BR112020018715A2 - Terapia de combinação para amiloidose associada a ttr - Google Patents

Terapia de combinação para amiloidose associada a ttr Download PDF

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Abstract

a presente invenção é direcionada a composições e métodos para o tratamento de amiloidose associada a transtiretina (ttr) e, em particular, composições e métodos que empregam uma quantidade eficaz de tolcapone e uma molécula de rnai em combinação para o tratamento de amiloidose associada a transtiretina.

Description

TERAPIA DE COMBINAÇÃO PARA AMILOIDOSE ASSOCIADA A TTR REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO
[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório dos EUA nº 62/641.747, depositado em 12 de março de 2018, cujo conteúdo é incorporado por referência na sua totalidade.
CAMPO DE INVENÇÃO
[002] A presente invenção é direcionada a composições e métodos para o tratamento de amiloidose associada a transtiretina (TTR) e, em particular, composições e métodos que empregam uma quantidade eficaz de tolcapone e pelo menos uma molécula de RNAi em combinação para o tratamento de amiloidose associada a transtiretina.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] A proteína transtirretina (TTR) é uma transportadora do líquido cefalorraquidiano e sérica do hormônio tireoidiano tiroxina e retinol. Mutações no gene TTR podem resultar em uma desestabilização da proteína TTR, levando à agregação anormal e amiloidose, ou seja, o acúmulo de proteínas amiloides em vários tecidos e órgãos. Especificamente, a desestabilização é entendida como resultante da dissociação da proteína homotetramérica em monômeros com tendência à agregação.
[004] Mais de 130 mutações amiloidogênicas no gene TTR foram identificadas. A grande maioria dessas mutações está localizada no éxon 2 a 4. A mutação mais comum (e geograficamente distribuída) envolve a substituição de metionina por valina na posição 30 (Val30Met). A deposição extracelular de agregados TTR de tipo selvagem e / ou variantes no coração, pulmão, trato gastrointestinal e nervos periféricos está associada com cardiomiopatia ATTR de tipo selvagem (amiloidose sistêmica senil (SSA)), polineuropatia ATTR hereditária (polineuropatia amiloidótica familiar (FAP)), cardiomiopatia ATTR hereditária (cardiomiopatia amiloide familiar (FAC)) e, mais raramente, ATTR-leptomeníngea hereditária (amiloidose do sistema nervoso central (CNSA)).
[005] Apesar do esforço considerável que tem sido feito no campo, permanece a necessidade de abordagens eficazes para o tratamento da amiloidose associada a TTR (ATTR).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] A invenção é dirigida a composições e métodos para o tratamento da amiloidose associada à transtirretina.
[007] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece uma composição que compreende (i) uma quantidade eficaz de tolcapone e (ii) uma quantidade eficaz de pelo menos uma molécula de RNAi.
[008] Em uma concretização, a molécula de RNAi é selecionada a partir do grupo que consiste em siRNA, miRNA, shRNA e combinações dos mesmos.
[009] Em uma concretização particular, a molécula de RNAi é um siRNA de fita dupla, em que (a) cada fita da molécula de siRNA tem cerca de 18 a cerca de 22 ribonucleotídeos de comprimento; e (b) uma fita da molécula de siRNA compreende uma sequência de ribonucleotídeo que é substancialmente complementar a uma sequência de mRNA que codifica a SEQ ID. NO: 1 ou um fragmento deste.
[0010] Em uma concretização particular, a molécula de RNAi é um siRNA de fita dupla, em que (a) cada fita da molécula de siRNA tem cerca de 18 a cerca de 22 ribonucleotídeos de comprimento; e (b) uma fita da molécula de siRNA compreende uma sequência de ribonucleotídeo que é totalmente complementar a uma sequência de mRNA que codifica SEQ ID. Nº: 1.
[0011] Em uma concretização, a molécula de RNAi é um l8-mer cego, um l9-mer cego, um 21-mer cego, um 23-mer cego, um 25-mer cego ou um 27-mer cego.
[0012] Em uma concretização, a molécula de RNAi contém pelo menos uma saliência de nucleotídeo. Em uma concretização particular, a saliência é uma saliência de dois nucleotídeos (2-nt) ou 3-nucleotídeos (3-nt) na extremidade 3' da molécula de RNAi, a extremidade 5' da molécula de RNAi ou ambos as extremidades 3’ e 5' da molécula de RNAi. Em uma concretização, a saliência de nucleotídeo compreende um ou mais não ribonucleotídeos.
[0013] Em uma concretização, a molécula de RNA compreende pelo menos uma modificação química selecionada do grupo que consiste em modificações de açúcar, modificações de base, modificações terminais, modificações de estrutura ou combinações das mesmas.
[0014] Em uma concretização particular, a molécula de RNAi compreende pelo menos uma modificação de açúcar e mais particularmente, uma modificação no anel de ribose ou um grupo substituinte do anel de ribose, ou substituição da fração de açúcar por uma fração de não açúcar.
[0015] Em um segundo aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende (i) uma quantidade eficaz de tolcapone; (ii) uma quantidade eficaz de pelo menos uma molécula de siRNAi e (iii) pelo menos um transportador farmacêutico.
[0016] Em uma concretização, a molécula de siRNA é conjugada a pelo menos um transportador farmacêutico. Em outra concretização, o siRNA é encapsulado ou associado de forma não covalente a pelo menos um transportador farmacêutico.
[0017] Em uma concretização particular, o pelo menos um transportador farmacêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em carboidratos, lipídios, peptídeos, proteínas, moléculas de ácido nucleico, polímeros sintéticos ou combinações dos mesmos.
[0018] Em uma concretização, o transportador farmacêutico é um nanocarreador. Em uma concretização particular, o nanocarreador compreende lipídios catiônicos, polímeros catiônicos, peptídeos catiônicos ou combinações dos mesmos.
[0019] Em uma concretização particular, a invenção fornece um lipoplex compreendendo um lipídio catiônico carregado positivamente e uma molécula de RNAi compreende uma sequência de ribonucleotídeo que é pelo menos substancialmente complementar a uma sequência de mRNA que codifica SEQ ID NO: 1.
[0020] Em outra concretização particular, a invenção fornece um poliplexo compreendendo um polímero catiônico e uma molécula de RNAi compreende uma sequência de ribonucleotídeo que é substancialmente complementar a uma sequência de mRNA que codifica SEQ ID NO: 1.
[0021] Em certas concretizações, a composição farmacêutica é direcionada a um determinado tecido, tipo de célula, compartimento celular ou combinação dos mesmos. Em uma concretização particular, a composição farmacêutica é direcionada ao fígado.
[0022] Em um terceiro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de amiloidose associada a transtiretina em um sujeito em necessidade, compreendendo a coadministração de (i) uma quantidade eficaz de tolcapone e (ii) uma quantidade eficaz de pelo menos uma molécula de RNAi, tratando assim a amiloidose associada à transtirretina
[0023] Em uma concretização particular, a amiloidose associada à transtiretina é polineuropatia ATTR hereditária (polineuropatia amiloide familiar (FAP)) ou cardiomiopatia ATTR hereditária (cardiomiopatia amiloide familiar (FAC)) ou uma mistura de manifestações da doença.
[0024] Em uma concretização, a forma de coadministração é selecionada a partir do grupo que consiste em administração simultânea, administração sequencial, administração sobreposta, administração de intervalo, administração contínua ou uma combinação das mesmas.
[0025] Em uma concretização, o tolcapone e a molécula de RNAi têm horários de dosagem diferentes.
[0026] Em uma concretização particular, o tolcapone e a molécula de RNAi são coadministrados sistemicamente. Em uma concretização, o tolcapone é administrado por via oral e a molécula de RNAi é administrada por injeção intravenosa.
[0027] Em uma concretização particular, o tolcapone e a molécula de RNAi são coadministrados em diferentes formas de dosagem unitária. Em uma concretização, o tolcapone é administrado como uma forma de dosagem unitária sólida (por exemplo, um comprimido ou cápsula) e a molécula de RNAi é administrada como uma forma de dosagem unitária líquida (por exemplo, uma injeção intravenosa ou subcutânea).
[0028] Em uma concretização, o tolcapone e a molécula de RNAi são coadministrados em uma dose única. Em outra concretização, o tolcapone e a molécula de RNAi são coadministrados em doses múltiplas.
[0029] Em uma concretização, a coadministração produz um efeito sinérgico, ou seja, um efeito terapêutico que é maior do que a soma dos efeitos terapêuticos dos componentes individuais da combinação. Em outra concretização, a coadministração produz um efeito aditivo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições
[0030] "G" "" "A," "T" e "U" representam cada um, de uma forma geral, um nucleotídeo que contém guanina, citosina, adenina, timidina e uracila como base, respectivamente. "T" e "dT" são usados indistintamente aqui e referem-se a um desoxirribonucleotídeo em que a nucleobase é timina, por exemplo, desoxirribotimina. No entanto, será entendido que o termo "ribonucleotídeo" ou "nucleotídeo" também pode se referir a um nucleotídeo modificado, como mais detalhado abaixo, ou uma porção de substituição substituta. Guanina, citosina, adenina e uracila podem ser substituídas por outras porções sem alterar substancialmente as propriedades de emparelhamento de base de um oligonucleotídeo compreendendo um nucleotídeo portando tal porção de substituição. Por exemplo, sem limitação, um nucleotídeo compreendendo inosina como sua base pode emparelhar com nucleotídeos contendo adenina, citosina ou uracila. Portanto, os nucleotídeos contendo uracila, guanina ou adenina podem ser substituídos nas sequências de nucleotídeos do dsRNA apresentado na invenção por um nucleotídeo contendo, por exemplo, inosina. Em outro exemplo, a adenina e a citosina em qualquer lugar do oligonucleotídeo podem ser substituídas por guanina e uracila, respectivamente para formar o par de bases GU Wobble com o mRNA alvo. As sequências contendo tais porções de substituição são adequadas para as composições e métodos apresentados na invenção. Em outro exemplo, a adenina e a citosina em qualquer lugar do oligonucleotídeo podem ser substituídas por guanina e uracila, respectivamente para formar o par de bases GU Wobble com o mRNA alvo. As sequências contendo tais porções de substituição são adequadas para as composições e métodos apresentados na invenção. Em outro exemplo, a adenina e a citosina em qualquer lugar do oligonucleotídeo podem ser substituídas por guanina e uracila, respectivamente para formar o par de bases GU Wobble com o mRNA alvo. As sequências contendo tais porções de substituição são adequadas para as composições e métodos apresentados na invenção.
[0031] O termo "administração", tal como aqui utilizado, se refere a fornecer agente (s) terapêutico (s) a um sujeito e inclui, mas não está limitado a, administração por um profissional médico e autoadministração.
[0032] O termo "agente anti-amiloide", tal como aqui utilizado, se refere a um agente que é capaz de produzir uma resposta imunitária contra um componente da placa amiloide num sujeito vertebrado, quando administrado por técnicas de imunização ativa ou passiva.
[0033] O termo "fita antissenso", tal como aqui utilizado, se refere à fita de um dsRNA que inclui uma região que é pelo menos substancialmente complementar à sequência alvo. Tal como aqui utilizado, o termo "região de complementaridade" se refere à região na cadeia antissenso que é pelo menos substancialmente complementar a uma sequência, por exemplo, uma sequência alvo. Onde a região de complementaridade não é totalmente complementar à sequência alvo, as incompatibilidades estão tipicamente em regiões terminais e, se presentes, estão geralmente em uma região ou regiões terminais, por exemplo, dentro de 6, 5, 4, 3 ou 2 nucleotídeos de extremidade 5' e / ou 3'.
[0034] O termo "expressão atenuante", tal como aqui utilizado com referência ao gene TTR ou mRNA que codifica a proteína TTR, significa administrar ou expressar uma quantidade de RNA interferente (por exemplo, um siRNA) para reduzir a tradução do mRNA TTR na proteína TTR, seja através clivagem do mRNA ou através da inibição direta da tradução. O gene TTR pode ser de tipo selvagem ou mutante. Os termos "inibir", "silenciar" e "atenuar", tal como aqui utilizados, referem-se a uma redução mensurável na expressão do mRNA de TTR ou a proteína correspondente em comparação com a expressão do mRNA de TTR ou a proteína TTR correspondente na ausência de um RNA interferente. A redução na expressão do mRNA de TTR ou da proteína correspondente é comumente referida como "knock-down" e é relatado em relação aos níveis presentes após a administração ou expressão de um RNA de controle sem direcionamento (por exemplo, um siRNA de controle sem direcionamento). A redução da expressão de uma quantidade incluindo e entre 50% e 100% é contemplada pelas concretizações aqui. No entanto, não é necessário que tais níveis de redução sejam atingidos para os fins da presente invenção. A atenuação da expressão do TTR por uma molécula de RNAi pode ser inferida em um ser humano ou outro mamífero, observando uma melhora nos sintomas de amiloidose associada a TTR.
[0035] O termo "cego" ou "ponta cega", tal como aqui utilizado em referência a um dsRNA, significa que não há nucleotídeos desemparelhados ou análogos de nucleotídeos em uma determinada extremidade terminal de um dsRNA, ou seja, nenhuma saliência de nucleotídeos. Uma ou ambas as extremidades de um dsRNA podem ser cegas. Onde ambas as extremidades de um dsRNA são cegas, diz-se que o dsRNA é cego. Para ser claro, um dsRNA de "extremidade cega" é um dsRNA cego em ambas as extremidades, ou seja, nenhum nucleotídeo saliente em nenhuma das extremidades da molécula. Na maioria das vezes, essa molécula terá fita dupla em todo o seu comprimento.
[0036] O termo "inibidor de catecol-O- metiltransferase" ou "inibidor de COMT" se refere a compostos que inibem a ação da catecol-O-metil transferase, uma enzima que está envolvida na degradação de neurotransmissores (Mannisto e Kaakkola, Pharm. Rev., 1999, vol 51, pág. 593- 628). A atividade do inibidor de COMT pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, o método divulgado em Zurcher et al (Biomedical Chromatography, 1996, vol. 10, p. 32-36). Vários inibidores da COMT foram descritos. Tolcapone, entacapone e nitecapone pertencem ao assim chamado “Inibidores da COMT de segunda geração”, que se mostraram potentes, altamente seletivos e inibidores da COMT ativos por via oral. O nitrocatecol é a estrutura chave nestas moléculas (Pharm. Rev., 1999, vol 51, p. 593-628, supra).
[0037] O termo "modificação química", tal como aqui utilizado, se refere a qualquer modificação da estrutura química dos nucleotídeos que difere dos nucleotídeos de RNA nativo ou moléculas de RNAi. A modificação pode atingir qualquer resultado pretendido, incluindo um aumento na afinidade e / ou resistência de nuclease. Em certas concretizações, o termo "modificação química" pode se referir a certas formas de RNA que ocorrem naturalmente em certos sistemas biológicos, por exemplo, modificações 2'-0- metil ou modificações da inosina.
[0038] O termo "região de codificação" se refere à porção do gene TTR ou mRNA que codifica naturalmente ou normalmente para o produto de expressão do gene em seu ambiente genômico natural, ou seja, a região que codifica in vivo para o produto de expressão nativa do gene , ou seja, a proteína TTR. A região codificadora do gene (e a região codificadora do mRNA) começa com um códon de iniciação: ATG no DNA e AUG no código do mRNA para o aminoácido metionina, Met. A região de codificação de um gene sempre termina com um códon de parada TAA, TAG ou TGA (no mRNA, esses têm um U em vez de um T). A sequência entre os códons de início e término contém nucleotídeos em múltiplos de três, codificando a sequência de aminoácidos na proteína.
[0039] O termo "coadministração", tal como aqui utilizado, se refere à administração de dois ou mais agentes terapêuticos (por exemplo, um estabilizador cinético TTR e um silenciador genético TTR) juntos de uma forma coordenada. Por exemplo, a coadministração pode ser administração simultânea, administração sequencial, administração sobreposta, administração de intervalo, administração contínua ou uma combinação das mesmas.
[0040] O termo "complementar", tal como aqui utilizado, se refere à capacidade dos polinucleotídeos de formar pares de bases uns com os outros. Os pares de bases são normalmente formados por ligações de hidrogênio entre unidades de nucleotídeos em fitas polinucleotídicas antiparalelas. Cadeias polinucleotídicas complementares podem emparelhar de maneira Watson-Crick (por exemplo, A a T, A a U, C a G), ou de qualquer outra maneira que permita a formação de duplexes. Ao usar o RNA em oposição ao DNA, o uracil, em vez do que a timina é a base considerada complementar à adenosina. No entanto, quando uma U é denotada no contexto da presente invenção, a capacidade de substituir um T está implícita, salvo indicação em contrário. Complementaridade perfeita ou complementaridade 100% se refere à situação em que cada unidade de nucleotídeo de uma fita polinucleotídica pode fazer uma ligação de hidrogênio com uma unidade de nucleotídeo de uma segunda fita polinucleotídica. Complementaridade menos que perfeita se refere à situação em que algumas, mas não todas, unidades de nucleotídeos de duas fitas podem se ligar por hidrogênio. Por exemplo, para dois 20-meros, se apenas dois pares de bases em cada fita puderem fazer uma ligação de hidrogênio entre si, as fitas polinucleotídicas exibirão complementaridade de 10%. No mesmo exemplo, se 18 pares de bases em cada fita podem fazer ligações de hidrogênio entre si, as cadeias polinucleotídicas exibem complementaridade de 90%. Tal como aqui utilizado, "substancialmente complementar" significa que em um par hibridizado de nucleobases ou moléculas de sequência de nucleotídeos, pelo menos 85%, mas não todas, as bases em uma sequência contígua de um primeiro oligonucleotídeo irão hibridizar com o mesmo número de bases em uma sequência contígua de um segundo oligonucleotídeo. A sequência contígua pode compreender a totalidade ou parte de uma primeira ou segunda sequência de nucleotídeos. Tal como aqui utilizado, "parcialmente complementar" significa que em um par hibridizado de nucleobases ou moléculas de sequência de nucleotídeos, pelo menos 70%, mas não todas, das bases em uma sequência contígua de um primeiro oligonucleotídeo irão hibridizar com o mesmo número de bases em uma sequência contígua de um segundo oligonucleotídeo.
