BR112020014565A2

BR112020014565A2 - Terapia de combinação para tratamento ou prevenção de câncer

Info

Publication number: BR112020014565A2
Application number: BR112020014565-3A
Authority: BR
Inventors: Alexander Stevenson
Original assignee: 4D Pharma Research Limited
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2020-12-08
Also published as: US20210060086A1; WO2019141998A1; AU2019210004A1; EP3740220A1; TW201934139A; JP2021516662A; SG11202006873UA; IL276074A; CN111727047A; CA3088338A1; KR20200110342A; MX2020007664A; US20230277602A1; MA51615A

Abstract

a presente invenção refere-se a uma terapia de combinação que compreende uma cepa bacteriana para tratar ou prevenir câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE COMPOSIÇÕES PARA TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE CÂN- CER, KIT, COMBINAÇÃO TERAPÊUTICA, PRODUTO ALIMENTÍCIO E VACINA".

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção está no campo de uma terapia de combinação para tratar ou prevenir câncer: uma combinação de uma composição que compreende uma cepa bacteriana e um inibidor sele- cionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO1, canrelizumabe, BCD-100, IBI308, AGEN2034, INCSHR1210, MEDIO680, JSO001/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ- 63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, SymO021, MGAO012, LZMOOS9, genolinzumabe, AK105, AB122, PF-O06801591, PF-O6688992 e TSR-042, para tratar ou prevenir câncer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Se acredita que o intestino humano seja estéril no útero, porém, está exposto a uma grande variedade de micróbios ambientais e maternais imediatamente após o nascimento. Portanto, um período dinâmico de colonização microbiana e sucessão ocorre, que é influen- ciado por fatores, tais como modo de distribuição, ambiente, dieta e genótipo do hospedeiro, em que todos estes impactam mediante a composição da microbiota intestinal, particularmente durante a vida pregressa. Subsequentemente, a microbiota se estabiliza e se torna adulta [1]. A microbiota intestinal humana contém mais de 500 a 1000 diferentes filotipos que pertencem essencialmente a duas principais divisões bacterianas, os Bacteroidetes e os Firmicutes [2]. As relações simbióticas bem-sucedidas que surgem da colonização bacteriana do intestino humano renderam uma ampla variedade de funções metabó- lica, estrutural, protetora e outra funções benéficas. As atividades me- tabólicas aprimoradas do intestino colonizado garantem que, de outra forma, componentes alimentares indigestos sejam degradados com a liberação de subprodutos que fornecem uma fonte de nutriente impor- tante para o hospedeiro. De modo similar, a importância imunológica da microbiota intestinal é bem reconhecida e é exemplificada em ani- mais livres de germes que têm um sistema imunológico prejudicado que é funcionalmente reconstituído depois da introdução de bactérias comensais [3-5].

[003] Alterações drásticas em composição de microbiota foram documentadas em distúrbios gastrointestinais, tais como doença intes- tinal inflamatória (IBD). Por exemplo, os níveis de bactérias de conjun- to XIVa de Clostridium são reduzidos em pacientes com IBD, enquanto os números de E. coli são aumentados, o que sugere uma mudança no saldo de simbióticos e patobiontes dentro do intestino [6-9]. De ma- neira interessante, esta disbiose microbiana também está associada aos desequilíbrios em populações de célula efetora T.

[004] Em reconhecimento ao potencial efeito positivo que deter- minadas cepas bacterianas podem ter sobre o intestino animal, várias cepas foram propostas para uso no tratamento de várias doenças (consultar, por exemplo, [10-13]). Além disto, determinadas cepas que incluem principalmente cepas de Lactobacillus e Bifidobacterium, fo- ram propostas para uso no tratamento de várias doenças inflamatórias e autoimunes que não são diretamente ligadas aos intestinos (consul- tar [14] e [15] para revisões). No entanto, a relação entre diferentes doenças e diferentes cepas bacterianas, e os efeitos precisos de ce- pas bacterianas particulares sobre o intestino e num nível sistemático e em quaisquer tipos particulares de doenças, são pouco caracteriza- dos. Por exemplo, determinadas espécies de Enterococcus estão en- volvidas no desencadeamento de câncer [16]. Em contraste, as cepas bacterianas da espécie Enterococcus gallinarum também foram descri- tas para uso no tratamento e na prevenção de câncer [54].

[005] Devido à natureza diversa de câncer, várias modalidades de tratamento estão em desenvolvimento de modo a tratar diferentes grupos de paciente. Uma modalidade de tratamento que se provou efi- caz é o uso de inibidores de checkpoint imunológico (ICIs). ICIs são compostos que inibem a habilidade de uma célula de câncer em evitar que as células imunológicas do hospedeiro ataquem as células de câncer. ICls podem ser, por exemplo, anticorpos terapêuticos que fo- ram desenvolvidos contra a interação entre a proteína de morte celular programada de receptor trcansmembranar 1 (denominada PDCDI, PD- 1, PD1 ou CD279) e seu ligante, ligante 1 de PD-1 (denominado PD- L1, PDL1 ou CD274).

[006] Embora o tratamento de pacientes com câncer com um ICI, quando eficaz, possa resultar em efeitos clínicos duradouros e signifi- cativos, ainda há uma porcentagem significativa de pacientes que não são responsivos ou apenas parcialmente responsivos ao tratamento com ICI. Portanto, há uma necessidade na técnica por modalidades de tratamento novas e melhoradas para evitar e tratar câncer e, em parti- cular, modalidades de tratamento que possam melhorar o efeito de tratamento com inibidores específicos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] A presente invenção refere-se às terapias de combinação inovadoras para tratar e prevenir câncer. Em particular, a presente in- venção se refere às terapias melhoradas nas quais a administração sequencial e/ou parcialmente paralela de uma cepa bacteriana da es- pécie Enterococcus gallinarum e um inibidor selecionado dentre o gru- po que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO01, canrelizumabe, BCD-100, IBI308, AGEN2034, INCSHR1210, ME- DIO680, JS001/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF- 06801591, GLS-010, AB122, Sym021, MGA012, LZMOOS9, genolinzu- mabe, AK105, AB122, PF-O06801591, PF-O06688992 e TSR-042 resulta num tratamento mais eficaz contra câncer do que o tratamento com a cepa bacteriana ou o inibidor sozinho.

[008] Composições que compreendem uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum são eficazes em terapia em geral, e no tratamento ou prevenção de câncer, em particular, conforme apre- sentado no presente documento abaixo e em [54]. A presente inven- ção é, adicionalmente, com base, em parte, no efeito inesperado al- cançado mediante administração tanto de um inibidor particular quanto de uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum. Conforme usado no presente documento, os termos "a combinação da invenção", "a combinação terapêutica da in- venção" e "a combinação terapêutica" podem ser usados intercambia- velmente e se referem a uma combinação terapêutica de: (a) uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Entero- coccus gallinarum; e (b) um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO1, canre- lizumabe, BCD-100, IBI308, AGENZ2034, INCSHR1210, MEDIO680, JSO01/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, SymO021, MGAO012, LZMOOS9, genolinzumabe, AK105, AB122, PF-O6801591, PF-O6688992 e TSR-042. Deve-se en- tender que o termo "combinação" no contexto da combinação terapêu- tica não se refere aos componentes (a) e (b) da combinação que estão necessariamente na mesma composição e/ou administrados ao mes- mo tempo. De acordo com modalidades preferenciais, (a) e (b) da combinação terapêutica estão em composições separadas. De acordo com algumas modalidades, é fornecida no presente documento a combinação da invenção para uso num método para tratar ou prevenir câncer num indivíduo. De acordo com algumas modalidades, é forne- cido no presente documento um método para tratar ou prevenir câncer num indivíduo, que compreende administrar a combinação terapêutica da invenção ao indivíduo.

[009] De acordo com algumas modalidades, a administração da composição bacteriana no contexto da combinação terapêutica possi- bilita tratamento de pacientes com câncer que não eram responsivos ou que demonstraram resposta insuficiente ao tratamento com um ini- bidor de checkpoint imunológico que foi administrado sem a composi- ção bacteriana. De acordo com algumas modalidades, os pacientes que não são responsivos ou responsivos parciais à terapia com ICI podem ser ICI virgem (isto é, não receberam precedentemente terapia com ICI) ou podem ter se tornado não responsivos ou responsivos parciais depois da administração precedentemente bem-sucedida de ICIs.

[0010] Sem desejar estar vinculado à teoria ou mecanismo, este efeito poderia ser através de modulação de mediadores que melhoram a eficiência de inibidores da invenção, tal como através de um aumen- to em células T CD8* de infiltração em tumor ou um aumento na razão entre células T CD8* de infiltração em tumor e células FoxP3+.

[0011] De acordo com um aspecto, é fornecida no presente docu- mento uma combinação terapêutica para uso num método para tratar ou prevenir câncer num indivíduo, sendo que a referida combinação terapêutica compreende: (a) uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b) um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO01, canrelizumabe, BCD- 100, IBI308, AGEN2034, INCSHR1210, MEDIO680, JSO001/PD1, CC- 90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, Sym021, MGAO012, LZMOOS, genolinzumabe, AK1I05, AB122, PF- 06801591, PF-O6688992 e TSR-042.

[0012] De acordo com algumas modalidades, é fornecida no pre-

sente documento uma composição que compreende uma cepa bacte- riana da espécie Enterococcus gallinarum para uso num método para tratar ou prevenir câncer num indivíduo, sendo que a referida compo- sição é usada em combinação com um inibidor da invenção.

[0013] De acordo com algumas modalidades, é fornecida no pre- sente documento uma primeira composição que compreende uma ce- pa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum para uso em com- binação com uma segunda composição que compreende um inibidor da invenção, para uso num método para tratar ou prevenir câncer num indivíduo, opcionalmente, sendo que a referida primeira composição é administrada antes da primeira administração da referida segunda composição e/ou em paralelo com a administração da segunda com- posição, opcionalmente, sendo que o indivíduo não foi responsivo a um tratamento precedente que usa um inibidor de checkpoint imunoló- gico sozinho.

[0014] De acordo com outro aspecto, é fornecido no presente do- cumento um método para tratar ou prevenir câncer num indivíduo que necessita do mesmo (também denominado no presente documento "o método da invenção"), sendo que o método compreende: (a) adminis- trar ao indivíduo uma composição que compreende uma cepa bacteri- ana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b) administrar ao indivíduo um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO1, canrelizumabe, BCD-100, IBI308, AGEN2034, INCSHR1210, MEDIO680, JSO01/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, Sym021, MGAO012, LZMOOS9, genolinzumabe, AK1O05, AB122, PF-O06801591, PF- 06688992 e TSR-042.

[0015] De acordo com outro aspecto, é fornecido no presente do- cumento um kit que compreende: (a) uma composição que compreen- de uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b)

uma composição que compreende um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDRO01, canrelizumabe, BCD-100, IBI308, AGENZ2034, INCSHR1210, MEDIO680, JSOO01/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF- 06801591, GLS-010, AB122, Sym021, MGA012, LZMOOS9, genolinzu- mabe, AK105, AB122, PF-O06801591, PF-O6688992 e TSR-042.

[0016] De acordo com algumas modalidades, câncer é seleciona- do dentre o grupo que consiste em: câncer de mama, câncer de pul- mão, câncer de cólon, câncer de rim, câncer de fígado, linfoma (tal como linfoma de não Hodgkin), hepatoma e câncer neuroendócrino. De acordo com algumas modalidades, a combinação terapêutica é pa- ra uso num método para tratar ou prevenir câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de rim, câncer de fígado, linfoma, hepatoma, câncer neuroendócrino ou câncer de cólon. De acordo com algumas modali- dades, câncer é selecionado dentre o grupo que consiste em: mela- noma, carcinoma pulmonar de célula não pequena, câncer de bexiga e câncer de cabeça e pescoço. Em determinadas modalidades, a com- binação terapêutica ou o método da invenção é para uso na redução de tamanho de tumor ou prevenção de crescimento de tumor no tra- tamento de câncer. De acordo com algumas modalidades, a combina- ção terapêutica ou o método da invenção é para uso em pelo menos um dentre a redução de tamanho de tumor, redução de crescimento de tumor, prevenção de metástase ou prevenção de angiogênese.

[0017] De acordo com algumas modalidades, os termos "a compo- sição", "a composição bacteriana" e "a composição da invenção" po- dem ser usados intercambiavelmente e se referem à composição in- cluída na combinação terapêutica da invenção, que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum. De acordo com algumas modalidades, a composição que compreende uma cepa bac- teriana da espécie Enterococcus gallinarum não contém bactérias de nenhuma outra espécie ou compreende apenas quantidades de mini- mis ou biologicamente irrelevantes de bactérias de outra espécie. De acordo com algumas modalidades, cepas intimamente ligadas de En- terococcus gallinarum também podem ser usadas como parte da com- binação terapêutica, tal como cepas bacterianas que têm uma se- quência de 16s rRNA que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência de 16s rRNA de uma cepa bac- teriana de Enterococcus gallinarum. De preferência, a cepa bacteriana tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou 2. De prefe- rência, a identidade de sequência é com a SEQ ID NO: 2. De prefe- rência, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da in- venção tem a sequência de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO:

2.

[0018] Consequentemente, a combinação terapêutica da invenção pode compreender uma composição que compreende uma cepa bac- teriana que tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95% idêntica à sequência de 16s rRNA de uma cepa bacteriana de Entero- coccus gallinarum, opcionalmente à SEQ ID NO: 2, para uso num mé- todo para tratar ou prevenir câncer. Enterococcus gallinarumEm al- gumas modalidades, a cepa bacteriana na composição não é de Ente- rococcus gallinarum, porém, é uma cepa intimamente ligada.

[0019] Em determinadas modalidades, a composição da invenção é para administração oral. Administração oral das cepas da invenção pode ser eficaz para tratar câncer, em particular quando administradas como parte da combinação terapêutica da invenção. Além disto, a ad- ministração oral é conveniente para pacientes e médicos, e permite a distribuição no e/ou colonização parcial ou total do intestino. De acordo com algumas modalidades, o inibidor usado como parte da combina- ção terapêutica da invenção é administrado por via intravenosa. De acordo com algumas modalidades, cada um dentre a composição bac- teriana e o inibidor da combinação terapêutica está presente numa composição separada, em que cada um compreende, possivelmente, um veículo e/ou um excipiente adequado para seu modo de adminis- tração. Em determinadas modalidades, a composição da invenção compreende um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Em determinadas modalidades, o inibidor da invenção está numa composição que compreende um ou mais excipientes ou veícu- los farmaceuticamente aceitáveis.

[0020] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana da invenção compreende uma cepa bacteriana que foi liofiizada. À liofilização é uma técnica eficaz e conveniente para preparar composi- ções estáveis que permitem a distribuição de bactérias. De acordo com algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição é capaz de colonizar parcial ou totalmente o intestino.

[0021] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana está compreendida num produto alimentício. Em determinadas moda- lidades, a composição bacteriana está compreendida numa vacina.

[0022] De acordo com algumas modalidades, a composição bacte- riana compreende uma única cepa de Enterococcus gallinarum. De acordo com algumas modalidades, a composição bacteriana compre- ende a cepa bacteriana de Enterococcus gallinarum como parte de um consórcio microbiano. De preferência, a composição bacteriana com- preende a cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488.

[0023] De acordo com algumas modalidades do método da inven- ção, a composição bacteriana é administrada ao indivíduo antes de uma primeira administração do inibidor da invenção ao indivíduo. De acordo com algumas modalidades do método da invenção, a composi- ção bacteriana é administrada ao indivíduo por pelo menos uma, duas,

três ou quatro semanas antes da primeira administração do inibidor da invenção. Deve-se entender que, no contexto do método da invenção, a primeira administração do inibidor da invenção se refere a uma pri- meira administração como parte da combinação terapêutica da inven- ção. Antes da administração da combinação terapêutica da invenção o indivíduo pode ter recebido um inibidor sem a composição bacteriana da invenção que é administrada durante/antes da administração do inibidor. De acordo com algumas modalidades, pelo menos uma, duas, três ou quatro semanas se passaram entre a administração da combi- nação terapêutica da invenção e antes da administração de um inibi- dor sozinho ou da composição bacteriana sozinha.

[0024] De acordo com algumas modalidades do método da inven- ção, a composição bacteriana é administrada ao indivíduo pelo menos parcialmente em paralelo com a administração do inibidor da invenção ao indivíduo. No contexto de vezes de administração da composição bacteriana e do inibidor da invenção, a administração se refere, pelo menos parcialmente em paralelo, às administrações que podem se sobrepor completamente (por exemplo, administração de ambos com- ponentes durante um período de tempo de 12 meses) ou parcialmente (por exemplo, administração de um componente durante um período de tempo de 12 meses e administração do segundo componente du- rante um período de tempo de 8 meses, que pode se sobrepor com- pleta ou parcialmente ao período de 12 meses). Deve-se entender que a administração paralela de ambos os componentes não significa que ambos componentes são necessariamente administrados usando o mesmo regime de dosagem. De acordo com algumas modalidades do método da invenção, a composição bacteriana é administrada ao indi- víduo antes da primeira administração do inibidor da invenção e/ou pelo menos parcialmente em paralelo com a administração do inibidor da invenção ao referido indivíduo. De acordo com determinadas mo-

dalidades, a composição bacteriana é administrada ao indivíduo por pelo menos uma, duas, três ou quatro semanas antes da primeira ad- ministração do inibidor da invenção, seguida por administração da composição bacteriana e inibidor da invenção pelo menos parcialmen- te em paralelo por pelo menos duas, quatro ou seis semanas.

[0025] De acordo com algumas modalidades, a cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum e o inibidor da invenção estão em composições separadas, sendo que, preferencialmente, a composição bacteriana é formulada para administração oral enquanto o inibidor da invenção está numa formulação formulada para administração intrave- nosa.

[0026] De acordo com algumas modalidades, a combinação tera- pêutica da invenção é para tratar ou prevenir câncer num indivíduo que não foi responsivo a um tratamento precedente que usa um inibi- dor de checkpoint imunológico sozinho. Conforme usado no presente documento, um indivíduo que não é responsivo ao tratamento com um inibidor de checkpoint imunológico se refere a um indivíduo que não é responsivo de acordo com os critérios RECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos) ou de acordo com os critérios ir- RECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos imunologicamente relacionados).

[0027] De acordo com algumas modalidades, a combinação tera- pêutica da invenção é para tratar ou prevenir câncer num indivíduo, em que um inibidor da invenção ou a composição bacteriana sozinhos não podem fornecer tratamento ou prevenção eficaz de câncer no in- divíduo. De acordo com algumas modalidades, um tratamento eficaz contra câncer num indivíduo compreende pelo menos uma dentre a redução de tamanho de tumor, redução de crescimento de tumor e/ou prevenção de metástase a um grau que resultará na remissão comple- ta ou parcial do câncer no indivíduo.

[0028] De acordo com algumas modalidades, a combinação tera- pêutica da invenção é capaz de reduzir tamanho de tumor e/ou reduzir crescimento de tumor e/ou prevenir metástase e/ou prevenir angiogê- nese a um grau maior que um inibidor da invenção ou a composição bacteriana sozinhos.

[0029] De acordo com algumas modalidades, a combinação tera- pêutica da invenção é para tratar câncer num indivíduo, de modo que haja remissão completa do câncer no indivíduo, preferencialmente num período de tempo mais curto do que aquele alcançado usando tratamento com o inibidor da invenção ou a composição bacteriana sozinhos.

[0030] A presente invenção também fornece uma composição que compreende um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO01, canrelizumabe, BCD- 100, IBIS08, AGEN2034, INCSHR1210, MEDIO680, JS001/PD1, CC- 90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, Sym0O21, MGAO012, LZMOOS9, genolinzumabe, AK1I05, AB122, PF- 06801591, PF-O6688992 e TSR-042, para uso num método para tra- tar ou prevenir câncer num indivíduo que recebeu precedentemente administração de uma composição que compreende uma cepa bacte- riana da espécie Enterococcus gallinarum, preferencialmente a cepa depositada sob o número de acesso NCIMB 42488.

[0031] A invenção também fornece uma composição que compre- ende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, prefe- rencialmente a cepa depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, para uso num método para tratar ou prevenir câncer num indi- víduo diagnosticado com necessidade de tratamento com um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO01, canrelizumabe, BCD-100, IBI308, AGENZ2034, INCSHR1210, MEDIO680, JS001/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ-

63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, Sym021, MGAO012, LZMOOS9, genolinzumabe, AK105, AB122, PF-O6801591, PF-O6688992 e TSR-042.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0032] Figura 1A: Modelo de camundongo de câncer de mama — volume tumoral.

[0033] Figura 1B: Painel superior: Área de necrose em tumores EMTSG (Não tratados n = 6, Veículo n = 6, MRx0518 n = 8). Painel infe- rior: Porcentagem de células divisoras em tumores EMTG6. P = 0,019 (Não tratados n = 4, número total de células contadas = 37201, Veícu- lo n = 6, número total de células contadas = 64297, MRx0518 n = 6, número total de células contadas = 33539).

