BR112018068809B1

BR112018068809B1 - Método para aumentar a tolerância de plantas a condições de estresse osmótico

Info

Publication number: BR112018068809B1
Application number: BR112018068809-6A
Authority: BR
Inventors: David JIMÉNEZ ARIAS; Andrés BORGES RODRÍGUEZ; Alicia Boto Castro; Francisco VALDÉS GONZÁLEZ; José Antonio Pérez Pérez; Juan Cristo Luis Jorge
Original assignee: Universidad De La Laguna; Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Priority date: 2016-03-17
Filing date: 2017-03-17
Publication date: 2022-09-06
Also published as: EP3430905B1; CL2018002634A1; PT3430905T; MX2018011301A; ES2898638T3; EP3430905A1; WO2017158225A1; BR112018068809A2; HRP20211694T1; PE20190167A1; ES2638213A1; ZA201806903B; ES2638213B1; US20190159449A1; EP3430905A4

Abstract

A presente invenção propõe o uso de aminoácidos cíclicos não prolínicos de fórmula geral (I), em que n, X, Y e Z possuem o significado descrito na descrição, para aumentar a tolerância das plantas às condições de estresse osmótico, que têm sua origem na falta de disponibilidade de água do meio ambiente. Os aminoácidos não prolínicos que são utilizados na invenção são de origem natural e têm uma eficácia muito mais elevada do que outros aminoácidos já conhecidos e utilizados para o mesmo fim, por isso considera-se que esta invenção pode ser muito útil para evitar perdas econômicas causadas pelo declínio da produtividade nas culturas agrícolas

Description

DESCRIÇÃO

[001] A presente invenção refere-se ao uso de moléculas orgânicas para aumentar a tolerância de plantas a condições de estresse osmótico provocadas pela dificuldade para acessar a água do meio, tais como as provocadas pelo estresse salino ou o déficit hídrico. Com base no anterior, esta invenção pode ser englobada na área da aplicação de compostos e substâncias para favorecer o desenvolvimento de plantas nas condições descritas de estresse osmótico.

ESTADO DA TÉCNICA

[002] A falta de acessibilidade à água por parte das plantas é um dos fatores que influem de maneira mais determinante no declínio de produtividade dos cultivos agrícolas. Essa falta de acessibilidade à água pode ser devida tanto a condições de seca meteorológica, agrícola ou hidrológica, o que se refere, em suma, a um déficit hídrico no meio, como a seca fisiológica.

[003] A seca fisiológica ocorre quando os sais solúveis se encontram em altas concentrações na solução do solo, limitando a tomada de água pela planta devido ao baixo potencial hídrico que é gerado.

[004] Em qualquer das situações de seca anteriormente descritas, produz-se um estresse osmótico das plantas que tem como consequência a geração de uma resposta fisiológica, bioquímica e molecular muito similar que afeta o seu desenvolvimento (Sairam e Tyagi, 2004. Current Science 86(3), 407 a 421).

[005] Sabe-se que as plantas, e como estratégia de sobrevivência diante dessas situações de estresse, podem ajustar seu potencial osmótico, gerando um potencial hídrico menor que o da solução do solo, para poder acessar a água presente na mesma (Munns e Tester, 2008. Annual Review of Plant Biology 59: 651 a 681).

[006] Sabe-se também que a adaptação das plantas a diferentes condições de estresse pode ser estimulada por meio de compostos químicos para tentar anular o efeito negativo sobre seu desenvolvimento. Assim, por exemplo, na patente ES2332494B1, reivindica-se o uso da menadiona, um derivado da vitamina K, para aumentar a tolerância das plantas ao estresse osmótico produzido pela salinidade.

[007] Em relação ao uso de aminoácidos para melhorar as condições de desenvolvimento das plantas, é amplamente conhecido que se utilizaram misturas desse tipo de moléculas orgânicas procedentes do hidrolisado de proteínas na Europa desde o ano de 1968 para: fertilizar o terreno, como pesticidas, como herbicidas, como fungicidas e como reguladores de crescimento por meio de um efeito nutricional dos cultivos.

