BR112020013910A2

BR112020013910A2 - composições e métodos para alvejamento de cânceres que expressam cd99

Info

Publication number: BR112020013910A2
Application number: BR112020013910-6A
Authority: BR
Inventors: Marco L. Davila
Original assignee: H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc.
Priority date: 2018-01-08
Filing date: 2019-01-08
Publication date: 2020-12-01
Also published as: EP3737391A4; US20200397882A1; AU2019205422A1; CN112040957A; WO2019136419A2; MX2020007281A; JP7281824B2; EP3737391A2; CA3087706A1; WO2019136419A3; JP2021509816A

Abstract

São divulgados composições e métodos para tratamento alvejado de cânceres que expressam CD99. Em particular, são divulgados polipeptídeos de receptor de antígeno quimérico (CAR) que podem ser usados com a transferência de células adotivas para alvejar e exterminar cânceres que expressam CD99. Também são divulgadas células imunológicas efetoras, tais como células T ou células exterminadoras naturais (NK), que são projetadas para expressar esses CARs. Portanto, também são divulgados métodos para fornecer uma imunidade antitumoral em um sujeito com um câncer que expressa CD99 que envolve a transferência adotiva das células efetoras imunológicas divulgadas, geneticamente modificadas para expressar os CARs divulgados. Também são divulgados anticorpos multivalentes que são capazes de envolver células T para destruir células malignas que expressam CD99.

Description

“COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA ALVEJAMENTO DE CÂNCERES QUE EXPRESSAM CD99”

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório n.º de Série U.S. 62/641.779, depositado em 8 de janeiro de 2018, Pedido n.º de série 62/654.617, depositado em 9 de abril de 2018, Pedido n.º de série 62/654.625, depositado em 9 de abril de 2018, Pedido n.º de série 62/730.374, depositado em 12 de setembro de 2018, Pedido n.º de série 62/730.397, depositado em 12 de setembro de 2018, Pedido n.º de série 62/767.864, depositado em 15 de novembro de 2018 e Pedido n.º de série 62/767.867, depositado em 15 de novembro de 2018, que são todos aqui incorporados por referência na sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] Este pedido contém uma listagem de sequência arquivada em formato eletrônico como um arquivo ASCII.txt intitulado "320103-2030 Sequence Listing_ST25" criado em 6 de janeiro de 2019. O conteúdo da listagem de sequências é incorporado aqui na sua totalidade.

ANTECEDENTES

[0003] Cirurgia, radioterapia e quimioterapia têm sido as abordagens padrão aceitas para o tratamento de cânceres, incluindo leucemia, tumores sólidos e metástases. A imunoterapia (às vezes chamada de terapia biológica, bioterapia ou terapia modificadora da resposta biológica), que usa o sistema imunológico do corpo, direta ou indiretamente, para encolher ou erradicar o câncer, tem sido estudada há muitos anos como um complemento à terapia convencional do câncer. Acredita-se que o sistema imunológico humano seja um recurso inexplorado para a terapia do câncer e que um tratamento eficaz possa ser desenvolvido quando os componentes do sistema imunológico forem adequadamente aproveitados.

SUMÁRIO

[0004] Composições e métodos para tratamento alvejado de cânceres que expressam CD99 são divulgados. Por exemplo, anticorpos monoclonais anti-CD99 a partir de hibridomas 1H3, 4C5, 9G12, 3C7, 2F11, 4D5, 4F4 e 6A10 são aqui fornecidos. Por exemplo, os anticorpos dos clones de hibridoma 1H3H7, 1H3E9, 4C5E2, 4C5H10, 9G12C9 e 9G12G6, demonstraram uma aglutinação particularmente boa a CD99. Também são divulgados anticorpos recombinantes, humanizados e/ou quiméricos que compreendem pelo menos as regiões de aglutinação a antígeno de um ou mais desses anticorpos.

[0005] Também aqui divulgados são anticorpos multiespecíficos e multivalentes que são capazes de engate a células T para destruir células malignas que expressam CD99. Por exemplo, o anticorpo pode ser um agente de célula T biespecífico. Os anticorpos podem ser geneticamente modificados a partir de polipeptídeos de fusão, como polipeptídeos de fusão com a seguinte fórmula:

[0006] VLI – VHI – VLT – VHT,

[0007] VLT – VHT – VLI – VHI,

[0008] VHT – VLT – VHI – VLI,

[0009] VHI – VLI – VHT – VLT,

[0010] VLI – VHI – VHT – VLT,

[0011] VLT – VHT – VHI – VLI,

[0012] em que “VLI” é um domínio variável de cadeia leve específico para um antígeno de células imunes;

[0013] em que "VHT" é um domínio variável de cadeia pesada específico para CD99;

[0014] em que “VGT” é um domínio variável de cadeia leve específico para CD99;

[0015] em que “VHI” é um domínio variável de cadeia pesada específico para o antígeno de células imunes; e

[0016] em que "-" consiste em um ligante peptídico ou uma aglutinação peptídica.

[0017] O antígeno de células imunes pode ser uma molécula de superfície celular que é expressa em células NK humanas, células T, monócitos, macrófagos ou granulócitos. Por exemplo, a molécula de superfície celular pode ser o antígeno CD2, CD3, CD16, CD64, CD89; NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLR-F1), NKG2C ou NKG2D.

[0018] Também é divulgado um ácido nucleico isolado que codifica o polipeptídeo de fusão divulgado, bem como vetores de ácido nucleico contendo esse ácido nucleico isolado operacionalmente ligado a uma sequência de controle de expressão. Também são divulgadas células transfectadas com esses vetores e o uso dessas células para produzir os polipeptídeos de fusão divulgados.

[0019] Também é divulgada uma composição farmacêutica que compreende uma molécula aqui divulgada em um carreador farmaceuticamente aceitável. Também é divulgado um método para tratar câncer em um sujeito que envolve administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica divulgada. Em alguns casos, o câncer pode ser qualquer neoplasia que expressa CD99. Em alguns casos, o câncer compreende uma síndrome mielodisplásica, leucemia mieloide aguda ou leucemia bifenotípica.

[0020] Também divulgados são polipeptídeos de receptor de antígeno quimérico (CAR) que podem ser usados com a transferência de células adotivas para alvejar e exterminar cânceres que expressam CD99. Os polipeptídeos CAR divulgados contêm em um ectodomínio um agente de aglutinação anti-CD99 que pode se aglutinar a células cancerosas que expressam CD99. Também é divulgada uma célula efetora imunológica modificada geneticamente para expressar o polipeptídeo CAR divulgado.

[0021] O agente de aglutinação anti-CD99 é, em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo que se aglutina especificamente a CD99. Por exemplo, o domínio de aglutinação a antígeno pode ser um Fab ou um fragmento variável de cadeia única (scFv) de um anticorpo que se aglutina especificamente a CD99. O agente de aglutinação anti- CD99 é, em algumas modalidades, um aptâmero que se aglutina especificamente a CD99. Por exemplo, o agente de aglutinação anti-CD99 pode ser um peptídeo aptâmero selecionado a partir de um conjunto de sequências aleatórias com base em sua capacidade de se aglutinar a CD99. O agente de aglutinação anti-CD99 também pode ser um ligando natural de CD99, ou uma variante e/ou fragmento do mesmo capaz de se aglutinar a CD99.

[0022] Em algumas modalidades, a região anti-CD99 do anticorpo ou CAR divulgado é derivada do hibridoma 1H3, 4C5, 9G12, 3C7, 2F11, 4D5, 4F4, 6A10 ou combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, a região anti-CD99 (por exemplo, scFv) pode compreender um domínio variável pesado (VH) com sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e um domínio leve variável (VL) com sequências CDR1, CDR2 e CDR3.

[0023] Em algumas modalidades, a sequência CDR1 do domínio VH compreende a sequência de aminoácidos GFDIKDTY (SEQ ID NO: 1), TYAMY (SEQ ID NO: 2), TFWM (SEQ ID NO: 3) ou TFWMQ (SEQ ID NO: 4); a sequência CDR2 do domínio V H compreende a sequência de aminoácidos IDPANGDT (SEQ ID NO: 5), RIRSKVNNYATYYADSVKDRFT (SEQ ID NO: 6) ou TIYPGDDDTRYTQKFKGRAT (SEQ ID NO: 7); a sequência CDR3 do domínio VH compreende a sequência de aminoácidos ARRGGLS (SEQ ID NO: 8), DPMDY (SEQ ID NO: 9) ou SGYERGPYYFDS (SEQ ID NO: 10) ou SGYERGPYYF (SEQ ID NO: 11); a sequência CDR1 do V L compreende a sequência de aminoácidos GNIHNY (SEQ ID NO: 12), GSSKSLLHSNGNTYLY (SEQ ID NO: 13), KSSQSLLCRSNQKNYLA (SEQ ID NO: 14) ou KSSQSLLYRSNQKNYLA (SEQ ID NO: 15); a sequência CDR2 do domínio VL compreende a sequência de aminoácidos NAKX (SEQ ID NO: 16), RVSNLAS (SEQ ID NO: 17) ou WASTRES (SEQ ID NO: 18); e a sequência CDR3 do domínio VL compreende a sequência de aminoácidos QHFWSTPWT (SEQ ID NO: 19), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 20) ou QQYYSYPLT (SEQ ID NO: 21).

[0024] Portanto, em algumas modalidades, o domínio VH anti-CD99 compreende a sequência de aminoácidos

EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDP

ANGDTRYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQFSNLTSEDTAVYYCARRGGLSW GQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 22, 1H3H7).

[0025] Portanto, em algumas modalidades, a cadeia pesada anti-CD99 é codificada pela sequência de ácidos nucleicos

[0026] GAGGTTCAACTGCAACAGTCTGGGGCAG

AGCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGC TTCGACATTAAAGACACCTATATCCACTGGGTGAAACAGAGGCCTGAACAG GGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTGATACTAGATA TGACCCGGAATTCCAGGGCAAGGCCTCTCTAACAGCTGACACATCCTCCA ATACAGCCTACCTACAATTCAGCAACCTGACATCTGAAGACACTGCCGTCT

ATTACTGTGCTAGAAGAGGCGGCCTCTCCTGGGGCCAAGGCACCACTCTC ACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 23, 1H3H7).

[0027] Portanto, em algumas modalidades, o domínio VH anti-CD99 compreende a sequência de aminoácidos

[0028] EVQLEESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN

TYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLF LHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSS (SEQ ID NO: 24, 4C5E2).

[0029] Portanto, em algumas modalidades, a cadeia pesada anti-CD99 é codificada pela sequência de ácidos nucleicos

[0030] GAGGTGCAGCTGGAGGAGTCTGGTGGAG

GATTGGTGCAGCCTAAAGGATCATTGAAACTCTCATGTGCCGCCTCCGGTT TCACCTTCAATACCTATGCCATGTACTGGGTCTGCCAGGCTCCAGGAAAG GGTTTGAAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTAAAGTTAATAATTATGCAACAT ATTATGCCGATTCAGTGAAAGACAGATTCACCATCTCCAGAGATGATTCAC AAAACATGCTCTTTCTGCACATGAACAACCTGAAAACTGAGGACACTGCCA

TATATTTCTGTGTGAGAGATCCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAATCTCAG TCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 25, 4C5E2).

[0031] Portanto, em algumas modalidades, o domínio VH anti-CD99 compreende a sequência de aminoácidos

[0032] EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN

TYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLF LHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSS (SEQ ID NO:26, 4C5H10).

[0033] Portanto, em algumas modalidades, a cadeia pesada anti-CD99 é codificada pela sequência de ácidos nucleicos

[0034] GAGGTGCAGCTTGTTGAGTCTGGTGGAG

TATATTTCTGTGTGAGAGATCCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAATCTCAG TCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:27, 4C5H10).

[0035] Portanto, em algumas modalidades, o domínio VH anti-CD99 compreende a sequência de aminoácidos

[0036] QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:28, 9G12C9).

[0037] Portanto, em algumas modalidades, a cadeia pesada anti-CD99 é codificada pela sequência de ácidos nucleicos

[0038] CAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGGCTG

AGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGC TACACGTTTACTACTTTCTGGATGCAGTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAG GGTCTGGAATGGATTGGGACTATTTATCCTGGAGATGATGATACTAGGTAC ACTCAGAAATTCAAGGGCAGGGCCACATTGACTGCAGATAAATCGTCCAC CACAGCCTACATGCAACTCAGCAACTTGTCATCTGAGGACTCTGCGGTCTA

TTACTGTGCAAGATCGGGGTATGAGAGGGGCCCATACTACTTTGACTCCT GGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO:29, 9G12C9).

[0039] Portanto, em algumas modalidades, o domínio VH anti-CD99 compreende a sequência de aminoácidos

[0040] DVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:30, 9G12G6 HB1).

[0041] Portanto, em algumas modalidades, a cadeia pesada anti-CD99 é codificada pela sequência de ácidos nucleicos

[0042] GATGTGAAGCTTCAGGAGTCTGGGGCTG

AGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGC TACACGTTTACTACTTTCTGGATGCAGCGGGTAAAACAGAGGCCTGGACA GGGTCTGGAATGGATTGGGACTATTTATCCTGGAGATGATGATACTAGGTA CACTCAGAAATTCAAGGGCAGGGCCACATTGACTGCAGATAAATCGTCCA CCACAGCCTACATGCAACTCAGCAACTTGTCATCTGAGGACTCTGCGGTCT

ATTACTGTGCAAGATCGGGGTATGAGAGGGGCCCATACTACTTTGACTCCT GGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 31, 9G12G6 HB1).

[0043] Em algumas modalidades, o domínio VH anti- CD99 compreende a sequência de aminoácidos

QVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWAKQRPGQGLEWIGTI

YPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYER GPYYFDSWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 32, 9G12G6 HB3).

[0044] Portanto, em algumas modalidades, a cadeia pesada anti-CD99 é codificada pela sequência de ácidos nucleicos

[0045] CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCTGGGGCTG

AGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGC TACACGTTTACTACTTTCTGGATGCAGTGGGCAAAACAGAGGCCTGGACA GGGTCTGGAATGGATTGGGACTATTTATCCTGGAGATGATGATACTAGGTA CACTCAGAAATTCAAGGGCAGGGCCACATTGACTGCAGATAAATCGTCCA CCACAGCCTACATGCAACTCAGCAACTTGTCATCTGAGGACTCTGCGGTCT

ATTACTGTGCAAGATCGGGGTATGAGAGGGGCCCATACTACTTTGACTCCT GGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 33, 9G12G6 HB3).

[0046] Em algumas modalidades, o domínio VL anti- CD99 compreende a sequência de aminoácidos

DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKT

LADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTTL ELEK (SEQ ID NO: 34, 1H3H9).

[0047] Portanto, em algumas modalidades, a cadeia leve anti-CD99 é codificada pela sequência de ácidos nucleicos

[0048] GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTC

CCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTG GGAATATTCACAATTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTC CTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAA GGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACAATATTCTCTCAAGATCAACAGCC

TGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGAGTACTCC GTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 35, 1H3H9).

[0049] Em algumas modalidades, o domínio VL anti- CD99 compreende a sequência de aminoácidos

[0050] GNSWSHSLRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLD

GNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRV EAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:36, 1H3H7 LC1).

[0051] Em algumas modalidades, o domínio VL anti- CD99 compreende a sequência de aminoácidos

[0052] GNSWRHSPRSLSVTIGQPASISCKSSQSLL

DGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISR VEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:37, 1H3H7 LC2).

[0053] Em algumas modalidades, o domínio VL anti- CD99 compreende a sequência de aminoácidos

[0054] DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLH

SNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVE AEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIK (SEQ ID NO:38, 4C5E2).

[0055] Portanto, em algumas modalidades, a cadeia leve anti-CD99 é codificada pela sequência de ácidos nucleicos

[0056] GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTC

TGTACCTGTCACTCCTGGGGAGTCAGTATCCATCTCCTGCGGGTCTAGTAA GAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAG GCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGGTGTCCAACCTTGCCT CAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACA CTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATG

CAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAGGCTGGAAAT AAAA (SEQ ID NO:39, 4C5E2).

[0057] Em algumas modalidades, o domínio VL anti- CD99 compreende a sequência de aminoácidos

[0058] DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLH

SNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVE AEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIK (SEQ ID NO:40, 4C5H10).

[0059] Portanto, em algumas modalidades, a cadeia leve anti-CD99 é codificada pela sequência de ácidos nucleicos

[0060] GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTC

CAACATCTAGAATATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAGGCTGGAAAT AAAA (SEQ ID NO:41, 4C5H10).

[0061] Em algumas modalidades, o domínio VL anti- CD99 compreende a sequência de aminoácidos

[0062] DTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLL

CRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS SVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:42, 9G12C9).

[0063] Portanto, em algumas modalidades, a cadeia leve anti-CD99 é codificada pela sequência de ácidos nucleicos

[0064] GACACTGTGATGTCACAGTCCCCATCCTC

CCTAGCTGTTTCAGTTGGAGAGAAGATAACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCA GAGTCTTTTATGTCGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCA GAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACAGCTGATTTACTGGGCATCTACTAGGG AATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGT

CAGCAATATTATAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGCACCAAGCTGGAG CTGAAA (SEQ ID NO:43, 9G12C9).

[0065] Em algumas modalidades, o domínio VL anti- CD99 compreende a sequência de aminoácidos

DTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYRSNQKNYLAWYQQKPGQSPK

QLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTF GAGTKLELK (SEQ ID NO: 44, 9G12G6).

[0066] Portanto, em algumas modalidades, a cadeia leve anti-CD99 é codificada pela sequência de ácidos nucleicos

[0067] GACACTGTGATGTCACAGTCCCCATCCTC

CCTAGCTGTTTCAGTTGGAGAGAAGATAACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCA GAGTCTTTTATATCGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCA GAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACAGCTGATTTACTGGGCATCTACTAGGG AATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACCATCAGCAGTGTGAAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGT

CAGCAATATTATAGTTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGCACCAAGCTGGAG CTGAAA (SEQ ID NO:45, 9G12G6).

[0068] As cadeias pesadas e leves são preferencialmente separadas por um ligante. Os ligantes adequados para anticorpos scFv são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o ligante compreende a sequência de aminoácidos GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 46). O scFv pode ter a fórmula geral NH 3-VH-ligante-VL-COOH ou NH3-VL- ligante-VH-COOH.

[0069] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0070] EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIK

DTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQ FSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQ MTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLA

DGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:47).

[0071] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0072] EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIK

DTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQ FSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGNS WSHSLRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLV

SKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTK LEIK (SEQ ID NO:48).

[0073] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0074] EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIK

DTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQ FSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGNS WRHSPRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLYLV

SKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGGTK LEIK (SEQ ID NO:49).

[0075] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0076] EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIK

DTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQ FSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIV MTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRV

SNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTR LEIK (SEQ ID NO:50).

[0077] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0078] EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIK

DTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQ FSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTV MSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLCRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIY

WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAG TKLELK (SEQ ID NO:51).

[0079] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0080] EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIK

DTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQ FSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDTV MSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIY

WASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAG TKLELK (SEQ ID NO:52).

[0081] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0082] EVQLEESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN

TYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLF LHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDI QMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTL

ADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEI K (SEQ ID NO:53).

[0083] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0084] EVQLEESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN

TYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLF LHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSG NSWSHSLRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLLY

LVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGG TKLEIK (SEQ ID NO:54).

[0085] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0086] EVQLEESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN

TYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLF LHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSG NSWRHSPRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLL

YLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGG GTKLEIK (SEQ ID NO: 55).

[0087] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0088] EVQLEESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN

TYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLF LHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDI VMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYR

VSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGT RLEIK (SEQ ID NO: 56).

[0089] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0090] EVQLEESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN

TYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLF LHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSD TVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLCRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQ

LIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFG AGTKLELK (SEQ ID NO:57).

