BR112020012338A2

BR112020012338A2 - compostos para controlar patógenos de planta

Info

Publication number: BR112020012338A2
Application number: BR112020012338-2A
Authority: BR
Inventors: Willem Desmedt; Tina Kyndt; Bartel Vanholme
Original assignee: Universiteit Gent; Vib Vzw; Taminco Bvba
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2020-11-24
Also published as: US20200305428A1; WO2019122107A1; CN111511211A; US11992011B2; CN111511211B; EP3726990A1

Abstract

A presente invenção está no campo do controle de patógenos agrícolas. Mais especificamente, a invenção se refere a compostos capazes de inibir cinamato-4-hidroxilase e seu uso para a proteção de plantas contra patógenos de planta, em particular, contra nematoides, fungos e/ou bactérias. A invenção também fornece composições compreendendo os mesmos, métodos de fabricação dos mesmos e métodos de controlar doenças de plantas.

Description

“COMPOSTOS PARA CONTROLAR PATÓGENOS DE PLANTAS” CAMPO DA INVENÇÃO

[001]A presente invenção está no campo do controle de patógenos agrícolas.

[002]Mais especificamente a invenção se refere a compostos capazes de inibir a cinamato-4-hidroxilase e seu uso para a proteção de plantas contra patógenos de planta, em particular, contra nematoides, fungos e/ou bactérias. A invenção também fornece composições compreendendo os mesmos, métodos de fabricação dos mesmos e métodos de controlar doenças de plantas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003]As plantas estão sujeitas a múltiplos agentes potenciais que causam doenças, incluindo bactérias patogênicas de plantas, fungos e nematoides parasíticos de plantas.

[004]As bactérias são micro-organismos unicelulares procarióticos, geralmente variando de 1 a 2 µm em tamanho que estão presentes em todas as superfícies das plantas (epífitas) e dentro das plantas (endófitas) onde elas podem se comportar como benéficas ou patogênicas ao hospedeiro. As bactérias patogênicas de plantas causam muitas doenças graves de plantas em todo o mundo, e seus sintomas variam de manchas, padrões de mosaico ou pústulas nas folhas e frutos, ou apodrecimento de tubérculo malcheiroso, galhas da coroa à morte da planta. A bactéria patogenética Erwinia amylovora foi mostrada pela primeira vez em 1878 como sendo responsável pela praga de fogo de maçãs e peras, que é atualmente uma doença generalizada em grande parte do mundo temperado. A Agrobacterium tumefaciens patogênica causa a doença das galhas da coroa em um grande número de hospedeiros. A maioria das bactérias patogênicas de plantas são Gram-positivas, classificadas dentro do Filo Actinobacteria ou Gram-negativas no Filo Proteobacteria.

[005]Os fungos são micro-organismos heterotróficos eucarióticos, que podem se reproduzir sexualmente e assexualmente por meio da produção de esporos e outras estruturas. A maioria dos fungos patogênicos de plantas pertence aos Ascomicetos e aos Basidiomicetos. Os esporos podem se espalhar por longas distâncias pelo ar ou água, ou podem ser transmitidos pelo solo.

[006]Os Oomicetos são organismos semelhantes aos fungos. Eles incluem alguns dos patógenos mais destrutivos de plantas, incluindo o gênero Phytophthora, que inclui os agentes causais da crestamento tardio da batata e morte súbita do carvalho. Espécies particulares de oomicetos são responsáveis pela podridão das raízes.

[007]Os nematoides são organismos ativos, flexíveis, elongados que vivem em superfícies úmidas ou em ambientes líquidos, incluindo filmes de água dentro do solo e tecidos úmidos dentro de outros organismos. Existem numerosas espécies nemátodes parasíticas de plantas, incluindo vários nematoides de nós das raizes (e.g., Meloidogyne sp.), nematoides de lesões (e.g., Pratylenchus sp.), nematoides de cistos (e.g., Heterodera sp.), nematoide-punhal (e.g., Xiphinema sp.) e nematoides do talo e bulbo (e.g., Ditylenchus sp.) entre outros. Os nematoides tilenchídeos (membros da ordem Tylenchida), incluindo as famílias Heteroderidae, Meloidogynidae e Pratylenchidae, são o grupo maior e mais economicamente importante de nematoides parasíticos de plantas. As espécies de nematoides crescem através de uma série de estágios de ciclo de vida e ecdises. Tipicamente, existem cinco estágios e quatro ecdises: estágio do ovo; J1 (i.e., primeiro estágio juvenil); M1 (i.e., primeira ecdise); J2 (segundo estágio juvenil; às vezes eclodem do ovo); M2; J3; M3; J4; M4; A (adulto).

Os estágios juvenis (“J”) também são algumas vezes referidos como estágios larvais (“L”).

[008]As espécies de nematoides específicas de plantas e específicas de animais evoluíram como parasitas de muito sucesso e são responsáveis por perdas econômicas significativas na agricultura e pecuária e por morbidez e mortalidade em humanos. Patógenos bacteriano e fúngicos ou parasitas nematoides de plantas podem atacar ou habitar todas as partes das plantas, incluindo raízes, desenvolvimento de botões de flores, folhas, sementes e caule. Nematoides parasíticos de plantas são classificados com base em seus hábitos alimentares nas amplas categorias ectoparasitas migratórios, endoparasitas migratórios e endoparasitas sedentários. Os endoparasitas sedentários, que incluem os nematoides de nós das raízes (Meloidogyne sp.) e nematoides de cistos (Globodera e Heterodera) induzem locais de alimentação (“células gigantes” no caso de nematoides de nós das raizes e “sincitia” para nematoides de cistos) e estabelecem infecções a longo prazo dentro de raízes que são frequentemente muito prejudiciais para as culturas. Fungos e bactérias patogênicos são classificados como biotróficos ou necrotróficos, onde os biotróficos colonizam o tecido de plantas vivas e obtêm nutrientes das células hospedeiras vivas e os necrotróficos infectam e matam o tecido do hospedeiro e extraem os nutrientes das células hospedeiras mortas.

[009]Composições, métodos e agentes para controlar as infestações por patógenos nematoides e fúngicos ou bacterianos foram fornecidos em várias formas.

Métodos de controle biológico e de cultura, incluindo quarentenas de plantas, foram tentados em numerosos casos. Em algumas culturas, foram identificados genes de resistência das plantas que permitem a resistência ou tolerância à doença.

Composições químicas, tais como nematicidas, fungicidas ou bactericidas têm sido tipicamente aplicados ao solo no qual os patógenos/parasitas de plantas estão presentes. Entretanto, novas raças de patógenos frequentemente evoluem para quebrar os genes de resistência e/ou para adquirir resistência contra vários produtos químicos.

[010]Existe uma necessidade urgente de medidas de controle seguras e eficazes. Os fatores relacionados às desvantagens das estratégias de controle atuais incluem uma preocupação crescente com a sustentabilidade da agricultura, e novos regulamentos governamentais que podem impedir ou restringir severamente o uso de muitos agentes químicos agrícolas anti-helmínticos, antifúngicos ou antibacterianos disponíveis.

[011]Agentes químicos são frequentemente não seletivos e execem seus efeitos em organismos não alvo, interrompendo eficazmente populações de micro- organismos e nematoides benéficos, por um período de tempo após a aplicação do agente. Agentes químicos podem permanecer no ambiente e apenas serem lentamente metabolizados. Os fumigantes nematicidas de solo, tais como cloropicrina e brometo de metila e compostos relacionados são altamente tóxicos. Os fungicidas também podem ser prejudiciais para a saúde dos seres humanos, tais como o dicarboximida vinclozolina, que agora foi retirado de uso, e o Dimetilditiocarbamato de zinco (Ziram), que se acredita ser tóxico para humanos após exposição constante.

Similarmente, agentes antibacterianos para o uso agrícola, tais como estreptomicina, estão sendo crescentemente recusados, em parte porque eles podem acelerar a evolução e disseminação de resistência a antibióticos em populações bacterianas, ameaçando assim a pecuária e saúde humana.

[012]Esses agentes também podem se acumular no lençol freático ou na cadeia alimentar e em espécies de nível trófico superior. Esses agentes também podem atuar como agentes mutagênicos e/ou carcinógenos causando modificações genéticas irreversíveis e deletérias.

[013]Assim, são necessários métodos alternativos para controle de nematoides, fungos ou bactérias em plantas e culturas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[014]A presente invenção fornece compostos e métodos para ativar a resposta imune em plantas de modo a realçar a imunidade nas plantas, o que eventualmente resulta em resistência aumentada a patógenos. O método compreende a etapa de inibir a atividade de uma enzima envolvida na via fenilpropanoide na planta e, mais especificamente, da enzima cinamato-4-hidroxilase (C4H), em comparação com uma célula da planta controle correspondente, ou planta ou parte da mesma, sem a inibição.

[015]Em uma modalidade, a invenção fornece um método de promover/melhorar a resistência da planta a nematoides parasíticos, fungos e/ou bactérias inibindo-se a C4H em uma planta, o dito método compreendendo aplicar um composto exógeno capaz de inibir a atividade da C4H na dita planta. O composto pode atuar “diretamente” na planta inibindo a C4H ou, como uma alternativa, o composto pode, depois da administração à planta, ser transformado/processado na planta em um inibidor eficaz da C4H e, como tal, realizar sua atividade.

[016]Em uma modalidade particular, o composto da invenção é uma molécula pequena (um composto orgânico tendo um baixo peso molecular (< 900 daltons) que pode ajudar a regular um processo biológico), ainda mais particularmente um ácido carboxílico aromático ou um ácido benzoico derivado que possui uma função alcino terminal. Em uma modalidade específica, a molécula pequena é caracterizada pela presença de um benzodioxol compreendendo um grupo de ácido carboxílico. O dito composto é capaz de inibir ou reduzir a atividade da C4H na planta. Em particular, o composto da invenção tem a Fórmula geral I, Ie, II, III ou IV como aqui divulgado, ou uma das Fórmulas dos subgrupos Ia-e e IIa-e, ou um estereoisômero, tautômero, hidrato, sal, éster, solvato e/ou análogo funcional do mesmo. Ainda mais particularmente, o composto é selecionado do grupo que consiste em: ácido piperonílico (PA) (ou, opcionalmente, um precursor do mesmo, tal como ácido 3,4- metilenodioxicinâmico (MDCA), ácido pipérico ou piperina; em particular, MDCA); ácido 4-iodobenzoico (4-IBA); ácido 4-trifluorometilbenzoico; ácido 4- propiniloxibenzoico (4-PB) e ácido 3-(4-piridil)acrílico (3PA); ou um estereoisômero, tautômero, hidrato, sal, éster, solvato e/ou análogo funcional do mesmo.

Concentrações adequadas do composto nos métodos e usos como aqui fornecidos estão na faixa de cerca de 10 a cerca de 1000 µM, em particular, de 10 a 500 µM.

[017]A invenção abrange o uso dos compostos aqui descritos para prevenir, tratar e/ou reduzir a infecção de plantas com patógenos bacterianos/fúngicos e/ou nematoides parasíticos, e/ou para controlar (e.g., prevenir ou reduzir) os danos à planta causados desse modo.

[018]A invenção divulga ainda o uso dos compostos aqui descritos para aumentar a resistência de uma planta contra um patógeno, em particular, contra um patógeno bacteriano/fúngico ou um nematoide parasítico, tal como, e.g., um nematoide de nós das raizes, um nematoide de lesão da raiz ou/e um nematoide de cisto, ainda mais particularmente um nematoide que pertence ao gênero selecionado do grupo que consiste em Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Aphelenchoides, Xiphinema, Radopholus, Bursaphelenchus, Rotylenchulus, Nacobbus, Longidorus, Ditylenchus e Trichodorus. Em uma outra modalidade, o patógeno é um fungo fitopatogênico, selecionado dos gêneros Magnaporthe, Botrytis, Puccinia, Fusarium, Blumeria, Mycosphaerella, Colletrotrichum, Ustilago, Melampsora, Rhizoctonia, Phaksora Alternaria, Sclerotinia e Cladosporium. Ainda em uma outra modalidade, o patógeno é uma bactéria patogênica de planta, dos gêneros Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya, Pectobacterium, Clavibacter, Burkholderia, Bacillus, Corynebacterium, Streptomyces e Candidatus Liberibacter.

[019]Em uma outra modalidade, a presente invenção divulga uma composição ou formulação compreendendo um composto como aqui descrito e um diluente, um aditivo, um (micro) nutriente de planta, um estabilizador de emulsão, um tensoativo, um tampão, um óleo vegetal, um inibidor de deriva e/ou um substrato (inerte). Em particular, a composição é uma pulverização foliar ou um revestimento de semente.

Além disso, os compostos ou composições podem compreender ainda ou serem usados em combinação com um ou mais fertilizantes, bioestimulantes, herbicidas, fungicidas, bactericidas, acaricidas, nematicidas e/ou inseticidas. Em particular, a composição é uma composição agroquímica compreendendo qualquer um ou mais dos compostos da Fórmula I, Ia-e, II, IIa-e, III ou IV e pelo menos um excipiente.

[020]Em uma outra modalidade, o composto ou composição é aplicado a uma planta ou parte da mesma, ao solo ao redor da planta ou no substrato usado para o crescimento da planta. Os métodos de aplicação preferidos são tratamento foliar (e.g., por pulverização), tratamento de semente (e.g., por revestimento de semente) ou tratamento do solo (e.g., por encharcamento do solo). As partes da planta podem ser uma semente, fruto, corpo do fruto, folha, talo, broto, talo, flor, raiz, tubérculo ou rizoma.

[021]A invenção se refere ainda a uma semente compreendendo um revestimento de ou incluindo um composto como aqui fornecido e um método para controlar (e.g., prevenir, inibir ou tratar infecção de plantas com) patógenos de planta tais como nematoides parasíticos, fungos e/ou bactérias, o dito método compreendendo aplicar um composto (ou composição compreendendo-o) à dita planta, em particular, em que o dito composto é capaz de reduzir a atividade da C4H na dita planta.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[022]Figura 1: significa o número de espigas, massa de sementes e densidade de empilhamento de plantas de trigo tratadas com ácido piperonílico (PA), piperina (PIP) ou um tratamento controle (CON), com barras de erro indicando o desvio padrão.

N = 24 (72 plantas no total, 3 plantas por vaso).

[023]Figura 2: taxa de germinação de sementes de trigo de plantas tratadas com ácido piperonílico (PA), piperina (PIP) ou um tratamento controle (CON) em papel úmido na temperatura ambiente, com barras de erro indicando o desvio padrão. N = 64 (oito sementes por vaso, oito vasos por tratamento).

[024]Figura 3: gráficos de caixas de traços fenotípicos em plantas de arroz tratadas com 100 µM de ácido piperonílico (PA 100), 100 µM de ácido 3,4-

metilenodioxicinâmico (MDCA 100) ou um tratamento controle (Controle), com pontos indicando pontos fora da curva. Tamanho da amostra = 24 (8 indivíduos por tratamento). J2 indica juvenis de segundo estágio, J3+J4 é a soma de terceiro e quarto estágios juvenis (distinguir visualmente J3 e J4 é quase impossível). Fêmeas adultas são fêmeas maduras sem massas de ovos, fêmeas de postura de ovos são fêmeas maduras com massas de ovos. Galhas não vazias foram classificadas como pequenas, médias, grandes ou muito grandes; a porcentagem de galhas pequenas é a proporção de galhas pequenas. AR: raiz adventícia

[025]Figura 4: modelo misto de spline cúbico (4 nós) do crescimento de plantas de arroz infectadas por M. graminicola tratadas com PA, MDCA ou tratamento simulado. Painel esquerdo: curvas de regressão a nível de sujeito. Painel direito: previsões do modelo a nível de população. Hora 0 corresponde ao início da medição (10 dias depois de transferir para o substrato de crescimento); inoculação com M.

graminicola ocorreu em 82 horas. Tamanho da amostra: 29 (controle: 10, PA: 10, MDCA: 9). O momento da inoculação é indicado com uma barra preta vertical.

[026]Figura 5: gráficos de caixas de traços fenotípicos em arroz infectado com Meloidogyne graminicola, com pontos indicando pontos fora da curva. Tamanho da amostra = 29 (controle: 10, PA: 10, MDCA: 9). J2 indica juvenis de segundo estágio, J3+J4 é a soma de terceiro e quarto estágios juvenis. Fêmeas adultas são fêmeas maduras sem massas de ovos, fêmeas de postura de ovos são fêmeas maduras com massas de ovos. Galhas não vazias foram classificadas como pequenas, médias, grandes ou muito grandes; a porcentagem de galhas pequenas é a proporção de galhas pequenas. ‘AR’ significa raiz adventícia.

[027]Figura 6: efeito do ácido piperonílico (PA), ácido 4-iodobenzoico (IBA) e ácido 3,4-metilenodioxicinâmico (MDCA) bem como o lipopolissacarídeo elicitor de defesa (LPS) no trigo no comprimento do broto, área de folha, comprimento da raiz, número de raízes adventícias e número de galhas de M. graminicola por sistema de raiz e por raiz comparado a um grupo controle (Controle). As barras mostram os valores médios; as barras de erro indicam o desvio padrão. N = 9.

[028]Figura 7: efeito do ácido piperonílico (PA), piperina (PIP), ácido 4- propiniloxibenzoico (4PB) e ácido 3-(4-piridil)acrílico (3PA) no arroz em estágio de desenvolvimento, crescimento de broto e raiz e número de galhas de M. graminicola por sistema de raiz comparado a um grupo controle (CON). As barras mostram os valores médios, as barras de erro indicam o desvio padrão. N = 8.

[029]Figura 8: efeito do ácido piperonílico em concentrações de 100, 400 e 700 µM (PA100, PA400 e PA700 respectivamente) no estágio de desenvolvimento de BBCH, massa de broto seco, comprimento da raiz primária e número de galhas por sistema de raiz comparado a um controle (CON). As barras mostram os valores médios; as barras de erro indicam o desvio padrão. N = 8.

[030]Figura 9: efeito de diferentes vias de aplicação de ácido piperonílico (PA) em infecção por M. graminicola no arroz: um revestimento de semente de carboximetilcelulose contendo 300 µM de ácido piperonílico (revestimento de PA), 100 µM pulverizações foliares repetida três vezes por semana (PA contínuo), uma única pulverização foliar de 300 µM um dia antes da inoculação (PA -1d), uma única pulverização foliar de 300 µM depois de sete dias (PA +7d) ou um controle (Controle).

As barras mostram os valores médios; as barras de erro indicam o desvio padrão. N = 8.

[031]Figura 10: gráfico de barras dos valores médios de cinco traços na beterraba sacarina infectada com H. schachtii, com desvio padrão mostrado como barras de erro depois do tratamento com 10 µM de ácido piperonílico (PA) ou um tratamento controle. ‘Cistos maduros’ se referem a cistos dessecados cheios de ovos.

N = 8.

[032]Figura 11: efeito do ácido piperonílico (PA) no trigo no sistema de comprimento da raiz, massa de broto seco, o número de lesões por sistema de raiz e o número de nematoides P. penetrans por sistema de raiz comparado a um grupo controle (CON). As barras mostram os valores médios; as barras de erro indicam o desvio padrão. N = 8.

[033]Figura 12: regressão logística de efeito misto da taxa de sobrevivência de juvenis J2 de Meloidogyne graminicola (12a) e Heterodera schachtii (12b), com faixas de previsão mostradas. ‘PA” se refere a uma solução de PA a 100 μM, enquanto “vertimec” é uma solução de abamectina a 0,02 % (v/v). N = 300 (6 poços com 50 J2s por tratamento cada).

[034]Figura 13: toxicidade do ácido piperonílico (PA), piperina (PIP), ácido 4- propiniloxibenzoico (4PB) e ácido 3-(4-piridil)acrílico (3PA) para juvenis J2 de Meloidogyne graminicola comparado a um controle (CON) e o nematicida Vertimec (VERT, abamectina 0,02 % (v/v)). N = 300 (6 poços com 50 nematoides cada por composto).

