BR112020014858A2 - Método para a harmonização dos resultados de ensaio - Google Patents

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Abstract

a presente invenção se refere a métodos para harmonização de resultados de teste de uma amostra biológica em um ensaio bioquímico multiplexado, em que a presença e/ou a concentração de múltiplos biomarcadores são determinadas ao mesmo tempo na mesma amostra, tornando comparáveis resultados de teste obtidos em diferentes laboratórios, sendo que os testes compreendem: quantificar uma pre-sença ou uma concentração de pelo menos dois biomarcadores diferentes em uma amostra biológica e em uma amostra padrão de harmonização, independentemente em cada amostra, por meio de um ensaio bioquímico definido multiplexado, imple-mentado em um tipo definido de instrumento analítico; receber os resultados de teste das amostras em um mecanismo de decisão baseado em computador para harmonizar os resultados de teste das amostras biológicas; e transformar os resultados de teste recebidos da amostra biológica, o que inclui transformar os resultados de teste da amostra padrão de harmonização em unidades generalizadas e ajustar os resultados de teste da amostra biológica nas unidades generalizadas, ge.

Description

“MÉTODO PARA A HARMONIZAÇÃO DOS RESULTADOS DE ENSAIO” CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção se refere, em geral, a um método, dispositivo de ensaio e kit para ensaios bioquímicos multiplexados, tornando comparáveis os resul- tados de teste obtidos em diferentes laboratórios. Em particular, a presente invenção se refere ao uso repetido de diferentes amostras de controle que, em conjunto, permi- tem a harmonização dos resultados de teste e o diagnóstico do equipamento de teste.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] As medições bioquímicas são comumente usadas para diagnosticar, monitorar e orientar o tratamento de doenças. Enquanto a maioria dos ensaios bioquíi- micos fornece resultados únicos, ou seja, mede a presença ou a concentração de um biomarcador definido, o uso de ensaios multiplexados está aumentando. Em um en- saio multiplexado, a presença ou a concentração de vários biomarcadores é determi- nada essencialmente ao mesmo tempo (por exemplo, no mesmo dia ou na mesma semana) em uma ou mais alíquotas da mesma amostra. Cada biomarcador pode ser analisado com o uso do mesmo dispositivo ou vários dispositivos podem ser neces- sários para analisar todo o conjunto de biomarcadores. Os dados resultantes são en- tão combinados para formar uma saída (por exemplo uma única estimativa de risco ou um padrão de algum tipo indicativo das características da amostra). Os ensaios multiplexados aumentam a eficiência, mas complicam o procedimento de calibração.
[003] Um tipo particular de ensaio bioquímico, o imunoensaio, utiliza anticor- pos para a detecção específica da presença ou da concentração de uma proteína ou outro antígeno. Os imunoensaios podem ser competitivos ou não competitivos, de fase sólida ou líquida e podem ou não exigir uma etapa de separação. Para fins de detecção, os imunoensaios podem usar um antígeno ou anticorpo marcado e um ou mais locais onde ocorrem reações detectáveis.
[004] A pessoa versada na técnica está ciente de que, às vezes, o produto de um ensaio bioquímico é de natureza arbitrária. É possível usar a concentração do biomarcador como saída. No entanto, também é possível definir a quantidade de um bioquímico em unidades de eficiência, como é feito para o fármaco com proteína do Fator IX (fabricado pela Baxter). Indivíduos com deficiência dessa proteína têm hemo- filia B, um distúrbio de coagulação. O Fator IX é quantificado em unidades arbitrárias de eficiência enzimática, de modo que uma quantidade definida do fármaco produz uma atividade enzimática definida, independentemente da concentração real do fator IX. Entre o ensaio bioquímico, existem vários métodos de formatos e padrões de pro- duto. Em geral, os produtos têm unidades muito variadas e linearidade variável à res- posta. Essa variabilidade complica a avaliação de qualquer produto bioquímico. Nos casos em que vários resultados de ensaio devem ser combinados, a situação se torna ainda mais complicada, e, se diferentes laboratórios estiverem implementando o mesmo ensaio usando diferentes tipos de instrumentos analíticos, a variação inerente de tipo de laboratório para laboratório, de instrumento para instrumento e de tipo de instrumento para tipo de instrumento será adicionada à variação geral.
[005] A comunidade médica reconheceu que a harmonização é necessária e procedimentos foram implementados para controlar e padronizar a qualidade dos re- sultados de um determinado ensaio bioquímico em um determinado laboratório. Mui- tos laboratórios clínicos/analíticos implementam a verificação do ensaio em três ní- veis. De acordo com um primeiro nível, normalmente há uma ou mais amostras de calibração embutidas em cada ensaio, de modo a produzir dados conhecidos para interpolar resultados para amostras desconhecidas. Se a curva de calibração não atender aos padrões predeterminados, os resultados do ensaio serão considerados não confiáveis. De acordo com um segundo nível, existem amostras de controle posi- tivo produzidas localmente com propriedades conhecidas, independentes das amos- tras de calibração. Se a curva de calibração não for capaz de reproduzir as proprieda-
des conhecidas das amostras de controle positivo, os resultados do ensaio serão con- siderados não confiáveis. Um terceiro nível, geralmente chamado de “teste de profici- ência”, envolve o uso de uma parte externa confiável para fornecer controles e, se a curva de calibração não for capaz de reproduzir as propriedades conhecidas das amostras de controle externo, os resultados do ensaio não serão considerados confi- áveis.
[006] Um exemplo do controle de terceiro nível é o College of American Patho- logists (CAP), uma organização com a missão de promover e defender a excelência na prática de patologia e medicina laboratorial em todo o mundo (www.cap.org). O CAP tem um programa de credenciamento que fornece aos laboratórios clínicos acesso a controles externos, de modo a garantir que o dito laboratório esteja real- mente realizando ensaios clínicos de laboratório de maneira adequada. Por exemplo, o CAP exige que todos os laboratórios que realizam medições de IgE de soro total demonstrem desempenho satisfatório em uma das várias pesquisas de testes de pro- ficiência interlaboratoriais externas mascaradas. Tais pesquisas de teste de proficiên- cia são realizadas várias vezes por ano. No caso extremo, os laboratórios clínicos fora dos Estados Unidos que falharem em várias pesquisas consecutivas podem estar su- jeitos a revogação de licença.
[007] Um exemplo é descrito no relatório “Proficiency Survey-Based Evalua- tion of Clinical Total and Allergen-Specific IgE Assay Performance” (Proficiency Sur- vey-Based Evaluation of Clinical Total and Allergen-Specific IgE Assay Performance) de Robert G Hamilton, publicado no Arch Pathol Lab Med. 2010; 134:975-982, que é incorporado a título de referência neste documento. O programa descrito nesta publi- cação se refere tanto à determinação de IgE total quanto à determinação IgE especí- fica a alérgenos em aproximadamente 200 laboratórios clínicos certificados com o uso de equipamentos de vários fornecedores. O mesmo conjunto de amostras foi forne- cido a todos os laboratórios participantes e analisado centralmente, conforme descrito na divulgação. Observou-se que, para a IgE total, a maioria dos ensaios teve bom desempenho, embora uma tecnologia fornecesse sistematicamente resultados mais baixos de concentração em altos níveis de IgE (Figura 1 em “Proficiency Survey-Ba- sed Evaluation of Clinical Total and Allergen-Specific IgE Assay Performance”). Para IgE específica a alérgenos, as diferenças nos resultados de concentração entre labo- ratórios e tecnologias foram muito maiores. Para alérgenos de gatos, uma tecnologia relatou uma concentração média de IgE em uma amostra superior a 14 kU/l, enquanto duas outras tecnologias relataram uma concentração média de IgE na mesma amos- tra de aproximadamente 4 KkU/I (Figura 2 em “Proficiency Survey-Based Evaluation of Clinical Total and Allergen-Specific IgE Assay Performance”). Isso significa que labo- ratórios clínicos certificados podem, para a mesma amostra, reportar valores de con- centração de IgE específica de alérgenos que diferem mais do que um fator três. Uma discrepância comum entre tecnologias é, de acordo com a mesma divulgação, uma diferença de 50% entre o valor mais alto e o mais baixo da concentração relatada (média de vários usuários clinicamente certificados de cada tecnologia) para a mesma amostra. É importante observar que essa diferença entre os valores mais altos e mais baixos de concentração relatados é considerada aceitável à luz de um padrão inter- nacional disponível da Organização Mundial da Saúde (OMS), conforme evidente na divulgação “3rd International Standard for serum IgE Report of the international colla- borative study to evaluate the candidate preparation” por Susan J Thorpe e coautores, cuja divulgação foi identificada como OMS/BS/2013.2220. Um padrão internacional é normalmente fornecido com o objetivo de padronizar os resultados de diferentes labo- ratórios.
[008] Uma consequência potencial da variabilidade aceitável entre laborató- rios para ensaios de IgE é a disponibilidade de material educacional extenso, como “Serological IgE Analyses in the Diagnostic Algorithm for Allergic Disease.” por Hamil- ton e Oppenheimer como publicado em J Allergy Clin Immunol Pract. Nov-Dez 2015;
3(6):833-40. doi: 10.1016/j.jaip.2015.08.016. Esse tipo de material educacional pre- para o usuário para a interpretação dos dados que podem diferir de site para site, em vez de uma harmonização funcional dos resultados dos ensaios entre os laboratórios.
[009] Outro exemplo de um campo em que o teste de proficiência é empre- gado é divulgado em “Standardization of Measurements for Cholesterol, Triglycerides, and Major Lipoproteins” por Warnick e coautores, conforme publicado em Lab medi- cine (agosto de 2008, volume 39, número 8; DOI: 10.1309/68UL9RHJH1JFFU4PY). Essa publicação discute a padronização e teste de proficiência de colesteróis e molé- culas semelhantes. A divulgação mostra que os testes de proficiência para colesterol total relataram resultados muito bons quando os laboratórios participantes estavam dentro dos critérios de aceitação em 97% do teste realizado. No entanto, a determi- nação de classes individuais de colesterol como lipoproteína de baixa densidade (LDL) e lipoproteína de alta densidade (HDL) foi mais variável e apenas 84 a 90% dos testes estavam dentro dos critérios de aceitação. Isso significa que pelo menos 1 em cada 10 amostras de pacientes correm o risco de serem analisadas em um ensaio que está fora dos critérios de aceitação de desempenho reconhecidos para a deter- minação do colesterol.
