BR112018074330B1 - Processo para preparar um composto oligomérico e compostos oligômeros morfolino fosforodiamidato - Google Patents

Processo para preparar um composto oligomérico e compostos oligômeros morfolino fosforodiamidato Download PDF

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Abstract

São fornecidos aqui processos para a preparação de um oligômero (por exemplo, um oligômero morfolino). Os processos sintéticos aqui descritos podem ser vantajosos para aumentar a síntese de oligômero enquanto se mantém o rendimento global e a pureza de um oligômero sintetizado.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS
[001]Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisória No. de série US 62/508.256, depositado em 18 de maio de 2017, pedido de patente provisório No. de série US 62/341.049, depositado em 24 de maio de 2016, pedido de patente provisória No. de série US 62/340.953, depositado em 24 de maio de 2016, pedido de patente provisória No. de série US 62/357.134, depositado em 30 de junho de 2016, e pedido de patente provisória No. de série US 62/357.153, depositado em 30 de junho de 2016. Todos os conteúdos dos pedidos de patente provisória citados acima são aqui incorporados por referência.
ANTECEDENTES
[002]A tecnologia anti-sentido proporciona um meio para modular a expressão de um ou mais produtos gênicos específicos, incluindo produtos de processamento alternativos, e é especialmente útil em diversas aplicações terapêuticas, diagnósticas e de pesquisa. O princípio subjacente à tecnologia anti-sentido é que um composto anti-sentido, por exemplo, um oligonucleotídeo, que hibridiza com um ácido nucleico alvo, modula atividades de expressão gênica, tais como transcrição, splicing ou tradução através de qualquer um de um número de mecanismos anti-sentido. A especificidade de sequência de compostos anti-sentido os torna atrativos como ferramentas para a validação do alvo e funcionalização do gene, bem como produtos terapêuticos para modular seletivamente a expressão de genes envolvidos na doença.
[003]A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é causada por um defeito na expressão da proteína distrofina. O gene que codifica a proteína contém 79 exons espalhados por mais de 2 milhões de nucleotídeos de DNA. Qualquer mutação exô- nica que altere o quadro de leitura do éxon, ou introduza um códon de parada, ou seja, caracterizada pela remoção de um éxon ou éxons de quadro inteiro, ou duplicações de um ou mais éxons, tem o potencial de interromper a produção de distrofina funcional, resultando em DMD.
[004]Ensaios clínicos recentes testando a segurança e a eficácia de sondas de oligonucleotídeos de sequência específica (SSOs) para o tratamento de DMD são baseados na tecnologia SSO para induzir splicing alternativo de pré-RNAms por bloqueio estérico do spliceossomo (Cirak et al., 2011; Goemans et al., 2011; Kinali et al., 2009; van Deutekom et al., 2007). No entanto, apesar desses sucessos, as opções farmacológicas disponíveis para o tratamento da DMD são limitadas.
[005]Casimersen é um oligômero morfolino fosforodiamidato (PMO) projetado para saltar o exon 45 do gene da distrofina humana em pacientes com DMD que são passíveis de alteração no exon 45 que salta para restaurar a estrutura lida e produzir uma forma funcional mais curta da proteína distrofina.
[006]Embora tenham sido feitos progressos significativos no campo da tecnologia anti-sentido, continua a existir uma necessidade na técnica para métodos de preparação de oligômeros morfolino fosforodiamidato com desempenho anti-sentido ou antígeno melhorado.
SUMÁRIO
[007]São aqui fornecidos processos para a preparação de oligômeros morfo- lino fosforodiamidato (PMOs). Os processos sintéticos aqui descritos permitem uma síntese de PMO aumentada enquanto se mantém o rendimento global e a pureza de um PMO sintetizado.
[008]Por conseguinte, em um aspecto, é fornecido aqui um processo para preparar um composto oligomérico de Fórmula (A):
Figure img0001
(A).
[009]Em certas modalidades, é fornecido aqui um processo para preparar um composto oligomérico de Fórmula (C):
Figure img0002
[0010]Ainda em outra modalidade, o composto oligomérico da divulgação incluindo, por exemplo, algumas modalidades de um composto oligomérico de Fórmula (C), é um composto oligomérico de Fórmula (XII):
Figure img0003
[0011]Para maior clareza, as fórmulas estruturais incluindo, por exemplo, composto oligomérico de Fórmula (C) e Casimersen representado pela Fórmula (XII), são uma fórmula estrutural contínua de 5' para 3' e, para a conveniência de representar a fórmula inteira em uma forma compacta nas fórmulas estruturais acima, os requerentes incluíram várias quebras de ilustração rotuladas como “QUEBRA A”, e “QUEBRA B.” Como seria entendido pelo especialista, por exemplo, cada indicação de "QUEBRA A" mostra uma continuação da ilustração da fórmula estrutural nesses pontos. A pessoa versada na técnica compreende que o mesmo é verdade para cada caso de "QUEBRA B", nas fórmulas estruturais acima, incluindo Casimersen. Nenhuma das quebras de ilustração, no entanto, tem a intenção de indicar, nem os especialistas as entenderiam como significando uma descontinuação real das formulas estruturais acima, incluindo Casimersen.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0012]A Figura 1 e a Figura 2 mostram um cromatograma analítico representativo de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) de uma substância farmacêutica bruta de Casimersen (SRP-4045) sintetizada e desprotegida (ver Exemplo 4).
[0013]A Figura 3 e a Figura 4 mostram um cromatograma de HPLC analítico representativo de uma solução de substância farmacêutica de Casimersen purificada (ver Exemplo 5).
[0014]A Figura 5 e a Figura 6 mostram um cromatograma de HPLC analítico representativo de uma substância farmacêutica de Casimersen dessalinizada e liofili- zada (ver Exemplo 5).
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0015]São aqui fornecidos processos para a preparação de um oligômero morfolino. O oligômero morfolino aqui descrito apresenta uma afinidade mais forte para o DNA e o RNA, sem comprometer a seletividade da sequência, em relação aos oligonucleotídeos nativos ou não modificados. Em algumas modalidades, o oligômero morfolino da divulgação minimiza ou previne a clivagem por RNase H. Em algumas modalidades, o oligômero morfolino da divulgação não ativa a RNase H.
[0016]Os processos aqui descritos são vantajosos em um processo de escala industrial e podem ser aplicados para preparar quantidades de um oligômero morfolino com elevado rendimento e escala (por exemplo, cerca de 1 kg, cerca de 1 a 10 kg, cerca de 2 a 10 kg, cerca de 5 a 20 kg, cerca de 10 a 20 kg, ou cerca de 10 a 50 kg).
Definições
[0017]Abaixo estão listadas as definições de vários termos usados para descrever esta divulgação. Estas definições se aplicam aos termos conforme são utilizados ao longo deste relatório descritivo e reivindicações, salvo limitação em contrário em casos específicos, individualmente ou como parte de um grupo maior.
[0018]“Protegido de base” ou “proteção de base” se refere à proteção dos grupos de pares de bases, por exemplo, bases de purina ou pirimidina, nas subunida- des de morfolino com grupos de proteção adequados para evitar reação ou interferência dos grupos de emparelhamento de bases durante a síntese de oligômeros stepWise. Um exemplo de uma subunidade de morfolino protegida por bases é o com-posto (C) da subunidade C ativada com um grupo protetor CBZ no grupo amino cito- sina descrito abaixo.
[0019]Um "grupo fosforamidato ativado" é tipicamente um grupo clorofosfora- midato, tendo substituição no nitrogênio que é desejado na eventual ligação fosforo- diamidato no oligômero. Um exemplo é (dimetilamino) clorofosforamidato, isto é, -O- P(=O)(NMe2)Cl.
[0020]O termo “ligado ao suporte” se refere a uma entidade química ligada covalentemente a um meio de suporte.
[0021]O termo "meio de suporte" se refere a qualquer material incluindo, por exemplo, qualquer partícula, grânulo ou superfície, sobre o qual um oligômero pode ser ligado ou sintetizado, ou pode ser modificado para ligação ou síntese de um oligô- mero. Substratos representativos incluem, mas não estão limitados a, suportes inorgânicos e suportes orgânicos, tais como vidro e vidro modificado ou funcionalizado, plásticos (incluindo acrílicos, poliestireno e copolímeros de estireno e outros materiais, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, TEFLON, etc.), polissacarídeos, náilon ou nitrocelulose, cerâmicas, resinas, sílica ou materiais à base de sílica, incluindo silício e silício modificado, carbono, metais, vidros inorgânicos, plásticos, feixes de fibras ópticas e uma variedade de outros polímeros. Superfícies sólidas e meio de suporte particularmente úteis para algumas modalidades estão localizadas dentro de um aparelho de células de fluxo. Em algumas modalidades dos processos aqui descritos, o meio de suporte compreende poliestireno com 1% de divinilbenzeno reticulado.
[0022]Em algumas modalidades, o meio de suporte representativo compreende pelo menos um local reativo para ligação ou síntese de um oligômero. Por exemplo, em algumas modalidades, um meio de suporte da divulgação compreende um ou mais grupos amino ou hidroxila terminais capazes de formar uma ligação química com uma subunidade que entra ou outro grupo ativado para ligar ou sintetizar um oligô- mero.
[0023]Alguns meios de suporte representativos que são passíveis de tratamento para os processos aqui descritos incluem, mas não se limitam aos seguintes: vidro de poro controlado (CPG); vidro de poro controlado com oxalila (ver, por exemplo, Alul, et al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 1527); partículas contendo sílica, tais como esferas de vidro porosas e sílica gel, tal como a formada pela reação de esferas de vidro tricloro-[3-(4-clorometil)fenil]propilsilano e porosas (ver Parr e Groh- mann, Angew. Chem. Internatl. Ed. 1972, 11, 314, vendido sob a marca comercial "PORASIL E" por Waters Associates, Framingham, Mass., EUA); um monoéster de 1,4-di-hidroximetilbenzeno e sílica (ver Bayer e Jung, Tetrahedron Lett., 1970, 4503, vendidos sob a marca comercial "BIOPAK" pela Waters Associates); TENTAGEL (ver, por exemplo, Wright, et al., Tetrahedron Letters 1993, 34, 3373); matriz de polímero de copolímero de estireno/divinilbenzeno reticulado, ou POROS, um copolímero de poliestireno/divinilbenzeno (disponível de Perseptive Biosystems); meio de suporte solúvel, tal como polietilenoglicol PEG (ver Bonora et al., Organic Process Research & Development, 2000, 4, 225 a 231); Suporte de PEPS, que é uma película de polie- tileno (PE) com enxertos pendentes de poliestireno de cadeia longa (PS) (ver Berg, et al., J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 8024 e Pedido de Patente Internacional WO 1990/02749); copolímeros de dimetilacrilamida reticulados com N,N-bisacriloiletileno- diamina, incluindo uma quantidade conhecida de N-terc-butoxicarbonil-beta-alanil-N'- criloil-hexametilenodiamina (ver Atherton, et al., J. Am. Chem. Soe, 1975, 97, 6584, Bioorg, Chem, 1979, 8, 351 e JCS, Perkin I, 538 (1981)); partículas de vidro revestidas com um polímero de estireno reticulado hidrofóbico (ver Scott, et al., J. Chrom. Sci., 1971, 9, 577); polímero de etileno fluorado no qual foi enxertado poliestireno (ver Kent e Merrifield, Israel J. Chem. 1978, 17, 243 e van Rietschoten em Peptides 1974, Y. Wolman, Ed., Wiley and Sons, Nova Iorque, 1975, p. 113 a 116); membranas de poli- propileno revestidas com hidroxipropilacrilato (Daniels, et al., Tetrahedron Lett.1989, 4345); barras de polietileno enxertadas com ácido acrílico (Geysen, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1984, 81, 3998); um “saquinho de chá” contendo pérolas de polímero tradicionalmente utilizadas (Houghten, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1985, 82, 5131); e combinações dos mesmos.