[0091] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0092] EVQLEESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN

TYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLF LHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSD TVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQ

LIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFG AGTKLELK (SEQ ID NO:58).

[0093] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0094] EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN

ADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEI K (SEQ ID NO:59).

[0095] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0096] EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN

LVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGGG TKLEIK (SEQ ID NO:60).

[0097] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0098] EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN

YLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHFPRTFGG GTKLEIK (SEQ ID NO:61).

[0099] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0100] EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN

VSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGT RLEIK (SEQ ID NO:62).

[0101] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0102] EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN

LIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFG AGTKLELK (SEQ ID NO:63).

[0103] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0104] EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFN

LIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFG AGTKLELK (SEQ ID NO:64).

[0105] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0106] QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLL

VYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTF GGGTKLEIK (SEQ ID NO:65).

[0107] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0108] QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSGNSWSHSLRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPG

QSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHF PRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:66).

[0109] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0110] QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSGNSWRHSPRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPG

QSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHF PRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:67).

[0111] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0112] QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQ

SPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYP YTFGGGTRLEIK (SEQ ID NO:68).

[0113] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0114] QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLCRSNQKNYLAWYQQKP

GQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYY SYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:69).

[0115] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0116] QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYRSNQKNYLAWYQQKP

GQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYY SYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:70).

[0117] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0118] DVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLL

VYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTF GGGTKLEIK (SEQ ID NO:71).

[0119] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0120] DVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSGNSWSHSLRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPG

QSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHF PRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:72).

[0121] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0122] DVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSGNSWRHSPRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPG

QSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHF PRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:73).

[0123] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0124] DVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQ

SPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYP YTFGGGTRLEIK (SEQ ID NO:74).

[0125] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0126] DVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

SPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYP YTFGGGTRLEIK (SEQ ID NO:75).

[0127] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0128] DVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLCRSNQKNYLAWYQQKP

GQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYY SYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:76).

[0129] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0130] DVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYRSNQKNYLAWYQQKP

GQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYY SYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:77).

[0131] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0132] QVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLL

VYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPWTF GGGTKLEIK (SEQ ID NO:78).

[0133] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0134] QVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSGNSWSHSLRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPG

QSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHF PRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:79).

[0135] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0136] QVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSGNSWRHSPRSLSVTIGQPASISCKSSQSLLDGNGKTYLNWLLQRPG

QSPKRLLYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCWQGTHF PRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:80).

[0137] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0138] QVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQ

SPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYP YTFGGGTRLEIK (SEQ ID NO:81).

[0139] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0140] QVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

SPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYP YTFGGGTRLEIK (SEQ ID NO:82).

[0141] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0142] QVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLCRSNQKNYLAWYQQKP

GQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYY SYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:83).

[0143] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0144] QVQLKESGAELARPGASVKLSCKASGYTFT

TFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYM QLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGS GGGGSDTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLLYRSNQKNYLAWYQQKP

GQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYY SYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:84).

[0145] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0146] DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHN

YLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDF GSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAEL VKPGASVKLSCTASGFDIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRYDPEF

QGKASLTADTSSNTAYLQFSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:85).

[0147] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0148] DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHN

YLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDF GSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLEESGGGL VQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYY

ADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTV SS (SEQ ID NO:86).

[0149] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0150] DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHN

YLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDF GSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGL VQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNYATYY

ADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGISVTV SS (SEQ ID NO:87).

[0151] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0152] DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHN

YLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDF GSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAE LARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYT

QKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWG QGTTLTVSS (SEQ ID NO:88).

[0153] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0154] DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHN

YLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDF GSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSDVKLQESGAEL ARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQ

KFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQ GTTLTVSS (SEQ ID NO:89).

[0155] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0156] DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHN

YLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDF GSYYCQHFWSTPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKESGAEL ARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDTRYTQ

KFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDSWGQ GTTLTVSS (SEQ ID NO:90).

[0157] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0158] DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLH

SNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVE AEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQS GAELVKPGASVKLSCTASGFDIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDTRY

DPEFQGKASLTADTSSNTAYLQFSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTLTV SS (SEQ ID NO:91).

[0159] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0160] DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLH

SNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVE AEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLEES GGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNY

ATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGI SVTVSS (SEQ ID NO:92).

[0161] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0162] DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLH

SNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVE AEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVES GGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVNNY

ATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQGI SVTVSS (SEQ ID NO:93).

[0163] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0164] DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLH

SNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVE AEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQS GAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDT

RYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDS WGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:94).

[0165] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0166] DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLH

SNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVE AEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSDVKLQES GAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDT

RYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDS WGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:95).

[0167] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0168] DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCGSSKSLLH

SNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRVSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVE AEDVGVYYCMQHLEYPYTFGGGTRLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKES GAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDDDT

RYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYFDS WGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:96).

[0169] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0170] DTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLL

CRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS SVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQ QSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDT

RYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQFSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTL TVSS (SEQ ID NO:97).

[0171] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0172] DTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLL

CRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS SVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLE ESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVN

NYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQ GISVTVSS (SEQ ID NO:98).

[0173] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0174] DTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLL

CRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS SVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLV ESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVN

NYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQ GISVTVSS (SEQ ID NO:99).

[0175] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0176] DTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLL

CRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS SVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQL QQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGD

DDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYY FDSWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:100).

[0177] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0178] DTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLL

CRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS SVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSDVKLQ ESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDD

DTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYF DSWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:101).

[0179] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0180] DTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLL

CRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS SVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLK ESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDD

DTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYF DSWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:102).

[0181] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0182] DTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLL

YRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS SVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQ QSGAELVKPGASVKLSCTASGFDIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDT

RYDPEFQGKASLTADTSSNTAYLQFSNLTSEDTAVYYCARRGGLSWGQGTTL TVSS (SEQ ID NO:103).

[0183] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0184] DTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLL

YRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS SVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLE ESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVN

NYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQ GISVTVSS (SEQ ID NO:104).

[0185] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0186] DTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLL

YRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS SVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLV ESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMYWVCQAPGKGLKWVARIRSKVN

NYATYYADSVKDRFTISRDDSQNMLFLHMNNLKTEDTAIYFCVRDPMDYWGQ GISVTVSS (SEQ ID NO:105).

[0187] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0188] DTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLL

YRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS SVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQL QQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGD

DDTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYY FDSWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:106).

[0189] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0190] DTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLL

YRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS SVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSDVKLQ ESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQRVKQRPGQGLEWIGTIYPGDD

DTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYF DSWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:107).

[0191] Em algumas modalidades, o scFv anti-CD99 compreende uma sequência de aminoácidos:

[0192] DTVMSQSPSSLAVSVGEKITMSCKSSQSLL

YRSNQKNYLAWYQQKPGQSPKQLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTIS SVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLK ESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTTFWMQWAKQRPGQGLEWIGTIYPGDD

DTRYTQKFKGRATLTADKSSTTAYMQLSNLSSEDSAVYYCARSGYERGPYYF DSWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:108).

[0193] Como com outros CARs, os polipeptídeos divulgados também podem conter um domínio transmembranar e um endodomínio capaz de ativar uma célula efetora imunológica. Por exemplo, o endodomínio pode conter um domínio de sinalização e uma ou mais regiões de sinalização coestimulatórias.

[0194] Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular é um domínio de sinalização CD3 zeta (CD3ζ). Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimulatória compreende o domínio citoplasmático de CD28, 4-1BB ou uma combinação dos mesmos. Em alguns casos, a região de sinalização coestimulatória contém 1, 2, 3 ou 4 domínios citoplasmáticos de uma ou mais moléculas coestimulatórias e/ou sinalizadoras intracelulares. Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimulatória contém uma ou mais mutações nos domínios citoplasmáticos de CD28 e/ou 4-1BB que melhoram a sinalização.

[0195] Em algumas modalidades, o polipeptídeo CAR contém um endodomínio incompleto. Por exemplo, o polipeptídeo CAR pode conter apenas um domínio de sinalização intracelular ou um domínio coestimulatório, mas não ambos. Nessas modalidades, a célula efetora imunológica não é ativada, a menos que ela e um segundo polipeptídeo CAR (ou receptor de células T endógeno) que contém o domínio ausente ambos se aglutinem a seus respectivos antígenos. Portanto, em algumas modalidades, o polipeptídeo CAR contém um domínio de sinalização CD3 zeta (CD3ζ), mas não contém uma região de sinalização coestimulatória (CSR). Em outras modalidades, o polipeptídeo CAR contém o domínio citoplasmático de CD28, 4- 1BB ou uma combinação dos mesmos, mas não contém um domínio de sinalização (SD) CD3 zeta (CD3ζ).

[0196] Também são divulgadas sequências isoladas de ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos CAR divulgados, vetores compreendendo esses ácidos nucleicos isolados e células contendo esses vetores. Por exemplo, a célula pode ser uma célula efetora imunológica selecionada a partir do grupo que consiste em células T alfa-beta, uma célula T gama-delta, uma célula Exterminadora Natural (NK), uma célula Exterminadora Natural T (NKT), uma célula B, uma célula linfoide inata (ILC), uma célula exterminadora induzida por citocinas (CIK), um linfócito T citotóxico (CTL), uma célula exterminadora ativada por linfocinas (LAK) e uma célula T reguladora.

[0197] Em algumas modalidades, a célula exibe uma imunidade antitumoral quando o domínio de aglutinação a antígeno do CAR se aglutina ao CD99.

[0198] Também é divulgado um método de fornecer uma imunidade antitumoral em um sujeito com um câncer que expressa CD99 que envolve a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma célula efetora imune geneticamente modificada com um CAR específico para CD99 divulgado.

[0199] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados nos desenhos anexos e na descrição abaixo. Outras características, objetos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e desenhos e das reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0200] A Figura 1 contém um gráfico de citometria de fluxo mostrando a porta usada para células vivas na análise de CD99-PE.

[0201] A Figura 2 contém gráficos de citometria de fluxo que mostram controles positivos (direito) e negativos (esquerdo) usados para análise de CD99-PE.

[0202] A Figura 3 contém gráficos de citometria de fluxo que mostram hibridomas positivos para CD99.

[0203] A Figura 4 contém um gráfico representando a aglutinação a CD99 por absorção de ELISA para cada hibridoma.

[0204] A Figura 5 contém gráficos de citometria de fluxo mostrando a triagem secundária de 1H3H7, IH3E9, 4C5E2, 4C5H10, 9G12C9 e 9G12G6.

[0205] As Figuras 6A a 6D mostram atividades citotóxicas de CARs anti-CD99. As células CHO com superexpressão de CD99 (CHO-CD99) foram usadas como células-alvo. Os gamarretrovírus que expressam CARs anti-CD99 foram transduzidos em células T primárias isoladas de PBMCs saudáveis. A eficiência de transdução de cada CAR foi determinada por análise citométrica de fluxo da expressão de mCherry (Figuras 6A e 6B). As células CAR positivas foram adicionadas às células alvo nas relações efetoras- alvo de 1:1 (Figura 6C) ou 1:5 (Figura 6D). UT = Não transduzido, MFI = intensidade mediana de fluorescência.

[0206] As Figuras 7A a 7C mostram secreção de citocinas por CARs anti-CD99. As células CAR positivas foram coincubadas com células-alvo CHO-CD99 com uma razão efetor-alvo de 1:1 durante a noite. Após a coincubação, os sobrenadantes foram coletados e a produção das citocinas IFNγ (Figura 7A), IL-2 (Figura 7B) e IL-6 (Figura 7C) foi analisada. UT = Não transduzido.

[0207] As Figuras 8A a 8I mostram imunofenótipo de CARs anti-CD99. As células T saudáveis isoladas de PBMCs foram transduzidas com CARs anti-CD99. Após 1 semana de cultura sem estimulação de antígeno, as células foram coradas para CD3, CD4, CD8, PD1, CCR7 e CD45RA, e os dados foram coletados em um citômetro de fluxo. A eficiência da transdução foi determinada com base na expressão de mCherry (Figuras 8A e 8B). As células T CAR positivas vivas foram analisadas quanto à expressão de CD4, CD8 e PD1 (Figuras 8C a 8H). Os subconjuntos de células T também foram analisados com base na expressão de CCR7 e CD45RA (Figura 8I). EFF = efetor, EM = memória efetiva, CM = memória central, N = Virgem.

[0208] As Figuras 9A a 9F mostram imunofenótipo CD4 e CD8 de CARs anti-CD99. As células T CD4 e CD8 foram analisadas quanto à expressão de PD1 (Figuras 9A e 9B, 9D e 9E) e para subconjuntos de células T (Figuras 9C e 9F). EFF = efetor, EM = memória efetiva, CM = memória central, N = Virgem.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0209] Aqui são divulgados anticorpos biespecíficos e receptores de antígeno quimérico (CAR), que podem reconhecer especificamente antígenos associados a tumores (TAA) em cânceres que expressam CD99. Também são divulgadas células efetoras imunes, como células T ou células Exterminadoras Naturais (NK), que são geneticamente modificadas para expressar esses CARs. Portanto, também são divulgados métodos para fornecer uma imunidade antitumoral em um sujeito com cânceres que expressam CD99 usando os anticorpos e as células efetoras imunes divulgados.

ANTICORPOS

[0210] Os anticorpos que podem ser utilizados nas composições e métodos divulgados incluem imunoglobulina completa (isto é, um anticorpo intacto) de qualquer classe, fragmentos do mesmo e proteínas sintéticas que contêm pelo menos o domínio variável de aglutinação a antígeno de um anticorpo. Os domínios variáveis diferem na sequência entre os anticorpos e são utilizados na aglutinação e especificidade de cada anticorpo em particular para o seu antígeno em particular. No entanto, a variabilidade geralmente não é distribuída uniformemente através dos domínios variáveis dos anticorpos. A mesma é tipicamente concentrada em três segmentos chamados regiões determinantes de complementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis da cadeia leve quanto da cadeia pesada. As partes mais altamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas de estruturais (FR). Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compreendem quatro regiões FR, adotando amplamente uma configuração de folha beta, conectada por três CDRs, que formam laços conectando e, em alguns casos, formando parte da estrutura da folha beta. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas nas proximidades das regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do local de aglutinação a antígeno dos anticorpos.

[0211] Animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção endógena de imunoglobulina, podem ser empregados. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de união da cadeia pesada do anticorpo (J (H)) em camundongos mutantes quiméricos e da linha germinativa resulta em inibição completa da produção endógena de anticorpos. A transferência da matriz de genes da imunoglobulina da linha germinativa humana nesses camundongos mutantes da linha germinativa resultará na produção de anticorpos humanos por desafio ao antígeno (ver, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 a 258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)). Os anticorpos humanos também podem ser produzidos em bibliotecas de exibição de fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)). As técnicas de Cote et al. e Boerner et al. também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1): 86 a 95 (1991)).

[0212] Opcionalmente, os anticorpos são gerados em outras espécies e "humanizados" para administração em seres humanos. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou seus fragmentos (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de anticorpos de aglutinação a antígeno) que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais os resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do anticorpo receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador), como camundongo, rato ou coelho com especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos estruturais de Fv da imunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados também podem compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem nas CDRs importadas ou nas sequências estruturais. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos os pelo menos um e, tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou praticamente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana (Jones et al., Nature, 321: 522 a 525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323 a 327 (1988) e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593 a 596 (1992))

[0213] Os métodos para humanizar anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente referidos como resíduos de "importação", que geralmente são retirados de um domínio variável de "importação". As técnicas de humanização de anticorpos geralmente envolvem o uso da tecnologia de DNA recombinante para manipular a sequência de DNA que codifica uma ou mais cadeias polipeptídicas de uma molécula de anticorpo. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522 a 525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323 a 327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1.534 a 1.536 (1988)), substituindo CDRs ou sequências CDR de roedores pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Por conseguinte, uma forma humanizada de um anticorpo não humano (ou um fragmento do mesmo) é um anticorpo ou fragmento quimérico (Pat. n.º 4.816.567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de locais análogos nos anticorpos de roedores.

[0214] Também são divulgados fragmentos de anticorpos que têm bioatividade. Os fragmentos, estejam ligados a outras sequências ou não, incluem inserções, deleções, substituições ou outras modificações selecionadas de regiões específicas ou resíduos de aminoácidos específicos, desde que a atividade do fragmento não seja significativamente alterada ou prejudicada em comparação com o anticorpo ou fragmento de anticorpo não modificado.

[0215] As técnicas também podem ser adaptadas para a produção de anticorpos de cadeia única específicos para uma proteína antigênica da presente divulgação. Os métodos para a produção de anticorpos de cadeia única são bem conhecidos dos versados na técnica. Um anticorpo de cadeia única pode ser criado fundindo os domínios variáveis das cadeias pesada e leve usando um ligante peptídeo curto, reconstituindo desse modo um local de aglutinação a antígeno em uma única molécula. Fragmentos variáveis de anticorpo de cadeia única (scFvs) em que o terminal C de um domínio variável está amarrado ao terminal N do outro domínio variável por meio de um peptídeo ou ligante de 15 a 25 aminoácidos, foram desenvolvidos sem interromper significativamente a aglutinação a antígeno ou especificidade da aglutinação. O ligante é escolhido para permitir que a cadeia pesada e a cadeia leve se aglutinem em sua orientação conformacional adequada.

[0216] Fragmentos variáveis de cadeia única divergentes (di-scFvs) podem ser geneticamente modificados através da aglutinação de dois scFvs. Isso pode ser feito produzindo uma única cadeia peptídica com duas regiões VH e duas VL, produzindo scFvs em tandem. Os ScFvs também podem ser projetados com peptídeos ligantes que são curtos demais para as duas regiões variáveis se dobrarem (cerca de cinco aminoácidos), forçando os scFvs a dimerizar. Esse tipo é conhecido como diacorpos. Foi demonstrado que os diacorpos têm constantes de dissociação até

40 vezes inferiores aos scFvs correspondentes, o que significa que eles têm uma afinidade muito maior ao seu alvo. Ligantes ainda mais curtos (um ou dois aminoácidos) levam à formação de trímeros (triacorpos ou tricorpos). Tetracorpos também foram produzidos. Eles exibem uma afinidade ainda maior com seus alvos do que os diacorpos.

[0217] Um anticorpo biespecífico projetado para aglutinar seletivamente CD3 e CD99 desencadearia ativação não específica de células T e tempestade de citocinas. Um diacorpo biespecífico projetado para aglutinar seletivamente CD3 e CD99 teria um peso molecular (55 a 60 kD) menor que o limiar de depuração renal, o que resultaria em eliminação rápida. Como tal, os diacorpos devem ser administrados por infusão contínua. O anticorpo biespecífico tetravalente divulgado pode ter um peso molecular (por exemplo, 105 a 110 kD) maior que o limiar de filtração renal com PK acentuadamente prolongada.

[0218] São fornecidos polipeptídeos de fusão capazes de formar um anticorpo geneticamente modificado multivalente que é capaz de engate a células T para destruir células malignas que expressam CD99. O anticorpo geneticamente modificado pode compreender, por exemplo, pelo menos um scFv, pelo menos um fragmento Fab, pelo menos um fragmento Fv, etc. O mesmo pode ser bivalente, trivalente, tetravalente, etc. Os anticorpos multivalentes são multiespecíficos, por exemplo, biespecíficos, triespecíficos, tetraespecíficos, etc. Os anticorpos multivalentes podem estar em qualquer forma, como um diacorpo, triacorpo, tetracorpo, etc.

