BR112019009924A2

BR112019009924A2 - materiais e métodos para o controle de nematoides

Info

Publication number: BR112019009924A2
Application number: BR112019009924A
Authority: BR
Inventors: Farmer Sean; S. Zorner Paul; Alibek Ken; Milovanovic Maja; MAZUMDER Sharmistha; Dixon Tyler; Fotsch Alex
Original assignee: Locus Agriculture Ip Company, Llc
Priority date: 2016-11-16
Filing date: 2017-11-16
Publication date: 2019-08-13
Also published as: JP2020512305A; AU2017361420A1; CA3044043A1; MX2019005778A; PH12019501082A1; KR102451636B1; CO2019005042A2; JP7071386B2; IL266661B; US20190357542A1; ZA201903030B; CN110087470A; EP3531835A4; CN110087470B; IL266661A; EP3531835A1; US11172669B2; AU2017361420B2; US20220053751A1; KR20190073577A

Abstract

a presente invenção se refere a materiais e método para o controle de pragas, em particular, nematoides. a invenção também se refere a composições compreendendo biotensoativos como pesticidas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MATERIAIS E MÉTODOS PARA O CONTROLE DE NEMATOIDES. REFERÊNCIA CRUZADA COM REQUERIMENTO RELACIONADO [001] Este requerimento reivindica o benefício do requerimento de patente provisória dos Estados Unidos, Serial No. U.S. 62/422.918, registrado em 16 de novembro de 2016, o qual é incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] De modo a aumentar as produções e a proteger as culturas contra patógenos, pragas, e doença, os agricultores têm se apoiado fortemente no uso de produtos químicos sintéticos e fertilizantes químicos; no entanto, quando usados excessivamente ou quando aplicados de maneira inadequada, estas substâncias podem correr para as águas superficiais, escoar para as águas subterrâneas, e evaporar para o ar. Estas substâncias são cada vez mais examinadas como fontes de poluição do ar e da água, fazendo com que sua utilização responsável seja um imperativo ecológico e comercial. Mesmo quando utilizadas adequadamente, a dependência excessiva e a utilização a longo prazo de determinados fertilizantes químicos e pesticidas pode alterar de maneira deletéria o ecossistema do solo, reduzir a tolerância ao estresse, aumentar a resistência das pragas, e impedir o crescimento e a vitalidade das plantas e dos animais.

[003] Os nematoides são uma classe de lombrigas ou vermes filiformes do filo Nemtoda. Exemplos na classe são os nematoides formadores de cistos do gênero Heterodera (por exemplo, H. glycines, H. avenae, e H. shachtii) e Globodera (por exemplo, G. rostochiens e G. pallida), os nematoides da raiz atarracada do gênero Trichodorus, os nematoides do bulbo e do caule do gênero Ditylenchus, o nematoide dourado, Heterodera rostochiensis, os nematoides do nó da raiz, do

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 45/115

2/57 gênero Meloidogyne (por exemplo, M. javanica, M. hapla, M. arenaria e M. incognita), os nematoides da lesão da raiz do gênero Pratylenchus (por exemplo, P. goodeyi, P. penetrans, Pos bractrvurus, P. zeae, P. coffeae, P. bractrvurus, e P. thornei), os nematoides dos cítricos do gênero Tylenchulus, e os nematoides do ferrão do gênero Belonolaimus.

[004] Os nematoides são conhecidos por infectarem tanto as plantas quanto os animais. Estes vermes microscópicos podem ser encontrados em quase qualquer tipo de meio ambiente. Quando residentes no solo, os nematoides se alimentam sobre as raízes das plantas, provocando dano significativo à estrutura das raízes e o desenvolvimento inadequado das plantas. Geral mente o dano é manifestado pelo crescimento de gallhas, nós das raízes, e outras anormalidades. A formação de galhas leva a redução do tamanho das raízes e à ineficácia do sistema radicular, o que, por sua vez, afeta gravemente outras partes da planta. Em consequência, a planta enfraquecida se torna vulnerável a ataques por outros patógenos. Sem tratamento adequado, a planta morre. Os nematoides provocam dano de milhões de dólares a cada ano para as gramas de relva, as plantas ornamentais, e as culturas alimentares.

[005] Os nematoides do nó da raiz (Meloidogyne spp.) são um dos três gêneros de nematoides parasitários de plantas mais economicamente prejudiciais sobre as culturas hortículas e de campo. Os nematoides do nó da raiz estão distribuídos mundialmente, e são parasitas obrigatórios das raízes de milhares de espécies de plantas, incluindo as plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, herbáceas e lenhosas. As culturas de legumes e verduras que crescem em climas quentes podem experimentar severas perdas devidas aos nematoides do nó da raiz, e freqüentemente são tratadas rotineiramente com um nematicida químico. O dano dos nematoides do nó da raiz resulta em

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 46/115

3/57 baixo crescimento, um declínio na qualidade e na produção da cultura e redução da resistência a outros estresses (por exemplo, seca, outras doenças). Um alto nível de dano pode levar a perda total da cultura. Por exemplo, aproximadamente 1,5 bilhão e meio de dólares por ano é perdido somente devido aos nematoides do cisto da soja.

[006] Os nematicidas convencionais usados para controlar nematoides são aplicados no sulco de sementes no ato do plantio. Devido à toxicidade para os animais nas proximidades, tais como as aves, pivôs centrais aéreos com aplicações líquidas de compostos tóxicos tais como Nemacur, Temik, Furadan, Dazinat e Mocap caírem em desuso.

[007] Desde os anos sessenta, o brometo de metilo tem sido usado pelos produtores para esterilizar de modo eficaz os campos antes do plantio, essencialmente para controlar os nematoides, bem como para tratar doenças e ervas daninhas; o entanto, como este composto tóxico é usado em forma de gás, mais da metade da quantidade injetada dentro do solo eventual mente pode acabar na atmosfera e contribuir para a diminuição da camada de ozônio. Em 2005, os países desenvolvidos baniram o brometo de metilo de acordo com o Protocolo de Montreal, o qual é um tratado internacional assinado em 1987 para proteger a camada de ozônio da estratosfera.

[008] De acordo com a proibição, o tratado permite o uso limitado de brometo de metilo em morangos, amêndoas, e outras culturas as quais carecem de alternativas tanto para controle efetivo quanto acessível de nematoides, doença, e ervas daninhas. A extensão do uso autorizado diminui a cada ano e provavelmente vai terminar em breve. Portanto, é uma a prioridade para os produtores e para as agências reguladoras descobrir alternativas para o brometo de metilo; no entanto, nenhum produto único proporciona o amplo espectro de controle oferecido pelos brometos de metilo.

[009] A montagem de mandatos reguladores governando a dis

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 47/115

4/57 ponibilidade e o uso de produtos químicos, bem como demandas dos consumidores por alimento livre de resíduos e cultivado de maneira sustentável está impactando a indústria e causando uma evolução do pensamento com relação a como tratar uma miríade de desafios. Apesar da eliminação indiscriminada de produtos químicos não ser viável neste momento, os agricultores estão cada vez mais abraçando o uso de medidas biológicas como componentes viáveis de programas de Manejo Integrado de Nutrientes e de Manejo Integrado de Pragas. [0010] Devido às desvantagens das principais abordagens descritas acima, é crescente a demanda por pesticidas mais seguros e estratégias de controle de pragas alternativas. Particularmente, nos últimos anos, o controle biológico de nematoides obteve grande interesse. Este método utiliza agentes biológicos, tais como micróbios vivos, bio-produtos derivados destes micróbios, e combinações dos mesmos como pesticidas. Estes pesticidas biológicos têm importantes vantagens em relação a outros pesticidas convencionais. Por exemplo, são menos prejudiciais comparados com pesticidas químicos convencionais. São mais eficientes e específicos, e frequentemente se biodegradam rapidamente, levando a menos poluição ambiental.

[0011] O uso de biopesticidas e outros agentes biológicos tem sido bastante limitado por dificuldades na produção, no transporte, na administração, na avaliação e na eficácia. Por exemplo, muitos micróbios são difíceis de cultivar e subseqüentemente implantar em sistemas de produção agrícola e florestal em quantidades suficientes para serem úteis. Este problema é exacerbado por perdas na viabilidade e/ou atividade devido ao processamento, formulação, armazenamento, estabilização antes da distribuição, esporulação de células vegetativas como um mei de estabilização, transporte, e aplicação. Além do mais, uma vez aplicados, os produtos biológicos podem não se desenvolver por qualquer número de razões incluindo, por exemplo, densidades celula

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 48/115

5/57 res iniciais insuficientes, a incapacidade para competir de maneira eficaz com a microflora existente em uma localização em particular, e ser introduzido no solo e/ou outras condições ambientais nas quais o micróbio não pode se desenvolver ou até mesmo sobreviver.

[0012] Portanto, existe uma necessidade urgente de desenvolvimento de métodos e materiais para a produção de biopesticidas eficazes para o controle de nematoides.

BREVE SUMÁRIO [0013] A presente invenção proporciona composições e métodos para o controle de nematoides. Além disso, a presente invenção proporciona métodos e composições para a prevenção de dano às culturas por nematoides, deste modo resultando em aumento da produção. Vantajosamente, os pesticidas de acordo com a presente invenção utilizam substâncias não tóxicas, tais como micróbios e subprodutos de cultivo microbiano.

[0014] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona métodos para a prevenção de dano por nematoides e para o controle de nematoides, compreendendo as etapas de: cultivo de um microorganismo que produz um subproduto do crescimento microbiano e contato dos nematoides, ou de seu meio ambiente, com uma quantidade eficaz do micróbio e/ou do subproduto do crescimento microbiano.

[0015] Em uma modalidade, o subproduto do crescimento microbiano é um biotensoativo. Em uma modalidade, o biotensoativo é um glicolipídeo tal como um ramnolipídeo, um soforolipídeo (SLP), um lipídeo trealose ou um lipídeo manosileritritol (MEL). Em modalidades particularmente preferenciais o biotensoativo é um SLP e/ou um MEL.

[0016] As composições nematicidas à base de micróbios da presente invenção podem ser obtidas através de processos de cultivo variando de pequena escala a larga escala. Estes processos de cultivo

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 49/115

6/57 incluem, mas não estão limitados a, cultivo / fermentação submersos, cultivo superficial, fermentação em estado sólido (SSF), e combinações dos mesmos. A composição nematicida pode ser, por exemplo, o caldo da fermentação e/ou biotensoativos purificados.

[0017] Em algumas modalidades, os micro-organismos produtores de biotensoativos na composição podem ser cultivados no local e produzir os biotensoativos para utilização direta para controlar nematoides. Consequentemente, uma alta concentração de biotensoativo e/ou micro-organismos produtores de biotensoativos em um sítio de tratamento (por exemplo, no solo) pode ser obtida de maneira fácil e contínua.

[0018] Em uma modalidade, o sistema de acordo com a presente invenção compreende um aspecto adicional proporcionando uma aplicação de campo dos produtos à base de micróbios. Os produtos à base de micróbios da presente invenção podem ser aplicados, por exemplo, através de um sistema de irrigação, como um spray, como um tratamento de sementes, na superfície do solo, nas superfícies das plantas, e/ou nas superfícies das pragas. Também é facilitada a aplicação mecânica através de implementos convencionais ou a aplicação robótica através de drones aéreos ou de base terrestre.

[0019] A composição nematicida pode ser usada para proteger plantas, seres humanos, ou animais por controle de nematoides. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0020] A Figura 1 mostra a redução da motilidade dos nematoides depois de 3 dias de tratamento sob várias condições: SD10 a 0,05% (em vol / vol), 0,125% (em vol / vol), 0,25% (em vol / vol), e 0,5% (em vol I vol), respectivamente; SD12 a 0,025% (em vol I vol), 0,05% (em vol / vol), 0,1% (em vol / vol), e 0,2% (em vol / vol), respectivamente; Nimitz® a 10 ppm ai; e verificação não tratada. SD10 se refere a tratamento com SLP. SD12 se refere a tratamento com MEL.

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 50/115

7/57 [0021] A Figura 2 mostra a taxa de mortalidade de nematóides depois de 3 dias de tratamento sob várias condições: SD10 a 0,05% (em vol / vol), 0,125% (em vol I vol), 0,25% (em vol I vol), e 0,5% (em vol I vol), respectivamente; SD12 a 0,025% (em vol I vol), 0,05% (em vol I vol), 0,1% (em vol I vol), e 0,2% (em vol I vol), respectivamente; Nimitz® a 10 ppm ai; e verificação não tratada.

[0022] A Figura 3 mostra a contagem de nematóides vivos depois de 3, 14, e 23 dias de vários tratamentos do solo em testes de frasco de laboratório de patologia: SD10 a 0,25% (em vol / vol) e 0,5% (em vol / vol); SD12 a 0,1% (em vol I vol) e 0,2% (em vol I vol); SD10 (0,25% em vol I vol/) + SD12 (0,1% em vol I vol); Nimitz® a 10 ppm pr; e verificação não tratada.

[0023] A Figura 4 mostra o controle de nematóides vivos (isto é, a morte de nematóides) depois de 3, 14, e 23 dias de vários tratamentos do solo em testes de frasco de laboratório de patologia: SD10 a 0,25% (em vol / vol) e 0,5% (em vol / vol); SD12 a 0,1% (em vol I vol) e 0,2% (em vol I vol); SD10 (0,25% em vol I vol/) + SD12 (0,1% em vol I vol); Nimitz® a 10 ppm pr; e verificação não tratada.