[0024]O termo "aparelho de célula de fluxo" se refere a uma câmara compreendendo uma superfície (por exemplo, superfície sólida) através da qual um ou mais reagentes de fluido (por exemplo, líquido ou gás) podem ser escoados.
[0025]O termo "agente de desbloqueio" se refere a uma composição (por exemplo, uma solução) compreendendo um ácido químico ou uma combinação de ácidos químicos para remover grupos protetores. Exemplos de ácidos químicos usados em agentes de desbloqueio incluem ácidos halogenados, por exemplo, ácido clo- roacético, ácido dicloroacético, ácido tricloroacético, ácido fluoroacético, ácido difluo- roacético e ácido trifluoroacético. Em algumas modalidades, um agente de desbloqueio remove um ou mais grupos tritila de, por exemplo, um oligômero, um oligômero ligado ao suporte, uma subunidade ligada ao suporte, ou outra porção de nitrogênio ou oxigênio protegida.
[0026]Os termos "halogênio" e "halo" se referem a um átomo selecionado do grupo que consiste em flúor, cloro, bromo e iodo.
[0027]O termo "agente de encapsulamento" se refere a uma composição (por exemplo, uma solução) compreendendo um anidrido de ácido (por exemplo, anidrido benzoico, anidrido acético, anidrido fenoxiacético e similares) útil para bloquear um sítio reativo de, por exemplo, um meio de suporte formando uma ligação química com uma subunidade de entrada ou outro grupo ativado.
[0028]O termo “agente de clivagem” se refere a uma composição (por exemplo, uma solução líquida ou mistura gasosa) que compreende uma base química (por exemplo, amônia ou 1,8-diazabicicloundec-7-eno) ou uma combinação de bases químicas úteis para clivagem; exemplo, um oligômero ligado ao suporte de um meio de suporte.
[0029]O termo “agente de desproteção” se refere a uma composição (por exemplo, uma solução líquida ou mistura gasosa) que compreende uma base química (por exemplo, amônia, 1,8-diazabicicloundec-7-eno ou carbonato de potássio) ou uma combinação de bases químicas úteis para remover grupos de proteção. Por exemplo, um agente de desproteção, em algumas modalidades, pode remover a proteína de base de, por exemplo, uma subunidade de morfolino, subunidades de morfolino de um oligômero morfolino ou suas versões de suporte.
[0030]O termo “solvente” se refere a um componente de uma solução ou mistura na qual um soluto é dissolvido. Os solventes podem ser inorgânicos ou orgânicos (por exemplo, ácido acético, acetona, acetonitrila, acetil acetona, 2-aminoetanol, anilina, anisol, benzeno, benzonitrila, álcool benzílico, 1-butanol, 2-butanol, i-butanol, 2- butanona, álcool t-butílico, dissulfeto de carbono, tetracloreto de carbono, cloroben- zeno, clorofórmio, ciclohexano, ciclohexanol, ciclohexanona, ftalato de di-n-butila, 1,1- dicloroetano, 1,2-dicloroetano, dietilamina, dietilenoglicol, diglima, dimetoxietano (glima), N,N-dimetilanilina, dimetilformamida, dimetilftalato, dimetilsulfóxido, dioxano, etanol, éter, acetato de etila, acetoacetato de etila, benzoato de etila, etilenoglicol, glicerina, heptano, 1-heptanol, hexano, 1-hexanol, metanol, acetato de metila, éter metil-t-butílico, cloreto de metileno, 1-octanol, pentano, 1-pentanol, 2-pentanol, 3-pen- tanol, 2-pentanona, 3-pentanona, 1-propanol, 2-propanol, piridina, tetrahidrofurano, tolueno, água, p-xileno).
[0031]Os termos “morfolino”, “oligômero morfolino” ou “PMO” (oligômero morfolino fosforoamidato ou fosforodiamidato) se referem a um oligômero fosforodia- midato morfolino da seguinte estrutura geral:
Figure img0004
B= nucleobase econforme descrito na Figura 2 de Summerton, J. et al., Antisense & Nucleic Acid DrugDevelopment, 7: 187 a 195 (1997). Morfolinos conforme descritos aqui são destinados a cobrir todos os estereoisômeros e configurações da estrutura geral an- terior. A síntese, as estruturas e as características de ligação dos oligômeros morfolino são detalhadas nas Patentes Nos. US 5.698.685, 5.217.866, 5.142.047, 5.034.506, 5.166.315, 5.521.063, 5.506.337, 8.076.476, e 8.299.206, todas aqui incorporadas por referência.
[0032]Em certas modalidades, um morfolino é conjugado na extremidade 5' ou 3' do oligômero com uma porção “cauda” para aumentar a sua estabilidade e/ou solubilidade. Caudas exemplares incluem:
Figure img0005
[0033]O termo "cauda EG3" se refere a porções trietilenoglicol conjugadas com o oligômero, por exemplo, no seu extremo 3' ou 5'. Por exemplo, em algumas modalidades, "cauda EG3" conjugada com a extremidade 3' de um oligômero pode ser da estrutura:
Figure img0006
[0034]Os termos "cerca de" ou "aproximadamente" são geralmente entendidos por pessoas com conhecimento na área de assunto relevante, mas em certas circunstâncias podem significar dentro de ± 10%, ou dentro de ± 5%, de um determinado valor ou intervalo.
Processos para a preparação de oligômeros morfolinos
[0035]A síntese é geralmente realizada, como aqui descrito, em um meio de suporte. Em geral, um primeiro sínton (por exemplo, um monômero, tal como uma subunidade de morfolino) é primeiro ligado a um meio de suporte, e o oligômero é então sintetizado por subunidades de acoplamento sequencial ao sínton ligado ao suporte. Este alongamento iterativo resulta eventualmenteem um composto oligomérico final. Meios de suporte adequados podem ser solúveis ou insolúveis, ou podem possuir solubilidade variável em diferentes solventes, para permitir que o polímero crescente ligado ao suporte esteja dentro ou fora da solução, conforme desejado. Os meios de suporte tradicionais são, em grande parte, insolúveis e são rotineiramente colocados em recipientes de reação, enquanto reagentes e solventes reagem com e/ou lavam a cadeia crescente até que o oligômero atinja o comprimento alvo, após o qual é clivado do suporte e se necessário, trabalhado adicionalmente para produzir o composto polimérico final. Abordagens mais recentes introduziram suportes solúveis incluindo suportes de polímeros solúveis para permitir a precipitação e a dissolução do produto sintetizado iterativamente nos pontos desejados da síntese (Gravert et al., Chem. Rev., 1997, 97, 489 a 510).
[0036]São aqui fornecidos processos para a preparação de oligômeros mor- folino.
[0037]Assim, em um aspecto, é fornecido aqui um processo para preparar um composto de Fórmula (II):
Figure img0007
em que R1 é um meio de suporte; em que o processo compreende contatar um composto de fórmula (A1):
Figure img0008
em que R1 é um meio de suporte e R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila; com um agente de desbloqueio para formar o composto de Fórmula (II).
[0038]Em outro aspecto, é fornecido aqui um processo para preparar um com- posto de Fórmula (A3):
Figure img0009
em que R1 é um meio de suporte, e R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila; em que o processo compreende contatar um composto de fórmula (II):
Figure img0010
(II); em que R1 é um meio de suporte; com um composto de Fórmula (A2):
Figure img0011
em que R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila; para formar o composto de Fórmula (A3).
[0039]Ainda em outro aspecto, é fornecido aqui um processo para preparar um composto de Fórmula (IV):
Figure img0012
em que R1 é um meio de suporte; em que o processo compreende contatar um composto de Fórmula (A3):
Figure img0013
em que R1 é um meio de suporte, e R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila; com um agente de desbloqueio para formar um composto de Fórmula (IV).
[0040]Ainda em outro aspecto, é fornecido aqui um processo para preparar um composto de Fórmula (A5):
Figure img0014
em que R1 é um meio de suporte, R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila, e R4 é selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0015
em que o processo compreende contatar um composto de Fórmula (IV):
Figure img0016
em que R1 é um meio de suporte; com um composto de Fórmula (A4):
Figure img0017
em que R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila e R4 é selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0018
para formar um composto de Fórmula (A5).
[0041]Em outro aspecto, é fornecido aqui um processo para preparar um composto de Fórmula (A9):
Figure img0019
em que n é um número inteiro de 10 a 40, R1 é um meio de suporte, R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trime- toxitritila, e R4 é, independentemente para cada ocorrência, selecionado do grupo con- sistindo em:
Figure img0020
Figure img0021
em que o processo compreende as etapas sequenciais de: (a) contatar um composto de Fórmula (IV):
Figure img0022
em que R1 é um meio de suporte; com um composto de Fórmula (A4):
Figure img0023
em que R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila e R4 é selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0024
Figure img0025
para formar um composto de Fórmula (A5):
Figure img0026
em que R1 é um meio de suporte, R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila, e R4 é selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0027
Figure img0028
(b1) contatar o produto formado pela etapa imediatamente anterior com um agente de desbloqueio; e (b2) contatar o composto formado pela etapa imediatamente anterior com um composto de Fórmula (A8):
Figure img0029
em que R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila e R4 é selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0030
Figure img0031
para formar um composto de Fórmula (A9).