[0041] O termo "RNA de fita dupla" ou "dsRNA", como aqui utilizado, se refere a um complexo de moléculas de ácido ribonucleico, tendo uma estrutura duplex que compreende duas fitas de ácido nucleico antiparalelas e substancialmente complementares, conforme definido acima. Em geral, a maioria dos nucleotídeos de cada fita são ribonucleotídeos, mas opcionalmente, cada uma ou ambas as fitas também podem incluir pelo menos um não-ribonucleotídeo, por exemplo, um desoxirribonucleotídeo e / ou um nucleotídeo modificado. Além disso, tal como aqui utilizado, "dsRNA" pode incluir modificações químicas em ribonucleotídeos, incluindo modificações substanciais em vários nucleotídeos e incluindo todos os tipos de modificações aqui divulgadas ou conhecidas na técnica. Uma molécula de dsRNA não precisa ser completamente de fita dupla, mas compreende pelo menos uma região de fita dupla que compreende pelo menos um elemento de silenciamento de fita dupla funcional.
[0042] O termo "quantidade eficaz", tal como aqui utilizado, significa a quantidade de um composto que, quando administrado a um mamífero ou outro sujeito para o tratamento de uma doença, é suficiente para efetuar tal profilaxia ou tratamento para a doença. A "quantidade terapeuticamente eficaz" ou “Quantidade profilaticamente eficaz” irá variar dependendo do composto, da doença e de sua gravidade e da idade, peso, etc., do sujeito.
[0043] O termo "equivalente", tal como aqui utilizado com referência a um resíduo de aminoácido, se refere a um aminoácido capaz de substituir outro resíduo de aminoácido em um polipeptídeo sem alterar substancialmente a estrutura e / ou funcionalidade do polipeptídeo. Os aminoácidos equivalentes, portanto, têm propriedades semelhantes, como volume da cadeia lateral, polaridade da cadeia lateral (polar ou não polar), hidrofobicidade (hidrofóbica ou hidrofílica), pH (ácido, neutro ou básico) e organização da cadeia lateral de moléculas de carbono
(aromático / alifático). Como tal, "resíduos de aminoácidos equivalentes" podem ser considerados como "substituições de aminoácidos conservativas".
[0044] O termo "vetor de expressão", tal como aqui utilizado, se refere a uma molécula de ácido nucleico que codifica um gene que é expresso em uma célula hospedeira. Normalmente, um vetor de expressão compreende um promotor de transcrição, um gene e um terminador de transcrição. A expressão do gene é geralmente colocada sob o controle de um promotor, e tal gene é dito estar "operacionalmente ligado ao" promotor. Da mesma forma, um elemento regulador e um promotor de núcleo estão operacionalmente ligados se o elemento regulador modula a atividade do promotor de núcleo. Os vetores mais simples chamados "vetores de transcrição" são apenas capazes de ser transcritos, mas não traduzidos: eles podem ser replicados em uma célula-alvo, mas não expressos, ao contrário dos vetores de expressão. Os vetores de transcrição são usados para amplificar sua inserção.
[0045] O termo "silenciador de gene", tal como aqui utilizado, se refere a uma atenuação da expressão gênica e, mais particularmente, uma redução mensurável na expressão do mRNA ou proteína correspondente em comparação com a expressão do mRNA ou proteína correspondente na ausência de um RNA interferente.
[0046] O termo "fita guia", tal como aqui utilizado, se refere a uma molécula de ácido nucleico de fita simples de uma molécula de dsRNAi que tem uma sequência suficientemente complementar àquela de um RNA alvo para resultar em interferência de RNA. Em algumas concretizações, a clivagem de Dicer não é necessária para a incorporação de um fio guia em RISC. Em algumas concretizações, após a clivagem da molécula de dsRNAi por Dicer, um fragmento da fita guia permanece associado a RISC, se liga a um RNA alvo como um componente do complexo RISC e promove a clivagem de um RNA alvo por RISC. Uma fita guia é uma fita antissenso.
[0047] O termo "isolado", conforme usado neste documento, se refere a uma molécula que é substancialmente separada de seu ambiente natural.
[0048] O termo "estabilizador cinético" se refere a um composto ou composição que tem a capacidade de prevenir a dissociação pós-secretória e agregação da proteína TTR ao retardar a dissociação do tetrâmero TTR. Em certas concretizações, o estabilizador cinético é uma pequena molécula que ocupa um sítio (s) de ligação de TTR T 4 a fim de estabilizar o estado tetramérico nativo de TTR sobre o estado de transição dissociativa, aumentando a barreira cinética, impondo estabilização cinética no tetrâmero e prevenção da amiloidogênese.
[0049] O termo "lipolex", tal como aqui utilizado, se refere a um complexo que compreende um lipídio catiônico carregado positivamente (citofectina) e um ácido nucleico. Uma formulação de lipoplex pode ser usada para entregar um agente de ácido nucleico às células para induzir um efeito desejado.
[0050] O termo "entrega local", tal como aqui utilizado, se refere à entrega de um agente terapêutico diretamente a um local alvo dentro de um sujeito.
[0051] O termo "molécula de microRNA", "microRNA" ou "miRNA", tal como aqui utilizado, se refere a moléculas de RNA de fita simples, tipicamente de cerca de 21-23 nucleotídeos de comprimento, que são capazes de modular a expressão gênica. Moléculas de miRNA maduras são parcialmente complementares a uma ou mais moléculas de RNA mensageiro (mRNA), e sua função principal é diminuir a expressão gênica.
[0052] O termo "TTR não nativo", tal como aqui utilizado, se refere a conformações estruturais de TTR que estão associadas à formação de agregados de TTR, incluindo fibrilas amiloides.
[0053] O termo "saliência de nucleotídeo", tal como aqui utilizado, se refere a pelo menos um nucleotídeo desemparelhado que se projeta da estrutura duplex de um ácido nucleico inibitório, por exemplo, um dsRNA. Por exemplo, quando uma extremidade 3 'de uma fita de um ácido nucleico inibidor de fita dupla se estende além da extremidade 5' da outra fita, ou vice-versa, há uma saliência de nucleotídeo. Um ácido nucleico inibidor de fita dupla pode compreender uma saliência de pelo menos um nucleotídeo; alternativamente, a saliência pode compreender pelo menos dois nucleotídeos, pelo menos três nucleotídeos, pelo menos quatro nucleotídeos, pelo menos cinco nucleotídeos ou mais. Uma saliência de nucleotídeo pode compreender ou consistir em um análogo de nucleotídeo / nucleosídeo, incluindo um desoxinucleotídeo / nucleosídeo. As saliências podem estar na fita sense, na fita anti-sense ou em qualquer combinação das mesmas.
[0054] Além disso, o (s) nucleotídeo (s) de uma saliência podem estar presentes na extremidade 5 ', extremidade 3' ou em ambas as extremidades de uma fita antissenso ou de sentido de um ácido nucleico inibidor de fita dupla. Em certas concretizações, a saliência é uma saliência de extremidade 3' ou 5' na fita antissenso ou fita senso.
[0055] O termo "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo", tal como aqui utilizado, se refere a um polímero de fita simples ou dupla de bases desoxirribonucleotídicas ou ribonucleotídicas lidas da extremidade 5' a 3'. A molécula de ácido nucleico da presente invenção abrange ácido nucleico natural, ácido nucleico artificial e suas misturas.
[0056] O termo "evento no alvo", tal como aqui utilizado, significa que o mRNA de TTR é impactado, isto é, derrubado, pelo RNAi projetado para direcionar o gene TTR como evidenciado por expressão reduzida, níveis reduzidos de mRNA, ou perda ou ganho de um fenótipo particular. Um evento "no alvo" pode ser verificado por meio de outro método, como o uso de uma droga que é conhecida por afetar o alvo, ou como o resgate de um fenótipo perdido pela introdução do mRNA de TTR de um ortólogo, por exemplo.
[0057] O termo "evento fora do alvo", conforme usado neste relatório descritivo, significa que qualquer evento diferente do evento desejado na interferência de RNA.
[0058] As subunidades nos referidos oligômeros compõem o TTR de tipo selvagem. Em outras concretizações, as subunidades nos referidos oligômeros compõem uma mistura de monômeros TTR mutantes e de tipo selvagem ou monômeros truncados.
[0059] O termo "transportador farmaceuticamente aceitável", tal como aqui utilizado, se refere a um significado, uma composição ou formulação que permite a distribuição eficaz do agente terapêutico para o local físico mais adequado para sua atividade desejada. Inclui materiais, composições ou veículos farmaceuticamente aceitáveis, como um enchimento líquido ou sólido, diluente, solvente ou material encapsulante envolvido no transporte ou transporte de qualquer composição em questão, de um órgão, ou porção do corpo, para outro órgão, ou porção de o corpo. Cada transportador deve ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes de uma composição em questão e não ser prejudicial ao paciente.
[0060] O termo "composição farmacêutica", tal como aqui utilizado, pretende abranger uma composição adequada para administração a um sujeito, como um mamífero, especialmente um humano. Em geral, uma "composição farmacêutica" é preferencialmente estéril e livre de contaminantes que são capazes de induzir uma resposta indesejável no sujeito (por exemplo, o (s) composto (s) na composição farmacêutica é de qualidade farmacêutica).
[0061] O termo "sal farmaceuticamente aceitável" de um composto significa um sal que é farmaceuticamente aceitável e que possui a atividade farmacológica desejada do composto original.
[0062] O termo "solvato ou hidrato farmaceuticamente aceitável" de um composto da invenção significa um complexo de solvato ou hidrato que é farmaceuticamente aceitável e que possui a atividade farmacológica desejada do composto original e inclui, mas não está limitado a, complexos de um composto da invenção com um ou mais solvente ou moléculas de água, ou 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 10, ou um a cerca de 2, 3 ou 4, solvente ou moléculas de água.
[0063] O termo "porcentagem de identidade de sequência (%)" com respeito a qualquer sequência de nucleotídeos aqui identificada é definido como a porcentagem de resíduos de nucleotídeos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de nucleotídeos na sequência de nucleotídeos específica, após o alinhamento das sequências e a introdução de lacunas , se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação de identidade de sequência percentual pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente, como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR).
[0064] O termo "poliplexo", tal como aqui utilizado, se refere a um complexo que compreende um polímero catiônico
[0065] (por exemplo, polietileniminas) e um ácido nucleico. Uma formulação de lipoplex pode ser usada para entregar um agente de ácido nucleico às células para induzir um efeito desejado.
[0066] O termo "potência", tal como aqui utilizado com referência a uma molécula de RNAi, é uma medida da concentração de um indivíduo ou um pool do RNAi necessário para derrubar o mRNA de TTR para 50% do nível de mRNA inicial. Geralmente, a potência é descrita em termos de IC50, a concentração de RNAi necessária para metade do máximo (50%) da inibição do mRNA.
[0067] O termo "pró-fármaco", tal como aqui utilizado, pretende abranger compostos que, sob condições fisiológicas, são convertidos nos agentes terapeuticamente ativos da presente invenção. Um método comum para fazer um pró-fármaco é incluir porções selecionadas que são hidrolisadas sob condições fisiológicas para revelar a molécula desejada. Em outras concretizações, o pró-fármaco é convertido por uma atividade enzimática do animal hospedeiro.
[0068] O termo "promotor", tal como aqui utilizado, se refere a uma sequência de nucleotídeos que direciona a transcrição de um gene estrutural. Normalmente, um promotor está localizado na região 5 'não codificante de um gene, próximo ao local de início da transcrição de um gene estrutural. Os elementos da sequência dentro de promotores que funcionam na iniciação da transcrição são frequentemente caracterizados por sequências de nucleotídeos de consenso. Se um promotor é um promotor induzível, então a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente indutor. Em contraste, a taxa de transcrição não é regulada por um agente indutor se o promotor for um promotor constitutivo. Promotores reprimíveis também são conhecidos.
[0069] O termo "recombinante", tal como aqui utilizado com referência a uma molécula de RNA, se refere a uma molécula de RNA produzida por técnicas de DNA recombinante; isto é, produzida a partir de células transformadas por uma construção de DNA exógeno que codifica o RNA desejado.
[0070] O termo "RNA", tal como aqui utilizado, se refere a RNA se refere a uma molécula que compreende pelo menos uma fração de ribofuranosídeo. O termo pode incluir RNA de fita dupla, RNA de fita simples, RNA isolado, tal como RNA parcialmente purificado, RNA essencialmente puro, RNA sintético, RNA produzido de forma recombinante, bem como RNA alterado que difere do RNA de ocorrência natural pela adição, deleção, substituição e / ou alteração de um ou mais nucleotídeos. Essas alterações podem incluir a adição de material não nucleotídico, tal como à (s) extremidade (s) do siNA ou internamente, por exemplo, em um ou mais nucleotídeos do RNA. Os nucleotídeos nas moléculas de RNA da presente invenção também podem compreender nucleotídeos não padronizados, tais como nucleotídeos de ocorrência não natural ou nucleotídeos sintetizados quimicamente ou desoxinucleotídeos. Esses RNAs alterados podem ser referidos como análogos ou análogos de RNA de ocorrência natural.
[0071] O termo "interferência de RNA" ou "RNAi" se refere a um mecanismo de silenciamento de gene específico de sequência. Na primeira etapa, o RNA desencadeador (transcrito primário de dsRNA ou miRNA) é processado em um pequeno RNA de interferência (siRNA) pelas enzimas RNase II Dicer e Drosha. Na segunda etapa, os siRNAs são carregados no complexo efetor do complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). O siRNA é desenrolado durante a montagem do RISC e o RNA de fita simples hibridiza com o mRNA alvo. O silenciamento do gene é o resultado da degradação nucleolítica do mRNA direcionado pela enzima RNase H Argonaute (Sheer). Se o duplex de siRNA / mRNA contém incompatibilidades, o mRNA não é clivado. Em vez disso, o silenciamento do gene é resultado da inibição da tradução. Além de moléculas de siRNA, outras moléculas de RNA interferentes e moléculas semelhantes a RNA podem interagir com RISC e silenciar a expressão gênica. Exemplos de outras moléculas de RNA interferentes que podem interagir com RISC incluem RNAs em gancho curto (shRNAs), siRNAs de fita simples, microRNAs (miRNAs) e duplexes dicer-substrato 27-mer. Exemplos de moléculas semelhantes a RNA que podem interagir com RISC incluem siRNA, siRNA de fita simples, microRNA e moléculas de shRNA contendo um ou mais nucleotídeos quimicamente modificados, um ou mais não nucleotídeos, um ou mais desoxirribonucleotídeos e / ou um ou mais ligações não fosfodiéster. Todas as moléculas de RNA ou semelhantes a RNA que podem interagir com RISC e participar em alterações relacionadas a RISC na expressão gênica são aqui referidas como "RNAs interferentes" ou "moléculas de RNA interferentes". SiRNAs, siRNAs de fita simples, shRNAs, miRNAs e duplexes dicer-substrato 27-mer são, portanto, subconjuntos de "RNAs interferentes".
[0072] O termo "molécula de RNAi", tal como aqui utilizado, se refere a uma molécula de RNA que pode induzir interferência de RNA in vivo e inibir a expressão de um gene alvo.
[0073] O termo "processamento de RNA", tal como aqui utilizado, se refere a atividades de processamento realizadas por componentes das vias siRNA, miRNA ou RNase H (por exemplo, Drosha, Dicer, Argonaute2 ou outras endoribonucleases RISC e RNaseH). O termo é explicitamente distinto dos processos pós-transcricionais de capeamento 5 'do RNA e degradação do RNA via processos não mediados por RISC ou não RNase H.
[0074] O termo "marcador selecionável", tal como aqui utilizado, se refere a qualquer gene que confere um fenótipo a uma célula na qual é expresso para facilitar a identificação e / ou seleção de células que são transfectadas ou transformadas com uma construção genética. Exemplos representativos de marcadores selecionáveis incluem o gene de resistência à ampicilina, gene de resistência à tetraciclina, gene de resistência à canamicina bacteriana, gene de resistência à zeocina, gene AURI-C que confere resistência ao antibiótico aureobasidina A, gene de resistência à fosfinotricina, gene de neomicina fosfotransferase (nptll), gene de resistência à higromicina, gene da beta-glucuronidase (GUS), gene da cloranfenicol acetiltransferase (CAT), gene que codifica a proteína fluorescente verde e gene da luciferase.
