BR112020002526A2 - composição de matéria, proteína de fusão, composição farmacêutica, método de tratamento ou prevenção de uma doença ou infecção viral associada ao arenavírus em um indivíduo em necessidade respectiva, polinucleotídeo isolado, estrutura de ácido nucleico, método de produção de um polipeptídeo e método de diagnóstico de uma infecção viral por arenavírus em um indivíduo - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA, PROTEÍNA DE FUSÃO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE UMA DOENÇA OU INFECÇÃO VIRAL ASSOCIADA AO ARENAVÍRUS EM UM INDIVÍDUO EM NECESSIDADE RESPECTIVA, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, ESTRUTURA DE ÁCIDO NUCLEICO, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO E MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE UMA INFECÇÃO VIRAL POR ARENAVÍRUS EM UM INDIVÍDUO. Divulga uma composição de matéria, compreendendo um polipeptídeo solúvel isolado que compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio apical da proteína do receptor de Transferrina 1 (TfR1), o polipeptídeo solúvel sendo capaz de se ligar a um Arenavírus. Também é divulgada uma proteína de fusão, compreendendo uma sequência de aminoácidos de um domínio apical do TfR1 e uma sequência de aminoácidos da IgG Fc, a proteína de fusão capaz de se ligar a um Arenavírus.

Description

“COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA, PROTEÍNA DE FUSÃO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO DE TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE UMA DOENÇA OU INFECÇÃO VIRAL ASSOCIADA AO ARENAVÍRUS EM UM INDIVÍDUO EM NECESSIDADE RESPECTIVA, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, ESTRUTURA DE ÁCIDO NUCLEICO, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO E MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE UMA INFECÇÃO VIRAL POR ARENAVÍRUS EM UM INDIVÍDUO”. CAMPO E HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção, em algumas aplicações respectivas, refere-se a fragmentos solúveis do domínio apical da proteína do receptor de Transferrina 1 (TfR1 |transferrin receptor 1) e, mais particularmente, mas não exclusivamente, ao uso dos mesmos para tratamento ou prevenção de uma infecção viral por Arenavírus.

[0002] As febres hemorrágicas virais são um grande problema de saúde global. A recente crise do Ebola demonstrou a rapidez com que as epidemias poderiam se espalhar com o transporte moderno e enfatizou a importância de medidas efetivas antes do início de tais surtos mortais. A imunoterapia efetiva apresenta uma grande promessa contra tais vírus mortais.

[0003] Os Arenavírus do ‘Novo Mundo’ (NW|New World) são vírus de RNA de fita simples com envelope zoonótico, predominantes nas Américas do Sul e do Norte, e são classificados em quatro categorias diferentes. São transportados por roedores reservatórios e causam doenças agudas ao infectar seres humanos, geralmente com manifestações de febre hemorrágica. Os Arenavírus NW patogênicos incluem os vírus Machupo (MACV|Machupo Virus) de clado-B, Junín (JUNV|Junin Virus), Guanarito (GTOV|Guanarito

Virus) e Sabiá (SBAV|Sabia Virus) que infectam pessoas na Bolívia, Argentina, Venezuela e Brasil, respectivamente. Além disso, o vírus Whitewater Arroyo (WWAV | Whitewater Arroyo Virus) de clado-A/B da América do Norte ou alguns de seus isolados geneticamente próximos também podem ser patogênicos aos seres humanos. Todos esses vírus usam o TfR1 como seu receptor de entrada [Radoshitzky et al., Nature (2007) 446: 92-96] e a capacidade de usar o TfR1 humano (hTfR1) os diferencia dos membros não patogênicos.

[0004] Os Arenavírus possuem uma glicoproteína trimérica de classe I com uma subunidade GP1 que adota um dobramento único e medeia o reconhecimento do receptor. Foi demonstrado que a neutralização de anticorpos monoclonais contra o vírus JUNV têm como alvo o local de ligação ao receptor em GP1, mas não foi observada qualquer neutralização cruzada de outros Arenavírus NW usando esses anticorpos ou soros de pacientes convalescentes com o JUNV [Mahmutovic et al., Cell Host Microbe (2015) 18: 705-713] devido a variações estruturais dos locais de ligação ao receptor [Mahmutovic et al., (2015) supra; Brouillette et al, J Virol (2017) 91]. Esses anticorpos podem resgatar animais de desafios letais contra o JUNV [Zeitlin et al., Proc Natl Acad Sci U S A (2016) 113: 4458-4463].

[0005] Focar o domínio apical do TfR1 usando anticorpos foi previamente sugerido como uma abordagem terapêutica [Abraham et al. Nat Struct Mol Biol (2010) 17: 438-444]. Helguera et al. identificaram um anticorpo anti- hTfR1, nomeadamente ch128.1, que inibiu eficientemente a entrada mediada pelas glicoproteínas de cinco Arenavírus, bem como a replicação do vírus Junín infeccioso [Helguera et al.,

J Virol. (2012) 86(7): 4024-8]. De acordo com Helguera et al., todos os Arenavírus NW de febre hemorrágica usam um epítopo comum de domínio apical do hTfR1 e agentes terapêuticos direcionados a esse epítopo, incluindo o ch128.1, podem ser amplamente efetivos no tratamento de febres hemorrágicas na América do Sul.

[0006] Aptâmeros direcionados ao domínio apical do hTfR1 também foram desenvolvidos e sugeridos para inibir a entrada de Mammarenavírus NW de febre hemorrágica [Maier et al., Mol Ther Nucleic Acids (2016) 5: e321].

[0007] A Patente norte-americana nº 9.439.973 e o Pedido de patente norte-americana nº 2015/125516 fornecem aptâmeros isolados de ácido ribonucleico de 60 bases ou menos que se ligam a um receptor de transferrina humana e inibem um Arenavírus do Novo Mundo de infectar uma célula, mas não competem com a transferrina humana pela ligação ao receptor de transferrina humana.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0008] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma composição de matéria, compreendendo um polipeptídeo solúvel isolado, compreendendo uma sequência de aminoácidos de um domínio apical da proteína do receptor de Transferrina 1 (TfR1), o polipeptídeo solúvel sendo capaz de se ligar a um Arenavírus.

[0009] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma composição de matéria que compreende um polipeptídeo solúvel, compreendendo uma sequência de aminoácidos de um domínio apical do TfR1, conforme estabelecido na ID. SEQ. Nº 6, o polipeptídeo solúvel sendo capaz de se ligar a um Arenavírus.

[0010] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma proteína de fusão, compreendendo uma sequência de aminoácidos de um domínio apical do TfR1 e uma sequência de aminoácidos da IgG Fc, a proteína de fusão capaz de se ligar a um Arenavírus.

[0011] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica, compreendendo a composição de matéria ou proteína de fusão de algumas aplicações da invenção, e um transportador farmaceuticamente aceitável.

[0012] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou infecção viral associada ao Arenavírus em um indivíduo em necessidade respectiva, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição de matéria ou proteína de fusão de algumas aplicações da invenção, tratando ou prevenindo, assim, a doença ou infecção viral associada ao Arenavírus no indivíduo.

[0013] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado que codifica o polipeptídeo ou a proteína de fusão de algumas aplicações da invenção.

[0014] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecida uma estrutura de ácido nucleico, compreendendo o polinucleotídeo isolado de algumas aplicações da invenção.

[0015] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de produção de um polipeptídeo, o método compreendendo a introdução da estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção em uma célula hospedeira; e o cultivo da célula hospedeira em condições adequadas para expressão do polipeptídeo.

[0016] De acordo com um aspecto de algumas aplicações da presente invenção, é fornecido um método de diagnóstico de uma infecção viral por Arenavírus em um indivíduo, o método compreendendo: (a) por em contato uma amostra biológica do indivíduo com a composição de matéria ou proteína de fusão de algumas aplicações da invenção sob condições que permitam a formação de imunocomplexos entre um Arenavírus e o polipeptídeo solúvel ou a proteína de fusão; e (b) determinar um nível dos imunocomplexos na amostra biológica, caracterizado por um aumento no nível dos imunocomplexos além de um limiar predeterminado em relação a um nível dos imunocomplexos em uma amostra biológica de um indivíduo saudável ser indicativo da infecção viral por Arenavírus.

[0017] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de aminoácidos é desprovida de uma estrutura em ansa longa.

[0018] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de aminoácidos compreende, pelo menos, uma deleção, inserção ou mutação pontual que torna o TfR1 solúvel.

[0019] De acordo com algumas aplicações da invenção, pelo menos, uma mutação pontual compreende uma substituição de um resíduo hidrofóbico por um resíduo hidrofílico.

[0020] De acordo com algumas aplicações da invenção, a mutação pontual se dá em uma interface entre o domínio apical e o domínio do tipo protease do TfR1.

[0021] De acordo com algumas aplicações da invenção, pelo menos, uma mutação pontual elimina um local de glicosilação do TfR1.

[0022] De acordo com algumas aplicações da invenção, o local de glicosilação compreende um motivo de glicosilação N-X-S.

[0023] De acordo com algumas aplicações da invenção, a Serina do motivo de glicosilação N-X-S é mutada para qualquer aminoácido ou mimético respectivo com a condição de que o aminoácido não seja Treonina.

[0024] De acordo com algumas aplicações da invenção, a Serina do motivo de glicosilação N-X-S é mutada para Alanina ou um mimético respectivo.

[0025] De acordo com algumas aplicações da invenção, a Asparagina do motivo de glicosilação N-X-S é mutada para qualquer aminoácido ou mimético respectivo com a condição de que o aminoácido não seja Asparagina.

[0026] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo compreende uma fração estabilizadora.

[0027] De acordo com algumas aplicações da invenção, a fração estabilizadora compreende um resíduo de cisteína.

[0028] De acordo com algumas aplicações da invenção, o resíduo de cisteína compreende, pelo menos, um resíduo de cisteína nos N-terminais e/ou C-terminais do polipeptídeo.

[0029] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo tem um comprimento não superior a 180 resíduos de aminoácidos.

[0030] De acordo com algumas aplicações da invenção, o TfR1 é de origem humana, de um roedor ou morcego.

[0031] De acordo com algumas aplicações da invenção, o roedor é um rato de garganta branca.

[0032] De acordo com algumas aplicações da invenção,

a sequência de aminoácidos do TfR1 é conforme estabelecido na ID. SEQ. Nº 2, 4, 16 ou 18.

[0033] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo é ligado a uma fração heteróloga.

[0034] De acordo com algumas aplicações da invenção, a fração heteróloga é capaz de induzir uma resposta de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC|antibody dependent cellular cytotoxicity).

[0035] De acordo com algumas aplicações da invenção, a fração heteróloga deve aumentar a avidez do polipeptídeo.

[0036] De acordo com algumas aplicações da invenção, a fração heteróloga existe para multimerização.

[0037] De acordo com algumas aplicações da invenção, a fração heteróloga é uma fração proteinácea.

[0038] De acordo com algumas aplicações da invenção, a fração proteinácea é selecionada do grupo que consiste em uma imunoglobulina, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glutationa-S-transferase (GST| Glutathione-S-Transferase), um peptídeo carbóxi-terminal (CTP |Carboxy Terminal Peptide) da gonadotrofina coriônica (CGβ| Chorionic Gonadotrophin) e uma cloranfenicol acetiltransferase (CAT | Chloramphenicol Acetyltransferase).

[0039] De acordo com algumas aplicações da invenção, a fração proteinácea é uma imunoglobulina.

[0040] De acordo com algumas aplicações da invenção, a imunoglobulina é uma IgG Fc.

[0041] De acordo com algumas aplicações da invenção, a composição de matéria é conforme estabelecido na ID SEQ. N°

8.

[0042] De acordo com algumas aplicações da invenção,

a composição de matéria é conforme estabelecido na ID SEQ. N°

23.

[0043] De acordo com algumas aplicações da invenção, a fração heteróloga é uma fração não proteinácea.

[0044] De acordo com algumas aplicações da invenção, a fração não proteinácea é selecionada do grupo que consiste em polietilenoglicol (PEG|Polyethylene Glycol), polivinilpirrolidona (PVP|Polyvinyl Pyrrolidone), poli(estireno-co-anidrido maleico) (SMA|Styrene Maleic Anhydride) e copolímero de éter divinílico e anidrido maleico (DIVEMA|Divinyl Ether Maleic Anhydride).

[0045] De acordo com algumas aplicações da invenção, a proteína de fusão é conforme estabelecido na ID SEQ. N° 8.

[0046] De acordo com algumas aplicações da invenção, a proteína de fusão é conforme estabelecido na ID SEQ. N° 23.

[0047] De acordo com algumas aplicações da invenção, a composição de matéria ou proteína de fusão de algumas aplicações da invenção é capaz de neutralizar o Arenavírus.

[0048] De acordo com algumas aplicações da invenção, a composição de matéria ou proteína de fusão de algumas aplicações da invenção é capaz de iniciar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC).

[0049] De acordo com algumas aplicações da invenção, a composição de matéria ou proteína de fusão de algumas aplicações da invenção existe para uso no tratamento ou prevenção de uma doença ou infecção viral associada ao Arenavírus em um indivíduo em necessidade respectiva.

[0050] De acordo com algumas aplicações da invenção, a doença é uma febre hemorrágica.

[0051] De acordo com algumas aplicações da invenção,

o Arenavírus é selecionado do grupo consistindo em, Junín (JUNV), Machupo (MACV), Guanarito (GTOV), Sabiá (SABV), Whitewater Arroyo (WWAV), Chapare (CHPV), Cupixi (CPXV), Tacaribe (TCRV), Bear Canyon (BCNV), Tamiami (TAMV), Big Brushy Tank (BBTV), Catarina (CTNV), Skinner Tank (SKTV) e Tonto Creek (TTCV).

[0052] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico é conforme estabelecido na ID SEQ. N° 1, 3, 15 ou 17.

[0053] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico é conforme estabelecido na ID SEQ. N° 5.

[0054] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico é conforme estabelecido na ID SEQ. N° 7.

[0055] De acordo com algumas aplicações da invenção, a sequência de ácido nucleico é conforme estabelecido na ID SEQ. N° 22.

[0056] De acordo com algumas aplicações da invenção, a estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações da invenção compreende, ainda, um peptídeo de sinal.

[0057] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, a recuperação do polipeptídeo.

[0058] De acordo com algumas aplicações da invenção, o método compreende, ainda, corroborar o diagnóstico usando um ensaio de diagnóstico selecionado a partir da medição de nível de antígeno, medição de nível de anticorpo, isolamento do vírus e/ou detecção genômica por reação em cadeia da transcriptase-polimerase reversa (RT-PCR |reverse transcriptase-polymerase chain reaction).

[0059] De acordo com algumas aplicações da invenção, o indivíduo é um indivíduo humano.

[0060] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e/ou científicos aqui usados têm o mesmo significado que o comumente entendido por alguém de habilidade comum na técnica a qual a invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou em teste das aplicações da invenção, métodos e/ou materiais exemplares são descritos abaixo. Em caso de conflito, o relatório descritivo da patente, incluindo suas definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser necessariamente limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS VÁRIAS VISUALIZAÇÕES DOS DESENHOS

[0061] Algumas aplicações da invenção são aqui descritas apenas a título de exemplo, tendo como referência os desenhos anexos. Com referência específica agora aos desenhos em detalhes, é enfatizado que os dados mostrados são a título de exemplo e para fins de discussão ilustrativa das aplicações da invenção. A este respeito, a descrição tomada juntamente com os desenhos torna aparente aos especialistas na técnica como as aplicações da invenção podem ser praticadas. Nos desenhos: As Figuras de 1A a 1D ilustram o design de um domínio apical solúvel do TfR1. Figura 1A - Visualização geral da estrutura complexa do TfR1/GP1 (ID do PDB: 3KAS). Duas moléculas de GP1 do vírus MACV (cinza) ligam-se ao TfR1 dimérico humano (azul claro e verde). Figura 1B - O domínio apical do TfR1 (laranja) é incorporado no domínio do tipo protease (azul claro) e, juntamente com o domínio de dimerização helicoidal (magenta), faz uma cópia completa da molécula do TfR1. Figura 1C - Alinhamento de sequência do TfR1 humano (Número de acesso ao GenBank: AB209254.1/UniProtKB - P02786), do TfR1 de um roedor da espécie Neotoma Albigula (NA) (Número de acesso ao GenBank KF982058/UniProt A0A060BIS8) e do domínio apical solúvel (sAD |soluble apical domain). O esquema de numeração segue a numeração do TfR1 humano e a sequência do TfR1 humano é colorida de acordo com o esquema de cores mostrado na ‘Figura 1B’ e na ‘Figura 1D’. Os potenciais locais de glicosilação ligados ao N são indicados com setas pretas.

Figura 1D - Visualização próxima da interface hidrofóbica do domínio apical (laranja) e do domínio do tipo protease (azul claro). Os resíduos hidrofóbicos que foram mutados no sAD são mostrados em verde.

As Figuras de 2A a 2E ilustram que o domínio apical projetado cria uma proteína solúvel e estável que efetivamente liga uma gama de domínios da GP1. Figura 2A - O perfil de cromatografia de exclusão por tamanho do domínio apical solúvel após purificação por afinidade demonstra um pico monomérico monodisperso predominante (marca com um asterisco). Figura 2B - O espectro de dicroísmo circular representativo do sAD demonstra uma proteína bem dobrada.

Figura 2C - Experimento de fusão do sAD.

O sinal de dicroísmo circular foi monitorado no comprimento de onda de 222 nm.

O sAD permaneceu estável até 55°C (região sombreada em azul claro), com uma TM estimada em aproximadamente 65°C (linha vermelha). Figura 2D - Um gráfico de radar mostrando as constantes de dissociação (KD) entre o sAD e os domínios da GP1 indicados de mammarenavírus dos clados B e A/B, medidos usando SPR.

Figura 2E - Estrutura cristalina do sAD no complexo com GP1MACV.

O domínio da GP1 é mostrado usando a representação de superfície (branco) e o SAD é apresentado como um diagrama de fita nas cores do arco-íris, do N’- terminal (azul) ao C’-terminal (vermelho). Os glicanos ligados ao N são mostrados usando representação em sticks, assim como a Tyr211 do sAD.

As Figuras de 3A a 3C ilustram que a imunoadesina Arenacept é biologicamente ativa contra os vírus patogênicos.

Figura 3A - Imagem confocal de fluorescência de células HEK293, transfectadas transitoriamente com genes que codificam GPCs a partir dos vírus indicados e corados com Arenacept.

Os núcleos foram corados com DAPI (azul), as membranas foram coradas com aglutinina do gérmen de trigo (verde) e a Arenacept foi visualizada usando Ab fluorescentes anti-humanos (vermelho). As barras de escala representam 20 µm.

Figura 3B - Neutralização de vírus pseudotipados.

Os gráficos mostram a neutralização representativa de vírus que carregam os complexos de ponta dos vírus indicados.

A infecção foi monitorada em uma linha celular HEK293 estável que expresso excessivamente o hTfR1 usando um gene repórter da luciferase.

As barras de erro mostram desvios padrão das réplicas técnicas.

Os valores de IC50 relatados são médias de, pelo menos, três experiências independentes.

Figura 3C - Ensaio de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). A Figura 4 ilustra que o sAD adota a mesma estrutura geral que o domínio apical do hTfR1. Um diagrama de fita mostra o domínio apical do hTfR1 (ID do PDB: 3KAS) em laranja sobreposto ao sAD, que é mostrado em azul.

A visualização direita é girada em 90° em relação à visualização esquerda.

É mostrada a Tyr211 como um resíduo central na interface com a GP1. Os resíduos de 301 a 326 do hTfR1 que foram omitidos no sAD são mostrados na cor rosa.

A Figura 5 ilustra que a unidade assimétrica contém quatro cópias do complexo sAD/GP1MACV.

As oito cadeias que compõem a unidade assimétrica são mostradas usando uma cor exclusiva para cada cadeia.

A visualização direita é girada em 90° em relação à visualização esquerda.

As cadeias são renderizadas usando tubos para os quais os raios são proporcionais ao fator B.

Existem diferenças entre os pares de proteínas na unidade assimétrica; algumas são bem definidas na densidade de elétrons, com baixos fatores B (p.ex., verde/ciano), outras são menos definidas e, portanto, têm maior fator B (p.ex., roxo/laranja). As Figuras 6A e 6B ilustram que uma Arenacept dimérica tem maior potência em comparação com o sAD monomérico.

É retratado um ensaio de neutralização de vírus pseudotipados portadores do complexo de ponta dos vírus MACV e JUNV por Arenacept (preto) e sAD (azul), mostrando potência elevada devido à dimerização e indicando o efeito da avidez.

