BR112020023359A2 - tratamentos e biomarcadores para o prognóstico de infecção pelo vírus zika - Google Patents

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Abstract

A divulgação fornece métodos, biomarcadores e kits para determinar o prognóstico de infecção pelo vírus Zika em relação à severidade de sintomas resultantes dos efeitos da infecção pelo vírus Zika no metabolismo ósseo, tais como artralgia, osteoporose e craniossinostose. A divulgação fornece ainda tratamentos para a infecção pelo vírus Zika, em particular, para tratar artralgia, osteoporose e craniossinostose.

Description

“TRATAMENTOS E BIOMARCADORES PARA O PROGNÓSTICO DE INFECÇÃO PELO VÍRUS ZIKA” CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A divulgação fornece métodos, biomarcadores e kits para determinar o prognóstico de infecção pelo vírus Zika em relação à severidade de sintomas resultantes dos efeitos da infecção pelo vírus Zika no metabolismo ósseo, tais como artralgia, osteoporose e craniossinostose. A divulgação fornece ainda tratamentos para a infecção pelo vírus Zika, em particular para tratar artralgia, osteoporose e craniossinostose.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] O vírus Zika (ZIKV) é um vírus transmitido por artrópodes (arbo) e pertence à família dos Flaviviridae. Tem um genoma de RNA de fita simples que codifica uma única poliproteína. Geralmente, os arbovírus são conhecidos por replicarem em células dendríticas. Também foi relatado que as infecções por ZIKV são altamente neurotrópicas.
[003] Desde sua descoberta em Uganda em 1947, o ZIKV tem invadido diferentes territórios ao redor do mundo. Em 2015, o ZIKV foi identificado no Brasil resultando em uma epidemia de escala sem precedentes nas Américas e no Caribe (1). A maioria das infecções humanas por ZIKV parece ser assintomática. Entretanto, complicações graves devido à infecção por ZIKV são observadas durante a gravidez, incluindo anormalidades congênitas, tais como microcefalia e calcificações subcorticais (3). Em adultos, a infecção sintomática aguda por ZIKV é tipicamente caracterizada por uma doença autolimitada com febre, erupção cutânea, conjuntivite, mialgia e artralgia/artrite (4). Uma complicação rara também observada é a síndrome de Guillain-Barre.
[004] Os testes de diagnóstico para detectar a infecção por ZIKV estão disponíveis. Entretanto, visto que muitos indivíduos infectados permanecerão assintomáticos, existe uma necessidade de ferramentas para prever o prognóstico de infecção, em particular para prognosticar o desenvolvimento de sintomas e/ou para prognosticar a severidade de sintomas que irão se desenvolver. Isto é particularmente relevante ao decidir se deve iniciar os tratamentos médicos antes que um indivíduo tenha desenvolvido os sintomas ou se apenas sintomas leves estão presentes. A presente divulgação aborda essa necessidade.
[005] Existe também uma necessidade atual por novos tratamentos para infecção por ZIKV, em particular tratamentos que previnem ou reduzem a artralgia, osteoporose ou craniossinostose. Em particular, são necessários tratamentos que são fundamentados nos mecanismos moleculares subjacentes que causam esses sintomas. A presente divulgação aborda essa necessidade.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] Em um aspecto, a divulgação fornece métodos para determinar o prognóstico de um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), em particular para prognosticar complicações decorrentes dos efeitos da infecção no metabolismo ósseo. Preferivelmente, em que a determinação do prognóstico compreende prognosticar a severidade de e/ou risco de desenvolver um ou mais sintomas. Preferivelmente, os sintomas são um resultado dos efeitos da infecção por ZIKV no metabolismo ósseo. Os métodos compreendem determinar a expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores indicativos da função de osteoblasto e/ou osteoclasto em uma amostra, em que a perturbação da função de osteoblasto e/ou osteoclasto indica uma perturbação no metabolismo ósseo e um prognóstico deficiente do dito indivíduo. Os sintomas resultantes dessa perturbação incluem transtornos relacionados a mineralização reduzida de osteoblastos, tal como artralgia e osteoporose, e problemas de desenvolvimento ósseo, tais como craniossinostose.
[007] Em algumas modalidades, o um ou mais biomarcadores são selecionados de interferon gama ou um ou mais marcadores da via de sinalização do interferon tipo I, fosfatase alcalina, osteocalcina, a razão RANKL/OPG, IL-6, IL-1 beta, CTX-I, DPD, um ou mais marcadores da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, um ou mais marcadores da via de sinalização de BMP, um ou mais marcadores dos marcadores da via de sinalização de Wnt.
[008] Em algumas modalidades, o sintoma é artralgia ou osteoporose e a amostra é do dito indivíduo. Em algumas modalidades o sintoma é craniossinostose e a amostra é do dito indivíduo ou o indivíduo é um feto e a amostra é de um sujeito carregando o feto.
[009] Em modalidades preferidas, a divulgação fornece um método para prognosticar a severidade de e/ou risco de desenvolvimento artralgia ou osteoporose em um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), o dito método compreendendo determinar o nível de expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores indicativos da função de osteoblasto e/ou osteoclasto em uma amostra, em que a perturbação da função de osteoblasto e/ou osteoclasto indica prognóstico deficiente do dito indivíduo, e.g., que o indivíduo tem probabilidade de desenvolver artralgia ou osteoporose. Preferivelmente, o um ou mais biomarcadores são selecionados de interferon gama ou um ou mais marcadores da via de sinalização do interferon tipo I, fosfatase alcalina, a razão RANKL/OPG, IL-6, IL-1 beta, CTX-I ou DPD. Mais preferivelmente, o um ou mais biomarcadores são selecionados de interferon gama, fosfatase alcalina, IL-6 ou razão RANKL/OPG. Preferivelmente, o método compreende: - determinar a expressão de um ou mais de MX1, OAS1, G1P3, IFIT1, G1P2, IFIT3, IFITM1, IFI35, STAT1, TAP1, IRF9, PSMB8, IFITM3, STAT2 ou IRF1; - determinar a expressão de interferon gama, - determinar a expressão de IL-6; - determinar a expressão de fosfatase alcalina e/ou - determinar a razão RANKL/OPG.
[010] Em modalidades preferidas, a divulgação fornece um método para prognosticar a severidade de e/ou risco de desenvolver craniossinostose em um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), o dito método compreendendo determinar o nível de expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores indicativos da função de osteoblasto e/ou osteoclasto em uma amostra, em que a perturbação da função de osteoblasto e/ou osteoclasto indica prognóstico deficiente do dito indivíduo, e.g., que o indivíduo tem probabilidade de desenvolver Craniossinostose.
Preferivelmente, o um ou mais biomarcadores são selecionados de fosfatase alcalina, a razão RANKL/OPG, IL-6, IL-1 beta, CTX-I, DPD, um ou mais marcadores da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, um ou mais marcadores da via de sinalização de BMP, ou um ou mais marcadores dos marcadores da via de sinalização de Wnt.
Mais preferivelmente, o um ou mais biomarcadores são selecionados de fosfatase alcalina, a razão RANKL/OPG, IL-6, um ou mais marcadores da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, um ou mais marcadores da via de sinalização de BMP, ou um ou mais marcadores dos marcadores da via de sinalização de Wnt.
Preferivelmente, o método compreende: - determinar a expressão de fosfatase alcalina, - determinar a razão RANKL/OPG; - determinar a expressão de IL-6; - determinar a expressão de FGFR2, FGF18, ERF, SPRY1, SPRY2, SPRY4, FGF2, FRS2, FGFR1, FGFR2, FGFRL1, THBS1, FGF5, FGF14, FGFR3 e/ou FGF7; - determinar a expressão de AMH, FST, BMP2, TGIF1, BMP8B, TGIF2, ACVR2B, BMP4, JAG2, INHBB, SMAD7, SMAD6, JAG1, TGFB1I1, NOG e/ou BMP6; - determinar a expressão de SOS9, SOX4, SOX15, TLE1, SOX6, EP300, CREBBP, FZD8, SFRP2, MYC, TLE3, AXIN1 e/ou PP2RC; e/ou - determinar a expressão de CREBBP, FZD8, NFKB2, NFATC2, AXIN1, PLCB4 e/ou PLCE1.
[011] Em um aspecto, a divulgação fornece um método para prevenir ou reduzir os efeitos da perturbação do metabolismo ósseo em um indivíduo infectado com vírus Zika. Em algumas modalidades, os métodos são para tratar, e.g., artralgia, osteoporose ou craniossinostose. Em algumas modalidades, os métodos compreendem administrar a um indivíduo em necessidade dos mesmos, uma composição que altera a função de osteoblasto e/ou osteoclasto.
[012] Em um aspecto, a divulgação fornece um método para tratar um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), o dito método compreendendo determinar o prognóstico do dito indivíduo como aqui divulgado e tratar um indivíduo determinado como tendo um prognóstico deficiente com um tratamento para artralgia. Preferivelmente, é fornecido um método para tratar um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV) para artralgia, o dito método compreendendo determinar o nível de expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores indicativos da função de osteoblasto e/ou osteoclasto em uma amostra, em que o um ou mais biomarcadores são selecionados de um ou mais marcadores da via de sinalização do interferon tipo I, interferon gama, IL-6, fosfatase alcalina ou razão RANKL/OPG, e tratar um indivíduo determinado como tendo um prognóstico deficiente com um tratamento para artralgia.
[013] Em um aspecto, a divulgação fornece um método para tratar um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), o dito método compreendendo determinar o prognóstico do dito indivíduo como aqui divulgado e tratar um indivíduo determinado como tendo um prognóstico deficiente com um tratamento para osteoporose. Preferivelmente, é fornecido um método para tratar um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV) para osteoporose, o dito método compreendendo determinar o nível de expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores indicativos da função de osteoblasto e/ou osteoclasto em uma amostra, em que o um ou mais biomarcadores são selecionados de um ou mais marcadores da via de sinalização do interferon tipo I, interferon gama, IL-6, fosfatase alcalina ou razão RANKL/OPG, e tratar um indivíduo determinado como tendo um prognóstico deficiente com um tratamento para osteoporose.
[014] Em um aspecto, a divulgação fornece um método para tratar um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), o dito método compreendendo determinar o prognóstico do dito indivíduo como aqui divulgado e tratar um indivíduo determinado como tendo um prognóstico deficiente com um tratamento para craniossinostose. Preferivelmente, é fornecido um método para tratar um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV) para craniossinostose, o dito método compreendendo determinar o nível de expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores indicativos da função de osteoblasto e/ou osteoclasto em uma amostra, em que o um ou mais biomarcadores são selecionados de fosfatase alcalina, a razão RANKL/OPG, IL-6, um ou mais marcadores da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, um ou mais marcadores da via de sinalização de BMP ou um ou mais marcadores dos marcadores da via de sinalização de Wnt e tratar um indivíduo determinado como tendo um prognóstico deficiente com um tratamento para craniossinostose.
[015] Em modalidades preferidas dos métodos aqui divulgados, o método compreende ainda obter uma amostra do dito indivíduo ou, se o indivíduo é um feto, a amostra de um sujeito carregando o feto. Preferivelmente, a amostra é um fluido corporal.
[016] Em algumas modalidades a divulgação fornece kits adequados para determinar o prognóstico de um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), preferivelmente em que a determinação do prognóstico compreende prognosticar a severidade de sintomas, o dito kit compreendendo pelo menos três dos seguintes: - um ou mais agentes de ligação que se ligam a IFNγ, - um ou mais agentes de ligação que se ligam à fosfatase alcalina (ALP) ou a um ou mais compostos para determinar a atividade de ALP, - um ou mais agentes de ligação que se ligam à osteocalcina,
- um ou mais agentes de ligação que se ligam a RANKL e um ou mais agentes de ligação que se ligam a OPG, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a IL-6, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a IL-1 beta, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a CTX-I, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a DPD, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a um membro da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, preferivelmente FGFR2, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a um membro da via de sinalização de BMP, preferivelmente BMP4, e - um ou mais agentes de ligação que se ligam a um membro da via de sinalização de Wnt.
[017] Preferivelmente, o dito kit compreende pelo menos três dos seguintes: - um ou mais agentes de ligação que se ligam a IFNγ ou um ou mais agentes de ligação que se ligam a um membro da via de sinalização do interferon tipo I, - um ou mais agentes de ligação que se ligam à fosfatase alcalina (ALP) ou a um ou mais compostos para determinar a atividade de ALP, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a RANKL e um ou mais agentes de ligação que se ligam a OPG, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a IL-6, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a um membro da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, preferivelmente FGFR2, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a um membro da via de sinalização de BMP, preferivelmente BMP4, e - um ou mais agentes de ligação que se ligam a um membro da via de sinalização de Wnt.
[018] Em um aspecto, a divulgação fornece uma composição farmacêutica que perturba a função de osteoblasto e/ou osteoclasto para o uso no tratamento de artralgia ou osteoporose em um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), em que a dita composição compreende: - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de IFNγ, preferivelmente em que o um ou mais compostos são selecionados de um anticorpo neutralizante contra IFNγ e glucocorticoides; - um ou mais compostos que aumentam a expressão ou atividade de fosfatase alcalina (ALP), preferivelmente em que o um ou mais compostos são uma terapia de substituição de enzima ALP, mais preferivelmente Alfa-asfotase; - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de osteocalcina; - um ou mais compostos que reduzem a razão RANKL/OPG, preferivelmente em que o um ou mais compostos são um anticorpo contra RANKL; - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de IL-6, preferivelmente em que o um ou mais compostos são um anticorpo contra IL-6; - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de IL-1β; preferivelmente em que o um ou mais compostos são um anticorpo contra IL-1β. - um ou mais compostos que aumentam a expressão ou atividade da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, preferivelmente em que o um ou mais compostos são FGF2 ou uma molécula de ácido nucleico que codifica FGF2; - um ou mais compostos que aumentam a expressão ou atividade da via de sinalização de BMP, preferivelmente em que o um ou mais compostos são selecionados de BMP2, BMP4, folistatina e ácidos nucleicos que codificam BMP2, BMP4 e folistatina; - um ou mais compostos que aumentam a expressão ou atividade da via de sinalização de Wnt, preferivelmente em que o um ou mais compostos são selecionados de Wnt (preferivelmente Wnt3a ou Wnt5), a molécula pequena
CHIR99021 e cloreto de lítio; - um ou mais compostos que compreendem uma terapia anabólica óssea, preferivelmente, a terapia anabólica óssea compreende fornecer Esclerostina (SOST) ou uma molécula de ácido nucleico que codifica Esclerostina; ou - um ou mais inibidores da atividade de osteoclasto, preferivelmente em que o inibidor é um bisfosfato.
[019] Preferivelmente, a dita composição compreende: - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de IFNγ, preferivelmente em que o um ou mais compostos são selecionados de um anticorpo neutralizante contra IFNγ e glucocorticoides; - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de um membro da via de sinalização do interferon tipo I, preferivelmente em que o composto é um glucocorticoide; - um ou mais compostos que aumentam a expressão ou atividade de fosfatase alcalina (ALP), preferivelmente em que o um ou mais compostos são uma terapia de substituição de enzima ALP, mais preferivelmente Alfa-asfotase; - um ou mais compostos que reduzem a razão RANKL/OPG, preferivelmente em que o um ou mais compostos são um anticorpo contra RANKL; - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de IL-6, preferivelmente em que o um ou mais compostos são um anticorpo contra IL-6; - um ou mais compostos que compreendem uma terapia anabólica óssea, preferivelmente, a terapia anabólica óssea compreende fornecer Esclerostina (SOST) ou uma molécula de ácido nucleico que codifica Esclerostina; ou - um ou mais inibidores da atividade de osteoclasto, preferivelmente em que o inibidor é um bisfosfato. Preferivelmente, os métodos para tratar um indivíduo em necessidade dos mesmos são fornecidos administrando-se uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições farmacêuticas ou um ou mais compostos aqui divulgados.
[020] Em um aspecto, a divulgação fornece uma composição farmacêutica que perturba a função de osteoblasto e/ou osteoclasto para o uso no tratamento de craniossinostose em um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), em que a dita composição compreende: - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de fosfatase alcalina (ALP) - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de osteocalcina; - um ou mais compostos que aumentam a razão RANKL/OPG; preferivelmente em que o um ou mais compostos são RANKL ou um ácido nucleico que codifica RANKL; - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, preferivelmente em que o um ou mais compostos são um anticorpo de FGFR neutralizante ou armadilha de FGF; - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade da via de sinalização de BMP, preferivelmente em que o um ou mais compostos são um inibidor de molécula pequena da sinalização de BMP, preferivelmente selecionado de K02288, LDN-193189 e dorsomorfina; Noggin, Gremlin 1, Chordin ou uma molécula de ácido nucleico que codifica Noggin, Gremlin 1 ou Chordin; - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de Wnt, preferivelmente em que o um ou mais compostos são Dkk1 ou Esclerostina ou um ácido nucleico que codifica Dkk1 ou Esclerostina; - um ou mais compostos que estimulam a renovação óssea, preferivelmente em que o composto é hormônio da paratireoide (PTH).
[021] Preferivelmente, a dita composição compreende: - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de fosfatase alcalina (ALP) - um ou mais compostos que aumentam a razão RANKL/OPG; preferivelmente em que o um ou mais compostos são RANKL ou um ácido nucleico que codifica RANKL; - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, preferivelmente em que o um ou mais compostos são um anticorpo de FGFR neutralizante ou armadilha de FGF; - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade da via de sinalização de BMP, preferivelmente em que o um ou mais compostos são um inibidor de molécula pequena da sinalização de BMP, preferivelmente selecionado de K02288, LDN-193189 e dorsomorfina; Noggin, Gremlin 1, Chordin ou uma molécula de ácido nucleico que codifica Noggin, Gremlin 1 ou Chordin; - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de Wnt, preferivelmente em que o um ou mais compostos são Dkk1 ou Esclerostina ou um ácido nucleico que codifica Dkk1 ou Esclerostina; - um ou mais compostos que estimulam a renovação óssea, preferivelmente em que o composto é hormônio da paratireoide (PTH). Preferivelmente, os métodos para tratar um indivíduo em necessidade dos mesmos são fornecidos administrando- se uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições farmacêuticas ou um ou mais compostos aqui divulgados.
[022] Em algumas modalidades, o tratamento compreendendo determinar o prognóstico do dito indivíduo por um método aqui divulgado.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[023] Figura 1: Replicação de ZIKV em osteoblastos. O sobrenadante da cultura foi coletado em diferentes pontos no tempo depois da infecção de osteoblastos primários por ZIKV (moi= 5). A) Cinética da curva de crescimento de infecção por ZIKV em osteoblastos do Doador 4266 (círculos fechados) e Doador 3520 (quadrados abertos) durante a diferenciação ao longo do período de 3 semanas. As barras de erro representam o erro padrão da média (S.E.M). B) Imagens imunofluorescentes representativas de infectados por ZIKV (painel direito) e controles não infectados (painel esquerdo).
[024] Figura 2: Efeito da infecção por ZIKV na diferenciação e maturação de osteoblastos. Efeito da infecção por ZIKV na diferenciação de osteoblastos é medido pela atividade de Fosfatase alcalina (ALP) nas culturas de A) Doador 4266 e B) Doador 3520, e efeito na mineralização é medido como uma concentração de cálcio presente nas culturas de C) Doador 4266 e D) Doador 3520. Os resultados são comparados entre infectados por ZIKV (barras brancas) e controles não infectados (barras pretas) e níveis de ALP são normalizados contra a proteína total. As barras de erro representam o erro padrão da média (S.E.M).*= p < 0,05 teste T de Student.