[010] Observações semelhantes foram feitas para o diagnóstico de câncer de próstata e/ou avaliação de risco. No relatório “Between-method differences in prostate- specific antigen assays affect prostate cancer risk prediction by nomograms” por C Stephan e coautores publicados em Clin. Chem. Julho de 2011; 57(7):995-1004. doi:
10.1373/clinchem.2010.151472, que é incorporado neste documento a título de refe- rência, a avaliação do risco de câncer de próstata com o uso de nomogramas foi ava- liada usando valores de PSA obtidos de diferentes plataformas. Essa observação é de particular relevância quando diferentes plataformas de instrumentos são usadas para produzir valores de biomarcadores no mesmo ensaio multiplexado.
[011] A presente invenção é aplicável a ensaios multiplexados, independente- mente do número de dispositivos de ensaio utilizados para obter dados. Um exemplo de um ensaio multiplexado em que todos os dados são produzidos por um único dis- positivo de ensaio é divulgado no relatório “Validation of a multiplex chip-based assay for the detection of autoantibodies against citrullinated peptides”. por Hansson e coau- tores, conforme publicado em Arthritis Res Ther. 1 de outubro de 2012; 14(5):R201, que é incorporado a título de referência neste documento. Um exemplo de um ensaio multiplexado em que os dados são produzidos por diferentes dispositivos de ensaio é divulgado no pedido de patente WO 2014079865, que é incorporado a título de refe- rência neste documento.
[012] As características descritas acima dos ensaios de analito único (isto é, ensaios que quantificam a concentração de um componente, como a concentração de PSA no soro) são complicadas, mas administráveis. Ao combinar vários analitos em um teste multiplexado, ocorrerão complicações semelhantes para cada analito pre- sente no painel múltiplo, levando a desafios consideráveis na produção de testes mul- tiplexados e na interpretação dos dados de ensaios multiplexados. A presente inven- ção tem como objetivo resolver tais questões, a fim de melhorar o desempenho de ensaios multiplexados.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[013] De acordo com um aspecto, a presente invenção, de acordo com várias modalidades, melhora o controle de terceiro nível para ensaios multiplexados através do uso repetido de amostras de controle externo, também denotados padrões de har- monização e incorporando os padrões de harmonização na interpretação do teste.
[014] De acordo com uma modalidade da presente invenção, é fornecido um método para harmonização de resultados de testes de amostras biológicas em en- saios bioquímicos multiplexados, em que a presença e/ou a concentração de cada um de um conjunto de múltiplos biomarcadores são determinadas essencialmente ao mesmo tempo na mesma amostra. O método compreende quantificar a presença e/ou a concentração de pelo menos dois biomarcadores diferentes em uma amostra bioló- gica e em uma amostra padrão de harmonização, independentemente em cada amos- tra, por meio de um dispositivo de ensaio bioquímico multiplexado definido implemen- tado em um tipo definido de instrumento analítico; receber os resultados de teste das amostras em um mecanismo de decisão baseado em computador para harmonizar os resultados de teste da amostra biológica; e transformar os resultados de teste da amostra biológica com o uso do mecanismo de decisão baseado em computador. Transformar os resultados de teste da amostra biológica inclui transformar pelo menos os resultados de teste da amostra padrão de harmonização em unidades generaliza- das (GE). Finalmente, os resultados transformados da amostra padrão de harmoniza- ção são usados para ajustar os resultados da amostra biológica em unidades genera- lizadas (GE).
[015] O uso de unidades generalizadas (GE) elimina erros sistemáticos, me- lhora a comparabilidade dos resultados entre laboratórios e plataformas tecnológicas e permite uma interpretação centralizada dos resultados.
[016] De acordo com outra modalidade da presente invenção, é fornecido um dispositivo de ensaio bioquímico multiplexado definido, adaptado para ser implemen- tado em um tipo definido de instrumento analítico e com uma presença ou uma con- centração de pelo menos dois biomarcadores diferentes em uma amostra biológica e em uma amostra padrão de harmonização, independentemente em cada amostra, que pode ser quantificada pelo instrumento analítico.
[017] De acordo com uma modalidade, o dispositivo de ensaio bioquímico compreende 10 ou mais ensaios independentes e simultâneos, em que um padrão de harmonização contém pelo menos 90% dos biomarcadores que fazem parte do en- saio. De acordo com modalidades alternativas, pode ser preferível alterar continua- mente as propriedades do padrão de harmonização, de modo que múltiplos aspectos do ensaio multiplexado sejam testados regularmente.
[018] De acordo com uma modalidade, o dispositivo de ensaio bioquímico compreende uma fase sólida tendo imobilizado no mesmo pelo menos duas catego- rias diferentes de ligantes, em que cada categoria de ligantes pode ser imobilizada em um único componente ou em múltiplos componentes que compreendem coletiva- mente o dispositivo, e: - a primeira categoria dos ligantes se liga especificamente a um biomarcador de câncer de próstata (PCa) e inclui uma pluralidade de ligantes diferentes que se ligam especificamente a cada um de uma pluralidade de biomarcadores de PCa dife- rentes, de preferência pelo menos um dentre PSA, iPSA, tPSA, fPSA, e hK2 e, opcio- nalmente, MSMB e/ou MIC-1; e - a segunda categoria dos ligantes se liga especificamente a um polimorfismo de nucleotídeo único relacionado ao câncer de próstata (SNPpc) e inclui uma plurali- dade de ligantes diferentes que se ligam especificamente a cada uma dentre uma pluralidade de SNPpc diferentes, como pelo menos um dentre rs11672691, rs811704416, rs3863641, rs12130132, rs4245739, rs3771570, rs7611694, rs1894292, rs6869841, rs2018334, rs16896742, rs2273669, rs 1933488, rs11135910, rs3850699, rs11568818, rs1270884, rs8008270, rs4643253, rs684232, rs11650494, rs7241993, rs6062509, rs 1041449, rs2405942, rs12621278, rs9364554, rs 10486567, rs6465657, rs2928679, rs6983561, rs16901979, rs16902094, rs12418451, rs4430796, rs11649743, rs2735839, rs9623117 e rs138213197.
[019] De acordo com uma modalidade, a fase sólida tem ainda uma terceira categoria de ligante imobilizado que se liga especificamente a um biomarcador asso- ciado ao SNP (SNPbm) e inclui um ou uma pluralidade de ligantes diferentes que se ligam especificamente a um ou a cada um de uma pluralidade de SNPbm diferentes, como pelo menos um dentre rs1227732, rs3213764, rs1354774, rs2736098, rs401681, rs10788160, rs11067228, rs 1363120, rs888663, e rs 1054564.
[020] De acordo com outra modalidade da presente invenção, é fornecido um Kit que compreende o dispositivo de ensaio bioquímico de acordo com as várias mo- dalidades descritas acima.
[021] De acordo com outra modalidade da presente invenção, é fornecido um sistema para harmonização de resultados de testes de amostras biológicas em en- saios bioquímicos multiplexados, em que o sistema compreende um dispositivo de ensaio bioquímico multiplexado definido implementado em um tipo definido de instru- mento analítico, ambos adaptados para quantificar uma presença ou uma concentra- ção de pelo menos dois biomarcadores diferentes em uma amostra biológica e pelo menos dois biomarcadores diferentes em uma amostra padrão de harmonização, in- dependentemente em cada amostra, um mecanismo de decisão baseado em compu- tador que compreende um meio para receber os resultados de teste das amostras em um mecanismo de decisão baseado em computador para harmonização dos resulta- dos de teste da amostra biológica; e meios para transformar os resultados de teste da amostra biológica com o uso do mecanismo de decisão baseado em computador. Os meios para transformar os resultados de teste da amostra biológica são dispostos para transformar os resultados de teste da amostra padrão de harmonização em unidades generalizadas e para ajustar os resultados da amostra biológica em unidades genera- lizadas.
[022] De acordo com um segundo aspecto da invenção, é fornecido um pro- duto de programa de computador que compreende instruções para fazer com que um computador execute as instruções para executar as partes do método fornecidas pelo mecanismo de decisão.
[023] Em uma modalidade, o mecanismo de decisão baseado em computador é incluído no sistema.
[024] Em uma modalidade, todos os componentes do mecanismo de decisão baseado em computador são fornecidos pelo produto do programa de computador integrado em um dispositivo unitário, que pode ser um servidor, um computador pes- soal, um instrumento analítico ou qualquer outro dispositivo com capacidade de pro- cessamento de dados.
[025] De acordo com um aspecto, os padrões de harmonização podem ser vinculados aos padrões fabricados.
[026] De acordo com um aspecto, um fornecedor de um novo lote de padrões de harmonização pode ser solicitado a executar a harmonização conforme descrito acima antes da entrega ao cliente.
[027] Uma vantagem com várias modalidades da presente invenção é que elas facilitam comparações entre os resultados de teste obtidos em diferentes labora- tórios.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[028] Modalidades da presente invenção serão agora descritas com referên- cia a figuras nos desenhos, das quais:
[029] A Figura 1 mostra um fluxograma de um método de acordo com uma modalidade da invenção.
[030] A Figura 2 mostra um dispositivo de ensaio bioquímico multiplexado de- finido de acordo com uma modalidade da divulgação.
[031] A Figura 3 mostra uma representação esquemática de um sistema de acordo com uma modalidade da invenção.
[032] A Figura 4 mostra uma representação esquemática de um mecanismo de decisão baseado em computador.
[033] A Figura 5 mostra o valor médio do PSA total para os padrões de har- monização (em unidades arbitrárias) no eixo geométrico y e o valor de PSA total de amostra desconhecida mediana (ou seja, amostra do paciente) no mesmo substrato no eixo geométrico x (nas mesmas unidades arbitrárias).
[034] A Figura 6 mostra o valor médio do MSMB para padrões de harmoniza- ção (em unidades arbitrárias) no eixo geométrico y e valor do MSMB de amostra des- conhecida mediana (isto é, amostra do paciente) no mesmo substrato no eixo geomé- trico x (nas mesmas unidades arbitrárias).