[0075] O termo "fita senso", tal como aqui utilizado, se refere à fita de um dsRNA que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma região da fita antissenso.
[0076] O termo "RNA em gancho curto" ou "shRNA", tal como aqui utilizado, se refere a moléculas de RNA com uma sequência de RNA que faz uma curva em gancho apertada que pode ser usada para silenciar a expressão gênica via interferência de RNA. A estrutura em gancho do shRNA é clivada pela maquinaria celular em siRNA, que é então ligada ao complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Este complexo se liga e cliva os mRNAs que correspondem ao siRNA que está ligado a ele. O shRNA é transcrito pela RNA Polimerase III, enquanto o miRNA é transcrito pela RNA Polimerase II.
[0077] Os termos "silenciar" ou "inibir a expressão de", "regular negativamente a expressão de", "suprimir a expressão de" e semelhantes, na medida em que se referem ao gene TTR, aqui referem-se a pelo menos supressão parcial da expressão de um gene alvo, conforme manifestado por uma redução da quantidade de mRNA de TTR que pode ser isolado ou detectado em uma primeira célula ou grupo de células em que o gene TTR é transcrito e que foi ou foi tratado tal que a expressão do gene alvo é inibida, em comparação com uma segunda célula ou grupo de células substancialmente idêntico à primeira célula ou grupo de células, mas que foi ou não tratado (células de controle).
[0078] O termo "pequeno RNA de interferência" ou "siRNA", tal como aqui utilizado, se refere a pequenos duplexes de RNA inibitório que induzem a via de interferência de RNA (RNAi). A molécula consiste em uma fita sense (fita passageira) incluindo uma sequência de nucleotídeos correspondente a uma parte de um gene alvo e uma fita anti- sentido (fita guia) do mesmo. Os siRNAs podem ser sintéticos ou processados a partir de precursores de fita dupla (dsRNAs) com duas fitas distintas de RNA pareado.
[0079] Os siRNAs que são derivados de sequências repetitivas no genoma são chamados de rasiRNAs.
[0080] O termo "especificidade", tal como aqui utilizado com referência ao siRNA, é uma medida da precisão com a qual um siRNA impacta a regulação do gene no nível do mRNA ou nível da proteína, ou o verdadeiro fenótipo exibido pelo knockdown da função do gene TTR.
[0081] O termo "sujeito" aqui utilizado significa um mamífero que pode ter uma necessidade dos métodos, composições e tratamentos farmacêuticos descritos neste documento. Sujeitos e pacientes, portanto, incluem, sem limitação, primatas (incluindo humanos), caninos, felinos, ungulados (por exemplo, equino, bovino, suíno (por exemplo, porco)) e outros sujeitos. Animais humanos e não humanos com importância comercial (por exemplo, gado e animais domésticos) são de particular interesse.
[0082] O termo "substancialmente complementar", tal como aqui utilizado, se refere a sequências de nucleotídeos em que a maioria (por exemplo, pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) ou todos das bases na sequência são complementares, ou uma ou mais (por exemplo, não mais que 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1%) as bases são não complementares ou incompatíveis.
[0083] O termo "sinérgico", conforme usado neste relatório descritivo, se refere a uma combinação que é mais eficaz do que os efeitos aditivos de quaisquer dois ou mais agentes únicos. Um efeito sinérgico pode permitir o tratamento eficaz de uma doença usando quantidades (doses) mais baixas de terapia individual. As doses mais baixas resultam em menor toxicidade sem eficácia reduzida. Além disso, um efeito sinérgico pode resultar em maior eficácia. Finalmente, a sinergia pode resultar em uma melhor prevenção ou redução da doença em comparação com qualquer terapia única.
[0084] Conforme usado aqui, o termo "sintético" se refere a um material preparado por síntese química.
[0085] O termo "entrega sistêmica", tal como aqui utilizado, se refere à entrega de um agente terapêutico que leva a uma ampla distribuição dentro do sujeito. A ampla distribuição geralmente requer que o agente não seja degradado ou depurado rapidamente (como por órgãos de primeira passagem (fígado, pulmão, etc.) ou por ligação celular não específica rápida) antes de atingir um local da doença distal ao local de administração.
[0086] O termo "alvo" é usado em uma variedade de maneiras diferentes aqui e é definido pelo contexto em que é usado, mas geralmente se refere a qualquer sequência de ácido nucleico cuja expressão ou atividade deve ser modulada. "RNA alvo" se refere a um RNA que seria sujeito a modulação guiada pela fita antisense, como clivagem direcionada ou bloqueio estérico. O RNA alvo poderia ser, por exemplo, RNA viral genômico, mRNA, um pré-mRNA ou um RNA não codificante. “MRNA alvo" se refere a um RNA mensageiro contra o qual uma dada molécula de RNAi pode ser direcionada. "Sequência alvo" e “sítio alvo" se referem a uma sequência dentro do RNA / mRNA para a qual a fita antisense de uma molécula de siRNA exibe vários graus de complementaridade A frase "alvo de RNAi" pode referir-se ao gene, mRNA ou proteína contra a qual uma molécula de RNA é dirigida.
[0087] Os termos "TTR tetramérica" e "TTR nativo" são usados indistintamente aqui para se referir a uma proteína formada pela associação de quatro monômeros de TTR.
[0088] O termo "agente terapêutico" ou "agente farmaceuticamente ativo" tal como aqui utilizado se refere a um composto ou outro agente que, após administração a um mamífero em uma quantidade terapeuticamente eficaz, fornece um benefício terapêutico ao mamífero.
[0089] O termo "tratar", tal como aqui utilizado, significa um alívio, no todo ou em parte, dos sintomas associados a um distúrbio ou doença, ou desaceleração ou parada de progressão ou agravamento desses sintomas, ou prevenção ou profilaxia da doença ou distúrbio em um paciente em risco de desenvolver a doença ou distúrbio.
[0090] O termo "forma de dosagem unitária", tal como aqui utilizado, se refere a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para seres humanos e animais, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de compostos da presente invenção calculada em uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado em associação com um diluente, transportador ou veículo farmaceuticamente aceitável. As especificações para as novas formas de dosagem unitária da presente invenção dependem do composto particular empregado e do efeito a ser alcançado, e da farmacodinâmica associada a cada composto no hospedeiro.
[0091] O termo "VaBOMet" se refere a uma mutação do gene TTR comum, envolvendo uma substituição de metionina por valina na posição 30 na proteína TTR madura (ou posição 50 na proteína TTR incluindo o peptídeo sinal).
[0092] O termo "vetor", tal como aqui utilizado, se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de mediar a entrada (por exemplo, transferência, transporte, etc.) de uma segunda molécula de ácido nucleico em uma célula. O ácido nucleico transferido está geralmente ligado (por exemplo, inserido) à molécula de ácido nucleico do vetor. Um vetor pode incluir sequências que direcionam a replicação autônoma ou pode incluir sequências suficientes para permitir a integração no DNA celular. Transtiretina (TTR)
[0093] TTR (também conhecido como pré-albumina, HsT265l, PALB e TBPA) transporta 15-20% da tiroxina circulante (T4). e a proteína de ligação ao retinol (RPB). (Blake C. et ah, JMol Biol. 1978; 121: 339-356). Ele circula no sangue como um homotetrâmero de 55kD. [Klabunde et ah, Nat. Struct. Biol. 7: 312-321 (2000)]. A concentração no plasma humano está entre 0,20-0,40 g / L [Hamilton et ah, Cell Mol Life Sci 2001, 58: 1491-1521].
[0094] Cada subunidade (monômero) é composta por 127 subunidades de aminoácidos caracterizadas por duas folhas b antiparalelas de quatro fitas e uma hélice a curta. A associação de dois monômeros por meio de suas fitas beta de borda forma um sanduíche beta estendido. A associação adicional de dois desses dímeros de forma face a face produz a estrutura homotetramérica e cria os dois locais de ligação de T4 por tetrâmero. A estrutura cristalina de raios X do TTR humano é conhecida (Blake, C. et al. (1974) J Mol Biol 88, 1-12. 88, 1-12).
[0095] A sequência da proteína TTR humana madura é:
GPTGTGESKCPLMVKVLDAVRGSPAINVAVHVFRKAADDTWEPFASGKTSESGELHGLT
TEEEFVEGIYKVEIDTKSYWKALGISPFHEHAEVVFTANDSGPRRYTIAALLSPYSYST TAVVTNPKE (SEQ ID NO: 1).
[0096] Em uma concretização, o mRNA que codifica a proteína TTR humana madura está previsto para ser: ggcccgaccggcaccggcgaaagcaaatgcccgctgatggtgaaagtgctggatgcggt gcgcggcagcccggcgattaacgtggcggtgcatgtgtttcgcaaagcggcggatgata cctgggaaccgtttgcgagcggcaaaaccagcgaaagcggcgaactgcatggcctgacc accgaagaagaatttgtggaaggcatttataaagtggaaattgataccaaaagctattg gaaagcgctgggcattagcccgtttcatgaacatgcggaagtggtgtttaccgcgaacg atagcggcccgcgccgctataccattgcggcgctgctgagcccgtatagctatagcacc accgcggtggtgaccaacccgaaagaa (SEQ ID NO: 2).
[0097] Uma única cópia do gene TTR de 6,8 kbp está localizada no braço longo do cromossomo 18 18ql 1.2-
12.1). Possui uma caixa TATAA e sítios de ligação para HNF- 1, 3 e -4. O TTR é expresso principalmente no fígado (> 95%).
[0098] Existem inúmeras doenças associadas a TTR, a maioria das quais são doenças amiloides. Mais de 100 mutações desestabilizadoras identificadas. (Connors LH, et al., 2003. Amyloid. 2003; 10: 160-184). Quase todas essas mutações desestabilizadoras são mutações pontuais.
[0099] Exemplos de mutações pontuais associadas a AMYL-TTR na proteína TTR madura incluem 10 (C → R); posição 12 (L → P); posição 18 (D → E); posição 18 (D → G); posição 20 (V → I); posição 23 (S → N); posição 24 (P → S); posição 28 (V → M); posição 30 (V → L ); posição 30 (V → M); posição 30 (V → G); posição 33 (F → I); posição 33 (F → L); posição 33 (F → V); posição 34 (R → T); posição 35 (K → N); posição
36 (A → P); posição 38 (D → V); posição 38 (D → A); posição 41 (W → L); posição 42 (E → D ); posição 42 (E → G); posição 44 (F → S); posição 45 (A → T); posição 45 (A → S); posição 45 (A → D); posição 47 (G → E); posição 47 (G → A); posição 47 ( G → R); posição 47 (G → V); posição 49 (T → I); posição 49 (T → A); posição 40 (S → R); posição 50 (S → I); posição 52 (S → P); posição 53 (G → E); posição 54 (E → K); posição 55 (L → Q); posição 55 (L → P); posição 58 (L → R); posição 58 (L → H); posição 59 (T → K); posição 59 (T → A); posição 60 (T → A); posição 61 (E → K); posição 61 (E → G ); posição 64 (F → L); posição 68 (I → L); posição 69 (Y → H); posição 70 (K → N); posição 71 (V → A); posição 73 (I → V); posição 77 (S → Y); posição 78 (Y → F); posição 84 (I → T); posição 84 (I → S); posição 84 (I → N); posição 89 (E → Q); posição 89 (E → K); posição 91 (A → S); posição 97 (A → G); posição 97 (A → S); posição 106 (T → N); posição 107 ( I → M); posição 107 (I → V); posição 111 (L → M); posição 114 (Y → C); posição 116 (Y → S); posição 120 (A → S); posição 122 (V → A); posição 122 (V → I); posição 124 (N → S). Composição
[00100] Em uma concretização, a presente invenção é uma composição que compreende uma quantidade eficaz de pelo menos um estabilizador cinético de TTR e, pelo menos, um silenciador de gene de TTR. (i) Estabilizador Cinético TTR
[00101] Sem estar limitado por nenhuma teoria em particular, acredita-se que a dissociação do tetrâmero é a etapa inicial e limitadora da taxa na cascata de amiloidogênese TTR. (Johnson SM, et al. Acc Chem Res. 2005;
38: 9l 1-921). Em certas concretizações, o estabilizador cinético de TTR da composição da presente invenção estabiliza o tetrâmero nativo mais do que o estado de transição dissociativo, aumentando assim a barreira cinética para barreira cinética para dissociação de tetrâmero, desacelerando a dissociação de tetrâmero e, assim, reduzindo a propensão de TTR para dobramento incorreto e agregação.
[00102] O estabilizador cinético TTR pode ser qualquer estabilizador cinético TTR adequado. Em certas concretizações, o estabilizador cinético TTR é seletivo e altamente potente. Em concretizações exemplificativas, o estabilizador cinético TTR não interage com o receptor do hormônio tireoidiano (THR) e exibe atividade NS AID mínima.
[00103] Em uma concretização, o estabilizador cinético TTR é selecionado do grupo que consiste em uma pequena molécula, um peptídeo, uma proteína, um anticorpo ou um polinucleotídeo. O estabilizador cinético TTR pode ser conjugado a uma droga, proteína, peptídeo ou hormônio peptídico.
[00104] Em uma concretização particular, o estabilizador cinético TTR é uma pequena molécula que estabiliza o estado nativo da transtirretina através da ligação do tetrâmero, retardando assim a dissociação e a amiloidose em condições desnaturantes e fisiológicas através de um mecanismo de estabilização cinética. Em certas concretizações, a molécula pequena tem um peso molecular inferior a cerca de 1500 e se liga à transtirretina de forma não ou positivamente cooperativa.
[00105] O grau em que o estabilizador cinético de TTR de molécula pequena inibe a agregação de TTR pode variar. A inibição da agregação pode ser medida por qualquer ensaio adequado. (Dolado I. et al. J Comb. Chem. 7, 246-252 (2005); Sekijima Y. et al. Lab. Invest. 83, 409-417 (2003)). A TTR pode ser TTR de tipo selvagem (WT-TTR) ou TTR mutante (por exemplo, Y78F-TTR, V122I-TTR, A25T-TTR). Em uma concretização, a molécula pequena inibe a agregação de TTR por uma quantidade que é cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45% ou cerca de 50 % ou mais do que tafamidis nas mesmas condições.
[00106] O grau em que o estabilizador cinético de TTR de molécula pequena estabiliza cineticamente o TTR pode variar. A estabilização de TTR pode ser medida por qualquer ensaio adequado. (Hurshman A., et al. Biochemistry 43, 7365- 7381 (2004)). O TTR pode ser TTR de tipo selvagem (WT-TTR) ou TTR mutante (por exemplo, Y78F-TTR, V122I-TTR). Em uma concretização, a molécula pequena estabiliza o TTR por uma quantidade que é cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45% ou cerca de 50% ou maior do que tafamidis nas mesmas condições.
[00107] O grau em que o estabilizador cinético de TTR de molécula pequena se liga ao TTR pode variar. A ligação ao TTR pode ser medida por qualquer ensaio adequado. (Almeida M. et al. Biochem. J. 381, 351-356 (2004)). Em uma concretização, a molécula pequena tem uma afinidade para TTR que é cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45% ou cerca de 50% ou maior do que tafamidis nas mesmas condições.
[00108] O grau em que o estabilizador cinético de TTR de molécula pequena se liga seletivamente ao TTR no plasma pode variar. A estabilização de TTR no plasma pode ser medida por qualquer ensaio adequado, por exemplo, eletroforese de focagem isoelétrica (IF) sob condições de semidesnaturação (ureia 4 M). Em uma concretização, a molécula pequena se liga seletivamente a TTR no plasma com uma estequiometria de ligação a TTR de cerca de 0,8 ou mais, ou mais particularmente, cerca de 0,8, cerca de 0,9, cerca de 1,0, cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,3, cerca de 1,4, cerca de 1,5 ou cerca de 1,6 ou mais.
[00109] A estrutura do estabilizador cinético TTR de molécula pequena pode variar. Em uma concretização, o estabilizador cinético TTR é uma pequena molécula que compreende dois anéis aromáticos e, mais particularmente, uma pequena molécula que compreende dois anéis aromáticos, em que um contém grupos hidrofílicos, como um ácido ou um fenol e o outro, grupos hidrofóbicos, como halogênios ou alquilas.
[00110] Em uma concretização, o estabilizador cinético TTR é selecionado a partir do grupo que consiste em inibidor de COMT, um derivado de benzoxazol (por exemplo, tafamidis), iododiflunisal, diflunisal (ou seus derivados), resveratrol, ácido tauroursodesoxicólico, doxocycline, AG10 ou epigalocatequina-3-galato (EGCG).
