BR112020025398A2

BR112020025398A2 - PROTEIN WITH ANTI-INFLAMMATORY PROPERTIES

Info

Publication number: BR112020025398A2
Application number: BR112020025398-7A
Authority: BR
Inventors: Valerie Mary Corrigall; Gabriel Stavros Panayi
Original assignee: Immune Regulation Limited
Priority date: 2018-06-13
Filing date: 2019-06-12
Publication date: 2021-04-06
Also published as: ZA202100115B; CO2020016749A2; KR20210039339A; CA3103370A1; CN112888704A; AU2024200977A1; CL2020003220A1; MX2020013569A; WO2019239126A1; AU2019285831B2; JP2021528100A; AU2019285831A1; EP3807303A1; SG11202012363XA; IL279350A

Abstract

proteina com propriedades anti-inflamatórias. a presente invenção refere-se a uma proteína isolada ou recombinante consistindo na sequência de aminoácido de acordo com seq id no: 3 ou seq id: no: 4 e seu uso na prevenção ou no tratamento de uma condição inflamatória.protein with anti-inflammatory properties. the present invention relates to an isolated or recombinant protein consisting of the amino acid sequence according to seq id no: 3 or seq id: no: 4 and its use in preventing or treating an inflammatory condition.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTE- ÍNA COM PROPRIEDADES ANTI-INFLAMATÓRIAS". Campo da invençãoDescriptive Report of the Invention Patent for "PROTEIN WITH ANTI-INFLAMMATORY PROPERTIES". Field of invention

[001] A presente invenção refere-se a uma proteína, seu uso em medicina, em particular seu uso na prevenção ou tratamento de condi- ções inflamatórias e processos para preparar a proteína. Antecedente[001] The present invention relates to a protein, its use in medicine, in particular its use in the prevention or treatment of inflammatory conditions and processes for preparing the protein. Background

[001] As propriedades anti-inflamatórias de uma chaperona mole- cular humana conhecida de várias maneiras como proteína de imuno- globulina de ligação (BiP) ou proteína regulada por glicose 78 (Grp78) foram relatadas (Corrigall VM, Bodman-Smith MD, Brunst M, Cornell H, Panayi GS. A proteína de tensão, BiP, estimula as células mononuclea- res do sangue periférico humano a expressarem um perfil de citocinas anti-inflamatórias e a inibir a função das células apresentadoras de an- tígeno: relevância para o tratamento da artrite inflamatória. Arthritis Rheum 2004; 50: 1167-1171). A sequência de aminoácidos da proteína humana recombinante expressa de forma bacteriana difere da sequên- cia conhecida da proteína de ocorrência natural (SEQ ID NO: 5).[001] The anti-inflammatory properties of a human molecular chaperone known in various ways as binding immunoglobulin protein (BiP) or glucose regulated protein 78 (Grp78) have been reported (Corrigall VM, Bodman-Smith MD, Brunst M, Cornell H, Panayi GS The strain protein, BiP, stimulates human peripheral blood mononuclear cells to express an anti-inflammatory cytokine profile and inhibit the function of antigen presenting cells: relevance for the treatment of inflammatory arthritis (Arthritis Rheum 2004; 50: 1167-1171). The amino acid sequence of the recombinant human protein expressed in a bacterial manner differs from the known sequence of the naturally occurring protein (SEQ ID NO: 5).

[002] BiP é uma proteína ubíqua expressa endogenamente resi- dente no retículo endoplasmático (ER) e necessária como uma proteína intracelular tanto para o enovelamento correto dos polipeptídeos nas- centes quanto para a proteção da célula contra proteínas mal enovela- das acumuladas em momentos de tensão do ER. Portanto, BiP também é definida como uma proteína de tensão e um membro da família de proteínas de choque térmico 70. Regulada para cima durante o estresse celular, BiP é a superfície celular expressa e segregada na matriz extra- celular, de modo que BiP livre de células pode ser segregada no fluido sinovial de pacientes com artrite reumatoide (Corrigall VM et al supra.).[002] BiP is an ubiquitous protein expressed endogenously residing in the endoplasmic reticulum (ER) and necessary as an intracellular protein both for the correct folding of nascent polypeptides and for the protection of the cell against poorly folded proteins accumulated in moments of the ER voltage. Therefore, BiP is also defined as a stress protein and a member of the 70 heat shock protein family. Regulated upward during cell stress, BiP is the cell surface expressed and secreted in the extracellular matrix, so that free BiP of cells can be secreted in the synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis (Corrigall VM et al supra.).

[003] O gene que codifica esta BiP nativa (de ocorrência natural), p78, foi clonado e a proteína humana recombinante foi expressa[003] The gene encoding this native (naturally occurring) BiP, p78, has been cloned and the recombinant human protein has been expressed

(WO2000 / 21995).(WO2000 / 21995).

[004] WOZ2000 / 21995 divulga novos análogos de proteína de BiP (SEQ.1 e SEQ.2) e sua utilidade no tratamento de doença inflamatória.[004] WOZ2000 / 21995 discloses new BiP protein analogs (SEQ.1 and SEQ.2) and their usefulness in the treatment of inflammatory disease.

[005] WOZ2006 / 111720 divulga a utilização dos mesmos dois aná- logos para o tratamento e prevenção de perda e reabsorção óssea.[005] WOZ2006 / 111720 discloses the use of the same two analogs for the treatment and prevention of bone loss and resorption.

[006] WOZ2002 / 072133 divulga a utilização de BiP, em particular SEQ.1 e SEQ.2 do documento WOZ2000 / 21995 para o tratamento ou prevenção de uma resposta imune indesejada, incluindo o tratamento de doença imunomediada, como doença autoimune, diabetes tipo |, ti- reoidite, esclerose múltipla, lúpus, doença de Crohn, hepatite ou res- posta imune indesejada associada com rejeição de órgão de trans- plante.[006] WOZ2002 / 072133 discloses the use of BiP, in particular SEQ.1 and SEQ.2 of WOZ2000 / 21995 for the treatment or prevention of an unwanted immune response, including the treatment of immune-mediated disease, such as autoimmune disease, type diabetes |, thyroidoid, multiple sclerosis, lupus, Crohn's disease, hepatitis or unwanted immune response associated with organ transplant rejection.

[007] Embora os análogos BiP (SEQ.1 e SEQ.2) mostrem resulta- dos em inúmeros modelos animais de inflamação in vitro e in vivo, a extrapolação desses modelos para prever o que pode acontecer na clí- nica é problemática e permanece o desafio de fabricação de uma pro- teína de pureza e eficácia adequadas para administração a pacientes.[007] Although the BiP analogs (SEQ.1 and SEQ.2) show results in numerous animal models of inflammation in vitro and in vivo, the extrapolation of these models to predict what may happen in the clinic is problematic and remains the challenge of manufacturing a protein of adequate purity and efficacy for administration to patients.

[008] Os análogos de BiP SEQ.1 e SEQ.2 (de agora em diante SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2) são produzidos usando células bacteri- anas, mas não são adequados como produtos clínicos para administra- ção humana por várias razões. Foi relatado que a etiqueta de histidina 6x na SEQ ID NO: 1 (usada para o isolamento de proteínas por croma- tografia de afinidade) pode alterar as propriedades físicas e funcionais da proteína. (Santiago FW et al, Propriedades antigênicas e imunogêni- cas de proteínas hemaglutininas recombinantes de H1N1 quando pro- duzidas em vários sistemas de expressão de proteínas, Vaccine, Vo- lume 30, Issue 31, 29 June 2012, Pages 4606-4616,) enquanto os íons metálicos usados para quelação podem lixiviar para a corrente sanguí- nea se não forem completamente removidos. SEQ ID NO: 1, portanto, não pode ser usada clinicamente.[008] BiP analogs SEQ.1 and SEQ.2 (hereafter SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) are produced using bacterial cells, but are not suitable as clinical products for administration for several reasons. It has been reported that the 6x histidine tag in SEQ ID NO: 1 (used for the isolation of proteins by affinity chromatography) can alter the physical and functional properties of the protein. (Santiago FW et al, Antigenic and immunogenic properties of H1N1 recombinant hemagglutinin proteins when produced in various protein expression systems, Vaccine, Volume 30, Issue 31, 29 June 2012, Pages 4606-4616,) while the metal ions used for chelation can leach into the bloodstream if they are not completely removed. SEQ ID NO: 1, therefore, cannot be used clinically.

[009] Embora o uso de células bacterianas como método de pro- dução seja mais fácil e barato do que o uso de células transformadas de mamíferos, tem o problema de resultar em proteínas que não são glicosiladas e podem não ter o mesmo enovelamento que seu equiva- lente de mamífero. Além disso, a carga de endotoxinas no produto bac- teriano permanece alta e pode causar efeitos adversos se administrada a humanos. É principalmente a dificuldade técnica de remover a endoto- xina do produto que levou ao aumento da popularidade da produção de proteínas de células de mamíferos transformadas, apesar de seu custo. A purificação para remover a endotoxina durante o processo de fabrica- ção é tecnicamente complexa, cara e demorada. Além disso, a escala- bilidade dos processos de produção e purificação pode ser um pro- blema.[009] Although the use of bacterial cells as a method of production is easier and cheaper than the use of transformed mammalian cells, it has the problem of resulting in proteins that are not glycosylated and may not have the same folding as yours equivalent of mammal. In addition, the endotoxin load in the bacterial product remains high and can cause adverse effects if administered to humans. It is mainly the technical difficulty of removing endotoxin from the product that has led to the increased popularity of protein production from transformed mammalian cells, despite its cost. Purification to remove endotoxin during the manufacturing process is technically complex, expensive and time-consuming. In addition, the scalability of the production and purification processes can be a problem.

[0010] Consequentemente, há uma necessidade de uma proteína com propriedades anti-inflamatórias e / ou imunorreguladoras com base em BiP que seja adequada para administração humana, embora seja fácil de fabricar usando um processo escalonável e também eficaz na terapia. Declaração da Invenção[0010] Consequently, there is a need for a protein with anti-inflammatory and / or immunoregulatory properties based on BiP that is suitable for human administration, although it is easy to manufacture using a scalable process and also effective in therapy. Declaration of Invention

[0011] Estas necessidades são abordadas pela proteína da inven- ção.[0011] These needs are addressed by the protein of the invention.

[0012] Consequentemente, um aspecto da invenção fornece uma proteína isolada ou recombinante que consiste na sequência de amino- ácidos de acordo com SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID: NO: 4.Accordingly, one aspect of the invention provides an isolated or recombinant protein consisting of the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3 or SEQ ID: NO: 4.

[0013] A presente invenção se refere a um análogo da Proteína de Imunoglobulina de Ligação (BiP), SEQ ID NO: 3, mostrado na Figura 4. A sequência de aminoácidos predita de BiP nativa é fornecida na Figura 1 e pode ser encontrada sob o número de acesso X87949 na base de dados disponível publicamente NCBI Genbank. A sequência de nucleo-[0013] The present invention relates to a binding immunoglobulin protein (BiP) analogue, SEQ ID NO: 3, shown in Figure 4. The predicted amino acid sequence of native BiP is provided in Figure 1 and can be found under accession number X87949 in the publicly available NCBI Genbank database. The nucleus sequence

tídeos de BiP nativa é mostrada na Figura 2. A sequência de aminoáci- dos nativa tem uma sequência de sinal MKLSLVAAML LLLSAARA ane- xada ao n-terminal. Clivagem da sequência de sinal após o resíduo de alanina liberar o polipeptídeo maduro começando com "EEED..."native BiP peptides are shown in Figure 2. The native amino acid sequence has a MKLSLVAAML LLLSAARA signal sequence attached to the n-terminus. Cleavage of the signal sequence after the alanine residue releases the mature polypeptide starting with "EEED ..."

[0014] A sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 difere da se- quência de BiP nativa em que o terminal N começa com a sequência "RAEEED ..." em vez de "EEED ...”. Isso inclui os dois aminoácidos ter- minais C da sequência de sinal nativa (arginina e alanina). Um especia- lista não teria nenhuma arzão paar incluir RA no terminal n - na forma nativa, o polipeptídeo ativo começa no resíduo de ácido glutâmico, e seria entendido que se um especialista estivesse procuarndo fornecer uma forma modificada de BiP existiriam múltiplas opções, incluindo cli- var a sequência de sinal em diferentes posições e fornecer qualquer número de mutações, adições ou deleções.[0014] The amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 differs from the native BiP sequence in which the N-terminus begins with the sequence "RAEEED ..." instead of "EEED ...". This includes the two terminal amino acids C of the native signal sequence (arginine and alanine) .A specialist would have no reason to include RA at the n-terminus - in the native form, the active polypeptide begins at the glutamic acid residue, and it would be understood that if if a specialist were looking to provide a modified form of BiP there would be multiple options, including clicking the signal sequence at different positions and providing any number of mutations, additions or deletions.

[0015] SEQ ID NO: 4 corresponde à SEQ ID: NO: 3 com uma eti- queta de afinidade de poli-histidina (a partir de agora uma etiqueta de His) no terminal n da proteína (ver Figura 3). A etiqueta de His facilita a purificação da proteína por cromatografia de afinidade com íons metáli- cos.[0015] SEQ ID NO: 4 corresponds to SEQ ID: NO: 3 with a polyhistidine affinity tag (hereafter a His tag) at the n-terminus of the protein (see Figure 3). His tag facilitates protein purification by affinity chromatography with metal ions.

[0016] SEQ ID NO: 3 também tem diferenças significativas da SEQ ID NO: 1 e SEQ. ID NO: 2 divulgadas em WOZ2000 / 21995. Como dis- cutido acima, a SEQ ID NO: 1 tem uma etiqueta de His no terminal ce o terminal n começa com "MEED ..." SEQ ID NO: 2 corresponde à SEQ ID NO: 1, mas sem a etiqueta de His.[0016] SEQ ID NO: 3 also has significant differences from SEQ ID NO: 1 and SEQ. ID NO: 2 disclosed in WOZ2000 / 21995. As discussed above, SEQ ID NO: 1 has a His tag at the terminal c and the terminal does not start with "MEED ..." SEQ ID NO: 2 corresponds to SEQ ID NO: 1, but without the His tag.

[0017] Foi surpreendentemente descoberto que a proteína de SEQ ID NO: 3 possui potentes propriedades anti-inflamatórias e imunorregu- ladoras que são distintas daquelas relatadas em WO2000 / 21995 e WOZ2006 / 111720. Essas diferenças significativas não seriam espera- das por um especialista. Estas propriedades são aqui demonstradas por estudos relevantes in vitro e in vivo. Além disso, a proteína da invenção é segura para uso em humanos.[0017] It was surprisingly found that the protein of SEQ ID NO: 3 has potent anti-inflammatory and immunoregulatory properties that are distinct from those reported in WO2000 / 21995 and WOZ2006 / 111720. These significant differences would not be expected by a specialist . These properties are demonstrated here by relevant studies in vitro and in vivo. In addition, the protein of the invention is safe for use in humans.