[035]Figura 14: curva de regressão logística da germinação com o passar do tempo de sementes de cebola revestidas com um revestimento simulado (CON) ou um revestimento contendo ácido piperonílico (PA) no solo alterado com os patógenos transmitidos pelo solo Fusarium solani (Fso18 isolado), Fusarium oxisporum (Foc26 isolado) e Fusarium proliferatum (Fpr18 isolado). N = 60 (3 vasos por tratamento, 20 sementes por vaso).

[036]Figura 15: fração de manchas de inoculação que apresentaram desenvolvimento da lesão bem-sucedido (esquerdo) e área média de lesões estabelecidas com êxito (direito) em folhas de tomate tratadas com um tratamento controle (CON) ou pulverização contendo 300 µM de ácido piperonílico (PA) quatro dias depois da inoculação. As barras indicam médias, as barras de erro indicam o desvio padrão. N = 36 (6 folhas por tratamento, 6 manchas de inoculação por folha).

[037]Figura 16: crescimento na área de micélio de quatro isolados fúngicos pertencentes a três espécies fúngicas (Alternaria solani, Botrytis cinerea e Fusarium graminearum PH1 e GFP isolados). As barras de erro indicam o desvio padrão. N =

6.

[038]Figura 17: curvas de crescimento para plantas de arroz do tipo selvagem (A) e plantas knockdown OsWRKY45 (B) por tratamento. Hora zero corresponde ao início das medições 8 dias depois de transferir para o substrato de crescimento.

[039]Figura 18: gráficos de caixas de traços fenotípicos, com pontos indicando pontos fora da curva. Tamanho da amostra = 63 (10 tipos selvagem + controle, 10 knockdown OsWRKY45 + 8 controles tipo selvagem + MDCA, 10 knockdown OsWRKY45 + 9 MDCA tipo selvagem + PA, 10 knockdown OsWRKY45 + PA). Galhas não vazias foram classificadas como pequenas, médias, grandes ou muito grandes; a fração de galhas pequenas é a proporção de galhas pequenas.

[040]Figura 19: efeito do ácido piperonílico (PA) na massa de broto seco, comprimento da raiz, número de galhas por sistema de raiz e número de galhas por cm de raiz primária comparado a um grupo controle (CON) em plantas de tomate do tipo selvagem (WT) e plantas de tomate transgênico que expressam NahG (NahG, linhagem deficiente em SA). As barras mostram os valores médios; as barras de erro indicam o desvio padrão. N = 8.

[041]Figura 20: efeito do ácido piperonílico (PA) na massa de broto seco, comprimento da raiz, número de galhas por sistema de raiz e número de galhas por cm de raiz primária da raiz primária comparado a um grupo controle (CON) em plantas de tomate do tipo selvagem (WT) com e sem tratamento com ácido dietilditiocarbâmico inibidor da biossíntese de JA (DIECA). As barras mostram os valores médios; as barras de erro indicam o desvio padrão. N = 8.

[042]Figura 21: expressão com base em qRT-PCR de vários genes depois do tratamento com PA em plantas de arroz em relação a plantas controle. A linha tracejada horizontal indica o nível de base de plantas controle não tratadas, definido como 1,0. Os pontos indicam expressão relativa média, as barras de erro mostram o intervalo de confiança de 95 %. N = 3 (três agrupamentos de três plantas cada por tratamento).

[043]Figura 22: efeito do ácido piperonílico (PA) no tomate no número de lesões por Pseudomonas syringae três dias depois da inoculação (22a) e a porcentagem de área de folha coberta por essas lesões depois de sete dias (22b) comparado a um grupo controle (CON). As barras mostram os valores médios; as barras de erro indicam o desvio padrão. ‘Folha 1’ se refere à primeira folha real; cotilédones não foram levados em consideração. N = 8.

[044]Figura 23: efeito do ácido piperonílico (PA) no tomate no índice médio de doença três dias depois da inoculação com Pseudomonas syringae comparado a um grupo controle (CON); o índice total de doenças de plantas é a mediana dos quatro escores por folha. As barras mostram os valores médios; as barras de erro indicam o desvio padrão. N = 9.

[045]Figura 24: efeito do ácido piperonílico (PA) no tomate no número de lesões por Pseudomonas syringae cinco dias depois da inoculação comparado a um grupo controle (CON). As barras mostram os valores médios; as barras de erro indicam o desvio padrão. ‘Folha 1’ se refere à primeira folha real; cotilédones não foram levados em consideração. N = 10.

[046]Figura 25: (A) efeito de um revestimento de ácido piperonílico a 500 µM comparado a um revestimento simulado na germinação no solo com ou sem Pythium splendens (PA: revestimento de ácido piperonílico, sem Pythium; CON: revestimento simulado, sem Pythium; PA+Ps: revestimento de ácido piperonílico, Pythium splendens; CON+Ps: revestimento simulado, Pythium splendens); N = 45. (b) escore de saúde da planta das mudas que emergiram quatorze dias depois do início do experimento. Escores: 0 = muda morreu depois de emergir; 1 = muda viva, mas atrofiada; 2 = muda saudável. (c) comprimento da raiz primária quatorze dias depois do início do experimento, com barras indicando as médias e as barras de erro do desvio padrão.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[047]Como aqui usado, as formas singulares “um/uma” e “o/a” incluem os referentes singulares e plurais a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Os termos “compreendendo”, “compreende” e “compreendido em”, como aqui usados, são sinônimos com “incluindo”, “inclui” ou “contendo”, “contém” e são inclusivos ou abertos e não excluem outros membros, elementos ou etapas do método não recitados. O termo “cerca de”, como aqui usado, quando se refere a um valor mensurável tal como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporal e semelhantes, significa abranger variações de +/-20 % ou menos, preferivelmente +1 - 10 % ou menos, mais preferivelmente +/-5 % ou menos, de e a partir do valor especificado, à medida que essas variações são apropriadas para realizar a invenção divulgada. Deve ser entendido que o valor ao qual o modificador “cerca de” se refere é sozinho também especificamente, e preferivelmente, divulgado. Considerando os termos “um ou mais” ou “pelo menos um”, tal como um ou mais ou pelo menos um membro de um grupo de membros, é claro por si, por meio de exemplificação adicional, que o termo abrange inter alia uma referência a qualquer um dos ditos membros, ou a qualquer dois ou mais dos ditos membros, tal como, e.g., qualquer >3, >4, >5, >6 ou >7 etc. dos ditos membros, e até todos os ditos membros. Todas as referências e ensinamentos especificamente referidos, citados no presente relatório descritivo são aqui incorporados por referência em sua totalidade. A menos que de outro modo definido, todos os termos usados na divulgação da invenção, incluindo termos técnicos e científicos, têm o significado como comumente entendidos por um especialista na técnica à qual esta invenção pertence. Por meio de orientações adicionais, definições do termo são incluídas para melhor apreciar o ensinamento da presente invenção. Nas passagens seguintes, diferentes aspectos da invenção são definidos em mais detalhes. Cada aspecto assim definido pode ser combinado com qualquer outro aspecto ou aspectos a menos que claramente indicado ao contrário.

Em particular, qualquer recurso indicado como sendo preferido ou vantajoso pode ser combinado com qualquer outro recurso ou recursos indicados como sendo preferidos ou vantajosos. A referência ao longo deste relatório descritivo a “uma modalidade” ou “uma modalidade” significa que uma característica, estrutura ou recurso particular descrito em relação à modalidade está incluído em pelo menos uma modalidade da presente invenção.

[048]A presente invenção refere-se a métodos e compostos que podem ser usados para estimular a defesa e/ou respostas imunológicas da planta contra patógenos, e.g., nematoides, bactérias e/ou fungos. Ao atuar através da planta, esses compostos têm um impacto mínimo em organismos benéficos ao solo, tornando-os assim agentes de proteção da safra mais adequados. Além disso, foi demonstrado que esses compostos têm um efeito positivo no crescimento da planta e mais específico em, por exemplo, desenvolvimento da raiz e broto (e.g., número e/ou altura aumentados) sob condições infectadas por nematoides. Consequentemente, os compostos da invenção podem ser usados para melhorar tolerância aos patógenos, em particular, nematoides, fungos e/ou bactérias patogênicos. A presente invenção demonstra que os compostos inibem a atração, invasão, migração, estabelecimento de locais de alimentação, alimentação, proliferação e/ou maturação de nematoides parasíticos de plantas e/ou reduzem locais de lesão e número de locais de alimentação tais como, e.g., a produção de galhas ou sincitia por esses nematoides.

Além disso, foi mostrado que os compostos da invenção melhoram a emersão da muda em solo infestado com Fusarium e inibem a formação e disseminação de lesões causadas por fungo fitopatogênicos e bactérias tais como Botrytis e Pseudomonas.

[049]Os compostos da presente invenção são inibidores/inativadores da cinamato-4-hidroxilase (C4H) (Sequência de Referência NCBI: NP_180607.1), a segunda enzima da via fenilpropanoide e um membro da superfamília de proteínas heme-tiolato P450 do Citocromo (Schalk et al., 1998). Consequentemente, os compostos operam estimulando-se o mecanismo de defesa da planta por meio de perturbação seletiva da via fenilpropanoide. Isso foi inesperado visto que a via fenilpropanoide tem um papel crítico na defesa da planta e é responsável e.g., por reforçar a parede da célula após o ataque de patógenos, pela biossíntese de moléculas tais como flavonoides que são tóxicos ou inibitórios para nematoides e por alterar o equilíbrio de hormônios vegetais na planta após o ataque de patógenos para transferir recursos do crescimento para a defesa. Supreendentemente foi descoberto que (temporariamente) inibir a dita via, e especialmente C4H, resulta em um efeito protetor contra patógenos de planta, em particular, nematoides parasíticos de plantas, fungos e/ou bactérias.

[050]Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece um método de melhorar a imunidade da planta, em particular, pela inibição ou inativação da enzima C4H, o dito método compreendendo a etapa de administrar a uma planta um composto (exógeno), em particular, uma molécula pequena, capaz de interromper a função ou atividade da C4H, e.g., ligando-se à C4H. Como aqui usado um “inibidor da cinamato-4-hidroxilase (C4H)” se refere a um composto capaz de reduzir ou inibir a atividade da C4H na planta. Como aqui usado o termo “inibição da atividade da C4H” ou “inibir a C4H” deve ser interpretado para significar qualquer mudança em um nível de síntese da enzima C4H funcional ou uma atividade biológica da C4H, que pode incluir um nível reduzido de enzima C4H funcional presente em uma célula da planta, eficácia reduzida da enzima C4H ou qualquer outro meio que afete uma ou mais das propriedades biológicas de uma enzima C4H, tal como, e.g., seu papel na conversão de ácido trans-cinâmico em ácido 4-hidroxicinâmico em plantas.

[051]As técnicas para medir e determinar (efeito sobre) a atividade da C4H são bem conhecidas por alguém com habilidade comum na técnica. Métodos úteis para determinar a inibição da atividade da C4H são (incorporados por referência):

[052]Medição da eficiência de conversão do ácido trans-cinâmico marcado com 13C ou 14C na presença de um potencial inibidor da C4H em culturas de células da planta ou em microssomas de levedura em que o CYP73A1 é expressado (como descrito em Schoch et al. 2002; Van de Wouwer et al. 2016; Schalk et al. 1998).

Valores cinéticos de inibição representativos obtidos em suspensões de células para os inibidores competitivos e irreversíveis da C4H podem ser encontrados na Tabela 1 em Schoch et al., 2002 (incorporado por referência).

[053]A inibição da enzima C4H aumenta a concentração de ácido trans- cinâmico livre, que é rapidamente conjugado in planta. O acúmulo de conjugados de aminoácido do ácido trans-cinâmico, que pode ser quantificado usando HPLC-MS, pode ser usado como uma medida proxi para a inibição de C4H in planta. Este método é esboçado em Steenackers et al. 2016. Brevemente, mudas de A. thaliana são cultivadas in vitro em meio contendo 10 µM do suspeito inibidor da C4H, depois que elas são coletadas, agrupadas e submetidas a análise por HPLC. Valores representativos para o aumento na quantidade dos conjugados de ácido trans- cinâmico são encontrados na Figura Suplementar S2 em Steenackers et al. 2016 (incorporado por referência).

[054]A inibição da enzima C4H causa uma suprarregulação compensatória do gene C4H, como mostrado no Exemplo 20. As plantas de arroz com quatorze dias de idade (Oryza sativa cv. Bomba) tratadas foliarmente vinte e quatro e três horas antes da colheita com 100 µM de PA e MDCA mostraram um aumento de dez vezes e três vezes de expressão da C4H no sistema de raiz, respectivamente.

[055]O alongamento da raiz primária de mudas de Arabidopsis thaliana após a exposição contínua aos inibidores da C4H é bastante reduzida. A raiz de IC50, a dose de inibidor candidato necessária para reduzir o alongamento da raiz primária em 50 %, pode ser outra medida indireta da atividade do inibidor da C4H. Este procedimento é descrito em Steenackers et al. 2016. Os valores de referência da raiz de IC50 para os inibidores da C4H são 5,07 µM para MDCA (Steenackers et al. 2016) e 40,0 µM para PA (dados não publicados).

[056]Quando as mudas de Arabidopsis thaliana são cultivadas in vitro com exposição contínua a 10 µM de um suspeito inibidor da C4H, deve ser visível um prejuízo claro da lignificação na tira de Caspariana de mudas de cinco dias de idade (menos células lignificadas). Para referência, PA, MDCA e 4-IBA aumentam o número de células endodérmicas não lignificadas na região da tira de Caspariana em 134, 104 e 57 % respectivamente (Van de Wouwer et al., 2016).

[057]Os ensaios In planta são particularmente úteis para determinar a atividade de inibição de análogos estruturais dos compostos aqui fornecidos, e de “precursores do inibidor da C4H”, i.e., compostos que são transformados na planta em um inibidor eficaz da C4H. No contexto da presente invenção, exemplos de precursores para ácido piperonílico (PA) são ácido 3,4-metilenodioxicinâmico (MDCA), ácido pipérico e piperina. Consequentemente, a invenção também se refere ao uso de precursores de inibidor da C4H nos métodos, composições e aplicações/usos como aqui descrito.

[058]Em uma modalidade específica, o inibidor da C4H é uma molécula pequena. Em uma modalidade, o composto é um ácido carboxílico aromático ou é caracterizado pela presença de um benzodioxol compreendendo um grupo de ácido carboxílico.

[059]Em particular, o composto da presente invenção tem a Fórmula geral I, ou um estereoisômero, tautômero, hidrato, sal ou solvato do mesmo: em que n é 0, 1, 2, 3 ou 4.

[060]Mais em particular, n é 0.

[061]Em uma outra modalidade, o composto da presente invenção tem a Fórmula geral II, ou um estereoisômero, tautômero, hidrato, sal ou solvato do mesmo:

O OH

X em que X é um halogênio ou -R, em que R é selecionado de -CF3 ou -O-C1- 6alquinila. Em uma modalidade particular X é -I e R é -4-O-propinila, -3-O-propinila ou -4-CF3.

[062]Em uma outra modalidade, o composto da invenção tem a Fórmula III, ou um estereoisômero, tautômero, hidrato, sal ou solvato do mesmo: em que n é 0, 1, 2, 3 ou 4.

[063]Mais em particular, n é 1.

[064]Como aqui usado, o termo “halogênio” abrange flúor (F), cloro (Cl), bromo (Br) ou iodo (I), em particular, iodo (I). O termo “alquinila”, como aqui usado, significa radicais hidrocarboneto de cadeia reta ou cadeia ramificada contendo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. Exemplos de radicais alquinila incluem etinila, propinila, butinila, isobutinila e pentinila, hexinila e semelhantes. Em uma modalidade particular, a alquinila é uma propinila. Uma “alquinila opcionalmente substituída” se refere a uma alquinila tendo opcionalmente um ou mais substituintes (por exemplo, 1, 2, 3 ou 4) em qualquer ponto de fixação disponível. Exemplos não limitativos desses substituintes incluem halo, hidroxila, carbonila, nitro, amino, oxima, imino, azido, hidrazino, ciano, arila, heteroarila, cicloalquila, acila, alquilamino, alcóxi, tiol, alquiltio,

ácido carboxílico, acilamino, alquil ésteres, carbamato, tioamido, ureia, sullfonamido e semelhantes.

[065]Em uma modalidade específica, o composto da invenção é selecionado do grupo de compostos conforme apresentados na Tabela 1. Tabela 1 Nome Estrutura Fórmula Ácido piperonílico (PA) Ia Ácido 3,4- Ib metilenodioxicinâmico(MDCA) Ácido 3,4- Ic (Metilenodioxi)fenilacético Ácido pipérico Id Piperina O Ie

N O

O Ácido 4-iodobenzoico (4-IBA) IIa Ácido 4-propiniloxibenzoico IIb Ácido 4- IIc propiniloximetilbenzoico

Ácido 3-propiniloxibenzoico IId Ácido 4-trifluorometilbenzoico O IIe Ácido 3-(4-piridil)-acrílico OH

III CF3 Ácido 2-hidróxi-1-naftoico IV (2HN)

[066]Ainda mais específico, o composto da invenção ou inibidor da C4H é selecionado do grupo que consiste em: ácido piperonílico (PA) (ou, opcionalmente, um precursor do mesmo, tal como ácido 3,4-metilenodioxicinâmico (MDCA), ácido pipérico ou piperina; em particular, MDCA); ácido 4-iodobenzoico (4-IBA); ácido 4- trifluorometilbenzoico; ácido 4-propiniloxibenzoico (4-PB) e ácido 3-(4-piridil)acrílico (3PA); ou um estereoisômero, tautômero, hidrato, sal, éster e/ou solvato do mesmo. Em uma outra modalidade, o composto é selecionado do grupo que consiste em ácido piperonílico (PA), ácido 3,4-metilenodioxicinâmico (MDCA), ácido pipérico e piperina, ou um estereoisômero, tautômero, hidrato, sal, éster e/ou solvato do mesmo. Em uma outra modalidade, o composto é selecionado do grupo que consiste em ácido 4- iodobenzoico (4-IBA), ácido 4-trifluorometilbenzoico, ácido 4-propiniloximetilbenzoico, ácido 4-propiniloxibenzoico (4-PB) e ácido 3-propiniloxibenzoico, ou um estereoisômero, tautômero, hidrato, sal, éster e/ou solvato do mesmo. Em ainda uma outra modalidade, o composto é ácido 3-(4-piridil)acrílico (3PA), ou um estereoisômero, tautômero, hidrato, sal, éster e/ou solvato do mesmo. Um composto preferido é ácido piperonílico (PA). Outros compostos podem ser avaliados como sendo equivalentes funcionais aos compostos da invenção, em particular, PA, usando os ensaios como aqui fornecidos, e.g., o composto pode ser descoberto como tendo um efeito semelhante ao composto de referência, e.g., PA, em pelo menos 1, 2 ou 3 dos ensaios como aqui descritos. Consequentemente, também é considerado na presente invenção um “equivalente funcional ou análogo” dos compostos aqui fornecidos, sendo um composto tendo uma diferença estrutural menor comparado ao composto de referência (também chamado análogo estrutural), mas tendo a mesma função ou propriedade considerada. Em uma modalidade, o análogo funcional é uma molécula pequena caracterizada pela presença de um ácido carboxílico aromático ou pela presença de um benzodioxol compreendendo um grupo de ácido carboxílico.