[035] A Figura 7 mostra o valor médio de GDF-15 para padrões de harmoni- zação (em unidades arbitrárias) no eixo geométrico y e o valor de GDF-15 de amostra mediana desconhecida (ou seja, amostra de paciente) no mesmo substrato no eixo geométrico x (nas mesmas unidades arbitrárias).
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES
[036] Para os fins desta divulgação e para maior clareza, são feitas as seguin- tes definições:
[037] O termo "ensaio de diagnóstico" se refere à detecção da presença ou caracterização de uma condição patológica. Pode ser usado alternadamente com "método de diagnóstico" ou "teste de diagnóstico". Os ensaios de diagnóstico podem diferir em sua sensibilidade e especificidade.
[038] O termo "ensaio prognóstico" se refere à avaliação do risco de desen- volver uma condição patológica. Pode ser usado alternadamente com "método prog- nóstico" ou "teste prognóstico". Os ensaios prognósticos são, ao fornecer um prog- nóstico sobre a ocorrência de um evento específico, semelhantes aos ensaios de di- agnóstico e podem, nesses casos, diferir em sua sensibilidade e especificidade. Um exemplo é a previsão do ensaio prognóstico, se for necessária terapia ativa.
[039] O termo “dispositivo de ensaio” se refere a um dispositivo físico para realizar um ensaio que pode compreender um ou mais componentes, compreendendo coletivamente o dispositivo.
[040] Uma medida da utilidade de uma ferramenta de diagnóstico é a “área sob o receptor - curva característica do operador”, que é comumente conhecida como estatística ROC-AUC. Essa medida amplamente aceita leva em consideração a sen- sibilidade e a especificidade da ferramenta. A medida ROC-AUC geralmente varia de 0,5 a 1,0, em que um valor de 0,5 indica que a ferramenta não tem valor de diagnóstico e um valor de 1,0 indica que a ferramenta tem 100% de sensibilidade e 100% de especificidade.
[041] O termo “sensibilidade” se refere à proporção de todos os indivíduos que requerem tratamento ativo corretamente identificados como tal (que é igual ao número de verdadeiros positivos dividido pela soma do número de verdadeiros positivos e fal- sos negativos).
[042] O termo "especificidade" se refere à proporção de todos os indivíduos que não requerem tratamento ativo (ou seja, adequado para espera vigilante) que são corretamente identificados como tal (que é igual ao número de negativos verdadeiros dividido pela soma do número de negativos verdadeiros e falsos positivos).
[043] O termo “analito” se refere a um bioquímico/biomarcador alvo que está sujeito a detecção e/ou quantificação em um ensaio. Exemplos de analitos são prote- íÍnas, oligonucleotídeos ou compostos químicos.
[044] O termo "elemento de reconhecimento" se refere a uma entidade capaz de interagir com um analito específico. Um exemplo não limitativo de um elemento de reconhecimento é um anticorpo que se liga especificamente a um analito definido. Outro exemplo não limitativo de um elemento de reconhecimento é um aptâmero que liga especificamente um analito definido.
[045] O termo “biomarcador” se refere a uma proteína, uma parte de uma pro- teína, um peptídeo, um polipeptídeo, um oligonucleotídeo (DNA ou RNA), um com- posto químico, metabólitos, catabolitos ou células circulantes (como células tumorais em circulação para mencionar um exemplo não limitativo) que pode ser usado como marcador biológico, por exemplo, para fins de diagnóstico. Em um ensaio, um biomar- cador é tipicamente o analito.
[046] O termo “padrão de harmonização” se refere a uma amostra com pro- priedades conhecidas pelo fabricante, mas geralmente desconhecidas pelo usuário. Um padrão de harmonização cobre pelo menos 50% dos ensaios individuais ou bio- marcadores analisados em um ensaio multiplexado.
[047] O termo “ensaio bioquímico multiplexado” se refere a um ensaio que combina pelo menos dois valores diferentes de biomarcadores (como concentração de biomarcador em uma amostra biológica ou presença detectável de biomarcador em uma amostra biológica, como dois exemplos não limitativos) com a finalidade de avaliar a condição do doador da amostra biológica (como estimar o risco de uma do- ença cancerígena, para mencionar um exemplo não limitativo). Os valores do biomar- cador podem ser obtidos com o uso de vários componentes de ensaio, cada um pro- duzindo pelo menos um valor de biomarcador e compreendendo coletivamente o en- saio multiplexado, ou podem ser obtidos usando apenas um dispositivo de ensaio que produz todos os valores desejados de biomarcador ou qualquer outra combinação dos mesmos que em conjunto produz todos valores desejados de biomarcadores. Um en- saio bioquímico multiplexado no contexto da presente divulgação produz todos os va- lores desejados de biomarcadores dentro de um período de tempo semelhante ao maior tempo de armazenamento da amostra biológica. No caso de uma amostra de sangue que é processada em plasma ou soro, o tempo de armazenamento típico mais longo em uma geladeira é de cerca de 2 a 4 semanas para ensaios de biomarcadores de proteínas, porque, quando armazenada por mais tempo, a degradação da amostra, como tal, pode ter um impacto na precisão dos valores determinados de biomarcado- res. Em modalidades específicas, o ensaio bioquímico multiplexado combina pelo me- nos dez valores de biomarcadores diferentes, pelo menos vinte valores de biomarca- dores diferentes, pelo menos trinta valores de biomarcadores diferentes, pelo menos quarenta valores de biomarcadores diferentes ou pelo menos cinquenta valores de biomarcadores.
[048] O Banco de Dados de Polimorfismo de Nucleotídeo Único (Single Nu- cleotide Polymorphism Database) (dbSNP) é um arquivo de variação genética em e entre diferentes espécies desenvolvidas e hospedadas pelo Centro Nacional de Infor- mações de Biotecnologia (National Center for Biotechnology Information) (NCBI) em colaboração com o Instituto Nacional de Pesquisa do Genoma Humano (National Hu- man Genome Research Institute) (NHGRI), ambos localizados nos EUA. Embora o nome do banco de dados implique uma coleção de apenas uma classe de polimorfis- mos (isto é, polimorfismos de nucleotídeo único (SNP)), ele de fato contém uma vari- edade de variações moleculares. Todo registro SNP enviado exclusivo recebe um nú- mero de ID SNP de referência (“rs H; "refSNP cluster"). No presente pedido, o SNP é identificado principalmente usando números rs H.
[049] Agora é feita referência à Figura 1, que mostra um fluxograma de um método de acordo com uma modalidade da divulgação.
[050] Em uma primeira etapa a), uma presença ou uma concentração de pelo menos dois biomarcadores diferentes em uma amostra biológica BS e em uma amos- tra padrão de harmonização HSS, independentemente em cada amostra BS, HSS é quantificada 11, por meio de um dispositivo de ensaio bioquímico multiplexado defi- nido implementado em um tipo definido de instrumento analítico, que ambos são des- critos abaixo em mais detalhes com referência às Figuras 2 e 3.
[051] Em seguida, em uma segunda etapa b), os resultados de teste do Re- sultado do testeamostra, Resultado do testenarmonização das amostras BS, HSS são rece- bidos 13 em um mecanismo de cálculo baseado em computador 44 para a transfor- mação 15, etapa c), os resultados de teste do Resultado do testeamostra recebidos da amostra BS e harmonização dos resultados de teste do Resultado do testeamostra da amostra biológica BS.
[052] Transformando 15 os resultados de teste do Resultado do testeamostra da amostra biológica BS inclui a transformação de pelo menos os resultados de teste do
Resultado do testenamonização da amostra padrão de harmonização HSS em unidades generalizadas (GE). Finalmente, os resultados de teste do Resultado do testeamostra da amostra biológica BS são ajustados em unidades generalizadas (GE).
[053] De acordo com uma modalidade, as etapas a) a c) são repetidas pelo menos duas vezes dentro de um determinado período de tempo.
[054] De acordo com uma modalidade, as etapas a) a c) são repetidas com uma amostra biológica diferente e usando os resultados de teste do Resultado do testenarmonização a partir de pelo menos dois padrões de harmonização HSS quantifica- dos em diferentes momentos no tempo como entrada na transformação 15 em unida- des generalizadas (GE).
[055] De acordo com uma modalidade, as etapas a) a c) são repetidas com uma amostra biológica diferente BS e um padrão de harmonização HSS diferente, e usando os resultados de teste do Resultado do testenamonização de pelo menos dois padrões de harmonização HSS quantificados em diferentes momentos no tempo a transformação 15 em unidades generalizadas (GE).
[056] Um exemplo não limitativo é descrito. Uma amostra biológica é ensaiada para medir os biomarcadores 1 a n na amostra, com as quantidades medidas dos biomarcadores da amostra designada como SM1 a SMn, em que n pode ser um nú- mero inteiro de 2 a 10, 20, 30, 40, 50 ou mais. Uma amostra de harmonização com os biomarcadores 1 a n (ou mais ou menos biomarcadores) é ensaiada nas mesmas condições (isto é, mesmo laboratório, equipamento e operador), com as quantidades medidas dos biomarcadores designados como HM1 a HMn. Com o uso de um meca- nismo de decisão baseado em computador, as quantidades medidas dos biomarca- dores na amostra de harmonização são transformadas em unidades generalizadas em comparação com as unidades generalizadas conhecidas KGE1 a KGEn para os biomarcadores de amostra de harmonização e a geração de uma função/algoritmo com base nas diferenças entre todos os biomarcadores de harmonização medidos
HM1 a HMn e as unidades generalizadas conhecidas KGE1 a KGEn. Essa função/al- goritmo é então usada para transformar SM1 em SMn em unidades generalizadas para os biomarcadores de amostra, SGE1 em SGEn, que podem ser usados para avaliação de diagnóstico.
