BR112019017224B1

BR112019017224B1 - HYALURONIC ACID, COMPOSITION OF HYALURONIC ACID FOR SKIN CARE, METHODS OF PREPARING HYALURONIC ACID AND ITS SALT AND METHOD FOR INHIBITING THE DEGRADATION OF THE EXTRACELLULAR MATRIX OF THE SKIN

Info

Publication number: BR112019017224B1
Application number: BR112019017224-6A
Authority: BR
Inventors: Martin Lovchik; Gerhard Brunner; Romain Reynaud; Amandine Scandolera
Original assignee: Givaudan Sa
Priority date: 2017-03-10
Filing date: 2018-03-08
Publication date: 2023-05-30

Abstract

A presente invenção refere-se a uma composição para o cuidado da pele contendo ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio com um peso molecular médio em peso menor que 50 kDa, e um grau de acetilação de pelo menos 3,6 que é útil no tratamento dos efeitos visíveis da idade sobre a pele humana.The present invention relates to a skin care composition containing low molecular weight acetylated hyaluronic acid or its sodium salt with a weight average molecular weight of less than 50 kDa, and a degree of acetylation of at least 3.6 which is useful in treating the visible effects of aging on human skin.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a princípios ativos e métodos que são úteis para reduzir os sinais visíveis do envelhecimento na pele humana. Mais especificamente, a invenção diz respeito ao uso do ácido hialurônico acetilado ou do seu sal de sódio, para inibir determinadas enzimas degradadoras da matriz que estão envolvidas na deterioração da pele induzida pela radiação ultravioleta ou pela ação do tempo. A invenção também se refere a novas formas do ácido hialurônico acetilado úteis para reduzir os sinais visíveis do envelhecimento, e aos métodos de preparação de tais formas.[0001] The present invention relates to active principles and methods that are useful for reducing the visible signs of aging in human skin. More specifically, the invention concerns the use of acetylated hyaluronic acid or its sodium salt to inhibit certain matrix-degrading enzymes that are involved in skin deterioration induced by ultraviolet radiation or the action of time. The invention also relates to new forms of acetylated hyaluronic acid useful for reducing the visible signs of aging, and methods of preparing such forms.

[0002] O desejo de parecer atraente está naturalmente enraizado nos consumidores modernos. Mesmo com as mudanças sofridas pelo padrão de beleza ao longo do tempo, existe um entendimento universal de que o estado e a aparência da nossa pele são pontos que colaboram de maneira preponderante para uma aparência externa sedutora.[0002] The desire to look attractive is naturally ingrained in modern consumers. Even with the changes suffered by the standard of beauty over time, there is a universal understanding that the state and appearance of our skin are points that contribute in a preponderant way to a seductive external appearance.

[0003] Atualmente, uma grande variedade de produtos cosméticos para o cuidado da pele é oferecida aos consumidores. De modo geral, esses produtos estão sob a forma de cremes e loções, contendo água para hidratar a pele, e gorduras e lipídeos que a mantêm lubrificada, com os seus efeitos sendo exercidos sobre a camada mais externa da pele.[0003] Currently, a wide variety of cosmetic skin care products are offered to consumers. In general, these products are in the form of creams and lotions, containing water to hydrate the skin, and fats and lipids that keep it lubricated, with their effects being exerted on the outermost layer of the skin.

[0004] Os efeitos de suavização da pele pelo ácido hialurônico são conhecidos na técnica. No entanto, também se sabe que, com o passar do tempo, a condição física do ácido hialurônico é deteriorada nas preparações cosméticas. O ácido hialurônico acetilado foi proposto no documento EP 0 725 083 como uma alternativa ao ácido hialurônico que, conforme relatado, tem as mesmas funções de suavização da pele do ácido hialurônico, mas não exibe a mesma deterioração física do ácido livre. Entretanto, o documento EP 0 725 083 não propõe ou insinua o uso do ácido hialurônico acetilado no tratamento dos efeitos do envelhecimento sobre a pele, ou suas causas subjacentes.[0004] The skin smoothing effects of hyaluronic acid are known in the art. However, it is also known that, with the passage of time, the physical condition of hyaluronic acid deteriorates in cosmetic preparations. Acetylated hyaluronic acid was proposed in EP 0 725 083 as an alternative to hyaluronic acid which, as reported, has the same skin smoothing functions as hyaluronic acid but does not exhibit the same physical deterioration as the free acid. However, EP 0 725 083 does not propose or imply the use of acetylated hyaluronic acid in the treatment of the effects of aging on the skin, or its underlying causes.

[0005] Existem várias descrições de ácido hialurônico acetilado e acetil hialuronato de baixo peso molecular (EP 0 725 083; e CN 106176286) e de peso molecular intermediário (Saturnino et al. em Biomed Research International, 2014, 921549: "Acetylated hyaluronic acid: enhanced bioavailability and biological studies"; e Oka et al. em Polymer, 41: "Differential scanning calorimetry studies on the mechanism of skin-softening effect of sodium acetylhyaluronate") com vários graus de substituição da acetila, que podem ser utilizados nos cuidados com a pele. No entanto, como mostraremos abaixo, esses produtos apresentam desvantagens substantivas em relação ao produto da presente invenção.[0005] There are several descriptions of acetylated hyaluronic acid and acetyl hyaluronate of low molecular weight (EP 0 725 083; and CN 106176286) and intermediate molecular weight (Saturnino et al. in Biomed Research International, 2014, 921549: "Acetylated hyaluronic acid: enhanced bioavailability and biological studies"; and Oka et al. in Polymer, 41: "Differential scanning calorimetry studies on the mechanism of skin-softening effect of sodium acetylhyaluronate") with various degrees of acetyl substitution, which can be used in skin care. However, as we will show below, these products have substantial disadvantages compared to the product of the present invention.

[0006] O fornecimento de preparações cosméticas eficazes úteis no tratamento das causas do envelhecimento cutâneo e que reduzam os sinais visíveis do envelhecimento continua sendo uma lacuna a ser preenchida.[0006] The supply of effective cosmetic preparations that are useful in treating the causes of skin aging and that reduce the visible signs of aging remains a gap to be filled.

[0007] O arcabouço estrutural da pele é designado como sua matriz extracelular. Essa estrutura interna contém uma rede de polímeros entremeados, como colágeno e elastina, em cujo interior encontramos as células da pele. A matriz extracelular é responsável pelas propriedades mecânicas da pele, entre elas firmeza, resistência, maleabilidade e elasticidade. Os sinais físicos do envelhecimento cutâneo são um reflexo da condição da matriz da pele. Mais particularmente, quanto mais frágil e menos regular a matriz, maior a tendência da pele de apresentar rugas, asperezas e flacidez.[0007] The structural framework of the skin is referred to as its extracellular matrix. This internal structure contains a network of intermingled polymers, such as collagen and elastin, within which we find skin cells. The extracellular matrix is responsible for the mechanical properties of the skin, including firmness, resistance, suppleness and elasticity. The physical signs of skin aging are a reflection of the condition of the skin's matrix. More particularly, the more fragile and less regular the matrix, the greater the tendency of the skin to show wrinkles, roughness and sagging.

[0008] A matriz extracelular da pele é um recurso valioso, que na pele jovem e saudável é produzida, mas também consumida. A suavidade, firmeza e juventude da pele humana dependem em larga medida da condição da sua matriz, e esta, por sua vez, depende do balanço entre a síntese da matriz e a degradação e reciclagem da matriz. A matriz extracelular da pele é formada por colágenos (com a prevalência do colágeno do tipo I); elastinas; e outros componentes como glicosaminoglicanos (GAGs). A matriz é sintetizada pelos fibroblastos na derme, e é remodelada por certas enzimas específicas (as metaloproteinases da matriz, ou MMPs). Via de regra, essas enzimas estão envolvidas na cura de feridas, mas são superexpressadas durante o envelhecimento causado pelo tempo e pela radiação ultravioleta, promovendo assim a degradação descontrolada e intensa da matriz, que é notoriamente responsável pelos sinais visíveis do envelhecimento, como o colapso da pele e a formação de rugas. Existem cerca de 20 MMPs, as quais são agrupadas em diferentes categorias conforme a sua especificidade de substrato. Entre elas estão as colagenases, gelatinases, estromelisinas, e MMPs do tipo membrana. A MMP-1 é a colagenase mais conhecida e está envolvida na clivagem dos colágenos estruturais, como o colágeno do tipo 1. A MMP-3 é uma estromelisina que está envolvida na clivagem de colágenos da membrana basal, como o colágeno IV.[0008] The extracellular matrix of the skin is a valuable resource, which in young and healthy skin is produced, but also consumed. The smoothness, firmness and youthfulness of human skin largely depend on the condition of its matrix, and this, in turn, depends on the balance between matrix synthesis and matrix degradation and recycling. The extracellular matrix of the skin is formed by collagen (with a predominance of collagen type I); elastins; and other components such as glycosaminoglycans (GAGs). The matrix is synthesized by fibroblasts in the dermis, and is remodeled by certain specific enzymes (matrix metalloproteinases, or MMPs). As a rule, these enzymes are involved in wound healing, but they are overexpressed during aging caused by time and ultraviolet radiation, thus promoting the uncontrolled and intense degradation of the matrix, which is notoriously responsible for the visible signs of aging, such as skin breakdown and wrinkle formation. There are about 20 MMPs, which are grouped into different categories according to their substrate specificity. These include collagenases, gelatinases, stromelysins, and membrane-type MMPs. MMP-1 is the best known collagenase and is involved in the cleavage of structural collagens such as type 1 collagen. MMP-3 is a stromelysin that is involved in the cleavage of basement membrane collagens such as collagen IV.

[0009] As proteínas da matriz são moléculas estruturais grandes de meias-vidas longas (da ordem de 70 anos no caso da elastina). Consequentemente, praticamente não há reposição ou renovação desses materiais no tempo de vida normal do homem. Sendo assim, ocorre uma alteração e degradação progressivas da matriz que é acelerada com a idade, corrompendo e enfraquecendo a sustentação da pele e criando sinais visíveis do envelhecimento.[0009] Matrix proteins are large structural molecules with long half-lives (on the order of 70 years in the case of elastin). Consequently, there is virtually no replenishment or renewal of these materials in man's normal lifetime. Thus, there is a progressive alteration and degradation of the matrix that is accelerated with age, corrupting and weakening the support of the skin and creating visible signs of aging.

[0010] O envelhecimento cutâneo é o resultado do processo de envelhecimento cronológico intrínseco associado aos fatores ambientais, que consiste predominantemente na exposição à radiação ultravioleta. Os níveis da MMP sobem excessivamente no decorrer do envelhecimento cronológico normal, e os fatores ambientais agem para elevar ainda mais os níveis da MMP. A redução dos níveis das enzimas MMP e o seu retorno aos patamares normais da juventude, que são suficientes para atenuar a degradação da matriz, e preservar uma matriz saudável, podem contribuir para minorar ou suprimir os sinais visíveis do envelhecimento na pele humana.[0010] Skin aging is the result of the intrinsic chronological aging process associated with environmental factors, which consists predominantly of exposure to ultraviolet radiation. MMP levels rise excessively in the course of normal chronological aging, and environmental factors act to further elevate MMP levels. Reducing levels of MMP enzymes and returning them to youthful normal levels, which are sufficient to attenuate matrix degradation and preserve a healthy matrix, can contribute to lessening or suppressing the visible signs of aging in human skin.

[0011] Existe a necessidade de fornecer métodos e preparações cosméticas para aplicação cutânea que possam reverter ou reduzir a degradação da matriz da pele, inibindo ou reduzindo os níveis elevados de enzimas degradadoras da matriz, como as MMPs, aos níveis balanceados encontrados na pele jovem ou saudável.[0011] There is a need to provide cosmetic methods and preparations for cutaneous application that can reverse or reduce degradation of the skin matrix by inhibiting or reducing elevated levels of matrix-degrading enzymes, such as MMPs, to the balanced levels found in young or healthy skin.

[0012] A invenção refere-se ao uso do ácido hialurônico acetilado ou do seu sal de sódio (acetil hialuronato de sódio) para controlar o balanço entre os materiais degradadores da matriz na matriz extracelular da pele, reduzindo a extensão da degradação de proteínas essenciais da matriz, como o colágeno, e para reduzir os sinais visíveis do envelhecimento (induzidos pelo tempo ou pelo ambiente), sobretudo a prevenção ou redução das rugas e para a produção e manutenção de uma pele com aparência jovial.[0012] The invention relates to the use of acetylated hyaluronic acid or its sodium salt (sodium acetyl hyaluronate) to control the balance between matrix-degrading materials in the extracellular matrix of the skin, reducing the extent of degradation of essential matrix proteins, such as collagen, and to reduce the visible signs of aging (induced by time or the environment), especially the prevention or reduction of wrinkles and for the production and maintenance of youthful-looking skin.

[0013] Por conseguinte, a invenção engloba os seguintes aspectos e modalidades:[0013] Therefore, the invention encompasses the following aspects and modalities:

[0014] Um método para inibir a degradação da matriz extracellular da pele associada aos níveis elevados de enzimas degradadoras da matriz, o dito método compreendendo a etapa de aplicar à pele uma quantidade eficaz de ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio, em particular na forma da composição para cuidado da pele da presente invenção.[0014] A method for inhibiting degradation of the extracellular matrix of the skin associated with elevated levels of matrix-degrading enzymes, said method comprising the step of applying to the skin an effective amount of acetylated hyaluronic acid or its sodium salt, in particular in the form of the skin care composition of the present invention.

[0015] O método descrito acima, que é um método para reduzir os sinais visíveis do envelhecimento cutâneo, mais particularmente um método para prevenção ou redução das rugas.[0015] The method described above, which is a method for reducing the visible signs of skin aging, more particularly a method for preventing or reducing wrinkles.

[0016] O método descrito acima, em que as enzimas degradadoras da matriz são metaloproteinases da matriz e, mais particularmente, as enzimas MMP-1 ou MMP-3.[0016] The method described above, wherein the matrix-degrading enzymes are matrix metalloproteinases, and more particularly MMP-1 or MMP-3 enzymes.

[0017] O método descrito acima, em que o ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio age para reduzir o grau de degradação do colágeno na matriz extracelular, em particular a degradação pelas metaloproteinases.[0017] The method described above, in which acetylated hyaluronic acid or its sodium salt acts to reduce the degree of degradation of collagen in the extracellular matrix, in particular degradation by metalloproteinases.

[0018] A fração de baixo peso molecular do ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, com um alto grau de acetilação, para uso em um método descrito no presente documento.[0018] The low molecular weight fraction of acetylated hyaluronic acid, or its sodium salt, with a high degree of acetylation, for use in a method described herein.

[0019] O ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, descrito acima tendo um peso molecular médio em peso de cerca de 50 kDa ou menos, mais particularmente de cerca de 35 kDa ou menos, e ainda mais particularmente de cerca de 30 kDa ou menos.[0019] The acetylated hyaluronic acid, or its sodium salt, described above having a weight average molecular weight of about 50 kDa or less, more particularly of about 35 kDa or less, and even more particularly of about 30 kDa or less.

