BR112020021195A2 - inibição do crescimento de fungo por depleção de manganês - Google Patents

Abstract

INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE FUNGO POR DEPLEÇÃO DE MANGANÊS. A presente invenção fornece um método para controle do crescimento de microrganismos indesejados, limitando seu acesso ao manganês. Mais especificamente, a presente invenção fornece um método para inibição ou retardamento do crescimento de leveduras e fungos, reduzindo a concentração de manganês em um produto que é preferivelmente um produto alimentício. A invenção também fornece removedores de manganês e seus usos para inibir ou retardar o crescimento de fungos.

Description

INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO DE FUNGO POR DEPLEÇÃO DE MANGANÊS

[1] CAMPO DA INVENÇÃO

[2] A presente invenção situa-se no campo da microbiologia e se refere a métodos para controlar a deterioração fúngica. A invenção também se refere a produtos e preparações alimentícias.

[3] ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[4] Um grande problema na indústria de alimentos é a deterioração por microorganismos indesejados. De acordo com a Organização para a Alimentação e Agricultura (FAO), uma em cada quatro calorias destinadas ao consumo humano acaba não sendo consumida por humanos. Em uma época de escassez de alimentos, com mais de 800 milhões de pessoas passando fome, o tema do desperdício de alimentos se tornou uma questão prioritária para formuladores de políticas globais e fabricantes de alimentos. Além dos impactos sociais e econômicos negativos para a sociedade, o desperdício de alimentos também inflige uma série de impactos ambientais relacionados, incluindo emissões desnecessárias de gases de efeito estufa e uso ineficiente de recursos escassos, como água e terra.

[5] Leveduras e bolores são altamente eficientes em causar a deterioração dos alimentos e são um problema para a maioria dos fabricantes de alimentos. A deterioração devido a leveduras e bolores é claramente visível como manchas de bolor ou descoloração na superfície do produto alimentício, permitindo a sua eliminação antes do consumo. As leveduras tendem a crescer dentro de matrizes de alimentos e bebidas na forma planctônica e tendem a fermentar açúcares, crescendo bem em condições anaeróbicas. Em contrapartida, bolores tendem a crescer na superfície dos produtos na forma de um micélio visível composto de células.

[6] Em particular no setor de laticínios, 29 milhões de toneladas de produtos lácteos são desperdiçados todos os anos na Europa. Um dos principais desafios em manter os produtos lácteos frescos é gerenciar a contaminação por fermentação e bolor, que estão naturalmente presentes em todos os lugares, especialmente se houver interrupções na cadeia do frio desde a produção até a mesa do consumidor.

[7] Por razões econômicas e ambientais, há uma necessidade constante de métodos novos ou aprimorados que sejam eficazes para controlar a contaminação por fungos e leveduras.

[8] SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[9] Os inventores da presente invenção procuraram encontrar métodos eficazes para controlar a contaminação por fungos e, surpreendentemente, identificaram o manganês como importante restrição para o seu crescimento. A presente invenção fornece um novo método de inibição do crescimento de fungos pela limitação do manganês livre que está disponível para levedura (s) ou bolor (es). A presente invenção é em parte baseada na descoberta surpreendente de que, ao reduzir o nível de manganês livre no produto alimentício, por exemplo, removendo o manganês livre, usando agentes removedores de manganês, a contaminação por levedura (s) e / ou bolor (es) pode ser reduzida ou adiada. Os inventores mostraram, além disso, que leveduras e bolores comuns são responsivos aos métodos aqui descritos.

[10] O manganês foi considerado vital para a saúde humana e, portanto, um oligoelemento essencial. O manganês é essencial para o bom funcionamento de humanos e animais, pois é necessário para o funcionamento de muitas enzimas celulares, tais como o manganês superóxido dismutase, piruvato carboxilase, e pode servir para ativar muitas outras tais como quinases, descarboxilases, transferases e hidrolases.

[11] O manganês pode ser encontrado naturalmente em muitas fontes de alimentos, incluindo vegetais com folhas, nozes, grãos e produtos animais. Faixas típicas de concentrações de manganês em alimentos comuns são, por exemplo, 0,4-40 ppm em produtos de grãos, 0,1-4 ppm em carnes, aves, peixes e ovos, 0,4-7 ppm em produtos vegetais.

[12] Além de ser suplemento dietético, o manganês é às vezes adicionado em produtos fermentados como ingrediente ativo para aumentar o crescimento de Bifidobactérias no leite (ver por exemplo, documento WO2017 / 021754, Compagnie Gervais Danone, França). No entanto, os inventores descobriram que isso pode ter um efeito adverso e seria vantajoso limitar a concentração de manganês em produtos alimentícios, a fim de prevenir ou atrasar o crescimento de microorganismos indesejados.

[13] Para combater o problema da deterioração microbiana, a presente invenção fornece em um primeiro aspecto um método para inibir ou retardar o crescimento de fungo/ fungos em um produto que compreende a etapa de redução do manganês livre presente no referido produto. A concentração de manganês livre pode ser reduzida pelos métodos descritos nesta invenção. Em uma modalidade preferida, um ou mais agentes removedores de manganês são adicionados para reduzir o manganês livre. A concentração de manganês livre é preferivelmente reduzida para menos de cerca de 0,01 ppm, tal como abaixo de cerca de 0,008 ppm ou abaixo de cerca de 0,003 ppm. Usando o método, é possível obter um produto, no qual levedura e / ou bolor indesejados dificilmente podem se desenvolver. O produto é caracterizado por uma concentração de manganês livre inferior a cerca de 0,01 ppm, tal como 0,009 ppm, 0,008 ppm, 0,007 ppm, 0,006, 0,005 ppm ou menos. O método compreende ainda a etapa de medir a concentração de manganês livre no produto e obter um valor abaixo de cerca de 0,01 ppm.

[14] Em particular, a presente invenção fornece um método para inibir ou retardar o crescimento de levedura e / ou bolor em um produto alimentício fermentado preparado a partir de leite, tais como iogurte ou queijo. O método é caracterizado pela etapa de redução da concentração de manganês no produto alimentício, a fim de privar a levedura e / ou bolor de manganês e, assim, retardar ou inibir o seu crescimento no produto alimentício.

[15] Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece um método para inibir ou retardar o crescimento de Torulaspora spp., Cryptococcus spp. e Rhodoturola spp. em um produto que compreende a etapa de redução do manganês livre presente no referido produto.

[16] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece um método de preparação de um produto, tal como um produto alimentício, compreendendo a redução do manganês livre presente no referido produto. A concentração de manganês livre pode ser reduzida pelos métodos descritos nesta invenção ou outros métodos conhecidos por um versado na técnica. Em uma modalidade preferida, um ou mais agentes removedores de manganês são adicionados para reduzir o manganês livre. A concentração de manganês livre é preferivelmente reduzida para menos de cerca de 0,01 ppm, tal como abaixo de cerca de 0,005 ppm ou abaixo de cerca de 0,003 ppm. Usando o método, é possível obter um produto compreendendo concentração de manganês livre abaixo de cerca de 0,01 ppm.

[17] Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece produtos, tais como produtos alimentícios obtidos pelos métodos aqui descritos. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para fornecer um produto, compreendendo as etapas de redução do manganês livre no produto e obtenção do produto, em que a concentração de manganês livre é inferior a cerca de 0,01 ppm no produto.

[18] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece o uso de um ou mais agentes removedores de manganês para inibir ou retardar o crescimento de fungos, bem como para produzir produtos alimentícios. Agentes removedores de manganês têm o efeito de disponibilizar menos manganês livre em um produto para leveduras e fungos, inibindo ou retardando seu crescimento.

[19] Em outro aspecto, a presente invenção fornece agentes removedores de manganês, seleções e usos dos mesmos para a captação de manganês.

[20] BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[21] As Figuras 1 e 2 mostram o crescimento de 2 Debaryomyces hansenii diferentes em meio quimicamente definido em pH 6,5 (círculos abertos) ou 4,5 (quadrados pretos) com diferentes concentrações de manganês. O crescimento foi medido após 6 dias de incubação a 17 ° C e determinado por absorbância a 600 nm.

[22] As figuras 3 e 4 mostram o crescimento de 2 Debaryomyces hansenii diferentes na fase aquosa do leite fermentado na presença de removedores de manganês e com diferentes concentrações de manganês adicionadas. A absorvância a 600 nm foi medida após 7 dias de incubação a 17 ° C. O crescimento após a adição do manganês à fase aquosa é mostrado na figura 3 para Debaryomyces hansenii (cepa 1) e na figura 4 para Debaryomyces hansenii (cepa 2) (círculos abertos), em comparação com a referência onde nenhum manganês adicional é adicionado (quadrado). Desvios médio e padrão de replicatas técnicas n = 6 (A) e n = 3 (B) são mostrados.

[23] A Figura 5 mostra o crescimento de Debaryomyces hansenii (cepa 2) em leite fermentado preparado com e sem diferentes agentes removedores, após a adição de diferentes concentrações de manganês variando de 6 ppm (linha superior) a 0,000006 ppm (linha inferior).

[24] A figura 6 mostra o crescimento de 3 leveduras diferentes em placas preparadas a partir do leite fermentado com uma cultura inicial isoladamente (referência, linha superior) ou juntamente com o removedor de manganês (linha inferior). Diferentes concentrações de manganês foram adicionadas como indicado acima nas fotos. Três contaminantes alvo (coluna A: Debaryomyces hansenii (cepa 2), coluna B: Cryptococcus fragicola, coluna C: Debaryomyces hansenii (cepa 1) foram adicionados em três concentrações diferentes: 1 x 103 cfu / ponto (linha superior na placa), 1 x 102 cfu / ponto (linha do meio na placa) e 1 x 101 cfu / ponto (linha inferior na placa).

[25] A figura 7 mostra o crescimento de 3 bolores diferentes em placas preparadas a partir do leite fermentado apenas com a cultura inicial (referência, linha superior) ou junto com o removedor de manganês (linha inferior). Diferentes concentrações de manganês foram adicionadas como indicado acima nas fotos. Três contaminantes alvo (A: Penicillium brevicompactum, B: Penicillium crustosum e C: Penicillium solitum) foram adicionados em concentrações de 500 esporos / mancha. As placas foram incubadas a 7 ± 1 ° C por 25 dias.

[26] A figura 8 mostra o crescimento de 3 bolores diferentes em placas preparadas a partir do leite fermentado apenas com a cultura inicial (referência, linha superior) ou junto com o removedor de manganês (linha inferior). Diferentes concentrações de manganês foram adicionadas como indicado acima nas fotos. Três contaminantes alvo (A: Penicillium brevicompactum, B: Penicillium crustosum e C: Penicillium solitum) foram adicionados em concentrações de 500 esporos / mancha. As placas foram incubadas a 22 ± 1 ° C por 8 dias.

[27] A figura 9 mostra o crescimento de 3 bolores diferentes em placas preparadas a partir do leite fermentado apenas com a cultura inicial (referência, linha superior) ou adicionalmente com removedor de manganês (linha inferior). Diferentes concentrações de manganês foram adicionadas conforme indicado acima nas imagens. Três contaminantes alvo (A: Penicillium carneum, B: Penicillium paneum e C: Penicillium roqueforti) foram adicionados em concentrações de 500 esporos / mancha. As placas foram incubadas a 7 ± 1 ° C por 25 dias.

[28] A figura 10 mostra o crescimento de 3 bolores diferentes em placas preparadas a partir do leite fermentado apenas com a cultura inicial (referência, linha superior) ou adicionalmente com removedor de manganês (linha inferior). Diferentes concentrações de manganês foram adicionadas conforme indicado acima nas imagens. Três contaminantes alvo (A: Penicillium carneum, B: Penicillium paneum e C: Penicillium roqueforti) foram adicionados em concentrações de 500 esporos / mancha. As placas foram incubadas a 22 ± 1 ° C por 8 dias.

[29] A Figura 11 mostra um exemplo de árvore filogenética de transportadores de manganês MntH de espécies selecionadas de Lactobacillus.

[30] A figura 12 mostra o crescimento de uma cepa Debaryomyces hansenii (cepa 1 ou cepa 2) em uma fase aquosa filtrada com um filtro de 1,2 m (aq filtrada), preferivelmente uma fase aquosa de leite fermentado, com diferentes concentrações de EDTA, com e sem outros removedores de manganês, preferivelmente removedor de manganês 1, e com e sem 6 ppm de manganês. A absorvância a 600 nm foi medida após 7 dias de incubação a 17 ° C, em comparação com a referência. Amostras feitas em triplicata.

[31] A figura 13 mostra o crescimento de uma cepa Debaryomyces hansenii (cepa 1 ou cepa 2) em uma fase aquosa filtrada com um filtro de 0,2 m (aq estéril), preferivelmente uma fase aquosa de leite fermentado, com diferentes concentrações de EDTA, com e sem outros removedores de manganês, preferivelmente removedor de manganês 1, e com e sem 0,6 ppm de manganês. A absorvância a 600 nm foi medida após 7 dias de incubação a 17 ° C, em comparação com a referência. Amostras feitas em triplicata.

[32] A figura 14 mostra o crescimento de uma cepa Debaryomyces hansenii (cepa 1 ou cepa 2) em iogurte com e sem diferentes removedores de manganês, tais como bactérias, preferivelmente bactérias de ácido láctico, e / ou um material quelante químico, como EDTA, após adição de 6 ppm de manganês. A concentração de EDTA varia de 14 mg / ml (linha superior), 7,10 mg / ml, 3,55 mg / ml, 1,78 mg / ml, 0,89 mg / ml, 0,44 mg / ml, 0,22 mg / ml a 0 mg / ml ( linha inferior).

[33] DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[34] A perda de alimentos é uma grande preocupação em todo o mundo - aproximadamente um terço de todos os alimentos produzidos para consumo humano são perdidos ou desperdiçados. As razões para essa enorme perda global de alimentos são diversas, mas a deterioração microbiana que afeta a qualidade do produto organoléptico (aspecto, textura, sabor e aroma) desempenha um papel importante. Como os fungos podem crescer em ambientes diferentes e até mesmo hostis, eles são os principais microrganismos destruidores encontrados em todos os estágios da cadeia do processo alimentar. Portanto, é crucial reduzir as perdas de alimentos controlando a contaminação por fungos.

[35] Em resposta a essa demanda, a presente invenção fornece um novo método para inibir ou retardar o crescimento de fungos em um produto. O método é baseado na descoberta surpreendente de que baixas concentrações de manganês livre podem servir como fator limitante para o crescimento de leveduras e / ou fungos. O manganês está presente em pequenas quantidades na natureza e em muitos de nossos bens de consumo. No entanto, ainda não houve nenhum relatório sugerindo que, manipulando a concentração de manganês livre, a deterioração microbiana possa ser gerenciada de forma eficaz. Com base nesta descoberta inesperada, prevê-se que tal estratégia de prevenção à deterioração seja aplicável não somente a produtos alimentícios e mas que se estenda a outros produtos que geralmente são propensos a contaminação microbiana, tais como produtos para rações, produtos biológicos, produtos de saúde, produtos farmacêuticos e semelhantes.

