BR112017021862B1 - Método e sistema para identificar micro-organismos - Google Patents
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Abstract
método e sistema para identificar micro-organismos. é fornecido um método de identificação de microorganismos. o método compreende: adquirir dados representando uma região em uma placa dentro da qual pelo menos uma colônia de micro-organismos está disposta; expor uma colônia alvo de pelo menos uma colônia de microorganismos para um feixe de luz coerente, de acordo com os dados; monitorar um padrão de difração resultante da difração da luz pela colônia alvo; e gerar dados de colônia alvo de acordo com o padrão de difração monitorado e um padrão de difração de referência.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um método e sistema para identificar micro-organismos.
[002] Os sistemas e métodos para rápida detecção e caracterização de colônias bacterianas utilizando a dispersão de luz são conhecidos, por exemplo, a partir do documento US 7465560. O sistema para caracterizar colônias bacterianas descrito aqui compreende uma fonte de luz, um suporte adaptado para manter um meio sólido tendo uma superfície adaptada para o crescimento de uma colônia bacteriana, um suporte disposto de tal maneira que a luz emanando da fonte de luz colide sobre pelo menos uma colônia cultivada no meio sólido, e uma película ou um sensor óptico eletrônico para obter uma imagem. O método de rápida detecção e caracterização de colônias bacterianas inclui uma colônia bacteriana em um meio sólido sendo disposta entre um laser e um detector óptico. A luz da fonte de luz é dirigida para a colônia bacteriana e a luz dispersa pela bactéria é detectada pelo detector óptico. O sinal é então analisado por um analisador e é exibido em uma tela ou salvo em um meio de armazenamento.
[003] Um método para testar colônias bacterianas cultivadas em meios sólidos e um sistema óptico para testar colônias bacterianas cultivadas em meio sólido são conhecidos a partir de PL 218010 B1. O método inclui colônias bacterianas sendo irradiadas com um feixe de luz laser, que é então detectado, e espectros de difração são analisados. Um feixe colimado de luz de uma fonte de luz coerente é filtrado em um filtro de amplitude, polarizado em um polarizador linear e expandido usando um expansor de feixe. O diâmetro de feixe é ajustado com um diafragma de íris e o feixe converge no plano focal posterior de uma lente positiva. Assim formado, o feixe de luz esférico convergente irradia a colônia bacteriana que está sendo testada, que está disposta em um meio transparente colocado em uma placa transparente montada em um suporte entre a lente e seu plano focal posterior. O feixe é transmitido e difratado através da colônia bacteriana, e a luz é monitorada pelo detector. A distribuição bidimensional da intensidade luminosa da luz difratada através da colônia bacteriana é então gravada e analisada em um computador. O sistema óptico para testar colônias bacterianas cultivadas em meios sólidos compreende um laser e um detector conectados com um sistema de análise que compreende uma tela e um meio de armazenamento. O sistema compreende uma fonte de luz coerente gerando um feixe colimado de luz ao longo de um eixo óptico do sistema. Arranjados ao longo do eixo óptico são um filtro de amplitude, um polarizador linear, um expansor de feixe, um diafragma de íris e uma lente positiva. Uma colônia bacteriana a ser testada é disposta em um meio transparente colocado em uma placa transparente montada em um suporte, e um detector conectado a um computador é fornecido.
[004] Nos campos de reconhecimento de bactérias e micro-organismos, a velocidade e a confiabilidade com que as espécies podem ser caracterizadas são de grande importância. Portanto, existe uma demanda por técnicas de análise por difração mais rápidas, eficientes e precisas para a identificação microbiana.
[005] De acordo com a invenção, é fornecido um método de identificação de micro-organismos, o método compreendendo:adquirir dados representando uma região em uma placa dentro da qual pelo menos uma colônia de micro-organismos está disposta;expor uma colônia alvo de pelo menos uma colônia de micro-organismos para um feixe de luz coerente, de acordo com os dados;monitorar um padrão de difração resultante da difração da luz pela colônia alvo; egerar dados de colônia alvo de acordo com o padrão de difração monitorado e um padrão de difração de referência.
[006] O método permite o teste rápido, eficiente, preciso, não destrutivo e sem contato de colônias bacterianas utilizando análise por difração em uma maneira que tem como alvo colônias microbianas individuais com base em dados representando a distribuição de colônias em uma placa. Os dados podem ser adquiridos por uma ou mais de uma variedade de métodos, incluindo: tirar uma imagem da placa; escanear a placa com um feixe de radiação; inocular uma ou mais colônias em posições conhecidas ou predeterminadas na placa; e receber dados representando a distribuição de microorganismos na placa de um sistema separado ou remoto ou dispositivo de monitoramento.
[007] Os dados representando a região na placa podem tipicamente compreender dados ópticos que representam uma imagem da região, e a posição na placa da colônia alvo de pelo menos uma colônia de micro-organismos pode ser localizada de acordo com os dados ópticos.
[008] Normalmente, os dados de colônia alvo incluem dados que indicam uma espécie presente na colônia alvo. O método pode assim permitir a identificação de microorganismos com base na maneira característica em que uma colônia de micro-organismos se comporta como um elemento óptico e difrata a luz que é incidente sobre ela.
[009] De preferência, os dados adquiridos representando a região na placa compreendem uma indicação da posição na placa da colônia alvo. Onde os dados compreendem uma imagem de uma região na placa, a posição da colônia pode ser indicada por um padrão óptico visível correspondente à colônia com propriedades ópticas diferentes, como uma opacidade, translucidez ou uma cor que permite distinguir visualmente a partir da placa circundante e o meio de crescimento, cada dos quais será normalmente transparente.
[0010] Em algumas modalidades, a exposição da colônia alvo de pelo menos uma colônia de micro-organismos ao feixe de luz coerente de acordo com os dados compreende: localizar a posição na placa da colônia alvo de acordo com os dados; e expor a colônia alvo ao feixe de luz coerente. Assim, os dados permitem que uma posição na placa, ou dentro da região na placa, da colônia alvo seja calculada de modo que esta colônia possa ser alvejada pelo feixe de luz coerente com a finalidade de identificação de análise por difração.
[0011] Normalmente, os dados de colônia alvo são gerados com base no padrão de difração monitorado e em um padrão de difração de referência. Na prática, um computador pode ser usado para comparar rapidamente o padrão monitorado com um grande número de padrões de difração de referência. Uma vez que diferentes espécies (ou diferentes tipos, gêneros, famílias, ordens, filos ou outras categorias taxonômicas) de micro-organismos podem ter propriedades ópticas e morfológicas características diferentes, o padrão de difração produzido quando uma colônia é irradiada pode permitir que a espécie ou tipo de micro-organismo presente na colônia seja identificado por reconhecer um grau de similaridade entre o padrão e um padrão de referência produzido por uma espécie ou tipo conhecido de micro-organismo. Normalmente, portanto, os dados de colônia alvo são gerados por comparar o padrão de difração monitorado com o padrão de difração de referência.
[0012] O método pode ainda compreender: gerar um parâmetro de comparação com base em uma comparação do padrão de difração monitorado com cada de uma pluralidade de padrões de difração de referência, cada padrão de difração de referência correspondente a uma espécie predeterminada; e identificar as espécies alvo presentes na colônia alvo como as espécies predeterminadas para as quais o parâmetro de comparação gerado tem o maior valor.
[0013] Normalmente, a exposição da colônia alvo ao feixe de luz coerente compreende fazer o feixe de luz coerente incidir sobre uma porção da região na placa correspondente à posição na placa da colônia alvo.
[0014] Normalmente, uma parte da região na placa sobre a qual o feixe de luz coerente incide é ajustada por ajustar um ou mais de: a direção do feixe; a posição da fonte do feixe; e a posição da placa. Esse movimento é, de preferência, efetuado por meio de mecanismos automatizados de modo que o método possa ser realizado em uma forma consistente, repetível e eficiente.
[0015] Normalmente, o método compreende ainda ajustar o ponto em que o eixo central do feixe incide sobre a placa de modo que este ponto seja centrado na posição na placa da colônia alvo.
[0016] Normalmente, o método compreende ainda ajustar as posições relativas de uma fonte do feixe de luz coerente e a placa de tal modo que o feixe é direcionado para a posição na placa da colônia alvo.
[0017] De preferência, expor a colônia alvo ao feixe de luz coerente compreende direcionar o feixe para um centroide óptico da colônia alvo. O centroide óptico corresponde a um ponto no interior da colônia alvo, que pode ser o mesmo que ou diferente a partir do centroide geométrico da colônia, que resulta no padrão de difração de mais alta qualidade sendo produzido quando o feixe de luz é centrado sobre esse ponto.
[0018] O método pode ainda compreender gerar um parâmetro de simetria para um ponto dentro da região na placa com base na simetria do padrão de difração monitorado produzido quando o feixe de luz coerente é centrado nesse ponto, e; em que o centroide óptico é definido como um ponto dentro da colônia alvo correspondente ao maior valor do parâmetro de simetria.
[0019] Normalmente, o parâmetro de simetria para um ponto dentro da região na placa é gerado com base em qualquer simetria, contraste ou homogeneidade do padrão de difração monitorado produzido quando o feixe de luz coerente é centrado nesse ponto.
[0020] Normalmente, dirigir o feixe para o centroide óptico compreende ajustar o ponto em que o eixo central do feixe de luz coerente incide na placa e monitorar o padrão de difração resultante de modo a verificar um ponto dentro da colônia alvo que corresponde a um valor máximo do parâmetro de simetria.
[0021] Normalmente, dirigir o feixe em direção ao centroide óptico compreende ajustar as posições relativas da placa e uma fonte do feixe de modo que o feixe coincide com a posição na placa da colônia alvo, e corrigir as posições relativas até o feixe coincidir com um ponto correspondente a um valor máximo do parâmetro de simetria.
[0022] Normalmente, dirigir o feixe para o centroide óptico compreende iterativamente ajustar o ponto dentro da região na placa sobre a qual o eixo central do feixe incide e gerar um parâmetro de simetria, até que seja gerado um valor máximo do parâmetro de simetria e um ponto correspondente a este valor é localizado.
