BR112020021901A2 - dispositivo e método para determinar a profundidade e a concentração de um objeto fluorescente subsuperficial - Google Patents

Abstract

DISPOSITIVO E MÉTODO PARA DETERMINAR A PROFUNDIDADE E A CONCENTRAÇÃO DE UM OBJETO FLUORESCENTE SUBSUPERFICIAL. A presente invenção refere-se a um método e um dispositivo para determinar a profundidade e a concentração de fluoróforo de uma concentração de fluoróforo abaixo da superfície de um meio opticamente absorvente e dispersante apropriado para o uso na orientação cirúrgica baseada em fluorescência tal como na ressecção de tumor. A luz de estímulo de comprimento de onda longo é usada para obter a penetração profunda do tecido. A recuperação da profundidade é executada ao designar amplitudes de modulação medidas para cada frequência espacial a amplitudes de modulação previamente computadas em uma tabela de amplitudes de modulação indexadas por parâmetros e profundidade ópticos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DISPOSI- TIVO E MÉTODO PARA DETERMINAR A PROFUNDIDADE E A CON- CENTRAÇÃO DE UM OBJETO FLUORESCENTE SUBSUPERFI- CIAL".

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

[0001] O presente pedido de patente reivindica a prioridade ao Pe- dido de Patente Provisório U.S. nº. 62/663.158 depositado em 26 de abril de 2018, o qual é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

DIREITOS DO GOVERNO

[0002] A presente invenção foi elaborada com apoio do governo sob a concessão nº. R01 NS052274 concedido pelos Institutos Nacionais da Saúde. O governo tem determinados direitos na invenção.

CAMPO TÉCNICO

[0003] São descritos um método e um dispositivo para determinar a concentração e a profundidade do fluoróforo dos objetos fluorescentes localizados abaixo de uma superfície opticamente absorvente e o meio dispersante. O método e o dispositivo são apropriados para o uso na orientação cirúrgica baseada na fluorescência, tal como na ressecção de tumor.

ANTECEDENTES

[0004] A cirurgia é normalmente usada como parte do tratamento de pacientes com tumores. Em muitos casos, o objetivo consiste em maximizar a extensão da ressecção do tumor, enquanto são minimiza- dos os danos aos tecidos saudáveis circundantes para melhorar a so- brevivência e a qualidade de vida. A formação da imagem radiológica pré-operatória, tal como a formação da imagem de ressonância magné- tico (MRI) ou a tomografia computada com raios X (CT), é usada fre- quentemente para guiar o procedimento, por exemplo, para mostrar a localização do tumor com referência a outras estruturas anatômicas. No entanto, durante a cirurgia, os tumores podem se deslocar na posição, conduzindo à perda de coregistro com imagens as pré-cirúrgicas. Além disso, pode ser difícil identificar a margem verdadeira do tumor. Perto do final da cirurgia, ainda pode não ser possível que o cirurgião visualize o tumor residual que pode voltar a crescer se não for removido.

[0005] Desse modo, a formação de imagem com fluorescência (res- secção guiada por fluorescência, FGR) durante a cirurgia está emer- gindo como uma técnica auxiliar valiosa para abordar essas limitações.

[0006] A FGR pode ser baseada no fluorescência natural do tecido, normalmente chamada autofluorescência do tecido. Alternativamente, um material fluorescente exógeno ("fluoróforo") pode ser administrado ao paciente para realçar o tumor. Neste caso, o espectro da luz fluores- cente que emerge do tecido com a iluminação do tecido com uma luz de um comprimento de onda de excitação apropriado é a combinação da autofluorescência do tecido mais a fluorescência do fluoróforo exó- geno à concentração que ele alcança no tecido particular.

[0007] Fluoróforos exógenos diferentes foram investigados em mo- delos pré-clínicos e em experimentações clínicas de localizações e es- tágios de tumor diferentes. Por exemplo, o verde indocianina (ICG), que emite fluorescência na região próxima do infravermelho do espectro é normalmente usado para a formação de imagem da perfusão do sangue dentro do tecido. Para a formação da imagem do tumor, e em particular para guiar a cirurgia, um fluoróforo comum é a protoporfirina IX (PpIX) que é sintetizada dentro das células com a administração de ácido ami- nolevulínico (ALA). De modo geral, isto mostra o contraste elevado entre o tumor e o tecido normal do hospedeiro. A PpIX absorve em uma faixa de comprimentos de onda, de cerca de 400 nm a cerca de 630 nm, ex- citando um espectro de emissão de fluorescência a cerca de 700 nm. A absorção de PpIX é muito mais forte na extremidade de comprimento de onda curto dessa faixa de absorção do que na extremidade longa, tal como ilustrado na Figura 1B. Por causa da maior eficiência de absorção e da filtração mais fácil das emissões de luz de excitação em separa- ções largas, os sistemas que formam imagens de concentrações de flu- oróforo de PpIX induzida por ALA usam tipicamente uma luz de compri- mento de onda curto, ou "azul", para a excitação enquanto se observa a luz a emissões vermelhas profundas.

[0008] A orientação da imagem de fluorescência de ALA-PpIX é ti- picamente usada, por exemplo, na cirurgia de tumor no cérebro, medi- ante a incorporação de uma fonte de luz azul para a excitação e a de- tecção de fluorescência vermelha até quase infravermelha em um mi- croscópio neurocirúrgico. Para outros sítios, a tecnologia de formação de imagem com fluorescência é incorporada em um endoscópio ou é "autônoma", independente de outros dispositivos médicos de formação de imagem. A orientação da imagem de fluorescência de ALA-PpIX de- monstrou um benefício clínico ao permitir uma ressecção mais completa do tumor perto do final da cirurgia. Por exemplo, a FGR baseada em ALA-PpIX de glioma de grau elevado ao usar a excitação de luz azul foi mostrada até pelo menos o dobro da taxa de ressecção completa e me- lhora a sobrevivência livre de progressão.

[0009] Quando as imagens de fluorescência são formadas em uma superfície do tecido, a intensidade do sinal de fluorescência é afetada pela atenuação da luz de excitação e emissão devido à absorção óptica e à dispersão da luz pelo tecido. Esta atenuação pode ser substancial e revela uma dependência complexa no comprimento de onda. Em con- sequência disto, um sinal de fluorescência medido relativamente fraco ou uma imagem de baixo brilho formada na superfície do tecido pode ser o resultado da baixa concentração de fluoróforo ou da absorção ele- vada e/ou da dispersão aos comprimentos de onda de excitação e/ou emissão. Por outro lado, uma região de intensidade de fluorescência brilhante pode ser devida à elevada concentração de fluoróforo e à baixa absorção e dispersão. A concentração absoluta do fluoróforo, para uma determinada dose administrada para o fluoróforo (ou seu precursor tal como no caso de ALA-PpIX) é um marcador importante da presença de células ou tecidos malignos, de modo que a resolução de tais ambigui- dades é de valia.

[0010] Desse modo, a medição da concentração de PpIX absoluta no tecido durante a ressecção pode melhorar de maneira significativa a sensibilidade e a especificidade da detecção de tumor residual, ao me- lhor identificar o tecido fluorescente que não é visto pela avaliação visual qualitativa. Isto foi demonstrado ao usar uma sonda de fibra óptica que mede o espectro de fluorescência da luz, em um único local específico na superfície do tecido. O espectro da luz difusamente refletida é me- dido e e os co- do tecido aos comprimentos de onda de excitação e detecção de fluorescência. Após a aplicação de fatores de calibração apropriados, esses dados são usados então como entrada para um modelo de transporte de luz no tecido para converter o sinal de fluorescência medido no sinal verdadeiro, ou intrínseco, corri- gido para os efeitos da confusão de atenuação de luz desconhecida pelo tecido. A concentração de PpIX no tecido no local da sonda é recupe- rada então mediante a não misturação espectral do espectro de fluores- cência de PpIX conhecido da autofluorescência do tecido e de quaisquer fotoprodutos de PpIX que podem ter sido gerados durante a cirurgia.

[0011] Neste modo de ponto espectroscópico, a quantificação da concentração de PpIX no tecido permite taxas realçadas de ressecção em gliomas de graus baixos e elevados além de e acima das taxas ob- tidas ao usar apenas a orientação de imagem de fluorescência quanti- tativa. Esta técnica é aqui indicada como espectroscopia de fluorescên- cia de ponto quantitativa, qFS.

SUMÁRIO

[0012] Será empregada a ressecção guiada por fluorescência de ALA-PpIX da ressecção de tumor no cérebro para demonstrar a pre- sente invenção, mas deve ficar compreendido que o método e o dispo- sitivo descritos no presente documento são aplicáveis a outros fluorófo- ros, incluindo os fluoróforos quase infravermelhos, e para tumores dife- rentes e aplicações não oncológicas.

[0013] A espectroscopia de fluorescência localizada quantitativa foi estendida para a formação de imagem quantitativa de campo amplo, do tecido são primeiramente mapeados através do campo de visão cirúrgico e esses dados são aplicados então para corrigir as imagens de fluorescência medidas em uma base de pixel a pixel, analogamente à técnica de pontos de sonda. Um método para mapear as propriedades ópticas é através da formação de imagem de domínio da frequência espacial (SFDI). Esta é uma forma específica de formação de imagem óptica difusa que pode produzir imagens de parâ- em campos de visão amplos com resolução espacial de submilímetro. Na SFDI, a onda senoidal ou outros padrões periódicos da luz são projetados na superfície do tecido, e é obtida a imagem do padrão de refletância difusa espacialmente resolvida do tecido. Este pa- drão tem a mesma frequência espacial e fase que o padrão projetado, mas a distribuição da intensidade é modulada pela dispersão e atenua- ção no tecido.

