BR112019026796B1 - Células de fluxo com revestimento com hidrogel - Google Patents

Abstract

Em um exemplo do método, uma camada de revestimento funcionalizada é aplicada em depressões de um substrato de célula de fluxo padronizado. As depressões são separadas por regiões intersticiais. Um iniciador é enxertado na camada de revestimento funcionalizada para formar uma camada de revestimento funcionalizada enxertada nas depressões. Um hidrogel é aplicado em pelo menos a camada de revestimento funcionalizada enxertada.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de patente provisório Norte-Americano Número de Série US 62/609,105, depositado em 21 de dezembro de 2017, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] As matrizes biológicas encontram-se entre uma ampla variedade de ferramentas utilizadas para a detecção e análise de moléculas, incluindo ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). Nestas aplicações, as matrizes são concebidas para incluir sondas para sequências de nucleotídeos presentes em genes humanos e de outros organismos. Em certas aplicações, por exemplo, de DNA individual e sondas de RNA podem estar ligadas em locais em uma grade geométrico (ou aleatoriamente) sobre um suporte de matriz. Uma amostra de teste, por exemplo, a partir de uma pessoa ou de organismo, pode ser exposta à grade, de modo a que os fragmentos complementares hibridizam para as sondas nos locais individuais na matriz. A matriz pode então ser analisada por varredura de frequências específicas de luz sobre os locais para identificar fragmentos que estão presentes na amostra, por meio de fluorescência dos locais no qual os fragmentos hibridizados.

[0003] As matrizes biológicas podem ser utilizadas para o sequenciamento genético. Em geral, a sequência genética envolve a determinação da ordem de nucleotídeos ou ácidos nucleicos em um comprimento de material genético, tal como um fragmento de DNA ou RNA. sequências de pares de base cada vez mais longas estão a ser analisada, e a informação sobre a sequência resultante pode ser utilizada em vários métodos de bioinformática para fragmentos logicamente se encaixam de modo a determinar com confiança a sequência de extensos comprimentos do material genético a partir dos quais os fragmentos foram derivados. Automatizado, exame baseado em computador de fragmentos característicos tem sido desenvolvido, e tem sido utilizada em mapeamento do genoma, a identificação de genes e a sua função, a avaliação de riscos de certas condições e estados de doença, e, assim por diante. Para além destas aplicações, matrizes biológicas podem ser utilizadas para a detecção e avaliação de uma vasta gama de moléculas, as famílias de moléculas, os níveis de expressão genética, polimorfismos de único nucleotídeo, e genotipagem.

INTRODUÇÃO

[0004] Em um primeiro aspecto, um método compreende a aplicação de uma camada de revestimento funcionalizada nas depressões de um substrato de célula de fluxo modelado, em que as depressões são separados por regiões intersticiais; enxertar um iniciador para a camada de revestimento funcionalizado, de modo a formar uma camada de revestimento funcionalizado enxertado nas depressões; e aplicação de um hidrogel na camada de revestimento funcionalizado enxertado.

[0005] Em um exemplo deste primeiro aspecto do método, o hidrogel é selecionado a partir do grupo que consiste em um poli (N-(5-azidoacetamidilpentil) acrilamida-co- acrilamida), poliacrilamida reticulada, um gel de agarose, e polietileno glicol reticulado.

[0006] Em um exemplo deste primeiro aspecto do método, o hidrogel é disposta sobre a camada de revestimento funcionalizado enxertado. Em um exemplo, o hidrogel é aplicada sobre a camada de revestimento funcionalizado nas depressões e em, pelo menos, algumas das regiões intersticiais. Em outro exemplo, a aplicação do hidrogel inclui depositar seletivamente o hidrogel na camada de revestimento funcionalizado enxertado nas depressões.

[0007] Em um exemplo deste primeiro aspecto do método, antes da aplicação da camada de revestimento funcionalizado, o método compreende ainda o tratamento de uma superfície do substrato célula de fluxo modelado para ligar um grupo funcional para a superfície para formar as depressões tratados e tratados intersticial regiões. Neste exemplo, a aplicação da camada de revestimento funcionalizado nas depressões inclui: aplicação da camada de revestimento funcionalizado nas depressões tratadas e nas regiões intersticiais tratados; e o polimento da camada de revestimento funcionalizado a partir das regiões intersticiais tratados.

[0008] Em um exemplo deste primeiro aspecto do método, a aplicação do hidrogel envolve a aplicação de uma mistura aquosa, incluindo de cerca de 0,001% até cerca de 0,1% (massa para volume) de um material hidrogel. Em um exemplo, o material hidrogel é selecionado a partir do grupo que consiste em um poli (N-(5-azidoacetamidylpentil) acrilamida- co-acrilamida), poliacrilamida reticulada, um gel de agarose, e polietileno glicol reticulado.

[0009] Em um exemplo deste primeiro aspecto do método, um perímetro do substrato da célula de fluxo modelado tem um espaçador camada a ele ligado, e após o hidrogel é aplicado, o modo compreende ainda ligação de uma tampa para a camada de espaçamento.

[0010] Em um exemplo deste primeiro aspecto do método, após a camada de revestimento é aplicada funcionalizado e antes de o iniciador é enxertado, o método compreende ainda a ligação de uma tampa para, pelo menos, algumas das regiões intersticiais.

[0011] Em um exemplo deste primeiro aspecto do método, a aplicação do hidrogel inclui depositar selectivamente o hidrogel na camada de revestimento funcionalizado enxertado. É para ser entendido que quaisquer funcionalidades deste primeiro aspecto do método podem ser combinadas em conjunto em qualquer forma e / ou configuração desejável.

[0012] Em um segundo aspecto, um método compreende a fixação de um silano ou um derivado de silano a uma superfície de um substrato padronizado, incluindo um canal de escoamento que apresenta depressões nela definidos, em que as depressões são separados por regiões intersticiais, formando assim depressões silanizadas e silanizada intersticial regiões; aplicação de uma camada de revestimento funcionalizado nas depressões silanizadas e nas regiões intersticiais silanizados; A camada de revestimento de polimento funcionalizado a partir das regiões intersticiais silanizados; enxertar um iniciador para a camada de revestimento funcionalizado nas depressões silanizadas para formar uma camada de revestimento funcionalizado enxertado nas depressões; e aplicação de um hidrogel na camada de revestimento funcionalizado enxertado nas depressões.

[0013] Em um exemplo deste segundo aspecto, a aplicação do hidrogel envolve a aplicação de uma mistura aquosa, incluindo de cerca de 0,001% até cerca de 0,1% (massa para volume) de um material hidrogel. Neste exemplo, o material hidrogel é selecionado a partir do grupo que consiste em um poli (N-(5-azidoacetamidylpentil) acrilamida-co- acrilamida), poliacrilamida reticulada, um gel de agarose, e polietileno glicol reticulado.

[0014] Em um exemplo deste segundo aspecto, uma camada de espaçador está ligada o substrato modelado e define um perímetro do canal de fluxo; e após o hidrogel é aplicada, o método compreende ainda a ligação de uma tampa para a camada de espaçamento.

[0015] Em um exemplo deste segundo aspecto, após a camada de revestimento funcionalizado é polida antes e o iniciador é enxertado, o método compreende ainda a ligação de uma tampa para, pelo menos, algumas das regiões intersticiais.

[0016] Em um exemplo deste segundo aspecto do método, a aplicação do hidrogel inclui a aplicação de hidrogel na camada de revestimento funcionalizado enxertado nas depressões. Em um exemplo, o hidrogel é aplicada sobre a camada de revestimento funcionalizado nas depressões e em, pelo menos, algumas das regiões intersticiais. Em outro exemplo, a aplicação do hidrogel inclui depositar seletivamente o hidrogel na camada de revestimento funcionalizado enxertado.

[0017] É para ser entendido que quaisquer funcionalidades deste segundo aspecto do método podem ser combinadas em conjunto de qualquer maneira desejável. Além disso, é para ser entendido que qualquer combinação de características deste aspecto do método e / ou do primeiro aspecto do método podem ser utilizados em conjunto, e / ou que todas as características de um ou ambos destes aspectos podem ser combinados com qualquer dos exemplos aqui descritos.

[0018] Em outro aspecto, uma célula de fluxo compreende um substrato padronizado incluindo depressões separadas por regiões intersticiais; química da superfície de sequenciamento ligado a cada uma das depressões, a química da superfície de sequenciamento incluindo: uma camada de revestimento funcionalizado; e um iniciador enxertado para a camada de revestimento funcional; e um hidrogel na química de superfície e, opcionalmente, na sequenciamento de algumas das regiões intersticiais.

[0019] Em um exemplo da célula de fluxo, o hidrogel é também sobre, pelo menos, algumas das regiões intersticiais.

[0020] Em um exemplo da célula de fluxo, a camada de revestimento funcionalizado é poli (N- (5- azidoacetamidilpentil) acrilamida-co-acrilamida).

[0021] Em um exemplo da célula de fluxo, o hidrogel é selecionado a partir do grupo que consiste em um poli (N- (5-azidoacetamidylpentil) acrilamida-co-acrilamida), poliacrilamida reticulada, um gel de agarose, e polietileno glicol reticulado.

[0022] Em um exemplo da célula de fluxo, o hidrogel é não enxertado à composição química da superfície.

[0023] Em um exemplo da célula de fluxo, o substrato modelado inclui pelo menos um canal de fluxo; as depressões são definidas no canal de fluxo de, pelo menos, um; e a célula de fluxo compreende ainda uma camada de espaçador ligado a outras regiões intersticiais do substrato modelado de tal modo que a camada espaçadora define um perímetro do canal de fluxo, pelo menos, um. Neste exemplo, a célula de fluxo pode compreender ainda uma tampa ligada à camada do espaçador.

[0024] É para ser compreendido que todas as características deste aspecto da célula de fluxo podem ser combinadas em conjunto de qualquer maneira desejável. Além disso, é para ser entendido que qualquer combinação de características deste aspecto da célula de fluxo e / ou do primeiro e / ou segundo aspectos do método podem ser utilizados em conjunto, e / ou que todas as características de qualquer um dos aspectos pode ser combinado com qualquer dos exemplos aqui descritos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0025] Características de exemplos da presente divulgação tornar-se- evidentes por referência à descrição detalhada que se segue e dos desenhos, em que números de referência iguais correspondem a semelhantes, embora talvez não idênticos, os componentes. Por uma questão de brevidade, os numerais de referência ou características que têm uma função previamente descrita pode ou não ser descrita em conexão com outros desenhos nos quais aparecem.

[0026] A Fig. l é um diagrama de fluxo que ilustra um exemplo de um processo aqui descrito;

[0027] Figura 2 é um diagrama de fluxo que ilustra um outro exemplo do processo aqui descrito;

[0028] As Figs. 3A a 3G e as Figs. 3A a 3D, 3H e 31 são vistas de cortes transversais esquemáticos que descrevem respectivos exemplos do processo aqui descrito;

[0029] A Fig. 4 é uma vista em corte transversal de uma célula de exemplo de fluxo formado pelos métodos ilustrados nas Figs. 3 A a 3G e as Figs. 3 A a 3D, 3H e 31;

[0030] A Fig. 5 é um gráfico que ilustra a percentagem de aglomerados de passagem do filtro (% PF) e a percentagem de depressões / poços ocupada com molde de DNA (% Ocupado) para ladrilhos de uma célula de fluxo comparativa sem revestimento de um hidrogel (1- 384 no eixo dos X) e telhas de uma célula de fluxo de exemplo incluindo um revestimento de hidrogel (385-768 no eixo-X);

[0031] A Fig. 6 é um gráfico da percentagem de aglomerados de passagem do filtro (% PF) versus uma concentração de molde (pM) para uma célula de fluxo de exemplo comparativo e um exemplo de célula de fluxo, incluindo um revestimento de hidrogel;

[0032] A Fig. 7 é um gráfico da percentagem líquida de aglomerados de passagem do filtro (% PF) após a remoção modelos duplicado com uma concentração de molde (pM) para a célula de fluxo exemplo comparativo e o exemplo de células de fluxo incluindo o revestimento de hidrogel; e

[0033] As Figs. 8A e 8B são trama do leitura 1 (Rl) (Fig. 8A) e a leitura 2 (R2) (Fig. 8B) as taxas de desadaptação após 150 ciclos de sequenciamento para a célula fluxo exemplificativa comparativa e a célula de fluxo de exemplo incluindo o revestimento de hidrogel.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0034] As células de fluxo são frequentemente utilizadas em operações de sequenciamento, ensaios, e outras aplicações biológicas. As células de fluxo padronizadas podem incluir um substrato ou suporte na qual ou sobre a qual depressões são definidas; e a superfície ativa quimicamente e / ou biologicamente química pode ser confinado às depressões. Como um exemplo, a química de superfície inclui uma camada de revestimento funcionalizado e um iniciador. Em algumas operações de sequenciamento, após o iniciador é imobilizado nas depressões do substrato da célula de fluxo, um modelo de sequenciamento (incluindo uma porção que é complementar ao iniciador) pode ser introduzido nas depressões, e, em seguida, o molde de sequenciamento pode ser amplificado para criar cópias idênticas do molde de sequenciamento (o processo de que é aqui referido como geração cluster).

[0035] Nos exemplos aqui revelados, um hidrogel (também aqui referido como um revestimento de hidrogel) é incluído diretamente na química de superfície, isto é, sobre a camada de revestimento funcionalizado e o iniciador. Verificou-se que o revestimento de hidrogel pode abrandar o modelo de sequenciamento semeando velocidade no momento da geração de cluster. Como um resultado, depois de um molde de sequenciamento é semeada na depressão, há mais tempo (em comparação com quando o hidrogel não está incluído) para amplificar o molde em aglomerados maiores, antes de qualquer modelo de sequenciamento subsequente tem a oportunidade de se difundir através do hidrogel e na depressão. Isto aumenta a população de depressões que as sementes de um único molde de sequenciamento. Em outras palavras, esta aumenta agrupamento monoclonal (ou seja, a criação de cópias múltiplas de um tipo de modelo de sequenciamento) dentro de uma particular depressão, e reduz agrupamento policlonal (isto é, a criação de várias cópias de vários tipos de modelos de sequenciamento) dentro de um determinado depressão. O número de cachos de passagem do filtro após remoção duplicado pode ser indicativo de um maior agrupamento monoclonal. Em um exemplo, o PF% líquidos para os exemplos aqui revelados, incluindo o hidrogel revestimento varia desde cerca de 2% a cerca de 17% mais elevada do que o líquido PF% para os exemplos comparativos que não incluem o revestimento de hidrogel.