[025] Figura 3: Níveis de expressão gênica de genes analisados depois da infecção por ZIKV. A expressão gênica de fatores de transcrição chave dos osteoblastos infectados por ZIKV (barras brancas) versus controles não infectados (barras pretas) em (A-C) Doador 4266 e (D-F) Doador 3520. A expressão gênica foi corrigida para os genes de manutenção (house keeping), GAPDH. As barras de erro representam o erro padrão da média (S.E.M).* =p < 0,05 teste T de Student.
[026] Figura 4: Níveis de expressão gênica de genes analisados depois da infecção por ZIKV. A expressão gênica de RANKL e OPG dos osteoblastos infectados por ZIKV. A expressão gênica foi corrigida para os genes de manutenção (house keeping), GAPDH. As barras de erro representam o erro padrão da média (S.E.M).
[027] Figura 5: Níveis de expressão gênica de genes analisados depois da infecção por ZIKV. A expressão gênica de FGFR2 dos osteoblastos infectados por ZIKV. A expressão gênica foi corrigida para os genes de manutenção (house keeping), GAPDH. As barras de erro representam o erro padrão da média (S.E.M).* =p < 0,05 teste T de Student.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES DIVULGADAS
[028] A divulgação tem como base, em parte, a identificação de biomarcadores que se correlacionam com o prognóstico de pacientes infectados com vírus Zika (ZIKV). Os exemplos aqui fornecidos demonstram que os osteoblastos são afetados pela infecção por ZIKV. Como ainda descrito aqui, os exemplos descrevem um modelo in vitro de artralgia e osteoporose usando células troncos mesenquimais derivadas da medula óssea humana (MSCs). Os exemplos também descrevem um modelo in vitro para estudar o processo de craniossinostose usando osteoblastos humanos. A remodelação óssea é um processo rigidamente regulado que exige um equilíbrio na reabsorção óssea e formação óssea por osteoclastos e osteoblastos, respectivamente (20). O rompimento deste equilíbrio pode levar à remodelação óssea anormal e início de múltiplas condições patológicas. Os osteoblastos desempenham um papel chave na remodelação óssea, tanto diretamente na síntese óssea bem como indiretamente pela regulação da reabsorção óssea. Os osteoblastos se originam de células troncos mesenquimais (MSC). Os osteoclastos são células multinucleadas envolvidas na reabsorção óssea. Várias citocinas inflamatórias tais como IL-6 e IL1β foram associadas à artrite. Esses mediadores inflamatórios chave demonstraram induzir a expressão de RANKL em células da linhagem dos osteoblastos. RANK é expressado em precursores de osteoclastos bem como osteoclastos maduros e a ligação de RANKL induz a formação e ativação de osteoclastos, respectivamente. OPG serve como um chamariz de receptor competindo com RANK pela ligação a RANKL. Portanto, alterações na razão de RANKL/OPG podem influenciar a reabsorção do osso. A indução de RANKL resulta em uma razão elevada de RANKL/OPG e um aumento subsequente na diferenciação e ativação de osteoclastos.
[029] Embora não desejando estar limitado pela teoria, uma hipótese é fornecida aqui de que a infecção por ZIKV de MSC afeta sua diferenciação em osteoblastos e/ou a infecção de osteoblastos diferenciados desregula a função parácrina de RANKL e a expressão de OPG por meio da indução de IL-6.
[030] Consequentemente, um aspecto da divulgação fornece métodos para determinar o prognóstico de um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV) compreendendo determinar a expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores indicativos da função de osteoblasto e/ou osteoclasto. Em algumas modalidades, o prognóstico se refere a prognosticar os efeitos da infecção por ZIKV no metabolismo ósseo e sintomas resultantes do metabolismo ósseo perturbado. Preferivelmente, os métodos aqui divulgados são para prognosticar em um indivíduo infectado por ZIKV a severidade de e/ou risco de desenvolver um ou mais sintomas, incluindo artralgia, osteoporose e craniossinostose.
[031] A artralgia resulta, em parte, da perda óssea patológica devido ao comprometimento da função dos osteoblastos (N. C. Walsh et al., Osteoblast function is compromised at sites of focal bone erosion in inflammatory arthritis. J Bone Miner Res 24, 1572-1585 (2009). A artralgia/artrite foi relatada mais de 70 % dos casos de ZIKV (T. E. Colombo et al., Clinical, laboratory and virological data from suspected ZIKV patients in an endemic arbovirus area. J Clin Virol 96, 20-25 (2017). A maioria desses casos é considerada suave e autolimitada, com artralgia relatada por 3 a 5 dias durante a infecção aguda, entretanto, a artralgia persistente ou recorrente por mais de 30 dias foi relatada (J. F. Chan, et al. J Infect 72, 507-524 (2016). Os sintomas da artralgia incluem rigidez, dor nas articulações, vermelhidão e a capacidade reduzida para mover as articulações. A artralgia normalmente não é caracterizada por edema articular. Ao contrário, a artrite é a inflamação de uma articulação e está associada ao edema articular. Os métodos e biomarcadores aqui divulgados fornecem informações prognósticas em relação à probabilidade de um indivíduo infectado com Zika desenvolver artralgia e, em particular, uma forma de artralgia mais grave e/ou persistente.
[032] A osteoporose é caracterizada por uma densidade diminuída do osso normalmente mineralizado. Isso resulta em um enfraquecimento do osso e um risco aumentado de fraturas e quebras do osso.
[033] A microcefalia é caracterizada por pelo menos duas reduções do desvio padrão no volume do cérebro, deficiências intelectuais e motoras e problemas comportamentais. Essa redução no volume do cérebro resulta em uma circunferência da cabeça reduzida. Um aumento dramático na microcefalia pré-natal foi observado em regiões endêmicas de ZIKV. Foi sugerido que o ZIKV tem a capacidade de atravessar a placenta e infectar os tecidos nervosos do feto (Sharma e Lal, Frontiers in Microbiology 2017 8: 1-14). As consequências a longo prazo da microcefalia dependem das anomalias cerebrais subjacentes e podem variar de leves atrasos do desenvolvimento a deficiências motoras e intelectuais graves, como paralisia cerebral.
[034] Um fator que contribui para a microcefalia é a craniossinostose. A craniossinostose é a fusão prematura de uma ou mais das suturas cranianas. A diferenciação prematura dos osteoblastos no crânio pode levar à fusão e ao fechamento precoce das suturas cranianas (craniossinostose) e resulta no desenvolvimento reduzido do cérebro. A evidência de craniossinostose foi relatada em até 25 % dos recém-nascidos infectados no pré-natal por ZIKV (M. Del Campo et al., The phenotypic spectrum of congenital Zika syndrome. Am J Med Genet A 173, 841-857 (2017)). Vários relatos especulam que o neurotropismo do vírus pode desempenhar um papel na microcefalia. Embora não desejando estarmos limitados pela teoria, levantamos a hipótese de que o fechamento prematuro das estruturas cranianas é um segundo mecanismo pelo qual problemas de desenvolvimento do cérebro podem se desenvolver, resultante da infecção pelo vírus Zika dos osteoblastos. Os métodos e biomarcadores aqui divulgados fornecem informações prognósticas em relação à probabilidade de um neonato infectado com Zika desenvolver craniossinostose e, em particular, uma forma mais grave de craniossinostose.
[035] Em algumas modalidades, os biomarcadores e os métodos de aplicação dos ditos biomarcadores aqui divulgados fornecem uma indicação quanto a uma perturbação no metabolismo ósseo. Embora não desejando estar limitado pela teoria, as perturbações no metabolismo ósseo podem levar a vários sintomas. Assim, os biomarcadores e os métodos de aplicação dos ditos biomarcadores aqui divulgados fornecem uma indicação quanto ao risco do desenvolvimento de sintomas e/ou uma indicação da severidade futura dos ditos sintomas (i.e., o risco de desenvolver uma forma severa dos sintomas).
[036] Os biomarcadores indicativos da função de osteoblasto e/ou osteoclasto incluem interferon gama ou um ou mais marcadores da via de sinalização do interferon tipo I, fosfatase alcalina, osteocalcina, a razão RANKL/OPG, IL-6, IL-1 beta, CTX-I, DPD, um marcador da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, um marcador da via de sinalização de BMP e um marcador da via de sinalização de Wnt. Em algumas modalidades, a expressão e/ou atividade de pelo menos dois biomarcadores é determinada. Em algumas modalidades, os biomarcadores são indicados como interferon gama ou um ou mais marcadores da via de sinalização do interferon tipo I (1), fosfatase alcalina (2), osteocalcina (3), a razão RANKL/OPG (4), IL-6 (5), IL-1 beta (6), CTX-I (7), DPD (8), um marcador da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos (9), um marcador da via de sinalização de BMP (10) e um marcador da via de sinalização de Wnt (11), em que os biomarcadores compreendem 1 e 2; 1 e 3; 1 e 4; 1 e 5; 1 e 6; 1 e 7; 1 e 8; 1 e 9; 1 e 10; ou 1 e 11. Em algumas modalidades, os biomarcadores compreendem 2 e 3; 2 e 4; 2 e 5; 2 e 6; 2 e 7; 2 e 8; 2 e 9; 2 e 10; ou 2 e 11. Em algumas modalidades, os biomarcadores compreendem 3 e 4; 3 e 5; 3 e 6; 2 e 7; 3 e 8; 3 e 9; 3 e 10; ou 3 e 11. Em algumas modalidades, os biomarcadores compreendem 4 e 5; 4 e 6; 4 e 7; 4 e 8; 4 e 9; 4 e 10; ou 4 e 11. Em algumas modalidades, os biomarcadores compreendem 5 e 6; 5 e 7; 5 e 8; 5 e 9; 5 e 10; ou 5 e 11. Em algumas modalidades, os biomarcadores compreendem 6 e 7; 6 e 8; 6 e 9; 6 e 10; ou 6 e 11. Em algumas modalidades, os biomarcadores compreendem 7 e 8; 7 e 9; 7 e 10; ou 7 e 11. Em algumas modalidades, os biomarcadores compreendem 8 e 9; 8 e 10; ou 8 e 11. Em algumas modalidades, os biomarcadores compreendem 9 e 10; ou 9 e 11. Em algumas modalidades, os biomarcadores compreendem 10 e 11.
[037] Em alguma modalidade, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 ou todos os 11 biomarcadores são determinados. O uso de múltiplos biomarcadores pode aumentar a confiança do prognóstico. Portanto, quando múltiplos marcadores são usados, nem todos os biomarcadores precisam exibir uma alteração significativa. É claro para um especialista, e.g., que a alteração na expressão e/ou atividade de um dos dois biomarcadores testados também fornece um prognóstico (e.g., uma indicação que o indivíduo desenvolverá uma forma severa de um sintoma).
[038] A via de sinalização do interferon tipo I compreende múltiplos subtipos de IFN-alfa e a ativação da sinalização leva à transcrição de vários genes alvo diferentes. Os membros preferidos da via de sinalização do interferon tipo I incluem MX1, OAS1, G1P3, IFIT1, G1P2, IFIT3, IFITM1, IFI35, STAT1, TAP1, IRF9, PSMB8, IFITM3, STAT2 e IRF1, mais preferivelmente o marcador é MX1, OAS1, G1P3, IFIT1, G1P2 ou IFIT3. A expressão gênica aumentada desses marcadores é indicativa de um prognóstico deficiente em relação à artralgia e osteoporose.
[039] O IFNγ (interferon gama) é uma citocina solúvel envolvida na imunidade inata e adaptativa e é um marcador para inflamação. Também foi relatado que o IFN- γ estimula a formação de osteoclasto e perda óssea (Gao et al. J Clin Invest. 2007 117: 122-132). Uma sequência humana exemplificativa para interferon gama é como se segue:
MKYTSYILAF QLCIVLGSLG CYC QDPYVKE AENLKKYFNA GHSDVADNGT LFLGILKNWKEESDRKIMQS QIVSFYFKLFKNFKDDQSIQ KSVETIKEDM
NVKFFNSNKK KRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTG KRKRSQMLFR GRRASQ (peptídeo sinal sublinhado).
[040] A sequência de mRNA correspondente pode ser encontrada no GenBank como Sequência de Referência do NCBI: NM_000619.2 (16 de abril de 2018).
[041] Preferivelmente, o nível de expressão da proteína do interferon gama é determinada. Os kits ELISA para detectar IFN-gama humano estão comercialmente disponíveis (e.g., IFN gamma Human ELISA Kit da InvitrogenTM e PelikineTM human IFNγ ELISA kit). Os ensaios com base em citometria de fluxo também foram descritos onde IFN gama intracelular é detectado por citometria de fluxo após a permeabilização celular (Andersson et al., J. Immunol Methods 1988 112: 139-142). Os métodos para medir mRNA de IFN-gama também foram descritos (ver, e.g., Hein et al. Scand. J. Immunol. 2001 54: 285-291).
[042] A fosfatase alcalina (ALP) é uma enzima glicosilada ligada à membrana que é expressada em vários tecidos (i.e., ALPL: Fosfatase alcalina, Fígado/Osso/Rim). Esta enzima é conhecida por desfosforilar compostos. A enzima desempenha um papel na diferenciação de osteoblastos. As mutações em ALPL foram associadas ao transtorno hipofosfatasia, que é caracterizado por hipercalcemia e defeitos esqueléticos (Mochizuki et al. Eur J Pediatr. 2000 159(5): 375-9).
[043] Uma sequência humana exemplificativa para ALPL é como se segue:
MISPFLVLAIGTCLTNSLVPEKEKDPKYWRDQAQETLKYALELQKLNTNVAK NVIMFLGDGMGVSTVTAARILKGQLHHNPGEETRLEMDKFPFVALSKTYNTNAQVP DSAGTATAYLCGVKANEGTVGVSAATERSRCNTTQGNEVTSILRWAKDAGKSVGIV TTTRVNHATPSAAYAHSADRDWYSDNEMPPEALSQGCKDIAYQLMHNIRDIDVIMG GGRKYMYPKNKTDVEYESDEKARGTRLDGLDLVDTWKSFKPRYKHSHFIWNRTEL LTLDPHNVDYLLGLFEPGDMQYELNRNNVTDPSLSEMVVVAIQILRKNPKGFFLLVE GGRIDHGHHEGKAKQALHEAVEMDRAIGQAGSLTSSEDTLTVVTADHSHVFTFGGY TPRGNSIFGLAPMLSDTDKKPFTAILYGNGPGYKVVGGERENVSMVDYAHNNYQA QSAVPLRHETHGGEDVAVFSKGPMAHLLHGVHEQNYVPHVMAYAACIGANLGHCA PASSAGSLAAGPLLLALALYPLSVLF.
[044] A sequência de mRNA correspondente pode ser encontrada no GenBank como Sequência de Referência do NCBI: NM_000478.5 (5 de abril de 2018).
[045] Em algumas modalidades, o nível de expressão da proteína de ALPL é determinado. Preferivelmente, o nível de atividade é determinado. O nível de atividade da Fosfatase alcalina pode ser determinado por um teste de ALP comercialmente disponível (e.g. Mayo Medical Laboratories). Um teste relacionado é o teste de isoenzima de ALP para medir as quantidades de diferentes tipos de ALP no sangue. Esse teste usualmente tem como base a eletroforese e está comercialmente disponível (e.g. Mayo medical Laboratories). Vários testes de laboratório estão comercialmente disponíveis, por exemplo, Abcam (colorimétrico), Sigma Aldrich (Fluorescência), Rockland immunochemicals (ELISA). Kits, especialmente os kits ELISA, são disponíveis de uma ampla gama de fornecedores comerciais.
[046] A osteocalcina também é conhecida como proteína óssea contendo ácido gama-carboxiglutâmico (BGLAP) e é o hormônio proteico encontrado no osso e dentina. Esse fator é secretado por osteoblastos e regula a remodelação óssea e metabolismo energético. A osteocalcina é usada como um marcador para o processo de formação óssea, uma vez que níveis séricos elevados de osteocalcina são relativamente bem correlacionados com aumento na densidade mineral óssea.
[047] Uma sequência humana exemplificativa de osteocalcina é como se segue:
MRALTLLALLALAALCIAGQAGAKPSGAESSKGAAFVSKQEGSEVVKRPRR YLYQWLGAPVPYPDPLEPRREVCELNPDCDELADHIGFQEAYRRFYGPV.
[048] A sequência de mRNA correspondente pode ser encontrada no GenBank como Sequência de Referência do NCBI: NM_199173.5 (1 de maio de
2018).
[049] Preferivelmente, o nível de expressão da proteína de osteocalcina é determinado. O nível de osteocalcina pode ser determinado usando um kit ELISA. Os kits ELISA estão comercialmente disponíveis, por exemplo, Osteocalcin Human ELISA kit (ThermoFisher scientific), Human Osteocalcin ELISA kit (Abcam) e Human Osteocalcin Quantikine ELISA kit (R&D systems). Além disso, a osteocalcina pode ser detectada histoquimicamente como descrito por Vermeulen et al. em 1989 (J Histochem Cytochem).
[050] O ativador do receptor do ligante kappa-B do fator nuclear (RANKL) é também conhecido como membro da superfamília do ligante do fator de necrose tumoral 11 (TNFSF11). RANKL é uma proteína de membrana da superfamília do fator de necrose tumoral. Sua expressão está relacionada ao sistema imune e ao controle do metabolismo ósseo. O RANKL funciona como um fator chave para a diferenciação e ativação de osteoclastos. A expressão induzida de RANKL leva à perda óssea aumentada.
[051] Uma sequência humana exemplificativa de RANKL é como se segue:
MRRASRDYTKYLRGSEEMGGGPGAPHEGPLHAPPPPAPHQPPAASRSMF VALLGLGLGQVVCSVALFFYFRAQMDPNRISEDGTHCIYRILRLHENADFQDTTLES QDTKLIPDSCRRIKQAFQGAVQKELQHIVGSQHIRAEKAMVDGSWLDLAKRSKLEA QPFAHLTINATDIPSGSHKVSLSSWYHDRGWAKISNMTFSNGKLIVNQDGFYYLYAN ICFRHHETSGDLATEYLQLMVYVTKTSIKIPSSHTLMKGGSTKYWSGNSEFHFYSIN VGGFFKLRSGEEISIEVSNPSLLDPDQDATYFGAFKVRDID.
[052] A sequência de mRNA correspondente pode ser encontrada no GenBank como Sequência de Referência do NCBI: NM_003701.3 (1 de abril de 2018).
[053] OPG é também conhecido como Membro da Superfamília do Receptor de TNF 11b (TNFRSF11B). Essa proteína é um chamariz de receptor secretado pelo osteoblasto que funciona como um regulador negativo da reabsorção óssea. OPG funciona como um chamariz de receptor para RANKL e neutraliza a função de RANKL no metabolismo ósseo.