[0042]Ainda em outro aspecto, é fornecido aqui um processo para preparar um composto de Fórmula (A10):
Figure img0032
em que n é um número inteiro de 10 a 40, R1 é um meio de suporte e R4 é, independentemente para cada ocorrência, selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0033
Figure img0034
em que o processo compreende contatar um composto de fórmula (A9):
Figure img0035
em que n é um número inteiro de 10 a 40, R1 é um meio de suporte, R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trime- toxitritila, e R4 é, independentemente para cada ocorrência, selecionado do grupo consistindo em:
Figure img0036
com um agente de desbloqueio para formar um composto de Fórmula (A10).
[0043]Ainda em outro aspecto, é fornecido aqui um processo para preparar um composto de Fórmula (A11):
Figure img0037
em que n é um número inteiro de 10 a 40 e R4 é, para cada ocorrência independentemente selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0038
e em que o processo compreende contatar o composto de Fórmula (A10):
Figure img0039
independentemente para cada ocorrência, selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0040
Figure img0041
com um agente de clivagem para formar um composto de Fórmula (All).
[0044]Em outro aspecto, é fornecido aqui um processo para preparar um com- posto oligomérico de Fórmula (A):
Figure img0042
em que n é um número inteiro de 10 a 40 e cada R2 é, independentemente para cada ocorrência, selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0043
em que o processo compreende contatar um composto de fórmula (A11):
Figure img0044
em que n é um número inteiro de 10 a 40 e R4 é, independentemente para cada ocorrência, selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0045
e com um agente de desproteção para formar o composto oligomérico de Fórmula (A).
[0045]Em outro aspecto, é fornecido aqui um processo para preparar um composto oligomérico de Fórmula (A):
Figure img0046
em que n é um número inteiro de 10 a 40 e cada R2 é, independentemente para cada ocorrência, selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0047
em que o processo compreende as etapas sequenciais de: (a) contatar um composto de Fórmula (A1):
Figure img0048
em que R1 é um meio de suporte e R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila; com um agente de desbloqueio para formar o composto de Fórmula (II):
Figure img0049
em que R1 é um meio de suporte; (b) contatar o composto de Fórmula (II) com um composto de Fórmula (A2):
Figure img0050
em que R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila; para formar um composto de Fórmula (A3):
Figure img0051
em que R1 é um meio de suporte, e R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila; (c) contatar o composto de Fórmula (A3) com um agente de desbloqueio para formar um composto de Fórmula (IV):
Figure img0052
em que R1 é um meio de suporte; (d) contatar o composto de Fórmula (IV) com um composto de Fórmula (A4):
Figure img0053
em que R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila e R4 é selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0054
para formar um composto de Fórmula (A5):
Figure img0055
em que R1 é um meio de suporte, R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila, e R4 é selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0056
(e) executar n-1 iterações das etapas sequenciais de: (e1) contatar o produto formado pela etapa imediatamente anterior com um agente de desbloqueio; e (e2) contatar o composto formado pela etapa imediatamente anterior com um composto de Fórmula (A8):
Figure img0057
em que R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila e R4 é, independentemente para cada composto de Fór- mula (A8), selecionado do grupo consistindo em:
Figure img0058
para formar um composto de Fórmula (A9):
Figure img0059
(A9); em que n é um número inteiro de 10 a 40, R1 é um meio de suporte, R3 é selecionado do grupo que consiste em tritil, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimeto- xitritila, e R4 é, independentemente para cada ocorrência, selecionado do grupo con- sistindo em:
Figure img0060
(f) contatar o composto de Fórmula (A9) com um agente de desbloqueio para formar um composto de Fórmula (A10):
Figure img0061
em que n é um número inteiro de 10 a 40, R1 é um meio de suporte e R4 é, independentemente para cada ocorrência, selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0062
(g) contatar o composto de Fórmula (A10) com um agente de clivagem para formar um composto de Fórmula (A11):
Figure img0063
em que n é um número inteiro de 10 a 40 e R4 é, independentemente para cada ocorrência, selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0064
(h) contatar o composto de Fórmula (A11) com um agente de desproteção para formar o composto oligomérico de Fórmula (A).
[0046]Em uma modalidade, a etapa (d) ou etapa (e2) compreende ainda contatar o composto de Fórmula (IV) ou o composto formado pela etapa imediatamente anterior, respectivamente, com um agente de cobertura (capping).
[0047]Em outra modalidade, cada etapa é realizada na presença de pelo menos um solvente.
[0048]Ainda em outra modalidade, o agente de desbloqueio utilizado em cada etapa é uma solução compreendendo um ácido halogenado.
[0049]Ainda em outra modalidade, o agente de desbloqueio utilizado em cada etapa é o ácido cianoacético.
[0050]Em outra modalidade, o ácido halogenado é selecionado do grupo consistindo em ácido cloroacético, ácido dicloroacético, ácido tricloroacético, ácido fluo- roacético, ácido difluoroacético e ácido trifluoroacético.
[0051]Em outra modalidade, o ácido halogenado é ácido trifluoroacético.
[0052]Ainda em outra modalidade, pelo menos uma das etapas (a), (c), (e1) e (f) compreende ainda a etapa de contatar o composto desbloqueado de cada etapa com um agente de neutralização.
[0053]Ainda em outra modalidade, cada uma das etapas (a), (c), (e1) e (f) compreende ainda a etapa de contatar o composto desbloqueado de cada etapa com um agente de neutralização.
[0054]Em outra modalidade, o agente de neutralização está em uma solução compreendendo diclorometano e álcool isopropílico.
[0055]Ainda em outra modalidade, o agente de neutralização é uma monoal- quil, dialquil ou trialquilamina.
[0056]Ainda em outra modalidade, o agente de neutralização é N,N-di-isopro- piletilamina.
[0057]Em outra modalidade, o agente de desbloqueio utilizado em cada etapa é uma solução compreendendo 4-cianopiridina, diclorometano, ácido trifluoroacético, trifluoroetanol e água.
[0058]Ainda em outra modalidade, o agente de cobertura está em uma solução compreendendo etilmorfolina e metilpirrolidinona.
[0059]Ainda em outra modalidade, o agente de cobertura é um anidrido de ácido.
[0060]Em outra modalidade, o anidrido de ácido é anidrido benzoico.
[0061]Em outra modalidade, os compostos de Fórmula (A4) e Fórmula (A8) estão cada um, independentemente, em uma solução compreendendo etilmorfolina e dimetilimidazolidinona.
[0062]Em outra modalidade, o agente de clivagem compreende ditiotreitol e 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno.
[0063]Ainda em outra modalidade, o agente de clivagem está em uma solução compreendendo N-metil-2-pirrolidona.
[0064]Ainda em outra modalidade, o agente de desproteção compreende NH3.
[0065]Ainda em outra modalidade, o agente de desproteção está em uma solução aquosa.
[0066]Ainda em outra modalidade, o meio de suporte compreende poliestireno com 1% de divinilbenzeno reticulado.
[0067]Em outra modalidade, o composto de Fórmula (A4) é de Fórmula (A4a):
Figure img0065
em que: R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxi- tritila e trimetoxitritila, e R4 é selecionado de:
Figure img0066
[0068]Em outra modalidade, o composto de Fórmula (A5) é de Fórmula (A5a):
Figure img0067
em que: R1 é um meio de suporte R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxi- tritila e trimetoxitritila, e R4 é selecionado de: .
Figure img0068
[0069]Ainda em outra modalidade, o composto de Fórmula (A8) é de Fórmula (A8a):
Figure img0069
em que: R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxi- tritila e trimetoxitritila, e R4 independentemente, em cada ocorrência do composto de Fórmula (A8a), selecionado do grupo consistindo em:
Figure img0070
[0070]Ainda em outra modalidade, o composto de fórmula (A9) é de Fórmula (A9a):
Figure img0071
em que: n é um número inteiro de 10 a 40, R1 é um meio de suporte, R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxi- tritila e trimetoxitritila, e R4 é, independentemente para cada ocorrência, selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0072
Figure img0073
[0071]Em outra modalidade, o composto de Fórmula (A10) é de Fórmula (A10a);
Figure img0074
em que: n é um número inteiro de 10 a 40, R1 é um meio de suporte, e R4 é, independentemente para cada ocorrência, selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0075
Figure img0076
[0072]Em outra modalidade, o composto de Fórmula (A11) é de Fórmula (A11a):
Figure img0077
em que: n é um número inteiro de 10 a 40, e R4 é, independentemente para cada ocorrência, selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0078
Figure img0079
[0073]Em uma modalidade do composto oligomérico de Fórmula (A), n é 22 e R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5' a 3':
Figure img0080
em que o composto oligomérico de Fórmula (A) é um composto de Fórmula (C):
Figure img0081
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0074]"Casimersen", anteriormente conhecido pela sua sigla de identificação "SPR-4045", é um PMO com a sequência de base 5'- CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (SEQ ID NO: 1). Casimersen está registrado sob o número de registro CAS 1422958-19-7. Nomes químicos incluem: todo-P-ambo- [P,2',3'-trideoxi-P-(dimetilamino)-2',3'-imino-2',3'-seco](2'a--5') (C-A-A-T-G-C-C-A-T- C-C-T-G-G-A-G-T-T-C-C-T-G)5'-[4-({2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etoxi}carbonil)-N,N-di- metilpiperazina-1-fosfonamidato].
[0075]Casimersen tem a seguinte estrutura química:
Figure img0082
e também é representado pela seguinte estrutura química:
Figure img0083
[0076]O Casimersen também pode ser representado pela estrutura da Fór- mula (XII):
Figure img0084
[0077]Assim, em uma modalidade do processo descrito acima, o composto oligomérico de Fórmula (A) é um composto de Fórmula (C):
Figure img0085
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0078]Ainda em outra modalidade, o composto oligomérico de Fórmula (C) é um composto oligomérico de Fórmula (XII):
Figure img0086
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
Processos para Preparar Casimersen
[0079]São fornecidos aqui processos para preparar o Casimersen.
