BR112020012373A2

BR112020012373A2 - composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal

Info

Publication number: BR112020012373A2
Application number: BR112020012373-0A
Authority: BR
Inventors: Henrik Johansson; Peter Schuisky; Thomas Pausch; Thilo HackErt
Original assignee: Magle Chemoswed Holding Ab; Universität Heidelberg
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2020-11-24
Also published as: KR20200123094A; US10869622B2; CN111565760A; RU2020123650A; CA3084723C; ZA202003671B; AU2018390922B2; EP3501552A1; ES2793424T3; EP3727471A1; ES2907184T3; CN111565760B; EP3501552B1; PL3501552T3; JP7219770B2; US20190343435A1; AU2018390922A1; EP3727471B1; WO2019122120A1; CA3084723A1

Abstract

Uma composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal, para uso, por exemplo, na detecção intraoperatória de vazamento de fluido pancreático. A composição compreende um agente gelificante, aumentando a viscosidade da composição e espécies tamponantes, a composição dessa forma sendo tamponada. O agente gelificante são microesferas de a-glucana reticulada. Além disso, a composição compreende um indicador de pH. O pH da composição é pelo menos 0,1 unidades de pH inferior ou superior a um pKa do indicador de pH.

Description

COMPOSIÇÃO AQUOSA DE DETECÇÃO DE VAZAMENTO DE FLUIDO CORPORAL CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a uma composição de detecção de vazamento de fluido corporal e ao seu uso na detecção de vazamento de fluido pancreático em conjunto com cirurgia do pâncreas, por exemplo, pancreatectomia parcial.

ANTECEDENTES

[002] O câncer de pâncreas é a quarta principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo, sendo a ressecção pancreática a única cura potencial. Dezenas de milhares desses procedimentos são realizados anualmente em todo o mundo. Uma complicação frequente, séria e cara é a fístula pancreática pós-operatória causada por vazamento de fluido pancreático, o problema não resolvido mais importante da cirurgia pancreática. O vazamento de fluido pancreático representa não apenas o risco de infecções bacterianas, mas também a digestão de órgãos próximos, como o intestino ou os vasos sanguíneos, por uma ação de autodigestão do fluido pancreático, que pode causar sangramentos graves e até a morte.

[003] Portanto, o vazamento de fluido pancreático é um dos mais importantes problemas de morbidade nas pancreatectomias. Embora várias técnicas de pancreatectomia de dissecção e fechamento pancreático, bem como técnicas de gerenciamento pós-operatório tenham sido estudadas, o vazamento de fluido pancreático ainda ocorre com uma frequência de 30% a 50%. Como todo caso de fístula pancreática pós-operatória é potencialmente fatal, a detecção precoce é vital. A dificuldade com o vazamento de fluido pancreático é que o vazamento é macroscopicamente imperceptível e, atualmente, os cirurgiões não conseguem ver se e onde o remanescente pancreático está vazando durante as operações pancreáticas. As abordagens intraoperatórias existentes para prevenir ou fechar vazamento de fluido pancreático são, portanto, imprecisas, porque não existem métodos confiáveis e viáveis que permitam a visualização do vazamento de fluido pancreático em uso clínico.

[004] Durante a pancreatectomia parcial é difícil impedir completamente o vazamento de fluido pancreático, já que as aberturas do sistema ductal pancreático na superfície de corte do tecido pancreático são pequenas e dificilmente visíveis, portanto, é difícil conduzir um fechamento direcionado. Além disso, o tecido pancreático é muito macio então o fechamento cirúrgico do vazamento deve ser muito suave a fim de evitar rupturas.

[005] A medição da concentração de amilase, que é uma enzima glicolítica, no fluido de drenagem intraperitoneal é atualmente usada como um método indireto de detectar vazamento de fluido pancreático após pancreatectomias parciais. No entanto, essa técnica sofre de ser indireta e não permite a detecção direta e a localização do vazamento de fluido pancreático durante a cirurgia pancreática. Seria, assim, desejado fornecer uma técnica que possa visualizar e localizar o vazamento de fluido pancreático incolor e transparente já durante a operação.

[006] EP 2 857 830, e a publicação relacionada por Mori et al em Gastroenterology (cf. 2015; 149: p. 1334 a 1336), descreve uma sonda fluorescente capaz de detectar e gerar imagens rapidamente a presença de vazamento de fluido pancreático durante ou após a cirurgia. Embora seja declarado capaz de fornecer detecção e geração de imagens rápidas com alta sensibilidade, a sonda ainda sofre com a necessidade de iluminação com luz UV e o uso de óculos de bloqueio de luz a fim de gerar imagens do vazamento. Além disso, as reações químicas que eventualmente resultam na visualização de vazamentos levam alguns minutos antes que o vazamento seja visualizado,

perturbando notavelmente o “fluxo de progresso cirúrgico”. Além disso, como geralmente se sabe, as sondas fluorescentes tendem a ter efeitos colaterais potencialmente tóxicos e a radiação UV pode levar a danos no DNA. Assim, a abordagem de visualização fornecida é bastante complexa, ineficiente e insegura para ser implementada nos hospitais. Além disso, a forma de dosagem utilizada sofre um pouco de imprecisão, ou seja, o ponto exato do vazamento pode ser difícil de localizar.

[007] CN105334209 e CN105203541 descrevem um revelador de suco pancreático. O revelador de suco pancreático compreende um composto de indicação ácido-base, por exemplo, azul de timol e azul de bromotimol. O revelador de suco pancreático é fornecido em várias formas de dosagem selecionadas dentre o grupo que consiste em loção, spray, papel indicador, gaze indicada, algodão e um cotonete. Semelhante à sonda fluorescente de EP 2 857 830, esses reveladores de suco pancreático sofrem por serem imprecisos, ou seja, o ponto exato de vazamento pode ser difícil de identificar e exigir a remoção da forma de dosagem uma vez usada.

[008] Dada a dificuldade de realizar um tratamento direcionado no tecido pancreático, seria altamente desejável a localização rápida e precisa do ponto exato do vazamento. Além disso, seria desejável fornecer um meio de visualização degradável, o que permite que a aplicação repetida verifique novamente o fechamento suficiente e que não precise ser removido no final da operação. Além disso, também seria desejável fornecer meios de visualização para detectar vazamento de fluido pancreático em cirurgia laparoscópica.

SUMÁRIO

[009] Consequentemente, a presente invenção procura mitigar, aliviar, eliminar ou contornar uma ou mais das deficiências acima identificadas no estado da técnica e desvantagens individualmente ou em qualquer combinação, fornecendo, de acordo com um primeiro aspecto da invenção, uma composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal, a composição compreendendo um agente gelificante, aumentando a viscosidade da composição e espécies tamponantes, sendo a composição tamponada. O agente gelificante são microesferas de α-glucana reticuladas. A composição compreende adicionalmente um indicador de pH. O pH da composição é pelo menos 0,1 unidades de pH inferior ou superior a um pKa do indicador de pH.

[010] De acordo com uma modalidade, o agente gelificante são microesferas de amido reticulado. A composição pode assim compreender 5 a 25% em peso de microesferas de amido reticulado, preferencialmente 10 a 20% em peso de microesferas de amido reticulado, mais preferencialmente 13 a 17% em peso de microesferas de amido reticulado. O grau de reticulação, expresso como a razão de peso reticulador:amido, pode estar na faixa de 12 a 20% em peso, como na faixa de 13,5 a 18,5% em peso, ou 15,0 a 17,0% em peso. De acordo com uma modalidade alternativa, o agente gelificante são microesferas de dextrano reticulado.

[011] Um pKa do indicador de pH pode estar na faixa de 5 a 9; preferencialmente na faixa de 6 a 8; mais preferencialmente na faixa de 6,5 a 7,5. O indicador de pH pode assim ser azul de bromotimol e a composição pode compreender 0,001 a 0,5% em peso, tal como 0,005 a 0,25% em peso ou 0,01 a 0,1% em peso de azul de bromotimol. Além disso, o pH da composição pode estar entre 4 e 7; preferencialmente entre 5 e 6. As espécies tamponantes presentes na composição para fornecer uma composição tamponada podem estar presentes em uma quantidade de 0,1 a 30 mM, preferencialmente 0,5 a 10 mM, mais preferencialmente 1,0 a 5 mM.

[012] De acordo com o aspecto preferido da invenção, o aquoso de detecção de vazamento de fluido corporal é uma composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático. O pH dessa composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático está na faixa de 4 a 6 e um pKa do indicador de pH está na faixa de 6 a 8; preferencialmente na faixa de 6,5 a 7,5.

[013] De acordo com outro aspecto da invenção é fornecida essa a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático para uso na detecção de vazamento de fluido pancreático em conjunto com cirurgia pancreática, por exemplo, pancreatectomia parcial.

[014] De acordo com outro aspecto da invenção é fornecido um método para detectar vazamento de fluido pancreático em conjunto com a cirurgia pancreática. O método compreende: - aplicar a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático; e - detectar e localizar qualquer vazamento de fluido pancreático na superfície do tecido do pâncreas por uma alteração na cor da composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático.

[015] Características vantajosas adicionais da invenção são definidas nas reivindicações dependentes. Além disso, características vantajosas da invenção são elaboradas nas modalidades divulgadas na presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[016] A fim de fornecer um meio de detecção de vazamento de fluido pancreático, abordando as necessidades do estado da técnica, vários conceitos foram considerados. Verificou-se que os meios à base de pó, por exemplo, microesferas de amido reticulado impregnadas por indicador sofriam de ser difíceis de manusear e aplicar. Além disso, o pó aplicado era facilmente lavado pelo suco do pâncreas, proporcionando assim uma detecção imprecisa, se houver. Além disso, nenhuma tentativa de superar as deficiências dos pós secos, fornecendo-os em uma fita ou substituindo-os por lenços de papel ou gaze impregnada com indicador, foi bem-sucedida e falharam em fornecer uma detecção precisa.

[017] A fim de superar essas deficiências e fornecer um meio de detecção de vazamento de fluido pancreático que atenda às necessidades do estado da técnica, foi então considerado um meio de detecção de vazamento de fluido pancreático fluido, em vez de seco, sólido ou imobilizado. Assim, foi fornecida uma composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal compreendendo um indicador de vazamento.