Uma vez que o MW do sAD e da Arenacept diferem significativamente, os dados de neutralização são comparados usando uma escala de molaridade.

Sem o efeito da avidez, o sAD pode neutralizar o MACV até certo ponto, mas foi praticamente inerte para a o vírus JUNV na faixa de concentrações usada para este ensaio.

Estas observações concordam com os valores medidos de KD para sAD com os vírus JUNV e MACV (ou seja, 1 µM e 4 nM, respectivamente). As Figuras 7A e 7B ilustram alterações conformacionais do sAD em relação ao domínio apical nativo.

Figura 7A - Um diagrama de fita mostra a estrutura do complexo sAD/GP1MACV, em azul e branco, respectivamente, sobreposta ao complexo hTfR1/GP1MACV (ID do PDB: 3KAS), em laranja e cinza, respectivamente.

A estrutura em ansa longa que conecta as fitas βII-6 e βII-7 muda de posição no sAD em comparação com o hTfR1 e é destacada em verde (sAD). Esta estrutura em ansa no hTfR1 inclui originalmente os resíduos de 301 a 326 (rosa) que foram eliminados do sAD.

Figura 7B – É mostrado o Glu294 com carga negativa do hTfR1 formando uma ponte de sal com a Lys169 da GP1. No caso do sAD, o Glu340 de αІI-2 que substitui um resíduo de alanina do hTfR1 se projeta na mesma direção que o Glu294 do hTfR1. Este Glu340 do sAD forma uma ponte de sal semelhante à Lys169 da GP1MACV.

As Figuras de 8A a 8E ilustram medições dos valores de KD entre o sAD e a GP1s do vírus trópico do TfR1. As proteínas de fusão GP1-Fc foram imobilizadas em um chip sensor de SPR revestido com a proteína A e o SAD foi injetado em uma série de concentrações crescentes (isto é, 5, 50, 250, 500, 1000 nM) usando um esquema cinético de ciclo único.

Os diagramas de sensores representativos subtraídos em branco são mostrados em laranja e um modelo de ligação 1:1, que foi ajustado aos dados, é mostrado em preto.

Abaixo de cada diagrama de sensor, um gráfico residual mostra a qualidade do modelo ajustado.

Os valores calculados de KD são mostrados para cada GP1. Cada experimento de ligação foi repetido duas vezes.

A Figura 9 ilustra que a mutação da Tyr211 reduz a potência da Arenacept.

É mostrado um ensaio de neutralização de vírus pseudotipados com o complexo de ponta do vírus JUNV por Arenacept (azul) e um Y211A-Arenacept (preto) indicando perda de potência. A Figura 10 ilustra um alinhamento de sequência do TfR1 humano (ou seja, Homo Sapiens), conforme estabelecido na ID SEQ. N° 2, do TfR1 de um rato de garganta branca (ou seja, Neotoma Albigula), conforme estabelecido na ID SEQ. N° 4, do TfR1 de um morcego jamaicano (ou seja, Artibeus Jamaicensis), conforme apresentado na ID SEQ. N° 12 e do TfR1 de um rato de algodão híspido (ou seja, Sigmodon Hispidus), conforme apresentado na ID SEQ. N° 21. A cor verde ilustra os resíduos ausentes em cada sequência. A cor azul ilustra os resíduos da estrutura em ansa longa. A cor magenta ilustra a Tyr211. As Figuras de 11A a 11D ilustram a neutralização de pseudovírus portadores dos complexos de ponta dos vírus indicados. A neutralização da Arenacept (curvas pretas) é comparada à neutralização da variante N206A da Arenacept (curvas vermelhas).

DESCRIÇÃO DAS APLICAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

[0062] A presente invenção, em algumas aplicações respectivas, refere-se a fragmentos solúveis do domínio apical da proteína do receptor de Transferrina 1 (TfR1) e, mais particularmente, mas não exclusivamente, ao uso dos mesmos para o tratamento ou prevenção de uma infecção viral por Arenavírus.

[0063] Os princípios e operação da presente invenção podem ser melhor compreendidos tomando como referência os desenhos e descrições anexas.

[0064] Antes de explicar, pelo menos, uma aplicação da invenção em detalhes, deve-se entender que a invenção não necessariamente limita suas aplicações aos detalhes estabelecidos na descrição a seguir ou exemplificados pelos Exemplos. A invenção é capaz de outras aplicações ou de ser praticada ou realizada de várias maneiras. Além disso, deve ser entendido que a expressãoologia e terminologia empregadas aqui são para fins de descrição e não devem ser consideradas limitativas.

[0065] Os arenavírus nascidos em roedores podem causar febres hemorrágicas graves com risco de vida ao infectar seres humanos. É altamente desejável tomar contramedidas eficazes contra esses vírus. Devido sua transmissão eficiente, eles representam um risco grave de surtos e podem ser explorados como armas de bioterrorismo. Idealmente, alguém poderia desejar ter um único remédio que fosse efetivo contra muitas ou mesmo todas as cepas patogênicas dessa família. No entanto, apesar de todos os arenavírus patogênicos do Novo Mundo (NW) usarem o receptor de transferrina 1 (TfR1) como receptor celular, suas glicoproteínas virais são altamente diversificadas, impedindo esforços para isolar anticorpos neutralizantes cruzados.

[0066] Ao colocar a presente invenção em prática, os presentes inventores projetaram e geraram uma proteína imitadora do TfR1 que bloqueia o local de ligação ao receptor da GP1 do Arenavirus e, desse modo, evita a infecção viral. Por conseguinte, um domínio apical solúvel (sAD) foi concebido como uma proteína isolada para criar um concorrente do local de ligação ao receptor TfR1. O domínio apical do TfR1 não possui funções biológicas conhecidas e, portanto, torna um reagente potencialmente seguro a ser injetado nos pacientes como um chamariz. A concepção do sAD teve base no gene do TfR1 do Neotoma Albigula (rato de garganta branca), no qual a estrutura em ansa longa (resíduos de 301 a 326) foi removida, vários resíduos hidrofóbicos que fazem parte da interface entre os domínios apical e do tipo protease foram mutados e dois resíduos de cisteína foram introduzidos em ambos os terminais do peptídeo (Figura 1C). O sAD foi ilustrado como uma proteína solúvel, dobrada e termoestável (Figuras de 2A a 2C), uma propriedade vantajosa que seria fundamental para a capacidade de distribuí-lo em regiões com más infraestruturas clínicas e logísticas. Além disso, o sAD compreendeu um amplo espectro de reatividade contra as GP1s dos Arenavírus NW de clado B e A/B, p.ex., JUNV, MACV, GTOV, SABV e WWAV (Figuras de 8A a 8E).

[0067] Os presentes inventores construíram, ainda, o domínio sAD como uma imunoadesina, fundindo ao seu C-terminal uma porção da região Fc da IgG1 em uma configuração que permite avidez (denominada “Arenacept”). A Arenacept reconhece especificamente os complexos de ponta nativos do MACV, JUNV, GTOV, SABV e WWAV (Figura 3A) e foi capaz de neutralizá-los efetivamente (Figura 3B). Também provou-se que a Arenacept foi, ainda, eficiente na indução de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC, Figura 3C). Assim, além da neutralização direta do vírus, a Arenacept é capaz de induzir a ADCC.

[0068] Os presentes inventores adicionaram outras modificações à Arenacept. Em particular, a Arenacept foi modificada para substituir a serina do motivo de glicosilação N-X-S por alanina. Foi ilustrado que a ArenaceptS206A neutraliza os arenavírus trópicos pseudotipados do TfR1 (Figuras de 11A a 11D e Tabela 4, abaixo).

[0069] Em conjunto, o desenvolvimento da Arenacept oferece uma nova e promissora abordagem imunoterapêutica no combate a infecções causadas pelos notórios Arenavírus NW patogênicos, os quais representam uma ameaça à saúde de milhões de pessoas nas regiões endêmicas e, até o momento, têm opções muito limitadas de tratamento. Além disso, a Arenacept pode ser útil para o diagnóstico de uma infecção causada por vírus trópicos do TfR1 usando, por exemplo, um ensaio de ligação proteica por sobreposição ao vírus (VOPBA |virus overlay protein binding assay).

[0070] Assim, de acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecida uma composição de matéria que compreende um polipeptídeo solúvel isolado, compreendendo uma sequência de aminoácidos de um domínio apical da proteína do receptor de Transferrina 1 (TfR1), o polipeptídeo solúvel sendo capaz de se ligar a um Arenavírus.

[0071] Conforme aqui utilizado, o termo “Arenavírus” refere-se a vírus contendo RNA que pertencem à família de vírus Arenaviridae.

[0072] De acordo com uma aplicação, os Arenavírus compreendem os Arenavírus do Novo Mundo (NW), isto é, os vírus de RNA de fita simples, prevalecentes nas Américas do Sul e do Norte, que tipicamente causam doenças agudas em humanos, frequentemente com manifestações de febre hemorrágica. Os Arenavírus infectam células hospedeiras via GP1, que faz parte do complexo de glicoproteínas do envelope trimérico, isto é, GP1/GP2/peptídeo de sinal estável (SSP | stable signal peptide).

[0073] As expressões “complexo de ponta”, “complexo de glicoproteína viral trimérico de classe 1” ou “complexo de glicoproteína de envelope trimérico”, conforme aqui utilizadas, referem-se todas ao complexo de proteínas virais composto por três cópias de cada uma das glicoproteínas de ligação GP1, a proteína de fusão GP2 ancorada na membrana e o peptídeo de sinal estável (SSP). O complexo de ponta reconhece os receptores celulares e medeia a fusão da membrana e a infectividade do hospedeiro.

[0074] O termo “GP1” ou “Glicoproteína 1”, conforme aqui utilizado, refere-se à glicoproteína do envelope do Arenavírus, isto é, o domínio de ligação ao receptor do complexo de ponta que medeia o reconhecimento do receptor (p.ex., o TfR1) para entrada na célula hospedeira.

[0075] De acordo com uma aplicação, os Arenavírus NW incluem aqueles de clados A, B, C e de clado A/B recombinante.

[0076] Arenavírus exemplares incluem, entre outros, Junín (JUNV), Machupo (MACV), Guanarito (GTOV), Sabiá (SABV), Whitewater Arroyo (WWAV), Chapare (CHPV), Cupixi (CPXV), Tacaribe (TCRV), Bear Canyon (BCNV), Tamiami (TAMV), Big Brushy Tank (BBTV), Catarina (CTNV), Skinner Tank (SKTV), Tonto Creek (TTCV), vírus Amapari (AMAV), vírus Oliveros (OLIV) e Sabiá (SBAV).

[0077] A expressão “proteína do receptor de Transferrina 1” ou “TfR1”, conforme aqui utilizado, refere- se ao receptor da superfície celular, também conhecido como CD71 ou P90.

[0078] De acordo com uma aplicação, o TfR1 é um TfR1 de mamífero.

[0079] De acordo com uma aplicação, o TfR1 é um TfR1 humano ou um ortólogo respectivo.

[0080] Exemplos de TfR1 humanos são apresentados nos Números de Acesso NP_003225.2, NP_001121620.1, NP_001300894.1 ou NP_001300895.1. Ortólogos do TfR1 exemplares incluem, mas não estão limitados a, um TfR1 de camundongo, p.ex., conforme estabelecido no Número de Acesso NP_035768.1; um TfR1 de rato, p.ex., conforme estabelecido no Número de Acesso NP_073203.1; um TfR1 de morcego, p.ex., conforme estabelecido nos Números de Acesso XP_008153714.1, XP_014314708.1, XP_006092878.1 e XP_014400772.1; um TfR1 de hamster, p.ex., conforme estabelecido no Número de Acesso NP_001233748.1; um TfR1 de gato, p.ex., conforme estabelecido no Número de Acesso NP_001009312.1; um TfR1 de cão, p.ex., conforme estabelecido no Número de Acesso NP_001003111.1; um TfR1 de porco, p.ex., conforme estabelecido no Número de Acesso NP_999166.1; um TfR1 de cavalo, p.ex., conforme estabelecido no Número de Acesso NP_001075382.1; um TfR1 de sapo, p.ex., conforme estabelecido no Número de Acesso XP_017949664.1; e um TfR1 de frango, p.ex., conforme estabelecido no Número de Acesso NP_990587.2.

[0081] De acordo com uma aplicação, o TfR1 é um TfR1 humano, p.ex., conforme estabelecido na ID SEQ. N° 2.

[0082] De acordo com uma aplicação, o TfR1 é de origem de um roedor. Roedores exemplares incluem, entre outros, camundongos, ratos, esquilos, cães da pradaria, porcos- espinhos, castores, porquinhos-da-índia, hamsters, gerbos e coelhos.

[0083] De acordo com uma aplicação, o TfR1 é o TfR1 de um rato. De acordo com uma aplicação específica, o TfR1 é o TfR1 de um rato de garganta branca (p.ex., o TfR1 de um Neotoma Albigula) p.ex., conforme estabelecido na ID SEQ. N°

4.

[0084] De acordo com uma aplicação, o TfR1 é o TfR1 de um rato de algodão híspido. De acordo com uma aplicação específica, o TfR1 é o TfR1 de um rato de algodão híspido (p.ex., o TfR1 de um Sigmodon Hispidus) p.ex., conforme estabelecido na ID SEQ. N° 21.

[0085] De acordo com uma aplicação, o TfR1 é um TfR1 de camundongo, p.ex., conforme estabelecido nas ID SEQ. N° 10 ou 14.

[0086] De acordo com uma aplicação, o TfR1 é um TfR1 de morcego. De acordo com uma aplicação específica, o TfR1 é um TfR1 de morcego da fruta jamaicano (p.ex., TfR1 de Artibeus Jamaicensis), p.ex., conforme estabelecido na ID SEQ. N° 12.

[0087] O TfR1 compreende três subdomínios: um “domínio do tipo protease”, um “domínio apical” e um “domínio helicoidal”. A transferrina normalmente interage com o “domínio do tipo protease” e o “domínio helicoidal”, enquanto o “domínio apical” é o principal local de interação com as glicoproteínas arenavirais (ou seja, os Arenavírus do Novo Mundo).

[0088] Conforme aqui utilizado, o termo “corresponde” ou “correspondendo” refere-se a um aminoácido ou um trecho de aminoácidos que seja homólogo em estrutura e/ou orientação no contexto do polipeptídeo, isto é, o TfR1.

[0089] De acordo com uma aplicação, a sequência de aminoácidos do “domínio do tipo protease” do TfR1 corresponde aos resíduos de 120 a 608 da ID SEQ. N° 2.

[0090] De acordo com uma aplicação, a sequência de aminoácidos do “domínio apical” do TfR1 corresponde aos resíduos de 189 a 300 da ID SEQ. N° 2. Assim, será entendido que o domínio apical do TfR1 se encontra incorporado no interior do domínio do tipo protease do TfR1.

[0091] De acordo com uma aplicação, a sequência de aminoácidos do “domínio helicoidal” do TfR1 corresponde aos resíduos de 609 a 756 da ID SEQ. N° 2.

[0092] A expressão “corresponde a resíduos” refere-se à posição de um aminoácido em uma sequência de aminoácidos em um determinado organismo (p.ex., o organismo humano). A determinação dos resíduos correspondentes em outros organismos (p.ex., de um roedor, morcego, etc.) pode ser realizada usando quaisquer métodos de alinhamento de sequência conhecidos por um especialista na técnica.

[0093] Assim, por exemplo, a determinação do domínio apical de um TfR1 (p.ex., ortólogos do TfR1, como, p.ex., de um humano, camundongo, rato, etc.) pode ser realizada usando qualquer método conhecido na técnica, como por software de alinhamento de sequência, como o software BLAST disponível no servidor NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

[0094] Geralmente, o presente pedido refere-se à sequência do TfR1 humano, p.ex., conforme estabelecido na ID SEQ. N° 2, portanto “corresponde a resíduos” refere-se à posição de resíduos de aminoácidos na sequência do TfR1 humano.

[0095] De acordo com uma aplicação, a numeração em sequência do domínio apical do TfR1 do rato de garganta branca é +1 em comparação com o TfR1 humano (conforme ilustrado no alinhamento de sequência da Figura 10).

[0096] Assim, o polipeptídeo isolado da invenção compreende, pelo menos, um fragmento do domínio apical (p.ex., pelo menos, cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% da sequência de 195 aminoácidos do domínio apical) e é capaz de se ligar a um Arenavírus (p. ex., a glicoproteína GP1 do Arenavírus). O polipeptídeo isolado da invenção pode,

ainda, compreender fragmentos do domínio helicoidal ou do domínio do tipo protease (ou seja, sequências de aminoácidos do domínio helicoidal ou do domínio do tipo protease), desde que o polipeptídeo seja solúvel, isolado e capaz de se ligar a um Arenavírus.

[0097] De acordo com uma aplicação da invenção, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado compreende uma sequência de aminoácidos possuindo, pelo menos, 80%, pelo menos, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, p.ex., 100% de homologia ou identidade de sequência com o domínio apical do TfR1, desde que o polipeptídeo seja solúvel, isolado e capaz de se ligar a um Arenavírus.

[0098] A homologia (p.ex., porcentagem de homologia, identidade + semelhança) pode ser determinada usando qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastP ou TBLASTN do Centro Nacional de Informações de Biotecnologia (NCBI|National Center of Biotechnology Information), como o uso de parâmetros padrão, ao iniciar a partir de um sequência polipeptídica; ou o algoritmo tBLASTX (disponível via NCBI), como o uso de parâmetros padrão, que compara os produtos de translação conceitual de seis estruturas de uma sequência de consulta de nucleotídeo (ambas as cadeias) com um banco de dados de sequências proteicas.

[0099] Por exemplo, os parâmetros padrão do tBLASTX incluem: Máximo de sequências alvo: 100; Limite esperado: 10; Tamanho da palavra: 3; Máximo de correspondências em um intervalo de consulta: 0; Parâmetros de pontuação: Matriz - BLOSUM62; filtros e mascaramento: Filtro - regiões de baixa complexidade.

[0100] A expressão “se ligar a um Arenavírus”, conforme aqui utilizada, refere-se à capacidade de, pelo menos, cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% dos polipeptídeos na composição se ligar ao complexo de ponta trimérico ou seu domínio GP1 de um Arenavírus, em comparação com a ligação de um TfR1 nativo a um Arenavírus. A medição da ligação do polipeptídeo isolado a um Arenavírus pode ser realizada usando qualquer método conhecido na técnica, como, por exemplo, pelo Ensaio de Ressonância de Plasmon de Superfície, Ensaio de imunoabsorção ligado à enzima (ELISA | Enzyme-linked immunosorbent), Termoforese em microescala (MST | Microscale thermophoresis), Bio-Interferometria de Camada (BLI | Bio-Layer Interferometry), Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC|Isothermal titration calorimetry) ou Ultracentrifugação Analítica.

[0101] De acordo com uma aplicação, a ligação do polipeptídeo isolado ao complexo de ponta trimérica ou seu domínio da GP1 a partir de um Arenavírus é caracterizada por uma KD inferior a 50µM.

[0102] Deve-se notar que a afinidade pode ser quantificada usando métodos conhecidos, como Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR|Surface Plasmon Resonance) (descrita em Scarano S, Mascini M, Turner AP, Minunni M. “Surface plasmon resonance imaging for affinity-based biosensors”. Biosens Bioelectron. 2010, 25: 957-66), e pode ser calculada usando, por exemplo, uma constante de dissociação, KD, de modo que uma KD menor reflita uma afinidade maior.

[0103] Conforme aqui utilizado, o termo “solúvel” refere-se à capacidade das moléculas da presente invenção de se ligarem a um Arenavírus (de acordo com as medidas acima) sob condições fisiológicas.

[0104] Conforme aqui utilizado, a expressão “polipeptídeo isolado” refere-se a um polipeptídeo separado, pelo menos parcialmente, de seu ambiente natural, por exemplo, o corpo humano. De acordo com uma aplicação, o polipeptídeo isolado é essencialmente livre de componentes celulares contaminantes, como carboidratos, lipídios ou outras impurezas proteicas associadas ao polipeptídeo na natureza. Tipicamente, uma preparação do polipeptídeo isolado contém o polipeptídeo em uma forma altamente purificada, isto é, pelo menos, cerca de 80% puro, pelo menos, cerca de 90% puro, pelo menos, cerca de 95% puro, pelo menos, cerca de 95% puro, mais que 95% puro ou mais que 99% puro. Uma maneira de mostrar que uma preparação de proteína específica contém um polipeptídeo isolado é pelo aparecimento de uma única banda após eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS | sodium dodecyl sulfate) da preparação de proteínas e coloração do gel com Coomassie Brilliant Blue. No entanto, o termo “isolado” não exclui a presença do mesmo polipeptídeo em formas físicas alternativas, como dímeros ou formas alternativamente glicosiladas ou derivatizadas.