[0023] Normalmente, expor a colônia alvo para um feixe de luz coerente compreende ajustar um sistema óptico compreendendo uma fonte do feixe de luz coerente em relação à placa de modo que o feixe é direcionado para a posição na placa da colônia alvo.
[0024] O método pode compreender ajustar o sistema óptico em relação à placa por mover a placa em qualquer uma de uma direção Z paralela ao eixo óptico do sistema e direções X e Y perpendiculares ao eixo óptico do sistema.
[0025] Normalmente, a aquisição dos dados compreende adquirir uma imagem da região na placa. Isto pode ser realizado com qualquer dispositivo de imagem adequado para gravação de dados ópticos indicando a posição ou distribuição de colônias na placa. A iluminação para gravação da imagem pode ser fornecida por luz ambiente, luz coerente da fonte do feixe ou uma fonte de luz separada capaz de produzir radiação de uma frequência e intensidade adequadas para permitir que as colônias sejam visualmente distinguidas na placa.
[0026] Normalmente, a aquisição dos dados compreende adquirir dados ópticos por expor a região na placa à radiação e adquirir uma imagem da região e a pelo menos uma colônia de micro-organismos. A imagem pode ser gravada a partir de uma direção perpendicular à região de superfície da placa dentro da qual a pelo menos uma colônia está disposta. A imagem também pode ser gravada a partir de uma direção paralela à região de superfície da placa dentro da qual a pelo menos uma colônia está disposta.
[0027] Normalmente, a imagem é gravada a partir da direção paralela à superfície da placa por gravar o feixe refletido a partir de um divisor de luz.
[0028] O método pode compreender localizar a posição na placa da colônia alvo por analisar a imagem adquirida utilizando um computador configurado para processar dados de imagem de modo a identificar e localizar a posição de uma colônia de micro-organismos dentro da imagem.
[0029] Normalmente, a aquisição dos dados compreende fazer com que o feixe de luz coerente escaneie a região na placa. O método pode incluir localizar a posição na placa da colônia alvo através do monitoramento da luz resultante do feixe de luz coerente escaneando a região na placa e detectar luz difratada pela colônia alvo.
[0030] Em algumas modalidades, antes do monitoramento do padrão de difração da colônia alvo: a pelo menos uma colônia de micro-organismos disposta dentro da região na placa é irradiada; uma imagem de toda a placa e a pelo menos uma colônia de micro-organismos é gravada, enviada para um computador, analisada utilizando algoritmos computacionais para processamento de informações visuais, e a localização de pelo menos uma colônia de micro-organismos gravada é distinguida e identificada e, então: a placa e a pelo menos uma colônia de micro-organismos são movidas em relação a um sistema óptico compreendendo uma fonte do feixe de luz coerente; e uma única colônia de micro-organismos de pelo menos uma colônia de micro-organismos é irradiada com o feixe de luz coerente e, após o monitoramento do padrão de difração da colônia alvo, o padrão é gravado e comparado com um padrão de referência.
[0031] Em algumas modalidades, após a localização na placa das colônias de micro-organismos ser distinguida e identificada, a placa é movida em relação ao sistema óptico e uma imagem ampliada de cada de pelo menos uma colônia individual é adquirida.
[0032] Normalmente, os algoritmos para processamento de informações visuais compreendem análise de morfologias de colônias. O uso de dados morfológicos, que são dados relacionados a ou indicando formas físicas ou aparentes e propriedades geométricas das colônias microbianas, fornece uma visão mais aprofundada das propriedades da colônia alvo. Esses dados podem ser usados em combinação com dados de análise por difração para identificar ou caracterizar com mais precisão micro-organismos dentro da colônia alvo.
[0033] Normalmente, o feixe de luz coerente compreende um raio laser. Devido à natureza colimada, coerente e monocromática dos feixes de luz produzidos por laser, os padrões de difração de um raio laser passado por objetos são adequados para analisar ou medir as dimensões ou propriedades geométricas de objetos ou elementos que variam de nanômetros a milímetros de tamanho ou periodicidade.
[0034] Cada um dos padrões de difração, que é o padrão monitorado para uma colônia, ou um padrão de referência, pode compreender um espectro de difração.
[0035] Em algumas modalidades, o passo de aquisição dos dados pode ser repetido pelo menos até que os dados adquiridos indiquem a posição na placa da colônia alvo. O passo pode ser repetido em um intervalo predeterminado e durante um período de tempo suficientemente longo para que uma colônia de micro-organismos cresça na placa, e dados indicando a posição na placa da colônia alvo podem ser definidos pela colônia alvo que cresceu para um tal tamanho que pode ser visualmente localizada de acordo com os dados.
[0036] Em algumas modalidades, os passos de expor a colônia alvo ao feixe, monitorar o padrão de difração, e gerar dados de colônia alvo são repetidos pelo menos até que os dados de colônia alvo incluam uma espécie identificada presente na colônia alvo. Os passos podem ser repetidos de acordo com um intervalo de tempo predeterminado e durante um período de tempo suficientemente longo para que uma colônia de micro-organismos cresça na placa, e os dados de colônia alvo podem incluir uma espécie identificada presente na colônia alvo definida pela colônia alvo tendo crescido até um tamanho tal que o padrão de difração contém dados suficientes para identificar a espécie com referência a um padrão de difração de referência.
[0037] Os dados de colônia alvo podem ser gerados de acordo com dois ou mais padrões de difração monitorados, em que os dois ou mais padrões são monitorados em momentos diferentes e são representativos das propriedades difrativas da colônia alvo nos diferentes momentos. Os dados de colônia alvo podem ser representativos de uma alteração nas propriedades difrativas da colônia alvo entre os diferentes momentos.
[0038] Em algumas modalidades, o método compreende ainda: inocular pelo menos um micro-organismo na placa; e incubar pelo menos um micro-organismo de modo a permitir o desenvolvimento de pelo menos uma colônia de microorganismos disposta na região na placa.
[0039] Cada da inoculação e incubação pode ser realizada por um sistema automatizado de acordo com parâmetros de inoculação e parâmetros de incubação predeterminados, respectivamente. Os parâmetros de inoculação e incubação podem ser configurados de modo que, cada vez que o método seja realizado, os processos físicos pelos quais as colônias de micro-organismos são inoculadas e incubadas são realizados de forma idêntica. Ter a inoculação e incubação realizadas por um sistema automatizado ou robótico, de forma repetitiva, minimiza a variação e melhora a repetibilidade da cultura de colônias microbianas para análise. Desta forma, resultados de análise superiores são alcançados, uma vez que os efeitos de quaisquer variações nas condições em que os micro-organismos são dispostos e desenvolvidos serão mitigados. Além disso, os parâmetros podem ser ajustados ou otimizados para preparar colônias mais confiáveis ou mais eficientes que são otimizadas para difração ou análise morfológica.
[0040] Em algumas modalidades, os dados representando a região na placa são adquiridos de acordo com os parâmetros de inoculação, de modo que os dados incluem uma indicação da porção da placa dentro da qual o pelo menos um micro-organismo foi disposto; e a posição na placa da colônia alvo está localizada de acordo com a porção indicada da placa. Esta técnica para localizar colônias alvo pode ser usada como uma alternativa às técnicas de aquisição de dados ou em combinação com elas envolvendo dados ópticos, como o escaneamento de feixe ou captura de instantâneos.
[0041] Os dados representando a região na placa podem tipicamente compreender dados ópticos representando uma imagem da porção indicada; e a posição na placa da colônia alvo pode estar localizada de acordo com os dados ópticos. A aquisição dos dados ópticos pode compreender fazer com que o feixe de luz coerente escaneie a porção indicada da placa; e localizar a posição da colônia alvo pode compreender monitorar a luz resultante do feixe de luz coerente escaneando a porção da placa e detectar luz difratada pela colônia alvo.
[0042] Normalmente, a região na placa compreende um meio de cultura, e a pelo menos uma colônia de microorganismos está disposta no meio. Este meio de crescimento ou meio de cultura pode compreender um líquido ou um gel adequado para suportar o crescimento de micro-organismos.
[0043] Algumas modalidades do método podem compreender fazer com que o feixe de luz escaneie a placa ao longo de um caminho representando uma faixa de inoculação pela qual o pelo menos um micro-organismo foi inoculado na placa. Deste modo, os dados representando a região da placa são adquiridos por meio da gravação da posição na placa em que os micro-organismos foram dispostos, por exemplo, por um dispositivo de inoculação automatizado ou robótico, e tomar essa posição para ser, ou para ser proximal para, a posição da colônia alvo, uma vez que esta foi incubada para um tamanho suficiente para análise pela invenção.
[0044] A invenção é adequada para localizar, analisar, caracterizar e identificar bactérias em colônias bacterianas. Além disso, o método é adequado para uso com colônias que compreendem bactérias, arqueias, eucariotas, protistas, rotíferos, fungos e células de levedura, e identificar micro-organismos compreendendo qualquer um desses.
[0045] De acordo com a invenção, também é fornecido um sistema para identificar micro-organismos, o sistema compreendendo:uma placa sobre a qual colônias de micro-organismos podem ser dispostas;uma fonte de luz coerente;um mecanismo configurado para dirigir um feixe de luz coerente emitido pela fonte de luz em relação à placa;um computador configurado para adquirir dados representando uma região em uma placa dentro da qual pelo menos uma colônia de micro-organismos está disposta, e para controlar o mecanismo de modo a expor uma colônia alvo de pelo menos uma colônia de micro-organismos ao feixe, de acordo com os dados; eum detector configurado para monitorar um padrão de difração resultante da difração da luz pela colônia alvo;em que o computador é ainda configurado para gerar dados de colônia alvo de acordo com o padrão de difração monitorado e um padrão de difração de referência.