[018] Reconheceu-se que empregar um indicador de pH como indicador de vazamento fornece uma resposta rápida à alteração de pH causada por vazamento de fluido pancreático, desde que o pH da composição seja diferente de um pKa do indicador de pH, de modo que uma alteração no pH resulte na alteração da cor do indicador de pH. O pH do fluido pancreático é mais alto (cerca de 8,3 a 8,5) que o pH do fluido intersticial normal (pH de cerca de 7,4). Pelo uso de um indicador de pH adequado, por exemplo, azul de bromotimol, pode ser detectado vazamento de fluido pancreático. Além disso, não apenas o pH da composição deve diferir de um pKa do indicador de pH. Também foi visto que a composição deve compreender espécies tamponantes para fornecer uma composição tamponada. O tampão permitirá um melhor contraste entre a detecção positiva e a negativa.

[019] Além disso, a fim de fornecer à composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal uma precisão aprimorada, a viscosidade da composição aquosa precisa ser aumentada. Como exemplo, a aplicação de um indicador de pH dissolvido em água, por exemplo, por pulverização, não forneceu nenhuma detecção precisa. No entanto, verificou-se que a adição de um agente gelificante aumentou a viscosidade de uma maneira desejável para fornecer uma borda nítida entre a detecção positiva e a negativa. Aumentar a viscosidade da composição diminuirá a difusão dentro da composição, estando presente como um gel ou uma massa semi-sólida. A difusão diminuída dentro da composição implica que uma alteração de pH devido ao fluido pancreático vazando, causando uma alteração na cor da composição (o azul de bromotimol muda de amarelo para azul na faixa de pH de 6,0 a 7,6) será mais localizada e, portanto, a precisão será melhorada. Assim, a precisão de uma composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal pode ser melhorada adicionando um agente gelificante aumentando a viscosidade da composição.

[020] De acordo com uma modalidade, é assim fornecida uma composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal compreendendo um agente gelificante na forma de microesferas de α-glucana reticuladas. A composição compreende adicionalmente um indicador de pH. A fim de fornecer uma alteração visível da cor em resposta a uma alteração do pH, o pH da composição é pelo menos 0,1 unidades de pH inferior ou superior a um pKa do indicador de pH.

[021] Como exemplo, para o azul de bromotimol ter um pKa de 7,0, o pH da composição deve ser 6,9 ou inferior ou 7,1 ou superior. Para fornecer uma alteração de cor mais clara, o pH da composição pode ser de pelo menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0, unidades de pH inferiores ou superiores a um pKa do indicador de pH. De acordo com uma modalidade, o pH da composição é pelo menos 1,0 unidades de pH inferior ou superior a um pKa do indicador de pH.

[022] Para detecção de vazamento de fluido pancreático, o pH da composição é preferencialmente menor que um pKa do indicador de pH, pois o pH do fluido intersticial é inferior ao pH do fluido pancreático. Assim, o pH da composição pode ser de pelo menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0,

unidades de pH inferiores a um pKa do indicador de pH. De acordo com uma modalidade, o pH da composição é pelo menos 1,0 unidades de pH inferior a um pKa do indicador de pH.

[023] Além disso, verificou-se ser necessário que a composição compreendesse espécies tamponantes, ou seja, a composição deve ser tamponada. De acordo com uma modalidade, a composição assim é tamponada. As espécies tamponantes podem estar presentes em uma quantidade total de 0,1 a 30 mM, tal como 0,5 a 10 mM ou 1,0 a 5 mM. Ter uma concentração muito alta de espécies tamponantes pode resultar em alteração de cor inexistente ou atrasada. A alteração de cor atrasada não apenas sofrerá com indicação atrasada, mas também com precisão diminuída. Além disso, uma concentração muito baixa de espécies tamponantes pode resultar em detecção imprecisa de vazamentos e potencialmente até em falsos positivos.

[024] O tamponamento da composição fornece uma composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal mais robusta. Além disso, o fluido intersticial e o fluido pancreático não diferem apenas no pH, mas também na força tampão. Enquanto o fluido intersticial não altere significativamente o pH de uma composição tamponada, o fluido pancreático, com maior força tampão devido às altas concentrações de bicarbonato no fluido pancreático, será capaz de aumentar o pH também de uma composição aquosa tamponada de detecção de vazamento de fluido corporal e assim fazendo a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal mudar de cor. O fluido pancreático compreende altas concentrações de bicarbonato a fim de poder neutralizar a acidez do ácido gástrico. Assim, tamponar a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal pode ser vantajoso para melhorar adicionalmente a precisão da composição.

[025] Como reconhecido pelo técnico no assunto, vários sistemas de tamponamento podem ser usados para fornecer uma composição tamponada. Como já destacado, a composição tamponada pode ter um pH de 4 a 7, tal como de 5 a 7, 5 a 6 ou 6 a 7. A composição pode assim compreender solução salina tamponada com fosfato (PBS). De acordo com uma modalidade, a composição assim é tamponada com fosfato e/ou citrato. A composição pode compreender de 0,1 a 30 mM de fosfato, tal como 0,5 a 10 mM ou 1,0 a 5 mM de fosfato. Nesse contexto, a concentração de fosfato refere-se à concentração geral de várias espécies de fosfato (por exemplo, HPO42- e H2PO4-).

[026] Além disso, as espécies tamponantes podem ser com base em um composto selecionado a partir do grupo que consiste em ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido acético, ácido lático, PIPES (piperazina-N, N′-bis(ácido 2- etanossulfônico)), MES (ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico) ou uma mistura de um ou vários destes compostos. Contudo, é preferencial que as espécies tamponantes sejam com base em composto(s) endógeno(s), por exemplo, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido acético e/ou ácido lático.

[027] Dependendo do indicador de pH, a presente composição pode ser usada para detectar vazamentos de vários tipos de fluidos corporais, por exemplo, bile, semelhante ao fluido pancreático sendo fracamente alcalino ou suco gástrico, sendo ácido. A bile é secretada pela vesícula biliar. Assim, a presente composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal também pode ser usada na detecção de vazamento de bile, por exemplo, após trauma ou em conjunto com cirurgia da vesícula biliar. Embora não limitado a isso, um pKa do indicador de pH pode estar na faixa de 5 a 9; preferencialmente na faixa de 6 a 8; mais preferencialmente na faixa de 6,5 a 7,5. Para detecção de vazamento de líquido pancreático, um pKa na faixa de 6 a 8, preferencialmente na faixa de 6,5 a 7,5, foi considerado adequado. Essa faixa também é preferida para a detecção de vazamento de bile. De acordo com uma modalidade, o indicador de pH é azul de bromotimol. O azul de bromotimol não apenas possui um pKa adequado, mas o azul de bromotimol também exibe um nítido contraste de cores entre pH baixo (amarelo) e alto (azul escuro). Além disso, também é nítido o contraste entre a indicação (azul escuro) e o tecido e o sangue. Além disso, o indicador de pH pode ser vermelho de fenol (cloridrato de 3-amino-7-dimetilamino-2-metilfenazina) ou vermelho neutro (também conhecido como fenolsulfonaftaleína ou 3,3-bis(p- Hidroxifenil)-2,1-3H-benzoxathiol-1,1-dióxido).

[028] Para detecção de vazamento de suco gástrico, um pKa dos indicadores de pH pode estar na faixa de 4 a 6. Como reconhecido pelo técnico no assunto, vários indicadores de pH com um pKa nessa faixa e, portanto, uma alteração de cor correspondente, são conhecidos. Como exemplo, podem ser mencionados os indicadores de pH verde de bromocresol (2,6-Dibromo-4-[7- (3,5-dibromo-4-hidroxi-2-metil-fenil)-9,9-dioxo-8-oxa-9λ6-tiabiciclo[4.3.0]nona- 1,3,5-trien-7-il]-3-metil-fenol), vermelho de metila (ácido 2-{[4- (dimetilamino)fenil]diazenil} benzóico) e violeta de metila (número de registro CAS: 1340-02-9).

[029] Como já mencionado, o pH da composição deve diferir de um pKa do indicador de pH. O pH da composição pode estar entre 4 e 7, preferencialmente entre 5 e 6. Verificou-se que um pH levemente ácido é benéfico na detecção de vazamento de fluido pancreático.

[030] Como já discutido, a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal compreende um agente gelificante na forma de microesferas de α-glucana reticuladas para aumentar a viscosidade da composição. Uma composição com viscosidade aumentada melhorou a precisão, ou seja, a alteração de cor apenas aparece próximo ao vazamento quando aplicada a, por exemplo, o remanescente pancreático após pancreatectomia. Deve-se notar, porém, que, embora o aumento da viscosidade da composição melhore a precisão, também pode tornar mais lenta a alteração de cor. Enquanto uma composição mais viscosa pode fornecer uma localização de vazamento mais precisa, uma composição muito viscosa pode sofrer alteração de cor lentamente em resposta ao vazamento. Além disso, uma composição muito fina ou muito viscosa pode ser mais difícil de aplicar.

[031] É preferível que a composição seja marcadamente pseudoplástico e/ou (pseudo)plástico de Bingham. Uma composição sendo pseudoplástico e/ou (pseudo)plástico de Bingham permanecerá em posição depois de aplicada e não se espalhará. Ainda assim, a composição pode ser facilmente aplicada via, por exemplo, uma seringa, dadas suas propriedades de pseudoplástico (cf. o "efeito ketchup").

[032] De acordo com uma modalidade, a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal compreende 5 a 25% em peso, tal como 10 a 20% em peso, 13 a 17% em peso ou 14 a 16% em peso do agente gelificante. Como destacado abaixo, as microesferas de amido reticulado representam um agente gelificante preferido.

[033] Não apenas a concentração do agente gelificante, mas também a concentração de sal, ou seja, a força iônica, afeta a viscosidade da composição. Um aumento na força da solução tem um efeito decrescente na viscosidade. Concentrações superiores a 1 M têm um efeito significativo na viscosidade. A diminuição é causada por um emparelhamento de íons entre os íons carregados e as macromoléculas na matriz. A introdução de íons leva a concentrações mais baixas a uma interação atraente diminuída entre as macromoléculas (biopolímeros) devido ao efeito de salga.

