BR112020023354A2 - vacina de peptídeo reverso - Google Patents

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Abstract

A invenção se refere a composições de vacina compreendendo peptídeos codificados por uma estrutura de leitura aberta (ORF) codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução e o uso de tais composições para o tratamento e prevenção de infecção viral

Description

“VACINA DE PEPTÍDEO REVERSO” Campo da invenção
[0001] A invenção se refere a composições de vacina compreendendo peptídeos codificados por uma estrutura de leitura aberta (ORF) codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução e o uso de tais composições para o tratamento e prevenção de infecção viral. Antecedentes da Invenção
[0002] A influenza é um problema de saúde global significativo, infectando até 20% da população mundial anualmente, causando até 5 milhões de casos de doenças graves e> 300.000 mortes em todo o mundo. Só nos Estados Unidos, estima-se que> 30.000 mortes e quase 300.000 hospitalizações são atribuídas à infecção por influenza a cada ano. Com o recente aparecimento de doenças sazonais novas, graves e potencialmente recorrentes, campanhas de vacinação generalizadas que reduzem a incidência de pneumonia induzida por influenza estão sendo incentivadas pela Organização Mundial de Saúde. A redução efetiva da incidência de influenza exigirá vigilância intensa contínua, aumento do uso de vacinas contra influenza atualmente disponíveis e disponibilidade de vacinas alternativas e medicamentos antivirais que podem fornecer proteção mais ampla contra estirpes de influenza de deslocamento e deriva. As campanhas de vacinação contra a influenza bem-sucedidas podem ter um enorme impacto social e econômico.
[0003] A resposta imune à influenza é governada tanto pela imunidade inata quanto pela adaptativa. A resposta imune inata à influenza limita a replicação viral inicial, mas é relativamente inespecífica. A eliminação eficiente do vírus influenza requer uma resposta imune adaptativa robusta. As vacinas convencionais contra influenza visam eliciar tal resposta imune adaptativa induzindo imunidade humoral ao vírus influenza. A imunidade humoral, mediada por anticorpos secretores IgA e IgM, fornece proteção contra o estabelecimento da infecção inicial, enquanto os anticorpos IgG neutralizam o vírus recém-replicado na infecção estabelecida. As respostas das células T CD4 + podem auxiliar no desenvolvimento da imunidade humoral e têm papéis na troca de isotipo para IgG e na geração de anticorpos de maior afinidade e memória de CTL. Isto é enfatizado pela descoberta de que células T CD4 + específicas para hemaglutinina (HA) proliferam após a vacinação contra influenza em humanos e auxiliam no desenvolvimento de respostas de anticorpos heterossubtípicos contra influenza.
[0004] Apesar de sua capacidade de induzir imunidade humoral, as vacinas convencionais contra influenza não são completamente protetoras. Isso se deve, pelo menos em parte, à ocorrência de variações antigênicas. Além disso, pensa-se que a imunidade mediada por células pode desempenhar um papel fundamental na proteção contra a gripe. Os linfócitos T citotóxicos (CTLs) de CD8+ medeiam a depuração viral e demonstraram ter respostas de reação cruzada a diferentes subtipos do vírus influenza A. Isso pode ajudar a explicar a relativa escassez de doenças entre indivíduos mais velhos e que foram vacinados contra a influenza ou que foram previamente expostos ao vírus da influenza várias vezes.
[0005] As vacinas contra a influenza atualmente no mercado são atualizadas anualmente. Seu projeto é baseado nas recomendações anuais de estirpes da OMS e são fabricados antes do início de uma temporada de influenza ou pandemia. As vacinas atuais para influenza induzem uma resposta imune humoral protetora contra as glicoproteínas HA e neuraminidase (NA) na superfície do vírion. No entanto, as glicoproteínas HA e NA virais são altamente suscetíveis a variações antigênicas frequentes e imprevisíveis e mutações de deslocamento menos frequentes, porém mais graves, que resultam na perda de reconhecimento de anticorpos. Isso exige o desenvolvimento frequente de novas vacinas para corresponder aos serótipo(s) virais atuais que infectam a população humana. Consequentemente, as vacinas contra influenza existentes são caras para produzir e provavelmente não protegem contra novas estirpes que surgem no meio da temporada (por exemplo, gripe suína H1N1 de 2009, H5N1, H7N9). Além disso, essas vacinas são projetadas para fornecer proteção baseada em anticorpos, com pouca consideração dada à indução de imunidade mediada por células, que é importante para eliminar células infectadas por vírus a partir do corpo.
[0006] Várias vacinas quadrivalentes (protegendo contra dois vírus influenza A e dois vírus influenza B) foram aprovadas pelo FDA. Embora essas vacinas forneçam proteção mais ampla do que as vacinas convencionais contra influenza, é improvável que elas sejam protetoras contra novas estirpes que surgem no meio da temporada ou estirpes pandêmicas emergentes e são caras para produzir. Além disso, como as vacinas contra influenza convencionais, as vacinas quadrivalentes não são projetadas para induzir imunidade mediada por células, que é importante para eliminar células infectadas por vírus a partir do corpo.
[0007] Uma vacina contra influenza “universal” que forneça ampla proteção contra todas as estirpes de influenza sazonais e estirpes pandêmicas por anos, se não por toda a vida, é portanto desejável. O desenvolvimento de uma vacina contra influenza universal eficaz diminuiria os temores de futuras pandemias de influenza e seria mais econômica do que desenvolver, fabricar e administrar vacinas anuais contra influenza sazonal, como é a prática atual. Sumário da invenção
[0008] A presente invenção se refere a uma composição de vacina que compreende um peptídeo imunogênico codificado por uma estrutura de leitura aberta (ORF) codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA, como o vírus influenza, no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de tradução . O peptídeo imunogênico compreende um epítopo que é capaz de ser reconhecido por uma célula T CD8 +.
[0009] Os presentes inventores identificaram surpreendentemente uma série de peptídeos que são apresentados por moléculas de MHC de classe I em células infectadas com o vírus influenza e que são codificados por uma ORF codificada por parte da fita genômica negativa do segmento 8 do vírus influenza. A ORF é amplamente conservada entre os vírus influenza humanos e, portanto, acredita-se que confere uma vantagem seletiva a tais vírus. A inclusão de um ou mais peptídeos codificados pela ORF conservada em uma composição de vacina pode conferir capacidade protetora contra múltiplas estirpes de vírus influenza humana, superando os problemas causados por sua tendência a desvio e desvio antigênico. Incluindo uma pluralidade de tais peptídeos, cada um capaz de se ligar a um supertipo de HLA diferente, na composição da vacina pode fornecer uma vacina de amplo espectro que é eficaz em indivíduos com diferentes tipos de HLA.
[0010] Os presentes inventores consideram que as células infectadas com outros vírus ssRNA, como filovírus ou flavivírus, também podem apresentar peptídeos que são codificados por uma ORF conservada codificada por parte do genoma no sentido oposto do RNA de sentido positivo capaz de tradução nas moléculas de MHC de Classe I dos mesmos. Incluir um ou mais desses peptídeos em uma composição de vacina pode conferir capacidade protetora contra várias espécies de vírus, estirpes ou serótipos, fornecendo proteção cruzada dentro de uma família de vírus.
[0011] Consequentemente, a presente invenção fornece uma composição de vacina caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de células T CD8 + a partir de um polipeptídeo codificado por uma estrutura de leitura aberta (ORF) codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de translação.
[0012] A presente invenção fornece adicionalmente: - um método de prevenção ou tratamento de uma infecção viral, o qual compreende administrar a composição de vacina da invenção para um indivíduo com, ou em risco de ser infectado por, um vírus ssRNA;
- um método de identificação de um peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de célula T CD8 + de uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução por: (a) identificar uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de tradução; (b) prever a sequência do polipeptídeo codificado pela ORF; e (c) avaliar se um peptídeo que se liga a uma molécula de MHC de Classe I compreende uma sequência presente na sequência prevista, Identificar, assim, o peptídeo imunogênico compreende um epítopo que é capaz de ser reconhecido por uma célula T CD8 +; - um peptídeo imunogênico caracterizado pelo fato de que compreende um epítopo de célula T CD4 + a partir de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de tradução; - um método para determinar o potencial pandêmico de um vírus influenza A, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) identificar uma primeira ORF codificada por pelo menos parte do segmento 8 do genoma do vírus influenza A no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução; (ii) determinar o número de códons compreendidos na primeira ORF; e (iii) comparar o número de códons compreendidos na primeira ORF com o número de códons compreendidos em uma segunda ORF codificada por pelo menos parte do segmento 8 do genoma de um vírus influenza A pandêmico conhecido no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução, em que uma diferença no número de códons na primeira ORF em comparação com a segunda ORF é indicativa de potencial pandêmico.
Breve Descrição das Figuras
[0013] Figura 1: Comparação de espectros de massa de IAPSSVKALS a partir de células infectadas com o vírus influenza A (A) e peptídeo IAPSSVKALS sintético (B). Alguns íons típicos em cada espectro são circulados para enfatizar a identidade do peptídeo a partir das células infectadas com o sintetizado.
[0014] Figura 2: Comparação de espectros de massa de LMQRGPSTF a partir de células infectadas com o vírus influenza A (A) e peptídeo LMQRGPSTF sintético (B). Alguns íons típicos em cada espectro são circulados para enfatizar a identidade do peptídeo a partir das células infectadas com o sintetizado.
[0015] Figura 3: Comparação de espectros de massa de KITLKFAFNMM a partir de células infectadas com o vírus influenza A (A) e peptídeo KITLKFAFNMM sintético (B). Alguns íons típicos em cada espectro são circulados para enfatizar a identidade do peptídeo a partir das células infectadas com o sintetizado.
[0016] Figura 4: Alinhamento de sequências de polipeptídeos NEG8 de SEQ ID NOs: 1 e 3 a 15.
[0017] Figura 5: Comprimento de ORF por ano. O gráfico mostra o número de vírus influenza A coletados (eixo Y) por ano e mês de coleta (eixo X). O código de cores indica o comprimento das ORFs presentes nos vírus coletados em cada momento.
[0018] Figura 6: Identidade de ORF por ano. O código de cores mostra o serótipo de cada vírus plotado.
[0019] Figura 7: Identidade de ORF por ano. O código de cores mostra o serótipo de cada vírus plotado.
[0020] Figura 8: Comprimentos de ORF prevalentes em diferentes espécies de vírus influenza A. Descrição Detalhada da Invenção Composições de vacina
[0021] A presente invenção fornece uma composição de vacina caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de células T CD8 + a partir de um polipeptídeo codificado por uma (ORF) codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de translação. Essa composição de vacina tem diversos benefícios que se tornarão aparentes a partir da discussão abaixo. Os benefícios principais são sumarizados no presente documento.
[0022] Primeiramente, a composição de vacina da invenção compreende vantajosamente um peptídeo compreendendo um epítopo de células T CD8 +, tal como um epítopo estabelecido em SEQ ID NOs: 5 a 41 e recém-identificado pelos inventores. A composição de vacina é, portanto, capaz de estimular uma resposta imune celular (por exemplo, uma resposta de célula T CD8+) contra um vírus ssRNA. Os linfócitos T citotóxicos (CTLs) de CD8+ medeiam o clareamento viral por meio de sua atividade citotóxica contra células infectadas. Estimular a imunidade celular pode, portanto, fornecer uma defesa benéfica contra a infecção por vírus, como o vírus influenza, flavivírus ou infecção por filovírus.
[0023] Em segundo lugar, a ORF que codifica o epítopo compreendido no peptídeo imunogênico pode ser conservada entre vários vírus. O próprio epítopo pode, portanto, ser conservado entre vários vírus. Por exemplo, a ORF e/ou o epítopo podem ser conservados entre os vírus influenza A humanos. A composição da vacina pode, portanto, fornecer proteção cruzada contra uma pluralidade de vírus influenza A humanos. Desta forma, a composição da vacina da invenção é adequada para fornecer profilaxia de amplo espectro contra os vírus influenza A humanos, combatendo os problemas causados pela mudança antigênica e deriva antigênica a que os vírus influenza A humanos são propensos. Em outras palavras, uma única composição de vacina da invenção pode induzir imunidade protetora contra uma ampla variedade de vírus influenza A humanos existentes e emergentes,
reduzindo ou eliminando a necessidade de uma nova vacina sazonal contra influenza a ser desenvolvida a cada ano.
[0024] A ORF e/ou o epítopo podem ser conservados entre os vírus influenza A humanos e um vírus influenza A suíno, equino e/ou aviário. Deste modo, a composição da vacina da invenção pode evitar que os vírus influenza A suíno, equino e/ou aviário se estabeleçam na população humana. Em outras palavras, além de proteger contra vírus influenza A humanos existentes e emergentes, a composição da vacina da invenção pode prevenir os vírus influenza A suínos, equinos e/ou aviários de cruzarem a divisão de espécies. Isso pode prevenir o surgimento de estirpes do vírus da influenza A pandêmicas.
[0025] Em terceiro lugar, o peptídeo imunogênico compreendido na composição da vacina da invenção pode ser capaz de se ligar a supertipos de HLA diferentes. A inclusão de múltiplos peptídeos que compreendem, cada um, um epítopo de célula T CD8+ capaz de se ligar a um supertipo de HLA diferente resulta em uma composição de vacina que é eficaz em indivíduos que têm diferentes tipos de HLA. Desse modo, uma única composição de vacina flavivírus pode ser usada para conferir proteção contra vírus ssRNA em uma grande razão da população humana. Isso fornece um meio com boa relação custo-benefício para controlar a incidência e disseminação da infecção por vírus.
[0026] Em quarto lugar, o polipeptídeo codificado pela ORF pode aumentar a aptidão do vírus ssRNA em humanos. Em outras palavras, o polipeptídeo pode conferir uma vantagem seletiva no vírus ssRNA pelo qual é codificado. A composição da vacina da invenção pode, portanto, ter como alvo epítopos associados a um vírus ssRNA conferido com uma vantagem seletiva. A composição de vacina da invenção pode, portanto, ser bem projetada para fornecer profilaxia eficaz contra estirpes emergentes e/ou potencialmente pandêmicas de um vírus ssRNA.
[0027] Em quinto lugar, o peptídeo imunogênico compreendido na composição de vacina da invenção pode ser unido a uma nanopartícula, por exemplo, uma nanopartícula de ouro. Como descrito em mais detalhes abaixo, a união a uma nanopartícula reduz ou elimina a necessidade de incluir um adjuvante na composição de vacina. Assim, a composição de vacina da invenção é menos propensa a causar efeitos clínicos adversos mediante a administração a um indivíduo.
VACINA DE PEPTÍDEO REVERSO
[0028] Os vírus de RNA de fita simples (ssRNA) são classificados como sentido positivo ou sentido negativo, dependendo do sentido ou da polaridade de seu RNA genômico. Em um vírus ssRNA de sentido negativo, o RNA genômico de sentido negativo (3’ a 5') é complementar ao mRNA e geralmente deve ser convertido em um RNA de sentido positivo pela RNA polimerase antes da tradução. Em um vírus ssRNA de sentido positivo, o RNA genômico de sentido positivo (5’ para 3') também pode servir como mRNA e pode ser traduzido em proteína na célula hospedeira. Isto é, a replicação de um vírus ssRNA de sentido negativo geralmente ocorre após a transcrição do genoma para formar um mRNA que é complementar ao genoma e a tradução do mRNA. A replicação de um vírus ssRNA de sentido positivo geralmente ocorre após a tradução do RNA genômico que se duplica como mRNA.
[0029] Tradicionalmente, tem-se considerado que o RNA de sentido negativo dos vírus ssRNA não é codificante. No entanto, a tradução não canônica pode ser possível. Parece que o RNA genômico de sentido negativo do vírus influenza pode realmente ser capaz de tradução na direção 5‘ para 3', produzindo produtos gênicos diferentes daqueles obtidos por meio da tradução canônica (ou seja, transcrição 3’ para 5' formando um mRNA complementar, e tradução do mRNA 5’ para 3'). Da mesma maneira, o RNA complementar ao genoma de vírus ssRNA de sentido positivo pode realmente ser traduzível.
[0030] Os presentes inventores obtiveram dados que demonstram que os polipeptídeos obtidos a partir da tradução não canônica em vírus ssRNA podem compreender peptídeos que são reconhecidos pelo sistema imune de um indivíduo infectado com o vírus ssRNA. Por exemplo, um polipeptídeo obtido a partir da tradução não canônica em vírus ssRNA pode compreender um peptídeo que é capaz de ser apresentado por uma molécula de MHC de classe I e de ser reconhecido por um receptor de células T (TCR) presente em uma célula T CD8 +. Em outras palavras, um polipeptídeo obtido da tradução não canônica em vírus ssRNA pode compreender um peptídeo que é um epítopo de célula T CD8 +. Esse peptídeo imunogênico pode ser administrado a um indivíduo, por exemplo, em uma composição de vacina, a fim de induzir uma resposta imune contra o vírus ssRNA. Desta maneira, a profilaxia e/ou terapia pode ser alcançada.
[0031] Consequentemente, a presente invenção fornece uma composição de vacina caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de células T CD8 + a partir de um polipeptídeo codificado por uma (ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de translação. Peptídeos imunogênicos
[0032] Um peptídeo imunogênico é um peptídeo capaz de induzir uma resposta imune. A composição da vacina da invenção compreende um peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de células T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao seu RNA de sentido positivo capaz de tradução. A composição de vacina pode compreender de cerca de um a cerca de 50 de tais peptídeos imunogênicos, como cerca de 2 a 40, 3 a 30, 4 a 25, 5 a 20, 6 a 15, 7, 8, 9 ou 10 de tais peptídeos imunogênicos.
[0033] O peptídeo imunogênico compreende um epítopo de célula T CD8 +. Um epítopo de célula T CD8+ é um peptídeo que é capaz de (i)
apresentação por uma molécula de MHC de classe I e (ii) reconhecimento por um receptor de célula T (TCR) presente em uma célula T CD8+. Preferencialmente, reconhecimento por um TCR resulta na ativação da célula T CD8+. A ativação célula T CD8+ por levar à proliferação aumentada, produção de citocina e/ou efeitos citotóxicos. Tipicamente, o epítopo de célula T CD8+ tem cerca de 9 aminoácidos de comprimento. O epítopo de célula T CD8+, no entanto, pode ser mais curto ou mais longo. Por exemplo, o epítopo de célula T CD8+ pode ter cerca de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos de comprimento. O epítopo de célula T CD8+ pode ter cerca de 8 a 15, 9 a 14 ou 10 a 12 aminoácidos de comprimento.
[0034] O epítopo de células T CD8 + compreendido no peptídeo imunogênico é de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de tradução. Em outras palavras, o epítopo de células T CD8 + pode, in natura, ser compreendido em ou fazer parte de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução . O polipeptídeo pode ser expresso na superfície do vírus ssRNA ou intracelularmente dentro do vírus ssRNA. A expressão do polipeptídeo pelo vírus pode ser transitória, isto é, o polipeptídeo só pode ser expresso pelo vírus ssRNA em certos pontos do seu ciclo de vida e/ou sob certas condições ambientais. Alternativamente, o vírus ssRNA pode ter expressão sustentada do polipeptídeo. O polipeptídeo pode ser um peptídeo estrutural ou um peptídeo funcional, como um peptídeo que está envolvido no metabolismo ou na replicação do vírus ssRNA. Em alguns casos, no entanto, o propósito e/ou função do polipeptídeo pode ser desconhecido.
[0035] O polipeptídeo que dá origem ao epítopo da célula T CD8 + pode aumentar a aptidão do vírus ssRNA em humanos. Por exemplo, o polipeptídeo pode melhorar a sobrevivência e/ou replicação do vírus em uma célula hospedeira humana. Consequentemente, o polipeptídeo pode conferir uma vantagem seletiva no vírus ssRNA. Em outras palavras, a expressão do polipeptídeo pode permitir que o vírus ssRNA sobreviva e/ou se reproduza melhor do que um vírus ssRNA que não expressa o polipeptídeo. Nesse caso, o processo seletivo evolutivo pode selecionar vírus em que pelo menos parte do genoma codifica, no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução, uma ORF que codifica o polipeptídeo. A ORF (e, conseqüentemente, o polipeptídeo) pode, portanto, ser conservada entre diferentes vírus ssRNA de um tipo particular. Por exemplo, a ORF e/ou o polipeptídeo podem ser conservados entre diferentes estirpes do vírus Influenza A ou diferentes entre flavivírus (por exemplo, entre o vírus Zika e o vírus da Dengue). A ORF (e, consequentemente, o polipeptídeo) é conservado entre dois ou mais vírus ssRNA diferentes se houver pelo menos 20% (tal como pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) de identidade entre a ORF codificada por pelo menos parte do genoma de cada vírus, no sentido oposto ao RNA de sentido positivo, capaz de tradução.
[0036] O peptídeo imunogênico pode compreender apenas um epítopo de célula T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de tradução. Alternativamente, o peptídeo imunogênico pode compreender dois ou mais, tais como três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, quinze ou mais, ou vinte ou mais desses epítopos.