[0014] Com o conhecimento desses mapas de absorção óptica e dispersão de transporte através do campo de visão cirúrgico, os efeitos da atenuação da luz na imagem de fluorescência detectada é corrigido, analogamente a qFS. Depois da subtração da autofluorescência do te- cido, é gerada uma imagem da concentração absoluta de PpIX em ou perto da superfície do tecido. Um dispositivo no qual a SFDI é incorpo- rada em um sistema de formação de imagem de fluorescência hiper es- pectral foi relatado e a concentração de PpIX em tumores intracranianos em um modelo de glioma em ratos foi calculada na forma de mapas 2D, com uma precisão de cerca de ±~10%, que é comparável àquela de qFS. A concentração detectável mínima era de cerca de 13 ng/ml.

[0015] Os métodos e os dispositivos para qFS e qFI tal como defi- nido acima que aplicam modelação analítica ou numérica rigorosa da propagação de luz no tecido são distintos de outros métodos e disposi- tivos baseados em algoritmos semiempíricos. Por exemplo, as imagens de fluorescência podem ser coletadas a dois comprimentos de onda de excitação diferentes ou a dois comprimentos de onda de detecção dife- rentes, e várias imagens da razão podem ser geradas a partir dos mes- mos. Estes métodos e dispositivos se prestam a minimizar ou compen- sar parcialmente os efeitos da atenuação da luz e outros fatores que podem afetar a imagem de fluorescência. No entanto, eles diferem da presente invenção porque não permitem que a concentração absoluta de fluoróforo no tecido seja calculada e mapeada.

[0016] Quando a luz a comprimentos de onda curtos tal como na região violeta ou azul do espectro é usada para excitar o fluoróforo, a profundidade de penetração limitada desta luz no tecido restringe a qFI aos tumores superficiais, até uma profundidade de cerca de 1 mm. A finalidade da presente invenção é de estender a capacidade quantitativa de qFI a tecidos mais profundos que se encontram além da superfície do leito de ressecção à imagem da profundidade do tumor subsuperficial e à concentração de fluoróforo no mesmo. A presente invenção difere dos métodos qFI e dispositivos acima, uma vez que a concentração de fluoróforo é calculada para o fluoróforo que se encontra substancial- mente abaixo da superfície do tecido.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0017] Os elementos nas figuras não estão em escala.

[0018] A FIGURA 1A é um diagrama esquemático de um instru- mento de SFDI hiper espectral de bancada usado em espectros de si- mulação de tecidos e gliomas ou outros cânceres, tal como descrito no presente documento.

[0019] A FIGURA 1B é um gráfico que ilustra a absorção da proto- porfirina IX (PpIX) versus o comprimento de onda, mostrando que a ab- sorção da luz de comprimento de onda de excitação a comprimentos de onda curtos é drasticamente mais elevada do que a comprimentos de onda longos perto do comprimento de onda de 632 nanômetros usado para a excitação no presente sistema.

[0020] A FIGURA 2 é um diagrama de blocos de um instrumento alternativo para usar qdFI durante a cirurgia, tal como a cirurgia do cé- rebro para a remoção de gliomas.

[0021] A FIGURA 3 é um fluxograma de um método de operação dos instrumentos das Figuras 1 e 2 para executar a qdFI e as imagens atuais do uso na análise de espécimes patológicos ou da indicação do tecido do tumor a um cirurgião de modo que o cirurgião possa remover o tecido do tumor durante a cirurgia.

[0022] A FIGURA 4 é um gráfico da amplitude de modulação nor- malizada medida do sinal de fluorescência a 705 nm como uma função da frequência espacial da luz de excitação de 632 nm incidente para profundidades diferentes do objeto fluorescente abaixo da superfície do espectro líquido. As profundidades em mm são indicadas em cada curva. O objeto fluorescente continha 10 µg/ml de PpIX misturados com o sangue e Intralipid para simular as propriedades ópticas do tecido de µa = 0,001 linha por milímetro (mm-1 = 1 mm-1 a 705 nm. As barras de erros são o desvio padrão através de três replicatas.

[0023] As FIGURAS 5A a 5C mostram os gráficos representativos da modulação da fluorescência versus a profundidade de inclusão para combinações diferentes de coeficientes de absorção óptica e dispersão de transporte do espectro a 705 nm e para uma frequência espacial par- ticular f.

[0024] As FIGURAS 6A a 6C mostram os gráficos da profundidade calculada versus a profundidade real da inclusão fluorescente para es- pectros de diferentes coeficientes de absorção e dispersão de trans- porte. As barras de erros são o desvio padrão de 3 replicatas. A linha do melhor ajuste ainda é mostrada junto com a excelência de ajuste R2.

[0025] As FIGURAS 7A a 7C mostram os gráficos da concentração calculada de PpIX versus a profundidade real da inclusão fluorescente para espectros de diferentes coeficientes de absorção e dispersão de transporte. O valor verdadeiro da concentração de PpIX é indicado pela linha horizontal em cada gráfico. As barras de erros são o desvio padrão de 3 replicatas. Os valores de p indicam se as concentrações calculadas são ou não estatisticamente diferentes das concentrações reais. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES E DADOS DE SU-

PORTE

[0026] Há pelo menos duas abordagens complementares para de- terminar a profundidade do tumor fluorescente subsuperficial, em uma forma de formação da imagem aqui indicada como dFI. Em um método e dispositivo, as imagens de fluorescência são formadas a múltiplos comprimentos de onda de excitação diferentes. As imagens são então classificadas de acordo com a profundidade de penetração eficaz pre- vista de cada comprimento de onda da luz no tecido, uma forma de limite de intensidade é aplicada, e uma imagem topográfica é gerada, a qual indica a profundidade da camada superior do tumor fluorescente subsu- perficial. Para a PpIX, este método e dispositivo determinaram a profun- didade de um objeto fluorescente subsuperficial com uma precisão de cerca de ±0,5 mm até uma profundidade de cerca de 3 mm no tecido do cérebro.

[0027] O segundo método e dispositivo, que ainda foram demons- trados para PpIX, são para excitar a fluorescência com luz vermelha que penetra muito mais profundamente no tecido, e então formar imagens a vários comprimentos de onda diferentes da emissão de fluorescência. Uma vez que comprimentos de onda mais longos são menos atenuados pelo tecido sobrejacente, o espectro de fluorescência detectado em cada ponto na imagem é distorcido até um grau que depende da pro- fundidade da qual a luz fluorescente origina. Para a PpIX, este método e dispositivo propiciaram uma precisão da profundidade de cerca de ±1 mm até uma profundidade de cerca de 8 mm no tecido do cérebro. A luz vermelha é geralmente uma luz de 630 nanômetros ou de um compri- mento de onda mais longo.

[0028] A presente invenção difere desses dois métodos e dispositi- vos para dFI, uma vez que as imagens da profundidade do fluoróforo subsuperficial são aqui calculadas a partir de uma série de imagens de SFDI formadas no modo de fluorescência sob excitação de compri- mento de onda longo (por exemplo, luz vermelha no caso da PpIX). A estimativa da profundidade é baseada então na taxa de deterioração da modulação do sinal de SFDI no modo de fluorescência com aumento da frequência espacial.

[0029] A ALA-PpIX FGR qualitativa ao usar a luz vermelha para ex- citar a PpIX foi relatada em 30 pacientes com várias patologias de tumor intracraniano, adaptando um microscópio neurocirúrgico habilitado por fluorescência a este comprimento de onda de excitação. Isto demons- trou uma ressecção de tumor realçada com a habilitação da detecção da fluorescência de PpIX subsuperficial até uma profundidade estimada de cerca de 5 mm, em comparação a cerca de 1 mm sob a excitação de luz azul. No entanto, a absorção de PpIX é de 1 a 2 ordens de magnitude perto de 635 nm menor do que a 405 nm e, devido aos trajetos ópticos muito mais longos a cerca de 635 nm, a intensidade de fluorescência detectada depende bastante da concentração, da profundidade e da dis- tribuição de fluoróforo, e ainda é afetada pela absorção do tecido e dis- persão. O impacto negativo destes fatores descontrolados na quantifi- cação da concentração de fluoróforo no tumor subsuperficial motiva o desenvolvimento e a validação dos métodos e dos dispositivos para se- parar a profundidade do fluoróforo de sua concentração a essa profun- didade, tal como na presente invenção.

[0030] A formação da imagem de fluorescência hiper espectral ainda pode ser usada para estimar a profundidade de PpIX subsuperfi- cial, ao empregar o fato que a razão logarítmica de duas imagens de fluorescência a comprimentos de onda de emissão diferentes é mais ou menos linear com a profundidade do fluoróforo e com a profundidade de penetração óptica. As profundidades do tumor de cerca de 1 a 9 mm podem ser recuperadas dentro de ±1 mm. No entanto, restrições adici- onais eram necessárias para estimar a concentração de fluoróforo à pro- fundidade. A SFDI no modo de fluorescência melhora a localização es- pacial do fluoróforo ao bloquear a profundidade de penetração da luz da excitação de acordo com a frequência espacial, facilitando desse modo a formação da imagem com profundidade resolvida. Isto deve ser con- trastado com a iluminação planar, isto é, a iluminação do tecido com luz sem padrão uniforme, onde o sinal coletado compreende a fluorescên- cia que origina de todas as profundidades, mas pesa rumo à superfície.

[0031] A formação da imagem de fluorescência com profundidade resolvida habilitada por SFDI foi relatada. Múltiplas frequências espaci- ais da SFDI de luz vermelha foram usadas para excitar a PpIX em tu- mores intracranianos subsuperficiais em camundongos. Uma aborda- gem tomográfica 3D foi aplicada para recuperar a distribuição e a con- centração de PpIX. Isto difere da presente invenção, uma vez que a profundidade do tumor tinha que ser conhecida a priori para este método relatado, ao passo que na presente invenção esta profundidade é cal- culada a partir dos dados medidos em um paciente individual sem o co- nhecimento prévio da profundidade subsuperficial do fluoróforo.