[034] De acordo com uma modalidade, a força iônica na composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal é de 50 a 500 mM, tal como 100 a 250 mM ou 125 a 175 mM. Uma força iônica na faixa de 100 a 250 mM, tal como 125 a 175 mM, pode ser especialmente preferida se o agente gelificante for microesferas de amido reticulado.

[035] Verificou-se que o agente gelificante é preferencialmente microesferas de polissacarídeos reticulados, tais como microesferas de polímero de α-D-glicose (ou seja, α-glucana) reticuladas, por exemplo, microesferas de amido reticulado ou microesferas de dextrano reticulado. As microesferas de polissacarídeo reticulado, por exemplo, microesferas de amido reticulado, fornecem uma composição sendo pseudoplástico e/ou (pseudo)plástico de Bingham. Como já destacado, uma composição sendo pseudoplástico e/ou (pseudo)plástico de Bingham permanecerá em posição depois de aplicada e não se espalhará. Ainda assim, a composição pode ser facilmente aplicada via, por exemplo, uma seringa, dadas suas propriedades de pseudoplástico (cf. o "efeito ketchup").

[036] Além disso, pelo uso de microesferas de polissacarídeo reticulado, por exemplo, microesferas de amido reticulado, como agente gelificante, verificou-se ser mais fácil estabelecer uma composição da composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal para obter uma viscosidade adequada para detecção de vazamento de fluido corporal. Microesferas inchadas melhoram o atrito interno da composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal. Isto dá que a consistência da composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal é tal que se torna muito mais fácil de manusear e aplicar. Além disso, também promove a ação do indicador no sentido de que a indicação de cores se torna mais precisa no local.

[037] Além disso, microesferas de amido reticulado e amido são biodegradáveis. Isso implica que uma composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal compreendendo microesferas de amido reticulado ou amido ou um agente gelificante relacionado, pois o gel não precisa ser removido, mas será degradado in situ. A reticulação, no entanto, implica que as microesferas de amido reticulado são degradadas mais lentamente do que o amido nativo. Dada a alta concentração de amilase no suco pancreático, a degradação do agente gelificante pode ser muito rápida, se o agente gelificante for amido não tendo sido reticulado.

[038] Como alternativa às microesferas de amido reticulado, as microesferas de dextrano reticulado podem ser usadas como agente gelificante. O dextrano difere principalmente do amido por ser ramificado por ligações α-1,3. Como dextrano mostra uma estrutura altamente ramificada e uma distribuição diferente de ligações glicosídicas não pode ser degradado pela α-amilase ou apenas parcialmente degradado pela α-amilase. A maior parte do dextrano administrado parentalmente ao corpo humano é assim excretada pelo rim, em vez de ser degradada em glicose pela α-amilase. No entanto, algumas células no corpo humano são capazes de degradar o dextrano em glicose.

[039] De acordo com uma modalidade alternativa, o agente gelificante são microesferas de dextrano reticulado. Dada a resistência à degradação pela α- amilase, as microesferas de dextrano reticulado podem fornecer detecção de vazamento mais persistente do que as microesferas de amido reticulado. Como o dextrano já é usado clinicamente em, por exemplo, soluções intravenosas como expansores de volume e como meio de nutrição parenteral, a degradação de α-amilase limitada não é considerada inaceitável para o presente uso como agente gelificante na presente composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal. Para algumas aplicações, o uso de microesferas de dextrano reticulado como agente gelificante pode até ser preferencial.

[040] De acordo com uma modalidade, o agente gelificante são microesferas de amido reticulado. As microesferas de amido reticulado consistem em amido de origem vegetal (por exemplo, batata) sendo reticulado para fornecer microesferas. Como reconhecido pelo técnico no assunto, o amido é um polímero natural, que é construído por uma mistura de duas cadeias poliméricas, um polímero de glicose ramificado (cadeias de α-4-glicose com ramificações α6). É um material natural encontrado em plantas e animais, onde funciona como reserva de energia. O polímero consiste em amilose (cadeia longa e pouco ramificada) e amilopectina (altamente ramificada e cadeia curta). A proporção entre esses dois polímeros é diferente dependendo da fonte. Como é conhecido no estado da técnica, as microesferas de amido reticulado degradáveis (DSM) são formadas por um processo de emulsificação no qual as cadeias poliméricas são reticuladas na forma esférica. Micropartículas de amido ou amido modificado foram mostradas no estado da técnica (por exemplo, D.R. Lu et al “Starch-based completely biodegradable polymer materials” eXPRESS polymer Letters Vol. 3 No. 6 (2009) p. 366-375; P.B. Malafaya et al. ”Starch-based microspheres produced by emulsion crosslinking with a potential media dependent responsive behavior to be used as drug delivery carriers” J. Mater. Sci: Mater Med (2006), 17:371-377). No estado da técnica, microesferas de amido reticulado são bem conhecidas como fazendo parte de sistemas de liberação de fármacos degradáveis. O amido nas microesferas de amido reticulado pode ser amido hidrolisado. O grau de hidrolisação pode ser usado para ajustar as propriedades das microesferas de amido reticulado resultantes.

[041] No amido reticulado para fornecer microesferas de amido reticulado é usado um reticulador, por exemplo, epicloridrina. De acordo com uma modalidade, o agente gelificante são microesferas de amido reticulado que foram reticuladas pelo uso de epicloridrina.

[042] As microesferas de dextrano reticulado podem ser obtidas de uma maneira correspondente.

[043] Como os níveis de amilase no fluido pancreático são substancialmente mais altos do que os níveis normais no corpo, o tempo de degradação das microesferas à base de amido também será respectivamente menor.

[044] O grau de reticulação afeta a resistência à degradação pela amilase. Maior grau de reticulação fornece maior resistência à degradação. O grau de reticulação deve preferencialmente ser tal que as microesferas de amido reticulado estejam intactas por pelo menos 5 minutos, quando expostas ao fluido corporal a ser detectado, a fim de permitir detectar qualquer vazamento com precisão suficiente. Um nível muito alto de reticulação no entanto afetará negativamente as propriedades, por exemplo, viscosidade e tempo de detecção da composição.

[045] De acordo com uma modalidade, o grau de reticulação, expresso como a razão em peso de reticulador: amido, pode estar na faixa de 12 a 20% em peso, tal como na faixa de 13,5 a 18,5% em peso, ou 15,0 a 17,0% em peso. Para a detecção de fluido pancreático, foi considerado preferencial um grau de reticulação de cerca de 25% em peso. As mesmas faixas se aplicam às microesferas de dextrano reticulado.

[046] As microesferas de amido reticulado são degradadas in vivo por amilase plasmática em oligossacarídeos, maltose e, eventualmente, em glicose que entra no metabolismo normal.

[047] Como a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal deve ser usada na cavidade abdominal quando usada como composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático, o agente gelificante deve preferencialmente ser biodegradável. O uso de um agente gelificante biodegradável implica que o agente gelificante não necessariamente deve ser completamente removido antes de fechar a cavidade abdominal. Especialmente quando usado em cirurgia laparoscópica, é vantajoso, ou mesmo quase necessário, que o agente gelificante seja biodegradável. As microesferas de amido reticulado representam um exemplo preferencial de um agente gelificante sendo biodegradável.

[048] As microesferas de amido reticulado, bem como as microesferas de dextrano reticulado, podem ser fornecidas em vários tamanhos e podem ter várias distribuições de tamanho. As figuras fornecidas abaixo referem-se a microesferas de amido reticulado no estado inchado como presentes na composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal. As mesmas faixas são aplicáveis a microesferas de dextrano reticulado. Verificou-se que as microesferas de amido reticulado, ou microesferas de dextrano reticulado, não devem ser muito pequenas a fim de exibir propriedades marcadamente de pseudoplástico e/ou (pseudo)plástico de Bingham. De acordo com uma modalidade, o diâmetro médio com base no volume (D[4,3]), conforme determinado de acordo com a ISO 13 320:2009 usando difração a laser, é de 100 a 1000 µm, tal como de 250 a 750 µm. Além disso, o diâmetro mediano com base no volume D[v, 0,5], conforme determinado de acordo com a ISO 13 320:2009, normalmente será ligeiramente menor que o diâmetro médio com base no volume. Ainda, também o diâmetro mediano com base no volume D[v, 0,5], conforme determinado de acordo com a ISO 13 320:2009, pode estar na faixa de 100 a 1000 µm, tal como na faixa de 250 a 750 µm, embora seja menor que o diâmetro mediano com base no volume. Além disso, a distribuição de tamanho pode ser tal que 90% das partículas, conforme determinado de acordo com a ISO 13 320:2009, tenham um diâmetro com base no volume (D[v, 0,9]) inferior a 300 a 2000 µm, tal como inferior a 500 a 1500 µm. Além disso, a distribuição de tamanho pode ser tal que 10% das partículas, conforme determinado de acordo com a ISO 13 320:2009, tenham um diâmetro com base no volume (D[v, 0,1]) inferior a 50 a 600 µm, tal como inferior a 100 a 500 µm, ou seja, 90% das partículas com um diâmetro de pelo menos 50 a 600 µm, tal como pelo menos 100 a 500 µm.

[049] De acordo com uma modalidade, a distribuição de tamanho das microesferas de amido reticulado, como presente na composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal, é tal que: - o diâmetro médio com base no volume D[4,3], conforme determinado de acordo com a ISO 13 320:2009 por difração a laser, é de 100 a 1000 µm, tal como de 250 a 750 µm; e/ou - o diâmetro com base no volume D[v, 0,9], conforme determinado de acordo com a ISO 13 320:2009 usando difração a laser, é de 300 a 2000 µm, tal como de 500 a 1500 µm; e/ou - o diâmetro médio com base no volume D[v, 0,1], conforme determinado de acordo com a ISO 13 320:2009 usando difração a laser, é de 50 a 600 µm, tal como de 100 a 500 µm.

[050] O tipo e a quantidade de agente gelificante na composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal afetará a viscosidade da composição. De acordo com uma modalidade, a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal compreende:

- 5 a 25% em peso, tal como 10 a 20% em peso 13 a 17% em peso ou 14 a 16% em peso do agente gelificante, por exemplo, microesferas de amido reticulado; - 0,001 a 0,5% em peso, tal como 0,005 a 0,25% em peso ou 0,01 a 0,1% em peso do indicador de pH, por exemplo, azul de bromotimol; e - pelo menos 75% em peso, tal como pelo menos 80% em peso de água.