[0020] O ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, descrito acima, tendo um peso molecular médio em peso de cerca de 50 kDa ou menos, mais particularmente de cerca de 35 kDa ou menos, e ainda mais particularmente de cerca de 30 kDa ou menos, e um índice de polidispersividade que é menor que 2,3, mais particularmente menor que 2,0, mais particularmente menor que 1,8, mais particularmente menor que 1,7, mais particularmente menor que 1,6 ou menos, mais particularmente menor que 1,5, mais particularmente menor que 1,4, e mais particularmente cerca de 1,3 ou menos.[0020] The acetylated hyaluronic acid, or its sodium salt, described above, having a weight average molecular weight of about 50 kDa or less, more particularly of about 35 kDa or less, and even more particularly of about 30 kDa or less, and a polydispersity index that is less than 2.3, more particularly less than 2.0, more particularly less than 1.8, more particularly less than 1.7, more particularly less than 1 .6 or less, more particularly less than 1.5, more particularly less than 1.4, and more particularly about 1.3 or less.

[0021] O ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, descrito acima tendo grau de acetilação que é maior que 3,6, mais particularmente igual ou maior que 3,7, mais particularmente igual ou maior que 3,8, mais particularmente igual ou maior que 3,9, e ainda mais particularmente igual a 4.[0021] The acetylated hyaluronic acid, or its sodium salt, described above having degree of acetylation that is greater than 3.6, more particularly equal to or greater than 3.7, more particularly equal to or greater than 3.8, more particularly equal to or greater than 3.9, and even more particularly equal to 4.

[0022] O ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, descrito acima tendo um grau de acetilação que é maior que 3,6, mais particularmente igual ou maior que 3,7, mais particularmente igual ou maior que 3,8, mais particularmente igual ou maior que 3,9, e ainda mais particularmente igual a 4 determinado com o uso da RMN 2D quantitativa.[0022] The acetylated hyaluronic acid, or its sodium salt, described above having a degree of acetylation that is greater than 3.6, more particularly equal to or greater than 3.7, more particularly equal to or greater than 3.8, more particularly equal to or greater than 3.9, and even more particularly equal to 4 determined using quantitative 2D NMR.

[0023] Um método para preparar um ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio com um peso molecular médio em peso de 50 kDa ou menos e um grau de acetilação médio maior que 3,6, que compreende as etapas de:[0023] A method for preparing a low molecular weight acetylated hyaluronic acid or its sodium salt with a weight average molecular weight of 50 kDa or less and an average degree of acetylation greater than 3.6, comprising the steps of:

[0024] (i) selecionar um ácido hialurônico de baixo peso molecular com um peso molecular igual ou menor que 50 kDa, mais particularmente igual ou menor que 35 kDa, ou ainda mais particularmente igual ou menor que 30 kDa;[0024] (i) selecting a low molecular weight hyaluronic acid with a molecular weight equal to or less than 50 kDa, more particularly equal to or less than 35 kDa, or even more particularly equal to or less than 30 kDa;

[0025] (ii) expor o ácido acima a condições de acetilação, sendo que as condições de acetilação incluem, de preferência, a etapa de reagir o ácido hialurônico de baixo peso molecular com uma mistura de ácido acético/anidrido acético na presença de um ácido forte; e[0025] (ii) exposing the above acid to acetylation conditions, the acetylation conditions preferably including the step of reacting low molecular weight hyaluronic acid with an acetic acid/acetic anhydride mixture in the presence of a strong acid; It is

[0026] (iii) isolar o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular, de preferência por precipitação, usando água de adição.[0026] (iii) isolating low molecular weight acetylated hyaluronic acid, preferably by precipitation, using addition water.

[0027] Uma preparação cosmética contendo uma quantidade eficaz do ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, descrito acima.[0027] A cosmetic preparation containing an effective amount of the acetylated hyaluronic acid, or its sodium salt, described above.

[0028] Uma composição para cuidado da pele contendo ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio, caracterizado por o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio ter um peso molecular médio em peso igual ou menor que 50 kDa e um grau de acetilação médio maior que 3,6.[0028] A skin care composition containing low molecular weight acetylated hyaluronic acid or its sodium salt, characterized in that the low molecular weight acetylated hyaluronic acid or its sodium salt has a weight average molecular weight equal to or less than 50 kDa and an average degree of acetylation greater than 3.6.

[0029] A preparação cosmética, e em particularmente a composição para cuidado da pele, descrita acima, contendo pelo menos um excipiente cosmeticamente aceitável.[0029] The cosmetic preparation, and in particular the skin care composition, described above, containing at least one cosmetically acceptable excipient.

[0030] Esses e outros aspectos da invenção serão mais bem compreendidos após a descrição detalhada das modalidades particulares da invenção, que é dada abaixo.[0030] These and other aspects of the invention will be better understood after the detailed description of the particular embodiments of the invention, which is given below.

[0031] Envelhecimento cutâneo é um termo que indica as mudanças sofridas pela pele com a idade, através do envelhecimento cronológico ou da exposição ao sol (fotoenvelhecimento) ou causado por outros agentes ambientais como a fumaça do tabaco, condições climáticas extremas de frio, calor, ou vento, poluentes ou contaminantes químicos, e engloba todas as alterações externas perceptíveis e/ou visíveis ao toque, tais como, entre outros, o desenvolvimento de descontinuidades na pele como rugas, linhas finas, sulcos, irregularidades ou asperezas, aumento do tamanho dos poros, perda de elasticidade, perda de firmeza, perda de suavidade, perda da capacidade de se recuperar de uma deformação, flacidez da pele como bochechas flácidas, o aparecimento de bolsas sob os olhos ou de queixo duplo, entre outros, alterações na coloração da pele como marcas, vermelhidão, ou o aparecimento de áreas hiperpigmentadas, a exemplo das manchas senis ou sardas entre outras, diferenciação anômala, hiperqueratinização, elastose, ceratose, perda da estrutura do colágeno e outras alterações histológicas do estrato córneo, da derme ou da epiderme.[0031] Cutaneous aging is a term that indicates the changes undergone by the skin with age, through chronological aging or exposure to the sun (photoaging) or caused by other environmental agents such as tobacco smoke, extreme weather conditions of cold, heat, or wind, pollutants or chemical contaminants, and encompasses all external changes perceptible and/or visible to the touch, such as, among others, the development of discontinuities in the skin such as wrinkles, fine lines, furrows, irregularities or roughness s, increase in pore size, loss of elasticity, loss of firmness, loss of smoothness, loss of ability to recover from deformation, sagging skin such as saggy cheeks, the appearance of bags under the eyes or double chin, among others, changes in skin color such as marks, redness, or the appearance of hyperpigmented areas, such as age spots or freckles, among others, anomalous differentiation, hyperkeratinization, elastosis, keratosis, loss of collagen structure and other histological changes stratum corneum, dermis or epidermis.

[0032] Como se sabe, o nível elevado de metaloproteinases da matriz (MMPs) é um fator crucial para o envelhecimento cutâneo. As MMPs, como a MMP-1 e a MMP-3, estão envolvidas na degradação da matriz, e em particular na degradação do colágeno do tipo I, que é o tipo de colágeno mais importante encontrado na derme. Durante o processo do envelhecimento cronológico, bem como resultado da exposição ao UV e da exposição aos demais agentes ambientais, a produção de MMPs cresce, levando à degradação dérmica, colapso da pele, formação de rugas e, assim, dos primeiros sinais visíveis do envelhecimento cutâneo.[0032] As is known, the high level of matrix metalloproteinases (MMPs) is a crucial factor for skin aging. MMPs, such as MMP-1 and MMP-3, are involved in matrix degradation, and in particular the degradation of type I collagen, which is the most important type of collagen found in the dermis. During the chronological aging process, as well as as a result of UV exposure and exposure to other environmental agents, the production of MMPs increases, leading to dermal degradation, skin breakdown, wrinkle formation and thus the first visible signs of skin aging.

[0033] De maneira surpreendente, foi constatado que o ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, é capaz de reduzir os níveis das MMPs, em particular da MMP-1 e da MMP-3. Acredita-se, embora a requerente não queira se vincular pela teoria, que o nível mais baixo das MMPs resulta da regulação negativa dos genes que codificam essas enzimas.[0033] Surprisingly, it was found that acetylated hyaluronic acid, or its sodium salt, is able to reduce the levels of MMPs, in particular MMP-1 and MMP-3. It is believed, although Applicant does not wish to be bound by theory, that the lower level of MMPs results from negative regulation of the genes encoding these enzymes.

[0034] O efeito biológico do ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio da presente invenção foi demonstrado em determinados estudos de expressão gênica conduzidos em três tipos principais de células presentes na pele: fibroblastos, queratinócitos e melanócitos. O impacto biológico do ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, também foi determinado por estudos funcionais e de proteínas in vitro. Descobrimos que ele apresenta uma nova atividade antienvelhecimento que está relacionada a limitar a degradação da matriz e proteger a pele contra os sinais da idade. Os estudos são descritos com mais profundidade nos exemplos abaixo.[0034] The biological effect of acetylated hyaluronic acid or its sodium salt of the present invention has been demonstrated in certain gene expression studies conducted in three main types of cells present in the skin: fibroblasts, keratinocytes and melanocytes. The biological impact of acetylated hyaluronic acid, or its sodium salt, has also been determined by functional and protein studies in vitro. We found that it has new anti-aging activity that is related to limiting matrix degradation and protecting the skin against the signs of aging. The studies are described in more depth in the examples below.

[0035] Em contrapartida, descobriu-se que o ácido hialurônico acetilado descrito no documento CN 106176286 (obtido da empresa Bloomage Freda Biopharm Co., Ltd.) não induziu qualquer resposta gênica.[0035] In contrast, it was found that acetylated hyaluronic acid described in document CN 106176286 (obtained from Bloomage Freda Biopharm Co., Ltd.) did not induce any gene response.

[0036] A descoberta de que o ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, quando aplicado à pele, pode gerar um efeito biológico que é percebido como uma redução nos sinais visíveis do envelhecimento cutâneo, como a redução de rugas, capacita o indivíduo versado na técnica a fornecer preparações cosméticas para aplicação à pele de um indivíduo humano.[0036] The discovery that acetylated hyaluronic acid, or its sodium salt, when applied to the skin, can generate a biological effect that is perceived as a reduction in the visible signs of skin aging, such as the reduction of wrinkles, enables the person skilled in the art to provide cosmetic preparations for application to the skin of a human subject.

[0037] As preparações cosméticas e, em particular, as composições para o cuidado da pele, da presente invenção contêm uma quantidade cosmeticamente aceitável de ácido hialurônico acetilado ou do seu sal de sódio.[0037] The cosmetic preparations, and in particular the skin care compositions, of the present invention contain a cosmetically acceptable amount of acetylated hyaluronic acid or its sodium salt.

[0038] Uma quantidade cosmeticamente eficaz de ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio é entendida como uma quantidade não tóxica, porém suficiente, de ácido hialurônico acetilado ou do sal de sódio para propiciar o efeito desejado. Com relação ao peso total de uma preparação cosmética, em particular da composição para cuidado da pele, o ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio pode estar presente em quantidades de cerca de 0,005 a cerca de 5,0% em peso, e mais particularmente cerca de 0,05 a cerca de 0,5% em peso.[0038] A cosmetically effective amount of acetylated hyaluronic acid or its sodium salt is understood to be a non-toxic but sufficient amount of acetylated hyaluronic acid or its sodium salt to provide the desired effect. With respect to the total weight of a cosmetic preparation, in particular the skin care composition, the acetylated hyaluronic acid or its sodium salt may be present in amounts from about 0.005 to about 5.0% by weight, and more particularly about 0.05 to about 0.5% by weight.

[0039] As preparações cosméticas e, em particular, as composições para cuidado da pele, da presente invenção podem conter um ou mais excipientes cosmeticamente aceitáveis. Todos os excipientes habitualmente utilizados na elaboração das preparações cosméticas para uso na pele humana podem ser empregados na presente invenção. Excipientes adequados incluem, mas não se limitam aos ingredientes que podem influenciar as propriedades organolépticas, a penetração na pele, e a biodisponibilidade do ácido hialurônico acetilado ou do seu sal de sódio. Mais especificamente, incluem líquidos, como água, óleos ou tensoativos, inclusive derivados do petróleo, animais, plantas ou sintéticos, tais como, entre outros, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim, óleo de rícino, polissorbatos, ésteres de sorbitano, sulfatos de éter, sulfatos, betaínas, glicosídeos, maltosídeos, álcoois graxos, nonoxinóis, poloxâmeros, polioxietilenos, polietilenos glicóis, dextrose, glicerol, digitonina, e similares.[0039] The cosmetic preparations, and in particular the skin care compositions, of the present invention may contain one or more cosmetically acceptable excipients. All excipients commonly used in the preparation of cosmetic preparations for use on human skin can be used in the present invention. Suitable excipients include, but are not limited to, ingredients that may influence organoleptic properties, skin penetration, and bioavailability of acetylated hyaluronic acid or its sodium salt. More specifically, they include liquids such as water, oils or surfactants, including petroleum, animal, plant or synthetic derivatives, such as but not limited to peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil, castor oil, polysorbates, sorbitan esters, ether sulfates, sulfates, betaines, glycosides, maltosides, fatty alcohols, nonoxynols, poloxamers, polyoxyethylenes, polyethylene glycols , dextrose, glycerol, digitonin, and the like.

[0040] A preparação cosmética, e em particular a composição para cuidado da pele, pode estar sob a forma de uma composição de lipossomas, lipossomas mistos, oleossomas, niossomas, etossomas, milipartículas, micropartículas, nanopartículas e nanopartículas de lipídeos sólidos, vesículas, micelas, micelas de tensoativos mistos, micelas mistas de fosfolipídeos-tensoativos, milisferas, microsferas e nanosferas, liposferas, milicápsulas, microcápsulas e nanocápsulas, bem como microemulsões e nanoemulsões, que podem ser adicionados para proporcionar uma penetração maior do ácido hialurônico acetilado ou do seu sal de sódio.[0040] The cosmetic preparation, and in particular the skin care composition, may be in the form of a composition of liposomes, mixed liposomes, oleosomes, niosomes, ethosomes, milliparticles, microparticles, nanoparticles and nanoparticles of solid lipids, vesicles, micelles, mixed surfactant micelles, mixed surfactant-phospholipid micelles, millispheres, microspheres and nanospheres, lipospheres, millicacapsules, microcapsules and nanocapsules, as well as microemulsions and nanoemulsions, which can be added to provide greater penetration of acetylated hyaluronic acid or its sodium salt.