[0032] O presente método e dispositivo determinam a profundidade do fluoróforo subsuperficial ao explorar as capacidades de codificação da profundidade de SFDI de imediatamente abaixo da superfície até cerca de 9 mm com excitação de luz vermelha da PpIX a cerca de 635 nm. Na presente invenção, as imagens da profundidade e da concen- tração de fluoróforo a essa profundidade para o tumor que se encontra abaixo da superfície do tecido acessível (por exemplo, o leito de ressec- ção) são determinadas. O objetivo aqui não é a produção de uma distri- buição tomográfica 3D completa do fluoróforo no tecido, mas ao invés disto obter imagens topográficas que indicam a profundidade do tumor fluorescente mais perto da superfície da cavidade de ressecção, bem como a concentração do fluoróforo a essa profundidade. Tanto separa- damente quanto em combinação, esta informação deve ajudar o cirur- gião a tomar uma decisão mais informada se deve ou não continuar a ressecção em uma região particular do campo cirúrgico. Este método é aqui indicado como qdFI.

[0033] Para codificar a profundidade do fluoróforo, a luz vermelha padronizada é projetada na amostra e as imagens de fluorescência es- pacialmente moduladas são coletadas por uma câmera espectralmente resolvida. A taxa de diminuição da modulação de fluorescência é calcu- lada. Os valores dos coeficientes de absorção óptica e de dispersão de transporte do tecido são determinados por um procedimento de SFDI separado ao usar a luz de banda larga e a formação da imagem de pa- drões de refletância difusa do tecido. Estes dados são usados, junto com essa taxa de diminuição, calcular a profundidade subsuperficial do objeto fluorescente. As imagens da absorção do tecido e de dispersão de transporte ainda são usadas então em um modelo antecipado de propagação da luz em um meio opticamente túrbido para calcular a con- centração do fluoróforo a esta profundidade em cada pixel da imagem.

[0034] Esta descrição, portanto, refere-se à cirurgia guiada por flu- orescência, e se refere em particular à avaliação quantitativa da fluores- cência. Ao invés de se basear na vista visual qualitativa fornecida ao cirurgião, a tecnologia estima os níveis quantitativos da concentração de fluoróforo, neste caso, a uma profundidade abaixo da superfície ci- rúrgica imediata. A invenção inclui métodos para quantificar a concen- tração de fluoróforo no tecido para guiar a cirurgia. A formação da ima- gem de fluorescência quantitativa tal como ensinada no presente docu- mento é mais sensível e mais precisa do que quando baseada na per- cepção visual da fluorescência pelo cirurgião. Os dados mostram que a fluorescência que deve ser visível ao cirurgião pode representar o tumor ressectável na neurocirurgia.

[0035] Pelo menos duas abordagens complementares foram apre- sentadas para determinar a profundidade do tumor fluorescente subsu- perficial, em uma forma de formação de imagem aqui indicada como o dFI. Em um método e dispositivo, as imagens de fluorescência são for- madas a múltiplos comprimentos de onda de excitação diferentes. As imagens são então classificadas de acordo com a profundidade de pe- netração eficaz prevista de cada comprimento de onda de luz no tecido, uma forma de limitação da intensidade é aplicada, e é gerada uma ima- gem topográfica que indica a profundidade da camada superior do tumor fluorescente subsuperficial. Para a PpIX, este método e dispositivo de- terminaram a profundidade de um objeto fluorescente subsuperficial com uma precisão de cerca de ±0,5 mm até uma profundidade de cerca de 3 mm no tecido do cérebro.

[0036] O segundo método e dispositivo, que ainda foram demons- trados para a PpIX, são para excitar a fluorescência com luz vermelha que penetra muito mais profundamente no tecido, e então forma ima- gens a vários comprimentos de onda diferentes da emissão de fluores- cência. Uma vez que os comprimentos de onda mais longos são menos atenuados pelo tecido sobrejacente, o espectro de fluorescência detec- tado em cada ponto na imagem é distorcido até um grau que depende da profundidade da qual a luz fluorescente origina. Para a PpIX, este método e dispositivo propiciaram uma precisão da profundidade de cerca de ±1 mm até uma profundidade de cerca de 8 mm no tecido do cérebro.

[0037] A presente invenção difere desses dois métodos e dispositi- vos para a dFI, uma vez que as imagens da profundidade de fluoróforo subsuperficial são aqui calculadas a partir de uma série de imagens de SFDI formadas no modo de fluorescência sob uma excitação de com- primento de onda longo (por exemplo, luz vermelha no caso de PpIX). A estimativa da profundidade é então baseada na taxa de deterioração da modulação do sinal de SFDI no modo de fluorescência com aumento da frequência espacial.

[0038] A ALA-PpIX FGR qualitativa ao usar a luz vermelha para ex- citar PpIX foi relatada em 30 pacientes com várias patologias de tumor intracraniano, adaptando um microscópio neurocirúrgico habilitado por fluorescência a esse comprimento de onda de excitação. Este trabalho (publicado pelos autores da presente invenção) demonstrou uma res- secção de tumor realçada ao habilitar a detecção da fluorescência de PpIX subsuperficial até uma profundidade estimada de cerca de 5 mm, em comparação a cerca de 1 mm sob a excitação de luz azul. No en- tanto, a absorção de PpIX é 1 a 2 ordens de magnitude menor do que a 405 nm e, devido aos trajetos ópticos muito mais longos a cerca de 635 nm, a intensidade da fluorescência detectada depende bastante da con- centração, da profundidade e da distribuição de fluoróforo e ainda é afe- tada pela absorção do tecido e dispersão. O impacto negativo destes fatores descontrolados na quantificação da concentração de fluoróforo no tumor subsuperficial motiva o desenvolvimento e a validação dos mé- todos e dispositivos para separar a profundidade do fluoróforo de sua concentração a essa profundidade, tal como na presente invenção.

[0039] A formação de imagem de fluorescência hiper espectral ainda pode ser usada para estimar a profundidade de PpIX subsuperfi- cial, ao empregar o fato que a razão logarítmica de duas imagens de fluorescência a comprimentos de onda de emissão diferentes é mais ou menos linear com a profundidade do fluoróforo e com a profundidade da penetração óptica. As profundidades do tumor de cerca de 1 a 9 mm podem ser recuperadas dentro de ±1 mm. No entanto, restrições adici- onais eram necessárias para estimar a concentração de fluoróforo à pro- fundidade. A SFDI no modo de fluorescência melhora a localização es- pacial do fluoróforo ao bloquear a profundidade de penetração da luz de excitação de acordo com a frequência espacial, facilitando desse modo a formação da imagem com profundidade resolvida. Isto deve ser con- trastado com a iluminação planar, isto é, a iluminação do tecido com luz sem padrão uniforme, onde o sinal coletado compreende a fluorescên- cia que origina de todas as profundidades, mas pesa rumo à superfície.

[0040] A formação da imagem de fluorescência com profundidade resolvida habilitada por SFDI foi relatada. Múltiplas frequências espaci- ais de SFDI de luz vermelha foram usadas para excitar a PpIX em tu- mores intracranianos subsuperficiais em camundongos. Uma aborda- gem tomográfica 3D foi aplicada para recuperar a distribuição e a con- centração de PpIX. Isto difere da presente invenção, uma vez que a profundidade do tumor tinha que ser conhecida a priori para este método relatado, ao passo que na presente invenção esta profundidade é cal- culada a partir dos dados medidos em um paciente individual sem ne- nhum conhecimento prévio da profundidade subsuperficial do fluoróforo. QdFI de Ondas Longas

[0041] O presente método e dispositivo determinam a profundidade subsuperficial do fluoróforo ao explorar as capacidades de codificação da profundidade de SFDI de imediatamente abaixo da superfície até cerca de 9 mm com excitação com luz vermelha da PpIX a cerca de 635 nm. Na presente invenção, as imagens da profundidade e da concen- tração de fluoróforo a essa profundidade para o tumor que se encontra abaixo da superfície do tecido acessível (por exemplo, o leito de ressec- ção) são determinadas. O objetivo aqui não é a produção de uma distri- buição tomográfica 3D completa de fluoróforo no tecido, mas, ao invés disto, obter as imagens topográficas que indicam a profundidade do tu- mor fluorescente mais próximo à superfície da cavidade de ressecção, bem como a concentração de fluoróforo a essa profundidade. Tanto se- paradamente quanto em combinação, esta informação deve ajudar o cirurgião a tomar uma decisão mais informado se deve ou não continuar a ressecção em uma região particular do campo cirúrgico. Este método é aqui indicado como qdFI.

[0042] Para codificar a profundidade do fluoróforo, a luz vermelha padronizada é projetada na amostra e as imagens de fluorescência es- pacialmente moduladas são coletadas por uma câmera espectralmente resolvida. A taxa de diminuição da modulação de fluorescência é calcu- lada. Os valores dos coeficientes de absorção óptica e de dispersão de transporte do tecido são determinados por um procedimento de SFDI separado ao usar a luz de banda larga e formação da imagem dos pa- drões de refletância difusa do tecido. Estes dados são usados, junto com essa taxa de diminuição, para calcular a profundidade subsuperfi- cial do objeto fluorescente. As imagens da absorção do tecido e da dis- persão de transporte ainda são usadas então em um modelo antecipado da propagação da luz em um meio opticamente túrbido para calcular a concentração de fluoróforo a esta profundidade em cada pixel da ima- gem.

[0043] São divulgados os seguintes métodos e dispositivos para qdFI. Estes métodos e dispositivos são ilustrados pelo exemplo da PpIX, mas não limitados a esse fluoróforo. Com ajuste apropriado e conhe- cendo os espectros de excitação e emissão de fluorescência, eles po- dem ser aplicados a outros fluoróforos que trabalham através das faixas ultravioleta-quase visível-infravermelha do espectro óptico.

[0044] O aparelho e os experimentos específicos são descritos junto com os resultados que ilustram o desempenho do método e do dispositivo. No entanto, o método e o dispositivo podem ser aplicados a outras condições experimentais, incluindo a cirurgia guiada por fluores- cência nos pacientes. Nem o método nem o dispositivo fica restringido a tumores do cérebro tais como gliomas. Nem os métodos nem os dis- positivos ficam restringidos à aplicação de cirurgia do tumor guiada, uma vez que podem ser aplicados para determinar a profundidade e a con- centração de qualquer fluoróforo subsuperficial dentro de um meio opti- camente absorvente e dispersante.

