BR112019023225A2

BR112019023225A2 - Profilina-1 constitutivamente ativa para utilização na terapia e/ou tratamento de um distúrbio neurológico e/ou para promover regeneração neuronal, kit e seus produtos.

Info

Publication number: BR112019023225A2
Application number: BR112019023225-7A
Authority: BR
Inventors: Monica Luisa Ribeiro Mendes De Sousa; Sérgio Ricardo CARVALHO LEITE; Ana Rita PINTO COSTA; Raquel ALBUQUERQUE SIMÕES BAETA MENDES; Joana Beatriz ANTUNES MOREIRA CARVALHO MARQUES; Sara Patrícia Castro Sousa
Original assignee: Instituto De Biologia Molecular E Celular - Ibmc
Priority date: 2017-05-05
Filing date: 2018-05-07
Publication date: 2020-05-26
Also published as: CN110831616A; EP3618849A1; CA3098246A1; US20200190153A1; CA3062510A1; WO2018203313A1

Abstract

profilina-1 constitutivamente ativa para utilização na terapia e/ou tratamento de um distúrbio neurológico e/ou para promover regeneração neuronal, kit e seus produtos. a presente divulgação refere-se à utilização de profilina-1 constitutivamente ativa (pfn1s137a) para utilização na terapia e/ou tratamento de um distúrbio neurológico e/ou para promover regeneração neuronal, kit e seus produtos relacionados.

Description

PROFILINA-1 CONSTITUTIVAMENTE ATIVA PARA UTILIZAÇÃO NA TERAPIA E/OU TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO NEUROLÓGICO E/OU PARA PROMOVER REGENERAÇÃO NEURONAL, KITE SEUS PRODUTOS.

[001] A presente divulgação refere-se à utilização de profilina-1 constitutivamente ativa (Pfn1 S137A) para utilização na terapia e/ou tratamento de um distúrbio neurológico e/ou para promover regeneração neuronal, kit e seus produtos relacionados.

Descrição Geral

[002] Os neurônios de mamíferos estendem prontamente os seus axônios durante o desenvolvimento embrionário. Na transição de embrionário para adulto, a atividade intrínseca de crescimento neuronal é reprimida para permitir o correto desenvolvimento sináptico, de modo que os neurônios adultos estão num estado não regenerativo. Como tal, no sistema nervoso central (SNC) maduro dos vertebrados, os axônios, na sua maioria, não conseguem regenerar-se espontaneamente, colocando um grande obstáculo no tratamento de distúrbios neurológicos e de lesão do SNC. Um princípio fundamental que orienta a investigação na regeneração de axônios é que indícios extrínsecos no ambiente de neurônios, assim como mecanismos intrínsecos das células, contribuem para a limitada capacidade dos neurônios estenderem axônios no SNC doente/lesionado. Embora tenha havido progresso na caracterização dos indícios extrínsecos que inibem o crescimento de axônios, os mecanismos intrínsecos da célula que governam o crescimento e a regeneração de axônios permanecem pouco entendidos. Esta incapacidade de ativar um programa pró-regenerativo é um dos principais responsáveis pela incapacidade dos axônios do SNC adulto reconstruírem um cone de crescimento competente e se regenerarem após uma lesão.

[003] Independentemente da incapacidade geral dos axônios do SNC se regenerarem, é possível estimular a capacidade de crescimento intrínseca de axônios específicos do SNC. Em neurônios dos gânglios da raiz dorsal (GRD) sensoriais, quando o axônio periférico sofre lesão - um paradigma conhecido como lesão condicionante - o axônio central ganha capacidade regenerativa e é capaz de voltar a crescer no local de lesão da medula espinhal inibitória. Para identificar as moléculas subjacentes a este efeito, foi realizada uma comparação proteômica de neurônios do GRD colhidos de ratos com LME

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2/11 (condição não regenerativa) com os de ratos onde a LME foi precedida por uma lesão no nervo ciático sensibilizadora - lesão condicionante (condição altamente regenerativa). [004] Os dados proteômicos agora divulgados suportaram fortemente um papel central da profilina-1 (Pfn1) no crescimento e regeneração de axônios. A Pfn1 proporciona o conjunto de monômeros ATP-actina competentes que podem ser adicionados a extremidades filamentosas de actina livres, tais como as no domínio periférico do cone de crescimento, para suportar a sua polimerização e dinâmica.

