RU2778402C2 - Pharmaceutical composition containing apl type peptide - Google Patents
Pharmaceutical composition containing apl type peptide Download PDFInfo
- Publication number
- RU2778402C2 RU2778402C2 RU2020124953A RU2020124953A RU2778402C2 RU 2778402 C2 RU2778402 C2 RU 2778402C2 RU 2020124953 A RU2020124953 A RU 2020124953A RU 2020124953 A RU2020124953 A RU 2020124953A RU 2778402 C2 RU2778402 C2 RU 2778402C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- peptide
- pharmaceutical composition
- disease
- patients
- citrullination
- Prior art date
Links
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 210000000440 Neutrophils Anatomy 0.000 claims abstract description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 206010039073 Rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 30
- 200000000018 inflammatory disease Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 206010001897 Alzheimer's disease Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 206010002556 Ankylosing spondylitis Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 208000005069 Pulmonary Fibrosis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 230000000087 stabilizing Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108009000252 Lung fibrosis Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 14
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 13
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 9
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 claims description 9
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N Trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 8
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003042 antagnostic Effects 0.000 claims description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 2
- 230000003110 anti-inflammatory Effects 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 19
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 21
- 108010052500 Calgranulin A Proteins 0.000 description 8
- 102000018803 Calgranulin A Human genes 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108010052495 Calgranulin B Proteins 0.000 description 5
- 102000018755 Calgranulin B Human genes 0.000 description 5
- 206010011401 Crohn's disease Diseases 0.000 description 5
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 5
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 5
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 5
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 4
- 101710006484 HSPA14 Proteins 0.000 description 4
- 101710013836 HSPD1 Proteins 0.000 description 4
- 102100003681 HSPD1 Human genes 0.000 description 4
- 101710022862 Hsp60A Proteins 0.000 description 4
- 102000001235 Protein-arginine deiminases Human genes 0.000 description 4
- 108060006632 Protein-arginine deiminases Proteins 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000010228 ex vivo assay Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101700057149 hsp60 Proteins 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003246 Arthritis Diseases 0.000 description 3
- 210000003743 Erythrocytes Anatomy 0.000 description 3
- 210000001723 Extracellular Space Anatomy 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 102000001109 Leukocyte L1 Antigen Complex Human genes 0.000 description 3
- 108010069316 Leukocyte L1 Antigen Complex Proteins 0.000 description 3
- 102000035443 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic Effects 0.000 description 3
- 230000004059 degradation Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 3
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 3
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 3
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 2
- 108090000206 Autoantibodies Proteins 0.000 description 2
- 102000003852 Autoantibodies Human genes 0.000 description 2
- 206010071155 Autoimmune arthritis Diseases 0.000 description 2
- 210000003719 B-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 2
- 210000000845 Cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 2
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102100010215 ENO1 Human genes 0.000 description 2
- 101700068129 ENO1 Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 229940012952 Fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 229940019698 Fibrinogen containing hemostatics Drugs 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 210000003714 Granulocytes Anatomy 0.000 description 2
- 206010019668 Hepatic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 210000002997 Osteoclasts Anatomy 0.000 description 2
- 210000003819 Peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007759 RPMI Media 1640 Substances 0.000 description 2
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 2
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 231100000494 adverse effect Toxicity 0.000 description 2
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 2
- 230000002489 hematologic Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- 230000002148 osteoclast Effects 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 231100000247 serious adverse effect Toxicity 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-NJFSPNSNSA-N (18)O Chemical compound [18O] QVGXLLKOCUKJST-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- DPFYBZWSVVKNPZ-AQWIXGDGSA-N (3S,4S,6R)-2-[[(2R,4R,5R)-3,5-dihydroxy-4-methoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]methoxymethyl]-6-ethyloxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)C(O)[C@@H](CC)OC1COC[C@@H]1C(O)[C@H](OC)[C@H](O)C(COC)O1 DPFYBZWSVVKNPZ-AQWIXGDGSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N Ala-Asn Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC(N)=O CCUAQNUWXLYFRA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 201000002428 Alzheimer's disease 2 Diseases 0.000 description 1
- 108010047814 Antigen-Antibody Complex Proteins 0.000 description 1
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MQLZLIYPFDIDMZ-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O MQLZLIYPFDIDMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBKIFHUVGLOJKT-UHFFFAOYSA-N Asparaginyl-Threonine Chemical compound CC(O)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(N)=O VBKIFHUVGLOJKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 210000003483 Chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 210000000172 Cytosol Anatomy 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 210000002744 Extracellular Matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229960002743 Glutamine Drugs 0.000 description 1
- ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N Glutaminyl-Leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(N)=O ARPVSMCNIDAQBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036499 Half live Effects 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 206010022114 Injury Diseases 0.000 description 1
- 210000001503 Joints Anatomy 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 210000000265 Leukocytes Anatomy 0.000 description 1
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 210000001616 Monocytes Anatomy 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 229940082622 Prostaglandin cardiac therapy preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940077717 Prostaglandin drugs for peptic ulcer and gastro-oesophageal reflux disease (GORD) Drugs 0.000 description 1
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 1
- 102000014128 RANK Ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010025832 RANK Ligand Proteins 0.000 description 1
- BXLYSRPHVMCOPS-UHFFFAOYSA-N Serinyl-Isoleucine Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CO BXLYSRPHVMCOPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 210000001179 Synovial Fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000001258 Synovial Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108091008153 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N Tyr-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AOLHUMAVONBBEZ-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001508 asparagines Chemical class 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 description 1
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001951 carbamoylamino group Chemical group C(N)(=O)N* 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic Effects 0.000 description 1
- 231100000749 chronicity Toxicity 0.000 description 1
- 108091005991 citrullinated proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cells Anatomy 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 1
- 238000005137 deposition process Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 238000010201 enrichment analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000037320 fibronectin Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N gly ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 108091005593 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000002314 neuroinflammatory Effects 0.000 description 1
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 1
- 230000011242 neutrophil chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics Prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutic aid Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O XPFJYKARVSSRHE-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 201000006704 ulcerative colitis Diseases 0.000 description 1
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly Effects 0.000 description 1
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N β-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности, к фармацевтической композиции, содержащей модифицированный пептид APL-типа (измененный пептидный лиганд, сокращенно APL). Введение этой композиции пациентам уменьшает явления, связанные с цитруллинированием белков. Эта композиция может быть использована для лечения воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (РА), анкилозирующий спондилит (АС), ювенильный идиопатический артрит (ЮИА), фиброз печени и болезнь Альцгеймера.The present invention relates to the field of medicine, in particular to a pharmaceutical composition containing a modified APL-type peptide (modified peptide ligand, abbreviated as APL). The introduction of this composition to patients reduces the phenomena associated with protein citrullination. This composition can be used to treat inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis (RA), ankylosing spondylitis (AS), juvenile idiopathic arthritis (JIA), liver fibrosis and Alzheimer's disease.
Предшествующий уровень техникиPrior Art
Цитруллинирование представляет собой посттрансляционную модификацию белков, которая превращает группу гуанидина (положительный заряд) из аргинина в цитруллинированную (нейтральную) группу уреидо. Ферменты пептидил-аргинин деиминаз (PAD) катализируют эту трансформацию (Bicker K. L., Thompson P. R. 2013, Biopolymers, 99: 155-163). При РА основными источниками цитруллинированных аутоантигенов являются воздействие агентов окружающей среды, вызывающих заболевание, и нетоз нейтрофилов. Нетоз представляет собой запрограммированную гибель клеток, при которой происходит разрыв плазматической мембраны, связанный с изменением ядерной морфологии нейтрофилов. При высвобождении из цитоплазматического содержимого нейтрофилов во внеклеточное пространство образуется матрица хроматина, обогащенная антимикробными белковыми гранулами и ферментами, так называемые внеклеточные ловушки нейтрофилов. В этом процессе высвобождаются ферменты PAD и цитруллинированные гистоны H3, которые становятся сильными аутоантигенами (Konig MF, Andrade F. 2016. Front Immunol 7: 461) и усиливают воспалительный ответ синовиальных фибробластов, которые проникают в хрящ. В то же время агенты окружающей среды, которые индуцируют РА, вызывают апоптоз и гибель вследствие некроза клеток, которые образуют внеклеточный матрикс. Некротические клетки выделяют свое цитоплазматическое содержимое во внеклеточное пространство. Во время данного процесса также высвобождаются ферменты PAD, которые активируются благодаря уровням кальция во внеклеточном пространстве и вызывают цитруллинирование собственных белков.Citrullination is a post-translational modification of proteins that converts the guanidine (positive charge) group from arginine to the citrullinated (neutral) ureido group. Peptidyl-arginine deiminases (PAD) enzymes catalyze this transformation (Bicker K. L., Thompson P. R. 2013, Biopolymers, 99: 155-163). In RA, the main sources of citrullinated self-antigens are exposure to disease-causing environmental agents and neutrophil netosis. Netosis is a programmed cell death in which there is a rupture of the plasma membrane associated with a change in the nuclear morphology of neutrophils. When neutrophils are released from the cytoplasmic contents into the extracellular space, a chromatin matrix is formed, enriched with antimicrobial protein granules and enzymes, the so-called extracellular traps of neutrophils. In this process, PAD enzymes and citrullinated H3 histones are released, which become strong autoantigens (Konig MF, Andrade F. 2016. Front Immunol 7: 461) and enhance the inflammatory response of synovial fibroblasts that infiltrate cartilage. At the same time, environmental agents that induce RA induce apoptosis and death due to necrosis of cells that form the extracellular matrix. Necrotic cells release their cytoplasmic contents into the extracellular space. During this process, PAD enzymes are also released, which are activated due to calcium levels in the extracellular space and cause citrullination of their own proteins.