[0080]Em outro aspecto, é fornecido aqui um processo para preparar um composto oligomérico de Fórmula (C):
Figure img0087
em que o processo compreende as etapas sequenciais de: (a) contatar um composto de Fórmula (I):
Figure img0088
em que R1 é um meio de suporte, com um agente de desbloqueio para formar o composto de Fórmula (II):
Figure img0089
em que R1 é um meio de suporte; (b) contatar o composto de Fórmula (II) com o composto (B):
Figure img0090
para formar um composto de Fórmula (III):
Figure img0091
em que R1 é um meio de suporte; (c) contatar o composto de Fórmula (III) com um agente de desbloqueio para formar um composto de Fórmula (IV):
Figure img0092
(d) contatar o composto de Fórmula (IV) com um composto de Fórmula (D):
Figure img0093
para formar um composto de Fórmula (V):
Figure img0094
em que R1 é um meio de suporte; (e) contatar o composto de Fórmula (V) com um agente de desbloqueio para formar um composto de Fórmula (VI):
Figure img0095
em que R1 é um meio de suporte; (f) contatar o composto de Fórmula (VI) com um composto de Fórmula (F):
Figure img0096
para formar um composto de Fórmula (VII):
Figure img0097
em que R1 é um meio de suporte; (g) realizar 20 iterações das etapas sequenciais de: (g1) contatar o produto formado pela etapa imediatamente anterior com um agente de desbloqueio; e (g2) contatar o composto formado pela etapa imediatamente anterior com um composto de Fórmula (VIII):
Figure img0098
em que R2 é, independentemente para cada composto de Fórmula (VIII), selecionado do grupo consistindo em:
Figure img0099
em que, para cada it eração de 1 a 20, R2 é:
Figure img0100
para formar um composto de Fórmula (IX):
Figure img0101
em que R1 é um meio de suporte, em que R2 é, independentemente para cada ocorrência, selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0102
em que R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0103
Figure img0104
(h) contatar o composto de Fórmula (IX) com um agente de desbloqueio para formar um composto de Fórmula (X):
Figure img0105
em que R1 é um meio de suporte, em que R2 é, independentemente para cada ocorrência, selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0106
em que R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0107
(i) contatar o composto de Fórmula (X) com um agente de clivagem para formar um composto de Fórmula (XI):
Figure img0108
em que R2 é, independentemente para cada ocorrência, selecionado do grupo que consiste em:
Figure img0109
em que R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0110
Figure img0111
e (j) contatar o composto de fórmula (XI) com um agente de desproteção para formar o composto oligomérico de fórmula (C).
[0081]Em uma modalidade, a etapa (d), a etapa (f), a etapa (g2), ou combinações das mesmas, compreende ainda contatar o composto de Fórmula (IV), Fórmula (VI) ou o composto formado pela etapa imediatamente anterior, respectivamente, com um agente de nivelamento.
[0082]Em certas modalidades, cada etapa (d), etapa (f) e etapa (g2) compreende ainda contatar o composto de Fórmula (IV), Fórmula (VI), ou o composto formado pela etapa imediatamente anterior, respectivamente, com um agente de cobertura.
[0083]Em outra modalidade, cada etapa é realizada na presença de pelo menos um solvente.
[0084]Ainda em outra modalidade, o agente de desbloqueio utilizado em cada etapa é uma solução compreendendo um ácido halogenado.
[0085]Ainda em outra modalidade, o agente de desbloqueio utilizado em cada etapa é o ácido cianoacético.
[0086]Em outra modalidade, o ácido halogenado é selecionado do grupo consistindo em ácido cloroacético, ácido dicloroacético, ácido tricloroacético, ácido fluo- roacético, ácido difluoroacético e ácido trifluoroacético.
[0087]Ainda em outra modalidade, o ácido halogenado é ácido trifluoroacético.
[0088]Ainda em outra modalidade, pelo menos um das etapas (c), (e) e (g1) compreende ainda a etapa de contatar o composto desbloqueado de cada etapa com um agente de neutralização.
[0089]Em outra modalidade, cada uma das etapas (c), (e) e (g1) compreende ainda a etapa de contatar o composto desbloqueado de cada etapa com um agente de neutralização.
[0090]Ainda em outra modalidade, o agente de neutralização está em uma solução compreendendo diclorometano e álcool isopropílico.
[0091]Ainda em outra modalidade, o agente de neutralização é uma monoal- quila, dialquila ou trialquilamina.
[0092]Em outra modalidade, o agente de neutralização é N,N-di-isopropileti- lamina.
[0093]Ainda em outra modalidade, o agente de desbloqueio utilizado em cada etapa é uma solução compreendendo 4-cianopiridina, diclorometano, ácido trifluoroa- cético, trifluoroetanol e água.
[0094]Ainda em outra modalidade, o agente de cobertura está em uma solução compreendendo etilmorfolina e metilpirrolidinona.
[0095]Em outra modalidade, o agente de cobertura é um anidrido de ácido.
[0096]Ainda em outra modalidade, o anidrido de ácido é o anidrido benzoico.
[0097]Ainda em outra modalidade, o composto de Fórmula (VIII), Fórmula (D) e Fórmula (F) estão cada um, independentemente, em uma solução compreendendo etilmorfolina e dimetilimidazolidinona.
[0098]Em outra modalidade, o agente de clivagem compreende ditiotreitol e 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno.
[0099]Ainda em outra modalidade, o agente de clivagem está em uma solução compreendendo N-metil-2-pirrolidona.
[00100]Ainda em outra modalidade, o agente de desproteção compreende NH3.
[00101]Em outra modalidade, o agente de desproteção está em uma solução aquosa.
[00102]Ainda em outra modalidade, o meio de suporte compreende poliestireno com 1% de divinilbenzeno reticulado.
[00103]Em outra modalidade, o composto de Fórmula (D) é de Fórmula (D1):
Figure img0112
[00104]Em outra modalidade, o composto de Fórmula (V) é de Fórmula (Va):
Figure img0113
em que R1 é um meio de suporte.
[00105]Em outra modalidade, o composto de Fórmula (F) é de Fórmula (F1):
Figure img0114
[00106]Em outra modalidade, o composto de Fórmula (VII) é de Fórmula (VIIa):
Figure img0115
em que R1 é um meio de suporte.
[00107]Em outra modalidade, o composto de Fórmula (VIII) é de Fórmula (VIIIa):
Figure img0116
em que R2 é, independentemente para cada composto de Fórmula (VIIIa), se- lecionado do grupo consistindo em:
Figure img0117
[00108]Em outra modalidade, o composto de Fórmula (IX) é de Fórmula (IXa):
Figure img0118
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1 é um meio de suporte, e R2 é, independentemente em cada ocorrência, selecionado do grupo consis- tindo em:
Figure img0119
em que R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0120
Figure img0121
[00109]Em outra modalidade, o composto de Fórmula (X) é de Fórmula (Xa):
Figure img0122
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1 é um meio de suporte, e R2 é, independentemente em cada ocorrência, selecionado do grupo consis- tindo em:
Figure img0123
em que R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0124
[00110]Em outra modalidade, o composto de Fórmula (XI) é de Fórmula (XIa):
Figure img0125
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: R2 é, independentemente em cada ocorrência, selecionado do grupo consis tindo em:
Figure img0126
em que R2 está em_ cada posição de 1 a . 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0127
Figure img0128
[00111]Em outra modalidade, o composto de Fórmula (VI) é de Fórmula (VIa):
Figure img0129
em que R1 é um meio de suporte.
[00112]Ainda em outra modalidade, o composto oligomérico de fórmula (C) é um composto oligomérico de Fórmula (XII):
Figure img0130
[00113]Em outro aspecto, é fornecido aqui um composto de Fórmula (V):
Figure img0131
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1 é um meio de suporte.
[00114]Em uma modalidade, o composto de Fórmula (V) é de Fórmula (Va)
Figure img0132
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1 é um meio de suporte.
[00115]Em outro aspecto, é fornecido aqui é um composto de Fórmula (A5):
Figure img0133
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1 é um meio de suporte, R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimeto- xitritila e trimetoxitritila e R4 é selecionado de:
Figure img0134
Figure img0135
[00116]Em uma modalidade, o composto de Fórmula (A5) é de Fórmula (A5a):
Figure img0136
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1 é um meio de suporte, R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimeto- xitritila e trimetoxitritila e R4 é selecionado de:
Figure img0137
Figure img0138
[00117]Em outro aspecto, é fornecido aqui é um composto de Fórmula (VI):
Figure img0139
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1 é um meio de suporte.
[00118]Em uma modalidade, o composto de Fórmula (VI) é de Fórmula (VIa):
Figure img0140
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1 é um meio de suporte.
[00119]Em outro aspecto, é fornecido aqui é um composto de Fórmula (VII):
Figure img0141
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1 é um meio de suporte.
[00120]Em uma modalidade, o composto de Fórmula (Vii) é de Fórmula (Viia):
Figure img0142
(VIIa), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1 é um meio de suporte.
[00121]Em outro aspecto, é fornecido aqui é um composto de Fórmula (IX):
Figure img0143
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: R1 é um meio de suporte, e R2 é, independentemente em cada ocorrência, selecionado do grupo consistindo em:
Figure img0144
Figure img0145
em que R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0146
[00122]Em uma modalidade, o composto de Fórmula (IX) é de Fórmula (IXa):
Figure img0147
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1 é um meio de suporte, e R2 é, independentemente em cada ocorrência, selecionado do grupo consis- tindo em:
Figure img0148
em que R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0149
Figure img0150
[00123]Em outro aspecto, é fornecido aqui é um composto de Fórmula (A9):
Figure img0151
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: n é um número inteiro de 10 a 40; R1 é um meio de suporte; R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxi- tritila e trimetoxitritila; e R4 é, independentemente em cada ocorrência, selecionado do grupo consis- tindo em:
Figure img0152
[00124]Em uma modalidade, o composto de Fórmula (A9) é de Fórmula (A9a):
Figure img0153
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: n é um número inteiro de 10 a 40; R1 é um meio de suporte; R3 é selecionado do grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxi- tritila e trimetoxitritila; e R4 é, independentemente em cada ocorrência, selecionado do grupo consistindo em:
Figure img0154
Figure img0155
[00125]Em outro aspecto, é fornecido aqui é um composto de Fórmula (X):
Figure img0156
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1 é um meio de suporte, e R2 é, independentemente em cada ocorrência, selecionado do grupo consis- tindo em:
Figure img0157
em que R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0158
[00126]Em uma modalidade, o composto de Fórmula (X) é de Fórmula (Xa):
Figure img0159
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1 é um meio de suporte, e R2 é, independentemente em cada ocorrência, selecionado do grupo consis- tindo em:
Figure img0160
em que R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0161
Figure img0162
[00127]Em outro aspecto, é fornecido aqui é um composto de Fórmula (A10):
Figure img0163
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que n é um número inteiro de 10 a 40; R1 é um meio de suporte; e R4 é, independente de cada ocorrência, selecionado do grupo que consiste
Figure img0164
[00128]Em uma modalidade, o composto de Fórmula (A10) é de Fórmula (A10a):
Figure img0165
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: n é um número inteiro de 10 a 40; R1 é um meio de suporte; e R4 é, independentemente em cada ocorrência, selecionado do grupo consis- tindo em:
Figure img0166
Figure img0167
[00129]Em outra modalidade destes compostos, o meio de suporte compre- ende poliestireno com 1% de divinilbenzeno reticulado.