[0036] O método (s) aqui descrito pode ser realizado inteiramente ao nível da bolacha, inteiramente ao nível da matriz, em parte, no nível de bolacha, e / ou em parte, no nível de matriz. Como um exemplo de realização do método parcialmente nos níveis de bolacha e da matriz, o método pode ser iniciado utilizando uma bolacha, que é então cortado para formar várias fieiras, e o processo pode continuar a utilizar cada uma das fieiras. A capacidade de executar o processamento da bolacha aberta, pelo menos em alguns exemplos, permite que uma variedade de técnicas analíticas de metrologia / a ser usado para o controlo de qualidade e caracterização. Antes de ser ligados para formar uma célula de fluxo, o modelado e modificado superfície da bolacha / substrato pode ser exposto a, por exemplo, microscopia de força atómica (AFM), microscopia electrónica de varrimento (SEM), elipsometria, goniometria, Scatterometry, e / ou fluorescência técnicas. Alternativamente, a célula de fluxo ligado pode ser expostos a estas técnicas. Ao nível do molde, o método (s) pode ser realizada em uma matriz de cara aberta, ou em uma célula de fluxo montada (com um canal de escoamento fechado).

[0037] É para ser entendido que os termos aqui usados irão tomar no seu significado ordinário na técnica relevante, a menos que especificado de outra forma. Vários termos utilizados aqui e os seus significados são apresentados abaixo.

[0038] As formas singulares “um”, “uma”, e “o” incluem referentes plurais a menos que o contexto claramente dita o contrário.

[0039] Os termos compreendendo, incluindo, contendo e várias formas de estes termos são sinónimos uns com os outros e destinam-se a ser igualmente amplo.

[0040] A parte superior termos, em baixo, inferior, superior, sobre, etc., são aqui utilizados para descrever a célula de fluxo e / ou os vários componentes da célula de fluxo. É para ser entendido que estes termos direcionais que não são destinadas a implicar uma orientação específica, mas são usadas para designar orientação relativa entre os componentes. A utilização de termos direcionais que não devem ser interpretados para limitar os exemplos divulgados no presente documento a qualquer orientação específica (s).

[0041] Tal como aqui utilizado, “alquil” refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificada que está completamente saturada (isto é, não contém ligações duplas ou triplas). O grupo alquilo pode ter de 1 a 20 átomos de carbono. Grupos alquil de exemplo incluem metil, etil, propil, isopropil, butil, isobutil, butil terciário, pentil, hexil e semelhantes. Como um exemplo, a designação “Cl -4 alquil” indica que existem um a quatro átomos de carbono na cadeia alquilo, isto é, a cadeia de alquilo é selecionado a partir do grupo que consiste em metilo, etilo, propilo, iso- propil, n- butil, isobutil, sec-butil e t-butil.

[0042] Tal como aqui utilizado, “alquenil” refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificado contendo uma ou mais duplas ligações. O grupo alquenil pode ter de 2 a 20 átomos de carbono. Grupos alquenil exemplificativos incluem etenil, propenil, butenil, pentenil, hexenil e semelhantes.

[0043] Tal como utilizado aqui, “alquino” ou “alquinil” refere-se a uma cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificado contendo uma ou mais triplas ligações. O grupo alquinil pode ter 2 a 20 átomos de carbono.

[0044] Tal como utilizado aqui, “aril” refere-se a um anel ou sistema de anel aromático (ou seja, dois ou mais anéis fundidos que a quota de dois átomos de carbono adjacentes), contendo apenas carbono no esqueleto do anel. Quando o arilo é um sistema de anel, cada anel no sistema aromático. O grupo aril pode ter de 6 a 18 átomos de carbono. Exemplos de grupos aril incluem fenil, naftil, azulenil e antracenil.

[0045] Tal como aqui utilizado, o termo “ligado” refere- se ao estado de duas coisas sendo unidos, fixadas, aderido, ligado ou ligados um ao outro. A ligação pode ser mecânica, ou pode ser química. Por exemplo, um ácido nucleico pode ser quimicamente ligado a uma camada de revestimento funcionalizado por uma ligação covalente ou não-covalente. Uma ligação covalente é caracterizada pela partilha de electrões entre pares de átomos. A ligação não covalente é uma ligação física que não envolve a partilha de pares de electrões e pode incluir, por exemplo, ligações de hidrogénio, ligações iónicas, forças de van der Waals, interações hidrofílicas e interações hidrófobas.

[0046] Um “azida” ou grupo funcional “azido” refere-se a -N3.

[0047] Tal como utilizado aqui, a “região de ligação” refere-se a uma área sobre um substrato que é para ser ligado a um outro material, o qual pode ser, como exemplos, uma camada espaçadora, uma tampa, um outro substrato, etc., ou combinações dos mesmos (por exemplo, uma camada de espaçamento e uma tampa). A ligação que é formada na região de ligação pode ser uma ligação química (como descrito acima), ou uma ligação mecânica (por exemplo, utilizando um elemento de fixação, etc.).

[0048] Tal como utilizado aqui, “carbociclil” significa um sistema de anel ou um anel cíclico não aromático contendo apenas átomos de carbono na cadeia principal do sistema de anel. Quando o carbociclil é um sistema de anel, dois ou mais anéis podem ser ligados em conjunto em um fundido, em ponte ou espiro-ligado da forma. Carbociclis podem ter qualquer grau de saturação, desde que pelo menos um anel em um sistema de anel não seja aromático. Assim, carbociclis incluem cicloalquilos, cicloalquenilos e cicloalquinilos. O grupo carbociclil pode ter 3 a 20 átomos de carbono. Exemplos de anéis carbociclilo incluem ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-hexenilo, 2,3-di-hidro- indeno, biciclo [2.2.2] octanila, adamantila, e espiro [4,4] nonanilo.

[0049] Tal como aqui utilizado, o termo “ácido carboxílico” ou “carboxilo” como aqui utilizado refere-se a -C(0)OH.

[0050] Tal como utilizado aqui, “cicloalquileno” significa um sistema de anel carbociclil ou anel completamente saturado, que está ligado ao resto da molécula por meio de dois pontos de fixação.

[0051] Tal como utilizado aqui, “cicloalquenil” ou “cicloalqueno” significa um anel carbociclil ou sistema de anel tendo pelo menos uma ligação dupla, em que qualquer anel do sistema em anel é aromático. Os exemplos incluem ciclo-hexenil ou ciclo-hexeno e norbornenil ou norborneno. Também como aqui utilizado, “heterocicloalquenil” ou “heterocicloalqueno” significa um anel carbociclil ou sistema de anel com pelo menos um heteroátomo no esqueleto do anel, tendo pelo menos uma ligação dupla, em que qualquer anel do sistema em anel é aromático.

[0052] Tal como utilizado aqui, “cicloalquinil” ou “cicloalquino” significa um sistema de anel carbociclil ou anel possuindo pelo menos uma ligação tripla, em que qualquer anel do sistema em anel é aromático. Um exemplo é ciclooctine. Outro exemplo é biciclononine. Também como aqui utilizado, “Heterocicloalquinil” ou “heterocicloalquino” significa um anel carbociclil ou sistema de anel com pelo menos um heteroátomo no esqueleto do anel, tendo pelo menos uma ligação tripla, em que qualquer anel do sistema em anel é aromático.

[0053] O termo “depositar”, tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer técnica de aplicação apropriado, que pode ser manual ou automatizado, e os resultados em modificação das propriedades de superfície. Geralmente, deposição pode ser realizada utilizando técnicas de deposição de vapor, revestimento de técnicas, enxertia técnicas, ou outros semelhantes. Alguns exemplos específicos incluem deposição química de vapor (CVD), o revestimento por pulverização (por exemplo, revestimento por pulverização de ultrassons), revestimento por centrifugação, húmido ou revestimento por imersão, revestimento por lâmina espalhadora, poços de distribuição, fluir através do revestimento, por aerossol, impressão de jacto de tinta, ou semelhante.

[0054] Tal como aqui utilizado, o termo “depressão” refere-se a uma característica côncava discreta em um substrato modelado tendo uma abertura de superfície que está completamente rodeada por uma região intersticiais (s) da superfície do substrato modelado. Depressões podem ter qualquer uma de uma variedade de formas na sua abertura em uma superfície, incluindo, como exemplos, redonda, elíptica, quadrada, poligonal, em forma de estrela (com qualquer número de vértices), etc. A secção transversal de uma depressão feita com ortogonalmente a superfície pode ser curvo, quadrada, poligonal, hiperbólica, cónico, angular, etc. Como exemplo, a depressão pode ser um poço.

[0055] A expressão “cada”, quando usado em referência a uma coleção de itens, se destina a identificar um item individual na coleção, mas não necessariamente referir-se a cada item na coleção. Exceções podem ocorrer se a divulgação explícita ou contexto indique claramente o contrário.

[0056] Tal como aqui utilizado, o termo “célula de fluxo” é entendido significar um vaso que possui uma câmara (isto é, o fluxo de canal), em que uma reação pode ser efetuada, uma entrada para o fornecimento de reagente (s) para a câmara, e uma saída para a remoção de reagente (s) a partir da câmara. Em alguns exemplos, a câmara permite a detecção da reação que ocorre na câmara. Por exemplo, a câmara pode incluir um ou mais superfícies transparentes que permitem a detecção óptica de matrizes, moléculas marcadas opticamente, ou semelhantes, na câmara.

[0057] Tal como utilizado aqui, um “canal de fluxo” pode ser uma área definida entre dois componentes ligados, que pode receber seletivamente uma amostra líquida. Em alguns exemplos, o canal de fluxo pode ser definida entre um substrato padronizado e uma tampa, e, portanto, pode estar em comunicação fluídica com um ou mais depressões definidos no substrato modelado.

[0058] A “camada de revestimento funcionalizado” aqui referido pretende significar um material semirrígido que é permeável aos líquidos e gases. A camada de revestimento funcionalizado pode ser um hidrogel que pode inchar quando o líquido é levado para cima e que contrato lata quando o líquido é removido por secagem. Nos exemplos aqui descritos, a camada de revestimento inclui um grupo funcional azida / azida funcionalizado que pode reagir com um grupo funcional alquino. Em um exemplo, a camada de revestimento funcionalizado é poli (N- (5-azidoacetamidilpentil) acrilamida-co-acrilamida) (PAZAM).

[0059] Tal como aqui utilizado, “heteroaril” refere-se a um anel ou sistema de anel aromático (por exemplo, dois ou mais anéis fundidos que partilham dois átomos adjacentes), que contêm (s) um ou mais heteroátomos, ou seja, um elemento diferente de carbono , incluindo mas não limitado a, azoto, oxigénio e enxofre, na estrutura do anel. Quando o heteroaril é um sistema de anel, cada anel no sistema aromico. O grupo heteroaril pode ter 5-18 membros no anel.

[0060] Tal como utilizado aqui, “heterociclil” significa um sistema de anel ou um anel cíclico não aromático contendo pelo menos um heteroátomo na cadeia principal do anel. Heterociclilos podem ser unidos em conjunto de uma forma fundida, em ponte, ou espiro-ligado. Heterociclilos pode ter qualquer grau de saturação, desde que pelo menos um anel no sistema de anel não é aromático. No sistema de anel, a (s) heteroátomo pode estar presente em qualquer um anel não aromático ou aromático. O grupo heterociclilo pode ter 3 a 20 membros no anel (isto é, o número de átomos que constituem a espinha dorsal do anel, incluindo os átomos de carbono e heteroátomos). Em alguns exemplos, o heteroátomo (s) s O, N, ou S.

[0061] O termo “hidrazina” ou “hidrazinil” como aqui utilizado refere-se a um grupo -NHNH2.

[0062] Tal como aqui utilizado, o termo “hidrazona” ou “hidrazonil” como aqui utilizado refere-se a um grupo em que Ra e Rb são aqui definidos.

[0063] Um “hidrogel”, conforme aqui usado, refere-se a uma estrutura de rede de polímero tridimensional composto por cadeias de polímeros reticulados. O hidrogel não é solúvel em água ou amovível que os líquidos a qual está exposta durante a sequenciamento.

[0064] Tal como utilizado aqui, “hidroxi” ou “hidroxila” refere-se a um grupo -OH.

[0065] Tal como aqui utilizado, o termo “região intersticial” refere-se a uma área de um substrato ou sobre uma superfície que separa as depressões. Por exemplo, uma região intersticial pode separar uma característica de uma matriz a partir de uma outra característica da matriz. As duas características que são separadas umas das outras podem ser discretas, isto é, sem contato físico com a outra. Em um outro exemplo, uma região intersticial pode separar uma primeira porção de uma característica a partir de uma segunda porção de um recurso. Em muitos exemplos, a região intersticial é contínua enquanto que as características são discretas, por exemplo, como é o caso de uma pluralidade de cavidades definidas em uma superfície de outra maneira contínua. A separação é fornecida por uma região intersticial pode ser a separação parcial ou completo. As regiões intersticiais pode ter um material de superfície que difere do material da superfície das características definidas na superfície. Por exemplo, dispõe de uma matriz pode ter uma quantidade ou concentração da camada de revestimento e iniciador (es) que excede a quantidade ou concentração presentes nas regiões intersticiais. Em alguns exemplos, a camada de revestimento e iniciador (es) podem não estar presentes nas regiões intersticiais.

[0066] “óxido de nitrila,” tal como é aqui usado, significa um grupo “RaC=N+O-”, em que Ra é aqui definido. Exemplos de preparação de óxido de nitrila incluem a geração in situ a partir de aldoximas, por tratamento com cloramida- T ou através da ação de uma base em cloretos de imidoil [RC(Cl)=NOH]

[0067] “nitrona,” tal como é aqui usado, significa um grupo, em que R1, R2, e R3 podem ser qualquer dos grupos Ra e Rb aqui definidos.

[0068] Tal como utilizado aqui, um “nucleotídeo” inclui uma base contendo nitrogênio heterocíclico, um açúcar, e um ou mais grupos fosfato. Os nucleotídeos são as unidades monoméricas de uma sequência de ácido nucleico. No ARN, o açúcar é uma ribose, e no DNA, o açúcar é uma desoxirribose, ou seja, um açúcar que falta um grupo hidroxilo que está presente na posição 2' na ribose. A base contendo azoto heteroclico (isto é, de nucleobases) pode ser uma base de purina ou uma base de pirimidina. bases purinas incluem adenina (A) e guanina (G), e derivados modificados ou análogos. bases de pirimidina incluem citosina (C), timina (T) e uracila (U), e derivados modificados ou análogos. O átomo de Cl de desoxirribose está ligado a N-l de uma pirimidina ou N-9 de uma purina.