[0105] O termo “polipeptídeo”, conforme aqui utilizado, abrange polipeptídeos nativos (produtos de degradação, polipeptídeos sintetizados ou polipeptídeos recombinantes) e peptidomiméticos (tipicamente, polipeptídeos sintetizados sinteticamente), bem como peptídeos e semipeptoides que são análogos de polipeptídeos, que podem ter, por exemplo, modificações que tornam os polipeptídeos mais estáveis enquanto estão no corpo ou mais capazes de penetrar nas células.

[0106] Tais modificações incluem, entre outros, modificação do N-terminal, modificação do C-terminal, modificação da ligação polipeptídica, modificações da estrutura principal e modificação do resíduo. Os métodos para a preparação de compostos peptidomiméticos são bem conhecidos na técnica e são especificados, por exemplo, na publicação “Quantitative Drug Design”, C.A. Ramsden Gd., Capítulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992), que é incorporado como referência, como se fosse aqui plenamente estabelecido. Mais detalhes a este respeito são fornecidos adiante.

[0107] O termo “análogo” refere-se à deleção, adição ou substituição de um ou mais resíduo(s) de aminoácidos. Ao preparar análogos obtidos por substituição de resíduos de aminoácidos, é importante que as substituições sejam selecionadas dentre aquelas que cumulativamente não alteram substancialmente o volume, o padrão hidrofóbico-hidrofílico e a carga da porção correspondente do polipeptídeo progenitor não substituído. Assim, um resíduo hidrofóbico pode ser substituído por um resíduo hidrofílico, ou vice-versa, desde que o efeito total não mude substancialmente o volume, o padrão hidrofóbico-hidrofílico e a carga do polipeptídeo progenitor não substituído correspondente, ou seja, desde que a capacidade de ligação com um Arenavírus seja mantida.

[0108] As ligações peptídicas (-CO-NH-) dentro do peptídeo podem ser substituídas, por exemplo, por ligações amida N-metiladas (-N(CH3)-CO-), ligações éster (-C(=O)-O-), ligações de cetometileno (-CO-CH2-), ligações de sulfinil- metileno (-S(=O)-CH2-), ligações α-aza (-NH-N(R)-CO-), caracterizado por R ser qualquer alquila (p.ex., metila),

ligações amina (-CH2-NH-), ligações sulfeto (-CH2-S-), ligações etileno (-CH2-CH2-), ligações hidróxietileno (- CH(OH)-CH2-), ligações tioamida (-CS-NH-), ligações duplas olefínicas (-CH=CH-), ligações duplas olefínicas fluoradas (- CF=CH-), ligações retroamidas (-NH-CO-), derivados peptídicos (-N(R)-CH2-CO-), em que R é a cadeia lateral “normal”, presente naturalmente no átomo de carbono.

[0109] Essas modificações podem ocorrer em qualquer uma das ligações ao longo da cadeia peptídica e até em várias (2-3) ligações ao mesmo tempo.

[0110] Os aminoácidos aromáticos naturais, Trp, Tyr e Phe, podem ser substituídos por aminoácidos aromáticos não naturais, como o ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3- carboxílico (Tic), naftilalanina, derivados de Phe, derivados halogenados de Phe ou O-metil-Tir.

[0111] Os polipeptídeos, de acordo com algumas aplicações da invenção, também podem incluir um ou mais aminoácido(s) modificado(s) ou um ou mais monômero(s) não aminoácido(s) (p.ex., ácidos graxos, carboidratos complexos, etc.).

[0112] O termo “aminoácido” ou “aminoácidos” é entendido como incluindo os 20 aminoácidos de ocorrência natural; aqueles aminoácidos frequentemente modificados pós- translação in vivo, incluindo, por exemplo, a hidróxiprolina, a fosfoserina e a fosfotreonina; e outros aminoácidos incomuns, incluindo, entre outros, ácido 2-aminoadípico, hidróxilisina, isodesmosina, nor-valina, nor-leucina e ornitina. Além disso, o termo “aminoácido” inclui os aminoácidos D e L.

[0113] As Tabelas 1 e 2 abaixo listam aminoácidos de ocorrência natural (Tabela 1) e aminoácidos não convencionais ou modificados (p.ex., sintéticos, Tabela 2) que podem ser usados com algumas aplicações da invenção.

TABELA 1 Aminoácido Abreviação de Três Letras Símbolo de Uma Letra Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Ácido aspártico Asp D Cisteína Cis C Glutamina Gln Q Ácido Glutâmico Glu E Glicina Gli G Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lis K Metionina Met M Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Serina Ser S Treonina Thr T Triptofano Trp W Tirosina Tir ou Tyr Y Valina Val V Qualquer aminoácido como acima Xaa X

TABELA 2 Aminoácido não convencional Código Aminoácido não convencional Código Ornitina Orn hidróxiprolina Hyp Ácido α-aminobutírico Abu carboxilato de aminonorbornila Norb D-alanina Dala aminociclopropano-carboxilato Cpro D-arginina Darg N-(3-guanidinopropil)glicina Narg D-asparagina Dasn N-(carbamilmetil)glicina Nasn Ácido D-aspártico Dasp N-(carboximetil)glicina Nasp D-cisteína Dcys N-(tiometil)glicina Ncys D-glutamina Dgln N-(2-carbamiletil)glicina Ngln Ácido D-glutâmico Dglu N-(2-carboxietil)glicina Nglu D-histidina Dhis N-(imidazoliletil)glicina Nhis D-isoleucina Dile N-(1-metilpropil)glicina Nile D-leucina Dleu N-(2-metilpropil)glicina Nleu D-lisina Dlys N-(4-aminobutil)glicina Nlys D-metionina Dmet N-(2-metiltioetil)glicina Nmet D-ornitina Dorn N-(3-aminopropil)glicina Norn D-fenilalanina Dphe N-benzilglicina Nphe D-prolina Dpro N-(hidróximetil)glicina Nser D-serina Dser N-(1-hidróxietil)glicina Nthr D-treonina Dthr N-(3-indoliletil)glicina Nhtrp D-triptofano Dtrp N-(p-hidróxifenil)glicina Ntyr D-tirosina Dtyr N-(1-metiletil)glicina Nval D-valina Dval N-metilglicina Nmgly D-N-metilalanina Dnmala L-N-metilalanina Nmala

Continuação da Tabela 2 D-N-metilarginina Dnmarg L-N-metilarginina Nmarg D-N-metilasparagina Dnmasn L-N-metilasparagina Nmasn D-N-metilasparatato Dnmasp Ácido L-N-metil-aspártico Nmasp D-N- metilcisteína Dnmcys L-N-metilcisteína Nmcys D-N-metilglutamina Dnmgln L-N-metilglutamina Nmgln D-N-metilglutamato Dnmglu Ácido L-N-metilglutâmico Nmglu D-N-metil-histidina Dnmhis L-N-metil-histidina Nmhis D-N-metilisoleucina Dnmile L-N-metilisolleucina Nmile D-N-metil-leucina Dnmleu L-N-metil-leucina Nmleu D-N-metil-lisina Dnmlys L-N-metil-lisina Nmlys D-N-metilmetionina Dnmmet L-N-metilmetionina Nmmet D-N-metilornitina Dnmorn L-N-metilornitina Nmorn D-N-metilfenilalanina Dnmphe L-N-metilfenilalanina Nmphe D-N-metilprolina Dnmpro L-N-metilprolina Nmpro D-N-metilserina Dnmser L-N-metilserina Nmser D-N-metiltritonina Dnmthr L-N-metiltritonina Nmthr D-N-metiltriptofano Dnmtrp L-N-metiltriptofano Nmtrp D-N-metiltirosina Dnmtyr L-N-metiltirosina Nmtyr D-N-metilvalina Dnmval L-N-metilvalina Nmval L-norleucina Nle L-N-metilnorleucina Nmnle L-norvalina Nva L-N-metilnorvalina Nmnva L-etilglicina Etg L-N-metil-etilglicina Nmetg L-t-butilglicina Tbug L-N-metil-t-butilglicina Nmtbug L-homofenilalanina Hphe L-N-metil-homofenilalanina Nmhphe α-naftilalanina Anap N-metil-α-naftilalanina Nmanap Penicilamina Pen N-methylpenicillamine Nmpen Ácido γ-aminobutírico Gabu N-metil-γ-aminobutirato Nmgabu Ciclohexilalanina Chexa N-metil-ciclohexilalanina Nmchexa Ciclopentilalanina Cpen N-metil-ciclopentilalanina Nmcpen α-amino-α-metilbutirato Aabu N-metil-α-amino-α-metilbutirato Nmaabu Ácido α-aminoisobutírico Aib N-metil-α-aminoisobutirato Nmaib D-α-metilarginina Dmarg L-α-metilarginina Marg D-α-metilasparagina Dmasn L-α-metilasparagina Masn D-α-metilaspartato Dmasp L-α-metilaspartato Masp D-α-metilcisteína Dmcys L-α-metilcisteína Mcys D-α-metilglutamina Dmgln L-α-metilglutamina Mgln Ácido glutâmico D-α-metila Dmglu L-α-metilglutamato Mglu D-α-metil-histidina Dmhis L-α-metil-histidina Mhis D-α-metilisoleucina Dmile L-α-metilisoleucina Mile D-α-metil-leucina Dmleu L-α-metil-leucina Mleu D-α-metil-lisina Dmlys L-α-metil-lisina Mlys D-α-metilmetionina Dmmet L-α-metilmetionina Mmet D-α-metilornitina Dmorn L-α-metilornitina Morn D-α-metilfenilalanina Dmphe L-α-metilfenilalanina Mphe D-α-metilprolina Dmpro L-α-metilprolina Mpro D-α-metilserina Dmser L-α-metilserina Mser D-α-metiltritonina Dmthr L-α-metiltritonina Mthr

Continuação da Tabela 2 D-α-metiltriptofano Dmtrp L-α-metiltriptofano Mtrp D-α-metilestirosina Dmtyr L-α-metilestirosina Mtyr D-α-metilvalina Dmval L-α-metilvalina Mval N-ciclobutilglicina Ncbut L-α-metilnorvalina Mnva N-cicloheptilglicina Nchep L-α-metiletilglicina Metg N-ciclohexilglicina Nchex L-α-metil-t-butilglicina Mtbug N-ciclodecilglicina Ncdec L-α-metil-homofenilalanina Mhphe N-ciclododecilglicina Ncdod α-metil-α-naftilalanina Manap N-ciclooctilglicina Ncoct α-metilpenicilamina Mpen N-ciclopropilglicina Ncpro α-metil-γ-aminobutirato Mgabu N-cicloundecilglicina Ncund α-metil-ciclohexilalanina Mchexa N-(2-aminoetil)glicina Naeg α-metil-ciclopentilalanina Mcpen N-(2,2-difeniletil)glicina Nbhm N-(N-(2,2-difeniletil)carbamilmetil-glicina Nnbhm N-(3,3-difenilpropil)glicina Nbhe N-(N-(3,3-difenilpropil)carbamilmetil-glicina Nnbhe 1- carbóxi-1-(2,2-difeniletilamino)ciclopropano Nmbc Ácido 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina-3-carboxílico Tic Fosfoserina pSer fosfotreonina pThr Fosfotirosina pTyr O-metil-tirosina Ácido 2-aminoadípico hidroxilisina

[0114] De acordo com uma aplicação, o aminoácido é um aminoácido não natural (também conhecido como aminoácido não padrão). Exemplos de aminoácidos não naturais, sem se limitar a, são aminoácidos D, aminoácidos alfa, aminoácidos alfa dissubstituídos, aminoácidos N-alquila, ácido lático, 4- hidroxiprolina, y-carbóxiglutamato, épsilon-N,N,N-tri metil- lisina, épsilon-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N- acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5- hidroxilisina, ômega-N-metilarginina e ácido isoaspártico.

[0115] De acordo com uma aplicação, o aminoácido é um “resíduo de aminoácido equivalente”. Um resíduo de aminoácido equivalente refere-se a um resíduo de aminoácido capaz de substituir outro resíduo de aminoácido em um polipeptídeo sem alterar substancialmente a estrutura e/ou a funcionalidade do polipeptídeo (p.ex., a capacidade de ligação a um Arenavírus). Assim, aminoácidos equivalentes têm propriedades semelhantes, como volume da cadeia lateral, polaridade da cadeia lateral

(polar ou não polar), hidrofobicidade (hidrofóbica ou hidrofílica), pH (ácido, neutro ou básico) e organização da cadeia lateral das moléculas de carbono (aromático/alifático). Assim, “resíduos de aminoácidos equivalentes” podem ser considerados como “substituições conservadoras de aminoácidos”.

[0116] Dentro do significado da expressão “substituição equivalente de aminoácidos”, um aminoácido pode ser substituído por outro dentro dos grupos de aminoácidos indicados abaixo: i) Aminoácidos com cadeias laterais polares (Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr, Cys); ii) Aminoácidos com cadeias laterais não polares (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Met); iii) Aminoácidos com cadeias laterais alifáticas não polares (Gly, Ala, Val, Leu, Ile); iv) Aminoácidos com cadeias laterais cíclicas (Phe, Tyr, Trp, His, Pro); v) Aminoácidos com cadeias laterais aromáticas (Phe, Tyr, Trp); vi) Aminoácidos com cadeias laterais ácidas (Asp, Glu); vii) Aminoácidos com cadeias laterais básicas (Lys, Arg, His); viii) Aminoácidos com cadeias laterais de amidas (Asn, Gln); ix) Aminoácidos com cadeias laterais hidróxi (Ser, Thr); x) Aminoácidos com cadeias laterais contendo enxofre (Cys, Met); xi) Aminoácidos neutros, fracamente hidrofóbicos (Pro, Ala, Gly, Ser, Thr); xii) Aminoácidos hidrofílicos (Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, His, Lys, Ser, Thr, Tyr); e xiii) Aminoácidos hidrofóbicos (Ala, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val); xiv) Aminoácidos carregados (Arg, Lys, Asp, Glu).

[0117] De acordo com uma aplicação específica, o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos do TfR1, conforme estabelecido na ID SEQ. N° 2, 4, 10, 12, 14 ou 21.

[0118] De acordo com uma aplicação específica, o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos do domínio apical do TfR1 humano, conforme estabelecido na ID SEQ. N°

16.

[0119] De acordo com uma aplicação específica, o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos do domínio apical do TfR1 do rato de garganta branca, conforme estabelecido na ID SEQ. N° 18.

[0120] De acordo com uma aplicação, o polipeptídeo é uma “variante ativa” ou “homólogo funcional” que se refere a qualquer polipeptídeo derivado de uma sequência de polipeptídeo do TfR1, p.ex., conforme estabelecido nas ID SEQ. N° 2, 4, 10, 12 e 14, e que compreende, pelo menos, uma substituição de aminoácidos, retendo, pelo menos, cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% da atividade biológica (p.ex., capacidade de ligação a um Arenavírus) da sequência da qual foi derivada ou da qual é mais semelhante. Estes termos também abrangem polipeptídeos compreendendo regiões com similaridade substancial ao polipeptídeo, como variantes estruturais.

[0121] A expressão “similaridade substancial” significa que duas sequências polipeptídicas, quando perfeitamente alinhadas, compartilham, pelo menos, cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% de identidade de sequência.

[0122] De acordo com uma aplicação, o polipeptídeo de acordo com algumas aplicações da invenção compreende uma modificação (p.ex., deleção, inserção ou mutação pontual) em, pelo menos, um aminoácido.

[0123] De acordo com uma aplicação, o polipeptídeo compreende uma modificação (p.ex., deleção, inserção ou mutação pontual) em um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais aminoácidos, desde que a atividade do polipeptídeo seja retida (p.ex., capacidade de se ligar a um Arenavírus).

[0124] Uma vez que os presentes polipeptídeos são preferencialmente usados em terapêuticos ou diagnósticos que exigem que os polipeptídeos se apresentem na forma solúvel, os polipeptídeos de acordo com algumas aplicações da invenção podem incluir um ou mais aminoácido(s) polares não naturais ou naturais, incluindo, mas não se limitando a, serina e treonina que sejam capazes de aumentar a solubilidade do polipeptídeo devido à sua cadeia lateral contendo hidroxila. Além disso, a sequência de aminoácidos dos polipeptídeos de acordo com algumas aplicações da invenção pode compreender, pelo menos, uma deleção, inserção ou mutação pontual que torne o TfR1 solúvel.

[0125] De acordo com uma aplicação, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado compreende uma mutação pontual em uma interface entre o domínio apical e o domínio do tipo protease do TfR1.

[0126] De acordo com uma aplicação, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado compreende uma mutação pontual que elimina um local de glicosilação do TfR1.

[0127] De acordo com uma aplicação, o local de glicosilação compreende um motivo de glicosilação N-X-S.

[0128] De acordo com uma aplicação, o polipeptídeo isolado compreende uma modificação em um motivo de glicosilação N-X-S.

[0129] De acordo com uma aplicação, a Serina do motivo de glicosilação N-X-S é mutada para qualquer aminoácido ou mimético respectivo com a condição de que o aminoácido não seja Treonina.

[0130] De acordo com uma aplicação, a Serina do motivo de glicosilação N-X-S é mutada para Alanina ou um mimético respectivo.

[0131] De acordo com uma aplicação, a modificação se dá na Serina 206.

[0132] De acordo com uma aplicação específica, a Serina 206 é modificada para Alanina ou um mimético respectivo. Uma sequência de aminoácidos exemplar do polipeptídeo isolado é apresentada na ID SEQ. N° 23.

[0133] De acordo com uma aplicação, a Asparagina do motivo de glicosilação N-X-S é mutada para qualquer aminoácido ou mimético respectivo com a condição de que o aminoácido não seja Asparagina.

[0134] De acordo com uma aplicação, a modificação se dá na Asparagina 204.

[0135] De acordo com uma aplicação, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado compreende uma substituição de, pelo menos, um resíduo hidrofóbico por um resíduo hidrofílico (exemplos de resíduos hidrofóbicos e hidrofílicos que podem ser substituídos de acordo com os presentes ensinamentos são descritos acima).

[0136] De acordo com uma aplicação, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado compreende uma substituição de, pelo menos, um resíduo hidrofóbico por um resíduo carregado (exemplos de resíduos hidrofóbicos e carregados que podem ser substituídos de acordo com os presentes ensinamentos são descritos acima).

[0137] De acordo com uma aplicação, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado compreende uma substituição de, pelo menos, um grande resíduo hidrofóbico (ou seja, Leu ou Phe) por um pequeno resíduo hidrofóbico (ou seja, Ala ou Gly).

[0138] De acordo com uma aplicação, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado compreende uma substituição de dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais resíduos hidrofóbicos por resíduos hidrofílicos (resíduos hidrofóbicos e hidrofílicos exemplares que podem ser substituídos de acordo com os presentes ensinamentos estão descritos acima).

[0139] De acordo com uma aplicação específica, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado compreende uma substituição de cinco resíduos hidrofóbicos por resíduos hidrofílicos (exemplos de resíduos hidrofóbicos e hidrofílicos que podem ser substituídos de acordo com os presentes ensinamentos são descritos acima).

[0140] De acordo com uma aplicação específica, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado compreende uma substituição de um resíduo hidrofóbico por um resíduo hidrofílico correspondente a qualquer um dos resíduos correspondentes aos resíduos 283, 288, 291, 295 e/ou 298 da ID SEQ. N° 2.

[0141] De acordo com uma aplicação específica, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado compreende uma substituição de uma metionina por uma lisina em um resíduo correspondente ao resíduo 283 da ID SEQ. N° 2.

[0142] De acordo com uma aplicação específica, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado compreende uma substituição de uma Fenilalanina por uma Tirosina em um resíduo correspondente ao resíduo 288 da ID SEQ. N° 2.

[0143] De acordo com uma aplicação específica, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado compreende uma substituição de uma Valina por uma Serina em um resíduo correspondente ao resíduo 291 da ID SEQ. N° 2.

[0144] De acordo com uma aplicação específica, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado compreende uma substituição de uma isoleucina por um ácido glutâmico em um resíduo correspondente ao resíduo 295 da ID SEQ. N° 2.

[0145] De acordo com uma aplicação específica, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado compreende uma substituição de uma Fenilalanina por uma Glutamina em um resíduo correspondente ao resíduo 298 da ID SEQ. N° 2.

[0146] De acordo com uma aplicação específica, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado compreende toda a substituição descrita acima de resíduos hidrofóbicos por resíduos hidrofílicos.

[0147] De acordo com uma aplicação, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado é desprovida de uma estrutura em ansa longa do TfR1.