[0024] A Figura 5 mostra a contagem de nematóides não móveis depois de 3, 14, e 23 dias de vários tratamentos do solo em testes de frasco de laboratório de patologia: SD10 a 0,25% (em vol / vol) e 0,5% (em vol / vol); SD12 a 0,1% (em vol I vol) e 0,2% (em vol I vol); SD10 (0,25% em vol I vol/) + SD12 (0,1% em vol I vol); Nimitz® a 10 ppm pr; e verificação não tratada.

[0025] A Figura 6 mostra a contagem de nematóides vivos não móveis depois de 3, 14, e 23 dias de vários tratamentos do solo em testes de frasco de laboratório de patologia: SD10 a 0,25% (em vol / vol) e 0,5% (em vol / vol); SD12 a 0,1% (em vol I vol) e 0,2% (em vol I vol); SD10 (0,25% em vol I vol/) + SD12 (0,1% em vol I vol); Nimitz® a 10 ppm pr; e verificação não tratada.

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 51/115

8/57 [0026] A Figura 7 mostra a taxa de formação de galhas na colheita para uma microparcela de pepinos tratada com 5 tratamentos diferentes: verificação não tratada; Nimitz® a 5 pt/a; SD12 A 0,2% (ai/v) único tratamento; SD12 A 0,2% (ai/v) duplo tratamento; SD12 A 0,2% (ai/v) triplo tratamento.

[0027] A Figura 8 mostra a contagem de nematoides na colheita para uma microparcela de pepinos tratada com 5 tratamentos diferentes: verificação não tratada; Nimitz® a 5 pt/a; SD12 A 0,2% (ai/v) único tratamento; SD12 A 0,2% (ai/v) duplo tratamento; SD12 A 0,2% (ai/v) triplo tratamento.

[0028] A Figura 9 mostra uma configuração de plotagem para avaliação da eficácia do atrativo de nematoides, incluindo localizações da zona de inoculação de nematoides e zona de aplicação do atrativo.

[0029] A Figura 10 mostra a percentagem de infestação (da parcela total da população de nematoides) em três localizações diferentes em parcelas para avaliação do atrativo de nematoides. Centro se refere ao centro da zona de inoculação, atrativo se refere à zona de atração, e não tratada se refere às áreas de todas as outras parcelas.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0030] A presente invenção proporciona materiais e métodos para o controle de nematoides. A presente invenção também proporciona composições que podem ser usadas como pesticidas para o controle de nematoides. A presente invenção adicionalmente proporciona métodos para a preparação de semelhantes composições. Além disso, a presente invenção proporciona métodos e composições para prevenir o dano de culturas por nematoides, deste modo resultando em aumentos na produção.

[0031] Os produtos à base de micróbios da presente invenção podem ser usados em cenários incluindo, mas não limitados a, culturas,

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 52/115

9/57 pecuária, silvicultura, manejo de relvados, pastagens, e saúde humana e animal.

[0032] Em uma modalidade, a composição para o controle de nematoides de acordo com a presente invenção compreende uma quantidade eficaz de um biotensoativo microbiano e/ou de um microorganismo produtor do referido biotensoativo.

[0033] Em uma modalidade, o método de controle de nematoides compreende as etapas de obtenção de um biotensoativo microbiano, e aplicação de uma quantidade eficaz do biotensoativo microbiano a nematoides ou a sua localização.

[0034] As composições de acordo com a presente invenção podem ser obtidas, por exemplo, por processos de cultivo variando de pequena escala a larga escala. Estes processos de cultivo incluem, mas não estão limitados a, cultivo / fermentação submersos, cultivo superficial, fermentação em estado sólido (SSF), e combinação dos mesmos.

[0035] O produto da fermentação contendo o biotensoativo microbiano pode ser usado diretamente para tratamentos de nematoide sem extração ou purificação. Caso desejado, pode ser realizada extração e purificação dos biotensoativos conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Vantajosamente, o método de cultivo de acordo com a invenção é capaz de produzir uma alta concentração de microorganismos e uma alta concentração de biotensoativo.

[0036] Em determinadas modalidades, os métodos e composições de acordo com a presente invenção reduzem o dano causado por nematoides, comparado com uma planta não tratada, por cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 70%, 80%, ou 90% ou mais.

[0037] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um método para aumentar as produções da cultura ou planta. Em determinadas modalidades, os métodos e composições de acordo com a

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 53/115

10/57 presente invenção aumentam a produção da cultura por cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 70%, 80%, ou 90% ou mais comparada com uma planta não tratada.

[0038] Em uma modalidade, os métodos da presente invenção reduzem o número de ovos de nematoides nas raízes de uma planta por cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 70%, 80%, ou 90% ou mais comparada com uma planta não tratada.

[0039] Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para aumentar o peso ou o tamanho da planta em relação a uma planta não tratada.

Definições Selecionadas [0040] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo controlar usado em referência à atividade produzida pelos biotensoativos ou pelos micro-organismos produtores de biotensoativos se estende ao ato de matar, incapacitar ou imobilizar pragas ou tornar de modo diverso as pragas substancial mente incapazes de causar dano.

[0041] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, nematicida significa tendo a capacidade de controlar nematoides. Portanto, por exemplo, matar nematoides, reduzir sua motilidade, e reduzir contagens de ovos são todos exemplos de atividade nematicida.

[0042] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, referência a uma composição à base de micróbios significa uma composição que compreende componentes que foram produzidos em conseqüência do crescimento de micro-organismos ou outras culturas celulares. Deste modo, a composição à base de micróbios pode compreender os próprios micróbios e/ou subprodutos do crescimento microbiano. Os micróbios podem estar em um estado vegetativo, em forma de esporos, em forma micelial, em qualquer outra forma de propágulo, ou uma mistura destas. Os micróbios podem ser planctônicos ou em for

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 54/115

11/57 ma de um biofilme, ou uma mistura de ambos. Os subprodutos do crescimento podem ser, por exemplo, metabólitos, componentes da membrana celular, proteínas expressas, e/ou outros componentes celulares. Os micróbios podem estar intactos ou podem ser lisados. Em modalidades preferenciais, os micróbios estão presentes, com caldo no qual foram cultivados, na composição à base de micróbios. As células podem estar presentes em, por exemplo, uma concentração de 1 x 10⁴, 1 x 10⁵, 1 x 10⁶, 1 x 10⁷, 1 x 10⁸, 1 x 10⁹, 1 x 10¹⁰, ou 1 x 10¹¹ ou mais propágulos por mililitro da composição. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, um propágulo é qualquer porção de um micro-organismo a partir do qual um organismo novo e/ou maduro pode se desenvolver, incluindo, mas não limitado a, células, esporos, micélios, botões e sementes.

[0043] A presente invenção adicional mente proporciona produtos à base de micróbios, os quais são produtos que devem ser aplicados na prática para obter um resultado desejado. O produto à base de micróbios pode ser simplesmente a composição à base de micróbios colhida do processo de cultivo de micróbios. Alternativamente, o produto à base de micróbios pode compreender ingredientes adicionais que tenham sido acrescentados. Estes ingredientes adicionais podem incluir, por exemplo, estabilizantes, tampões, veículos apropriados, tais como água, soluções salinas, ou qualquer outro veículo apropriado, nutrientes acrescentados de modo a suportar crescimento microbiano adicional, reforçadores do crescimento não nutrientes, tais como hormônios vegetais, e/ou agentes que facilitam o rastreamento dos micróbios e/ou da composição no meio ambiente ao qual é aplicada. O produto à base de micróbios também pode compreender misturas de composições à base de micróbios. O produto à base de micróbios também pode compreender um ou mais componentes da composição à base de micróbios que tenham sido processados de algum modo tal

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 55/115

12/57 como, mas não limitado a, filtração, centrifugação, lise, secagem, purificação e semelhantes.

Micro-orqanismos [0044] Biotensoativos microbianos são compostos produzidos por uma variedade de micro-organismos tais como bactérias, fungos, e leveduras.

[0045] Em uma modalidade, os micro-organismos são bactérias incluindo bactérias gram-positivas e gram-negativas. Estas bactérias podem incluir, mas não estão limitadas a, por exemplo, Escherichia coli, Rhizobium (por exemplo, Rhizobium japonicum, Sinorhizobium mel Hoti, Sinorhizobium fredii, Rhizobium leguminosarum biovar trifolii, e Rhizobium etli), Bradyrhizobium (por exemplo, B. japanicum, e B. parasponia), Bacillus (por exemplo, B. subtilis, B. firmus, B. laterosporus, B. pumillus, B. cereus, B. licheniformis, B. megaterium, e B. amyloliquifaciens), Azobacter (por exemplo, A. vinelandii, e A. chroococcum), Arthrobacter (por exemplo, A. pascens), Agrobacterium (por exemplo, A. radiobacter), Pseudomonas (por exemplo, P. chlororaphis subsp. aureofaciens (Kluyver), P. aeruginosa, P. putida, P. florescens, P. fragi, e P. syringae), Flavobacterium spp.; Azospirillium (por exemplo, A. brasil iensis), Azo monas, Derxia, Beijerinckia, Nocardia, Klebsiella, Clavibacter (por exemplo, C. xyli subsp. xyli e C. xyli subsp. cynodontis), Cyanobacteria, Pantoea (por exemplo, P.agglomerans), Sphingomonas (por exemplo, S. paucimobilis), Streptomyces (por exemplo, S. griseochromogenes, S. qriseus, S. cacaoi, S. aureus, e S. kasugaenis), Streptoverticillium (por exemplo, S. ri mo fadens), Ralslonia (por exemplo, R. eulropha), Rhodospirillum (por exemplo, R.rubrum), Xanthomonas (por exemplo, X. campestris), Erwinia (por exemplo, E. carotovora), Clostridium (por exemplo, C. butyricum, C. tyrobutyricum, C. acetobutyricum, C. beijerinckii, C. bravidaciens, e C. malacusomae), Rhodococcus, Campylobacter, Cornybacterium, e combinações das mesPetição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 56/115

13/57 mas.

[0046] Em outra modalidade, o micro-organismo é uma levedura. Uma série de espécies de leveduras são adequadas para produção de acordo com a presente invenção, incluindo, mas não limitadas a, Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae, S. boulardii sequela e S. torula), Debaromyces, Issalchenkia, Candida (C. albicans, C. rugosa, C. tropicalis, C. lipolytica, e C. torulopsis), Kluyveromyces (por exemplo, K. lactis, K. frágil is), Pichia (por exemplo, Pichia pastoris), Wickerhamomyces, Starmerella (por exemplo, Starmerella bombicola), e/ou combinações das mesmas.

[0047] Em uma modalidade, a levedura é uma levedura assassina. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, levedura assassina significa uma cepa de levedura caracterizada por sua secreção de proteínas ou glicoproteínas tóxicas, às quais a própria cepa é imune. As exotoxinas secretadas pelas leveduras assassinas têm a capacidade de destruir outras cepas de levedura, fungos, ou bactérias. Por exemplo, micro-organismos que podem ser controlados por levedura assassina incluem Fusarium e outros fungos filamentosos. Exemplos de leveduras assassinas de acordo com a presente invenção são aquelas que podem ser usadas com segurança nas indústrias de alimentos e de fermentação, por exemplo, cerveja, vinho, e fabricação de pão; aquelas que podem ser usadas para controlar outros micro-organismos que podem contaminar os processos de produção referidos; aquelas que podem ser usadas em biocontrole para a preservação de alimentos; aquelas que podem ser usadas para o tratamento de infecções fúngicas tanto em seres humanos quanto em plantas; e aquelas que podem ser usadas em tecnologia de DNA recombinante. As leveduras referidas podem incluir, mas não estão limitadas a, Wickerhamomyces, Pichia (por exemplo, Pichia anômala, Pichia guielliermondii, Pichia kudrizvzevii) Hansenula, Saccharomyces, Han

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 57/115

14/57 seniaspora, tais como Hanseniaspora uvarum, Ustilago maydis, Debaryomyces hansenii, Candida, Cryptococcus, Kluyveromyces, Torulopsis, Ustilago, Williopsis, Zygosaccharomyces, tais como Zygosaccharomyces bailii, e outras.

[0048] Em uma modalidade, os micro-organismos são fungos, incluindo, mas não estão limitados a, Mycorrhiza (por exemplo, micorrízicos vesiculares-arbusculares (VAM), micorrízicos arbusculares (AM)), Mortierella, Phycomyces, Blakeslea, Thraustochytrium, Penicillin m, Phythium, Entomophthora, Aureobasidium pullulans, Fusarium venenalum, Aspergillus, Trichoderma (por exemplo, T. reesei, T. harzianum, T. viride e T. hamatum), Rhizopus spp, fungos endofíticos (por exemplo, Piriformis indica) e combinações dos mesmos.

[0049] Em uma modalidade adicional, os micro-organismos são fungos micorrízicos tais como Glomus spp. e Acaulospora spp. Em uma modalidade, o micro-organismo é fungo micorrízico arbuscular (AMF).

[0050] Em modalidades específicas, micróbios para a produção de SLPs podem ser Candida sp., Starmerella sp., Cryptococcus sp., Cyberlindnera samutprakarnensis JP52 (T), Pichia sp., Rhodotorula sp., ou Wickerhamiellasp.

[0051] Em modalidades adicionalmente específicas, micróbios para a produção de MELs podem ser Pseudozyma sp., Candida sp., Ustilago sp., Schizonella sp., ou Kurtzmanomyces sp.

[0052] Em modalidades preferenciais, os micróbios são leveduras. Em modalidades específicas, as leveduras são Starmerella, Pichia, e/ou Pseudozyma. Especificamente exemplificados aqui, neste requerimento de patente, são Starmerella bombicola, Pichia anômala (Wickerhamomyces anomalus) e Pseudozyma aphidis.