[0069] O termo “substrato de célula de fluxo” ou “substrato” refere-se a um suporte sobre o qual pode ser adicionado a química da superfície. O termo “substrato modelado” refere-se a um suporte na qual ou sobre a qual são definidas depressões. O substrato pode ser uma bolacha, um painel, uma folha retangular, de um molde, ou qualquer outra configuração adequada. O substrato é geralmente rígido e é insolúvel em um líquido aquoso. O substrato pode ser inerte a uma química que é usada para modificar as depressões. Por exemplo, um substrato pode ser inerte para a química usada para aplicar a camada de revestimento funcionalizado, para fixar o iniciador (es) para a camada de revestimento funcionalizado, para aplicar o hidrogel, etc. Exemplos de substratos adequados incluem siloxano epoxi, silsequioxanes oligoméricos poliédricos (POSS) ou seus derivados, vidro e vidro modificado ou funcionalizado, plástico (incluindo acrílico, poliestireno e copolímeros de estireno e outros materiais, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, politetrafluoroetileno (como TEFLON® de Chemours), polímeros cíclicos olefinas / ciclo-olefina (COP) (tal como, ZEONOR® de Zeon), poli-imidas, etc.), nylon, cerâmica / óxidos de cerâmica, sílica, sílica fundida, ou materiais à base de sílica (por exemplo, incluindo pelo menos 10% de sílica), silicato de alumínio, silício e silício modificado (por exemplo, dopado com boro P + silício), nitreto de silício (Si 3 N 4 ), óxido de silício (SI0 2 ), tântalo pentóxido (GAT) ou outro óxido de tântalo (s) (TAOx), óxido de háfnio (HA02) , carbono, metais, vidros inorgânicos, ou outros semelhantes. O substrato pode também ser de vidro ou de silício ou de POSS ou um seu derivado, com uma camada de revestimento de óxido de tântalo ou outro óxido de cerâmica na superfície.

[0070] Tal como utilizado aqui, “calcinação por plasma” refere-se a um processo de remoção de matéria orgânica a partir de um substrato por meio de um plasma de oxigénio. Os produtos que resultam de calcinação por plasma podem ser removidos com uma bomba de vácuo / sistema. calcinação por plasma pode ativar o substrato mediante a introdução de grupos hidroxilo reativos ou grupos carboxila.

[0071] Tal como utilizado aqui, o “iniciador” é definido como uma sequência de cadeia simples de ácido nucleico (por exemplo, DNA de cadeia simples ou RNA de cadeia única) que serve como um ponto de partida para a síntese de DNA ou RNA. Terminal 5' do iniciador pode ser modificado para permitir que uma reação de acoplamento com a camada de revestimento funcionalizado. O comprimento do iniciador pode ser qualquer número de bases de comprimento e podem incluir uma variedade de nucleotídeos não naturais. Em um exemplo, o iniciador de sequenciamento é uma cadeia curta, variando de 20 a 40 bases.

[0072] Como utilizado aqui, os termos “silano” e “derivado de silano” referem-se a um composto orgânico ou inorgânico contendo um ou mais átomos de silício. Um exemplo de um composto de silano inorgânico é SiH4, ou derivados halogenados SiH4, em que o hidrogênio é substituído por um ou mais átomos de halogéneo. Um exemplo de um composto de silano orgânico é XR -Si(OR)3, em que X é um grupo orgânico, tais como amino, de vinilo, metacrilato, epóxido enxofre, um grupo alquil, alquenil ou alquinil; RB é um espaçador, por exemplo -(CH2)n-, em que n é de 0 a 1000; Rc é selecionado a partir de hidrogênio, alquil opcionalmente substituído, alquenil opcionalmente substituído, alquinil opcionalmente substituído, carbociclilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído, opcionalmente substituído heteroarilo de 5-10 membros, e heterociclilo de 5-10 membros opcionalmente substituído como aqui definido. Tal como aqui utilizado, os termos “silano” e “derivado de silano” pode incluir misturas de diferentes silanos e / ou compostos derivados de silano.

[0073] Em alguns exemplos, o silano ou derivado de silano inclui um radical insaturado que é capaz de reagir com um grupo funcional da camada de polímero funcionalizado. Tal como aqui utilizado, o termo “radical insaturado” refere- se a um grupo quico que inclui alcenos, alquinos, cicloalquenos, cicloalquinos, heterocicloalquenos, heterocicloalquinos, ou variantes, opcionalmente substituídos dos mesmos, incluindo, pelo menos, uma ligação dupla ou uma ligação tripla. Os radicais insaturados podem ser mono-valente ou di-valente. Quando o grupo insaturado é mono-valente, cicloalqueno, cicloalquino, heterocicloalqueno, e heterocicloalquino são usados alternadamente com cicloalcenilos, cicloalquinilos, heterocicloalcenilo, e heterocicloalquinil, respectivamente. Quando o grupo insaturado é di-valente, cicloalceno, cicloalquino, heterocicloalqueno, e heterocicloalquino são usados alternadamente com cicloalcenileno, cicloalquinileno, heterocicloalkenylene, e heterocicloalquinileno, respectivamente.

[0074] O resíduo insaturado pode ser ligado covalentemente, quer diretamente aos átomos de silício do silano ou derivado de silano, ou indiretamente ligados através de ligantes. Exemplos de ligantes adequados incluem alquilenos opcionalmente substituído (por exemplo, radicais alifáticos bivalentes saturados (tais como, etileno) considerados como sendo derivados de um alceno por abertura da ligação dupla ou de um alcano por remoção de dois átomos de hidrogénio a partir de diferentes átomos de carbono), substituídos glicóis de polietileno, ou semelhantes.

[0075] Uma “camada de espaçamento”, tal como aqui utilizado refere-se a um material que se liga dois componentes em conjunto. Em alguns exemplos, a camada de espaçamento pode ser um material de absorção de radiação que auxilia na ligação ou pode ser colocado em contato com um material de absorção de radiação que auxilia na ligação.

[0076] O termo “superfície química,” tal como aqui utilizado refere-se quimicamente e / ou biologicamente ativo componente (s) que estão incorporados nas depressões do substrato modelado. Os exemplos de química de superfície aqui divulgados incluem a camada de polímero funcionalizado, ligado a pelo menos uma porção de uma superfície do substrato e / ou e o iniciador ligado a pelo menos uma porção da camada de polímero funcionalizado.

[0077] Um grupo funcional “tiol” refere-se a -SH.

[0078] Como utilizado aqui, os termos “tetrazina” e “tetrazinil” referem-se ao grupo heteroarilo de seis membros compreendendo quatro átomos de azoto. Tetrazina pode ser opcionalmente substituído.

[0079] “Tetrazol” tal como aqui utilizado, referem-se a um grupo heterocíclico de cinco membros, incluindo quatro átomos de azoto. Tetrazol pode ser opcionalmente substituído.

[0080] Um exemplo do método 100 é descrito na Fig. 1. O método 100 inclui a aplicação de uma camada de revestimento funcionalizado nas depressões de um substrato de célula de fluxo modelado, em que as depressões são separados por regiões intersticiais (como mostrado no número de referência 102) , enxertando um iniciador para a camada de revestimento funcionalizado de modo a formar uma camada de revestimento enxertado funcionalizado nas depressões (conforme ilustrado com o em umeral de referência 104), e a aplicação de um hidrogel em, pelo menos, a camada de revestimento funcionalizado enxertado (tal como, mostrado no número de referência 106).

[0081] O substrato célula de fluxo modelado pode ser uma bolacha padrão ou uma matriz modelada, ou qualquer dos outros substratos padronizados aqui divulgado. Pode ser utilizado qualquer exemplo do substrato aqui descrito. O substrato padronizado (mostrado como o em umeral de referência 12 nas Figs. 3A e 4) inclui depressões definidas em ou dentro de uma camada exposta ou superfície do substrato, e regiões intersticiais que separam as depressões adjacentes. As depressões podem ser fabricados em ou sobre o substrato, utilizando uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, fotolitografia, litografia nanoimpressão, técnicas de estampagem, estampagem técnicas, moldagem técnicas, micro ataque químico técnicas, imprimindo técnicas, etc. Como será reconhecido pelos técnicos versados no assunto, a técnica utilizada dependerá da composição e da forma do substrato. podem ser consideradas muitas disposições diferentes das depressões, como é discutido abaixo em referência à Fig. 4A.

[0082] Embora não mostrado na Fig. 1, antes da aplicação da camada de revestimento funcionalizado e enxertar o iniciador (isto é, antes de se adicionar a química de superfície), o método pode envolver o tratamento da superfície por exposição do substrato modelado para um processo de limpeza e / ou a outro processo que prepara a superfície (por exemplo, depressões e, em alguns casos, regiões intersticiais adjacentes) do substrato modelado para a deposição subsequente da química da superfície. Como um exemplo, o método pode envolver o tratamento da superfície do substrato de célula de fluxo modelado para ligar um grupo funcional para a superfície tratada para formar depressões e, em alguns casos, tratadas regiões intersticiais. Mais exemplos do processo de tratamento descrito (por exemplo, o processo de limpeza e o processo de preparação da superfície (s)) são discutidos mais adiante em referência às Figs. 3A a 3I.

[0083] No exemplo mostrado na Fig. 1, adicionando a química de superfície envolve a aplicação da camada de revestimento funcionalizado na depressão (s) (número de referência 102) e o iniciador de enxerto para a camada de revestimento funcionalizado (em umeral de referência 104).

[0084] Um exemplo da camada de revestimento funcionalizado inclui um copolímero de acrilamida, tais como poli (N- (5-azidoacetamidylpentil) acrilamida-co- acrilamida, PAZAM. PAZAM e algumas outras formas do copolímero de acrilamida são representados pela Fórmula (I): em que: RA é selecionado a partir do grupo que consiste em azido, amino opcionalmente substituído, alquenil opcionalmente substituído, hidrazona opcionalmente substituída, hidrazina opcionalmente substituído, carboxil, hidroxi, tetrazol opcionalmente substituído, tetrazina opcionalmente substituído, óxido de nitrila, nitrona e tiol; RB é H ou alquilo opcionalmente substituído; RC, RD e RE são selecionados de forma independente a partir do grupo que consiste de H e alquil opcionalmente substituído; cada um de a -(CH2)P- pode ser opcionalmente substituo; p é um número inteiro na gama de 1 a 50; n é um número inteiro no intervalo de 1 a 50.000; e m é um número inteiro na gama de 1 a 100.000.

[0085] Um técnico versado no assunto reconhecerá que o arranjo do recorrentes de “n” e “m” apresenta na Fórmula (I) são representativos, e as subunidades monoméricas podem estar presentes em qualquer ordem na estrutura do polímero (por exemplo, aleatória, em bloco, modelado, ou uma combinação dos mesmos).

[0086] Um exemplo específico de PAZAM são representados por: em que n é um número inteiro na gama de 1-20000, e m é um número inteiro na gama de 1-100,000.

[0087] O peso molecular do PAZAM pode variar de cerca de 10 kDa a cerca de 1500 kDa, ou seja, em um exemplo específico, a cerca de 312 kDa.

[0088] Em alguns exemplos, PAZAM é um polímero linear. Em alguns outros exemplos, PAZAM é um polímero ligeiramente reticulado.

[0089] Em outros exemplos, a camada de revestimento funcionalizado pode ser uma variação da Fórmula (I). Em um exemplo, a unidade de acrilamida pode ser substituída com N / N-dimetilacrilamida ( ) . Neste exemplo, a unidade de acrilamida na Fórmula (I) podem ser substituídos com , RD, RE, e RF são cada H, e RG e RH são cada um um grupo metil (em vez de H, tal como é o caso com a acrilamida). Neste exemplo, Q pode ser um número inteiro na gama de 1 a 100.000. Em outro exemplo, o N / N- dimetilacrilamida pode ser usado em adição à unidade de acrilamida. Neste exemplo, a Fórmula (I) podem incluir em adição as características recorrentes de “n” e “m”, em que RD, RE, e RF são cada um H, e Rg e Rh são cada um grupo metilo. Neste exemplo, Q pode ser um número inteiro na gama de 1 a 100.000.

[0090] É para ser compreendido que outras moléculas funcionalizadas podem ser usadas para formar a camada de revestimento funcionalizado, contanto que eles são funcionalizados para interagir com o substrato modelado e o iniciador subsequentemente aplicada (s). Outros exemplos de moléculas adequadas para a formação da camada de revestimento funcionalizado incluem aqueles que têm uma estrutura coloidal, tais como agarose; ou um polímero de estrutura de malha, tais como gelatina; ou uma estrutura do polímero com ligações cruzadas, tais como polímeros e copolímeros de poliacrilamida, acrilamida silano livre (SFA), ou uma versão azidolyzed de SFA. Exemplos de polímeros de poliacrilamida adequados podem ser sintetizados a partir de acrilamida e um ácido acrílico ou um ácido acrílico que contém um grupo vinilo, ou a partir de monómeros que formam [2 + 2] reações foto-cicloadição.

[0091] A molécula funcionalizada (por exemplo, PAZAM) pode ser depositado sobre a superfície do substrato modelado usando revestimento por rotação, imersão ou mergulho ou de revestimento, ou fluxo da molécula funcionalizada sob pressão positiva ou negativa, ou outra técnica adequada. A molécula funcionalizada pode estar presente em uma mistura. Em um exemplo, a mistura inclui PAZAM em água ou em uma mistura de etanol e água.

[0092] Depois de ter sido revestido, a molécula funcionalizada poderá também ser expostos a um processo de cura para formar a camada de revestimento funcionalizado através de todo o substrato modelado (isto é, sobre a depressão (s) e a região intersticial (s)). Em um exemplo, a cura da molécula funcionalizada pode ter lugar a uma temperatura que varia desde a temperatura ambiente (por exemplo, cerca de 25 ° C) a cerca de 60 ° C durante um tempo que varia desde cerca de 5 minutos a cerca de 2 horas.

[0093] Para formar a camada de revestimento funcionalizado na depressão (s) e não na região intersticial (s) do substrato padronizado, a camada de revestimento funcionalizado pode ser polido fora das regiões intersticiais usando i) uma suspensão de base aquosa, tendo um pH variando entre cerca de 7,5 a cerca de 11 e incluindo uma partícula abrasiva ou ii) uma almofada de polimento e uma solução livre de partículas abrasivas.

