BR112019027282A2 - método para induzir a diferenciação em células neuronais sensoriais periféricas e método de triagem de um agente biológico in vitro - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se ao campo da biologia de células-tronco, em particular a diferenciação linhagem-específica de células-tronco pluripotentes ou multipotentes. são especificamente descritos métodos para direcionar a diferenciação linhagem-específica da hipsc em neurônios sensitivos ou fibras neuronais que inervam a pele humana, tal como células-tronco da crista neural (ncpcs) e os aqui denominados neurônios sensoriais periféricos (psns) usando novas condições de cultura. também é descrito um método para rastrear/triar um agente biológico in vitro. os psns obtidos pelo uso do método da presente invenção são adicionalmente contemplados para diversos usos, incluindo, mas não se limitando, ao uso em testes in vitro ou desenvolvimento de modelos de doenças, como ensaios de descoberta de fármacos, terapia celular em uma maior escala, detecção de uma variedade de irritantes da pele e outros compostos de interesse, para estudar o mecanismo de envelhecimento da pele e para produzir um produto dermocosmético. também é contemplado o uso de ligantes in vitro para verificar a diferenciação e/ou ativação das células psn produzidas pelo método da invenção, e as células psn produzidas pelo método da invenção.

Description

“MÉTODO PARA INDUZIR A DIFERENCIAÇÃO EM CÉLULAS NEURONAIS SENSORIAIS PERIFÉRICAS E MÉTODO DE TRIAGEM DE UM AGENTE BIOLÓGICO /N VITRO” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se ao campo da biologia de células-tronco, particularmente a diferenciação linhagem-específica de células- tronco pluripotentes ou multipotentes, que podem incluir, mas não se limitam às células-tronco embrionárias humanas (hESC), células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs), células-tronco somáticas, células-tronco cancerosas ou qualquer outra célula capaz de diferenciação linhagem- específica. Especificamente, são descritos métodos para direcionar a diferenciação linhagem-específica de hiPSC em neurônios sensitivos ou fibras neuronais que inervam a pele humana, tal como células-tronco da crista neural (NCPCs) e os aqui denominados neurônios sensoriais periféricos (PSNs) usando novas condições de cultura. Os PSNs obtidos utilizando os métodos da presente invenção são adicionalmente contemplados para várias utilizações, incluindo, mas não se limitando, ao uso in vitro em ensaios de descoberta de fármacos e terapias celulares. Além disso, o presente método pode ser aplicado às hiPSCs derivadas de pacientes e, portanto, serve como uma poderosa ferramenta para modelar doenças humanas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O microambiente celular (composto por sinais solúveis, sinais insolúveis/físicos e interações célula-célula) desempenha um papel decisivo na regulação da diferenciação das células-tronco. Entretanto, a função dos fatores microambientais das células-tronco na diferenciação é extremamente difícil de investigar, pois esses estudos exigem amplo conhecimento de múltiplos sinais regulatórios e como eles interagem influenciando a função celular. Embora tenha sido feito um progresso generoso na tentativa de abordar essas questões, os métodos convencionais atualmente disponíveis para essa investigação são ainda limitados.

[003] As células-tronco embrionárias e somáticas têm a capacidade de se diferenciar em qualquer tipo celular, por exemplo, as células- tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) estão sendo usadas para gerar diferentes tipos de neurônios para estudar a biologia dos mesmos, a farmacologia e rastrear possíveis novos medicamentos.

[004] As hiPSCs podem se diferenciar em células precursoras da crista neural (NCPCs), que por sua vez se diferenciam em vários tipos de células e tecidos durante o desenvolvimento embrionário, incluindo músculos lisos, tecido conjuntivo, osso, cartilagem, células adiposas, células endócrinas, melanócitos, neurônios e células gliais, entre muitos outros. O alto potencial de diferenciação das NCPCs em neurônios sensoriais periféricos (PSN) transforma essas células em uma ferramenta poderosa para investigar diversos distúrbios somatossensoriais e em um modelo confiável para a triagem de medicamentos, não apenas para químicos e pesquisadores da dor que buscam novos analgésicos, mas também para a indústria cosmética para substituir certos testes em animais, como irritação da pele e envelhecimento da pele. Entretanto, a derivação in vitro de neurônios hiPSCs requer períodos de cultura prolongados, tipicamente com duração de 30 dias ou mais.

[005] Existem poucos estudos que abordam a geração de NCSCs e PSNs a partir de células-tronco embrionárias (ESCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs). A maioria desses estudos baseia-se em células estromais murinas e cocultura, que promove a diferenciação neural das células-tronco e a formação de rosetas neurais ou neuroesferas. À heterogeneidade do tipo celular é um dos principais obstáculos nesses sistemas de cultura, além do rendimento da diferenciação e funcionalidade dos neurônios. Estudos recentes tentaram superar esses problemas. Entretanto, os resultados geraram protocolos caros ou demorados e de baixa eficiência na geração de NCPCs ou PSNs maduros.

[006] Além disso, houve várias tentativas de desenvolver um protocolo eficaz de diferenciação de células-tronco para a obtenção de neurônios periféricos in vitro.

[007] Em 2012, Chambers et al. (Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat Biotechnol 2012; 30: 715-720) aplicaram uma abordagem combinatória baseada em pequenas moléculas para identificar os fatores necessários para produzir nociceptores, tal como fator de crescimento neural B humano (NGF), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e fator neurotrófico derivado de célula glial (GDNF).

[008] Outras tentativas seguiram otimizando ainda mais o protocolo de diferenciação e foram capazes de mostrar expressão de marcadores periféricos canônicos, como BRN3A, perifina e TUJ1 em neurônios sensoriais derivados de hPSC. A expressão do receptor de capsaicina (TRPV1) revelou que a maioria das células positivas para TUJ1 abrigava identidade nociceptora, com 83% das células positivas para TUJ1 em aglomerados semelhantes a gânglios positivos para TRPV1. A análise funcional testou a excitabilidade neuronal por experimentos com técnica clamp-patch de células inteiras, mostrando que os nociceptores derivados de hiPSC dispararam tonicamente ou em fase, quando evocados eletronicamente (Eberhardt et al., Pattern of Functional TTX-Resistant Sodium Channels Reveals a Developmental Stage of Human iPSC- and ESC-Derived Nociceptors. Stem Cell Reports Journal vol. 5 j 305-313, 2015). A expressão do canal TRPV1I/TRPA1 foi demonstrada em uma ampla variedade de tecidos, mas ainda não foram demonstradas evidências de funcionalidade para todos esses receptores (Fernandes et al., The functions of TRPA1 and TRPV1: moving away from sensory nerves. British

Journal of Pharmacology. 2012; 166(2):510-521)

[009] Um dos primeiros tipos celulares no qual a funcionalidade foi identificada pela primeira vez em queratinócitos epidérmicos (Inoue et al. Functional vanilloid receptors in cultured normal human epidermal keratinocytes. Biochem Biophys Res Commun. 2002; 291: 124 - 129.) demonstrou que tanto a capsaicina como a acidificação produziam elevações na concentração intracelular de cálcio em queratinócitos epidérmicos humanos cultivados. Além disso, esses aumentos foram inibidos pelo antagonista de TRPV1, capsazepina (Inoue et a/., 2002). De forma similar, o tratamento de fibroblastos da pele humana com capsaicina induziu alterações significativas na corrente da membrana e no nível intracelular de cálcio que foram antagonizados pela capsazepina (Kim et al., Expression of vanilloid receptor 1 in cultured fibroblast. Exp Dermatol. 2006; 15: 362-367).

[010] Kreitzer et al. (A robust method to derive functional neural crest cells from human pluripotent stem cells. Am J Stem Cells. 2013; 2(2):119- 31) foram capazes de diferenciar múltiplas linhagens de células-tronco pluripotentes humanas em células da crista neural (NC). Ao iniciar a diferenciação para NC logo após a formação de precursores neurais, eles foram capazes de gerar altas porcentagens de células NC (80% em média e até — 90% em algumas diferenciações de NC). Essas células NC podem proliferar, autorrenovar, migrar para alvos apropriados e diferenciar-se espontaneamente em várias linhagens NC e nervos periféricos, expressando os marcadores NC apropriados, incluindo HNK1 e p75, em um total de 8 dias, o que é significativamente mais rápido do que os protocolos anteriormente descritos (Chambers et al., Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009); Menendez et al., Directed differentiation of human pluripotent cells to neural crest stem cells. Nature Protoc. 2013; 8:203-212; Lee et al., Human Sensory Neurons

Derived from Induced Pluripotent Stem Cells Support Varicella-Zoster Virus Infection. PLoS ONE 7 (12):253010).