[0037] Bem como o (s) epítopo (s) de células T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução, o peptídeo imunogênico pode compreender um ou mais outros epítopos de células T CD8 +, um ou mais epítopos de células T CD4 + e/ou um ou mais epítopos de células B. Por exemplo, o peptídeo imunogênico pode compreender um ou mais, tais como dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, quinze ou mais, ou vinte ou mais epítopos de células T CD8 + que não são um epítopo de células T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de tradução. O peptídeo imunogênico pode compreender um ou mais (como dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, quinze ou mais ou vinte ou mais) de outros epítopos de célula T CD4+. O peptídeo imunogênico pode compreender um ou mais (como dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, quinze ou mais ou vinte ou mais) de outros epítopos de célula B.
[0038] Preferencialmente, o peptídeo imunogênico compreende uma ou mais das sequências estabelecidas na SEQ ID NO: 5 a 41.
[0039] A composição da vacina pode compreender dois ou mais peptídeos imunogênicos, tais como cerca de um a cerca de 50, 2 a 40, 3 a 30, 4 a 25, 5 a 20, 6 a 15, 7, 8, 9 ou 10 peptídeos imunogênicos. Neste caso, cada um dos dois ou mais peptídeos imunogênicos pode, por exemplo, ser um peptídeo imunogênico que compreende um epítopo de célula T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução Alternativamente, a composição da vacina pode conter uma mistura de (i) peptídeos imunogênicos que compreendem um epítopo de células T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao de um RNA de sentido positivo capaz de tradução e (ii) outros peptídeos imunogênicos.
[0040] A composição de vacina pode compreender dois ou mais peptídeos imunogênicos, cada um compreendendo um epítopo de célula T CD8 + diferente a partir de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto para
RNA de sentido positivo capaz de translação. Em outras palavras, a composição da vacina pode compreender dois ou mais peptídeos imunogênicos que cada um compreende um fragmento diferente de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA de sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução. Preferencialmente, o fragmento é imunogênico. A composição da vacina pode compreender cerca de um a cerca de 50, 2 a 40, 3 a 30, 4 a 25, 5 a 20, 6 a 15, 7, 8, 9 ou 10 peptídeos imunogênicos, cada um compreendendo um epítopo de célula T CD8 + diferente de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de tradução. Em alguns aspectos, cada um dos peptídeos imunogênicos pode interagir com um subtipo de HLA diferente, conforme descrito em detalhes abaixo.
[0041] A composição da vacina pode compreender (i) um ou mais (tal como cerca de 2 a 40, 3 a 30, 4 a 25, 5 a 20, 6 a 15, 7, 8, 9 ou 10) peptídeos imunogênicos que cada um compreende um epítopos de célula T CD8+ de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução, e (ii) um ou mais outros peptídeos imunogênicos (ou seja, peptídeos imunogênicos que não compreende um epítopo de célula T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução). O (s) outro (s) peptídeo (s) imunogênico (s) podem, portanto, compreender um ou mais epítopos, tais como cerca de 2 a 40, 3 a 30, 4 a 25, 5 a 20, 6 a 15, 7, 8, 9 ou 10 epítopos. O epítopo pode ser um epítopo de células B, um epítopo de células T CD4 + e/ou um epítopo de células T CD8 +. O epítopo de célula T CD4+ pode ser, por exemplo um peptídeo que é expresso por um ou mais vírus ssRNA e que é capaz de (i) apresentação por uma molécula de MHC de classe II e (ii) reconhecimento por um receptor de célula T (TCR) presente em uma célula T CD4+. Alternativamente, o epítopo de célula T CD4+ pode ser um epítopo de célula T CD4+ que não é expresso por um ou mais vírus ssRNA. O epítopo de célula T CD8+ pode ser, por exemplo um peptídeo que é expresso por um ou mais vírus ssRNA e que é capaz de (i) apresentação por uma molécula de MHC de classe I e (ii) reconhecimento por um receptor de célula T (TCR) presente em uma célula T CD8+. Preferencialmente, o epítopo de células T CD8 + é um epítopo de células T CD8 + que não é um epítopo de células T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução. O epítopo de célula T CD8+ pode ser um epítopo de célula T CD8+ que não é expresso por um ou mais vírus ssRNA.
[0042] Muitos epítopos de células B, epítopos de células T CD4 + e epítopos de células T CD8 + (tais como epítopos de células B, epítopos de células T CD4 + e epítopos de células T CD8 + de vírus ssRNA) são conhecidos na técnica. Métodos para identificar epítopos de células B, epítopos de células T CD4 + e epítopos de células T CD8 + são conhecidos na técnica. Os métodos de mapeamento de epítopo incluem cocristalografia de raios X, varredura de oligopeptídeo com base em arranjo (por vezes chamada de varredura de peptídeo de sobreposição ou análise de pepvarredura (pepscan)), mutagênese direcionada ao sítio, mapeamento de mutagênese de alta produtividade, troca de hidrogênio-deutério, espectrometria de massa acoplada por reticulação, exibição de fago e proteólise limitada. As metodologias de previsão de motivo de MHC também podem ser usadas. Os epítopos de células T CD8 + apresentados por células infectadas com o vírus ssRNA podem ser identificados para identificar diretamente os epítopos de células T CD8 + para inclusão na composição da vacina, conforme descrito abaixo.
[0043] Qualquer um dos peptídeos imunogênicos descritos neste documento pode conter qualquer número de aminoácidos, ou seja, ser de qualquer comprimento. Tipicamente, o peptídeo imunogênico tem cerca de 8 a cerca de 30, 35 ou 40 aminoácidos de comprimento, como cerca de 9 a cerca de 29, cerca de 10 a cerca de 28, cerca de 11 a cerca de 27, cerca de 12 a cerca de 26, cerca de 13 a cerca de 25, cerca de 13 a cerca de 24, cerca de 14 a cerca de 23, cerca de 15 a cerca de 22, cerca de 16 a cerca de 21, cerca de 17 a cerca de 20 ou cerca de 18 a cerca de 29 aminoácidos de comprimento.
[0044] Qualquer um dos peptídeos imunogênicos descritos neste documento pode ser quimicamente derivado a partir de um antígeno polipeptídico, por exemplo, por clivagem proteolítica. Mais tipicamente, o peptídeo imunogênico pode ser sintetizado usando métodos bem conhecidos na técnica.
[0045] O termo "peptídeo" inclui, não apenas moléculas em que os resíduos de aminoácido são unidos por ligações de peptídeo (-CO-NH-), mas também, moléculas em que a ligação de peptídeo é invertida. Esses peptidomiméticos retro-inversos podem ser feitos usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, tais como aqueles descritos em Meziere et al (1997) J. Immunol.159, 3230-3237. Essa abordagem envolve realizar pseudopeptídeos contendo alterações envolvendo a estrutura principal, e não a orientação de cadeias laterais. Meziere et al (1997) mostra que, pelo menos, para respostas de célula auxiliar de T e de classe de MFC II, esses pseudopeptídeos são úteis. Os peptídeos retroinversos, que contêm ligações de NH-CO em vez de ligações de peptídeo de CO-NH, são muito mais resistentes à proteólise.
[0046] De modo similar, a ligação de peptídeo pode ser totalmente dispensada, desde que uma fração de ligante adequada que retém o espaçamento entre os átomos de carbono dos resíduos de aminoácido seja usada; é particularmente preferencial se a fração de ligante tiver substancialmente a mesma distribuição de carga e substancialmente a mesma planura que uma ligação de peptídeo. Também será observado que o peptídeo pode ser convenientemente bloqueado em sua terminação N ou C de modo que ajude a reduzir a suscetibilidade à digestão exoproteolítica. Por exemplo, o grupo amino N terminal dos peptídeos pode ser protegido através da reação com um ácido carboxílico e o grupo carboxila C terminal do peptídeo pode ser protegido através da reação com uma amina. Outros exemplos de modificações incluem glicosilação e fosforilação. Outra modificação potencial é que hidrogênios nas aminas de cadeia lateral de R ou K podem ser substituídos por grupos metileno (-NH2 pode ser modificado por -NH(Me) ou - N(Me)2).
[0047] O termo “peptídeo” também inclui variantes de peptídeo que aumentam ou diminuem a meia-vida do peptídeo in vivo. Os exemplos de análogos capazes de aumentar a meia-vida de peptídeos usados de acordo com a invenção incluem análogos peptoides dos peptídeos, derivados de D- aminoácido dos peptídeos e híbridos de peptídeo-peptoide. Uma modalidade adicional dos polipeptídeos variantes usados de acordo com a invenção compreende formas de D-aminoácido do polipeptídeo. A preparação de polipeptídeos com o uso de D-aminoácidos em vez de L-aminoácidos diminui amplamente qualquer decomposição indesejada de tal agente por processos metabólicos normais, diminuindo as quantidades de agente que precisam ser administradas, junto com a frequência de sua administração. Estrutura de leitura aberta (ORF)
[0048] O epítopo de células T CD8 + compreendido no peptídeo imunogênico é de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de tradução.
[0049] Uma estrutura de leitura é um agrupamento de três nucleotídeos sucessivos em uma sequência de ácido nucleico, como uma sequência de RNA, que constitui os códons para os aminoácidos codificados pela sequência de ácido nucleico. Uma ORF é a parte de uma estrutura de leitura que pode ser traduzida. Uma ORF é uma extensão contínua de códons que contém um códon de início e um códon de parada. Dentro da ORF, um códon de iniciação (por exemplo, ATG) pode servir como um local de iniciação para a tradução do RNA em proteína.
[0050] Na presente invenção, a ORF é codificada por pelo menos parte do genoma do vírus ssRNA, no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução. Em um vírus ssRNA de sentido negativo, a ORF está presente no RNA genômico (normalmente considerado como sentido negativo) e pode, por exemplo, ser traduzido sem transcrição intermediária. Em um vírus ssRNA de sentido positivo, o RNA genômico viral tem o mesmo sentido que o mRNA e pode ser traduzido sem transcrição intermediária, ou seja, o RNA genômico dobra como mRNA. Aqui, a ORF é codificada no sentido oposto ao RNA genômico viral e, portanto, ao mRNA.
[0051] A ORF pode, por exemplo, ser codificada por todo o genoma do vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de tradução. Alternativamente, a ORF pode ser codificada por apenas parte do genoma do vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução. Por exemplo, a ORF pode ser codificada em cerca de 1% a cerca de 99%, tal como cerca de 2% a cerca de 98%, cerca de 3% a cerca de 97%, cerca de 5% a cerca de 95%, cerca de 10% a cerca de 90% , cerca de 15% a cerca de 85%, cerca de 20% a cerca de 80%, cerca de 25% a cerca de 75%, cerca de 30% a cerca de 70%, cerca de 40% a cerca de 60%, ou cerca de 50% do genoma do vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução.
[0052] Alguns vírus ssRNA têm um genoma segmentado. A ORF pode ser codificada por todo ou parte de um segmento do genoma, no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução. Por exemplo, a ORF pode ser codificada em cerca de 1% a cerca de 99%, tal como cerca de 2% a cerca de 98%, cerca de 3% a cerca de 97%, cerca de 5% a cerca de 95%, cerca de 10% a cerca de 90% , cerca de 15% a cerca de 85%, cerca de 20% a cerca de 80%, cerca de 25% a cerca de 75%, cerca de 30% a cerca de 70%, cerca de 40% a cerca de 60%, ou cerca de 50% do segmento de genoma, no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução. O segmento do genoma pode, por exemplo, ser segmento 1, segmento 2, segmento 3,
segmento 4, segmento 5, segmento 6, segmento 7 ou segmento 8 do genoma de um vírus Influenza A. Preferencialmente, o segmento do genoma é o segmento 8 do genoma de um vírus Influenza A.
[0053] A ORF pode ser de qualquer comprimento. Por exemplo, a ORF pode ser de cerca de 8 a cerca de 300, tal como cerca de 9 a cerca de 290, cerca de 10 a cerca de 280, cerca de 11 a cerca de 275, cerca de 12 a cerca de 270, cerca de 13 a cerca de 260, cerca de 14 a cerca de 250 , cerca de 15 a cerca de 240, cerca de 16 a encostar em 230, cerca de 17 a cerca de 225, cerca de 18 a cerca de 220, cerca de 19 a cerca de 210, cerca de 20 a cerca de 200, cerca de 25 a cerca de 190, cerca de 30 a cerca de 180, cerca de 35 a cerca de 175, cerca de 40 a cerca de 170, cerca de 45 a cerca de 160, cerca de 50 a cerca de 150, cerca de 55 a cerca de 140, cerca de 60 a cerca de 130, cerca de 65 a cerca de 125, cerca de 70 a cerca de 120, cerca de 75 a cerca de 110, cerca de 80 a cerca de 100, cerca de 85 a cerca de 95, cerca de 167 a cerca de 216 ou cerca de 90 códons de comprimento. A ORF pode ser pelo menos 8, tal como pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos, 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40 , pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250 ou pelo menos pelo menos 275 códons de comprimento. A ORF pode, por exemplo, ser pelo menos 31, pelo menos 36, pelo menos 37, pelo menos 39, pelo menos 40, pelo menos 41, pelo menos 45, pelo menos 48, pelo menos 49, pelo menos 50, pelo menos 53, pelo menos 58, pelo menos 60, pelo menos 63, pelo menos 73, pelo menos 74, pelo menos 80, pelo menos 81, pelo menos 84, pelo menos 85, pelo menos 87, pelo menos 88, pelo menos 89, 92, 93, pelo menos 94, pelo menos 105, 1 pelo menos 21, pelo menos 135, pelo menos 140, pelo menos 167, pelo menos 170, pelo menos 178, pelo menos 197, pelo menos 216 ou pelo menos 246 códons em comprimento. A ORF pode, por exemplo, ter pelo menos 85 códons de comprimento. A ORF pode, por exemplo, ter pelo menos 167 códons de comprimento. A ORF pode, por exemplo, ter pelo menos 216 códons de comprimento.
[0054] A ORF pode compreender a sequência:
TTAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTCTTATCTCTTGCTCCACTTCAAGCAAT AGTTGTAAGGCTTGCATAAATGTTATTTGCTCAAAACTATTCTCTGTTATCTT CAGTCTATGTCTCACTTCTTCAATCAACCATCTTATTTCTTCAAACTTCTGAC TTAATTGTTCTCGCCATTTTCCGTTTCTGTTTTGGAGGGAGTGGAGGTCTC CCATTCTCATTACTGCTTCTCCAAGCGAATCTCTGTAGAGTTTCAGAGACT CGAACTGTGTTATCATTCCATTCAAGTCCTCCGATGAGGACCCCAACTGCA TTTTTGACATCCTCATCAGTATGTCCTGGAAGAGAAGGCAATGGTGAAATT TCGCCAACAATTGCTCCCTCTTCGGTGAAAGCCCTTAGTAGTATTAGAGTC TCCAGCCGGTCGAAAATCACACTGAAGTTCGCTTTCAGTATGATGTTCTTA TCCATGATCGCCTGGTCCATTCTGATACAAAGAGAGCCTGCCACTTTCTGC TTGGGCATGAGCATGAACCAGTCCCTTGACATCTCCTCAAGAGTCATGTCA GTTAGGTAGCGCGAAGCAGGTACAGAGGCAATGGTCATTTTAAGTGCCTC ATCGGATTCTTCCTTCAGAATCCGCTCCACTATCTGCTTTCCAGCACGGGT GGCTGTCTCGATGTCCAGACCAAGAGTGCTGCCTCTTCCTCTTAGGGACT TCTGATCTCGGCGAAGCCGATCAAGGAATGGGGCATCACCCAGTTCTTGG
TCTGCAAACCGTTTGCGGACATGCCAAAGAAAGCAGTCTACCTGAAAGCTT GACACAGTGTTGGAATCCAT (SEQ ID NO: 56).
[0055] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência:
MLFAQNYSLLSSVYVSLLQSTILFLQTSDLIVLAIFRFCFGGSGGLPFSLLLLQA NLCRVSETRTVLSFHSSPPMRTPTAFLTSSSVCPGREGNGEISPTIAPSSVKAL
SSIRVSSRSKITLKFAFSMMFLSMIAWSILIQREPATFCLGMSMNQSLDISSRV MSVR (SEQ ID NO: 1).
[0056] A ORF pode compreender a sequência:
TATCATTAAATAAGCTGAAATGAGAAAGTTCTTATCTCCTGTTCCACTTCAA ACAGCAGTTGTAATGCTTGCATGAATGTTATTTGTTCAAAGCTATTTTCCGT TGTTTTTAGTCTGTGTCTCACTTCTTCAATCAGCCATCTTATCTCTTCAAACT TTTGACCTAGCTGTTCTCGCCATTTTCCGTTTCTGTTTTGGAGTAAGTGGA GGTCCCCCATTCTCATTACTGCTTCTCCAAGCGAATCTCTGTAGATTTTTAG AGACTCGAACTGTGTTATCATTCCATTCAAGTCCTCCGATGAGGACCCCAA TTGCATTTTTGACATCCTCAATAGTATGTCCTGGAAAAGAAGGCAATGGTG AGATTTCGCCAACAATTGCTCCCTCTTCGGTGAAAGCCCTTAGTAATACTA TGGTCTCTAGTCGGTCAAAAATCACACTGAAATTCGCTTTCAATATGATGTT TTTCTCCATGATTGCCTGGTCCATTCTGATGCAAAGAGGTCCTTCCACTTT CTGCTTGGGCATTAGCATGAACCAGTTTCTTGACAATTCCTCAATAGTCAT GTCAGTTATGTATCGCGAAGCAGGTGTGGAGACCATGGTCATTTTAAGTGC CTCATCAGATTCTTCTTTCAGAATCTTTTCTACAATTTGCTTTCCAACATGG GTGGCTGCTTTGATGTCTAGACCGAGAGTATTGCCTCTTCCCCTTAGGGAC CTCTGATCTCGGCGAAGCCGATCAAGGAATGGGGCATCACTCAGTTCTTG
GTCTACAACTTGTTTCCGGATATGCCAAAGAAAGCAATCTACCTGGAAACT TGACACAGTGTTGGAATCCATTATGT (SEQ ID NO: 57).
[0057] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência:
MLFVQSYFPLFLVCVSLLQSAILSLQTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLLQA NLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALS NTMVSSRSKITLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIV
MSVMYREAGVETMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL (SEQ ID NO: 2).
[0058] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência:
MLFARNYSLLSSIYVSLLQSTTLFLQTSDSIVLAIFRFCFGGSGGLLSSLLLLQA NLCRVSETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSSVCPGREGTGEISPTIAPSSVKAL
SSIRVSNRSKIILKFAFSVMFLSMIAWSILIQREPATFCLGMSMNQSLDISSRVM SVR (SEQ ID NO: 3).
[0059] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência:
MLFAQNYSLLSSVCVSLLQSTILFLQTSDLIVPAISRFCFGVSCGLPFSLLLLQA NLCRVSETRTVLSFHSSPPMRTPTAFLTSSAVCPGREGNGEISPTIAPSSVKAL
SNIRVSSRSKITLKFAFSMMFLSMIAWSILIQRGPATFCLGMSMDQSLDISSRV MSVR (SEQ ID NO: 4).
[0060] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência:
MLFAQNYSLLFSICVSLLQSTILFLRTSDLIVLAIFRFCFGVSGGLPVSLLLLQAN LCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSLVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALS
NIRVSSRSKITLKFAFSMMLLSMIAWSILIQRGPATFCLGMSMNQSLDISSIVMS VR (SEQ ID NO: 5).
[0061] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência:
MLFAQNYSLLFSICASLLQSTILFLRTSDLIVLAIFRFCFGVSGGLPVSLLLLQAN LCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSLVCPGREGNGEISPYIAPSSVKALS
NIRVSSRSKITLKFAFSMMLLSMIAWSILIQRGPATFCLGMSMNQSLDISSIVMS VR (SEQ ID NO: 6).
[0062] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência:
MLFAQNYSLLSSICVSLLQSAILFLRTFDLIVLAIFRFCFGVSGGLPFSLLLLQAN LCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSLVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALS
NIRVSSRSKITLKFAFNMMFLSMIAWSILIQRGPATFCLGISMNQSLDISSIVMSV RYREAGAEAMVILSASSDSSFRILSTICFPTRVAVSMFRPRVLPLPLRDF (SEQ ID NO: 7).
[0063] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência:
MLFAQNYSLLSSICVSLLQSAILFLRTFDLIVLAIFRFYFGVSGGLPFSSLLLQAN LCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSLVCPGREGNGEISPTIAPASVKALS
NIRVSSRSKITLKFAFNMMFLSMIAWSILIQRGPATFCLGISMNQSLDISSIVMSB RYREAGAEAMVILSASSDSSFRILSTICFPTRVAVSMFRPRVLPLPLRDF (SEQ ID NO: 8).
[0064] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência:
MLFAQNYSLLSSICVSLLQSAILSLRTFDLTVLAIFRFCFGVSGGLPFSLLLPQA NLCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALS
NIRVSSRSKITLKFAFNMTFLSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQSLDNSSIVM SVRYREAGAEAMVILSASSDSSFRILSTICFPTRVAASMFRPRVLPLPLRDF(SE Q ID NO: 9).