[054] Uma sequência humana exemplificativa de OPG é como se segue:
MNNLLCCALVFLDISIKWTTQETFPPKYLHYDEETSHQLLCDKCPPGTYLKQ HCTAKWKTVCAPCPDHYYTDSWHTSDECLYCSPVCKELQYVKQECNRTHNRVCE CKEGRYLEIEFCLKHRSCPPGFGVVQAGTPERNTVCKRCPDGFFSNETSSKAPCR KHTNCSVFGLLLTQKGNATHDNICSGNSESTQKCGIDVTLCEEAFFRFAVPTKFTPN WLSVLVDNLPGTKVNAESVERIKRQHSSQEQTFQLLKLWKHQNKDQDIVKKIIQDID LCENSVQRHIGHANLTFEQLRSLMESLPGKKVGAEDIEKTIKACKPSDQILKLLSLWR IKNGDQDTLKGLMHALKHSKTYHFPKTVTQSLKKTIRFLHSFTMYKLYQKLFLEMIGN QVQSVKISCL.
[055] A sequência de mRNA correspondente pode ser encontrada no GenBank como Sequência de Referência do NCBI: NM_002546.3 (1 de maio de 2018).
[056] A razão entre OPG e RANKL é importante na regulação da osteogênese (razão RANKL/OPG). Preferivelmente, a razão de expressão da proteína de RANKL/OPG é determinada. O nível de expressão de RANKL pode ser determinado por ELISA. Kits para determinar o nível de RANKL humano estão comercialmente disponíveis (Human TNFSF11 ELISA kit, Abcam; RANKL (total), soluble (human) ELISA kit Enzo Lifesciences). O nível de expressão de OPG pode ser determinado por ELISA. Kits para determinar o nível de OPG humano estão comercialmente disponíveis (Human Osteoprotegerin ELISA kit, Abcam; TNFRSF11B Human Instant ELISA™ Kit, ThermoFisher Scientific). Os resultados dos ensaios ELISA podem ser usados para calcular a razão RANKL/OPG.
[057] A interleucina 6 (IL-6) é um mediador da resposta inflamatória. A IL-6 é uma citocina que funciona na inflamação e na maturação de células B. O funcionamento da IL-6 é implicado em uma ampla variedade de doenças associadas a inflamação. As citocinas IL-6 são descritas como atuantes em células ósseas e têm um importante papel no esqueleto (Blanchard et al. Cytokine Growth Fator Rev. 2009).
[058] Uma sequência humana exemplificativa de IL-6 é como se segue:
MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSE RIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNE ETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTP DPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM.
[059] A sequência de mRNA correspondente pode ser encontrada no GenBank como Sequência de Referência do NCBI: NM_000600.4 (29 de março de 2018).
[060] Preferivelmente, o nível de expressão da proteína de IL-6 é determinado. Os kits ELISA para detectar a IL-6 humana estão comercialmente disponíveis (e.g., PeliKineTM compact human IL-6 ELISA kit; Human IL-6 ELISA Kit (Interleukin-6) High Sensitivity, Abcam; IL-6 Human ELISA Kit, ThermoFisher scientific). Além disso, um biosensor desenvolvido recentemente para detectar IL-6 pode ser usado para detectar os níveis de IL-6 (Huang et al. Procedia Engineering, 2013).
[061] A interleucina-1 beta (IL-1 beta) é uma citocina e é produzida por macrófagos ativados como uma pró-proteína, que é processada em sua forma ativa pela caspase 1. A IL1 beta é um mediador da resposta inflamatória. Além disso, a IL1 beta é relatada como estando envolvida na reabsorção óssea sob condições patológicas e fisiológicas (Lee et al. International Immunology. 2010).
[062] Uma sequência humana exemplificativa de IL-1 beta é como se segue:
MAEVPELASEMMAYYSGNEDDLFFEADGPKQMKCSFQDLDLCPLDGGIQL RISDHHYSKGFRQAASVVVAMDKLRKMLVPCPQTFQENDLSTFFPFIFEEEPIFFDT WDNEAYVHDAPVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMS FVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFN KIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS.
[063] A sequência de mRNA correspondente pode ser encontrada no GenBank como Sequência de Referência do NCBI: NM_000576.2 (1 de maio de 2018).
[064] Preferivelmente, o nível de expressão da proteína de IL-1 beta é determinado. Os kits ELISA para detectar IL-1B humana estão comercialmente disponíveis (e.g., IL-1 beta Human ELISA Kit, ThermoFisher scientific; Human IL-1 beta ELISA Kit, Abcam). Outro método para detectar o nível de expressão da proteína de IL-1 beta é o kit Singleplex com base em fluorescência (IL-1 beta Human Singleplex Kit, Thermo Fisher Scientific).
[065] As reticulações de colágeno carboxi/terminal (CTX-1), também conhecidas como o telopeptídeo do terminal C, são produtos de degradação do colágeno Tipo I e são biomarcadores de reabsorção óssea bem conhecidos. Os ensaios ELISA para detectar CTX-I estão comercialmente disponíveis, tais como Serum CrossLapsTM, que detecta sequências EKAHD-ß-GGR reticuladas.
[066] A desoxipiridinolina (DPD) é um derivado de hidroxipiridínio que é liberado durante a reabsorção óssea na corrente sanguínea e é eliminado não modificado na urina. Essa molécula é usada como um biomarcador para a reabsorção óssea e pode ser medida em, por exemplo, urina ou plasma.
[067] Preferivelmente, o nível de DPD é determinado. Os kits ELISA para determinar o nível de DPD estão comercialmente disponíveis (e.g., Human DPD (Desoxipiridinolina) ELISA kit, Elabscience). Alternativamente, um kit comercial para determinar os níveis de DPD na urina chamado MicroVue está disponível (Quidel). Os níveis de DPD também podem ser medidos usando HPLC, por exemplo, na urina.
[068] A via do receptor do fator de crescimento do fibroblasto influencia a mitogênese e a diferenciação de células. As vias de sinalização de FGF também são conhecidas por estarem envolvidas no desenvolvimento ósseo. Ver, Cell Biol Int. 1 de agosto de 2012; 36(8): 691-6 para uma revisão das mesmas. Um dos principais atores nessa via é o receptor do fator de crescimento do Fibroblasto 2 (FGFR2). O FGFR2 é um receptor para o fator de crescimento do fibroblasto (FGF).
[069] Uma sequência humana exemplificativa de FGFR2 é como se segue:
MVSWGRFICLVVVTMATLSLARPSFSLVEDTTLEPEEPPTKYQISQPEVYVA APGESLEVRCLLKDAAVISWTKDGVHLGPNNRTVLIGEYLQIKGATPRDSGLYACTA SRTVDSETWYFMVNVTDAISSGDDEDDTDGAEDFVSENSNNKRAPYWTNTEKMEK RLHAVPAANTVKFRCPAGGNPMPTMRWLKNGKEFKQEHRIGGYKVRNQHWSLIM ESVVPSDKGNYTCVVENEYGSINHTYHLDVVERSPHRPILQAGLPANASTVVGGDV EFVCKVYSDAQPHIQWIKHVEKNGSKYGPDGLPYLKVLKAAGVNTTDKEIEVLYIRN VTFEDAGEYTCLAGNSIGISFHSAWLTVLPAPGREKEITASPDYLEIAIYCIGVFLIACM VVTVILCRMKNTTKKPDFSSQPAVHKLTKRIPLRRQVTVSAESSSSMNSNTPLVRITT RLSSTADTPMLAGVSEYELPEDPKWEFPRDKLTLGKPLGEGCFGQVVMAEAVGIDK DKPKEAVTVAVKMLKDDATEKDLSDLVSEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLY VIVEYASKGNLREYLRARRPPGMEYSYDINRVPEEQMTFKDLVSCTYQLARGMEYL ASQKCIHRDLAARNVLVTENNVMKIADFGLARDINNIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEA LFDRVYTHQSDVWSFGVLMWEIFTLGGSPYPGIPVEELFKLLKEGHRMDKPANCTN ELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRILTLTTNEEYLDLSQPLEQYSPSYPDT RSSCSSGDDSVFSPDPMPYEPCLPQYPHINGSVKT.
[070] A sequência de mRNA correspondente pode ser encontrada no GenBank como Sequência de Referência do NCBI:. NM_000141.4 (10 de abril de 2018).
[071] Preferivelmente, o nível da atividade da via do receptor do fator de crescimento do Fibroblasto é determinado. Preferivelmente, o nível de expressão da proteína de FGFR2 é determinado. Os kits ELISA para determinar o nível de expressão de FGFR2 estão comercialmente disponíveis (e.g., Fibroblast Growth Factor Receptor 2 ELISA Kit, Sigma Aldrich; FGFR2 (Human) ELISA Kit, BioVision).
Além disso, os anticorpos para detectar FGFR2 estão comercialmente disponíveis (e.g., Anti-FGFR2 antibody (ab58201), Abcam). Um kit ELISA de FGF geral pode ser usado para determinar a atividade da via e está comercialmente disponível (Human FGF basic Quantikine ELISA Kit, R&D systems).
[072] Outros membros da via do receptor do fator de crescimento do Fibroblasto útil na invenção aqui divulgada incluem FGF18, ERF, SPRY1, SPRY2, SPRY4, FGF2, FRS2, FGFR1, FGFR2, FGFRL1, THBS1, FGF5, FGF14, FGFR3 e FGF7. Preferivelmente, um ou mais marcadores da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos são selecionados de FGF18 e ERF. A expressão gênica aumentada desses marcadores é indicativa de um prognóstico deficiente em relação à Craniossinostose.
[073] As proteínas morfogênicas ósseas (BMP) representam um grupo de fatores de crescimento. Esses fatores são originalmente descobertos pela sua capacidade para induzir a formação de osso e cartilagem. A via de sinalização da BMP desempenha um papel na formação de cartilagem e osso.
[074] Preferivelmente, o nível de ativação da via de sinalização da BMP é determinado. O nível da via de sinalização de BMP pode ser determinado por um kit de bioensaio de BMP4. Os kits ELISA para determinar os níveis de BMP4 estão comercialmente disponíveis (e.g., BMP-4 Human ELISA Kit, Thermo Fisher Scientific; Human BMP-4 Quantikine ELISA Kit, R&D systems). O nível de ativação da via de sinalização da BMP pode ser determinado por um bioensaio para a medição simultânea de múltiplas proteínas morfogenéticas ósseas, por exemplo, como descrito por Herrera et al. (BMC Cell Biol. 2009). Outros membros da via de sinalização de BMP útil na invenção aqui divulgada incluem AMH, FST, BMP2, TGIF1, BMP8B, TGIF2, ACVR2B, BMP4, JAG2, INHBB, SMAD7, SMAD6, JAG1, TGFB1I1, NOG e BMP6. Preferivelmente, um ou mais marcadores da via de sinalização de BMP são selecionados de AMH, FST e BMP2. A expressão gênica aumentada desses marcadores é indicativa de um prognóstico deficiente em relação à Craniossinostose.
[075] A via de sinalização de Wnt/β-catenina é conhecida por estar envolvida no desenvolvimento embrionário e homeostase do tecido adulto. Além disso, os sinais de Wnt são fatores chave para manter as populações de célula tronco. O papel da sinalização de Wnt na regulação da massa óssea é discutido na revisão de Krishnan et al. (J Clin Invest. 2006).
[076] Preferivelmente, o nível de ativação da via de Wnt é determinado. O nível de atividade da via de Wnt em células e tecidos pode ser medido por um ensaio repórter de Wnt/b-catenina, tal como um ensaio repórter de luciferase responsivo aos níveis de β-catenina. Os kits repórter de Wnt estão comercialmente disponíveis (e.g., LEADING LIGHT® Wnt Reporter Assay Starter Kit, Enzo Life Sciences). A expressão da proteína β-catenina, a proteína efetora da via de sinalização de Wnt, pode ser medida por western blot ou coloração imuno-histoquímica. Os anticorpos contra β- catenina estão comercialmente disponíveis (e.g., Anti-beta Catenin antibody (ab16051) Abcam, β-Catenin Antibody #9562 CellSignaling). O nível de ativação da via de Wnt pode ser determinado pela análise da expressão de Axin2, um gene alvo a jusante. Os anticorpos específicos para Axin2 estão comercialmente disponíveis (e.g., Anti-Axin 2 antibody (ab32197) Abcam). Outros membros da via de sinalização de Wnt/β-catenina útil na invenção aqui divulgada incluem SOS9, SOX4, SOX15, TLE1, SOX6, EP300, CREBBP, FZD8, SFRP2, MYC, TLE3, AXIN1 e PP2RC. Preferivelmente, um ou mais marcadores são selecionados de SOX9 e SOX4. A expressão gênica aumentada desses marcadores é indicativa de um prognóstico deficiente em relação à Craniossinostose.
[077] Os membros da via de sinalização de Wnt/Ca2+ também são úteis na presente invenção. Os membros preferidos dessa via de sinalização incluem CREBBP, FZD8, NFKB2, NFATC2, AXIN1, PLCB4 e PLCE1. A expressão gênica aumentada desses marcadores é indicativa de um prognóstico deficiente em relação à Craniossinostose.
[078] Métodos são fornecidos em que a perturbação da função de osteoblasto e/ou osteoclasto indica prognóstico deficiente. A perturbação da função pode ser identificada medindo-se o nível de expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores. Para alguns dos biomarcadores aqui divulgados, o alto nível de expressão/atividade indica prognóstico deficiente, enquanto para outros biomarcadores, o baixo nível de expressão/atividade indica prognóstico deficiente. Os termos “alto” e “baixo” são termos relativos. Entretanto, um especialista reconhecerá que para biomarcadores onde o alto nível de expressão/atividade indica prognóstico deficiente, o alto nível de expressão/atividade se refere a níveis que, e.g., são significativamente aumentados em relação aos níveis observados em sujeitos que não têm um prognóstico deficiente (e.g., sujeitos saudáveis ou sujeitos que desenvolveram sintomas leves) e/ou são semelhantes (ou diminuídos) em relação aos níveis observados em sujeitos que têm um prognóstico deficiente. Reciprocamente, um especialista reconhecerá que para os biomarcadores onde o baixo nível de expressão/atividade indica prognóstico deficiente, o baixo nível de expressão/atividade se refere a níveis que, e.g., são significativamente diminuídos em relação aos níveis observados em sujeitos que não têm um prognóstico deficiente (e.g., sujeitos saudáveis ou sujeitos que desenvolveram sintomas leves) e/ou são semelhantes (ou aumentados) em relação aos níveis observados em sujeitos que têm um prognóstico deficiente.
[079] Em modalidades exemplificativas, a expressão e/ou atividade de um ou mais de os biomarcadores de uma amostra é comparada com um valor de referência. Como é claro para um especialista, o valor de referência não precisa ser determinado separadamente para cada indivíduo. Em algumas modalidades, um valor pode ser determinado inicialmente e usado como uma comparação para testes posteriores. Em algumas modalidades, o valor de referência pode ser o nível de expressão/atividade do biomarcador determinado em uma amostra comparável (e.g., do mesmo tipo de tecido que o tecido testado, tal como sangue ou soro), de um saudável, i.e., indivíduo negativo para ZIKV (preferivelmente de idade compatível). Além disso, um pool ou uma população de sujeitos saudáveis pode ser usada e o valor de referência pode ser um médio ou uma média das medições da população. Esse valor de referência é referido aqui como um valor de referência de bom prognóstico, visto que os sujeitos saudáveis (em média) não têm perturbações no metabolismo ósseo e não estão em risco para complicações devido a essas perturbações. Em algumas modalidades, o valor de referência é de um indivíduo positivo para ZIKV (preferivelmente de idade compatível) ou um pool ou população de sujeitos positivos para ZIKV. Em algumas modalidades, o valor de referência é de um indivíduo positivo para ZIKV (preferivelmente de idade compatível) ou um pool ou população de sujeitos positivos para ZIKV que desenvolveram um sintoma particular ou desenvolveram uma severidade de sintoma particular. Por exemplo, os níveis de expressão/atividade podem ser medidos em sujeitos positivos para ZIKV. O desenvolvimento de sintomas e progressão da doença podem ser monitorados e os sujeitos podem então serem estratificados com base no desenvolvimento/severidade do sintoma. Um valor de referência pode ser determinado, o qual está ligado aos níveis de expressão/atividade de sujeitos que desenvolveram posteriormente sintomas leves. Esse valor de referência é referido aqui como um valor de referência de bom prognóstico. Um valor de referência pode ser determinado, o qual está ligado aos níveis de expressão/atividade de sujeitos que desenvolveram posteriormente, e.g., sintomas severos. Esse valor de referência é referido aqui como um valor de referência de prognóstico deficiente.
[080] Em algumas modalidades, os biomarcadores são fornecidos, em que um aumento na expressão/atividade indica prognóstico deficiente. Um aumento significativo no nível de expressão e/ou atividade de um biomarcador na amostra em comparação com um valor de referência de bom prognóstico (e.g., valor obtido de sujeitos saudáveis), ou diminuição ou nível semelhante em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente (e.g., valor obtido dos sujeitos infectados por ZIKV que desenvolveram posteriormente sintomas severos) indica que o indivíduo tem um prognóstico deficiente. Em algumas modalidades, os biomarcadores são fornecidos, em que uma diminuição na expressão/atividade indica prognóstico deficiente. Uma diminuição significativa no nível de expressão e/ou atividade de um biomarcador na amostra em comparação com um valor de referência de bom prognóstico, ou aumento ou nível semelhante em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente, indica que o indivíduo tem um prognóstico deficiente.
[081] Em algumas modalidades, o sintoma é craniossinostose. Embora complicações graves tenham sido observadas no caso de infecção por ZIKV durante a gravidez, nem todos os bebês afetados apresentarão craniossinostose, nem todos bebês apresentarão o mesmo nível de craniossinostose. Os biomarcadores aqui divulgados são úteis em métodos para determinar o risco de um feto infectado por ZIKV desenvolver craniossinostose. É entendido por um especialista que estar em risco de desenvolver craniossinostose indica que o indivíduo tem um alto risco de desenvolver craniossinostose que uma população de indivíduos de idade compatível, ou melhor, o indivíduo tem um risco aumentado em relação à média de desenvolver craniossinostose. Os biomarcadores aqui divulgados também são úteis em métodos para determinar o risco de um feto infectado por ZIKV desenvolver uma forma severa de craniossinostose. Um especialista está bem ciente das diferenças na severidade de craniossinostose. Por exemplo, as formas mais brandas de craniossinostose envolvem o fechamento prematuro de apenas uma das quatro suturas.
[082] Em algumas modalidades, o prognóstico se refere ao risco de um feto desenvolver craniossinostose. Em algumas modalidades, os biomarcadores são fornecidos, em que uma diminuição na expressão/atividade indica prognóstico deficiente. Em uma modalidade exemplificativa, uma diminuição significativa no nível de expressão e/ou atividade de tal biomarcador na amostra em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou um aumento significativo ou nível semelhante em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente, indica que o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver craniossinostose. A adetecção/previsão precoce é importante para a craniossinostose pois, quando detectada em tempo hábil, pode ser tratada. Em algumas modalidades, os biomarcadores são fornecidos, em que um aumento na expressão/atividade indica prognóstico deficiente. Em uma modalidade exemplificativa, um aumento significativo no nível de expressão e/ou atividade de tal biomarcador na amostra em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou uma diminuição significativa ou nível semelhante em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente, indica que o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver craniossinostose. Em algumas modalidades, o valor de referência de bom prognóstico é de um indivíduo negativo para ZIKV ou pool de indivíduos ou de um indivíduo positivo para ZIKV ou pool de indivíduos que não desenvolveram craniossinostose. Em algumas modalidades, o valor de referência de prognóstico deficiente é de um indivíduo positivo para ZIKV ou pool de indivíduos que desenvolveram craniossinostose.
