BR112020004221A2 - célula dendrítica pró-inflamatória, composição farmacêutica, e, método para prover células dendríticas pró-inflamatórias - Google Patents
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Abstract
É descrita uma célula dendrítica pró-inflamatória com capacidade melhorada de ativar células T alogênicas através da via direta de alorreconhecimento. A célula dendrítica é infectada com um adenovírus. Adicionalmente, a célula dendrítica pró-inflamatória foi obtida: - provendo uma célula dendrítica imatura; - infectando a célula dendrítica com um adenovírus; e - maturando a célula dendrítica imatura em uma célula dendrítica pró-inflamatória pela adição do ligante do receptor tipo Toll 3 (TLR3) poli-I:C, um ligante de TLR7/8, tal como Resiquimod, e interferon gama (IFN-¿) para induzir maturação da célula dendrítica imatura.
Description
1 / 41 CÉLULA DENDRÍTICA PRÓ-INFLAMATÓRIA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODO PARA PROVER CÉLULAS DENDRÍTICAS PRÓ-INFLAMATÓRIAS
[001] A presente invenção se refere a células dendríticas pró- inflamatórias com capacidade de ativar células T alogênicas através da via direta de alorreconhecimento, bem como ao uso de tais células dendríticas pró-inflamatórias no tratamento de câncer.
[002] Terapias de câncer tradicionais, tais como cirurgia, radiação e quimioterapia, são frequentemente insuficientes no tratamento de pacientes com câncer e normalmente causam efeitos colaterais graves. A imunoterapia tem se mostrado promissora como um método para tratamento alternativo com menos efeitos colaterais negativos.
[003] A imunoterapia de câncer tem feito enorme progresso recentemente graças à introdução de anticorpos de bloqueio de ponto de verificação, em particular, anticorpos que bloqueiam PD-1 (proteína de morte celular programada 1) e interações de ligante de PD-1 (PD-L1). Entretanto, apenas uma fração de pacientes com câncer se beneficia desse tratamento. Adicionalmente, ele é eficaz apenas contra certas formas de câncer. Como ainda há ambiente para melhoria no campo, imunoterapias de câncer evoluem para que sejam mais eficientes e robustas.
[004] É bem estabelecido atualmente que o sistema imune tem células, particularmente linfócitos T citotóxicos CD8+ (CTLs), que podem reconhecer e potencialmente exterminar células tumorais. No entanto, um grande problema é que a capacidade exterminadora dessas células T ou não é induzida ou é apenas fracamente induzida em pacientes com câncer. Uma possibilidade é que haja apresentação e coestimulação de antígeno tumoral inadequadas por células dendríticas (DCs) para elicitar uma imunidade de
2 / 41 célula T funcional e específica do tumor em pacientes com câncer. Assim, é de interesse desenvolver estratégias de imunoterapia para “ligar” o sistema imune para que o mesmo reconheça e extermine células tumorais.
[005] As estratégias de imunoterapia de câncer existentes, envolvendo ativação de linfócitos T citotóxicos CD8+ (CTLs), têm focado principalmente em DCs derivadas de paciente autólogas carregadas com antígeno, que foram diferenciadas e carregadas com antígeno ex vivo. A premissa fundamental dessa abordagem é que a eficiência e controle providos pela manipulação ex vivo das DCs gera DCs com forte apresentação de antígeno e capacidade coestimulatória. A qualidade da resposta da célula T depende da capacidade de essas DCs autólogas apresentarem antígenos de tumor para células T de uma maneira restrita a MHC (DCs e células T têm de ser do mesmo indivíduo, isto é, autólogas) na drenagem de linfonodos e assim criarem uma resposta da célula T específica do tumor.
[006] As células dendríticas modificadas ex vivo derivadas de paciente (DCs) visam induzir imunidade de célula T específica do tumor pela educação direta de células T contra antígenos associados ao tumor, ou específicos do tumor. Embora prova de princípio tenha sido observada para vacinas de DCs autólogas em diversos estudos clínicos, as respostas clínicas são ainda subideais (Anguille, S., et al. 2014. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy . Lancet Oncol 15: e257-267). Resultados clínicos variáveis adicionais parecem correlacionar com o estado de ativação das DCs de vacina, assim o consenso no campo no momento aciona processos de otimização e padronização para a produção de intensificadores imunes capazes de induzir respostas imunes polarizadas tipo 1 auxiliar T (Th1) mediadas por DC.
[007] Interessantemente, no entanto, recentes revelaçãos indicam que a DCs de vacina modificadas ex vivo atualmente exigem ajuda de DCs espectadoras endógenas para iniciar imunidade específica de célula T CD8+
3 / 41 (Yewdall, A. W., et al 2010. CD8+ T cell priming by dendritic cell vaccines requires antigen transfer to endogenous antigen presenting cells. PLoS One 5: el 1144; Liu, C, et al 2008. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell- dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J Clin Invest 118: 1165-1175). Muitos observaram que essa iniciação indireta de DCs espectadoras é dependente da secreção ativa de fatores pró- inflamatórios de recrutamento de célula imune e ativação de célula imune pelas DCs administradas.
[008] DCs de humano derivadas de monócito imaturo podem secretar quantidades substanciais de citocinas e quimiocinas auxiliares T (Th)-l quando estimuladas por um coquetel de estimulação, tais como ligantes do receptor tipo Toll (TLR) e IFN-γ (Napolitani, G., A. et al 2005. Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1-polarizing program in dendritic cells. Nat Immunol 6: 769-776; Lovgren, T., D. et al 2017. Enhanced stimulation of human tumor-specific T cells by dendritic cells matured in the presence of interferon-gamma and multiple toll- like receptor agonists. Cancer Immunol Immunother.). Adicionalmente, o papel da iniciação indireta de DCs espectadoras endógenas implica que a administração local de DCs alogênicas (alloDCs) pode criar um ambiente enriquecido de fatores pró-inflamatórios através do assim chamado “via direta de alorreconhecimento”, subsequentemente levando ao recrutamento e ativação intensificados de DCs espectadoras endógenas por fatores pró- inflamatórios liberados por células T alorreativas recrutadas e ativadas (Wallgren, A. C et al 2005. Direct allorecognition promotes activation of bystander dendritic cells and licenses them for Th1 priming: a functional link between direct and indirect allosensitization. Scand J Immunol 62: 234-242). Essa via direta de alorreconhecimento, um fenômeno em que até 10 % das células T do recipiente transplantado podem ficar ativadas por seu reconhecimento direto de complexos MHC/peptídeo alogênicos intatos
4 / 41 presentes em DCs alogênicas derivadas de enxerto (cf. Lombardi G, et al Allorecognition of DR1 by T cells from a DR4/DRw13 responder mimics selfrestricted recognition of endogenous peptides. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:4190-), é uma resposta vigorosa, que parece violar a regra de restrição de auto-MHC, e é basicamente acionada por mimetismo antigênico (cf. Lechler R, et al Dendritic cells in transplantation – friend or foe? Immunity 2001; 14:357-68).
[009] O uso de DCs alogênicas (alloDCs) foi descrito previamente na técnica (cf. EP 1 509 244 Bl e EP 2 534 242 Bl). Adicionalmente, a abordagem de alloDC usando alloDCs pró-inflamatórias injetadas intratumoralmente foi testada com sucesso em um experimento clínico de fase I/II em pacientes com carcinoma de célula renal metastático (mRCC) como reportado por Laurell, A et al (cf. Intratumorally injected pro-inflammatory allogeneic dendritic cells as immune enhancers: a first-in-human study in unfavourable risk patients with metastatic renal cell carcinoma. Journal for Immuno Therapy of Cancer, 2017, 5: 52) e é atualmente submetido a estudos clínicos adicionais em um estudo de fase II multicentralizado randomizado em pacientes diagnosticados com mRCC (NCT02432846). Dados do experimento clínico da fase I/II em pacientes com mRCC indicaram que a administração intratumoral de ativação induzida por alloDCs de células T específicas de tumor com infiltração intratumoral forte/massiva de células T CD8+ na maioria de pacientes tratados. Adicionalmente, um efeito antitumoral sinergístico foi visto em combinação com sunitinib. Hipotetizou- se que as alloDCs elicitam uma resposta da célula T específica do tumor e que a adição de sunitinib torna o tumor mais suscetível a resposta da célula T específica do tumor, uma vez que sunitinib mostrou afetar e reduzir o número de células supressoras derivadas de melodie e células T regulatórias. Uma visão geral de DCs alogênicas para uso como iniciadores imunes anticâncer foi recentemente publicado por Karlsson-Parra et al (Ilixadencel – an
5 / 41 Allogeneic Cell-Based Anticancer Immune Primer for Intratumoral Administration Pharm Res (2018) 35: 156).
[0010] Embora o uso de alloDCs na técnica aparentemente forneça uma estratégia de imunoterapia promissora, ainda seria de interesse poder melhorar ainda mais a capacidade de alloDCs na melhoria do número e função de linfócitos T citotóxicos CD8+ específicos de tumor que afetam células tumorais.
[0011] Consequentemente, a presente invenção procura mitigar, aliviar, eliminar ou evitar uma ou mais das deficiências potenciais identificadas anteriormente na técnica e desvantagens individualmente ou em qualquer combinação provendo, de acordo com um primeiro aspecto da invenção, uma célula dendrítica pró-inflamatória com capacidade melhorada de ativar células T alogênicas através da via direta de alorreconhecimento. A célula dendrítica foi infectada com um adenovírus. Adicionalmente, a célula dendrítica foi obtida: - provendo uma célula dendrítica imatura; - transduzindo a célula dendrítica com um vetor de adenovírus; e - maturando a célula dendrítica imatura em uma célula dendrítica pró-inflamatória. Na maturação da célula dendrítica imatura em uma célula dendrítica pró-inflamatória, uma mistura de fatores de maturação incluindo o ligante do receptor tipo Toll 3 (TLR3) poli-I:C, um ligante de TLR7/8, tal como Resiquimod, e interferon gama (IFN-γ) é adicionada para induzir maturação da célula dendrítica imatura.
[0012] Células dendríticas pró-inflamatórias sendo infectadas com um adenovírus e maturadas pela adição do ligante do receptor tipo Toll 3 (TLR3) poli-I:C, um ligante de TLR7/8, tal como Resiquimod, e interferon gama (IFN-γ), têm, ao contrário à opinião prevalecente, capacidade melhorada para
6 / 41 estimular a via direta de alorreconhecimento de células T alogênicas em comparação com células dendríticas pró-inflamatórias correspondentes não infectadas com um adenovírus, como determinado in vitro durante uma reação de leucócito mista (MLR). Importantemente, tais células dendríticas pró-inflamatórias por meio disso também têm capacidade aumentada para eventualmente, por meio de ativação/maturação de DCs espectadoras carregadas com antígeno, aumentar o número e função de linfócitos T citotóxicos CD8+ autólogos (com relação às DCs espectadoras) sendo capazes de reconhecer especificamente células tumorais. Assim, essas células dendríticas pró-inflamatórias infectadas com adenovírus são úteis como um intensificador imune alogênico à base de célula melhorada no tratamento ou prevenção de câncer.