[011] Em 2014, Young e colaboradores (Characterizing human stem cell- derived sensory neurons at the single-cell level reveals their ion channel expression and utility in pain research. Mol. Ther. 2014; 22, 1530-1543) relataram um protocolo otimizado para a geração de neurônios sensoriais a partir de células-tronco embrionárias humanas via inibição de pequenas moléculas, podendo gerar uma população altamente enriquecida de neurônios sensoriais que expressavam mais de 80% dos canais de íons encontrados em gânglios da raiz dorsal (DRG) de humanos adultos. As células-tronco foram cultivadas em matrigel e tratadas com meio contendo diversos fármacos do tipo moléculas pequenas, levando à diferenciação em direção a um destino neuronal por 10 dias. Muitas células individuais examinadas expressaram marcadores indicativos de DRG de maneira tão precoce quanto 16 dias de diferenciação. Entretanto, também é evidente a partir desta análise que a população de células no dia 16 permaneceu heterogênea (Young et al., Characterizing human stem cell-derived sensory neurons at the single-cell level reveals their ion channel expression and utility in pain research. Mol. Ther. 2014; 22, 1530-1543).

[012] De acordo com o acima mencionado, houve várias tentativas de desenvolver protocolos eficazes de diferenciação de células-tronco para a obtenção de neurônio periférico in vitro; no entanto, ainda é necessário um método aprimorado para produzir neurônios sensoriais periféricos, com maior pureza (homogeneidade), rendimento e/ou funcionalidade dos neurônios.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[013] A presente invenção divulga um novo e eficaz método para a diferenciação linhagem-específica de hiPSCs em neurônios sensitivos ou fibras neuronais que inervam a pele humana, como células progenitoras da crista neural (NCPCs) e neurônios sensoriais periféricos (PSNs), com alto rendimento de diferenciação, que é menos trabalhoso, menos propenso a erros e mais robusto e reprodutível.

[014] Assim, um primeiro objeto da presente invenção é um método para induzir a diferenciação em células neurais sensoriais periféricas (PSN), compreendendo as etapas de: (a) fornecimento de: (i) uma cultura celular compreendendo células-tronco humanas; (ii) um meio 3N; (iii) pelo menos um inibidor da via SMAD; (b) contato da referida célula-tronco de (i) com (ii) e (iii) em um primeiro frasco de cultura por 2 a 22 dias in vitro; (c) contato em um segundo frasco de cultura das células diferenciadas primariamente com meio 3N, suplementado com pelo menos um mitógeno, revestido com poli-ornitina/laminina, em que as células diferenciadas primariamente são mantidas na referida cultura por até 12 dias; (d) contato das células diferenciadas primariamente com meio 3N, suplementado com pelo menos um fator neurotrófico, pelo menos um indutor da diferenciação e pelo menos um indutor da transdução celular, mantendo as células diferenciadas primariamente por 5 a 25 dias em cultura para se obter células secundárias diferenciadas; (e) cultivo das células secundárias diferenciadas de 2 a 22 dias em meio condicionado de queratinócitos epidérmicos humanos neonatais (HEKn).

[015] Em um exemplo de realização preferido do método da invenção, a célula-tronco humana é uma célula-tronco pluripotente induzida humana (hiPSC).

[016] De preferência, os inibidores da via SMAD são escolhidos a partir de LDN193189, SB431542 e CHIR, ou qualquer mistura dos mesmos, em que, preferencialmente, o LDN193189 está presente entre cerca de 100 e cerca de 700 nM, o SB431542 está entre cerca de 0,1 e cerca de 100 uM e CHIR está entre cerca de 0,1 e cerca de 10 uM.

[017] Além disso, de acordo com um exemplo de realização preferido do método da presente invenção, as células diferenciadas primariamente são células progenitoras da crista neural (NCPC), pois, preferencialmente, as NCPCs expressam um ou mais marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em Nestina, TRPV1, Periferina, Pax 6 e BRN3a.

[018] De preferência, os mitógenos são escolhidos dentre os fatores de crescimento de fibroblastos (como FGF-2) e EGF, ou qualquer mistura dos mesmos.

[019] De preferência, o fator neurotrófico é escolhido a partir de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator neurotrófico derivado da linhagem de células gliais (GDNF), NT-3, fator de crescimento neural (NGF) ou qualquer mistura dos mesmos.

[020] De preferência, o indutor de diferenciação é escolhido a partir de ácido ascórbico.

[021] Preferencialmente, o indutor de transdução celular é escolhido a partir de adenosina monofosfato cíclico (AMPc).

[022] De preferência, as células secundárias diferenciadas são células neuronais sensoriais periféricas (PSN).

[023] De preferência, os neurônios sensoriais periféricos expressam um ou mais marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em TRPV1 e Substância P.

[024] Um segundo objeto da presente invenção é um método de triagem de um agente biológico in vitro, compreendendo: (a) o fornecimento de: (i) neurônios sensoriais periféricos derivados in vitro de um método para induzir a diferenciação de células neuronais sensoriais periféricas (PSN),

conforme definido no presente pedido; (ii) um composto teste; e (b) o contato dos referidos neurônios sensoriais periféricos com o referido composto teste e a medição da função dos neurônios sensoriais periféricos, de modo que a referida função é a medição de pelo menos uma atividade de marcador.

[025] Em um exemplo de realização preferido do segundo objeto da presente invenção, os neurônios sensoriais periféricos são derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC).

[026] De preferência, o marcador é escolhido dentre TRPV1 e Substância P.

[027] Um terceiro objeto da presente invenção é o uso de neurônios sensoriais periféricos (PSNs), produzidos pelo método para a indução da diferenciação de células neuronais sensoriais periféricas (PSN), conforme definido na presente invenção, para a realização de testes in vitro, em que, de acordo com um exemplo de realização preferido da presente invenção, o teste in vitro detecta uma variedade de irritantes da pele, alérgenos, antienvelhecimentos, calmantes da pele e/ou anti-inflamatórios.

[028] De preferência, os irritantes são escolhidos dentre fragrâncias, conservantes, solventes, propelentes, como esfoliantes e agentes de renovação de células da pele, medicamentos antiacne, compostos antitranspirantes, anti-histamínicos, agentes anti-inflamatórios, agentes de proteção da pele, produtos químicos repelentes de insetos, filtros solares, tensoativos, conservantes, agentes suavizantes da pele, medicamentos antienvelhecimento, medicamentos para cicatrização de feridas, compostos biológicos tópicos usados em cosméticos e/ou dermocosméticos, ou qualquer mistura dos mesmos.

[029] Além disso, de acordo com um exemplo de realização preferido da presente invenção, o teste in vitro estuda o mecanismo de envelhecimento da pele.

[030] Um quinto objeto da presente invenção é o uso de ligantes in vitro para verificar a diferenciação e/ou ativação da célula, produzida pelo método para induzir a diferenciação de células neuronais sensoriais periféricas (PSN), conforme definido na presente invenção.

[031] De preferência, a diferenciação e/ou ativação da célula é verificada através da análise da atividade de TRPV1 e/ou liberação de substância P.

[032] De preferência, os ligantes são selecionados de anandamida, capsaicina, resiniferotixina, rutênio vermelho, lidocaína, mirricitrina, capsaicina crônica, cânfora, riamilorida, capsazepina, linopirdina e/ou rimonabanto.

[033] Um sexto objeto da presente invenção é o uso de células de neurônios sensoriais periféricos (PSNs), produzidas pelo método para induzir a diferenciação de células neuronais sensoriais periféricas (PSN), conforme definido na presente invenção, para a produção de um produto cosmético.

[034] Um sétimo objeto da presente invenção são as células neuronais sensoriais periféricas (PSN), produzidas pelo método para induzir a diferenciação das células neuronais sensoriais periféricas (PSN), conforme definido na presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[035] A Figura 1 mostra as etapas da diferenciação dos neurônios sensoriais periféricos. Modelo esquemático do protocolo de diferenciação em neurônios sensoriais. Dia O (DO): a diferenciação começa com células hiPS apresentando todos os principais marcadores de pluripotência; D5; formação de estruturas semelhantes a tubos neurais; D10: comprometimento celular com o fenótipvo NCPC; D13: substituição de meios suplementados com fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), ácido ascórbico (AA), fator neurotrófico derivado da glia (GDNF), neurotrofina 3 (NT-3) e AMP cíclico (AMPc) para induzir diferenciação de NCPC em neurônios sensoriais; D13-D33: maturação dos neurônios sensoriais.

[036] A Figura 2 mostra a caracterização do NCPC com marcadores específicos. No dia 10, as células apresentaram morfologia de células progenitoras neurais e coloração positiva para Nestina (a, d, g e j), TRPV!1 (b), Periferina (e), Pax6 (h) e BRN3a (k). As NCPCs eram negativas para Islet1 e Oct4. Os núcleos foram corados com DAP! (c, f, l e). A quantificação de células positivas em relação aos núcleos corados com DAPI (4', 6-diamidino-2- fenilindol) (m).

