BR112019020367A2

BR112019020367A2 - modulação da expressão do gene para sirtuína com decapeptídeo-12 em progenitores de queratinócito epidérmico

Info

Publication number: BR112019020367A2
Application number: BR112019020367A
Authority: BR
Inventors: Abu Ubeid Anan; M Hantash Basil
Original assignee: Escape Therapeutics Inc
Priority date: 2017-03-30
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2020-04-28
Also published as: RU2019134619A3; CA3058169A1; AU2022209240A1; US20180296456A1; EP3601316A4; CN110770248A; JP2020513031A; WO2018183882A1; RU2019134619A; EP3601316A1; KR20200002868A; AU2018243658A1

Abstract

a presente invenção refere-se a recentes relatórios que detalham as funções pleiotrópicas que sirtuínas desempenham na repressão de envelhecimento prematuro, atrasando a senescência celular, aumentando a longevidade e melhorando uma ampla gama de distúrbios do envelhecimento. são relatadas aqui as conclusões sobre o potente ativador de sirtuína, decapeptídeo-12, e compara-se seu desempenho com o bem documentado oxirresveratrol. o tratamento de progenitores de queratinócito epidérmico humano com 100 µm de decapeptídeo-12 aumentou a transcrição de sirt1 em 141 ± 11 porcento em relação a células de controle, enquanto os níveis de sirt3, sirt6 e sirt7 aumentaram em 121 ± 13 porcento, 147 ± 8 porcento e 95,4 ± 14 porcento, respectivamente. decapeptídeo-12 regulou em excesso a transcrição de sirtuína a níveis semelhantes aos de oxirresveratrol, mas com reduzida citotoxicidade.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO DO GENE PARA SIRTUÍNA COM DECAPEPTÍDEO-12 EM PROGENITORES DE QUERATINÓCITO EPIDÉRMICO.

Descrição

Referência Cruzada a Pedido Correlato [0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente U.S. 62/479.248, depositado em 30 março de 2017, intitulado Modulação da Expressão do Gene Para Sirtuína com Decapeptídeo12 em Queratinócitos Epidérmicos, que é incorporado como referência juntamente com todas as outras referências citadas neste pedido.

Listagem de Sequências [0002] O presente pedido incorpora como referência uma listagem de sequências intitulada ELIXP004US_ST25.txt (3 quilobytes) que foi criada em 21 março de 2018 e depositada eletronicamente com este pedido.

Antecedentes da Invenção [0003] A presente invenção refere-se ao campo de novos agentes biológicos.

Breve Sumário da Invenção [0004] Relatórios recentes detalham os papéis pleiotrópicos que sirtuínas desempenham na repressão de envelhecimento prematuro, atrasando a senescência celular, aumentando a longevidade e melhorando uma ampla faixa de distúrbios do envelhecimento. Relatam-se aqui nossas conclusões sobre o potente ativador de sirtuína, decapeptídeo-12, e compara-se o seu desempenho com o bem documentado oxirresveratrol. O tratamento de progenitores humanos de queratinócitos epidérmicos com 100 μΜ de decapeptídeo-12 aumentou a transcrição de SIRT1 em 141 ± 11

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2/28 porcento em relação a células de controle, enquanto os níveis de SIRT3, SIRT6 e SIRT7 sofreram aumento em 121 ± 13 porcento, 147 ± 8 porcento e 95 ± 14 porcento, respectivamente. Decapeptídeo-12 regulou em excesso a transcrição de sirtuína a níveis semelhantes aos de oxirresveratrol, mas com reduzida citotoxicidade.

[0005] Um peptídeo de acordo com uma modalidade da presente invenção consiste em SEQ ID N²: 9, SEQ ID N²: 10, SEQ ID N²: 11 ou SEQ. ID N²: 12.

[0006] Um peptídeo de acordo com certas modalidades da presente invenção consiste em SEQ ID N²: 9 modificada por um grupo de modificação, o grupo de modificação sendo um grupo palmitoíla ou um grupo acetila em uma extremidade aminoterminal, ou amidação de uma extremidade carbóxi-terminal, ou ambos.

[0007] Um peptídeo de acordo com várias modalidades da presente invenção consiste em SEQ ID N²: 11 que possui um aminoácido tirosina na posição 6 como uma isoforma D, e todos os outros aminoácidos sendo isoformas L.

[0008] Uma composição de acordo com uma modalidade da presente invenção compreende um primeiro peptídeo que consiste em SEQ ID N²: 9, SEQ ID N²: 10, SEQ ID N²: 11 ou SEQ. ID N²: 12.

[0009] Uma composição de acordo com certas modalidades da presente invenção consiste em SEQ ID N²: 9 modificada por um grupo de modificação, o grupo de modificação sendo um grupo palmitoíla ou um grupo acetila em uma extremidade aminoterminal, ou amidação de uma extremidade carbóxi-terminal, ou ambos.

[00010] Uma composição de acordo com algumas modalidades da presente invenção consiste em SEQ ID N²: 11 que possui um aminoácido tirosina na posição 6 como uma isoforma D, e todos os outros aminoácidos sendo isoformas L.

[00011] Uma composição de acordo com modalidades particulares

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3/28 da presente invenção compreende o peptídeo presente em uma concentração de 1 pm ou mais.

[00012] Uma modalidade de um método de tratamento de um indivíduo por modulação da expressão de um gene para sirtuína em uma célula da pele para reduzir sintomas de envelhecimento da pele compreende administrar a um indivíduo com necessidade desse tratamento uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um ou mais peptídeos, em que o um ou mais peptídeos consistem de SEQ ID N^Q: 9, SEQ ID N^Q: 10, SEQ ID N^Q: 11 ou SEQ. ID N^Q: 12.

[00013] Em um método de acordo com modalidades particulares da presente invenção, o peptídeo consiste em SEQ ID N^Q: 9 modificado por um grupo de modificação, o grupo de modificação sendo um grupo palmitoíla ou um grupo acetila em uma extremidade aminoterminal, ou amidação de um grupo carbóxi-terminal, ou ambos.

