícios, a fim de garantir a seus clientes benefí- cios de saúde de bactérias aceitáveis e uma qualidade de produto ali- mentício constante, em particular quando o produto alimentício é ar- mazenado em temperatura ambiente. Entretanto, em alguns países, tais como a China, há uma exigência tanto para produtores quanto consumidores terem a capacidade para armazenar produtos alimentí- cios por pelo menos 6 meses à temperatura ambiente, sem impactar as características do produto alimentício.
[006] Portanto, ainda há uma necessidade de identificar bactérias que tenham - quando inoculadas em um produto alimentício – tanto a capacidade para reter uma alta viabilidade quanto a capacidade para levar a uma menor diminuição de pH, após o armazenamento desse produto alimentício à temperatura ambiente em condições mais estri- tas (pelo menos 6 meses).
[007] A Figura 1 é um gráfico que mostra a viabilidade (em log cfu) de 80 cepas (representando 33 espécies de Lactobacillus) em um iogurte de teste após armazenamento por 30 dias a 37 °C pelo ensaio A.
[008] A Figura 2 é um gráfico que mostra o pH de um iogurte de teste inoculado com uma das 80 cepas (33 espécies de Lactobacillus) após armazenamento por 30 dias a 37 °C pelo ensaio A.
[009] A Figura 3 é um gráfico que mostra o pH de um iogurte de teste inoculado com uma das 20 cepas testadas (barras de teste) e que mostra a viabilidade (em log cfu) das 20 cepas testadas em um iogurte de teste (pontos pretos), após armazenamento por 30 dias a 37 °C pelo ensaio A.
[0010] A Figura 4 é um gráfico que mostra (A) a evolução da viabi- lidade (em log cfu) da cepa DSM32493 em um iogurte e (B) a evolução do pH do iogurte, durante armazenamento por 180 dias a 25 °C.
[0011] A Figura 5 é um gráfico que mostra (A) a evolução da viabi- lidade (em log cfu) da cepa DSM32493v em um iogurte e (B) a evolu- ção do pH do iogurte, durante armazenamento por 180 dias a 25 °C.
[0012] A Figura 6 é um gráfico que mostra (A) a evolução da viabi- lidade (em log cfu) da cepa DSM33120 em um iogurte e (B) a evolução do pH do iogurte, durante armazenamento por 180 dias a 25 °C.
[0013] A Figura 7 é um gráfico que mostra (A) a evolução da viabi- lidade (em log cfu) da cepa DSM33121 em um iogurte e (B) a evolução do pH do iogurte, durante armazenamento por 180 dias a 25 °C.
[0014] Os inventores surpreendentemente identificaram cepas do gênero Lactobacillus, que podem ser adicionadas a um produto ali- mentício, de modo que tanto a viabilidade dessas cepas no produto alimentício quanto o pH desse produto alimentício sejam aceitavel- mente diminuídos, quando armazenado em temperatura ambiente. As-
sim, esse produto alimentício contém um alto nível de bactérias e tem um pH aceitável, quando armazenado em temperatura ambiente, por pelo menos 6 meses.
[0015] A invenção refere-se a um processo para fabricação de um produto alimentício estável em temperatura ambiente, sendo que o dito processo compreende: 1) fornecer um produto alimentício inicial com um pH entre 3,4 e 4,6, em particular, um produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias com um pH entre 3,4 e 4,6 contendo um nível de bactérias que é no máximo 1x102 CFU por g; 2) adicionar ao produto alimentício inicial, em particular, ao produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias, uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis em uma quantidade total de pelo menos 1,0x105 CFU por g, para obter um produto alimentício es- tável em temperatura ambiente, caracterizado pelo fato de que: (i) cada uma dentre a dita uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis é selecionada a partir do grupo que consiste em cepas de espécies Lactobacillus plantarum, Lactobacillus zymae, Lactobaci- llus rossiae, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus similis, Lactobaci- llus versmoldensis, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus hammesii, Lactobacillus namurensis, Lactobacillus nodensis e Lactobacillus tuc- ceti; e (ii) cada uma dentre a dita uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tra- tado com calor a 75 °C por 25 segundos: a) retém a viabilidade em uma quantidade de pelo menos 5,0x103 CFU/g após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,6 unidade após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma tempe- ratura de 37 °C.
[0016] A invenção também se refere ao uso de uma ou mais bac- térias de ácido lático estáveis para inoculação em um produto alimen- tício inicial, em particular um produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias, com um pH entre 3,4 e 4,6, em que (i) a dita bactéria de ácido lático estável é selecionada a partir do grupo que consiste em cepas de espécies Lactobacillus plan- tarum, Lactobacillus zymae, Lactobacillus rossiae, Lactobacillus colli- noides, Lactobacillus similis, Lactobacillus versmoldensis, Lactobaci- llus acidipiscis, Lactobacillus hammesii, Lactobacillus namurensis, Lac- tobacillus nodensis e Lactobacillus tucceti; e (ii) a dita bactéria de ácido lático estável, quando adiciona- da em uma quantidade de 1x106 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 se- gundos: a) retém a viabilidade em uma quantidade de pelo menos 5,0x103 CFU/g após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,6 unidade após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma tempe- ratura de 37 °C. Produto alimentício inicial
[0017] Um produto alimentício inicial com um pH entre 3,4 e 4,6 é fornecido na etapa 1) do processo da invenção ou fornecido no uso da invenção.
[0018] Por "produto alimentício", entende-se qualquer produto que é destinado ao consumo por seres humanos. De acordo com a inven- ção (e em particular a etapa 2 do processo), o produto alimentício ini-
cial deve ser adequado para ser inoculado com a uma ou mais bacté- rias de ácido lático estáveis. Por "produto alimentício inicial", entende- se um produto alimentício antes da adição da uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis e, portanto, que não contém bactérias de ácido lático estáveis conforme definido no presente documento. O produto alimentício inicial deve ser distinguido do "produto alimentício estável em temperatura ambiente" que contém bactérias de ácido lático está- veis conforme definido no presente documento.
[0019] Em uma modalidade, o dito produto alimentício inicial é um produto alimentício fermentado. A fermentação é executada através da ação de uma cultura iniciadora de bactérias pela conversão de carboi- dratos em ácido. Uma "cultura iniciadora de bactérias" é definida como uma composição que compreende ou consiste em uma ou mais bacté- rias que tem a capacidade de iniciar e realizar a fermentação de um substrato. Em uma modalidade particular, o dito produto alimentício inicial é um produto alimentício fermentado por ácido acético, o que significa que a fermentação é executada através da ação de uma cul- tura iniciadora de bactérias de ácido acético pela conversão de carboi- dratos em ácido acético. Em uma modalidade, o dito produto alimentí- cio inicial é um produto alimentício fermentado por ácido lático, o que significa que a fermentação é executada através da ação de uma cul- tura iniciadora de bactérias de ácido lático pela conversão de carboi- dratos em ácido lático. A expressão "bactérias de ácido lático" (LAB) refere-se a bactérias de grau alimentício que produzem ácido lático como o produto final metabólico principal da fermentação de carboidra- to. As bactérias de ácido lático são bem conhecidas na técnica e inclu- em cepas do gênero Lactococcus, do gênero Streptococcus, do gêne- ro Lactobacillus, do gênero Bifidobacterium, do gênero Leuconostoc, do gênero Enterococcus, do gênero Pediococcus, do gênero Brevibac- terium e do gênero Propinibacterium.
[0020] Em uma modalidade, o dito produto alimentício inicial da etapa 1) é selecionado a partir do grupo que consiste em um produto à base de leite, um produto à base de fruta, tal como uma bebida à base de fruta, um produto à base de vegetais, tal como uma bebida à base de vegetais, um produto à base de cereal, tal como uma bebida à base de cereal, um produto à base de arroz, tal como uma bebida à base de arroz, um produto à base de castanhas, tal como uma bebida à base de castanhas, um produto à base de soja e qualquer mistura dos mesmos. Por "produto à base de leite", "produto ou bebida à base de fruta", "produto ou bebida à base de vegetais", "produto ou bebida à base de cereal", "produto ou bebida à base de arroz", "produto ou be- bida à base de castanhas" e "produto à base de soja", entende-se que o componente principal do produto alimentício inicial é, respectivamen- te, leite, fruta, vegetais, cereal, arroz, castanhas e soja. Em uma mo- dalidade, leite, fruta, vegetais, cereal, arroz, castanhas e soja são o único componente usado como substrato para fabricar o produto à ba- se de leite, produto ou bebida à base de fruta, produto ou bebida à ba- se de vegetais, produto ou bebida à base de cereal, produto ou bebida à base de arroz, produto ou bebida à base de castanhas e produto à base de soja (como produtos alimentícios iniciais), respectivamente. O termo "bebida" é definido neste pedido como um produto alimentício líquido.
[0021] Em uma modalidade, o produto à base de leite (como pro- duto alimentício inicial) é um produto lácteo fermentado ou um produto lácteo quimicamente acidificado. Em uma modalidade, um produto lác- teo fermentado é selecionado a partir do grupo que consiste em um leite fermentado, um iogurte, um queijo, creme azedo, leitelho e soro de leite fermentado. Os produtos lácteos fermentados são bem conhe- cidos na técnica e são fabricados através da ação de uma cultura ini- ciadora de bactérias de ácido lático (conforme definido no presente documento) em um substrato de leite (o pH do substrato de leite é de cerca de 6,5 a 7). Um "substrato de leite" é definido no presente do- cumento como qualquer leite de origem mamífera, incluindo, porém sem limitação, leite de vaca, ovelha e cabra. O leite pode estar no es- tado nativo, pode ser um leite reconstituído ou um leite desnatado. O substrato de leite, em particular o leite, é tipicamente tratado anterior- mente, em particular por padronização, adição de aditivos [por exem- plo, açúcar, adoçantes e/ou estabilizantes], homogeneização e/ou tra- tamento com calor [por exemplo, pasteurização]. Em uma modalidade particular, o leite fermentado é obtido pela fermentação de leite com uma cultura iniciadora de bactérias de ácido lático selecionada a partir do grupo que consiste em uma cultura iniciadora que compreende uma cepa de Streptococcus thermophilus, uma cultura iniciadora que com- preende uma cepa do gênero Lactobacillus e uma cultura iniciadora que compreende uma cepa de Lactococcus lactis. Em uma modalida- de particular, o dito leite fermentado é obtido pela fermentação de leite com uma cultura iniciadora de bactérias de ácido lático selecionada a partir do grupo que consiste em uma cultura iniciadora que compreen- de ou consiste em Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgari- cus, uma cultura iniciadora que compreende ou consiste em Strepto- coccus thermophilus e Lactobacillus johnsonii e uma cultura iniciadora que compreende ou consiste em Streptococcus thermophilus e Lacto- bacillus fermentum. Em uma modalidade particular, o dito leite fermen- tado é um iogurte.
[0022] Em uma modalidade, o produto à base de fruta (como pro- duto alimentício inicial) é uma bebida à base de fruta. Em uma modali- dade particular, o produto à base de fruta é um suco de fruta ou um suco de fruta fermentado.