[0219] Os anticorpos bivalentes e biespecíficos podem ser construídos usando apenas domínios variáveis de anticorpos. Um método bastante eficiente e relativamente simples é tornar a sequência do ligante entre os domínios VH e VL tão curta que eles não possam se dobrar e se aglutinar. A redução do comprimento do ligante para 3 a 12 resíduos evita a configuração monomérica da molécula scFv e favorece os pares VH-VL intermoleculares com a formação de um “diacorpo" de dímero scFv não covalente de 60 kDa. O formato diacorpo também pode ser usado para a geração de anticorpos biespecíficos recombinantes, que são obtidos pela associação não covalente de dois produtos de fusão de cadeia única, consistindo no domínio VH de um anticorpo conectado por um ligante curto ao domínio VL de outro anticorpo. Reduzir o comprimento do ligante ainda mais abaixo de três resíduos pode resultar na formação de trímeros (“triacorpo", cerca de 90 kDa) ou tetrâmeros (“tetracorpo", cerca de 120 kDa). Para uma revisão de anticorpos geneticamente modificados, particularmente fragmentos de domínio único, ver Holliger e Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23: 1.126 a 1.136. Todos esses anticorpos geneticamente modificados podem ser utilizados nos polipeptídeos de fusão aqui fornecidos. O Tetravalent Tandab® pode ser preparado substancialmente como descrito nos documentos WO 1999057150 A3 ou US20060233787, que são incorporados por referência para o ensino dos métodos de produção de moléculas Tandab®.

[0220] Os locais de reconhecimento de antígeno ou regiões variáveis inteiras dos anticorpos geneticamente modificados podem ser derivados de um ou mais anticorpos parentais direcionados contra qualquer antígeno de interesse (por exemplo, CD99). Os anticorpos parentais podem incluir anticorpos ou fragmentos de anticorpo de ocorrência natural, anticorpos ou fragmentos de anticorpo adaptados de anticorpos de ocorrência natural, anticorpos construídos de novo usando sequências de anticorpos ou fragmentos de anticorpo conhecidos por serem específicos para um antígeno de interesse. Sequências que podem ser derivadas de anticorpos parentais incluem regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve e/ou CDRs, regiões estruturais ou outras porções das mesmas.

[0221] Os anticorpos multivalentes e multiespecíficos podem conter uma cadeia pesada compreendendo duas ou mais regiões variáveis e/ou uma cadeia leve que compreende uma ou mais regiões variáveis em que pelo menos duas das regiões variáveis reconhecem epítopos diferentes no mesmo antígeno.

[0222] Os anticorpos geneticamente modificados candidatos para inclusão nos polipeptídeos de fusão, ou nos próprios polipeptídeos de fusão, podem ser triados quanto à atividade usando uma variedade de ensaios conhecidos. Por exemplo, ensaios de triagem para determinar a especificidade de aglutinação são bem conhecidos e praticados rotineiramente na técnica. Para uma discussão abrangente de tais ensaios, consulte Harlow et al. (Eds.), ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, N.Y., 1988, Capítulo 6.

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

[0223] Também é divulgada uma composição farmacêutica que compreende uma molécula divulgada em um carreador farmaceuticamente aceitável. Os carreadores farmacêuticos são conhecidos dos versados na técnica. Esses seriam tipicamente carreadores padrão para administração de fármacos a seres humanos, incluindo soluções como água estéril, solução salina e soluções tamponadas a pH fisiológico. Por exemplo, carreadores adequados e suas formulações são descritos em Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21 ed.) Ed. PP. Gerbino, Lippincott Williams e Wilkins, Filadélfia, PA. 2005. Tipicamente, uma quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável é usada na formulação para tornar a formulação isotônica. Exemplos do carreador farmaceuticamente aceitável incluem, mas não estão limitados a, solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose. O pH da solução é preferencialmente de cerca de 5 a cerca de 8, e mais preferencialmente de cerca de 7 a cerca de 7,5. A solução deve estar livre de RNAse. Outros carreadores incluem preparações de liberação sustentada, tais como matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes, lipossomas ou micropartículas. Será evidente para aqueles versados na técnica que certos carreadores podem ser mais preferíveis dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração da composição sendo administrada.

[0224] As composições farmacêuticas podem incluir carreadores, espessantes, diluentes, tampões, conservantes, agentes tensoativos e similares, além da molécula de escolha. As composições farmacêuticas também podem incluir um ou mais ingredientes ativos, como agentes antimicrobianos, agentes anti-inflamatórios, anestésicos e similares.

[0225] As preparações para administração parentérica incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas estéreis. Exemplos de solventes não aquosos incluem o propilenoglicol, o polietilenoglicol, óleos vegetais tais como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Os carreadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e meios tamponados. Os veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer com lactato ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos (como os baseados na dextrose de Ringer) e similares. Conservantes e outros aditivos também podem estar presentes, como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e similares.

[0226] Algumas das composições podem potencialmente ser administradas como um sal de adição de ácido ou base farmaceuticamente aceitável, formado por reação com ácidos inorgânicos, como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido perclórico, ácido nítrico, ácido tiociânico, ácido sulfúrico e ácido fosfórico, e ácidos orgânicos como ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido lático, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido maleico e ácido fumárico, ou por reação com uma base inorgânica, como hidróxido de sódio, hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, e bases orgânicas, como mono-, di-, trialquila e arilaminas e etanolaminas substituídas.

MÉTODOS DE TRATAMENTO

[0227] Também é divulgado um método para o tratamento de um câncer que expressa CD99 em um sujeito, administrando ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição farmacêutica divulgada. O método pode ainda envolver a administração ao sujeito de uma quimioterapia, como fludarabina, citarabina, ciclofosfamida, idarubicina, daunorrubicina ou um inibidor alvejado, como imbruvica, midostaurina, idelalisibe ou agentes imunológicos, como inibidores de PD1 ou PDL1.

[0228] As composições divulgadas, incluindo a composição farmacêutica, podem ser administradas de várias maneiras, dependendo de se o tratamento local ou sistêmico é desejado e da área a ser tratada. Por exemplo, as composições divulgadas podem ser administradas por via intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intracavidade ou transdérmica. As composições podem ser administradas por via oral, parentérica (por exemplo, por via intravenosa), por injeção intramuscular, por injeção intraperitoneal, por via transdérmica, extracorpórea, oftalmicamente, vaginal, retal, intranasal, tópica ou similar, incluindo administração intranasal tópica ou administração por inalante.

[0229] A administração parentérica da composição, se usada, é geralmente caracterizada por injeção. Os injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, como soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas adequadas para solução de suspensão em líquido antes da injeção ou como emulsões. Uma abordagem revisada para administração parenteral envolve o uso de um sistema de liberação lenta ou de liberação sustentada, de modo que uma dosagem constante seja mantida.

[0230] As composições aqui divulgadas podem ser administradas profilaticamente a pacientes ou sujeitos que estão em risco de um câncer que expressa CD99. Assim, o método pode ainda compreender a identificação de um sujeito em risco de um câncer que expressa CD99 antes da administração das composições aqui divulgadas.

[0231] A quantidade exata das composições necessárias variará de sujeito para sujeito, dependendo da espécie, idade, peso e condição geral do indivíduo, gravidade do distúrbio alérgico a ser tratado, ácido ou vetor nucleico específico usado, seu modo de administração e similar. Portanto, não é possível especificar uma quantidade exata para cada composição. No entanto, uma quantidade apropriada pode ser determinada por um versado na técnica usando apenas experimentação de rotina, dados os ensinamentos aqui apresentados. Por exemplo, dosagens e esquemas eficazes para administrar as composições podem ser determinados empiricamente, e a realização dessas determinações está dentro dos conhecimentos da técnica. As faixas de dosagem para a administração das composições são grandes o suficiente para produzir o efeito desejado no qual os distúrbios dos sintomas são afetados. A dosagem não deve ser tão grande que cause efeitos colaterais adversos, como reações cruzadas indesejadas, reações anafiláticas e similares. Geralmente, a dosagem varia com a idade, condição, sexo e extensão da doença no paciente, via de administração ou se outros fármacos estão incluídos no regime, e pode ser determinada por um versado na técnica. A dosagem pode ser ajustada pelo médico em caso de contraindicação. A dosagem pode variar e pode ser administrada em uma ou mais doses diárias, por um ou vários dias. Pode ser encontrada orientação na literatura para dosagens apropriadas para determinadas classes de produtos farmacêuticos. Uma dosagem diária típica da composição divulgada usada sozinha pode variar de cerca de 1 µg/kg a até 100 mg/kg de peso corporal ou mais por dia, dependendo dos fatores mencionados acima.

[0232] Em algumas modalidades, a molécula é administrada em uma dose equivalente à administração parenteral de cerca de 0,1 ng a cerca de 100 g por kg de peso corporal, cerca de 10 ng a cerca de 50 g por kg de peso corporal, cerca de 100 ng a cerca de 1 g por kg de peso corporal, de cerca de 1 μg a cerca de 100 mg por kg de peso corporal, de cerca de 1 μg a cerca de 50 mg por kg de peso corporal, de cerca de 1 mg a cerca de 500 mg por kg de peso corporal; e de cerca de 1 mg a cerca de 50 mg por kg de peso corporal. Como alternativa, a quantidade de molécula que contém lenalidomida administrada para atingir uma dose terapêutica eficaz é de cerca de 0,1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 μg, 10 μg, 100 μg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 500 mg por kg de peso corporal ou superior. RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICO (CAR) ESPECÍFICOS PARA CD99

[0233] Os CARs geralmente incorporam um domínio de reconhecimento de antígeno a partir dos fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) de um anticorpo monoclonal (mAb) com motivos de sinalização transmembranar envolvidos na ativação de linfócitos (Sadelain M, et al. Nat Rev Cancer 2003 3: 35 a 45). É divulgado aqui um receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para CD99 que pode ser expresso em células efetoras imunes para aumentar a atividade antitumoral contra CARs específicos para CD99.

[0234] O CAR divulgado é geralmente composto de três domínios: um ectodomínio, um domínio transmembranar e um endodomínio. O ectodomínio compreende a região de aglutinação ao CD99 e é responsável pelo reconhecimento do antígeno. Ele também contém opcionalmente um peptídeo sinal (SP) para que o CAR possa ser glicosilado e ancorado na membrana celular da célula efetora imunológica. O domínio transmembranar (TD), como o próprio nome sugere, conecta o ectodomínio ao endodomínio e reside na membrana celular quando expresso por uma célula. O endodomínio é a extremidade ativa do CAR que transmite um sinal de ativação para a célula efetora do sistema imunológico após o reconhecimento do antígeno. Por exemplo, o endodomínio pode conter um domínio de sinalização (ISD) e uma região de sinalização coestimulatória (CSR).

[0235] Um "domínio de sinalização (SD)" geralmente contém motivos de ativação baseados em tirosina de imunorreceptores (ITAMs)

que ativam uma cascata de sinalização quando o ITAM é fosforilado. O termo "região de sinalização coestimulatória (CSR)" refere-se a domínios de sinalização intracelular de receptores de proteínas coestimulatórias, como CD28, 41BB e ICOS, capazes de melhorar a ativação de células T por receptores de células T.

[0236] Em algumas modalidades, o endodomínio contém um SD ou um CSR, mas não ambos. Nessas modalidades, uma célula efetora imunológica contendo o CAR divulgado é ativada apenas se outro CAR (ou um receptor de célula T) contendo o domínio ausente também se aglutinar ao seu antígeno respectivo.

[0237] Em algumas modalidades, o CAR divulgado é definido pela fórmula:

[0238] SP-CD99-HG-TM-CSR-SD; ou

[0239] SP-CD99-HG-TM-SD-CSR;

[0240] em que "SP" representa um peptídeo de sinal opcional,

[0241] em que "CD99" representa uma região de aglutinação a CD99,

[0242] em que "HG" representa um domínio de dobradiça opcional,

[0243] em que "TM" representa um domínio transmembranar,

[0244] em que "CSR" representa uma ou mais regiões de sinalização coestimulatórias,

[0245] em que "SD" representa um domínio de sinalização e

[0246] em que "-" representa uma aglutinação peptídica ou ligante.

[0247] Construtos CAR adicionais são descritos, por exemplo, em Fresnak AD, et al. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 23 de agosto de 2016; 16 (9): 566 a 581, que é incorporado por referência na sua totalidade para o ensino desses modelos de CAR.

[0248] Por exemplo, o CAR pode ser um TRUCK, um CAR Universal, um CAR autônomo, um CAR Blindado, um CAR de autodestruição, um CAR Condicional, um CAR Marcado, um TenCAR, um CAR Duplo ou um sCAR.

[0249] TRUCKs (células T redirecionadas para o extermínio universal de citocinas) coexpressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) e uma citocina antitumoral. A expressão de citocinas pode ser constitutiva ou induzida pela ativação de células T. Alvejado pela especificidade do CAR, a produção localizada de citocinas pró-inflamatórias recruta células imunes endógenas para locais tumorais e pode potencializar uma resposta antitumoral.

[0250] As células T universais e alogênicas de CAR são geneticamente modificadas para não expressar mais o receptor endógeno de células T (TCR) e/ou moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), prevenindo, assim, a doença ou a rejeição do enxerto contra o hospedeiro (GVHD), respectivamente.

[0251] Os CARs autônomos coexpressam um CAR e um receptor de quimiocina, que se aglutina a um ligando tumoral, melhorando, assim, o retorno do tumor.

[0252] As células T CAR geneticamente modificadas para serem resistentes à imunossupressão (CAR blindados) podem ser geneticamente modificadas para não expressar mais várias moléculas de ponto de verificação imune (por exemplo, antígeno 4 citotóxico associado a linfócitos T (CTLA4) ou proteína de morte celular programada 1 (PD1)), com um receptor de troca de ponto de verificação imune, ou podem ser administradas com um anticorpo monoclonal que bloqueia a sinalização de ponto de verificação imune.

[0253] Um CAR de autodestruição pode ser projetado usando RNA entregue por eletroporação para codificar o CAR. Alternativamente, a apoptose induzível da célula T pode ser alcançada com base na aglutinação do ganciclovir à timidina-quinase em linfócitos com modificação de genes ou no sistema de ativação da caspase 9 humana por um dimerizador de pequenas moléculas mais recentemente descrito.

[0254] Uma célula T CAR condicional é, por padrão, sem resposta ou desativada, até a adição de uma molécula pequena para completar o circuito, permitindo a transdução completa do sinal 1 e do sinal 2, ativando a célula T CAR. Alternativamente, as células T podem ser geneticamente modificadas para expressar um receptor específico do adaptador com afinidade para anticorpos secundários administrados subsequentemente direcionados ao antígeno alvo.

[0255] As células T CAR marcadas expressam um CAR mais um epítopo tumoral ao qual um agente anticorpo monoclonal existente se aglutina. No cenário de efeitos adversos intoleráveis, a administração do anticorpo monoclonal limpa as células T CAR e alivia os sintomas sem efeitos adicionais fora do tumor.

[0256] Uma célula T em tandem de CAR (TanCAR) expressa um único CAR que consiste em dois fragmentos variáveis de cadeia única ligados (scFvs) que têm afinidades diferentes fundidas com domínio (ou domínios) coestimulatório intracelular e um domínio CD3ζ. A ativação das células T TanCAR é alcançada apenas quando as células alvo coexpressam os dois alvos.

[0257] Uma célula T dupla CAR expressa dois CAR separados com diferentes alvos de aglutinação ao ligando; um CAR inclui apenas o domínio CD3ζ e o outro CAR inclui apenas os domínios coestimulatórios. A ativação dupla de células T CAR requer a coexpressão de ambos os alvos no tumor.

[0258] Um CAR de segurança (sCAR) consiste em um scFv extracelular fundido com um domínio inibitório intracelular. As células T sCAR que coexpressam um CAR padrão são ativadas apenas quando encontram células alvo que possuem o alvo CAR padrão, mas não possuem o alvo sCAR.

[0259] O domínio de reconhecimento de antígeno do CAR divulgado é geralmente um scFv. No entanto, existem muitas alternativas. Um domínio de reconhecimento de antígeno das cadeias únicas alfa e beta do receptor de células T nativas (TCR) foi descrito, como possui ectodomínios simples (por exemplo, ectodomínio CD4 para reconhecer células infectadas pelo HIV) e componentes de reconhecimento mais exóticos, como uma citocina ligada (que leva a reconhecimento de células portadoras do receptor de citocinas). De fato, quase tudo o que se aglutina a um determinado alvo com alta afinidade pode ser usado como uma região de reconhecimento de antígeno.

[0260] O endodomínio é a extremidade ativa do CAR que, após o reconhecimento do antígeno, transmite um sinal para a célula efetora do sistema imunológico, ativando pelo menos uma das funções efetoras normais da célula efetora do sistema imunológico. A função efetora de uma célula T, por exemplo, pode ser atividade citolítica ou atividade auxiliar, incluindo a secreção de citocinas. Portanto, o endodomínio pode compreender o "domínio de sinalização intracelular" de um receptor de células T (TCR) e correceptores opcionais. Embora geralmente todo o domínio de sinalização intracelular possa ser empregado, em muitos casos, não é necessário usar toda a cadeia. Na medida em que uma porção truncada do domínio de sinalização intracelular é usada, essa porção truncada pode ser usada no lugar da cadeia intacta, desde que transduza o sinal da função efetora.

[0261] As sequências de sinalização citoplasmáticas que regulam a ativação primária do complexo TCR que atua de maneira estimulatória podem conter motivos de sinalização que são conhecidos como motivos de ativação baseados em tirosina imunorreceptores (ITAMs). Exemplos de sequências de sinalização citoplasmáticas contendo ITAM incluem aquelas derivadas de CD8, CD3ζ, CD3δ, CD3γ, CD3ε, CD32 (Fc gama RIIa), DAP10, DAP12, CD79a, CD79b, FcγRIγ, FcγRIIIγ, FcεRIβ (FCERIB) e FcεRIγ (FCERIB) e FcεRIγ (FCIGIB).

[0262] Em modalidades particulares, o domínio de sinalização intracelular é derivado de CD3 zeta (CD3ζ) (TCR zeta, GenBank accno. BAG36664.1). A cadeia CD3 zeta (CD3ζ) da glicoproteína de superfície das células T, também conhecida como cadeia zeta T3 do receptor de células T ou CD247 (Agrupamento de Diferenciação, Cluster of Differentiation 247), é uma proteína que em humanos é codificada pelo gene CD247.

[0263] Os CARs de primeira geração geralmente possuíam o domínio intracelular da cadeia CD3ζ, que é o principal transmissor de sinais de TCRs endógenos. Os CARs de segunda geração adicionam domínios de sinalização intracelular de vários receptores coestimulatórios de proteínas (por exemplo, CD28, 41BB, ICOS) ao endodomínio do CAR para fornecer sinais adicionais à célula T. Estudos pré-clínicos indicaram que a segunda geração de desenhos de CAR melhora a atividade antitumoral das células T. Os CARs de terceira geração mais recentes combinam vários domínios de sinalização para aumentar ainda mais a potência. As células T enxertadas com esses CARs demonstraram melhora na expansão, ativação, persistência e eficiência na erradicação de tumores, independentemente da interação ligando/receptor coestimulatório(Imai C, et al. Leukemia 2004 18: 676 a 684; Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002 20: 70 a 75).

[0264] Por exemplo, o endodomínio do CAR pode ser projetado para compreender o domínio de sinalização de CD3ζ por si só ou combinado com qualquer outro domínio (ou domínios) citoplasmático desejado, útil no contexto do CAR da invenção. Por exemplo, o domínio citoplasmático do CAR pode compreender uma porção da cadeia CD3ζ e uma região de sinalização coestimulatória. A região de sinalização coestimulatória refere-se a uma porção do CAR compreendendo o domínio intracelular de uma molécula coestimulatória. Uma molécula coestimulatória é uma molécula da superfície celular que não seja um receptor de antígeno ou seus ligandos que é necessária para uma resposta eficiente de linfócitos a um antígeno. Exemplos de tais moléculas incluem CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, antígeno-1 associado à função de linfócito (LFA-1), CD2, CD7, LUZ, NKG2C, B7- H3 e um ligando que se aglutina especificamente a CD83, CD8, CD4, b2c, CD80, CD86, DAP10, DAP12, MyD88, BTNL3 e NKG2D. Assim, enquanto o CAR é exemplificado principalmente com CD28 como elemento de sinalização coestimulatório, outros elementos coestimulatórios podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com outros elementos de sinalização coestimulatórios.