[0045] Um objeto que contém um material fluorescente (o fluoró- foro) de espectros conhecidos de excitação e emissão de fluorescência fica localizado abaixo da superfície de um meio homogêneo de proprie- dades de absorção e dispersão óptica desconhecidas. A superfície do meio é iluminada com padrões conhecidos de luz espacialmente modu- lada, em que cada padrão tem uma frequência espacial conhecida dife- rente, f. Duas formas diferentes de iluminação são usadas uma após a outra em uma ou outra sequência

[0046] Na primeira forma, aqui indicada como SFDI no modo de flu- orescência, a luz de iluminação está a um comprimento de onda ou uma faixa de comprimentos de onda conhecidos para excitar o fluoróforo e para prover uma penetração suficiente no meio para interagir com o ob- jeto fluorescente, por exemplo, a luz vermelha, para excitar a fluores- cência de PpIX no tecido, tal como a luz vermelha a um comprimento de onda de 632 nm que excita um pico de fluorescência a 705 nm, ainda a luz vermelha, e este pico fica entre 700 e 710 nanômetros. As imagens de fluorescência na superfície do tecido são coletadas. Na segunda forma, aqui indicada como SFDI no modo de refletância, a luz de ilumi- nação é de banda espectralmente larga e as imagens da luz difusa- mente refletida do tecido são coletadas aos comprimentos de onda de interesse. Em modalidade alternativas, outros fluoróforos podem ser usados com a luz de excitação vermelha ou infravermelha e as emis- sões de luz fluorescente vermelha ou infravermelha.

[0047] Um sistema construído para demonstrar a qdFI, a integração da formação de imagem hiper espectral e da SFDI em um único dispo- sitivo, é ilustrado na FIGURA 1. O sistema opera para localizar uma in- clusão fluorescente de PpIX subsuperficial 2 em um espectro de simu- lação de tecido 1, ou um glioma ou um outro câncer no tecido. A luz de uma luz LED de 632 nm 3 é mostrada como um exemplo de uma de várias fontes de LED que podem ser ativadas. Esta luz é acoplada por um guia de luz 4 a um projetor de luz digital 5 em um espelho 6 que reflete o padrão de luz espacialmente modulado 7 na superfície do es- pectro 1. As imagens de fluorescência espacialmente moduladas são filtradas por um filtro de passagem longa de 650 nm 8 e passadas atra- vés das lentes de repetição 9 e então através de um filtro ajustável de cristal líquido 10 a uma câmera de CCD 11. O sistema inclui 6 fontes de luz LED centradas a 390, 440, 475, 512, 586 e 632 nm, cada uma delas com uma largura de faixa de 20 nm (Spectra X, Lumencor, Beaverton, OR, EUA), um das quais exemplo é mostrado na figura. Comprimentos de onda centrais e larguras de faixa diferentes podem ser selecionados para combinar com outros fluoróforos. Depois de ter passado através de um guia de luz líquido 4 (LGG0338, ThorLabs, Montreal, Canadá), a luz é refletida por um modulador de luz espacial, DLP, 5 (Digital Micro- mirror Device, 0,55XGA Series 450, Texas Instruments, Dallas, TX,

EUA) na superfície do meio 1. Todos os LEDs são ativados simultanea- mente para simular a SFDI no modo de refletância de luz branca para mapear os coeficientes de absorção óptica e de dispersão de transporte do tecido. Na SFDI no modo de fluorescência, somente o LED de 632 nm é ativado. A intensidade de cada LED é selecionada para cobrir de maneira ideal a faixa dinâmica do detector enquanto é evitada a satura- ção. O subsistema de formação de imagem consiste em um arranjo de detectores de CCD de 14 bits 11 (Pixelfly, PCO AG, Kelheim, Alemanha) conectado a um filtro ajustável de cristal líquido de faixa visível 10 (LCTF:Varispec-07-02, Perkin Elmer, Inc, Waltham, MA, EUA) por uma lente de montagem em C de repetição de 1:1 9, obtendo um campo de visão de 5 cm por 5 cm com uma profundidade de campo de 2,0 cm no plano focal. Um filtro de passagem longa de 650 nm 8 (FELH0650, Thor- labs, Montreal, Canadá) é usado para bloquear a luz vermelha disper- sada da excitação do meio durante a formação da imagem no modo de fluorescência. O emparelhamento de duas em duas das imagens realça a razão entre sinal e ruído das imagens de fluorescência com tempos de aquisição razoáveis (50 a 1.000 m) por frequência espacial.

[0048] O arranjo de detectores de CCD 11 serve como uma câmera digital e fornece imagens a uma unidade de captura de imagem ou de recepção de imagem 13 na unidade de processamento de imagem 15. Dentro da unidade de processamento de imagem 15 há uma memória 17 e um processador de imagem 19. O processador de imagem 19 é configurado por instruções que podem ser lidas por máquina de proces- samento de imagem de código 21 e padrões espaciais de luz estrutura- dos 23 na memória 17. O código de processamento de imagem 21 é configurado para usar uma tabela de consulta 25 de modulação de flu- orescência prevista pré-computada para as concentrações de fluoróforo localizadas em uma pluralidade de profundidades abaixo da superfície do meio para cada frequência espacial da pluralidade de frequências espaciais.

[0049] Uma modalidade alternativa de um sistema 200 configurado para usar a qdFI é ilustrada na Figura 2, e este sistema 200 é integrado com um microscópio cirúrgico para ser usado na cirurgia. As fontes de luz 202 alimentam através de um modulador espacial 204, em uma mo- dalidade um projetor baseado em um dispositivo de microespelho digi- tal. A luz padronizada é acoplada a uma cabeça de microscópio 206 onde é focalizada e projetada como luz 208 em uma superfície do tecido que está sendo inspecionado, tal como o tecido do cérebro 210 abaixo de um crânio aberto 212 durante a cirurgia. A luz do tecido 210 é rece- bida pela cabeça de microscópio 206 onde é focalizada e ampliada, e a seguir entra no corpo 214 do microscópio onde um separador de feixes permite que uma parcela da luz recebida seja visualizada através das peças oculares 216 por um cirurgião, e uma parcela desviada através dos filtros 218 em uma câmera eletrônica 220 onde as imagens são capturadas. As imagens capturadas da câmera eletrônica 220 são ali- mentadas em um sistema de processamento de imagem digital 222 através de uma interface 224 da câmera. As imagens são processadas tal como descrito a seguir com referência à Figura 3 em um processador de imagem 226 que opera sob o controle de instruções que podem ser lidas por máquina na memória 228. A memória 228 ainda contém os padrões da luz de iluminação, que o processador de imagem 226 pode fornecer ao modulador espacial 204 para gerar a luz espacialmente mo- dulada que tem frequências espaciais predeterminadas; em uma moda- lidade, os padrões da luz de iluminação incluem padrões com 0,1, 0,3, 0,5, 0,6, 0,8 e 1,0 linhas por milímetro.

[0050] Ambos os sistemas da Figura 1A e da Figura 2 operam ao empregar o método 300 da Figura 3. Para determinar 302 os parâmetros ópticos, incluindo os coeficientes de absorção e os coeficientes de dis- persão ao comprimento de onda de excitação, uma superfície do meio ou o tecido é iluminados mediante a projeção 304 de um feixe de luz largo a um comprimento de onda de excitação do fluoróforo na superfí- cie ao empregar um padrão espacialmente modulado que compreende a alternação de regiões de alta e baixa intensidades a uma frequência espacial de um dos padrões predefinidos. A luz recebida da superfície é 306 formada como imagem na câmera e gravada no processador de imagem, em que essas imagens contêm um padrão da luz difusamente refletida emitida pela superfície do meio para formar uma imagem do comprimento de onda de excitação. As etapas de projeção da luz e de formação da imagem são repetidas 308 em pelo menos duas frequên- cias espaciais adicionais, de maneira tal que todos os 6 padrões dispo- níveis da luz de iluminação que têm uma frequência espacial definida são usados, incluindo três que têm uma frequência espacial entre 0,2 e 0,8 mm-1. A luz a cada frequência espacial é projetada em mais de uma fase espacial, deslocando eficazmente as barras claras e escuras dos padrões de luz espacialmente modulados de modo que todas as por- ções da superfície do meio são iluminadas em pelo menos uma fase de cada padrão. Um modelo de propagação de luz em um meio optica- mente absorvente e dispersante é usado para calcular 310 um coefici- ente de absorção e um coeficiente de dispersão de transporte do meio ao comprimento de onda de excitação do fluoróforo nos pixels das ima- gens de comprimento de onda de excitação.

[0051] Os parâmetros ópticos em pixels são determinados então a um comprimento de onda de emissão do fluoróforo que deve estar pre- sente em inclusões dentro do meio, tal como a PpIX dentro de tumores em tumores no cérebro após a administração de ALA. Em uma modali- dade, isto é feito ao repetir as etapas de iluminação ao comprimento de onda de emissão com luz espacialmente modulada em uma pluralidade de fases, ao gravar imagens e ao extrair os parâmetros das imagens tal como feito ao comprimento de onda de excitação; em uma modalidade alternativa porém menos precisa isto é feito pela extrapolação dos pa- râmetros de comprimento de onda do estímulo.

[0052] Então, enquanto são iluminadas 314 com padrões espacial- mente modulados ao comprimento de onda de excitação, as imagens de emissão fluorescente da superfície do meio são gravadas 316 em uma pluralidade de frequências espaciais, nas modalidades as frequên- cias da mesma pluralidade de frequências espaciais usadas enquanto são obtidos os parâmetros ópticos são usadas mediante a iteração 318 dos padrões sequencialmente. A partir destas imagens, as amplitudes de modulação medidas são extraídas 320 na pluralidade de frequências espaciais para blocos de pixels, tais como blocos de pixels de 15 x 20, nas imagens fluorescentes das emissões gravadas na pluralidade de frequências espaciais; essas amplitudes de modulação são então nor- malizadas 322.