[0094] Neste exemplo do método 100, o iniciador é então enxertado na camada de revestimento funcionalizado permanece na depressão (s), como mostrado no número de referência 104, para formar uma camada de revestimento funcionalizado enxertado. Exemplos de iniciadores adequados incluem os iniciadores de amplificação diretos ou iniciadores de amplificação inversos. Os exemplos específicos de iniciadores adequados incluem os iniciadores P5 ou P7, que são usados na superfície de células de fluxo comerciais vendidos por Illumina Inc. para sequenciamento em HISEQ®, HISEQX®, MISEQ ™, MISEQX ™, NEXTSEQ ™, NOVASEQ ™, ™ GENOMA ANALISADOR e outras plataformas instrumento.

[0095] O enxerto pode ser realizado por revestimento úmido, o revestimento por pulverização, distribuição poça, ou por outro método adequado que vai anexar o iniciador (es) para a camada de revestimento funcionalizado em, pelo menos, algumas das depressões. Cada uma destas técnicas exemplo, pode utilizar uma solução de iniciador ou mistura, que pode incluir o iniciador (s), água, um tampão, e um catalisador.

[0096] de revestimento húmido pode envolver submergindo o substrato padronizado (tendo a camada de revestimento e funcionalizada na depressão (s) dos mesmos) para uma série de banhos de temperatura controlada. Os banhos podem também ser fluxo controlado e / ou coberta com um cobertor de azoto. Os banhos podem incluir a solução de primário ou mistura. Ao longo dos vários banhos, o iniciador (es) vai anexar à camada de revestimento funcionalizado em, pelo menos, alguns dos (s) da depressão. Em um exemplo, o substrato modelado revestido e polido vai ser introduzido em um primeiro banho, incluindo a solução de primário ou mistura onde uma reação tem lugar para prender o iniciador (es), e, em seguida, o substrato modelado será movido para banhos adicionais para lavar roupa. O substrato modelado pode ser movido a partir de banho de banho com um braço robótico ou manualmente. Um sistema de secagem também pode ser utilizado em um processo de revestimento úmido.

[0097] o revestimento por pulverização pode ser realizado por pulverização da solução de iniciador ou mistura diretamente sobre o revestimento e polido modelado substrato. A pastilha revestida pulverizar pode ser incubada durante um tempo que varia desde cerca de 4 minutos a cerca de 60 minutos a uma temperatura variando entre cerca de 0 ° C até cerca de 70 ° C. Após incubação, a solução de primário ou mistura pode ser diluída e removido usando, por exemplo, um revestidor de rotação.

[0098] poça de distribuição pode ser realizada de acordo com uma piscina e cisão método, e, portanto, pode ser realizada com um revestidor de rotação. A solução de primário ou mistura pode ser aplicada (manualmente ou através de um processo automatizado) para o revestimento e polido modelado substrato. A solução aplicada iniciador ou mistura podem ser aplicados ou distribuídos por toda a superfície do revestimento polido e substrato modelado. O substrato modelado revestida com primário pode ser incubada durante um tempo que varia desde cerca de 2 minutos a cerca de 60 minutos a uma temperatura variando entre cerca de 0 ° C até cerca de 80 ° C. Após incubação, a solução de primário ou mistura pode ser diluída e removido usando, por exemplo, o dispositivo de revestimento de centrifugação.

[0099] Em um exemplo, depois de o iniciador é enxertado para a camada de revestimento funcionalizado no (s) da depressão para formar a camada de revestimento funcionalizado enxertado, este exemplo do método 100 inclui ainda aplicar o hidrogel na camada de revestimento funcionalizado enxertado (tal como mostrado no número de referência 106).

[0100] O hidrogel pode ser qualquer polímero hidrofílico, que serve como um filtro de um dos modelos de sequenciamento que são expostas à célula de fluxo. A deposição do hidrogel é controlada em parte pela concentração de polímero em solução que é depositado sobre a célula de fluxo. Os retarda hidrogel para baixo a difusão dos modelos de sequenciamento para as depressões, e, portanto, permite que o tempo para um único molde de sequenciamento de semente e de cachos em uma depressão antes de outro modelo de sequenciamento é capaz de difundir-se através do hidrogel. O hidrogel também permanece na célula de fluxo, durante a semeadura modelo de sequenciamento e durante outras etapas de sequenciamento, e, portanto, não é solúvel em água ou amovível que os líquidos a qual está exposta durante a sequenciamento. Alguns exemplos de hidrogel incluem PAZAM (ou suas variações, tal como aqui descrito), reticulado poliacrilamida, um gel de agarose, ligação cruzada de polietileno glicol (PEG), ou outros semelhantes. O hidrogel pode ser outros copolímeros à base de acrilamida, copolímeros à base de agarose, ou copolímeros à base de PEG. É para ser entendido que um copolímero à base de X (por exemplo, com base acrilamida, agarose base, PEG com base, etc.) inclui a componente X, em uma quantidade de cerca de 10% ou mais da composição de peso molecular. Em alguns exemplos, o copolímero à base de X inclui cerca de 10% da composição de peso molecular, ou cerca de 11% da composição de peso molecular, ou cerca de 12% da composição de peso molecular, ou cerca de 15% da composição de peso molecular, ou cerca de 20% da composição de peso molecular, ou cerca de 39% da composição de peso molecular, ou uma percentagem mais elevada do componente X. Além disso, o componente X pode ser maior ou menor do que as percentagens indicadas, desde que as funções de copolímero como um hidrogel. Um reticulado PEG de hidrogel podem ser sintetizados via covalente de ligação cruzada de macrômeros de PEG com extremidades de cadeia reactivos, tais como acrilato, metacrilato, alilo éter, maleimida, vinil-sulfona, éster NHS e grupos de éter de vinilo. Qualquer um dos exemplos de hidrogéis podem incluir cadeias laterais hidrófobas ou hidrófilas.

[0101] O hidrogel não é enxertado com iniciador (es), mas, em vez reveste o iniciador (es).

[0102] Em alguns exemplos, o hidrogel pode ser depositada seletivamente, ou modelado, de modo a que a química da superfície (neste exemplo, a camada de revestimento funcionalizado e o primer (s) sobre a mesma) é coberta e de tal forma que uma região de ligação do fluxo modelado restos de substrato célula exposta. A região de ligação do substrato da célula de fluxo modelado está geralmente localizada na parte da região intersticial (s) do substrato da célula de fluxo modelado onde uma tampa será ligado ao substrato modelado. Quando o substrato é modelado uma bolacha, a região de ligação pode definir os limites (por exemplo, perímetros) de várias células de fluxo que estão a ser formados a partir da bolacha. Quando o substrato é uma matriz modelado, a região de ligação pode definir os limites exteriores (por exemplo, o perímetro) de uma célula de fluxo que está a ser formado. É para ser compreendido que a outra parte (s) do substrato da célula de fluxo modelado que não são parte da região de ligação pode ser revestido com o hidrogel.

[0103] Neste exemplo do método 100, depositando ou padronizando o hidrogel pode ser realizado através de incubação solução, revestimento por imersão, revestimento por rotação, revestimento por pulverização, revestimento por pulverização ultrassônica, revestimento de lâmina raspadora, de aerossol a impressão ou impressão a jacto de tinta seletivamente. A máscara pode ser usada para cobrir a região de ligação do substrato modelado de modo a que o hidrogel não é aplicada sobre a região de ligação. deposição seletiva do hidrogel podem ser utilizadas para depositar o hidrogel na camada de revestimento funcionalizado enxertado nas depressões, e não nas regiões intersticiais.

[0104] Em outros exemplos, a tampa pode ser ligada à região de ligação do substrato da célula de fluxo modelado depois da camada de revestimento funcionalizado é formado, e ambos os iniciadores e o hidrogel pode ser aplicada utilizando fluxo por meio de processos.

[0105] Cada um dos exemplos de técnicas para aplicar o hidrogel pode utilizar uma mistura aquosa, a qual pode incluir a água e até cerca de 0,1% (massa para volume) de um material hidrogel. Em alguns exemplos, o material hidrogel torna-se 0,1% ou menos da mistura aquosa. Em outros exemplos, a mistura aquosa inclui a partir de cerca de 0,001% a cerca de 0,1% do material de hidrogel, ou de cerca de 0,025% a cerca de 0,005% do material hidrogel. É para ser entendido que a concentração da mistura aquosa pode variar dependendo do escoamento da arquitetura celular (por exemplo, as dimensões das portas do canal de fluxo, de entrada e saída, etc). Por exemplo, quando o fluxo através da deposição é utilizada, a concentração pode ser selecionada de modo a que a mistura aquosa pode escoar através da célula de fluxo sem obstruir a porta (s), o fluxo de canal, etc. Como tal, a concentração também pode ser maior do que cerca de 0,1%. O material hidrogel (e o revestimento de hidrogel resultante) pode ser qualquer um dos exemplos descritos aqui (isto é, PAZAM ou variações destas, poliacrilamida reticulada, um gel de agarose, etc.).

[0106] Em alguns exemplos, a mistura aquosa pode também incluir aditivos, tais como co-solventes, anti-oxidantes, corantes, estabilizadores de luz ultravioleta, auxiliares de processamento, ou semelhantes. Estes aditivos podem ser incluídos na mistura aquosa, em quantidades que não afectam prejudicialmente a fluidez da mistura ou a capacidade de formação de película de hidrogel.

[0107] Após a mistura aquosa é aplicada, ela é deixada a incubar para formar o hidrogel. O tempo e temperatura para a solução de incubação pode ser qualquer temperatura e tempo que é suficiente para a formação de hidrogel. Como exemplos, a temperatura pode variar desde a temperatura ambiente até cerca de 65 ° C e o tempo pode variar de cerca de 5 minutos a cerca de 1 hora, ou mais. Em um exemplo, a solução de incubação tem lugar a uma temperatura de cerca de 50 ° C durante cerca de 10 minutos.

[0108] Em alguns casos, a mistura aquosa pode ser parcialmente seco durante a formação do hidrogel. secagem parcial pode ser conseguida através de exposição ao ar, a exposição de azoto, vácuo, aquecimento (por exemplo, em um forno), ou revestimento por centrifugação (isto é, girando até secar). Em um exemplo em que é utilizado aquecimento, a temperatura pode ser de cerca de 50 ° C, e o hidrogel pode ser mantida a esta temperatura durante cerca de 10 minutos. O hidrogel pode também ser lavado com um tampão diluído.

[0109] Um outro exemplo do método 200 é descrito na Fig. 2. O método 200 inclui ligação de um silano ou um derivado de silano a uma superfície de um substrato padronizado, incluindo um canal de escoamento que apresenta depressões nela definidos, em que as depressões são separados por intersticial regiões, formando assim depressões silanizadas e regiões intersticiais silanizadas (em umeral de referência 202), a aplicação de uma camada de revestimento funcionalizado nas depressões silanizadas e nas regiões intersticiais silanizadas (em umeral de referência 204); A camada de revestimento de polimento funcionalizado a partir das regiões intersticiais silanizadas (em umeral de referência 206); enxertar um iniciador para a camada de revestimento funcionalizado nas depressões silanizadas para formar uma camada enxertada funcionalizado revestimento nas depressões (em umeral de referência 208); e aplicação de um hidrogel na camada enxertada funcionalizado revestimento nas depressões (em umeral de referência 210). Exemplos do método 200 será adicionalmente descrita em referência às Figs. 3A a 3E, e nas Figs. 3A a 3D em combinação com as Figs. 3H e 31.

[0110] A Fig. 3A é uma vista em corte transversal de um exemplo do substrato 12. O substrato modelado padronizada 12 pode ser uma bolacha padrão ou uma matriz modelada, ou qualquer outro substrato modelado (por exemplo, painel, folha retangular, etc.). Pode ser utilizado qualquer exemplo do substrato 12 aqui descrito. A bolacha modelada pode ser usado para formar várias células de fluxo, e o molde modelado pode ser utilizado para formar uma única célula de fluxo. Em um exemplo, o substrato pode ter um diâmetro que varia de cerca de 2 mm a cerca de 300 mM, ou uma folha retangular ou painel que tem a sua maior dimensão até 10 pés (~ 3 metros). Em um exemplo, o wafer de substrato tem um diâmetro que varia de cerca de 200 mm a cerca de 300 mm. Em outro exemplo, a matriz de substrato tem uma largura que varia de cerca de 0,1 mm a cerca de 10 mm. Enquanto exemplo dimensões têm sido fornecida, é para ser entendido que os substratos com quaisquer dimensões adequadas pode ser usado.

[0111] O substrato modelado 12 inclui depressões 14 definidas em ou dentro de uma camada exposta ou superfície do substrato 12, e regiões intersticiais 16 que separam as depressões adjacentes 14. Nos exemplos aqui descritos, as depressões 14 tornam-se funcionalizado com a química de superfície (por exemplo, 20, 22), enquanto que as regiões intersticiais 16 pode ser usado para a ligação, mas não terá iniciador (es) (22 mostrada nas Figs. 3E-3G e 31) presente no mesmo.

[0112] As depressões 14 podem ser fabricados em ou sobre o substrato 12 utilizando uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, fotolitografia, litografia nanoimpressão, técnicas de estampagem, estampagem técnicas, moldagem técnicas, micro ataque químico técnicas, imprimindo técnicas, etc. Como será ser apreciado por aqueles na arte, a técnica utilizada dependerá da composição e da forma do substrato 12.

[0113] Muitos layouts diferentes das depressões 14 pode ser previsto, incluindo regular, repetindo, e os padrões não-regulares. Em um exemplo, as depressões 14 estão dispostas em um quadro hexagonal para fechar a embalagem e uma melhor densidade. Outras disposições podem incluir, por exemplo, esquemas retilíneas (isto é, retangulares), disposições triangulares, e assim por diante. Em alguns exemplos, o layout ou padrão pode ser um formato xy de depressões 14 que estão em linhas e colunas. Em outros exemplos, a disposição ou o padrão pode ser um arranjo de repetição de 14 depressões e / ou regiões intersticiais 16. Em ainda outros exemplos, a disposição ou o padrão pode ser um arranjo aleatório das depressões 14 e / ou regiões intersticiais 16. O padrão pode incluir pontos, almofadas, poços, postes, listras, redemoinhos, linhas, triângulos, retângulos, círculos, arcos, cheques, mantas, diagonais, setas, quadrados, e / ou transversais escotilhas.