[00111] Em uma concretização particular, o estabilizador cinético TTR é um inibidor de COMT, isto é, um composto que inibe direta ou indiretamente a atividade da catecol-O-metiltransferase. A atividade do inibidor de COMT pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, o método divulgado em Zurcher et al (Biomedical Chromatography, 1996, vol. 10, p. 32-36). O inibidor de COMT pode ser um ácido nucleico, uma proteína (peptídeo ou polipeptídeo), um análogo deste, uma pequena molécula ou qualquer outro agente ou produto químico que modifique o ácido nucleico que codifica COMT, proteína COMT ou sua atividade. O inibidor também pode ser um pró-fármaco, o que significa que é convertido em um inibidor de COMT por processos metabólicos.
[00112] Em uma concretização, o estabilizador cinético TTR é um inibidor de COMT de molécula pequena selecionado a partir do grupo que consiste em tolcapone (Tasmar®), entacapone (Comtan®), opicapone, nitecapone e combinações dos mesmos.
[00113] Em uma concretização, o estabilizador cinético TTR é tolcapone ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Tolcapone
[00114] O tolcapone é um inibidor potente e reversível da COMT e o único inibidor da COMT disponível que é permeável através da barreira hematoencefálica. É aprovado pela FDA em pacientes adultos para o tratamento da doença de Parkinson
(DP) como uma terapia adjuvante com levodopa, que é um precursor da dopamina e é metabolizado por COMT. O tolcapone se liga especificamente ao TTR no plasma humano, estabiliza o tetrâmero nativo in vivo em camundongos e humanos e inibe a citotoxicidade do TTR. (Sant 'Anna, R. et al., Nat Commun. 2016; 7: 10787). (ii) Silenciador de gene TTR
[00115] O silenciador de gene TTR pode ser qualquer silenciador de gene adequado. Em uma concretização, o silenciador de gene permite a regulação pós-transcricional do gene TTR por interferência de RNA. Em certas concretizações, o silenciador do gene TTR é uma molécula de RNAi capaz de interferência de RNA dentro de uma célula ou sistema reconstituído in vitro.
[00116] Em uma concretização particular, o silenciador do gene TTR é uma molécula de RNAi selecionada a partir do grupo que consiste em RNA de interferência curto (siRNA), microRNA (miRNA) e RNA em gancho curto (shRNA).
[00117] O silenciador do gene TTR pode ser, em certas concretizações, fornecido na forma de um sal, solvato ou pró-fármaco.
[00118] siRNA Gene Silencer. Em uma concretização, o silenciador do gene TTR é uma molécula de siRNA.
[00119] Em concretizações preferidas, o siRNA tem alta especificidade, alta potência, alta estabilidade e / ou baixa toxicidade.
[00120] O siRNA pode ser um siRNA de fita dupla (siRNA ds) ou siRNA de fita simples (siRNA ss). Em uma concretização, o siRNA é um siRNA de fita dupla que compreende uma fita guia (com complementaridade antissenso ao seu alvo de mRNA) emparelhada com sua fita passageira (senso). O silenciamento do gene pós-transcricional envolve o carregamento da fita guia em um complexo de carregamento de RISC, em que a fita passageira é então descartada e a fita guia siRNA direciona o RISC para alvos de RNA perfeitamente complementares.
[00121] O comprimento do siRNA pode variar. Em uma concretização, o siRNA tem entre cerca de 9 e cerca de 35 nucleotídeos de comprimento. Em uma concretização particular, o siRNA é cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24, cerca de 25, cerca de 26, cerca de 27, cerca de 28, cerca de 29, cerca de 30, cerca de 31, cerca de 32, cerca de 33, cerca de 34 ou cerca de 35 ou mais nucleotídeos de comprimento.
[00122] Em outra concretização particular, o siRNA está entre cerca de 15 e cerca de 19, cerca de 15 e 21, cerca de 15 e cerca de 23, cerca de 15 e cerca de 25, cerca de 16 e cerca de 27, cerca de 18 e cerca de 19, cerca de 18 e cerca de 21, cerca de 18 e cerca de 23, cerca de 18 e cerca de 25, cerca de 18 e cerca de 27, cerca de 19 e cerca de 21, cerca de 19 e cerca de 23, cerca de 19 e cerca de 25, cerca de 19 e cerca de 27, cerca de 20 e 21, cerca de 20 e 23, cerca de 20 e 24, cerca de 20 e 25, cerca de 21 e cerca de 23, cerca de 23 e cerca de 25 ou cerca de 23 e cerca de 27 nucleotídeos de comprimento. Em uma concretização particular, o siRNA tem menos do que cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
[00123] Em uma concretização, o siRNA de extremidade cega ou cega. Em uma concretização particular, o siRNA é um 19-mer de extremidade romba ou cega, um 2l-mer de extremidade cega ou cega, um 23-mer de extremidade cega ou cega, um 25- mer de extremidade cega ou cega ou um 27-mer de ponta cega ou cega.
[00124] Em outra concretização, o siRNA tem pelo menos uma saliência de nucleotídeo. Em uma concretização particular, o siRNA tem pelo menos uma saliência de nucleotídeo na extremidade 3', na extremidade 5' ou combinações das mesmas. As saliências podem compreender, por exemplo, entre cerca de um e cerca de 5 nucleotídeos e, mais particularmente, um, dois, três, quatro ou cinco nucleotídeos. Em certas concretizações, a saliência é estendida (ou seja, maior do que 5 nucleotídeos) para permitir a conjugação da molécula de siRNA a um transportador.
[00125] Em uma concretização, o siRNA compreende pelo menos uma saliência 3 'de dois nucleotídeos (2-nt).
[00126] Em uma concretização particular, o siRNA é um 19/21 mer assimétrico, 21/23 mer assimétrico, 23/25 mer assimétrico ou 25/27-mer assimétrico.
[00127] Em outra concretização, o siRNA compreende pelo menos uma saliência 5 'de três nucleotídeos (3-nt).
[00128] Em uma concretização particular, o siRNA é um 19/22 mer assimétrico, 21/24 mer assimétrico, 23/26 mer assimétrico ou 25/28-mer assimétrico.
[00129] A identidade da saliência do nucleotídeo pode variar. Em uma concretização, a saliência compreende um ou mais ribonucleotídeos complementares ao mRNA alvo, incluindo ribonucleotídeos modificados ou modificados (por exemplo, ribonucleotídeos modificados com 2'-O-metil).
[00130] Em outra concretização, a saliência compreende um ou mais um ou mais nucleotídeos que não são ribonucleotídeos (isto é, não ribonucleotídeos). Em uma concretização particular, o não ribonucleotídeo é um desoxinucleotídeo, tal como desoxi timidina (ponto), desoxiadenosina (dia), desoxiguanosina (cão) ou desoxi citosina (DC). Em uma concretização particular, a saliência de nucleotídeo inclui um, dois, três, quatro ou mais desoxinucleotídeos (por exemplo, did, dada).
[00131] Quando mais siRNA contém mais de uma saliência, as saliências podem ser simétricas ou assimétricas.
[00132] Em uma concretização particular, o siRNA contém uma ou mais modificações químicas. Em uma concretização, o siNA é um duplex em que uma ou ambas as fitas são quimicamente modificadas. Em uma concretização particular, a fita de sentido compreende pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 ou mais modificações químicas. Em outra concretização particular, a fita antissenso compreende pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 ou mais modificações químicas.
[00133] A modificação química pode ser qualquer modificação adequada. Em uma concretização particular, a modificação química é selecionada a partir do grupo que consiste em modificações ou substituições de açúcar, modificações de base, modificações terminais, modificações de estrutura ou combinações dos mesmos. A modificação pode melhorar uma ou mais propriedades da molécula de siRNA, incluindo, sem limitação, estabilidade de nuclease aumentada, afinidade de ligação aumentada ou alguma outra propriedade biológica benéfica da molécula de siRNA.
[00134] O grau de modificação pode variar. Em uma concretização, a molécula de siRNA pode incluir de cerca de 5% a cerca de 100% de nucleotídeos modificados (por exemplo, cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de nucleotídeos modificados). A porcentagem real de nucleotídeos modificados presentes em uma determinada molécula de ácido nucleico dependerá do número total de nucleotídeos presentes no ácido nucleico. Em concretizações em que o siRNA é de fita dupla, a modificação percentual pode ser baseada no número total de nucleotídeos presentes na fita senso, fita antissenso ou ambas as fitas senso e antissenso.
[00135] Em uma concretização particular, o siRNA compreende um ou mais ribonucleotídeos com uma modificação de açúcar. A modificação do açúcar pode ser, por exemplo, uma modificação na porção 2 'do resíduo de açúcar e abrange amino, flúor, alcoxi (por exemplo, metoxi), alquil, amino, flúor, cloro, bromo, CN, CF, imidazole, carboxilato, tioato, Cl a C10 alquil inferior, alquil inferior substituído, alcaril ou aralquil, OCF3, OCN, O-, S- ou N-alquilo; O-, S ou N-alquenil; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilami no; polialquilamino ou silil substituído. Em uma concretização, o siRNA compreende um ou mais ribonucleotídeos com uma modificação de açúcar 2'0-metil (metoxi).
[00136] Em uma concretização, o siRNA compreende pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos pelo menos 10 ou 2'-0-metil nucleotídeos.
[00137] Em uma concretização, o siRNA compreende pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10 2'-desoxi-2'-fluoro nucleotídeos.
[00138] Em certas concretizações, o siRNA compreende um ou mais ácidos nucleicos desbloqueados (UNA). Em uma concretização, a molécula de RNAi compreende pelo menos um nucleosídeo UNA e, mais particularmente, pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7 ou pelo menos 8 Nucleosídeos UNA, por exemplo, de cerca de 2 a cerca de 6 nucleosídeos UNA, cerca de 3 a cerca de 7 nucleosídeos UNA, cerca de 4 a cerca de 6 nucleosídeos UNA ou cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6 ou cerca de 7 nucleosídeos UNA.
[00139] Em uma concretização particular, o siRNA compreende um ou mais ácidos nucleicos bloqueados (LNA). No LNA, o oxigênio 2'-hidroxila da ribose está conectado ao átomo C-4 da mesma unidade de ribose por meio de uma ponte de metileno. Em uma concretização, a molécula de RNAi compreende pelo menos um nucleosídeo LNA e, mais particularmente, pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7 ou pelo menos 8 Nucleosídeos LNA, por exemplo, de cerca de 2 a cerca de 6 nucleosídeos LNA, cerca de 3 a cerca de 7 nucleosídeos LNA, cerca de 4 a cerca de 6 nucleosídeos LNA ou cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6 ou cerca de 7 nucleosídeos LNA.
[00140] Em uma concretização, o siRNA compreende duas ou mais modificações selecionadas do grupo que compreende o ácido nucleico bloqueado desbloqueado e 2'-0-metilação (OMe). Essas modificações podem ser encontradas nas mesmas fitas ou em diferentes (ou seja, tanto antissenso quanto sentido).
[00141] Em uma concretização particular, o siRNA compreende um ou mais ácidos nucleicos peptídicos (PNA). PNA é um polímero de bases de purina e pirimidina que estão conectadas entre si via
[00142] uma ponte 2-aminoetil. Em uma concretização, a molécula de RNAi compreende pelo menos um nucleosídeo PNA e, mais particularmente, pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7 ou pelo menos 8 Nucleosídeos PNA, por exemplo, de cerca de 2 a cerca de 6 nucleosídeos PNA, cerca de 3 a cerca de 7 nucleosídeos PNA, cerca de 4 a cerca de 6 nucleosídeos PNA ou cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6 ou cerca de 7 nucleosídeos PNA.
[00143] Em certas concretizações, o siRNA compreende um ou mais ribonucleotídeos com uma modificação de base. Em uma concretização, a nucleobase de modificação é selecionada a partir do grupo que consiste em 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2- aminoadenina, 6-metil e outros derivados alquil de adenina e guanina, 2-propil e outros derivados alquil de adenina e guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5- halouracil e citosina, 5-propinil uracil e citosina, 6-azo uracil, citosina e timina, 5-uracil (pseudouracil), 4- tiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxil anal outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil e outros 5 - uracilos e citosinas substituídos, 7-metilguanina e 7- metiladenina, 8-azaguanina e 8-azaadenina, 7-deazaguanina e 7-daazaadenina e 3-deazaguanine e 3-deazaadenina.
[00144] Em certas concretizações, o siRNA compreende uma ou mais modificações de estrutura. Em uma concretização específica, a modificação da estrutura é uma modificação da estrutura de fosfato selecionada do grupo que consiste em fosforotioato, fosfonoacetato e / ou tiofosfonoacetato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosfotriéster, morfolino, carbamato de amidato, carboximetil, acetamidato, poliamida, sulfonato, sulfonamida, sulfamato, formacetal, tioformacetal e / ou alquilsilil, substituições ou uma combinação dos mesmos.
[00145] Em uma concretização particular, o siRNA contém uma ou mais modificações terminais. Essas modificações terminais podem incluir, por exemplo, a adição de um nucleotídeo, um nucleotídeo modificado, um lipídeo, um peptídeo, um açúcar e uma porção abásica invertida. Tais modificações são incorporadas, por exemplo, no terminal 3 'e / ou 5' do siRNA.
[00146] A sequência alvo pode ser uma sequência codificante, uma sequência não codificante ou ambas as sequências codificantes e não codificantes. Em uma concretização particular, a sequência alvo compreende pelo menos uma região de um mRNA que codifica uma proteína TTR tendo uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos. Em uma concretização, a sequência alvo é um mRNA que codifica uma proteína TTR com uma mutação Val30Met. Em outra concretização, a sequência alvo é um mRNA que codifica uma proteína TTR com mutação T60A (Ala 60). Em outra concretização, a sequência alvo é um mRNA que codifica uma proteína TTR com uma mutação Vall22Ile. Em ainda outra concretização, a sequência alvo é uma proteína TTR com uma mutação Val50Met.
[00147] Em uma concretização, o siRNA é totalmente complementar à sequência alvo. Em outra concretização, o siRNA é substancialmente complementar à sequência alvo.
[00148] Em uma concretização particular, o siRNA é de cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98 %, cerca de 99% ou cerca de 100% complementar à sequência alvo.
[00149] Em outra concretização particular, o siRNA é de cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98 %, cerca de 99% ou cerca de 100% complementar à sequência alvo ao longo de uma região de cerca de 14 a cerca de 32 nucleotídeos de comprimento. Em uma concretização, o siRNA é cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% , cerca de 99% ou cerca de 100% complementar à sequência alvo ao longo de uma região de cerca de 16 a cerca de 28 nucleotídeos de comprimento, cerca de 18 e cerca de 26 nucleotídeos de comprimento, ou cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24, cerca de 25 ou cerca de 26 nucleotídeos de comprimento. Em uma concretização particular, o siRNA é de cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% complementar à sequência alvo ao longo de uma região maior do que cerca de 24 nucleotídeos de comprimento, maior do que cerca de 26 nucleotídeos de comprimento ou maior do que cerca de 28 nucleotídeos de comprimento.
[00150] Em uma concretização, o siRNA não contém mais do que 3 incompatibilidades com a sequência alvo. Em outra concretização, o siRNA não contém mais do que 5 incompatibilidades com a sequência alvo.
[00151] Em uma concretização, o siRNA contém mais de 1 incompatibilidade com a sequência alvo, mas preferencialmente na região central do siRNA.
[00152] Em uma concretização, o siRNA é totalmente complementar a um mRNA que codifica a SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma.
[00153] Em outra concretização, o siRNA é substancialmente complementar a uma sequência de mRNA que codifica a SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma.
[00154] Em uma concretização particular, a sequência alvo é um mRNA que codifica um fragmento da SEQ ID NO: 1, em que o fragmento está entre cerca de 14 a cerca de 32 nucleotídeos, cerca de 14 e cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 14 e cerca de 28 nucleotídeos, cerca de 14 e cerca de 26 nucleotídeos, cerca de 14 e cerca de 24 nucleotídeos, cerca de 14 e cerca de 22 nucleotídeos, cerca de 14 e cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 14 e cerca de 18 nucleotídeos, cerca de 14 e cerca de 16 nucleotídeos; cerca de 16 e cerca de 32 nucleotídeos, cerca de 16 e cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 16 e cerca de 28 nucleotídeos; cerca de 16 e cerca de 26 nucleotídeos, cerca de 16 e cerca de 22 nucleotídeos, cerca de 16 e cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 16 e cerca de 18 nucleotídeos; cerca de 20 e cerca de 32 nucleotídeos; cerca de 20 e cerca de 30 nucleotídeos; cerca de 20 e cerca de 28 nucleotídeos; cerca de 20 e cerca de 26 nucleotídeos; cerca de 20 e cerca de 24 nucleotídeos; cerca de 22 e cerca de 24 nucleotídeos; cerca de 22 e cerca de 32 nucleotídeos; cerca de 22 e cerca de 30 nucleotídeos; cerca de 24 e cerca de 28 nucleotídeos; cerca de 24 e cerca de 26 nucleotídeos; cerca de 26 e cerca de 32 nucleotídeos; cerca de 26 e cerca de 30 nucleotídeos; cerca de 26 e cerca de 38 nucleotídeos; cerca de 28 e cerca de 32 nucleotídeos; cerca de 28 e cerca de 30 nucleotídeos. Em outra concretização particular, a sequência alvo é um mRNA que codifica um fragmento de SEQ ID NO: 1, em que o fragmento tem cerca de 30 nucleotídeos; cerca de 28 nucleotídeos; cerca de 26 nucleotídeos; cerca de 24 nucleotídeos; cerca de 22 nucleotídeos; cerca de 20 nucleotídeos; cerca de 18 nucleotídeos; cerca de 16 nucleotídeos ou cerca de 14 nucleotídeos.