[0148] De acordo com uma aplicação específica, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado é desprovida de resíduos correspondentes aos resíduos de 301 a 326 (isto é, uma estrutura em ansa longa) da ID SEQ. N° 2.

[0149] Será apreciado que um segmento curto no domínio apical do TfR1 (isto é, correspondendo aos resíduos de 208 a 212 da ID SEQ. N° 2) seja um determinante crítico da especificidade do hospedeiro do vírus. Por conseguinte, o polipeptídeo, de acordo com algumas aplicações da invenção, não compreende uma modificação nos resíduos de aminoácidos correspondentes aos resíduos de 208 a 212 da ID SEQ. N° 2.

[0150] De acordo com uma aplicação, o polipeptídeo não compreende uma modificação em um resíduo correspondente à tirosina 211 (ou em qualquer resíduo que flanqueie esse resíduo) da ID SEQ. N° 2.

[0151] De acordo com uma aplicação, o polipeptídeo isolado, de acordo com algumas aplicações da invenção, compreende até 50 aminoácidos, até 75 aminoácidos, até 100 aminoácidos, até 110 aminoácidos, até 120 aminoácidos, até 130 aminoácidos, até 130 aminoácidos, até 140 aminoácidos, até 150 aminoácidos, até 160 aminoácidos, até 170 aminoácidos, até 175 aminoácidos, até 180 aminoácidos, até 185 aminoácidos, até 190 aminoácidos, até 195 aminoácidos, até 200 aminoácidos, até 210 aminoácidos, até 220 aminoácidos, até 230 aminoácidos, até 240 aminoácidos, até 250 aminoácidos, até 260 aminoácidos, até 260 aminoácidos, até 270 aminoácidos, até 280 aminoácidos, até 290 aminoácidos, até 300 aminoácidos, até 350 aminoácidos ou até 400 aminoácidos.

[0152] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo isolado tem um comprimento não superior a 170 resíduos de aminoácidos.

[0153] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo isolado tem um comprimento não superior a 175 resíduos de aminoácidos.

[0154] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo isolado tem um comprimento não superior a 180 resíduos de aminoácidos.

[0155] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo isolado tem um comprimento não superior a 185 resíduos de aminoácidos.

[0156] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo isolado tem um comprimento não superior a 195 resíduos de aminoácidos.

[0157] De acordo com uma aplicação, o polipeptídeo isolado, de acordo com algumas aplicações da invenção, compreende de 50 a 75 aminoácidos, de 50 a 100 aminoácidos, de 50 a 150 aminoácidos, de 50 a 200 aminoácidos, de 50 a 300 aminoácidos, de 50 a 400 aminoácidos, de 75 a 100 aminoácidos, de 75 a 125 aminoácidos, de 75 a 150 aminoácidos, de 75 a 175 aminoácidos, de 75 a 200 aminoácidos, de 100 a 125 aminoácidos, de 100 a 150 aminoácidos, de 100 a 175 aminoácidos, de 100 a 200 aminoácidos, de 100 a 300 aminoácidos, de 100 a 400 aminoácidos, de 125 a 150 aminoácidos, de 125 a 175 aminoácidos, de 125 a 200 aminoácidos, de 125 a 250 aminoácidos, de 150 a 175 aminoácidos, de 150 a 200 aminoácidos, de 150 a 250 aminoácidos, de 150 a 300 aminoácidos, de 150 a 400 aminoácidos, de 200 a 250 aminoácidos, de 200 a 300 aminoácidos, de 200 a 400 aminoácidos, de 250 a 300 aminoácidos, de 300 a 400 aminoácidos ou de 350 a 400 aminoácidos.

[0158] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo isolado tem de 160 a 180 aminoácidos de comprimento.

[0159] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo isolado tem de 160 a 190 aminoácidos de comprimento.

[0160] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo isolado tem de 170 a 180 aminoácidos de comprimento.

[0161] De acordo com algumas aplicações da invenção, o polipeptídeo isolado tem de 170 a 175 aminoácidos de comprimento.

[0162] Os polipeptídeos isolados, de acordo com algumas aplicações da invenção, podem ser usados em uma forma linear, embora seja apreciado que nos casos em que a ciclização não interfira severamente nas características do polipeptídeo, também possam ser usadas formas cíclicas do polipeptídeo.

[0163] De acordo com outra aplicação, o polipeptídeo compreende uma fração protetora ou uma fração estabilizadora.

[0164] A expressão “fração protetora” refere-se a qualquer fração (p.ex., fração química) capaz de proteger o polipeptídeo de efeitos adversos, como proteólise, degradação ou depuração, ou aliviar esses efeitos adversos.

[0165] A expressão “fração estabilizadora” refere-se a qualquer fração (p.ex., fração química) que inibe ou impede a degradação de um polipeptídeo.

[0166] A adição de uma fração protetora ou uma fração estabilizadora ao polipeptídeo resulta tipicamente no mascaramento da carga do terminal polipeptídico e/ou na alteração das características químicas respectivas, tais como hidrofobicidade, hidrofilicidade, reatividade, solubilidade e similares. Exemplos de frações protetoras adequadas podem ser encontrados, por exemplo, na publicação “Protective Groups in Organic Chemistry”, de Green et al. (Wiley, 2º sup. ed. 1991) e na publicação “Compendium of Synthetic Organic Methods”, de Harrison et al. Vols. de 1-8 (Ed. John Wiley and Sons, 1971- 1996).

[0167] A fração (ou grupo) protetora ou a fração (ou grupo) estabilizadora pode ser adicionada ao N-terminal (amina) e/ou ao C-terminal (carboxila) do polipeptídeo.

[0168] Exemplos representativos de frações protetoras/estabilizadoras do N-terminal incluem, entre outros, formila, acetila (também denotada aqui como “Ac”), trifluoroacetila, benzila, benziloxicarbonila (também denotada aqui como “CBZ”), terc-butoxicarbonila (também denotada aqui como “BOC”), trimetilsilila (também denotada aqui como “TMS”), 2-trimetilsilil-etanossulfonila (também denotada aqui como “SES”), grupos tritil e tritil substituído, aliloxicarbonila, 9-fluorenilmetiloxicarbonila (também denotada aqui como “FMOC”), nitro-veratriloxicarbonila (também denotada aqui como “NVOC”), t-amiloxicarbonila, adamantil-oxicarbonila, além de p-metoxibenziloxicarbonila, 2-clorobenziloxicarbonila e semelhantes, nitro, tosila (CH3C6H4SO2-), 2,2amanto, 8-pentametilcroman-6-sulfonila, 2,3,6-trimetil-4-metoxifenilsulfonila, t-butilbenzila (também denotada aqui como “BZL”) ou BZL substituída, como p- metoxibenzila, p-nitrobenzila, p-clorobenzila, o- clorobenzila, 2,6-diclorobenzila, t-butila, ciclo-hexila, ciclopentila, benziloximetila (também denotada aqui como “BOM”), tetra-hidropiranila, clorobenzila, 4-bromobenzila e 2,6-diclorobenzila.

[0169] De acordo com uma aplicação da invenção, a fração protetora/estabilizadora é uma fração protetora de amina.

[0170] De acordo com uma aplicação específica, a fração protetora/estabilizadora é um resíduo terminal de cisteína.

[0171] Exemplos representativos de fração protetora/estabilizadora do C-terminal são tipicamente frações que levam à acilação do grupo carbóxi no C-terminal e incluem, entre outros, éteres benzílicos e tritílicos, bem como éteres alquílicos, éteres tetrahidropiranílicos, éteres trialquilsilílicos, éteres alílicos, monometóxitritila e dimetoxitritila. Alternativamente, o grupo –COOH do C- terminal pode ser modificado para um grupo amida.

[0172] Outras aplicações de polipeptídeos incluem a substituição da amina e/ou carboxila por uma fração diferente, como hidroxila, tiol, halogeneto, alquila, arila, alcóxi, arilóxi e similares.

[0173] De acordo com uma aplicação específica, a fração protetora/estabilizadora é uma amida.

[0174] De acordo com uma aplicação específica, a fração protetora/estabilizadora é um resíduo terminal de cisteína.

[0175] De acordo com uma aplicação, a fração protetora/estabilizadora compreende, pelo menos, um, dois, três ou mais resíduo(s) de cisteína nos N-terminais ou C- terminais do polipeptídeo.

[0176] De acordo com uma aplicação, a fração protetora/estabilizadora compreende um resíduo de cisteína nos N-terminais ou C-terminais do polipeptídeo.

[0177] De acordo com uma aplicação, a fração protetora/estabilizadora compreende, pelo menos, um, dois, três ou mais resíduo(s) de cisteína nos N-terminais e C- terminais do polipeptídeo.

[0178] De acordo com uma aplicação, a fração protetora/estabilizadora compreende um resíduo de cisteína nos N-terminais e C-terminais do polipeptídeo.

[0179] Adicional ou alternativamente, o polipeptídeo da invenção pode, ainda, compreender uma fração desativadora da protease. Essa fração é capaz de se ligar a uma protease e desativar transitória ou permanentemente sua atividade proteolítica.

[0180] Em algumas aplicações, a fração desativadora da protease pode ser um inibidor irreversível selecionado do grupo consistindo em acetila substituída (1-x-actil), sulfonilfluoretos (-SO2F), clorometilcetonas (-COCH2CI), ésteres (-COOR), ácidos borônicos (-B(OR)2) e combinações respectivas.

[0181] Em algumas aplicações, a fração desativadora da protease pode ser um inibidor reversível selecionado do grupo consistindo em aldeídos (-CHO), arilcetonas (-CO-Aril), trifluorometilcetonas (-COCF3), ácidos cetocarboxílicos (- COCOOH) e combinações respectivas.

[0182] Em algumas aplicações, a fração desativadora da protease pode ser um composto desativador da protease selecionado do grupo consistindo em clorometileticetona (CK) e derivados respectivos, sulfonilfluoretos (-SO2F), clorometilcetonas (-COCH2CII), ésteres (-COOR), ácidos borônicos (-B(OR)2), aldeídos (-CHO), arilcetonas (-CO-aril), trifluorometilcetonas (-COCF3) e ácidos cetocarboxílicos (- COCOOH).

[0183] Em algumas aplicações, a fração desativadora da protease pode ser uma acetila substituída. Em algumas aplicações, a acetila substituída pode ser uma haloacetila. Em algumas aplicações, a haloacetila pode ser uma cloroacetila. Em algumas aplicações, a fração desativadora da protease pode ser uma clorometilcetona (CK | Chloromethylketone).

[0184] Em uma aplicação, os polipeptídeos são modificados apenas nos N-terminais ou nos C-terminais respectivos (resultando, p.ex., em uma molécula que possui uma carga líquida negativa ou positiva, respectivamente). Em outra aplicação, os polipeptídeos são modificados nos N- terminais e C-terminais (resultando, p.ex., em moléculas não carregadas).

[0185] De acordo com uma aplicação, a fração é ligada à sequência de aminoácidos do polipeptídeo diretamente ou via um ligante.

[0186] De acordo com uma aplicação específica, o polipeptídeo solúvel isolado compreendendo a fração protetora e/ou uma fração estabilizadora é o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na ID SEQ. N° 6.

[0187] De acordo com uma aplicação, é fornecida uma composição de matéria compreendendo um polipeptídeo solúvel que compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio apical do TfR1 (também denominado sAD), conforme estabelecido na ID SEQ. N° 6, sendo o polipeptídeo solúvel capaz de se ligar a um Arenavírus.

[0188] Também estão incluídos no escopo da presente invenção “derivados químicos” de um polipeptídeo ou análogo. Tais derivados químicos contêm frações químicas adicionais que normalmente não fazem parte do polipeptídeo. Modificações covalentes do polipeptídeo se encontram incluídas no escopo desta invenção. Tais modificações podem ser introduzidas na molécula reagindo resíduos de aminoácidos direcionados do polipeptídeo com um agente de derivação orgânico que seja capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou resíduos terminais. Muitos desses derivados químicos e métodos para criá-los são bem conhecidos na técnica, alguns são discutidos abaixo.

[0189] Também estão incluídos no escopo da invenção os sais dos polipeptídeos e análogos da invenção. Conforme aqui utilizado, o termo “sais” refere-se a ambos os sais de grupos carboxila e a sais de adição de ácido de grupos amina da molécula polipeptídica. Os sais de um grupo carboxila podem ser formados por meios conhecidos na técnica e incluem sais inorgânicos, por exemplo, sais de sódio, cálcio, amônio, férrico ou zinco e similares, e sais com bases orgânicas, como os formados, por exemplo, com aminas, como trietanolamina, arginina, lisina, piperidina, procaína e similares. Os sais de adição de ácido incluem, por exemplo, sais com ácidos minerais, como, por exemplo, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico, e sais com ácidos orgânicos, como, por exemplo, ácido acético ou ácido oxálico. Tais derivados e sais químicos são preferencialmente usados para modificação das propriedades farmacêuticas do polipeptídeo no que diz respeito à estabilidade, solubilidade, etc.

[0190] De acordo com uma aplicação da invenção, o polipeptídeo isolado capaz de se ligar a um Arenavírus (isto é, o polipeptídeo aqui descrito) é ligado a uma fração heteróloga.

[0191] Conforme aqui utilizado, a expressão “porção heteróloga” refere-se a uma sequência de aminoácidos que não forma endogenamente uma parte da sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado. Preferencialmente, a fração heteróloga não afeta a atividade biológica do polipeptídeo isolado (p.ex., a capacidade de ligação a um Arenavírus).

[0192] A fração heteróloga pode, assim, servir para garantir a estabilidade do polipeptídeo isolado da presente invenção sem comprometer sua atividade. Por exemplo, o polipeptídeo heterólogo pode aumentar a meia-vida do polipeptídeo isolado ou molécula no soro.

[0193] A fração heteróloga de acordo com a presente invenção pode ser capaz de induzir uma resposta de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), conforme discutido em detalhes abaixo.

[0194] De acordo com uma aplicação, a fração heteróloga não induz uma resposta imune. Assim, por exemplo, no caso de Ig, pode haver sequências humanas que não produzem uma resposta imune em um indivíduo administrado com ela.

[0195] De acordo com uma aplicação, a fração heteróloga deve aumentar a avidez do polipeptídeo.

[0196] De acordo com uma aplicação, a fração heteróloga existe para multimerização do polipeptídeo isolado (p.ex., pelo menos, para dimerização dos polipeptídeos isolados).

[0197] De acordo com uma aplicação, a fração heteróloga é uma fração proteinácea.

[0198] Exemplos de sequências de aminoácidos heterólogos que podem ser usados de acordo com os ensinamentos da presente invenção incluem, entre outros, imunoglobulina,

galactosidase, glucuronidase, glutationa-S-transferase (GST), peptídeos carbóxi-terminais (CTP) da gonadotrofina coriônica (CGb) e cloranfenicol acetiltransferase (CAT) [vide, por exemplo, a Publicação Norte-Americana N° 20030171551].

[0199] De acordo com uma aplicação específica, a sequência de aminoácidos heteróloga é uma imunoglobulina.

[0200] Geralmente, a sequência de aminoácidos heteróloga está localizada no terminal amina ou carboxila (N- ter ou C-ter, respectivamente) do polipeptídeo isolado de acordo com a presente invenção. A sequência de aminoácidos heteróloga pode ser ligada à sequência de aminoácidos polipeptídica isolada por qualquer ligação peptídica ou não peptídica. A ligação da sequência de aminoácidos polipeptídica isolada à sequência de aminoácidos heteróloga pode ser efetuada por ligação covalente direta (ligação peptídica ou ligação peptídica substituída) ou ligação indireta, como pelo uso de um ligante com grupos funcionais. Grupos funcionais incluem, entre outros, um ácido carboxílico livre (C(=O)OH), um grupo amino livre (NH2), um grupo éster (C(=O)OR, onde R é alquila, cicloalquila ou arila), um grupo halogeneto de acila (C(=O)A, onde A é fluoreto, cloreto, brometo ou iodeto), um halogeneto (fluoreto, cloreto, brometo ou iodeto), um grupo hidroxila (OH), um grupo tiol (SH), um grupo nitrila (C≡N), um grupo C-carbâmico livre (NR’’-C(=O)- OR’, onde cada um de R’ e R’’ é independentemente um hidrogênio, uma alquila, cicloalquila ou arila).

[0201] Um exemplo de uma sequência de aminoácidos heteróloga que pode ser usada de acordo com este aspecto da presente invenção é uma sequência de aminoácidos da imunoglobulina, tal como as regiões hinge (regiões flexíveis) e Fc de um domínio pesado de imunoglobulina (vide a Patente Norte-Americana Nº 6.777.196). A fração de imunoglobulina nas moléculas deste aspecto da presente invenção pode ser obtida a partir dos subtipos IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, IgA, IgE, IgD ou IgM, conforme discutido mais adiante.

[0202] Tipicamente, nessas fusões, a molécula quimérica reterá, pelo menos, os domínios hinge, CH2 e CH3 funcionalmente ativos da região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. As fusões também podem ser geradas no C- terminal da porção da Fc de um domínio constante ou imediatamente o N-terminal no CH1 da cadeia pesada ou na região correspondente da cadeia leve.

[0203] Embora possa ser possível conjugar toda a região constante da cadeia pesada com a sequência isolada de aminoácidos polipeptídicos da presente invenção, é preferível fundir sequências mais curtas. Por exemplo, uma sequência que começa na região hinge a montante do local de clivagem da papaína, que define quimicamente a Fc da IgG; o resíduo 216, que leva o primeiro resíduo da região constante da cadeia pesada a ser 114, ou locais análogos de outras imunoglobulinas, pode ser usado na fusão. Em uma aplicação específica, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado é fundida à região hinge, CH2 e CH3, ou aos domínios CH1, hinge, CH2 e CH3 de uma cadeia pesada de IgG1, IgG2 ou IgG3 (vide Patente Norte-Americana N° 6.777.196).

[0204] Como mencionado, as sequências de imunoglobulina usadas na construção das moléculas quiméricas deste aspecto da presente invenção podem ser de um domínio constante da cadeia pesada da imunoglobulina IgG. Essa sequência da imunoglobulina IgG pode ser purificada eficientemente, por exemplo, na proteína imobilizada A. A seleção de um parceiro de fusão também pode levar em consideração as propriedades estruturais e funcionais das imunoglobulinas. Assim, por exemplo, o peptídeo heterólogo pode ser uma região hinge da IgG3, que é mais longa e mais flexível, de modo que pode acomodar sequências de aminoácidos maiores que podem não dobrar ou funcionar adequadamente quando fundidas à IgG1. Outra consideração pode ser a valência; As IgG são homodímeros bivalentes, enquanto subtipos de Ig, como IgA e IgM, podem dar origem a estruturas diméricas ou pentaméricas, respectivamente, da unidade básica de homodímeros de Ig. Outras considerações na seleção da porção de imunoglobulina das moléculas quiméricas deste aspecto da presente invenção são descritas na Patente Norte-Americana N°

6.777.196.

[0205] As moléculas de acordo com a presente invenção podem ser geradas usando técnicas recombinantes, conforme as descritas por Bitter et al. (1987) “Methods in Enzymol”, 153:516-544; Studier et al. (1990) “Methods in Enzymol”. 185:60-89; Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514; Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Brogli et al. (1984) Science 224:838-843; Gurley et al. (1986) “Mol. Cell. Biol.” 6:559- 565 e Weissbach & Weissbach, 1988, “Methods for Plant Molecular Biology”, Academic Press, NY, Seção VIII, pp 421-

463.

[0206] A fração heteróloga também pode ser quimicamente ligada ao polipeptídeo isolado após a geração independente de cada um. Assim, os dois polipeptídeos podem ser ligados covalentemente ou não covalentemente usando qualquer método de ligação ou união e/ou qualquer ligante químico adequado conhecido na técnica. Essa ligação pode ser direta ou indireta, por meio de uma ligação peptídica ou via ligação covalente a um elemento ligante interveniente, como um peptídeo ligante ou outra fração química, como um polímero orgânico. Tais peptídeos quiméricos podem ser ligados via ligação nos terminais carbóxi (C) ou amina (N) dos peptídeos, ou via ligação a grupos químicos internos, como cadeias laterais lineares, ramificadas ou cíclicas, átomos internos de carbono ou nitrogênio e semelhantes. O tipo exato e a natureza química desses reticuladores e métodos de reticulação são preferencialmente adaptados ao tipo e natureza dos peptídeos usados.

[0207] De acordo com uma aplicação, é fornecida uma proteína de fusão compreendendo uma sequência de aminoácidos de um domínio apical do TfR1 e uma sequência de aminoácidos da IgG Fc, a proteína de fusão capaz de se ligar a um Arenavírus.