[0053] Antes da obtenção de imagens, uma tabela de consulta 232 contendo as modulações de fluorescência previstas para as concentra- ções de fluoróforo localizadas em uma variedade de profundidades abaixo da superfície do meio foi computada 324 para cada frequência espaciais ao uma pluralidade de frequências espaciais utilizando um modelo de propagação da luz.

[0054] As amplitudes moduladas medidas obtidas na pluralidade de frequências espaciais para regiões de pixels na pluralidade de frequên- cias espaciais são então ajustadas 326 aos valores pré-computados na tabela de consulta para determinar a profundidade da concentração de fluoróforo. Uma vez determinada a profundidade da concentração de fluoróforo, a profundidade e pelo menos o parâmetro de absorção são usados para compensar a absorção, uma imagem que representa a concentração e a profundidade pode ser gerada, tal como uma imagem com um brilho que representa a quantidade de fluoróforo e uma cor que representa a profundidade.

[0055] Nas modalidades, o comprimento de onda de excitação é menos de 100 nanômetros mais curto do que o comprimento de onda de emissão, tal como comprimentos de onda de estímulo de 632 nanô- metros com comprimentos de onda de emissão de 705 nanômetros. Primeiro Exemplo de Operação

[0056] Um sistema de acordo com a Figura 1A projeta seis padrões espaciais sequencialmente a frequências espaciais de 0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,27 e 0,38 mm-1. Estas frequências particulares são selecionadas para ilustrar o método. Outras combinações podem ser usadas se elas pro- vêm uma faixa suficiente de modulação do padrão de luz espacial de- tectado. As imagens espacial e espectralmente resolvidas são coleta- das a cada frequência espacial no modo de reflectância e no modo de fluorescência, e analisadas.

[0057] Cada padrão periódico da luz é um padrão espacialmente modulado, e para as finalidades deste documento um padrão espacial- mente modulado é um padrão que tem múltiplas barras claras e escuras alternantes através de um campo de visão, em que as barras claras e escuras têm uma frequência espacial igual a um inverso de um passo das barras escuras. Os padrões espacialmente modulados de ondas senoidais incluem os padrões em que, se uma linha for desenhada per- pendicular às barras do padrão e a intensidade da luz for traçada ao longo da linha, a intensidade da luz varia senoidalmente ao longo da linha de um mínimo no centro das barras escuras a um máximo no cen- tro das barras claras. Em uma modalidade alternativa, seis padrões de luz estruturada são projetados em sequência a frequências espaciais de 0,1, 0,3, 0,5, 0,6, 0,8 e 1 mm-1. Nas modalidades, pelo menos três fre- quências espaciais entre 0,2 e 0,8 mm-1 são usadas em três fases es- paciais para a extração dos coeficientes de absorção e de dispersão de transporte do meio a um comprimento de onda de excitação do fluoró- foro PpIX e a um comprimento de onda de emissão do fluoróforo PpIX. Além disso, em algumas modalidades é projetado um padrão de alta intensidade elevada sólido.

[0058] Em uma demonstração do método e do dispositivo, os es- pectros líquidos foram preparados para simular os coeficientes de ab- sorção óptica e de dispersão de transporte do tecido de interesse atra- vés da faixa de comprimento de onda apropriada. Esses espectros in- cluíram Intralipid, uma suspensão de lipídio-proteína de dispersão óp- tica conhecida, bem como uma corante absorvente verde de coeficiente de extinção conhecido (coeficiente de absorção por unidade de concen- tração) e concentração. As concentrações de Intralipid e de corante fo- ram selecionadas para ser terem coeficientes de absorção e de disper- são de transporte de cerca de 635 e 705 nm que são típicos do tecido normal do cérebro, e estes comprimentos de onda representam, respec- tivamente, os comprimentos de onda da excitação de fluorescência de PpIX de onda longa e os comprimentos de onda de emissão de PpIX. Uma região de fluorescência 2 que contém uma concentração do fluo- róforo PpIX, foi posicionada a uma distância variável abaixo da superfí- cie do espectro para simular, por exemplo, um tumor subsuperficial. Em uma modalidade isto incluiu uma inclusão cilíndrica transparente (diâ- metro interno de 3,2 mm, diâmetro externo de 4,8 mm) passando atra- vés do espectro e paralela à superfície, e preenchida com soro tampo- nado com fosfato contendo PpIX, e Intralipid ou sangue a concentrações que resultaram em propriedades ópticas tais como aquelas do meio com um todo, mas com o fluoróforo PpIX adicionado. O corante verde foi usado em vez de sangue de rato para simular a absorção do tecido no meio com um todo, por causa do suprimento limitado de sangue dispo- nível. A profundidade subsuperficial da inclusão fluorescente foi alterada ao remover ou adicionar o líquido ao recipiente, mantendo uma distância fixa entre o instrumento e a inclusão. A preparação do espectro e as medições foram repetidas três vezes para todos os experimentos. A Ta- bela 1 lista os coeficientes ópticos usados no espectro. Tabela 1. Propriedades ópticas do espectro líquido aos comprimentos de onda de excitação (632 nm, 'x') e aos comprimentos de onda de de- tecção (705 nm, 'm'), e concentração de PpIX na inclusão

[0059] Em uma segunda demonstração do método e do dispositivo, o músculo bovino picado ex vivo foi usado para representar condições bi- ológicas mais realistas. O tecido foi colocado em um recipiente tal como aquele usado para os espectros líquidos, e uma inclusão cilíndrica fina (diâmetro interno de 1,6 mm, diâmetro externo de 3,2 mm) contendo uma concentração fixa de PpIX de 5 µg/ml foi colocada em cima. O te- cido adicional cobriu então a inclusão até 3 profundidades diferentes (2,5, 4,5 e 9 mm), e as imagens em triplicata foram coletadas em cada profundidade. Foi usado uma diâmetro da inclusão menor do que nos espectros líquidos para minimizar os espaços vazios entre a inclusão e o tecido que podem perturbar o padrão de luz no tecido.

[0060] A formação de imagem SFDI no modo de refletância foi usada para mapear as propriedades de absorção e de dispersão de transporte dos espectros. Cada uma das 6 frequências espaciais, f, de 0 a 0,38 mm-1, foi projetada na superfície do espectro para cada uma de

3 fases espaciais, = [0, 2 4 Uma vez que o comprimento de onda de excitação usado aqui era de 632 nm e o LCTF tinha uma sen- sibilidade limitada acima de 680 nm, as propriedades ópticas em torno da faixa do comprimento de onda da emissão de PpIX não foram recu- peradas diretamente. Ao invés disto, os coeficientes de absorção de he- moglobina e de dispersão reduzida de Intralipid foram extrapolados a 705 nm. A SFDI com luz branca foi executada tanto no começo quanto no final de cada experimento para confirmar que não houve nenhuma mudança nas propriedades ópticas do espectro devida, por exemplo, à sedimentação de Intralipid ou de sangue.

[0061] No modo de fluorescência, só foi usada a fonte de 632 nm, projetando padrões senoidais às mesmas frequências espaciais que aquelas acima. As modalidades alternativas com fontes de luz entre 620 e 640 nanômetros devem produzir resultados similares à fonte de luz de 632 nanômetros do experimento. Uma imagem de fluorescência planar da inclusão no ar ainda foi capturada tanto no começo quanto no final de cada experimento para medir toda perda de sinal devida ao fotodes- coramento ou à possível separação de Intralipid e sangue na própria inclusão. O recipiente foi então preenchido com 200 ml do meio com um todo e retirado por etapas (5 ml ~= 1 mm de mudança na profundidade) até a fluorescência da inclusão ficar apenas detectável acima do fundo (sinal/fundo > 1,5). Isto foi empregado para representar a profundidade detectável máxima. A profundidade do fluoróforo é definida aqui como a distância entre a superfície do espectro e o topo da inclusão. As ima- gens de fluorescência planar e de SFD foram adquiridas então para cada profundidade, integrando cerca de 660 a 720 nm. O meio líquido foi removido ou adicionado aleatoriamente para variar a profundidade sem a introdução de polarização sistemática.

[0062] Os dados medidos do espectro foram analisados tal como segue para calcular a profundidade subsuperficial, z, da inclusão no meio. Em primeiro lugar, uma região de 10 por 20 pixels (~2,4 mm por 4,8 mm) de interesse no centro da inclusão foi selecionada para deter- minar a amplitude da modulação, Mf, como uma função de f a 705 nm. A Mf depende do fluoróforo e do sistema de formação de imagem. Desse modo, a cada profundidade desconhecida, a Mf foi normalizada à amplitude da modulação DC (f = 0), de modo que era independente da concentração de fluoróforo ou do rendimento de quantum. A ampli- tude de modulação medida foi corrigida então pela função de transfe- rência de modulação do sistema de formação de imagem, MTF system (x, y, z, f). Desse modo, para um objeto fluorescente à profundidade z e irradiado com intensidade de luz unitária ao comprimento de onda de excitação de fluorescência, a amplitude de modulação normalizada é fornecida por (1) onde é a fluorescência difusa espacialmente resolvida nor- malizado no domínio da frequência.

[0063] Ao usar a teoria da difusão, a amplitude de modulação nor- malizada e corrigida espacialmente iluminada Fm foi calculada com uma função de f para uma faixa de profundidades z (0 a 30 mm em incre- mentos de 0,05 mm) e para uma faixa de coeficientes de absorção óp- tica e dispersão de transporte. Uma tabela de consulta das amplitudes de modulação indexadas pelos coeficientes de absorção e de dispersão de transporte e frequência foi criada deste conjunto de dados.