[067]O termo “composto(s) da invenção”, e expressões equivalentes, significa abranger os pró-fármacos, os sais farmaceuticamente aceitáveis, os óxidos, os solvatos, e.g., hidratos e complexos de inclusão daquele composto, onde o contexto permita, bem como qualquer forma estereoisomérica ou tautomérica, ou uma mistura de quaisquer dessas formas daquele composto em qualquer razão, a menos que de outro modo especificado. Além disso, visto que os compostos da invenção possuem uma porção ácida, sais agroquímicos aceitáveis adequados dos mesmos podem incluir sais de metal alcalino, e.g., sais de sódio ou potássio; sais de metais alcalinos terrosos, e.g., sais de cálcio ou magnésio; e sais formados com ligantes orgânicos adequados, e.g., sais de amônio quaternário. Um sal pode ser qualquer composto iônico que pode ser formado pela reação de neutralização de um composto ácido como aqui fornecido e uma base. Exemplos incluem, mas não estão limitados a um sal de amônio, de potássio ou de isopropilamina. Em uma outra modalidade, sais de base são formados a partir de bases que formam sais não tóxicos, incluindo sais de alumínio, arginina, benzatina, colina, dietilamina, diolamina, glicina, lisina, meglumina, olamina, trometamina e zinco. Em uma modalidade, hemisais de ácidos e bases também podem ser formados, por exemplo, sais de hemissulfato e hemicálcio. Em uma modalidade particular, a invenção também abrange ésteres derivados dos compostos da invenção, i.e., em que o grupo -OH (hidroxil) do ácido carboxílico é substituído por um -O-alquil (alcóxi) ou outro grupo orgânico. Consequentemente, o ácido carboxílico (-COOH) nas Fórmulas I, II, III e IV (incluindo compostos individuais dos subgrupos) é substituído por R1-0-C=O em que R1 é C1-C4-alquila. Exemplos incluem, mas não estão limitados a ésteres de metila, etil-hexila ou etila. Os ditos ésteres podem ser de interesse particular para uma aplicação foliar em vista de propriedades de penetração aprimoradas.

[068]A invenção fornece métodos, compostos e composições para controlar patógenos de plantas tais como bactérias, vírus, fungos e nematoides e, em particular, para controlar nematoides parasíticos, fungos e/ou bactérias, mais em particular, nematoides. O termo “controlar patógenos de planta e nematoides parasíticos” se refere a reduzir o efeito negativo geral das bactérias patogênicas de plantas e fungos, ou nematoides parasíticos em plantas tal que as plantas experimentem uma quantidade reduzida de efeitos negativos pelos ditos patógenos/nematoides em comparação com plantas não tratadas com o composto. O efeito negativo geral pelas bactérias patogênicas/fungos ou nematoides parasíticos de plantas pode ser reduzido, tal como reduzindo-se o número ou densidade geral de nematoides parasíticos de plantas (i.e., diminuição da população de nematoides) na planta ou no solo ou reduzindo-se a severidade ou extensão dos efeitos negativos dos patógenos (eg.

número de lesões, manchas, murchidão, formação de galhas, putrefação, morte da muda, redução do crescimento, perdas de produção, etc.), ou os nematoides parasíticos de plantas (i.e., população de nematoides permanece inalterada, mas exibe menos efeitos prejudiciais tais como, e.g., formação de cistos ou galhas, número de lesões, redução do crescimento, perdas de produção, etc.). Para fungos e bactérias, os efeitos positivos na planta tratada usando os compostos da invenção são reduções no número, tamanho e disseminação de lesões na raiz, folha, talo ou fruto, um impacto reduzido de doenças da murcha vascular, emergência melhorada em solos infestados com fungos transmitidos pelo solo, rendimento melhorado,

propriedades organolépticas e de armazenamento pó-colheita melhoradas etc.

[069]Como aqui usado, o termo “nematoides” se refere a animais multicelulares no filo Nematoda. “Nematoides parasíticos de planta” se refere a parasitas nematoides de plantas que podem ser encontrados nas raízes, sementes, flores, folhas, caule da planta ou no solo no qual a planta está crescendo. Os nematoides parasíticos de plantas se alimentam em todas as partes da planta, incluindo raízes, caule, folhas, flores e sementes.

[070]“Nematoides de cistos” (gêneros Heterodera e Globodera) e “nematoides do nó da raiz” (gênero Meloidogyne), em particular, causam significativa perda econômica em plantas, especialmente nas culturas agrícolas. Exemplos de nematoides de cistos incluem, H. schachtii (nematoides de cisto da beterraba sacarina), H. avenae (nematoides de cistos de cereais), H. glycines (nematoides de cisto da soja), H. sacchari (nematoides de cisto da cana de açúcar), H. carotae (nematoides de cisto da cenoura), G. pallida (nematoides de cisto da batata branca) e G. rostochiensis (nematoides de cisto da batata amarela). Os nematoides de nós das raizes incluem, por exemplo, M. graminicola, M. javanica, M. incognita, M. arenaria, M. chitwoodi, M. artiellia, M. fallax, M. hapla, M. microtyla, M. partityla, M. panyuensis, M. naasi, M. exigua, M. enterolobii e M. paranaensis. Esses patógenos estabelecem “locais de alimentação” na planta, causando a transformação morfológica das células das plantas em células gigantes ou sincitia, que bloqueiam o fluxo de nutrientes e produtos da fotossíntese. Consequentemente, a “infecção” por nematoides se refere à invasão e alimentação dos tecidos da planta hospedeira. Outros nematoides que causam prejuízos significativos incluem os nematoides de “lesão da raiz”, tais como Pratylenchus, particularmente o P. penetrans, que infecta milho, arroz e vegetais, P.

brachyurus que infecta o abacaxi, P. zeae, que infecta cereais, cana de açúcar e café, P. coffeae, que infecta o café e a banana e P. thornei, que infecta o trigo.

[071]Em um aspecto, os “nematoides parasíticos de plantas” incluem micro-

organismos dos gêneros Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Aphelenchoides, Xiphinema, Radopholus, Bursaphelenchus, Rotylenchulus, Nacobbus, Longidorus, Ditylenchus e Trichodorus e, em particular, dos gêneros Meloidogyne, Heterodera e Pratylenchus.

[072]Em uma modalidade particular, os nematoides são membros da ordem Tylenchida.

[073]Em particular, as espécies de nematoides são selecionadas do grupo que consiste em: Heterodera glycines, Heterodera schachtii, Globodera rostochiensis, Meloidogyne incognita, Meloidogyne graminicola, Pratelynchus penetrans, Globodera pallida, Heterodera avenae, Heterodera sacchari, Heterodera zeae, Heterodera carotae, Pratylenchus coffeae, Pratylenchus neglectus, Pratylenchus zeae, Pratylenchus loosi, Meloidogyne javanica, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne hapla, Meloidogyne fallax, Meloidogyne chitwoodi. Meloidogyne exigua, Aphelenchoides besseyi, Aphelenchoides fragariae, Xiphinema index, Radopholus similis, Bursaphelenchus xylophilus, Rotylenchulus reniformis, Nacobbus abberans, Longidorus elongatus, Ditylenchus destructor, Ditylenchus dipsaci, Ditylenchus angustus e Tricochodorus minor.

[074]Exemplos de bactérias fitopatogênicas incluem os gêneros Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xyllela, Dickeya, Pectobacterium, Streptomyces, Clavibacter, Candidatus Liberibacter, Bacillus, Corynebacterium e Burkholderia. Exemplos de vírus fitopatogênicos incluem Vírus da Batata X, Vírus da Batata Y, Vírus do Mosaico do Tabaco, Vírus do Mosaico do Pepino, Vírus do Enrolamento das Folhas Amarelas do Tomate, Vírus da Murcha Manchada do Tomate e Vírus da Tristeza dos Citrus. Espécies fúngicas de patógenos de plantas são principalmente nos filos Ascomycota e Basidiomycota. Entre os ascomicetos, os patógenos de plantas estão em várias classes tais como os Dothideomicetos (e.g., Cladosporium sp.), Sordariomicetos (e.g., Magnaporthe sp.),

ou os Leotiomicetos (e.g., Botrytis sp.). Os basidiomicetos são representados pelos dois maiores grupos de patógenos de plantas: as ferrugens (Pucciniomicetos) e as fuligens (disseminação entre o subfilo de Ustilaginomycotina). Exemplos de fungos fitopatogênicos incluem os gêneros Magnaporthe, Botrytis, Puccinia, Fusarium, Blumeria, Mycosphaerella, Colletotrichum, Ustilago, Phakopsora, Alternaria, Sclerotinia, Cladosporium e Rhizoctonia.

[075]Exemplos de oomicetos fitopatogênicos (formalmente classificados como fungos) são as espécies dos gêneros Pythium e Phytophtora. A podridão das raízes induzida por Pythium é uma doença comum das culturas.

[076]Em uma modalidade particular, o controle de nematoides parasíticos de plantas, fungos e/ou bactérias é realizado por uma resistência melhorada aos efeitos prejudiciais de patógenos e parasitas, especialmente nematoides, e resulta em uma melhoria na saúde geral das plantas em questão, tal como uma maior produção de algum parâmetro desejável, tal como, por exemplo, a quantidade de safra colhida produzida.

[077]O termo “resistência melhorada à doença”, como aqui usado, se refere a um aumento da defesa da planta em uma planta saudável ou uma redução na severidade da doença de uma planta ou uma população de plantas ou no número de plantas doentes em uma população de plantas.

[078]Uma vantagem particular é que o composto da invenção não exibe (significativa) toxicidade e consequentemente não tem efeitos prejudiciais em organismos não alvo em uma concentração de trabalho adaptada para ser aplicada à planta. E.g., os compostos aqui fornecidos não demonstraram serem tóxicos para camundongos, moscas, nematoides, bactérias e fungos. Consequentemente, em uma modalidade específica, os compostos da invenção não são considerados como nematicidas, fungicidas ou bactericidas. Nematicidas são, por definição, produtos químicos que matam nematoides. As ditas características podem ser determinadas por métodos conhecidos na técnica tais como, e.g., fornecidos na seção de exemplos ou por um bioensaio de contato direto, tal como descrito em Faske & Hurd 2015. No dito ensaio, os compostos são considerados como nematicidas se sobrevivência dos nematoides depois de 24 horas de exposição a uma solução aquosa a 100 µM do composto de teste for menor que 60 %, em particular, menor que 50 %, mais particularmente menor que 40 %, ainda mais particularmente menor que 30 % comparado ao grupo controle.

[079]Igualmente, fungicidas e bactericidas são produtos químicos que matam resp. fungos e bactérias. As ditas características podem ser determinadas por métodos conhecidos pelos especialistas ou e.g., como fornecido nos presentes exemplos.

[080]Uma vantagem particular é que os presentes compostos podem ser usados preventivamente (e.g., para mudas) bem como de maneira curativa, requerem apenas uma simples formulação e são altamente estáveis na temperatura ambiente.

O uso como um agente primário retardará ou mesmo evitará os danos à planta quando infectada.

[081]Em uma outra modalidade, o composto da invenção é isolado (e.g., na forma substancialmente purificada) ou sinteticamente fabricado usando técnicas padrão, ou comercialmente disponíveis. Em uma modalidade particular, o composto não é parte de um extrato natural feito extraindo-se uma parte de uma matéria-prima, frequentemente usando-se um solvente, tal como etanol ou água (e.g., extratos aquosos ou etanólicos de sementes ou plantas; óleos). Mais particularmente, os compostos (como parte de uma composição) são utilizados em uma pureza de 90 % a 100 %, preferivelmente de 95 % a 100 % (de acordo com seu espectro de NMR).

[082]A presente invenção também abrange (o uso de) uma composição ou formulação compreendendo um composto da invenção. Uma “composição agroquímica”, como aqui usado, significa uma composição para uso agroquímico, tal como uso na indústria agroquímica (incluindo agricultura, horticultura, floricultura e usos domésticos e de jardim, para a proteção de plantas ou partes das plantas,

culturas, bulbos, tubérculos, frutos (e.g., de organismos, doenças ou pragas prejudiciais) como aqui definido, compreendendo pelo menos uma substância ativa de um composto como aqui definido, opcionalmente com um ou mais aditivos que favorecem dispersão ótima, atomização, deposição, umidificação das folhas,

distribuição, retenção e/ou captação de agroquímicos.

Tipicamente, essa composição ou formulação compreende ainda pelo menos um componente ou excipiente adicional,

tal como um tensoativo, um diluente (sólido ou líquido) e/ou um estabilizador de emulsão, que serve como um portador.

A formulação (agroquímica) geralmente compreende entre 0,01 e 95 %, preferivelmente entre 0,1 e 90 %, o mais preferivelmente entre 0,5 e 90 % em peso de substância ativas.

Com “tensoativo”

entende-se aqui um composto que diminui a tensão superficial de um líquido,

permitindo uma pulverização mais fácil.

O tensoativo pode ser um detergente, um emulsificador (incluindo alquil poliglucosídeo glicerol éster ou monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano), um agente dispersante (incluindo cloreto de sódio,

cloreto de potássio, nitrato de potássio, cloreto de cálcio ou amido de milho), um agente de formação de espuma (incluindo derivados de ácido tartárico, ácido málico ou álcoois), um realçador de penetração, um umectante (incluindo sulfato de amônio,

glicerina ou ureia) ou um agente umectante do tipo iônico ou não iônico ou uma mistura desses tensoativos.

Em particular, os tensoativos usados na composição como aqui definidos são realçadores de penetração, agentes dispersantes ou emulsificadores.

O termo “realçador de penetração” é entendido aqui como um composto que acelera a captação de ingrediente ativo através da cutícula de uma planta na planta, i.e., a taxa de captação, e/ou aumenta a quantidade de ingrediente ativo absorvido na planta.

Classes de substâncias conhecidas como realçadores de penetração, incluem alquil fosfatos, tais como tributil fosfato e tripropil fosfato, e sais de ácido naftalenossulfônico. Com “agente dispersante” entende-se uma substância adicionada a uma suspensão, usualmente um coloide, para melhorar a separação de partículas e para prevenir sedimentação ou aglomeração. O termo “emulsificador”, como aqui usado, se refere a uma substância que estabiliza uma emulsão, i.e., uma mistura de dois ou mais líquidos. É possível mencionar os emulsificadores vendidos sob os nomes comerciais Tween® 20, que essencialmente compreendem monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano (polisorbato 20) e Radia®, que essencialmente compreende alquil poliglicosídeos.

[083]Como um exemplo, um tensoativo compreende um ou mais dos seguintes componentes: etoxilato de óleo de mamona, metil éster de semente de colza, alquil fosfatos, tributil fosfato, tripropil fosfato, sais de ácido naftalenossulfônico, sulfonato orgânico/2-metilpentano-2,4-diol, alquilpoliglucosídeo, derivados de siloxanos, alquilsulfonatos, policarboxilatos, lignossulfonatos, triglicerídeos alcoxilados, polímeros de aminas graxas, dioctilssulfosuccinatos ou monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano (polisorbato 20).

[084]Um aditivo, um (micro) nutriente de planta, um tampão, um óleo vegetal, um inibidor de deriva e/ou um substrato (inerte) também podem fazer parte da composição. Tipicamente, o composto da invenção pode ser administrado a uma planta em uma formulação agrícola aceitável adequada, incluindo, mas não limitado um meio de crescimento tal como solo ou meio líquido hidropônico, pós, grânulos, concentrados de solução, concentrados emulsificáveis e pós umedecíveis. O termo “agrícola aceitável” indica que a formulação não é tóxica e, de outro modo, aceitável para a aplicação a uma planta, seja aplicada ambientes fechados (e.g., em um ambiente contido) ou ao ar livre (e.g., em um ambiente não contido que está exposto a outra vida vegetal, animal e humana). A formulação pode incluir aditivos tais como solventes, por exemplo, cetonas, álcoois, éteres alifáticos, enchedores e portadores, por exemplo, argila e minerais. Os tipos gerais de composições sólidas são poeiras,

pós, grânulos, pellets, prills, pastilhas, tabletes, películas preenchidas (incluindo revestimentos de sementes) e semelhantes, que podem ser dispersáveis em água (“molháveis”) ou solúveis em água. Películas e revestimentos formados de soluções formadoras de película ou suspensões fluidas são particularmente úteis para o tratamento de semente. Formulações pulverizáveis são tipicamente estendidas em um meio adequado antes da pulverização. Essas formulações líquidas e sólidas são formuladas para serem prontamente diluídas no meio de pulverização, usualmente água, mas ocasionalmente outro meio adequado como um hidrocarboneto aromático ou parafínico ou óleo vegetal. Os volumes de pulverização podem variar de cerca de um a vários milhares de litros por hectare, mas mais tipicamente estão na faixa de cerca de dez a várias centenas de litros por hectare. As formulações pulverizáveis podem ser misturadas em tanque com água ou outro meio adequado para tratamento foliar por aplicação aérea ou no solo, ou por aplicação ao meio de crescimento da planta. Formulações líquidas e secas podem ser medidas diretamente nos sistemas de irrigação ou medidas no sulco durante o plantio.

[085]Os diluentes líquidos incluem, por exemplo, água, NN- dimetilalcanamidas (e.g., NN-dimetilformamida), limoneno, dimetil sulfóxido, N- alquilpirrolidonas (e.g., N-metilpirrolidinona), alquil fosfatos (e.g., trietil fosfato), etileno glicol, trietileno glicol, propileno glicol, dipropileno glicol, polipropileno glicol, carbonato de propileno, carbonato de butileno, parafinas (e.g., óleos minerais brancos, parafinas normais, isoparafinas), alquilbenzenos, alquilnaftalenos, glicerina, triacetato de glicerol, sorbitol, hidrocarbonetos aromáticos, alifáticos desaromatizados, alquilbenzenos, alquilnaftalenos, cetonas tais como ciclohexanona, 2-heptanona, isoforona e 4-hidróxi-4-metil-2-pentanona, acetatos tais como acetato de isoamila, acetato de hexila, acetato de heptila, acetato de octila, acetato de nonila, acetato de tridecila e acetato de isobornila, outros ésteres tais como ésteres de lactato alquilados, ésteres dibásicos, alquil e aril benzoatos e y-butirolactona e álcoois, que podem ser lineares, ramificados, saturados ou insaturados, tais como metanol, etanol, n- propanol, álcool isopropílico, n-butanol, álcool isobutílico, n-hexanol, 2-etil-hexanol, n- octanol, decanol, álcool isodecílico, isooctadecanol, álcool cetílico, álcool laurílico, álcool tridecílico, álcool oleílico, ciclo-hexanol, álcool tetra-hidrofurfurílico, álcool diacetona, cresol e álcool benzílico. Os diluentes líquidos também incluem ésteres de glicerol de ácidos graxos saturados e insaturados (normalmente C6-C22), como sementes de plantas e óleos de frutas (por exemplo, óleos de oliva, mamona, linhaça, gergelim, milho (milho), amendoim, girassol, semente de uva, cártamo, semente de algodão, soja, colza, coco e palmiste), gorduras de origem animal (por exemplo, sebo bovino, sebo de porco, banha de porco, óleo de fígado de bacalhau, óleo de peixe) e suas misturas. Os diluentes líquidos também incluem ácidos graxos alquilados (por exemplo, metilados, etilados, butilados), em que os ácidos graxos podem ser obtidos por hidrólise de ésteres de glicerol de fontes vegetais e animais, e podem ser purificados por destilação. Diluentes líquidos típicos são descritos em Marsden, Solventes Guide, 2a Ed., Interscience, Nova Iorque, 1950.

[086]Em uma modalidade particular, a invenção fornece uma composição fibrosa compreendendo uma fibra não trançada e uma quantidade eficaz de pelo menos um composto como aqui fornecido, covalentemente ligado ou adsorvido de forma estável à fibra.

[087]A composição ou formulação tipicamente conterá quantidades eficazes do composto como aqui descrito. Uma “quantidade eficaz” significa que elas são usadas em uma quantidade que permite obter o efeito desejado, mas que não gera qualquer sintoma fitotóxico na planta tratada. Uma modalidade particular usa o composto da invenção, que vantajosamente pode ser administrado em concentrações de até 500 µM, 600 µM, 700 µM, 800 µM, 900 µM ou 1000 µM; ou em concentrações variando de cerca de 0,1 μM a cerca de 1000 µM, mais específico em concentrações variando de cerca de 1 μM a cerca de 800 µM, ainda mais específico de cerca de 1 µM a cerca de 500 µM, e mais em particular, em concentrações de pelo menos ou em torno de 5,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 a 900 µM. Em particular, a quantidade usada é não nematicida e/ou não fungicida.

[088]Os compostos da invenção podem ser usados individualmente ou já parcialmente ou completamente misturados entre si para preparar a composição de acordo com a invenção. Também é possível que eles sejam embalados e usados como composição combinada, tal como um kit de partes. De acordo com o método da presente invenção, os compostos ou composição de acordo com a invenção podem ser aplicados uma vez a um solo/planta (parte)/safra, ou podem ser aplicados duas ou mais vezes uma após a outra com um intervalo a cada duas aplicações.