[00130]Em outro aspecto, é fornecido aqui é um composto de Fórmula (XI):
Figure img0168
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: R2 é, independentemente em cada ocorrência, selecionado do grupo consistindo em:
Figure img0169
Figure img0170
em que R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0171
[00131]Em uma modalidade, o composto de Fórmula (XI) é de Fórmula (XIa):
Figure img0172
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R2 é, independentemente em cada ocorrência, selecionado do grupo consis- tindo em:
Figure img0173
em que R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0174
Figure img0175
[00132]Em outro aspecto, é fornecido aqui é um composto de Fórmula (A11):
Figure img0176
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: n é um número inteiro de 10 a 40; e R4 é, independentemente em cada ocorrência, selecionado do grupo consistindo em:
Figure img0177
[00133]Em uma modalidade, o composto de Fórmula (All) é de Fórmula (A11a):
Figure img0178
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: n é um número inteiro de 10 a 40; e R4 é, independentemente em cada ocorrência, selecionado do grupo consistindo em:
Figure img0179
Oligômeros
[00134]Propriedades importantes de subunidades baseadas em morfolino incluem: 1) a capacidade de ser ligada em uma forma oligomérica por ligações de estrutura estáveis, não carregadas ou carregadas positivamente; 2) a capacidade de suportar uma base nucleotídica (por exemplo, adenina, citosina, guanina, timidina, uracila, 5-metil-citosina e hipoxantina), de tal forma que o polímero formado pode hi- bridizar com um ácido nucleico alvo de base complementar, incluindo RNA alvo; 3) a capacidade do oligômero para ser ativamente ou passivamente transportado para células de mamífero; e 4) a capacidade do oligômero e heteroduplex de oligômero:RNA para resistir à degradação da RNAase e da RNAase H, respectivamente.
[00135]Em algumas modalidades, os oligômeros anti-sentido contêm modificações ou substituições de base. Por exemplo, certas nucleo-bases podem ser selecionadas para aumentar a afinidade de ligação dos oligômeros anti-sentido aqui descritos. Foi demonstrado que as substituições de 5-metilcitosina aumentam a estabilidade do duplex de ácido nucleico em 0,6 a 1,2 °C, e podem ser incorporadas nos oligômeros anti-sentido aqui descritos. Em uma modalidade, pelo menos uma base de pirimidina do oligômero compreende uma base de pirimidina substituída em 5, em que a base de pirimidina é selecionada do grupo consistindo em citosina, timina e uracila. Em uma modalidade, a base de pirimidina substituída em 5 é 5-metilcitosina. Em outra modalidade, pelo menos uma base de purina do oligômero compreende hi- poxantina.
[00136]Os oligômeros baseados em morfolino (incluindo oligômeros anti-sentido) estão detalhados, por exemplo, nas Patentes US Nos. 5.698.685, 5.217.866, 5.142.047, 5.034.506, 5.166.315, 5.185.444, 5.521.063, 5.506.337, 8.299.206 e 8.7076.476, Publicações do Pedido Internacional de Patente Nos. WO/2009/064471 e WO/2012/043730, e Summerton et al. (1997, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 7, 187 a 195), cada um dos quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade.
[00137]Os compostos oligoméricos da divulgação podem ter centros assimétricos, eixos quirais e planos quirais (como descrito, por exemplo, em: EL Eliel e SH Wilen, Stereo-chemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1994, pinas 1119 a 1190, e March, J., Advanced Organic Chemistry, 3a Ed., Cap. 4, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1985)), e podem ocorrer como racematos, misturas racêmicas e como diastereômeros individuais, com todos os isômeros possíveis e misturas dos mesmos, incluindo isômeros ópticos. Os compostos oligoméricos da presente divulgação especificamente mencionados, sem qualquer indicação da sua es- tereoquímica, pretendem representar todos os isômeros possíveis e as misturas dos mesmos.
[00138]Especificamente, sem desejar estar ligado a qualquer teoria em particular, os compostos oligoméricos da divulgação são preparados, como discutido aqui, a partir de subunidades de morfolino ativadas incluindo tais exemplos não limitativos, tais como um composto de Fórmula (VIII):
Figure img0180
em que R2 é, independentemente para cada composto de Fórmula (VIII), se- lecionado do grupo consistindo em:
Figure img0181
[00139]Cada um dos compostos acima mencionados de Fórmula (VIII), pode ser preparado, por exemplo, a partir do correspondente beta-D-ribofuranosila como representado abaixo:
Figure img0182
[00140]Ver Summerton et al., Anti-sense & Nucleic Acid Drug Dev. 7: 187 a 195 (1997). Sem estar vinculado a qualquer teoria particular, a estereoquímica dos dois carbonos quirais é retida sob as condições sintéticas de tal forma que um número de possíveis estereoisômeros de cada subunidade de morfolino pode ser produzido baseado na seleção de, por exemplo, um material de partida de alfa-L- ribofuranosila, alfa-D-ribofuranosila, beta-L-ribofuranosila ou beta-D-ribofuranosila.
[00141]Por exemplo, em algumas modalidades, um composto de Fórmula (VIII) da divulgação pode ser de Fórmula (VIIIa):
Figure img0183
em que R2 é, independentemente para cada composto de Fórmula (VIIIa), se- lecionado do grupo consistindo em:
Figure img0184
[00142]Sem querer estar ligado a qualquer teoria em particular, a incorporação de 10 a 40 compostos de Fórmula (VIII), por exemplo, em um composto oligomé- rico da divulgação pode resultar em numerosos estereoisômeros possíveis.
[00143]Sem querer estar limitado por qualquer teoria particular, os compostos oligoméricos da divulgação compreendem uma ou mais intersubunidades contendo fósforo, que criam um centro quiral em cada fósforo, cada um dos quais é designado como uma configuração “Sp” ou “Rp” como entendido na técnica. Sem querer estar vinculado a qualquer teoria em particular, essa quiralidade cria estereoisômeros, que têm composição química idêntica, mas diferentes arranjos tridimensionais de seus átomos.
[00144]Sem querer estar limitado por qualquer teoria particular, a configuração de cada ligação intersubunidade fosforosa ocorre aleatoriamente durante a síntese de, por exemplo, compostos oligoméricos da divulgação. Sem desejar estar ligado a qualquer teoria em particular, o processo de síntese gera um número exponencialmente grande de estereoisômeros de um composto oligomérico da divulgação porque os compostos oligoméricos da divulgação são constituídos por numerosas li-gações intersubunidades de fósforo - com cada ligação intersubunidade de fósforo tendo um configuração de radical quiral. Especificamente, sem desejar estar ligado a qualquer teoria particular, cada ligação intersubunidade de uma subunidade de mor- folino adicional dobra o número de estereoisômeros do produto, de modo que uma preparação convencional de um composto oligomérico da divulgação é de fato uma mistura altamente heterogênea de 2N. estereoisômeros, onde N representa o número de ligações intersubunidades de fósforo.
[00145]Assim, salvo indicação em contrário, todos esses isômeros, incluindo misturas diastereoméricas e enantioméricas, e enantiômeros e diastereômeros puros são incluídos, tais como, por exemplo, quando uma ou mais ligações de um ou mais centro estéreo está indicada por "-" ou "~~" Ou um equivalente como seria entendido na técnica.
[00146]A Tabela 1 representa várias modalidades das subunidades de morfo- lino fornecidas nos processos aqui descritos. Tabela 1: Várias modalidades de subunidades de morfolino.
Figure img0185
EXEMPLOS
[00147]Exemplos foram estabelecidos abaixo com a finalidade de ilustrar e descrever certas modalidades específicas da divulgação. No entanto, o escopo das reivindicações não deve ser de forma alguma limitado pelos exemplos aqui estabelecidos. Várias alterações e modificações para as modalidades divulgadas serão evidentes para as pessoas versadas na técnica e tais alterações e modificações incluindo, sem limitação, aquelas relacionadas com as estruturas químicas, substituintes, derivados, formulações ou métodos da divulgação podem ser feitas sem sair do espírito da divulgação e do escopo das reivindicações anexas. As definições das variáveis nas estruturas nos esquemas aqui apresentados são proporcionais àquelas das correspondentes posições nas fórmulas aqui apresentadas. Exemplo 1: Síntese da âncora NCP2 1. Preparação de 4-fluoro-3-nitrobenzoato de metila (1)
Figure img0186
[00148]A um balão de 100 L, adicionou-se 12,7 kg de ácido 4-fluoro-3-nitro- benzoico, 40 kg de metanol e 2,82 kg de ácido sulfúrico concentrado. A mistura foi agitada a refluxo (65 °C) durante 36 horas. A mistura reacional foi arrefecida até 0 °C. Cristais formados a 38 °C. A mistura foi mantida a 0 °C durante 4 h e depois filtrada sob nitrogênio. O frasco de 100 L foi lavado e o bolo de filtração foi lavado com 10 kg de metanol que tinha sido arrefecido a 0 °C. O bolo de filtração sólido foi seco no funil durante 1 hora, transferido para tabuleiros e seco em uma estufa de vácuo à temperatura ambiente a um peso constante de 13,695 kg de 4-fluoro-3-nitrobenzoato de metila (rendimento de 100%; HPLC a 99%). 2. Preparação do ácido 3-nitro-4-(2-oxopropil)benzoico A. (Z)-metil-4-(3-hidroxi-1-metoxi-1-oxobut-2-en-2-il)-3-nitrobenzoato (2)
Figure img0187
[00149]A um frasco de 100 L foram carregados 3,98 kg de 4-fluoro-3- nitrobenzoato de metila (1) da etapa anterior, 9,8 kg de DMF, 2,81 kg de acetoacetato de metila. A mistura foi agitada e arrefecida a 0 °C. Adicionou-se 3,66 kg de DBU durante cerca de 4 horas enquanto a temperatura era mantida a ou abaixo de 5 °C. A mistura foi agitada durante mais 1 hora. Ao balão reacional foi adicionada uma solução de 8,15 kg de ácido cítrico em 37,5 kg de água purificada enquanto a temperatura da reação era mantida a ou abaixo de 15 °C. Após a adição, a mistura reacional foi agitada durante 30 minutos depois filtrada sob nitrogênio. O bolo de filtração úmido foi devolvido ao frasco de 100 L juntamente com 14,8 kg de água purificada. A pasta foi agitada durante 10 minutos e depois filtrada. O bolo úmido foi de novo devolvido ao frasco de 100 L, empastado com 14,8 kg de água purificada durante 10 minutos, e filtrado para (Z)-metil-4-(3-hidroxi-1-metoxi-1-oxobut-2-en-2-il)-3-nitrobenzoato. B. Ácido 3-nitro-4-(2-oxopropil)benzoico
Figure img0188
[00150]Carregou-se (Z)-metil4-(3-hidroxi-1-metoxi-1 -oxobut-2-en-2-il)-3-nitro- benzoato bruto em um balão de reação de 100 L sob atmosfera de nitrogênio. A isto adicionou-se 14,2 kg de 1,4-dioxano e agitou-se. À mistura foi adicionada uma solução de 16,65 kg de HCl concentrado e 13,33 kg de água purificada (HCl 6 M) ao longo de 2 horas enquanto a temperatura da mistura reacional era mantida abaixo de 15 °C. Quando a adição estava completa, a mistura reacional foi aquecida a refluxo (80 °C) durante 24 horas, arrefecida até à temperatura ambiente e filtrada sob nitrogênio. O bolo de filtro sólido foi triturado com 14,8 kg de água purificada, filtrado, triturado novamente com 14,8 kg de água purificada e filtrado. O sólido foi devolvido ao frasco de 100 L com 39,9 kg de DCM e colocado em refluxo com agitação durante 1 hora. Adicionaram-se 1,5 kg de água purificada para dissolver os sólidos remanescentes. A camada orgânica inferior foi dividida em um balão de 72 litros pré-aquecido, em seguida, retornou a um frasco de 100 L seco e limpo. A solução foi arrefecida a 0 °C, mantida durante 1 hora, depois filtrada. O bolo de filtração sólido foi lavado duas vezes cada com uma solução de 9,8 kg de DCM e 5 kg de heptano, depois seco no funil. O sólido foi transferido para tabuleiros e seco até um peso constante de 1,855 kg de ácido 3-nitro-4-(2-oxopropil) benzoico. Rendimento global de 42% a partir do composto 1. HPLC 99,45%. 3. Preparação do succinato de N-tritilpiperazina (NTP)
Figure img0189
[00151]A um balão encamisado de 72 L foi carregado sob nitrogênio 1,805 kg de cloreto de trifenilmetila e 8,3 kg de tolueno (solução de TPC). A mistura foi agitada até os sólidos se dissolverem. A um balão de reação de 100 L foi adicionado sob nitrogênio 5,61 kg de piperazina, 19,9 kg de tolueno e 3,72 kg de metanol. A mistura foi agitada e arrefecida até 0°C. A esta foi lentamente adicionada em porções a solução de TPC ao longo de 4 horas enquanto a temperatura de reação foi mantida a ou abaixo de 10 °C. A mistura foi agitada durante 1,5 horas a 10 °C e depois deixou-se aquecer a 14 °C. Carregou-se 32,6 kg de água purificada no frasco de 72 L, transferiu- se depois para o frasco de 100 L enquanto a temperatura interna do lote era mantida a 20 +/- 5 °C. A camada aquosa inferior foi separada e armazenada. A camada orgânica foi extraída três vezes com 32 kg de água purificada cada, e as camadas aquosas foram separadas e combinadas com a solução aquosa armazenada.