[0018] As principais diferenças funcionais entre SEQ ID NO: 3 de acordo com a invenção e SEQ ID NO: 1 de WOZ2000 / 21995 e WO2006 1 111720 são as seguintes: 1) A produção da citocina TNFa por células mononucleares de sangue periférico é grandemente reduzida na presença de SEQ ID NO: 3 em comparação com SEQ ID NO: 1 (ver Exemplo 2); 2) SEQID NO: 1 causa infrarregulação de CD86 e HLA-DR, enquanto SEQ ID NO: 3 não mostrou perda significativa de expressão de HLA-DR e CD86 (ver Exemplo 3); 3) ASEQID NO: 3 é adequada para uso em humanos e em um ensaio clínico não foram observadas reações à infusão ou reações adversas graves ao medicamento (ver Exemplo 4). Ao contrário, a SEQ ID NO: 1 não é adequada para administração a humanos.[0018] The main functional differences between SEQ ID NO: 3 according to the invention and SEQ ID NO: 1 of WOZ2000 / 21995 and WO2006 1 111720 are as follows: 1) The production of the TNFa cytokine by peripheral blood mononuclear cells is greatly reduced in the presence of SEQ ID NO: 3 compared to SEQ ID NO: 1 (see Example 2); 2) SEQID NO: 1 causes CD86 and HLA-DR to be downregulated, while SEQ ID NO: 3 did not show significant loss of HLA-DR and CD86 expression (see Example 3); 3) ASEQID NO: 3 is suitable for use in humans and in a clinical trial no infusion reactions or serious adverse drug reactions were observed (see Example 4). In contrast, SEQ ID NO: 1 is not suitable for administration to humans.

4) SEQID NO: 3 causa uma redução significativa nas con- centrações séricas de CRP, VEGF e IL-8 em humanos em relação aos grupos de placebo. Isso indica que a inflamação da doença foi significa- tivamente reduzida pela administração de SEQ ID NO: 3 (ver Exemplo 4) 5) SEQID NO: 3 causa um aumento na expressão de CD39 em células T reguladoras em relação à SEQ ID NO: 1; na clínica foi observado um aumento significativo na expressão de CD39 em células T reguladoras de pacientes que respondem a SEQ ID NO: 3, e isso foi mantido por 12 semanas após a infusão (ver Exemplo 5); 6) SEQ ID NO: 3 inibe a diferenciação de osteoclastos e a atividade de reabsorção (ver Exemplo 6); 7) Existe evidência para indicar que a SEQ ID NO: 3 não tem efeito imunossupressor geral, ao contrário da SEQ ID NO: 1 que reduz a resposta do antígeno de recall ao PPD da tuberculina (ver Exemplo 7);4) SEQID NO: 3 causes a significant reduction in serum concentrations of CRP, VEGF and IL-8 in humans compared to placebo groups. This indicates that the inflammation of the disease has been significantly reduced by the administration of SEQ ID NO: 3 (see Example 4) 5) SEQID NO: 3 causes an increase in CD39 expression in regulatory T cells over SEQ ID NO: 1 ; in the clinic, a significant increase in CD39 expression was observed in regulatory T cells of patients who respond to SEQ ID NO: 3, and this was maintained for 12 weeks after the infusion (see Example 5); 6) SEQ ID NO: 3 inhibits osteoclast differentiation and resorption activity (see Example 6); 7) There is evidence to indicate that SEQ ID NO: 3 has no general immunosuppressive effect, unlike SEQ ID NO: 1 which reduces the response of the recall antigen to tuberculin PPD (see Example 7);

8) A administração de SEQ ID NO: 3 leva a uma sobrevi- vência mais longa de enxertos de pele em um modelo animal (ver Exem- plo 8).8) Administration of SEQ ID NO: 3 leads to longer skin graft survival in an animal model (see Example 8).

[0019] A invenção inclui proteínas isoladas ou recombinantes tendo uma ou mais substituições conservativas em SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. Uma "substituição conservativa" é aquela em que um resíduo de aminoácido é substituído com outro resíduo de aminoácido biologica- mente semelhante, por exemplo, tendo uma cadeia lateral semelhante. As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exem- plo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carrega- das (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cis- teína) cadeias laterais não polares (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais ra- mificadas por beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histi- dina). Por exemplo, a substituição de uma fenilalanina por uma tirosina é uma substituição conservadora. Os métodos de identificação de subs- tituições conservativas de aminoácidos que não afetam adversamente a função da proteína são bem conhecidos na técnica.[0019] The invention includes isolated or recombinant proteins having one or more conservative substitutions in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. A "conservative substitution" is one in which an amino acid residue is replaced with another biological amino acid residue - similarly, for example, having a similar side chain. Families of amino acid residues having similar side chains have been defined in the art, including basic side chains (for example, lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg, aspartic acid, glutamic acid), non-polar side chains loaded (eg, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cistein) non-polar side chains (eg, glycine, alanine, valine, leucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), radial side chains modified by beta (eg, threonine, valine, isoleucine) and aromatic side chains (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine). For example, replacing a phenylalanine with a tyrosine is a conservative substitution. Methods of identifying conservative amino acid substitutions that do not adversely affect protein function are well known in the art.

[0020] Em uma forma de realização preferida, a proteína BiP iso- lada ou recombinante da presente invenção compreende impurezas de endotoxina em uma quantidade inferior a 50 unidades de endotoxina (EU) por mg de proteína. Em uma forma de realização preferida, a pro- teína isolada ou recombinante compreende impurezas de endotoxina em uma quantidade inferior a 25 Unidades de Endotoxina (EU) por mg de proteína. Em uma modalidade preferida, a proteína isolada ou re- combinante compreende impurezas de endotoxina em uma quantidade inferior a 2 unidades de endotoxina por mg de proteína, mais preferen- cialmente inferior a 1,5 unidade de endotoxina por mg de proteína.[0020] In a preferred embodiment, the isolated or recombinant BiP protein of the present invention comprises endotoxin impurities in an amount less than 50 units of endotoxin (EU) per mg of protein. In a preferred embodiment, the isolated or recombinant protein comprises endotoxin impurities in an amount of less than 25 Endotoxin Units (EU) per mg of protein. In a preferred embodiment, the isolated or recombinant protein comprises endotoxin impurities in an amount of less than 2 units of endotoxin per mg of protein, more preferably less than 1.5 units of endotoxin per mg of protein.

[0021] A endotoxina é detectada usando o teste Limulus Amebocyte Lysate (LAL) para detectar e quantificar endotoxinas bacterianas extra- ídas da membrana externa de bactérias gram negativas (Associates of Cape Cod, Liverpool, UK). O componente crítico dos reagentes LAL usados em testes de endotoxina é derivado de células sanguíneas (amebócitos) do caranguejo ferradura Limulus Polyphemus. Os testes LAL são descritos no capítulo Teste de Endotoxinas Bacterianas na Far- macopeia dos Estados Unidos (Capítulo <85>) e nos capítulos equiva- lentes na Farmacopeia Europeia (Capítulo 2.6.14) e na Farmacopeia Japonesa (Testes Gerais, No. 4.01).[0021] Endotoxin is detected using the Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test to detect and quantify bacterial endotoxins extracted from the outer membrane of gram negative bacteria (Associates of Cape Cod, Liverpool, UK). The critical component of LAL reagents used in endotoxin tests is derived from blood cells (amebocytes) of the horseshoe crab Limulus Polyphemus. LAL tests are described in the chapter Bacterial Endotoxin Testing in the United States Pharmacopoeia (Chapter <85>) and in the equivalent chapters in the European Pharmacopoeia (Chapter 2.6.14) and in the Japanese Pharmacopoeia (General Tests, No. 4.01 ).

[0022] A proteína da invenção é não glicosilada ou substancial- mente não glicosilada, ao contrário da proteína nativa que é glicosilada.[0022] The protein of the invention is non-glycosylated or substantially non-glycosylated, unlike the native protein which is glycosylated.

[0023] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada ou recombinante que codifica uma proteína recombinante que consiste na sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID: NO. 4.[0023] In a further aspect, the present invention provides an isolated or recombinant nucleic acid molecule that encodes a recombinant protein that consists of the amino acid sequence according to SEQ ID: NO. 4.

[0024] De preferência, a molécula de ácido nucleico isolada ou re- combinante de acordo com a reivindicação 3 consiste na sequência de ácido nucleico de acordo com SEQ ID: NO 8.[0024] Preferably, the isolated or recombinant nucleic acid molecule according to claim 3 consists of the nucleic acid sequence according to SEQ ID: NO 8.

[0025] Um aspecto adicional fornece um vetor recombinante com- preendendo a molécula de ácido nucleico conforme definido acima.[0025] An additional aspect provides a recombinant vector comprising the nucleic acid molecule as defined above.

[0026] O vetor pode compreender um promotor e / ou uma sequên- cia operadora. O vetor pode compreender sequências de não mamífe- ros, por exemplo, sequências de bactérias ou levedura. O vetor pode compreender um promotor não mamífero e / ou sequência operadora, tal como um promotor bacteriano ou de levedura e / ou sequência ope- radora.[0026] The vector can comprise a promoter and / or an operator sequence. The vector can comprise sequences of non-mammals, for example, sequences of bacteria or yeast. The vector can comprise a non-mammalian promoter and / or operator sequence, such as a bacterial or yeast promoter and / or operator sequence.

[0027] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma proteína isolada ou recombinante conforme definido acima para uso em medicina ou medicina veterinária. A proteína da invenção pode ser para uso em animais humanos ou não humanos.[0027] In a further aspect, the invention provides an isolated or recombinant protein as defined above for use in medicine or veterinary medicine. The protein of the invention can be for use in human or non-human animals.

[0028] Ainda em um aspecto adicional, a invenção fornece uma pro- teína isolada ou recombinante conforme definido acima para uso no tra- tamento e / ou prevenção de uma condição inflamatória. De preferência, o tratamento e / ou prevenção de uma condição inflamatória é alcançado sem imunossupressão significativa. Em uma modalidade, o tratamento e / ou prevenção de uma condição inflamatória é alcançado sem imu- nossupressão significativa conforme medido pela atividade de linfócitos T em relação à atividade antes da administração da proteína. Em uma modalidade, não há inibição significativa da proliferação de células T para um antígeno de recall, tal como derivado de proteína purificada por tuberculina ou um mitógeno, como fito-hemaglutinina (PHA) ou esferas revestidas de anticorpo anti-CD3 ou anti-CD28.[0028] Still in an additional aspect, the invention provides an isolated or recombinant protein as defined above for use in the treatment and / or prevention of an inflammatory condition. Preferably, treatment and / or prevention of an inflammatory condition is achieved without significant immunosuppression. In one embodiment, the treatment and / or prevention of an inflammatory condition is achieved without significant immunosuppression as measured by the activity of T lymphocytes in relation to the activity before administration of the protein. In one embodiment, there is no significant inhibition of T cell proliferation for a recall antigen, such as derived from a protein purified by tuberculin or a mitogen, such as phytohemagglutinin (PHA) or beads coated with anti-CD3 or anti-CD28 antibody .

[0029] Em uma modalidade preferida, a condição inflamatória é se- lecionada de artrite reumatoide, artrite psoriática, artrite idiopática juve- nil, espondilite anquilosante, rejeição de um transplante de um órgão, pele, tecido, sangue, soro, plasma ou células, ou doença inflamatória intestinal, como Doença de Crohn.[0029] In a preferred embodiment, the inflammatory condition is selected from rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, juvenile idiopathic arthritis, ankylosing spondylitis, organ transplant rejection, skin, tissue, blood, serum, plasma or cells , or inflammatory bowel disease, such as Crohn's disease.

[0030] Em uma modalidade particularmente preferida, a condição inflamatória é selecionada de artrite reumatoide, artrite psoriática ou ar- trite idiopática juvenil.[0030] In a particularly preferred embodiment, the inflammatory condition is selected from rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis or juvenile idiopathic arthritis.

[0031] Em uma modalidade, a proteína isolada ou recombinante é para uso no tratamento ou prevenção de doenças de desregulação do metabolismo ósseo, por exemplo, osteoporose, perda óssea, reabsor- ção óssea, doença de Paget, câncer de mama, câncer ósseo ou perda Óssea associada ao câncer. O câncer de mama metastático é conhecido por estar associado à perda óssea (http://www .nationalbreastcan- cer.org/metastatic-breast-cancer).[0031] In one embodiment, the isolated or recombinant protein is for use in the treatment or prevention of disorders of bone metabolism dysregulation, for example, osteoporosis, bone loss, bone resorption, Paget's disease, breast cancer, bone cancer or Bone loss associated with cancer. Metastatic breast cancer is known to be associated with bone loss (http: // www .nationalbreastcancer.org/metastatic-breast-cancer).

[0032] Em outro aspecto, a proteína isolada ou recombinante con- forme definido acima é para uso na prevenção de afrouxamento da ar- ticulação protética.[0032] In another aspect, the isolated or recombinant protein as defined above is for use in preventing loosening of the prosthetic joint.

[0033] Em uma modalidade da proteína isolada ou recombinante como definido acima para o uso definido acima, o uso compreende a administração da proteína como uma dose de 1 mg a 1g, opcionalmente 1 mg a 500 mg, opcionalmente 1 mg a 50 mg, opcionalmente 1 a 15 mg.[0033] In an isolated or recombinant protein embodiment as defined above for the use defined above, the use comprises administering the protein as a dose of 1 mg to 1 g, optionally 1 mg to 500 mg, optionally 1 mg to 50 mg, optionally 1 to 15 mg.

[0034] A dose pode ser de 1 mg, 5 mg ou 15 mg.[0034] The dose can be 1 mg, 5 mg or 15 mg.

[0035] A proteína pode ser administrada como uma dose única ou como doses múltiplas.[0035] The protein can be administered as a single dose or as multiple doses.

[0036] A dose pode ser administrada como uma única infusão intra- venosa por um período de tempo de 0,5 a 3 horas, opcionalmente 1 a 2 horas, de preferência 1 hora.[0036] The dose can be administered as a single intravenous infusion over a period of 0.5 to 3 hours, optionally 1 to 2 hours, preferably 1 hour.

[0037] Em uma modalidade preferida, uma dose de 1 mg, ou 5 mg ou 15 mg é administrada a um paciente por um período de tempo de 1 hora.[0037] In a preferred embodiment, a dose of 1 mg, or 5 mg or 15 mg is administered to a patient over a period of time of 1 hour.

[0038] Em uma modalidade alternativa, doses múltiplas podem ser administradas ao paciente, em que o intervalo entre a administração de cada dose é de pelo menos 1 hora, ou pelo menos 2 horas, ou pelo menos um dia, ou pelo menos | semana.[0038] In an alternative embodiment, multiple doses can be administered to the patient, in which the interval between the administration of each dose is at least 1 hour, or at least 2 hours, or at least one day, or at least | week.