[00155] Em uma concretização, o siRNA é rico em U e empobrecido em G. Em uma concretização particular, o siRNA é um siRNA de fita dupla isolado com uma ou mais das seguintes características: (i) A / U na extremidade 5 ' ; (ii) riqueza de AU na região 5 'terminal de 7 bp da fita antisense; (ii) G / C na extremidade 5 'da fita com sentido; e (ii) a ausência de qualquer trecho GC longo com mais de 9 bp de comprimento.
[00156] O siRNA pode ser empregado em uma variedade de sais farmaceuticamente aceitáveis. Esses sais podem incluir ácidos orgânicos ou inorgânicos não tóxicos. Por exemplo, aqueles derivados de ácidos inorgânicos, tais como cloridrato, bromídrico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e semelhantes; e os sais preparados a partir de ácidos orgânicos, tais como acético, propiônico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, palmítico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzóico, salicíclico, sulfanílico, 2- acetoxibenzoico, fumárico, toluenossulfônico, metanossulfônico, etano dissulfônico, oxálico, isotiônico e semelhantes.
[00157] Em uma concretização, o siRNA é um siRNA de fita dupla isolado, em que (a) cada fita da molécula de siRNA tem cerca de 9 a cerca de 35 nucleotídeos de comprimento, ou mais particularmente, cerca de 14 a cerca de 32, cerca de 18 a cerca de 27 nucleotídeos , cerca de 18 a cerca de 24 nucleotídeos ou cerca de 19 a cerca de 23 nucleotídeos de comprimento; e (b) um filamento da molécula de siRNA compreende uma sequência de ribonucleotídeo substancialmente complementar a um mRNA que codifica SEQ ID. NO: 1 ou um fragmento deste. Em uma concretização particular, o fragmento tem menos do que cerca de 30 nucleotídeos, menos do que cerca de 28 nucleotídeos, menos do que cerca de 26 nucleotídeos, menos do que cerca de 24 nucleotídeos ou menos do que cerca de 22 nucleotídeos, mas em cada caso, mais do que três nucleotídeos.
[00158] Em uma concretização particular, o siRNA é um siRNA de fita dupla isolado, em que (a) cada fita da molécula de siRNA tem cerca de 9 a cerca de 35 nucleotídeos de comprimento, ou mais particularmente, cerca de 14 a cerca de 32, cerca de 18 a cerca de 27 nucleotídeos, cerca de 18 a cerca de 24 nucleotídeos ou cerca de 19 a cerca de 23 nucleotídeos de comprimento; e (b) uma fita da molécula de siRNA compreende uma sequência de ribonucleotídeo totalmente complementar a um mRNA que codifica a SEQ ID. NO: 1 ou um fragmento deste. Em uma concretização particular, o fragmento tem menos do que cerca de 30 nucleotídeos, menos do que cerca de 28 nucleotídeos, menos do que cerca de 26 nucleotídeos, menos do que cerca de 24 nucleotídeos ou menos do que cerca de 22 nucleotídeos, mas em cada caso, mais do que três nucleotídeos.
[00159] Em uma concretização, o siRNA é um siRNA de fita dupla isolado, em que (a) cada fita da molécula de siRNA tem cerca de 9 a cerca de 35 nucleotídeos de comprimento, ou mais particularmente, cerca de 14 a cerca de 32, cerca de 18 a cerca de 27 ou cerca de 19 a cerca de 23 nucleotídeos de comprimento; e (b) uma fita da molécula de siRNA compreende uma sequência de ribonucleotídeo pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 85, pelo menos cerca de 90, pelo menos cerca de 95, pelo menos cerca de 96, pelo menos cerca de 97, pelo menos cerca de 98, pelo menos pelo menos cerca de 99% de cortesia para um mRNA que codifica SEQ ID. NO: 1 ou um fragmento deste.
[00160] Em uma concretização, o siRNA é sintetizado quimicamente. O siRNA pode ser sintetizado quimicamente por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando um sintetizador automático ou gerado pela clivagem de um dsRNA mais longo. O siRNA quimicamente sintetizado pode ser administrado em sua forma nativa, opcionalmente em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável. Em certas concretizações, uma versão mais longa do siRNA é administrada (siRNA +), que é então processada in vivo para fornecer o siRNA maduro.
[00161] Em outra concretização, o siRNA é produzido por um vetor de expressão. Em uma concretização particular, o siRNA é fornecido como um vetor que expressa um shRNA, que é posteriormente processado em um siRNA no citoplasma. O vetor pode ser qualquer vetor adequado, como um plasmídeo ou vetor viral (por exemplo, um retroviral, incluindo lentiviral, adenoviral, baculoviral e vetor viral aviário).
[00162] Em uma concretização, a invenção fornece um vetor de expressão que compreende um promotor e uma sequência que codifica um shRNA. O promotor da transcrição está operacionalmente ligado, direta ou indiretamente, ao gene e selecionado com base na célula hospedeira e no efeito observado. Pode ser, por exemplo, um promotor constitutivo ou induzível. Em uma concretização particular, o promotor é um promotor de RNA polimerase III (por exemplo, Hl ou U6).
[00163] Em uma concretização particular, o siRNA é altamente estável sob uma variedade de condições pertinentes ao armazenamento, entrega e / ou uso. A estabilidade pode ser medida por qualquer meio adequado, incluindo (por exemplo), PAGE não desnaturante.
[00164] Em uma concretização particular, o siRNA é altamente ativo sob uma variedade de condições pertinentes ao armazenamento, entrega e / ou uso. A atividade pode ser medida por qualquer método adequado, incluindo, por exemplo, um ensaio de cultura de tecidos à base de bioluminescência (luciferase).
[00165] Em uma concretização, o siRNA é altamente estável e / ou retém alta atividade quando armazenado a C ou 2l ° C por 4 semanas ou alternativamente a 37 ° C por 5 e 24 horas ou 95 ° C por 10, 30, 60 e 120 minutos.
[00166] Em outra concretização, o siRNA é altamente estável e / ou retém alta atividade quando incubado em vários fluidos biológicos (por exemplo, soro humano) a 37 ° C por 10 minutos, 1 hora, 5 horas e 48 horas.
[00167] O silenciador de gene de siRNA pode ser, em certas concretizações, fornecido na forma de um sal, solvato ou pró-fármaco.
[00168] Silenciador do gene miRNA. Em uma concretização, o silenciador do gene TTR é uma molécula de miRNA. Em concretizações preferidas, o miRNA tem alta especificidade, alta potência, alta estabilidade e / ou baixa toxicidade.
[00169] Em uma concretização particular, o miRNA não induz significativamente efeitos fora do alvo e / ou uma resposta de interferon. Em outra concretização particular, o miRNA não interfere significativamente na biogênese de miRNA endógeno.
[00170] O comprimento da molécula de miRNA pode variar. Em uma modalidade, a molécula de miRNA está entre cerca de 9 e cerca de 35 nucleotídeos. Em uma modalidade particular, o siRNA é cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24, cerca de 25, cerca de 26, cerca de 27, cerca de 28, cerca de 29, cerca de 30, cerca de 31, cerca de 32, cerca de 33, cerca de 34 ou cerca de 35 ou mais nucleotídeos. Em outra modalidade particular, o miRNA está entre cerca de 15 e cerca de 19 nucleotídeos, cerca de 15 e 21 nucleotídeos, cerca de 15 e cerca de 23 nucleotídeos, cerca de 15 e cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 16 e cerca de 27 nucleotídeos, cerca de 18 e cerca de 19 nucleotídeos, cerca de 18 e cerca de 21 nucleotídeos, cerca de 18 e cerca de 23 nucleotídeos, cerca de 18 e cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 18 e cerca de 27 nucleotídeos, cerca de 19 e cerca de 21 nucleotídeos, cerca de 19 e cerca de 23 nucleotídeos, cerca de 19 e cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 19 e cerca de 27 nucleotídeos, cerca de 21 e cerca de 23 nucleotídeos, cerca de 21 e cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 21 a cerca de 27 nucleotídeos, cerca de 23 a cerca de 25, ou cerca de 23 a cerca de 27 nucleotídeos. Em uma modalidade particular, o miRNA é inferior a cerca de 30 nucleotídeos.
[00171] Em uma concretização, o miRNA tem extremidades cegas, ou seja, o miRNA não tem saliência 3' ou 5'.
[00172] Em outra concretização, o miRNA tem um ou mais nucleotídeos pendentes na extremidade 5 'ou na extremidade 3' de qualquer fita do miRNA. As saliências podem compreender, por exemplo, entre cerca de um e cerca de 5 nucleotídeos e, mais particularmente, um, dois, três, quatro ou cinco nucleotídeos. Em uma concretização particular, os nucleotídeos salientes são dinucleotídeos.
[00173] Em uma concretização particular, o miRNA compreende uma saliência 2 nt, 3'.
[00174] Em uma concretização, a molécula de miRNA tem uma ou mais modificações químicas. A modificação química pode ser qualquer modificação adequada. Em uma concretização particular, a modificação química é selecionada a partir do grupo que consiste em modificações ou substituições de açúcar, modificações de base, modificações terminais, modificações de estrutura ou combinações dos mesmos. A modificação pode melhorar uma ou mais propriedades da molécula de miRNA, incluindo, sem limitação, estabilidade de nuclease aumentada, afinidade de ligação aumentada ou alguma outra propriedade biológica benéfica da molécula de miRNA.
[00175] O grau de modificação pode variar. Em uma concretização, a molécula de miRNA pode incluir de cerca de 5% a cerca de 100% de nucleotídeos modificados (por exemplo, cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,
55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de nucleotídeos modificados).
[00176] A modificação química pode ser, por exemplo, qualquer modificação química ensinada aqui para uso com moléculas de siRNA- acima.
[00177] Em uma concretização particular, o miRNA compreende fosforotioatos e sequências modificadas de 2'-0- metil.
[00178] A sequência alvo pode ser uma sequência codificante, uma sequência não codificante ou ambas as sequências codificantes e não codificantes. Em uma concretização, a sequência alvo é pelo menos uma região de um mRNA que codifica uma proteína TTR normal. Em outra concretização, a sequência alvo é pelo menos uma região de um mRNA que codifica uma proteína TTR mutante. Em uma concretização particular, a sequência alvo é pelo menos uma região de um mRNA que codifica uma proteína TTR uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos - incluindo qualquer proteína TTR mutante aqui descrita.
[00179] Em uma concretização, a sequência alvo é um mRNA que codifica uma proteína TTR com uma mutação Val30Met. Em outra concretização, a sequência alvo é um mRNA que codifica uma proteína TTR com mutação T60A (Ala 60). Em uma outra concretização, a sequência alvo é um mRNA que codifica uma proteína TTR com uma mutação Val122Ile
[00180] Sem estar limitado por qualquer teoria particular, acredita-se que a extensão da complementaridade de sequência entre a fita guia de miRNA e o mRNA alvo determina se interrupção da tradução ou clivagem do mRNA resulta do reconhecimento do mRNA por RISC. Geralmente, quanto maior o grau de complementaridade, mais provável é o mecanismo de clivagem.
[00181] Em uma concretização, o miRNA é substancialmente complementar ao mRNA alvo. Em outra concretização, o miRNA é totalmente complementar ao mRNA alvo.
[00182] Em uma concretização particular, o miRNA é de cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91% cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% , cerca de 99% ou cerca de 100% complementar à sequência alvo.
[00183] Em uma concretização particular, o miRNA é de cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91% cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% , cerca de 99% ou cerca de 100% complementar à sequência alvo através de uma região de 14 cerca de 32 nucleotídeos.
[00184] Em uma concretização particular, o miRNA é de cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91% cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% , cerca de 99% ou cerca de 100% complementar à sequência alvo através de uma região de cerca de 16 a cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 18 a cerca de 28 nucleotídeos, cerca de 20 a cerca de 26 nucleotídeos, ou cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21 , cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24, cerca de 25, cerca de 26, cerca de 27 ou cerca de 28 ou mais nucleotídeos.
[00185] Em uma concretização particular, o miRNA é de cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91% cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100% complementar à sequência alvo através de uma região inferior a cerca de 30, inferior a cerca de 28, inferior a cerca de 26, inferior a cerca de 24 nucleotídeos de comprimento, mas em cada caso, maior do que três nucleotídeos.
[00186] Em uma concretização, o miRNA é administrado na forma nativa e, opcionalmente, associado a um transportador farmacêutico.
[00187] Em outra concretização, o miRNA é a administração na forma de um vetor compreendendo uma sequência que codifica o miRNA que é então transcrito in vivo. O vetor pode ser qualquer vetor adequado incluindo, por exemplo, um plasmídeo ou vetor viral (por exemplo, um adenovírus, um vírus adeno-associado, um retrovírus ou lentivírus). Assim, em uma concretização, a invenção fornece um vetor de expressão que compreende uma sequência que codifica um ou mais miRNAs capazes de modular a expressão do gene TTR. O vetor de expressão pode ser qualquer vetor adequado, por exemplo, um vetor plasmídeo ou um vetor viral (por exemplo, um vetor lentiviral). Em uma concretização, o vetor de expressão compreende um promotor de transcrição, um gene que codifica o miRNA e um terminador de transcrição. O promotor de transcrição está operacionalmente ligado, direta ou indiretamente ao gene e selecionado com base na célula hospedeira e no efeito desejado. Pode ser, por exemplo, um promotor constitutivo ou induzível. Em uma concretização particular, o promotor é o promotor da polimerase de RNA II.
[00188] Em uma concretização particular, o promotor é um promotor indutível selecionado do grupo que consiste em promotores indutíveis por tetraciclina, promotores indutíveis por PIT, sistemas ativadores trans de tetraciclina e sistemas ativadores trans de tetraciclina reversa (rattan).
[00189] Em uma concretização, o miRNA é fornecido como um prim-miRNA ou uma variante do mesmo. A sequência prim- miRNA pode compreender 45-250, 55-200, 70-150 ou 80-100 nucleotídeos. O pri-mRNA pode ser DRQSHA / DGCR8 clivado para fornecer uma estrutura em grampo conhecida como um pré- miRNA. O pré-miRNA é posteriormente processado para produzir um miRNA duplex (miRNA / miRNA) com o grampo removido. O duplex é então incorporado a um RISC, em que o fio guia associado estável permanece no RISC, enquanto o fio passageiro é geralmente liberado e clivado. O complexo e RISC subsequentemente encontra mRNAs celulares parcialmente complementares à sequência da fita guia carregada e evita a tradução, seja por meio de interrupção da tradução ou clivagem do mRNA. Um único pri-miRNA pode conter de um a vários precursores de miRNA.
[00190] Em uma concretização, o miRNA é expresso em uma quantidade suficiente para atenuar a expressão do gene TTR de uma maneira específica de sequência. Em uma concretização preferida, o miRNA é expresso de forma estável na célula de mamífero.
[00191] O miRNA pode ser empregado em uma variedade de sais farmaceuticamente aceitáveis. Esses sais podem incluir ácidos orgânicos ou inorgânicos não tóxicos. Por exemplo, aqueles derivados de ácidos inorgânicos, tais como cloridrato, bromídrico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e semelhantes; e os sais preparados a partir de ácidos orgânicos, tais como acético, propiônico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, palmítico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzóico, salicíclico, sulfanílico, 2- acetoxibenzoico, fumárico, toluenossulfônico, metanossulfônico, etano dissulfônico, oxálico, isotiônico e semelhantes.
[00192] O silenciador de gene miRNA pode ser, em certas concretizações, fornecido na forma de um sal, solvato ou pró-droga.
[00193] Silenciador do gene shRNA. Em uma concretização, o silenciador do gene TTR é um shRNA. Em concretizações preferidas, o siRNA tem alta especificidade, alta potência, alta estabilidade e / ou baixa toxicidade.
[00194] Em uma concretização particular, o shRNA compreende um antissenso (inferior) e um fita senso (superior) conectados por uma alça de nucleotídeos desemparelhados. A haste shRNA é definida como o trecho de sequência entre os nucleotídeos emparelhados terminais. A haste pode compreender uma perfeitamente complementar ou pode conter uma ou mais protuberâncias ou laços interiores. Em uma concretização, a fita antissenso contém pelo menos uma incompatibilidade e, em particular, pelo menos uma substituição, deleção ou inserção, desde que a fita antissenso e a fita senso possam hibridizar sob condições rigorosas.
[00195] Em uma concretização particular, o shRNA não induz significativamente efeitos fora do alvo e / ou uma resposta de interferon. Em outra concretização particular, o shRNA não interferência significativa na biogênese do shRNA endógeno.
[00196] O shRNA pode variar em comprimento. Em uma concretização, o shRNA tem entre cerca de 40 e 100 nucleotídeos de comprimento, ou mais particularmente, cerca de 40 e cerca de 70 nucleotídeos e, ainda mais particularmente, cerca de 40 e cerca de 60 nucleotídeos, cerca de 35 e cerca de 55 ou cerca de 40 e cerca de 50 nucleotídeos de comprimento. Em uma concretização particular, o shRNA tem cerca de 40, cerca de 45, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90 ou cerca de 100 nucleotídeos de comprimento.