[0065] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência:
MLFAQNYSLLSSICVSLLQSAILSLRTFDLIVLAIYRFCFGVSGCLPFSLLLLQAN LCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALSNI
RVSSRSKITLKFAFNMMFLSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQSLDNSSIVMSV RYREAGAEAMVILSASSDFSFRILSTICFPTRVAASMFRPRVLPLPLRDF (SEQ ID NO: 10).
[0066] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência:
MLFAQNYSQLFSVCVSLLQSAILSLRTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLPQ ANLCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKAL SNTRVSSRSKITLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIV
MSVMYREAGVEAMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL (SEQ ID NO: 11).
[0067] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência:
MLFAQNYSQLFLVCVSLLQSAILSLRTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLPQA NLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPYIAPSSVKALS NTRVSSRSKITLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVI
SVMYREAGVEAMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL (SEQ ID NO: 12).
[0068] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência:
MLFAQNYSQLFLVCVSLLQSAILSLQTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLLQA NLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALS NTMVSSRSKTTLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIV
MSVMYREAGVEAMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALISRPRVLPLPLRDL (SEQ ID NO: 13).
[0069] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência:
MLFVQSYFQLFLICVSLLQLAILSLQTFDLAVLAISRFCFGVSGGPPFSLLLLQA NLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALS NTIVSSRSKITLKFAFNVMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVMS
VMYREAGVETMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL (SEQ ID NO: 14).
[0070] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência:
MLFVQSYFQLFLICVSPLQLAILSLQTSDLAVLAISRFCFGVSGGPPFSLLLLQA NLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTASIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALS NTMVSSRPKITLKFAFNMIFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDSSSIVM
SVMYREAGVETMVILSASSDSSFRIFSIICFPAWVAALVSRPRVLPLPLRDL (SEQ ID NO: 15).
[0071] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência:
MLFVRNYSLSLSICAAFLQLTTLFPQISVPIALATFHFCSGGSEGLPFSSQFLQA NLCIFSETRTVLPFHSSPPMRTPTAFLTSS (SEQ ID NO: 58).
[0072] Conforme mencionado acima, a ORF que codifica o epítopo compreendido no peptídeo imunogênico pode ser conservada entre diferentes vírus ssRNA, tais como diferentes vírus ssRNA do mesmo tipo. A ORF pode ser conservada entre dois ou mais vírus ssRNA diferentes se houver pelo menos 50% (tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95 %, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) de identidade entre a ORF codificada por pelo menos parte do genoma de cada vírus no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução. Por exemplo, a ORF pode ser conservada entre dois ou mais vírus ssRNA diferentes se houver cerca de 75% (tal como cerca de 70% a cerca de 80%, por exemplo, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78% ou cerca de 79%) de identidade entre a ORF codificada por pelo menos parte do genoma de cada vírus, no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução. O polipeptídeo codificado pela ORF pode aumentar a aptidão do vírus ssRNA em humanos, isto é, conferir uma vantagem seletiva ao vírus ssRNA.
[0073] A ORF pode ser conservada entre dois ou mais (tais como três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, ou 1000 ou mais) vírus influenza A. Os vírus influenza A entre os quais a ORF é conservada podem ser do mesmo sorotipo. Os vírus influenza A entre os quais a ORF é conservada podem ser de sorotipos diferentes. Por exemplo, a ORF pode ser conservada entre dois ou mais vírus, cada um pertencente a um dos seguintes serotipos: H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, H7N9, H6N1, O ORF pode ser conservado entre dois ou mais (como três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais ou 1000 ou mais) vírus influenza A humana. A ORF pode ser conservada entre um ou mais (tais como dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, ou 1000 ou mais) vírus influenza A humanos e um ou mais (tais como dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, ou 1000 ou mais) vírus da influenza A suíno. A ORF pode ser conservada entre um ou mais (tais como dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, ou 1000 ou mais) vírus influenza A humanos e um ou mais (tais como dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, ou 1000 ou mais) vírus da influenza A aviário. A ORF pode ser conservada entre um ou mais (tais como dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, ou 1000 ou mais) vírus influenza A humanos e um ou mais (tais como dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 250 ou mais, 500 ou mais, 750 ou mais, ou 1000 ou mais) vírus da influenza A equino.
[0074] A ORF pode ser conservada entre dois ou mais (tais como três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais) flavivírus. Por exemplo, a ORF pode ser conservada entre dois ou mais serotipos do vírus da Dengue selecionados de DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. A ORF pode ser conservada entre duas ou mais estirpes do vírus Zika, como o vírus Zika africano e o vírus Zika asiático. A ORF pode ser conservada entre um ou mais serotipos do vírus da dengue (por exemplo, um ou mais de DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4) e uma ou mais estirpes do vírus Zika (por exemplo, um ou ambos do Zika africano vírus e vírus Zika asiático).
[0075] A ORF pode ser conservada entre dois ou mais (tais como três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais) filovírus. Por exemplo, a ORF pode ser conservada entre dois ou mais ebolavírus selecionados de ebolavírus do Zaire (ZEBOV), ebolavírus Bundibugyo (BDBV), ebolavírus
Reston (RESTV), ebolavírus do Sudão (SUDV) e ebolavírus da floresta Taï (TAFV). A ORF pode ser conservada entre dois ou mais vírus Marburg, como o vírus Marburg (MARV) e o vírus Ravn (RAVV). A ORF pode ser conservada entre um ou mais ebolavírus (por exemplo, um ou mais de ZEBOV, BDBV, RESTV, SUDV e TAFV) e um ou mais marburgvírus (por exemplo, um ou ambos de MARC e RAVV).
[0076] O polipeptídeo codificado pela ORF, e/ou o epítopo que inclui, pode ser conservado de forma similr dois ou mais vírus. A composição da vacina pode, portanto, ser capaz de fornecer proteção cruzada contra vários vírus. Uma única composição de vacina da invenção pode, portanto, ser capaz de induzir imunidade protetora contra uma variedade de vírus ssRNA existentes e emergentes, tais como vírus Influenza A, flavivírus ou filovírus. Por exemplo, em um aspecto, o polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre dois ou mais vírus influenza A humanos. Neste caso, a composição da vacina da invenção pode ser capaz de fornecer proteção contra dois ou mais vírus influenza A humanos. Em outro aspecto, o polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A humano e um vírus influenza A suíno, equino e/ou aviário. Neste caso, a composição da vacina da invenção pode ser capaz de proteger um indivíduo humano contra a infecção com um vírus da influenza A suíno, equino e/ou aviário, evitando que os vírus da influenza A suíno, equino e/ou aviário cruzem a divisão de espécies. Em qualquer caso, os dois ou mais vírus influenza A humanos pode ser do mesmo serótipos ou de serótipos diferentes. Cada um dos dois ou mais vírus influenza A humana pode ser do serotipo H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, H7N9 ou H6N1. Vírus
[0077] O vírus ssRNA cujo genoma codifica, no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de RNA de tradução, uma ORF que codifica um polipeptídeo pode ser um vírus ssRNA de sentido negativo ou um vírus ssRNA sentido positivo.
[0078] O vírus ssRNA pode ser qualquer vírus ssRNA de sentido negativo. Os vírus ssRNA de sentido negativo são bem conhecidos na técnica e incluem vírus das ordens Mononegavirales e Bunyvirales. A ordem Mononegavirales inclui as famílias Bornavirida, Filoviridae, Mymonaviridae, Nyamiviridae, Paramyxoviridae, Pneumoviridae, Rhabdoviridae e Sunviridae, bem como os gêneros Anphevirus, Arlivirus, Chengtivirs, Crustavirus e Wastrivirus. A ordem Bunyavirales inclui as famílias Feraviridae, Fimoviridae, Hantavirida, Jonviridae, Nairoviridae, Peribunyaviridae, Phasmaviridae, Phenuiviridae e Tospoviridae. Outros vírus ssRNA de sentido negativo incluem aqueles das famílias Arenaviridae, Ophiovirida e Orthomyxoviridae, bem como o gênero Deltavirus.
[0079] O vírus ssRNA pode ser um Orthomyxovirus. Por exemplo, o vírus ssRNA pode ser um vírus influenza. Existem centenas de estirpes de vírus influenza que podem ser classificadas em três categorias principais, Influenza A, Influenza B ou Influenza C, com base nas proteínas HA e NA que expressam. O vírus ssRNA pode ser um vírus Influenza A, Influenza B ou Influenza C de qualquer estirpe. Assim, a ORF que codifica o polipeptídeo compreendendo o epítopo de células T CD8 + pode ser codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus Influenza A, Influenza B e/ou Influenza C no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução. Preferencialmente, o vírus ssRNA é um vírus Influenza A. O vírus Influenza A pode ser de qualquer serótipo. Preferencialmente, o vírus Influenza A é do serótipo H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, H7N9 ou H6N1. Os vírus influenza e as ORFs que eles podem codificar são considerados em mais detalhes a seguir.
[0080] O vírus ssRNA pode ser um filovírus. Numerosas espécies de filovírus existem em dois gêneros principais, ebolavírus e marburgvírus. As espécies de ebolavírus incluem Zaire ebolavirus (ZEBOV), Bundibugyo ebolavirus (BDBV), Reston ebolavirus (RESTV), Sudan ebolavirus (SUDV) e Taï Forest ebolavirus (TAFV). As espécies de Marburgvirus incluem o vírus Marburg (MARV) e o vírus Ravn (RAVV). Um terceiro gênero, cuevaviruses, inclui as espécies de vírus Lloviu. Preferencialmente, o vírus ssRNA é um vírus Ebola ou vírus Marburg.
[0081] O vírus ssRNA pode ser qualquer vírus ssRNA de sentido positivo. Os vírus ssRNA de sentido positivo são bem conhecidos na técnica e incluem as famílias Picornaviridae, Astroviridae, Caliciviridae, Hepeviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Arteriviridae e Coronaviridae.
[0082] O vírus ssRNA pode ser um Flavivírus. Numerosas espécies de flavivírus podem existir, incluindovírus Zika, vírus da Dengue, vírus do Vale do Nilo, vírus da febre amarela, vírus da encefalite de São Luís, vírus da encefalite japonesa, vírus da encefalite do Vale Murray, vírus da encefalite transmitida por carrapatos, vírus da encefalite de Kunjin, vírus da encefalite Rocio, vírus da encefalite russa primavera-verão, vírus Negeishi, vírus da Floresta de Kyasanur, vírus da Febre Hemorrágica de Omsk, vírus Powassan, vírus Louping I11, vírus Rio Bravo, vírus Tyuleniy, vírus Ntaya e vírus Modoc. Existem quatro serótipos do vírus da dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4) e duas cepas do vírus Zika (vírus Zika africano e vírus Zika asiático). Preferencialmente, o vírus ssRNA é um vírus da Dengue ou um vírus Zika. Vírus influenza
[0083] Conforme estabelecido acima, o vírus ssRNA pode ser um vírus ssRNA de sentido negativo. Por exemplo, o vírus ssRNA pode ser um Orthomyxovirus, como um vírus influenza. O vírus influenza pode, por exemplo, ser um vírus influenza A e vírus influenza B ou um vírus influenza C. Preferencialmente, o vírus ssRNA é um vírus Influenza A. O vírus influenza A pode, por exemplo, ser um vírus influenza A humano, um vírus influenza A suíno, um vírus influenza A equino ou um vírus influenza A aviário. O vírus influenza A pode ser um vírus influenza A zoonótico.
[0084] O vírus influenza pode, por exemplo, ser um vírus influenza espanhol, como o vírus influenza A H1N1 que foi responsável pela pandemia de gripe de 1918 (o “ vírus influenza de 1918 ”). A sequência de codificação completa do vírus influenza de 1918 é conhecida na técnica. O vírus influenza pode, por exemplo, ser um vírus influenza espanhol reconstruído. Um vírus influenza espanhol reconstruído é um vírus influenza que carrega as sequências codificadoras dos oito segmentos gênicos do vírus influenza de 1918. Por exemplo, um vírus influenza espanhol reconstruído compreende a sequência de codificação conhecida do vírus influenza de 1918 e regiões não codificantes correspondentes às de um vírus intimamente relacionado. O vírus intimamente relacionado pode, por exemplo, ser um vírus influenza a H1N1, como o vírus A/WSN/33 (H1N1).
[0085] O genoma do vírus influenza A é segmentado, compreendendo 8 segmentos de ssRNA de sentido negativo. Embora existam muitas similaridades estruturais e genéticas entre os vírus influenza A humano, suíno, equino e aviário, a infecção cruzada de espécies tende a ser infrequente e ineficiente. No entanto, a coinfecção de um único hospedeiro com vários vírus influenza A diferentes pode levar a uma reorganização do genoma segmentado, dando origem a novas estirpes que podem ter potencial pandêmico.
[0086] Quando traduzido da maneira normal (ou seja, após a transcrição para mRNA complementar), o segmento 8 do genoma do vírus influenza A codifica duas proteínas, NS1 e NEP. Nos vírus influenza A humanos, o segmento 8 também codifica uma ORF no sentido oposto ao RNA de sentido positivo, capaz de tradução. A ORF é conhecida como NEG8, pois é codificada pela chamada fita negativa do segmento 8. Quase todos os vírus influenza A humanos isolados na primeira metade do século 20 possuía uma ORF NEG8 de 167 códons de comprimento. A conservação da ORF NEG8 de 167 códons em vírus influenza A humanos durante um período de cerca de 50 anos indica que a ORF NEG8 de 167 códons confere uma vantagem seletiva aos vírus influenza A humanos. Isso é enfatizado pelo fato de que os vírus que perderam a ORF NEG8 de 167 códons não persistiram na população humana por mais do que alguns anos. Sobre a meio do século 20, uma mutação do códon de parada TAG da ORF NEG8 de 167 códons de TAT (tirosina que codifica) ocorreu, dando origem a uma ORF NEG8 de 216 códons alargado. A mutação não teve efeito nas outras proteínas codificadas pelo segmento 8, devido à degenerescência no código de aminoácidos. Essencialmente, todos os vírus influenza A humanos isolados após 1947 possuem a ORF NEG8 de 216 códons, indicando que esta ORF também confere uma vantagem seletiva aos vírus influenza A humanos. Recentemente, uma ORF NEG8 de 85 códons também foi observada em alguns vírus influenza A humanos. Os ORFs de 167 códons e 216 códons também foram, cada um, observados em uma série de vírus influenza A suíno e aviário. ORFs de outros comprimentos também foram observadas em vírus influenza A humano, aviário, equino e suíno (ver Exemplo 5). Por exemplo, uma ORF de 93 códons (ou mais raramente, uma ORF de 135 códons) foi observada em vírus influenza A aviário, aviário e equino. Uma ORF de 140 códons e uma ORF de 167 códons foram observados em vírus da influenza A suíno.
[0087] A presença de uma ORF NEG8 de 85, 167 ou 216 códons conservada conferindo uma vantagem seletiva sobre (isto é, aumentando a aptidão de) vírus influenza A humanos tem implicações importantes para o surgimento de novas estirpes de vírus influenza A. Em particular, a coinfecção de um hospedeiro com dois ou mais vírus influenza A pode causar o rearranjo do genoma viral. Em essência, os segmentos podem alternar entre os vírus, dando origem aos vírus com novas combinações de segmentos do genoma. Por exemplo, a coinfecção com o vírus X e o vírus Y pode levar à geração de um novo vírus tendo, por exemplo, segmentos 1 a 7 do vírus X e segmento 8 do vírus Y. Isso é preocupante porque o segmento 8 de um vírus influenza A humano que possui a ORF NEG8 de 216 códons poderia se reorganizar com segmentos de um vírus da influenza A aviário (por exemplo, H5N1), um vírus da influenza A equino ou um vírus da influenza A suíno (por exemplo, H1N1). Normalmente, o vírus influenza aviário A não possui ORF NEG8 e tem patogenicidade limitada e/ou transmissão deficiente em humanos. A aquisição da ORF NEG8 por meio do reagrupamento com um vírus influenza A humano pode aumentar a aptidão do vírus influenza A aviário, equino ou suíno em humanos, potencialmente levando ao desenvolvimento de uma nova estirpe pandêmica.
[0088] Além disso, a análise do segmento 8 dos vírus da influenza A suíno, equino ou aviário mostrou que, para certas estirpes, apenas pequenas mutações são necessárias para dar origem a ORF NEG8 de 167 códons ou 126 códons que confere aptidão viral em humanos. Por exemplo, apenas 2 códons de parada precisam ser removidos (cada um por uma única mudança de nucleotídeo) do segmento 8 do genoma H1N1 derivado de suínos para dar origem a ORF NEG8 de 216 códons encontrado em vírus influenza A humanos. É necessária apenas uma alteração de 1 nucleotídeo para chegar ao códon ORF NEG8 de 167 códons historicamente encontrado nos vírus influenza A humanos.
[0089] É claro, portanto, que uma composição de vacina eficaz contra a infecção pelo vírus influenza A é necessária. Em um aspecto, a composição de vacina da invenção é uma composição de vacina contra infecção pelo vírus influenza A. Preferencialmente, o peptídeo imunogênico compreendido na composição da vacina compreende um epítopo de células T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF que é codificada por pelo menos parte do segmento 8 do genoma do vírus influenza A, no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução. Consequentemente, a ORF pode ser uma ORF NEG8. A ORF pode ser codificada por todo ou parte do segmento 8, no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução. Por exemplo, a ORF pode ser codificada em cerca de 1% a cerca de 99%, tal como cerca de 2% a cerca de 98%, cerca de 3% a cerca de 97%, cerca de 5% a cerca de 95%, cerca de 10% a cerca de 90% , cerca de 15% a cerca de 85%, cerca de 20% a cerca de 80%, cerca de 25% a cerca de 75%, cerca de 30% a cerca de 70%, cerca de 40% a cerca de 60%, ou cerca de 50% do segmento 8, no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução.
[0090] A ORF pode ser de qualquer comprimento, conforme descrito acima.
Por exemplo, a ORF pode ser de cerca de 8 a cerca de 300, tal como cerca de 9 a cerca de 290, cerca de 10 a cerca de 280, cerca de 11 a cerca de 275, cerca de 12 a cerca de 270, cerca de 13 a cerca de 260, cerca de 14 a cerca de 250 , cerca de 15 a cerca de 240, cerca de 16 a encostar em 230, cerca de 17 a cerca de 225, cerca de 18 a cerca de 220, cerca de 19 a cerca de 210, cerca de 20 a cerca de 200, cerca de 25 a cerca de 190, cerca de 30 a cerca de 180, cerca de 35 a cerca de 175, cerca de 40 a cerca de 170, cerca de 45 a cerca de 160, cerca de 50 a cerca de 150, cerca de 55 a cerca de 140, cerca de 60 a cerca de 130, cerca de 65 a cerca de 125, cerca de 70 a cerca de 120, cerca de 75 a cerca de 110, cerca de 80 a cerca de 100, cerca de 85 a cerca de 95, cerca de 167 a cerca de 216 ou cerca de 90 códons de comprimento.
A ORF pode ser pelo menos 8, tal como pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos, 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40 , pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 150, pelo menos 175, pelo menos 200, pelo menos 225, pelo menos 250 ou pelo menos pelo menos 275 códons de comprimento.
A ORF pode, por exemplo, ser pelo menos 31, pelo menos 36, pelo menos 37, pelo menos 39, pelo menos 40, pelo menos 41, pelo menos 45, pelo menos 48, pelo menos 49, pelo menos 50, pelo menos 53, pelo menos 58, pelo menos 60, pelo menos 63, pelo menos 73, pelo menos 74, pelo menos 80, pelo menos 81, pelo menos 84, pelo menos 85, pelo menos 87, pelo menos 88, pelo menos 89, 92, 93, pelo menos 94, pelo menos 105, 1 pelo menos 21, pelo menos 135, pelo menos 140, pelo menos 167, pelo menos 170, pelo menos 178, pelo menos 197, pelo menos 216 ou pelo menos 246 códons em comprimento.
A ORF pode, por exemplo, ter pelo menos 85 códons de comprimento.
Preferencialmente, a ORF tem pelo menos 167 códons de comprimento.
Preferencialmente, a ORF tem pelo menos 216 códons de comprimento.
[0091] Em alguns aspectos, a ORF pode compreender a sequência:
TTAAATAAGCTGAAACGAGAAAGTTCTTATCTCTTGCTCCACTTCAAGCAAT AGTTGTAAGGCTTGCATAAATGTTATTTGCTCAAAACTATTCTCTGTTATCTT CAGTCTATGTCTCACTTCTTCAATCAACCATCTTATTTCTTCAAACTTCTGAC TTAATTGTTCTCGCCATTTTCCGTTTCTGTTTTGGAGGGAGTGGAGGTCTC CCATTCTCATTACTGCTTCTCCAAGCGAATCTCTGTAGAGTTTCAGAGACT CGAACTGTGTTATCATTCCATTCAAGTCCTCCGATGAGGACCCCAACTGCA TTTTTGACATCCTCATCAGTATGTCCTGGAAGAGAAGGCAATGGTGAAATT TCGCCAACAATTGCTCCCTCTTCGGTGAAAGCCCTTAGTAGTATTAGAGTC TCCAGCCGGTCGAAAATCACACTGAAGTTCGCTTTCAGTATGATGTTCTTA TCCATGATCGCCTGGTCCATTCTGATACAAAGAGAGCCTGCCACTTTCTGC TTGGGCATGAGCATGAACCAGTCCCTTGACATCTCCTCAAGAGTCATGTCA GTTAGGTAGCGCGAAGCAGGTACAGAGGCAATGGTCATTTTAAGTGCCTC ATCGGATTCTTCCTTCAGAATCCGCTCCACTATCTGCTTTCCAGCACGGGT GGCTGTCTCGATGTCCAGACCAAGAGTGCTGCCTCTTCCTCTTAGGGACT TCTGATCTCGGCGAAGCCGATCAAGGAATGGGGCATCACCCAGTTCTTGG
TCTGCAAACCGTTTGCGGACATGCCAAAGAAAGCAGTCTACCTGAAAGCTT GACACAGTGTTGGAATCCAT (SEQ ID NO: 56) ou uma variante da SEQ ID NO: 56.