[00014] Em um método de acordo com algumas modalidades da presente invenção, o peptídeo consiste em SEQ ID N^Q: 11 que possui um aminoácido tirosina na posição 6 como uma isoforma D, e todos os outros aminoácidos sendo isoformas L.

[00015] Em um método de acordo com várias modalidades da presente invenção, a célula da pele é um progenitor.

[00016] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, o progenitor é um progenitor de queratinócitos da epiderme, um melanoblasto, um fibroblasto, um histioblasto ou um dendroblasto.

[00017] Em um método de acordo com modalidades particulares da presente invenção, a célula da pele é terminalmente diferenciada.

[00018] De acordo com diversas modalidades da presente invenção a célula da pele é um queratinócito, um melanócito, um fibrócito, um histiócito ou um dendrócito.

[00019] Em certas modalidades dos métodos, o peptídeo está presente em uma concentração de 1 pm ou mais.

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4/28 [00020] Em modalidades particulares da presente invenção, o gene para sirtuína compreende SEQ ID N^Q: 1, SEQ ID N^Q: 2, SEQ ID N-: 3, SEQ ID N^Q: 4, SEQ ID N^Q: 5, SEQ ID N^Q: 6 ou SEQ ID N^Q: 7.

[00021] Em algumas modalidades da presente invenção, a composição compreende ainda oxirresveratrol.

[00022] Em modalidades particulares da presente invenção, a células da pele é uma célula de mamífero.

[00023] Em algumas modalidades da presente invenção, a célula da pele é humana.

[00024] Uma modalidade de um método de modulação da expressão de um gene para sirtuína em uma célula da pele compreende administrar a um indivíduo com necessidade desse tratamento uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um ou mais peptídeos, em que o um ou mais peptídeos consistem de SEQ ID N^Q: 9, SEQ ID N^Q: 10, SEQ ID N^Q: 11 ou SEQ. ID N^Q: 12.

[00025] Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes após consideração da descrição detalhada que se segue e dos desenhos anexos, nos quais designações de referência similares representam características semelhantes ao longo das figuras.

Breve Descrição dos Desenhos [00026] A Figura 1A mostra aumento reativo de transcrição de SIRT1 dependente da dose, (a). Os dados são expressos como aumento múltiplo relativamente ao gene de controle interno 18S e representam média ± SEM de três experimentos independentes.

[00027] A Figura 1B mostra aumento reativo da transcrição de SIRT3 dependente da dose, (b). Os dados são expressos como aumento múltiplo relativamente ao gene de controle interno 18S e representam média ± SEM de três experimentos independentes.

[00028] A Figura 1C mostra aumento reativo da transcrição de

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SIRT6 dependente da dose, (c). Os dados são expressos como aumento múltiplo relativamente ao gene de controle interno 18S e representam média ± SEM de três experimentos independentes.

[00029] A Figura 1D mostra aumento reativo da transcrição de SIRT7 dependente da dose, (d). Os dados são expressos como aumento múltiplo relativamente ao gene de controle interno 18S e representam média ± SEM de três experimentos independentes.

[00030] A Figura 2A mostra os efeitos citotóxicos do decapeptídeo12 e oxirresveratrol sobre queratinócitos epidérmicos. Os dados são expressos como percentagem do controle e representam média ± SEM de três experimentos separados. *P<0,05.

[00031] A Figura 2B mostra os efeitos de decapeptídeo-12 e oxirresveratrol sobre a proliferação de queratinócitos epidérmicos. Os dados são expressos como percentagem do controle e representam média ± SEM de três experimentos separados. *P<0,05.

Descrição Detalhada da Invenção [00032] A pele manifesta as consequências da cronologia e do fotoenvelhecimento tornando-nos constantemente cientes do processo de envelhecimento e em busca de remédios para diminuir ou reverter o seu impacto. O envelhecimento da pele tem sido tradicionalmente classificado como extrínseco ou intrínseco. Evidências recentes indicam que ambos os tipos compartilham características moleculares importantes que incluem vias de transdução de sinal alteradas que promovem a expressão da metaloproteinase de matriz, diminuição da síntese de procolagênio e danos ao tecido conjuntivo.

[00033] Na pele humana, o envelhecimento está associado a um aumento do número de células senescentes e a uma capacidade reduzida de proliferação e diferenciação celulares. A evidência substancial sustenta a teoria de que o envelhecimento é predominantemente uma consequência de danos causados via

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6/28 radicais livres por várias espécies endógenas de oxigênio reativo (ROS). Velarde et al. relataram sobre a evidência in vivo para uma relação causai entre dano oxidante mitocondrial, senescência celular e fenótipos de envelhecimento na pele. Além disso, a radiação ultravioleta (UV) estimula a síntese de ROS, que têm sido implicadas na mutagênese e fotoenvelhecimento. De acordo com esses resultados, os dados sugerem a expressão alterada de atividade de sirtuína em UV irradiado versus pele protegida do sol e que essas diferenças podem ser responsáveis por certos aspectos do envelhecimento da pele.

[00034] A senescência celular descreve um processo no qual as células deixam de se dividir e sofrem alterações fenotípicas distintas, incluindo profundas alterações na cromatina e secretoma, bem como ativação supressora de tumor. Numerosos relatos ajudaram a estabelecer o conceito de sirtuínas como potentes proteínas antienvelhecimento, detalhando seus papéis pleiotrópicos em retardar senescência celular e envelhecimento prematuro. Sirtuínas são efetores principais em vias tais como reparação de danos do DNA, encurtamento dos telômeros, resposta celular a tensão oxidante e melhora das patologias induzidas por ROS.