[0034] Figura 1C: Modelo de camundongo de câncer de mama — células imunológicas infiltradas. Gráficos de dispersão representam contagens de célula de diferentes marcadores imunológicos de ani- mais individuais de cada grupo de tratamento.

[0035] Figura 1D: Modelo de camundongo de câncer de mama — Produção de citocina em lisados tumorais. Colunas representam a média de pg/ml de proteína total de cada grupo de tratamento. *p < 0,05 entre grupos que usam ANOVA de uma via seguido do teste de múltiplas comparações de Dunnett.

[0036] Figura 1E: Modelo de camundongo de câncer de mama — Produção de citocina em plasma sanguíneo. Colunas representam a média de pg/ml de cada grupo de tratamento (+/- SEM).

[0037] Figura 1F: Imagens representativas de criosseções de íleo do veículo, camundongos tratados com MRx0518 e CTLA-4 imuno- marcados com anticorpos contra CD8a (painéis inferiores) e contra- manchados com DAP! (painéis superiores).

[0038] Figura 1G: Plotagem que quantifica subconjuntos de estu- do animal com mais de 3 células CD8a+ por campo obtidas a partir da região de cripta de fleo de camundongos tratados com veículo, MRx0518 ou CTLAH.

[0039] Figura 2: Modelo de camundongo de câncer de pulmão — volume tumoral.

[0040] Figura 3A: Modelo de camundongo de câncer de fígado — peso do fígado.

[0041] Figura 3B: Modelo de camundongo de câncer de rim — vo- lume tumoral.

[0042] Figura 4A: Níveis de citocina (pg/ml) em células dendríti- cas imaturas (Sem bactéria).

[0043] Figura 4B: Níveis de citocina (pg/ml) em células dendríticas imaturas após a adição de LPS.

[0044] Figura 4C: Níveis de citocina (pg/ml) em células dendríticas imaturas após a adição de MRX518.

[0045] Figura 4D: Níveis de citocina (pg/ml) em células dendríti- cas imaturas após a adição de MRX518 e LPS.

[0046] Figura 5A: Níveis de citocina em células THP-1 (Sem bac- téria).

[0047] Figura 5B: Níveis de citocina em células THP-1 após a adição de sedimento bacteriano.

[0048] Figura 5C: Níveis de citocina em células THP-1 após a adição de MRX518 sozinho ou em combinação com LPS.

[0049] Figura 6: Gráfico de barras que representa a porcentagem de células CD8+ de proliferação depois de vários tratamentos (NCD — Sem divisão celular, IRCD — Uma divisão celular, 2RCD — Duas divi- sões celulares, 3RCD — Três divisões celulares, 4RCD — Quatro divi- sões celulares).

[0050] Figura 7A: Uma representação esquemática do cronogra- ma de tratamento dos diferentes grupos usados no Exemplo 6 descrito no presente documento abaixo.

[0051] Figura 7B: Volume tumoral médio em camundongos que carregam um tumor formado por células EMT-6. Os camundongos eram não tratados ou tratados com um veículo YCFA (Veículo), bacté- rias MRx518 em meio YCFA (MRx518), um anticorpo anti-PD1 (RMP1- 14) e meio YCFA (Anti-PD1), um anticorpo anti-CTLA-4 e meio YCFA (Anti-CTLA-4), uma combinação de MRx518 e o anticorpo anti-PD1 ou uma combinação de MRx518 e o anticorpo anti-CTLA-4.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO CEPAS BACTERIANAS

[0052] As composições da invenção compreendem uma cepa bac- teriana da espécie Enterococcus gallinarum. Os exemplos demons- tram que uma combinação terapêutica que compreende bactérias des- ta espécie é útil para tratar ou prevenir câncer.

[0053] De acordo com algumas modalidades, é fornecida no pre- sente documento uma combinação terapêutica para uso num método para tratar ou prevenir câncer num indivíduo, sendo que a referida combinação terapêutica compreende: (a) uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b) um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO01, canrelizumabe, BCD- 100, IBIS308, AGEN2034, INCSHR1210, MEDIO680, JSO001/PD1, CC- 90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF-O06801591, GLS-010, AB122, Sym021, MGAO012, LZMOOS9, genolinzumabe, AK1IO05, AB122, PF- 06801591, PF-O6688992 e TSR-042.

[0054] De acordo com algumas modalidades, uma composição que compreende uma cepa bacteriana que tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95% idêntica à sequência de 16s rRNA de uma cepa bacteriana de Enterococcus gallinarum pode ser usada na combinação terapêutica e no método da presente invenção. De acor-

do com determinadas modalidades, a invenção também fornece uma composição que compreende uma cepa bacteriana que tem uma se- quência de 16s rRNA que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2 para uso no tratamento ou prevenção de câncer em combinação com o um inibidor da invenção. Em algumas modalidades, a cepa bacteri- ana na composição não é de Enterococcus gallinarum, porém, é uma cepa intimamente ligada.

[0055] Em determinadas modalidades, a composição da invenção compreende uma cepa bacteriana que tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, por exemplo, que é um Enterococcus gallinarum, e não contém nenhum outro gêne- ro bacteriano. Em determinadas modalidades, a composição da in- venção compreende uma única cepa de uma cepa bacteriana que tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, por exemplo, que é um Enterococcus gallinarum, e não contém nenhuma outra cepa ou espécie bacteriana.

[0056] Enterococcus gallinarum forma células cocoides, principal- mente em pares ou cadeias curtas. A mesma é não móvel e colônias em ágar sanguíneo ou ágar de nutriente são circulares e suaves. Ente- rococcus gallinarum reage com o antissoro de grupo D Lancefield. À cepa de tipo de Enterococcus gallinarum é F87/276 = PB21 = ATCC 49573 = CCUG 18658 = CIP 103013 = JCM 8728 = LMG 13129 = NBRC 100675 = NCIMB 702313 (precedentemente NCDO 2313) = NCTC 12359 [17]. O número de acesso GenBank para uma sequência de gene de 16S rRNA de Enterococcus gallinarum é AFO39900 (des- crito no presente documento como SEQ ID NO:1). Uma cepa de Ente- rococcus gallinarum exemplificativa é descrita em [Erro! Indicador não definido.].

[0057] A bactéria Enterococcus gallinarum depositada sob o nú- mero de acesso NCIMB 42488 foi testada nos Exemplos e também é denominada no presente documento cepa MRX518. Referências a MRX518 e MRx0518 são usadas intercambiavelmente. Uma sequên- cia de 16S rRNA para a cepa MRX518 que foi testada é fornecida na SEQ ID NO: 2. A cepa MRX518 foi depositada com a autoridade de depósito internacional NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Escócia) pela 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences In- novation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Escócia) em 16 de novembro de 2015 como "Enterococcus sp" e recebeu o número de acesso NCIMB 42488.

[0058] O genoma da cepa MRX518 compreende um cromossomo e plasmídeo. Uma sequência de cromossomo para a cepa MRX518 é fornecida na SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520. Uma sequência de plasmídeo para a cepa MRX518 é fornecida na SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520. Estas sequências foram ge- radas usando a plataforma PacBio RS |l.

[0059] Também se espera que as cepas bacterianas intimamente ligadas à cepa testada nos exemplos sejam eficazes para tratar ou prevenir câncer na combinação terapêutica da invenção. Em determi- nadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação tera- pêutica da invenção tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo me- nos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência de 16s rRNA de uma cepa bacteriana de Enterococcus gallinarum. De preferência, a cepa bacteriana, para uso na combinação terapêutica da invenção, tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou 2. De preferência, a identidade de sequência é com a SEQ ID NO: 2. De preferência, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem a sequência de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO: 2.

[0060] Também se espera que as cepas bacterianas que são bio-

tipos da bactéria depositada sob o número de acesso 42488 sejam eficazes para tratar ou prevenir câncer no contexto da combinação te- rapêutica da invenção. Um biotipo é uma cepa intimamente ligada que tem características fisiológicas e bioquímicas iguais ou muito similares.

[0061] Cepas que são biotipos da bactéria depositada sob o núme- ro de acesso NCIMB 42488 e que são adequadas para uso na combi- nação terapêutica da invenção podem ser identificadas sequenciando- se outras sequências de nucleotídeos para a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488. Por exemplo, substancialmente o genoma inteiro pode ser sequenciado e uma cepa de biotipo para uso na combinação terapêutica da invenção pode ter pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência através de pelo menos 80% de seu genoma inteiro (por exemplo, atra- vés de pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99%, ou através de seu geno- ma inteiro). Por exemplo, em algumas modalidades, uma cepa de bio- tipo tem pelo menos 98% de identidade de sequência através de pelo menos 98% de seu genoma ou pelo menos 99% de identidade de se- quência através de 99% de seu genoma. Outras sequências adequa- das para uso na identificação de cepas de biotipo podem incluir se- quências de hsp60 ou repetitivas, tais como BOX, ERIC, (GTG)s, ou REP ou [18]. Cepas de biotipo podem ter sequências com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de se- quência com a sequência correspondente da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488. Em algumas modalidades, uma cepa de biotipo tem uma sequência com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência com a se- quência correspondente da cepa MRX518 depositada como NCIMB 42488 e compreende uma sequência de 168 rRNA que é pelo menos 99% idêntica (por exemplo, pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,9% idêntica) à SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, uma cepa de biotipo tem uma sequência com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência com a sequência correspondente da cepa MRX518 depositada como NCIMB 42488 e tem a sequência de 168 rRNA da SEQ ID NO: 2.

[0062] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem um cromossomo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO?2017/085520. Em modalidades preferenciais, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem um cromossomo com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520. Por exemplo, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção pode ter um cromos- somo com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 70% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 90% de iden- tidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO?2017/085520 através de 80% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO?2017/085520, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 90% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do do- cumento nº WOZ2017/085520 através de 100% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 70% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 80% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 90% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 100% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 70% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 80% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 90% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 95% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 100% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do do- cumento nº WO2017/085520 através de 90% da SEQ ID NO: 3 do do- cumento nº WO2017/085520, ou pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 95% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 99,5% de identidade com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO?2017/085520 através de 98% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO?2017/085520, ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de 100% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520.

[0063] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem um plasmídeo com identi- dade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO?2017/085520. Em modalidades preferenciais, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem um plasmídeo com pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de pelo menos 60% (por exemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520. Por exemplo, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção pode ter um plasmí- deo com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 70% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 90% de iden- tidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO?2017/085520 através de 80% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO?2017/085520, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 90% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do do- cumento nº WO2017/085520 através de 100% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 70% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 80% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 90% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 100% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 70% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 80% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 90% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, ou pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520 através de 100% da SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520.

[0064] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem um cromossomo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO?2017/085520 e um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520.

[0065] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem um cromossomo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO?2017/085520, por exemplo, conforme descrito acima, e uma se- quência de 168 rRNA com identidade de sequência com qualquer uma dentre a SEQ ID NO: 1 ou 2, por exemplo, conforme descrito acima, preferencialmente com uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID NO: 2, mais preferencialmente que compreen- de a sequência de 16S rRNA da SEQ ID NO: 2 e compreende, opcio- nalmente, um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, conforme descrito acima.

[0066] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem um cromossomo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO?2017/085520, por exemplo, conforme descrito acima e compreen- de, opcionalmente, um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, conforme descrito acima, e é eficaz para tratar ou prevenir câncer.

[0067] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem um cromossomo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO?2017/085520, por exemplo, conforme descrito acima, e uma se- quência de 16S rRNA com identidade de sequência com qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 1 ou 2, por exemplo, conforme descrito acima e compreende, opcionalmente, um plasmídeo com identidade de se- quência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, con- forme descrito acima, e é eficaz para tratar ou prevenir câncer.

[0068] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO: 2 (por exemplo, que compreende a sequência de 168 rRNA da SEQ ID NO: 2) e um cro- mossomo com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 através de pelo me- nos 90% da SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 e com- preende, opcionalmente, um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, conforme descrito acima, e que é eficaz para tratar ou prevenir câncer.

[0069] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO: 2 (por exemplo, que compreende a sequência de 168 rRNA da SEQ ID NO: 2) e um cro-

mossomo com pelo menos 98% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de se- quência) com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO2017/085520 atra- vés de pelo menos 98% (por exemplo, através de pelo menos 99% ou pelo menos 99,5%) da SEQ |D NO: 3 do documento nº WO?2017/085520 e compreende, opcionalmente, um plasmídeo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO?2017/085520, conforme descrito acima, e que é eficaz para tratar ou prevenir câncer.

[0070] Em determinadas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção é um Enterococcus gallinarum e tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 99%, 99,5% ou 99,9% idêntica à sequência de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO: 2 (por exemplo, que compreende a sequência de 16S rRNA da SEQ ID NO: 2) e um cromossomo com pelo menos 98% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 3 do documento nº WO?2017/085520 através de pelo menos 98% (por exemplo, através de pelo menos 99% ou pelo menos 99,5%) da SEQ ID NO: 3 do docu- mento nº WO2017/085520 e compreende, opcionalmente, um plasmí- deo com identidade de sequência com a SEQ ID NO: 4 do documento nº WO2017/085520, conforme descrito acima, e que é eficaz para tra- tar ou prevenir câncer.

[0071] Alternativamente, cepas que são biotipos da bactéria depo- sitada sob o número de acesso NCIMB 42488 e que são adequadas para uso na combinação terapêutica da invenção podem ser identifi- cadas usando análise de fragmento de depósito e restrição e/ou análi- se de PCR de número de acesso NCIMB 42488, por exemplo, usando polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado fluorescente (FAFLP) e identificação genética por (rep)-PCR de elemento de DNA repetitivo, ou perfilagem de proteína, ou sequenciamento de 16S ou 23s rDNA parcial. Em modalidades preferenciais, tais técnicas podem ser usadas para identificar outras cepas de Enterococcus gallinarum.

[0072] Em determinadas modalidades, cepas que são biotipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 e que são adequadas para uso na combinação terapêutica da invenção são ce- pas que fornecem o mesmo padrão que a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 quando analisada por análise de res- trição de DNA ribossômico amplificada (ARDRA), por exemplo, ao usar enzima de restrição Sau3Al (para métodos exemplificativos e orienta- ção, consultar, por exemplo, [19]). Alternativamente, as cepas de bioti- po são identificadas como cepas que têm os mesmos padrões de fer- mentação de carboidrato que a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488. Em algumas modalidades, o padrão de fer- mentação de carboidrato é determinado usando o painel API 50 CHL (bioMérieux). Em algumas modalidades, a cepa bacteriana usada na combinação terapêutica da invenção é: (i) positiva para fermentação de pelo menos um dentre (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou todos dentre): L-arabinose, D-ribose, D-xilose, D-galactose, D- glicose, D-frutose, D-manose, N-acetilglicosamina, amidalina, arbutina, salicina, D-celobiose, D-maltose, sacarose, D-trealose, gentiobiose, D- tagatose e gliconato de potássio; e/ou (ii) intermediária para fermentação de pelo menos um den- tre (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4 ou todos dentre): D-manitol, Metil- aD-glicopiranosídeo, D-lactose, amido e L-fucose; preferencialmente, conforme determinado por análise API 50 CHL (preferencialmente usando o painel API 50 CHL da bioMérieux).

[0073] Outras cepas de Enterococcus gallinarum que são úteis nas composições e métodos da invenção, tais como biotipos da bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, podem ser identi- ficadas usando qualquer método ou estratégia apropriada, que inclui os ensaios descritos nos exemplos. Por exemplo, cepas para uso na combinação terapêutica da invenção podem ser identificadas cultivan- do-as em YCFA anaeróbico e/ou administrando-se as bactérias para o modelo de camundongo com artrite induzida por colágeno tipo || e, en- tão, avaliando-se os níveis de citocina. Em particular, cepas bacteria- nas que têm padrões de crescimento, tipo metabólico e/ou antígenos de superfície similares com a bactéria depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 podem ser úteis na combinação terapêutica da invenção. Uma cepa útil terá atividade imunomoduladora comparável com a cepa NCIMB 42488. Em particular, uma cepa de biotipo elicitará efeitos comparáveis nos modelos de doença de câncer para os efeitos mostrados nos Exemplos, que podem ser identificados usando os pro- tocolos de cultivo e administração descritos nos Exemplos. De acordo com algumas modalidades, uma cepa de biotipo que pode ser usada na combinação terapêutica da invenção é uma cepa que é capaz de elicitar efeitos comparáveis nos modelos de câncer mostrados nos Exemplos quando administrada na combinação terapêutica ou método da invenção.

[0074] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana usada na combinação terapêutica da invenção é: (i) Positiva para pelo menos uma dentre (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou todos dentre): fermentação de manose, des- carboxilase de ácido glutâmico, arilamidase de arginina, arilamidase de fenilalanina, arilamidase de ácido piroglutâmico, arilamidase de ti- rosina, arilamidase de histidina e arilamidase de serina; e/ou (ii) Intermediária para pelo menos um dentre (por exemplo, pelo menos 2 ou todos dentre): B-galactosidase-6-fosfato, B- glicosidase e N-acetil-B-glicosaminidase; e/ou

(iii) Negativa para pelo menos uma dentre (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 ou todos dentre): fermentação de rafinose, ari- lamidase de prolina, arilamidase de leucil-glicina, arilamidase de leuci- na, arilamidase de alanina, arilamidase de glicina e arilamidase de áci- do glutamil-glutâmico, preferencialmente, conforme determinado por um ensaio de metabo- lismo de carboidrato, aminoácido e nitrato e, opcionalmente, um en- saio de atividade de fosfatase alcalina, mais preferencialmente, con- forme determinado por análise Rapid ID 32A (preferencialmente usan- do o sistema Rapid ID 32A da bioMérieux).

[0075] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana usada na combinação terapêutica da invenção é: (i) Negativa para pelo menos uma dentre (por exemplo, pe- lo menos 2, 3, ou todos os 4 dentre) arilamidase de glicina, fermenta- ção de rafinose, arilamidase de prolina e arilamidase de leucina, por exemplo, conforme determinado por um ensaio de metabolismo de carboidrato, aminoácido e nitrato, preferencialmente conforme deter- minado por análise Rapid ID 32A (preferencialmente usando o sistema Rapid ID 32A da bioMérieux); e/ou (ii) Intermediária positiva para fermentação de L-fucose, preferencialmente, conforme determinado por análise API 50 CHL (preferencialmente usando o painel API 50 CHL da bioMérieux).

[0076] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana usada na combinação terapêutica da invenção é um produtor de ATP extracelu- lar, por exemplo, um que produz 6 a 6,7 ng/ul (por exemplo, 6,1 a 6,6 ng/ul ou 6,2 a 6,5 ng/ul ou 6,33 + 0,10 ng/ul) de ATP conforme medido usando o Kit de Ensaio de ATP (Sigma-Aldrich, MAK190). ATP extra- celular bacteriano pode ter efeitos pleiotrópicos que incluem ativação de sinalização mediada por receptor de célula T (Schenk et al., 2011), promoção de diferenciação célula Th17 intestinal (Atarashi et al., 2008)

e indução de secreção do mediador pro-inflamatório IL-18 ativando-se o infamossoma NLRP3 (Karmarkar et al., 2016). Consequentemente, uma cepa bacteriana que é um produtor de ATP extracelular é útil para tratar ou prevenir câncer no contexto da combinação terapêutica e mé- todo da invenção.

[0077] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana para uso na combinação terapêutica da invenção compreende um ou mais dentre os seguintes três genes: Proteína de elemento móvel; Transportador ABC de xilose, componente de permease; e FIGO0632333: proteína hipotética. Por exemplo, em determinadas modalidades, a cepa bacte- riana para uso na combinação terapêutica da invenção compreende genes que codificam proteína de elemento móvel e transportador ABC de xilose, componente de permease; proteína de elemento móvel e FIGO0632333: proteína hipotética; transportador ABC de xilose, com- ponente de permease e FIGO0632333: proteína hipotética; ou proteína de elemento móvel, transportador ABC de xilose, componente de per- mease e FIGO0632333: proteína hipotética.

[0078] Uma cepa particularmente preferencial da combinação te- rapêutica da invenção é a cepa de Enterococcus gallinarum deposita- da sob o número de acesso NCIMB 42488. Esta é a cepa MRX518 exemplificativa testada nos exemplos e que se mostrou eficaz para tratar uma doença. A invenção fornece, de acordo com algumas moda- lidades, uma composição bacteriana como parte da combinação tera- pêutica da invenção, que compreende uma célula da cepa de Entero- coccus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, ou um derivado da mesma. Um derivado da cepa depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 pode ser uma cepa filha (progênie) ou uma cepa cultivada (subclonada) a partir da original.

[0079] Um derivado de uma cepa da composição compreendida na combinação terapêutica da invenção pode ser modificado, por exemplo, no nível genético, sem ablação da atividade biológica. Em particular, uma cepa derivada da combinação terapêutica da invenção é terapeuticamente ativa. Uma cepa derivada terá atividade imunomo- duladora comparável com a cepa NCIMB 42488 original. Em particular, uma cepa derivada elicitará efeitos comparáveis nos modelos de cân- cer quando combinadas com um inibidor da invenção para os efeitos mostrados nos Exemplos, que podem ser identificados usando os pro- tocolos de cultivo e administração descritos nos Exemplos. Um deriva- do da cepa NCIMB 42488 será, de modo geral, um biotipo da cepa NCIMB 42488.