[0023] Em uma modalidade, o produto à base de vegetais (como produto alimentício inicial) é uma bebida à base de vegetais. Em uma modalidade particular, o produto à base de vegetais é um suco de ve- getais ou um suco de vegetais fermentado.
[0024] Em uma modalidade, o produto à base de cereal (como produto alimentício inicial) é uma bebida à base de cereal. Em uma modalidade particular, o produto à base de cereal é um produto de ce- real quimicamente acidificado, um produto de cereal fermentado, uma bebida de cereal quimicamente acidificada ou uma bebida de cereal fermentada.
[0025] Em uma modalidade, o produto à base de arroz (como pro- duto alimentício inicial) é uma bebida à base de arroz. Em uma moda- lidade particular, o produto à base de arroz é um produto de arroz quimicamente acidificado, um produto de arroz fermentado, uma bebi- da de arroz quimicamente acidificada ou uma bebida de arroz fermen- tada.
[0026] Em uma modalidade, o produto à base de castanhas é uma bebida à base de castanhas. Em uma modalidade particular, o produto à base de castanhas é um produto de castanhas quimicamente acidifi- cado, um produto de castanhas fermentado, uma bebida de castanhas quimicamente acidificada ou uma bebida de castanhas fermentada. Em uma modalidade particular de qualquer produto à base de casta- nhas descrito no presente documento, o produto alimentício é um pro- duto à base de noz.
[0027] Em uma modalidade, o produto à base de soja (como pro- duto alimentício inicial) é uma bebida à base de soja. Em uma modali- dade particular, o produto à base de soja é um produto de leite de soja fermentado.
[0028] Em uma modalidade, o termo "produto alimentício inicial" também cobre qualquer mistura de produto à base de leite, produto ou bebida à base de fruta, produto ou bebida à base de vegetais, produto ou bebida à base de cereal, produto ou bebida à base de arroz, produ-
to ou bebida à base de castanhas e produto à base de soja conforme definido no presente documento, tal como, por exemplo, porém sem limitação, uma mistura de um produto à base de leite e bebida à base de cereal, ou uma mistura de um produto à base de leite e bebida à base de fruta.
[0029] Em uma modalidade, o dito produto alimentício inicial é um produto alimentício "que contém baixo teor de bactérias" inicial com um pH entre 3,4 e 4,6, isto é, é um produto alimentício inicial conforme definido no presente documento com um nível de bactérias que é no máximo 1x102 CFU por g do dito produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias. Por "nível de bactérias" usado no presente documento, entende-se a quantidade total de bactérias conforme cal- culado como cfu/g do produto. A contagem de cfu pode ser medida plaqueando-se a diluição (ou diluições) do produto a ser testado em ágar MRS/M17/PCA [Atlas, 2010 Handbook of Microbiological Media, Quarta Edição, páginas 986, 1.231 e 1.402].
[0030] Qualquer produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias pode ser usado na etapa 1) do processo da invenção ou no uso da invenção. De acordo com a invenção (e em particular a eta- pa 2 do processo), o produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias deve ser adequado para ser inoculado com as bactérias estáveis.
[0031] Em uma modalidade, o produto alimentício inicial tem natu- ralmente um nível de bactérias que é no máximo 1x102 CFU por g do produto alimentício.
[0032] Em outra modalidade, o produto alimentício inicial tem um nível de bactérias, diferente das bactérias de ácido lático estáveis con- forme definido no presente documento, que é maior do que 1x102 CFU por g do produto alimentício. A presença de bactérias, em particular bactérias de ácido lático, pode resultar do uso desses micro-
organismos (em particular como cultura iniciadora) durante a fabrica- ção do produto alimentício inicial, por exemplo, quando o produto ali- mentício inicial resulta da fermentação de um substrato (conforme ex- plicado acima).
[0033] Em uma modalidade opcional da invenção, o produto ali- mentício inicial é, portanto, tratado, anteriormente à inoculação da LAB estável, de modo a obter um produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias. Por "tratamento", entende-se qualquer tratamento que inativa as bactérias contidas no produto alimentício inicial (por exemplo, que inibe ou reduz o crescimento das bactérias ou extermina as bactérias), de modo a reduzir o nível de bactérias em no máximo 1x102 CFU por g do produto alimentício que contém baixo teor de bac- térias. Os meios de tratamento são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, o produto alimentício inicial é tratado com o uso de meios selecionados a partir do grupo que consiste em esterilização por alta pressão, irradiação, ultrafiltração e tratamento com calor. Em uma modalidade particular, o produto alimentício inicial é tratado com calor de modo a reduzir o nível de bactérias em no máximo 1x102 CFU por g do produto alimentício que contém baixo teor de bactérias.
[0034] Por "tratamento com calor", entende-se qualquer tratamen- to baseado em temperatura que inativa as bactérias contidas no pro- duto alimentício inicial (por exemplo, que inibe ou reduz o crescimento das bactérias ou extermina as bactérias), de modo a reduzir o nível de bactérias no produto alimentício que contém baixo teor de bactérias em no máximo 1x102 CFU por g do produto alimentício que contém baixo teor de bactérias.
[0035] Assim, em uma modalidade, a invenção refere-se a um processo para fabricação de um produto alimentício estável em tempe- ratura ambiente, sendo que o dito processo compreende: 1) fornecer um produto alimentício inicial com um pH entre
3,4 e 4,6; 1b) tratar o produto alimentício inicial de modo a obter um nível de bactérias que é no máximo 1x102 CFU por g [do produto ali- mentício que contém baixo teor inicial de bactérias resultante], em par- ticular tratando-se com calor o dito produto alimentício inicial; e 2) adicionar ao produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias, uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis em uma quantidade total de pelo menos 1,0x105 CFU por g, para obter um produto alimentício estável em temperatura ambiente, caracterizado pelo fato de que: (i) cada uma dentre a dita uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis é selecionada a partir do grupo que consiste em cepas de espécies Lactobacillus plantarum, Lactobacillus zymae, Lactobaci- llus rossiae, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus similis, Lactobaci- llus versmoldensis, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus hammesii, Lactobacillus namurensis, Lactobacillus nodensis e Lactobacillus tuc- ceti; e (ii) cada uma dentre a dita uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tra- tado com calor a 75 °C por 25 segundos: a) retém a viabilidade em uma quantidade de pelo menos 5,0x103 CFU/g após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,6 unidade após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma tempe- ratura de 37 °C.
[0036] Em uma modalidade, o processo da invenção é executado em um leite fermentado conforme definido no presente documento, em particular um iogurte conforme definido no presente documento. As-
sim, a invenção refere-se a um processo para a fabricação de um leite fermentado, em particular um iogurte, estável em temperatura ambien- te, sendo que o dito processo compreende 1a) produzir um leite fermentado inicial, em particular um iogurte inicial, com um pH entre 3,4 e 4,6 pela fermentação de um substrato de leite; 1b) tratar, em particular tratar com calor, o dito leite fermen- tado inicial, em particular o dito iogurte inicial, de modo a obter um leite fermentado que contém baixo teor inicial de bactérias, em particular um iogurte que contém baixo teor inicial de bactérias contendo um ní- vel de bactérias que é no máximo 1x102 CFU por g; e 2) adicional ao leite fermentado que contém baixo teor inici- al de bactérias, em particular ao iogurte que contém baixo teor inicial de bactérias, uma ou mais das cepas de bactérias de ácido lático es- táveis em uma quantidade total de pelo menos 1,0x105 CFU por g para obter um leite fermentado, em particular um iogurte, estável em tempe- ratura ambiente, caracterizado pelo fato de que: (i) cada uma dentre uma ou mais das ditas bactérias de ácido lático estáveis é selecionada a partir do grupo que consiste em cepas de espécies Lactobacillus plantarum, Lactobacillus zymae, Lac- tobacillus rossiae, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus similis, Lac- tobacillus versmoldensis, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus ham- mesii, Lactobacillus namurensis, Lactobacillus nodensis e Lactobaci- llus tucceti; e (ii) cada uma dentre uma ou mais das ditas bactérias de ácido lático estáveis, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos: a) retém a viabilidade em uma quantidade de pelo menos
5,0x103 CFU/g após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,6 unidade após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma tempe- ratura de 37 °C.
[0037] O produto alimentício, opcionalmente contendo baixo teor de bactérias, inicial [em particular fornecido como tal (etapa 1) ou após o tratamento (etapa 1b) ou após a produção por fermentação e trata- mento (etapa 1b)] deve ser adequado para atingir o objetivo da inven- ção, isto é, fabricar um produto alimentício estável em temperatura ambiente.
[0038] Em uma modalidade, o pH do produto alimentício, opcio- nalmente contendo baixo teor de bactérias, inicial está entre 3,4 e 4,6. Em uma modalidade, o pH do produto alimentício, opcionalmente con- tendo baixo teor de bactérias, inicial está entre 3,4 e 4,0. Em uma mo- dalidade, o pH do produto alimentício, opcionalmente contendo baixo teor de bactérias, inicial está entre 4,0 e 4,6. Em uma modalidade, o pH do produto alimentício, opcionalmente contendo baixo teor de bac- térias, inicial está entre 3,6 e 4,2. O pH pode ser determinado com o uso de qualquer medidor de pH.
[0039] Em uma modalidade, opcionalmente em combinação com qualquer modalidade do parágrafo anterior, o teor de açúcar do dito produto alimentício, opcionalmente contendo baixo teor de bactérias, inicial está entre 0 e 13%. Por "teor de açúcar", entende-se o teor de açúcar total no produto alimentício, opcionalmente contendo baixo teor de bactérias, inicial, seja o açúcar originalmente contido no produto alimentício inicial, açúcar adicionado ao produto alimentício inicial ou uma combinação do açúcar originalmente contido no produto alimentí- cio inicial e do açúcar adicionado ao produto alimentício inicial. Em uma modalidade, o teor de açúcar do dito produto alimentício, opcio-
nalmente contendo baixo teor de bactérias, inicial está entre 4 e 10%. Em uma modalidade, o teor de açúcar do dito produto alimentício, op- cionalmente contendo baixo teor de bactérias, inicial está entre 6 e 9%. Em um conteúdo particular, o teor de sacarose do dito produto alimentício, opcionalmente contendo baixo teor de bactérias, inicial es- tá entre 0 e 8%. Em uma modalidade, o teor de sacarose do dito pro- duto alimentício, opcionalmente contendo baixo teor de bactérias, ini- cial está entre 5 e 8%. Adição/inoculação de uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis ao produto alimentício inicial
[0040] O produto alimentício inicial conforme definido no presente documento, em particular ao produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias conforme definido no presente documento, é inocu- lado com uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis em uma quantidade total de pelo menos 1,0x105 CFU por g (etapa 2 do proces- so da invenção ou uso da invenção).
[0041] Dentro do contexto da invenção, "adicionar" é usado de forma intercambiável com "inocular" (assim como "adicionado" e "ino- culado") e significa que a uma ou mais bactérias de ácido lático está- veis (conforme definido no presente documento) são colocadas em contato com o produto alimentício inicial. Por "uma ou mais", entende- se pelo menos uma bactéria de ácido lático (LAB). Em uma modalida- de, o número de LABs adicionadas ao produto alimentício é seleciona- do a partir do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10. Em uma modalidade, 1 LAB estável é adicionada ao produto alimentício. Em uma modalidade, 2 LABs estáveis são adicionadas ao produto ali- mentício. Em uma modalidade, 3 LABs estáveis são adicionadas ao produto alimentício. Em uma modalidade, 4 LABs estáveis são adicio- nadas ao produto alimentício. Em uma modalidade, 5 LABs estáveis são adicionadas ao produto alimentício.