[0039] Faixas numéricas incluem os números que definem a faixa, e qualquer valor individual fornecido neste documento pode servir como um ponto final para uma faixa que inclui outros valores individuais for- necidos neste documento. Por exemplo, um conjunto de valores como 1, 2, 3, 8, 9 e 10 também é uma divulgação de uma faixa de números de 1-10, de 1-8, de 3-9 e assim por diante. Da mesma forma, uma faixa divulgada é uma divulgação de cada valor individual abrangido pela faixa. Por exemplo, uma faixa declarada de 5-10 também é uma divul- gação de 5,6,7,8,9e10.[0039] Numeric ranges include the numbers that define the range, and any individual value provided in this document can serve as an end point for a range that includes other individual values provided in this document. For example, a set of values such as 1, 2, 3, 8, 9 and 10 is also a disclosure of a range of numbers from 1-10, 1-8, 3-9 and so on. Likewise, a disclosed range is a disclosure of each individual value covered by the range. For example, a declared range of 5-10 is also a disclosure of 5,6,7,8,9e10.

[0040] Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma composi- ção farmacêutica compreendendo a proteína isolada ou recombinante como definida em qualquer reivindicação anterior e um ou mais excipi- entes, adjuvantes ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Um ou mais excipientes, adjuvantes ou transportadores farmaceutica- mente aceitáveis não são especialmente limitados, e excipientes, adju- vantes ou transportadores adequados seriam conhecidos por um espe- cialista na técnica.[0040] In a further aspect, the invention provides a pharmaceutical composition comprising the isolated or recombinant protein as defined in any preceding claim and one or more pharmaceutically acceptable excipients, adjuvants or carriers. One or more pharmaceutically acceptable excipients, adjuvants or carriers are not particularly limited, and suitable excipients, adjuvants or carriers would be known to a person skilled in the art.

[0041] Qualquer via de administração adequada pode ser usada. Por exemplo, qualquer uma das vias de administração oral, tópica, pa- renteral, ocular, retal, vaginal, inalação, bucal, sublingual e intranasal pode ser adequada.[0041] Any suitable route of administration can be used. For example, any of the oral, topical, parenteral, ocular, rectal, vaginal, inhalation, buccal, sublingual and intranasal routes of administration may be suitable.

[0042] As composições farmacêuticas para administração parente- ral podem ser preferidas. As proteínas e composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas parenteralmente, por exemplo, por via intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intra-tecal, intraventricular, intra-esternal, intracraniana, intramuscular ou subcutânea, ou podem ser administradas por técnicas de infusão. A administração intravenosa é particularmente preferida.[0042] Pharmaceutical compositions for parenteral administration may be preferred. The proteins and pharmaceutical compositions of the invention can be administered parenterally, for example, by intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intra-tecal, intraventricular, intrasternal, intracranial, intramuscular or subcutaneous route, or can be administered by infusion techniques. Intravenous administration is particularly preferred.

[0043] As composições farmacêuticas podem compreender um transportador farmaceuticamente aceitável, tal como salina fisiológica. As composições farmacêuticas adequadas podem compreender um ou mais de um tampão (por exemplo, acetato, fosfato, citrato), um tensoa- tivo (por exemplo, polissorbato), um agente estabilizador (por exemplo, albumina humana, poliol, aminoácido), um conservante (por exemplo, benzoato de sódio), e / ou outros agentes convencionais de solubiliza- ção ou dispersão[0043] The pharmaceutical compositions can comprise a pharmaceutically acceptable carrier, such as physiological saline. Suitable pharmaceutical compositions can comprise one or more of a buffer (for example, acetate, phosphate, citrate), a surfactant (for example, polysorbate), a stabilizing agent (for example, human albumin, polyol, amino acid), a preservative (eg sodium benzoate), and / or other conventional solubilizing or dispersing agents

[0044] As composições farmacêuticas da invenção podem ser na forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outras substân-[0044] The pharmaceutical compositions of the invention can be in the form of a sterile aqueous solution that can contain other substances

cias, por exemplo, sais ou glicose suficientes para tornar a solução iso- tônica com sangue. As soluções aquosas devem ser adequadamente tamponadas (de preferência a um pH de 3 a 9), se necessário. A prepa- ração de formulações parenterais adequadas em condições estéreis é prontamente realizada por técnicas farmacêuticas padrões bem conhe- cidas pelos especialistas na técnica.for example, enough salts or glucose to make the solution isotonic with blood. Aqueous solutions should be adequately buffered (preferably at a pH of 3 to 9), if necessary. The preparation of suitable parenteral formulations under sterile conditions is readily accomplished by standard pharmaceutical techniques well known to those skilled in the art.

[0045] Os medicamentos e composições farmacêuticas adequados para administração parenteral incluem soluções de injeção estéreis aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bac- teriostatos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. Os medicamentos e composições podem ser apresentados em recipientes de dose unitária ou de múltiplas doses, por exemplo, ampolas e frascos vedados, e podem ser armazenados em uma condição seca por conge- lamento (liofilizada) requerendo apenas a adição do transportador |í- quido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes da utilização. As soluções e suspensões injetáveis extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos, e comprimidos do tipo previamente descrito.[0045] Medicines and pharmaceutical compositions suitable for parenteral administration include sterile aqueous and nonaqueous injection solutions that may contain antioxidants, buffers, bacteriostats and solutes that make the formulation isotonic with the blood of the intended recipient; and sterile aqueous and non-aqueous suspensions which may include suspending agents and thickening agents. Medicines and compositions can be presented in single-dose or multi-dose containers, for example, sealed ampoules and vials, and can be stored in a freeze-dried (lyophilized) condition requiring only the addition of the | liquid carrier. sterile, for example, water for injections, just before use. Extemporaneous injectable solutions and suspensions can be prepared from sterile powders, granules, and tablets of the type previously described.

[0046] Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica compreende solução salina tamponada com fosfato em pH 7,2 a 7,6, mais preferencialmente pH 7,4. Em uma modalidade, a composição far- macêutica compreende 0,9% p / v de salina.[0046] In a preferred embodiment, the pharmaceutical composition comprises phosphate buffered saline at pH 7.2 to 7.6, more preferably pH 7.4. In one embodiment, the pharmaceutical composition comprises 0.9% w / v saline.

[0047] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compre- ende a proteína isolada ou recombinante em uma quantidade de 2,0 a 50,0 mg / mL, opcionalmente de 2,0 a 10,0 mg / mL, de preferência em uma quantidade de cerca de 5,0 mg / mL.[0047] In one embodiment, the pharmaceutical composition comprises the isolated or recombinant protein in an amount of 2.0 to 50.0 mg / ml, optionally from 2.0 to 10.0 mg / ml, preferably in a amount of about 5.0 mg / mL.

[0048] Tipicamente, a composição farmacêutica é adequada para administração intravenosa.[0048] Typically, the pharmaceutical composition is suitable for intravenous administration.

[0049] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método de tra- tamento e / ou prevenção de uma condição conforme definido acima em um paciente, compreendendo a etapa de administrar a um paciente que necessita do mesmo uma quantidade eficaz de uma proteína isolada ou recombinante conforme definido acima ou uma composição farmacêu- tica conforme definido acima.[0049] In another aspect, the invention provides a method of treating and / or preventing a condition as defined above in a patient, comprising the step of administering to a patient in need of an effective amount of an isolated protein or recombinant as defined above or a pharmaceutical composition as defined above.

[0050] Termos tal como "tratar" ou "tratamento" ou "tratar" referem- se a medidas terapêuticas que curam, retardam, diminuem os sintomas e / ou interrompem a progressão de uma condição fisiológica indese- jada, uma condição patológica diagnosticada, uma doença ou um dis- túrbio . Assim, os que precisam de tratamento incluem aqueles já com a condição, doença ou distúrbio. Em certas modalidades, um sujeito é "tratado" com sucesso de uma condição, doença ou distúrbio se o paci- ente mostrar, por exemplo, alívio total, parcial ou transitório ou elimina- ção de sintomas associados à condição, doença ou distúrbio; diminui- ção da extensão da condição, doença ou distúrbio; estabilização (isto é, sem agravamento) da condição, doença ou distúrbio; atraso no início de ação ou desaceleração da progressão da condição, doença ou distúr- bio; melhora da condição, doença ou distúrbio, incluindo remissão par- cial ou total; e / ou prolongar a sobrevida, em comparação com a sobre- vida esperada se não receber tratamento.[0050] Terms such as "treat" or "treatment" or "treat" refer to therapeutic measures that cure, delay, decrease symptoms and / or stop the progression of an unwanted physiological condition, a diagnosed pathological condition, a disease or a disorder. Thus, those in need of treatment include those already with the condition, disease or disorder. In certain modalities, a subject is successfully "treated" for a condition, disease or disorder if the patient shows, for example, total, partial or transient relief or elimination of symptoms associated with the condition, disease or disorder; decrease in the extent of the condition, disease or disorder; stabilization (that is, without worsening) of the condition, disease or disorder; delayed onset of action or slowed down progression of the condition, disease or disorder; improvement in condition, disease or disorder, including partial or total remission; and / or prolong survival, compared to expected survival if you do not receive treatment.

[0051] "Impedir" ou "prevenção" ou "prevenir" referem-se a medidas profiláticas ou preventivas que evitam e / ou retardam o desenvolvi- mento de uma condição patológica, doença ou distúrbio visado. Assim, os que precisam de prevenção incluem aqueles propensos a ter ou sus- cetíveis à condição, doença ou distúrbio. Em certas modalidades, uma condição, doença ou distúrbio é prevenido com sucesso se o paciente desenvolver, de forma transitória ou permanente, por exemplo, poucos ou menos sintomas graves associados à condição, doença ou distúrbio, ou um início de ação posterior dos sintomas associados à condição ,[0051] "Prevent" or "prevention" or "prevent" refer to prophylactic or preventive measures that prevent and / or delay the development of a target pathological condition, disease or disorder. Thus, those in need of prevention include those prone to having or susceptible to the condition, disease or disorder. In certain modalities, a condition, disease or disorder is successfully prevented if the patient develops, transiently or permanently, for example, few or less serious symptoms associated with the condition, disease or disorder, or a later onset of action of the associated symptoms the condition ,

doença ou distúrbio, do que um paciente que não foi submetido aos mé- todos da invenção.disease or disorder, than a patient who has not been subjected to the methods of the invention.

[0052] Em uma modalidade, o paciente é ainda administrado com um ou mais agentes terapêuticos ou quando a proteína é fornecida em combinação com um ou mais agentes terapêuticos. Em uma modali- dade preferida, o agente terapêutico é selecionado a partir de agentes modificadores da doença, analgésicos, agentes anti-inflamatórios, agen- tes imunoterapêuticos, antibióticos, anticorpos e esteroides. Em uma modalidade particular, o agente terapêutico é um fármaco anti-reumá- tico modificador da doença (DMARD).[0052] In one embodiment, the patient is further administered with one or more therapeutic agents or when the protein is supplied in combination with one or more therapeutic agents. In a preferred mode, the therapeutic agent is selected from disease-modifying agents, analgesics, anti-inflammatory agents, immunotherapeutic agents, antibiotics, antibodies and steroids. In a particular embodiment, the therapeutic agent is a disease-modifying antirheumatic drug (DMARD).

[0053] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para preparar uma proteína recombinante consistindo na sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 3, o método compreendendo: a) transformar um micro-organismo com o vetor recombi- nante conforme definido na reivindicação 6; b) cultivar o micro-organismo levando à produção de uma proteína de acordo com SEQ ID NO: 4; Cc) lisar os micro-organismos para liberar a proteína; d) tratar o lisado com um detergente para remover a endoto- xina; e) isolar e purificar a proteína usando cromatografia de afi- nidade de metal imobilizado, em que o metal imobilizado é cobalto; e f) contatar a proteína purificada com uma enzima diamino- peptidase, em que a diaminopeptidase cliva a etiqueta de histidina do terminal N da proteína; e g) separar a proteína clivada da etiqueta de histidina.[0053] In a further aspect, the invention provides a method for preparing a recombinant protein consisting of the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3, the method comprising: a) transforming a microorganism with the recombinant vector as defined in claim 6; b) cultivating the microorganism leading to the production of a protein according to SEQ ID NO: 4; Cc) lyse microorganisms to release the protein; d) treating the lysate with a detergent to remove the endotoxin; e) isolate and purify the protein using immobilized metal affinity chromatography, where the immobilized metal is cobalt; and f) contacting the purified protein with a diamino-peptidase enzyme, wherein the diaminopeptidase cleaves the N-terminal histidine tag of the protein; and g) separating the cleaved protein from the histidine tag.

[0054] De preferência, o micro-organismo é uma bactéria, mais pre- ferencialmente Escheriícia coli.[0054] Preferably, the microorganism is a bacterium, more preferably Escheriícia coli.

[0055] Em uma modalidade preferida, o micro-organismo é culti- vado em um meio sem, ou substancialmente sem produtos derivados de animal.[0055] In a preferred embodiment, the microorganism is grown in a medium without, or substantially without animal-derived products.

[0056] Tipicamente, o método compreende uma ou mais etapas adi- cionais de tratamento da proteína com um detergente para remover a endotoxina. O detergente pode ser 1,1,3,3- (tetrametilbutil) fenil-polieti- lenoglicol. Como alternativa, a proteína pode ser tratada com arginina a fim de remover a endotoxina.[0056] Typically, the method comprises one or more additional steps of treating the protein with a detergent to remove the endotoxin. The detergent can be 1,1,3,3- (tetramethylbutyl) phenyl-polyethylene-glycol. Alternatively, the protein can be treated with arginine to remove the endotoxin.

[0057] O método acima mencionado é preferencialmente para a produção de uma proteína com menos de 25 unidades de endotoxina por mg de proteína, opcionalmente menos de 2 unidades de endotoxina por mg de proteína. A adição de detergente ou arginina permite a remo- ção da endotoxina.[0057] The aforementioned method is preferably for the production of a protein with less than 25 units of endotoxin per mg of protein, optionally less than 2 units of endotoxin per mg of protein. The addition of detergent or arginine allows the removal of the endotoxin.

[0058] A etapa f) ocorre a uma temperatura adequada para a ativi- dade da enzima diaminopeptidase, de preferência aproximadamente 37ºC.[0058] Step f) occurs at a temperature suitable for the activity of the enzyme diaminopeptidase, preferably approximately 37ºC.

[0059] Tipicamente, a etapa g) é realizada usando cromatografia de afinidade com metal imobilizado, em que o metal imobilizado é cobalto.[0059] Typically, step g) is performed using affinity chromatography with immobilized metal, where the immobilized metal is cobalt.

A etiqueta de His clivada liga à coluna e a proteína purificada elui da coluna.The cleaved His tag binds to the column and the purified protein elutes from the column.

[0060] De preferência, o método não inclui mais de uma etapa de congelamento-descongelamento. De preferência, a proteína não é con- gelada em nenhuma fase do método. Caso seja necessário armazenar a proteína entre as etapas do método, a proteína será armazenada a uma temperatura de 2 a 8ºC.[0060] Preferably, the method does not include more than one freeze-thaw step. Preferably, the protein is not frozen at any stage of the method. If it is necessary to store the protein between the steps of the method, the protein will be stored at a temperature of 2 to 8ºC.

[0061] Em uma modalidade, o método compreende ainda uma ou mais etapas de filtração, purificação ou concentração.[0061] In one embodiment, the method further comprises one or more stages of filtration, purification or concentration.

[0062] Em uma modalidade, as células são lisadas por cisalha- mento, em particular usando uma prensa francesa.[0062] In one embodiment, the cells are lysed by shear, in particular using a French press.