[057] A harmonização é usada para ajustar diferenças de tecnologia para tec- nologia, diferenças de laboratório para laboratório e diferenças de descartáveis para descartáveis. Se o HM1 e o HM2 de um laboratório específico tiverem os valores es- perados (concentração real dos marcadores fornecidos pelo fabricante em cada pa- drão de harmonização), somente a correção de tecnologia para tecnologia será apli- cada. Por exemplo, sabe-se que certas plataformas de PSA (antígeno específico da próstata) têm diferenças sistemáticas de redução de 5 a 10%. Portanto, se HM1 e HM?2 forem medidos em um dispositivo desse tipo, espera-se que o HM1 e o HM2 medidos sejam 10% inferiores às unidades generalizadas conhecidas e, consequen- temente, todas as amostras precisarão de ajuste pela multiplicação de 1,1 para cor- responder ao perfil de medição dos dados usado para criar o algoritmo. Agora, se o HM1, ... o HMn se desviar esporadicamente dos valores esperados, pode haver um problema descartável, isto é, alguns descartáveis significativamente acima ou abaixo das concentrações estimadas. Se todos os HM1, HM2, ... HMn forem consistente- mente diferentes dos valores esperados, pode-se assumir que também os dados da amostra são consistentemente diferentes da mesma maneira, e os valores de HM1, HMZ2,... HMn podem orientar a transformação dos dados da amostra. Por exemplo, se HM1 = 0,5*valor esperado KGE1 e HM2 = 0,5*valor esperado KGE2, então todas as amostras são multiplicadas por 2 para produzir valores em unidades generalizadas. Assim, em uma vista simplificada, (Valor da amostra da unidade generalizada) = (valor medido da amostra) / MÉDIA (HM1/KGE1; HM2/KGE2; ... HMn/KGEn). Portanto, se HM1 = 2*KGE1 e o mesmo para todos os outros valores de HMn/KGEn, a média = 2 e as amostras medidas serão divididas por 2 para ajustar HM1, HM2,... HMn inespe- radamente altos. Como será aparente, em um sistema múltiplo, a etapa de transfor- mação conforme descrita é consideravelmente complexa.
[058] KGE1 a KGEn e HM1 a HMn que apresentam pequenas diferenças (me- nos que um mínimo predeterminado) podem indicar ruído no sistema de medição e para diferenças menores que um mínimo predeterminado (refletindo o ruído cumula- tivo), o mecanismo de decisão baseado em computador pode ser programado para não aplicar correções, ou seja, o sistema é limitado por ruído. Por outro lado, para KGE1 a KGEn e HM1 a HMn com grandes diferenças, o mecanismo de decisão ba- seado em computador pode ser programado para avisar o usuário quando grandes diferenças (por exemplo, maiores que um máximo predeterminado) são observadas e um dentre vários avisos podem ser feitos. Por exemplo, variações estocásticas/alea- tórias e/ou grandes de proporções HM/KGE podem ser indicativas de operadores dis- plicentes, de qualidade disponível ruim e/ou variável, etc., enquanto desvios sistemá- ticos e consistentes podem ser indicativos de que algo é feito sistematicamente dife- rente no laboratório disponível e pode exigir uma atualização dos valores de KGE para esse laboratório específico. As proporções HM/KGE também podem ter variação sa- zonal, como o desempenho do ensaio durante o inverno sendo diferente do desem- penho do ensaio durante o verão como um exemplo não limitativo.
[059] De acordo com uma modalidade, as etapas a) a c) são repetidas com uma amostra biológica (BS) diferente ou um padrão de harmonização diferente (HSS), e usando os resultados (Resultados de testenarmonização) dos pelo menos dois padrões de harmonização (HSS) quantificados em diferentes momentos, como entrada na transformação (15) em unidades generalizadas (GE).
[060] Agora é feita referência à Figura 2.
[061] A Figura 2 mostra uma modalidade de um dispositivo de ensaio bioqui- mico multiplexado definido 22 adaptado para ser implementado em um tipo definido de instrumento analítico 34 e com uma presença ou uma concentração de pelo menos dois biomarcadores diferentes 25, 26 em uma amostra biológica BS e dois biomarca- dores diferentes 27, 28 em uma amostra padrão de harmonização HSS. Um exemplo não limitativo de um dispositivo de ensaio bioquímico multiplexado 22 é um microar- ranjo. O microarranjo 22 compreende tipicamente um suporte sólido 21 no qual uma pluralidade de elementos de reconhecimento 25, 26, 27, 28, cada um sendo capaz de interagir especificamente e imobilizar diferentes analitos definidos. Geralmente, os an- ticorpos são usados como elementos de reconhecimento. Depois que os analitos se ligam aos seus respectivos elementos de reconhecimento, o suporte sólido é lavado e um reagente de detecção é colocado em contato com o suporte sólido. Um reagente de detecção é tipicamente uma molécula marcada que se liga a um ou mais analitos, tornando a presença do analito detectável através do marcador. Ao realizar um ensaio de microarranjo, o fluxo de trabalho típico compreende o contato do suporte sólido com uma amostra biológica seguida de incubação de 10 a 60 minutos. Depois disso, o suporte sólido 21 é lavado com um líquido desprovido de todos os analitos alvo. Um reagente de detecção marcado (por exemplo, um reagente marcado com uma porção química fluorescente) é adicionado e incubado por 10 a 60 minutos. Após uma lava- gem final do suporte sólido 21, o microarranjo 22 pode ser submetido à varredura em um escâner de fluorescência para revelar quais pontos no microarranjo 22 demons- traram presença de analito.
[062] Em seguida, os analitos estão sujeitos a quantização no instrumento analítico 34, correspondendo à etapa a) descrita acima em relação à Figura 1.
[063] De acordo com uma modalidade, o dispositivo de ensaio bioquímico compreende um ou mais componentes de fase sólida 21 tendo imobilizado nele pelo menos duas categorias diferentes de ligantes, em que: - a primeira categoria dos ligantes se liga especificamente a um biomarcador de PCa e inclui uma pluralidade de ligantes diferentes que se ligam especificamente a cada um de uma pluralidade de biomarcadores de PCa diferentes, de preferência pelo me- nos um dentre PSA, iPSA, tPSA, fPSA e hK2, e opcionalmente MSMB e/ou MIC-1; e - a segunda categoria dos ligantes se liga especificamente a um SNPpc e inclui uma pluralidade de ligantes diferentes que se ligam especificamente a cada um dentre uma pluralidade de SNPpc diferentes, como pelo menos um de rs11672691, rs11704416, rs3863641, rs12130132, rs4245739, rs3771570, rs7611694, rs1894292, rs6869841, rs2018334, rs16896742, rs2273669, rs1933488, rs11135910, rs3850699, rs11568818, rs1270884, rs8008270, rs4643253, rs684232, rs11650494, rs7241993, rs6062509, rs 1041449, rs2405942, rs12621278, rs9364554, rs 10486567, rs6465657, rs2928679, rs6983561, rs16901979, rs16902094, rs12418451, rs4430796, rs811649743, rs2735839, rs9623117 e rs138213197.
[064] De acordo com uma modalidade, a fase sólida 21 tem ainda uma terceira categoria de ligante imobilizado que se liga especificamente a um SNPbm e inclui um ou uma pluralidade de ligantes diferentes que se ligam especificamente a um ou a cada um dentre uma pluralidade de SNPbm diferentes, como pelo menos um dentre 1581227732, rs3213764, rs1354774, rs2736098, rs401681, rs10788160, rs11067228, rs1363120, rs888663, e rs1054564.
[065] Agora é feita referência à Figura 3, que mostra um sistema 30 para har- monização dos resultados de testes de amostras biológicas em dispositivos de en- saios bioquímicos multiplexados 22, como microarranjos, e implementação do método descrito acima descrito acima em relação à modalidade descrita e mostrada na Figura
1.
[066] O sistema 30 compreende um dispositivo de ensaio bioquímico multiple- xado definido 22 implementado em um tipo definido de instrumento analítico 34. O dispositivo de ensaio bioquímico 22 e o instrumento analítico 34 são, tipicamente, adaptados em conjunto para executar a etapa a), ou seja, para quantificar 11 uma presença ou uma concentração de pelo menos dois biomarcadores diferentes em uma amostra biológica e uma amostra padrão de harmonização, independentemente em cada amostra. O sistema 30 compreende ainda um mecanismo de decisão baseado em computador 44, que compreende um componente 46 para receber 13 os resulta- dos de teste das amostras no mecanismo de decisão baseado em computador 44; e um componente 48 para transformar 15 os resultados de teste recebidos da amostra biológica. Estes componentes 46, 48 são esquematicamente indicados na Figura 4. O componente 48 para transformar 15 os resultados de teste da amostra biológica é disposto para transformar os resultados de teste da amostra padrão de harmonização em unidades generalizadas (GE) e para ajustar os resultados desconhecidos da amostra biológica em unidades generalizadas (GE).
[067] De acordo com um aspecto da divulgação, os componentes 46 e 48 que definem o mecanismo de decisão 44 neste exemplo podem ser implementados por software de propósito especial (ou firmware) executado em um ou mais dispositivos de computação de uso geral ou de uso especial. Esse dispositivo de computação pode incluir uma ou mais unidades de processamento, por exemplo, uma CPU (“Unidade de Processamento Central”), um DSP (“Processador de Sinais Digitais”), um ASIC (“Circuitos Integrados de Aplicação Específica”), componentes analógicos e/ou digi- tais discretos ou algum outro dispositivo lógico programável, como um FPGA (“Arranjo de Portas Programável em Campo”). Nesse contexto, deve ser entendido que cada “componente” do mecanismo de decisão 44 se refere a um equivalente conceitual de uma etapa do método; nem sempre existe uma correspondência individual entre com- ponentes e peças específicas de rotinas de hardware ou software. Às vezes, uma peça de hardware compreende componentes diferentes. Por exemplo, a unidade de processamento pode servir como um componente ao executar uma instrução, mas serve como outro componente ao executar outra instrução. Além disso, um compo- nente pode ser implementado por uma instrução em alguns casos, mas por uma plu-
ralidade de instruções em outros casos. O dispositivo de computação pode ainda in- cluir uma memória do sistema e um barramento do sistema que acopla vários compo- nentes do sistema, incluindo a memória do sistema na unidade de processamento. O barramento do sistema pode ser qualquer um dos vários tipos de estruturas de barra- mento, incluindo um barramento de memória ou controlador de memória, um barra- mento periférico e um barramento local usando qualquer uma das várias arquiteturas de barramento. A memória do sistema pode incluir mídia de armazenamento de com- putador na forma de memória volátil e/ou não volátil, como memória somente para leitura (ROM), memória de acesso aleatório (RAM) e memória flash. O software para fins especiais pode ser armazenado na memória do sistema ou em outra mídia de armazenamento de computador removível/não removível volátil/não volátil incluída ou acessível ao dispositivo de computação, como mídia magnética, mídia ótica, cartões de memória flash, fita digital, RAM de estado sólido, ROM de estado sólido, etc. O dispositivo de computação pode incluir uma ou mais interfaces de comunicação, como uma interface serial, uma interface paralela, uma interface USB, uma interface sem fio, um adaptador de rede etc. Um ou mais dispositivos de E/S podem ser conectados ao dispositivo de computação, por meio de uma interface de comunicação, incluindo, por exemplo, um teclado, mouse, tela sensível ao toque, monitor, impressora, unidade de disco, etc. O software para fins especiais pode ser fornecido ao dispositivo de com- putação em qualquer meio legível por computador adequado, incluindo um meio de gravação, uma memória somente para leitura ou um sinal de portador elétrico.