[00152]A camada orgânica restante foi arrefecida a 18 °C e uma solução de 847 g de ácido succínico em 10,87 kg de água purificada foi adicionada lentamente em porções à camada orgânica. A mistura foi agitada durante 1,75 horas a 20 +/- 5 °C. A mistura foi filtrada, e os sólidos foram lavados com 2 kg de TBME e 2 kg de acetona e depois secos no funil. O bolo de filtração foi triturado duas vezes com 5,7 kg cada de acetona e filtrado e lavado com 1 kg de acetona entre as triturações. O sólido foi seco no funil, depois transferido para tabuleiros e seco em uma estufa de vácuo à temperatura ambiente até um peso constante de 2,32 kg de NTP. Rendimento 80%. 4. Preparação de (4-(2-hidroxipropil)-3-nitrofenil)(4-tritilpiperazin-1-il)meta- nona A. Preparação de 1-(2-nitro-4(4-tritilpiperazina-1-carbonil)fenil)propan-2-ona
Figure img0190
[00153]A um balão de 100 L foi carregado sob nitrogênio 2 kg de ácido 3-nitro- 4-(2-oxopropil)benzoico (3), 18,3 kg de DCM, 1,845 kg de cloridrato de N-(3-dimetila- minopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC.HCl). A solução foi agitada até se formar uma mistura homogênea. Adicionou-se 3,048 kg de NTP durante 30 minutos à temperatura ambiente e agitou-se durante 8 horas. Adicionou-se 5,44 kg de água purificada à mistura reacional e agitou-se durante 30 minutos. As camadas foram deixadas separar e a camada orgânica inferior contendo o produto foi drenada e armazenada. A camada aquosa foi extraída duas vezes com 5,65 kg de DCM. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com uma solução de 1,08 kg de cloreto de sódio em 4,08 kg de água purificada. As camadas orgânicas foram secas sobre 1,068 kg de sulfato de sódio e filtradas. O sulfato de sódio foi lavado com 1,3 kg de DCM. As camadas orgânicas combinadas foram suspensas com 252 g de sílica gel e filtradas através de um funil de filtração contendo um leito de 252 g de sílica gel. O leito de sílica gel foi lavado com 2 kg de DCM. As camadas orgânicas combinadas foram evaporadas em um eva- porador rotativo. Foram adicionados 4,8 kg de THF ao resíduo e depois evaporados no evaporador rotativo até serem atingidos 2,5 volumes de 1- (2-nitro-4(4-tritilpipera- zina-1-carbonil)fenil)propan-2-ona bruta em THF. B. Preparação de (4-(2-hidroxipropil)-3-nitrofenil) (4-tritilpiperazin-1-il)meta- nona (5)
Figure img0191
[00154]A um frasco de 100 L foi carregado sob nitrogênio 3600g de 4 da etapa anterior e 9800g de THF. A solução agitada foi arrefecida a 5 °C. A solução foi diluída com 11525 g de etanol e adicionaram-se 194 g de borohidreto de sódio durante cerca de 2 horas a 5 °C. Agitou-se a mistura reacional durante mais 2 horas a 5 °C. A reação foi extinta com uma solução de cerca de 1,1 kg de cloreto de amônio em cerca de 3 kg de água por adição lenta para manter a temperatura a 10 °C. Agitou-se a mistura reacional durante mais 30 minutos, filtrou-se para remover os materiais inorgânicos e recarregou-se para um frasco revestido de 100 L e extraiu-se com 23 kg de DCM. A camada orgânica foi separada e a aquosa foi extraída duas vezes com 4,7 kg de DCM cada. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com uma solução de cerca de 800 g de cloreto de sódio em cerca de 3 kg de água, depois secas sobre 2,7 kg de sulfato de sódio. A suspensão foi filtrada e o bolo de filtração foi lavado com 2 kg de DCM. Os filtrados combinados foram concentrados para 2,0 volumes, diluídos com cerca de 360 g de acetato de etila e evaporados. O produto bruto foi carregado em uma coluna de sílica gel de 4 kg de sílica carregada com DCM sob nitrogênio e eluído com 2,3 kg de acetato de etila em 7,2 kg de DCM. As frações combinadas foram evaporadas e o resíduo foi recolhido em 11,7 kg de tolueno. A solução de tolueno foi filtrada e o bolo de filtração foi lavado duas vezes com 2 kg de tolueno cada. O bolo de filtração foi seco até um peso constante de 2,275 kg do composto 5 (46% de rendimento a partir do composto 3) HPLC 96,99%. 5. Preparação de carbonato de 2,5-dioxopirrolidin-1-il(1- (2-nitro-4-(4-trifenil- metilpiperazina-1carbonil)fenil) propan-2-il) (âncora NCP2)
Figure img0192
[00155]A um frasco de 100 L foi carregado sob nitrogênio 4,3 kg do composto 5 (peso ajustado com base no tolueno residual por H1 RMN; todos os reagentes aqui depois foram redimensionados em conformidade) e 12,7 kg de piridina. A este foram carregados 3,160 kg de DSC (78,91% em peso por H1 RMN) enquanto a temperatura interna foi mantida a 35 °C. A mistura reacional foi envelhecida durante cerca de 22 horas em um ambiente e depois filtrada. O bolo de filtração foi lavado com 200 g de piridina. Em dois lotes compreendendo cada um metade do volume do filtrado, a lava-gem do filtrado foi lentamente carregada para um frasco revestido de 100 L contendo uma solução de cerca de 11 kg de ácido cítrico em cerca de 50 kg de água e agitada durante 30 minutos para permitir a precipitação sólida. O sólido foi recolhido com um funil de filtração, lavado duas vezes com 4,3 kg de água por lavagem e seco no funil de filtração sob vácuo.
[00156]Os sólidos combinados foram carregados para um frasco revestido de 100 L e dissolvidos em 28 kg de DCM e lavados com uma solução de 900 g de carbonato de potássio em 4,3 kg de água. Após 1 hora, as camadas foram deixadas separar e a camada aquosa foi removida. A camada orgânica foi lavada com 10 kg de água, separada e seca sobre 3,5 kg de sulfato de sódio. O DCM foi filtrado, evaporado e seco sob vácuo até 6,16 kg de âncora NCP2 (114% de rendimento).