[004] Um aspeto da presente divulgação demonstra que os níveis e a atividade da profilina-1 são críticos para a dinâmica da actina e dos microtúbulos (MT) necessária para ótimos crescimento e regeneração de axônios.

[005] A presente divulgação demonstra o papel central da profilina-1 (Pfn1) no suporte de ótimos crescimento e regeneração de axônios.

[006] Utilizando a lesão condicionante, um modelo em que a capacidade de regeneração de axônios, de axônios da coluna espinhal dorsal, é aumentada após uma lesão sensibilizadora no nervo ciático, determinou-se que os níveis totais de Pfn1 estão aumentados em axônios em regeneração enquanto a forma inativa da proteína está significativamente diminuída. In vitro, a sobre-expressão de Pfn1 constitutivamente ativa (Pfn1S137A) melhorou fortemente a dinâmica da actina e dos MT, e a excrescência de neuhtes.

[007] A presente divulgação mostra que in vitro, a queda aguda de Pfn1 prejudica gravemente a formação/crescimento de axônios em neurônios do hipocampo e o crescimento de axônios em neurônios dos gânglios da raiz dorsal (GRD). É interessante notar que a ablação de Pfn1 não apenas reduziu a dinâmica da actina como também diminuiu significativamente a velocidade de crescimento de microtúbulos. In vivo, ratinhos com uma deleção neuronal induzível de Pfn1 tinham reduzida regeneração de axônios, tanto de axônios dos GRD periféricos, como centrais, adicionalmente suportando o papel fundamental da Pfn1 para o ótimo (re)crescimento de axônios.

[008] In vivo, a entrega mediada por AAV de Pfn1 constitutivamente ativa aumenta a regeneração de axônios após lesão do nervo ciático; o seu efeito após lesão da medula

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3/11 espinhal está atualmente a ser avaliado. Em resumo, os dados experimentais mostram que a Pfn1 é um determinante da atuação da capacidade de regeneração de axônios.

[009] Numa forma de realização, a profilina é uma proteína citosólica ubíqua que é um participante fundamental na dinâmica do citoesqueleto de actina. Dado o papel da profilina neste componente fundamental de todos os tipos de células, antecipa-se que a desregulação da sua atividade basal possa resultar numa ampla variedade de doenças. [011] De fato, a Pfn1 foi relacionada com várias condições médicas incluindo Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), câncer (glioblastoma e câncer da mama, entre outros), aterosclerose e outros distúrbios vasculares. A este respeito, é muito importante que as estratégias que tenham como alvo a atividade da Pfn1 em neurônios sejam estritamente específicas da célula, para evitar efeitos secundários resultantes de desregulação da atividade da Pfn1 em outros tipos de células.

Descrição dos desenhos

[010] As figuras que se seguem proporcionam formas de realização preferidas para ilustração da descrição e não deverão ser consideradas limitativas do âmbito da divulgação.

[013] Figura 1. É necessária atividade de Pfn1 aumentada para uma regeneração ótima de axônios. (A) Representação esquemática do paradigma de lesão da medula espinhal condicionada utilizado no trabalho (à esquerda da linha tracejada cinzenta: lesão da medula espinhal não condicionada, LME; à direita da linha tracejada cinzenta: lesão da medula espinhal condicionada, LC). As amostras para análise western blot (\NB) foram obtidas do local de lesão (A-5) uma semana após a lesão da medula espinhal (A1). (Be C) análise WB (B) e quantificação (C) dos níveis de p137Pfn1, Pfn1 e ROCK1 no local de lesão da medula espinhal (A-5) de medulas espinhais de rato condicionadas e não condicionadas. Valor p *<0,05. (D, E) Os níveis totais de Pfn1 estão aumentados em axônios em crescimento rápido. (D) Quantificação da razão de níveis totais de Pfn1 /βΙIl-tubulina em relação à distância à borda principal do cone de crescimento. Valor p ****<0,0001. (E) Imunofluorescência representativa de Pfn1 e βΙΙΙ-tubulina em cones de crescimento de neurônios dos GRD condicionados e não condicionados. Barra de escala: 10 pm.