[00035] Em mamíferos, existem sete genes para sirtuína (SIRT1-7) localizadas em diferentes compartimentos celulares e capazes de diversas ações. Bioquimicamente, sirtuínas são uma classe de proteínas que possuem principalmente atividade de lisina desacetilase dependente de NAD⁺. Sirtuínas são amplamente reconhecidas como reguladores críticos de várias vias metabólicas, sensores de energia e estado redox em células, e como moduladores de tensão oxidante.

[00036] Esses resultados provocaram interesse em desenvolver ativadores de pequenas moléculas ou produtos farmacêuticos para ajudar a retardar o progresso do envelhecimento e sua ampla gama de

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7/28 doenças associadas à idade. Das sete sirtuínas de mamíferos, SIRT1 tem sido a mais estudada com relação a envelhecimento e longevidade. Por exemplo, os efeitos antienvelhecimento de resveratrol são atribuídos principalmente à ativação de SIRT1.Com efeito, Ido et al. relataram que o resveratrol, por meio do aumento da atividade de proteína quinase ativada por AMP e sirtuínas, melhoraram a senescência celular e disfunção proliferativa.

[00037] Descreve-se previamente a potente eficácia de hipopigmentação de decapeptídeo-12 na pele humana. Estudos clínicos adicionais revelaram uma melhoria global na aparência da pele facial em pacientes com discromia que foram tratados duas vezes por dia com creme tópico contendo 0,01 porcento de decapeptídeo-12 durante oito semanas. Essas conclusões levaram-nos à hipótese de que decapeptídeo-12 pode modular a atividade da sirtuína para melhorar a aparência geral da pele. Para clarificar essa possibilidade, foram avaliados os efeitos de decapeptídeo-12 na transcrição de sirtuína em progenitores epidérmicos humanos.

Materiais e Métodos

Reaqentes [00038] Decapeptídeo-12 (YRSRKYSSWY) SEQ ID N^Q: 9 foi sintetizado pela Bio Basic, Inc. (Ontário, Canadá) usando química do FMOC em fase sólida. Oxirresveratrol foi adquirido de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Cultura de Células [00039] Progenitores epidérmicos neonatais humanos (Thermo Fisher Scientific, Nova Iorque) foram semeados em placas de 6 poços sob uma densidade de 2 x 10⁵ células/poço. Cada poço recebeu 2 ml de meio EpiLife contendo 60 μΜ de cloreto de cálcio (Thermo Fisher Scientific, Nova Iorque). As placas foram incubadas em uma câmara umidificada a 37 graus Celsius e 5 porcento de CO2. Vinte e quatro

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8/28 horas mais tarde, as células foram tratadas com várias concentrações de oxirresveratrol ou decapeptídeo-12 dissolvido em PBS contendo 5 porcento de DMSO. Os poços de controle receberam apenas veículo (5 porcento de DMSO e PBS). A concentração final de DMSO em cada poço foi de 0,05 porcento.

Extração, quantificação de RNA total e síntese de cDNA [00040] Depois de um período de incubação de 72 horas, as células foram tripsinizadas e RNA total extraído, utilizando o kit RNeasy (Qiagen, Valência, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.

[00041] A concentração de RNA foi determinada utilizando Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Nova Iorque). Dois pg de RNA total foram usados para sintetizar cDNA, utilizando iniciadores oligo dT e reagentes de transcrição reversa TaqMan (Thermo Fisher Scientific, Nova Iorque). A reação foi efetuada em DNA Engine Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA). A temperatura de recozimento foi de 25 graus Celsius durante 10 minutos, seguido de síntese da primeira cadeia a 48 graus Celsius durante 1 hora e inativação por calor a 95 graus Celsius durante 5 minutos.

Análise Semiquantitativa [00042] Os iniciadores de SIRT1-7 (tabela 1) foram concebidos utilizando Primer3. As reações de PCR semiquantitativas foram realizadas em um DNA Engine Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA). PCR foi realizado sob as seguintes condições: desnaturação a 94 graus Celsius durante 2 minutos e extensão do iniciador a 54 graus Celsius durante 30 segundos em 34 ciclos para SIRT1 - 7, e o gene de arrumação 18S.

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Tabela 1: Sequências dos iniciadores para SIRT1 -7 e 18S

Tabela 1

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V f Ã ] i S SMA ASM H \Ms M MAM & CAirCAOW· ΑΟΜΪΟMM \s * »M S <. < *. ax S s x s! ά U»Ά* Mk A s. M S A ⁵ ! h MíjíMaSR CsM' [00043] Amostras foram corridas e separadas em um gel de agarose a 1,5 porcento contendo 0,5 pg/ml de brometo de etídio e visualizadas utilizando o sistema de imagiologia FluorChem HD2 (Protein simple, San Jose, CA). Análise de densitometria foi realizada utilizando o software AlphaEase FC (Protein simple, San Jose, CA). As relações de intensidade foram calculadas como o valor de intensidade

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10/28 para cada gene dividido pelo valor de intensidade dos genes de controle interno 18S.

Ensaios de viabilidade/proliferacão e citotoxicidade [00044] As taxas de proliferação foram determinadas usando um kit de proliferação celular TACS® MTT (R&D Systems, Minneapolis, MN). As células foram semeadas sob 2,5 x 10⁴/poço em placas de 96 poços em uma atmosfera umidificada com 5 porcento de CO2 a 37 graus Celsius. Vinte e quatro horas mais tarde, decapeptídeo-12 ou oxirresveratrol foram adicionados aos poços correspondentes sob concentrações variáveis (0, 3, 10, 30, 100, 300 e 1.000 μΜ), e as culturas foram então incubadas durante 72 horas. O restante do procedimento foi realizado seguindo 0 protocolo do fabricante.

[00045] A toxicidade celular foi medida utilizando um ensaio de exclusão com corante azul de tripano. As células foram cultivadas em placas de seis poços sob uma densidade de 4 x 10⁵ células/poço. Cada poço recebeu uma concentração diferente de decapeptídeo-12 ou oxirresveratrol (0, 3, 10, 30, 100, 300 e 1.000 μΜ). As placas foram incubadas a 37 graus Celsius em uma câmara umidificada com 5 porcento de CO2. Após 72 h, uma alíquota foi retirada e as células contadas utilizando um hemacitômetro. A citotoxicidade foi medida de acordo com a seguinte fórmula: [1 (número de células no controle - número de células vivas na amostra de teste)/número de células no controle] x 100 porcento.