[008] Existem também documentos que mencionam o uso de aminoácidos para aumentar a tolerância a situações de baixa disponibilidade de água por seca fisiológica. Nesse sentido, cabe destacar o trabalho de El-Samad et al. (2011. Journal of Medicinal Plants Research 5:24, 5.692 a 5.699) que menciona o uso de aminoácidos não cíclicos, como a fenilalanina ou a prolina; ou o documento de pedido de patente US2009054241A1, no qual é utilizado um derivado da prolina, a saber, a hidroxiprolina. Contudo, em qualquer desses casos, a efetividade em relação ao aumento da tolerância é ainda limitada.

[009] O documento WO 2007/056409 A2 revela o uso de ácido piroglutâmico para aumentar o desempenho de uma planta alvo por aplicação foliar ou na raiz e o uso de uma mistura de ácido (D) e (L)-piroglutâmico promove a resistência das plantas ao estresse.

[010] P. V. Devi Prasad et al. (1996. In Vitro Cellular & Developmental Biology- Plant, 32, 47-50) divulga o uso de hidroxiprolina para aumentar a tolerância das plantas de batata contra o estresse salino, enquanto o fornecimento exógeno de prolina ou hidroxiprolina a uma planta causa algum tipo de estresse por por si só, ambos os compostos aliviam o estresse salino.

[011] O documento WO 2007/104489 A1 divulga o uso de 4-hidroxiprolina para aumentar a tolerância das plantas a condições de estresse abiótico que incluem seca e salinidade do solo.

[012] Com base no exposto, considera-se de interesse a busca de novos aminoácidos que, ao serem aplicados nas plantas, sejam capazes de estimular seus mecanismos naturais para aumentar a tolerância a condições de estresse osmótico.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[013] Considera-se que o problema solucionado pela invenção é a seleção de moléculas orgânicas, a saber, aminoácidos que, ao serem aplicados a plantas, permitem aumentar sua tolerância às condições de estresse osmótico ou hídrico e, portanto, não tenham sua produtividade reduzida em relação a plantas não submetidas a tal estresse.

[014] Os inventores observaram que alguns aminoácidos, a saber, os aminoácidos cíclicos não prolínicos da fórmula geral (III) são capazes de estimular os mecanismos naturais das plantas que permitem às mesmas superar condições de estresse osmótico, aumentando de forma significativa sua produção de biomassa em tais condições adversas e aproximando-a dos valores de plantas-controle não submetidas a tal estresse (consultar exemplo 2). Também observaram o efeito do estímulo de tais aminoácidos no uso da água das plantas tratadas com os mesmos em situação de estresse osmótico provocado por déficit hídrico (consultar exemplo 5). Os inventores também comprovaram que o uso de outros aminoácidos distintos, utilizados nas mesmas condições de experimentação, não conseguem uma recuperação da produção de biomassa com relação a um controle ou, se o conseguem, é em menor medida (consultar exemplos 1 a 5).

[015] As vantagens do uso dos aminoácidos cíclicos não prolínicos da fórmula geral (III) que se incluem no âmbito da presente invenção são: -têm um efeito claramente superior ao que mostraram outros aminoácidos descritos no estado da técnica, como, por exemplo, a alanina ou a hidroxiprolina, na melhora da tolerância a condições de estresse osmótico; -trata-se de aminoácidos naturais ou derivados biodegradáveis que minimizam o impacto ambiental; e -possibilitam um manejo seguro por parte dos operários durante a aplicação.

[016] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se ao uso de um composto da fórmula (III).

[017] O composto de fórmula (III) apresenta um centro quiral que dá lugar a estereisômeros. A presente invenção descreve cada um desses estereisômeros e seus misturas.

[018] No âmbito da invenção também se incluem os derivados hidrossolúveis do aminoácido da invenção.

[019] As “condições de estresse osmótico” estão provocadas por uma dificuldade no acesso à água disponível no meio que abriga uma planta e que o especialista no estado da técnica conhece como um elemento comum a circunstâncias de seca meteorológica, agrícola, hidrológica (situações de déficit hídrico) ou fisiológica (situações de salinidade), e que tem efeitos similares sobre a ativação de mecanismos de defesa da planta e sobre o declínio do seu desenvolvimento (Sairam e Tyagi, 2004. Current Science 86(3), 407 a 421).

[020] Os resultados incluídos neste documento (consultar exemplo 2), demonstrado que o aminoácido da invenção é efetivo para aumentar a tolerância em condições de estresse osmótico, como as que, por exemplo, são provocadas em condições de salinidade e, também, em condições de estresse osmótico provocado por déficit hídrico (consultar exemplo 5).