[00197] O comprimento da haste shRNA pode variar. Em uma concretização particular, a haste do shRNA tem entre cerca de 15 e cerca de 50 nucleotídeos de comprimento, ou mais particularmente, cerca de 20 e cerca de 45, cerca de 25 e cerca de 35 ou cerca de 30 nucleotídeos de comprimento. Em uma concretização particular, o shRNA é cerca de 15, cerca de 16, cerca de 17, cerca de 18, cerca de 19, cerca de 20, cerca de 21, cerca de 22, cerca de 23, cerca de 24, cerca de 25, cerca de 26, cerca de 27, cerca de 28, cerca de 29, cerca de 30, cerca de 31, cerca de 32, cerca de 33, cerca de 34, cerca de 35, cerca de 36, cerca de 37, cerca de 38, cerca de 39 ou cerca de 40 nucleotídeos de comprimento.
[00198] Em uma concretização, a haste do shRNA está entre cerca de 15 e cerca de 20, cerca de 16 e cerca de 22, cerca de 18 e cerca de 24, cerca de 20 e cerca de 26, cerca de 22 e cerca de 28, cerca de 24 e cerca de 30, cerca de 26 e cerca de 32 ou cerca de 28 e cerca de 34 nucleotídeos de comprimento.
[00199] Em uma concretização, a haste do shRNA tem menos do que cerca de 20 nucleotídeos.
[00200] Em uma concretização particular, o shRNA tem uma alça de pelo menos cerca de 4, pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 6, pelo menos cerca de 7 ou pelo menos cerca de 8 ou mais nucleotídeos.
[00201] Em uma concretização, o shRNA tem extremidade cega, isto é, não tem saliência 3 'ou 5'.
[00202] Em outra concretização, o shRNA tem um ou mais nucleotídeos pendentes na extremidade 5 'e / ou na extremidade 3' de qualquer fita do miRNA. As saliências podem compreender, por exemplo, entre cerca de um e cerca de 5 nucleotídeos e, mais particularmente, um, dois, três, quatro ou cinco nucleotídeos. Em uma concretização particular, os nucleotídeos salientes são dinucleotídeos.
[00203] Em uma concretização, o shRNA compreende a saliência 5 ', uma sequência de direcionamento, alça, a sequência de direcionamento do complemento reverso, a sequência do terminador da transcrição e a saliência 3'. Em uma concretização particular, a saliência na extremidade 5 'é uma saliência de 2 nucleotídeos (nt) ou 3-nt. Em outra concretização particular, a saliência na extremidade 3 'é uma saliência de 2 nt ou 3-nt.
[00204] O shRNA pode ter uma ou mais modificações químicas, em uma ou ambas as fitas. A modificação química pode ser qualquer modificação adequada. Em uma concretização particular, a modificação química é selecionada a partir do grupo que consiste em modificações ou substituições de açúcar, modificações de base, modificações terminais, modificações de estrutura ou combinações dos mesmos. A modificação pode melhorar uma ou mais propriedades da molécula de shRNA, incluindo, sem limitação, estabilidade de nuclease aprimorada, afinidade de ligação aumentada ou alguma outra propriedade biológica benéfica da molécula de shRNA.
[00205] O grau de modificação pode variar. Em uma concretização, a molécula de shRNA pode incluir de cerca de 5% a cerca de 100% de nucleotídeos modificados (por exemplo, cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de nucleotídeos modificados).
[00206] A modificação pode ser qualquer modificação adequada incluindo, mas não se limitando a, aquelas descritas acima em relação ao siRNA.
[00207] O shRNA pode ser empregado em uma variedade de sais farmaceuticamente aceitáveis. Esses sais podem incluir ácidos orgânicos ou inorgânicos não tóxicos. Por exemplo, aqueles derivados de ácidos inorgânicos, tais como cloridrato, bromídrico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e semelhantes; e os sais preparados a partir de ácidos orgânicos, tais como acético, propiônico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico,
ascórbico, palmítico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzóico, salicíclico, sulfanílico, 2- acetoxibenzoico, fumárico, toluenossulfônico, metanossulfônico, etano dissulfônico, oxálico, isotiônico e semelhantes.
[00208] A sequência alvo pode ser uma sequência codificante, uma sequência não codificante ou ambas as sequências codificantes e não codificantes. Em uma concretização, a sequência alvo é pelo menos uma porção de um mRNA que codifica como proteína TTR normal (isto é, nativa). Em outra concretização, a sequência alvo é pelo menos uma porção de um mRNA que codifica uma proteína TTR mutante (isto é, não nativa). Em uma concretização particular, a sequência alvo corresponde a uma proteína TTR tendo uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos - incluindo qualquer proteína TTR mutante aqui descrita.
[00209] Em uma concretização, a sequência alvo é um mRNA que codifica uma proteína TTR com uma mutação Val30Met. Em outra concretização, a sequência alvo é um mRNA que codifica uma proteína TTR com mutação T60A (Ala 60). Em outra concretização, a sequência alvo é um mRNA que codifica uma proteína TTR com uma mutação Vall22Ile.
[00210] O shRNA pode ser administrado na forma nativa, opcionalmente, em combinação com um transportador farmacêutico.
[00211] Alternativamente, o sHRNA pode ser fornecido na forma de um vetor compreendendo uma sequência que codifica o shRNA que é então transcrito in vivo. O vetor pode ser qualquer vetor adequado incluindo, por exemplo, um plasmídeo ou vetor viral (por exemplo, um adenovírus, um vírus adeno- associado, um retrovírus ou lentivírus). Assim, em uma concretização, a invenção fornece um vetor de expressão que compreende uma sequência que codifica um ou mais shRNAs capazes de modular a expressão do gene TTR. O vetor de expressão pode ser qualquer vetor adequado, por exemplo, um vetor plasmídeo ou um vetor viral (por exemplo, um vetor lentiviral). Em uma concretização, o vetor de expressão compreende um promotor de transcrição, um gene que codifica o sHRNA e um terminador de transcrição. O promotor de transcrição está operacionalmente ligado, direta ou indiretamente ao gene e selecionado com base na célula hospedeira e no efeito desejado. Pode ser, por exemplo, um promotor constitutivo ou induzível. Em uma concretização particular, o promotor é selecionado de U6, Hl, CMV, PGK e UbiC.
[00212] Em uma concretização, o shRNA é fornecido na forma de transcritos de pri-miRNA artificiais, ou seja, embutido em um contexto de miRNA, como o precursor miR-30 stem loop.
[00213] Em outra concretização, a invenção fornece um vetor de expressão que compreende uma sequência que codifica um ou mais shRNAs capazes de modular a expressão do gene TTR. Em uma concretização, o vetor de expressão compreende um promotor de transcrição, um gene que codifica o shRNA e um terminador de transcrição. O promotor da transcrição está operacionalmente ligado, direta ou indiretamente, ao gene e selecionado com base na célula hospedeira e no efeito observado. Pode ser, por exemplo, um promotor constitutivo ou induzível. Em uma concretização particular, o promotor é um promotor de RNA polimerase III.
[00214] O silenciador de gene shRNA pode ser, em certas concretizações, fornecido na forma de um sal, solvato ou pró-fármaco. (iii) Outros agentes farmaceuticamente ativos
[00215] Em certas concretizações, a composição pode ainda compreender ou ser coadministrada com um ou mais agentes farmaceuticamente ativos, incluindo um agente anti- amiloide ou anti-fibrila.
[00216] Em uma concretização, a composição pode ainda compreender ou ser coadministrada com um agente estabilizador de proteína, tal como resveratrol, proteínas de choque térmico, chaperones de proteína e seus imitadores.
[00217] Em outras concretizações, a composição pode ainda compreender ou ser coadministrada em combinação com outras terapias para doenças causadas por fibrilas amiloides TTR. As terapias para doenças causadas por fibrilas amiloides TTR incluem transplante de coração para cardiomiopatia TTR, transplante de fígado, tratamento com Tafamidis e semelhantes.
[00218] O composto descrito acima pode ser administrado antes, depois ou durante outra terapia para doenças causadas por fibrilas amiloides TTR. (iv) Outros componentes
[00219] O estabilizador cinético TTR e / ou silenciador de gene TTR usado no método da presente invenção pode ser administrado sozinho ou em conjunto com um transportador farmacêutico selecionado em relação à forma pretendida de administração e conforme consistente com as práticas farmacêuticas convencionais. Os veículos farmacêuticos adequados são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., Última edição. As composições farmacêuticas podem ser especificamente formuladas para administração por qualquer via adequada, como oral, retal, nasal, pulmonar, tópica (incluindo bucal e sublingual), transdérmica, intracisternal, intraperitoneal, vaginal e parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intratecal, intravenosa e via intradérmica). Os agentes terapêuticos podem ser administrados na forma líquida ou sólida.
[00220] Em uma concretização, um ou ambos os agentes terapêuticos (isto é, o estabilizador cinético TTR e / ou silenciador do gene TTR) podem ser administrados por via intravenosa ou intraperitoneal por infusão ou injeção. As soluções do agente terapêutico ou seus sais podem ser preparadas em água ou solução salina, opcionalmente misturadas com um surfactante não tóxico. As dispersões podem ser preparadas em glicerol, polietilenoglicóis líquidos, triacetina e suas misturas e em óleos. Em condições normais de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para evitar o crescimento de microorganismos.
[00221] As formas de dosagem farmacêutica adequadas para injeção ou infusão podem incluir soluções ou dispersões aquosas estéreis ou pós estéreis compreendendo o ingrediente ativo, que são adaptados para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis ou infusíveis estéreis,
opcionalmente encapsuladas em lipossomas. A forma de dosagem final é opcionalmente estéril, fluida e estável sob condições de fabricação e armazenamento. O transportador ou veículo líquido pode ser um solvente ou meio de dispersão líquido compreendendo, por exemplo, água, etanol, um poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicóis líquidos e semelhantes), óleos vegetais, ésteres de gliceril não tóxicos e suas misturas adequadas.
[00222] Em uma concretização, um ou ambos os agentes terapêuticos (ou seja, o estabilizador cinético TTR e / ou silenciador de gene TTR) podem ser combinados com um ou mais excipientes e usados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolachas e semelhantes. Essas composições e preparações podem conter pelo menos 0,1% (p / p) de pelo menos um agente terapêutico. A percentagem das composições e preparações pode, com certeza, variar, por exemplo de cerca de 0,1% a quase 100% do peso de uma dada forma de dosagem unitária. A quantidade de pelo menos um agente terapêutico é tal que um nível de dosagem eficaz será obtido após a administração.
[00223] Os comprimidos, trociscos, pílulas, cápsulas e semelhantes também podem conter um ou mais dos seguintes: aglutinantes, tais como celulose microcristalina, goma adragante, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes, tais como fosfato dicálcico, amido ou lactose; um agente desintegrante, tal como amido de milho, amido de batata, ácido algínico, primogel e semelhantes; um lubrificante, como estearato de magnésio ou Sterotes; um deslizante, como dióxido de silício coloidal; um adoçante, como sacarose, frutose, lactose, sacarina ou aspartame; um agente aromatizante como hortelã-pimenta, salicilato de metilo, óleo de gaultéria ou aroma de cereja; e um agente antibacteriano peptídico, como envuvirtide (FuzeonTM). Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, ela pode conter, além de materiais do tipo acima, um transportador líquido, tal como um óleo vegetal ou um polietilenoglicol. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou de outro modo modificar a forma física da forma de dosagem unitária sólida.
[00224] Em uma concretização, um ou ambos os agentes terapêuticos são preparados com transportadores que irão proteger o composto contra a eliminação rápida do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de distribuição microencapsulados. Polímeros biodegradáveis e biocompatíveis podem ser usados, tais como celulose conjugada modificada, etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliacético.
[00225] Em uma concretização, o estabilizador cinético TTR e o silenciador de gene TTR são coadministrados sistemicamente. Em uma concretização particular, o estabilizador cinético TTR é administrado por via oral, enquanto o silenciador do gene TTR é administrado por administração intravenosa ou intraperitoneal. Em outra concretização, o estabilizador cinético TTR é administrado sistemicamente, por exemplo, oralmente, enquanto o silenciador do gene TTR é administrado localmente.
[00226] Em uma concretização, a molécula de RNAi é administrada nua, isto é, não conjugada, encapsulada por ou complexada com um transportador. Esta concretização geralmente requer uma ou mais modificações químicas para proteger a molécula de RNAi da degradação. Qualquer modificação química adequada pode ser usada, incluindo, mas não se limitando a, as modificações químicas aqui divulgadas.
[00227] A relação entre a molécula de RNAi e o transportador pode variar, incluindo associação covalente e não covalente. Em uma concretização particular, a molécula de RNAi é encapsulada em uma formulação nanoparticulada. Em outra concretização particular, a molécula de RNAi é complexada com o transportador, por exemplo, com base na carga. Em ainda outra concretização particular, o RNAi é conjugado ao transportador.
[00228] Em uma concretização, a molécula de RNAi é conjugada a uma molécula destinada a fazer um ou mais dos seguintes: aumentar o direcionamento da célula, prolongar o tempo de circulação da droga e / ou melhorar a permeação da membrana celular. Em uma concretização, a molécula de RNAi é conjugada a uma pequena molécula, lipídeo, peptídeo, proteína, polímero ou ácido nucleico.
[00229] Em uma concretização particular, a molécula de RNAi é conjugada a um lipídeo. Em uma concretização, o lipídio é selecionado do grupo que consiste em colesterol, ácidos biliares, ácidos graxos de cadeia longa ou a- tocoferol.
[00230] Em outra concretização particular, a molécula de RNAi é conjugada a um peptídeo. Em uma concretização, o peptídeo é um peptídeo de penetração celular (CPP). CPPs são pequenos peptídeos, tipicamente entre cerca de 7 e cerca de 30 aminoácidos, e geralmente compreendem alto teor de aminoácidos básicos. Em uma concretização particular, o CPP é selecionado a partir do grupo que consiste em Tat, transportan, penetratina, sequência Argx do peptídeo poliarginina, proteína VP22 do vírus Herpes Simplex (HSV), peptídeos antimicrobianos Buforin I e SynB e peptídeo seta doce de poliprolina.
[00231] Em uma outra concretização, a molécula de RNAi é conjugada a um fragmento de anticorpo de cadeia pesada (FAB), por exemplo, através de um ligante de protamina.
[00232] Em outra concretização, a molécula de RNAi é conjugada ao polímero.
[00233] Em uma concretização, a molécula de RNAi é conjugada com PEG. Em uma concretização particular, o RNAi é formulado como um complexo de polieletrólito (PEC) micela.
[00234] Em outra concretização, a molécula de RNAi é conjugada a um aptâmero, por exemplo, um aptâmero de RNA.
[00235] Em outras concretizações, a molécula de RNAi não é covalentemente conjugada ao transportador. O transportador pode ser, por exemplo, um nanocarreador.
[00236] Em uma concretização particular, a molécula de RNAi é encapsulada pelo transportador. Em certas concretizações, o RNAi pode ser encapsulado por um lipossoma. Os lipossomas são estruturas vesiculares que podem se formar por meio do acúmulo de lipídios, interagindo uns com os outros de maneira energeticamente favorável. O componente lipídico do lipossoma pode ser lípidos catiónicos, lípidos fusogénicos, lípidos polietileno glicosilados (PEG), colesterol ou uma combinação dos mesmos. Em uma concretização particular, o lipossoma é revestido com PEG.
[00237] Em outra concretização, a molécula de RNAi é complexada com um lipídio catiônico, por exemplo, com base na carga, onde a molécula de RNAi é aniônica e o transportador é catiônico ou compreende uma molécula catiônica. Em uma concretização particular, o transportador catiônico é um lipídio catiônico, um peptídeo catiônico ou um polímero catiônico.
[00238] Em uma concretização particular, a molécula de RNAi é complexada com uma mistura de lipídios catiônicos e fusogênicos, revestidos com polietilenoglicol difusível, para fornecer uma partícula lipídica de ácido nucleico estável (SNALP). Em uma concretização, o SNALP é entregue sistemicamente. Em outra concretização particular, a molécula de RNAi é complexada com colesterol e lipídios modificados por PEG para fornecer nanopartículas de lipidoide.
[00239] Em uma concretização, a molécula de RNAi é complexada com um peptídeo catiônico, incluindo, mas não se limitando a, atelocolágeno, poli (l-lisina) ou protamina.
[00240] Em outra concretização particular, a molécula de RNAi é complexada com um polímero catiônico incluindo, mas não limitado a, polietilenimina (PEI). Em uma concretização particular, o RNAi é complexado com ciclodextrina para fornecer uma nanopartícula de polímero de ciclodextrina. Dentro outra concretização particular, o RNAi é complexado com um fosfolipídeo e PEI de baixo peso molecular para fornecer uma nanopartícula semelhante a micela (MNP).