[0063] Em uma outra modalidade, a proteína da invenção é produ- zida usando células hospedeiras diferentes de bacterianas. Em uma modalidade, a proteína da invenção é produzida usando células deriva- das de levedura, inseto ou fungo. Em uma modalidade preferida, a pro- teína da invenção é produzida utilizando células de mamífero.[0063] In another embodiment, the protein of the invention is produced using host cells other than bacterial. In one embodiment, the protein of the invention is produced using cells derived from yeast, insect or fungus. In a preferred embodiment, the protein of the invention is produced using mammalian cells.

[0064] Exemplos não limitantes serão agora descritos com referên- cia às seguintes figuras:[0064] Non-limiting examples will now be described with reference to the following figures:

[0065] A Figura 1 mostra a sequência de aminoácidos de BiP nativa.[0065] Figure 1 shows the native BiP amino acid sequence.

A estrutura primária de BiP é composta por 664 aminoácidos. No termi- nal N', a sequência líder de 18 aminoácidos (sublinhada) é clivada du- rante as mudanças pós-translacionais.The primary structure of BiP is made up of 664 amino acids. At the N 'endpoint, the 18 amino acid leader sequence (underlined) is cleaved during post-translational changes.

[0066] A Figura 2 mostra a sequência de nucleotídeos de BiP na- tiva. O gene BiP tem 2,5 quilobases.[0066] Figure 2 shows the nucleotide sequence of native BiP. The BiP gene has 2.5 kilobases.

[0067] A Figura 3 mostra a SEQ ID: NO 4, a proteína da invenção incluindo a etiqueta de His no terminal N antes da clivagem durante a purificação.[0067] Figure 3 shows SEQ ID: NO 4, the protein of the invention including the His tag at the N-terminus prior to cleavage during purification.

[0068] A Figura 4 mostra a SEQ ID: NO 3, a proteína da invenção (não incluindo a etiqueta de His)[0068] Figure 4 shows SEQ ID: NO 3, the protein of the invention (not including the His tag)

[0069] A Figura 5A mostra o vetor recombinante pQE-2 usado para clonar o gene BiP nativo. Um esquema do vetor usado mostra o sítio para o marcador de histidina e os sítios de clivagem para as enzimas de restrição. A Figura 5B mostra a sequência BiP (SEQ ID NO: 8) clonada no sítio Ndel / Notl do vetor pQE-2.[0069] Figure 5A shows the recombinant vector pQE-2 used to clone the native BiP gene. A scheme of the vector used shows the site for the histidine marker and the cleavage sites for the restriction enzymes. Figure 5B shows the BiP sequence (SEQ ID NO: 8) cloned at the Ndel / Notl site of the pQE-2 vector.

[0070] A Figura 6 mostra um alinhamento da sequência de aminoá- cidos da proteína de SEQ ID NO: 4 de acordo com a invenção com a sequência de aminoácidos da proteína nativa.[0070] Figure 6 shows an alignment of the amino acid sequence of the SEQ ID NO: 4 protein according to the invention with the amino acid sequence of the native protein.

[0071] A Figura 7 mostra a SEQ ID NO: 1, SEQ 1 de WOO00 / 21995.[0071] Figure 7 shows SEQ ID NO: 1, SEQ 1 of WOO00 / 21995.

[0072] A Figura 8 mostra a SEQ ID NO: 2, SEQ 2 de WOO00 / 21995.[0072] Figure 8 shows SEQ ID NO: 2, SEQ 2 of WOO00 / 21995.

[0073] A Figura 9 mostra a SEQ ID NO: 7.[0073] Figure 9 shows SEQ ID NO: 7.

[0074] A Figura 10 mostra uma comparação da produção de citoci- nas induzidas por SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3. As células mononu-[0074] Figure 10 shows a comparison of cytokine production induced by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3. Mononuclear cells

cleares de sangue periférico foram cultivadas durante 24 horas na pre- sença de SEQ ID NO: 1 (A, B) ou SEQ ID NO: 3 (C, D, E e F) nas con- centrações mostradas. PBMC de 4 controles saudáveis (símbolos cheios) e um paciente com artrite reumatoide (símbolo vazio) foram usa- dos. Em 24h os sobrenadantes foram coletados e a produção do fator de necrose tumoral (TNF) a e da interleucina (IL) 10 foram quantificados por ensaio imunoenzimático (ELISA). E e F mostram os mesmos dados que C e D, mas com uma escala do eixo y individual para permitir a identificação das cinco amostras a serem observadas.peripheral blood clearances were cultured for 24 hours in the presence of SEQ ID NO: 1 (A, B) or SEQ ID NO: 3 (C, D, E and F) in the concentrations shown. PBMC from 4 healthy controls (filled symbols) and one patient with rheumatoid arthritis (empty symbol) were used. In 24 hours, the supernatants were collected and the production of tumor necrosis factor (TNF) a and interleukin (IL) 10 were quantified by immunoenzymatic assay (ELISA). E and F show the same data as C and D, but with an individual y-axis scale to allow the identification of the five samples to be observed.

[0075] A Figura 11 mostra dados dos experimentos usando células mononucleares de sangue periférico (PBMC) cultivadas sozinhas ou com SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 1 por 24 horas antes da análise citométrica de fluxo usando anticorpos conjugados com fluorocromo, isotiocianato de anti-CD80.ficoeritrina, anti-CD86 .fluoresceína (FITC) ou HLA-DR.FITC. Em todos os casos, as amostras de PBMC foram fe- chadas vivas para acessar apenas a população de CD14.[0075] Figure 11 shows data from experiments using peripheral blood mononuclear cells (PBMC) grown alone or with SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 1 for 24 hours before flow cytometric analysis using fluorochrome-conjugated antibodies, isothiocyanate anti-CD80.fycoerythrin, anti-CD86 .fluorescein (FITC) or HLA-DR.FITC. In all cases, the PBMC samples were closed alive to access only the CD14 population.

[0076] As PBMC foram cultivadas A) não tratadas; B e E) na pre- sença de SEQ ID NO: 3, ou C) e D) na presença de SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 mostrou regulação para baixo de CD86 e também de HLA-DR. Em contraste, a SEQ ID NO: 3 de acordo com a invenção não mostrou perda significativa de expressão de HLA-DR e CD86.[0076] PBMC were grown A) untreated; B and E) in the presence of SEQ ID NO: 3, or C) and D) in the presence of SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 showed downward regulation of CD86 and also of HLA-DR. In contrast, SEQ ID NO: 3 according to the invention showed no significant loss of HLA-DR and CD86 expression.

[0077] A Figura 12 mostra o efeito de SEQ ID NO: 3 sobre os níveis de proteína C reativa (CRP) sérica obtidos de pacientes no primeiro en- saio clínico humano para SEQ ID NO: 3. Três grupos de pacientes são mostrados, placebo, respondedores ativos (R) e todos os pacientes que receberam SEQ ID NO: 3. A mudança nos níveis séricos de CRP a partir do nível pré-infusão em 2 semanas e 12 semanas após-infusão foi me- dida para o grupo de placebo, o grupo respondedor e todos os pacientes tratados com SEQ ID NO: 3. Em 12 semanas, uma queda significativa no nível de CRP foi observada em pacientes tratados com SEQ ID NO:[0077] Figure 12 shows the effect of SEQ ID NO: 3 on serum C-reactive protein (CRP) levels obtained from patients in the first human clinical trial for SEQ ID NO: 3. Three groups of patients are shown, placebo, active responders (R) and all patients who received SEQ ID NO: 3. The change in serum CRP levels from the pre-infusion level at 2 weeks and 12 weeks after infusion was measured for the group of placebo, responder group and all patients treated with SEQ ID NO: 3. Within 12 weeks, a significant drop in CRP level was observed in patients treated with SEQ ID NO:

3. * este paciente abandonou sua medicação concomitante de metotre- xato, uma violação do protocolo.3. * this patient abandoned his concomitant methotrexate medication, a violation of the protocol.

[0078] A Figura 13 mostra as mudanças nos níveis de biomarcado- res em pacientes tratados com SEQ ID NO: 3. As concentrações séricas de VEGF e IL-8 foram medidas pela tecnologia Luminex bead e a alte- ração da concentração sérica de pré-infusão calculada para cada paci- ente em 2 e 12 semanas. (A) Mudança na concentração de VEGF; (B) alteração na concentração de IL-8. Os dados mostram o grupo placebo (n = 6), grupo respondedor (R) [n = 8 (2 semanas) e 6 (12 semanas)] e o grupo total de pacientes tratados com SEQ ID NO: 3 [n = 14 (2 sema- nas) e 12 (12 semanas)] que permaneceram no estudo nas 12 semanas. Faixa de concentração (todos os pacientes) VEGF, 4-195 pg / ml; e para I1L-8, 0,7-19 pg / ml.[0078] Figure 13 shows the changes in the levels of biomarkers in patients treated with SEQ ID NO: 3. The serum concentrations of VEGF and IL-8 were measured by the Luminex bead technology and the alteration of the serum pre -infusion calculated for each patient in 2 and 12 weeks. (A) Change in VEGF concentration; (B) change in the concentration of IL-8. The data show the placebo group (n = 6), responder group (R) [n = 8 (2 weeks) and 6 (12 weeks)] and the total group of patients treated with SEQ ID NO: 3 [n = 14 ( 2 weeks) and 12 (12 weeks)] that remained in the study for 12 weeks. Concentration range (all patients) VEGF, 4-195 pg / ml; and for I1L-8, 0.7-19 pg / ml.

[0079] A Figura 14 mostra a expressão regulada para cima de CD39, um marcador de eficiência funcional de célula T reguladora au- mentada. Células mononucleares de sangue periférico de um paciente com RA foarm estabelecidas em cultuar não estimuladas (barars vazias) ou com SEQ ID NO: 1 (10 ug / ml) (barras hachuradas) ou SEQ ID NO: 3 (10 ug / ml) (barras pretas) . Após 24h, 48h ou 72h as células foram removidas da cultura e manchadas com um painel de anticorpos conju- gados com fluorocromo para CD45, CD3, CD4, CD25, CD127 e CD39. As células foram analisadas em um citômetro de fluxo FACSCanto (BD Biosciences). Os resultados são expressos como a intensidade fluores- cente média (MFI) para: (A) células CD25hi e CD127Io após o uso de múltiplas portas vivas para acessar células vivas, CD45 +, CD3 +, CD4 +; (B) a expressão de CD39 pela população CD45 + CD3 + CD4 + CD25hicD1271/o em (A). (C) PBMC (10º ml) foram pré-tratadas por 96h em cultura com SEQ ID NO:1(10 ou 0,11ug / ml) ou SEQ ID NO: 3 de acordo com a invenção (10 ou 0,1ug / ml), lavadas e adicionadas às células T manchadas com CFSE autólogas frescas e estimuladas com esferas revestidas de anticorpo anti-CD3 e anti-CD28. A razão de célu- las T pré-tratadas para células T respondedoras foi de 1:10. As células foram analisadas quanto à redução em CFSE MFI usando o software Cellquest em um citômetro de fluxo FACSCAalibur (BD Biosciences) após 3 dias. Nenhuma inibição da resposta foi observada quando as células T foram pré-incubadas com SEQ ID NO: 1, mas até 30% de redução na resposta foram observados com células pré-incubadas com SEQ ID NO:[0079] Figure 14 shows the up-regulated expression of CD39, a marker of increased regulatory T cell functional efficiency. Peripheral blood mononuclear cells from a patient with RA were established in cultured unstimulated (empty bars) or with SEQ ID NO: 1 (10 ug / ml) (hatched bars) or SEQ ID NO: 3 (10 ug / ml) ( black bars). After 24h, 48h or 72h the cells were removed from the culture and stained with a panel of antibodies conjugated with fluorochrome for CD45, CD3, CD4, CD25, CD127 and CD39. The cells were analyzed using a FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences). The results are expressed as the mean fluorescent intensity (MFI) for: (A) CD25hi and CD127Io cells after using multiple live ports to access living cells, CD45 +, CD3 +, CD4 +; (B) CD39 expression by the CD45 + CD3 + CD4 + CD25hicD1271 / o population in (A). (C) PBMC (10º ml) were pre-treated for 96h in culture with SEQ ID NO: 1 (10 or 0.11ug / ml) or SEQ ID NO: 3 according to the invention (10 or 0.1ug / ml ), washed and added to T cells stained with fresh autologous CFSE and stimulated with anti-CD3 and anti-CD28 antibody coated beads. The ratio of pretreated T cells to responding T cells was 1:10. The cells were analyzed for reduction in CFSE MFI using the Cellquest software on a FACSCAalibur flow cytometer (BD Biosciences) after 3 days. No inhibition of response was seen when T cells were preincubated with SEQ ID NO: 1, but up to 30% reduction in response was seen with cells preincubated with SEQ ID NO:

3. (D) No ensaio clínico RAGULA, as amostras de sangue total de paci- entes com artrite reumatoide tratados com placebo e SEQ ID NO: 3, respondedores (R) ou não respondedores (NR) foram monitorados quanto à alteração na expressão de CD39 em células Treg (vivas , CD45 + CD3 + CD4 + CD25hi CD1271l0) ao longo de 12 semanas. Os resultados são expressos como uma % na mudança na expressão da superfície celular nos pontos no tempo indicados, a partir da pré-infusão. Após uma única infusão, a expressão de CD39 + aumentou significati- vamente por pelo menos 12 semanas pós-infusão.3. (D) In the RAGULA clinical trial, whole blood samples from patients with rheumatoid arthritis treated with placebo and SEQ ID NO: 3, responders (R) or non-responders (NR) were monitored for changes in expression of CD39 in Treg cells (live, CD45 + CD3 + CD4 + CD25hi CD127110) over 12 weeks. The results are expressed as a% in the change in the expression of the cell surface at the indicated points in time, from the pre-infusion. After a single infusion, CD39 + expression increased significantly for at least 12 weeks post-infusion.