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[014] Figura 2. A deleção aguda de Pfn1 prejudica a neuritogênese e a excrescência de neurites. Neurônios sem Pfn1 apresentam extensão de neurites prejudicada e defeitos no citoesqueleto. (A-D) Neurônios embrionários do 18.° dia (E18) de hipocampo de rato foram co-nucleofectados com um pMAX-GFP e um plasmídeo control-pLKO ou um plasmídeo Pfn1 ShRNA-pLKO. São mostradas as quantificações de imunofluorescência de βΙIl-tubulina (A) e excrescência de axônios (B)/dendrites (C). Valor p****< 0,0001. Barra de escala: 50 pm. (D) Percentagem de neurônios em diferentes estádios do desenvolvimento. (E-H) Análise do fluxo de retomo de actina (E,F) e da velocidade de crescimento de microtúbulos (G,H) utilizando transfecções de LifeActGFP ou EB3-GFP, respetivamente. Valor p****< 0,0001. Neurônios dos gânglios da raiz dorsal (GRD) (l-L) Adultos (I, J) e E16 (K,L) foram co-nucleofectados com um pMAX-GFP e um plasmídeo control-pLKO ou um plasmídeo Pfn1 ShRNA-pLKO. São mostradas quantificações do comprimento total de neurites (l,K) e análise de ramificações (J,L). Valor p****< 0,01.

[015] Figura 3. A Profilina-1 é necessária para um ótimo crescimento de axônios in vitro. (A-D) Demonstração de depleção de Pfn1 no cérebro (A-C) de ratinhos Cre+Pfn1wt/wt (controlo) e Cre+Pfn1 fl/fl (com deleção neuronal induzível específica de Pfn1). Ausência de alterações nos níveis de Pfn2 nestas amostras (A,C). (E-G) Ensaio de excrescência de neurites de neurônios dos GRD de Cre+Pfn1wt/wt e Cre+Pfn1 fl/fl quer transfectados com um plasmídeo control-pLKO quer com um Pfn2 ShRNA-pLKO. Valor p ****<0,0001. São mostrados a imunofluorescência de βΙIl-tubulina representativa (E), o comprimento total de neurites (F) e o número médio de ramificações (G). Barra de escalas: 50 pm. Valor p ***<0,001. Análise de (H,l) Fluxo de retorno de actina (H) e velocidade de crescimento de microtúbulos (I) em cones de crescimento de neurônios dos GRD de Cre+Pfn1wt/wt, Cre+Pfn1 fl/fl utilizando transfecções de LifeAct-RFP e EB3mCherry, respetivamente. Valor p ***<0,001, **<0,01 e *<0,05.

[016] Figura 4. A Profilina-1 é necessária para uma ótima regeneração de axônios in vivo, análise da regeneração do sistema nervoso periférico (SNP) e do sistema nervoso central (SNC). (A) Secção do nervo ciático de Cre+Pfn1wt/wt YFP. (B) Imagens representativas de secções de nervo ciático semifinas coradas com PPD de ratinhos

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Cre+Pfn1wt/wt e Cre+Pfn1 fl/fl 2 semanas após esmagamento do nervo ciático (NC); barra de escala: 50 pm. (C) Quantificação de densidade de axônios mielinizados ilustrados em (B). As barras de erro são EPM. Valor p **<0,005. (D) Imagens representativas de fibras positivas para a toxina B da cólera (CT-B+) em secções sagitais de medula espinhal após lesão condicionante (LC) em ratinhos Cre+Pfn1wt/wt e Cre+Pfn1 fl/fl. Os axônios YFP+ estão mostrados a verde e as fibras da coluna dorsal rastreadas com CT-B estão marcadas a vermelho. Os axônios duplamente positivos YFP+/CT-B+ estão destacados com setas; barra de escala: 100 pm; linhas tracejadas marcam a fronteira da cicatriz glial. (E) Quantificação do número de fibras da coluna dorsal CT-B+/YFP+ que são capazes de entrar na cicatriz glial. (F) Quantificação do comprimento dos axônios em regeneração na cicatriz glial, desde a fronteira da lesão. Todas as barras de erro são EPM. Valor p *<0,05.