Нетоз нейтрофилов также связан с патогенезом АС и ЮИА (Giaglis S et al., 2016. Front, Pediatr, 4:97). В то же время нетоз может усугублять нейровоспалительные процессы, способствуя повреждению сосудов в паренхиме у пациентов с болезнью Альцгеймера (Pietronigro EC et al., 2017. Front Immunol 8: 211). Кроме того, нетоз представляет собой биологический процесс, который способствует развитию фиброза в различных тканях, таких как ткани легких и печени, связанных с цитруллинированием виментина (Branzk N, Papayannopoulos V. Seminars in Immunopathology, 2013; 35 (4): 513-530).Neutrophil netosis is also associated with the pathogenesis of AS and JIA (Giaglis S et al., 2016. Front, Pediatr, 4:97). At the same time, netosis can exacerbate neuroinflammatory processes, contributing to vascular damage in the parenchyma in patients with Alzheimer's disease (Pietronigro EC et al., 2017. Front Immunol 8: 211). In addition, netosis is a biological process that promotes the development of fibrosis in various tissues such as lung and liver tissues associated with vimentin citrullination (Branzk N, Papayannopoulos V. Seminars in Immunopathology, 2013; 35 (4): 513-530) .
В частности, было описано несколько белков, при РА являющихся мишенями цитруллинирования, среди которых фибриноген, кератин, фибронектин, виментин, коллаген II типа и α-энолаза (McInnes IB, Schett G. 2011 N Engl J Med. 365 (23): 2205-2219). В то же время было обнаружено, что цитруллинирование виментина вносит значительный вклад в патогенез АС, ЮИА, печеночного и легочного фиброза и болезни Альцгеймера (S. Gudmann et al., 2015. Autoimmunity 48: 73-79).In particular, several proteins have been described that are targets of citrullination in RA, including fibrinogen, keratin, fibronectin, vimentin, type II collagen, and α-enolase (McInnes IB, Schett G. 2011 N Engl J Med. 365 (23): 2205 -2219). At the same time, vimentin citrullination was found to significantly contribute to the pathogenesis of AS, JIA, hepatic and pulmonary fibrosis, and Alzheimer's disease (S. Gudmann et al., 2015. Autoimmunity 48: 73-79).
На фоне прогрессии РА B-клетки пролиферируют и дифференцируются в клетки, секретирующие антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП), после взаимодействия с T-клетками-хелперами, активированными цитруллинированными пептидами. АЦЦП обнаруживаются у 50% пациентов, приблизительно за год до появления РА. Исследования на животных моделях предполагают, что миграция этих аутоантител из внесуставных участков к синовиальной оболочке вызывает воспаление суставов. Кроме того, присутствие АЦЦП в синовиальной оболочке является фактором риска развития для этого заболевания, поскольку эти аутоантитела распознают молекулы цитруллинированного виментина и индуцируют дифференцировку мононуклеарных клеток в остеокласты, которые способствуют рассасыванию и разрушению кости (Martin-Mola E. et al 2016. Rheumatol Int. 36 (8): 1043-1063).Against the background of RA progression, B cells proliferate and differentiate into cells secreting anti-cyclic citrullinated peptide antibodies (ACCP) after interacting with T-helper cells activated by citrullinated peptides. ACCPs are found in 50% of patients, approximately one year before the onset of RA. Animal model studies suggest that the migration of these autoantibodies from extra-articular sites to the synovium causes joint inflammation. In addition, the presence of ACCP in the synovial membrane is a risk factor for the development of this disease, since these autoantibodies recognize citrullinated vimentin molecules and induce the differentiation of mononuclear cells into osteoclasts, which promote bone resorption and destruction (Martin-Mola E. et al 2016. Rheumatol Int. 36 (8): 1043-1063).
Фактором, который вносит заметный вклад в патогенез РА, является активация нейтрофилов иммунными комплексами, откладывающимися в синовиальной жидкости или на поверхности хряща (Rollet-Labelle E. et al., 2013. J Inflamm (Lond). 1): 27). Нейтрофилы индуцируют синтез и высвобождение цитотоксических продуктов (простагландинов, протеаз и свободных кислородных радикалов), которые серьезно повреждают сустав. Нейтрофилы управляют воспалительным процессом с помощью четырех механизмов: (1) секреции цитокинов и хемокинов, включая IL-23, IL-12, RANKL (лиганд рецептора-активатора ядерного фактора-κB) и IL-18, которые вызывают активацию остеокластов и В-лимфоцитов; (2) повышенной экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости класса II; (3) межклеточных взаимодействий, которые вызывают активацию других типов клеток, которые разрушают сустав; и (4) высвобождения протеаз, которые активируют или инактивируют цитокины и хемокины, участвующие в повреждении суставов (Wright H. L et al. (2014. Nat Rev Rheumatol.10 (10): 593-601).A factor that makes a significant contribution to the pathogenesis of RA is the activation of neutrophils by immune complexes deposited in the synovial fluid or on the cartilage surface (Rollet-Labelle E. et al., 2013. J Inflamm (Lond). 1): 27). Neutrophils induce the synthesis and release of cytotoxic products (prostaglandins, proteases, and free oxygen radicals) that severely damage the joint. Neutrophils control inflammation through four mechanisms: (1) secretion of cytokines and chemokines, including IL-23, IL-12, RANKL (nuclear factor-κB activator receptor ligand) and IL-18, which induce osteoclast and B-lymphocyte activation ; (2) increased expression of major histocompatibility complex class II molecules; (3) intercellular interactions that cause the activation of other cell types that destroy the joint; and (4) release of proteases that activate or inactivate cytokines and chemokines involved in joint damage (Wright H. L et al. (2014. Nat Rev Rheumatol. 10 (10): 593-601).
Нейтрофилы имеют короткий период полужизни, приблизительно от 30 мин до 8 ч. Белки S100A8/9 представляют 40% белков в цитозоле этих клеток; этот комплекс индуцирует запрограммированную клеточную гибель нейтрофилов (M Atallah, et al., 2012. PLoS ONE 7: 2 (e29333). S100A8 и S100A9 обычно находятся в комплексе, известном как кальпротектин; как S100A8, так и S100A9, и кальпротектин вызывают хемотаксис нейтрофилов в очень низких концентрациях (наномолярный диапазон). Кальпротектин (S100A8/9) обнаруживается в высоких концентрациях в очагах локального воспаления или в сыворотке пациентов с воспалительными заболеваниями, такими как РА, фиброз и болезнь Крона (Cerezo, L. et al. 2011. Arthritis Res. Ther. 13 (4): R122).Neutrophils have a short half-life, approximately 30 minutes to 8 hours. S100A8/9 proteins represent 40% of the proteins in the cytosol of these cells; this complex induces programmed neutrophil cell death (M Atallah, et al., 2012. PLoS ONE 7:2 (e29333). S100A8 and S100A9 are commonly found in a complex known as calprotectin; both S100A8 and S100A9 and calprotectin induce neutrophil chemotaxis at very low concentrations (nanomolar range) Calprotectin (S100A8/9) is found at high concentrations in localized inflammation or in the serum of patients with inflammatory diseases such as RA, fibrosis and Crohn's disease (Cerezo, L. et al. 2011. Arthritis Res. Ther. 13 (4): R122).
Cohen и Monsonego в заявке на патент No. WO2009090650 заявили о применении для лечения болезни Альцгеймера пептида, полученного из HSP60, в комбинации с β-амилоидным белком. Указанный пептид содержит последовательность аминокислот 458-474 HSP60. Другие авторы показали использование для лечения болезни Альцгеймера малых пептидов, которые также предотвращают агрегацию β-амилоидного белка (P Sundaram et al., Patents on Potential Drugs to Treat Alzheimer's Disease: Special Emphasis on Small Peptides, 2014. 9: 71-75). В заявке на патент No. PCT/IL2003/000132 для лечения различных заболеваний, хронических воспалений, среди которых упоминается легочный фиброз заявлено использование пептида p277, полученного из HSP60, который способен модулировать активность Т-клеток посредством TLR 2 типа. В заявке на патент WO2006032216 заявлен пептид APL-типа, идентифицированный в списке последовательностей как Seq ID No. 1; и его использование при лечении РА. В то же время в патенте EP2374468 раскрыто применение указанного пептида при лечении болезни Крона, язвенного колита и сахарного диабета I типа.Cohen and Monsonego in patent application no. WO2009090650 claims the use of a peptide derived from HSP60 in combination with an amyloid-β protein for the treatment of Alzheimer's disease. Said peptide contains the amino acid sequence 458-474 of HSP60. Other authors have shown the use of small peptides in the treatment of Alzheimer's disease, which also prevent β-amyloid protein aggregation (P Sundaram et al., Patents on Potential Drugs to Treat Alzheimer's Disease: Special Emphasis on Small Peptides, 2014. 9: 71-75). In patent application no. PCT/IL2003/000132 for the treatment of various diseases, chronic inflammation, among which pulmonary fibrosis is mentioned, the use of the p277 peptide derived from HSP60, which is able to modulate the activity of T cells through TLR type 2, is claimed. Patent application WO2006032216 claims an APL-type peptide identified in the sequence listing as Seq ID No. one; and its use in the treatment of RA. At the same time, patent EP2374468 discloses the use of said peptide in the treatment of Crohn's disease, ulcerative colitis and type I diabetes mellitus.