[0092] Em alguns aspectos, a ORF pode compreender a sequência:
TATCATTAAATAAGCTGAAATGAGAAAGTTCTTATCTCCTGTTCCACTTCAA ACAGCAGTTGTAATGCTTGCATGAATGTTATTTGTTCAAAGCTATTTTCCGT TGTTTTTAGTCTGTGTCTCACTTCTTCAATCAGCCATCTTATCTCTTCAAACT TTTGACCTAGCTGTTCTCGCCATTTTCCGTTTCTGTTTTGGAGTAAGTGGA GGTCCCCCATTCTCATTACTGCTTCTCCAAGCGAATCTCTGTAGATTTTTAG AGACTCGAACTGTGTTATCATTCCATTCAAGTCCTCCGATGAGGACCCCAA TTGCATTTTTGACATCCTCAATAGTATGTCCTGGAAAAGAAGGCAATGGTG AGATTTCGCCAACAATTGCTCCCTCTTCGGTGAAAGCCCTTAGTAATACTA TGGTCTCTAGTCGGTCAAAAATCACACTGAAATTCGCTTTCAATATGATGTT TTTCTCCATGATTGCCTGGTCCATTCTGATGCAAAGAGGTCCTTCCACTTT CTGCTTGGGCATTAGCATGAACCAGTTTCTTGACAATTCCTCAATAGTCAT GTCAGTTATGTATCGCGAAGCAGGTGTGGAGACCATGGTCATTTTAAGTGC CTCATCAGATTCTTCTTTCAGAATCTTTTCTACAATTTGCTTTCCAACATGG GTGGCTGCTTTGATGTCTAGACCGAGAGTATTGCCTCTTCCCCTTAGGGAC CTCTGATCTCGGCGAAGCCGATCAAGGAATGGGGCATCACTCAGTTCTTG
GTCTACAACTTGTTTCCGGATATGCCAAAGAAAGCAATCTACCTGGAAACT TGACACAGTGTTGGAATCCATTATGT (SEQ ID NO: 57) ou uma variante da SEQ ID NO: 57.
[0093] Ao longo de todo o comprimento da sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 56 ou SEQ ID NO: 57, uma variante será preferencialmente pelo menos 50% idêntica àquela sequência com base na identidade de nucleotídeos. Mais preferencialmente, a variante pode ser pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% e mais preferencialmente pelo menos pelo menos 95%, 97% ou 99% idêntica com base na identidade de nucleotídeos com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 56 ou SEQ ID NO: 57 em toda a sequência. Pode haver pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, 90% ou 95%, identidade de nucleotídeos em um trecho de 100 ou mais, por exemplo 125, 150, 175 ou 200 ou mais, nucleotídeos contíguos.
[0094] Conforme descrito acima, a ORF pode ser conservada entre dois ou mais vírus influenza A humanos. A ORF pode ser conservada entre um ou mais vírus da influenza A humano e um ou mais vírus da influenza A aviário. A ORF pode ser conservada entre um ou mais vírus da influenza A humano e um ou mais vírus da influenza A equinos. A ORF pode ser conservada entre um ou mais vírus da influenza A humano e um ou mais vírus da influenza A suínos. Para ser conservado entre dois ou mais vírus influenza A, a ORF em cada um dos dois ou mais vírus influenza A tem preferencialmente pelo menos 50% (tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80 %, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) de identidade em toda a sua sequência com a ORF em cada um dos outros vírus influenza A. Por exemplo, a ORF pode ser conservada entre dois ou mais vírus influenza A se houver cerca de 75% (tal como cerca de 70% a cerca de 80%, por exemplo, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78% ou cerca de 79%) identidade entre as ORFs em cada vírus.
[0095] O ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência
MLFAQNYSLLSSVYVSLLQSTILFLQTSDLIVLAIFRFCFGGSGGLPFSLLLLQA NLCRVSETRTVLSFHSSPPMRTPTAFLTSSSVCPGREGNGEISPTIAPSSVKAL
SSIRVSSRSKITLKFAFSMMFLSMIAWSILIQREPATFCLGMSMNQSLDISSRV MSVR (SEQ ID NO: 1 ou uma variante da mesma. SEQ ID NOs: 1 é a sequência de 167 aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 56.
[0096] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência de
MLFVQSYFPLFLVCVSLLQSAILSLQTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLLQA NLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALS
NTMVSSRSKITLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIV MSVMYREAGVETMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL( SEQ ID NO: 2 ou uma variante da mesma. SEQ ID NOs: 2 é a sequência de 216 aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:
57.
[0097] O ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência
MLFARNYSLLSSIYVSLLQSTTLFLQTSDSIVLAIFRFCFGGSGGLLSSLLLLQA NLCRVSETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSSVCPGREGTGEISPTIAPSSVKAL
SSIRVSNRSKIILKFAFSVMFLSMIAWSILIQREPATFCLGMSMNQSLDISSRVM SVR (SEQ ID NO: 3 ou uma variante da mesma.
[0098] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência
MLFAQNYSLLSSVCVSLLQSTILFLQTSDLIVPAISRFCFGVSCGLPFSLLLLQA NLCRVSETRTVLSFHSSPPMRTPTAFLTSSAVCPGREGNGEISPTIAPSSVKAL
SNIRVSSRSKITLKFAFSMMFLSMIAWSILIQRGPATFCLGMSMDQSLDISSRV MSVR (SEQ ID NO: 4 ou uma variante da mesma.
[0099] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência
MLFAQNYSLLFSICVSLLQSTILFLRTSDLIVLAIFRFCFGVSGGLPVSLLLLQAN LCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSLVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALS
NIRVSSRSKITLKFAFSMMLLSMIAWSILIQRGPATFCLGMSMNQSLDISSIVMS VR (SEQ ID NO: 5 ou uma variante da mesma.
[00100] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência
MLFAQNYSLLFSICASLLQSTILFLRTSDLIVLAIFRFCFGVSGGLPVSLLLLQAN LCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSLVCPGREGNGEISPYIAPSSVKALS
NIRVSSRSKITLKFAFSMMLLSMIAWSILIQRGPATFCLGMSMNQSLDISSIVMS VR (SEQ ID NO: 6 ou uma variante da mesma.
[00101] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência de
MLFAQNYSLLSSICVSLLQSAILFLRTFDLIVLAIFRFCFGVSGGLPFSLLLLQAN LCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSLVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALS
NIRVSSRSKITLKFAFNMMFLSMIAWSILIQRGPATFCLGISMNQSLDISSIVMSV RYREAGAEAMVILSASSDSSFRILSTICFPTRVAVSMFRPRVLPLPLRDF (SEQ ID NO: 7 ou uma variante da mesma.
[00102] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência de
MLFAQNYSLLSSICVSLLQSAILFLRTFDLIVLAIFRFYFGVSGGLPFSSLLLQAN LCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSLVCPGREGNGEISPTIAPASVKALS
NIRVSSRSKITLKFAFNMMFLSMIAWSILIQRGPATFCLGISMNQSLDISSIVMSB RYREAGAEAMVILSASSDSSFRILSTICFPTRVAVSMFRPRVLPLPLRDF (SEQ ID NO: 8 ou uma variante da mesma.
[00103] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência
MLFAQNYSLLSSICVSLLQSAILSLRTFDLTVLAIFRFCFGVSGGLPFSLLLPQA NLCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALS
NIRVSSRSKITLKFAFNMTFLSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQSLDNSSIVM SVRYREAGAEAMVILSASSDSSFRILSTICFPTRVAASMFRPRVLPLPLRDF(SE Q ID NO: 9 ou uma variante da mesma.
[00104] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência
MLFAQNYSLLSSICVSLLQSAILSLRTFDLIVLAIYRFCFGVSGCLPFSLLLLQAN LCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGREGNGEISPTIAPSSVKALSNI
RVSSRSKITLKFAFNMMFLSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQSLDNSSIVMSV RYREAGAEAMVILSASSDFSFRILSTICFPTRVAASMFRPRVLPLPLRDF (SEQ ID NO: 10 ou uma variante da mesma.
[00105] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência
MLFAQNYSQLFSVCVSLLQSAILSLRTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLPQ ANLCRVLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKAL SNTRVSSRSKITLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIV
MSVMYREAGVEAMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL (SEQ ID NO: 11 ou uma variante da mesma.
[00106] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência
MLFAQNYSQLFLVCVSLLQSAILSLRTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLPQA NLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPYIAPSSVKALS NTRVSSRSKITLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVI
SVMYREAGVEAMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL (SEQ ID NO: 12 ou uma variante da mesma.
[00107] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência
MLFAQNYSQLFLVCVSLLQSAILSLQTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLLQA NLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALS NTMVSSRSKTTLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIV
MSVMYREAGVEAMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALISRPRVLPLPLRDL (SEQ ID NO: 13 ou uma variante da mesma.
[00108] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência
MLFVQSYFQLFLICVSLLQLAILSLQTFDLAVLAISRFCFGVSGGPPFSLLLLQA NLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALS NTIVSSRSKITLKFAFNVMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVMS
VMYREAGVETMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL (SEQ ID NO: 14 ou uma variante da mesma.
[00109] A ORF pode codificar um polipeptídeo compreendendo a sequência
MLFVQSYFQLFLICVSPLQLAILSLQTSDLAVLAISRFCFGVSGGPPFSLLLLQA NLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTASIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALS NTMVSSRPKITLKFAFNMIFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDSSSIVM
SVMYREAGVETMVILSASSDSSFRIFSIICFPAWVAALVSRPRVLPLPLRDL (SEQ ID NO: 15 ou uma variante da mesma.
[00110] Ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15, uma variante será preferencialmente pelo menos 50% idêntica àquela sequência com base na identidade de aminoácidos. Mais preferencialmente, a variante pode ser pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% e mais preferencialmente pelo menos pelo menos 95%, 97% ou 99% idêntica com base na identidade de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15 em toda a sequência. Pode haver pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 85%, 90% ou 95%, identidade de aminoácidos em um trecho de 100 ou mais, por exemplo 125, 150, 175 ou 200 ou mais, aminoácidos contíguos.
[00111] O polipeptídeo codificado pela ORF pode ser conservado entre dois ou mais vírus influenza A humanos. O polipeptídeo pode ser conservado entre um ou mais vírus da influenza A humano e um ou mais vírus da influenza A aviário. O polipeptídeo pode ser conservado entre um ou mais vírus da influenza A humano e um ou mais vírus da influenza A equinos. O polipeptídeo pode ser conservado entre um ou mais vírus da influenza A humano e um ou mais vírus da influenza A suínos. Para ser conservado entre dois ou mais vírus influenza A, o polipeptídeo codificado pela ORF em cada um dos dois ou mais vírus influenza A tem preferencialmente pelo menos 50% (tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80 %, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) de identidade em toda a sua sequência com o polipeptídeo codificado pela ORF em cada um dos outros vírus influenza A. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser conservado entre dois ou mais vírus influenza A se houver cerca de 75% (tal como cerca de 70% a cerca de 80%, por exemplo, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78% ou cerca de 79%) de identidade entre os polipeptídeos codificados pela ORF em cada vírus.
[00112] O epítopo de células T CD8 + do polipeptídeo pode ser conservado entre dois ou mais vírus influenza A humanos. O epítopo pode ser conservado entre um ou mais vírus da influenza A humano e um ou mais vírus da influenza A aviário. O epítopo pode ser conservado entre um ou mais vírus da influenza A humano e um ou mais vírus da influenza A equinos. O epítopo pode ser conservado entre um ou mais vírus da influenza A humano e um ou mais vírus da influenza A suínos. Para ser conservado entre dois ou mais vírus influenza A, um epítopo codificado pela ORF em cada um dos dois ou mais vírus influenza A tem preferencialmente pelo menos 50% (tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75% , pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%) identidade ao longo de sua sequência inteira com um epítopo codificado pela ORF em cada um dos outros vírus influenza A. Por exemplo, o epítopo pode ser conservado entre dois ou mais vírus influenza A se houver cerca de 75% (tal como cerca de 70% a cerca de 80%, por exemplo, cerca de 71%, cerca de 72%, cerca de 73%, cerca de 74%, cerca de 76%, cerca de 77%, cerca de 78% ou cerca de 79%) identidade entre epítopos codificados pela ORF em cada vírus.
[00113] A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H1N1 humanos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H5N1 humanos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H3N2 humanos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H2N2 humanos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H7N7 humanos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H7N9 humanos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H1N1 aviários. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H5N1 aviários. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H3N2 aviários. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H2N2 aviários. A ORF,
polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H7N7 aviários. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H7N9 aviários. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H1N1 suínos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H5N1 suínos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H3N2 suínos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H2N2 suínos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H7N7 suínos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H7N9 suínos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H1N1 equinos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H5N1 equinos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H3N2 equinos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H2N2 equinos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H7N7 equinos. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza A H7N9 equinos.
[00114] A ORF pode ser conservada entre (i) vírus influenza A H1N1 humanos, (ii) vírus influenza A H5N1 humanos, (iii) vírus influenza A H3N2 humanos, (iv) vírus influenza A H2N2 humanos , (v) vírus influenza A H7N7 humanos , (vi) vírus influenza A H7N9 humanos, (vii) vírus influenza A H1N1 aviários, (viii) vírus influenza A H5N1 aviários, (ix) vírus influenza A H3N2 aviários, (x) vírus influenza A H2N2 aviários, (xi) vírus influenza A aviário Vírus da gripe A H7N7, (xii) vírus influenza A H7N9 aviário, (xiii) vírus influenza A H1N1 suíno, (xiv) vírus influenza A H5N1 suíno, (xv) vírus influenza A H3N2 suíno, (xvi) vírus influenza A H2N2 suíno , (xvii) vírus da influenza A H7N7 suíno , (xviii) vírus da influenza A H7N9 suíno, (xix) vírus da influenza A H1N1 equinos, (xx) vírus da influenza A H5N1 equinos, (xxi) vírus da influenza A H3N2 equinos, (xxii) vírus influenza A H2N2 equinos , (xxiii) vírus influenza A
H7N7 equinos e/ou (xxiv) vírus influenza A H7N9 equino, sozinhos ou em qualquer combinação.
[00115] O polipeptídeo pode ser conservado entre (i) vírus influenza A H1N1 humanos, (ii) vírus influenza A H5N1 humanos, (iii) vírus influenza A H3N2 humanos, (iv) vírus influenza A H2N2 humanos , (v) vírus influenza A H7N7 humanos , (vi) vírus influenza A H7N9 humanos, (vii) vírus influenza A H1N1 aviários, (viii) vírus influenza A H5N1 aviários, (ix) vírus influenza A H3N2 aviários, (x) vírus influenza A H2N2 aviários, (xi) vírus influenza A aviário Vírus da gripe A H7N7, (xii) vírus influenza A H7N9 aviário, (xiii) vírus influenza A H1N1 suíno, (xiv) vírus influenza A H5N1 suíno, (xv) vírus influenza A H3N2 suíno, (xvi) vírus influenza A H2N2 suíno , (xvii) vírus da influenza A H7N7 suíno , (xviii) vírus da influenza A H7N9 suíno, (xix) vírus da influenza A H1N1 equinos, (xx) vírus da influenza A H5N1 equinos, (xxi) vírus da influenza A H3N2 equinos, (xxii) vírus influenza A H2N2 equinos , (xxiii) vírus influenza A H7N7 equinos e/ou (xxiv) vírus influenza A H7N9 equino, sozinhos ou em qualquer combinação.
[00116] O epítopo pode ser conservado entre (i) vírus influenza A H1N1 humanos, (ii) vírus influenza A H5N1 humanos, (iii) vírus influenza A H3N2 humanos, (iv) vírus influenza A H2N2 humanos , (v) vírus influenza A H7N7 humanos , (vi) vírus influenza A H7N9 humanos, (vii) vírus influenza A H1N1 aviários, (viii) vírus influenza A H5N1 aviários, (ix) vírus influenza A H3N2 aviários, (x) vírus influenza A H2N2 aviários, (xi) vírus influenza A aviário Vírus da gripe A H7N7, (xii) vírus influenza A H7N9 aviário, (xiii) vírus influenza A H1N1 suíno, (xiv) vírus influenza A H5N1 suíno, (xv) vírus influenza A H3N2 suíno, (xvi) vírus influenza A H2N2 suíno , (xvii) vírus da influenza A H7N7 suíno , (xviii) vírus da influenza A H7N9 suíno, (xix) vírus da influenza A H1N1 equinos, (xx) vírus da influenza A H5N1 equinos, (xxi) vírus da influenza A H3N2 equinos, (xxii) vírus influenza A H2N2 equinos , (xxiii) vírus influenza A H7N7 equinos e/ou (xxiv) vírus influenza A H7N9 equino, sozinhos ou em qualquer combinação.
[00117] A conservação do epítopo entre dois ou mais vírus influenza A pode permitir que a composição da vacina forneça proteção contra múltiplos vírus influenza A. Por exemplo, após a administração a um indivíduo, a composição da vacina pode induzir uma resposta imune que é protetora contra a infecção com alguns ou todos os vírus influenza A possuindo o epítopo conservado. Desta maneira, uma única composição de vacina pode ser usada para prevenir ou tratar a infecção com uma ampla variedade de vírus influenza A. Isso pode ajudar a superar alguns dos problemas associados às vacinas existentes do vírus influenza A. Em particular, alvejar um epítopo conservado pode evitar a necessidade de desenvolver frequentemente novas vacinas para corresponder ao (s) serótipo (s) viral (is) atual (is) que infectam a população humana. A composição da vacina da invenção pode ser usada para prevenir ou tratar novas estirpes de infecção que surgem no meio da temporada, tais como estirpes potencialmente pandêmicas. A composição de vacina da invenção pode ser usada para prevenir ou tratar a infecção com estirpes que surgem do rearranjo de segmentos de um vírus da influenza A suíno, equino e/ou aviário com o segmento 8 de um vírus da influenza A humana.
[00118] Em um aspecto, o epítopo de células T CD8 + pode estar presente em uma ORF prevista de pelo menos 85, pelo menos 167 ou pelo menos 216 códons de comprimento em um vírus da influenza A suíno, equino e/ou aviário, tal como um vírus influenza A suíno do serótipo H1N1. Por exemplo, o epítopo de células T CD8 + pode estar presente em uma ORF de pelo menos 85, pelo menos 167 ou pelo menos 216 códons de comprimento que surgiriam em um vírus da influenza A suíno, equino e/ou aviário caso o segmento 8 sofresse mutação. Por exemplo, o epítopo de células T CD8 + pode estar presente em uma ORF de pelo menos 85, pelo menos 167 ou pelo menos 216 códons de comprimento que surgiriam em um vírus da influenza A suíno, equino e/ou aviário caso um ou mais nucleotídeos (tal como dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais ou dez ou mais nucleotídeos) no segmento 8 sofrem substituição por um nucleotídeo diferente. A substituição por um nucleotídeo diferente pode alterar um códon de parada codificado pelo segmento 8 no sentido oposto para um RNA de sentido positivo capaz de tradução em um códon que codifica um aminoácido. Por exemplo, a substituição de um único nucleotídeo em um códon de parada UAG pode dar origem a um códon UAU, UAC, UUG, UCG, UGG, CAG, AAG ou GAG que codifica um aminoácido.
[00119] Ao incluir um peptídeo imunogênico que compreende um epítopo de célula T CD8 + que está presente em uma ORF prevista de pelo menos 85, pelo menos 167 ou pelo menos 216 códons de comprimento em um vírus da influenza A suíno, equino e/ou aviário na composição da vacina , a capacidade da composição da vacina de proteger contra estirpes potencialmente pandêmicas do vírus influenza A pode ser melhorada. Por exemplo, fazer isso pode permitir que a composição da vacina induza uma resposta imune protetora contra um vírus da influenza A suíno, equino ou aviário que adquire o códon 85, o códon 167 ou o códon 216 ou a ORF NEG8 de 216 códons que é encontrado nos vírus influenza A humano e confere a aptidão viral em humanos. Peptídeos NEG8
[00120] Conforme estabelecido nos Exemplos, os presentes inventores identificaram uma série de peptídeos que são (i) de um polipeptídeo codificado pela ORF codificada pelo segmento 8 de vírus influenza A humanos no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução (a ORF NEG8), e (ii) apresentado por moléculas de MHC de classe I em células infectadas com o vírus influenza A humano. Consequentemente, os presentes inventores identificaram uma série de epítopos de células T CD8 + que são codificados pela ORF NEG8. Os epítopos são apresentados nas Tabelas 1 e 2 abaixo.