[021] Em outra realização, a invenção refere-se ao uso de um composto da fórmula (III), tal e como definido anteriormente, para aumentar a tolerância ao estresse osmótico produzido por um déficit hídrico.

[022] Em outra realização, a invenção refere-se ao uso de um composto da fórmula (III), tal e como definido anteriormente, para aumentar a tolerância ao estresse osmótico produzido pela salinidade.

[023] Como mencionado anteriormente, alguns dos compostos da presente invenção podem existir como vários diastereoisômeros e/ou vários isômeros ópticos. Os diastereoisômeros podem ser separados por técnicas convencionais, tais como cromatografia ou cristalização fracionada. Os isômeros ópticos podem ser resolvidos por técnicas convencionais de resolução óptica para obter isômeros opticamente puros. Essa resolução pode ser levada a cabo em qualquer dos produtos intermediários de um composto da fórmula (III). Os isômeros opticamente puros também podem ser obtidos individualmente, através do uso de síntese enantiosseletiva. A presente invenção abrange todos os isômeros individuais, bem como as misturas dos mesmos (por exemplo, misturas racêmicas ou misturas de diastereoisômeros), obtidos tanto por síntese quanto por mistura física dos mesmos.

[024] Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a um método para melhorar a tolerância a condições de estresse osmótico, doravante método da invenção, que compreende administrar à planta uma dose eficaz de pelo menos um composto da fórmula (III), tal e como definido anteriormente.

[025] Ainda que o especialista no estado da técnica saiba que é possível utilizar o aminoácido da invenção em qualquer suporte que favoreça sua penetrabilidade no material vegetal, preferencialmente, o método da invenção compreende utilizar o composto da fórmula (III) em solução aquosa.

[026] O método da invenção também compreende utilizar o aminoácido da invenção junto a diversos veículos e agentes que facilitem sua conservação, manejo e aplicação.

[027] Em outra realização, a invenção refere-se ao método definido anteriormente, em que o composto da fórmula (III) pode ser utilizado conjuntamente com outro ingrediente ativo. Exemplos de ingrediente ativo adicional são, a título indicativo e não limitativo, nematicidas, inseticidas, acaricidas, fungicidas, bactericidas, herbicidas, reguladores do crescimento, fertilizantes, sinérgicos, fertilizantes e condicionadores do solo, e preferivelmente em que o ingrediente ativo adicional é selecionado a partir de nematicida, inseticida, acaricida, fungicida, bactericida e herbicida.

[028] Tal e como explicado anteriormente, na descrição do uso do aminoácido da invenção (composto da fórmula (III)), e de forma coerente, o método da invenção tem por aplicação aumentar a tolerância ao estresse osmótico provocado por um déficit hídrico ou pela salinidade.

[029] A eficácia do método da invenção fica evidente quando se comprova a redução dos efeitos negativos que ocasiona o estresse osmótico, após a aplicação do aminoácido da invenção em plantas tratadas com dose moderadas de NaCl (50 mM) (Attia et al., 2008. Physiologia Plantarum 132: 293 a 305), que aumenta de forma evidente a produção de biomassa até valores próximos aos obtidos por plantas-controle sem estresse osmótico. Comprova-se, ademais, que a aplicação do aminoácido da invenção ocasiona uma resposta de natureza sistêmica e, consequentemente, seus efeitos se estendem ao resto da planta desde as raízes.

[030] Nas definições anteriores, o termo C1-4alquila, como grupo ou parte de um grupo, significa um grupo alquila de cadeia linear ou ramificada que contém de 1 a 4 átomos de C; e inclui os grupos metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, sec-butila e terc-butila.

[031] No presente documento, entende-se por “planta” indistintamente tanto a um indivíduo quanto a uma pluralidade das mesmas, seja considerada em sua totalidade, ou seja, incluindo parte aérea e parte radical com independência de seu estado de desenvolvimento, ou considerada parcialmente, ou seja, qualquer parte da mesma que possa ser utilizada como material vegetal de reprodução ou multiplicação.

[032] Por “material vegetal de reprodução”, entende-se tanto a semente quanto o fruto que a compreende.

[033] Por “material vegetal de multiplicação”, entende-se qualquer fragmento de uma planta a partir do qual seja possível obter pelo menos um novo exemplar e que se utiliza normalmente como base em técnicas de propagação, como, por exemplo, propagação por mergulhia, reprodução vegetativa, estacas, estolhos, gomos, rizomas, tubérculos, bulbos ou cormos; propagação por enxertos; micropropagação; ou propagação por cultivo in-vitro.

