BR112020012237A2

BR112020012237A2 - Método para medir as concentrações médias de cortisol e glicose em cera de ouvido

Info

Publication number: BR112020012237A2
Application number: BR112020012237-8A
Authority: BR
Inventors: Andres Herane-Vives; Jan Benöhr-Riveros
Original assignee: Andres Herane-Vives; Jan BENÖHR-RIVEROS
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2020-12-29
Also published as: WO2019123392A1; ES2929728T3; EP3729076A1; US20200333363A1; MX2020007469A; CN113748341A; AU2018389856A1; US11959928B2; CA3086330A1; EP3729076B1

Abstract

um método para medir os níveis de glicose e cortisol em cera de ouvido, em que os níveis medidos de cortisol e glicose são interpretados como os níveis médios de cortisol e glicose. e um dispositivo médico que fornece uma auto extração eficaz, segura e higiênica da cera de ouvido.

Description

MÉTODO PARA MEDIR AS CONCENTRAÇÕES MÉDIAS DE CORTISOL E GLICOSE EM CERA DE OUVIDO FUNDO DA INVENÇÃO A. CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção está relacionada a métodos para medir as concentrações de cortisol e glicose e, mais particularmente, a um método para medir os níveis médios de cortisol e glicose em cera de ouvido. B. DESCRIPÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA 1º Problema A falta de um método confiável e inócuo para medir a concentração média dos níveis de glicose.

[002] As doenças crônicas representam a maior dentre as mortes (71%) em todo o mundo, e o diabetes é a quarto entre elas (OMS, 2018). Além disso, de acordo com o mesmo relatório da OMS, 650 milhões de adultos sofrem de outra doença crônica, como a obesidade. Ainda mais escandaloso é o número que indica que 39% dos adultos com 18 anos ou mais estão acima do peso. Infelizmente, essa doença crônica generalizada adicional também mostra uma tendência ascendente. De fato, a prevalência mundial de obesidade quase triplicou entre 1975 e 2016 (NCD-RisC et al., 2017).

[003] Essas duas doenças epidêmicas estão intimamente relacionadas. Quase 90% dos pacientes com o tipo mais comum de diabetes ou diabetes tipo II estão relacionados ao excesso de peso corporal (Wu et al., 2014). Além disso, eles geralmente compartilham a mesma alteração metabólica: aumento dos níveis de glicose. Essa descoberta é necessária para o diagnóstico da diabetes. Além disso, indivíduos com níveis glicêmicos aumentados, mas não na faixa diabética, também apresentam até 4,5 chances de serem obesos (Meigs et al., 1998).

[004] As medidas atuais de amostras de glicose de "curto prazo", como o soro, têm limitações significativas na avaliação da concentração média do nível de glicose. Isso ocorre porque os níveis de glicose variam muito durante o dia. Além disso, perturbações do dia-a-dia durante períodos de estresse (Dagogo-Jack, 2010), tabagismo

(Frati et al., 1996), pressão alta (Modan et al., 1985), IMC (Hiller et al., 1988 ) e atividade física (Allen et al., 2009) podem afetar seus níveis.

[005] Várias medições de glicose, como durante o jejum e as concentrações pós-prandiais de glicose, foram padronizadas com o objetivo de fornecer um nível glicêmico mais preciso. No entanto, fazer esses testes de laboratório pode ser bastante cansativo para os pacientes. Além disso, eles não refletem com precisão os níveis glicêmicos médios, que é o nível necessário para monitorar o perfil glicêmico de longo prazo em pacientes diabéticos. De fato, eles geralmente são encontrados abaixo da média, como os observados na glicemia de jejum (FSG) ou abaixo desse valor na glicemia pós-prandial (PSG) (Peter et al., 2006).

[006] Hemoglobina glicada (HbA1c ); uma forma de hemoglobina que mostra correlações positivas com ambos os índices glicêmicos: os níveis de jejum e pós-prandial são comumente usados como um índice da média a longo prazo dos níveis de glicose (Monnier et al., 2006; Bonora et al., 2001; Rohlfing et al., 2002), é por isso que é considerado o método padrão-ouro atual para refletir a concentração média de glicose. No entanto, em comparação com pacientes diabéticos, pessoas saudáveis mostram associações mais fracas entre pós-prandial e HbA1c e entre os níveis glicêmicos em jejum e HbA1c (van t Riet et al., 2010). De fato, um grande estudo mostrou correlações de 0,46 entre FSG e HbA1c e 0,33 entre PSG e HbA1c na população geral em comparação com a população diabética que exibiu 0,71 e 0,79 para as mesmas associações (van't Riet et al., 2010). Esses resultados prejudicam a capacidade da HbA1c de atuar como teste de triagem (Dagogo-Jack, 2010). Por outro lado, os níveis de glicose em jejum mostram uma associação mais forte com a HbA1c do que os níveis pós-prandiais de glicose com a mesma proteína entre pessoas saudáveis e em pacientes diabéticos com controle glicêmico deficiente (Monnier et al., 2006). Isso significa que a HbA1c pode ser encontrada dentro de uma faixa normal em pacientes diabéticos que frequentemente sofrem transgressões alimentares. Isso certamente diminui a capacidade da HbA 1c de monitorar rigorosamente os níveis médios de glicose entre esses pacientes. Portanto, um método mais preciso para refletir a concentração média dos níveis de glicose pode ser igualmente ponderado nos níveis glicêmicos pós-prandial e em jejum. HbA1c é uma proteína que é medida para identificar a concentração média de glicose no plasma em três meses, mas é mais fortemente ponderada (75%) para a concentração de glicose no plasma do último mês (Leow, 2016; Mortensen & V∅Lund, 1988; Tahara e Shima, 1993). No entanto, a HbA1c não fornece informações precisas por períodos mais curtos, como as seguintes mudanças anteriores no controle glicêmico, que é um período que geralmente requer um controle metabólico rígido (Goldstein et al., 2004; JH Kim et al., 2012; Koenig et al., 1976).

[007] Também possui algumas limitações adicionais. Por um lado, não é um método preciso, considerando que algumas variáveis usuais, como o envelhecimento, variam a concentração de HbA1c (Dagogo-Jack, 2010). Por outro lado, alguns distúrbios comuns, como anemia (Sundaram et al., 2007) e várias hemoglobinopatias (até 7%) (Weatherall, 2011) podem afetar seus níveis. Mesmo longas horas de trabalho previam um nível mais alto de HbA1c (Azami et al., 2018). Além disso, é um teste de laboratório caro e geralmente indisponível (Sacks, 2011). Em última análise, é uma aproximação indireta ao nível médio de glicose, uma vez que é uma proteína, e não o açúcar em questão, que é diretamente medida. Alguns autores, por todos os motivos citados, até duvidam de sua validade como teste diagnóstico para diabetes mellitus e pré-diabetes (Dagogo-Jack, 2010).

[008] Mais recentemente, a albumina glicada tem sido utilizada como índice por períodos intermediários, durante 2-4 semanas. No entanto, apesar das várias variáveis sociodemográficas, como idade ou IMC (Miyashita et al., 2007) ou distúrbios que afetam o metabolismo da albumina, como disfunção na tireóide, síndrome nefrótica ou cirrose hepática (KJ Kim & Lee, 2012) tornam a albumina glicada uma medida bastante irregular na prática clínica (Huh et al., 2014). Além disso, até o momento, não foi validado como método de diagnóstico.

[009] Também é importante destacar que todas as amostras anteriores, que medem os níveis glicêmico, HbA1c ou albumina glicada, são tomadas a partir do sangue, o que significa que são caras, pois trabalhadores qualificados, como enfermeiros, são necessários para colher essas amostras. Além disso, eles podem estar associados a alguns efeitos colaterais, como sangramentos e infecções, que são ainda mais frequentes e complicados em pacientes com alterações metabólicas, como diabetes. No entanto, e independentemente de todas as desvantagens mencionadas anteriormente, o açúcar no sangue ainda está sendo o exame laboratorial mais solicitado no Centro de Atenção Primária à Saúde em vários países (Salinas et al., 2014, Zunic, 2012), também representando o terceiro maior custo laboratorial para sistemas de saúde (Zunic, 2012). A HbA1c também está entre os exames laboratoriais mais exigidos e acredita-se que ainda não seja requisitada (Salinas et al., 2012). Portanto, há uma necessidade inquestionável de desenvolver não apenas uma amostra mais benéfica quanto à capacidade de obter uma média direta da concentração de glicose em diferentes períodos, mas também um método mais econômico e inócuo. 2º Problema A falta de um método confiável e prático para medir a concentração média dos níveis de cortisol

[0010] A depressão é outro distúrbio crônico e epidêmico. Seu diagnóstico é considerado menos que totalmente confiável (Lieblich et al., 2015). Isso pode ser explicado pela grande heterogeneidade dessa síndrome. Por isso, foram investidos grandes esforços no desenvolvimento de um biomarcador preciso que pode melhorar a consistência de seu diagnóstico. A medição dos níveis de cortisol tem sido seu biomarcador mais popular, pois é a alteração neurobiológica mais frequentemente encontrada nessa síndrome (Pariante, 2009). No entanto, devido ao perfil reativo da secreção de cortisol, os resultados desse hormônio têm sido muito divergentes. De fato, ele não apenas possui seu próprio ritmo circadiano forte (Bhagwagar, 2003; Bhagwagar et al., 2005), mas também várias variáveis comuns, como ingestão de alimentos (Gibson & Checkley, 1999), nicotina (Steptoe & Ussher, 2006 ), exercício físico (Hill et al., 2008) e níveis de estresse (Kirschbaum et al., 1993; Sharpley, 2012) podem afetar seus níveis. Isso significa que quase todas as amostras atuais, como o plasma, não são as mais adequadas para refletir a concentração média de cortisol, que é o nível necessário para descrever a alteração de estado relacionada aos diferentes tipos de MDEs.

[0011] Há pouco tempo, as amostras de cabelo começaram a ser usadas para medir os níveis de cortisol (Dettenborn et al., 2012). Foi demonstrado que este espécime fornece um índice da concentração média de cortisol, porque acumula o hormônio sem ser afetado pelas variáveis anteriores de confusão do cortisol a curto prazo (Short et al., 2016a). No entanto, também possui várias limitações. A maioria de seus estudos de validação foi realizada comparando a concentração de cortisol capilar (HCC) com a única ou a agregação de várias amostras diárias de cortisol, sem considerar os níveis noturnos de cortisol. Isso pode explicar por que, até agora, a maioria dos coeficientes de correlação entre o cabelo e a amostra única ou a agregação de várias amostras de saliva tem sido bastante modesta (D'Anna-Hernandez et al., 2011; Sauve et al., 2007; van Holland et al. ., 2012; Xie et al., 2011). De fato, poucos estudos de validação capilar foram conduzidos adequadamente. Esse estudo ideal pode correlacionar o HCC com níveis contínuos de cortisol ou com níveis de cortisol que foram coletados durante o dia e a noite. De fato, os estudos que associaram o HCC à coleta de urina por 24 horas mostraram resultados diferentes. Enquanto Sauve et al., (2007) encontraram apenas uma correlação moderada entre HCC e coleta de cortisol na urina de 24 horas, Short et al., (2016b) não encontraram associação significativa.

[0012] Por fim, também é possível que o cabelo não seja tão bom quanto se pensa para refletir o nível médio de concentração de cortisol. Por exemplo, não está completamente claro se as glândulas sudoríparas, que de fato são afetadas por influências agudas, também contribuem com uma certa quantidade de cortisol que é acumulada no interior do cabelo (Sharpley, 2012). O que fica claro, no entanto, é que as glândulas sebáceas que, sem dúvida, liberam cortisol dentro da haste capilar são tocadas e, portanto, influenciadas por redes finas de fibras nervosas (Okumura, 1967). Além disso, influências agudas também podem afetar o ciclo capilar. De fato, existem evidências acumuladas que indicam que neuro-hormônios e neurotransmissores liberados durante a resposta ao estresse também podem influenciar significativamente o ciclo capilar (Paus et al., 2006, 1997; Botchkarev, 2003). Além disso, a parte do cortisol no folículo piloso e, portanto, no futuro segmento livre de cabelos também depende de variáveis metabólicas locais que refletem o crescimento do estado capilar (Terao & Katayama, 2016). Isso explica por que o protocolo capilar sugere cortar esse tecido queratinizado do vértice do couro cabeludo posterior. De fato, menor variabilidade do crescimento capilar foi observada nessa área (Pragst & Balikova, 2006). Isso pode significar que, embora as variáveis agudas de confusão de cortisol possam não afetar o HCC, esses fatores locais podem afetar. Pode ser possível argumentar que, em vez de refletir com precisão os níveis sistêmicos de cortisol a longo prazo, a amostra de cabelo pode fornecer melhor um índice dos níveis locais de cortisol a longo prazo.

[0013] A amostra capilar também encontra várias questões práticas que impedem seu uso clínico generalizado. Na área com menor variabilidade de crescimento capilar, o vértice posterior do couro cabeludo é, ao mesmo tempo, a região mais afetada quando as pessoas começam a perder cabelo. De fato, esse tipo de calvície (tipo IV) afeta até 40% dos homens e 10% das mulheres acima de 40 anos (Hamilton, 1951). Além disso, esse número não inclui a grande porcentagem de pessoas que não podem fornecer a amostra apenas porque não possuem o mínimo exigido de cabelos compridos (pelo menos um cm que representa as quatro semanas retrospectivas de secreção de cortisol). De fato, um estudo recente mostrou que até 30% de sua amostra não podia, ou não estava disposto a fornecer essa amostra por vários motivos, inclusive estéticos (Fischer et al., 2016). É importante ressaltar que cortar com precisão ± 1 mm de cabelo parece uma tarefa impossível de ser realizada. No entanto, ser capaz de discriminar o nível médio de cortisol entre semanas pode ser extremamente importante para os médicos. De fato, o efeito antidepressivo normalmente começa a mostrar seu efeito após 3, em vez de 4 semanas de tratamento (Tanum & Malt, 1996). Isso significa que o real efeito antidepressivo em termos de alterações a longo prazo do nível de cortisol pode não ser possível ser descrito com precisão usando amostras de cabelo. Por fim, ao contrário de tecidos não queratinizados, sua análise é muito lenta. De fato, enquanto a análise de uma amostra de saliva pode levar 4 horas e 20 minutos, a análise de uma amostra de cabelo leva mais de 30 horas, o que significa quase oito vezes mais. Portanto, é um processo altamente ineficiente. Isso pode explicar por que seu custo pode ser 44,3% maior do que analisar uma amostra de cortisol de curto prazo, como a saliva (Bristow, 2017). Todas as variáveis mencionadas dificultam definitivamente seu amplo uso clínico.

[0014] Algumas covariáveis também podem afetar os níveis de cortisol no cabelo. O sexo, por exemplo, pode variar HCC. Vários estudos mostraram que os homens possuem HCC aumentado em relação às mulheres (Garcia-Leon et al., 2018; Vanaelst et al., 2012). Embora o efeito de lavagem do cortisol, causado por fatores externos, como a radiação UV ou o uso de produtos de limpeza, tenha sido descartado abaixo do quarto cm mais próximo do cabelo da raiz (Dettenborn et al., 2010), não se sabe se um efeito de lavagem adicional ou, em outras palavras, um efeito quando a amostra acaba de sair do couro cabeludo reduz seus níveis de cortisol. Além disso, os estudos capilares não concordam com um tipo único de extração de cortisol, embora uma grande variabilidade também tenha sido relacionada a essa etapa da análise do cortisol capilar. De fato, até 3,5 vezes mais cortisol foi extraído quando a amostra foi pulverizada, em vez de cortá- la em pedaços pequenos (Davenport et al., 2006). Por fim, não está claro se alguns tratamentos cosméticos, como o cabelo tingido, também possuem um efeito sobre o HCC (Manenschijn et al., 2011; Sauve et al., 2007). 3º Problema: Falta de um dispositivo eficiente e seguro para a auto limpeza dos ouvidos externos.