[0208] Conforme aqui utilizado, o termo “fundido” significa que, pelo menos, uma proteína ou peptídeo é fisicamente associado a outra proteína ou peptídeo, o que naturalmente não forma um complexo. De acordo com uma aplicação específica, a molécula fundida é um “polipeptídeo de fusão” ou “proteína de fusão”, uma proteína criada pela união de duas ou mais sequências polipeptídicas relacionadas heterologicamente. Os polipeptídeos de fusão abrangidos nesta invenção incluem produtos de translação de uma estrutura de ácido nucleico quimérico que unem a sequência de DNA que codifica um domínio apical do TfR1 com a sequência de DNA que codifica uma IgG Fc para formar uma única estrutura de leitura aberta. Em outras palavras, um “polipeptídeo de fusão” ou “proteína de fusão” é uma proteína recombinante de duas ou mais proteínas que são unidas por uma ligação peptídica.

[0209] As expressões “proteína de fusão”, “quimera”, “molécula quimérica” ou “proteína quimérica” são usadas de forma intercambiável.

[0210] De acordo com uma aplicação específica, a proteína de fusão (denominada Arenacept) se dá conforme estabelecido na ID SEQ. N° 8.

[0211] De acordo com uma aplicação específica, a proteína de fusão (denominada ArenaceptS206A) se dá conforme estabelecido na ID SEQ. N° 23.

[0212] Assim, a molécula deste aspecto da presente invenção pode compreender uma fração heteróloga, conforme descrito acima. Adicional ou alternativamente, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado, de acordo com a presente invenção, pode ser ligada a uma fração não proteica.

[0213] A expressão “fração não proteica”, conforme aqui utilizada, refere-se a uma molécula, não incluindo aminoácidos ligados a peptídeos, que é anexada à sequência de aminoácidos isolada do polipeptídeo isolado acima descrita.

[0214] De acordo com uma aplicação, a fração não proteinácea é não tóxica.

[0215] Frações não proteinácea exemplares que podem ser usadas, de acordo com os presentes ensinamentos, incluem, entre outros, polietilenoglicol (PEG), polivinilpirrolidona (PVP), poli(estireno-co-anidrido maleico) (SMA) e copolímero de éter divinílico e anidrido maleico (DIVEMA).

[0216] Essa molécula é altamente estável (resistente à atividade proteolítica in vivo, provavelmente devido ao impedimento estérico conferido pela fração não proteica), e pode ser produzida por métodos comuns de síntese em fase sólida que são baratos e altamente eficientes, conforme descrito a seguir. No entanto, será apreciado que técnicas recombinantes ainda possam ser usadas, em que o produto polipeptídico recombinante é sujeito a modificação in vitro (p.ex., PEGuilação, conforme descrito a seguir).

[0217] Será apreciado que essas frações não proteicas também possam ser ligadas às moléculas de fusão acima mencionadas (isto é, que compreendem um domínio apical do TfR1 e uma sequência de aminoácidos da IgG Fc, as moléculas de fusão capazes de se ligar a um Arenavírus) para promover a estabilidade e possivelmente solubilidade das moléculas.

[0218] A bioconjugação de uma fração não proteica (como a PEGuilação) pode conferir a sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado ou da proteína de fusão com estabilidade (p.ex., contra atividades de protease) e/ou solubilidade (p.ex., dentro de um fluido biológico, como sangue, fluido digestivo), preservando sua atividade biológica e prolongando sua meia-vida.

[0219] A bioconjugação é vantajosa principalmente nos casos de proteínas terapêuticas que exibem meia-vida curta e rápida eliminação do sangue. O aumento da meia-vida das proteínas bioconjugadas no plasma resulta do aumento do tamanho dos conjugados de proteínas (o que limita sua filtração glomerular) e da diminuição da proteólise devido ao impedimento estérico do polímero. Geralmente, quanto mais cadeias poliméricas ligadas por polipeptídeo, maior a extensão da meia-vida. No entanto, são tomadas medidas para não reduzir a atividade específica do polipeptídeo isolado ou da proteína de fusão de acordo com a presente invenção (p.ex., a capacidade de ligação a um arenavírus).

[0220] A bioconjugação da sequência isolada de aminoácidos do polipeptídeo ou da proteína de fusão com PEG (p.ex., PEGilação) pode ser efetuada usando derivados de PEG, como ésteres de N-hidroxissuccinimida (NHS | N- hydroxysuccinimide) dos ácidos carboxílicos do PEG, monometóxiPEG2-NHS, éster succinimidílico do PEG carboximetilado (SCM-PEG), derivados de benzotriazol- carbonato de PEG, éteres glicidílicos de PEG, PEG- carbonofenil-carbonatos (PEG-NPC, como metóxi PEG-NPC), aldeídos de PEG, dissulfeto de PEG-ortopiridila, PEGs ativados por carbonildimidazol, PEG-tiol e PEG-maleimida. Tais derivados de PEG estão disponíveis comercialmente em vários pesos moleculares [Vide, p.ex., Catalog, “Polyethylene Glycol and Derivatives”, 2000 (Shearwater Polymers, Inc., Huntsvlle, Ala.)]. Se desejado, muitos dos derivados acima estão disponíveis na forma monometóxipEG monofuncional (mPEG).

[0221] Em geral, o PEG adicionado à sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado ou da proteína de fusão de acordo com a presente invenção deve variar de um peso molecular (MW) de várias centenas de Daltons a cerca de 100 kDa (p.ex., entre 3 a 30 kDa). Pode ser usado um PEG com MW maior, mas isso pode resultar em alguma perda de produção de peptídeos PEGuilados. A pureza de moléculas maiores de PEG também deve ser observada, pois pode ser difícil obter PEG de MW maior com pureza tão alta quanto a obtida para PEGs de MW menor. É preferível usar PEGs com, pelo menos, 85% de pureza e mais preferencialmente com, pelo menos, 90% de pureza, 95% de pureza ou superior. A PEGuilação de moléculas é, ainda, discutida, p.ex., na publicação “Bioconjugate Techniques”, Academic Press San Diego, Hermanson, Calif. (1996), no capítulo 15, e na publicação “Succinimidyl Carbonates of Polyethylene Glycol”, de Zalipsky et al., em Dunn e Ottenbrite, eds., “Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems”, America Chemical Society, Washington, D.C. (1991).

[0222] Convenientemente, o PEG pode ser ligado a uma posição escolhida na sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado ou da proteína de fusão por mutagênese específica do local, desde que a atividade do conjugado seja mantida (p.ex., capacidade de ligação a um Arenavírus). Um alvo para PEGuilação pode ser qualquer resíduo de cisteína no N-terminal ou no C-terminal da sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado ou da proteína de fusão. Adicional ou alternativamente, outros resíduos de cisteína podem ser adicionados à sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado ou da proteína de fusão (p.ex., no N-terminal ou no C-terminal) para, assim, servir como um alvo para PEGuilação. A análise computacional pode ser efetuada para selecionar uma posição preferida para mutagênese sem comprometer a atividade.

[0223] Podem ser empregados várias químicas de conjugação de PEG ativado, como PEG-maleimida, PEG-vinil- sulfona (VS), PEG-acrilato (AC) ou dissulfeto de PEG- ortopiridila. Os métodos de preparação de moléculas de PEG ativadas são conhecidos nas técnicas. Por exemplo, o PEG-VS pode ser preparado sob argônio, fazendo reagir uma solução de diclorometano (DCM|dichloromethane) do PEG-OH com NaH e depois com di-vinilsulfona (razões molares: OH 1: NaH 5: divinilsulfona 50, com 0,2 gramas de PEG/mL de DCM). O PEG- AC é produzido sob árgon fazendo reagir uma solução de DCM do PEG-OH com cloreto de acriloíla e trietilamina (razões molares: OH 1: cloreto de acriloíla 1,5: trietilamina 2, a 0,2 gramas de PEG/mL DCM). Esses grupos químicos podem ser ligados a moléculas de PEG linearizadas, com 2 braços, 4 braços ou 8 braços.

[0224] Embora a conjugação com resíduos de cisteína seja um método conveniente pelo qual o aminoácido do polipeptídeo isolado ou da proteína de fusão de acordo com a presente invenção possa ser PEGuilado, outros resíduos também podem ser usados, se desejado. Por exemplo, o anidrido acético pode ser usado para reagir com os grupos NH2 e SH, mas não com os grupos COOH, S--, ou --SCH3, enquanto o peróxido de hidrogênio pode ser usado para reagir com os grupos --SH e - -SCH3, mas não com NH2. As reações podem ser conduzidas sob condições apropriadas para conjugação com um resíduo desejado no polipeptídeo, empregando substâncias químicas que exploram reatividades bem estabelecidas.

[0225] Para bioconjugação da sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado ou da proteína de fusão da presente invenção com PVP, a PVP terminal contendo COOH é sintetizada a partir de N-vinil-2-pirrolidona por polimerização radical em dimetil formamida com o auxílio de 4,4'-azobis-(ácido 4- cianovalérico) como iniciador de radical e ácido 3- mercaptopropiônico como agente de transferência de cadeia. As PVPs resultantes com um peso molecular médio de Mr 6.000 podem ser separadas e purificadas por cromatografia líquida de alta eficiência e o grupo COOH terminal de PVP sintética é ativado pelo método N-hidroxisuccinimida/diciclohexilcarbodiimida. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo isolado ou da proteína de fusão é reagida com um excesso molar de 60 vezes da PVP ativada e a reação é interrompida com ácido aminocaproico (excesso molar de 5 vezes contra PVP ativado), essencialmente conforme descrito em Haruhiko Kamada, et al., 2000, “Cancer Research” 60: 6416-6420, que é totalmente incorporado aqui por referência.

[0226] As moléculas do polipeptídeo isolado conjugado resultantes ou proteínas de fusão (p.ex., o polipeptídeo isolado conjugado com PVP ou PEGuilado, ou a proteína de fusão) são separadas, purificadas e qualificadas usando, por exemplo, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC | high-performance liquid chromatography). Além disso, as moléculas conjugadas purificadas deste aspecto da presente invenção podem ser, ainda, qualificadas usando, por exemplo, ensaios in vitro nos quais a especificidade de ligação do polipeptídeo isolado ou da proteína de fusão ao seu ligante (p.ex., Arenavírus) é testada na presença ou ausência dos conjugados de polipeptídeo isolado ou de proteína de fusão da presente invenção, essencialmente conforme descrito para outros polipeptídeos, por exemplo, pelo Ensaio de Ressonância de Plasmon de Superfície.

[0227] As moléculas deste aspecto da presente invenção podem ser sintetizadas bioquimicamente, como, por exemplo, pelo uso de técnicas padrão de fase sólida. Esses métodos incluem síntese exclusiva de fase sólida, métodos de síntese parcial de fase sólida, condensação de fragmentos e síntese de solução clássica. Estes métodos são preferencialmente usados quando o polipeptídeo é relativamente curto (ou seja,

10 kDa) e/ou quando não pode ser produzido por técnicas recombinantes (ou seja, não codificado por uma sequência de ácido nucleico) e, portanto, envolve diferentes substâncias químicas.

[0228] Assim, os polipeptídeos, de acordo com algumas aplicações da invenção, podem ser sintetizados por quaisquer técnicas conhecidas pelos especialistas na técnica da síntese de peptídeos. Para a síntese de peptídeos em fase sólida, um resumo das muitas técnicas pode ser encontrado em J. M. Stewart e J. D. Young, “Solid Phase Peptide Synthesis”, W. H. Freeman Co. (São Francisco), 1963 e J. Meienhofer, “Hormonal Proteins and Peptides”, vol. 2, p. 46, Academic Press (Nova York), 1973. Para síntese de solução clássica, vide G. Schroder e K. Lupke, “The Peptides”, vol. 1, Academic Press (Nova York), 1965.

[0229] Em geral, esses métodos compreendem a adição sequencial de um ou mais aminoácido(s) ou aminoácido(s) adequadamente protegido(s) a uma cadeia peptídica crescente. Normalmente, o grupo amina ou carboxila do primeiro aminoácido é protegido por um grupo protetor adequado. O aminoácido protegido ou derivatizado pode, então, ser anexado a um suporte sólido inerte ou usado em uma solução adicionando o próximo aminoácido na sequência que possua o grupo complementar (amina ou carboxila) adequadamente protegido, sob condições adequadas para formar a ligação amida.

[0230] O grupo protetor é, então, removido deste resíduo de aminoácido recém-adicionado e o próximo aminoácido (adequadamente protegido) é, então, adicionado, e assim por diante. Depois de todos os aminoácidos desejados terem sido ligados na sequência apropriada, quaisquer grupos protetores restantes (e qualquer suporte sólido) são removidos sequencial ou simultaneamente, a fim de fornecer o composto peptídico final. Pela simples modificação deste procedimento geral, é possível adicionar mais de um aminoácido de cada vez a uma cadeia crescente, por exemplo, acoplando (sob condições que não racemizam os centros quirais) um tripeptídeo protegido com um dipeptídeo devidamente protegido para formar, após a desproteção, um pentapeptídeo, e assim por diante. Uma descrição adicional da síntese de peptídeos é divulgada na Patente Norte-Americana N° 6.472.505.

[0231] Um método preferido de preparação dos compostos polipeptídicos de acordo com algumas aplicações da invenção envolve a síntese de peptídeos em fase sólida.

[0232] A síntese de peptídeos em larga escala é descrita por Andersson Biopolymers 2000; 55(3):227-50.

[0233] Os polipeptídeos sintéticos podem ser purificados por cromatografia líquida de alta eficiência preparativa [Creighton T. (1983) “Proteins, structures and molecular principles”. WH Freeman e Co. N.Y.] cuja composição pode ser confirmada por sequenciação de aminoácidos.

[0234] Nos casos em que grandes quantidades dos polipeptídeos da presente invenção são desejadas, os polipeptídeos de acordo com a presente invenção podem ser gerados usando técnicas recombinantes, conforme descrito por Bitter et al. (1987) “Methods in Enzymol”. 153:516-544; Studier et al. (1990) “Methods in Enzymol”. 185:60-89; Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514; Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Brogli et al. (1984) Science 224:838-843; Gurley et al. (1986) “Mol. Cell. Biol.” 6:559-565 e Weissbach & Weissbach, 1988,

“Methods for Plant Molecular Biology”, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463.

[0235] Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo isolado de acordo com a presente invenção (p.ex., as sequências de aminoácidos estabelecidas nas ID SEQ. N° 2, 4, 6, 10, 12 ou 14) é ligada a uma sequência de ácido nucleico que possa incluir uma sequência de infraestrutura que codifica uma fração proteica, como imunoglobulina.

[0236] De acordo com uma aplicação, a sequência de ácido nucleico codifica uma proteína de fusão (p.ex., Arenacept, conforme estabelecido na ID SEQ. N° 8 ou conforme estabelecido na ID SEQ. N° 23).

[0237] Para expressão, uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo isolado pode compreender a sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na ID SEQ. N° 1, 3, 5, 9, 11, 13 ou 20.

[0238] De acordo com uma aplicação, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão (p.ex., Arenacept) pode compreender a sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na ID SEQ. N° 7 ou conforme definido na ID SEQ. N° 22.

[0239] Também é fornecido um vetor de expressão, compreendendo o polinucleotídeo isolado de acordo com algumas aplicações da invenção. De acordo com uma aplicação, a sequência polinucleotídica é operacionalmente ligada a um elemento regulador de ação cis.

[0240] A estrutura de ácido nucleico (também aqui referida como um “vetor de expressão”), de acordo com algumas aplicações da invenção, inclui sequências adicionais que tornam esse vetor adequado para replicação e integração em procariontes, eucariotos ou, preferencialmente, ambos (p.ex., vetores de transporte). Além disso, os vetores de clonagem típicos também podem conter uma sequência de início de transcrição e translação, um terminador de transcrição e translação e um sinal de poliadenilação. A título de exemplo, tais estruturas incluem tipicamente uma LTR 5', um local de ligação ao tRNA, um sinal de empacotamento, uma origem da síntese de DNA de segunda fita e uma LTR 3' ou uma porção respectiva.

[0241] A estrutura de ácido nucleico, de acordo com algumas aplicações da invenção, inclui tipicamente uma sequência sinal para secreção ou apresentação de um anticorpo a partir de uma célula hospedeira na qual é colocado. Preferencialmente, a sequência sinal para este fim é uma sequência de sinal de mamífero.

[0242] De acordo com uma aplicação, o peptídeo sinal se dá conforme estabelecido na ID SEQ. N° 19.

[0243] Preferencialmente, o promotor usado pela estrutura de ácido nucleico, de acordo com algumas aplicações da invenção, é ativo na população celular específica transformada.

[0244] Na construção do vetor de expressão, o promotor é preferencialmente posicionado aproximadamente à mesma distância do local de início da transcrição heteróloga e do local de início da transcrição em sua configuração natural. Conforme é conhecido na técnica, no entanto, algumas variações nessa distância podem ser acomodadas sem perda da função do promotor.

[0245] As sequências de poliadenilação também podem ser adicionadas ao vetor de expressão para aumento da eficiência da translação do mRNA do TCRL.

[0246] Além dos elementos já descritos, o vetor de expressão, de acordo com algumas aplicações da invenção, pode tipicamente conter outros elementos especializados destinados a aumentar o nível de expressão de ácidos nucleicos clonados ou facilitar a identificação de células que transportam o DNA recombinante. Por exemplo, vários vírus animais contêm sequências de DNA que promovem a replicação cromossômica extra do genoma viral em tipos de células permissivas. Os plasmídeos portadores desses replicões virais são replicados episomalmente, desde que os fatores apropriados sejam fornecidos por genes transportados no plasmídeo ou com o genoma da célula hospedeira.

[0247] O vetor pode ou não incluir um replicão eucariótico. Se um replicão eucariótico estiver presente, o vetor é amplificável em células eucarióticas usando o marcador selecionável apropriado. Se o vetor não compreender um replicão eucariótico, nenhuma amplificação epissomal é possível. Em vez disso, o DNA recombinante se integra ao genoma da célula manipulada, onde o promotor direciona a expressão do ácido nucleico desejado.

[0248] Melhorias na expressão do polipeptídeo recombinante em células de mamíferos podem ser alcançadas aumentando efetivamente a dosagem do gene em uma célula hospedeira transfectada. Os aumentos no número de cópias de genes são mais comumente alcançados por amplificação de genes usando linhas celulares deficientes em uma enzima como diidrofolato redutase (DHFR | dihydrofolate reductase) ou glutamina sintetase (GS | glutamine synthetase) em conjunto com vetores de expressão contendo genes que codificam essas enzimas e agentes como o metotrexato (MTX | methotrexate), que inibe a DHFR, e a metionina sulfoxamina (MSX | methionine sulfoxamine), que inibe a GS.

[0249] Exemplos de sistemas para expressão são descritos nos Documentos EP2861741, US20120178126 e US20080145895, cada um dos quais sendo incorporado aqui por referência em sua totalidade.

[0250] Também são fornecidas células que compreendem os polinucleotídeos/vetores de expressão conforme aqui descritos.

[0251] As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão incluem células procarióticas ou eucarióticas. Vide, p.ex., Charlton, Methods em “Molecular Biology”, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N. J., 2003), pp. 245-254, descrevendo a expressão de fragmentos de anticorpos na presença de E. coli; vide também Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), e Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) para fungos e leveduras adequados; e vide, p.ex., as Patentes Norte-Americanas N° 5.959.177, 6.040.498,

6.420.548, 7.125.978 e 6.417.429 para culturas de células vegetais adequadas que também podem ser usadas como hospedeiros.

[0252] Após a expressão, o polipeptídeo isolado ou a proteína de fusão podem ser isolados das células em uma fração solúvel e podem ser ainda mais purificados.

[0253] A recuperação do polipeptídeo isolado ou da proteína de fusão pode ser realizada após um tempo apropriado na cultura. A expressão “recuperação do polipeptídeo recombinante ou proteína de fusão” refere-se à coleta de todo o meio de fermentação que contém o polipeptídeo ou proteína de fusão e não precisa implicar etapas adicionais de separação ou purificação.

[0254] Não obstante o acima exposto, as proteínas da presente invenção podem ser purificadas usando uma variedade de técnicas padrão de purificação de proteínas, tais como, entre outras, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, filtração, eletroforese, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de filtração em gel, fase reversa cromatografia, cromatografia da Concanavalina A, cromatofoco e solubilização diferencial.

[0255] As moléculas da presente invenção são preferencialmente recuperadas na forma “substancialmente pura”. Conforme aqui utilizado, a expressão “substancialmente puro” refere-se a uma pureza que permite o uso eficaz da proteína nas aplicações aqui descritas.