Análise Estatística [00046] As médias e seus erros padrões foram calculados a partir de três corridas independentes usando 0 Microsoft Excel, e significância estatística foi determinada utilizando uma análise de variância emparelhada. Valores P foram tomados como sendo estatisticamente significativos em P<0,05.

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Resultados

Efeitos de decapeptídeo nas taxas de proliferação e citotoxicidade:

[00047] Primeiro foi avaliado o efeito citotóxico de decapeptídeo-12 e oxirresveratrol em progenitores epidérmicos humanos. A Figura 2A mostra que o tratamento com 100 μΜ de decapeptídeo-12 ou oxirresveratrol resultou em 3 ± 1 porcento ou 6 ± 1 porcento de morte celular, respectivamente. A 1 mM, decapeptídeo-12 ou oxirresveratrol resultou em 7 ± 2 porcento ou 16 ± 2 porcento de morte celular, respectivamente.

[00048] Também foram avaliados os efeitos de decapeptídeo-12 e oxirresveratrol sobre a viabilidade e a proliferação de progenitores epidérmicos humanos. A Figura 2B mostra que tratamento com 300 μΜ de decapeptídeo-12 ou oxirresveratrol resultou em 2 ± 1 porcento ou 5 ± 1 porcento de redução na proliferação de células, respectivamente. No entanto, ao contrário de 1 mM de decapeptídeo12 que reduziu a proliferação em 3 ± 2 porcento, incubação de 3 d com oxirresveratrol reduziu a proliferação em 12 ± 2 porcento.

Transcrição de SIRT1-7 regulou em excesso com decapeptídeo-12:

[00049] Foi avaliado em seguida o efeito de oxirresveratrol e decapeptídeo-12 sobre a expressão de sirtuína em progenitores epidérmicos humanos. As Figuras 1A-1D e tabela 2 mostram transcrição de SIRT1-7 modulada com decapeptídeo-12 e oxirresveratrol de uma forma dependente da dose. Sob 30 μΜ de oxirresveratrol, os níveis de transcrição de SIRT1 regularam em excesso em 125 ± 9 porcento em relação a células de controle, ao passo que os níveis de transcrição de SIRT3, SIRT6 e SIRT7 regularam em excesso em 133 ± 5 porcento, 73 ± 8 porcento e 95 ± 7 porcento, respectivamente.

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12/28 [00050] Tabela 2. O perfil de expressão gênica de SIRT1-7 em resposta a tratamento com decapeptídeo-12 (a) e oxirresveratrol (b). Os resultados são média de três corridas independentes.

Tabela 2a

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Tabela 2b

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[00051] Os dados mostram que 100 μΜ de decapeptídeo-12 aumentou a transcrição de SIRT1 em 141 ± 11 porcento em relação a células não tratadas, enquanto SIRT3, SIRT6 e SIRT7 aumentaram em 121 ± 13 porcento, 147 ± 8 porcento e 95 ± 14 porcento, respectivamente (Figuras 1A-1D).

Discussão [00052] O papel pleiotrópico que sirtuínas desempenham em retardar a senescência celular e bloquear o desenvolvimento de envelhecimento prematuro tem ajudado a substanciá-las como potentes proteínas antienvelhecimento. O uso terapêutico de resveratrol como um activador de SIRT1 e potencial agente antienvelhecimento tem sido amplamente estudado e documentado. Resveratrol protege o endotélio humano de tensão oxidante induzida por H2O2 e senescência via ativação de

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SIRT1. Similarmente, oxirresveratrol é também um potente antioxidante sequestrante de radicais livres. No entanto, ao contrário de resveratrol, exibe menos citotoxicidade e melhor solubilidade em água. Consequentemente, oxirresveratrol foi eleito para uso como um controle positivo em relação ao qual foram comparados o desempenho e a capacidade de decapeptídeo-12 em modular a transcrição de sirtuína em queratinócitos epidérmicos humanos.

[00053] Mesmo que todas as 7 sirtuínas sofram aumento reativo após tratamento com decapeptídeo-12, nossa discussão incidirá sobre as sirtuínas diretamente implicadas no envelhecimento da pele.

[00054] Em 100 μΜ ou 1 mM, decapeptídeo-12 aumentou a transcrição de SIRT1 transcrição em uma impressionante percentagem de 141 ou 213, respectivamente. SIRT1 é principalmente uma deacetilase nuclear. Ela controla vários processos celulares, tais como proliferação celular, diferenciação, apoptose, metabolismo, resposta à tensão, estabilidade do genoma e sobrevivência das células. Cao et al. relataram que SIRT1 confere proteção contra morte celular induzida UVB e H2O2 via modulação de p53 e quinases Nterminais c-Jun em queratinócitos da pele em cultura, sugerindo que ativadores de SIRT1 poderíam servir como novos agentes antienvelhecimento da pele. Outros pesquisadores relataram que SIRT1 pode suprimir sinalização de NF-κΒ e, assim, atrasar 0 processo de envelhecimento e prolongar a vida útil. Ativação de SIRT1 inibe a sinalização de NF-κΒ diretamente por desacetilação da subunidade p65 do complexo NF-κΒ e melhora 0 metabolismo oxidante e a solução da inflamação. Consequentemente, SIRT1 pode ser considerada como uma proteína antienvelhecimento fundamental que media os seus efeitos disseminados na prevenção de senescência prematura e envelhecimento acelerado ao regular múltiplas vias moleculares.