Biotensoativos [0053] Os biotensoativos formam uma classe importante de meta

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 58/115

15/57 bólitos secundários que ocorrem em muitos micro-organismos. Os biotensoativos são biodegradáveis e podem ser produzidos facilmente e de maneira barata usando organismos selecionados sobre substratos renováveis. A maioria dos organismos produtores de biotensoativos produzem biotensoativos em resposta à presença de uma fonte de hidrocarbonetos (por exemplo, óleos, açúcar, glicerol, etc.) no meio de crescimento. Outros componentes do meio também podem afetar a produção de biotensoativos de maneira significativa. Por exemplo, a produção de ramnolipídeos pelas bactérias Pseudomonas aeruginosa pode ser aumentada se for usado nitrato como uma fonte de nitrogênio ao invés de amônio. Do mesmo modo, a concentração de ferro, magnésio, sódio, e potássio; a proporção de carbono : fósforo; e agitação podem afetar bastante a produção de ramnolipídeo.

[0054] Os biotensoativos incluem glicolipídeos de baixo peso molecular (GLs), lipopeptídeos (LPs), flavolipídeos (FLs), fosfolipídeos, e polímeros de alto peso molecular tais como lipoproteínas, complexos de lipopolissacarídeos e proteínas, e complexos de polissacarídeosproteínas-ácidos graxos. A porção lipofílica comum de uma molécula de biotensoativo é a cadeia de hidrocarboneto de um ácido graxo, ao passo que a parte hidrofílica é formada por grupos de éster ou álcool de lipídeos neutros, pelo grupo de carboxilato de ácidos graxos ou aminoácidos (ou peptídeos), ácido orgânico no caso de flavolipídeos, ou, no caso de glicolipídeos, pelo carboidrato.

[0055] De acordo com modalidades desta invenção, o biotensoativo tem a capacidade de penetrar através dos tecidos das pragas e é eficaz para reduzir as quantidades sem o uso de adjuvantes. Foi visto que em concentrações acima da concentração crítica de micelas, os biotensoativos têm a capacidade de penetrar de maneira mais eficaz nos objetos tratados.

[0056] O desenvolvimento dos biopesticidas naturais da presente

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 59/115

16/57 invenção, os quais podem ser produzidos em altas quantidades, representa um avanço significativo na arte. As pragas podem ser controladas usando ou os organismos produtores de biotensoativos como um agente de biocontrole ou pelos próprios biotensoativos. Além disso, pode ser realizado o controle de pragas por meio do uso de substratos específicos para suportar o crescimento de organismos produtores de biotensoativos bem como para produzir agentes pesticidas biotensoativos. Vantajosamente, os biotensoativos naturais têm a capacidade de inibir o crescimento de organismos concorrentes e de reforçar o crescimento dos organismos produtores de biotensoativos específicos.

[0057] Além disso, estes biotensoativos podem desempenhar papéis importantes no tratamento de doenças animais e humanas. Os animais podem ser tratados, por exemplo, por mergulho ou banho em uma solução de biotensoativo isolada, com ou sem massa celular de micróbios, e/ou na presença de outros compostos tais como cobre ou zinco.

Métodos para Cultivo dos Micróbios [0058] A presente invenção proporciona métodos para o cultivo de micro-organismos e produção de biotensoativos e/ou outros subprodutos do crescimento microbiano. Estes processos de cultivo incluem, mas não estão limitados a, cultivo / fermentação submersos, cultivo superficial, fermentação em estado sólido (SSF), e combinação dos mesmos.

[0059] Os sistemas de cultivo microbiano tipicamente vão usar fermentação de cultivo submerso; no entanto, também podem ser usados sistemas híbridos e de cultivo superficial. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, fermentação se refere ao crescimento de células, esporos, micélios e/ou outros propágulos microbianos sob condições controladas. O crescimento pode ser aeróbico ou

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 60/115

17/57 anaeróbico.

[0060] O vaso de crescimento microbianos usado de acordo com a presente invenção pode ser qualquer fermentador ou reator de cultivo para uso industrial. O processo de cultivo é realizado em um vaso que pode ser, por exemplo, cônico ou tubular. Em uma modalidade, o vaso opcionalmente pode ter controles / sensores funcionais ou pode ser conectado a controles / sensores funcionais para medir fatores importantes no processo de cultivo, tais como pH, oxigênio, pressão, temperatura, potência do eixo agitador, umidade, viscosidade e/ou densidade microbiana e/ou concentração de metabólitos.

[0061] Em uma modalidade adicional, o vaso também pdoe ter a capacidade de monitorar o crescimento de micro-organismos dentro do vaso (por exemplo, medição do número de células e das fases de crescimento). Alternativamente, uma amostra diária pode ser retirada do vaso e submetida a enumeração por técnicas conhecidas na área, tais como a técnica de diluição em placas. Diluição em placas é uma técnica simples usada para estimar o número de bactérias em uma amostra. A técnica também pode proporcionar um índice por meio do qual podem ser comparados diferentes meio ambientes ou tratamentos.

[0062] Em uma modalidade, o método inclui a suplementação do cultivo com uma fonte de nitrogênio. A fonte de nitrogênio pode ser, por exemplo, nitrato de potássio, nitrato de amônio sulfato de amônio, fosfato de amônio, amônia, ureia, e/ou cloreto de amônio. Estas fontes de nitrogênio podem ser usadas de maneira independente ou em uma combinação de duas ou mais.

[0063] O método pode proporcionar oxigenação da cultura de crescimento. Uma modalidade utiliza lento movimento do ar de modo a remover o ar contendo baixo nível de oxigênio e introduzir ar oxigenado. O ar oxigenado pode ser o ar ambiente suplementado diariamente

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 61/115

18/57 através de mecanismos incluindo impulsores para agitação mecânica do líquido, e aspersores de ar para suprimento de bolhas de gás ao líquido para dissolução de oxigênio dentro do líquido.

[0064] O método pode compreender adicionalmente a suplementação do cultivo com uma fonte de carbono. A fonte de carbono é tipicamente um carboidrato, tal como glicose, sacarose, lactose, frutose, trealose, manose, manitol, e/ou maltose; ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido propiônico, ácido málico, ácido malônico, e/ou ácido pirúvico; álcoois, tais como etanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol, isobutanol, e/ou glicerol; gorduras e óleos tais como óleo de soja, óleo de canola, óleo de coco, óleo de farelo de arroz, azeite de oliva, óleo de milho, óleo de gergelim, e/ou óleo de linhaça; etc. Estas fontes de carbono podem ser usadas de maneira independente ou em uma combinação de duas ou mais.

[0065] Em uma modalidade, fatores de crescimento e nutrientes traço para micro-organismos são incluídos no meio. Isto é particularmente preferencial quando se cultiva micróbios, os quais são incapazes de produzir todas as vitaminas que necessitam. Nutrientes inorgânicos, incluindo elementos traço, tais como ferro, zinco, cobre, manganês, molibdênio e/ou cobalto também podem ser incluídos no meio.

[0066] Em uma modalidade, sais inorgânicos também podem ser incluídos. Sais inorgânicos úteis podem ser di-hidrogenofosfato potássico, hidrogenofosfato dipotássico, hidrogenofosfato dissódico, sulfato de magnésio, cloreto de magnésio, sulfato de ferro, cloreto de ferro, sulfato de manganês, cloreto de manganês, sulfato de zinco, cloreto de chumbo, sulfatoi de cobre, cloreto de cálcio, carbonato de cálcio, e/ou carbonato de sódio. Estes sais inorgânicos podem ser usados de modo independente ou em uma combinação de dois ou mais.

[0067] Em algumas modalidades, o método para cultivo pode compreender adicionalmente o acréscimo de ácidos e/ou antimicrobia

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 62/115

19/57 nos adicionais no meio líquido antes, e/ ou durante o processo de cultivo. Agentes antimicrobianos ou antibióticos são usados para proteger a cultura contra contaminação. Adicionalmente, agentes antiespumantes também podem ser adicionados para prevenir a formação e/ou acumulação de espuma quando é produzido gás durante o cultivo. [0068] O pH da mistura deve ser adequado para o microorganismo de interesse. Tampões, e reguladores do pH, tais como carbonatos e fosfatos, podem ser usados para estabilizar o pH proximo a um valor preferencial. Quando íons de metal estão presentes em altas concentrações, pode ser necessário o uso de um agente quelante no meio líquido.

[0069] O método e equipamento para cultivo de micro-organismos e produção dos subprodutos microbianos podem ser realizados em alguns processos em descontínuo, quase contínuos, ou contínuos. [0070] Os micróbios podem ser cultivados em forma planctônica ou como biofilme. No caso de biofilme, o vaso pode ter dentro do mesmo um substrato sobre o qual os micróbios podem ser cultivados em um estado de biofilme. O sistema também pode ter, por exemplo, a capacidade de aplicar estímulos (tais como tensão de cisalhamento) que estimula e/ou melhora as características de crescimento de biofilme.

[0071] Em uma modalidade, o método para cultivo de microorganismos é realizado em cerca de 5^o a cerca de 10 0°C, de modo preferencial, 15 a 60° C, de modo mais preferencial, 25 a 50° C. Em uma modalidade adicional, o cultivo pode ser realizado continuamente em uma temperatura constante. Em outra modalidade, o cultivo pode estar sujeito a mudanças de temperatura.

[0072] Em uma modalidade, o equipamento usado no método e processo de cultivo é estéril. O equipamento de cultivo, tal como o reator / vaso, pode ser separado de, porém conectado a, uma unidade de

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 63/115

20/57 esterilização, por exemplo, uma autoclave. O equipamento de cultivo também pode ter uma unidade de esterilização que esteriliza in situ antes de iniciar a inoculação. Ar pode ser esterilizado por métodos conhecidos na arte. Por exemplo, o ar ambiente pode passar através de no mínimo um filtro antes de ser introduzido dentro do vaso. Em outras modalidades, o meio pode ser pasteurizado ou, opcionalmente, não ser adicionado nenhum calor, onde o uso de baixa atividade de água e baixo pH pode ser explorado para controlar o crescimento bacteriano. [0073] O conteúdo de biomassa do caldo de fermentação pode ser, por exemplo, a partir de 5 g/l a 180 g/l ou mais. Em uma modalidade, o conteúdo de sólidos do caldo é a partir de 10 g/l a 150 g/l.

[0074] Em uma modalidade, o método para produção de um metabolite microbiano de acordo com a presente invenção compreende as etapas de: 1) misturar partículas hidrofóbicas e hidrofílicas para formar uma substância sólida formadora de matriz; 2) contactar a referida substância sólida formadora de matriz com um meio inoculado com um micro-organismo de interesse, deste modo criando uma matriz de microrreatores; e 3) crescimento do micro-organismo referido dentro dos micro-reatores referidos.

[0075] O subproduto do crescimento microbiano produzido por micro-organismos de interesse pode ser retido nos micro-organismos ou secretado dentro do meio líquido. Em outra modalidade, o método para produção de subproduto do crescimento microbiano pode compreender adicional mente etapas de concentração e purificação do subproduto do crescimento microbiano de interesse. Em uma modalidade adicional, o meio líquido pode conter compostos que estabilizam a atividade do subproduto do crescimento microbiano.

[0076] Em uma modalidade, toda a composição de cultivo microbiano é removida depois do completamento do cultivo (por exemplo, depois de, por exemplo, atingir uma densidade celular desejada, ou uma

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 64/115

21/57 densidade de um metabolite especificado no caldo). Neste procedimento em lote, um lote inteiramente novo é iniciado depois de colher o primeiro lote.

[0077] Em outra modalidade, somente uma porção do produto da fermentação é removida a qualquer momento. Nesta modalidade, biomassa com células viáveis permanece no vado como um inoculante para um novo lote de cultivo. A composição que é removida pode ser um caldo livre de células ou pode conter células. Desta maneira, é criado um sistema quase contínuo.

[0078] Em uma modalidade, os micróbios são cultivados dentro de 100, 50, 25, 10, 5, 1, ou menos milhas de onde o produto à base de micróbios será usado.

Preparação de Produtos à Base de Micróbios [0079] Um produto à base de micróbios da presente invenção é simplesmente o caldo da fermentação contendo o micro-organismo e/ou os metabólitos microbianos (tais como biotensoativos) produzidos pelo micro-organismo e/ou quaisquer nutrientes residuais. O produto da fermentação pode ser usado diretamente sem extração, isolamento, ou purificação. Caso desejado, pode ser facilmente realizada extração, isolamento e/ou purificação usando métodos ou técnicas de rotina descritos aqui, neste requerimento de patente, e/ou na literatura.

[0080] Os micro-organismos no produto à base de micróbios podem estar em uma foram ativa ou inativa, em forma de células, em forma de esporos, e/ou em forma micelial. Os produtos à base de micróbios podem ser usados sem estabilização, preservação, e armazenamentos adicionais. Vantajosamente, o uso direto destes produtos à base de micróbios preserve uma alta viabilidade dos microorganismos, reduz a possibilidade de contaminação por agentes estranhos e por micro-organismos indesejáveis, e mantém a atividade dos subprodutos do crescimento microbiano.

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 65/115

22/57 [0081] Os micróbios e/ou caldo (incluindo camadas ou frações distintas) resultantes do crescimento microbiano podem ser removidos do vaso de crescimento e transferidos, por exemplo, através de canalização para utilização imediata.

[0082] Em outras modalidades, a composição (micróbios, caldo, ou micróbios e caldo) podem ser colocados dentro de recipientes de tamanho apropriado, tendo em conta, por exemplo, a utilização pretendida, o método de aplicação contemplado, o tamanho do tanque de fermentação, e q ualquer modo de transporte da instalação de crescimento de micróbios até a localização de utilização. Deste modo, os recipientes dentro dos quais a composição à base de micróbios é colocada podem ter, por exemplo, de 1 galão a 1.000 galões ou mais. Em outras modalidades os recipientes têm 2 galões, 5 galões, 25 galões, ou são maiores.