[0046] Exemplos da presente invenção serão agora descritos, com referência aos desenhos anexos, nos quais:A Figura 1 é uma vista em perspectiva mostrando um primeiro sistema de exemplo para a identificação de microorganismos de acordo com a invenção;A Figura 2 é um fluxograma ilustrando um primeiro método de exemplo de acordo com a invenção;A Figura 3A e a Figura 3B são diagramas esquemáticos mostrando duas alternativas de um segundo sistema de exemplo de acordo com a invenção;A Figura 4 é um fluxograma ilustrando um segundo método de exemplo de acordo com a invenção;A Figura 5 é um fluxograma ilustrando um terceiro método de exemplo de acordo com a invenção;A Figura 6A e a Figura 6B são diagramas esquemáticos mostrando duas alternativas de um terceiro sistema de exemplo de acordo com a invenção;A Figura 7 é um fluxograma ilustrando um quarto método de exemplo de acordo com a invenção;A Figura 8 é um diagrama esquemático mostrando um quarto sistema de exemplo de acordo com a invenção;A Figura 9 é um fluxograma ilustrando um quinto método de exemplo de acordo com a invenção;A Figura 10 é um fluxograma ilustrando um sexto método de exemplo de acordo com a invenção; A Figura 11 é um fluxograma ilustrando um sétimo método de exemplo de acordo com a invenção;A Figura 12 é uma vista em perspectiva de um quinto sistema de exemplo de acordo com a invenção;A Figura 13 é um fluxograma ilustrando um oitavo método de exemplo de acordo com a invenção; e,A Figura 14 é um fluxograma ilustrando um nono método de exemplo de acordo com a invenção.
[0047] Com referência à Figura 1, um sistema 15 para identificar micro-organismos é ilustrado por uma vista em perspectiva mostrando as características de aparelho principal do sistema adequado para a realização do método da invenção. O sistema compreende um laser 5 configurado para gerar um raio laser, que é um feixe de luz monocromática coerente, tendo um comprimento de onda da mesma ordem que o tamanho linear dos micro-organismos ou bactérias em estudo. O laser 5 é disposto para projetar o feixe 23 ao longo de uma direção correspondente ao eixo óptico do sistema. Uma placa transparente 1 é posicionada em um suporte 8 de tal modo que a placa está no eixo óptico do sistema, que está substancialmente no caminho do feixe 23. No presente exemplo, a placa 1 compreende uma placa de ágar que compreende uma placa petri contendo um meio de crescimento incluindo ágar e nutrientes, adequada para a cultura de micro-organismos. No exemplo ilustrado, várias colônias 17 de bactérias estão dispostas na placa 1. Um detector óptico 14 compreendendo um dispositivo de imagem de CCD é montado no suporte 21 e é posicionado dentro do eixo óptico do sistema e no lado oposto da placa 1 para o laser 5. Assim, o arranjo é tal que a luz do laser 5 pode passar através da placa 1 e ser recebida pelo detector 14.
[0048] O laser 5 é montado em um mecanismo 19 que permite que o laser seja movido nos eixos ascendente- descendente e esquerdo-direito em relação à direção do feixe. Ou seja, o mecanismo 19 pode mover o laser em ambos os eixos que são ortogonais ao eixo óptico do sistema. Assim, o mecanismo pode fazer com que o raio laser 23 incida em qualquer parte da placa 1 por meio da movimentação da fonte de luz 5 em conformidade. Além disso, o mecanismo 19 pode mover o laser 5 em direções paralelas ao eixo óptico do sistema, de modo a alterar a distância entre o laser 5 e a placa 1. O laser 5 contém elementos ópticos necessários para modular o feixe 23 de modo a estreitar ou ampliar o feixe, ou focar o feixe em um ponto específico, conforme necessário para análise óptica de colônias bacterianas 17.
[0049] Além disso, o suporte 8 também pode compreender um mecanismo capaz de mover a placa em duas dimensões dentro da placa ortogonal ao eixo óptico do sistema. Assim, o laser e a placa podem ser movidos em relação um ao outro movendo um ou ambos do laser e a placa.
[0050] O movimento desses mecanismos é controlado pelo computador 4, que é conectado eletricamente ao mecanismo 19, bem como ao suporte 8 no caso em que o suporte 8 também compreende um mecanismo para mover a placa. O computador é ainda conectado ao dispositivo de câmera digital 14, e é configurado para receber dados ópticos ou de imagem monitorados pelo detector.
[0051] A Figura 1 mostra uma colônia alvo 20 da pluralidade de colônias bacterianas 17 dispostas na placa, sendo irradiadas pelo raio laser 23. No arranjo representado, o mecanismo 19 foi controlado pelo computador 4 para mover o laser 5 de tal modo que o feixe 23 emitido a partir do laser incide na colônia alvo 20. O dispositivo laser 5 também foi controlado pelo computador 4 para confinar e focar o feixe 23 de modo a irradiar a colônia alvo 20 especificamente sem expor nenhuma das outras colônias dispostas na placa 1 para a luz coerente 23. A luz coerente 23 é difratada à medida que passa através da colônia alvo. O padrão da pluralidade de bactérias dentro da colônia 20 faz com que a colônia atue como um elemento de difração ou uma grade de difração bidimensional, e resulta na formação de um padrão de difração bidimensional 16. Os parâmetros ópticos do feixe, e a posição e o tamanho do detector, são configurados e dispostos de modo que o padrão de difração 16 seja recebido pelo detector 14, de modo que os dados de imagem representativos do padrão 16 possam ser enviados ao computador para que sejam armazenados e analisados. Usando o sistema 15, um padrão de difração característico 16 produzido por uma colônia bacteriana particular 20 pode então ser comparado visualmente, por meio de técnicas de análise de imagem de computador, com padrões de difração de referência representativos dos padrões equivalentes produzidos por espécies de bactérias conhecidas ou predeterminadas. Desta forma, o sistema permite que bactérias dentro de colônias individuais sejam identificadas de forma direcionada.
[0052] Com referência à Figura 1 e à Figura 2, um primeiro método de exemplo de acordo com a invenção, que pode ser realizado utilizando o primeiro sistema de exemplo, é agora descrito. O método começa no passo 101 em que são adquiridos dados representando uma região na placa 1 dentro da qual pelo menos uma colônia de micro-organismos está disposta 17. No exemplo atualmente ilustrado, os dados representando a região na placa compreendem dados ópticos representando uma imagem da região. Estes dados compreendem uma imagem digital de uma região da placa 1 que é capturada pela câmera de CCD 14. A câmera 14 compreende os elementos ópticos de requisito para capturar uma imagem visual, ou instantâneo, da placa ou uma região particular da placa, de modo que as colônias bacterianas 17, ou a distribuição espacial das colônias, sejam visíveis dentro da imagem. Desta forma, os dados da imagem representam a região.
[0053] Uma colônia alvo 20 de pelo menos uma colônia de micro-organismos 17 é, então, exposta ao feixe 23 de luz coerente, de acordo com os dados, no passo 102. Focalizar o feixe de laser 23 sobre a colônia alvo 20 utilizando os dados de imagem adquiridos para localizar a posição da colônia alvo dentro da região na placa, e controlar o mecanismo 19 para direcionar o laser 5 de tal forma que o feixe emitido coincida com a colônia alvo. O mecanismo 19 é controlado pelo computador 4. O sinal que o computador envia ao mecanismo 19 para mover o laser é gerado pelo computador com base na posição localizada da colônia alvo 20 dentro da imagem instantânea adquirida pela câmera 14 e recebida pelo computador. A imagem instantânea é analisada utilizando algoritmos computacionais para processar informações visuais, que distinguem as colônias bacterianas individuais dentro da imagem e adquirem as posições das colônias dentro da imagem. O computador é configurado com dados que relacionam coordenadas ou posições dentro da imagem 2 correspondendo a coordenadas ou posições físicas na placa 1, e, assim, as posições de imagem adquiridas são convertidas em posições alvo físicas na placa em que o laser pode ser direcionado. Assim, o feixe colimado de luz coerente é feito irradiar uma única colônia bacteriana selecionada em um determinado momento, e assim produzir uma imagem de difração representativa das bactérias presentes na única colônia selecionada.
[0054] No passo 103, o padrão de difração resultante da difração da luz pela colônia alvo é monitorado pelo detector 14. No presente exemplo, o detector é capaz de, e configurado para, ajustar sua configuração óptica e de detecção para monitorar o padrão de difração em passo 103, bem como adquirir os dados de imagem no passo 101. O padrão de difração monitorado é enviado do detector 14 para o computador 4 através da conexão elétrica representada na Figura 1. Deve ser entendido que as conexões com fio ilustradas podem ser prontamente substituídas para conexões de dados sem fio adequadamente configuradas.
[0055] No passo 104, os dados de colônia alvo são gerados pelo computador 4 de acordo com o padrão de difração monitorado e um padrão de fração referenciado. Para fins de comparação e identificação, uma pluralidade de padrões de difração referenciados é armazenada no computador, com cada padrão de referência correspondente a uma espécie, tipo ou outra classificação taxonômica ou grupo de bactérias ou outro micro-organismo conhecidos. Os dados de colônia alvo são gerados por software de análise de padrões ou algoritmos executados pelo computador que comparam o padrão de difração monitorado com qualquer ou cada dos padrões de difração referenciados para estabelecer qual dos padrões de referência possui o maior grau de similaridade visual com o padrão monitorado. Isso é feito por meio da geração de um parâmetro de comparação para cada dos padrões de referência, e determinação da espécie, tipo ou outra classificação das bactérias presentes na colônia alvo 20 para ser a mesma a partir da qual o padrão de referência com o maior parâmetro de comparação foi gerado.
[0056] Uma vez que a colônia alvo 20 foi testada e as espécies dentro da colônia identificadas nos dados de colônia alvo, uma segunda colônia alvo pode ser selecionada das outras colônias 17 dispostas na placa. O laser pode então ser movido em relação à placa de modo que a nova colônia alvo seja irradiada pelo feixe e os passos 102 a 104 podem ser repetidos para esta colônia alvo, bem como quaisquer outras colônias identificadas dentro da região da placa.