[0256] Será apreciado que a composição de matéria, compreendendo o polipeptídeo isolado ou a proteína de fusão da presente invenção, pode compreender um único polipeptídeo isolado ou a proteína de fusão ou, alternativamente, possa compreender dois ou mais polipeptídeos isolados ou proteínas de fusão fundidos de acordo com qualquer um dos métodos descritos acima.

[0257] Uma vez obtidos os polipeptídeos, eles podem ser testados quanto à afinidade de ligação ao Arenavírus, conforme discutido em detalhes acima.

[0258] De acordo com uma aplicação, a composição de matéria que compreende os polipeptídeos isolados ou proteínas de fusão, de acordo com algumas aplicações da invenção, também é selecionada capaz de neutralizar os Arenavírus para maximização da eficácia terapêutica.

[0259] O termo “neutralização” refere-se à capacidade da composição de matéria compreendendo os polipeptídeos isolados ou proteínas de fusão em bloquear o(s) local(is) nos vírus que usam para entrar na célula alvo. De acordo com uma aplicação, a composição de matéria compreendendo os polipeptídeos isolados ou proteínas de fusão, de acordo com algumas aplicações da invenção, é capaz de neutralizar a infectividade do vírus em, pelo menos, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% em comparação com a infectividade na ausência da composição de matéria compreendendo os polipeptídeos isolados ou proteínas de fusão da invenção.

[0260] A determinação da neutralização dos Arenavírus pode ser realizada usando qualquer método conhecido na técnica, como por ensaios de neutralização in vitro (conforme o descrito na seção ‘materiais gerais e procedimentos experimentais’ abaixo).

[0261] De acordo com uma aplicação, a composição de matéria compreendendo os polipeptídeos isolados ou proteínas de fusão, de acordo com algumas aplicações da invenção, também é selecionada capaz de iniciar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), isto é, a morte de uma célula alvo revestida por anticorpo por uma célula efetora citotóxica (p.ex., células NK, monócitos, macrófagos, neutrófilos eosinófilos e células dendríticas) através de um processo não fagocítico (p.ex., pela liberação do conteúdo de grânulos citotóxicos ou pela expressão de moléculas indutoras de morte celular).

[0262] A determinação de que os peptídeos isolados ou proteínas de fusão iniciam a ADCC pode ser realizada usando qualquer método conhecido na técnica, como a medição da liberação de lactato desidrogenase (LDH | Lactate Dehydrogenase) usando o conjunto de Detecção de Citotoxicidade LDH (disponível, p.ex., pela Roche Applied Science).

[0263] De acordo com uma aplicação, a composição da matéria que compreende os polipeptídeos isolados ou proteínas de fusão, de acordo com algumas aplicações da invenção, é tipicamente capaz de promover a erradicação das células infectadas, bem como neutralizar diretamente os Arenavírus.

[0264] De acordo com uma aplicação, a composição de matéria compreendendo os polipeptídeos isolados ou proteínas de fusão de acordo com algumas aplicações da invenção também é selecionada de maneira termoestável (p.ex., estável até 45°C, até 50°C, até 55°C, até 60°C ou até 65°C). Tais determinações podem ser realizadas usando qualquer método conhecido na técnica, como por medições circulares de dicroísmo (conforme descrito na “seção de materiais gerais e procedimentos experimentais” abaixo).

[0265] A composição de matéria compreendendo os polipeptídeos isolados ou proteínas de fusão, de acordo com a presente invenção, pode ser administrada ao indivíduo per se, ou em uma composição farmacêutica, sendo misturada com transportadores ou excipientes adequados.

[0266] Conforme aqui utilizado, uma “composição farmacêutica” refere-se a uma preparação de um ou mais dos ingredientes ativos aqui descritos com outros componentes químicos, tais como transportadores e excipientes fisiologicamente adequados. O objetivo de uma composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto a um organismo.

[0267] Aqui, a expressão “ingrediente ativo” refere- se à composição de matéria que compreende os polipeptídeos isolados ou proteínas de fusão responsáveis pelo efeito biológico.

[0268] Doravante, as expressões “transportador fisiologicamente aceitável” e “transportador farmaceuticamente aceitável”, que podem ser usadas de forma intercambiável, referem-se a um transportador ou diluente que não cause irritação significativa a um organismo e não anule a atividade biológica e as propriedades do composto administrado. Um adjuvante está incluído nessas expressões.

[0269] Aqui, o termo “excipiente” refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para facilitar ainda mais a administração de um ingrediente ativo. Exemplos, sem limitação, de excipientes, incluem: carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietilenoglicóis.

[0270] As técnicas para formulação e administração de medicamentos podem ser encontradas em “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, edição mais recente, a qual é incorporada aqui por referência.

[0271] As vias de administração adequadas podem, por exemplo, incluir administração oral, retal, transmucosa, especialmente transnasal, intestinal ou parenteral, incluindo injeções intramusculares, subcutâneas e intramedulares, bem como injeções intratecais, intraventriculares diretas, intracardíacas, p.ex., na cavidade ventricular direita ou esquerda, na artéria coronária comum, injeções intravenosas, intraperitoneais, intranasais ou intraoculares.

[0272] As abordagens convencionais para administração de medicamentos ao sistema nervoso central (CNS | central nervous system) incluem: estratégias neurocirúrgicas (p.ex., injeção intracerebral ou infusão intracerebroventricular); manipulação molecular do agente (p.ex., produção de uma proteína de fusão quimérica que compreenda um peptídeo de transporte com afinidade por uma molécula de superfície celular endotelial, em combinação com um agente que seja incapaz de atravessar a barreira hematoencefalica (BBB | blood brain barrier ) em uma tentativa de explorar uma das vias de transporte endógenas da BBB; estratégias farmacológicas projetadas para aumento da solubilidade lipídica de um agente (p.ex., conjugação de agentes solúveis em água a transportadores de lipídios ou colesterol); e a interrupção transitória da integridade da BBB por ruptura hiperosmótica (resultante da infusão de uma solução de manitol na artéria carótida ou do uso de um agente biologicamente ativo, como um peptídeo de angiotensina). No entanto, cada uma dessas estratégias possui limitações, como os riscos inerentes a um procedimento cirúrgico invasivo, uma limitação de tamanho imposta por uma limitação inerente aos sistemas de transporte endógenos, efeitos colaterais biológicos potencialmente indesejáveis associados à administração sistêmica de uma molécula quimérica composta de um motivo portador que possa estar ativo fora do CNS e o possível risco de dano cerebral em regiões do cérebro em que a BBB é interrompida, o que a torna um método de entrega abaixo do ideal.

[0273] Alternativamente, pode-se administrar a composição farmacêutica de maneira local e não sistêmica, por exemplo, via injeção da composição farmacêutica diretamente na região do tecido de um paciente.

[0274] As composições farmacêuticas, de acordo com algumas aplicações da invenção, podem ser fabricadas por processos bem conhecidos na técnica, p.ex., por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, fabricação de drágeas, levigação, emulsificação, encapsulamento, aprisionamento ou liofilização.

[0275] As composições farmacêuticas para uso, de acordo com algumas aplicações da invenção, portanto, podem ser formuladas de maneira convencional usando um ou mais transportador(es) fisiologicamente aceitável(is), compreendendo excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos ingredientes ativos em preparações que podem ser usadas farmaceuticamente. A formulação adequada depende da via de administração escolhida.

[0276] Para injeção, os ingredientes ativos da composição farmacêutica podem ser formulados em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis, como solução de Hank, solução de Ringer ou tampão fisiológico de sal. Para administração transmucosa, são usados na formulação penetrantes apropriados à barreira a ser permeada. Esses penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.

[0277] Para administração oral, a composição farmacêutica pode ser formulada prontamente combinando os compostos ativos com transportadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Tais transportadores permitem que a composição farmacêutica seja formulada como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e similares, para ingestão oral por um paciente. As preparações farmacológicas para uso oral podem ser feitas usando um excipiente sólido, moendo opcionalmente a mistura resultante e processando a mistura de grânulos, após adição de auxiliares adequados, se desejado, para obtenção de comprimidos ou núcleos de drágeas. Excipientes adequados são, em particular, agentes de preenchimento, tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose, tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, tragacanta de goma, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carbometilcelulose de sódio; e/ou polímeros fisiologicamente aceitáveis, tais como polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, podem ser adicionados agentes desintegrantes, como polivinilpirrolidona reticulada, ágar ou ácido algínico ou um sal respectivo, como alginato de sódio.

[0278] Os núcleos de drágeas são fornecidos com revestimentos adequados. Para este fim, podem ser usadas soluções de açúcar concentradas que podem opcionalmente conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenoglicol, dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de comprimidos ou drágeas para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doses de compostos ativos.

[0279] As composições farmacêuticas que podem ser usadas por via oral incluem cápsulas de encaixe feitas de gelatina, bem como cápsulas macias e seladas de gelatina, e um plastificante, como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe podem conter os ingredientes ativos em uma mistura com cargas como lactose, ligantes como amidos, lubrificantes como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Nas cápsulas moles, os ingredientes ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, como óleos graxos, parafina líquida ou polietilenoglicóis líquidos. Além disso, estabilizadores também podem ser adicionados. Todas as formulações para administração oral devem se apresentar em dosagens adequadas para a via de administração escolhida.

[0280] Para administração bucal, as composições podem assumir a forma de comprimidos ou pastilhas formuladas de maneira convencional.

[0281] Para administração por inalação nasal, os ingredientes ativos para uso, de acordo com algumas aplicações da invenção, são convenientemente entregues na forma de uma apresentação em spray de aerossol a partir de uma embalagem pressurizada ou um nebulizador com o uso de um propulsor adequado, p.ex., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dicloro-tetrafluoroetano ou dióxido de carbono. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada fornecendo uma válvula para fornecer uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de, p.ex., gelatina para uso em um dispensador, podem ser formulados contendo uma mistura de pó do composto e uma base de pó adequada, como lactose ou amido.

[0282] A composição farmacêutica aqui descrita pode ser formulada para administração parentérica, p.ex., por injeção em bolus ou infusão contínua. As formulações para injeção podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária, p.ex., em ampolas ou em recipientes de doses múltiplas com, opcionalmente, um conservante adicionado. As composições podem ser suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes de formulação, como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.

[0283] As composições farmacêuticas para administração parentérica incluem soluções aquosas da preparação ativa na forma solúvel em água. Além disso, as suspensões dos ingredientes ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosas ou à base de água apropriadas. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, como óleo de gergelim, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, como oleato de etila, triglicerídeos ou lipossomas. As suspensões aquosas de injeção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos ingredientes ativos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

[0284] Alternativamente, o ingrediente ativo pode se dar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, p.ex., uma solução estéril à base de água, livre de pirogênio, antes do uso.

[0285] A composição farmacêutica, de acordo com algumas aplicações da invenção, também pode ser formulada em composições retais, como supositórios ou enemas de retenção, usando, p.ex., bases de supositórios convencionais, como manteiga de cacau ou outros glicerídeos.

[0286] As composições farmacêuticas adequadas para uso no contexto de algumas aplicações da invenção incluem composições em que os ingredientes ativos estão contidos em uma quantidade eficaz que atinja o objetivo pretendido. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de ingredientes ativos (composição de matéria que compreende os polipeptídeos isolados ou proteínas de fusão) eficazes na prevenção, alívio ou melhoria dos sintomas de um distúrbio (p.ex., infecção por Arenaviral) ou que prolonguem a sobrevivência do indivíduo sendo tratado.

[0287] De acordo com uma aplicação da presente invenção, uma quantidade eficaz da composição de matéria compreendendo os polipeptídeos isolados ou proteínas de fusão, de acordo com algumas aplicações da presente invenção, é uma quantidade selecionada para neutralizar os Arenavírus e/ou eliminar as células infectadas, p.ex., iniciando a ADCC.

[0288] A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está dentro da capacidade dos especialistas na técnica, especialmente à luz da divulgação detalhada aqui fornecida.

[0289] Por exemplo, qualquer método in vivo ou in vitro de avaliação da carga viral de Arenavirus pode ser empregado.

[0290] Para qualquer preparação usada nos métodos da invenção, a quantidade ou dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios in vitro e de cultura celular. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma concentração ou título desejado. Essa informação pode ser usada para determinar com mais precisão doses úteis em humanos.

[0291] A toxicidade e eficácia terapêutica dos ingredientes ativos aqui descritos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão in vitro, em culturas celulares ou animais experimentais. Os dados obtidos a partir destes ensaios in vitro e de culturas celulares e estudos em animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em humanos. A dosagem pode variar dependendo da forma de dosagem usada e da via de administração usada. A formulação exata, a via de administração e a dosagem podem ser escolhidas pelo médico em vista da condição do paciente. (Vide, p.ex., Fingl, et al., 1975, na publicação “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Cap. 1 p.1).

[0292] A quantidade e o intervalo da dosagem podem ser ajustados individualmente para fornecer o ingrediente ativo em uma quantidade suficiente que induza ou suprima o efeito biológico (concentração eficaz mínima (MEC | minimal effective concentration)). A MEC varia para cada preparação, mas pode ser estimada a partir de dados in vitro. As dosagens necessárias para atingir a MEC dependerão das características individuais e da via de administração. Os ensaios de detecção podem ser usados para determinar as concentrações plasmáticas.

[0293] Dependendo da gravidade e capacidade de resposta da condição a ser tratada, a dosagem pode ser de administração única ou de uma pluralidade de administrações, com o curso do tratamento durando de vários dias a várias semanas ou até que a cura seja efetivada ou a diminuição do estado da doença seja alcançada.

[0294] A quantidade de uma composição a ser administrada dependerá, é claro, do indivíduo a ser tratado, da gravidade da aflição, do modo de administração, do julgamento do médico prescritor, etc.

[0295] As composições de acordo com algumas aplicações da invenção podem, se desejado, ser apresentadas em uma embalagem ou dispositivo dispensador, como um conjunto aprovado pela FDA que possa conter uma ou mais forma(s) de dosagem unitária(s) contendo o ingrediente ativo. A embalagem pode, por exemplo, compreender folhas de metal ou plástico, como uma embalagem em blister. A embalagem ou dispositivo dispensador pode vir acompanhado de instruções para administração. A embalagem ou dispensador também pode ser acomodado por um aviso associado ao recipiente em uma forma prescrita por uma agência governamental que regule sua fabricação, uso ou a venda de produtos farmacêuticos. Tal aviso atesta a aprovação pela agência da forma das composições ou administração humana ou veterinária. Esse aviso, por exemplo, pode ter sua rotulagem aprovada pela Agência de Administração de Alimentos e Medicamentos dos EUA (U.S. Food and Drug Administration) para prescrição de fármacos ou um folheto de produto aprovado. As composições compreendendo uma preparação da invenção formulada em um transportador farmacêutico compatível também podem ser preparadas, colocadas em um recipiente apropriado e rotuladas para o tratamento de uma condição indicada, conforme é detalhado acima.

[0296] Será apreciado que o conjunto possa, ainda, compreender outra composição terapêutica para o tratamento de uma infecção por Arenavírus, p.ex., um agente antiviral. Assim, por exemplo, a composição da matéria compreendendo o polipeptídeo isolado ou a proteína de fusão pode ser embalada em um recipiente enquanto o agente antiviral pode ser embalado em um segundo recipiente, ambos para tratamento terapêutico. Alternativamente, a composição da matéria compreendendo o polipeptídeo isolado ou a proteína de fusão pode ser embalada em uma co-formulação com o agente antiviral.

[0297] Conforme mencionado acima, a composição de matéria compreendendo os polipeptídeos isolados ou proteínas de fusão da invenção visa especificamente os Arenavírus. Assim, a composição de matéria que compreende os polipeptídeos isolados ou proteínas de fusão pode ser usada para tratar ou prevenir uma infecção viral por Arenavirus ou doença associada respectiva (conforme discutido abaixo).

[0298] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou infecção viral associada ao Arenavírus em um indivíduo em necessidade respectiva, o método compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição de matéria que compreende um polipeptídeo solúvel isolado, compreendendo uma sequência de aminoácidos de um domínio apical do TfR1 ou proteína de fusão de acordo com algumas aplicações da invenção, tratando ou prevenindo, assim, a doença ou infecção viral associada ao Arenavírus no indivíduo.

[0299] De acordo com outro aspecto, é fornecida uma composição de matéria que compreende um polipeptídeo solúvel isolado, compreendendo uma sequência de aminoácidos de um domínio apical do TfR1 ou proteína de fusão, de acordo com algumas aplicações da invenção, para uso no tratamento ou prevenção de uma doença ou infecção viral associada ao

Arenavírus em um indivíduo em necessidade respectiva.

[0300] O termo “tratar” refere-se a inibir, prevenir ou interromper o desenvolvimento de uma patologia (doença, distúrbio ou condição) e/ou causar a redução, remissão ou regressão de uma patologia. Os especialistas na técnica entenderão que várias metodologias e ensaios podem ser usados para avaliar o desenvolvimento de uma patologia e, similarmente, várias metodologias e ensaios podem ser usados para avaliar a redução, remissão ou regressão de uma patologia.

[0301] Conforme aqui utilizado, o termo “prevenção” refere-se a impedir que uma doença, distúrbio ou condição ocorra em um indivíduo que possa estar em risco de uma doença, mas ainda não tenha sido diagnosticado como portador da mesma.

[0302] Conforme aqui utilizado, o termo “indivíduo” inclui mamíferos, preferencialmente seres humanos, machos ou fêmeas, em qualquer idade ou gênero, que sofram da patologia. Preferencialmente, este termo abrange indivíduos que correm risco de desenvolver a patologia.

[0303] Conforme aqui utilizado, a expressão “infecção viral por Arenavírus” refere-se a qualquer infecção causada por um Arenavírus. De acordo com uma aplicação específica, o Arenavírus é um Arenavírus do Novo Mundo, conforme descrito em detalhes acima.

[0304] Conforme aqui utilizado, a expressão “doença associada” refere-se a qualquer doença ou sintoma causado como resultado da infecção viral por Arenavirus. Isso pode incluir, sem limitação, sintomas semelhantes aos da gripe (p.ex., febre, calafrios etc.), vômitos, dores de cabeça, rigidez muscular, fotofobia, hiperexcitabilidade, tremores e movimentos anormais, incoordenação, paralisia, perda sensorial, convulsões, apatia, defeitos de memória, confusão, dificuldades mentais, disfunção respiratória, dano neuronal, dano vascular, sangramento, hemorragias graves e febre hemorrágica.

[0305] De acordo com uma aplicação, quando a doença for uma infecção por Junín (JUNV), os sintomas podem incluir, por exemplo, conjuntivite, púrpura, petéquia e, ocasionalmente, sepse.

[0306] De acordo com uma aplicação, quando a doença for uma infecção por Machupo (MACV), os sintomas podem incluir, por exemplo, febre, dor de cabeça, fadiga, mialgia e artralgia, bem como sinais hemorrágicos, por exemplo, sangramento da mucosa nasal e oral, trato broncopulmonar, gastrointestinal e geniturinário.

[0307] De acordo com uma aplicação, quando a doença for uma infecção por Guanarito (GTOV), os sintomas podem incluir, por exemplo, febre, mal-estar, dor de cabeça, artralgia, dor de garganta, vômito, dor abdominal, diarreia, convulsões e uma variedade de manifestações hemorrágicas.

[0308] De acordo com uma aplicação, quando a doença for uma infecção por Sabiá (SABV), os sintomas podem incluir, por exemplo, febre, dor de cabeça, mialgia, náusea, vômito, fraqueza, dor de garganta pronunciada, conjuntivite, diarreia, dor epigástrica e sangramento nas gengivas.

[0309] De acordo com uma aplicação, a doença é uma febre hemorrágica.

[0310] O polipeptídeo solúvel isolado ou a proteína de fusão de acordo com a presente invenção também pode ser administrado com outros agentes terapeutica ou nutricionalmente úteis, como antibióticos, vitaminas, extratos de ervas, anti-inflamatórios, glicose, antipiréticos, analgésicos, interleucinas (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10 IL-11, IL-12, IL- 13, IL-14, ou IL-15), TPO, ou outro fator de cultivo, como CSF-1, SF, fator inibidor de leucemia (LIF|leukemia inhibitory factor) ou fator de crescimento de fibroblastos (FGF|fibroblast growth factor), além do ligante C-KIT, M-CSF e TNF-α, PIXY-321 (proteína de fusão GM-CSF/IL-3), proteína de fusão), proteína inflamatória de macrófagos, trombopoietina, quimioterapia ou oncogene relacionado ao crescimento e similares. Tais determinações fazem parte das habilidades de uma pessoa de habilidade comum na técnica.