[089]Qualquer planta/safra pode ser tratada. O termo “planta (ou plantas)” é um sinônimo do termo “safra” que deve ser entendido como uma planta de importância econômica e/ou uma planta cultivada pelo homem. Os métodos, compostos e composições da presente invenção podem ser aplicados a qualquer planta monocotiledônea ou dicotiledônea, dependendo do controle do patógeno (e.g., nematoides) desejado. Plantas exemplificativas protegidas pela presente invenção com espécies parasíticas de plantas (nematoides, fúngicos ou bacterianos) incluem, mas não são limitadas a alfalfa: Meloidogyne hapla, Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica, Ditylenchus dipsaci, Pratylenchus sp., Paratylenchus sp., Xiphinema sp.; banana: M. incognita, M. arenaria, M. javanica, Radopholus similis, Helicotylenchus multicinctus, Pratylenchus coffeae, Rotylenchulus reniformis; feijões e ervilhas: Meloidogyne sp., Heterodera sp., Belonolaimus sp., Helicotylenchus sp., Rotylenchulus reniformis, Paratrichodorus anemones, Trichodorus sp.; cassava: Meloidogyne sp., Rotylenchulus reniformis; cereais: Meloidogyne naasi (cevada, trigo, centeio), Heterodera avenae; chickpea: Meloidogyne sp., Heterodera cajani, Rotylenchulus reniformis, Hoplolaimus seinhorsti, Pratylenchus sp.; cítricos:

Meloidogyne sp., Tylenchulus semipenetrans, Radopholus similis, Radopholus citrophilus, Hemicycliophora arenaria, Pratylenchus sp., Bolonolaimus longicaudatus,

Trichodorus sp., Paratrichodorus sp., Xiphinema sp.; trevo: Meloidogyne sp.,

Heterodera trifolii; milho: Meloidogyne incognita, Pratylenchus sp., Paratrichodorus minor, Longidorus sp., Hoplolaimus columbus; algodão: Meloidogyne incognita,

Belonolaimus longicaudatus, Rotylenchulus reniformis, Hoplolaimus galeatus,

Pratylenchus sp., Tylenchorhynchus sp., Paratrichodorus minor; uvas: Meloidogyne sp., Xiphinema sp., Pratylenchus vulnus, Tylenchulus semipenetrans, Rotylenchulus reniformis; gramíneas: Pratylenchus sp., Longidorus sp., Paratrichodorus christiei,

Xiphinema sp., Ditylenchus sp.; amendoim: Meloidogyne hapla, Meloidogyne arenaria,

Ditylenchus sp., Pratylenchus sp., Criconemella sp., Belonolaimus longicaudatus;

ervilha de pombo: Meloidogyne sp., Heterodera cajani, Rotylenchulus reniformis,

Hoplolaimus seinhorsti, Pratylenchus sp.; batata: Meloidogyne sp., Globodera rostochiensis, Globodera pallida, Pratylenchus sp., Trichodorus primitives, Ditylenchus sp., Paratrichodorus sp., Nacobbus aberrans; arroz: Meloidogyne sp., Aphelenchiodes besseyi, Ditylenchus angustus, Hirchmanniella sp., Heterodera sp.; pequenos frutos:

Meloidogyne sp.; Pratylenchus sp., Xiphinema sp., Longidorus sp., Paratrichodorus christiei, Aphelenchoides sp.; soja: Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica,

Heterodera glycines, Belonolaimus sp., Hoplolaimus columbus; beterraba sacarina:

Meloidogyne sp., Heterodera schachtii, Ditylenchus dipsaci, Nacobbus aberrans,

Trichodorus sp., Longidorus sp., Paratrichodorus sp.; cana de açúcar: Meloidogyne sp., Pratylenchus sp., Radopholus sp., Heterodera sp., Hoplolaimus sp.,

Helicotylenchus sp., Scutellonema sp., Belonolaimus sp., Tylenchorhynchus sp.,

Xiphinema sp., Longidorus sp., Paratrichodorus sp.; fumo: Meloidogyne sp.,

Pratylenchus sp., Tylenchorhynchus claytoni, Globodera tabacum, Trichodorus sp.,

Xiphinema americanum, Ditylenchus dipsaci, Paratrichodorus sp.; e tomate:

Meloidogyne sp., Pratylenchus sp.

[090]Em uma modalidade específica, as plantas a serem tratadas são essas culturas com as maiores perdas estimadas devido aos patógenos e parasitismo de nematoides i.e., milho, algodão, cucurbita, vegetais leguminosos, amendoim, vegetais solanáceos (e.g., tomate, batata, berinjela, cápsico e pimenta-de-cheiro), alface, morango, batata, cebola, trigo, arroz, banana, frutos de árvores (e.g., maçã, citros), café, soja, cana de açúcar, beterraba sacarina e fumo, em particular, tomate, trigo, beterraba sacarina, cebola e arroz.

[091]Em uma outra modalidade da presente invenção, o composto, ou uma composição compreendendo o composto, é aplicado a uma planta, diretamente ou indiretamente. Qualquer parte apropriada da planta pode ser tratada ou usada incluindo órgãos da planta (e.g., folhas, caule, raízes, etc.), sementes, e células da planta e progênie da mesma. Em alternativa, a composição ou composto pode ser aplicado ao solo ao redor da planta. A aplicação do composto é antes do plantio, no plantio ou depois do plantio. Em uma modalidade, o contato inclui a aplicação direta a uma planta. Toda ou parte de uma planta incluindo, sem limitação, folhas, caule, sementes, raízes, propágulos (e.g., estacas), fruto, etc., pode ser contatado com um ou mais dos compostos aqui descritos. O contato também pode ser realizado indiretamente, por meio da aplicação, e.g., ao solo ou outros substratos vegetais.

[092]Métodos de aplicação adequados incluem pulverização de alta ou baixa pressão, imersão, atomização, formação de espuma, nebulização, revestimento e incrustação. Outros procedimentos de aplicação adequados podem ser previstos pelo especialista na técnica. Em uma modalidade particular, os compostos da invenção são aplicados às partes da planta acima do solo ou à folhagem da planta por pulverização e.g., pelo uso de pulverizadores mecânicos. Os pulverizadores convertem uma formulação da invenção que é misturada com um portador líquido, tal como água ou fertilizante, em gotículas. As gotículas podem ser de qualquer tamanho.

Pulverizadores de lança e pulverizadores de jato de ar também podem ser usados para aplicar as formulações da invenção em culturas pré-emergentes ou pós- emergentes. Os pulverizadores de jato de ar injetam as formulações da invenção misturadas com um portador líquido em uma corrente de ar em movimento rápido. Os pulverizadores de lança, pulverizadores aéreos, pulverizadores de volume ultra-baixo, irrigação por gotejamento, irrigação por aspersão e nebulizadores também podem ser usados para aplicar as formulações da invenção. Quando as formulações da invenção estão em uma forma sólida, em pó ou grânulo, elas podem ser aplicadas com equipamento de aplicação de grânulo ou poeira. As formulações da invenção também podem ser aplicadas ao solo, meios vegetais, plantas, tecidos ou sementes da planta como um fumigante.

[093]Em uma outra modalidade, as sementes de uma planta são revestidas com o composto da invenção (“sementes revestidas”). Qualquer método de revestimento de semente apropriado conhecido pelo especialista pode ser usado.

E.g., as sementes podem ser tratadas com os compostos da invenção de múltiplas maneiras incluindo, sem limitação, por meio de pulverização ou gotejamento, encharcamento ou aplicação de pellet. O tratamento com pulverização e gotejamento pode ser conduzido, por exemplo, formulando-se uma quantidade eficaz do composto em um portador agronômico aceitável, tipicamente aquoso em natureza, e pulverizando ou gotejando a composição nas sementes por meio de um sistema de tratamento contínuo (que é calibrado para aplicar tratamento a uma taxa predefinida em proporção ao fluxo contínuo de sementes), tal como um tratador do tipo tambor.

Esses métodos incluem aqueles que vantajosamente utilizam volumes relativamente pequenos de portador de modo a permitir uma secagem relativamente rápida da semente tratada. Grandes volumes de sementes podem ser eficientemente tratados.

Os sistemas de lote, em que um tamanho de lote predeterminado de sementes e composições de molécula de sinal são entregues em um misturador, também podem ser utilizados. Os sistemas e aparelhos para realizar esses processos estão comercialmente disponíveis de numerosos fornecedores. A presente invenção também fornece uma semente revestida com um ou mais dos compostos/composição da presente invenção.

[094]Em outro aspecto, a composição ou composto pode ser aplicado diretamente ao solo, e.g., por aplicação de encharcamento (encharcar o solo). Um encharcamento o solo aplica o composto, opcionalmente misturado com água, ao solo em torno da base de uma planta de modo que suas raízes possam absorver o composto.

[095]Em uma modalidade específica, os compostos da presente invenção podem ser aplicados a uma planta como aqui fornecido sozinho, em combinação ou em uma mistura com outros compostos. Outros compostos adequados incluem quantidades eficazes de outros produtos químicos agrícolas ou hortícolas, tais como herbicidas, inseticidas, nematicidas, moluscicidas, bactericidas, acaricidas, fungicidas e/ou reguladores do crescimento da planta ou fertilizantes.

[096]Ainda em uma outra modalidade, a invenção fornece um método para a fabricação (‘ou a produção de’ que é equivalente) uma composição (agroquímica) de acordo com a invenção, compreendendo a formulação de um composto da invenção e, em particular, uma molécula da Fórmula I, II, III ou IV (incluindo qualquer subgrupo e compostos da Tabela 1) como aqui definido anteriormente, junto com pelo menos um agente auxiliar agroquímico habitual. Métodos de fabricação adequados são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a mistura de alto ou baixo cisalhamento, moagem úmida ou seca, moldagem por gotejamento, encapsulamento, emulsificação, revestimento, incrustação, pilling, granulação por extrusão, granulação em leito fluido, coextrusão, secagem por pulverização, resfriamento por pulverização, atomização, polimerização por adição ou condensação, polimerização interfacial, polimerização in situ, coacervação, encapsulamento por pulverização, dispersões fundidas por resfriamento, evaporação do solvente, separação de fase, extração do solvente, polimerização sol-gel, revestimento de leito fluido, revestimento em panela, fusão, absorção ou adsorção passiva ou ativa. Agentes auxiliares agroquímicos habituais são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a solventes aquosos ou orgânicos, agentes tamponantes, acidificantes, tensoativos, agente umectantes, agentes de difusão, aderentes, adesivadores, portadores, enchedores, espessantes, emulsificadores, dispersantes, agentes sequestradores, agentes antissedmentação, agentes coalescentes, modificadores de reologia, agentes antiespuma, fotoprotetores, agentes anticongelantes, biocidas, penetrantes, óleos minerais ou vegetais, pigmentos e agentes de controle de deriva ou qualquer combinação adequada dos mesmos.

[097]Os exemplos seguintes são apresentados abaixo para ilustrar os métodos, composições e resultados de acordo com a matéria objeto divulgada. Esses exemplos não são intencionados a serem inclusivos de todos os aspectos da matéria objeto aqui divulgada, mas ilustrar métodos, composições e resultados representativos. Esses exemplos não são intencionados a excluir equivalentes e variações da presente invenção, que são evidentes para o especialista na técnica.

EXEMPLOS

MATERIAL E MÉTODOS Material Vegetal Arroz (Oryza sativa)

[098]Todos os experimentos foram realizados nas cultivares japonica Nipponbare, Bomba ou Kitaake. Os Exemplos 3, 4, 18 e 19 usaram Bomba, o Exemplo 6 usou Kitaake e os Exemplos 8 e 15 usaram Nipponbare. Kitaake, Bomba e sementes mutantes foram obtidas de plantas cultivadas em estufa cultivadas na estufa UGent no Instituto Flamengo de Pesquisa em Agricultura e Pesca (ILVO Plant, Melle, Bélgica). As sementes de Nipponbare do tipo selvagem foram obtidas no Centro Nacional de Pesquisa de Arroz Dale Bumpers (Stuttgart, EUA).

[099]As sementes foram germinadas em papel de seda úmido a 30 °C no escuro por três dias, seguidas de transferência para tubos de PVC individuais (para infecção por nematoides) contendo SAP (Reversat et al., 1999). SAP (polímero absorvente de areia) é uma mistura de areia fina de sílica e copolímero acrílico ultra absorvente (DCM AquaPerla, DSM, Grobbendonk, Bélgica) na proporção de 1 kg de areia para 1,5 g de copolímero seco.

[0100]Antes da utilização, cada tubo foi lavado em água com sabão e seco num forno a 70 °C durante dois dias. Os tubos de crescimento foram colocados dentro de caixas plásticas de maneira completamente aleatória para minimizar o viés induzido pelo ambiente e transferidos para uma câmara de crescimento a 28 °C com 16 horas de luz. Nos dois primeiros dias após a transferência, os tubos foram cobertos com um filme de polietileno (Saran Film, Dow Chemicals, Midland, EUA) para evitar a evaporação excessiva. As mudas foram regadas três vezes por semana com 8 ml de solução de Hoagland (Hoagland, 1938).

Beta vulgar (beterraba sacarina)

[0101]As sementes de beterraba sacarina (cultivar Jolgeh) foram germinadas durante cinco dias a 25 °C em solo de envasamento estéril saturado com água destilada. As mudas foram transferidas para tubos SAP, que foram colocados em uma câmara de crescimento a 24 °C (16 horas por dia de iluminação fluorescente). Nos dois primeiros dias após a transferência, os tubos foram cobertos com um filme de polietileno (Saran Film, Dow Chemicals, Midland, EUA) para evitar a evaporação excessiva. As mudas foram regadas três vezes por semana com 8 ml de solução Hoagland.

Triticum aestivum (trigo)

[0102]Para os Exemplos 1, 5 e 10, foram utilizadas sementes da cultivar de trigo de inverno Sahara (Aveve Agrarisch, Landen, Bélgica). As sementes foram lavadas em uma solução de etanol a 10 % para remover quaisquer vestígios residuais de fungicida e depois germinadas em papel úmido à temperatura ambiente por quatro dias; as sementes foram transferidas para tubos SAP e colocadas em uma câmara de crescimento (25 °C, 16 horas por dia de luz). As plantas foram regadas com 8 ml de solução Hoagland de meia força a cada dois dias durante os primeiros dez dias e com 8 ml de solução Hoagland de força total a cada dois dias depois.

[0103]Para o Exemplo 2, foi utilizada a cultivar de trigo da primavera Fielder.

As sementes foram obtidas de plantas cultivadas no complexo de estufa do VIB (Zwijnaarde, Bélgica). As sementes foram semeadas diretamente no envasamento do solo (quatro sementes por vaso, afinadas para três plantas por vaso após a emergência) e colocadas em uma câmara de crescimento a 21 °C com 16 horas por dia de luz. Essas plantas foram cultivadas até a colheita; eles foram pulverizados três vezes com os compostos da invenção a uma concentração de 300 µM usando o protocolo descrito na seção de produtos químicos. A pulverização ocorreu 14 e 21 dias após a emergência e uma última vez no cabeçalho.

Tomate (Solanum lycopersicum)

[0104]Sementes de tomate, cv. Moneymaker (Zaden da Vreeken, Dordrecht, Holanda) foi semeado em solo de envasamento em autoclave coberto de filme de polietileno e colocado a 24 °C por oito dias. As mudas foram então transferidas para vasos individuais preenchidos com SAP e colocadas em uma câmara de crescimento a 24 °C. As plantas foram regadas três vezes por semana com 25 ml de solução de Hoagland com um quarto de força durante as duas primeiras semanas e meia força a partir de então.

Cenoura (Daucus carota)

[0105]Sementes de cenoura, cv. Nantes 2 (Zaden de Vreeken, Dordrecht, Holanda) foram germinados em papel úmido por sete dias a 21 °C. Após a germinação, as mudas foram transferidas para vasos individuais preenchidos com terra de envasamento e colocados em uma câmara de crescimento a 21 °C.

Culturas de nematoides Cultura de Meloidogyne graminicola

[0106]O M. graminicola foi extraído de raízes de Echinocloa crus-galli infectadas, cultivadas em solo de envasamento a 25 °C. As raízes foram lavadas até a maior parte do solo ser removida, após o que foram cortadas em fragmentos curtos (com cuidado especial para abrir quaisquer galhas visíveis externamente). O material cortado foi colocado em peneiras com 200 µM de diâmetro de poro, que foram colocadas em banho-maria com temperatura ambiente por três dias. A água foi então vertida sobre uma peneira de malha de 20 µM. A superfície da peneira foi lavada com aproximadamente 50 ml de água não desmineralizada, que foi coletada em um copo antes que pudesse penetrar na peneira.

[0107]O número de nematoides em cinco amostras de 100 µl tomadas a partir da suspensão de nematoides foi contado sob um microscópio estéreo e a média para determinar a concentração de inoculo. Cada planta (cultivada de acordo com o protocolo descrito na seção anterior) foi então inoculada injetando o número desejado de nematoides no SAP ao redor do sistema de raiz usando uma micropipeta.

Cultura de Meloidogyne incognita

[0108]M. incognita foi extraído a partir de plantas infectadas tomate (cv.

Moneymaker) raízes crescidas em solo de envasamento em 24 °C. Os nematoides foram coletados, contados e inoculados usando o mesmo procedimento descrito para M. graminicola acima.

Cultura Heterodera schachtii

[0109]Os cistos foram recolhidos a partir de beterraba sacarina (cv. Jolgeh) mantidos em uma câmara de crescimento a 21 °C por meio de um protocolo de flutuação. As raízes das plantas e o solo circundante foram colocadas em banho-maria à temperatura ambiente e suavemente agitadas, seguidas de decantação e peneiração para permitir a coleta de cistos. Os cistos foram secos por dois dias e armazenados até o uso.

[0110]A incubação dos cistos foi induzida expondo-os a uma solução de cloreto de zinco (3 mM em água destilada) a 25 °C por três dias. Foram retiradas cinco amostras de 100 µl desta suspensão. O número de juvenis J2 em cada amostra foi contado e a média dos resultados. As plantas de beterraba sacarina foram inoculadas quatorze dias após a transferência para SAP com o volume necessário de suspensão para inocular cada planta com uma média de 250 nematoides J2.

Cultura de Pratylenchus penetrans

[0111]A cultura pura de P. penetrans cultivadas em discos de cenoura foi gentilmente cedido por Giuseppi Lucarelli (Service Horto, Noicattaro, Itália). Os nematoides foram multiplicados inoculando aproximadamente 100 nematoides em um disco de cenoura esterilizado, colocando-o em uma placa de Petri selada e incubando a placa a 24 °C por seis semanas no escuro. As cenouras foram esterilizadas lavando- as e descascando-as, mergulhando-as em etanol e, finalmente, queimando-as em um queimador de Bunsen.

Culturas fúngicas

[0112]Todos os isolados de fungos foram gentilmente fornecidos pelo professor Kris Audenaert da Universidade de Ghent. O inóculo foi obtido inoculando 20 µl de estoque de esporos de glicerol mantidos em um freezer a -80 °C em placas de agar dextrose de batata (Sigma-Aldrich). As placas foram mantidas no escuro à temperatura ambiente e expostas à luz UV durante oito horas por dia. Após dez dias, os esporos foram colhidos inundando a placa com 15 ml de tampão PBS estéril com tensoativo Tween 20 a 0,01 % e raspando suavemente os esporos e o micélio. A suspensão resultante foi filtrada através de MiraCloth estéril (VWR) e o número de esporos por ml foi determinado através da contagem em uma câmara de Bürker (Marienfeld). Os esporos foram então diluídos ou concentrados conforme necessário para atingir a densidade de inóculo desejada. Os esporos foram concentrados por centrifugação a 4000 rpm, seguido pela remoção do sobrenadante e substituição por um volume menor.

Produtos químicos

[0113]A menos que mencionado de outro modo, todos os produtos químicos para experimentos de nematoides foram aplicados como uma pulverização da folhagem que consiste no composto alvo a uma concentração de 300 uM em conjunto com 0,1 % (v/v) de tensoativo Tween 20 (Calbiochem) em água destilada. Novamente, a menos que mencionado de outra forma, todos os tratamentos para os experimentos com nematoides foram realizados três vezes: um e oito dias antes da inoculação do patógeno e sete dias após a inoculação do patógeno. Em todos os casos, as plantas foram pulverizadas até o escoamento com um atomizador.