[0013] De acordo com um outro aspecto da invenção, é provido um método para prover uma célula dendrítica pró-inflamatória tendo capacidade melhorada de ativar células T alogênicas através da via direta de alorreconhecimento e sendo infectada com um adenovírus. Um método como esse compreende as etapas de: - prover uma célula dendrítica imatura; - infectar a célula dendrítica com um adenovírus; e - maturar a célula dendrítica imatura em uma célula dendrítica pró-inflamatória, em que a dita maturação é realizada por adição do ligante do receptor tipo Toll 3 (TLR3) poli-I:C, um ligante de TLR7/8, tal como Resiquimod, e interferon gama (IFN-γ) para induzir maturação da célula dendrítica imatura.
[0014] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provida uma composição farmacêutica compreendendo uma célula dendrítica pró- inflamatória infectada com adenovírus como essa e pelo menos um carreador farmacêutico aceitável. Semelhantemente, também uma composição como essa é útil como um intensificador imune alogênico à base de célula
7 / 41 melhorada no tratamento ou prevenção de câncer.
[0015] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provida uma célula dendrítica pró-inflamatória infectada com adenovírus, ou uma composição farmacêutica compreendendo uma célula dendrítica pró- inflamatória infectada com adenovírus como essa, e pelo menos um carreador farmacêutico aceitável, para uso no tratamento ou prevenção de câncer em um indivíduo, em que a célula dendrítica pró-inflamatória é alogênica para o indivíduo.
[0016] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provido um método para tratar ou prevenir câncer em um indivíduo que necessita do mesmo. O método compreende administração de uma célula dendrítica pró- inflamatória infectada com adenovírus, ou uma composição farmacêutica compreendendo uma célula dendrítica pró-inflamatória infectada com adenovírus como essa, e pelo menos um carreador farmacêutico aceitável, a um indivíduo que necessita da mesma. Adicionalmente, a célula dendrítica pró-inflamatória é alogênica para o indivíduo.
[0017] Recursos vantajosos adicionais da invenção são definidos nas reivindicações dependentes. Além disso, recursos vantajosos da invenção são elaborados em modalidades descritas aqui.
[0018] Na imunoterapia baseada em células dendríticas (DCs) derivadas do paciente, isto é, autólogas, são tipicamente modificadas ex vivo para expressar ou compreender antígenos tumorais (antígenos associados a tumor ou específicos de tumor). Como reconhecido na técnica, diversos meios são disponíveis para modificar DCs para expressar ou compreender antígenos de tumor. Esses meios incluem infecção com vetores virais, por exemplo, vetores de adenovírus, vírus adeno-associados, lentivírus e retrovírus, com genes que codificam para antígenos de tumor.
[0019] Como já descrito aqui anteriormente, DCs alogênicas também
8 / 41 pró-inflamatórias podem ser usadas em imunoterapia, uma vez que foi observado que elas ativam DCs espectadoras. DCs alogênicas administradas intratumoralmente não precisam ser carregadas com antígeno (isto é, expressar ou compreender antígenos de tumor), uma vez que antígenos de tumor para processamento por DCs espectadoras endógenas ativadas de qualquer maneira está presente no local de administração. O uso de DCs alogênicas como intensificadores imunes à base de célula em imunoterapia de câncer se baseiam na estimulação da via direta de alorreconhecimento por células T alogênicas em uma reação de leucócito mista (MLR), resultando em produção adicional de fatores pró-inflamatórios (Wallgren et al, 2005, Scand J Immunol 62: 234-242).
[0020] DCs pró-inflamatórias são tipicamente providas diferenciando monócitos isolados ex vivo em DCs imaturas e subsequentemente maturando- os ex vivo em DCs pró-inflamatórias. Como reconhecido na técnica, o protocolo de maturação específico afetará o fenótipo. Assim, a expressão de marcadores de superfície, bem como a secreção, por exemplo, de citocinas e quimiocinas, diferirão entre DCs pró-inflamatórias providas por diferentes protocolos de maturação. Adicionalmente, também outras propriedades podem diferir. Como um exemplo, maturação na presença de prostaglandina E2 (PGE2) é essencial para prover DCs migratórias (cf. Boullart I A C et al: “Maturation of monocyte-derived dendritic cells with Toll-like receptor 3 and 7/8 ligands combined with prostaglandin E2 results in high interleukin-12 production and cell migration”, CANCER IMMUNOLOGY, IMMUNOTHERAPY vol. 57(11), 2008, p. 1589-1597). Contrariamente, foi reportado que maturação na presença de interferon-gama (IFN-γ) confere a capacidade migratória de DCs (cf. Alder J et al: “Interferon-gamma dose- dependently inhibits prostaglandin E2-mediated dendritic-cell-migration towards secondary Iymphoid organ chemokines”, VACCINE, vol. 24 (49-50), 2006, p. 7087-7094).
9 / 41
[0021] Foi previamente mostrado (cf. EP 2 534 242 Bl) que DCs alogênicas maturadas em DCs pró-inflamatórias por uso de uma combinação do ligante do receptor tipo Toll 3 (TLR3) poli-I:C, Resiquimod (um ligante de TLR7/8; l-[4-amino-2-(etoxietil)imidazo[4,5-c]quinolin- 1 -il]-2-metilpropan- 2-ol), e interferon gama (IFN-γ) provêm uma composição útil em tratamento intratumoral de câncer, por exemplo, carcinoma de célula renal metastático.
[0022] Na avaliação de diversos meios para prover DCs que carregam antígenos de tumor, como esperado, confirmou-se que infectar DCs imaturas com um adenovírus não prejudica a capacidade de uma mistura, compreendendo o ligante do receptor tipo Toll 3 (TLR3) poli-I:C, Resiquimod (um ligante de TLR7/8), e interferon gama (IFN-γ), induzir maturação das DCs imaturas em DCs pró-inflamatórias infectadas com adenovírus. As DCs pró-inflamatórias infectadas com adenovírus secretaram fatores inflamatórios em quantidade correspondente a uma das DCs pró- inflamatórias não infectadas, assim confirmando os relatórios anteriores.
[0023] Entretanto, foi considerado que elas são de pouco ou nenhum uso em um quadro alogênico, dado que é conhecido na técnica que a infecção com adenovírus prejudica a capacidade de DCs infectadas ativarem células T alogênicas em uma MLR.
[0024] Especialmente, em 2002, Jonleit et al (cf. Jonuleit et al em Gene Terapy (2000) 7, 249-254) reportaram que infecção de DCs com um El- substituído, adenovírus deletado de E3 e maturação com fatores pró- inflamatórios prejudicaram a capacidade de as DCs resultantes estimular a proliferação de células T alogênicas (CD4+ e CD8+) a alta razão de DC para célula T. Semelhantemente, Tan et al reportaram (cf. BLOOD, (2005), 105(10), 3824- 3832) que infecção de DCs derivadas de monócito maturadas (TNF-alfa, IL-1 beta, IL-6, e PGE2) com um adenovírus suprimiu a capacidade de as DCs ativar células T alogênicas em uma MLR. Adicionalmente, Newton et al reportaram (cf. Immunology (2008), 125, 469-
10 / 41 479) que DCs infectadas com adenovírus maturadas com fatores pró- inflamatórios (TNF-alfa, IL-1 beta, IL-6 e PGE2) têm uma capacidade bastante reduzida de promover proliferação de células T alogênicas. De acordo com Newton, o efeito é específico para infecção adenoviral, uma vez que o mesmo efeito não foi visto com DCs infectadas, ou falso-infectadas com lentivírus.
[0025] No entanto, a capacidade de DCs pró-inflamatórias infectadas com adenovírus ativarem células T alogênicas em uma MLR foi avaliada. Foi observado muito surpreendentemente, em contraste profundo à opinião prevalecente, que a infecção adenoviral não prejudica a capacidade de ativar células T alogênicas em uma MLR, contanto que as DCs não tenham sido maturadas usando uma combinação do ligante do receptor tipo Toll 3 (TLR3) poli-I:C, um ligante de TLR7/8, tal como Resiquimod, e interferon gama (IFN-γ).
[0026] Realmente, foi observado ainda que as DCs pró-inflamatórias infectadas com adenovírus tiveram capacidade melhorada de estimular a via direta de alorreconhecimento como determinado pela ativação de células T alogênicas cocultivadas em uma MLR e a produção aumentada de IFN-gama. Além do mais, DCs pró-inflamatórias infectadas com adenovírus não apenas tiveram a capacidade melhorada de estimular a via direta de alorreconhecimento, mas também proveram maturação aumentada de DCs espectadoras alogênicas que subsequentemente levaram a uma capacidade de intensificação dessas DCs espectadoras para ativar células T específicas de antígeno (com relação a DCs espectadoras) autólogas. Assim, DCs pró- inflamatórias infectadas com adenovírus são úteis como um intensificador imune alogênico à base de célula melhorado para uso no tratamento de câncer, no qual o modo de ação é dependente da via direta de alorreconhecimento.
[0027] Dessa maneira, uma modalidade da presente invenção se refere
11 / 41 a uma célula dendrítica pró-inflamatória infectada com um adenovírus. a célula dendrítica pró-inflamatória infectada com adenovírus tem capacidade melhorada de ativar células T alogênicas através da via direta de alorreconhecimento, comparadas a células dendríticas pró-inflamatórias correspondentes não infectadas com um adenovírus. Adicionalmente, a célula dendrítica pró-inflamatória infectada com adenovírus foi obtida: - provendo uma célula dendrítica imatura; - transduzindo a célula dendrítica com um vetor de adenovírus; e - maturando a célula dendrítica imatura em uma célula dendrítica pró-inflamatória. A maturação da célula dendrítica imatura em uma célula dendrítica pró-inflamatória é realizada por adição de o ligante do receptor tipo Toll 3 (TLR3) poli-I:C, um ligante de TLR7/8, tal como Resiquimod, e interferon gama (IFN-γ) para induzir maturação da célula dendrítica imatura.
[0028] O presente coquetel de maturação compreendendo uma combinação do ligante do receptor tipo Toll 3 (TLR3) poli-I:C, Resiquimod (um ligante de TLR7/8), e interferon gama (IFN-γ) foi descrito em WO 2011/098516. O ligante do receptor tipo Toll 3 (TLR3) poli-I:C é um análogo sintético de dsRNA compreendendo uma fita de poli(I) anelado a uma fita de poli(C). O tamanho da fita pode variar. O tamanho pode ser 200 pares de base a 8.000 pares de base, como 200 a 1.500 ou 1.500 a 8.000 pares de base. O ligante de TLR7/8 R848 é também denotado Resiquimod na técnica. Como uma alternativa para Resiquimod, Gardiquimod (l-(4-amino-2- etilaminometilimidazo[4,5-c]quinolin-l-il)-2-metilpropan-2-ol) ou Imiquimod (l-isobutil-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina) pode ser usado como ligante de TLR7/8s. Tipicamente, as DCs imaturas são expostas aos fatores de ativação por 8 a 24 horas, tal como 18 horas.
[0029] De acordo com uma modalidade, os fatores de maturação
12 / 41 usados são ligante do receptor tipo Toll 3 (TLR3) poli-I:C, Resiquimod (um ligante de TLR7/8), e interferon gama (IFN-γ).
[0030] Embora não seja necessária, a ativação pode, de acordo com modalidade alternativa, incluir adicionalmente a adição de pelo menos uma substância selecionada do grupo que consiste em ligantes de TLR2, ligantes de TLR4, tais como lipopolissacarídeo bacteriano e monofosforil lipídio A, ligantes de TLR9, tais como sequências de oligonucleotídeos CpG (ODN) que distinguem DNA microbiano de DNA de mamífero, Interferon alfa (IFN-ɑ), interleucina 1β (IL-Ιβ), e fator de necrose tumoral alfa (TNF-ɑ). Adicionalmente, a ativação preferivelmente não compreende adição de prostaglandina E2 (PGE2) a fim de prevenir que as DCs maduras se tornem DCs migratórias que deixarão rapidamente o sítio de injeção (tumor), o que poderia ser desvantajoso no contexto dessa invenção.