[051] Preferencialmente, as microesferas de amido reticulado em tal modalidade possuem um grau de reticulação de 12 a 20% em peso, tal como 13,5 a 18,5% em peso, ou 15,0 a 17,0% em peso. Além disso, a concentração do tampão pode ser de 0,1 a 30 mM, tal como 0,5 a 10 mM ou 1,0 a 5 mM. O tampão pode ser um tampão de fosfato. Além disso, a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal pode ser baseada em solução salina. Preferencialmente, a composição aquosa compreende solução salina tamponada com fosfato a fim de fornecer uma composição isotônica tamponada. A força iônica da composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal pode de acordo com essa modalidade ser de 100 a 200 mM, preferencialmente de 125 a 175 mM.

[052] Os aspectos preferenciais (reticulação, tamanho, etc.) fornecidos na presente invenção acima em relação às microesferas de amido reticulado são igualmente aplicáveis às microesferas de dextrano reticulado. Assim, de acordo com uma modalidade, o diâmetro médio com base no volume (D[4,3]) das microesferas de dextrano reticulado, conforme determinado de acordo com a ISO 13 320:2009 usando difração a laser, é de 100 a 1000 µm, tal como de 250 a 750 µm. Além disso, o diâmetro mediano com base no volume D[v, 0,5], conforme determinado de acordo com a ISO 13 320:2009, normalmente será ligeiramente menor que o diâmetro médio com base no volume. Ainda, também o diâmetro mediano do volume D[v, 0,5], conforme determinado de acordo com a ISO 13 320:2009, pode estar na faixa de 100 a 1000 µm, tal como na faixa de 250 a 750 µm, embora seja menor que o diâmetro mediano com base no volume. Além disso, a distribuição de tamanho pode ser tal que 90% das partículas, conforme determinado de acordo com a ISO 13 320:2009, tenham um diâmetro com base no volume (D[v, 0,9]) inferior a 300 a 2000 µm, tal como inferior a 500 a 1500 µm. Além disso, a distribuição de tamanho pode ser tal que 10% das partículas, conforme determinado de acordo com a ISO 13 320:2009, tenham um diâmetro com base no volume (D[v, 0,1]) inferior a 50 a 600 µm, tal como inferior a 100 a 500 µm, ou seja, 90% das partículas com um diâmetro de pelo menos 50 a 600 µm, tal como pelo menos 100 a 500 µm. Além disso, de acordo com uma modalidade, o grau de reticulação das microesferas de dextrano reticulado, expresso como a razão em peso de reticulador:dextrano, pode estar na faixa de 12 a 20% em peso, tal como na faixa de 13,5 a 18,5% em peso, ou 15,0 a 17,0% em peso. Para a detecção de fluido pancreático, foi considerado preferencial um grau de reticulação de cerca de 25% em peso.

[053] De acordo com uma modalidade, a distribuição de tamanho das microesferas de dextrano reticulado, como presente na composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal, é tal que: - o diâmetro médio com base no volume D[4,3], conforme determinado de acordo com a ISO 13 320:2009 por difração a laser, é de 100 a 1000 µm, tal como de 250 a 750 µm; e/ou - o diâmetro com base no volume D[v, 0,9], conforme determinado de acordo com a ISO 13 320:2009 usando difração a laser, é de 300 a 2000 µm, tal como de 500 a 1500 µm; e/ou

- o diâmetro com base no volume D[v, 0,1], conforme determinado de acordo com a ISO 13 320:2009 usando difração a laser, é de 50 a 600 µm, tal como de 100 a 500 µm.

[054] O indicador de pH deve estar presente em uma quantidade suficiente para fornecer composição colorida, pelo menos acima ou abaixo de seu pKa. Assim, a concentração do indicador de pH pode ser de pelo menos 0,001% em peso, tal como pelo menos 0,005% em peso ou 0,01% em peso. Além disso, visto do ponto de vista da segurança, a concentração do indicador de pH não deve ser muito alta. Assim, a concentração do indicador de pH pode ser de 0,5% em peso ou menos, tal como 0,25% em peso ou 0,1% em peso ou menos.

[055] A fim de melhorar o prazo de validade da composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal, ela pode adicionalmente compreender um conservante. Exemplos de conservantes são conhecidos pelo técnico no assunto e incluem ácido lático e ácido benzoico, entre outros. Dado que a composição é normalmente ligeiramente ácida, a adição de conservante pode até ser dispensada com ela.

[056] Além disso, a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal pode compreender cloreto de sódio (NaCl) para ajustar a tonicidade e fornecer uma composição isotônica. A fim de fornecer uma composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal isotônica, tamponada a solução salina tamponada com fosfato (PBS) pode ser usada para dissolver o agente gelificante.

[057] De acordo com uma modalidade preferencial, a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal é uma composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático. O pH dessa composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático está na faixa de 4 a 6. Além disso, um pKa do indicador de pH pode estar na faixa de 6 a 8; tal como na faixa de 6,5 a 7,5. O indicador de pH na composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em azul de bromotimol, vermelho de fenol e vermelho neutro; e preferencialmente o indicador de pH é azul de bromotimol.

[058] Essa composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático pode ser usada na detecção de vazamento de fluido pancreático em conjunto com cirurgia pancreática, por exemplo, pancreatectomia parcial. Uma modalidade refere-se, assim, à composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático para uso na detecção de vazamento de fluido pancreático em conjunto com cirurgia pancreática, por exemplo, pancreatectomia parcial. Nesse uso, a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático é aplicada ao pâncreas durante a cirurgia pancreática. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático pode ser aplicada por meio de uma seringa. Preferencialmente, a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático é aplicada como uma camada contínua no pâncreas. Uma camada contínua pode ser fornecida aplicando uma corda de uma seringa em um padrão sinuoso no pâncreas. A espessura da camada aplicada deve ser a mais uniforme possível. Uma camada muito grossa pode dificultar a visualização de qualquer vazamento.

[059] Com base em suas propriedades, a composição manterá sua cor inicial (amarelo se for usado azul de bromotimol), a menos que haja vazamento de fluido pancreático. Um vazamento de fluido pancreático aumentará localmente o pH na composição e resultará em uma alteração de cor local (azul para azul esverdeado se for usado azul de bromotimol), não apenas sendo indicativo da quantidade, mas também localizando o ponto exato do vazamento. Assim, o cirurgião está ciente de que o fechamento ou a anastomose do remanescente pancreático é insuficiente e é necessário tratamento adicional antes que a cavidade abdominal seja fechada ou que o manejo perioperatório precise ser alterado, por exemplo, colocação de drenagem, medicação ou tratamento em unidade de terapia intensiva. Além disso, o cirurgião também recebe orientações sobre a localização exata do vazamento na superfície do tecido. O último é uma orientação importante para direcionar o tratamento de fechamento; por exemplo, ligadura adicional.

[060] Uma outra modalidade da invenção refere-se a um método para detectar vazamento de fluido pancreático em conjunto com cirurgia pancreática. Nesse método, a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático é aplicada ao pâncreas durante a cirurgia pancreática, por exemplo, após o fechamento convencional do remanescente pancreático na pancreatectomia distal com tratamento por ligadura, como suturas transversais não absorvíveis de ponto único ou uso de grampeador. Como já explicado, o vazamento de fluido pancreático será detectado e localizado na superfície do tecido por uma alteração na cor da composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático aplicada à superfície. O método pode compreender uma etapa adicional para interromper um vazamento detectado, tal como por tratamento por ligadura direcionada, por exemplo, suturas não absorvíveis de ponto único/em x ou aplicação de grampos. Como a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático é aplicada à superfície do tecido por injeção intra-abdominal, ela pode ser usada tanto em cirurgia aberta quanto em laparoscópica ou cirurgia assistida por robô.

[061] De acordo com outra modalidade, a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal é uma composição aquosa de detecção de vazamento biliar. O pH dessa composição aquosa de detecção de vazamento de bile está na faixa de 4 a 6. Além disso, um pKa do indicador de pH pode estar na faixa de 6 a 8; tal como na faixa de 6,5 a 7,5. O indicador de pH na composição aquosa de detecção de vazamento de bile pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em azul de bromotimol, vermelho de fenol e vermelho neutro; e preferencialmente é o indicador de pH azul de bromotimol.

[062] Essa composição aquosa de detecção de vazamento biliar pode ser usada na detecção de vazamento de bile em conjunto com cirurgia abdominal, por exemplo, após ressecção parcial do fígado em doenças benignas ou malignas, trauma hepático ou transplante de fígado. Uma modalidade refere- se, assim, à composição aquosa de detecção de vazamento de bile para uso na detecção de vazamento de bile em conjunto com a superfície do fígado de transseção, dano hepático traumático ou anastomose biliodigestiva. Nesse uso, a composição aquosa de detecção de vazamento biliar é aplicada na superfície do tecido, significando cápsula hepática, superfície de corte do parênquima ou anastomose biliodigestiva. Com base em suas propriedades, a composição manterá sua cor inicial (amarelo se for usado azul de bromotimol), a menos que haja vazamento de bile. Um vazamento de bile aumentará localmente o pH na composição e resultará em uma alteração de cor local (azul para azul esverdeado se for usado azul de bromotimol), não apenas sendo indicativo mas também localizando o ponto exato do vazamento biliar. Assim, o cirurgião está ciente do fechamento insuficiente do remanescente de fígado ou anastomose biliodigestiva e que é necessário tratamento adicional antes que a cavidade abdominal seja fechada ou que o gerenciamento perioperatório precise ser alterado, por exemplo, colocação de drenagem, medicação ou tratamento em unidade de terapia intensiva. Além disso, o cirurgião também recebe orientações sobre a quantidade e a localização exata do vazamento biliar. Esta última é uma orientação importante para o fechamento direcionado da superfície do tecido hepático com vazamento ou anastomose biliodigestiva, tal como ligaduras, tratamento com grampos ou aplicação de adesivos biológicos ou artificiais. Como a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido biliar é aplicada à superfície do tecido por injeção intra-abdominal, ela pode ser usada tanto em cirurgia aberta quanto em cirurgia laparoscópica ou assistida por robô. Sem elaboração adicional, acredita-se que um técnico no assunto possa, usando a descrição anterior, utilizar a presente invenção em toda a sua extensão. As modalidades específicas preferenciais anteriores devem, portanto, ser interpretadas como meramente ilustrativas e não limitativas da divulgação de qualquer forma.