[017] Figura 5. Atividade de Pfn1 aumentada é crucial para um ótimo crescimento de axônios. Neurônios dos GRD adultos (A-E) e neurônios do hipocampo de ratinhos E16.5 (F-J) foram co-transfectados com pMAX-GFP e plasmídeo de WT ou de Pfn1S137A; a sobre-expressão de WT e Pfn1S137A foi confirmada em extratos de células CAD (K). São mostradas imunofluorescências representativas de βΙΙΙ-tubulina de neurônios dos GRD adultos (A, barra de escala: 200 pm) e do hipocampo DIV4 (F, barra de escala: 100pm). São mostradas a quantificação do comprimento total de neurites (B) e a análise de ramificações (C) para culturas de neurônios dos GRD e a excrescência axonal (G) e dendrítica (H) para neurônios do hipocampo DIV4. Quantificaram-se, o fluxo de retomo de actina (D- neurônios dos GRD; I- neurônios do hipocampo) e a velocidade de crescimento de microtúbulos (E- neurônios dos GRD; J- neurônios do hipocampo). Valor p *<0,05, **<0,01, ****<0,0001.

[018] Figura 6. A entrega in vivo, mediada por AAV, de Pfn1 constitutivamente ativa aumenta a regeneração de axônios após lesão do nervo ciático. Quantificação do comprimento de axônios em regeneração distalmente à fronteira da lesão do nervo ciático após entrega de AAV de controlo ou AAV portador de Pfn1 constitutivamente ativa. Valor p *<0,05.

Descrição Detalhada

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[011] A presente divulgação refere-se à utilização de profilina-1 constitutivamente ativa (Pfn1 S137A) para utilização na terapia e/ou tratamento de um distúrbio neurológico e/ou para promover regeneração neuronal, kit e seus produtos relacionados.

[012] Na presente divulgação, a profilina-1 constitutivamente ativa significa profilina-1 onde, por mutagênese dirigida ao local, o resíduo de Serina 137 foi substituído por uma Alanina (Pfn1S137A). A profilina-1 é inativada por fosforilação na Serina 137; se este resíduo for substituído por uma Alanina, que não pode ser fosforilada, a proteína tornase constitutivamente ativa.

[013] Numa forma de realização, a figura 1 ilustra que a atividade de Pfn1 é necessária para uma ótima regeneração de axônios.

[014] Um aspeto da presente divulgação refere-se a uma profilina-1 constitutivamente ativa, i.e., Pfn1, em que o resíduo Ser137 foi mutado para uma Ala para gerar uma forma fosforresistente da proteína, Pfn1-Pfn1S137A, para utilização na terapia e/ou tratamento de um distúrbio neurológico e/ou para promover a regeneração de axônios. Numa forma de realização, a presente divulgação refere-se a profilina-1 constitutivamente ativa para utilização no tratamento ou terapia de lesão ou distúrbio no sistema nervoso central e/ou periférico.

[015] Numa forma de realização, a presente divulgação refere-se a uma profilina-1 constitutivamente ativa para utilização na terapia e/ou tratamento de um distúrbio neurológico, selecionado do grupo que consiste em neuropatias periféricas causadas por lesão física ou estados de doença, danos físicos no cérebro, danos físicos na medula espinhal, acidente vascular cerebral associado a danos cerebrais, e distúrbios neurológicos relacionados com neurodegeneração.

[016] Numa forma de realização, a presente divulgação refere-se a uma profilina-1 constitutivamente ativa para utilização na terapia e/ou tratamento de um distúrbio neurológico selecionado a partir do grupo que consiste em neuralgias, distrofia muscular, paralisia de Bell, myasthenia gravis, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, esclerose múltipla, acidente vascular cerebral e isquemia associada a acidente vascular cerebral, neuropatia neuronal, outra doença neuronal degenerativa, doença dos

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7/11 neurônios motores, e lesão dos nervos. Em particular, em que o tecido nervoso lesionado é tecido da medula espinhal.