[0083] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, caldo inclui todo o caldo ou frações do caldo inteiro.

[0084] Depois de colher a composição à base de micróbios dos vasos de crescimento, componentes adicionais podem ser adicionados à medida que o produto colhido é colocado dentro dos recipientes e/ou canalizado (ou transportado de modo diverso para utilização). Os aditivos podem ser, por exemplo, tampões, veículos, outras composições à base de micróbios produzidas na mesma instalação ou em instalação diferente, modificadores da viscosidade, preservantes, modificadores do pH, nutrientes para o crescimento de micróbios, nutrientes para o crescimento de plantas, agentes de rastreamento, pesticidas, herbicidas, ração animal, produtos alimentícios e outros ingredientes específicos para uma utilização pretendida.

[0085] Vantajosamente, de acordo com a presente invenção, o produto à base de micróbios pode compreender caldo no qual os micróbios foram cultivados. O produto pode ser, por exemplo, no mínimo,

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 66/115

23/57 por peso, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, ou 100% de caldo. A quantidade de biomassa no produto, por peso, pode ser, por exemplo, qualquer um de 0% a 100% inclusive de todas as percentagens entre os mesmos.

[0086] Opcionalmente, o produto pode ser armazenado antes do uso. O tempo de armazenamento é curto, de modo preferencial. Portanto, o tempo de armazenamento pode ser menos de 60 dias, 45 dias, 30 dias, 20 dias, 15 dias, 10 dias, 7 dias, 5 dias, 3 dias, 2 dias, 1 dia, ou 12 horas. Em uma modalidade preferencial, se células vivas estiverem presentes no produto, o produto é armazenado em uma temperatura fria tal como, por exemplo, menos de 20° C, 15°C, 10°C, ou 5^o C. Por outro lado, uma composição de biotenso ativo tipicamente pode ser armazenada por períodos de tempo mais longos e em temperatura ambiente.

[0087] Em uma modalidade, os produtos de cultivo podem ser preparados como um produto de biomassa seca por pulverização. A biomassa pode ser separada por métodos conhecidos, tais como centrifugação, filtragem, separação, decantação, uma combinação de separação e decantação, ultrafiltragem ou microfiltragem. O produto da biomassa pode ser separado do meio de cultivo, e seco por pulverização.

[0088] Os produtos à base de micróbios podem ser formulados em uma variedade de modos, incluindo líquido, sóolidos, granulares, em pó, ou produtos de liberação lenta por meios que serão entendidos pelos peritos na arte, tendo o benefício da presente revelação.

[0089] Para aplicações em seres humanos ou animais, as formulações podem ser preparadas em formas líquidas, de pasta, pomada, supositório, cápsulas ou comprimidos e usada em um modo similar aos fármacos usados na indústria de fármacos medicinais. As formulações podem ser encapsuladas usando componentes conhecidos na

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 67/115

24/57 indústria farmacêutica. Encapsulação protege os componentes contra reações indesejáveis e ajuda os ingredientes a resistirem a condições adversas no meio ambiente ou no objeto tratado ou corpo por exemplo, no estômago.

[0090] As formulações sólidas da invenção podem ter diferentes formas e formatos, tais como cilindros, hastes, blocos, cápsulas, comprimidos, pílulas, péletes, tiras, grampos, etc. As formulações sólidas formulações também podem ser moídas, granuladas ou pulverizadas. O material granulado ou pulverizado pode ser prensado em comprimidos ou usado para preencher cápsulas ou conchas de gelatina préfabricadas. Formulações semi-sólidas podem ser preparadas em preparações em pasta, cera, gel, ou creme.

[0091] As composições sólidas ou semi-sólidas da invenção podem ser revestidas usando compostos de revestimento de película usados na indústria farmacêutica, tais como polietileno glicol, gelatina, sorbitol, goma, açúcar ou álcool polivinílico. Isto é particularmente essencial para comprimidos ou cápsulas usados em formulações de pesticidas. Revestimento de película pode proteger o manipulador contra entrar em contato direto com o ingrediente ativo nas formulações. Além disso, um agente amargante, tal como benzoate de denatônio ou quassino, também pode ser incorporado nas formulações pesticidas, no revestimento ou em ambos.

[0092] As composições da invenção também podem ser preparadas em formulações em pó e preenchidas dentro de cápsulas de gelatina pré-fabricadas.

[0093] As concentrações dos ingredientes nas formulações e a taxa de aplicação das composições podem ser amplamente variadas dependendo da praga, da planta ou da área tratada, ou do método de aplicação.

[0094] Em modalidades preferenciais, a composição para o contro

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 68/115

25/57 le de nematóides de acordo com a presente invenção compreende uma quantidade eficaz de um biotensoativo microbiano.

[0095] Em uma modalidade, o biotensoativo microbiano é um glicolipídeo tal como um ramnolipídeo, soforolipídeos (SLP), lipídeo trealose e/ou lipídeo manosileritritol (MEL).

[0096] Em uma modalidade, a composição para o controle de nematoides de acordo com a presente invenção compreende uma quantidade eficaz de um único biotensoativo microbiano e/ou um único micro-organismo produtor do biotensoativo. Em outra modalidade, a composição para o controle de nematóides pode compreender uma mistura de biotensoativos microbianos e/ou uma mistura de microorganismos produtores destes biotensoativos.

[0097] Em uma modalidade, a composição para o controle de nematoides compreende SLP. SLP pode estar em uma forma purificada ou em uma mistura de produtos da fermentação. A composição de modo preferencial contém os componentes ativos, tais como o SLP, em concentrações de 0,01 a 90 em peso % (% em peso), de modo preferencial de 0,1 a 50 % em peso, e de modo mais preferencial de 0,1 a 20 % em peso. Em outra modalidade, SLP purificado pode estar em combinação com um veículo aceitável, em que SLP pode ser apresentado em concentrações de 0,001 a 50% (em vol / vol), de modo preferencial, de 0,01 a 20% (em vol / vol), de modo mais preferencial, de 0,02 a 5% (em vol / vol).

[0098] Em uma modalidade, a composição para o controle de nematoides compreende MEL. MEL pode estar em uma forma purificada ou em uma mistura de produto da fermentação. A composição de modo preferencial contém os componentes ativos, tais como o MEL, em concentrações de 0,01 a 90 em peso % (% em peso), de modo preferencial de 0,1 a 50 % em peso, e de modo mais preferencial de 0,1 a 20 % em peso. Em outra modalidade, MEL purificado pode estar em

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 69/115

26/57 combinação com um veículo aceitável, em que MEL pode ser apresentado em concentrações de 0,0001 a 50% (em vol / vol), de modo preferencial, de 0,005 a 20% (em vol / vol), de modo mais preferencial, de 0,001 a 5% (em vol / vol).

[0099] Em outra modalidade, a composição para o controle de nematoides compreende uma mistura de SLP e MEL. SLP e MEL podem ser misturados em qualquer proporção contanto que a composição contenha os componentes ativos, a combinação de SLP e MEL, em uma concentração de 0,01 a 90 em peso % (% em peso), de modo preferencial de 0,1 a 50 % em peso, e de modo mais preferencial de 0,1 a 20 % em peso. Em outra modalidade, MEL e SLP purificado podem estar em combinação com um veículo aceito, em que SLP pode ser apresentado em concentrações de 0,0001 a 50% (em vol / vol), de modo preferencial, de 0,005 a 20% (em vol / vol), de modo mais preferencial, de 0,001 a 5% (em vol / vol).

[00100] Em uma modalidade adicional, a composição compreende SLP e/ou MEL em combinação com uma cepa de micro-organismo produtor de SLP e/ou MEL, tal como, por exemplo, Starmerella, Wickerhamomyces anomalus ou Pseudozymas species.

[00101] Os biotensoativos podem ser usados ou isolados ou combinados com outros componentes ativos ou inativos aceitáveis. Estes componentes podem ser, por exemplo, um componente de óleo tal como óleo de canela, óleo de cravo, óleo de algodão, óleo de alho, ou óleo de alecrim; outro tensoativo natural, tal como saponinas Yucca ou Quillaja; ou o componente pode ser um aldeído tal como aldeído cinâmico. Outros óleos que podem ser usados como um componente pesticida ou adjuvantes incluem: óleo de amêndoas, óleo de cânfora, óleo de canola, óleo de rícino, óleo de cedro, óleo de citronela, óleo de de cítricos, óleo de coco, óleo de milho, óleo de eucalipto, óleo de peixe, óleo de gerânio, lecitina, óleo de capim limão, óleo de linhaça, óleo

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 70/115

27/57 mineral, óleo de menta ou hortelã pimenta, azeite de oliva, óleo de pinho, óleo de cola, óleo de açafrão, óleos de sálvia, óleo de semente de gergelim, óleo de laranja doce, óleo de tomilho, óleo vegetal, e óleo de Wintergreen.

[00102] Outros componentes aceitáveis podem ser, por exemplo, substâncias atrativas de nematoides, tais como substâncias solúveis e gasosas produzidas pelas raízes de plantas hospedeiras ou por microorganismos da rizosfera presente. Um exemplo de um atrativo de nematoides de acordo com a presente invenção é raiz de Valeriana (Valeriana officianalis). Particularmente, soluções compreendendo extrato da raiz de Valeriana, bem como qualquer outro composto ou subproduto associado com raízes da planta Valeriana, podem ser usadas como um atrativo de acordo com as presentes composições e métodos.

[00103] Outros aditivos adequados, os quais podem estar contidos nas formulações de acordo com a invenção, incluem substâncias que são costomeiramente usadas para semelhantes preparações. Exemplo de semelhantes aditivos incluem adjuvantes, tensoativos, agentes emulsificantes, nutrientes vegetais, enchimentos, plastificantes, lubrificantes, deslizantes, colorantes, pigmentos, agentes amargantes, agentes de tamponamento, agentes de controle da solubilidade, agentes de ajuste do pH, preservantes, estabilizantes e agentes resistentes à luz ultra-violeta. Agentes endurecedores ou de endurecimento também podem ser incorporados para reforçar as formulações e as tornar fortes o suficiente para resistirem a pressão ou força em determinadas aplicações tais como comprimidos para injeção no solo, em alargamentos da raiz ou em árvore.

[00104] Em uma modalidade, a composição pode compreender adicionalmente agentes de tamponamento incluindo ácidos orgânicos e aminoácidos ou seus sais. Tampões adequados incluem citrato, glu

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 71/115

28/57 conato, tartarato, malato, acetato, lactato, oxalato, aspartato, malonato, glucoheptonate, piruvato, galactarato, glucarato, tartaronato, glutamate, glicina, lisina, glutamina, metionina, cisteína, arginina e uma mistura dos mesmos. Também podem ser usados ácidos fosfóricos e fosforosos ou seus sais. Tampões sintéticos são adequados para serem usados, mas é preferencial usar tampões naturais, tais como ácidos orgânicos e aminoácidos ou seus sais listados acima.

[00105] Em uma modalidade adicional, agentes de ajuste do pH incluem hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, carbonato ou bicarbonate de potássio, ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico ou uma mistura.

[00106] Em uma modalidade, componentes adicionais, tais como bicarbonate ou carbonato de sódio, sulfato de sódio, fosfato de sódio, bifosfato de sódio, podem ser incluídos na formulação.

[00107] Em uma modalidade, as composições podem incluir um ou mais compostos químicos com atividade nematicida. Estes incluem nematicidas antibióticos tais como abamectina; nematicidas de carbamate tais como benomil, carbofurano, carbossulfan, e cleotocard; nematicidas de carbamate de oxima tais como alanicarb, aldicarb, aldoxicarb, oxamil; nematicidas organofosforosos tais como diamidafos, fenamifos, fostietan, fosfamidon, cadusafos, clorpirifos, diclofention, dimetoato, etoprofos, fensulfotion, fostiaZato, heterofos, isamidofos, isaZofos, metomil, forato, fosfocarb, terbufos, tiodicarb, tionaZin, triaZofos, imiciafos, e mecarfon. Outros compostos com atividade nematicida incluem acetoprol, benclotiaz, cloropicrin, dazomet, DB CP, DCIP, 1,2dicloropropano, 1,3-dicloropropeno, furfural, iodometano, metam, brometo de metilo, isotiocianato de metilo, e xilenóis.

[00108] Em uma modalidade, as composições podem compreender adicionalmente uma quantidade eficaz de no mínimo um inseticida. Inseticidas adequados incluem, mas não estão limitados a, inseticidas

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 72/115

29/57 neonicotinoides não nematicidas, tais como 1-(6-cloro-3-piridilmetil)-Nnitroimidazolidin-2-ilidenoamina (imidacloprida); 3-(6-cloro-3piridilmetil)-1,3-tiazolidin-2-ilidenocianamida (tiacloprida); 1-(2-cloro1,3-tiazol-5-ilmetil)-3-metil-2-nitroguanidina (clotianidina); nitempiran; N¹-[(6-cloro-3-piridil)metil]-N²-ciano-N¹-metilacetamidina (acetamiprida); 3-(2-cloro-1,3-tiazol-5-ilmetil)-5-metil-1,3,5-oxadiazinan-4ilideno(nitro)amina (tiametoxam); e 1-metil-2-nitro-3-(tetraidro-3furilmetil)guanidina (dinotefurano).

Aplicação dos Produtos à Base de Micróbios [00109] Em ainda outro aspecto, a presente invenção inclui métodos, sistemas, e dispositivos para aplicação dos produtos à base de micróbios.

[00110] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona um método para melhorar a saúde das plantas e/ou aumentar a produção da cultura por aplicação da composição revelada aqui, neste requerimento de patente, ao solo, semente, ou partes das plantas. Em outra modalidade, a presente invenção proporciona um método para aumentar a produção da cultura ou planta compreendendo múltiplas aplicações da composição descrita aqui, neste requerimento de patente.