[0080] A Figura 15 mostra os resultados da análise de citometria de fluxo da expressão dos níveis de proteína CD115 / c-Fms (A) e RANK (B) por precursores de osteoclasto humano dependentes de M-CSF cul- tivados na ausência ou presença de SEQ ID NO: 1 (2 ug/ml) por 48h. Amostras representativas mostrando intensidade de fluorescência mé- dia: Linha pontilhada, controle não tratado; Linha cheia grossa, controle ativado por RANKL; linha cheia fina, células tratadas com SEQ ID NO: 3 ativadas com RANKL (n = 4). (C) Análise de qPCR da expressão de c-fms e RANK após 48h de tratamento de precursores de osteoclasto dependentes de M-CSF de murino com SEQ ID NO: 1 (2 ug/ml). Os dados mostram a média + SEM de experimentos duplicados usando ini- ciadores específicos e normalizados para B-actina. * p <0,05. (D) Aná- lise de Western blot mostrando a expressão de pERK e pp38 em pre- cursores de osteoclasto humanos em resposta a RANKL (10ng / ml)[0080] Figure 15 shows the results of flow cytometry analysis of the expression of CD115 / c-Fms (A) and RANK (B) protein levels by M-CSF-dependent human osteoclast precursors cultivated in the absence or presence of SEQ ID NO: 1 (2 µg / ml) for 48 hours. Representative samples showing average fluorescence intensity: Dotted line, untreated control; Thick full line, control activated by RANKL; thin full line, cells treated with SEQ ID NO: 3 activated with RANKL (n = 4). (C) qPCR analysis of c-fms and RANK expression after 48h of treatment of murine M-CSF-dependent osteoclast precursors with SEQ ID NO: 1 (2 µg / ml). The data show the mean + SEM of duplicate experiments using specific and normalized primers for B-actin. * p <0.05. (D) Western blot analysis showing the expression of pERK and pp38 in human osteoclast precursors in response to RANKL (10ng / ml)

para os tempos indicados em células cultivadas na ausência ou pre- sença de SEQ ID NO: 1 (2ug / ml, 48h) . (E) Expressão de pERK indu- zido por RANKL em culturas contendo osteoclastos humanos maduros cultivados na ausência ou presença de SEQ ID NO: 1 (2 ug/mL, 48h). (F) Análise de Western blot mostrando a expressão de fatores de trans- crição c-Fos e NFATc1 em resposta a RANKL (10ng / ml) em precurso- res de osteoclasto e osteoclastos maduros tratados na ausência ou pre- sença de BiP (2 ug/ml). As proteínas ERK e p38 totais e GAPDH foram utilizadas como controles de carregamento conforme indicado. * p <0,01. Isto demonstra que a SEQ ID NO: 1 regula para baixo a expres- são da superfície celular CD115 e RANK e a sinalização à jusante em precursores de osteoclasto humano.for the times indicated in cells cultured in the absence or presence of SEQ ID NO: 1 (2ug / ml, 48h). (E) RANKL-induced pERK expression in cultures containing mature human osteoclasts cultured in the absence or presence of SEQ ID NO: 1 (2 µg / mL, 48h). (F) Western blot analysis showing the expression of transcription factors c-Fos and NFATc1 in response to RANKL (10ng / ml) in osteoclast and mature osteoclast precursors treated in the absence or presence of BiP (2 ug / ml). The total ERK and p38 proteins and GAPDH were used as loading controls as indicated. * p <0.01. This demonstrates that SEQ ID NO: 1 downwardly regulates the expression of the CD115 and RANK cell surface and downstream signaling in human osteoclast precursors.

[0081] A Figura 16 mostra que SEQ ID NO: 3 inibe a translocação nuclear de NF-KB p65 e p52 em precursores de osteoclasto e monócitos THP1 após estimulação com TNFa e RANKL. Precursores de osteo- clasto humano dependentes de M-CSF (A) ou células (B) THP-1 foram pré-tratados por 1h na ausência (Co) ou na presença de SEQ ID NO: 3 (10 ug / ml!) (A, B) e em seguida, estimulados com TNFa (10ng / ml) por 10min. (C) Pré-osteoclasto foi cultivado na presença ou ausência de SEQ ID NO: 3 (1019 / ml) com ou sem RANKL (50ng / ml) por 4h. As células foram fixadas e processadas para citometria de fluxo, citometria de fluxo de imagem ou microscopia confocal após manchamento para NF-KB p65 (A, B) ou p52 (C) com contramanchamento DAPI. Os painéis à direita de cada seção da figura mostram imagens confocais de trans- locação nuclear de p65 e p52 em uma única célula representativa, mos- trando a ausência de translocação nuclear em células tratadas com SEQ ID NO: 3. * p <0,01, n=3.[0081] Figure 16 shows that SEQ ID NO: 3 inhibits nuclear translocation of NF-KB p65 and p52 in osteoclast precursors and THP1 monocytes after stimulation with TNFa and RANKL. Human osteoclast precursors dependent on M-CSF (A) or THP-1 cells (B) were pretreated for 1 h in the absence (Co) or in the presence of SEQ ID NO: 3 (10 ug / ml!) ( A, B) and then stimulated with TNFa (10ng / ml) for 10min. (C) Pre-osteoclast was cultured in the presence or absence of SEQ ID NO: 3 (1019 / ml) with or without RANKL (50ng / ml) for 4h. The cells were fixed and processed for flow cytometry, image flow cytometry or confocal microscopy after staining for NF-KB p65 (A, B) or p52 (C) with DAPI counter-staining. The panels to the right of each section of the figure show confocal images of nuclear transport of p65 and p52 in a single representative cell, showing the absence of nuclear translocation in cells treated with SEQ ID NO: 3. * p <0, 01, n = 3.

[0082] Figura 17: Após o tratamento com SEQ ID NO: 3 ou placebo, a resposta imune dos pacientes foi medida usando cultura de PBMC estimulada para detectar respostas de células T a um estímulo máximo,[0082] Figure 17: After treatment with SEQ ID NO: 3 or placebo, the patients' immune response was measured using stimulated PBMC culture to detect T cell responses to a maximum stimulus,

esferas revestidas de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 (cultura de 3 dias) ( Figura 17A) ou antígeno de recuperação, PPD de tuberculina (cultura de 5 dias) (Figura 17B). A ativação foi medida pela absorção de timidina tritiada nas últimas 24 horas de cultura.beads coated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies (3-day culture) (Figure 17A) or recovery antigen, tuberculin PPD (5-day culture) (Figure 17B). Activation was measured by the absorption of tritiated thymidine in the last 24 hours of culture.

[0083] A Figura 18A mostra uma representação esquemática do protocolo e resultados de um experimento de transplante de pele de murino. A Figura 18B mostra a análise de sobrevivência em um gráfico Kaplan Meier. Isso demonstra que a SEQ ID NO: 3 estendeu a sobrevi- vência de 5/6 dos enxertos além da do grupo de controle com 50% dos enxertos sobrevivendo por aproximadamente 30% mais do que os en- xertos de camundongos de controle.[0083] Figure 18A shows a schematic representation of the protocol and results of a murine skin transplantation experiment. Figure 18B shows the survival analysis on a Kaplan Meier chart. This demonstrates that SEQ ID NO: 3 extended the survival of 5/6 of the grafts beyond that of the control group with 50% of the grafts surviving by approximately 30% more than the grafts of control mice.

[0084] A Figura 19 mostra um esquema de um segundo experi- mento exploratório de transplante. Novamente a administração de SEQ ID NO: 3 leva a uma sobrevivência mais longa de enxertos de pele em comparação com aqueles animais que receberam células dendríticas modificadas (DC). Mistura da administração de DC com SEQ ID NO; 3 não foi benéfica.[0084] Figure 19 shows a schematic of a second exploratory transplantation experiment. Again, administration of SEQ ID NO: 3 leads to longer skin graft survival compared to those animals that received modified dendritic cells (DC). Mixing DC administration with SEQ ID NO; 3 was not beneficial.

[0085] A Figura 20 mostra a produção de citocinas por tecido peri- protético cultivado com e sem SEQ ID NO: 3. Pequenos pedaços de tamanho semelhante foram cortados do tecido periprotético retirado du- rante a cirurgia de revisão após o afrouxamento da articulação protética e com o consentimento completo do paciente. O tecido foi cultivado por 24-72h na ausência (controle) ou na presença de SEQ ID NO: 3 (20 ug / ml). Fator de necrose tumoral de citocinas (TNF) a ou interleucina (IL) foram quantificados por ensaio imunoenzimático ligado a enzima co- mercial (ELISA) (PharMingen, BD, Oxford, UK). Os dois gráficos mos- tram que, enquanto a quantidade de TNFa nas culturas de controle e nas culturas de SEQ ID NO: 3 mostram pouca mudança em todas as 4 culturas, há um aumento na produção de IL-10.[0085] Figure 20 shows the production of cytokines by periprosthetic tissue cultured with and without SEQ ID NO: 3. Small pieces of similar size were cut from the periprosthetic tissue removed during the revision surgery after loosening of the prosthetic joint and with the patient's full consent. The tissue was cultured for 24-72h in the absence (control) or in the presence of SEQ ID NO: 3 (20 µg / ml). Cytokine tumor necrosis factor (TNF) a or interleukin (IL) were quantified by immunoenzymatic assay linked to commercial enzyme (ELISA) (PharMingen, BD, Oxford, UK). The two graphs show that, while the amount of TNFa in the control cultures and in the cultures of SEQ ID NO: 3 shows little change in all 4 cultures, there is an increase in the production of IL-10.

Exemplos Exemplo 1: Preparação da proteína da invençãoExamples Example 1: Preparation of the protein of the invention

[0086] O gene BiP foi modificado para colocar uma etiqueta de His na extremidade do terminal N da molécula. A etiqueta 6x Histidina foi colocada de forma que pudesse ser removida por digestão enzimática por uma diaminopeptidase após purificação por afinidade da proteína em uma coluna de cobalto. O níquel não foi usado porque o níquel po- deria levar a uma reação alérgica se restasse o suficiente para contami- nar a preparação. Uma combinação de mudanças de temperatura e de- tergente foi usada para remover eficientemente a endotoxina. Rendimento e purificação[0086] The BiP gene was modified to place a His tag at the N-terminus of the molecule. The 6x Histidine tag was placed so that it could be removed by enzymatic digestion by a diaminopeptidase after affinity purification of the protein in a cobalt column. Nickel was not used because nickel could lead to an allergic reaction if there was enough left to contaminate the preparation. A combination of changes in temperature and detergent was used to efficiently remove the endotoxin. Yield and purification

[0087] O rendimento é muito melhorado, assim como a pureza da proteína pelo sistema removível de etiqueta de His. Tabela 1: Rendimento de SEQ ID NO: 3 a partir do precipitado bac- teriano: Ponto no Tempo — Peso do precipitado BiP (SEQ ID NO: 3) medido (g) Rendimento (mg / g) Dia O 2,49 19,6 2 meses 60g 31,9 8 meses 2,49 24,2 Tabela 2: Pureza e rendimento de SEQ ID NO: 3 emite ee usado para filtração estéril de substân- | 3900 mBar cia medicamentosa[0087] The yield is greatly improved, as well as the protein purity by the removable His tag system. Table 1: Yield of SEQ ID NO: 3 from the bacterial precipitate: Point in Time - Weight of the BiP precipitate (SEQ ID NO: 3) measured (g) Yield (mg / g) Day O 2.49 19, 6 2 months 60g 31.9 8 months 2.49 24.2 Table 2: Purity and yield of SEQ ID NO: 3 emits and is used for sterile filtration of substances | 3900 mBar drug company

Exemplo Comparativo; preparação de SEQ ID: NO 7Comparative Example; preparation of SEQ ID: NO 7

[0088] Durante o desenvolvimento da proteína da invenção, foi de- cidido que a molécula deve ter a sequência KDEL correta no terminal C' e não deve ter nenhuma outra etiqueta ligada à proteína. Esta proteína foi preparada de acordo com técnicas recombinantes padrões conheci- das por um especialista na técnica. No entanto, havia muito pouca pro- teína, a pureza era muito baixa e quase toda a atividade biológica havia sido perdida. Consequentemente, a proteína não poderia ser usada.[0088] During the development of the protein of the invention, it was decided that the molecule must have the correct KDEL sequence at the C 'terminal and must not have any other tag attached to the protein. This protein was prepared according to standard recombinant techniques known to a person skilled in the art. However, there was very little protein, the purity was very low and almost all biological activity had been lost. Consequently, the protein could not be used.

[0089] SEQ ID NO: 7 corresponde a SEQ ID NO: 1 (SEQ1 de WOO00 121995) com a etiqueta de His removida e a sequência de aminoácidos KDEL restaurada, mas nenhuma outra alteração de SEQ1 de WOO00 /[0089] SEQ ID NO: 7 corresponds to SEQ ID NO: 1 (SEQ1 of WOO00 121995) with His tag removed and the KDEL amino acid sequence restored, but no other changes to SEQ1 of WOO00 /

21995. Esta proteína provou ser muito difícil de purificar, a pureza final da proteína foi <90% e a carga de endotoxina foi muito alta para uso Clínico. Isto demonstra que é difícil fornecer um análogo de BiP nativa que seja fácil de preparar, estável e possua atividade biológica, além de ser adequado para administração a humanos.21995. This protein proved to be very difficult to purify, the final purity of the protein was <90% and the endotoxin load was too high for clinical use. This demonstrates that it is difficult to provide a native BiP analogue that is easy to prepare, stable and has biological activity, in addition to being suitable for administration to humans.

[0090] Quatro lotes de experimento foram preparados para tentar melhorar o rendimento, a pureza e a redução na contaminação por en- dotoxinas da proteína pura. Isso provou ser impossível. A recuperação da proteína foi cerca de 1%, mas os níveis de endotoxina permanece- ram elevados. Exemplo 2[0090] Four batches of experiments were prepared to try to improve the yield, the purity and the reduction in contamination by en- dotoxins of pure protein. This proved to be impossible. Protein recovery was about 1%, but endotoxin levels remained high. Example 2

[0091] Uma comparação da produção de TNFa induzida por prote- ínas de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 1 é fornecida na Figura 10. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de 4 controles saudáveis (símbolos cheios) e 1 paciente com artrite reumatoide (símbolo vazio) foram cultivadas por 24h na presença de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:[0091] A comparison of TNFα production induced by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 1 proteins is provided in Figure 10. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 4 healthy controls (filled symbols) and 1 patient with rheumatoid arthritis (empty symbol) were cultured for 24h in the presence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO:

3. As citocinas produzidas no sobrenadante foram detectadas e quanti- ficadas por ELISA.3. The cytokines produced in the supernatant were detected and quantified by ELISA.

[0092] A produção de TNFa por PBMC é muito reduzida na pre- sença de SEQ ID NO: 3 em comparação com SEQ ID NO: 1. Além disso, a proteína da invenção não aumenta a produção de TNFa por PBMC de artrite reumatoide de forma diferente de controles saudáveis, enquanto a proteína de SEQ ID NO: 1 parece induzir maior produção de TNFa por PBMC de RA do que por PBMC saudáveis.[0092] Production of TNFa by PBMC is greatly reduced in the presence of SEQ ID NO: 3 compared to SEQ ID NO: 1. Furthermore, the protein of the invention does not increase the production of TNFa by PBMC of rheumatoid arthritis of different form of healthy controls, while SEQ ID NO: 1 protein appears to induce higher TNFa production by RA PBMC than by healthy PBMC.