[0114]Os inibidores mais C4H, bem como por LPS foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, EUA). O ácido 3- (4-piridil) acrílico e o ácido 4- propiniloxibenzóico foram obtidos da Enamine (Kiev, Ucrânia). Todos os compostos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (Duchefa Biochemie, Haarlem, Países Baixos) para formar uma solução estoque 100 mM que foi então usada para fazer os tratamentos por pulverização. Os tratamentos de controle consistiram em água destilada com Tween 20 e dimetilsulfóxido adicionado na mesma concentração que nos grupos de tratamento.

[0115]Os revestimentos de sementes foram aplicados por imersão de sementes em uma solução de revestimento contendo 20 g/l de carboximetilcelulose de alta viscosidade (Sigma-Aldrich, Saint Louis, EUA) em água destilada, bem como 300 µM do composto alvo. As sementes foram então secas durante a noite à temperatura ambiente.

Experimentos de infecção por nematoides

[0116]Os experimentos de infecção com M. graminicola foram executados através da inoculação de plantas hospedeiras de 14 dias após a transferência para o

SAP ao introduzir a quantidade desejada de juvenis J2 ao lado do sistema de raiz usando uma micro-pipeta. Plantas de arroz (cv. Nipponbare ou Kitaake) foram inoculadas com 250 juvenis de J2 por planta; plantas de trigo (cv. Sahara) foram inoculadas com 600 juvenis de J2 por planta. As plantas foram colhidas 14 dias após a inoculação. Nesse ponto, as plantas foram fenotipadas medindo-se o comprimento do broto e da raiz com uma régua, contando o número de raízes adventícias e, em alguns experimentos, medindo-se a área foliar usando o software EasyLeafArea (Easlon e Bloom, 2014) e determinando a massa seca do broto após 72 horas de secagem em estufa a 70 °C. Os sistemas de raiz foram então corados em fucsina ácida, como descrito em (Byrd et al., 1983) e deixados a estaína em glicerol com 1 ml/l de HCl fumegante adicionado por aproximadamente dez dias. O número de galhas e nematoides foi então contado usando um microscópio binocular.

[0117]Os experimentos de infecção com M. incognita foram realizados da mesma maneira como aqueles com M. graminicola, excepto que as plantas foram colhidas 31 dias após a inoculação, em vez de 14 dias. Nesse ponto, as plantas foram fenotipadas medindo o comprimento da raiz com uma régua e, em alguns experimentos, medindo a área foliar usando o software EasyLeafArea (Easlon e Bloom, 2014) e determinando a massa seca do broto após 72 horas de secagem em um forno em 70 °C. As galhas foram coradas e contadas como descrito acima.

[0118]Os experimentos de infecção com H. schachtii foram executados através da inoculação de plantas hospedeiras de 14 dias após a transferência para o SAP através da introdução de 250 J2 juvenis para o seu sistema de raiz usando uma micro pipeta. As plantas foram colhidas 31 dias após a inoculação. Neste ponto, as plantas foram fenotipadas medindo a raiz e o comprimento do broto com uma régua.

Os cistos foram coletados através de um protocolo de flotação de sacarose e depois contados e avaliados microscopicamente quanto à maturidade.

[0119]Os experimentos de infecção com P. penetrans foram executados através da inoculação de plantas hospedeiras de 14 dias após a transferência para o SAP através da introdução de 500 nematoides para o seu sistema de raiz usando uma micro-pipeta. As plantas foram colhidas 31 dias após a inoculação. Neste ponto, as plantas foram fenotipadas. As lesões foram contadas manualmente usando uma lupa após a lavagem e a abertura do sistema de raiz. Os nematoides foram contados macerando os sistemas de raiz com um misturador de cozinha, colocando um sistema de raiz em 30 ml de água da torneira autoclavada por 24 horas e finalmente contando o número de nematoides em quatro alíquotas de 500 µl de cada suspensão de raiz de 30 ml sob um microscópio binocular.

Experimentos de infecção fúngica Fusarium-cebola

[0120]As sementes de cebola foram revestidas com uma solução de PA de 300 µM, conforme descrito na seção de tratamentos químicos. F. oxysporum (isolado Foc26), F. solani (isolado Fso18) e F. proliferatum (isolado Fpr18) foram originalmente extraídos de campos de cebola vietnamitas. O inóculo foi obtido como descrito na seção de cultura de fungos. O inóculo foi diluído para uma concentração de 1,0 x 10 7 esporos por ml com tampão PBS estéril. As sementes revestidas foram então embebidas na solução de esporos durante uma hora. Para evitar lixiviação excessiva de PA do revestimento de PA, foram adicionados 100 µM de PA à solução de esporos.

[0121]Após a imersão na solução de PA, as sementes foram deixadas a secar durante trinta minutos. Vinte sementes foram então semeadas por vaso em vasos; foram utilizados três vasos por tratamento e por isolado de fungos (para um total de 60 sementes por combinação de tratamento-isolado). Os vasos foram cobertos com filme plástico e deixados no peitoril da janela à temperatura ambiente. Após oito e dez dias, foi contado o número de mudas germinadas por vaso.

Botrytis (tomate)

[0122]As plantas de tomate (cv. Moneymaker) foram cultivadas por quatro semanas no solo para vasos, conforme descrito na seção de material vegetal. Seis horas antes da inoculação, a terceira folha de cada tomateiro foi destacada. Os pecíolos foram embrulhados em papel de seda e as folhas foram colocadas em uma placa de Petri. As placas de Petri com as folhas foram então colocadas em uma bandeja plástica com água para que as folhas não tocassem na água. Finalmente, a bandeja foi coberta com um saco de autoclave de plástico para manter a umidade em 100 %.

[0123]Os esporos de Botrytis cinerea (linha R16) foram obtidos conforme descrito na seção de cultura de fungos, centrifugados por cinco minutos a 3000 rpm e ressuspensos em uma concentração de 1,0x106 esporos por ml com uma solução de glicose 0,01 M e KH 0,0067 M2PO4. A suspensão de esporos foi deixada à temperatura ambiente por uma hora para acionar a germinação. Nesse ponto, 10 µM de PA ou a quantidade equivalente de DMSO para o controle foram adicionados à solução de esporos para imitar a pulverização foliar final aplicada após a inoculação em todos os outros experimentos.

[0124]Seis gotas de suspensão de esporos de 15 ul de cada foram manchados em cada uma folha de tomate individual, após o que o tabuleiro foi novamente coberto. A bandeja foi colocada à temperatura ambiente, longe da luz solar direta e deixada por quatro dias. Nesse ponto, foram realizadas medições de fluorescência da clorofila para avaliar o sucesso da infecção. Dois parâmetros foram avaliados: se a lesão de B. cinerea se espalhou além da área das gotículas (invasão bem-sucedida) e a área total da superfície das lesões estabelecidas com sucesso (crescimento pós-invasão).

Ensaios de toxicidade de nematoides

[0125]Juvenis J2 de Meloidogyne graminicola e Heterodera schachtii foram isolados a partir de Echinocloa Cruss-galli raízes e raízes de beterraba sacarina, respectivamente. Por tratamento e combinação de espécies, 300 nematoides foram isolados e divididos em seis poços que continham 1,5 ml de água da torneira esterilizada, uma solução inibidora de C4H 100 μM ou uma solução a 0,02 % (v/v) do nematicida abamectina (Vertimec®, Syngenta AG). Os nematoides foram incubados no escuro em um agitador rotativo de movimento lento (50 rpm) e o número de nematoides vivos foi contado regularmente usando um microscópio binocular.

Ensaio de toxicidade fúngica

[0126]Cinco microlitros de uma solução de esporos (esporos de fungos em uma mistura de 30 % de glicerol e 70 % de água, armazenados a -80 °C) foram vistos no meio de uma placa de Petri contendo 25 ml de ágar de dextrose de batata que continham PA de 300 µM ou uma solução de controle. Foram utilizadas dez placas por espécie de fungo (cinco PA e cinco controle). Cada placa foi marcada com os eixos x e y passando pelo centro da placa.

[0127]As placas foram incubadas à temperatura ambiente. Começando 24 horas após a mancha, a área de superfície da colônia foi calculada diariamente medindo o crescimento ao longo dos eixos x e y e aplicando a fórmula para a área de superfície de uma elipse (A = πab). As placas também foram examinadas visualmente quanto a fenótipos anormais, como micélio do ar ou esporulação precoce.

Experimento de infecção por Pseudomonas syringae

[0128]As plantas de tomate (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker) foram cultivadas em vasos, como descrito na seção de materiais vegetais, até o quarto estágio foliar. As plantas foram tratadas com um ácido piperonílico ou spray de controle, conforme descrito na seção de produtos químicos. Vinte e quatro horas antes da inoculação, as plantas de tomate foram colocadas em uma cloche selada para manter a umidade a 100 %.

[0129]Um estoque de glicerol de P. syringae pv. O DC3000 mantido a -80 °C foi visto em placas de petri contendo ágar B de King alterado com 75 µg/ml de rifampicina (Duchefa Biochemie, Haarlem, Países Baixos). As placas foram incubadas no escuro a 28 °C por uma semana. Neste momento, tubos de ensaio de vidro contendo 5 ml de B de King líquido cada (sem rifampicina) foram inoculados com células das placas e colocados em um agitador orbital a 200 rpm por 24 horas a 28 °C. Transferiram-se 100 µL deste inóculo líquido para tubos de ensaio de vidro fresco contendo 5 ml de B de King líquido cada (sem rifampicina), que foram colocados num agitador orbital a 200 rpm durante 24 horas a 28 °C.

[0130]Neste ponto de tempo, a cultura líquida foi diluída com meio fresco de King B a uma DO de 1,0. Este meio foi então centrifugado a 3000 rpm por dez minutos; o sobrenadante foi rejeitado e as células foram ressuspensas em 10 mM de MgSO 4 a um OD de 0,20. A este inoculo, foi adicionado tensoativo Silwet 77 a 0,01 % (v/v).

[0131]Tomateiros inteiros foram inoculados por imersão brevemente em uma proveta do inoculo acima mencionada. Após a imersão, as plantas foram colocadas de volta na cloche selada por 12 horas. Nesse ponto, a cobertura foi removida e as plantas foram expostas ao nível de umidade normal na câmara de crescimento.

Experimento de toxicidade de Pseudomonas syringae

[0132]Um estoque de glicerol de P. syringae pv. O DC3000 mantido a -80 °C foi visto em placas de petri contendo ágar B de King alterado com 75 µg/ml de rifampicina (Duchefa Biochemie, Haarlem, Países Baixos). As placas foram incubadas no escuro a 28 °C por uma semana. Neste momento, tubos de ensaio de vidro contendo 5 ml de B de King líquido cada (sem rifampicina) foram inoculados com células das placas e colocados em um agitador orbital a 200 rpm por 24 horas a 28 °C. 100 µl deste inóculo líquido foram transferidos para tubos de ensaio de vidro fresco contendo 5 ml de B de King líquido cada (sem rifampicina) alterados com 100 µM de PA ou um controle correspondente, que foram colocados em um agitador orbital a 200 rpm por 24 horas a 28 °C. Neste momento, as células foram diluídas dez vezes com o meio B líquido de King e o OD600 da suspensão resultante foi determinado usando um espectrofotômetro (BioRad SmartSpec Plus), com B estéril de King como blanc.

qRT-PCR (PCR quantitativa de transcriptase reversa)

[0133]As plantas de arroz da Bomba cultivar foram colhidas 13 dias após a germinação. As plantas foram germinadas em papel embebido em água corrente da torneira ou em uma solução de 100 µM de MDCA ou PA. Após a transferência para a SAP, as plantas foram pulverizadas a cada dois dias com MDCA, PA ou tratamento simulado. Cada grupo de tratamento continha nove plantas, que foram reunidas em três grupos de três plantas para extração de RNA. Como restrições práticas impediram a análise da raiz e do broto, apenas o tecido da raiz foi utilizado.

[0134]As amostras foram congeladas em nitrogênio líquido antes de ser moído num almofariz e argamassa congelado tratados com inibidor de RNAse. O tecido da raiz do solo foi suspenso em tampão de extração e sonicado três vezes por 15 segundos, antes da extração de RNA com um kit Qiagen RNeasy Plant Mini (Qiagen, Venlo, Holanda). A pureza e quantidade do RNA foram medidas usando um espectrofotômetro NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, EUA); se a qualidade era insuficiente, o protocolo de extração era repetido.

[0135]Um micrograma de ARN total foram incubados com DNAse I (ThermoFisher Scientific, Waltham, EUA). O cDNA total foi gerado usando um kit de síntese de cDNA de Bioline Tetro (Meridian Life Sciences, Cincinnati, EUA). A qualidade do cDNA foi testada através da realização de uma reação de PCR com iniciadores para o gene de referência OsEIF5C.

[0136]Após o controle de qualidade, foi realizado o qPCR. Dois genes de referência (OsEXP e OsEXPNarsai) foram incluídos; cada amostra foi dividida em duas repetições técnicas. Um controle negativo por gene também foi incluído. Os iniciadores qPCR foram encomendados à ThermoFisher Scientific; O Bioline SensiMix SYBR foi utilizado como uma mistura principal de PCR e como um corante fluorescente. A reação de qPCR foi realizada em um sistema BioRad CFX Connect; o controle de qualidade foi realizado pela análise da curva de fusão.

Análise estatística

[0137]Todas as análises estatísticas foram realizadas no Microsoft Open R (v.

3.5.0), exceto os resultados de qPCR que foram analisados usando o teste de permutação implementado no software Rest 2009 (Pfaffl, Horgan e Dempfle, 2002).

Todas as análises foram realizadas no nível de significância α = 0,05. Os gráficos estatísticos foram criados usando o pacote ggplot2 (Wickham, 2009).

[0138]Os experimentos de fitotoxicidade de curto prazo (Exemplo 1) foram analisados usando métodos não paramétricos. Para cada variável, a significância geral foi determinada usando o teste de Kruskal-Wallis (Kruskal e Wallis, 1952), seguido de um teste pós-doc de Conover-Iman (Conover e Iman, 1981) com correção da multiplicidade de Hommel (Hommel, 1988) se o teste de Kruskal- O teste de Wallis foi significativo. Quando apenas dois grupos estavam presentes, foi utilizado o teste de Wilcoxon-Mann-Whitney (Mann e Whitney, 1947).

[0139]Os experimentos de infecção, bem como o experimento de longo prazo no Exemplo 2, foram analisados usando modelos lineares generalizados (usando uma distribuição normal para dados contínuos e proporções como comprimento da raiz ou galhas por raiz adventícia, um modelo de quasipoisson superdisperso para contar dados como número de galhas e um modelo binomial para dados binários, como disseminação de lesões ou sobrevivência de nematoides). Em todos os casos, as premissas do modelo foram verificadas usando gráficos de diagnóstico (resíduos, QQ- plot, escala-localização e resíduos-alavancagem). Os pontos fora da curva foram removidos apenas se fossem pontos fora da curva, tanto no sentido estatístico quanto se houvesse uma razão biológica para a remoção (por exemplo, a planta foi atrofiada ou desenvolveu uma infecção secundária). Os métodos não paramétricos descritos no parágrafo anterior foram utilizados para variáveis que se desviaram dos requisitos para métodos paramétricos com base nas plotagens de diagnóstico acima mencionadas.

[0140]Além dos modelos lineares, também foram utilizados testes post-hoc para obter comparações aos pares. Para análises todos-vs-controle, foi utilizado o teste de Dunnett (Dunnett, 1955), para comparações todos-vs-todos o teste de Tukey (Bretz, Hothorn e Westfall, 2011). O estágio de desenvolvimento do BBCH foi analisado de forma não paramétrica, usando o teste de Kruskal-Wallis e o teste pós- doc de Conover-Iman com correção da multiplicidade de Hommel.

[0141]As curvas de crescimento construídas enquanto o experimento estava em andamento foram geradas por modelos lineares mistos, conforme implementado no pacote Rnlme (Pinheiro et al., 2017). As premissas do modelo foram verificadas usando três gráficos de diagnóstico: um gráfico QQ, um gráfico residual estudado e um gráfico de alavancagem. Para explicar a autocorrelação entre os momentos, diferentes estruturas de correlação foram testadas e escolhidas com base no critério da AIC. Dois tipos de modelo foram considerados: splines polinomiais ou splines de regressão cúbica (via função bs na base R). Para a regressão de splines, o número ideal de nós foi determinado pela AIC. O modelo final foi sempre ajustado usando REML, mas o ML foi usado para a seleção inicial do modelo baseado em AIC, conforme recomendado (Zuur et al., 2009).

[0142]Os experimentos de germinação foram analisados ajustando um modelo logístico de três parâmetros, conforme implementado no pacote R drc.

[0143]Os dados de qPCR no exemplo 5 foram analisados usando o método de Pfaffl e um teste de permutação de significância estatística conforme implementado no software REST 2009 (Pfaffl, Horgan e Dempfle, 2002).

Exemplo 1: Efeito de inibição de C4H no crescimento e desenvolvimento nas culturas não infectadas

[0144]Para testar se os inibidores da C4H induzem efeitos fitotóxicos nas culturas, tomate, trigo e cenoura não infectados foram tratados com ácido piperonílico (PA), ácido 4-iodobenzoico (4-IBA) e ácido pipérico (PIA) a uma concentração de 500 µM através da aplicação foliar. Na colheita, a área foliar (ou comprimento do broto no caso de trigo) e comprimento da raiz primária foram registrados. O estágio de desenvolvimento de BBCH (Lancashire et al., 1991), uma medição de atraso no desenvolvimento, foi usado para testar os efeitos no desenvolvimento. Finalmente, a presença de sinais visíveis de fitotoxicidade, tais como clorose, descoloração ou necrose foi registrada.

[0145]Nenhum dos compostos testados causou quaisquer efeitos no crescimento ou desenvolvimento em comparação com o tratamento controle em qualquer uma das culturas testadas. Os dados são resumidos na Tabela 2, Tabela 3 e Tabela 4. Safra Tratamento Área foliar (cm²) Estágio de

BBCH Tomate Controle 9,17 ± 1,22 102 ± 0 PA 11,83 ± 1,70p = 0,8900 102 ± 1,0p = 0,677 4-IBA 8,92 ± 1,91p = 0,8900 102,5 ± 1,0p = 0,677 PIA 12,21 ± 1,66p = 0,4600 103 ± 1,0p = 0,677 Cenoura Controle 5,65 ± 1,64 13 ± 0 PA 6,07 ± 2,12p = 0,8400 13 ± 0p = 1,000 4-IBA 5,05 ± 1,35p = 0,3500 13 ± 0p = 1,000 PIA 4,78 ± 0,85p = 0,2300 13 ± 0p = 1,000 Tabela 2: Área foliar média com desvio padrão e estágio de desenvolvimento de BBCH mediano com intervalo interquartil para cenoura e tomate depois do tratamento com um PA a 500 µM, pulverização foliar com 4-IBA ou PIA. Tamanho da amostra: 8 plantas por tratamento.

Tabela 3: Comprimento do broto médio com desvio padrão e estágio de desenvolvimento de BBCH mediano com intervalo interquartil para trigo depois do tratamento com um PA a 500 µM, pulverização foliar com 4-IBA ou PIA. Tamanho da amostra: 8 plantas por tratamento. Safra Tratamento Comprimento do Estágio de BBCH broto (cm) Trigo Controle 30,25 ± 5,43 13 ± 0 PA 31,75 ± 2,84p = 13 ± 0p = 1,000 1,000 4-IBA 31,93 ± 3,38p = 13 ± 0p = 1,000 1,000 PIA 31,07 ± 4,82p = 13 ± 0p = 1,000 1,000 Tabela 4: Comprimento do sistema de raiz médio com desvio padrão no trigo e tomate depois do tratamento com um PA a 500 µM, pulverização foliar com 4-IBA ou PIA. Tamanho da amostra: 8 plantas por tratamento. Safra Tratamento Comprimento de raiz (cm) Tomate Controle 8,82 ± 0,83 PA 7,95 ± 1,83p = 0,8500 4-IBA 7,40 ± 0,79p = 0,3200 PIA 8,24 ± 1,90p = 0,3800 Trigo Controle 12,67 ± 5,13 PA 15,75 ± 2,64p = 0,7200 4-IBA 14,36 ± 2,78p = 0,7200 PIA 14,57 ± 1,24p = 0,7200

[0146]Estes resultados demonstram que os compostos são bem tolerados pela planta em concentrações biologicamente relevantes e não causam efeitos adversos no crescimento vegetativo.