[0114] A disposição ou o padrão pode ser caracterizada com respeito à densidade das depressões 14 (isto é, número de depressões 14) em uma zona definida. Por exemplo, as depressões 14 podem estar presentes a uma densidade de aproximadamente 2 milhões por mm2. A densidade pode ser ajustado para diferentes densidades, incluindo, por exemplo, uma densidade de pelo menos cerca de 100 por mm2, a cerca de 1000 por mm2, cerca de 0,1 milhões por mm2, cerca de 1 milhão por mm2, cerca de 2 milhões por mm2, cerca de 5 milhões por mm2, cerca de 10 milhões por mm2, cerca de 50 milhões por mm2, ou mais. Em alternativa ou adicionalmente, a densidade pode ser ajustado para ser não mais do que cerca de 50 milhões por mm2, cerca de 10 milhões por mm2, cerca de 5 milhões por mm2, cerca de 2 milhões por mm2, cerca de 1 milhão por mm2, sobre 0.100.000 por mm2, a cerca de 1000 por mm2, cerca de 100 por mm2 ou menos. Deve ser ainda entendido que a densidade de depressões 14 no substrato 12 pode situar-se entre um dos valores mais baixos e um dos valores superiores selecionados de entre os intervalos acima. Como exemplos, um arranjo de alta densidade pode ser caracterizado como tendo depressões 14 separados por menos do que cerca de 100 nm, uma gama de densidade média pode ser caracterizado como possuindo depressões 14 separadas por cerca de 400 nm a cerca de 01:00, e uma matriz de baixa densidade pode ser caracterizado como tendo depressões 14, separados por mais de cerca de 01:00. Enquanto exemplo densidades foram fornecidos, é para ser entendido que quaisquer substratos com densidades adequados podem ser utilizados.

[0115] A disposição ou o padrão pode também ou alternativamente, ser caracterizado em termos do campo médio, isto é, o espaçamento a partir do centro da depressão 14 ao centro de uma região intersticial adjacente 16 (espaçamento de centro a centro). O padrão pode ser regular, de tal modo que o coeficiente de variação em torno da média passo é pequena, ou o padrão pode ser não-normal, caso em que o coeficiente de variação pode ser relativamente grande. Em ambos os casos, o passo médio pode ser, por exemplo, pelo menos cerca de 10 nM, cerca de 12:01, cerca de 12:05, cerca de 01:00, cerca de 05:00, cerca de 22:00, cerca de 100 pm, ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, o passo médio pode ser, por exemplo, no máximo cerca de 100 pM, cerca de 22:00, cerca de 17:00, cerca de 01:00, cerca de 12:05, cerca de 12:01, ou menos. O passo médio de um padrão particular de locais de 16 pode estar entre um dos valores mais baixos e um dos valores superiores selecionados de entre os intervalos acima. Em um exemplo, as depressões 14 tem um passo (espaçamento de centro a centro) de cerca de 13:05. Embora tenham sido fornecidos exemplos de valores médios de passo, é para ser entendido que podem ser utilizados outros valores médios de passo.

[0116] Nos exemplos mostrados nas Figs. 3A a 31, as depressões 14 são poços 14', e, assim, o substrato modelado 12 inclui uma matriz de poços de 14' em uma das suas superfícies. Os poços 14' pode ser micropoços ou nanopoços. O tamanho de cada poço 14' pode ser caracterizado pelo seu volume, área da abertura do poço, profundidade, e / ou diâmetro.

[0117] Cada poço 14' podem ter qualquer volume que seja capaz de aprisionar um líquido. O volume mínimo ou máximo pode ser selecionado, por exemplo, para acomodar o débito (por exemplo, multiplexidade), resolução, composição de analito, ou a reatividade do analito prevista para utilizações a jusante da célula de fluxo. Por exemplo, o volume pode ser, pelo menos, cerca de 1x10-3 μm3, cerca de 1x10-2 μm3, cerca de 0.1 μm3, cerca de 1 μm3, cerca de 10 μm3, cerca de 100 μm3ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, o volume pode ser, no máximo, cerca de 1x104 μm3, cerca de 1x103 μm3, cerca de 100 μm3, cerca de 10 μm3, cerca de 1 μm3, cerca de 0.1 μm3 ou menos. É para ser entendido que a camada de revestimento funcionalizado pode encher a totalidade ou parte do volume de um poço 14'. O volume da camada de revestimento em um indivíduo bem 14' pode ser maior do que, ou menor do que entre os valores especificados acima.

[0118] A área ocupada por cada poço de abertura sobre uma superfície pode ser selecionado com base em critérios semelhantes como os descritos acima para o volume do poço. Por exemplo, a área de cada abertura bem sobre uma superfície pode ser, pelo menos, cerca de 1x10-3 μm2, cerca de 1x10-2 μm2, cerca de 0.1 μm2, cerca de 1 μm2, cerca de 10 μm2, cerca de 100 μm2 ou mais. Em alternativa ou adicionalmente, a zona pode ser, no máximo, cerca de 1x103 μm2, cerca de 100 μm2, cerca de 10 μm2, cerca de 1 μm2, cerca de 0.1 μm2, cerca de 1x10-2 μm2ou menos. A área ocupada por cada abertura bem pode ser maior do que, ou menor do que entre os valores especificados acima.

[0119] A profundidade de cada cavidade 14' pode ser, pelo menos, cerca de 12:01, cerca de 01:00, cerca de 10:00, cerca de 100 pm, ou mais. Em alternativa ou adicionalmente, a profundidade pode ser, no máximo, cerca de 1 x 10 3 horas, cerca de 100 pM, cerca de 10:00, cerca de 13:00, cerca de 12:01, ou menos. A profundidade de cada cavidade 14' pode ser maior do que, ou menor do que entre os valores especificados acima.

[0120] Em alguns casos, o diâmetro de cada cavidade 14' pode ser, pelo menos, cerca de 50 nM, cerca de 12:01, cerca de 12:05, cerca de 01:00, cerca de 22:00, cerca de 100 pm, ou mais. Alternativamente ou adicionalmente, o diâmetro pode ser, no máximo, cerca de 1 c 10 3 horas, cerca de 100 pM, cerca de 10:00, cerca de 13:00, cerca de 12:05, cerca de 12:01, ou menos (por exemplo, cerca de 50 nm). O diâmetro de cada cavidade 14' pode ser maior do que, ou menor do que entre os valores especificados acima.

[0121] O substrato padronizado 12 pode ser exposta a uma série de processos, a fim de adicionar a química da superfície 20, 22 na (s) 14 da depressão.

[0122] Embora não mostrado, é para ser entendido que o substrato padronizado 12 pode ser exposta a uma calcinação por plasma, a fim de limpar e ativar a superfície. Por exemplo, o processo de calcinação por plasma pode remover o material orgânico e introduzir grupos hidroxilo de superfície. Outros processos de limpeza adequados podem ser usados para limpar o substrato 12, dependendo, em parte, do tipo de substrato 12. Por exemplo, a limpeza química pode ser realizada com agentes oxidantes ou soluções cáusticas.

[0123] O substrato padronizado 12 (mostrado na Fig. 3A) pode então ser exposta a um processo que irá preparar a superfície 12 para a deposição do polímero funcionalizado para formar a camada de polímero funcionalizado 20 (Fig. 3C). Em um exemplo, o substrato 12 pode ser modelado expostos a silanização, o qual atribui um silano ou o derivado de silano 18 (Fig. 3B), para a superfície da bolacha modelado. Silanização introduz o silano ou o derivado de silano 18 em toda a superfície, incluindo na depressão 14, 14' (por exemplo, sobre a superfície de fundo e ao longo das paredes laterais) e nas regiões intersticiais 16. Em alguns aspectos, o silano ou derivado de silano é introduzido selectivamente apenas para as depressões de um substrato padronizado ou de microposições (que são isoladas umas das outras) de um substrato não-padronizado.

[0124] Silanização pode ser conseguida utilizando qualquer silano ou derivado de silano 18. A seleção do silano ou silano derivado 18 pode depender, em parte, a molécula funcionalizado que é para ser usado para formar a camada de polímero funcionalizado 20 (mostrado na Fig . 3C), como pode ser desejável de modo a formar uma ligação covalente entre o silano ou derivado de silano 18 e a camada de polímero funcionalizada 20. o método utilizado para acoplar o silano ou derivado de silano 18 para o substrato 12 pode variar dependendo do silano ou derivado de silano 18 que está a ser usado. Vários exemplos são apresentados aqui.

[0125] Em um exemplo, o silano ou derivado de silano 18 é (3 -aminopropil) tri etoxi silano (APTES) ou (3 - aminopropil) trimetoxi-silano (APTMS) (isto é, X-RB-Si(ORC)3, em que X é amino, R é - (CH 2 ) 3-, e R é etilo ou metilo). Neste exemplo, a superfície do substrato 12 pode ser pré- tratada com o (3 -aminopropil) tri etoxi silano (APTES) ou (3-aminopropil) trimetoxi-silano (APTMS) para ligação covalente de silício a um ou mais átomos de oxigénio na superfície ( sem a pretensão de ser realizada por um mecanismo, cada silício pode ligar-se a um, dois ou três átomos de oxigénio). Esta superfície quimicamente tratado é cozida para formar uma monocamada de grupo amina. Os grupos amina são, em seguida, feito reagir com Sulfo-HSAB para formar um derivado de az ido. Ativação ETV em 2l ° C com 1 J / cm 2 para 30 de J / cm 2 de energia gera uma espécie de nitreno ativas, que podem facilmente submetidos a uma variedade de reações de inserção com PAZAM (por exemplo, a molécula funcionalizada). Em alguns aspectos, um silano ou derivado de silano é aplicado seletivamente para as depressões de um substrato ou modelado para microposições sobre um substrato não modelado. Também podem ser utilizados

[0126] Outros métodos de silanização. Exemplos de métodos adequados incluem silanização de deposição de vapor, um método SIM, revestimento por centrifugação, ou outros métodos de deposição. Alguns exemplos de métodos e materiais que podem ser utilizados para silanizar o substrato 12 são aqui descrita, embora seja para ser entendido que outros métodos e materiais podem ser utilizados.

[0127] Em um exemplo utilizando a CVD SIM forno, o substrato modelado 12 é colocado no forno de CVD. A câmara pode ser ventilada e, em seguida, o ciclo de silanização iniciado. Durante a ciclagem, o silano ou recipiente derivado de silano pode ser mantida a uma temperatura adequada (por exemplo, cerca de l20 ° C durante silano norborneno), o silano ou linhas de vapor derivado de silano ser mantida a uma temperatura adequada (por exemplo, cerca de l25 ° C durante norborneno silano), e as linhas de vácuo ser mantida a uma temperatura adequada (por exemplo, cerca de L45 ° C).

[0128] Em outro exemplo, o silano ou derivado de silano 18 (por exemplo, silano norborneno líquido) pode ser depositado no interior de um frasco de vidro e colocado no interior de um exsicador de vácuo de vidro com um substrato padronizado 12. O exsicador pode em seguida ser evacuado para uma pressão variando desde cerca de 15 mTorr a cerca de 30 mTorr, e colocado dentro de um forno a uma temperatura variando entre cerca de 60 ° C até cerca de l25 ° C. Silanização é deixada prosseguir, e, em seguida, o exsicador é removido do forno, arrefecido e evacuado em ar.

[0129] A deposição de vapor, o método SIM e / ou o exsicador de vácuo pode ser usado com uma variedade de silano ou derivado de silano 18, tais como aqueles derivados de silano silano ou 18, incluindo exemplos dos radicais insaturados aqui descritos. Como exemplos, podem ser utilizados estes métodos, quando o silano ou silano derivado 18 inclui um alceno ou insaturado cicloalceno, tais como norborneno, um derivado de norborneno (por exemplo, um (hetero) norborneno, incluindo um átomo de oxigénio ou de azoto em vez de uma parte do carbono átomos), transciclooctene, derivados transciclooctene, transciclopentene, transcicloheptene, trans-ciclononeno, biciclo [3.3. l] non-l-eno, biciclo [4.3. l] dec-l (9) -eno, biciclo [4.2. l] non-l (8) -eno, e biciclo [4.2. l] non-l- eno. Qualquer destes cicloalcenos podem ser substituídos, por exemplo, com um grupo R, tal como hidrogénio, alquilo, alcenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalcenilo, cicloalquinilo, arilo, heteroarilo, heteroaliciclilo, aralquilo, ou (heteroaliciclilo) alquilo. Um exemplo do derivado de norborneno inclui [(5-biciclo [2.2. L] hept-2- enil) etil] trimetoxissilano. Como outros exemplos, estes métodos podem ser utilizados quando o silano ou silano derivado 18 inclui um alquino ou radical insaturado cicloalquino, tais como ciclooctyne, um derivado ciclooctine, ou biciclononynes (por exemplo, biciclo [6.l.0] non-4-ina ou seus derivados, biciclo [6.l.0] non-2- ino, ou biciclo [6. l.0] non-3-ino). Estes cicloalquinos pode ser substituído com qualquer um dos grupos R aqui descritos.

[0130] Como mostrado na Fig. 3B, a fixação do silano ou derivados de silano 18 forma um substrato silanizado modelado, incluindo depressões silanizadas e regiões intersticiais silanizadas (que são um exemplo das depressões tratados e as regiões intersticiais tratados).

[0131] A bolacha silanizada estampada pode então ser exposta a um processo que irá formar a camada de polímero funcionalizado 20 nas depressões silanizadas e regiões intersticiais silanizadas.

[0132] Como aqui descrito, exemplos da camada de polímero funcionalizado 20 incluem PAZAM, ou qualquer outra molécula que é funcionalizado para interagir com a pastilha estampados 12 e o iniciador subsequentemente aplicada (s) 22. A molécula funcionalizada pode estar presente em uma mistura. Em um exemplo, a mistura inclui PAZAM em água, ou em uma mistura de etanol e água. A camada de polímero funcionalizada 20 pode ser formada sobre a superfície da bolacha modelado silanizada (isto é, para as depressões silanizadas e as regiões intersticiais silanizados) usando qualquer técnica adequada. A molécula funcionalizada pode ser depositada na superfície do substrato 12 modelado usando revestimento por rotação, imersão ou mergulho ou de revestimento, ou fluxo da molécula funcionalizada sob pressão positiva ou negativa, ou outras técnicas adequadas. A camada resultante 20 está representada na Fig. 3C.

[0133] A fixação da camada de polímero funcionalizado 20 para as depressões silanizadas e regiões intersticiais silanizadas (isto é, 18) pode ser através de ligação covalente. A ligação covalente da camada de polímero funcionalizado 20 para as depressões silanizada é útil para manter a camada de polímero funcionalizado 20 nas depressões 14, 14' ao longo do tempo de vida da célula de fluxo, em última análise formada durante uma variedade de usos. A seguir estão alguns exemplos de reações que podem ocorrer entre o silano ou derivado de silano 18 e a camada de polímero funcionalizado 20.