[0093] O significado clínico do TNFa na patogênese da artrite reu- matoide (RA) está bem estabelecido (ver Role of cytokines in rheuma- toid arthritis: an education in pathophysiology and therapeutics, Feld- mann M, Maini SR, Immunol Rev. 2008 Jun;223:7-19). É portanto uma característica positiva importante da proteína da invenção que ela não suprarregula o TNFa. Exemplo 3[0093] The clinical significance of TNFa in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA) is well established (see Role of cytokines in rheumatoid arthritis: an education in pathophysiology and therapeutics, Feldmann M, Maini SR, Immunol Rev. 2008 Jun; 223: 7-19). It is therefore an important positive feature of the protein of the invention that it does not suppress TNFα. Example 3

[0094] A interação entre as moléculas que regulam a ativação das células T é complexa, mas como a artrite reumatoide é uma doença de inflamação crônica, essas moléculas e sua expressão relativa são im- portantes. Antígeno de leucócito humano - relacionado ao antígeno D (HLA-DR) é uma molécula expressa constitutivamente por monócitos, macrófagos e células dendríticas, geralmente conhecida como células apresentadoras de antígeno, cada uma das quais contém um peptídeo antigênico pronto para ser apresentado ao receptor de células T CD4 +. No entanto, para a ativação completa das células T, dois sinais são ne- cessários, um através da ligação do receptor da célula HLA-DR-T e um segundo sinal simultâneo através do CD28 por meio da ligação do CD86 ou CD80. O segundo sinal é fornecido por moléculas coestimulatórias CD86 e / ou CD80, também expressas pelas células apresentadoras de antígeno, inicialmente ligando a CD28, expresso pela célula T CD4 que é posteriormente regulada para baixo enquanto CTLA-4 é regulada para cima. A ativação da célula T é regulada pela expressão dessas molécu- las. CD28 dá um sinal de ativação positivo enquanto CTLA-4 dá um sinal negativo para a célula T. CTLA-4 também liga a CD80 e CD86 com maior avidez do que CD28, isso tem o efeito de inibir a ativação de cé- lulas T, evitando assim a ativação crônica ou contínua de células T.[0094] The interaction between the molecules that regulate the activation of T cells is complex, but since rheumatoid arthritis is a disease of chronic inflammation, these molecules and their relative expression are important. Human leukocyte antigen - related to antigen D (HLA-DR) is a molecule expressed constitutively by monocytes, macrophages and dendritic cells, generally known as antigen-presenting cells, each of which contains an antigenic peptide ready to be presented to the recipient. CD4 + T cells. However, for the complete activation of T cells, two signals are required, one through the connection of the HLA-DR-T cell receptor and a second simultaneous signal through CD28 through the connection of CD86 or CD80. The second signal is provided by co-stimulatory molecules CD86 and / or CD80, also expressed by antigen presenting cells, initially binding to CD28, expressed by the CD4 T cell, which is later regulated downwards while CTLA-4 is regulated upwards. T cell activation is regulated by the expression of these molecules. CD28 gives a positive activation signal while CTLA-4 gives a negative signal to the T cell. CTLA-4 also binds to CD80 and CD86 with greater avidity than CD28, this has the effect of inhibiting T cell activation, thus avoiding chronic or continuous T-cell activation.

[0095] A interação dessas quatro moléculas ajuda a regular a res- posta imune. Assim, é notável que SEQ ID NO: 1 mostrou regulação para baixo de CD86 e também de HLA-DR. Isso agiu para reduzir a ativação de células T, ilustrada por uma resposta in vitro reduzida de PBMC tratadas com BiP ao antígeno de recall, como PPD de tubercu- lina, mas também sinaliza a possibilidade de imunossupressão genera- lizada que não seria clinicamente benéfica a longo prazo (Michael Dan- del , Hans Brendan Lehmkuhl, Christoph Knosalla, Roland Hetzer, Im- pacto de diferentes estratégias de terapia imunossupressora de manu- tenção de longo prazo no resultado dos pacientes após o transplante cardíaco, Transplant Immunology; Volume 23, Edição 3, julho de 2010, Páginas 93-103), consulte a Figura 11D . Ao contrário, a SEQ ID NO: 3 de acordo com a invenção não causou perda significativa de expressão de HLA-DR (Figura 11E) e CD86.[0095] The interaction of these four molecules helps to regulate the immune response. Thus, it is notable that SEQ ID NO: 1 showed downward regulation of CD86 and also of HLA-DR. This acted to reduce the activation of T cells, illustrated by a reduced in vitro response of PBMC treated with BiP to the recall antigen, such as tuberculin PPD, but it also signals the possibility of generalized immunosuppression that would not be clinically beneficial to long-term (Michael Dan- del, Hans Brendan Lehmkuhl, Christoph Knosalla, Roland Hetzer, Impact of different long-term maintenance immunosuppressive therapy strategies on the outcome of patients after heart transplantation, Transplant Immunology; Volume 23, Edition 3, July 2010, Pages 93-103), see Figure 11D. In contrast, SEQ ID NO: 3 according to the invention did not cause significant loss of expression of HLA-DR (Figure 11E) and CD86.

[0096] A Figura 11 mostra os resultados dos experimentos de cito- metria de fluxo em células CD14 +. Na presença de SEQ ID NO: 3 (Fi- gura 11B, há um aumento na expressão de CD80 e um aumento em CDB86 em relação às células não estimuladas (Figura 11A). Na presença de SEQ ID NO: 1 (Figura 11C), há um aumento na expressão de CD80, mas não CD86 em relação às células não estimuladas.[0096] Figure 11 shows the results of the flow cytometry experiments in CD14 + cells. In the presence of SEQ ID NO: 3 (Figure 11B, there is an increase in CD80 expression and an increase in CDB86 in relation to unstimulated cells (Figure 11A). there is an increase in CD80 expression, but not CD86 in relation to unstimulated cells.

[0097] Em conclusão, isso revela dois pontos importantes de inte- resse. Em primeiro lugar, que embora uma redução na ativação de cé- lulas T reduza a inflamação, como visto com SEQ ID NO: 1, uma su- pressão geral do sistema imunológico não é benéfica para o paciente a longo prazo, levando ao aumento da infecção, etc. Em segundo lugar, a SEQ ID NO: 3 de acordo com a invenção já mostrou eficácia anti-infla-[0097] In conclusion, this reveals two important points of interest. First, that although a reduction in T cell activation reduces inflammation, as seen with SEQ ID NO: 1, a general suppression of the immune system is not beneficial to the patient in the long run, leading to increased infection, etc. Second, SEQ ID NO: 3 according to the invention has already shown anti-inflammatory efficacy

matória em modelos in vivo. Isso demonstra modulação do sistema imu- nológico para resolver a inflamação crônica através da atividade espe- cífica da BiP, evitando um efeito imunossupressor generalizado. Exemplo 4: Dados clínicosin vivo models. This demonstrates modulation of the immune system to resolve chronic inflammation through the specific activity of BiP, avoiding a generalized immunosuppressive effect. Example 4: Clinical data

[0098] Os resultados de um ensaio clínico de fase | / Il duplo cego, com aumento de dose, arndomizado, controlado por placebo, em paci- entes com RA ativa que não tivearm sucesso com as tearpias aceitas, mostraram que a proteína da invenção é seguar. Além disso, análise do biomarcador mostrou considerável atividade anti-inflamatória com be- nefício clínico (ver Kirk;kham B, Chaabo K, Hall C, Garrood T, Mant T, Allen E, et al. Segurança e resposta do paciente, conforme indicado pe- las mudanças de biomarcadores em ligação de proteína de imunoglo- bulina no experimento clínico de fase | / IIA RAGULA em artrite reuma- toide, Rhneumatology 2016; 55: 1993-2000.)[0098] The results of a phase clinical trial | / Double-blind, dose-increasing, aromatic, placebo-controlled, in patients with active RA who were unsuccessful with accepted tearpias, showed that the protein of the invention is to follow. In addition, biomarker analysis showed considerable anti-inflammatory activity with clinical benefit (see Kirk; kham B, Chaabo K, Hall C, Garrood T, Mant T, Allen E, et al. Patient safety and response, as indicated for changes in biomarkers in immunoglobulin protein binding in the clinical phase | / IIA RAGULA experiment in rheumatoid arthritis, Rhneumatology 2016; 55: 1993-2000.)

[0099] Vinte e quatro pacientes com RA ativa que não respondearm ao tartamento com um ou mais fármacos anti-reumáticos modificadores da doença (DMarDs) foarm sequencialmente atribuídos a três grupos, cada um dos oito pacientes alocados aleatoriamente para receber pla- cebo (dois pacientes) ou a proteína de SEQ ID NO: 3 de acordo com a invenção (seis pacientes), em doses de 1, 5 ou 15 mg. Os pacientes receberam uma única infusão i.v. durante 1 hora e foram observados como pacientes internados durante a noite. Os pacientes foram monito- rados nas 12 semanas seguintes com avaliações laboratoriais e acom- panhamento clínico quanto a segurança, eficácia (DAS28-ESR) e aná- lise de biomarcadores. Segurança[0099] Twenty-four patients with active RA who did not respond to tartanism with one or more disease-modifying antirheumatic drugs (DMarDs) were sequentially assigned to three groups, each of the eight patients randomly allocated to receive placebo (two patients) or the SEQ ID NO: 3 protein according to the invention (six patients), in doses of 1, 5 or 15 mg. Patients received a single i.v. infusion for 1 hour and were observed as inpatients during the night. Patients were monitored over the next 12 weeks with laboratory evaluations and clinical follow-up for safety, efficacy (DAS28-ESR) and analysis of biomarkers. Safety

[00100] Não foram observadas reações à infusão ou reações adver- sas graves ao fármaco. Os eventos adversos foram distribuídos unifor- memente entre os grupos placebo e ativo, sem toxicidades relacionadas ao fármaco. Os parâmetros hematológicos, renais e metabólicos não mostraram toxicidades relacionadas ao fármaco. Eficácia[00100] No reactions to the infusion or serious adverse reactions to the drug were observed. Adverse events were evenly distributed between the placebo and active groups, with no drug-related toxicities. The hematological, renal and metabolic parameters did not show toxicities related to the drug. Efficiency

[00101] A pontuação de atividade da doença (DAS28) foi desenvol- vida como uma ferramenta de avaliação dinâmica e uma medida de res- posta terapêutica para uso em experimentos clínicos e prática. DAS28- ESR usa os seguintes indicadores de doença: contagem de articulações doloridas (28 articulações), contagem de articulações inchadas (28 arti- culações), Taxa de Sedimentação de Eritrócitos (ESR) e estado geral de saúde relatado pelo paciente em uma escala análoga visual de 100 mm, ver Prevoo, ML et al, Arthritis Rheum 1995; 38: 44-8.[00101] The disease activity score (DAS28) was developed as a dynamic assessment tool and a therapeutic response measure for use in clinical and practical experiments. DAS28- ESR uses the following disease indicators: sore joint count (28 joints), swollen joint count (28 joints), erythrocyte sedimentation rate (ESR) and general health status reported by the patient on an analogous scale 100 mm visual, see Prevoo, ML et al, Arthritis Rheum 1995; 38: 44-8.

[00102] O ponto final principal de eficácia foi a resposta DAS28-ESR, classificada de acordo com os critérios de resposta EULAR em boa, mo- derada e sem resposta com remissão definida como DAS28-ESR infe- rior a 2,6 (Kirkham B, Chaabo K, Hall C, Garrood T, Mant T, Allen E, et al. Segurança e resposta do paciente, conforme indicado pelas mudan- ças do biomarcador em ligação de proteína de imunoglobulina no ensaio clínico de fase | / IIA RAGULA em artrite reumatoide. Rheumatology 2016; 55: 1993-2000). Os pontos finais de eficácia biológica foram mu- danças na CRP (Figura 12), IL-8 e VEGF (Figura 13), ver discussão adicional abaixo. Esses são comumente usados para monitorar a ativi- dade da doença em experimentos clínicos de fármacos de tratamentos para a artrite reumatoide.[00102] The main end point of effectiveness was the DAS28-ESR response, classified according to the EULAR response criteria as good, moderate and unresponsive with remission defined as DAS28-ESR less than 2.6 (Kirkham B, Chaabo K, Hall C, Garrood T, Mant T, Allen E, et al. Patient safety and response, as indicated by changes in the immunoglobulin protein binding biomarker in the phase clinical trial | / IIA RAGULA in rheumatoid arthritis. Rheumatology 2016; 55: 1993-2000). The end points of biological efficacy were changes in CRP (Figure 12), IL-8 and VEGF (Figure 13), see further discussion below. These are commonly used to monitor disease activity in clinical trials of treatment drugs for rheumatoid arthritis.

[00103] Clinicamente, boas respostas EULAR foram mais comuns naqueles tratados com doses mais altas de SEQ ID NO: 3 com pontua- ções baixas sustentadas de DAS28 (de 3 a 12 semanas) observadas em três pacientes que receberam SEQ ID NO: 3, comparadas com ne- nhum paciente que recebeu placebo, embora boas respostas DAS28- ESR tenham sido alcançadas em todos os grupos de tratamento. Concentração sérica de VEGF e IL-8[00103] Clinically, good EULAR responses were more common in those treated with higher doses of SEQ ID NO: 3 with sustained low DAS28 scores (from 3 to 12 weeks) seen in three patients who received SEQ ID NO: 3, compared to any patient who received a placebo, although good DAS28-ESR responses have been achieved in all treatment groups. Serum concentration of VEGF and IL-8

[00104] A Figura 13 mostra a mudança nos níveis séricos de VEGF ou IL-8 na presença de SEQ ID NO: 3 da linha de base pré-infusão para cada paciente em 2 semanas ou 12 semanas medidos pela tecnologia Luminex (Bio-Rad, Hemel Hempstead, REINO UNIDO). Apenas os pa- cientes que permaneceram no estudo em 12 semanas foram incluídos nesta análise (Figura 13).[00104] Figure 13 shows the change in serum VEGF or IL-8 levels in the presence of pre-infusion baseline SEQ ID NO: 3 for each patient in 2 weeks or 12 weeks measured by Luminex technology (Bio-Rad , Hemel Hempstead, UNITED KINGDOM). Only patients who remained in the study for 12 weeks were included in this analysis (Figure 13).

[00105] A análisede CRP, VEGF e IL-8 provou ser útil na diferenci- ação de indivíduos que receberam fármaco ativo comparado com pla- cebo. Os pacientes que responderam à SEQ ID NO: 3 mostraram uma diminuição significativa em CRP em 2 semanas (nível pré-infusão, 12,7 + 1,7 versus 2 semanas pós-infusão, 7,1 + 2,1; p = 0,02), comparado com os grupos placebo e não respondedores. Soro VEGF e IL-8 são biomarcadores comuns usados em ensaios clínicos porque eles corre- lacionam bem com a medição de sinovite e infiltração de monócitos, respectivamente. Mudanças significativas nos níveis desses biomarca- dores ocorreram em grupos de pacientes que receberam SEQ ID NO:[00105] CRP, VEGF and IL-8 analysis proved to be useful in differentiating individuals who received active drug compared to placebo. Patients who responded to SEQ ID NO: 3 showed a significant decrease in CRP at 2 weeks (pre-infusion level, 12.7 + 1.7 versus 2 weeks post-infusion, 7.1 + 2.1; p = 0 , 02), compared with the placebo and non-responders groups. Serum VEGF and IL-8 are common biomarkers used in clinical trials because they correlate well with the measurement of synovitis and monocyte infiltration, respectively. Significant changes in the levels of these biomarkers occurred in groups of patients who received SEQ ID NO:

3. Além disso, os biomarcadores não suportaram melhoria clínica em pacientes com placebo. Notavelmente, na semana 12, significativa- mente menos pacientes que receberam placebo mostraram VEGF e IL- 8 séricos reduzidos (17 e 50%, respectivamente), comparados com o grupo respondedor SEQ ID NO: 3 (71 e 83% dos pacientes, respectiva- mente). Interessantemente, mesmo o grupo não respondedor SEQ ID NO: 3 mostrou concentrações séricas reduzidas (66 e 83% dos pacien- tes, respectivamente), sugerindo uma mudança na patologia de sua do- ença.3. In addition, biomarkers did not support clinical improvement in patients with placebo. Notably, at week 12, significantly fewer patients who received placebo showed reduced serum VEGF and IL-8 (17 and 50%, respectively), compared to the responder group SEQ ID NO: 3 (71 and 83% of patients, respectively). - mind). Interestingly, even the non-responding group SEQ ID NO: 3 showed reduced serum concentrations (66 and 83% of patients, respectively), suggesting a change in the pathology of their disease.