[037] A Figura 3 mostra a diferenciação dos neurônios sensoriais. Neurônios corados com EB-tubulina classe Ill (verde) após 2, 5 ou 10 dias em meio neuronal condicionado com 75% de meio HEKn. Os núcleos foram corados com DAPI (a-c). Quantificação do comprimento da neurita em neurônios sensoriais periféricos. O comprimento das neuritas foi medido com base na imunocoloração de B-tubulina Classe Ill (verde). A segmentação de imagens assistidas por computador identificou todas as neuritas e mediu o comprimento total em cada momento. As neuritas aumentaram 328% em comprimento após 5 dias e 514% após 10 dias em cultura com meio condicionado com 75% de HEKn (d). Porcentagem de neurônios diferenciados. O meio de células HEKn condicionado aumentou 17,4% o número de neurônios após 10 dias de cultivo (e).

[038] A Figura 4 mostra a maturação dos neurônios sensoriais periféricos. Os neurônios cultivados em meio de células HEKn a 75% apresentaram expressão crescente relacionada ao tempo de TRPV1 (a,cee), Periferina (h, j e |) e Islet-1 (o, qe s). B-tubulina classe Ill (verde) e DAPI foram cocoradas em todas as condições (b, d, f, l k m, p, re t). A intensidade da fluorescência do TRPV1 aumentou 328% e 514% após 5 e 10 dias, respectivamente (g); A periferina apresentou aumento de 118% e 165% após 5 e 10 dias, respectivamente (n) e Islet-1 também apresentou aumento de 205% e 276% após 5 e 10 dias, respectivamente (u).

[039] A Figura 5 mostra o ensaio de liberação de cálcio em neurônios sensoriais derivados de células hiPS. Imagem de contraste de fase para localização celular (a) imagem de fluorescência dos níveis basais de cálcio (b). Respostas de cálcio em neurônios sensoriais após capsaicina 100 nM (c) e tratamento com KCL 70 mM (d). Imagem de cálcio dos neurônios sensoriais com conversão da razão de excitação Fura-2 (340/380 nm) para pseudo-cor, de acordo com a escala à esquerda de cada imagem. As setas indicam células ativas.

[040] A Figura 6 mostra a liberação da substância P após tratamento in vitro com agonistas e antagonistas. A liberação de substância P medida no sobrenadante da cultura de neurônios sensoriais após incubação de 1h a 37ºC na presença de ligantes. CAP: capsaicina; CPZ: capsazepina; RR: vermelho de rutênio; AEA: anandamida (10 uM); KCI: solução de alto potássio (70 mM). AEA apresentou aumento de 887% em relação ao controle.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[041] As células precursoras da crista neural (NCPCs) diferenciam-se em vários tipos celulares e tecidos durante o desenvolvimento embrionário, incluindo músculos lisos, tecido conjuntivo, osso, cartilagem, células adiposas, células endócrinas, melanócitos, neurônios e células gliais, entre muitos outros. O alto potencial das NCPCs para se diferenciarem em neurônios sensoriais periféricos (PSN) transforma essas células em uma ferramenta poderosa para investigar vários distúrbios somatossensoriais e em um modelo confiável para a triagem de fármacos/irritantes, mas a derivação in vitro de neurônios a partir das hiPSCs requer períodos de cultura prolongados,

tipicamente duradouros, de 30 dias ou mais. Existem poucos estudos que abordam a geração de NCSCs e PSNs a partir de células-tronco embrionárias (ESCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs). A maioria desses estudos baseia-se em células estromais murinas e cocultura, que promove a diferenciação neural das células-tronco e a formação de rosetas neurais ou neuroesferas. A heterogeneidade do tipo celular é um dos principais obstáculos nesses sistemas de cultura, além do rendimento da diferenciação e funcionalidade dos neurônios. Publicações recentes tentaram superar esses problemas, entretanto, os resultados geraram protocolos caros ou demorados e de baixa eficiência na geração de NCPCs ou PSNs maduros.

[042] Em vista o exposto, embora tenha sido feito um progresso generoso na tentativa de abordar essas questões, os métodos convencionais atualmente disponíveis para essa investigação ainda são limitados. Portanto, é necessário ainda o desenvolvimento de um método para induzir a diferenciação de hiPSCs em PSNs, resultando em sistemas de cultura homogêneos, apresentando rendimento de diferenciação e funcionalidade de neurônios, especialmente focado em ensaios de descoberta de fármacos e na substituição de determinados testes em animais na indústria de cosméticos.

[043] A presente invenção diz respeito a um método eficiente para induzir a diferenciação linhagem-específica de uma célula-tronco, particularmente a diferenciação de hiPSCs em neurônios sensitivos ou fibras neuronais que inervam a pele humana, como células-tronco da crista neural (NCPCs) e neurônios sensoriais periféricos (PSNs), com um alto rendimento de diferenciação e usos de uma célula diferenciada produzida pelo método da presente invenção para detectar uma variedade de irritantes da pele e para estudar o mecanismo de envelhecimento da pele. De modo mais específico, a presente invenção fornece um método para diferenciar hiPSCs em células progenitoras da crista neural (NCPCs) por meio de tratamento com inibidores de

Smad, de 2 a 22 dias, preferencialmente de 5 a 18 dias, mais preferencialmente de 7 a 12, ainda mais preferencialmente 12 dias.

[044] As células diferenciadas primariamente são colocadas em contato com meio 3N, suplementado com pelo menos um mitógeno, revestido com poli-ornitina/laminina, e pode ser mantido na referida cultura por até 12 dias, preferencialmente de 2 a 10, mais preferencialmente por 2 dias. Posteriormente, as células diferenciadas primariamente são colocadas em contato com meio 3N, suplementado com pelo menos um fator neurotrófico, pelo menos um indutor de diferenciação e pelo menos um indutor de transdução celular, em que as células diferenciadas primariamente são mantidas em cultura de 5 a 25 dias, de preferência de 10 a 20, mais preferencialmente 15 dias, para obter as células diferenciadas secundárias. Em seguida, as células diferenciadas secundárias são cultivadas de 2 a 22 dias, preferencialmente de 2 a 10 dias, em meio condicionado com 50% a 100%, preferencialmente com 60% a 90%, mais preferencialmente de 70% a 80%, ainda mais preferencialmente com 75% de meio para queratinócitos epidérmicos de neonatos humanos (HEKn).

[045] Em seguida, um protocolo de diferenciação para obter neurônios sensoriais periféricos a partir de NCPC por até 35 dias. Foram realizados testes funcionais para provar a atividade neuronal e a responsividade a partir do dia 11 após a diferenciação em PSN. Os dados apresentados mostram que a via de sinalização canônica Wnt desempenha um papel importante durante a diferenciação em células da crista neural, enquanto a inibição das vias de sinalização BMP e Ativina A/Nodal leva a uma geração rápida e eficiente de NPCs.

[046] O objetivo primário desse método era evitar a classificação de NPCs p75/Hnk1*, pois era esperada uma alta porcentagem dessas células. O método da presente invenção inclui os receptores BMP tipo | ALK2 e inibidor de ALK3, LDN-193189 (LDN), no protocolo de diferenciação no qual o bloqueador de sinalização da Ativina A/Nodal, SB431542 (SB), foi utilizado, paralelamente ao inibidor de GSK-3, CHIR, resultando em uma condição de dupla inibição de Smad. Esse método é mais simples de executar e não requer uma etapa de classificação por FACS, o que significa que é significativamente menos trabalhoso, menos propenso a erros e mais robusto e reprodutível. Desde então, as NCPCs induzidas obtidas com esse método foram usadas para diferenciar neurônios periféricos por meio de incubação com ligantes de GDNF e neurotrofinas, seguidos por dez dias em meio condicionado a 75% dos queratinócitos epidérmicos neonatais humanos (HEKn). Os neurônios gerados foram funcionais em resposta à anandamida, o que causou a liberação da substância P (SP). Os sinais de cálcio foram modestos em resposta à capsaicina e outros agentes e foi observado um aumento adicional na expressão de marcadores de PSN, como TRPV1 após tratamento com meio condicionado.

[047] Além disso, outro exemplo de realização da presente invenção inclui um método para rastrear um agente biológico in vitro, compreendendo as etapas aqui descritas.

[048] Adicionalmente, os PSNs produzidos usando o método da presente invenção são contemplados ainda para diversos usos, incluindo, mas não se limitando, o uso em testes in vitro, como ensaios de descoberta de fármacos, terapia celular em maior escala, detecção de uma variedade de irritantes da pele e outros compostos de interesse, para estudar o mecanismo de envelhecimento da pele e para produzir um produto cosmético, tal como um produto antienvelhecimento para a pele.

[049] Também é contemplado o uso de ligantes in vitro para verificar a diferenciação e/ou ativação das células PSN produzidas pelo método da invenção, e as células PSN produzidas pelo método da invenção.

[050] Antes da presente invenção ser descrita em maiores detalhes por meio dos exemplos, deve ser entendido que esta invenção não está limitada aos exemplos de realização específicos descritos, que logicamente podem variar. Também é preciso entender que a terminologia utilizada no presente tem apenas para o propósito de descrever exemplos de realizações específicos, e pretende ser limitante do escopo da presente invenção, que será limitado somente pelas reivindicações anexas.