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15/28 [00055] A transcrição de SIRT3 aumentou em 121 porcento em seguir a tratamento com 100 μΜ de decapeptídeo. SIRT3 tem sido principalmente ligada à regulação de uma variedade de processos mitocondriais, tais como β-oxidação, geração de ATP e controle de ROS. SIRT3 também tem sido implicada na manutenção da capacidade de regeneração de células estaminais hematopoiéticas. SIRT3 é suprimida com o envelhecimento e o aumento reativo de SIRT3 em células estaminais hematopoiéticas envelhecidas melhora sua capacidade de regeneração. Essa descoberta estabelece o papel significativo que SIRT3 desempenha na manutenção do sternness, e mais importante ainda, ajuda a estabelecer o caminho para intervenções futuras baseadas em células estaminais em relação a distúrbios metabólicos que resultam em envelhecimento prematuro.

[00056] SIRT6 pode ser considerada como uma importante proteína antienvelhecimento com funções multifacetadas na reparação de danos do DNA, regulação metabólica, inflamação e supressão de tumor. SIRT6 ganhou destaque quando o seu modelo de camundongo knockout desenvolveu graves fenótipos de envelhecimento prematuro com mortalidade resultante dentro de um mês. Além disso, SIRT6 é a única sirtuína de mamífero que exibiu claro aumento do tempo de vida quando superexpressa em todo o corpo dos ratos. Além disso, Kawahara et al. relataram que SIRT6 atenua a sinalização hiperativa de NF-κΒ ao desacetilar a histona H3 em K9 nos promotores de genes-alvo de NF-κΒ, o que aumenta o papel de SIRT6 como uma proteína anti-inflamatória crítica.

[00057] Baohua et al. mostrou que SIRT6 desempenha um papel chave no processo de envelhecimento da pele via modulação do metabolismo de colágeno e sinalização de NF-κΒ. Eles relataram que o bloqueio de SIRT6 diminuiu significativamente o teor de

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16/28 hidroxiprolina pela inibição da transcrição de um tipo de colágeno, levando a secreção de metaloproteinase de matriz 1 e aumentando a sinalização de NF-κΒ. Tomadas juntamente, SIRT6 destaca-se como um modulador-chave de processos antienvelhecimento, ao regular múltiplas vias para retardar a senescência celular e envelhecimento acelerado. Assim, decapeptídeo-12, que aumentou a transcrição de SIRT6 em 147 porcento sob 100 μΜ, pode conter uma grande promessa como um candidato terapêutico antienvelhecimento para tratar os fenótipos muitas vezes concomitantes de envelhecimento prematuro da pele e pele danificada pelo sol.

[00058] Em suma, decapeptídeo-12 foi mostrado neste relatório regular em excesso os níveis de transcrição de SIRT1, SIRT3 e SIRT6, as quais desempenham papéis importantes na luta contra o envelhecimento da pele e outras patologias associadas à idade. Estudos clínicos com várias formulações tópicas contendo decapeptídeo-12 estão atualmente sendo concebidos para ajudar a validar os resultados in vitro e testar a eficácia desse potente ativador de sirtuína in vivo.

EXEMPLO [00059] Neste exemplo, foram feitas certas modificações no decapeptídeo P4, tal como detalhado na seguinte Tabela 3.

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Tabela 3

Peptídeo	Ref. Abreviada	Sequência	Modificação
P4 Nativo SEQ ID N^s: 9	P4	YRSRKYSSWY	Nenhuma
Palm-P4- Amida SEQ ID N^s: 10	P4A	Palmitoil- YRSRKYSSWY-amida	©N-terminal: Palmitoíla •C-terminal: Amida
Palm-D-ISSO- Amida SEQ ID N^s: 11	P4B	Palmitoil- YRSRK[*Y]SSWYamida	©N-terminal: Palmitoíla ©Interno: Tirosina na posição 6 na Isoforma D ©C-terminal: Amida
Acet-P4- Amida SEQ ID N^s: 12	P4C	Acetil-YRSRKYSSWYamida	©N-terminal: Acetila ©C-terminal: Amida

[00060] Essas modificações no decapeptídeo P4 podem servir para melhorar a estabilidade contra proteases e aumentar a penetração transcutânea ou transcelular, ou ambas.

[00061] Os peptídeos da presente invenção podem compreender resíduos de qualquer um dos aminoácidos de ocorrência natural, ou de

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18/28 aminoácidos de ocorrência não natural. Esses aminoácidos de ocorrência natural e de ocorrência não natural podem estar na configuração D ou L, ou podem incluir ambas as formas destrorrotatórias. Os termos D e L são usados neste pedido como são sabidos ser usados no estado da técnica. Os peptídeos da invenção incluem aminoácidos individuais e extensões curtas (por exemplo, 120) de aminoácidos. Além disso, os peptídeos modificados da presente invenção podem também incluir um monômero ou dímero. [00062] A letra padrão única e os códigos de três letras para aminoácidos são utilizados neste pedido e estão na TABELA A abaixo. TABELA A

A (Ala) Alanina	C (Cys) Cisteína	D (Asp) Ácido aspártico
E (Glu) Ácido glutâmico	F (Phe) Fenilalanina	G (Gly) Glicina
H (His) Histidina	1 (He) Isoleucina	K (Lys) Lisina
L (Leu) Leucina	M (Met) Metionina	N (Asn) Asparagina
P (Pro) Prolina	Q (Gin) Glutamina	R (Arg) Arginina
S (Ser) Serina	T (Thr) Treonina	V (Vai) Valina
W (Trp) Triptofano	Y (Tyr) Tirosina

[00063] Como descrito acima, os resíduos indicados podem ser o aminoácido L que ocorre naturalmente, ou uma modificação deste, isto é, uma modificação química, um isômero óptico ou uma ligação com um grupo de modificação. Considera-se que modificações específicas podem ser feitas no peptídeo que mantém a capacidade dos presentes peptídeos em modular especificamente a expressão do(s) gene(s) para sirtuína(s).