[0041] A preparação cosmética, e em particular a composição para cuidado da pele, pode ser produzida em qualquer forma útil, sólida, líquida, ou semissólida, para aplicação tópica ou transdérmica à pele. Portanto, essas preparações de aplicação tópica ou transdérmica incluem, mas não se limitam a cremes, múltiplas emulsões como, entre outras, óleo e/ou silicone em emulsões aquosas, emulsões água em óleo e/ou emulsões do tipo silicone, água/óleo/água ou água/silicone/água, e emulsões do tipo óleo/água/óleo ou silicone/água/silicone, microemulsões, emulsões e/ou soluções, cristais líquidos, composições anidras, dispersões aquosas, óleos, leites, bálsamos, espumas, loções aquosas ou oleosas, géis aquosos ou oleosos, creme, soluções hidroalcoólicas, soluções hidroglicólicas, hidrogéis, linimentos, soros, sabonetes, máscaras faciais, séruns, filmes de polissacarídeos, unguentos, musses, pomadas, pastas, pós, barras, lápis e borrifadores ou aerossóis (borrifadores), inclusive formulações não enxaguáveis ou enxaguáveis.[0041] The cosmetic preparation, and in particular the skin care composition, can be produced in any useful form, solid, liquid, or semi-solid, for topical or transdermal application to the skin. Therefore, such topical or transdermal application preparations include, but are not limited to, creams, multiple emulsions such as, but not limited to, oil and/or silicone in aqueous emulsions, water-in-oil emulsions and/or silicone, water/oil/water or water/silicone/water emulsions, and oil/water/oil or silicone/water/silicone emulsions, microemulsions, emulsions and/or solutions, liquid crystals, anhydrous compositions, aqueous dispersions, oils, milk s, balms, foams, aqueous or oily lotions, aqueous or oily gels, cream, hydroalcoholic solutions, hydroglycolic solutions, hydrogels, liniments, serums, soaps, face masks, serums, polysaccharide films, ointments, mousses, ointments, pastes, powders, bars, pencils and sprays or aerosols (sprays), including non-rinse-off or rinse-off formulations.

[0042] A descoberta de que o ácido hialurônico acetilado ou o seu sal de sódio gera um efeito biológico foi especialmente surpreendente, tendo em vista que esse efeito não podia ser reproduzido por um ácido hialurônico ou sal não modificado, confirmando que a atividade está atrelada à acetilação da forma de ácido livre ou sal.[0042] The discovery that acetylated hyaluronic acid or its sodium salt generates a biological effect was especially surprising, given that this effect could not be reproduced by an unmodified hyaluronic acid or salt, confirming that the activity is linked to the acetylation of the free acid or salt form.

[0043] As formas particularmente preferenciais do ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio para uso na presente invenção são caracterizados por exibirem um grau de acetilação muito alto. Mais particularmente, as formas preferenciais do ácido hialurônico acetilado são caracterizadas por um grau médio de acetilação maior que 3,6, mais particularmente igual ou maior que 3,7, mais particularmente igual ou maior que 3,8, mais particularmente igual ou maior que 3,9, e ainda mais particularmente igual a 4.[0043] Particularly preferred forms of acetylated hyaluronic acid or its sodium salt for use in the present invention are characterized by exhibiting a very high degree of acetylation. More particularly, preferred forms of acetylated hyaluronic acid are characterized by an average degree of acetylation greater than 3.6, more particularly equal to or greater than 3.7, more particularly equal to or greater than 3.8, more particularly equal to or greater than 3.9, and even more particularly equal to 4.

[0044] O ácido hialurônico é um polissacarídeo formado por uma unidade de repetição contendo N-acetil glicosamina e ácido glicurônico. Ele pode existir na sua forma de ácido livre ou sal de sódio. Na forma acetilada, a expressão "grau de acetilação" indica uma medida do número de grupos hidroxila na unidade de repetição polimérica que são acetilados. Cada unidade de repetição do polímero do sal/ácido hialurônico nativo contém quatro grupos hidroxila que podem ser acetilados e o grau de acetilação é uma medida de quantos desses grupos são substituídos por um grupo acetila.[0044] Hyaluronic acid is a polysaccharide formed by a repeating unit containing N-acetyl glucosamine and glucuronic acid. It can exist in its free acid or sodium salt form. In the acetylated form, the term "degree of acetylation" denotes a measure of the number of hydroxyl groups on the polymeric repeating unit that are acetylated. Each repeating unit of the native salt/hyaluronic acid polymer contains four hydroxyl groups that can be acetylated, and the degree of acetylation is a measure of how many of these groups are replaced by an acetyl group.

[0045] A mensuração do grau de acetilação é particularmente desafiadora quando utilizamos técnicas de análise convencionais. Por exemplo, descobrimos que a RMN unidimensional é ineficaz devido à coincidência dos deslocamentos químicos dos prótons a serem medidos.[0045] Measuring the degree of acetylation is particularly challenging when using conventional analysis techniques. For example, we found that one-dimensional NMR is ineffective due to the coincidence of the chemical shifts of the protons to be measured.

[0046] No entanto, a requerente demonstrou um método analítico usando RMN bidimensional no qual o grupo N-acetila na fração glicosamina do ácido hialurônico ou do seu sal de sódio é usada como padrão interno para quantificar a funcionalidade acetila introduzida no processo de acetilação.[0046] However, applicant has demonstrated an analytical method using two-dimensional NMR in which the N-acetyl group in the glucosamine fraction of hyaluronic acid or its sodium salt is used as an internal standard to quantify the acetyl functionality introduced in the acetylation process.

[0047] Para integrar esses dois tipos de sinais (grupo O-acetila e N-acetila), a requerente concebeu um método RMN-2D. Mais particularmente, o método RMN-2D é um método heteronuclear (análise Heteronuclear de Coerência de Quantum Único), que mede um sinal do próton em uma dimensão, e o sinal dos núcleos de carbono na segunda dimensão.[0047] To integrate these two types of signals (O-acetyl and N-acetyl group), the applicant has designed a 2D-NMR method. More particularly, the 2D-NMR method is a heteronuclear method (Single Quantum Coherence Heteronuclear Analysis), which measures a signal from the proton in one dimension, and the signal from the carbon nuclei in the second dimension.

[0048] Ao empregar a técnica de RMN-2D, a requerente notou que era possível distinguir claramente o sinal N-acetila, dos sinais associados aos grupos O-acetila, permitindo a integração do volume desses grupos, e, portanto, possibilitando a determinação quantitativa do grau de acetilação. O esquema básico de um experimento de HSQC adequado é discutido nos parágrafos abaixo:[0048] By employing the 2D-NMR technique, the applicant noted that it was possible to clearly distinguish the N-acetyl signal from the signals associated with O-acetyl groups, allowing the integration of the volume of these groups, and therefore enabling the quantitative determination of the degree of acetylation. The basic outline of a proper HSQC experiment is discussed in the paragraphs below:

[0049] A análise do grau de acetilação é efetuada por um método HSQC 1H-13C melhorado por gradiente que permite a integração do volume para os grupos acetilas citados de maneira quantitativa.[0049] The analysis of the degree of acetylation is carried out by an HSQC 1H-13C method improved by gradient that allows the integration of the volume for the acetyl groups mentioned in a quantitative way.

[0050] A constante de acoplamento 1H-13C oferece informações sobre a conectividade dos átomos em uma molécula, e na espectroscopia RMN é responsável pelo surgimento de muitos sinais em um espectro. Os volumes de integração dos picos cruzados em um experimento de HSQC são modulados pela constante de acoplamento 1H-13C 1JC,H. Porém, picos cruzados oriundos de diferentes constantes de acoplamento normalmente não permitem a integração quantitativa. No entanto, a requerente notou, em um aspecto vantajoso, que no caso do método analítico corrente, 1JC,H(N-acetila) foi substancialmente igual a 1JC,H(O-acetila), permitindo uma análise quantitativa.[0050] The 1H-13C coupling constant provides information about the connectivity of atoms in a molecule, and in NMR spectroscopy it is responsible for the appearance of many signals in a spectrum. The integration volumes of cross peaks in an HSQC experiment are modulated by the 1H-13C coupling constant 1JC,H. However, cross peaks arising from different coupling constants usually do not allow quantitative integration. However, applicant noted, in an advantageous aspect, that in the case of the current analytical method, 1JC,H(N-acetyl) was substantially equal to 1JC,H(O-acetyl), allowing a quantitative analysis.

[0051] Assim como nas quantificações RMN-1D tradicionais, um tempo de espera de relaxamento suficiente pode ser fornecido para garantir que os prótons tanto N-acetila como O-acetila tenham tempo para relaxar de uma varredura para outra, a fim de permanecer em condições quantitativas. Adicionalmente, a fim de restringir a relaxação T2 diferenciada entre as espécies N-acetila e O-acetila de interesse durante a sequência, os dois tempos de espera dados por (4 X JC,H)-1 no âmbito da transferência INEPT (Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Transfer - Núcleos Insensíveis Melhorados por Transferência de Polarização) do HSQC foram mantidos tão breves quanto possível, por exemplo, por aproximadamente 1,5 milissegundos.[0051] As with traditional 1D-NMR quantifications, a sufficient relaxation hold time can be provided to ensure that both N-acetyl and O-acetyl protons have time to relax from scan to scan in order to remain in quantitative condition. Additionally, in order to restrict the differentiated T2 relaxation between the N-acetyl and O-acetyl species of interest during the sequence, the two hold times given by (4 X JC,H)-1 within the HSQC Insensitive Nuclei Enhanced by Polarization Transfer (INEPT) transfer were kept as short as possible, for example by approximately 1.5 milliseconds.

[0052] As medições RMN-2D podem ser conduzidas em qualquer instrumento de campo alto disponível na técnica. Um exemplo de um instrumento adequado é um instrumento RMN de campo alto equipado com uma cabeça de sonda Cryoprobe, mais especificamente um Bruker Avance III 600 MHz, MicroCryoprode TCI 1,7 mm.[0052] 2D-NMR measurements can be conducted on any high-field instrument available in the art. An example of a suitable instrument is a high field NMR instrument equipped with a Cryoprobe probe head, more specifically a Bruker Avance III 600 MHz, MicroCryoprode TCI 1.7 mm.

[0053] As amostras para análise podem ser preparadas como 1,2 mg de ácido hialurônico acetilado, ou seu sal de sódio, dissolvidas em 50 ml de D2O 99,96% D. A solução da amostra pode ser transferida no tubo de RMN (1,7 mm, Bruker) para medição. Parâmetros de medição típicos incluem: T = 60°C; número de varreduras = 4; varreduras fictícias = 32; tempo de espera da recuperação = 10s; tempo de aquisição = 177 ms; largura espectral (1H) = 6,0 ppm; largura espectral (13C) = 110 ppm; 1H-deslocamento de pulso = 3,5 ppm; 13C-deslocamento de pulso = 60 ppm; domínio de tempo (1H) = 1272; domínio de tempo (13C) = 256. O software para aquisição e processamento de dados, inclusive para a integração de picos cruzados, é o TopSpin 3.0 (Bruker).[0053] Samples for analysis can be prepared as 1.2 mg of acetylated hyaluronic acid, or its sodium salt, dissolved in 50 ml of D2O 99.96% D. The sample solution can be transferred into the NMR tube (1.7 mm, Bruker) for measurement. Typical measurement parameters include: T = 60°C; number of scans = 4; dummy scans = 32; recovery timeout = 10s; acquisition time = 177 ms; spectral width (1H) = 6.0 ppm; spectral width (13C) = 110 ppm; 1H-pulse shift = 3.5 ppm; 13C-pulse displacement = 60 ppm; time domain (1H) = 1272; time domain (13C) = 256. The software for data acquisition and processing, including the integration of cross peaks, is TopSpin 3.0 (Bruker).

[0054] Em particular, essa técnica de RMN-2D permitiu distinguir o ácido hialurônico acetilado ou sal de sódio da presente invenção do produto descrito no documento EP 0 725 083 e comercializado pela Shiseido: o acetil hialuronato da Shiseido tinha um grau médio de acetilação de apenas 3,6 aproximadamente. Isso é importante, já que o produto da Shiseido também mostrou ser inferior ao produto da presente invenção quanto à atividade antienvelhecimento, como mostra o Exemplo 5 adiante.[0054] In particular, this 2D-NMR technique made it possible to distinguish the acetylated hyaluronic acid or sodium salt of the present invention from the product described in EP 0 725 083 and marketed by Shiseido: Shiseido's acetyl hyaluronate had an average degree of acetylation of only approximately 3.6. This is important, as Shiseido's product has also been shown to be inferior to the product of the present invention in anti-aging activity, as shown in Example 5 below.

[0055] O ácido hialurônico acetilado ou sal de sódio usados nos métodos e preparações cosméticas, em particular nas composições para cuidado da pele, da presente invenção é um ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou sal de sódio deste ácido. A expressão "baixo peso molecular" designa um material polimérico com um peso molecular médio em peso (PM) igual ou menor que 50 kDa, mais particularmente igual ou menor que 35 kDa, mais particularmente igual ou menor que cerca de 30 kDa, mais particularmente igual ou menor que 25 kDa, mais particularmente igual ou menor que 20 kDa, mais particularmente igual ou menor que 15 kDa, e ainda mais particularmente de cerca de 10 kDa a 15 kDa, por exemplo, 13 kDa +/1 kDa.[0055] The acetylated hyaluronic acid or sodium salt used in the cosmetic methods and preparations, in particular in the skin care compositions, of the present invention is a low molecular weight acetylated hyaluronic acid or sodium salt of this acid. The expression "low molecular weight" designates a polymeric material with a weight average molecular weight (WM) equal to or less than 50 kDa, more particularly equal to or less than 35 kDa, more particularly equal to or less than about 30 kDa, more particularly equal to or less than 25 kDa, more particularly equal to or less than 20 kDa, more particularly equal to or less than 15 kDa, and even more particularly from about 10 kDa to 15 kDa, for example, 13 kDa Give +/1 kDa.

[0056] A massa molecular do ácido hialurônico acetilado ou frações poliméricas do seu sal de sódio deve ser estritamente dispersa. De preferência, o ácido hialurônico acetilado ou o seu sal de sódio tem um índice de polidispersividade (PM/Mn) que é menor que 2,0, mais particularmente menor que 1,8, mais particularmente menor que 1,7, mais particularmente igual ou menor que 1,6, mais particularmente menor que 1,5, e ainda mais particularmente igual ou menor que cerca de 1,4.[0056] The molecular mass of acetylated hyaluronic acid or polymeric fractions of its sodium salt must be strictly dispersed. Preferably, the acetylated hyaluronic acid or its sodium salt has a polydispersity index (PM/Mn) that is less than 2.0, more particularly less than 1.8, more particularly less than 1.7, more particularly equal to or less than 1.6, more particularly less than 1.5, and even more particularly equal to or less than about 1.4.