[0265] Em algumas modalidades, o CAR compreende uma sequência de dobradiça. Uma sequência de dobradiça é uma sequência curta de aminoácidos que facilita a flexibilidade do anticorpo (ver, por exemplo, Woof et al., Nat. Rev. Immunol., 4 (2): 89 a 99 (2004)). A sequência de dobradiça pode ser posicionada entre a porção química de reconhecimento de antígeno (por exemplo, anti-CD99 scFv) e o domínio transmembranar. A sequência de dobradiça pode ser qualquer sequência adequada derivada ou obtida de qualquer molécula adequada. Em algumas modalidades, por exemplo, a sequência de dobradiça é derivada de uma molécula de CD8a ou de uma molécula de CD28.

[0266] O domínio transmembranar pode ser derivado de uma fonte natural ou de uma fonte sintética. Onde a fonte é natural, o domínio pode ser derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana. Por exemplo, a região transmembranar pode ser derivada (isto é, compreendendo pelo menos a região (ou regiões) transmembranar) da cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de célula T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8 (por exemplo, CD8 alfa, CD8 beta), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 ou CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM

(LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2R beta, IL2R gama, IL7R α, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tátil), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR e PAG/Cbp. Alternativamente, o domínio transmembranar pode ser sintético, caso em que compreenderá predominantemente resíduos hidrofóbicos, como leucina e valina. Em alguns casos, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio transmembranar sintético. Um ligante oligo- ou polipeptídico curto, com comprimento entre 2 e 10 aminoácidos, pode formar a aglutinação entre o domínio transmembranar e o domínio endoplasmático do CAR.

[0267] Em algumas modalidades, o CAR tem mais de um domínio transmembranar, que pode ser uma repetição do mesmo domínio transmembranar ou pode ser diferentes domínios transmembranares.

[0268] Em algumas modalidades, o CAR é um CAR de várias cadeias, conforme descrito no documento WO2015/039523, que é incorporado por referência para este ensino. Um CAR de múltiplas cadeias pode compreender domínios de aglutinação e sinalização de ligando extracelular separados em diferentes polipeptídeos transmembranares. Os domínios de sinalização podem ser projetados para serem montados na posição justamembrana, que forma uma arquitetura flexível mais próxima dos receptores naturais, que confere uma ótima transdução de sinal. Por exemplo, o CAR de múltiplas cadeias pode compreender uma parte de uma cadeia alfa de FCERI e uma parte de uma cadeia beta de FCERI, de modo que as cadeias de FCERI se dimerizem espontaneamente para formar um CAR.

[0269] As Tabelas 1, 2 e 3 abaixo fornecem alguns exemplos de combinações de região de aglutinação a CD99, regiões de sinalização coestimulatória e domínio de sinalização intracelular que podem ocorrer nos CARs divulgados.

Tabela 1. CARs de primeira geração ScFv Domínio de Sinal CD99 CD8 CD99 CD3ζ CD99 CD3δ CD99 CD3γ CD99 CD3ε CD99 FcγRI-γ CD99 FcγRIII-γ CD99 FcεRIβ CD99 FcεRIγ CD99 DAP10 CD99 DAP12 CD99 CD32 CD99 CD79a

TABELA 4. CARs SEM SINAL DE COSSIMULAÇÃO (PARA ABORDAGEM DE CAR DUPLO) ScFv Sinal coestimulatório Domínio de Sinal CD99 nenhum CD8 CD99 nenhum CD3ζ CD99 nenhum CD3δ CD99 nenhum CD3γ CD99 nenhum CD3ε CD99 nenhum FcγRI-γ CD99 nenhum FcγRIII-γ CD99 nenhum FcεRIβ CD99 nenhum FcεRIγ CD99 nenhum DAP10 CD99 nenhum DAP12 CD99 nenhum CD32 CD99 nenhum CD79a CD99 nenhum CD8 CD99 nenhum CD3ζ CD99 nenhum CD3δ CD99 nenhum CD3γ CD99 nenhum CD3ε CD99 nenhum FcγRI-γ

TABELA 5. CARs SEM DOMÍNIO DE SINAL (PARA ABORDAGEM DE CAR DUPLO) ScFv Sinal coestimulatório Domínio de Sinal CD99 CD28 nenhum CD99 CD8 nenhum CD99 CD4 nenhum CD99 b2c nenhum CD99 CD137/41BB nenhum CD99 ICOS nenhum CD99 CD27 nenhum CD99 CD28δ nenhum CD99 CD80 nenhum CD99 CD86 nenhum CD99 OX40 nenhum CD99 DAP10 nenhum CD99 MyD88 nenhum CD99 CD7 nenhum CD99 DAP12 nenhum CD99 MyD88 nenhum CD99 CD7 nenhum CD99 BTNL3 nenhum CD99 NKG2D nenhum

TABELA 6. CARs DE TERCEIRA GERAÇÃO SEM DOMÍNIO DE SINAL (PARA ABORDAGEM DE CAR DUPLO) Coestimulatório Coestimulatório Sinal ScFv Sinal Sinal Domínio CD99 CD28 CD28 nenhum CD99 CD28 CD8 nenhum CD99 CD28 CD4 nenhum CD99 CD28 b2c nenhum CD99 CD28 CD137/41BB nenhum CD99 CD28 ICOS nenhum CD99 CD28 CD27 nenhum CD99 CD28 CD28δ nenhum CD99 CD28 CD80 nenhum CD99 CD28 CD86 nenhum CD99 CD28 OX40 nenhum CD99 CD28 DAP10 nenhum CD99 CD28 MyD88 nenhum CD99 CD28 CD7 nenhum CD99 CD28 DAP12 nenhum CD99 CD28 MyD88 nenhum CD99 CD28 CD7 nenhum CD99 CD8 CD28 nenhum CD99 CD8 CD8 nenhum CD99 CD8 CD4 nenhum CD99 CD8 b2c nenhum CD99 CD8 CD137/41BB nenhum CD99 CD8 ICOS nenhum CD99 CD8 CD27 nenhum CD99 CD8 CD28δ nenhum CD99 CD8 CD80 nenhum CD99 CD8 CD86 nenhum CD99 CD8 OX40 nenhum CD99 CD8 DAP10 nenhum CD99 CD8 MyD88 nenhum CD99 CD8 CD7 nenhum CD99 CD8 DAP12 nenhum CD99 CD8 MyD88 nenhum CD99 CD8 CD7 nenhum CD99 CD4 CD28 nenhum CD99 CD4 CD8 nenhum CD99 CD4 CD4 nenhum CD99 CD4 b2c nenhum CD99 CD4 CD137/41BB nenhum CD99 CD4 ICOS nenhum CD99 CD4 CD27 nenhum

CD99 CD4 CD28δ nenhum CD99 CD4 CD80 nenhum CD99 CD4 CD86 nenhum CD99 CD4 OX40 nenhum CD99 CD4 DAP10 nenhum CD99 CD4 MyD88 nenhum CD99 CD4 CD7 nenhum CD99 CD4 DAP12 nenhum CD99 CD4 MyD88 nenhum CD99 CD4 CD7 nenhum CD99 b2c CD28 nenhum CD99 b2c CD8 nenhum CD99 b2c CD4 nenhum CD99 b2c b2c nenhum CD99 b2c CD137/41BB nenhum CD99 b2c ICOS nenhum CD99 b2c CD27 nenhum CD99 b2c CD28δ nenhum CD99 b2c CD80 nenhum CD99 b2c CD86 nenhum CD99 b2c OX40 nenhum CD99 b2c DAP10 nenhum CD99 b2c MyD88 nenhum CD99 b2c CD7 nenhum CD99 b2c DAP12 nenhum CD99 b2c MyD88 nenhum CD99 b2c CD7 nenhum CD99 CD137/41BB CD28 nenhum CD99 CD137/41BB CD8 nenhum CD99 CD137/41BB CD4 nenhum CD99 CD137/41BB b2c nenhum CD99 CD137/41BB CD137/41BB nenhum CD99 CD137/41BB ICOS nenhum CD99 CD137/41BB CD27 nenhum CD99 CD137/41BB CD28δ nenhum CD99 CD137/41BB CD80 nenhum CD99 CD137/41BB CD86 nenhum CD99 CD137/41BB OX40 nenhum CD99 CD137/41BB DAP10 nenhum CD99 CD137/41BB MyD88 nenhum CD99 CD137/41BB CD7 nenhum CD99 CD137/41BB DAP12 nenhum CD99 CD137/41BB MyD88 nenhum CD99 CD137/41BB CD7 nenhum CD99 ICOS CD28 nenhum CD99 ICOS CD8 nenhum

CD99 ICOS CD4 nenhum CD99 ICOS b2c nenhum CD99 ICOS CD137/41BB nenhum CD99 ICOS ICOS nenhum CD99 ICOS CD27 nenhum CD99 ICOS CD28δ nenhum CD99 ICOS CD80 nenhum CD99 ICOS CD86 nenhum CD99 ICOS OX40 nenhum CD99 ICOS DAP10 nenhum CD99 ICOS MyD88 nenhum CD99 ICOS CD7 nenhum CD99 ICOS DAP12 nenhum CD99 ICOS MyD88 nenhum CD99 ICOS CD7 nenhum CD99 ICOS CD28 nenhum CD99 ICOS CD8 nenhum CD99 ICOS CD4 nenhum CD99 ICOS b2c nenhum CD99 ICOS CD137/41BB nenhum CD99 ICOS ICOS nenhum CD99 ICOS CD27 nenhum CD99 ICOS CD28δ nenhum CD99 ICOS CD80 nenhum CD99 ICOS CD86 nenhum CD99 ICOS OX40 nenhum CD99 ICOS DAP10 nenhum CD99 ICOS MyD88 nenhum CD99 ICOS CD7 nenhum CD99 ICOS DAP12 nenhum CD99 ICOS MyD88 nenhum CD99 ICOS CD7 nenhum CD99 CD27 CD28 nenhum CD99 CD27 CD8 nenhum CD99 CD27 CD4 nenhum CD99 CD27 b2c nenhum CD99 CD27 CD137/41BB nenhum CD99 CD27 ICOS nenhum CD99 CD27 CD27 nenhum CD99 CD27 CD28δ nenhum CD99 CD27 CD80 nenhum CD99 CD27 CD86 nenhum CD99 CD27 OX40 nenhum CD99 CD27 DAP10 nenhum CD99 CD27 MyD88 nenhum CD99 CD27 CD7 nenhum

CD99 CD27 DAP12 nenhum CD99 CD27 MyD88 nenhum CD99 CD27 CD7 nenhum CD99 CD28δ CD28 nenhum CD99 CD28δ CD8 nenhum CD99 CD28δ CD4 nenhum CD99 CD28δ b2c nenhum CD99 CD28δ CD137/41BB nenhum CD99 CD28δ ICOS nenhum CD99 CD28δ CD27 nenhum CD99 CD28δ CD28δ nenhum CD99 CD28δ CD80 nenhum CD99 CD28δ CD86 nenhum CD99 CD28δ OX40 nenhum CD99 CD28δ DAP10 nenhum CD99 CD28δ MyD88 nenhum CD99 CD28δ CD7 nenhum CD99 CD28δ DAP12 nenhum CD99 CD28δ MyD88 nenhum CD99 CD28δ CD7 nenhum CD99 CD80 CD28 nenhum CD99 CD80 CD8 nenhum CD99 CD80 CD4 nenhum CD99 CD80 b2c nenhum CD99 CD80 CD137/41BB nenhum CD99 CD80 ICOS nenhum CD99 CD80 CD27 nenhum CD99 CD80 CD28δ nenhum CD99 CD80 CD80 nenhum CD99 CD80 CD86 nenhum CD99 CD80 OX40 nenhum CD99 CD80 DAP10 nenhum CD99 CD80 MyD88 nenhum CD99 CD80 CD7 nenhum CD99 CD80 DAP12 nenhum CD99 CD80 MyD88 nenhum CD99 CD80 CD7 nenhum CD99 CD86 CD28 nenhum CD99 CD86 CD8 nenhum CD99 CD86 CD4 nenhum CD99 CD86 b2c nenhum CD99 CD86 CD137/41BB nenhum CD99 CD86 ICOS nenhum CD99 CD86 CD27 nenhum CD99 CD86 CD28δ nenhum CD99 CD86 CD80 nenhum

CD99 CD86 CD86 nenhum CD99 CD86 OX40 nenhum CD99 CD86 DAP10 nenhum CD99 CD86 MyD88 nenhum CD99 CD86 CD7 nenhum CD99 CD86 DAP12 nenhum CD99 CD86 MyD88 nenhum CD99 CD86 CD7 nenhum CD99 OX40 CD28 nenhum CD99 OX40 CD8 nenhum CD99 OX40 CD4 nenhum CD99 OX40 b2c nenhum CD99 OX40 CD137/41BB nenhum CD99 OX40 ICOS nenhum CD99 OX40 CD27 nenhum CD99 OX40 CD28δ nenhum CD99 OX40 CD80 nenhum CD99 OX40 CD86 nenhum CD99 OX40 OX40 nenhum CD99 OX40 DAP10 nenhum CD99 OX40 MyD88 nenhum CD99 OX40 CD7 nenhum CD99 OX40 DAP12 nenhum CD99 OX40 MyD88 nenhum CD99 OX40 CD7 nenhum CD99 DAP10 CD28 nenhum CD99 DAP10 CD8 nenhum CD99 DAP10 CD4 nenhum CD99 DAP10 b2c nenhum CD99 DAP10 CD137/41BB nenhum CD99 DAP10 ICOS nenhum CD99 DAP10 CD27 nenhum CD99 DAP10 CD28δ nenhum CD99 DAP10 CD80 nenhum CD99 DAP10 CD86 nenhum CD99 DAP10 OX40 nenhum CD99 DAP10 DAP10 nenhum CD99 DAP10 MyD88 nenhum CD99 DAP10 CD7 nenhum CD99 DAP10 DAP12 nenhum CD99 DAP10 MyD88 nenhum CD99 DAP10 CD7 nenhum CD99 DAP12 CD28 nenhum CD99 DAP12 CD8 nenhum CD99 DAP12 CD4 nenhum CD99 DAP12 b2c nenhum

CD99 DAP12 CD137/41BB nenhum CD99 DAP12 ICOS nenhum CD99 DAP12 CD27 nenhum CD99 DAP12 CD28δ nenhum CD99 DAP12 CD80 nenhum CD99 DAP12 CD86 nenhum CD99 DAP12 OX40 nenhum CD99 DAP12 DAP10 nenhum CD99 DAP12 MyD88 nenhum CD99 DAP12 CD7 nenhum CD99 DAP12 DAP12 nenhum CD99 DAP12 MyD88 nenhum CD99 DAP12 CD7 nenhum CD99 MyD88 CD28 nenhum CD99 MyD88 CD8 nenhum CD99 MyD88 CD4 nenhum CD99 MyD88 b2c nenhum CD99 MyD88 CD137/41BB nenhum CD99 MyD88 ICOS nenhum CD99 MyD88 CD27 nenhum CD99 MyD88 CD28δ nenhum CD99 MyD88 CD80 nenhum CD99 MyD88 CD86 nenhum CD99 MyD88 OX40 nenhum CD99 MyD88 DAP10 nenhum CD99 MyD88 MyD88 nenhum CD99 MyD88 CD7 nenhum CD99 MyD88 DAP12 nenhum CD99 MyD88 MyD88 nenhum CD99 MyD88 CD7 nenhum CD99 CD7 CD28 nenhum CD99 CD7 CD8 nenhum CD99 CD7 CD4 nenhum CD99 CD7 b2c nenhum CD99 CD7 CD137/41BB nenhum CD99 CD7 ICOS nenhum CD99 CD7 CD27 nenhum CD99 CD7 CD28δ nenhum CD99 CD7 CD80 nenhum CD99 CD7 CD86 nenhum CD99 CD7 OX40 nenhum CD99 CD7 DAP10 nenhum CD99 CD7 MyD88 nenhum CD99 CD7 CD7 nenhum CD99 CD7 DAP12 nenhum CD99 CD7 MyD88 nenhum

CD99 CD7 CD7 nenhum CD99 BTNL3 CD28 nenhum CD99 BTNL3 CD8 nenhum CD99 BTNL3 CD4 nenhum CD99 BTNL3 b2c nenhum CD99 BTNL3 CD137/41BB nenhum CD99 BTNL3 ICOS nenhum CD99 BTNL3 CD27 nenhum CD99 BTNL3 CD28δ nenhum CD99 BTNL3 CD80 nenhum CD99 BTNL3 CD86 nenhum CD99 BTNL3 OX40 nenhum CD99 BTNL3 DAP10 nenhum CD99 BTNL3 MyD88 nenhum CD99 BTNL3 CD7 nenhum CD99 BTNL3 DAP12 nenhum CD99 BTNL3 MyD88 nenhum CD99 BTNL3 CD7 nenhum CD99 NKG2D CD28 nenhum CD99 NKG2D CD8 nenhum CD99 NKG2D CD4 nenhum CD99 NKG2D b2c nenhum CD99 NKG2D CD137/41BB nenhum CD99 NKG2D ICOS nenhum CD99 NKG2D CD27 nenhum CD99 NKG2D CD28δ nenhum CD99 NKG2D CD80 nenhum CD99 NKG2D CD86 nenhum CD99 NKG2D OX40 nenhum CD99 NKG2D DAP10 nenhum CD99 NKG2D MyD88 nenhum CD99 NKG2D CD7 nenhum CD99 NKG2D DAP12 nenhum CD99 NKG2D MyD88 nenhum CD99 NKG2D CD7 nenhum

[0270] Em algumas modalidades, o agente de aglutinação anti-CD99 é anticorpo de fragmento variável de cadeia simples (scFv). A afinidade/especificidade de um anti-CD99 scFv é conduzido em grande parte por sequências específicas dentro de regiões determinantes de complementaridade (CDRs) na cadeia pesada (VH) e leve (VL). Cada sequência VH e VL terá três CDRs (CDR1, CDR2, CDR3).

[0271] Em algumas modalidades, o agente de aglutinação anti-CD99 é derivado de anticorpos naturais, como anticorpos monoclonais. Em alguns casos, o anticorpo é humano. Em alguns casos, o anticorpo sofreu uma alteração para torná-lo menos imunogênico quando administrado a seres humanos. Por exemplo, a alteração compreende uma ou mais técnicas selecionadas do grupo que consiste em quimerização, humanização, enxerto de CDR, desimunização e mutação de aminoácidos estruturais para corresponder à sequência da linha germinativa humana mais próxima.

[0272] Também são divulgados CARs biespecíficos que têm como alvo CD99 e pelo menos um antígeno tumoral adicional. Também são divulgados CARs projetados para funcionar apenas em conjunto com outro CAR que se aglutina a um antígeno diferente, como um antígeno tumoral. Por exemplo, nessas modalidades, o endodomínio do CAR divulgado pode conter apenas um domínio de sinalização (SD) ou uma região de sinalização coestimulatória (CSR), mas não ambos. O segundo CAR (ou célula T endógena) fornece o sinal ausente, se estiver ativado. Por exemplo, se o CAR divulgado contiver um SD, mas não um CSR, a célula efetora imunológica contendo este CAR será ativada apenas se outro CAR (ou célula T) contendo um CSR se aglutinar ao seu antígeno respectivo. Da mesma forma, se o CAR divulgado contiver um CSR, mas não um SD, a célula efetora imunológica contendo este CAR será ativada apenas se outro CAR (ou célula T) contendo um SD se aglutinar ao seu respectivo antígeno.