[083] Em algumas modalidades, o prognóstico se refere à severidade de craniossinostose que um feto infectado por ZIKV desenvolverá. Em modalidades exemplificativas, a expressão e/ou atividade de um ou mais de os biomarcadores de uma amostra é comparada com um valor de referência. Em algumas modalidades, os biomarcadores são fornecidos, em que um aumento na expressão/atividade indica prognóstico deficiente. Em uma modalidade exemplificativa, um aumento significativo no nível de expressão e/ou atividade de tal biomarcador na amostra em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou uma diminuição significativa ou nível semelhante em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente, indica que o indivíduo está em risco de desenvolver uma forma severa de craniossinostose. Em algumas modalidades, os biomarcadores são fornecidos, em que uma diminuição na expressão/atividade indica prognóstico deficiente. Em uma modalidade exemplificativa, uma diminuição significativa no nível de expressão e/ou atividade de tal biomarcador na amostra em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou um aumento significativo ou nível semelhante em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente, indica que o indivíduo está em risco de desenvolver uma forma severa de craniossinostose. Em algumas modalidades, o valor de referência de bom prognóstico é de um indivíduo negativo para ZIKV ou pool de indivíduos ou de um indivíduo positivo para ZIKV ou pool de indivíduos que não desenvolveram ou desenvolveram apenas sintomas leves de craniossinostose. Em algumas modalidades, o valor de referência de prognóstico deficiente é de um indivíduo positivo para ZIKV ou pool de indivíduos que desenvolveram craniossinostose severa.
[084] Preferivelmente, o um ou mais biomarcadores para prognosticar o risco de desenvolver e a severidade de craniossinostose são selecionados de: - IFNγ e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade diminuída em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou aumentada ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - fosfatase alcalina (ALP) e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade aumentada em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou diminuída ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - osteocalcina e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade aumentada em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou diminuída ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - a razão RANKL/OPG, e uma razão diminuída em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou aumentada ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - IL-6 e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade diminuída em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou aumentada ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - IL-1 beta e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade diminuída em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou aumentada ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - CTX-I e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade diminuída em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou aumentada ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - DPD e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade diminuída em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou aumentada ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - um marcador da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, preferivelmente FGFR2, ou selecionado de FGFR2, FGF18 e ERF e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade aumentada em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou diminuída ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - um marcador da via de sinalização de BMP, preferivelmente BMP4, ou selecionado de AMH, FST ou BMP2, o mais preferivelmente AMH e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade aumentada em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou diminuída ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; e - um marcador da via de sinalização de Wnt, preferivelmente selecionado de SOX9, SOX4 e SOX15 e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade aumentada em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou diminuída ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente.
[085] Em algumas modalidades, o prognóstico se refere à severidade de artralgia ou osteoporose que um indivíduo infectado por ZIKV vai desenvolver. Em algumas modalidades, os biomarcadores são fornecidos, em que uma diminuição na expressão/atividade indica prognóstico deficiente. Em uma modalidade exemplificativa, uma diminuição significativa no nível de expressão e/ou atividade de tal biomarcador na amostra em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou um aumento significativo ou nível semelhante em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente, indica que o indivíduo tem o risco de desenvolver uma forma severa de artralgia ou osteoporose. Em algumas modalidades, os biomarcadores são fornecidos, em que um aumento na expressão/atividade indica prognóstico deficiente. Em uma modalidade exemplificativa, um aumento significativo no nível de expressão e/ou atividade de tal biomarcador na amostra em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou um aumento significativo ou nível semelhante em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente, indica que o indivíduo tem o risco de desenvolver uma forma severa de artralgia ou osteoporose. Em algumas modalidades, o valor de referência de bom prognóstico é de um indivíduo negativo para ZIKV ou pool de indivíduos ou de um indivíduo positivo para ZIKV ou pool de indivíduos que não desenvolveram ou desenvolveram apenas sintomas leves de artralgia ou osteoporose. Em algumas modalidades, o valor de referência de prognóstico deficiente é de um indivíduo positivo para ZIKV ou pool de indivíduos que desenvolveram artralgia ou osteoporose severa.
[086] Preferivelmente, o um ou mais biomarcadores para prognosticar a severidade de artralgia ou osteoporose são selecionados de: - IFNγ e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade aumentada em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou diminuída ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - um marcador da via de sinalização do interferon tipo I, preferivelmente selecionado de MX1, OAS1, G1P3, IFIT1, G1P2 e IFIT3 e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade aumentada em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou diminuída ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - fosfatase alcalina (ALP) e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade diminuída em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou aumentada ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - osteocalcina e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade diminuída em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou aumentada ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - a razão RANKL/OPG, e uma razão aumentada em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou diminuída ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - IL-6 e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade aumentada em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou diminuída ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - IL-1 beta e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade aumentada em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou diminuída ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - CTX-I e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade aumentada em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou diminuída ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - DPD e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade aumentada em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou diminuída ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - um marcador da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, preferivelmente FGFR2 e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade diminuída em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou aumentada ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; - um marcador da via de sinalização de BMP, preferivelmente BMP4 e,
preferivelmente, a expressão e/ou atividade diminuída em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou aumentada ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente; e - um marcador da via de sinalização de Wnt e, preferivelmente, a expressão e/ou atividade diminuída em comparação com um valor de referência de bom prognóstico ou aumentada ou sem mudança na expressão e/ou atividade em comparação com um valor de referência de prognóstico deficiente indica prognóstico deficiente.
[087] Os métodos e usos aqui divulgados são úteis para determinar o prognóstico de um indivíduo infectado com ZIKV. Pelo menos duas linhagens geograficamente distintas de ZIKV foram relatadas, isto é, a cepa Africana e a Asiática. Os métodos de diagnóstico para detectar a infecção por vírus Zika são conhecidos por um especialista e incluem, e.g., a detecção de RNA viral de Zika em uma amostra e a detecção de anticorpos produzidos por um indivíduo infectado contra o vírus Zika. Ver Sharma e Lal, Frontiers in Microbiology 2017 8: 110 e Singh et al. Frontiers in Microbiology 2018: 2677 para uma revisão de diagnóstico e transmissão de ZIKV. Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos incluem uma etapa de determinar que um indivíduo está infectado com ZIKV. Quando o indivíduo é um neonato, esses métodos incluem determinar se a mãe e/ou neonato está infectado com ZIKV. Como entendido por um especialista, os métodos aqui descritos não exigem que um diagnóstico definitivo de infecção por ZIKV deva ser estabelecido. Em vez disso, esses métodos podem ser realizados se um indivíduo é suspeito de infecção por ZIKV com base em, e.g., sintomas iniciais ou contato com indivíduos infectados. Assim, “indivíduos infectados com ZIKV” como aqui usado também inclui indivíduos suspeitos de estarem infectados por ZIKV.
[088] A expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores é determinada a partir de uma amostra (i.e., uma amostra biológica). Preferivelmente, a expressão e/ou atividade é determinada in vitro. Em algumas modalidades, a amostra é um fluido biológico (e.g., sangue, urina, saliva, fluido cerebrospinal (CSF), fluido sinovial, sêmen, fluido linfático, fluido amniótico).
[089] Os métodos aqui descritos se referem a determinar a expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores. Não é necessário determinar a quantidade absoluta de proteína biomarcadora em uma amostra. Em vez disso, como entendido por um especialista na técnica, o nível de expressão e/ou atividade do biomarcador pode ser comparado entre um indivíduo e um valor de referência e, portanto, um nível de expressão relativo pode ser determinado.
[090] Em algumas modalidades, o nível de expressão do biomarcador se refere a determinar o nível de proteína do biomarcador em uma amostra. Em algumas modalidades, um agente de ligação é usado para ligar e detectar um biomarcador aqui divulgado. Preferivelmente, a etapa de determinar o nível de um biomarcador também pode ser expressada como determinar a quantidade de ligação de um agente de ligação à dita amostra biológica de um indivíduo.
[091] Agentes de ligação incluem anticorpos bem como agentes de ligação não imunoglobulina, tais como ligantes peptídicos derivados de exibição de fago e mímicos de anticorpos, e.g., affibodies, tetranectinas (CTLDs), adnectinas (monobodies), anticalinas, DARPins (anquirinas), avímeros, iMabs, microbodies, aptâmeros peptídicos, domínios Kunitz, aptâmeros e afilinas.
[092] Em algumas modalidades, a expressão da proteína é determinada em um imunoensaio. Imunoensaios adequados incluem, e.g., radioimunoensaio, ELISA (ensaio de imunoabsorção ligado a enzima), imunoensaio “sandwich”, ensaio imunoradiométrico, reação de precipitação de difusão em gel, ensaio de imunodifusão, reação de precipitação, ensaio de aglutinação (e.g., ensaio de aglutinação em gel, ensaio de hemaglutinação, etc.), ensaio de fixação de complemento, ensaio de imunofluorescência, ensaio de proteína A e ensaio de imunoeletroforese. Além do uso de ensaios com base em anticorpo, ensaios usando outros compostos de ligação de biomarcador podem ser usados. Por exemplo, um peptídeo de ligação de biomarcador pode ser imobilizado em um suporte sólido, tal como um chip. Uma amostra biológica é passada sobre o suporte sólido. O biomarcador ligado é então detectado usando qualquer método adequado, tal como ressonância plasmônica de superfície (SPR) (Ver e.g., WO 90/05305, aqui incorporado por referência).
[093] Anticorpos que se ligam a um epítopo particular podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, anticorpos policlonais podem ser feitos pelo método convencional de imunizar um mamífero (e.g., coelhos, camundongos, ratos, ovelhas, cabras). Os anticorpos policlonais são então contidos no soro dos animais imunizados e pode ser isolado usando procedimentos padrão (e.g., cromatografia de afinidade, imunoprecipitação, cromatografia de exclusão de tamanho e cromatografia de troca iônica). Os anticorpos monoclonais podem ser feitos pelo método convencional de imunização de um mamífero, seguida por isolamento de células B do plasma que produzem os anticorpos monoclonais de interesse e fusão com uma célula de mieloma (ver, e.g., Mishell, B. B., et al., Selected Methods In Cellular Immunology, (W.H. Freeman, ed.) São Francisco (1980)).
[094] Em algumas modalidades, a expressão da proteína é determinada incluindo a detecção de fragmentos peptídicos dos ditos biomarcadores. Fragmentos peptídicos são entendidos como tendo de 10 a 100 aminoácidos em comprimento, preferivelmente de 10 a 50 aminoácidos em comprimento. Fragmentos peptídicos podem ser detectados por, e.g. espectroscopia de massa. A espectroscopia de massa permite a detecção e quantificação de um analito em virtude de seu peso molecular.
[095] Determinar o nível de expressão também inclui determinar a expressão de ácido nucleico. Preferivelmente, o ácido nucleico é RNA, tal como mRNA ou pré- mRNA. Como é entendido por um especialista, o nível de expressão de RNA determinado pode ser detectado diretamente ou pode ser determinado indiretamente, por exemplo, gerando-se primeiramente cDNA e/ou amplificando-se o RNA/cDNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é purificado da amostra. O nível de expressão de ácido nucleico pode ser determinado por qualquer método conhecido na técnica incluindo RT-PCR, PCR quantitativo, Northern blotting, sequenciamento genético, em particular, sequenciamento de RNA, e as técnicas de perfil de expressão gênica. Em algumas modalidades, o nível de ácido nucleico é determinado usando um microarray.
[096] Em algumas modalidades, determinar o nível de expressão do biomarcador compreende ainda normalizar o nível de expressão do dito biomarcador. Esses métodos são bem conhecidos por um especialista e dependerão do método de medição de proteína/ácido nucleico usado. Tipicamente, a expressão de uma proteína/mRNA de referência é determinada em paralelo à expressão do biomarcador. O nível de expressão normalizado do dito biomarcador pode ser determinado como a razão do biomarcador para a proteína de referência. Proteínas de referência preferidas incluem proteínas de manutenção (housekeeping) tais como actina, beta- tubulina e Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH). A normalização também pode ser realizada por outros métodos conhecidos, como normalizando o nível de expressão pelo número total de células. Preferivelmente, o nível de expressão do indivíduo e o valor de referência são normalizados para permitir a comparação direta.
[097] A divulgação também fornece kits que podem ser usados nos métodos aqui descritos. Em particular, os ditos kits são úteis para determinar o prognóstico de um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV). Preferivelmente, os kits são úteis para prognosticar os efeitos da infecção por ZIKV no metabolismo ósseo e sintomas resultantes do metabolismo ósseo perturbado. Preferivelmente, os kits são úteis para determinar o prognóstico compreendendo prognosticar a severidade de sintomas (e.g., artralgia, osteoporose ou craniossinostose). Em algumas modalidades os kits compreendem pares de iniciadores para amplificar os marcadores aqui divulgados.
Preferivelmente, os kits compreendem pares de iniciadores para amplificar pelo menos um, pelo menos dois ou pelo menos três dos marcadores aqui divulgados. Em algumas modalidades, os kits compreendem ainda um ou mais dos seguintes: DNA polimerase, desoxinucleosídeo trifosfato, tampão e Mg2+. Em algumas modalidades os kits compreendem cDNA controle, preferivelmente o cDNA abrange pelo menos um limite de intron-éxon tal que o dito par de iniciadores é capaz de distinguir cDNA do DNA genômico.
[098] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas, usos das ditas composições e métodos são fornecidos para tratar um indivíduo infectado com ZIKV. Em algumas modalidades, os compostos aqui divulgados podem ser usados para a fabricação de um medicamento usado para tratar um indivíduo infectado com ZIKV.
[099] Em algumas modalidades, o dito indivíduo não exibe ou exibe apenas sintomas leves de artralgia ou osteoporose. Embora não desejando estar limitado pela teoria, a divulgação prevê que a perturbação da função de osteoblasto e/ou osteoclasto contribui para o desenvolvimento e severidade de artralgia ou osteoporose. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos compreendendo tratar um indivíduo ou determinar um regime de tratamento com base no prognóstico determinado pelos métodos aqui divulgados. Em uma modalidade exemplificativa, o prognóstico de um indivíduo infectado com ZIKV é determinado, e.g., usando um ou mais biomarcadores aqui divulgados. Um indivíduo que é prognosticado como tendo um risco de desenvolver uma forma severa de artralgia pode ser tratado antes de exibir sintomas (ou sintomas significativos) de artralgia. Similarmente, um indivíduo que é prognosticado como tendo um risco de desenvolver uma forma severa de osteoporose pode ser tratado antes de exibir sintomas (ou sintomas significativos) de osteoporose. A este respeito, o tratamento de artralgia ou osteoporose também se refere à prevenção do desenvolvimento de artralgia/osteoporose ou à prevenção do desenvolvimento de uma forma severa de artralgia/osteoporose, ou à redução na velocidade de progressão de artralgia/osteoporose. De acordo, a divulgação fornece métodos para tratar um indivíduo infectado com ZIKV para artralgia ou osteoporose, compreendendo primeiramente determinar se o dito indivíduo tem probabilidade de desenvolver artralgia/osteoporose ou uma forma severa de artralgia/osteoporose. Visto que nem todos os indivíduos infectados com ZIKV desenvolvem artralgia ou osteoporose, os métodos permitem um tratamento personalizado e dirigido apenas aos indivíduos em necessidade do mesmo. Isso permite um tratamento mais precoce e evita o “tratamento excessivo” de indivíduos que não precisam desse tratamento.
[0100] Adicionalmente, um especialista está ciente dos fatores de risco da osteoporose (e.g., idade avançada, ser mulher, ter um histórico familiar de osteoporose, uso de medicamentos que causam enfraquecimento ósseo, mulher na menopausa ou, de outro modo, tendo baixos níveis de estrogênio) que podem fornecer informação adicional para determinar um prognóstico.
[0101] Em algumas modalidades, os métodos e composições são úteis para tratar um feto. Embora não desejando estar limitado pela teoria, a divulgação prevê que a perturbação da função de osteoblasto e/ou osteoclasto contribui para o desenvolvimento e severidade de craniossinostose como uma causa da microcefalia. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos compreendendo tratar um indivíduo ou determinar um regime de tratamento com base no prognóstico determinado pelos métodos aqui divulgados. Em uma modalidade exemplificativa, o prognóstico de um feto infectado com ZIKV é determinado, e.g., usando um ou mais biomarcadores aqui divulgados. Um feto que é prognosticado como tendo um risco de desenvolver craniossinostose ou uma forma severa de craniossinostose pode ser tratado antes de exibir sintomas (ou sintomas significativos) de craniossinostose ou pode ser tratado de forma mais agressiva. A este respeito, o tratamento de craniossinostose também se refere à prevenção do desenvolvimento de craniossinostose ou à prevenção do desenvolvimento de uma forma severa de craniossinostose, ou à redução na velocidade de progressão da craniossinostose. De acordo, a divulgação fornece métodos para tratar um indivíduo infectado com ZIKV para craniossinostose, compreendendo primeiramente determinar se o dito indivíduo tem probabilidade de desenvolver craniossinostose ou uma forma severa de craniossinostose. Visto que nem todos os indivíduos infectados com ZIKV vão desenvolver craniossinostose, os métodos permitem o tratamento personalizado e dirigido apenas aos indivíduos em necessidade do mesmo. Isso permite o tratamento mais precoce e evita o “tratamento excessivo” de indivíduos que não precisam desse tratamento.
[0102] A divulgação também fornece tratamentos inovadores. Em particular, esses tratamentos são úteis para alterar a função de osteoblasto e/ou osteoclasto. Tratamentos de Artralgia e Osteoporose
[0103] Em uma modalidade, a divulgação fornece composições farmacêuticas que são particularmente úteis para tratar artralgia ou osteoporose em um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV). Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que reduz a expressão ou atividade de IFN gama. O tratamento, portanto, fornece um ou mais compostos que inibem IFN gama. Em algumas modalidades, o inibidor é um anticorpo anti-IFN gama ou fragmento de ligação com o antígeno do mesmo. Anticorpos adequados são conhecidos ao especialista e exemplos no tratamento humano são também descritos em EP1975180. Em algumas modalidades, o inibidor é uma molécula de ácido nucleico que se liga a mRNA ou pré-mRNA de IFN gama, preferivelmente o dito inibidor é um oligonucleotídeo antisense, miRNA ou siRNA. Em algumas modalidades, o inibidor é um glucocorticoide. Glucocorticoides, em particular, dexametasona, são conhecidos inibir a sinalização de IFN-gama (ver, e.g., Hu et al. J Immunol. 2003 70:4833-9). Em uma outra modalidade, o tratamento reduz a sinalização de interferon tipo I. Glucocorticoides podem ser usados para reduzir a sinalização de interferon tipo I.