[051] Quando é fornecido um intervalo de valores, deve-se compreender que cada valor interveniente, da décima unidade do limite inferior, salvo quando o contexto dita claramente de outra forma, entre os limites superior e inferior desse intervalo e qualquer outro valor declarado ou interveniente nesse intervalo declarado, está abrangido pela invenção. Os limites superior e inferior desses intervalos menores podem ser incluídos de maneira independente nos intervalos menores e também estão incluídos na invenção, e sujeitos a qualquer limite especificamente excludente no intervalo indicado. Quando o intervalo indicado inclui um ou ambos os limites, os intervalos excludentes de um ou ambos os limites incluídos também estão incluídos na presente divulgação.

[052] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados na presente divulgação têm o mesmo significado que é comumente compreendido por um técnico hábil no assunto ao qual a presente invenção pertence. Embora quaisquer materials e métodos semelhantes ou equivalentes aos descritos na presente invenção também possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os materiais e métodos preferidos serão agora descritos. Todas as publicações mencionadas no presente são incorporadas pela referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em conexão com as quais as publicações são citadas.

[053] Todos os métodos divulgados e reivindicados no presente documento podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente divulgação. Embora os métodos da presente invenção tenham sido descritos em termos de exemplos de realização preferidos, será evidente para os especialistas na técnica que podem ser aplicadas variações aos métodos e etapas ou na sequência de etapas do método descrito na presente invenção sem nos afastarmos do conceito, espírito e escopo da invenção. De modo mais específico, será evidente que determinados agentes que são quimicamente e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos na presente invenção, enquanto que os mesmos resultados ou resultados ou semelhantes seriam alcançados. Todos esses substitutos e modificações semelhantes evidentes para os especialistas na técnica são considerados dentro do espírito, escopo e conceito da invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas.

[054] A menos que divulgado de outra forma, todos os termos técnicos, anotações e outras terminologias científicas utilizadas na presente divulgação pretendem ter os significados normalmente entendidos pelos técnicos hábeis no campo da presente invenção. Em alguns casos, termos com significados comumente entendidos são definidos no presente com o objetivo de trazer clareza e/ou rápida referência, e a inclusão de tais definições neste documento não deve necessariamente ser interpretada como representando uma diferença substancial nas definições geralmente entendidas na arte anterior.

DEFINIÇÕES

[055] As células-tronco são células indiferenciadas definidas por sua capacidade, em um nível de célula única, de se renovar e se diferenciar. As células-tronco podem produzir células descendentes, incluindo progenitores autorrenováveis, progenitores não renováveis e células terminalmente diferenciadas. As células-tronco também são caracterizadas por suas capacidades de se diferenciarem in vitro em células funcionais de diferentes linhagens a partir de múltiplas camadas germinativas (endoderme, mesoderme e ectoderme). As células-tronco também dão origem aos tecidos de múltiplas camadas germinativas após o transplante e contribuem substancialmente para a maioria dos tecidos, se não todos, após a injeção em blastocistos. As células- tronco são classificadas de acordo com o potencial de desenvolvimento.

[056] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “totipotente” refere-se a capacidade de dar origem a todos os tipos de células do corpo, além de todos os tipos de células que compõem os tecidos extraembrionários.

[057] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “multipotente” refere-se a capacidade da célula se desenvolver em mais de um tipo de célula do corpo.

[058] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “pluripotente” refere-se à capacidade de se desenvolver nas três camadas germinativas de desenvolvimento do organismo, incluindo endoderme, mesoderme e ectoderme.

[059] As características das células-tronco pluripotentes são bem conhecidas pelos especialistas no assunto e continuam a ser identificadas novas características das células-tronco pluripotentes. Os marcadores de células- tronco pluripotentes incluem, por exemplo, a expressão de um ou mais dos seguintes marcadores: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXINA4S5, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1- 81. Em um exemplo de realização, as células-tronco pluripotentes adequadas para uso nos métodos da invenção expressam um ou mais dentre NANOG, SOX2, TRA-1-60 e TRA-1-81, e não expressam marcadores da diferenciação neural Islet1, BRN3A, perífina e TRPV1.

[060] Células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC), conforme utilizado no presente, referem-se às células-tronco induzidas a partir de células somáticas, por exemplo, uma célula somática diferenciada, e que possui uma potência maior que a referida célula somática. As células hiPS são capazes de autorrenovação e diferenciação em células maduras, por exemplo, células progenitoras da crista neural (NCPCs).

[061] As NCPCs também são referidas na presente invenção como células diferenciadas primariamente.

[062] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “célula progenitora neuronal sensorial periférica (PSN)' e “células diferenciadas secundárias” significam uma célula derivada de uma célula-tronco da crista neural de mamífero que está comprometida com uma ou mais linhagens neuronais do SNP e é uma célula em dividida, mas ainda não expressa marcadores da superfície ou intracelulares encontrados nas células neuronais PSN mais diferenciadas e não divididas. Quando estas células progenitoras neuronais PSN são colocadas em condições de cultura apropriadas elas se diferenciam em PSNs maduros que expressam os marcadores de diferenciação apropriados, por exemplo, perifina e TRPV (potencial receptor transitório).

[063] Os termos “cultura celular” ou “cultura” geralmente se referem às células retiradas de um organismo vivo e cultivadas sob condições controladas (“em cultura” ou “cultivadas”). Uma cultura celular primária é uma cultura de células, tecidos ou órgãos retirados diretamente de um organismo antes da primeira subcultura. As células são expandidas em cultura quando são colocadas em um meio de crescimento em condições que facilitam um ou ambos o crescimento e a divisão celular, resultando em uma população maior de células. Quando as células são expandidas em cultura, às vezes a taxa de proliferação celular é medida pela quantidade de tempo necessária para que as células dobrem de número (conhecido como tempo de duplicação).

[064] Um frasco de cultura que pode ser usado para cultivar a(s) célula(s)-tronco pode incluir, mas não está particularmente limitado a: balão, balão para cultura de tecidos, prato, placa de Petri, placa para cultura de tecidos, placa múltipla, frasco de microcultura, placa com micropoços, placa múltipla,

placa de múltiplos poços, micro lâmina, lâmina de câmara, schale, tubo, bandeja, saco de cultura e garrafa de cultivo rotatória, desde que seja capaz de cultivar as células-tronco no mesmo.

[065] O frasco de cultura pode ser adesivo celular ou não adesivo e selecionado dependendo da finalidade. O frasco de cultura de adesivo para células pode ser revestido com qualquer substrato para a adesão celular, como matriz extracelular (ECM), para melhorar a adesividade da superfície do frasco às células. O substrato para adesão celular pode ser qualquer material destinado a anexar células-tronco ou células alimentadoras (se usadas).

[066] As condições de cultura podem ser adequadamente definidas. Por exemplo, a temperatura de cultura pode ser de cerca de 30 a 40ºC e de preferência cerca de 37ºC, mas particularmente não se limitando a ela. À concentração de CO> pode ser de cerca de 1 a 10% e preferencialmente de cerca de 2 a 5%. A tensão de oxigênio pode ser de 1 a 10%.

[067] Diferenciação é o processo pelo qual uma célula não especializada (“não comprometida”) ou menos especializada adquire os recursos de uma célula especializada, como uma célula nervosa ou uma célula muscular. Uma célula diferenciada ou uma célula induzida por diferenciação é aquela que assumiu uma posição mais especializada (“comprometida”) dentro da linhagem de uma célula. O termo “comprometida”, quando aplicado ao processo de diferenciação, refere-se a uma célula que prosseguiu no caminho da diferenciação até um ponto em que, em circunstâncias normais, continuará a se diferenciar em um tipo de célula específico ou subconjunto de tipos celulares, e não pode, em circunstâncias normais, diferenciar-se em um tipo de célula diferente ou reverter para um tipo de célula menos diferenciado.

[068] Um meio de indução neural adequado pode ser baseado em um meio padrão que suporta indução neural, neurogênese e diferenciação neuronal. Um meio 3N pode compreender uma mistura 1:1 de meio contendo N2 e B27, em que o meio N2 compreende DMEM/F12 suplementado com N2 (GIBCO), insulina, L-glutamina, aminoácidos não essenciais (NEAA), B- mercaptoetanol, penicilina e estreptomicina e o meio contendo B27 compreende neurobasal (Invitrogen) suplementado com suplemento B27 (GIBCO), L- glutamina, penicilina e estreptomicina.

[069] O meio 3N descrito acima pode ser suplementado com inibidores da sinalização TGFB e BMP para produzir um meio de indução neural.