[0015] Infelizmente, até o momento, nenhum dispositivo de autolimpeza seguro é tão eficaz quanto o método clínico tradicional para limpar o ouvido externo. Isso significa que, independentemente da utilidade potencial da amostra de cera de ouvido para medir a média a longo prazo dos níveis de glicose e cortisol, seu amplo uso clínico parece irreal. Seria muito caro fazer esta extração, pois, até agora, apenas médicos qualificados podem fazê-la com segurança.

[0016] Além disso, embora a limpeza dos ouvidos externos não seja uma indicação médica, milhões de pessoas praticam esse hábito perigoso diariamente. De fato, as hastes de algodão, que são o método mais comum de autolimpeza dos ouvidos externos (Khan et al., 2017) são, ao mesmo tempo, o principal fator de risco para várias doenças externas do ouvido externo, como cerume impactado e sangramento (Ahmed et al., 2014; Nussinovitch et al., 2004).

[0017] Portanto, considerando seus potenciais efeitos colaterais graves, sua eficácia pode não ser a única razão para entender sua popularidade. Outras hipóteses também foram propostas. Já foi dito que esses aparelhos podem ter um efeito viciante. De fato, a estimulação das fibras sensíveis que circundam o canal auditivo externo pode provocar vários estímulos viscerais agradáveis. No entanto, seu uso crônico pode desencadear um círculo vicioso, descrito como “ciclo de coceira e arranhão”, que tende a se perpetuar automaticamente ao longo do tempo. Assim, o aumento do uso deles não só pode causar aumento da coceira, mas também explica seu abuso consequente (Mochizuki et al., 2014; Pata et al., 2003). Portanto, alertar as pessoas sobre seus possíveis efeitos colaterais pode ser insuficiente para reduzir sua enorme demanda. Eles já são um sucesso comercial com grandes expectativas de continuar crescendo a taxas elevadas nos principais mercados globais. Apenas uma marca, por exemplo, registrou vendas de US $ 189,3 milhões em 2005 e US $ 204,8 em 2014. Além disso, um estudo de mercado recente revelou que suas vendas apresentaram taxas de crescimento de 20% nos EUA, 32% na China e 26 % na Europa entre 2011 e 2017, e prevê-se um crescimento nas taxas de 20%, 24% e 19%, respectivamente nos cinco anos seguintes (Hexa Reports, 2017). Portanto, é necessário desenvolver uma alternativa eficiente e segura a esses dispositivos arriscados populares.

[0018] Infelizmente, até agora, isso não foi possível. Atualmente, vários produtos de limpeza para os ouvidos são comercializados sem efeito ou com efeito mínimo. De fato, uma revisão sistemática abrangente mostrou que, embora algumas soluções cerumenolíticas, como as que contêm óleos minerais, possam ter alguma utilidade, não está claro qual delas pode fornecer essa ajuda. Além disso, até o momento, nenhum dispositivo (mecânico ou elétrico) é tão bom quanto a extração mecânica realizada pelo especialista, ou através do uso de uma seringa (a seringa de Reiner-Alexander), que pode efetivamente remover essa secreção (Clegg et al. , 2010). 1ª Solução A cera de ouvido reflete a média da concentração de glicose e cortisol.

[0019] Poucas outras amostras biológicas podem fornecer uma média dos níveis de glicose e cortisol. O tecido adiposo pode ser um deles, devido às características conhecidas de acúmulo de substâncias (Szymczak e Milewicz, 1998). No entanto, a realização de uma biópsia adiposa dos pacientes parece extremamente irreal, pois não é apenas um procedimento arriscado, mas também muito mais caro do que a coleta de amostras de sangue. No entanto, outra amostra mais acessível pode fornecer esses níveis. A cera do ouvido é uma secreção oleosa, também constituída principalmente por lipídios (Inaba et al, 1987). É secretado pelas glândulas apócrinas e sebáceas no canal auditivo (Montagna, 1955). Essa secreção pode fornecer uma média precisa dos níveis de glicose e cortisol, porque nenhuma influência local ou aguda, dada a última pelo efeito das fibras nervosas, afeta sua concentração. De fato, inversamente às glândulas sebáceas do folículo piloso, foi demonstrado que as glândulas apócrinas e sebáceas do ouvido não são inervadas (Bende, 1981).

[0020] As abelhas também produzem sua própria cera. O papel dos favos de mel também sugere que a cera do ouvido pode oferecer vantagens adicionais sobre as amostras de sangue. Por um lado, as abelhas são capazes de armazenar (acumular) seu açúcar (mel) nos favos de mel (Fratini et al., 2016) e, por outro lado, devido à sua propriedade bacteriostática, não é consumido por micro-organismo (Ghanem, 2011). De fato, essa propriedade também é compartilhada com a cera humana (Stoeckelhuber et al., 2006). Assim, isso sugere que a cera do ouvido pode não apenas ser capaz de acumular níveis de glicose e cortisol por longos períodos, mas também pode ser protegida da flora epidérmica. Isso implica que a cera de ouvido pode ser coletada em casa, por quê; inversamente das amostras de sangue, nenhuma condição especial de armazenamento ou transporte deve ser necessária.

[0021] Cortisol e glicose são duas substâncias altamente reativas. Medir seus níveis crônicos é uma necessidade crucial, pois eles são alterados nos distúrbios epidêmicos. No entanto, até agora, as amostras biológicas só podem medir seus níveis por períodos curtos, ou com amostras que, embora sejam capazes de acumulá-las por períodos mais longos; seu amplo uso clínico é inviável ou caro. A cera do ouvido pode ser uma amostra bastante viável, com capacidade de acumular essas substâncias por longos períodos. No entanto, não se sabe se essa secreção acumula essas substâncias reativas por longos períodos.

[0022] Portanto, foi desenvolvido um método de análise para detectar glicose e cortisol usando cera de ouvido.

[0023] Uma revisão sistemática avaliou o método da presente invenção e um estudo piloto avaliou a eficiência da análise de cera e se a glicose e o cortisol podem ser detectados em uma nova amostra. Finalmente, a eficácia de vários tipos de esponjas para remover a cera artificial de uma pele de porco também foi testada.

[0024] Resultados: Os níveis de cortisol não foram medidos anteriormente na cera. Cortisol e glicose são detectados nessa secreção oleosa. O tempo necessário para analisar o cortisol da cera do ouvido era muito menor que o tempo necessário para analisar a mesma substância usando o cabelo. Uma esponja de celulose com características abrasivas e absorventes específicas foi a mais eficiente para remover a cera de um pedaço de pele de porco.

[0025] Conclusão: A cera do ouvido pode constituir a amostra mais precisa e eficiente para medir os níveis de cortisol e glicose a longo prazo. Uma esponja de celulose pode ser um material eficaz, econômico e seguro para sua extração. 2ª Solução Projetando um dispositivo seguro e eficaz para autolimpeza de ouvidos

[0026] Tendo em conta os problemas acima mencionados, foi desenvolvido um dispositivo médico que fornece uma auto extração eficaz, segura e higiênica da cera.

[0027] Além disso, o dispositivo para auto extração de cera de ouvido da presente invenção é capaz de fornecer uma amostra adequada para o método de análise para detectar glicose e cortisol usando cera de ouvido.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[0028] Portanto, é um objetivo principal da presente invenção fornecer um método para medir os níveis de glicose e cortisol na cera do ouvido.

[0029] É outro objetivo principal da presente invenção fornecer um novo dispositivo médico que forneça uma auto extração eficaz, segura e higiênica da cera de ouvido.

[0030] Esses e outros objetos e vantagens do método para medir os níveis de glicose e cortisol na cera de ouvido e no dispositivo médico da presente invenção se tornarão evidentes para as pessoas que possuem um conhecimento comum na técnica, a partir da descrição detalhada a seguir das modalidades da invenção que será feita com referência aos desenhos anexos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0031] A Figura 1 é uma vista lateral esquerda de uma primeira modalidade do dispositivo médico da presente invenção mostrando a seção transversal da ponta incluindo a esponja.

[0032] A Figura 2 é uma vista em perspectiva da ponta do dispositivo médico da presente invenção sem a esponja.

[0033] A Figura 3 é uma vista superior da ponta do dispositivo médico da presente invenção sem a esponja.

[0034] A Figura 4 é uma vista lateral esquerda de uma segunda modalidade do dispositivo médico da presente invenção, mostrando a seção transversal da ponta incluindo a esponja.

[0035] A Figura 5 é um gráfico que mostra os resultados da associação entre Baseline-EGC e FSG.

[0036] A Figura 6 é um gráfico que mostra os resultados da associação entre Baseline-HbA1c e FSG.

[0037] A Figura 7 é um gráfico que mostra os resultados da associação entre EGC de acompanhamento e FSG.

[0038] A Figura 8 é um gráfico que mostra os resultados da associação entre HbA1c de acompanhamento e FSG.

[0039] A Figura 9 é um gráfico que mostra os resultados da associação entre EGC de linha de base e a média dos níveis glicêmicos.

[0040] A Figura 10 é um gráfico que mostra os resultados da associação entre HbA1c de linha de base e a média dos níveis glicêmicos.

[0041] A Figura 11 é um gráfico que mostra os resultados da associação entre o EGC de acompanhamento e a média dos níveis glicêmicos.

[0042] A Figura 12 é um gráfico que mostra os resultados da associação entre HbA1c de acompanhamento e a média dos níveis glicêmicos.

[0043] A Figura 13 é um gráfico que mostra os resultados da associação entre HCC e ECC.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0044] O método para medir os níveis de glicose e cortisol a longo prazo na cera de ouvido da presente invenção será descrito de acordo com uma modalidade preferida desta, em que em sua modalidade mais geral, o método da presente invenção compreende: extração de amostras de cera do ouvido por qualquer meio adequado. A quantidade mínima de cera necessária para medir os níveis médios de cortisol e glicose é de 0,8 mg; preparação de amostras de cera para a medição dos níveis de cortisol e glicose, de acordo com os meios ou métodos de medição; medir cortisol e glicose usando quaisquer meios ou métodos conhecidos, em que os níveis de cortisol e glicose são interpretados como os níveis médios de cortisol e glicose.

[0045] A extração das amostras de cera de ouvido pode ser realizada por meios tradicionais, por exemplo, usando uma seringa Reiner-Alexander ou usando qualquer dispositivo de extração adequado.

[0046] A preparação das amostras pode ser realizada de diferentes maneiras, dependendo do método de medição de cortisol e glicose a ser utilizado. As amostras podem compreender cera de ouvido pura e seca. Suas análises de glicose e cortisol podem ser realizadas de diferentes maneiras, como imuno-histoquímica ou ELISA.

[0047] Numa primeira concretização específica da presente invenção, a cera é obtida utilizando uma seringa Reiner-Alexander, a partir dos ouvidos externos.

[0048] Nessa primeira modalidade específica, a preparação das amostras e a medição dos níveis de cortisol e glicose são realizadas da seguinte forma: Preparação de amostras Extração de cortisol a) secagem das amostras de cerume por meio de um vapor de N2 à temperatura ambiente, até que toda a água seja evaporada a partir da amostra.

Esta etapa também pode ser feita usando liofilização; b) pesagem das amostras de cera seca que permitem normalizar a quantidade de cortisol em peso seco.

Normalizar significa que o peso medido é ajustado em uma balança comum para poder comparar os dados; c) homogeneização das amostras secas com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para obter uma solução de cera em PBS.

A quantidade de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pode ser de 10 volumes em peso de cerume, por exemplo, para 100 g de cerume, são utilizados 1000 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Além disso, qualquer solvente hidrofílico pode ser utilizado, como com soro fisiológico; d) divisão da solução obtida na etapa c) em uma primeira porção de solução e uma segunda porção de solução e adicionar cada porção de solução a um tubo respectivo; e) adição de 0,5 ml de éter dietílico à primeira porção da solução, a fim de obter uma solução de cera de ouvido em PBS misturada com 0,5 mg de éter dietílico; uma vez que a relação entre as duas substâncias é 1:1. Contudo, também podem ser utilizadas outras famílias de substâncias adequadas. f) agitação do tubo contendo a solução obtida na etapa e) durante um período de pelo menos um minuto para misturar a solução obtida na etapa f) e adição de 0,5 mg de éter dietílico após ressuspensão, sendo a relação com PBS 1:1; g) resfriamento da solução mista obtida na etapa g) a uma temperatura de -18 a -21 °C, preferencialmente -20 °C, durante um período de pelo menos duas horas, para garantir que a parte líquida esteja congelada e não contamina a fração orgânica.

Esta etapa permite extrair os compostos que são especificamente solubilizados em éter dietílico, como o cortisol.

Isso ocorre porque, enquanto a fração éter dietílico permanece líquida a -20 °C, a fração fosfato congela; h) extração, a partir da solução arrefecida, dos compostos que são especificamente solubilizados em éter dietílico;

i) secagem da fração restante da solução líquida usando o método de deslocamento com N2. No entanto, outros métodos também podem ser utilizados, como evaporação; j) armazenamento da fração seca obtida na etapa i) a -80 °C para uso posterior; k) adição de 300 pg de cortisol à segunda porção da solução, a fim de obter uma solução de cera de ouvido em PBS misturada com cortisol; l) adição de 0,5 ml de éter dietílico à solução obtida no passo k) para quantificar a quantidade de cortisol purificado como forma de avaliar a eficiência do método de extração; m) agitação do tubo contendo a solução obtida na etapa I) durante um período de tempo de pelo menos um minuto para misturar a solução obtida na etapa m) e adicionar 0,5 mg de éter dietílico após ressuspensão, sendo a relação com PBS 1:1; n) resfriamento da solução mista obtida na etapa m) a uma temperatura de -18 a - 21 °C, preferencialmente -20 °C, durante um período de pelo menos duas horas, a fim de garantir que a parte líquida esteja congelada, e não contamina a fração orgânica; o) extrair da solução arrefecida os compostos que são especificamente solubilizados em éter dietílico; p) secar a fração restante da solução líquida usando novamente o método de deslocamento com N2; q) armazenamento da fração seca obtida na etapa i) a -80 °C para uso posterior; r) em um terceiro tubo - sem a presença de solução homogeneizada - 0,5 ml de 300 pg / ml de solução de cortisol purificada foram dissolvidos em PBS a pH 7. Essa etapa foi realizada para obter a eficiência do protocolo de extração de cortisol da cera de ouvido. s) realizar o mesmo procedimento usado para a primeira porção da solução e para a segunda porção da solução para extrair cortisol desta. Quantificação de cortisol

[0049] Técnicas de ELISA são usadas, de acordo com as instruções do fabricante (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) para quantificar a quantidade de concentração de cortisol em amostras de cera de ouvido, em que a quantificação do cortisol é realizada da seguinte maneira: a) reconstituir as amostras extraídas usando um ensaio de tampão fornecido pelo fabricante, que permite a quantificação de cortisol, utilizando técnicas ELISA competitivas colorimétricas, adicionando o tampão às amostras extraídas para obter uma solução, deixando a solução descansar por 20 minutos. Contudo, outro intervalo de tempo também pode ser usado. Foram suficientes 20 minutos para reidratar a solução para uma ressuspensão mais fácil do tampão. Depois disso, a solução foi agitada durante um período de tempo de 1 minuto para homogeneizar a solução. Para os fins desta aplicação, o tampão é entendido como uma solução estável, pois mantém seu pH dentro de um intervalo, independentemente da adição de uma base ou ácido. b) usar uma curva padronizada para os níveis de cortisol - leitor de microplacas (NovoStar) - para medir a quantidade total de cortisol na amostra; c) normalizar a quantidade quantificada em gramas secas de cera de ouvido usando técnicas fluorométricas nas quais o fluorômetro é excitado dentro de um intervalo de 530-570 nm e lido dentro de um intervalo de emissão de 590-600 nm. Como várias variáveis, como idade, sexo, diferentes condições médicas e os níveis de estresse podem afetar os níveis de cortisol na cera do ouvido, é usado, o nível de colesterol, que não é afetado pelas variáveis acima mencionadas, evitando confundir os resultados de cortisol pelas covariáveis anteriores. Quantificação de glicose

[0050] Uma fração da solução de cera do ouvido dissolvida anteriormente em PBS para medir os níveis de cortisol é usada para medir os níveis de glicose, em que a quantificação de glicose é realizada da seguinte forma: a) medir os níveis de glicose usando o Kit SERA-PAK PLUS (Bayer Healthcare) para níveis de glicose a partir da solução de cera dissolvida, seguindo as instruções do fabricante. As absorções de glicose são quantificadas em triplicado a 505 nm. A concentração de glicose (mg / dl) é obtida usando suas médias de absorção, e a quantidade total de glicose na solução dissolvida é calculada de acordo com o peso inicial das amostras após um processo de normalização.