[017] Numa forma de realização, o tecido nervoso lesionado é tecido de nervos periféricos.

[018] Numa forma de realização, a lesão é selecionada a partir do grupo que consiste em uma lesão mecânica, uma lesão bioquímica e uma lesão isquêmica.

[019] Outro aspeto da presente divulgação refere-se a um construto genético compreendendo profilina-1 constitutivamente ativa, em particular Pfn1S137A, descrita na presente divulgação.

[020] Outro aspeto da presente divulgação refere-se a um vetor compreendendo o construto genético que codifica a profilina-1 constitutivamente ativa, em particular Pfn1S137A, da presente divulgação.

[021] Numa forma de realização, o vetor é um vetor viral.

[022] Numa forma de realização, o vetor viral é capaz de ter como alvo neurônios.

[023] Numa forma de realização, o vetor viral é um vírus adenoassociado recombinante, em particular em que o vírus adenoassociado recombinante é de um serotipo selecionado a partir do grupo que consiste em AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, e seus híbridos.

[024] Outro aspeto da presente divulgação refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de profilina-1 constitutivamente ativa (Pfn1S137A) ou do vetor, descritos na presente divulgação, e um veículo adequado.

[025] Numa forma de realização, a composição farmacêutica é uma formulação injetável, em particular uma injeção in situ ou sistêmica.

[026] Numa forma de realização, a concentração mínima do vetor é 10¹² cópias do genoma/ml (CG/ml).

[027] Outro aspeto da presente divulgação refere-se a um kit compreendendo a profilina1 constitutivamente ativa descrita na presente matéria, a composição farmacêutica, ou o vetor, descritos na presente divulgação.

[028] Numa forma de realização, a proteína verde fluorescente melhorada (eGFP) ligada ao peptídeo pequeno 2A autoclivável, ligado a profilina-1 Ser137Ala (Pfn1S137A), foi

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8/11 clonada num plasmfdeo de virus adenoassociado 1 (AAV1) dirigida pelo promotor de citomegalovírus (CMV) (AAV1.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH) para obter o construto AAV1.CMV.eGFP-T2A-Pfn1S137A.WPRE.bGH. Foi também gerado um vetor de AAV de controlo, onde Pfn1 S137A está substituída por uma sequência 5Gly (AAV1,5Gly-T2AeGFP.WPRE.bGH). Os vetores de AAV foram produzidos como descrito em Lock M, Alvira M, Vandenberghe LH, Samanta A, Toelen J, DebyserZ, Wilson JM. 2010. “Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale”. Hum Gene Ther. 21:1259-1271. Ambos os vetores foram empacotados em partículas de AAV2/1 (com cápside viral de AAV1 e com repetições terminais invertidas de AAV2). Determinaram-se os títulos de cópias do genoma (CG) de vetores de AAV. [037] Para a lesão do nervo ciático (LNC), injetaram-se 2 pL (mínimo de 10¹²CG/ml) dos AAV de controlo ou experimentais em cada um dos DRG L4 e L5 utilizando uma seringa Hamilton (33G) (n = 8 ratos/grupo). Uma semana mais tarde, os nervos ciáticos dos ratos foram esmagados ao nível do nó ciático e 3 dias mais tarde, nervo ciático distai ao local da lesão foi colhido para análise de regeneração de axônios. Após a lesão do nervo ciático, a entrega de Pfn1 constitutivamente ativa induziu um aumento de 1,5 vezes na distância a que os axônios se regeneraram distalmente à fronteira da lesão. Para a lesão da medula espinhal (LME), axônios da coluna dorsal ascendente foram rastreados por injeção de 2pL (mínimo de 10¹² CG/ml) dos AAV de controlo ou experimentais no nervo ciático esquerdo de ratos Wistar de 12 semanas de idade utilizando uma seringa Hamilton (33G) (n = 8 ratos/grupo). Duas semanas mais tarde, realizou-se uma laminectomia ao nível T9-T10 e a metade dorsal da medula espinhal foi cortada utilizando um microbistuh oftálmico Feather. A análise funcional dos animais foi realizada semanalmente após a lesão utilizando a classificação BBB e o teste dos filamentos de Von Frey. Deixaram-se os ratos recuperar durante 6 semanas antes de recolher as medulas espinhais lesionadas para a análise de axônios em regeneração positivos para eGFP. Especificamente, perfundiram-se os ratos transcardiacamente com paraformaldeído a 4% e as medulas espinhais foram pós-fixadas durante 1 semana e, mais tarde, transferidas para sacarose a 30% em PBS antes do processamento do tecido. Cortaram-se criossecções seriadas (50pm de espessura) da medula espinhal no