[0042] A uma ou mais LABs estáveis são adicionadas ao produto alimentício inicial, em particular ao produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias, em uma quantidade total de pelo menos 1x105 cfu por g do produto alimentício. Quando diversas (isto é, pelo menos 2) LABs estáveis são adicionadas, "quantidade total" significa a soma de cada quantidade individual da LAB estável inoculada (como um exemplo, a adição de uma primeira LAB estável a 3x105 cfu/g e de uma segunda LAB estável a 7x105 cfu/g leva a uma quantidade total de 1x106 cfu/g). Em uma modalidade, a uma ou mais LABs estáveis são adicionadas ao produto alimentício inicial, em particular ao produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias, em uma quanti- dade total selecionada a partir do grupo que consiste em pelo menos 5x105 CFU por g, pelo menos 1x106 CFU por g, pelo menos 5x106 CFU por g ou pelo menos 1x107 CFU por g do produto alimentício ini- cial. Em uma modalidade, a uma ou mais LABs estáveis são adiciona- das ao produto alimentício inicial, em particular ao produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias, em uma faixa de quantidade total selecionada a partir do grupo que consiste em de 1x105 a 1x108 cfu por g, de 1x106 a 1x108 cfu por g e de 5x106 a 1x108 cfu por g.
[0043] A uma ou mais LABs estáveis podem ser inoculados no produto alimentício inicial sob qualquer forma, tal como sob formato congelado, seco, seco por congelamento, líquido ou sólido, na forma de péletes ou péletes congelados, ou na forma de um pó ou pó seco. Em uma modalidade, a uma ou mais LABs estáveis são adicionadas ao produto alimentício inicial, sob forma líquida, por exemplo, como cultura iniciadora em escala industrial [isto é, uma cultura de LAB ante- riormente propagada em um meio de crescimento para obter a con- centração de inoculação exigida]. Em uma modalidade, a uma ou mais LABs estáveis são diretamente adicionadas ao produto alimentício ini- cial sob a forma de concentrados, por exemplo, concentrados conge-
lados ou secos. Em uma modalidade, a uma ou mais LABs estáveis são adicionadas ao produto alimentício sob forma líquida como uma diluição [por exemplo, em água ou solução salina] de concentrados, tal como de concentrados congelados ou secos. A expressão "diretamen- te inoculada" significa que a uma ou mais LABs estáveis são adiciona- das ao produto alimentício inicial sem propagação anterior. A inocula- ção direta exige que a concentração da uma ou mais LABs estáveis seja alta o suficiente. Assim, a concentração de LABs estáveis no con- centrado congelado ou seco está na faixa de 108 a 1012 cfu por g de concentrado e, mais preferencialmente, pelo menos 108, pelo menos 109, pelo menos 1010, pelo menos 1011 ou pelo menos 1012 cfu/g de concentrado.
[0044] Em uma modalidade, a dita uma ou mais cepas são assep- ticamente adicionadas ao produto alimentício inicial. Por "asseptica- mente", entende-se que nenhum outro micro-organismos diferente da uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis é adicionado ao produ- to alimentício, por exemplo, com o uso de sistema de inoculação em linha asséptica Tetra FlexDosTM. As bactérias de ácido lático estáveis (LABs estáveis)
[0045] A uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis (LABs) adicionadas ao produto alimentício inicial (na etapa 2) do processo rei- vindicado da invenção ou no uso da invenção) são caracterizadas pe- los 2 seguintes recursos: (i) a uma ou mais cepas de bactérias de ácido lático está- veis são selecionadas a partir do grupo que consiste em cepas de es- pécies Lactobacillus plantarum, Lactobacillus zymae, Lactobacillus rossiae, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus similis, Lactobacillus versmoldensis, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus hammesii, Lac- tobacillus namurensis, Lactobacillus nodensis e Lactobacillus tucceti.
[0046] Em uma modalidade, a uma ou mais cepas de bactérias de ácido lático estáveis são selecionadas a partir do grupo que consiste em cepas de espécies Lactobacillus plantarum, Lactobacillus zymae, Lactobacillus rossiae, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus versmol- densis e Lactobacillus namurensis. Em uma modalidade, a uma ou mais cepas de bactérias de ácido lático estáveis são selecionadas a partir do grupo que consiste em cepas de espécies Lactobacillus plan- tarum e Lactobacillus zymae.
[0047] Em uma modalidade, a uma ou mais cepas de bactérias de ácido lático estáveis são da espécie Lactobacillus plantarum. Em uma modalidade, a uma ou mais cepas de bactérias de ácido lático estáveis são da espécie Lactobacillus zymae. Em uma modalidade, a uma ou mais cepas de bactérias de ácido lático estáveis são da espécie Lac- tobacillus rossiae. Em uma modalidade, a uma ou mais cepas de bac- térias de ácido lático estáveis são da espécie Lactobacillus collinoides. Em uma modalidade, a uma ou mais cepas de bactérias de ácido láti- co estáveis são da espécie Lactobacillus similis. Em uma modalidade, a uma ou mais cepas de bactérias de ácido lático estáveis são da es- pécie Lactobacillus versmoldensis. Em uma modalidade, a uma ou mais cepas de bactérias de ácido lático estáveis são da espécie Lac- tobacillus acidipiscis. Em uma modalidade, a uma ou mais cepas de bactérias de ácido lático estáveis são da espécie Lactobacillus ham- mesii. Em uma modalidade, a uma ou mais cepas de bactérias de áci- do lático estáveis são da espécie Lactobacillus namurensis. Em uma modalidade, a uma ou mais cepas de bactérias de ácido lático estáveis são da espécie Lactobacillus nodensis. Em uma modalidade, a uma ou mais cepas de bactérias de ácido lático estáveis são da espécie Lac- tobacillus tucceti.
[0048] Para evitar dúvidas, as espécies de Lactobacillus descritas no presente documento são conforme definido na literatura, em parti- cular em Salvetti et al. 2012 Probiotics & Antimicro. Prot. 4(4): 217 a
226, e Cay et al. 2012 Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62: 1.140 a 1.144. (ii) cada uma dentre a uma ou mais cepas de bactérias de ácido lático estáveis permanece viável em, e não diminui significativamente o pH de, um iogurte tratado com calor armazenado 30 dias a uma tempera- tura de 37 °C (isto é, sob condições estritas).
[0049] Assim, em uma modalidade, a dita cepa de bactéria de áci- do lático estável, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos: a) retém a viabilidade em uma quantidade de pelo menos 5,0x103 CFU/g após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,6 unidade após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma tempe- ratura de 37 °C.
[0050] Em uma modalidade, o teor de açúcar do dito iogurte de teste está entre 0 e 13%. Em uma modalidade, o teor de açúcar do dito iogurte de teste está entre 4 e 10%. Em uma modalidade, o teor de açúcar do dito iogurte de teste está entre 6 e 9%. Em um conteúdo particular, o teor de sacarose do dito iogurte de teste está entre 0 e 8%. Em uma modalidade, o teor de sacarose do dito iogurte de teste está entre 5 e 8%. Em uma modalidade, o teor de açúcar do dito iogur- te de teste está entre 12 e 13%, incluindo um teor de sacarose entre 7 e 9%.
[0051] Em uma modalidade, o recurso (ii) é testado aplicando-se o ensaio A conforme descrito a seguir: - o inóculo da LAB a ser testada é preparado da seguinte forma: uma cultura da LAB a 106 cfu/ml é cultivada em 10 ml de caldo MRS/M17 de um dia para o outro a 37 °C; após 2 h a 4 °C, a cultura é centrifugada a 4.000 rpm por 10 min; o pélete é ressuspenso em 10 ml de solução salina estéril; a etapa de centrifugação/ressuspensão é re- petida uma segunda vez, para gerar o inóculo - após a padronização do inóculo a cerca de 1x109 CFU/ml, 0,4 ml do inóculo foi adicionado a 40 ml do iogurte tratado com calor (2,8% de proteína, 3% de gordura, 12,5% de açúcar total incluindo 8% de sacarose; pH 4,3) e bem misturado [a concentração de LAB estável final no iogurte tratado com calor é cerca de 1x107 CFU/g de iogurte]; o tubo é, então, vedado. - o iogurte inoculado é incubado a 37 °C por 30 dias. - após 30 dias, o pH é determinado pelo medidor de pH (Mettler Toledo, SevenEasy); o pH no dia 30 é, então, comparado ao pH do iogurte tratado com calor no momento da adição de LAB - após 30 dias, a contagem de CFU é determinada plaque- ando-se no ágar MRS/M17 da seguinte forma: 1 ml da amostra de io- gurte foi diluída em série por solução salina estéril até 10-7; ágar MRS/M17 (1,5%) foi fundido e mantido a 48 °C em banho de água; 1 ml de diluição 10-1 a 10-7 foi adicionado à placa de petri e vertido com 25 ml do ágar MRS/M17; as placas foram incubadas a 37 °C anaerobi- camente por 2 dias para contagem; a quantidade de LABs no dia 30 é, então, comparada à quantidade de LAB adicionada ao iogurte tratado com calor.