[0080] Referências às células da cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 englobam quais- quer células que têm as mesmas características de eficácia de segu- rança e terapêutica que as cepas depositadas sob o número de aces- so NCIMB 42488, e tais células são englobadas pela combinação te- rapêutica da invenção. Assim, em algumas modalidades, referência às células da cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o nú- mero de acesso NCIMB 42488 se refere apenas à cepa MRX518 de- positada sob NCIMB 42488 e não se refere a uma cepa bacteriana que não foi depositada sob NCIMB 42488. Em algumas modalidades, referência às células da cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488 se refere às células que têm as mesmas características de eficácia de segurança e terapêutica que as cepas depositadas sob o número de acesso NCIMB 42488, porém, que não são a cepa depositada sob NCIMB 42488.

[0081] Em modalidades preferenciais, as cepas bacterianas nas composições da invenção são viáveis e capazes de colonizar parcial ou totalmente o intestino.

TRATAMENTO DE CÂNCER

[0082] Em modalidades preferenciais, as combinações terapêuti-

cas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer. Os exemplos demonstram que a administração das combinações tera- pêuticas da invenção pode resultar numa redução no crescimento de tumor.

[0083] Em determinadas modalidades, o tratamento com as com- binações terapêuticas da invenção resulta numa redução no tamanho de tumor ou numa redução em crescimento de tumor. Em determina- das modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na redução de tamanho de tumor ou redução de crescimento de tumor. As combinações terapêuticas da invenção podem ser eficazes para reduzir tamanho ou crescimento de tumor. Em determinadas mo- dalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso em pacientes com tumores sólidos. Em determinadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na redução ou prevenção de angiogênese no tratamento de câncer. As combinações terapêuticas da invenção podem ter um efeito sobre os sistemas imu- nológicos ou inflamatórios, que têm papeis central em angiogênese. Em determinadas modalidades, as combinações terapêuticas da in- venção são para uso na prevenção de metástase.

[0084] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer de mama. Os exemplos demonstram que as combinações terapêuticas da invenção podem ser eficazes para tratar câncer de mama. Em de- terminadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na redução de tamanho de tumor, redução de crescimen- to de tumor ou redução de angiogênese no tratamento de câncer de mama. Em modalidades preferenciais, o câncer é carcinoma de ma- ma. Em modalidades preferenciais, o câncer é câncer de mama em estágio IV.

[0085] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti-

cas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer de pulmão. Os exemplos demonstram que as combinações terapêuti- cas da invenção podem ser eficazes para tratar câncer de pulmão. Em determinadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na redução de tamanho de tumor, redução de crescimen- to de tumor ou redução de angiogênese no tratamento de câncer de pulmão. Em modalidades preferenciais, o câncer é carcinoma de pul- mão.

[0086] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer de fígado. Os exemplos demonstram que as combinações terapêuticas da invenção podem ser eficazes para tratar câncer de fígado. Em de- terminadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na redução de tamanho de tumor, redução de crescimen- to de tumor ou redução de angiogênese no tratamento de câncer de fígado. Em modalidades preferenciais, o câncer é hepatoma (carcino- ma hepatocelular).

[0087] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer de cólon. Os exemplos demonstram que as combinações terapêuticas da invenção têm um efeito sobre células de câncer de cólon e podem ser eficazes para tratar câncer de cólon. Em determinadas modalida- des, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na redu- ção de tamanho de tumor, redução de crescimento de tumor ou redu- ção de angiogênese no tratamento de câncer de cólon. Em modalida- des preferenciais, o câncer é adenocarcinoma colorretal.

[0088] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer de rim (também denominado no presente documento câncer renal). Os exemplos demonstram que as combinações terapêuticas da invenção têm um efeito sobre células de câncer renal e podem ser eficazes para tratar câncer renal. Em determinadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na redução de tamanho de tu- mor, redução de crescimento de tumor ou redução de angiogênese no tratamento de câncer renal. Em modalidades preferenciais, o câncer é carcinoma de célula renal ou carcinoma de célula transicional.

[0089] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de mela- noma. De acordo com algumas modalidades, as combinações tera- pêuticas da invenção têm um efeito sobre melanócitos e podem ser eficazes para tratar melanoma. Em determinadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na redução de tamanho de tumor, redução de crescimento de tumor ou redução de angiogênese no tratamento de melanoma.

[0090] Em algumas modalidades, o câncer é do intestino. Em al- gumas modalidades, o câncer é de uma parte do corpo que não é o intestino. Em algumas modalidades, o câncer não é câncer do intesti- no. Em algumas modalidades, o câncer não é câncer colorretal.. Em algumas modalidades, o câncer não é câncer do intestino delgado. Em algumas modalidades, o tratamento ou prevenção ocorre num sítio diferente do intestino. Em algumas modalidades, o tratamento ou pre- venção ocorre no intestino e também num sítio diferente do intestino.

[0091] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de carci- noma. Os exemplos demonstram que as combinações terapêuticas da invenção podem ser eficazes para tratar diversos tipos de carcinoma. Em determinadas modalidades, as combinações terapêuticas da in- venção são para uso no tratamento ou prevenção de câncer não imu- nogênico. Os exemplos demonstram que as combinações terapêuticas da invenção podem ser eficazes para tratar cânceres não imunogêni-

cos.

[0092] Os efeitos terapêuticos das composições bacterianas da invenção sobre câncer, no contexto das combinações terapêuticas da invenção, podem ser mediados por um mecanismo pró-inflamatório. Exemplos 2, 4 e 5 demonstram que a expressão de diversas citocinas pró-inflamatórias pode ser aumentada depois da administração de MRX518. A inflamação pode ter um efeito supressor de câncer [20] e citocinas pró-inflamatórias, tais como TNFa são investigadas como te- rapias contra câncer [21]. A regulação crescente de genes, tal como TNF mostrada nos exemplos, pode indicar que as composições bacte- rianas da invenção podem ser úteis para tratar câncer via um meca- nismo similar. A regulação crescente de ligantes CXCR3 (CXCL9, CXCL10) e genes de IFNy induzível (I1L-32) pode indicar que as com- posições bacterianas da invenção elicitam uma resposta do tipo IFNy. IFNy é um fator de ativação de macrófago potente que pode estimular atividade tumirocida [22], e CXCL9 e CXCL10, por exemplo, também têm efeitos anticâncer [23-25]. Portanto, em determinadas modalida- des, as composições bacterianas da invenção, quando usadas no con- texto da combinação terapêutica da invenção, são para uso na promo- ção de inflamação no tratamento de câncer. Em modalidades prefe- renciais, as composições da invenção, quando usadas no contexto da combinação terapêutica da invenção, são para uso na promoção de inflamação de Th1 no tratamento de câncer. Células Th1i produzem IFNy e têm efeitos anticâncer potentes [Erro! Indicador não defini- do.]l. Em determinadas modalidades, as composições da invenção, quando usadas no contexto da combinação terapêutica da invenção, são para uso no tratamento de um câncer em estágio inicial, tal como um câncer que não sofreu metástase, ou um câncer em estágio O ou estágio 1. Promover inflamação pode ser mais eficaz contra cânceres em estágio inicial [Erro! Indicador não definido.]. Em determinadas modalidades, as composições da invenção, quando usadas no contex- to da combinação terapêutica da invenção, são para uso na promoção de inflamação para aprimorar o efeito de um inibidor da invenção. Em determinadas modalidades, o tratamento ou prevenção de câncer compreende aumentar o nível de expressão de uma ou mais citocinas. Por exemplo, em determinadas modalidades, o tratamento ou preven- ção de câncer compreende aumentar o nível de expressão de um ou mais dentre IL-16, IL-6 e TNF-a, por exemplo, IL-18 e IL-6, IL-1fB.e TNF-a, IL-6 e TNF-o ou todos os três dentre IL-1B, IL-6 e TNF-a. Sa- be-se que aumentos nos níveis de expressão de qualquer um dentre IL-1B, IL-6 e TNF-a são indicativos de eficácia no tratamento de cân- cer.

[0093] Exemplos 4 e 5 demonstram que, quando uma cepa bacte- riana, conforme descrito no presente documento, é usada em combi- nação com lipopolissacarídeo (LPS), há um aumento sinérgico em IL- 1f. Sabe-se que LPS elicita um efeito pró-inflamatório. Assim, em determinadas modalidades, o tratamento ou prevenção de câncer compreende usar uma cepa bacteriana, conforme descrito no presente documento, em combinação com um agente que regula de modo cres- cente IL-1p. Em determinadas modalidades, o tratamento ou preven- ção de câncer compreende usar uma cepa bacteriana, conforme des- crito no presente documento, em combinação com LPS. Consequen- temente, a combinação terapêutica da invenção pode compreender, adicionalmente, um agente que regula de modo crescente IL-1B. Con- sequentemente, a composição bacteriana da invenção pode compre- ender adicionalmente LPS.

[0094] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento de um paciente que rece- beu, precedentemente, quimioterapia. Em determinadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso no tratamento de um paciente que não tolerou um tratamento de quimioterapia. As combinações terapêuticas da invenção podem ser particularmente adequadas para tais pacientes. Em outras modalidades, as combina- ções terapêuticas da invenção são para uso no tratamento de um pa- ciente com câncer que não foi responsivo a um tratamento precedente com um inibidor de checkpoint imunológico. Em outras modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso no tratamento de um paciente com câncer que não foi responsivo a um tratamento precedente com um inibidor de PD-1. Sem desejar estar vinculado à teoria ou mecanismo, se acredita que a composição bacteriana da in- venção é capaz de estimular o sistema imunológico do indivíduo atra- vés de um mecanismo diferente daquele de inibidores da invenção, fornecendo, assim, um mecanismo complementar para tratar pacientes que não são responsivos aos inibidores de checkpoint imunológico.

[0095] De acordo com algumas modalidades, o tratamento de câncer que usa a combinação terapêutica dos resultados da invenção é mais eficaz do que usar um inibidor da invenção sozinho, conforme medido pelos critérios RECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos) ou os critérios irRECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos imunologicamente relacionados). De acordo com algumas modalidades, o tratamento de câncer que usa a combinação terapêutica dos resultados da invenção é mais eficaz do que usar a composição bacteriana sozinha, conforme medido pelos critérios RECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Só- lidos) ou os critérios ir»rRECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos imunologicamente relacionados). De acordo com algumas modalidades, o tratamento de câncer que usa a combinação terapêutica da invenção resulta em efeitos clínicos sinérgicos em com- paração com o tratamento com um inibidor da invenção sozinho ou a composição bacteriana sozinha, conforme medido pelos critérios RE-

CIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos) ou os critérios ir»RECIST (Critérios de Avaliação de Resposta em Tumores Sólidos imunologicamente relacionados).

[0096] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para prevenir recaída. As composições bacteria- nas, no contexto das combinações terapêuticas da invenção, podem ser adequadas para administração a longo prazo. Em determinadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso na prevenção da progressão de câncer.

[0097] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento de carcinoma pulmonar de célula não pequena (NSCLC). Em determinadas modalidades, as combinações terapêuticas da invenção são para uso no tratamento de carcinoma pulmonar de célula pequena. Em determinadas modalida- des, as combinações terapêuticas da invenção são para uso no trata- mento de carcinoma de célula escamosa. Em determinadas modalida- des, as combinações terapêuticas da invenção são para uso no trata- mento de adenocarcinoma. Em determinadas modalidades, as combi- nações terapêuticas da invenção são para uso no tratamento de tumo- res glandulares, tumores carcinoides ou carcinomas não diferenciados.

[0098] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento de hepatoblastoma, co- langiocarcinoma, cistadenocarcinoma colangiocelular ou câncer de fígado que resulta de uma infecção viral.

[0099] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção são para uso no tratamento de carcinoma ductal inva- sivo, carcinoma ductal in situ ou carcinoma lobular invasivo.

[00100] Em modalidades adicionais, as combinações terapêuticas da invenção são para uso no tratamento ou prevenção de leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda, carcinoma adre-

nocortical, carcinoma de célula basal, câncer de duto biliar, câncer de bexiga, tumor ósseo, osteossarcomal/histiocitoma fibroso maligno, gli- oma do tronco encefálico, tumor cerebral, astrocitoma cerebelar, as- trocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tu- mores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, câncer de mama, adenomas bronquiais/carcinoides, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, câncer cervical, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielogenosa crônica, distúrbios mieloproliferativos crônicos, câncer de cólon, linfo- ma de célula T cutâneo, câncer endometrial, ependimoma, câncer do esôfago, sarcoma de Ewing, melanoma intraocular, retinoblastoma, câncer de vesícula biliar, câncer gástrico, tumor carcinoide gastrointes- tinal, tumor do estroma gastrointestinal (GIST), tumor de célula germi- nal, glioma de via visual infantil e hipotalâmico, linfoma de Hodgkin, melanoma, carcinoma de célula de ilhota, sarcoma Kaposi, câncer de célula renal, câncer laríngeo, leucemias, linfomas, mesotelioma, neu- roblastoma, linfoma de não Hodgkin, câncer orofaríngeo, osteossar- coma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de paratireoide, câncer faríngeo, adenoma de hipófise, neoplasia de célula plasmática, câncer de próstata, carcinoma de célula renal, retinoblastoma, sarco- ma, câncer testicular, câncer de tireoide ou câncer uterino.

[00101] De acordo com algumas modalidades, as combinações te- rapêuticas são para uso no tratamento ou prevenção de câncer seleci- onado dentre o grupo que consiste em: melanoma, NSCLC, câncer de bexiga e câncer de cabeça e pescoço.

[00102] Em determinadas modalidades, as combinações terapêuti- cas da invenção compreendem um agente anticâncer adicional. De acordo com algumas modalidades, o agente anticâncer adicional é se- lecionado dentre: uma imunoterapia de anticorpo alvejado, uma terapia de célula T CAR, um vírus oncolítico ou um fármaco citostático.

MODOS DE ADMINISTRAÇÃO

[00103] De preferência, as composições bacterianas da invenção devem ser administradas no trato gastrointestinal de modo a permitir a distribuição no e/ou colonização parcial ou total do intestino com a ce- pa bacteriana da invenção. De modo geral, as composições bacteria- nas da invenção são administradas por via oral, porém, podem ser administradas por via retal, intranasal ou através de rotas bucal ou sublingual.

[00104] Em determinadas modalidades, as composições bacteria- nas da invenção podem ser administradas como uma espuma, como uma aspersão ou um gel.

[00105] Em determinadas modalidades, as composições bacteria- nas da invenção podem ser administradas como um supositório, tal como um supositório retal, por exemplo, na forma de um óleo teobro- ma (manteiga de cacau), gordura dura sintética (por exemplo, suppo- cire, witepsol), glicero-gelatina, polietilenoglicol, ou composição de gli- cerina de sabão.

[00106] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana da invenção é administrada no trato gastrointestinal via um tubo, tal como um tubo nasogástrico, tubo orogástrico, tubo gástrico, tubo de jejunostomia (tubo J), gastrostomia endoscópica percutânea (PEG), ou uma porta, tal como uma porta da parede torácica que dá acesso ao estômago, jejuno e outras portas de acesso adequadas.

[00107] As composições bacterianas da invenção podem ser admi- nistradas uma vez, ou podem ser administradas em sequência como parte de um regime de tratamento. Em determinadas modalidades, as composições bacterianas da invenção devem ser administradas diari- amente.

[00108] Em determinadas modalidades da invenção, o tratamento, de acordo com a invenção, é acompanhado pela avaliação da microbi- ota intestinal do paciente. Tratamento pode ser repetido caso a distri-

buição de e/ou colonização parcial ou total com a cepa da composição bacteriana da invenção não seja alcançada de modo que a eficácia não seja observada, ou o tratamento pode ser interrompido caso a dis- tribuição e/ou colonização parcial ou total seja bem-sucedida e eficácia seja observada. De acordo com algumas modalidades, a composição bacteriana da invenção é administrada ao indivíduo antes da primeira administração com o inibidor da combinação terapêutica da invenção. De acordo com algumas modalidades, a microbiota intestinal do indiví- duo é avaliada após administração da composição bacteriana e antes da primeira administração do inibidor da invenção, de modo que o ini- bidor da invenção seja administrado apenas após distribuição e/ou co- lonização parcial ou total com a cepa da cepa bacteriana na composi- ção ser alcançada. Em determinadas modalidades, a combinação te- rapêutica da invenção pode ser administrada a um animal grávido, por exemplo, um mamífero, tal como um ser humano, de modo a reduzir a probabilidade do câncer se desenvolver em seu filho no útero e/ou após o mesmo nascer.

[00109] A combinação terapêutica da invenção pode ser adminis- trada a um paciente que foi diagnosticado com câncer, ou que foi iden- tificado como em risco de um câncer. A combinação terapêutica tam- bém pode ser administrada como uma medida profilática para prevenir o desenvolvimento de câncer num paciente saudável.

[00110] A combinação terapêutica da invenção pode ser adminis- trada a um paciente que foi identificado com uma microbiota intestinal anormal. Por exemplo, o paciente pode ter colonização reduzida ou ausente por Enterococcus gallinarum.

[00111] As composições bacterianas da invenção podem ser admi- nistradas como um produto alimentício, tal como um complemento nu- tricional.

[00112] De modo geral, as combinações terapêuticas da invenção são para o tratamento de seres humanos, embora possam ser usadas para tratar animais que incluem mamíferos monogástricos, tais como aves, porcos, gatos, cães, cavalos ou coelhos. As combinações tera- pêuticas da invenção podem ser úteis para aprimorar o crescimento e desempenho de animais. Se a composição bacteriana for administrada aos animais, gavagem oral pode ser usada.

[00113] De acordo com algumas modalidades, o inibidor da inven- ção é administrado por via intravenosa. De acordo com algumas mo- dalidades, o inibidor da invenção que é administrado por via intraveno- sa está numa composição que, opcionalmente, compreende ainda pe- lo menos um veículo ou excipiente farmaceuticamente compatível. De acordo com algumas modalidades, o inibidor da invenção é adminis- trado por via intravenosa aproximadamente a cada uma, duas, três ou quatro semanas, preferencialmente a cada três semanas.

[00114] De acordo com algumas modalidades, a composição bacte- riana e o inibidor da combinação terapêutica da invenção são adminis- trados usando rotas de administração diferentes. De acordo com al- gumas modalidades, a composição bacteriana é administrada por via oral, enquanto o inibidor da combinação terapêutica da invenção é administrado usando uma rota diferente. De acordo com algumas mo- dalidades, o inibidor da combinação terapêutica é administrado por via intravenosa, enquanto a composição bacteriana é administrada por via oral.

[00115] De acordo com algumas modalidades, a composição bacte- riana é administrada ao indivíduo antes de uma primeira administração de inibidor da invenção ao indivíduo. De acordo com algumas modali- dades, a composição bacteriana é administrada ao indivíduo antes de uma primeira administração do inibidor da invenção ao indivíduo; sen- do que a composição bacteriana é administrada até que a distribuição e/ou colonização parcial ou total com a cepa da cepa bacteriana na composição seja alcançada. De acordo com algumas modalidades, a composição bacteriana é administrada ao indivíduo antes de uma pri- meira administração do inibidor da invenção ao indivíduo; sendo que a composição bacteriana é administrada até que a modulação suficiente de biomarcadores ocorra, de modo que o inibidor da invenção seja ca- paz de tratar um paciente com câncer que precedentemente foi não responsivo ao tratamento com ICI. De acordo com algumas modalida- des, a composição bacteriana é administrada ao indivíduo por pelo menos uma, duas, três ou quatro semanas antes da primeira adminis- tração do inibidor da invenção. De acordo com algumas modalidades, a composição bacteriana é administrada ao indivíduo por cerca de du- as semanas antes da primeira administração do inibidor da invenção. De acordo com algumas modalidades, a composição bacteriana é ad- ministrada ao indivíduo por pelo menos uma, duas, três ou quatro se- manas antes da primeira administração do inibidor da invenção e não é administrada ao indivíduo em paralelo com a administração do inibi- dor da invenção.

[00116] De acordo com algumas modalidades, a primeira adminis- tração da composição bacteriana na combinação terapêutica da inven- ção é antes da primeira administração do inibidor da invenção. De acordo com algumas modalidades, a primeira administração do inibi- dor da invenção ocorre não mais que cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias depois da administração da composição bacteriana.