[0104] Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que aumenta a expressão ou atividade de fosfatase alcalina (ALP). É relatado que a atividade enzimática reduzida de ALP leva à hipofosfatasia em combinação com hipercalcemia e defeitos esqueléticos (Mochizuki 2000 Eur J Pediatr). Restaurar a atividade enzimática ou expressão de ALP pode ser uma estratégia potencial para restaurar desenvolvimento ósseo saudável ou homeostase. Preferivelmente, em que o um ou mais compostos são uma terapia de substituição de enzima ALP, tal como alfasfotase (StrensiqTM). Em algumas modalidades, o tratamento compreende fornecer um indivíduo com ALP ou um ácido nucleico que codifica ALP. Proteína humana exemplar e sequências de mRNA de ALP são aqui descritas.
[0105] Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que aumenta a expressão ou atividade de osteocalcina. A osteocalcina é uma proteína que é secretada por osteoblastos e regula a remodelação óssea e metabolismo energético. A proteína compreende um domínio Gla, que pode se ligar a cálcio e hidroxiapatite. Os níveis de osteocalcina são usados como um índice para a renovação óssea ativa. O aumento dos níveis de expressão de Osteocalcina pode ser uma estratégia potencial para restaurar o desenvolvimento ósseo saudável ou homeostase. Em algumas modalidades, o tratamento compreende fornecer um indivíduo com osteocalcina ou um ácido nucleico que codifica osteocalcina. Proteína humana exemplar e sequências de mRNA de osteocalcina são aqui descritas.
[0106] Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que reduz a razão RANKL/OPG. O tratamento, portanto, fornece um ou mais compostos que inibem RANKL. Em algumas modalidades, o inibidor é um anticorpo anti-RANKL ou fragmento de ligação com o antígeno do mesmo. Preferivelmente, o anticorpo é denosumabe. Em algumas modalidades, o inibidor é uma molécula de ácido nucleico que se liga a mRNA ou pré-mRNA de RANKL, preferivelmente o dito inibidor é um oligonucleotídeo antisense, miRNA ou siRNA.
[0107] Em algumas modalidades, o tratamento compreende fornecer um indivíduo com OPG ou um ácido nucleico que codifica OPG. Proteína humana exemplar e sequências de mRNA de OPG são aqui descritas.
[0108] Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que reduz a expressão ou atividade de IL-6. O tratamento, portanto, fornece um ou mais compostos que inibem IL-6. Em algumas modalidades, o inibidor é um anticorpo anti- IL-6 ou fragmento de ligação com o antígeno do mesmo. Preferivelmente, o anticorpo é siltuximabe. Preferivelmente, o anticorpo é olokizumabe. Preferivelmente, o anticorpo é elsilimomabe. Preferivelmente, o anticorpo é clazakizumabe. Preferivelmente, o anticorpo é sirukumabe. Em algumas modalidades, o inibidor é uma molécula de ácido nucleico que se liga a mRNA ou pré-mRNA de IL-6, preferivelmente o dito inibidor é um oligonucleotídeo antisense, miRNA ou siRNA.
[0109] Em algumas modalidades, o inibidor é um anticorpo receptor anti-IL-6 ou fragmento de ligação com o antígeno do mesmo. Preferivelmente, o anticorpo é tocilizumabe. Preferivelmente, o anticorpo é Sarilumabe.
[0110] Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que reduz a expressão ou atividade de IL-1 beta. O tratamento, portanto, fornece um ou mais compostos que inibem IL-1 beta. Em algumas modalidades, o inibidor é um anti-IL-1 beta; anticorpo ou fragmento de ligação com o antígeno do mesmo. Preferivelmente, o anticorpo é canaquiem umabe. Em algumas modalidades, o inibidor é uma molécula de ácido nucleico que se liga a mRNA ou pré-mRNA de IL-1 beta, preferivelmente o dito inibidor é um oligonucleotídeo antisense, miRNA ou siRNA.
[0111] Em algumas modalidades, o inibidor de sinalização de IL-1 é um antagonista receptor de IL-1, preferivelmente anacinra. Em algumas modalidades, o inibidor de sinalização de IL-1 é um chamariz de receptor solúvel, preferivelmente rilonacept.
[0112] Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que aumenta a expressão ou atividade da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos. Em algumas modalidades, o tratamento compreende fornecer um indivíduo com FGFR2 ou um ácido nucleico que codifica FGFR2. Proteína humana exemplar e sequências de mRNA de FGFR2 são aqui descritas. Em algumas modalidades, o tratamento compreende ativar a via FGFR com ligantes para o receptor FGFR2. Por exemplo, fatores de crescimento fibroblástico (FGF), tais como FGF1 e FGF2. Em algumas modalidades, o tratamento compreende ativar o receptor FGFR2 mediando- se a dimerização do receptor, por exemplo, por anticorpos que estimulam a dimerização.
[0113] Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que aumenta a expressão ou atividade da via de sinalização de BMP. Em algumas modalidades, o tratamento compreende fornecer um indivíduo com BMP2, BMP4, folistatina ou um ácido nucleico que codifica BMP2, BMP4 ou folistatina. Proteína humana exemplar e sequências de mRNA de BMP4, são aqui descritas. Em algumas modalidades, o tratamento compreende ativar a via BMP com ativadores de moléculas pequenas, por exemplo, isoliquiritigenina, 4’-hidroxichalcona, apigenina e/ou diosmetina (Vrijens et al. 2013 Plos one) ou Ventromorfinas (Genthe et al. 2017 ACS Chem Biol).
[0114] Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que aumenta a expressão ou atividade da via de sinalização de Wnt. Em algumas modalidades, o tratamento compreende fornecer um indivíduo com um Wnt (preferivelmente Wnt3a ou Wnt5) ou um ácido nucleico que codifica um Wnt. Em algumas modalidades, o tratamento compreende fornecer CHIR99021, para inibir a GSK3 cinase. Em algumas modalidades, o tratamento compreende fornecer cloreto de lítio. Em algumas modalidades, o tratamento compreende fornecer agonista Wnt 1.
[0115] Uma sequência humana exemplificativa de WNT3A é como se segue:
MAPLGYFLLLCSLKQALGSYPIWWSLAVGPQYSSLGSQPILCASIPGLVPKQ LRFCRNYVEIMPSVAEGIKIGIQECQHQFRGRRWNCTTVHDSLAIFGPVLDKATRES AFVHAIASAGVAFAVTRSCAEGTAAICGCSSRHQGSPGKGWKWGGCSEDIEFGGM VSREFADARENRPDARSAMNRHNNEAGRQAIASHMHLKCKCHGLSGSCEVKTCW WSQPDFRAIGDFLKDKYDSASEMVVEKHRESRGWVETLRPRYTYFKVPTERDLVY YEASPNFCEPNPETGSFGTRDRTCNVSSHGIDGCDLLCCGRGHNARAERRREKCR CVFHWCCYVSCQECTRVYDVHTCK.
[0116] A sequência de mRNA correspondente pode ser encontrada no GenBank como Sequência de Referência do NCBI: NM_033131.3 (23 de abril de 2018).
[0117] Uma sequência humana exemplificativa de WNT5A é como se segue:
MKKSIGILSPGVALGMAGSAMSSKFFLVALAIFFSFAQVVIEANSWWSLGM NNPVQMSEVYIIGAQPLCSQLAGLSQGQKKLCHLYQDHMQYIGEGAKTGIKECQYQ FRHRRWNCSTVDNTSVFGRVMQIGSRETAFTYAVSAAGVVNAMSRACREGELSTC GCSRAARPKDLPRDWLWGGCGDNIDYGYRFAKEFVDARERERIHAKGSYESARIL MNLHNNEAGRRTVYNLADVACKCHGVSGSCSLKTCWLQLADFRKVGDALKEKYDS AAAMRLNSRGKLVQVNSRFNSPTTQDLVYIDPSPDYCVRNESTGSLGTQGRLCNK TSEGMDGCELMCCGRGYDQFKTVQTERCHCKFHWCCYVKCKKCTEIVDQFVCK.
[0118] A sequência de mRNA correspondente pode ser encontrada no GenBank como Sequência de Referência do NCBI: NM_003392.4 (7 de Maio de 2018).
[0119] Uma sequência humana exemplificativa de WNT1 é como se segue:
MGLWALLPGWVSATLLLALAALPAALAANSSGRWWGIVNVASSTNLLTDSK SLQLVLEPSLQLLSRKQRRLIRQNPGILHSVSGGLQSAVRECKWQFRNRRWNCPTA PGPHLFGKIVNRGCRETAFIFAITSAGVTHSVARSCSEGSIESCTCDYRRRGPGGPD WHWGGCSDNIDFGRLFGREFVDSGEKGRDLRFLMNLHNNEAGRTTVFSEMRQEC KCHGMSGSCTVRTCWMRLPTLRAVGDVLRDRFDGASRVLYGNRGSNRASRAELL RLEPEDPAHKPPSPHDLVYFEKSPNFCTYSGRLGTAGTAGRACNSSSPALDGCELL CCGRGHRTRTQRVTERCNCTFHWCCHVSCRNCTHTRVLHECL.
[0120] A sequência de mRNA correspondente pode ser encontrada no GenBank como Sequência de Referência do NCBI: NM_005430.3 (29 de março de 2018).
[0121] Em algumas modalidades, uma terapia anabólica óssea é fornecida. Em algumas modalidades, a terapia anabólica óssea compreende fornecer Esclerostina (SOST) ou uma molécula de ácido nucleico que codifica Esclerostina.
[0122] Uma sequência humana exemplificativa de SOST é como se segue
MQLPLALCLVCLLVHTAFRVVEGQGWQAFKNDATEIIPELGEYPEPPPELE NNKTMNRAENGGRPPHHPFETKDVSEYSCRELHFTRYVTDGPCRSAKPVTELVCS GQCGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVR LVASCKCKRLTRFHNQSELKDFGTEAARPQKGRKPRPRARSAKANQAELENAY.
[0123] A sequência de mRNA correspondente pode ser encontrada no GenBank como Sequência de Referência do NCBI: NM_025237.2 (16 de abril de 2018).
[0124] Outras terapias anabólicas adequadas são bem conhecidas a um especialista e incluem hormônio de crescimento, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) 1, estrôncio, fluoreto, proteína morfogenética óssea (BMP)-2, BMP-7 (i.e., proteína osteogênica-1 [OP-1]), fatores de crescimento de fibroblastos básicos (bFGFs) em particular, FGF-2, e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Ver Lane e Kelman para uma revisão de terapias anabólicas ósseas (Artrite Res Ther. 2003; 5(5): 214-222. Tratamentos exemplares incluem o curto prazo ou uso intermitente de hormônio da paratireoide (PTH). Hormônio da paratireoide humana recombinante (rhPTH) aumenta massa e resistência óssea e foi usado para tratar osteoporose.
[0125] Em algumas modalidades, um inibidor da atividade de osteoclasto é fornecido. Em algumas modalidades, o inibidor da atividade de osteoclasto é um bisfosfonato ou denosumabe. Tratamentos de Craniossinostose
[0126] Em uma modalidade, a divulgação fornece composições farmacêuticas que são particularmente úteis para tratar craniossinostose em um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV). Como é claro a um especialista, os compostos e composições aqui fornecidos podem ser administrados ao indivíduo ou a um sujeito carregando o indivíduo (feto), tal como uma mãe em gestação.
[0127] Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que aumenta a expressão ou atividade de IFNγ. Em algumas modalidades, o tratamento compreende fornecer um indivíduo com IFNγ ou um ácido nucleico que codifica IFNγ. Proteína humana exemplar e sequências de mRNA de IFNγ são aqui descritas. IFN-gama recombinante humano também é comercialmente disponível (e.g., STEMCELLTM Technologies). O tratamento também inclui variantes de IFN-gama, tais como aquelas descritas na Patente U.S. 604603 tendo estabilidade aumentada.
[0128] Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que reduz a expressão ou atividade de fosfatase alcalina (ALP). O tratamento, portanto, fornece um ou mais compostos que inibem ALP. Em algumas modalidades, o inibidor é um anticorpo anti-ALP ou fragmento de ligação com o antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o inibidor é uma molécula de ácido nucleico que se liga a mRNA ou pré- mRNA de ALP, preferivelmente o dito inibidor é um oligonucleotídeo antisense, miRNA ou siRNA.
[0129] Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que reduz a expressão ou atividade de osteocalcina. O tratamento, portanto, fornece um ou mais compostos que inibem osteocalcina. Em algumas modalidades, o inibidor é um anticorpo anti-osteocalcina ou fragmento de ligação com o antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o inibidor é uma molécula de ácido nucleico que se liga a mRNA ou pré-mRNA de osteocalcina, preferivelmente o dito inibidor é um oligonucleotídeo antisense, miRNA ou siRNA.
[0130] Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que aumenta a razão RANKL/OPG. Em algumas modalidades, o tratamento compreende fornecer um indivíduo com RANKL ou um ácido nucleico que codifica RANKL. Proteína humana exemplar e sequências de mRNA de RANKL são aqui descritas. Em algumas modalidades, o tratamento compreende fornecer um indivíduo com glucocorticoides. Glucocorticoides afetam a remodelação óssea e aumenta a expressão de RANKL (Francisco J.A. De Paula, et al. em Williams Textbook of Endocrinology (Décima terceira edição), Osteoporosis and Bone 2016)
[0131] Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que reduz a expressão ou atividade de OPG. O tratamento, portanto, fornece um ou mais compostos que inibem OPG. Em algumas modalidades, o inibidor é um anti-OPG anticorpo ou fragmento de ligação com o antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o inibidor é uma molécula de ácido nucleico que se liga a mRNA ou pré- mRNA de OPG, preferivelmente o dito inibidor é um oligonucleotídeo antisense, miRNA ou siRNA.
[0132] Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que reduz a expressão ou atividade da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos. O tratamento, portanto, fornece um ou mais compostos que inibem a via. Em algumas modalidades, o inibidor é um anticorpo anti-FGFR2 ou fragmento de ligação com o antígeno do mesmo. Por exemplo, HuGAL-FR21 é um anti-FGFR2 humanizado. Em algumas modalidades, o inibidor é uma molécula de ácido nucleico que se liga a mRNA ou pré-mRNA de FGFR2, preferivelmente, o dito inibidor é um oligonucleotídeo antisense, miRNA ou siRNA. Em algumas modalidades, o inibidor é um “armadilha de ligante de FGF” que é capaz de se ligar a e sequestrar FGFs (ver Presta et al. Pharmacol Ther. Novembro de 2017; 179:171-187 para uma revisão de armadilhas de ligante de FGF).
[0133] Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que reduz a expressão ou atividade da via de sinalização de BMP. O tratamento, portanto, fornece um ou mais compostos que inibem a via. Em algumas modalidades, o inibidor é um anticorpo anti-BMP2, BMP4 ou folistatina ou fragmento de ligação com o antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o inibidor é uma molécula de ácido nucleico que se liga a BMP2, BMP4, ou mRNA ou pré-mRNA de folistatina, preferivelmente, o dito inibidor é um oligonucleotídeo antisense, miRNA ou siRNA. Preferivelmente, o inibidor é um inibidor de molécula pequena da sinalização de BMP, preferivelmente selecionado de K02288, LDN-193189 e dorsomorfina (ver, e.g., Sanvitale et al., 2013 PLoS ONE 8(4):e62721).
[0134] Em algumas modalidades, o inibidor é Noggin, Gremlin 1, Chordin ou uma molécula de ácido nucleico que codifica Noggin, Gremlin 1 ou Chordin.
[0135] Uma sequência humana exemplificativa de Noggin é como se segue
MERCPSLGVTLYALVVVLGLRATPAGGQHYLHIRPAPSDNLPLVDLIEHPDP IFDPKEKDLNETLLRSLLGGHYDPGFMATSPPEDRPGGGGGAAGGAEDLAELDQLL RQ RPSGAMPSEIKGLEFSEGLA QGKKQRLSKKLRRKLQMWLW SQTFCPVLYA
WNDLGSRFWP RYVKVGSCFSKRSCSVPEGM VCKPSKSVHL TVLRWRCQRR GGQRCGWIPI QYPIISECKC SC (peptídeo sinal sublinhado).
[0136] A sequência de mRNA correspondente pode ser encontrada no GenBank como Sequência de Referência do NCBI: NM_005450.4 (23 de abril de 2018).
[0137] Uma sequência humana exemplificativa de Gremlin-1 é como se segue
MSRTAYTVGA LLLLLGTLLP AAEGKKKGSQ GAIPPPDKAQ HNDSEQTQSP QQPGSRNRGRGQGRGTAMPG EEVLESSQEA LHVTERKYLK RDWCKTQPLK QTIHEEGCNS RTIINRFCYGQCNSFYIPRH IRKEEGSFQS CSFCKPKKFT TMMVTLNCPE LQPPTKKKRV TRVKQCRCISIDLD.
[0138] A sequência de mRNA correspondente pode ser encontrada no
GenBank como Sequência de Referência do NCBI: NM_ O60565.1 (28 de março de 2018).
[0139] Uma sequência humana exemplificativa de Chordin é como se segue
MPSLPAPPAPLLLLGLLLLGSRPARGAGPEPPVLPIRSEKEPLPVRGAAGCT FGGKVYALDETWHPDLGEPFGVMRCVLCACEAPQWGRRTRGPGRVSCKNIKPEC PTPACGQPRQLPGHCCQTCPQERSSSERQPSGLSFEYPRDPEHRSYSDRGEPGA EERARGDGHTDFVALLTGPRSQAVARARVSLLRSSLRFSISYRRLDRPTRIRFSDSN GSVLFEHPAAPTQDGLVCGVWRAVPRLSLRLLRAEQLHVALVTLTHPSGEVWGPLI RHRALAAETFSAILTLEGPPQQGVGGITLLTLSDTEDSLHFLLLFRGLLEPRSGGLTQ VPLRLQILHQGQLLRELQANVSAQEPGFAEVLPNLTVQEMDWLVLGELQMALEWA GRPGLRISGHIAARKSCDVLQSVLCGADALIPVQTGAAGSASLTLLGNGSLIYQVQV VGTSSEVVAMTLETKPQRRDQRTVLCHMAGLQPGGHTAVGICPGLGARGAHMLLQ NELFLNVGTKDFPDGELRGHVAALPYCGHSARHDTLPVPLAGALVLPPVKSQAAGH AWLSLDTHCHLHYEVLLAGLGGSEQGTVTAHLLGPPGTPGPRRLLKGFYGSEAQG VVKDLEPELLRHLAKGMASLMITTKGSPRGELRGQVHIANQCEVGGLRLEAAGAEG VRALGAPDTASAAPPVVPGLPALAPAKPGGPGRPRDPNTCFFEGQQRPHGARWA PNYDPLCSLCTCQRRTVICDPVVCPPPSCPHPVQAPDQCCPVCPEKQDVRDLPGL PRSRDPGEGCYFDGDRSWRAAGTRWHPVVPPFGLIKCAVCTCKGGTGEVHCEKV QCPRLACAQPVRVNPTDCCKQCPVGSGAHPQLGDPMQADGPRGCRFAGQWFPE
SQSWHPSVPPFGEMSCITCRCGAGVPHCERDDCSLPLSCGSGKESRCCSRCTAH RRPAPETRTDPELEKEAEGS (peptídeo sinal sublinhado).
[0140] A sequência de mRNA correspondente pode ser encontrada no GenBank como Sequência de Referência do NCBI: NM_003741.3 (03 de outubro de 2017).