[0057] Para comparação, os produtos descritos nos documentos EP 0 725 083 (obtido da empresa Shiseido) e CN 106176286 (obtido da empresa Freda) foram analisados por HPLC-SEC (cromatografia por exclusão de tamanho e cromatografia líquida de alta eficiência) usando detecção por espalhamento de luz. Foram obtidos os seguintes resultados: [0057] For comparison, the products described in EP 0 725 083 (obtained from Shiseido company) and CN 106176286 (obtained from Freda company) were analyzed by HPLC-SEC (size exclusion chromatography and high performance liquid chromatography) using light scattering detection. The following results were obtained:

[0058] A viscosidade intrínseca do ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio é de preferência menor que 0,3 dl/g (30 cm3/g), e mais particularmente 0,245 dl/g (24,5 cm3/g) +/- 0,01 dl/g (1 cm3/g).[0058] The intrinsic viscosity of acetylated hyaluronic acid or its sodium salt is preferably less than 0.3 dl/g (30 cm3/g), and more particularly 0.245 dl/g (24.5 cm3/g) +/- 0.01 dl/g (1 cm3/g).

[0059] Os parâmetros físicos supracitados podem ser medidos por Cromatografia por Exclusão de Tamanho HPLC. Um instrumento adequado é um Viscotek GPC max VE2001, equipado com Triple Detection Parameters (Viscotek TDA 305): refratômetro, viscosímetro capilar e espalhamento de luz.[0059] The aforementioned physical parameters can be measured by HPLC Size Exclusion Chromatography. A suitable instrument is a Viscotek GPC max VE2001, equipped with Triple Detection Parameters (Viscotek TDA 305): refractometer, capillary viscometer and light scattering.

[0060] As medições do espalhamento de luz caracterizam a distribuição do tamanho de partícula pela medição da variação angular em intensidade da luz espalhada enquanto um feixe de laser passa através de uma amostra de particulado disperso. Partículas grandes espalham a luz em ângulos relativamente menores do que o feixe de laser e partículas pequenas espalham a luz em ângulos relativamente maiores. Os dados da intensidade do espalhamento angular são então analisados para calcular o tamanho das partículas responsáveis por criar o padrão de espalhamento, usando a Teoria Mie de espalhamento da luz. O tamanho da partícula é informado como o diâmetro da esfera de volume equivalente. A Cromatografia por Exclusão de Tamanho (SEC) é uma técnica analítica que separa as macromoléculas dissolvidas por tamanho com base na sua eluição de colunas abastecidas com um gel poroso. Quando a SEC for associada ao espalhamento da luz, viscosímetro e detectores de concentração (conhecida como detecção tripla), o peso molecular, tamanho molecular e viscosidade intrínseca podem ser medidos.[0060] Light scattering measurements characterize the particle size distribution by measuring the angular change in intensity of scattered light as a laser beam passes through a scattered particulate sample. Large particles scatter light at relatively smaller angles than the laser beam, and small particles scatter light at relatively larger angles. The angular scattering intensity data is then analyzed to calculate the size of the particles responsible for creating the scattering pattern, using the Mie theory of light scattering. Particle size is reported as the diameter of the sphere of equivalent volume. Size Exclusion Chromatography (SEC) is an analytical technique that separates dissolved macromolecules by size based on their elution from columns filled with a porous gel. When SEC is combined with light scattering, viscometer and concentration detectors (known as triple detection), molecular weight, molecular size and intrinsic viscosity can be measured.

[0061] Em um protocolo de medição típico, o ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio (0,2 g) é solubilizado em tampão TBS (100 ml) mediante agitação por 1 hora a 45°C, antes de armazenar a solução por mais 2 horas em temperatura ambiente sob agitação para hidratar completamente o polímero. A solução é filtrada através de um filtro de seringa de náilon de 0,2 μm. Depois disso a solução é injetada em SEC LALS HPLC (100 μl). A análise é realizada a 0,35 ml/min com tampão TBS pH 7 a 35°C. O tempo de processamento normal é de 90 minutos e o volume típico de injeção é de 100 μl.[0061] In a typical measurement protocol, acetylated hyaluronic acid or its sodium salt (0.2 g) is solubilized in TBS buffer (100 ml) by stirring for 1 hour at 45°C, before storing the solution for a further 2 hours at room temperature under stirring to fully hydrate the polymer. The solution is filtered through a 0.2 µm nylon syringe filter. After that the solution is injected into SEC LALS HPLC (100 μl). The analysis is performed at 0.35 ml/min with TBS buffer pH 7 at 35°C. Typical processing time is 90 minutes and typical injection volume is 100 µl.

[0062] O ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio é um material preferencial para uso nos métodos e preparações cosméticas, em particular nas composições para cuidado da pele, da presente invenção. Acredita-se que o uso de um material de baixo peso molecular é vantajoso porque as suas propriedades de penetração na pele são superiores às das frações de pesos moleculares mais altos.[0062] Low molecular weight acetylated hyaluronic acid or its sodium salt is a preferred material for use in the cosmetic methods and preparations, in particular the skin care compositions, of the present invention. It is believed that the use of a low molecular weight material is advantageous because its skin penetrating properties are superior to those of higher molecular weight fractions.

[0063] O ácido hialurônico ou seu sal de sódio pode ser acetilado de acordo com as metodologias conhecidas na técnica.[0063] Hyaluronic acid or its sodium salt can be acetylated according to methodologies known in the art.

[0064] Em um método adequado, o ácido hialurônico é dissolvido em uma mistura de anidrido acético e ácido acético. Depois disso, um ácido forte como o ácido sulfúrico é adicionado à solução, para efetuar a acetilação. Esse método está descrito no documento EP 0 725 083 B1.[0064] In a suitable method, hyaluronic acid is dissolved in a mixture of acetic anhydride and acetic acid. Thereafter, a strong acid such as sulfuric acid is added to the solution to effect acetylation. Such a method is described in EP 0 725 083 B1.

[0065] Em uma modalidade da invenção, a razão da mistura (p/p) entre ácido acético e anidrido acético pode variar na faixa de 1:4 a 1:1. A razão da mistura (p/p) entre o ácido forte e o ácido hialurônico pode ser de 1:5 a 1:1.[0065] In one embodiment of the invention, the mixing ratio (w/w) between acetic acid and acetic anhydride can vary in the range of 1:4 to 1:1. The mixing ratio (w/w) between strong acid and hyaluronic acid can be from 1:5 to 1:1.

[0066] A requerente notou de forma surpreendente que um grau de acetilação particularmente alto pode ser obtido se na reação de acetilação for utilizado um ácido hialurônico de baixo peso molecular como material de partida. Sem buscar vínculos teóricos, acredita-se que o ácido hialurônico de baixo peso molecular seja acetilado mais facilmente e mais extensivamente do que um material de partida com alto peso molecular porque os grupos hidroxila são menos impedidos estericamente no material de partida de baixo peso molecular e, portanto, mais facilmente acetilados. Por este motivo, é preferível preparar o ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio da presente invenção usando como substrato de partida um ácido hialurônico ou sal de sódio de baixo peso molecular.[0066] Applicant has surprisingly noted that a particularly high degree of acetylation can be obtained if a low molecular weight hyaluronic acid is used as a starting material in the acetylation reaction. Without seeking theoretical bindings, it is believed that low molecular weight hyaluronic acid is acetylated more easily and more extensively than a high molecular weight starting material because hydroxyl groups are less sterically hindered in the low molecular weight starting material and therefore more easily acetylated. For this reason, it is preferable to prepare the acetylated hyaluronic acid or its sodium salt of the present invention using a low molecular weight hyaluronic acid or sodium salt as the starting substrate.

[0067] Por conseguinte, em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de acetilação do ácido hialurônico, no qual o material de partida do ácido hialurônico é uma fração de baixo peso molecular com um peso molecular médio em peso igual ou menor que cerca de 50 kDa, mais particularmente igual ou menor que cerca de 35 kDa, e ainda mais particularmente igual ou menor que cerca de 30 kDa.[0067] Therefore, in another aspect, the present invention provides a method of acetylating hyaluronic acid, in which the hyaluronic acid starting material is a low molecular weight fraction having a weight average molecular weight equal to or less than about 50 kDa, more particularly equal to or less than about 35 kDa, and even more particularly equal to or less than about 30 kDa.

[0068] Utilizando um substrato de ácido hialurônico com o baixo peso molecular mencionado, é possível preparar um ácido hialurônico altamente acetilado, ou seu sal de sódio, com um peso molecular médio em peso (PM) igual ou menor que 50 kDa, mais particularmente igual ou menor que 35 kDa, mais particularmente igual ou menor que cerca de 30 kDa, mais particularmente igual ou menor que 25 kDa, mais particularmente igual ou menor que 20 kDa, mais particularmente igual ou menor que 15 kDa, e ainda mais particularmente igual ou menor que cerca de 10 kDa a 15 kDa, por exemplo, 13 kDa +/- 1 kDa. Essas formas de baixo peso molecular do ácido hialurônico acetilado e do acetil hialuronato de sódio constituem aspectos adicionais da presente invenção.[0068] Using a hyaluronic acid substrate with the mentioned low molecular weight, it is possible to prepare a highly acetylated hyaluronic acid, or its sodium salt, with a weight average molecular weight (WM) equal to or less than 50 kDa, more particularly equal to or less than 35 kDa, more particularly equal to or less than about 30 kDa, more particularly equal to or less than 25 kDa, more particularly equal to or less than 20 kDa, more particularly equal to or less than 15 kDa, and even more particularly equal to or less than about 10 kDa to 15 kDa, for example, 13 kDa +/- 1 kDa. These low molecular weight forms of acetylated hyaluronic acid and sodium acetyl hyaluronate constitute additional aspects of the present invention.

[0069] Um método para preparar o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ou seu sal de sódio, o dito método compreendendo as etapas de selecionar um ácido hialurônico de baixo peso molecular com peso molecular médio em peso igual ou menor que cerca de 50 kDa, mais particularmente igual ou menor que cerca de 35 kDa, e ainda mais particularmente igual ou menor que cerca de 30 kDa, e fazê-lo reagir em condições de acetilação, por exemplo, as condições aqui descritas, constituem mais um aspecto da invenção.[0069] A method for preparing low molecular weight acetylated hyaluronic acid or its sodium salt, said method comprising the steps of selecting a low molecular weight hyaluronic acid with weight average molecular weight equal to or less than about 50 kDa, more particularly equal to or less than about 35 kDa, and even more particularly equal to or less than about 30 kDa, and reacting it under acetylation conditions, for example, the conditions described herein, constitute a further aspect of the invention.

[0070] Por meio do procedimento sintético descrito acima, obtém-se uma mistura de reação bruta contendo o ácido hialurônico acetilado desejado, da qual o ácido hialurônico acetilado é preferencialmente isolado e purificado.[0070] By means of the synthetic procedure described above, a crude reaction mixture containing the desired acetylated hyaluronic acid is obtained, from which the acetylated hyaluronic acid is preferably isolated and purified.

[0071] Portanto, a invenção fornece em outro dos seus aspectos um método de isolamento do ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular de uma mistura de reação bruta contendo o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular em solução.[0071] Therefore, the invention provides in another of its aspects a method of isolating low molecular weight acetylated hyaluronic acid from a crude reaction mixture containing low molecular weight acetylated hyaluronic acid in solution.

[0072] Em uma modalidade particular da invenção, o método de isolamento do ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular compreende a etapa de precipitar o ácido da solução usando água de adição.[0072] In a particular embodiment of the invention, the method of isolating low molecular weight acetylated hyaluronic acid comprises the step of precipitating the acid from the solution using addition water.

[0073] O baixo peso molecular característico do ácido hialurônico acetilado permite que a etapa de precipitação seja realizada usando água de adição, invés de um solvente orgânico volátil de adição. Isso contrasta com os processos da técnica anterior que empregam solventes orgânicos voláteis de adição, como acetona, para precipitar os sais de sódio do ácido hialurônico acetilado a partir de uma mistura de reação bruta.[0073] The characteristic low molecular weight of acetylated hyaluronic acid allows the precipitation step to be carried out using addition water, rather than a volatile organic addition solvent. This is in contrast to prior art processes which employ volatile organic addition solvents such as acetone to precipitate the sodium salts of acetylated hyaluronic acid from a crude reaction mixture.

[0074] Dada a dificuldade de se remover todo o solvente orgânico durante o work-up (marcha de obtenção e desenvolvimento do produto da reação), os sais de sódio do ácido hialurônico formados conforme os processos da técnica anterior podem conter resíduos do solvente volátil, o que pode ser indesejável. Uma vantagem preponderante da presente invenção é poder obter um ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular isento de solventes orgânicos voláteis, como acetona.[0074] Given the difficulty of removing all the organic solvent during the work-up (obtaining and developing the reaction product), the sodium salts of hyaluronic acid formed according to the processes of the prior art may contain residues of the volatile solvent, which may be undesirable. A preponderant advantage of the present invention is the ability to obtain a low molecular weight acetylated hyaluronic acid free of volatile organic solvents, such as acetone.

[0075] O ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular que está isento de resíduos de solvente orgânico volátil constitui outro aspecto da invenção.[0075] Low molecular weight acetylated hyaluronic acid that is free from residual volatile organic solvent constitutes another aspect of the invention.

[0076] Ademais, o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular, isento do solvente orgânico volátil, também pode ser convertido no seu sal de sódio, conforme o método descrito abaixo, e o sal de sódio do ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular, isento dos solventes orgânicos voláteis, constitui um aspecto adicional da presente invenção.[0076] In addition, low molecular weight acetylated hyaluronic acid, free of volatile organic solvent, can also be converted into its sodium salt, according to the method described below, and low molecular weight acetylated hyaluronic acid sodium salt, free of volatile organic solvents, constitutes an additional aspect of the present invention.

[0077] Antes da etapa de precipitação, talvez seja desejável remover da mistura da reação, ao menos parcialmente, o ácido acético e o anidrido acético não consumidos. O ácido acético é um solvente para o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular, e a sua remoção parcial, junto com o anidrido acético, facilita a precipitação do ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular ao permitir que a etapa de precipitação seja realizada com volumes relativamente pequenos de água de adição.[0077] Before the precipitation step, it may be desirable to remove, at least partially, the unconsumed acetic acid and acetic anhydride from the reaction mixture. Acetic acid is a solvent for low molecular weight acetylated hyaluronic acid, and its partial removal, together with acetic anhydride, facilitates the precipitation of low molecular weight acetylated hyaluronic acid by allowing the precipitation step to be performed with relatively small volumes of addition water.

[0078] A mistura de ácido acético/anidrido acético pode ser removida por destilação, deixando a mistura de reação bruta na forma de uma pasta viscosa constituída basicamente pelo ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular desejado. Em seguida, água é adicionada a essa mistura bruta para concluir a precipitação. A mistura destilada de ácido acético/anidrido acético pode ser coletada e reciclada.[0078] The acetic acid/acetic anhydride mixture can be removed by distillation, leaving the crude reaction mixture in the form of a viscous paste consisting primarily of the desired low molecular weight acetylated hyaluronic acid. Then water is added to this crude mixture to complete the precipitation. The distilled acetic acid/acetic anhydride mixture can be collected and recycled.