[0134] Quando o silano ou silano derivado 18 inclui norborneno ou um derivado de norborneno, como o radical insaturado, o norborneno ou um derivado de norborneno lata: i) submeter a uma reação de cicloadição 1,3-dipolar com um grupo azida / azida de PAZAM; ii) submeter a uma reação de acoplamento com um grupo ligado a tetrazina PAZAM; iii) submeter a uma reação de cicloadição com um grupo ligado a hidrazona PAZAM; iv) submeter a uma reação foto-clique com um grupo tetrazolo ligado a PAZAM; ou v) submeter a uma cicloadição com um grupo óxido de nitrila ligado a PAZAM.

[0135] Quando o silano ou silano derivado 18 inclui ciclooctyne ou um derivado ciclooctine como o radical insaturado, o ciclooctine ou lata derivado ciclooctine: i) submeter a um alquino azida-1,3 -cicloadição (SPAAC reação promovida por estirpe) com uma azida / azido de PAZAM, ou ii) submetido a um alquino-nitrila reação de cicloadição óxido promoveu-tensão com um grupo óxido de nitrila ligado a PAZAM.

[0136] Quando o silano ou silano derivado 18 inclui uma biciclononyne como o radical insaturado, o biciclononyne pode sofrer semelhante cicloadição SPAAC alquino com azidas ou óxidos de nitrilo ligados a PAZAM devido à tensão no sistema de anel bicíclico.

[0137] Embora não mostrado, é para ser entendido que, em alguns exemplos do método, o substrato padronizado 12 pode não ser exposto a silanização. Em vez disso, o substrato 12 pode ser modelado expostos a calcinação por plasma, e, em seguida, a camada de polímero funcionalizada 20 pode ser directamente revestido rotativamente (ou de outra forma depositada) no plasma Incinera modelado substrato 12. Neste exemplo, a calcinação por plasma pode gerar agente de activação de superfície (s) (por exemplo, grupos -OH), que podem aderir a camada de revestimento funcionalizado 20 para o substrato modelado 12. Nestes exemplos, a camada de polímero funcionalizado 20 é selecionada de modo que ela reage com os grupos superficiais gerados por calcinação por plasma.

[0138] Depois de ter sido revestido, a molécula funcionalizada poderá também ser expostos a um processo de cura para formar a camada de polímero funcionalizado 20 ao longo de todo o substrato modelado (isto é, sobre a depressão (s) 14 e intersticial região (s) 16,). Em um exemplo, a cura da molécula funcionalizada pode ter lugar a uma temperatura que varia desde a temperatura ambiente (por exemplo, cerca de 25 ° C) a cerca de 95 ° C durante um tempo que varia desde cerca de 1 milissegundo a cerca de vários dias. Em outro exemplo, o tempo pode variar entre 10 segundos a pelo menos, 24 horas. Em ainda outro exemplo, o tempo pode variar de cerca de 5 minutos a cerca de 2 horas.

[0139] O substrato modelado silanizado e revestido (mostrado na Fig. 3C), pode ser exposto a um processo de limpeza. Este processo pode utilizar um banho de água e sonicação. O banho de água pode ser mantido a uma temperatura relativamente baixa que varia de cerca de 22 ° C a cerca de 45 ° C. Em outro exemplo, a temperatura varia de banho de água de cerca de 25 ° C a cerca de 30 ° C.

[0140] O silanizada e modelado substrato revestido é, então, exposta ao polimento, se necessário, para remover a parte (s) da camada de polímero funcionalizado 20 a partir das regiões intersticiais silanizadas. O silanizada, revestidos, e modelado substrato polido é mostrado na Fig. 3D. As porções do silano ou derivado de silano 18 que estão adjacentes às regiões intersticiais 16 podem ou não podem ser removidos como um resultado de polimento. Como tal, nas Figs. 3D a 31, as partes do silano ou silano derivado 18 que estão adjacentes às regiões intersticiais 16 está representada a tracejado, uma vez que podem, pelo menos parcialmente, permanecer após o polimento ou eles podem ser removidos após o polimento. Quando estas porções silanizadas são completamente removidos, é para ser entendido que o substrato subjacente 12 é exposto.

[0141] O processo de polimento pode ser realizado com uma pasta suave química (incluindo, por exemplo, um abrasivo, um tampão, um agente quelante, um tensoativo e / ou um agente dispersante), que pode remover a camada de polímero funcionalizado fina 20, e em Nalguns casos, pelo menos uma parte do silano ou derivado de silano 18, a partir das regiões intersticiais 16, sem afetar prejudicialmente o substrato subjacente 12 nessas regiões. Alternativamente, o polimento pode ser realizado com uma solução que não inclui as partículas abrasivas.

[0142] A pasta química pode ser utilizada em um sistema de polimento mecânico-químico de polir a superfície do substrato revestido modelado silanizada e mostrado na Fig. 3C. A cabeça de polimento (s) / bloco (s) ou outra ferramenta de polimento (s) é / são capazes de polimento a camada de polímero funcionalizado 20 a partir das regiões intersticiais 16, deixando a camada de polímero funcionalizado 20 nas depressões 14, 14' e deixando o substrato subjacente 12, pelo menos substancialmente intacta. Como um exemplo, a cabeça de polimento pode ser uma cabeça de polimento Strasbaugh ViPRR II.

[0143] Como mencionado acima, de polimento pode ser realizado com uma almofada de polimento e uma solução sem qualquer abrasivo. Por exemplo, a almofada de polonês pode ser utilizada com uma solução livre de partículas abrasivas (por exemplo, uma solução que não inclui partículas abrasivas).

[0144] O polimento remove parte (s) da camada de polímero funcionalizado 20 (e em alguns casos pelo menos uma parte do silano ou silano derivado 18) a partir das regiões intersticiais 16 e porção de folhas (s) da camada de polímero funcionalizado 20 no depressões silanizada, como mostrado na Fig. 3D. Além disso, como mencionado acima, a região intersticial (s) 16 pode permanecer silanizada após polimento é completa. Em outras palavras, as regiões intersticiais silanizadas pode permanecer intacto após o polimento. Alternativamente (como indicado pelas porções fantasma de 18), o silano ou silano derivado 18 pode ser removido da região intersticial (s) 16 como um resultado do polimento.

[0145] Embora não mostrado, é para ser entendido que o silanizada, revestida, polida e modelado substrato (mostrado na Fig. 3D) pode ser exposto a um processo de limpeza. Este processo pode utilizar um banho de água e sonicação. O banho de água pode ser mantido a uma temperatura relativamente baixa que varia de cerca de 22 ° C a cerca de 30 ° C. O substrato modelado silanizada, revestida, polida e podem também ser de centrifugação seca, ou seca por meio de outra técnica adequada.

[0146] O substrato silanizada, revestida, polida e modelado mostrado na Fig. 3D pode então ser exposto aos processos mostrados nas Figs. 3E através 3G, que geram a célula de fluxo 10, ou para os processos mostrados nas Figs. 3H através de 31, o que gera a célula de fluxo 10'. Nas Figs. 3E através 3G, os iniciadores 22 são enxertados e o hidrogel 24 é aplicado antes da tampa 26 está ligada ao substrato da célula de fluxo modelado 12. Nas Figs. 3H e 31, a tampa 26 está ligada ao substrato da célula de fluxo modelado 12 antes de os iniciadores 22 são enxertados e o hidrogel 24 é aplicado.

[0147] Na Fig. 3E, um processo de enxerto é realizado a fim de enxertar os iniciadores 22 para a camada de polímero funcionalizado 20 na depressão (s) 14, 14'. Neste exemplo, enxerto pode ser realizada por revestimento húmido, o revestimento por pulverização, distribuição poça, ou por outro método adequado que vai anexar o primer (s) 22 para a camada de polímero funcionalizado 20 em, pelo menos, algumas das depressões 14, 14'. Cada uma destas técnicas de exemplo pode utilizar a solução de primário ou mistura aqui divulgado, o que pode incluir o iniciador (s), água, um tampão, e um catalisador, e pode ser realizada como aqui descrito.

[0148] Como mostrado na Fig. 3F, após o iniciador 22 é enxertado para a camada de revestimento funcionalizado 20 nas depressões 14, 14', o hidrogel 24 é formada sobre a camada de revestimento funcionalizado enxertado 20, 22 e em pelo menos uma porção do fluxo modelado substrato célula 12. neste exemplo, o hidrogel 24 pode ser formada na superfície exposta do substrato com padrão 12, que não é parte de uma região de ligação 25. neste exemplo, o hidrogel 24 é seletivamente depositada ou modelado sobre as regiões intersticiais 16 entre depressões adjacentes 14, 14', mas não na borda / periferia do substrato modelado 12 onde a região de ligação 25 está localizado. A deposição seletiva / padronização do hidrogel 24 pode ser realizado utilizando a mistura aquosa, como aqui descrito. Depois da mistura aquosa é depositada, que pode ser parcialmente seco para formar o hidrogel 24.

[0149] Tal como representado na Fig. 3G, a tampa 26 pode então ser ligada à região de ligação 25. Quando o substrato célula de fluxo modelado 12 é uma bolacha, diferentes áreas da tampa 26 pode, pelo menos parcialmente definem respectivos canais de fluxo 30 que estão sendo formadas usando a bolacha. Quando o substrato da célula de fluxo é modelado 12 de um molde, a tampa 26 pode definir um ou mais canais de fluxo 30 que está / estão a ser formados.

[0150] A tampa 26 pode ser qualquer material que seja transparente para uma radiação de excitação que é dirigida para a química de superfície 20, 22 no (s) 14. Como exemplos a depressão, a tampa 26 pode ser de vidro (por exemplo, de borossilicato, fundido sílica, etc.), de plástico, ou semelhante. Um exemplo disponível comercialmente de um vidro de borosilicato é adequado D 263®, disponível a partir de Schott North America, Inc. comercialmente disponíveis exemplos de materiais plásticos adequados, ou seja, polímeros de olefina ciclo, são os produtos disponíveis a partir de ZEONOR® Zeon Chemicals LP.

[0151] Em alguns exemplos, a tampa 26 pode ser integralmente formada com parede lateral (s) 29, que correspondem com a forma da região de ligação 25, e que vai ser ligado à região de ligação 25. Por exemplo, uma reentrância pode ser gravada em um bloco transparente para formar uma forma substancialmente planar (por exemplo, no topo) 27 e porção de parede lateral (s) 29, que se prolonga a partir da porção substancialmente plana 27. Quando o bloco gravado é montado para a região de ligação do substrato modelado 12, o recesso pode tornar o canal de fluxo 30.

[0152] Em outros exemplos, a parede lateral (s) 29 e a tampa 26 podem ser componentes separados que são acoplados um ao outro. Por exemplo, a tampa 26 pode ser um bloco substancialmente retangular, que possui um, pelo menos, substancialmente plana superfície exterior e um pelo menos substancialmente plana superfície interior que define uma porção (por exemplo, uma porção de topo) do canal de fluxo 30 (uma vez ligado ao modelado substrato 12). O bloco pode ser montado sobre (por exemplo, ligado a) da parede lateral (s) 29, que estão ligados à região de ligação 25 do substrato da célula de fluxo modelado 12 e forma da parede lateral (s) do canal de fluxo 30. Neste exemplo, a parede lateral (s) 29 pode incluir qualquer um dos materiais aqui estabelecidos para a camada de espaçamento (descrito abaixo).

[0153] A tampa 26 pode ser ligado à região de ligação 25 do substrato da célula de fluxo modelado 12 utilizando qualquer técnica adequada, tal como a ligação a laser, soldadura por difusão, de ligação anódica, a ligação eutética, ligação de ativação de plasma, de ligação de frita de vidro, ou outros métodos conhecidos na arte. Em um exemplo, uma camada de espaçamento 28 podem ser usadas para ligação a tampa 26 para a região de ligação 25. A camada de espaçamento 28 pode ser qualquer material que vai selar, pelo menos, algumas das regiões intersticiais 16 (por exemplo, a região de ligação 25) de o substrato estampados 12 e a tampa 26 em conjunto.

[0154] Em um exemplo, a camada de espaçamento 28 pode ser um material de absorção de radiação que absorve radiação a um comprimento de onda que é transmitida pela tampa 26, e / ou modelado do substrato 12. A energia absorvida, por sua vez, forma a ligação entre a camada de espaçamento 28 e a tampa 26 e entre a camada espaçadora 28 e o substrato modelado 12. Um exemplo deste material que absorve radiação é preto KAPTON® (poliimida contendo negro de carbono) a partir de DuPont (EUA), que absorve a cerca de 1064 nm. É para ser entendido que poliimida pode ser utilizado sem a adição de negro de carbono, a não ser que o comprimento de onda deveria ser alterado para um que é significativamente absorvido pelo material de poliimida naturais (por exemplo, 480 nm). Como outro exemplo, poliimida CEN JP pode ser ligado quando irradiado com luz a 532 nm. Quando a camada de espaçamento 28 é o material de absorção de radiação, a camada de espaçamento 28 pode ser posicionado em uma interface entre a tampa 26 e o substrato 12, modelada de modo que a camada de espaçamento região 28 contata a ligação desejada 25. A compressão pode ser aplicada (por exemplo, cerca de 100 psi de pressão) enquanto que a energia laser a um comprimento de onda adequado é aplicado para a interface (ou seja, o material de absorção de radiação é irradiado). A energia laser pode ser aplicada para a interface tanto a partir do topo e do fundo, a fim de alcançar uma boa ligação adequado.

[0155] Em um outro exemplo, a camada de espaçamento 28 pode incluir um material de absorção de radiação em contato com o mesmo. O material absorvente de radiação pode ser aplicada na interface entre a camada espaçadora 28 e a tampa 26, bem como na interface entre a camada espaçadora 28 e o substrato da célula de fluxo modelado 12. Como um exemplo, a camada de espaçamento 28 podem ser poliimida e o material de absorção de radiação separada pode ser negro de fumo. Neste exemplo, o material de absorção de radiação separada absorve a energia laser que forma as ligações entre a camada espaçadora 28 e a tampa 26 e entre a camada espaçadora 28 e o substrato modelado 12. Neste exemplo, a compressão pode ser aplicada no respectivo enquanto interfaces de energia laser a um comprimento de onda adequado é aplicado às interfaces (isto é, o material de absorção de radiação é irradiada).