[0051] Numa segunda modalidade específica da invenção, a cera é obtida por meio do dispositivo de extração da presente invenção que compreende: uma alça (1) tendo uma primeira extremidade (2) e uma segunda extremidade (3), a referida segunda extremidade (3) que possui meios de acoplamento que, em uma modalidade preferida da invenção, podem compreender uma rosca (4); uma cabeça destacável (ponta) compreendendo uma base (5) e um suporte de esponja alongado que se estende longitudinalmente (6) diretamente dependendo de uma porção superior da base, em que a porção inferior da base tem um alojamento incluindo um padrão rosqueado interno (7) para receber a rosca (4) da alça (1), e em que o suporte de esponja (6) tem uma seção transversal em forma de estrela; uma esponja alongada (8) tendo um alojamento longitudinal localizado centralmente (não mostrado) tendo uma seção transversal em forma de estrela para receber o suporte de esponja (6) da base (5).

[0052] A alça (1) e a base (5) podem incluir qualquer meio de acoplamento adequado para acoplar a alça, como uma junta de pressão (9).

[0053] A esponja (8) pode ser preferível à celulose e é colada ao suporte da esponja (6) usando uma cola não alergênica.

[0054] Como descrito anteriormente, o suporte de esponja (6) tem uma seção transversal em forma de estrela, o que melhora a extração de cera de ouvido ao esfregar a esponja (8) dentro do ouvido, no entanto, sua seção transversal pode ter qualquer formato adequado.

[0055] A base (5) é mais larga que a alça (1) e atua como um freio de segurança que dificulta a introdução da ponta dentro do canal auditivo.

[0056] A alça (1) é caracterizada por ter uma forma rotacionalmente simétrica, que permite ao usuário esfregar a esponja dentro do ouvido, girando-a dentro do canal do ouvido externo.

[0057] A esponja (8) é embalada e selada em condições úmidas para mantê-la macia. O umidificador usado é o cloreto de magnésio (MgCl2 ), que atua como um agente antimicrobiano para impedir o crescimento de microrganismos durante o tempo de prateleira. O cloreto de magnésio não apenas impede que a esponja cresça o microorganismo, mas também suporta a extração de cera. Além disso, também tem sido utilizado no tratamento de dermatites (Zhai et al., 1999), o efeito colateral mais comum devido ao uso de hastes de algodão (Ahmed et al., 2014). Outros agentes antimicrobianos conhecidos podem ser utilizados.

[0058] A cera de ouvido é obtida inserindo a ponta com a esponja (8) no ouvido e girando a esponja (8) dentro do canal do ouvido por cerca de 30 a 60 segundos.

[0059] Na segunda forma de realização da invenção, a preparação da amostra é efetuada através da adição de 500 μl de uma solução de tampão de PBS a um tubo de 5 ml. A esponja foi separada do seu suporte plástico e introduzida no tubo. Depois que a esponja absorveu toda a solução, a esponja foi repetidamente espremida e absorvida por um período de 2 minutos ou conforme necessário e, em seguida, a esponja foi espremida a seco e removida do tubo. Subsequentemente, a solução resultante foi seca por deslocamento com N2 e o conteúdo resultante foi ressuspenso em 500 μl de água ultrapura. A solução resultante no tubo foi armazenada a 4 °C até uso posterior, no entanto, a solução pode ser resfriada em outra faixa adequada de temperaturas. Será óbvio para um especialista na técnica que outras quantidades de PBS podem ser usadas. A proporção entre o peso e o volume é normalmente de 1:2, sendo por isso que 500 μl foram usados.

[0060] Nesta segunda modalidade específica, os níveis de cortisol são medidos por meio de técnicas ELISA e os níveis de glicose são medidos por meio do Kit SERA-PAK PLUS (Bayer Healthcare) para níveis de glicose da solução de cera de ouvido dissolvida, seguindo as instruções do fabricante . Outros métodos adequados e conhecidos podem ser utilizados, como espectrometria de massa em tandem por cromatografia líquida (LC- MS/MS). Estudo piloto Extração de cera

[0061] Os ouvidos de voluntários foram limpos com uma seringa Reiner- Alexander, porque, até o momento, é o único método seguro para remover efetivamente a cera dos ouvidos externos (Clegg et al., 2010). Essa seringa é o método tradicional usado por médicos especialistas em nariz e garganta para remover o cerume impactado. Antes de limpar ambos os ouvidos, o canal auditivo externo foi examinado usando um otoscópio para descartar a presença de qualquer patologia externa do ouvido externo, como cerume impactado ou tímpano perfurado. Resumidamente, a seringa Reiner-Alexander injeta água lentamente a 37 graus Celsius dentro do canal auditivo externo. O processo de seringa cria uma sensação de leve pressão no ouvido, pois a água quente da seringa libera a cera. A água expelida e o volume de cera de ouvido extraída foram coletados em uma bacia reniforme. Análises de cortisol e glicose usando amostra de cera de ouvido

[0062] O cortisol foi extraído de acordo com a primeira modalidade específica da invenção. Além disso, a quantificação de cortisol e glicose foi realizada de acordo com a primeira modalidade específica da invenção.

[0063] O estudo piloto a seguir foi realizado em um grupo de participantes saudáveis para padronizar o protocolo de extração de cortisol e glicose para amostras de cera de ouvido. Resultados de glicose e cortisol usando amostra de cera de ouvido (tabela 1) Tabela II.1: Estudo piloto de análises de cortisol e glicose usando amostras de cera de ouvido humano de cinco voluntários (Voluntários 0-4).

Amostra Total pg. Secreção Medição Total de mg Secreção seca de cortisol seca de de glicose de glucose na de glicose na cortisol (mg/dl) amostra (mg/mg) amostra (pg./mg) Voluntário 7251.7 127.0 16.3 815.0 14.3 0 Voluntário 4917.6 111.8 38.5 1925.0 43.8 1

Voluntário 3450.8 862.7 3.6 180.0 45.0 2 Voluntário 3978.3 180.8 5.4 270.0 12.3 3 Voluntário 3279.8 489.5 4.2 210.0 31.3 4 Voluntário 23564.6 1 + 15000 pg.

CORTISOL Voluntário 5199.3 1 + 300 pg.

CORTISOL Voluntário 3765.3 2 + 300 pg.

CORTISOL Voluntário 4249.1 3 + 300 pg.

CORTISOL A eficácia do protocolo de extração e quantificação de cortisol em amostras de cera d ouvido em comparação com amostras de plasma

[0064] Como explicado anteriormente, a eficácia da extração de cortisol foi controlada dissolvendo 0,5 ml de 300 pg./ml de solução de cortisol purificada em PBS a pH 7 e executando o mesmo protocolo de extração usado na cera de ouvido. Os resultados mostraram uma média de 281,48 ± 5,16 pg./ml de concentração de cortisol, correspondendo à média da concentração de cortisol dos 3 tubos (289,2 pg./ml, 273,42 pg./ml e 281,6 pg./ml). Isso fornece 93,8 ± 1,72% da eficácia da extração, o que indica alta eficácia do protocolo de extração de cortisol em amostras de cera de ouvido.

[0065] A eficácia do procedimento de extração também foi avaliada adicionando 300 pg. de cortisol purificado na solução de homogenato dissolvido em cera antes da adição de éter dietílico (ver métodos). Isso foi feito em uma tentativa de determinar se os componentes da cera de ouvido não interferem na purificação do cortisol. Os resultados são mostrados na tabela 2, mostrando uma média de 99,3% de taxa de recuperação de cortisol purificado de homogenatos de cera da cera de ouvido, confirmando a alta eficácia do protocolo de cera de ouvido para medir os níveis de cortisol. Tabela II.2: Taxa de recuperação dos níveis de cortisol em amostras de cera de ouvido Peso seco de cera de ouvido Taxa de receupeação (%) de of 300 extraída(pg./mg) pg. de cortisol adicionado Voluntário 0 127.0 108.7% Voluntário 1 44.0 94.0% Voluntário 2 4.0 105.0% Voluntário 3 22.0 90.0% Voluntário 4 6.7 99.0%

[0066] O procedimento de medição também foi avaliado usando três amostras de soro (participantes 0-2) de um projeto anterior, que atuou como um grupo controle (Tabela 3). Foi confirmado que o protocolo de cera de ouvido para medir os níveis de cortisol é realmente confiável, porque quando os níveis de cortisol foram medidos novamente usando as mesmas amostras de soro, mas usando o protocolo atual de cera de ouvido, os resultados foram quase os mesmos (compare as colunas 3 e 4 na tabela 3). Tabela II.3: Níveis séricos de cortisol de três participantes (grupo controle) Amostra Total pg. de cortisol Níveis originais de Mesmas amostras de soro, na amostra níveis de cortisol mas usando o protocolo de de soro (ng/ml) cera de ouvido atual para medição dos níveis de cortisol (ng/ml) Participante 0 73364.9 70.5 71.3 Participante 1 153712.6 147.8 139.1 Participante 2 79258.5 76.2 65.4

[0067] Finalmente, pode-se observar, comparando as tabelas II.4 e II.5 que as análises de cortisol e glicose na cera após o uso da seringa Alexander-Reiner foram mais rápidas do que a medição dos níveis de cortisol no cabelo.

Tabela II.4: Tempo necessário para analisar cortisol e glicose usando amostras de cera após a utilização da seringa Alexander-Reiner Procedimento Quantificação do tempo de análise em horas e minutos Cortisol na lavagem de Glicose na lavagem de ouvidos ouvidos Centrifugação da 00:00 00:00 amostra Secagem da amostra 08:30 08:30 com N2 antes da extração Extração da amostra 02:10 02:10 com solvente orgânico Secagem da amostra 00:40 00:40 após a extração Protocolo de 04:00 01:00 quantificação TEMPO TOTAL 15:20 12:20

Tabela II.5: Tempo necessário e custos associados à análise do cortisol capilar em relação aos mesmos parâmetros para análise de uma amostra de saliva Amostra Cortisol na Cortisol capilar  biológica saliva  Custo (por Custo (libras) £27.3 £64.51  unidade) Tempo (horas) Tempo de processamento (horas) Tempo técnico 0 0:26 Incubação 0 24:00 Tempo de 0 3:00 evaporação de rotação Total, 0 27:26 Tempo de processamento

Tempo de análise (horas) Tempo técnico 0:05 0:06 (horas) Centrifugação 0:25 0:25 Tempo robô 4:00 4:00 Total, análise 4:30 4:31 Processamento 4:30 31:57 Tempo Total + Análise (horas) : Esses valores foram obtidos graças à cortesia de Bristow, M. BIOMARKER ANALYSIS LABORATORY QUOTATION AT ANGLIA RUSKIN ENTERPRISE (2017), Cambridge.

[0068] No entanto, também pode ser visto na tabela II.4 que, quando a seringa Alexander-Reiner é usada, as amostras de cera de ouvido precisam ser secas antes de analisar seus níveis de glicose e cortisol, aumentando muito o tempo total necessário para a análise dessas amostras. Portanto, o dispositivo da presente invenção também deve remover a cera sem o mecanismo de seringar qualquer solução. Conclusão

[0069] Os resultados deste estudo piloto mostraram que os níveis de glicose e cortisol são detectáveis em amostras de cera de ouvido humano. O tempo necessário para analisar o cortisol de cera foi significativamente menor que o tempo necessário para analisar o cortisol de cabelo. Verificou- se também que a esponja mais apropriada para remover a cera artificial era feita de celulose. Estudo de validação Método

[0070] Os participantes foram recrutados predominantemente de funcionários e estudantes voluntários da Universidade Católica do Norte (UCN) em Coquimbo, Chile e de sua área de influência. Todos os participantes foram avaliados pelo mesmo pesquisador clínico. A amostra foi composta por trinta e sete participantes saudáveis; 20 eram do sexo feminino, com idade média de 29,9 anos e IMC médio de 25,6 kg/m 2 .

[0071] Todos os participantes foram recrutados durante o inverno do hemisfério sul (entre 6 de julho e 3 de agosto de 2018). Foi descoberto anteriormente que as estações do ano variam a composição de triglicerídeos da cera do ouvido (Cipriani et al.,

1990). Foram excluídos os asiáticos e as pessoas com retardo mental, devido às diferentes características da cera de ouvido em relação à composição e quantidade, respectivamente (Cipriani et al., 1990; Crandell & Roeser, 1993). Os participantes não relataram ocorrências histórico de condições médicas atuais ou durante o mês anterior, incluindo patologias do ouvido, como cerume impactado, tímpano perfurado ou otite e doenças metabólicas, como diabetes e intolerância à glicose ou lactose. Os participantes foram selecionados para estarem livres de qualquer medicamento por pelo menos um mês. Os sujeitos também foram excluídos se relataram, durante o mês anterior, uso de substâncias ilícitas ou foram expostos a algum estressor grave, de acordo com a definição do DMS-III (Pichot, 1986).

[0072] O estudo de validação teve duas entrevistas que foram realizadas com um mês de intervalo. Uma visita de linha de base (dia = 1) e uma visita de acompanhamento (dia = 30). Durante a avaliação de linha de base, os participantes tiveram uma entrevista clínica abrangente com o objetivo de descartar a presença de qualquer doença médica, como patologias do ouvido, doenças metabólicas ou condições psiquiátricas. Os dados sociodemográficos também foram registrados durante essa avaliação. Uma vez que os participantes foram incluídos no estudo, seus ouvidos foram limpos com a seringa Reiner-Alexander, porque, até agora, é o único método seguro para remover efetivamente a cera de ouvido dos ouvidos externos (Clegg et al., 2010). Essa seringa é o método tradicional usado por médicos especialistas em nariz e garganta para remover o cerume impactado. Os participantes foram instruídos a evitar o uso de hastes de algodão ou o uso de qualquer método de limpeza das orelhas durante o período de acompanhamento. Isso permitiu coletar uma quantidade padronizada de secreção de cera de ouvido trinta dias após (a avaliação de acompanhamento). 3-8 mg de cera representam quatro semanas de produção de cera (Cipriani et al., 1986).