В настоящее время не существует эффективных методов лечения, вызывающих снижение уровней АЦЦП, нетоза и биологического процесса цитруллинирования белков. Также не существует эффективного лечения аутоиммунного артрита, например РА, ЮИА и АС, или других заболеваний, которые также характеризуются цитруллинированием собственных белков, таких как болезнь Альцгеймера и фиброз печени и легких. Таким образом, все еще представляет интерес получить лекарственные средства, которые обладают терапевтическими преимуществами по сравнению с лекарственными средствами, которые существуют при лечении этого типа заболеваний.Currently, there are no effective treatments that cause a decrease in the levels of ACCP, netosis and the biological process of protein citrullination. There is also no effective treatment for autoimmune arthritis, such as RA, JIA, and AS, or other diseases that are also characterized by self-protein citrullination, such as Alzheimer's disease and liver and lung fibrosis. Thus, it is still of interest to obtain drugs that have therapeutic advantages over drugs that exist in the treatment of this type of disease.
Объяснение изобретенияExplanation of the invention
Настоящее изобретение решает вышеупомянутую проблему, поскольку оно относится к фармацевтической композиции, содержащей пептид APL-типа, идентифицированный как SEQ ID No. 1, натрий-ацетатный буферный раствор со значением рН 3,9-7,7; и по меньшей мере один стабилизирующий сахар, выбранный из: сахарозы или трегалозы. Пептид, идентифицированный как Seq ID No. 1, получают из участка человеческого HSP60, содержащего от 83 до 109 аминокислот. Пептиды APL-типа подобны аналогам иммуногенных пептидов, но с одной или несколькими заменами в положениях, существенных для контакта с Т-клеточным рецептором или с главным комплексом гистосовместимости класса II, который модифицирует каскад явлений, необходимых для активации Т-клеток. Концентрации этого пептида в фармацевтической композиции по настоящему изобретению обеспечивают эффективный иммунный ответ у хозяина.The present invention solves the above problem since it relates to a pharmaceutical composition containing an APL-type peptide identified as SEQ ID No. 1, sodium acetate buffer solution with a pH value of 3.9-7.7; and at least one stabilizing sugar selected from: sucrose or trehalose. The peptide identified as Seq ID No. 1 is derived from a region of human HSP60 containing 83 to 109 amino acids. APL-type peptides are similar to immunogenic peptide analogues, but with one or more substitutions at positions essential for contact with the T-cell receptor or major histocompatibility complex class II, which modifies the cascade of events required for T-cell activation. The concentrations of this peptide in the pharmaceutical composition of the present invention provide an effective immune response in the host.
Пептид Seq ID No. 1 получают путем химического синтеза. Уровень и качество вызванного им иммунного ответа можно оценить в экспериментах, подобных тем, которые описаны в настоящем изобретении. В примере этого изобретения пептид находится в концентрации от 0,5 мг/мл до 10 мг/мл в фармацевтической композиции, натрий-ацетатный буферный раствор имеет концентрацию от 30 до 70 мМ. В то время как концентрация стабилизирующего сахара в примере по этому изобретению находится в диапазоне от 10 до 40 мг/мл.Peptide Seq ID No. 1 is obtained by chemical synthesis. The level and quality of the immune response caused by it can be assessed in experiments similar to those described in the present invention. In an example of this invention, the peptide is at a concentration of 0.5 mg/ml to 10 mg/ml in a pharmaceutical composition, the sodium acetate buffer solution is at a concentration of 30 to 70 mM. While the concentration of stabilizing sugar in the example of this invention is in the range of 10 to 40 mg/ml.
Фармацевтическая композиция по этому изобретению отличается своей высокой стабильностью и безопасностью. Это было подтверждено во время обследования пациентов. Фармацевтическая композиция хорошо переносилась. Ни у одного пациента не было выявлено серьезных нежелательных явлений, и не были изменены биохимические или гематологические параметры. Эти результаты были неожиданными, принимая во внимание, что значение рН состава составляет приблизительно 4,0; или далеко от физиологических значений рН. В аналогичных составах других соединений, где значения рН далеки от физиологических значений рН, наблюдались нежелательные явления в месте инъекции, такие как чувствительность и боль. В варианте осуществления этого изобретения композиция, которая вводится пациентам, представляет собой жидкость или лиофилизат.The pharmaceutical composition according to this invention is distinguished by its high stability and safety. This was confirmed during the examination of patients. The pharmaceutical composition was well tolerated. None of the patients experienced serious adverse events and no biochemical or hematological parameters were altered. These results were unexpected considering that the pH of the formulation is approximately 4.0; or far from physiological pH values. In similar formulations of other compounds, where pH values are far from physiological pH values, adverse effects at the injection site, such as sensitivity and pain, have been observed. In an embodiment of this invention, the composition that is administered to patients is a liquid or a lyophilisate.
В настоящем изобретении раскрыта способность фармацевтической композиции, содержащей пептид, идентифицированный как Seq ID No. 1, вспомогательное вещество сахарозу или трегалозу, и натрий-ацетатный буферный раствор со значением рН от 3,9 до 4,7, к снижению процентного содержания нейтрофилов, нетоза и уровней АЦЦП. Эти патогенные явления участвуют в развитии РА, ЮИА, АС, болезни Альцгеймера и фиброза. Фармацевтическая композиция, описанная выше, значительно снижала количество нейтрофилов в анализах ex vivo, проводимых с клетками, полученными от пациентов с этими заболеваниями.The present invention discloses the ability of a pharmaceutical composition containing a peptide identified as Seq ID No. 1, the excipient sucrose or trehalose, and sodium acetate buffer solution with a pH value of 3.9 to 4.7, to reduce the percentage of neutrophils, netosis and levels of ACCP. These pathogenic phenomena are involved in the development of RA, JIA, AS, Alzheimer's disease and fibrosis. The pharmaceutical composition described above significantly reduced the number of neutrophils in ex vivo assays performed on cells obtained from patients with these diseases.
Неожиданным образом, этот фармацевтический препарат также значительно снижал уровни антител к циклическому цитруллинированному пептиду (анти-ЦЦП) в группе пациентов с РА, которых лечили этим препаратом. Кроме того, пептид снижал уровни белков S100A9 и S100A8 в анализах ex vivo, проводимых с мононуклеарными клетками, полученными от пациентов с РА.Surprisingly, this pharmaceutical also significantly reduced anti-cyclic citrullinated peptide (anti-CCP) antibody levels in a group of RA patients treated with this drug. In addition, the peptide reduced the levels of S100A9 and S100A8 proteins in ex vivo assays performed with mononuclear cells derived from RA patients.
Следовательно, другим аспектом этого изобретения является применение указанной фармацевтической композиции для изготовления лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания, связанного с увеличением нейтрофилов или цитруллинированием белков. Использование антиген-специфических стратегий, которые регулируют усиленный иммунный ответ с последующим снижением процесса цитруллинирования, характерного для этих заболеваний, представляет собой совершенно новый терапевтический подход. В варианте осуществления изобретения, композицию используют для получения лекарственного средства против воспалительного заболевания, которое выбрано из группы, состоящей из РА, ЮИА, АС, болезни Альцгеймера и фиброза печени и легких.Therefore, another aspect of this invention is the use of said pharmaceutical composition for the manufacture of a medicament for the treatment of an inflammatory disease associated with an increase in neutrophils or citrullination of proteins. The use of antigen-specific strategies that regulate an enhanced immune response followed by a reduction in the citrullination process characteristic of these diseases represents an entirely new therapeutic approach. In an embodiment of the invention, the composition is used to prepare a drug for an inflammatory disease, which is selected from the group consisting of RA, JIA, AS, Alzheimer's disease and liver and lung fibrosis.