[0064] A amplitude da modulação normalizada no espectro foi de- terminada como uma função da frequência espacial a partir das medi- ções de SFDI no modo de fluorescência. Os coeficientes de absorção óptica e de dispersão de transporte do espectro ao comprimento de onda de emissão de fluorescência foram determinados a partir das me- dições de SFDI no modo de refletância. Ao usar a interpolação linear entre os valores na tabela de consulta, um ajuste de quadrados mínimos foi executado entre i) a amplitude de modulação medida versus a fre- quência espacial, e ii) a curva prevista correspondente com base nos coeficientes ópticos medidos. Neste ajuste, a profundidade da inclusão fluorescente era a variável livre a ser determinada.

[0065] Ao conhecer desse modo o valor de z, a concentração de PpIX a esta profundidade em cada pixel da imagem foi calculada a partir da imagem de fluorescência não modulada calculada (f = 0), corrigida para os efeitos da absorção e da dispersão da luz de excitação e emis- são de fluorescência pelo tecido intermediário. Esta correção foi obtida ao modelar antecipadamente a propagação da luz no meio, ao usar a teoria da difusão com os coeficientes de absorção óptica e de dispersão de transporte medidos como entrada.

[0066] Os resultados desses experimentos nos espectros líquidos que simulam tecido e o espectro de tecido ex vivo foram tal como segue.

[0067] A modulação do padrão de intensidade fluorescente medida na superfície de um dos espectros líquidos quando iluminada com luz a 632 nm em frequências de modulação diferentes, tal como mostrado na FIGURA 4, demonstra um aspecto crítico da invenção, ou seja, o fato que a taxa de diminuição da modulação de fluorescência com aumento da frequência espacial é dependente da profundidade da inclusão fluo- rescente abaixo da superfície óptica do meio de absorção e dispersão.

[0068] Os exemplos dos gráficos da modulação de fluorescência versus a profundidade do fluoróforo são mostrados nas FIGURAS 5A a 5C e demonstram que os gráficos dependem da combinação particular dos coeficientes de absorção e de dispersão de transporte do meio ao comprimento de onda de emissão de fluorescência. Isto mostra então que é necessário, por exemplo, ao usar a formação da imagem de SFDI no modo de refletância, medir ainda esses coeficientes ópticos de modo que a profundidade da inclusão possa ser calculada a partir da modula- ção da fluorescência medida versus a frequência espacial.

[0069] As FIGURAS 6A a 6C mostram exemplos do gráfico de dis- persão da profundidade calculada versus a profundidade real da inclu- são fluorescente abaixo da superfície do espectro. A excelência de ajuste, R2, para a linha de igualdade era > 0,95 em todos os casos. Es- tes resultados demonstram que a profundidade pode ser determinada, dentro de uma incerteza média de ±0,42 mm. A profundidade máxima que pode ser medida dentro deste nível de incerteza variou de 5,5 a 7,5 mm, dependendo das propriedades ópticas do espectro e da concentra- ção de PpIX. A incerteza na medição da profundidade aumentou para ±1,5 mm a profundidades maiores devido a uma menor razão entre o sinal e o fundo.

[0070] As FIGURAS 7A a 7C mostram os gráficos correspondentes da concentração de PpIX na inclusão subsuperficial e a comparação com a concentração real usada nos experimentos. Os valores de p indi- cam que as concentrações calculadas de PpIX a profundidades diferen- tes não são estatisticamente diferentes dos valores reais na inclusão fluorescente subsuperficial. Tabela 2. Estimativas da profundidade e concentração de PpIX para um espectro (µa,m = 0,002 mm-1 = 2 mm-1) a uma profundidade da in- clusão de 1,75 mm para variar a concentração de PpIX

[0071] Os resultados para o modelo de tecido ex vivo são resumidos na Tabela 3. As propriedades ópticas medidas do tecido, para a excita- ção a 632 nm e a detecção a 705 nm, calculadas na média em relação a três posições perto da inclusão, foram µax = 2,74 ± 0,14, µa,m = 0,0046 = 2,24 ± 0,085 mm-1. As profun- didades recuperadas estavam dentro de 10% das profundidades nomi- nais exceto a 9 mm, onde as imagens demoduladas tinham um con- traste limitado (sinal e o fundo = 1,8). As concentrações derivadas de PpIX estavam dentro de 15% dos valores reais para as duas primeiras profundidades, aumentando para 40% na profundidade maior. Tabela 3. Sumário da profundidade e da concentração de PpIX estima- das no tecido ex vivo com uma concentração de PpIX da inclusão = 5 µg/ml. * indica p<0,05

[0072] Os resultados dos espectros que simulam tecido com con- centração relativamente elevada de PpIX (Figura 5) mostram que a pro- fundidade e a concentração de fluoróforo foram um tanto super estima- das a grandes profundidades (7 a 9 mm). Por outro lado, os estudos em tecidos ex vivo (Tabela 3) indicam que a profundidade e a concentração de PpIX foram subestimadas a grandes profundidades (9 mm) quando a inclusão tinha uma concentração relativamente baixa de fluoróforo de 5 µg/ml. Este comportamento diferente de acordo com a concentração de PpIX ainda foi observado na técnica de profundidade subsuperficial de Kolste et al. No entanto, em todos os casos os erros na recuperação tanto da profundidade recuperando quanto da concentração de PpIX fo- ram reduzidos de maneira marcante a uma razão entre sinal e fundo maior (> 1,5), em que o fundo se deve, por exemplo, à autofluorescência do tecido. Para uma razão entre sinal e fundo mínima de 2, a profundi- dade foi recuperada dentro de ± 0,45 mm e a concentração de PpIX dentro de ±10% dos valores reais a um nível confiável de 95% para os tumores ricos em PpIX encontrados imediatamente abaixo da superfície até uma profundidade máxima de 5 a 9 mm, dependendo da turbidez do tecido. A uma razão entre sinal e fundo baixa, a profundidade foi recu- perada dentro de ± 1 mm, ao passo que a concentração de PpIX foi recuperada dentro de uma precisão média de ± 25%.

[0073] Outras melhorias de modificações no método e no disposi- tivo podem ser previstas. Em primeiro lugar, o procedimento de calibra- ção descrito acima é adicionado às etapas requeridas. Alternativa- mente, múltiplas inclusões fluorescentes podem ser encapsuladas em géis e ser espaçadas lateralmente a profundidades diferentes para a formação da imagem simultaneamente para prover a calibração do ins- trumento.

[0074] Em segundo lugar, outras melhorias devem reduzir o tempo de aquisição e aumentar a sensibilidade para detectar concentrações mais baixas do fluoróforo a profundidades maiores. Por exemplo, a fonte de excitação de LED vermelho pode ser substituída por um diodo laser de maior potência a um comprimento de onda similar. A LCTF de faixa visível pode ser substituída por uma LCTF com elevada transmissão perto do infravermelho (por exemplo, Varispec SNIR/NIRR, Perkin El- mer.Inc, Waltham, MA) ou outros filtros espectrais que são eficientes na faixa próxima ao infravermelho. Um sistema detector de formação de imagem mais sensível tal como uma câmera EM-CCD deve melhorar a sensibilidade e reduzir o tempo de aquisição. A computação direta de µa,m em todos os comprimentos de onda com SFDI No modo de refletância deve ser então possível em vez de extrapolar estes valo- res de 632 nm, tal como foi feito nos experimentos relatados acima. O mapeamento quantitativo rápido de propriedades ópticas é possível com único SFDI de instantâneos, tal como foi relatado recentemente. Esta abordagem pode ser incorporada na presente invenção. Combinações

[0075] É antecipado que os vários conceitos divulgados no presente documento podem ser combinados de várias maneiras. Entre as com- binações antecipadas pelos inventores temos:

[0076] Um método designado como A para determinar uma profun- didade de uma concentração de fluoróforo que se encontra abaixo de uma superfície de um meio opticamente absorvente e dispersante inclu- indo a iluminação de uma superfície do meio com um feixe de luz largo a um comprimento de onda de excitação do fluoróforo utilizando um pri- meiro padrão espacialmente modulado que compreende regiões de alta e baixa intensidades alternadas a uma primeira frequência espacial en- tre 0,1 e 1 mm-1, em que o primeiro padrão espacialmente modulado é projetado sobre a superfície do meio em uma pluralidade de fases dife- rentes. Enquanto é assim iluminado, o método continua com a formação da imagem da luz refletida de maneira difusa emitida pela superfície do meio para formar uma imagem do comprimento de onda de excitação para cada fase da pluralidade de fases diferentes do primeiro padrão espacialmente modulado. O método continua com a iluminação da su- perfície do meio com um feixe de luz largo ao comprimento de onda de excitação do fluoróforo ao usar um segundo padrão espacialmente mo- dulado que compreende regiões de alta e baixa intensidades alternadas a uma segunda frequência espacial entre 0,1 e 1 mm-1, em que o se- gundo padrão espacialmente modulado é projetado sobre a superfície do meio em uma pluralidade de fases diferentes, o segundo padrão es- pacialmente modulado tem uma frequência espacial diferente daquela do primeiro padrão espacialmente modulado, e a formação da imagem de um padrão da luz difusamente refletida emitida pela superfície do meio para formar uma imagem do comprimento de onda de excitação para cada fase da pluralidade de fases diferentes do segundo padrão espacialmente modulado.

As imagens são processadas mediante a apli- cação de um modelo de propagação de luz em um meio opticamente absorvente e dispersante para calcular um coeficiente de absorção e um coeficiente de dispersão de transporte do meio ao comprimento de onda de excitação do fluoróforo nos pixels das imagens de comprimento de onda de excitação.

O método ainda inclui a determinação de coefici- entes dos parâmetros ópticos de comprimento de onda de emissão em pixels.

O método ilumina a superfície do meio com padrões espacial- mente modulados ao comprimento de onda de excitação, gravando as imagens fluorescentes ao comprimento de onda de emissão da superfí- cie do meio a uma terceira frequência espacial; e enquanto ilumina a superfície do meio com padrões espacialmente modulados ao compri- mento de onda de excitação, grava as imagens de comprimento de onda de emissão fluorescente da superfície do meio a uma quarta frequência espacial.