[0156] Quando o substrato de fluxo modelado 12 é uma pastilha, a camada de espaçamento 28 e paredes laterais 29 (ou ligado à tampa 26) pode fisicamente separado do canal de fluxo de um 30 a partir de um canal de fluxo adjacente 30 e pode ser localizado na periferia de as bolachas. Quando o substrato modelado 12 é uma fieira e a célula de fluxo 10 que está a ser formado é de incluir um único canal de fluxo 30 ou pista, a camada de espaçamento 28 e paredes laterais 29 (ou ligado à tampa 26) pode estar localizado na periferia do molde para definir o canal de fluxo 30 e vedar a célula de fluxo 10. Quando o substrato 12 é modelado de uma fieira e a célula de fluxo 10 que está a ser formado é incluir vários canais de fluxo 30 isolado (por exemplo, oito ou quatro canais de fluxo / pistas), a camada espaçadora 28 e paredes laterais 29 (ou ligados à tampa 26) pode fisicamente separados um canal de fluxo / pista 30 a partir de um canal de fluxo adjacente / pista 30 e pode ser localizado na periferia da matriz. É para ser compreendido, contudo, que a camada de espaçamento 28 e paredes laterais 29 podem estar localizados em qualquer região desejada, dependendo da implementação.

[0157] Quando o substrato é modelado 12 de um molde, a montagem da célula de fluxo 10 pode envolver a ligação da tampa 26. Quando o substrato é modelado uma bolacha, a montagem da célula de fluxo 10, pode envolver um processamento adicional, tal como o corte em cubos, após a tampa 26 está ligado. Em um exemplo, a tampa 26 pode ser ligada à bolacha modelado e 12 que cortam formas células de fluxo individuais 10. Tal como mencionado neste documento, sobre uma bolacha, as paredes laterais 29 de canal de fluxo 30 podem fisicamente ser separados a partir de um canal de fluxo adjacente 30, e, assim segmentado pode ter lugar por meio de, pelo menos, algumas das paredes laterais 29, de modo que cada célula de fluxo individuais 10 inclui um número desejável de canais de escoamento 30, cada um dos quais tem uma porção da parede lateral original de 29 em torno da sua periferia. Em outro exemplo, a bolacha pode ser modelada em cubos para formar matrizes não com tampa, que pode ter respectivas tampas 26 ligada ao mesmo de modo a formar células de fluxo individuais 10.

[0158] No exemplo mostrado na Fig. 3G, a tampa 26 inclui a parte superior 27 integralmente formada com parede lateral (s) 29. A parede lateral (s) 29 estão ligados à região de ligação 25 do substrato 12 modelado através do espaçador A camada 28.

[0159] Em conjunto, a tampa 26 e o substrato da célula de fluxo modelado 12 definem o canal de fluxo 30, que está em comunicação fluida seletiva com as depressões 14, 14'. O canal de fluxo 30 pode servir para, por exemplo, introduzir seletivamente componentes da reação ou os reagentes para o hidrogel 24 e a química da superfície subjacente 20, 22, a fim iniciam reações em designada / nível das depressões 14, 14'.

[0160] Um exemplo da célula de fluxo 10 é mostrado na Fig. 3G.

[0161] Referindo-nos agora às Figs. 3H e 31, um outro exemplo do método 200 inclui a ligação da tampa 26 para o substrato célula de fluxo modelado 12 antes de os iniciadores 22 são enxertados e o hidrogel 24 é aplicado.

[0162] Como mostrado na Fig. 3H, o revestimento funcionalizado camada 20 ter sido aplicada (por exemplo, depositados e polido) como descrito na Fig. 3D e em referência à Fig. 1. Pelo menos algumas das regiões intersticiais 16 polidos podem definir a região de ligação 25, e a tampa 26 pode ser ligado à região de ligação 25. a tampa 26 pode ser qualquer um dos materiais e pode ter qualquer das configurações descritas aqui. A tampa 26 pode ser ligado à região de ligação 25 por meio de qualquer das técnicas aqui descritas.

[0163] No exemplo mostrado na Fig. 3H, a tampa 26 inclui uma porção de topo 27 da parede lateral formada integralmente com o (s) 29. A parede lateral (s) 29 estão ligados à região de ligação 25 do substrato 12 modelado através do espaçador camada 28. Depois da tampa 26 está ligado, o canal de escoamento 30 é formado entre a tampa 26 e o substrato 12. o fluxo modelado canal 30 pode servir para introduzir seletivamente vários fluidos para a célula de fluxo 10' (Fig. 31).

[0164] Neste exemplo do método 200, o iniciador 22 é então enxertada na camada de revestimento funcionalizado 20 na depressão (s) 14, como mostrado na Fig. 31. Pode ser utilizado qualquer um dos iniciadores aqui descritos. Neste exemplo, o enxerto pode ser realizado por um fluxo através do processo. No fluxo através do processo, a solução de primário ou mistura aqui descritos pode ser introduzida no canal de fluxo (s) 30 através de respectivas portas de entrada (s) (não mostrado), pode ser mantido no canal de fluxo (s) 30 para um tempo suficiente (isto é, um período de incubação) para o iniciador 22 para fixar a camada de revestimento funcionalizado 20 em uma ou mais das depressões 14, e, em seguida, pode ser removido da respectiva porta de saída (s) (não mostrado). Depois de iniciador 22 de fixação, os adicionais de fluido (s) podem ser dirigidos através do canal de fluxo (s) 30 para lavar as depressões agora funcionalizados e o canal de fluxo (s) 30.

[0165] Após o iniciador 22 é enxertado para a camada de revestimento funcionalizado 20 na depressão (s) 14, este exemplo do método 200 inclui ainda a formação do hidrogel na camada de revestimento funcionalizado enxertado 20, 22 e em, pelo menos, algum do regiões intersticiais 16 (por exemplo, as regiões 16 entre as depressões 14).

[0166] Neste exemplo, o hidrogel de revestimento 14 pode ser depositado por um processo de fluxo por meio de. No fluxo através do processo, a mistura aquosa (incluindo a água e o material hidrogel) pode ser introduzido no canal de fluxo (s) 30 da célula de fluxo (s) através da respectiva porta de entrada (s) e pode ser mantido no canal de escoamento (s) 30. Chega-se a mistura aquosa pode ser introduzido para cobrir a camada de revestimento enxertada funcionalizada 20, 22 e quaisquer superfícies expostas do substrato célula de fluxo modelado 12 dentro do canal de escoamento 30. Isto formas solução de incubação o hidrogel revestimento 24. Em alguns exemplos, enquanto a mistura está no canal de fluxo (s) 30, o canal de fluxo (s) 30 pode ser exposta a uma seco baixo processo em que o ar, azoto, ou vácuo é lavada através da porta de entrada para um determinado período de tempo a secar parcialmente o hidrogel de revestimento 24 sobre a química de superfície 20, 22 e quaisquer porções expostas (por exemplo, algumas regiões intersticiais 16) do substrato 12. neste exemplo, o hidrogel de revestimento 24 pode ser qualquer um dos exemplos descritos neste documento.

[0167] Um exemplo da célula de fluxo 10” , formado pelos métodos 100, 200 aqui descritos é mostrada na Fig. 4. A célula de fluxo 10” inclui o substrato estampados 12, que pode ser uma matriz que tenha sido exposto aos processos do método 100, 200, ou uma pastilha que tem sido que foi exposta para os processos do método 100, 200 e foi cortada em cubos.

[0168] De um modo geral, o substrato modelado 12 inclui depressões 14 separados por regiões intersticiais 16, e a superfície de química 20, 22 posicionado nas depressões 14. A composição química da superfície inclui a camada de revestimento funcionalizado 20 e os iniciadores 22. Embora não mostrado, que é para ser entendido que as depressões 14 podem também ter a preparação da superfície ou a química de tratamento (por exemplo, silano ou um derivado de silano) posicionado entre o substrato 12 e a camada de revestimento funcionalizado 20. Esta mesma preparação de superfície ou a química de tratamento pode também ser posicionado no intersticial 16 regiões.

[0169] A célula de fluxo 10” também inclui a tampa 26, ligada à região de união (s) 25 do substrato modelado 12, em que a tampa 26, pelo menos, define parcialmente uma 30A canal de fluxo, 30B, etc., que está em comunicação seletiva com as depressões 14. no exemplo mostrado na Fig. 4, a tampa 26 inclui uma porção de topo 27 que está ligado a vários paredes laterais 29, e estes componentes 27, 29 define uma porção de cada um dos seis canais de fluxo 30A, 30B, 30C , 30D, 30E, 30F. O respectivas paredes laterais 29 isolado de uma 30A canal de fluxo, 30B, 30C, 30D, 30E, 30F a partir de cada canal de fluxo adjacente 30 A, 30B, 30C, 30D, 30E, 3 DE, cada canal de fluxo 30 A, 30B, 30C, 30D, 30E, 30F está em comunicação fluida seletiva com um conjunto respectivo das depressões 14.

[0170] Embora não seja mostrado, a tampa 26 ou o substrato padronizada 12 pode incluir orifícios de entrada e de saída que são para fluidicamente envolver outros portos (não mostrados) para dirigir fluido (s) para os respectivos canais de fluxo 30A, 30B, 30C, 30D , 30E, 30F (por exemplo, a partir de um cartucho de reagente ou outro sistema de armazenamento de fluido) e para fora do canal de fluxo (por exemplo, para um sistema de remoção de resíduos).

[0171] O hidrogel / hidrogel o revestimento 24 cobre a química da superfície 20, 22 nas depresssões 14, e pelo menos uma porção do substrato 12 modelado (por exemplo, as regiões intersticiais 16 que não são também regiões de ligações 25). Na célula de fluxo exemplo 10”, o hidrogel / hidrogel o revestimento 24 foi formado, tal como aqui descrito. Como tal, o hidrogel / hidrogel o revestimento 24 pode ser qualquer um dos exemplos descritos aqui (isto é, PAZAM, poliacrilamida reticulada, gel de agarose, etc.).

[0172] Embora não mostrado, é para ser entendido que alguns exemplos da célula de fluxo 10, 10', 10” podem ser fixadas diretamente para, e assim estar em contato físico com, um dispositivo de detecção (não mostrado) através de um ou mais mecanismos de fixação (por exemplo, adesivo, ligação, fixadores e semelhantes). O dispositivo de detecção pode incluir um dispositivo CMOS (que inclui uma pluralidade de camadas empilhadas incluindo, por exemplo, camada de silicone (s), a camada dielétrica (s), de metal-dielétrico camada (s), camada de metal (s), etc.) e componentes ópticos. Os componentes ópticos podem ser dispostos de tal modo que um sensor óptico do dispositivo de detecção é, pelo menos, substancialmente alinhado com, e, assim, é operativamente associado com, uma única guia de ondas tico do dispositivo de detecção e a química de superfície 20, 22, dentro de uma única depressão 14, 14' ou dentro de um canal 30 de fluxo da célula de fluxo.

[0173] Além disso, embora não mostrado, é para ser entendido que, em vez de ser ligado a uma tampa 26, um substrato funcionalizado (com a química de superfície, 20, 22 e o hidrogel / hidrogel revestimento 24 mesma) pode ser ligado a outro substrato funcionalizado com a química de superfície, 20, 22 e o hidrogel / hidrogel revestimento 24 sobre o mesmo. As duas superfícies funcionalizadas podem enfrentar uns aos outros e pode ter um canal de fluxo definido entre os mesmos. Uma camada de espaçamento e o método de ligação adequado poderá ser utilizado para ligação de dois dos substratos funcionalizados em conjunto.

[0174] As células de fluxo 10, 10', 10” aqui divulgados podem ser usados em uma variedade de sequenciamento se aproxima ou tecnologias, incluindo técnicas muitas vezes referida como a sequenciamento por síntese (SBS), sequenciamento-matriz cíclico, sequenciamento-a-ligação, pirossequenciamento, e assim por diante. Com qualquer destas técnicas e nos exemplos que utilizam um substrato padronizado, uma vez que a camada de polímero funcional 20 e ligado iniciador de sequenciamento (s) 22 estão presentes nas depressões funcionalizados (ou seja, 14, 14' com a química de superfície 20, 22 na mesma) e não nas regiões intersticiais 16, amplificação vai ser confinado às depressões funcionalizados. Além disso, devido à presença do hidrogel 24, não há mais tempo (em comparação com quando o hidrogel não está incluído) para amplificar um modelo de sequenciamento em aglomerados maiores, o que aumenta a população das depressões 14 em todo o substrato célula de fluxo modelado 12 que sementes de um único molde de sequenciamento.

[0175] Como um exemplo, um sequenciamento por reação de síntese (SBS) pode ser executado em um sistema, tal como o HISEQ ™, HISEQX ™, MISEQ ™, NOVASEQ ™, ou NEXTSEQ ™ sistemas sequenciador de Illumina, Inc. (San Diego, CA). No SBS, a extensão de um iniciador de ácido nucleico (por exemplo, iniciador 22) ao longo de um molde de ácido nucleico (ou seja, o modelo de sequenciamento) é monitorizado para determinar a sequência de nucleotídeos no molde. O processo químico subjacente pode ser de polimerização (por exemplo, catalisada por uma enzima polimerase) ou de ligação (por exemplo, catalisada por uma enzima ligase). Em um processo em particular à base de polimerase de SBS, nucleotídeos marcados com fluorescência são adicionados ao iniciador de 22 (estendendo-se desse modo o iniciador 22) de uma forma dependente do molde de tal modo que a detecção da ordem e tipo de nucleotídeos adicionados ao iniciador de 22 pode ser usada para determinar a sequência do molde. Por exemplo, para iniciar um primeiro ciclo de SBS, um ou mais nucleotídeos marcados, polimerase de DNA, etc, podem ser entregues em / através do canal 30 de fluxo, etc., que aloja um conjunto de iniciadores 22 revestido com o hidrogel 24. O funcionalizado depressões (isto é, 14, 14' com a química de superfície 20, 22 correspondentes), onde a extensão do iniciador provoca um nucleotídeo marcado para ser incorporada, pode ser detectada através de um evento de imagem. Durante um evento de imagem, um sistema de iluminação (não mostrado) pode proporcionar uma luz de excitação para as depressões funcionalizados (ou seja, 14, 14' com a química de superfície 20, 22 na mesma).