Было высказано предположение, что пептид, идентифицированный как Seq ID No. 1, может быть использован для лечения РА (Dominguez MC et al., 2011. Autoimmunity 44 (6): 471-482; Barberá A. et al., 2016. Cell Stress and Chaperones 21: 735-744). Однако нет никаких данных, позволяющих предположить, что конкретный состав этого пептида может быть использован для лечения воспалительных заболеваний, при которых увеличивается цитруллинирование белка и присутствуют антитела к цитруллинированным белкам.It has been suggested that the peptide identified as Seq ID No. 1 can be used to treat RA (Dominguez MC et al., 2011. Autoimmunity 44 (6): 471-482; Barberá A. et al., 2016. Cell Stress and Chaperones 21: 735-744). However, there is no data to suggest that a particular formulation of this peptide can be used to treat inflammatory diseases in which protein citrullination is increased and antibodies to citrullinated proteins are present.
В другом аспекте, изобретение относится к способу лечения воспалительного заболевания, связанного с увеличением количества нейтрофилов или цитруллинированием белков. Этот способ включает введение нуждающемуся субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению. В варианте осуществления изобретения, воспалительное заболевание выбрано из группы, состоящей из РА, ЮИА, болезни Альцгеймера (AD) и фиброза печени и легких.In another aspect, the invention relates to a method of treating an inflammatory disease associated with an increase in the number of neutrophils or protein citrullination. This method includes administering to a subject in need a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition of the invention. In an embodiment of the invention, the inflammatory disease is selected from the group consisting of RA, JIA, Alzheimer's disease (AD), and liver and lung fibrosis.
Эффективным количеством композиции является то количество, которое при введении приводит к снижению уровней анти-ЦЦП, антител к нетозу и, как следствие, цитруллинированию белков у пациентов. В ходе лечения количество вводимого пептида может изменяться в соответствии с определенными факторами, такими как возраст, пол, общее состояние здоровья, а также уровень иммунного ответа в целом.An effective amount of a composition is that amount which, when administered, results in a reduction in levels of anti-CCP, anti-netosis antibodies and, as a consequence, protein citrullination in patients. During treatment, the amount of peptide administered may vary according to certain factors such as age, sex, general health, and the level of the immune response in general.
В другом варианте осуществления изобретения, как часть способа, пациентам также вводят противовоспалительные лекарственные средства или антагонисты цитокинов. В конкретном варианте осуществления, в способе лечения воспалительных заболеваний фармацевтическая композиция, содержащая пептид APL-типа, является жидкой или лиофилизированной, которая растворяется для введения.In another embodiment of the invention, as part of the method, patients are also administered anti-inflammatory drugs or cytokine antagonists. In a specific embodiment, in a method for treating inflammatory diseases, the pharmaceutical composition containing the APL-type peptide is liquid or lyophilized, which is dissolved for administration.
В одном варианте осуществления фармацевтическую композицию вводят парентерально или через слизистую оболочку. В предпочтительном варианте осуществления, фармацевтическую композицию пептида вводят подкожно. В другом варианте осуществления, фармацевтическую композицию вводят перорально.In one embodiment, the pharmaceutical composition is administered parenterally or transmucosally. In a preferred embodiment, the peptide pharmaceutical composition is administered subcutaneously. In another embodiment, the pharmaceutical composition is administered orally.
Краткое описание фигурBrief description of the figures
Фиг. 1. Хроматографический профиль пептида APL-типа, идентифицированного как Seq ID No. 1, растворенного в концентрации 50 мМ в натрий-фосфатном буферном растворе; значение рН 7,4. Профиль был получен с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ), (А) время 0, (В) 15 сут хранения при температуре 37°С. Fig. 1. Chromatographic profile of an APL-type peptide identified as Seq ID No. 1, dissolved at a concentration of 50 mm in sodium phosphate buffer solution; pH value 7.4. The profile was obtained using reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), (A)
Фиг. 2. Оценка растворимости пептида, идентифицированного как Seq ID No. 1, в нескольких вспомогательных веществах, определенная с помощью ОФ-ВЭЖХ. Fig. 2. Estimation of the solubility of the peptide identified as Seq ID No. 1 in several excipients, determined by RP-HPLC.
Фиг. 3. Молекулярная эксклюзионная хроматография - ВЭЖХ пептида Seq ID No. 1, растворенного в воде (A), в фосфатно-солевой буферном растворе (PBS) (B) и в сахарозе (C). Fig. 3. Molecular size exclusion chromatography - HPLC of the peptide Seq ID No. 1 dissolved in water (A), in phosphate buffered saline (PBS) (B), and in sucrose (C).
Фиг. 4. Влияние значений pH на концентрацию пептида, идентифицированного как Seq ID No. 1, в образцах, составленных и хранящихся при температурах 4°C (A) и 37°C (B). Fig. 4. Effect of pH values on the concentration of the peptide identified as Seq ID No. 1 in samples prepared and stored at 4°C (A) and 37°C (B).
Фиг. 5. Влияние значений pH на чистоту пептида, идентифицированного как Seq ID No. 1, в образцах, составленных и хранящихся при температуре 37°C. Fig. 5. Effect of pH values on the purity of the peptide identified as Seq ID No. 1 in samples prepared and stored at 37°C.
Фиг. 6. Влияние фармацевтической композиции пептида на клеточную жизнеспособность нейтрофилов, полученных из периферической крови пациентов с АС. Клетки, культивируемые без стимуляции пептидом, являются отрицательным контролем. Fig. 6. Effect of the pharmaceutical composition of the peptide on the cell viability of neutrophils obtained from the peripheral blood of patients with AS. Cells cultured without peptide stimulation are negative controls.
Фиг. 7. Влияние введения фармацевтической композиции пептида на концентрацию анти-ЦЦП у пациентов с РА, получавших пептид. Звездочки указывают на статистически значимые различия между значениями, полученными в нулевой момент времени (без лечения) и в трех повторах. Fig. 7. Influence of the administration of the pharmaceutical composition of the peptide on the concentration of anti-CCP in patients with RA treated with the peptide. Asterisks indicate statistically significant differences between values obtained at time zero (no treatment) and triplicate.
Подробное описание примеровDetailed description of examples
Пример 1. Получение пептидного состава APL-типа для применения у людейExample 1 Preparation of an APL-type peptide formulation for use in humans
Пептид APL-типа получали путем химического синтеза. Было отмечено, что при растворении пептида, идентифицированного как Seq ID No. 1, в 50 мМ натрий-фосфатном буферном растворе; значение рН 7,4, пептид постепенно дестабилизируется. Для изучения причин такого эффекта пептид растворяли в этом буферном растворе и хранили при температуре 37°С в течение 15 сут. Затем несколько аликвот периодически анализировали с помощью ОФ-ВЭЖХ. Было проверено наличие загрязняющих молекул, они были очищены и проанализированы с помощью масс-спектрометрии, и было выявлено несколько фракций, которые могли бы соответствовать деградации.The APL-type peptide was obtained by chemical synthesis. It was noted that upon dissolution of the peptide identified as Seq ID No. 1, in 50 mM sodium phosphate buffer; pH value of 7.4, the peptide is gradually destabilized. To study the reasons for this effect, the peptide was dissolved in this buffer solution and stored at 37°C for 15 days. Several aliquots were then periodically analyzed by RP-HPLC. Contaminant molecules were checked for presence, purified and analyzed by mass spectrometry, and several fractions were identified that could correspond to degradation.
Чтобы ускорить деградацию, пептид инкубировали в стрессовых условиях, которые позволяют быстро и в высоких пропорциях получать возможные деградированные молекулы пептида. Фракции, собранные после ОФ-ВЭЖХ, характеризовали с помощью масс-спектрометрии. Хроматографический профиль интактного пептида в нулевой момент времени показан на Фиг. 1А. На Фиг. 1В показан профиль того же пептида после инкубации в течение 15 сут при температуре 37°С в вышеупомянутых условиях. После анализа с помощью масс-спектрометрии фракций, наблюдаемых на Фиг. 1В, было установлено, что фракции 1, 2 и 4 соответствуют дезамидированным вариантам пептида, в то время как фракция 3 соответствует интактному пептиду.In order to accelerate degradation, the peptide was incubated under stressful conditions, which allow the production of possible degraded peptide molecules quickly and in high proportions. Fractions collected after RP-HPLC were characterized by mass spectrometry. The chromatographic profile of the intact peptide at time zero is shown in FIG. 1A. On FIG. 1B shows the profile of the same peptide after incubation for 15 days at 37°C under the above conditions. After analysis by mass spectrometry of the fractions observed in FIG. 1B,
Пептид содержит четыре аспарагина, что объясняет полученные деамидированные молекулы, которые влияют на его стабильность при растворении в 50 мМ натрий-фосфатном буферном растворе; значение рН 7,4. Кроме того, пептид очень плохо растворим в данном буферном растворе, что затрудняет приготовление фармацевтического состава, который можно вводить пациентам в эффективной дозе. С учетом данных результатов перед приготовлением препарата были проведены исследования для получения стабильного фармацевтического продукта, содержащего пептид. Для достижения общей растворимости пептида и высокой химической стабильности оценивали разные ионные вещества, значения pH и вспомогательные вещества. Растворимость пептида оценивали с использованием различных вспомогательных веществ, которые включали разные ионные соли, сахара, полиолы, аминокислоты и детергенты.The peptide contains four asparagines, which accounts for the resulting deamidated molecules that affect its stability when dissolved in 50 mM sodium phosphate buffer; pH value 7.4. In addition, the peptide is very poorly soluble in this buffer solution, which makes it difficult to prepare a pharmaceutical composition that can be administered to patients in an effective dose. Taking into account these results, before preparing the preparation, studies were carried out to obtain a stable pharmaceutical product containing the peptide. Various ionic species, pH values and excipients were evaluated to achieve overall peptide solubility and high chemical stability. The solubility of the peptide was evaluated using various excipients, which included various ionic salts, sugars, polyols, amino acids and detergents.