[068] Em uma modalidade do método, a medição de uma presença ou ausên- cia de um SNP (pertencente a qualquer categoria de SNPs) compreende medir o nú- mero de alelos do dito SNP. Em uma modalidade, um ou dois alelos correspondem a uma presença do dito SNP e zero alelos corresponde a uma ausência do dito SNP no dito indivíduo; em que alelos zero correspondem a negativo homozigoto para o dito
SNP, um alelo corresponde a positivo heterozigoto e dois alelos correspondem a po- sitivo homozigoto. As categorias adequadas de SNPs incluem, mas não estão limita- das a, SNPs relacionados à doença à qual o ensaio de diagnóstico ou prognóstico está relacionado, SNP's relacionados a fatores de risco para a doença à qual o ensaio de diagnóstico ou prognóstico está relacionado. Exemplos não limitativos de fatores de risco são os níveis de biomarcadores de proteínas e a obesidade.
[069] Em uma modalidade, o método descrito acima, etapa a) compreende a utilização de um ou mais dispositivos analíticos, incluindo, sem limitação, um dispo- sitivo de ensaio ELISA, um dispositivo de ensaio de microarranjo, um dispositivo de ensaio de imunoprecipitação, um dispositivo de ensaio de imunofluorescência, um dis- positivo de radioimunoensaio, ou um dispositivo de espectrometria de massa usando dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI), para medir uma presença ou uma concentração de um biomarcador de PCa.
[070] Em uma modalidade, que pode ser combinada com a modalidade men- cionada acima, o método descrito acima compreende o uso de um dispositivo de es- pectrometria de massa usando dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI), para a medição de uma presença ou ausência de um SNP.
[071] Em uma modalidade, o instrumento analítico descrito acima compre- ende um ou mais dispositivos analíticos, incluindo, sem limitação, um dispositivo de ensaio ELISA, um dispositivo de ensaio de microarranjos, um dispositivo de ensaio de imunoprecipitação, um dispositivo de ensaio de imunofluorescência, um dispositivo de radioimunoensaio ou um dispositivo de espectrometria de massa usando dessor- ção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI), para medição de presença ou con- centração de um biomarcador de PCa. Em uma modalidade, que pode ser combinada com a modalidade mencionada acima, o dispositivo de ensaio descrito acima compre- ende um dispositivo de espectrometria de massa usando dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI), para a medição de uma presença ou ausência de um
SNP.
[072] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é fornecido um kit de teste para executar a etapa a) medir uma presença ou uma concentração de pelo menos dois biomarcadores e opcionalmente medir uma presença ou ausência de pelo menos um SNP do método descrito acima para indicar uma presença ou não presença de uma doença ou condição definida em um indivíduo, o que compreende um dispo- sitivo de ensaio correspondente conforme descrito acima e o uso de pelo menos uma amostra padrão de harmonização HSS para possibilitar a transformação dos valores medidos em unidades generalizadas (GE), e finalmente estimando a probabilidade de um indivíduo ter à dita doença ou condição.
[073] Uma aplicação potencial para o presente método é um ensaio de diag- nóstico para determinar a presença ou não de câncer de próstata, em que os biomar- cadores adequados incluem, mas não estão limitados a, PSA, iPSA, tPSA, fPSA e hK2 e, opcionalmente, MSMB e/ou MIC-1; e em que o SNP adequado inclui, mas não está limitado a, rs582598, rs439378, rs2207790, rs1046011, rs10458360, rs7525167, rs10489871, rs/529518, rs4245739, rs4512641, rs10178804, rs11900952, rs1873555, rs10191478, rs6755901, rs6545962, rs721048, rs27 10647, rs12612891, rs2028900, rs1009, rs12233245, rs6760417, rs10496470, rs10199796, rs12475433, rs16860513, rs12151618, rs3765065, rs13017302, rs12988652, rs87 1688, rs749264, rs3771570, rs4346531, rs6770955, rs12637074, rs2660753, rs13319878, rs6437715, rs2162185, rs1515542, rs2270785, rs9830294, rs1439024, rs6762443, rs888507, rs6794467, rs12490248, rs1477886, rs4833103, rs3796547, rs17779822, rs2366711, rs16849146, rs1894292, rs12640320, rs3805284, rs12500426, rs4699312, 1817021918, rs7679673, rs2047408, rs2647262, rs 12506850, rs7658048, rs2078277, rs12505546, rs13113975, rs4246742, rs2736098, rs401681, rs11134144, rs10060513, rs40485, rs2087724, rs1482679, rs16901841, rs1295683, rs2070874, 187752029, rs2018334, rs9358913, rs1140809, rs409558, rs3096702, rs9267911,
rs2025645, rs9359428, rs6569371, rs2813522, rs1933488, rs712242, rs6934898, rs9456490, rs651164, rs3120137, rs9364554, rs9457937, rs10486562, rs10807843, rs7801918, rs6962297, rs2465796, rs6957416, rs7777631, rs2272316, rs6961773, 152132276, rs13265330, rs 16887736, rs2911756, rs2272668, rs2339654, rs 1380862, rs9297746, rs12543663, rs10086908, rs16901922, rs1016343, rs17832285, rs16901979, rs4871779, rs10107982, rs16902094, rs620861, rs17467139, rs6983267, rs9297756, rs10094059, rs7818556, rs1992833, rs986472, rs12552397, rs4273907, rs4237185, rs753032, rs11253002, rs2386841, rs10795841, rs10508422, rs7075945, rs10508678, rs539357, rs10826398, rs3818714, rs7090755, rs 10993994, rs4382847, rs1891158, rs10887926, rs10788160, rs6579002, rs10832514, rs7358335, rs 1944047, rs3019779, rs10896437, rs12793759, rs7 106762, rs7 102758, rs2449600, rs585197, rs2509867, rs11568818, rs7 125415, rs11601037, rs11222496, rs4570588, rs6489721, rs3213764, rs17395631, rs4423250, rs11168936, rs10875943, rs3759129, rs902774, rs1827611, rs4760442, rs11610799, rs6539333, rs11067228, rs/485441, rs6489/94, rs4119478, rs170/70292, rs2293710, rs17256058, rs 1950198, rs2331780, rs7 141529, rs12880777, rs17123359, rs785437, rs524908, rs12903579, rs7178085, rs7 164364, rs896615, rs11634741, rs9972541, rs12594014, rs11631109, rs1558902, rs8044335, rs2738571, rs885479, rs385894, rs684232, rs4925094, rs17138478, rs1 1649743, rs2107131, rs7213769, rs12946864, rs306801, rs138213197, rs1863610, rs17224342, rs9911515, rs12947919, rs966304, rs817744022, rs7234917, rs1943821, rs2227270, rs1363120, rs888663, rs122773222, rs1054564, rs4806120, rs11672691, rs758643, rs3745233, rs6509345, rs2659051, 152735839, rs1354774, rs2691274, rs6090461, rs2297434, rs6062509, rs2315654, rs2823118, rs2838053, rs398146, rs16988279, rs2269640, rs4822763, rs132774, rs747745, rs5978944, rs6530238, rs5934705, rs5935063, rs4830488, rs17318620, rs5945619, rs5945637, rs11091768, rs2473057, rs5918762, rs4844228, rs6625760 e rs17324573.
[074] A presente invenção de acordo com várias modalidades descritas acima fornece harmonização dos resultados do ensaio obtidos de diferentes laboratórios em que plataformas de instrumentos potencialmente diferentes foram usadas. A harmo- nização é alcançada transformando os valores dos ensaios em unidades generaliza- das que são comparáveis entre plataformas de instrumentos. O uso de um kit de har- monização é essencial para o funcionamento do método, que é projetado para que as propriedades de praticamente todos os analitos alvo em um dispositivo de ensaio bi- oquímico multiplexado sejam verificadas com um ou alguns padrões de harmoniza- ção. Para lidar com quaisquer desvios do desempenho esperado, cada resultado pro- duzido em um ensaio é transformado em unidades generalizadas (GE), em que vários aspectos são considerados, incluindo, entre outros, o desvio sistemático no desem- penho do ensaio quantificado pela amostra de controle de harmonização no presente ensaio, qualquer desvio sistemático no laboratório ou na instrumentação quantificado usando o padrão de harmonização atual resulta em combinação com vários resultados do padrão de harmonização anterior e o perfil de desempenho do tipo de instrumento usado para obter os resultados do ensaio.
[075] Um princípio básico da invenção, de acordo com um aspecto, pode ser descrito da seguinte maneira. O método de harmonização inventivo divulgado e rei- vindicado de acordo com várias modalidades visa harmonizar a saída do ensaio de diferentes laboratórios que potencialmente usam diferentes tipos de equipamento ana- lítico (plataformas de instrumento). Para alcançar a harmonização, cada conjunto de amostras desconhecidas (geralmente amostras de pacientes) é complementado com um padrão de harmonização. Como é conhecido que diferentes laboratórios e tecno- logias podem ser sistematicamente diferentes de uma maneira que muda com o tempo, os resultados do padrão de harmonização são usados para ajustar os resulta- dos de todas as amostras desconhecidas em unidades generalizadas. O uso de uni-
dades generalizadas elimina a soma de erros sistemáticos e melhora a comparabili- dade dos resultados entre laboratórios e plataformas de tecnologia e permite uma in- terpretação centralizada dos resultados. Portanto, todas as decisões diagnósticas ou prognósticas ou outras decisões clínicas são tomadas usando unidades generaliza- das, de modo a obter o mesmo desempenho do método diagnóstico/prognóstico, in- dependentemente do tipo de laboratório ou instrumento.