[0141] Em algumas modalidades, um tratamento é fornecido que reduz a expressão ou atividade da via Wnt. O tratamento, portanto, fornece um ou mais compostos que inibem a via. Em algumas modalidades, o inibidor é um anticorpo contra Wnt3A, Wnt5, ou agonista Wnt 1, ou fragmento de ligação com o antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o inibidor é uma molécula de ácido nucleico que se liga a Wnt3A, Wnt5, ou mRNA ou pré-mRNA de agonista Wnt 1, preferivelmente, o dito inibidor é um oligonucleotídeo antisense, miRNA ou siRNA. Em algumas modalidades, o inibidor é Dkk1 ou Esclerostina ou uma molécula de ácido nucleico que codifica Dkk1 ou Esclerostina.
[0142] Uma sequência humana exemplificativa de Dkk1 é como se segue
MMALGAAGATRVFVAMVAAALGGHPLLGVSATLNSVLNSNAIKNLPPPLGG AAGHPGSAVSAAPGILYPGGNKYQTIDNYQPYPCAEDEECGTDEYCASPTRGGDA GVQICLACRKRRKRCMRHAMCCPGNYCKNGICVSSDQNHFRGEIEETITESFGNDH STLDGYSRRTTLSSKMYHTKGQEGSVCLRSSDCASGLCCARHFWSKICKPVLKEG QVCTKHRRKGSHGLEIFQRCYCGEGLSCRIQKDHHQASNSSRLHTCQRH.
[0143] A sequência de mRNA correspondente pode ser encontrada no GenBank como Sequência de Referência do NCBI: AY359005.1 (03 de outubro de 2003).
[0144] Em algumas modalidades, o tratamento estimula a renovação óssea. Os tratamentos exemplares incluem administração crônica do hormônio da paratireoide (PTH), que leva a reabsorsão óssea.
[0145] Em algumas modalidades aqui divulgadas, os tratamentos aumentam a atividade ou expressão de uma proteína ou uma via de sinalização. Em algumas modalidades, isso é obtido fornecendo-se uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína como aqui divulgado. As proteínas para uso terapêutico podem ser isoladas e purificadas a partir de fontes naturais. Alternativamente, tais proteínas podem ser recombinantemente expressadas usando técnicas de clonagem molecular conhecidas a um especialista. As proteínas podem compreender substituições de aminoácido, e.g., para permitir a expressão solúvel em sistemas hospedeiros, para otimizar a estabilidade da proteína e/ou modular a imunogenicidade. As ditas proteínas também podem compreender epítopo ou marcadores de purificação ou ser fundidas a outras proteínas terapêuticas ou proteínas tais como Fc ou albumina sérica para propósitos farmacocinéticos. Preferivelmente, as proteínas têm uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90, pelo menos 95 ou pelo menos 99 % de identidade com as sequências aqui divulgadas. Preferivelmente, a fonte de proteína é combinada com a espécie do indivíduo, ou melhor, uma proteína humana é usada no tratamento de um ser humano.
[0146] Ácidos nucleicos que codificam as proteínas aqui divulgadas são também fornecidos. Os ácidos nucleicos podem ser ligados de maneira operável às sequências adicionais, tais como sequências promotoras, sítios de ligação ribossômica, sequências de início e parada de transcrição, sequências de início e parada de tradução, e sequências intensificadoras ou ativadoras. As sequências promotoras codificam promotores constitutivos ou induzíveis.
[0147] Os vetores compreendendo os ditos ácidos nucleicos também são fornecidos. Um “vetor” é um construto de ácido nucleico recombinante, como plasmídeo, genoma de fase, genoma de vírus, cosmídeo ou cromossomo artificial, ao qual outro segmento de DNA pode ser anexado. O termo “vetor” inclui meios virais e não virais para a introdução do ácido nucleico em uma célula in vitro, ex vivo ou in vivo. Os vetores não virais incluem plasmídeos, lipossomas, lipídeos eletricamente carregados (citofectinas), complexos DNA-proteína e biopolímeros. Os vetores virais incluem retrovírus, vírus adeno-associados, varíola, baculovírus, vaccinia, herpes simples, Epstein-Barr e vetores de adenovírus. As sequências de vetor também podem conter uma ou mais regiões regulatórias e/ou marcadores selecionáveis úteis na seleção, medição e monitoramento dos resultados de transferência de ácido nucleico.
[0148] As células compreendendo os ditos ácidos nucleicos ou vetores também são fornecidas. O método de introdução é amplamente ditado pelo tipo de célula-alvo, por exemplo, precipitação de CaPO4, fusão de lipossomas, lipofectina, eletroporação, transfecção mediada por dextrano, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, infecção viral, encapsulação do polinucleotídeo(s) em lipossomas e microinjeção direta do DNA nos núcleos. Os ácidos nucleicos podem integrar-se de forma estável no genoma da célula hospedeira ou podem existir transitoriamente ou de forma estável no citoplasma.
[0149] As proteínas podem ser produzidas através da cultura de uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão contendo ácido nucleico que codifica uma proteína. As células hospedeiras apropriadas incluem leveduras, bactérias, arqueobactérias, fungos e células de insetos e animais, incluindo células de mamíferos. Preferencialmente, as proteínas são expressas em células de mamíferos. Os sistemas de expressão de mamíferos também são conhecidos na técnica e incluem sistemas retrovirais.
[0150] O ácido nucleico que codifica a proteína também pode ser usado em terapia gênica. Em aplicações de terapia gênica, os genes são introduzidos nas células a fim de alcançar a síntese in vivo de um produto genético terapeuticamente eficaz. “Terapia gênica” inclui a terapia gênica convencional, em que um efeito duradouro é alcançado por um único tratamento, e a administração de agentes terapêuticos gênicos, que envolve a administração única ou repetida de um DNA ou mRNA terapeuticamente eficaz. A molécula de ácido nucleico é preferencialmente fornecida em um vetor viral adequado para terapia gênica. Os vetores virais incluem lentivírus, retrovírus, vírus adeno-associados (AAV), varíola, baculovírus, vaccinia, herpes simples, Epstein-Barr e vetores de adenovírus. Vectores e métodos de liberação apropriados são conhecidos por um especialista e são descritos, por exemplo, em Schlachetzki et al. Neurology, Gene therapy of the brain. (2004) 62: 1275-1281 e Richardson et al. Neurosurg Clin N Am. 20 (2): 205-10.
[0151] Há uma variedade de técnicas disponíveis para a introdução de ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo se o ácido nucleico é transferido para células em cultura in vitro ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. Técnicas adequadas para a transferência de ácido nucleico para células de mamíferos in vitro incluem o uso de lipossomas, eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano, método de precipitação com fosfato de cálcio, etc. As técnicas atualmente preferidas de transferência de genes in vivo incluem transfecção com vírus (tipicamente retrovirais) e transfecção mediada por lipossoma-proteína de revestimento viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11: 205-210 (1993)).
[0152] Em algumas modalidades, os tratamentos diminuem a atividade ou expressão de um biomarcador ou uma via de sinalização. O tratamento pode, assim, compreender o fornecimento de um ou mais inibidores de atividade e/ou expressão. O termo “inibidor” é usado no sentido mais amplo e inclui, por exemplo, qualquer molécula que parcialmente ou totalmente bloqueia, inibe ou neutraliza uma atividade biológica de um biomarcador ou reduz a expressão de mRNA de biomarcador ou proteína funcional. Os inibidores adequados incluem moléculas que se ligam especificamente às referidas proteínas e inibem suas respectivas funções ou levam à sua degradação (por exemplo, anticorpos, pequenos compostos químicos), bem como compostos que afetam a transcrição de mRNA, splicing de mRNA ou tradução de proteínas (por exemplo, oligonucleotídeos antisense e siRNA). Os inibidores incluem polipeptídeos, moléculas pequenas e inibidores baseados em ácido nucleico.
[0153] Preferencialmente, o inibidor é um anticorpo, em particular, um anticorpo antagonista ou “neutralizante”. Como aqui usado, o termo “anticorpo” inclui, por exemplo, anticorpos de ocorrência natural e não natural, anticorpos policlonais e monoclonais, anticorpos quiméricos e anticorpos totalmente sintéticos e seus fragmentos, tais como, por exemplo, os fragmentos Fab’, F(ab’)2, Fv ou Fab, ou outro antígeno que reconhece fragmentos de imunoglobulina. Os métodos de preparação de anticorpos são bem conhecidos na técnica e muitos anticorpos adequados estão disponíveis comercialmente. Preferencialmente, os anticorpos aqui divulgados incluem fragmentos de ligação ao antígeno (por exemplo, fragmentos Fab’, F(ab’)2, Fv ou Fab).
[0154] Preferencialmente, o inibidor é uma molécula de ácido nucleico, em particular, uma molécula que causa a degradação da ou inibe a função, transcrição, ou tradução do biomarcador de uma maneira específica da sequência. Moléculas de ácido nucleico exemplares incluem aptâmeros, siRNA, microRNA artificial, RNA ou RNAi interferente, dsRNA, ribozimas, oligonucleotídeos antisense e cassetes de expressão de DNA que codificam as referidas moléculas de ácido nucleico.
[0155] Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é um oligonucleotídeo antisense. Os oligonucleotídeos anti-sentido (ASO) geralmente inibem o seu alvo ligando-se ao mRNA alvo e bloqueando estericamente a expressão pela obstrução do ribossomo. ASOs também podem ser usados para “salto de exon”. Os ASOs também podem inibir seu alvo ligando-se ao mRNA alvo, formando assim um DNA-RNA híbrido que pode ser uma substância para RNase H. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é uma molécula de RNAi, i.e., molécula de interferência de RNA. As moléculas de RNAi preferidas incluem siRNA, shRNA e miRNA artificial. Métodos para projetar e produzir inibidores de ácido nucleico adequados são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Crooke et al. “RNA- Targeted Therapeutics” 2018 Cell Metabolism 27: 714-739 para uma revisão sobre inibidores de ácido nucleico.
[0156] Os inibidores da molécula de ácido nucleico podem ser quimicamente sintetizados e fornecidos diretamente às células de interesse. O composto de ácido nucleico pode ser fornecido a uma célula como parte de um veículo de liberação de genes. Tal veículo é preferencialmente um lipossoma ou um veículo de liberação de gene viral. Os lipossomas são bem conhecidos na técnica e muitas variantes estão disponíveis para fins de transferência de genes.
[0157] As composições farmacêuticas aqui descritas compreendem preferivelmente um ou mais veículos, conservantes, solubilizantes, diluentes e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis e semelhantes. Os transportadores, conservantes, solubilizantes, diluentes e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados podem, por exemplo, ser encontrados em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Edição. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000.
[0158] Ao administrar as composições farmacêuticas a um indivíduo, a um ou mais compostos são, preferencialmente dissolvidos em uma solução que é compatível com o método de liberação. Para administração intravenosa, subcutânea, intramuscular, intratecal e/ou intraventricular, é preferível que a solução seja uma solução salina fisiológica. Preferidos são os excipientes capazes de formar complexos, vesículas e/ou lipossomas que liberam um composto como aqui definido em uma vesícula ou lipossoma através de uma membrana celular. Excipientes adequados são conhecidos na técnica.
[0159] Os níveis de dosagem das composições farmacêuticas podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um determinado indivíduo, evitando/minimizar a toxicidade. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto específico, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto específico a ser empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente a ser tratado e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas. Um médico ou veterinário com habilidade comum na técnica pode facilmente determinar e prescrever a quantidade eficaz da composição farmacêutica necessária.
[0160] Em algumas modalidades, um tratamento conforme divulgado neste documento compreende uma terapia de combinação. Em algumas modalidades, dois são mais compostos fornecidos como parte dos tratamentos. Os compostos podem ser administrados sequencialmente ou simultaneamente ou o tratamento pode compreender, por exemplo, um primeiro tratamento com um primeiro composto (por exemplo, abrangendo vários dias ou semanas) e um segundo tratamento com um segundo composto. Em algumas modalidades, os dois ou mais compostos são formulados em uma única composição farmacêutica.
[0161] Em algumas modalidades, os tratamentos terapêuticos divulgados neste documento compreendem ainda o monitoramento do referido tratamento usando os biomarcadores divulgados neste documento. A expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores podem ser comparadas a um valor de referência como aqui descrito ou ao nível previamente determinado no referido indivíduo (por exemplo, antes do início do tratamento). Está dentro da competência de um especialista determinar com base na expressão/atividade do biomarcador se um indivíduo está respondendo ao tratamento. Em algumas modalidades, os biomarcadores são fornecidos, em que um aumento na expressão/atividade indica mau prognóstico. Uma diminuição significativa no nível de expressão/atividade na amostra em comparação com um nível anterior, dito indivíduo, indica que o indivíduo está respondendo ao tratamento. Em algumas modalidades, são fornecidos biomarcadores, em que uma diminuição na expressão/atividade indica mau prognóstico. Um aumento significativo no nível de expressão/atividade na amostra em relação a um nível anterior, dito indivíduo, indica que o indivíduo está respondendo ao tratamento. Definições
[0162] “Indivíduo”, como aqui usado, inclui, mas não está limitado a, mamíferos, incluindo, por exemplo, um ser humano, um primata não humano, um camundongo, um porco, uma vaca, uma cabra, um gato, um coelho, um rato, uma cobaia, um hamster, um degu, um cavalo, um macaco, uma ovelha.
Preferencialmente, o indivíduo é um humano. Em algumas modalidades, o indivíduo em um feto humano. Preferencialmente, o sujeito que carrega um feto (i.e., o indivíduo) é uma mãe em gestação.
[0163] Uma “significativa” alteração de um valor, como aqui usado, pode referir-se a uma diferença, que é reprodutível ou estatisticamente significativa, como determinado usando métodos estatísticos que são apropriados e bem conhecidos na técnica, geralmente com um valor de probabilidade de menos de cinco por cento de chance de a mudança ser devido a variação aleatória. Preferencialmente, um aumento significativo é pelo menos 20, pelo menos 40 ou pelo menos 50 % maior do que o valor de referência. Está bem ao alcance de um especialista determinar a quantidade de aumento ou semelhança que é considerada significativa.
[0164] Como aqui usado, “compreender” e suas conjugações é usado em seu sentido não limitativo para significar que os itens após a palavra estão incluídos, mas os itens não mencionados especificamente não são excluídos. Além disso, o verbo “consistir” pode ser substituído por “consistir essencialmente em”, o que significa que um composto ou composto adjunto, como aqui definido, pode compreender componente(s) adicional(is) do que aqueles especificamente identificados, os ditos componentes adicionais não alterando o característica única da invenção.
[0165] Os artigos “um” e “uma” são usados neste documento para se referir a um ou mais de um (i.e., a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento.
[0166] A palavra “aproximadamente” ou “cerca de” quando usada em associação com um valor numérico (aproximadamente 10, cerca de 10) significa preferencialmente que o valor pode ser o valor dado de 10 mais ou menos 1 % do valor.
[0167] Como aqui usado, os termos “tratamento”, “tratar”, e “tratando” referem-se a reverter, aliviar, retardar o surgimento de, ou inibir o progresso de uma doença ou transtorno, ou um ou mais dos seus sintomas, como aqui descrito. Em algumas modalidades, o tratamento pode ser administrado após um ou mais sintomas terem se desenvolvido. Em outras modalidades, o tratamento pode ser administrado na ausência de sintomas. Por exemplo, o tratamento pode ser administrado a um indivíduo suscetível antes do início dos sintomas (por exemplo, à luz de um histórico de sintomas e/ou à luz de fatores genéticos ou outros fatores de suscetibilidade). O tratamento também pode ser continuado após a resolução dos sintomas, por exemplo, para prevenir ou retardar sua recorrência. Como aqui usado, tratar um indivíduo infectado com ZIKV, preferencialmente refere-se a tratar, prevenir, retardar a progressão e/ou reduzir um ou mais sintomas da infecção. Em particular, um ou mais sintomas estão relacionados ao metabolismo ósseo, como artralgia, osteoporose e craniossinostose.
[0168] Todas as referências de patentes e literatura citadas no presente relatório descritivo são incorporadas por meio deste por referência em sua totalidade.
[0169] A invenção é ainda explicada nos exemplos seguintes. Estes exemplos não limitam o âmbito da invenção, mas servem apenas para esclarecer a invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1A Materiais e Métodos:
[0170] Culturas de células primárias: Células estromais mesenquimais derivadas de medula óssea humana (hMSCs) de dois doadores saudáveis foram adquiridas da Lonza (PT-2501). As hMSCs foram diferenciadas em osteoblastos conforme descrito anteriormente (15). Resumidamente, as hMSCs foram cultivadas em meio αMEM (Gibco, Thermofisher) suplementado com 10 % de soro fetal de bezerro inativado pelo calor (FCS, Sigma), 20 mM de Hepes (Sigma), estreptomicina/penicilina (Thermofisher) e 1,8 mM de CaCl2 (Sigma) a 37 °C e CO2 5 % em uma atmosfera umidificada. O meio no dia 3 após a semeadura (d = -3) foi suplementado com 100 mM de dexametasona (dex) e 10 mM de β-glicerofosfato para diferenciação em osteoblastos mineralizantes em 2 a 3 semanas. Os meios foram renovados duas vezes por semana. As células Vero (células epiteliais de rim de macaco verde africano, ATCC CCL-81) foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Lonza, Holanda) suplementado com 10 % de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS, Greiner Bio-One, Áustria), L-glutamina 2 mM (Lonza), bicarbonato de sódio 1 % (Lonza), Hepes 1 % (Lonza), penicilina 100 U/mL (Lonza), estreptomicina 100 µg/mL (Lonza) a 37 °C e CO2 5 % em atmosfera umidificada.