[063] Embora a presente invenção tenha sido descrita acima com referência a modalidades específicas, não se destina a ser limitada à forma específica estabelecida aqui. Em vez disso, a invenção é limitada apenas pelas reivindicações anexas e, outras modalidades além das específicas acima são igualmente possíveis dentro do escopo dessas reivindicações anexas, por exemplo, diferentes daquelas descritas acima.

[064] Nas reivindicações, o termo "compreende/compreendendo" não exclui a presença de outros elementos ou etapas. Adicionalmente, embora características individuais possam ser incluídas em diferentes reivindicações ou diferentes modalidades, elas podem ser combinadas com vantagem, e a inclusão em diferentes reivindicações ou modalidades não implica que uma combinação de características não seja viável e/ou vantajosa.

[065] Além disso, referências singulares não excluem uma pluralidade. Os termos "um", "uma", "primeiro", "segundo" etc. não excluem uma pluralidade.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[066] Esses e outros aspectos, características e vantagens de que a invenção é capaz serão aparentes e elucidados a partir da descrição a seguir das modalidades exemplares da presente invenção, sendo feita referência aos desenhos anexos, nos quais:

[067] Fig. 1 é uma sequência de fotografias tiradas durante a cirurgia pancreática (pancreatectomia distal). Fig. 1a retrata a parte fechada do pâncreas remanescente após pancreatectomia distal. Nenhum vazamento é aparente a olho nu. No entanto, como pode ser visto na Fig. 1b o vazamento ainda era visualizado (cf. setas) por meio da presente composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal. Fig. 1c retrata o pâncreas após fechamento direcionado de vazamento localizado. Finalmente, como pode ser visto na Fig. 1d, a reaplicação da presente composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal confirmou que o fechamento direcionado de vazamento localizado (cf. Fig. 1b) foi bem-sucedido.

[068] Fig. 2 mostra os níveis de p-amilase diretamente após a cirurgia pancreática (DO) e até D7 (com e sem suturas extras após detectar vazamento de fluido pancreático); e

[069] Fig. 3 mostra os níveis de lipase nos diferentes grupos de animais logo após e até o dia 7 após a cirurgia pancreática (com e sem suturas extras após a detecção de vazamento de fluido pancreático).

EXPERIMENTAL

[070] Os exemplos a seguir são meros exemplos e não devem de maneira alguma ser interpretados para limitar o escopo da invenção. Pelo contrário, a invenção é limitada apenas pelas reivindicações anexas. Material

[071] Dos três tipos diferentes (tamanho e grau de reticulação) das microesferas de amido reticulado usadas, duas foram produzidas internamente na Magle AB (Kristianstad, Suécia), conforme descrito abaixo, e a terceira (Arista ®) foi obtida da Davol Inc. Todos os outros produtos químicos e reagentes usados na fabricação das microesferas de amido reticulado e nas preparações subsequentes dos hidrogéis de grau analítico obtiveram o VWR International AB, salvo indicação em contrário. O amido de batata nativo foi obtido da Lyckeby Starch (Kristianstad, Suécia). Geral

[072] Em suma, microesferas de amido reticulado dos dois primeiros tipos foram fornecidas por: - Hidrolisar o amido nativo para fornecer cadeias poliméricas mais curtas; - Reduzir o grupo de aldeídos terminais para evitar reduzir a descoloração; - Formar uma emulsão compreendendo gotas esféricas de amido; - Reticular o amido nas gotas para fornecer microesferas de amido reticulado; e microesferas de amido reticulado; e - Lavar as microesferas de amido reticulado.

[073] As propriedades das microesferas de amido reticulado resultantes, como reconhecidas no estado da técnica, dependem de vários fatores, incluindo: - o grau de hidrólise, ou seja, o comprimento das cadeias poliméricas (afetadas pelo pH, tempo de reação e temperatura); - o tamanho das microesferas (afetadas pelo tipo de emulsificante, o comprimento das cadeias poliméricas e a taxa de agitação); e - o grau de reticulação (afetado pela razão em peso de epicloridrina:amido). Preparação da solução de amido hidrolisado (HST)

[074] Para um primeiro reator, água purificada sob agitação à temperatura ambiente é carregada. Ao primeiro reator é então carregado ácido clorídrico concentrado. Ao ácido diluído é agora carregado amido de batata nativo em porções sob agitação. A temperatura encamisada é aumentada. A mistura é agitada a temperatura elevada até o grau desejado de hidrólise ser alcançado. Após o tempo de reação, a temperatura encamisada é reduzida para a temperatura ambiente. A mistura de reação ácida é arrefecida por uma adição controlada de hidróxido de sódio. A temperatura interna não deve exceder a temperatura da reação durante o carregamento da base. À mistura, o borohidreto de sódio é carregado sob agitação e condições controladas à temperatura ambiente. Uma vez que o borohidreto é dissolvido completamente, a mistura é agitada para que ocorra uma reação completa. Preparação de microesferas

[075] Para o segundo reator, tolueno e Rhodafac PA17 (emulsificante) são carregados sob condições controladas e agitados a temperatura elevada até o Rhodafac estar completamente dissolvido. Ao segundo reator é agora carregado o conteúdo do primeiro reator, compreendendo amido nativo hidrolisado e reduzido, a uma alta taxa de agitação até obter uma suspensão estável. A taxa de agitação e a composição da suspensão da mesma é ajustada dependendo de qual faixa de microesferas que deve ser produzida. À suspensão, epicloridrina é carregada sob condições controladas. A quantidade do reticulador carregado depende de qual faixa de microesferas que deve ser produzida. A reação é mantida durante a noite à temperatura elevada. Etanol é carregado e a temperatura encamisada é reduzida até a temperatura ambiente, e o produto bruto é sedimentado. A fase superior clara é sifonada. Trabalho

[076] O etanol é carregado no produto bruto sob agitação. Uma vez homogênea, a mistura foi deixada sedimentar. A fase superior é sifonada. Esta sequência é repetida três vezes.

[077] À mistura do produto é carregada água purificada, sob agitação. À pasta é agora carregado ácido acético, sob agitação para obter pH 4 a 5. O etanol é carregado. Uma vez homogênea, a mistura é deixada sedimentar e então a fase superior é sifonada.

[078] Ao reator é carregada uma solução aquosa pré-fabricada de etanol (20% em peso), a mistura é agitada. Uma vez homogênea, a mistura é deixada sedimentar e então a fase superior é sifonada. Esta sequência é repetida quatro vezes.

[079] Repetindo o procedimento acima sem sedimentação, mas a mistura é coletada da válvula inferior e filtrada.

[080] O produto é enxaguado com etanol absoluto e filtrado. O procedimento de enxágue é repetido cinco vezes.

[081] O produto é seco em uma bandeja de aço inoxidável a 60 °C sob vácuo e peneirado por uma peneira de 400 mícrons (primeiro tipo) para fornecer microesferas na faixa de tamanho (estado úmido; disperso em água purificada) de 32 a 900 µm ou através de uma peneira de 600 mícrons (segundo tipo) para fornecer microesferas na faixa de tamanho (estado úmido; disperso em água purificada) de 50 a 1200 µm. Tipos de microesferas

[082] Usando este método, foram produzidos dois tipos de microesferas de amido reticulado. O primeiro tipo possui um diâmetro médio com base no volume (D[4,3]) de cerca de 450 µm (estado úmido; disperso em água purificada) e grau de reticulação de cerca de 14%. O segundo tipo possui um diâmetro médio com base no volume (D[4,3]) de cerca de 620 µm (estado úmido; disperso em água purificada) e grau de reticulação de cerca de 15% foram produzidos.

[083] Como já foi dito, o terceiro tipo de microesferas foi o Arista® fornecido pela Davol Inc. Essas microesferas têm diâmetro médio com base no volume (D[4,3]) de cerca de 138 µm (estado úmido; disperso em água purificada) e grau de reticulação de cerca de 11%. Fornecimento de composição de detecção de vazamento de fluido pancreático

[084] A fim de fornecer uma composição de detecção de vazamento de fluido pancreático, amido de batata nativo (cf. exemplos 21 e 22), microesferas (15 g) do primeiro, segundo ou terceiro tipo foram carregadas em uma solução de etanol 25 ml contendo azul de bromotimol (0,2% p/p). A mistura resultante foi agitada durante 30 minutos à temperatura ambiente, após a qual a mistura foi seca sob vácuo a 60 °C durante a noite.

[085] O produto seco, mistura central (stem) (15 g) foi dissolvida em 100 ml de água purificada ou solução pré-fabricada contendo solução salina e um tampão de fosfato, e acidificado opcionalmente pela adição de ácido clorídrico. A mistura foi agitada até se obter uma solução homogênea à temperatura ambiente, depois o gel central homogêneo foi então preenchido em seringas.

[086] Usando este protocolo, foram obtidas 25 composições de detecção de vazamento de fluido pancreático. Modificações neste protocolo, bem como o tipo de microesferas para fornecer cada exemplo, são indicados abaixo.

[087] Exemplo 1: Mistura central compreendendo microesferas do terceiro tipo é carregada em água purificada, 100 ml e acidificada com ácido clorídrico (0,1 M). O gel homogêneo foi então preenchido em seringas.

[088] Exemplo 2: Mistura central compreendendo microesferas do segundo tipo é carregada em água purificada, 100 ml sem acidificação. O gel homogêneo foi então preenchido em seringas.

[089] Exemplo 3: Mistura central compreendendo microesferas do terceiro tipo é carregada em água purificada, 100 ml e acidificação por 5 ml de ácido clorídrico (0,1 M). O gel homogêneo foi então preenchido em seringas.

[090] Exemplo 4: Mistura central compreendendo microesferas do segundo tipo é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 83 ml e um tampão de fosfato a pH 6,4, 1 ml. O pH do gel resultante é ajustado para 4,5 usando ácido clorídrico a 0,1 M. A mistura foi agitada até se obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo foi então preenchido em seringas.