[0273] Antígenos tumorais são proteínas produzidas por células tumorais que provocam uma resposta imune, particularmente respostas imunes mediadas por células T. O domínio de aglutinação a antígeno adicional pode ser um anticorpo ou um ligando natural do antígeno do tumor. A seleção do domínio de aglutinação a antígeno adicional dependerá do tipo particular de câncer a ser tratado. Os antígenos tumorais são bem conhecidos na arte e incluem, por exemplo, um antígeno associado ao glioma, antígeno carcinoembrionário (CEA), EGFRvIII, IL-llRa, IL-13Ra, EGFR, FAP, B7H3, Kit, CA LX, CS-1, MUC1, BCMA, bcr-abl, HER2, gonadotrofina coriônica β-humana, alfafetoproteína (AFP), ALK, CD19, CD123, ciclina Bl, AFP reativa à lectina, antígeno 1 relacionado à Fos, ADRB3, tireoglobulina, EphA2, RAGE-1, RUl, RU2, SSX2, AKAP-4, LCK, OY-TESl, PAX5, SART3, CLL-1, fucosil GM1, GloboH, MNH-CA IX, EPCAM, EVT6-AML, TGS5, transcriptase reversa da telomerase humana, ácido plisiálico, PLAC1, RUl, RU2 (AS), carboxilesterase intestinal, lewisY, sLe, LY6K, mut hsp70-2, M-CSF, MYCN, RhoC, TRP-2, CYPIBI, BORIS, prostase, antígeno prostático específico (PSA), PAX3, PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, LMP2, NCAM, p53, mutante p53, mutante Ras, gplOO, prostein, OR51E2, PANX3, PSMA, PSCA, Her2/neu, hTERT, HMWMAA, HAVCR1, VEGFR2, PDGFR-beta, survivina e telomerase, legumaína, HPV E6, E7, proteína do esperma 17, SSEA-4, tirosinase, TARP, WT1, antígeno tumoral próstata-carcinoma-1 (PCTA-1), ML-IAP, MAGE, MAGE-A1, MAD-CT-1, MAD- CT-2, MelanA/MART 1, XAGE1, ELF2M, ERG (gene de fusão TMPRSS2 ETS), NA17, elastase de neutrófilos, pontos de interrupção da translocação de sarcoma, NY-BR-1, ephnn2, CD20, CD22, CD24, CD30, TIM3, CD38, CD44v6, CD97, CD171, CD179a e receptor de androgênio, FAP, fator de crescimento de insulina (IGF) -I, IGFII, receptor IGF-I, GD2, o-acetil-GD2, GD3, GM3, GPRC5D, GPR20, CXORF61, receptor de folato (FRa), receptor de folato beta, ROR1, Flt3, TAG72, TN Ag, Tie 2, TEM1, TEM7R, CLDN6, TSHR, UPK2 e mesotelina. Em uma modalidade preferida, o antígeno tumoral é selecionado a partir do grupo que consiste em receptor de folato (FRa), mesotelina, EGFRvIII, IL-13Ra, CD123, CD19, TIM3, BCMA, GD2, CLL-1, CA-IX, MUCl, HER2 e qualquer combinação dos mesmos.

[0274] Exemplos não limitativos de antígenos tumorais incluem o seguinte: Antígenos de diferenciação tais como tirosinase, TRP-1, TRP-2 e antígenos multilinha específicos de tumores, como MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pi 5; antígenos embrionários superexpressos, como CEA; oncogenes superexpressos e genes supressores de tumor mutados tais como p53, Ras, HER-2/neu; antígenos tumorais únicos resultantes de translocações cromossômicas; tais como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; e antígenos virais, como os antígenos EBVA do vírus Epstein Barr e os antígenos E6 e E7 do papilomavírus humano (HPV). Outros antígenos grandes baseados em proteínas incluem TSP- 180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, nm- 23H1, PSA, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-catenina, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfa-fetoproteína, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCASl, SDCCAG1 6, proteína de aglutinação a TA- 90\Mac-2\proteína associada ao ciclofilme C, TAAL6, TAG72, TLP, TPS, GPC3, MUC16, LMP1, EBMA-1, BARF-1, CS1, CD319, HER1, B7H6, L1CAM, IL6 e MET.

ÁCIDOS NUCLEICOS E VETORES

[0275] Também são divulgados polinucleotídeos e vetores de polinucleotídeos que codificam os CARs específicos a CD99 que permitem a expressão dos CARs específicos a CD99 nas células efetoras imunes divulgadas.

[0276] As sequências de ácido nucleico que codificam os CARs divulgados e suas regiões podem ser obtidas usando métodos recombinantes conhecidos na técnica, como, por exemplo, pesquisando bibliotecas de células que expressam o gene, derivando o gene de um vetor conhecido por incluir o mesmo, ou isolando diretamente de células e tecidos contendo os mesmos, usando técnicas padrão. Alternativamente, o gene de interesse pode ser produzido sinteticamente, em vez de clonado.

[0277] A expressão de ácidos nucleicos que codificam CARs é tipicamente alcançada pela aglutinação operacional de um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo CAR a um promotor e incorporação do construto em um vetor de expressão. Os vetores de clonagem típicos contêm terminadores de transcrição e tradução, sequências de iniciação e promotores úteis para a regulação da expressão da sequência de ácido nucleico desejada.

[0278] O ácido nucleico divulgado pode ser clonado em vários tipos de vetores. Por exemplo, o ácido nucleico pode ser clonado em um vetor incluindo, mas não limitado a, um plasmídeo, um fagomídeo, um derivado de fago, um vírus animal e um cosmídeo. Vetores de interesse particular incluem vetores de expressão, vetores de replicação, vetores de geração de sonda e vetores de sequenciamento.

[0279] Além disso, o vetor de expressão pode ser fornecido a uma célula na forma de um vetor viral. A tecnologia do vetor viral é bem conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, em Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York) e em outros manuais de virologia e biologia molecular. Os vírus, que são úteis como vetores, incluem, mas não se limitam a, retrovírus, adenovírus, vírus adenoassociados, vírus do herpes e lentivírus. Em geral, um vetor adequado contém uma origem de replicação funcional em pelo menos um organismo, uma sequência promotora, locais convenientes de endonucleases de restrição e um ou mais marcadores selecionáveis. Em algumas modalidades, os vetores polinucleotídicos são vetores lentivirais ou retrovirais.

[0280] Vários sistemas baseados em vírus foram desenvolvidos para transferência de genes para células de mamíferos. Por exemplo, os retrovírus fornecem uma plataforma conveniente para sistemas de entrega de genes. Um gene selecionado pode ser inserido em um vetor e empacotado em partículas retrovirais usando técnicas conhecidas na técnica. O vírus recombinante pode então ser isolado e entregue às células do sujeito in vivo ou ex vivo.

[0281] Um exemplo de um promotor adequado é a sequência de promotor citomegalovírus (CMV) imediato precoce. Esta sequência promotora é uma forte sequência promotora constitutiva capaz de conduzir altos níveis de expressão de qualquer sequência polinucleotídica operacionalmente ligada a ela. Outro exemplo de um promotor adequado é o Fator de Crescimento de Alongamento-1a (EF-1a). No entanto, outras sequências promotoras constitutivas também podem ser utilizadas, incluindo, entre outras, o promotor inicial do vírus símio 40 (SV40), o promotor MND (vírus do sarcoma mieloproliferativo), vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV), vírus de imunodeficiência humana (HIV) promotor de repetição terminal longo (LTR), promotor MoMuLV, promotor do vírus da leucemia aviária, promotor precoce imediato do vírus Epstein-Barr, promotor do vírus Rous sarcoma, bem como promotores de genes humanos, como o promotor de actina, promotor de miosina, promotor de hemoglobina e promotor de creatina quinase. O promotor pode, alternativamente, ser um promotor indutível. Exemplos de promotores induzíveis incluem, mas não estão limitados a, um promotor de metalotionina, um promotor de glicocorticoide, um promotor de progesterona e um promotor de tetraciclina.

[0282] Elementos promotores adicionais, por exemplo, intensificadores, regulam a frequência do início da transcrição. Normalmente, eles estão localizados na região 30-110 pb a montante do local de início, embora vários promotores tenham demonstrado recentemente conter elementos funcionais a jusante do local de início. O espaçamento entre elementos do promotor frequentemente é flexível, de tal modo que a função do promotor seja mantida quando os elementos forem invertidos ou movidos em relação uns aos outros.

[0283] Para avaliar a expressão de um polipeptídeo CAR ou de partes dele, o vetor de expressão a ser introduzido em uma célula também pode conter um gene marcador selecionável ou um gene repórter ou ambos para facilitar a identificação e seleção de células expressoras a partir da população de células a qual busca-se transfectar ou infectar através de vetores virais. Em outros aspectos, o marcador selecionável pode ser carregado em um pedaço separado de DNA e usado em um procedimento de cotransfecção. Os marcadores selecionáveis e os genes repórteres podem ser flanqueados com sequências reguladoras apropriadas para permitir a expressão nas células hospedeiras. Marcadores selecionáveis úteis incluem, por exemplo, genes de resistência a antibióticos.

[0284] Os genes repórteres são utilizados para identificar células potencialmente transfectadas e para avaliar a funcionalidade das sequências reguladoras. Em geral, um gene repórter é um gene que não está presente ou expresso pelo organismo ou tecido receptor e que codifica um polipeptídeo cuja expressão se manifesta por alguma propriedade facilmente detectável, por exemplo, atividade enzimática. A expressão do gene repórter é analisada em um momento adequado após a introdução do DNA nas células receptoras. Os genes repórter adequados podem incluir genes que codificam luciferase, beta-galactosidase, cloranfenicol acetil transferase, fosfatase alcalina segregada ou o gene da proteína fluorescente verde. Os sistemas de expressão adequados são bem conhecidos e podem ser preparados utilizando técnicas conhecidas ou obtidas comercialmente. Em geral, o construto com a região flanqueadora mínima de 5’ que mostra o nível mais alto de expressão do gene repórter é identificado como o promotor. Tais regiões promotoras podem ser ligadas a um gene repórter e usadas para avaliar agentes quanto à capacidade de modular a transcrição acionada por promotor.

[0285] Os métodos de introdução e expressão de genes em uma célula são conhecidos na técnica. No contexto de um vetor de expressão, o vetor pode ser facilmente introduzido em uma célula hospedeira, por exemplo, célula de mamífero, bactéria, levedura ou inseto por qualquer método na técnica. Por exemplo, o vetor de expressão pode ser transferido para uma célula hospedeira por meios físicos, químicos ou biológicos.

[0286] Os métodos físicos para a introdução de um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem precipitação com fosfato de cálcio, lipofecção, bombardeio de partículas, microinjeção, eletroporação e similares. Os métodos para produzir células compreendendo vetores e/ou ácidos nucleicos exógenos são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo,

Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York).

[0287] Métodos biológicos para introduzir um polinucleotídeo de interesse em uma célula hospedeira incluem o uso de vetores de DNA e RNA. Vetores virais, e em especial vetores retrovirais, tornaram-se o método mais difundidamente adotado para inserir genes em células mamíferas, por exemplo, humanas.

[0288] Meios químicos para introduzir um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem sistemas de dispersão coloidal, tais como complexos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, esferas e sistemas à base de lipídios, incluindo emulsões óleo em água, micelas, micelas mistas e lipossomas. Um exemplo de sistema coloidal para uso como veículo de distribuição in vitro e in vivo é um lipossoma (por exemplo, uma vesícula de membrana artificial).

[0289] No caso em que é utilizado um sistema de entrega não viral, um veículo de entrega exemplar é um lipossoma. Em outro aspecto, o ácido nucleico pode estar associado a um lipídeo. O ácido nucleico associado a um lipídeo pode ser encapsulado no interior aquoso de um lipossomo, intercalado na bicamada lipídica de um lipossomo, anexado a um lipossomo por meio de uma molécula de aglutinação que está associada ao lipossomo e ao oligonucleotídeo, aprisionado em um lipossomo, complexado com um lipossomo, disperso em uma solução contendo um lipídeo, misturado com um lipídeo, combinado com um lipídeo, contido como uma suspensão em um lipídeo, contido ou complexado com uma micela ou associado a outro lipídeo. As composições associadas a lípidos, lípidos/DNA ou vetor de lípidos/expressão não estão limitadas a qualquer estrutura particular em solução. Por exemplo, eles podem estar presentes em uma estrutura de duas camadas, como micelas, ou com uma estrutura "colapsada". Eles também podem simplesmente ser intercalados em uma solução, possivelmente formando agregados que não são uniformes em tamanho ou forma. Os lipídios são substâncias gordurosas que podem ser lipídios naturais ou sintéticos. Por exemplo, lipídios incluem as gotículas gordurosas que ocorrem naturalmente no citoplasma, bem como a classe de compostos que contêm hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa e seus derivados, como ácidos graxos, álcoois, aminas, aminoálcoois e aldeídos. Lipídios adequados para uso podem ser obtidos junto a fontes comerciais. Por exemplo, dimiristilfosfatidilcolina ("DMPC") pode ser obtida junto a Sigma, St. Louis, Mo.; o fosfato de dicetila ("DCP") pode ser obtido junto a K & K Laboratories (Plainview, NY); colesterol ("Choi") pode ser obtido junto a Calbiochem-Behring; dimiristilfosfatidilglicerol ("DMPG") e outros lipídios podem ser obtidos junto a Avanti Polar Lipids, Inc, (Birmingham, Ala.).

CÉLULAS EFETORAS IMUNES

[0290] Também são divulgadas células efetoras imunes que são geneticamente modificadas para expressar os CARs divulgados (também aqui referidas como "células CAR-T”). Estas células são preferencialmente obtidas do sujeito a ser tratado (isto é, são autólogas). No entanto, em algumas modalidades, são utilizadas linhas de células efetoras imunes ou células efetoras de doadores (alogênicas). As células efetoras imunes podem ser obtidas de várias fontes, incluindo células mononucleares do sangue periférico, medula óssea, tecido linfonodal, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um local de infecção, ascites, derrame pleural, tecido do baço e tumores. As células efetoras imunes podem ser obtidas a partir do sangue coletado de um sujeito usando qualquer número de técnicas conhecidas do versado, como a separação Ficoll™. Por exemplo, as células do sangue circulante de um indivíduo podem ser obtidas por aférese. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes são isoladas dos linfócitos do sangue periférico, lisando os glóbulos vermelhos e esgotando os monócitos, por exemplo, por centrifugação através de um gradiente PERCOLL™ ou por elutriação centrífuga de contrafluxo. Uma subpopulação específica de células efetoras imunes pode ser ainda mais isolada por técnicas de seleção positiva ou negativa. Por exemplo, as células efetoras imunes podem ser isoladas usando uma combinação de anticorpos direcionados a marcadores de superfície exclusivos para as células selecionadas positivamente, por exemplo, por incubação com esferas conjugadas com anticorpos por um período de tempo suficiente para a seleção positiva das células efetoras imunes desejadas. Alternativamente, o enriquecimento da população de células efetoras imunes pode ser realizado por seleção negativa usando uma combinação de anticorpos direcionados a marcadores de superfície exclusivos das células selecionadas negativamente.

[0291] Em algumas modalidades, as células efetoras imunes compreendem qualquer leucócito envolvido na defesa do corpo contra doenças infecciosas e materiais estranhos. Por exemplo, as células efetoras imunes podem compreender linfócitos, monócitos, macrófagos, células dentríticas, mastócitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, as células efetoras imunes podem compreender linfócitos T.

[0292] As células T ou linfócitos T podem ser distinguidos de outros linfócitos, como células B e células exterminadoras naturais (células NK), pela presença de um receptor de células T (TCR) na superfície celular. As mesmas são chamadas de células T porque amadurecem no timo (embora alguns também amadureçam nas amígdalas). Existem vários subconjuntos de células T, cada um com uma função distinta.

[0293] As células T auxiliares (células TH) auxiliam outros glóbulos brancos nos processos imunológicos, incluindo a maturação das células B em células plasmáticas e células B de memória e a ativação de células T citotóxicas e macrófagos. Essas células também são conhecidas como células T CD4+ porque expressam a glicoproteína CD4 em sua superfície. As células T auxiliares são ativadas quando são apresentadas com antígenos peptídicos pelas moléculas do MHC classe II, que são expressas na superfície das células apresentadoras de antígenos (APCs). Uma vez ativadas, as mesmas se dividem rapidamente e secretam pequenas proteínas chamadas citocinas que regulam ou auxiliam na resposta imune ativa. Estas células podem diferenciar-se em um dos diversos subtipos, incluindo TH1, TH2, TH3, TH17, TH9 ou TFH, que secretam citocinas diferentes para facilitar um tipo diferente de resposta imune.

[0294] As células T citotóxicas (células TC ou CTLs) destroem células infectadas por vírus e células tumorais e também estão implicadas na rejeição de transplantes. Essas células também são conhecidas como células T CD8+, pois expressam a glicoproteína CD8 em sua superfície. Essas células reconhecem seus alvos pela aglutinação a antígeno associado às moléculas de MHC classe I, que estão presentes na superfície de todas as células nucleadas. Através da IL-10, adenosina e outras moléculas secretadas pelas células T reguladoras, as células CD8+ podem ser inativadas para um estado anérgico, o que evita doenças autoimunes.

[0295] As células T de memória são um subconjunto de células T com especificidade de antígeno que persistem a longo prazo após a resolução de uma infecção. As mesmas rapidamente se expandem para um grande número de células T efetoras após a reexposição ao antígeno cognato, proporcionando assim ao sistema imunológico “memória” contra infecções passadas. As células de memória podem ser CD4 + ou CD8+. As células T de memória expressam tipicamente a proteína da superfície celular CD45RO.

[0296] As células T reguladoras (células Treg), anteriormente conhecidas como células T supressoras, são cruciais para a manutenção da tolerância imunológica. Seu principal papel é desligar a imunidade mediada por células T no final de uma reação imune e suprimir células T autorreativas que escaparam do processo de seleção negativa no timo. Duas classes principais de células Treg CD4+ foram descritas - células Treg que ocorrem naturalmente e células Treg adaptativas.

[0297] As células T exterminadoras naturais (NKT) (que não devem ser confundidas com as células exterminadoras naturais (NK)) fazem a ponte do sistema imunológico adaptativo com o sistema imunológico inato. Ao contrário das células T convencionais que reconhecem antígenos peptídicos apresentados pelas moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), as células NKT reconhecem o antígeno glicolipídico apresentado por uma molécula chamada CD1d.

[0298] Em algumas modalidades, as células T compreendem uma mistura de células CD4+. Em outras modalidades, as células T são enriquecidas para um ou mais subconjuntos com base na expressão da superfície celular. Por exemplo, em alguns casos, as T compreendidas são linfócitos T CD8+ citotóxicos. Em algumas modalidades, as células T compreendem células T γδ, que possuem um receptor de célula T distinto (TCR) com uma cadeia γ e uma cadeia δ em vez de cadeias α e β.

[0299] As células exterminadoras naturais (NK) são linfócitos granulares CD56+CD3- grandes que podem exterminar células infectadas e transformadas por vírus e constituem um subconjunto celular crítico do sistema imunológico inato (Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53: 1.666 a 1.676). Ao contrário dos linfócitos T CD8 + citotóxicos, as células NK lançam citotoxicidade contra células tumorais sem a necessidade de sensibilização prévia e também podem erradicar células negativas para MHC-I (Narni- Mancinelli E, et al. Int Immunol 2011 23: 427 a 431). As células NK são células efetoras mais seguras, pois podem evitar as complicações potencialmente letais das tempestades de citocinas (Morgan RA, et al. Mol Ther 2010 18: 843 a 851), síndrome de lise tumoral (Porter DL, et al. N Engl J Med 2011 365: 725 a 733) e efeitos fora do tumor no alvo. Embora as células NK tenham um papel bem conhecido como exterminadoras de células cancerígenas, e o comprometimento das células NK tenha sido extensivamente documentado como crucial para a progressão da MM (Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53: 1.666 a 1.676; Fauriat C, et al. (Leucemia 2006 20: 732 a 733), o meio pelo qual se pode aprimorar a atividade anti-MM mediada por células NK foi amplamente inexplorado antes dos CARs divulgados.