[0052] Em uma modalidade do recurso a), a dita cepa de bactéria de ácido lático estável, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteri- ormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos (tal como aplican- do-se o ensaio A), retém a viabilidade em uma quantidade de pelo menos 5x103 CFU/g, pelo menos 1x104 CFU/g, pelo menos 5x104 CFU/g, pelo menos 1x105 CFU/g, pelo menos 5x105 CFU/g ou pelo menos 1x106 CFU/g, após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
[0053] Em uma modalidade do recurso b), considerada individual- mente ou em combinação com a modalidade parágrafo anterior [recur- so a], a dita cepa de bactéria de ácido lático estável, quando adiciona- da em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 se- gundos (tal como aplicando-se o ensaio A), diminui o pH do dito iogur- te de teste em no máximo 0,6 unidade, no máximo 0,5 unidade, no máximo 0,4 unidade ou no máximo 0,3 unidade, após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
[0054] Em uma modalidade, a dita cepa de bactéria de ácido lático estável, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos (tal como aplicando-se o ensaio A): a) retém a viabilidade em uma quantidade selecionada a partir do grupo que consiste em pelo menos 5,0x103 CFU/g, pelo me- nos 1,0x104 CFU/g, pelo menos 5,0x104 CFU/g, pelo menos 1,0x105 CFU/g, pelo menos 5,0x105 CFU/g ou pelo menos 1,0x106 CFU/g; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,6 unidade, no máximo 0,5 unidade, em no máximo 0,4 unidade ou no máximo 0,3 unidade, após o armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
[0055] Em uma modalidade particular, a dita cepa de bactéria de ácido lático estável, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos (tal como aplicando-se o ensaio A): a) retém a viabilidade em uma quantidade selecionada a partir do grupo que consiste em pelo menos 1x104 CFU/g, pelo menos 5x104 CFU/g, pelo menos 1x105 CFU/g, pelo menos 5x105 CFU/g ou pelo menos 1x106 CFU/g; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,6 unidade, no máximo 0,5 unidade, em no máximo 0,4 unidade ou no máximo 0,3 unidade, após o armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
[0056] Em uma modalidade particular, a dita cepa de bactéria de ácido lático estável, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos (tal como aplicando-se o ensaio A): a) retém a viabilidade em uma quantidade selecionada a partir do grupo que consiste em pelo menos 5x103 CFU/g, pelo menos 1x104 CFU/g, pelo menos 5x104 CFU/g, pelo menos 1x105 CFU/g, pelo menos 5x105 CFU/g ou pelo menos 1,0x106 CFU/g; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,5 unidade, em no máximo 0,4 unidade ou no máximo 0,3 unidade, após o armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
[0057] Em uma modalidade particular, a dita cepa de bactéria de ácido lático estável, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos (tal como aplicando-se o ensaio A): a) retém a viabilidade em uma quantidade selecionada a partir do grupo que consiste em pelo menos 1x104 CFU/g, pelo menos 5x104 CFU/g, pelo menos 1x105 CFU/g, pelo menos 5x105 CFU/g ou pelo menos 1x106 CFU/g; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,5 unidade, em no máximo 0,4 unidade ou no máximo 0,3 unidade,
após o armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
[0058] Em uma modalidade particular, a dita cepa de bactéria de ácido lático estável, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos (tal como aplicando-se o ensaio A): a) retém a viabilidade em uma quantidade selecionada a partir do grupo que consiste em pelo menos 1x105 CFU/g, pelo menos 5x105 CFU/g ou pelo menos 1x106 CFU/g; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,3 unidade, após o armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
[0059] Qualquer cepa de Lactobacillus plantarum, Lactobacillus zymae, Lactobacillus rossiae, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus similis, Lactobacillus versmoldensis, Lactobacillus acidipiscis, Lactoba- cillus hammesii, Lactobacillus namurensis, Lactobacillus nodensis e Lactobacillus tucceti que satisfaça o recurso (ii) conforme definido no presente documento, em particular quando avaliada pelo teste A, pode ser usada no processo da invenção ou no uso da invenção.
[0060] Em uma modalidade, a dita cepa de bactéria de ácido lático estável é selecionada a partir do grupo que consiste em cepas de es- pécies Lactobacillus plantarum, Lactobacillus zymae, Lactobacillus rossiae, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus similis, Lactobacillus versmoldensis, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus hammesii, Lac- tobacillus namurensis, Lactobacillus nodensis e Lactobacillus tucceti e, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um io- gurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos (tal como aplicando-se o ensaio A):
a) retém a viabilidade em uma quantidade selecionada a partir do grupo que consiste em pelo menos 5x103 CFU/g, pelo menos 1x104 CFU/g, pelo menos 5x104 CFU/g, pelo menos 1x105 CFU/g, pelo menos 5,0x105 CFU/g ou pelo menos 1x106 CFU/g; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,6 unidade, no máximo 0,5 unidade, em no máximo 0,4 unidade ou no máximo 0,3 unidade, após o armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
[0061] Em uma modalidade, a dita cepa de bactéria de ácido lático estável é selecionada a partir do grupo que consiste em cepas de es- pécies Lactobacillus plantarum, Lactobacillus zymae, Lactobacillus rossiae, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus versmoldensis, Lacto- bacillus hammesii, Lactobacillus similis, Lactobacillus nodensis, Lacto- bacillus tucceti e Lactobacillus namurensis e, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos (tal como aplicando-se o ensaio A): a) retém a viabilidade em uma quantidade selecionada a partir do grupo que consiste em pelo menos 1x104 CFU/g, pelo menos 5x104 CFU/g, pelo menos 1x105 CFU/g, pelo menos 5x105 CFU/g ou pelo menos 1x106 CFU/g; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,6 unidade, no máximo 0,5 unidade, em no máximo 0,4 unidade ou no máximo 0,3 unidade, após o armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
[0062] Em uma modalidade, a dita cepa de bactéria de ácido lático estável é selecionada a partir do grupo que consiste em cepas de es- pécies Lactobacillus plantarum, Lactobacillus zymae, Lactobacillus rossiae, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus versmoldensis, Lacto- bacillus similis e Lactobacillus namurensis e, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos (tal como aplicando-se o ensaio A): a) retém a viabilidade em uma quantidade selecionada a partir do grupo que consiste em pelo menos 5x103 CFU/g, pelo menos 1x104 CFU/g, pelo menos 5x104 CFU/g, pelo menos 1x105 CFU/g, pelo menos 5x105 CFU/g ou pelo menos 1x106 CFU/g; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,5 unidade, em no máximo 0,4 unidade ou no máximo 0,3 unidade, após o armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
[0063] Em uma modalidade, a dita cepa de bactéria de ácido lático estável é selecionada a partir do grupo que consiste em cepas de es- pécies Lactobacillus plantarum, Lactobacillus zymae, Lactobacillus rossiae, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus versmoldensis, Lacto- bacillus similis e Lactobacillus namurensis e, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos (tal como aplicando-se o ensaio A): a) retém a viabilidade em uma quantidade selecionada a partir do grupo que consiste em pelo menos 1x104 CFU/g, pelo menos 5x104 CFU/g, pelo menos 1x105 CFU/g, pelo menos 5x105 CFU/g ou pelo menos 1x106 CFU/g; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,5 unidade, em no máximo 0,4 unidade ou no máximo 0,3 unidade, após o armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
[0064] Em uma modalidade, a dita cepa de bactéria de ácido lático estável é selecionada a partir do grupo que consiste em cepas de es- pécies Lactobacillus plantarum e Lactobacillus zymae e, quando adici- onada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos (tal como aplicando-se o ensaio A): a) retém a viabilidade em uma quantidade selecionada a partir do grupo que consiste em pelo menos 1x105 CFU/g, pelo menos 5x105 CFU/g ou pelo menos 1x106 CFU/g; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,3 unidade, após o armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
[0065] Em uma modalidade, a dita cepa de bactéria de ácido lático estável é da espécie Lactobacillus plantarum e, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos (tal como aplicando-se o ensaio A): a) retém a viabilidade em uma quantidade selecionada a partir do grupo que consiste em pelo menos 1x105 CFU/g, pelo menos 5x105 CFU/g ou pelo menos 1x106 CFU/g; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,3 unidade, após o armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
[0066] Em uma modalidade, a uma ou mais LABs estáveis, a se- rem adicionadas à etapa 2) do processo da invenção ou a serem usa- das no uso da invenção, são selecionadas a partir do grupo que con- siste na cepa de Lactobacillus plantarum DSM32493 depositada no DSMZ em 26 de abril de 2017, uma variante da cepa DSM32493, a cepa DSM33120 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019, uma variante da cepa DSM33120, a cepa DSM33121 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019 e uma variante da cepa DSM33121.
[0067] Em uma modalidade, a uma ou mais LABs estáveis, a se- rem adicionadas à etapa 2) do processo da invenção ou a serem usa- das no uso da invenção, é a cepa de Lactobacillus plantarum DSM32493 depositada no DSMZ em 26 de abril de 2017, ou uma vari- ante da cepa DSM32493.
[0068] Em uma modalidade, a uma ou mais bactérias de ácido lá- tico estáveis, a serem adicionadas à etapa 2) do processo da invenção ou a serem usadas no uso da invenção, é uma variante da cepa Lac- tobacillus plantarum DSM32493 depositada no DSMZ em 26 de abril de 2017, em que a dita variante porta uma mutação (por exemplo, mu- tação pontual, deleção, inserção, …) no gene de subunidade alfa de ATP sintase (em comparação à cepa DSM32493). A sequência do tipo selvagem do operon de ATP-sintase é conforme apresentado na SEQ ID NO:1. A pessoa versada na técnica sabe como determinar se esse operon sofre mutação e como medir a atividade de H+-ATPase de uma bactéria [consultar, por exemplo, Jaichumjai et al. 2010; Food Micro- biology 27 (2010) 741 a 748]. Em uma modalidade, a uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis são uma variante de DSM32493, em que a dita variante tem pelo menos uma mutação no gene de subuni- dade alfa de ATP sintase do operon de ATP-sintase (no presente do- cumento denominado como "o gene de subunidade alfa de ATP sin- tase"). Em uma modalidade particular, a uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis são uma variante de DSM32493, em que o gene de subunidade alfa de ATP sintase da dita variante de DSM32493 con- forme definido no presente documento codifica uma proteína de subu- nidade alfa de ATP sintase que tem um resíduo de ácido aspártico na posição 169. Em uma modalidade particular, a uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis são uma variante de DSM32493, em que a dita variante tem pelo menos uma mutação no gene de subunidade alfa de ATP sintase do operon de ATP-sintase conforme definido na SEQ ID NO:2. Em uma modalidade particular, em combinação com a modali- dade anterior na SEQ ID NO:2 ou não, a uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis são uma variante de DSM32493 conforme defini- do no presente documento, em que a dita variante porta a mutação de G para A em sua posição 506 do gene de subunidade alfa de ATP sin- tase (em comparação à cepa DSM32493). Em uma modalidade parti- cular, a uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis são uma vari- ante de DSM32493 conforme definido no presente documento, em que o gene de subunidade alfa de ATP sintase da dita variante é conforme definido na SEQ ID NO:4 (em que o códon GGT nas posições 505 a 507 é alterado para GAT). Em uma modalidade particular, a uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis, a serem adicionadas à etapa 2) do processo da invenção, são uma variante de DSM32493, em que o gene de subunidade alfa de ATP sintase da dita variante de DSM32493 conforme definido no presente documento codifica uma proteína de subunidade alfa de ATP sintase conforme definido na SEQ ID NO:5.
[0069] Em uma modalidade, a uma ou mais LABs estáveis, a se- rem adicionadas à etapa 2) do processo da invenção ou a serem usa- das no uso da invenção, é a cepa de Lactobacillus plantarum DSM33120 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019 ou uma vari- ante da cepa DSM33120.
[0070] Em uma modalidade, a uma ou mais LABs estáveis, a se- rem adicionadas à etapa 2) do processo da invenção ou a serem usa- das no uso da invenção, é a cepa de Lactobacillus plantarum DSM33121 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019 ou uma vari- ante da cepa DSM33121. Cepas de Lactobacillus plantarum
[0071] A invenção também se refere a uma cepa de Lactobacillus plantarum selecionada a partir do grupo que consiste na cepa DSM33120 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019, uma varian- te conforme definido no presente documento da cepa DSM33120, a cepa DSM33121 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019 e uma variante conforme definido no presente documento da cepa DSM33121.
[0072] Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma cepa de Lactobacillus plantarum selecionada a partir do grupo que consiste na cepa DSM33120 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019 ou uma variante conforme definido no presente documento da cepa DSM33120. Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma cepa de Lactobacillus plantarum selecionada a partir do grupo que consiste na cepa DSM33121 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019 ou uma variante conforme definido no presente documento da cepa DSM33121. Composições bacterianas
[0073] A invenção também se refere a uma composição bacteriana que compreende ou consiste em uma cepa de Lactobacillus plantarum selecionada a partir do grupo que consiste na cepa DSM33120 deposi- tada no DSMZ em 22 de maio de 2019, uma variante conforme defini- do no presente documento da cepa DSM33120, a cepa DSM33121 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019 e uma variante conforme definido no presente documento da cepa DSM33121.