[00064] Foi avaliado o efeito dos decapeptídeos P4, P4A, P4B e P4C sobre os níveis de transcrição de sirtuínas 1-7. A Tabela 4 resume os níveis de transcrição de todos os quatro decapeptídeos com os genes correspondentes, em concentrações testadas de: 10, 30, 50, 100 e 300 (todas em μΜ).

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Tabela 4

Concentration jP4 \|P4A	P4B JHC
10 \|SUIT1	\|O±3%	18 ±2%	i U F 4^ a	\|7-i 3%
jSÍRT2	k λ· 3%	14 ± 1%	5 A 1%	s5.00
\|smT	b ± 3%	25 χ 4%	kKWAXV.VAVAM.MAV.V.MJ 22 3%	i .3%
\|SIRT4	í8 -r 3 ^a ό 3	lól%	1%	β :i: !3 í>

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S1R.T5 IS ► 1\<

SIRT6 pl ± 8% i 5% 21 ± 5% %^J 1 (?% UO o%

Côncentratíon ;Gene

P4

SIRTl 134 t 7% _tí μoi 3%

SÍRT2 111 ±4% p :Áv 3

SIRI

2Ó.4 3% μΜ

SIRT4 Π

S1RT5

7% .i 3% h 00

SIRT6

5% ± 5%

Λ 4%

SIR I 7 % i S%

Concentration

Gene [Ρ4

Ρ4.Α =Ρ4Β

SIRTl <1

50' μΜ

S1KT3 |65

SIRT4 |41 ±

StRT5^: |33 ± t> %

81RTO 195 ± 13%

SIRT7 Ιβί 4 10%

Concentration IGenè |P4..

SIRTl 1141 ±119

SIRT2 Β5±5%

S1RT3 *>· ^:Ι0Ο·:μΜ:

STRT4.

ί.4%

SIRT5 |46± 7%

SIRT6 1147 ± 8¼

SIR’S? p? * 14%

C ο π cen ί πι ti ο π Gen e

300 μΜ [P4

SIRTl Τί8%ΓΪ2%

SIRT2 161 ±7%

SIRT3 1155

Ί3

±4%

9±.4%

1 -% Π.00 :6 4% ]S4 ± 7% .40

Ρ4.Α

144 ± 5%

4 1% 152.1-4^-0

152 .±2% [78 -110% § ± j 2^Ü a pô 1 (± _t.

1 7% ± !O% UO? t 2% k> I ± 7° Ο

Ρ4Α

184 ± 2% 155 i *%

140 ± 4°

M7-*2% h42±5B

4,

P4C

5.00 .%%

Λ

Ο

1% ΐ«ί

IP4C

1.00

0'

Ο

P4C '3% ±9% •w _vm d ± 5% μο > 4'%

ο

P4C

100 ± 9¼ ±9%

159 ± 654

7%

7^ * U ±8% *2 9% so ± :i i %

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SIKT4	115 ± 12% [65 i ]%		1
SIRT5	__________________________________ 67 ±9% [29 ±4%	p9 ± $%	28 t 9%
SIRT6	189 A 10% \|85± 5% . J	fel ±4%	87 ±3%
SffifT

Gene [00065] Em baixas concentrações, o decapeptídeo Ρ4 nativo exibiu elevação dos níveis de transcrição em relação aos decapeptídeos modificados. Entretanto, cada um dos três decapeptídeos modificados (P4A, P4B e P4C) regulou em excesso os níveis de transcrição dos genes para sirtuína em relação ao controle. Sob uma concentração de 100 μΜ, o efeito sobre o nível de transcrição foi comparável em todos os quatro decapeptídeos.

[00066] As taxas de proliferação de três linhagens de células humanas (progenitores epidérmicos, melanoblastos e fibroblastos) foram determinados utilizando um kit de proliferação celular TACS® MTT. As células foram semeadas sob 2,5 x 10⁴/poço em placas de 96 poços em uma atmosfera umidificada com 5 porcento de CO2 a 37 graus Celsius. Vinte e quatro horas mais tarde, os decapeptídeos foram adicionados aos poços correspondentes sob concentrações variáveis e incubados durante 72 horas. O restante do procedimento foi realizado seguindo 0 protocolo do fabricante.

[00067] A Tabela 5 mostra taxa de proliferação de progenitores epidérmicos após 72 horas.

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Tabela 5

C&stCèiíttistiôíi (jíM) \| P4	IM A ]	P4Í %C
.3 \| 19G% i....................................................\|...................... J	%%% ;	99± !% 99*!%
ii \| 99*1%· ;	%* j%	991% 99 Pi .
W \| ή . i'\ Ί	1%	981%. 98. í%
50 [ 9 . l'\ ; ί....................................................k.................................	s>?* 1%	98 * i% 98 * i%.
!M [ *>7 t%	97*7%;	97* i% o?
300 \| %-!%	96 3- 2* a	97*i'% o? - p_s
3M \| % t 2% Ί	96*2%:	% * 2% Ob _t 2%
lÓW \| :	-í · 2%	94*2% P-22;

Concentração (μΜ) [00068] A Tabela 6 mostra a taxa de proliferação de melanoblastos após 72 horas.

Tabela 6

Címeemratkm (μΜ) \| P4	P4A \| P4B	P4C
3 [ ÍOQ%	I0GH \| W0%	100%

10	Í(X)% [ 10% <> ;	%()% SOrV',.
.......................30.......................	......99* 1%......[.........99±·ϊ%........;	99* 1%
	98!% \| 984%	98 * 1% 98 > i%
____	9%%%~~Ί	ÕF*2% 1 tFT>%
300'	97 -1 1% \| 97x2%	99*2% %%„
SÓO	± 2% 2% ................... j........................................	95*2% 9-n 29.
100®	95 2% \| 95 2%:	04 * 2% 05

Concentração (μΜ) [00069] A Tabela 7 mostra a taxa de proliferação de fibroblastos após 72 horas.