[034] Conforme sabido pelo especialista no estado da técnica, em função do estado de desenvolvimento da planta ou do tipo de material vegetal, são possíveis diferentes técnicas de aplicação de produtos fitossanitários. Assim, por exemplo, para plantas já estabelecidas em campo, para aplicação na parte aérea, as técnicas mais adequadas podem compreender a pulverização do aminoácido da invenção sobre as folhas, ou a injeção no talo, enquanto que para a parte radicular, a aplicação pode ser feita por incorporação à água de irrigação ou ao substrato que abriga a planta.

[035] Contudo, para material vegetal em estados prévios à sua colocação em campo, em acréscimo às técnicas anteriores, também é possível a imersão da parte radical em uma solução que compreende o aminoácido da invenção ou a imersão total do material vegetal, seja de reprodução ou multiplicação. Preferencialmente, a aplicação é por imersão da parte radical.

[036] Exemplos de cultivo nos quais é possível aplicar o método da invenção, são qualquer cultivo de monocotiledôneas ou dicotiledôneas, a título indicativo e não limitativo, cultivos de cereais, de frutíferas, de legumes, de hortaliças ou de plantas ornamentais. Em particular, um exemplo de cultivo é o tomate.

[037] Em outra realização, a invenção refere-se ao método tal e como definido anteriormente, que compreende a aplicação em solução aquosa do composto da fórmula (III) por imersão do sistema radicular.

[038] Em outra realização, a invenção refere-se ao método tal e como definido anteriormente, que compreende a aplicação em solução aquosa do composto da fórmula (III) por imersão das sementes.

[039] A “dose eficaz” pode aumentar ou diminuir opcionalmente segundo o aminoácido da invenção selecionado, do material vegetal, de seu estado de desenvolvimento, do tipo de formulação, do tempo, do lugar, da frequência de aplicação e do grau de estresse osmótico.

[040] Em uma realização particular do método da invenção, o aminoácido da invenção é utilizado em uma faixa de concentrações de 0,1 μM a 3 M.

[041] Ao longo da descrição e das reivindicações, a palavra “compreende” e suas variações não pretendem excluir outras características técnicas. Para o especialista na matéria, outros aspectos, vantagens e características da invenção serão depreendidos em parte da descrição e em parte da prática da invenção. Os seguintes exemplos e figuras são proporcionados a título ilustrativo e não se pretende que limitem a presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[042] Figura 1. Representa um esquema em que são mostradas as condições de cultivo durante o ensaio.

[043] Figura 2. Representa o peso de plantas de tomate após 7 dias de crescimento nas diferentes soluções. * Diferenças significativas com relação ao grupo-controle com o mesmo tratamento com um p valor < 0,05;** Diferenças significativas com relação ao grupo- controle com o mesmo tratamento com um p valor < 0,01.

[044] Figura 3. Representa o conteúdo hídrico relativo dos diferentes tratamentos após 10 dias de ensaio.** Diferenças significativas com relação ao seu controle com um p valor < 0,01.

[045] Figura 4. Representa as medidas de fotossíntese líquida.** Diferenças significativas com relação ao controle seca com um p valor < 0,01

[046] Figura 5. Representa a eficiência no uso da água (Evapotranspiração/fotossíntese líquida. Evapotranspiração = μmol H2O s-1; Fotossíntese líquida = μmol CO2 m-2 s-1. ** Diferenças significativas com relação ao controle seca com um p valor <0,01

EXEMPLOS

[047] As condições descritas a seguir serão utilizadas como base para todos os exemplos incluídos a seguir. As condições de cultivo, tais como a solução nutritiva e o substrato empregado, foram otimizadas para a realização desse tipo de experimento. Do mesmo modo, a dose de NaCl utilizada foi otimizada para esse tipo de experimento, posto que 50 mM permite avaliar se um tratamento é capaz de aumentar a tolerância à salinidade (Jiménez-Arias et al., 2015. Environmental and Experimental Botany 120, 23 a 30).