[0074] Em uma modalidade particular, a composição bacteriana é uma cultura pura, isto é, compreende ou consiste em uma única cepa de Lactobacillus plantarum da invenção. Em outra modalidade, a com- posição bacteriana é uma cultura mista, isto é, compreende ou consis- te em uma cepa de Lactobacillus plantarum da invenção e pelo menos uma outra cepa de bactéria, em particular uma outra bactéria de ácido lático.
[0075] Em uma modalidade, a composição bacteriana, como uma cultura pura ou mista conforme definido acima, compreende adicio- nalmente um ingrediente aceitável para uso em alimentos.
[0076] Em uma modalidade particular, a composição bacteriana, como uma cultura pura ou mista conforme definido acima, está sob formato congelado, seco, seco por congelamento, líquido ou sólido, na forma de péletes ou péletes congelados, ou em um pó ou pó seco. Em uma modalidade particular, a composição bacteriana da invenção está em um formato congelado ou na forma de péletes ou péletes congela- dos, em particular contida em uma ou mais caixas ou sachês. Em ou- tra modalidade, a composição bacteriana conforme definido no presen- te documento está sob uma forma em pó, tal como um pó seco ou se- co por congelamento, em particular contida em uma ou mais caixas ou sachês.
[0077] Em uma modalidade particular, a composição bacteriana da invenção, como uma cultura pura ou uma cultura mista conforme defi- nido acima, e seja qual for o formato (formato congelado, seco, seco por congelamento, líquido ou sólido, na forma de péletes ou péletes congelados) compreende a cepa de Lactobacillus plantarum da inven- ção em uma concentração compreendida na faixa de 105 a 1012 cfu (unidades de formação de colônia) por grama da composição bacteri- ana. Em uma modalidade particular, a concentração da cepa de Lac- tobacillus plantarum dentro da composição bacteriana da invenção es- tá na faixa de 107 a 1012 cfu por grama da composição bacteriana e, em particular, pelo menos 107, pelo menos 108, pelo menos 109, pelo menos 1010 ou pelo menos 1011 CFU/g da composição bacteriana. Em uma modalidade particular, quando na forma de concentrado congela- do ou seco, a concentração da cepa de Lactobacillus plantarum da in- venção - como cultura pura ou como uma cultura mista - dentro da composição bacteriana está na faixa de 108 a 1012 cfu/g de concentra- do congelado ou concentrado seco e, mais preferencialmente, pelo menos 108, pelo menos 109, pelo menos 1010, pelo menos 1011 ou pelo menos 1012 cfu/g de concentrado congelado ou concentrado seco. Variantes de cepas de Lactobacillus plantarum
[0078] Os recursos detalhados no presente documento para as variantes das cepas de Lactobacillus plantarum depositadas aplicam- se às cepas de L. plantarum adicionadas dentro do método da inven- ção, às cepas de L. plantarum como tais e às cepas de L. plantarum como parte da composição bacteriana.
[0079] Uma variante da cepa DSM32493, DSM33120 ou DSM33121 é definida no presente documento como uma cepa de Lac- tobacillus plantarum que apresenta pelo menos uma mutação, tal co- mo a adição, deleção, inserção e/ou substituição de pelo menos um nucleotídeo em seu genoma em comparação à cepa DSM32493, DSM33120 ou DSM33121, respectivamente. Em uma modalidade par- ticular, a sequência de genoma da variante tem uma identidade de pe- lo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,1%, pelo me- nos 99,2%, pelo menos 99,3%, pelo menos 99,4%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8%, pelo me- nos 99,9%, pelo menos 99,92%, pelo menos 99,94%, pelo menos 99,96%, pelo menos 99,98% ou pelo menos 99,99% à sequência de genoma da cepa DSM32493, DSM33120 ou DSM33121, respectiva- mente. Tal variante pode ser, por exemplo: - uma variante natural obtida espontaneamente a partir da cepa DSM32493, DSM33120 ou DSM33121 após a incubação em um meio de seleção. Uma variante natural é assim obtida sem qualquer manipulação genética, mas apenas pela mutação espontânea da cepa e seleção da cepa em um meio apropriado; um exemplo do protocolo usado para selecionar mutantes particulares da cepa DSM32493, DSM33120 ou DSM33121 é revelado no exemplo 5; ou - uma variante que compreende pelo menos uma mutação em seu genoma, sendo que a mutação é induzida por engenharia ge- nética, por exemplo, por mutagênese direcionada ou mutagênese aleatória. A mutagênese aleatória pode ser realizada com radiações UV ou compostos mutagênicos, tais como ácido nitroso, etil- metanossulfonato, NMetil- N'-nitro-N-nitrosoguanidina, N-etil-N- nitrosoureia, laranja de acridina, proflavina.
[0080] Em uma modalidade, a dita variante da cepa DSM32493, DSM33120 ou DSM33121 (conforme definido no presente documen- to), quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com ca- lor a 75 °C por 25 segundos (tal como aplicando-se o ensaio A): a) retém a viabilidade em uma quantidade selecionada a partir do grupo que consiste em pelo menos 5x103 CFU/g, pelo menos 1x104 CFU/g, pelo menos 5x104 CFU/g, pelo menos 1x105 CFU/g, pelo menos 5x105 CFU/g ou pelo menos 1x.106 CFU/g; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,6 unidade, no máximo 0,5 unidade, em no máximo 0,4 unidade ou no máximo 0,3 unidade, após o armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
[0081] Em uma modalidade, a dita variante da cepa DSM32493, DSM33120 ou DSM33121 (conforme definido no presente documen- to), quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com ca- lor a 75 °C por 25 segundos (tal como aplicando-se o ensaio A): a) retém a viabilidade em uma quantidade selecionada a partir do grupo que consiste em pelo menos 5x103 CFU/g, pelo menos 1x104 CFU/g, pelo menos 5x104 CFU/g, pelo menos 1x105 CFU/g, pelo menos 5x105 CFU/g ou pelo menos 1x106 CFU/g; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,5 unidade, em no máximo 0,4 unidade ou no máximo 0,3 unidade, após o armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
[0082] Em uma modalidade, a dita variante da cepa DSM32493, DSM33120 ou DSM33121 (conforme definido no presente documento) mantém pelo menos a mesma viabilidade e no máximo a mesma dimi- nuição de pH que a cepa DSM32493, DSM33120 ou DSM33121 res- pectivamente (quando cada uma é adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteri- ormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos, tal como aplican- do-se o ensaio A), isto é, a dita variante da cepa DSM32493, DSM33120 ou DSM33121: a) retém uma viabilidade idêntica à retenção de viabilidade da cepa DSM32493, DSM33120 ou DSM33121 respectivamente ou retém uma viabilidade maior do que a retenção de viabilidade da cepa DSM32493, DSM33120 ou DSM33121 respectivamente (calculada em cfu/g); e b) diminui o pH do iogurte de teste identicamente à diminui- ção de pH da cepa DSM32493, DSM33120 ou DSM33121 respectiva- mente ou diminui o pH menos do que a diminuição de pH da cepa DSM32493, DSM33120 ou DSM33121 respectivamente (calculado em unidade de pH). Um produto alimentício estável em temperatura ambiente
[0083] O objetivo do processo é fabricar um produto alimentício estável em temperatura ambiente. A expressão "estável em temperatu- ra ambiente" ao se referir a um produto alimentício significa um produ-
to alimentício contendo uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis conforme definido no presente documento e para qual tanto a quanti- dade de bactérias de ácido lático estáveis quanto o pH não são signifi- cativamente diminuídos quando armazenado à temperatura ambiente.
[0084] Assim, um produto alimentício, conforme fabricado pelo processo da invenção, é considerado estável quando, após o armaze- namento desse produto por 180 dias a uma temperatura de 25 °C: - seu pH não é diminuído mais do que 0,7 unidade; e - a quantidade de bactérias de ácido lático estáveis que o mesmo contém não é diminuída mais do que 3 log e/ou é pelo menos 1x103 CFU/g.
[0085] Assim, o produto alimentício é armazenado por 180 dias a 25 °C, a partir do dia em que a uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis conforme definido no presente documento são adicionadas ao produto alimentício inicial (dia 0). Em uma modalidade, o produto ali- mentício é armazenado sob um formato vedado (isto é, em recipiente estéril fechado).
[0086] Após 180 dias, o pH é determinado pelo medidor de pH (Mettler Toledo, SevenEasy) e comparado ao pH do produto alimentí- cio no dia 0. Assim, em uma modalidade, o pH do produto alimentício em 180 dias não é diminuído mais do que 0,6 unidade, mais do que 0,5 unidade ou mais do que 0,4 unidade (em comparação ao pH no dia 0).
[0087] Após 180 dias, a contagem de CFU é determinada confor- me descrito no ensaio A detalhado no presente documento e compa- rada à quantidade de uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis conforme definido no presente documento adicionadas no dia 0. As- sim, em uma modalidade, a quantidade de uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis que o mesmo contém é pelo menos 1x103 CFU/g (em comparação à quantidade adicionada no dia 0), qualquer seja o nível de adição na etapa 2) (que é pelo menos 1x105 CFU). Em uma modalidade, a quantidade de uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis que o mesmo contém não é diminuída mais do que 3 log (em comparação à quantidade adicionada no dia 0). Em uma modalidade, a quantidade de uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis que o mesmo contém não é diminuída mais do que 2 log (em comparação à quantidade adicionada no dia 0). Em uma modalidade, a quantidade de uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis que o mesmo con- tém não é diminuída mais do que 3 log e é pelo menos 1x103 CFU/g (em comparação à quantidade adicionada no dia 0). Em uma modali- dade, a quantidade de uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis que o mesmo contém não é diminuída mais do que 2 log e é pelo me- nos 1x103 CFU/g (em comparação à quantidade adicionada no dia 0).
[0088] A invenção também se refere a um produto alimentício es- tável em temperatura ambiente, conforme definido no presente docu- mento ou conforme obtido pelo processo da invenção, e contendo uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis conforme definido no pre- sente documento.
[0089] Em uma modalidade, o produto alimentício estável em tem- peratura ambiente, conforme definido no presente documento ou con- forme obtido pelo processo da invenção, contém uma cepa de Lacto- bacillus plantarum selecionada a partir do grupo que consiste na cepa DSM33120 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019, uma varian- te conforme definido no presente documento da cepa DSM33120, a cepa DSM33121 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019 e uma variante conforme definido no presente documento da cepa DSM33121.
[0090] Em uma modalidade, o produto alimentício estável em tem- peratura ambiente, conforme definido no presente documento ou con- forme obtido pelo processo da invenção, contém uma cepa de Lacto-
bacillus plantarum selecionada a partir do grupo que consiste na cepa DSM33120 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019 ou uma vari- ante conforme definido no presente documento da cepa DSM33120. Em uma modalidade, o produto alimentício estável em temperatura ambiente, conforme definido no presente documento ou conforme ob- tido pelo processo da invenção, contém uma cepa de Lactobacillus plantarum selecionada a partir do grupo que consiste na cepa DSM33121 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019 ou uma vari- ante conforme definido no presente documento da cepa DSM33121.