[00111] Vantajosamente, o método pode controlar de modo eficaz nematoides, e as doenças correspondentes causadas por pragas enquanto é obtido um aumento da produção e são evitados efeitos colaterais e custos adicionais.

[00112] Em uma modalidade, a composição pode ser aplicada a uma planta já germinada e/ou em crescimento incluindo raízes, caules, e folhas. A composição também pode ser aplicada como um tratamento de sementes. O uso como um tratamento de sementes é benéfico porque a aplicação pode ser realizada facilmente, e a quantidade usada para o tratamento pode ser reduzida, reduzindo adicional mente a potencial toxicidade, se houver.

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 73/115

30/57 [00113] Em uma modalidade, micro-organismos produtores de biotensoativos e/ou biotensoativos podem ser adicionados ao solo, ao meio de crescimento das plantas, às plantas, ao meio aquático, ou a qualquer área a ser tratada para prevenir dano por pragas. Os microorganismos podem crescer in situ e produzir os biotensoativos no local para controlar nematoides. Além disso, organismos naturais produtores de biotensoativos aplicados no sítio de aplicação vão ser capazes de crescer e produzir o biotensoativo. Consequentemente, pode ser obtida uma alta concentração de biotensoativo e micro-organismos produtores de biotensoativos o sítio de tratamento (por exemplo, no solo) de modo fácil e contínuo.

[00114] Substâncias que reforçam o crescimento de microorganismos e a produção de biotensoativos também podem ser adicionadas à composição e/ou ao sítio de tratamento para suportar o crescimento de organismos produtores de biotensoativos bem como para produzir os biotensoativos desejados no sítio para obter o objetivo da invenção. Estas substâncias incluem, mas não estão limitadas a, carbono, ou substratos orgânicos tais como óleo, glicerol, açúcar, ou outros nutrientes. Por exemplo, organismos produtores de biotensoativos podem crescer sobre o substrato para produzirem biotensoativo no local e controlar nematoides. Organismos naturais produtores de biotensoativos no sítio de aplicação (solo, sistema aquático, partes das plantas, etc.) vão produzir biotensoativos enquanto utilizando o substrato de carbono. Durante este processo, o biotensoativo produzido vai destruir ou paralisar pragas na área visada. De acordo com a invenção, não é necessário pré-inocular o sítio visado ou a mistura de substrato de carbono com organismos produtores de biotensoativos.

[00115] Substratos de carbono podem incluir, mas não estão limitados a, fontes de carbono orgânico tais como óleo natural ou sintético incluindo óleo de tritura usado; gordura; lipídeo; cera (natural ou para

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 74/115

31/57 fina); ácidos graxos tais como láurico; mirístico, etc; álcool de ácido graxo, tal como álcool laurílico; ésteres anfifílicos de ácidos graxos com glicerol, tais como monolaurato de glicerila; ésteres glicólicos de ácido graxo, tais como monoestearato de polietileno; aminas de ácido graxo, tais como lauril amina; amidas de ácido graxo; hexanos; glicerol; glicose; etc. É preferencial usar um substrato de carbono insolúvel em água para estimular a produção dos biotensoativos.

[00116] Uma modalidade envolve cravar ou alterar o substrato de carbono com uma quantidade suficiente de biotensoativo específico para iniciar o processo de emulsificação e para inibir ou reduzir o crescimento de outros organismos competitivos para o organismo produtor de biotensoativos e para controlar nematoides. Pseudomonas syringae e Bacillus subtilis, por exemplo, produzem uma série de biotensoativos de lipopeptídeos referidos como porens. Estes lipopeptídeos porens incluem pseudomicina, siringomicina, tabtoxina, faseolotoxina, e surfactina. Alguns lipopeptídeos são capazes de criar orifícios nas membranas celulares, células, e tecidos.

[00117] Pseudomicina pode ser aplicada como um tratamento préplanta para controle de nematoides na produção da cultura. Se for desejável estimular o crescimento de Bacillus subtilis, uma pequena quantidade de biotensoativo surfactina é adicionada ao meio de substrato de carbono para ajudar no estabelecimento da população de B. subtilis e na produção de mais surfactina no local.

[00118] Em uma modalidade, a composição pode ser aplicda por pulverização, derramamento, mergulho, sob a forma de líquidos concentrados ou diluídos, soluções, suspensões, pós, e semelhantes, contendo as referidas concentrações do agente ativo conforme for mais conveniente para uma finalidade em particular à mão. Podem ser aplicadas no estado em que se encontram ou reconstituídas antes do uso. Por exemplo, podem ser aplicadas por injeção direta dentro das

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 75/115

32/57 árvores ou alargamentos das raízes.

[00119] Em uma modalidade, a composição de acordo com a presente invenção pode ser aplicada a cerca de (0,0001 libra/ acre até cerca de 10 libras/ acre, cerca de 0,001 libra/ acre até cerca de 5 libras/ acre, cerca de 0,01 libra/ acre até cerca de 1 libras/ acre, cerca de 0,01 libra/ acre até cerca de 0,1 libra/ acre, ou cerca de 0,01 libra/ acre até cerca de 0,05 libra/ acre).

[00120] Em uma modalidade, a composição de acordo com a presente invenção é aplicada à planta ou cultura a partir de cerca de 1 a cerca de 100 dias, cerca de 2 a cerca de 50 dias, cerca de 10 a cerca de 40 dias, cerca de 20 a cerca de 30 dias depois da aplicação inicial ao solo ou semente.

[00121] Em modalidades específicas, as composições podem ser, por exemplo, introduzidas dentro de um sistema de irrigação, pulverizadas a partir de uma mochila ou dispositivos similares, aplicada por um dispositivo robótico baseado na terra ou transportado pelo ar, tal como um drone, e/ou aplicadas com uma semente.

[00122] A aplicação nas sementes pode ser, por exemplo, por um revestimento de sementes ou por aplicação da composição ao solo contemporaneamente com o plantio das sementes. Isto pode ser automatizado, por exemplo, proporcionando um dispositivo ou um sistema de irrigação que aplique a composição à base de micróbios junto com as sementes, e/ou adjacente às mesmas no momento de plantio das sementes, ou próximo a este. Deste modo, a composição à base de micróbios pode ser aplicada dentro de, por exemplo, 5, 4, 3, 2, ou 1 dia antes ou depois do momento dos plantios ou simultaneamente com o plantio das sementes.

[00123] Em determinadas modalidades, as composições proporcionadas aqui, neste requerimento de patente, são aplicadas à superfície do solo sem incorporação mecânica. OI efeito benéfico da aplicação

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 76/115

33/57 no solo pode ser ativado pela chuva, por borrigador, inundação, ou irrigação por gotejamento, e subsequentemente liberado para, por exemplo, pragas alvo de modo a levar seus níveis populacionais para limiares aceitáveis ou para as raízes de plantas para influenciar o microbioma das raízes ou facilitar a captação do produto microbiano dentro do sistema vascular da cultura ou planta à qual o produto microbiano é aplicado. Em um exemplo de modalidade, as composições proporcionadas aqui, neste requerimento de patente, podem ser aplicadas de maneira eficaz através de um sistema de irrigação de pivô central ou com um pulverizador sobre o sulco de sementes.

[00124] Referência aqui, neste requerimento de patente, a administração da composição sobre ou próxima a uma praga ou uma planta, ou ao meio ambiente de uma praga ou planta, significa que a administração é tal que a composição está suficientemente em contato com a praga ou planta de tal modo que é obtido o resultado desejado (por exemplo, destruição da praga, aumento da produção, prevenção de dano para a planta, regulação de genes e/ou hormônios, etc.). Isto tipicamente pode estar dentro de, por exemplo, 10, 5, 3, 2, ou 1 pés ou menos, da praga, planta, erva daninha, ou outro alvo desejado.

[00125] O produto à base de micróbios também pode ser aplicado de modo a promover a colonização das raízes e/ou rizosfera bem como do sistema vascular da planta de modo a promover a saúde e a vitalidade das plantas. Deste modo, micróbios de fixação de nutrientes tais como rhizohium e/ou mycorrhzae podem ser estimulados bem como outros micróbios endógenos (já presentes no solo), bem como exógenos, ou seus subprodutos, que combatam pragas, ou doença, ou estimulem de modo diverso o crescimento, a saúde e/ou a produção da cultura. O produto à base de micróbios também pode suportar o sistema vascular de uma planta, por exemplo, penetrando e colonizando o referido sistema vascular e metabólitos contribuintes, e nutri

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 77/115

34/57 entes importantes para a saúde e a produtividade da planta ou metabolites com propriedades de contolle de pragas.

[00126] Vantajosamente, o método nãoi requer equipamento complicado ou alto consumo de energia. Os micro-organismos de interesse podem ser cultivados em pequena escala ou em larga escala no local e utilizados, mesmo sendo ainda misturado com seus meios. De modo similar, os metabolites microbianos também podem ser produzidos em grandes quantidades no sítio de necessidade.

[00127] Vantajosamente, os produtos à base de micróbios podem ser produzidos em localizações remotas. Em uma modalidade, os produtos à base de micróbios podem ser usados para nutrição humana e/ou prevenção de doença e/ou tratamento.

Praqas-alvo [00128] Em modalidades preferenciais, porém não limitantes, da invenção, o nematoide controlado é escolhido entre:

[00129] (1) um nematoide que é um nematoide patogênico das plantas, tal como, mas não limitado a: Nematóides das Galhas (Meloidogyne spp.) no arroz (por exemplo, M. incognita, M. javanica ou M. graminicola), na soja (por exemplo, M. incognita ou M. arenaria), no algodão (por exemplo, M. incognita), ba batata (por exemplo, M. chitwoodi ou M. hapla), no tomate (por exemplo, M. chitwoodi), no tabaco (por exemplo, M. incognita, M. javanica ou M. arenaria), e no milho (por exemplo, M. incognita); Nematóides do cisto (Heterodera spp.) no arroz (por exemplo, H. oryzae), na soja (por exemplo, H. glycines) e no milho (por exemplo, H. zeae); Nematóides do cisto (Globodera spp.) na batata (por exemplo, G. pallida ou G. rostochiensis); Nematoides Reniformes (Rotylenchulus spp.) no algodão (por exemplo, R. reniformis); Nematóides de lesão radicular (Pratylenchus spp.) na banana (por exemplo, P. coffeae ou P. goodeyi); Nematóides Cavernículas (Radopholus spp.) na banana (por exemplo, R. similis); e outros nema

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 78/115

35/57 toides de dano para o arroz tais como o nematoide da raiz do arroz (Hirschmaniella spp., por exemplo, H. oryzae);

[00130] (2) um nematoide capaz de infestar seres humanos tal como, mas não limitado a: Enterobius vermicularis, o pinworm que causa enterobiase; Ascaris lumbridoides, a grande lombriga intestinal que causa ascaríase; Necator e Ancylostoma, dois tipos de ancilostomideos que causam ancilostomíase; Trichuris trichiura, o whipworm que causa tricuriase; Strongyloides stercoralis que causa estrongiloidiase; e Trichonella spirae que causa triquinose; Brugia malayi e Wuchereria bancrofti, os nematoides filariais associados com as infecções por vermes conhecidas como filaríase linfática e sua manifestação grosseira, a elefantíase, e Onchocerca volvulus que causa a cegueira dos rios (oncocercose);

[00131] (3) um nematoide capaz de infestar animais tais como, mas não limitados a: cães (Ancilostomídeos, por exemplo, Ancylostoma caninum ou Uncinaria stenocephala, Ascarídeos, por exemplo, Toxocara canis ou Toxascaris leonina, ou Whipworms, por exemplo, Trichuris vulpis), gatos (Ancilostomídeos, por exemplo, Ancylostoma tubaeforme, Ascarids, por exemplo, Toxocara cati), peixe (vermes do arenque ou vermes do bacalhau, por exemplo, Anisakid, ou tênia, por exemplo, Diphyllobothrium), carneiro (Wire worms por exemplo, Haemonchus contortus) e gado (vermes gastrointestinais, por exemplo, Ostertagia ostertagi, Cooperia oncophora);

[00132] (4) um nematoide que causa dano indesejado a substratos ou materiais, tais como nematoides que atacam os gêneros alimentícios, as smentes, madeira, tinta, plástico, vestuário, etc. Exemplos de semelhantes nematoides incluem, mas não estão limitados a: Meloidogyne spp. (por exemplo, M. incognita, M. javanica, M. arenaria, M. graminicola, M. chitwoodi ou M. hapla); Heterodera spp. (por exemplo, H. oryzae, H. glycines, H. zeae ou H. schachtii); Globodera spp. (por

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 79/115

36/57 exemplo, G. pallida ou G. rostochiensis); Ditylenchus spp. (por exemplo, D. dipsaci, D. destructor ou D. angustus); Belonolaimus spp.; Rotylenchulus spp. (por exemplo, R. reniformis); Pratylenchus spp. (por exemplo, P. coffeae, P. goodeyi ou P. zeae); Radopholus spp. (por exemplo, R. Similis); Hirschmaniella spp. (por exemplo, H. oryzae); Aphelenchoides spp. (por exemplo, A. besseyi); Criconemoides spp.; Longidorus spp.; Helicotylenchus spp.; Hoplolaimus spp.; Xiphinema spp.; Paratrichodorus spp. (por exemplo, P. minor); Tylenchorhynchus spp;

[00133] (5) nematoides transmissores de vírus (por exemplo, Longidorus macrosoma: transmite o vírus do ponto do anel necrótico do prunus, Xiphinema americanum: transmite o vírus do ponto do anel do tabaco, Paratrichadorus teres: transmite o vírus do escurecimento precoce da ervilha, ou Trichodorus similis: transmite o vírus do chocalho do tabaco).