SEQ Sequência ID de Modificações Confiança XCorr m/z [Da] ID proteín NOs: a WSILMQR NEG8 Alto 2,14 544,2912 16 GP 0 EAGVETM NEG8 Alto 1,95 531,2797 17 VIL 9 IAPSSVKA NEG8 Alto 1,88 486,7971 18 LS 8 PMRTPIAF NEG8 Médio 1,74 349,2038 19 L 3 ISMNQFL NEG8 M3 Médio 1,67 592,7704 20 DNS (oxidação) 5 LMQRGPS NEG8 Médio 1,66 518,7751 21 TF 5 FHSSPPM NEG8 Médio 1,65 386,1880 22 RTP 5 KITLKFAF NEG8 M10 Médio 1,60 688,3472 NMM (oxidação); 9 23 M11 (oxidação) LVCVSLL NEG8 Médio 1,48 729,9323 24 QSAILSL 1
[00121] Tabela 1
SEQ ID Seq. Proteína Motivo Xcorr m/z NOs:
AFNMMFL 25 NSP A24 1,35 554,24
SM
AILSLQTF 26 NSP A24 1,10 504,26
D
DNSSIVIS 27 NSP 1,40 467,24
V 28 IAWSILIQ NS1 1,22 472,28
IVMSVMY 29 NSP A3 1,17 507,75
R
FLICVSPL 30 NSP A2/24 1,76 566,81
QL
GGLPFSL 31 NS1 1,82 458,78
LL
LFLICVSL 32 NSP A24 1,74 510,81
L 33 SPLQLAIL NSP B7 1,90 527,82
SL
IFRFCFG 34 Polimerase PB2 1,49 545,76
GSG
VAASMFR 35 NSP 1,45 447,74
P
LSLQTSD 36 NSP 1,11 474,25
LA
SIRVSNR 37 Polimerase PB2 1,08 459,76
S
FSVMFLS 38 NS1 1,17 489,22
M 39 SVKALSSI HA A2/24 1,15 402,74
ALMSRPR 40 NSP A2 1,24 465,27
V
EGNGEIS 41 NSP 1,02 452,21
PT
AFNMMFF 42 NSP 1,06 505,69
S 43 PAISRFCF HA A24 1,48 470,73
AFSVMFL 44 NSP A24 1,36 516,74
SM
LIQRGPA 45 Proteína da matriz A2/24 1,36 609,83
TFCL
LIQRGPA 46 Proteína da matriz
TF
AILSLQTF 47 NSP A24 1,10 504,26
D ALSSIRVS A2 48 Polimerase PB2 1,10 460,25 S B7
FSMMLLS 49 Polimerase PB1 1,00 560,76
MI
SPPMRTP 50 Proteína PA-X 1,13 451,72
T
LIVLAIYRF 51 NSP A24 1,11 605,86
C
SLRTFDL 52 NSP A2 1,09 461,74
A
MLFVQSY 53 NSP 1,05 581,79
FQ
[00122] Tabela 2
[00122] Composição de vacina pode compreender um ou mais dos peptídeos estabelecidos em SEQ ID NOs: 5 a 41. Por exemplo, a composição da vacina pode compreender dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais, 14 ou mais, 15 ou mais, 16 ou mais, 17 ou mais, 18 ou mais, 19 ou mais, 20 ou mais, 21 ou mais, 22 ou mais, 23 ou mais, 24 ou mais, 25 ou mais, 26 ou mais, 27 ou mais, 28 ou mais, 29 ou mais, 30 ou mais, 31 ou mais, 32 ou mais, 33 ou mais, 34 ou mais, 35 ou mais, ou 36 ou mais dos peptídeos estabelecidos em SEQ ID NOs: 5 a 41, em qualquer combinação. A composição da vacina pode compreender todos os peptídeos estabelecidos em SEQ ID NOs: 5 a 41.
[00123] A composição da vacina pode, por exemplo, compreender um ou mais peptídeos, cada um consistindo em um dos peptídeos estabelecidos em SEQ ID NOs: 5 a 41. A composição da vacina pode, por exemplo, compreender um ou mais peptídeos, cada um consistindo em um dos peptídeos estabelecidos em SEQ ID NOs: 5 a 41. Peptídeo compreendendo um peptídeo estabelecido em uma das SEQ ID NOs: 5 a 41 pode compreender o peptídeo estabelecido em uma das SEQ ID NOs: 5 a 41 e uma série de outros aminoácidos no terminal N e/ou no terminal C do peptídeo estabelecido em uma das SEQ ID NOs: 5 a 41. Por exemplo, a composição da vacina pode compreender um peptídeo compreendendo um peptídeo estabelecido em uma das SEQ ID NOs: 5 a 41 e um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, 15 ou mais, 20 ou mais ou 25 ou mais aminoácidos no terminal N do peptídeo estabelecido em uma das SEQ ID NOs: 5 a 41. Por exemplo, a composição da vacina pode compreender um peptídeo compreendendo um peptídeo estabelecido em uma das SEQ ID NOs: 5 a 41 e um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, 15 ou mais, 20 ou mais ou 25 ou mais aminoácidos no terminal C do peptídeo estabelecido em uma das SEQ ID NOs:
5 a 41. O número de aminoácidos no terminal N e terminal C do peptídeo estabelecido em uma das SEQ ID NOs: 5 a 41 podem ser iguais ou diferentes.
[00124] Como a ORF NEG8 é altamente conservada entre os vírus influenza A humanos, SEQ ID NOs: 5 a 41 também devem ser conservados entre os vírus influenza A humanos. Uma composição de vacina que compreende um ou mais peptídeos definidos nas SEQ ID NOs: 5 a 41 podem, portanto, possuir as vantagens associadas à inclusão de um epítopo conservado e estabelecido acima.
[00125] Cada uma das SEQ ID NOs: 5 a 41 podem estar presentes em uma ORF prevista de pelo menos 167 ou pelo menos 216 códons de comprimento em um vírus influenza A suíno, equino e/ou aviário. Uma composição de vacina que compreende um ou mais peptídeos definidos nas SEQ ID NOs: 5 a 41 podem, portanto, possuir as vantagens acima indicadas. Composições de vacina de proteção cruzada
[00126] Conforme estabelecido acima, a ORF NEG8 é altamente conservada entre os vírus influenza A humanos e também está presente nos vírus influenza A aviário, equino e/ou suíno. Outros vírus ssRNA podem possuir similarmente um ORF que é codificada por pelo menos parte de seu genoma no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução, e que é conservado entre os vírus do mesmo gênero ou família. O polipeptídeo codificado pela ORF e o (s) epítopo (s) de células T CD8 + que ele contém também podem ser conservados.
[00127] Por exemplo, a ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza B. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus influenza C.
[00128] A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre flavivírus, tais como ebolavírus e/ou marburgvírus. Por exemplo, a ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre dois ou mais de ZEBOV, BDBV, RESTV, SUDV e TAFV. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre margburgvírus. Por exemplo, a ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre MARV e RAVV. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre ebolavírus e marburgvírus. Por exemplo, a ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre um ou mais de ZEBOV, BDBV, RESTV, SUDV e TAFV e um ou mais de MARV e RAVV.
[00129] A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre flavivírus. Por exemplo, a ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre dois ou mais dentre vírus Zika, vírus da Dengue, vírus do Vale do Nilo, vírus da febre amarela, vírus da encefalite de São Luís, vírus da encefalite japonesa, vírus da encefalite do Vale Murray, vírus da encefalite transmitida por carrapatos, vírus da encefalite de Kunjin, vírus da encefalite Rocio, vírus da encefalite russa primavera-verão, vírus Negeishi, vírus da Floresta de Kyasanur, vírus da Febre Hemorrágica de Omsk, vírus Powassan, vírus Louping I11, vírus Rio Bravo, vírus Tyuleniy, vírus Ntaya e vírus Modoc. Por exemplo, a ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre o vírus Zika e o vírus da Dengue, ou o vírus Zika, o vírus da Dengue e o vírus do Nilo Ocidental. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus Zika. Por exemplo, a ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre o vírus Zika africano e o vírus Zika asiático. A ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre os vírus da Dengue. Por exemplo, a ORF, polipeptídeo e/ou epítopo pode ser conservado entre dois ou mais de DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4.
[00130] Como já mencionado, a inclusão de um epítopo conservado na composição da vacina pode conferir capacidade protetora contra múltiplas espécies de vírus, estirpes ou serotipos, fornecendo proteção cruzada dentro de um gênero e/ou família de vírus. Consequentemente, uma única composição de vacina pode ser usada para conferir proteção contra uma variedade de vírus ssRNA diferentes. Isso fornece um meio com boa relação custo-benefício para controlar a disseminação da infecção por vírus ssRNA. A inclusão de peptídeos conservados na composição da vacina pode conferir capacidade protetora contra estirpes emergentes de vírus ssRNA, auxiliando no controle de infecção a longo prazo. Além disso, quando o vírus ssRNA é um flavivírus, a inclusão de um epítopo conservado na composição da vacina pode prevenir ou minimizar beneficamente o desenvolvimento do aumento dependente de anticorpos da infecção pelo vírus da Dengue após a administração da composição da vacina. Interação com supertipos de HLA
[00131] A composição da vacina pode compreender pelo menos um peptídeo imunogênico que compreende um epítopo de células T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de tradução, e que interage com pelo menos dois supertipos de HLA diferentes. Isso permite que a composição de vacina substitua uma resposta de célula T CD8+ em uma proporção maior de indivíduos aos quais a composição de vacina é administrada. Isso ocorre porque a composição da vacina deve ser capaz de induzir uma resposta de células T CD8 + em todos os indivíduos de um supertipo de HLA que interage com o epítopo de células T CD8 +. A composição da vacina pode compreender pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos dez, pelo menos quinze ou pelo menos vinte peptídeos imunogênicos que compreendem, cada um, um epítopo de célula T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução e interagir com pelo menos dois supertipos de HLA diferentes. Cada peptídeo imunogênico pode interagir com pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 supertipos de HLA diferente. Cada peptídeo imunogênico pode interagir com dois ou mais de HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B27, HLA-B44, HLA-B58 ou HLA-B62, ou qualquer outro supertipo de HLA conhecido na técnica, em qualquer combinação.
[00132] A composição da vacina pode compreender dois ou mais peptídeos imunogênicos que (i) cada um compreende um epítopo de célula T CD8 + diferente de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução e (ii) cada um interage com um supertipo de HLA diferente. Incluindo dois ou mais peptídeos imunogênicos na composição de vacina permite a composição de vacina para surtir uma resposta de célula T CD8+ em uma proporção maior de indivíduos aos quais a composição de vacina é administrada. Isso ocorre porque a composição da vacina deve ser capaz de induzir uma resposta de células T CD8 + em todos os indivíduos de um supertipo de HLA que interage com um dos epítopos de células T CD8 + compreendidos em dois ou mais peptídeos imunogênicos. Cada peptídeo de flavivírus pode interagir com dois ou mais dentre HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B27, HLA-B44, HLA-B58 ou HLA-B62, ou qualquer outro supertipo de HLA conhecido na técnica, em qualquer combinação. Qualquer combinação de peptídeos imunogênicos compreendendo um tal epítopo de células T CD8 + é possível. Epítopos de célula T CD8+
[00133] Os epítopos de células T CD8 + apresentados por células infectadas com o vírus ssRNA podem ser identificados para identificar diretamente os epítopos de células T CD8 + para inclusão na composição da vacina. Esse é um método eficaz e lógico que pode ser usado em separado ou para confirmar a utilidade de epítopos de célula T CD8+ potenciais identificados por metodologias de previsão de motivo de MHC.
[00134] Para realizar o método, as células são infectadas por um vírus ssRNA e mantidas em cultura por um período de cerca de 72 horas a uma temperatura de cerca de 37 °C. Após a cultura, as células são então colhidas e lavadas. Em seguida, as células são lisadas, por exemplo, por homogeneização e congelamento/descongelamento em tampão contendo
NP40 a 1 %. Os lisados são liberados por centrifugação a 2000 rpm por 30 minutos para remover detritos celulares.
[00135] Os complexos de MHC/peptídeo são então isolados dos lisados por cromatografia de imunoafinidade com o uso de esferas de proteína A/G (Proteína Imobilizada A/G UltraLink, Pierce, Rockford, IL) revestidas com W6/32 (uma molécula de pan-MHC de classe I de reconhecimento de anticorpo monoclonal). Para revestir as esferas com o anticorpo, as esferas são lavadas com tampão de baixo pH sucedido por enxágues com PBS, incubadas com 0,5 mg do anticorpo à temperatura ambiente por 2 horas e lavadas três vezes para remover anticorpo não ligado. Para cromatografia de imunoafinidade, as esferas revestidas são incubadas com lisado por 2 horas à temperatura ambiente com agitação contínua. As esferas são então separadas do lisado por centrifugação a 1000 rpm por 5 minutos. Os complexos de MHC ligados são eluídos a partir das esferas pela adição de ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1 %, pH 1,5.
[00136] Em seguida, o eluato é aquecido a 85 °C por 15 minutos para dissociar os peptídeos ligados das moléculas de MHC. Após resfriamento à temperatura ambiente, os peptídeos são separados do anticorpo por centrifugação com o uso, por exemplo, de filtros de membrana de corte de massa molecular de 3 kDa (Millipore). O filtrado é concentrado com o uso de centrifugação a vácuo e reconstituído a um volume final de 100 µL. A mistura de peptídeo purificada é fracionada, por exemplo, com o uso de uma coluna de fase reversa (RP) C-18 (por exemplo, 4,6 mm de diâmetro x 150 mm de comprimento) com o uso de uma CLAE fora de linha. Para essa etapa, a fase móvel A pode ser acetonitrila (CAN) a 2 % e ácido fórmico (FA) a 0,1 % em água, enquanto a fase móvel B pode ser FA a 0,1 % e CAN a 90 % em água.
[00137] As frações contendo peptídeo são então eluídas a partir da coluna, secas a vácuo e analisadas por espectrometria de massa para identificar as sequências das frações. Os dados espectrais adquiridos podem então ser pesquisados contra todas as proteínas do banco de dados para o vírus ssRNA para identificar sequências de peptídeos associadas ao vírus ssRNA. Os peptídeos sintéticos, então, podem ser feitos de acordo com as sequências identificadas e submetidos à espectrometria de massa para confirmar sua identidade para os peptídeos nas frações contendo peptídeo.
[00138] Neste método, qualquer tipo de células pode ser infectado com qualquer tipo de vírus ssRNA. Os vírus ssRNA são descritos em detalhes abaixo. As células podem ser células apresentando antígeno. As células podem ser células de hepatoma como células de HepG2, células B linfoblastoides transformadas por EBV como células JY ou linfoblastos como células T2.
[00139] A identificação direta de epítopos de célula T CD8+ apresentada pelas células infectadas por vírus ssRNA é vantajosa em comparação com as metodologias de previsão de motivo de MHC. O banco de dados de epítopo imune (IEDB; http://www.iedb.org) é gerado pelos métodos de previsão de motivo, e mão métodos funcionais, e contém vários epítopos de célula T de vírus ssRNA específico de HLA previstos, incluindo alguns epítopos compartilhados com pontuações de ligação de alto MHC e caracterização de CTL limitada. Como tanto os epítopos dominantes quanto os subdominantes podem ser apresentados por células infectadas por vírus ssRNA, é difícil classificar as hierarquias de dominância de epítopos apresentados naturalmente com o uso do banco de dados. Assim, não é claro a partir do banco de dados de epítopo imune em separado qual dos epítopos listados podem ser esperados para induzir de modo eficaz uma resposta de célula T CD8+ quando incluído em uma composição de vacina. O método de identificação direta definido acima fornece um mecanismo para confirmar a utilidade dos epítopos.
[00140] As composições de vacinas baseadas em epítopos apresentados por células infectadas com vírus ssRNA são superiores às vacinas baseadas em uma subunidade de proteína viral ou um epítopo predito de motivo. O processamento de proteína pelo sistema imunológico é propenso a alterar os epítopos virais nativos. Basear uma composição de vacina em peptídeos demonstrou ser apresentado por células infectadas remove essa fonte de incerteza, visto que os peptídeos já foram submetidos ao processamento de proteína. Epítopos de célula T CD4+
[00141] Conforme estabelecido acima, a composição de vacina da invenção pode compreender um peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de célula T CD4 +. A composição de vacina pode compreender dois ou mais, como três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, quinze ou mais ou vinte ou mais peptídeos imunogênicos compreendendo um epítopo de célula T CD4+. Um epítopo de célula T CD4+ é um peptídeo que é capaz de (i) apresentação por uma molécula de MHC de classe II e (ii) reconhecimento por um receptor de célula T (TCR) presente em uma célula T CD4+. Preferencialmente, reconhecimento por um TCR resulta na ativação da célula T CD4+. A ativação da célula T CD4+ pode levar à proliferação e/ou produção de citocina aumentadas.
[00142] O epítopo de célula T CD4+ pode ser um epítopo de célula T CD4+ de vírus ssRNA. Ou seja, o epítopo da célula T CD4 + pode ser um peptídeo que é expresso por um ou mais vírus ssRNA (como vírus Influenza A, vírus Dengue, vírus Zika, vírus Ebola ou vírus Marburg) e que é capaz de (i) apresentação por uma molécula de MHC de classe II e (ii) reconhecimento por um receptor de células T (TCR) presente em uma célula T CD4 +. Tais peptídeos são conhecidos na técnica.
[00143] O epítopo de célula T CD4+ pode ser um epítopo de célula T CD4+ que não seja um epítopo de célula T CD4+ de vírus ssRNA. Por exemplo, a célula T CD4+ pode ser expressa por um organismo que não seja um vírus ssRNA. O epítopo de célula T CD4+ pode ser, por exemplo, expresso por Clostriudium tetani. Por exemplo, o epítopo de célula T CD4+ pode ser derivado de toxina tetânica.
[00144] O epítopo de célula T CD4+ pode ser um epítopo de célula T CD4+ que reage com todos os tipos de HLA classe II, isto é, um epítopo denominado “promíscuo”. A inclusão de um epítopo promíscuo na composição da vacina pode melhorar a capacidade da composição da vacina de induzir uma resposta imune ao peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de células T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo, capaz de tradução. O epítopo de célula T CD4+ pode compreender, por exemplo, a sequência FKLQTMVKLFNRIKNNVA (SEQ ID NO: 54) e/ou a sequência LQTMVKLFNRIKNNVAGGC (SEQ ID NO: 55). SEQ ID NOs 54 e 55 são epítopos promíscuos derivados da toxina tetânica.
[00145] O peptídeo compreendendo um epítopo de célula T CD4 + pode ser um peptídeo diferente do peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de célula T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução. O epítopo de células T CD4 + pode, por exemplo, estar compreendido em um peptídeo adicional na composição da vacina, isto é, em um peptídeo que não compreende um epítopo de células T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução. Como mencionado acima, o peptídeo adicional pode compreender um ou mais epítopos de célula T CD8+ e/ou um ou mais epítopos de célula B, bem com o epítopo de célula T CD4+.
[00146] O peptídeo compreendendo um epítopo de célula T CD4 + pode ser o mesmo peptídeo do peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de célula T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução. Ou seja, o peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de célula T CD8 + a partir de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução pode compreender ainda um epítopo de célula T CD4 + .
[00147] Quando o peptídeo que compreende um epítopo de células T CD4 + também compreende um epítopo de células T CD8 + (como um epítopo de células T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução), o epítopo CD8 + pode ser aninhado dentro do epítopo de células T CD4 +. Os epítopos de célula T CD4+ são tipicamente mais longos do que epítopos de célula T CD8+. Portanto, estender uma ou ambas as terminações do epítopo de célula T CD8+ pode produzir um epítopo de célula T CD4+ mais longo cuja sequência ainda compreende o epítopo de célula T CD8+. Portanto, o epítopo de células T CD4 + pode compreender um epítopo de células T CD8 +, como um epítopo de células T CD8 + de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução (por exemplo, um epítopo estabelecido em SEQ ID NOs: 5 a 41), estendido em seu terminal N ou terminal C. O epítopo de células T CD8 + pode ser estendido por 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos em sua terminação N. O epítopo de células T CD8 + pode ser estendido por 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos em sua terminação C. Preferencialmente, o epítopo de célula T CD8+ é estendido por 3 aminoácidos na terminação N, e 3 aminoácidos na terminação C. Entretanto, o epítopo de célula T CD8+ não precisa ser estendido pelo mesmo número de aminoácidos em cada terminal.
[00148] O epítopo de célula T CD8+ aninhado em um epítopo de célula T CD4+ pode ser capaz de gerar uma resposta de CTL robusta. O peptídeo estendido (epítopo de célula T CD4+) pode ser capaz de induzir respostas de citocina mediadas por auxiliar T. Assim, a inclusão de um peptídeo de vírus ssRNA compreendendo um epítopo de células T CD8 + e um epítopo de células T CD4 + na composição da vacina pode permitir que a composição da vacina induza respostas de células T citotóxicas e auxiliares. Epítopos de células B
[00149] A composição de vacina da invenção pode compreender um peptídeo imunogênico que compreende um epítopo de célula B. A composição de vacina pode compreender dois ou mais, como três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais, quinze ou mais ou vinte ou mais peptídeos compreendendo um epítopo de célula B. Um epítopo de célula B é um peptídeo que é capaz de reconhecimento por um receptor de célula B (BCR) presente em uma célula B. Preferencialmente, reconhecimento por um TCR resulta na ativação da célula T CD8+. A ativação da célula B pode levar à proliferação e/ou produção de anticorpo.