Exemplo 2: Inibidores da C4H não têm efeito no rendimento e fertilidade no trigo

[0147]Para determinar os efeitos de inibição de C4H em rendimento e fertilidade, o trigo da primavera (Triticum aestivum cv. Fielder) foi cultivado em uma câmara de crescimento livre de patógeno até a maturidade e tratado com um controle ou inibidor da pulverização foliar contendo C4H em intervalos regulares. Na colheita, foram medidos o número de espigas por planta, a massa de sementes, o tamanho das sementes e a capacidade de germinação das sementes recém-colhidas. O tamanho da semente foi medido usando a densidade de empilhamento da semente como uma medida proxy; se uma dada massa de sementes absorve um volume maior, as sementes individuais devem ser maiores.

[0148]Embora não tenha sido explicitamente medido, não houve diferença visível na data superior ou na antese entre os três tratamentos. Da mesma forma, o número médio de espigas por planta foi o mesmo em todos os tratamentos (PA vs.

controle: p = 0,738; piperina vs. controle: p = 0,208).

[0149]Também não houve efeito no tamanho da semente (PA vs. controle: p = 0,362; piperina vs. controle: p = 0,766). O rendimento total (massa de sementes) não foi significativamente diferente após o tratamento com PA (p = 0,08812), mas a piperina resultou em um pequeno, mas estatisticamente significativo aumento na massa de sementes por planta (p = 0,00107). Finalmente, a germinação após quatorze dias não foi significativamente diferente em nenhum tratamento (PA vs.

controle: p = 0,1004; piperina vs. controle: p = 0,1643). Os resultados deste experimento estão resumidos na Figura 1 e na Figura 2.

Exemplo 3: A via fenilpropanoide inicial e a defesa do arroz Testando o efeito de MDCA e PA na defesa do arroz contra nematoides

[0150]As plantas de arroz foram germinadas por três dias, transferidas para SAP e cultivadas por doze dias. Após doze dias, 240 nematoides de M. graminicola J2 foram adicionados em média a cada planta. As plantas foram colhidas doze dias após a infecção e as raízes foram coradas com fucsina ácida para visualizar galhas e nematoides. Os resultados são mostrados na Tabela 5 e na Figura 3.

Tabela 5: Valores medianos e intervalos interquartis para várias características fenotípicas (comprimento do broto, comprimento da raiz, número de raízes adventícias, número de galhas por sistema radicular, número de galhas por raiz adventícia, número de juvenis J2, número de juvenis J3/J4, número de fêmeas adultas com e sem óvulos, número total de nematoides, número de galhas vazias e galhas pequenas como uma fração do número total de galhas). Nenhum valor de p post-hoc é dado quando o teste omnibus não foi significativo. Abreviações: AR = raiz adventícia, J2 = segundo estágio juvenil, J3/J4 = terceiro/quarto estágio juvenil. Controle (n = MDCA 100 PA 100 µM (n = 8) 8) µM (n = 8) Comprimento do broto 54,1 (IQR = 50,4 (IQR = 51,3 (IQR = 1,8)p = (cm) 4,5) 2,7)p = 0,0921 0,4459 Comprimento de raiz 19,6 (IQR = 18,0 (IQR = 19,5 (IQR = 2,3)p = (cm) 1,8) 2,7)p = 0,4605 0,8226 Número de raízes 15,0 (IQR = 13,5 (IQR = 14,0 (IQR = 1,3)p = 1,3) 2,0)p = 0,0479 0,1329 Número de galhas 20,5 (IQR = 11,5 (IQR = 12,5 (IQR = 4,0)p < 9,5) 3,3)p < 0,0001 0,0001 Galhas por AR 1,24 (IQR = 0,78 (IQR = 0,83 (IQR = 0,29)p = 0,62) 0,22)p = 0,0480 0,0380 Número de J2 6,0 (IQR = 5,5) 7,5 (IQR = 9,0 (IQR = 8,3) 8,0) Número de J3 + J4 10,0 (IQR = 8,0 (IQR = 5,0 (IQR = 5,5)p = 5,0) 8,3)p = 0,7470 0,7400 Número de adultos 12,0 (IQR = 20,0 (IQR = 19,5 (IQR = 11,8)p = (sem ovos) 13,5) 7,3)p = 0,8200 0,8200 Número de adultos 0,0 (IQR = 0,3) 3,0 (IQR = 0,5 (IQR = 1,3)p =

(com ovos) 13,3)p = 0,6140 0,1060 Nematoides totais 32,0 (IQR = 41,5 (IQR = 32,5 (IQR = 17,8)p = 15,3) 14,3)p = 0,7208 0,6660 Galhas vazias 0,0 (IQR = 0,0) 0,5 (IQR = 0,0 (IQR = 1,0) 1,3) Fração de 0,69 (IQR = 0,84 (IQR = 0,76 (IQR=0,08)p = Galhas pequenas 0,05) 0,13)p = 0,0858 0,0002

[0151]Antes da infecção, as plantas tratadas com MDCA e PA pareciam ter uma parte mais curta do que o grupo controle. No entanto, o MDCA e o PA alcançaram o grupo controle após a inoculação do nematoide, e seu comprimento não foi significativamente diferente do controle no final do experimento.

[0152]Os grupos tratados com MDCA/PA mostraram evidências de defesa aprimorada. Em primeiro lugar, a contagem de galhas foi significativamente reduzida, tanto em números absolutos quanto por raiz. Além disso, ambos os grupos hospedavam galhas vazias, que foram ocasionalmente cercadas por tecido necrosado. Dentro da raiz, também havia manchas necróticas que pareciam ser nematoides que morreram durante a migração. Essa evidente resposta hipersensível não foi vista no controle.

[0153]No entanto, o menor número de galhas não pareceu prejudicar o desenvolvimento de nematoides em nenhum grupo de tratamento. Nem o número total de nematoides nem a participação de nematoides que atingiram a maturidade diferiram significativamente entre as plantas tratadas e o grupo controle. Apesar das plantas tratadas com MDCA/PA que hospedam galhas cada vez menores e menores, cada galha foi, em média, povoada por um número maior de nematoides do que no grupo controle.

[0154]Apesar do número semelhante de nematoides, o MDCA e o PA parecem reduzir o dano ao nematoide. Embora o MDCA e o PA reduzam o tamanho do broto em plantas não infectadas, as plantas tratadas com estes compostos parecem alcançar o grupo controle sob infecção por nematoides.

Exemplo 4: Segundo experimento de infecção no arroz

[0155]O segundo experimento foi metodologicamente semelhante ao primeiro. Desta vez, as plantas foram cultivadas por 15 dias antes da inoculação com 210 nematoides em média e colhidas 13 dias após a inoculação.

[0156]No experimento anterior, observou-se que as plantas tratadas com MDCA e PA foram menores antes da infecção, mas recuperadas posteriormente.

Neste experimento, uma curva de crescimento foi usada para testar esta hipótese mais formalmente.

[0157]Começando dez dias após a transferência para SAP, a altura da planta e o estágio de desenvolvimento do BBCH foram avaliados diariamente e uma curva de crescimento foi construída usando splines de regressão cúbica não paramétrica (Poirier, 1973). O modelo ideal foi encontrado com quatro nós e mostrou três regiões distintas (Figura 4). Na primeira região, aproximadamente equivalente às primeiras 140 horas após o início das medições, as plantas tratadas com MDCA/PA foram um pouco, mas estatisticamente significativamente menores (p = 0,011 ep = 0,003, respectivamente). Na segunda região, nenhum grupo foi significativamente mais alto que o outro (PA: p = 0,891; MDCA: p = 0,237). Na região final, equivalente às 140 horas finais, os grupos tratados com MDCA/PA foram significativamente mais altos que o controle (PA: p = 0,043; MDCA: p = 0,039).

[0158]Nunca houve diferença significativa na escala de BBCH entre os grupos, mostrando assim que o MDCA e o PA afetam positivamente o crescimento - mas não o desenvolvimento - da planta de arroz em condições de infecção por nematoides. Após a colheita aos 13 dias após a infecção, os mesmos parâmetros fenotípicos avaliados no experimento anterior foram medidos (ver Tabela 6 e Figura

5).

Tabela 6: Valores medianos e intervalos interquartis para várias características fenotípicas. CWR (resíduo da parede celular) é a razão entre a massa da parede celular e a massa seca total (em %). Controle (n = MDCA 100 µM (n PA 100 µM (n = 10) = 9) 10) Comprimento do broto 51,0 (IQR = 53,5 (IQR = 1,5)p 53,0 (IQR = 0,5)p (cm) 2,6) = 0,0062 = 0,0377 Comprimento de raiz 22,5 (IQR = 21,0 (IQR = 5,5) 20,5 (IQR = 3,0) (cm) 2,8) Número de raízes 11,0 (IQR = 11,0 (IQR = 0,0) 11,0 (IQR = 1,0) 0,0) Peso do broto seco 160,1 (IQR = 165,4 (IQR = 40,1) 173,55 (IQR = (mg) 36,3) 41,8) Broto CWR (%) 0,66 (IQR = 0,65 (IQR = 0,03) 0,64 (IQR = 0,03) 0,02) Número de galhas 11,0 (IQR = 8,0 (IQR = 1,0)p = 7,0 (IQR = 1,8)p < 0,8) < 0,0001 0,0001 Galhas por raiz 1,00 (IQR = 0,80 (IQR = 0,17)p 0,62 (IQR = 0,13)p adventícia 0,09) < 0,0001 < 0,0001 Número de J2 2,0 (IQR = 1,0) 0,0 (IQR = 0,0)p = 0,0 (IQR = 1,0)p = 0,010 0,015 Número de J3 + J4 11,0 (IQR = 7,0 (IQR = 5,0)p = 8,0 (IQR = 2,5)p = 2,8) 0,0002 0,0014 Número de adultos 7,0 (IQR = 5,8) 10,0 (IQR = 2,0)p 5,0 (IQR = 1,8)p = (sem ovos) = 0,6388 0,0183 Número de adultos 0,0 (IQR = 0,0) 0,0 (IQR = 1,0)p = 0,0 (IQR = 0,0)p = (com ovos) 0,183 1,000 Nematoides totais 20,0 (IQR = 17,0 (IQR = 5,0)p 13,5 (IQR = 2,5)p 8,5) < 0,0001 < 0,0001 Fração de galhas 0,00 (IQR = 0,11 (IQR = 0,03)p 0,13 (IQR = 0,17)p vazias 0,00) = 0,0022 = 0,0032 Probabilidade de 0,00 ± 0,00 0,78 ± 0,44p = 0,70 ± 0,48p = necrose 0,0030 0,0090

[0159]Como já indicado pelas curvas de crescimento, as plantas tratadas com MDCA ou PA infectadas tiveram uma parte significativamente mais alta do que as plantas tratadas com controle infectadas. Curiosamente, o sistema radicular mostrou menos diferenças: nem o seu comprimento nem o número de raízes adventícias diferiram entre os tratamentos. O comprimento da raiz também foi independente do comprimento do broto (coeficiente de correlação de Spearman = 0,06).

[0160]Como já indicado pelas curvas de crescimento, as plantas tratadas com MDCA ou PA infectadas tiveram uma parte significativamente mais alta do que as plantas tratadas com controle infectadas. Curiosamente, o sistema radicular mostrou menos diferenças: nem o seu comprimento nem o número de raízes adventícias diferiram entre os tratamentos. O comprimento da raiz também foi independente do comprimento do broto (coeficiente de correlação de Spearman = 0,06).

[0161]O número absoluto de galhas e o número de galhas por raiz adventícia são significativamente reduzidos nas plantas tratadas com MDCA/PA. Comparado aos controles não tratados, o número médio de galhas foi 36 % menor no grupo tratado com PA e 28 % menor no grupo tratado com MDCA. As plantas tratadas com MDCA/PA hospedam significativamente menos nematoides no total, mas o número médio de nematoides por galão não é afetado.

[0162]A comparação dos números de nematoides em cada estágio do desenvolvimento é difícil, pois os resultados são misturados e o erro técnico é relativamente alto. No entanto, o MDCA/PA parece reduzir o número de jovens muito mais do que o número de adultos. Isto sugere que os compostos inibem a invasão e o estabelecimento de galhas em vez do desenvolvimento, de acordo com o experimento anterior.

[0163]Finalmente, a porcentagem de galhas vazias foi significativamente maior após o tratamento com MDCA/PA. O grupo de controle não hospedou galhas vazias. Por outro lado, aproximadamente um em cada dez galões estavam vazios em plantas tratadas com MDCA/PA. Para verificar se uma suspeita de vesícula vazia estava realmente vazia, foi aberta com um bisturi. Estas galhas vazias foram fortemente associadas à necrose. A necrose estava presente em aproximadamente 75 % das plantas tratadas com MDCA/PA, mas estava ausente nas plantas controle.

A extensão da necrose variou bastante entre plantas e entre raízes individuais.

Geralmente, foi a mais extensa perto de galhas vazias ou muito pequenas, mas também foi vista longe das galhas como pontos isolados. Vários destes pontos pareciam cercar nematoides invasores J2 mortos, mas pontos necróticos também ocorreram em áreas sem presença visível de nematoides.

Exemplo 5: Inibição de CH4 no trigo contra nematoides das raízes

[0164]Neste experimento, os compostos PA, MDCA e 4-IBA foram testados como pulverização foliar no trigo monocotiledônea (Triticum aestivum, cv. Sahara) contra o nematoide Meloidogyne graminicola. O composto bacteriano LPS (lipopolissacarídeo), que é um potente indutor do sistema imunológico da planta e um agente primário conhecido (Desaki et al., 2006), também foi incluído como controle positivo.

[0165]Os resultados do experimento estão resumidos na Tabela 7 e na Figura

6. PA, MDCA, 4-IBA e LPS resultaram em uma redução no número de galhas, embora para o LPS a redução não fosse estatisticamente significativa, nem em números absolutos e normalizado em relação ao número de raízes.

Tabela 7: Resumo de várias características fenotípicas em plantas tratadas com inibidores da C4H, ácido piperonílico (PA), ácido 3,4-metilenodioxicinâmico (MDCA), ácido 4-iodobenzóico (4-IBA), o lipopolissacarídeo elicitor (LPS) ou um tratamento controle. ‘AR1’ significa ‘raiz adventícia’. Controle PA (n = 9) MDCA (n = 4-IBA (n = LPS (n = (n = 9) 9) 9) 9)

Comprimento do 34,9 ± 1,7 35,4 ± 2,2 34,4 ± 1,9 33,8 ± 2,2 34,2 ± 1,5 broto (cm) p = 0,988 p = 0,983 p = 0,743 p = 0,932 Área foliar (cm2) 24,0 ± 3,7 23,3 ± 6,9 22,3 ± 6,5 23,5 ± 7,6 22,1 ± 3,5 p = 0,999 p = 0,976 p = 1,000 p = 0,957 Estágio de BBCH 22,7 ± 1,0 22,8 ± 0,4 23,0 ± 0,0 22,8 ± 0,4 22,7 ± 0,5 p = 0,960 p = 0. 960 p = 0. 960 p = 0. 960 Comprimento de 15,2 ± 4,6 18,0 ± 3,7 17,4 ± 2,5p 16,4 ± 2,1p 16,3 ± 5,1 raiz (cm) p = 0,525 = 0,776 = 0,965 p = 0,977 Número de AR 9,9 ± 0,8 10,9 ± 2,3 10,3 ± 1,7 10,5 ± 1,1 10,1 ± 1,8 p = 0,688 p = 0,936 p = 0,977 p = 0,998 Número de 38,1 ± 9,4 25,6 ± 6,5 24,6 ± 6,3 27,8 ± 7,5 28,9 ± 6,1 galhas p = 0,007 p = 0,004 p = 0,036 p = 0,076 Número de 3,9 ± 1,2 2,5 ± 1,1 2,4 ± 0,8 2,7 ± 0,8 2,9 ± 0,7 galhas por AR p = 0,023 p = 0,015 p = 0,073 p = 0,180

[0166]De acordo com experimentos anteriores no arroz, o experimento de trigo novamente mostra uma redução significativa no número de galhas após o tratamento com inibidores de C4H (-33 % para PA, -35 % para MDCA e -27 % para 4- IBA). Mais uma vez, não houve efeitos negativos no crescimento ou desenvolvimento do trigo. Este experimento demonstra a aplicabilidade dos inibidores de C4H no trigo e fornece novamente evidências de que todos os três compostos são eficazes contra os nematoides quando aplicados como uma pulverização foliar.

Exemplo 6: Teste de inibidores adicionais de C4H contra Meloidogyne graminicola no arroz (Oryza sativa cv. Kitaake)

[0167]Neste exemplo, foi demonstrada a capacidade de pulverizações foliares de inibidores de C4H em controlar o nematoide Meloidogyne graminicola dos nós da raiz no arroz (cv. Kitaake). Foram utilizados quatro inibidores de C4H diferentes: ácido piperonílico (PA), piperina (PIP), ácido 4-propiniloxibenzóico (4PB) e ácido 3-(4-piridil) acrílico (3PA).

[0168]Todos os compostos testados resultaram em uma redução significativa no número de galhas em comparação com o grupo controle (PA: -40 %, p <0,0001; 4PB: -44 %, p <0,0001; 3PA: -47 %, p < 0,0001; PIP: -33 %, p = 0,00013). Nenhum dos compostos testados apresentou fitotoxicidade: não houve diferenças significativas entre os tratamentos em termos de desenvolvimento, massa do broto ou tamanho do sistema radicular. Também não houve sinais de clorose ou outras reações adversas em nenhum grupo de tratamento. Os resultados do experimento estão resumidos na Figura 7.

Exemplo 7: Inibidores da C4H reduzem a pressão da doença por Meloidogyne incognita no tomate (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker)

[0169]Neste experimento, foi demonstrada a capacidade de uma pulverização foliar do ácido piperonílico (PA) do inibidor de C4H em controlar o nematoide dos nós da raiz Meloidogyne incognita no tomate (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker).

Além disso, um possível efeito de resposta à dose foi investigado aplicando-se PA em três concentrações: 100, 400 e 700 µM.

[0170]Os resultados do experimento estão resumidos na Figura 8 e Tabela 8.

O PA resultou em uma redução significativa no número de galhas por sistema radicular em todas as concentrações; não houve diferença significativa entre as concentrações.

Assim como no arroz e no trigo, não foram observados efeitos negativos no crescimento ou desenvolvimento do tomateiro.

Tabela 8: Comparações aos pares do número médio de galhas por sistema radicular por tratamento, com valores de p de acordo com o teste post-hoc de Tukey. Comparação Diferença percentual Valor de p PA100 vs. CON - 54 % 0,00575 PA400 vs. CON - 50 % 0,01478 PA700 vs. CON - 55 % 0,00482 PA100 vs. PA400 -9% 0,99212 PA100 vs. PA700 -2% 0,99985 PA400 vs. PA700 + 11 % 0,98473

Exemplo 8: Teste de diferentes regimes de aplicação para inibidores de C4H

[0171]Foram comparados quatro regimes de aplicação de PA na interação arroz-Meloidogyne graminicola: um tratamento de revestimento de sementes, uma única pulverização foliar de alta dose antes da infecção, uma única pulverização foliar de alta dose após a infecção e pulverizações foliares repetidos de baixa dose durante todo o período de crescimento. Todos os quatro tratamentos mostraram oferecer um nível comparável de proteção. Isto demonstra a praticidade do uso de inibidores de C4H em diferentes sistemas de produção agrícola.