[048] Para o cultivo das plantas de Arabidopsis thaliana necessárias para os ensaios, empregou-se um sistema de cultivo hidropônico. Esse sistema foi estabelecido em bacias de hidroponia com 1,9 l de capacidade (Araponics®) em que se cultivaram 18 plantas por recipiente. Uma mistura de areia de rio de duas granulometrias distintas foi usada como substrato físico. As sementes foram semeadas em contentores de sementes (seed-holders), que foram depositados durante uma semana em uma pequena estufa, que consiste em uma bandeja de polietileno de alta densidade com areia de rio (areia silícea lavada, com granulometria média) com água destilada estéril coberta com uma lâmina plástica transparente, que foi depositada em uma câmara de cultivo a 22 ± 2 °C, com um fotoperíodo de 16 horas de luz (100 a 110 μmol m-2 s-1 de PAR) e com 100% de umidade relativa. Após uma semana, os seed-holders com as plântulas foram transferidas a as bacias de hidroponia nas mesmas condições de fotoperíodo e intensidade luminosa, mas com 60 a 70% de umidade relativa. As plântulas foram mantidas sem arejamento durante a primeira semana, a partir da qual a solução (Tabela 1) foi generosamente arejada através de bombas de arejamento e foi renovada a cada 7 dias.TABELA 1. SOLUÇÃO HIDROPÔNICA UTILIZADA NOS EXPERIMENTOS

EXEMPLO 1. EFEITO DA ALANINA SOBRE A RESPOSTA DE A. THALIANA AO ESTRESSE SALINO PROVOCADO PELA ADIÇÃO DE NACL

[049] Para comprovar se a estrutura fundamental dos aminoácidos produz efeitos protetores frente ao estresse salino, utilizou-se um aminoácido simples como a alanina.

[050] Dessa forma, plantas de 21 dias foram tratadas durante 24 horas em solução nutritiva enriquecida com uma concentração de 2,5 mM de alanina. Posteriormente, as plantas foram depositadas em solução nutritiva normal durante 24 horas e posteriormente cresceram durante 7 dias em solução nutritiva, com ou sem um aporte de 50 mM de NaCl. Esse experimento foi repetido duas vezes, utilizando-se 12 plantas por experimento, sendo o valor mostrado na tabela 2 a média de 24 plantas para cada uma das condições.

[051] Posteriormente, passou-se a determinar o peso úmido da parte aérea das plantas.

[052] Na tabela seguinte (Tabela 2) são mostrados os resultados do aminoácido alanina sobre o desenvolvimento das plantas.TABELA 2: EFEITOS DA ALANINA SOBRE O CRESCIMENTO EM CONDIÇÕES IDEAIS E SALINAS.

[053] Os dados mostrados são a média de dois experimentos independentes com 24 plantas no total. Os ** mostram diferenças significativas com relação ao grupo- controle com p < 0,01. TCR: Taxa de crescimento relativo (T.C.R= (ln Ps2- ln Ps1) / (T2-T1); sendo ln logaritmo neperiano; Ps peso seco e T tempo).

[054] Como se pode observar, a estrutura representada pelo aminoácido alanina não foi capaz de promover o crescimento e nem de aumentar a tolerância à salinidade, parecendo ter prejudicado as plantas ante uma mesma dose de sal.

EXEMPLO 2. EFEITO DO ÁCIDO PIROGLUTÂMICO OU DO ÁCIDO PIPECOLÍNICO SOBRE A RESPOSTA DE A. THALIANA AO ESTRESSE SALINO PROVOCADO PELA ADIÇÃO DE NACL

[055] Plantas de 21 dias foram tratadas durante 24 horas em solução nutritiva enriquecida com uma concentração de 2,5 mM de ácido piroglutâmico ou o ácido pipecolínico. Posteriormente, as plantas foram depositadas em solução nutritiva normal durante 24 horas e cresceram posteriormente durante 7 dias em solução nutritiva com ou sem um aporte de 50 mM de NaCl. Esse experimento foi repetido duas vezes, empregando-se 12 plantas por experimento, sendo o valor mostrado na tabela 2 a média de 24 plantas para cada uma das condições.

[056] O peso fresco dos exemplares é mostrado na seguinte tabela (Tabela 3).TABELA 3: EFEITOS DE ÁCIDO PIROGLUTÂMICO E AC. PIPECOLÍNICO SOBRE O CRESCIMENTO EM CONDIÇÕES IDEAIS E SALINAS

[057] Os dados mostrados são a média de dois experimentos independentes com 24 plantas no total. Os ** mostram diferenças significativas com relação ao grupo- controle com um p < 0,01. TCR: Taxa de crescimento relativo (T.C.R= (ln Ps2- ln Ps1) / (T2-T1); sendo ln logaritmo neperiano; Ps peso seco e T tempo).