[36] A presente invenção fornece, em um primeiro aspecto, um método para inibir ou retardar o crescimento de fungos em um produto compreendendo a depleção de manganês livre no referido produto para uma concentração abaixo de cerca de 0,01 ppm.

[37] Em geral, inibição significa uma diminuição, seja parcial ou total, na função e atividade das células ou microorganismos. Tal como aqui utilizado, os termos "inibir" e "inibindo" em relação a leveduras e bolores significam que o crescimento, o número ou a concentração de leveduras e bolores é o mesmo ou reduzido. Isso pode ser medido por quaisquer métodos conhecidos no campo da microbiologia. A inibição pode ser observada comparando o crescimento, número ou concentração de fungos em ou sobre um produto com manganês livre reduzido com um controle. O controle pode ser o mesmo produto, mas sem redução do manganês livre.

[38] O termo “retardar” em geral significa o ato de parar, adiar, dificultar ou fazer com que algo ocorra mais lentamente do que o normal. Conforme usado neste documento, "retardar o crescimento de fungos" refere-se ao ato de adiar o crescimento de fungos. Isso pode ser observado comparando o tempo necessário para os fungos crescerem até um determinado nível em dois produtos, um dos quais com manganês reduzido e o outro sem (mas, de outra forma, o mesmo).

[39] Em algumas modalidades, "retardar o crescimento de fungos" refere-se a retardar em 7 dias, como 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 dias.

[40] Um fungo é um membro pertencente ao reino dos fungos. O crescimento de fungos pode ser medido com vários métodos conhecidos por um versado na técnica. Por exemplo, o crescimento do fungo pode ser medido pela densidade ou tamanho da colônia, número de células, mudanças na massa micelial, produção de esporos, crescimento de hifas, unidades formadoras de colônias (CFU) e semelhantes, dependendo do tipo de fungo e do produto ao qual o método é aplicado. O crescimento fúngico também pode ser observado medindo a mudança nas concentrações de nutrientes ou metabólitos, tais como liberação de dióxido de carbono e consumo de oxigênio. Os termos "inibição do crescimento fúngico " ou "inibição do crescimento de fungos" se referem à inibição da proliferação de células fúngicas. Os termos “retardamento do crescimento fúngico” ou “retardamento do crescimento de fungos” se referem ao abrandamento da proliferação das células fúngicas. Isso pode ser observado, por exemplo, medindo o crescimento fúngico e comparando-o com um controle. Tal controle pode ser, por exemplo, um produto sem removedores de manganês aplicados. Métodos para determinar a inibição ou retardamento do crescimento fúngico são conhecidos por um versado na técnica.

[41] "Manganês livre" ou às vezes "manganês" de acordo com a presente invenção se refere ao manganês que está presente em um produto (ou seja, formando parte do produto, estando dentro do produto ou na superfície de um produto) que está disponível para ser absorvido por fungos, incluindo leveduras e bolores. Por exemplo, manganês livre se refere ao manganês que está presente na matriz alimentar do produto.

[42] Em uma modalidade preferida, a presente invenção é direcionada a um método de inibição ou retardamento do crescimento de fungos em um produto alimentício, compreendendo a redução da concentração de manganês livre em uma matriz alimentar do produto alimentício. Conforme usado neste documento, o termo "matriz alimentar" se refere à composição e estrutura do alimento. Ele é baseado no conceito de que os nutrientes estão contidos em um meio contínuo.

[43] O termo "reduzir" ou "reduzindo" geralmente significa diminuir a quantidade de uma substância em um determinado contexto. Tal como aqui utilizado, o termo "para reduzir o manganês livre" ou "reduzindo o manganês livre" significa reduzir a quantidade de manganês presente em um produto que está disponível para ser absorvido por fungos, incluindo leveduras e bolores.

[44] Por exemplo, isso pode ser realizado removendo o manganês presente no produto ou em um material que vai se tornar parte do produto. Por exemplo, isso pode ser realizado submetendo a cromatografia de troca iônica de matéria-prima para remover o manganês de modo que a concentração no produto final seja reduzida.

[45] Uma vez tendo acesso, os fungos colonizam rapidamente, aumentam em população e absorvem nutrientes de seus arredores imediatos. Em algumas modalidades, dado que os fungos podem primeiramente entrar em contato com um produto na superfície, está dentro do espírito da presente invenção que a etapa de redução seja realizada em partes do produto, por exemplo, na parte externa do produto, como o revestimento ou uma camada externa. Em tais casos, a etapa de redução, no entanto, leva a uma diminuição geral na concentração no produto.

[46] A concentração de manganês ou nível de manganês, conforme usado aqui, é expresso em partes por milhão ("ppm") calculado com base em peso / peso. A redução do manganês livre em um produto para uma concentração abaixo de um valor significa reduzir o manganês livre no produto ou partes dele, de modo que a concentração de manganês livre em todo o produto em peso seja reduzida. Os métodos de determinação de oligoelementos, como manganês, são conhecidos no estado da técnica e descritos, por exemplo, em Nielsen, S. Suzanne, ed. Food analysis. Vol. 86. Gaithersburg, MD: Aspen Publishers, 1998.

[47] Ao aplicar os presentes métodos, um versado na técnica poderá primeiramente determinar o nível de manganês que está presente nos produtos a serem tratados. A concentração de manganês para produtos alimentícios é bem estudada e pode ser encontrada em bancos de dados nacionais de composição de alimentos, tais como o Danish Food Composition Databank e o Canadian Nutrient Files. Em geral, o manganês está presente em uma concentração de pelo menos 0,03 ppm para o leite, tornando os laticínios suscetíveis à contaminação por fungos. Os níveis de manganês variam de 0,04 a 0,1 ppm no leite de vaca e até 0,18 ppm no leite de cabra ou ovelha (Muehlhoff et al. Milk and dairy products in human nutrition. Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO) , 2013). Quanto aos produtos lácteos fermentados, como o queijo, o nível de manganês geralmente aumenta devido ao processo de concentração do leite, muitas vezes até 10 vezes ou mais. Diferentes níveis foram relatados para vários tipos de queijos, por exemplo cerca de 0,06 ppm para queijo ricota, 0,11 ppm para queijo cremoso, 0,34 ppm para queijo tipo brie, 0,3 ppm para queijo mussarela, 0,7 ppm para queijo tipo cottage, 0,68 ppm para queijo tipo gouda e 0,74 ppm para queijo tipo cheddar (Smit, LE, et al. The nutritional content of South African cheeses. ARC-Animal Improvement Institute, 1998; Gebhardt, Susan, et al. “ USDA national nutrient database for standard reference, release 12"

Departamento de Estados Unidos da América Agricultura, Serviço de Pesquisa Agrícola, 1998).

[48] O manganês livre em um produto é preferivelmente reduzido a uma concentração abaixo de cerca de 0,01 ppm, tal como abaixo de cerca de 0,009 ppm, abaixo de cerca de 0,008 ppm, abaixo de cerca de 0,007 ppm, abaixo de cerca de 0,006 ppm, abaixo de cerca de 0,005 ppm, abaixo de cerca de 0,004 ppm , abaixo de cerca de 0,003 ppm, abaixo de cerca de 0,002 ppm, abaixo de cerca de 0,001 ppm, abaixo de cerca de 0,0009 ppm, abaixo de cerca de 0,0008 ppm, abaixo de cerca de 0,0007 ppm, abaixo de cerca de 0,0006 ppm, abaixo de cerca de 0,0005 ppm, abaixo de cerca de 0,0004 ppm, abaixo de cerca de 0,0003 ppm ou menos.

[49] Conforme usado neste documento, o termo "cerca de" indica que os valores estão ligeiramente fora dos valores citados, ou seja, mais ou menos 0,1% a 10%. Portanto, as concentrações ligeiramente fora das faixas citadas também são abrangidas pelo escopo das presentes invenções.

[50] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para inibição ou retardamento do crescimento de fungos em um produto, preferivelmente um produto alimentício, compreendendo as etapas de

[51] redução do manganês livre no produto, e

[52] obtenção do produto em que a concentração de manganês livre está abaixo de cerca de 0,01 ppm no produto.

[53] O presente método compreende ainda a etapa de medição da concentração de manganês livre. Isso pode ser realizado após a etapa de redução para determinar se a concentração de manganês livre foi reduzida. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para inibição do crescimento retardado de fungos em um produto alimentício, compreendendo a redução do manganês livre no produto para uma concentração abaixo de cerca de 0,01 ppm no produto e medição do manganês livre no produto, e, opcionalmente, obter um valor abaixo de 0,01 ppm.

[54] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para inibição ou retardamento do crescimento de fungos em um produto, compreendendo as etapas de

[55] redução do manganês livre no produto a uma concentração abaixo de cerca de 0,01 ppm no produto,

[56] medição da concentração de manganês livre no produto e obtenção de um valor abaixo de 0,01 ppm.

[57] Métodos de medição de manganês em baixa concentração são bem conhecidos por um versado na técnica. Tais métodos incluem espectroscopia de absorção atômica, espectroscopia de emissão atômica, espectrometria de massa, análise de ativação de nêutrons e fluorimetria de raios-X (ver, por exemplo, Williams et al. "Toxicological profile for manganese." (2012)).

[58] Preferivelmente, a concentração de manganês é medida de acordo com o procedimento padrão, conforme descrito em "Alimentos - Determinação de oligoelementos - Digestão por pressão" na Norma Europeia EN13805: 2014 publicada pelo Comitê Europeu de Padronização ou conforme descrito em " Foodstuffs - Determination of trace elements - Pressure digestion ” na Norma Europeia EN13805: 2014 publicada pelo Comitê Europeu de Padronização ou conforme descrito em "Water quality - Determination of selected elements by inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES)" na ISO 11885: 2007 publicada pela Organização Internacional de Padronização

[59] Fungo

[60] Os inventores da presente invenção descobriram surpreendentemente que tanto a levedura quanto o bolor podem ser inibidos pela depleção de manganês. Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece um método para inibição ou retardamento do crescimento de levedura em um produto, preferivelmente um produto alimentício, compreendendo a etapa de redução do manganês livre no produto. Em outra modalidade preferida, a presente invenção fornece um método para inibição ou retardamento do crescimento de fungos em um produto,

preferivelmente um produto alimentício, compreendendo a etapa de manganês livre no produto.

[61] Em uma modalidade, o método é usado para inibição do crescimento de levedura, tais como Candida spp., Meyerozyma spp., Kluyveromyces spp., Pichia spp., Galactomyces spp., Trichosporon spp., Sporidiobolus spp., Torulaspora spp., Cryptococcus spp., Sacharomyces spp., Yarrowia spp., Debaryomyces spp., e Rhodoturola spp. Preferivelmente, o fungo é uma levedura selecionada a partir do grupo que consiste em Torulaspora spp., Cryptococcus spp., Sacharomyces spp., Yarrowia spp., Debaryomyces spp., Candida spp. e Rhodoturola spp. Mais preferivelmente, o fungo é uma levedura selecionada do grupo que consiste em Torulaspora delbrueckii, Cryptococcus fragicola, Sacharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii e Rhodoturola mucilaginosa.

[62] Em uma modalidade, o método é usado para inibição do crescimento de fungos. preferivelmente, o fungo é um bolor selecionado do grupo que consiste em Aspergillus spp., Cladosporium spp., Didymella spp. ou Penicillium spp. Mais preferiencialmente, o fungo é um boloro selecionado do grupo que consiste em Penicillium brevicompactum, Penicillium crustosum, Penicillium solitum, Penicillium carneum, Penicillium paneum, e Penicillium roqueforti.

[63] Remoção de Manganês

[64] Métodos de remoção de manganês são conhecidos no estado da técnica. O manganês é um contaminante comum em muitas águas de minas, águas subterrâneas e águas doces. No tratamento de águas residuais, os íons de manganês podem ser removidos quimicamente dos efluentes por oxidação a MnO2, adsorção ou precipitação como um carbonato.

[65] Alternativamente, a remoção do manganês pode envolver processos biológicos como alternativas às rotas químicas. O papel da atividade microbiana na recuperação de águas contaminadas com manganês foi descrito em várias literaturas, e. Burger et al. Rapid manganese removal from mine waters using an aerated packed-bed bioreactor. Water Research. 2008; 42 (19): 4733–4742; Johnson et al. Remoção rápida de manganês das águas da mina usando um biorreator aerado de leito compactado. Journal of Environmental Quality. 2005;34(3):987– 993; Tekerlekopoulou et al. "Removal of ammonium, iron and manganese from potable water in biofiltration units: a review." Journal of Chemical Technology and Biotechnology 88.5 (2013): 751-773; Patil et al. “A review of technologies for manganese removal from wastewaters." Journal of Environmental Chemical Engineering 4.1 (2016): 468-487. Em uma modalidade, a etapa de redução do manganês livre no produto compreende o uso de cromatografia de troca iônica. Isto é especialmente aplicável se o produto for líquido ou substancialmente líquido.

[66] Em uma modalidade preferida, a etapa de redução do manganês livre no produto é realizada pela adição de um agente removedor de manganês. Tal como aqui utilizado, os termos "agente removedor de manganês" ou "removedor de manganês" se referem a um material que é capaz de tornar o manganês indisponível para levedura ou bolor. O material pode ser um material químico, tal como um material quelante químico selecionado do grupo que consiste em ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), etilenoglicol-bis (éter β- aminoetil) -N, N, N ′, ácido N′-tetraacético (EGTA), ácido diaminociclohexanotetraacético (DCTA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido 1-2-bis(o-aminofenoxi) etano-N, N, N ', N' - tetraacético (BAPTA) ou ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA), preferivelmente o material quelante químico é o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). O material também pode ser um material biológico, como bactérias.

[67] Em algumas modalidades preferidas, o agente removedor de manganês é uma ou mais cepas de bactérias. Nesses casos, deve-se notar que, ao medir o manganês livre, esse manganês livre não inclui o manganês que se encontra intracelularmente. Antes, manganês livre se refere ao manganês que é encontrado extracelularmente, isto é, nas partes livres de células do produto, uma vez que estariam disponíveis para serem absorvidos por fungos. Assim, em tais casos, a concentração de manganês livre deve ser medida levando-se em consideração apenas o manganês extracelular. Isto pode ser feito, por exemplo, removendo células (como culturas iniciais) por centrifugação e obtendo o sobrenadante livre de células, seguido pela medição do manganês no sobrenadante livre de células. Conforme usado neste documento, o termo "cepa de bactéria" tem seu significado comum no campo da microbiologia e se refere a uma variante genética de uma bactéria.

[68] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para inibição ou retardamento do crescimento de fungos em um produto, compreendendo as etapas de

[69] seleção de uma ou mais cepas de bactérias como um agente removedor de manganês, e

[70] redução do manganês livre no produto a uma concentração abaixo de cerca de 0,03 ppm no produto pela adição do agente removedor de manganês.