[0300] As doenças linfoproliferativas induzidas pelo vírus Epstein-Barr (EBV) (EBV-LPDs) são uma causa significativa de morbidade e mortalidade para os receptores de transplante alogênico de células hematopoiéticas (HCT), particularmente naqueles que receberam certos Abs reativos às células T para prevenir ou tratar a DECH. A profilaxia e o tratamento pela transferência adotiva de células T específicas do EBV e a subsequente restauração da imunidade a longo prazo contra a linfoproliferação associada ao EBV proporcionaram resultados positivos no tratamento dessa complicação uniformemente fatal da transferência da medula óssea. Portanto, em algumas modalidades, as células efetoras imunes divulgadas são linfócitos T citotóxicos (CTLs) alógenos ou autólogos específicos de EBV. Por exemplo, isso pode envolver o isolamento de PBMCs de um doador autólogo ou alogênico e o enriquecimento das mesmas para células T pela depleção de monócitos e células NK. Por exemplo, o doador pode ser um doador soropositivo para EBV. Estas células T podem então ser estimuladas com linfócitos autólogos transformados ou soropositivos para EBV. Os antígenos EBV incluem proteína de membrana latente (LMP) e proteínas do antígeno nuclear EBV (EBNA), como LMP-1, LMP-2A e LMP-2B e EBNA-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C e EBNA-LP. Esses métodos são descritos, por exemplo, em Barker et al., Blood 2010 116 (23): 5.045 a 5.049; Doubrovina et al., Blood 2012 119 (11): 2.644 a

2.656; Koehne et al. Blood 2002 99 (5): 1.730 a 1.740; e Smith et al. Cancer Res 2012 72 (5): 1.116 a 1.125, que são incorporados por referência para esses ensinamentos.

MÉTODOS TERAPÊUTICOS

[0301] As células efetoras imunes que expressam os CARs divulgados podem provocar uma resposta imune antitumoral contra células cancerígenas que expressam CD99. A resposta imune antitumoral desencadeada pelas células efetoras imunes modificadas por CAR divulgadas pode ser uma resposta imune ativa ou passiva. Além disso, a resposta imune mediada por CAR pode ser parte de uma abordagem de imunoterapia adotiva na qual as células efetoras imunes modificadas por CAR induzem uma resposta imune específica para CD99.

[0302] A transferência adotiva de células efetoras imunes que expressam receptores quiméricos de antígeno é um terapêutico anticâncer promissor. Após a coleta das células efetoras imunes de um paciente, as células podem ser geneticamente modificadas para expressar os CARs específicos de CD99 divulgados, e depois infundidas de volta no paciente.

[0303] As células efetoras imunes modificadas por CAR divulgadas podem ser administradas sozinhas ou como uma composição farmacêutica em combinação com diluentes e/ou com outros componentes como IL-2, IL-15 ou outras citocinas ou populações de células. Resumidamente, as composições farmacêuticas podem compreender uma população de células alvo como aqui descrito, em combinação com um ou mais carreadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitáveis. Essas composições podem compreender tampões tais como solução salina tamponada neutra, solução salina tamponada com fosfato e seus semelhantes; carboidratos tais como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos tais como glicina; antioxidantes; agentes quelantes tais como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e conservantes. As composições para uso nos métodos divulgados estão em algumas modalidades formuladas para administração intravenosa. As composições farmacêuticas podem ser administradas de qualquer maneira apropriada para tratar MM. A quantidade e a frequência da administração serão determinadas por fatores como a condição do paciente e a gravidade da doença do paciente, embora dosagens apropriadas possam ser determinadas por ensaios clínicos.

[0304] Quando "uma quantidade imunologicamente eficaz", "uma quantidade eficaz antitumoral", "uma quantidade eficaz inibidora de tumor" ou "quantidade terapêutica" é indicada, a quantidade precisa das composições da presente invenção a serem administradas pode ser determinada por um médico, considerando as diferenças individuais em idade, peso, tamanho do tumor, extensão da infecção ou metástase e condição do paciente (sujeito). Pode-se geralmente afirmar que uma composição farmacêutica compreendendo as células T aqui descritas pode ser administrada em uma dosagem de 104 a 109 células/kg de peso corporal, tal como 10 5 a 106 células/kg de peso corporal, incluindo todos os valores inteiros dentro desses intervalos. As composições de células T também podem ser administradas várias vezes nessas dosagens. As células podem ser administradas usando técnicas de infusão que são comumente conhecidas em imunoterapia (ver, por exemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1.676, 1988). A dosagem e regime de tratamento ideais para um paciente específico podem ser prontamente determinados pelos versados na técnica da medicina monitorando o paciente em busca de sinais da doença e ajustando o tratamento de acordo.

[0305] Em certas modalidades, pode ser desejável administrar células T ativadas a um sujeito e, em seguida, coletar novamente sangue (ou realizar uma aférese), ativar células T a partir do mesmo de acordo com os métodos divulgados e reinfundir o paciente com essas células T ativadas e expandidas. Esse processo pode ser realizado várias vezes a cada poucas semanas. Em certas modalidades, as células T podem ser ativadas a partir de amostras de sangue de 10 cm3 a 400 cm3. Em certas modalidades, as células T são ativadas a partir de coleta de sangue de 20 cm3, 30 cm3, 40 cm3, 50 cm3, 60 cm3, 70 cm3, 80 cm3, 90 cm3 ou 100 cm3. O uso desse protocolo de coleta múltipla de sangue/reinfusão múltipla pode servir para selecionar determinadas populações de células T.

[0306] A administração das composições divulgadas pode ser realizada de qualquer maneira conveniente, incluindo por injeção, transfusão ou implantação. As composições aqui descritas podem ser administradas a um paciente por via subcutânea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, por injeção intravenosa (i.v.) ou intraperitoneal. Em algumas modalidades, as composições divulgadas são administradas a um paciente por injeção intradérmica ou subcutânea. Em algumas modalidades, as composições divulgadas são administradas por injeção i.v. As composições também podem ser injetadas diretamente em um tumor, linfonodo ou local de infecção.

[0307] Em certas modalidades, as células efetoras imunes modificadas por CAR divulgadas são administradas a um paciente em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) qualquer número de modalidades de tratamento relevantes, incluindo, mas não se limitando a, talidomida, dexametasona, bortezomibe e lenalidomida. Em outras modalidades, as células efetoras imunes modificadas por CAR podem ser usadas em combinação com quimioterapia, radiação, agentes imunossupressores, como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato e FK506, anticorpos ou outros agentes imunoablativos, como CAM PATH, anticorpos anti-CD3 ou outras terapias de anticorpos, citocina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiação. Em algumas modalidades, as células efetoras imunes modificadas por CAR são administradas a um paciente em conjunto com (por exemplo, antes, simultaneamente ou após) o transplante de medula óssea, terapia ablativa de células T usando agentes quimioterápicos, como fludarabina, radioterapia por feixe externo (XRT), ciclofosfamida ou anticorpos como OKT3 ou CAMPATH. Em outra modalidade, as composições celulares da presente invenção são administradas após uma terapia ablativa com células B, tais como agentes que reagem com CD20, por exemplo, Rituxan. Por exemplo, em algumas modalidades, os sujeitos podem ser submetidos a tratamento padrão com quimioterapia em altas doses seguida de transplante de células-tronco do sangue periférico. Em certas modalidades, após o transplante, os sujeitos recebem uma infusão de células imunes expandidas da presente invenção. Em uma modalidade adicional, células expandidas são administradas antes ou depois de uma cirurgia.

[0308] O câncer dos métodos divulgados pode ser qualquer célula que expresse CD99 em um sujeito submetido a crescimento, invasão ou metástase não regulamentada. Os cânceres que expressam CD99 incluem câncer de próstata, câncer de ovário, adenocarcinoma do pulmão, câncer de mama, câncer de endométrio, câncer de estômago, câncer de cólon e câncer de pâncreas. O CD99 também foi encontrado nas células Jurkat. Em alguns aspectos, o câncer é um câncer de vesícula biliar, adenocarcinoma exócrino ou adenocarcinoma apócrino. Em alguns casos, o câncer compreende síndrome mielodisplásica, leucemia mieloide aguda ou leucemia bifenotípica.

[0309] Em alguns aspectos, o câncer pode ser qualquer neoplasia ou tumor para o qual a radioterapia é usada atualmente. Alternativamente, o câncer pode ser um neoplasma ou tumor que não é suficientemente sensível à radioterapia usando métodos padrão. Assim, o câncer pode ser um tumor de sarcoma, linfoma, leucemia, carcinoma, blastoma ou célula germinativa. Uma lista representativa, mas não limitativa, de cânceres que as composições divulgadas podem ser usadas para tratar, inclui linfoma, linfoma de células B, linfoma de células T, micose fungoide, doença de Hodgkin, leucemia mieloide, câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer do sistema nervoso, câncer de cabeça e pescoço, carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, câncer de rim, câncer de pulmão, como câncer de pulmão de células pequenas e câncer de pulmão de células não pequenas, neuroblastoma/glioblastoma, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de pele, câncer de fígado, melanoma, carcinomas espinocelulares da boca, garganta, laringe e pulmão, câncer endometrial, câncer cervical, carcinoma cervical, câncer de mama, câncer epitelial, câncer renal, câncer geniturinário, câncer pulmonar, carcinoma de esôfago, carcinoma de cabeça e pescoço, câncer de intestino grosso, cânceres hematopoiéticos; câncer de testículo; câncer de cólon e reto, câncer de próstata e câncer de pâncreas.

[0310] Os CARs divulgados podem ser usados em combinação com qualquer composto, porção química ou grupo que tenha um efeito citotóxico ou citostático. As porções químicas de fármaco incluem agentes quimioterapêuticos, que podem funcionar como inibidores de microtubulina,

inibidores de mitose, inibidores de topoisomerase ou intercaladores de DNA, e particularmente aqueles que são usados para terapia de câncer.

[0311] Os CARs divulgados podem ser usados em combinação com um inibidor de ponto de verificação. As duas vias de ponto de verificação inibitórias conhecidas envolvem sinalização através dos receptores citotóxicos do antígeno-4 de linfócitos T (CTLA-4) e morte programada 1 (PD-1). Essas proteínas são membros da família CD28-B7 de moléculas de cossinalização que desempenham papéis importantes em todos os estágios da função das células T. O receptor PD-1 (também conhecido como CD279) é expresso na superfície das células T ativadas. Seus ligandos, PD-L1 (B7-H1; CD274) e PD-L2 (B7-DC; CD273), são expressos na superfície de APCs, como células dendríticas ou macrófagos. PD-L1 é o ligando predominante, enquanto PD-L2 tem um padrão de expressão muito mais restrito. Quando os ligandos se aglutinam ao PD-1, um sinal inibitório é transmitido para a célula T, o que reduz a produção de citocinas e suprime a proliferação de células T. Os inibidores de ponto de verificação incluem, entre outros, anticorpos que bloqueiam PD-1 (Nivolumabe (BMS-936558 ou MDX1106), CT-011, MK-3475), PD-L1 (MDX- 1105 (BMS-936559), MPDL3280A, MSB0010718C), PD-L2 (rHIgM12B7), CTLA- 4 (Ipilimumabe (MDX-010), Tremelimumabe (CP-675,206)), IDO, B7-H3 (MGA271), B7-H4, TIM3, LAG-3 (BMS-986016).

[0312] Anticorpos monoclonais humanos para a morte programada 1 (PD-1) e métodos para tratamento de câncer usando anticorpos anti-PD-1 sozinhos ou em combinação com outros imunoterapêuticos são descritos na Patente US n.º 8.008.449, que é incorporada por referência para esses anticorpos. Os anticorpos anti-PD-L1 e suas utilizações estão descritos na Patente US n.º 8.552.154, a qual é incorporada por referência para esses anticorpos. O agente anticâncer que compreende anticorpo anti-PD-1 ou anticorpo anti-PD-L1 é descrito na Patente US n.º 8.617.546, que é incorporada por referência para esses anticorpos.

[0313] Em algumas modalidades, o inibidor de PDL1 compreende um anticorpo que se aglutina especificamente a PDL1, como BMS- 936559 (Bristol-Myers Squibb) ou MPDL3280A (Roche). Em algumas modalidades, o inibidor de PD1 compreende um anticorpo que se aglutina especificamente a PD1, como lambrolizumabe (Merck), nivolumabe (Bristol- Myers Squibb) ou MEDI4736 (AstraZeneca). Anticorpos monoclonais humanos para PD-1 e métodos para tratamento de câncer usando anticorpos anti-PD-1 sozinhos ou em combinação com outros imunoterapêuticos são descritos na Patente US N.º 8.008.449, que é incorporada por referência para esses anticorpos. Os anticorpos anti-PD-L1 e suas utilizações estão descritos na Patente US n.º 8.552.154, a qual é incorporada por referência para esses anticorpos. O agente anticâncer que compreende anticorpo anti-PD-1 ou anticorpo anti-PD-L1 é descrito na Patente US n.º 8.617.546, que é incorporada por referência para esses anticorpos.

[0314] Os CARs divulgados podem ser usados em combinação com outras imunoterapias de câncer. Existem dois tipos distintos de imunoterapia: a imunoterapia passiva usa componentes do sistema imunológico para direcionar a atividade citotóxica alvejada contra as células cancerígenas, sem necessariamente iniciar uma resposta imune no paciente, enquanto a imunoterapia ativa desencadeia ativamente uma resposta imune endógena. Estratégias passivas incluem o uso de anticorpos monoclonais (mAbs) produzidos pelas células B em resposta a um antígeno específico. O desenvolvimento da tecnologia de hibridoma na década de 1970 e a identificação de antígenos específicos para tumores permitiram o desenvolvimento farmacêutico de mAbs que poderiam atingir especificamente células tumorais para destruição pelo sistema imunológico. Até agora, os mAbs têm sido a maior história de sucesso da imunoterapia; os três principais fármacos anticâncer mais vendidos em 2012 foram os mAbs. Entre eles está o rituximabe (Rituxan, Genentech), que se aglutina à proteína CD20, que é altamente expressa na superfície das neoplasias das células B, como o linfoma não Hodgkin (NHL). O rituximabe é aprovado pelo FDA para o tratamento de LNH e leucemia linfocítica crônica (LLC) em combinação com quimioterapia. Outro mAb importante é o trastuzumabe (Herceptin; Genentech), que revolucionou o tratamento do câncer de mama positivo para HER2 (receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2), visando a expressão de HER2.

[0315] A geração de respostas ótimas das células T CD8 “exterminadora” também requer a ativação do receptor de células T e a coestimulação, que pode ser fornecida através da aglutinação de membros da família de receptores do fator de necrose tumoral, incluindo OX40 (CD134) e 4- 1BB (CD137). OX40 é de particular interesse, pois o tratamento com um mAb anti-OX40 ativador (agonista) aumenta a diferenciação de células T e a função citolítica, levando a uma imunidade antitumoral aumentada contra uma variedade de tumores.

[0316] Em algumas modalidades, esse agente terapêutico adicional pode ser selecionado a partir de um antimetabólito, como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5- fluorouracila, decarbazina, hidroxiureia, asparaginase, gemcitabina ou cladribina.

[0317] Em algumas modalidades, um agente terapêutico adicional pode ser selecionado a partir de um agente alquilante, como mecloretamina, tioepa, clorambucila, melfalano, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatina e outros derivados da platina, como a carboplatina.

[0318] Em algumas modalidades, um agente terapêutico adicional pode ser selecionado a partir de um agente antimitótico, como taxanos, por exemplo, docetaxel e paclitaxel e alcaloides da vinca, por exemplo, vindesina, vincristina, vinblastina e vinorelbina.

[0319] Em algumas modalidades, esse agente terapêutico adicional pode ser selecionado a partir de um inibidor de topoisomerase, como topotecano ou irinotecano, ou um fármaco citostático, como etoposídeo e teniposídeo.

[0320] Em algumas modalidades, esse agente terapêutico adicional pode ser selecionado a partir de um inibidor do fator de crescimento, como um inibidor de ErbBl (EGFR) (como um anticorpo EGFR, por exemplo, zalutumumabe, cetuximabe, panitumumabe ou nimotuzumabe ou outros inibidores de EGFR, como gefitinibe ou erlotinibe), outro inibidor de ErbB2 (HER2/neu) (como um anticorpo HER2, por exemplo, trastuzumabe, trastuzumabe-DM l ou pertuzumabe) ou um inibidor de EGFR e HER2, como lapatinibe).

[0321] Em algumas modalidades, um agente terapêutico adicional pode ser selecionado a partir de um inibidor de tirosina- quinase, como imatinibe (Glivec, Gleevec STI571) ou lapatinibe.

[0322] Portanto, em algumas modalidades, um anticorpo divulgado é usado em combinação com ofatumumabe, zanolimumabe, daratumumabe, ranibizumabe, nimotuzumabe, panitumumabe, hu806, daclizumabe (Zenapax), basiliximabe (Simulect), infliximabe (Remicade), adalimumabe (Humira), natalizumabe (Tysabri), omalizumabe (Xolair), efalizumabe (Raptiva) e/ou rituximabe.

[0323] Em algumas modalidades, um agente terapêutico para uso em combinação com um CAR para tratamento dos distúrbios como descrito acima pode ser uma citocina anticancerígena, quimiocina ou uma combinação dos mesmos. Exemplos de citocinas e fatores de crescimento adequados incluem IFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL- 13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa (por exemplo, INFa2b), IFN, GM-CSF, CD40L, ligando Flt3, fator de célula-tronco, ancestral e TNFa. As quimiocinas adequadas podem incluir quimiocinas negativas para Glu-Leu-Arg (ELR), como IP-10, MCP-3, MIG e SDF-la das famílias de quimiocinas CXC e CC humanas. As citocinas adequadas incluem derivados de citocinas, variantes de citocinas, fragmentos de citocinas e proteínas de fusão de citocinas.

[0324] Em algumas modalidades, um agente terapêutico para uso em combinação com um CAR para tratamento dos distúrbios como descrito acima pode ser um regulador de controle/apoptose do ciclo celular (ou "agente regulador"). Um regulador de controle/apoptose do ciclo celular pode incluir moléculas que visam e modulam reguladores de controle/apoptose do ciclo celular, como (i) cdc-25 (como NSC 663284), (ii) quinases dependentes de ciclina que superestimulam o ciclo celular (como flavopiridol (L868275, HMR1275), 7-hidroxistaurosporina (UCN-01, KW-2401) e roscovitina (R-roscovitina, CYC202)) e (iii) moduladores de telomerase (como BIBR1532, SOT-095, GRN163 e composições descritas por exemplo, em US

6.440.735 e US 6.713.055). Exemplos não limitativos de moléculas que interferem nas vias apoptóticas incluem ligando indutor de apoptose relacionado a TNF (TRAIL)/ligando de apoptose-2 (Apo-2L), anticorpos que ativam receptores TRAIL, IFNs e Bcl-2 antissenso.

[0325] Em algumas modalidades, um agente terapêutico para uso em combinação com um CAR para tratamento dos distúrbios como descrito acima pode ser um agente regulador hormonal, como agentes úteis para terapia antiandrogênio e antiestrogênio. Exemplos desses agentes reguladores hormonais são tamoxifeno, idoxifeno, fulvestrant, droloxifeno, toremifeno, raloxifeno, dietilestilbestrol, etinilestradiol/estinila, um antiandrogênio (como flutaminde/eulexina), uma progestina (como caproato de hidroxiprogesterona, medoxi- progesterona/provera, megace/acepato demegestrol), um adrenocorticosteroide (como hidrocortisona, prednisona), hormônio liberador de hormônio luteinizante (e seus análogos e outros agonistas de LHRH, como buserelina e goserelina), um inibidor da aromatase (como anastrazol/arimidex, aminoglutetimida/citradeno, examestano) ou um inibidor de hormônio (como octreotide/sandostatina).