[00150] O epítopo de célula B pode ser um epítopo de célula B de ssRNA. Isto é, o epítopo da célula B pode ser um peptídeo que é expresso por um ou mais vírus ssRNA e que é capaz de ser reconhecido por um receptor de célula B (BCR) presente em uma célula B. Tais peptídeos são conhecidos na técnica.
[00151] O epítopo de célula B pode ser um epítopo linear, isto é, um epítopo que é definido pela sequência de aminoácidos primário de uma região particular de uma proteína de vírus ssRNA. Alternativamente, o epítopo pode ser um epítopo conformacional, isto é, um epítopo que é definido pela estrutura conformacional de uma proteína de vírus ssRNA nativa. Nesse caso, o epítopo pode ser contínuo (isto é, os componentes que interagem com o anticorpo são situados próximos um ao outro sequencialmente na proteína) ou descontínuo (isto é, os componentes que interagem com anticorpo são situados em partes díspares da proteína, que são aproximadas uma da outra na estrutura de proteína nativa dobrada).
[00152] Tipicamente, o epítopo de célula B tem cerca de 5 a 20 aminoácidos de comprimento, como 6 a 19, 7 a 18, 8 a 17, 9 a 16, 10 a 15, 11 a 14 ou 12 a 13 aminoácidos de comprimento.
[00153] Métodos para identificar epítopos de célula B também são conhecidos na técnica. Por exemplo, métodos de mapeamento de epítopos podem ser usados para identificar epítopos de células B. Esses métodos incluem abordagens estruturais, em que a estrutura conhecida ou modelada de uma proteína deve ser usada em uma abordagem baseada em algoritmo para prever epítopos de superfície, e abordagens funcionais, em que a ligação de proteínas integrais, fragmentos de proteína ou peptídeos a um anticorpo pode ser quantizada, por exemplo, com o uso de um Ensaio Imunossorvente Ligado à Enzima (ELISA). Os métodos de mapeamento de competição, modificação de antígeno ou fragmentação de proteína também podem ser usados. Nanopartículas
[00154] Qualquer peptídeo imunogênico compreendido na composição de vacina da invenção pode ser unido a uma nanopartícula, por exemplo, uma nanopartícula de ouro. A união a uma nanopartícula, por exemplo, uma nanopartícula de ouro, é benéfica.
[00155] A união do peptídeo a uma nanopartícula (como uma nanopartícula de ouro) reduz ou elimina a necessidade de incluir um vírus ou um adjuvante na composição de vacina. As nanopartículas podem conter “sinais de perigo” imune que ajudam a induzir de modo eficaz uma resposta imune aos peptídeos. As nanopartículas podem induzir ativação e maturação de célula dendrítica (DC), necessárias para uma resposta imune robusta. As nanopartículas podem conter componentes não próprios que aprimoram a absorção das nanopartículas e, assim, os peptídeos por células como células apresentando antígeno. A união de um peptídeo a uma nanopartícula, portanto, pode aprimorar a capacidade de células apresentando antígeno de estimular células T e/ou B específicas de vírus. A união a uma nanopartícula também facilita a entrega das composições de vacina por meio das vias subcutânea, intradérmica, transdérmica e oral/bucal, fornecendo uma flexibilidade em administração.
[00156] As nanopartículas são partículas entre 1 e 100 nanômetros (nm) de tamanho que podem ser usadas como um substrato para imobilizar os ligandos. Nas composições de vacina da invenção, a nanopartícula pode ter um diâmetro médio de 1 a 100, 20 a 90, 30 a 80, 40 a 70 ou 50 a 60 nm. Preferencialmente, a nanopartícula tem um diâmetro médio de 20 a 40 nm. Um diâmetro médio de 20 a 40 nm facilita a absorção da nanopartícula ao citosol. O diâmetro médio pode ser medido com o uso de técnicas bem conhecidas na técnica como microscopia de elétron de transmissão.
[00157] As nanopartículas adequadas para a entrega de antígeno, como um peptídeo imunogênico, são conhecidas na técnica. Os métodos para a produção de tais nanopartículas também são conhecidos.
[00158] A nanopartícula, por exemplo, pode ser uma nanopartícula polimérica, uma nanopartícula inorgânica, um lipossomo, um complexo de estimulação imune (ISCOM), uma partícula tipo vírus (VLP) ou uma proteína de automontagem. A nanopartícula é preferencialmente uma nanopartícula de fosfato de cálcio, uma nanopartícula de silício ou uma nanopartícula de ouro.
[00159] A nanopartícula pode ser uma nanopartícula polimérica. A nanopartícula polimérica pode compreender um ou mais polímeros sintéticos, como poli(d,l-lactídeo-co-glicolídeo) (PLG), poli(ácido d,l-láctico-coglicólico) (PLGA), ácido poli(g-glutâmico) (g-PGA)m poli(etilenoglicol) (PEG) ou poliestireno. A nanopartícula polimérica pode compreender um ou mais natural polímeros como um polissacarídeo, por exemplo, pululana, alginato, inulina e quitosana. O uso de uma nanopartícula polimérica pode ser vantajoso devido às propriedades dos polímeros que podem ser incluídos na nanopartícula. Por exemplo, os polímeros naturais e sintéticos mencionados acima podem ter boa biocompatibilidade e biodegradabilidade uma natureza não tóxica e/ou a capacidade de ser manipulada em formatos e tamanhos desejados. A nanopartícula polimérica pode formar uma nanopartícula de hidrogel. As nanopartículas de hidrogel são um tipo de rede de polímero tridimensional hidrofílica nanodimensionada. As nanopartículas de hidrogel têm propriedades favoráveis incluindo tamanho de mescla flexível, área de superfície grande para conjugação multivalente, alto teor de água e alta capacidade de carregamento para antígenos. Os polímeros como ácido poli(L-láctico) (PLA), PLGA, PEG e polissacarídeos são particularmente adequados para formar nanopartículas de hidrogel.
[00160] A nanopartícula pode ser uma nanopartícula inorgânica. Tipicamente, as nanopartículas inorgânicas têm uma estrutura rígida e são não biodegradáveis. Entretanto, a nanopartícula inorgânica pode ser biodegradável. A nanopartícula inorgânica pode compreender um invólucro em que um antígeno pode ser encapsulado. A nanopartícula inorgânica pode compreender um núcleo ao qual um antígeno pode ser covalentemente unido. O núcleo pode compreender um metal. Por exemplo, o núcleo pode compreender átomos de ouro (Au), prata (Ag) ou cobre (Cu). O núcleo pode ser formado por mais de um tipo de átomo. Por exemplo, o núcleo pode compreender uma liga, como uma liga de Au/Ag, Au/Cu, Au/Ag/Cu, Au/Pt, Au/Pd ou Au/Ag/Cu/Pd. O núcleo pode compreender fosfato de cálcio (CaP). O núcleo pode compreender um material semicondutor, por exemplo, seleneto de cádmio.
[00161] Outras nanopartículas inorgânicas exemplificativas incluem nanopartículas de carbono e nanopartículas à base de sílica. As nanopartículas de carbono têm boa biocompatibilidade e podem ser sintetizadas em nanotubos e esferas mesoporosas. As nanopartículas à base de sílica (SiNPs) são biocompatíveis e podem ser preparadas com parâmetros estruturais ajustáveis para se adequar à sua aplicação terapêutica.
[00162] A nanopartícula pode ser uma nanopartícula de silício, como uma nanopartícula de silício elementar. A nanopartícula pode ser mesoporosa ou ter uma estrutura de poro de colmeia. Preferencialmente, a nanopartícula é uma partícula de silício elementar que tem uma estrutura de poro de colmeia. Tais nanopartículas são conhecidas na técnica e oferecem carregamento de fármaco ajustável e controlado, alvejamento e liberação que podem ser adaptados a quase qualquer carga, via de administração, perfil de liberação ou alvo. Por exemplo, tais nanopartículas podem aumentar a biodisponibilidade de sua carga e/ou aprimorar a permeabilidade intestinal e a absorção de ativos administrados oralmente. As nanopartículas podem ter uma capacidade de carregamento excepcionalmente alta devido à sua estrutura porosa e área de superfície grande. As nanopartículas podem liberar sua carga ao longo de dias, semanas ou meses, dependendo de suas propriedades físicas. Visto que o silício é um elemento de ocorrência natural do corpo humano, as nanopartículas podem não surtir resposta do sistema imunológico. Isso é vantajoso para a segurança in vivo das nanopartículas.
[00163] Qualquer uma das SiNPs descritas acima podem ser biodegradáveis ou não biodegradáveis. Uma SiNP biodegradável pode dissolver ao ácido ortossílico, a forma biodisponível de silício. O ácido ortossílico mostrou ser benéfico para a saúde dos ossos, tecido conectivo, cabelo e pele.
[00164] A nanopartícula pode ser um lipossomo. Os lipossomos são tipicamente formados a partir de fosfolipídeos não tóxicos biodegradáveis e compreendem um invólucro de bicamada de fosfolipídeo de automontagem com núcleo aquoso. Um lipossomo pode ser uma vesícula unilamelar compreendendo uma bicamada única de fosfolipídeo ou uma vesícula multilamelar que compreende vários invólucros de fosfolipídeos concêntricos separados por camadas de água. Como uma consequência, os lipossomos podem ser adaptados para incorporar moléculas hidrofílicas no núcleo aquoso ou moléculas hidrofóbicas dentro das bicamadas de fosfolipídeo. Os lipossomos podem encapsular o antígeno dentro do núcleo para a entrega. Os lipossomos podem incorporar glicoproteínas de envelope viral ao invólucro para formam virossomas. Inúmeros produtos à base de lipossomo são estabelecidos na técnica e são aprovados para uso humano.
[00165] A nanopartícula pode ser um complexo imunoestimulante (ISCOM). Os ISCOMs são partículas tipo gaiola que são tipicamente formadas a partir de micelas contendo saponina coloidal. Os ISCOMs podem compreender colesterol, fosfolipídeo (como fosfatidiletanolamina ou fosfatidilcolina) e saponina (como Quil A da árvore Quillaia saponaria). Os ISCOMs foram tradicionalmente usados para capturar proteínas de envelope viral, como proteínas de envelope do vírus de herpes simplex tipo 1, hepatite B ou vírus influenza.
[00166] A nanopartícula pode ser uma partícula tipo vírus (VLP). As VLPs são nanopartículas de automontagem que são desprovidas de ácido nucleico infeccioso, que são formadas por automontagem de proteína de capsídeo biocompatível. As VLPs são tipicamente têm diâmetro de cerca de 20 a cerca de 150 nm, como cerca de 20 a cerca de 40 nm, cerca de 30 a cerca de 140 nm, cerca de 40 a cerca de 130 nm, cerca de 50 a cerca de 120 nm, cerca de 60 a cerca de 110 nm, cerca de 70 a cerca de 100 nm ou cerca de 80 a cerca de 90 nm. As VLPs vantajosamente exploram a potência de estrutura viral evoluída, que é naturalmente otimizada para a interação com o sistema imunológico. O tamanho das nanopartículas naturalmente otimizado e a ordem estrutural repetitiva significam que as VLPs induzem respostas imunes potentes, mesmo na ausência de adjuvante. A nanopartícula pode ser uma proteína de automontagem. Por exemplo, a nanopartícula pode compreender ferritina. A ferritina é uma proteína que pode se automontar em estruturas quase esféricas de 10 nm. A nanopartícula pode compreender proteína de vault principal (MVP). Noventa e seis unidades de MVP podem realizar a automontagem em uma nanopartícula de vault em formato de tambor, com um tamanho de aproximadamente 40 nm de largura e 70 nm de comprimento.
[00167] A nanopartícula pode ser uma nanopartícula de fosfato de cálcio (CaP). As nanopartículas de CaP podem compreender um núcleo compreendendo uma ou mais (tais como duas ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 50 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, ou 500 ou mais) moléculas de CaP. As nanopartículas de CaP e os métodos para sua produção são conhecidos na técnica. Por exemplo, uma nanossuspensão estável de nanopartículas de CAP pode ser gerada através da mistura de soluções de sal inorgânico de cálcio e fosfatos em razões predeterminadas sob mistura constante.
[00168] A nanopartícula de CaP pode ter um tamanho médio de partícula de cerca de 80 a cerca de 100 nm, como cerca de 82 a cerca de 98 nm, cerca de 84 a cerca de 96 nm, cerca de 86 a cerca de 94 nm ou cerca de 88 a cerca de 92 nm. Esse tamanho de partícula pode produzir um melhor desempenho em termos de absorção de célula imune e resposta imune do que outros tamanhos de partícula maiores. O tamanho de partícula pode ser estável (isto é, não mostrar alteração significativa), por exemplo, quando medido ao Longo de um período de 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 12 meses, 18 meses, 24 meses, 36 meses ou 48 meses. As nanopartículas de CaP podem ser coformuladas com um ou múltiplos antígenos adsorvidos na superfície da nanopartícula ou coprecipitadas com CaP durante a síntese de partícula. Por exemplo, um peptídeo, como um peptídeo imunogênico, pode ser anexado à nanopartícula de CaP por dissolução do peptídeo em DMSO (por exemplo, a uma concentração de cerca de 10 mg/mL), adicionando a uma suspensão de nanopartículas de CaP juntamente com N- acetil-glucosamina (GlcNAc) (por exemplo, a 0,093 mol/l e água ultrapura e mistura à temperatura ambiente por um período de cerca de 4 horas (por exemplo, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas ou 10 horas).
[00169] A composição de vacina pode compreender cerca de 0,15 a cerca de 0,8 %, como 0,2 a cerca de 0,75 %, 0,25 a cerca de 0,7 %, 0,3 a cerca de 0,6 %, 0,35 a cerca de 0,65 %, 0,4 a cerca de 0,6 %, ou 0,45 a cerca de 0,55 % de nanopartículas de CaP. Preferencialmente, a composição de vacina compreende cerca de 0,3 % de nanopartículas de CaP.
[00170] As nanopartículas de CaP têm um alto grau de biocompatibilidade devido à sua similaridade química aos tecidos rígidos humanos como o osso e dentes. Vantajosamente, portanto, as nanopartículas de CaP são não tóxicas quando usadas para aplicações terapêuticas. As nanopartículas de CaP são seguras para administração por meio de vias intramuscular, subcutânea, oral ou de inalação. As nanopartículas de CaP também são simples para sintetizar comercialmente. Ademais, as nanopartículas de CaP podem ser associadas à liberação lenta de antígeno, que pode aprimorar a indução de uma resposta imune a um peptídeo unido à nanopartícula. As nanopartículas de CaP podem ser usadas tanto como um adjuvante quando como um veículo de entrega de fármaco.
[00171] A nanopartícula pode ser uma nanopartícula de ouro. A nanopartícula de ouro unida a cada peptídeo pode ser uma nanopartícula de ouro descrita em qualquer um dentre os documentos WO 2002/32404, WO 2006/037979, WO 2007/122388, WO 2007/015105 e WO 2013/034726. A nanopartícula de ouro unida a cada peptídeo pode ser uma nanopartícula de ouro descrita em qualquer um dentre os documentos WO 2002/32404, WO 2006/037979, WO 2007/122388, WO 2007/015105 e WO 2013/034726.
[00172] As nanopartículas de ouro compreendem um núcleo compreendendo um átomo de ouro (Au). O núcleo pode compreender adicionalmente um ou mais átomos de Fe, Cu ou Gd. O núcleo pode ser formado a partir de um ouro liga como Au/Fe, Au/Cu, Au/Gd, Au/Fe/Cu, Au/Fe/Gd ou Au/Fe/Cu/Gd. O número total de átomos no núcleo pode ser 100 a 500 átomos, como 150 a 450, 200 a 400 ou 250 a 350 átomos. A nanopartícula de ouro pode ter um diâmetro médio de 1 a 100, 20 a 90, 30 a 80, 40 a 70 ou 50 a 60 nm. Preferencialmente, a nanopartícula de ouro tem um diâmetro médio de 20 a 40 nm.
[00173] A nanopartícula pode compreender uma superfície revestida com alfa-galactose e/ou beta-GlcNHAc. Por exemplo, a nanopartícula pode compreender uma superfície recoberta por alfa-galactose e/ou beta-
GlcNHAc. Nesse caso, a nanopartícula pode ser, por exemplo, uma nanopartícula que compreende um núcleo incluindo átomos de metal e/ou semicondutor. Por exemplo, a nanopartícula pode ser uma nanopartícula de ouro. Beta-GlcNHAc é um padrão molecular associado a patógeno bacteriano (PAMP), o qual é capaz de ativar células que apresentam antígenos. Desse modo, uma nanopartícula que compreende uma superfície revestida ou recoberta com Beta-GlcNHAc pode estimular não especificamente uma resposta imune. A ligação de um peptídeo imunogênico a tal nanopartícula pode, portanto, melhorar a resposta imune induzida pela administração da composição da vacina da invenção a um indivíduo.
[00174] Um ou mais ligantes além do peptídeo podem ser unidos à nanopartícula, que podem ser de qualquer dos tipos de nanopartícula descrita acima. Os ligantes podem formar uma “corona”, uma camada ou revestimento que pode cobrir parcial ou completamente a superfície do núcleo. A corona pode ser considerada uma camada orgânica que circunda ou circunda parcialmente o núcleo de nanopartícula. A corona pode fornecer ou participar no apassivamento do núcleo da nanopartícula. Assim, em certos casos, a corona pode ser uma camada de revestimento suficientemente completa para estabilizar o núcleo. A corona pode facilitar a solubilidade, como a solubilidade de água das nanopartículas da presente invenção.
[00175] A nanopartícula pode compreender pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40 ou pelo menos 50 ligantes. Os ligantes podem incluir um ou mais peptídeos, domínios de proteína, moléculas de ácido nucleico, grupos lipídicos, grupos de carboidrato, grupos aniônicos ou grupos catiônicos, glicolipídeos e/ou glicoproteínas. O grupo de carboidrato pode ser um polissacarídeo, um oligossacarídeo ou um grupo de monossacarídeo (por exemplo, glicose). Um ou mais dos ligantes podem ser um componente não próprio, que torna a nanopartícula mais propensa a ser absorvida por células apresentando antígeno devido à sua similaridade a um componente patogênico. Por exemplo, um ou mais ligantes podem compreender uma fração de carboidrato (como uma fração de carboidrato bacteriana), uma fração de tensoativo e/ou uma fração de glutationa. Os ligandos exemplificativos incluem glicose, N-acetilglucosamina (GlcNAc), glutationa, 2'-tioetil-β-D-glucopiranosídeo e 2'-tioetil-D-glucopiranosídeo. Os ligantes preferenciais incluem glicoconjugados, que formam gliconanopartículas.
[00176] A ligação dos ligantes ao núcleo pode ser facilitada por um ligante. O ligante pode compreender um grupo tiol, um grupo alquila, um grupo glicol ou um grupo de peptídeo. Por exemplo, o ligante pode compreender C2-C15 alquila e/ou C2-C15 glicol. O ligante pode compreender um grupo contendo enxofre, grupo contendo amino, grupo contendo fosfato ou grupo contendo oxigênio que é capaz de união covalente ao núcleo. Alternativamente, os ligantes podem ser diretamente ligados ao núcleo, por exemplo através de um grupo contendo enxofre, grupo contendo amino, grupo contendo fosfato ou grupo contendo oxigênio compreendido no ligante. União às nanopartículas
[00177] O peptídeo imunogênico pode ser unido em sua terminação N à nanopartícula. Normalmente, o peptídeo imunogênico pode ser ligado ao núcleo da nanopartícula, mas a ligação à coroa ou a um ligante também pode ser possível.
[00178] O peptídeo pode ser diretamente unido à nanopartícula, por exemplo, por ligação covalente de um átomo em um grupo contendo enxofre, um grupo contendo amino, um grupo contendo fosfato ou um grupo contendo oxigênio no peptídeo a um átomo na nanopartícula ou seu núcleo.
[00179] Um ligante pode ser usado para ligar o peptídeo à nanopartícula. O ligante pode compreender um grupo contendo enxofre, grupo contendo amino, grupo contendo fosfato ou grupo contendo oxigênio que é capaz de união covalente a um átomo no núcleo. Por exemplo, o ligante pode compreender um grupo tiol, um grupo alquila, um grupo glicol ou um grupo de peptídeo.
[00180] O ligante pode compreender uma porção de peptídeo e uma porção de não peptídeo. A porção de peptídeo pode compreender a sequência X1X2Z1, em que X1 é um aminoácido selecionado a partir de A e G; X2 é um aminoácido selecionado de A e G; e Z1 é um aminoácido selecionado a partir de Y e F. A porção de peptídeo pode compreender a sequência AAY ou FLAAY. A porção de peptídeo do ligante pode ser unida à terminação N do peptídeo. A porção de não peptídeo da ligante pode compreender um grupo C2-C15 alquila e/ um C2-C15 glicol, por exemplo, um grupo tioetila ou um grupo tiopropila.