[71] De acordo com modalidades preferidas da presente invenção, o método compreende a seleção de uma cepa de bactéria com atividades de captação de manganês como um agente removedor de manganês. A seleção é baseada em se a cepa de bactéria tem sistemas de transporte de manganês.

[72] O manganês está envolvido em muitos processos biológicos cruciais e é encontrado de forma ubíqua em todos os organismos. O manganês também contribui para a proteção contra o estresse oxidativo e também pode contribuir para a desintoxicação catalítica de espécies reativas de oxigênio. Muitas bactérias desenvolveram um sistema de aquisição sofisticado para eliminar metais essenciais do meio ambiente, usando sistemas de transporte de baixa e alta afinidade para metais quelados ou livres. O manganês, que é absorvido pelas bactérias, forma um grande complexo de agregados polifosfato- proteína não dialisáveis na proteína, que podem atingir concentrações intracelulares muito altas.

[73] Os sistemas de transporte de manganês foram estudados e são, por exemplo, descritos em Kehres et al., "Emerging themes in manganese transport, biochemistry and pathogenesis in bactéria." FEMS microbiology reviews 27.2-3 (2003): 263-290.

[74] Em uma modalidade, uma cepa de bactéria com atividades de absorção de manganês compreende transportadores de Mn2+ bacterianos. Os transportadores de Mn2+ podem ser um transportador ABC (por exemplo, SitABCD e YfeABCD) ou um sistema de transporte relacionado a Nramp dependente de prótons pertencente à família designada como TC # 3.A.1.15 e TC # 2.A.55 no sistema de classificação do transportador fornecido pelo Banco de dados de Classificação de Transporte (M. Saier; U of CA, San Diego, Saier MH, Reddy VS, Tamang DG, Vastermark A. (2014)). O sistema TC é um sistema de classificação para proteínas de transporte que é análogo ao sistema da Comissão de Enzimas (EC) para classificação de enzimas. O sistema de classificação do transportador (TC) é um sistema aprovado de nomenclatura para classificação de proteínas de transporte pela União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular.

[75] TCDB é acessível gratuitamente pelo site http://www.tcdb.org que fornece vários métodos diferentes para acessar os dados, incluindo acesso passo a passo para classificação hierárquica, pesquisa direta por sequência ou número TC e pesquisa de texto completo.

[76] Em uma modalidade, o método compreende a seleção de uma cepa de bactéria que compreende uma proteína pertencente à família designada como TC # 3.A.1.15 (família do transportador de captação de quelato de manganês (MZT)) como agente removedor de manganês.

[77] Por exemplo, o agente removedor de manganês é uma cepa de bactéria que compreende um transportador de captação de quelato de manganês designado como TC # 3.A.1.15.2, TC #

3.A.1.15.6, TC # 3.A.1.15. 8, TC # 3.A.1.15.14 ou variantes funcionais dos mesmos.

[78] Enquanto o transportador ABC é principalmente ativo em pH mais alto, os transportadores acionados por prótons podem ser mais ativos em condições ácidas. Isso os torna particularmente úteis como agentes removedores de manganês em produtos alimentícios fermentados. Assim, em uma modalidade, uma cepa de bactéria que compreende uma proteína pertencente à família designada como TC # 2.A.55 (a família do transportador de íon metálico (Mn2+ -fer) (Nramp)) é selecionada.

[79] A etapa de seleção de uma ou mais cepas de bactérias como agente removedor de manganês compreende determinação se uma ou mais cepas de bactérias compreendem um transportador de manganês designado como TC # 2.A.55 ou suas variantes funcionais.

[80] Mais preferivelmente, o transportador pertence à subfamília designada como TC # 2.A.55.2 ou à subfamília designada como TC # 2.A.55.3, como agente removedor de manganês.

[81] Por exemplo, o agente removedor de manganês é uma cepa de bactéria que compreende um transportador de íon metálico (Mn2+ -fer) (Nramp) designado como TC # 2.A.55.3.1, TC #

2.A.55.3.2, TC # 2.A.55.3.2, TC # 2.A.55.3.3, TC # 2.A.55.3.4, TC # 2.A.55.3.5, TC # 2.A.55.3.6, TC # 2.A.55.3.7, TC #

2.A.55.3.8 ou TC # 2.A.55.3.9 ou suas variantes funcionais como agente removedor de manganês.

[82] Mais preferivelmente, o método compreende a seleção de uma cepa de bactéria compreendendo uma proteína designada como TC # 2.A.55.2.6 ou suas variantes funcionais como agente removedor de manganês.

[83] Preferivelmente, o agente removedor de manganês é selecionado a partir do grupo que consiste em Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus. reuteri, Lactobacillus sakei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus alimentarius, Pediococcus acidilactici, Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus kefiri.

[84] O termo "variante funcional" é uma variante de proteína com uma atividade biológica substancialmente semelhante, ou seja, atividades de absorção de manganês.

[85] Como usado aqui, uma "variante" se refere a uma forma variante de uma proteína que compartilha pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um ácido nucleico particular ou sequência de aminoácidos da proteína.

[86] A invenção fornece adicionalmente sequências polipeptídicas de transportadores de manganês para selecionar removedores de manganês adequados para realização da presente invenção.

[87] Em uma modalidade preferida, um agente removedor de manganês é uma cepa de bactéria que compreende um polipeptídeo com a sequência de SEQ ID NO: 1(MASEDKKSKREHIIHFEDTPSKSLDEVNGSVEVPHNAGFWKTLAAYTGPGILVAVGYMDPGN

WITSIAGGASFKYSLLSVILISSLIAMLLQAMAARLGIVTGRDLAQMTRDHTSKAMGGFLWVIT ELAIMATDIAEIIGSAIALKLLFNMPLIVGIIITTADVLILLLLMRLGFRKIEAVVATLVLVIL LVFAYEVILAQPNVPELLKGYLPHADIVTNKSMLYLSLGIVGATVMPHDLFLGSSISQTRKIDR TKHEEVKKAIKFSTIDSNLQLTMAFIVNSLLLILGAALFFGTSSSVGRFVDLFNALSNSQIVGA IASPMLSMLFAVALLASGQSSTITGTLAGQIIMEGFIHLKMPLWAQRLLTRLMSVTPVLIFAIY

YHGNEAKIENLLTFSQVFLSIALPFAVIPLVLYTSDKKIMGEFANRAWVKWTAWFISGVLIILN LYLIAQTLGFVK) ou suas variantes funcionais.

[88] Em outras modalidades preferidas, um agente removedor de manganês é uma cepa de bactéria que compreende um polipeptídeo com pelo menos 55%, tal como pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 1.

[89] A tabela 1 mostra sequências exemplificativas que codificam variantes funcionais de SEQ ID NO: 1 e sua identidade de sequência com SEQ ID NO: 1.

[90] Tabela 1 SEQ % de Origem ID Proteína ID ident Sequência NO idade Lactobacil WP_01324530 MASEDKKSKREHIIHFEDTPSKSLDEVNGSV 4 99.8 lus casei 8.1 EVPHNAGFWKTLAAYTVPGILVAVGYMDPGN

WITSIAGGASFKYSLLSVILISSLIAMLLQA MAARLGIVTGRDLAQMTRDHTSKAMGGFLWV ITELAIMATDIAEIIGSAIALKLLFNMPLIV GIIITTADVLILLLLMRLGFRKIEAVVATLV LVILLVFAYEVILAQPNVPELLKGYLPHADI VTNKSMLYLSLGIVGATVMPHDLFLGSSISQ TRKIDRTKHEEVKKAIKFSTIDSNLQLTMAF IVNSLLLILGAALFFGTSSSVGRFVDLFNAL SNSQIVGAIASPMLSMLFAVALLASGQSSTI TGTLAGQIIMEGFIHLKMPLWAQRLLTRLMS VTPVLIFAIYYHGNEAKIENLLTFSQVFLSI ALPFAVIPLVLYTSDKKIMGEFANRAWVKWT AWFISGVLIILNLYLIAQTLGFVK MKNHETDTKTKHHMIESTGSGQKSLDEVNGT VEVPQNAGFWRTLMAYTGPGALIAVGYMDPG NWITSIAGGAQYKYTLLTVVLLSSLVAMLLQ AMSARLGIVTGKDLAQLTREHTGKRTGFALW IITELAIMATDIAEIIGSAIALKLLFGFPLI VGIIITAMDVLVLLVLMKLGFRKIEAIVATL

VAVILFVFLYEVILAQPHMGEVLKGYLPSST Lactobacil WP_01166712 5 76.5 VVTNHGMLYLSLGIVGATVMPHDLYLGSSIS lus brevis 5.1

QTRSFDRKNRKSVAQAIKFTTIDSNIQLTLA FVVNSLLLILGAALFFGTNSDLGRFVDLFNA LSDSQIVGAIASPMLSMLFALALLSSGQSST ITGTLAGQIIMEGFINLKMPLWAQRLITRLL SVTPVIIFAIIYHGNEAKIEDLLTFSQVFLS IALPFAMIPLVIFTSSKKLMGEFANRTWSKI LGWIIAVILIILNIYLILNTLHIVQ MSKKLDEVDNKSLDEINGSIKVPKNAGFFKT LMAYTGPGILIAVGYMDPGNWITSIAGGAQF KYTLLSVVLISSLIAMLLQAMSARLGIVTGK DLAQLTRERTSKRVGFMLWVVAELAIMATDI AEIIGSGIALELLFHIPLIIGILITAADVLI

LLLLMRLGFRKIEAIVATLVMVILIVFAYEV Pediococcu

FLSDPSISGIIKGYVPAPVILQNNSMLYLSL s WP_07036643 6 76.4 GIVGATVMPHDLYLGSSISQTREIDRRDRKN acidilacti 5.1

VAQAIRFSTIDSNMQLFLAFIVNSLLLILGA ci

ALFYGTDSSLGRFVDLFNALSDNQIVGAIAS PMLSMLFAVALLASGQSSTITGTLSGQIIME GFIRLRVPLWVQRLVTRLLSVAPVLIFAIYY HGDEAKIENLLTFSQVFLSVALPFAVIPLVM YTSSKKLMGEFANRQWVKWCAWIATIILILL NIYLILQTLGIVK MKSAKTKDHAKMKAAEEKAIHSTGADSKSLD EVNGSVRVPKDASFWRTLIAYTGPGALVAVG YMDPGNWITSIAGGSQYKYALLSVILLSSLI AMLLQAMAARLGIVTGKDLAQLTRERTSKGM GIFLWIITELAIMATDVAEIIGSGIALKLLF

GFPLIVGILITTADVLILLLLMKLGFRKIEA Lactobacil YP_00488831 IVATLVAVILFVFLYEVIISQPNIPEMLKGY lus 7 74.3

6.1 VPTSRIVSNRSMLFLALGIVGATVMPHNLYL plantarum

GSSISQTRQVDRSDEKEVAKAVKFTTIDSNI QLSVAFVVNSLLLILGAALFFGTKGDLGRFV DLYNALGDSKVVGSIASPLLSMLFAIALLSS GQSSTITGTLSGQIIMEGFIRLKMPLWAQRL LTRLISVTPVLAFAIYYHGNEAKIEDLLTMS QVFLSIALPFAMIPLVMFTSNRALMGNFTNR VWVKWTAWIVTVILIILNIYLILQTVGLVK MHYADGSSLEEINNTVAIPKNAGFWKTLMAF MGPGALVAVGYMDPGNWITSIAGGAQFAYTL ISVILVSNLIAMLLQAMAARLGIVTGMDLAQ MTRAKTGKKMGIFLWIVTELAIMATDIAEII GSAIALELIFNIPLLWGVLITAFDVLLLLLL MKLGFRKIEAIVATLVAVILFVFLYEVILAQ

PNMGDVVRGFVPSPRIMTDKKMLFLALGIVG Lactobacil WP_08953516 8 67.9 ATVMPHNLYLHSSIAQARQYDRDDVAEKRKA lus sakei 1.1

IKFTVIDSNIQLTIAFVVNCLLLILGAAMFY GTNSDLGRFVDLFNALQNKEIVGSIASPMLS LLFAVALLASGQNSTITGTLSGQIVMEGFVR MKIPLWARRVITRGLSILPVIIFTVYYHGNE AQVENLLIYSQVFLSIALPVSMIPLTLFTSD EKIMGPFVNRPWVKYTAWFVTIVLTLLNIYL ILQTVGLAA MSSKNKKHESLIHYANGPSLEEINDTVEIPK DAGFFKTLLAYSGPGALVAVGYMDPGNWVTS IAGGAQFKYKLLSVILISSLIAMLLQYMSAK LGIVTGRDLAQLTRDRTSRVGGFILWIITEL AIMATDIAEIIGSAIALKLLFNIPVLWGVII

TAFDVLLLLVLMKLGFRKIEAIVATLIMVIL Lactobacil

LVFLYEVILAKPDVGQMMVGFIPEPKILQNQ lus WP_05773711 9 68.3 SMLYLSLGIVGATVMPHNLYLHSSISQARKY alimentari 3.1

DRDDPKSIHQAVRFSTWDSNIQLTLAFVVNT us

LLLLLGAALFYGTSSDLGRFVDLFNALQDPK VAGAVASPVLSILFAVALLASGQNSTITGTL SGQIVMEGFIHMKMKLWARRVITRLMSIIPV ITFAIIYHGNEAKIESLLTFSQVFLSVALPF SIFPLIKFTSNKKLMGEFVNNKLVEYIGYFV AIVLTILNIWLIYTTFVPTA MTKEETKLFHYADGPSLEEINGTVAVPKKGG FWKTLFAFSGPGALVAVGYMDPGNWVTSIAG GAQYQYTLLSVILISSLIAMLLQAMSARLGI ASGLDLAQATAKHSPKWLRYTLWIITELAIM ATDIAEIVGAAIALKLLFNLPLIVGIFLTTL

DVMLLLLLMKLGFRKIEAIVGALIVSILVIF Lactobacil LYEVILARPDVGAMFAGYIPQPEVVTNKGAF WP_05697401 lus 10 65.1 YIALGIVGATVMPHNLYLHSSIAQARQYDRN

5.1 floricola DIEEKKRAIKFTVLDSNIQLSVAFVVNTLLL

LLGAALFYGAQTDLGTFSELYNALQNPQVAG VIASPILSVLFAVALLASGQNSTITGTLSGQ IVMEGFIHLKMPMWARRVITRLISVIPVLIF AIIYHSNEAKIEDLLVFSQVFLSIALPVSII PLVMFTANKKIMGPFVNKKWVTITSSLVAII LTGLNIFLILQTLGWVQ MTDNVSAKSVQGDLTNGPSLAEINGSVRVPK EKGFVRNLLAFSGPGALVAVGYMDPGNWV TSIGGGAQYGYLLMSVILMSSLIAMLLQYMA AKLGIVTQMDLARATRAHTGKRIGAVLWV

MTELAIMATDIAEVIGGAIALKLLFGVPLIL Lactobacil WP_01166739 11 57.6 GVSLTVLDVLLLLLLTRLGFRKIEAIVLC lus brevis 6.1

LILVILVVFAYEVVIAQPSMGQAVASFVPQA EIMRPGQLTMALGIVGATVMPHNLYLHSS IAQTRKFDRQDPAEMARAVKFTAWDSNIQLF GAFIINCLLLLLGAAMFFGKDAGALGTFG QLYDALQDNRLAGAVASPVLSTLFAVALLAS GQNSTITGTLTGQVIMEGFINMRLPIWVR RLVTRLISVAPVIIVTILYGGSEQALDRLLV NSQVFLSIALPFSMIPLTIFTSSKRIMGT RWVNRWWVTALAWGCTAILTVLNIQIVWATM TTLF

[91] Em uma modalidade preferida, um agente removedor de manganês é uma cepa de bactéria que compreende um polipeptídeo com a sequência de SEQ ID NO: 2 (MARPDERLTVQREKRSLDDINRSVQVPSVYESSFFQKFLAYSGPGALVAVGYMDPGNWLTALE

GGSRYHYALLSVLLMSILVAMFMQTLAIKLGVVARLDLAQAIAAFIPNWSRICLWLINEAAMMA TDMTGVVGTAIALKLLFGLPLMWGMLLTIADVLVVLLFLRFGIRRIELIVLVSILTVGIIFGIE VARADPSIGGIAGGFVPHTDILTNHGMLLLSLGIMGATIMPHNIYLHSSLAQSRKYDEHIPAQV TEALRFGKWDSNVHLVAAFLINALLLILGAALFYGVGGHVTAFQGAYNGLKNPMIVGGLASPLM STLFAFALLITGLISSIASTLAGQIVMEGYLNIRMPLWERRLLTRLVTLIPIMVIGFMIGFSEH

NFEQVIVYAQVSLSIALPFTLFPLVALTNRRDLMGIHVNSQLVRWVGYFLTGVITVLNIQLAIS VFV) ou suas variantes funcionais.