[00117] De acordo com algumas modalidades do método e da combinação terapêutica da invenção, a composição bacteriana é ad- ministrada ao indivíduo pelo menos parcialmente em paralelo com a administração do inibidor da invenção ao indivíduo. De acordo com algumas modalidades, a composição bacteriana é administrada ao in- divíduo por um primeiro período de tempo, seguido pela administração do inibidor da invenção ao indivíduo por um segundo período de tem-

po; sendo que a composição bacteriana é opcionalmente administrada adicionalmente ao indivíduo por pelo menos parte do referido segundo período de tempo, opcionalmente tudo através do segundo período de tempo. De acordo com determinadas modalidades, a composição bacteriana é administrada ao indivíduo por um primeiro período de tempo, tal como, porém, sem limitação, por cerca de duas semanas, seguido pela administração do inibidor da invenção ao indivíduo por um segundo período de tempo, tal como, porém, sem limitação, por cerca de três semanas. De acordo com determinadas modalidades, a composição bacteriana é administrada ao indivíduo por um primeiro período de tempo, tal como, porém, sem limitação, por cerca de duas semanas, seguido pela administração do inibidor da invenção ao indi- víduo por um segundo período de tempo, tal como, porém, sem limita- ção, por cerca de três semanas; sendo que a composição bacteriana é administrada adicionalmente ao indivíduo por pelo menos parte do re- ferido segundo período de tempo, preferencialmente tudo através do segundo período de tempo.

[00118] De acordo com algumas modalidades, a composição bacte- riana e o inibidor da invenção não são administrados na mesma fre- quência. Num exemplo sem limitação, o inibidor da invenção é admi- nistrado por via intravenosa a cada três semanas, enquanto a compo- sição bacteriana é administrada por via oral todos os dias ou em dias alternados. De acordo com algumas modalidades, a composição bac- teriana é administrada ao indivíduo por um primeiro período de tempo, seguido pela administração do inibidor da invenção ao indivíduo por um segundo período de tempo; sendo que a composição bacteriana é opcionalmente administrada adicionalmente ao indivíduo por pelo me- nos parte do referido segundo período de tempo; sendo que a fre- quência de administração da composição bacteriana é diferente no primeiro período de tempo e segundo período de tempo.

COMPOSIÇÕES BACTERIANAS DA COMBINAÇÃO TERAPÊUTICA DA INVENÇÃO

[00119] De modo geral, a composição compreendida na combina- ção terapêutica da invenção compreende bactérias. Em modalidades preferenciais da invenção, a composição bacteriana é formulada na forma liofilizada. Por exemplo, a composição bacteriana da invenção pode compreender grânulos ou cápsulas de gelatina, por exemplo, cápsulas de gelatina dura que compreendem uma cepa bacteriana da invenção.

[00120] De preferência, a composição bacteriana da invenção com- preende bactérias liofilizadas. Liofilização de bactérias é um procedi- mento bem estabelecido e uma orientação relevante está disponível, por exemplo, nas referências [26-28].

[00121] Alternativamente, a composição bacteriana da invenção pode compreender uma cultura bacteriana ativa e viva.

[00122] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composi- ção bacteriana da invenção não foi inativada, por exemplo, não foi termicamente inativada. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição bacteriana da invenção não foi eliminada, por exemplo, não foi termicamente eliminada. Em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição bacteriana da invenção não foi atenuada, por exemplo, não foi termicamente atenuada. Por exemplo, em algu- mas modalidades, a cepa bacteriana na composição bacteriana da in- venção não foi eliminada, inativada e/ou atenuada. Por exemplo, em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição bacteriana da invenção está viva. Por exemplo, em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição bacteriana da invenção é viável. Por exemplo, em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição bacteriana da invenção é capaz de colonizar parcial ou totalmente o intestino. Por exemplo, em algumas modalidades, a cepa bacteriana na composição bacteriana da invenção é viável e é capaz de colonizar parcial ou totalmente o intestino.

[00123] Em algumas modalidades, a composição bacteriana com- preende uma mistura de cepas bacterianas vivas e cepas bacterianas que foram eliminadas.

[00124] Em modalidades preferenciais, a composição bacteriana da combinação terapêutica da invenção é encapsulada para permitir a distribuição da cepa bacteriana no intestino. A encapsulação protege a composição bacteriana da degradação até a distribuição no local-alvo através, por exemplo, da ruptura com estímulos químicos ou físicos, tais como pressão, atividade enzimática ou desintegração física, que pode ser disparada através de alterações em pH. Qualquer método de encapsulação apropriado pode ser usado. Técnicas de encapsulação exemplificativas incluem prisão dentro de uma matriz porosa, ligação ou adsorção em superfícies de veículo sólido, auto agregação por flo- culação ou com agentes de reticulação, e contenção mecânica atrás de uma membrana microporosa ou uma microcápsula. Orientação em encapsulação que pode ser útil para preparar composições da inven- ção está disponível, por exemplo, nas referências [29] e [30].

[00125] A composição bacteriana pode ser administrada por via oral e pode estar na forma de um tablete, cápsula ou pó. Produtos encap- sulados são preferenciais, uma vez que Enterococcus gallinarum é anaeróbio. Outros ingredientes (tais como vitamina C, por exemplo), podem ser incluídos como depuradores de oxigênio e substratos pre- bióticos para melhorar a distribuição e/ou colonização parcial ou total e sobrevivência in vivo. Alternativamente, a composição probiótica da invenção pode ser administrada por via oral como um alimento ou pro- duto nutricional, tal como produto lácteo fermentado à base de soro ou leite, ou como um produto farmacêutico.

[00126] A composição bacteriana pode ser formulada como um probiótico.

[00127] “Uma composição bacteriana da invenção inclui uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de uma cepa bacteriana da invenção. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma cepa bacteriana é suficiente para exercer um efeito benéfico num paciente. Uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de uma cepa bacteriana pode ser sufici- ente para resultar na distribuição no e/ou colonização parcial ou total do intestino de um paciente.

[00128] Uma dose diária adequada das bactérias, por exemplo, pa- ra um ser humano adulto, pode ser de cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10" unidades formadoras de colônia (UFC); por exemplo, de cerca de 1x 107 a cerca de 1 x 10ºº UFC; em outro exemplo de cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10*º UFC.

[00129] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana contém a cepa bacteriana numa quantidade de cerca de 1 x 10º a cer- ca de 1 x 10** UFC/g, com relação ao peso da composição; por exem- plo, de cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10ºº UFC/g. A dose pode ser, por exemplo, de 19, 3g,5ge109g.

[00130] Um probiótico, tal como a composição bacteriana da inven- ção, pode ser, opcionalmente, combinado com pelo menos um com- posto prebiótico adequado. Um composto prebiótico é normalmente um carboidrato não digerível, tal como um oligo ou polissacarídeo, ou um álcool de açúcar, que não é degradado ou absorvido no trato di- gestivo superior. Prebióticos conhecidos incluem produtos comerciais, tais como inulina e transgalacto-oligossacarídeos.

[00131] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana probiótica da presente invenção inclui um composto prebiótico numa quantidade de cerca de 1 a cerca de 30% em peso, com relação à composição de peso total (por exemplo, de 5 a 20% em peso). Carboi- dratos podem ser selecionados dentre o grupo que consiste em: fruto-

oligossacarídeos (ou FOS), fruto-oligossacarídeos de cadeia curta, inulina, isomalte-oligossacarídeos, pectinas, xilo-oligossacarídeos (ou XOS), quitosana-oligossacarídeos (ou COS), beta-glucanos, goma arável modificada e amidos resistentes, polidextrose, D-tagatose, fi- bras acácia, alfarroba, aveia e fibras cítricas. Num aspecto, os prebió- ticos são os fruto-oligossacarídeos de cadeia curta (para fins de sim- plicidade mostrados abaixo no presente documento como FOSs-c.c); os referidos FOSs-c.c. são carboidratos não digeríveis obtidos, de mo- do geral, através da conversão do açúcar de beterraba e que incluem uma molécula de sacarose à qual três moléculas de glicose estão liga- das.

[00132] As composições bacterianas da invenção podem compre- ender excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Exem- plos de tais excipientes adequados podem ser encontrados na refe- rência [31]. Veículos ou diluentes aceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidos na técnica farmacêutica e são descritos, por exemplo, na referência [32]. Exemplos de veículos adequados incluem lactose, amido, glicose, metilcelulose, estearato de magnésio, manitol, sorbitol e semelhantes. Exemplos de diluentes adequados incluem etanol, gli- cerol e água. A escolha de veículo, excipiente ou diluente farmacêutico pode ser selecionada com relação à rota de administração desejada e prática farmacêutica padrão. As composições farmacêuticas podem compreender como, ou além do, veículo, excipiente ou diluente qual- quer aglutinante (ou aglutinantes), lubrificante (ou lubrificantes), agente (ou agentes) de suspensão, agente (ou agentes) de revestimento, agente (ou agentes) de solubilização adequado. Exemplos de agluti- nantes adequados incluem amido, gelatina, açúcares naturais, tais como glicose, lactose anidra, lactose de fluxo livre, beta-lactose, edul- corantes de milho, gomas naturais e sintéticas, tal como acácia, agra- dante ou alginato de sódio, carboximetilcelulose e polietilenoglicol.

Exemplos de lubrificantes adequados incluem oleato de sódio, estea- rato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e semelhantes. Conservantes, estabilizadores, corantes e até mesmo agentes saborizantes podem ser fornecidos na composição farmacêutica. Exemplos de conservantes incluem benzoa- to de sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Antio- xidantes e agentes de suspensão também podem ser usados.

[00133] As composições bacterianas da invenção podem ser formu- ladas como um produto alimentício. Por exemplo, um produto alimentí- cio pode fornecer benefício nutricional adicionalmente ao efeito tera- pêutico da invenção, tal como num complemento nutricional. De modo similar, um produto alimentício pode ser formulado para aprimorar o gosto da composição da invenção ou para tornar a composição mais atrativa ao consumo ao ser mais similar a um item alimentício comum, em vez de uma composição farmacêutica. Em determinadas modali- dades, a composição da invenção é formulada como um produto à ba- se de leite. O termo "produto à base de leite" significa qualquer produ- to à base de leite ou soro líquido ou semissólido que tem um teor de gordura variado. O produto à base de leite pode ser, por exemplo, leite de vaca, leite de cabra, leite de ovelha, leite desnatado, leite integral, leite recombinado a partir de leite em pó e soro sem nenhum proces- samento, ou um produto processado, tal como iogurte, leite coagulado, coalhada, leite coalhado, leite integral coalhado, leite de manteiga e outros produtos de leite coalhado. Outro grupo importante inclui bebi- das lácteas, tais como bebidas à base de soro, leites fermentados, lei- tes condensados, leites para bebês ou crianças; leites com sabor, sor- vete; alimento que contém leite, tal como doces.

[00134] Em determinadas modalidades, as composições bacteria- nas da invenção contêm uma única cepa bacteriana ou espécie e não contêm qualquer uma das outras cepas bacterianas ou espécies. Tais composições bacterianas podem compreender apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevantes de outras cepas bacterianas ou espécies. Tais composições bacterianas podem ser uma cultura que está substancialmente livre de outra espécie de organismo. Assim, em algumas modalidades, a composição bacteriana da combinação tera- pêutica compreende uma ou mais cepas da espécie Enterococcus gal- linarum, e não contém bactérias de nenhuma outra espécie ou com- preende apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevan- tes de bactérias de outra espécie.

[00135] Em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção compreendem mais de uma cepa bacteriana ou espécie. Por exemplo, em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção compreendem mais de uma cepa da mesma espécie (por exemplo, mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 45 cepas) e, opcionalmente, não contêm bactérias de nenhuma outra espécie. Em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção compreendem menos de 50 cepas da mesma espécie (por exemplo, menos de 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8,7, 6,5, 4 ou 3 cepas) e, opcionalmente, não contêm bactérias de nenhuma outra espécie. Em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção compreendem 1 a 40, 1 a 30, 1a 20, 1a19,/1a18,1a15,1 a 10,1a9,1a8,1a7,1a6,1a5,1a4,1a3,1a2,2a50,2a40, 2a30,2a20,2a15,2a10,2a5,6a30,6a15, 16 a 25, ou 31 a 50 cepas da mesma espécie e, opcionalmente, não contêm bactérias de nenhuma outra espécie. Em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção compreendem mais de uma espécie do mesmo gênero (por exemplo, mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 23, 25, 30, 35 ou 40 espécies) e, opcionalmente, não con- têm bactérias de nenhum outro gênero. Em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção compreendem menos de 50 es-

pécies do mesmo gênero (por exemplo, menos de 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4 ou 3 espécies) e, opcionalmente, não contêm bactérias de nenhum outro gênero. Em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção compreendem 1 a 50, 1 a 40, 1a30,1a20,1a15,1a10,/1a9,/1a8,/1a7,1a6,/1a5,1a4, 1a3,1a2,2a50,2a40,2a30,2a20,2a15,2a10,2a5,6a30, 6 a 15, 16 a 25, ou 31 a 50 espécies do mesmo gênero e, opcional- mente, não contêm bactérias de nenhum outro gênero. A composição bacteriana para uso na combinação da invenção pode compreender qualquer combinação do supracitado.

[00136] Em algumas modalidades, a composição bacteriana com- preende um consórcio microbiano. Por exemplo, em algumas modali- dades, a composição bacteriana compreende a cepa bacteriana que tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, por exemplo, que é uma Enterococcus gallinarum, co- mo parte de um consórcio microbiano. Por exemplo, em algumas mo- dalidades, a cepa bacteriana está presente na composição bacteriana em combinação com uma ou mais (por exemplo, pelo menos 2,3, 4,5, 10, 15 ou 20) outras cepas bacterianas de outros gêneros com os quais pode viver simbioticamente in vivo no intestino. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição bacteriana compreende uma cepa bacteriana que tem uma sequência de 16s rRNA que é pelo me- nos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, por exemplo, que é uma Entero- coccus gallinarum, em combinação com uma cepa bacteriana de um gênero diferente. Em algumas modalidades, o consórcio microbiano compreende duas ou mais cepas bacterianas obtidas a partir de uma amostra de fezes de um único organismo, por exemplo, um ser huma- no. Em algumas modalidades, o consórcio microbiano não se encon- tra junto na natureza. Por exemplo, em algumas modalidades, o con- sórcio microbiano compreende cepas bacterianas obtidas a partir de amostras de fezes de pelo menos dois organismos diferentes. Em al- gumas modalidades, os dois organismos diferentes são da mesma es- pécie, por exemplo, dois seres humanos diferentes, por exemplo, duas crianças diferentes. Em algumas modalidades, os dois organismos diferentes são uma criança e um adulto. Em algumas modalidades, os dois organismos diferentes são um ser humano e um mamífero não humano.

[00137] Em algumas modalidades, a composição bacteriana da in- venção compreende adicionalmente uma cepa bacteriana que tem as mesmas características de eficácia de segurança e terapêutica que a cepa MRX518, porém, que não é MRX518 depositada como NCIMB 42488, ou que não é uma Enterococcus gallinarum.

[00138] Em algumas modalidades, a cepa bacteriana para uso na composição bacteriana é obtida a partir de fezes de crianças. Em al- gumas modalidades nas quais a composição bacteriana compreende mais de uma cepa bacteriana, todas as cepas bacterianas são obtidas a partir de fezes de criança ou se outras cepas bacterianas estiverem presentes as mesmas estão presentes apenas em quantidades de mi- nimis. As bactérias podem ter sido cultivadas subsequente a serem obtidas das fezes de criança e serem usadas na composição bacteria- na.

[00139] “Conforme mencionado acima, em algumas modalidades, a uma ou mais cepas bacterianas que têm uma sequência de 16s rRNA que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 2, por exemplo, que é uma Enterococcus gallinarum, é o único agente (ou agentes) terapeu- ticamente ativo na composição bacteriana da invenção. Em algumas modalidades, a cepa (ou cepas) bacteriana na composição bacteriana é o único agente (ou agentes) terapeuticamente ativo na composição.

[00140] As composições bacterianas para uso, de acordo com a invenção, podem ou não exigir aprovação para comercialização.

[00141] Em determinadas modalidades, a invenção fornece a com- posição bacteriana acima, sendo que a referida cepa bacteriana é liofi- lizada. Em determinadas modalidades, a invenção fornece a composi- ção bacteriana acima, sendo que a referida cepa bacteriana é seca por pulverização. Em determinadas modalidades, a invenção fornece a composição bacteriana acima, sendo que a cepa bacteriana é liofiliza- da ou seca por pulverização, e sendo que a mesma está viva. Em de- terminadas modalidades, a invenção fornece a composição bacteriana acima, sendo que a cepa bacteriana é liofiizada ou seca por pulveri- zação, e sendo que a mesma é viável. Em determinadas modalida- des, a invenção fornece a composição bacteriana acima, sendo que a cepa bacteriana é liofiizada ou seca por pulverização, e sendo que a mesma é capaz de colonizar parcial ou totalmente o intestino. Em de- terminadas modalidades, a invenção fornece a composição bacteriana acima, sendo que a cepa bacteriana é liofiizada ou seca por pulveri- zação, e sendo que a mesma é viável e capaz de colonizar parcial ou totalmente o intestino.

[00142] Em alguns casos, a cepa bacteriana liofilizada ou seca por pulverização é reconstituída antes da administração. Em alguns casos, a reconstituição é através do uso de um diluente descrito no presente documento.

[00143] As composições bacterianas da invenção podem compre- ender excipientes, diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[00144] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana, conforme usada na invenção; e um excipiente, veículo ou diluente far- maceuticamente aceitável; sendo que a cepa bacteriana está numa quantidade suficiente para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor da invenção; e sendo que o distúrbio é câncer de mama. Em modalidades preferenciais, o câncer é carcinoma de mama. Em modalidades preferenciais, o câncer é câncer de mama em estágio |V.

[00145] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana, conforme usada na invenção; e um excipiente, veículo ou diluente far- maceuticamente aceitável; sendo que a cepa bacteriana está numa quantidade suficiente para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor da invenção; e sendo que o distúrbio é câncer de pulmão. Em modalidades preferenciais, o câncer é carcinoma de pulmão.

[00146] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana, conforme usada na invenção; e um excipiente, veículo ou diluente far- maceuticamente aceitável; sendo que a cepa bacteriana está numa quantidade suficiente para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor da invenção; e sendo que o distúrbio é câncer de fígado. Em modalidades preferenciais, o câncer é hepatoma (carcinoma hepatocelular).

[00147] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; sendo que a cepa bacteriana está numa quantidade suficien- te para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor da invenção; e sendo que o distúrbio é câncer de cólon. Em modalidades preferenciais, o câncer é adenocar- cinoma colorretal.

[00148] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; sendo que a cepa bacteriana está numa quantidade suficien-

te para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor da invenção; e sendo que o distúrbio é carcinoma.

[00149] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; sendo que a cepa bacteriana está numa quantidade suficien- te para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor da invenção; e sendo que o distúrbio é câncer não imunogênico.

[00150] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; sendo que a cepa bacteriana está numa quantidade suficien- te para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor da invenção; e sendo que o distúrbio é selecionado dentre o grupo que consiste em carcinoma pulmonar de célula não pequena, carcinoma pulmonar de célula pequena, carcino- ma de célula escamosa, adenocarcinoma, tumores glandulares, carci- nomas não diferenciados de tumores carcinoides.

[00151] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; sendo que a cepa bacteriana está numa quantidade suficien- te para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor da invenção; e sendo que o distúrbio é selecionado dentre o grupo que consiste em hepatoblastoma, colangi- ocarcinoma, cistadenocarcinoma colangiocelular ou câncer de fígado que resulta de uma infecção viral.

[00152] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; sendo que a cepa bacteriana está numa quantidade suficien- te para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor da invenção; e sendo que o distúrbio é selecionado dentre o grupo que consiste em carcinoma ductal invasi- vo, carcinoma ductal in situ ou carcinoma lobular invasivo.

[00153] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é uma composição farmacêutica que compreende: uma cepa bacteriana da invenção; e um excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; sendo que a cepa bacteriana está numa quantidade suficien- te para tratar um distúrbio quando administrada a um indivíduo em combinação com um inibidor da invenção; e sendo que o distúrbio é selecionado dentre o grupo que consiste em leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, car- cinoma de célula basal, câncer de duto biliar, câncer de bexiga, tumor ósseo, osteossarcoma/histiocitoma fibroso maligno, glioma do tronco encefálico, tumor cerebral, astrocitoma cerebelar, astrocitoma cere- bral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroec- todérmicos primitivos supratentoriais, câncer de mama, adenomas bronquiais/carcinoides, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, câncer cervical, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielogenosa crônica, distúrbios mieloproliferativos crônicos, câncer de cólon, linfoma de cé- lula T cutâneo, câncer endometrial, ependimoma, câncer do esôfago, sarcoma de Ewing, melanoma intraocular, retinoblastoma, câncer de vesícula biliar, câncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumor do estroma gastrointestinal (GIST), tumor de célula germinal, glioma de via visual infantil e hipotalâmico, linfoma de Hodgkin, melanoma, carcinoma de célula de ilhota, sarcoma Kaposi, câncer de célula renal, câncer laríngeo, leucemias, linfomas, mesotelioma, neuroblastoma,

linfoma de não Hodgkin, câncer orofaríngeo, osteossarcoma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de paratireoide, câncer faríngeo, adenoma de hipófise, neoplasia de célula plasmática, câncer de prós- tata, carcinoma de célula renal, retinoblastoma, sarcoma, câncer testi- cular, câncer de tireoide ou câncer uterino.