[0031] Subsequente à ativação, as DCs pró-inflamatórias infectadas com adenovírus resultantes podem ser lavadas para remover essencialmente todos os fatores de ativação. Assim, os fatores de ativação tipicamente são lavados antes do uso das DCs pró-inflamatórias infectadas com adenovírus como intensificador imune em terapia imune de câncer. A remoção dos fatores de ativação evita coadministração de fatores de ativação (adicionados para induzir DCs pró-inflamatórias ex vivo). A coadministração de fatores de ativação mais provavelmente levará a uma forte e persistente ativação também de DCs imaturas intratumoralmente recrutadas, levando a sua diferenciação em DCs maduras pró-inflamatórias ao invés da diferenciação desejada em DCs maduras migratórias.
[0032] A fim de melhorar a capacidade de ativar células T alogênicas através da via direta de alorreconhecimento, como determinado pela reação de leucócito mista (MLR), a DC é infectada com um adenovírus.
[0033] Diversos adenovírus são conhecidos na técnica. Em US
9.017.672 um tipo preferido de adenovírus, sendo um adenovírus modificado
13 / 41 de TAT (transativador de transcrição)-PTD (domínio de transdução) de hexon com eficiência de distribuição de gene intensificado, é descrito. Esse vetor foi estudado adicionalmente por Yu, D., como reportado 2013 em PLoS One 8: e54952.
[0034] De acordo com uma modalidade, o presente adenovírus é um adenovírus sorotipo-5 (Ad5). O adenovírus sorotipo-5 (Ad5) pode ser um adenovírus sorotipo-5 (Ad5) com haste e/ou botão de fibra de adenovírus sorotipo-35 (Ad35) no lugar da haste e/ou botão de fibra de Ad5. Como reconhecido pelos versados na técnica, diversos sorotipos de adenovírus, incluindo o Ad5 e Ad35, são conhecidos na técnica. Substituindo a haste e/ou botão de fibra de Ad5 com uma haste e/ou botão de fibra de Ad35 a eficiência de transdução é melhorada. Adicionalmente, isso é preferido se a proteína hexon do vetor de adenovírus ou modificada para compreender pelo menos um domínio de transdução de proteína (PTD) do transativador de transcrição (TAT) do vírus de imunodeficiência humana (HIV). Modificando a proteína hexon do vetor de adenovírus para compreender pelo menos um domínio de transdução de proteína (PTD) do transativador de transcrição (TAT) do vírus de imunodeficiência humana (HIV), a eficiência de transdução é melhorada. A sequência de TAT-PTD pode ser introduzida na região hipervariável 5 (HV5R) da proteína hexon. De acordo com uma modalidade, a proteína hexon do vetor de adenovírus assim compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID No. 1 (YGRK.K.RRQRRR). Adicionalmente, a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID No. 1 pode ser flanqueada por adaptadores curtos e pode assim compreender uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID No. 2 (AGGGAGGGYGRK RRQRRRGGGAGGGA). Um exemplo de um adenovírus preferido (Ad5PTDf35) é descrito em PLoS One (2013) 8(1): e54952. Adicionalmente, o adenovírus pode ser um adenovírus deletado de E1. Como reconhecido pelos versados na técnica, deleção de El significa que o adenovírus é
14 / 41 deficiente em replicação. A fim de ter melhor controle do vírus no indivíduo a quem ele é administrado, prefere-se que o adenovírus seja deficiente em replicação. De acordo com uma modalidade, o adenovírus é assim deficiente em replicação, por exemplo, deletado de El. O adenovírus pode também ser um adenovírus deletado de E3, tal como um adenovírus deletado de El/E3. Adicionalmente, o adenovírus pode ser um adenovírus que expressa genes que codificam para as proteínas E6 e E7 do papilomavírus humano (HPV) tipo 16 (Ad-HPV16E6E7). Um adenovírus do adenovírus sorotipo-5 (Ad5) que expressa genes que codificam para as proteínas E6 e E7 do papilomavírus humano (HPV) tipo 16 podem ser denotadas Ad5-HPV16E6E7.
[0035] Embora os adenovírus sejam usados na técnica como vetores de entrega de genes, os efeitos fundamentais da presente invenção não são dependentes da inclusão de qualquer gene que codifique para um antígeno tumoral no vetor de adenovírus, mas sim da infecção com um adenovírus como tal. Assim, a DC pró-inflamatória infectada com adenovírus, de acordo com uma modalidade, não compreende nenhum gene que codifica para antígenos de tumor, isto é, as DCs são infectadas com os adenovírus, mas não transduzidas com genes que codificam para antígenos de tumor.
[0036] Embora não seja necessário que DCs pró-inflamatórias alogênicas sejam administradas intratumoralmente, em algumas aplicações (por exemplo, quando o tumor é difícil de atingir por injeção ou quando o tumor é pequeno) pode ainda ser de interesse prover DCs pró-inflamatórias infectadas com um adenovírus que codifica antígenos de tumor que são expressos no tumor, isto é, DCs infectadas e transduzidas, e assim expressando antígenos associados a tumor ou específicos de tumor. A DC pró-inflamatória infectada com adenovírus pode, portanto, de acordo com uma modalidade, compreender pelo menos um gene que codifica para um antígeno associado a tumor ou específico de tumor. Provendo DCs pró- inflamatórias infectada com um adenovírus compreendendo pelo menos um
15 / 41 gene que codifica para um antígeno associado a tumor ou específico de tumor, a célula dendrítica infectada é transduzida para expressar um antígeno associado a tumor ou específico de tumor. Exemplos do antígeno tumoral a ser expresso pela DC pró-inflamatória transduzida incluem antígenos oncovirais, tais como papilomavírus humano, por exemplo, HPV-16 ou HPV- 18, vírus Epstein-Barr, vírus do sarcoma de Kaposis, ou poliomavírus da célula de Merkel, e neoantígenos derivados de mutação.
[0037] Na provisão das presentes DCs pró-inflamatórias infectadas com adenovírus, DCs imaturas devem ser infectadas bem como maturadas em DCs pró-inflamatórias. Aspectos da infecção, bem como a maturação, já foram descritos aqui. De acordo com uma modalidade, a infecção e maturação, respectivamente, são realizadas simultaneamente. De acordo com uma modalidade alternativa, a DC imatura é primeiramente infectada para prover uma DC infectada com adenovírus imatura, e subsequentemente maturada em uma DC pró-inflamatória infectada com adenovírus.
[0038] A provisão de DCs imaturas é bem conhecida na técnica. Tipicamente, monócitos são primeiramente isolados dos leucócitos do sangue periférico, por exemplo, por leucaférese de sangue total. Os monócitos isolados podem então ser diferenciados nas células dendríticas imaturas por uso, por exemplo, de interleucina 4 (IL-4) e Fator Estimulador de Colônia de Granulócito e Macrófago (GM-CSF). O monócito pode ser cultivado em meio de cultura celular suplementado com fator estimulador de colônia de granulócito e macrófago (GM-CSF) em combinação com interleucina-4 (IL- 4), por 2 a 7 dias, tal como cerca de 5 dias, para diferenciar os monócitos em DCs imaturas. Adicionalmente, em WO 2014/096033 um processo para prover DCs imaturas é descrito.
[0039] Congelando as células dendríticas pró-inflamatórias subsequentes à ativação, elas podem ser armazenadas. Tipicamente, as células dendríticas pró-inflamatórias são congeladas em um meio contendo sulfóxido
16 / 41 de dimetila (DMSO) e soro ou plasma. Antes do uso, as células congeladas são descongeladas e o DMSO pode ser lavado. Alternativamente, as células descongeladas são usadas diretamente.
[0040] Para uso no tratamento de câncer, a célula dendrítica pró- inflamatória infectada com adenovírus pode ser formulada em uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica pode compreender pelo menos um carreador farmacêutico aceitável, tais como uma solução de salina tamponada com fosfato, água, ou uma emulsão, tal como uma emulsão de óleo/água ou água/óleo. A composição farmacêutica pode compreender adicionalmente um agente umectante. Adicionalmente, a composição farmacêutica pode compreender adjuvantes, excipientes, estabilizantes, conservantes e/ou outros componentes farmacêuticos aceitáveis conhecidos na técnica.
[0041] Como um exemplo, o carreador pode ser uma solução de salina compreendendo albumina de soro humano. Adicionalmente, o carreador pode ser um meio que preserva células congeladas. Como exemplo, a célula dendrítica pró-inflamatória infectada com adenovírus pode, como já mencionado, ser congelada em plasma de doador universal inativado termicamente compreendendo sulfóxido de dimetila (DMSO) para permitir armazenamento da mesma. Um meio como esse compreendendo células dendríticas pró-inflamatórias infectadas com adenovírus pode ser usado diretamente, por exemplo, injetado intratumoralmente, uma vez descongelado. Alternativamente, células congeladas em um meio como esse podem ser descongeladas, lavadas e ressuspensas em salina compreendendo albumina de soro humano antes de ser administradas, por exemplo, injetadas intratumoralmente.
[0042] A composição farmacêutica aceitável pode ser formulada para administração parenteral, tal como administração intratumoral, intradérmica, subcutânea ou intranodal. De acordo com uma modalidade, a composição
17 / 41 farmacêutica aceitável é formulada para administração intratumoral. Na administração intratumoral, a composição farmacêutica aceitável é injetada diretamente em um tumor. Como já descrito (cf. WO 2011/098516), células dendríticas pró-inflamatórias são úteis no tratamento de câncer, já que elas podem induzir uma reação pró-inflamatória por meio de uma reação de leucócito mista (MLR) no sitio de administração que recruta e ativa a própria DCs do paciente (aqui denotadas DCs espectadoras) para desenvolver nas DCs migratórias carregadas com tumor.
[0043] Uma modalidade adicional assim se refere a célula dendrítica pró-inflamatória infectada com adenovírus, ou uma composição como essa compreendendo tais células dendríticas pró-inflamatórias infectadas com adenovírus para uso no tratamento ou prevenção de câncer. Em tal uso, as células dendríticas pró-inflamatórias infectadas com adenovírus são alogênicas ao indivíduo, a fim de ser capaz de induzir uma ativação de MLR de células T alorreativas dos próprios indivíduos, sendo alogênicas para as células dendríticas pró-inflamatórias infectadas administradas com adenovírus. Exemplos de cânceres a ser tratados pelas células dendríticas pró- inflamatórias infectadas com adenovírus, incluem, mas não se limitam, a carcinoma de célula renal, carcinoma hepatocelular, tumores estromais gastrintestinais, câncer do duto biliar, cânceres de cabeça e pescoço, câncer de célula não pequena, câncer gástrico, câncer cervical e melanoma maligno.
[0044] Quando usadas no tratamento de câncer, células dendríticas pró-inflamatórias infectadas com adenovírus podem ser combinadas com outras terapias existentes. Uma alternativa preferida é combinar administração de células dendríticas pró-inflamatórias infectadas com adenovírus com fármacos que diminuem o ambiente de tumor imunossupressor ou ativando o sistema imune. Como um exemplo, as presentes células dendríticas pró- inflamatórias infectadas com adenovírus podem ser combinadas com sunitinib ou um similar, ou inibidores de tirosina quinase do receptor relacionados.