[058] Como se pode observar, o sal novamente diminuiu consideravelmente o crescimento, como mostra o peso fresco e a taxa de crescimento relativo da planta, após uma semana de submissão a estresse salino. Isso não ocorreu de maneira significativa naquelas plantas que foram tratadas previamente com 2,5 mM de ácido piroglutâmico ou com 2,5 mM de ácido pipecolínico, pelo que fica provado seu efeito sobre o aumento de tolerância frente ao estresse salino.

EXEMPLO 3. COMPARAÇÃO DO EFEITO DO ÁCIDO PIROGLUTÂMICO, DO ÁCIDO PIPECOLÍNICO OU DA HIDROXIPROLINA SOBRE A RESPOSTA DE A. THALIANA AO ESTRESSE SALINO PROVOCADO PELA ADIÇÃO DE NACL

[059] A fim de demostrar que a utilização desses compostos é mais efetiva que o uso de outros aminoácidos já descritos, como é o caso da hidroxiprolina (US20090054241 A1), comparou-se o efeito de um tratamento com dose de 2,5 mM de ácido piroglutâmico ou de ácido pipecolínico, ou de hidroxiprolina.

[060] As plantas foram depositadas em solução nutritiva enriquecida com algum dos compostos mencionados anteriormente durante 24 horas e cresceram posteriormente durante 7 dias em solução nutritiva com um aporte de 50 mM de NaCl. Como controle, foram utilizadas as plantas cultivadas sobre solução nutritiva e NaCl. Esse experimento foi repetido duas vezes, empregando-se 12 plantas por experimento, sendo o valor mostrado na tabela 2 a média de 24 plantas para cada uma das condições.

[061] A fim de ilustrar a defesa frente ao estresse salino, se empregam duas medidas. Mostra-se primeiro os valores para o índice de sensibilidade (S.I) descrito por Saadallah et al. (2001, Agronomie 21, 627 a 634).

[062] Quanto maior o valor negativo do S.I., maior o efeito negativo da salinidade sobre a planta. A segunda medida é uma porcentagem de redução da taxa de crescimento relativa da planta submetida a condições de estresse salino.

[063] Na tabela seguinte (Tabela 4) são mostrados os resultados.TABELA 4: EFEITOS DE ÁCIDO PIROGLUTÂMICO, ÁCIDO PIPECOLÍNICO OU A HIDROXIPROLINA SOBRE O ÍNDICE DE SENSIBILIDADE

[064] (S.I=PSs-PSc/PSc; sendo Peso seco plantas em condições salinas; Peso seco em condições de controle) e a porcentagem de redução da taxa de crescimento relativo (% Red. T.C.R=(TCRs-TCRc/TCRc)x100; sendo TCRs taxa de crescimento de plantas cultivadas em condições salinas; TCRc taxa de crescimento de plantas cultivadas em condições de controle). Os dados mostrados são a média de dois experimentos independentes com 24 plantas no total. Os ** mostram diferenças significativas com relação ao grupo-controle com um p < 0,01.

[065] Como se pode observar, a utilização de qualquer dos dois compostos aumentou consideravelmente a tolerância com relação à hidroxiprolina, pelo que o emprego desses compostos na mesma dose foi mais benéfico para o cultivo da planta em condições de estresse salino.

EXEMPLO 4. COMPARAÇÃO DO EFEITO DO ÁCIDO PIROGLUTÂMICO, DO ÁCIDO PIPECOLÍNICO OU DA HIDROXIPROLINA SOBRE A RESPOSTA DE SOLANUM LYCOPERSICUM (TOMATE) AO ESTRESSE SALINO PROVOCADO PELA ADIÇÃO DE NACL

[066] Esse ensaio permite demostrar que a utilização dos compostos da invenção é mais efetiva que o uso de outros aminoácidos já descritos, como é o caso da hidroxiprolina antes comentada, para cultivos de plantas comerciais. Como exemplo, foi usado tomate (Solanum lycopersicum) da variedade Pera realeza. O experimento se iniciou com tomates de três semanas de idade, que foram colocados em bacias de hidroponia, com 4 L de uma mistura de solução nutritiva (Tabela 1) e água destilada em uma proporção de 1:1.