[92] Em outras modalidades preferidas, um agente removedor de manganês é uma cepa de bactéria que compreende um polipeptídeo com pelo menos 55%, tal como pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 2.

[93] A tabela 2 mostra sequências exemplificativas que codificam variantes funcionais de SEQ ID NO: 2 e sua identidade de sequência com SEQ ID NO: 2.

[94] Tabela 2 SEQ % de Proteína Origem ID ident Sequência

ID NO idade

MARPDERLTVQREKRSLDDINRSVQVPSVYES SFFQKFLAYSGPGALVAVGYMDPGNWLTALEG GSRYHYALLSVLLMSILVAMFMQTLAIKLGVV ARLDLAQAIAAFIPHWSRICLWLINEAAMMAT DMTGVVGTAIALKLLFGLPLMWGMLLTIADVL VVLLFLRFGIRRVELIVLVSILTVGIIFGIEV

ARADPSIGGIAGGFVPHTDILTNHGMLLLSLG Lactobacil WP_0124917 12 99.3 IMGATIMPHNIYLHSSLAQSRKYDEHIPAQVT lus casei 67.1

EALRFGKWDSNVHLVAAFLINALLLILGAALF YGVGGHVTAFQGVYNGLKNPMIVGGLASPLMS TLFAFALLITGLISSIASTLAGQIVMEGYLNI RMPLWERRLLTRLVTLIPIMVIGFMIGFSEHN FEQVIVYAQVSLSIALPFTLFPLVALTNRRDL MGIHVNSQLVRWVGYFLTGVITVLNIQLAISV FV MTKRNEQLSVQQAKPSLDEINRSVQVPGVYEP SFVQKFLAYSGPGALVAVGYMDPGNWLTALEG GSRYHETLLAVLLLSILAAMFMQTLAIKLGVV ARLDLAQAIAAFVPKWSRIGLWLVNEAAMMAT DMTGVVGTAIALKLLFGLPLMWGMLLTIADVL

VVLMFLRFGIRRIELIVLASILTVGIIFGIEV Lactobacil VRARPSMGGIVAGLVPHTEILTNRGMLLLSLG WP_0057128 lus 13 85.6 IMGATIMPHNIYLHSSLAQSRRYDEHIPAQVT

42.1 rhamnosus EALRFGKWDSNVHLVAAFIINALLLILGATLF

YGMSSHATAFEGVYNGLKNPAIVGGLASPLMS TLFAFALLITGLISSIASTLAGQIVMEGYLNI QIPLWARRLLTRLVTLIPIMIIGFVMGFSEQH FEQVIVYAQVALSIALPFTLFPLVALTDRRDL MGQHVNSPVVRWMGYVLTGIITLLNVQLILSV ILP MSQEPTHKSLDEINQSVEVPSVYETSFLQKFL AYSGPGALVAVGYMDPGNWLTSLSGGSQFRYA LLSVLLMSILVAMFMQTLSIKLGVVARLDLAQ AIAQKVPKSGRYTLWIINELAMMATDMTGVVG TAIALKLLFGLPLVYGILLTIFDVLLVLLFLR

FGIRRIEFIVLAAILIVGVIFGIEVTRATPNI Lactobacil WP_0547687 VEIAGGLIPTTHIVTNHEMLIMSLGIVGATIM 14 72.4 lus kefiri 93.1 PHNVYLHSSLAQSRRYDYHNPKQVNEALRFAK

WDSNVHLVAAFLINALLLVLGGTLFFHTNSHF SAFQDVYNGLKSSAIVGSLASPLMSTLFAFAL LITGMISSITSTLSGQIVMEGYLHIRLPLWER RLLTRFVTLIPILAIGFLVGFNDHDFEEIIVY AQIALSIALPFTLFPMVALTSNHDLMGVHTNR RYVTVIGYLLTSIITILNLQFVLASI MPNKKSLDEINESVKVPSVYDTSFLQKFLAYS GPGALVAVGYMDPGNWLTSLSGGSQYRYDLLS VLLISILVAMFMQTLSIKLGVVARLDLAQAIA TKVSKPIRYFLWILNEIAMMATDLTGVIGTAI

ALKLLFNLPLVFGILLTVFDVLIVLIFLRFGI Lactobacil RRIEFIVLAAILTVGIIFGIEVFRAQPKLFSI lus WP_0577389 ISGVIPSTDLFTNHRKLVLSLGIVGATIMPHN 15 68.7 alimentari 92.1 IYLHSSLAQSRRYDHNDPLQVNEALRFAKWDS us NVHLIAAFIINALLLVLGGTLFYHMTNQLASL

QDVFTGLKSHAIVGTLASPLMSWLFAFALLIT GMISSITSTLSGQIVMEGYLNIRLPLWQRRLL TRFVTLIPILIIGFIVHFNEQDFENLIVYAQI ILSIALPFTLFPMIFLTNDKKIMGNHVNSKLT TTVGIILASAITILNLQLLFSLI MQSHRHQSLEEINQSVAVPDVHQTAFWRKFLA YSGPGALVAVGYMDPGNWLTSLAGGGQFQYRL LAVLALAIIVAMFMQGLAIRLGVVARQDLAQA IASKLPRPVRYAAWILNEVAMMATDMTGVIGT AIALKMLFGLPLLAGILLTIADVLVVLLFLRF

GIRRVEVIVLVAILTVGIIFGIEVGRAHVQFG Lactobacil YP_0048891 NVLLGLVPTPLIVKNHTALVLSLGILGATIMP lus 16 67.4

77.1 HNLYLHSSLAQSRRYDYHNPAQVTEALRFANW plantarum

DSTVHLIAAFLINALLLVLGGTLFFGHTNALA SLQAVFDGLKSTTVVGALASPVMSWLFALALL ITGLISSITSTLAGQIVMEGYLHIRLPLWQRR LLTRAVTLIPILIIGMLVGFSDAAFENLIIYA QVALSIALPFTLLPLVALTNDASLMKAHVNRP AVTWVGYGLAGIITVLNIYLVYSLF MERKSLDEINGSVDVPNVYQSAFWQKFLAYSG PGALVAVGYMDPGNWLTSLAGGSQYRYQLLVV LFTAILIAMYMQSLAIKLGVTTRTDLAQAIAR RLPTPLRIALWLFNEIAMMATDLTGVVGTAVA LNMLFKLPLLIGVLLTIADVLVVLFFLHFGIR

RIEFIVLTAILVVGAIFAIEVCRAHPEFSAIM Lactobacil WP_0036689 DGFVPRSTIFTNHSELLISLGIVGATIMPHNI lus 17 65.8

01.1 YLHSSLAQSRRYDEHDPKQVKETLRFANWDSL reuteri

IHLFAAFIVNALLLILGGTLFFHAASLGSLED VFFGLKNPQIVGSLASPLMSWLFAFALLVTGL ISSITSTLAGQIVMEGFINIRLPLWKRRLLTR AVTLVPILIIGFMINFKEEQFEQLIIYAQIVL SIALPFTLYPLVALTGNKKLMGPHVNSRWQTV LGYILASLVTGLNLLVLV MTEKKSLDEINGSVAVPQYNTSFFRKFLAYSG PGALIAVGYMDPGNWLTSLVGGAHHKYQLLSV LLISILVATFMQSLSIRLGIASRQDLAQAIAK KAKKPVRYCLWIINELAMMATDLTGVIGTALA LNMLFKLPLVFGVLITILDVFLILWFMRFGIR

RIESIVVISILTVGLIFAFEVSHVQPNLTAIF Lactobacil WP_0758872 KGFVPSQTIITNQNKLILSLGIIGATIMPHNI lus 18 61.4

52.1 YLHSALAQSRRYDYHDSRQVREALRFANWDSI crustorum

VHLIAALIINCLLLILGGTIFYDKADQLASLM TVFKGLMNYQVVGSLASSFMSYLFAFALLVTG LISSITSTLSGQIVMEGYLNIRLPLWQRRLLT RIITLIPILVIGFLVHFNEVIFEDLIVYAQIA LSVALPFTLFPLVYLTNNAKIMGKHVNKKWQT ILGFVLALIITILNIVLIATTLSH

[95] Em uma modalidade preferida, um agente removedor de manganês é uma cepa de bactéria que compreende um polipeptídeo com a sequência de SEQ ID NO: 3 (MSDDHKKRHPIKLIQYANGPSLEEINGTVEVPHGKGFWRTLFAYSGPGALVAVGYMDPGNWST

SITGGQNFQYLLISVILMSSLIAMLLQYMAAKLGIVSQMDLAQAIRARTSKKLGIVLWILTELA IMATDIAEVIGAAIALYLLFHIPLVIAVLVTVLDVLVLLLLTKIGFRKIEAIVVALILVILLVF VYQVALSDPNMGALLKGFIPTGETFASSPSINGMSPIQGALGIIGATVMPHNLYLHSAISQTRK IDYKNPDDVAQAVKFSAWDSNIQLSFAFVVNCLLLVMGVAVFKSGAVKDPSFFGLFQALSDSST LSNGVLIAVAKSGILSILFAVALLASGQNSTITGTLTGQVIMEGFVHMKMPLWARRLVTRIISV IPVIVCVMLTARDTPIQQHEALNTLMNNSQVFLAFALPFSMLPLLMFTNSKVEMGDRFKNTGWV

KVLGWISVLGLTGLNLKGLPDSIAGFFGDHPTATQTNMANIIAIVLIVAILALLAWTIWDLYKG NQRYEAHLAAVADEKEAKADVDEQ) ou suas variantes funcionais.

[96] Em outras modalidades preferidas, um agente removedor de manganês é uma cepa de bactéria que compreende um polipeptídeo com pelo menos 55%, tal como pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de SEQ ID NO: 3.

[97] A tabela 3 mostra sequências exemplificativas que codificam variantes funcionais de SEQ ID NO: 3 e sua identidade de sequência com SEQ ID NO: 3.

[98] Tabela 3 SEQ % de Proteína Origem ID ident Sequência

ID NO idade

MSDDHKKRHPIKLIQYANGPSLEEINGTVEVPH GKGFWRTLFAYSGPGALVAVGYMDPGNWSTSIT GGQNFQYLLISVILMSSLIAMLLQYMAAKLGIV SQMDLAQAIRARTSKKLGIVLWILTELAIMATD IAEVIGAAIALYLLFHIPLVIAVLVTVLDVLVL LLLTKIGFRKIEAIVVALILVILLVFVYQVALS DPNMGALLKGFIPTGETFASSPSINGMSPIQGA

LGIIGATVMPHNLYLHSAISQTRKIDHKNPDDV Lactobacil WP_003567 19 99.8 AQAVKFSAWDSNIQLSFAFVVNCLLLVMGVAVF lus casei 390.1

KSGAVKDPSFFGLFQALSDSSTLSNGVLIAVAK SGILSILFAVALLASGQNSTITGTLTGQVIMEG FVHMKMPLWARRLVTRIISVIPVIVCVMLTARD TPIQQHEALNTLMNNSQVFLAFALPFSMLPLLM FTNSKVEMGDRFKNTGWVKVLGWISVLGLTGLN LKGLPDSIAGFFGDHPTATQTNMANIIAIVLIV AILALLAWTIWDLYKGNQRYEAHLAAVADEKEA KADVDEQ MSDDHKKKHSMKLIQYANGPSLEEINGTVEVPH GKGFWRTLFAYSGPGALVAVGYMDPGNWSTSIT GGQNFQYLLISVILMSSLIAMLLQYMAAKLGIV SQMDLAQAIRARTSKKLGIVLWILTELAIMATD IAEVIGAAIALYLLFHIPLVIAVLVTVLDVLVL LLLTKIGFRKIEAIVVALILVILLVFVYQVALS

DPNMGALLKGFIPTGETFASSPSVNGMSPIQGA Lactobacil LGIIGATVMPHNLYLHSAISQTRKIDHKDPEDV WP_005686 lus 20 95 AQAVKFSAWDSNIQLTFAFVVNCLLLVMGVAVF

822.1 rhamnosus KSGAVKDPSFFGLFQALSDSSTLSNGVLIAVAK

SGILSILFAVALLASGQNSTITGTLTGQVIMEG FIHMKMPLWARRLVTRVISVIPVIVCVMLTARE TPIQQHEALNTLMNNSQVFLAFALPFSMLPLLM FTNSKVEMGDRFKNTGWVKVLGWVSVIGLTYLN LKGLPDSIAGFFGDNPTAAQTNIANMIAYVLIA AVLALLAWTIWDLYKGNKRYEAHLEAVADEEEA KANDDVQ MSEKTNTPNRKHKLIEYANGPSLEEINGTIEVP KNLNFWKTLFAYSGPGALVAVGYMDPGNWSTSI TGGQNYQYMLMSVILISSLIAMLLQYMAAKLGI VSQMDLAQAIRARTSKSLGIVLWILTELAIMAT