18 / 41 Adicionalmente, também anticorpos contra PD-1 (proteína de morte celular Programada 1) ou contra ligantes de PD-1 podem ser combinados com as presentes células dendríticas pró-inflamatórias infectadas com adenovírus. PD-1 é um receptor de superfície da célula conhecido por desempenhar um papel importante em infrarregular o sistema imune e promover auto tolerância suprimindo atividade inflamatória da célula T. Anticorpos contra PD-1 incluem, por exemplo, nivolumab, pembrolizumab, e pidilizumab. Adicionalmente, também anticorpos alvejando ligantes de PD-1, por exemplo, atezolizumab e avelumab, podem encontrar uso na suplementação do tratamento com as presentes células dendríticas pró-inflamatórias infectadas com adenovírus. Além do mais, as presentes células dendríticas pró- inflamatórias infectadas com adenovírus podem também ser combinadas, por exemplo, com gemcitabina ou 5-fluoruracila.
[0045] Semelhantemente, uma modalidade se refere ao uso de tais células dendríticas pró-inflamatórias alogênicas infectadas com adenovírus para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.
[0046] Uma modalidade adicional se refere a um método para tratar câncer, em que uma célula dendrítica pró-inflamatória infectada com adenovírus é administrada a um paciente que necessita de tal tratamento. A dose administrada deve ser suficiente para ativar as próprias DCs do paciente para desenvolver dentro de DCs migratórias carregadas com tumor. A fim de induzir uma MLR, as células dendríticas pró-inflamatórias infectadas administradas com adenovírus são alogênicas para o paciente.
[0047] A célula dendrítica pró-inflamatória infectada com adenovírus tipicamente não expressa nenhum antígeno tumoral. Ela é assim preferivelmente administrada intratumoralmente. Como reconhecido na técnica (Laurell, A et al, Intratumorally injected pro-inflammatory allogeneic dendritic cells as immune enhancers: a first-in-human study in unfavourable risk patients with metastatic renal cell carcinoma. Journal for Immuno
19 / 41 Therapy of Cancer, 2017, 5: 52; Karlsson-Parra et al, Ilixadencel – an Allogeneic Cell-Based Anticancer Immune Primer for Intratumoral Administration, Pharm Res (2018) 35: 156), administração de células dendríticas pró-inflamatórias alogênicas intratumoralmente induz ativação de células T específicas de tumor e infiltração intratumoral de células T CD8+. As células dendríticas pró-inflamatórias infectadas que também foram transduzidas com genes que codificam antígenos de tumor podem ser administradas intratumoralmente, mas são preferivelmente administradas em tecidos dérmicos ou subcutâneos normais ou em linfonodos.
[0048] Uma modalidade adicional se refere a um método para prover células dendríticas pró-inflamatórias como essas como descrito aqui, isto é, células dendríticas pró-inflamatórias tendo capacidade melhorada de ativar células T alogênicas através da via direta de alorreconhecimento, e sendo infectadas com um adenovírus. Esse método compreende as etapas de: - prover células dendríticas imaturas; - infectar as células dendríticas com um adenovírus; e - maturar as células dendríticas imaturas em uma célula dendrítica pró-inflamatória, em que a dita maturação é realizada por adição do ligante do receptor tipo Toll 3 (TLR3) poli-I:C, um ligante de TLR7/8, tal como Resiquimod, e interferon gama (IFN-γ) para induzir maturação da célula dendrítica imatura. As células dendríticas pró-inflamatórias infectadas com adenovírus providas têm capacidade melhorada de ativar células T alogênicas através da via direta de alorreconhecimento comparadas com células dendríticas pró-inflamatórias correspondentes não infectadas com um adenovírus.
[0049] Aspectos adicionais em relação à provisão de células dendríticas infectadas com adenovírus já foram descritos aqui e são igualmente aplicáveis a essa modalidade.
[0050] Sem elaboração adicional, acredita-se que versados na técnica
20 / 41 possam, usando a descrição anterior e a parte experimental seguinte, utilizar a presente invenção em toda sua extensão. As modalidades específicas preferidas descritas aqui, portanto, devem ser consideradas meramente ilustrativas, e não restritivas, do restante da descrição de qualquer maneira que seja. Adicionalmente, embora a presente invenção tenha sido descrita aqui com referência a modalidades específicas, ela não deve ser limitada à forma específica apresentada aqui. Mais propriamente, a invenção é limitada apenas pelas reivindicações anexas e, modalidades além das específicas citadas são igualmente possíveis dentro do escopo dessas reivindicações anexas, por exemplo, diferentes daquelas descritas anteriormente.
[0051] Nas reivindicações, o termo “compreende/compreendendo” não exclui a presença de outros elementos ou etapas. Adicionalmente, embora recursos individuais possam ser incluídos em diferentes reivindicações, esses podem possivelmente ser combinados vantajosamente, e a inclusão em diferentes reivindicações não implica que uma combinação de recursos não é provável e/ou vantajosa.
[0052] Além disso, referências singulares não excluem uma pluralidade. Os termos “um”, “uma”, “primeiro”, “segundo” etc. não impedem uma pluralidade.
[0053] Figura 1. DCs COMBIG/Ad5M-maturadas expressam um fenótipo maduro e perfil de secreção de citocina Th1-polarizada. (Dados são mostrados como média ±SEM (n.s. p>0,05; * P<0,05; ** P<0,01; *** P0,001; **** P0,0001)).
[0054] (A) Monócitos de CD14+ foram isolados de PBMCs de doador saudável, diferenciados em imDCs por GM-CSF/IL-4 por 5 dias, maturados em diferentes condições por 18 horas, lavados e cultivados adicionalmente por 24 horas e analisados.
[0055] (B) DCs foram caracterizadas quanto a expressão de HLA-DR,
21 / 41 CD40, CD80, CD86 e CD83 por citometria de fluxo. Intensidade de fluorescência média (MFI) para cada marcador em DCs (CD14”CDla+) produzido de oito doadores é mostrada.
[0056] (C) ELISA foi usado para medir secreção de IL-12p70, IL-6 e CXCL10 para cada doador de PBMC.
[0057] Figura 2. Allo-COMBIG/Ad5M-DCs ativam células imunes inatas e adaptativas ativadas in vitro. (Dados são mostrados como média ±SEM (n.s. p>0,05; * P<0,05; ** P<0,01; *** P0,001; **** P0,0001))
[0058] (A) Após maturação por 18 horas e lavagem (amostras como descrito na Figura 1A) as DCs, aqui chamadas alloDCs, foram cocultivadas com PBMCs alogênicos (significando de um doador distinto). Após 24 horas de cocultura, ativação de células T no agrupamento de PBMC foi caracterizada pela expressão de CD69.
[0059] (B) Intensidades de fluorescência média para CD69 em células T (CD3+CD56”) das dezesseis combinações individuais de oito doadores não relacionados são mostradas.
[0060] (C) Os sobrenadantes de MLR (reação de leucócito mista) (allo-SN) das coculturas de alloDC-PBMC foram usados como estimulação de maturação para DCs imaturas espectadoras (im) (DCs do mesmo doador dos PBMCs) para imitar um cenário para imDCs “espectadoras” hospedeiras. Maturação de DC espectadora foi avaliada pela suprarregulação de HLA-DR, CD40, CD80, CD86 e CD83 como mostrado em gráficos de dispersão de MFI para cada marcador em DCs espectadoras (CD14”CDla+). Seis combinações individuais de três doadores não relacionados foram avaliadas.
[0061] Figura 3. Ativação e expansão de células T específicas de antígeno induzidas por apresentação cruzada do antígeno por DCs espectadoras autólogas maturadas pelo sobrenadante de MLR (allo-SN) das coculturas de allo-COMBIG/Ad5M-DC de PMBC.
[0062] (A) Im DCs espectadoras de doadores de HLA-A2+ (DCs
22 / 41 espectadoras) foram pulsadas por 2 horas com lisato de células tumorais que expressam o antígeno de CMV-pp65 (A549(pp65)) e maturadas por 38 horas por allo-SN das várias coculturas (Figura 2A). As DCs espectadoras de apresentação cruzada foram então misturadas por 18 horas com células T autólogas, geneticamente modificadas com um TCR contra o peptídeo CMV- pp65495-503 HLA-A2 restrito.
[0063] (B) ELISA foi usado para medir a concentração de IFN-γ liberado pelas células T específicas de antígeno geneticamente modificadas nos sobrenadantes. Seis combinações individuais de três doadores não relacionados foram examinadas.
[0064] (C) DCs espectadoras de doador de HLA-A2+ soropositivo para CMV foram preparadas como mencionado anteriormente e usadas para estimular autólogos (com relação às DCs espectadoras), células T não modificadas geneticamente, por 12 dias na presença de IL-2 de baixa dose (20IU/mL).
[0065] (D) Expansão específica de CMV-pp65 de células T não modificadas geneticamente foi quantificada por citometria de fluxo usando tetrâmero HLA-A*0201/pp65495-503 PE-conjugado. Gráficos de FACS de uma combinação individual representativa fora das quatro usando o allo-SN de coculturas de PBMC allo-COMBIG/Ad5M-DC como estimulação de maturação são mostrados.
[0066] (E) As células T não modificadas geneticamente expandidas foram então reestimuladas por exposição a células T2 carregadas tanto com peptídeo CMV-pp65495-503 (alvo relevante) quanto com peptídeo TARP4- 13 (alvo irrelevante). ELISA foi usado para medir a concentração de IFN-γ em sobrenadantes colhidos 18 horas após ré-estimulação. A linha pontilhada indica a liberação de IFN-γ de fundo das células T estimuladas por DCs espectadoras imaturas. Dados são mostrados como média ±SEM (* P0,05; ** P<0,01; **** P0,0001).
23 / 41
[0067] Figura 4. Vacinação profilática com COMBIG-DC transduzida com o vetor Ad5M que codifica para gp-100 indiretamente iniciam células T específicas de gp-100
[0068] (A) A capacidade de DCs COMBIG (alloDCs) transduzidas com o vetor Ad5M que codifica para o antígeno tumoral gp 100 (Ad5M(gpl00)-alloDCs) de estimular indiretamente células T específicas de gp 100 em camundongos que não carregam tumor foi avaliada combinando injeção s.c. de Ad5M(gpl00)-alloDCs (dia 0) com transferência de célula adotiva intravenosa (i.v.) de esplenócitos Thy 1.1+ pmel-1 específicos de gp 100 (dia 2). Leitura de célula T foi realizada cinco dias mais tarde por manchamento de Thy 1.1 (dia 7).
[0069] (B) Gráficos de dispersão representativos da proliferação específica de células T Thy 1.1 + pmel-1 (Thy 1.1+) em resposta a alloDCs ou Ad5M(gpl00)-alloDCs de dois camundongos são mostrados.
[0070] Figura 5. Vacinação terapêutica com COMBIG-DC transduzida com o vetor Ad5M que codifica para gp-100 diminui crescimento de tumor e prolonga sobrevivência
[0071] (A) Em um ambiente terapêutico, camundongos C57BL/6NRj foram primeiro injetados s.c. no flanco traseiro com 1 x 105 células B16-F10 (dia 0) e receberam i. v esplenócitos 1 x 107 pmel- 1. (dia 8). O tratamento foi combinado com injeções i.t. de 1 x 106 Ad5M(gpl00)-alloDCs (dia 8 e 14) ou PBS como controle negativo. Crescimento de tumor foi monitorado por medição de paquímetro.