[0172]Cem sementes de arroz (cv. Nipponbare) foram divididas aleatoriamente em cinco grupos de vinte sementes: um grupo controle, sementes revestidas com carboximetilcelulose contendo PA a 300 μM (revestimento de PA), um grupo que seria pulverizado foliarmente com solução de PA a 100 μM três vezes por semana (PA contínuo), um grupo que seria pulverizado uma vez com uma solução de PA a 300 μM um dia antes da inoculação do nematoide (PA -1dpi) e um grupo que seria pulverizado uma vez com uma solução de PA a 300 μM sete dias após a inoculação do nematoide (PA + 7dpi).

[0173]O experimento foi realizado de acordo com os materiais e métodos descritos em Materiais e métodos, seções Oryza sativa (arroz) e cultura de Meloidogyne graminicola.

[0174]Os resultados do experimento estão resumidos na Tabela 9 e na Figura

9. Todos os quatro tratamentos reduziram o número médio de galhas, tanto em termos absolutos quanto normalizados por raiz, embora a diferença nem sempre seja estatisticamente significativa devido ao tamanho da amostra bastante pequeno usado (controle: n = 8; PA contínuo: n = 9; PA -1 dpi: n = 8; PA + 7 dpi: n = 8; revestimento PA: n = 7). Enquanto dez mudas foram transferidas para os tubos de crescimento em todos os grupos, todos os grupos experimentaram alguma mortalidade logo após a transferência para a SAP. Para garantir resultados representativos, foi decidido não substituir estas mudas após o início do experimento.

[0175]Todos os tratamentos reduziram o número de galhas, o que é um bom indicador da gravidade da doença. Além disso, todos os tratamentos resultaram em uma porcentagem mais alta de galhas classificadas como “pequenas” (em oposição a “médias” ou “grandes”). Nenhum dos tratamentos teve efeito no desenvolvimento da planta (como evidenciado pelo escore de BBCH) nem no crescimento do broto (como evidenciado pelo comprimento do broto).

Tabela 9: Resumo das características fenotípicas. ‘AR’ significa ‘raiz adventícia’. Tratamentos: ‘PA contínuo’ são plantas que foram pulverizadas três vezes por semana com uma solução de PA a 100 μM, ‘PA -1 dpi’ refere-se a plantas que foram pulverizadas uma vez com uma solução de PA a 300 μM, um dia antes da inoculação. ‘PA +7 dpi’ são plantas que foram pulverizadas uma vez com uma solução de PA a 300 μM, sete dias após a inoculação. ‘Revestimento de PA’ refere-se a sementes que foram revestidas com uma solução de carboximetilcelulose contendo PA a 300 μM. “Fração de galhas pequenas” refere-se à proporção de galhas que foram classificadas como “pequenas” comparando-as com uma série de pontos de referência. Controle PA contínuo PA -1 dpi PA +7 dpi PA (n = 8) (n = 9) (n = 8) (n = 8) revestimento (n = 7) Comprimento 37,9 ± 32,9 ± 7,2 p 39,0 ± 9,2 34,3 ± 12,5 32,9 ± 9,8 p do broto (cm) 7,9 = 0,650 p = 0,998 p = 0,876 = 0,728 Estágio de 15,8 ± 15,6 ± 0,5 p 15,8 ± 0,7 15,6 ± 0,5 15,8 ± 0,5 p BBCH 0,5 = 1,000 p = 1,000 p = 1,000 = 0,840 Comprimento 16,3 ± 11,9 ± 4,1 p 14,8 ± 5,7 12,5 ± 6,8 14,0 ± 5,9 p de raiz (cm) 3,9 = 0,286 p = 0,946 p = 0,466 = 0,650 Número de AR 13,5 ± 13,8 ± 3,3 p 18,3 ± 5,5 15,3 ± 7,0 13,3 ± 3,2 p 1,5 = 1,000 p = 0,131 p = 0,860 = 1,000 Número de 33,8 ± 18,1 ± 13,1 25,3 ± 9,4 18,1 ± 13,6 19,0 ± 11,0 galhas 18,6 p = 0,021 p = 0,494 p = 0,079 p = 0,391 Número de 2,5 ± 1,4 1,2 ± 0,7p = 1,4 ± 0,5 p 1,1 ± 0,6 p 1,3 ± 0,8 p = galhas por AR 0,014 = 0,056 = 0,011 0,048 Fração de 0,80 ± 0,95 ± 0,08 0,91 ± 0,06 0,91 ± 0,11 0,96 ± 0,04 galhas 0,07 p = 0,001 p = 0,030 p = 0,031 p = 0,003 pequenas

[0176]Todos os tratamentos parecem ter um efeito benéfico no número e no tamanho das galhas, de acordo com os resultados anteriores. É particularmente surpreendente que o tratamento sete dias após a inoculação ainda seja eficaz. Este efeito curativo facilita muito o uso destes compostos na prática, pois os problemas com nematoides são às vezes diagnosticados muito tempo após a infecção.

[0177]Foi observada uma mortalidade mais alta em sementes revestidas com PA (quatro de dez versus dois em cada dez no grupo controle), mas a diferença não é estatisticamente significativa conforme o teste do qui-quadrado com correção de Yates (p = 0,626) Experimentos repetidos em outras culturas confirmaram que não há mortalidade adicional após um revestimento de sementes com PA (dados não mostrados).

Exemplo 9: PA reduz a pressão da doença na beterraba contra nematoides do cisto

[0178]Para testar se os compostos da invenção são eficazes contra outros nematoides e em outras espécies vegetais, o PA foi testado na interação entre a beterraba sacarina (Beta vulgaris) e o nematoide do cisto Heterodera schachtii. Neste ponto, não se sabia se as dicotiledôneas tolerariam o PA, bem como as monocotiledôneas e, portanto, uma dose muito menor (10 μM) foi usada.

[0179]Os resultados do experimento estão resumidos na Tabela 10 e na Figura 10. O tratamento com PA reduziu o número de nematoides de Heterodera schachtii em 20 % estatisticamente insignificante. No entanto, houve uma redução altamente estatisticamente significativa no número de cistos maduros (-52 %), o que sugere forte inibição do desenvolvimento e reprodução de nematoides. O comprimento da raiz aumentou significativamente com o tratamento com PA, enquanto o comprimento do broto não foi afetado.

Tabela 10: Comparação de cinco características entre plantas de beterraba sacarina tratadas com ácido piperonílico (PA) e tratadas com simulação (Controle) infectadas com H. schachtii, com média e desvio padrão relatados. 0 Comprimento Comprimento Número Número Proporção do broto (cm) de raiz (cm) total de de cistos de cistos cistos maduros maduros Controle 21,0 ± 3,3 17,8 ± 1,9 18,8 ± 15,6 ± 5,2 0,88 ± 0,22 (n = 8) 9,2 PA (n = 20,9 ± 3,4 20,4 ± 1,7 p = 15,3 ± 7,5 ± 4,4 0,48 ± 0,25 8) p = 0,394 0,018 0,7 p = p = 0,008 p = 0,011 0,398

[0180]Mesmo quando aplicado em dose única e muito baixa (10 μM), o PA inibe significativamente o desenvolvimento e a reprodução do nematoide do cisto de beterraba sacarina Heterodera schachtii. Esta experiência demonstra que os compostos da invenção podem não apenas controlar nematoides de nó de raiz em monocotiledôneas, mas também aumentar a defesa contra nematoides do cisto em dicotiledôneas.

[0181]Curiosamente, é observado um aumento estatisticamente significativo no comprimento da raiz. Dado que a beterraba sacarina dedica a maior parte de sua energia disponível ao desenvolvimento da raiz primária, que atua como órgão de armazenamento, este aumento sugere que o tratamento com PA reduz significativamente o consumo de energia causado pela infecção por nematoides.

Exemplo 10: Inibidores de C4H reduzem a pressão da doença de Pratylenchus penetrans no trigo (Triticum aestivum cv. Sahara)

[0182]Neste experimento, foi demonstrada a capacidade de uma pulverização foliar de ácido piperonílico (PA) em controlar o nematoide migratório Pratylenchus penetrans no trigo (Triticum aestivum cv. Sahara).

[0183]Os resultados do experimento estão resumidos na Tabela 11 e na Figura 11. O tratamento com PA reduziu o número médio de nematoides de P.

penetrans encontrados no sistema radicular (-32 %, p = 0,0246), bem como o número médio de raízes lesões na planta hospedeira (-39 %, p = 0,0072).

Tabela 11: Comparação de cinco características entre plantas de trigo tratadas com ácido piperonílico (PA) e tratadas com simulação (Controle) infectadas com P. penetrans, com média e desvio padrão relatados. Massa de Comprimento Número de Número de broto seco de raiz (cm) lesões nematoides por (mg) sistema de raiz Controle (n 203,1 ± 30,8 23,5 ± 5,6 23,5 ± 2,4 244,8 ± 61,6 = 8) PA (n = 8) 225,3 ± 24,6 23,1 ± 5,6 p 14,4 ± 6,8 p 165,6 ± 61,1 p = p = 0,1350 = 0,8810 = 0,0072 0,0246

[0184]Em conclusão, os Exemplos 3 a 10 demonstram que os compostos da presente invenção controlam os principais grupos de nematoides parasitas de plantas (nó de raiz, cisto e migratório) em uma ampla gama de culturas, usando diferentes esquemas de aplicação.

Exemplo 11: Teste in vitro da toxicidade do inibidor de C4H para nematoides

[0185]Para excluir definitivamente que os compostos da invenção operam através de toxicidade direta para nematoides, foi realizado um ensaio de toxicidade in vitro em juvenis J2 dos nematoides Meloidogyne graminicola e Heterodera schachtii.

[0186]Primeiro, a sobrevivência após exposição ao ácido piperonílico (PA) do inibidor de C4H foi comparada a um controle negativo (água da torneira) e um controle positivo, o nematicida comercial Vertimec (Abamectina a 0,02 %). Uma curva de sobrevivência detalhada é mostrada na Figura 12a (M. graminicola) e na Figura 12b (H. schachtii). Para Meloidogyne graminicola, a sobrevivência diferiu significativamente entre controle e Vertimec (p <2e-16), mas não entre controle e PA (p = 0,1340). Para Heterodera schachtii, controle e Vertimec novamente diferiram significativamente (p <0,0001), enquanto controle e PA não (p = 0,3310).

[0187]Para Meloidogyne graminicola, a sobrevivência após 24 horas de exposição foi de (94,2 ± 2,4) % no grupo controle, (97,1 ± 1,8) % no grupo tratado com PA e (3,7 ± 3,5) % no grupo tratado com Vertimec. Para Heterodera schachtii, as taxas de sobrevivência foram (83,1 ± 7,6) %, (92,8 ± 2,5) % e (4,4 ± 7,8) %, respectivamente.

[0188]Estes dados mostram conclusivamente que o composto de PA não é nematicida, o que suporta a teoria de que a estimulação do sistema imunológico da planta, em vez da toxicidade para o nematoide, sustenta o efeito protetor dos inibidores de C4H contra os nematoides.

[0189]Em um segundo experimento, uma gama mais ampla de inibidores de C4H foi testada da mesma maneira. A toxicidade do ácido piperonílico (PA), da piperina (PIP), do ácido 4-propiniloxibenzóico (4PB) e do ácido 3- (4-piridil) acrílico (3PA) em juvenis J2 de Meloidogyne graminicola foi comparada a um controle negativo (água da torneira) e um verdadeiro nematicida (Vertimec, ingrediente ativo abamectina). Os resultados deste ensaio são mostrados na Figura 13.

[0190]A exposição ao Vertimec resultou em 0 % de sobrevivência no final do experimento, que diferiu significativamente de 93 % de sobrevivência observada no controle da água (p <0,0001). Por outro lado, a sobrevivência após exposição aos inibidores da C4H foi a mesma do grupo controle negativo (PA: 95 %, p = 0,9867; 3PA: 93 %, p = 0,9999; 4PB: 91 %, p = 0,7661; IBA: 89 %, p = 0,3519; PIP: p = 91 %, p = 0,8108).

Exemplo 12: Inibidores de C4H reduzem Fusarium spp. pressão da doença em mudas de cebola (Allium cepa)

[0191]Neste experimento, foi demonstrada a capacidade de um revestimento de sementes contendo ácido piperonílico (PA) para controlar os patógenos fúngicos do solo Fusarium oxysporum (Foc26 isolado), Fusarium solani (Fso18) e Fusarium proliferatum (Fpr18) em mudas de cebola.

[0192]Os resultados do experimento estão resumidos na Figura 14. Um revestimento de PA melhorou a emergência de mudas no solo alterado com qualquer um dos três isolados testados (Fso18: +27 %, p = 0,0086; Foc26: +42 %, p = 0,0021; Fpr18: +79 %, p <0,0001). Isto demonstra que o revestimento de sementes com PA melhora a emergência de mudas no solo infestado por Fusarium spp.

Exemplo 13: Inibidores de C4H reduzem a pressão da doença de Botrytis cinerea no tomate (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker)

[0193]Neste experimento, foi demonstrada a capacidade de uma pulverização foliar contendo ácido piperonílico (PA) para controlar o patógeno fúngico foliar Botrytis cinerea (R16 isolado) no tomate.

[0194]Os resultados do experimento estão resumidos na Figura 15. O tratamento com ácido piperonílico reduziu o número de pontos de inoculação nos quais as lesões fúngicas se desenvolveram (-50 %, p = 0,0006) e reduziu o tamanho médio das lesões estabelecidas/espalhadas com sucesso (-62 %, p = 0,0073). Estes dados mostram que o tratamento com PA inibe o estabelecimento e a expansão de lesões causadas pela infecção por Botrytis.

Exemplo 14: Ensaio in vitro da toxicidade do inibidor de C4H para fungos

[0195]Para apoiar a hipótese de que o efeito de controle da doença dos inibidores de C4H é devido ao efeito dessas moléculas no sistema imunológico da planta, em vez de efeitos fungicidas diretos, a toxicidade do ácido piperonílico (PA) foi investigada em quatro isolados de fungos: Alternaria solani, Botrytis cinerea R16, Fusarium graminearum PH1 e Fusarium graminearum GFP. Os resultados do experimento estão resumidos na Figura 16.

[0196]Os esporos de fungos inoculados em agar contendo PA a uma concentração de 300 µM por oito dias germinaram normalmente, mas apresentaram um ligeiro retardo de crescimento (específico da espécie) em comparação com aqueles cultivados em ágar de controle. Embora o efeito seja estatisticamente significativo em alguns isolados (A. solani: p <0,0001; B. cinerea: p = 0,7740; F.

graminearum PH1: p <0,0001; F. graminearum GFP: p <0,0001), estes dados mostram que PA não é suficientemente fungicida para ter um efeito significativo quando usado como pulverização foliar. Afinal, dado o rápido sequestro de PA em planta (Steenackers et al., 2016), um fungo em uma planta tratada com PA não seria exposto a PA por qualquer período de tempo.

Exemplo 15: Testando análogos do ácido 4-iodobenzóico quanto à atividade inibidora de C4H

[0197]Análogos estruturais adicionais do ácido 4-iodobenzóico (IBA) do inibidor de C4H foram testados quanto à sua capacidade de inibir a enzima C4H em um ensaio de expressão heteróloga de leveduras. Além do ácido 4- propiniloxibenzóico, um análogo estrutural adicional do ácido 4-iodobenzóico (sem um átomo de halogênio como substituinte 4) mostrou significativa atividade inibidora de C4H: ácido 4-trifluorometilbenzóico (CF3-BA).

[0198]Quando testadas em ensaio in vitro sobre crescimento de Arabidopsis thaliana (ecótipo Col-0), as mudas cultivadas em meio modificado com CF3-BA mostraram um fenótipo idêntico àquelas cultivadas em meio contendo IBA: raiz adventícia significativamente mais curta, indução de lateral e enraizamento adventício, agravitropia acentuada (inclinação da raiz primária para longe do eixo vertical) e crescimento reduzido da roseta. Os resultados do experimento estão resumidos na Tabela 12.

[0199]Estes dados mostram que o CF3-BA fenocopia os efeitos do IBA; combinado com sua similaridade estrutural ao IBA e seus efeitos semelhantes em um ensaio de expressão heteróloga, pode-se concluir que o CF3-BA é um inibidor de C4H.

Tabela 12: Área média da roseta, comprimento da raiz primária, razão de agravitropia (a razão da distância entre a ponta da raiz primária e a base dividida pelo comprimento total da raiz primária; uma proxy para perturbação da gravitropia) e taxa de germinação no Mudas de Col-0 do ecótipo A. thaliana com 14 dias de idade expostas ao ácido 4-iodobenzóico (IBA) ou ácido 4-trifluorometilbenzóico (CF 3-BA) em concentrações de 50 ou 100 µM, com desvio padrão mostrado. Controle IBA 50 IBA 100 CF3-BA 50 CF3-BA 100 (n = 27) µMn = 24 µMn = 38 µMn = 39 µMn = 22 Área da roseta 2,25 ± 0,10 ± 0,05 ± 0,16 ± 0,06p 0,15 ± 0,09p (cm2) 0,42 0,06p < 0,01p < < 0,0001 < 0,0001 0,0001 0,0001 Comprimento 4,63 ± 0,43 ± 0,28 ± 0,42 ± 0,14p 0,41 ± 0,14p da raiz 0,73 0,15p < 0,07p < < 0,0001 < 0,0001 primária (cm) 0,0001 0,0001 Razão de 0,96 ± 0,78 ± 0,82 ± 0,79 ± 0,15p 0,81 ± 0,10p agravitropia 0,03 0,17p = 0,11p < < 0,0001 < 0,0001 0,0003 0,0001 Taxa de 0,89 ± 0,88 ± 0,84 ± 0,95 ± 0,22p 0,84 ± 0,37p germinação 0,32 0,34p = 0,37p = = 1,0000 = 1,0000 1,0000 1,0000 Exemplo 16: Efeito de MDCA/PA na infecção por Meloidogyne graminicola em uma linhagem knockdown de arroz OsWRKY45

[0200]Para testar o potencial envolvimento do ácido salicílico (SA) no aprimoramento da defesa do MDCA/PA, examinou-se a resposta dos mutantes de RNAi-knockdown tratados com MDCA/PA em OsWRKY45 à infecção por nematoides.

As proteínas OsWRKY formam uma família de fatores de transcrição de arroz que regulam uma ampla gama de processos celulares, a maioria relacionada à resposta ao estresse abiótico e biótico (Jimmy e Babu, 2015). De acordo com seu importante papel na defesa, muitos genes de OsWRKY são controlados pelos hormônios vegetais de defesa ácido jasmônico e SA (Ryu et al., 2006; Jimmy e Babu, 2015).

[0201]OsWRKY45 é um regulador mestre das respostas de defesa induzidas por SA. As linhagens knockdown neste gene são úteis para testar se o aprimoramento da defesa do MDCA/PA depende da sinalização do SA, pois acredita-se que o OsWRKY45 (diferente da maioria dos outros genes de defesa) seja acionado apenas pelo SA (Ryu et al. 2006; incorporado por referência).

[0202]Se a linhagem knockdown do OsWRKY45 não mostrar defesa aprimorada após o tratamento com MDCA/PA, isto forneceria fortes evidências de que SA foi o agente causador do aprimoramento de defesa mediado por MDCA/PA. O inverso forneceria fortes evidências de que o SA não é o principal agente causal do aprimoramento da defesa relacionado ao MDCA/PA.

[0203]Os parâmetros fenotípicos do sistema radicular são mostrados na Tabela 13 e na Figura 18. As galhas foram contadas e classificadas pelo tamanho e se estavam vazias ou não. A presença ou ausência de necrose no sistema radicular também foi registrada.

[0204]Como no experimento anterior, o tratamento com MDCA/PA reduz bastante a contagem de galhas, tanto em termos absolutos quanto por raiz.

Notavelmente, o tratamento com MDCA/PA aumentou o número de raízes no tipo selvagem e na linhagem knockdown do OsWRKY45 em comparação com as plantas de WT não tratadas e RNAs de OsWRKY45 não tratadas. Mais uma vez, as plantas tratadas com MDCA/PA mostraram galhas vazias, algo que não é visto em plantas de controle infectadas e não tratadas.