[076] O método de harmonização requer que tanto o laboratório quanto o equi- pamento sejam caracterizados a fim de recuperar a relação entre infraestru- tura/hardware e as unidades generalizadas (GE).
[077] Um instrumento analítico é caracterizado de uma maneira que revela como a saída desse tipo de instrumento é transformada para estar em conformidade com as unidades generalizadas.
[078] Um laboratório que está usando um instrumento analítico previamente caracterizado com a finalidade de realizar um ensaio generalizável também deve ser caracterizado para revelar como o impacto da dita infraestrutura de laboratório e pro- cedimentos operacionais padrão na saída do ensaio devem ser transformados para estar em conformidade com as unidades generalizadas.
[079] Um instrumento analítico de um tipo que foi previamente caracterizado geralmente não precisa ser caracterizado se um laboratório diferente adquirir esse instrumento. Cada nova instalação de (qualquer) instrumento em um laboratório nor- malmente requer uma caracterização laboratorial repetida para a harmonização da saída do dito instrumento recém-instalado.
[080] Uma vez que o instrumento analítico e o laboratório são caracterizados para produzir a saída do ensaio em unidades generalizadas, o laboratório utiliza o instrumento analítico para ensaios definidos, em que cada ensaio normalmente inclui um ou mais padrões de harmonização. Um padrão de harmonização é projetado para servir como um controle independente (um controle de terceiro nível) para a maioria dos ensaios individuais no sistema multiplexado e como ponto de referência para a generalização dos resultados do ensaio. Na conclusão do ensaio, a saída do ensaio (preferencialmente a saída de dados brutos) é tipicamente transferida para uma ins- talação central (digital) em que os resultados reais do ensaio são transformados em unidades generalizadas. Os fatores que têm impacto na transformação incluem (mas não estão limitados a) resultados do padrão de harmonização do presente ensaio, resultado do padrão de harmonização de outros laboratórios em que o mesmo lote padrão de harmonização foi usado, características do instrumento, características do laboratório, lote de reagentes usados para operação e calibração do ensaio e evolu- ção temporal dos resultados do padrão de harmonização no presente laboratório.
[081] O padrão de harmonização não precisa ser composto da mesma ma- neira o tempo todo. De fato, é preferível alterar continuamente as propriedades do padrão de harmonização para que múltiplos aspectos do ensaio multiplexado sejam testados regularmente. Por exemplo, se um ensaio mede a concentração de quatro biomarcadores no sangue, pode ser razoável ter dois padrões de harmonização dife- rentes: um em que dois biomarcadores estejam presentes em alta concentração e os outros dois em baixa concentração e um segundo padrão de harmonização com o perfil de concentração oposto. Através da troca sistemática e regular (normalmente diária ou semanal) do padrão de harmonização em cada ensaio, não apenas a função do ensaio será quantificada em cada ensaio através do teste de medição do perfil de concentração alta-alta-baixa-baixa (ou vice-versa) conhecido, mas após ter ensaiado os dois padrões de harmonização, a faixa dinâmica do ensaio é verificada porque uma baixa concentração conhecida e uma alta concentração conhecida para cada um dos biomarcadores incluídos são testadas em um curto espaço de tempo.
[082] Os padrões de harmonização podem ainda ser adaptados para investi- gar aspectos particulares de um ensaio multiplexado. Por exemplo, se houver suspeita de reatividade cruzada não intencional em um novo lote de reagentes, um conjunto de padrões de harmonização pode ser projetado para investigar se o problema sus- peito estava presente ou não. De maneira semelhante, o mesmo lote de padrões de harmonização pode ser distribuído para vários laboratórios diferentes, o que possibilita comparar e corrigir pequenos desvios sistemáticos de laboratório para laboratório, além de identificar se algum laboratório em particular está enfrentando problemas com um ensaio específico.
[083] Os dispositivos de ensaios bioquímicos multicomponentes são imprati- cáveis para calibrar e controlar um por um. Portanto, amostras de controle regulares e padrões externos não são fáceis de implementar nem de avaliar. Com o uso de um padrão de harmonização, um controle multiplexado fica disponível e complementa qualquer outra tentativa de controle do ensaio. Nos casos em que o perfil de resultado do padrão de harmonização conhecido é mantido em sigilo, ele também serve como um controle de segurança ou autenticidade. Um perfil de resultado relatado para um padrão de harmonização definido e identificado com exclusividade, que difere signifi- cativamente do perfil de resultado conhecido e esperado, indica que ocorreram erros técnicos durante o processamento do padrão de harmonização ou que o padrão de harmonização usado pelo laboratório é falsificado. Reagentes falsificados podem comprometer a precisão analítica e, portanto, constituem um grande risco para o pa- ciente.
[084] É difícil produzir dispositivos bioquímicos de múltiplos componentes de maneira que todos os biomarcadores sejam analisados com a mesma precisão e a mesma faixa dinâmica, independentemente do lote de produção. Supondo-se que um ensaio tenha um rendimento de produção de 95% (ou seja, 19 das 20 tentativas de produção sejam bem-sucedidas), um dispositivo de ensaio bioquímico multicompo- nente que compreende 10 ensaios individuais localizados no mesmo suporte sólido terá um rendimento de produção de (0,95 * 10) *100% = 59,8%. De acordo com o melhor entendimento, esse fato é um gargalo no desenvolvimento de ensaios multi- componentes, em que moléculas de proteínas são incorporadas, porque as proteínas são sensíveis e difíceis de usar na produção, o que automaticamente leva a um baixo rendimento de produção em ensaios multicomponentes. A presente invenção torna possível aceitar um desempenho mais baixo do ensaio multicomponente como tal, porque o padrão de harmonização é usado para ajustar os desvios detectados no suporte sólido ao avaliar amostras desconhecidas. Como um exemplo não limitativo, supõe-se que a implementação de unidades generalizadas por meio do procedimento de harmonização torne possível reduzir os requisitos de desempenho em cada ensaio individual, aceitando o desempenho mais fraco do ensaio e corrigindo a saída através do uso do padrão de harmonização. Nos casos em que o rendimento inicial da produ- ção é de 95% e a implementação de um procedimento de harmonização aumente o rendimento para 98%, o rendimento geral da produção de um ensaio multicomponente que compreende 10 ensaios individuais localizados no mesmo suporte sólido será (0,98 º 10) *100% = 81,7%. Isso significa que também um pequeno aumento no ren- dimento da produção de ensaios individuais pode ter um grande impacto no rendi- mento geral da produção de ensaios multicomponentes. O uso de um padrão de har- monização é um método externo para aumentar o rendimento da produção e não exi- girá nenhuma alteração nos métodos de produção existentes.
[085] Nos casos em que o ensaio é conduzido em um suporte sólido que com- preende uma infinidade de pontos independentes, cada ponto tendo um elemento de reconhecimento como um anticorpo ligado, os aspectos de harmonização também podem ser incorporados no suporte sólido do ensaio. Por exemplo, é possível anexar o mesmo elemento de reconhecimento em vários pontos, em que um subconjunto dos pontos tem uma densidade mais baixa conhecida do dito elemento de reconhecimento e outros têm uma densidade mais alta conhecida do dito elemento de reconhecimento. Quando analisados com o uso de um padrão de harmonização, é possível avaliar a variação da produção pontual (comparando resultados de múltiplos pontos da mesma densidade) e a linearidade da produção pontual (comparando resultados de múltiplos pontos de densidade diferente). A variação da linearidade da produção pontual pode resultar em variação da faixa dinâmica do ensaio. Ao monitorar a linearidade da pro- dução pontual in situ através de um padrão de harmonização, torna-se possível ajustar os resultados para compensar as características alteradas do ensaio, como faixa di- nâmica.
[086] É ainda possível incluir uma molécula completamente irrelevante no pa- drão de harmonização e um ensaio multicomponente correspondente. Por exemplo, se um teste é projetado para uso em humanos, o padrão de harmonização pode ser suplementado com uma proteína de camundongo e o suporte sólido pode ser proje- tado para incluir ensaios para os biomarcadores humanos pretendidos, mas também para a proteína de camundongo suplementada. Esse ensaio artificial incorporado no ensaio multicomponente e no padrão de harmonização é benéfico porque serve como controle funcional e ponto fixo ao longo do ensaio e avaliação. Esse ponto estável é benéfico para avaliar danos externos aos componentes, como transporte de reagentes ou suportes sólidos a temperaturas elevadas que podem reduzir ou até destruir o de- sempenho do ensaio, o que pode constituir um risco maior para o paciente.
[087] Embora esta invenção seja principalmente aplicável a um ensaio que estima a concentração de múltiplos biomarcadores, certas modalidades também são aplicáveis a ensaios qualitativos, como o ensaio de genotipagem. Como um exemplo não limitativo, um padrão de harmonização aplicado em um ensaio de genotipagem em que uma quantidade de polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) é medida tem a capacidade de servir como um controle de autenticidade: devido ao perfil de geno- tipagem conhecido do padrão de harmonização, o genótipo medido pode correspon- der ao genótipo conhecido, de modo a confirmar a função do ensaio e o ensaio autên-
tico. Em uma situação de genotipagem, é ainda possível incorporar moléculas irrele- vantes ou projetar ensaios para SNP'ss irrelevantes, de modo a servir como um controle funcional, semelhante ao discutido anteriormente.