[0057] Com referência às Figuras 3A e 3B, são ilustradas duas alternativas de um segundo sistema de exemplo 15 de acordo com a presente invenção. O sistema de medição para testar bactérias cultivadas em meios sólidos compreende uma fonte de luz 5 na forma de um laser. Um elemento 6 para modular um feixe de luz a partir da fonte de luz 5 é disposto de acordo com o eixo óptico da fonte de luz. O elemento de modulação 6 compreende um filtro de amplitude, um polarizador linear, um expansor de feixe e um diafragma de íris. Uma lente convergente 11 é disposta no lado de saída de feixe do elemento de modulação 6. Uma placa transparente 1 é disposta ao longo do eixo óptico do sistema, juntamente com um meio com colônias bacterianas. A placa é montada em um suporte 8 compreendendo um acionamento 9. O suporte 8 compreende uma fonte de luz radiante sob a forma de diodos emissores de luz dispostos em um anel na borda da placa transparente 1. Um detector 7 na forma de uma câmera é disposto, ao longo do eixo óptico, atrás da placa transparente 1. O detector é conectado a um computador 4. O computador 4 compreende um sistema para analisar espectros de difração e algoritmos para processamento de informações visuais, que incluem a análise de morfologias de colônias. Entre a lente 11 e a placa transparente 1, um divisor de luz 3 é disposto obliquamente na direção da propagação do feixe de luz. O divisor de luz 3 tem a forma de um cubo divisor de feixe. Em algumas modalidades, o divisor 3 pode compreender um paralelo óptico de vidro fino coberto por uma película de divisão de luz. Uma câmera adicional 2 é disposta sobre o divisor de luz 3 e é conectada ao computador 4. O suporte 8 compreende o acionamento 9 para mover o suporte, o que permite que o suporte 8 seja movido, com a placa transparente 1, nas direções X e Y perpendiculares ao eixo óptico do sistema, como mostrado na Figura 3A ou, adicionalmente, na direção Z paralela ao eixo óptico do sistema, o que é indicado na Figura 3B.
[0058] Com referência à Figura 4, um segundo método de exemplo de acordo com a invenção, que pode ser realizado no sistema como mostrado na Figura 3A e Figura 3B, é ilustrado por um fluxograma. O método começa no passo 401 em que uma imagem de todo o meio, juntamente com colônias bacterianas dispostas na placa transparente 1, é gravada com a câmera adicional. A imagem é gravada a partir de uma direção perpendicular ao eixo óptico do sistema, que é uma direção paralela à superfície da placa transparente 1, com a câmera adicional 2 por gravação do feixe refletido a partir do divisor de luz 3. O divisor de luz 3 é situado, no exemplo descrito, em um ângulo de 45 graus para o eixo óptico do sistema, e a câmera adicional 2 é situada perpendicularmente ao eixo óptico do sistema. É possível tirar uma fotografia por meio da iluminação do sujeito por radiação emitida a partir da fonte dentro do suporte 8. No passo 402, a imagem de todo o meio e colônias bacterianas é enviada ao computador 4. É então analisada pelo computador 4, no passo 403, utilizando algoritmos de computador para processamento de informações visuais. As colônias bacterianas na fotografia são distinguidas e seus locais exatos são identificados. No passo 404, a placa transparente 1 com as colônias bacterianas é então movida para um local no qual uma única colônia alvo é colocada no eixo óptico do sistema. A placa é movida por meio da mudança da localização do suporte 8 em que a placa é montada, utilizando o acionamento 9 que controla o movimento do suporte 8 nas direções X e Y perpendiculares ao eixo óptico do sistema, conforme mostrado em Figura 3A, ou em três direções: ao longo do eixo óptico do sistema e nas direções X e Y perpendiculares ao eixo óptico do sistema, como mostrado na Figura 3B. No passo 405, a colônia bacteriana única é então irradiada com o feixe de luz coerente que se projeta a partir da fonte de luz 5 e passa através do elemento 6, que modula o feixe. No passo 406, utilizando o detector 7, que tem a forma de uma câmera, são tomadas uma série de medidas dos espectros de difração das colônias bacterianas dispostas na placa transparente 1. No passo 407, os espectros de difração das colônias bacterianas individuais são comparados com os espectros de referência e, com base em suas características de classificação, as espécies bacterianas são diferenciadas. A placa transparente 1 com as colônias bacterianas é, então, movida, utilizando o acionamento 9 do suporte 8 em que a placa é montada, para uma localização na qual outra colônia única é posicionada no eixo óptico do sistema, como no passo 404. Essa colônia bacteriana é então irradiada com o feixe de luz coerente que se projeta a partir da fonte de luz 5 e passa através do elemento de modulação, como no passo 405. Os passos até 407 são repetidos, até que cada colônia tenha sido irradiada com o feixe convergente de luz coerente gerada pela fonte 5 e modulada pelo elemento de modulação 6, compreendendo elementos ópticos que alteram o diâmetro, intensidade e frente de onda do feixe.
[0059] Com referência à Figura 5, o fluxograma mostra um terceiro método de exemplo de acordo com a invenção, que tem vários passos (501 a 504) em comum com o segundo método de exemplo descrito acima. No passo 504, depois de distinguir e identificar a localização exata na placa transparente 1 das colônias bacterianas gravadas, a placa transparente 1 é movida, utilizando o acionamento 9 do suporte 8 em que a placa é montada e no passo 505 uma única colônia é irradiada com um feixe convergente de luz coerente gerada pela fonte de luz 5 e, com a câmera adicional 2, são tiradas fotos ampliadas de colônias individuais. Então, no passo 506, os espectros de difração daquela colônia são detectados e os espectros são comparados com os espectros de referência. No presente exemplo, a câmera adicional 2 compreende duas lentes. Uma das lentes tem uma distância focal variável, e a câmera 2 tira, portanto, a fotografia ampliada da colônia bacteriana única e as imagens de todo o meio da placa transparente 1 junto com as colônias bacterianas. Os algoritmos para o processamento de informações visuais do computador 4 permitem analisar a morfologia das colônias bacterianas.
[0060] A Figura 6A e a Figura 6B mostram duas alternativas de um terceiro sistema de exemplo 15 de acordo com a invenção. O sistema compreende a fonte de luz 5, na forma de um laser, e um elemento 6 para modular o feixe de luz que se projeta a partir da fonte de luz 5, disposta ao longo do eixo óptico da fonte. O elemento compreende um filtro de amplitude, um polarizador linear, um extensor de feixe e um diafragma de íris e, na saída do feixe de luz do elemento de modulação 6, é disposta uma lente convergente 11. Além disso ao longo do eixo óptico do sistema, a placa transparente 1 com colônias bacterianas está montada no suporte 8. O suporte 8 compreende uma fonte de luz radiante compreendendo diodos emissores de luz dispostos na forma de um anel na borda da placa transparente 1. O suporte 8 também possui um acionamento 9 para mover o suporte nas direções X e Y perpendiculares ao eixo óptico do sistema. Por trás da placa transparente, em relação à fonte do feixe e posicionado ao longo do eixo óptico, o detector 7, na forma de uma câmera, é disposto e é conectado ao computador 4. O computador 4 compreende um sistema para analisar os espectros de difração e algoritmos para processamento de informações visuais, incluindo a análise de morfologias de colônias. A câmera 2 adicional é disposta ao lado do detector 7 e também é conectada com o computador 4. A câmera adicional 2 é disposta em paralelo à câmera 7, ao longo do eixo óptico do sistema. A fonte de luz coerente 5, juntamente com o elemento 6 para modular o feixe e a lente 11, compreende o segundo acionamento 10 que permite que toda a unidade composta dos elementos mencionados acima seja movida como um todo, na direção Z paralela ao eixo óptico do sistema.
[0061] Na segunda alternativa do terceiro sistema de exemplo 15, como mostrado na Figura 6B, o sistema representado na Figura 6A compreende ainda um detector adicional 12 para gravação de sinais adicionais. O detector adicional 12 e a câmera adicional 2 estão situados em paralelo à câmera 7 disposta ao longo do eixo óptico do sistema. A fonte de luz 5, o elemento de modulação 6 e a lente de transformação 11 estão integrados com o segundo acionamento 10, que move automaticamente estes elementos em direção Z paralela ao eixo óptico do sistema. O detector adicional 12 pode ter a forma de uma câmera e ser usado para gravar imagens ampliadas de colônias bacterianas individuais.
[0062] Um quarto método de exemplo de acordo com a invenção, relativo ao sistema como mostrado na Figura 6A e na Figura 6B, é mostrado pelo fluxograma da Figura 7. No passo 701, a placa transparente 1 com as colônias bacterianas é movida na frente da câmera adicional 2, e no passo 702, uma imagem de todo o meio juntamente com as colônias bacterianas no modo de transmissão é gravada. Essa imagem é enviada para o computador 4 no passo 703 e é analisada utilizando os algoritmos de computador para processar informações visuais de modo a distinguir e identificar a localização exata das colônias bacterianas gravadas no passo 704. Então, no passo 705, a placa transparente 1 com as colônias bacterianas, montadas no suporte 8, é movida utilizando o acionamento 9 do suporte 8, para colocar as colônias individuais diretamente opostas à câmera adicional 2 e as imagens ampliadas das colônias bacterianas dispostas na placa, são gravadas. No passo 706, as imagens gravadas são enviadas ao computador 4. No passo 707, a placa transparente 1 com as colônias bacterianas é movida, novamente utilizando o acionamento 9 para mover o suporte 8, na frente da câmera 7 disposta ao longo do eixo óptico do sistema e uma única colônia bacteriana é irradiado com o feixe de luz coerente. Em seguida, os espectros de difração da colônia bacteriana irradiada são detectados no passo 708, os espectros são gravados e são comparados com os espectros de referência no passo 709. Neste sistema, o suporte 8 compreende um acionamento 9 que permite movê-lo automaticamente nas direções X e Y perpendiculares ao eixo óptico do sistema. Além disso, a fonte de luz 5, o elemento de modulação 6 e a lente de transformação 11 estão integrados com o segundo acionamento 10 que move automaticamente estes elementos na direção Z paralela ao eixo óptico do sistema. As distâncias entre estes elementos são definidas, e todo o conjunto se move para ajustar o diâmetro do raio irradiado ao diâmetro da colônia.