[00181] O ligante pode ser (i) HS-(CH2)2-CONH-AAY; (ii) HS- (CH2)2-CONH-LAAY; (iii) HS-(CH2)3-CONH-AAY; (iv) HS-(CH2)3-CONH- FLAAY; (v) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAY; e (vi) HS-(CH2)10- (CH2OCH2)7-CONH-FLAAY. Nesse caso, o grupo tiol da porção de não peptídeo do ligante liga o ligante ao núcleo.
[00182] Outros ligantes adequados para unir um peptídeo a uma nanopartícula são conhecidos na técnica, e podem ser prontamente identificados e implementados pela pessoa versada.
[00183] Como explicado acima, a composição da vacina pode compreender vários peptídeos imunogênicos. Quando a composição de vacina compreende mais de um peptídeo imunogênico, dois ou mais (como três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais ou vinte ou mais) dos peptídeos podem ser unidos à mesma nanopartícula. Dois ou mais (como três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, dez ou mais ou vinte ou mais) dos peptídeos imunogênicos podem ser, cada um, unidos a diferentes nanopartículas. As nanopartículas às quais os peptídeos imunogênicos são unidos podem ser, no entanto, o mesmo tipo de nanopartícula. Por exemplo, cada peptídeo imunogênico pode ser unido a uma nanopartícula de ouro. Cada peptídeo imunogênico pode ser unido a uma nanopartícula de CaP. A nanopartícula à qual os peptídeos imunogênicos são unidos pode ser um tipo diferente de nanopartícula. Por exemplo, um peptídeo imunogênico pode ser unido a uma nanopartícula de ouro e outro peptídeo imunogênico pode ser unido a uma nanopartícula de CaP. Medicamentos, métodos e uso terapêutico
[00184] A invenção fornece um método de prevenção ou tratamento de uma infecção viral, o qual compreende administrar a composição de vacina da invenção para um indivíduo com, ou em risco de ser infectado por, um vírus ssRNA. A invenção também fornece uma composição de vacina da invenção para uso em um método de prevenção ou tratamento de uma infecção por vírus ssRNA em um indivíduo;
[00185] O indivíduo pode, por exemplo, ser humano. O indivíduo pode ser, por exemplo, um suíno, um equino ou um aviário.
[00186] A infecção pelo vírus ssRNA pode ser causada por um vírus zoonótico. A infecção pelo vírus ssRNA pode ser uma infecção viral pandêmica.
[00187] A infecção por vírus ssRNA pode ser, por exemplo, uma infecção por ortomixovírus. A infecção por ortomixovírus pode ser, por exemplo, uma infecção por vírus influenza. O vírus influenza pode ser um vírus influenza A, influenza B e/ou influenza C. O vírus influenza A pode, por exemplo, ser do serótipo H1N1, H5N1, H7N9, H7N7, H2N2 ou H3N2. O vírus influenza pode ser um vírus influenza humano, um vírus influenza suíno, um vírus influenza equino ou um vírus influenza aviário. O vírus influenza pode ser um vírus influenza pandêmico ou um vírus influenza potencialmente pandêmico.
[00188] A infecção por vírus ssRNA pode ser, por exemplo, uma infecção por flavivírus. A infecção por flavivírus pode ser, por exemplo, uma infecção por vírus Zika, uma infecção por vírus da Dengue, uma infecção por vírus do Vale do Nilo, uma infecção por vírus da febre amarela, uma infecção por vírus da encefalite de São Luís, uma infecção por vírus da encefalite japonesa, uma infecção por vírus da encefalite do Vale Murray, uma infecção por vírus da encefalite transmitida por carrapatos, uma infecção por vírus da encefalite de Kunjin, uma infecção por vírus da encefalite Rocio, uma infecção por vírus da encefalite russa primavera-verão, uma infecção por vírus Negeishi, uma infecção da Floresta de Kyasanur Forest, uma infecção por vírus da Febre Hemorrágica de Omsk, uma infecção por vírus Powassan, uma infecção por vírus Louping I11, uma infecção por vírus Rio Bravo, uma infecção por vírus Tyuleniy, uma infecção por vírus Ntaya ou uma infecção por vírus Modoc. A infecção por vírus Zika pode ser, por exemplo, infecção por Vírus Zika africano ou infecção por Vírus Zika asiático. O vírus da Dengue pode ser, por exemplo, infecção por DENV-1, infecção por DENV-2, infecção por DENV-3 ou infecção por DENV-4.
[00189] A infecção por vírus ssRNA pode ser, por exemplo, uma infecção por filovírus. A infecção por filovírus pode ser, por exemplo, uma infecção por ebolavírus ou infecção por marburgvírus. A infecção por ebolavírus pode ser, por exemplo, uma infecção por ebolavírus Zaire (ZEBOV), ebolavírus do Sudão (SUDV), ebolavírus Reston (RESTV), ebolavírus Taï Forest (TAFV) ou ebolavírus Bundibugyo (BDBV). A infecção por vírus de marburg pode ser, por exemplo, uma infecção por vírus de Marburg (MARV) ou vírus Ravn (RAVV)
[00190] A composição de vacina pode ser fornecida como uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica preferencialmente compreende um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode ser formulada com o uso de qualquer método adequado. A formulação de células com carreadores e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis padrão pode ser executado com o uso de métodos de rotina na técnica farmacêutica. A natureza exata de uma formulação dependerá de vários fatores incluindo as células a serem administradas e a via de administração desejada. Os tipos adequados de formulação são totalmente descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, 19ª Edição, Mack Publishing Company, Pensilvânia Oriental, EUA.
[00191] A composição de vacina ou composição farmacêutica pode ser administrada qualquer via. As vias adequadas incluem, mas sem limitações, as vias intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea, intradérmica, transdérmica e oral/bucal.
[00192] As composições podem ser preparadas junto com um carreador ou diluente fisiologicamente aceitável. Tipicamente, tais composições são preparadas como suspensões líquidas de peptídeos e/ou nanopartículas unidas ao peptídeo. Os peptídeos e/ou nanopartículas unidas ao peptídeo podem ser misturados com um excipiente que é farmaceuticamente aceitável e compatível com o ingrediente ativo. Os excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol ou similares e combinações dos mesmos.
[00193] Além disso, se for desejado, as composições farmacêuticas podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares como agentes umectantes e emulsificantes e/ou agentes de tamponamento de pH.
[00194] Os peptídeos ou nanopartículas unidas ao peptídeo são administrados de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade serão terapeuticamente eficazes. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, da doença a ser tratada e da capacidade do sistema imunológico do indivíduo. As quantidades precisas de nanopartículas que precisam ser administradas podem depender do parecer do técnico e pode ser peculiar a cada indivíduo.
[00195] Qualquer número adequado de peptídeos e/ou nanopartículas unidas ao peptídeo pode ser administrado a um indivíduo. Por exemplo, pelo menos ou cerca de 0,2 x 106, 0,25 x 106, 0,5 x 106, 1,5 x 106, 4,0 x 106 ou 5,0 x 106 peptídeos e/ou nanopartículas unidas ao peptídeo por kg do paciente podem ser administradas. Por exemplo, pelo menos, ou cerca de, 10 5, 106, 107, 108, 109 peptídeos e/ou nanopartículas unidas ao peptídeo podem ser administradas. Como um guia, o número de peptídeos e/ou nanopartículas unidas ao peptídeo a ser administrado pode ser de 105 a 109, preferencialmente de 106 a 108. Métodos
[00196] A invenção fornece um método de identificação de um peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de célula T CD8 + de uma estrutura de leitura aberta ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução por: (a) identificar uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução; (b) prever a sequência do polipeptídeo codificado pela ORF; e (c) avaliar se um peptídeo que se liga a uma molécula de MHC de classe I compreende uma sequência presente na sequência prevista, identificando assim um peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de célula T CD8 +.
[00197] O peptídeo imunogênico pode ser qualquer um dos peptídeos imunogênicos discutidos acima. O epítopo de células T CD8 + pode ser qualquer um dos epítopos de células T CD8 + discutidos acima. O vírus ssRNA pode ser qualquer um dos vírus ssRNA discutidos acima. Preferencialmente, o vírus ssRNA é um vírus Influenza A.
[00198] A ORF pode ser qualquer um dos ORFs discutidos acima. A ORF pode, por exemplo, ser uma ORF NEG8. Em alguns aspectos, a ORF compreende um códon de parada. Neste caso, a sequência prevista é prevista com base em que a ORF é mutada para um códon que codifica um aminoácido e o peptídeo compreende uma sequência presente em uma parte da sequência prevista que é o terminal C do códon mutado.
[00199] Os métodos para identificar uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a ORF pode ser identificada por meio da análise da sequência do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de tradução. Conforme estabelecido acima, uma ORF é uma extensão contínua de códons que contém um códon de início e um códon de parada. Se a sequência do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de tradução compreender esse trecho de códons, ela pode compreender uma ORF.
[00200] Os métodos para prever a sequência do polipeptídeo codificado pela ORF são rotineiros na técnica. Por exemplo, no conhecimento do código genético, o versado na técnica pode facilmente determinar a sequência de aminoácidos do polipeptídeo a partir dos códons compreendidos na ORF.
[00201] Métodos para avaliar se um peptídeo que se liga a uma molécula de MHC de Classe I compreende uma sequência presente na sequência prevista também são conhecidos. Por exemplo, os peptídeos que se ligam a uma molécula MHC de classe I podem ser determinados conforme estabelecido na seção "Epítopos de células T CD8 +" acima. Em resumo, as células são infectadas com um vírus ssRNA, cultivadas, coletadas e lavadas. As células são lisadas e os complexos de MHC/peptídeo são então isolados dos lisados por cromatografia de imunoafinidade. Os complexos de MHC obtidos por cromatografia de imunoafinidade são aquecidos para dissociar os peptídeos ligados das moléculas de MHC. A mistura de peptídeos é purificada e analisada por espectrometria de massa para identificar as sequências dos peptídeos. A sequência do peptídeo pode então ser comparada com a sequência prevista para determinar se o peptídeo compreende ou não uma sequência presente na sequência prevista. Em outras palavras, a sequência prevista pode ser comparada àquela de uma sequência conhecida ou recentemente mostrada para se ligar a uma molécula de MHC de classe I. Se, por exemplo, houver identidade entre a sequência prevista e o peptídeo sobre alguns (por exemplo, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90 %, 95%, 97%, 98% ou 99%) ou todo o comprimento do peptídeo, o peptídeo pode compreender uma sequência presente na sequência prevista. Pode, por exemplo, haver pelo menos 50% de identidade (tal como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% m pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade) entre o peptídeo e a sequência prevista ao longo de algum ou todo o comprimento do peptídeo, com base na identidade de aminoácidos.
[00202] Como o peptídeo imunogênico compreende um epítopo de células T CD8 +, espera-se que seja capaz de induzir uma resposta de células T CD8 +. O método da invenção pode compreender ainda uma ou mais etapas que ajudam a confirmar se este é ou não o caso. Por exemplo, o método pode compreender ainda (d) contatar células T CD8 + obtidas a partir de um indivíduo infectado com, ou previamente infectado com, o vírus ssRNA com o peptídeo; e (e) medição in vitro da resposta imune ao peptídeo. Em outras palavras, as células T CD8 + obtidas de um indivíduo infectado com, ou previamente infectado com o vírus ssRNA são estimuladas com o peptídeo imunogênico para determinar se a população de células T CD8 + compreende células T CD8 + específicas para o epítopo compreendido no peptídeo imunogênico. Métodos para medir a resposta imune in vitro são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a proliferação de células T CD8 + pode ser medida. A produção de IFNγ pode ser medida, por exemplo, testando IFNγ no sobrenadante da cultura ou investigando IFNγ intracelular usando citometria de fluxo. A expressão de CD107a, um marcador de desgranulação, pode ser medida usando citometria de fluxo. Peptídeos imunogênicos
[00203] A invenção fornece um peptídeo imunogênico caracterizado pelo fato de que compreende um epítopo de célula T CD4 + ou um epítopo de célula B a partir de um polipeptídeo codificado por uma estrutura de leitura aberta (ORF) codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de tradução.
[00204] Um epítopo de célula T CD4+ é um peptídeo que é capaz de (i) apresentação por uma molécula de MHC de classe II e (ii) reconhecimento por um receptor de célula T (TCR) presente em uma célula T CD4+. Preferencialmente, reconhecimento por um TCR resulta na ativação da célula T CD4+. A ativação da célula T CD4+ pode levar à proliferação e/ou produção de citocina aumentadas.
[00205] Um epítopo de célula B é um peptídeo que é capaz de reconhecimento por um receptor de célula B (BCR) presente em uma célula B. Preferencialmente, reconhecimento por um TCR resulta na ativação da célula T CD8+. A ativação da célula B pode levar à proliferação e/ou produção de anticorpo.
[00206] O peptídeo imunogênico pode ser usado em uma composição de vacina. Qualquer um dos aspectos descritos acima em relação a uma composição de vacina compreendendo um peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de célula T CD8 + ou um epítopo de célula B de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto para RNA de sentido positivo capaz de tradução pode igualmente se aplicar a uma composição de vacina compreendendo um peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de célula T CD4 + ou um epítopo de célula B de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no RNA de sentido oposto a RNA de sentido positivo capaz de tradução A administração de uma composição de vacina compreendendo o peptídeo imunogênico pode induzir uma resposta imune protetora contra o vírus ssRNA. Por exemplo, a administração da composição da vacina pode induzir uma resposta das células T CD4 + contra o vírus ssRNA. A administração da composição da vacina pode induzir uma resposta de células B contra o vírus ssRNA. Desta maneira, a imunidade humoral contra o vírus ssRNA pode ser induzida.
[00207] O peptídeo imunogênico pode ser usado em um ensaio para o diagnóstico de infecção com o vírus ssRNA. Por exemplo, o peptídeo imunogênico pode ser usado para detectar anticorpos contra o vírus ssRNA, tais como anticorpos específicos para o epítopo de células B compreendido no peptídeo imunogênico. O peptídeo imunogênico pode ser usado para detectar células B específicas contra o vírus ssRNA, tais como células B cujo receptor de células B é específico para o epítopo de células B compreendido no peptídeo imunogênico. O peptídeo imunogênico pode ser usado para detectar células T CD4 + específicas para o vírus ssRNA, tais como células T CD4 + específicas para o epítopo de células T CD4 + compreendido no peptídeo imunogênico. Identificando potencial pandêmico
[00208] Tradicionalmente, as pandemias do vírus influenza A têm sido associadas a uma mudança global no serótipo HA do vírus. No entanto, os inventores notaram que certos surtos de vírus influenza A não foram associados a uma mudança no sorotipo HA, mas sim a uma mudança no comprimento do códon de uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma do vírus influenza A no oposto sentido para RNA de sentido positivo capaz de tradução
[00209] Consequentemente, a presente invenção fornece um método para determinar o potencial pandêmico de um vírus influenza A, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) identificar uma primeira ORF codificada por pelo menos parte do segmento 8 do genoma do vírus influenza A no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução; (ii) determinar o número de códons compreendidos na primeira ORF; e (iii) comparar o número de códons compreendidos na primeira ORF com o número de códons compreendidos em uma segunda ORF codificada por pelo menos parte do segmento 8 do genoma de um vírus influenza A pandêmico conhecido no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução,
em que uma diferença no número de códons na primeira ORF em comparação com a segunda ORF é indicativa de potencial pandêmico.
[00210] No contexto da invenção, potencial pandêmico significa a capacidade de um vírus influenza A de causar uma pandemia de influenza. Uma pandemia de influenza ocorre quando um novo vírus da influenza surge e se espalha pelo mundo.
[00211] A primeira ORF pode compreender qualquer sequência de nucleotídeos. A primeira ORF pode codificar qualquer sequência de polinucleotídeos. A segunda ORF pode compreender qualquer sequência de nucleotídeos. A segunda ORF pode codificar qualquer sequência de polinucleotídeos.
[00212] A primeira ORF pode ter qualquer comprimento, isto é, compreender qualquer número de códons. A segunda ORF pode ter qualquer comprimento, isto é, compreender qualquer número de códons. Comprimentos de ORF exemplares são discutidos acima.
[00213] A primeira e a segunda ORFs podem diferir em comprimento por qualquer número de códons. . Por exemplo, uma diferença de um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, 10 ou mais, 11 ou mais, 12 ou mais, 13 ou mais, 14 ou mais, 15 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 30 ou mais, 35 ou mais, 40 ou mais, 45 ou mais, 50 ou mais, 60 ou mais, 70 ou mais, 75 ou mais, 80 ou mais, 90 ou mais ou 100 ou mais códons podem ser indicativos de potencial pandêmico.
[00214] Deve ser entendido que diferentes aplicações dos produtos revelados e métodos podem ser adaptados às necessidades específicas na técnica. Também deve ser entendido que uma terminologia usada no presente documento tem uma finalidade de descrever apenas modalidades particulares da invenção e não se destina a ser limitativa.
[00215] Além disso, como usado no presente relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "a/o" incluem referentes no plural, exceto se o conteúdo claramente declarar de outro modo. Então, por exemplo, a referência a “um peptídeo” inclui “peptídeos”, a referência a “uma nanopartícula” inclui duas ou mais de tais nanopartículas, e similares.
[00216] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados no presente documento, independentemente de ser acima ou abaixo, são incorporados por meio deste, a título de referência em sua totalidade.
[00217] Os seguintes Exemplos ilustram a invenção. Exemplo 1 - Identificação de epítopos de células T CD8 + Linhagens celulares
[00218] As células de hepatoma HepG2 foram obtidas na ATCC e mantidas em DMEM: F12 (Mediatech, Manassas, VA). O meio de cultura foi suplementado com 10% de soro fetal bovino, L-glutamina (300 mg/mL), aminoácidos não essenciais (1 × concentração), piruvato de sódio 0,5 mM, penicilina e estreptomicina (1 × concentração, suplementos foram adquiridos na Mediatech ) [meio completo]. As células foram mantidas a 37°C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. Preparação de amostras para análise de peptídeo de MHC
[00219] Células HepG2 cresceram até cerca de células 1E9. Estas células foram então infectadas com o vírus influenza A da estirpe PR8. Após um pulso de 1 hora, o vírus foi removido por lavagem e as células foram incubadas por 72 horas a 37°C. Neste ponto, as células foram coletadas e processadas para análise de peptídeo de MHC. Isolamento, purificação e fracionamento de peptídeos ligados ao MHC de classe I
[00220] Em seguida, as células são lisadas, por exemplo, por homogeneização e congelamento/descongelamento em tampão contendo 1,0% de NP40. Os lisados são liberados por centrifugação a 2000 rpm por 30 minutos para remover detritos celulares. Os complexos de MHC/peptídeo foram isolados por cromatografia de imunoafinidade utilizando o anticorpo W6/32
(anticorpo monoclonal que reconhece a molécula pan de MHC de classe I), esferas de proteína A/G revestidas (UltraLink Immobilized Protein A/G, Pierce, Rockford, IL). Esferas de proteína A/G de 400 μL foram lavados com tampão de baixo pH seguido por enxágues de PBS. As esferas foram então incubadas com 0,5 mg do anticorpo à temperatura ambiente durante 2 horas. As esferas marcadas foram lavadas três vezes para remover os anticorpos não ligados, e as esferas revestidas com anticorpo foram adicionadas ao lisado celular preparado. Após uma incubação de duas horas à temperatura ambiente com agitação contínua, as esferas foram separadas do lisado por centrifugação a 1000 rpm por 5 minutos. Os complexos de MHC ligados foram eluídos a partir das esferas pela adição de ácido trifluoroacético a 0,1 %, (TFA), pH 1,5. Em seguida, o eluato foi aquecido a 85 °C por 15 minutos para dissociar os peptídeos ligados das moléculas de MHC. Depois que a solução foi resfriada à temperatura ambiente, os peptídeos foram separados do anticorpo por centrifugação usando filtros de membrana de corte de massa molecular Amicon Ultra-3 kDa (Millipore). O filtrado foi concentrado com o uso de centrifugação a vácuo e reconstituído a um volume final de 100 µL. A mistura de peptídeos purificada foi fracionada usando uma coluna de fase reversa (RP) C-18 (4,6 mm de diâmetro x 150 mm de comprimento) usando um HPLC final de 3000 offline (Dionex, Sunnyvale, CA). A fase móvel A foi acetonitrila (ACN) a 2 % e ácido fórmico (FA) a 0,1 % em água, enquanto a fase móvel B pode ser FA a 0,1 % e ACN a 90 % em água. Os peptídeos foram então eluídos da coluna com um gradiente linear de 80 min de 5 a 80% de tampão B a uma taxa de fluxo de 200 μL/min. Um total de 35 frações foram coletadas e secas a 6 μL sob vácuo para análise LC/MS/MS. Análise de espectrometria de massa
[00221] Os experimentos de espectrometria de massa foram realizados usando LTQ (Thermo) e instrumentos Orbitrap com interface com nano ultimate HPLC (Dionex). As frações de peptídeo purificado por RP-HPLC foram injetadas individualmente no sistema LC-MS/MS para identificar as sequências de peptídeos. Como parte da etapa de limpeza da amostra on-line, os peptídeos foram primeiro concentrados usando uma coluna 300 μm ID × 5mm C18 RP trap (Dionex, Sunnyvale CA) e, em seguida, separados usando uma coluna analítica C18 RP de 75 μm ID × 15 cm (Dionex, Sunnyvale CA), equilibrado em 4% ACN/0,1% FA a 250 nL/min de taxa de fluxo. A fase móvel A foi 2% ACN e 0,1% FA na água, enquanto a fase móvel B foi 0,1% FA e 90% ACN na água. Peptídeos foram separados com um gradiente de 4% a 50% B em 60 min e 50% a 80% em 90 min e eluídos diretamente no espectrômetro de massa. A faixa de massa no modo MS foi de 350 Da a 1500 Da e no modo MS/MS foi definida como 100 Da a 1500 Da. Os peptídeos foram analisados usando um método Data-Dependent. Os dados de espectros adquiridos foram pesquisados em um banco de dados de proteína A de influenza usando o Proteome Discoverer (Thermo) para interpretar dados e derivar sequências de peptídeos. As sequências de peptídeos ligados ao MHC de classe I em células infectadas com PR8 foram registradas em um banco de dados. Identificação de peptídeos de MHC na ORF NEG8
[00222] O banco de dados de peptídeos encontrados para se ligar a MHC de classe I em células infectadas com PR8 foi pesquisado contra a sequência do polipeptídeo (SEQ ID NO: 2; MLFVQSYFPLFLV
CVSLLQSAILSLQTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLLQANLCRFLETRTVLS FHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALSNTMVSSRSKITLK
FAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIVMSVMYREAGVET MVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL) codificada pela ORF NEG8. Verificou-se que o polipeptídeo NEG8 compreende uma série de peptídeos que se ligam ao MHC de classe I em células infectadas com o vírus influenza A. A Tabela 3 abaixo mostra os peptídeos codificados pela ORF NEG8 que se ligam ao MHC de classe I em células infectadas com o vírus influenza A.