Первый этап разработки состава включал оценку влияния группы буферных растворов и значений рН на химическую и физическую стабильность пептида. Пептид плохо растворим в натрий-фосфатном буферном растворе и очень плохо растворим в других ионных веществах, таких как цитрат натрия, глутамат натрия и трис-HCl. На Фиг. 2 показана растворимость пептида в некоторых оцениваемых вспомогательных веществах. Натрий-ацетатный буферный раствор, приготовленный с использованием уксусной кислоты и гидроксида натрия, лучше всего растворял пептид в концентрации в диапазоне от 10 до 70 мМ.The first stage of formulation development included evaluating the effect of a group of buffer solutions and pH values on the chemical and physical stability of the peptide. The peptide is poorly soluble in sodium phosphate buffer solution and very poorly soluble in other ionic substances such as sodium citrate, monosodium glutamate and tris-HCl. On FIG. 2 shows the solubility of the peptide in some of the excipients evaluated. A sodium acetate buffer solution prepared using acetic acid and sodium hydroxide best dissolved the peptide at a concentration in the range of 10 to 70 mM.
В то же время в Табл. 1 приведены результаты оценки растворимости пептида, приготовленного в концентрациях от 1 до 10 мг/мл, с различными типами фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ. Отмечено, что наибольшая растворимость пептида была получена в растворах сахарозы или трегалозы, затем в натрий-ацетатном буферном растворе. Другие вспомогательные вещества не стабилизировали исследуемый пептид таким же образом.At the same time, in Tab. 1 shows the results of the evaluation of the solubility of the peptide, prepared at concentrations from 1 to 10 mg/ml, with various types of pharmaceutically acceptable excipients. It was noted that the highest solubility of the peptide was obtained in solutions of sucrose or trehalose, then in a sodium acetate buffer solution. Other excipients did not stabilize the test peptide in the same way.
Таблица 1. Влияние оцениваемых вспомогательных веществ на растворимость пептидовTable 1. Influence of evaluated excipients on peptide solubility
Анализ пептида, растворенного в воде, в сахарозе (20 мг/мл) и в PBS, также проводили с помощью ВЭЖХ, которая показала влияние сахара на физическую стабильность пептида. В PBS пептид элюировали в течение более короткого времени удерживания, по сравнению с образцом, растворенным в воде и в растворе сахарозы. Это указывает на то, что PBS может способствовать взаимодействиям между мономерами пептида, поэтому в хроматографии он элюируется как агрегированный. Тем не менее, сахароза ингибирует взаимодействие между молекулами пептида, и в большинстве случаев элюируется как группа веществ с более длительным временем удерживания, которая может соответствовать мономеру пептида. Данный результат, который показан на Фиг. 3, подтверждает наилучший профиль растворимости пептида, полученный с помощью раствора сахарозы. Пептид, растворенный в воде, который используется в качестве контроля, также достигает хорошей растворимости. Однако он не представляет собой буферный раствор, который необходим для составления пептида при его использовании в качестве лекарственного средства.Analysis of the peptide dissolved in water, in sucrose (20 mg/ml) and in PBS was also performed by HPLC, which showed the effect of sugar on the physical stability of the peptide. In PBS, the peptide was eluted with a shorter retention time compared to the sample dissolved in water and sucrose solution. This indicates that PBS may promote interactions between peptide monomers, so it is eluted as aggregated in chromatography. However, sucrose inhibits the interaction between peptide molecules, and in most cases elutes as a group of substances with a longer retention time, which may correspond to the peptide monomer. This result, which is shown in Fig. 3 confirms the best peptide solubility profile obtained with the sucrose solution. The peptide dissolved in water, which is used as a control, also achieves good solubility. However, it is not a buffer solution, which is necessary for the formulation of the peptide when used as a drug.
Исходя из этих результатов, для дальнейших исследований пептид составляли в концентрации 2,5 мг/мл в 50 мМ натрий-ацетатном буферном растворе и анализировали влияние значения рН на химическую и физическую стабильность пептида в составе. Были проанализированы три значения рН: 3,0; 4,0 и 5,0. Образцы фильтровали и хранили при температуре 4°С или при температуре 37°С в течение 15 дней. Оценку стабильности и концентрации пептида проводили с помощью ОФ-ВЭЖХ. Результаты концентрации пептида, хранящегося при температурах 4°С или 37°С, показаны на Фиг. 4А и 4В соответственно. Пептид не растворяется полностью при значении рН 5,0, следовательно, его концентрация ниже, чем концентрации, полученные при значениях рН 3,0 или 4,0. При температуре 37°C процесс осаждения ускоряется. Со временем наблюдается снижение концентрации пептида при трех изученных значениях pH, причем этот эффект увеличивается в следующем порядке: pH 5,0 > pH 4,0 > pH 3,0. В этих анализируемых условиях физическая стабильность пептида была выше при значении рН 3,0.Based on these results, for further studies, the peptide was formulated at a concentration of 2.5 mg/ml in 50 mm sodium acetate buffer solution and analyzed the effect of pH on the chemical and physical stability of the peptide in the composition. Three pH values were analyzed: 3.0; 4.0 and 5.0. Samples were filtered and stored at 4°C or at 37°C for 15 days. The stability and concentration of the peptide was assessed using RP-HPLC. The concentration results of the peptide stored at 4°C or 37°C are shown in FIG. 4A and 4B, respectively. The peptide does not completely dissolve at pH 5.0, hence its concentration is lower than concentrations obtained at pH 3.0 or 4.0. At a temperature of 37°C, the deposition process is accelerated. Over time, a decrease in peptide concentration was observed at the three pH values studied, with this effect increasing in the following order: pH 5.0 > pH 4.0 > pH 3.0. Under these analyzed conditions, the physical stability of the peptide was higher at pH 3.0.
Химическая сохранность структуры пептида (выраженная в % чистоты в ОФ-ВЭЖХ) была выше 95% для образцов, составленных при трех значениях pH, когда они хранились при температуре 4°C в течение 15 сут. Однако когда образцы инкубировали при температуре 37°С, наблюдалась тенденция к снижению чистоты, которая была выше для образцов, составленных при значении рН 3,0. Эти результаты показаны на Фиг. 5, которая показывает, что значение pH 3,0 способствует химической деградации пептида.The chemical retention of the peptide structure (expressed as % purity in RP-HPLC) was above 95% for samples formulated at three pH values when stored at 4°C for 15 days. However, when the samples were incubated at 37° C., there was a downward trend in purity, which was higher for samples formulated at pH 3.0. These results are shown in FIG. 5 which shows that a pH value of 3.0 promotes chemical degradation of the peptide.
В соответствии с этими результатами был сделан вывод, что оптимальным составом является тот, где пептид находится в натрий-ацетатном буферном растворе с концентрацией в диапазоне от 30 до 70 мМ, со значением рН приблизительно 4,0. Кроме того, в соответствии с этими результатами исследования растворимости (Табл. 1) было решено использовать в качестве стабилизирующего сахара сахарозу или трегалозу в концентрации от 10 до 40 мг/мл для приготовления лиофилизированной композиции исследуемого пептида APL-типа. Эти стабилизирующие сахара были необходимы для полной растворимости пептида, и эти сахара также были важны для хранения в лиофилизированном состоянии, поскольку способствовали стабильности пептида.In accordance with these results, it was concluded that the optimal composition is one where the peptide is in a sodium acetate buffer solution with a concentration in the range from 30 to 70 mm, with a pH value of approximately 4.0. In addition, in accordance with these results of the solubility study (Table 1), it was decided to use sucrose or trehalose at a concentration of 10 to 40 mg/ml as a stabilizing sugar to prepare a lyophilized composition of the APL-type peptide under study. These stabilizing sugars were essential for complete solubility of the peptide, and these sugars were also important for freeze-dried storage as they contributed to the stability of the peptide.
В описанной композиции не было обнаружено никаких молекулярных частиц, соответствующих деградации пептида. Эта фармацевтическая композиция оказалась стабильным продуктом на протяжении всего производства нескольких партий. Это показало реальную стабильность в течение 24 месяцев хранения при температуре 4°C.No molecular species corresponding to degradation of the peptide was found in the described composition. This pharmaceutical composition proved to be a stable product throughout the production of several batches. This showed real stability over 24 months at 4°C.