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9/11 plano sagital e realizou-se uma imunofluorescência contra SCG10/ Estatmina-2 (1:5000, NBP1-49461 Novus Biolologicals) para identificar axônios sensoriais em regeneração. [038] Os axônios em regeneração foram rastreados rostralmente ao local da lesão (2000 pm rostrais à fronteira da lesão). Após a lesão da medula espinhal, a entrega de Pfn1 constitutivamente ativa induziu um aumento de 1,4 vezes na distância a que os axônios se regeneraram distalmente à fronteira da lesão.

[029] Em resumo, os dados mostram que, in vitro, a queda de Pfn1 prejudicou gravemente o fluxo de retorno de actina, a velocidade de crescimento de microtúbulos, e a formação e crescimento de axônios. In vivo, ratinhos com uma deleção neuronal induzível de Pfn1 tinham regeneração de axônios diminuída. Num modelo de elevada capacidade de regeneração, a atividade de Pfn1 estava aumentada no cone de crescimento de axônios em regeneração. Em linha com estas constatações, a sobreexpressão de Pfn1 constitutivamente ativa melhorou fortemente a dinâmica da actina e dos MT, e o crescimento de axônios in vitro. In vivo, a entrega de Pfn1 constitutivamente ativa aumentou a regeneração de axônios após lesão do nervo ciático e lesão da medula espinhal. No global, fica demonstrado que a Pfn1 é um determinante de crescimento e regeneração de axônios que atua como um regulador fundamental da dinâmica da actina e dos MT no cone de crescimento.

[030] O termo compreendendo, sempre que utilizado neste documento, pretende indicar a presença das características, números inteiros, passos, componentes indicados, mas não exclui a presença ou a adição de uma ou mais outras características, números inteiros, passos, componentes ou seus grupos.

[031] Quando se utilizam as formas no singular de elementos ou características na especificação das reivindicações, está também incluída a forma no plural, e vice-versa, se não for especificamente excluída. Por exemplo, a expressão “um gene” ou “o gene” também inclui as formas no plural, “genes” ou “os genes,” e vice-versa. Nas reivindicações, artigos como “um”, “uma” e “a”, “o”, podem significar um ou mais do que um, a menos que seja indicado o contrário ou seja de outro modo evidente no contexto. [042] As reivindicações ou descrições que incluem “ou” entre um ou mais membros de um grupo consideram-se satisfeitas se um, mais do que um, ou todos os membros do

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10/11 grupo estiverem presentes, forem empregues, ou forem de outro modo relevantes para um determinado produto ou processo, a menos que seja indicado o contrário ou que seja de outro modo evidente no contexto. A divulgação inclui formas de realização em que exatamente um membro do grupo está presente, é empregue, ou é de outro modo relevante para um determinado produto ou processo. A divulgação também inclui formas de realização em que mais do que um, ou todos os membros do grupo estão presentes, são empregues, ou são de outro modo relevantes para um determinado produto ou processo.

[032] Além disso, quando as reivindicações recitam uma composição, deve-se entender que estão incluídos os métodos de utilização da composição para quaisquer dos propósitos aqui divulgados, e estão incluídos os métodos de produção da composição de acordo com quaisquer dos métodos de produção aqui divulgados ou outros métodos conhecidos no estado da técnica, a menos que de outro modo indicado ou a menos que seja evidente para uma pessoa competente na matéria que surgiría uma contradição ou inconsistência.