SEQ Sequência ID de Modificações Confiança XCorr m/z [Da] ID proteín NOs: a WSILMQR NEG8 Alto 2,14 544,2912 5 GP 0 EAGVETM NEG8 Alto 1,95 531,2797 6 VIL 9 IAPSSVKA NEG8 Alto 1,88 486,7971 7 LS 8 PMRTPIAF NEG8 Médio 1,74 349,2038 8 L 3 ISMNQFL NEG8 M3 Médio 1,67 592,7704 9 DNS (oxidação) 5 LMQRGPS NEG8 Médio 1,66 518,7751 10 TF 5 FHSSPPM NEG8 Médio 1,65 386,1880 11 RTP 5 KITLKFAF NEG8 M10 Médio 1,60 688,3472 NMM (oxidação); 9 12 M11 (oxidação) LVCVSLL NEG8 Médio 1,48 729,9323 13 QSAILSL 1
[00223] Tabela 3 Exemplo 2
[00224] A identidade de cinco peptídeos codificados pela ORF NEG8 e que se ligam ao MHC de classe I em células infectadas com o vírus influenza A foi confirmada usando análise de espectrometria de massa de peptídeo sintético. Os cinco peptídeos mostrados na Tabela 3 foram sintetizados e submetidos à análise LC-MS/MS sob condições experimentais idênticas conforme descrito acima. O espectro obtido para cada peptídeo isolado de células infectadas com o vírus influenza A com o espectro obtido para seu análogo sintético para confirmar a sequência de cada peptídeo. Os resultados são mostrados nas Tabela 4 Figuras 1 a 3. Seq. Origem Motiv Origem do vírus Tipo de Confirmaçã o célula o EAGVE Polipeptídeo A2 NEG8 Células Não TMVIL NSP [vírus infectadas
Influenza A por vírus (A/Moscow/343/2 influenza 003 (H3N2))], NSP [vírus Influenza A (A/Moscow/328/2 003 (H3N2))] IAPSSV Células Não NEG8 Células sim KALS infectadas por NSP [vírus infectadas vírus influenza Influenza A por vírus (A/Moscow/343/2 influenza 003 (H3N2))], NSP [vírus Influenza A (A/Moscow/328/2 003 (H3N2))] IAPSSV Proteína A2 NEG8 Células sim KALS transmembran NSP [vírus infectadas ar Influenza A por vírus (A/Moscow/343/2 influenza 003 (H3N2))], NSP [vírus Influenza A (A/Moscow/328/2 003 (H3N2))] PMRTP Proteína A2/2 NEG8 Células Não IAFL transmembran 4 NSP [vírus infectadas ar Influenza A por vírus (A/Moscow/343/2 influenza 003 (H3N2))], NSP [vírus Influenza A (A/Moscow/328/2 003 (H3N2))] LMQRG Proteína A24 NEG8 Células sim PSTF transmembran NSP [vírus infectadas ar Influenza A por vírus (A/Moscow/343/2 influenza 003 (H3N2))], NSP [vírus Influenza A (A/Moscow/328/2 003 (H3N2))]
[00225] Tabela 4
[00226] As Figuras 1 a 3 comparam os espectros de massa obtidos para peptídeos sintéticos com aqueles obtidos para peptídeos isolados de células infectadas. Alguns íons típicos são circulados em cada espectro para ilustrar a identidade dos peptídeos isolados de células infectadas com seu análogo sintético. Os dados confirmam que os peptídeos IAPSSVKALS, LMQRGPSTF e KITLKFAFNMM codificados pela ORF NEG8 são realmente encontrados em células infectadas com o vírus influenza A. Exemplo 3
[00227] A sequência do polipeptídeo codificada pela ORF NEG8 (SEQ ID NO: 2;
MLFVQSYFPLFLVCVSLLQSAILSLQTFDLAVLAIFRFCFGVSGGPPFSLLLLQA NLCRFLETRTVLSFHSSPPMRTPIAFLTSSIVCPGKEGNGEISPTIAPSSVKALS
NTMVSSRSKITLKFAFNMMFFSMIAWSILMQRGPSTFCLGISMNQFLDNSSIV MSVMYREAGVETMVILSASSDSSFRIFSTICFPTWVAALMSRPRVLPLPLRDL) foi utilizada para pesquisar bases de dados de epítopos de células T derivados a partir de células infectadas pelo vírus influenza. Os peptídeos NEG8 descritos nos Exemplos 1 e 2 também foram identificados utilizando esta pesquisa. O objetivo da pesquisa foi estabelecer se quaisquer peptídeos NEG8 ou sequências dentro do polipeptídeo codificado pela ORF NEG8 são compartilhados com quaisquer outras proteínas do vírus influenza A. A Tabela 5 apresenta epítopos de células T derivados de proteínas do vírus influenza A diferentes de NEG8 que também estão compreendidos em um ou mais dos peptídeos NEG8 identificados nos Exemplos 1 e 2 ou o polipeptídeo codificado pela ORF NEG8. A partir disso, numerosos peptídeos NEG8 considerados para se ligar ao MHC em células infectadas com o vírus influenza A podem ser identificados com base no nível de confiança, XCorr e desempenho do espectro de massa do fragmento.
Estirpe Ligação Seq. Proteína Motivo Xcorr m/z Notas de de HLA gripe H2N2 A2: 10 Conjunto AFNMM H3N2 NSP A24 1,35 554,24 A24: 7 de dados FLSM (human múltiplos o) H3N2 Conjunto
AILSLQ NSP A24 (human 1,10 504,26 de dados
TFD o) múltiplos H3N2 Conjunto
DNSSI NSP (human 1,40 467,24 de dados
VISV o) múltiplos H1N1 (human o) Conjunto IAWSILI H7N7 NS1 1,22 472,28 de dados Q (aviário) múltiplos H2N2 (human o) H3N2 Conjunto
IVMSV NSP A3 (human 1,17 507,75 de dados
MYR o) múltiplos H3N2 A2:24
FLICVS NSP A2/24 (human 1,76 566,81 A24:13 VLS0670
PLQL o) H1N1
GGLPF NS1 (human 1,82 458,78 VLS0670
SLLL o) H3N2 A2:18
LFLICV NSP A24 (human 1,74 510,81 A24:21 VLS0670
SLL o) H3N2
SPLQL NSP B7 (human 1,90 527,82 B7:22 VLS0670
AILSL o) H3N2
WSILM NSP (human 2,14 544,29 VLS0670
QRGP o) H7N7 (aviário) IFRFCF Polimerase H1N1 1,49 545,76 VLS3056 GGSG PB2 (human o) VAASM NSP H3N2 1,45 447,74 VLS3056
FRP (human o) H3N2
LSLQT NSP (human 1,11 474,25 VLS3056
SDLA o) SIRVS Polimerase H7N7 1,08 459,76 VLS3056 NRS PB2 (aviário) FSVMF H7N7 VLS3056 NS1 1,17 489,22 LSM (aviário) VLS3063 H7N7 (aviário) SVKAL VLS3056 HA A2/24 H1N1 1,15 402,74 SSI VLS3063 (human o) H3N2
ALMSR NSP A2 (human 1,24 465,27 VLS3056
PRV o) H3N2 H2N2
EGNGE NSP H1N1 1,02 452,21 VLS3056
ISPT (human o) H3N2
AFNMM NSP (human 1,06 505,69 VLS3056
FFS o) H1N1
PAISRF HA A24 (human 1,48 470,73 VLS3056
CF o) AFSVM H7N7 A24:7 NSP A24 1,36 516,74 VLS3056 FLSM (aviário) H2N2
LIQRG Proteína H1N1 PATFC A2/24 1,36 609,83 VLS3063 da matriz (human
L o) H3N2 AILSLQ A24:2 NSP A24 (human 1,10 504,26 VLS3063
TFD o) H1N1 A2:16 ALSSIR Polimerase A2 (human 1,10 460,25 B7:7 VLS3063 VSS PB2 B7 o) H1N1 FSMML Polimerase (human 1,00 560,76 VLS3063 LSMI PB1 o)
H1N1 SPPMR Proteína (human 1,13 451,72 VLS3063 TPT PA-X o) H3N2
LIVLAIY NSP A24 (human 1,11 605,86 VLS3063
RFC o) H3N2
SLRTF NSP A2 (human 1,09 461,74 VLS3063
DLA o) H3N2
MLFVQ NSP (human 1,05 581,79 VLS3063
SYFQ o)
[00228] Tabela 5 Peptídeos NEG8 compartilhados com outras proteínas da gripe Exemplo 4 Estimulação de respostas de CTL in vitro
[00229] As células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de um doador humano saudável (ingênuo) são estimuladas com peptídeos codificados pela ORF NEG8 e se ligam ao MHC de classe I em células infectadas pelo vírus influenza A (em um coquetel de citocinas para induzir um antígeno específico de Resposta CTL. Os PBMCs foram estimulados com peptídeos livres agrupados (FPs) para um total de quatro estimulações em cargas de peptídeo variáveis.
[00230] Estas PBMCs estimuladas são então testadas por co- cultura com alvos não infectados, infectados ou carregados com peptídeo para resposta específica ao antígeno. Células deficientes em TAP (T2) foram usadas para carregamento de peptídeo, e células T2 em branco foram usadas como controle. PBMCs ativados foram testados para ambos os marcadores de desgranulação de interferon gama (IFNγ) e CD107a por citometria de fluxo. Estudos dextrâmeros
[00231] Os reagentes de Dextramêros são marcados com fluorescência e são usados para detectar células T específicas do antígeno em suspensões de células e amostras de tecido sólido. Dextrâmeros de MHC são adicionados a PBMCs ou esplenócitos. Uma quantidade ideal de anticorpo anti- CD8 conjugado com um fluorocromo relevante é então adicionada. Anticorpos adicionais (por exemplo, anticorpos anti-CD3 ou anti-CD4) conjugados com outros fluorocromos relevantes também podem ser adicionados nesta etapa. As células são então analisadas usando um citômetro de fluxo. Estudos CTL in vivo
[00232] Camundongos transgênicos (5-6 camundongos por grupo) são imunizados com peptídeo sintético livre ou conjugados de nanopartícula- peptídeo misturados com e sem adjuvante montanida-51 três vezes em intervalos de 2 semanas por vias de administração subcutânea e intradérmica. O baço e os nódulos linfáticos de drenagem são coletados 7 dias após o reforço final para análise de CTL. As suspensões de células individuais são preparadas a partir dos órgãos linfóides e as células são estimuladas com antígenos peptídicos em cultura por 7 dias. As células T reativadas são testadas para respostas de CTL específicas de epítopo usando células T2 carregadas com peptídeo NEG8 e células HepG2 infectadas com vírus influenza A como alvos nos seguintes ensaios: produção de IFN-γ e granzima- B por ELISpot; secreção de citocinas pelo ensaio MAGPIX; Coexpressão de CD107a por citometria de fluxo. Experimentos de transferência adotiva
[00233] Experimentos de transferência adotiva são realizados para investigar se CTL específico de peptídeo gerado em camundongos transgênicos tem efeito citotóxico contra células infectadas pelo vírus influenza A in vivo em camundongos SCID-Beige. A suspensão de tumor de fígado infectado é injetada sc ou iv em camundongos SCID Beige, seguido por transferência adotiva única ou múltipla de CTL específico de peptídeo gerado em camundongos transgênicos A2 contra construções de peptídeo- nanopartículas. Controles apropriados são usados. A sobrevivência dos camundongos é monitorada. Exemplo 5
Mudanças no comprimento de ORF predominante ao longo do tempo
[00234] O banco de dados internacional de gripe foi usado para obter a sequência do segmento 8 para vários vírus influenza A humanos. A sequência genômica de sentido negativo foi analisada para determinar o comprimento da ORF NEG8 em cada vírus. O comprimento da ORF foi calculado determinando a posição do primeiro códon de parada na sequência de sentido negativo. Por exemplo, um vírus cuja sequência NEG8 tem um códon de parada na posição 94 tem um ORF de 93 códons de comprimento.
[00235] A Figura 5 mostra o número de vírus influenza A analisados (eixo Y) por ano e mês de coleta (eixo X). O código de cores indica o comprimento das ORFs presentes nos vírus coletados em cada momento. Os dados mostram que de 1918 a 1947 o comprimento de ORF predominante nos vírus influenza A humanos foi de 167 códons. De 1947 a 2009, um códon ORF de 216 foi predominante. Desde a pandemia de gripe de 2009, a ORF predominante tinha 85 códons de comprimento. Comprimento de ORF por serotipo
[00236] A relação entre o serótipo e o comprimento da ORF também foi considerada. A Figura 6 mostra a identidade de ORF por ano. O código de cores mostra o serótipo de cada vírus plotado. Entre 1918 (gripe espanhola verde) e 1957 (gripe asiática azul), o códon ORF de 167 predominante estava presente em vírus do serótipo H1N1. A ORF de 167 códons predominante estava então presente em vírus do sorotipo H2N2 até 1968 (HK de gripe amarela), momento em que a ORF de 167 códons tornou-se presente em vírus do serótipo H3N2. A ORF de 167 códons foi visto novamente em vírus do serótipo H1N1 em 1976 como gripe russa (verde). Os resultados são confirmados na Figura 7, que representa a identidade de ORF de 167 códons por ano, com o serótipo mostrado na codificação por cores. Estes dados mostram que o comprimento da ORF pode ser mantido na população de vírus influenza A, apesar das mudanças no serótipo e efeitos de constelação associados. Comprimento de ORF por espécie
[00237] Figura 8 mostra comprimentos de ORF prevalentes em diferentes espécies de vírus influenza A. Uma ORF de 93 códons (ou mais raramente, uma ORF de 135 códons) foi observada em vírus influenza A aviário, aviário e equino. Uma ORF de 140 códons e uma ORF de 167 códons foram observados em vírus da influenza A suíno. Nos vírus da influenza A equinos, a ORF NEG8 tem 93 códons de comprimento quase 100% do tempo. Os vírus da influenza A equino nunca contêm ORFs de comprimento humano de 85.167 ou 216 códons.

Claims (36)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição de vacina caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de células T CD8 + a partir de um polipeptídeo codificado por uma estrutura de leitura aberta (ORF) codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus de ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de translação.
2. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende dois ou mais peptídeos imunogênicos.
3. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende dois ou mais peptídeos imunogênicos, cada um compreendendo um epítopo de célula T CD8 + diferente a partir de um polipeptídeo codificado por uma estrutura de leitura aberta (ORF) codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus de ssRNA no sentido oposto para RNA de sentido positivo capaz de translação.
4. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um peptídeo imunogênico que interage com pelo menos dois supertipos de HLA diferentes.
5. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo intensifica a aptidão do vírus de ssRNA em humanos.
6. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o vírus de ssRNA é um vírus ssRNA de sentido negativo e a ORF é de sentido negativo.
7. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o vírus ssRNA de sentido negativo é um Orthomyxovirus.
8. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o Orthomyxovirus é um vírus influenza.
9. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o vírus influenza é um vírus influenza A.
10. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a ORF é codificada por pelo menos parte do segmento 8 do genoma do vírus influenza A.
11. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a ORF tem pelo menos 85 códons de comprimento.
12. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que a ORF tem pelo menos 167 códons de comprimento.
13. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizada pelo fato de que a ORF tem pelo menos 216 códons de comprimento.
14. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que o vírus influenza A é um vírus da gripe espanhola ou um vírus da gripe espanhola reconstruído.
15. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a ORF compreende a sequência de SEQ ID NO. 56 ou uma variante da mesma, ou a sequência da SEQ ID NO: 57 ou uma variante da mesma.
16. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, caracterizada pelo fato de que o epítopo de células T CD8 + é conservado entre os vírus influenza A humanos.
17. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 16, caracterizada pelo fato de que o epítopo de células T CD8 + é conservado entre os vírus influenza A humanos e um vírus influenza A suíno, equino e / ou aviário.
18. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 17, caracterizada pelo fato de que o epítopo de células T
CD8 + está presente em uma ORF prevista de pelo menos 85, pelo menos 167 ou pelo menos 216 códons de comprimento em um vírus influenza A suíno, equino e / ou aviário.
19. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que o vírus influenza A suíno é do sorotipo H1N1.
20. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais dos peptídeos estabelecidos em SEQ ID NOs: 16 a 53.
21. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o vírus ssRNA é um filovírus.
22. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que vírus do filovírus é um ebolavírus ou marburgvírus.
23. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o vírus de ssRNA é um vírus ssRNA de sentido positivo e a ORF é de sentido negativo.
24. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o vírus ssRNA é um flavivírus.
25. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que vírus do flavivírus é um vírus da Dengue ou vírus da Zika.
26. Método de prevenção ou tratamento de uma infecção viral caracterizado por compreender administrar a composição de vacina conforme definida em qualquer uma das reivindicações anteriores a um indivíduo infectado por, ou em risco de ser infectado por, um vírus ssRNA.
27. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada por ser para uso em um método de prevenção ou tratamento de uma infecção viral em um indivíduo.
28. Método, de acordo com a reivindicação 26, ou composição de vacina para uso de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a infecção viral é causada por um vírus zoonótico.
29. Método, de acordo com a reivindicação 26 ou 28, ou composição de vacina para uso de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é humano.
30. Método, de acordo com a reivindicação 26, ou composição de vacina para uso de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a infecção viral é uma infecção viral pandêmica.
31. Método de identificação de um peptídeo imunogênico caracterizado pelo fato de que compreende um epítopo de célula T CD8 + de uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução por: (a) identificar uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de tradução; (b) prever a sequência do polipeptídeo codificado pela ORF; e (c) avaliar se um peptídeo que se liga a uma molécula de MHC de Classe I compreende uma sequência presente na sequência prevista, identificar assim um peptídeo imunogênico compreendendo um epítopo de célula T CD8 +.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a ORF compreende um códon de parada, a sequência prevista é prevista com base em que o códon de parada é mutado para um códon que codifica um aminoácido e o peptídeo compreende uma sequência presente em uma parte da sequência prevista que é o terminal C do códon mutado.
33. Método, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:
(d) contatar células T CD8 + obtidas a partir de um indivíduo infectado com, ou previamente infectado com, o vírus de ssRNA com o peptídeo; e (e) medição in vitro da resposta imune ao peptídeo.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que a resposta imune é medida in vitro determinando a produção de interferon gama (IFNy).
35. Peptídeo imunogênico caracterizado pelo fato de que compreende um epítopo de célula T CD4 + ou um epítopo de célula B a partir de um polipeptídeo codificado por uma ORF codificada por pelo menos parte do genoma de um vírus ssRNA no sentido oposto ao do RNA de sentido positivo capaz de tradução.
36. Método para determinar o potencial pandêmico de um vírus influenza A, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (i) identificar uma primeira ORF codificada por pelo menos parte do segmento 8 do genoma do vírus influenza A no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução; (ii) determinar o número de códons compreendidos na primeira ORF; e (iii) comparar o número de códons compreendidos na primeira ORF com o número de códons compreendidos em uma segunda ORF codificada por pelo menos parte do segmento 8 do genoma de um vírus influenza A pandêmico conhecido no sentido oposto ao RNA de sentido positivo capaz de tradução, em que uma diferença no número de códons na primeira ORF em comparação com a segunda ORF é indicativa de potencial pandêmico.
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