[070] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “inibidor” refere-se a um composto que reduz ou abole a função ou atividade biológica da via de sinalização citada, interferindo em um alvo específico que faz parte dessa via de sinalização ou interferindo na interação entre dois ou mais alvos. Um inibidor pode executar qualquer um ou mais dos seguintes efeitos para reduzir ou abolir a função ou atividade biológica da proteína a ser inibida: (i) a transcrição do gene que codifica a proteína a ser inibida é reduzido, ou seja, o nível de MGRNA é reduzido, (ii) a tradução do mMRNA que codifica a proteína a ser inibida é reduzida, (iii) a proteina desempenha sua função bioquímica com menor eficiência na presença do inibidor e (iv) a proteína executa sua função celular com eficiência reduzida na presença do inibidor.

[071] Tais compostos podem incluir, sem se limitar a, molécula pequena, peptídeo, peptidomimético, composto natural, siRNA, ácido nucleico antissenso, aptâmero ou anticorpo. Por exemplo, em um exemplo de realização da presente invenção, podem ser usadas “pequenas moléculas” como inibidores, tal como um inibidor da sinalização SMAD.

[072] Em outras palavras, um inibidor é qualquer composto ou molécula que altera qualquer atividade de uma determinada proteína (molécula de sinalização, qualquer molécula envolvida com a molécula de sinalização nomeada, uma molécula associada nomeada, como uma glicogênio sintase quinase 38 (GSK3B) (por exemplo, incluindo, mas não se limitando, as moléculas de sinalização descritas na presente invenção), por exemplo, pelo contato direto com a sinalização SMAD, contato com o MRNA SMAD, causando alterações conformacionais de SMAD, pela diminuição dos níveis de proteína SMAD ou interferindo nas interações SMAD com parceiros de sinalização (por exemplo, incluindo os descritos na presente invenção) e afetando a expressão dos genes SMAD alvos (por exemplo, aqueles descritos na presente invenção).

[073] Os inibidores também incluem moléculas que regulam indiretamente a atividade biológica do SMAD, interceptando moléculas de sinalização a montante (por exemplo, dentro do domínio extracelular, exemplos de molécula de sinalização e um efeito incluem: Noggin, que sequestra proteínas ósseas morfogênicas, inibindo a ativação de receptores ALK 1,23, e 6, impedindo assim a ativação SMAD a jusante. Da mesma forma, a cordina (Chordin), Cerberus, folistatina (Follistatin), sequestram de maneira semelhante os ativadores extracelulares da sinalização SMAD. Bambi, uma proteína transmembranar, também atua como um pseudorreceptor para sequestrar moléculas de sinalização de TGFB extracelulares. Os anticorpos que bloqueiam ativinas, nodais, TGFB e BMPs são contemplados para uso para neutralizar ativadores extracelulares da sinalização SMAD e similares. Assim, em um exemplo de realização, um inibidor da presente invenção induz (modifica) ou altera a diferenciação de um tipo de célula padrão para um tipo de célula não padrão. Em um exemplo de realização preferido, um inibidor da presente invenção “altera” ou “abaixa” ou “bloqueia” a sinalização padrão, a fim de direcionar a diferenciação celular para um tipo de célula não padrão, tal como descrito na presente invenção para produzir células de neurônios sensoriais periféricos da presente invenção.

[074] Assim, um inibidor da presente invenção é um composto natural ou molécula pequena para a atividade da molécula de sinal modificada que auxilia na produção de células de neurônios sensoriais periféricos da presente invenção. Os inibidores são descritos em termos de inibição competitiva (se ligam ao sítio ativo de maneira a excluir ou reduzir a ligação de outro composto de ligação conhecido) e inibição alostérica (se ligam a uma proteína de maneira a alterar a conformação da proteína de uma maneira que interfere na ligação de um composto ao sítio ativo dessa proteína), além da inibição induzida pela ligação e afetando uma molécula a montante da referida molécula sinalizadora que, por sua vez, causa a inibição da referida molécula. Em alguns casos, um inibidor é referido como um “inibidor direto”, referindo-se à inibição de um alvo da sinalização ou da via de sinalização ao entrar em contato com o alvo de sinalização. Inibidores diretos exemplares incluem, mas não se limitam a: lidocaína, miricitrina, capsaicina crônica, cânfora, amilorida, capsazepina, linopirdina e a maioria dos anestésicos locais que bloqueiam a função nervosa geral.

[075] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “influencia a sinalização extracelular” refere-se ao efeito que as moléculas de sinalização extracelular (por exemplo, agentes de teste, como pequenas moléculas descritas na presente invenção, agentes farmacêuticos, ligantes a um receptor, citocinas, quimiocinas, fatores solúveis, moléculas de adesão ou outras moléculas de sinalização) possuem sobre uma célula (por exemplo, uma célula eucariótica). Em alguns exemplos de realização, a sinalização extracelular reduz a atividade de sinalização, como atividade SMAD, altera a cinética de ativação SMAD ou altera o padrão de expressão do gene SMAD alvo.

[076] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “Sma Mothers Against Decapentaplegi'' (Sma Mãe Contra a Proteína Decapentaplégica) ou “Small Mothers Against Decapentaplegic" (Pequenas Mães Contra Decapentaplégica) ou “SMAD” referem-se a uma molécula de sinalização.

[077] Conforme utilizado na presente invenção, o termo

“SB431542” refere-se a uma molécula capaz de diminuir ou bloquear a sinalização do fator de crescimento transformador beta (TGFB)/Ativina-Nodal, com um número CAS 301836-41-9, uma fórmula molecular C2a2H8N4O03 e um nome de 4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1 H-imidazol-2-il]-benzamida, por exemplo, veja a estrutura abaixo:

LP AE SA IAN o

SA DA Fo = EX” "NH (Qt |

[078] As quantidades preferidas de SB431542 a serem empregues estão entre cerca de 0,1 e cerca de 100 UM, mais preferencialmente entre cerca de 1 e cerca de 50 UM, como, por exemplo, entre cerca de 5 e cerca de 20 uM e de modo mais preferido a quantidade é de cerca de 10 uM.

[079] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “LDN193189” refere-se a uma molécula pequena DM- 3189, nome IUPAC; 4-(6- (4-(piperazin-1-il)fenil)pirazol[1,5-a]pirimidin-3-il)quinolina, — possuindo — uma fórmula química Ca5H22N6 e número CAS 1062368-24-4. O LDN193189 é capaz de funcionar como um inibidor de sinalização SMAD. O LDN193189 também é um inibidor tipo molécula pequena altamente potente de ALK2, ALK3 e ALK6, proteína tirosina quinases (PTK), inibindo a sinalização de membros das famílias ALK1I e ALK3 de receptores de TGFB tipo |, resultando na inibição da transmissão de múltiplos sinais biológicos, incluindo as proteínas morfogenéticas ósseas (BMP), os sinais de citocinas BMP2, BMP4, BMP6, BMP7 e Ativina e, posteriormente, a fosforilação SMAD de Smad1, Smad5 e Smad8 (Yu et al. Nat Med. 2008. 14:1363-1369; Cuny et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008. 18: 4388- 4392, incorporados ao presente como referência). O LDN193189 apresenta a estrutura abaixo:

AD NO * jp e = |

[080] As quantidades preferidas de LDN193189 a serem utilizadas estão entre cerca de 100 e cerca de 700 nM, mais preferencialmente entre cerca de 150 e cerca de 650 nM, tal como, por exemplo, entre cerca de 200 e cerca de 600 nM e mais preferencialmente a quantidade é de cerca de 500 nM.

[081] Conforme utilizado na presente invenção, os termos “inibidor da glicogênio sintase quinase 328” ou “inibidor GSK-3" ou CHIR referem-se a um composto que inibe uma enzima glicogênio sintase quinase 3B, por exemplo, vide Doble et al., J Cell Sci. 2003; 116:1175-1186, incorporado ao presente como referência. Especificamente, CHIR99021 tem um número CAS 252917-06-9, uma fórmula molecular Ca2H18Cl2aNg, e o nome 6-(2-(4-(2,4-Diclorofenil)-5-(4- metil-1H-imidazol-2-il)-pirimidin-2-ilamino)etil- amino)-nicotinoniítrila, por exemplo, veja a estrutura abaixo: “O y Cc! fe]

DD AO ela

[082] As quantidades preferidas de CHIR99021 a serem utilizadas estão entre cerca de 0,1 e cerca de 10 uM, mais preferencialmente entre cerca de 1 e cerca de 7 uM, tal como, por exemplo, entre cerca de 5 e cerca de 6 uM e mais preferencialmente a quantidade é de cerca de 3 uM.

[083] O termo “mitógenos”, conforme utilizado na presente invenção, refere-se aos compostos que são membros da família de fatores de crescimento de fibroblastos, como FGF-2 (FGF básico) e FGF-4. Também exembplificativo é o fator de crescimento epidérmico (EGF), homólogos funcionais e outros fatores que se ligam ao receptor de EGF. Outros fatores de crescimento candidatos são fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF). Esses mitógenos são usados para aumentar o número de células de uma linhagem, fazendo com que elas proliferem ainda mais em uma cultura.