Пример 2. Уменьшение нейтрофилов в анализах ex vivo, выполненных с использованием клеток, полученных от пациентов, получавших лечениеExample 2 Neutrophil Reduction in Ex Vivo Assays Performed Using Cells Obtained from Treated Patients
Как упомянуто выше, нейтрофилы играют решающую роль в развитии и хронизации некоторых воспалительных заболеваний. Поэтому было изучено влияние на жизнеспособность нейтрофилов у пациентов фармацевтической композиции пептида APL-типа, идентифицированного как Seq ID No. 1, которая была выбрана в Примере 1.As mentioned above, neutrophils play a critical role in the development and chronicity of several inflammatory diseases. Therefore, the effect on the viability of neutrophils in patients of the pharmaceutical composition of the APL-type peptide, identified as Seq ID No. 1, which was chosen in Example 1.
Кровь пациентов разводили 3%-ным раствором декстрана T500 в соотношении 1:2, перемешивали путем многократного переворачивания пробирок и инкубировали в течение 18-20 мин при комнатной температуре для осаждения эритроцитов. Верхний слой, с высоким содержанием лейкоцитов, экстрагировали и переносили в центрифужные пробирки объемом 50 мл. Пробирки центрифугировали при 500 g в течение 10 мин при температуре 4°С. Клеточный осадок ресуспендировали в 10 мл не содержащего ионов PBS. Пять миллилитров этой клеточной суспензии переносили в центрифужные пробирки объемом 15 мл, которые содержали 3 мл раствора «Ficoll-Paque™ PLUS» (Amersham Biosciences AB, Sweden). Пробирки центрифугировали при 400 g в течение 40 мин при комнатной температуре. После центрифугирования наблюдали четыре слоя, соответствующих плазме плюс PBS, мононуклеарным клеткам периферической крови (PBMC), раствору фиколла-пак и слою гранулоцитов плюс эритроцитов. Забирали слой, соответствующий гранулоцитам. Оставшиеся эритроциты лизировали, добавляя стерильную дистиллированную воду. Центрифугировали при 500 g в течение 5 мин при температуре 4°C. Нейтрофилы ресуспендировали в культуральной среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки крови плодов коров и дополненной гентамицином (100 ед./мл) и L-глутамином (2 мМ) (Gibco BRL, США).Patients' blood was diluted with 3% dextran T500 solution in a ratio of 1:2, mixed by repeated inversion of tubes and incubated for 18-20 min at room temperature to precipitate erythrocytes. The upper layer, with a high content of leukocytes, was extracted and transferred to 50 ml centrifuge tubes. The tubes were centrifuged at 500 g for 10 min at 4°C. The cell pellet was resuspended in 10 ml ion-free PBS. Five milliliters of this cell suspension was transferred to 15 ml centrifuge tubes which contained 3 ml of "Ficoll-Paque™ PLUS" solution (Amersham Biosciences AB, Sweden). The tubes were centrifuged at 400 g for 40 min at room temperature. After centrifugation, four layers were observed corresponding to plasma plus PBS, peripheral blood mononuclear cells (PBMC), ficollapak solution, and granulocyte plus erythrocyte layer. The layer corresponding to granulocytes was taken. The remaining erythrocytes were lysed by adding sterile distilled water. Centrifuged at 500 g for 5 min at 4°C. Neutrophils were resuspended in RPMI-1640 culture medium containing 10% fetal bovine serum and supplemented with gentamicin (100 units/ml) and L-glutamine (2 mM) (Gibco BRL, USA).
Нейтрофилы высевали (1×106 кл./лунка) в 96-луночные планшеты (Costar, США) в конечном объеме 100 мкл и стимулировали (в трех повторах) композицией, выбранной в Примере 1, при следующих концентрациях пептида: 10, 40, 80 и 160 мкг/мл. Стимуляцию проводили в течение 24 ч. Клетки, не стимулированные указанной композицией, использовали в качестве контроля роста базальных клеток. Влияние пептидного состава на жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа с 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромидом (сокращенно МТТ, Sigma, США), следуя протоколу, описанному производителем. Через 24 ч культивирования в количестве 20 мкл на лунку добавляли МТТ, приготовленный в концентрации 5 мг/мл в культуральной среде. Затем планшеты инкубировали в течение 4 ч при аналогичных условиях культивирования. По истечении этого времени добавляли 100 мкл диметилсульфоксида и содержимое лунок гомогенизировали. Среднее значение оптической плотности нестимулированных клеток считалось 100% жизнеспособности клеток. Исходя из этого значения, при использовании пептидного состава жизнеспособность культивируемых клеток рассчитывали в соответствии со средними оптическими плотностями в каждом конкретном случае.Neutrophils were seeded (1×10 6 cells/well) in 96-well plates (Costar, USA) in a final volume of 100 μl and stimulated (in triplicate) with the composition selected in Example 1 at the following peptide concentrations: 10, 40, 80 and 160 mcg/ml. Stimulation was carried out for 24 hours. Cells not stimulated with this composition were used as a control for the growth of basal cells. The effect of the peptide composition on cell viability was determined using a 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay (abbreviated as MTT, Sigma, USA) following the protocol described by the manufacturer. After 24 hours of cultivation, MTT prepared at a concentration of 5 mg/ml in culture medium was added in an amount of 20 μl per well. The plates were then incubated for 4 hours under similar culture conditions. After this time, 100 μl of dimethyl sulfoxide was added and the contents of the wells were homogenized. The mean optical density of unstimulated cells was considered to be 100% cell viability. Based on this value, when using the peptide composition, the viability of cultured cells was calculated in accordance with the average optical densities in each case.
Как видно из Фиг. 6, снижение жизнеспособности клеток нейтрофилов пациентов с АС было очень заметным по сравнению с клетками без стимуляции пептидом. Составленный пептид снижал жизнеспособность клеток до 35% по сравнению с клетками без стимуляции пептидом. Очень похожие результаты были получены в экспериментах, которые проводились с нейтрофилами, полученными от пациентов с другими воспалительными заболеваниями (Табл. 2). Эти результаты подтверждают использование выбранной композиции данного пептида для лечения указанных заболеваний, поскольку она уменьшает популяцию клеток, участвующих в патогенезе этих патологий.As can be seen from FIG. 6, the decrease in cell viability of neutrophils from AS patients was very marked compared to cells without peptide stimulation. The formulated peptide reduced cell viability by up to 35% compared to cells without peptide stimulation. Very similar results were obtained in experiments that were carried out with neutrophils obtained from patients with other inflammatory diseases (Table 2). These results confirm the use of the selected composition of this peptide for the treatment of these diseases, since it reduces the population of cells involved in the pathogenesis of these pathologies.
Таблица 2. Влияние фармацевтической композиции пептида APL-типа на клеточную жизнеспособность нейтрофилов пациентов с воспалительными заболеваниямиTable 2. Influence of the pharmaceutical composition of the APL-type peptide on the cell viability of neutrophils in patients with inflammatory diseases
* Пациенты с выраженной активностью. ** Пациенты с полиартикулярным подтипом с выраженной активностью* Patients with severe activity. ** Patients with polyarticular subtype with severe activity
Однако при анализе фармацевтических составов пептидов, приготовленных с вспомогательными веществами, было обнаружено, что эффект снижения клеточной жизнеспособности нейтрофилов заметно снижается. Это видно из Табл. 3. Данные клетки были выделены из периферической крови пациентов с воспалительными заболеваниями, характеризующимися повышением уровня цитруллинирования белков, из расчета по одному пациенту на каждое заболевание. Для выделения исследуемых клеток использовали протокол, описанный выше.However, when analyzing pharmaceutical compositions of peptides prepared with excipients, it was found that the effect of reducing the cell viability of neutrophils was markedly reduced. This can be seen from Table. 3. These cells were isolated from the peripheral blood of patients with inflammatory diseases characterized by an increase in the level of protein citrullination, at the rate of one patient for each disease. The protocol described above was used to isolate test cells.
Таблица 3. Влияние вспомогательных веществ, присутствующих в составе пептида APL-типа, на жизнеспособность клеток нейтрофилов пациентов с воспалительными заболеваниямиTable 3. Effect of excipients present in the APL-type peptide on the viability of neutrophil cells in patients with inflammatory diseases
Эти результаты подтверждают, что состав пептида в натрий-ацетатном буферном растворе (30-70 мМ), при значении рН 3,9-7,7; и сахароза или трегалоза (10-40 мг/мл), полезен для индуцирования снижения жизнеспособности клеток нейтрофилов, полученных от пациентов с РА, ЮИА, АС, фиброзом и болезнью Альцгеймера.These results confirm that the composition of the peptide in sodium acetate buffer solution (30-70 mm), at a pH value of 3.9-7.7; and sucrose or trehalose (10-40 mg/mL), useful for inducing a decrease in the viability of neutrophil cells derived from patients with RA, JIA, AS, fibrosis, and Alzheimer's disease.