DIAEVIGAAIALYLLFNIPLVIAVFITVLDVLV Lactobacil YP_004890 LLLLTKIGFRKIEAIVVCLILVILFVFVYQVAL lus 21 76.3

566.1 SNPDWGGVIKGLVPTADTFSTSRSVNGMTPLSG plantarum

ALGIIGATVMPHNLYLHSAISQTRKIDHNDEED VARTVKFAAWDSNIQLSFAFVVNSLLLIMGVAV FKSGAVKDPSFFGLYEALSNTSMLSNGILISVA KSGALSALFAIALLASGQNSTITGTLTGQVIME GFVHMRMPLWLRRLVTRLISVIPVLICVLLTSG KSAIDEHTALNNLMNNSQVFLAFALPFSMLPLL MMTDSAAEMGKRFKNSLWIKGLGWLSVIGLTFL NLLGLPDSILGFFGDNPSAGEQTFSKILAYLLI AAILALLVWTVFDLQRGNKRYVEQQLAAAAKEA NK MSNEIKNPKKRRKLISYANGRSLEEINGTVKVP KNIGFWKTLFMYSGPGALVAVGYMDPGNWSTSI TGGQNFQYMLMSIILISSLIAMLLQYMAAKLGI VSQMDLAQAIRARTSRALGIVLWILTELAIMAT DIAEVIGAAIALYLLFHIPLVVAVFITVFDVLL LLLLTKIGFRKIEAIVVCLIMVILVVFVYQVAL

SHPSWGAVFGGLIPTTKAFATTPTVGGMTPLSG Pediococcu

SLGIIGATVMPHNLYLHSAVSQTRKINHDDEED s WP_065124 22 76.2 VARTVRFSTWDSNIQLSFAFVVNALLLVMGVAV acidilacti 048.1

FKTGAVQDPSFFGLFHALNDTSTLSNGILIGVA ci

KTGILSTLFAVALLASGQNSTITGTLTGQVIME GFVHMRMPLWARRLITRLISVVPVLICVMLTSG KGTIQEHEALNNLMNNSQVFLAFALPFSMVPLL MMTDSRVEMGDRFKNSWIVRILGWISVIFLTYL NLTGLPDSIAAFFGENASAAEISMAHDIAYALI VAVLALLAWTVIELYKGNKRYEIELAEKANAKE AA MVNNENNHKKHKMIQYANGKSLEEANGTVEIPK GKGFWKTLFAYSGPGALVAVGYMDPGNWSTSIT GGQNFQYLLMSVILLSSLIAMLLQYMAAKLGIV SQMDLAQAIRARTSKALGIVLWILTELAIMATD IAEVIGAAIALYLLFDIPLIIAVFITVFDVLLL LLLTKVGFRKIEAIVVCLIFVILFVFVYQVALS

NPDWGGVFKGLIPTSETFAKHPVVHDMSPLNGA Lactobacil YP_535797 LGIIGATVMPHNLYLHSAISQTRKFDRNNEDDI lus 23 72.7 .1 ANAVRFTAWDSNIQLGLAFVVNSLLLIMGVAVF salivarius

KSGAVEDPSFFGLYQALSDTSVMSNGLLAAAAR TGILSTLFAVALLASGQNSTITGTLTGQVIMEG FIHLRMPLWARRLITRLLSVIPVLICVALTSGK STIEEHEALNNLMNNSQVFLAFALPFSMLPLVI MTGSKVEMGERFKNRLWINILGWISVISLTYLN MIGLPQNLEPFFPADKVGLAHTVAYILIVLIIA LLIWTLVELHLGNKRFAAEQAKKHNK MDNTKNQHRKLRLIEHANGKSLEEINGTVEVPH GKGFFRTLFAYSGPGALVAVGYMDPGNWSTSIT GGQSFQYTLMTTILISSLIAMLLQYMAAKLGIV SQMDLAQAIRARTGKALGVILWLMTELAIMATD IAEVIGAAIALNLLFHIPLVLAVFITVLDVLVL LLLTKIGFRKIEAIVACLILVILAVFAYQVALS

HPDWAGVFKGLLPTKEAIAKEPVVGGISPLTGS Lactobacil WP_012391 LGIIGATVMPHNLYLHSAISQTRKIDHTNAEDI lus 24 69.6

805.1 KQTVRFTAWDSNIQLTLAFFVNALLLIMGVAVF fermentum

KNGAVQDSSFFGLYDALNNTDMLSNGLLIAVAK SGVLSTLFAIALLASGQNSTITGTLTGQVIMEG FVHMKMPLWARRLITRLLSVVPVLVCVAMTAHE STIDQHASLNILMENSQVFLAFALPFSMLPLLI MTNSDTEMGQFKNSLWVRVLGWISVIGLTFLNL YNLPQTYEGFGIWSKGLSDVLAWISIVVIVVLL

AWTCFELIRGDRRLAAEREKHTWEK Lactobacil MCSRKVLLTKQKGKHYLIRYANGKSLSEINGTI WP_080881 lus 25 63.7 EIPKKRTFWRMLWAYTGPGALVAVGYMDPGNWA

380.1 amylolytic TSITGGQSFQYILMSTILISSLMAMLLQYMAAK us LGIVTQMDLAQAIRLRTGKALGIVLWLMTELAI

MATDIAEVIGAAIALNLLFDIPLVPAVFITVLD VLLLLLLARIGFRKIEAVVSCLILVILLVFVYE VLLSNPDWSKAFVGLVPSAKIIQTHPVVGGISP LTGTLGIIGATVMPHNLYLHSAISQTRKINHHN LQLIRDAVKYTALDSNIQLSLAFLVNALLLIMG AAVFKSGAVRDSSFFGLYQALDNAKMLSDPLLV HVARTGILSTLFAVALLASGQNSTITGTLTGQV IMEGYIHLKMPLWARRLVTRLLSVIPVLLCVSF TMNDSVMQQHFALNMLMENSQVFLAFALPFSVL PLLIMTNNKAEMGEFKNKPLWHYLGWACALVLT FLNLYNLPSQFVNFKFASKEVSTIIAYFVIVVI AALLLWTCIEIYIGDRKVKIHHSGFDAKEKELK EEGQK

[99] Para os fins da presente invenção, o grau de "identidade de sequência" entre duas sequências de aminoácidos é determinado usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al.r 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferivelmente versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade para abertura de lacuna de 10, penalidade por extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS do BLOSUM62). A saída da agulha rotulada como "identidade mais longa" (obtida usando a opção nobrief) é usada como a identidade percentual e é calculada da seguinte forma: (Resíduos Idênticos x 100) / (Comprimento de Alinhamento - Número Total de Lacunas no Alinhamento)

[100] Para os fins da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinado usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) conforme implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferivelmente versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade para abertura de lacuna de 10, penalidade por extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS do NCBI NUC4.4).

A saída da Agulha rotulada como "identidade mais longa" (obtida usando a opção -nobrief) é usada como a identidade percentual e é calculada da seguinte forma: (Desoxirribonucleotídeos idênticos x 100) / (Comprimento do alinhamento - Número total de lacunas no alinhamento)

[101] Em uma modalidade, a etapa de seleção compreende determinar se a cepa de bactérias compreende um transportador de manganês com pelo menos 55%, tal como pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% , 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com as sequências de qualquer uma das SEQ ID NO: 1-3. A determinação pode ser baseada no sequenciamento da cepa de bactéria ou uma busca rápida em bancos de dados de sequência conhecidos.

[102] Os removedores de manganês usados nas seções de Exemplos na presente invenção têm transportador de manganês como codificado na SEQ ID NO: 1-3 ou suas variantes funcionais.

[103] Em outras modalidades, a presente invenção fornece um método para inibir ou retardar o crescimento de fungos em um produto, compreendendo as etapas de:

[104] seleção de uma ou mais cepas de bactérias como agente removedor de manganês, e

[105] redução do manganês livre no produto a uma concentração abaixo de cerca de 0,01 ppm no produto pela adição do agente removedor de manganês,

[106] em que a etapa de seleção compreende medir uma atividade de absorção de manganês de uma ou mais cepas de bactérias.

[107] As atividades de captação de manganês podem ser medidas usando métodos de rotina conhecidos no estado da técnica, ver, por exemplo, Kehres et al. " The NRAMP proteins of Salmonella typhimurium and Escherichia coli are selective manganese transporters involved in the response to reactive oxygen." Microbiologia molecular 36.5 (2000): 1085-1100.

[108] Para produtos alimentícios fermentados, tais como produtos lácteos fermentados, um agente removedor de manganês é preferivelmente uma espécie de lactobacilos. Diferentes famílias de transportadores de manganês estão presentes em Lactobacillus e, muitas vezes, vários homólogos destes também estão presentes. Na figura 11, os inventores fornecem uma árvore que fornece uma visão geral da filogenia da família MntH do transportador de manganês dentro das espécies de Lactobacillus. Como mostrado, os transportadores de manganês podem ser encontrados em todas as espécies de Lactobacillus. Além de Lactobacillus spp., a família de transportadores de MntH também pode ser encontrada em outras bactérias. A árvore foi construída pelo alinhamento das sequências da proteína Lactobacillus MntH usando mafft v.7, enquanto a filogenia foi inferida por agrupamento de vizinhos.

[109] Em modalidades preferidas, o agente removedor de manganês é uma cepa de bactéria selecionada a partir do grupo que consiste em L. rhamnosus, L. salivarius, L. casei, L. paracasei, L. fermentum, L. sakei, L. reuteri, L. plantarum, L. brevis, L. kefiri, L alimentarius e Pedicoccus acidilactici.

[110] Por outro lado, esse transportador parece estar ausente em L. helveticus, L. acidophilus, L. gasseri, e L. delbrueckii subsp. bulgaricus, tornando-os menos adequados para a remoção de manganês livre.

[111] De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o método compreende uma etapa de seleção para determinar que uma ou mais cepas de bactérias estão livres de uma superóxido dismutase, preferivelmente livre de uma superóxido dismutase de manganês.

[112] Superóxido dismutases, como superóxido dismutase de manganês, foram estudadas e são, por exemplo, descritas em Kehres et al., "Emerging themes in manganese transport, biochemistry and pathogenesis in bacteria." FEMS microbiology reviews 27.2-3 (2003): 263-290; Culotta V.C “Superoxide dismutase, oxidative stress, and cell metabolism” Curr. Top. Cell Regul. 36, 117–132 (2000) ou Whittaker J.W “Manganese superoxide dismutase” Met. Ions Biol. Syst. 37, 587–611 (2000), entre outros.

[113] No contexto da presente invenção, o termo "livre de" significa que o genoma de uma ou mais cepas de bactérias não apresenta um gene que codifica uma superóxido dismutase, ou mesmo se o genoma de uma ou mais cepas de bactérias apresente um gene que codifica uma superóxido dismutase, este gene não é expresso por uma ou mais cepas de bactérias.

[114] Produtos

[115] Em algumas modalidades, o produto é um produto alimentício, um produto cosmético, um produto de saúde ou um produto farmacêutico. “Alimento” e “produto alimentício” têm o significado comum destes termos. “Produto alimentício” se refere a qualquer alimento ou ração adequados para consumo por humanos ou animais. Os produtos alimentícios podem ser produtos alimentícios frescos ou perecíveis, bem como produtos alimentícios armazenados ou processados. Os produtos alimentícios incluem, mas não estão limitados a, frutas e vegetais, incluindo produtos derivados, grãos e produtos derivados de grãos, laticínios, carnes, aves e frutos do mar. Mais preferivelmente, o produto alimentício é um produto de carne ou produtos lácteos, tais como iogurte, queijo caseiro tvarog, creme de leite, queijo e semelhantes.

[116] No entanto, deve-se notar que, no contexto da presente invenção, o termo "produto" e "produto alimentício" na presente invenção se refere à água como tal. Embora o manganês seja essencial para a nutrição humana, na água ele é geralmente considerado prejudicial à saúde humana, de acordo com a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (EPA). Portanto, o tratamento de água potável ou de águas residuais para remover o excesso de manganês às vezes é realizado para fins de descontaminação e saúde, o que não está relacionado com o espírito da presente invenção.

[117] A presente invenção é especialmente aplicável para produtos alimentícios com atividade de água intermediária a alta. As atividades de água (aw) determinam a viabilidade e funcionalidade dos microrganismos. A atividade da água ou aw é a pressão de vapor parcial da água em uma substância dividida pela pressão de vapor parcial do estado padrão da água. No campo da ciência alimentar, o estado padrão é mais frequentemente definido como a pressão de vapor parcial da água pura na mesma temperatura. Usando esta definição particular, a água destilada pura tem uma atividade de água de exatamente 1.

[118] As principais categorias de alimentos propensas à deterioração por fungos são produtos lácteos com atividade de água intermediária a alta, como iogurte, creme, manteiga, queijo e similares. No entanto, também se prevê que a presente invenção seja adequada para produtos alimentícios com baixa atividade de água, como carne processada, cereais, nozes, especiarias, leite em pó, carnes secas e carnes fermentadas.

[119] Em uma modalidade preferida, o produto onde os métodos divulgados na presente invenção podem ser aplicados é um produto com uma atividade de água (aw) inferior a 0,98, tal como menos do que cerca de 0,97, menos do que cerca de 0,96, menos do que cerca 0,95, menos do que cerca de 0,94, menos do que cerca de 0,93, menos do que cerca de 0,92, menos do que cerca de 0,91, menos do que cerca de 0,90, menos do que cerca de 0,89, menos do que cerca de 0,88, menos do que cerca de 0,87, menos do que cerca de 0,86, menos do que cerca de 0,85, menos do que cerca de 0,84, menos do que cerca de 0,83, menos do que cerca de 0,82, menos do que cerca de 0,81, menos do que cerca de 0,80, menos do que cerca de 0,79, menos do que cerca de 0,78, menos do que cerca de 0,77, menos do que cerca de 0,76, menos do que cerca de 0,75, menos do que cerca de 0,74, menos do que cerca de 0,73, menos do que cerca de 0,72, menos do que cerca de 0,71, menos do que cerca de 0,70 ou menos.

[120] Em algumas modalidades, o produto é aquele que tem uma atividade de água (aw) de cerca de 0,70 a cerca de 0,98, tal como cerca de 0,75 a cerca de 0,97, tal como cerca de 0,80 a cerca de 0,96, tal como cerca de 0,85 a cerca de 0,95.

[121] Os métodos para medir a atividade da água são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, como descrito em

Fontana Jr, Anthony J. " Measurement of water activity, moisture sorption isotherms, and moisture content of foods." Atividade da água em alimentos: fundamentos e aplicações (2007): 155-173.

[122] Em uma modalidade, as etapas aqui descritas são realizadas para inibir ou retardar o crescimento de fungos em produtos alimentícios fermentados. Produtos alimentícios fermentados são alimentos produzidos ou preservados pela ação de microrganismos. Fermentação significa a conversão de carboidratos em álcoois ou ácidos pela ação de um microrganismo. Fermentação normalmente se refere à fermentação do açúcar em álcool usando levedura. No entanto, também pode envolver a conversão de lactose em ácido láctico. Por exemplo, a fermentação pode ser usada para fazer alimentos tais como iogurte, queijo, salame, chucrute, kimchi, picles e semelhantes.