[0311] Conforme mencionado acima, a composição de matéria compreendendo o polipeptídeo isolado ou a proteína de fusão de acordo com algumas aplicações da invenção é adequada para aplicações de diagnóstico.

[0312] De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecido um método para diagnóstico de uma infecção viral por Arenavírus em um indivíduo, o método compreendendo: (a) contatar uma amostra biológica do indivíduo com a composição de matéria, compreendendo um polipeptídeo solúvel isolado que compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio apical do TfR1 ou a proteína de fusão de acordo com algumas aplicações da invenção sob condições que permitam a formação de imunocomplexos entre um Arenavírus e o polipeptídeo solúvel ou proteína de fusão; e (b) determinar um nível dos imunocomplexos na amostra biológica, em que um aumento no nível dos imunocomplexos além de um limiar predeterminado em relação a um nível dos imunocomplexos em uma amostra biológica de um indivíduo saudável é indicativo da infecção viral por Arenavírus.

[0313] Conforme aqui utilizado, o termo “diagnóstico” refere-se à classificação de uma doença, determinação da gravidade de uma doença (grau ou estágio), monitoramento da progressão, previsão de um resultado da doença e/ou perspectivas de recuperação.

[0314] O indivíduo pode ser um indivíduo saudável (p.ex., um ser humano) passando por um check-up de rotina de bem-estar. Alternativamente, o indivíduo pode estar em risco de doença ou infecção. Alternativamente, o método pode ser usado para monitorar a eficácia do tratamento.

[0315] Conforme aqui utilizado, “amostra biológica” refere-se a uma amostra de tecido ou fluido isolado de um indivíduo, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, plasma, soro, fluido espinhal, fluido linfático, seções externas da pele, respiratórias, intestinais, e tratos geniturinários, lágrimas, saliva, escarro, leite, células sanguíneas, tumores, tecido neuronal, órgãos e também amostras de constituintes da cultura celular in vivo. Deve- se notar que uma “amostra biológica obtida do indivíduo” também pode opcionalmente compreender uma amostra que não foi fisicamente removida do indivíduo, conforme descrito em maiores detalhes abaixo.

[0316] Numerosos métodos de coleta de tecidos ou fluidos bem conhecidos podem ser usados para coletar a amostra biológica do indivíduo, a fim de determinar o nível de Arenavírus ou células infectadas na amostra. Os métodos de coleta incluem, entre outros, biópsia com agulha fina, biópsia com agulha, biópsia com agulha central e biópsia cirúrgica

(p.ex., biópsia cerebral), lavagem e esfregaço bucal. Independentemente do procedimento empregado, uma vez obtida uma biópsia/amostra, é possível determinar o nível da variante e, assim, fazer um diagnóstico.

[0317] Conforme mencionado, o método da presente invenção é efetuado sob condições suficientes para formar um imunocomplexo (p.ex., um complexo entre a composição da matéria compreendendo o polipeptídeo isolado ou a proteína de fusão da presente invenção e o Arenavírus). Tais condições (p.ex., concentrações apropriadas, tampões, temperaturas, tempos de reação), bem como métodos para otimizar tais condições, são conhecidos dos especialistas na técnica e exemplos são divulgados abaixo.

[0318] A composição de matéria, compreendendo o polipeptídeo isolado ou a proteína de fusão da presente invenção, pode compreender, por exemplo, estar ligada a uma fração identificável. Alternativa ou adicionalmente, a composição de matéria que compreende o polipeptídeo isolado ou a proteína de fusão pode ser identificada indiretamente, como, por exemplo, usando um anticorpo secundário.

[0319] De acordo com uma aplicação, o diagnóstico é corroborado pelo uso de qualquer método de diagnóstico conhecido na técnica, como medição da carga ou título viral, medição do nível de antígeno, medição do nível de anticorpos, isolamento do vírus e/ou detecção genômica por reação em cadeia da transcriptase-polimerase reversa (RT-PCR), etc. Por exemplo, uma carga ou título viral mais alto geralmente se correlaciona com a gravidade de uma infecção viral ativa. A quantidade de vírus por mL pode ser calculada, por exemplo, estimando a quantidade viva de vírus em um fluido corporal envolvido (p.ex., amostra de soro ou sangue total).

[0320] Conforme aqui utilizado, a expressão “cerca de” refere-se a ± 10%.

[0321] Os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui”, “incluindo”, “tendo” e seus conjugados significam “incluindo, entre outros”.

[0322] A expressão “consistindo em” significa “incluindo e limitado a”.

[0323] A expressão “consistindo essencialmente em” significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas apenas se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alterarem materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicadas.

[0324] Conforme aqui utilizado, a forma singular “um”, “uma” e “o”, “a” incluem referências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, a expressão “um composto” ou “pelo menos, um composto” pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas respectivas.

[0325] Ao longo deste pedido, várias aplicações desta invenção podem ser apresentadas em um formato de intervalo. Deve ser entendido que a descrição no formato de intervalo é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo da invenção. Por conseguinte, a descrição de um intervalo deve ser considerada como tendo divulgado especificamente todos os subintervalos possíveis, bem como os valores numéricos individuais dentro desse intervalo. Por exemplo, a descrição de um intervalo de 1 a 6 deve ser considerada como abrangendo subintervalos especificamente divulgados, como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., bem como números individuais dentro desses intervalos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isso se aplica independentemente da amplitude do intervalo.

[0326] Sempre que um intervalo numérico for aqui indicado, deve-se incluir qualquer número citado (fracionário ou integral) dentro do intervalo indicado. As expressões “variando/varia entre” um primeiro número indicado e um segundo número indicado e “variando/varia de” um primeiro número indicado “a” um segundo número indicado são usadas aqui de forma intercambiável e devem incluir o primeiro e o segundo números indicados e todos os números fracionários e integrais entre eles.

[0327] Conforme aqui utilizado, o termo “método” refere-se a modos, meios, técnicas e procedimentos para realização de uma determinada tarefa, incluindo, entre outros, aqueles modos, meios, técnicas e procedimentos conhecidos ou facilmente desenvolvidos a partir de modos, meios, técnicas e procedimentos conhecidos de praticantes das técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas.

[0328] Aprecia-se que certas características da invenção que são, para maior clareza, descritas no contexto de aplicações separadas também podem ser fornecidas combinadas em uma única aplicação. Inversamente, várias características da invenção que são, por uma questão de brevidade, descritas no contexto de uma única aplicação também podem ser fornecidas separadamente em qualquer subcombinação adequada ou conforme adequadas em qualquer outra aplicação descrita da invenção. Certas características descritas no contexto de várias aplicações não devem ser consideradas características essenciais dessas aplicações, a menos que a aplicação seja inoperante sem esses elementos.

[0329] Várias aplicações e aspectos da presente invenção, conforme delineado acima e conforme reivindicado na seção de reivindicações abaixo, encontram suporte experimental nos exemplos a seguir.

[0330] Entende-se que qualquer Número de Identificação de Sequência (ID SEQ. N°) divulgado no presente pedido pode se referir a uma sequência de DNA ou a uma sequência de RNA, dependendo do contexto em que a ID SEQ. N° é mencionada, mesmo que essa ID SEQ. N° seja expressa somente em um formato de sequência de DNA ou um formato de sequência de RNA. Por exemplo, as ID SEQ. N° 1, 3, 5 e 7 são expressas em um formato de sequência de DNA (p.ex., recitando T para timina), mas podem se referir a uma sequência de DNA que corresponde a uma sequência de ácido nucleico do TfR1 ou a sequência de RNA de uma sequência de ácido nucleico da molécula de RNA. Da mesma forma, embora algumas sequências sejam expressas em um formato de sequência de RNA (p.ex., recitando U para uracil), dependendo do tipo real de molécula sendo descrito, ele pode se referir à sequência de uma molécula de RNA que compreende um dsRNA ou à sequência de uma molécula de DNA que corresponde à sequência de RNA mostrada. Em qualquer caso, estão previstas moléculas de DNA e RNA com as sequências divulgadas com quaisquer substitutos.

EXEMPLOS

[0331] Agora é feita referência aos exemplos a seguir que, juntamente com as descrições acima, ilustram a invenção de maneira não limitativa.

[0332] Geralmente, a nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos laboratoriais utilizados na presente invenção incluem técnicas de DNA molecular, bioquímico, microbiológico e de DNA recombinante. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura. Vide, por exemplo, “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, Nova York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, Nova York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1- 4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York (1998); metodologias conforme estabelecidas nas Patentes Norte- Americanas N° 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e

5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I- III Cellis, J. E., ed. (1994); “Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8ª Edição), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell e Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman & Co., Nova York (1980); os imunoensaios disponíveis são descritos extensivamente na literatura científica e de patentes, vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas N°

3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987;

3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533;

3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e

5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed.

(1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., e Higgins S. J., Eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) e “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996); todos os quais são aqui incorporados por referência como se totalmente estabelecidos. Outras referências gerais são fornecidas ao longo deste documento. Acredita-se que os procedimentos nele contidos sejam bem conhecidos na técnica e são fornecidos para conveniência do leitor. Todas as informações aqui contidas são aqui incorporadas por referência.

MATERIAIS GERAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS CONSTRUÇÃO DE VETORES DE EXPRESSÃO

[0333] As formas otimizadas por códon dos genes do complexo de glicoproteínas MACV, JUNV, GTOV e SBOV (GPC) foram sintetizadas quimicamente (Genescript) de acordo com suas sequências UniProt, como a seguir: MACV (Q6IUF7), JUNV (O10428), GTOV (Q8AYW1) e SBOV (H6V7J2). Genes que codificam o GPC dos vírus WWAV e MACV também foram fornecidos. Todos os GPCs foram subclonados no vetor de expressão pcDNA3.1 usando locais de restrição BamHI-NotI. As proteínas de fusão GP1JUNV– Fc, GP1MACV–Fc, GP1GTOV–Fc, GP1SBOV–Fc, GP1WWAV–Fc e sAD-Fc (Arenacept) foram geradas conforme descrito anteriormente [Cohen-Dvashi, et al., J Virol (2015) 89: 7584-7592]. A variante mutada Y211A da Arenacept foi gerada por PCR usando a polimerase Kapa HiFi DNA (Kapa Biosystems) de acordo com o manual de mutagênese direcionada ao local QuikChange. O vetor de codificação do receptor de transferrina humana, hTfR- pENTR221, foi obtido do banco de plasmídeos Weizmann Institute Forscheimer e foi subclonado em pQXIP usando locais de restrição BamHI-NotI.

EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

[0334] Para expressar e purificar o complexo do domínio apical solúvel (sAD) com o vírus GP1MACV para estudos estruturais, os presentes inventores usaram as mesmas metodologias usadas anteriormente para produzir GP1LASV [Cohen- Dvashi, et al. (2015) supra]. Resumidamente, as duas proteínas foram coexpressas como proteínas segregadas usando o sistema de baculovírus em células Tni (Trichoplusia ni) (Expression Systems). Os meios foram coletados e trocados de tampão para TBS (20 mM de Tris-HCl em pH 8,0, 150 mM de cloreto de sódio) usando um sistema de filtração de fluxo tangencial (Millipore). O complexo foi capturado usando uma coluna de afinidade HiTrap IMAC FF Ni+2 (GE Healthcare) seguida de purificação por cromatografia de exclusão de tamanho com uma coluna superdex 75 10/300 (GE Healthcare). As GP1s fundidas com Fc (GP1JUNV –Fc, GP1MACV –Fc, GP1GTOV –Fc, GP1SBOV –Fc e GP1WWAV –Fc) e a Arenacept foram expressas em células HEK293 adaptadas às células em suspensão (Expression Systems). As transfecções foram realizadas usando polietilenimina linear de 25 kDa (PEI) (Polysciences) a 1 mg de DNA plasmídico por 1 L de cultura em densidade celular de 1 M/ml. Os meios foram coletados após 5 dias de incubação e suplementados com 0,02% (p/v) de azida de sódio e PMSF. As proteínas de fusão foram isoladas usando a coluna de afinidade da proteína-A (GE Healthcare). MEDIÇÕES DE RESSONÂNCIA DE PLASMON DE SUPERFÍCIE (SPR)

[0335] A ligação das proteínas de fusão NA-sAD à GP1JUNV –Fc, GP1MACV –Fc, GP1GTOV –Fc, GP1SBOV –Fc e GP1WWAV –Fc foi medida usando um instrumento Biacore T200 (GE Healthcare). As proteínas de fusão foram primeiro imobilizadas na densidade de acoplamento de aproximadamente 500 unidades de ressonância (RU) em uma proteína A de chip sensor da série S (GE Healthcare) em TBS e tampão azida de sódio a 0,02%. Uma das quatro células de fluxo no chip sensor foi acoplada à GP1LASV –Fc para servir como um espaço em branco. A NA-sAD foi então injetada nas concentrações de 1000, 500, 250, 50 e 5 nM, a uma taxa de fluxo de 80 μL/min. Foi realizada uma cinética de ciclo único para o ensaio de ligação. O chip sensor foi regenerado usando 10 mM de tampão Glicina-HCL em pH de 1,5.

ENSAIOS DE NEUTRALIZAÇÃO IN VITRO

[0336] Partículas pseudovirais dos vírus MACV, JNV, GOV e SBOV foram produzidas, conforme descrito anteriormente [Cohen-Dvashi et al., J Virol (2016) 90: 10329-10338], exceto pelo uso de pLXIN-Luc como gene repórter (plasmídeo Addgene # 60683). Meios contendo pseudovírus foram concentrados 10x por precipitação com PEG. Para isso, os meios contendo vírus foram suplementados com PEG 6000 (Sigma) em PBS até uma concentração final de 8% (p/vol). Após incubação de 18 horas a 4°C, os vírus foram sedimentados por centrifugação a 10.000 g por 20 minutos. Grânulos de vírus foram ressuspensos no meio celular.

[0337] Para gerar uma linha celular estável que expresse em excesso o hTfR, as células HEK293T foram transfectadas com o vetor hTfR-pQXIP. 48 horas após a transfecção, os meios foram substituídos por meios frescos suplementados com 2 µg/ml de puromicina para seleção. As células foram cultivadas na presença de antibióticos durante 1 semana. Colônias resistentes de células estáveis foram coletadas e cultivadas para formar uma linha celular policlonal.

[0338] ‘Para ensaios de neutralização, as HEK293T estáveis no hTfR foram semeadas em placa de 96 poços chimney branca e pré-revestida com poli-L-lisina (Greiner Bio-One). As células foram deixadas aderir por 2 horas, seguidas pela adição de 10 pseudovírus concentrados, que foram pré- incubados com concentrações descendentes de 3 vezes de Arenacept ou sAD. As células foram lavadas dos vírus 18 horas após a infecção e a luminescência da atividade da luciferase foi medida 48 horas após a infecção usando um leitor de placas TECAN após a aplicação do reagente Bright-Glo (Promega) nas células.

COLORAÇÃO CELULAR E IMAGEM POR MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA

[0339] As células HEK293T foram semeadas em lamínulas pré-revestidas com poli-L-lisina em placas de 24 poços e transfectadas com diferentes GPCs usando reagente PEI. Nas 24 horas após a transfecção, as células foram incubadas por 5 minutos com 1 µg/ml de Arenacept diluído no meio celular, fixado com solução pré-aquecida de formaldeído a 3,7% (PFA) em PBS e bloqueado com BSA a 3% em PBS. As células foram coradas com Fc anti-humana conjugada com Cy3 e aglutinina de germe de trigo conjugada com FITC (WGA | Wheat Germ Agglutinin). As células foram fotografadas com ampliação de 100x usando um microscópio Olympus IX83 acoplado a um scanner confocal de disco giratório Yokogawa CSU-W1. As imagens foram processadas usando o ImageJ.

MEDIÇÕES CIRCULARES DE DICROÍSMO

[0340] Solução estoque de 10 mg/ml do sAD em 20 mM de Tris-HCl (pH 8,0) e 150 mM de cloreto de sódio foi diluída 1:40 em 150 mM de solução de cloreto de sódio (pH 5,0) para registro de espectros de dicroísmo circular (CD | circular dichroism) usando um Espectrômetro ACD Chirascan-plus. Para determinar a estabilidade de temperatura da proteína, os espectros de CD no comprimento de onda de 222 nm foram medidos em temperaturas entre 30 e 85°C (aumento de 0,5 graus por 5s).

CRISTALIZAÇÃO

[0341] O rastreamento das condições iniciais de cristalização foi realizado com um estoque de 8,8 mg/ml do complexo sAD/GP1MACV, usando um robô de cristalização Mosquito (TTP Labs). Os hits iniciais foram identificados usando a tela JCSG-plus (Molecular Dimensions) e foram otimizados manualmente. Os cristais foram obtidos usando difusão de vapor por método de gota assente em Tiiocianato, 0,2 M, sob pH de 6,9, 20% de PEG 3350 e 5% de MPD. Os cristais foram, então, sucessivamente protegidos por criogenia usando 20% de MPD em solução do reservatório antes do resfriamento instantâneo em nitrogênio líquido. COLETA DE DADOS, SOLUÇÃO E REFINAMENTO DA ESTRUTURA

[0342] Os dados de difração de raios X foram coletados nas linhas de luz ID30B da Instalação Europeia de Radiação Síncrotron (ESRF|European Synchrotron Radiation Facility) usando um detector Pilatus 6M-F a 100 ᵒK. Dados de 2,7 Å que pareciam pertencer a um grupo espacial tetragonal foram coletados. Os presentes inventores usaram HKL2000 [Otwinowski, et al. Method Enzymol (1997) 276: 307-326] para indexar, integrar e dimensionar os dados. Os presentes inventores usaram Phaser [Adams et al., Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography (2010) 66: 213-221] para obter solução de RM usando a estrutura de GP1MACV em complexo com o domínio apical de hTfR1 (PDB: 3KAS), como modelo de pesquisa. O cristal fez parte de um grupo espacial P 43 2 2 tetragonal, e os presentes inventores conseguiram localizar 4 cópias de complexos sAD/GP1 no ASU. O modelo foi ajustado manualmente em mapas de densidade eletrônica usando Coot [Emsley et al. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography (2010) 66: 486-501] e refinado usando Phenix Refine [Adams et al., (2010) supra] de maneira iterativa.

ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE MEDIADA POR CÉLULAS DEPENDENTE DE ANTICORPOS (ADCC)

[0343] Para medir a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), as células 293A foram cultivadas até uma confluência de 80 a 90% em placa de 100 mm. A mistura de transfecção de 1 ml contendo 40 µg/ml de 25 kDa PEI (Polysciences) com 8 µg de JUNV, MACV ou plasmídeo controle em DMEM foi feita e incubada por 15 minutos à temperatura ambiente (RT). 2 ml de meio foram removidos da cultura e 1 ml da mistura de transfecção foi adicionado à placa. As células foram incubadas com uma mistura de transfecção por 24 horas e depois levantadas da placa usando 10 mM de EDTA. A capacidade da Arenacept de promover a ADCC foi avaliada medindo a liberação de lactato desidrogenase (LDH) usando o conjunto de Detecção de Citotoxicidade LDH (Roche Applied Science) de acordo com as instruções do fabricante. As células alvo (células T; 293A transfectadas com GPC de JUNV, MACV ou vetor irrelevante como controle, foram incubadas a 1 x 105 células/ml com ou sem 10 µg/ml de Arenacept em gelo por 1 hora. As PBMCs foram coletadas do sangue humano usando tubos de CPT, após lavagens extensivas com PBS, as células foram suspensas em RPMI e plaqueadas em uma placa de fundo redondo de 96 poços em diferentes quantidades. Posteriormente, para cada poço contendo PBMCs, foram adicionadas 1 x 104 células alvo. Triton X-100 a 1% foi usado como controle de liberação máxima e células sem PBMCs e Arenacept como controles de baixa liberação espontânea. As placas foram, então, incubadas por 3 horas a 37°C e os sobrenadantes foram coletados para determinação da liberação de LDH. A citotoxicidade percentual foi calculada como: (células com Arenacept - células sem Arenacept)/(liberação máxima - espontânea). EXEMPLO 1 DESIGN DO DOMÍNIO APICAL SOLÚVEL (sAD)

[0344] Para desenvolver uma imunoterapia amplamente reativa, os presentes inventores projetaram uma imitação de TfR1 que bloquearia os locais de ligação ao receptor da GP1. O TfR1 é uma glicoproteína transmembranar homodimérica do tipo II grande (Figura 1A) com formato de borboleta. Três subdomínios fazem uma única cópia da região extracelular do TfR1 (Figura 1B): o domínio helicoidal que medeia a dimerização, o domínio do tipo protease e o domínio apical que é inserido entre duas cadeias β do domínio do tipo protease (Figuras 1B e 1C). O local de ligação para os Arenavírus trópicos do TfR1 é o domínio apical, que não está envolvido nos papéis fisiológicos conhecidos do TfR1 na ligação de transferrina ou proteína de hemocromatose hereditária. Assim, um domínio apical solúvel (sAD) foi projetado como um potencial bloqueador do local de ligação ao TfR1. O design teve base no gene do TfR1 do roedor da espécie Neotoma Albigula (rato de garganta-branca) (Número de acesso ao GenBank KF982058/UniProt A0A060BIS8) que pode servir eficientemente como um receptor de entrada para vários Arenavírus de clado B e A/B, e tem maior afinidade com diversas GP1s em comparação com o hTfR1. Os presentes inventores eliminaram uma estrutura em ansa longa (resíduos de 301 a 326) que se estende do domínio apical (Figuras 1B e 1C) para mutar vários resíduos hidrofóbicos que fazem parte da interface entre os domínios apical e do tipo protease (Figuras 1C e 1D) para torná-los hidrofílicos e introduzir dois resíduos de cisteína nos terminais dessa estruturas (Figura 1C). Esse projeto deve permitir a expressão do domínio apical como uma proteína isolada para criar um local de ligação ao receptor concorrente.