[0073] A quantidade comparável de secreção de cera de ouvido entre os lados direito e esquerdo (Cipriani al., 1986) também permitiu projetar um caso-controle prospectivo, em vez de um estudo de pesquisa transversal prospectivo. Portanto, durante a avaliação de acompanhamento, a orelha esquerda foi limpa usando a seringa

Reiner-Alexander [controles] e a direita usando o dispositivo de extração da presente invenção.

A autoavaliação de alguns fatores ambientais, como a frequência e a gravidade dos distúrbios ambientais mais comuns do dia-a-dia, usando a Escala de Aborrecimentos (Kanner & Coyne, 1981), e mais fatores ambientais inesperados, como eventos significativos da vida , utilizando o Questionário de Mudanças Recentes na Vida (RLCQ; Miller & Rahe, 1997) foram avaliados durante o mês anterior à inscrição no estudo.

Os participantes também avaliaram sua percepção de estresse durante o último mês usando a Escala de Estresse Percebido (PSS; Cohen, 1994). Todas as ferramentas psicométricas foram validadas em espanhol.

Por fim, foi administrada uma pesquisa de satisfação padronizada para avaliar a experiência dos participantes usando o dispositivo da presente invenção.

Essa avaliação foi feita usando técnicas de construção de escala de atitude para escalas de classificação somadas (Likert) de 5 pontos (Spector, 1985). Algumas variáveis categóricas e contínuas, como o conhecimento de seus participantes anteriores ou a frequência de uso de hastes de algodão, também foram registradas nessa pesquisa.

Variáveis antropométricas, como peso, altura, Índice de Massa Corporal (IMC) e circunferência da cintura, também foram detalhadas durante a visita.

Resultados gerais: resultados sociodemográficos, antropométricos e de questionário autoadministrado Resultados: Tabela III.1: Variáveis sociodemográficas e antropométricas

Variável Resultados N: Feminino 20; (%) (54.1) Idade (Anos), 29.9, Média (Desvio padrão) (1.4) Estado civil: solteiro (sim), 32; N (%) (86.5) Inferior ou estudos de pós graduação 16; N, (%) (43.2) Etnicidade Raça misturada, 36, n(%) (96.3) Ascendência asiática 0, n(%) (0) Álcool (sim), 10,

n (%) (27.0) Unidades  1.3; média, (desvio padrão) (0.5) Tabaco (sim), 9, n (%) (24.3) Pílula contraceptiva 9, n (%) (52.9) Retardo Mental 0; Média (desvio padrão) (0) Comorbidade médica ou psiquiátrica 0, n (%) (0) Frequência de lavagem do cabelo 4.9, (semana) (0.3) Tratamento cosmético ,  1, n (%) sim (2.7) Medicamento , & 0, n (%) (0) : pelo menos uma unidade na última semana e: qualquer medicamento, incluindo medicamentos psicotrópicos e esteróides. : Uma unidade de álcool é medida em 10 ml ou 8 g de álcool puro. Isso equivale a uma medida única de 25 ml de uísque (álcool em volume [ABV] 40%), ou um terço de um litro de cerveja (ABV 5-6%) ou meio copo de vinho tinto (175 ml) padrão (175 ml) (ABV 12%). : tingimento, clareamento, alisamento permanente ou ondulação .

Tabela III.2: Resultados antropométricos Variável Q1 Mediana Média, Q3 (Desvio padrão) Altura (cm) Amostra 160 167 166.7, 173 Média, (desvio completa (1.4) padrão) Feminino 157 160 161.6 166 (1.8) Masculino 168 173 172.7, 176 (1.3) Peso (kg) Amostra 62 72 72.5, 78 Média, (desvio completa (2.5) padrão) Feminino 57.5 65.5 64.6, 72 (2.0) Masculino 72 75 81.8, 95 (3.9)

IMC (Kg/m2), Amostra 23.3 24.9 25.6, 26.7 Média, (desvio completa (0.6) padrão) Feminino 22.8 24.6 24.2, 25.5 (0.6) Masculino 24.1 25.4 27.2, 31.2 (1.1) Circunferência Amostra 77 86 85.9, 95 da cintura completa (2.4) (cm), Média, (desvio Feminino 70.5 78 78.8, 87 padrão) (2.3) Masculino 88 93 94.4, 102 (3.4) IMC: Índice de Massa Corporal

Tabela III. 3: Resultados de questionário autoadministrados

Questionário Resultados Escala de Estresse Percebido (PSS), 22.6, Média, (desvio padrão) (1.1) Quadro de eventos da vida (RLCQ), 141.2, Média, (desvio padrão) (20.8) Histórico de eventos graves da vida (RLCQ) 10, (último mês), N (%) (27.0) Número de aborrecimentos (último mês), 16.7, Média, (desvio padrão) (1.7) Índice de gravidade de aborrecimentos , 22.9, Média, (desvio padrão) (2.8) Sujeitos abaixo do número aumentado (>25) de aborrecimentos 9; (último mês), (24.3) N (%) Sujeitos que possuem problemas para lidar com seus 1, aborrecimentos (último mês), N (%) (2.7) RLCQ: Questionário de Alterações Recentes de Vida (Recent Life Change Questionnaire) PSS: Escala de estresse Percebido (Perceived Stress Scale)

[0074] No geral, pode-se afirmar das tabelas III.1, III.2 e III.3 que os participantes compuseram uma amostra jovem bastante homogênea, constituída principalmente por mulheres (54,1%). Também era um grupo saudável de pessoas, em termos de variáveis antropométricas. No entanto, esse grupo de participantes foi exposto a um número aumentado e a problemas e eventos de vida mais graves do que outras amostras de controle chilenas (Herane-Vives et al., 2018). Isso explica, talvez por que a percepção deles sobre o estresse tenha sido maior do que em outras amostras de latinos saudáveis (em Cohen, 1994). Avaliação do dispositivo de extração da presente invenção (Trears©)

[0075] Antecedentes: Até o momento, nenhum dispositivo de autolimpeza seguro é tão eficaz quanto o método clínico tradicional para remover a cera de ouvido. Um deles pode substituir as hastes de algodão arriscados. Neste estudo, avaliamos a efetividade e a experiência do usuário de um dispositivo auditivo externo original de autolimpeza seguro (Trears).

[0076] Métodos: O peso de 37 amostras de cera do ouvido direito usando Trears foi comparado com o peso do mesmo número de amostras de cera do ouvido esquerdo que foram coletadas pelo método clínico tradicional (a seringa de Reiner-Alexander). As amostras representaram o mês retrospectivo da secreção da cera de ouvido. Os participantes também avaliaram sua experiência com o aparelho auditivo de autolimpeza usando uma pesquisa de satisfação padronizada.

[0077] Resultados: Trears foi significativamente mais eficaz que o uso da seringa Reiner-Alexander na remoção de cera (p <0,001). Pontas de Trears com 50% (105,1 μl) de humidade foram mais eficazes do que Trears com 12,5% (30 μl) para remoção de cera (p <0,05). Os participantes consideraram que seu uso era mais seguro e confortável do que o uso de hastes de algodão.

[0078] Conclusão: Trears pode constituir um método mais econômico, conveniente e eficiente para autolimpeza dos ouvidos externos em pessoas saudáveis. Este dispositivo também pode substituir o uso das hastes de algodão arriscadas atuais.

[0079] Os resultados do estudo piloto anterior confirmaram que uma esponja abrasiva e absorvente específica era muito eficaz para remover a cera artificial da pele de um animal (Herane-Vives & Benohr, 2018). No entanto, sua utilidade ainda não foi testada em cera de ouvido. Neste projeto prospectivo de estudo de controle de caso, foi testada a efetividade e segurança do dispositivo de extração da presente invenção (Trears) que incorpora essa esponja em participantes saudáveis. Amostras de cera de ouvido

[0080] O assistente de pesquisa clínica foi explicitamente treinado no uso da seringa Reiner-Alexander por um médico especialista em otorrinolaringologia em 30 de maio de 2018. Antes de limpar ambos os ouvidos, o canal auditivo externo foi examinado usando um otoscópio para descartar a presença de qualquer patologia auditiva externa, como cerume impactado ou tímpano perfurado. Resumidamente, a seringa Reiner- Alexander injeta água lentamente a 37 graus Celsius dentro do canal auditivo externo. O processo de seringar cria uma sensação de leve pressão no ouvido, pois a água quente da seringa libera a cera. A água expelida e o volume de cera extraída foram coletados em uma bacia reniforme. Durante a visita de acompanhamento, os participantes fizeram uma autolimpeza do ouvido direito usando o Trears, de acordo com as instruções do fabricante (Diagrama 1). Diagrama 1: Instruções de uso Trears Dispositivo de limpeza para os ouvidos Atenção • Este produto não deve ser usado em crianças com menos de 12 anos • Este produto não deve ser utilizado em indivíduos com tubos auriculares • Não use se sentir dor, desconforto, perda auditiva, pressão no ouvido ou sangramento dos ouvidos • Trears® não deve ser usado nas seguintes situações sem a supervisão de um médico: - Indivíduos que sofrem de cerume impactado - Indivíduos que sofrem de perda auditiva ou surdez devido ao excesso de produção de cera de ouvido - Indivíduos com síndrome de Meniere ou qualquer forma de tontura, incluindo vertigem

- Indivíduos que sofrem de dificuldades auditivas ou outros problemas de ouvido - Indivíduos com uma infecção corrente no ouvido - Indivíduos com tubos nos ouvidos - Indivíduos que fizeram cirurgia mastóide - Indivíduos com tímpanos atualmente ou previamente perfurados - Indivíduos com qualquer malformação do ouvido externo Cuidado Por favor, não reutilize ou lave as pontas descartáveis. As dicas de limpeza são boas para uso único (uma por canal auditivo). A reutilização das pontas pode causar infecção ou danos nos ouvidos. Se desejar, você pode limpar o dispositivo Trears® com água morna e sabão e secar bem antes de guardar.

• A cera é produzida perto da entrada do canal auditivo, conhecido como canal auditivo externo.

Não cutucar, espetar ou forçar o Trears® em seu ouvido mais profundamente do que o freio de segurança permite. Forçar o Trears® além do limite do freio de segurança pode danificar o tímpano e o aparelho auditivo, resultando em perda auditiva permanente e / ou zumbido / dor / tontura.

• O cerume impactado deve ser removido por um profissional de saúde.

• Faça o uso seguro deste produto seguindo as instruções passo a passo. O mau uso do Trears® pode causar ferimentos graves. Por favor, leia todas as instruções cuidadosamente antes de usar.

Leia atentamente as instruções antes de usar o TREARS® Dispositivo de limpeza de ouvido Instruções de uso Siga estas instruções para uma limpeza segura e eficaz dos seus ouvidos Preparação

1. Lave as mãos.

2. Remova o dispositivo Trears® e uma ponta descartável selada da caixa e coloque-a em uma superfície limpa. Aviso: Não use nem reutilize as pontas de limpeza se elas não estiverem adequadamente seladas.

3. Remova uma ponta de limpeza da embalagem e insira no dispositivo Trears® girando- a no sentido horário até ouvir um clique. Limpeza

4. Cuidadosamente e gentilmente insira Trears® (com uma ponta descartável presa) no ouvido. Não force a ponta de limpeza no canal auditivo. Cuidado: O dispositivo possui um freio de segurança; você não deve introduzir o dispositivo no canal auditivo além do que o freio permite.

5. Limpe o ouvido esfregando a ponta da limpeza em todas as paredes da parte interna da orelha por cerca de 30 a 60 segundos. Você será capaz de limpar seu ouvido com segurança devido ao freio de segurança do Trears®. Dispositivo de limpeza de ouvido Instruções de uso Siga estas instruções para uma limpeza segura e eficaz dos seus ouvidos. Descarte

6. Remova a ponta de limpeza do Trears®, girando-a no sentido anti-horário.

7. Descarte a ponta de limpeza usada anteriormente em qualquer recipiente de lixo doméstico. A ponta é biodegradável. Aviso: Não jogue no vaso sanitário.

8. Repita o mesmo procedimento para o outro ouvido.

9. Armazene o dispositivo Trears® e suas pontas de limpeza seladas em local seco.

[0081] As esponjas descartáveis das pontas foram previamente umedecidas com diferentes níveis de umidade, utilizando cloreto de magnésio (MgCl2). O óleo de magnésio usado durante o estudo foi uma solução de cloreto de magnésio a 31% em água, que também é usada para massagens, regeneração da pele e cuidados. Devido ao seu alto teor de magnésio, a solução possui uma textura suave, nutritiva e fluida. Não contém óleo na natureza, mas tem uma sensação sedosa como o óleo. Cada mililitro de óleo de magnésio continha cerca de 103 mg de magnésio elementar. Quatro amostras de cera de ouvido foram rotuladas, pesadas e armazenadas em menos. Todas as amostras de cera de ouvido foram rotuladas, pesadas e armazenadas a 4 graus Celsius. Análise estatística

[0082] Os dados foram verificados quanto à normalidade usando o teste estatístico Kolmogorov-Smirnov e métodos gráficos, como histogramas. Além das amostras deixadas de acompanhamento (p = 0,03), todos os outros valores foram normalmente distribuídos (todos p> 0,05). Portanto, usamos testes t repetidos para comparar a quantidade de volume extraído da cera de ouvido entre o ouvido esquerdo e o ouvido direito das extrações da linha de base e entre a linha de base e a extração de acompanhamento. O teste de postos assinados de pares combinados de Wilcoxon foi utilizado para comparar a quantidade de cera extraída entre as extrações de acompanhamento do ouvido esquerdo e direito. A análise de regressão linear foi utilizada para determinar a associação entre o volume de cera extraída por Trears e diferentes variáveis biológicas, ou entre o mesmo volume e as perguntas da pesquisa de satisfação do cliente. O nível de significância foi estabelecido em p <0,05 (bicaudal). Resultados

[0083] Resultados detalhados do questionário sociodemográfico, antropométrico e auto-administrado podem ser encontrados nas tabelas III.1, III.2 e III.3, respectivamente. A maioria dos participantes considerou que o uso da Trears era muito confortável, eficaz e seguro. Eles também descreveram que seu uso era mais eficaz, mais seguro e tão agradável quanto o uso de hastes de algodão. Embora apenas 14,3% estariam dispostos a comprar esse produto, a maioria deles disse que poderia considerar essa opção (60,7%) (Tabela V.1).

[0084] Embora a quantidade de amostras extraídas de cera de ouvido de linha de base esquerda e direita não tenha diferido entre si, Trears extraiu significativamente mais cera do que o uso da seringa Alexander-Reiner (p <0,001) (Tabela IV.2). Ambas as orelhas aumentaram significativamente a produção de cera após a limpeza inicial da seringa Alexander-Reiner (ambas p <0,05). A quantidade de amostra extraída de cera extraída de acompanhamento do lado esquerdo também foi significativamente maior que a amostra de linha de base de cera do lado direito (p <0,05).