[00134] Pragas de nematoides específicos incluem:

[00135] Dracunculus medinensis, a lombriga que causa Dracunculíase (doença do verme da Guiné); nematoides Loa loa (o verme dos olhos africano), Mansonella streptocerca e Onchocerca volvulus, os quais causam a Filaríase Cutânea; Mansonella perstans e Mansonella ozzardi, os quais causam a Filaríase das Cavidades Corporais; Trichinella, incluindo T. pseudospiralis (que infecta mamíferos e aves mundialmente), T. nativa (que infecta os ursos do Ártico), T. nelsoni (que infecta predadores e catadores africanos), e T. britovi(que infecta carnívoros da Europa e da Ásia Ocidental), os quais causam Triquinelose; Angiostrongylus cantonensis (o verme dos pulmões do rato), o qual é a causa mais comum de meningite eosinofílica humana; Angiostrongylus costaricensis, o qual causa angiostrongilíase abdominal (ou intestinal); Toxocara, o qual causa a toxocaríase humana; Gnathostoma spinigerum, e raramente G. hispidum, os quais causam Gnotostomíase; e

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 80/115

37/57

Anisakis simplex, ou Pseudoterranova decipiens, o qual causa a Anisaquiase.

[00136] Em modalidades específicas, os métodos e composições da presente invenção são usados para controlar nematoide das galhas (Meloidogyne incognita!), nematoide do ferrão (Belonolaimus longicaudatus), nematoide do cisto da soja (Heterodera glycines), nematoide de lesão (Pratylenchus sp.), nematoide punhal (Xiphinema sp.), e/ou nematoide dos cítricos (Tylenchulus semipenetrans).

Plantasalvo [00137] Plantas que podem se beneficiar da aplicação dos produtos e métodos da presente invenção incluem: Culturas de Leiras (por exemplo, Milho, Soja, Sorgo, Amendoins, Batatas, etc.), Culturas de Campo (por exemplo, Alfalfa, Trigo, Grãos, etc.), Culturas de Árvores (por exemplo, Nozes, Amêndoas, Nozes Pecan, Avelãs, Pistaches, etc.), Culturas de Cítricos (por exemplo, laranja, limão, grapefruit, etc.), Culturas de Frutos (por exemplo, maçãs, peras, etc.), Culturas de Relva, Culturas Ornamentais (por exemplo, Flores, vinhas, etc.), Legumes (por exemplo, tomates, cenouras, etc.), Culturas de Vinhas (por exemplo, Uvas, Morangos, Blueberries, Blackberries, etc.), Silvicultura (por exemplo, pinheiro, abeto, eucalipto, álamo, etc.), Pastos Manejados (qualquer mistura de plantas usadas para suporte de animais de pastoreio).

[00138] O benefício pode ser sob a forma de, por exemplo, aumento da produção, qualidade, resistência a doenças e pragas, redução de estresse (por exemplo, de sal, seca, calor, etc.) e melhor uso da água. [00139] Plantas adicionais que podem se beneficiar dos produtos e métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo leguminosas de forragem ou forrageiras, plantas ornamentais, culturas alimentares, árvores ou arbustos seleciona

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 81/115

38/57 dos entre Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Amaranthus spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens, Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por exemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina, Avena fatua var. sativa, Avena hybrida), Averrhoa carambola, Bambusa sp., Benincasa hispida, Bertholletia excelsea, Beta vulgaris, Brassica spp. (por exemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [canola, colza oleaginosa, colza de nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia, Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp., Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucurbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por exemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleifera), Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp., Eriobotrya japonica, Eucalyptus sp., Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por exemplo, Glycine max, Soja hispida ou Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por exemplo, Helianthus annuus), Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por exemplo, Hordeum vulgare), Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum, Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por exemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum, Lycopersicon pyriforme), Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa,

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 82/115

39/57

Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por exemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia), Panicum miliaceum, Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp., Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Punica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarbarum, Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Secale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por exemplo, Solanum tuberosum, Solanum integrifolium ou Solanum lycopersicum), Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por exemplo, Triticum aestivum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum ou Triticum vulgare), Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays, Zizania palustris, Ziziphus spp., entre outras.

[00140] Exemplos adicionais de plantas de interesse incluem, mas não estão limitados a, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente as espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de sementes, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milheto (por exemplo, milheto pérola (Pennisetum glaucum), panço (Panicum miliaceum), milheto rabo de raposa (Setaria italica), painço de dedo (Eleusine coracana)), girassol (Helianthus annuus), açafrão (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 83/115

40/57 (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoins (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), árvores cítricas (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), mamão papaia (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), amêndoa (Prunus amygdalus), beterrabas sacarinas (Beta vulgaris), cana de açúcar (Saccharum spp.), aveias, cevada, legumes e verduras, ornamentais, e coníferas.

[00141] Legumes e verduras incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface (por exemplo, Lactuca sativa), vagens (Phaseolus vulgaris), feijões lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.), e membros do gênero Cucumis tais como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis), e melão (C. melo). Ornamentais incluem azaleia (Rhododendron spp.), hidrângea (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipas (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbia pulcherrima), e crisântemo. Coníferas que podem ser empregadas na prática das modalidades incluem, por exemplo, pinheiros tais como loblolly pine (Pinus taeda), slash pine (Pinus elliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), lodgepole pine (Pinus contorta), e pinheiro de Monterey (Pinus radiata); abeto Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii); cicuta ocidental (Tsuga canadensis); abeto Sitka (Picea glauca); pau-brasil (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros tais como abeto de prata (Abies amabilis) e abeto de bálsamo (Abies balsamea); e cedros tais como cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro amarelo do Alasca (Chamaecyparis nootkatenPetição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 84/115

41/57 sis). Plantas das modalidades incluem plantas de cultura (por exemplo, milho, alfalfa, girassol, Brassica, soja, algodão, açafrão, amendoim, sorgo, trigo, milheto, tabaco, etc.), tais como plantas de milho e de soja.

[00142] Relvados incluem, mas não estão limitados a: bluegrass anual (Poa annua); azevém anual (Lolium multiflorum); bluegrass do Canadá (Poa compressa); festuca de mastigar (Festuca rubra); bentgrass colonial (Agrostis tenuis); bentgrass rastejante (Agrostis palustris); wheatgrass com crista (Agropyron desertorum); wheatgrass fairway (Agropyron cristatum); festuca dura (Festuca longifolia); bluegrass Kentucky (Poa pratensis); orchardgrass (Dactylis glomerate); azevém perene (Lolium perenne); festuca vermelha (Festuca rubra); redtop (Agrostis alba); bluegrass áspero (Poa trivialis); festuca de ovelhas (Festuca ovine); smooth bromegrass (Bromus inermis); festuca alta (Festuca arundinacea); erva dos prados (Phleum pretense); bentgrass de veludo (Agrostis canine); weeping alkaligrass (Puccinellia distans); western wheatgrass (Agropyron smithii); grama Bermuda (Cynodon spp.); grama de Santo Agostinho (Stenotaphrum secundatum); grama zoysia (Zoysia spp.); grama Bahia (Paspalum notatum); grama tapete (Axonopus affinis); grama centopeia (Eremochloa ophiuroides); grama kikuyu (Pennisetum clandesinum); seashore paspalum (Paspalum vaginatum); blue grama (Bouteloua gracilis); grama de búfalo (Buchloe dactyloids); sideoats grama (Bouteloua curtipendula).

[00143] Plantas de interesse adicionais incluem Cannabis (por exemplo, sativa, indica, e ruderalis) e cânhamo industrial.

[00144] Plantas de interesse incluem plantas de grãos que proporcionam sementes de interesse, plantas oleaginosas, e plantas leguminosas. Sementes de interesse incluem sementes de grãos, tais como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, milheto, etc. Plantas oleaginosas incluem algodão, soja, açafrão, girassol, Brassica, milho, alfalfa,

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 85/115

42/57 palma, coco, linho, mamona, oliva, etc. Plantas leguminosas incluem feijões e ervilhas. Feijões incluem guar, feijão de alfarroba, feno grego, soja, feijões de jardim, feijão de corda, mungbean, feijão lima, feijão fava, lentilhas, grão de bico, etc.

[00145] Todas as plantas e partes das plantas podem ser tratadas de acordo com a invenção. Neste contexto, plantas são entendidas como significando todas as plantas e populações de plantas, tais como plantas selvagens desejadas ou indesejadas ou plantas de cultivo (incluindo plantas de cultivo que ocorrem natural mente). Plantas de cultivo podem ser plantas que podem ser obtidas por métodos de reprodução e otimização tradicionais ou por métodos biotecnológicos e recombinantes, ou combinações destes métodos, incluindo as plantas transgênicas e as variedades de plantas.

[00146] Partes das plantas são entendidas como significando todas as partes e órgãos das plantas aéreas e subterrâneas tais como rebento, folha, flor e raiz, cujos exemplos podem ser mencionados sendo folhas, agulhas, talos, caules, flores, corpos frutíferos, frutos e sementes, mas também raízes, tubérculos e rizomas. As partes das plantas também incluem material de cultura e material de propagação vegetativa e generativa, por exemplo, cortes, tubérculos, rizomas, enxertos e sementes.

EXEMPLOS [00147] Deve ser entendido que os exemplos e as modalidades descritos aqui, neste requerimento de patente, são para fins ilustrativos somente e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas aos peritos na arte e devem ser incluídas dentro do espírito e do âmbio deste requerimento.

EXEMPLO 1 - FERMENTAÇÃO DE S. BOMBICOLA PARA PRODUÇÃO DE SOFOROLIPÍDEOS (SLP) EM UM REATOR distribuível DE 110 L

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 86/115

43/57 [00148] É utilizado um reator portátil, do tipo de transporte aéreo, totalmente fechado operado por PLC com filtragem de água, unidade de controle da temperatura, e um ventilador de ar a bordo. O reator tem um volume de trabalho de 90 L quando se cultiva Starmerella bombicola para produção de SLP.

[00149] Em modalidades preferenciais, os nutrientes para produção de SLP são glicose, ureia, extrato de levedura, óleo de canola, sulfato de magnésio, e fosfato de potássio.

[00150] O reator é inoculado com 8 litros de líquido de cultura cultivada em frascos. A duração do ciclo de cultivo para produção de SLP é de 7 a 8 dias, a 25°C e pH 3,5, com amostragem realizada duas vezes ao dia.

[00151] A concentração final de SLP é a grosso modo 10% do volume de trabalho, neste caso cerca de 9 L de produto, contendo 300 a 400 gramas de SLP por litro.

EXEMPLO 2 - FERMENTAÇÃO DE S. BOMBICOLA PARA PRODUÇÃO DE SLP EM REATOR DISTRIBUÍVEL PORTÁTIL DE 14 L [00152] Este reator é um vaso de vidro encamisado autoclavável com spurge de ar e impulsor. É equipado com oxigênio dissolvido, pH, temperatura, e sonda de espuma; tem uma estação de controle integrada com uma interface de tela sensível ao toque colorida, bombas embutidas, controladores do fluxo de gás, e controladores do pH / da espuma DO / do nível. O volume de trabalho do reator é de 10 litros. [00153] O meio nutriente contém glicose, extrato de levedura, ureia, e óleo vegetal. O inóculo pode ser uma cultura de 1 a 2 dias de idade de Starmerella bombicola a cerca de 5 a 10% do volume da cultura total. A duração do cultivo e a compilação de produto vulgar continua por 5 a 14 dias. A produção de soforolipídeo final pode atingir 1 a 2 quilogramas por ciclo.

EXEMPLO 3 - FERMENTAÇÃO DE LEVEDURA WICKERHAMOPetição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 87/115

44/57

MYCES E/OU PICHIA PARA PRODUÇÃO DE SLP EM UM REATOR DISTRIBUÍVEL [00154] É utilizado um reator de transporte aéreo móvel operado por PLC com filtragem de água, unidade de controle da temperatura, e um ventilador de ar para aeração suficiente. O processo pode ser realizado como um processo de cultivo de lotes. O reator tem um volume de trabalho de 400 L quando se cultiva Wickerhamomyces ou Pichia para produção de SLP.

[00155] Em modalidades preferenciais, os nutrientes para produção de SLP são glicose, ureia, extrato de levedura, óleo de canola, sulfato de magnésio, e fosfato de potássio.

[00156] A inoculação deste reator requer até 5% de cultura de semente líquida de volume de trabalho. A duração do ciclo de cultivo é de 7 dias, em uma temperatura de 25°C e pH 3,5, com amostragem realizada duas vezes ao dia.

[00157] A concentração final de SLP é a grosso modo de 20 a 25% do volume de trabalho, neste caso forma mais de 90 L de produto.

EXEMPLO 4 - FERMENTAÇÃO DE LEVEDURA WICKERHAMOMYCES E/OU PICHIA PARA PRODUÇÃO DE CÉLULAS E DE PROTEÍNAS DE CÉLULA ÚNICA EM REATOR DISTRIBUÍVEL DE 900 L [00158] É utilizado um reator portátil dividido em dois tanques operado por um transporte aéreo central para ajudar a misturar os dois tanques simultaneamente. O reator tem um volume de trabalho de 600 L ao se cultivar Wickerhamomyces e/ou Pichia para produção de células.

[00159] Em uma modalidade preferencial, os nutrientes para produção de células são glicose ou açúcar de confeiteiro, ureia, extrato de levedura, sulfato de magnésio, e fosfato de potássio.

[00160] O reator é inoculado com 2% de cultura de semente. A fermentação continua por 48 a 72 horas sem estabilização do pH, e em

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 88/115

45/57 uma temperatura de 26 a 32°C.