[0091] Em uma modalidade, o produto alimentício estável em tem- peratura ambiente da invenção (como tal ou conforme obtido pelo pro- cesso da invenção) tem seu pH que não é diminuído mais do que 0,7 unidade e não tem a quantidade de bactérias de ácido lático estáveis que o mesmo contém diminuída mais do que 3 log e/ou é pelo menos 1x103 CFU/g, após o armazenamento desse produto por 180 dias a uma temperatura de 25 °C.
[0092] Em uma modalidade, o produto alimentício estável em tem- peratura ambiente da invenção (como tal ou conforme obtido pelo pro- cesso da invenção) é selecionado a partir do grupo que consiste em um produto alimentício à base de leite, um produto alimentício à base de fruta, tal como uma bebida alimentícia à base de fruta, um produto alimentício à base de vegetais, tal como uma bebida alimentícia à ba- se de vegetais, um produto alimentício à base de cereal, tal como uma bebida alimentícia à base de cereal, um produto alimentício à base de arroz, tal como uma bebida alimentícia à base de arroz, um produto alimentício à base de castanhas, tal como uma bebida alimentícia à base de castanhas, um produto alimentício à base de soja e qualquer mistura dos mesmos. Em uma modalidade, o produto alimentício à ba- se de leite estável em temperatura ambiente é um produto lácteo fer- mentado ou um produto lácteo quimicamente acidificado. Em uma mo-
dalidade, um produto lácteo fermentado é selecionado a partir do gru- po que consiste em um leite fermentado, um iogurte, um queijo, creme azedo, leitelho e soro de leite fermentado. Em uma modalidade, o pro- duto alimentício à base de leite é um leite fermentado.
[0093] Em uma modalidade, o produto alimentício estável em tem- peratura ambiente da invenção - em particular o produto alimentício lácteo fermentado conforme definido no presente documento - contém uma ou mais das ditas bactérias de ácido lático estáveis selecionadas a partir do grupo que consiste em cepas de espécies Lactobacillus plantarum, Lactobacillus zymae, Lactobacillus rossiae, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus similis, Lactobacillus versmoldensis, Lacto- bacillus acidipiscis, Lactobacillus hammesii, Lactobacillus namurensis, Lactobacillus nodensis e Lactobacillus tucceti, em que cada uma den- tre uma ou mais das ditas bactérias de ácido lático estáveis, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos: a) retém a viabilidade em uma quantidade de pelo menos 5,0x103 CFU/g após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,6 unidade após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C. Em uma modalidade particular, a dita uma ou mais cepas de bactérias de ácido lático estáveis são sele- cionadas a partir do grupo que consiste em cepas de espécies Lacto- bacillus plantarum, Lactobacillus zymae, Lactobacillus rossiae, Lacto- bacillus collinoides, Lactobacillus versmoldensis e Lactobacillus namu- rensis. Em uma modalidade particular, a dita uma ou mais cepas de bactérias de ácido lático estáveis são selecionadas a partir do grupo que consiste em cepas de espécies Lactobacillus plantarum e Lacto- bacillus zymae. Em uma modalidade particular, a dia uma ou mais ce- pas de bactérias de ácido lático estáveis são da espécie Lactobacillus plantarum. Em uma modalidade particular, a dita uma ou mais cepas de bactérias de ácido lático estáveis é a cepa DSM32493 depositada no DSMZ em 26 de abril de 2017 ou qualquer variante da mesma con- forme definido no presente documento.
[0094] As definições e modalidades específicas detalhadas para o processo de fabricação da invenção aplicam-se similarmente no con- texto do produto alimentício estável em temperatura ambiente da in- venção, em particular para, porém sem limitação, as espécies de bac- térias de ácido lático, o número de bactérias de ácido lático, o recurso de diminuição de pH após armazenamento por 180 dias a uma tempe- ratura de 25 °C da LAB a ser adicionada, o recurso de retenção de vi- abilidade de LAB após armazenamento por 180 dias a uma temperatu- ra de 25 °C da LAB a ser adicionada, qualquer combinação desses recursos de diminuição de pH e retenção de viabilidade de LAB, o tipo de produto alimentício (tal como uma bebida) e a natureza do produto alimentício (tal como produto alimentício à base de leite, à base de fru- ta, à base de vegetais, à base de cereal, à base de arroz, à base de castanhas e à base de soja e qualquer mistura dos mesmos).
[0095] Os depósitos a seguir foram feitos de acordo com o tratado de Budapeste no reconhecimento internacional do depósito de micro- organismos para os propósitos do procedimento de patente. - Cepa de Lactobacillus plantarum DGCC12411 depositada por DuPont Nutrition Biosciences ApS sob o número de acesso DSM32493 em 26 de abril de 2017, no DSMZ [Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7B, D- 38124 Braunschweig - Alemanha]; - Cepa de Lactobacillus plantarum DGCC12119 depositada por DuPont Nutrition Biosciences ApS sob o número de acesso DSM33120 em 22 de maio de 2019, no DSMZ; e
- Cepa de Lactobacillus plantarum DGCC12480 depositada por DuPont Nutrition Biosciences ApS sob o número de acesso DSM33121 em 22 de maio de 2019, no DSMZ.
[0096] Solicita-se que o material biológico seja disponibilizado apenas pelo fornecimento de uma amostra a um especialista indicado pelo solicitante. Em relação a essas designações nas quais uma Pa- tente europeia é solicitada, uma amostra do micro-organismo deposi- tado será disponibilizada até a publicação da menção do concessão da patente europeia ou até a data em que o pedido foi recusado ou retirado ou é considerado retirado, apenas pelo fornecimento de tal amostra a um especialista indicado pela pessoa solicitando a amostra e aprovado ou i) pelo Requerente e/ou ii) pelo Escritório Europeu de Patentes, o que for aplicável (Regra 32 EPC).
SEQUÊNCIAS SEQ ID NO:1: Operon de ATP-sintase de L. plantarum
CGGCATTAA SEQ ID NO:2: Gene de subunidade alfa de ATP sintase da cepa DSM32493
CAGCCAACCGCTGCCGCTGCGAAGTAG SEQ ID NO:3: Proteína de subunidade alfa de ATP sintase da cepa DSM32493
LPEADKMNGALDAFAEQFQPTAAAAK SEQ ID NO:4: Gene de subunidade alfa de ATP sintase de uma vari- ante da cepa DSM32493
CAGCCAACCGCTGCCGCTGCGAAGTAG SEQ ID NO:5: Proteína de subunidade alfa de ATP sintase de uma variante da cepa DSM32493
[0097] Vários recursos e modalidades preferenciais da presente invenção serão agora descritos a título de exemplos não limitantes.
EXEMPLOS Exemplo 1: triagem de bactérias de ácido lático estáveis (espécies)
[0098] Bactérias de ácido lático estáveis foram selecionadas com o uso do ensaio A conforme descrito a seguir: Preparação de inóculo
[0099] Cada LAB a ser testada foi preparada da seguinte forma: uma cultura da LAB a 106 cfu/ml foi cultivada em 10 ml de caldo MRS/M17 de um dia para o outro a 37 °C; após 2 h a 4 °C, a cultura foi centrifugada a 4.000 rpm por 10 min; o pélete foi ressuspenso em 10 ml de solução salina estéril; a etapa de centrifugação/ressuspensão foi repetida uma segunda vez. O inóculo foi padronizado a uma quantida- de de cerca de 1x109 CFU/ml. As espécies de Lactobacillus listada na
Tabela 1 foram testadas. Iogurte de teste
[00100] Um iogurte que tem os recursos a seguir - 2,8% de proteí- na, 3% de gordura, 12,5% de açúcar total incluindo 8% de sacarose; pH 4,3 - foi tratado com calor para reduzir o nível de bactérias a menos do que 1x102 CFU por g. Adição/Inoculação
[00101] 0,4 ml do inóculo preparado foi adicionado a 40 ml do iogur- te tratado com calor (em tubo) e bem misturado. O tubo foi, então, ve- dado. A concentração da LAB estável adicionada ao iogurte tratado com calor (dia 0) foi de cerca de 1x107 CFU/g de iogurte. Armazenamento
[00102] O tubo vedado foi, então, armazenado a 37 °C por 30 dias. Essas condições foram consideradas como representando um modelo de armazenamento acelerado à temperatura ambiente.