[088] Para ilustrar a importância da supressão do erro sistemático, foram re- visados os resultados de um grande estudo populacional de triagem de câncer de próstata. Neste estudo, vários biomarcadores de proteínas, vários SNP e vários outros fatores relacionados à informação (como idade e histórico familiar de câncer de prós- tata etc.) foram combinados em uma pontuação de risco que se mostrou altamente funcional com o objetivo de detectar o câncer de próstata como divulgado em “Pros- tate cancer screening in men aged 50-69 years (STHLM3): a prospective population- based diagnostic study" por H Grônberg e coautores, conforme publicado em Lancet Oncology (9 de novembro de 2015 http://dx.doi.org/10.1016/S1470-2045(15)00361- 7), que é incorporado a título de referência neste documento. Os biomarcadores de proteínas utilizados neste estudo foram medidos usando uma plataforma multiplex ba- seada na tecnologia IMmmunoCAP ISAC (Thermo Fisher Scientific). Em suma, aproxi- madamente 70 amostras de pacientes, 12 calibradores e 12 amostras de controle fo- ram medidas usando o mesmo dispositivo de teste descartável. Em uma análise de sensibilidade, cada dispositivo descartável recebeu um fator multiplicativo que foi apli- cado em todas as amostras e em todos os biomarcadores de proteínas. Os fatores multiplicativos foram autorizados a variar dentro de um intervalo definido e os fatores foram escolhidos para aumentar o desempenho diagnóstico em termos de ROC-AUC. Quando os fatores multiplicativos permitiram variar entre 0,96 e 1,04, ou seja, quando cada dispositivo descartável foi submetido a uma provocação sistemática de no má- ximo 4%, o desempenho do ensaio de diagnóstico não foi aprimorado de maneira significativa. Quando os fatores multiplicativos podiam variar entre 0,86 e 1,16, ou seja, quando cada dispositivo descartável era submetido a uma provocação sistemá- tica de no máximo 16%, o desempenho do ensaio de diagnóstico podia ser claramente melhorado de 0,74 para aproximadamente 0,78. Esse aumento no desempenho é maior que a contribuição de qualquer um dos biomarcadores, exceto o PSA total. À conclusão da análise de sensibilidade é que o método divulgado por Grónberg e co- autores requer um alto nível de controle para que erros e mudanças sistemáticas no desempenho do ensaio sejam inferiores a 16%.
[089] Paralelamente ao estudo realizado por Grónberg e coautores, foi avali- ado o desempenho do ensaio PSA total em um instrumento Roche Cobas em um laboratório clínico regular em Estocolmo. Aproximadamente 2 anos de dados da amostra de controle indicaram que, ao alterar o lote de reagentes de calibração, o valor total de PSA de uma amostra de controle pode mudar na ordem de 3 a 6%. Essa alteração por si só não terá um grande impacto no desempenho do método de triagem divulgado por Grônberg, mas pode se tornar uma preocupação quando combinada com outras fontes potenciais de erro sistemático.
[090] Outra atividade realizada paralelamente ao estudo realizado por Grôn- berg e coautores foi a comparação do valor total de PSA e do valor livre de PSA de dois fornecedores independentes de instrumentos, o analisador Roche Cobas e o ana- lisador BRAHMS Kryptor (Thermo Fisher Scientific) em 282 amostras de sangue. Em- bora ambas as plataformas sejam aprovadas para uso em laboratórios clínicos regu- lares, houve uma diferença sistemática nos valores relatados: o PSA total do ensaio Kryptor foi 5% maior que o do ensaio Cobas e o PSA livre do ensaio Kryptor foi 16% maior que o ensaio Cobas.
[091] Tomados em conjunto, isso ilustra que o ensaio multiplex divulgado por Grônberg exigirá controle estrito do erro sistemático e mostra que há uma necessi- dade da presente invenção, a fim de tornar o método de Grônberg aplicável de ma- neira ampla. Isso está de acordo com as conclusões do relatório “Between-method differences in prostate-specific antigen assays affect prostate cancer risk prediction by nomograms.” por C Stephan e coautores, publicado em Clin Chem. Julho de 2011;
57(7):995 a 1004. doi: 10.1373/clinchem.2010.151472 como discutido em outra parte da presente divulgação.
[092] Do ponto de vista geral, os ensaios multiplexados enfrentam muitos de- safios para se tornarem confiáveis em um ambiente de diagnóstico ou prognóstico. O recurso de multiplexação fornece uma característica diferente dos dados em compa- ração com os ensaios singleplex, que por sua vez requerem uma mentalidade dife- rente ao utilizar dados multiplexados. Os resultados de dados multiplexados podem ser vistos preferencialmente como um perfil (um padrão, uma impressão digital). Um perfil constitui vários pontos de dados que podem ter relacionamentos relativos e ab- solutos entre si. Ao comparar padrões, a similaridade pode ser reivindicada mesmo que uma fração dos pontos de dados se desvie um do outro. Isso significa que o uso de um padrão que compreende vários pontos de dados será inerentemente robusto às variações individuais das entidades medidas e permite que o ensaio multiplexado tenha maior ruído em comparação ao que é normalmente aceitável para um ensaio singleplex. A propriedade de redundância do multiplexado foi discutida no contexto de diagnóstico de câncer de próstata no documento WO 2014079865, que é incorporado neste documento a título de referência. Outra questão genérica para os ensaios são os desvios sistemáticos. Existem diferenças sistemáticas entre plataformas de instru- mentos, às vezes entre itens descartáveis usados no ensaio, e também podem ser causadas por alterações nos procedimentos pré-analíticos antes da execução do en- saio. Erros sistemáticos são complicados porque estão relacionados ao problema de corte; em que nível (magnitude ou semelhança) deve ser um resultado marcado como “positivo”. No caso em que um ensaio multiplexado é usado para fins de diagnóstico e, por algum motivo, metade dos pontos de dados no ensaio são deslocados para cima em 20%, os resultados anteriormente semelhantes a um perfil predeterminado podem não ser mais, resultando em desempenho impreciso do ensaio. A presente invenção trata do erro sistemático incorporando um padrão de harmonização e trans- formando dados multiplex em unidades generalizadas com base no resultado do pa- drão de harmonização. Tomados em conjunto, o uso de perfis, no que diz respeito à propriedade de redundância divulgada no documento WO 2014079865 e implemen- tação do procedimento padrão de harmonização da presente invenção, resulta em ensaios multiplexados mais confiáveis.
EXEMPLO 1
[093] Um subconjunto dos dados produzidos no estudo STHLMS3 foi usado neste exemplo. O STHLM3 é descrito em “Prostate cancer screening in men aged 50- 69 years (STHLM3): a prospective population-based diagnostic study" por Grôónberg e coautores, conforme publicado na Lancet Oncology (Volume 16, No. 16, p 1667 a 1676, dezembro de 2015), que é incorporado a título de referência neste documento. O subconjunto de dados usado neste exemplo compreendeu dados de biomarcadores de proteínas de 4335 indivíduos (3585 com Escore de Gleason abaixo de 7, 617 com Escore de Gleason 7, 133 com Escore de Gleason 8 ou superior), mais especifica- mente a concentração sanguínea de PSA total, PSA livre, PSA livre intacto, hK2, GDF- e MSMB. As determinações da concentração sanguínea foram conduzidas com o uso de um formato de microarranjo em que diferentes anticorpos foram anexados a um substrato; a amostra do paciente foi autorizada a entrar em contato com o subs- trato, seguida de um conjunto de moléculas conjugadas com o substrato, o dito con- junto de conjugados contendo moléculas que se ligam especificamente às proteínas diferentes capturadas da amostra do paciente no substrato. As moléculas do conju- gado foram marcadas com um corante fluorescente de modo a serem quantificáveis.
[094] Cada substrato tinha 96 poços independentes e idênticos, significando que 96 amostras independentes poderiam ser processadas ao mesmo tempo. Os da- dos para o exemplo atual foram gerados com o uso de 12 poços para fins de calibra-
ção, 9 poços para controles de ensaio (três controles, cada um ensaiado em três po- ços independentes) e três poços para um padrão de harmonização (um padrão ensai- ado em três poços independentes). Os 72 poços restantes foram utilizados para amos- tras de pacientes. Os dados gerados para o exemplo atual consumiram, portanto, aproximadamente 100 substratos e as amostras dos pacientes foram distribuídas ale- atoriamente pelos substratos.
[095] Ao comparar o valor médio para o padrão de harmonização com o valor mediano das 72 amostras desconhecidas dentro de cada substrato, três dos seis bio- marcadores de proteínas mostraram uma correlação. A Figura 5 mostra o valor médio do PSA total para os padrões de harmonização (em unidades arbitrárias) no eixo ge- ométrico y e a amostra mediana desconhecida (ou seja, amostra do paciente) valor total de PSA no mesmo substrato no eixo geométrico x (nas mesmas unidades arbi- trárias). Nos casos em que o padrão de harmonização resulta em um valor abaixo da média, as amostras medianas desconhecidas foram consistentemente abaixo da mé- dia. Os resultados para MSMB e GDF-15 foram semelhantes, como mostrado na Fi- gura 6 e na Figura 7.
[096] Ao comparar os 13 substratos (453 pacientes, deles 69 com o Escore de Gleason 7 e 12 com o Escore de Gleason 8 ou superior) que apresentaram os menores valores totais de PSA para o padrão de harmonização com o conjunto de dados restante, as concentrações de biomarcadores medianas para PSA total e MSMB como apresentado na Tabela A foram obtidos. Os valores medianos de PSA para pacientes analisados nos 13 substratos selecionados foram, independentemente da agressividade do câncer, consistentemente inferiores ao valor mediano para paci- entes benignos não cancerígenos no conjunto de dados restante. Além disso, os va- lores do MSMB para os 13 substratos selecionados foram consistentemente superio- res, independentemente da agressividade do câncer, em comparação com o conjunto de dados restante. Como o PSA total está positivamente relacionado ao risco de cân- cer de próstata (isto é, um valor superior indica um risco maior) e o MSMB está corre- lacionado negativamente (isto é, um valor inferior é indicativo de aumento do risco de câncer, os 13 substratos selecionados apresentaram valores divergentes para PSA total e MSMB e, simultaneamente, desviar-se de uma maneira que oculte incorreta- mente o risco.
TABELA A | |18sunstratos selecionados — | conjunto de dados restante — | PSA total medi- | MSMB total me- | PSA total medi- | MSMB total me- ano para amos- | diano para | ano para amos- | diano para tras desconhe- | amostras desco- | tras desconhe- | amostras desco- cidas nhecidas cidas nhecidas Escore de Glea- | 1,86 1,48 2,48 1,385 son=6 Escore de Glea- | 2,22 1,62 2,87 1,380 son=7 Escore de Glea- | 2,34 1,61 4,16 1,43 son>7
[097] É possível ajustar o desvio sistemático dos 13 substratos selecionados, transformando os valores de concentração produzidos pelo ensaio através do uso dos valores obtidos para as amostras padrão de harmonização em cada substrato. Como a determinação da concentração de qualquer amostra está associada ao erro, cada substrato foi transformado em unidades generalizadas usando a seguinte transforma- ção conservadora: Fator de correção = 2 / (1 + (valor padrão de harmonização esperado - valor padrão de harmonização medido) / (valor padrão de harmonização esperado)).