Uma vez que as imagens de comprimento de onda de emissão são gravadas, o método continua com a extração da amplitude modu- lada medida a cada uma dentre a terceiras e a quarta frequências es- paciais para regiões de pixels nas imagens de comprimento de onda de emissão fluorescente gravadas à terceira e quarta frequências espaci- ais.

O método inclui a predição da amplitude modulada nas imagens para as concentrações de fluoróforo localizadas a uma pluralidade de profundidades abaixo da superfície do meio para cada uma dentre a terceira e a quarta frequências espaciais, e o ajuste da amplitude mo- dulada medida à terceira e quarta frequências espaciais para as regiões de pixels às amplitudes moduladas previstas correspondentes para de- terminar a profundidade da concentração de fluoróforo. A terceira e a quarta frequências espaciais compreendem pelo menos duas frequên- cias espaciais entre 0,1 e 0,1 mm-1.

[0077] Um método designado como AA que inclui o método desig- nado como A onde os comprimentos de onda de excitação e de emissão são comprimentos de onda vermelhos ou infravermelhos maiores do que ou iguais a 630 nanômetros.

[0078] Um método designado como AB para determinar uma pro- fundidade de uma concentração do fluoróforo que se encontra abaixo de uma superfície opticamente absorvente e dispersante, o qual inclui a iluminação de uma superfície do meio com um feixe de luz largo a um comprimento de onda de excitação do fluoróforo utilizando um primeiro padrão espacialmente modulado que compreende regiões de alta e baixa intensidades alternadas a uma primeira frequência espacial entre 0,1 e 1 mm-1, em que o primeiro padrão espacialmente modulado é pro- jetado sobre a superfície do meio em uma pluralidade de fase diferentes. Enquanto é assim iluminado, o método continua com a formação da imagem da luz refletida de maneira difusa emitida pela superfície do meio para formar uma imagem do comprimento de onda de excitação para cada fase da pluralidade de fases diferentes do primeiro padrão espacialmente modulado. O método continua com a iluminação da su- perfície do meio com um feixe de luz largo ao comprimento de onda de excitação do fluoróforo utilizando um segundo padrão espacialmente modulado que compreende regiões de alta e baixa intensidades alter- nadas a uma segunda frequência espacial entre 0,1 e 1 mm-1, em que o segundo padrão espacialmente modulado é projetado sobre a super- fície do meio em uma pluralidade de fases diferentes, e o segundo pa- drão espacialmente modulado tem uma frequência espacial diferente daquela do primeiro padrão espacialmente modulado, e a formação da imagem um padrão da luz difusamente refletida emitida pela superfície do meio para formar uma imagem do comprimento de onda de excitação para cada fase da pluralidade de fases diferentes do segundo padrão espacialmente modulado.

As imagens são processadas mediante a apli- cação de um modelo de propagação da luz em um meio opticamente absorvente e dispersante para calcular um coeficiente de absorção e um coeficiente de dispersão de transporte do meio ao comprimento de onda de excitação do fluoróforo em pixels das imagens de comprimento de onda de excitação.

O método ainda inclui a determinação dos coefi- cientes ópticos dos parâmetros de comprimento de onda de emissão em pixels.

O método ilumina a superfície do meio com padrões espaci- almente modulados ao comprimento de onda de excitação, gravando imagens do comprimento de onda de emissão fluorescente da superfí- cie do meio a uma terceira frequência espacial; e enquanto ilumina a superfície do meio com padrões espacialmente modulados ao compri- mento de onda de excitação, grava as imagens do comprimento de onda de emissão fluorescente da superfície do meio a uma quarta frequência espacial.

Uma vez que as imagens do comprimento de onda de emissão são gravadas, o método continua com a extração da amplitude modu- lada medida em cada uma dentre a terceira e a quarta frequências es- paciais para regiões de pixels nas imagens de comprimento de onda de emissão fluorescente gravadas à terceira e quarta frequências espaci- ais.

O método usa as imagens de comprimento de onda de emissão para determinar a profundidade da concentração de fluoróforo.

A ter- ceira e a quarta frequências espaciais compreendem pelo menos duas frequências espaciais entre 0,1 e 0,1 mm-1, e o comprimento de onda de excitação e o comprimento de onda de emissão ficam ambos na por- ção "vermelha" do espectro conhecido tradicional, tais como compri- mentos de onda de 630 a 740 nanômetros, ou na porção infravermelha do espectro com comprimentos de onda de 740 nanômetros e mais lon- gos.

[0079] Um método designado como AC que inclui o método desig- nado como A, AA, ou AB em que os padrões espacialmente modulados compreendem uma pluralidade de barras claras e escuras alternadas.

[0080] Um método designado como AD que inclui o método desig- nado como A, AA, AB, ou AC em que a determinação dos parâmetros ópticos de comprimento de onda de emissão em pixels nas imagens é executada por um método que inclui a irradiação de uma superfície do meio com um feixe de luz largo ao comprimento de onda de emissão de fluoróforo ao usar um padrão espacialmente iluminado que compreende regiões de alta e baixa intensidades alternadas a uma quinta frequência espacial entre 0,1 e 1 linha por milímetro em cada fase de uma plurali- dade de fases; a formação da imagem de um padrão de luz difusamente refletida emitida pela superfície do meio para formar uma imagem espa- cialmente iluminada de comprimento de onda de emissão para a quinta frequência espacial em cada fase da pluralidade de fases; a irradiação de uma superfície do meio com um feixe de luz largo ao comprimento de onda de emissão de fluoróforo ao usar um padrão espacialmente iluminado que compreende regiões de alta e baixa intensidades alterna- das a uma sexta frequência espacial entre 0,1 e 1 linha por milímetro em cada fase de uma pluralidade de fases; a formação da imagem de um padrão de luz difusamente refletida emitida pela superfície do meio para formar um imagem espacialmente iluminada de comprimento de onda de emissão para a sexta frequência espacial em cada fase da plu- ralidade de fases; e a aplicação de um modelo de propagação de luz em um meio opticamente absorvente e dispersante para calcular um coeficiente de absorção e um coeficiente de dispersão de transporte do meio ao comprimento de onda de emissão do fluoróforo em cada pixel nas imagens.

[0081] Um método designado como AE que inclui o método desig- nado como A, AA, AB, AC, ou AD e ainda inclui o uso da profundidade da concentração de fluoróforo e pelo menos o coeficiente de absorção em cada pixel para quantificar a concentração de fluoróforo.

[0082] Um método designado como AF que inclui o método desig- nado como A, AA, AB, AC, AD, ou AE em que o material fluorescente é a protoporfirina IX.

[0083] Um método designado como AG que inclui o método desig- nado como A, AA, AB, AC, AD, AE, ou AF e ainda compreende a pre- paração de uma imagem com a concentração de fluoróforo codificada como brilho e a profundidade do fluoróforo codificada como cor.

[0084] Um método designado como AH que inclui o método desig- nado como AF em que o meio absorvente e dispersante é um tecido de mamífero e o protoporfirina IX é gerada endogenamente no tecido com a administração do ácido 5-aminolevulínico.

[0085] Um método designado como AJ que inclui o método desig- nado como A, AA, AB, AC, AD, AE, AF, AG, ou AH em que a concen- tração do fluoróforo compreende um tumor.

[0086] Um método designado como AK que inclui o método desig- nado como A, AA, AB, AC, AD, AE, AF, AG, ou AH em que a concen- tração do fluoróforo compreendem um material molecular ou nanoma- terial que apresenta uma fluorescência na faixa espectral vermelha ou perto da infravermelha de cerca de 600 nm a 1.300 nm.

[0087] Um método designado como AL que inclui o método desig- nado como AD, AE, AF, AG, AH, AJ, ou AK em que a primeira, a terceira e a quinta frequências espaciais são as mesmas, a segunda, a quarta e a sexta frequências espaciais são as mesmas, e a primeira e a segunda frequências espaciais diferem.

[0088] Um dispositivo designado como B para quantificar e determi- nar a profundidade das concentrações de fluoróforos inclui: uma fonte de luz de comprimento de onda de excitação configurável para excitar os fluoróforos no meio ao usar um padrão de luz espacialmente modu- lado, em que o padrão de luz espacialmente modulado é selecionável de uma pluralidade de padrões de luz com frequências espaciais entre 0,1 e 1 linha por milímetro; pelo menos um elemento óptico configurado para transferir as imagens difusamente refletidas e as imagens de emis- são de fluorescência do meio a um subsistema de formação de imagem; em que o subsistema de formação de imagem compreende pelo menos um filtro inserível na passagem da luz para rejeitar a luz ao comprimento de onda de excitação, e pelo menos uma câmera eletrônica configurada para converte a luz recebida em uma matriz de valores digitais de acordo com uma intensidade de luz que atinge os pixels do detector; e pelo menos um computador configurado para controlar o padrão de luz espacialmente modulado, para capturar imagens, e configurado com instruções que podem ser lidas por máquina para determinar uma pro- fundidade da concentração de fluoróforo e para determinar uma con- centração de fluoróforo para os pixels de imagem da câmera; e um apa- relho configurado para exibir a profundidade da concentração e a con- centração de fluoróforo.

[0089] Um dispositivo designado como BA que inclui o dispositivo designado como B em que o comprimento de onda de excitação fica dentro de 100 nanômetros de um pico do comprimento de onda de emis- são fluorescente da concentração de fluoróforo.

[0090] Um dispositivo designado como BB que inclui o dispositivo designado como B ou BA em que as instruções que podem ser lidas por máquina para determinar uma profundidade de uma concentração de fluoróforo configurado para um método incluem: a extração da amplitude modulada medida à pluralidade de frequências espaciais para regiões de pixels em imagens de emissões fluorescentes gravadas a uma plu-

ralidade de frequências espaciais; a predição da modulação de fluores- cência para uma concentração de fluoróforo localizada em uma plurali- dade de profundidades abaixo da superfície do meio para cada frequên- cia espacial da pluralidade de frequências espaciais; e o ajuste da am- plitude modulada medida à pluralidade de frequências espaciais para regiões de pixels na pluralidade de frequências espaciais à modulação de fluorescência prevista correspondente para determinar a profundi- dade da concentração de fluoróforo.