[0171] Vírus: O vírus Zika Suriname ZIKVNL00013 (ZIKVAS-Sur16) foi isolado de um paciente na Holanda (EVAg no 011V-01621) (12). O estoque de vírus usado neste estudo foi cultivado em células Vero e a passagem número 3 foi usada para o estudo atual. O título de vírus no sobrenadante foi determinado por titulações de ponto final em células Vero como descrito anteriormente (16). Resumidamente, diluições em série de dez vezes foram feitas e inoculadas em uma monocamada de células Vero em uma placa de 96 poços (2 x 104 células/poço). O efeito citopático (CPE) foi usado como lido e determinado 5 dias após a infecção (dpi), e os títulos do vírus foram calculados como a dose infectante de cultura de tecidos de 50 % (TCID50) usando o método de Spearman-Kärber (17). Uma diluição inicial de 1:10 do sobrenadante resultou em um limite de detecção de 101,5 TCID50/ml. Cinética de Replicação de ZIKV
[0172] hMSCs foram semeadas três dias antes da infecção (dia = -3). Três dias após a semeadura (dia = 0), as células pré-osteoblastos foram renovadas com meio contendo estimulantes osteogênicos. Após 6 horas de estimulação, as células foram infectadas a uma multiplicidade de infecção (moi) de 5 com ZIKV durante 1 hora a 37 °C em CO2 5 %. Após a incubação, o sobrenadante foi removido e as células foram lavadas três vezes com meio αMEM contendo FCS 10 % inativado pelo calor. Foi adicionado meio αMEM contendo FCS 10 % inativado pelo calor suplementado com 100 nM de dexametasona (dex) e β-glicerofosfato 10 mM e as células foram cultivadas por até três semanas dependendo do experimento. Os controles não infectados foram tratados e executados em paralelo. Para determinar os títulos infecciosos de ZIKV produzidos, os sobrenadantes celulares foram coletados em diferentes pontos de tempo e, após 96 horas, as células infectadas foram fixadas e coradas para ensaio de imunofluorescência (IFA) para confirmar a infecção. O sobrenadante foi armazenado a -80 °C até uso posterior. As experiências foram realizadas em triplicado com dois doadores diferentes. Microscopia de Imunofluorescência
[0173] As células infectadas do ensaio de cinética de crescimento de replicação foram fixadas com PFA 4 % no dia 4 após a infecção, permeabilizadas com etanol 70 % e foram coradas para IFA conforme descrito anteriormente (16). Resumidamente, as células após incubação com o antígeno do grupo anti-flavivírus de anticorpo monoclonal de camundongo (MAB10216) clone D1-4G2-4-15 (Millipore, Alemanha) foram coradas com IgG anti-camundongo de cabra conjugado com Alexa Fluor 488 (Life technologies, Holanda). Após a incubação, as células foram montadas em ProLong® Diamond Antifade Mountant com DAPI (Life technologies, USA). As células não infectadas e células infectadas com ZIKV coradas com anticorpo IgG2a de isotipo de camundongo (Dako, Dinamarca) foram usadas como controles negativos. As células infectadas com ZIKV foram identificadas pelo uso de um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss LSM 700 instalado em um microscópio invertido de observador Axio Z1 (Zeiss). Todas as imagens foram processadas no software Zen 2010 (Zeiss). Fosfatase Alcalina, Mineralização e Ensaios de Proteína
[0174] As medições de ALP e cálcio foram realizadas conforme descrito anteriormente (18). Resumidamente, a atividade de ALP foi determinada por uma reação enzimática, onde a conversão mediada por ALP de para-nitrofenilfosfato
(pNPP) [Sigma] em paranitrofenol (PNP) durante 10 min a 37 °C é medida a 405 nm. Para medições de cálcio, os lisados celulares foram incubados durante a noite com HCl 0,24 M a 4 °C. O teor de cálcio foi determinado colorimetricamente usando um reagente de ensaio de cálcio preparado combinando tampão de etanolamina 1 M (pH 10,6) com complexo 0-cresolftaleína 0,35 mM em uma proporção de 1:1. Os resultados de ALP foram ajustados para o conteúdo de proteína dos lisados celulares. Para medição de proteína, 200 µL de reagente de trabalho foram adicionados a 25 µL de lisado celular. A mistura foi incubada durante 30 min a 37 °C, arrefecida até à temperatura ambiente (RT) durante 10 min e a absorvância foi medida a 595 nm. Todas as medições foram realizadas usando um leitor de placas Victor2. Quantificação da Expressão de mRNA
[0175] As culturas infectadas e não infectadas com ZIKV continuamente tratadas com dexametasona a 100 mM e β-glicerolfosfato 10 mM, foram colhidas a pontos de tempo diferentes durante o período de diferenciação e maturação (dias 7, 14,18/21 após a infecção). O isolamento do RNA, a síntese de cDNA e as reações de PCR foram realizados conforme descrito anteriormente (15). Os pares de iniciadores oligonucleotídicos foram concebidos para estarem nas fronteiras do exão ou abrangendo pelo menos um intrão (Tabela 1). A expressão do gene foi corrigida para o gene Gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase de manutenção, GAPDH. Análise Estatística
[0176] As análises estatísticas foram realizadas usando o software GraphPad Prism 5.01. Todos os resultados são expressos como médias com erro padrão da média (S.E.M.). O teste t de Student e o teste U de Mann Whitney foram usados para a comparação entre dois grupos (infectados versus não infectados). O valor de P ≤ 0,05 foi considerado significativo. Resultados: Uso de modelo humano de MSC para artralgia e osteoporose:
[0177] Células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea humana (MSCs) provaram ser um modelo de formação óssea perspicaz ao estudar processos moleculares e celulares relacionados à tomada de decisão de células-tronco, diferenciação e mineralização de osteoblastos. Além dos osteoblastos, essas células podem ser direcionadas para os adipócitos e condrócitos, dependendo dos estímulos a que essas células-tronco são submetidas. Os ensaios realizados rotineiramente para estudar a diferenciação e maturação de osteoblastos incluem as análises da atividade enzimática da fosfatase alcalina, a deposição de minerais na matriz extracelular (ECM), a expressão do gene marcador e várias colorações para mineralização (Curr Protoc Stem Cell Biol. Junho de 2011; Capítulo 1). Isso indica claramente que as MSCs são pluripotentes e é esse aspecto que permite que este modelo seja empregado para estudar artralgia e osteoporose (ver também. J Cell Physiol. Junho de 2018; 233 (6): 4895-4906. Doi: 10.1002/jcp. 26298. Epub 2018, 15 de janeiro). Na verdade, a injeção intra-articular de MSCs está sendo explorada como um tratamento contra a osteoartrite (Am J Sports Med. Outubro de 2017; 45 (12): 2774-2783. Doi: 10.1177/0363546517716641. Epub 26 de julho de 2017). A infecção de MSCs no Dia 0 de cultura, portanto, representa um modelo adequado de pluripotência para estudar artralgia e osteoporose. Uso de modelo de osteoblasto humano para craniossinostose:
[0178] Quando as MSCs estão sendo estimuladas com os fatores de crescimento corretos, as células tornam-se comprometidas com os osteoblastos. Amplos estudos forneceram novas compreensões sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao processo de tomada de decisão de MSCs em relação aos osteoblastos, bem como sua diferenciação e mineralização (Stem Cell Reports. 11 de abril de 2017; 8 (4): 947-960. Doi: 10.1016/j.stemcr.2017.02.018. Epub 23 de março de 2017; JBMR Plus. 28 de abril de 2017; 1 (1): 16-26. doi: 10.1002/jbm4.10003. eCollection. Agosto de 2017; Proc Natl Acad Sci USA. 13 de outubro 2015; 112 (41):
12711-6. Doi: 10.1073/pnas.1501597112. Epub, 29 de setembro de 2015). O ponto de tempo escolhido para a nossa infecção com ZIKV para estudar a craniossinostose (Dia 7) representa uma situação em que as MSCs pluripotentes foram conduzidas para um genótipo osteoblástico homogêneo e fenótipo que representa uma cultura de formação e mineralização óssea. Este modelo é ideal para monitorar mudanças na capacidade de mineralização óssea, como é o caso da craniossinostose. A craniossinostose é tipicamente uma doença de mineralização alterada por osteoblastos, levando à fusão prematura das placas do crânio, que consistem principalmente de osteoblastos e não de outros tipos de células derivadas de MSC (Biomed Res Int. 2013; 2013: 292506. Doi: 10.1155/2013/292506. Epub 9 de maio de 2013; BMC Med Genet. 30 de maio de 2018; 19 (1): 91. Doi: 10.1186/s12881-018- 0607-8.). Portanto, nosso modelo de infecção do dia 7 reflete idealmente a situação da formação óssea no crânio e permite estudar o processo de craniossinostose. Cinética de Replicação de ZIKV
[0179] A fim de determinar se os osteoblastos são suscetíveis à infecção com ZIKV, infectamos culturas pré-osteoblastos com ZIKV em moi de 5. As culturas infectadas não mostraram qualquer efeito citopático devido à infecção com ZIKV. A infecção intracelular com ZIKV foi confirmada por IFA no dia 4 pós-infecção e o título do vírus infeccioso foi confirmado por ensaio de titulação de ponto final. O ZIKV infectou com eficiência os osteoblastos em diferenciação e produziu altos títulos infecciosos de 107 TCID50/mL em 2 dias após a infecção. A cinética de crescimento do vírus ao longo do período de diferenciação mostrou que as culturas pré-osteoblastos foram persistentemente infectadas com ZIKV e a liberação de vírions infecciosos foi observada durante o período de três semanas após a infecção para ambos os doadores (Fig; 1). ALP e Ensaio de Mineralização:
[0180] Foi determinado o efeito de infecção com ZIKV sobre a diferenciação e maturação de osteoblastos após a infecção das culturas a uma moi de 5 (d = 0), e quantificar a atividade de ALP e teores de minerais em diferentes pontos de tempo após a infecção. Em osteoblastos infectados com ZIKV, a atividade de ALP foi significativamente reduzida (valor de p <0,05) no dia 11 após a infecção em comparação com controles não infectados (Fig; 2). Além disso, a infecção com ZIKV reduziu significativamente a maturação em termos de conteúdo mineral (valor de p <0,05) em osteoblastos infectados com ZIKV em comparação com controles não infectados em pontos de tempo tardios, dias 18 e 21 após a infecção, durante a maturação. Análises de Expressão de mRNA:
[0181] Para quantificar o impacto da infecção com ZIKV nos níveis de expressão dos principais fatores de transcrição durante a infecção com ZIKV, que desempenham um papel instrumental na determinação do fenótipo dos osteoblastos, infectamos os osteoblastos com ZIKV em uma moi de 5 no dia 3 após a semeadura (d = 0). Quantificamos a expressão gênica dos principais biomarcadores para a proliferação, diferenciação, maturação e homeostase óssea dos osteoblastos em diferentes pontos de tempo pós-infecção durante a diferenciação dos osteoblastos (ver Fig. 4 e Fig. 5). A expressão gênica de ALP, fator de transcrição relacionado a Runt 2 (RUNX2, um fator de transcrição chave para a diferenciação de osteoblastos) e um mediador inflamatório clássico interleucina 6 (IL-6) foram medidos. Foi observada uma redução significativa da expressão de ALP e RUNX2 (~ 2 vezes) em osteoblastos de diferenciação infectados com ZIKV em comparação com controles não infectados (valor de p <0,05) (Fig; 3). Curiosamente, os níveis de IL-6 foram significativamente (valor de p <0,05) aumentados em osteoblastos infectados. Exemplo 1B Identificação de marcadores adicionais de prognóstico:
[0182] A cultura celular e isolamento de RNA total foi idêntica para os experimentos para gerar os dados de PCR. Usando uma abordagem imparcial, o sequenciamento de próxima geração (NGS) foi realizado para gerar listas de genes e vias celulares associadas à infecção com ZIKV no dia 0 (artralgia) e no modelo de infecção no dia 7 (craniossinostose). A metodologia foi idêntica ao que foi amplamente descrito anteriormente (J Cell Biochem. Outubro de 2014; 115 (10): 1816-28). Seguindo NGS e vários controles de qualidade, as listas de genes resultantes foram rigorosamente filtradas quanto ao nível de expressão, significância da expressão e regulação de dobra por infecção com ZIKV em comparação com as condições de controle. Dada esta restrição e limites aplicados, todos os genes fornecidos nas listas são considerados genes de alta prioridade associados às vias especificamente identificadas após a infecção com ZIKV em ambos os modelos de cultura de células.
[0183] A análise do transcriptoma do hospedeiro foi realizada em MSC infectados com ZIKV. A análise de anotação de mRNAs expressos diferencialmente resultou na identificação da via de sinalização do interferon como uma via canônica superior ativada durante a infecção com ZIKV (ver Tabela 1). Tabela 1: Alterações dobradas na expressão de genes da via de sinalização do interferon após infecção com ZIKV em osteoblastos.
Símbolo Genético Razão Log Expressada MX1 7,87 OAS1 6,94 G1P3 6,62 IFIT1 6,56 G1P2 6,11 IFIT3 5,00 IFITM1 3,85 IFI35 3,06 STAT1 2,49
TAP1 2,10 IRF9 1,98 PSMB8 1,58 IFITM3 1,36 STAT2 1,24 IRF1 1,20
[0184] A análise do transcriptoma do hospedeiro foi realizada em osteoblastos infectados com ZIKV. Após a infecção com ZIKV no dia 7, encontramos um conjunto de genes da via de sinalização FGF (ver Tabela 2), conjunto de genes da via de sinalização BMP (ver Tabela 3) e um conjunto de genes da via de sinalização Wnt (veja as Tabelas 4 e 5) que foram todas fortemente reguladas, que apontam para o aumento da osteogênese. Tabela 2: Ativação da via do FGF durante a infecção com ZIKV no dia 7 de osteoblastos.
ID do Gene Razão Log Expressada FGF18 5,746386651 ERF 4,15887107 SPRY1 2,293644343 SPRY2 1,794091326 SPRY4 1,68238207 FGF2 1,679021761 FRS2 1,638885841 FGFR1 1,574952205 FGFR2 0,860409654 FGFRL1 0,835884722 THBS1 0,805001242 FGF5 0,710632434
FGF14 0,684350501 FGFR3 0,533420967 FGF7 0,448929347 Tabela 3: Ativação da via de sinalização BMP durante a infecção com ZIKV no dia 7 de osteoblastos. A análise do transcriptoma do hospedeiro foi realizada em osteoblastos infectados com ZIKV.
ID do Gene Razão Log Expressada AMH 18,71960606 FST 4,390540238 BMP2 3,219238278 TGIF1 2,958577591 BMP8B 2,523043173 TGIF2 2,414796733 ACVR2B 2,285210792 BMP4 2,091935471 JAG2 2,003232321 INHBB 1,948417506 SMAD7 1,909490464 SMAD6 0,872045494 JAG1 0,857745974 TGFB1I1 0,714338002 NOG 0,710903417 BMP6 0,58647364 Tabela 4: Alterações dobradas na expressão de genes da via de sinalização Wnt/β-catenina após infecção com ZIKV no dia 7 de osteoblastos.
ID do Gene Mudança de Dobra SOX9 5,966976
SOX4 4,278188 SOX15 3,668016 TLE1 3,080149 SOX6 2,657372 EP300 2,637187 CREBBP 2,475981 FZD8 2,39828 SFRP2 2,39828 MEU C 2,096525 TLE3 2,067661 AXIN1 2,03637 PPP2R2C 0,495858 Tabela 5: Alterações na expressão de genes da via de sinalização Wnt/Ca2+ após infecção com ZIKV no dia 7 de osteoblastos.
ID do gene Mudança de Dobra CREBBP 2,475980582 FZD8 2,398279828 NFKB2 2,318191904 NFATC2 2,267338826 AXIN1 2,0363704 PLCB4 0,477641468 PLCE1 0,40332088 Discussão:
[0185] Seguindo a observação de que a infecção com ZIKV resultou em artralgia persistente ou recorrente e detecção de ZIKV no fluido sinovial de paciente infectado por ZIKV, é necessário investigar a influência da infecção com ZIKV na remodelação óssea e homeostase. Atualmente, um modelo ósseo in vitro biologicamente relevante para estudar a patogênese do ZIKV e complicações osteoarticulares subsequentes não está disponível. Assim, no presente estudo, investigamos a suscetibilidade dos osteoblastos à infecção com ZIKV e os efeitos da infecção na diferenciação e maturação dos osteoblastos.
[0186] As descobertas atuais estão de acordo com um estudo relatado recentemente que confirma a suscetibilidade da linhagem celular semelhante a osteoblastos humanos (HOBIT) contra duas cepas de ZIKV (asiática: PRVABC59 e africana: MR766) e produzindo 107,9 TCID50/mL de títulos de vírus infecciosos e CPE observada ao longo do período de 96 horas (14). No entanto, não observamos qualquer CPE em osteoblastos primários infectados com ZIKV por um período de 3 semanas. Essa disparidade pode ocorrer possivelmente devido às diferenças nos modelos in vitro, visto que outro estudo usou linhagem celular semelhante a osteoblastos em comparação com células de osteoblastos primários no estudo atual. Além disso, a presença e replicação de flavivírus podem não inibir completamente a síntese macromolecular da célula hospedeira, o que pode resultar em infecções persistentes não citopáticas (19). No estudo atual, a cinética de replicação da infecção com ZIKV demonstrou infecção persistente dos osteoblastos até 3 semanas após a infecção, semelhante ao CHIKV (7), que pode ser o fator contribuinte para a persistência viral nas articulações.
[0187] Em ambos os dadores, a infecção com ZIKV reduziu a diferenciação e maturação, em termos de ALP e teores de minerais, em comparação com os controles não infectados, o que sugeriu que a infecção com ZIKV influenciara o fenótipo de diferenciação dos osteoblastos em comparação com os controles. Esses ensaios funcionais fornecem pistas de que a infecção com ZIKV perturba a função dos osteoblastos, que são cruciais para a formação óssea que pode levar a patologias relacionadas ao osso devido à infecção com ZIKV. Essas descobertas foram ainda validadas pela expressão de mRNA significativamente reduzida de ALP e RUNX2 durante a diferenciação inicial (dia 7 após a infecção).
[0188] Além dos marcadores de diferenciação óssea, também observamos os níveis alterados de IL-6, uma citocina pró-inflamatória, em osteoblastos infectados com ZIKV. Em ambos os doadores foi observada uma expressão consistentemente elevada de IL-6. Vários estudos têm mostrado que a infecção com alfavírus artritogênicos, incluindo o vírus Ross River (RRV) e CHIKV, resulta em um aumento nos níveis de citocinas, particularmente os níveis de IL-6 e IL-β. Esses mediadores inflamatórios chave estimulam a indução da expressão de RANKL em culturas de osteoblastos. A relação RANKL/OPG elevada leva ao aumento da diferenciação e ativação dos osteoclastos, o que foi relatado anteriormente como aumentando a perda óssea e a inflamação das articulações durante a infecção com RRV e CHIKV (5, 7). A remodelação óssea é um processo rigidamente regulado, que requer um equilíbrio na reabsorção e formação óssea pelos osteoclastos e osteoblastos, respectivamente (20). A ruptura desse equilíbrio pode levar à remodelação óssea anormal e ao início de várias condições patológicas. A artrite resulta, em parte, da perda óssea patológica devido ao comprometimento da função dos osteoblastos. Portanto, o desequilíbrio na remodelação óssea de citocinas parácrinas e várias citocinas inflamatórias, como a IL-6, têm sido associadas à artrite (5). No estudo atual, os níveis elevados de IL-6 em osteoblastos infectados com ZIKV, semelhantes aos achados anteriores, destacaram as consequências da infecção com ZIKV no metabolismo ósseo. Em conclusão, esses dados demonstram claramente que os osteoblastos são suscetíveis à infecção com ZIKV e que a infecção resulta em diferenciação e maturação reduzidas, o que pode induzir patologias ósseas em indivíduos infectados. Referências:
[0189] 1. Wikan N, Smith DR. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. The Lancet Infectious diseases. 2016;16(7):e119-e26.
[0190] 2. Lazear HM, Diamond MS. Zika virus: new clinical syndromes and its emergence in the western hemisphere. Journal of virology. 2016;90(10):4864-75.
[0191] 3. Martines RB, Bhatnagar J, de Oliveira Ramos AM, Davi HPF, Iglezias SDA, Kanamura CT, et al. Pathology of congenital Zika syndrome in Brazil: a case series. The Lancet. 2016;388(10047):898-904.
[0192] 4. Edupuganti S, Natrajan MS, Rouphael N, Lai L, Xu Y, Feldhammer M, et al., editors. Biphasic Zika illness with rash and joint pain. Open forum infectious diseases; 2017: Oxford University Press.
[0193] 5. Chen W, Foo S-S, Rulli NE, Taylor A, Sheng K-C, Herrero LJ, et al. Arthritogenic alphaviral infection perturbs osteoblast function and triggers pathologic bone loss. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2014;111(16):6040-5.
[0194] 6. Borgherini G, Poubeau P, Jossaume A, Gouix A, Cotte L, Michault A, et al. Persistent arthralgia associated with chikungunya virus: a study of 88 adult patients on reunion island. Clinical Infectious Diseases. 2008;47(4):469-75.