[00106] Emresumo, os pacientes com resposta ativa mostraram con- centrações séricas significativamente mais baixas de CRP, 2 semanas após a infusão comparadas com os níveis de pré-infusão (Figura 12), e de VEGF e IL-8 (Figura 13) do grupo de placebo. Isso indica que a in- flamação da doença é consideravelmente menor do que os níveis pré- infusão.[00106] In summary, patients with active response showed significantly lower serum concentrations of CRP 2 weeks after infusion compared to pre-infusion levels (Figure 12), and of VEGF and IL-8 (Figure 13) the placebo group. This indicates that the inflammation of the disease is considerably lower than the pre-infusion levels.

Exemplo 5: SEQ ID NO: 3 regula para cima CD39 em células T re- guladorasExample 5: SEQ ID NO: 3 upward regulates CD39 on regulatory T cells

[00107] Células mononucleares de sangue periférico de um paciente com RA foarm estabelecidas em cultuar não estimuladas (barars vazias) ou com SEQ ID NO: 1 (10 ug / ml) (barars archuardas) ou SEQ ID NO: 3 (10 ug / ml) (barars pretas, figuar 14).[00107] Peripheral blood mononuclear cells from a patient with RA were established in cultured unstimulated (empty bars) or with SEQ ID NO: 1 (10 ug / ml) (barar archuardas) or SEQ ID NO: 3 (10 ug / ml) (black bars, fig. 14).

[00108] Após 24h, 48h ou 72h as células foram removidas da cultura e manchadas com um painel de anticorpos conjugados com fluorocromo para CD45, CD3, CD4, CD25, CD127 e CD39. As células foram anali- sadas em um citômetro de fluxo FACSCanto (BD Biosciences).[00108] After 24h, 48h or 72h the cells were removed from the culture and stained with a panel of fluorochrome-conjugated antibodies for CD45, CD3, CD4, CD25, CD127 and CD39. The cells were analyzed using a FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences).

[00109] Os resultados na Figura 14 são expressos como a intensi- dade fluorescente média (MFI) para: (A) células CD25hi e CD1271lo após o uso de múltiplas portas vivas para acessar células CD45 +, CD3 +, CD4 + vivas; (B) a expressão de CD39 na população CD45 + CD3 + CD4 + CD25hiCD127/0o em (A).[00109] The results in Figure 14 are expressed as the mean fluorescent intensity (MFI) for: (A) CD25hi and CD1271lo cells after using multiple live ports to access live CD45 +, CD3 +, CD4 + cells; (B) CD39 expression in the CD45 + CD3 + CD4 + CD25hiCD127 / 0o population in (A).

(C) PBMC (10º ml) foram pré-tratadas por 96h em cultura com SEQ ID NO:1(10 ou 0,11ug / ml) ou SEQ ID NO: 3 de acordo com a invenção (10 ou 0,1ug / ml), lavadas e adicionadas às células T man- chadas com CFSE autólogas frescas (éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína de corante citoplásmico) e estimuladas com es- feras revestidas com anticorpo anti-CD3 e anti-CD28. A razão de células T pré-tratadas para células T respondedoras foi de 1:10. As células fo- ram analisadas quanto à redução em CFSE MFI usando software Cell- quest em um FACS Calibur após 3 dias. À medida que as células proli- feram, o teor de CFSE é reduzido em cada divisão e as células que não proliferam permanecem altamente manchadas.(C) PBMC (10º ml) were pre-treated for 96h in culture with SEQ ID NO: 1 (10 or 0.11ug / ml) or SEQ ID NO: 3 according to the invention (10 or 0.1ug / ml ), washed and added to the T cells stained with fresh autologous CFSE (succinimidyl ester of cytoplasmic dye carboxyfluorescein diacetate) and stimulated with spheres coated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. The ratio of pretreated T cells to responding T cells was 1:10. The cells were analyzed for reduction in CFSE MFI using Cell-quest software in a FACS Calibur after 3 days. As cells proliferate, the CFSE content is reduced in each division and cells that do not proliferate remain highly stained.

(D) No experimento clínico, amostras de sangue total de pa- cientes com artrite reumatoide tratados com placebo e SEQ ID NO: 3, respondedores (R) ou não respondedores (NR) foram monitoradas quanto à alteração na expressão de CD39 em células Treg (CD45 + CD3 + CD4 + CD25hi CD1271Io vivas) ao longo de 12 semanas. Os re- sultados são expressos como uma % na mudança na expressão da su- perfície celular nos pontos no tempo indicados, a partir da pré-infusão.(D) In the clinical trial, whole blood samples from patients with rheumatoid arthritis treated with placebo and SEQ ID NO: 3, responders (R) or non-responders (NR) were monitored for changes in CD39 expression in Treg cells. (CD45 + CD3 + CD4 + CD25hi CD1271Io) over 12 weeks. The results are expressed as a% in the change in the expression of the cell surface at the indicated points in time, from the pre-infusion.

[00110] A comparação in vitro entre SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3 de acordo com a invenção mostra que embora o aumento real no nú- mero de Treg seja baixo, confirmando assim o trabalho anterior com SEQ ID NO: 1, há uma diferença maior na % de expressão de CD39 no Treg com SEQ ID NO: 3 quando comparada diretamente com SEQ ID NO: 1. De interesse é que em 72h a expressão de CD39 em Treg das culturas SEQ ID NO: 1 seja inferior à das células de controle. Na clínica, foi observado um aumento significativo na expressão de CD39 em cé- lulas Treg de pacientes que respondem à SEQ ID NO: 3 e isso foi man- tido por 12 semanas após a infusão. Exemplo 6: SEQ ID NO: 3 suprime as vias de sinalização de dife- renciação de osteoclasto[00110] The in vitro comparison between SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 according to the invention shows that although the real increase in the number of Treg is low, thus confirming the previous work with SEQ ID NO: 1 , there is a greater difference in the% of CD39 expression in Treg with SEQ ID NO: 3 when compared directly with SEQ ID NO: 1. It is of interest that in 72h the expression of CD39 in Treg of SEQ ID NO: 1 cultures is lower that of the control cells. At the clinic, a significant increase in CD39 expression was observed in Treg cells of patients who respond to SEQ ID NO: 3 and this was maintained for 12 weeks after the infusion. Example 6: SEQ ID NO: 3 suppresses osteoclast differentiation signaling pathways

[00111] —Parainvestigar os mecanismos subjacentes à inibição da os- teoclastogênese pela SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3, analisamos a si- nalização de citocina específica e as vias de sinalização à jusante co- nhecidas por serem essenciais para a diferenciação dos osteoclasto. Análise de citometria de fluxo de CD115/c-Fms e RANK, os receptores para M-CSF e RANKL respectivamente, em precursores de osteoclasto dependentes de M-CSF derivados de sangue periférico humano revela- ram que SEQ ID NO: 3 regulou para baixo a expressão de CD115 em 63 + 16 % (intervalo de inibição, 43-79%) (Figura 15A). SEQ ID NO: 1 inibiu de forma semelhante a expressão da proteína RANK em 51 + 29% (intervalo de inibição, 22-90%) (Figura 15B). A inibição da expressão de c-Fms e RANK também foi observada no nível de MRNA, uma vez que a análise de qPCR mostrou reduções significativas em c- fms e RANK[00111] —To investigate the mechanisms underlying the inhibition of osteoclastogenesis by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, we analyzed the specific cytokine signaling and the downstream signaling pathways known to be essential for the differentiation of osteoclasts. Flow cytometry analysis of CD115 / c-Fms and RANK, receptors for M-CSF and RANKL respectively, in M-CSF-dependent osteoclast precursors derived from human peripheral blood revealed that SEQ ID NO: 3 regulated down CD115 expression at 63 + 16% (inhibition range, 43-79%) (Figure 15A). SEQ ID NO: 1 similarly inhibited RANK protein expression by 51 + 29% (inhibition range, 22-90%) (Figure 15B). Inhibition of c-Fms and RANK expression was also observed at the MRNA level, since qPCR analysis showed significant reductions in c-fms and RANK

RNA (Figura 15C). Para analisar se a diminuição na expressão do re- ceptor resultou em responsividade reduzida às citocinas osteoclastogê- nicas, analisamos o efeito do tratamento com SEQ ID NO: 1 na sinali- zação de MAPK dependente de RANKL. O pré-tratamento de precurso- res de osteoclasto derivados de PBMC humanas com SEQ ID NO: 1 suprimiu notavelmente a fosforilação de ERK e p38 induzida por RANKL comparado com células não tratadas (Figura 15D). Resultados seme- lhantes foram obtidos usando precursores de osteoclasto derivados de medula óssea de murino dependente de M-CSF (dados não mostrados). Um exame adicional da responsividade de RANKL em culturas de está- gio final revelou de forma semelhante que os níveis de pERK induzidos por RANKL também foram atenuados em culturas enriquecidas em os- teoclastos maduros após o tratamento com SEQ ID NO: 1 (Figura 15E).RNA (Figure 15C). To analyze whether the decrease in receptor expression resulted in reduced responsiveness to osteoclastogenic cytokines, we analyzed the effect of treatment with SEQ ID NO: 1 on RANKL-dependent MAPK signaling. Pretreatment of osteoclast precursors derived from human PBMCs with SEQ ID NO: 1 remarkably suppressed RANKL-induced ERK and p38 phosphorylation compared to untreated cells (Figure 15D). Similar results were obtained using osteoclast precursors derived from M-CSF-dependent murine bone marrow (data not shown). An additional examination of RANKL responsiveness in end-stage cultures similarly revealed that RANKL-induced pERK levels were also attenuated in cultures enriched in mature osteoclasts after treatment with SEQ ID NO: 1 (Figure 15E) .

[00112] Em seguida, investigamos o efeito da SEQ ID NO: 1 na ex- pressão dos fatores de transcrição c-Fos e NFATc1, que são essenciais para a diferenciação de osteoclasto e que ficam à jusante da sinalização de RANK e TNFa em precursores de osteoclasto e monócitos. A pré- incubação de precursores de osteoclasto humanos com SEQ ID NO: 1 reduziu muito a ativação da proteína c-Fos após o tratamento com RANKL (Figura 15F). A estimulação de RANKL de NFATc1, um gene alvo c-Fos, foi similarmente bloqueada em precursores de osteoclasto tratados com SEQ ID NO: 1 quando comparada com lisados celulares de controle (Figura 15F). Culturas de osteoclasto maduro tratadas com SEQ ID NO: 1 também mostraram uma diminuição notável na expressão endógena de fatores de transcrição de c-Fos e NFATc1 (Figura 15F).[00112] Next, we investigated the effect of SEQ ID NO: 1 on the expression of the transcription factors c-Fos and NFATc1, which are essential for osteoclast differentiation and which are downstream of RANK and TNFa signaling in precursors osteoclast and monocytes. Preincubation of human osteoclast precursors with SEQ ID NO: 1 greatly reduced activation of the c-Fos protein after treatment with RANKL (Figure 15F). RANKL stimulation of NFATc1, a c-Fos target gene, was similarly blocked in osteoclast precursors treated with SEQ ID NO: 1 when compared to control cell lysates (Figure 15F). Cultures of mature osteoclast treated with SEQ ID NO: 1 also showed a notable decrease in the endogenous expression of c-Fos and NFATc1 transcription factors (Figure 15F).

[00113] Uma vez que a SEQ ID NO: 1 inibe as vias de sinalização necessárias para a diferenciação de monócitos para osteoclastos, pro- curamos ver se a SEQ 3 teria um efeito semelhante no NF-KB, um dos fatores de transcrição que impulsiona a inflamação, mas a via alterna- tiva é exigida por RANK-RANKL para conduzir a diferenciação à jusante.[00113] Since SEQ ID NO: 1 inhibits the signaling pathways needed to differentiate monocytes into osteoclasts, we tried to see if SEQ 3 would have a similar effect on NF-KB, one of the transcription factors that drives inflammation, but the alternative route is required by RANK-RANKL to drive differentiation downstream.

[00114] A citometria de fluxo de imagem demonstrou que o trata- mento com SEQ ID NO: 3 inibiu a translocação nuclear induzida por TNFa de p65 NF-«B em precursores de osteoclasto (Figura 16A). Re- sultados semelhantes foram obtidos em resposta à estimulação RANKL (dados não mostrados). Uma vez que RANKL também estimula células por meio da via não canônica de NF-«B, investigamos a translocação nuclear de p52 NF-«B após estimulação de RANKL. A microscopia con- focal e a análise de imagem mostraram que enquanto RANKL estimulou a translocação nuclear eficiente de p52 em células não tratadas, esta foi inibida pelo pré-tratamento SEQ ID NO: 3 (Figura 16B). Estes resultados sugerem que a SEQ ID NO: 3 bloqueia a sinalização de NF-KB tanto canônica bem como não canônica em monócitos e precursores de os- teoclasto após tratamento com TNFa e RANKL.[00114] Image flow cytometry demonstrated that treatment with SEQ ID NO: 3 inhibited TNFα-induced nuclear translocation of p65 NF- «B in osteoclast precursors (Figure 16A). Similar results were obtained in response to RANKL stimulation (data not shown). Since RANKL also stimulates cells via the non-canonical NF- «B pathway, we investigated the nuclear translocation of p52 NF-« B after RANKL stimulation. Conocal microscopy and image analysis showed that while RANKL stimulated efficient nuclear translocation of p52 in untreated cells, it was inhibited by pretreatment SEQ ID NO: 3 (Figure 16B). These results suggest that SEQ ID NO: 3 blocks both canonical and non-canonical NF-KB signaling in monocytes and osteoclast precursors after treatment with TNFa and RANKL.

[00115] “Tomados em conjunto, esses dados demonstram que o tra- tamento de monócitos e precursores de osteoclasto com SEQ ID NO: 3 reduz a transdução de sinal induzida por M-CSF e RANKL e ativação dos fatores essenciais de transcrição osteoclastogênica NF-KB, c-Fos e NFATC1, por meio disso fornecendo percepções nos mecanismos pelos quais SEQ ID NO: 3 inibe a diferenciação de osteoclastos e a atividade de reabsorção.[00115] “Taken together, these data demonstrate that the treatment of monocytes and osteoclast precursors with SEQ ID NO: 3 reduces signal transduction induced by M-CSF and RANKL and activation of essential osteoclastogenic transcription factors NF- KB, c-Fos and NFATC1, thereby providing insights into the mechanisms by which SEQ ID NO: 3 inhibits osteoclast differentiation and resorption activity.