[0072] (B) Crescimento de tumor médio é apresentado para cada tratamento (n=8 por grupo).
[0073] (C) Sobrevivência de camundongos é demonstrada pela curva de sobrevivência de Kaplan-Meier e comparada pelo teste de classificação log (n=8 por grupo) (* P<0,05).
[0074] Figura 6. DCs maturadas COMBIG/Ad5-HPV16E6E7
24 / 41 expressam um fenótipo maduro.
[0075] (A) Monócitos de CD14+ foram isolados de PBMCs de doador saudável, diferenciados em imDCs por GM-CSF/IL-4 por 5 dias, maturados em diferentes condições por 18 horas, lavados e cultivados adicionalmente por 24 horas e analisados.
[0076] (B) DCs foram caracterizadas quanto a expressão de CD40, CD80, CD86 e HLA-DR por citometria de fluxo. Intensidades de fluorescência média (MFI) para cada marcador em DCs (CD 14- CDla+) produzida de oito doadores são mostradas.
[0077] Figura 7. Células imunes inatas ativadas e adaptativas Allo-COMBIG/Ad5-HPV16E6E7-DCs in vitro.
[0078] (A) Após maturação por 18 horas e lavagem (amostras como descrito na Figura 6A) as DCs, aqui chamadas alloDCs, foram cocultivadas com PBMCs alogênicos (significando de um doador distinto). Após 24 horas de cocultura, ativação de células T no agrupamento de PBMC foi caracterizada pela expressão de CD69.
[0079] (B) Intensidades de fluorescência média para CD69 em células T (CD3+CD56-) de dezesseis combinações individuais de oito doadores não relacionados são mostradas.
[0080] (C) Os sobrenadantes de MLR (reação de leucócito mista) (allo-SN) das coculturas alloDC-PBMC foram usados como estimulação de maturação para (im) DCs imatura espectadoras (DCs do mesmo doador dos PBMCs) para imitar um cenário para imDCs “espectadoras” hospedeiras. Maturação de DC espectadora foi avaliada pela suprarregulação de CD40, CD80, CD86, e HLA-DR como mostrado em gráficos de dispersão de MFI para cada marcador em DCs espectadoras (CD14”CDla+). Seis combinações individuais de três doadores não relacionados foram avaliadas.
[0081] Os exemplos seguintes são meros exemplos e de maneira
25 / 41 alguma devem ser interpretados para limitar o escopo da invenção. Mais propriamente, a invenção é limitada apenas pelas reivindicações anexas. EXEMPLO 1 - COMBIG-DCs transduzidas com um vetor de adenovírus sem nenhum transgene
[0082] No exemplo 1, o impacto de infectar DCs imaturas com um vetor adenoviral vazio (Ad5M) em ativação/maturação induzida pelo coquetel de Combig (Poli-I:C, R848 e IFN-gama) sozinho foi avaliado (por exemplo, maturação e secreção fenotípicas de fatores inflamatórios, por exemplo, IL-6, IL-12 e CXCL10, foram estudadas). Resumidamente, foi observado que infecção por Ad5M não confere a capacidade do coquetel de Combig para induzir maturação de DCs pró-inflamatórias (cf. Figura 1). Esses dados estão em linha com a opinião prevalecente. Entretanto, contrário à opinião prevalecente, foi observado que infecção com Ad5M melhora, e não prejudica, como presumido (cf. e.g. Jonuleit et al in Gene Therapy (2000) 7, 249-254; Tan et al in BLOOD, (2005), 105(10), 3824- 3832; e Newton et al em Immunology, 125, 469-479), a capacidade de Combig-DCs de estimular a via direta de alorreconhecimento, como medido pela ativação (CD69 expressão) de células T alogênicas durante uma reação de leucócito mista (MLR) (cf. Figura 2B).
[0083] Além disso, a revelação de que ativação/maturação de DCs espectadoras com sobrenadantes de MLR de coculturas de DCs e PBMCs allo COMBIG-Ad5M foi aumentada (Figura 2C) e por sua vez provê capacidade melhorada de DCs espectadoras de ativar células T autólogas específicas de antígeno produzindo a citocina IFN-gama associada a Th1 (cf. Figura 3B e 3D) significa que COMBIG-DCs transduzidas com o vetor Ad5M são úteis como um intensificador imune alogênico à base de célula melhorada no qual o modo de ação é crucialmente dependente da via direta de alorreconhecimento. Materiais e Métodos Linhagens celulares
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[0084] Células K562(Luc), A549(pp65) e T2 (ATCC) foram cultivadas em RPMI-1640 suplementado com FBS 10% inativado termicamente, PeSt 1% e HEPES 1%. Todos os componentes e meios de cultura foram da Thermo Fisher Scientific. Células K562(Luc) foram geneticamente modificadas com um vetor de lentivírus para expressar luciferase de vaga-lume e células A549(pp65) para expressar o antígeno (CMV)-pp65 de citomegalovírus. Todas as células foram cultivadas em um incubador umidificado com uma atmosfera de CO2 5% a 37°C. Produção do vírus recombinante
[0085] O vetor Ad5M foi construído e produzido como previamente descrito (Yu, D., C. Jin, J. Leja, N. Majdalani, B. Nilsson, F. Eriksson, e M. Essand. 2011. Adenovirus with hexon Tat-protein transduction domain modification exhibits increased therapeutic effect in experimental neuroblastoma and neuroendocrine tumors. J Virol 85: 13114-13123). Ad5M é um vetor de adenovírus sorotipo-5 humano deletado de El (Ad5) com haste de fibra e botão de sorotipo-35 e uma modificação de hexon para intensificar eficácia de transdução (Yu, D. et al 2013. Adenovirus serotype 5 vectors with Tat-PTD modified hexon and serotype 35 fiber show greatly enhanced transduction capacity of primary cell cultures. PLoS One 8: e54952). Ad5M não codifica nenhum transgene. Tituladores foram determinados por PCR quantitativa como genomas de vírus encapsidados (evg) por mL (Yu, D. et al
2013. Vetores de adenovírus sorotipo 5 com hexon Tat-PTD modificado e fibra sorotipo 35 apresentam capacidade de transdução bastante intensificada de culturas celulares primárias. PLoS One 8: e54952) Isolamento de PBMCs de humano e geração de DCs
[0086] Camadas leucocitárias de doadores saudáveis foram obtidas do banco de sangue no Uppsala University Hospital, Uppsala, Suécia. PBMCs foram isolados por separação com Ficoll-Paque Premium (GE Healthcare Life Science) e cultivados em RPMI-1640 suplementado com FBS inativado
27 / 41 termicamente 10%, PeSt l%, L-glutamina 0,5%, HEPES 1% e β- mercaptoetanol 20mM (meio DC). Geração e tratamento de DCs.
[0087] Monócitos isolados de PBMCs por seleção magnética positiva de CD14+ (Miltenyi Biotec) foram diferenciados em DCs imaturas (imDCs) usando IL-4 humana 20ng/mL e GM-CSF 100ng/mL (Gentaur) por 5 dias. O meio foi substituído a cada 2 dias. No dia 5, as células foram deixadas tanto não tratadas (imDCs) quanto maturadas por 18 horas com um coquetel de estimulação de maturação (Napolitani, G.. et al. 2005. Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1- polarizing program in dendritic cells. Nat Immunol 6: 769-776; Lovgren, T. et al 2017. Enhanced stimulation of human tumor-specific T cells by dendritic cells matured in the presence of interferon-gamma and multiple toll-like receptor agonists. Cancer Immunol Immunother) consistindo em 2,5µg/mL R848 (InvivoGen), 20μg/mL de ácido poli-inossínico:policitidílico (poliLC) (Sigma-Aldrich) e l000IU/mL IFN-γ (Shenandoah Biotechnology). Este coquetel de maturação foi denominado “combinações de ligante do receptor tipo Toll combinados com IFN-γ” (COMBIG). DCs maturadas com COMBIG usadas como estimulação alogênico são referidas como allo-COMBIG-DCs. DCs imaturas tratadas com Ad5M (2000 evg/célula) por 18 horas são referidas como allo-Ad5M-DCs enquanto allo-COMBIG/Ad5M-DCs foram tratadas tanto com COMBIG quanto com Ad5M por 18 horas. Após lavagem, as células foram cultivadas adicionalmente em meio DC fresco. Arranjo de Citocina Humana e ensaio de liberação de Citocina
[0088] Sobrenadantes de culturas de DC (2,5-5xl05 células/poço em placas de 48 poços) foram coletados. Kits de ELISA foram usados para estudar a produção de IL-12p70 (Mabtech), IL-6 (BioLegend) e CXCL 10 (BioLegend). Citometria de fluxo
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[0089] Fenotipagem de DC Humanas. Anti-CD1a-BV510 (BD Biosciences), anti-CD14-APC/Cy7, anti-HLA-DR-perCP (MHC classe II), anti-CD40-FITC, anti-CD80-PE, anti-CD83-APC e anti-CD86-BV421 foram usados para avaliar as DCs. Ativação de células T em reação de leucócito mista alogênica.
[0090] AlloDCs foram cocultivadas com PBMCs de doadores não relacionados (MLR) a razão 1:5 (alloDCs:PBMCs). Ativação foi avaliada 24 horas depois por citometria de fluxo com anti-CD3-FITC e anti-CD69- BV510. ELISA foi usado para a detecção de IFN-γ (Mabtech) no sobrenadante de cocultura alogênica (allo-SN). Ativação de DCs imaturas espectadoras.
[0091] AlloDCs foram cocultivadas com PBMCs a razão 1:5 (alloDCs:PBMCs) por 24 horas e o allo-SN foi usado como uma estimulação de maturação para DCs espectadoras imaturas. Maturação de DC espectadora foi avaliada 48 horas depois por citometria de fluxo como antes.
[0092] Todos os anticorpos foram adquiridos da BioLegend, a menos que especificado em outra parte. A aquisição de dados foi realizada usando um citômetro de fluxo FACSCanto II (BD Biosciences), e a análise foi realizada usando software Flow Jo (versão 7.6.5; Tree Star). Apresentação cruzada de antígeno de DC e ensaios de estimulação de célula
T Apresentação cruzada de CMV-pp65 por DCs para estimulação específica de células T CMV-pp65495-503 autólogas TCR modificadas.
[0093] DCs imaturas (HLA-A2+) foram cultivadas por 2 horas a 37°C com lisato celular congelado/descongelado das células tumorais A549(pp65), como um meio de prover proteína CMV-pp65 a DCs de modo exógeno. As DCs foram subsequentemente maturadas em sobrenadante de alloDC/PBMCs (allo-SNs) por 38 horas. Células T autólogas geneticamente modificadas para expressar um receptor de célula T (TCR) HLA- A*0201 restrito para o
29 / 41 epítopo de CMV-pp65495-503 (Hillerdal, V., et al 2016. Avidity characterization of genetically engineered T-cells with novel and established approaches. BMC Immunol 17: 23) foram então misturadas com DCs que apresentam cruzamento de CMV-pp65 a razão 5:1 (células T:DCs) e cultivadas em meio fresco por 18 horas. Ativação de célula T específica de TCR foi avaliada pela secreção de IFN-γ. Expansão e ré-estimulação de células T por DCs que apresentam cruzamento.