[084] Os fatores neurotróficos são peptídeos endógenos, encontrados no sistema nervoso ou em tecidos não nervosos inervados pelo sistema nervoso, que atuam para promover a sobrevivência e manter a diferenciação fenotípica das células nervosas e/ou gliais. A família de fatores tróficos, denominada neurotrofinas, atualmente inclui fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento neural (NGF), fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial (GDNF), neurotrofina-3 (NT-3), NT- 4/5 e NT-

6. Todos os fatores neurotróficos podem ser usados isolados ou em combinação.

[085] As quantidades preferidas de cada fator neurotrófico a ser utilizado estão entre cerca de 1 ngíml e cerca de 25 ng/ml, mais preferencialmente entre cerca de 5 ngml e cerca de 15 ng/ml, mais preferencialmente cerca de 10 ng/mL.

[086] Conforme utilizado na presente invenção, a expressão “indutor de diferenciação” refere-se ao ácido ascórbico (AA).

[087] As quantidades preferidas do indutor de diferenciação a serem empregadas estão entre cerca de 50 UM e cerca de 500 UM, mais preferencialmente entre cerca de 100 UM e cerca de 300 UM, mais preferencialmente cerca de 200 uM.

[088] Conforme utilizado na presente invenção, a expressão “indutor de transdução celular” refere-se a um composto que medeia a transdução de sinal, tal como, por exemplo, AMPc.

[089] As quantidades preferidas do indutor de transdução celular a serem empregadas estão entre cerca de 0,01 mM e cerca de 1 mM, mais preferencialmente entre cerca de 0,1 mM e cerca de 0,8 mM, mais preferencialmente cerca de 0,5 mM.

[090] “Marcadores”, conforme utilizado no presente, são moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeo que são expressas diferencialmente em uma célula de interesse. Nesse contexto, expressão diferencial significa um nível aumentado para um marcador positivo e um nível diminuído para um marcador negativo em comparação com uma célula indiferenciada. O nível detectável do ácido nucleico ou polipeptídeo marcador é suficientemente mais alto ou mais baixo nas células de interesse em comparação com outras células, de modo que a célula de interesse possa ser identificada e distinguida de outras células usando qualquer um dentre uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica.

[091] Conforme utilizado na presente invenção, uma célula é “positiva para” um marcador específico, ou “positiva”, quando o marcador específico é suficientemente detectado na célula. Da mesma forma, a célula é “negativa para” um marcador específico, ou “negativa”, quando o marcador específico não é suficientemente detectado na célula.

[092] Conforme utilizado na presente invenção, o termo “ativador” ou “ativação” refere-se a compostos para ativar moléculas resultando na diferenciação direcionada de células da presente invenção. Os ativadores exemplares incluem, mas não se limitam a: calor/frio nocivos, estimulação mecânica, estímulos químicos (mentol, piperinay capsaicina aguda, cinamaldeído, resiniferatoxina, bradicinina, ATP, prostaglandinas, citocinas inflamatórias, solução salina ácida, fator de crescimento de fibroblastos (FGF), etc).

[093] Os agentes biológicos, tal como referido na presente invenção, abrangem muitos ingredientes usados em produtos tópicos que são conhecidamente irritantes ou potencialmente irritantes, especialmente para pessoas com “pele sensível”. Esses ingredientes irritantes incluem fragrâncias, conservantes, solventes, propelentes e muitos outros ingredientes que poderiam ser considerados componentes inertes dos produtos. Além disso, muitos ingredientes ativos de produtos tópicos, incluindo produtos químicos que também podem ser classificados como fármacos, produzem irritação quando aplicados na pele. Isso inclui, entre outros, ingredientes como esfoliantes e agentes de renovação de células da pele, medicamentos antiacne, compostos antitranspirantes, — anti-histamínicos, agentes —anti-inflamatórios, agentes protetores da pele, produtos químicos repelentes de insetos, filtros solares e muitos outros. Quando mais de um irritante químico está presente, seus efeitos irritantes podem ser aditivos. Além disso, os ingredientes químicos podem reagir uns com os outros, ou no ambiente da pele, para formar novos produtos químicos que são irritantes. Os veículos nos quais os ingredientes ativos do medicamento são formulados também podem produzir irritação em pessoas sensíveis, especialmente no caso de medicamentos como corticosteroides tópicos.

[094] Além dos produtos químicos que provocam diretamente a irritação da pele, alguns produtos indiretos fazem com que a pele se torne mais sensível a outros produtos químicos ou condições ambientais que normalmente não causariam irritação. Muitos produtos químicos que atuam como “esfoliantes” da pele, como retinóides (por exemplo, tretinoína, retinol e retina), ácidos carboxílicos, incluindo a-hidroxiácidos (por exemplo, ácido lático, ácido glicólico), B-hidroxiácidos (por exemplo, ácido salicílico), a-ceto ácidos, ácido acético e ácido tricloroacético, ácido 1-pirrolidona-5-carboxílico, ácido caprilil salicílico, ácido a-hidroxi decanóico, ácido a-hidroxi octanóico, gluconolactona, metoxipropil gluconamida, ácido oxálico, ácido málico, ácido tartárico, ácido mandélico, ácido benzílico, ácido glucônico, peróxido de benzoíla e fenol, entre outros, podem tornar a pele mais sensível à irritação provocada por outros produtos químicos aplicados topicamente, tais como hidratantes, protetores solares, fragrâncias, conservantes, tensoativos (por exemplo, em sabonetes, creme de barbear) e outros produtos tópicos.

[095] Os irritantes citados acima, também podem ser testados em culturas de células PSN da presente invenção, uma vez que podem ser usadas como modelo in vitro para sensibilidade da pele, inflamação neurogênica e sensibilização da pele.

[096] Como referido no presente documento, os canais TRP (potencial de receptor transitório) compreendem uma família diversa de canais catiônicos dependentes de ligantes, principalmente não seletivos, que são expressos de maneira robusta nos sistemas sensoriais de todas as espécies (Nilius & Szallasi, Transient receptor potential channels as drug targets from the Science of basic research to the art of medicine. Pharmacol Rev 2014; 66(3): 676 - 814). Dentre estes, o TRPV1 é o mais bem estudado e considerado o canal TRP prototípico presente nos neurônios somatossensoriais (Basbaum et al, Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell.; 2009; 139:267-284). O TRPV1 pode ser bloqueado diretamente por moléculas externas, como capsaicina, resiniferatoxina e piperina, e também pode ser modulado de forma positiva ou negativa via ativação de outros receptores e sistemas de segundo mensageiro, como hidrólise de PIP2 e fosforilação de PKC (Julius, TRP channels and pain. Annu Rev Cell Dev Biol. 2013; 29:355-84). Um dos receptores que parece inibir a ativação do TRPV1 é o receptor canabinoide 1 (CB1), também presente nos neurônios somatossensoriais (Julius & Basbaum, Molecular mechanisms of nociception. Nature. 2001; 413: 203-210). Entretanto, um agonista endógeno de CB1, a anandamida, também é um agonista TRPV1, embora com um valor EC5o uma ordem de magnitude maior do que este último (Zygmunt et al., Vanilloid receptors on sensory nerves mediate the vasodilator action of anandamide. Nature. 1999; 400: 452-457).

[097] Os queratinócitos e os neurônios sensoriais têm uma interação extensa durante o desenvolvimento e na pele madura. Por exemplo, os queratinócitos liberam fatores neurotróficos que induzem a arborização das terminações nervosas livres e o crescimento de neurita em direção à superfície da pele (Albers & Davis, The skin as a neurotrophic organ. Neuroscientist 2007; 13: 371-82). Eles também liberam mediadores inflamatórios envolvidos nas respostas a danos nos tecidos e reações de hipersensibilidade, bem como respostas ao frio e ao calor, através de receptores da família TRP de canais catiônicos (Chung et al., TRPV3 and TRPV4 mediate warmth-evoked currents in primary mouse keratinocytes. J Biol Chem. 2004; 279: 21569-75). Por outro lado, as terminações sensoriais não apenas transduzem sinais sensoriais, mas têm um papel ativo no metabolismo cutâneo e na homeostase, através da secreção de neuropeptídeos pró-inflamatórios e mediadores inflamatórios que controlam a vascularização e a renovação tecidual (Roosterman et al., Neuronal control of Skin function: the skin as a neuroimmunoendocrine organ. Physiol Rev. 2006; 86: 1309-79). Particularmente, os nociceptores positivos para TRPV1 também regulam a longevidade e o metabolismo da pele, bem como a resposta imune ao longo do envelhecimento (Riera et al., TRPV1 pain receptors regulate longevity and metabolism by neuropeptide signaling. Cell 2014; 157, 1023-1036).

[098] A substância P (SP) é um membro neuropeptídeo da família das taquicininas, sintetizada por neurônios sensoriais que emanam suas extensões a partir do DRG para as camadas mais superficiais da pele, mediando a comunicação entre neurônios periféricos e queratinócitos epidérmicos (Ribeiro- da-Silva & Hokfelt, Neuroanatomical localization of Substance P in the CNS and sensory neurons. Neuropeptides. 2000; 34: 256-271). A maioria dos neurônios que liberam a substância P é sensível à capsaicina, destacando a importância da expressão de TRPV1 e da interação dos neurônios sensoriais e queratinócitos sensoriais.