[091] Exemplo 5: Mistura central (20,5 g) compreendendo microesferas do segundo tipo foi carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 100 ml. A solução é acidificada pelo uso de ácido clorídrico, 0,1 M. A mistura é agitada até obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas.

[092] Exemplo 6: Mistura central (29,5 g) compreendendo microesferas do segundo tipo é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 150 ml. A solução é ajustada para 4,5 pelo uso de ácido clorídrico, 1 M. A mistura é agitada até obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas.

[093] Exemplo 7: Mistura central compreendendo microesferas do segundo tipo, é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 85 ml e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 1,13 ml. A solução é ajustada para 4,6 pelo uso de ácido clorídrico, 1 M. A mistura é agitada até obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas.

[094] Exemplo 8: Mistura central compreendendo microesferas do segundo tipo, é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 85 ml e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 1,13 ml. A solução é ajustada para 5,0 pelo uso de ácido clorídrico, 1 M. A mistura é agitada até obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas.

[095] Exemplo 9: Mistura central compreendendo microesferas do segundo tipo, é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 85 ml e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 1,13 ml. A solução é ajustada para 4,3 pelo uso de ácido clorídrico, 1 M. A mistura é agitada até obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas.

[096] Exemplo 10: Mistura central compreendendo microesferas do segundo tipo, é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 85 ml e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 0,565 ml. A solução é ajustada para 4,5 pelo uso de ácido clorídrico, 1 M. A mistura é agitada até obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas.

[097] Exemplo 11: Mistura central compreendendo microesferas do segundo tipo, é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 85 ml e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 0,565 ml. A solução é ajustada para 4,8 pelo uso de ácido clorídrico, 1 M. A mistura é agitada até obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas.

[098] Exemplo 12: Mistura central compreendendo microesferas do segundo tipo, é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 85 ml e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 2,26 ml. A solução é ajustada para 4,1 pelo uso de ácido clorídrico, 1 M. A mistura é agitada até obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas.

[099] Exemplo 13: Mistura central compreendendo microesferas do segundo tipo, é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 85 ml e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 2,26 ml. A solução é ajustada para 4,7 pelo uso de ácido clorídrico, 1 M. A mistura é agitada até obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas.

[0100] Exemplo 14: Mistura central compreendendo microesferas do segundo tipo, é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 83 ml e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 0,1 ml. O pH do gel é ajustado para 5,8 usando ácido clorídrico a 1 M. A mistura é agitada até se obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas e esterilizado em uma autoclave.

[0101] Exemplo 15: Mistura central compreendendo microesferas do segundo tipo, é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 83 ml e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 0,457 ml. O pH do gel é ajustado para 4,7 usando de ácido clorídrico a 1 M. A mistura é agitada até se obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas e esterilizado em uma autoclave.

[0102] Exemplo 16: Mistura central compreendendo microesferas do segundo tipo é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 83 ml e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 0,125 ml. O pH do gel é ajustado para 4,5 usando ácido clorídrico a 0,1 M. A mistura é agitada até se obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas e esterilizado a vapor em uma autoclave.

[0103] Exemplo 17: Mistura central, 48 g compreendendo microesferas do segundo tipo é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 230 ml e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 0,345 ml. O pH do gel é ajustado para 4,6 usando ácido clorídrico a 1 M. A mistura é agitada até se obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas.

[0104] Exemplo 18: Mistura central, 48 g compreendendo microesferas do segundo tipo é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 230 ml e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 0,345 ml. O pH do gel é ajustado para 4,6 usando ácido clorídrico a 1 M. A mistura é agitada até se obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas e esterilizado a vapor em uma autoclave.

[0105] Exemplo 19: Mistura central, 31 g compreendendo microesferas do segundo tipo, exceto a faixa de tamanho (estado úmido; disperso em água purificada) das microesferas sendo 150 a 2000 µm, é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 140 ml e tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 0,21 ml. O pH do gel é ajustado para 4,6 usando ácido clorídrico a 1 M. A mistura é agitada até se obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas.

[0106] Exemplo 20: Mistura stem, 28 g compreendendo microesferas do segundo tipo, exceto a faixa de tamanho (estado úmido; disperso em água purificada) das microesferas sendo 150 a 1600 µm, é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 130 ml e tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 0,195 ml. O pH do gel é ajustado para 4,5 usando ácido clorídrico a 1 M. A mistura é agitada até se obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas.

[0107] Exemplo 21: Mistura central, 10g compreendendo amido de batata nativo é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 120 ml, glicerol 4,4 g e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 0,075 ml. A mistura foi aquecida a 70 °C e agitada por 30 minutos. O pH do gel é ajustado para 4,5 usando ácido clorídrico a 0,1 M. A mistura é agitada até se obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas.

[0108] Exemplo 22: Mistura central, 10g compreendendo amido de batata nativo é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 120 ml, glicerol 4,4 g e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 0,05 ml. A mistura foi aquecida a 70 °C e agitada por 30 minutos. O pH do gel é ajustado para 4,5 usando ácido clorídrico a 0,1 M. A mistura é agitada até se obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas.

[0109] Exemplo 23: Mistura central compreendendo microesferas do primeiro tipo, é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 87 ml e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 0,124 ml. A mistura foi aquecida a 70 °C e agitada por 30 minutos. O pH do gel é ajustado para 4,4 usando ácido clorídrico a 0,1 M. A mistura é agitada até se obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas.

[0110] Exemplo 24: Mistura central compreendendo microesferas do primeiro tipo, é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 87 ml e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 0,124 ml. A mistura foi aquecida a 70 °C e agitada por 30 minutos. O pH do gel é ajustado para 4,4 usando ácido clorídrico a 0,1 M. A mistura é agitada até se obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas.

[0111] Exemplo 25: Mistura central compreendendo microesferas do primeiro tipo, é carregada em uma solução pré-fabricada contendo solução salina, 83 ml e um tampão de fosfato a 1 M a pH 5,8, 0,124 ml. A mistura foi aquecida a 70 °C e agitada por 30 minutos. O pH do gel é ajustado para 4,6 usando ácido clorídrico a 0,1 M. A mistura é agitada até se obter uma pasta homogênea. O gel homogêneo é então preenchido em seringas. Avaliação in vitro

[0112] As composições aquosas de detecção de vazamento de fluidos corporais obtidas (isto é, exemplos 1 a 25) foram avaliadas in vitro usando papel de filtro umedecido com saliva, tecido pancreático porcino fresco e fluido pancreático humano fresco. O tecido pancreático porcino foi doado pelo matadouro regional (Fleischversorgungszentrum Mannheim) e armazenado a 2°C de temperatura até o uso experimental dentro de 12 horas post mortem. O fluido pancreático humano foi aspirado a partir de espécime cirúrgica fresca de pacientes após consentimento informado, de acordo com a Declaração de Helsinki (aprovada pelo comitê de ética da Heidelberg University; votos 301/2001, 159/2002). Métodos in vitro forneceram testes altamente controlados com complexidade limitada. Assim, as amostras poderiam ser avaliadas rapidamente quanto a) praticabilidade do uso, b) tempo de reação, c) clareza e d) precisão das indicações e retorno imediato aos reveladores, possibilitando a otimização rápida do indicador.

[0113] Nos testes in vitro, algumas conclusões podem ser tiradas: - Verificou-se que um grau de reticulação de cerca de 12,5% em peso (cf. exemplo 3) era um pouco baixo demais para fornecer propriedades ótimas, pois a composição aparentemente foi degradada rapidamente. Aumentar o grau de reticulação para cerca de 16% em peso (cf. exemplos 2, 11, 14, 16 e 17)

forneceu à composição resistência adequada à degradação da amilase pelo suco pancreático (ou seja, ficando estável por pelo menos 5 minutos); - A quantidade de microesferas na composição afeta a viscosidade da composição. Concluiu-se que menos de 10% em peso de microesferas (cf. exemplos 21 e 22) forneceram composições muito líquidas para fornecer propriedades ótimas, enquanto 20% em peso de microesferas ou mais (cf. exemplo 5) forneceram uma composição muito espessa para fornecer propriedades ótimas. Uma concentração de 13 a 18% em peso de microesferas (cf. exemplos 1, 2, 6 - 20, 23 e 24) forneceu uma composição que é fácil de manusear e fornece detecção de vazamentos rápida, ou seja, em 5 minutos, e precisa; - É preferível manter a concentração do indicador de pH o mais baixa possível. No entanto, deve ser suficientemente alto para fornecer uma detecção de vazamento claramente visível. Uma concentração de BTB inferior a 0,04% em peso (cf. exemplos 1 e 2) forneceu cores um pouco fracas, embora ainda visíveis; e - As composições que não são tamponadas forneceram uma detecção de vazamento menos precisa. Além disso, a composição com alta força tampão (cf. exemplos 5 - 9, 12 e 13) forneceu uma detecção um pouco lenta, enquanto uma força tampão de 1 a 10 mM (cf. exemplos 10, 11 e 14 a 24) forneceu uma detecção de vazamento rápida e precisa. Verificação in vivo

[0114] Com base na avaliação in vitro, as composições aquosas de detecção de vazamento de fluido corporal selecionadas (ou seja, exemplo 1 - 25) também foram avaliadas em modelo animal. O projeto de teste com animais foi aprovado pela autoridade administrativa regional (Regierungspräsidium Karlsruhe, de acordo com a Deutsches TierSchG (lei alemã dos animais) §8 Abs. 1, número de referência 35-9835.81 / G-184/16) para o desenvolvimento de indicadores e testes em porcos domésticos (sus scrofa domestica) submetidos a cirurgia pancreática. A cirurgia foi realizada sob anestesia geral, como usada em humanos.

[0115] Em uma primeira prova de experimento de conceito (n = 10 animais) foram testadas composições aquosas de detecção preliminar de vazamento de fluido corporal (exemplo 1 - 5) quanto à sua aplicabilidade técnica e desempenho em operações pancreáticas finais (pancreatectomia distal, DP, ver abaixo). Paralelo a experimentos in vitro foram avaliadas as características a) praticabilidade do uso, b) tempo de reação, c) clareza e d) precisão das indicações, seguidas pela avaliação do dano tecidual inicial causado pelo indicador usando análise histológica pós-operatória do coto pancreático.