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Tabela 7

	w	ÍMA	1MB	P4C
a
10	IsB		99 χ Í U.	99 _s
30		Wá iw	99 X	99 í '< „
50	w ‘ 1'·..		99 x !%	99 , r,<
1«		97 á 2%	õSx2%:	9S - 2«
		07 í 2%	97 x 2%
	07x2%	Oh x 2% :	96 x 2%	96x2?»
looo:		95 Λ 2%	9b x 2%	9u * 2%

Concentração (μΜ) [00070] Após uma incubação de 72 horas de progenitores epidérmicos, melanoblastos e fibroblastos com 100 μΜ de decapeptídeo P4A, o resultado foi uma redução de três porcento na taxa de proliferação de todas as três linhagens de células.

[00071] Sob 1000 μΜ, a taxa de proliferação de progenitores epidérmicos foi reduzida em 6 porcento, enquanto a de melanoblastos e fibroblastos foi reduzida em 5 porcento e 4 porcento, respectivamente.

[00072] Também foi testado o efeito de cada um dos decapeptídeos sobre viabilidade celular. Em particular, as células foram incubadas com o decapeptídeo em várias concentrações e em seguida contadas em relação a viabilidade quanto ao controle (células não tratadas) utilizando azul de tripano. A citotoxicidade foi medida de acordo com a seguinte fórmula:

[1 - (número de células no controle - número de células vivas na amostra de teste)/número de células no controle] x 100 porcento.

[00073] A Tabela 8 apresenta a viabilidade de progenitores epidérmicos ao fim de 7 dias.

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Tabela 8

Concentração (μΜ); Mudar ponto para vírgula [00074] A Tabela 9 apresenta a viabilidade de melanoblastos após dias.

Tabela 9

	Μ	MC
	\|D0%
W \| 901% \| «Wát 1%	OS 5 - i%	09 ά 1%.
M \| 9Γ t 1%	07 8 * 3%	4 τ. 1 %
50 \| \| 1%	97 2 * 2%	97 9 £·
10® I 1 97 ±2%	OOs	^k ο _e
300 \| 9’ 2 ‘ :% I - 2% —-................... J ..................... 4......... ,ξ........................................	95.6 ±2% 7^7%	<«<>' '%
Í000 1 ’Μ ' 2% 1 Ms .-2%	.90 ±2%	90% 3%

Concentração (μΜ); Mudar ponto para vírgula [00075] A Tabela 10 apresenta a viabilidade de fibroblastos após 7 dias.

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Tabela 10

í 95 íj x	2% \|			965 - 2¾		2%
§ ......		j5 5	’ 2%	05 3 ± »	’)? 7 .·*.	2’^4
\| ^8-		94 3		94 2 4· 3* «	9 -s	3%

Concentração (μΜ); Mudar ponto para vírgula [00076] Na concentração de 100 μΜ, a viabilidade celular permaneceu acima de 97 porcento para todas as três linhagens de células. Em 1000 μΜ, a viabilidade celular diminuiu 6 porcento em relação ao controle.

[00077] Em conclusão, relatórios recentes detalham os papéis pleiotrópicos que sirtuínas desempenham na repressão de envelhecimento prematuro, atrasando a senescência celular, aumentando a longevidade e melhorando uma ampla gama de distúrbios do envelhecimento. Relatou-se aqui as conclusões sobre o potente ativador de sirtuína, decapeptídeo-12, e comparou-se o seu desempenho com o bem documentado oxirresveratrol. O tratamento de progenitores epidérmicos humanos com 100 μΜ de decapeptídeo12 aumentou a transcrição de SIRT1 em 141 ± 11 porcento em relação a células de controle, enquanto os níveis de SIRT3, SIRT6 e SIRT7 aumentaram em 121 ± 13 porcento, 147 ± 8 porcento e 95,4 ± 14 porcento, respectivamente. Decapeptídeo-12 regulou em excesso a transcrição de sirtuína a níveis semelhantes aos de oxirresveratrol, mas com reduzida citotoxicidade. Assim, decapeptídeo-12 pode ser

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26/28 uma esperança como uma terapêutica mais segura para combater o envelhecimento da pele e outras patologias associadas à idade.

[00078] Embora a descrição acima mencione uma concentração típica de decapeptídeo de 100 μΜ ou mais ao observar onde o efeito foi evidente, os resultados demonstram também concentrações mais baixas como tendo um efeito positivo. Assim, algumas modalidades da presente invenção podem utilizar uma concentração de decapeptídeo de 1 μΜ ou mais, com modalidades particulares da presente invenção empregando um intervalo de concentrações de peptídeo de 100 μΜ ou mais. Exemplos de intervalos de concentrações de peptídeo de acordo com várias modalidades da presente invenção são 1 μΜ ou mais, 5 μΜ ou mais, 10 μΜ ou mais, 30 μΜ ou mais, 50 μΜ ou mais, 100 μΜ ou mais, 300 μΜ ou mais, 500 μΜ ou mais e 1.000 μΜ ou mais.

[00079] Observa-se adicionalmente que um decapeptídeo particular pode ser utilizado em combinação com outro(s) componente(s) a fim de alcançar o efeito desejado. Por exemplo, um decapeptídeo particular podería ser utilizado em combinação com outros peptídeos tais como decapeptídeos P4A, 4B e/ou 4C, e/ou com outros componentes tal como oxirresveratrol. De acordo com tais modalidades da presente invenção, um efeito sinérgico realizado pela inclusão de outros componentes pode em última análise reduzir a concentração de qualquer componente individual (por exemplo, outro decapeptídeo) que seja necessário para atingir o resultado desejado.