[0085] Considerando que diferentes espessuras de ponta não mostram qualquer diferença em relação à quantidade de cera extraído, essas esponjas com 50% de humidade ou 105,1 μl de MgCl2 (Tabela IV.3) extraiu-se mais a cera do que aqueles com 12,5% (p <0,05) ( Quadro IV.4). Nenhuma variável biológica ou psicológica variou a quantidade de cera secretada (todas p> 0,05) (Tabela IV.5). Embora as variantes de Trears não tenham alterado as avaliações dos participantes sobre sua experiência no uso de Trears, os indivíduos com um número aumentado de ou dificuldades mais graves consideraram que sua efetividade era mais fraca e pior que os hastes de algodão (Tabela IV.6). Tabelas: Tabela IV.1: Pesquisa de satisfação de Trears N Questões: Resultados: Significado: Q1 Mediano Média Q3 (desvio padrão) 1 Como 1= muito 4 4 4.0 5 descreveria desconfortável (1.0) sua 5= muito experiência confortável usando Trears? 2 Como você 1= muito 4 4 4.2 5 descreveria ineficaz, (0.9) a eficácia de 5= muito eficaz Trears para limpar seus ouvidos externos? 3 Quão seguro 1= muito 4 4 4.3 5 você inseguro, (0.6) considera 5= muito que foi o Seguro uso de Trears dentro do seu ouvido? 4 Você Sim Não conhece n (%) 28, 0, hastes de (100) (0) algodão? 5 Com que n (%) Todo dia Quase Algumas Rara- Quase Nunca frequência todo vezes mente nunca você usa dia hastes de 2, 8, 8, 1, 3, 6, algodão (7.1) (28.6) (28.6) (3.6) (10.7) (21.4) Significado: Q1 Mediana média Q3 (desvio padrão) 6 Você acha 1= discorda 2 3.1, 4.5 que o uso de totalmente 3 (1.4) Trears era 5= concorda mais totalmente confortável do que as hastes de algodão? 7 Você acha 1= discorda 3 4 3.9, 5 que o uso de totalmente (1.2) Trears para 5= concorda limpar seus totalmente ouvidos foi mais eficaz que as hastes de algodão? 8 Você acha 1= discorda 4 4 4.2,(0.9) 5 que o uso de totalmente 5= Trears foi concorda mais seguro totalmente que as hastes de algodão? 9 Como 1=muito não 3 4 3.7,(1.0) 4 definiria o atrativo design de 5= muito Trears? atrativo 10 O que você 1= muito 3 3.5 3.5,(0.8) 4 acha do pequeno tamanho 5= muito dos Trears? grande 11 Você estaria Não Talvez Sim disposto a n (%) 7, 17, 4, comprar (25.0) (60.7) (14.3) Trears? 12 Quanto você Moeda Q1 Mediana Média Q3 estaria (CLP) (desvio disposto a padrão) pagar por 1000 2000 3452.5 3000 uma unidade de Trears?

Tabela IV.2: Comparações da extração de cera de ouvido entre o uso da seringa Reiner- Alexander e o dispositivo Trears.

Ouvido Esquerdo Direito Método Seringa de Reiner-Alexander Seringa de Reiner-Alexander (mg) (mg)

Avaliação Q1 Mediana Média Q3 Q1 Mediana Média Q3 Valor (desvio (desvio de P  padrão) padrão) Linha de base 6.2 8.5 10.7, 15.7 5.1 7.9 9.2, 13.7 0.07 (day=0) (1.1) (0.7) Método Seringa de Reiner-Alexander Trears (mg) (mg) Avaliação Q1 Mediana Média Q3 Q1 Mediana Média Q3 Valor (desvio (desvio de P  padrão) padrão) Acompanhamento 12.0 17.3 19.1 19.6 79.8 124.7 155.8 200.3 <0.001* (dia=30) (1.8) (18.2) : valor de p foi obtido usando teste t repetido : valor de p foi obtido com o teste de postos assinados de pares combinados de Wilcoxon *: valor de p foi significativo no nível 0.05 Tabela IV.3: umidade do Trears % Volume of MgCl2 Média (µl) Desvio padrão(µl)

12.5 30 0 25 56.6 5.2 30 63.7 2.5 50 105.1 5.6 Tabela IV.4: Análises do modelo de regressão linear entre as variantes de Trears e as de cera de ouvido extraída usando Trears Variantes de Trears Entre cerca de ouvido extraída por Trears β CI Valor de P Umidade da esponja de 25 39.6 -105.9; 185.2 0.58 Trears (%) 30 26.7 -63.7; 117.2 0.55 50 147.1 71.1; 223.2 <0.01* Espessura da ponta de 4.5 19.4 -67.6; 106.5 0.65 Trears (mm) *:p significativo em p<0.05 Tabela IV.5: Modelo de regressão linear entre análises entre a cera de ouvido extraída com Trears e algumas variáveis biológicas e psicológicas β Valor de p CI Variáveis Idade 0.6 0.78 -3.8; 5.0 Sexo 53.8 0.14 -19.0; 126.7 Álcool (unidade)  -2.3 0.73 -16.0; 11.4 Tabaco -26.0 0.54 -112.9; 60.8 IMC 4.3 0.37 -5.41, 14.0 Circunferência da cintura 0.8 0.53 -1.8; 3.4 Anticoncepcional 31.8 0.18 -16.5; 80.2 PSS -1.0 0.72 -6.9; 4.9 Número aborrecimentos -0.2 0.91 -3.8; 3.4 Gravidade aborrecimentos -0.6 0.58 -2.7; 1.6 RLCQ -0.1 0.51 -3.4; 0.2 Severe RLCQ -17.6 0.43 -62.7; 27.6 : Uma unidade de álcool é medida em 10 ml ou 8 g de álcool puro. Isso equivale a uma medida única de 25 ml de uísque (álcool em volume [ABV] 40%), ou um terço de um litro de cerveja (ABV 5-6%) ou meio copo de vinho tinto (175 ml) padrão (175 ml) (ABV 12%) .: Questionário de evento de vida recente (Recent Life Event Questionnaire) Tabela IV.6: Modelos de regressão linear entre alguns resultados das perguntas da pesquisa de satisfação de Trears e algumas variáveis psicológicas ou variantes de Trears Questões de pesquisa de Como você descreve a sua Como você descreve a eficácia Você acha que Trears foi mais Você acha que o uso de Trears satisfação Trears experiência de usuário? de Trears eficaz que hastes de algodão foi mais confortável que hastes para limpar seus ouvidos? de algodão? Variáveis Rs valor p Cl Rs valor p Cl Rs valor p Cl Rs valor p Cl Quantidade de cera -41,5; <-64,7; -43,8; -15,3; 5,7 0,80 -13,5 0,59 -4,7 0,80 16,7 0,29 extraída por Trears (mg) 53,0 37,8 34,3 46,7 -1,4; -1,2; -2,1; -2,8; 25 0,3 0,72 0,4 0,60 -0,1 0,9 -0,2 0,87 2,0 1,9 1,9 2,4 de Trears Umidade Variáveis -1,9; -1,8; -2,9; -2,1; 30 -0,7 0,19 -0,7 0,17 -1,5 0,04* -0,3 0,70 0,4 0,4 -0,1 1,4 -1,0; -1,4; -1,9; -1,5 50 <0,1 0,97 -0,5 0,34 -0,7 0,23 -0,1 0,89 1,1 0,5 0,5 1,7 Espessura -0,21; -1,1; -0,89; -0,52; 1,5 0,80 -0,1 0,88 -0,2 0,65 0,12 0,70 da ponta 3,17 0,9 0,56 0,77 Número de -4,7; -9,4; -7,2; -3,9; -0,4 0,90 -5,2 0,02* -3,9 0,02* -0,9 0,51 aborrecimentos 3,9 -0,9 -0,7 2,0 Fatores ambientais Gravidade de -8,2; -15,1; -11,1; -6,4; -1,0 0,76 -7,9 0,03* -5,6 0,04* -1,4 0,58 psicológicas aborrecimentos 6,2 0,8 0,1 3,6 Variáveis Número de -74,6; -79,1; -74,2; -46,4; -19,2 0,48 -18,5 0,53 -29,4 0,18 -7,5 0,69 eventos de vida 36,2 42,0 15,3 31,4 Gravidade de -0,5; -0,7; -1,1; -0,9; <0,01 0,83 -0,3 0,10 -0,6 0,03* -0,2 0,57 eventos de vida 0,4 0,1 -0,4 0,5 Estresse -0,8; -1,9; -0,7; -0,4 1,8 0,16 0,9 0,50 1,4 0,17 1,3 0,12 Percebido 4,3 3,8 3,5 3,0 satisfação Trears Pesquisa de Frequência de -0,3; -1,0; -0,6; -0,7; uso de hastes 0,4 0,23 -0,2 0,55 -0,1 0,85 -0,3 0,23 1,1 0,5 0,5 0,2 de algodão Discussão

[0086] Verificou-se que a produção de cera aumentou significativamente após a limpeza da linha de base com o uso da seringa Alexander-Reiner nos dois ouvidos. Trears removeu mais cera do que o método clínico (a seringa Alexander-Reiner). A maioria dos participantes considerou que o uso de Trears era confortável, eficaz e seguro. Eles também relataram que seu uso foi mais eficaz, mais seguro e confortável do que o uso de hastes de algodão. Embora apenas 14,3% estejam dispostos a comprar este produto, a maioria dos participantes afirmou que poderia considerar essa opção (60,7%).

[0087] É perceptível que, independentemente do método de extração utilizado, a quantidade de cera, em vez de diminuir, aumentou significativamente durante o período de acompanhamento. Isso pode ser explicado por que, após a limpeza da linha de base, as glândulas ceruminosas aumentaram sua produção de cera de ouvido, agindo como um mecanismo compensatório, devido à falta de cera causada pela limpeza da orelha externa da linha de base que foi realizada com a seringa Alexander-Reiner. Essa diferença também pode ser entendida pela característica do protocolo de estudo. Os participantes foram instruídos a evitarem limpar os ouvidos durante o período seguinte, a fim de extrair uma quantidade padronizada de cera que representa o mês retrospectivo da produção de cera. Essa possibilidade também é reforçada após observar que 35,7% dos participantes eram usuários intensos de hastes de algodão, e outros 28,6% fazem, pelo menos, um uso esporádico deles.

[0088] O uso da seringa Alexander-Reiner, além da água quente, extraiu um pouco mais de cera (2,25 ± 0,18 mg / semana) do que o método extraído mais eficaz usado por Cipriani et al. (1986) que combinaram o efeito de um método mecânico de extração não especificado que injetou uma solução de álcool / éter 3: 1 v/v (2,02 ± 0,22 mg/semana). Houve confirmação prévia de Cipriani et al. (1986), após comparar os resultados da linha de base, de que não houve variação do volume da cera na lateral do ouvido. No entanto, o volume de linha de base de cera de ouvido não representou a quantidade secretada de cera de ouvido um mês depois, pois Trears extraiu mais de oito vezes mais cera do que a seringa em pessoas saudáveis de raça mista.

[0089] Embora altamente desaconselhável, o uso de hastes de algodão continuará a aumentar. Portanto, projetar uma alternativa segura é uma necessidade atual. Infelizmente, todos os produtos ou dispositivos de autolimpeza atuais apresentam nenhum efeito ou efeito mínimo em comparação com o uso clínico da seringa Alexander-Reiner. No entanto, Trears mostrou que não só é tão útil quanto o método tradicional para remover a cera, mas também foi capaz de extrair ainda mais cera de ouvido do que o método clínico. Por outro lado, o material das pontas de Trears foi feito com uma esponja celular abrasiva e absorvente específica, que anteriormente demonstrou sua utilidade na remoção de cera líquida artificial. Além disso, a ponta da Trears também incorporou um óleo mineral que já demonstrou algum efeito na remoção da cera de ouvido. Foi confirmado que uma concentração maior (50%) de um tipo de óleo mineral, como cloreto de magnésio, também aumentou a extração de Trears em comparação aos dispositivos que usavam pontas mais secas (12,5%). O futuro dispositivo Trears conterá esse nível de umidade. Então, o efeito aditivo, dado o material da ponta mais o óleo mineral, pode explicar os resultados significativos. Medição da concentração média de glicose usando cera de ouvido

[0090] Antecedentes: Um aumento na média da concentração de glicose está associado a doenças epidêmicas e crônicas. Atualmente, nenhum teste isolado é apenas preciso, mas também acessível, conveniente e inócuo para refletir esse nível a longo prazo. A cera do ouvido pode atender a essas características. Os níveis de glicemia em jejum e pós-prandial foram associados a amostras de linha de base e de acompanhamento de cera de ouvido e hemoglobina glicada (HbA1c ).

[0091] Métodos: 37 participantes saudáveis forneceram duas amostras de cera do ouvido direito e duas amostras de soro que foram colhidas com um mês de intervalo. As medidas de linha de base foram tomadas após 8 horas de jejum e as amostras de acompanhamento foram tomadas após a ingestão de uma refeição padronizada. Enquanto a concentração inicial de glicose na cera de ouvido (EGC) representava a concentração média dos níveis de glicemia pós-prandial e de jejum retrospectivo anteriores, o EGC de acompanhamento representava a mesma média no último mês. Ambas as amostras de HbA1c representaram a concentração média retrospectiva de glicose de um período entre um e três meses. A média glicêmica foi calculada usando a média entre sua respectiva linha de base e medida de acompanhamento. Os níveis basais e de acompanhamento de cada amostra foram comparados entre si. O efeito de várias covariáveis foi investigado nessas amostras. A glicose sérica em jejum [FSG] foi correlacionada com sua respectiva amostra basal de EGC e HbA1c . A mesma correlação foi feita entre a glicemia pós-prandial [PSG] e suas respectivas amostras de EGC de acompanhamento e de HbA1c . O nível glicêmico médio foi correlacionado com todas as amostras de HbA1c e EGC acima mencionadas. Diferentes níveis glicêmicos foram previstos usando amostras de EGC e HbA1c de linha de base e acompanhamento .

[0092] Resultados: Todas as concentrações de acompanhamento foram maiores que as respectivas concentrações basais. As amostras de cera de ouvido não foram afetadas por nenhuma covariável. Enquanto todas as associações entre EGC e níveis glicêmicos apresentaram correlações positivas altas (todos R> 0,60; p <0,001), as associações HbA1c com diferentes níveis glicêmicos exibiram correlações moderadas ou baixas (todas R <0,50; 0,10 <p <0,01). O EGC de base previu o maior aumento na média dos níveis glicêmicos (todos p <0,001).

[0093] Conclusão: O EGC é mais preciso que o HbA1c para refletir os níveis glicêmicos. A cera de ouvido é mais estável que o açúcar no sangue e a HbA1c para medir a concentração de glicose. Os resultados do EGC sugeriram que a cera de ouvido representa melhor o nível médio de glicose a longo prazo.

[0094] Embora os níveis de glicose já tenham sido medidos em amostras de cera em outros lugares (Masuda et al, 1978; Shichjo & Masuda, 1979; Herane-Vives & Benohr, 2018), mesmo em pacientes diabéticos (Khasanov & Popova, 1984), não se sabe se a EGC encontrada nos estudos anteriores representa os níveis glicêmicos de forma precisa. É por isso que neste estudo foram medidos os níveis de EGC, glicêmico e HbA1c que foram tomados durante o jejum e após uma refeição padronizada em uma amostra de participantes saudáveis. Os níveis basais e de acompanhamento de cada amostra foram comparados entre si. O efeito de várias covariáveis nos níveis de glicose também foi investigado. A glicemia de jejum [FSG] foi correlacionada com seus respectivos EGC de base e HbA1c , e a mesma correlação foi feita entre glicose pós-prandial de glicose [PSG] e seus respectivos níveis de acompanhamento de EGC e HbA1c . O nível médio de glicose foi correlacionado com todas as amostras de HbA1c e EGC acima mencionadas . Diferentes níveis glicêmicos foram previstos usando amostras de EGC e HbA1c de linha de base e acompanhamento .