[033] Quando são dadas gamas, estão incluídos os pontos das extremidades. Além disso, deve-se entender que, a menos que de outro modo seja indicado ou de outro modo seja evidente no contexto e/ou no entendimento de uma pessoa competente na matéria, os valores que estão expressos como gamas podem assumir qualquer valor específico dentro das gamas indicadas em diferentes formas de realização da divulgação, até à décima da unidade do limite inferior da gama, a menos que o contexto claramente o dite de outro modo. Deve também entender-se que, a menos que de outro modo indicado ou de outro modo evidente no contexto e/ou no entendimento de uma pessoa competente na matéria, os valores expressos como gamas podem assumir qualquer subgama dentro da gama dada, em que as extremidades da subgama são expressas com o mesmo grau de precisão que a décima da unidade do limite inferior da gama.

[034] A divulgação não deve ser considerada de modo algum restrita às formas de realização descritas e uma pessoa competente na matéria antecipará várias possibilidades de modificação das mesmas.

[035] As formas de realização descritas acima são combináveis.

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[036] As reivindicações que se seguem adicionalmente estabelecem formas de realização particulares da divulgação.

Claims

1. Profilina-1 humana constitutivamente ativa (Pfn1), caracterizada por ser utilizada na terapia e/ou tratamento de um distúrbio neurológico e/ou para promover regeneração neuronal, em particular regeneração de axônios.

2. Profilina-1 humana constitutivamente ativa para utilização de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada pela profilina-1 (Pfn1) ser Pfn1S137A.

3. Profilina-1 humana constitutivamente ativa para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por ser utilizada para o tratamento ou terapia de lesão ou distúrbio do sistema nervoso central e/ou periférico.

4. Profilina-1 humana constitutivamente ativa para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo distúrbio neurológico ser selecionado a partir do grupo que consiste em neuropatias periféricas causadas por lesão física ou estado de doença, dano físico no cérebro, dano físico na medula espinhal, acidente vascular cerebral associado a dano cerebral, e distúrbios neurológicos relacionados com neurodegeneração.

5. Profilina-1 humana constitutivamente ativa para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo distúrbio neurológico ser selecionado a partir do grupo que consiste em neuralgias, distrofia muscular, paralisia de Bell, myasthenia gravis, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, esclerose múltipla, acidente vascular cerebral e isquemia associada a acidente vascular cerebral, neuropatia neuronal, outra doença neuronal degenerativa, doença dos neurônios motores, ou lesão dos nervos.

6. Profilina-1 humana constitutivamente ativa para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo tecido nervoso lesionado ser tecido da medula espinhal.

7. Profilina-1 humana constitutivamente ativa para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo tecido nervoso lesionado ser tecido de nervos periféricos.

8. Profilina-1 humana constitutivamente ativa para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela lesão ser selecionada a partir do

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2/2 grupo que consiste em uma lesão mecânica, uma lesão bioquímica e uma lesão isquêmica.

9. Construto genético, caracterizado por compreender a profilina-1 constitutivamente ativa descrita em qualquer uma das reivindicações anteriores.

10. Vetor, caracterizado por compreender a profilina-1 constitutivamente ativa descrita em qualquer uma das reivindicações 1 -8 anteriores, em particular a descrita em qualquer uma das reivindicações 1-7 anteriores.

11. Vetor de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo vetor ser um vetor viral.

12. Vetor de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo vetor viral ser capaz de ter como alvo um neurônio.

13. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-12 anteriores, caracterizado pelo vetor viral ser um vírus adenoassociado recombinante, em particular em que o vírus adenoassociado recombinante é de um serotipo selecionado a partir do grupo que consiste em AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, e/ou seus híbridos.

14. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender um veículo adequado e uma quantidade eficaz de profilina-1 constitutivamente ativa descrita em qualquer uma das reivindicações 1-8 anteriores ou o vetor descrito em qualquer uma das reivindicações 10-13 anteriores.

15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada pela composição ser uma formulação injetável, em particular uma formulação injetável in situ ou sistêmica.

16. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-15 anteriores, caracterizada pela concentração mínima do vetor ser 1012 CG/ml.

17. Um kit, caracterizado por compreender a profilina-1 constitutivamente ativa descrita em qualquer uma das reivindicações 1-8 anteriores, a composição farmacêutica descrita em qualquer uma das reivindicações 14-16 anteriores, ou o vetor descrito em qualquer uma das reivindicações 10-13 anteriores.