[00161] A concentração final de células será 100 g de peso a úmido por litro. A concentração de biomassa a úmido pode atingir 90 quilos por ciclo com concentração de proteína até 45 quilos.

EXEMPLO 5 - FERMENTAÇÃO DE LEVEDURA WICKERHAMOMYCES E/OU PICHIA PARA PRODUÇÃO DE CÉLULAS E DE PROTEÍNAS DE CÉLULA ÚNICA EM REATOR DISTRIBUÍVEL DE 2000 L [00162] É utilizado um reator portátil dividido em dois tanques quadrados acompanhados com 2 alças para permuta de massa entre os mesmos. O reator tem um volume de trabalho de 2000 L quando se cultiva Wickerhamomyces e/ou Pichia para produção de células.

[00163] Em uma modalidade preferencial, os nutrientes para produção de células são glicose ou açúcar de confeiteiro, ureia, extrato de levedura, sulfato de magnésio, e fosfato de potássio.

[00164] O reator é inoculado com 2% de cultura de semente. A fermentação continua por 48 a 72 horas sem estabilização do pH, e em uma temperatura de 26 a 32°C.

[00165] A concentração final de células será 100 g de peso a úmido por litro. A concentração de biomassa a úmido pode atingir até 200 quilos por ciclo com concentração de proteína até 100 quilos.

EXEMPLO 6 - FERMENTAÇÃO DE PSEUDOZYMA APHIDIS PARA PRODUÇÃO DO LIPÍDEO MANOSILERITRITOL (MEL) EM REATOR DISTRIBUÍVEL PORTÁTIL DE 14 L [00166] Este é um vaso de vidro encamisado autoclavável a vapor com spurge de ar e impulsor Rushton. É equipado com DO, pH, temperatura, e sonda de espuma. Tem uma estação de controle integrada com uma interface de tela sensível ao toque colorida, bombas embutidas, controladores do fluxo de gás, e controladores do pH / da espuma DO / do nível. O volume de trabalho do reator é de 10 litros, de tela sensível ao toque colorida, bombas embutidas, controladores do fluxo

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 89/115

46/57 de gás, e controladores do pH I da espuma [00167] Composição do meio nutriente: Nitrato de sódio, Fosfato de potássio, Sulfato de magnésio, Extrato de levedura, e óleo vegetal. O inóculo pode ser uma cultura de 1 a 2 dias de idade de Pseudozyma aphidis, a cerca de 5 a 10% do volume da cultura total. Duração do cultivo e compilação de amostras: 9 a 15 dias. Produção de MEL final: 800 a 1000 gramas.

EXEMPLO 7 - USO DE SLP PARA REDUZIR OVOS DE NEMATOIDES DAS GALHAS SOBRE PLANTAS DE TOMATE [00168] Starmerella bombicola foi cultivado conforme descrito acima. Ao final da cultura de fermentação, o caldo assenta e a maior parte do SLP separa como uma camada marrom-escuro (concentração de cerca de 500 gm/L). Esta camada marrom contém essencialmente SLP e algumas células também. A camada é coletada e o pH é ajustado para pH 7,0. Em seguida a solução é diluída com água de modo a obter as concentrações desejadas.

[00169] Dia 1 Germinar sementes de tomate (Moneymaker) [00170] Dia 14 Preparar areia / turface (1:1) com 1% de fertilizante (osmocote), transplantar mudas de tomate de 2 semanas [00171] Dia 28 Inocular micróbios por encharcamento do solo a plantas de 4 semanas de idade. Para cada ponte de 10 cm x10 cm quadrado, 80 a 100 ml de cultura foi suficiente para umedecer o solo.

[00172] Dia 32 Quatro dias depois, após a inoculação de micróbios, aplicar ovos de RKN (4000 ovos por pote) a cada planta.

[00173] Dia 76 Seis semanas depois da inoculação de ovos, colher as plantas.

[00174] Depois da colheita, as plantas foram lavadas sob água corrente para remover a areia / turface anexada sobre as raízes. O peso fresco das raízes foi registrado. Em seguida, as raízes foram cortadas em pequenos pedaços e postas dentro de um pequeno saco plástico

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 90/115

A7I57 de lanche. Depois de ser adicionado 200 ml de alvejante a 5%, o saco foi incubado e sacudido delicadamente por 15 min. Em seguida, os ovos foram contados em amostras de 10 ul em triplicata sob Stereo Microscope. Foi calculado o número total de ovos sobre cada raiz. Finalmente, foi calculado o número de ovos em cada grama de biomassa de raiz.

[00175] SLP a 0,25% também mostra atividade contra Nematoide das Galhas (RNK) com uma redução de ovos por cerca de 52%.

EXEMPLO 8 - COMPARAÇÃO DE SLP, MEL, E NIMITZ® NA CAPACIDADE PARA CONTROLAR NEMATOIDES DE GALHAS, DE FERRÃO E DE LESÃO [00176] Nimitz® é o primeiro novo nematicida químico a ser desenvolvido em mais de 20 anos. Nimitz® provoca atividade nematicida rápida e irreversível imediatamente depois de uma aplicação. Dentro de uma hora de contato, os nematoides param de se alimentar e rapidamente se tornam paralisados. Dentro de 24 a 48 horas, ocorre mortalidade da praga ao invés de temporária atividade nematostática (imobilizante), conforme visto com os nematicidas de organofosfato e de carbamato.

[00177] Pseudozyma aphidis foi cultivado conforme descrito acima. Ao final da fermentação, todo o caldo de cultura foi usado, já que MEL é muito duro de separar sem usar qualquer solvente. Em seguida MEL é diluído com água até as concentrações desejadas imediatamente antes da aplicação.

[00178] Starmerella bombicola foi cultivado conforme descrito acima. Ao final da cultura de fermentação, o caldo assenta e a maior parte do SLP separa como uma camada marrom escuro (concentração de cerca de 500 gm/L). Esta camada marrom contém essencialmente SLP e algumas células também. A camada é coletada e o pH é ajustado para pH 7,0. Em seguida a solução é diluída com água de modo a

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 91/115

48/57 obter as concentrações desejadas.

[00179] Foi conduzido o seguinte bioensaio: Preencher lâminas de cavidade de vidro com quantidades apropriadas de produto de teste. Adicionar uma população conhecida de nematoides jovens alvo à solução contendo nematicida. Manter as lâminas de cavidade em temperatura ambiente. A mortalidade dos nematoides pode ser avaliada contando o número de nematoides em 24, 48 e 72 horas. A percentagem de mortalidade foi calculada como: [média do número de jovens mortos em tratamento / número total de jovens em tratamento] x 100.

A. Nematoide das Galhas [00180] A mortalidade (isto é, quantos dos nematoides foram mortos) e a falta de motilidade (isto é, quantos dos nematoides estavam mortal mente doentes) dos nematoides das galhas (Meloidogyne incognita) foram determinadas depois de 3 dias de tratamento de SLP (SD10) ou MEL (SD12) em várias concentrações e comparadas com o tratamento de Nimitz® e controle não tratado (FIGURAS 1 e 2). A percentagem de mortalidade foi calculada pelo número de nematoides mortos / o número de contagens totais de nematoides antes do teste. A percentagem de nematoides não móveis foi calculada pelo número de nematoides não móveis / o número de nematoides vivos. Portanto, a motilidade é calculada como a percentagem dos nematoides que não estavam mortos mas são determinados como estando não móveis.

[00181] O alto nível de MELs (0,1% em vol / vol) foi o tratamento mais eficaz no teste. Foi significativamente mais eficaz do que Nimitz® com relação à mortalidade. Foi observada uma nítida dose resposta. Os resultados também mostram que SLP foi tão eficaz quanto Nimitz® sobre a mortalidade e a falta de motilidade dos nematoides das galhas.

B· Nematoide do Ferrão

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 92/115

49/57 [00182] As taxas de mortalidade e de redução da motilidade de nematoide do ferrão (Belonolaimus longicaudatus) foram determinadas depois de 3 dias de tratamento de SLP ou MEL em várias concentrações e comparadas com o tratamento de Nimitz® e controle não tratado (FIGURAS 1 e 2).

[00183] Os resultados mostram que tanto SLP quanto MEL aumentam a mortalidade e a taxa de redução da motilidade dos nematoides do ferrão em uma maneira dependente da dose. Os altos níveis de MEL (0,1% ou 0,2% em vol / vol) foram o tratamento mais eficaz no teste. Foram tão eficazes quanto Nimitz® com relação à mortalidade e mais eficazes do que Nimitz® com relação à taxa de redução da motilidade.

C· Nematoide de Lesão [00184] As taxas de mortalidade e de redução da motilidade de nematoides de lesão (Pratylenchus sp.) foram determinadas depois de 3 dias de tratamento de SLP ou MEL em várias concentrações e comparadas com o tratamento de Nimitz® e controle não tratado (FIGURAS 1 e2).

[00185] Os resultados mostram que tanto SLP quanto MEL aumentam a mortalidade e a taxa de redução da motilidade de nematoides de lesão em uma maneira dependente da dose. MEL foi mais eficaz do que SLP e comparável a Nimitz® no teste.

EXEMPLO 9 - AVALIAÇÃO DE TRATAMENTOS VARIÁVEIS CONTRA NEMATOIDES DAS GALHAS DO SUL EM TESTES DE FRASCO DE LABORATÓRIO DE PATOLOGIA [00186] O tratamento com SLP (SD10) e o tratamento com MEL (SD12) aplicados diretamente ao solo infectado com nematoides foram testados em duas taxas, isolados ou juntos, e comparados com Nimitz® e controle não tratado para diminuição de populações de Nematoides das Galhas do Sul vivos. As contagens foram feitas em três

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 93/115

50/57 pontos do tempo diferentes depois do tratamento.

[00187] Seis replicatas de 7 tratamentos foram conduzidas em frascos de vidro contendo 350 cm³ de solo arenoso a 99%. Os frascos foram inoculados com 70 Nematoides das Galhas do Sul adultos (Meloidogyne incognita). Uma aplicação de tratamento foi feita logo depois da inoculação de nematoides, onde 85 mL do tratamento foi vertido manual mente dentro de cada frasco. As misturas do tratamento foram preparadas de acordo com a Tabela 1 (abaixo). Foram feitas contagens de nematoides vivos e mortos no dia 3, no dia 14, e no dia 23 pós-tratamento. Também foram tabuladas as contagens de nematoides não móveis, como uma percentagem dos nematoides vivos totais. Tabela 1. Preparação de Misturas de Tratamento

Trat. No.	Tratamento Nome	Forma Tipo	Taxa	Taxa Unidade	Quantidade de Produto A Medir/
1	SD10	L	0,25	% em vol / vol	2,5 ml/ mistura
2	SD10	L	0,5	% em vol / vol	4,999 ml/ mistura
3	SD12	L	0,1	% em vol / vol	0,9999 ml/ mistura
4	SD12	L	0,2	% em vol / vol	2,0 ml/ mistura
5	SD10 + SD12	L L	0,25 0,1	% em vol / vol % em vol / vol	2,5 ml/ mistura 0,9999 ml/ mistura
6	Nimitz®	L	10	ppm pr	9,999 ul/ mistura
7	Verificação não tratada

Reps: 6; Volume de pulverização: 85 mL/item; Parcelas; 4 x 20 pés.; Tamanho da mistura: 1 L (0 L tamanho da mistura calculado).

Resultados [00188] Os resultados do teste de frasco para os produtos SD10 e SD12 sugere uma dose resposta positiva para atividade contra Nematoides das Galhas do Sul. SD10 e SD12 aplicados juntos em uma baixa taxa não foram tão eficazes quanto um ou outro produto isolado em uma taxa maior. Nimitz® proporcionou controle superior.

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 94/115

51/57 [00189] A FIG. 3 e a Tabela 2 (abaixo) mostram contagens de nematoides vivos para cada tratamento. A FIG. 4 e a Tabela 3 (abaixo) mostram o controle de nematoides vivos (isto é, taxa de morte de nematoides) para cada tratamento.

Tabela 2. Contagem de Nematoides Vivos

Trat. No.	Tratamento Nome	Taxa	Taxa Unidade	Apl. Código	PréContagem	3 DA-A	14 DA-A	23 DA-A
1	SD10	0,25	% em vol / vol	A	77,00	a	52,00	a	38,17	a	13,50	ab
2	SD10	0,5	% em vol I vol	A	77,00	a	47,67	a	36,67	a	11,50	b
3	SD12	0,1	% em vol I vol	A	77,00	a	46,33	a	36,00	a	11,83	b
4	SD12	0,2	% em vol 1 vol	A	77,00	a	48,50	a	33,33	a	8,17	c
5	SD10 + SD12	0,25 0,1	% em vol 1 vol % em vol 1 vol	A A	77,00	a	46,00	a	36,50	a	11,83	b
6	Nimitz®	10	ppm pr	A	77,00	a	16,00	b	4,17	b	1,67	d
7	Verificação não tratada				77,00	a	50,50	a	39,83	a	15,33	a

[00190] Houve significativamente maior controle registrado como precoce como dia 3 (3 DA-A) nos frascos tratados com Nimitz® (10 ppm). Tanto para SD10 quanto para SD12, houve importantes doses respostas observadas para cada um a 23 DA-A, com as amostras tratadas com maiores taxas tendo menores contagens de nematoides do que as amostras com taxas menores. Quando tanto SD10 quanto SD12 foram aplicados na baixa taxa em combinação, a mortalidade de nematoides não foi significativamente reforçada até níveis vistos em tratamentos com maiores taxas.