[00241] Em uma concretização, o RNAi é formulado para entrega direcionada, isto é, a um tecido, célula ou localização subcelular de interesse. Em uma concretização particular, o RNAi é formulado para entrega ao fígado. Em uma concretização particular, os RNAi s são formulados como uma nanopartícula de lipídio compreendendo lipídios conjugados com polietilenoglicol (PEGuilados), colesterol e ácidos nucleicos. O lipídio nanoparticular pode ser, por exemplo, entre cerca de 50-100 nm de diâmetro. Em outra concretização particular, o RNAi é formulado como um conjugado GalNAc, isto é, ligado a N-acetilgalactosamina (GalNAc).
[00242] Em outra concretização, o transportador é um vetor viral. Os vetores virais representativos e não limitantes incluem retrovirais, adenovírus, associados a adenovírus, lentevírus e vetores de vírus herpes simplex.
[00243] Em certas concretizações, o estabilizador cinético TTR e o silenciador de gene TTR são formulados para administração de dosagem única. Em outras concretizações, o estabilizador cinético TTR e o silenciador de gene TTR são formulados para administração de dosagem múltipla.
[00244] A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com os materiais transportadores para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do hospedeiro tratado e do modo particular de administração. Deve ser entendido, no entanto, que uma dosagem específica e regime de tratamento para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto específico empregado, a idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de drogas e o julgamento do médico assistente e a gravidade da doença específica a ser tratada. A quantidade de ingrediente ativo também pode depender do agente terapêutico ou profilático, se houver, com o qual o ingrediente é coadministrado. Métodos
[00245] Em uma concretização, a invenção fornece um método de fabricação da molécula de RNAi aqui divulgada. Em concretizações particulares, o método compreende reagir unidades de nucleotídeo e, assim, formando unidades de nucleotídeo contíguas covalentemente ligadas compreendendo o RNAi.
[00246] Em uma concretização, a invenção fornece um método de prevenção da amiloidose associada à transtiretina, compreendendo a administração de uma quantidade profilaticamente eficaz da composição aqui divulgada a um sujeito em necessidade, por exemplo, um humano.
[00247] Em uma concretização, a invenção fornece um método de tratamento da amiloidose associada à transtiretina, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição divulgada neste documento a um sujeito em necessidade, por exemplo, um humano.
[00248] Como um técnico versado na técnica irá entender, a amiloidose associada a TTR é uma condição lentamente progressiva caracterizada pelo acúmulo de depósitos anormais de amiloide (amiloidose) nos órgãos e tecidos do corpo. O processo de amiloidose está ligado à degeneração do tecido, mas as próprias fibrilas amiloides podem não mediar a citotoxicidade. A ativação celular local, resultando em disfunção celular e morte, pode contribuir para a patogênese.
[00249] Existem três formas principais de amiloidose transtirretina: neuropática, cardíaca e leptomeníngea. Essas formas podem afetar uma ampla variedade de tecidos e órgãos.
[00250] A forma neuropática da transtirretina amiloidose afeta principalmente os sistemas nervosos periférico e autônomo, resultando em neuropatia periférica e dificuldade de controlar as funções corporais. Prejuízos nas funções corporais podem incluir impotência sexual, diarreia, constipação, problemas ao urinar e uma queda acentuada da pressão arterial ao levantar (hipotensão ortostática). Algumas pessoas também têm problemas cardíacos e renais. Vários problemas oculares podem ocorrer, como turvação do gel transparente que preenche o globo ocular (opacidade vítrea), olhos secos, aumento da pressão nos olhos (glaucoma) ou pupilas com aparência irregular ou "denteada". Algumas pessoas com esta forma de amiloidose transtirretina desenvolvem a síndrome do túnel do carpo, que é caracterizada por dormência, formigamento e fraqueza nas mãos e dedos.
[00251] Em uma concretização, a amiloidose associada a TTR neuropática é polineuropatia amiloide familiar (FAP)
(também chamada de polineuropatia ATTR hereditária, também abreviada como polineuropatia hATTR ou doença de Corino de Andrade). É uma doença neurodegenerativa autossômica dominante, que se manifesta quando a deposição de amiloide se acumula ao longo do tempo e tipicamente, entre cerca de 20 e cerca de 40 anos de idade. Dada a natureza difusa da deposição de fibrila amiloide, a FAP está associada a vários sintomas, muitos dos quais são inespecíficos. Os sintomas comuns incluem dor, parestesia, fraqueza muscular e disfunção autonômica.
[00252] A neuropatia pode ser acompanhada por várias combinações de sintomas cardíacos, gastrointestinais, renais ou oculares. Nos estágios iniciais, a sensibilidade ao frio e à picada de agulha pode estar presente. Em seu estado terminal, os rins e o coração são afetados.
[00253] A FAP é caracterizada pela deposição sistêmica de variantes amiloidogênicas da proteína transtirretina, especialmente, no sistema nervoso periférico. Os depósitos amiloides são distribuídos difusamente no sistema nervoso periférico, envolvendo troncos nervosos, plexos e gânglios sensoriais e autonômicos. Depósitos amiloides nos nervos periféricos ocorrem especialmente no endoneuro, onde aparecem próximos às células de Schwann (SCs) e às fibrilas de colágeno. Em nervos gravemente afetados, o conteúdo endoneural é substituído por amiloide e poucas fibras nervosas mantêm a viabilidade. O sistema nervoso central (SNC) é relativamente afetado, com exceção do revestimento ependimal e das leptomeninges. Fora do sistema nervoso, depósitos amiloides extensos foram observados em todo o tecido conjuntivo em uma distribuição perivascular. O receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE) exibe expressão aumentada em tecidos FAP.
[00254] A substituição de valina por metionina na posição 30 (TTR V30M) é a mutação mais comumente encontrada na FAP, embora mais de 100 mutações pontuais amiloidogênicas tenham sido identificadas em todo o mundo. Em uma concretização particular, o sujeito tem uma mutação genética no gene TTR selecionado de Val30Met, Val50Met, Ala25Ser, Val30Leu, Phe33Val, Asp38Ala, Glu42Gly, Phe44Ser, Gly47Arg, Gly47Val, Thr49Ile, Thr49Ala, Ser50Arg, Glu54Lys, Leu55Pro, Glu6lLys, Val7lAla, Ser77Tyr, Ala97Gly, Alal09Ser, Val28Ser, Val28Met, Ala36Pro, Ile84Asn, His88Arg, Alal20Ser, Leu58Arg, Tyr69Ile, Ilel07Val, Tyrl l4His, Alal20Ser.
[00255] Uma investigação típica de polineuropatia geralmente inclui um histórico médico completo, um exame neurológico clínico detalhado, estudos de condução nervosa e testes laboratoriais de rotina. Em uma concretização, o sujeito é diagnosticado pela determinação de uma pontuação de comprometimento neurológico (NIS) para nervos cranianos, tórax e membros superiores e inferiores (0-244 pontos) (Dyck, PJ et al. (1995) Neurology, 45, 1115 -1121). Em outra concretização, o sujeito é diagnosticado por determinar uma pontuação de deficiência neurológica (NDS) (10 pontos) (Dyck, PJ, et al., (1988) Muscle and Nerve, 11, 21-32). Em outra concretização, o sujeito é diagnosticado por teste sensorial quantitativo (QST) (Rolke et al. (2006) Pain, 125, 197). Em uma outra concretização, o sujeito é diagnosticado por teste de função autonômica (AFT), como a resposta simpática da pele (SSR) e a variabilidade da frequência cardíaca (HRV) (Haegele-Link et al., (2008) The Open Neurology Journal, 2, 12-19). A coloração com vermelho do Congo pode ser usada para identificar histologicamente a deposição de amiloide. A identificação histológica da deposição de amiloide pode envolver aspirado de gordura abdominal Uma vez que a deposição de amiloide é identificada, a coloração imunohistoquímica pode ser usada para identificar a TTR. Em certas concretizações, o sujeito é diagnosticado pela combinação de um ou mais desses métodos.
[00256] Em uma concretização particular, a invenção fornece um método de prevenção de amiloidose associada a TTR neuropática, compreendendo a administração de uma quantidade profilaticamente eficaz da composição divulgada neste documento a um sujeito em necessidade, evitando assim a amiloidose associada a TTR neuropática.
[00257] Em uma concretização particular, a invenção fornece um método de tratamento de amiloidose associada a TTR neuropática, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição divulgada neste documento a um sujeito em necessidade, tratando assim a amiloidose associada a TTR neuropática.
[00258] Em uma concretização, a invenção fornece um método de tratamento de amiloidose associada a TTR neuropática compreendendo a coadministração de uma quantidade eficaz de pelo menos um estabilizador cinético de TTR (por exemplo, tolcapone) e uma quantidade eficaz de pelo menos uma molécula de RNAi (por exemplo, siRNA), em que a forma de coadministração é selecionada a partir do grupo que consiste em administração simultânea, administração sequencial, administração sobreposta, administração de intervalo, administração contínua ou uma combinação das mesmas.
[00259] Em uma concretização, o tratamento produz uma redução em uma ou mais medidas clínicas de amiloidose associada a TTR neuropática (em comparação com as mesmas medidas clínicas pré-tratamento), em que a medida clínica é selecionada a partir de expressão gênica de TTR, níveis de proteína TTR sérica e / ou formação de fibrilas. A redução na medida clínica relevante pode ser medida usando qualquer método adequado, incluindo, mas não se limitando aos métodos aqui divulgados.
[00260] Em concretizações exemplificativas, o tratamento produz uma redução ou eliminação de sintomas associados à amiloidose associada a TTR neuropática do sujeito. Sintomas representativos e não limitantes que podem ser reduzidos pelo método aqui divulgado incluem neuropatia periférica, impotência sexual, diarreia, constipação, problemas urinários, hipotensão ortostática, problemas cardíacos, problemas renais, problemas oculares e síndrome do túnel do carpo.
[00261] Em uma concretização, o tratamento produz uma redução no Neuropathy Impairment Score (NIS) de um sujeito humano, que mede a fraqueza, a sensação e os reflexos, especialmente com respeito à neuropatia periférica. (Dyck, P. et ah, Neurology 1997. 49 (1): pgs. 229-239). Em certas concretizações, o escore NIS do sujeito é reduzido após o tratamento em pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45% ou pelo menos cerca de 50% ou mais. Em outras concretizações, o método interrompe uma pontuação NIS crescente, por exemplo, o método resulta em um aumento de cerca de 0% na pontuação NIS.
[00262] Em uma concretização particular, o tratamento permite um aumento na expectativa de vida de um sujeito diagnosticado com FAP. Em uma concretização particular, um grupo de pacientes com FAP é tratado e a progressão da doença é maior do que cerca de 3 meses, maior do que cerca de 6 meses, maior do que cerca de 1 ano, maior do que cerca de 3 anos ou maior do que cerca de cinco anos - em cada caso em comparação com pacientes não tratados de acordo com o método aqui descrito.
[00263] Em uma concretização, a amiloidose associada a TTR cardíaca é cardiomiopatia amiloide familiar (FAC) (também chamada de cardiomiopatia hereditária ATTR, também abreviada como cardiomiopatia hATTR). A infiltração do coração por depósitos de proteínas insolúveis na amiloidose frequentemente resulta em cardiomiopatia restritiva que se manifesta tardiamente em seu curso com insuficiência cardíaca e anormalidades de condução. Os indivíduos com amiloidose cardíaca podem apresentar batimento cardíaco anormal (arritmia), coração aumentado (cardiomegalia) ou hipertensão ortostática.
[00264] Uma mutação do gene da isoleucina 122 do gene
TTR causa uma amiloidose hereditária envolvendo principalmente o coração sem sintoma neurológico, com uma idade de apresentação tipicamente> 60 anos e associada à etnia africana / caribenha. Uma mutação T60A também está associada à cardiomiopatia hATTR, com uma apresentação de idade tipicamente> 60 anos e associada à etnia caucasiana (irlandesa). Em uma concretização particular, o sujeito tem uma mutação genética no gene TTR selecionado de Aspl8Glu, Ala36Asp, Ala45Asp, Ser50Ile, Thr59Arg, Thr60Ala, Glu89Lys, Gln92Lys, Val94Gly, Asp38Ala, Ser50 Valg, Vall22Ile, Glu89Gln, Pro24Leuer.
[00265] Métodos de diagnóstico de cardiomiopatia hATTR em uma base não genética incluem os testes histoquímicos aqui descritos, bem como ecocardiografia com imagem de deformação, ressonância magnética cardíaca (CMR), eletrocardiografia (ECG) e teste de biomarcador sérico, incluindo peptídeo natriurético tipo B (BNP ou pró-BNP N- terminal) e troponina cardíaca (T ou I).
[00266] Em uma concretização, a invenção fornece um método de tratamento de hATTR-cardiomiopatia compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição aqui divulgada a um sujeito em necessidade, tratando assim a hATTR-cardiomiopatia.
[00267] Em outra concretização, a invenção fornece um método de tratamento de hATTR-cardiomiopatia compreendendo a coadministração de uma quantidade eficaz de pelo menos um estabilizador cinético de TTR (por exemplo, tolcapone) e uma quantidade eficaz de pelo menos uma molécula de RNAi (por exemplo, siRNA) em que a forma de coadministração é selecionada a partir do grupo que consiste em administração simultânea, administração sequencial, administração sobreposta, administração de intervalo, administração contínua ou uma combinação das mesmas.
[00268] Em uma concretização, o tratamento produz uma redução em uma ou mais medidas clínicas de hATTR- cardiomiopatia (em comparação com o pré-tratamento), em que a medida clínica é selecionada a partir da expressão do gene TTR, níveis de proteína TTR sérica e / ou formação de fibrilas. A redução na medida clínica relevante pode ser medida usando qualquer método adequado, incluindo, mas não se limitando aos métodos aqui divulgados.
[00269] Em uma concretização, o tratamento produz uma redução ou eliminação dos sintomas associados à cardiomiopatia hATTR do sujeito. Sintomas que podem ser reduzidos com o tratamento, incluindo batimento cardíaco anormal (arritmia), coração aumentado (cardiomegalia) ou hipertensão ortostática.
[00270] Em uma concretização, a amiloidose associada a TTR cardíaca é a amiloidose sistêmica senil (SSA) (também chamada de cardiomiopatia ATTR de tipo selvagem, também abreviada como cardiomiopatia wtATTR). A infiltração do coração por depósitos de proteínas insolúveis na amiloidose frequentemente resulta em cardiomiopatia restritiva que se manifesta tardiamente em seu curso com insuficiência cardíaca e anormalidades de condução. Os indivíduos com amiloidose cardíaca podem apresentar batimento cardíaco anormal (arritmia), coração aumentado (cardiomegalia) ou hipertensão ortostática.
[00271] Os métodos de diagnóstico de amiloidose cardíaca incluem os testes histoquímicos aqui descritos, bem como ecocardiografia com imagem de tensão, ressonância magnética cardíaca (CMR), eletrocardiografia (ECG) e teste de biomarcador sérico, incluindo peptídeo natriurético tipo B (BNP ou pró-terminal N -BNP) e troponina cardíaca (T ou I).
[00272] Em uma concretização, a invenção fornece um método de tratamento de cardiomiopatia ATTR de tipo selvagem, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição aqui divulgada a um sujeito em necessidade, tratando assim a cardiomiopatia wtATTR.
[00273] Em outra concretização, a invenção fornece um método de tratamento de cardiomiopatia wtATTR que compreende a coadministração de uma quantidade eficaz de pelo menos um estabilizador cinético de TTR (por exemplo, tolcapone) e uma quantidade eficaz de pelo menos uma molécula de RNAi (por exemplo, siRNA) em que a forma de coadministração é selecionada a partir do grupo que consiste em administração simultânea, administração sequencial, administração sobreposta, administração de intervalo, administração contínua ou uma combinação das mesmas.
[00274] Em uma concretização, o tratamento produz uma redução em uma ou mais medidas clínicas de wtATTR- cardiomiopatia (em comparação com o pré-tratamento), em que a medida clínica é selecionada a partir da expressão do gene TTR, níveis de proteína TTR sérica e / ou formação de fibrila. A redução na medida clínica relevante pode ser medida usando qualquer método adequado, incluindo, mas não se limitando aos métodos aqui divulgados.
[00275] Em uma concretização, o tratamento produz uma redução ou eliminação dos sintomas associados à cardiomiopatia wtATTR do sujeito. Sintomas que podem ser reduzidos com o tratamento, incluindo batimento cardíaco anormal (arritmia), coração aumentado (cardiomegalia) ou hipertensão ortostática.
[00276] A amiloidose leptomeníngea associada a TTR (hATTR-leptomeníngea) afeta principalmente o acúmulo de proteínas no sistema nervoso central em leptomeninges, podendo causar acidente vascular cerebral e sangramento no cérebro, acúmulo de fluido no cérebro (hidrocefalia), dificuldade de coordenação de movimentos (ataxia), rigidez muscular e fraqueza (paralisia espástica), convulsões e perda da função intelectual (demência). Também podem ocorrer problemas oculares semelhantes aos da forma neuropática.
[00277] Em uma concretização, a invenção fornece um método de tratamento da amiloidose associada a TTR leptomeníngea, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição aqui divulgada a um sujeito em necessidade, tratando assim a amiloidose associada a TTR leptomeníngea.