[0079] Em uma modalidade preferencial da invenção, a quantidade de água de adição é 1 a 5 equivalentes em peso, mais particularmente 2 a 4 equivalentes em peso por uma parte da mistura da reação bruta contendo o ácido hialurônico acetilado desejado. À medida que adicionamos água à mistura da reação, qualquer anidrido residual acético é hidrolisado. A hidrólise fortemente exotérmica é realizada, preferencialmente, para que a temperatura da massa da reação não ultrapasse 40°C.[0079] In a preferred embodiment of the invention, the amount of addition water is 1 to 5 equivalents by weight, more particularly 2 to 4 equivalents by weight per one part of the crude reaction mixture containing the desired acetylated hyaluronic acid. As we add water to the reaction mixture, any residual acetic anhydride is hydrolyzed. Strongly exothermic hydrolysis is preferably carried out so that the temperature of the reaction mass does not exceed 40°C.

[0080] O ácido acético/anidrido acético pode ser removido por destilação. Antes da etapa de destilação, pode ser desejável neutralizar qualquer ácido forte na mistura da reação para evitar o contato do ácido hialurônico acetilado com o ácido forte em condições de refluxo, o que pode levar ao desenvolvimento de uma descoloração indesejável. O ajuste do pH da mistura da reação bruta antes da precipitação, portanto, é uma etapa de processo preferencial em um processo de isolamento e purificação de acordo com a invenção.[0080] Acetic acid/acetic anhydride can be removed by distillation. Prior to the distillation step, it may be desirable to neutralize any strong acid in the reaction mixture to avoid contact of the acetylated hyaluronic acid with the strong acid under reflux conditions, which can lead to the development of undesirable discoloration. Adjusting the pH of the crude reaction mixture prior to precipitation, therefore, is a preferred process step in an isolation and purification process according to the invention.

[0081] Por conseguinte, em outro aspecto, a invenção fornece um método para isolar o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular de uma mistura de reação contendo o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular em solução, o dito método compreendendo a etapa de precipitar o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular da solução em pH 5 a 8 usando água de adição.[0081] Accordingly, in another aspect, the invention provides a method for isolating low molecular weight acetylated hyaluronic acid from a reaction mixture containing low molecular weight acetylated hyaluronic acid in solution, said method comprising the step of precipitating low molecular weight acetylated hyaluronic acid from solution at pH 5 to 8 using addition water.

[0082] Em uma modalidade particular, a invenção fornece um método para isolar o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular de uma mistura de reação contendo o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular em solução, o dito método compreendendo a etapa de ajustar o pH da mistura de reação para um pH na faixa de 5 a 8 e precipitar o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular dessa solução usando água de adição.[0082] In a particular embodiment, the invention provides a method for isolating low molecular weight acetylated hyaluronic acid from a reaction mixture containing low molecular weight acetylated hyaluronic acid in solution, said method comprising the step of adjusting the pH of the reaction mixture to a pH in the range of 5 to 8 and precipitating low molecular weight acetylated hyaluronic acid from this solution using addition water.

[0083] Para os propósitos da presente invenção, o pH pode ser ajustado com um agente de tamponamento adequado, por exemplo fosfatos, acetatos e citratos conhecidos para essa finalidade, e mais particularmente, o tamponamento é efetuado pela adição de uma quantidade eficaz de acetato de sódio.[0083] For the purposes of the present invention, the pH can be adjusted with a suitable buffering agent, for example phosphates, acetates and citrates known for that purpose, and more particularly, the buffering is effected by adding an effective amount of sodium acetate.

[0084] O ácido hialurônico acetilado precipitado pode ser separado e isolado dos demais componentes da mistura de reação mediante filtração em filtro adequado, como qualquer filtro têxtil de malha fina conhecido para essa finalidade.[0084] The precipitated acetylated hyaluronic acid can be separated and isolated from the other components of the reaction mixture by filtration through a suitable filter, such as any fine mesh textile filter known for this purpose.

[0085] O ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular precipitado pode ser submetido a procedimentos de work-up adicionais depois da precipitação. Por exemplo, ele pode ser lavado com água para remover eventuais traços de impurezas solúveis em água, antes de secar o material precipitado para produzir o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular na forma de um pó branco e brilhante de fluxo livre com nenhum ou quase nenhum matiz amarelado.[0085] The precipitated low molecular weight acetylated hyaluronic acid can be subjected to additional work-up procedures after precipitation. For example, it can be washed with water to remove any traces of water-soluble impurities, before drying the precipitated material to produce the low molecular weight acetylated hyaluronic acid as a free-flowing, bright white powder with little or no yellowish tint.

[0086] O ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular pode ser usado nessa forma nos métodos e preparações cosméticas, em particular nas composições para cuidado da pele, da presente invenção.[0086] Low molecular weight acetylated hyaluronic acid can be used in this form in cosmetic methods and preparations, in particular in skin care compositions, of the present invention.

[0087] Neste estágio, também pode ser desejável submeter o ácido hialurônico acetilado a procedimentos de work-up adicionais, como uma etapa de branqueamento ou polimento para remover qualquer coloração amarela indesejada usando, por exemplo, carbono ativado. Depois disso, o ácido hialurônico purificado acetilado pode ser secado, opcionalmente a vácuo, para proporcionar o ácido hialurônico acetilado na forma adequada para uso nos métodos e preparações cosméticas da presente invenção sem modificação adicional.[0087] At this stage, it may also be desirable to subject the acetylated hyaluronic acid to additional work-up procedures, such as a bleaching or polishing step to remove any unwanted yellow coloring using, for example, activated carbon. Thereafter, the purified acetylated hyaluronic acid can be dried, optionally under vacuum, to provide the acetylated hyaluronic acid in a form suitable for use in the cosmetic methods and preparations of the present invention without further modification.

[0088] Em alternativa, pode ser desejável converter o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular no seu sal de sódio.[0088] Alternatively, it may be desirable to convert low molecular weight acetylated hyaluronic acid to its sodium salt.

[0089] O ácido hialurônico acetilado da presente invenção pode ser convertido no seu sal de sódio correspondente através de uma etapa de neutralização.[0089] The acetylated hyaluronic acid of the present invention can be converted into its corresponding sodium salt through a neutralization step.

[0090] A neutralização pode ser efetuada adicionando uma fonte aquosa de íons sódio, como hidróxido de sódio, acetato de sódio ou qualquer outra base adequada que contenha um íon sódio, a uma suspensão ou solução aquosa do ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular.[0090] Neutralization can be effected by adding an aqueous source of sodium ions, such as sodium hydroxide, sodium acetate, or any other suitable base containing a sodium ion, to an aqueous suspension or solution of low molecular weight acetylated hyaluronic acid.

[0091] A etapa de neutralização pode ser realizada na temperature de 0 a 30°C, e o tempo de reação pode variar na faixa de 0,5 a 12 horas.[0091] The neutralization step can be performed at a temperature of 0 to 30°C, and the reaction time can vary in the range of 0.5 to 12 hours.

[0092] Durante a neutralização, é desejável que a base, por exemplo, hidróxido de sódio, seja adicionada lentamente à solução ou suspensão do ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular para não acumular concentrações consideráveis da base, e para que o pH não ultrapasse cerca de 9, mais particularmente cerca de 8, mais particularmente cerca de 7,5, mais particularmente cerca de 7, e ainda mais particularmente cerca de 6,5. Desta maneira, subprodutos indesejáveis não são gerados e o desenvolvimento da descoloração indesejável é evitado.[0092] During neutralization, it is desirable that the base, for example sodium hydroxide, be added slowly to the solution or suspension of the low molecular weight acetylated hyaluronic acid so as not to build up considerable concentrations of the base, and so that the pH does not exceed about 9, more particularly about 8, more particularly about 7.5, more particularly about 7, and even more particularly about 6.5. In this way, undesirable by-products are not generated and the development of undesirable discoloration is prevented.

[0093] O curso da reação de neutralização pode ser seguido convenientemente acompanhando o pH da mistura de reação, e uma solução neutralizada do acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular correspondente é obtido quando o pH atinge 6,5 +/- 0,5.[0093] The course of the neutralization reaction can be followed conveniently by monitoring the pH of the reaction mixture, and a neutralized solution of the corresponding low molecular weight sodium acetyl hyaluronate is obtained when the pH reaches 6.5 +/- 0.5.

[0094] A solução de acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular, que constitui outro aspecto da invenção, pode ser usada nessa forma nos métodos e preparações cosméticas, em particular nas composições para cuidado da pele, da presente invenção sem modificação adicional. No entanto, se a intenção for utilizar a solução de acetil hialuronato de sódio como matéria prima nas ditas composições e métodos, é desejável incorporar à solução um agente antimicrobiano adequado, que são agentes bastante conhecidos na técnica.[0094] The low molecular weight sodium acetyl hyaluronate solution, which constitutes another aspect of the invention, can be used in that form in the cosmetic methods and preparations, in particular in the skin care compositions, of the present invention without further modification. However, if the intention is to use sodium acetyl hyaluronate solution as a raw material in said compositions and methods, it is desirable to incorporate a suitable antimicrobial agent into the solution, which are agents well known in the art.

[0095] Em alternativa, o acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular pode ser processado adicionalmente para ser produzido em forma sólida, mais particularmente em forma de pó.[0095] Alternatively, low molecular weight sodium acetyl hyaluronate can be further processed to be produced in solid form, more particularly in powder form.

[0096] Os métodos da técnica anterior para isolamento do acetil hialuronato de sódio em forma sólida compreendem a etapa de precipitar o dito composto de uma solução de acetona aquosa usando acetona pura. No entanto, quando isolado e purificado dessa maneira, existe a possibilidade de resíduos do solvente orgânico volátil permanecerem no produto acabado e, de maneira geral, esses solventes devem ser evitados ao máximo (ou removidos quando apropriado) para satisfazer as especificações do produto e outras características de qualidade que tipicamente possam ser exigidas das matérias primas destinadas ao uso na indústria cosmética.[0096] Prior art methods for isolating sodium acetyl hyaluronate in solid form comprise the step of precipitating said compound from an aqueous acetone solution using pure acetone. However, when isolated and purified in this manner, there is a possibility that volatile organic solvent residues may remain in the finished product and, generally speaking, these solvents should be avoided as much as possible (or removed where appropriate) to meet product specifications and other quality characteristics that may typically be required of raw materials intended for use in the cosmetic industry.

[0097] Além disso, dada a elevada solubilidade do acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular em água, solventes orgânicos voláteis, e em misturas desses compostos, ele não pode ser fornecido na forma sólida por precipitação.[0097] Furthermore, given the high solubility of low molecular weight sodium acetyl hyaluronate in water, volatile organic solvents, and in mixtures of these compounds, it cannot be provided in solid form by precipitation.

[0098] Outro aspecto da presente invenção, portanto, se baseia no objetivo de fornecer um método para a produção do acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular livre de solventes orgânicos voláteis em forma sólida, e de preferência em forma de pó, que é branco brilhante, de fluxo livre e fácil manipulação.[0098] Another aspect of the present invention, therefore, is based on the objective of providing a method for the production of low molecular weight sodium acetyl hyaluronate free of volatile organic solvents in solid form, and preferably in powder form, which is bright white, free flowing and easy to handle.

[0099] A requerente atingiu esses objetivos e fornece um método para converter uma solução aquosa do acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular para a forma em pó, o dito método compreendendo a etapa de desidratar a solução de acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular. A etapa de desidratação pode ser efetuada usando técnicas conhecidas, como liofilização. No entanto, mais preferencialmente, a etapa de desidratação é efetuada usando secagem por pulverização.[0099] Applicant has achieved these objectives and provides a method for converting an aqueous solution of low molecular weight sodium acetyl hyaluronate to powder form, said method comprising the step of dehydrating the low molecular weight sodium acetyl hyaluronate solution. The dehydration step can be carried out using known techniques such as lyophilization. However, more preferably, the dehydration step is carried out using spray drying.

[0100] De acordo, a invenção fornece, em outro aspecto, um método para desidratar um meio aquoso líquido, e em particular uma solução, contendo acetil hialuronato de sódio, em particular, acetil hialuronato de sódio formado de acordo com um processo aqui descrito.[0100] Accordingly, the invention provides, in another aspect, a method for dehydrating a liquid aqueous medium, and in particular a solution, containing sodium acetyl hyaluronate, in particular sodium acetyl hyaluronate formed in accordance with a process described herein.

[0101] Em uma modalidade, a invenção fornece o método descrito acima, sendo que o dito método compreende as etapas de atomizar o meio aquoso líquido em forma de gotas dentro de uma câmara de secagem mantida em condições que ensejam a evaporação do meio aquoso líquido para formar partículas do acetil hialuronato de sódio.[0101] In one embodiment, the invention provides the method described above, said method comprising the steps of atomizing the liquid aqueous medium in the form of drops inside a drying chamber maintained under conditions that allow for the evaporation of the liquid aqueous medium to form particles of sodium acetyl hyaluronate.

[0102] Em uma modalidade mais particular, a temperatura de entrada da câmara de secagem por pulverização é de cerca de 150°C, e a temperatura de saída da câmara de secagem por pulverização é igual ou menor que 70°C aproximadamente.[0102] In a more particular embodiment, the inlet temperature of the spray drying chamber is about 150°C, and the outlet temperature of the spray drying chamber is equal to or less than 70°C approximately.

[0103] Em uma modalidade ainda mais particular, o ar é bombeado para dentro da câmara de secagem para reduzir a temperatura de saída da câmara de secagem a cerca de 40 a 50°C.[0103] In an even more particular embodiment, air is pumped into the drying chamber to reduce the outlet temperature of the drying chamber to about 40 to 50°C.

[0104] O acetil hialuronato de sódio seco por pulverização, que constitui outro aspecto da presente invenção, exibe propriedades desejáveis, como elevada densidade a granel, forma e fluidez, que facilitam a manipulação, transporte e uso do produto. Evitar um produto em pó de baixa densidade é uma vantagem particular do acetil hialuronato de sódio seco por pulverização.[0104] The spray-dried sodium acetyl hyaluronate, which is another aspect of the present invention, exhibits desirable properties, such as high bulk density, shape and fluidity, which facilitate the handling, transportation and use of the product. Avoiding a low density powder product is a particular advantage of spray dried sodium acetyl hyaluronate.

[0105] O acetil hialuronato de sódio seco por pulverização é formado com brancura e clareza suficientes, o que é eminentemente adequado para uso em produtos destinados às aplicações cosméticas, e em particular para as composições para cuidado da pele.[0105] The spray-dried sodium acetyl hyaluronate is formed with sufficient whiteness and clarity, which is eminently suitable for use in products intended for cosmetic applications, and in particular for skin care compositions.