[0063] Conforme mostrado na Figura 8, é mostrado um quarto sistema de exemplo 15 de acordo com a invenção. O sistema compreende a fonte de luz 5 na forma de um laser, elemento de modulação 6 disposto ao longo do eixo óptico do feixe de luz que se projeta a partir da fonte 5. O elemento compreende um filtro de amplitude, um polarizador linear, um expansor de feixe e um diafragma de íris. Uma lente convergente 11 é disposta na saída do feixe de luz a partir do elemento de modulação 6. A placa transparente 1 com colônias bacterianas é disposta ao longo do eixo óptico do sistema, montado no suporte 8 compreendendo o acionamento 9. O detector 13 na forma de uma câmera é disposto atrás da placa transparente 1 ao longo do eixo óptico e é conectado ao computador 4. O computador 4 compreende um sistema para analisar espectros de difração e algoritmos para processamento de informações visuais que inclui a análise de morfologias de colônias. O detector 13 é uma câmera compreendendo duas lentes e uma dessas lentes tem uma distância focal variável, que permite a gravação da fotografia de toda a placa transparente 1 com as colônias bacterianas, as fotos ampliadas de colônias individuais, e os espectros de difração. No exemplo presente, a imagem de todo o meio juntamente com as colônias bacterianas é gravada a partir de uma direção perpendicular à superfície da placa transparente 1. O acionamento 9 permite o movimento do suporte 8 na direção paralela ao eixo óptico do sistema e nas direções X e Y perpendiculares ao eixo óptico do sistema.
[0064] Os passos de um quarto método de exemplo de acordo com a invenção são mostrados pelo fluxograma na Figura 9. No passo 901, a placa transparente 1 com as colônias bacterianas é irradiada com o feixe de luz convergente e coerente que se projeta da fonte de luz 5 e, em seguida, no passo 902, uma fotografia de toda a placa transparente 1 com as colônias bacterianas é gravada utilizando a câmera 13 e é enviada para o computador 4. Então, no passo 903, a imagem é analisada utilizando os algoritmos de computador para processamento de informações visuais e a localização exata das colônias bacterianas gravadas é distinguida e identificada. Então, no passo 904, o suporte 8 é movido automaticamente com a placa transparente 1 com as colônias bacterianas nas direções X e Y perpendiculares ao eixo óptico do sistema, e uma única colônia bacteriana é irradiada com o feixe de luz coerente. No passo 905, as imagens ampliadas de colônias bacterianas individuais são gravadas. Então, no passo 906, a colônia bacteriana única é irradiada com o feixe coerente de luz e os espectros de difração são gravados. O suporte 8 é movido automaticamente nas direções X e Y perpendiculares ao eixo óptico do sistema utilizando o acionamento 9.
[0065] O teste rápido, eficiente, não destrutivo e sem contato de colônias bacterianas pode ser realizado pela invenção por meio da imagem da placa transparente 1, as colônias bacterianas sendo gravadas a partir de uma direção perpendicular ao eixo óptico do sistema da localização da placa transparente por gravar o feixe refletido a partir do divisor de luz, com a imagem sendo enviada para o computador e analisada utilizando os algoritmos de computador para processamento de informações visuais e a localização exata das colônias bacterianas gravadas sendo distinguida e identificada. Os dados representando a distribuição das colônias bacterianas individuais na placa transparente 1 permite o movimento da placa transparente 1, de tal maneira que a colônia bacteriana alvo única testada pode ser irradiada com o feixe coerente de luz, e, em seguida, os espectros de difração da colônia bacteriana irradiada podem ser medidos e comparados com os espectros de referência.
[0066] A provisão do suporte 8 com o acionamento 9 permite a mudança automática e rápida na localização do suporte 8, ao mesmo tempo que facilita a medição rápida e precisa dos espectros de difração das bactérias cultivadas. A gravação adicional da fotografia de toda a placa transparente 1 com colônias bacterianas fornece informações sobre a contagem de colônias, que por sua vez, em conjunto com os espectros de difração de Fresnel gravados nas colônias bacterianas testadas, permitem a determinação de uma espécie bacteriana específica. A correlação ou a qualidade da correspondência visual ou o grau de confiança na caracterização ou identificação obtidas com os dados de colônia alvo podem ser quantificados como uma porcentagem, por exemplo.
[0067] A provisão do sistema óptico (uma fonte de luz 5, um elemento de modulação 6 e a lente de transformação 11) com o segundo acionamento 10 permite a mudança da localização do sistema óptico em relação à placa transparente 1 com as colônias bacterianas.
[0068] O ajuste do diâmetro de feixe radiante para o diâmetro da colônia bacteriana testada é obtido pela provisão da unidade compreendendo a fonte de luz coerente 5 juntamente com o elemento de modulação 6 e a lente 11 com o segundo acionamento 10 na direção paralela ao eixo óptico do sistema.
[0069] A provisão do suporte 8 com a fonte de luz radiante permite a rápida aquisição de fotografias de toda a placa transparente 1 com as colônias bacterianas.
[0070] A gravação das imagens ampliadas de colônias individuais é possível com a câmera tendo duas lentes ou a câmera tendo uma distância focal que permite determinar os caracteres fenotípicos da colônia bacteriana testada. A determinação desses caracteres fenotípicos adicionais, juntamente com a medição dos espectros de difração de Fresnel da colônia bacteriana testada, permite distinguir um maior número de caracteres que diferenciam a espécie bacteriana e / ou a cepa.
[0071] A Figura 10 mostra os passos de um sexto método de exemplo de acordo com a invenção em que a análise por difração é melhorada por uma maneira de centralizar precisamente o raio laser em um ponto ótimo da colônia alvo. O método começa no passo 1001, em que os dados representando uma região em uma placa dentro da qual pelo menos uma colônia de micro-organismos está disposta são adquiridos. Isto pode ser realizado através de quaisquer técnicas semelhantes às descritas nos exemplos anteriores. No passo 1002, a posição na placa de uma colônia alvo é localizada de acordo com os dados, assim como em uma maneira correspondente aos exemplos anteriormente descritos. No passo 1003, o laser é direcionado para expor a colônia alvo a um feixe coerente de luz, com base na posição localizada a partir do passo de método anterior. No presente exemplo, os dados de colônia alvo não são necessariamente gerados imediatamente com base no padrão de difração monitorado neste passo. No passo 1004, o padrão de difração resultante da difração da luz pela colônia alvo é monitorado por um detector. No entanto, ao invés de gerar imediatamente um parâmetro de comparação ou dados de colônia alvo, um parâmetro de simetria é gerado no passo 1005. O parâmetro gerado é para o ponto na placa em que o feixe é centrado e é baseado na simetria do padrão de difração monitorado. Isto é conseguido por técnicas de análise de imagem executadas pelo computador. O computador pode ser configurado para avaliar e quantificar a simetria, a homogeneidade, o tamanho, a relação de contraste ou a nitidez do padrão de difração monitorado, por exemplo, na geração do parâmetro de simetria. O parâmetro é gerado de tal forma que indica se o alinhamento entre o laser e a colônia alvo é ideal para alcançar um padrão de difração simétrico e de alta qualidade. Isto pode ser realizado utilizando o cálculo do centroide de energia, em que um centro da energia da imagem de difração ou uma porção de uma imagem é determinado utilizando algoritmos de computador. Se o centro de energia não estiver alinhado com o centro da imagem, a difração não é indicada como homogênea, e também não é finalmente simétrica.
[0072] Razões para parâmetros de simetria não ótimos indicando feixes de laser desalinhados podem incluir lasers posicionados de forma otimizada e uma colônia de agrupamento, que é um grupo de colônias de bactérias que crescem juntas. No passo 1006, o computador avalia se o parâmetro de simetria tem um valor máximo ou excede um limite predeterminado, o que indica que o centroide foi encontrado. Se o parâmetro não cumprir os critérios, o ponto na placa sobre a qual o feixe é centrado é ajustado no passo 1007. Isso é conseguido movendo o laser em graus correspondentes às posições na placa da ordem das frações do tamanho linear da colônia alvo. Os passos 1004 a 1006 são então repetidos com o laser tendo sido reposicionado por uma quantidade fracionada para procurar o centroide óptico da colônia em um ponto ligeiramente diferente dentro da colônia. Ao repetir estes passos e mover o ponto em que o eixo central do laser coincide com a colônia alvo até que o parâmetro de simetria seja maximizado, o centroide óptico é localizado por meio de um processo de procura iterativo. Uma vez que o parâmetro de simetria atingiu um valor máximo, o padrão de difração gerado pela centralização do eixo óptico do feixe é monitorado e os dados de colônia alvo são gerados de acordo com o padrão de difração monitorado e um padrão de difração de referência no passo 1008. Assim, o padrão monitorado para uma determinada colônia alvo que é usada para identificar esta colônia é gerado por centrar o laser sobre o centroide óptico ideal, em vez de simplesmente selecionar para direcionar o feixe para o centroide geométrico da colônia, o que pode produzir um projeto menos simétrico, menos representativo e, portanto, imagem de difração menos útil.
[0073] Com referência à Figura 11, um sétimo método de exemplo de acordo com a invenção é ilustrado por um fluxograma. Este método de exemplo envolve adquirir dados que são usados para localizar e direcionar o laser em direção a uma colônia alvo, são adquiridos por escanear o laser através da placa em vez de usar uma câmera para adquirir uma imagem da placa utilizando uma única exposição.