[00278] Em uma concretização, a invenção fornece um método de tratamento de amiloidose associada a TTR leptomeníngea compreendendo a coadministração de uma quantidade eficaz de pelo menos um estabilizador cinético de TTR (por exemplo, tolcapone) e uma quantidade eficaz de pelo menos uma molécula de RNAi (por exemplo, siRNA) em que a forma de coadministração é selecionada a partir do grupo que consiste em administração simultânea, administração sequencial, administração sobreposta, administração de intervalo, administração contínua ou uma combinação das mesmas.
[00279] Em concretizações exemplificativas, o tratamento produz uma redução em uma ou mais medidas de amiloidose associada a TTR leptomeníngea (em comparação com o pré-tratamento), em que a medida clínica é selecionada a partir da expressão do gene TTR, níveis de proteína TTR sérica e / ou formação de fibrila. A redução na medida clínica relevante pode ser medida usando qualquer método adequado, incluindo, mas não se limitando aos métodos aqui divulgados.
[00280] Em uma concretização, o tratamento produz uma redução ou eliminação dos sintomas associados à amiloidose associada a TTR leptomeníngea do sujeito. Sintomas representativos e não limitantes incluem acidente vascular cerebral, sangramento no cérebro, um acúmulo de fluido no cérebro (hidrocefalia), dificuldade de coordenação de movimentos (ataxia), rigidez muscular e fraqueza (paralisia espástica), convulsões, perda da função intelectual (demência) e problemas oculares (ou seja, problemas oculoleptomeníngeos).
[00281] Em uma concretização, os pacientes com amiloidose associada a TTR podem ter um ou mais de uma combinação de sintomas associados com ATTR-cardiomiopatia, ATTR-polineuropatia ou ATTR-leptomeníngea.
[00282] Em uma concretização, o tratamento produz uma redução ou eliminação de um ou mais sintomas associados à ATTR-cardiomiopatia, ATTR-polineuropatia ou ATTR- leptomeníngea do sujeito.
[00283] Em uma concretização, a invenção fornece um método de tratamento de amiloidose associada a TTR que compreende a coadministração de uma quantidade eficaz de pelo menos um estabilizador cinético de TTR (por exemplo, tolcapone) e uma quantidade eficaz de pelo menos uma molécula de RNAi (por exemplo, siRNA) em que a forma de coadministração é selecionada a partir do grupo que consiste em administração simultânea, administração sequencial, administração sobreposta, administração de intervalo, administração contínua ou uma combinação das mesmas.
[00284] Em uma concretização, a invenção fornece um método para inibir a expressão do gene TTR em comparação a um controle, compreendendo a administração da composição aqui divulgada a um sistema (por exemplo, sistema in vitro sem células), célula, tecido ou organismo.
[00285] A inibição da expressão do gene TTR pode ser medida por qualquer método adequado, como a medição dos níveis de mRNA ou níveis de proteína TTR. Métodos representativos e não limitantes de medição da expressão do gene TTR incluem amplificação de reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), hibridização de solução de RNA, proteção de nuclease, hibridização do norte, monitoramento da expressão gênica com um microarray, ligação de anticorpo, radioimunoensaio e análise de células ativadas por fluorescência.
[00286] Em concretizações exemplificativas, a expressão do gene TTR é inibida em pelo menos cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45% ou cerca de 50% ou mais. Em concretizações exemplificativas, a expressão do gene TTR é inibida em pelo menos cerca de 60%, cerca de 70% ou 80% ou mais. Em concretizações exemplificativas, a expressão do gene TTR é inibida em pelo menos cerca de 85%, cerca de 90% ou cerca de 95% ou mais.
[00287] Em concretizações exemplificativas, a expressão do gene TTR é inibida sinergicamente em comparação com a inibição do gene TTR por um estabilizador cinético de TTR (por exemplo, tolcapone) ou um silenciador genético de TTR (por exemplo, siRNA) quando administrado sozinho, ou seja, não em combinação. Em concretizações exemplificativas, o sinergismo é de cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,3, cerca de 1,4, cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,7, cerca de 1,8, cerca de 1,9 ou cerca de 2,0 ou mais.
[00288] Em uma concretização, a invenção fornece um método para reduzir a expressão de TTR no soro da proteína TTR em comparação com um controle, compreendendo a administração da composição aqui divulgada a um sistema (por exemplo, sistema in vitro livre de células), célula, tecido ou organismo.
[00289] A concentração de proteína TTR no soro pode ser determinada diretamente usando quaisquer métodos conhecidos por um versado na técnica, por exemplo, um ensaio baseado em anticorpo ou um ELISA.
[00290] Em concretizações exemplificativas, a concentração de proteína TTR sérica é reduzida em cerca de
5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45% ou cerca de 50 % ou mais. Em concretizações exemplificativas, a expressão do gene TTR é inibida em pelo menos cerca de 60%, cerca de 70% ou 80% ou mais. Em concretizações exemplificativas, a expressão do gene TTR é inibida em pelo menos cerca de 85%, cerca de 90% ou cerca de 95% ou mais.
[00291] Em concretizações exemplificativas, a concentração de proteína TTR sérica é sinergicamente reduzida em comparação com a redução da concentração de proteína TTR sérica por um estabilizador cinético TTR (por exemplo, tolcapone) ou um silenciador genético de TTR (por exemplo, siRNA) administrado sozinho, ou seja, não em combinação. Em concretizações exemplificativas, o sinergismo é de cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,3, cerca de 1,4, cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,7, cerca de 1,8, cerca de 1,9 ou cerca de 2,0 ou mais.
[00292] Em concretizações exemplificativas, a concentração de proteína TTR sérica é reduzida para menos de cerca de 50 ng / mL, cerca de 45 ng / mL, cerca de 40 ng / mL, cerca de 35 ng / mL, cerca de 30 ng / mL, cerca de 25 ng / mL, cerca de 20 ng / ml, cerca de 15 ng / ml, cerca de 10 ng / ml ou cerca de 5 ng / ml.
[00293] Em algumas concretizações, a concentração de proteína TTR sérica é reduzida para menos de 50 pg / ml ou para menos de 40 pg / ml, 25 pg / ml ou 10 pg / ml. Em algumas concretizações, a concentração de proteína TTR sérica é reduzida em 80%, ou em 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% ou em 95%.
[00294] Em uma concretização, a invenção fornece um método para estabilizar TTR em comparação com um controle, compreendendo a administração da composição aqui divulgada a um sistema (por exemplo, sistema in vitro sem células), célula, tecido ou organismo.
[00295] A estabilidade da proteína TTR pode ser determinada por qualquer método adequado, por exemplo, uma diminuição da taxa de dissociação de TTR mediada por ureia.
[00296] Em uma concretização, a proteína TTR é estabilizada em cerca de 2,0 kcal / mol ou mais.
[00297] Em uma concretização, a invenção fornece um método para reduzir a formação de fibrilas em comparação com um controle, compreendendo a administração da composição aqui divulgada a um sistema (por exemplo, sistema in vitro sem células), célula, tecido ou organismo.
[00298] Em uma concretização, o método divulgado diminui a taxa de amilooidogênese mediada por ácido ou MeOH. A formação de fibrilas pode ser medida por qualquer método adequado. A formação de fibrilas pode ser medida in vitro (por exemplo, intra ou extracelular em cultura de células) ou in vivo, como TTR encontrada em fluidos corporais, incluindo, mas não restrito a sangue, soro, líquido cefalorraquidiano, tecido e órgãos, incluindo, mas não restrito a , o coração, o rim, os nervos periféricos, as meninges, o sistema nervoso central, o olho (incluindo a retina e o fluido vítreo), o trato gastrointestinal de um sujeito.
[00299] Em concretizações exemplificativas, a formação de fibrilas é reduzida em cerca de 5%, cerca de
10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45% ou cerca de 50% ou mais. Em concretizações exemplificativas, a formação de fibrilas é reduzida em pelo menos cerca de 60%, cerca de 70% ou 80% ou mais. Em concretizações exemplificativas, a formulação de fibrila é reduzida em pelo menos cerca de 85%, cerca de 90% ou cerca de 95% ou mais.
[00300] Em concretizações exemplificativas, a formação de fibrilas é reduzida sinergicamente em comparação com a redução da concentração de proteína TTR no soro por um estabilizador cinético de TTR (por exemplo, tolcapone) ou um silenciador genético de TTR (por exemplo, siRNA) administrado sozinho, ou seja, não em combinação. Em concretizações exemplificativas, o sinergismo é de cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,3, cerca de 1,4, cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,7, cerca de 1,8, cerca de 1,9 ou cerca de 2,0 ou mais.
[00301] A administração pode ser por qualquer método convencional ou via de administração de agentes terapêuticos, incluindo vias sistêmicas ou localizadas. Em geral, as vias de administração contempladas incluem, mas não estão necessariamente limitadas a intranasal, intrapulmonar, intramuscular, intratraqueal, subcutânea, intradérmica, aplicação tópica, intravenosa, retal, nasal, oral e outras vias de administração parenteral. As vias de administração podem ser combinadas, se desejado, ou ajustadas dependendo do agente e / ou do efeito desejado.
[00302] Em uma concretização particular, o método envolve a administração da composição divulgada neste documento a um sujeito em necessidade por administração sistêmica ou local.
[00303] Em outra concretização particular, o método envolve a coadministração de (i) uma quantidade eficaz de pelo menos um estabilizador cinético TTR (por exemplo, tolcapone) e (ii) uma quantidade eficaz de pelo menos uma molécula de RNAi a um sujeito em necessidade do mesmo por ou administração local. Em uma concretização, o método envolve a coadministração de tolcapone e a molécula de RNAi sistemicamente, opcionalmente por diferentes vias e mais particularmente, a administração de tolcapone por via oral (por exemplo, como uma mesa) e a administração da molécula de RNAi por injeção intravenosa.
[00304] Os técnicos versados no assunto irão prontamente apreciar que os níveis de dose podem variar em função do agente específico (por exemplo, o estabilizador cinético de TTR específico e / ou o silenciador genético de TTR específico), a gravidade dos sintomas e a suscetibilidade do sujeito aos efeitos colaterais.
[00305] As dosagens preferidas para um determinado composto são facilmente determináveis pelos especialistas na técnica por uma variedade de meios.
[00306] Embora a dosagem usada varie dependendo do objetivo clínico a ser alcançado, em uma concretização, o estabilizador cinético TTR é administrado em uma dose fixa entre cerca de 5 mg e cerca de 900 mg, entre cerca de 10 mg e cerca de 750 mg, entre cerca de 25 mg e cerca de 500 mg, entre cerca de 50 mg e cerca de 250 mg, ou entre cerca de 75 mg e cerca de 150 mg. Em outra concretização, o estabilizador cinético TTR é administrado em uma dose fixa de cerca de 10 mg, cerca de 12,5 mg, cerca de 15 mg, cerca de 20 mg, cerca de 25 mg, cerca de 30 mg, cerca de 35 mg, cerca de 40 mg, cerca de 45 mg , cerca de 50 mg, cerca de 55 mg, cerca de 60 mg, cerca de 65 mg, cerca de 70 mg, cerca de 75 mg, cerca de 80 mg, cerca de 85 mg, cerca de 90 mg, cerca de 95 mg, cerca de 100 mg, cerca de 110 mg, cerca de 120 mg, cerca de 125 mg, cerca de 130 mg, cerca de 140 mg, cerca de 150 mg, cerca de 160 mg, cerca de 170 mg, cerca de 175 mg, cerca de 180 mg, cerca de 190 mg, 200 mg, cerca de 225 mg, cerca de 250 mg, cerca de 275 mg, cerca de 300 mg, cerca de 325 mg, cerca de 350 mg, cerca de 375 mg, cerca de 400 mg, cerca de 425 mg, cerca de 450 mg, cerca de 475 mg, cerca de 500 mg, cerca de 525 mg, cerca de 550 mg, cerca de 575 mg, cerca de 600 mg, cerca de 625 mg, cerca de 650 mg, cerca de 675 mg, cerca de 700 mg, cerca de 725 mg, cerca de 750 mg, cerca de 775 mg, cerca de 800 mg, cerca de 825 mg, cerca de 850 mg, cerca de 875 mg, ou cerca de 900 mg.
[00307] Em uma concretização exemplificativa, o estabilizador cinético TTR é tolcapone e é administrado em uma dose fixa entre cerca de 5 mg e cerca de 500 mg, entre cerca de 10 mg e cerca de 250 mg, entre cerca de 25 mg e cerca de 200 mg ou entre cerca de 50 mg e cerca de 150 mg. Em uma concretização particular, o tolcapone é administrado em uma dose fixa de cerca de 5 mg, cerca de 15 mg, cerca de 20 mg, cerca de 25 mg, cerca de 30 mg, cerca de 35 mg, cerca de 40 mg, cerca de 45 mg, cerca de 50 mg, cerca de 55 mg, cerca de 60 mg, cerca de 65 mg, cerca de 70 mg, cerca de 75 mg, cerca de 80 mg, cerca de 85 mg, cerca de 90 mg, cerca de 95 mg, cerca de 100 mg, cerca de 110 mg, cerca de 120 mg, cerca de 130 mg, cerca de 140 mg ou cerca de 150 mg ou mais.
[00308] Embora a dosagem usada varie dependendo dos objetivos clínicos a serem alcançados, em uma concretização, a dosagem do silenciador do gene TTR (por exemplo, molécula de siRNA) é selecionada entre cerca de 5 mg e cerca de 900 mg, entre cerca de 10 mg e cerca de 750 mg , entre cerca de 25 mg e cerca de 500 mg, entre cerca de 50 mg e cerca de 250 mg, ou entre cerca de 75 mg e cerca de 150 mg. Em outra concretização, o estabilizador cinético TTR é administrado em uma dose fixa de cerca de 10 mg, cerca de 12,5 mg, cerca de 15 mg, cerca de 20 mg, cerca de 25 mg, cerca de 30 mg, cerca de 35 mg, cerca de 40 mg, cerca de 45 mg , cerca de 50 mg, cerca de 55 mg, cerca de 60 mg, cerca de 65 mg, cerca de 70 mg, cerca de 75 mg, cerca de 80 mg, cerca de 85 mg, cerca de 90 mg, cerca de 95 mg, cerca de 100 mg, cerca de 110 mg, cerca de 120 mg, cerca de 125 mg, cerca de 130 mg, cerca de 140 mg, cerca de 150 mg, cerca de 160 mg, cerca de 170 mg, cerca de 175 mg, cerca de 180 mg, cerca de 190 mg, 200 mg, cerca de 225 mg, cerca de 250 mg, cerca de 275 mg, cerca de 300 mg, cerca de 325 mg, cerca de 350 mg, cerca de 375 mg, cerca de 400 mg, cerca de 425 mg, cerca de 450 mg, cerca de 475 mg, cerca de 500 mg, cerca de 525 mg, cerca de 550 mg, cerca de 575 mg, cerca de 600 mg, cerca de 625 mg, cerca de 650 mg, cerca de 675 mg, cerca de 700 mg, cerca de 725 mg, cerca de 750 mg, cerca de 775 mg, cerca de 800 mg, cerca de 825 mg, cerca de 850 mg, cerca de 875 mg, ou cerca de 900 mg.
[00309] Dependendo da dosagem, pode ser conveniente administrar a dosagem diária em várias unidades de dosagem.
[00310] O regime de dosagem pode ser o mesmo ou pode variar dramaticamente entre o estabilizador cinético TTR e o silenciador do gene TTR. Em uma concretização, a administração ou coadministração é uma vez ao dia. Em outra concretização, a administração ou coadministração é duas vezes ao dia. Em ainda outra concretização, a administração ou co-administração é três, quatro, cinco ou seis vezes ao dia. Em uma concretização, a administração ou coadministração ocorre uma vez a cada dois dias.
[00311] Em outra concretização, a administração ou co-administração é uma vez por semana, mês ou ano. Em outra concretização, a administração ou coadministração é duas, três ou quatro vezes ou mais por semana, mês ou ano.
[00312] O tempo de administração ou co-administração pode variar. Em uma concretização, a administração ou coadministração é de manhã, meio-dia, ao meio-dia, tarde, noite ou madrugada.

Claims (3)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição caracterizada pelo fato de que compreende (i) uma quantidade eficaz de tolcapone; (ii) uma quantidade eficaz de uma molécula de RNAi; e (iii) um transportador farmacêutico, em que a molécula de RNAi é adequada para uso na redução da expressão do gene que codifica a proteína transtirretina (TTR).
2. Método de tratamento da polineuropatia amilóide familiar (FAP), caracterizado pelo fato de que compreende (i) administrar a composição da reivindicação 1 a um sujeito em necessidade, tratando, assim, a polineuropatia amilóide familiar.
3. Método de tratamento de polineuropatia amilóide familiar, caracterizado pelo fato de que compreende (i) administrar a um sujeito em necessidade uma composição compreendendo (i) uma quantidade eficaz de tolcapone; (ii) uma quantidade eficaz de uma molécula de RNAi e (iii) um transportador farmacêutico, em que a molécula de RNAi é adequada para uso na redução da expressão do gene que codifica a proteína transtirretina, tratando, assim, a polineuropatia amilóide familiar.
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