[0116] O segundo experimento (n = 8 animais) consistiu em pancreatectomia distal inicial (cf. abaixo), seguida de 48 horas de observação da citotoxicidade local e efeitos colaterais sistêmicos das composições aquosas de detecção de vazamento de fluido corporal (exemplo 5 - 25) e reoperação terminal com avaliação de patologias intra-abdominais e recuperação de amostras de tecido para análise histológica. Após um projeto de estudo de três braços os animais foram divididos em um grupo de indicador negativo sem vazamento detectado e se o indicador detectasse vazamento aleatoriamente subdividido em um grupo de indicador positivo sem fechamento extra e um grupo de indicador positivo com fechamento extra direcionado. Assim, a sensibilidade e a especificidade, bem como o impacto do fechamento refinado da fístula pancreática pós-operatória, poderiam ser estudados. Durante a observação, o impacto a curto prazo do uso da composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal no organismo biológico foi observado por avaliação clínica complementada por análise laboratorial de amostras de sangue e de fluido peritoneal. Os parâmetros clínicos incluíram sinais de infecção ou fístula pancreática pós-operatória; a análise sanguínea incluiu marcadores de inflamação, anemia ou pancreatite no sangue, além de vazamento pancreático no fluido peritoneal.

[0117] O experimento número três (n = 16 animais) foi conduzido de forma análoga ao segundo experimento, mas o tempo de observação foi estendido para 8 dias para possibilitar a avaliação do impacto de médio a longo prazo do uso da composição aquosa de detecção de vazamentos de fluidos corporais no organismo biológico. Com base no conhecimento clínico, sabe-se que nesse tempo quase todas as fístulas pancreáticas pós-operatórias se tornam clinicamente aparentes. Pelo contrário, se nenhuma complicação ocorrer uma semana após a operação, isso pode ser visto como um ponto de tempo médio de alta hospitalar, que define o maior prazo para o gerenciamento clínico. Pancreatectomia distal (DP)

[0118] A cavidade abdominal foi aberta por laparotomia mediana e a bolsa omental foi aberta para expor o pâncreas. Uma vez expostos, os últimos 2 a 3 cm do pâncreas (lobo esplênico porcino) foram liberados cirurgicamente do tecido peritoneal circundante e os 2 cm distais do pâncreas foram ressecados com bisturi. O sangramento foi interrompido com suturas não absorvíveis de ponto único/em x (máximo de 3 por animal). O fechamento do remanescente pancreático foi realizado com suturas transversais não absorvíveis de ponto único (superfície de 1x/cm). Depois disso, o coto pancreático fechado foi lavado e limpo com solução salina.

[0119] Uma vez enxaguada, uma composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de acordo com acima foi aplicada a toda a superfície do coto pancreático. A composição parece amarela quando aplicada, mas fica localmente verde-azulado se o suco pancreático estiver vazando devido ao fechamento insuficiente em alguma localização. Essa reação do indicador ocorre imediatamente, ou seja, em segundos. Dada a viscosidade da composição, a alteração de cor aparece apenas nas proximidades do vazamento.

[0120] Em caso de vazamento de suco pancreático, o fechamento fino do coto usando suturas não absorvíveis de ponto único / em x pode ser aplicado sobre vazamentos visualizados. Depois disso, o fechamento pode ser controlado por repetição ilimitada da aplicação da composição.

[0121] Eventualmente, o gel de composição foi removido com gaze e enxaguamento com solução salina. Uma drenagem abdominal de silicone foi colocada ao lado do coto pancreático para evacuação pós-operatória e análise de líquido; e a parede abdominal foi fechada. Toxicologia e citotoxicidade

[0122] A toxicologia de PAN foi avaliada analisando-se farmacocinética in vivo de seus produtos de degradação em 48 horas. Além disso, foram avaliadas lesões agudas no tecido local causadas pelo indicador em minutos, bem como efeitos colaterais intra-abdominais macroscópicos e histológicos locais do dispositivo durante 8 dias. Finalmente, analisou-se a citotoxicidade de seus produtos de degradação em células direcionadas pancreáticas.

[0123] Para avaliação toxicológica de hidrogel do indicador PAN estudos de farmacocinética foram conduzidos medindo as concentrações de produtos de degradação do dispositivo nos componentes de fluidos corporais ao longo do tempo, consequentemente à aplicação abdominal na cirurgia pancreática. Sangue a partir da veia portal e fluido peritoneal a partir do situs intraoperatório ou drenagens pós-operatórias foram amostrados. Os pontos de tempo de amostragem em relação à aplicação do indicador foram: 0 min (linha de base antes da aplicação do indicador), 1, 5, 30, 60 e 120 min, 1º e 2º dia do pós-operatório. Devido à sua composição com água e microesferas de amido de componentes degradáveis, apenas o constituinte adicional azul de bromotimol (BTB) precisou ser avaliado. Deve-se avaliar se quanto de BTB permanece no organismo após a aplicação no campo da cirurgia pancreática, é reabsorvido à circulação venosa portal e passa pelo metabolismo hepático para alcançar a circulação venosa central. Assim, amostras de corpo foram coletadas nos diferentes compartimentos do corpo ao longo do tempo, conforme descrito acima. Devido às quantidades de BTB extremamente pequenas esperadas a serem medidas, foi utilizado o método de detecção muito sensível por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - Espectrometria de Massa (HPLC- MS).

[0124] Em todos os porcos um aumento imediato e forte da concentração de BTB no fluido de drenagem após a aplicação do indicador foi seguido por uma diminuição gradual com pequenas quantidades detectáveis de BTB no 1º dia pós-operatório (<20 ng/ml) até o 2º dia pós-operatório não havia quantidade detectável de BTB restante em nenhum dos fluidos de drenagem do porco. No sangue venoso portal, pequenas quantidades de BTB foram encontradas apenas em um porco 5 e 30 minutos após a aplicação. Nos demais porcos e pontos de tempo, nenhum BTB foi detectado (Tabela 1). Tabela 1 - Concentração de BTB na drenagem e no Sangue Venoso Portal, respectivamente Concentração de BTB na drenagem no ponto do tempo [ng/ml] Nº do Min. 0 Min. 1 Min. 5 Min. 30 Min. 60 Min. 120 Dia 1 Dia 2 Animal Tox. 1 0 2060 7650 3280 1140 619 32,1 -

Tox. 2 0 9220 389 10,7 9,27 263 18,9 0 Tox. 3 0 3600 2560 1220 1270 631 14,4 0 Tox. 4 7,44 2010 2070 712 224 121 2,98 0 Média 1,9 4222,5 3167,3 1305,7 660,8 408,5 17,1 0 Concentração de BTB no Sangue Venoso Portal no ponto de tempo [ng/ml] Nº do Mín. 0 Mín. 1 Mín. 5 Mín. 30 Mín. 60 Mín. 120 Dia 1 Dia 2 Animal Tox. 1 0 0 0 0 0 0 0 0 Tox. 2 0 0 0 0 0 0 0 0 Tox. 3 0 0 0 0 0 0 0 0 Tox. 4 0 0 2,02 2,11 0 0 0 0 Média 0 0 0,51 0,53 0 0 0 0

[0125] Para verificar as alterações histopatológicas locais de curto prazo no pâncreas causadas pelo indicador, foram colhidos um total de 24 espécimes de tecido pancreático fresco de seis porcos para avaliação histopatológica. Quatro fatias transversais de tamanho igual (2 cm) foram colhidas de cada porco e tratadas com PAN ou solução salina (controle) por 5 ou 10 minutos. Após 5 ou 10 minutos, o indicador foi lavado e os tecidos pancreáticos foram imediatamente fixados e colocados em blocos de parafina para avaliação histológica.

[0126] A histologia mostrou nenhum dano local, pancreatite ou citotoxicidade significantes. Não foram observadas diferenças na classificação histopatológica da lesão pancreática aguda entre os grupos de tratamento e controle.

[0127] A citotoxicidade por PAN foi adicionalmente avaliada em um ensaio de cultura de células. A atividade metabólica das células viáveis foi avaliada por fotometria de fluorescência da resofurina metabolizada a partir da resazurina após incubação com quantidade crescente de BTB. Os hidrogéis indicadores de PAN contêm BTB a uma concentração de quase 0,5 mg/ml.

Assim, foram testadas soluções de BTB com concentrações de 0,5 mg/ml, 1 mg/ml, 1,5 mg/ml e 5,5 mg/ml, respectivamente. Citotoxicidade é definida como viabilidade celular inferior a 70%. Não foi observada citotoxicidade para 0,5-1,5 mg/ml de BTB. 5,5 mg/ml de BTB mostraram toxicidade leve. Comparação: indicador (+)/sutura extra, indicador (+)/sem sutura extra e indicador (-)

[0128] O impacto do fechamento direcionado baseado em indicadores do remanescente pancreático para reduzir a taxa de fístula pancreática foi avaliado pela investigação dos níveis de p-amilase e p-lipase no fluido de drenagem.

[0129] O indicador foi testado após pancreatectomia distal em porcos vivos. Os porcos foram divididos em grupos de estudo de acordo com a reação do indicador, visualizando o vazamento do remanescente pancreático fechado padrão como "indicador negativo/positivo". No caso de reação "positiva" do indicador, os animais foram subagrupados randomicamente naqueles que receberam um fechamento direcionado baseado em indicador ("sutura extra") ou naqueles que não receberam nenhum fechamento extra do vazamento visualizado. A randomização foi conduzida pelo lançamento de uma moeda. Grupo 1: Indicador positivo, sem sutura extra; Grupo 2: Indicador positivo, sutura extra; e Grupo 3: Indicador negativo

[0130] A fim de avaliar o efeito do fechamento direcionado, α-amilase e lipase foram medidas no soro e na drenagem no dia 0 - 8 (cf. resultado apresentado nas Figs. 2 e 3). Concentrações elevadas de enzimas pancreáticas na cavidade abdominal/ascite no pós-operatório representam a ocorrência e a intensidade do vazamento bioquímico das secreções pancreáticas que podem levar à fístula pancreática pós-operatória. Os valores no dia 0 representam as condições da linha de base, enquanto os valores seguintes indicam o curso pós- operatório. De acordo com definições internacionais, a partir do terceiro dia após a operação, os níveis de enzimas devem ter caído abaixo de 3 vezes os valores séricos normais institucionais de limite superior para descartar a existência de vazamento bioquímico. Se as manifestações clínicas se adicionarem a um vazamento bioquímico existente, uma fístula pancreática pós-operatória pode ser diagnosticada de acordo com a definição.