[00154] Em determinadas modalidades, a quantidade da cepa bac- teriana na composição bacteriana é de cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 10** unidades formadoras de colônia por grama com relação a um pe- so da composição.

[00155] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é administrada a uma dose de 1 g, 3g, 59 ou 109.

[00156] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana é administrada através de um método selecionado dentre o grupo que consiste em oral, retal, subcutâneo, nasal, bucal e sublingual.

[00157] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana compreende um veículo selecionado dentre o grupo que consiste em lactose, amido, glicose, metilcelulose, estearato de magnésio, manitol e sorbitol.

[00158] Em determinadas modalidades, a invenção fornece a com- posição bacteriana que compreende um diluente selecionado dentre o grupo que consiste em etanol, glicerol e água.

[00159] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana compreende um excipiente selecionado dentre o grupo que consiste em amido, gelatina, glicose, lactose anidra, lactose de fluxo livre, beta- lactose, edulcorante de milho, acácia, adragante, alginato de sódio, carboximetilcelulose, polietilenoglicol, oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio e cloreto de sódio.

[00160] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana compreende ainda pelo menos um dentre um conservante, um antioxi-

dante e um estabilizador.

[00161] Em determinadas modalidades, a composição bacteriana compreende um conservante selecionado dentre o grupo que consiste em benzoato de sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p- hidroxibenzoico.

[00162] Em determinadas modalidades, quando a composição bac- teriana é armazenada num recipiente vedado a cerca de 4ºC ou cerca de 25ºC e o recipiente é colocado numa atmosfera com 50% de umi- dade relativa, pelo menos 80% da cepa bacteriana, conforme medido em unidades formadoras de colônia, permanece após um período de pelo menos cerca de: 1 mês, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 2,5 anos ou 3 anos.

[00163] Em algumas modalidades, a composição bacteriana da in- venção é fornecida num recipiente vedado. Em algumas modalidades, o recipiente vedado é um sachê ou garrafa. Em algumas modalida- des, a composição bacteriana da invenção é fornecida numa seringa.

[00164] As bactérias; a composição pode, em algumas modalida- des, ser fornecida como uma formulação farmacêutica. Por exemplo, a composição bacteriana pode ser fornecida como um tablete ou cápsu- la. Em algumas modalidades, a cápsula é uma cápsula de gelatina ("gel-cap").

[00165] Em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção são administradas por via oral. Em algumas modalidades, as composições bacterianas da invenção são formuladas numa formula- ção farmacêutica adequada para administração oral. Administração oral pode envolver deglutição, de modo que o composto entre no trato gastrointestinal, e/ou administração bucal, lingual ou sublingual através da qual o composto entra na corrente sanguínea diretamente a partir da boca.

[00166] Formulações farmacêuticas adequadas para administração oral incluem tampões sólidos, microparticulados sólidos, semissólido e líquido (que incluem múltiplas fases ou sistemas dispersos) tais como tabletes; cápsulas moles ou duras que contêm multi- ou nano- particulados, líquidos (por exemplo, soluções aquosas), emulsões ou pós; drágeas (que incluem carregadas com líquido); mastigáveis; géis; formas de dosagem de dispersão rápida; filmes; óvulos; pulverizações; e adesivos bucais/mucoadesivos.

[00167] Em algumas modalidades a formulação farmacêutica é uma formulação entérica, isto é, uma formulação gastrorresistente (por exemplo, resistente ao pH gástrico) que é adequada para distribuição da composição da invenção no intestino através de administração oral. Formulações entéricas podem ser particularmente úteis quando as bactérias ou outro componente da composição é sensível ao ácido, por exemplo, propensa à degradação sob condições gástricas.

[00168] Em algumas modalidades, a formulação entérica compre- ende um revestimento entérico. Em algumas modalidades, a formula- ção é uma forma de dosagem revestida entérica. Por exemplo, a for- mulação pode ser um tablete revestido entérico ou uma cápsula reves- tida entérica, ou semelhantes. O revestimento entérico pode ser um revestimento entérico convencional, por exemplo, um revestimento convencional para um tablete, cápsula ou semelhantes para distribui- ção oral. A formulação pode compreender um revestimento de filme, por exemplo, uma camada de filme fino de um polímero entérico, por exemplo, um polímero insolúvel em ácido.

[00169] Em algumas modalidades, a formulação entérica é intrinse- camente entérica, por exemplo, gastrorresistente sem a necessidade de um revestimento entérico. Assim, em algumas modalidades, a for- mulação é uma formulação entérica que não compreende um revesti- mento entérico. Em algumas modalidades, a formulação é uma cápsu- la produzida a partir de um material termogelificante. Em algumas modalidades, o material termogelificante é um material celulósico, tal como metilcelulose, hidroximetilcelulose ou hidroxipropilmetilcelulose (HPMC). Em algumas modalidades, a cápsula compreende um invó- lucro que não contém nenhum polímero formador de filme. Em algu- mas modalidades, a cápsula compreende um invólucro e o invólucro compreende hidroxipropilmetilcelulose e não compreende nenhum po- límero formador de filme (por exemplo, consultar [33]) Em algumas modalidades, a formulação é uma cápsula intrinsecamente entérica (por exemplo, VcapsO da Capsugel).

[00170] Em algumas modalidades, a formulação é uma cápsula mo- le. Cápsulas moles são cápsulas que podem, devido às adições de amaciantes, tais como, por exemplo, glicerol, sorbitol, maltitol e polieti- lenoglicóis, presentes no invólucro de cápsula, ter uma determinada elasticidade e maciez. Cápsulas moles podem ser produzidas, por exemplo, com base em gelatina ou amido. Cápsulas moles à base de gelatina estão comercialmente disponíveis a partir de vários fornece- dores. Dependendo do método de administração, tal como, por exem- plo, por via oral ou retal, cápsulas moles podem ter vários formatos, podem ser, por exemplo, redondas, ovais, oblongas ou em formato de torpedo. Cápsulas moles podem ser produzidas através de processos convencionais, tais como, por exemplo, através do processo Scherer, do processo Accogel ou do processo atomização ou insuflagem.

MÉTODOS DE CULTIVO

[00171] As cepas bacterianas para uso na presente invenção po- dem ser cultivadas usando técnicas de microbiologia padrão conforme detalhado, por exemplo, nas referências [34-36].

[00172] O meio sólido ou líquido usado para cultura pode ser ágar de YCFA ou meio de YCFA. Meio de YCFA pode incluir (por 100 ml, valores aproximados): Casitona (1,0 g), extrato de levedura (0,25 9), NaHCO; (0,4 g), cisteína (0,1 g), K2HPO. (0,045 g), KH2PO+ (0,045 g),

NaCl (0,09 g), (NH4)2SOas (0,09 g), MgSO.s + 7H2O0 (0,009 g), CaClz (0,009 g), resazurina (0,1 mg), hemina (1 mg), biotina (1 ug), cobala- mina (1 ug), ácido p-aminobenzoico (3 ug), ácido fólico (5 ug) e pirido- xamina (15 ug). CEPAS BACTERIANAS PARA USO EM COMPOSIÇÕES DE VACI-

NA

[00173] Os inventores identificaram que as cepas bacterianas da composição bacteriana da invenção são úteis para tratar ou prevenir câncer quando administradas em combinação com um inibidor seleci- onado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemi- plimabe, PDROO1, canrelizumabe, BCD-100, IBI308, AGENZ034, IN- CSHR1210, MEDIO680, JSO001/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ- 63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, SymO021, MGAO012, LZMOOS9, genolinzumabe, AK105, AB122, PF-06801591, PF-O06688992 e TSR-042. Isto é provavelmente um resultado do efeito que as cepas bacterianas da invenção têm sobre o sistema imunológico de hospe- deiro. Em determinadas modalidades, as cepas bacterianas são viá- veis. Em determinadas modalidades, as cepas bacterianas são capa- zes de colonizar parcial ou totalmente o intestino. Em determinadas modalidades, as cepas bacterianas são viáveis e capazes de colonizar parcial ou totalmente o intestino. Em outras determinadas modalida- des, as cepas bacterianas podem ser eliminadas, inativadas ou atenu- adas. Em determinadas modalidades, as composições bacterianas são para administração via injeção, tal como via injeção subcutânea.

INIBIDORES DA INVENÇÃO

[00174] A combinação terapêutica da invenção compreende pelo menos um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivo- lumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO1, canrelizumabe, BCD-100, IBI308, AGEN2034, INCSHR1210, MEDIO680, JS001/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, Sym021,

MGAO012, LZMOOS, genolinzumabe, AK105, AB122, PF-O06801591, PF- 06688992 e TSR-042 (denominados coletivamente no presente docu- mento “inibidores', “inibidores da invenção' ou “inibidores da combina- ção terapêutica', ou unicamente “inibidor, inibidor da invenção ou “inibi- dor da combinação terapêutica'). Estes compostos inibem checkpoints imunológicos, assim, se permite que o sistema imunológico do corpo ataque as células que são reconhecidas como as próprias células do corpo que incluem células cancerígenas.

[00175] Nivolumabe é comercializado pela Bristol-Myers Squibb sob o nome comercial OPVIDOS e BGB-A137 é desenvolvido pela BeiGe- ne para o tratamento de vários tipos de câncer.

[00176] O termo "anticorpo" se refere a qualquer forma de anticorpo que exibe a atividade biológica desejada, tal como inibição de ligação de um ligante a seu receptor, ou inibição de sinalização induzida por ligante de um receptor. Assim, "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e cobre especificamente, porém, sem limitação, anticorpos mo- noclonais (que incluem anticorpos monoclonais de comprimento com- pleto), anticorpos policlonais e anticorpos multiespecíficos (por exem- plo, anticorpos biespecíficos). De acordo com algumas modalidades, um anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) usado na presente invenção é um anticorpo isolado.

[00177] Os termos "fragmento de anticorpo", "fragmento de ligação ao antígeno" e "fragmento de ligação anticorpo" usados intercambia- velmente ao longo do pedido significam fragmentos de ligação ao antí- geno que incluem, tipicamente, pelo menos uma porção das regiões variáveis ou de ligação ao antígeno (por exemplo, uma ou mais CDRs) do anticorpo parental. Um fragmento de anticorpo retém pelo menos alguma especificidade de ligação do anticorpo parental. Tipicamente, um fragmento de anticorpo retém pelo menos 10% da atividade de li- gação parental quando esta atividade é expressa numa base molar.

De preferência, um fragmento de anticorpo retém pelo menos 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% ou mais da afinidade de ligação ao anticorpo parental para o alvo. Exemplos de fragmentos de anticor- po incluem, porém, sem limitação, fragmentos de Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; moléculas de anticorpo de cadeia única, por exemplo, sc-Fv.

[00178] O "fragmento de Fab" é compreendido por uma cadeia leve e as regiões variáveis e CH1 de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula de Fab não pode formar uma ligação de dissulfeto com outra molécula de cadeia pesada.

[00179] Um "fragmento de Fab" contém uma cadeia leve e uma porção de uma cadeia pesada que contém o domínio Vx e o domínio CH1 e também a região entre os domínios CH1 e CH2, de modo que uma ligação de dissulfeto entre cadeias possa ser formada entre as duas cadeias pesadas de dois fragmentos de Fab' para formar uma molécula de F(ab')2.

[00180] Um "fragmento de F(ab')" contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que contêm uma poção da região constante entre os domínios CH1 e CH2, de modo que uma ligação de dissulfito entre cadeias seja formada entre as duas cadeias pesadas. Um frag- mento de F(ab'): é composto, assim, por dois fragmentos de Fab' que são mantidos juntos por uma ligação de dissulfeto entre as duas ca- deias pesadas.

[00181] A "região de Fv" compreende as regiões variáveis de am- bas as cadeias pesadas e leves, porém, carece das regiões constan- tes.

[00182] “Um "anticorpo Fv de cadeia única" (ou "anticorpo scFv") se refere aos fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios VH e VL de um anticorpo, sendo que estes domínios estão presentes nu- ma cadeia polipeptídica única. De modo geral, o polipeptídeo Fv com- preende ainda um ligante de polipeptídeo entre os domínios Vx e V.

que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação a an- tígeno.

[00183] Um anticorpo "isolado" é um anticorpo que foi separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Em al- gumas modalidades, o anticorpo será purificado em mais que 95% em peso de anticorpo conforme determinado pelo método de Lowry, e com máxima preferência mais de 99% em peso.

[00184] Um "anticorpo humano" é um anticorpo que tem uma se- quência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo pro- duzido por um ser humano. Esta definição exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação ao antíge- no não humano.

[00185] Um anticorpo "quimérico" se refere aos anticorpos em que uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo par- ticular, enquanto o restante da cadeia (ou cadeias) é idêntico a ou ho- mólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados uma outra espécie ou pertencendo a uma outra classe ou subclasse de an- ticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada.

[00186] Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo de receptor) nas quais resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma es- pécie não humana (anticorpo de doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade e a capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de região de su-

porte humana Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Ademais, anticorpos humani- zados podem compreender resíduos que não são encontrados no an- ticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para refinar o desempenho de anticorpo. Em geral, o anticorpo huma- nizado irá compreender substancialmente todo de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todos ou substancial- mente todos os laços hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as re- giões FR são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também irá compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana.

[00187] O termo "região hipervariável", conforme usado no presente documento, se refere aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido a partir de uma "região determi- nante de complementaridade" ou "CDR".

[00188] O termo "anticorpo monoclonal", como usado neste docu- mento, se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos indivi- duais que compreendem a população são idênticos exceto pelas mu- tações de ocorrência natural possíveis podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monocionais são altamente es- pecíficos, sendo diretamente contra a um sítio antigênico único. Adici- onalmente, em contraste com as preparações de anticorpo (policlonal) convencionais que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclional é dirigido contra um único determinante no antígeno. O termo "mono- clonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma popu-

lação substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser in- terpretado como exigindo a produção do anticorpo por nenhum método particular. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos pelo método hibridoma, ou podem ser produzidos pelos métodos de DNA recombinante. Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados das bibliotecas de anticorpo de fago.

[00189] Os termos "ligação específica" ou "especificamente ligado", conforme usado no presente documento, se referem a uma associa- ção não aleatória entre duas moléculas, isto é, anticorpo e antígeno. De acordo com algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, via seu domínio de ligação ao antíge- no, se liga especificamente ao antígeno com uma afinidade de ligação (Kd) de < 10'ºM. Alternativamente, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, via seu domínio de ligação ao antígeno, pode se ligar ao antígeno com uma Kd <10'*M ou <10" M. Kd, conforme usado no presente documento, se refere à razão da taxa de dissocia- ção para a taxa de associação (Kdesativado/Kativado), €& pode ser determi- nada usando quaisquer métodos adequados conhecidos na técnica.

[00190] De acordo com algumas modalidades, o inibidor da combi- nação terapêutica é administrado sistematicamente. De acordo com algumas modalidades, o inibidor da invenção é formulado para admi- nistração sistemática.

[00191] De acordo com outra modalidade, administração sistemati- camente é através de uma rota parenteral. De acordo com algumas modalidades, preparações do inibidor da invenção para administração parenteral incluem soluções aquosas ou não aquosas estéreis, sus- pensões ou emulsões, em que cada uma representa uma modalidade separada da presente invenção.

[00192] De acordo com algumas modalidades, a administração pa- renteral é administração por via intravenosa, intra-arterial, administra-

ção numa parede de vaso sanguíneo, por via intramuscular, intraperi- toneal, intradérmica, intravítrea, transdérmica ou subcutânea. Cada uma das rotas de administração mencionadas acima representa uma modalidade separada da presente invenção. De acordo com algumas modalidades, o inibidor da combinação terapêutica é administrado por via intravenosa.

[00193] De acordo com algumas modalidades, a administração sis- temática do inibidor da invenção é através de injeção. Para adminis- tração através de injeção, o inibidor da invenção pode ser formulado numa solução aquosa, por exemplo, num tampão fisiologicamente compatível, que inclui, porém, sem limitação, solução de Hank, solu- ção de Ringer ou tampão de sal fisiológico. Formulações para injeção podem ser apresentadas em formas de dosagem unitárias, por exem- plo, em ampolas, ou em recipientes de múltiplas doses com, opcio- nalmente, um conservante adicionado. Suspensões de injeção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspen- são, tal como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrana. Op- cionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos ingredientes ativos, para permitir a preparação de soluções altamente concentra- das.

[00194] De acordo com algumas modalidades, a administração pa- renteral é realizada através de injeção de bolo. De acordo com outras modalidades, a administração parenteral é realizada através de infu- são contínua. De acordo com algumas modalidades, o inibidor da in- venção é entregue num sistema de liberação controlada e é formulado para infusão intravenosa, bomba osmótica implantável, adesivo trans- dérmico, lipossomas ou outros modos de administração. Numa moda- lidade, uma bomba é usada. Ainda em outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser colocado próximo ao alvo terapêuti-

CO, assim, se exige apenas uma fração da dose sistemática.

A COMBINAÇÃO TERAPÊUTICA

[00195] “De acordo com algumas modalidades, é fornecida no pre- sente documento a combinação terapêutica da invenção para uso num método para tratar ou prevenir câncer num indivíduo. De acordo com algumas modalidades, é fornecida no presente documento a combina- ção terapêutica da invenção para uso num método para tratar câncer num indivíduo.

[00196] De acordo com algumas modalidades, o câncer a ser trata- do ou prevenido usando a combinação terapêutica da invenção é sele- cionado dentre o grupo que consiste em: melanoma, carcinoma pul- monar de célula não pequena, câncer de bexiga e câncer de cabeça e pescoço. De acordo com algumas modalidades, o câncer a ser trata- do ou prevenido usando a combinação terapêutica da invenção é sele- cionado dentre o grupo que consiste em: câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de cólon e câncer de fígado.

[00197] De acordo com algumas modalidades, tratamento de cân- cer se refere a pelo menos uma dentre a redução de tamanho de tu- mor ou prevenção de crescimento de tumor num indivíduo. De acordo com algumas modalidades, a combinação terapêutica ou o método da invenção é para uso em pelo menos um dentre a redução de tamanho de tumor, redução de crescimento de tumor, prevenção de metástase ou prevenção de angiogênese num indivíduo afetado com câncer.

[00198] De acordo com algumas modalidades, a combinação tera- pêutica da invenção compreende: (a) uma composição que compreen- de uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b) um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO1, canrelizumabe, BCD-100, IBI308, AGEN2034, INCSHR1210, MEDIO680, JS001/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, Sym021,

MGAO012, LZMOOS9, genolinzumabe, AK105, AB122, PF-O06801591, PF- 06688992 e TSR-042.

[00199] De acordo com algumas modalidades, a composição bacte- riana da combinação terapêutica não contém bactérias de nenhuma outra espécie diferente de Enterococcus gallinarum, ou compreende apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevantes de bac- térias de outra espécie. De acordo com algumas modalidades, a com- posição bacteriana da combinação terapêutica contém apenas uma única cepa da espécie Enterococcus gallinarum, e não contém bacté- rias de nenhuma outra espécie ou compreende apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevantes de bactérias de outra espé- cie. De acordo com algumas modalidades, a composição bacteriana da combinação terapêutica compreende a cepa de Enterococcus galli- narum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488. De acordo com algumas modalidades, a composição bacteriana da combinação terapêutica compreende uma única cepa da espécie Enterococcus gal- linarum, depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, e não contém bactérias de nenhuma outra espécie ou compreende apenas quantidades de minimis ou biologicamente irrelevantes de bactérias de outra espécie.

[00200] De acordo com algumas modalidades, o inibidor da inven- ção está numa composição que compreende, possivelmente, pelo me- nos um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00201] De acordo com algumas modalidades, a combinação tera- pêutica da invenção compreende: (a) uma composição que compreen- de uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, sendo que a composição compreende uma única cepa da espécie Entero- coccus gallinarum, depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, sendo que, opcionalmente, a composição não contém bactérias de nenhuma outra espécie ou compreende apenas quantidades de mini-

mis ou biologicamente irrelevantes de bactérias de outra espécie; e (b) um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO1, canrelizumabe, BCD-100, IBI308, AGEN2Z034, INCSHR1210, MEDIO680, JSOO01/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, Sym021, MGAO012, LZMOOS9, genolinzumabe, AK1O05, AB122, PF-O06801591, PF- 06688992 e TSR-042.

[00202] De preferência, a combinação terapêutica da invenção compreende: (a) uma composição que compreende a cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488; e (b) um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO1, can- relizumabe, BCD-100, IBI308, AGENZ2034, INCSHR1210, MEDIO680, JS001/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF-06801591, GLS-010, AB122, Sym021, MGAO12, LZMOO9, genolinzumabe, AK105, AB122, PF-O6801591, PF-O6688992 e TSR-042. De acordo com algumas modalidades, é fornecida no presente documento uma combinação terapêutica para uso num método para tratar ou prevenir câncer num indivíduo, sendo que a combinação terapêutica compre- ende: (a) uma composição que compreende a cepa bacteriana da es- pécie Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488; e (b) um inibidor selecionado dentre o grupo que con- siste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO1, canrelizu- mabe, BCD-100, IBIS08, AGEN2Z034, INCSHR1210, MEDIO680, JSO001/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, SymO021, MGAO012, LZMOOS9, genolinzumabe, AK105, AB122, PF-06801591, PF-O06688992 e TSR-042.