[123] Em uma modalidade, o produto alimentar é um produto da fermentação de ácido láctico, isto é, preparado por fermentação de bactérias de ácido láctico (LAB). "Bactéria de ácido láctico" designa uma bactéria gram-positiva, microaerofílica ou anaeróbica, que fermenta açúcares com a produção de ácidos, incluindo ácido láctico como o ácido predominantemente produzido. O produto alimentício apresenta tipicamente um pH de cerca de 3,5 a cerca de 6,5, tal como cerca de 4 a cerca de 6, tal como cerca de 4,5 a cerca de 5,5, tal como cerca de 5.

[124] A presente invenção é particularmente útil na inibição ou retardamento do crescimento de fungos em produtos lácteos. Nesses produtos, a contaminação com leveduras e bolores é comum e limita a vida útil desses produtos. “Produtos lácteos” incluem, além do leite, produtos derivados do leite, tais como creme, sorvete, manteiga, queijo e iogurte, bem como produtos secundários, tais como lactossoro e caseína e qualquer alimento preparado contendo leite ou constituintes do leite tais como o ingrediente principal, como leite em pó. Em uma modalidade preferida, o produto lácteo é um produto lácteo fermentado. O termo "leite" é entendido como a secreção láctea obtida pela ordenha de qualquer mamífero, como vacas, ovelhas, cabras, búfalas ou camelos. Em uma modalidade preferencial, o leite é leite de vaca. O termo leite também inclui soluções de proteína / gordura feitas de materiais vegetais, por exemplo, leite de soja.

[125] A concentração de manganês varia no leite, dependendo do animal de onde é produzido, da ração e da estação do ano. Em geral, o manganês está presente em uma concentração de pelo menos 0,03 ppm em produtos lácteos, por exemplo, pelo menos 0,08 ppm para leite desnatado, e pelo menos 0,1 ppm para leite integral. Com a presente descoberta dos inventores, a redução da quantidade de manganês em tais produtos ou produtos preparados a partir deles os tornaria mais resistentes à deterioração.

[126] Em uma modalidade, o produto alimentício é um produto preparado por fermentação com termófilos, isto é, produto alimentício fermentado termofílico. O termo "termófilo" se refere a microrganismos que se desenvolvem melhor em temperaturas acima de 43°C. As bactérias termofílicas industrialmente mais úteis incluem Streptococcus spp. e Lactobacillus spp. O termo "fermentação termofílica" neste documento se refere à fermentação a uma temperatura acima de cerca de 35 ° C, tal como entre cerca de 35 ° C e cerca de 45 ° C. “Produto alimentício fermentado termofílico” se refere a produtos alimentícios fermentados preparados por fermentação termofílica de uma cultura inicial termofílica. Estão incluídos nesses produtos, por exemplo, iogurte, skyr, labneh, lassi, ayran e doogh.

[127] Em uma modalidade, o produto alimentício é um produto preparado por fermentação com mesófilos, ou seja, produto alimentício fermentado mesófilo. O termo “mesófilo” se refere a microrganismos que se desenvolvem melhor em temperaturas moderadas (15 ° C-40 ° C). As bactérias mesófilas industrialmente mais úteis incluem Lactococcus spp. e Leuconostoc spp. O termo "fermentação mesofílica" neste documento se refere à fermentação a uma temperatura entre cerca de 22 ° C e cerca de 35 ° C. “Produto alimentício fermentado mesofílico”, que se refere a produtos alimentícios fermentados preparados por fermentação mesofílica de uma cultura inicial mesofílica. Incluídos em tais produtos estão, por exemplo, leite batido, leite azedo, leite de cultura, creme de leite azedo, creme de leite e queijo fresco, como quark, tvarog e queijo cremoso.

[128] Preparação de produtos fermentados

[129] Os métodos aqui divulgados são particularmente úteis para inibir ou retardar o crescimento de levedura e / ou bolor em produtos de leite fermentados, tais como produtos de leite fermentado termofílico e mesofílico, por exemplo, um produto de iogurte. O termo “produto de leite fermentado” é um termo geralmente definido de acordo com os regulamentos oficiais relevantes e os padrões são bem conhecidos no campo. Por exemplo, culturas simbióticas de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus são usados como cultura inicial para iogurte, enquanto Lactobacillus acidophilus é usado para fazer leite acidophilus. Outras bactérias mesofílicas de ácido lático são usadas para produzir quark ou queijo fresco.

[130] A expressão "produto de leite fermentado" significa um alimento ou produto alimentício em que a preparação do alimento ou produto alimentício envolve a fermentação de uma base de leite com uma bactéria de ácido láctico. "Produto lácteo fermentado", tal como aqui utilizado, inclui, mas não está limitado a produtos como produtos lácteos fermentados termofílicos (por exemplo, iogurte) e produtos lácteos fermentados mesofílicos (por exemplo, creme de leite e leite batido, bem como leite batido fermentado, quark e queijo fresco). O produto lácteo fermentado também inclui queijos, como queijo do tipo continental, queijo fresco, queijo macio, cheddar, mascarpone, pasta filata, mussarela, provolone, queijo branco de salmoura, queijo para pizza, queijo feta, brie,

camembert, queijo cottage, Edam, Gouda, Tilsiter, Havarti ou Emmental, queijo suíço e Maasdamer.

[131] O termo “iogurte” tem seu significado usual e é geralmente definido de acordo com os regulamentos oficiais relevantes e os padrões são bem conhecidos na área. As culturas iniciais usadas para fazer iogurte compreendem pelo menos uma cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus. Curiosamente, o transportador de manganês não está presente em L. delbrueckii subsp. bulgaricus e apenas exibe baixa expressão em Streptococcus thermophilus, as duas cepas encontradas na cultura inicial de iogurte, tornando-as particularmente suscetíveis à deterioração por fungos. Portanto, é preferível incluir outra (s) cepa (s) de bactérias para eliminar o manganês livre presente no iogurte.

[132] Preferivelmente, o manganês livre no produto fermentado é reduzido a uma concentração abaixo de cerca de 0,005 ppm.

[133] Durante o processamento de alimentos, conservantes químicos têm sido tradicionalmente usados para evitar a deterioração por fungos. No entanto, em vista de uma forte demanda da sociedade por alimentos menos processados e sem conservantes, a invenção contribui para fornecer uma solução eficaz para gerenciar o crescimento de leveduras e fungos usando agentes removedores de manganês biológicos para reduzir a concentração de manganês.

[134] Ao usar um agente removedor biológico, o versado na técnica é capaz de ajustar vários parâmetros, como pH, temperatura e quantidade de agente removedor de manganês ou bactérias para alcançar os resultados desejados, levando em consideração os exemplos fornecidos nesta invenção também como as propriedades do produto alimentício, como atividade de água, nutrientes, nível de manganês de ocorrência natural, prazo de validade, condições de armazenamento, embalagem, etc.

[135] O produto no qual a concentração de manganês livre é reduzida é preferivelmente embalado para limitar ainda mais o contato com levedura e bolor. Também é preferível armazenar o produto sob temperatura fria (abaixo de 15 ° C) para ajudar a estender a vida útil.

[136] Para produtos alimentícios fermentados, bactérias removedoras de manganês podem ser adicionadas antes, no início ou durante a fermentação. Dependendo dos parâmetros escolhidos, a etapa de redução do nível de manganês a um nível preferido pode levar várias horas, como pelo menos 5 horas, como pelo menos 10 horas, como pelo menos 15 horas, como pelo menos 20 horas, como pelo menos 1 dia, 2 dias, 3 dias ou mais. Um versado na técnica será capaz de escolher os parâmetros apropriados, dependendo do produto em que a inibição de fungos ou retardamento da ocorrência de fungos é desejada.

[137] A invenção fornece um método de preparação de um produto alimentício fermentado, compreendendo a adição de uma cultura inicial e um agente removedor de manganês a um substrato alimentar, fermentando o substrato por um período de tempo até que um pH alvo seja alcançado. O agente removedor de manganês é, preferivelmente, uma cepa de bactéria lactobacillus.

[138] Conforme usado neste documento, o termo "substrato alimentar" base se refere ao substrato no qual a fermentação deve ser realizada.

[139] Para fazer laticínios fermentados, o substrato alimentar é uma base de leite. "Base de leite" é amplamente utilizada na presente invenção para se referir a uma composição à base de leite ou componentes do leite que podem ser usados como um meio para o crescimento e fermentação de uma cultura inicial. “Leite” geralmente se refere à secreção láctea obtida pela ordenha de qualquer mamífero, como vacas, ovelhas, cabras, búfalas ou camelos. A base de leite pode ser obtida de qualquer leite cru e / ou processado, bem como de leite em pó reconstituído. A base de leite também pode ser à base de plantas, ou seja, preparada a partir de material vegetal, por exemplo leite de soja. A base de leite preparada a partir do leite ou componentes do leite de vacas é preferida.

[140] As bases do leite incluem, mas não estão limitadas a, soluções / suspensões de qualquer leite ou produtos semelhantes ao leite compreendendo proteínas, como leite integral ou com baixo teor de gordura, leite desnatado, leite batido, leite em pó reconstituído, leite condensado, leite em pó.

[141] A base de leite também pode ser reduzida em lactose, dependendo da necessidade dos consumidores. Leite com redução de lactose pode ser produzido de acordo com qualquer método conhecido no estado da técnica, incluindo hidrólise da lactose pela enzima lactase em glicose e galactose, ou por nanofiltração, eletrodiálise, cromatografia de troca iônica e centrifugação.

[142] Para fermentar a base do leite, uma cultura inicial é adicionada. O termo "iniciador" ou "cultura iniciadora", conforme usado no presente contexto, se refere a uma cultura de um ou mais microrganismos de qualidade alimentar em particular bactérias de ácido láctico, que são responsáveis pela acidificação da base do leite.

[143] O agente removedor de manganês pode ser adicionado antes, no início ou durante a fermentação ao mesmo tempo ou em um momento diferente com a cultura iniciadora.

[144] Depois de adicionar a cultura iniciadora e os agentes removedores de manganês e submeter a base de leite a uma condição adequada, o processo de fermentação começa e continua por um período de tempo. Um versado na técnica sabe como selecionar as condições de processo adequadas, tais como temperatura, oxigênio, adição de carboidratos, quantidade e características do (s) microorganismo (s) e o tempo de processo que leva. Este processo pode levar de três, quatro, cinco, seis horas ou mais.

[145] Essas condições incluem o ajuste de uma temperatura que é adequada para as cepas de cultura iniciadora particulares. Por exemplo, quando a cultura iniciadora compreende bactérias lácticas mesofílicas, a temperatura pode ser ajustada para cerca de 30 ° C, e se a cultura compreender cepas bacterianas de ácido lático termofílicas, a temperatura é mantida na faixa de cerca de 35 ° C a 50 ° C , tal como 40 ° C a 45 ° C. O ajuste da temperatura de fermentação também depende da (s) enzima (s) adicionada (s) à fermentação, que pode ser prontamente determinada por um versado na técnica. Em uma modalidade particular da invenção, a temperatura de fermentação se situa entre 35 ° C e 45 ° C, preferivelmente entre 37 ° C e 43 ° C, e mais preferivelmente entre 40 ° C e 43 ° C. Em outra modalidade, a temperatura de fermentação se situa entre 15 ° C e 35 ° C, preferivelmente entre 20 ° C e 35 ° C, e mais preferivelmente entre 30 ° C e 35 ° C.

[146] A fermentação pode ser encerrada usando quaisquer métodos conhecidos no estado da técnica. Em geral, dependendo de vários parâmetros do processo, a fermentação pode ser encerrada tornando a base de leite inadequada para o crescimento da (s) cepa (s) da cultura iniciadora. Por exemplo, o término pode ser realizado por resfriamento rápido do produto de leite fermentado quando um pH alvo é atingido. Sabe-se que durante a fermentação ocorre a acidificação, o que leva à formação de uma rede tridimensional composta por grupos e cadeias de caseínas. O termo "pH alvo" significa o pH no qual termina a etapa de fermentação. O pH alvo depende do produto de leite fermentado a ser obtido e pode ser prontamente determinado por um versado na técnica.

[147] Em uma modalidade particular da invenção, a fermentação é realizada até que pelo menos um pH de 5,2 seja alcançado, tal como até um pH de 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2 , 4.1, 4.0, 3.9, 3.8 ou 3.7 seja alcançado. Preferivelmente, a fermentação é realizada até que um pH alvo entre 4,0 e 5,0 e mais preferivelmente entre 4,0 e 4,6 seja alcançado. Em uma modalidade preferida, a fermentação é realizada até que o pH alvo abaixo de 4,6 seja alcançado.

[148] Em uma modalidade preferida, o produto alimentício fermentado é selecionado do grupo que consiste em queijo quark, queijo cremoso, queijo fresco, iogurte grego, skyr, labneh, leite batido, creme de leite, leite azedo, leite de cultura, kefir, lassi, ayran , twarog, doogh, smetana, yakult e dahi.

[149] Em outra modalidade preferida, o produto alimentício fermentado é um queijo, incluindo queijo do tipo continental, queijo fresco, queijo macio, cheddar, mascarpone, pasta filata, mussarela, provolone, queijo de salmoura branco, queijo de pizza, feta, brie, camembert, queijo cottage, Edam, Gouda, Tilsiter, Havarti ou Emmental, queijo suíço e Maasdamer.

[150] Em uma outra modalidade, o método compreende ainda embalar o produto alimentício para reduzir o contato com a levedura e o bolor.

[151] Na presente invenção está incluído um produto alimentício obtido pelos métodos aqui descritos.

[152] O produto obtido pela presente invenção é preferivelmente um produto de leite fermentado com uma concentração de manganês livre reduzida para menos de 0,01 ppm após ser armazenado por pelo menos dois dias, por exemplo, pelo menos 3 dias, pelo menos 4 dias, mais preferivelmente pelo menos 5 dias, pelo menos 6 dias, pelo menos 7 dias, pelo menos 8 dias, pelo menos 9 dias, pelo menos 10 dias, pelo menos 11 dias, pelo menos 12 dias, pelo menos 13 dias, e pelo menos 14 dias.

[153] Outras características e vantagens da invenção se tornarão evidentes a partir da leitura da descrição seguinte em conjunto com as figuras anexas. A menos que definido de outra forma, todos os termos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por um versado na técnica. O uso dos termos "um" e "uma" e "a/o" e referentes similares no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) devem ser interpretados para abranger tanto a forma singular quanto a forma plural, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto. Os termos "compreendendo", "tendo", "incluindo" e "contendo" devem ser interpretados como termos abertos (ou seja, significando "incluindo, mas não se limitando a"), a menos que seja indicado de outra forma. A indicação de faixas de valores neste documento é meramente destinada a servir como um método abreviado de referência individual a cada valor separado dentro da faixa, a menos que indicado de outra forma aqui, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse individualmente citado neste documento. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma aqui ou claramente contradito pelo contexto. A menos que indicado de outra forma, todos os valores exatos fornecidos neste documento são representativos dos valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os valores exemplificativos exatos fornecidos com relação a um fator ou medição particular podem ser considerados como fornecendo também uma medição aproximada correspondente, modificada por "cerca de", quando apropriado). O uso de todo e qualquer exemplo, ou linguagem exemplificativa (por exemplo, "tal como") fornecido neste documento, destina-se meramente a esclarecer melhor a invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção, a menos que seja reivindicado o contrário. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[154] EXEMPLOS

[155] A invenção descrita e reivindicada neste documento não deve ser limitada em escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, uma vez que esses aspectos se destinam a ser ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes devem estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas aqui se tornarão aparentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição anterior e dos exemplos seguintes. Essas modificações também se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação incluindo definições prevalecerá.