[0326] Em algumas modalidades, um agente terapêutico para uso em combinação com um CAR para tratamento dos distúrbios como descrito acima pode ser um ácido nucleico anticâncer ou uma molécula de RNA inibidora de câncer.

[0327] A administração combinada, como descrito acima, pode ser simultânea, separada ou sequencial. Para administração simultânea, os agentes podem ser administrados como uma composição ou como composições separadas, conforme apropriado.

[0328] Em algumas modalidades, os CARs divulgados são administrados em combinação com radioterapia. A radioterapia pode compreender radiação ou a administração associada de radiofármacos a um paciente é fornecida. A fonte de radiação pode ser externa ou interna ao paciente que está sendo tratado (o tratamento com radiação pode, por exemplo, estar na forma de radioterapia por feixe externo (EBRT) ou braquiterapia (BT)). Os elementos radioativos que podem ser usados na prática de tais métodos incluem, por exemplo, rádio, césio-137, irídio-192, amerício-241, ouro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnécio-99, iodeto-123, iodeto- 131 e índio-111.

[0329] Em algumas modalidades, os CARs divulgados são administrados em combinação com cirurgia.

[0330] As células CAR-T podem ser projetadas de várias maneiras que aumentam a citotoxicidade e especificidade do tumor, evitam a imunossupressão do tumor, evitam a rejeição do hospedeiro e prolongam sua meia-vida terapêutica. As células T TRUCK (células T redirecionadas para o extermínio universal de citocinas), por exemplo, possuem um CAR, mas também são geneticamente modificadas para liberar citocinas como IL-12 que promovem o extermínio de tumores. Como essas células são projetadas para liberar uma carga molecular após a ativação do CAR, uma vez localizada no ambiente do tumor, essas células CAR-T também são chamadas de 'CAR blindadas'. Várias citocinas como terapias contra o câncer estão sendo investigadas tanto pré-clinicamente quanto clinicamente, e também podem ser úteis quando incorporadas de maneira semelhante em uma forma TRUCK da terapia CAR-T.

Entre estas incluem-se IL-2, IL-3. IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL- 12, IL-13, IL-15, IL-18, M-CSF, GM-CSF, IFN-α, IFN- γ, TNF-α, TRAIL, ligando FLT3, linfotactina e TGF-β (Dranoff 2004). As células CAR-T “autodirigidas” ou “homing” são geneticamente modificadas para expressar um receptor de quimiocina além do seu CAR.

Como certas quimiocinas podem ser reguladas positivamente em tumores, a incorporação de um receptor de quimiocinas auxilia no tráfico a e infiltração em tumores pela célula T adotiva, aumentando assim a especificidade e a funcionalidade do CAR-T (Moon 2011). As células CAR-T universais também possuem um CAR, mas são geneticamente modificadas de modo a não expressar proteínas TCR (receptor de células T) endógenas ou MHC (complexo principal de histocompatibilidade). A remoção dessas duas proteínas do repertório de sinalização da terapia de células T adotiva impede a doença do enxerto contra hospedeiro e a rejeição, respectivamente.

As células CAR-T blindadas são adicionalmente nomeadas por sua capacidade de evitar a imunossupressão de tumores e a hipofunção de CAR-T induzida por tumores.

Esses CAR-Ts particulares possuem um CAR e podem ser geneticamente modificados para não expressar inibidores de ponto de verificação.

Alternativamente, esses CAR-Ts podem ser coadministrados com um anticorpo monoclonal (mAb) que bloqueia a sinalização do ponto de verificação.

A administração de um anticorpo anti-PDL1 restaurou significativamente a capacidade de exterminar de TILs (linfócitos infiltrantes de tumor) CAR.

Embora as vias de sinalização PD1-PDL1 e CTLA-4-CD80/CD86 tenham sido investigadas, é possível direcionar outras moléculas de sinalização de ponto de verificação imune no projeto de um CAR-T blindado incluindo LAG-3, Tim-3, IDO- 1, 2B4 e KIR.

Outros inibidores intracelulares de TILs incluem fosfatases (SHP1), ubiquitina-ligases (isto é, cbl-b) e cinases (isto é, diacilglicerol cinase). Os CAR- Ts blindados também podem ser geneticamente modificados para expressar proteínas ou receptores que os protegem ou os tornam resistentes aos efeitos de citocinas secretadas por tumores.

Por exemplo, os CTLs (linfócitos T citotóxicos) transduzidos com a forma dupla negativa do receptor TGF-β são resistentes à imunossupressão pelo TGF-β secretado por linfoma. Essas células transduzidas apresentaram atividade antitumoral notavelmente aumentada in vivo quando comparadas às suas contrapartes de controle.

[0331] As células CAR-T em tandem e duplas são únicas por possuírem dois domínios distintos de aglutinação a antígeno. Um CAR em tandem contém dois domínios de aglutinação a antígeno sequenciais voltados para o ambiente extracelular conectado aos domínios estimulatório e coestimulatório intracelular. Um CAR duplo é geneticamente modificado de modo que um domínio de aglutinação a antígeno extracelular seja conectado ao domínio coestimulatório intracelular e um segundo domínio de aglutinação a antígeno extracelular distinto seja conectado ao domínio estimulatório intracelular. Como os domínios estimulatório e coestimulatório estão divididos entre dois domínios separados de aglutinação a antígeno, os CARs duplos também são referidos como "CARs divididos". Tanto nos projetos em tandem quanto nos de CAR duplo, a aglutinação de ambos os domínios de aglutinação a antígeno é necessária para permitir a sinalização do circuito CAR na célula T. Como esses dois projetos de CAR têm afinidades de aglutinação a antígeno diferentes e distintos, eles também são chamados de CAR "biespecíficos".

[0332] Uma preocupação primária com as células CAR-T como uma forma de "terapêutico vivo" é sua manipulação in vivo e seus possíveis efeitos colaterais estimuladores do sistema imunológico. Para melhor controlar a terapia CAR-T e prevenir contra efeitos colaterais indesejados, uma variedade de recursos foram geneticamente modificados, incluindo interruptores de desligamento, mecanismos de segurança e mecanismos de controle condicional. As células CAR-T de autodestruição e marcadas/identificadas, por exemplo, são geneticamente modificadas para ter um “interruptor de desligamento” que promove a liberação da célula T que expressa CAR. Um CAR- T de autodestruição contém um CAR, mas também é geneticamente modificado para expressar um gene suicida pró-apoptótico ou "gene de eliminação" indutível após a administração de uma molécula exógena.

Uma variedade de genes suicidas pode ser empregada para esse fim, incluindo HSV-TK (vírus da herpes simplex timidina cinase), Fas, iCasp9 (caspase induzível 9), CD20, MYC TAG e EGFR truncado (receptor do fator de crescimento endotelial). O HSK, por exemplo, converterá o pró-fármaco ganciclovir (GCV) em trifosfato de GCV que se incorpora ao DNA replicante, levando à morte celular.

O iCasp9 é uma proteína quimérica que contém componentes da proteína de aglutinação ao FK506 que se aglutina à pequena molécula AP1903, levando à dimerização e apoptose da caspase 9. Uma célula CAR-T marcada/identificada, no entanto, é aquela que possui uma CAR, mas também é geneticamente modificada para expressar um marcador de seleção.

A administração de um mAb contra esse marcador de seleção promoverá a depuração da célula CAR-T.

O EGFR truncado é um desses antígenos direcionáveis pelo mAb anti-EGFR, e a administração de cetuximabe trabalha para promover a eliminação da célula CAR-T.

Os CARs criados para ter esses recursos também são chamados de sCARs de 'switchable CARs’ (CARs comutáveis) e RCARs para 'regulatable CARs’ (CARs reguláveis). Um "CAR de segurança", também conhecido como "CAR inibitório" (inhibitory CAR, iCAR), é geneticamente modificado para expressar dois domínios de aglutinação a antígeno.

Um desses domínios extracelulares é direcionado contra um antígeno relacionado ao tumor e aglutinado a um domínio coestimulatório e estimulatório intracelular.

O segundo domínio de aglutinação a antígeno extracelular é específico para o tecido normal e está ligado a um domínio de ponto de verificação intracelular, como CTLA4, PD1 ou CD45. A incorporação de múltiplos domínios inibidores intracelulares no iCAR também é possível.

Algumas moléculas inibidoras que podem fornecer esses domínios inibitórios incluem B7-H1, B7-1, CD160, PIH, 2B4, CEACAM (CEACAM-1. CEACAM-3 e/ou CEACAM-5), LAG-3, TIGIT, BTLA, LAIR1 e TGFβ-R.

Na presença de tecido normal, a estimulação deste segundo domínio de aglutinação a antígeno funcionará para inibir o CAR.

Deve-se notar que, devido a essa especificidade dupla de antígeno, os iCARs também são uma forma de células CAR-T biespecíficas. A engenharia de segurança do CAR-T aprimora a especificidade da célula CAR-T para o tecido tumoral e é vantajosa em situações em que certos tecidos normais podem expressar níveis muito baixos de um antígeno associado a um tumor que levaria a efeitos fora do alvo com um CAR padrão (Morgan 2010). Uma célula CAR-T condicional expressa um domínio de aglutinação a antígeno extracelular conectado a um domínio coestimulatório intracelular e um coestimulador intracelular separado. As sequências de domínio coestimulatório e estimulatório são geneticamente modificadas de tal maneira que, após administração de uma molécula exógena, as proteínas resultantes se juntem intracelularmente para completar o circuito CAR. Dessa maneira, a ativação do CAR-T pode ser modulada e, possivelmente, até 'ajustada' ou personalizada para um paciente específico. Semelhante a um projeto de CAR duplo, os domínios estimulatório e coestimulatório são fisicamente separados quando inativos no CAR condicional; por esse motivo, eles também são chamados de "CAR dividido".

[0333] Em algumas modalidades, dois ou mais desses recursos geneticamente modificados podem ser combinados para criar um CAR-T multifuncional aprimorado. Por exemplo, é possível criar uma célula CAR-T com design CAR duplo ou condicional que também libere citocinas como um TRUCK. Em algumas modalidades, uma célula CAR-T condicional dupla pode ser feita de modo que expresse dois CARs com dois domínios de aglutinação a antígeno separados contra dois antígenos de câncer distintos, cada um ligado aos seus respectivos domínios coestimulatórios. O domínio coestimulatório só se tornaria funcional com o domínio estimulatório após a administração da molécula ativadora. Para que essa célula CAR-T seja eficaz, o câncer deve expressar ambos os antígenos de câncer e a molécula ativadora deve ser administrada ao paciente; portanto, esse projeto incorpora recursos de células CAR-T duplas e condicionais.

[0334] Tipicamente, as células CAR-T são criadas usando células T a-β, no entanto, as células T γ-δ também podem ser usadas.

Em algumas modalidades, os construtos CAR, domínios e recursos geneticamente modificados descritos usados para gerar células CAR-T poderiam similarmente ser empregados na geração de outros tipos de células imunes que expressam CAR, incluindo células NK (exterminadora natural), células B, mastócitos, fagócitos derivados de mieloides e células NKT. Alternativamente, uma célula que expressa o CAR pode ser criada para ter propriedades de células T e células NK. Em uma modalidade adicional, o transduzido com CARs pode ser autólogo ou alogênico.

[0335] Vários métodos diferentes para expressão de CAR podem ser utilizados, incluindo transdução retroviral (incluindo γ-retroviral), transdução lentiviral, transposon/transposases (sistemas Sleeping Beauty e PiggyBac) e expressão gênica mediada por transferência de RNA mensageiro. A edição de genes (inserção ou exclusão/interrupção de genes) tornou-se de importância crescente no que diz respeito à possibilidade de engenharia de células CAR-T também. Os sistemas CRISPR-Cas9, ZFN (nuclease de dedo de zinco) e TALEN (ativador de transcrição como nuclease efetora) são três métodos potenciais pelos quais as células CAR-T podem ser geradas.

DEFINIÇÕES

[0336] O termo "sequência de aminoácidos" refere-se a uma lista de abreviações, letras, caracteres ou palavras representando resíduos de aminoácidos. As abreviaturas de aminoácidos aqui usadas são códigos convencionais de uma letra para os aminoácidos e são expressos da seguinte forma: A, alanina; B, asparagina ou ácido aspártico; C, cisteína; D ácido aspártico; E, glutamato, ácido glutâmico; F, fenilalanina; G, glicina; H histidina; I isoleucina; K, lisina; L, leucina; M, metionina; N, asparagina; P, prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, serina; T, treonina; V, valina; W, triptofano; Y, tirosina; Z, glutamina ou ácido glutâmico.

[0337] O termo "anticorpo" refere-se a uma imunoglobulina, seus derivados que mantêm capacidade de aglutinação específica e proteínas com um domínio de aglutinação homólogo ou amplamente homólogo a um domínio de aglutinação à imunoglobulina. Essas proteínas podem ser derivadas de fontes naturais ou produzidas parcial ou totalmente sinteticamente. Um anticorpo pode ser monoclonal ou policlonal. O anticorpo pode ser um membro de qualquer classe de imunoglobulina de qualquer espécie, incluindo qualquer uma das classes humanas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Em modalidades exemplares, os anticorpos usados com os métodos e composições aqui descritos são derivados da classe IgG. Além das moléculas de imunoglobulina intactas, também estão incluídos no termo "anticorpos" fragmentos ou polímeros dessas moléculas de imunoglobulina e versões humana ou humanizada de moléculas de imunoglobulina que se aglutinam seletivamente ao antígeno alvo.

[0338] O termo "fragmento de anticorpo" refere-se a qualquer derivado de um anticorpo que seja menor que o comprimento total. Em modalidades exemplares, o fragmento de anticorpo retém pelo menos uma porção significativa da capacidade de aglutinação específica do anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, diacorpo dsFv, Fc e Fd. O fragmento de anticorpo pode ser produzido por qualquer meio. Por exemplo, o fragmento de anticorpo pode ser produzido enzimaticamente ou quimicamente por fragmentação de um anticorpo intacto, pode ser produzido de forma recombinante a partir de um gene que codifica a sequência de anticorpos parcial ou pode ser total ou parcialmente produzido sinteticamente. O fragmento de anticorpo pode opcionalmente ser um fragmento de anticorpo de cadeia única. Alternativamente, o fragmento pode compreender várias cadeias que estão ligadas entre si, por exemplo, por ligações dissulfeto. O fragmento também pode ser opcionalmente um complexo multimolecular. Um fragmento de anticorpo funcional compreenderá tipicamente pelo menos cerca de 50 aminoácidos e mais tipicamente compreenderá pelo menos cerca de 200 aminoácidos.

[0339] O termo "local de aglutinação a antígeno" refere-se a uma região de um anticorpo que se aglutina especificamente a um epítopo em um antígeno.

[0340] O termo "aptâmero" refere-se a moléculas de peptídeo ou ácido oligonucleico que se ligam a uma molécula alvo específica. Essas moléculas são geralmente selecionadas de um conjunto de sequências aleatórias. Os aptâmeros selecionados são capazes de adaptar estruturas terciárias únicas e reconhecer moléculas alvo com alta afinidade e especificidade. Um "aptâmero de ácido nucleico" é um ácido oligonucleico de DNA ou RNA que se aglutina a uma molécula alvo por meio de sua conformação e, assim, inibe ou suprime funções de tal molécula. Um aptâmero de ácido nucleico pode ser constituído por DNA, RNA ou uma combinação dos mesmos. Um "peptídeo aptâmero" é uma molécula combinatória de proteína com uma sequência peptídica variável inserida dentro de uma proteína de andaime constante. A identificação de aptâmeros peptídicos é tipicamente realizada sob condições rigorosas de di-híbridos de levedura, o que aumenta a probabilidade de os aptâmeros peptídicos selecionados serem expressos de forma estável e dobrados corretamente em um contexto intracelular.

[0341] O termo “carreador" significa um composto, composição, substância ou estrutura que, quando em combinação com um composto ou composição, ajuda ou facilita a preparação, armazenamento, administração, entrega, eficácia, seletividade ou qualquer outra característica do composto ou composição para o uso ou propósito pretendido. Por exemplo, um carreador pode ser selecionado para minimizar qualquer degradação do ingrediente ativo e minimizar quaisquer efeitos colaterais adversos no sujeito.

[0342] O termo "molécula quimérica" refere-se a uma única molécula criada pela união de duas ou mais moléculas que existem separadamente em seu estado nativo. A molécula quimérica única tem a funcionalidade desejada de todas as suas moléculas constituintes. Um tipo de moléculas quiméricas é uma proteína de fusão.

[0343] O termo "anticorpo geneticamente modificado" refere-se a uma molécula recombinante que compreende pelo menos um fragmento de anticorpo que compreende um local de aglutinação a antígeno derivado do domínio variável da cadeia pesada e/ou cadeia leve de um anticorpo e pode opcionalmente compreender o todo ou parte do domínios variáveis e/ou constantes de um anticorpo de qualquer uma das classes de Ig (por exemplo IgA, IgD, IgE, IgG, IgM e IgY).

[0344] O termo "epítopo" refere-se à região de um antígeno ao qual um anticorpo se aglutina preferencialmente e especificamente. Um anticorpo monoclonal se aglutina preferencialmente a um único epítopo específico de uma molécula que pode ser definida molecularmente. Na presente invenção, múltiplos epítopos podem ser reconhecidos por um anticorpo multiespecífico.

[0345] O termo "proteína de fusão" refere-se a um polipeptídeo formado pela união de dois ou mais polipeptídeos através de uma aglutinação peptídica formada entre o terminal amino de um polipeptídeo e o terminal carboxila de outro polipeptídeo. A proteína de fusão pode ser formada pelo acoplamento químico dos polipeptídeos constituintes ou pode ser expressa como um único polipeptídeo a partir da sequência de ácido nucleico que codifica a única proteína de fusão contígua. Uma proteína de fusão de cadeia única é uma proteína de fusão que tem uma única estrutura principal polipeptídica contígua. As proteínas de fusão podem ser preparadas usando técnicas convencionais em biologia molecular para unir os dois genes de estrutura em um único ácido nucleico e, em seguida, expressar o ácido nucleico em uma célula hospedeira apropriada sob condições nas quais a proteína de fusão é produzida.

[0346] O termo "fragmento Fab" refere-se a um fragmento de um anticorpo que compreende um local de aglutinação a antígeno gerado pela clivagem do anticorpo com a enzima papaína, que corta na região de dobradiça N-terminalmente à aglutinação dissulfeto da cadeia inter-H e gera dois fragmentos Fab de uma molécula de anticorpo.

[0347] O termo "fragmento F(ab′)2" refere-se a um fragmento de um anticorpo contendo dois locais de aglutinação a antígeno, gerados pela clivagem da molécula de anticorpo com a enzima pepsina que corta na região de dobradiça terminalmente C à aglutinação de dissulfeto inter-H- cadeia.

[0348] O termo "fragmento Fc" refere-se ao fragmento de um anticorpo que compreende o domínio constante de sua cadeia pesada.

[0349] O termo "fragmento Fv" refere-se ao fragmento de um anticorpo compreendendo os domínios variáveis de sua cadeia pesada e cadeia leve.