[00203] De acordo com algumas modalidades, a combinação tera- pêutica da invenção compreende: (a) uma composição que compreen- de uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b) um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO1, canrelizumabe, BCD-100, IBI308, AGEN2Z034, INCSHR1210, MEDIO680, JSOO01/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, Sym021, MGAO012, LZMOOS, genolinzumabe, AK1O05, AB122, PF-06801591, PF- 06688992 e TSR-042.

[00204] “De acordo com algumas modalidades, a combinação tera- pêutica da invenção compreende: (a) uma composição que compreen- de uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, opcio- nalmente a cepa depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, sendo que, opcionalmente, a composição não contém bactérias de nenhuma outra espécie e/ou cepa ou compreende apenas quantida- des de minimis ou biologicamente irrelevantes de bactérias de outra espécie e/ou cepa; e (b) um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO1, canre- lizumabe, BCD-100, IBI308, AGENZ2034, INCSHR1210, MEDIO680, JSO001/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, SymO021, MGAO12, LZMOOS9, genolinzumabe, AK105, AB122, PF-06801591, PF-O06688992 e TSR-042.

[00205] “De acordo com algumas modalidades, é fornecido no pre- sente documento um método para tratar e/ou prevenir câncer num in- divíduo usando qualquer uma das combinações terapêuticas descritas no presente documento. De acordo com algumas modalidades, a pre- sente invenção fornece qualquer uma das combinações terapêuticas descritas no presente documento para uso no tratamento e/ou preven- ção de câncer num indivíduo.

GERAL

[00206] A prática da presente invenção empregará, a menos que seja indicado de outra forma, métodos convencionais de química, bio- química, biologia molecular, imunologia e farmacologia, dentro da ha-

bilidade da técnica. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Consultar, por exemplo, referências [37] e [38-44], etc.

[00207] O termo "que compreende" engloba "que inclui" assim co- mo "que consiste" por exemplo, uma composição "que compreende" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.

[00208] O termo "cerca de" em relação a um valor numérico x é op- cional e significa, por exemplo, x+10%.

[00209] A palavra "substancialmente" não exclui "completamente" por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y po- de ser completamente livre de Y. Quando necessário, a palavra "subs- tancialmente" pode ser omitida da definição da invenção.

[00210] Referências a uma porcentagem de identidade de sequên- cia entre duas sequências de nucleotídeos significa que, quando ali- nhadas, esta porcentagem de nucleotídeos é igual em comparação com as duas sequências. Este alinhamento e o percentual de homolo- gia ou identidade de sequência podem ser determinados usando pro- gramas de software conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles des- critos na seção 7.7.18 da referência [45]. Um alinhamento preferencial é determinado pelo algoritmo de busca de homologia de Smith- Waterman que usa busca de intervalo afim com uma penalidade de abertura de intervalo de 12 e uma penalidade de extensão de intervalo de 2, matriz de BLOSUM de 62. O algoritmo de busca de homologia de Smith-Waterman é descrito na referência [46].

[00211] A menos que seja especificamente afirmado, um processo ou método que compreende diversas etapas pode compreender eta- pas adicionais no começo ou fim do método, ou pode compreender etapas de intervenção adicionais. Além disto, etapas podem ser com- binadas, omitidas ou realizadas numa ordem alternativa, caso apropri- ado.

[00212] Várias modalidades da invenção são descritas no presente documento. Será reconhecido que os recursos especificados em cada modalidade possam ser combinados com outros recursos especifica- dos, para fornecer modalidades adicionais. Em particular, modalidades destacadas no presente documento como adequadas, típicas ou prefe- renciais podem ser combinadas entre si (exceto quando são mutua- mente exclusivas).

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO EXEMPLO 1 — EFICÁCIA DE INÓCULOS BACTERIANOS EM MO-

DELOS DE CÂNCER EM CAMUNDONGO SUMÁRIO

[00213] Este estudo testou a eficácia de composições que compre- endem cepas bacterianas, de acordo com a invenção, em quatro mo- delos de tumor.

MATERIAIS

[00214] Substância de teste - Cepa bacteriana nº MRX518.

[00215] Substância de Referência - Anticorpo Anti-CTLA-4 (clone: 9H10, catálogo: BE0131, isotipo: Hamster Sírio IgG1, Bioxcell).

[00216] Veículos de substâncias de teste e referência - Meio de cultura bacteriano (Meio de Extrato de Levedura, Casitona, Ácido Gra- xo (YCFA)). Cada dia de injeção em camundongos, o anticorpo foi di- luído com PBS (referência: BE14-516F, Lonza, França).

[00217] Doses de tratamento - Bactérias: 2x10º em 200 ul. O a- CTLA+ foi injetado a 10 mg/kg/inj. Anti-CTLA-4 foi administrado a um volume de dose de 10 mli/kg/adm (isto é, para um camundongo que pesa 20 g, 200 ul de substância de teste serão administrados) de acordo com o peso de corpo mais recente dos camundongos.

[00218] Rotas de administração - Inóculo bacteriano foi adminis- trado através de gavagem oral (por os, PO) via uma cânula. Cânulas foram descontaminadas todos os dias. Anti-CTLA-4 foi injetado na ca-

vidade peritoneal de camundongos (Por via intraperitoneal, IP).

[00219] Condições de cultura de cepa bacteriana - As condições de cultura para a cepa bacteriana foram as seguintes: * Pipeta de 10 ml de YCFA (das garrafas de laboratório E&O de 10 ml preparadas) em tubos Hungate * Vedar os tubos e nivelar com CO, usando um sistema de entrada e escape de seringa * Autoclave dos tubos Hungate * Quando resfriados, inocular os tubos Hungate com 1 ml das reservas de glicerol * Colocar os tubos numa incubadora estática a 37ºC por cerca de 16 horas.

* No dia seguinte, pegar 1 ml desta subcultura e inocular 10 ml de YCFA (tubos Hungate nivelados pré-aquecidos novamente, tudo duas vezes) * Colocar os mesmos numa incubadora estática a 37ºC por 5a6h LINHAGEM CELULAR CANCERÍGENA E CONDIÇÕES DE CULTU- RA -

[00220] As linhagens celulares que foram usadas são detalhadas na Tabela abaixo: celular mundongo CRL1642

VATION

[00221] A linhagem celular EMT-6 foi estabelecida a partir de um carcinoma mamário de murino transplantável que surgiu num camun-

dongo BALB/cCRGL após implante de um nódulo alveolar mamário hiperplástico [47].

[00222] A linhagem celular LL/2 (LLC1) foi estabelecida a partir do pulmão de um camundongo C57BL que carrega um tumor que resulta de um implante de carcinoma pulmonar de Lewis primário [48].

[00223] A linhagem celular Hepa 1-6 é um derivado do hepatoma de camundongo BW7756 que surgiu num camundongo C57/L [49].

[00224] “Condições de cultura celular - Todas as linhagens celula- res foram cultivadas como monocamada a 37ºC numa atmosfera umi- dificada (5% de CO», 95% de ar). O meio de cultura e complemento são indicados na Tabela abaixo: Linha- Meio de cultura Complemento gem ce- lular EMT6 |RPMI! 1640 que contém 2 mM | 10% de soro bovino fetal (re- de L-glutamina (referência: ferência: nº 3302, Lonza) BE12-702F, Lonza) LL/2 |RPMI 1640 que contém 2 mM | 10% de soro bovino fetal (re- (LLC1) | de L-glutamina (referência: ferência: nº 3302, Lonza) BE12-702F, Lonza) Hepa1-6) DMEM (referência: 11960- | 10% de soro bovino fetal (re- 044, Gibco) ferência: nº 3302, Lonza) 2 mM de L-glutamina penicilina-estreptomicina (Sigma G-6784) RENCA DMEM 10% de soro bovino fetal, 2 mM de L-glutamina, 1 ug/ml de puromicina

[00225] Para uso experimental, células de tumor aderentes foram removidas do frasco de cultura por um tratamento de 5 minutos com tripsina-verseno (referência: BE17-161E, Lonza), em meio de Hanks sem cálcio ou magnésio (referência: BE10-543F, Lonza) e neutraliza- das pela adição de meio de cultura completo. As células foram conta-

das num hemocitômetro e sua viabilidade será avaliada por ensaio de exclusão de 0,25% de azul de tripano. USO DE ANIMAIS -

[00226] Camundongos Balb/C fêmeas saudáveis (BALB/cByJ), de peso e idade correspondentes, foram obtidos junto à CHARLES RI- VER (L'Arbresles) para os experimentos de modelo EMT6 e RENCA.

[00227] “Camundongos C57BL/6 fêmeas saudáveis (C57BLI6J), de peso e idade correspondentes, foram obtidos junto à CHARLES RI- VER (L'Arbresles) para os experimentos de modelo LL/2(LLC1) e He- pa1-6.

[00228] Animais foram mantidos em situação de saúde SPF de acordo com as orientações da FELASA, e procedimentos experimen- tais e de alojamento de animal de acordo com as Regras Europeias e Francesas e o Guia da NRC para o Uso e Cuidado com Animais de Laboratório foram seguidos [50-51]. Animais foram mantidos em alo- jamentos sob condições ambientais controladas: Temperatura: 22 + 2ºC, Umidade 55 + 10%, Fotoperíodo (12 h de luz/12 h de escuro), ar filtrado com HEPA, 15 trocas de ar por hora sem recirculação. Recin- tos fechados para animal foram dotados de espaço estéril e adequado com roupa de cama, comida e água, enriquecimento ambiental e soci- al (alojamento em grupo) conforme descrito: gaiolas de 900 cm? (refe- rência: green, Tecniplast) em suportes ventilados, roupas de cama Epicea (SAFE), dieta irradiada de 10 kGy (AO04-10, SAFE), Ração completa para roedores imunocompetentes - Extrudado de R/M-H, água de garrafas de água.

PROJETO EXPERIMENTAL E TRATAMENTOS ATIVIDADE ANTITUMORAL, MODELO EMT6

[00229] “Cronograma de tratamento - O começo da primeira dosa- gem foi considerado DO. Em DO, camundongos não enxertados foram aleatorizados de acordo com seu peso corporal individual em grupos de 9/8 usando o software Vivo managerO (Biosystemes, Couternon, França). Em DO, os camundongos receberam veículo (meio de cultura) ou cepa bacteriana. Em D14, todos os camundongos foram enxerta- dos com células tumorais EMT-6 conforme descrito abaixo. Em D24, camundongos do grupo de controle positivo receberam tratamentos com anticorpo anti-CTLA-4.

[00231] A indução de tumores EMT6 em animais - Em D14, tumo- res foram induzidos por injeção subcutânea de 1x10º células EMT-6 em 200 ul de RPMI 1640 no flanco direito de camundongos.

[00232] Eutanásia - Cada camundongo sofreu eutanásia quando o mesmo alcançou um ponto final humanitário, conforme descrito abai- xo, ou após um máximo de 6 semanas após o começo da dosagem. ATIVIDADE ANTITUMORAL, MODELO LL/2 (LLC1)

[00233] Cronograma de tratamento - O começo da primeira dosa- gem foi considerado DO. Em DO, camundongos não enxertados foram aleatorizados de acordo com seu peso corporal individual em 7 grupos de 9/8 usando o software Vivo manager8 (Biosystemes, Couternon, França). Em DO, os camundongos receberão veículo (meio de cultura) ou cepa bacteriana. Em D14, todos os camundongos foram enxerta- dos com células tumorais LL/2, conforme descrito abaixo. Em D27, camundongos do grupo de controle positivo receberam tratamentos com anticorpo anti-CTLA-4.

[00235] A indução de tumores LL/2 (LLC1) em animais - Em D14, tumores foram induzidos por injeção subcutânea de 1x10º células LL/2 (LLC1) em 200 ul de RPMI 1640 no flanco direito de camundongos.

[00236] Eutanásia - Cada camundongo sofreu eutanásia quando o mesmo alcançou um ponto final humanitário, conforme descrito abai- xo, ou após um máximo de 6 semanas após o começo da dosagem. Atividade antitumoral, modelo Hepa1-6

[00237] “Cronograma de tratamento - O começo da primeira dosa- gem foi considerado DO. Em DO, camundongos não enxertados foram aleatorizados de acordo com seu peso corporal individual em 7 grupos de 9 usando o software Vivo managerO (Biosystemes, Couternon, França). Em DO, os camundongos receberam veículo (meio de cultura) ou cepa bacteriana. Em D14, todos os camundongos foram enxerta- dos com células tumorais Hepa 1-6, conforme descrito abaixo. Em D16, camundongos do grupo de controle positivo receberam tratamen- tos com anticorpo anti-CTLA-4.

[00238] O cronograma de tratamento é resumido na Tabela abaixo: Mil A Bi al aaa o Animais de Tratamento) Os [sore TO E] = | 2 | 9 | vecuo(meos)| - | PO| QD |

[00239] A indução ortotópica de células tumorais Hepa 1-6 em ani- mais através de injeção intrasplênica - Em D14, um milhão de (1x10º) células tumorais Hepa 1-6 em 50 ul de meio RPMI 1640 foram trans- plantadas via injeção intrasplênica em camundongos. Brevemente, uma pequena incisão no flanco subcostal esquerdo foi feita e o baço foi exteriorizado. O baço foi exposto num coxim de gaze estéril, e inje- tado sob controle visual com a suspensão de célula com uma agulha de calibre 27. Após a inoculação de célula, o baço foi excisado.

[00240] Eutanásia - Cada camundongo sofreu eutanásia quando o mesmo alcançou um ponto final humanitário, conforme descrito na se- ção abaixo, ou após um máximo de 6 semanas após o começo da do- sagem.

[00241] Avaliação de fardo tumoral na eutanásia - No momento de morte, os fígados foram coletados e pesados. ATIVIDADE ANTITUMORAL, MODELO RENCA

[00242] “Cronograma de tratamento - O começo da primeira dosa- gem foi considerado DO. Em DO, camundongos não enxertados foram aleatorizados de acordo com seu peso corporal individual em grupos de 9 camundongos usando o software Vivo managerO (Biosystemes, Couternon, França), Em DO, os camundongos receberam veículo (meio de cultura) ou cepa bacteriana (2x10º em 200 ul, PO). Em D14, todos os camundongos foram enxertados com SC injetado com células tumorais RENCA na superfície ventral do flanco inferior conforme des- crito abaixo. Tratamento com anti-CTLA-4 (10 mg/kg, IP) e anti-PDL1 (clone 10F.9G2, 10 mg/kg) foi iniciado quando tumores alcançaram um volume de 50 a 70 mm3.

[00244] O monitoramento de animais foi realizado conforme des- crito abaixo.

[00245] A indução ortotópica de células tumorais RENCA em ani- mais através de injeção SC - Em D14, um milhão (1x10º) de células tumorais RENCA em 50 ul de meio RPMI 1640 foram transplantadas via injeção SC na superfície ventral do flanco inferior de camundongos.

[00246] Eutanásia - Cada camundongo sofreu eutanásia quando o mesmo alcançou um ponto final humanitário, conforme descrito na se- ção abaixo, ou após um máximo de 6 semanas após o começo da do- sagem.

[00247] Avaliação de fardo tumoral na eutanásia - No momento de morte, tumores foram coletados e seu volume avaliado.

MONITORAMENTO DE ANIMAL

[00248] “Monitoramento clínico - O comprimento e largura do tumor foram medidos duas vezes por semana com paquímetros e o volume do tumor foi estimado por esta Fórmula [52]: Valume tera Largaãã? xcomprinoaio E

[00249] — Pontos finais humanitários [53]: Sinais de dor, sofrimento ou angústia: postura de dor, careta de dor, comportamento; Tumor que excede 10% do peso corporal normal, porém, não excede 2000 mm?; Tumores que interferem com a ambulação ou nutrição; Tumor ulcera- do ou erosão de tecido; 20% de perda de peso corporal que permane- ce por 3 dias consecutivos; Condição corporal fraca, emaciação, ca- quexia, desidratação; Ausência prolongada de respostas voluntárias aos estímulos externos; Respiração rápida ofegante, anemia, hemor- ragia significativa; Sinais neurológicos: tontura, convulsão, paralisia; Diminuição constante na temperatura corporal; Distensão abdominal.

[00250] Anestesia - Anestesias com gás isoflurano foram usadas para todos os procedimentos: cirurgia ou inoculação tumoral, injeções i.v., coleta de sangue. Anestesias com Ketamina e Xilazina foram usa- das para procedimento cirúrgico estereotaxia.

[00251] —Analgesia - Protocolos de analgesia com carprofeno ou carprofeno/buprenorfina multimodal foram adaptados para a gravidade do procedimento cirúrgico. Cuidado não farmacológico foi fornecido para todos os procedimentos dolorosos. Adicionalmente, o cuidado farmacológico que não interfere nos estudos (tratamento tópico) foi fornecido na recomendação do veterinário presente.

[00252] Eutanásia - Eutanásia de animais foi realizada através de superdosagem de gás para anestesia (Isoflurano) seguido por deslo- camento cervical ou exsanguinação.

RESULTADOS ATIVIDADE ANTITUMORAL, MODELO EMT6

[00253] Os resultados são mostrados na Figura 1A. Tratamento com a cepa bacteriana da invenção resultou numa redução clara em volume tumoral com relação a ambos os controles negativos. O con- trole positivo também resultou numa redução em volume tumoral, co- mo seria esperado.

[00254] Para elucidar adicionalmente mecanismos através dos quais MRx0518 transporta seus efeitos terapêuticos em modelos de tumorsingeneicos, a análise ex vivo foi realizada nos estudos de mo- delo tumoral EMT6singeneico. Embora o volume tumoral seja a princi- pal medição em estudos de oncologia pré-clínicos, tumores consistem, frequentemente, em dividir ativamente células tumorais juntamente com um núcleo necrótico. Para investigar se o tratamento com MRx0518 teve influência sobre o grau de necrose encontrado dentro de tumores EMTG6, seções de parafina da região média do ventre dos tumores foram machadas com Hematoxilina e Eosina. Tratamento com MRx0518 de um modelo de carcinoma de mama EMTG6 murino de- monstrou uma tendência em relação ao aumento da área em seção transversal de necrose dentro do tumor (Figura 1B, painel superior). Para investigar se o tratamento com MRx0518 teve influência sobre células divisoras dentro do tumor, as seções de parafina da região média do ventre dos tumores foram manchadas com a proteína de proliferação Ki67, juntamente com a contramancha DAPI, para estimar a porcentagem de células que se dividem dentro do tumor EMT6. Tra- tamento com MRx0518 de um modelo de carcinoma de mama EMT6 murino diminuiu significativamente a porcentagem de células divisoras vistas dentro do tumor (Figura 1B, painel inferior, P = 0,019).

POPULAÇÕES DE CÉLULA IMUNOLÓGICA

[00255] Investigação adicional do microambiente tumoral foi reali- zada através de citometria de fluxo do tumor, para investigar a hipóte- se de que a cepa bacteriana MRx518 tem a habilidade para regular o sistema imunológico na indução de um efeito antitumoral. Tumores excisados dos diferentes grupos de tratamento foram cortados em pe- daços. Um pedaço foi submetido à análise de citometria de fluxo. Para avaliar a porcentagem relativa de linfócitos T, presentes dentro dos tumores, os seguintes marcadores foram usados: CD45, CD3, CDA, CD8, CD25 e FoxP3.

[00256] Os dados de citometria de fluxo mostram que a porcenta-

gem relativa de linfócitos em tumores foi levemente diminuída em am- bos os grupos tratados com MRx0518 e anti-CTLA-4, em comparação, respectivamente, com animais de veículo ou controle (Figura 1C). De modo semelhante, a porcentagem relativa de células CD4+ pareceu diminuir nos animais tratados com MRx0518 e anti-CTLA-H4, enquanto a porcentagem relativa de células CD8+ seguida pela tendência opos- ta em ambos grupos, embora com diferente magnitude. A porcenta- gem relativa de células CD4+FoxP3+ foi menor no grupo tratado com anti-CTLA-4 em comparação com a leve diminuição nos animais trata- dos com MRx0518; no entanto, a redução na porcentagem relativa de células CD4+CD25+ foi notável apenas no grupo tratado com anti- CTLAH. A razão de CD8+/FoxP3+ demonstrou um aumento maior no grupo tratado com anti-CTLA-4 do que nos animais com MRx0518. Estes dados apresentados aqui sustentam a hipótese de que anticorpo anti-CTLA-4 alveja células T reguladoras (Tregs) reduzindo-se seus números celulares ou atenuando-se sua atividade supressiva em teci- do tumoral, enquanto sugere um modo de ação diferente para MRx0518.