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 95/115

52/57

Tabela 3· Controle de nematoides vivos (%)

Trat. No.	Tratamento Nome	Taxa	Taxa Unidade	Apl. Código	3 DA-A	14 DA-A	23 DA-A
1	SD10	0,25	% em vol / vol	A	1,84	be	9,09%	be	15,56	cd
2	SD10	0,5	% em vol / vol	A	8,29	be	8,03%	be	25,72	c
3	SD12	0,1	% em vol / vol	A	8,84	be	9,24%	be	22,18	c
4	SD12	0,2	% em vol / vol	A	9,39	b	18,64%	b	44,88	b
5	SD10 + SD12	0,25 0,1	% em vol / vol % em vol / vol	A A	10,88	b	11,40%	be	20,90	c
6	Nimitz®	10	ppm pr	A	68,24	a	89,94%	a	89,77	a
7	Verificação não tratada				0,00	c	0,00%	c	0,00	d

[00191] A FIG. 5 e a Tabela 4 (abaixo) mostram as contagens de nematoides não móveis. A FIG. 6 e Tabela 5 (abaixo) mostram a contagem de nematoides vivos não móveis (%).

Tabela 4. Contagem de Nematoides Não Móveis

Trat. No.	Tratamento Nome	Taxa	Taxa Unidade	Apl. Código	3 DA-A	14 DA-A	23 DA-A
1	SD10	0,25	% em vol / vol	A	3,33	c	4,67	be	2,50	ab
2	SD10	0,5	% em vol / vol	A	5,17	be	4,67	be	3,17	a
3	SD12	0,1	% em vol / vol	A	7,33	b	4,67	be	1,50	be
4	SD12	0,2	% em vol / vol	A	11,83	a	6,67	a	2,00	abc
5	SD10 +	0,25	% em vol / vol	A	10,00	a	6,33	ab	3,17	a

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 96/115

53/57

Trat. No.	Tratamento Nome	Taxa	Taxa Unidade	Apl. Código	3 DA-A	14 DA-A	23 DA-A
	SD12	0,1	% em vol / vol	A
6	Nimitz®	10	ppm pr	A	4,67	c	2,50	d	0,67	c
7	Verificação não tratada				2,83	c	3,33	cd	1,83	abc

[00192] As contagens de nematoides não móveis foram menores nas amostras tratadas com Nimitz®. Em 3 DA-A houve uma maior percentagem de nematoides não móveis em taxas de ou aumento de SD10 ou SD12, sugerindo que a atividade precoce dos pesticidas não resultou em fatalidade imediata. Por volta de 14 DA-A a percentagem de nematoides vivos classificados não móveis não foi diferente estatisticamente, entre os frascos tratados com SD.

Tabela 5· Contagem de Nematoides Vivos Não Móveis (%)

Trat. No.	Tratamento Nome	Taxa	Taxa Unidade	Apl. Código	3 DA-A	14 DA-A	23 DA-A
1	SD10	0,25	% em vol / vol	A	6,39	e	12,86	b	18,80	a
2	SD10	0,5	% em vol I vol	A	11,18	de	12,55	b	28,61	a
3	SD12	0,1	% em vol 1 vol	A	15,78	cd	13,51	b	13,16	a
4	SD12	0,2	% em vol 1 vol	A	25,03	ab	20,85	b	22,59	a
5	SD10 + SD12	0,25 0,1	% em vol 1 vol % em vol 1 vol	A A	22,00	be	17,89	b	27,85	a
6	Nimitz®	10	ppm pr	A	30,55	a	43,06	a	36,67	a
7	Verificação não tratada				5,91	e	8,54	b	13,01	a

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 97/115

54/57

EXEMPLO 10 - USO DE MEL COMO UM NEMATICIDA EM Um SISTEMA DE MICRO-PARCELA DE PLANTAS DE PEPINO [00193] Uma microparcela externa localizada em Thonotosassa, Florida, EUA, foi usada para estudar o tratamento de nematoides com MEL para plantas de pepino comparado com Nimitz® e um controle não tratado. Foram estudados seis grupos de tratamento diferentes, cada um consistindo em 8 plantas. Para os grupos recebendo tratamento com SD12 (0,2% ai/v), o tratamento foi aplicado ao solo uma vez, duas vezes ou três vezes. Tanto a contagem de nematoides quanto a taxa de formação de galhas foram coletadas na colheita. Também forammedidos o vigor da planta, a produção e o peso das plantas.

[00194] Plantas recebendo tratamento com Nimitz® (5 pt/a) foram plantadas em solo tratado 7 dias antes do plantio (o tratamento químico é fitotóxico demais para ser aplicado na estação de crescimento). Para todas as plantas recebendo tratamento com SD12, a primeira aplicação de SD12 ao solo (60 mL para cada planta) ocorreu por ocasião do plantio. Para plantas recebendo duplo tratamento e triplo tratamento com SD12, a seguna aplicação de 60 mL ocorreu duas semanas depois do primeiro tratamento. Para plantas recebendo triplo tratamento com SD12, a terceira aplicação de 60 mL ocorreu quatro semanas depois do primeiro tratamento.

[00195] As contagens de nematoides e as taxas de formação de galhas foram coletadas para todos os grupos 31 dias depois do tratamento final com SD12 no grupo de triplo tratamento. O vigor (índice / escala de 0 a 10), a produção (em libras) e o peso (em libras) das plantas foram medidos no dia seguinte.

Resultados [00196] A taxa de resposta foi observada em formação de galhas (FIG. 7 e Tabela 6 (abaixo)) e em contagens de nematoides pós

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 98/115

55/57 tratamento (FIG. 8 e Tabela 7 (abaixo)). SD12 teve performance de padrões comerciais. Não houve nenhuma separação significativa entre os tratamentos com SD12 e o tratamento com Nimitz®, porém foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos com SD12 e a verificação não tratada. O vigor, a produção e o peso das plantas na colheita são reportados na Tabela 8 abaixo.

Tabela 6· Taxa de Formação de Galhas (índice / escala de 1 a 10)

Trat. No.	Tratamento Nome	Taxa	Taxa Unidade	Apl. Código	Taxa de Galhas
1	Não tratada				2,9	a
2	Nimitz®	5	pt/a	A	1,1	b
3	SD12x 1	0,2	% ai/v	B	1,1	b
4	SD12x2	0,2	% ai/v	BC	0,7	b
5	SD12x3	0,2	% ai/v	BCD	0,3	b
LSD (P=0,05) = 0,88; S	D = 0,86; CV = 69,39; X2 de Bartlett = 11,754;

P (X2 de Bartlett) = 0,019*; Replicata F = 3,712; Replicata Prob(F) =

0,0061; Tratamento F = 11,133; Tratamento Prob(F) = 0,0001.

Tabela 7. Contagem de nematóides

Trat. No.	Tratamento Nome	Taxa	Taxa Unidade	Apl. Código	Contagem de nematóides
1	Não tratada				59	a
2	Nimitz®	5	pt/a	A	27	b
3	SD12x 1	0,2	% ai/v	B	20	b
4	SD12x2	0,2	% ai/v	BC	18	b
5	SD12x3	0,2	% ai/v	BCD	9	b

LSD (P=0,05) = 17,33; SD = 16,3; CV = 63,88; X2 de Bartlett = 17,263; P (X2 de Bartlett) = 0,002*; Replicata F = 2,774; Replicata Prob(F) = 0,0261; Tratamento F = 10,44; Tratamento Prob(F) = 0,0001.

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 99/115

56/57

Tabela 8· Medições do vigor (0 a 10), da produção (em libras) e do peso (em libras) das plantas na colheita das plantas.

Trat. No.	Tratamento Nome	Taxa	Taxa Unidade	Apl. Código	Vigor	Produção	Peso
1	Não tratada				6,2	b	2,188	a	1,131	a
2	Nimitz®	5	pt/a	A	8,0	a	3,063	a	1,550	a
3	SD12x 1	0.2	% ai/v	B	8,1	a	2,438	a	1,288	a
4	SD12x2	0.2	% ai/v	BC	8,4	a	2,638	a	1,263	a
5	SD12x3	0.2	% ai/v	BCD	8,2	a	3,281	a	1,425	a

EXEMPLO 11 - AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA DO ATRATIVO DE NEMATOIDES [00197] As contagens e as percentagens de infestação de Nematoides das Galhas do Sul foram realizadas em quatro câmaras seladas de 11,6 polegadas x 7,6 polegadas contendo solo de areia fina do lago cravado com um material atrativo. Extrato da raiz de Valeriana adquirido pré-fabricado, foi misturado com água, glicerina vegetal e álcool de cereais a 20% para produzir o atrativo.

[00198] Cada parcela foi inoculada com nematóides em uma zona de 2 cm de diâmetro. 10 mL do atrativo de nematóides foi adicionado em uma zona de 3 cm (altura) x 1 cm (largura), a 2 cm da zona de inoculação (FIG. 9).

[00199] As contagens de nematóides e as percentagens de infestação foram realizadas em três localizações, 3 dias depois do tratamento e 8 dias depois do tratamento. As três localizações testadas incluíram o centro da zona de inoculação, a zona de atração, e a área não tratada.

Resultados [00200] Os resultados estão resumidos na FIG. 10 e na Tabela 9 (abaixo). As migrações para o atrativo ou para a área não tratada foram significativamente diferentes em relação à área de inoculação co

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 100/115

57/57 mo uma percentagem da população total. Em eventos de amostragem de 24 e 48 horas, houve mais nematoides contados na zona de atração do que nas áreas não tratadas da câmara por mais de 14%; no entanto, a zona central onde os nematoides foram inoculados detinha o maior número de nematoides.

Tabela 9· Contagem de Nematoides e Percentagem de Infestação na

Avaliação de Atrativos

	Contagem	% de Infestação
Trat. No.	Tratamento Zona	Taxa	Taxa Unidade	3 DA-A	8 DA-A	3 DA-A	8 DA-A
1	Centro			63,50	a	22,50	a	62,17	a	76,52	a
2	Tratado - Atrativo	10	mL/item	27,50	b	6,00	b	28,67	b	18,66	b
3	Não tratado			8,75	b	1,75	b	9,16	c	4,82	c

[00201] Todas as patentes, requerimentos de patente, requerimentos provisórios, e publicações referidos ou citados aqui, neste requerimento de patente, são incorporados por meio de referência em sua totalidade, incluindo todas as figuras e tabelas, na medida que não sejam inconsistentes com os explícitos ensinamentos deste relatório.

[00202] A descrição aqui, neste requerimento de patente, de qualquer aspecto ou modalidade da invenção usando termos tais como compreendendo, tendo, incluindo ou contendo com referência a um elemento ou elementos se destina a proporcionar suporte para um aspecto ou modalidade similar da invenção que consiste em, consiste essencialmente em, ou compreende substancialmente aquele elemento ou elementos em particular, a menos que declarado de modo diverso ou claramente negado pelo contexto.

Claims

1. Método para o controle de nematoides caracterizado pelo fato de que o referido método compreende a preparação de uma composição nematicida à base de micróbios por cultivo de um microorganismo sob condições tais que o micro-organismo produz um biotensoativo, em que a referida composição nematicida compreende o micro-organismo e/ou caldo no qual o micro-organismo é cultivado, e em que o referido método adicionalmente compreende a aplicação da composição nematicida a nematoides e/ou a seu meio ambiente.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o biotensoativo é um glicolipídeo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o glicolipídeo é um soforolipídeo (SLP).

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o glicolipídeo é um lipídeo manosileritritol (MEL).

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é um fungo selecionado entre Starmerella, Pichia e Pseudozyma.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o fungo é Starmerella bombicola.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o fungo é Pseudozyma aphidis.

8. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o fungo é Pichia anômala (Wickerhamomyces anomalus).

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o caldo compreende o referido biotensoativo.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o método adicional mente compreende o tratamento do caldo de modo a separar o biotensoativo da massa celular, seguido

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 102/115

2/3 pela aplicação do biotensoativo a nematoides e/ou seu meio ambiente.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o caldo é aplicado aos nematoides, e/ou a seu meio ambiente, sem primeiro separar o biotensoativo da massa celular.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser usado para controlar um nematoide selecionado entre nematoide das galhas (Meloidogyne incognita!), nematoide do ferrão (Belonolaimus longicaudatus), nematoide do cisto da soja (Heterodera glycines), nematoide de lesão (Pratylenchus sp.), nematoide punhal (Xiphinema sp.), e nematoide dos cítricos (Tylenchulus semipenetrans).

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido método é usado para controlar pragas de nematoides de plantas.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as plantas são selecionadas entre tomates, sojas, milho, cítricos e relvados.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada como um tratamento de sementes.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada ao solo.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método adicionalmente compreende a aplicação de um atrativo de nematoides.

18. Composição para o controle de nematoides, caracterizada pelo fato de que a referida composição compreende um biotensoativo e um micro-organismo que produz o referido biotensoativo.

19. Composição de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o biotensoativo é um glicolipídeo.

Petição 870190045657, de 15/05/2019, pág. 103/115

3/3

20. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o glicolipídeo é um SLP.

21. Composição, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o glicolipídeo é um MEL.

22. Composição, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende uma substância atrativa de nematoides.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a substância atrativa de nematoides compreende extrato da raiz de Valeriana.

24. Método para o controle de nematoides, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende a aplicação aos nematoides, e/ou ao meio ambiente dos nematoides, de um lipídeo manosileritritol (MEL).

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende a aplicação de um SLP aos nematoides.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende uma substância atrativa de nematoides.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de ser usado para controlar um nematoide selecionado entre nematoide das galhas (Meloidogyne incognita!), nematoide do ferrão (Belonolaimus longicaudatus), nematoide do cisto da soja (Heterodera glycines), nematoide de lesão (Pratylenchus sp.), nematoide punhal (Xiphinema sp.), e nematoide dos cítricos (Tylenchulus semipenetrans).