[0074] No passo 1101 um feixe de luz coerente é feito escanear uma região em uma placa dentro da qual pelo menos uma colônia de micro-organismos está disposta. Assim, em vez de usar uma câmera para adquirir um instantâneo da placa para localizar as colônias bacterianas sobre a mesma, o laser começa a escanear através da placa. Isto pode ser conseguido movendo um ou ambos o laser e a placa por meio de um mecanismo automatizado, tal como nos exemplos anteriormente descritos, e pode ser realizado em um padrão de escaneamento regular, como o escaneamento de “raster”, ou em um padrão aleatório. Os dados representando a região na placa são assim adquiridos por monitorar a luz resultante do escaneamento do feixe através da região da placa. Estes dados ópticos são adquiridos por um detector tal como o ilustrado nas figuras anteriores em 14. No exemplo atual, uma vez que não é necessário um instantâneo de câmera para localizar a colônia alvo, o detector óptico necessário pode ser mais simples do que o requerido para métodos que incluem tanto instantâneos quanto o monitoramento do padrão de difração. Enquanto o laser está sendo escaneado e a luz que passa através da placa está sendo monitorada pelo detector, o detector envia um sinal representando o padrão monitorado para um computador, que avalia se a imagem recebida corresponde a um padrão de difração. Esta decisão, indicada em 1103, é feita com base no processamento da imagem monitorada pelo computador e compreende comparar os dados ópticos recebidos com propriedades visuais características de padrões de difração de colônias para identificar se a luz laser que passa através da placa em um ponto particular está sendo difratada por uma colônia ou não. O escaneamento continua, ou seja, o método volta ao passo 1102, até que se verifique que o padrão monitorado corresponde ao padrão esperado quando o laser é difratado por uma colônia alvo, ou uma colônia de um tipo particular. O método prossegue então para o passo 1104, e o laser para escaneamento no ponto correspondente ao padrão de difração detectado, de modo que a colônia alvo que causou a difração continua a ser exposta ao feixe.
[0075] O método continua então, em passos 1105 e 1106, no monitoramento e geração de dados alvo com base no padrão de difração resultante a partir da colônia alvo afetando o feixe.
[0076] Com referência à Figura 12 um quinto sistema de exemplo para a identificação de bactérias de acordo com a invenção é ilustrado por uma vista em perspectiva. O presente sistema de exemplo, compreende as mesmas características principais como as ilustradas nas figuras anteriores, e inclui ainda um aparelho para a inoculação e incubação automatizadas de colônias na placa.
[0077] De acordo com exemplos anteriores, o sistema 15 inclui uma placa de ágar transparente 1, posicionada de tal forma que ela, bem como quaisquer colônias bacterianas em cultura, pode ser iluminada por iluminador 5. Este iluminador é configurado para fornecer iluminação em ordem para o instantâneo inicial da placa ser tirado, bem como para fazer com que um feixe de luz coerente irradie as colônias dispostas. Um detector óptico 14 é posicionado dentro do sistema integrado de tal modo que está acima da placa alinhada horizontalmente e tem um campo de visão dirigido para baixo sobre a placa. O mecanismo 19 compreende atuadores robóticos que são configurados para mover a placa, laser, e, opcionalmente, o detector 14, um em relação ao outro. Assim, o sistema é capaz de adquirir dados de modo a localizar uma colônia alvo em uma placa e posicionar o aparelho de monitoramento e de iluminação de modo a alvejar esta colônia particular, uma vez localizada. O sistema compreende ainda um manipulador robótico 25. Este é posicionado e configurado para depositar as amostras de bactérias a partir da área de entrada 28 para um meio de crescimento dentro de uma placa transparente, tal como a placa 1. Este compreende também um mecanismo de entrega para a entrega de placas nas quais as colônias tenham sido cultivadas a partir da torre de incubação 22 para a área de análise proximal à fonte de luz 5 e o detector 14. O manipulador 25 pode inocular amostras bacterianas sobre uma placa, de modo que estas placas possam ser movidas por meio de um mecanismo automatizado para a torre de incubação 22, em que as placas podem ser incubadas, de modo a encorajar o desenvolvimento de colônias de bactérias a partir de amostras inicialmente depositadas. A inoculação de bactérias em placas, a incubação das placas, a análise por difração, e gerar dados de colônia alvo e identificação, e todos os movimentos no interior do sistema necessários para estes passos podem ser realizados automaticamente pelos atuadores robóticos e manipuladores do sistema integrado 15. Todo o processo é controlado por um computador (não mostrado), que também é parte integrante do sistema, mas pode, alternativamente, ser separado a partir do sistema e emitir comandos de controle e receber retorno por meio de conexões de dados.
[0078] A Figura 13 é um fluxograma ilustrando um oitavo método de exemplo de acordo com a invenção que pode ser executado pelo sistema de inoculação, incubação e análise integrado representado na Figura 12. O método começa no passo 1301, em que pelo menos um micro-organismo é inoculado em uma placa de acordo com parâmetros de inoculação predeterminados. Estes parâmetros de inoculação podem compreender instruções programadas para controlar o inoculador robotizado, de modo a executar este passo de uma maneira consistente e repetível. No presente exemplo, o passo compreende o manipulador 25 pegar uma amostra bacteriana a partir da área de entrada 28 e a dispor em cima de uma placa de ágar. A placa é, então, movida, automaticamente, pelos mecanismos compreendidos pelo sistema, para a torre de incubação 22, e o pelo menos um micro-organismo é incubado, no passo 1302, em conformidade com parâmetros de incubação predeterminados de modo a permitir o desenvolvimento de pelo menos uma colônia de micro-organismos disposta em uma região na placa. Deve ser entendido que os parâmetros programados podem incluir instruções de computador para a manutenção de certas temperaturas dentro da torre, ou incubação das placas durante certos períodos de tempo.
[0079] Uma vez que as colônias foram incubadas durante um período de tempo suficiente para que tenham atingido um tamanho suficientemente grande para que um padrão de difração possa ser produzido a partir delas, o mecanismo de entrega do sistema remove a placa a ser examinada a partir da torre 22 e a monta no mecanismo 19.
[0080] O sistema pode, então, adquirir dados representando a região na placa e permitindo uma colônia alvo ser localizada por meio de técnicas semelhantes às já descritas. No presente exemplo, no entanto, os dados representando a região na placa são adquiridos em conformidade com os parâmetros de inoculação. Este processo, no passo 1303, compreende a obtenção, a partir dos parâmetros de incubação armazenados, de uma indicação do ponto ou porção da placa sobre a qual o dispositivo de inoculação foi programado para depositar o exemplo bacteriano inicial. Utilizando esta informação, no passo 1304 a posição sobre a placa de uma colônia alvo é localizada em conformidade com uma indicação incluída nos dados da porção da placa dentro da qual o pelo menos um micro-organismo foi inoculado. Usando esta técnica, o processo automatizado executado pelo sistema ilustrado pode ser realizado mais rapidamente, uma vez que nenhum escaneamento ou passo de captura de fotografia separado é necessário. As posições das colônias na placa podem ser conhecidas antes do início da análise.
[0081] Os passos de análise por difração indicados nos passos 1305, 1306 e 1307 são, então, realizados de modo semelhante aos passos correspondentes nos exemplos descritos anteriormente.
[0082] Com referência à Figura 14, o fluxograma ilustra um nono método de exemplo de acordo com a invenção, em que uma técnica de reconhecimento de tempo-curso é empregue. No passo 1401, pelo menos um micro-organismo é incubado de acordo com parâmetros de incubação predeterminados, de modo a permitir o desenvolvimento de pelo menos uma colônia de micro-organismos disposta em uma região de uma placa. Isto pode ser realizado de modo semelhante ao passo de incubação, no exemplo anteriormente descrito. No entanto, no presente exemplo, a placa é periodicamente retirada da torre de incubação 20 e analisada por métodos, em conformidade com os descritos acima, a fim de estabelecer se o desenvolvimento das colônias tem sido, até agora, suficiente para que as colônias sejam localizadas e identificadas.
[0083] A placa é removida da incubadora e os dados são adquiridos representando uma região, a placa dentro da qual pelo menos uma colônia de micro-organismos é disposta no passo 1402. Este passo de adquirir dados pode ser executado por um meio óptico, como o escaneamento a laser ou captura de fotografia descritas nos exemplos acima. Se os dados adquiridos não indicam a posição de uma colônia alvo, a placa é devolvida para a incubadora e os passos de 1401 a 1403 são repetidos. Pode ser determinado, no passo 1403, que os dados, até agora, não têm qualquer indicação da posição da colônia alvo porque o tempo de incubação insuficiente decorreu e as colônias são de um tamanho que é demasiado pequeno para serem detectadas por meios visuais ou ópticos. Se necessário, este processo é repetido até que uma posição de colônia alvo seja indicada pelos dados. Uma vez que isto tenha ocorrido, a posição de colônia alvo é localizada em conformidade com os dados no passo 1404.
[0084] Com a colônia alvo localizada, a placa 1 é posicionada de tal modo que a colônia é exposta para um feixe de luz coerente, no passo 1405. O padrão de difração resultante da difração da luz coerente pela colônia alvo é monitorado no passo 1406, e dados de colônia alvo são gerados no passo 1407, em conformidade com o padrão de difração monitorado e um padrão de difração de referência, por um método similar aos descritos anteriormente.
[0085] No passo 1408 o computador 4 faz uma determinação de se os dados de colônias incluem uma espécie identificada, isto é, se a espécie é identificável a partir dos dados por um computador com referência aos padrões de referência predeterminados. Se este não for o caso, a placa é removida da área de análise e devolvida para a torre de incubação de modo que incubação adicional pode ser realizada, retornando o método para o passo 1401. Os passos 1401 são então repetidos até que o computador possa determinar no passo 1408 que os dados de colônia incluem uma espécie identificada de bactérias. Quando a espécie foi identificada, o método termina.
[0086] O presente exemplo permite a localização e identificação mais eficazes de bactérias por meio de repetição dos passos indicados, de modo a identificar as espécies presentes logo que as colônias tenham se desenvolvido suficientemente para serem identificadas por análise visual e de difração. Usando este método, o crescimento de colônias de bactérias pode ser monitorado de modo que os dados são adquiridos a cada hora ou duas horas, por exemplo, até que a espécie seja reconhecível.
[0087] Além disso, as imagens de difração de tempo- curso podem ser utilizadas como informação adicional para identificar bactérias. Esta técnica consiste em repetir os passos de análise, tal como indicado na Figura 14, a fim de controlar a forma como a imagem de difração de uma determinada colônia altera com o tempo. Mais dados de difração podem, assim, ser adquiridos, em adição aos dados indicando as propriedades de crescimento e desenvolvimento das colônias, tal como indicado pelos dados ópticos obtidos.