Exemplo 2: Síntese de Resina Carregada por Ancoragem
[00157]A um reator de síntese em fase sólida de 75L foi carregado cerca de 52 L de NMP e 2600 g de resina de poliestireno de aminometila. A resina foi agitada no NMP para inchar durante cerca de 2 horas, depois drenada. A resina foi lavada duas vezes com cerca de 39 L de DCM por lavagem, depois duas vezes com 39 L de solução de neutralização por lavagem, depois duas vezes com 39 L de DCM por lavagem. A solução de ancoragem NCP2 foi lentamente adicionada à solução de resina em agitação, agitada durante 24 horas à temperatura ambiente e drenada. A resina foi lavada quatro vezes com 39 L de NMP por lavagem e seis vezes com 39 L de DCM por lavagem. A resina foi tratada e agitada com metade da solução de cobertura DEDC durante 30 minutos, escorrida, e foi tratada e agitada com a outra metade da solução de cobertura DEDC durante 30 minutos e drenada. A resina foi lavada seis vezes com 39 L de DCM por lavagem e depois seca em uma estufa até um peso constante de 3573,71 g da resina carregada por ancoragem. Exemplo 3: Preparação da cauda EG3 ativada 1. Preparação do tritil piperazina fenil carbamato (35)
Figure img0193
[00158]A uma suspensão arrefecida de NTP em diclorometano (6 mL/g de NTP) adicionou-se uma solução de carbonato de potássio (3,2 eq) em água (4 mL/g de carbonato de potássio). A esta mistura de duas fases foi lentamente adicionada uma solução de cloroformato de fenila (1,03 eq) em diclorometano (2 g/g de clorofor- mato de fenila). A mistura reacional foi aquecida até 20 °C. Após a conclusão da reação (1 a 2 h), as camadas foram separadas. A camada orgânica foi lavada com água e seca sobre carbonato de potássio anidro. O produto 35 foi isolado por cristalização a partir de acetonitrila. Rendimento = 80% 2. Preparação do álcool de carbamato (36)
Figure img0194
[00159]Hidreto de sódio (1,2 eq) foi suspenso em 1-metil-2-pirrolidinona (32 mL/g de hidreto de sódio). A esta suspensão foram adicionados trietilenoglicol (10,0 eq) e o composto 35 (1,0 eq). A suspensão resultante foi aquecida a 95 °C. Completada a reação (1 a 2 h), a mistura foi arrefecida a 20 °C. A esta mistura foi adicionado 30% de diclorometano/éter metil-tert-butílico (v:v) e água. A camada orgânica contendo o produto foi lavada sucessivamente com NaOH aquoso, ácido succínico aquoso e cloreto de sódio aquoso saturado. O produto 36 foi isolado por cristalização a partir de diclorometano/éter metil tert-butílico/heptano. Rendimento = 90%. 3. Preparação do ácido da cauda EG3 (37)
Figure img0195
[00160]A uma solução do composto 36 em tetrahidrofurano (7 mL/g 36) adicionou-se anidrido succínico (2,0 eq) e DMAP (0,5 eq). A mistura foi aquecida a 50 °C. Terminada a reação (5 h), a mistura foi arrefecida a 20 °C e ajustada a pH 8,5 com NaHCO3 aquoso. Adicionou-se éter metil-tert-butílico e o produto foi extraído para a camada aquosa. Foi adicionado diclorometano e a mistura foi ajustada a pH 3 com ácido cítrico aquoso. A camada orgânica contendo o produto foi lavada com uma mistura de tampão citrato a pH = 3 e cloreto de sódio aquoso saturado. Esta solução de diclorometano de 37 °C foi utilizada sem isolamento na preparação do composto 38. 4. Preparação da cauda EG3 ativada (38)
Figure img0196
[00161]Solução do composto 37 foi adicionada imida do ácido N-hidroxi-5- norborneno-2,3-dicarboxílico (HONB) (1,02 eq), 4-dimetilaminopiridina (DMAP) (0,34 eq) e, em seguida, cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodi-imida (EDC) (1,1 eq). A mistura foi aquecida a 55 °C. Completada a reação (4 a 5 horas), a mistura foi arrefecida a 20 °C e lavada sucessivamente com ácido cítrico/salmoura 1:1 0,2 M e salmoura. A solução de diclorometano sofreu troca de solvente para acetona e depois para N,N-dimetilformamida, e o produto foi isolado por precipitação a partir de acetona/N,N-dimetilformamida em cloreto de sódio aquoso saturado. O produto bruto foi ressuspenso várias vezes em água para remover N,N-dimetilformamida e sais residuais. Rendimento = 70% da cauda de EG3 38 ativada a partir do composto 36. Exemplo 4: Síntese da fase sólida de 50L de substância de fármaco bruto Casimersen [Composto Oligomérico (XII)] 1. Materiais Tabela 2: Materiais de Partida
Figure img0197
Figure img0198
Estruturas Químicas dos Materiais de Partida: A. Cauda EG3 Ativada
Figure img0199
Composto (B) B. Subunidade C Ativada (Para preparação, ver Patente US No. 8.067.571)
Figure img0200
Composto - de Fórmula (D1) C. Subunidade A ativada (Para preparação, ver Patente US No. 8.067.571)
Figure img0201
Composto de Fórmula (F1) D. Subunidade DPG Ativada (Para preparação, ver WO 2009/064471)
Figure img0202
Composto (E1) E. Subunidade T ativada (Para preparação, ver WO 2013/082551)
Figure img0203
Composto (G1) F. Resina Carregada por Ancoragem
Figure img0204
Fórmula (I) em que R1 é um meio de suporte. Tabela 3: Descrição das Soluções para a Síntese de Oligômeros de Fase Só- ida da Substância de Fármaco Bruto Casimersen
Figure img0205
Figure img0206
2. Síntese da Substância de Fármaco Bruto Casimersen A. Inchaço da Resina
[00162]750 g de resina carregada por ancoragem e 10,5 L de NMP foram carregados em um reator sinalizado de 50 L e agitados durante 3 horas. O NMP foi drenado e a resina carregada por ancoragem foi lavada duas vezes com 5,5 L de DCM e duas vezes com 5,5 L cada de TFE/DCM a 30%.
B. Ciclo 0: Engate da Cauda EG3
[00163]A resina carregada por ancoragem foi lavada três vezes com 5,5 L de TFE/DCM a 30% e escorrida, lavada com 5,5 L de solução de CYFTA durante 15 minutos e escorrida e novamente lavada com 5,5 L de solução de CYTFA durante 15 minutos sem drenagem. Carregaram-se 122 mL de NEM/DCM 1:1 e a suspensão foi agitada durante 2 minutos e drenada. A resina foi lavada uma vez com 5,5 L de solução de neutralização durante 10 minutos e drenada, depois duas vezes com 5,5 L cada de DCM e escorrida. Uma solução de 706,2 g de cauda de EG3 ativada (PM 765,85) e 234 mL de NEM em 3 L de DMI foi carregada na resina e agitada durante 3 horas à temperatura ambiente e drenada. A resina foi lavada uma vez com 5,5 L de solução de neutralização durante 10 minutos e depois drenada, uma vez com 5,5 L de solução de neutralização durante 5 minutos e depois drenada, e uma vez com 5,5 L de DCM e escorrida. Uma solução de 374,8 g de anidrido benzoico e 195 mL de NEM em 2680 mL de NMP foi carregada e agitada durante 15 minutos e drenada. A resina foi lavada um vez com 5,5 L de solução de neutralização durante 10 minutos e depois drenada, uma vez com 5,5 L de solução de neutralização durante 5 minutos e depois drenada, e lavada uma vez com 5,5 L de DCM e drenada e duas vezes com 5,5 L cada de TFE/DCM a 30%. A resina foi suspensa em 5,5 L de 30% de TFE/DCM e mantida durante 14 horas.
C. Ciclos de acoplamento de subunidades 1 a 22 i. Tratamentos pré-acoplamento
[00164]Antes de cada ciclo de acoplamento como descrito na Tabela 4, a resina foi: 1) lavada com 30% de TFE/DCM; 2) a) tratada com solução de CYTFA durante 15 minutos e escorrida, e b) tratada com solução de CYTFA durante 15 minutos à qual foi adicionado 1:1 de NEM/DCM, agitada e escorrida; 3) agitada três vezes com solução de neutralização; e 4) lavada duas vezes com DCM. Ver Tabela 4.
ii. Tratamentos pós-acoplamento
[00165]Depois de cada solução de subunidade ter sido drenada como descrito na Tabela 4, a resina foi: 1) lavada com DCM; e 2) lavada três vezes com 30% de TFE/DCM. Se a resina foi mantida por um período de tempo antes do próximo ciclo de acoplamento, a terceira lavagem de TFE/DCM não foi drenada e a resina foi retida na referida solução de lavagem de TFE/DCM. Ver Tabela 4.
iii. Ciclos de acoplamento de subunidades ativadas
[00166]Os ciclos de acoplamento foram realizados conforme descrito na Tabela 4.
iv. Lavagem Final com IPA
[00167]Após a etapa de acoplamento final ter sido realizada como descrito na Tabela 4, a resina foi lavada 8 vezes com 19,5 L cada de IPA e seca sob vácuo à temperatura ambiente durante cerca de 63,5 horas até um peso seco de 4523 g.
D. Clivagem
[00168]A substância de fármaco bruto Casimersen ligada à resina foi dividida em dois lotes, cada lote foi tratado como se segue. Dois lotes de resina de 2261,5 g foram cada um: 1) agitado com 10 L de NMP durante 2 h, depois o NMP foi drenado; 2) lavados três vezes com 10 L cada de 30% de TFE/DCM; 3) tratado com 10 L de solução de CYTFA durante 15 minutos; e 4) 10 L de solução de CYTFA durante 15 minutos aos quais 130 ml de NEM/DCM 1:1 foram então adicionados e agitados durante 2 minutos e escorridos. A resina foi tratada três vezes com 10 L de cada solução de neutralização, lavada seis vezes com 10 L de DCM e oito vezes com 10 L cada de NMP. A resina foi tratada com uma solução de clivagem de 1530,4 g de DTT e 2980 de DBU em 6,96 L de NMP durante 2 horas para separar a substância de fármaco bruto Casimersen da resina. A solução de clivagem foi drenada e retida em um recipiente separado. O reator e a resina foram lavados com 4,97 L de NMP que foi combinado com a solução de clivagem. Tabela 4:
Figure img0207
Figure img0208
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Figure img0214
Figure img0215
Figure img0216
E. Desproteção
[00169]A solução de clivagem combinada e a lavagem com NMP foram transferidas para um recipiente de pressão ao qual foram adicionadas 39,8 L de NH4OH (NH3^H2O) que foram resfriadas a uma temperatura de -10 a -25 °C em um freezer. O vaso de pressão foi selado e aquecido a 45 °C por 16 horas, depois foi resfriado a 25 °C. Esta solução de desproteção contendo a substância de fármaco bruto Casimersen foi diluída 3:1 com água purificada antes da remoção do solvente. Durante a remoção do solvente, a solução de desproteção teve o pH ajustado para 3,0 com ácido fosfórico 2M, depois para pH 8,03 com NH4OH. HPLC: C18) 80,93% (Fig. 1) e SCX-10 84,4% (Fig. 2).
Exemplo 5: Purificação da Substância de Fármaco Bruto Casimersen
[00170]A solução de desproteção do Exemplo 4, parte E, contendo a substância de fármaco bruto Casimersen foi carregada em uma coluna de resina de troca aniônica ToyoPearl Super-Q 650S (Tosoh Bioscience) e eluída com um gradiente de 0 a 35% de B ao longo de 17 volumes de coluna (Tampão A: hidróxido de sódio 10 mM; Tampão B: cloreto de sódio 1 M em hidróxido de sódio 10 mM) e as frações de pureza aceitável (C18 e SCX HPLC) foram reunidas em uma solução purificada de produto farmacêutico. HPLC: 97,74% (C18; Figura 3) 94,58% (SCX; Figura 4).