[156] Exemplo 1 Crescimento de leveduras em diferentes concentrações de manganês

[157] O exemplo demonstra os requisitos de manganês de Debaryomyces hansenii em meio mínimo. Dois D. hansenii isolados de iogurte estragado (cepa 1) e quark (cepa 2), respectivamente, foram usados. As cepas foram cultivadas em meio quimicamente definido com diferentes concentrações de manganês.

[158] O meio mínimo contém biotina 2 µg / L, pantotenato de cálcio 400 µg / L, ácido fólico 2 µg / L, inositol 2 mg / L, ácido nicotínico 400 µg / L, ácido p- aminobenzóico 200 µg / L, piridoxina 400 µg / L, riboflavina 200 µg / L, tiamina 400 µg / L, ácido bórico 500 µg / L, sulfato de cobre 40 µg / L, iodeto de potássio 100 µg / L, cloreto férrico 200 µg / L, molibdato de sódio 200 µg / L, sulfato de zinco 400 µg / L, fosfato de potássio monobásico 0,5 g / L, fosfato de potássio dibásico 0,5 g / L, sulfato de magnésio 0,5 g / L, cloreto de sódio 0,1 g / L, cloreto de cálcio 0,2 g / L, glicose 20 g / L, sulfato de amônio 5 g / L.

[159] Concentração de manganês utilizada: 6 ppm, 0,6 ppm, 0,06 ppm, 0,006 ppm, 0,0006 ppm, 0,00006 ppm 0,000006 ppm.

[160] Dois pH diferentes foram testados: pH 6,5 e 4,5.

[161] As cepas foram inoculadas em 150 µl do meio diferente em uma placa de 96 poços. As placas foram incubadas a 17 ° C por vários dias e o crescimento das cepas de levedura foi seguido pela medição da absorbância a 600 nm em um leitor de placas.

[162] O efeito de diferentes pH e diferentes concentrações de manganês para o crescimento das duas diferentes cepas de D. hansenii são mostrados na figura 1 (cepa 1) e na figura 2 (cepa 2). Pode-se observar que o crescimento de D. hansenii é inibido abaixo de uma concentração de cerca de 0,01 ppm de manganês. Não houve diferença entre os dois diferentes pH, demonstrando que este mecanismo é válido nesta faixa de pH.

[163] Exemplo 2 Inibição de levedura em produtos lácteos fermentados

[164] O exemplo demonstra os requisitos de manganês de Debaryomyces hansenii em produtos lácteos fermentados.

[165] Produtos lácteos fermentados com uma cultura iniciadora (Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) ou adicionalmente com agentes removedores de manganês (L. rhamnosus e L.paracasei) foram preparados. Os produtos lácteos fermentados foram centrifugados (10 min a 5000 rpm) e o sobrenadante foi esterilizado por filtração. O sobrenadante foi transferido para uma placa de 96 poços estéril (150 µl em cada poço) e manganês foi adicionado ao primeiro poço para uma concentração final de 6 ppm, em seguida, uma diluição em série de 10 vezes foi realizada para resultar em diferentes concentrações de manganês atingindo de 6 ppm a 0,000006 ppm. D. hansenii foi inoculado em ~ 20 células / poço e as placas foram incubadas a 17 ° C por vários dias e o crescimento das cepas de levedura foi seguido pela medição da absorbância a 600 nm em um leitor de placas no dia 7.

[166] As figuras 3 e 4 mostram o crescimento de D. hansenii (cepa 1 e cepa 2, respectivamente). O crescimento da levedura após a adição do manganês à fase aquosa é mostrado na figura 3 para a cepa 1 e na figura 4 para a cepa 2 (círculos abertos). A média e o desvio padrão das replicatas técnicas n = 6 (A) e n = 3 (B) são mostrados. Em termos de comparação, o crescimento da levedura também é mostrado para a fase aquosa do iogurte de referência, onde nem os removedores de manganês nem manganês adicional foram adicionados (quadrado). Deve-se notar que a referência tem uma concentração inerente de manganês de 0,03 ppm. Para os círculos abertos, o eixo x indica a concentração de manganês adicionada, e para o quadrado (a fase aquosa de iogurte de referência), o eixo x indica o manganês inerente à fase aquosa.

[167] Este resultado demonstra que o crescimento das cepas de levedura em uma matriz alimentar depende do manganês. A adição de manganês resulta em um crescimento semelhante ao de referência, provando que baixas concentrações de manganês são a principal limitação para o crescimento de levedura no produto lácteo fermentado.

[168] Exemplo 3 Inibição de Debaryomyces e rodoturola

[169] Este exemplo mostra as atividades de eliminação de manganês de várias bactérias e seu efeito inibidor contra Debaryomyces e Rhodoturola. O efeito inibitório em produtos lácteos fermentados com baixa concentração de manganês e elevada concentração de manganês foi avaliado.

[170] A Tabela 4 lista as bactérias adicionadas e se elas compreendem transportadores de manganês.

[171] Tabela 4 No. Espécies Contém transportador de manganês 1 Lactobacillus rhamnosus Sim 2 Lactobacillus rhamnosus Sim 3 Lactobacillus rhamnosus Sim 4 Lactobacillus rhamnosus (ATCC Sim 7469) 5 Lactobacillus salivarius Sim 6 Lactobacillus casei Sim 7 Lactobacillus paracasei Sim 8 Lactobacillus fermentum Sim 9 Lactobacillus sakei (ATCC Sim 15521) 10 Lactobacillus reuteri (ATCC Sim 23272) 11 Lactobacillus plantarum Sim 12 Lactobacillus delbrueckii Não 13 Lactobacillus helveticus Não 14 Lactobacillus gasseri (ATCC Não 33323) 15 Lactobacillus brevis Sim 16 Lactobacillus kefiri (ATCC Sim 35411) 17 Lactobacillus alimentarius Sim 18 Pediococcus acidilactici Sim (DSM20284) 19 Controle (cultura iniciadora apenas)

[172] As bactérias listadas foram cultivadas em meio MRS durante a noite.

[173] Preparação: 2 ml de leite contendo uma cultura iniciadora (Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) foram inoculados com 10 µl da cultura durante a noite. O leite foi fermentado a 43 ° C por cerca de 6 horas até que o pH 4,5 fosse atingido. O leite fermentado foi armazenado na geladeira em uso posterior. 150 µl do leite fermentado foram transferidos para poços individuais em uma placa de 96 poços em duplicata. À metade da amostra foi adicionado manganês para obter um aumento de 6 ppm de manganês e todos os poços foram inoculados com cerca de 20 células de Debaryomyces hansenii ou Rhodoturola mucilaginosa. Após 4 dias, uma série de diluição foi colocada em placas YGC seletivas para analisar o crescimento da levedura. O crescimento da levedura foi medido por inspeção óptica, enquanto um valor de 0 é dado para nenhum crescimento e 5 para crescimento completo. A média de dois experimentos biológicos independentes foi mostrada na Tabela 5 para Debaryomyces e na Tabela 6 para Rhodoturola.

[174] Tabela 5 Inibição de Debaryomyces Removedor Crescimento de Crescimento de levedura (a.u.) levedura (a.u.) com 6 ppm de manganês 1 Lactobacillus rhamnosus 0 5 2 Lactobacillus rhamnosus 0 5 3 Lactobacillus rhamnosus 0 5 4 Lactobacillus rhamnosus 0 4.5 5 Lactobacillus salivarius 3.75 5 6 Lactobacillus casei 3.75 5 7 Lactobacillus paracasei 0 5 8 Lactobacillus fermentum 0 5 9 Lactobacillus sakei 0.5 5 10 Lactobacillus reuteri 4 5 11 Lactobacillus plantarum 0.5 5 12 Lactobacillus 4.5 4.5 delbrueckii 13 Lactobacillus helveticus 5 3 14 Lactobacillus gasseri 5 5 15 Lactobacillus brevis 3.5 5 16 Lactobacillus kefiri 1.5 5 17 Lactobacillus 3.5 5 alimentarius 18 Pediococcus acidilactici 4 5

19 Controle (cultura 5 5 iniciadora apenas)

[175] Tabela 6 Inibição de Rhodoturola Agente removedor(s) Crescimento de Crescimento de levedura levedura (a.u.) (a.u.) com 6 ppm de manganês 1 Lactobacillus rhamnosus 1 4.5 2 Lactobacillus rhamnosus 1.5 4.5 3 Lactobacillus rhamnosus 1 4.5 4 Lactobacillus rhamnosus 1 4.5 5 Lactobacillus salivarius 3.5 5 6 Lactobacillus casei 3.5 5 7 Lactobacillus paracasei 2 5 8 Lactobacillus fermentum 3 5 9 Lactobacillus sakei 1 4.5 10 Lactobacillus reuteri 4 5 11 Lactobacillus plantarum 2.5 4 12 Lactobacillus 4 4 delbrueckii 13 Lactobacillus helveticus 4.5 5 14 Lactobacillus gasseri 4.5 4.5 15 Lactobacillus brevis 3.5 4.5 16 Lactobacillus kefiri 3.5 4.5 17 Lactobacillus 5 5 alimentarius 18 Pediococcus acidilactici 5 5 19 Controle (cultura 5 5 iniciadora apenas)

[176] Os resultados mostram que as cepas que eliminam o manganês podem ser usadas para inibir D. hansenii e R. mucilaginosa, mas a inibição é diminuída com a adição de manganês.

[177] Exemplo 4 Inibição de Debaryomyces, Saccharomyces, Rhodoturola, Cryptococcus e Torulaspora

[178] O exemplo avalia as diferenças no crescimento da levedura na fase aquosa do leite fermentado que é preparado com uma cultura iniciadora, com e sem agentes removedores de manganês.

[179] A Tabela 7 lista os agentes removedores de manganês usados:

[180] Tabela 7 agente(s) Transportador de No. removedor(es) manganês

L. rhamnosus 1 Sim L. paracasei 2 L. rhamnosus Sim 3 L. rhamnosus Sim

[181] Este exemplo mostra o crescimento de levedura em 2 concentrações diferentes de manganês. Foram avaliados os efeitos inibitórios para 6 diferentes leveduras em produtos lácteos fermentados com baixa concentração de manganês e elevada concentração de manganês.

[182] Leite homogeneizado com gordura reduzida (1,5% w / v) foi tratado termicamente a 90 ± 1 ° C por 20 min e resfriado imediatamente. Uma cultura comercial iniciadora (Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) foi inoculada a 0,02% (v / p) em baldes de 3 L. Um balde foi inoculado com agentes removedores de manganês na concentração total de 100 U / T e um balde foi usado como referência e inoculado apenas com a cultura iniciadora. Todos os baldes foram incubados em banho-maria a 43 ± 1 ° C e fermentados nessas condições até atingir pH 4,60 ± 0,1. Os produtos lácteos fermentados foram divididos em frascos de 200 mL e resfriados.

[183] O produto de leite fermentado foi então centrifugado (10 min a 5000 rpm) e o sobrenadante foi esterilizado por filtração. O sobrenadante foi transferido para uma placa estéril de 96 poços (150 µl em cada poço) e a metade do manganês foi adicionada para obter um aumento de 6 ppm de manganês. Seis leveduras diferentes foram selecionadas e inoculadas com cerca de 20 células por poço em crescimento durante 7 dias a 17 ° C. Como controle, foi utilizado leite fermentado apenas com uma cultura iniciadora (referência). O crescimento foi determinado pela absorbância medindo a 600 nm.

[184] A média e o desvio padrão de pelo menos 5 repetições são mostrados na Tabela 8 -13.

[185] Tabela 8 Inibição de Debaryomyces hansenii (cepa 1): Agente(s) Crescimento de Crescimento de removedor(es) levedura levedura (absorvância a 600 (absorvância a 600 nm) nm) com 6 ppm de manganès 1 L. rhamnosus 0.14 ± 0.01 0.48 ± 0.07 L. paracasei 2 L. rhamnosus 0.18 ± 0.01 0.46 ± 0.05 3 L. rhamnosus 0.27 ± 0.01 0.62 ± 0.08 Ref Nenhum 0.40 ± 0.03

[186] Tabela 9 Inibição de Debaryomyces hansenii (cepa 2) Agente(s) Crescimento de Crescimento de removedor(es) levedura levedura (absorvância a 600 (absorvância a 600 nm) nm) com 6 ppm de manganês 1 L. rhamnosus 0.01 ± 0.01 0.43 ± 0.06 L. paracasei 2 L. rhamnosus 0.01 ± 0.00 0.44 ± 0.03 3 L. rhamnosus 0.10 ± 0.02 0.51 ± 0.06 Ref Nenhum 0.33 ± 0.04

[187] Tabela 10 Inibição de Saccharomyces cerevisiae Agente(s) Crescimento de Crescimento de removedor(es) levedura levedura (absorvância a 600 (absorvância a 600 nm) nm) com 6 ppm de manganês 1 L. rhamnosus 0.51 ± 0.06 0.63 ± 0.09 L. paracasei Ref Nenhum 0.62 ± 0.02

[188] Tabela 11 Inibição de Rhodoturola mucilaginosa Agente(s) Crescimento de Crescimento de removedor(es) levedura levedura (absorvância a 600 (absorvância a 600 nm) nm) com 6 ppm de manganês 1 L. rhamnosus 0.15 ± 0.01 0.19 ±0.01 L. paracasei 2 L. rhamnosus 0.13 ± 0.01 0.23 ± 0.02 3 L. rhamnosus 0.17 ± 0.01 0.22 ± 0.02 Ref Nenhum 0.24 ± 0.01

[189] Tabela 12 Inibição de Cryptococcus fragicola Agente(s) Crescimento de Crescimento de removedor(es) levedura levedura (absorvância a 600 (absorvância a 600 nm) nm) com 6 ppm de manganês 1 L. rhamnosus 0.06 ± 0.01 0.08 ± 0.01 L. paracasei 2 L. rhamnosus 0.06 ± 0.01 0.08 ± 0.01 3 L. rhamnosus 0.07 ± 0.00 0.09 ± 0.01 Ref Nenhum 0.10 ± 0.01

[190] Tabela 13 Inibição de Torulaspora delbrueckii Agente removedor Crescimento de Crescimento de levedura levedura (absorvância a 600 (absorvância a 600 nm) nm) com 6 ppm de manganês 1 L. rhamnosus 0.11 ± 0.00 0.16 ± 0.02 L. paracasei Ref Nenhum 0.20 ± 0.02

[191] Os resultados demonstram que as cepas Debaryomyces, Saccharomyces, Rhodoturola, Cryptococcus e Torulaspora podem ser inibidas por bactérias que eliminam manganês, e o efeito de inibição é reduzido com a adição de manganês.