EXEMPLOS DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES INDUZIDAS HUMANAS (HIPSCS) EM NCPCS

[099] As células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC) foram cultivadas em meio mTeSRº 1 (STEMCELL Technologies, Canadá) em placas revestidas com Matrigel (BD Biosciences) em condições de cultura padrão (37ºC, 5% de CO>2). As colônias foram divididas usando EDTA a 0,5 mM (Thermo Fisher Scientific, EUA) a cada 4-5 dias. Utilizou-se culturas de células iPS humanas com 40-70% de confluência para indução de NCPC. As hiPSCs foram expostas por 10 dias (veja a Figura 1) em meio de indução 3N quimicamente definido fresco (DMEM + meio neurobasal 50:50 v/v, 1% de Glutamax, 0,5% de N2, 1% de B2, 1% de B27, 0,5% de NEAA, B-mercaptoetanol a 55 MM e 1% de penicilina/estreptomicina, todos da Thermo Fisher Scientific, EUA), suplementados com três compostos de moléculas pequenas. A adição destes compostos foi a seguinte: dia 1: 500 nM de LDN (Stemgen, EUA) + 10 uM de SB (Sigma Aldrich, EUA); dia 2: 500 nM de LDN + 10 uM de SB + 3 uM de CHIR (Tocris Bioscience, EUA); dia 3: uM SB +3 uM CHIR. Nos dias 4, 6 e 8, o meio foi suplementado apenas com 3 UM de CHIR. Após 10 dias de diferenciação, as NCPCs foram posteriormente cultivadas em meio de expansão (meio 3N suplementado com 10 ng/ml de BFGF e 10 ng/ml de EGF, ambos da Thermo Fisher Scientific, EUA). No dia 11, as NCPCs foram passadas enzimaticamente (passagem 0) usando Accutase (Merck Millipore, EUA) por 2-3 minutos a 37ºC e divididas 1:3 em poli-L-ornitina (100 pg/ml, Sigma Aldrich, EUA) )/placas revestidas com laminina (20 ug/mL, Thermo Fisher Scientific, EUA) e cultivadas até a confluência. O meio foi substituído a cada dois dias. Quando a confluência chegou a 70-100% (normalmente 24-48 horas após a passagem O), as células foram submetidas a uma nova passagem e foram cultivadas em um frasco de cultura em densidades específicas: 1 x 106º células por placa de 60 mm ou 3 x 106 células por placa de 100 mm. 10 uM de inibidor ROCK (Merck Millipore, EUA) foram adicionados no dia da passagem e removidos após 24 horas. GERAÇÃO DE NEURÔNIOS SENSORIAIS PERIFÉRICOS A PARTIR DE NCPCsS

[100] As culturas de NCPCs com aproximadamente 80% de confluência (geralmente no dia 13, veja a Figura 1) foram usadas para diferenciação neuronal. Resumidamente, as células foram mantidas por aproximadamente 23 dias em meio de indução neural contendo os seguintes fatores de diferenciação: 0,5 mM de AMPc (Sigma Aldrich, EUA), 200 uM de AA (Sigma Aldrich, EUA), 10 ng/mL de NT-3 (R&D) Systems, EUA), 10 ng/ml de NGF (R&D Systems, EUA), 10 ng/mL de BDNF (R&D Systems, EUA) e ng/mL de GDNF (R&D Systems, EUA). O meio foi substituído a cada 3-4 dias. Os neurônios foram divididos enzimaticamente (se necessário) usando Accutase (Merck Millipore, EUA) por 3-5 minutos a 37ºC em placas de Poli- L-ornitina/Laminina preparadas na hora. A adição de 10 uM de inibidor ROCK (Merck Millipore, EUA) foi realizada em todas as passagens para aumentar a capacidade de sobrevivência e ligação dos neurônios. No dia 35, aproximadamente, os neurônios foram coletados e cultivados em um frasco de cultura para análise e/ou experimentos subsequentes.

CULTURA DE QUERATINÓCITOS EPIDÉRMICOS HUMANOS

[101] Os queratinócitos epidérmicos humanos neonatais (HEKn) foram obtidos da Cascade Biologics (Portland, OR) e cultivados em meio isento de soro EpiLife (ThermoFischer). As células foram cultivadas em um frasco de cultura a 10.000 células por poço. Os vasos de cultura previamente tratados com gelatina (Sigma) e meio EpiLife (Thermo Fisher Scientific) foram divididas quando atingiram 70% a 75% de confluência durante 48h de condicionamento e, em seguida, as células foram coletadas e foi adicionado meio fresco aos neurônios, que foram centrifugados para se livrar de detritos e células mortas.

CocCcuLTURA DE NEURÔNIOS SENSORIAIS PERIFÉRICOS HUMANOS E

QUERATINÓCITOS EPIDÉRMICOS HUMANOS E TRATAMENTO COM MEIO CONDICIONADO

[102] No dia 35 da diferenciação neural, os neurônios sensoriais periféricos foram coletados e cultivados em um frasco de cultura a 30.000 células por poço em placas de cultura de 96 poços (Perkin-Elmer, EUA) revestidas com poli-L-ornitina/laminina por mais dois, cinco e dez dias adicionais sob as seguintes condições: em cocultura com células HEKn em meio de indução neural padrão; e sem células HEKn, mas com adição de meio condicionado com HEKn em três proporções diferentes (25, 50 e 75%). Os meios condicionados foram trocados a cada 3 dias.

TESTES DE DIFERENCIAÇÃO E ATIVIDADE

1. IMUNOCITOQUÍMICA

[103] As NCPCs e neurônios sensoriais foram cultivados em frascos de 96 poços e fixados com paraformaldeído a 4%, permeabilizados com Triton X-100 e bloqueados com albumina de soro bovino (BSA) a 3%. As células foram incubadas por 2 horas com anticorpos primários diluídos em BSA a 3%. Após lavagem com PBS, os anticorpos secundários conjugados foram adicionados por 40 minutos no escuro, lavados minuciosamente com PBS, seguidos de uma incubação de 5 minutos com DAP! (4',6- diamidino-2-fenilindol) para coloração nuclear. Após a lavagem com PBS e água, foram adicionados 50 uL de glicerol como meio de montagem e os frascos de cultura foram selados com adesivo de alumínio antes da análise. Os anticorpos primários utilizados foram: nestina (1:100, Sigma-Aldrich, EUA), anti-beta- tubulina Classe Ill (1:200, Merck-Millipore, Alemanha), anti-Islet1 (1:1000, Abcam), anti-TRPV1 (1:1000, Abcam), anti-Bm3A (1:250, Abcam) e anti-periferina (1:250, Santa Cruz Biotechnology). Os anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor

488 e Alexa Fluor 594 (1:400, Life Technologies, EUA) foram incubados por 40 minutos e protegidos da luz. Os núcleos foram corados com 0,5 ug/mL de 4'-6- diamino-2-fenilindol (DAPI) por 5 min. As imagens foram adquiridas em um microscópio com aquisição automatizada (High-Content Screening, Operetta (PerkinElmer, EUA)) e as análises foram realizadas no programa de análise de imagem para High-Content Screening, Harmony 5.1 (PerkinElmer, EUA). Para identificar se as NCPCs estavam comprometidas com o destino neuronal sensorial, foi realizada uma coloração dupla com Islet-1/2 e Brn3. A coloração dupla para a periferina e Bm3 foi usada para quantificar o nível de maturação dos neurônios sensoriais periféricos, comparado às células progenitores neurais imaturas.

2. ENSAIOS DE CÁLCIO

[104] Os neurônios foram cultivados em um frasco de cultura em PLO e lamínulas tratadas com laminina (onde foram tratadas com meio condicionado HEKn por 10 dias). No dia do experimento, o meio foi removido e as células foram incubadas com meio fresco (sem fatores) contendo 5 uM de Fura-2 AM (Molecular Probes) e 0,04% de ácido plurônico por uma hora a 37ºC. Em seguida, esta solução foi substituída por tampão de fluorimetria, composto por (em mM): 145 de NaCl, 5 de KCl, 1,2 de NaHPO 4, 1,5 de CaCl2, 10 de D-glicose, 5 de HEPES, pH 7,4. Se um antagonista foi usado, ele foi adicionado a esta solução neste momento. Após 30 minutos a 37ºC, as lamínulas foram levadas para um microscópio invertido (Nikon) equipado com uma câmera CCD (Orca, Hamamatsu Photonics) e uma fonte de luz Lambda DG+4 (Sutter Instrument). As imagens foram obtidas a cada 500 milissegundos via software MetaFluor (Molecular Probes) e os níveis de fluorescência foram representados em pseudo-cor. Todos os fármacos foram preparados a fresco e diluídos no tampão de fluorimetria, com a estimulação controle contendo apenas veículo (etanol a 0,1%).