[00103] No dia 30, o pH e a quantidade de LAB estável (contagem de células) foram determinados, e a diferença com, respectivamente, o pH e a quantidade da LAB estável adicionada no dia 0 foi calculada. Medição de pH e contagem de células
[00104] O pH foi determinado pelo medidor de pH (Mettler Toledo, SevenEasy)
[00105] A contagem de CFU foi determinada plaqueando-se no ágar MRS/M17 da seguinte forma: 1 ml da amostra de iogurte (dia 30) foi diluída em série por solução salina estéril até 10-7; ágar MRS/M17 (1,5%) foi fundido e mantido a 48 °C em banho de água; 1 ml de dilui- ção 10-1 a 10-7 foi adicionado à placa de petri e vertido com 25 ml do ágar MRS/M17; as placas foram incubadas a 37 °C anaerobicamente por 2 dias para contagem. Seleção
[00106] Os dois seguintes recursos foram considerados para sele-
cionar LABs estáveis: - uma quantidade de LAB de pelo menos 5x103 cfu (3,69 log10 cfu); e - uma diminuição de pH de no máximo 0,6 unidade (isto é, um pH de pelo menos 3,7). Resultados
[00107] 80 cepas, representativas de 33 espécies, foram testadas e selecionadas pelo ensaio A. O nível de cepas (cfu) no iogurte e o pH do iogurte, após armazenamento a 37 °C por 30 dias são resumidos na Tabela 1 e representados na Figura 1 (log cfu) e na Figura 2 (pH). Espécie número Log cfu pH seleção de cepa média STD média STD L. bulgaricus 19 1,24 0,73 3,89 0,14 não L. plantarum 4 4,71 1,23 3,85 0,26 sim L. rhamnosus 2 1,00 0,00 3,33 0,09 não L. acidophilus 2 1,00 0,00 3,53 0,02 não L. gasseri 1 1,00 n.a. 3,63 n.a. não L. helvericus 1 1,00 n.a. 3,52 n.a. não L. casei 1 4,11 n.a. 3,54 n.a. não L. paracasei 1 1,00 n.a. 3,33 n.a. não L. acidifarinae 1 1,00 n.a. 4,25 n.a. não L. acidipiscis 1 3,77 n.a. 3,79 n.a. sim L. collinoides 1 6,14 n.a. 3,92 n.a. sim L. paracollinoides 2 3,49 3,52 3,82 0,08 não L. coryniformis 5 2,20 1,65 3,96 0,05 não L. diolivorans 2 2,06 1,49 3,90 0,04 não L. hammesii 2 3,73 3,87 3,98 0,33 sim L. herbarum 1 1,00 n.a. 3,84 n.a. não L. kefiranofaciens 1 1,00 n.a. 3,22 n.a. não L. kimchii 1 1,00 n.a. 3,92 n.a. não L. kisonensis 2 2,50 2,12 3,91 0,10 não L. namurensis 5 3,93 1,69 3,86 0,08 sim
Espécie número Log cfu pH seleção de cepa média STD média STD L. nodensis 1 7,27 n.a. 3,79 n.a. sim L. otakiensis 1 1,00 n.a. 3,72 n.a. não L. brevis 1 4,00 n.a. 3,69 n.a. não L. parabrevis 3 3,07 3,58 3,93 0,21 não L. rapi 1 3,00 n.a. 4,08 n.a. não L. rossiae 2 4,32 2,55 4,01 0,04 sim L. saniviri 2 1,00 0,00 3,93 0,01 não L. senmaizukei 1 1,00 n.a. 4,18 n.a. não L. similis 1 5,45 n.a. 3,91 n.a. sim L. sunkii 1 1,00 n.a. 3,72 n.a. não L. tucceti 1 7,34 n.a. 3,78 n.a. sim L. versmoldensis 4 6,02 0,69 3,82 0,04 sim L. zymae 6 4,86 2,01 3,94 0,11 sim Tabela 1: log cfu e pH após o armazenamento a 37 °C por 30 dias ob- tidos pelo ensaio A com o uso de cepas de 33 espécies de Lactobaci- llus; STD: desvio padrão; n.a.: não aplicável
[00108] Conforme mostrado na Tabela 1 e nas Figuras 1 e 2, as cepas de 11 espécies de Lactobacillus satisfizeram os dois parâmetros definidos para a seleção, isto é, tanto uma viabilidade de pelo menos 5x103 cfu (3,69 log10 cfu) e uma diminuição de pH de no máximo 0,6 unidade (isto é, um pH de pelo menos 3,7) após o armazenamento a 37 °C por 30 dias: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus zymae, Lac- tobacillus rossiae, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus similis, Lac- tobacillus versmoldensis, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus ham- mesii, Lactobacillus namurensis, Lactobacillus nodensis e Lactobaci- llus tucceti. Exemplo 2: triagem de bactérias de ácido lático estáveis (cepas)
[00109] Um estudo mais aprofundado das cepas abrangidas por essas 11 espécies de Lactobacillus foi executado, pelo ensaio A. As cepas foram, então, classificadas em 4 categorias de acordo com sua viabilidade e o pH do iogurte, após o armazenamento a 37 °C por 30 dias (Tabela 2). Classificação pH mínimo cfu mínimas valor ΔpH Log10 / 1 4 < 0,3 5 1x105 2 3,8 < 0,5 4 1x104 3 3,7 < 0,6 4 1x104 3 3,8 < 0,5 3,69 5x103 4 3,7 < 0,6 3,69 5x103 Tabela 2: classificação das cepas em relação a sua viabilidade e ca- pacidade de diminuir o pH
[00110] Os resultados obtidos pelo ensaio A em 20 cepas é resumi- do na Tabela 3 e na Figura 3. Cepa log CFU pH classificação L. acidipiscis B6 3,8 3,79 4 L. plantarum DSM32493 3,8 3,99 3 L. namurensis C8 4,0 3,92 2 L. namurensis F12 4,8 3,96 2 L. namurensis H9 4,8 3,78 3 L. versmoldensis F7 5,0 3,85 2 L. namurensis G1 5,1 3,80 2 L. similis E11 5,4 3,91 3 L. zymae F4 5,5 3,87 2 L. plantarum DSM32493v* 5,5 4,10 1 L. versmoldensis H1 6,1 3,77 3 L. rossiae E5 6,1 3,98 2 L. collinoides F9 6,1 3,92 2 L. zymae C8 6,4 4,05 1 L. hammesii F3 6,5 3,75 3 L. versmoldensis D9 6,5 3,79 3 L. versmoldensis D1 6,5 3,86 2 L. zymae E12 6,9 4,06 1
Cepa log CFU pH classificação L. nodensis F11 7,3 3,79 3 L. tucceti G4 7,3 3,78 3 Tabela 3: log CFU e pH obtidos com o uso de bactérias de ácido lático estáveis após o armazenamento 30 dias a 37 °C (*: DSM32493v é uma variante de DSM32493 que porta a mutação de G para A na posi- ção 506 de seu gene de subunidade alfa de ATP sintase em compara- ção a DSM32493 e que produz uma proteína de subunidade alfa de ATP sintase conforme definido na SEQ ID NO:5)
[00111] Assim, as 20 cepas foram classificadas da seguinte forma: - 3 cepas na categoria 1 (viabilidade excepcionalmente alta e diminuição de pH excepcionalmente baixa, após armazenamento) - 8 cepas na categoria 2 (viabilidade muito alta e diminuição de pH muito baixa, após armazenamento) - 8 cepas na categoria 3 (viabilidade muito alta e diminuição de pH baixa, ou viabilidade alta e diminuição de pH muito baixa, após armazenamento) - 1 cepa na categoria 4 (viabilidade alta e diminuição de pH baixa, após armazenamento).
[00112] Esses resultados mostram que o ensaio A descrito no pre- sente documento permite selecionar cepas não apenas mantendo uma alta viabilidade no iogurte após armazenamento a 37 °C por 30 dias, mas também cepas que diminuem ligeiramente o pH desse iogurte após o armazenamento. Essas 20 cepas são bactérias de ácido lático estáveis adequadas para fabricação de um produto alimentício estável em temperatura ambiente. Exemplo 3: fabricação de um produto alimentício estável em tempera- tura ambiente com DSM32493 de L. plantarum
[00113] Um iogurte que tem os recursos a seguir - 2,8% de proteí- na, 3% de gordura, 8% de sacarose; pH 4,3 - foi tratado com calor pa- ra reduzir o nível de bactérias a menos do que 1x102 CFU por g. A ce-
pa DSM32493 (classificada na categoria 3 de acordo com o exemplo 2) foi inoculada a um nível de 1x107 cfu/ml do iogurte.
[00114] O iogurte inoculado foi misturado, vedado e armazenado a 25 °C por 180 dias. Essas condições representam condições de arma- zenamento ambiente médias, quando produtos alimentícios são arma- zenados fora do refrigerador ou fora de salas frias.
[00115] O pH e a quantidade de LAB estável (contagem de células) foram determinados conforme descrito para o ensaio A acima, nos di- as 90, 120, 150 e 180. A viabilidade de cepa e o pH ao longo do tempo são representados nas Figuras 4A e 4B respectivamente.
[00116] A quantidade da cepa DSM32493 após 180 dias a 25 °C é de 4,8 log10 CFU, isto é, estava acima de 1x104 cfu/g do produto. Isso representou uma diminuição na quantidade de bactérias que é menor do que 3 log, confirmando que a DSM32493 pode manter uma alta vi- abilidade após armazenamento de 6 meses à temperatura ambiente. De modo interessante, a diminuição de quantidade máxima foi obtida em 150 dias e ligeiramente diminuída entre o 150 e o dia 180.
[00117] O pH do produto após 180 dias a 25 °C foi de 3,67, isto é, representando uma diminuição de pH que é menor do que 0,7 unida- de. De modo interessante, a diminuição de pH máxima foi atingida em 90 dias e foi estável entre o dia 90 e o dia 180.
[00118] Esses dados confirmam que a cepa DSM32493 é uma bac- téria de ácido lático adequada para fabricar um produto alimentício es- tável em temperatura ambiente. Isso também confirma de modo mais geral que bactérias de ácido lático com a capacidade para manter uma viabilidade de 5x103 cfu/g juntamente com uma diminuição de pH de no máximo 0,5 ou manter uma viabilidade de 1x104 cfu/g juntamente com uma diminuição de pH de no máximo 0,6 (isto é, classificadas na categoria 3) quando selecionadas pelo ensaio A são bactérias de áci- do lático estáveis adequadas para fabricar um produto alimentício es-
tável em temperatura ambiente Exemplo 4: fabricação de um produto alimentício estável em tempera- tura ambiente com uma variante de DSM32493 de L. plantarum (DSM32493v)
[00119] Um iogurte que tem os recursos a seguir - 2,8% de proteí- na, 3% de gordura, 8% de sacarose; pH 4,3 - foi tratado com calor pa- ra reduzir o nível de bactérias a menos do que 1x102 CFU por g. Uma variante da cepa DSM32493, DSM32493v (classificada na categoria 1 de acordo com o exemplo 2), foi inoculada a um nível de 1x107 cfu/ml do iogurte. O iogurte inoculado foi misturado, vedado e armazenado a 25 °C por 180 dias.
[00120] O pH e a quantidade de LAB estável (contagem de células) foram determinados conforme descrito para o ensaio A acima, nos di- as 90, 120, 150 e 180. A viabilidade de cepa e o pH ao longo do tempo são representados nas Figuras 5A e 5B respectivamente.
[00121] A quantidade da cepa DSM32493v após 180 dias a 25 °C é de 5,3 log10 CFU, isto é, estava acima de 1x105 cfu/g do produto. Isso representou uma diminuição na quantidade de bactérias que é menor do que 2 log, confirmando que a DSM32493v pode manter uma viabili- dade muito alta após armazenamento de 6 meses à temperatura am- biente.
[00122] O pH do produto após 180 dias a 25 °C foi de 3,77, isto é, representando uma diminuição de pH que é menor do que 0,6 unida- de. De modo interessante, a diminuição de pH máxima foi atingida em 90 dias e foi estável entre o dia 90 e o dia 180.
[00123] Esses dados confirmam que a cepa DSM32493v é uma bactéria de ácido lático adequada para fabricar um produto alimentício estável em temperatura ambiente. Isso também confirma de modo mais geral que bactérias de ácido lático com a capacidade para man- ter uma viabilidade de 1x105 cfu/g juntamente com uma diminuição de pH de no máximo 0,3 (isto é, classificadas na categoria 1) quando se- lecionadas pelo ensaio A são bactérias de ácido lático estáveis ade- quadas para fabricar um produto alimentício estável em temperatura ambiente.
[00124] De modo geral, esses dados mostram que as cepas seleci- onadas de acordo com o ensaio A conforme descrito no presente do- cumento são confirmadas como sendo adequadas para a fabricação de um produto alimentício estável em temperatura ambiente. Exemplo 5: identificação de cepas de Lactobacillus plantarum estáveis adicionais
[00125] Cepas de L. plantarum adicionais da coleção Dupont Da- nisco foram testadas pelo ensaio A, e sua viabilidade e o pH do iogur- te, após o armazenamento a 37 °C por 30 dias, determinados. Os re- sultados para 2 cepas de L. plantarum são descritos na Tabela 4. Cepa log CFU pH classificação DSM33120 de L. plantarum 5,4 4,11 1 DSM33121 de L. plantarum 5,7 4,08 1 Tabela 4: log CFU e pH obtidos com o uso de cepas de L. plantarum estáveis após o armazenamento por 30 dias a 37 °C
[00126] As duas cepas de L. plantarum identificadas (DSM33120 e DSM33121) mostram uma alta viabilidade excepcional e baixa dimi- nuição de pH excepcional, após o armazenamento, quando testadas pelo ensaio A, e foram classificadas na categoria 1. Essas 2 novas ce- pas são bactérias de ácido lático estáveis adequadas para fabricação de um produto alimentício estável em temperatura ambiente.