[0195] 7. Noret M, Herrero L, Rulli N, Rolph M, Smith PN, Li RW, et al. Interleukin 6, RANKL, and Osteoprotegerin Expression by Chikungunya Virus– Infected Human Osteoblasts. The Journal of infectious diseases. 2012;206(3):455-7.
[0196] 8. Terrier CS-P, Gasque P. Bone responses in health and infectious diseases: A focus on osteoblasts. Journal of Infection. 2017;75(4):281-92.
[0197] 9. Jayamali W, Herath H, Kulatunga A. A young female presenting with unilateral sacroiliitis following dengue virus infection: a case report. Journal of medical case reports. 2017;11(1):307.
[0198] 10. Colombo TE, Estofolete CF, Reis AFN, da Silva NS, Aguiar ML, Cabrera EMS, et al. Clinical, laboratory and virological data from suspected ZIKV patients in an endemic arbovirus area. Journal of Clinical Virology. 2017;96:20-5.
[0199] 11. Chan JF, Choi GK, Yip CC, Cheng VC, Yuen K-Y. Zika fever and congenital Zika syndrome: an unexpected emerging arboviral disease. Journal of Infection. 2016;72(5):507-24.
[0200] 12. van der Eijk AA, van Genderen PJ, Verdijk RM, Reusken CB, Mögling R, van Kampen JJ, et al. Miscarriage associated with Zika virus infection. New England Journal of Medicine. 2016;375(10):1002-4.
[0201] 13. Bayless NL, Greenberg RS, Swigut T, Wysocka J, Blish CA. Zika virus infection induces cranial neural crest cells to produce cytokines at levels detrimental for neurogenesis. Cell host & microbe. 2016;20(4):423-8.
[0202] 14. Colavita F, Musumeci G, Caglioti C. Human Osteoblast-like Cells Are Permissive for Zika Virus Replication. The Journal of rheumatology. 2018;45(3):443-.
[0203] 15. Both T, van de Peppel HJ, Zillikens MC, Koedam M, van Leeuwen JP, van Hagen PM, et al. Hydroxychloroquine decreases human MSC‐derived osteoblast differentiation and mineralization in vitro. Journal of cellular and molecular medicine. 2018;22(2):873-82.
[0204] 16. Anfasa F, Siegers JY, van der Kroeg M, Mumtaz N, Raj VS, de Vrij FM, et al. Phenotypic differences between Asian and African lineage Zika viruses in human neural progenitor cells. mSphere. 2017;2(4):e00292-17.
[0205] 17. Kärber G. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für experimentelle pathologie und pharmakologie. 1931;162(4):480-3.
[0206] 18. Bruedigam C, Driel Mv, Koedam M, Peppel Jvd, van der Eerden BC, Eijken M, et al. Basic techniques in human mesenchymal stem cell cultures: differentiation into osteogenic and adipogenic lineages, genetic perturbations, and phenotypic analyses. Current protocols in stem cell biology. 2011:1H. 3.1-H. 3.20.
[0207] 19. Bakonyi T, Lussy H, Weissenböck H, Hornyák Á, Nowotny N. In vitro host-cell susceptibility to Usutu virus. Emerging Infectious Diseases. 2005;11(2):298.
[0208] 20. Boyce BF, Xing L. Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and remodeling. Archives of biochemistry and biophysics. 2008;473(2):139-
46. Exemplo 2:
[0209] Para demonstrar que o bloqueio de IL-6 e IL-1β durante a infecção de osteoblastos por ZIKV resultará na restauração dos níveis de expressão de RANKL/OPG, as culturas de osteoblastos serão infectadas com ZIKV e antes ou em diferentes momentos após a infecção, estas culturas serão tratadas com anticorpos neutralizantes contra IL-6, IL-1β ou uma combinação de IL-6 e IL-1β. Iremos determinar a expressão de RANKL e OPG no sobrenadante. Exemplo 3: Modelo de camundongo
[0210] Um modelo de ZIKV murino estabelecido será usado para gerar dados de translação na patogênese esquelética mediada por ZIKV pré e pós-natal. Além disso, realizaremos culturas primárias de osteoblastos e osteoclastos derivados da medula óssea.
[0211] A infecção intracerebral ZIKA de embriões pode resultar em pós-natal microcefalia. Este modelo foi usado anteriormente para estudar o desenvolvimento neural e seu papel na microcefalia. Aqui, vamos nos concentrar na hipótese alternativa de que a microcefalia é o resultado de fusão craniana prematura. Os recém-nascidos serão examinados cuidadosamente para microcefalia e outros fenótipos, como restrições de crescimento. Em diferentes pontos de tempo após a infecção, realizaremos a fenotipagem extensa do crânio e dos ossos longos de camundongos fetais e recém-nascidos após a infecção com ZIKA. Isso inclui tomografia microcomputada (µCT) para estudar ossos longos e microarquitetura de crânio e histologia para triagem de craniossinostose. Finalmente, os biomarcadores aqui divulgados serão medidos em tecidos maternos e fetais e soro em diferentes pontos de tempo pós-infecção.
[0212] A fusão da sutura craniana foi estudada em camundongos por meio da cultura de suturas cranianas posteriores antes da fusão da sutura frontal posterior, que é facilitada pela dura-máter subjacente [Bradley, JP, et al., Studies in cranial suture biology: regional dura mater determines in vitro cranial suture fusion. Plast Reconstr Surg, 1997. 100 (5): p. 1091-9; discussion; 1100-2]. Iremos explantar suturas frontais posteriores com a dura-máter subjacente com 3 semanas de idade e cultivá- las por até 30 dias in vitro. Após a infecção com ZIKV, examinaremos esses explantes por µCT (Quantum Fx) por Perkin Elmer em instalações de animais) a cada 3 dias para monitorar o processo de fusão em comparação com explantes não infectados. Além disso, faremos histologia para comparar o grau de fusão da sutura frontal posterior. Após a coleta, realizaremos estudos de expressão gênica para procurar vias de sinalização conhecidas de craniossinostose (FGF, BMP). Semelhante aos experimentos no Aim 1a, adicionaremos a essas culturas anticorpos neutralizantes ou fármacos supressores de sinalização de interferon ou compostos que inibem a sinalização de FGF e/ou BMP. Exemplo 4:
[0213] As consequências do knockdown lentiviral (usando shRNAs) ou knockout (usando Crispr-Cas9) de genes afetados pelo ZIKV serão avaliadas. Além disso, os fármacos específicos para bloquear a via de sinalização do interferon tipo I e tipo II em osteoblastos derivados de MSC e NCC após infecção com ZIKV serão testadas. Exemplo 5:
[0214] Serão avaliados os resultados ósseos e cartilaginosos em adultos e humanos fetais/recém-nascidos em uma coorte de mulheres grávidas nas Américas e no Caribe, como parte do projeto da UE ZIKAlliance. ZIKAlliance é um projeto interdisciplinar com foco global no impacto da infecção com ZIKV durante a gravidez e na história natural do ZIKV em humanos. O objetivo é incluir 10.000 participantes dos Estados Unidos, nos quais a infecção com ZIKV na mãe e no filho será monitorada de perto durante e após a gravidez. Amostras clínicas (incluindo soro materno e infantil e tecidos fetais em caso de aborto ou natimorto) estão sendo coletadas de casos com evidência de craniossinostose e/ou microcefalia e também de infecção com ZIKV.
[0215] Neste estudo, as amostras clínicas coletadas serão utilizadas para determinar os níveis de expressão/atividade de biomarcadores em pares mãe/filho, comparando amostras de crianças com ou sem craniossinostose ou outras malformações ósseas e com ou sem infecção com ZIKV.

Claims (25)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para determinar o prognóstico de um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende determinar o nível de expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores indicativos da função de osteoblasto e/ou osteoclasto em uma amostra, em que a perturbação da função de osteoblasto e/ou osteoclasto indica prognóstico deficiente do dito indivíduo.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a determinação do prognóstico compreende prognosticar a severidade de e/ou risco de desenvolver um ou mais sintomas relacionados ao metabolismo ósseo.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais biomarcadores são selecionados de um ou mais marcadores da via de sinalização do interferon tipo I, interferon gama, fosfatase alcalina, osteocalcina, a razão RANKL/OPG, IL-6, IL-1 beta, CTX-I, DPD, um ou mais marcadores da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, um ou mais marcadores da via de sinalização de BMP, um ou mais marcadores dos marcadores da via de sinalização de Wnt.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de expressão e/ou atividade de dois biomarcadores selecionados de interferon gama, um ou mais marcadores da via de sinalização do interferon tipo I, fosfatase alcalina, osteocalcina, a razão RANKL/OPG, IL-6, IL-1 beta, CTX-I, DPD, um ou mais marcadores da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, um ou mais marcadores da via de sinalização de BMP, e um ou mais marcadores dos marcadores da via de sinalização de Wnt são determinados.
5. Método para prognosticar a severidade de e/ou risco de desenvolvimento artralgia ou osteoporose em um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende determinar o nível de expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores indicativos da função de osteoblasto e/ou osteoclasto em uma amostra, em que a perturbação da função de osteoblasto e/ou osteoclasto indica prognóstico deficiente do dito indivíduo.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais biomarcadores são selecionados de um ou mais marcadores da via de sinalização do interferon tipo I, interferon gama, IL-6, fosfatase alcalina ou razão RANKL/OPG.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende: - determinar a expressão de um ou mais de MX1, OAS1, G1P3, IFIT1, G1P2, IFIT3, IFITM1, IFI35, STAT1, TAP1, IRF9, PSMB8, IFITM3, STAT2 ou IRF1; - determinar a expressão de interferon gama, - determinar a expressão de IL-6; - determinar a expressão de fosfatase alcalina e/ou - determinar a razão RANKL/OPG.
8. Método para prognosticar a severidade de e/ou risco de desenvolvimento craniossinostose em um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende determinar o nível de expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores indicativos da função de osteoblasto e/ou osteoclasto em uma amostra, em que a perturbação da função de osteoblasto e/ou osteoclasto indica prognóstico deficiente do dito indivíduo, e.g., que o indivíduo tem probabilidade de desenvolver craniossinostose.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais biomarcadores são selecionados de fosfatase alcalina, a razão RANKL/OPG, IL-6, um ou mais marcadores da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, um ou mais marcadores da via de sinalização de BMP ou um ou mais marcadores dos marcadores da via de sinalização de Wnt.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: - determinar a expressão de fosfatase alcalina, - determinar a razão RANKL/OPG; - determinar a expressão de IL-6; - determinar a expressão de FGFR2, FGF18, ERF, SPRY1, SPRY2, SPRY4, FGF2, FRS2, FGFR1, FGFR2, FGFRL1, THBS1, FGF5, FGF14, FGFR3 e/ou FGF7; - determinar a expressão de AMH, FST, BMP2, TGIF1, BMP8B, TGIF2, ACVR2B, BMP4, JAG2, INHBB, SMAD7, SMAD6, JAG1, TGFB1I1, NOG e/ou BMP6; - determinar a expressão de SOS9, SOX4, SOX15, TLE1, SOX6, EP300, CREBBP, FZD8, SFRP2, MYC, TLE3, AXIN1 e/ou PP2RC; e/ou - determinar a expressão de CREBBP, FZD8, NFKB2, NFATC2, AXIN1, PLCB4 e/ou PLCE1.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito nível de expressão e/ou atividade é comparado a um valor de referência.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que o sintoma é artralgia ou osteoporose e a amostra é do dito indivíduo.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 8 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o sintoma é craniossinostose e a amostra é do dito indivíduo ou o indivíduo é um feto e a amostra é de um sujeito carregando o feto.
14. Método para tratar um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende determinar o prognóstico do dito indivíduo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 11 a 12 e tratar um indivíduo determinado como tendo um prognóstico deficiente com um tratamento para artralgia ou osteoporose.
15. Método para tratar um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende determinar o prognóstico do dito indivíduo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, 11 ou 13, e tratar um indivíduo determinado como tendo um prognóstico deficiente com um tratamento para craniossinostose.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda obter uma amostra do dito indivíduo ou, se o indivíduo é um feto, a amostra de um sujeito carregando o feto.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que a amostra é um fluido corporal.
18. Kit adequado para determinar o prognóstico de um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), preferivelmente em que a determinação do prognóstico compreende prognosticar a severidade de sintomas, o dito kit CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos três dos seguintes: - um ou mais agentes de ligação que se ligam a IFNγ, - um ou mais agentes de ligação que se ligam à fosfatase alcalina (ALP) ou a um ou mais compostos para determinar a atividade de ALP, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a RANKL e um ou mais agentes de ligação que se ligam a OPG, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a IL-6, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a IL-1 beta, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a CTX-I, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a DPD, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a um membro da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, preferivelmente FGFR2, - um ou mais agentes de ligação que se ligam a um membro da via de sinalização de BMP, preferivelmente BMP4, e - um ou mais agentes de ligação que se ligam a um membro da via de sinalização de Wnt.
19. Composição farmacêutica que perturba a função de osteoblasto e/ou osteoclasto para o uso em prevenir ou reduzir os efeitos da perturbação do metabolismo ósseo, preferivelmente para o uso no tratamento de artralgia ou osteoporose, em um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), a dita composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de IFNγ, preferivelmente em que o um ou mais compostos são selecionados de um anticorpo neutralizante contra IFNγ e glucocorticoides; - um ou mais compostos que aumentam a expressão ou atividade de fosfatase alcalina (ALP), preferivelmente em que o um ou mais compostos são uma terapia de substituição de enzima ALP, mais preferivelmente Alfasfotase; - um ou mais compostos que reduzem a razão RANKL/OPG, preferivelmente em que o um ou mais compostos são um anticorpo contra RANKL; - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de IL-6, preferivelmente em que o um ou mais compostos são um anticorpo contra IL-6; - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de IL-1β; preferivelmente em que o um ou mais compostos são um anticorpo contra IL-1β. - um ou mais compostos que aumentam a expressão ou atividade da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, preferivelmente em que o um ou mais compostos são FGF2 ou uma molécula de ácido nucleico que codifica FGF2; - um ou mais compostos que aumentam a expressão ou atividade da via de sinalização de BMP, preferivelmente em que o um ou mais compostos são selecionados de BMP2, BMP4, folistatina e ácidos nucleicos que codificam BMP2, BMP4 e folistatina;
- um ou mais compostos que aumentam a expressão ou atividade da via de sinalização de Wnt, preferivelmente em que o um ou mais compostos são selecionados de Wnt (preferivelmente Wnt3a ou Wnt5), a molécula pequena CHIR99021 e cloreto de lítio; - um ou mais compostos que compreendem uma terapia anabólica óssea, preferivelmente, a terapia anabólica óssea compreende fornecer Esclerostina (SOST) ou uma molécula de ácido nucleico que codifica Esclerostina; ou - um ou mais inibidores da atividade de osteoclasto, preferivelmente em que o inibidor é um bisfosfato.
20. Composição farmacêutica que perturba a função de osteoblasto e/ou osteoclasto para o uso em prevenir ou reduzir os efeitos da perturbação do metabolismo ósseo, preferivelmente para o tratamento de craniossinostose, em um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), a dita composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de fosfatase alcalina (ALP) - um ou mais compostos que aumentam a razão RANKL/OPG; preferivelmente em que o um ou mais compostos são RANKL ou um ácido nucleico que codifica RANKL; - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, preferivelmente em que o um ou mais compostos são um anticorpo de FGFR neutralizante ou armadilha de FGF; - um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade da via de sinalização de BMP, preferivelmente em que o um ou mais compostos são um inibidor de molécula pequena da sinalização de BMP, preferivelmente selecionado de K02288, LDN-193189 e dorsomorfina; Noggin, Gremlin 1, Chordin ou uma molécula de ácido nucleico que codifica Noggin, Gremlin 1 ou Chordin;
- um ou mais compostos que reduzem a expressão ou atividade de Wnt, preferivelmente em que o um ou mais compostos são Dkk1 ou Esclerostina ou um ácido nucleico que codifica Dkk1 ou Esclerostina; - um ou mais compostos que estimulam a renovação óssea, preferivelmente em que o composto é hormônio da paratireoide (PTH).
21. Composição, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, CARACTERIZADA pelo fato de que o prognóstico do dito indivíduo é determinado por um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17.
22. Método para tratar um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV) para artralgia, o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende determinar o nível de expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores indicativos da função de osteoblasto e/ou osteoclasto em uma amostra, em que o um ou mais biomarcadores são selecionados de um ou mais marcadores da via de sinalização do interferon tipo I, interferon gama, IL-6, fosfatase alcalina ou razão RANKL/OPG, e tratar um indivíduo determinado como tendo um prognóstico deficiente com um tratamento para artralgia.
23. Método para tratar um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV) para osteoporose, o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende determinar o nível de expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores indicativos da função de osteoblasto e/ou osteoclasto em uma amostra, em que o um ou mais biomarcadores são selecionados de um ou mais marcadores da via de sinalização do interferon tipo I, interferon gama, IL-6, fosfatase alcalina ou razão RANKL/OPG, e tratar um indivíduo determinado como tendo um prognóstico deficiente com um tratamento para osteoporose.
24. Método para tratar um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV) para craniossinostose, o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende determinar o nível de expressão e/ou atividade de um ou mais biomarcadores indicativos da função de osteoblasto e/ou osteoclasto em uma amostra, em que o um ou mais biomarcadores são selecionados de fosfatase alcalina, a razão RANKL/OPG, IL-6, um ou mais marcadores da via do Receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos, um ou mais marcadores da via de sinalização de BMP ou um ou mais marcadores dos marcadores da via de sinalização de Wnt e tratar um indivíduo determinado como tendo um prognóstico deficiente com um tratamento para craniossinostose.
25. Método para prevenir ou reduzir os efeitos da perturbação do metabolismo ósseo em um indivíduo infectado com vírus Zika (ZIKV), o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma composição farmacêutica que perturba a função de osteoblasto e/ou osteoclasto.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113797202B (zh) * 2020-06-16 2024-06-28 珠海宇繁生物科技有限责任公司 Hpk1激酶抑制剂在预防和/或治疗动物的病原体感染中的应用
CN114085901A (zh) * 2021-12-21 2022-02-25 中国医学科学院输血研究所 一种环状rna作为寨卡病毒感染生物标志物的应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US604603A (en) 1898-05-24 John i
SE8804074D0 (sv) 1988-11-10 1988-11-10 Pharmacia Ab Sensorenhet och dess anvaendning i biosensorsystem
US5888511A (en) 1993-02-26 1999-03-30 Advanced Biotherapy Concepts, Inc. Treatment of autoimmune diseases, including AIDS
US8034344B2 (en) * 2008-05-13 2011-10-11 Novimmune S.A. Anti-IL-6/IL-6R antibodies and methods of use thereof
JP2015523058A (ja) * 2012-05-10 2015-08-13 バイオマトセル アクチエボラグＢｉｏｍａｔｃｅｌｌ ＡＢ 間葉系幹細胞の骨形成分化
US10822596B2 (en) * 2014-07-11 2020-11-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating craniosynostosis
CN105256039A (zh) * 2015-10-29 2016-01-20 北京泱深生物信息技术有限公司 骨质疏松症诊断标志物

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