[0176] Em alguns exemplos, os nucleotídeos podem ainda incluir uma propriedade de terminação reversível que termina a extensão adicional do iniciador uma vez que um nucleotídeo tenha sido adicionado ao iniciador de 22. Por exemplo, um análogo nucleotídeo tendo um grupo terminador reversível pode ser adicionado ao iniciador 22 de tal modo que a extensão subsequente não pode ocorrer até que um agente de desmontagem é entregue para remover a porção. Assim, para os exemplos que a utilização da terminação reversível, um reagente de desproteção pode ser entregue ao canal 30 de fluxo, etc. (antes ou após a detecção ocorre).

[0177] A lavagem (es) pode ter lugar entre os vários passos de fornecimento de fluido. O ciclo de SBS pode então ser repetido n vezes para alongar o iniciador 22 por n nucleotídeos, detectando-se assim uma sequência de comprimento.

[0178] Enquanto o SBS foi descrito em detalhe, é para ser entendido que as células de fluxo 10, 10', 10” aqui descritas pode ser utilizada com outro protocolo de sequenciamento, para genotipagem, ou em outras aplicações biológicas e químicas e / ou.

[0179] Para ilustrar ainda mais a presente descrição, os exemplos são aqui dados. É para ser entendido que estes exemplos são fornecidos para fins ilustrativos e não são para ser interpretados como limitando o âmbito da descrição. EXEMPLOS DE TRABALHO NÃO LIMITATIVOS

Exemplo 1

[0180] célula de fluxo A foi usado que incluiu 8 de fluxo de canais / pistas definidas em um substrato modelado fundido sílica, onde cada pista incluiu 96 telhas (que correspondem com uma área de imagem), e em que cada azulejo foi em comunicação de fluido com uma pluralidade de poços. Uma camada PAZAM foi formada em cada poço, e 1 pm de iniciadores foram enxertados sobre a camada PAZAM.

[0181] As pistas 1-4, e, assim, pistas 1-384, foram exemplo faixas de rodagem e telhas comparativas. Como tal, um revestimento de hidrogel não foi aplicada sobre a camada de PAZAM ou os iniciadores nestas pistas e telhas.

[0182] As pistas 5-8, e, assim, azulejos 385-768, foram exemplo faixas de rodagem e telhas. Como tal, um revestimento de hidrogel foi aplicado sobre a camada de PAZAM e nos iniciadores nestas pistas e telhas. O revestimento de hidrogel era outra camada PAZAM que foi aplicado através do fluxo através de processo. Uma solução PAZAM 0,025% em água foi introduzido para pistas 5-8, foi aquecida a 60 ° C, e foi mantida a essa temperatura durante cerca de 10 minutos.

[0183] Todas as pistas foram lavadas com um tampão diluído.

[0184] Um ciclo de sequenciamento foi realizado em cada uma das pistas 1-8. foi usada solução de modelo Um Phi X sequenciamento com uma concentração de 150 pM.

[0185] A Fig. 5 mostra a percentagem de aglomerados que passam através de um filtro (filtro passando% (% PF)) e a percentagem de poços ocupadas com o molde de sequenciamento de DNA (% ocupados). Passando a % filtro (% PF) é a métrica utilizada para descrever aglomerados que passam um limiar de pureza são usados para posterior processamento e análise dos dados de sequenciamento. % Superior de passar filtro de resultados em maior rendimento de aglomerados únicos utilizados para os dados de sequenciamento.

[0186] Os dados da Fig. 5 mostra que o filtro passa% foi melhorados (em cerca de 5% a cerca de 10%) quando foi utilizado o hidrogel (comparar os dados para os ladrilhos de 1 a 384 (nenhum hidrogel) para os dados para os ladrilhos 385 através de 768 (com hidrogel).

[0187] A diferença entre a% Ocupado e a% PF é uma estimativa aproximada de aglomerados policlonais. A diferença entre a% Ocupado e a% PF telhas, por exemplo telhas 385 através de 768, é muito menos do que a diferença entre a% Ocupado e a% PF ladrilhos para os ladrilhos comparativos 1 a 384, o que indica que o PAZAM hidrogel revestidos telhas / pistas teve agrupamento muito menos policlonal do que as telhas / pistas não revestidos comparativos.

[0188] Em geral, os dados na Fig. 5 indica que a presença do revestimento de hidrogel ajuda a melhorar agrupamento monoclonal e a pureza do componente principal / cluster em poli cl poços de uma fragmentação, que também iria aumentar o rendimento de sequenciamento e a qualidade dos dados.

Exemplo 2

[0189] Foram utilizadas células de fluxo de duas, cada uma das quais incluía oito canais de fluxo são pistas definido em um substrato modelado fundido sílica, onde cada pista incluiu 96 telhas (e das zonas de imagem), e onde cada ladrilho foi em comunicação de fluido com uma pluralidade de poços. Uma camada PAZAM foi formada em cada poço, e 1 pm de iniciadores foram enxertados sobre a camada PAZAM.

[0190] Na célula de fluxo de comparativo, um revestimento de hidrogel não foi aplicada sobre a camada de PAZAM ou os iniciadores em qualquer uma das faixas de rodagem e telhas.

[0191] No exemplo da célula de fluxo, um revestimento de hidrogel foi aplicado sobre a camada de PAZAM e nos iniciadores em cada uma das faixas de rodagem e telhas. O revestimento de hidrogel era outra camada PAZAM que foi aplicado através do fluxo através de processo. Uma mistura / solução de PAZAM em água foi introduzido para pistas 1-8 da célula de fluxo exemplo, foi aquecida a 60 ° C, e foi mantida a essa temperatura durante cerca de 10 minutos.

[0192] Todas as pistas na célula de fluxo comparativo e o exemplo de células de fluxo foram lavadas com um tampão diluído.

[0193] ciclos de sequenciamento foram realizadas em cada uma das faixas 1-8 de cada um da célula de fluxo comparativo e o exemplo de células de fluxo. 151 ciclos foram sequenciados em readl, e mais 151 ciclos foram sequenciados em READ2. métricas de sequenciamento foram retirados do centro das telhas, para efeitos de borda remove. soluções molde de sequenciamento diferentes com diferentes concentrações variando de 100 pM a 800 pM foram usados em cada uma das pistas. Mais especificamente, a pista 1 de cada uma das células de fluxo comparativos e exemplos foi exposto a uma solução modelo de sequenciamento de 100 pM; pista 2 de cada uma das células de fluxo comparativos e exemplos foi exposto a uma solução modelo de sequenciamento de 200 pM; pista 3 de cada uma das células de fluxo comparativos e exemplos foi exposto a uma solução modelo de sequenciamento de 300 pM; Pista 4 de cada uma das células de fluxo comparativos e exemplos foi exposto a uma solução modelo de sequenciamento de 400 pM; pista 5 de cada uma das células de fluxo comparativos e exemplos foi exposto a uma solução modelo de sequenciamento de 500 pM; pista 6 de cada uma das células de fluxo comparativos e exemplos foi exposto a uma solução modelo de sequenciamento de 600 pM; pista 7 de cada uma das células de fluxo comparativos e exemplos foi exposto a uma solução modelo de sequenciamento de 700 pM; e pista 8 de cada uma das células de fluxo comparativos e exemplos foi exposto a uma solução modelo de sequenciamento de 800 pM.

[0194] A Fig. 6 mostra a percentagem de aglomerados que passam através de um filtro (% passando filtro (% PF) para as várias pistas do exemplo comparativo e as células exemplo de fluxo. Tal como ilustrado, a% PF foi mais consistente para o exemplo fluxo pistas celulares incluindo o hidrogel através de uma gama de concentrações mais larga do que as pistas de células fluxo comparativos com o hidrogel.

[0195] Os modelos duplicados foram removidas bioinformaticamente das pistas celulares exemplo de fluxo e as pistas celulares fluxo comparativos, de acordo com se as leituras de alinhamento exatos para as mesmas posições genômicas. O líquido% PF após remoção duplicado é mostrado na Fig. 7. Em geral, um rendimento mais elevado (a partir de cerca de 2% para o ganho de rendimento de cerca de 17%) pode ser obtido com a célula de fluxo de hidrogel revestidos usando moldes de sequenciamento que têm uma concentração que varia de 300 pM a 800 pM, quando comparado com a célula de fluxo comparativa.

[0196] O valor máximo% PF após remoção duplicado para a célula de fluxo comparativo era 76,13% na faixa exposta à solução de modelo de sequenciamento de 300 pM. O valor máximo% PF após remoção duplicado para a célula de fluxo foi de exemplo 83,42% na faixa exposta à solução de modelo sequenciamento de 600 pM. Este ilustra um ganho de 9,6% em aglomerados monoclonais.

[0197] As Figs. 8 A e 8B ilustram o lido um lido e 2 as taxas de desadaptação (MMR) para a célula de fluxo exemplo comparativo e a célula de fluxo exemplo depois de 150 ciclos de sequenciamento. As taxas de desadaptação semelhantes através das células de fluxo e comparativos exemplo indica que o revestimento de hidrogel não afeta prejudicialmente a operação de sequenciamento. Notas Adicionais

[0198] Deve ser apreciado que todas as combinações dos conceitos anteriores e conceitos adicionais discutidos em maior detalhe abaixo (desde que tais conceitos não são mutuamente incompatíveis) estão contemplados como sendo parte do tema inventivo aqui divulgado. Em particular, todas as combinações de matéria reivindicada aparecendo no final da presente memória descritiva são contemplados como sendo parte do tema inventivo assunto aqui divulgado. Também deve ser entendido que a terminologia aqui empregue explicitamente que também pode aparecer em qualquer divulgação incorporada por referência deve ser atribuído um significado mais consistente com os conceitos particulares aqui revelados.

[0199] As referências ao longo do relatório descritivo para “um exemplo”, “outro exemplo”, “o exemplo”, e assim por diante, significa que um elemento particular (por exemplo, recurso, estrutura, e / ou a característica) descrita em ligação com o exemplo está incluída em, pelo menos, um exemplo aqui descrito, e pode ou pode não estar presente em outros exemplos. Além disso, é para ser entendido que os elementos descritos para qualquer exemplo podem ser combinados de qualquer modo adequado nos vários exemplos, a menos que o contexto dite claramente o contrário.

[0200] É para ser compreendido que as faixas aqui proporcionadas incluem o intervalo indicado e qualquer valor ou sub-intervalo dentro do intervalo indicado. Por exemplo, uma faixa de 1 a 50000, deve ser interpretado para incluir não apenas os limites citados explicitamente de desde 1 até 50.000, mas também a incluir valores individuais, tais como cerca de 708, cerca de 945 cerca de 3500, etc., e sub- faixas, tal como a partir de cerca de 825 a cerca de 29000, a partir de cerca de 95 a cerca de 40000, etc. para além disso, quando “cerca de” e / ou “substancialmente” estão / é utilizado para descrever um valor, eles destinam-se a abranger variações menores (até a +/- 10%) a partir do valor indicado.

[0201] Enquanto vários exemplos foram descritos em detalhe, é para ser entendido que os exemplos descritos podem ser modificados. Portanto, a descrição anterior é para ser considerado não limitante.

Claims (12)

1. Célula de fluxo (10) caracterizada pelo fato de que compreende: um substrato padronizado (12) incluindo depressões (14) separadas por regiões intersticiais (16) e incluindo uma região de ligação (25); química da superfície de sequenciamento anexada a cada uma das depressões, a química da superfície de sequenciamento incluindo: uma camada de revestimento funcionalizada (20); e um iniciador (22) enxertado na camada de revestimento funcional; e um hidrogel não-enxertado em pelo menos na química da superfície de seqUenciamento, o hidrogel não enxertado selecionado do grupo que consiste em poliacrilamida reticulada, um gel de agarose e polietilenoglicol reticulado; uma tampa (26) fixada ao substrato padronizado na região de ligação, e um canal de fluxo (30) definido entre o substrato padronizado e a tampa.

2. Célula de fluxo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o hidrogel também está em pelo menos algumas das regiões intersticiais.

3. Célula de fluxo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a camada de revestimento funcionalizada é poli (N-(5- azidoacetamidilpentil) acrilamida-co-acrilamida).

4. Célula de fluxo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma camada espaçadora ligando a tampa à região de ligação.

5. Método para preparar a célula de fluxo, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende: aplicar uma camada de revestimento funcionalizada em depressões do substrato de célula de fluxo padronizado, em que as depressões são separadas por regiões intersticiais; enxertar o iniciador na camada de revestimento funcionalizada para formar uma camada de revestimento funcionalizada enxertada nas depressões; e aplicar o hidrogel sobre pelo menos a camada de revestimento funcionalizada enxertada, ligar uma tampa ao substrato padronizado.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o hidrogel está disposto na camada de revestimento funcionalizada enxertada e em algumas das regiões intersticiais.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que, antes de aplicar a camada de revestimento funcionalizada, o método compreende ainda o tratamento de uma superfície do substrato de célula de fluxo padronizado para conectar um grupo funcional à superfície para formar depressões tratadas e regiões intersticiais tratadas, opcionalmente, em quea aplicação da camada de revestimento funcionalizada nas depressões inclui: aplicar a camada de revestimento funcionalizada nas depressões tratadas e nas regiões intersticiais tratadas; e polir a camada de revestimento funcionalizada das regiões intersticiais tratadas.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que a aplicação do hidrogel envolve a aplicação de uma mistura aquosa incluindo de cerca de 0,001% a cerca de 0,1% (massa em volume) de um material de hidrogel.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato de que a região de ligação do substrato de célula de fluxo padronizado tem uma camada espaçadora (28) ligada a ela, e, em que após a aplicação do hidrogel, a ligação da tampa ao substrato padronizado compreende a ligação da tampa à camada espaçadora..

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5, 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a aplicação do hidrogel inclui depositar seletivamente o hidrogel na camada de revestimento funcionalizada enxertada.

11. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: anexar um silano ou um derivado de silano a uma superfície do substrato padronizado incluindo o canal de fluxo com depressões definidas no mesmo, em que as depressões são separadas por regiões intersticiais, formando, assim, depressões silanizadas e regiões intersticiais silanizadas; aplicar a camada de revestimento funcionalizada nas depressões silanizadas e nas regiões intersticiais silanizadas; polir a camada de revestimento funcionalizada das regiões intersticiais silanizadas; enxertar o iniciador na camada de revestimento funcionalizada nas depressões silanizadas para formar uma camada de revestimento funcionalizada enxertada nas depressões; e aplicar o hidrogel na camada de revestimento funcionalizada enxertada nas depressões.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a aplicação do hidrogel envolve a aplicação de uma mistura aquosa incluindo de cerca de 0,001% a cerca de 0,1% (massa em volume) de um material de hidrogel.