[0205]A linhagem knockdown do OsWRKY45 hospedava mais galhas do que o tipo selvagem, independentemente do tratamento. No entanto, a redução proporcional na contagem de galhas é semelhante no tipo selvagem e no OsWRKY45, sugerindo que o MDCA/PA funcione igualmente bem em ambos os contextos genéticos. Isto contradiz a hipótese de que a sinalização de SA é o principal fator no aprimoramento da defesa mediada por MDCA/PA.

[0206]A queda do fator de transcrição WRKY45 (e, portanto, a inibição da resposta do ácido salicílico) aumenta ligeiramente o número de galhas de Meloidogyne graminicola, embora não significativamente (+12 %, p = 0,5415), em comparação com o controle. No entanto, os inibidores da C4H, ácido piperonílico (PA) e ácido 3,4-metilenodioxicinâmico (MDCA), reduzem significativamente o número de galhas por sistema radicular nas plantas do tipo selvagem e WRKY45-RNAi (WT + PA vs WT + CON: -42 %, p <0,0001; WT + MDCA vs WT + CON: -42 %, p <0,0001; WRKY45 + PA vs WRKY45 + CON: -41 %, p = 0,0006; WRKY45 + MDCA vs WRKY45 + MDCA: - 23 %, p = 0,0420). Isto sugere fortemente que o acúmulo de ácido salicílico não explica a resistência induzida pelo inibidor de C4H.

Tabela 13: Valores medianos e faixas interquartis (entre parênteses) para várias características fenotípicas em plantas knockdown do tipo selvagem e WRKY45- RNAi infectadas com Meloidogyne graminicola e tratadas com uma solução de controle ou com uma pulverização de MDCA/PA. Diferenças significativas (p ≤ 0,05) são indicadas usando uma exibição de letras Tukey. Tipo selvagem WRKY45 Controle MDCA PA (n = Controle MDCA PA (n = (n = 10) (n = 8) 9) (n = 10) (n = 10) 10) Comprimento 45,3 (3,9) 43,0 42,5 44,5 (2,4) 44,3 45,8 do broto (cm) a (3,0) (7,8) a (5,8) (4,5) a a a a Comprimento 14,8 (1,6) 12,3 12,5 14,5 (3,4) 15,0 16,5 de raiz (cm) a (2,0) (6,5) a (1,8) (1,9) a a a a Número de 13,5 (1,8) 17,0 18,0 13,0 (1,0) 16,5 18,0 raízes bc (2,5) (5,0) bc (1,8) (1,8) c c ab ab Número de 60,5 (7,8) 36,5 33,0 72,0 (14,5) 52,0 39,0 galhas a (10,3) (10,0) a (10,8) (20,3)

c bc ab bc Galhas por 4,2 (0,9) 2,3 (0,6) 1,8 5,1 (1,4) 3,3 (0,7) 2,2 AR a b (0,5) a b (0,8) b b Fração de 0,0 (0,0) 0,02 0,03 0,0 (0,0) 0,09 0,02 galhas vazias b (0,04) (0,03) b (0,01) (0,03) ab a a ab Fração de 0,93 (0,02) 0,86 0,93 0,91 (0,04) 0,94 0,91 galhas a (0,07) (0,06) a (0,03) a (0,05) pequenas a a a Probabilidade 0,30 ± 0,63 ± 0,78 0,60 ± 0,50 ± 0,60 ± de necrose 0,48 0,52 ±0,44 0,52 0,53 0,52 a b b b b b Exemplo 17: A atividade dos inibidores de C4H contra os nematoides dos nós da raiz é independente do ácido salicílico no tomate (Solanum lycopersicum cv.

Moneymaker)

[0207]Foi relatado anteriormente que o ácido piperonílico (PA) do inibidor de C4H induz o acúmulo do ácido salicílico do hormônio de defesa em culturas de células de tabaco (Nicotinium tabacum BY2) (Schoch et al., 2002).

[0208]Para avaliar ainda mais, uma linhagem de tomate deficiente em biossíntese e sinalização de ácido salicílico, respectivamente, foi tratada com PA. A linhagem de tomate expressa a construção transgênica de NahG, que converte ácido salicílico em catecol inativo (Brading et al., 2000). Se esta linhagem ainda responder ao PA, reforça ainda mais a noção de que o acúmulo de ácido salicílico não é a causa da resistência ao nematoide induzida pelo inibidor de C4H, para a qual já foram fornecidas evidências no arroz no Exemplo 16.

[0209]Os resultados desta experiência são mostrados na Figura 19. As plantas de tomate que expressam NahG são significativamente mais suscetíveis a Meloidogyne incognita do que o tipo selvagem, conforme medido pelo número de galhas (+23 %, p = 0,0357). No entanto, elas ainda respondem ao tratamento com PA: as plantas NahG tratadas com PA mostram significativamente menos galhas do que as plantas selvagens não tratadas (-36 %, p = 0,0012) e não diferem significativamente das plantas selvagens tratadas com PA em número de galhas (+9 %, p = 0,9499).

Estes dados demonstram que a atividade indutora de defesa do PA não depende do acúmulo de ácido salicílico.

[0210]No exemplo 16, mostramos que os inibidores de C4H do ácido piperonílico (PA) e do ácido 3,4-metilenodioxicinâmico (MDCA) reduzem significativamente o número de galhas por sistema radicular nas plantas do tipo selvagem e WRKY45-RNAi (WT + PA vs WT + CON: -42 %, p <0,0001; WT + MDCA vs WT + CON: -42 %, p <0,0001; WRKY45 + PA vs WRKY45 + CON: -41 %, p = 0,0006; WRKY45 + MDCA vs WRKY45 + MDCA: - 23 %, p = 0,0420). Os dados dos Exemplos 16 e 17 demonstram claramente que o acúmulo de ácido salicílico não explica a resistência induzida pelo inibidor de C4H.

Exemplo 18: A atividade dos inibidores de C4H contra nematoides dos nós da raiz é independente do ácido jasmônico no tomate (Solanum lycopersicum cv.

Moneymaker)

[0211]Embora não exista uma ligação óbvia entre a inibição de C4H e o acúmulo do hormônio da defesa ácido jasmônico, anteriormente havia sido observado que outros indutores de defesa causaram este acúmulo e que o próprio jasmonato pode induzir uma medida de resistência contra os nematoides dos nós da raiz quando aplicados às plantas (Cooper, Jia e Goggin, 2005; Nahar et al., 2011; Martínez-Medina et al., 2017).

[0212]Para determinar se os inibidores de C4H dependem desta via hormonal, foi testado se as plantas de tomate tratadas com o inibidor químico de dietilditiocarbamato de biossíntese de ácido jasmônico (DIECA) (Farmer et al., 1994) ainda respondiam ao tratamento com PA.

[0213]Os resultados deste experimento são mostrados na Figura 20. As plantas de tomate tratadas com DIECA são significativamente mais suscetíveis a Meloidogyne incognita do que o tipo selvagem, conforme medido pelo número de galhas (+26 %, p = 0,0357). No entanto, elas ainda respondem fortemente ao tratamento com AP: as plantas de tomate tratadas com PA e DIECA mostram significativamente menos galhas do que as plantas selvagens não tratadas (-31 %, p = 0,0014) e não diferem significativamente das plantas selvagens tratadas com PA (+14 %, p = 0,5760). Estes dados indicam que a atividade indutora de defesa do PA não depende do acúmulo de ácido jasmônico.

Exemplo 19: Análise de qPCR de genes relacionados ao SA após tratamento com MDCA/PA

[0214]O tratamento com MDCA/PA aprimora a defesa do arroz contra nematoides e induz vários sintomas remanescentes da sinalização de SA aprimorada (resposta hipersensível, retardo leve no crescimento e pressão reduzida da doença).

No entanto, os Exemplos 16 e 17 provaram que o acúmulo de SA não pode ser a única ou mesma causa principal do aprimoramento de defesa induzido pelo inibidor de C4H. Para explorar ainda mais isto, foi realizado um experimento de qRT-PCR para testar o efeito de MDCA/PA na expressão de seis genes envolvidos na homeostase da SA: quatro genes envolvidos na biossíntese de fenilpropanoide de SA (OsPAL2/4/6 e OsC4H), um gene envolvido na biossíntese baseada em isochorismato de SA (OsICS1) e um gene responsivo a SA (OsWRKY45).

[0215]Os três genes de OsPAL foram escolhidos ad hoc, pois estes três são os únicos para os quais estão disponíveis iniciadores seletivos de qPCR (Tonnessen et al., 2014). A expressão destes genes foi avaliada em amostras de raízes.

[0216]Foi observado um aumento significativo de OsPAL4 em plantas tratadas com inibidores de C4H; isto se correlaciona com as observações da literatura de que a indução de OsPAL4 está associada à defesa no arroz (Tonnessen et al., 2014). Uma regulação positiva ainda mais forte foi observada para o gene OsC4H. Isto aponta para uma forte regulação positiva compensatória do gene C4H em resposta à inibição de C4H, que pode estar na raiz do aprimoramento de defesa mediado por inibidor de C4H e explica por que os inibidores de C4H não causam efeitos fenotípicos significativos em plantas saudáveis. Juntamente com a regulação positiva observada de OsPAL4, estes resultados de qPCR sugerem que os inibidores da C4H desencadeiam a via do fenilpropanoide, um importante participante na imunidade basal das plantas.

[0217]Para os outros genes, incluindo o fator de transcrição de OsWRKY45 sensível ao SA, não foi observada regulação positiva significativa. Isto fornece mais evidências de que o acúmulo de SA não é a principal causa de respostas imunes induzidas por PA/MDCA em raízes de arroz.

[0218]Um resumo dos resultados pode ser encontrado na Tabela 14 e na Figura 21.

Tabela 14: Alterações na expressão de seis genes de arroz envolvidos na biossíntese e sinalização de SA e na defesa basal após tratamento com ácido piperonílico (PA) ou ácido 3,4-metilenodioxicinâmico (MDCA). Os valores de mudança de dobra em log foram obtidos pelo método de Pffafl; Os valores de p foram calculados usando testes de permutação. Gene Tratamento Mudança de 95 % de Valor de p dobra vs. intervalo de vs. controle controle confiança OsPAL2 MDCA 1,86 1,22 a 3,44 0,068 PA 1,29 0,47 a 3,17 0,501 OsPAL4 MDCA 2,38 1,44 a 3,94 0,005 PA 3,04 1,33 a 7,06 0,045 OsPAL6 MDCA 1,40 0,54 a 2,75 0,375 PA 1,26 0,48 a 2,22 0,775 OsC4H MDCA 3,73 5,68 a 8,93 0,030

PA 9,87 5,45 a 17,27 0,025 OsICS1 MDCA 1,73 0,78 a 4,23 0,175 PA 1,36 0,47 a 2,91 0,680 OsWRKY45 MDCA 1,67 0,60 a 4,42 0,378 PA 1,30 0,35 a 4,80 0,693 Exemplo 20: Análise de qPCR de genes de defesa adicionais após tratamento com inibidor de C4H

[0219]Como o exemplo anterior demonstra, a análise da expressão gênica não encontrou evidências de acúmulo significativo de ácido salicílico em plantas inteiras tratadas com inibidor de C4H. Para testar se outros hormônios da defesa podem estar envolvidos, genes responsivos ao ácido jasmônico (gene de biossíntese OsAOS2) e auxina (a enzima conjugadora de auxina OsGH3.1) foram investigados.

Além disso, a enzima degradadora de calose OsGNS5, cuja regulação negativa está associada à defesa basal, também foi investigada. A análise de qRT-PCR foi realizada nas mesmas amostras utilizadas no exemplo anterior.

[0220]Os genes de resposta à auxina e ao ácido jasmônico não apresentaram expressão diferencial significativa. Por outro lado, o gene OsGNS5 foi significativamente desregulado - um resultado que foi previamente correlacionado com o aumento da deposição de calose e, portanto, maior imunidade basal (Ji et al., 2015). Os resultados estão resumidos na Figura 21 e na Tabela 15.

Tabela 15: Alterações na expressão de outros três genes de arroz após o tratamento com ácido piperonílico (PA): o gene de biossíntese do ácido jasmônico OsAOS2, o gene responsivo à auxina OsGH3.1 e o gene de degradação da calose OsGNS5. Os valores de mudança de dobra em log foram obtidos pelo método de Pffafl; Os valores de p foram calculados usando testes de permutação. Gene Tratamento Mudança de 95 % de Valor de p dobra vs. intervalo de vs. controle controle confiança OsAOS2 PA 0,71 0,44 a 1,17 0,251

OsGH3.1 PA 1,21 0,67 a 1,90 0,363 OsGNS5 PA 0,41 0,24 a 0,81 0,032 Exemplo 21: Inibidores de C4H reduzem a pressão da doença de Pseudomonas syringae DC3000 no tomate (Solanum lycopersicum cv. Moneymaker)

[0221]Neste experimento, foi demonstrada a capacidade de uma pulverização foliar contendo ácido piperonílico (PA) para controlar o patógeno bacteriano foliar Pseudomonas syringae (pv. DC3000) no tomate.

[0222]Devido à variabilidade inerente às experiências de inoculação bacteriana (causada pela dependência das bactérias nos estômatos abertos ou nas feridas para entrar), três repetições desta experiência são mostradas aqui. A primeira resultou em uma pressão de infecção relativamente modesta, enquanto a segunda resultou em um nível extremamente alto de pressão da doença que causou a morte de muitas folhas de tomate após apenas três dias.

[0223]Devido à diferença na progressão da doença, foram utilizados dois sistemas de escore diferentes. No primeiro experimento, o número de lesões por planta foi contado três dias após a inoculação e a porcentagem de área foliar coberta por lesões foi quantificada usando o software ImageJ após sete dias. No segundo experimento, cada folha totalmente desenvolvida foi pontuada em uma escala de doença entre 0 e 4 da seguinte maneira: 0 = sem sintomas visíveis; 1 = lesões isoladas; 2 = lesões grandes, cobrindo <50 % da área foliar; 3 = lesões que cobrem mais da metade da área foliar; 4 = folha irreversivelmente enrugada ou abscisada.

Cada planta recebeu então um escore total no índice de doença, que é a mediana dos escores individuais de doença de cada folha.

[0224]Os resultados da primeira experiência são mostrados nas Figuras 22a e 22b. O tratamento com PA reduziu o número total de lesões por planta (-25 %, p = 0,0011) e a porcentagem média de área foliar coberta por lesões. No segundo experimento, resumido na Figura 23, o tratamento com PA reduziu o índice médio de doenças das plantas em 20 % (p = 0,0317).

[0225]Antes da inoculação, o efeito do ácido piperonílico na própria Pseudomonas syringae DC3000 também foi verificado através do crescimento de bactérias em cultura líquida alterada com ácido piperonílico ou um controle correspondente e a medição do OD600 (conforme descrito na seção de materiais e métodos). A uma concentração de 100 µM, o ácido piperonílico não teve efeito no crescimento bacteriano após 24 horas de exposição contínua (OD600 0,737 vs. 0,757, p = 0,457).

[0226]Em todas as experiências, o tratamento com ácido piperonílico (PA) reduziu a pressão da doença de uma maneira estatisticamente significativa, embora o tamanho do efeito tenha sido menor do que o observado com nematoides ou fungos.

O efeito do PA na infecção por P. syringae não pode ser explicado pela toxicidade direta do PA para a bactéria, pois mesmo a exposição prolongada ao PA não resultou em retardo de crescimento. Tomadas em conjunto, estas experiências demonstram que os inibidores de C4H fornecem um efeito protetor contra doenças bacterianas nas culturas.

Exemplo 22: Inibidores da C4H reduzem a pressão da doença por Pythium splendens no feijão verde (Phaseolus vulgaris cv. Prelude)

[0227]Neste experimento, foi demonstrada a capacidade de um revestimento de sementes contendo ácido piperonílico (PA) para controlar o patógeno oomiceto Pythium splendens no feijão.

[0228]Um revestimento de sementes com PA não melhorou a emergência no solo contendo P. splendens (veja a Figura 25a), mas a saúde das mudas após a emergência foi significativamente melhorada (veja a Figura 25b). Os brotos foram mais vigorosos, e a raiz primária das sementes revestidas com PA no solo infestado por P. splendens foi mais longa do que as sementes revestidas com controle no solo infestado por P. splendens (p = 0,043, veja a Figura 25c). Os sintomas de Pythium não diferiram visivelmente, no entanto, entre os tratamentos. Nas sementes controle e revestidas com PA, grande parte do sistema radicular ficou marrom pálido, mas a extensão deste escurecimento não foi obviamente diferente.

[0229]A ausência de um efeito na germinação é uma consequência lógica do mecanismo de ação dos inibidores de C4H. Eles operam estimulando a resposta imune da planta, que está ausente em plantas extremamente jovens. No entanto, em plantas que sobrevivem por tempo suficiente para se desenvolver além da emergência, o efeito da imunidade aumentada se torna evidente na forma de maior vigor das mudas.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para controlar e/ou tratar infecções por nematoides, oomiceto, bacterianas e/ou fúngicas em plantas, o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende aplicar uma quantidade eficaz de um composto a uma planta ou parte da mesma, ou ao solo, substrato ou água ao redor da planta, em que o dito composto é selecionado do grupo que consiste em ácido piperonílico (PA), ácido 3,4- metilenodioxicinâmico (MDCA), ácido pipérico, piperina, ácido 3,4-metilenodióxi)fenil acético, ácido 4-iodobenzoico (4-IBA), ácido 4-trifluorometilbenzoico, ácido 4- propiniloxibenzoico (4-PB), ácido 4-propiniloximetilbenzoico, ácido 3- propiniloxibenzoico (3-PB), ácido 3-(4-piridil)acrílico (3PA) e ácido 2-hidróxi-1- naftoico, ou um estereoisômero, tautômero, hidrato, sal, éster e/ou solvato do mesmo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que os nematoides é um nematoide de nós das raízes, um nematoide de lesão da raiz ou um nematoide de cisto.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que os nematoides pertencem ao gênero selecionado do grupo que consiste em: Meloidogyne, Heterodera, Globodera, Pratylenchus, Aphelenchoides, Xiphinema, Radopholus, Bursaphelenchus, Rotylenchulus, Nacobbus, Longidorus, Ditylenchus e Trichodorus.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o fungo é um fungo fitopatogênico.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o fungo pertence ao gênero selecionado do grupo que consiste em: Magnaporthe, Botrytis, Puccinia, Fusarium, Blumeria, Mycosphaerella, Colletotrichum, Ustilago, Melampsora, Phakopsora, Alternaria, Sclerotinia, Cladosporium e Rhizoctonia.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as bactérias são bactérias fitopatogênicas, em particular, um gênero selecionado do grupo que consiste em: Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya, Pectobacterium, Clavibacter, Burkholderia, Bacillus, Corynebacterium, Streptomyces e Candidatus Liberibacter.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o oomiceto é um fitopatógeno, em particular, pertencente aos gêneros Pythium ou Phytophtora.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é usado em uma concentração entre 0,1 µM e 1000 µM.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é isolado.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é formulado como parte de uma composição que compreende ainda um diluente, um aditivo, um (micro) nutriente de planta, um estabilizador de emulsão, um tensoativo, um tampão, um óleo vegetal, um inibidor de deriva e/ou um substrato (inerte).

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto ou composição é aplicado às folhas da planta, como um revestimento para as sementes da planta, ou como um banho de solo ou raiz.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto ou composição é aplicado por pulverização de alta ou baixa pressão, imersão, atomização, formação de espuma, embaçamento, revestimento ou incrustação.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto ou composição é aplicado duas ou mais vezes.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição compreende ainda um herbicida, inseticida, nematicida, moluscicida, bactericida, acaricida, fungicida e/ou regulador ou fertilizante de crescimento da planta.

15. Semente de planta, CARACTERIZADA pelo fato de que é revestida com um composto ou composição como definido nas reivindicações 1 ou 10.

16. Pulverização foliar, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um composto ou composição como definido nas reivindicações 1 ou 10.

17. Método para a fabricação de uma composição agroquímica, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende formular um composto como fornecido na reivindicação 1 junto com pelo menos um agente auxiliar agroquímico.