[00080] Embora o descrito acima inclua especificamente decapeptídeos e oxirresveratrol como possíveis componentes adicionais, modalidades da presente invenção não são limitadas a isso. Exemplos de outros aditivos possíveis podem incluir, mas sem limitação, ácido a-lipoico, biotina, cafeína, ceramidas, coenzima Q10, ácido glicólico, chá verde, células estaminais humanas, extratos de células estaminais humanas, ácido hialurônico, hidroquinona, óleo de

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27/28 jojoba, ácido cójico, ácido láctico, ácido málico, niacinamida, oligopeptídeos, peptídeos, células estaminais de plantas, extratos de células estaminais de plantas, resveratrol, retinol, vitamina C, vitamina E e vitamina K, entre outros.

[00081] É de notar que modalidades da presente invenção podem ser usadas para tratar uma variedade de tipos de células da pele. Exemplos de células cutâneas diferenciadas terminalmente podem incluir, mas sem limitação, queratinócitos, fibrócitos, melanócitos e células imunitárias tais como células de Langerhans (por exemplo, histiócitos ou dendrócitos) que envelhecem também ao longo do tempo.

[00082] Modalidades da presente invenção podem também ser utilizadas para tratar células progenitoras da pele para reduzir envelhecimento da pele e permitir renovação da pele ao longo de seu tempo de vida. Exemplos de tais células progenitoras podem incluir, mas sem limitação, progenitores de queratinócitos epidérmicos, fibroblastos, melanoblastos, histioblastos ou dendroblastos que são progenitores de células de Langerhans que se alojam na epiderme.

[00083] Por fim, embora o texto acima tenha descrito o tratamento de células da pele humana, modalidades específicas da presente invenção não se limitam a essas abordagens. Modalidades da presente invenção alternativas poderíam empregar o tratamento de células da pele a partir de outros organismos, incluindo mas sem limitação, mamíferos tais como vacas (por exemplo, na fabricação de couro), porcos e outros animais (por exemplo, cães, gatos e outros que podem ser valorizados com base na aparência da pele para fins de concurso).

[00084] Esta descrição da invenção foi apresentada para os fins de ilustração e descrição. Não se pretende que seja exaustiva ou que limite a invenção à forma precisa descrita, e muitas modificações e

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28/28 variações são possíveis à luz dos ensinamentos acima. As modalidades da presente invenção foram escolhidas e descritas de modo a explicar melhor os princípios do invento e suas aplicações práticas. Esta descrição possibilitará que outros versados no estado da técnica utilizem e pratiquem melhor a invenção em várias modalidades e com várias modificações conforme sejam apropriadas para uma utilização particular. O escopo da invenção é definido pelas reivindicações seguintes.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que consiste em SEQ ID N^Q: 9, SEQ ID N^Q: 10, SEQ ID N^Q: 11 ou SEQ. ID N^Q: 12.
2. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que consiste em SEQ ID N^Q: 9 modificada por um grupo de modificação, o grupo de modificação sendo um grupo palmitoíla ou um grupo acetila em uma extremidade aminoterminal, ou amidação de uma extremidade carbóxi-terminal, ou ambos.
3. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que consiste em SEQ ID N^Q: 11 que possui um aminoácido tirosina em uma posição 6 como uma isoforma D, e todos os outros aminoácidos sendo isoformas L.
4. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um primeiro peptídeo que consiste em SEQ ID N^Q: 9, SEQ ID N^Q: 10, SEQ ID N^Q: 11 ou SEQ. ID N^Q: 12.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o peptídeo consiste em SEQ ID N^Q: 9 modificada por um grupo de modificação, o grupo de modificação sendo um grupo palmitoíla ou um grupo acetila em uma extremidade aminoterminal, ou amidação de uma extremidade carbóxi-terminal, ou ambos.
6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 e 5, caracterizada pelo fato de que consiste em SEQ ID N^Q: 11 que possui um aminoácido tirosina em uma posição 6 como uma isoforma D, e todos os outros aminoácidos sendo isoformas L.
7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizada pelo fato de que o peptídeo está presente em uma concentração de 1 pm ou mais.
8. Método de tratamento de um indivíduo por modulação da expressão de um gene para sirtuína em uma célula da pele para

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2/3 reduzir sintomas de envelhecimento da pele, método caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um ou mais peptídeos, em que o um ou mais peptídeos consistem em SEQ ID N^Q: 9, SEQ ID N^Q: 10, SEQ ID N^Q: 11 ou SEQ. ID N^Q: 12.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o peptídeo consiste em SEQ ID N^Q: 9 modificada por um grupo de modificação, o grupo de modificação sendo um grupo palmitoíla ou um grupo acetila em uma extremidade aminoterminal, ou amidação de uma extremidade carbóxi-terminal, ou ambos.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 e 9, caracterizado pelo fato de que o peptídeo consiste em SEQ ID N^Q: 11 que possui um aminoácido tirosina em uma posição 6 como uma isoforma D, e todos os outros aminoácidos sendo isoformas L.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a célula da pele é um progenitor.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o progenitor é um progenitor de queratinócito da epiderme, um melanoblasto, um fibroblasto, um histioblasto ou um dendroblasto.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que a célula da pele é terminalmente diferenciada.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a célula da pele é um queratinócito, um melanócito, um fibrócito, um histiócito ou um dendrócito.
15. Método, de acordo com qualquer uma das

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3/3 reivindicações 8 a 14, caracterizado pelo fato de que o peptídeo está presente em uma concentração de 1 pm ou mais.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 15, caracterizado pelo fato de que o gene para sirtuína compreende SEQ ID N^Q: 1, SEQ ID N^Q: 2, SEQ ID N^Q: 3, SEQ ID N^Q: 4, SEQ ID N^Q: 5, SEQ ID N^Q: 6 ou SEQ ID N^Q: 7.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 16, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda oxirresveratrol.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 17, caracterizado pelo fato de que a célula da pele é uma célula de mamífero.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a célula da pele é humana.
20. Método de modulação da expressão de um gene para sirtuína em uma célula da pele, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um ou mais peptídeos, em que o um ou mais peptídeos consistem em SEQ ID N^Q: 9, SEQ ID N^Q: 10, SEQ ID N^Q: 11 ou SEQ. ID N^Q: 12.