[00116] Estes dados fornecem evidências de que a SEQ ID NO: 3 pode ser usada para tratar doenças do metabolismo ósseo desregulado. Exemplo 7[00116] These data provide evidence that SEQ ID NO: 3 can be used to treat disorders of unregulated bone metabolism. Example 7

[00117] Apósotratamento com SEQ ID NO: 3 ou placebo, a resposta imune dos pacientes foi medida usando cultura de PBMC estimulada para detectar respostas de células T a um estímulo máximo, esferas revestidas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 (cultura de 3 dias) (Fi- gura 17A) ou antígeno de recuperação, PPD de tuberculina (cultura de dias) (Figura 17B).[00117] After treatment with SEQ ID NO: 3 or placebo, the patients' immune response was measured using PBMC culture stimulated to detect T cell responses to a maximum stimulus, beads coated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies (culture of 3 days) (Figure 17A) or recovery antigen, tuberculin PPD (culture of days) (Figure 17B).

[00118] A ativação foi medida pela absorção de timidina tritiada pela proliferação de células nas últimas 24 horas de cultura. Os dados não mostram nenhuma mudança na resposta ao mitógeno ou antígeno de recall ao longo das 12 semanas do experimento clínico. Isso indica que a SEQ ID NO: 3 não tem efeito imunossupressor geral, diferente da SEQ ID NO: 1 que já foi publicada como reduzindo a resposta do antígeno de recall a tuberculina PPD (Corrigall VM, Bodman-Smith MD, Brunst M, Cornell H, Panayi GS. A proteína de tensão, BiP, estimula as células mononucleares do sangue periférico humano a expressarem um perfil de citocinas anti-inflamatórias e a inibir a função das células apresenta- doras de antígeno: relevância para o tratamento da artrite inflamatória. Arthritis Rhneum 2004; 50: 1167-1171). Exemplo 8: Transplante; Modelo de camundongo de enxertos de pele[00118] Activation was measured by the absorption of thymidine tritiated by the proliferation of cells in the last 24 hours of culture. The data show no change in response to the recalled mitogen or antigen over the 12 weeks of the clinical trial. This indicates that SEQ ID NO: 3 has no general immunosuppressive effect, unlike SEQ ID NO: 1 which has already been published as reducing the response of the recall antigen to tuberculin PPD (Corrigall VM, Bodman-Smith MD, Brunst M, Cornell H, Panayi GS The strain protein, BiP, stimulates human peripheral blood mononuclear cells to express an anti-inflammatory cytokine profile and to inhibit the function of antigen presenting cells: relevance for the treatment of inflammatory arthritis. Arthritis Rhneum 2004; 50: 1167-1171). Example 8: Transplantation; Mouse model of skin grafts

[00119] A Figura 18 mostra uma representação esquemática do pro- tocolo e resultados de um experimento de transplante de pele de mu- rino: Todos os camundongos receptores foram administrados com anti- corpo anti-CD8 para esgotar células dendríticas endógenas oito dias an- tes do transplante. Havia 6 ratos em cada um dos quatro grupos. Sete dias antes do transplante, os camundongos de controle receberam ape- nas veículo. SEQ ID NO: 3 (20ug / camundongo) foi administrada por via intravenosa. Dois outros grupos receberam células dendríticas plas- mocitoides imaturas ou maduras de camundongos compatíveis com H2Kb. Após 1 semana, pequenos pedaços de pele da cauda de camun- dongos incompatíveis com H2Kd foram transplantados para as costas dos camundongos receptores.[00119] Figure 18 shows a schematic representation of the protocol and results of a muzzle skin transplantation experiment: All recipient mice were administered anti-CD8 antibodies to deplete endogenous dendritic cells eight days before transplant. There were 6 rats in each of the four groups. Seven days before transplantation, control mice received only vehicle. SEQ ID NO: 3 (20ug / mouse) was administered intravenously. Two other groups received immature or mature plasmacytoid dendritic cells from mice compatible with H2Kb. After 1 week, small pieces of skin from the mice tail incompatible with H2Kd were transplanted to the back of the recipient mice.

[00120] Análise de sobrevivência por gráfico Kaplan Meier mostra que a SEQ ID NO: 3 estendeu a sobrevivência de 5/6 dos enxertos além da do grupo de controle com 50% dos enxertos sobrevivendo por apro- ximadamente 30% mais do que os enxertos de camundongos de con- trole.[00120] Survival analysis by Kaplan Meier chart shows that SEQ ID NO: 3 extended the survival of 5/6 of the grafts beyond that of the control group with 50% of the grafts surviving by approximately 30% more than the grafts control mice.

[00121] Os dados apresentados mostram que a SEQ ID NO: 3 é efi- caz na manutenção da sobrevivência do enxerto no modelo de camun- dongo de enxertos de pele, um modelo considerado altamente difícil de manter a sobrevivência do enxerto.[00121] The data presented show that SEQ ID NO: 3 is effective in maintaining graft survival in the mouse model of skin grafts, a model considered highly difficult to maintain graft survival.

[00122] Um segundo experimento exploratório de transplante tam- bém foi realizado (ver Figura 19). Novamente, a administração de SEQ ID NO: 3 leva a uma sobrevivência mais longa de enxertos de pele em comparação com aqueles animais que receberam células dendríticas modificadas (DC). Mistura da administração de DC com SEQ ID NO: 3 não foi benéfica. Exemplo 9: Afrouxamento da articulação protética[00122] A second exploratory transplantation experiment was also carried out (see Figure 19). Again, administration of SEQ ID NO: 3 leads to longer skin graft survival compared to those animals that received modified dendritic cells (DC). Mixing DC administration with SEQ ID NO: 3 was not beneficial. Example 9: Loosening of the prosthetic joint

[00123] No afrouxamento da prótese, o tecido que se desenvolve ao redor das articulações protéticas, o tecido periprotético, é muito seme- lhante à membarna sinovial que fica inflamada duarnte AR. Esse tecido pode causar afrouxamento da articulação protética. O tecido periproté- tico (PPT) foi coletado durante a cirurgia de revisão para substituições de articulação protética. O tecido foi cortado em pequenos pedaços de igual peso e cultivado durante a noite em meio de cultura de tecidos (1 ml) em placas de vinte e quatro poços na presença ou ausência de SEQ ID NO: 3. Os sobrenadantes da cultura foram coletados entre 24h-72h e TNFa, pró-inflamatório, ou interleucina-10, anti-inflamatório, as citoci- nas foram quantificadas por ensaio imunoenzimático de enzima comer- cial (ELISA) (PharMingen, BD, Oxford, Reino Unido).[00123] In loosening the prosthesis, the tissue that develops around the prosthetic joints, the periprosthetic tissue, is very similar to the synovial limb that becomes inflamed during RA. This tissue can cause loosening of the prosthetic joint. The periprosthetic tissue (PPT) was collected during the revision surgery for prosthetic joint replacements. The tissue was cut into small pieces of equal weight and grown overnight in tissue culture medium (1 ml) in twenty-four well plates in the presence or absence of SEQ ID NO: 3. Culture supernatants were collected between 24h-72h and TNFa, pro-inflammatory, or interleukin-10, anti-inflammatory, cytokines were quantified by immunoenzymatic commercial enzyme assay (ELISA) (PharMingen, BD, Oxford, United Kingdom).

[00124] A Figura 20 mostra que embora a proteína da invenção tenha pouco efeito na produção de TNFa, IL-10 foi notavelmente aumentada.[00124] Figure 20 shows that although the protein of the invention has little effect on the production of TNFα, IL-10 has been markedly increased.

[00125] Os dados fornecidos pelos inventores demonstram que a SEQ ID NO: 3 tem um efeito anti-inflamatório significativo. Isso indica que a SEQ ID NO: 3 pode ser usada para tratar doenças inflamatórias do intestino, por exemplo, doença de Crohn.[00125] The data provided by the inventors demonstrate that SEQ ID NO: 3 has a significant anti-inflammatory effect. This indicates that SEQ ID NO: 3 can be used to treat inflammatory bowel diseases, for example, Crohn's disease.

Exemplo 10Example 10

[00126] As Tabelas4 e 5 resumem as diferenças físicas e funcionais entre a proteína da invenção, SEQ ID NO: 1 e BiP nativa. Isto resume claramente as diferenças significativas entre a proteína da invenção, a BiP SEQ ID NO: 1 recombinante publicada anteriormente e a proteína nativa.[00126] Tables 4 and 5 summarize the physical and functional differences between the protein of the invention, SEQ ID NO: 1 and native BiP. This clearly summarizes the significant differences between the protein of the invention, the previously published recombinant BiP SEQ ID NO: 1 and the native protein.

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Claims

1. Isolated or recombinant protein, characterized by the fact that it consists of the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3 or SEQ ID: NO: 4.

2. Isolated or recombinant protein according to claim 1, characterized by the fact that it comprises endotoxin impurities in an amount of less than 50 units of endotoxin per mg of protein, optionally less than 25 units of endotoxin per mg of protein or less than 2 Endotoxin Units per mg of protein.

3. Isolated or recombinant protein, according to claim 1 or 2, characterized by the fact that the protein is not glycosylated.

4. Isolated or recombinant nucleic acid molecule, characterized by the fact that it encodes a recombinant protein consisting of the amino acid sequence according to SEQ ID: NO. 4.

5. Isolated or recombinant nucleic acid molecule according to claim 4, characterized in that it consists of the nucleic acid sequence according to SEQ ID: NO 8.

6. Recombinant vector, characterized by the fact that it comprises the nucleic acid molecule, as defined in claim 4 or 5.

7. Isolated or recombinant protein, according to claim 1 or 2, characterized by the fact that it is for use in medicine or veterinary medicine.

8. Isolated or recombinant protein, according to claim 1 or 2, characterized by the fact that it is for use in the treatment and / or prevention of an inflammatory condition, optionally, in a human subject.

9. Isolated or recombinant protein, according to claim 8, for use, as defined in claim 8, characterized by the fact that the treatment and / or prevention of an inflammatory condition is achieved without significant immunosuppression.

10. Isolated or recombinant protein, according to claim 8, for use, as defined in claim 9, characterized by the fact that the treatment and / or prevention of an inflammatory condition is achieved without significant immunosuppression as measured by T-lymphocyte activity in relation to activity before protein administration.

11. Isolated or recombinant protein according to any one of claims 8 to 10, for use, as defined in any one of claims 8 to 10, characterized by the fact that the inflammatory condition is selected from rheumatoid arthritis , psoriatic arthritis, juvenile idiopathic arthritis, ankylosing spondylitis, organ, skin, tissue, blood, serum, plasma or cell transplant rejection, or inflammatory bowel disease, such as Crohn's disease.

12. Isolated or recombinant protein, according to claim 11, for use, as defined in claim 10, characterized by the fact that the inflammatory condition is selected from rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis or juvenile idiopathic arthritis.

13. Isolated or recombinant protein, according to claim 1 or 2, characterized by the fact that it is for use in the treatment or prevention of disorders of bone metabolism dysregulation, optionally osteoporosis, bone loss, bone resorption , Paget's disease, bone cancer, breast cancer or bone loss associated with cancer.

14. Isolated or recombinant protein, according to claim 1 or 2, characterized by the fact that it is for use in the prevention of loosening of the prosthetic joint.

15. Isolated or recombinant protein according to any one of claims 8 to 14 for use, as defined in any one of claims 8 to 14, characterized by the fact that the use comprises administering the protein as a dose of 1 mga1g.

16. Pharmaceutical composition, characterized by the fact that it comprises the isolated or recombinant protein, as defined in any of the preceding claims and one or more pharmaceutically acceptable excipients, adjuvants or carriers.

17. Isolated or recombinant protein according to any one of claims 1 to 15, or pharmaceutical composition, as defined in claim 16, characterized by the fact that it is for use in humans.

18. Pharmaceutical composition according to claim 16 or 17, characterized by the fact that it comprises phosphate buffered saline at a pH of 7.2 to 7.6.

19. Pharmaceutical composition according to any one of claims 16 to 18, characterized in that it comprises the isolated or recombinant protein in an amount of 2.0 to 50.0 mg / ml.

20. Pharmaceutical composition according to claim 19, characterized by the fact that it comprises the isolated or recombinant protein in an amount of about 5.0 mg / mL.

21. Pharmaceutical composition according to any one of claims 16 to 20, characterized in that it is suitable for intravenous administration.

22. Method for treating and / or preventing a condition, as defined in any of the preceding claims, in a patient, characterized by the fact that it comprises the step of administering to a patient in need of the patient an effective amount of an isolated or recombinant protein, as defined in any of the preceding claims, or a pharmaceutical composition, as defined in any of claims 16 to 21.

23. Isolated or recombinant protein, isolated or recombinant protein for use, pharmaceutical composition or method, according to any of the preceding claims, characterized by the fact that the patient is still administered one or more therapeutic agents or when the peptides are provided in combination with one or more therapeutic agents.

24. Isolated or recombinant protein, isolated or recombinant protein for use, pharmaceutical composition or method, according to claim 23, characterized by the fact that the therapeutic agent is selected from disease-modifying agents, analgesics , anti-inflammatory agents, immunotherapeutic agents, antibiotics, antibodies and steroids.

25. Method for preparing a recombinant protein consisting of the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3, characterized by the fact that it comprises: a) transforming a microorganism with the recombinant vector, as defined in claim 6; b) cultivate the microorganism leading to the production of a protein, according to SEQ ID NO: 4; Cc) lyse microorganisms to release the protein; d) treating the lysate with a detergent to remove endotoxin; e) isolate and purify the protein using immobilized metal affinity chromatography, where the immobilized metal is cobalt; and f) contacting the purified protein with a diamino-peptidase enzyme, wherein the diaminopeptidase cleaves the histidine marker of the N-terminus of the protein; and g) separating the cleaved protein from the histidine marker.

26. Method according to claim 25, characterized by the fact that the microorganism is a bacterium, optionally Escherichia coli.

27. The method of claim 25 or 26, characterized in that the method comprises one or more additional steps for treating the protein with a detergent to remove endoxoxin.

28. Method according to any one of claims to 27, characterized in that the method is to produce a protein having less than 25 Units of Endotoxin per mg of protein, optionally less than 2 Units of Endotoxin per mg of protein.

29. Method according to any one of claims 25 to 28, characterized in that step g) is carried out using immobilized metal affinity chromatography, wherein the immobilized metal is cobalt.

30. Method according to claim 29, characterized in that the detergent is 1,1,3,3- (tetramethylbutyl) phenyl-polyethylene glycol.

31. Method according to any one of claims 25 to 30, characterized in that the method further comprises one or more stages of filtration, purification or concentration.

32. Method according to any one of claims 25 to 31, characterized in that the method does not include more than one freeze-thaw step.

33. Method according to any one of claims 25 to 32, characterized by the fact that the microorganism is grown in a medium free of products derived from animals.

34. Method for preparing a recombinant protein

consisting of the amino acid sequence according to SEQ ID NO: 3, characterized by the fact that it comprises the use of non-bacterial host cells.

35. Method according to claim 34, characterized by the fact that the protein is produced using cells derived from yeast, insect or fungus.

36. Method according to claim 34, characterized in that the protein is produced using mammalian cells.