[0106] O produto seco por pulverização formado de acordo com um processo descrito acima constituiu outro aspecto da invenção.[0106] The spray-dried product formed according to a process described above constituted another aspect of the invention.

[0107] Tanto o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular como o acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular são facilmente incorporados às preparações cosméticas, e em particular às composições para cuidado da pele. Graças ao peso molecular muito baixo e à forma física em pó, eles não são viscosos ou grumosos e podem ser facilmente dissolvidos ou suspendidos em meios aquosos e misturados às bases cosméticas.[0107] Both low molecular weight acetylated hyaluronic acid and low molecular weight sodium acetyl hyaluronate are easily incorporated into cosmetic preparations, and in particular skin care compositions. Thanks to the very low molecular weight and physical powder form, they are not sticky or lumpy and can be easily dissolved or suspended in aqueous media and mixed with cosmetic bases.

[0108] Ademais, como ingredientes altamente coloridos podem ser inaceitáveis como matérias primas para os fabricantes de preparações cosméticas, é altamente vantajoso que o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular e o acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular possam ser preparados como pós brancos com nenhum, ou substancialmente nenhum, matiz amarelado, e que não alterem ou prejudiquem o tom de cor de qualquer preparação cosmética em que sejam incorporados, independentemente da quantidade do material empregado na preparação cosmética.[0108] Furthermore, as highly colored ingredients may be unacceptable as raw materials for manufacturers of cosmetic preparations, it is highly advantageous that low molecular weight acetylated hyaluronic acid and low molecular weight sodium acetyl hyaluronate can be prepared as white powders with no, or substantially no, yellowish tint, and that do not alter or impair the color tone of any cosmetic preparation in which they are incorporated, regardless of the amount of material used in cosmetic preparation.

[0109] Ao término do work-up do ácido hialurônico acetilado ou seu sal de sódio, podemos conduzir uma etapa de branqueamento ou polimento através da qual qualquer leve descoloração é removida por um agente de branqueamento adequado, por exemplo, uma argila ou uma forma de carbono ativado. No entanto, essas etapas não são particularmente eficientes para descolorir esses produtos se estes já estiverem altamente descoloridos como consequência do processo sintético.[0109] Upon completion of the work-up of acetylated hyaluronic acid or its sodium salt, we can conduct a bleaching or polishing step through which any slight discoloration is removed by a suitable bleaching agent, for example, a clay or a form of activated carbon. However, these steps are not particularly efficient in discoloring these products if they are already heavily discolored as a result of the synthetic process.

[0110] Uma característica da presente invenção é que os métodos de preparação e isolamento aqui descritos fornecem o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular e o acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular como produtos que estão sob a forma de pós brancos com brilho e clareza suficientes que, caso uma etapa de branqueamento ou polimento seja necessária, ela é capaz de descolorir efetivamente os produtos.[0110] A feature of the present invention is that the preparation and isolation methods described herein provide low molecular weight acetylated hyaluronic acid and low molecular weight sodium acetyl hyaluronate as products that are in the form of white powders with sufficient brightness and clarity that, if a bleaching or polishing step is required, it is capable of effectively discoloring the products.

[0111] Mais particularmente, os métodos de preparação e isolamento aqui descritos fornecem o ácido hialurônico acetilado de baixo peso molecular e o acetil hialuronato de sódio de baixo peso molecular como produtos que estão sob a forma de pós brancos, cada um deles com um valor L* igual ou maior que 90; e um valor b*, que é menor que 8, sendo que os valores L* e b* representam as coordenadas de cromaticidade do sistema CIELAB.[0111] More particularly, the preparation and isolation methods described herein provide low molecular weight acetylated hyaluronic acid and low molecular weight sodium acetyl hyaluronate as products that are in the form of white powders, each with an L* value equal to or greater than 90; and a b* value, which is less than 8, where the L* and b* values represent the chromaticity coordinates of the CIELAB system.

[0112] A luminância e a matiz de um pó podem ser caracterizadas pelas coordenadas de cromaticidade CIELAB L* a* b* de acordo com os métodos colorimétricos conhecidos na técnica. O valor L* é um valor que especifica a luminância de uma substância e é indicado por um valor entre 0 e 100. Um valor L* igual a 100 indica o estado mais claro (completamente branco), e um valor L* igual a 0 indica o estado mais escuro (completamente preto). O valor b* especifica a matiz azul- amarelada de uma substância. Quanto maior o valor b*, mais intenso o tom de amarelo. Quanto menor o valor b*, mais intenso o tom de azul.[0112] The luminance and hue of a powder can be characterized by the CIELAB chromaticity coordinates L* a* b* according to colorimetric methods known in the art. The L* value is a value that specifies the luminance of a substance and is indicated by a value between 0 and 100. An L* value of 100 indicates the lightest state (completely white), and an L* value of 0 indicates the darkest state (completely black). The b* value specifies the blue-yellow hue of a substance. The higher the b* value, the more intense the shade of yellow. The smaller the b* value, the more intense the blue tone.

[0113] O valor L* e o valor b* podem ser medidos com qualquer espectrofotômetro comercialmente disponível adequado, como o Minolta CM3500d. O espectrofotômetro deve ser ligado pelo menos uma hora antes da medição. Um recipiente de vidro deve ser abastecido pela metade com o produto sólido a ser medido, tendo-se o cuidado de verificar que o fundo do recipiente esteja completamente coberto com o produto. Depois disso, o recipiente abastecido deve ser colocado no suporte de amostra fornecido. A tecla da amostra no instrumento deve ser pressionada e os valores L* e b* lidos no painel do visor. Antes de tomar as leituras, o instrumento deve ser calibrado para reflexão zero e 100% posicionando os objetos brancos e pretos fornecidos para essa finalidade na janela do sensor óptico dos instrumentos.[0113] The L* value and b* value can be measured with any suitable commercially available spectrophotometer, such as the Minolta CM3500d. The spectrophotometer must be turned on at least one hour before the measurement. A glass container must be half filled with the solid product to be measured, taking care to verify that the bottom of the container is completely covered with the product. Thereafter, the filled container must be placed in the provided sample holder. The sample key on the instrument must be pressed and the L* and b* values read from the display panel. Before taking readings, the instrument must be calibrated for zero and 100% reflection by placing the white and black objects provided for this purpose in the instruments optical sensor window.

[0114] Segue abaixo uma série de exemplos ilustrativos da invenção.Exemplo 1: Método para Fabricação do Acetil Hialuronato de Sódio [0114] Below is a series of illustrative examples of the invention. Example 1: Method for the Manufacture of Sodium Acetyl Hyaluronate

[0115] Um reator de 5 l foi lavado com nitrogênio e carregado com ácido hialurônico (RenovhyalTM fabricado pela Soliance, peso molecular 10-50 kDa; 300 g, 0,7 mol). Anidrido acético de classificação comercial (2160 g, 21,2 mol) e ácido acético (525 g, 8.7 mol) foram adicionados e a temperatura da suspensão foi definida para 25°C. Ácido sulfúrico 96% (194 g, 1,9 mol) foi adicionado ao longo do período de 10 minutos. A temperatura foi mantida a 25°C pelo controle interno. A agitação continuou por 15 horas. O controle interno foi desligado e acetato de sódio (154 g, 1,9 mol) foi adicionado mediante agitação. A temperatura subiu para 35°C e a agitação continuou por 30 minutos. O reator foi evacuado para 40 mbar e a temperatura da camisa foi definida para 50°C. Ao longo do período de 5 horas, uma mistura de anidrido acético e ácido acético foi removida por destilação (1343 g). O conteúdo restante, levemente pastoso, mas ainda possível de ser agitado, do reator foi resfriado até a temperatura ambiente e água (5500 ml) foi adicionada (de início com muita cautela), mantendo a temperatura da mistura sempre abaixo de 50°C. Aos poucos foi formada uma suspensão branca fina. Os sólidos foram isolados por filtração e lavados com água (10 l). Os sólidos foram então ressuspendidos em água (700 ml) e a mistura neutralizada (pH 6,5) com a adição de NaOH 1M (600 ml) para produzir uma solução de acetil hialuronato de sódio (1520 g, c = 0,11 g/g). A solução foi seca por pulverização para produzir o acetil hialuronato de sódio (175 g, 0,3 mol, 44% de rendimento) como um pó fino de fluxo livre. A análise pelo experimento de HSQC-RMN indicou um grau de acetilação de 3,9.[0115] A 5 L reactor was flushed with nitrogen and charged with hyaluronic acid (RenovhyalTM manufactured by Soliance, molecular weight 10-50 kDa; 300 g, 0.7 mol). Commercial grade acetic anhydride (2160 g, 21.2 mol) and acetic acid (525 g, 8.7 mol) were added and the temperature of the suspension was set to 25°C. 96% sulfuric acid (194 g, 1.9 mol) was added over a 10 minute period. The temperature was maintained at 25°C by internal control. Stirring continued for 15 hours. The internal control was turned off and sodium acetate (154 g, 1.9 mol) was added while stirring. The temperature rose to 35°C and stirring was continued for 30 minutes. The reactor was evacuated to 40 mbar and the jacket temperature was set to 50°C. Over the period of 5 hours, a mixture of acetic anhydride and acetic acid was distilled off (1343 g). The remaining content, slightly pasty, but still able to be stirred, of the reactor was cooled to room temperature and water (5500 ml) was added (very cautiously at first), keeping the temperature of the mixture always below 50°C. Gradually a fine white suspension was formed. The solids were isolated by filtration and washed with water (10 L). The solids were then resuspended in water (700 ml) and the mixture neutralized (pH 6.5) with the addition of 1M NaOH (600 ml) to produce a sodium acetyl hyaluronate solution (1520 g, c = 0.11 g/g). The solution was spray-dried to afford sodium acetyl hyaluronate (175 g, 0.3 mol, 44% yield) as a free-flowing fine powder. Analysis by the HSQC-NMR experiment indicated an acetylation degree of 3.9.

Example 2: Method for Isolating Sodium Acetyl Hyaluronate Using the Spray Drying Technique

[0116] A secagem por pulverização de uma solução aquosa de acetil hialuronato de sódio a 11% foi realizada usando um secador pulverizador GEA VERSATILE-SD™ 6.3, equipado com um atomizador rotativo, aplicando os seguintes parâmetros: - Temperatura de alimentação: 15°C - Temperatura de entrada: 150°C - Temperatura de saída: 70°C - Taxa de alimentação: 20 kg/h - Velocidade da ventoinha: 400 kg ar/h - Velocidade das rodas: 12000 rpm[0116] Spray drying of an aqueous solution of 11% sodium acetyl hyaluronate was carried out using a GEA VERSATILE-SD™ 6.3 spray dryer, equipped with a rotary atomizer, applying the following parameters: - Feed temperature: 15°C - Inlet temperature: 150°C - Outlet temperature: 70°C - Feed rate: 20 kg/h - Fan speed: 400 kg air/h - Wheel speed: 12000 rpm

[0117] Um pó branco de fluxo livre de acetil hialuronato de sódio foi obtido.[0117] A free-flowing white powder of sodium acetyl hyaluronate was obtained.

Example 3: Cytotoxicity

[0118] As avaliações citotóxicas preliminares do acetil hialuronato de sódio em fibroblastos e melanócitos foram efetuadas por um teste de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio). Em resumo, as células foram semeadas em placas de cultura com 96 cavidades e tratadas com acetil hialuronato de sódio em diferentes concentrações de 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, e 0,005 mg/ml,respectivamente, por 24 horas e 48 horas. A citotoxicidade foi avaliada pela solução de MTT (5 mg/ml diluída a 1/6 em tampão fosfato-salino (PBS)). As placas foram incubadas por 4 horas a 37°C ao abrigo da luz. O produto púrpura insolúvel Formazan foi dissolvido em 50 μl de DMSO e a densidade óptica foi lida a 560 nm com uma leitora de microplacas (TECAN).Quadro 1: Avaliação de citol toxicidade efetuada pe o teste de MTT em fibroblastos e melanócitos[0118] Preliminary cytotoxic assessments of sodium acetyl hyaluronate in fibroblasts and melanocytes were performed by an MTT test (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Briefly, cells were seeded in 96-well culture plates and treated with sodium acetyl hyaluronate at different concentrations of 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, and 0.005 mg/ml, respectively, for 24 hours and 48 hours. Cytotoxicity was assessed by MTT solution (5 mg/ml diluted 1/6 in phosphate-buffered saline (PBS)). Plates were incubated for 4 hours at 37°C away from light. The insoluble purple product Formazan was dissolved in 50 µl of DMSO and the optical density was read at 560 nm with a microplate reader (TECAN). Table 1: Evaluation of cytotoxicity performed by the MTT test in fibroblasts and melanocytes

[0119] Quanto ao impacto do acetil hialuronato de sódio sobre os fibroblastos em termos de citotoxicidade, a citotoxicidade foi induzida apenas nas concentrações de 10 e 5 mg/ml. Abaixo dessas doses, nenhum efeito foi observado.[0119] Regarding the impact of sodium acetyl hyaluronate on fibroblasts in terms of cytotoxicity, cytotoxicity was induced only at concentrations of 10 and 5 mg/ml. Below these doses, no effect was observed.

[0120] Quanto ao impacto sobre os melanócitos, apenas a concentração 10 mg/ml do acetil hialuronato de sódio mostrou um efeito citotóxico. Abaixo dessa dose, não houve efeito sobre os melanócitos (quadro 1).[0120] Regarding the impact on melanocytes, only the 10 mg/ml concentration of sodium acetyl hyaluronate showed a cytotoxic effect. Below this dose, there was no effect on melanocytes (chart 1).

[0121] A concentração ótima que pode ser utilizada sem induzir efeitos tóxicos em cada tipo de célula foi determinada como 0,1 mg/ml para fibroblastos e de 0,5 mg/ml para melanócitos. Essas concentrações foram empregadas no decorrer das investigações biológicas.[0121] The optimal concentration that can be used without inducing toxic effects in each cell type was determined as 0.1 mg/ml for fibroblasts and 0.5 mg/ml for melanocytes. These concentrations were used in the course of biological investigations.

Example 4: Transcriptomic Assessment

[0122] A fim de identificar a potencial atividade biológica do acetil hialuronato de sódio, uma análise transcriptômica in vitro foi efetuada em dois tipos de células presentes na pele, incluindo melanócitos e fibroblastos. Foi estudada em 128 genes distribuídos em duas placas transcriptômicas. Uma primeira placa era específica para a função da derme com muitos genes envolvidos na matriz extracelular, remodelamento da matriz, defesas à oxidação, respostas ao estresse, cura de ferimentos e outras funções biológicas. Uma segunda placa foi específica para funções de pigmentação da pele com os genes mais importantes envolvidos na síntese da melanina, formação e maturação de melanossomas e outras funções atreladas aos melanócitos.[0122] In order to identify the potential biological activity of sodium acetyl hyaluronate, an in vitro transcriptomic analysis was performed on two types of cells present in the skin, including melanocytes and fibroblasts. It was studied in 128 genes distributed in two transcriptomic plates. A first plate was specific for dermal function with many genes involved in extracellular matrix, matrix remodeling, oxidation defenses, stress responses, wound healing, and other biological functions. A second plate was specific for skin pigmentation functions with the most important genes involved in melanin synthesis, formation and maturation of melanosomes and other functions linked to melanocytes.