[0091] Um dispositivo designado como BC que inclui o dispositivo designado como B, BA, ou BB em que o meio de absorção e dispersão é o tecido de um mamífero.

[0092] Um dispositivo designado como BD que inclui o dispositivo designado como B, BA, BB, ou BC em que o comprimento de onda de excitação tem um comprimento de onda entre 620 e 640 nanômetros.

[0093] Um dispositivo designado como BE que inclui o dispositivo designado como B, BA, BC, ou BD em que o comprimento de onda de emissão fluorescente tem um pico entre 700 e 720 nanômetros, tal como no caso de PpIX.

[0094] Mudanças podem ser feitas nos métodos e nos sistemas acima sem desviar do seu âmbito. Desse modo, deve ser observado que a matéria contida na descrição acima ou mostrada nos desenhos anexos deve ser interpretada como ilustrativa e não em um sentido limi- tador. As reivindicações a seguir se prestam a cobrir todas as caracte- rísticas genéricas e específicas descritas no presente documento, assim como todas as afirmações do âmbito do presente método e sistema, que, como uma questão de linguagem, pode se dizer que caem entre as mesmas.

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para determinar uma profundidade de uma con- centração do fluoróforo que se encontra abaixo de uma superfície de um meio opticamente absorvente e dispersante, caracterizado pelo fato de que compreende: iluminar uma superfície do meio com um feixe de luz largo a um comprimento de onda de excitação do fluoróforo ao usar um primeiro padrão espacialmente modulado que compreende regiões de alta e baixa intensidades alternadas a uma primeira frequência espacial entre 0,1 e 1 mm-1, em que o primeiro padrão espacialmente modulado é pro- jetado sobre a superfície do meio a uma pluralidade de fases diferentes; formar a imagem da luz refletida de maneira difusa emitida pela superfície do meio para formar uma imagem do comprimento de onda de excitação para cada fase da pluralidade de fases diferentes do primeiro padrão espacialmente modulado; iluminar a superfície do meio com um feixe de luz largo ao comprimento de onda de excitação do fluoróforo ao usar um segundo padrão espacialmente modulado que compreende regiões de alta e baixa intensidades alternadas a uma segunda frequência espacial entre 0,1 e 1 mm-1, em que o segundo padrão espacialmente modulado é pro- jetado sobre a superfície do meio a uma pluralidade de fases diferentes, e o segundo padrão espacialmente modulado tem uma frequência es- pacial diferente daquela do primeiro padrão espacialmente modulado; formar a imagem de um padrão da luz difusamente refletida emitida pela superfície do meio para formar uma imagem do compri- mento de onda de excitação para cada fase da pluralidade de fases di- ferentes do segundo padrão espacialmente modulado; aplicar um modelo de propagação da luz em um meio opti- camente absorvente e dispersante para calcular um coeficiente de ab-

sorção e um coeficiente de dispersão de transporte do meio ao compri- mento de onda de excitação do fluoróforo nos pixels das imagens do comprimento de onda de excitação; determinar os coeficientes ópticos do comprimento de onda de emissão nos pixels; enquanto ilumina a superfície do meio com padrões espaci- almente modulados ao comprimento de onda de excitação, grava as imagens do comprimento de onda de emissão fluorescente da superfí- cie do meio a uma terceira frequência espacial; enquanto ilumina a superfície do meio com padrões espaci- almente modulados ao comprimento de onda de excitação, grava as imagens do comprimento de onda de emissão fluorescente da superfí- cie do meio a uma quarta frequência espacial; extrair a amplitude modulada medida em cada uma dentre a terceira e a quarta frequências espaciais para regiões de pixels nas ima- gens do comprimento de onda de emissão fluorescente gravadas à ter- ceira e quarta frequências espaciais; prever a amplitude modulada nas imagens para as concen- trações de fluoróforo localizadas em uma pluralidade de profundidades abaixo da superfície do meio para cada uma dentre a terceira e a quarta frequências espaciais; designar a amplitude modulada medida à terceira e quarta frequências espaciais para as regiões de pixels às amplitudes modula- das previstas correspondentes para determinar a profundidade da con- centração de fluoróforo; onde a terceira e a quarta frequências espaciais compreen- dem pelo menos duas frequências espaciais entre 0,1 e 1 mm-1.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a excitação e o comprimento de onda de emissão são ambos a luz vermelha ou infravermelha do comprimento de onda maior do que 630 nanômetros.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que os padrões espacialmente modulados compreendem uma pluralidade de barras claras e escuras alternadas.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a determinação dos parâmetros ópticos de compri- mento de onda de emissão nos pixels nas imagens é executada por um método que compreende: irradiar uma superfície do meio com um feixe de luz largo ao comprimento de onda de emissão do fluoróforo ao usar um padrão es- pacialmente iluminado que compreende regiões de alta e baixa intensi- dadess alternadas a uma quinta frequência espacial entre 0,1 e 1 linha por milímetro em cada fase de uma pluralidade de fases; formar a imagem de um padrão da luz difusamente refletida emitida pela superfície do meio para formar uma imagem do compri- mento de onda de emissão espacialmente iluminada para a quinta fre- quência espacial em cada fase da pluralidade de fases; irradiar uma superfície do meio com um feixe de luz largo ao comprimento de onda de emissão do fluoróforo ao usar um padrão es- pacialmente iluminado que compreende regiões de alta e baixa intensi- dades alternadas a uma sexta frequência espacial entre 0,1 e 1 linha por milímetro em cada fase de uma pluralidade de fases; formar a imagem de um padrão da luz difusamente refletida emitida pela superfície do meio para formar uma imagem do compri- mento de onda de emissão espacialmente iluminada para a sexta fre- quência espacial em cada fase da pluralidade de fases;

aplicar um modelo de propagação da luz em um meio opti- camente absorvente e dispersante para calcular um coeficiente de ab- sorção e um coeficiente de dispersão de transporte do meio ao compri- mento de onda de emissão do fluoróforo em cada pixel nas imagens.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, 2, 3, ou 4, ca- racterizado pelo fato de que ainda compreende o uso da profundidade da concentração do fluoróforo e pelo menos o coeficiente de absorção em cada pixel para quantificar, a concentração do fluoróforo.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o material fluorescente é a protoporfirina IX.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que ainda que compreende a preparação de uma imagem com a concentração do fluoróforo codificada como brilho e a profundi- dade do fluoróforo codificada como cor.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o meio absorvente e dispersante é o tecido de um ma- mífero, em que a protoporfirina IX é gerada dentro do tecido com a ad- ministração de ácido 5-aminolevulínico.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a concentração do fluoróforo com- preende um tumor.

10. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a concentração do fluoróforo compreende um material molecular ou nanomaterial que apresenta fluorescência na faixa espec- tral vermelha ou quase infravermelha de cerca de 600 nm a 1.300 nm.

11. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracte- rizado pelo fato de que a primeira, a terceira e a quinta frequências es- paciais são as mesmas, a segunda, a quarta e a sexta frequências es- paciais são as mesmas, e a primeira e a segunda frequências espaciais diferem.

12. Dispositivo para quantificar e determinar a profundidade das concentrações de fluoróforos, caracterizado pelo fato de que com- preende: uma fonte de luz de comprimento de onda de excitação con- figurável para excitar os fluoróforos no meio ao usar um padrão de luz espacialmente modulado, em que o padrão de luz espacialmente mo- dulado é selecionável de uma pluralidade de padrões de luz com fre- quências espaciais entre 0,2 e 1 linha por milímetro; pelo menos um elemento óptico configurado para transferir imagens difusamente refletidas e imagens da emissão de fluorescência do meio a um subsistema de formação de imagem; em que o subsistema de formação de imagem compreende pelo menos um filtro inserível na passagem da luz para rejeitar a luz ao comprimento de onda de excitação, e pelo menos uma câmera eletrô- nica configurada para converter a luz recebida em uma matriz de valores digitais de acordo com uma intensidade de luz que atinge os pixels do detector; e pelo menos um computador configurado para controlar o pa- drão de luz espacialmente modulado, para capturar imagens, e configu- rado com instruções que podem ser lidas por máquina para determinar uma profundidade da concentração do fluoróforo e para determinar uma concentração do fluoróforo para pixels da imagem da câmera; e um aparelho configurado para indicar a profundidade da con- centração e a concentração de fluoróforo.

13. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 12, caracteri- zado pelo fato de que o comprimento de onda de excitação fica dentro de 100 nanômetros de um pico do comprimento de onda de emissão fluorescente da concentração do fluoróforo.

14. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 12, caracteri- zado pelo fato de que as instruções que podem ser lidas por máquina para determinar uma profundidade de uma concentração do fluoróforo são configuradas para um método que compreende: extrair a amplitude modulada medida à pluralidade de fre- quências espaciais para regiões do pixel nas imagens fluorescentes das emissões gravadas em uma pluralidade de frequências espaciais; prever a modulação da fluorescência para uma concentração de fluoróforo localizada em uma pluralidade de profundidades abaixo da superfície do meio para cada frequência espacial da pluralidade de fre- quências espaciais; e designar a amplitude modulada medida à pluralidade de fre- quências espaciais para regiões de pixels na pluralidade de frequências espaciais à modulação da fluorescência prevista correspondente para determinar a profundidade da concentração de fluoróforo.

15. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 14, caracte- rizado pelo fato de que o meio absorvente e dispersante é o tecido de um mamífero.

16. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 13, caracteri- zado pelo fato de que o comprimento de onda de excitação fica entre 620 e 640 nanômetros.

17. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o comprimento de onda fluores- cente das emissões tem um pico que fica entre 700 e 720 nanômetros.

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