[0350] "Construto genético" refere-se a um ácido nucleico, como um vetor, plasmídeo, genoma viral ou semelhante, que inclui uma "sequência de codificação" para um polipeptídeo ou que é transcrevível para um RNA biologicamente ativo (por exemplo, antissenso, chamariz, ribozima, etc), podem ser transfectados para células, por exemplo, em certas modalidades, células de mamíferos, e podem causar expressão da sequência de codificação em células transfectadas com o construto. O construto genético pode incluir um ou mais elementos reguladores operacionalmente ligados à sequência de codificação, bem como sequências intrônicas, locais de poliadenilação, origens de replicação, genes marcadores, etc.

[0351] O termo "identidade" refere-se à identidade de sequência entre duas moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeos. A identidade pode ser determinada comparando uma posição em cada sequência que pode ser alinhada para fins de comparação. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base, as moléculas são idênticas nessa posição. Um grau de semelhança ou identidade entre sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos é uma função do número de nucleotídeos idênticos ou correspondentes em posições compartilhadas pelas sequências de ácidos nucleicos. Vários algoritmos de alinhamento e/ou programas podem ser usados para calcular a identidade entre duas sequências, incluindo FASTA ou BLAST, que estão disponíveis como parte do pacote de análise de sequência GCG (University of Wisconsin, Madison, Wis.) e podem ser usados com, por exemplo, configuração padrão. Por exemplo, são contemplados polipeptídeos com pelo menos 70%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade com polipeptídeos específicos aqui descritos e exibindo preferencialmente substancialmente as mesmas funções, bem como polinucleotídeos que codificam esses polipeptídeos. Salvo indicação em contrário, uma pontuação de similaridade será baseada no uso do BLOSUM62. Quando o BLASTP é usado, a similaridade percentual é baseada na pontuação positiva do BLASTP e a identidade da sequência percentual é baseada na pontuação das identidades de BLASTP. “Identidades" de BLASTP mostra o número e a fração do total de resíduos nos pares de sequências de alta pontuação que são idênticos; e “Positivos” de BLASTP mostra o número e a fração de resíduos para os quais as pontuações de alinhamento têm valores positivos e são semelhantes entre si. As sequências de aminoácidos que possuem esses graus de identidade ou similaridade ou qualquer grau intermediário de identidade de similaridade com as sequências de aminoácidos aqui divulgadas são contempladas e abrangidas por esta divulgação. As sequências polinucleotídicas de polipeptídeos semelhantes são deduzidas usando o código genético e podem ser obtidas por meios convencionais, em particular por tradução reversa de sua sequência de aminoácidos usando o código genético.

[0352] O termo "ligante" é reconhecido na técnica e refere-se a uma molécula ou grupo de moléculas que conectam dois compostos, como dois polipeptídeos. O ligante pode ser constituído por uma única molécula de ligação ou pode compreender uma molécula de ligação e uma molécula espaçadora, destinada a separar a molécula de ligação e um composto por uma distância específica.

[0353] O termo "anticorpo multivalente" refere-se a um anticorpo ou anticorpo geneticamente modificado que compreende mais de um local de reconhecimento de antígeno. Por exemplo, um anticorpo "bivalente" possui dois locais de reconhecimento de antígeno, enquanto um anticorpo "tetravalente" possui quatro locais de reconhecimento de antígeno. Os termos "monoespecífico", "biespecífico", "triespecífico", “tetraespecífico" etc. referem-se ao número de diferentes especificidades do local de reconhecimento de antígeno (em oposição ao número de locais de reconhecimento de antígeno) presentes em um anticorpo multivalente. Por exemplo, todos os locais de reconhecimento de antígeno de um anticorpo "monoespecífico" se aglutinam ao mesmo epítopo. Um anticorpo "biespecífico" possui pelo menos um local de reconhecimento de antígeno que se aglutina a um primeiro epítopo e pelo menos um local de reconhecimento de antígeno que se aglutina a um segundo epítopo que é diferente do primeiro epítopo. Um anticorpo "multivalente monoespecífico" possui vários locais de reconhecimento de antígeno que todos se aglutinam ao mesmo epítopo. Um anticorpo "multivalente biespecífico" possui vários locais de reconhecimento de antígeno, alguns dos quais se aglutinam a um primeiro epítopo e alguns dos quais se aglutinam a um segundo epítopo que é diferente do primeiro epítopo.

[0354] O termo "ácido nucleico" refere-se a uma molécula natural ou sintética compreendendo um único nucleotídeo ou dois ou mais nucleotídeos ligados por um grupo fosfato na posição 3 'de um nucleotídeo na extremidade 5' de outro nucleotídeo. O ácido nucleico não é limitado pelo comprimento e, portanto, o ácido nucleico pode incluir ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA).

[0355] O termo "operacionalmente ligado a" refere-se à relação funcional de um ácido nucleico com outra sequência de ácido nucleico. Promotores, intensificadores, locais de parada transcricionais e traducionais e outras sequências de sinal são exemplos de sequências de ácidos nucleicos operacionalmente ligadas a outras sequências. Por exemplo, a aglutinação operável do DNA a um elemento de controle transcricional refere-se à relação física e funcional entre o DNA e o promotor, de modo que a transcrição desse

DNA é iniciada a partir do promotor por uma RNA polimerase que reconhece especificamente, se aglutina a e transcreve o DNA.

[0356] Os termos "peptídeo", "proteína" e "polipeptídeo" são usados de forma intercambiável para se referir a uma molécula natural ou sintética compreendendo dois ou mais aminoácidos ligados pelo grupo carboxila de um aminoácido ao grupo alfa-amino de outro.

[0357] O termo "farmaceuticamente aceitável" refere- se aos compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo de um julgamento médico adequado, adequados para uso em contato com tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade, irritação excessiva, resposta alérgica ou outros problemas ou complicações proporcionais a uma relação risco/benefício razoável.

[0358] Os termos "fragmento polipeptídico" ou "fragmento", quando usados em referência a um polipeptídeo específico, referem-se a um polipeptídeo no qual os resíduos de aminoácidos são excluídos em comparação com o próprio polipeptídeo de referência, mas em que a sequência de aminoácidos restante é geralmente idêntica àquela do polipeptídeo de referência. Tais deleções podem ocorrer no terminal amino ou no terminal carbóxi do polipeptídeo de referência, ou alternativamente ambos. Os fragmentos têm tipicamente pelo menos cerca de 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos de comprimento, pelo menos cerca de 14 aminoácidos de comprimento, pelo menos cerca de 20, 30, 40 ou 50 aminoácidos de comprimento, pelo menos cerca de 75 aminoácidos de comprimento ou pelo menos cerca de 100, 150, 200, 300, 500 ou mais aminoácidos de comprimento. Um fragmento pode reter uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo de referência. Em várias modalidades, um fragmento pode compreender uma atividade enzimática e/ou um local de interação do polipeptídeo de referência. Em outra modalidade, um fragmento pode ter propriedades imunogênicas.

[0359] O termo "domínio proteico" refere-se a uma porção de uma proteína, porções de uma proteína ou uma proteína inteira mostrando integridade estrutural; esta determinação pode ser baseada na composição de aminoácidos de uma porção de uma proteína, porções de uma proteína ou toda a proteína.

[0360] O termo "fragmento variável de cadeia única ou scFv" refere-se a um fragmento Fv no qual o domínio da cadeia pesada e o domínio da cadeia leve estão ligados. Um ou mais fragmentos de scFv podem ser ligados a outros fragmentos de anticorpo (como o domínio constante de uma cadeia pesada ou de uma cadeia leve) para formar construtos de anticorpos com um ou mais locais de reconhecimento de antígeno.

[0361] Um "espaçador", como aqui utilizado, refere- se a um peptídeo que une as proteínas que compreendem uma proteína de fusão. Geralmente, um espaçador não tem atividade biológica específica além de unir as proteínas ou preservar alguma distância mínima ou outra relação espacial entre elas. No entanto, os aminoácidos constituintes de um espaçador podem ser selecionados para influenciar algumas propriedades da molécula, como dobragem, carga líquida ou hidrofobicidade da molécula.

[0362] O termo “aglutina-se especificamente", como usado aqui, ao se referir a um polipeptídeo (incluindo anticorpos) ou receptor, refere-se a uma reação de aglutinação que é determinante da presença da proteína ou polipeptídeo ou receptor em uma população heterogênea de proteínas e outros produtos biológicos. Assim, sob condições designadas (por exemplo, condições de imunoensaio no caso de um anticorpo), um ligando ou anticorpo especificado "se aglutina especificamente" ao seu "alvo" específico (por exemplo, um anticorpo se aglutina especificamente a um antígeno endotelial) quando não se aglutina em uma quantidade significativa a outras proteínas presentes na amostra ou a outras proteínas com as quais o ligando ou anticorpo pode entrar em contato em um organismo. Geralmente, uma primeira molécula que "se aglutina especificamente" a uma segunda molécula tem uma constante de afinidade (Ka) maior que cerca de 10 5 M–1 (por exemplo, 106 M-1,

107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1 e 1012 M-1 ou mais) com essa segunda molécula.

[0363] O termo "entregar especificamente", conforme usado neste documento, refere-se à associação preferencial de uma molécula com uma célula ou tecido contendo uma molécula ou marcador alvo específico e não a células ou tecidos que não possuem essa molécula alvo. É claro que é reconhecido que um certo grau de interação não específica pode ocorrer entre uma molécula e uma célula ou tecido não alvo. No entanto, a entrega específica pode ser distinguida como mediada através do reconhecimento específico da molécula alvo. A administração tipicamente específica resulta em uma associação muito mais forte entre a molécula entregue e as células portadoras da molécula alvo do que entre a molécula entregue e as células que não possuem a molécula alvo.

[0364] O termo “sujeito" se refere a qualquer pessoa que seja alvo de administração ou tratamento. O sujeito pode ser um vertebrado, por exemplo, um mamífero. Assim, o sujeito pode ser um paciente humano ou veterinário. O termo "paciente" refere-se a um sujeito sob tratamento de um clínico, por exemplo, médico.

[0365] O termo "terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade da composição utilizada ser de quantidade suficiente para melhorar uma ou mais causas ou sintomas de uma doença ou distúrbio. Essa melhoria requer apenas uma redução ou alteração, não necessariamente eliminação.

[0366] Os termos "transformação" e "transfecção" significam a introdução de um ácido nucleico, por exemplo, um vetor de expressão, em uma célula receptora, incluindo a introdução de um ácido nucleico no DNA cromossômico da referida célula.

[0367] O termo "tratamento" refere-se ao tratamento médico de um paciente com a intenção de curar, melhorar, estabilizar ou prevenir uma doença, condição patológica ou distúrbio. Esse termo inclui tratamento ativo, isto é, tratamento direcionado especificamente para a melhoria de uma doença, condição patológica ou distúrbio, e também inclui tratamento causal, isto é, tratamento direcionado para a remoção da causa da doença associada, condição patológica ou distúrbio. Além disso, esse termo inclui tratamento paliativo, ou seja, tratamento destinado ao alívio dos sintomas, e não à cura da doença, condição patológica ou distúrbio; tratamento preventivo, isto é, tratamento direcionado a minimizar ou inibir parcial ou completamente o desenvolvimento da doença, condição patológica ou distúrbio associada; e tratamento de suporte, isto é, tratamento empregado para suplementar outra terapia específica direcionada à melhoria da doença, condição patológica ou distúrbio associada.

[0368] O termo "variante" refere-se a uma sequência de aminoácidos ou peptídeos que possui substituições conservadoras de aminoácidos, substituições não conservadoras de aminoácidos (ou seja, uma variante degenerada), substituições na posição de oscilação de cada códon (isto é, DNA e RNA) que codifica um aminoácido, aminoácidos adicionados ao terminal C de um peptídeo, ou um peptídeo com 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência a uma sequência de referência.

[0369] O termo "vetor" refere-se a uma sequência de ácido nucleico capaz de transportar para uma célula outro ácido nucleico ao qual a sequência do vetor foi ligada. O termo "vetor de expressão" inclui qualquer vetor (por exemplo, um cromossomo de fago, plasmídeo ou cosmídeo) contendo um construto de gene em uma forma adequada para expressão por uma célula (por exemplo, ligada a um elemento de controle transcricional).

[0370] Um número de modalidades da invenção foi descrito. No entanto, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo da invenção. Sendo assim, outras modalidades encontram-se dentro do âmbito das reivindicações a seguir.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: VARREDURA DE HIBRIDOMA CD99

[0371] As células EL4-hCD99 foram incubadas com anticorpos/sobrenadante de hibridomas. As células foram então coradas com o corante Zombie Green vivo morto e coradas com F(ab2) anti-mIgG-PE. O rastreador de alto rendimento INTELLICYT (iQue) foi usado para avaliar as células positivas para CD99 PE. A Figura 1 contém um gráfico de citometria de fluxo mostrando a porta usada para células vivas na análise de CD99-PE. A Figura 2 contém gráficos de citometria de fluxo mostrando controles positivo (direito) e negativo (esquerdo) usados para análise de CD99-PE. O histograma esquerdo é de uma amostra de controle na qual nenhum sobrenadante, ou seja, anticorpos (abs) foi usado. O histograma direito é de um controle positivo no qual o anticorpo CD99 marcado com PE foi usado. O portão representa uma população positiva para CD99-PE. A Figura 3 contém gráficos de citometria de fluxo mostrando hibridomas positivos para CD99. Os números na parte inferior do histograma representam poços/hibridomas.

[0372] Os hibridomas selecionados da triagem primária foram subclonados. As placas ELISA foram revestidas com antígeno CD99 (Origene, Sku # TP304058, lote ## 105470), 0,5 µg/ml em DPBS (Lonza cat # 17-512F, lote # 0000615334), 50 ul/poço, em temperatura ambiente por 1 hora e, em seguida, bloqueados com 1% de BSA/DPBS 100 ul/poço, temperatura ambiente por 1 hora. O sobrenadante dos hibridomas monoclonais foi então adicionado às placas revestidas (50 ul/poço). O anticorpo foi detectado utilizando Ig de cabra anti-camundongo-HRP (1010-05), 1:4.000 em TBST, 50 ul/poço, temperatura ambiente, durante 40 minutos, seguido por ABT/H 2O2 durante 10 minutos. As Tabelas 7 a 12 mostram os resultados dessa tela.

[0373] A Figura 4 contém um gráfico representando clones que foram positivos com ELISA e selecionados para clonagem de IgH/IgL. O clone 1H3 D1 é negativo/baixo para CD99. A Figura 5 contém gráficos de citometria de fluxo mostrando a triagem secundária de 1H3H7, IH3E9, 4C5E2, 4C5H10, 9G12C9 e 9G12G6.

[0374] Utilizando triagem primária com iQUe e triagem secundária com iQue e ELISA, foram selecionados hibridomas e clones que produziram anticorpos CD99 monoclonais. Os hibridomas monoclonais da triagem secundária são ainda subclonados e os rearranjos gênicos da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo são determinados para projetar o receptor de antígeno quimérico (CAR) de CD99.

[0375] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm os mesmos significados que comumente entendidos por um especialista na técnica à qual a invenção divulgada pertence. As publicações citadas aqui e os materiais para os quais são citadas são especificamente incorporadas por referência.

[0376] Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes devem ser abrangidos pelas seguintes reivindicações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo de receptor de antígeno quimérico (CAR) caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de aglutinação a antígeno CD99, um domínio transmembranar, um domínio de sinalização intracelular e uma região de sinalização coestimulatória.

2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de aglutinação a antígeno CD99 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) de um anticorpo que se aglutina especificamente ao CD99.

3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o scFv compreende um domínio variável pesado (VH) com sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e um domínio variável leve (V L) com sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que a sequência CDR1 do domínio V H compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; a sequência CDR2 do domínio V H compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7; a sequência CDR3 do domínio VH compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11; a sequência CDR1 do VL compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15; a sequência CDR2 do domínio V L compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18; e a sequência CDR3 do domínio V L compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 21.

4. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimulatória compreende o domínio citoplasmático de uma molécula coestimulatória selecionada a partir do grupo que consiste em CD27, CD28, 4- 1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 associado à função de linfócitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, um ligando que se aglutina especificamente a CD83 e qualquer combinação dos mesmos.

5. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo CAR é definido pela fórmula: SP–CD99–HG–TM–CSR–ISD; ou SP–CD99–HG–TM–ISD–CSR em que "SP" representa um peptídeo de sinal, em que "CD99" representa uma região de aglutinação a CD99, em que "HG" representa um domínio de dobradiça opcional, em que "TM" representa um domínio transmembranar, em que "CSR" representa uma região de sinalização coestimulatória, em que "ISD" representa um domínio de sinalização intracelular e em que "-" representa um ligante bivalente.

6. Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização de CD3 zeta (CD3ζ).

7. Sequência isolada de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que codifica o polipeptídeo recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende a sequência isolada de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 7.

9. Célula caracterizada pelo fato de que compreende o vetor, de acordo com a reivindicação 8.

10. Célula, de acordo com a reivindicação 9, sendo que a célula é caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula αβT, célula γδT, uma célula Exterminadora Natural (NK), uma célula exterminadora natural T (NKT), uma célula B, uma célula linfoide inata (ILC), uma célula exterminadora induzida por citocina (CIK), um linfócito T citotóxico (CTL), uma célula exterminadora ativada por linfocina (LAK), uma célula T reguladora ou qualquer combinação das mesmas.

11. Célula, de acordo com a reivindicação 10, sendo que a célula é caracterizada pelo fato de que exibe uma imunidade antitumoral quando o domínio de aglutinação a antígeno do CAR se aglutina ao CD99.

12. Célula caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo de receptor de antígeno quimérico (CAR), de acordo com a reivindicação 1.

13. Célula, de acordo com a reivindicação 12, sendo que a célula é caracterizada pelo fato de que é um linfócito citotóxico específico do vírus Epstein-Barr (EBV), autólogo ou alogênico.

14. Método para fornecer uma imunidade anticâncer em um sujeito com um câncer que expressa CD99, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de uma célula efetora imune geneticamente modificada para expressar o polipeptídeo CAR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, fornecendo, assim, uma imunidade antitumoral no mamífero.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a célula efetora imunológica é selecionada a partir do grupo que consiste em uma célula T, uma célula Exterminadora Natural (NK), um linfócito T citotóxico (CTL) e uma célula T reguladora.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a célula imunológica efetora é um linfócito citotóxico específico do vírus Epstein-Barr (EBV), autólogo ou alogênico.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar ao sujeito um inibidor de ponto de verificação.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o inibidor do ponto de verificação compreende um anticorpo anti-PD-1, anticorpo anti-PD-L1, anticorpo anti-CTLA-4 ou uma combinação dos mesmos.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizado pelo fato de que o câncer compreende síndromes mielodisplásicas, leucemia mieloide aguda ou leucemia bifenotípica.

20. Polipeptídeo de fusão caracterizado pelo fato de que compreende a seguinte fórmula: VLI – VHI – VLT – VHT, VLT – VHT – VLI – VHI, VHT – VLT – VHI – VLI, VHI – VLI – VHT – VLT, VLI – VHI – VHT – VLT, VLT – VHT – VHI – VLI, em que “VLI” é um domínio variável de cadeia leve específico para um antígeno de células imunes; em que "VHT" é um domínio variável de cadeia pesada específico para CD99; em que “VGT” é um domínio variável de cadeia leve específico para CD99; em que “VHI” é um domínio variável de cadeia pesada específico para o antígeno de células imunes; em que "-" consiste em um ligante peptídico ou uma aglutinação peptídica.

21. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o antígeno de célula imune é CD3.

22. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que o VHT compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e o VLT compreende as sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que a sequência CDR1 do domínio VH compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; a sequência CDR2 do domínio VH compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7; a sequência CDR3 do domínio V H compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11; a sequência CDR1 do V L compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 15; a sequência CDR2 do domínio VL compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 18; e a sequência CDR3 do domínio VL compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 21.

23. Método para tratar câncer em um sujeito caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, em um carreador farmaceuticamente aceitável.