[0123] A análise transcriptômica foi realizada por Rt-qPCR (Reação em Cadeia de Polimerização com Quantificação em Tempo Real) usando ensaios TaqMan em três repetições para cada tipo de célula. Em resumo, depois de 24 horas de estimulação das células com 0,1 mg/ml para fibroblastos e 0,5 mg/ml para melanócitos, o RNA total foi extraído pelo método Trizol. O RNA total foi quantificado com o espectrômetro e as concentrações ajustadas para 400 ng/μl. A qualidade do RNA foi verificada por migração em gel de agarose. O RNA total foi retrotranscrito em cDNA usando um kit Verso de cDNA seguindo as recomendações do fornecedor. A transcrição reversa foi validada por PCR clássica direcionada ao gene de manutenção: o gene RPL32. O cDNA foi então utilizado para realizar a RT-qPCR na qual 10 ng do cDNA foi depositado por cavidade usando um ensaio de TaqMan.[0123] Transcriptomic analysis was performed by Rt-qPCR (Real Time Quantification Polymerization Chain Reaction) using TaqMan assays in three replicates for each cell type. Briefly, after 24 hours of cell stimulation with 0.1 mg/ml for fibroblasts and 0.5 mg/ml for melanocytes, total RNA was extracted by the Trizol method. Total RNA was quantified with the spectrometer and concentrations adjusted to 400 ng/μl. RNA quality was checked by agarose gel migration. Total RNA was retrotranscribed into cDNA using a Verso cDNA kit following the supplier's recommendations. Reverse transcription was validated by classical PCR directed at the maintenance gene: the RPL32 gene. The cDNA was then used to perform RT-qPCR in which 10 ng of the cDNA was deposited per well using a TaqMan assay.

[0124] Os resultados obtidos estão representados no quadro 2 abaixo. Uma indução acima de 1,3 vezes (positiva ou negativa) em comparação com a condição não tratada é considerada um indício de uma modificação biológica.Quadro 2: Genes que são modulados significativamente pelo acetil hialuronato de sódio em fibroblastos (derme) e melanócitos (pigmentação). p<0,05 *[0124] The results obtained are shown in Table 2 below. An induction greater than 1.3 times (positive or negative) compared to the untreated condition is considered to be indicative of a biological change. Table 2: Genes that are significantly modulated by sodium acetyl hyaluronate in fibroblasts (dermis) and melanocytes (pigmentation). p<0.05 *

Example 5: Impact of Sodium Acetyl Hyaluronate on Fibroblasts (Dermis)

[0125] Quanto aos resultados relativos à derme, MMP-1 e MMP-3 são duas metaloproteinases da matriz envolvidas na degradação da matriz, como o colágeno do tipo I, que é o colágeno mais importante presente na derme.[0125] As for the results relating to the dermis, MMP-1 and MMP-3 are two matrix metalloproteinases involved in matrix degradation, such as type I collagen, which is the most important collagen present in the dermis.

[0126] Durante o envelhecimento, a produção de MMPs aumenta, causando a degradação da matriz intradérmica, que promove o colapso da pele e a formação de rugas. Esses são os primeiros sinais visíveis do envelhecimento cutâneo.[0126] During aging, the production of MMPs increases, causing degradation of the intradermal matrix, which promotes skin breakdown and wrinkle formation. These are the first visible signs of skin aging.

[0127] Esse fenômeno pode ser acelerado por fatores externos,como a exposição ao UV. De fato, o UV induz o estresse oxidativo na pele, que é responsável por um aumento substancial da liberação das MMPs, as quais, por seu turno, promovem o envelhecimento prematuro da pele pela intensa degradação da matriz.[0127] This phenomenon can be accelerated by external factors, such as UV exposure. In fact, UV induces oxidative stress in the skin, which is responsible for a substantial increase in the release of MMPs, which, in turn, promote premature aging of the skin by intense degradation of the matrix.

[0128] Os resultados transcriptômicos sugerem que o acetil hialuronato de sódio poderia limitar esse efeito pela regulação negativa da MMP-1 e MMP-3 (quadro 2).[0128] The transcriptomic results suggest that sodium acetyl hyaluronate could limit this effect by downregulating MMP-1 and MMP-3 (Table 2).

[0129] Foi desenvolvido um modelo de envelhecimento in vitro específico capaz de superexpressar a MMP-1 e a MMP-3 pelo estresse oxidativo (H2O2 100μM - 200μM por 2 horas) nos fibroblastos. Em resumo, fibroblastos foram pré-condicionados com acetil hialuronato de sódio (0,1 mg/ml) em meio basal por 2 horas antes da indução do estresse oxidativo. Em seguida ao estresse oxidativo, os fibroblastos foram incubados por 48 horas em meio basal a 37°C, permitindo que as MMPs se acumulassem no meio de cultura. A quantidade de MMP-1 e MMP-3 liberada pelos sobrenadantes foi então estimada pelo método multiplex usando a tecnologia Luminex (princípio do ELISA em esferas). Liberação da MMP-1:Quadro 3: Impacto do acetil hialuronato de sódio sobre a liberação da MMP-1 induzida por estresse oxidativo in vitro sobre os fibroblastos (expresso em Unidades Arbitrárias). * = p<0,05; ns = não significativo. Os valores percentuais mostrados em parênteses refletem o grau de inibição induzido pelo acetil hialuronato de sódio ou hialuronato de sódio em relação à ausência de ativo.[0129] A specific in vitro aging model capable of overexpressing MMP-1 and MMP-3 by oxidative stress (H2O2 100μM - 200μM for 2 hours) in fibroblasts was developed. In summary, fibroblasts were preconditioned with sodium acetyl hyaluronate (0.1 mg/ml) in basal medium for 2 hours before oxidative stress induction. Following oxidative stress, fibroblasts were incubated for 48 hours in basal medium at 37°C, allowing MMPs to accumulate in the culture medium. The amount of MMP-1 and MMP-3 released by the supernatants was then estimated by the multiplex method using Luminex technology (bead ELISA principle). MMP-1 release: Table 3: Impact of sodium acetyl hyaluronate on in vitro oxidative stress-induced MMP-1 release on fibroblasts (expressed in Arbitrary Units). * = p<0.05; ns = not significant. The percentage values shown in parentheses reflect the degree of inhibition induced by sodium acetyl hyaluronate or sodium hyaluronate in relation to the absence of active.

[0130] Foi demonstrado que o acetil hialuronato de sódio reduziu significativamente a secreção de MMP-1 mediada pelo estresse oxidativo no nível da proteína. Inversamente, constatou-se que o hialuronato de sódio não conseguiu reproduzir esse efeito, confirmando que os efeitos observados decorreram da modificação na acetilação (quadro 3).Estudo comparativo sobre a liberação da MMP-1:[0130] Sodium acetyl hyaluronate was shown to significantly reduce MMP-1 secretion mediated by oxidative stress at the protein level. Conversely, it was found that sodium hyaluronate failed to reproduce this effect, confirming that the observed effects resulted from the change in acetylation (chart 3). Comparative study on MMP-1 release:

[0131] Para comparação, os efeitos do (a) produto da presente invenção, (b) hialuronato monoacetato e (c) hialuronato acetilado de acordo com o documento EP 0 725 083 (da Shiseido; grau médio de acetilação de cerca de 3,6; PM cerca de 100 kDa) sobre a MMP-1 foram investigados observando o seguinte procedimento:[0131] For comparison, the effects of (a) product of the present invention, (b) hyaluronate monoacetate and (c) acetylated hyaluronate according to EP 0 725 083 (by Shiseido; average degree of acetylation about 3.6; MW about 100 kDa) on MMP-1 were investigated by observing the following procedure:

[0132] Fibroblastos da biópsia abdominal de uma mulher caucasiana (26 anos de idade) foram semeados em placas de 12 cavidades à densidade de 200.000 células/cavidade em 1 ml de meio completo (ZenBio, ref. DF-1). Passadas 24 horas do plaqueamento, o meio completo foi substituído por meio basal sem soro (Zen-Bio, ref. DF- 2). Após 24 horas de cultura em meio basal, as células foram pré- incubadas com os produtos de teste a 0,1 mg/ml por 2 horas a 37°C e em seguida expostas ao estresse oxidativo (H2O2 200 μM) por 2 horas a 37°C. O meio de cultura foi substituído por meio basal e as células incubadas por mais 48 horas a 37°C. O sobrenadante foi coletado e armazenado a -80°C até análise.[0132] Fibroblasts from the abdominal biopsy of a Caucasian woman (26 years old) were seeded in 12-well plates at a density of 200,000 cells/well in 1 ml of complete medium (ZenBio, ref. DF-1). After 24 hours of plating, the complete medium was replaced by serum-free basal medium (Zen-Bio, ref. DF-2). After 24 hours of culture in basal medium, the cells were pre-incubated with the test products at 0.1 mg/ml for 2 hours at 37°C and then exposed to oxidative stress (H2O2 200 μM) for 2 hours at 37°C. The culture medium was replaced by basal medium and the cells incubated for another 48 hours at 37°C. The supernatant was collected and stored at -80°C until analysis.

[0133] A MMP-1 foi quantificada usando o kit de ELISA para MMP- 1 Humana RayBio®, um ensaio imunoadsorvente ligado à enzima in vitro para a medição quantitativa das formas ativas e pró-ativas da MMP-1 humana no soro, plasma, e sobrenadantes da cultura de células. Esse ensaio usa um anticorpo específico para a MMP-1 humana revestido em uma placa de 96 cavidades. Os padrões e as amostras são pipetados e depositados nas cavidades, e a MMP-1 presente em uma amostra se liga às cavidades pelo anticorpo imobilizado. As cavidades são lavadas e o anticorpo anti-MMP-1 humana biotinilado é adicionado. Depois de lavar o anticorpo biotinilado não ligado, a estreptavidina conjugada com HRP é pipetada e depositada nas cavidades. As cavidades são novamente lavadas e uma solução do substrato TMB (3,3',5'5'-tetrametilbenzidina) é adicionada às cavidades, havendo o desenvolvimento de uma coloração proporcional à quantidade da MMP-1 ligada. A Solução de Interrupção muda a cor de azul para amarelo, e a intensidade da cor é medida a 450 nm.[0133] MMP-1 was quantitated using the RayBio® Human MMP-1 ELISA Kit, an in vitro enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative measurement of active and proactive forms of human MMP-1 in serum, plasma, and cell culture supernatants. This assay uses an antibody specific for human MMP-1 coated in a 96-well plate. Standards and samples are pipetted into the wells, and the MMP-1 present in a sample is bound to the wells by the immobilized antibody. The wells are washed and biotinylated anti-human MMP-1 antibody is added. After washing away the unbound biotinylated antibody, the HRP-conjugated streptavidin is pipetted into the wells. The wells are washed again and a solution of the TMB substrate (3,3',5'5'-tetramethylbenzidine) is added to the wells, with the development of a color proportional to the amount of MMP-1 bound. The Stop Solution changes the color from blue to yellow, and the color intensity is measured at 450 nm.

[0134] A MMP-1 foi medida após diluição 1/100 das amostras, em três repetições. A curva padrão foi realizada com duas repetições. A partir das concentrações padronizadas da MMP-1 de 18.000, 6.000, 2.000, 666,7, 222,2, 74,07 e 24,69 pg/ml, uma regressão logística de quatro parâmetros foi calculada.[0134] MMP-1 was measured after 1/100 dilution of the samples, in three repetitions. The standard curve was performed with two replications. From standardized MMP-1 concentrations of 18000, 6000, 2000, 666.7, 222.2, 74.07, and 24.69 pg/ml, a four-parameter logistic regression was calculated.

[0135] Os resultados são mostrados na Figura 1.[0135] The results are shown in Figure 1.

[0136] Em condição basal, notou-se que apenas o hialuronato de sódio acetilado da presente invenção (a) induziu uma inibição significativa da produção da MMP-1 (-23%). O hialuronato monoacetato (b) não reproduziu o efeito, mostrando inclusive um efeito oposto, com um aumento na produção da MMP-1 (+44%). O ácido hialurônico acetilado da Sisheido (c) não teve efeito significativo sobre a liberação da MMP-1 nessa condição experimental (+3%).[0136] In basal condition, it was noted that only the acetylated sodium hyaluronate of the present invention (a) induced a significant inhibition of MMP-1 production (-23%). Hyaluronate monoacetate (b) did not reproduce the effect, even showing an opposite effect, with an increase in MMP-1 production (+44%). Sisheido's acetylated hyaluronic acid (c) had no significant effect on MMP-1 release in this experimental condition (+3%).

[0137] Sob estresse oxidativo mediado por uma H2O2 (sem o tratamento com hialuronato acetilado) a fim de reproduzir o efeito do envelhecimento, foi observada uma produção excessiva significativa da MMP-1 (+103%), que validou o experimento.[0137] Under oxidative stress mediated by an H2O2 (without treatment with acetylated hyaluronate) in order to reproduce the effect of aging, a significant overproduction of MMP-1 (+103%) was observed, which validated the experiment.

[0138] Uma pré-incubação com o hialuronato de sódio acetilado da presente invenção (a) induziu uma redução significativa na produção da MMP-1 mediada pelo estresse, enquanto os outros dois produtos mostraram efeito inverso, com +63% e +12% para o hialuronato monoacetato (b) e o ácido hialurônico acetilado da Sisheido (c), respectivamente.[0138] A pre-incubation with the acetylated sodium hyaluronate of the present invention (a) induced a significant reduction in the production of MMP-1 mediated by stress, while the other two products showed the opposite effect, with +63% and +12% for monoacetate hyaluronate (b) and Sisheido's acetylated hyaluronic acid (c), respectively.

[0139] Como conclusão, apenas o hialuronato de sódio acetilado da presente invenção (a) apresenta uma atividade eficiente para inibir a liberação da MMP-1 em basal e na presença de estresse oxidativo (similar ao envelhecimento).Liberação da MMP-3:Quadro 4: Impacto do acetil hialuronato de sódio sobre a liberação da MMP-3 induzida por estresse oxidativo in vitro em fibroblastos (expresso em Unidades Arbitrárias). * = p<0,05; ns = não significativo. Os valores percentuais mostrados em parênteses refletem o grau de inibição induzida pelo acetil hialuronato de sódio em relação à ausência de ativo (sem acetil hialuronato de sódio).[0139] In conclusion, only the acetylated sodium hyaluronate of the present invention (a) has an efficient activity to inhibit the release of MMP-1 in basal and in the presence of oxidative stress (similar to aging). MMP-3 release: Table 4: Impact of sodium acetyl hyaluronate on MMP-3 release induced by oxidative stress in vitro in fibroblasts (expressed in Arbitrary Units). * = p<0.05; ns = not significant. The percentage values shown in parentheses reflect the degree of inhibition induced by sodium acetyl hyaluronate in relation to the absence of active (no sodium acetyl hyaluronate).