[0094] Células T (não modificadas) de doadores de HLA-A2+ soropositivo para CMV, foram misturadas com DCs que apresentam cruzamento de CMV-pp65 autólogas preparadas como anteriormente a razão de 20:1 (células T:DCs) e cultivadas em meio fresco por um total de 12 dias. Meio com 30IU/mL IL-2 (Proleucina, Novartis) e 20ng/mL IL-7 (Nordic Biosite) foi substituído após 7 dias. Expansão de célula T específica de CMV- pp65 foi detectada com um tetrâmero HLA-A* 020 l/pp65495-503 (Beckman Coulter).
[0095] Células T2 (HLA-A2+) foram pulsadas com 5μg/mL de peptídeo de CMV-pp65495-503 ou o peptídeo TARP(P5L)4-13 irrelevante de ligação a HLA-A2. As células T2 pulsadas foram usadas para ré-estimular as células T específicas de CMV-pp65 expandidas por 18 horas. Liberação de IFN-γ foi medida como um indicador de ativação de célula T. Estatística
[0096] Os dados são reportados como média ±SEM. A análise estatística foi realizada por software GraphPad prism versão 6.01 (La Jolla). As análises estatísticas foram realizadas usando ANOVA a um fator paramétrico com teste de Holm-Sidak para correção de múltiplas comparações. Teste t de Student foi usado quando apenas dois grupos foram avaliados. Valores com P<0,05 foram considerados estatisticamente significantes.
30 / 41 Resultados e Discussão
[0097] DCs COMBIG-maturadas e COMBIG/Ad5M-maturadas exibiram um fenótipo e perfil de secreção de citocina associados com polarização de célula T auxiliar (Th1)
[0098] O estado de maturação de DCs é muito crucial para a indução de respostas efetoras ideais em vacinação contra câncer de DC autóloga ((Sabado, R. L., and N. hardwaj. 2010. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy 2: 37- 56). Interessantemente, foi observado também ser importante para a ativação de células T alogênicas (Jonuleit, H. et al 2000. Induction of interleukin 10- producing, nonproliferating CD4(+) T cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells. J Exp Med 192: 1213- 1222.). Em nossos experimentos, DCs imaturas (imDCs) foram deixadas não tratadas ou maturadas por 18 horas por COMBIG, Ad5M ou sua combinação. O uso do vetor adenoviral Ad5M intensificado por infecção pode facilitar o carregamento de DCs com antígenos de tumor, uma prática ex vivo padrão para modificar DCs derivadas de paciente (Tacken, P. J., e C. G. Figdor. 2011. Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: steps towards cost effective vaccines. Semin Immunol 23: 12- 20). Por questão de se ter um sistema simples para avaliar o efeito de maturação de Ad5M em DCs, nesse estudo Ad5M foi usado sem um transgene. Células foram lavadas e cultivadas por mais 24 horas em meio DC fresco sem adição de nenhuma citocina. Mudanças fenotípicas de DC foram avaliadas por citometria de fluxo e os sobrenadantes (SN) foram coletados para mapear os perfis de secreção (Figura 1 A).
[0099] Maturação de COMBIG, sozinha ou combinada com Ad5M, induziu suprarregulação de HLA-DR, CD40, CD80, CD86 e CD83, implicando em um fenótipo maduro e ativado (Figura 1B). COMBIG-DCs- maturado e COMBIG/Ad5M-maturado demonstraram também secreção
31 / 41 elevada de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias. Assim, confirmando que a transdução não prejudicou a maturação de imDCs em DCs pró- inflamatórias.
[00100] Considerados juntos, nossos dados indicam que a maturação de Ad5M/COMBIG é bem tolerada por DCs derivadas de monócito de humano e resultou na geração de um fenótipo de DC totalmente maturado e pró-inflamatório. DCs maturadas com o coquetel de COMBIG combinado com infecção por Ad5M aumenta sua capacidade de ativar células T alogênicas
[00101] Ativação de célula T no agrupamento de PBMC alogênico por Combig-DCs ou COMBIG-DCs/Ad5M cocultivadas foi avaliada pela suprarregulação e a proteína de ativação inicial CD69. Interessantemente, em claro contraste à opinião prevalecente, a ativação de célula T foi maior em coculturas com allo-COMBIG infectada com o vetor do vírus Ad5M comparada àquelas de allo-COMBIC-DCs não infectadas. Sobrenadantes de coculturas de allo-COMBIG VAd5M-DCs e PBMCs induzem uma eficiente maturação DCs espectadoras
[00102] Foi observado que sobrenadantes de MLR (Allo-SN) de coculturas de PBMCs com allo-COMBIG-DCs ou allo-COMBIG/ Ad5M- DCs induzem significativamente suprarregulação de CD40 em DCs espectadoras imaturas. Em linha com a capacidade aumentada de allo COMBIG/Ad5 DCs de ativar células T alogênicas, sobrenadantes de MLR de coculturas de PBMC allo-COMBIG/Ad5M-DC, mas não sobrenadantes de MLR de coculturas de allo-COMBIG-DC não infectadas com PBMC, adicionalmente levaram a suprarregulação significante dos marcadores de maturação CD80 e CD86 nas DCs espectadoras (Figura 2E). DCs espectadoras, maturadas pelo sobrenadante de MLR de coculturas de PMBC allo- COMBIG VAd5M-DC, eficientemente realizam apresentação cruzada de antígenos para expansão de célula T
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[00103] Além de maturação de DC, captação de antígeno e apresentação de antígeno desempenham papéis importantes na indução de imunidade tumoral adaptativa (Vandenberk, L. et al 2015. Exploiting the Immunogenic Potential of Cancer Cells for Improved Dendritic Cell Vaccines. Front Immunol 6: 663).
[00104] A fim de testar captação de antígeno e apresentação de antígeno usamos um sistema de modelo in vitro onde DCs de doadores de HLA-A2+ (DCs espectadoras) foram incubadas com lisato celular de células tumorais (A549(pp65)) que expressam a proteína CMV-pp65 de comprimento total, imitando a condição de células tumorais lisadas (Figura 3 A, C). Essas DCs espectadoras imaturas carregadas com antígeno foram então maturadas com sobrenadantes de MLR de coculturas de PBMC-alloDC. O antígeno pp65 exógeno precisa ser processado pelas DCs espectadoras no peptídeo pp65495-503 e apresentado cruzado em HLA-A2 (MHC classe I) a fim de estimular células T autólogas, geneticamente modificadas com um TCR específico para CMV-pp65495-503. Observamos que DCs espectadoras maturadas carregadas com antígeno em sobrenadantes de MLR podem eficientemente realizar apresentação cruzada do antígeno e estimular geneticamente modificadas células T específicas de CMV-pp65495-503 TCR (Figura 3 A) para secretar altas quantidades de IFN-γ, com sobrenadantes de MLR de coculturas de PBMC allo-COMBIG/Ad5M-DC produzindo ativação significativamente melhor comparados com os sobrenadantes de MLR de PBMCs cocultivados com allo-COMBIG-DC não transduzida (Figura 3B).
[00105] Em seguida quisemos testar se células T específicas de CMV- pp65 endógenas (não modificadas geneticamente) poderiam ser ativadas e expandidas. Nesse caso iniciamos com DCs espectadoras de doadores de HLA-A2+ soropositivo para CMV, carregadas com lisato celular tumoral contendo pp65 e maturadas com allo-SN de coculturas de PBMC allo- COMBIG/Ad5M-DC (Figura 3C). Essas DCs espectadoras produziram uma
33 / 41 expansão 5 vezes de células T específicas de CMV-pp65 autólogas de doadores soropositivos para CMV (Figura 3D). A capacidade dessas células T de reconhecer seu alvo e exercer funções efetoras foi testada em um ensaio de ré-estimulação. As células T expandidas foram expostas a células T2 pulsadas tanto com o peptídeo pp65495-503 HLA-A2 restrito quanto com um peptídeo HLA-A2 restrito irrelevante e a liberação de IFN-γ foi medida. Mediante ré- estimulação com as células alvos positivas para pp65, alta liberação de IFN-γ pode ser detectada das células T expandidas por DCs espectadoras apresentadoras de pp65 maturadas com allo-SN de coculturas de allo- COMBIG/Ad5M-DCs de PBMC (Figura 3E). As células T expandidas foram também confirmadas como específicas de antígeno uma vez que exposição a células T2 pulsadas com um peptídeo irrelevante levou apenas a quantidades de fundo de liberação de IFN-γ (Figura 3E).