Пример 3. Снижение содержания S100A8 и S100a9 и белков нетоза в анализах ex vivo с клетками, полученными от пациентов с РАExample 3 Reduction in S100A8 and S100a9 and Netose Proteins in Ex Vivo Assays with Cells Derived from RA Patients
Образцы были получены от трех пациенток с РА, с развитием заболевания в течение 5 лет, и в возрасте от 50 до 55 лет. Во время сбора крови пациенты имели умеренную активность заболевания согласно клиническому индексу DAS28 (оценка активности заболевания), который является показателем активности заболевания, известным специалистам в этой области медицины (PL Van Riel and J. Fransen, 2005. Arthritis Res Ther 7: 189-190).Samples were obtained from three patients with RA, with the development of the disease within 5 years, and aged 50 to 55 years. At the time of blood collection, patients had moderate disease activity according to the clinical index DAS28 (disease activity score), which is a measure of disease activity known to those skilled in the art (PL Van Riel and J. Fransen, 2005. Arthritis Res Ther 7: 189-190 ).
Кровь пациентов разбавляли в соотношении 1 : 2 фосфатным буферным раствором. Выделение мононуклеарных клеток проводили в градиенте фиколла. Клетки повторно суспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки крови плодов коров. Десять миллионов клеток культивировали с приготовленным как описано в Примере 1 пептидом (40 мкг/мл) при температуре 37°С в увлажненной атмосфере с 5% СО2 в течение 24 ч или 5 сут. Кроме того, нестимулированные клетки культивировали с пептидом, который представлял собой контроль в экспериментах.Patients' blood was diluted 1 : 2 with phosphate buffer solution. Isolation of mononuclear cells was carried out in a ficoll gradient. Cells were resuspended in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum. Ten million cells were cultured with the peptide prepared as described in Example 1 (40 μg/ml) at 37° C. in a humidified atmosphere with 5% CO 2 for 24 hours or 5 days. In addition, unstimulated cells were cultured with the peptide, which was the control in the experiments.
После культивирования клетки обрабатывали раствором хлорида натрия с высоким содержанием детергентов, протеаз и с изотопом кислорода-18, чтобы вызвать разрыв плазматической мембраны и маркировку белков. Образцы анализировали в масс-спектрометре LC/MS/MS, выполняя 18 прогонов для каждого образца.After culturing, the cells were treated with sodium chloride solution high in detergents, proteases, and oxygen-18 isotope to induce plasma membrane rupture and protein labeling. Samples were analyzed on an LC/MS/MS mass spectrometer with 18 runs per sample.
Впоследствии была проведена биологическая интерпретация результатов, для которых были определены белки, которые значительно изменились в каждой клеточной культуре, как через 24 ч, так и через 5 сут инкубации с фармацевтической композицией, содержащей пептид. Все белки были охарактеризованы с точки зрения их биологической функции, их возможных посттрансляционных модификаций и их связи с заболеваниями. Используя общий список белков, которые существенно изменились, были проведены анализы обогащения по метаболическим путям, молекулярным процессам, системам взаимодействия и болезням. Эту процедуру также применяли к образцам каждого пациента независимо друг от друга, сравнивая результаты с двумя другими исследованиями и с общим анализом.Subsequently, a biological interpretation of the results was carried out, for which proteins were determined that significantly changed in each cell culture, both after 24 hours and after 5 days of incubation with a pharmaceutical composition containing the peptide. All proteins have been characterized in terms of their biological function, their possible post-translational modifications, and their association with diseases. Using a common list of proteins that have changed significantly, enrichment analyzes were performed by metabolic pathways, molecular processes, interaction systems, and diseases. This procedure was also applied to each patient's samples independently, comparing the results with the other two studies and with the overall analysis.
В то же время были отобраны те идентифицированные белки, которые имели одинаковое поведение по крайней мере у двух исследуемых пациентов или в образцах в двух исследованиях у одного пациента. С помощью этого нового списка белков был проведен анализ текстовых данных для выявления тех белков, которые были непосредственно связаны с болезнью. Белки, которые были идентифицированы с помощью этой стратегии, были изучены с точки зрения их функций и их качества как биомаркеров заболевания.At the same time, those identified proteins were selected that had the same behavior in at least two study patients or in samples in two studies in one patient. With this new list of proteins, the text data was analyzed to identify those proteins that were directly associated with the disease. The proteins that have been identified with this strategy have been studied in terms of their functions and their quality as disease biomarkers.
Анализ обогащения проводили по картам, метаболическим путям и биологическим процессам, сравнивая все эксперименты между собой (клетки каждого пациента оценивали через 24 ч и через 5 сут). Среди карт или биологических путей наиболее представлены нетоз и карты, связанные с реакцией на повреждение в дезоксирибонуклеиновой кислоте. При анализе белков, идентифицированных у трех пациентов, в качестве релевантных белков были обнаружены S100A8 и S100A9.Enrichment analysis was performed by maps, metabolic pathways, and biological processes, comparing all experiments with each other (the cells of each patient were evaluated after 24 h and after 5 days). Among the maps or biological pathways, netosis and maps associated with the response to damage in deoxyribonucleic acid are most represented. When analyzing proteins identified in three patients, S100A8 and S100A9 were found as relevant proteins.
Содержание этих белков в клетках у трех пациентов уменьшалось, когда клетки культивировались с фармацевтической композицией, содержащей пептид, как в течение 24 ч, так и в течение 5 сут, по сравнению с клетками без пептидной стимуляции.The content of these proteins in the cells of three patients decreased when the cells were cultured with a pharmaceutical composition containing the peptide, both for 24 hours and for 5 days, compared with cells without peptide stimulation.
Указанная фармацевтическая композиция также значительно уменьшила нетоз. Белки S100A8 и S100A9 присутствуют в нейтрофилах, где они составляют 40% цитозольных белков, но также присутствуют в моноцитах. Тем не менее, нетоз представляет собой процесс, в частности, связанный с нейтрофилами. Этот последний пункт можно объяснить тем, что существует вероятность того, что кольцо полученных от пациентов мононуклеарных клеток было загрязнено с нейтрофилами. Это весьма вероятный факт, учитывая, что у трех пациентов была обнаружена умеренная активность заболевания, при которой увеличивается количество нейтрофилов.Said pharmaceutical composition also significantly reduced netosis. Proteins S100A8 and S100A9 are present in neutrophils, where they make up 40% of cytosolic proteins, but are also present in monocytes. However, netosis is a process particularly associated with neutrophils. This last point can be explained by the fact that there is a possibility that the ring of mononuclear cells obtained from patients was contaminated with neutrophils. This is a highly probable fact, given that three patients were found to have moderate disease activity, in which the number of neutrophils increases.
В то же время эти результаты свидетельствуют о том, что упомянутая фармацевтическая композиция, содержащая пептид APL-типа и выбранные вспомогательные вещества, может способствовать снижению цитруллинирования белков, характерных для некоторых заболеваний, таких как аутоиммунный артрит, фиброз и болезнь Альцгеймера. Цитруллинированием является процесс, который способствует развитию данных патологий, и именно продукты, которые выделяются во внеклеточную среду во время нетоза, являются предшественниками цитруллинирования.At the same time, these results indicate that said pharmaceutical composition containing an APL-type peptide and selected excipients can help reduce the citrullination of proteins characteristic of certain diseases such as autoimmune arthritis, fibrosis, and Alzheimer's disease. Citrullination is the process that contributes to the development of these pathologies, and it is the products that are released into the extracellular environment during netosis that are the precursors of citrullination.
Пример 4. Снижение уровня анти-ЦЦП у пациентов с РА, получавших композицию, содержащую пептид APL-типа.Example 4 Decreased Anti-CCP Level in RA Patients Treated with a Composition Containing an APL Type Peptide.
Анализировали образцы крови, полученные от пациентов с РА, включенных в I фазу клинических исследований. Пациентам вводили композицию, содержащую пептид APL-типа, идентифицированный как Seq. ID No. 1, который был описан в Примере 1. На момент введения пациенты имели умеренную активность заболевания согласно клиническому индексу DAS28.Blood samples obtained from RA patients enrolled in Phase I clinical trials were analyzed. Patients were administered a composition containing an APL-type peptide identified as Seq. ID no. 1, which was described in Example 1. At the time of administration, patients had moderate disease activity according to the clinical index DAS28.
Клиническое исследование было построено на трех уровнях доз пептида: 1 мг, 2,5 мг и 5 мг. Пациентов лечили фармацевтической композицией пептида в течение шести месяцев. Они получали девять инъекций указанного состава подкожно, разделенных на недельную дозу в течение первого месяца и месячную дозу в течение пяти месяцев.The clinical study was constructed at three peptide dose levels: 1 mg, 2.5 mg and 5 mg. Patients were treated with the pharmaceutical composition of the peptide for six months. They received nine subcutaneous injections of the indicated formulation, divided into a weekly dose for the first month and a monthly dose for five months.