[067] As bacias foram colocadas em uma câmara de cultivo a 22 ± 2 °C, com uma umidade relativa de 60 a 70%, utilizando um fotoperíodo de 16 horas de luz (100 a 110 μmol m-2 s-1 de PAR) . Desde o primeiro dia, a solução foi generosamente arejada por bombas de ar (30 min ao dia). As plantas foram mantidas durante dois dias com esta proporção de solução e água destilada, e em seguida foram retiradas do meio e colocadas, sob as mesmas condições ambientais, em frascos plásticos durante 24 horas com os tratamentos distintos em água destilada (tabela 5):TABELA 5: TRATAMENTOS EMPREGADOS NO ENSAIO

[068] Após 24 horas, as plantas foram novamente introduzidas nas bacias com a mesma proporção de água destilada/solução nutritiva antes mencionada e foram mantidas assim durante 48 horas. Então a solução nutritiva foi retirada de todas as bacias e trocada por 4 litros de uma nova solução com cada uma das condições sob estudo (Figura 1) mantendo-se as plantas nessas condições durante 7 dias (a quantidade de água de cada uma das bacias foi controlada a cada dois dias e, caso necessário, era corrigida com uma solução de NaCl em água destilada com a concentração estabelecida para a bacia.

[069] A seguir, comparou-se o crescimento das plantas tratadas e das não tratadas, em condições normais e em condições de salinidade. Para a análise estatística, os dados coletados foram submetidos à prova de normalidade do teste de Kolmogorov-Smirnov com a correção Lilliefors. Para comprovar a homocedasticidade dos dados, empregou-se o teste de Levene. Como os dados se comportaram seguindo uma distribuição normal, suas médias se compararam mediante one-way ANOVA e as diferenças significativas foram calculadas utilizando o teste post hoc de Bonferroni. As análises estatísticas foram realizadas com o pacote informático SSPS versão 20 para Windows.

[070] Como indica a figura 2, sob condições de controle, apenas as plantas tratadas com hidroxiprolina mostram um crescimento significativamente diferente do controle. Essas mostram um declínio em seu crescimento (de 35%), pelo que podemos estabelecer que o tratamento radicular com hidroxiprolina em nossas condições foi prejudicial para a planta.

[071] Quanto ao crescimento em condições salinas, pode-se observar como as plantas do grupo- controle diminuem seu crescimento em 32%. Essa diminuição se incrementa nas plantas tratadas com prolina mediante um tratamento radicular de 24 horas (42% com relação ao crescimento na solução-controle) ainda que não haja diferenças significativas quando se compara com o controle em condições salinas. Por sua vez, a hidroxiprolina apenas diminui seu crescimento em 17%. Quanto às plantas tratadas com ácido pipecolínico e piroglutâmico, o crescimento diminui apenas em 7 e 9% respectivamente, sendo esse valor de peso fresco muito significativo com relação a sua contrapartida no grupo- controle. Isso pressupõe um aumento de tolerância de 72% (piroglutâmico) e de 78% (pipecolínico), se comparamos com o controle, e se comparamos com o tratamento de prolina é de 78% (piroglutâmico) e de 83% (pipecolínico).

EXEMPLO 5. COMPARAÇÃO DO EFEITO DO ÁCIDO PIROGLUTÂMICO, DO ÁCIDO PIPECOLÍNICO OU DA HIDROXIPROLINA SOBRE A RESPOSTA DE SOLANUM LYCOPERSICUM (TOMATE) À SECA EM CONDIÇÕES DE ESTUFA (DÉFICIT HÍDRICO).

[072] O cultivo utilizado foi o tomate (Solanum lycopersicum) da variedade “Gransol” capa negra. O experimento foi realizado em uma estufa de cristal com quatro mesas de 10 metros de comprimento por 2 de largura. Utilizou-se irrigação por gotejamento, fornecido por gotejadores autocompensados para controlar o fluxo de água a todo momento.