[0095] Foi levantada a hipótese de que: 1) Todas as concentrações de acompanhamento seriam maiores que suas respectivas concentrações de linha de base; 2) A cera de ouvido seria mais estável que os níveis glicêmicos e de HbA1c para refletir a concentração de glicose; 3) Todas as associações entre EGC e diferentes níveis glicêmicos seriam mais fortes do que as associações entre HbA1c e as mesmas medidas glicêmicas; e 4) o EGC da linha de base preveria o maior aumento na média dos níveis glicêmicos. Métodos:

[0096] 37 participantes saudáveis forneceram duas ceras do ouvido direito e duas amostras de soro que foram colhidas com um mês de intervalo. As medidas de linha de base foram tomadas após 8 horas de jejum e as amostras de acompanhamento foram tomadas após a ingestão de uma refeição padronizada. Embora o período retrospectivo de acúmulo de glicose na cera do ouvido seja desconhecido, o EGC de acompanhamento cobriu o último mês de acúmulo. Ambas as amostras de HbA1c representaram a concentração média retrospectiva de glicose de um período entre um e três meses. A média do nível glicêmico foi calculada usando a média entre os níveis glicêmicos basal e de acompanhamento. Os níveis basais e de acompanhamento de cada amostra foram comparados entre si. O efeito de várias covariáveis foi investigado nessas amostras. A glicemia sérica em jejum [FSG] foi correlacionada com seus respectivos EGC de base e HbA1c, e o mesmo foi feito entre a glicemia pós-prandial [PSG] e seus respectivos EGC e HbA1c. A média do nível glicêmico foi correlacionada com todas as medidas de HbA1c e EGC acima mencionadas . Amostras de cera de ouvido

[0097] Amostra de cera de base direita foi coletada após 8 horas de jejum. Amostra de cera de acompanhamento do lado direito foi coletada duas horas após o início da ingestão de uma refeição líquida padronizada de 236 ml de Ensure Avance®. Todas as amostras foram rotuladas e armazenadas a 4 graus Celsius. Amostras de cera de ouvido usando a seringa de Alexander-Reiner.

[0098] As amostras de cera obtidas por lavagem das orelhas foram processadas secando-as pelo método de deslocamento de N2. Resumidamente, cada um dos 50 ml foi separado em 4 tubos, cada um dos quais foi inserida uma cânula ligada a um tanque de gás N2, a manutenção de uma temperatura constante de 25 °C utilizando um banho regulado termicamente. Quando o N2 de fluxo é aberto, ele desloca o H2O que se evapora, permitindo, assim, a secagem da amostra. Depois que as amostras basais foram secas como a amostra esquerda obtida no dia 30, o peso da amostra de cerume seco foi obtido subtraindo o peso dos tubos com a amostra seca menos o peso do tubo vazio (previamente pesado). Finalmente, 125 μl de PBS foi adicionado a cada tubo, o conteúdo de cada tubo foi ressuspenso, e as amostras foram combinadas em um único tubo de 5 ml, que continha o total da amostra ressuspensa em 500 μl de PBS e armazenados a 4 °C até o uso. Amostras de cera de ouvido usando Trears

[0099] As amostras de cera de ouvido obtidas utilizando o instrumento Trears® foram processadas por lavagem da esponja com 500 μl de PBS, durante 2 minutos. No entanto, o tempo de secagem com N2 foi muito menor, pois o mecanismo de extração de Trears é seco. De fato, inversamente à seringa de Alexander-Reiner, Trears não injeta água.

[00100] Em detalhe, 500 μl de uma solução tampão, PBS foram adicionados a um tubo de 5 ml, a esponja foi separada a partir do seu suporte de plástico e introduzido no tubo. Depois que a esponja absorveu toda a solução, a esponja foi repetidamente espremida e absorvida por um período de 2 minutos e, em seguida, a esponja foi espremida a seco e removida do tubo. Subsequentemente, a solução resultante foi seca por deslocamento com N2 e o conteúdo foi ressuspensa em 500 μl de água ultrapura. A solução resultante no tubo foi armazenada a 4 °C até o uso. Amostras de soro

[00101] As amostras de sangue em jejum foram coletadas (com uma seringa de 3 cm3 na veia antecubital e usando um tubo de coleta de sangue sem anticoagulante). Todas as amostras de soro foram coletadas durante a manhã. Uma amostra de HbA 1c e glicêmica [FSG] foram coletadas durante a manhã da visita inicial. Os participantes foram previamente instruídos a evitar comer ou beber qualquer coisa oito horas antes dessa avaliação. Outra amostra de HbA1c e glicêmica [PSG] foram coletadas durante a visita de acompanhamento. Essas amostras de acompanhamento foram tomadas duas horas após o início da ingestão de uma refeição líquida padronizada de 236 ml de Ensure Avance®, que contém 1,5kcal / ml, administrada por 24,3% de proteína, 44,8% de carboidratos, 28,8% de gordura, 1% de fibra e 1,1% % Butirato de beta-hidroxi-beta- metil. A concentração média de glicose no soro foi estimada a partir da média entre os níveis glicêmicos em jejum e pós-prandial. Análise de glicose sérica:

[00102] Preparação de amostras de soro. As amostras de sangue obtidas em jejum e pós-prandiais foram armazenadas a 4 °C por 24 horas, a fim de permitir a coagulação e separação do soro e, em seguida, centrifugadas a 1000xg por 20 minutos a 4 °C. Posteriormente, o soro foi separado da pelota usando uma seringa de 1 ml e coletando-os em tubos plásticos de 2 ml devidamente rotulados. Uma vez obtidos os soros, eles foram armazenados a -20 °C até seu uso. Quantificação de glicose a partir de amostras de cerume e soro:

[00103] A quantidade de glicose foi quantificada pelo uso de ensaios de oxidação enzimática e marcação de glicose oxidada em placas de 96 poços, de acordo com as instruções fornecidas por seus fornecedores (BioVision Inc., Milpitas, CA, EUA), usando uma curva padrão de 0, 2, 4, 6, 8 e 10 nmol de padrão de glicose por poço. 50 μl de padrão, fração aquosa e uma diluição 1:25 de soros foram adicionados aos poços restantes em conjunto com 50 μl de mistura de ração de glicose, contendo glicose tampão de ensaio, 2 μl de amostra de glicose e 2 μl de mistura de glicose enzimática. A mistura foi incubada por 30 min a 37 °C, protegida da luz, para imediatamente após medir a absorbância a 570 nm em um leitor de microplacas (NovoStar). A absorbância da curva padrão foi ajustada para uma equação da linha e o conteúdo de glicose foi calculado por interpolação dentro da curva ajustada. Quantificação de hemoglobina glicosilada a partir de amostras de soro:

[00104] A quantidade de hemoglobina glicosilada (HbA1c) foi quantificada pelo uso de ELISA sanduíche, de acordo com as instruções fornecidas por seus fornecedores (Abbexa Ltd., Cambridge, Reino Unido), usando uma curva padrão de 0,30125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 e 200 ng / ml de padrão HbA1c. Padrões e padrões de 100 μl e soros não diluídos foram adicionados aos poços de uma placa revestida com um anticorpo contra HbA1c, que foram incubadas durante 90 minutos a 37 °C com agitação. Depois de se rejeitar o conteúdo e lavar 2 vezes com solução de lavagem, foi adicionado 100 μl de um anticorpo de detecção HbA1c conjugado com Biotin, e em seguida, incubada durante 60 minutos a 37 °C com agitação. Depois de se rejeitar o conteúdo e lavar 3 vezes com tampão de lavagem, adicionou-se 100 μl de uma solução de conjugado de Estrepatavidin com Rabinito peroxidase (HRP) a cada poço e incubou-se durante 30 min a 37 °C com agitação. Depois de se rejeitar o conteúdo e lavar 5 vezes com tampão de lavagem, 90 μl de substrato de TMB foi adicionado a cada poço e incubou-se no escuro a 37 °C durante 20 minutos. Finalmente, 50 μl de solução de paragem da reação foi adicionada a cada poço e a absorbância a 450 nm foi quantificada num leitor de microplacas (NOVOSTAR). A absorbância da curva padrão se ajusta a uma linha reta e as absorbâncias das amostras são interpoladas na referida curva. Análise estatística

[00105] Os dados foram verificados quanto à normalidade usando o teste estatístico Kolmogorov-Smirnov e métodos gráficos. Todos os outros valores foram normalmente distribuídos (todos p> 0,05). Portanto, foram utilizados testes t repetidos para comparar os níveis de glicose basais e de acompanhamento usando as diferentes amostras. A análise de regressão linear foi usada para determinar a associação entre a concentração de glicose e diferentes variáveis biológicas e psicológicas e para prever diferentes níveis glicêmicos usando amostras de EGC e HbA1c. As correlações de Pearson foram usadas para determinar associações entre EGC basal e de acompanhamento e diferentes níveis glicêmicos ou entre HbA1c basal e de acompanhamento e diferentes níveis glicêmicos. Foram utilizados os critérios de correlação de Cohen: baixo quando r = 0,1-0,3, moderado quando r = 0,3-0,5 e alto quando r = 0,5-1,0 (J Cohen, 2013). O tempo necessário para analisar cada amostra também foi registrado. O nível de significância foi estabelecido em p <0,05 (bicaudal). Resultados

[00106] Resultados detalhados do questionário sociodemográfico, antropométrico e auto-administrado podem ser encontrados nas tabelas III.1, III.2 e

III.3, respectivamente.

O uso de Trears diminuiu significativamente o tempo necessário para analisar a cera de ouvido, em comparação com o tempo necessário quando a seringa Alexander-Reiner foi usada (comparar as tabelas II.4 e V.1). Todas as concentrações de acompanhamento foram maiores que suas respectivas concentrações de linha de base (Tabela V.2). As amostras de cera de ouvido foram mais estáveis do que os níveis de HbA1c ou glicêmico, uma vez que sua concentração de glicose não foi afetada por nenhuma covariável (Tabela V.3). A idade tem um efeito direto na amostra basal de HbA1c.

Além disso, enquanto um número maior de anos de educação aumentou o acompanhamento dos níveis de HbA1c e PSG, o tabagismo diminuiu os níveis de FSG e PSG (Tabela V.3). Considerando que todas as associações entre EGC e níveis glicêmicos apresentaram correlações positivas altas (todas R> 0,60; p <0,001), as associações HbA1c com diferentes níveis glicêmicos exibiram correlações moderadas ou baixas (todas R <0,50; 0,10 <p <0,01) (Figuras 5, 6, 7 e 8). O acompanhamento HbA1c mostrou uma correlação mais forte com o FSG (R = 0,48, p <0,001) do que a associação entre o HbA 1c inicial e o FSG (R = 0,43, p <0,001) (Figuras 6 e 8). Ambas as associações EGC foram mais fortes que a associação HbA1c.

No entanto, a amostra de EGC de acompanhamento também mostrou uma associação mais forte com PSG (R = 0,90, p <0,001) (Figura 7), do que a amostra de EGC basal com níveis de FSG (R = 71 p <0,001) (Figura 5) . O nível glicêmico médio também mostrou uma associação mais forte com a cera de ouvido do que as amostras de HbA1c (veja as figuras 9, 10 e 11, 12) e, entre elas, a amostra de cera de ouvido pós-prandial também mostrou a associação mais forte com o nível glicêmico médio (R = 0,84, p <0,001) (Figura 11). Tabela V.1: Tempo necessário para analisar amostras diferentes

Tabela V.2: Comparações da linha de base e do tempo de acompanhamento, comparações de glicose, HbA1c e EGC.

Ω: valor p foi obtido usando teste repetido. *: valor p foi significativo em nível 0,05. HbA1c: hemoglobina glicada. FSG: Glicose de Soro de Jejum. PSG: Glicose de Soro Pós- prandial PSS: Escala de Estresse Percebido. RLCQ: Questionário de Eventos de Vida Recentes. HbA1c: Hemoglobina glicada. EGC: Concentração de Glicose em cera de ouvido. FSG: Glicose de Soro de Jejum. PSG: Glicose de Soro Pós-prandial. Φ. Uma unidade de álcool é medida como 10 ml ou 8g de álcool puro. Isto é igual a uma does simples de 25 ml de whisky (álcool por volume (ABV) 40%), ou um terço de uma dose de cerveja (ABV 5-6%) ou metade de um copo padrão (175 ml) de vinho tinto (ABV 12%). ξ: em comparação com escolaridades sub ou de pós graduação.

[00107] Veja as figuras 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12 Tabela V.4: Modelos de regressão linear entre a linha de base, o acompanhamento e os valores médios das amostras de jejum, pós-prandial e HbA1c e FSG, PSG e níveis glicêmicos médios EGC: Concentração de Glicose em cera de ouvido. FSG: Glicose de Soro de Jejum. PSG: Glicose de Soro Pós-prandial. HbA1c: Hemoglobina glicada. As médias de EGC, glicêmica e HbA1c foram calculadas como a média entre sua linha de base e a amostra de acompanhamento. *: valor p significativo em 0,05 Discussão

[00108] Verificou-se que todas as concentrações de acompanhamento, utilizando amostras glicêmicas, HbA1c e EGC, foram significativamente maiores que suas respectivas concentrações basais, confirmando que o estudo foi realizado adequadamente. A cera do ouvido era uma amostra mais estável do que as amostras de HbA1c e glicêmicas, uma vez que seus níveis de glicose não foram afetados por nenhuma covariável. Enquanto todas as associações entre EGC e os níveis de glicemia mostrou elevados coeficientes de correlação positivos (todos de P> 0,60; p <0,001), associações de HbA1c entre ambos os níveis de glicemia única exibiram correlações moderadas ou baixas (todos os grupos R <0,50; 0,10 <p <0,01). Ambas as medidas de EGC e HbA1c de acompanhamento mostraram que a correlação mais forte com a correlação de PSG encontrada foi entre o EGC de acompanhamento e PSG (R = 0,90, p <0,001 e R = 0,48, p <0,01, respectivamente). No entanto, o maior aumento nos níveis glicêmicos foi previsto pelo EGC da linha de base e pela HbA1c (β = 13,2, p <0,001; β = 11,7, p <0,01, respectivamente.

[00109] Houve resultados anteriores corroborados que indicam que a força da associação entre HbA1c usando níveis glicêmicos em jejum ou pós-prandial é muito modesta em pessoas saudáveis (van 't Riet et al., 2010). Isso pode ser explicado pelo lado moderado da amostra ou porque a HbA1c normalmente mostra uma associação aumentada em pessoas que aumentaram os níveis de glicose, como as observadas em pacientes diabéticos (van 't Riet et al., 2010).

[00110] É importante destacar que o período em que o EGC da linha de base não é completamente comparável à sua amostra de acompanhamento, uma vez que representaram diferentes períodos de acúmulo de glicose por cera de ouvido. De fato, o projeto do estudo apenas nos permitiu, antes da realização de uma limpeza inicial do ouvido externo, padronizar a quantidade de cera de ouvido secretada nas amostras de acompanhamento. Pode ser possível que alguns episódios anteriores de atividade física intensa ou alguns eventos estressantes tenham aumentado momentaneamente a amostra inicial de EGC. Nesse sentido, o EGC da linha de base pode representar o acúmulo a longo prazo de vários episódios de níveis glicêmicos em jejum e pós- prandiais. No entanto, o fato de o maior aumento na média dos níveis glicêmicos ter sido previsto não apenas pela medida basal de HbA1, mas também pelo EGC basal, sugere que o EGC representa melhor a concentração média de glicose, em vez de sua concentração em jejum ou pós-prandial. É sabido que a HbA1c é influenciada principalmente pelo FSG, e não pelo PSG, devido ao fato de as pessoas passarem mais tempo em jejum do que comer durante o dia (Monnier et al., 2006). De fato, o EGC da linha de base também pode ser influenciado principalmente pelos níveis de glicose em jejum, uma vez que a concentração de glicose foi menor que a amostra de cera de ouvido de acompanhamento (p <0,01).