[00171]A solução da substância de fármaco purificada foi dessalinizada e lio- filizada para 1477,82 g de substância de fármaco Casimersen purificada. Rendimento 63,37%; HPLC 96,045% (Figura 5; C18) 96,346% (Figura 6; SCX). Tabela 5. Acrônimos
Figure img0217
Figure img0218
Incorporação por referência
[00172]O conteúdo de todas as referências (incluindo referências bibliográficas, patentes publicadas, pedidos de patente publicados e pedidos de patentes co- pendentes) citados ao longo deste pedido são aqui expressamente incorporados na sua totalidade. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados são concedidos com o significado vulgarmente conhecido por uma pessoa versada na técnica.
Equivalentes
[00173]Aquelas pessoas versadas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar, utilizando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas da divulgação aqui descrita. Tais equivalentes se destinam a ser englobados pelas reivindicações seguintes.

Claims (20)

1. Processo para preparar um composto oligomérico de Fórmula (C):
Figure img0219
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, o processo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas sequenciais de: (a) colocar um composto de Fórmula (A1):
Figure img0220
em que R1 é um meio de suporte e R3 é selecionado dentre o grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila, em contato com um agente de desbloqueio para formar o composto de Fór- mula (II):
Figure img0221
em que R1 é um meio de suporte; (b) colocar o composto de Fórmula (II) em contato com um composto de Fórmula (A2):
Figure img0222
em que R3 é selecionado dentre o grupo que consiste em tritila, monometoxi- tritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila, para formar um composto de Fórmula (A3):
Figure img0223
(c) colocar o composto de Fórmula (A3) em contato com um agente de desbloqueio para formar um composto de Fórmula (IV):
Figure img0224
(d) colocar o composto de Fórmula (IV) em contato com um composto de Fór- mula (A4):
Figure img0225
em que R3 é selecionado dentre o grupo que consiste em tritila, monometoxi- tritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila e R4 é:
Figure img0226
para formar um composto de Fórmula (A5):
Figure img0227
em que R1 é um meio de suporte, R3 é selecionado dentre o grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila, e R4 é:
Figure img0228
(e) executar 21 iterações das etapas sequenciais de: (e1) colocar o produto formado pela etapa imediatamente anterior em contato com um agente de desbloqueio; e (e2) colocar o composto formado pela etapa imediatamente anterior em contato com um composto de Fórmula (A8):
Figure img0229
em que R3 é selecionado dentre o grupo que consiste em tritila, monometoxi- tritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila e R4 é, de acordo com o composto oligomérico de Fórmula (C), selecionado dentre o grupo que consiste em:
Figure img0230
para formar um composto de Fórmula (A9):
Figure img0231
em que n é 22, R1 é um meio de suporte, R3 é selecionado dentre o grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, dimetoxitritila e trimetoxitritila, e R4 é, de acordo com o composto oligomérico de Fórmula (C), selecionado dentre o grupo que consiste em:
Figure img0232
(f) colocar o composto de Fórmula (A9) em contato com um agente de desbloqueio para formar um composto de Fórmula (A10):
Figure img0233
em que n é 22, R1 é um meio de suporte e R4 é, de acordo com o composto oligomérico de Fórmula (C), selecionado dentre o grupo que consiste em:
Figure img0234
(g) colocar o composto de Fórmula (A10) em contato com um agente de clivagem para formar um composto de Fórmula (A11):
Figure img0235
em que n é 22 e R4 é, de acordo com o composto oligomérico de Fórmula (C), selecionado dentre o grupo que consiste em:
Figure img0236
e (h) colocar o composto de Fórmula (A11) em contato com um agente de des proteção para formar o composto oligomérico de Fórmula (C); em que o meio de suporte compreende um material selecionado do grupo que consiste em vidro, vidro modificado ou funcionalizado, plásticos (incluindo acrílicos, poliestireno (por exemplo, poliestireno com 1% de divinilbenzeno reticulado), copolí- meros de estireno e outros materiais, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos e TEFLON), polissacarídeos, náilon ou nitrocelulose, cerâmicas, resinas, sílica ou materiais à base de sílica (incluindo silício e silício modificado), carbono, metais e feixes de fibras ópticas.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de Fórmula (A4) é de Fórmula (A4a):
Figure img0237
em que: R3 é selecionado dentre o grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, di- metoxitritila e trimetoxitritila, e R4 é:
Figure img0238
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fatode que o composto de Fórmula (A5) é de Fórmula (A5a):
Figure img0239
em que: R1 é um meio de suporte, R3 é selecionado dentre o grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, di- metoxitritila e trimetoxitritila, e R4 é:
Figure img0240
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de Fórmula (A8) é de Fórmula (A8a):
Figure img0241
em que: R3 é selecionado dentre o grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, di- metoxitritila e trimetoxitritila, e R4 é, de acordo com o composto oligomérico de Fórmula (C), selecionado de que o composto de Fórmula (A9) é de Fórmula (A9a):
Figure img0242
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de Fórmula (A9) é de Fórmula (A9a):
Figure img0243
em que: n é 22, R1 é um meio de suporte, R3 é selecionado dentre o grupo que consiste em tritila, monometoxitritila, di- metoxitritila e trimetoxitritila, e R4 é, de acordo com o composto oligomérico de Fórmula (C), selecionado dentre o grupo que consiste em:
Figure img0244
Figure img0245
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de Fórmula (A10) é de Fórmula (A10a):
Figure img0246
em que: n é 22, R1 é um meio de suporte, e R4 é, de acordo com o composto oligomérico de Fórmula (C), selecionado dentre o grupo que consiste em:
Figure img0247
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de Fórmula (A11) é de Fórmula (A11a):
Figure img0248
em que: n é 22, e R4 é, de acordo com o composto oligomérico de Fórmula (C), selecionado dentre o grupo que consiste em:
Figure img0249
8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto oligomérico de Fórmula (C) é um composto oligomérico de Fórmula (XII):
Figure img0250
9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que R3 é, em cada ocorrência, tritila.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas sequenciais de: (a) colocar um composto de Fórmula (I):
Figure img0251
em que R1 é um meio de suporte, em contato com um agente de desbloqueio para formar o composto de Fórmula (II):
Figure img0252
em que R1 é um meio de suporte; (b) colocar o composto de Fórmula (II) em contato com o composto (B):
Figure img0253
para formar um composto de Fórmula (III):
Figure img0254
em que R1 é um meio de suporte; (c) colocar o composto de Fórmula (III) em contato com um agente de desbloqueio para formar um composto de Fórmula (IV):
Figure img0255
(d) colocar o composto de Fórmula (IV) em contato com um composto de Fór- mula (D):
Figure img0256
para formar um composto de Fórmula (V):
Figure img0257
em que R1 é um meio de suporte; (e) colocar o composto de Fórmula (V) em contato com um agente de desbloqueio para formar um composto de Fórmula (VI):
Figure img0258
(f) colocar o composto de Fórmula (VI) em contato com o composto de Fór- mula (F):
Figure img0259
para formar um composto de Fórmula (VII):
Figure img0260
em que R1 é um meio de suporte; (g) realizar 20 iterações das etapas sequenciais de: (g1) colocar o produto formado pela etapa imediatamente anterior em contato com um agente de desbloqueio; e (g2) colocar o composto formado pela etapa imediatamente anterior em con- tato com um composto de Fórmula (VIII):
Figure img0261
em que R2 é, de acordo com o composto oligomérico de Fórmula (C), selecionado dentre o grupo que consiste em:
Figure img0262
em que, para cada iteração de 1 a 20, R2 é:
Figure img0263
para formar um composto de Fórmula (IX):
Figure img0264
em que R1 é um meio de suporte, em que R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0265
em que:
Figure img0266
(h) colocar o composto de Fórmula (IX) em contato com um agente de des- bloqueio para formar um composto de Fórmula (X):
Figure img0267
em que R1 é um meio de suporte, em que R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0268
Figure img0269
em que:
Figure img0270
(i) colocar o composto de Fórmula (X) em contato com um agente de clivagem para formar um composto de Fórmula (XI):
Figure img0271
em que R2 está em cada posição d e 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0272
em que:
Figure img0273
(j) colocar o composto de Fórmula (XI) em contato com um agente de desproteção para formar o composto oligomérico de Fórmula (C).
11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (d), etapa (f) ou etapa (g2) compreende ainda colocar o composto de Fórmula (IV), Fórmula (VI) ou o composto formado pela etapa imediatamente anterior, respectivamente, em contato com um agente de cobertura (capping).
12. Processo, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de desbloqueio usado em cada etapa é ácido halogenado ou ácido cianoacético.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o ácido halogenado é selecionado dentre o grupo que consiste em ácido clo- roacético, ácido dicloroacético, ácido tricloroacético, ácido fluoroacético, ácido difluo- roacético e ácido trifluoroacético.
14. Composto CARACTERIZADO pelo fato de que apresenta a Fórmula (IX):
Figure img0274
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: R1 é um meio de suporte; e R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0275
em que:
Figure img0276
em que o meio de suporte compreende um material selecionado do grupo que consiste em vidro, vidro modificado ou funcionalizado, plásticos (incluindo acrílicos, poliestireno (por exemplo, poliestireno com 1% de divinilbenzeno reticulado), copolí- meros de estireno e outros materiais, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos e TEFLON), polissacarídeos, náilon ou nitrocelulose, cerâmicas, resinas, sílica ou materiais à base de sílica (incluindo silício e silício modificado), carbono, metais e feixes de fibras ópticas.
15. Composto, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de Fórmula (IX) é de Fórmula (IXa):
Figure img0277
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: R1 é um meio de suporte, e R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0278
em que:
Figure img0279
16. Composto CARACTERIZADO pelo fato de que apresenta a Fórmula (X):
Figure img0280
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: R1 é um meio de suporte, e R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0281
Figure img0282
em que:
Figure img0283
em que o meio de suporte compreende um material selecionado do grupo que consiste em vidro, vidro modificado ou funcionalizado, plásticos (incluindo acrílicos, poliestireno (por exemplo, poliestireno com 1% de divinilbenzeno reticulado), copolí- meros de estireno e outros materiais, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos e TEFLON), polissacarídeos, náilon ou nitrocelulose, cerâmicas, resinas, sílica ou materiais à base de sílica (incluindo silício e silício modificado), carbono, metais e feixes de fibras ópticas.
17. Composto, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de Fórmula (X) é de Fórmula (Xa):
Figure img0284
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: R1 é um meio de suporte, e R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0285
em que:
Figure img0286
18. Composto, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio de suporte compreende poliestireno com 1% de divinilbenzeno reticulado.
19. Composto CARACTERIZADO pelo fato de que apresenta a Fórmula (XI):
Figure img0287
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0288
Figure img0289
em que:
Figure img0290
20. Composto, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de Fórmula (XI) é de Fórmula (XIa):
Figure img0291
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: R2 está em cada posição de 1 a 22 e de 5’ a 3’:
Figure img0292
em que:
Figure img0293
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