[00127] Esses resultados confirmam que o ensaio A descrito no presente documento permite selecionar cepas não apenas mantendo uma alta viabilidade no iogurte após armazenamento a 37 °C por 30 dias, mas também cepas que diminuem ligeiramente o pH deste iogur- te após o armazenamento. Exemplo 6: fabricação de um produto alimentício estável em tempera-
tura ambiente com a cepa DSM33120 ou DSM33121 de L. plantarum
[00128] Um iogurte que tem os recursos a seguir - 2,8% de proteí- na, 3% de gordura, 8% de sacarose; pH 4,3 - foi tratado com calor pa- ra reduzir o nível de bactérias a menos do que 1x102 CFU por g. A ce- pa DSM33120 ou DSM33121 (classificada na categoria 1 de acordo com o exemplo 5) foi inoculada a um nível de 1x107 cfu/ml do iogurte.
[00129] O iogurte inoculado foi misturado, vedado e armazenado a 25 °C por 180 dias. Essas condições representam condições de arma- zenamento ambiente médias, quando produtos alimentícios são arma- zenados fora do refrigerador ou fora de salas frias. O pH e a quantida- de de LAB estável (contagem de células) foram determinados confor- me descrito para o ensaio A acima, nos dias 90, 120, 150 e 180.
[00130] A viabilidade de cepa e o pH ao longo do tempo para a ce- pa DSM33120 são representados nas Figuras 6A e 6B respectivamen- te. A quantidade da cepa DSM33120 após 180 dias a 25 °C é de 5,96 log10 CFU, isto é, estava acima de 9x105 cfu/g do produto. Isso repre- sentou uma diminuição na quantidade de bactérias de cerca de 1 log, confirmando que a DSM33120 pode manter uma viabilidade muito alta após armazenamento de 6 meses à temperatura ambiente. O pH do produto após 180 dias a 25 °C foi de 3,75, isto é, representando uma diminuição de pH que é menor do que 0,5 unidade.
[00131] A viabilidade de cepa e o pH ao longo do tempo para a ce- pa DSM33121 são representados nas Figuras 7A e 7B respectivamen- te. A quantidade da cepa DSM33121 após 180 dias a 25 °C é de 6,35 log10 CFU, isto é, estava acima de 2x106 cfu/g do produto. Isso repre- sentou uma diminuição na quantidade de bactérias que é menor do que 0,7 log, confirmando que a DSM333121 pode manter uma viabili- dade muito alta após armazenamento de 6 meses à temperatura am- biente. O pH do produto após 180 dias a 25 °C foi de 3,87, isto é, re- presentando uma diminuição de pH que é menor do que 0,4 unidade.
[00132] Esses dados confirmam que as cepas DSM33120 e DSM33121 são bactérias de ácido lático adequadas para fabricar um produto alimentício estável em temperatura ambiente.
Isso também confirma de modo mais geral que bactérias de ácido lático com a ca- pacidade para manter uma viabilidade de 1x105 cfu/g juntamente com uma diminuição de pH de no máximo 0,3 (isto é, classificadas na cate- goria 1) quando selecionadas pelo ensaio A são bactérias de ácido lático estáveis adequadas para fabricar um produto alimentício estável em temperatura ambiente.
Claims (19)
1. Processo para fabricação de um produto alimentício es- tável em temperatura ambiente, o dito processo compreendendo: 1) fornecer um produto alimentício inicial com um pH entre 3,4 e 4,6, em particular, um produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias com um pH entre 3,4 e 4,6 contendo um nível de bactérias que é no máximo 1x102 CFU por g; 2) adicionar ao produto alimentício inicial, em particular, ao produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias, uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis em uma quantidade total de pelo menos 1x105 CFU por g, para obter um produto alimentício está- vel em temperatura ambiente, caracterizado pelo fato de que: (i) cada uma dentre a dita uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis é selecionada a partir do grupo que consiste em cepas de espécies Lactobacillus plantarum, Lactobacillus zymae, Lactobaci- llus rossiae, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus similis, Lactobaci- llus versmoldensis, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus hammesii, Lactobacillus namurensis, Lactobacillus nodensis e Lactobacillus tuc- ceti; e (ii) cada uma dentre a dita uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tra- tado com calor a 75 °C por 25 segundos: a) retém a viabilidade em uma quantidade de pelo menos 5x103 CFU/g após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,6 unidades após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma tempe- ratura de 37 °C.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que a dita bactéria de ácido lático estável quando adi- cionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos, retém a viabilidade em uma quantidade de pelo menos 1x104 CFU/g, pelo menos 5x104 CFU/g, pelo menos 1x105 CFU/g, pelo menos 5x105 CFU/g ou pelo menos 1x106 CFU/g, após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte- rizado pelo fato de que a dita bactéria de ácido lático estável, quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos, diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,5 unidades, no máximo 0,4 unidades ou no máximo 0,3 unidades, após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito produto alimentício inicial com um pH entre 3,4 e 4,6 é selecionado a partir do grupo que consiste em um produto à base de leite como um produto lácteo fer- mentado ou um produto lácteo quimicamente acidificado, um produto à base de fruta como um suco de fruta ou um suco fermentado, um pro- duto à base de vegetais como um suco de vegetal ou um suco de ve- getal fermentado, um produto à base de cereal como um produto de cereal quimicamente acidificado ou um produto de cereal fermentado, um produto à base de arroz como um produto de arroz quimicamente acidificado ou um produto de arroz fermentado, um produto à base de castanhas como um produto de castanhas quimicamente acidificado ou um produto de castanhas fermentado, um produto à base de soja como um produto de leite de soja fermentado e qualquer mistura dos mesmos.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito produto alimentício inicial com um pH entre 3,4 e 4,6 é um produto alimentício lácteo, em particular, um produto de leite fermentado, mais particularmente, um iogurte.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o dito produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias com um pH entre 3,4 e 4,6 é um produto alimentício inicial tratado de modo a obter um nível de bac- térias que é no máximo 1x102 CFU por g do dito produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias, em particular, um produto alimentício tratado com calor inicial.
7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende: 1) fornecer um produto alimentício inicial com um pH entre 3,4 e 4,6; 1b) tratar o produto alimentício inicial de modo a obter um nível de bactérias que é no máximo 1x102 CFU por g do dito produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias, em particular, tratando-se com calor o dito produto alimentício inicial; e 2) adicionar ao produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis em uma quantidade total de pelo menos 1x105 CFU por g, para obter um produto alimentício estável em temperatura ambiente.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o dito produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias é um produto alimentício lác- teo tratado ou tratado com calor, em particular, um produto de leite fermentado tratado ou tratado com calor, mais particularmente, um io-
gurte tratado ou tratado com calor.
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, o dito processo é caracterizado pelo fato de que compre- ende: 1a) produzir um leite fermentado inicial, em particular, um iogurte inicial, com um pH entre 3,4 e 4,6 por meio de fermentação de um substrato do leite; 1b) tratar, em particular tratar com calor, o dito leite fermen- tado inicial, em particular, o dito iogurte inicial, de modo a obter um lei- te fermentado que contém baixo teor inicial de bactérias, em particular, um iogurte que contém baixo teor inicial de bactérias contendo um ní- vel de bactérias que é no máximo 1x102 CFU por g; e 2) adicionar ao leite fermentado que contém baixo teor ini- cial de bactérias, em particular ao iogurte que contém baixo teor inicial de bactérias, uma ou mais das cepas de bactérias de ácido lático es- táveis em uma quantidade total de pelo menos 1x105 CFU por g para obter um leite fermentado, em particular, um iogurte, estável em tem- peratura ambiente.
10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o pH do dito produto alimen- tício inicial, em particular do produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias, é entre 3,4 e 4,0, entre 4,0 e 4,6 ou entre 3,6 e 4,2.
11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a dita uma ou mais das bactérias de ácido lático estáveis são adicionadas ao produto alimentí- cio inicial, em particular ao produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias, em uma quantidade total de pelo menos 5x105 por g, pelo menos 1x106 por g, pelo menos 5x106 por g ou pelo menos 1x107 CFU por g.
12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a dita uma ou mais bacté- rias de ácido lático estáveis são adicionadas assepticamente ao produ- to alimentício inicial, em particular ao produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias.
13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a dita uma ou mais das bactérias de ácido lático estáveis são da espécie Lactobacillus planta- rum.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracteri- zado pelo fato de que a dita uma ou mais das bactérias de ácido lático estáveis são selecionadas a partir do grupo que consiste na cepa DSM32493 depositada no DSMZ em 26 de abril de 2017, uma variante da cepa DSM32493, na cepa DSM33120 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019, uma variante da cepa DSM33120, na cepa DSM33121 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019 e uma vari- ante da cepa DSM33121, em que a dita variante - quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segun- dos - a) retém a viabilidade em uma quantidade de pelo menos 5x103 CFU/g após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma tempera- tura de 37 °C; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,6 unidades após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de que a dita variante de DSM32493 é a cepa DSM32493 na qual o gene de subunidade alfa de ATP sintase do ope- ron ATP-sintase suporta a mutação G para A em sua posição 506.
16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 15, caracterizado pelo fato de que um produto alimentício é estável em temperatura ambiente quando, após armazenar o mesmo por 180 dias a uma temperatura de 25 °C: - seu pH não é diminuído mais de 0,7 unidade; e - a quantidade de bactérias de ácido lático estáveis que o mesmo contém é de pelo menos 1x103 CFU/g e/ou não é diminuída em mais de 3 log.
17. Produto alimentício estável em temperatura ambiente, caracterizado pelo fato de que é obtido através do processo, como de- finido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16.
18. Uso de uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis para inoculação em um produto alimentício, em particular um produto alimentício que contém baixo teor inicial de bactérias, com um pH en- tre 3,4 e 4,6, caracterizado pelo fato de que (i) cada uma dentre a dita uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis é selecionada a partir do grupo que consiste em cepas de espécies Lactobacillus plantarum, Lactobacillus zymae, Lactobaci- llus rossiae, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus similis, Lactobaci- llus versmoldensis, Lactobacillus acidipiscis, Lactobacillus hammesii, Lactobacillus namurensis, Lactobacillus nodensis e Lactobacillus tuc- ceti; e (ii) cada uma dentre a dita uma ou mais bactérias de ácido lático estáveis, quando adicionada em uma quantidade de 1x106 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tra- tado com calor a 75 °C por 25 segundos: a) retém a viabilidade em uma quantidade de pelo menos 5x103 CFU/g após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,6 unidades após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma tempe- ratura de 37 °C.
19. Cepa de Lactobacillus plantarum, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste na cepa DSM33120 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019, em uma va- riante da cepa DSM33120, na cepa DSM33121 depositada no DSMZ em 22 de maio de 2019 e em uma variante da cepa DSM33121, em que a dita variante - quando adicionada em uma quantidade de 1x107 CFU por g a um iogurte de teste que tem um pH de 4,3, anteriormente tratado com calor a 75 °C por 25 segundos - a) retém a viabilidade em uma quantidade de pelo menos 5x103 CFU/g após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C; e b) diminui o pH do dito iogurte de teste em no máximo 0,6 unidades após armazenar o dito iogurte de teste 30 dias a uma temperatura de 37 °C.
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