[073] Foram transplantadas plantas de viveiro com cinco semanas de idade a potes de 2 litros de capacidade, utilizando uma mistura de turfa e areia de rio para facilitar a drenagem. No total, foram utilizadas 120 plantas de tomates. Após o transplante, foram realizados quatro tratamentos (espaçados a cada 15 dias) a 40 plantas, adicionando-se a cada pote 50 ml de uma concentração de 2,5 mM de Piroglutâmico. Outras 40 plantas foram tratadas mediante aplicações radiculares, utilizando 2,5 mM de ácido pipecolínico. O resto das plantas distribuídas aleatoriamente por toda a estufa foi tratado com água destilada a modo de controle. Ao finalizar os quatro tratamentos, começou o ensaio de seca, que foi realizado retirando-se o gotejador de 20 plantas escolhidas aleatoriamente para cada um dos tratamentos. As plantas foram privadas de água durante 10 dias.

[074] O conteúdo hídrico relativo da folha foi estimado aos 10 dias de seca para cada um dos tratamentos, em condições de controle e condições de seca, utilizando 15 folhas. Para isso foi empregada a seguinte formula:

[075] C.H.R (%)= [(Pf-Ps) / (Pt-Ps)] x 100

[076] Sendo Pf: peso fresco; Ps: peso seco; Pt: peso de turgor. O CHR é a medida mais empregada para estimar o possível déficit de água uma folha de planta possua.

[077] Por outro lado, estimou-se a fotossíntese com o sistema “Lc-pro sd” (ADC Bioscientific). Para isso, as folhas de tomate foram estimuladas com uma fonte de luz a 1.000 μmol m-2 s-1, sendo essa intensidade de luz previamente estimada para obter o máximo de fotossíntese em nosso cultivo e condições. Com isso, foram determinados os parâmetros de Fotossíntese líquida (A) e evapotranspiração (E), calculando-se com os mesmos a eficiência no uso da água (A/E), tal como descrevem Lambers et al. (2008. Plant Physiological Ecology. 2° edição. Springer, Nova York). As medidas foram tomadas aos 10 dias de ensaio de seis plantas para cada um dos tratamentos.

[078] Os dados das diferentes variáveis foram submetidos à prova de normalidade usando o teste de Kolmogorov-Smirnov com a correção Lilliefors. Para comprovar a homocedasticidade dos dados, foi empregado o teste de Levene. Como os dados se comportaram seguindo uma distribuição normal, suas médias foram comparadas mediante one-way ANOVA e as diferenças significativas foram calculadas utilizando o teste post hoc de Bonferroni. As análises estatísticas foram realizadas com o pacote informático SSPS versão 20 para Windows.

[079] Os resultados da análise estatística são mostrados na Figura 3, em que é possível observar como após dez dias de seca as plantas do controle diminuem significativamente seu conteúdo hídrico relativo (10,2%), enquanto as plantas tratadas com quatro tratamentos a 2,5 mM de piroglutâmico não apresentaram essa diminuição. As plantas tratadas com ácido pipecolínico apresentaram uma diminuição com relação ao seu controle, mas essa foi inferior à ocorrida nas plantas-controle (5,1%); contudo, essas diferenças não se mostraram significativas com relação a seu controle.

[080] Esses dados foram corroborados pelas medidas de intercâmbio gasoso. Como mostra a figura 4, as plantas tratadas com piroglutâmico ou pipecolínico tiveram uma fotossíntese líquida superior às plantas do controle seco.

[081] A análise das medidas de fotossíntese líquida e de evapotranspiração revelou que a eficiência no uso da água foi significativamente maior para as plantas tratadas (Figura 5). Essa eficiência foi quase o dobro nas plantas tratadas que no controle seco.

Claims

1. Método para aumentar a tolerância de plantas a condições de estresse osmótico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar à planta uma dose eficaz de pelo menos um composto de fórmula (III):

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARAC TERI ZADO pelo fato de que o composto da fórmula (III) é utilizado em solução aquosa.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de, além do composto da fórmula (III), ser utilizado um ingrediente ativo selecionado a partir de um nematicida, inseticida, acaricida, fungicida, bactericida e herbicida.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, CARAC TERI ZADO pelo fato do estresse osmótico ser produzido por um déficit hídrico ou pela salinidade.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARAC TERI ZADO pelo fato da aplicação do composto da fórmula (III) ser levada a cabo através do uso de uma técnica selecionada dentre pulverização, injeção, irrigação, imersão e aplicação em substrato.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, CARAC TERI ZADO pelo fato aplicação ser feita por imersão no sistema radicular.

7. Método, de acordo com qualquer uma reivindicações de 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato aplicação ser feita por imersão de sementes.