[0131] Após a cirurgia, a concentração de enzimas pancreáticas nas drenagens abdominais diferiu significativamente entre os grupos de tratamento. Houve uma grande elevação dos níveis de amilase do grupo de tratamento 1 (indicador positivo, sem tratamento extra) em comparação com o grupo de tratamento 3 (indicador negativo) (Figura 2). Nos seguintes dias 5 - dia 7, permaneceu uma tendência de elevação, embora diminuindo gradualmente. Interessantemente, a variação dos níveis de concentração no grupo 1 (indicador positivo, sem tratamento extra) foi alta, com desvio padrão >10 000U/l no dia 1 e >5 000U/l no dia 2, dia 3, dia 5 e dia 7. A variação no grupo 2 (indicador positivo, sutura extra) e especialmente no grupo 3 (indicador negativo) foi muito menor com desvios padrão sempre <3500U/l e <1500U/l, respectivamente.

[0132] O fechamento direcionado no grupo de tratamento 2 (indicador positivo, sutura extra) levou a uma redução definitiva dos níveis de enzimas do fluido de drenagem em comparação com o grupo de tratamento 1 (indicador positivo, sem tratamento extra). A redução dos níveis de enzimas de drenagem foi tão distintiva que uma diferença significativa não pôde mais ser observada mesmo se o grupo 2 (indicador positivo, tratamento extra) e o grupo 3 (indicador negativo) fossem comparados (p> 0,05 para todos os dias pós- operatórios).

[0133] Os valores de lipase na drenagem foram analisados do dia 0 - 7. Foi demonstrado que a lipase, além da amilase, é um indicador precoce de vazamento pancreático. Como esperado, os níveis de lipase na drenagem se desenvolveram paralelamente (cf. Figura 2) aos níveis de amilase na drenagem correlacionados com o vazamento pancreático. De acordo com os resultados dos níveis de amilase houve níveis muito maiores de lipase nas drenagens no grupo de tratamento 1 (positivo, sem tratamento extra), em comparação com o grupo 3 (negativo), enquanto uma redução foi observada no grupo 2 (positivo, sutura extra). Conclusões

[0134] Uma nova composição aquosa para detecção de vazamento de fluido corporal in vitro foi desenvolvida. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal foi avaliada e adaptada in vivo para finalmente ser facilmente aplicável no remanescente pancreático ou no tecido anastomótico como uma composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de reação rápida. A prova de conceito mostrou que a composição visualiza o vazamento pancreático com precisão e rapidez na margem de ressecção em um modelo porcino de pancreatectomia distal.

[0135] A sensibilidade e a especificidade da composição em relação ao vazamento pancreático foram ambas de 100%. A resolução visual foi menor que uma gota (<500 µm de diâmetro). Assim, tornou-se possível o fechamento de vazamento direcionado refinado seguido de controle de estanqueidade através da reaplicação de indicadores ilimitada.

[0136] Em estudos observacionais de porcinos a médio e longo prazo, a composição não prejudicou significativamente o organismo. Importante salientar, nenhum efeito colateral sistêmico ocorreu. No pâncreas, a composição não levou a pancreatite, sangramento ou citotoxicidade significante como confirmado pela histologia. O vazamento pancreático detectado visualizado pela reação positiva do indicador levou especificamente à fístula pancreática pós-operatória em todos os casos, o que não só foi confirmado pelo aumento das concentrações de enzimas pancreáticas nos fluidos peritoneais nos primeiros dias após a operação, mas também acompanhado por condições médicas específicas, como esvaziamento gástrico tardio ou abscesso intra-abdominal. Pelo contrário, o fechamento de vazamento direcionado reduz significativamente a taxa de fístula pancreática pós-operatória, como visto pela enorme redução dos níveis de enzimas pancreáticas no fluido peritoneal, seguida pela rápida recuperação dos animais.

[0137] Esta composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal visualiza vazamentos pancreáticos em operações pancreáticas experimentais com facilidade e rapidez, sem efeitos colaterais ou toxicidade relevantes e permite quantificação e localização precisa do vazamento pancreático diretamente na operação. A visualização permite um gerenciamento perioperatório adaptado, bem como o fechamento direcionado do vazamento, reduzindo significativamente a ocorrência de fístula pancreática pós-operatória.

[0138] Além disso, a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal foi confirmada como segura, ou seja, não está associada a nenhum efeito de citotoxicidade significante. Além disso, foi verificado que o gel pode contribuir para diminuir o risco pós-operatório após a cirurgia pancreática.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uma composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal, a composição compreendendo um agente gelificante, aumentando a viscosidade da composição, em que o agente gelificante são microesferas de α- glucana reticulada e espécies tamponantes, a composição dessa forma sendo tamponada, em que a composição compreende adicionalmente um indicador de pH, e em que o pH da composição é pelo menos 0,1 unidades de pH inferior ou superior a um pKa do indicador de pH.

2. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de acordo com a reivindicação 1, em que o agente gelificante são microesferas de amido reticulado.

3. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de acordo com a reivindicação 1, em que o agente gelificante são microesferas de dextrano reticulado.

4. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de acordo com a reivindicação 2 ou 3, em que a composição compreende 5 a 25% em peso de microesferas de amido reticulado ou microesferas de dextrano reticulado, preferencialmente 10 a 20% em peso de microesferas de amido reticulado ou microesferas de dextrano reticulado, mais preferencialmente 13 a 17% em peso de microesferas de amido reticulado ou microesferas de dextrano reticulado.

5. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de acordo com a reivindicação 2, 3 ou 4, em que o grau de reticulação, expresso como a razão em peso de reticulador:amido ou como a razão reticulador:dextrano, está na faixa de 12 a 20% em peso, tal como na faixa de 13,5 a 18,5% em peso, ou 15,0 a 17,0% em peso; preferencialmente as microesferas de amido reticulado ou as microesferas de dextrano reticulado, sendo reticuladas por epicloridrina.

6. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, em que o diâmetro médio com base no volume (D[4,3]), como determinado de acordo com a ISO 13 320:2009 usando difração de laser, das microesferas de amido reticulado ou microesferas de dextrano reticulado, como presentes na composição, é de 100 a 1000 µm, tal como de 250 a 750 µm.

7. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o pH da composição é pelo menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0 unidades de pH inferiores ou superiores a um pKa do indicador de pH; preferencialmente o pH da composição sendo pelo menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0 unidades de pH inferiores a um pKa do indicador de pH.

8. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que um pKa do indicador de pH está na faixa de 5 a 9; preferencialmente na faixa de 6 a 8; mais preferencialmente na faixa de 6,5 a 7,5.

9. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de acordo com a reivindicação 8, em que o indicador de pH é azul de bromotimol, preferencialmente a composição compreendendo 0,001 a 0,5% em peso, tal como 0,005 a 0,25% em peso ou 0,01 a 0,1% em peso de azul de bromotimol.

10. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o pH da composição está entre 4 e 7; preferencialmente entre 5 e 6.

11. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que as espécies tamponantes estão presentes em uma quantidade de 0,1 a 30 mM, preferencialmente de 0,5 a 10 mM, mais preferencialmente de 1,0 a 5 mM.

12. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de acordo com a reivindicação 11, em que a composição é tamponada com fosfato.

13. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a composição compreende: - 10 a 20% em peso, tal como 13 a 17% em peso ou 14 a 16% em peso do agente gelificante, o agente gelificante sendo microesferas de amido reticulado; - 0,001 a 0,5% em peso, tal como 0,005 a 0,25% em peso ou 0,01 a 0,1% em peso do indicador de pH, preferencialmente o indicador de pH sendo azul de bromotimol; - pelo menos 75% em peso de água; e - opcionalmente, solução salina tamponada com fosfato; em que: - as microesferas de amido reticulado, se presentes, têm um grau de reticulação de 12 a 20% em peso, tal como 13,5 a 18,5% em peso, ou 15,0 a 17,0% em peso; e - a concentração de tampão é de 0,1 a 30 mM, tal como 0,5 a 10 mM ou 1,0 a 5 mM.

14. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que a composição aquosa compreende adicionalmente: - um conservante; e/ou - solução salina.

15. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de acordo com a reivindicação 1 a 14, em que a composição é uma composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático e o pH da composição está na faixa de 4 a 6; e em que um pKa do indicador de pH está na faixa de 6 a 8; preferencialmente na faixa de 6,5 a 7,5.

16. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido corporal de acordo com a reivindicação 15, em que o indicador de pH é selecionado a partir do grupo que consiste em azul de bromotimol, vermelho de fenol, antocianinas e vermelho neutro.

17. A composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em que a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático é para uso na detecção de vazamento de fluido pancreático em conjunto com cirurgia pancreática, por exemplo, pancreatectomia parcial.

18. Um método para detectar vazamento de fluido pancreático em conjunto com cirurgia pancreática, o método compreendendo: - aplicar a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático de acordo com a reivindicação 15 ou 16 ao pâncreas durante a cirurgia pancreática; e - detectar e localizar qualquer vazamento de fluido pancreático na superfície do tecido do pâncreas por uma alteração na cor da composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático.

19. O método para detectar vazamento de fluido pancreático em conjunto com cirurgia pancreática de acordo com a reivindicação 18, em que a composição aquosa de detecção de vazamento de fluido pancreático é aplicada após o fechamento do remanescente pancreático na pancreatectomia distal com tratamento por ligadura.

20. O método para detectar vazamento de fluido pancreático em conjunto com cirurgia pancreática de acordo com a reivindicação 18 ou 19, em que o método compreende adicionalmente a etapa de:

- interromper um vazamento detectado.

21. O método para detectar vazamento de fluido pancreático em conjunto com cirurgia pancreática de acordo com a reivindicação 20, em que o vazamento é interrompido pelo tratamento por ligaduras ou pela aplicação de grampos.