[192] Exemplo 5 Inibição de Debaryomyces hansenii

[193] O exemplo avalia a influência de diferentes concentrações de manganês no leite fermentado preparado com uma cultura iniciadora, sendo testado com e sem agentes removedores de manganês.

[194] Tabela 14 Listas de agentes removedores de manganês usados:

[195] Tabela 14 Agente(s) Contém transportador de No. removedor(es) manganês L. rhamnosus 1 Sim L. paracasei 2 L. rhamnosus Sim 3 L. rhamnosus Sim

[196] O produto de leite fermentado foi preparado como no Exemplo 4.

[197] 150 µl do leite fermentado foram transferidos para poços individuais em uma placa de 96 poços em duplicata ou triplicata. Uma diluição em série foi realizada para resultar em diferentes concentrações de manganês adicionadas atingindo de 6 ppm a 0,000006 ppm. Todos os poços foram inoculados com cerca de 20 células de Debaryomyces hansenii (cepa 2) e as placas foram incubadas a 17 ° C durante 5 dias. Posteriormente, 10 µl de uma diluição de 1000 vezes, preparada em peptona salina, foi colocada em placas YGC seletivas para analisar o crescimento de levedura.

[198] A figura 5 mostra o crescimento de Debaryomyces hansenii em leite fermentado preparado com agentes removedores (No. 1, No. 2 e No. 3) e sem agentes removedores (REF), após adição de diferentes concentrações de manganês: 6 ppm (linha de topo), 0,6 ppm (linha 2), 0,06 ppm (linha 3), 0,006 ppm (linha 4), 0,0006 ppm (linha 5), 0,00006 ppm (linha 6), 0,000006 ppm (linha 7) e 0 ppm (linha inferior )

[199] Como mostrado, o crescimento de levedura em leite fermentado com agente (s) removedor (es) No. 1 e No. 2 foi inibido após adição de 0,6 ppm (comparar a linha 3 com a linha 2); adição de 0,006 ppm resultou em algum crescimento de levedura na presença do agente removedor nº 3.

[200] Exemplo 6 Inibição de levedura em leite fermentado com diferentes teores de manganês

[201] A influência do manganês no efeito inibitório contra diferentes fungos foi avaliada. Um ensaio de ágar semelhante ao processo de fabricação e produção de produtos lácteos fermentados foi usado. L. rhamnosus e L. paracasei foram usados juntos como agentes removedores de manganês.

[202] Preparação de amostras de leite fermentado:

[203] Leite homogeneizado com gordura reduzida (1,5% w / v) foi tratado termicamente a 90 ± 1 ° C por 20 min e resfriado imediatamente. Uma cultura comercial iniciadora (Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus) foi inoculada a 0,02% (v / p) em baldes de 3 L. Um balde foi inoculado com agente removedor de manganês na concentração total de 100 U / T e um balde foi utilizado como referência e inoculado apenas com a cultura iniciadora. Todos os baldes foram incubados em banho-maria a 43 ± 1 ° C e fermentados nessas condições até atingir pH 4,60 ± 0,1. Os produtos lácteos fermentados foram divididos em frascos de 200 mL e resfriados. A concentração de manganês já presente no produto de referência foi previamente determinada em cerca de 0,03 ppm e no produto com as cepas removedoras abaixo do limite de detecção de 0,003 ppm.

[204] Adição de manganês:

[205] Diferentes concentrações de manganês foram adicionadas aos produtos lácteos fermentados com e sem removedor de manganês para obter uma adição nos níveis de manganês (0, 0,006 e 6 ppm de manganês em produtos de referência e 0, 0,000006, 0,00006, 0,0006, 0,006, 0,06, 0,6 e 6 ppm de manganês).

[206] Todas as amostras de leite fermentado foram aquecidas a uma temperatura de 40 ° C e adicionadas 40 ml de uma solução de ágar 5% estéril que foi derretida e resfriada a 60 ° C. Esta solução de leite fermentado e ágar foi então vertida em placas de Petri estéreis e as placas foram secas em uma bancada LAF por 30 min.

[207] Teste de desafio usando fermento:

[208] Três contaminantes alvo, incluindo dois Debaryomyces hansenii (cepa 1 e cepa 2) e um Cryptococcus fragicola foram identificados em concentrações de 103, 102 e 101 CFU / mancha. As placas foram incubadas a 7 ± 1 ° C e regularmente examinadas para o crescimento de levedura.

[209] Resultados:

[210] Os resultados do ensaio de levedura agar são apresentados na figura 6, mostrando o crescimento de 3 leveduras diferentes em placas preparadas a partir de leite fermentado com uma cultura iniciadora individual (referência, linha superior) ou juntamente com captadores de manganês (linha inferior). Diferentes concentrações de manganês foram adicionadas como indicado acima nas fotos. Três contaminantes alvo (coluna A:

Debaryomyces hansenii (cepa 2), coluna B: Cryptococcus fragicola, coluna C: Debaryomyces hansenii (cepa 1) foram adicionados em três concentrações diferentes: 1 x 103 cfu / ponto (linha superior na placa), 1 x 102 cfu / ponto (linha do meio na placa) e 1 x 101 cfu / ponto (linha inferior na placa).

[211] Como pode ser visto na figura 6, as leveduras testadas cresceram bem nas placas de ágar feitas de leite fermentado apenas com a cultura iniciadora (referência). No entanto, quando os necrófagos de manganês estavam presentes durante a fermentação do leite, o crescimento de todas as leveduras foi atrasado.

[212] Em níveis de manganês de até 0,0006 ppm, o removedor manteve a alta atividade inibitória para todas as três leveduras. Em níveis de manganês entre 0,006 ppm e 0,6 ppm, a atividade inibitória do removedor para C. fragicola foi diminuída. A concentração de manganês de 6 ppm pareceu inibir o crescimento de C. fragicola. D. hansenii (cepa 1) foi inibida pelo removedor de manganês em níveis de manganês de até 0,006 ppm. Em níveis de manganês de 0,06 ppm e acima, o removedor de manganês perdeu a atividade inibitória para D. hansenii (cepa 1). D. hansenii (cepa 2) foi inibida pelo removedor de manganês em níveis de manganês de até 0,6 ppm e a 6 ppm de manganês a atividade foi perdida.

[213] Exemplo 7 Inibição de bolor em leite fermentado com diferentes teores de manganês

[214] Amostras de produtos lácteos fermentados com diferentes níveis de manganês foram preparadas conforme descrito no Exemplo 6.

[215] Teste de desafio usando bolor:

[216] A figura 7 mostra o crescimento de 3 bolores diferentes em placas preparadas a partir do leite fermentado apenas com a cultura iniciadora (referência, linha superior) ou adicionalmente com removedor de manganês (linha inferior). Diferentes concentrações de manganês foram adicionadas conforme indicado acima nas imagens. Três contaminantes alvo (A:

Penicillium brevicompactum, B: Penicillium crustosum e C: Penicillium solitum) foram adicionados em concentrações de 500 esporos / mancha. As placas foram incubadas a 7 ± 1 ° C por 25 dias.

[217] A figura 8 mostra o crescimento de 3 bolores diferentes em placas preparadas a partir do leite fermentado apenas com a cultura iniciadora (referência, linha superior) ou adicionalmente com removedor de manganês (linha inferior). Diferentes concentrações de manganês foram adicionadas conforme indicado acima nas imagens. Três contaminantes alvo (A: Penicillium brevicompactum, B: Penicillium crustosum e C: Penicillium solitum) foram adicionados em concentrações de 500 esporos / mancha. As placas foram incubadas a 22 ± 1 ° C por 8 dias.

[218] A figura 9 mostra o crescimento de 3 bolores diferentes em placas preparadas a partir do leite fermentado apenas com a cultura iniciadora (referência, linha superior) ou adicionalmente com removedor de manganês (linha inferior). Diferentes concentrações de manganês foram adicionadas conforme indicado acima nas imagens. Três contaminantes alvo (A: Penicillium carneum, B: Penicillium paneum e C: Penicillium roqueforti) foram adicionados em concentrações de 500 esporos / mancha. As placas foram incubadas a 7 ± 1 ° C por 25 dias.

[219] A figura 10 mostra o crescimento de 3 bolores diferentes em placas preparadas a partir do leite fermentado apenas com a cultura iniciadora (referência, linha superior) ou adicionalmente com removedor de manganês (linha inferior). Diferentes concentrações de manganês foram adicionadas conforme indicado acima nas imagens. Três contaminantes alvo (A: Penicillium carneum, B: Penicillium paneum e C: Penicillium roqueforti) foram adicionados em concentrações de 500 esporos / mancha. As placas foram incubadas a 22 ± 1 ° C por 8 dias.

[220] Todos os bolores testados cresceram muito bem nas placas de ágar feitas de leite fermentado apenas com a cultura iniciadora (referência). No entanto, quando os necrófagos de manganês estavam presentes durante a fermentação do leite, o crescimento de todos os fungos testados foi retardado. O efeito inibitório é mais intenso em temperaturas mais baixas (figura 7 e 9).

[221] O removedor de manganês manteve a alta atividade inibitória para todos os fungos em níveis adicionais de manganês de até 0,006 ppm. Em níveis de manganês de 0,06 ppm e acima, a atividade inibitória dos removedores de manganês diminuiu. Os removedores de manganês perderam a maior parte da atividade inibitória a 6 ppm para os susceptíveis (Figura 7 e 8) e a 0,06 ppm para os bolores robustos (Figura 9 e 10).

[222] A concentração mais elevada de manganês adicionado, que diminui o efeito inibitório encontrado neste ensaio, em comparação com as concentrações encontradas na fase aquosa, é devido à absorção contínua pelo removedor de manganês vivo e metabolicamente ativo no produto de leite fermentado.

[223] Exemplo 8 Inibição de Debaromyces hansenii na fase aquosa e em diferentes concentrações de um material quelante químico

[224] Duas concentrações de manganês foram usadas, 6 ppm e 0,6 ppm, no exemplo 8. A concentração de 6 ppm mostrou ter um efeito inibitório / tóxico no crescimento de levedura, enquanto 0,6 ppm foi usado como uma concentração padrão, que é o suficiente para revogar a deficiência de manganês causada por uma ou mais cepas de bactérias atuando como necrófagas de manganês.

[225] As figuras 12 e 13 mostram que um material quelante químico, como o EDTA, tem um efeito inibitório no crescimento de Debaromyces hansenii, em fase aquosa.

[226] A figura 12 mostra que as células de Debaryomyces hansenii param de crescer quando confrontadas com uma concentração de 0,05 mg / ml de EDTA. Assim, o EDTA mostra um efeito inibidor a uma concentração de 0,05 mg / ml.

[227] A figura 13 mostra que uma concentração de 0,05 mg / ml de EDTA e na ausência de manganês (0,6 ppm) Debaromyces hansenii para de crescer; portanto, o EDTA tem um efeito inibitório sobre Debaromyces hansenii sob essas condições. A adição de 0,6 ppm de manganês e 0,05 mg / ml de EDTA restaura o crescimento de Debaromyces hansenii e o efeito do EDTA é revogado pelo excesso de manganês.

[228] Exemplo 9 Inibição de Debaryomyces hansenii em iogurte

[229] No iogurte, foi possível reproduzir a inibição de removedores de manganês selecionados de uma ou mais cepas de bactérias (agente removedor 1) pela adição de 0,89 mg / ml de EDTA, um removedor de manganês, ao iogurte. Nessa concentração, o iogurte de referência apresentou inibição semelhante à observada quando o agente removedor de manganês 1 é adicionado. Os controles negativos na linha inferior da figura 14 (sem adição de EDTA) mostram inibição normal na presença de removedor de manganês 1 e crescimento de levedura restaurado com manganês adicionado.

[230] Exemplo 9 mostra que um material quelante químico, como EDTA, tem o mesmo efeito que removedores de manganês selecionados de uma ou mais bactérias aqui divulgadas (figura 14). Portanto, o exemplo 9 demonstra que o EDTA tem o mesmo efeito que uma ou mais cepas de bactérias aqui divulgadas como removedores de manganês.

[231] Necrófagos de manganês, um material quelante químico e / ou um material biológico, como uma ou mais cepas de bactérias, quando presentes em um determinado produto, como um produto alimentício, levam à depleção de manganês para os fungos de deterioração, inibindo, portanto, o crescimento de fungos.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para inibição ou retardamento do crescimento de fungos em um produto, caracterizado pelo fato de que ele compreende a etapa de redução do manganês livre no produto a uma concentração abaixo de cerca de 0,01 ppm no produto, em que a etapa de redução do manganês livre no produto compreende a adição de um ou mais agente removedor de manganês, em que o agente removedor de manganês é uma ou mais cepas de bactérias e / ou um material quelante químico.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ele compreende ainda a etapa de medição da concentração de manganês livre no produto e obtenção de um valor abaixo de 0,01 ppm.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o fungo é levedura ou bolor.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o fungo é uma levedura selecionada a partir do grupo que consiste em Torulaspora spp., Cryptococcus spp., Saccharomyces spp., Yarrowia spp., Debaryomyces spp., Candida spp. and Rhodoturola spp. ou em que o fungo é um bolor selecionado do grupo que consiste em Aspergillus spp., Cladosporium spp., Didymella spp. ou Penicillium spp.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o produto é um produto alimentício.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o produto é um produto fermentado.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o produto é um produto alimentício fermentado termofílico ou mesofílico.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o manganês livre no produto é reduzido a uma concentração abaixo de cerca de 0,005 ppm.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa de redução do manganês livre no produto compreende o uso de cromatografia de troca iônica.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o material quelante químico é selecionado do grupo que consiste em ácido etilenodiaminotetraacético, ácido etilenoglicol-bis (β- aminoetil éter) -N, N, N ′, N′-tetraacético, ácido diaminociclohexanotetraacético, ácido nitrilotriacético, ácido 1,2-bis (o-aminofenoxi) etano-N, N, N ′, N′-tetraacético ou ácido dietilenotriaminopentaacético, preferivemente o material quelante químico é o ácido etilenodiaminotetraacético.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que ele compreende ainda a etapa de seleção de uma ou mais cepas de bactérias como agente removedor de manganês.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa de seleção compreende determinação se uma ou mais cepas de bactérias compreendem um transportador de manganês com pelo menos 55%, tal como pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80 %, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de qualquer uma das SEQ ID NO: 1-3.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa de seleção compreende determinação que uma ou mais cepas de bactérias estão livres de uma superóxido dismutase, preferivelmente livres de uma superóxido dismutase de manganês.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa de seleção compreende medição de uma atividade de absorção de manganês de uma ou mais cepas de bactérias.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa de redução do manganês livre compreende adição como um agente removedor de manganês, de uma ou mais bactérias de ácido láctico, opcionalmente selecionadas do grupo que consiste em Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus alimentarius, Pediococcus acidilactici, Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus kefiri.