[00111] A cera de ouvido é certamente melhor que a HbA1c para refletir os níveis de glicose. Não apenas porque todas as correlações entre EGC e níveis glicêmicos foram muito mais fortes do que os coeficientes de correlação observados entre HbA1c e níveis de açúcar no sangue, mas também porque a correlação entre o EGC de acompanhamento e PSG mostrou uma associação mais forte (R = 0,90; p <0,001 ) do que a relação entre o EGC da linha de base e o FSG (R = 0,71; p <0,001). Portanto, um EGC de base que cubra exclusivamente um período de jejum pode exibir uma associação ainda maior do que a correlação observada entre o EGC de acompanhamento e os diferentes níveis glicêmicos.

[00112] Houve resultados anteriores corroborados que indicam que os níveis de HbA1c são afetados pela idade. A HbA1c também foi afetada pelo nível de educação. É bem provável que o tipo de trabalho realizado possa explicar isso. Foi demonstrado que esses trabalhos que exigem uma área de alto nível educacional também estão associados ao aumento do horário de trabalho (Uehata, 1991) que, por sua vez, também estão associados ao aumento da HbA1c (Azami et al., 2018). Também foram verificados resultados anteriores que indicam que o tabagismo diminuiu o FSG e o PSG. Por outro lado, a cera de ouvido também foi uma amostra mais estável, pois seus níveis de cortisol não eram afetados por nenhuma covariável. Os resultados obtidos sugerem que o próximo passo deve ser iniciar o teste de EGC entre pacientes diabéticos e obesos.

[00113] Alguns estudos anteriores usaram a área sob a curva, em vez da média entre os níveis de glicose em jejum e pós-prandial para estimar a concentração média de glicose (Avignon et al., 1997). No entanto, a média entre os níveis glicêmicos em jejum e pós-prandial também demonstrou ser um índice muito preciso. De fato, Svendson e colaboradores descobriram que os níveis médios de glicose derivados de aproximadamente 2 a 300 medições em cada um dos 18 pacientes com diabetes tipo 1 se correlacionaram quase perfeitamente (R = 0,96) com a HbA1c (Aaby Svendsen et al., 1982). Ozmen et al descobriram que os níveis glicêmicos plasmáticos médios derivados dos níveis de glicose plasmática em jejum e pós-prandial também se correlacionam fortemente com a HbA1c em pacientes diabéticos tipo 2 (Ozmen et al., 2006). Recentemente, a média entre os níveis glicêmicos pós-prandial e em jejum também foi utilizada em mulheres com diabetes mellitus gestacional (Koren et al., 2016). Portanto, esse índice pode se correlacionar ainda melhor com os níveis glicêmicos médios em pessoas saudáveis, uma vez que seus níveis de glicose no sangue em 24 horas variam menos do que em pacientes diabéticos (Praet et al., 2006).

[00114] Diferenças interindividuais relacionadas à capacidade dos participantes de absorver diferentes componentes das refeições também podem afetar seus níveis de glicose (Freckmann et al., 2007). É por isso que alguns estudos usam o teste de tolerância à glicose após a ingestão de 75 g de glicose, em vez de níveis pós-prandiais após uma refeição padronizada (Ensure), que contém vários nutrientes, como proteínas, lipídios e glicose, que podem ter diferentes taxas de absorção, variando o nível final do PSG. No entanto, usamos um teste amplamente utilizado, fornecendo uma refeição líquida que é fácil de absorver. Além disso, houve participantes excluídos com alergias alimentares, como intolerância à lactose.

[00115] No que diz respeito às diferenças no nível de glicose no sangue entre plasma e soro, alguns estudos relataram que a glicose plasmática é maior que a glicose sérica, enquanto outros estudos não encontraram diferença. No entanto, a medição de glicose no soro não é recomendada para o diagnóstico de diabetes (American Diabetes Association, 2010). No entanto, não foram usados os níveis de FSG ou PSG para fazer qualquer diagnóstico, pois foi recrutada uma amostra de participantes saudáveis para investigar seus níveis de glicose usando amostras diferentes.

[00116] Para concluir, a cera de ouvido é mais precisa que as amostras glicêmicas e HbA1c para refletir os níveis médios de glicose, porque é uma amostra mais estável e sua concentração de glicose previu melhor a concentração média de glicose, em vez dos níveis de jejum ou pós-prandial. Medição dos níveis de cortisol usando amostra de cera

[00117] Antecedentes: O diagnóstico depressivo é considerado menos do que totalmente confiável. Isso pode ser explicado pela grande heterogeneidade dessa síndrome. Um biomarcador preciso pode melhorar a consistência desse diagnóstico. O nível de cortisol normalmente é medido na depressão, uma vez que é uma alteração neurobiológica frequente nessa síndrome. No entanto, os resultados de cortisol usando amostras de curto prazo têm sido muito divergentes, devido ao perfil de secreção reativa de cortisol. Essas amostras são inadequadas para refletir a concentração média de cortisol, porque várias influências agudas afetam seus níveis de cortisol. A concentração de cortisol no cabelo (HCC) pode refletir com precisão os níveis de cortisol a longo prazo, porque acumula o hormônio por longos períodos. No entanto, seu amplo uso parece irrealista. Além disso, não está completamente claro se algumas influências agudas variam o HCC. A concentração de cortisol na cera do ouvido (ECC) pode ser uma amostra mais conveniente e precisa para refletir a concentração média de cortisol.

[00118] Métodos: Os ouvidos de 37 participantes saudáveis foram limpos durante uma visita inicial. Um mês depois, as ECC foram analisadas no ouvido direito dos participantes. Durante a visita de acompanhamento, os participantes também forneceram 1 cm de cabelo que representava o mês retrospectivo de acúmulo de cortisol. ECC e HCC foram comparados e correlacionados entre eles.

[00119] Resultados: O ECC foi significativamente maior que o HCC (P <0,001). ECC e HCC apresentaram associação positiva moderada significativa (R = 0,39; p = 0,03). Enquanto homens tiveram HCC aumentado em relação às mulheres (p <0,001), a ECC não foi afetada por sexo.

[00120] Conclusão: A ECC pode constituir outra amostra que reflete com precisão a concentração média de cortisol. Em comparação com os cabelos, a cera de ouvido acumula maiores concentrações de cortisol. A cera de ouvido também foi um espécime mais estável, uma vez que seus níveis de cortisol não foram afetados por nenhuma covariável. Por fim, o tempo necessário para analisar o ECC foi significativamente menor que o tempo necessário para analisar o HCC. Objetivos e Hipótese:

[00121] Embora tenha sido descoberto recentemente que esse hormônio é detectável nessa secreção (Herane-Vives & Benohr, 2018), não se sabe se o nível encontrado representava a concentração média de cortisol. Por esse motivo, neste estudo, foram correlacionados a concentração de cortisol de cera de ouvido (ECC) e o HCC em uma amostra de 37 participantes saudáveis. A hipótese foi de que: 1) O tempo necessário para analisar o ECC seria menor que o tempo necessário para analisar o HCC, 2) O ECC seria maior que o HCC, 3) O ECC e o HCC se correlacionariam positivamente entre si e, 4) As covariáveis de cortisol capilar e de curto prazo não afetariam a ECC. Métodos:

[00122] Os níveis de cortisol que foram obtidos na amostra de cera de acompanhamento do lado direito foram comparados e correlacionados e foi formada uma amostra de cabelo de 1 cm, obtida também durante a mesma visita. Ambas as amostras representaram o mês retrospectivo de acúmulo de cortisol. O efeito de várias covariáveis foi investigado nessas amostras. O tempo necessário para analisar o ECC também foi registrado. Amostra de cera usando Trears: (veja o diagrama 1 das instruções) Análise de cortisol em cera:

[00123] A purificação do cortisol a partir de cera: Após a obtenção das amostras de cerume pelo dispositivo Tears ®, as amostras ressuspensas em 500 μl de PBS foram homogeneizadas utilizando uma seringa de 1 ml. Em seguida, 500 μl de éter dietílico foram adicionados e cada uma das amostras foi agitada por 1 minuto usando um vórtice e depois deixada a -20 °C por 2 horas. Após esse tempo, a fração líquida de cada uma das amostras (fração orgânica) foi transferida para um novo tubo de 5 ml devidamente rotulado e seco usando o método de deslocamento de N2 descrito acima. Depois de secas, as amostras foram ressuspensas em 500 μl de PBS e os níveis de cortisol foram quantificados. Por outro lado, a fração aquosa que permaneceu após a extração com éter dietílico foi utilizada para quantificar os níveis de glicose no cerume.

[00124] Quantificação de cortisol a partir de amostras de cera: a quantidade de cortisol foi quantificada pelo uso de ELISA, de acordo com as instruções fornecidas por seus fornecedores (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, EUA). A quantidade de cortisol foi quantificada por técnicas ELISA colorimétricas competitivas, usando uma curva padrão de 0, 156, 313, 625, 1250, 2500, 5000 e 10000 pg / ml de Cortisol Standard.

[00125] 100 μl de soluções-padrão, frações das amostras orgânicas e diluições de soros foram adicionados aos poços de uma placa revestida com um anticorpo anti- camundongo. Além das soluções acima mencionadas, 50 μl de um conjugado contendo azul cortisol covalentemente ligado a uma fosfatase alcalina e 50 μl de um anticorpo monoclonal de camundongo contra cortisol são adicionados a todos os poços. Depois que o anticorpo é adicionado, eles são incubados por 2 horas com agitação, a fim de fazer o cortisol presente nas amostras / padrões competir com o cortisol do conjugado com o anticorpo contra o hormônio e este anticorpo permanecerá ligado ao poço por sua interação com o anticorpo. O anticorpo secundário aderiu às paredes dos poços. Após 2 horas, os poços são cuidadosamente lavados e 200 μl de para-nitrofenil-fosfato (pNPP) foram adicionados a cada poço e incubou-se durante 1 hora sem agitação. Isto é para que o para-nitrofenil-fosfato seja transformado por uma reação enzimática mediada por fosfatase alcalina ligada covalentemente ao cortisol em para-nitro fenol e com uma coloração inversamente proporcional à quantidade de cortisol presente. Finalmente, 50 μl de uma solução para parar a reação enzimática foram adicionados a cada poço. A placa é lida a 405 nm em um leitor de microplacas (NovoStar), a absorbância da curva padrão é ajustada para uma curva logística de 4 pontos e as absorbâncias das amostras são interpoladas na referida curva, obtendo a concentração das amostras em pg / ml. Para o cálculo da pg / mg de cerume, a concentração é multiplicado pelo μI de amostra (500 μl) e dividido pelo peso da amostra seca. Para calcular a concentração no soro, foi multiplicada a concentração pelo fator de diluição. Amostras de cabelo

[00126] Um clínico treinado coletou amostras de cabelo de todos os participantes. A presença e a frequência de quaisquer fatores de confusão e procedimentos biológicos que potencialmente afetem os níveis de cortisol capilar foram medidos, incluindo tratamentos cosméticos (tingimento, clareamento, alisamento ou ondulação permanente) e frequência de lavagem dos cabelos. Amostras de cabelo foram retiradas do vértice na parte de trás da cabeça e cortadas com tesoura limpa o mais próximo possível do couro cabeludo. Para este estudo, foram necessárias quatro mechas de cabelo de diferentes locais do vértice posterior, cada uma com a espessura aproximada de uma tira de elástico de 1 centímetro. No laboratório, 1 cm de cabelo medido do final da superfície do couro cabeludo foi cortados de cada mecha, representando aproximadamente 1 mês de crescimento de cabelo equivalente à avaliação retrospectiva de 1 mês da produção de cortisol. O peso total dos quatro segmentos de 1 cm de cada mecha é aproximadamente equivalente a 25-50 mg de cabelo. Uma vez coletadas, as amostras de cabelo foram armazenadas à temperatura ambiente no escuro, em um recipiente fechado. Análise de cortisol capilar

[00127] Antes da análise, as amostras de cabelo foram lavadas em 1 ml de isopropanol para remover contaminantes externos, o isopropanol foi removido do frasco e o cabelo foi deixado secar em ambiente de ar limpo por 48 horas. Uma vez completamente secas, cinco bolas de cerâmica foram adicionadas a cada tubo e as amostras de cabelo foram moídas em pó usando um MPbio Fast Prep (MP Biomedicals, LLC). Para extrair cortisol, 1,75 ml de metanol foram adicionados a cada amostra e as amostras foram incubadas por 20 horas enquanto giravam as amostras constantemente.

[00128] Os cabelos, metanol e bolas de cerâmica foram decantados em um tubo de polipropileno (Sarstedt AG & Co, Alemanha) que separou as bolas de cerâmica do restante da mistura. O tubo foi centrifugado a 3000 RCF para separar o cabelo moído e o metanol e decantou-se 1,25 ml do sobrenadante transparente de metanol em um criotubo de polipropileno de 2 ml. O metanol foi então removido usando uma centrífuga a vácuo (Scan Speed 40, Labgene) e os tubos congelados a -80 °C até serem necessários para o cortisol ELISA. Os níveis de cortisol foram determinados usando um ELISA competitivo comercialmente disponível (Salimetrics LLC, EUA). As amostras foram descongeladas e reconstituídas com 0,125 ml de diluente de ensaio Salimetrics cortisol e as amostras foram então analisadas de acordo com o protocolo do fabricante. Os resultados foram expressos em picogramas de cortisol por miligrama de cabelo. Todas as amostras de cabelo foram analisadas no Biomarker Analysis Laboratory da Anglia Ruskin University, Cambridge, Reino Unido (www.anglia.ac uk) (Albermann & Musshoff, 2012). Análise estatística

[00129] Os dados foram verificados quanto à normalidade usando o teste estatístico Kolmogorov-Smirnov e métodos gráficos, como histogramas; Os valores de ECC e HCC foram normalmente distribuídos. Portanto, foi usado o (teste t dependente) para amostras dependentes para comparar ECC e HCC. As correlações de Pearson foram usadas para determinar a associação entre HCC e ECC. Foram utilizados os critérios de correlação de Cohen: baixo quando r = 0,1-0,3, moderado quando r = 0,3-0,5 e alto quando r = 0,5-1,0 (J Cohen, 2013). A análise de regressão linear foi utilizada para determinar a associação entre a concentração de glicose e diferentes variáveis biológicas e psicológicas. O tempo necessário para analisar o ECC também foi registrado. O nível de significância foi estabelecido em p <0,05 (bicaudal). Resultados

[00130] Resultados detalhados do questionário sociodemográfico, antropométrico e autoadministrado podem ser encontrados nas tabelas III.1, III.2 e III.3, respectivamente. O tempo necessário para analisar o ECC usando Trears foi metade do tempo necessário para analisar o ECC usando a seringa Alexander-Reiner (compare as tabelas II.4 e VI.1). O tempo necessário para analisar o ECC usando Trears foi mais de 4 vezes menor que o tempo necessário para analisar o HCC (tabela VI.1). O ECC foi significativamente maior que o HCC (Tabela VI.2). Embora os homens tenham o HCC aumentado em comparação às mulheres (P <0,001) (tabela VI.3), o sexo não afetou a ECC. O ECC mostrou uma correlação positiva moderada com o HCC (R = 0,39, p = 0,003) (Figura 13) Tabela VI.1: Tempo necessário para analisar o ECC Tempo de quantificação PROCESSO Cortisol usando PROCESSO Cabelo

TEARS Centrifugação da amostra 00:00 Tempo Técnico 0:26 Secagem da amostra 00:47 incubação 24:00 usando N2 antes da extração Extração da amostra com 02:10 Tempo de 3:00 solvente orgânico evaporador de rotação Secagem da amostra após 00:40 Total, 27:26 extração Tempo de processamento Protocolo de 04:00 quantificação Tempo técnico 0:06 (horas) Centrifugação 0:25 Tempo de robô 4:00 Total, análise 4:31 TEMPO TOTAL 07:37 31:57 : Esses valores foram obtidos graças à cortesia de Bristow, M. BIOMARKER ANALYSIS LABORATORY QUOTATION AT ANGLIA RUSKIN ENTERPRISE (2017), Cambridge.