PRODUÇÃO DE CITOCINA

[00257] Um pedaço de tumor adicional foi usado para extração de proteína total e subsequente análise de citocina, juntamente com amostras de plasma. Níveis de proteína de I|L-10, CXCL1, CXCL?2, CXCL10, IL-18, IL-17A, GM-CSF, TNF-a, IL-12p70 e IFN-y no micro- ambiente tumoral foram analisados por tecnologia MagPix. Embora |IL- 17A e GM-CSF estivessem abaixo dos níveis de detecção, todos os outros marcadores foram expressos em níveis razoáveis (Figura 1D). Uma diferença significativa foi observada entre o grupo de veículo e anti-CTLA-4 para IFN-y. A produção dos marcadores imunológicos IL- e I1L-12p70 pareceu reduzida depois de tratamento com MRx518 em comparação com os tratamentos com controle.

[00258] Níveis de citocina também foram avaliados em plasma san- guíneo dos mesmos animais. Níveis de proteína de 11-23, IL-6, 11-10, VEGF, CXCL1, CXCL2, CXCL10, IL-2, IL-18, IL-17A, GM-CSF, TNF-a, IL-12p70 e IFN-y foram analisados por tecnologia MagPix. No geral, pouca produção de citocina foi detectada no plasma sanguíneo de animais seja antes da indução de tumor ou no fim do estudo (Figura 1E). VEGF e CXCL10 foram detectados em níveis substanciais, en- quanto IL-23, IL-6, I1L-10, CXCL1 e CXCL?2 foram detectados em níveis baixos. IL-2, IL-1b, IL-17A, GM-CSF, TNF-a, IL-12p70 e IFN-y não fo- ram detectados nas amostras. MRx0518 aumentou significativamente produção de IL-6 no Dia 0. MRx0518 também pareceu aumentar pro- dução de I1L-23. VEGF e CXCL10 foram significativamente regulados de modo decrescente no grupo anti-CLTA-4 no Dia 22. De modo simi- lar aos resultados mostrados para as populações de células imunoló- gicas, as diferenças na produção de citocina no tumor e plasma, entre MRx518 e CTLA-4 sugere que cada um deles atue sobre um meca- nismo distinto e potencialmente complementar.

[00259] Localização de Células Positivas CD8a no Íleo

[00260] Crio-seções de 10 um de íleo foram cortadas em cryostat (CM 1950 Leica), capturadas em lâminas de lisina de poli-L. As se- ções foram, então, secadas com ar por 1 hora, fixadas por 10 minutos em metanol gelado, lavadas em PBS, bloqueadas em 10% de BSA em PBS, pH 7,2, antes de serem incubadas de um dia para o outro com o anticorpo primário (anticorpo rato-anticcamundongo-CD8a, Sigma- Aldrich, Millipore).

[00261] Na manhã seguinte as lâminas foram lavadas em PBS e manchadas com um anticorpo secundário: cabra-anti-rato-anticorpo- Alexa488 (Molecular Probe, Invitrogen) por 1 hora em temperatura ambiente. Após outra etapa de lavagem, as lâminas foram contra manchadas com dicloridrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)

(Sigma-Aldrich, Millipore) e montadas em Vectashield (Vector Labora- tories). As lâminas foram visualizadas e transformadas em imagem usando um microscópio Zeiss Axioscope equipado com uma lâmpada de vapor de mercúrio, filtros apropriados e uma lente objetiva apocro- mática x20. Exemplos de imagens obtidas a partir das lâminas dos animais de veículo, MRx0518 e anti-CTL4 são mostrados (Figura 1F — painéis superiores: tingimento com DAPI, painéis inferiores: tingimento com CD8a).

[00262] Campos de visão foram examinados a partir de 20 animais e transformados em imagem usando tempo de exposição manual. O número de animais e campos analisados são mostrados na seguinte Tabela: dos

[00263] As imagens foram classificadas como a seguir: campos com < 3 células positivas foram pontuados como 0, enquanto campos com 23 células foram pontuados como 1. Os resultados desta análise são mostrados (Figura 1G).

[00264] Crio-seções de íleo manchadas com anti-CD8a mostraram um número maior de células positivas CD8a localizadas nos tecidos de região de cripta dos animais tratados com MRx0518 e anti-CTLA-4 em comparação com o grupo de veículo.

[00265] Esta observação está alinhada com células T CD8+ que estão presentes no intestino no caso de infecção ou microambiente inflamatório, como parte da resposta imune. ATIVIDADE ANTITUMORAL, MODELO LL/2 (LLC1)

[00266] Os resultados são mostrados na Figura 2. Tratamento com a cepa bacteriana da invenção resultou numa redução clara em volu-

me tumoral com relação a ambos os controles negativos. ATIVIDADE ANTITUMORAL, MODELO HEPA1-6

[00267] Os resultados são mostrados na Figura 3A. O controle ne- gativo não tratado não parece conforme seria esperado, uma vez que o peso do fígado estava mais baixo neste grupo do que em outros grupos. No entanto, os grupos de controle negativo e controle positivo de veículo aparecem, ambos, conforme seria esperado, uma vez que camundongos tratados com veículo apenas tiveram fígados maiores do que camundongos tratados com anticorpos anti-CTLAA4, o que refle- te um fardo tumoral maior no grupo de controle negativo de veículo. Tratamento com a cepa bacteriana da invenção resultou numa redu- ção clara no peso de fígado (e, portanto, fardo tumoral) em relação aos camundongos no grupo de controle negativo de veículo. ATIVIDADE ANTITUMORAL, MODELO RENCA

[00268] Os resultados são mostrados na Figura 3B. Tratamento com monoterapia de MRx0518 reduziu volume tumoral com Tes- te/Controle de 51% (dia 18) em comparação com os grupos tratados com veículo. Paclitaxel e anti-CTLA-4 + anti-PDL-1 mostraram uma redução (quase) completa em tamanho de tumor em D18 e D22 em comparação com ambos grupos não tratados e de veículo.

[00269] Estes dados indicam que a cepa MRX518 pode ser útil para tratar ou prevenir câncer e, em particular, para reduzir volume tumoral em cânceres de mama, pulmão, rim e fígado. EXEMPLO 2 — ANÁLISE DE GENE DE PCR

[00270] Uma cultura pura de bactérias MRX518 foi estudada numa análise de gene de PCR. Havia dois braços para o experimento: 1) MRX518 foi cocultivado com células do cólon humano (CaCo2) para investigar os efeitos das bactérias sobre o hospedeiro, e 2) MRX518 foi cocultivado em células CaCo2 que foram estimuladas com IL1 para imitar o efeito das bactérias num ambiente inflamatório. Os efeitos em ambos os cenários foram avaliados através de análise de expressão de gene.

Os resultados são mostrados abaixo: o [são | pressão gia com CXCL1. considerado quimioatraente de célula Th1 (induzível por IFN-g) mente neutrófilo), diversos receptores que incluem CXCR1 e CXCR2/ ração celular, assim como migração, superexpressão é neuroprotetora em EAE. vação DC dependente de célula T. partir do epitélio, sinérgica com IL-22, a SCORE gante de CXCR3 também? de GPCR.

DUSP1 6,36 Fosfatase anti-inflamatória inativa Ro a a ot JAK-STAT o [são | pressão são IFN-, IL-18 TLR, foz parte de AP-1

B de TGF-b. viral, regulador de proliferação de célula T. Diferenciação de célula auxiliar T promove autofagia nítrico

[00271] Estes dados parecem mostrar duas assinaturas de expres- são gênica - ligantes de CXCR1/2 (CXCL3, CXCL2, CXCL1, IL-8), que são associados à migração de célula pró-inflamatória, e ligantes de CXCR3 (CXCL9,CXCL10), que são mais especificamente indicativos de respostas tipo IFN-y, também suportados por IL-32, que é induzível por IFN-y. EXEMPLO 3 — TESTE DE ESTABILIDADE

[00272] Uma composição descrita no presente documento que con- tém pelo menos uma cepa bacteriana descrita no presente documento é armazenada num recipiente vedado a 25ºC ou 4ºC e o recipiente é colocado numa atmosfera com 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ou 95% de umidade relativa. Após 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 ano, 1,5 anos, 2 anos, 2,5 anos ou 3 anos, pelo menos 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% da cepa bacteriana deve permanecer, con- forme medido em unidades formadoras de colônia determinadas pelos protocolos padrão. EXEMPLO 4 — PRODUÇÃO DE CITOCINA EM CÉLULAS DENDRÍ- TICAS IMATURAS INDUZIDAS POR MRX518 EM COMPARAÇÃO COM MRX518 + LPS

SUMÁRIO

[00273] Este estudo testou o efeito da cepa bacteriana MRX518 so- zinha e em combinação com lipopolissacarídeo (LPS) sobre a produ- ção de citocina em células dendríticas imaturas.

[00274] Uma população de monócitos foi isolada das células mono- nucleares de sangue periférico (PBMCs). As células de monócito fo- ram subsequentemente diferenciadas em células dendríticas imaturas. As células dendríticas imaturas foram colocadas em placa em 200000 células/poço e incubadas com MRX518 numa concentração final de 10”/ml, com a adição opcional de LPS numa concentração final de 100 ng/ml. O controle negativo envolveu incubar as células com meios de RPMI sozinhos e controles positivos incubaram as células com LPS numa concentração final de 100 ng/ml. O teor de citocina das células foi, então, analisado.

RESULTADOS

[00275] Os resultados destes experimentos podem ser vistos nas

Figuras 4a a d. A adição de MRX518 sozinha resulta num aumento substancial no nível de citocinas IL-6 e TNF-a em comparação com o controle negativo (Figura 4a e c). A adição de LPS (controle positivo) resulta num aumento no nível de IL-6 e TNF-a em comparação com o controle negativo, porém, não com IL-16 (Figura 4b). Uma combinação de MRX518 e LPS resultou num aumento sinérgico no nível de IL-1B produzido (Figura 4d).

CONCLUSÃO

[00276] MRX518 tem a habilidade de induzir produção de citocina IL-6 e TNF-o. maior em células dendríticas imaturas. A combinação LPS e MRX518 pode aumentar os níveis de citocinas IL-1B em células dendríticas imaturas. Estes dados indicam que MRX518 sozinho ou em combinação com LPS pode aumentar as citocinas inflamatórias IL- 13, IL-6 e TNF-a, que promove inflamação que pode suprimir o câncer. Tratamento com MRX518 sozinho ou em combinação pode induzir ci- tocinas que podem limitar o crescimento de tumor. EXEMPLO 5 — PRODUÇÃO DE CITOCINA EM CÉLULAS THP-1 IN- DUZIDA POR MRX518 EM COMPARAÇÃO COM MRX518 + LPS

SUMÁRIO

[00277] Este estudo testou o efeito de cepa bacteriana MRX518 so- zinha e em combinação com LPS na produção de citocina em células THP-1, uma linhagem celular modelo para monócitos e macrófagos.

[00278] Células THF-1 foram diferenciadas em meio MO por 48 h com 5 ng/ml de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA). Estas células foram subsequentemente incubadas com MRX518 numa concentração final de 10º/ml, com ou sem a adição de LPS numa concentração final de 100 ng/ml. As bactérias foram, então, lavadas e permitiu-se que as células incubassem sob condições de crescimento normal por 24 h. As células foram, então, centrifugadas e o sobrenadante resultante foi analisado para teor de citocina.

RESULTADOS

[00279] Os resultados destes experimentos podem ser vistos nas Figuras 5a a c. A adição de MRX518 sem LPS resulta num aumento nos níveis de citocina de IL-16, IL-6 e TNF-a em comparação com os controles de sedimento não bacterianos e bacterianos. A adição de LPS e MRX518 resulta num aumento sinérgico na produção de citoci- nas.

CONCLUSÃO

[00280] MRX518 tem a habilidade de induzir a produção de citocina em células THP-1, que pode ser sinergicamente aumentada com a adição de LPS. Estes dados indicam que MRX518 sozinho ou em combinação com LPS pode aumentar as citocinas inflamatórias IL-1B, IL-6 e TNF-a, que promove inflamação que pode suprimir o câncer. Tratamento com MRX518 sozinho ou em combinação pode induzir ci- tocinas que podem limitar o crescimento de tumor. EXEMPLO 6 — ATIVIDADE ANTITUMORAL DE UMA COMBINAÇÃO TERAPÊUTICA DE MRX518 E O INIBIDOR DE PD-1 RMP1-14 OU UM INIBIDOR DE CTLA-4

SUMÁRIO

[00281] Este estudo comparou a atividade antitumoral de MRX518, o inibidor de PD-1 RMP1-14, um inibidor de CTLA4 e combinações terapêuticas de MRX518 com o inibidor de PD-1 RMP1-14 ou o inibi- dor de CTLA-4 em camundongos que carregam células tumorais EMT-

6.

MATERIAIS

[00282] Substâncias de teste e referência - Cepa bacteriana nº MRX518; Anticorpo anti-PD-1 (clone: RMP1-14, catálogo: BEO0146, iso- tipo: Rato IgG2a, Bioxcell); Anticorpo anti-CTLA4 (referência: BEO0131, Bioxcell; clone: 9H10; reatividade: camundongo; isotipo: Hamster I9G1; condições de armazenamento: +4ºC).

[00283] Veículos de substâncias de teste e referência — As bac- térias MRX518 foram cultivadas num meio de cultura bacteriano (Ex- trato de levedura, Casitona, Meio de Ácido Graxo (YCFA)) e mantidas como uma reserva de glicerol a -80ºC. Os animais foram dosados com as bactérias de acordo com o protocolo de estudo. Os anticorpos anti- PD1 e anti-CTLA-4 foram diluídos com PBS (referência: BE14-516F, Lonza, França) em cada dia de injeção em camundongos.

[00284] Doses de tratamento - Bactérias: 2x10º em 200 ul. Os an- ticorpos anti-PD1-1 e anti-CTLA4 foram administrados em 10 mg/kg de peso corporal de acordo com o peso corporal mais recente dos ca- mundongos.

[00285] Rotas de administração — A composição bacteriana foi administrada através de gavagem oral (por os, PO) via um tubo de ga- vagem num volume de 200 ul/inj. Os anticorpos anti-PD-1 e anti-CTLA- 4 foram injetados na cavidade peritoneal de camundongos (por via in- traperitoneal, IP) num volume de 10 ml/kg ajustada ao peso corporal individual mais recente de camundongos.

[00286] Linhagem celular cancerígena e condições de cultura - A linhagem celular que foi usada neste estudo é a linhagem celular EMT-6 que foi obtida a partir da ATCC (American Type Culture Collec- tion, Manassas, Virginia, E.U.A.). A linhagem celular EMT-6 foi esta- belecida a partir de um carcinoma mamário de murino transplantável que surgiu num camundongo BALB/cCRGL após implante de um nó- dulo alveolar mamário hiperplástico.

[00287] Células tumorais foram cultivadas como monocamada a 37ºC numa atmosfera umidificada (5% de CO2, 95% de ar). O meio de cultura foi RPMI 1640 que contém 2 mM de L-glutamina (referência: BE12-702F, Lonza, Verviers, Bélgica) complementado com 10% de soro bovino fetal (referência: 3302, Lonza). Células tumorais EMT-6 são aderentes em frascos plásticos. Para uso experimental, células de tumor foram removidas do frasco de cultura por um tratamento de 5 minutos com tripsina-verseno (referência: BE0O2-007E, Lonza), em meio de Hanks sem cálcio ou magnésio (referência: BE10-543F, Lon- za) e neutralizadas pela adição de meio de cultura completo. As célu- las foram contadas e sua viabilidade foi avaliada por ensaio de exclu- são de 0,25% de azul de tripano.

[00288] Uso de animais - Centro e trinta (130) camundongos Balb/C fêmeas saudáveis (BALB/cByJ), de 5 a 7 semanas de idade, foram obtidos junto à CHARLES RIVER (L'Arbresles) e mantidos em situação de saúde SPF de acordo com as orientações da FELASA. Alojamento de animal e procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as regras europeias e francesas e o guia NRC para o cuidado e uso de animais de laboratório. Animais foram mantidos de 3 a 4 por gaiola em alojamentos sob condições ambientais controladas: Temperatura: 22 + 2ºC, Umidade 55 + 10%, Fotoperíodo (12 h de luz/12 h de escuro), ar filtrado com HEPA, 15 trocas de ar por hora sem recirculação. Recintos fechados para animal foram dotados de espaço estéril e adequado com roupa de cama, comida e água, enri- quecimento ambiental e social (alojamento em grupo) conforme des- crito: Gaiolas do tipo Ill ou IV Eurostandard de policarbonato de filtro superior, roupa de cama de espiga de milho (referência: LAB COB 12, SERLAB, França), dieta irradiada de 25 kGy (Ssniffê Soest, Alema- nha), Comida completa para roedores imunocompetentes - R/M-H Ex- trudada, Estéril, filtrada em 0,2 um de água e enriquecimento ambien- tal (SIZZLE-dri kraft - D20004 SERLAB, França). Animais são individu- almente identificados com transponder RFID e cada gaiola foi identifi- cada com um código específico. Tratamento dos animais começou após uma semana de aclimação para os lotes 2 e 3, ou após três se- manas de aclimação para o lote 1.

[00289] Projeto experimental e tratamentos

[00290] No dia-14 (D-14), 130 camundongos não enxertados foram aleatorizados de acordo com seu peso corporal individual em 3 grupos de 30 animais e 4 grupos de 10 animais usando o software Vivo Ma- nager€ (Biosystemes, Couternon, França). Os camundongos foram separados em 3 lotes de 10 animais por grupo de tratamento (lote 1: animais de grupos 1, 2 e 3; lote 2: 10 animais de grupos 1,2e3e lote 3: 10 animais de grupos 1 a 7) com pontos de terminação diferen- tes desde o começo do estudo: D-14 ou DO.

[00291] Na terminação, o lote 3 foi dividido em 2 coortes, devido à terminação e cronogramas de análises de FACS; estas foram escalo- nadas durante 1 dia: D24/D25 Portanto, todo coorte de animais teve 5 animais por grupo de tratamento (4 animais da gaiola um e um animal da gaiola 2). Com base nos critérios éticos, se o volume tumoral for maior que 1500 mm?, a seleção dos animais a serem sacrificados em D24 e D25 é com base em volume tumoral em vez da gaiola. O projeto experimental é representado na Figura 7A e resumido abaixo: 1) Lote 1 (grupos 1, 2 e 3) começou tratamento em DO e foi abatido em D14 (10 animais formam os grupos 1 a 3). Estes não rece- beram células tumorais e constituíram o grupo de linha de base.

2) Lote 2 (grupo 1, 2 e 3) começou tratamento em D-14 e foi abatido em D7 (10 animais formam os grupos 1 a 3).

3) Lote 3 (grupos 1 a 7) começou tratamento em D-14 e foi abatido em D24/25 (10 animais formam os grupos 1 a 7). O tratamento de anti-PD-1 e Anti-CTLA-4 começou em D10.

[00292] No dia O (DO) todos os camundongos de lotes 2 e 3 (termi- nação no dia 7 e 24/25, respectivamente) foram enxertados com célu- las tumorais EMT-6 através de uma injeção subcutânea de 1x106 célu- las EMT-6 em 200 ul de RPMI 1640 no flanco direito (os 30 camun- dongos do lote 1, que foram sacrificados em D14, não receberam a injeção de tumor). Os camundongos foram tratados de acordo com os seguintes grupos de cronograma de tratamento (TWx2 = duas vezes por semana): nº de Animais Tratamento Cronograma de Tra- tamento 30 = 1 10 lote 1 Não tratado (+ 10 lote 2 Tumor) 10 lote 3 30 = Diariamente -14 a DO 10/ote 1 , Diariamente -14 a D7 ? 10 lote 2 Veículo (YCFA) Diariamente -14 a 10 lote 3 D24/25 30= MRX518 (culti- Diariamente -14 a DO 3 10 lote 1 vado a partir de 2x108 Diariamente -14 a D7 10 lote 2 reserva de glice- Diariamente -14 a 10 lote 3 rol) em YCFA D24/25 : TWx2 de D10 4 10 lote 3 AntrPD-1 | 19mgkg | IP+PO |YCFA Diariamente -14 +YCFA a D24/25 Anti-PD-1 + 10 mg/kg + TWx2 de D10 ote 3 MRX518 2x10º bac-| IP+PO Bactérias Diariamente -| térias 14 a D24/25 TWx2 de D10 10 lote 3 AntiCTLA-4 | 19 mg/kg | IP+PO | YCFA Diariamente -14 +YCFA a D24/25 ; 10 mg/kg + TWx2 de D10 Anti-CTLA-4 7 10/ote 3 A uoxES + 2x10º bac-| IP+PO Bactérias Diariamente -| térias 14 a D24/25

[00293] As seguintes amostras são coletadas ao longo do experi- mento:

1. Fezes (apenas para o lote 3) — Em três pontos no tempo durante o estudo (D-15, D-1 e D22) amostras fecais foram coletadas de oito camundongos idênticos por grupo (o equivalente a 80 a 100 mg ou 6 a 7 pelotas por camundongo, porém, pelo menos 3 pelotas fe- cais), congeladas rapidamente e armazenadas a -80ºC.

2. Sangue — No momento da terminação dos camundongos (D14 para o lote 1, D7 para o lote 2 e D25 para o lote 3), aproximada- mente 1 ml de sangue intracardíaco foi coletado de cada animal num tubo de EDTA em procedimentos terminais sob gás profundo de anes- tesia. O sangue foi centrifugado para obter plasma, e o plasma arma-

zenado a -80ºC.