Claims (15)
1. Método para identificar micro-organismos compreendendo qualquer das bactérias, arqueias, eucariotas, protistas, rotíferos, fungos e células de levedura, o método caracterizado pelo fato de que compreende a realização automática dos passos de:- inocular (1301) pelo menos um micro-organismo em uma placa; e incubar (1302) opelo menos um micro-organismo de modo a permitir o desenvolvimento de pelo menos uma colônia de micro-organismos disposta em uma região na placa, em que cada uma inoculação e incubação é realizada por um sistema automatizado de acordo com parâmetros de inoculação e parâmetros de incubação predeterminados, respectivamentee compreendendo ainda:- adquirir dados (1303) representando a região na placa compreendendo um meio de cultura, e a pelo menos uma colônia de micro-organismos é disposta no meio;- localizar (1304) a posição na placa de uma colônia alvo de pelo menos uma colônia de micro-organismos, de acordo com os dados;- adquirir dados resolvidos no tempo compreendendo uma imagem ampliada de cada de pelo menos uma colônia individual sendo colônia alvo e sua morfologia,- expor (1305) a colônia alvo a um feixe de luz coerente, de acordo com os dados;- monitoramento (1306) resolvido no tempo de um padrão de difração resultante da difração da luz pela colônia alvo; e- gerar dados (1307) de colônia alvo resolvidos no tempo indicando uma espécie presente na colônia alvo de acordo com a morfologia da colônia, o padrão de difração monitorado e um padrão de difração de referência,em que os dados de colônia alvo são gerados por comparar o padrão de difração monitorado com o padrão de difração de referência compreendendo gerar um parâmetro de comparação com base em uma comparação do padrão de difração monitorado com cada de uma pluralidade de padrões de difração de referência, cada padrão de difração de referência correspondente a uma espécie predeterminada; e identificar as espécies alvo presentes na colônia alvo como as espécies predeterminadas para qual o parâmetro de comparação gerado tem o maior valor e pela comparação de dados morfológicos, compreendendo: forma, geometria de uma colônia, com dados morfológicos de referência e em que um feixe de luz modulado é configurado para escanear a placa ao longo de um caminho que representa uma faixa de inoculação pela qual o pelo menos um micro-organismo foi inoculado na placa, em que um feixe de luz coerente modulado é uma luz gerada por uma fonte (5) de uma luz coerente modulada por um elemento de modulação (6), que compreende elementos ópticos que alteram o diâmetro, a intensidade e a frente de onda do feixe de luz coerente da fonte(5).
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma parte da região na placa sobre a qual o feixe de luz coerente incide é ajustada por ajustar uma ou ambas de: a direção do feixe coerente modulado; e a posição da placa, o que é alcançado por direcionar o feixe coerente modulado para um centroide óptico, definido como um ponto dentro da colônia alvo correspondente ao maior valor do parâmetro de simetria relacionado à simetria, contraste ou homogeneidade do padrão de difração monitorado, compreende ajustar as posições relativas da placa e o feixe coerente modulado de modo que o feixe coincide com a posição na placa da colônia alvo, e corrigir as posições relativas até o feixe coerente modulado coincidir com um ponto correspondente a um valor máximo de um parâmetro de simetria.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a aquisição (1303) dos dados compreende adquirir uma imagem da região na placa, pela exposição da região na placa à radiação e adquirir uma imagem da região e apelo menos uma colônia de micro-organismos e a imagem é gravada a partir de uma direção perpendicular ou paralela à região de superfície da placa dentro da qual apelo menos uma colônia é disposta ou a imagem é gravada a partir da direção paralela à superfície da placa por gravar o feixe coerente modulado refletido a partir de um divisor de luz; e localizar (1304) a posição na placa da colônia alvo é conseguido através da análise da imagem adquirida utilizando um computador configurado para processar dados de imagem de modo a identificar e localizar a posição de uma colônia de micro-organismos dentro da imagem, em que a aquisição (1303) dos dados compreende fazer com que o feixe coerente modulado de luz coerente escaneie a região na placa e a localização da posição na placa da colônia alvo é realizada por monitoramento de luz resultante do feixe coerente modulado de luz coerente escaneando a região na placa e detectando a luz difratada pela colônia alvo.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que, antes do monitoramento do padrão de difração da colônia alvo: a pelo menos uma colônia de micro-organismos disposta dentro da região na placa é irradiada;uma imagem de toda a placa e a pelo menos uma colônia de micro-organismos é gravada, enviada para um computador, analisada utilizando algoritmos computacionais para processamento de informações visuais, e a localização de pelo menos uma colônia de micro-organismos gravada é distinguida e, então:a placa e a pelo menos uma colônia de micro-organismos são movidas em relação a um sistema óptico compreendendo uma fonte do feixe de luz coerente; euma única colônia de micro-organismos de pelo menos uma colônia de micro-organismos é irradiada com o feixe de luz coerente, eapós o monitoramento do padrão de difração da colônia alvo, o padrão é gravado e comparado com um padrão de referência.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que após a localização na placa das colônias de micro-organismos ser distinguida e identificada,a placa é movida em relação ao sistema óptico, uma imagem ampliada de cada de pelo menos uma colônia individual é adquirida,e os algoritmos para o processamento de informações visuais compreendem a análise de morfologias de colônias estendendo os dados de colônia alvo relacionados ou indicando as formas físicas ou aparentes e as propriedades geométricas das colônias microbianas são aplicados;e usados em combinação com dados de análise por difração para identificar ou qualificar micro-organismos dentro da colônia alvo;em que os dados de colônia alvo são gerados por comparar o padrão de difração monitorado e / ou os dados morfológicos com o padrão de difração de referência e os dados morfológicos e de preferência o passo de aquisição dos dados é repetido pelo menos até que os dados adquiridos indiquem a posição na placa da colônia alvo e exposição da colônia alvo ao feixe, monitorar o padrão de difração, e gerar dados de colônia alvo são repetidos pelo menos até que os dados de colônia alvo incluam uma espécie identificada presente na colônia alvo e mais preferencialmente os passos são repetidos de acordo com um intervalo de tempo predeterminado e durante um período de tempo suficientemente longo para que uma colônia de micro-organismos cresça na placa, e em que os dados indicando a posição na placa da colônia alvo e os dados de colônia alvo incluem uma espécie identificada presente na colônia alvo são definidos pela colônia alvo que cresceu até um tamanho que pode ser localizada visualmente de acordo com os dados e o padrão de difração contém dados suficientes para identificar as espécies com referência a um padrão de difração de referência.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que os dados de colônia alvo são gerados de acordo com dois ou mais padrões de difração monitorados em que os dois ou mais padrões são monitorados em momentos diferentes e são representativos das propriedades de difração da colônia alvo e suas mudanças nos diferentes momentos e os parâmetros de inoculação e incubação são configurados de modo que, cada vez que o método é realizado, os processos físicos pelos quais as colônias de micro- organismos são inoculadas e incubadas são realizados de forma idêntica.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que os dados representando a região na placa são adquiridos (1303) de acordo com os parâmetros de inoculação, de modo que os dados incluem uma indicação da porção da placa dentro da qualo pelo menos um micro-organismo foi disposto; e a posição na placa da colônia alvo está localizada de acordo com a porção indicada da placa ou o feixe de luz está escaneando a placa ao longo de um caminho representando uma faixa de inoculação pela qual o pelo menos um micro-organismo foi inoculado na placa.
8. Sistema (15) para identificar micro-organismos, o sistema caracterizado pelo fato de que compreende:- uma placa (1) sobre a qual colônias de micro-organismos podem ser dispostas;- um dispositivo de inoculação para inocular pelo menos um micro-organismo na placa;- uma incubadora para incubar opelo menos um microorganismo de modo a permitir o desenvolvimento de pelo menos uma colônia de micro-organismos disposta na placa;- uma fonte de luz coerente (5);- um mecanismo (19) configurado para dirigir um feixe coerente modulado de luz coerente emitido pela fonte de luz em relação à placa;- um computador (4) configurado para adquirir dados representando uma região em uma placa dentro da qual pelo menos uma colônia de micro-organismos é disposta e indicando a posição na placa da colônia alvo (20), localizar a posição na placa da colônia alvo de pelo menos uma colônia de micro- organismos de acordo com os dados, e controlar o mecanismo de modo a expor a colônia alvo ao feixe; e- um detector (14) configurado para monitorar um padrão de difração resolvido no tempo resultante da difração da luz pela colônia alvo e sua morfologia;em que o computador é ainda configurado para gerar dados de colônia alvo, compreendendo indicar uma espécie presente na colônia alvo de acordo com o padrão de difração monitorado e um padrão de difração de referência; eem que o sistema compreende um detector configurado para gerar dados de colônia alvo em resposta à radiação incidente sobre o detector, e em que os dados representando a região na placa compreendem dados ópticos gerados pelo detector e representando uma imagem da região; eem que o computador é configurado para localizar a posição na placa da colônia alvo de pelo menos uma colônia de micro-organismos de acordo com os dados ópticos, e gerar um parâmetro de comparação com base em uma comparação do padrão de difração monitorado com cada de uma pluralidade de padrões de difração de referência, cada padrão de difração de referência correspondente a uma espécie predeterminada; e identificar as espécies alvo presentes na colônia alvo como espécies predeterminadas para as quais o parâmetro de comparação gerado tem o maior valor e em que o feixe de luz modulado é configurado para escanear a placa ao longo de um caminho que representa uma faixa de inoculação pela qual pelo menos um micro-organismo foi inoculado na placa.