Tabela VI.2: Comparações HCC e ECC

ECC: Concentração de Cortisol de Cera de Ouvido; HCC: Concentração de Cortisol Capilar. *: valor p significativo em 0,05 Tabela VI.3: Modelo de regressão linear entre covariáveis e HCC e entre covariáveis e

ECC PSS: Escala de Estresse Percebido. RLCQ: Questionário de Eventos de Vida Recentes. φ. Uma unidade de álcool é medida como 10 ml ou 8g de álcool puro. Isto é igual a uma does simples de 25 ml de whisky (álcool por volume (ABV) 40%), ou um terço de uma dose de cerveja (ABV 5-6%) ou metade de um copo padrão (175 ml) de vinho tinto (ABV 12%). ξ: em comparação com escolaridades sub ou de pós graduação. Ver a Figura 13. Discussão:

[00131] O ECC usando Trears foi significativamente mais eficiente do que a seringa Alexader-Reiner. Esse desempenho é ainda melhor se compararmos o tempo necessário para analisar o HCC. A cera do ouvido concentrou significativamente mais concentração de cortisol do que o cabelo. A cera do ouvido também é um espécime mais estável do que o cabelo para refletir os níveis de cortisol, uma vez que não foi afetado por nenhuma covariável. De fato, foram corroborados estudos anteriores que indicam que os homens aumentaram o HCC em comparação com as mulheres (Garcia- Leon et al., 2018; Vanaelst et al., 2012).

[00132] O cabelo é outra amostra capaz de acumular a concentração de cortisol, pois mostrou uma correlação positiva com uma amostra que já foi validada para medir os níveis de cortisol a longo prazo. Esta propriedade foi reforçada após observar que este novo espécime não foi afetado por nenhuma influência aguda. O ECC pode mostrar uma correlação aumentada com a coleta de urina por 24 horas ou com níveis contínuos de cortisol, uma vez que algumas evidências sugerem que o HCC é afetado por influências agudas, como suor (Sharpley, 2012) e fibras nervosas (Okumura, 1967).

[00133] A cera de ouvido acumula maior concentração de cortisol do que o cabelo. O cortisol é indiretamente entregue no eixo do cabelo por um modelo de compartimento múltiplo pouco claro. No entanto, o cortisol é secretado diretamente no canal auditivo externo pelo modelo simples de compartimento único, fornecido pelas glândulas ceruminosas. Uma limitação potencial está relacionada às comparações de ECC / HCC. Embora este estudo tenha utilizado a mesma amostra de participantes, seus resultados não foram estritamente comparáveis porque essas amostras foram analisadas em dois laboratórios diferentes. Clark et al., (1998) mostraram, por exemplo, razões de viés significativas de até 1,2 entre cinco imunoensaios diferentes em controles submetidos a um teste padrão de corticotrofina (Jeremy Cohen et al., 2006). No entanto, encontramos uma relação ECC / HCC até 14,3. Além dessa fração extremamente grande, os dois laboratórios usaram técnicas de ELISA. Portanto, é extremamente improvável que a diferença tenha sido encontrada por acaso. Estudos futuros podem correlacionar a ECC com os níveis de cortisol nas unhas, outra amostra que pode agregar níveis de cortisol a longo prazo (Izawa et al., 2015). Por fim, o ECC deve ser medido entre pacientes depressivos. Conclusão:

[00134] Trears pode constituir um método mais econômico, conveniente e eficaz para a autolimpeza dos ouvidos externos em pessoas saudáveis.

Este dispositivo também pode substituir o uso de hastes de algodão de risco atuais.

As amostras de cera refletem com precisão uma média dos níveis de cortisol e glicose.

Influências agudas comuns não afetam os níveis de glicose e cera de cortisol.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para medir os níveis de glicose e cortisol na cera do ouvido, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: extrair amostras de cera do ouvido por qualquer meio adequado; preparar amostras de cera do ouvido para a medição dos níveis de cortisol e glicose, de acordo com os métodos de medição; medir cortisol e glicose usando quaisquer meios ou métodos conhecidos, em que os níveis de cortisol e glicose são interpretados como os níveis médios de cortisol e glicose.

2. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: a extração da cera é realizada com uma seringa Reiner-Alexander dos ouvidos externos; a preparação das amostras é realizada por: a) secagem das amostras de cera de ouvido até toda a água evaporar da amostra, em que esta etapa também pode ser feita usando liofilização; b) pesagem das amostras de cera de ouvido seca que permitem normalizar a quantidade de cortisol em peso seco, em que normalizar significa que o peso medido é ajustado em uma balança comum para poder comparar os dados; c) homogeneização das amostras secas com 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para obter uma solução de cera em PBS, em que a quantidade de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pode ser de 10 volumes em peso de cerume, por exemplo, para 100 g de cerume, são utilizados 1000 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS), e qualquer solvente hidrofílico pode ser utilizado, como com soro fisiológico; d) divisão da solução obtida na etapa c) em uma primeira porção de solução e uma segunda porção de solução e adicionar cada porção de solução a um tubo respectivo;

e) adição de um solvente à primeira porção da solução em uma relação de 1:1 entre o PBS e a primeira porção da solução, a fim de obter uma solução de cera em PBS misturada com solvente; f) agitação do tubo contendo a solução obtida na etapa e) durante um período de pelo menos um minuto para misturar a solução obtida na etapa f) e adicionar 0,5 mg de éter dietílico após ressuspensão, sendo a relação com PBS 1:1; g) resfriamento da solução mista obtida na etapa g) a uma temperatura de -18 a -21 °C, preferencialmente -20 °C durante um período de pelo menos duas horas, a fim de garantir que a parte líquida esteja congelada e não contamina a fração orgânica, para extrair os compostos que são especificamente solubilizados em éter dietílico, como o cortisol, em que, enquanto a fração éter dietílico permanece líquida a -20 °C, a fração fosfato congela; h) extração da solução arrefecida em que os compostos que são especificamente solubilizados em éter dietílico; i) secagem da fração restante da solução líquida; j) armazenamento da fração seca obtida na etapa i) a -80 °C para uso posterior; k) adição de 300 pg de cortisol à segunda porção da solução, a fim de obter uma solução de cera em PBS misturada com cortisol; l) adição de 0,5 ml de um solvente à solução obtida no passo k) para quantificar a quantidade de cortisol purificado; m) agitação do tubo contendo a solução obtida na etapa I) durante um período de tempo de pelo menos um minuto para misturar a solução obtida na etapa m) e adicionar 0,5 mg de éter dietílico após ressuspensão, sendo a relação com PBS 1:1; n) resfriamento da solução mista obtida na etapa m) a uma temperatura de - 18 a -21 °C, preferencialmente -20 °C, durante um período de pelo menos duas horas, para garantir que a parte líquida esteja congelada, e não contamina a fração orgânica; o) extração, a partir da solução arrefecida, dos compostos que são especificamente solubilizados em éter dietílico;

p) secagem da fração restante da solução líquida; q) armazenamento da fração seca obtida na etapa i) a uma temperatura entre cerca de -20 a -90 °C para uso posterior; r) dissolução de 0,5 ml de 300 pg / ml de solução purificada de cortisol em PBS a um pH entre cerca de 6,8 e 7,2, em que esta etapa é realizada na tentativa de obter a eficiência do protocolo de extração de cortisol com cera de ouvido; s) realizar o mesmo procedimento usado para a primeira porção da solução e para a segunda porção da solução extrair cortisol dela; em que a medição de cortisol é realizada por: a) reconstituição das amostras extraídas usando um ensaio de tampão fornecido pelo fabricante, que permite a quantificação de cortisol, utilizando técnicas ELISA competitivas colorimétricas, adicionando o tampão às amostras extraídas para obter uma solução, deixar a solução descansar e agitar a solução; b) uso de uma curva padronizada para os níveis de cortisol - leitor de microplacas (NovoStar) - para medir a quantidade total de cortisol na amostra; c) normalização da quantidade quantificada por gramas secas de cera de ouvido usando técnicas fluorométricas nas quais o fluorômetro é excitado dentro de um intervalo de 530-570 nm e lido dentro de um intervalo de emissão de 590-600 nm, em que várias variáveis, como idade, sexo, diferentes condições médicas e níveis de estresse, podem afetar os níveis de cortisol na cera do ouvido, sendo utilizado o nível de colesterol, que não é afetado pelas variáveis acima mencionadas, evitando confundir os resultados de cortisol pelas covariáveis anteriores; e a medição da glicose é realizada usando o Kit SERA-PAK PLUS (Bayer Healthcare) para os níveis de glicose da solução de cera dissolvida, seguindo as instruções do fabricante, em que as absorções de glicose são quantificadas em triplicado a 505 nm e a concentração de glicose (mg / dl ) é obtido usando suas médias de absorção e a quantidade total de glicose na solução dissolvida é calculada de acordo com o peso inicial das amostras após um processo de normalização.

3. Método para medir os níveis de glicose e de cortisol, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que na etapa a), a cera de ouvido é seca por meio de um vapor de N2 à temperatura ambiente.

4. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que na etapa a) a cera de ouvido é seca usando liofilização.

5. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que na etapa e) o solvente compreende éter dietílico.

6. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que na etapa i) a fração restante da solução líquida é seca por meio de um vapor de N2 à temperatura ambiente.

7. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que na etapa I) o solvente compreende éter dietílico.

8. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que na etapa p) a fração restante da solução líquida é seca por meio de um vapor de N2 à temperatura ambiente.

9. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que na etapa a) da medição de cortisol, a solução é deixada em repouso por um período de tempo de 20 minutos.

10. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que na etapa a) da medição de cortisol, a solução é agitada durante um período de tempo de 1 minuto.

11. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: a extração da cera de ouvido é realizada por meio de um dispositivo de extração que compreende: uma alça com uma primeira e uma segunda extremidade, tendo a referida segunda extremidade meios de acoplamento;

uma cabeça de esponja removível (ponta) compreendendo uma base e um membro alongado que se estende longitudinalmente diretamente, dependendo de uma porção superior da base, em que a porção inferior da base tem meios de acoplamento para receber os meios de acoplamento da alça, e em que o membro alongado tem uma seção transversal em forma de estrela; uma esponja alongada tendo um alojamento longitudinal localizado centralmente para receber o membro alongado da base; em que a cera de ouvido é obtida inserindo a ponta com a esponja na orelha e girando a esponja dentro do canal auditivo; a preparação da amostra é realizada: adicionando uma solução tampão de PBS a um tubo; a esponja é separada do seu suporte plástico e introduzida no tubo; depois que a esponja absorveu toda a solução, a esponja é repetidamente espremida e absorvida; espremer a esponja e removê-la do tubo; secar a solução resultante; ressuspender o conteúdo resultante em água ultrapura; e armazenar a solução resultante até o uso; e os níveis de cortisol são medidos por meio de técnicas ELISA e os níveis de glicose são medidos por meio de um Kit SERA-PAK PLUS (Bayer Healthcare) para os níveis de glicose da solução de cera dissolvida, seguindo as instruções do fabricante.

12. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que, na preparação da amostra, a proporção entre o peso da esponja e o volume de PBS é de 1:2.

13. Método para medir os níveis de glicose e de cortisol, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que na preparação da amostra, a solução resultante é seca por deslocamento com N2 .

14. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que na preparação da amostra, a solução resultante é armazenada a 4 °C.

15. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de extração tem as seguintes características adicionais:

os meios de acoplamento do manípulo compreendem um fio; e os meios de acoplamento da base compreendem um alojamento que inclui um padrão rosqueado interno para receber a rosca da alça.

16. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de extração tem as seguintes características adicionais: o membro alongado tem uma seção transversal em forma de estrela, o que melhora a extração da cera de ouvido ao esfregar a esponja dentro da orelha; o alojamento longitudinal localizado centralmente tem uma seção transversal em forma de estrela para receber o membro alongado da base;

17. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de extração tem a seguinte característica adicional: a esponja é feita de celulose.

18. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de extração tem a seguinte característica adicional: a esponja é colada ao membro alongado usando uma cola não alergênica.

19. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de extração tem a seguinte característica adicional: a base é mais larga que a alça, atuando como um freio de segurança que impede a introdução da ponta dentro do canal auditivo.

20. Método para medir os níveis de glicose e de cortisol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de extração tem a seguinte característica adicional: a esponja é embalada e selada em condições molhadas para mantê-la macia usando um humidificador que compreende cloreto de magnésio (MgCl2 ).

21. Método para medir os níveis de glicose e cortisol, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de extração tem a seguinte característica adicional: a cera é obtida inserindo a ponta com a esponja na orelha e girando a esponja dentro do canal auditivo por cerca de 30 a 60 segundos.

22. Dispositivo para extração de cera de ouvido, caracterizado pelo fato de que compreende: uma alça com uma primeira e uma segunda extremidade, tendo a referida segunda extremidade meios de acoplamento; uma cabeça de esponja removível (ponta) compreendendo uma base e um membro alongado que se estende longitudinalmente diretamente, dependendo de uma porção superior da base, em que a porção inferior da base tem meios de acoplamento para receber os meios de acoplamento da alça e em que o membro alongado tem uma seção transversal em forma de estrela; uma esponja alongada tendo um alojamento longitudinal localizado centralmente para receber o membro alongado da base; em que a cera de ouvido é limpa de um ouvido inserindo a ponta com a esponja na orelha e girando a esponja dentro do canal auditivo.

23. Dispositivo para extração de cera de ouvido, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que: os meios de acoplamento da alça compreendem uma rosca; e os meios de acoplamento da base compreendem um alojamento que inclui um padrão rosqueado interno para receber a rosca da alça.

24. Dispositivo para extração de cera de ouvido, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que: o membro alongado tem uma seção transversal em forma de estrela, o que melhora a extração da cera de ouvido ao esfregar a esponja dentro do ouvido; o alojamento longitudinal localizado centralmente tem uma seção transversal em forma de estrela para receber o membro alongado da base;

25. Dispositivo para extração de cera de ouvido, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a esponja é feita de celulose.

26. Dispositivo para extração de cera de ouvido, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a esponja é colada ao elemento alongado usando uma cola não alergênica.

27. Dispositivo para extração de cera de ouvido, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a base é mais larga que a alça, atuando como um freio de segurança que impede a introdução da ponta no interior do canal auditivo.

28. Dispositivo para extração de cera de ouvido, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a esponja é embalada e selada em condição úmida para mantê-la macia usando um umidificador.

29. Dispositivo para a extração de cera de ouvido, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a esponja é embalada e selada em condições molhadas para mantê-la macia usando um humidificador que compreende cloreto de magnésio (MgCl2 ).

30. Dispositivo para extração de cera de ouvido, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a cera de ouvido é obtida inserindo a ponta com a esponja na orelha e girando a esponja dentro do canal auditivo por cerca de 30 a 60 segundos.