[00106] Resumidamente, postulamos uma justificativa para usar allo DCs COMBIG infectadas com o adenovírus Ad5M (allo COMBIG- DCs/Ad5M) como um intensificador imune induzindo maturação de DC espectadora e subsequente iniciação de células T específicas de antígeno. Quando comparadas com COMBIG-DCs não infectadas, foi observado surpreendentemente que COMBIG-DCs infectadas com o vírus Ad5M (COMBIG-DCs/Ad5M) criam um ambiente pró-inflamatório com capacidade intensificada de induzir maturação de DC espectadora quando cocultivadas com PBMCs alogênicos. Quando um antígeno modelo foi provido de forma exógena, imitando lisato celular tumoral, DCs espectadoras maturadas com sobrenadantes de MLR de coculturas de allo COMBIG/Ad5M DCs e PBMCs podem eficientemente digerir e realizar apresentação cruzada do antígeno modelo e provocar expansão e ativação de célula T citotóxica específica de antígeno. EXEMPLO 2 - Estudos em camundongos in vivo com COMBIG DC:s de camundongos infectadas e transduzidas com vetor de adenovírus que
34 / 41 codifica para um tumor associado antígeno (glicoproteína 100)
[00107] No exemplo 2, alloDCs infectadas com o vírus Ad5M com genes que codificam para o antígeno tumoral gp 100 foram avaliadas. Foi observado que a administração subcutânea de Ad5M(gpl00)-alloDCs estimulou a proliferação de células T CD8+ pmel-1 adotivamente transferidas (gp-100-direcionado) no ambiente profilático. Além disso, administração intratumoral de Ad5M(gpl00)-alloDCs no ambiente terapêutico resultou em crescimento de tumor atrasado e sobrevivência prolongada. Materiais e Métodos Produção do vírus recombinante
[00108] Os vetores de Ad5M(MOCK) e Ad5M(gpl00) foram construídos e produzidos como previamente descrito (Yu D, et al. Adenovírus com modificação do domínio de transdução de hexon Tat-proteína apresenta maior efeito terapêutico em tumores de neuroblastoma e neuroendócrinos experimentais. J Virol 2011;85(24): 13114-23 doi 10.1128/JVI.05759-11). Eles são vetores de adenovírus sorotipo 5 deletados de El (Ad5) tendo a haste de fibra e botão substituídos com a contraparte de sorotipo-35. Eles também contêm um peptídeo de penetração celular de HIV Tat no laço hipervariável de suas proteínas hexon (principal proteína de capsídeo). Eles são vetores intensificados com infecção com capacidade melhorada de transduzir a maioria de células hematopoiéticas incluindo DCs (Yu D, et al. Vetores de Adenovírus sorotipo 5 com hexon Tat-PTD modificado e fibra sorotipo 35 mostram capacidade de transdução bastante intensificada de culturas celulares primárias. PLoS One 2013;8(l):e54952 doi 10.1371/journal.pone.0054952). Ad5M(MOCK) não codifica nenhum transgene, enquanto Ad5M(gpl00) codifica o glicoproteína 100 do antígeno de melanoma humano (gp 100, aminoácidos 25-33). Tituladores foram determinados por reação em cadeia de polimerase quantitativa como genomas de vírus encapsidados (evg) por mL (Yu D, et al. Vetores de adenovírus sorotipo 5 com hexon Tat-PTD
35 / 41 modificado e fibra sorotipo 35 mostram capacidade bastante intensificada de culturas celulares primárias. PLoS One 2013;8(l):e54952 doi
10.1371/journal.pone.0054952). Linhagens celulares
[00109] A linhagem celular 911 (Crucell, Leiden, Países Baixos) usada para produção de adenovírus foi cultivada em DMEM suplementado com FBS inativado termicamente 10%, penicilina/estreptomicina (PeSt) 1% e piruvato de sódio 1%. A linhagem celular de melanoma de camundongo B 16-F 10 (ATCC, Rockville, MD) foi cultivada em DMEM suplementado com FBS inativado termicamente 10%, PeSt 1% e piruvato de sódio 1%. As linhagens celulares de melanoma de camundongo Hcme e Hcmell2 são derivadas de um modelo de melanoma HGF-CDK4(R24C) primário (Bald T, et al. Ultraviolet-radiation-induced inflammation promotes angiotropism and metastasis in melanoma. Nature 2014;507(7490): 109-13; Landsberg J, et al. Melanomas resist T-cell therapy through inflammation-induced reversible dedifferentiation. Nature 2012;490(7420):412-6) e são um tipo de doação do Prof. Thomas Tilting, University Hospital Magdeburg. Tanto HcmeB quanto Hcmell2 foram cultivados em RPMI-1640 suplementado com FBS inativado termicamente 10%. Todos os componentes e meios de cultura foram da Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA). Todas as células foram cultivadas em um incubador umidificado com uma atmosfera de CO2 5% a 37°C. Isolamento e maturação de DCs alogênicas derivadas de medula óssea de camundongo
[00110] DCs derivadas de medula óssea foram geradas do fêmur e tíbia de camundongos BALB/c fêmeas tipo selvagem (wt) de 7-8 semanas de idade (H-2Dd) (The Janvier Labs, França) expondo a medula óssea e lavando as células com uma seringa estéril. As células colhidas foram cultivadas em IMDM suplementado com FBS inativado termicamente 10%, PeSt 1%, HEPES 1%, β-mercaptoetano 150 μΜ. Meio de cultura foi suplementado com
36 / 41 IL-4 de murino recombinante 20ng/mL e 20ng/mL GM-CSF de murino recombinante (Nordic BioSite, Stockholm, Suécia). Células de medula óssea foram plaqueadas em pratos Petri não tratados (Sarstedt, Numbrecht, Alemanha). O meio foi substituído a cada 3 dias. No dia 7 a imDCs não aderentes foram colhidas e tratadas por 18 horas com um coquetel de ligantes de receptor tipo Toll combinados com IFN-γ (COMBIG), que consiste em 2,5 μg/mL de R848 (InvivoGen, Sam Diego, CA), 20 μg/mL de ácido poli- inosínico:policitidílico (polyLC) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e 1.000 IU/mL IFN-γ (Nordic Biosite) (Napolitani G, Rinaldi A, Bertoni F, Sallusto F, Lanzavecchia A. Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1-polarizing program in dendritic cells. Nat Immunol 2005;6(8):769-76 doi 10.1038/nil223) a fim de obter alloDCs. Ad5M(gpl00)-alloDCs maduras foram obtidas transduzindo imDCs precipitadas por 2 horas, a 37°C com 2.000 evg/célula Ad5M(gpl00) e maturadas como anteriormente. Células foram cultivadas em um incubador umidificado com uma atmosfera de CO2 5% a 37°C. Fenotipagem de célula imune de murino
[00111] Citometria de fluxo foi usada para fenotipar células T de murino usando tetrâmero anti-CD3-PB, anti-CD8a-APC, anti-Thyl .l-PE, anti- VP-13-FITC, H-2Db/hgpl0025-33-PE (Beckman Coulter, San Diego, CA). Todos os anticorpos foram adquiridos da BioLegend (San Diego, CA). Aquisição de dados foi realizada usando um citômetro de fluxo FACSCanto II (BD Biosciences), e a análise foi realizada usando software Flow Jo (versão
7.6.5; Tree Star, Ashland, OR). Experimentos em animal
[00112] O Comitê de Ética em Pesquisa em Animais de Uppsal (C215/12) e o Comitê de Ética em Pesquisa do Norte de Estocolmo (N 170/13, N 164/15) aprovaram os estudos em animal. Todos os experimentos in vivo foram realizados com camundongos fêmeas C57BL/6NRj (H-2Db) de
37 / 41 6-7 semanas de idade recebendo vacinações com DCs alogênicas tratadas (células de vacina) geradas da medula óssea de camundongos fêmeas BALB/c (H-2Dd) de 7-8 semanas de idade e tratadas como descrito anteriormente. Todos os camundongos foram obtidos da Janvier Labs. Transferência adotiva de esplenócitos de pmel-1 (específico de gp 100).
[00113] Camundongos foram injetados s.c. com 1x106 células de vacina. Esplenócitos de pmel-1 (10x106 por camundongos) foram injetados intravenosamente (i.v.) 48 horas depois. Os camundongos pmel-1 transgênicos têm um fundo de C57BL/6NRj (H-2Db) e cerca de 20% de seus esplenócitos são células T Thy 1.1+ CD8+ que carregam um TCR específico de gpl0025-33-. Camundongos pmel-1 foram originalmente obtidos da Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine, USA) e mantidos em reprodução por nosso grupo. Linfonodos de drenagem (inguinal) foram colhidos 7 dias após transferência de esplenócito adotivo de pmel-1 e digeridos em suspensões de célula única. Avaliação in vivo de eficácia terapêutica em um modelo de melanoma B16 após injeção intratumoral com alloDCs
[00114] Camundongos foram injetados s.c. no flanco traseiro com 1 x 105 células tumorais B16-F10. Para o experimento de transferência de célula T pmel-1, camundongos receberam injeção i.v. de l x l08 esplenócitos Pmel-1 no dia 8 e injeções i.t. de 106 alloDCs no dia 8 e 14 após inoculação de célula tumoral B16-F10. Os tumores foram medidos com paquímetro e o tamanho do tumor foi calculado como a fórmula: Volume = comprimento x largura 2 x π/6. Camundongos foram sacrificados quando o volume do tumor excedeu 1 cm3 ou se úlceras hemorrágicas desenvolveram. Células foram obtidas do baço, sangue e linfonodo dos camundongos sacrificados no dia 15 após inoculação de B16-F10 e manchados para expressão dos marcadores de célula T pmel-1Thyl .1 e Υβ13. Estatística
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[00115] Os dados são reportados como média e SEM. Análise estatística foi realizada por software GraphPad prism versão 6.01 (La Jolla, CA, USA). Análises estatísticas foram realizadas usando teste ANOVA a um fator paramétrica (> 2 grupos experimentais) com teste de Holm-Sidak para correção de múltiplas comparações e teste de Mann- Whitney U (apenas 2 grupos experimentais). Associação de células T gpl00-TCR+ e carga do tumor foi avaliada por um modelo de regressão linear computando correlação de Spearman. Comparação estatística da curva de sobrevivência de Kaplan- Meier foi realizada usando teste de classificação log. Valores com P<0,05 foram considerados estatisticamente significantes. Resultados Vacinação com Ad5M(gpl00)-alloDCs em um modelo de melanoma de camundongo aumenta a proliferação e persistência de células T pmel-1 adotivamente transferidas, atrasa o crescimento de tumor e prolonga a sobrevivência
[00116] Procuramos examinar se Ad5M(gpl00)-alloDCs em combinação com célula T de transferência adotiva de esplenócitos Pmel-1 tem um efeito de sobrevivência positivo em camundongos que carregam melanoma. Camundongos C57BL/6NRj Naive foram injetados s.c no membro posterior direito com 1x106 alloDCs ou Ad5M(gpl00)-alloDCs, seguido por transferência adotiva intravenosa (i.v) de 10x106 esplenócitos Pmel-1 (Figura 4A). Ao contrário de COMBIG-DCs não transfectadas, COMBIG/Ad5M(gp 100)-DCs foram capazes de estimular a proliferação das células T CD8+ Thy
1.1+ específicas de gp 100 adotivamente transferidas e sustentar sua presença cinco dias após a transferência (Figura 4B).
[00117] Posto que células T pmel-1 persistem após vacinação com COMBIG/Ad5M(gpl00)-DCs, avaliamos em seguida o efeito combinatorial de transferência de esplenócito pmel-1 adotivo com injeção i.t. de COMBIG/Ad5M(gp 100)-DCs (Figura 5 A) em um ambiente terapêutico. O
39 / 41 crescimento de tumor atrasou o tratamento combinado (Figura 5B) e prolongou significativamente a sobrevivência do camundongo que carrega tumor (Figura 5C). Discussão
[00118] Considerados juntos, o presente exemplo demonstra que o uso de DCs COMBIG infectadas com Ad5M que codifica para o antígeno tumoral gp 100 pode potencializar respostas da célula T específica de gp 100 sistêmicas, suprimir o crescimento de tumor e prolongar a sobrevivência em um modelo de melanoma de camundongo. Iniciação eficaz de respostas da célula T por um iniciador/vacina imune exige que DCs endógenas absorvam antígenos, maturem e migrem para dLNs onde elas podem interagir produtivamente com células T na’ive (Dieu-Nosjean MC, et al. Tertiary lymphoid structures in cancer and beyond. Trends Immunol 2014;35(11):571- 80; Kleindienst P, et al Endogenous dendritic cells are required for amplification of T cell responses induced by dendritic cell vaccines in vivo. J Immunol 2003;170(6):2817- 23), assim indicando que COMBIG-DC localmente injetada que foi infectada com um vírus Ad5M que codifica para antígenos de tumor será similar a COBMIG DCs infectada com vírus não codificante Ad5M (vide Exemplo 1) induz uma resposta pró-inflamatória que estimula maturação de DCs espectadoras endógenas e uma iniciação eficiente subsequente de células T específicas de tumor. EXEMPLO 3 - COMBIG-DCs transduzidas com um vetor de adenovírus com transgenes que codificam para proteínas E6 e E7 de HPV-16
[00119] No exemplo 3, o impacto de infectar DCs imaturas com um vetor adenoviral (Ad5) com transgenes que codificam para proteínas E6 e E7 de HPV-16 (Ad5-HPV16E6E7) em ativação/maturação fenotípica induzida pelo coquetel de COMBIG (Poli-I:C, R848 e IFN-gama) sozinho foi avaliado. Resumidamente, foi observado que infecção com Ad5-HPV16E6E7, similar à infecção com o vetor vazio Ad5M (cf. exemplo 1), não confere a capacidade
40 / 41 de o coquetel de COMBIG induzir maturação de DC fenotípica (cf. Figura 6 A, B). Além disso, a capacidade de COMBIG-DCs estimular a via direta de alorreconhecimento, como medido pela ativação (expressão de CD69) de células T alogênicas durante uma reação de leucócito mista (MLR) foi aumentada (cf. Figura 7 B). Um efeito similar foi visto no exemplo 1 com o vetor vazio Ad5M (cf. Figura 2 B).