[0345] O sAD projetado gerou uma proteína solúvel, dobrada e estável. O sAD foi expresso fundido a uma etiqueta His no seu C’-terminal usando células HEK293 em suspensão. Após purificação por afinidade, um pico monodisperso definido foi obtido usando cromatografia de exclusão por tamanho (Figura 2A), indicando que o sAD é um monômero em solução. Usando espectroscopia de dicroísmo circular, foram obtidos espectros para o SAD característicos de uma proteína dobrada, com pico negativo no comprimento de onda de 222 nm, indicando conteúdo helicoidal (Figura 2B). Após este pico negativo a 222 nm, a estabilidade térmica do sAD foi monitorada (Figura 2C). Os presentes inventores obtiveram uma curva de fusão bifásica complexa e, portanto, não tentaram ajustar um modelo a esses dados para derivar um ponto de fusão preciso. No entanto, o SAD permaneceu completamente estável até 55°C e a TM foi estimada em aproximadamente 65°C. Assim, o sAD projetado produziu uma proteína monomérica, bem dobrada e estável quando produzida como domínio autônomo. EXEMPLO 2 O sAD SE LIGA DE MANEIRA EFICAZ AOS DOMÍNIOS DE GP1 DOS ARENAVÍRUS TRÓPICOS DO TFR1, PRESERVANDO UM MODO DE LIGAÇÃO

SEMELHANTE AO NATIVO

[0346] Para avaliar se o sAD poderia atingir vírus trópicos patogênicos do TfR1, uma série de domínios da GP1 fundidos em seus C’-terminais com porções Fc de anticorpos foram construídos. Os domínios da GP1 dos vírus JUNV, MACV, GTOV e SABV, que são os principais Arenavírus patogênicos do clado B, foram incluídos, e o WWAV adicional foi incluído como representante do clado A/B do trópico TfR1. Experimentos de cinética de ciclo único foram realizados usando Ressonância de Plasmon de Superfície e as constantes de dissociação (KD) do sAD em relação aos vários domínios representativos da GP1 foram medidas, em uma configuração que permitiu ligação monovalente (Figuras de 8A a 8E). Todos os domínios da GP1 se ligam efetivamente ao sAD com valores de KD que variam de 4 nM para MACV a 1 µM para os vírus JUNV e WWAV (Figura 2D). Para verificar o modo de ligação do sAD à GP1, os presentes inventores cristalizaram e resolveram a estrutura do GP1MACV em complexo com o sAD para resolução de 2,7Å (Tabela 3 abaixo). Os cristais pertenciam a um grupo espacial tetragonal (P4322) com quatro cópias de sAD/GP1MACV na unidade assimétrica (Figura 5). O sAD projetado mantém a estrutura geral do domínio apical do hTfR1 (Figura 4) e forma um complexo com

GP1MACV (Figura 2E) de maneira semelhante ao hTfR1. Dos dois potenciais locais de glicosilação ligada ao N do sAD (Figura 1C), os presentes inventores observaram densidade e, portanto, modelaram um glicano apenas na posição Asn251 (Figura 2E). A maioria das interações importantes que a GP1MACV faz com o hTfR1 também foi formada com o sAD, incluindo a interação principal com a Tyr211 (Figura 2E). No entanto, os presentes inventores observaram algumas diferenças estruturais; a estrutura em ansa longa que conecta as cadeias paralelas βII-6 e βII-7 do sAD que foram mutadas e parcialmente eliminadas (Figuras 1B, 1C e 1D) mudou sua conformação (Figura 7A). No caso do hTfR1, essa estrutura em ansa contribui com o Glu294 que forma uma ponte de sal com a Lys169 da GP1MACV (Figura 7B). No caso do sAD, o Glu340 de αII- 2 substitui o Glu294 e forma uma ponte salina equivalente com Lys169 (Figura 7B). No geral, o sAD preserva principalmente a estrutura nativa do domínio apical do TfR1 e mostra um notável amplo espectro de reatividade contra GP1s dos Arenavírus NW do clado B e A/B.

TABELA 3 Coleta de dados Comprimento de onda (Å) 0,9198 Grupo espacial P 43 2 2 Dimensões da célula a, b, c (Å) 104.6 104.6 281.4 α, β, γ ° 90 90 90 Resolução (Å) 50,00 a 2,7 (2,75 a 2,7) a Rpim (%) 3,8 (48,3) a CC1/2 99,8 (30,0) a I/σI 17,2 (0,9) a Completude (%) 94,3 (46,5) a Multiplicidade 10,2 Reflexões totais 425370 Reflexões únicas 41703

Refinamento Resolução (Å) 49,56 a 2,70 Nº de reflexões 36590

Continuação da Tabela 3 Rwork/Rfree (%) 24,1 / 27,4 Nº de átomos Proteína 9648 Água 51 Fatores B Proteína 80,8 Água 69,6 Ramachandran Favorecido (%) 94,0 Permitido (%) 6,0 Ponto fora da curva (%) 0,0 Desvios quadrados médios da raiz Comprimento da ligação (Å) 0,03 Ângulos de adesão° 0,746 a Os valores entre parênteses são para a camada de resolução mais alta.

EXEMPLO 3 ARENACEPT - UMA IMUNOADESINA COM BASE NO DOMÍNIO sAD

[0347] Os presentes inventores construíram o domínio sAD como uma imunoadesina, fundindo ao seu C’-terminal uma porção da região Fc da IgG1 em uma configuração que permite avidez e denominaram essa configuração como “Arenacept”. Primeiramente, os presentes inventores testaram se a Arenacept podia reconhecer os complexos de ponta nativos dos vírus trópicos do TfR1. Usando imagens de fluorescência confocal, foi demonstrado que a Arenacept reconhece os complexos de ponta nativos dos vírus MACV, JUNV, GTOV, SABV e WWAV do clado A/B quando expressos em células HEK293 (Figura 3A). Esse reconhecimento foi específico, pois o complexo de ponta do Lassa Arenavirus não trópico do TfR1 não foi reconhecido pela Arenacept (Figura 3A). Em seguida, os presentes inventores examinaram se a Arenacept poderia neutralizar pseudo-vírus portadores dos complexos de ponta dos vírus patogênicos do clado B. Foram gerados pseudo-vírus com base em MLV que liberam luciferase ao entrar nas células e foram monitorados quanto à redução da infectividade na presença de Arenacept (Figura 3B). A aplicação de Arenacept neutralizou efetivamente os vírus MACV, JUNV, GTOV e SABV com valores médios calculados de IC50 de 0,4 a 3,4 µg/ml (Figura 3B). Os vírus pseudotipados WWAV não infectam efetivamente células HEK293 e, portanto, a neutralização não pode ser avaliada. A introdução da mutação Y211A que elimina o contato crítico com GP1 (Figura 2E) na Arenacept resultou na revogação da atividade de neutralização contra o vírus JUNV (Figura 9), indicando que a Arenacept preserva o mesmo modo de ligação observado para o domínio sAD (Figura 2E). Os valores IC50 semelhantes para os vários vírus (Figura 3B) comparados com a diferença de marca na afinidade do sAD com os GP1s (Figura 2D) implicam que a avidez desempenha um papel na neutralização da Arenacept. De fato, o sAD tem um valor mais alto de IC50 na neutralização do vírus MACV em comparação com a Arenacept (Figuras 6A e 6B). Assim, a Arenacept usa com sucesso a avidez e neutraliza todos os quatro vírus patogênicos do clado B.

[0348] A Arenacept pode recrutar o sistema imunológico para eliminar células infectadas. Ter uma porção da Fc como parte da Arenacept pode permitir que ela recrute o sistema imunológico complementar e induza a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Para testar isso, os presentes inventores expressaram transitoriamente os complexos de ponta dos vírus MACV e JUNV nas células HEK293, aplicaram células mononucleares do sangue periférico de doadores saudáveis às células HEK293 transfectadas e monitoraram a atividade de morte celular (Figura 3C). Um claro aumento na citotoxicidade foi observado em função da razão entre as células efetoras e as células-alvo (Figura 3C). Embora a Arenacept tenha induzido uma ADCC mais forte e mais robusta no caso do vírus JUNV em comparação com o vírus MACV, em ambos os casos a atividade da ADCC foi significativa. Assim, a Arenacept tem o potencial de promover a eliminação de células infectadas, além de neutralizar os vírus. EXEMPLO 4

FORMA MODIFICADA DE ARENACEPT

[0349] Os presentes inventores observaram na estrutura do sAD (Arenacept) dois potenciais locais de glicosilação ligados ao N, um deles (no Asn204) foi incorporado no local de interação entre o Arenacept e as diferentes glicoproteínas virais. Como a glicosilação é estocástica, uma porção da Arenacept produzida teria um glicano anexado a esse local e, assim, impediria sua ligação. A eliminação deste local de glicosilação pode aumentar a quantidade de moléculas ativas e, portanto, aumentar a potência de neutralização da Arenacept.

[0350] Portanto, a serina 206 (parte do motivo da glicosilação N-X-S) foi mutada para alanina. A versão mutada da Arenacept foi expressa, purificada e examinada quanto às propriedades de neutralização. Conforme é evidente na Tabela 4, abaixo, e nas Figuras de 11A a 11D, a ArenaceptS206A neutraliza os arenavírus trópicos pseudotipados do TfR1 e é mais potente em comparação com o WT da Arenacept discutida acima. TABELA 4: VALORES IC50 (ΜG/ML)

MACV JUNV SABV GTOV Arenacept 0,5 2,4 3,5 1,8 ArenaceptS206A 0,3 1,4 2,0 1,5 EXEMPLO 5

ATIVIDADE IN VIVO DA ARENACEPT

[0351] A eficácia da Arenacept in vivo é testada em modelos murinos (p.ex., modelo de vírus JUNV em porquinho-da- índia), bem como em modelos de primatas para avaliação da gravidade da doença viral e da sobrevivência na presença ou ausência de Arenacept. Para o modelo de JUNV no porquinho-da- índia, a doença viral é iniciada pela administração intramuscular de 1000 pfu de JUNV. Em seguida, a Arenacept é administrada por via intraperitoneal em doses diferentes (p.ex., 40 mg/kg) e em diferentes momentos (p.ex., 2 e 6 dias) após a infecção viral. A eficácia da Arenacept é avaliada através da medição da carga viral e da percentagem de sobrevivência pós- infecção em comparação com animais não tratados.

[0352] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com aplicações específicas respectivas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes aos especialistas na técnica. Consequentemente, pretende-se abranger todas essas alternativas, modificações e variações que se enquadrem no espírito e no amplo escopo das reivindicações anexas.

[0353] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são aqui incorporados em sua totalidade no relatório descritivo, na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado a ser aqui incorporado por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência neste pedido não deve ser interpretada como uma admissão de que essa referência esteja disponível como técnica prévia à presente invenção. Na medida em que os títulos das seções são utilizados, eles não devem ser interpretados como necessariamente limitantes.

Claims (50)

REIVINDICAÇÕES

1. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, caracterizada por compreender um polipeptídeo solúvel isolado que compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio apical da proteína do receptor de Transferrina 1 (TfR1), o referido polipeptídeo solúvel sendo capaz de se ligar a um Arenavírus.

2. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a referida sequência de aminoácidos ser desprovida de uma estrutura em ansa longa.

3. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por a referida sequência de aminoácidos compreender, pelo menos, uma deleção, inserção ou mutação pontual que torna o referido TfR1 solúvel.

4. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por, pelo menos, uma mutação pontual compreender uma substituição de um resíduo hidrofóbico por um resíduo hidrofílico.

5. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada por, pelo menos, a referida mutação pontual ser em uma interface entre o domínio apical e o domínio do tipo protease do referido TfR1.

6. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 3 a 5, caracterizada por, pelo menos, uma referida mutação pontual eliminar um local de glicosilação do referido TfR1.

7. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o referido local de glicosilação compreender um motivo de glicosilação N-X-S.

8. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a referida Serina do referido motivo de glicosilação N-X-S ser mutada para qualquer aminoácido ou mimético respectivo com a condição de que o referido aminoácido não seja Treonina.

9. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 7 a 8, caracterizada por a referida Serina do referido motivo de glicosilação N-X-S ser mutada para Alanina ou um mimético respectivo.

10. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a referida Asparagina do referido motivo de glicosilação N-X-S ser mutada para qualquer aminoácido ou mimético respectivo com a condição de que o referido aminoácido não seja Asparagina.

11. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 10, caracterizada por o referido polipeptídeo compreender uma fração estabilizadora.

12. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por a referida fração estabilizadora compreender um resíduo de cisteína.

13. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por o referido resíduo de cisteína comp-reender, pelo menos, um resíduo de cisteína nos N-terminais e/ou C-terminais do referido polipeptídeo.

14. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 13, caracterizada por o referido polipeptídeo ter um comprimento não superior a 180 resíduos de aminoácidos.

15. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 14, caracterizada por o referido TfR1 ser de origem humana, de um roedor ou morcego.

16. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 15, caracterizada por a referida sequência de aminoácidos do referido TfR1 ser conforme estabelecido na ID SEQ. N° 2, 4, 16 ou 18.

17. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, caracterizada por compreender um polipeptídeo solúvel que compreende uma sequência de aminoácidos de um domínio apical do TfR1, conforme estabelecido na ID SEQ. N° 6, o referido polipeptídeo solúvel sendo capaz de se ligar a um Arenavírus.

18. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 17, caracterizada por o referido polipeptídeo ser ligado a uma fração heteróloga.

19. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por a referida fração heteróloga ser capaz de induzir uma resposta de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC).

20. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por a referida fração heteróloga servir para aumentar a avidez do polipeptídeo.

21. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por a referida fração heteróloga servir para multimerização.

22. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 18 a 21, caracterizada por a referida fração heteróloga ser uma fração proteinácea.

23. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por a referida fração proteinácea ser selecionada do grupo consistindo em uma imunoglobulina, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glutationa-S-transferase (GST), um peptídeo carbóxi-terminal

(CTP) da gonadotrofina coriônica (CGβ) e uma cloranfenicol acetiltransferase (CAT).

24. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada por a referida fração proteinácea ser uma imunoglobulina.

25. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por a referida imunoglobulina ser uma IgG Fc.

26. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por ser conforme estabelecido na ID SEQ. N° 8.

27. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada por ser conforme estabelecido na ID SEQ. N° 23.

28. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 18 a 21, caracterizada por a referida fração heteróloga ser uma fração não proteinácea.

29. “PROTEÍNA DE FUSÃO”, caracterizada por compreender uma sequência de aminoácidos de um domínio apical do TfR1 e uma sequência de aminoácidos da IgG Fc, a referida proteína de fusão sendo capaz de se ligar a um Arenavírus.

30. “PROTEÍNA DE FUSÃO”, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada por ser conforme estabelecido na ID SEQ. N°

8.

31. “PROTEÍNA DE FUSÃO”, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada por ser conforme estabelecido na ID SEQ. N°

23.

32. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 28 ou a proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores

29 a 31, caracterizada por ser capaz de neutralizar o referido Arenavírus.

33. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 24 a 27 ou a proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 29 a 31, caracterizada por ser capaz de iniciar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

34. “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”, caracterizada por ter a composição de matéria definida em qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 28, 32, 33 ou a proteína de fusão definida em qualquer uma das reivindicações anteriores 29 a 33 e um transportador farmaceuticamente aceitável.

35. “MÉTODO DE TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE UMA DOENÇA

OU INFECÇÃO VIRAL ASSOCIADA AO ARENAVÍRUS EM UM INDIVÍDUO EM NECESSIDADE RESPECTIVA”, o método caracterizado por consistir da administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição de matéria definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 28, 32, 33 ou uma proteína de fusão definida em qualquer uma das reivindicações de 29 a 33, tratando ou prevenindo, assim, a doença ou infecção viral associada ao Arenavírus no indivíduo.

36. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 28, 32, 33 ou proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 29 a 33 caracterizada por ser para uso no tratamento ou prevenção de uma doença ou infecção viral associada ao Arenavirus em um indivíduo em necessidade respectiva.

37. “MÉTODO DE TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE UMA DOENÇA

OU INFECÇÃO VIRAL ASSOCIADA AO ARENAVÍRUS EM UM INDIVÍDUO EM

NECESSIDADE RESPECTIVA”, de acordo com a reivindicação 35 ou a composição de matéria ou proteína de fusão para uso de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por a referida doença ser uma febre hemorrágica.

38. “COMPOSIÇÃO DE MATÉRIA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 28, 32, 33, uma proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 29 a 33, uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 34, um método de acordo com a reivindicação 35 ou 37 ou uma composição de matéria ou proteína de fusão para uso de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracterizada por o referido Arenavírus ser selecionado do grupo consistindo em Junín (JUNV), Machupo (MACV), Guanarito (GTOV), Sabiá (SABV), Whitewater Arroyo (WWAV), Chapare (CHPV), Cupixi (CPXV), Tacaribe (TCRV), Bear Canyon (BCNV), Tamiami (TAMV), Big Brushy Tank (BBTV), Catarina (CTNV), Skinner Tank (SKTV) e Tonto Creek (TTCV).

39. “POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO”, caracterizado por codificar o polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 27 ou uma proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 29 a

31.

40. “POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO”, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por ter a sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na ID SEQ. N° 1, 3, 15 ou 17.

41. “POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO”, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por ter a sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na ID SEQ. N° 5.

42. “POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO”, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por ter a sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na ID SEQ. N° 7.

43. “POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO”, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por ter a sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na ID SEQ. N° 22.

44. “ESTRUTURA DE ÁCIDO NUCLEICO”, caracterizada por ter o polinucleotídeo isolado definido em qualquer uma das reivindicações anteriores 39, 40, 41, 42 ou 43.

45. “ESTRUTURA DE ÁCIDO NUCLEICO”, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada por ter, ainda, um peptídeo de sinal.

46. “MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO”, o método caracterizado por ter a introdução da estrutura de ácido nucleico definida na reivindicação 44 ou 45 em uma célula hospedeira; e o cultivo da célula hospedeira em condições adequadas para expressão do polipeptídeo.

47. “MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO”, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por ter, ainda, a recuperação do polipeptídeo.

48. “MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE UMA INFECÇÃO VIRAL POR ARENAVÍRUS EM UM INDIVÍDUO”, o método consistindo em: (a) por em contato uma amostra biológica do indivíduo com a composição de matéria de acordo com qualquer uma das reivindicações de 24 a 27 ou a proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações de 29 a 31 sob condições que permitam a formação de imunocomplexos entre um Arenavírus e o referido polipeptídeo solúvel ou a referida proteína de fusão; e (b) determinar um nível dos referidos imunocomplexos na referida amostra biológica, caracterizado por um aumento no nível dos referidos imunocomplexos além de um limiar predeterminado em relação a um nível dos referidos imunocomplexos em uma amostra biológica de um indivíduo saudável ser indicativo da infecção viral por Arenavírus.

49. “MÉTODO DE DIAGNÓSTICO DE UMA INFECÇÃO VIRAL POR ARENAVÍRUS EM UM INDIVÍDUO”, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado por consistir, ainda, da corroboração do diagnóstico usando um ensaio de diagnóstico selecionado a partir da medição do nível de antígeno, medição do nível de anticorpo, isolamento do vírus e/ou detecção genômica por reação em cadeia da transcriptase-polimerase reversa (RT- PCR).

50. “MÉTODO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 35, 37, 38, 48 ou 49 ou uma composição da matéria ou proteína de fusão para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 36, 37 ou 38, caracterizado por o referido indivíduo ser um indivíduo humano.