9. Sistema (15), de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o mecanismo (19), compreendendo atuadores robóticos que são configurados para mover a placa e a fonte de luz coerente, é configurado para expor a colônia alvo (20) ao feixe de luz coerente por direcionar a fonte de luz (5) de modo que o feixe de luz coerente incide em uma porção da região na placa (1) correspondente à posição na placa da colônia alvo e o eixo central do feixe incide na placa de modo que este ponto é centrado sobre a posição na placa da colônia alvo; e disposto para ajustar uma parte da região na placa sobre a qual o feixe de luz coerente incide por ajustar uma ou ambas de: a direção do feixe; e a posição da placa e / ou para ajustar as posições relativas da fonte de luz e a placa de modo que o feixe seja direcionado para a posição na placa da colônia alvo,em que o computador (4) é configurado para:- controlar o mecanismo de modo a expor a colônia alvo ao feixe de luz coerente direcionando o feixe para um centroide óptico da colônia alvo;- e o mecanismo de modo a direcionar o feixe para o centroide óptico por ajustar as posições relativas da placa e a fonte de luz de modo que o feixe coincide com a posição na placa da colônia alvo, e para corrigir as posições relativas até o feixe coincidir com um ponto correspondente a um valor máximo do parâmetro de simetria;- e o mecanismo de modo a direcionar o feixe para o centroide óptico por ajustar iterativamente o ponto dentro da região na placa sobre a qual o eixo central do feixe incide e gerar um parâmetro de simetria, até que seja gerado um valor máximo do parâmetro de simetria e um ponto correspondente a este valor é localizado;- usar um algoritmo de análise de imagem para gerar o parâmetro de simetria para um ponto dentro da região na placa com base em qualquer dentre simetria, contraste ou homogeneidade do padrão de difração monitorado produzido quando o feixe de luz coerente é centrado nesse ponto, e em que o centroide óptico é definido como um ponto dentro da colônia alvo correspondente ao maior valor do parâmetro de simetria.
10. Sistema (15), de acordo com a reinvindicação 9, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende um sistema óptico compreendendo a fonte de luz, e em que o mecanismo é configurado para expor a colônia alvo (20) ao feixe de luz coerente por ajustar o sistema óptico de tal modo que o feixe é direcionado para a posição na placa (1) da colônia alvo ou por ajustar o sistema óptico em relação à placa por mover a placa em qualquer uma direção Z paralela ao eixo óptico do sistema e direções X e Y perpendiculares ao eixo óptico do sistema, de preferência, o sistema compreende uma câmera (14) configurada para adquirir os dados por adquirir uma imagem da região na placa e disposta para gravar a imagem a partir de uma direção perpendicular, paralela ou a partir de uma direção inclinada em um ângulo de 45 graus em relação à superfície da placa sobre a qual a pelo menos uma colônia é disposta, e em que o sistema é configurado para adquirir os dados por expor a região na placa à radiação por um de: dirigir uma fonte de luz para irradiar a região; ou expor a região à luz ambiente, e adquirir uma imagem da região na placa e a pelo menos uma colônia de micro-organismos utilizando a câmera e a imagem é gravada a partir da direção paralela à superfície da placa por gravar o feixe refletido a partir de um divisor de luz.
11. Sistema (15), de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende um mecanismo configurado para fazer com que o feixe de luz coerente escaneie a região na placa por ajustar as posições relativas da fonte de luz (5) e a placa (1) de modo a adquirir os dados; e o detector (14) configurado para monitorar a luz resultante do feixe de luz coerente escaneando a região na placa e para detectar luz difratada pela colônia alvo de modo a localizar a posição da colônia alvo (20).
12. Sistema (15), de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que é configurado para, antes de monitorar o padrão de difração da colônia alvo (20), em que o sistema compreende uma fonte de luz coerente e um detector:13. irradiar a pelo menos uma colônia de micro-organismos disposta na placa;14. gravar, e enviar a um computador uma imagem da placa inteira e a pelo menos uma colônia de micro-organismos;15. analisar a imagem utilizando algoritmos de computador para processar informações visuais de modo a distinguir a localização de pelo menos uma colônia de micro-organismos gravada; e depois: mover a placa (1) e a pelo menos uma colônia de micro-organismos em relação a um sistema óptico compreendendo uma fonte do feixe de luz coerente (5);16. adquirir uma imagem ampliada de cada de pelo menos uma colônia individual;17. irradiar uma única colônia de micro-organismos de pelo menos uma colônia de micro-organismos com o feixe coerente de luz; e18. após monitorar o padrão de difração da colônia alvo, gravar e comparar o padrão monitorado com um padrão de referência; e aplicar os algoritmos para processamento de informações visuais compreendendo a análise de morfologias de colônias,19. os dados de colônia alvo são gerados por comparar o padrão de difração monitorado e / ou os dados morfológicos com o padrão de difração de referência e dados morfológicos para identificar ou qualificar micro-organismos dentro da colônia alvoem que o computador (4) é configurado para:20. controlar a execução do passo de adquirir dados e é ainda configurado para repetir este passo pelo menos até que os dados adquiridos indiquem a posição na placa da colônia alvo; e para21. repetir o passo em um intervalo predeterminado e durante um período de tempo suficientemente longo para que uma colônia de micro-organismos cresça na placa, e em que os dados indicando a posição na placa da colônia alvo são definidos pela colônia alvo que cresceu para um tamanho tal que pode ser visualmente localizada de acordo com os dados; e22. para controlar a execução dos passos de expor a colônia alvo ao feixe, monitorar o padrão de difração e gerar dados de colônia alvo, e é ainda configurado para repetir esses passos pelo menos até que os dados de colônia alvo incluam uma espécie identificada presente na colônia alvo; e23. para repetir os passos de acordo com um intervalo de tempo predeterminado e durante um período de tempo suficientemente longo para que uma colônia de microorganismos cresça na placa, e em que os dados de colônia alvo incluindo uma espécie identificada presente na colônia alvo são definidos pela colônia alvo que cresceu até um tamanho tal que o padrão de difração contém dados suficientes para identificar as espécies com referência a um padrão de difração de referência; e24. para gerar dados de colônia alvo de acordo com dois ou mais padrões de difração monitorados, em que os dois ou mais padrões são monitorados em momentos diferentes e são representativos das propriedades difrativas da colônia alvo nos diferentes momentos.
13. Sistema (15), de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o computador (4) é configurado para gerar dados de colônia alvo de acordo com dois ou mais padrões de difração monitorados, em que os dois ou mais padrões são monitorados em momentos diferentes e são representativos das propriedades de difração da colônia alvo nos diferentes momentos; eem que os dados de colônia alvo (20) são representativos de uma mudança nas propriedades difrativas da colônia alvo entre os diferentes momentos e em que cada um do dispositivo de inoculação e a incubadora compreende um sistema automatizado configurado para inocular e incubar o pelo menos um micro-organismo de acordo com parâmetros de inoculação e parâmetros de incubação predeterminados, que são configurados de modo que, cada vez que o método é realizado, cada um do dispositivo de inoculação e a incubadora realizam os processos físicos, por meio dos quais as colônias de micro-organismos são inoculadas e incubadas, de forma idêntica, mais preferencialmente o dispositivo de inoculação é configurado para inocular o pelo menos um micro-organismo por dispor o micro-organismo na placa, e em que o computador é configurado para adquirir os dados representando a região na placa de acordo com os parâmetros de inoculação, de modo que os dados incluem uma indicação da porção da placa dentro da qual pelo menos um micro-organismo estava disposto; eem que o computador (4) é configurado para localizar a posição na placa da colônia alvo de acordo com a porção indicada da placa, e em que o mecanismo é configurado para direcionar a fonte de luz (5) de modo a fazer com que o feixe de luz escaneie a placa ao longo de um caminho representando uma faixa de inoculação pela qual o pelo menos um microorganismo foi inoculado na placa (1).
14. Sistema (15), de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende:- uma fonte de luz coerente (5);- elementos ópticos para modular um feixe de luz emitido pela fonte de luz coerente;- uma lente convergente (11);- uma placa (1) sobre a qual as colônias de microorganismos podem ser dispostas, a placa sendo montada em um suporte (8), a placa sendo disposta entre a lente e um detector;- o detector compreendendo uma câmera e sendo conectado a um computador (4) configurado para analisar padrões de difração;- um divisor de luz (3) disposto entre a lente e a placa;- uma segunda câmera (2) compreendendo duas lentes ou uma lente com uma distância focal variável situada obliquamente em relação à direção de propagação do feixe de luz e ao lado do divisor de luz, e configurada para gravar uma imagem da placa e / ou imagens ampliadas de pelo menos uma colônia individual de micro-organismos dispostos na placa,- a segunda câmera sendo conectada com o computador;- o suporte compreendendo a fonte de luz compreende uma pluralidade de diodos dispostos na forma de um anel na borda da placa e- um acionamento (9) para mover a fonte de luz,- o computador compreendendo algoritmos para processamento de informações visuais.
15. Sistema (15), de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende uma fonte de luz coerente (5), elementos modulando um feixe de luz projetando dessa fonte, uma lente convergente (11), uma placa (1) transparente sobre a qual colônias de micro-organismos podem ser dispostas, montada em um suporte (8), disposta entre a lente e o detector conectado a um computador (4) compreendendo um sistema que analisa padrões de difração, em que o detector é uma câmera compreendendo duas lentes ou uma lente com uma distância focal variável e o sistema compreende uma segunda câmera (2) compreendendo duas lentes ou uma lente com uma distância focal variável para gravar uma imagem de todo o meio juntamente com as colônias de micro-organismos e / ou imagens ampliadas de colônias individuais de microorganismos, conectada ao computador, em que o suporte compreende a fonte de luz radiante compreende diodos dispostos na forma de um anel na borda da placa e o acionamento (9) para movê-la nas direções X e Y perpendiculares a um eixo óptico do sistema, uma fonte de luz coerente, juntamente com um elemento para modulá-la e uma lente, compreendendo um segundo acionamento permitindo mover a fonte de luz coerente junto com o elemento para modulá-la e a lente, como um todo, na direção Z paralela ao eixo óptico do sistema, e o computador também compreende algoritmos para processamento de informações visuais, e uma fonte de luz coerente, elementos modulando o feixe de luz projetando dessa fonte, uma lente convergente, uma placa transparente, juntamente com um meio com colônias de microorganismos, montada em um suporte, disposta entre a lente e o detector conectado a um computador compreendendo um sistema que analisa os padrões de difração, em que o suporte compreende a fonte de luz radiante e o acionamento para movê- la na direção Z paralela a um eixo óptico do sistema e direções X e Y perpendiculares ao eixo óptico do sistema, enquanto o detector é uma câmera compreendendo pelo menos duas lentes e pelo menos uma das lentes tem uma distância focal variável, e o computador compreende ainda os algoritmos para processamento de informações visuais.
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