[00120] Além disso, a revelação de que ativação/maturação de DCs espectadoras com sobrenadantes de MLR de coculturas de DCs e PBMCs allo COMBIG-Ad5M foi aumentada (Figura 7 C) implica que COMBIG-DCs transduzidas com o vetor Ad5-HPV16-E6E7 são úteis como um intensificador imune alogênico à base de célula melhorada na qual o modo de ação é crucialmente dependente da via direta de alorreconhecimento. Materiais e Métodos Produção de Ad5-HPV16E6E7
[00121] Ad5 é um vetor do adenovírus sorotipo-5 humano (Ad5) deletado de El que codifica os transgenes de E6 e E7. Tituladores foram determinados por PCR quantitativa como genomas de vírus encapsidados (evg) por mL (Yu, D. et al 2013. Vetores de adenovírus sorotipo 5 com hexon Tat-PTD modificado e fibra sorotipo 35 apresentam capacidade de transdução bastante intensificada de culturas celulares primárias. PLoS One 8: e54952). Isolamento de PBMCs de humano e geração de DCs, Geração e tratamento de Citometria de fluxo de DCs, e Fenotipagem de DC Humanas, Ativação de células T em reação de leucócito mista alogênico, Ativação de DCs imaturas espectadoras e Estatística.
[00122] Vide Material e métodos no Exemplo 1 Resultados e Discussão
[00123] DCs estimuladas com COMBIG/Ad5-HPV16E6E7 exibem um fenótipo maduro para avaliar o efeito de maturação de Ad5-HPV-16-E6 e E7 em DCs, mudanças fenotípicas foram estudadas por citometria de fluxo
41 / 41 (Figura A, B). Como mostrado na Figura 6 B, estimulação com COMBIG, sozinha ou combinada com Ad5-HPV-16E6E7, induziu suprarregulação de CD40, CD80, CD86, e HLA-DR, implicando um fenótipo maduro e ativado (Figura 6B). Tomados juntos, esses dados indicam que maturação de Ad5- HPV-16-E6E7/COMBIG- é bem tolerada por DCs derivadas de monócito de humano e resultaram na geração de um fenótipo de DC totalmente maturado. DCs maturadas com o coquetel de COMBIG combinado com infecção de Ad5-HPVl 6E6E7 aumenta sua capacidade de ativar células T alogênicas
[00124] Ativação de célula T no agrupamento de PBMC alogênico por COMBIG-DCs ou COMBIG/Ad5-HPV16E6E7 DCs cocultivadas foi avaliada pela suprarregulação da proteína de ativação precoce CD69. Interessantemente, em notável contraste à opinião prevalecente, ativação de célula T foi maior em coculturas com allo-COMBIG infectada com o vetor do vírus Ad5-HPV16E6E7 comparada com aquelas de allo-COMBIG-DCs não infectadas (Figura 7 B). Sobrenadantes de coculturas de DCs e PBMCs com allo-COMBIG/Ad5- HPVl6E6E7 induzem uma maturação eficiente de DCs espectadoras
[00125] Foi observado que sobrenadantes de MLR (Allo-SN) de coculturas de PBMCs com allo-COMBIG-DCs e allo-COMBIG/Ad5- HPV16E6E7 DCs, respectivamente induzem suprarregulação de marcadores de maturação (CD40, CD80 e CD86) em DCs espectadoras imaturas. Em linha com a capacidade aumentada de allo COMBIG/Ad5-HPV-16E6E7 DCs ativar células T alogênicas (cf. Figura 7 B), sobrenadantes de MLR de coculturas de PBMC allo-COMBIG/ Ad5-HPV16-E6E7-DC proveram suprarregulação aumentada dos marcadores de maturação (CD40, CD80 e CD86) comparados com sobrenadantes de MLR de coculturas de allo- COMBIG-DC não infectadas com PBMC (Figura 7 C).
Claims (25)
1. Célula dendrítica pró-inflamatória com capacidade de ativar células T alogênicas através da via direta de alorreconhecimento, a dita célula dendrítica sendo infectada com um adenovírus, caracterizada pelo fato de que a dita célula dendrítica pró-inflamatória foi obtida: - provendo uma célula dendrítica imatura; - infectando a célula dendrítica com um adenovírus; e - maturando a célula dendrítica imatura em uma célula dendrítica pró-inflamatória, em que a dita maturação é realizada por adição do ligante do receptor tipo Toll 3 (TLR3) poli-I:C, um ligante de TLR7/8, e interferon gama (IFN-γ) para induzir maturação da célula dendrítica imatura.
2. Célula dendrítica pró-inflamatória de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o adenovírus é um adenovírus sorotipo-5 (Ad5) com haste e/ou botão de fibra de adenovírus sorotipo-35 (Ad35) no lugar da haste e/ou botão de fibra de Ad5.
3. Célula dendrítica pró-inflamatória de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a proteína hexon do adenovírus é modificada para compreender pelo menos um domínio de transdução de proteína (PTD) do transativador de transcrição (TAT) do vírus de imunodeficiência humana (HIV).
4. Célula dendrítica pró-inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o adenovírus é um adenovírus deletado de El.
5. Célula dendrítica pró-inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o adenovírus não compreende nenhum gene que codifica para um antígeno tumoral, por meio do que a célula dendrítica pró-inflamatória é infectada, mas não transduzida.
6. Célula dendrítica pró-inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o adenovírus compreende pelo menos um gene que codifica para um antígeno associado a tumor ou específico de tumor, por meio do que a célula dendrítica infectada é transduzida para expressar o antígeno associado ou específico do tumor; preferivelmente o antígeno tumoral é selecionado do grupo que consiste em antígenos oncovirais, tais como papilomavírus humano, vírus Epstein-Barr, vírus do sarcoma de Kaposis, ou poliomavírus da célula de Merkel, e neoantígenos derivados de mutação.
7. Célula dendrítica pró-inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a maturação e a infecção com o adenovírus, respectivamente, são realizadas simultaneamente.
8. Célula dendrítica pró-inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o ligante de TLR7/8 é Resiquimod.
9. Célula dendrítica pró-inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que: - a dita etapa de maturar a célula dendrítica imatura na célula dendrítica pró-inflamatória compreende adicionalmente a adição de pelo menos uma substância selecionada do grupo que consiste em ligantes de TLR2, ligantes de TLR4, ligantes de TLR9, Interferon alfa (IFN-um), interleucina 1β (IL-Ιβ), e fator de necrose tumoral alfa (TNF-ɑ) para induzir ativação; e/ou - a dita etapa de maturar a célula dendrítica imatura na célula dendrítica pró-inflamatória não compreende adição de prostaglandina E2 (PGE2).
10. Célula dendrítica pró-inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a célula dendrítica imatura é provida diferenciando monócitos nas células dendríticas imaturas por uso de interleucina 4 (IL-4) e Fator Estimulador de Colônia de Granulócito e Macrófago (GM-CSF), os monócitos tendo sido isolados de leucócitos do sangue periférico.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a célula dendrítica pró-inflamatória como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 e pelo menos um carreador farmacêutico aceitável.
12. Célula dendrítica pró-inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, ou a composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento ou prevenção de câncer em um indivíduo, em que a célula dendrítica pró- inflamatória é alogênica para o indivíduo.
13. Célula dendrítica pró-inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, para uso como definido na reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a célula dendrítica pró-inflamatória é administrada intratumoralmente.
14. Célula dendrítica pró-inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, para uso como definido na reivindicação 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que o dito uso inclui a administração adicional de um fármaco diminuindo o ambiente de tumor imunossupressor ou ativando o sistema imune; preferivelmente o dito fármaco é selecionado do grupo que consiste em sunitinib, nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, atezolizumab, avelumab, gemcitabina e 5-fluoruracila; mais preferivelmente o dito fármaco é selecionado do grupo que consiste em sunitinib, nivolumab, pembrolizumab, e pidilizumab; ainda mais preferivelmente o dito fármaco é sunitinib.
15. Célula dendrítica pró-inflamatória de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, 7 a 10, para uso como definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizada pelo fato de que o adenovírus compreende pelo menos um gene que codifica para um antígeno associado a tumor ou específico de tumor, por meio do que a célula dendrítica infectada é transduzida para expressar o antígeno associado ou específico do tumor; preferivelmente o antígeno tumoral sendo selecionado do grupo que consiste em antígenos oncovirais, tais como papilomavírus humano, vírus Epstein- Barr, vírus do sarcoma de Kaposis, ou poliomavírus da célula de Merkel, e neoantígenos derivados de mutação; e em que a célula dendrítica pró- inflamatória é administrada intradermicamente, subcutaneamente ou intranodalmente.
16. Método para prover células dendríticas pró-inflamatórias como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, as ditas células dendríticas pró-inflamatórias tendo capacidade de ativar células T alogênicas através da via direta de alorreconhecimento, e as ditas células dendríticas sendo infectadas com um adenovírus, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende as etapas de: - prover células dendríticas imaturas; - infectar as células dendríticas com um adenovírus; e - maturar as células dendríticas imaturas em uma célula dendrítica pró-inflamatória, em que a dita maturação é realizada por adição do ligante do receptor tipo Toll 3 (TLR3) poli-I:C, um ligante de TLR7/8, e interferon gama (IFN-γ) para induzir maturação da célula dendrítica imatura.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o adenovírus é um adenovírus sorotipo-5 (Ad5) com haste e/ou botão de fibra de adenovírus sorotipo-35 (Ad35) no lugar da haste e/ou botão de fibra de Ad5.
18. Método de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que a proteína hexon do adenovírus é modificada para compreender pelo menos um domínio de transdução de proteína (PTD) do transativador de transcrição (TAT) do vírus da imunodeficiência humana (HIV).
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações
16 a 18, caracterizado pelo fato de que o adenovírus é um adenovírus deletado de El.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que o adenovírus não compreende nenhum gene que codifica para um antígeno tumoral, por meio do que a célula dendrítica pró-inflamatória é infectada mas não transduzida.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que o adenovírus compreende pelo menos um gene que codifica para um antígeno associado a tumor ou específico de tumor, por meio do que a célula dendrítica infectada é transduzida para expressar o antígeno associado ou específico do tumor; preferivelmente o antígeno tumoral sendo selecionado do grupo que consiste em antígenos oncovirais, tais como papilomavírus humano, vírus Epstein-Barr, vírus do sarcoma de Kaposis, ou poliomavírus da célula de Merkel, e neoantígenos derivados de mutação.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, caracterizado pelo fato de que a maturação e a infecção com o adenovírus, respectivamente, são realizadas simultaneamente.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 22, caracterizado pelo fato de que o ligante de TLR7/8 é Resiquimod.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 23, caracterizado pelo fato de que: - a dita etapa de maturar a célula dendrítica imatura na célula dendrítica pró-inflamatória compreende adicionalmente a adição de pelo menos uma substância selecionada do grupo que consiste em ligantes de TLR2, ligantes de TLR4, ligantes de TLR9, Interferon alfa (IFN-ɑ), interleucina 1β (IL-Ιβ), e fator de necrose tumoral alfa (TNF-ɑ) para induzir ativação; e/ou - a dita etapa de maturar a célula dendrítica imatura na célula dendrítica pró-inflamatória não compreende adição de prostaglandina E2 (PGE2).
25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 24, caracterizado pelo fato de que as células dendríticas imaturas são providas diferenciando monócitos nas células dendríticas imaturas por uso de interleucina 4 (IL-4) e Fator Estimulador de Colônia de Granulócito e Macrófago (GM-CSF), os monócitos tendo sido isolados de leucócitos do sangue periférico.
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