Пациенты находились под наблюдением для выявления нежелательных явлений. Фармацевтическая композиция вводимого пептида APL-типа хорошо переносилась всеми пациентами. Ни у одного пациента не было выявлено серьезных нежелательных явлений, и не были изменены биохимические или гематологические параметры. Данные результаты оказались непредвиденными, принимая во внимание, что значение рН композиции составляет приблизительно 4,0; что далеко от физиологических значений рН. В предыдущих исследованиях других авторов сообщалось о локальном повреждении в месте введения, когда значения рН введенного препарата были далеки от физиологических значений рН.Patients were monitored for adverse events. The pharmaceutical composition of the administered APL-type peptide was well tolerated by all patients. No patient experienced serious adverse events, and no biochemical or hematological parameters were altered. These results were unexpected given that the pH of the composition is approximately 4.0; which is far from physiological pH values. Previous studies by other authors have reported local injury at the injection site when the pH values of the administered drug were far from physiological pH values.
Кроме того, концентрацию анти-ЦЦП определяли количественно в плазме пациентов с помощью метода ИФА с использованием коммерческого набора. Данный метод ИФА позволяет определять антитела к четырем антигенам: виментину, коллагену II типа, фибриногену и α-энолазе. Результаты выражены в пг/мл и проанализированы с помощью статистической программы «Prism», компании «GraphPad». Для сравнения значений времени, оцениваемых по отношению к нулевому моменту времени, применяли t-критерий Стьюдента.In addition, the concentration of anti-CCP was quantified in patients' plasma by ELISA using a commercial kit. This ELISA method allows you to determine antibodies to four antigens: vimentin, type II collagen, fibrinogen and α-enolase. The results are expressed in pg/ml and analyzed using the statistical program Prism, GraphPad. Student's t-test was used to compare time values estimated with respect to time zero.
Однако как показано на Фиг. 7, обработка выбранным пептидным составом APL-типа индуцировала значительное снижение концентрации анти-ЦЦП в плазме у пациентов, получавших лечение, относительно нулевого момента времени (p<0,05). Образцы пациентов соответствовали 13, 25 и 48 неделям лечения. Эти результаты продемонстрировали терапевтический эффект данного состава, поскольку анти-ЦЦП вносят вклад в патогенез РА и других воспалительных заболеваний, таких как ЮИА, АС, болезнь Альцгеймера, а также фиброз печени и легких. В то же время результаты показывают, что указанная фармацевтическая композиция, которая содержит пептид APL-типа, может способствовать снижению процесса цитруллинирования собственных белков, характерного для упомянутых заболеваний.However, as shown in FIG. 7, treatment with the selected APL-type peptide formulation induced a significant decrease in plasma anti-CCP concentration in treated patients relative to time zero (p<0.05). Patient samples corresponded to 13, 25 and 48 weeks of treatment. These results demonstrate the therapeutic effect of this formulation as anti-CCPs contribute to the pathogenesis of RA and other inflammatory diseases such as JIA, AS, Alzheimer's disease, and hepatic and pulmonary fibrosis. At the same time, the results show that said pharmaceutical composition, which contains an APL-type peptide, can help reduce the process of self-protein citrullination, which is characteristic of the mentioned diseases.
--->--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙSEQUENCE LIST
<110> ЦЕНТР ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТЕХНИКИ И БИОТЕХНОЛОГИИ<110> CENTER FOR GENETIC ENGINEERING AND BIOTECHNOLOGY
<120> ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПЕПТИД APL-ТИПА <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING APL-TYPE PEPTIDE
<130> APL-цитруллинирование <130> APL citrullination
<140> CU 2017-0176<140>CU 2017-0176
<141> 29.12.2017<141> 12/29/2017
<160> 1 <160> 1
<170> PatentIn Ver. 2.1<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1<210> 1
<211> 27<211> 27
<212> белок<212> protein
<213> Искусственная Последовательность<213> Faux Sequence
<220><220>
<223> Описание Искусственной Последовательности: Пептид<223> Artificial Sequence Description: Peptide
APL-типа APL-type
<400> 1<400> 1
Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys Leu Val
1 5 10 15 1 5 10 15
Gln Leu Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala Gln Leu Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala
20 25 20 25
<---<---
Claims (12)
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU2017-0176 | 2017-12-29 | ||
| CU2017000176A CU24508B1 (en) | 2017-12-29 | 2017-12-29 | PHARMACEUTICAL COMPOSITION INCLUDING APL TYPE PEPTIDE |
| PCT/CU2018/050007 WO2019129315A1 (en) | 2017-12-29 | 2018-12-21 | Pharmaceutical composition comprising an apl peptide |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2020124953A3 RU2020124953A3 (en) | 2022-01-31 |
| RU2020124953A RU2020124953A (en) | 2022-01-31 |
| RU2778402C2 true RU2778402C2 (en) | 2022-08-18 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007124082A2 (en) * | 2006-04-21 | 2007-11-01 | Amgen, Inc. | Buffering agents for biopharmaceutical formulations |
| EP2371847A1 (en) * | 2004-09-24 | 2011-10-05 | Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia | Peptides and their derived type APL of the HSP60 and pharmaceutical compositions |
| EP2374468A1 (en) * | 2008-12-29 | 2011-10-12 | Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia | Use of apl-type peptide for treating intestinal inflammatory diseases and type 1 diabetes |
| RU2496497C1 (en) * | 2009-08-25 | 2013-10-27 | Католик Юниверсити Индастри Академик Кооперейшн Фаундейшн | Pharmaceutical composition for preventing and treating rheumatoid arthritis, containing rebamipide |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2371847A1 (en) * | 2004-09-24 | 2011-10-05 | Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia | Peptides and their derived type APL of the HSP60 and pharmaceutical compositions |
| WO2007124082A2 (en) * | 2006-04-21 | 2007-11-01 | Amgen, Inc. | Buffering agents for biopharmaceutical formulations |
| EP2374468A1 (en) * | 2008-12-29 | 2011-10-12 | Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia | Use of apl-type peptide for treating intestinal inflammatory diseases and type 1 diabetes |
| RU2496497C1 (en) * | 2009-08-25 | 2013-10-27 | Католик Юниверсити Индастри Академик Кооперейшн Фаундейшн | Pharmaceutical composition for preventing and treating rheumatoid arthritis, containing rebamipide |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CABRALES-RICO ANIA et al., "Development and validation of a bioanalytical method based on LC-MS/MS analysis for the quantitation of CIGB-814 peptide in plasma from Rheumatoid Arthritis patients", JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS, NEW YORK, NY, US vol. 143, 01.06.2017; BARBERÁ ARIANA et al., "APL1, an altered peptide ligand derived from human heat-shock protein 60, increases the frequency of Tregs and its suppressive capacity against antigen responding effector CD4 + T cells from rheumatoid arthritis patients", CELL STRESS AND CHAPERONES, ALLEN PRESS ONLINE PUBLISHING, EDINBURGH, GB vol. 21, no. 4, 30.05.2016. * |
| SATOSHI OHTAKE et al.: "Interactions of formulation excipients with proteins in solution and in the dried state", ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS, vol. 63, no. 13, 01.07.2011. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3733196B1 (en) | Pharmaceutical composition comprising an altered peptide ligand (apl) type peptide | |
| AU2020203183B2 (en) | C1-inh compositions and methods for the prevention and treatment of disorders associated with c1 esterase inhibitor deficiency | |
| JP6472142B2 (en) | Composition comprising HC-HA / PTX3 complex and method of use thereof | |
| AU2003300266B2 (en) | Methods and compositions for suppressing fibrocyte differentiation | |
| US20220054554A1 (en) | Scalable Production of Standardized Extracellular Vesicles, Extracellular Vesicle Preparations and Uses Thereof | |
| AU2016273847A1 (en) | Use of low dose IL-2 for treating autoimmune - related or inflammatory disorders | |
| EP3568143B1 (en) | Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles and their medical use | |
| US20220047671A1 (en) | Protein for treatment of inflammatory diseases | |
| US11701406B2 (en) | Combination of low dose IL-2 and an inhibitor of Treg IL-2R desensitization to treat autoimmune and allergic inflammatory diseases | |
| US20130095127A1 (en) | METHODS OF INHIBITING INFLAMMATION AND INFLAMMATORY DISEASES USING Gal-3BP (BTBD17B, LGALS3BP, GALECTIN-3 BINDING PROTEIN, MAC-2 BINDING PROTEIN) | |
| RU2778402C2 (en) | Pharmaceutical composition containing apl type peptide | |
| US7387993B2 (en) | Mannan-binding lectin (MBL) treatment of infections in individuals treated with TNF-αinhibitors | |
| KR20210039339A (en) | New protein with anti-inflammatory properties | |
| CA3225321A1 (en) | Ptprs in autoimmunity | |
| Malange et al. | The implications of Brain-derived neurotrophic factor in the biological activities of platelet-rich plasma. | |
| Tian et al. | Gingival Mesenchymal Stem Cells (GMSC)-derived Exosomes are more Immunosuppressive than GMSC in Ameliorating Collagen-induced Arthritis | |
| WO2023164134A1 (en) | Compositions and methods for modulating the immune system | |
| Larbi | Investigation of the machanism of exocytosis form the permeabilised guinea pig eosinophils |