3. ELISA

[105] Os níveis da substância P (SP) foram determinados usando um kit de ELISA disponível no mercado (Cayman), seguindo as instruções do fabricante. Os neurônios sensoriais foram cultivados em um frasco de cultura de 24 poços em alta confluência. Após 24 h, as células foram lavadas com tampão de fluorimetria e incubadas com diferentes concentrações de agonistas TRPV1 por 45 minutos no mesmo tampão. Quando um antagonista foi utilizado, o mesmo foi aplicado 15 minutos antes e a solução foi alterada para agonista mais antagonista. — Posteriormente, os sobrenadantes foram coletados e imediatamente utilizados com o kit ELISA. Todos os experimentos foram realizados em triplicatas e os níveis de absorbância foram mensurados em um leitor de microcultura.

RESULTADOS

[106] As hiPSCs foram diferenciadas em células progenitoras da crista neural (NCPCs) pelo tratamento com inibidores de Smad durante 10 dias, quando as NCPCs foram obtidas (D10, Figura 1). Em seguida, as células foram dissociadas, cultivadas em placas de 96 poços e caracterizadas para a expressão de marcadores de NCPCs. As NCPCs foram positivas para Nestina (Figura 2a, d, g ej), TRPV1 (Figura 2b), Periferina (Figura 2e), Pax6 (Figura 2h) e BRN3a (Figura 2k) e negativos para Islet1.

[107] No dia 10, as NCPCs foram trocadas para meio contendo FGF e EGF por 2 dias, e em seguida foram semeadas em placas revestidas com PLO/Laminina. Em seguida, as células foram mantidas em meio 3N com adição de BDNF, ácido ascórbico, GDNF, NGF, NT-3 e AMPc, resultando na formação de neurônios sensoriais periféricos. É importante notar que os neurônios tendem a formar estruturas semelhantes a gânglios após 7 dias em meio 3N, o que também é descrito para culturas primárias de camundongo e rato. No dia 33 (D33) de diferenciação, as células foram descoladas enzimaticamente e recultivadas em placas de 96 poços.

[108] Os neurônios sensoriais periféricos imaturos foram tratados com meio HEKn condicionado. O meio HEKn condicionado foi misturado com o meio 3N a 75% e adicionado aos neurônios por 2, 5 e 10 dias. Em seguida, quantificou-se a maturação neuronal com coloração de B-Tubulina Ill nesses diferentes momentos. Os neuritas que emanam das estruturas semelhantes a gânglios aumentaram de maneira robusta ao longo desse tempo, aproximadamente 157% de comprimento após 5 dias em cultura e 542% após dias (Figuras 3a, b, e c). A presença de meio condicionado HEKn é responsável por um aumento de 17,4% na diferenciação dessas células quando comparadas às de culturas controle (Figura 3e).

[109] Existem vários marcadores que compõem o perfil de expressão distinto dos neurônios somatossensoriais. Foi avaliada a expressão de TRPV1 (Figura 4a-g9), Periferina (PRPH, Figura 4h-n) e Islet1 (Figura 40-u). Todos os marcadores apresentaram expressão aumentada nos momentos observados (Figuras 49, n e u). Esses resultados mostram que o meio condicionado promoveu maturação e crescimento de neurônios sensoriais, pois exibiram maior expressão de marcadores de diferenciação, características da transição para a maturidade dos neurônios sensoriais.

[110] O canal TRPV1 é um canal não seletivo permeável a cátions, com significativa permeabilidade ao cálcio (Szallazi et al., The vanilloid receptor TRPV1: 10 years from channel cloning to antagonist proof-of-concept. Nat Rev Drug Discov, 2007; 6: 357-372). Por esse motivo, as medições intracelulares de cálcio foram usadas como representante da ativação de TRPV1. Foram quantificados os aumentos de cálcio mediados pela ativação de TRPV1, através da obtenção de imagens dinâmicas de cálcio transitório em células individuais. Nestes experimentos a atividade induzida por capsaicina pode ser detectada (Figura 5).

[111] As PSNs respondem a substâncias irritantes, como a capsaicina, através da liberação de neuropeptídeos na extremidade epidérmica e glutamato e neuropeptídeos no corno dorsal da medula (Basbaum et al. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 2009; 139: 267 - 284). Para verificar se os neurônios sensoriais eram funcionais em relação à liberação de neuropeptídeos, após D33, eles foram semeados em placas de 24 poços e tratados 10 dias com meio HEKn condicionado. A substância P apresentou um nível basal de aproximadamente 3 pg/ml/h. A capsaicina a 300 nM foi capaz de triplicar essa quantidade, embora esse aumento não tenha sido estatisticamente significativo. Esse aumento foi bloqueado eficientemente pelo tratamento com capsazepina a 1 uM. Uma concentração mais alta de capsaicina foi aplicada (3 pv), mas não mostrou aumento da liberação, provavelmente devido à dessensibilização por TRPV1. A pré-incubação com vermelho de rutênio (10 uM) seguido de capsaicina (3 uM) pareceu diminuir a liberação de substância P abaixo dos níveis basais. De maneira interessante, a anandamida (10 UM) evocou a maior liberação de substância P nessas células. Finalmente, quando uma solução com alto teor de potássio (70 mM) foi adicionada para despolarizar os neurônios, obteve-se liberação da substância P equivalente à 300 uM de capsaicina (Figura 6).

[112] Na presente invenção, é mostrada a importante atividade de TRPV1, a liberação de SP mediada por capsaicina e anandamida na cultura celular produzida pelo método de acordo com a presente invenção, que pode ser usada para rastrear substâncias irritantes e possivelmente analgésicos.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO PARA INDUZIR A DIFERENCIAÇÃO EM CÉLULAS NEURONAIS SENSORIAIS PERIFÉRICAS (PSN), caracterizado por compreender: (a) o fornecimento de: (i) uma cultura celular compreendendo células tronco humanas; (ii) um meio 3N; (iii) pelo menos um inibidor da via SMAD; (b) o contato da referida célula-tronco de (i) com (ii) e (iii) em um primeiro frasco de cultura por 2 a 22 dias in vitro; (c) o contato em um segundo frasco de cultura das células diferenciadas primárias com meio 3N, suplementado com pelo menos um mitógeno, revestido com poli- ornitina/laminina, em que as células diferenciadas primárias são mantidas na referida cultura por até 12 dias; (d) o contato das células diferenciadas primariamente com meio SN, suplementado com pelo menos um fator neurotrófico, pelo menos um indutor da diferenciação e pelo menos um indutor da transdução celular, mantendo as células diferenciadas primárias por 5 a 25 dias em cultura para se obter células diferenciadas secundárias; (e) o cultivo das células diferenciadas secundárias de 2 a 22 dias em meio condicionado de queratinócitos neonatais de epiderme humana (HEKn).

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo referida célula-tronco humana ser uma célula-tronco pluripotente induzida humana (hiPSC).

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos inibidores da via SMAD serem escolhidos de LDN193189, SB431542 e CHIR, ou qualquer mistura dos mesmos.

4, MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo LDN193189 estar entre cerca de 100 e cerca de 700 nM, o SB431542 estar entre cerca de 0,1 e cerca de 100 uM e o CHIR estar entre cerca de 0,1 a cerca de 10 uM.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas células diferenciadas primárias serem células progenitoras da crista neural (NCPCs).

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos mitógenos serem escolhidos dentre fatores de crescimento de fibroblastos (tal como FGF-2) e EGF, ou qualquer mistura dos mesmos.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fator neurotrófico ser escolhido dentre fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator neurotrófico derivado da linhagem de células gliais (GDNF), NT-3, fator de crescimento neural (NGF) ou qualquer mistura dos mesmos.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo indutor de diferenciação ser escolhido a partir do ácido ascórbico.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo indutor de transdução celular ser escolhido a partir de adenosina monofosfato cíclico (AMPc).

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas células diferenciadas secundárias serem células neuronais sensoriais periféricas (PSN).

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelas NCPCs expressarem um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste em Nestina, TRPV1, Periferina, Pax 6 e BRN3a.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos neurônios sensoriais periféricos expressarem um ou mais marcadores selecionados a partir do grupo que consiste em TRPV1 e Substância P.

13. MÉTODO DE TRIAGEM DE UM AGENTE BIOLÓGICO /N VITRO, caracterizado por compreender; (a) o fornecimento de: (i) neurônios sensoriais periféricos derivados in vitro de um método para induzir a diferenciação de células neuronais sensoriais periféricas (PSN), conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12; (ii) um composto teste; e (b) o contato dos referidos neurônios sensoriais periféricos com o referido composto teste e a medição da função dos neurônios sensoriais periféricos, de modo que a referida função é a medição de pelo menos uma atividade de marcador.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelos neurônios sensoriais periféricos serem derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSC).

15. — MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo marcador ser escolhido a partir de TRPV1 e Substância P.

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