[0140] Foi demonstrado que o acetil hialuronato de sódio reduziu significativamente a secreção da MMP-3 mediada por estresse oxidativo no nível da proteína. Inversamente, constatou-se que o hialuronato de sódio não conseguiu reproduzir esse efeito, confirmando que os efeitos observados decorreram da modificação na acetilação (quadro 4).[0140] Sodium acetyl hyaluronate was shown to significantly reduce MMP-3 secretion mediated by oxidative stress at the protein level. Conversely, it was found that sodium hyaluronate failed to reproduce this effect, confirming that the observed effects resulted from the change in acetylation (Table 4).

Fluorescence Measurements

[0141] As MMPs são liberadas sob duas formas que englobam a pró-forma inativa (pró-MMP) e a forma ativa com o pró-peptídeo clivado (MMP). Apenas as MMPs ativas são capazes de induzir a degradação do colágeno. O colágeno do tipo I DQ, que é um colágeno do tipo I fluorescente acoplado a um quencher, foi usado. Quando degradado, ele promove a liberação e a emissão de fluorescência pelo quencher. Por fim, a fluorescência emitida, que é proporcional à degradação do colágeno, foi medida. Esse experimento foi conduzido exatamente nas mesmas condições experimentais usadas para quantificar a secreção de MMP-1 e MMP-3. Em resumo, o sobrenadante foi incubado com o colágeno-DQ por 4 horas à temperatura ambiente e a fluorescência medida pela Leitora de Microplacas (TECAN) com comprimento de onda de excitação de 495 nm e comprimento de onda de emissão de 515 nm.Quadro 5: Impacto do acetil hialuronato de sódio sobre a degradação do colágeno do tipo I após estresse oxidativo in vitro em fibroblastos (expresso em Unidades Arbitrárias). * = p<0,05; ns = não significativo. Os valores percentuais mostrados em parênteses refletem o grau de inibição induzido pelo acetil hialuronato de sódio ou hialuronato de sódio em relação à ausência de ativo.[0141] MMPs are released in two forms that include the inactive pro-form (pro-MMP) and the active form with the cleaved propeptide (MMP). Only active MMPs are capable of inducing collagen degradation. Type I collagen DQ, which is a fluorescent type I collagen coupled to a quencher, was used. When degraded, it promotes the release and emission of fluorescence by the quencher. Finally, the emitted fluorescence, which is proportional to collagen degradation, was measured. This experiment was conducted under exactly the same experimental conditions used to quantify MMP-1 and MMP-3 secretion. In summary, the supernatant was incubated with collagen-DQ for 4 hours at room temperature and the fluorescence measured by the Microplate Reader (TECAN) with an excitation wavelength of 495 nm and an emission wavelength of 515 nm. Table 5: Impact of sodium acetyl hyaluronate on type I collagen degradation after in vitro oxidative stress in fibroblasts (expressed in Arbitrary Units). * = p<0.05; ns = not significant. The percentage values shown in parentheses reflect the degree of inhibition induced by sodium acetyl hyaluronate or sodium hyaluronate in relation to the absence of active.

[0142] Foi observado que o acetil hialuronato de sódio reduzia a degradação do colágeno-DQ de acordo com a observação da redução no nível de fluorescência (quadro 5). Esses resultados demonstraram que o acetil hialuronato de sódio limita a liberação das formas ativas da MMP-1 e MMP-3 responsáveis pela degradação do colágeno-DQ. Sobretudo, esses resultados in vitro provaram que o acetil hialuronato de sódio possui uma atividade antienvelhecimento que se dá pelo impacto no remodelamento da matriz, que está envolvida nos sinais visíveis do envelhecimento cutâneo. Na verdade, a substância limita o envelhecimento através de uma expressão negativa da MMP-1 e MMP- 3 que controlam a degradação da matriz, como o colágeno do tipo I. Além disso, o hialuronato de sódio não conseguiu promover os mesmos resultados, confirmando que a bioatividade está associada à modificação acetilada (quadro 5).[0142] It was observed that sodium acetyl hyaluronate reduced the degradation of collagen-DQ according to the observation of the reduction in the level of fluorescence (Table 5). These results demonstrated that sodium acetyl hyaluronate limits the release of the active forms of MMP-1 and MMP-3 responsible for the degradation of collagen-DQ. Above all, these in vitro results proved that sodium acetyl hyaluronate has an anti-aging activity that is due to its impact on matrix remodeling, which is involved in the visible signs of skin aging. In fact, the substance limits aging through a negative expression of MMP-1 and MMP-3 that control matrix degradation, such as type I collagen. Furthermore, sodium hyaluronate failed to promote the same results, confirming that bioactivity is associated with acetylated modification (chart 5).

Example 6: Impact of Sodium Acetyl Hyaluronate on Melanocytes (Melanocytes) pigmentation function

[0143] Quanto à função de pigmentação, foi constatado que o acetil hialuronato de sódio induziu um aumento significativo das expressões dos genes HPS4, MITF e ENDR6 no nível transcriptômico. Esses resultados sugerem que ele possa ter uma propriedade pró- pigmentadora. O efeito do acetil hialuronato de sódio sobre a síntese da melanina in vitro foi analisado em melanócitos em condição basal e em condições estimuladas mediadas pela adição do substrato L-Tirosina. Em resumo, com relação à condição basal, melanócitos foram incubados em placa de 24 cavidades para 24 horas de cultura. O meio foi então substituído por meio de cultura com ou sem acetil hialuronato de sódio ou hialuronato de sódio não modificado nas concentrações de 0,1, 0,25, 0,5, e 1 mg/ml, respectivamente, ou referência (L-tirosina 1 mM). As células foram incubadas por 10 dias com duas renovações de tratamento no 3° e 7° dia posteriores à incubação.Quadro 6: Impacto do acetil hialuronato de sódio sobre a síntese da melanina in vitro em melanócitos em condição basal (expresso em % das condições de controle). ** = p<0,01 **; *** = p<0,001; ns = não significativo. Os valores percentuais em parênteses refletem os efeitos exercidos pelos compostos testados (L-tirosina, acetil hialuronato de sódio e hialuronato de sódio em relação ao desempenho na ausência do composto de teste (controle)).[0143] Regarding the pigmentation function, it was found that sodium acetyl hyaluronate induced a significant increase in the expression of the HPS4, MITF and ENDR6 genes at the transcriptomic level. These results suggest that it may have a pro-pigmenting property. The effect of sodium acetyl hyaluronate on melanin synthesis in vitro was analyzed in melanocytes in basal condition and in stimulated conditions mediated by the addition of substrate L-Tyrosine. In summary, regarding the baseline condition, melanocytes were incubated in a 24-well plate for 24 hours of culture. The medium was then replaced with culture medium with or without sodium acetyl hyaluronate or unmodified sodium hyaluronate at concentrations of 0.1, 0.25, 0.5, and 1 mg/ml, respectively, or reference (1 mM L-tyrosine). Cells were incubated for 10 days with two treatment renewals on the 3rd and 7th day after incubation. Table 6: Impact of sodium acetyl hyaluronate on in vitro melanin synthesis in melanocytes in basal condition (expressed as % of control conditions). ** = p<0.01 **; *** = p<0.001; ns = not significant. Percentage values in parentheses reflect the effects exerted by the tested compounds (L-tyrosine, sodium acetyl hyaluronate and sodium hyaluronate on performance in the absence of the test compound (control)).

[0144] Os resultados mostraram que o acetil hialuronato de sódio induz uma redução na síntese da melanina na condição basal com um efeito dependente da dose (+2% a 0,1 mg/ml e -9% a 1 mg/ml). O hialuronato de sódio não modificado foi menos eficiente, demonstrando que a acetilação melhora a atividade biológica do hialuronato de sódio. Estimulação[0144] The results showed that sodium acetyl hyaluronate induces a reduction in melanin synthesis in the basal condition with a dose-dependent effect (+2% at 0.1 mg/ml and -9% at 1 mg/ml). Unmodified sodium hyaluronate was less efficient, demonstrating that acetylation improves the biological activity of sodium hyaluronate. Stimulation

[0145] No que concerne à condição estimulada, melanócitos foram incubados em placas de 24 cavidades para 24 horas de cultura. O meio foi então substituído por meio de cultura contendo L-tirosina (1 mM) suplementado com acetil hialuronato de sódio ou hialuronato de sódio não modificado nas concentrações de 0,1, 0,25, 0,5, e 1 mg/ml,respectivamente, ou referência (Ácido Lipoico 5 μg/ml). As células foram incubadas por 10 dias com duas renovações do tratamento no 3° e 7° dia posteriores incubação.Quadro 7: Impacto do acetil hialuronato de sódio sobre a síntese in vitro da melanina em melanócitos na condição estimulada (expressa em % da condição de controle L-tirosina 1 mM). * = p<0,05 ; ** = p<0,01; *** = p<0,001; ns = não significativo. Os valores percentuais em parênteses refletem os efeitos exercidos pelos compostos testados (Ácido Lipoico, acetil hialuronato de sódio e hialuronato de sódio em relação ao desempenho na ausência do composto de teste (controle)).[0145] Regarding the stimulated condition, melanocytes were incubated in 24-well plates for 24 hours of culture. The medium was then replaced with culture medium containing L-tyrosine (1 mM) supplemented with acetyl sodium hyaluronate or unmodified sodium hyaluronate at concentrations of 0.1, 0.25, 0.5, and 1 mg/ml, respectively, or reference (Lipoic Acid 5 μg/ml). The cells were incubated for 10 days with two renewals of the treatment on the 3rd and 7th day after incubation. Table 7: Impact of sodium acetyl hyaluronate on in vitro melanin synthesis in melanocytes in the stimulated condition (expressed as % of the control condition 1 mM L-tyrosine). * = p<0.05; ** = p<0.01; *** = p<0.001; ns = not significant. Percentage values in parentheses reflect the effects exerted by the tested compounds (Lipoic Acid, sodium acetyl hyaluronate and sodium hyaluronate on performance in the absence of the test compound (control)).

[0146] Os resultados mostraram que o acetil hialuronato de sódio induz um aumento na síntese da melanina com um efeito inverso conforme as doses (+11% a 0,1 mg/ml e -7% em 1 mg/ml). O hialuronato de sódio não modificado foi menos eficiente, demonstrando que a acetilação melhora a atividade biológica do hialuronato de sódio.[0146] The results showed that sodium acetyl hyaluronate induces an increase in melanin synthesis with an inverse effect depending on the doses (+11% at 0.1 mg/ml and -7% at 1 mg/ml). Unmodified sodium hyaluronate was less efficient, demonstrating that acetylation improves the biological activity of sodium hyaluronate.

Claims

1. A skin care composition comprising low molecular weight acetylated hyaluronic acid or its sodium salt, characterized in that the low molecular weight acetylated hyaluronic acid or its sodium salt has a weight average molecular weight of 10 to 15 kDa, an average degree of acetylation greater than 3.8, and a polydispersity index that is less than 1.5.

2. Skin care composition according to claim 1, characterized in that the low molecular weight acetylated hyaluronic acid or its sodium salt has an average degree of acetylation of 3.9 or greater, and more particularly of 4.0.

3. Composition for skin care according to claim 1 or 2, characterized in that the low molecular weight acetylated hyaluronic acid or its sodium salt has a weight average molecular weight of 13 kDa ± 1 kDa.

4. Skin care composition according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the low molecular weight acetylated hyaluronic acid or its sodium salt has a polydispersity index that is 1.4 or less.

5. Composition for skin care according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the degree of acetylation is determined by quantitative 2D-NMR, and the 2D-NMR method is a gradient-enhanced 1H-13C HSQC method that allows the integration of the volume for the aforementioned acetyl groups in a quantitative manner.

6. Method of preparing low molecular weight acetylated hyaluronic acid that has a weight average molecular weight of 10 to 15 kDa, an average degree of acetylation greater than 3.8 and a polydispersity index that is less than 1.5, characterized in that it comprises the steps of: (i) selecting low molecular weight hyaluronic acid that has a molecular weight of 30 kDa or less; (ii) subjecting the above acid to acetylation conditions, wherein the acetylation conditions preferably comprise the step of reacting low molecular weight hyaluronic acid with an acetic acid/acetic anhydride mixture in the presence of a strong acid; and (iii) isolating low molecular weight acetylated hyaluronic acid by precipitation using addition water.

7. Method of preparing low molecular weight acetylated hyaluronic acid sodium salt that has a weight average molecular weight of 10 to 15 kDa, an average degree of acetylation greater than 3.8 and a polydispersity index that is less than 1.5, characterized in that it comprises the steps of: (i) selecting low molecular weight hyaluronic acid that has a molecular weight of 30 kDa or less; (ii) subjecting the above acid to acetylation conditions, wherein the acetylation conditions preferably comprise the step of reacting low molecular weight hyaluronic acid with an acetic acid/acetic anhydride mixture in the presence of a strong acid; (iii) isolating low molecular weight acetylated hyaluronic acid by precipitation using addition water; and (iv) reacting low molecular weight acetylated hyaluronic acid with a base providing a source of sodium ions to obtain a sodium acetyl hyaluronate solution.

8. Method according to claim 7, characterized in that the conversion of low molecular weight acetylated hyaluronic acid into sodium acetyl hyaluronate is carried out at a pH not greater than 9, more particularly not greater than 8, more particularly not greater than 7, and even more particularly not greater than 6.5.

9. Method according to claim 7 or 8, characterized in that it further comprises the step of: (v) dehydrating the solution by lyophilization or spray drying.

10. Low molecular weight acetylated hyaluronic acid or its sodium salt, characterized in that it has a weight average molecular weight of 10 to 15 kDa, an average degree of acetylation greater than 3.8 and a polydispersity index that is less than 1.5, being in the form of a white powder with an L* value of 90 or greater, and a b* value of less than 8.

11. Method for inhibiting the degradation of the extracellular matrix of the skin associated with high levels of matrix-degrading enzymes, characterized in that it comprises the step of applying to the skin an effective amount of the skin care composition as defined in any one of claims 1 to 5, or low molecular weight acetylated hyaluronic acid or its sodium salt as defined in claim 10.

12. Method according to claim 11, characterized in that it reduces the visible signs of aging on the skin.

13. Method according to claim 11 or 12, characterized in that the matrix-degrading enzymes are metalloproteinases, in particular MMP-1 or MMP-3.

14. Method according to any one of claims 11 to 13, characterized in that acetylated hyaluronic acid or its sodium salt inhibits collagen degradation in the extracellular matrix.