[098] Essa transformação corrige apenas metade do desvio indicado pelo pa- drão de harmonização e foi selecionada para reduzir o potencial erro de medição na amostra de harmonização para propagar nas unidades generalizadas. Ao comparar o desempenho geral para discriminar o câncer agressivo (definido como Escore de Gleason 7 ou superior) de outros, o uso de unidades generalizadas não melhorou o desempenho diagnóstico geral da perspectiva da população. Isso significa que (a) a grande maioria dos dados produzidos é boa como está e (b) é possível implementar unidades generalizadas de maneira segura do ponto de vista da população. Nos casos extremos, por exemplo, os 13 substratos discutidos acima, unidades generalizadas serão importantes e melhorarão a precisão dos pacientes envolvidos. Portanto, de um ponto de vista individual, as unidades generalizadas têm o potencial de corrigir os resultados dos ensaios e produzir estimativas de risco adequadas. Em suma, isso sugere que a presente invenção é de importância muito alta para indivíduos que são analisados em um substrato em que amostras de harmonização indicam desvio siste- mático e de importância moderada para a maioria dos indivíduos que são analisados em um substrato em que as amostras de harmonização estão níveis normais.
[099] Embora a invenção tenha sido descrita em relação à sua modalidade preferida, que constitui o melhor modo atualmente conhecido pelos inventores, deve- se entender que várias alterações e modificações, como seriam aparentes para uma pessoa versada na técnica, podem ser feitas sem divergir do âmbito da invenção, conforme estabelecido nas reivindicações anexas.

Claims (10)

REIVINDICAÇÕES
1.Método para harmonização de resultados de testes de uma amostra bioló- gica em um ensaio bioquímico multiplexado, em que uma presença e/ou uma concen- tração de múltiplos biomarcadores são determinadas ao mesmo tempo na mesma amostra e tornadas comparáveis a resultados de teste obtidos em diferentes labora- tórios, sendo que o dito método compreende as etapas a) a c), - a) quantificar (11) uma presença e/ou uma concentração de pelo menos dois biomarcadores diferentes (25, 26) em uma amostra biológica e (27, 28) em uma amos- tra padrão de harmonização, independentemente em cada amostra, por meio de um dispositivo de ensaio bioquímico multiplexado definido (20) implementado em um ins- trumento analítico definido (22); - b) receber (13) os resultados de teste (Resultado do testeamostra, Resultado de testenarmonização) das amostras em um mecanismo de decisão baseado em compu- tador (44); e - c) transformar (15) os resultados de teste (Resultado de testeamostra) recebi- dos da amostra biológica, CARACTERIZADO pelo fato de que a transformação (15) dos resultados de teste (Resultado de testeamostra) da amostra biológica inclui transfor- mar os resultados de teste (Resultado de testenarmonização) da amostra padrão de har- monização para unidades generalizadas, GE, e ajustar (16) os resultados da amostra biológica para as unidades generalizadas, GE.
2.Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as etapas de a) a c) são repetidas pelo menos duas vezes dentro de um período de tempo específico.
3.Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que as etapas a) a c) são repetidas com uma amostra biológica diferente e com o uso de resultados (Resultado de testenarmonização) dos pelo menos dois padrões de harmo- nização (HSS) quantificados em diferentes momentos no tempo como entrada na transformação (15) em unidades generalizadas (GE).
4.Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que as etapas a) a c) são repetidas com uma amostra biológica (BS) diferente e um padrão de harmonização diferente (HSS), e usando os resultados (Resultado de tes- tenarmonização) dos pelo menos dois padrões de harmonização (HSS) quantificados em diferentes momentos no tempo como entrada na transformação (15) em unidades ge- neralizadas (GE).
5.Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que as etapas a) a c) são repetidas com uma amostra biológica (BS) diferente ou um padrão de harmonização diferente (HSS) e com o uso de resultados (Resultado de testenarmonização) dos pelo menos dois padrões de harmonização (HSS) quantificados em diferentes momentos como entrada na transformação (15) em unidades generali- zadas (GE).
6.Dispositivo de ensaio bioquímico multiplexado definido (22) adaptado para ser implementado em um tipo definido de instrumento analítico (34) e com uma pre- sença ou uma concentração de pelo menos dois biomarcadores diferentes (25, 26) em uma amostra biológica (BS) e pelo menos dois biomarcadores diferentes (27, 28) em uma amostra padrão de harmonização (HSS), independentemente em cada amos- tra (BS, HSS), que podem ser quantificados pelo instrumento analítico (34), CARACTERIZADO pelo fato de que o dispositivo de ensaio bioquímico (22) compre- ende 10 testes independentes e simultâneos, e em que um padrão de harmonização (HSS) contém pelo menos 90% dos biomarcadores (27, 28) que fazem parte do teste.
7.Dispositivo de ensaio bioquímico, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que são fornecidos pelo menos dois padrões de har- monização (HSS), sendo que os ditos dois padrões de harmonização (HSS) são pro- jetados para fornecer duas concentrações diferentes para pelo menos 90% dos bio- marcadores (27, 28) que fazem parte do teste.
8. Dispositivo de ensaio bioquímico (22), de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma fase sólida tendo imobilizado no mesmo pelo menos duas categorias diferentes de ligantes, em que: - a primeira categoria dos ligantes se liga especificamente a um biomarcador de PCa e inclui uma pluralidade de ligantes diferentes que se ligam especificamente a cada um de uma pluralidade de biomarcadores de PCa diferentes, de preferência pelo menos um dentre PSA, iPSA, tPSA, fPSA e hK2, e opcionalmente MSMB e/ou MIC-1; e - a segunda categoria dos ligantes se liga especificamente a um SNPpc e inclui uma pluralidade de ligantes diferentes que se ligam especificamente a cada um dentre uma pluralidade de SNPpc diferentes, como pelo menos um dentre rs11672691, rs11704416, rs3863641, rs12130132, rs4245739, rs3771570, rs7611694, rs1894292, rs6869841, rs2018334, rs 16896742, rs2273669, rs1933488, rs11135910, rs3850699, rs11568818, rs1270884, rs8008270, rs4643253, rs684232, rs11650494, rs7241993, rs6062509, rs1041449, rs2405942, rs12621278, rs9364554, rs10486567, rs6465657, rs2928679, rs6983561, rs16901979, rs16902094, rs812418451, rs4430796, rs11649743, rs2735839, rs9623117 e rs138213197.
9.Dispositivo de ensaio bioquímico (22), de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a fase sólida tem ainda uma terceira categoria de ligante imobilizado que se liga especificamente a um SNPbm e inclui um ou uma pluralidade de ligantes diferentes que se ligam especificamente a um ou a cada um de uma pluralidade de SNPbm diferente, como pelo menos um dentre rs1227732, rs3213764, rs1354774, rs2736098, rs401681, rs10788160, rs11067228, rs1363120, rs888663 e rs 1054564.
10.Sistema (30) para harmonização dos resultados de teste de uma amostra biológica em um ensaio bioquímico multiplexado, sendo que o sistema (30) compre- ende:
- um dispositivo de ensaio bioquímico multiplexado definido (22) implemen- tado em um tipo definido de instrumento analítico (34), ambos (22, 34) adaptados para quantificar a presença ou a concentração de pelo menos dois biomarcadores diferen- tes (25, 26) em uma amostra biológica (BS) e pelo menos dois biomarcadores dife- rentes em (27, 28) uma amostra padrão de harmonização (HSS), independentemente em cada amostra (BS, HSS),
um mecanismo de decisão baseado em computador (44) que compreende:
- um componente (46) para receber (13) os resultados de teste (TestBS, Teste HSS) das amostras (BS, HSS) no mecanismo de decisão baseado em computador (4) e
- um componente (48) para transformar (15) os resultados de teste (TestBS) recebidos a partir da amostra biológica (BS), CARACTERIZADO pelo fato de que o componente (28) para a transformação (15) dos resultados de teste da amostra bioló- gica (BS) é disposto para transformar os resultados de teste (Teste HSS) da amostra padrão de harmonização (HSS) em unidades generalizadas, GE, e disposto para ajus- tar os resultados de teste da amostra biológica nas unidades generalizadas, GE.
Quantificar a presença ou concentração de pelo menos dois biomarcadores diferentes em uma amostra biológica e em uma amostra de harmonização, independentemente em cada amostra nu Receber os resultados de teste 13 Transformar os resultados de teste 15 Ajustar os resultados das amostras biológicas nas unidades generalizadas (GE) 16 Figura 1
” A To Vas oocoor 26 <—— po00 “ 27 (| 000000 28 000009 SN assadas CA BS,
VA . N Figura 3 Figura 2 30 i i i i í i i i i i i i i i 1 i i i i i 1 ques i i Resultado do testezmostra 46 48 Resultado do testenarmonização / 44 Figura 4
PSA total FF 16 2 o o o 1 o & : S o º%% % Es o 8 o! o o 12 o - ã o o 8 o 00% 5 8 à FE» o SF o o - S oo E à o É o8 Êo o | Ê &ºo ,º & 06 o o - s o o o É oa z ) o - = O2 8 1 vs 2 2,5 3 35 4 Ss concentração média desconhecida da amostra no substrato (a.u.) Figura 5
MSMB Za 2,2
E o & 2 o Ss o Ê 18 o % o 3 “o 8 e “ço 3 1,6 bo õ 8 : Ss o vv o o” do & 14 oo E oo Sº so o o s o 9 0 o o 8 12 o oo 5º $ 2 go “S o o o o o E o o Ss o = o E os 8 08 1 12 14 16 18 2 22 8 concentração média desconhecida da amostra no substrato (a.u.) Figura 6
- GDF-15 3 14 2 o o Ex) z”
E É 12 o + o = o So s o ooo o 8 14 *g% 8 o o8E&ão 3 8 o pego 21 oeo &so & Do oo : o º .: oo o 2 os 8% co 2 [RS o = g 08 o É o & o7 o o 8 3 08 0,9 1 11 12 13 14 concentração média desconhecida da amostra no substrato (a.u.) Figura 7
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