3. Tumor e baço — O tumor (em D e D24/D25) e os baços (em D7, D14 e D24/D25) de todos os camundongos foram coletados. As células de infiltrado imunológico tumoral nas amostras de tumor foram quantificadas por análise de FACS conforme descrito abaixo.

4. Gânglios linfáticos mesentéricos — Em D7, DI4 e D24/D25 gânglios linfáticos mesentéricos de todos os animais por gru- pos e por ponto no tempo foram coletados e congelados rapidamente a -8B0ºC.

5. Intestino - No momento de eutanásia (D7, DiI4 e D24/D25), diversas seções dos intestinos de todos os camundongos por grupo e por temporização foram coletadas e dissecadas. O teor cecal foi colhido também. Análise de FACS

[00294] Para análise de células tumorais, tumores de todos os ca- mundongos por grupos e por temporização foram coletados no mo- mento de terminação (em D7 e D24/25). Todos os tumores foram cole- tados em meio de cultura HBSS. As células de infiltrado imunológico tumoral foram quantificadas por análise de FACS de cada amostra co- letada. Brevemente, as amostras coletadas foram processadas por dissociação mecânica e preparadas em 100 ul de tampão de tingimen- to (PBS, 0,2% de BSA, 0,02% de NaN3). Então, os anticorpos direcio- nados contra os marcadores escolhidos foram adicionados, de acordo com o procedimento descrito pelo fornecedor para cada anticorpo. To- dos os anticorpos exceto FoxP3 foram para marcação de superfície e FoxP3 para marcação intracelular. Os anticorpos usados para análise de FACS são listados nas Tabelas abaixo:

PAINEL 1: PAINEL DE VIABILIDADE DE CÉLULAS T, CD45, CD3, CDA4, CD8, CD25, FOXP3, PD1, B220 cromo cidade dor dongo ences od 1 em ences dongo ences

E A A ences 665 dongo Biotec [sm Dos ee] o ace | 624 sal Green Biotec dongo ences A enem ences 601 dongo Biotec Espere ee 615 G1 Biotec o mero laeo | ans Stain 700 AF700 ences 250 Vio770 | dongo Biotec [se So No [| 634 Vio770 Biotec so po Same | soe 800 dongo Biotec Ear Mar 628 sal Biotec cromo cidade dor 845 dongo Biotec [Coe Pe e | o e Roo 626 sal Biotec PAINEL 2 MACRÓFAGOS ASSOCIADOS AO TUMOR (TAM): VIABI- LIDADE, CD45, CD3, CD11B, LY6C, F4/80, CD68, CD80, CD206,

MHCII cromo ficidade dor dongo Md RN A A halo ences 396 dongo Biotec Era RAE 628 sal G1 Biotec 289 Vio700 | dongo- Biotec humano so do ve | o | aum 620 Vio700 Biotec 530 Vio770 | dongo G1 Biotec [ssa posa venmo | [oro] ame | 632 sal Vio770 G1 Biotec 861 dongo Biotec [Causo ota o PS aos 625 sal* G1 Biotec cromo ficidade dor 412 dongo Biotec

[00295] A mistura foi incubada por 20 a 30 minutos em temperatura ambiente no escuro, lavada e ressuspensa em 200 ul de tampão de tingimento. Todas as amostras foram armazenadas em gelo e protegi- das da luz até análise de FACS. Amostras de tumor também foram processadas com anticorpos de isotipo de controle. As células man- chadas foram analisadas com um citômetro de fluxo de espaço CyFlowº (LSR II, BD Biosciences) equipado com 3 lasers de excitação em comprimentos de onda de 405, 488 e 633 nm.

[00296] Para análisede amostras de intestino, o intestino delgado e o cólon de todos os camundongos por grupos e por temporização fo- ram coletados no momento de terminação (em D7, D14 e D24/25). Todos os tecidos frescos foram coletados em meio de cultura HBSS. As células imunológicas na lâmina própria foram quantificadas por análise de FACS de cada amostra coletada. As amostras foram pro- cessadas como as amostras tumorais. Os anticorpos usados para aná- lise de FACS são aqueles do painel 1 listados acima e aqueles listados na Tabela abaixo (incubação subsequente de amostras e análise ocor-

reram conforme descrito acima): PAINEL 3: DCS INTESTINAIS: VIABILIDADE, CD45, CD3, CD11B, CD11C, MHC Il, CD103 rocromo cidade dor Vio700 j|go-humano Biotec a o o o | ade (S) Vio700 Biotec go G1 Biotec o ee Dr | ane) versal G1 Biotec 700 go ence o o o Pas 700 ence go Biotec a a a A a E] Biotec o insane Pancas lity Stain 575V ences go Biotec sr esa | o | for] muee | universal G1 Biotec vio770 go G1 Biotec e saw vom) — ot mue| universal Vio770 G1 Biotec go Biotec rocromo cidade dor Cr me | o Bate] universal Biotec

[00297] Para análise de amostras do baço, o baço de todos os ca- mundongos por grupos e por temporização foram coletados no mo- mento de terminação (em D7, D14 e D24/25). Todos os baços foram coletados em meio de cultura de RPMI completo (10% de dFBS, 1% de Penicilina/estreptomicina, 2 mM de L-glutamina e 55 uM de 2- mer- captoetanol). As células de infiltrado imunológico tumoral foram quanti- ficadas por análise de FACS de cada amostra coletada após estímulo por 72 h com CD3 e CD28. Procedimento: Esplenócitos foram cultiva- dos com um dentre dois estímulos (CD3/CD28, MRx0518 eliminado por calor) e um controle negativo. Havia uma razão de 1:1 entre o MRx0518 eliminado por calor e os esplenócitos por poço. Havia 1x106 células bacterianas fornecidas em 20 ul da amostra de MRx0518 eli- minado por calor. Os anticorpos direcionados contra os marcadores de painel 1 acima foram adicionados às pelotas de célula de cada trata- mento, de acordo com o procedimento descrito pelo fornecedor para cada anticorpo. Incubação subsequente de amostras e análise foram realizadas conforme descrito acima.

MONITORAMENTO DE ANIMAL

[00298] A viabilidade e o comportamento dos animais foram grava- dos todos os dias. Pesos corporais foram medidos duas vezes por semana. O comprimento e a largura do tumor foram medidos duas ve- zes por semana com paquímetros e o volume do tumor foi estimado pela seguinte Fórmula: 7 'olume-tumoral= Large a »Ecuprimen'to - dd a

[00299] A eficácia de tratamento foi avaliada em termos dos efeitos da substância de teste sobre os volumes tumorais de animais tratados em relação aos animais de controle. Os seguintes critérios de avalia- ção de eficácia antitumoral foram determinados usando o software Vi- vo ManagerO (Biosystemes, Couternon, França):

1. Volumes tumorais individuais e/ou médios (ou media- nos). Volumes tumorais médios de grupos 1 a 7 são representados na Figura 7B.

2. Tempo de dobra de tumor (DT).

3. Inibição de crescimento tumoral (T/C%) definida como a razão dos volumes tumorais medianos de grupo tratado em relação ao controle, calculada como a seguir (Dx = Dia de medição):

TF Enlume-tumaoral inediiho de grupo tratada em D, 7 Fodume tamoralamadiança: grapo cruecado com veiculo -em Da O O valor ideal é a razão de T/C% mínima que reflete a inibição de cres- cimento de tumor máxima alcançada. Os critérios eficazes para a ra- zão de T/C%, de acordo com os padrões NCI, é < 42%.

4, Curvas de volume tumoral relativo (RTV) de grupos de teste e controle, em que o RTV é calculado como a seguir (Dx = Dia de medição; Dr= Dia de aleatorização): Ev 2 TV er, "Tv erD,

5. Volume V e tempo para alcançar V são calculados. Vo- lume V é definido como um volume-alvo deduzido dos dados experi- mentais e escolhido em fase exponencial de crescimento de tumor. Para cada tumor, o volume tumoral mais próximo ao volume-alvo V é selecionado nas medições de volume tumoral. O valor deste volume V e o tempo para o tumor alcançar este volume são gravados. Para cada grupo, a média dos volumes tumorais V e a média dos tempos para alcançar este volume são calculadas.

EXEMPLO 7 — AVALIAÇÃO DE PROLIFERAÇÃO DE CD8

[00300] Para investigar os efeitos imunoestimuladores de MRX518 e inibidores da invenção, uma avaliação in vitro do impacto sobre proli- feração de célula CD8+ de MRX518 e um inibidor de checkpoint anti- PD-1 Miltenyi Biotech CD279, em combinação, foi conduzida.

[00301] Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs, crio- preservadas da Stemcell Technologies, número de catálogo: 70025) foram removidas do nitrogênio líquido e deixadas para descansar de um dia para o outro num frasco. Uma placa de 96 poços foi revestida com anticorpo CD3 (ThermoFisher Anticorpo Monoclonal CD3 (OKT3), 0,3 ug/ml) como uma metade de uma combinação mitogênica. Depois do período de descanso, as PBMCs foram contadas e manchadas com marcador de célula fluorescente (Kit de Proliferação de Glóbulos Vermelhos Remoto CellTrace"Y).

[00302] Dez conjuntos de células foram preparados desta maneira. Para nove destes conjuntos, o anticorpo anti-PD-1 foi adicionado (da Miltenyi Biotech CD279 (PD1) grau funcional puro, 10 ug/ml). Nenhum anticorpo anti-PD-1 foi adicionado ao conjunto adicional, que serviu como um conjunto de controle (denominado Conjunto de Célula 1 na Tabela abaixo). Todos os conjuntos de célula foram, então, incubados por 1,5 horas.

[00303] “Depois do período de incubação, componentes de teste bacteriano foram adicionados aos Conjuntos de Célula 3 a 10, confor- me mostrado nas Tabela a seguir: de Célula sentado na Figura 6 ti-PD-1 numa razão de 1:1* numa razão de 10:1*

Conjunto! Componente Bacteriano | Acrônimo conforme apre- de Célula sentado na Figura 6 MRX518 Eliminado por Calor HK MRx0518 KO 1:1 com knockout de flagelina** numa razão de 1:1* MRX518 Eliminado por Calor HK MRx0518 KO 10:1 com knockout de flagelina** numa razão de 10:1* 7 Sobrenadante de MRX518 HK MRx0518 WT SN 1:1 numa razão de 1:1*** Sobrenadante de MRX518 | HK MRx0518 WT SN 10:1 numa razão de 10:1*** 'sobrenadante de knockout der HK MRx0518 KO SN 1:1 flagelihna MRX518** numa razão de 1:1** sobrenadante de knockout dei HK MRx0518 KO SN 10:1 flagelina MRX518** numa razão de 10:1*** * Razão de células MRX518: células PBMC ** Um mutante de MRX518 modificado para ter uma montagem flage- lar rompida foi testado. Os inventores entenderam que a flagelina con- tribui para o efeito imunoestimulador de MRX518. *** Para a Multiplicidade de Infecção (MOI) de 1:1, o sobrenadante foi obtido a partir do mesmo número de bactérias que o número de PBMCs tratadas com o sobrenadante. Para a MOI de 10:1, o sobrena- dante foi obtido a partir de uma cultura bacteriana altamente concen- trada, porém, o número preciso de bactérias com relação às PBMCs não foi medido.

[00304] Depois da adição dos componentes de teste bacteriano, um anticorpo CD28 (Anticorpo Monoclonal CD28 (CD28.2) Thermofisher, 1 pg/ml) foi adicionado em cada um dos conjuntos de célula como a outra metade da combinação mitogênica, para disparar proliferação. PDL-1 (Sistemas R&D, Quimera de Fc PD-L1/B7-H1 Humana Recom-

binante, 10 pg/ml) foi, então, adicionada em cada conjunto de célula.

[00305] Os conjuntos de célula foram, então, incubados por 5 dias (37ºC, 5% de CO>). Depois da incubação, as células foram colhidas e analisadas por FACS de acordo com a fluorescência celular transmiti- da pelo marcador de célula, que fornece uma indicação do número de divisões celulares que ocorreram no período de incubação. Os resul- tados que mostram as porcentagens de células agrupadas no número de divisões (desde nenhuma divisão celular (NCD) até 4 divisões celu- lares (4RCD)) são mostrados na Figura 6.

SEQUÊNCIAS SEQ ID NO:1 (Enterococcus gallihnarum gene de 168 rRNA - AFO39900) 1 taatacatgc aagtcgaacg ctttttettt caccggagcet tactecaceg aaagaaaaag 61 agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat cagaagggga taacacttgg 121 aaacaggtgc taataccgta taacactatt ttccgcatgg aagaaagttg aaaggegett 181 ttgcgtcact gatagatgga ccegeggtac attagctagt tagtgaggta acggctcace 241 aaggccacga tagcatageeg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tagagacacgg 301 cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatctteggc aatggacgaa agtctgaceg 361 agcaacgccg cgtgagtgaa gaagatttte ggatcgtaaa actctattgt tagagaagaa 421 caaggatgag agtagaacgt tcatccettg acggtatcta accagaaage cacggctaac 481 tacgtgccag cagcegeggt aatacgtagg tagcaagcegt tatecggatt tattaggcgt 541 aaagcgageg caggcggttt cttaagtctg atatagaaage ceceggetea aceggaggagg 601 gtcattggaa actgggagac ttgagtgcag aagaggagag tagaattcca tatatagegg 661 tgaaatgcgt agatatatgg aggaacacca gtggcgaagg cggctetetg gtetataact 721 gacgctgagg ctegaaageg tagggagega acaggattag ataccctggt agtccacgec 781 gtaaacgatg agtgctaagt gttagagggt ttecgcecectt cagtgctgca gcaaacgcat 841 taagcactcc gectagggag tacgacegca aggttgaaac traaaggaat tagacgggggc 901 ccgcacaagc ggtggagcat gtagtttaat tegaagcaac gegaagaacc ttaccaggte 961 ttgacatcct ttgaccactc tagagataga gcettecectt caggggcaaa gtgacaggta 1021 gtacatggtt gtcgtcaget catategtga gatattgggt taagtecege aacgagegca 1081 acccttattg ttagttacca tceatttagtt gggcactcta gegagactgc cggtgacaaa 1141 ccagaggaag gtagggatga cgtcaaatca teatgcececet tatgacetag gctacacacg 1201 tgctacaatg ggaagtacaa cgagttgcga agtcgcgagg ctaagctaat ctcttaaage 1261 ttctctcagt teggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagcceggaat cgctagtaat 1321 cgcggatcag cacgccegegg tgaatacgtt ccegggcectt gtacacaceg cecgteacac 1381 cacgagagtt tataacaccc gaagtcggtg aggtaacctt tttggagcca gcegectaag 1441 gtgggataga tgattggggt gaagtcgtaa caaggtagcc gtateggaag gtacgagctag 1501 atcacc SEQ ID NO: 2 (sequência de 168 rRNA de consenso para a cepa de Enterococcus gallinarum MRX518)

TGCTATACATGCAGTCGAACGCTTTTTCTTTCACCGGAGCTTGCTC CACCGAAAGAAAAAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGT AACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATA CCGTATAACACTATTTTCCGCATGGAAGAAAGTTGAAAGGCGCTTT TGCGTCACTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGA GGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGG GTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACG GGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGAC CGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACT CTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTAGAACGTTCATCCCTT GACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGC CGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCG TAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCC GGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGC AGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA TATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAA CTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGAT ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAG GGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGC CTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGG GGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTOCGAAGCAAC GCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGA TAGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTT GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA GCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAG CGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCA AATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGG GAAGTACAACGAGTTGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCTCTTAA AGCTTCTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAG CCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACG TTCCCEGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGT AACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTA AGGTG REFERÊNCIAS

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum e um inibidor selecio- nado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemi- plimabe, PDROO1, canrelizumabe, BCD-100, IBI308, AGENZ034, IN- CSHR1210, MEDIO680, JSO001/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ- 63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, SymO021, MGAO012, LZMOOS9, genolinzumabe, AK105, AB122, PF-O06801591, PF-O6688992 e TSR-042, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma combinação terapêutica para tratar ou prevenir câncer.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida composição não contém bactérias de qualquer outra espécie, ou compreende apenas quantidades de minimis ou bio- logicamente irrelevantes de bactérias de outra espécie.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a combinação terapêutica é para tratar ou prevenir câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de rim, câncer de fígado, linfoma, hepatoma, câncer neuroendócrino ou câncer de cólon; e/ou reduzir tamanho de tumor, reduzir crescimento de tumor, prevenir me- tástase ou prevenir angiogênese.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a cepa bacteriana tem a sequência de 16s rRNA representada pela SEQ ID NO: 2.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a composição é para administração oral e/ou em que o inibidor é para administração intravenosa; e/ou a composição compreende um ou mais excipientes ou veículos farma- ceuticamente aceitáveis.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a cepa bacteriana é liofilizada; e/ou é capaz de colonizar parcial ou totalmente o intestino.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a composição compreende: (a) uma única cepa de Enterococcus gallinarum; e/ou (b) a cepa bacteriana de Enterococcus gallinarum como parte de um consórcio microbiano; e/ou (c) a cepa de Enterococcus gallinarum depositada sob o número de acesso NCIMB 42488.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a composição está compreendida em um produto alimentício ou em uma composição de vacina.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a composição é administrada ao indi- víduo antes da primeira administração do inibidor ao indivíduo; ou a composição é administrada ao indivíduo durante pelo menos uma, duas, três ou quatro semanas antes da primeira adminis- tração do inibidor; ou a composição é administrada ao indivíduo antes da primeira administração do inibidor e/ou pelo menos parcialmente em paralelo com a administração do inibidor ao referido indivíduo.

10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a cepa bacteriana da espécie Ente- rococcus gallinarum e o inibidor estão em composições separadas.

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o indivíduo foi não responsivo a um tratamento precedente que usa um inibidor sozinho.

12. Uso de uma primeira composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum e uma segunda composição que compreende um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO01, can-

relizumabe, BCD-100, IBI308, AGEN2034, INCSHR1210, MEDIO680, JSO001/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, SymO021, MGAO12, LZMOOS9, genolinzumabe, AK105, AB122, PF-O06801591, PF-O6688992 e TSR-042, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma combinação para tratar ou prevenir câncer, sendo que, opcionalmente, a referida primeira com- posição é administrada antes da primeira administração da referida segunda composição e/ou em paralelo com a administração da se- gunda composição.

13. Uso de uma primeira composição que compreende um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO1, canrelizumabe, BCD-100, IBI308, AGEN2034, INCSHR1210, MEDIO680, JSOO01/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, Sym021, MGAO012, LZMOOS, genolinzumabe, AK105, AB122, PF-06801591, PF- 06688992 e TSR-042, e uma segunda composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, caracteri- zado pelo fato de que é na preparação de uma combinação para tratar ou prevenir câncer, sendo que, opcionalmente, a referida primeira composição é administrada em paralelo com a administração da se- gunda composição

14. Uso de uma composição que compreende um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO1, canrelizumabe, BCD-100, IBI308, AGEN2034, INCSHR1210, MEDIO680, JSO001/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ- 63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, SymO021, MGAO012, LZMOOS9, genolinzumabe, AK105, AB122, PF-06801591, PF-O06688992 e TSR-042, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo que rece- beu precedentemente administração de uma composição que compre-

ende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, prefe- rencialmente a cepa depositada sob o número de acesso NCIMB

42488.

15. Uso de uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum, preferencialmente a cepa depositada sob o número de acesso NCIMB 42488, caracteriza- do pelo fato de que é na preparação de uma composição para tratar ou prevenir câncer num indivíduo diagnosticado com necessidade de tratamento com um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO1, canrelizumabe, BCD-100, IBI308, AGEN2034, INCSHR1210, MEDIO680, JS001/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, Sym021, MGA012, LZMOOS9, genolinzumabe, AK1I05, AB122, PF-06801591, PF-O6688992 e TSR-042.

16. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b) uma composição que compreende um inibidor selecio- nado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemi- plimabe, PDROO1, canrelizumabe, BCD-100, IBI308, AGENZ2034, IN- CSHR1210, MEDIO680, JSO001/PD1, CC-90006, BI 754091, JNJ- 63723283, PF-O6801591, GLS-010, AB122, SymO021, MGAO012, LZMOOS9, genolinzumabe, AK105, AB122, PF-06801591, PF-O06688992 e TSR-042.

17. Combinação terapêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma composição que compreende uma cepa bacteriana da espécie Enterococcus gallinarum; e (b) um inibidor selecionado dentre o grupo que consiste em Nivolumabe, BGB-A137, cemiplimabe, PDROO01, canrelizumabe, BCD-

100, IBIS08, AGEN2034, INCSHR1210, MEDIO680, JS001/PD1, CC- 90006, BI 754091, JNJ-63723283, PF-O06801591, GLS-010, AB122, Sym021, MGAO012, LZMOOS9, genolinzumabe, AK1IO05, AB122, PF- 06801591, PF-O6688992 e TSR-042.

18. Produto alimentício, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição ou combinação como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

19. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende uma composição ou combinação como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.